Brevet FR3061179A1 — publié le 20180629

PEPTIDES THERAPEUTIQUES La présente invention concerne des peptides thérapeutiques. Les microARNs (miRs) sont des petits ARNs non codants, d'environ 21 nucléotides après maturation, qui contrôlent l'expression de gènes cibles au niveau post-transciiptionnel, en dégradant l'ARNm cible ou en inhibant sa traduction, chez les organismes eucaryotes. Les miRs peuvent notamment réguler l'expression de gènes spécifiques impliqués dans certaines pathologies chez l'humain et les animaux. Il est d'ailleurs désormais admis que les miRs jouent un rôle important dans de nombreuses pathologies, et ces derniers constituent, par conséquent, des cibles intéressantes pour le développement de nouveaux médicaments. La régulation de l'expression des miRs est très peu connue, mais on sait notamment que celle-ci fait intervenir, à l'instar de la plupart des gènes codants, une ARN polymerase II: cette enzyme produit un transcrit primaire, appelé « pri-miR », qui est ensuite maturé par un complexe protéique contenant notamment les enzymes type Dicer. Cette maturation conduit tout d'abord à la formation d'un précurseur de miR appelé « pre-miR », ayant une structure secondaire en forme tige-boucle contenant le miR et sa séquence miR* complémentaire. Puis le précurseur est maturé, ce qui conduit à la formation d'un ARN double brin plus court contenant le miR et le miR*. Le miR est ensuite pris en charge par le complexe RISC qui clive l'ARNm du gène cible ou bien inhibe sa traduction. A l'heure actuelle, il existe principalement deux types d'approches thérapeutiques permettant de réguler l'expression des miRs in vivo. La première approche consiste à mimer l'effet du miR en utilisant des duplex d'ARN synthétiques conçus pour imiter le miR d'intérêt. L'un des brins est identique au miR d'intérêt, tandis que l'autre brin peut être modifié pour faciliter l'absorption cellulaire de la molécule. Cependant, étant donné que l'un des brins doit fonctionner comme un miR et être reconnu comme tel par la cellule, les modifications autorisées sont chimiquement limitées. De plus, bien que cette approche permette de remplacer les quantités de miRs perdues lors d'une pathologie, il est difficile de cibler les molécules d'ARN vers des tissus spécifiques, et les tissus qui n'expriment normalement pas le miR d'intérêt peuvent aussi capter le duplex d'ARN synthétique et conduire à des effets secondaires indésirables. La seconde approche consiste à recourir à des oligonucléotides antisens. De tels oligonucléotides antisens possèdent une séquence complémentaire de tout ou partie de celle 3061179 2 du miR cible et vont réduire la quantité endogène de miRs. Cependant, en raison de la faible stabilité in vivo de ce type de molécules, leur manipulation est rendue délicate et coûteuse. Il est donc nécessaire de fournir un moyen permettant de réguler plus simplement, et de 5 manière spécifique, les miRs impliqués dans certaines pathologies. Récemment, il a également été découvert de petits cadres ouverts de lecture (ORFs) dans de longs ARNs non codants intergéniques (lincRNAs) dont la fonction putative, si elle existe, n'est pas connue (Ingolia et al., Cell, 147(4):789-802, 2011 ; Guttman & Rinn, Nature, 10 482(7385):339-46, 2012). Toutefois, aucun exemple n'a encore été rapporté concernant l'existence d'ORFs codant des peptides au sein des miRs. Jusqu'à présent, les miRs, et par extension leur transcrit primaire, ont toujours été considérés, de par leur mode d'action particulier, comme des ARNs régulateurs non codants ne produisant aucun peptide. 15 Or, les Inventeurs ont récemment mis en évidence l'existence de micropeptides (ou « miPEPs », rnicroRNA encoded PEPtides) capables de moduler l'accumulation des miRs dans les cellules (Lauressergues et al., Nature, 520(7545): 90-3, 2015 ; demande internationale WO 2015/063431). 20 L'un des aspects de l'invention est donc de proposer des compositions contenant des micropeptides capables de moduler l'accumulation des miRs impliqués dans certaines pathologies. Un autre aspect de l'invention concerne ces micropeptides pour leur utilisation en tant que médicaments, et pour le traitement de pathologies spécifiques. 25 Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'identification de micropeptides permettant de moduler l'accumulation des miRs impliqués dans des pathologies. D'autres aspects de l'invention concernent également des micropeptides en tant que tels et les acides nucléiques codant ces derniers. 30 Dans un aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant : - un miPEP de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, et - un excipient pharmaceutiquement acceptable. 3061179 3 Dans l'invention, les termes « microARN », « microARN non codant » et « miR » sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent des petites molécules d'ARN d'environ 21 nucléotides, qui ne sont pas traduites et ne conduisent pas à un peptide 5 ou une protéine. Cependant, sous cette forme mature, les microARNs assurent une fonction de régulation de certains gènes via des mécanismes post-transcriptionnels, comme par exemple par l'intermédiaire du complexe RISC. Le transcrit primaire du microARN ou « pri-miR » correspond lui à la molécule d'ARN 10 directement obtenue à partir de la transcription de la molécule d'ADN. Généralement, ce transcrit primaire subit une ou plusieurs modifications post-transcriptionnelles, qui entraînent par exemple une structure particulière de l'ARN ou un clivage de certaines parties de l'ARN, et qui conduisent à la forme précurseur du microARN ou «pre-miR », puis à la forme mature du microARN ou « miR ». 15 Les termes « micropeptides » et « miPEPs » (microRNA encoded PEPtides) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent un peptide qui est codé par un cadre ouvert de lecture présent sur le transcrit primaire d'un microARN, et qui est capable de moduler l'accumulation dudit microARN. Les micropeptides au sens de la présente invention ne doivent être entendus comme étant nécessairement des peptides de 20 petite taille, dans la mesure où « micro » ne correspond pas à la taille du peptide. Selon l'invention, un miPEP peut être également assimilé à un modulateur de transcription, et notamment un activateur transcriptionnel. Un tel modulateur de transcription peut agir au niveau de la transcription pour moduler l'accumulation du pri-miR, du pre-miR et du miR. Compte tenu de la dégénérescence du code génétique, un même mieropeptide peut être codé 25 par plusieurs séquences nucléotidiques. De telles séquences nueléotidiques, différentes entre elles d'au moins un nucléotide mais codant un même peptide, sont appelées « séquences dégénérées ». Les termes « cadre ouvert de lecture » ou « ORF » (open reading frame) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils correspondent à une séquence de nucléotides dans 30 une molécule d'ADN ou d'ARN pouvant potentiellement coder un peptide ou une protéine: ledit cadre ouvert de lecture débute par un codon start (le codon start codant généralement une méthionine), suivi d'une série de codons (chaque codon codant un acide aminé), et se termine par un codon stop (le codon stop n'étant pas traduit). 3061179 4 Dans l'invention, les ORFs peuvent être dénommés de manière spécifique « miORFs » lorsque ceux-ci sont présents sur les transcrits primaires de microARN. Les miORFs peuvent être contenus dans la partie 5' ou 3' dudit transcrit primaire du microARN, de préférence dans la partie 5'. 5 Les parties 5' ou 3' du transcrit primaire du microARN correspondent aux parties terminales de la molécule de l'ARN qui sont clivées au cours de la maturation du microARN. Les miORFs tels que définis dans l'invention particulier peuvent avoir une taille de 12 à 1503 nucléotides et coder des peptides de 3 à 500 acides aminés. En particulier, les miORFs codent des miPEPs ayant une taille de : 10 15 20 25 30 3, 4, 5, 6, 7, 8, 30, 31, 32, 33, 54, 55, 56, 57, 78, 79, 80, 81, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 29, 53, 77, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 3061179 5 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ou 500 acides aminés. Les miPEPs peuvent notamment avoir une taille de 100 à 500 acides aminés, de 101 à 500 acides aminés, 200 à 500 acides aminés, de 300 à 500 acides aminés, ou de 400 à 500 acides 5 aminés. Selon l'invention, un « fragment de miPEP » correspond à une partie N-terminale, à une partie C-terminale ou à une partie interne de la séquence d'un miPEP. En d'autres termes, un REVENDICATIONS1. miPEP isolé de 3 à 500 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, pour son utilisation comme médicament, ledit miPEP étant notamment choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q1, q variant de 1 à 5 875, de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO: 11745, SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749. 2. miPEP isolé, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation selon la revendication 1, ledit miPEP étant identifié, ou tel qu'identifié, par la mise en oeuvre d'un procédé d'identification d'un miPEP modulant l'accumulation d'un miR impliqué dans une pathologie, comprenant : - a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 1 503 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, puis - b) une étape de comparaison entre : - l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR, en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit miR, et - l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR, en absence dudit peptide, dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit miR en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit miR en absence dudit peptide indique l'existence d'un miPEP, celui-ci étant codé par ledit cadre ouvert de lecture et étant capable de moduler l'accumulation dudit miR impliqué dans une pathologie. 3. miPEP isolé, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi ceux présentés dans les tableaux 1, 2, 3, 4 et 5. 3061179 4. miPEP isolé de 3 à 500 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, pour son utilisation dans le traitement des pathologies choisies parmi : le cancer, les infections bactériennes, les mycoses, les maladies cardiovasculaires, les maladies congénitales héréditaires, les maladies de la peau, les maladies des yeux, les maladies du système digestif, les maladies du système endocrinien, les maladies du système nerveux, les maladies liées à des virus, les maladies liées à la nutrition et au métabolisme, les maladies lymphatiques et hémopathies, les maladies néonatales et héréditaires, les maladies respiratoires, les maladies urogénitales chez l'homme, les maladies urogénitales chez la femme, les troubles du système immunitaire, les troubles musculo-squelettiques, les maladies ou les traumatismes du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit miPEP étant notamment choisi parmi le groupe consistant en SEQ ID NO : 2q-1, q variant de 1 à 5 875, de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO: 11 745, SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749. 5. miPEP isolé, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation selon la revendication 4, pour le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux. 6. Fragment de miPEP isolé pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, ledit fragment de miPEP étant choisi parmi : le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO: 11 751, le miPEP//125a-1 consistant en SEQ ID NO: 11 752, et le miPEP//15a-16-1 consistant en SEQ ID NO: 11 753. 7. miPEP isolé, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ledit miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant fusionné ou lié à une ou plusieurs molécules facilitant l'entrée du miPEP ou du fragment de miPEP dans la cellule, ledit miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant de préférence fusionné en N-ter ou en C-ter avec le peptide TAT (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 11 754). 3061179 8. Procédé in vitro d'identification d'un miPEP modulant l'accumulation d'un miR impliqué dans une pathologie, le dit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, comprenant : - a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 1 503 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, puis - b) une étape de comparaison entre : - l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR, en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit miR, et - l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR, en absence dudit peptide, dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit miR en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit miR en absence dudit peptide indique l'existence d'un miPEP, celui-ci étant codé par ledit cadre ouvert de lecture et capable de moduler l'accumulation dudit miR impliqué dans une pathologie. 9. miPEP isolé choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q-1, q variant de 1 à 5 875, ou fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 745, SEQ ID NO: 11 747 et SEQ ID NO: 11 749, ledit miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant notamment fusionné avec le peptide TAT (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 11 754), fusionné à la pénétratine, fusionné à un peptide polyhistidine, fusionné à un peptide polyarginine, ou lié à une ou plusieurs molécules d'acide palmitique. 10. Acide nucléique isolé codant l'un des miPEP choisis parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q, q variant de 1 à 5 875, de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO: 11 746, SEQ ID NO: 11 748 et SEQ ID NO: 11 750. 11. Utilisation in vitro ou ex vivo d'un miPEP isolé de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit 3061179 miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, pour favoriser la différenciation cellulaire des cellules.