Brevet FR3058223A1 — publié le 20180504

INTRODUCTION La présente invention se situe dans le domaine technique du contrôle de la qualité du sperme et des méthodes d'évaluation de la fertilité mâle, pour des applications vétérinaires. L'invention a pour objet un procédé de détermination objective de la motilité massale dans un échantillon de semence animale. La diminution de la fertilité mâle est notamment liée à l'altération de la qualité de la spermatogenèse. Dans le domaine vétérinaire, la semence produite au sein des centres d'insémination animale (CIA) subit un contrôle de sa qualité avant sa diffusion (voir par exemple Leboeuf et al., 2009 ; Gerard et al., 2008). La première étape de contrôle comprend l'évaluation subjective par un opérateur de la motilité massale, ou turbulence induite par le mouvement d'ensemble des spermatozoïdes. Juste après la collecte de la semence, une goutte de semence est déposée sur une lame de verre et les mouvements collectifs des spermatozoïdes en forme de tourbillons sont observés par microscopie en contraste de phase. Pour les mammifères, la vitesse de formation de ces tourbillons est évaluée et notée sur une grille de référence avec une note comprise entre 0 et 5, 0 pour une motilité minimale (pas de déplacement des spermatozoïdes) et 5 pour une motilité maximale (tourbillons très rapides). Seuls les éjaculats présentant une note supérieure à une valeur seuil, variable selon les CIA, et par exemple pour une note supérieure à 4 (présence de tourbillons), seront conservés pour diffusion. Cette méthode permet d'éliminer les éjaculats présentant un défaut de motilité manifeste. Pour les oiseaux, la grille de référence est comprise entre 0 et 8. Certains opérateurs de CIA ovins ont acquis une expertise leur permettant de définir une notation beaucoup plus précise, notation de 4 à 5 avec 0,1 point de précision, dans ce cas la note de motilité massale présente une corrélation positive avec la fertilité après insémination avec de la semence fraiche. La motilité massale est le seul paramètre de qualité de semence corrélé avec la fertilité chez les ovins pouvant être utilisé comme critère prédictif de la fertilité après insémination. Une étude récente a montré la corrélation entre la motilité massale et la fertilité après insémination sur plus de 800 000 inséminations (David et al., 2015). 3058223 2 Cependant, le caractère hautement subjectif de la mesure de la motilité massale, telle qu'elle est actuellement mise en oeuvre, limite fortement son utilisation. En pratique, il n'est pas utilisé par les CIA ovins comme critère prédictif de la fertilité. Il existe des analyseurs de motilité individuelle de spermatozoïdes, tel que 5 l'Hamilton, développé par la société Hamilton Thorn et commercialisé par la société IMV, ou le SpermVision, commercialisé par la société Minitüb. Les méthodes de l'art antérieur décrivent la méthode CASA (Computer-Assisted Sperm Analysis) qui consiste en une analyse d'image de microscopie comprenant l'identification des trajectoires de spermatozoïdes individuels (Amann et Waberski, 10 2014, Boryspolets et al., 2013, Yang et al., 2014). WO 2012/061578 décrit un outil reposant sur un classement automatisé des spermatozoïdes à partir de critères classiques de motilité individuelle. Il existe donc un besoin de méthodes permettant une meilleure estimation du pouvoir fécondant de la semence et une sélection objective et pertinente des 15 semences destinées à la fécondation. DESCRIPTION La présente invention a pour objet un procédé de mesure objective de la motilité massale d'un échantillon de sperme, permettant le développement de l'utilisation de la motilité massale pour sélectionner les semences, fraiches ou congelées, aptes à 20 l'utilisation en insémination et, d'autre part, estimer la fertilité de ladite semence. Les inventeurs ont mis au point une nouvelle méthode permettant de mesurer de façon objective et reproductible la motilité massale d'un échantillon de sperme. Ils ont montré que cette méthode était au moins aussi sensible que les méthodes de l'art antérieur. En revanche, elle est plus fiable, étant totalement indépendante de 25 l'observateur, puisqu'elle est basée sur une analyse vidéo du comportement de billes mélangées à l'échantillon étudié. En outre, elle permet des comparaisons pertinentes entre des échantillons analysés par des observateurs différents, ce qui n'était pas possible avec les méthodes de l'art antérieur. Les inventeurs ont procédé à une analyse à grande échelle, en testant plus de 500 30 échantillons d'éjaculats de béliers et en déterminant pour chaque échantillon des paramètres issus du procédé selon l'invention, tels que la vitesse moyenne des billes, 3058223 3 l'écart type de la vitesse des billes et l'entropie de la vitesse des billes. La note de motilité massale subjective a en outre été évaluée par un opérateur expérimenté. Les inventeurs ont montré que ces paramètres présentent une relation de dépendance forte avec la motilité massale subjective. Comme la fertilité d'un 5 échantillon de sperme est elle-même directement liée à la motilité massale subjective dans ledit échantillon (David et al., 2015), les résultats des inventeurs montrent que la mesure de paramètres objectifs permet d'estimer la fertilité d'un éjaculat. Le procédé selon l'invention a également été appliqué et validé à grande échelle sur 10 plus de 100 échantillons de sperme de boucs destinés à être congelés avant insémination. Les paramètres objectifs de motilité massale obtenus par un procédé selon l'invention ont été mis en relation avec la motilité massale subjective. Les résultats montrent que la mesure objective par le procédé de l'invention de la motilité massale avant congélation permet une estimation de la qualité de la 15 semence après congélation. Ce procédé présente donc l'avantage d'éviter de congeler de la semence de mauvaise qualité. Le procédé selon l'invention a en outre été appliqué et validé à grande échelle sur plus de 80 échantillons de sperme de coq. Le procédé de l'invention est donc particulièrement avantageux. En effet, il n'est pas limité aux ovins ou aux caprins, 20 mais est plus largement utilisable avec n'importe quelle espèce animale, notamment de mammifère ou d'oiseau. Le procédé selon l'invention, simple et objectif, permet donc, d'une part, de sélectionner les semences, fraîches ou congelées, qui sont aptes à l'utilisation en insémination et, d'autre part, d'estimer la fertilité de la semence. Un tel procédé 25 présente un intérêt commercial certain, notamment pour les CIA, et pourra être utilisé isolément ou couplé à la mesure de la motilité individuelle des spermatozoïdes. L'amélioration de l'évaluation de la fertilité de la semence permet notamment la diminution des retours en chaleurs, et donc la diminution des coûts d'insémination artificielle, l'amélioration des performances de l'insémination 30 permettant un développement économique des CIA, et présente un intérêt direct pour les éleveurs. Selon la méthode de l'invention, le sperme non dilué est mélangé à des billes passives. La motilité massale des spermatozoïdes entraîne les billes dont la 3058223 4 trajectoire est aisément observable, par exemple par microscopie. Sur la base de cette observation, il est possible de mesurer plusieurs paramètres qui peuvent être utilisés pour définir la motilité dudit sperme. L'invention a donc pour objet, selon un premier aspect, un procédé de détermination 5 de la motilité massale dans un échantillon de semence, ledit procédé comprenant les étapes successives suivantes : a) la mise en contact d'un échantillon de ladite semence avec des billes détectables, pour obtenir un mélange, b) l'analyse par microscopie du mouvement d'au moins une bille dans ce 10 mélange, et c) la détermination de la motilité massale de la semence à partir des données de l'analyse du mouvement de ladite bille, obtenues lors de l'étape b). Le terme - motilité massale », tel qu'on l'entend ici, désigne la turbulence induite par le mouvement d'ensemble des spermatozoïdes, évaluée dans la semence. La 15 motilité massale, parfois également dénommée - mobilité massale », est le critère de sélection de la semence dans les centres d'insémination animale. Les mouvements d'un spermatozoïde résultent en partie du battement flagellaire et seraient sensibles à de nombreux facteurs tels que le pH, la température, la viscosité du milieu et la nature des protéines présentes dans le plasma séminal (6). Ces mouvements jouent 20 un rôle majeur dans le passage du col de l'utérus et lorsque cette motilité est altérée, le passage est réduit. Le terme - billes détectables » désigne des billes, ou des sphères, dont les caractéristiques techniques sont telles que leur présence et leurs éventuels déplacements peuvent être détectés et observés individuellement. 25 Avantageusement, les billes détectables utilisées dans la méthode de l'invention peuvent être spécifiquement identifiées par des paramètres tels que leur taille, diamètre, masse, granulométrie ou leur marquage. Ce marquage peut être lié par exemple à un fluorochrome, un fluorophore, un chromophore, un radioisotope, ou n'importe quel type de marqueur de détection connu dans l'art. De préférence, on 30 entend par - billes détectables » des billes dont la présence ou les déplacements peuvent être détectés par microscopie. Dans le procédé selon l'invention, on 3058223 5 visualise le mouvement des billes détectables qui sont emportées, de façon passive, dans le déplacement de masse des spermatozoïdes. Les billes peuvent être constituées de n'importe quel matériel, par exemple le polystyrène, la cellulose, la nitrocellulose, le verre, la céramique, une résine, le 5 caoutchouc, un plastique, la silice, le silicone, le métal, et/ou un polymère. Les matériaux polymériques qui peuvent être utilisés incluent le polystyrène bromé, l'acide polyacrylique, le polyacrylonitrile, la polyamide, la polyacrylamide, la polyacroléine, le polybutadiène, la polycaprolactone, le polycarbonate, le polyester, le polyéthylène, le téréphtalate de polyéthylène, le polydiméthylsiloxane, le 10 polyisoprène, le polyuréthane, le polyvinylacétate, le polyvinylchloride, le polyvinylpyridine, le polyvinylbenzylchloride, le polyvinyltoluène, le chlorure de polyvinylidène, le polydivinylbenzène, le polyméthylméthacrylate, le polylactide, le polyglycolide, le poly(lactide-co-glycolide), le polyanhydride, le polyorthoester, le polyphosphazene, le polyphosophaze, la polysulfone, ou les combinaisons des 15 matériaux précédents. Des billes faites à partir de la plupart de ces matériaux sont disponibles commercialement. Par exemple, des billes de polymères synthétiques tels que le polystyrène, la polyacrylamide, le polyacrylate, ou le latex sont disponibles auprès de nombreuses sources commerciales comme, par exemple, BioRad Laboratories (Richmond, Calif.) et LKB Produkter (Stockholm, Sweden). Des 20 billes formées de macromolécules naturelles comme l'agarose, l'agarose réticulé, la globuline et les liposomes sont disponibles commercialement de sources telles que Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, NJ) et IBF (France). Des billes formées de copolymères de polyacrylamide et d'agarose sont disponibles commercialement de sources telles que IBF et Pharmacia. 25 Selon un aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention de détermination objective de la motilité massale dans un échantillon de semence, lesdites billes détectables sont choisies parmi des billes comprenant une quantité suffisante d'un matériau détectable en tant que tel et des billes marquées. Selon un premier mode de réalisation, les billes marquées sont des billes comprenant 30 un matériau détectable, c'est-à-dire un matériau dont les propriétés sont telles qu'elles permettent une détection en microscopie desdites billes quand celles-ci sont placées dans les conditions appropriées. Dans ce mode de réalisation, ledit matériau est présent en quantité suffisante pour permettre la détection de la bille par une 3058223 6 observation en microscopie. A titre d'exemple, lesdites billes détectables peuvent être des billes contenant de l'or. Alternativement, il peut être avantageux d'utiliser des billes sur lesquelles sont greffées des composés qui peuvent être facilement détectées en microscopie. Par 5 exemple, des billes fluorescentes peuvent être particulièrement avantageuses pour l'invention. Le terme - fluorescent » se réfère en général à la propriété d'une substance (telle un fluorophore) de produire de la lumière lorsqu'elle est excitée par une source énergétique telle que la lumière ultra-violette par exemple. De telles billes fluorescentes peuvent être facilement observées en microscopie, en utilisant 10 un filtre approprié. En outre, l'utilisation de billes fluorescentes diminue le risque d'observer des signaux non spécifiques. L'utilisation de billes fluorescentes permet donc un suivi et une analyse des mouvements des billes à la fois plus sensibles et plus spécifiques. De telles billes fluorescentes sont bien connues de l'homme du métier. Ainsi, les publications de Christensen et al. (mar-apr 2004, oct 2004) décrivent 15 l'utilisation de billes fluorescentes pour déterminer la concentration du sperme. Toutefois, ces publications ne décrivent pas un procédé de détermination de la motilité massale. Selon un mode de réalisation préféré, un fluorophore est greffé sur les billes. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de l'invention, les billes sont des billes 20 comprenant un matériau tel que, par exemple, le latex, associées à un marqueur détectable. Un tel marqueur détectable est notamment un - fluorophore », c'est-à-dire un composé fluorescent. De tels fluorophores sont bien connus de l'homme du métier (voir Johnson, I.; Spence, M.T.Z. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th ed.; Molecular Probes: Eugene, 25 OR, USA, 2010) et incluent des composés tels que, par exemple, le 4,6- Diannidino-2- phénylindole (DAPI) avec une fluorescence bleue, l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) avec une fluorescence verte et le Texas RedTM avec une fluorescence rouge. De telles billes sont disponibles commercialement et aisément accessibles à un homme du métier. On peut citer par exemple les billes FluoSpheres Fluorescent 30 Microspheres commercialisées par Thermofisher et qui sont décrites dans - Johnson, I.; Spence, M.T.Z. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th ed.; Molecular Probes: Eugene, OR, USA, 2010. » 3058223 7 Selon un mode de réalisation préféré du procédé de détermination de la motilité massale de l'invention, lesdites billes détectables sont des billes fluorescentes en latex. Selon un mode de réalisation préféré, les billes utilisées dans la méthode de 5 l'invention ont un diamètre inférieur à un millimètre, de préférence un diamètre compris entre 0,1 et 100 micromètres (pm). Bien que les billes puissent avoir n'importe quelle taille dans cette gamme, elles ont de préférence un diamètre compris entre 0,2 et 50 pm, plus préférablement entre 0,5 et 25 pm, encore plus préférablement entre 0,7 et 10 pm, et toujours plus préférablement entre 1 et 5 pm. 10 Selon un autre aspect particulier, dans un procédé de détermination objective de la motilité massale selon l'invention, la concentration desdites billes détectables dans le mélange constitué par la semence et les billes est comprise entre 0,01 et 50 pM, de préférence entre 0,2 et 20 pM. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape b) comprend l'analyse du déplacement 15 d'au moins une bille. De façon plus préférée, l'étape b) comprend l'analyse du déplacement de plusieurs billes. De façon encore plus préférée, l'étape b) comprend l'analyse du déplacement d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 20, d'au moins 30, d'au moins 40, d'au moins 50, d'au moins 100, d'au moins 500 ou 20 d'au moins 1000 billes. Ce déplacement peut être mesuré de toute manière connue de l'homme du métier. Il peut être pratique en particulier, d'utiliser une caméra couplée à un micro-ordinateur, notamment un système CASA (Computer-assisted sperm analysis ; pour une revue voir par exemple Amann RP, Waberski D., Computer-assisted sperm 25 analysis (CASA): capabilities and potential developments. Theriogenology. (2014) 81(1): 5-17) pour analyser la trajectoire de chaque bille. Par exemple, en prenant des clichés de la bille à intervalles réguliers, il est possible de déterminer la distance parcourue par la bille, ce qui permet d'en déduire la vitesse. Selon ce mode de réalisation, l'étape b) dudit procédé comprend l'enregistrement d'au moins deux 30 images d'au moins une bille. Il est particulièrement avantageux de pouvoir détecter la bille d'une image à l'autre. Cela permet notamment de pouvoir reconstruire la trajectoire de ladite bille. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape b) comprend l'enregistrement d'au moins deux images d'au moins une bille et la 3058223 8 détection automatique de la bille sur chacune de ces images. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape b) comprend l'enregistrement d'au moins deux images d'au moins une bille, la détection automatique de la bille sur chacune de ces images et la reconstruction de la trajectoire. Selon un mode de réalisation préféré de 5 l'invention, une séquence vidéo est enregistrée, c'est-à-dire une séquence d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 20, d'au moins 30, d'au moins 40, d'au moins 50, d'au moins 100, d'au moins 500 ou d'au moins 1000 images. De façon plus préférée, la séquence vidéo comprend au moins 2, au moins 3, au moins 4, au 10 moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 20, au moins 30, au moins 40, au moins 50, au moins 100 images par unité de temps, celle-ci pouvant notamment être la seconde. Par exemple, la séquence vidéo est une séquence vidéo de 100 images, à la fréquence de 100 images par seconde. Selon un mode de réalisation encore plus préféré, la séquence vidéo comprend des images 15 d'au moins une bille, et plus particulièrement d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 20, d'au moins 30, d'au moins 40, d'au moins 50, d'au moins 100, d'au moins 500 ou d'au moins 1000 billes. Selon un mode de réalisation préféré, l'analyse de l'étape b) comprend la mesure de 20 la vitesse de déplacement d'au moins une bille. De façon encore plus préférée, l'étape b) comprend la mesure de la vitesse de déplacement d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 20, d'au moins 30, d'au moins 40, d'au moins 50, d'au moins 100, d'au moins 500 ou d'au moins 1000 billes. Par - vitesse de 25 déplacement » de la bille, on entend ici la distance parcourue par la bille par unité de temps. La - vitesse de déplacement » selon l'invention recouvre aussi bien la vitesse de déplacement effective que la vitesse de déplacement apparente. Par vitesse de déplacement effective », on entend ici la distance parcourue par la bille dans le plan d'observation et dans le plan perpendiculaire à celui-ci, par unité de 30 temps. La - vitesse de déplacement apparente » telle qu'on l'entend ici correspond la distance parcourue par la bille dans le plan d'observation par unité de temps. Les inventeurs ont montré que le procédé de l'invention peut être avantageusement mis en oeuvre en mesurant la vitesse de déplacement apparente. 3058223 9 Selon un aspect plus particulier, la vitesse de déplacement d'au moins une bille est calculée à l'aide d'un algorithme mathématique et utilisée comme critère objectif d'évaluation de la motilité massale. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, la vitesse de déplacement d'au 5 moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 20, d'au moins 30, d'au moins 40, d'au moins 50, d'au moins 100, d'au moins 500 ou d'au moins 1000 billes est ainsi calculée et permet d'évaluer la motilité massale de la semence. L'homme du métier comprendra d'ailleurs aisément que le suivi de plusieurs billes dans un même 10 échantillon de semence permet d'obtenir un résultat plus précis et plus significatif. En particulier, il est possible de se livrer à une analyse statistique sur la population de billes dont la vitesse de déplacement est ainsi calculée. De façon préférée, la vitesse de déplacement d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 20, 15 d'au moins 30, d'au moins 40, d'au moins 50, d'au moins 100, d'au moins 500 ou d'au moins 1000 billes est mesurée. Plusieurs paramètres sont issus de cette analyse : - la vitesse moyenne des billes - l'écart type de la vitesse des billes 20 - l'entropie. Selon un premier mode de réalisation préféré, la vitesse moyenne de déplacement des billes est indicative de la motilité massale de la semence. La vitesse moyenne de déplacement des billes est obtenue en calculant la moyenne des vitesses de déplacement de chacune des billes. C'est un paramètre qu'il est particulièrement 25 simple de déterminer. Les inventeurs ont ainsi montré que la vitesse moyenne permet de discriminer significativement les semences de bonne et mauvaise qualité. Par ailleurs, pour les semences de bonne qualité, la vitesse moyenne est fortement corrélée à la motilité massale. Selon ce mode de réalisation, la vitesse moyenne de déplacement des billes est utilisée comme critère objectif d'évaluation de la motilité 30 massale. Il sera immédiatement apparent à l'homme du métier que la détermination de la vitesse de chacune des billes de la population permet non seulement de calculer une 3058223 10 vitesse moyenne, mais aussi un écart type à cette vitesse moyenne. De même que la vitesse moyenne, l'écart type est un critère de discrimination entre semences de bonne et mauvaise qualité et est fortement corrélé à la motilité massale dans les semences de bonne qualité. Selon un autre mode de réalisation, l'écart type à la 5 vitesse moyenne de déplacement des billes est utilisé comme critère objectif d'évaluation de la motilité massale. La variance étant le carré de l'écart type, l'homme du métier comprendra aisément que la mesure de chacun de ces paramètres donne immédiatement la valeur de l'autre. L'analyse du déplacement des billes peut aussi impliquer la caractérisation de la 10 trajectoire de chacune des billes. Plus particulièrement, la fréquence des changements de trajectoire de chacune des billes peut être déterminée, ce qui donne une bonne indication de la motilité de l'échantillon de semence testé. L'entropie selon l'invention est celle utilisée en théorie de l'information (Claude E. Shannon, "A Mathematical Theory of Communication", The Bell System Technical 15 Journal, 27 (3): 379-423, July 1948, doi:10.1002/j.1538-7305.1948.tb01338.x). Cette entropie mesure la quantité d'information produite par une source d'information donnée, ou, en termes probabilistes, le degré d'incertitude concernant cette source. En termes statistiques, elle correspond à une mesure de dispersion de la distribution de probabilité, au même titre que l'écart-type ou la variance. L'intérêt de l'entropie 20 de Shannon dans ce cadre est son comportement pour des variables aléatoires dont la distribution de probabilité est multimodale. Dans le contexte de l'invention, une version plus générale de l'entropie peut aussi être utilisée (Alfred Rényi, "On Measures of Information and Entropy", Berkeley Symposium on Mathematics, Statistics and Probability, Berkeley, CA, USA, 547-561, June-July 1960), caractérisée 25 par un ordre communément désigné - alpha ». Lorsque alpha tend vers 1, l'entropie de Rényi tend vers l'entropie de Shannon. En l'espèce, les inventeurs ont montré que l'entropie des vitesses apparentes instantanées le long des trajectoires des billes permet également de discriminer entre semences de bonne et mauvaise qualité. Ce paramètre est directement corrélé 30 à la motilité massale dans les semences de bonne qualité. Les inventeurs ont montré que le coefficient de corrélation dans ce cas est plus élevé que celui obtenu pour la vitesse, ce qui souligne l'intérêt d'utiliser ce paramètre pour évaluer la motilité 3058223 11 massale. Selon un autre mode de réalisation, l'entropie est utilisée comme critère objectif d'évaluation de la motilité massale. Selon un aspect plus particulier de l'invention, au moins l'un des trois paramètres ci-dessus, à savoir la vitesse moyenne de déplacement des billes, l'écart type à cette 5 vitesse et l'entropie, est retenu pour le calcul d'un score de motilité massale de l'échantillon. Ledit score est défini comme une règle de décision de classer, garder ou écarter un échantillon. Selon un autre aspect préféré de l'invention, une combinaison d'au moins deux des trois paramètres ci-dessus est retenue pour le calcul du score de motilité massale de 10 l'échantillon. Ainsi, ledit score peut être calculé à l'aide de la vitesse moyenne de déplacement des billes et de l'écart type, ou bien à l'aide de la vitesse moyenne de déplacement des billes et de l'entropie, ou encore à l'aide de l'écart type et de l'entropie. De façon encore plus préférée, la combinaison de ces trois paramètres, la vitesse moyenne de déplacement des billes, l'écart type à cette vitesse et 15 l'entropie, est retenue pour le calcul du score de motilité massale de l'échantillon. Avantageusement, ledit score sera comparé à un score de référence. On entend au sens de la présente demande tout score obtenu par la mesure d'au moins un des paramètres ci-dessus et utilisé à titre de référence. Par exemple, un score de référence peut être obtenu en mesurant au moins l'un des trois paramètres décrits 20 plus haut dans des conditions particulières, notamment dans un ou plusieurs échantillons particuliers. L'homme du métier saura choisir ces conditions particulières en fonction de son objectif lors de la mise en oeuvre de l'invention. Avantageusement, le score de référence correspond à un échantillon de semence provenant de la même espèce animale que l'échantillon testé. En outre, il est 25 particulièrement avantageux que le score de référence soit déterminé dans les mêmes conditions de préparation des échantillons ou d'acquisition des images telles que décrites ci-dessus. Dans un mode de réalisation préféré, ledit score de référence est obtenu en mesurant au moins l'un des trois paramètres ci-dessus, à savoir la vitesse moyenne 30 de déplacement des billes, l'écart type à cette vitesse et l'entropie, dans au moins un échantillon de sperme de motilité massale connue. Ainsi, la motilité de l'échantillon testé est bonne quand le score dudit échantillon est supérieur ou égal à celui d'un échantillon connu pour avoir une bonne motilité. De même, la motilité de 3058223 12 l'échantillon testé est mauvaise quand le score dudit échantillon est inférieur ou égal à celui d'un échantillon connu pour avoir une mauvaise motilité. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le score de référence est déterminé sur une population d'échantillons de semence provenant de la même 5 espèce animale que l'échantillon testé. Selon ce mode de réalisation préféré, l'un au moins des trois paramètres décrits plus haut, c'est-à-dire vitesse moyenne de déplacement des billes, écart type à cette vitesse et entropie, est mesuré dans chacun de ces échantillons. De façon plus préférée au moins deux, et de façon encore plus préférée, au moins trois paramètres sont mesurés. En outre, selon ce 10 mode de réalisation préféré, la motilité massale subjective est déterminée pour chacun desdits échantillons de semence. Le score de référence peut alors être déterminé en utilisant une fonction de régression dont les variables d'entrée sont l'un au moins des paramètres décrits plus haut, c'est-à-dire vitesse moyenne de déplacement des billes, écart type à cette vitesse et entropie, et l'unique variable 15 de sortie, le score de motilité massale subjective. Préférentiellement, la fonction de régression appartient à la famille des fonctions de régression à vecteurs de support (en anglais, Support Vector Regression ou SVR). Ces familles peuvent notamment être mises en oeuvre à l'aide d'une bibliothèque logicielle disponible en accès libre (LibSVM : https://www.csie.ntu.edu.twf-cilinnibsvm/). Le score de référence dans 20 ce mode de réalisation correspond à la valeur au-dessus de laquelle les échantillons de ladite population présentent une bonne motilité massale subjective. Dans ce mode de réalisation particulier, la motilité de l'échantillon testé est bonne quand le score dudit échantillon est supérieur ou égal au score de référence. En revanche, la motilité de l'échantillon testé est mauvaise quand le score dudit 25 échantillon est inférieur ou égal au score de référence. Il peut être avantageux pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention d'utiliser un récipient spécifique qui permet d'étudier la motilité de la semence. L'échantillon de semence est ajouté dans ledit récipient, avant que la motilité de ladite semence ne soit déterminée. De façon préférée, ledit récipient permet une observation au 30 microscope de l'échantillon. De tels récipients sont bien connus de l'homme du métier. Ils incluent notamment les microplaques et les lames de microscope. En particulier, ledit récipient est constitué par une chambre délimitée par deux lames 3058223 13 transparentes, une chambre délimitée par deux lames de verre, ou une lame d'observation. Selon un mode de réalisation plus particulier du procédé de l'invention, les dimensions dudit récipient sont connues. Selon ce mode de réalisation particulier de 5 l'invention, ledit récipient possède des dimensions appropriées avec lesquelles les parois du récipient n'imposent pas de contrainte trop forte vis-à-vis de la formation de tourbillons. De plus, les parois du récipient sont constituées d'un matériau permettant d'observer les tourbillons par microscopie, notamment un matériau transparent ; plus particulièrement les parois sont en verre. 10 De préférence, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre avec des récipients calibrés, permettant ainsi une analyse à grande échelle d'échantillons de semence. Un récipient adapté à la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention est notamment une lame d'observation, en particulier une lame d'observation comprenant une chambre et, plus particulièrement, une lame d'observation 15 comprenant une chambre de profondeur connue, par exemple d'environ 100 pm. Il est ainsi possible d'utiliser une lame d'observation de type Leja, contenant une chambre de profondeur connue, notamment de 100 pm. Le procédé de l'invention permet de déterminer la motilité des spermatozoïdes dans un échantillon de semence. Le terme - semence », comme on l'entend ici, désigne le 20 sperme émis par un animal. Selon un mode de réalisation particulier dudit procédé, ledit échantillon est constitué de semence pure, c'est-à-dire non diluée. Selon un autre mode de réalisation particulier dudit procédé, ledit échantillon est constitué de semence diluée. Le procédé de l'invention pourra donc comprendre le cas échéant une étape de dilution de l'échantillon de sperme avant que celui-ci ne soit 25 mélangé avec les billes. Selon un mode de réalisation particulier, la semence utilisée dans le procédé de détermination de la motilité massale est une semence fraîche. Par - semence fraîche » on entend de la semence récemment collectée, n'ayant notamment pas subi de congélation ni de décongélation. Selon un autre mode de réalisation 30 particulier du procédé de l'invention, ladite semence est une semence décongelée. Par « semence décongelée » on entend de la semence ayant subi au moins une congélation suivi d'une décongélation, par des moyens bien connus de l'homme du métier. 3058223 14 Le procédé de l'invention permet de déterminer la motilité massale d'un échantillon de semence provenant de n'importe quel animal. En particulier, le procédé de l'invention est avantageux pour déterminer la motilité massale d'un échantillon de semence provenant d'un animal ayant un intérêt économique. On entend notamment 5 par - animal ayant un intérêt économique » les animaux d'élevage, tels que les ovins, les bovins, les équins, les porcins, les caprins et les oiseaux. Sont aussi des animaux ayant un intérêt économique les animaux de compagnie comme les chiens et les chats, notamment ceux de race pure. Selon un mode de réalisation préféré, ladite semence animale est collectée à partir 10 d'un animal sélectionné parmi les ovins, les bovins, les équidés, les caprins et les oiseaux. Par - ovins », on entend en particulier les moutons et les mouflons. De préférence, un ovin selon l'invention est un bélier, comme, par exemple, un bélier de race Lacaune, Manech et Blanche du Massif central. 15 Par - bovins », on entend une sous-famille des bovidés, mammifères ruminants, qui comprend plusieurs espèces importantes d'animaux d'élevage, en particulier le Bos taurus, le gayal, le buffle, le zébu et le yack. Par - équidés », on entend en particulier les chevaux, les ânes, les hémiones et les zèbres. Préférentiellement, un équidé tel qu'on l'entend ici est un cheval ou un âne. 20 Par - caprins », on entend notamment les chèvres et les chamois. Les - caprins » de l'invention sont notamment les boucs de toute espèce. Par oiseaux, on entend notamment les coqs, les dindons, les canards, les jars et les cailles. La note de motilité massale permet d'estimer la fertilité après insémination. Une 25 étude récente a démontré, en se fondant sur plus de 800 000 inséminations, qu'il existe une corrélation entre la motilité massale et la fertilité après insémination (David et al., 2015). Le procédé selon l'invention permet donc d'obtenir une estimation de la fertilité d'un animal dont est issu l'échantillon de semence par la détermination de la motilité massale de l'échantillon. 30 Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci a pour objet un procédé d'estimation de la fertilité d'un échantillon de semence, ledit procédé comprenant une première 3058223 15 étape de détermination de la motilité massale selon le procédé décrit plus haut et une deuxième étape d'estimation de la fertilité de la semence à partir de la motilité massale de la semence. Avantageusement, la fertilité de l'échantillon est forte quand la motilité massale est élevée. 5 Le procédé de l'invention peut être avantageusement mis en oeuvre à l'aide d'un kit. Ce kit contient notamment l'ensemble des moyens nécessaires pour mesurer la motilité massale d'un échantillon de semence. Ledit kit peut contenir en particulier des billes détectables. Alternativement, ce kit peut contenir au moins un récipient adapté à l'observation par microscopie d'un échantillon de semence mélangé à des 10 billes détectables. De façon préférée, le kit comprend des billes détectables et un récipient adapté à l'observation par microscopie d'un échantillon de semence mélangé à des billes détectables. Selon un autre aspect de l'invention, l'invention a donc également pour objet un kit destiné à la mise en oeuvre d'un procédé de détermination objective de la motilité 15 massale selon l'invention, ledit kit comprenant : - au moins un récipient adapté à l'observation par microscopie d'un échantillon de semence mélangé à des billes détectables, et/ou - des billes détectables. De façon préférée, le kit de l'invention comprend un récipient adapté à l'observation 20 par microscopie d'un échantillon de semence mélangé à des billes détectables. Avantageusement, ledit récipient est un récipient tel que décrit plus haut. De façon préférée, le kit de l'invention comprend des billes détectables telles que celles décrites plus haut. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le kit 25 comprend également un logiciel permettant de calculer au moins des paramètres du procédé décrit plus haut, à savoir vitesse moyenne, écart type et entropie. De façon plus préféré, ledit logiciel est un logiciel logiciel de calcul implémenté dans un système CASA (Computerized Assisted Sperm Assessment). Selon un mode de réalisation particulier, l'analyse d'images de l'étape c) du procédé de l'invention est 30 réalisée par un logiciel de calcul implémenté dans un système CASA (computer assisted sperm assessment). 3058223 16 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et figures suivants. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Représentation de la vitesse des billes en fonction de la note de motilité 5 massale subjective. La vitesse des billes permet de discriminer les semences de bonne (note supérieure à 4) et de mauvaise (note inférieure à 4) motilité massale subjective. La relation entre la motilité massale subjective et la vitesse des billes est forte (coefficient de détermination : R2 de 0,92). Figure 2 : Représentation de l'entropie en fonction de la note de motilité massale 10 subjective. L'entropie permet de discriminer les semences de bonne et de mauvaise motilité massale. La relation entre la motilité massale subjective et l'entropie est forte (coefficient de détermination : R2 de 0,79). Figure 3 : Relation entre la motilité massale subjective et la motilité individuelle après décongélation chez les caprins. La relation entre la motilité massale subjective 15 et la motilité des spermatozoïdes après décongélation est très forte (coefficient de détermination : R2 de 0,90). Seuls les éjaculats ayant une note supérieure à 4 méritent d'être congelés (pourcentage de spermatozoïdes mobiles supérieur à 5%), tandis que la motilité massale subjective, entre 4 et 5, est fortement corrélée avec la motilité après décongélation. 20 Figure 4 : Relation entre la vitesse des billes et la motilité massale subjective de la semence caprine. La vitesse des billes, issue de la motilité massale objective, présente une corrélation élevée avec la motilité massale subjective (coefficient de détermination : R2 de 0,95) et permet donc son estimation. Figure 5 : Relation entre la motilité massale objective (vitesse des billes) et la 25 motilité individuelle après décongélation chez les caprins. La vitesse des billes, issue de la motilité massale objective présente une corrélation élevée avec la motilité individuelle après décongélation (coefficient de détermination : R2 de 0,76) et permet donc son estimation. Figure 6 : Relation entre la vitesse des billes et la mobilité massale subjective chez 30 l'oiseau. La vitesse des billes, issue de la motilité massale objective, présente une 3058223 17 corrélation élevée avec la motilité massale subjective (coefficient de détermination : R2 de 0,94) et permet donc son estimation. EXEMPLES Exemple 1 : Collecte et contrôle de la semence de béliers, note de motilité 5 subjective La collecte de la semence a été réalisée sur deux races de béliers : Lacaune et Manech à tête rousse. Afin de limiter la variation de libido et de qualité de la semence induite par le cycle photopériodique naturel, ces béliers sont soumis à un traitement lumineux en alternant 1 mois de jours courts (8 heures de lumière/16 10 heures d'obscurité) et 1 mois de jours longs (16 heures de lumière/ 8 heures d'obscurité) reproduisant le cycle de la lumière naturelle. Les brebis utilisées lors de la collecte, appartiennent à la race laitière Ile de France, qui ont subi une ovariectomie pour supprimer leur cycle sexuel et le risque de gestation. Pour simuler l'oestrus, ce cycle a été reproduit grâce à un traitement hormonal, dont le principe 15 repose sur la pose d'une éponge de 30 mg d'acétate de fluorogestone durant douze jours et d'une injection de 100 pg de benzoate d'oestradiol, le jour du retrait de l'éponge. Le comportement d'oestrus apparait 16 à 36 heures après l'injection, et dure deux à trois jours. Pour la collecte de la semence, les béliers sont emmenés en premier et attachés 20 dans la salle de collecte. Trois brebis leur sont présentées et celle étant en oestrus est choisie pour la collecte. La méthode de prélèvement de la semence est le vagin artificiel. L'éjaculation instantanée est provoquée par la chaleur du vagin artificiel (37°C). Une fois la collecte réalisée, la semence est maintenue à 37°C au bain-marie, le temps de l'analyse et de la dilution de la semence. Après la collecte, la 25 qualité de chaque éjaculat est évaluée et repose sur l'évaluation de différents critères : volume de l'éjaculat, concentration en spermatozoïdes (en milliards/ml), évaluée par mesure spectrophotonnétrique (À = 546nm) en diluant 20 pl de semence pure dans 4 ml de chlorure de sodium 0,9% (NaCl) maintenue à 37°C au bain-marie, et l'analyse subjective de la motilité massale. 30 Pour la mesure de la motilité massale, une goutte de 5pl de semence pure est déposée sur une lame disposée sur une plaque chauffante (37° ). L'observation de la motilité massale se fait à l'aide d'une caméra numérique de haute résolution reliée 3058223 18 au microscope à contraste de phase. Les séquences vidéo réalisées, sont ensuite visionnées et une note de 0 à 5 est attribuée à l'échantillon étudié selon la motilité, les mouvements et les tourbillons produits par les spermatozoïdes. Exemple 2 : Analyse objective de la Motilité Massale 5 Ces analyses consistent à récolter des données à partir d'échantillons de semence de bélier, en utilisant un microscope à contraste de phase et à fluorescence ainsi qu'une caméra à haute résolution PCO, avec le logiciel CAMWARE. La semence de béliers a été collectée à l'aide d'un vagin artificiel et conservée pure à 37°C dans le tube de collecte jusqu'à leur utilisation (voir exemple 1). 10 Préalablement à la collecte, la solution contenant les microbilles fluorescentes a été préparée en ajoutant 10 pl de microbilles fluorescentes (Hile Red, Haute Intensité, diamètre = 2 pm, chez Spherotech) dans 90 pl de NaCl. La solution de billes fluorescentes est ensuite ajoutée à la semence. La concentration en billes est de 0,0025% après l'ajout de la semence (5 pl de billes pour 195 pl de semence par 15 exemple). Cette solution est placée dans un tube de type Eppendorf (un tube par bélier). Ces tubes ont été conservés à 37°C dans un bain-marie. Afin de standardiser l'analyse du déplacement des billes induit par la motilité des spermatozoïdes, des lames de type Leja sont utilisées. Elles comprennent une chambre de profondeur connue et standardisée, ce qui homogénéise les images obtenues. Dans le présent 20 système, une profondeur de 100 pm a été retenue. Ces lames sont placées sur une plaque chauffante à 37°C. Un volume de 30 pl de mélange semence + billes est injecté dans une chambre de 100 pm d'épaisseur et le déplacement des billes est visualisé par microscopie à fluorescence. Une séquence vidéo de 100 images est ensuite enregistrée à la 25 fréquence de 100 images par seconde. Exemple 3 : Analyses statistiques Le déplacement des billes est ensuite quantifié par l'utilisation d'un outil d'analyse d'image. Cet outil est une routine d'analyse fonctionnant avec le logiciel Matlab (développé par la société The MathWorks, Inc.) qui calcule la vitesse de déplacement 30 des billes entre deux images successives et répète cette opération sur l'ensemble de la séquence. 3058223 19 Préalablement au calcul des vitesses de déplacement des billes, les billes sont détectées dans chaque cliché de la séquence vidéo. Dans les clichés, les billes apparaissent comme des objets circulaires au contour plus ou moins flou. Il existe de nombreuses méthodes de détection de tels objets. Pour chaque cliché et de manière 5 indépendante, le cliché est lissé par un filtre passe-bas (pour réduire la quantité de bruit visuel) puis seuillé par une valeur de seuil fixée. Autrement dit, tous les pixels d'une valeur d'intensité supérieure au seuil sont retenus. Pour un ensemble contigu de pixels retenus, si le nombre de pixels est inférieur à un seuil fixé (ce seuil peut être calibré par la connaissance de la taille des billes et des caractéristiques 10 d'acquisition des clichés), l'ensemble est rejeté. Sinon, l'ensemble correspond à une bille et la position associée à cette bille est calculée comme le barycentre des pixels qui la composent. Ensuite, la vitesse de déplacement d'une bille particulière est mesurée entre deux clichés successifs selon le principe suivant. 15 Soit une bille (ci-après B) d'un cliché (ci-après C1). La bille choisie comme correspondant à B dans le cliché suivant (ci-après C2) est celle qui est la plus proche de la position attendue de B dans C2 étant donnée la position P1 de la bille B dans le cliché Cl et les vitesses de déplacement précédemment calculées pour cette bille. La position attendue de B dans C2 peut être calculée de diverses manières selon le 20 modèle de déplacement retenu, en particulier linéaire ou non linéaire. En pratique, il a été choisi un modèle linéaire simple utilisant uniquement la dernière vitesse de déplacement calculée (ci-après VO), c'est-à-dire celle calculée entre le cliché précédant Cl (ci-après CO) et C1. Si Cl est le premier cliché de la séquence vidéo, cette dernière vitesse de déplacement est arbitrairement fixée à 25 zéro. On a retenu comme position attendue (ci-après P2a) de B dans C2 la position P2a égale à P1 + VO. Soit P2 la position de la bille dans C2 la plus proche de la position P2a : si P2 est à une distance de P2a plus grande qu'un seuil fixé, la correspondance n'est pas retenue et la bille B est considérée non visible sur le cliché C2. Dans le cas contraire, la correspondance est retenue et la vitesse de 30 déplacement de B à l'instant du cliché Cl est calculée comme le vecteur de déplacement de P1 à P2 divisé par l'intervalle de temps entre Cl et C2. Le suivi de la bille B peut alors continuer selon le même principe du cliché C2 au cliché suivant, ci-après C3. 3058223 20 La trajectoire de la bille B est ainsi construite au fil des clichés. Cette trajectoire peut être représentée par une courbe dans l'espace XYT construite à partir des positions et des vitesses de déplacement successives de la bille au cours de la séquence vidéo. Une représentation plus simple sous forme de l'ensemble ordonné 5 des vitesses de déplacement calculées a été choisie. A l'issue de cette construction, si la trajectoire calculée est trop courte (nombre de clichés impliqués inférieur à un seuil fixé), la trajectoire est considérée invalide et n'est pas utilisée dans le critère objectif d'évaluation de la motilité massale. Plusieurs paramètres sont issus de cette quantification : 10 - la vitesse moyenne des billes - l'écart type de la vitesse des billes - l'entropie. Exemple 4 : Mise en oeuvre à grande échelle chez les ovins Cette méthode objective de mesure de la motilité massale a été testée à grande 15 échelle dans le cadre d'un essai mené dans un centre d'insémination animale. Pour cela, un total de 530 éjaculats a été analysé selon cette méthode objective en parallèle de la méthode subjective de référence. Pour chaque éjaculat ont été obtenus : - les paramètres issus de la quantification (vitesse, écart type, entropie), et 20 - la note de motilité massale subjective évaluée par un opérateur expérimenté. Les paramètres issus de la quantification sont mis en relation avec la motilité massale subjective évaluée par un opérateur. La motilité massale subjective est couramment utilisée comme critère de sélection des éjaculats : seuls les éjaculats ayant une note supérieure à 4 sont conservés. Les données ont donc été analysées 25 selon deux modalités : motilité massale inférieure à 4 et motilité massale supérieure à 4. La moyenne des vitesses observées a été calculée pour chaque note de motilité massale (Figure 1). La vitesse des billes permet de discriminer les semences selon qu'elles ont une motilité massale subjective bonne (supérieure à 4) ou mauvaise (inférieure à 4). Pour 30 les semences dont la note de motilité est supérieure à 4, le coefficient de corrélation R2 entre la motilité massale subjective et la vitesse des billes est de 0,78. L'écart 3058223 21 type de la vitesse des billes permet d'obtenir des résultats similaires avec un coefficient de corrélation R2 de 0,73. L'entropie permet également de discriminer les semences de bonne (supérieure à 4) et mauvaise (inférieure 4) motilité massale (Figure 2). Pour les semences dont la 5 note de motilité est supérieure à 4, le coefficient de corrélation R2 entre la motilité massale subjective et la vitesse des billes est de 0,79. La méthode d'analyse vidéo des billes fluorescentes est donc capable de discriminer des éjaculats de mauvaise qualité (motilité massale inférieure à 4) des éjaculats de bonne qualité (motilité massale supérieure à 4) pour chacun des paramètres 10 mesurés. La motilité massale étant elle-même un bon critère d'estimation de la fertilité (cf David et al., 2015), cette bonne corrélation entre les paramètres issus de l'analyse du déplacement des billes et la motilité massale subjective permet d'estimer la fertilité de la semence de manière objective chez les ovins. 15 Exemple 5 : Mise en oeuvre chez les caprins La méthode a été validée chez les caprins, dont la semence est congelée avant insémination. La motilité massale subjective et la motilité massale objective de la semence fraîche (avant congélation) ont été mesurées pour 101 éjaculats de boucs. Puis la motilité individuelle (pourcentage de spermatozoïdes mobiles) a été mesurée 20 après décongélation à l'aide d'un outil objectif CASA (Computerized Assisted Sperm Assessment). Les échantillons de semence ont été prélevés comme indiqué précédemment. La solution contenant les microbilles a été préparée et mélangée avec la semence comme décrit plus haut. Enfin, l'analyse vidéo et le traitement statistique ont été 25 réalisés en suivant la méthode décrite ci-dessus. La relation entre la motilité massale subjective et la motilité après congélation est très forte (R2 = 0,90). La Figure 3 montre que seuls les éjaculats ayant une note supérieure à 4 méritent d'être congelés (pourcentage de mobiles supérieur à 5 %) et que la motilité massale subjective, entre 4 et 5, est fortement corrélée avec la 30 motilité après décongélation. 3058223 22 Les paramètres objectifs de motilité massale ont été mis en relation avec la motilité massale subjective. La vitesse des billes, issue de la motilité massale objective, présente une corrélation élevée avec la motilité massale subjective (R2 =0,94) et permet donc son estimation 5 (Figure 4). La motilité massale objective a été mise en relation avec la motilité après décongélation (Figure 5). La vitesse des billes, issue de la motilité massale objective, présente une bonne corrélation avec la motilité individuelle après congélation (R2 =0,72) et permet donc 10 une estimation de la qualité de la semence après congélation. Ces résultats montrent que la mesure de la motilité massale de la semence avant congélation par la méthode objective permet une estimation de la qualité de la semence après congélation. Exemple 6 : Mise en oeuvre chez le coq 15 La méthode a été validée chez les oiseaux, en particulier, dont la semence fait également l'objet d'une mesure de la motilité massale avant insémination. La motilité massale subjective et la motilité massale objective de la semence fraîche ont été mesurées pour 80 éjaculats de coq. Chez le coq, la mobilité massale subjective est mesurée avec une échelle de 2 à 8. 20 La solution contenant les microbilles a été préparée et mélangée avec la semence comme décrit plus haut. Enfin, l'analyse vidéo et le traitement statistique ont été réalisés en suivant la méthode décrite ci-dessus. La vitesse des billes, issue de la motilité massale objective, présente une corrélation élevée avec la motilité massale subjective (R2 =0,94) et permet donc son estimation 25 (Figure 6). REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Amann et Waberski, 2014, Theriogenology 81: 5-17. Boryspolets et al., 2013, Theriogenology 80: 758- . 3058223 23 Christensen et al. (mar-apr 2004), Journal of Andrology, 25(2): 255-264. Christensen et al. (oct 2004), Theriogenology, 62(7): 1218-12. David et al.,2015, Anim Reprod Sci, 161:75-81. Leboeuf et al., 2003, INRA Prod. Anim., 16 (2): 91-99. - Production et conservation 5 de la semence de bouc pour l'insémination artificielle. » Gerard et al., 2008, Renc. Rech. Ruminants, 15 : 351-354. - Evolution des techniques de préparation de la semence et d'insémination artificielle chez les bovins. » Yang et al., 2014, International Symposium on Biomedical Imaging, Beijing, China, - Head tracking and flagellum tracing for sperm motility analysis » REVENDICATIONS1. Procédé de détermination de la motilité massale dans un échantillon de semence animale, ledit procédé comprenant les étapes successives suivantes : a) la mise en contact d'un échantillon de ladite semence avec des billes détectables, pour obtenir un mélange, b) l'analyse par microscopie du mouvement d'au moins une bille dans ce mélange, comprenant l'enregistrement d'au moins deux images du mouvement de ladite bille, et c) la détermination de la motilité massale de la semence à partir des données de l'analyse du mouvement de ladite bille, obtenues lors de l'étape b). 2. Procédé selon la revendication 1, l'étape b) comprenant en outre la détection automatique de la bille sur chacune de ces images et la reconstruction de la trajectoire. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, l'étape b) comprenant la détermination d'au moins un paramètre choisi parmi : - la vitesse moyenne des billes ; - l'écart type de la vitesse des billes ; et - l'entropie. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape b) comprend la détermination des trois paramètres. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdites billes sont fluorescentes. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'analyse de l'étape b) est réalisée à l'aide d'un microscope à fluorescence. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le diamètre des billes est compris entre 0,1 et 100 pm. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la concentration des billes dans le mélange comprenant la semence est comprise entre 0,2 et 20 pM. 3058223 25 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite semence est collectée d'un animal choisi parmi les ovins, les bovins, les caprins et les oiseaux. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'analyse 5 d'images de l'étape c) est réalisée par un logiciel de calcul implémenté dans un système CASA (computer assisted sperm assessment). 11. Kit destiné à la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant : - au moins un récipient adapté à l'observation par microscopie d'un échantillon 10 de semence mélangé à des billes détectables, notamment une lame d'observation comportant une chambre, et - des billes détectables. 12. Kit selon la revendication 11, comprenant en outre un logiciel permettant de calculer au moins des paramètres de la bille choisi parmi la vitesse moyenne, l'écart 15 type et l'entropie. 13. Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit logiciel est un logiciel de type CASA (Computerized Assisted Sperm Assessment).