Brevet FR3057070A1 — publié le 20180406

Diagnostique et pronostique précoce de la prééclampsie Domaine technique L'invention concerne un nouveau procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la prééclampsie. Arrière-plan technologique La prééclampsie (PE) est une maladie majeure de la grossesse affectant 2 à 5 % des femmes enceintes dans les pays industrialisés. Elle est généralement caractérisée par (i) une tension artérielle anormale à partir du second trimestre de la gestation avec une pression systolique supérieure à 140 mm de mercure, et une pressions diastolique supérieure à 90 mm de mercure et (ii) une protéinurie supérieure à 300 mg par jour. La maladie apparait au plus tôt à la 20ème semaine de grossesse, mais peut se déclencher tardivement par exemple après la 37ème semaine, la durée normale de gestation chez la femme étant d'environ 41 semaines. Les conséquences pour la mère vont de très modérées à mortelles, dans la mesure où la prééclampsie peut se compliquer d'atteintes cérébrales (éclampsie), hépatiques (HELLP syndrome) et/ou vasculaires. Sur 830 000 naissances annuelles en France, environ 40 000 présentent une prééclampsie qui aboutissent à la mort maternelle dans environ 20 cas par an. Les conséquences sur le foetus sont également importantes car la prise en charge de la pathologie revient à tenter de contenir l'hypertension, mais nécessite souvent l'extraction de l'unité foeto-placentaire, ce qui fait de la prééclampsie une pourvoyeuse majeure de prématurité iatrogène. Par ailleurs, environ 1/3 des prééclampsies se compliquent d'un retard de croissance intra-utérin, sans être forcément associé à une prématurité. On estime que 500 enfants environ meurent chaque année en France des conséquences d'une prééclampsie (prématurité extrême ou trop petit poids de naissance). La thérapeutique de la prééclampsie est très limitée, comme c'est souvent le cas pour les pathologies de la femme enceinte. Il est possible d'utiliser des antihypertenseurs (par exemple nimodipine, hydralazine, labétalol, diazoxide, kétansérine), mais toutes ces molécules présentent des inconvénients dans leur cinétique d'action. Plusieurs études concordent pour accorder à l'aspirine à faible dose un rôle marginal mais bénéfique ; 3057070 2 il semble cependant que l'effet de l'aspirine pourrait être important quand il est administré très tôt, c'est-à-dire avant 16 semaines de grossesse (Bujold et al., Prevention of preedampsia and intrauterine growth restriction with aspirin started in ear/y pregnancy: a rneta-analysis. Obstetrics and Gynecology 2010 Aug; 116, p 402-414). On se trouve donc 5 confronté à une difficulté thérapeutique majeure : des symptômes apparaissant au plus tôt au second trimestre de la grossesse et un traitement potentiellement efficace uniquement s'il est administré au premier trimestre de la grossesse. La recherche de marqueurs présymptomatiques de la prééclampsie est donc devenue une priorité pour pouvoir diagnostiquer ou pronostiquer la prééclampsie de façon précoce afin 10 de pouvoir traiter la pathologie de manière efficace. De ce point de vue, l'effort international a été considérable, et des marqueurs sériques présymptomatiques ont été identifiés. Il s'agit en particulier du récepteur soluble du VEGF (sFLT1), de l'endogline soluble (sENG), de la PAPP-A (Pregnancy-Associated Plasma Protein-A) et du PIGF (Placental Growth Factor). Les deux premiers marqueurs sont augmentés en cas de la 15 prééclampsie, les deux autres sont diminués. Certaines sociétés produisent d'ores et déjà des kits « prédictifs » (Alere, Roche), dont l'efficacité est loin d'être parfaite en termes de spécificité et de sensibilité à des stades précoces de la grossesse, notamment avant la 16e semaine. Il existe donc un réel besoin d'identifier des nouveaux marqueurs permettant de diagnostiquer ou pronostiquer précocement la prééclampsie, notamment dans la période 20 de gestation inférieure ou égale à 16 semaines. Résumé de l'invention La présente invention vise à proposer un nouveau procédé de diagnostic ou de pronostique in vitro de la prééclampsie, permettant une détection très précoce de la 25 prééclampsie ou une détection très précoce d'un risque de développer la pathologie. Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la pré-éclampsie comprenant : a) la mesure dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte de la concentration d'un ou de plusieurs marqueurs choisi parmi LIFR, TTR 30 (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs, 3057070 3 b) l'utilisation du résultat de la mesure de l'étape a) dans le diagnostic ou le pronostique de la pré-éclampsie, dans lequel un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueur(s) par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) 5 obtenue chez les femmes enceintes. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la prééclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs 10 par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits marqueurs étant choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs. Selon un troisième aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un ou plusieurs anticorps 15 dirigés contre un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la prééclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueurs obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits 20 marqueurs étant choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs. Selon un quatrième aspect, l'invention concerne un kit de diagnostic ou de pronostic utile pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. 25 Selon un cinquième aspect, l'invention concerne une méthode de traitement d'une prééclampsie chez une femme enceinte, comprenant : (i) la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, et (ii) lorsque le diagnostic est positif ou le pronostic est positif, instaurer un traitement approprié chez la femme enceinte. 30 3057070 4 Description détaillée de l'invention Définitions Au sens de l'invention, le terme « pronostique » désigne la détermination d'une probabilité, d'un risque ou d'une possibilité de développer une prééclampsie chez une 5 femme enceinte. En particulier la femme enceinte est suspectée d'être atteinte ou de pouvoir développer une pré-éclampsie. Au sens de l'invention, le terme « diagnostic » désigne la détermination d'une probabilité ou d'une possibilité d'avoir une prééclampsie chez une femme enceinte. Le terme englobe le diagnostic (la détection) précoce de la prééclampsie. 10 Au sens de l'invention, les termes « fluide biologique » désignent tout fluide prélevé chez une femme enceinte à partir duquel il est possible de mesurer la concentration des marqueurs de l'invention. Par exemple, le fluide biologique est choisi parmi le sang, le plasma, le sérum, l'urine, la salive ou le liquide amniotique, de préférence le sérum. Le fluide biologique peut être prélevé à tout moment de la grossesse, de préférence la 15 femme enceinte se trouve dans une période de gestation inférieure ou égale à 20 semaines, de préférence inférieure ou égale à 16 semaines, de préférence dans une période de gestation comprise entre 7 semaines et 16 semaines. Cette période, qui correspond au premier trimestre de gestation, prépare des remaniements vasculaires importants à l'interface foeto-maternelle et il a été montré qu'un traitement efficace 20 nécessite une détection très précoce des signes avant-coureurs de la maladie. Le LIFR (Leukemia Inhibitory Factor Receptor), également connu sous la dénomination « CD118 », est le récepteur d'une cytokine (LIF) qui agit sur la différenciation, la survie et la prolifération d'une grande variété de cellules. La mesure de LIFR dans un échantillon de fluide biologique peut s'effectuer par des méthodes classiques, par exemple par ELISA en 25 utilisant un anticorps qui se lie au LIFR. LIFR existe sous une forme soluble et sous une forme membranaire. Dans le cadre de la présente invention, le LIFR est le LIFR soluble. ApoA2 (Apolipoprotein A-II) est une protéine présente dans le plasma sous la forme de monomère, d'homodimère ou d'hétérodimère avec l'apolipoprotéine D. La mesure de ApoA2 dans un échantillon de fluide biologique peut s'effectuer par des méthodes 30 classiques, par exemple par ELISA en utilisant un anticorps qui se lie à ApoA2. 3057070 5 A2M (Alpha-2-macoglobuline), également connue sous le nom de Pzp (Pregnancy Zone Protein), est une protéine plasmatique composée de quatre sous-unités identiques liées entre elles par des ponts dissulfures. A2M existe également sous forme dimérique et monomérique. A2M est notamment synthétisée par le foie. La mesure de A2M dans un 5 échantillon de fluide biologique peut s'effectuer par des méthodes classiques, par exemple par ELISA en utilisant un anticorps qui se lie à A2M. La transthyretin (TTR) est une protéine tétramérique présente dans le plasma et le liquide cérébro-spinal qui possède quatre sous-unités identiques. Elle est notamment synthétisée dans le foie et dans les plexus choroïdes. Elle constitue une des protéines de liaison de la 10 thyroxine (T4), une hormone thyroïdienne, et de la vitamine A (rétinol). Elle a également un rôle dans la neurogenèse, la croissance des axones et la régénération nerveuse. Son rôle dans la prééclampsie a été décrit dans la littérature où il a été montré une diminution de la concentration de la transthyretin dans le sérum de patientes symptomatiques à un stade tardif de la pathologie (Kalkunte et al 2013, Transthyretin is dysregulated in 15 preedampsia, and its native foret prevents the onset of disease in a preclinical mouse model, Am J Pathology, et Zhu et al, Exp Ther Med, 2014). La mesure de TTR dans un échantillon de fluide biologique peut s'effectuer par des méthodes classiques, par exemple par immunoprecipitation et MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) (Théberge et al. 2000, Detection of transmethyretin variants using imrnunopreeitation and matrix- 20 assisted laser desorption/ionization bioactive probes : a clinical application of mass spectrornetty, J Am Soc Mass Spectrom). PAPPA (Pregnancy-associated plasma protein A) est une protéine qui a été décrite comme ayant un rôle dans la prééclampsie (Dugoff et ai. 2004 First-trirnester maternai serum PAPP-A and free-beta subunit human chorionic gonadotropin concentrations and nuchal 25 translucency are associated with obstetric complications: A population-based screening study (The FASTER Trial), Am J Obstet Gynecol). Cette protéine a été découverte comme spécifique du placenta et de certains cancers ; on suppose qu'elle pourrait être un inhibiteur de la cascade du complément avec une activité protéolytique. On observe une une diminution de la concentration sérique de PAPPA en cas de prééclampsie. Elle peut 30 par exemple être détectée en utilisant un anticorps spécifique dans un test ELISA. sFLT1 (Soluble fms-like tyrosine kinase-1) est une protéine de la famille des tyrosines kinases qui a été décrite comme marqueur de la prééclampsie (Levine et al. (2006), Soluble endoglin and other circulating antiangiogenic factors in preedampsia, NUM). 3057070 6 sFLT1 entrerait en compétition avec les récepteurs membranaires du VEGF, VEGFR 1, 2 et 3, empêchant son activation cellulaire et diminuant ainsi l'angiogenèse, en particulier placentaire. On observe une augmentation de la concentration sérique de sFLT1 en cas de prééclampsie. 5 sENG (endoglin) est une protéine qui a été présentée comme un marqueur de la prééclampsie avec une augmentation de sa concentration sérique chez les patientes atteintes. sENG agit comme un récepteur soluble et donc inactif de la voie de signalisation des BMP (Bone Morphogenetic Protein, de la famille du TGF(3), molécules ayant un impact pro-angiogénique. De ce point de vue le fonctionnement de sENG dans la prééclampsie 10 serait fort comparable à celui du trio VEGF/sFLT1/VEGFRs. PIGF (Placental Growth Factor) est une protéine qui a également été présentée comme un marqueur de la prééclampsie avec une diminution de sa concentration sérique chez les patientes atteintes. Il faut noter que PIGF interagit aussi avec le récepteur VEGFR1 (flt1) et est donc un contributeur majeur de la vascularisation placentaire active, ce qui 15 expliquerait l'effet délétère de sa diminution dans le cas de la prééclampsie. L'Hémoglobine foetale est une des hémoglobines de la famille des hémoglobines 13 produite par le foetus et le placenta. On trouve l'Hémoglobine foetale dans le sérum des femmes enceintes. Des études récentes indiquent qu'elle est augmentée précocement chez les patientes prééclamptiques (environ deux fois, avec cependant une variation 20 interindividuelle très importante (Anderson et al. Pregnancy Hypertension 6 (2016) 103109). L'Hémopexine est une protéine qui a également été présentée comme marqueur de la prééclampsie avec une diminution de sa concentration sérique chez les patientes atteintes. La diminution de la concentration en hémopexine est proportionnelle à la 25 gravité de la pathologie. Son rôle biologique essentiel est l'élimination de l'hématine, produit de la dégradation de l'hème extracellulaire. Il est connu depuis 1978 que des troubles hémolytiques peuvent être associés à une prééclampsie. Si son taux diminue, alors l'élimination du produit de l'hème ne se fera plus. La dernière étude publiée montre une concentration de 1143 pg/ml chez les patientes contrôles, 947 chez les prééclampsies 30 les plus sévères (p = 0.04) et 1085 chez les prééclampsies plus modérées (non significatif), (Anderson et al. Pregnancy Hypertension 6 (2016) 103-109). 3057070 7 Les séquences peptidiques des marqueurs mentionnés ci-dessus sont définies par rapport aux séquences actuellement référencées dans les bases de données de séquences, à la date de priorité de la présente demande. De plus, les séquences spécifiques des marqueurs sont des exemples. L'homme de l'art sait que des variants polymorphes 5 peuvent exister dans la population humaine. Ces variants polymorphes ne diffèrent généralement que par quelques acides aminés (par exemple 1 à 5 ou de 1 à 3 acides aminés). Au sens de l'invention, le terme « concentration » doit être pris en son sens premier, c'est-à-dire la quantité de l'entité d'intérêt par rapport à un volume donné. La 10 concentration peut être exprimée en concentration molaire (e.g. mol/L) ou en concentration massique (e.g. g/L). La concentration du ou des marqueurs peut être déterminée en utilisant n'importe quelle méthode appropriée, de préférence une méthode immunologique. Des méthodes pour effectuer des analyses immunologiques sont bien connues de l'homme de l'art, par exemple la méthode ELISA (Enzyme-Linked 15 Immunosorbent Assay), la méthode IRMA (Immunoradiometric Assay), la spectrométrie de masse, la chromatographie ou la méthode RIA (Radioimmuno Assay). Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la concentration du ou des marqueurs est déterminée par ELISA. La concentration normale obtenue chez les femmes enceintes, ci-après « concentration normale », est déterminée classiquement, par exemple pour 20 l'ensemble de la population ou une population spécifique. La population spécifique peut être définie sur la base, par exemple, de l'origine ethnique ou toute autre caractéristique qui peut affecter la concentration normale du ou des marqueurs. La population pour établir le niveau normal des marqueurs est, par exemple, choisie sur la base d'un faible risque de développer une prééclampsie (c'est à dire sans antécédent à risque pour la 25 prééclampsie, par exemple sans prééclampsie antérieure, sans diabète, ou sans hypertension). Une fois que les concentrations normales sont connues, les concentrations déterminées du ou des marqueurs peuvent être comparées et l'importance de la différence déterminée en utilisant des méthodes statistiques standard. Les méthodes statistiques permettent notamment d'évaluer la spécificité et la sensibilité de la mesure. 30 On peut par exemple citer les courbes de ROC qui permettent de définir un seuil de signification. Dans un mode de réalisation particulier, s'il y a une différence significative entre la concentration déterminée du ou des marqueurs et la concentration normale (à savoir une différence statistiquement significative), alors il y a une probabilité cliniquement significative que la femme enceinte aie ou risque de développer une 3057070 8 prééclampsie. Le risque de développer une prééclampsie sera ainsi quantifié et exprimé en probabilité par l'utilisation de rapports de vraisemblance. La détermination du risque de développer une prééclampsie peut également faire appel à des paramètres ou algorithmes statistiques largement connus de l'homme de l'art, comme par exemple le 5 score de déviation standard (Z score) pour chaque marqueur. Au sens de l'invention, le terme « marqueur » (ou « biomarqueur ») est une entité biologique, par exemple une protéine, de l'ARN ou de l'ADN, qui peut être utilisé pour le diagnostic ou le pronostique de la prééclampsie. Au sens de l'invention, le marqueur est de préférence une protéine. Une protéine est une macromolécule biologique formée d'une 10 ou de plusieurs chaînes polypeptidiques, chacune de ces chaînes est constituée de résidus d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le marqueur est sous une forme soluble. Procédé de diagnostic ou de pronostic La présente invention découle des avantages surprenants mis en évidence par les 15 inventeurs que l'augmentation ou la diminution de la concentration de certains marqueurs dans un fluide biologique permettent de diagnostiquer ou pronostiquer une prééclampsie. L'ensemble des applications qui en découlent sont décrites ci-après. L'invention concerne en effet un procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la pré-éclampsie comprenant : 20 a) la mesure dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte de la concentration d'un ou de plusieurs marqueurs choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs, b) l'utilisation du résultat de la mesure de l'étape a) dans le diagnostic ou le 25 pronostique de la pré-éclampsie, dans lequel un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueur(s) par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes. Dans un mode de réalisation particulier, le fluide biologique est choisi parmi le sang, le 30 plasma, le sérum, l'urine, la salive ou le liquide amniotique, de préférence le sérum. Le fluide biologique peut être analysé immédiatement après le prélèvement ou à un moment ultérieur. Par exemple, l'échantillon peut être congelé ou séché (e.g. lyophilisé) puis 3057070 9 stocké. La congélation ou le séchage permet un stockage facile et une analyse ultérieure en limitant le risque d'altération de l'échantillon (par exemple, la dénaturation des protéines). L'échantillon peut également être stocké avec un agent qui stabilise le ou les marqueurs. L'échantillon peut également être préparé de manière à augmenter la 5 détectabilité du ou des marqueurs, par exemple en fractionnant et/ou en concentrant l'échantillon. Comme détaillé plus haut, l'un des avantages majeurs du procédé selon l'invention est de pouvoir diagnostiquer ou pronostiquer de manière précoce la prééclampsie. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, ladite femme enceinte se trouve dans une période de 10 gestation inférieure ou égale à 20 semaines, de préférence inférieure ou égale à 16 semaines, de préférence dans une période de gestation comprise entre 7 semaines et 16 semaines. Dans un mode de réalisation particulier, un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des 15 marqueur(s) par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes. A titre d'exemple, un diagnostic positif ou un pronostique peut se présenter sous la forme d'une quantification du risque d'avoir ou de développer une prééclampsie, par exemple exprimée en pourcentage. A titre d'exemple, s'il y a une différence importante entre la concentration déterminée du ou des marqueurs et la 20 concentration normale obtenue chez les femmes enceintes (à savoir une différence statistiquement significative), alors il y a un risque cliniquement important que la femme enceinte aie ou risque de développer une prééclampsie. Certains des marqueurs de l'invention sont présents dans le corps sous une forme circulante et une forme membranaire (e.g. LIFR). Dans un mode de réalisation préféré, le 25 marqueur est sous une forme circulante (e.g. LIFR circulant). Le procédé selon l'invention peut également être associé à d'autres procédés qui mettent en oeuvre d'autres marqueurs et/ou qui mesurent des paramètres physiologiques associés à (sont des indicateurs de) la prééclampsie. Cela peut inclure, par exemple, (i) la détection de la concentration d'autres marqueurs, par exemple sENG, sFLT1, PIGF, PAPP- 30 A, l'hémoglobine foetale et/ou l'hémopexine, (ii) la mesure de certains paramètres physiologiques, par exemple par la mesure de la vélocité dans les artères utérines ou placentaires (e.g. test doppler par ultrasons), par le test BOLD en Imagerie Résonance Magnétique (IRM), et/ou (iii) la détection de marqueurs de prédisposition génétiques par 3057070 10 exemple des gènes codant des variants à risque de HLA, des gènes codant pour des protéines de la cascade de coagulation ou des gènes codant pour des protéines de la cascade du complément. Dans un mode de réalisation particulier, lesdits un ou plusieurs autres marqueurs de 5 l'étape a) sont choisis parmi sENG, sFLT1, PIGF, PAPP-A, hémoglobine foetale et/ou l'hémopexine. Dans un mode de réalisation particulier, la mesure de la concentration de plusieurs autres marqueurs permet de calculer des ratios, par exemple le ratio sFLT1/PIGF. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, la mesure de la 10 concentration d'un ou de plusieurs marqueurs choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M) permet de calculer des ratios, par exemple le ratio LIFR/TTR, LIFR/ApoA2 et/ou LIFR/Pzp. Ainsi, la présente invention peut comprendre une étape a') le calcul d'un ou plusieurs ratios de deux marqueurs et éventuellement le calcul d'un ou plusieurs ratios de deux autres marqueurs. Dans ce mode de réalisation particulier, l'étape 15 b) sera donc : étape b) l'utilisation du résultat de la mesure de l'étape a) et/ou du calcul de l'étape a') dans le diagnostic ou le pronostique de la pré-éclampsie, dans lequel un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de (i) la concentration du ou des marqueur(s) et/ou (ii) du ou des ratios de deux marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue 20 chez les femmes enceintes. Dans certains modes de réalisation, le procédé de l'invention comprend une étape préliminaire d'obtention d'un échantillon de fluide biologique à partir d'une femme enceinte. Cette étape est en amont de la mesure de la concentration du ou des marqueurs dans ledit échantillon de fluide biologique. 25 Comme il est largement répandu dans l'art antérieur, la concentration du ou des marqueurs peut être normalisée par rapport à la concentration en protéines totales de l'échantillon de fluide biologique. Ainsi, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de détermination de la concentration en protéines totales de l'échantillon de fluide biologique. Cette détermination ne pose aucune difficulté particulière et peut être 30 facilement mise en oeuvre par l'homme de l'art par des méthodes classiques de détermination de la concentration en protéines totales. 3057070 11 L'invention peut également se définir comme étant un procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la prééclampsie comprenant la détermination de l'augmentation ou de la diminution de la concentration, par rapport à la concentration normale obtenue chez les femmes enceintes, d'un ou plusieurs marqueurs dans un échantillon de fluide 5 biologique issu d'une femme enceinte, le ou lesdits marqueurs étant choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs. Dans un mode de réalisation particulier, un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une concentration du ou des marqueurs supérieure ou inférieure à la 10 concentration normale du ou des marqueurs obtenue chez les femmes enceintes. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend en outre la détermination de l'augmentation ou de la diminution de la concentration, par rapport à la concentration normale obtenue chez les femmes enceintes, d'un ou plusieurs autres marqueurs dans l'échantillon de fluide biologique, le ou lesdits autres marqueurs étant choisis parmi sENG, 15 sFLT1, PIGF, PAPP-A, hémoglobine foetale et/ou l'hémopexine. Utilisations L'invention concerne également l'utilisation d'un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la pré-éclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une 20 augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits marqueurs étant choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs. 25 L'invention concerne également l'utilisation d'un ou plusieurs anticorps dirigés contre un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la pré-éclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueurs 30 obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits marqueurs étant choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs. 3057070 12 Dans un mode de réalisation particulier, un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution d'un ou plusieurs ratios de concentration de deux marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes, par exemple le ratio LIFR/TTR, LIFR/ApoA2 et/ou 5 LIFR/Pzp. Le terme « anticorps » tel qu'il est utilisé ici fait référence à des molécules d'immunoglobulines ou d'autres molécules qui comprennent au moins un domaine de liaison à un antigène. Il englobe notamment des anticorps entiers, des fragments d'anticorps comprenant un domaine de liaison à l'antigène (e.g. Fab, Fab' et F(ab)2, scFv, 10 les fragments comprenant soit un domaine VL soit un domaine VH), des anticorps monoclonaux, des anticorps polyclonaux, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des anticorps primatisés, des anticorps monospécifiques, des anticorps multispécifiques, des anticorps mono-chaine (e.g. de type camélidé). Les anticorps selon l'invention peuvent être des molécules de tout type, par exemple, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 15 et IgY, de toute classe, par exemple, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 et IgA2 ou de toute sous-classe. Généralement, les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec le marqueur concerné (ou un fragment de marqueur), suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum 20 dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment ledit marqueur. Généralement, Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après. Dans un premier temps, on 25 immunise un animal, généralement une souris avec le marqueur d'intérêt (ou un fragment de marqueur), dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (par exemple murines) pour donner lieu à des hybridomes. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun 30 conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis dudit marqueur pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert (Western blot) en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite 3057070 13 purifiés notamment selon la technique de chromatographie. Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation préféré, le ou les anticorps dirigés contre un ou plusieurs 5 marqueurs sont des anticorps monoclonaux. De préférence, le ou les anticorps monoclonaux dirigés contre un ou plusieurs marqueurs sont utilisés pour la mesure d'une augmentation ou d'une diminution de la concentration dans un test ELISA. Méthode de traitement Le procédé selon l'invention peut également être utilisé afin de surveiller l'efficacité d'un 10 traitement prophylactique pour prévenir le développement de la prééclampsie, dans lequel une réduction du risque de développer une prééclampsie sera le signe de l'efficacité du traitement prophylactique. Comme décrit plus haut, le procédé selon l'invention est notamment utile pour diagnostiquer ou pronostiquer de manière précoce la prééclampsie, ce qui permet à la fois de prendre en charge les patientes de manière précoce afin 15 qu'elles puissent recevoir des soins adaptés, mais également de ne pas traiter des patientes qui ne nécessitent pas de traitement. Ainsi, la présente invention concerne également une méthode de traitement d'une prééclampsie chez une femme enceinte, comprenant : (i) la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic ou de pronostic selon l'invention, 20 et (ii) lorsque le diagnostic est positif ou le pronostic est positif, instaurer un traitement approprié chez la femme enceinte. Dans un mode de réalisation particulier, ledit traitement approprié est un ou plusieurs médicaments choisis parmi l'aspirine (acide acétylsalicylique), le sulfate de magnésium, 25 les anti-hypertenseurs, les corticostéroïdes, les héparines de bas poids moléculaire, les régulateurs du cholestérol (e.g. pravastatine) et les régulateurs du stress oxydatif (e.g. liés au hème circulant, tels l'Alpha-1- microglobuline), de préférence l'aspirine. Kits L'invention concerne également des kits de diagnostic ou de pronostic utiles pour la mise 30 en oeuvre des procédés selon l'invention. Les kits comprennent généralement un ou plusieurs réactifs (par exemple, un ou plusieurs anticorps qui se lient au(x) marqueur(s) 3057070 14 d'intérêt) permettant de déterminer la concentration du ou des marqueurs. Les kits peuvent également comprendre un ou plusieurs récipients et/ou un ou plusieurs tubes adaptés pour mélanger l'échantillon de fluide biologique avec le ou les réactifs. Dans certains modes de réalisation, les kits peuvent comprendre une ou plusieurs surfaces qui 5 possèdent une affinité pour le ou les marqueurs qui peuvent être mise en contact avec l'échantillon de fluide biologique (par exemple une ou plusieurs plaques ELISA). Les kits peuvent contenir une ou plusieurs solutions de lavage appropriées. Les kits, dans certains modes de réalisation, peuvent également comprendre d'autres composants, tel qu'un ou plusieurs agents tampon, un ou plusieurs conservateurs ou un ou plusieurs agents 10 stabilisants des protéines. Le kit peut comprendre en outre un ou des composants nécessaires à la détection du ou des marqueurs (par exemple une enzyme et/ou un substrat). 3057070 15 Légendes des figures Figure 1: diagramme représentant les résultats de l'expérience iTRAQ montrant l'augmentation ou la diminution de la concentration de plusieurs marqueurs présents dans le plasma de souris ayant une gestation prééclamptique par rapport à la concentration 5 normale de ces marqueurs dans le plasma de souris ayant une gestation normale, à 6,5 jours de gestation (la durée totale de gestation pour la lignée de souris étudiée est de 18,5 jours). Parmi les marqueurs étudiés dont la concentration est modifiée chez la souris prééclamptique, utilisables chez l'Homme en raison de l'homologie des gènes, il peut être noté que les concentrations des protéines LIFR et TTR sont fortement modulées. A noter 10 que les SERPIN de la famille A (Serpina#) sont peu transposables à l'Homme en raison d'un polygénisme important de ce gène chez la souris. Figure 2 : diagramme représentant la concentration de LIFR circulant dans le plasma de 30 femmes prééclamptiques et 30 femmes contrôle (A. mesure brute et B. rapportée aux protéines totales). Les femmes prééclamptiques ont une concentration de LIFR circulant 15 significativement plus importante dans leur plasma que les femmes contrôle. Figure 3 : diagramme représentant la concentration de LIFR et de sFLT1 circulants dans le plasma de 20 patientes prééclamptiques et 20 patientes contrôle, en mesure brute ou rapportée aux protéines totales. Les femmes prééclamptiques ont une concentration de LIFR circulant significativement plus importante dans leur plasma que les femmes 20 contrôle. Les résultats montrent que le marqueur LIFR apparait plus discriminant que le marqueur sFLT1, marqueur de référence actuel. Figure 4 : courbe représentant la concentration de LIFR circulant dans le plasma de 20 patientes prééclamptiques et 20 patientes contrôle, en mesure brute en fonction de la date de gestation. On note que quel que soit le stade de gestation, la concentration de 25 LIFR circulant est augmentée dans le plasma des patientes prééclamptiques par rapport à la concentration de LIFR circulant chez les patientes contrôles. Les patientes contrôles étant définies comme des patientes enceintes en bonne santé et sans complication médicale connue (pas de diabete mellitus, hypertension préexistante, pathologie rénale ou cardiovasculaire, grossesse gémellaire ou autre grossesse multiple). 30 3057070 16 Exemples Exemple 1 : préparation du modèle murin de prééclampsie par surexpression de STOX1 L'ADNc du cadre de lecture ouvert complet (ORF) du gène STOX1 humain (isoforme A) a été micro-injecté dans un pronucléus mâle après fécondation. Le pronucléus ainsi 5 transfecté a été implanté dans l'utérus d'une souris femelle. Après 18,5 jours de gestation, des souris transgéniques ont été obtenues. Le nombre de copies du transgène STOX1 a été évalué par la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) à partir de l'ADN de la souris transgénique par rapport à un gène à copie unique. Trois lignées de souris transgéniques ont été obtenues et amplifiées. L'analyse de la 10 transmission du transgène STOX1 à travers les générations a montré qu'il y avait un seul locus d'insertion du transgène STOX1 sur les 3 lignées de souris transgéniques qui ont été amplifiées. Le phénotypage des souris transgéniques a été effectuée comme décrit dans Doridot et al, Hypertension, 2013, avec la mesure de la pression sanguine quotidienne tout au long de la gestation, et des prélèvements d'urine destinés à mesurer la 15 protéinurie. Dans l'article Doridot et al. il a été montré également que des marqueurs caractéristiques de la prééclampsie (sFLT1 et sENG) sont augmentés dans le sérum/plasma des souris transgéniques porteuses de foetus et donc prééclamptiques. Exemple 2 : mise en évidence des marqueurs de l'invention chez la souris 20 Des échantillons de plasma poolés ou isolés ont été collectés à partir de sang hépariné de la veine jugale de souris transgéniques de l'exemple 1 porteuses de foetus à 6,5 jours de gestation (souris prééclamptiques) ou de souris non-prééclamptiques à 6,5 jours de gestation (groupe contrôle). Ces plasmas ont été déplétés des protéines majeures du plasma sur des colonnes MARS-3 (Agilent) permettant d'éliminer l'albumine, 25 les IgG et la transferrine. Pour ce faire, les plasmas ont été dilués 20 fois dans le tampon d'équilibration fourni avec la colonne MARS-3, puis filtré par microcentrifugation sur filtres à 0,22 pM. Deux lavages à 100g pendant 2,5 min ont été réalisés, et la fraction obtenue a été concentré à l'aide d'un concentrateur 5K MWCO. La quantité de protéines restantes a été évaluée par le 2D Quant protein assay (GE Healthcare, France). La fraction a ensuite 30 été aliquotée et stockée à -80 C. Par la suite des échantillons contenant 50pg de protéines ont été lyophilisés, puis resuspendus dans 25p1 de tampon TEAB 500 mM (Sigma) avec 1% de SDS. Les protéines contenues dans les échantillons ont ensuite été 3057070 17 alkylées, digérées et marquées avec les réactifs iTRAQ selon les protocoles du fournisseur (Applied Biosystems), pour obtenir des peptides marqués. Les échantillons contenant les peptides marqués sont appelés ci-après « échantillons marqués ». Les échantillons marqués ont été identifiés en fonction de leur statut : prééclampsie ou contrôles. Puis, les 5 échantillons marqués ont été combinés et lyophilisés. Pour limiter la complexité, les peptides marqués (ci-après « peptides ») ont été lavés et fractionnés par chromatographie sur colonne d'échange de cations. 200 pg de peptides secs ont été resuspendus dans 1 ml de KH2PO4 à 5 mM et 20% d'acétonitrile (Carlo Erba), pH 2.8 (buffer A). 80% des peptides ont été préfractionnés avec une colonne PoIySULFOETHYL A 10 column (PolyLC, Columbia, MD) 5 pm de 200 mm de longueur x 2,1 mm de diamètre et une taille de pore de 300 Â, sur une HPLC (Waters625 HPLC) avec un flux constant de 0,2 ml/min. La colonne a d'abord été lavée avec le tampon A du fournisseur pendant 30 min, puis un gradient de 19 min a été appliqué pour augmenter la concentration en tampon B à 63% puis un plateau de 5 min et à nouveau 100% de tampon A pendant 5 15 min. Des fractions ont été collectées toutes les 30 sec, poolées en fonction de l'absorbance UV à 210 nm (16pg/pool). Pour l'extraction à forte concentration en sel, un dessalage a été réalisé avec une cartouche C18-Sep-Pak (Waters). Les fractions ont ensuite été lyophilisées et conservées à -20°C. Puis les fractions ont été resuspendues dans le tampon TFA 0,1% (Fluka) et 10% acetonitrile (Carlo Erba), puis 2pg ont été 20 injectés à deux reprises dans une nano-HPLC Ultimate 3000 (Dionex). Puis les peptides ont été purifiés à l'aide d'une colonne C18 PepMap (Dionex, 0,3 mm I.D. x 5 mm, taille des pores 100 Â, Particules de 3 pm) à 30 pl/min dans du TFA 0,1% (Fluka) et 2% acétonitrile (Carlo Erba). Puis les peptides ont été séparés avec une colonne C18 PepMap 100 (Dionex, 75 pM ID. x 150 mm, taille des pores 100 Â, Particules de 3 pm) à 25 300 nl/min (solution A: 0,1% TFA, 2% acétonitrile; solution B: 20% solution A mélangée vol/vol avec 80% d'acétonitrile). Après équilibration à 7% de B et un gradient multi-pallier est commencé 3 min après l'injection, avec 16% de B 14 min post-injection, 19% à 22 min, 23% à 25 min, 32% à 51 min, 50% à 65 min et un plateau à 95% pendant 79 min avant une équilibration pendant 16 min. Un fractionnement a ensuite été réalisé pour 30 chaque duplicat de 2pg avec un robot Dionex (Probot), 18 min après le début de l'injection, et la collecte a été couplée directement avec les plaques de MALDI, toutes les 10 secondes pour 384 points par fraction. L'éluant et la solution de matrice ont été mélangés, puis placées sur les plaques de MALDI. La matrice d'acide a-cyano-4- hydrocinnamique (CHCA) a été dissoute à 2 mg/ml dans une solution d'acétonitrile (70%) 3057070 18 avec 0,1% de TFA et 110 pM de glu-fibrinopeptide-B pour calibration interne (m/z= 1570.677). Les spectres de masse ont été mesurés avec un spectromètre 4800 MALDI-TOF-TOF (Applied Biosystems) version 3.5.28193 build 1011 avec un mode de réflexion positive à 5 une fréquence laser fixée. Pour chaque fraction 50 spectres ont été collectés entre 850 et 4000 Da avec une fréquence laser fixée à 200 Hz. 500 spectres par échantillons ont été sommés, et traités pour obtenir les valeurs monoisotopiques avec un spectre brut dont le rapport signal/bruit était supérieur à 20. Chaque spectre a permis de sélectionner les 8 pics les plus abondants, avec un rapport signal/bruit > 15. 1000 spectres MS/MS ont été 10 sommés pour chaque précurseur avec la ligne de base soustraite utilisant l'algorithme de Savitsky-Golay (régression sur un polynôme de degré 4). Pour identifier des protéines non dominantes, une liste d'exclusion a été réalisée à partir d'une série dupliquée. L'identification des peptides a été réalisée avec ProteinPilot version 2.0.1 (Applied Biosytems, MDS-Sciex, Foster City, CA). L'analyse a été faite par comparaison avec la 15 'Human Protein Database' de l'IPI (International protein Index version 3.38). Les données ont été traitées en tenant compte du clivage à la trypsine effectué, des cystéines carbamidomethylées, avec la force de recherche fixée à 'thorough'. Une protéine est considérée significativement identifiée quand au moins deux peptides sûrement identifiés sont assignés avec un score de confiance > 95%, et un taux de différence sur l'iTRAQ 20 >1,2 avec p REVENDICATIONS1. Procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la pré-éclampsie comprenant : a) la mesure dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte de la concentration du marqueur LIFR, b) l'utilisation du résultat de la mesure de l'étape a) dans le diagnostic ou le pronostique de la pré-éclampsie, dans lequel un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du marqueur par rapport à la concentration normale du marqueur obtenue chez les femmes enceintes. Procédé selon la revendication 1, ledit fluide biologique est choisi parmi le sang, le plasma, le sérum le plasma, l'urine, la salive ou le liquide amniotique, de préférence le sérum. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, ladite femme enceinte se trouve dans une période de gestation inférieure ou égale à 20 semaines, de préférence inférieure ou égale à 16 semaines, de préférence dans une période de gestation comprise entre 7 semaines et 16 semaines. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit marqueur est sous une forme circulante. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre la mesure à l'étape a) d'un ou plusieurs marqueurs choisis parmi TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M). Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant en outre la mesure à l'étape a) d'un ou de plusieurs autres marqueurs choisis parmi sENG, sFLT1, PIGF, PAPP-A, hémoglobine foetale et/ou hémopexine. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, comprenant une étape a') le calcul d'un ou plusieurs ratios de deux marqueurs et éventuellement le calcul d'un ou plusieurs ratios de deux autres marqueurs, de préférence le calcul du ratio LIFR/TTR et ladite étape b) étant l'utilisation du résultat de la mesure de l'étape a) et/ou du calcul de l'étape a') dans le diagnostic ou le pronostique de la pré-éclampsie, dans lequel un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de (i) la concentration du ou des marqueur(s) et/ou (ii) du ou des ratios de deux marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes. Utilisation d'un marqueur dans l'évaluation in vitro de la pré-éclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du marqueur par rapport à la concentration normale du marqueurobtenue chez les femmes enceintes, le marqueur étant LIFR. Utilisation selon la revendication 8, comprenant en outre la mesure d'un ou plusieurs marqueurs choisis parmi TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M). Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, comprenant en outre la mesure ld'un ou de plusieurs autres marqueurs choisis parmi sENG, sFLT1, PIGF, PAPP-A, hémoglobine foetale et/ou hémopexine. Kit de diagnostic ou de pronostic utile pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 7, comprenant un ou plusieurs réactifs permettant de déterminer la concentration du ou des marqueurs et un ou plusieurs récipients et/ou un ou plusieurs tubes adaptés pour mélanger ledit échantillon de fluide biologique avec le ou les réactifs.