Brevet FR3055635A1 — publié le 20180309

UTILISATION DE QTL POUR CONFERER A DES SOUCHES DE LEVURE UNE RESISTANCE A L'ACIDE ACETIQUE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne l'identification et l'utilisation de QTL (« Quantitative Trait Loci » ou en français « loci de caractères quantitatifs ») pour conférer une résistance à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, à une souche de levure, notamment lors de sa fermentation du glucose. Ainsi, la présente invention offre un procédé permettant la sélection génotypique d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose. De même, l'invention permet d'optimiser grandement l'obtention de souches de levure résistantes à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, basée sur la sélection génotypique des ségrégeants. ETAT DE LA TECHNIQUE La capacité des levures génétiquement modifiées à fermenter divers substrats en fait un outil de choix dans divers procédés industriels, en particulier dans la production d'éthanol à partir de la biomasse lignocellulosique. La fermentation alcoolique est le processus opéré par les levures en milieu anaérobie au cours duquel des sucres sont transformés en alcool. La levure Saccharomyces cerevisiae, aussi connue sous le nom « levure du boulanger », reste le microorganisme le plus utilisé pour la fermentation alcoolique. Cependant, certains inhibiteurs de la fermentation se retrouvent naturellement dans ces substrats et impactent négativement la production d'éthanol. C'est notamment le cas des acides organiques faibles, en particulier de l'acide acétique, un produit de la dégradation de l'hémicellulose. Lorsque les levures sont confrontées à la présence d'acide organique dans leur environnement, elles bloquent leur cycle cellulaire afin de pouvoir se préparer à réagir à ce nouveau stress abiotique. Ce n'est qu'une fois la machinerie cellulaire de résistance mise en place que la fermentation est initiée. La présence d'acide organique faible a ainsi pour conséquence de retarder l'initiation de la fermentation sur glucose, augmentant de ce fait les coûts de production. La problématique liée à l'acide acétique est d'autant plus cruciale que celui-ci est un inhibiteur très puissant de la fermentation alcoolique par les levures et qu'il se retrouve en concentration importante dans certains milieux de fermentation. 3055635 2 Différents moyens ont été décrits pour tenter de contrer l'effet des inhibiteurs de la fermentation, comme par exemple la détoxification du milieu de fermentation, ou l'adaptation des levures aux inhibiteurs de la fermentation par acclimatation ou par modification génétique. Dans le cas de l'acide acétique, la détoxification du milieu de 5 fermentation est une option difficile à mettre en oeuvre, en particulier au niveau industriel. Il est donc nécessaire de tenter de modifier les levures elles-mêmes. Dans ce contexte, l'acclimatation des levures peut être réalisée en introduisant l'inhibiteur dans le milieu de culture, de préférence à des doses croissantes. Toutefois, il a été observé 10 que l'adaptation des levures selon cette méthode n'est que transitoire, et disparaît rapidement lorsque celles-ci sont à nouveau cultivées dans un milieu dépourvu d'inhibiteur. La méthode s'avère donc peut intéressante d'un point de vue industriel, où il est nécessaire de disposer de souches phénotypiquement stables. 15 Dans le cas de la sensibilité à l'acide acétique, seule la modification génétique des levures est donc envisageable. Ceci peut être réalisé soit par modification par génie génétique, en ciblant des gènes spécifiques, soit de manière classique en croisant des souches d'intérêt. A l'heure actuelle, les mécanismes moléculaires liés à la sensibilité ou au contraire à la résistance à l'acide acétique sont mal connus, et insuffisants pour des méthodes ciblées de 20 génie génétique. Ainsi, la méthode de choix pour améliorer la résistance à l'acide acétique reste l'obtention de levures par croisement. Toutefois, même si certains procédés ont permis l'obtention de souches de levure résistantes à l'acide acétique, ceux-ci sont par définition aléatoires et 25 sans garantie de succès. Le document WO 2013/178915 décrit des procédés de croisement de souches de levures permettant la production de levures aptes à métaboliser le xylose et résistantes à l'acide acétique. Ce procédé consiste à croiser la souche de levure déposée à la CNCM sous le 30 numéro 1-4538 avec la souche de levure déposée à la CNCM sous le numéro I-4627, puis à sélectionner un hybride apte à métaboliser le xylose et, de manière indépendante, résistant à l'acide acétique lors de la fermentation du glucose. Cette méthode dite d'hybridation repose sur la capacité des levures à se reproduire soit de 35 manière asexuée, soit de manière sexuée, en fonction notamment des conditions de culture. 3055635 3 La levure S. cerevisiae est un organisme à cycle reproductif haplodiplobiontique, c'est à dire un organisme capable de se multiplier activement aussi bien à l'état haploïde qu'à l'état polyploïde, par exemple diploïde. 5 Tant que le milieu est favorable, les levures polyploïdes sont capables d'une multiplication végétative par bourgeonnement donnant naissance à des levures polyploïdes. Dans le cas de milieu pauvre en nutriments azotés et contenant uniquement une source de carbone non fermentescible (par exemple glycérol, acétate...), les cellules hétérozygotes pour le locus Mat entrent en méiose et forment des levures ayant une 10 ploïdie réduite (spores ou ségrégeants) par un mécanisme dit de sporulation. Les ségrégeants peuvent se multiplier par bourgeonnement, donnant des levures possédant le même génome. On distingue parmi les levures haploïdes deux signes sexuels opposés, appelés MATa et MATa. Deux spores haploïdes de type sexuel opposé sont 15 capables de fécondation pour donner une levure diploïde. Le cycle haplodiplobiontique de S. cerevisiae a largement été utilisé pour croiser des ségrégeants sexuellement compatibles (MATa et MATa), en particulier dans la méthode dite de recombinaison aléatoire issue de sporulation et hybridation en masse. De manière 20 classique, deux souches parentales (différentes d'un point de vue génomique) diploïdes sont utilisées. La sporulation des souches parentales diploïdes est typiquement induite en les cultivant dans des conditions où l'apport en azote est limité et uniquement en présence d'une source de carbone non fermentescible. La méiose opérée lors de cette étape conduit à un brassage génétique, créant des spores au génotype varié. Les spores (haploïdes) 25 obtenues pour chacune des souches parentales sont alors mises en contact, pour produire des souches diploïdes (hybrides) par fusion. Cette dernière étape est appelée l'étape d'hybridation. Cette méthode est intéressante en ce qu'elle permet de créer un brassage génétique d'où 30 peuvent ressortir des traits phénotypiques d'intérêt. Elle nécessite toutefois une étape de sélection des hybrides sur la base des traits phénotypiques recherchés. A titre d'exemple, dans le cas de souches parentales strictement diploïdes présentant chacune un trait phénotypique porté par 10 gènes, la probabilité d'obtenir l'hybride d'intérêt est estimée à 1 / 2,097.106. Or, l'étape de sélection finale est fastidieuse, longue et surtout coûteuse. 35 Il existe donc un besoin évident de procédés améliorés pour la production de souches de levure résistantes à l'acide acétique. 3055635 4 DESCRIPTION DE L'INVENTION Les inventeurs ont mis en évidence différents QTL, répartis sur les chromosomes I, IV, V, VII, X, et XV de S. cerevisiae, associés au phénotype de résistance à l'acide acétique lors 5 de la fermentation du glucose. En outre, les inventeurs ont identifié, au sein de ces QTL, les polymorphismes nucléotidiques potentiellement associés à ce phénotype de résistance à l'acide acétique. 10 De façon particulièrement intéressante, les inventeurs ont déterminé que la présence d'au moins un polymorphisme nucléotidique d'intérêt dans les souches de levure S. cerevisiae était associée à une augmentation de sa résistance à l'acide acétique lors de la fermentation du glucose. 15 Sur la base de ces éléments, il est proposé des procédés de sélection et d'obtention de souches de levure résistantes à l'acide acétique. DEFINITIONS 20 Les termes « souche de levure » désignent au sens de l'invention une population de levures rigoureusement identiques du point de vue génétique. Cela englobe aussi bien les souches dites de laboratoire que les souches dites industrielles. Ce terme est à différencier du terme « levure », une levure étant obtenue par culture d'une souche telle que définie ci-dessus. On entend par « levure » un produit commercial obtenu grâce à la mise en 25 oeuvre d'un procédé de production d'une souche de levure. Ainsi, des levures présentant des caractéristiques différentes peuvent être obtenues à partir d'une même souche, ces différences étant liées au procédé de production mis en oeuvre. Au sens de l'invention, un « ségrégeant » est le produit de la méiose d'une souche de 30 levure, quel que soit le niveau de ploïdie de ladite levure. Dans la suite de la demande, les termes « ségrégeant » et « spore » pourront être utilisés indifféremment. Les termes « souche de levure apte à métaboliser le glucose » désignent au sens de l'invention une souche de levure capable de convertir le glucose en éthanol, c'est-à-dire 35 capable de fermenter le glucose. Une souche de levure apte à métaboliser le glucose au sens de l'invention est une souche de levure qui convertit au moins 70%, de préférence au moins 80%, plus préférentiellement au moins 90 % du glucose en éthanol en 60 heures dans un milieu de fermentation comprenant 150 g de glucose par kg de milieu de fermentation, dans des conditions de fermentation alcoolique usuelles. 3055635 5 De préférence, la méthode utilisée pour mesurer le pourcentage de glucose converti en éthanol est la suivante : La souche de levure utilisée est ensemencée dans du milieu synthétique de fermentation à 5 hauteur de 0,25 g de levure en matière sèche / kg de milieu de fermentation. La durée de 60 heures est calculée à partir de l'ensemencement de la souche de levure dans le milieu synthétique de fermentation. Un milieu synthétique de fermentation est un milieu dont la composition chimique exacte est connue. Dans le cadre de l'invention, un milieu synthétique de fermentation comprend une source de carbone, une source d'azote, une 10 source de phosphore, ainsi que les vitamines et minéraux essentiels à la croissance d'une souche de levure. De préférence, le milieu de fermentation utilisé pour mesurer le pourcentage de glucose converti en éthanol est le milieu YF tel que défini dans les exemples de réalisation (noté YF Ac en raison de la présence d'acide acétique). 15 La fermentation est typiquement conduite à une température comprise entre 28 et 37°C, voire entre 30 et 35°C, avantageusement égale à 32°C, sous agitation modérée, par exemple à 90 ou 100 rpm. L'agitation est modérée pour ne pas être oxygénante. Le pH du milieu est de préférence contrôlé, par exemple par le pouvoir tampon d'un couple acide/base (tel que le couple acide acétique/acétate), et acide, avantageusement compris 20 entre 3,5 et 6, voire 4 et 5,5, encore plus avantageusement égal à 4,4 ou 5. La quantité d'éthanol présente dans le milieu de fermentation est mesurée par tout moyen approprié connu de l'homme du métier. Il peut s'agir d'une mesure directe de l'éthanol produit ou d'une mesure indirecte via un paramètre corrélé à la production d'éthanol, tel 25 que la production de CO2 déterminée en mesurant la perte de masse. Par exemple, la production d'alcool peut être mesurée par chromatographie, notamment par HPLC (High Performance Liquid Chromatography), un kit enzymatique (par exemple le kit de dosage de l'éthanol de Boehringer), ou un dosage par le dichromate de potassium. La quantité de glucose présente dans le milieu de fermentation est mesurée par tout moyen approprié 30 connu de l'homme du métier, de préférence par chromatographie, notamment par HPLC. Dans le cadre de l'invention, on entend par « acide organique » ou « acide organique faible », un acide carboxylique susceptible d'inhiber la fermentation d'un sucre, avantageusement du glucose. Il s'agit avantageusement d'acide acétique, d'acide 35 lévulinique ou d'acide formique, encore plus avantageusement d'acide acétique. 3055635 6 A noter que de manière connue, seule la forme non dissociée ou non ionisée de tels acides présente une capacité d'inhibition. Dans le cadre de l'invention, on entend par « forme non ionisée ou non dissociée » d'un acide carboxylique sa forme protonée. En pratique, la forme de tels acides organiques dépend du pH du milieu dans lequel ils sont incorporés. A 5 un pH supérieur au pKa de l'acide, celui-ci se trouve majoritairement sous forme dissociée ou d'ions C00-. Au contraire et à un pH inférieur, la forme majoritaire est la forme non dissociée ou non ionisée (COOH). Dans la suite de l'invention, les quantités ou concentrations mentionnées font référence à l'acide acétique introduit dans le milieu, englobant formes dissociée et non dissociée en fonction du pH dudit milieu. 10 Les termes « résistante à un acide organique » ou « résistante à l'acide acétique » désignent une souche de levure apte à fermenter au moins un sucre, en particulier le glucose, avec un impact limité de l'acide organique/acétique sur la courbe de fermentation alcoolique. La courbe de fermentation alcoolique représentant la quantité 15 d'alcool produit en fonction du temps comporte généralement trois phases : une phase de latence au cours de laquelle il n'y a pas de production d'éthanol, une phase de production d'alcool, et une phase de plateau, qui correspond à la fin de la fermentation. De manière connue, l'acide acétique est un inhibiteur de la fermentation du glucose, cette 20 inhibition se traduisant par un retard lors de l'initiation de la fermentation, la cinétique restant par la suite inchangée. A noter qu'en présence à la fois de glucose et de xylose dans le milieu, les souches de levure fermentent en priorité le glucose en raison de la répression catabolique. 25 Ainsi, une « souche résistante à l'acide acétique » présente avantageusement un retard d'initiation de la fermentation alcoolique inférieur à 30 heures, de préférence inférieur à 20 heures, plus préférentiellement inférieur à 15 heures voire 10 heures. De préférence, référence est faite à l'aptitude à fermenter du glucose avec un retard d'initiation de la fermentation alcoolique tel qu'indiqué plus haut. 30 Le milieu de fermentation utilisé pour évaluer la résistance à l'acide acétique est de préférence un milieu synthétique, plus préférentiellement le milieu YFAc tel qu'illustré dans les exemples de réalisation. La composition du milieu YFAc est la suivante : 150 g/kg de glucose, 5 g/kg d'extrait de levure, 4,7 g/kg de DAP (diammonium 35 phosphate), 11,4 g/kg d'acide citrique, 4 g/kg d'acide acétique, 13,5 g/kg de citrate de sodium, 1 ml/kg de Tween 80, 2 ml/kg de ZnSO4 (à 10,6 g/L), 2,5 ml/kg de MgSO4 7H20 (à 400 g/L), 1 ml/kg de thiamine (à 18,24 g/L), 1 ml/kg de pyridoxine (à 5,28 g/L), 1 ml/kg de biotine (à 1,76 g/L), 1 ml/kg de panthoténate (à 3,8 g/L), 2,5 ml/kg d'acide 3055635 7 nicotinique (à 8 g/L), 1 ml/kg de mésoinositol (à 50 g/L), 1 ml/kg de riboflavine (à 1 g/L), 1 ml/kg de para-aminobenzoate (à 1,2 g/L), pH ajusté à 4,4 avec KOH. L'ensemencement de la souche de levure utilisée pour évaluer la résistance à l'acide acétique est de préférence, 0,25 g en matière sèche / kg de milieu de fermentation. Le temps t=0 de la 5 courbe de fermentation alcoolique correspond au moment de l'ensemencement de la souche de levure dans le milieu de fermentation. La fermentation alcoolique est conduite en condition anaérobie, de préférence à 32°C et sous agitation modérée, par exemple 90 rpm. 10 Il convient de noter qu'à la concentration de 2000 ppm, l'acide acétique n'a pas d'effet inhibiteur sur la fermentation. De manière adaptée, l'acide acétique est ajouté à hauteur de 1 à 10 g / kg de milieu de fermentation, par exemple 4 g / kg de milieu de fermentation Dans le contexte de l'invention, les abréviations suivantes sont utilisées pour les bases 15 d'acide nucléique (ou nucléotides) les plus courantes. « A» » se réfère à l'adénosine, « C » se réfère à la cytosine, « G » désigne la guanosine et « T » désigne la thymidine. Dans le cadre de l'invention, on entend par « QTL » (pour « Quantitative Trait Loci ») des séquences du génome, d'une taille pouvant aller de plusieurs centaines à plusieurs 20 milliers de bases (ou de nucléotides), dont la présence est corrélée avec une variation de phénotype. Ces séquences comprennent des modifications génétiques, appelées mutations, qui sont responsables de la variation mesurable de phénotype observée. Dans le cadre de l'invention, on entend par « polymorphisme nucléotidique » ou « SNP » 25 (pour « Single-Nucleotide Polymorphism »), la variation (ou polymorphisme) d'une seule paire de bases du génome entre un individu d'une espèce et celui de l'organisme de référence de cette espèce, en l'occurrence des souches de levure. De manière plus générale, on entend par « mutation » (ou polymorphisme nucléotidique) 30 toute altération observée à une position donnée du génome. Ainsi, le terme « mutation » comprend aussi bien : - mutation par substitution ou SNP : remplacement d'un (ou plusieurs) nucléotides par un autre (ou plusieurs autres) ; - mutation par insertion ou insertion : ajout d'un ou plusieurs nucléotides ; 35 - mutation par délétion ou délétion : perte d'un ou plusieurs nucléotides. 3055635 8 Dans le cadre de l'invention, ces positions sont indiquées en référence au génome de la souche de levure S. cerevisiae S288c, dont la séquence complète est disponible dans les bases de données sous la référence GenBank GCA 000146045.2. (version du 18 avril 2011) et dont la référence NCBI est Gene ID: 852501. 5 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Selon un premier aspect, l'invention concerne l'utilisation de régions chromosomiques d'intérêt, nouvellement identifiées, pour conférer une résistance à un acide organique à 10 une souche de levure. Des chromosomes particulièrement d'intérêt dans le cadre de la présente invention sont les suivants : - le chromosome I, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae 15 S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence NC 001133.8 ; - le chromosome IV, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence NC 001136.9; 20 - le chromosome V, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence NC 001137.2; - le chromosome VII, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence 25 NC 001139.8 ; - le chromosome X, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence NC 001142.8 ; - le chromosome XV, dont la séquence issue de la souche Saccharomyces 30 cerevisiae S288c est disponible dans la base de données NCBI sous la référence NC 001147.5. Sur ces chromosomes, des régions particulièrement d'intérêt ont pu être localisées. Leur position est donnée par référence à la numérotation du chromosome correspondant dans la 35 souche de référence S288c. Il s'agit avantageusement de : - la région localisée entre les bases 70000 et 120000 du chromosome I ; et/ou - la région localisée entre les bases 370000 et 560000 du chromosome IV, avantageusement la région localisée entre les bases 525000 et 526500 ; et/ou 3055635 9 - la région localisée entre les bases 1100000 et 1250000 du chromosome IV ; et/ou - la région localisée entre les bases 420000 et 500000 du chromosome V, avantageusement la région localisée entre les bases 458000 et 470000 ; et/ou - la région localisée entre les bases 410000 et 570000 du chromosome VII, 5 avantageusement la région localisée entre les bases 522000 à 549000 ; et/ou - la région localisée entre les bases 350000 et 490000 du chromosome X ; et/ou - la région localisée entre les bases 590000 et 660000 du chromosome X, avantageusement la région localisée entre les bases 606900 et 607900 ; et/ou - la région localisée entre les bases 550000 et 680000 du chromosome XV, 10 avantageusement la région localisée entre les bases 610500 et 612000. Selon un mode de réalisation particulier, l'ensemble de ces régions est utilisé. Selon un autre aspect, à l'intérieur de ces différentes régions, des positions particulières 15 d'intérêt ont pu être localisées. Avantageusement, il s'agit des positions suivantes : - au moins l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I ; - au moins l'une des positions listées dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV ; 20 - au moins l'une des positions listées dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V ; - au moins l'une des positions listées dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII ; - au moins l'une des positions listées dans le tableau 6 en rapport avec le 25 chromosome X ; - au moins l'une des positions listées dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV. Dans le cadre de l'invention, une position d'intérêt correspond à un polymorphisme 30 nucléotidique, c'est-à-dire l'absence à cette position (ou à la position correspondante dans la souche analysée) du nucléotide observé dans la souche de référence S288c. En d'autres termes, une mutation, qui peut aussi bien être une substitution, une insertion ou une délétion, est observée à cette position. 35 Selon un mode de réalisation particulier, une région chromosomique visée porte une mutation à l'ensemble des positions listées. Selon un autre mode de réalisation, toutes ces régions portent une mutation à toutes les positions listées. 3055635 10 Selon un autre aspect, à ces différentes positions, des mutations particulières d'intérêt ont pu être identifiées. Avantageusement, il s'agit des mutations suivantes : mutations mutations mutations mutations mutations mutations le tableau le tableau le tableau le tableau le tableau 3 en rapport avec le 4 en rapport avec le 5 en rapport avec le 6 en rapport avec le 7 en rapport avec le listées dans le tableau 2 en rapport avec le listées dans listées dans listées dans listées dans listées dans - au moins l'une des chromosome I ; 5 - au moins l'une des chromosome IV ; - au moins l'une des chromosome V ; - au moins l'une des 10 chromosome VII ; - au moins l'une des chromosome X ; - au moins l'une des chromosome XV. 15 Selon un mode de réalisation particulier, une région chromosomique visée porte l'ensemble des mutations listées. Selon un autre mode de réalisation, toutes ces régions portent toutes les mutations listées. 20 Selon un mode de réalisation avantageux, la résistance conférée est une résistance à l'acide acétique, dont la présence en fortes concentrations dans les hydrolysats lignocellulosiques est intrinsèquement liée à celle de groupements acétyles associés de manière covalente avec les molécules d'hémicellulose. 25 Selon un autre mode de réalisation avantageux, la résistance à l'acide organique de la souche de levure se traduit lors de la fermentation du glucose, pour laquelle le retard d'initiation de la fermentation est diminué ou réduit. Selon un mode de réalisation privilégié, la souche de levure visée par la présente 30 invention appartient au groupe des hemi-ascomycètes. Des souches privilégiées appartiennent au genre Saccharomyces, Pichia ou Yarrowia, avantageusement Saccharomyces. Parmi les Saccharomyces, il s'agit avantageusement de S. cerevisiae. Selon un autre aspect, l'invention vise un procédé de sélection ou d'identification d'une 35 souche de levure résistante à un acide organique comprenant la mise en évidence de : - une mutation au moins à l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le 3055635 11 tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement à toutes ces positions; et/ou au moins l'une des mutations listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le 5 tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement toutes ces mutations. 10 Comme déjà dit, l'acide organique est avantageusement de l'acide acétique. Selon un autre mode de réalisation privilégié, la résistance à l'acide organique de la souche ainsi sélectionnée est observée lors de sa fermentation sur glucose. 15 Ainsi, la présente invention offre un procédé de criblage génotypique de souches d'intérêt, en l'occurrence résistantes à un acide organique. Cette approche est beaucoup plus économique, aussi bien en termes de temps que d'argent, que les criblages phénotypiques traditionnellement mis en oeuvre. 20 Comme énoncé, ce criblage repose sur la mise en évidence d'une mutation à au moins l'une des positions listées, avantageusement à toutes les positions listées, et/ou la mise en évidence d'au moins l'une des mutations listées, avantageusement de toutes les mutations listées. 25 De manière connue, la mise en évidence de ces mutations peut être réalisée par toute technique disponible pour l'homme du métier telle que séquençage, PCR, hybridation. Ceci peut concerner un seul allèle de cette souche, voire plusieurs, voire même tous les allèles (deux en cas d'une levure diploïde, trois en cas de souche triploïde, ...). 30 L'intérêt d'une souche identifiée à l'aide de ce procédé peut bien sûr être confirmé par une approche phénotypique, consistant à évaluer la capacité de la souche sélectionnée à fermenter du glucose en présence d'acide acétique, par exemple comme décrit ci-dessus. 35 Ces différents critères de criblage génotypique peuvent également être mis en oeuvre pour la production ou l'obtention de souches de levure résistantes à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, en particulier dans le cadre de la fermentation du glucose. 3055635 12 Ainsi et à l'aide des outils de biologie moléculaire disponibles, il est possible de faire de la mutagénèse (dirigée ou aléatoire) sur des souches de levure pour obtenir le phénotype désiré. Comme déjà dit, la présence des caractéristiques génotypiques mentionnées ci-dessus n'est a priori nécessaire qu'au niveau d'un allèle. Alternativement, cette 5 mutagénèse peut donc être réalisée sur des spores (ou ségrégeants) qui sont par la suite hybridés avec d'autres spores, issues éventuellement d'une autre souche présentant un autre trait phénotypique d'intérêt. Ainsi et selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de production ou 10 d'obtention d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose comprenant : - l'introduction dans la souche d'une mutation au moins à l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans 15 le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement à toutes ces positions; et/ou - l'introduction dans la souche d'au moins l'une des mutations listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le 20 chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement toutes ces mutations. 25 Selon un autre mode de réalisation, l'invention propose un procédé de production ou d'obtention d'une souche de levure résistante à un acide organique, basé sur un criblage génotypique réalisé au niveau des spores ou ségrégeants, haploïdes. Ainsi et selon un autre aspect, l'invention propose un procédé d'obtention d'une souche 30 de levure résistante à un acide organique, comprenant : - une étape de sporulation de deux souches parentales possédant des génomes différents ou des traits phénotypiques divergents ; - une étape d'hybridation en masse des spores ou ségrégeants obtenus, ledit procédé comprenant au moins une étape de sélection des ségrégeants en raison de la 35 présence - d'une mutation au moins à l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le 3055635 13 chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement à toutes ces positions; et/ou - d'au moins l'une des mutations listées dans le tableau 2 en rapport avec le 5 chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement toutes ces mutations. 10 De manière caractéristique, le procédé de l'invention comprend une étape de sporulation des souches parentales. Cette technique est bien connue de l'homme du métier et ne nécessite donc pas d'être détaillée plus avant. A titre d'exemple, l'étape de sporulation peut être réalisée en cultivant les souches parentales dans des conditions de cultures 15 appropriées, tel que par exemple en milieu carencé. Parmi les souches parentales, au moins l'une d'elle présente le phénotype d'intérêt, en l'occurrence une résistance à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, au sens de l'invention. Avantageusement, celle-ci présente un retard d'initiation de la 20 fermentation alcoolique inférieur à 30 h, de préférence inférieur à 20 heures, plus préférentiellement inférieur à 15 heures voire 10 heures dans le milieu de fermentation YFAc avec un inoculum de 0,25 g de matière sèche de levure / kg de milieu. De telles souches sont bien connues de l'homme du métier. Le cas échéant, l'homme du métier pourra produire la souche de levure parentale résistante à l'acide organique/acétique au 25 sens de l'invention, par exemple par les techniques usuelles utilisant la pression de sélection. A noter qu'une souche parentale d'intérêt peut également être identifiée à l'aide du procédé de sélection, objet de la présente invention. 30 Dans le cas particulier de la mise en oeuvre de S. cerevisiae, il peut notamment s'agir de la souche EGAc1 déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-4839 en date du 13 Mars 2014. 35 3055635 14 Comme mis en évidence dans le cadre de la présente demande, ce trait phénotypique n'étant éventuellement porté que par un allèle, la sporulation donne lieu à des spores ne portant pas ce trait génotypique, en l'occurrence la moitié des spores dans le cas d'une souche parentale diploïde ne portant qu'un allèle de résistance à l'acide 5 organique/acétique. Dans un cas particulier, les deux souches parentales mises en oeuvre dans le cadre du procédé selon l'invention présentent un phénotype de résistance à un acide organique au sens de l'invention. 10 De manière adaptée, au moins l'une des souches de levure parentales, en particulier celle résistante à l'acide organique/acétique, avantageusement les deux souches parentales sont aptes à fermenter le glucose au sens de l'invention. 15 Selon un mode de réalisation privilégié, la seconde souche de levure parentale, avantageusement celle ne présentant pas de résistance à l'acide organique/acétique, présente un second trait phénotypique d'intérêt. Il s'agit par exemple de la capacité à métaboliser les pentoses, en particulier le xylose présent en grande quantité dans les hydrolysats lignocellulosiques. 20 Ainsi, des souches de levures aptes à fermenter le glucose et pouvant également métaboliser les pentoses sont disponibles : A titre d'exemple, le document WO 2010/000464 rapporte l'obtention de souches de 25 levure aptes à fermenter les pentoses grâce à un gène bactérien codant une xylose isomérase (XI) qui convertit le xylose en xylulose métabolisable par la levure. A noter que de manière alternative, une voie eucaryote comprenant une xylose réductase (XR ou XYL1) générant du xylitol et une xylitol déshydrogénase (XDH ou XYL2) permet également d'aboutir au xylulose. 30 Ainsi, le document WO 2012/072793 décrit des souches de levure améliorées, associant des gènes exogènes codant une xylose isomérase et une xylitol déshydrogénase permettant d'éliminer le xylitol qui s'avère être un inhibiteur de la xylose isomérase. De telles souches, en particulier la souche déposée à la CNCM le 5.10.2011 sous le numéro I- 35 4538, présentent des rendements améliorés et donc une utilité industrielle avérée pour la production d' éthanol. 3055635 15 Selon un mode de réalisation particulier, la seconde souche parentale mise en oeuvre dans le cadre du procédé selon l'invention est la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F75724 Paris Cedex 15) sous le numéro I-4538 en date du 5 Octobre 2011. 5 Le procédé de l'invention comprend en outre une étape d'hybridation en masse des spores ou ségrégeants obtenus. Cette étape est facilement réalisée selon les méthodes classiques utilisées dans le domaine 10 et décrites en détail dans le chapitre 7 « Sporulation and Hydridization of Yeast » par R.R. Fowell, de l'ouvrage de référence « The Yeasts », Volume 1, édité par A.H. Rose et J. S. Harrison, 1969-Academic Press. Brièvement, l'hybridation est réalisée en introduisant les spores en question dans un milieu de culture adapté à l'étape d'hybridation. Typiquement, l'homme du métier pourra utiliser pour cette étape du milieu 15 de culture complet de type YPG (contenant extrait de levure 10 g/L, Bactopeptone 20 g/L, glucose 20 g/L et eau déminéralisée qsp 1 L). L'étape de sélection des spores ou ségrégeants d'intérêt est réalisée comme décrit précédemment et repose sur la mise en évidence d'une mutation à au moins l'une des 20 positions listées, avantageusement à toutes les positions listées, et/ou la mise en évidence d'au moins l'une des mutations listées, avantageusement de toutes les mutations listées. Comme déjà dit, la mise en évidence de ces séquences peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier telle que séquençage, PCR, hybridation. 25 Une telle sélection peut par exemple être réalisée sur la base du séquençage total ou partiel selon les techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme de l'art, ou encore par des techniques de PCR. Le séquençage peut ainsi être réalisé par séquençage par hybridation ou par des techniques de séquençage haut débit telles que le 30 pyroséquençage, le séquençage par synthèse ou le séquençage par ligation. Alternativement, la sélection peut être réalisée sur la base de techniques PCR en recherchant les polymorphismes visés. On peut dans ce cadre citer par exemple les techniques de PCR multiplexe, qui permettra de rechercher plusieurs polymorphismes en un seul test, la PCR emboitée, qui permet une grande sensibilité de résultat, ou encore la 35 PCR sur colonie qui ne nécessite pas d'extraction de l'ADN. 3055635 16 Afin de réaliser le séquençage ou la PCR, une étape de multiplication de l'ADN peut s'avérer nécessaire, afin de disposer de suffisamment de matière biologique. Il sera alors possible de procéder à une amplification en cultivant chaque souche ou spore dans un milieu de culture adapté à sa reproduction. En outre, une étape d'extraction de l'ADN des 5 levures peut s'avérer nécessaire, qui pourra être faite selon les méthodes de biologie moléculaire bien connues dans le domaine de l'invention. Comme déjà dit, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre de diverses façons, l'étape de sélection des levures pouvant être réalisée à partir des souches parentales, et/ou 10 à partir des spores qui en découlent, et/ou à partir des souches obtenues après hybridation. Comme déjà dit, il est toutefois particulièrement avantageux de procéder à l'étape de sélection à partir des spores découlant des souches parentales. Ainsi et selon un mode de réalisation privilégié, un procédé selon l'invention comprend 15 les étapes suivantes : a) préparer des ségrégeants issus d'une première souche parentale et des ségrégeants issus d'une deuxième souche parentale ; b) sélectionner parmi les ségrégeants issus de l'étape a) ceux présentant : - une mutation au moins à l'une des positions listées dans le tableau 2 en rapport 20 avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement à toutes ces positions; et/ou 25 - au moins l'une des mutations listées dans le tableau 2 en rapport avec le chromosome I, dans le tableau 3 en rapport avec le chromosome IV, dans le tableau 4 en rapport avec le chromosome V, dans le tableau 5 en rapport avec le chromosome VII, dans le tableau 6 en rapport avec le chromosome X, dans le tableau 7 en rapport avec le chromosome XV, avantageusement toutes ces 30 mutations ; c) hybrider les ségrégeants issus de la première souche parentale et sélectionnés à l'étape b) avec les ségrégeants issus de la deuxième souche parentale, éventuellement sélectionnés à l'étape b) ; d) sélectionner parmi les hybrides issus de l'étape c) ceux résistants à l'acide 35 organique. 3055635 17 L'étape a) du procédé correspond à une étape de préparation de ségrégeants à partir de deux souches parentales de levure, avantageusement S. cerevisiae, différentes, c'est-à-dire une étape de sporulation. L'homme du métier pourra aisément obtenir des ségrégeants à partir des souches parentales définies plus haut, selon les méthodes bien connues dans le 5 domaine de l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux, cette étape comprend la culture de la première souche de levure parentale d'une part et de la deuxième souche de levure parentale d'autre part, dans un milieu carencé en azote ou en sucre. 10 De manière préférée, les souches parentales mises en oeuvre sont des souches de levure appartenant au groupe des Saccharomyces, avantageusement Saccharomyces cerevisiae. Selon un mode de réalisation privilégié, la première souche est choisie pour sa capacité de 15 résistance à l'acide organique, avantageusement l'acide acétique, en particulier lors de la fermentation sur glucose. Il peut notamment s'agir de la souche EGAc1 déposée à la CNCM sous le numéro I-4839 en date du 13 Mars 2014. Les ségrégeants de cette souche feront en priorité l'objet de l'étape de sélection b) du procédé. 20 Selon un autre mode de réalisation privilégié, la seconde souche de levure parentale est choisie pour un autre trait phénotypique d'intérêt, par exemple sa capacité à métaboliser le xylose. Il peut par exemple d'agir de la souche déposée à la CNCM sous le numéro I4538 en date du 5 Octobre 2011. 25 Dans un cas particulier, la seconde souche de levure parentale peut également présenter une capacité de résistance à l'acide organique, avantageusement l'acide acétique, en particulier lors de la fermentation sur glucose. Dans ce cas de figure, les spores de cette souche feront également l'objet de l'étape de sélection b) du procédé. 30 L'étape b) du procédé de l'invention est mis en oeuvre comme décrit ci-dessus et permet d'éliminer les spores ne présentant pas le trait phénotypique recherché, en l'occurrence une résistance à un acide organique au sens de l'invention. Ainsi et grâce à cette étape, la probabilité d'obtenir à l'issue de l'hybridation une souche présentant ce trait phénotypique est fortement augmentée. 35 L'étape c) du procédé de l'invention est une étape d'hybridation des ségrégeants issus d'une première souche de levure parentale avec des ségrégeants issus d'une deuxième souche parentale, au moins l'une des populations de ségrégeants ayant été préalablement 3055635 18 sélectionnée à l'étape b), avantageusement celle issue de la première souche de levure parentale. De préférence, on réalise à l'étape c) une hybridation en masse. En d'autres termes, 5 l'étape c) correspond de préférence à une étape d'hybridation de la totalité des spores issues de l'étape b). L'étape d) du procédé, optionnelle, consiste à sélectionner parmi les hybrides issus de l'étape c) ceux capables de fermentation alcoolique et possédant un phénotype de 10 résistance à l'acide organique, avantageusement l'acide acétique. Comme déjà dit, cette étape est aisément réalisée par des méthodes traditionnelles de sélection, mettant en oeuvre des techniques de culture usuelles. Cette étape est avantageusement mise en oeuvre sur un milieu comprenant du glucose. 15 La présente invention va être illustrée plus avant à l'aide des exemples de réalisation qui suivent, à l'appui des figures annexées. Toutefois, ceux-ci n'ont aucune portée limitative. LEGENDES DES FIGURES : 20 La figure 1 représente le logigramme utilisé pour déterminer la proportion d'allèles issus de EGAc1 (I-4839) dans les populations de levures ayant fermenté en présence d'acide acétique (popB) ou dans les populations de levures ayant fermenté sans acide acétique (popC). 25 S288c : souche de S. cerevisiae dont le génome sert de référence (GenBank GCA 000146045.2., version du 18 avril 2011 ; NCBI Gene ID: 852501) EGAc1 : souche déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 13 Mars 2014 sous le numéro I-4839 30 1-4538 : souche déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en date du 5 Octobre 2011 EGAc2 : souche déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) en 35 date du 13 Mars 2014 sous le numéro I-4840 La figure 2 représente les moyennes des fréquences des allèles de la souche EGAc1 (I4839) dans les deux populations : PopC = non stressées, en pointillés ; PopB = stressées, 3055635 19 en trait plein, et cela le long des chromosomes I (A), IV (B), V (C), VII (D), X (E) et XV (F). Les blocs en pointillés représentent les QTL potentiels. EXEMPLES DE REALISATION 5 Identification de traits génétiques et mutations liés au phénotype de résistance aux acides organiques faibles tels que l'acide acétique Dans ces expériences, l'objectif est de produire une population de levures diverses d'un 10 point de vue génétique (a), afin non seulement de sélectionner les souches résistantes aux acides organiques faibles mais aussi de pouvoir analyser les traits génétiques impliqués dans ce phénotype (b). a. Production d'une population de levures comprenant des souches résistantes aux 15 acides organiques faibles : La population de levures a été obtenue par recombinaison aléatoire issue de sporulation et hybridation en masse. Cette stratégie est inspirée des travaux de Leo Parts et al. (2011, Genome Res, 21(7) :1131-8). Brièvement, un ségrégeant (aussi appelé spore) d'une 20 souche résistante à l'acide acétique (souche EGAc1/I-4839) est croisé avec un autre ségrégeant, issu de la souche 1-4538, créant ainsi un premier hybride (souche EGAc2/I4840), comme décrit dans W02013/178915. Dans un second temps, le génome de la souche EGAc2 (I-4840) a été recombiné de 25 manière aléatoire pour obtenir une population de levures très diverses d'un point de vue génétique. En pratique, l'hybride EGAc2 (I-4840) a été mis à sporuler puis les spores obtenues ont été laissées libres de se réhybrider entre elles, comme décrit dans W02013/178915. Le cycle a été reproduit 4 fois, générant ainsi une réduction de 24 de la distance génétique en centiMorgan (cM). 30 b. Sélection des souches résistantes aux acides organiques faibles : Les souches résistantes aux acides organiques faibles ont été sélectionnées en suivant les principes de la génétique des populations, en particulier le principe de Hardy et Weinberg 35 qui énonce que dans une population isolée d'effectif illimité, non soumise à la sélection, et dans laquelle il n'y a pas de mutations, les fréquences alléliques et les fréquences génotypiques restent stables de génération en génération. 3055635 20 Ainsi, en l'absence de sélection, dans le cas de 2 allèles « A » et « B », dont seule « A » est susceptible de jouer un rôle dans l'adaptation de la population à une pression de sélection donnée (par exemple la résistance aux acides organiques faibles), les fréquences de l'allèle « A » et de l'allèle « B » dans la population restent stables. En revanche, si 5 l'environnement change, et que le milieu est enrichi en acide organique faible, alors les souches les moins adaptées vont disparaître (B) au profit des souches les plus adaptées (A). Selon ce principe, dans le cas où il existe une pression de sélection, on observe alors un écart à cet équilibre sur quelques générations. Ainsi, en comparant les variations de fréquence allélique entre une population non soumise à la sélection et une population 10 soumise à une pression de sélection, on peut déterminer les allèles susceptibles d'être impliqués dans la résistance ou l'adaptation à la sélection appliquée. En pratique, afin de disposer d'une population contrôle, un échantillon de la population obtenue au point a) a été cultivé en milieu dépourvu d'acide acétique (sans pression de 15 sélection). La population ainsi obtenue est appelée « population C ». Parallèlement, un échantillon de la population obtenue au point a) a été soumis à une forte pression de sélection par ajout d'acide acétique au début de la fermentation alcoolique en présence de glucose. La population ainsi obtenue est appelée « population B ». En 20 pratique, l'acide acétique a été ajouté au milieu de culture de façon à obtenir une concentration de 4g/L. c. Détermination des traits génétiques impliqués dans le phénotype de résistance aux acides organiques faibles : 25 La souche EGAc1 (I-4839) étant résistante à l'acide acétique, il est attendu que les traits génétiques associés à cette résistance soient présents dans cette souche. Par conséquent, afin de limiter le nombre d'allèles à analyser, on identifie dans un premier temps les allèles spécifiques à la souche EGAc1 (1-4839) qui sont présents dans la souche EGAc2 30 (I-4840), ainsi que dans les populations C et B. Dans un second temps, il est possible de déterminer la fréquence d'apparition de chacun de ces allèles dans les populations stressées (B) ou non (C). L'étude des variations de la fréquence allélique le long du génome a été réalisée de la 35 manière suivante : 3055635 21 A l'issue des fermentations, les ADN génomiques provenant de la souche EGAc1 (I4839), de la souche EGAc2 (I-4840) et provenant des populations B et C ont été extraits puis séquences par la méthode « Paired End » via un HiSeq 2000 d'Illumina. 5 Les résultats sont ensuite traités selon l'approche illustrée à la figure 1. A noter que le génome de référence est celui de la souche S288c (GenBank GCA 000146045.2., version du 18 avril 2011 ; NCBI Gene ID: 852501). Dans le cas d'une étude menée sur des populations complexes, la fréquence allélique est 10 le reflet du nombre d'individus portant l'allèle en question. Ainsi, à titre d'exemple et en application directe de la loi de Hard et Weinberg, si un allèle est présent avec une fréquence de 70 %, il est possible d'en déduire que 91 % des individus de la population portent au moins une copie de cet allèle. 15 La figure 2 représente l'évolution de la fréquence des allèles issus de la souche EGAcl (I- 4839) et présents dans les populations B et C, et ce le long du chromosome I (Fig. 2A), IV (Fig. 2B), V (Fig. 2C), VII (Fig. 2D), X (Fig. 2E) et XV (Fig. 2F). Les résultats présentés sur la figure 2 montrent, sur chacun de ces chromosomes, des 20 régions (blocs en pointillés) dans lesquelles une dissociation des courbes correspondant aux fréquences des allèles issus de l'EGAcl (I-4839) dans les deux types de populations est observée. Ces résultats montrent qu'il y a un allèle qui est plus représenté dans les populations soumises à pression de sélection que dans celles qui ont fermenté sans cette pression. Cette surreprésentation suggère que l'allèle issu de l'EGAcl (I-4839) 25 favoriserait la multiplication des cellules en présence d'acide acétique. En d'autres termes, ces régions des chromosomes I, IV, V, VII, X et XV sont identifiées comme étant des traits génétiques quantifiables (aussi appelés QTL), c'est-à-dire des régions génétiques impliquées dans la résistance à l'acide acétique. 30 Plus précisément, ces régions ont pu être localisées sur les chromosomes de la souche de référence S288c, comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous : 3055635 22 Chromosome Séquence de référence Position de la région en kb (taille de la région en kb) Référence dans la base de données NCBI I NC 001133.8 70 à 120 (50) IV NC 001136.9 1/ 370 à 560 (190), en particulier 525 à 526,5 (1,5) 2/ 1100 à 1250 (150) V NC 001137.2 420 à 500 (80), en particulier 458 à 470 (1,2) VII NC 001139.8 410 à 570 (160), en particulier 522 à 549 (27) X NC 001142.8 1/ 350 à 490 (140) 2/ 590 à 660 (70), en particulier 606,9 à 607,9 (1) XV NC 001147.5 550 à 680 (130), en particulier 610,5 à 612 (1,5) Tableau 1 : Position des régions d'intérêt sur les chromosomes de la souche S288c d. Analyse des traits génétiques impliqués dans le phénotype de résistance aux acides 5 organiques faibles : Au sein des QTL, ce sont plus spécifiquement les variations de fréquence des polymorphismes ponctuels (SNP pour « Single-Nucleotide Polymorphism »), en comparaison avec les souches ne présentant pas le trait phénotypique étudié, qui peuvent 10 s'avérer les plus pertinentes. Les régions repérées ci-dessus ont donc été analysées plus en détail et des mutations ont été identifiées dans ces régions. Les résultats sont présentés dans les 6 tableaux ci-dessous (numérotés 2 à 7) : 15 Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome I de la souche S288c ; NCBI NC_001133.8 ) souche de référence 70850 T C 71531 TAAAA T 73491 T C 73977 A T 74000 A G 74048 C T 3055635 23 74051 A G 74228 G A 75198 C T 76220 G A 76821 G T 77000 A G 77219 C T 77534 A G 78227 C T 78824 G A 79070 T C 79223 G A 79568 A G 79573 T C 79587 CT C 79669 G A 79698 G GT 79998 A G 80055 G A 80078 G A 80176 G A 80183 G A 80194 G A 80235 G A 80243 A G 80500 C T 80752 C T 85481 C T 88174 C A 88783 G A 88813 A G 89011 T C 89061 C T 89267 A C 89269 T C 89335 T C 89431 C T 89434 A G 89473 A G 89485 C G 89495 A G 89562 T C 89617 G C 3055635 24 89680 T A 89706 T C 89806 C T 89980 A G 90065 G T 91315 G C 93603 A G 93790 T A 94570 A G 94683 G A 94994 G A 98114 G A 98420 A T 99563 A T 99564 T C 99565 C CG 99855 G A 99871 A T 101599 T C 105774 G T 108493 C A 109946 G A 109985 G A 110187 A G 110729 A G 113133 A G 114320 T C 114358 C A 114881 A G 115183 T C 115591 G C 115628 C G 115801 T C 116188 C T 116207 G A 116299 A G 117847 T C 117941 C T 118998 G A 119208 G A 119345 G A 119351 A G 119395 C T 3055635 25 119405 G C 119461 G A 119600 C T 119660 T G 119952 T C Tableau 2: Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome I Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome IV de la souche S288c ; NCBI NC_001136.9) souche de référence 525266 C CT 525560 C T 525713 A T 525716 C T 525752 G A 525755 C T 525758 G A 525764 A G 525770 G C 525818 T C 525848 C T 525860 A G 525866 T C 525875 C T 525881 T C 525905 C A 525974 C T 525986 G A 526040 C T 526115 G A 526133 G A 526181 T C 526184 C T 526213 G A 526220 G A 526301 C A 526352 G A 526355 C T 526370 T C 526418 T C 3055635 26 526454 C T 526478 C T 526481 T G 526493 T C Tableau 3: Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome IV Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome V de la souche S288c ; NCBI NC_001137.2) souche de référence 458176 C G 458213 G A 458599 A T 458605 A G 458635 T C 458860 G A 458959 A G 459692 C T 459735 C T 460023 C G 460126 A G 460177 A G 460220 A G 460336 G GA 461859 C T 461866 T C 461872 C T 462221 G A 462244 A G 462256 A G 462363 T C 462432 A G 462441 G A 462442 C T 462609 A G 462666 G A 464187 A G 464286 T C 464731 C T 464951 T C 465013 G A 3055635 27 465038 A G 465639 A G 465738 G A 465927 A G 466818 G C 467307 G A 467940 C G 468173 A G 468189 T C 468264 C T 468302 G T 468640 T C 469073 A G 469145 T G 469419 T C Tableau 4: Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome V Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome VII de la souche de référence souche S288c ; NCBI NC 001139.8) 522071 G C 522174 C CTGTG 522236 G A 522414 T C 522681 T C 522696 C T 522767 G C 522896 C T 522952 T G 522991 T G 522992 T C 523009 T C 523081 G A 523088 T A 523091 G A 523093 A T 523108 C G 523374 G C 523396 A G 523523 GTT G 3055635 28 523621 T G 523668 C A 523736 A G 523744 CA C 523768 C T 523780 A G 523862 A G 523951 G A 524180 C T 524219 C T 524262 G A 524588 G A 524717 T C 525191 G A 526679 C CT 527394 T G 527400 T C 527443 C G 527472 A T 527677 C T 528011 G C 528678 C CG 529252 T C 529816 G A 530038 A C 530044 A C 530547 G A 530587 G A 530651 A G 531038 T C 531084 T C 531196 T A 531265 G T 531326 G A 531469 C G 531485 T G 531688 A T 531745 A C 531980 T C 532404 T C 532487 C T 532775 G A 532819 T C 3055635 29 533332 A G 533630 C T 533763 T C 533945 A T 534522 C T 534711 G A 534743 T C 534965 T C 534970 G A 534992 G A 535022 T A 535124 A G 535139 C T 535213 G A 535543 T C 535872 A T 536317 C A 541514 A T 541716 A G 541812 G A 542103 A C 542104 G A 542287 C T 542761 A G 543480 A T 543674 C A 544223 A G 544226 C T 544264 A T 544290 T G 544400 A G 544469 C T 544655 A C 544690 T A 544715 T TCCC 544849 C T 544855 C T 544868 C A 544913 G A 544942 G C 544956 T C 545037 G A 545103 C T 3055635 30 545179 G C 545195 T C 545230 G C 545240 A G 545323 T A 545586 C T 545860 C T 545958 C A 546205 TC T 546371 G A 546402 TAAA T 546450 G T 546510 C T 546638 T A 547212 C T 547493 A AGG 547849 A G 547966 T A 548029 C T 548110 A G 548213 A G 548265 G A 548927 T C 548957 A G Tableau 5: Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome VII Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome X de la souche S288c ; NCBI NC_001142.8) souche de référence 606956 A T 606971 G A 607039 T C 607166 A AT 607213 T TA 607222 C T 607224 C T 607254 T C 607290 G A 607353 C T 607379 C T 607383 G A 3055635 31 607434 T C 607450 G T 607500 G A 607515 G T 607628 G A 607664 T C 607713 C CA 607738 A G 607742 C T 607756 T C 607798 C T 607800 T C 607835 A G 607866 G GT Tableau 6: Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome X Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome XV de la souche de référence souche S288c ; NCBI NC 001147.5) 610550 G A 610555 C G 610661 G A 610865 A G 610883 A C 610892 A G 610940 T C 611030 T G 611066 T A 611164 C T 611204 G A 611431 T A 611435 A G 611460 C A 611573 A G 611600 T C 611618 T C 611687 A G 611689 A C 611713 A G 611715 C G 3055635 32 611753 A G 611843 A G 611905 A T 611955 C A Tableau 7: Liste des polymorphismes nucléotidiques observés au niveau du chromosome XV 5 REVENDICATIONS1. Procédé de sélection d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose comprenant la mise en évidence, au moins au niveau d'un allèle de la souche, de : une mutation dans le chromosome I au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau : Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome I de la souche S288c ; NCBI NC001133.8 ) souche de référence 70850 T C 71531 TAAAA T 73491 T C 73977 A T 74000 A G 74048 C T 74051 A G 74228 G A 75198 C T 76220 G A 76821 G T 77000 A G 77219 C T 77534 A G 78227 C T 78824 G A 79070 T C 79223 G A 79568 A G 79573 T C 79587 CT C 79669 G A 79698 G GT 79998 A G 80055 G A 80078 G A 80176 G A 80183 G A 80194 G A 80235 G A 3055635 34 80243 A G 80500 C T 80752 C T 85481 C T 88174 C A 88783 G A 88813 A G 89011 T C 89061 C T 89267 A C 89269 T C 89335 T C 89431 C T 89434 A G 89473 A G 89485 C G 89495 A G 89562 T C 89617 G C 89680 T A 89706 T C 89806 C T 89980 A G 90065 G T 91315 G C 93603 A G 93790 T A 94570 A G 94683 G A 94994 G A 98114 G A 98420 A T 99563 A T 99564 T C 99565 C CG 99855 G A 99871 A T 101599 T C 105774 G T 108493 C A 109946 G A 109985 G A 110187 A G 3055635 35 110729 A G 113133 A G 114320 T C 114358 C A 114881 A G 115183 T C 115591 G C 115628 C G 115801 T C 116188 C T 116207 G A 116299 A G 117847 T C 117941 C T 118998 G A 119208 G A 119345 G A 119351 A G 119395 C T 119405 G C 119461 G A 119600 C T 119660 T G 119952 T C et/ou une mutation dans le chromosome IV au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau : Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome IV de la souche S288c ; NCBI NC_001136.9) souche de référence 525266 C CT 525560 C T 525713 A T 525716 C T 525752 G A 525755 C T 525758 G A 525764 A G 525770 G C 525818 T C 3055635 36 525848 C T 525860 A G 525866 T C 525875 C T 525881 T C 525905 C A 525974 C T 525986 G A 526040 C T 526115 G A 526133 G A 526181 T C 526184 C T 526213 G A 526220 G A 526301 C A 526352 G A 526355 C T 526370 T C 526418 T C 526454 C T 526478 C T 526481 T G 526493 T C et/ou une mutation dans le chromosome V au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau : Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome V de la souche S288c ; NCBI NC_001137.2) souche de référence 458176 C G 458213 G A 458599 A T 458605 A G 458635 T C 458860 G A 458959 A G 459692 C T 459735 C T 460023 C G 3055635 37 460126 A G 460177 A G 460220 A G 460336 G GA 461859 C T 461866 T C 461872 C T 462221 G A 462244 A G 462256 A G 462363 T C 462432 A G 462441 G A 462442 C T 462609 A G 462666 G A 464187 A G 464286 T C 464731 C T 464951 T C 465013 G A 465038 A G 465639 A G 465738 G A 465927 A G 466818 G C 467307 G A 467940 C G 468173 A G 468189 T C 468264 C T 468302 G T 468640 T C 469073 A G 469145 T G 469419 T C et/ou une mutation dans le chromosome VII au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau : 3055635 38 Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome VII de la souche de référence souche S288c ; NCBI NC 001139.8) 522071 G C 522174 C CTGTG 522236 G A 522414 T C 522681 T C 522696 C T 522767 G C 522896 C T 522952 T G 522991 T G 522992 T C 523009 T C 523081 G A 523088 T A 523091 G A 523093 A T 523108 C G 523374 G C 523396 A G 523523 GTT G 523621 T G 523668 C A 523736 A G 523744 CA C 523768 C T 523780 A G 523862 A G 523951 G A 524180 C T 524219 C T 524262 G A 524588 G A 524717 T C 525191 G A 526679 C CT 527394 T G 527400 T C 527443 C G 3055635 39 527472 A T 527677 C T 528011 G C 528678 C CG 529252 T C 529816 G A 530038 A C 530044 A C 530547 G A 530587 G A 530651 A G 531038 T C 531084 T C 531196 T A 531265 G T 531326 G A 531469 C G 531485 T G 531688 A T 531745 A C 531980 T C 532404 T C 532487 C T 532775 G A 532819 T C 533332 A G 533630 C T 533763 T C 533945 A T 534522 C T 534711 G A 534743 T C 534965 T C 534970 G A 534992 G A 535022 T A 535124 A G 535139 C T 535213 G A 535543 T C 535872 A T 536317 C A 541514 A T 3055635 40 541716 A G 541812 G A 542103 A C 542104 G A 542287 C T 542761 A G 543480 A T 543674 C A 544223 A G 544226 C T 544264 A T 544290 T G 544400 A G 544469 C T 544655 A C 544690 T A 544715 T TCCC 544849 C T 544855 C T 544868 C A 544913 G A 544942 G C 544956 T C 545037 G A 545103 C T 545179 G C 545195 T C 545230 G C 545240 A G 545323 T A 545586 C T 545860 C T 545958 C A 546205 TC T 546371 G A 546402 TAAA T 546450 G T 546510 C T 546638 T A 547212 C T 547493 A AGG 547849 A G 547966 T A 3055635 41 548029 C T 548110 A G 548213 A G 548265 G A 548927 T C 548957 A G et/ou une mutation dans le chromosome X au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau : Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome X de la souche S288c ; NCBI NC_001142.8) souche de référence 606956 A T 606971 G A 607039 T C 607166 A AT 607213 T TA 607222 C T 607224 C T 607254 T C 607290 G A 607353 C T 607379 C T 607383 G A 607434 T C 607450 G T 607500 G A 607515 G T 607628 G A 607664 T C 607713 C CA 607738 A G 607742 C T 607756 T C 607798 C T 607800 T C 607835 A G 607866 G GT et/ou 3055635 42 - une mutation dans le chromosome XV au moins à l'une des positions listées dans le tableau suivant, avantageusement au moins l'une des mutations listées dans ce tableau : Position (en référence au Base(s) dans la Mutation(s) chromosome XV de la souche de référence souche S288c ; NCBI NC 001147.5) 610550 G A 610555 C G 610661 G A 610865 A G 610883 A C 610892 A G 610940 T C 611030 T G 611066 T A 611164 C T 611204 G A 611431 T A 611435 A G 611460 C A 611573 A G 611600 T C 611618 T C 611687 A G 611689 A C 611713 A G 611715 C G 611753 A G 611843 A G 611905 A T 611955 C A 2. Procédé d'obtention d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose comprenant l'introduction dans la souche d'une mutation au moins à l'une des positions telles que définies à la revendication 1, avantageusement l'introduction dans la souche d'au moins l'une des mutations telles que définies à la revendication 1. 3055635 43 3. Procédé d'obtention d'une souche de levure résistante à un acide organique, avantageusement l'acide acétique, lors de la fermentation du glucose comprenant les étapes suivantes : une étape de sporulation de deux souches parentales possédant des génomes différents ; une étape d'hybridation en masse des ségrégeants obtenus ; au moins une étape de sélection des ségrégeants en raison de la présence d'une mutation au moins à l'une des positions telles que définies à la revendication 1, avantageusement d'au moins l'une des mutations telles que définies à la revendication 1. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) préparer des ségrégeants issus d'une première souche parentale et des ségrégeants issus d'une deuxième souche parentale ; b) sélectionner parmi les ségrégeants issus de l'étape a) ceux présentant une mutation au moins à l'une des positions telles que définies à la revendication 1, avantageusement d'au moins l'une des mutations telles que définies à la revendication 1 ; c) hybrider les ségrégeants issus de la première souche parentale et sélectionnés à l'étape b) avec les ségrégeants issus de la deuxième souche parentale, éventuellement sélectionnés à l'étape b) ; d) sélectionner parmi les hybrides issus de l'étape c) ceux résistants à l'acide organique. 5. Procédé selon l'un des revendications 3 à 4, caractérisé en ce que la première souche est choisie pour sa capacité de résistance à l'acide organique et la seconde souche pour une autre caractéristique d'intérêt, par exemple sa capacité à métaboliser le xylose. 6. Procédé selon l'un des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la première souche est la souche EGAc 1 déposée à la CNCM sous le numéro I-4839 en date du 13 Mars 2014 et la seconde souche est la souche déposée à la CNCM sous le numéro I-4538 en date du 5 Octobre 2011. 7. Procédé selon l'un des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche de levure appartient au groupe des Saccharomyces, avantageusement Saccharomyces cerevisiae. 8. Procédé selon l'un des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que la capacité de résistance à l'acide organique est testée sur un milieu comprenant du glucose. 3055635 44 9. Procédé selon l'un des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche de levure sélectionnée ou obtenue présente une mutation à toutes les positions. 10. Procédé selon l'un des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche de levure sélectionnée ou obtenue présente toutes les mutations.