Brevet FR3056224A1 — publié le 20180323

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne des boites de Pétri pour une culture cellulaire in vitro, en particulier destinée à une fécondation in vitro. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Le nombre de naissances médicalement assistées n'a cessé d'augmenter depuis la naissance du premier « bébé éprouvette » en 1978, et concerne désormais près de 2,5% des naissances en France. La fécondation in vitro (FIV) consiste à mettre en présence in vitro un 10 ovocyte et des spermatozoïdes. Après une culture cellulaire, l'ceuf ainsi obtenu est replacé dans l'utérus : c'est le transfert embryonnaire. La fécondation in vitro peut également être réalisée avec injection cytoplasmique de sperme (ICSI) : cette technique consiste à injecter un spermatozoïde directement dans l'ovocyte. 15 Malgré le succès de la fécondation in vitro, de récentes études ont montré que les enfants nés selon cette technique présentent davantage de cas de malformations congénitales notamment liées à une perturbation de l'expression des gènes soumis à emprunte parentale (Beckwith Wiedemann par exemple) (4,24% vs. 2-3% dans le reste de la population), de maladies 20 cardiaques, de malformations du système urogénital (2,6% vs. 1,4% dans le reste de la population), d'angiomes, de troubles génétiques et de rétinoblastomes (0.03% vs. 0.006% dans le reste de la population) (M. Hansen et al. The New England Journal of Medecine 2002, 346, 10, 725730 et European Genetics Conference 2010 - Gothenburg, Sweden - June 25 12-15, 2010 - Abstract C06.1). Enfin, les enfants nés par fécondation in vitro sont généralement de plus petite taille et de plus faible poids à la naissance que ceux nés de conception naturelle. Les causes de ces risques sont encore à l'heure actuelle mal identifiées et les hypothèses émises mettent notamment en cause les 30 traitements médicamenteux pour provoquer l'ovulation ou maintenir la grossesse ou encore les procédures en elles-mêmes qui consistent en particulier à congeler puis décongeler les embryons. 3056224 2 Lors des FIV et des ICSI, les gamètes et les embryons humains sont conservés jusqu'à 5 jours dans des boites de Pétri en matière plastique, dont la toxicité sur les embryons et les gamètes n'a jamais été étudiée. De plus, les cultures embryonnaires et les gamètes sont conservés 5 dans les boites de Pétri dans des microgouttes sous huile. Des gouttes de milieu sont déposées dans le fond de la boite et sont recouvertes d'huile pour éviter leur évaporation et les échanges avec l'atmosphère afin d'éviter la désaturation des milieux et leur variation de pH en dehors des incubateurs. Pour éviter que les gouttes de milieu ne s'étalent dans le fond de la boite avant d'être recouvertes d'huile, celui-ci est enduit d'un revêtement qui garde la goutte en place et dont la toxicité pour les embryons et les gamètes est également méconnue. RESUME DE L'INVENTION Un objectif de l'invention est donc de proposer un système permettant de réaliser une culture cellulaire, qui réduise les risques de toxicité pour les embryons en comparaison avec les systèmes actuels et qui évite en particulier tout contact entre les cultures embryonnaires et les gamètes avec d'éventuelles substances toxiques ou des perturbateurs endocriniens. Pour cela, l'invention propose une boîte de Pétri pour une culture cellulaire in vitro, ladite boîte de Pétri étant réalisée dans un matériau inerte et comportant une plaque de fond, et au moins un logement formé dans la plaque de fond et configuré pour recevoir des cellules en culture. Certaines caractéristiques préférées mais non limitatives de la boîte de Petri décrite ci-dessus sont les suivantes : - le logement présente une forme concave - le logement présente une forme hémisphérique - le logement présente un volume interne compris entre 1µL et 40 de préférence entre 20 kit et 30 }IL 3056224 3 - la plaque de fond présente une épaisseur, au niveau du logement, inférieure ou égale à 1.2 mm, de préférence inférieure ou égale à 1.0 mm - la boîte de Pétri comprend en outre une paroi latérale fixée sur la plaque de fond et un couvercle configuré pour venir en appui sur la paroi 5 latérale, la paroi latérale, la plaque de fond et le couvercle définissant ensemble une chambre interne de la boîte de Pétri, - la boîte de Pétri comprend en outre au moins une butée formée sur l'un parmi le couvercle et la paroi latérale de sorte que lorsque le couvercle vient en appui sur la paroi latérale, un jeu subsiste entre ledit couvercle et 10 ladite paroi latérale de manière à permettre une circulation de fluide entre un milieu externe à la boîte de Pétri et la chambre interne, - la boîte de Pétri comprend au moins une butée discrète, de préférence au moins deux butées discrètes, par exemple entre trois et quatre butées discrètes, fixées sur le couvercle de sorte que, lorsque le couvercle est placé 15 sur la paroi latérale, lesdites butées discrètes viennent en appui contre ladite paroi latérale, - la paroi latérale et le couvercle présentent chacun une largeur maximale, la largeur maximale du couvercle étant plus grande que la largeur maximale de la paroi latérale, 20 - le matériau inerte comprend l'un au moins des matériaux suivants : verre borosilicate, verre sodocalcique, verre de quartz, verre d'aluminosilicate, polycarbonate, polyméthacrylate de méthyle. Avantageusement, les boites pour culture cellulaire selon la présente invention sont conçues en un matériau inerte et/ou ne nécessitent pas de 25 revêtement particulier, permettant ainsi de s'affranchir des problèmes de toxicité potentielle pour les embryons et les gamètes. Avantageusement, les boites pour la culture cellulaire selon la présente invention sont également translucides et n'induisent pas de déformations de l'image des objets observés au microscope ou la loupe au 30 travers desdites boites. Avantageusement, les boites pour culture cellulaire selon la présente invention sont réutilisables après nettoyage et stérilisation. 3056224 4 BREVE DESCRIPTION DES DESSINS D'autres caractéristiques, buts et avantages de la présente invention apparaîtront mieux à la lecture de la description détaillée qui va suivre, et au 5 regard des dessins annexés donnés à titre d'exemples non limitatifs et sur lesquels : La figure 1 est une vue éclatée de profil d'un exemple de réalisation d'une boîte de Pétri conforme à un mode de réalisation de l'invention, La figure 2 est une vue du dessus de la boîte de Pétri de la figure 1. 10 DESCRIPTION DETAILLEE D'UN MODE DE REALISATION L'invention propose de réaliser une culture cellulaire dans un environnement inerte afin de préserver les cellules des milieux ou composés susceptibles de les contaminer. Plus précisément, l'invention propose une 15 boîte de Pétri 1 réalisée dans un matériau inerte et comportant : - une plaque de fond 2, et - au moins un logement 3 formé dans la plaque de fond 2 et configuré pour recevoir des cellules en culture. Par matériau inerte, on comprendra ici un matériau ne diffusant 20 aucune substance et n'interagissant avec aucune substance ni aucune molécule. La boîte de Pétri 1 ne comprend donc pas non plus de revêtement hydrophobe, puisque la fonction de ce revêtement est remplie par le ou les logements 3 formés dans la plaque de fond 2. Le matériau inerte est donc ici dépourvu de perturbateur endocrinien, et notamment de paraben, de 25 bisphenol A ou de phtalates. Le matériau inerte peut notamment comprendre l'un au moins des matériaux suivants : les verres minéraux tel que le verre borosilicate, le verre sodocalcique, le verre de quartz, le verre d'aluminosilicate ou des verres organiques tel que le polycarbonate ou le polyméthacrylate de méthyle. De 30 préférence, le matériau inerte est transparent, afin de permettre une visualisation des cellules à travers la plaque de fond 2. Par ailleurs, en vue de permettre sa réutilisation, le matériau inerte est de préférence stérilisable 3056224 5 suivant les méthodes de stérilisation conventionnelles (stérilisation par rayonnement gamma ou par la chaleur). Cette boîte de Pétri 1 pourra aussi bien être celle mise en oeuvre pour 5 réaliser une FIV à proprement parler que pour recueillir ou laver des cumulus ou faire des micro-injections. Dans une forme de réalisation, la boîte de Pétri 1 est une enceinte fermée. Elle comporte donc en outre au moins une paroi latérale 4 fixée sur 10 la plaque de fond 2 et un couvercle 5 configuré pour venir en appui sur la paroi latérale 4. La plaque de fond 2, la paroi latérale 4 et le couvercle 5 délimitent donc ensemble une chambre interne de la boîte de Pétri 1, dans laquelle s'étendent le ou les logements 3 pour les cellules en culture. 15 La boîte de Pétri 1 peut par exemple présenter une forme sensiblement circulaire. La plaque de fond 2 et le couvercle 5 présentent donc la forme d'un disque tandis que la plaque latérale est de forme sensiblement cylindrique de révolution. En variante, la boîte de Pétri 1 peut présenter toute autre forme, 20 typiquement une forme parallélépipédique, et plus précisément une forme carrée ou rectangulaire. La boîte de Pétri 1 peut alors comprendre quatre parois latérales, la plaque de fond 2 et le couvercle 5 présentant une forme parallélépipédique. On notera que la boîte de Pétri 1 peut être réalisée dans un unique 25 matériau inerte, ou en variante comprendre des parties (couvercle 5, paroi latérale 4, plaque de fond 2) réalisées dans des matériaux inertes distincts. Dans une forme de réalisation, plusieurs logements 3 sont formés dans la plaque de fond 2 afin de permettre à la boîte de Pétri 1 de recevoir 30 plusieurs cellules en culture en parallèle. Les logements 3 peuvent être identiques en forme et en volume, ou en variante être distincts les uns des autres. 3056224 6 Un logement 3 peut notamment présenter une forme concave, par exemple une forme sensiblement hémisphérique. Une telle forme permet ainsi de localiser facilement les cellules dans le logement 3 lors de leur examen. Ceci n'est cependant pas limitatif, d'autres formes de logement 3 5 pouvant être réalisées tant qu'elles permettent d'isoler les cellules cultivées et d'assurer leur visualisation par un opérateur. Ainsi, le logement 3 peut par exemple présenter un fond sensiblement plan et être délimité par une paroi cylindrique de révolution ou conique. Chaque logement 3 peut présenter un volume interne compris entre 1 10 FIL et 40 F.t.L, de préférence entre 204_ et 30 !IL. Les logements 3 peuvent être creusés dans la plaque de fond 2, ou en variante être obtenu par moulage lors de la réalisation de la plaque de fond 2. 15 La plaque de fond 2 présente une épaisseur e au niveau du logement 3 inférieure ou égale à la distance focale du microscope utilisé pour observer les cellules placées dans le logement 3. Par épaisseur e on comprendra ici la dimension sensiblement perpendiculaire à la surface de la plaque dans laquelle sont formés le ou les logements 3. De manière générale, la plaque 20 peut ainsi présenter une épaisseur e, au niveau du logement 3, inférieure ou égale à 1.2 mm, de préférence inférieure ou égale à 1.0 mm. Une telle épaisseur e permet ainsi d'utiliser une majorité des microscopes actuels employés pour l'observation de cellules en culture, tout en étant suffisamment fine pour garantir une bonne visualisation des cellules à travers la plaque de 25 fond 2. Afin de permettre à des gaz, et notamment à de l'oxygène et à l'azote, d'entrer dans la boîte de Pétri 1 et d'atteindre les cellules, un jeu peut être ménagé entre le couvercle 5 et la paroi latérale 4 lorsque la boîte de Pétri 1 30 est fermée. Le jeu peut être obtenu notamment en fixant une butée 6 discrète sur la paroi latérale 4 (respectivement sur le couvercle 5) et configurée pour recevoir le couvercle 5 (respectivement la paroi latérale 4) lorsque la boîte de 3056224 7 Pétri 1 est fermée. En variante, le couvercle 5 et/ou la paroi latérale 4 peuvent comprendre un orifice traversant, le cas échéant fermé par un diaphragme, afin de permettre une circulation des gaz entre la chambre interne de la boîte de Pétri 1 et l'environnement externe. 5 A cet effet, dans l'exemple de réalisation illustré sur les figures, le couvercle 5 comprend un fond 5a et une bordure périphérique 5b qui s'étend depuis le fond 5a de manière à former une cuvette de sorte que, lorsque le couvercle 5 est positionné sur la paroi latérale 4 pour fermer la boîte 1, le fond 5a du couvercle 5 s'étend en regard de la tranche supérieure de la paroi 10 latérale 4 tandis que sa bordure périphérique 5b s'étend en dehors de la chambre interne de la boîte 1, sur une partie de la hauteur de la paroi latérale 4. Une butée 6 discrète - c'est-à-dire ne s'étendant pas sur tout le tour du couvercle 5 - est fixée sur une face interne 5c de la bordure périphérique 5b. Lorsque la boîte de Pétri 1 est fermée, le couvercle 5 repose donc sur la 15 tranche supérieure 4a de la paroi latérale 4 par l'intermédiaire de la butée 6. Un jeu est ainsi formé entre le couvercle 5 et la paroi latérale 4, de part et d'autre de la butée 6. Dans une variante de réalisation, la boîte de Pétri 1 comprend plusieurs butées 6 discrètes, par exemple quatre butées 6 qui s'étendent 20 deux à deux en regard, de manière à former un appui stable pour le couvercle 5. Un espace entre deux butées 6 discrètes adjacentes permet ainsi à des gaz de circuler vers la chambre interne et d'en sortir. En variante, la ou les butées 6 discrètes peuvent être fixées sur la paroi latérale 4, typiquement sur sa face externe 4b, et être configurées pour 25 recevoir la tranche inférieure 5d de la bordure périphérique 5b du couvercle 5. Dans tous les cas le nombre de butées doit assurer la stabilité du couvercle en position horizontale. On comprendra que, le couvercle 5 est alors plus grand que la paroi 30 latérale 4. Par exemple, dans le cas d'une boîte de Pétri 1 circulaire, le diamètre interne du couvercle 5 est plus grand que le diamètre externe de la paroi latérale 4. A titre indicatif, le couvercle peut par exemple présenter un 3056224 8 diamètre interne égal à 6.2 cm tandis que la paroi latérale peut présenter un diamètre externe égal à 6.0 cm. Plus généralement, la largeur maximale du couvercle 5 est plus grande que la largeur maximale de la paroi latérale 4, sachant que par « largeur » on comprend ici la distance entre deux droites 5 parallèles (ou « lignes d'appui) qui sont tangentes à la courbe fermée formée par la périphérique 5b du couvercle 5 (ou de la paroi interne) en deux points distincts. La hauteur de la paroi latérale 4 peut notamment être comprise entre 0.5 cm et plusieurs centimètres, par exemple de l'ordre d'1 cm. En variante, 10 les boîtes peuvent être beaucoup plus petites pour s'adapter à des incubateurs spéciaux. L'utilisation d'une boîte de Pétri 1 conforme à l'invention va à présent être décrite dans le cas d'une boîte de Pétri 1 circulaire en verre comprenant 15 plusieurs logements 3 et un couvercle 5 comportant des butées 6 discrètes configurées pour venir en appui sur la tranche supérieure 4a de la paroi latérale 4. Ceci n'est cependant pas limitatif, la forme de la boîte 1, la présence de butées 6 et le matériau inerte choisi pouvant être différents. 20 Au cours d'une première étape, des cellules sont ensemencées dans les logements 3. Pour cela, un ovocyte et au moins un spermatozoïde (de préférence plusieurs) peuvent être placés dans chaque logement 3. 25 Au cours d'une deuxième étape, la boîte de Pétri 1 est fermée en posant le couvercle 5 sur la paroi latérale 4, de manière à ménager un jeu entre la paroi latérale 4 et le couvercle permettant la circulation de l'air. Ici, le couvercle 5 est par exemple posé sur la tranche supérieure 4a de la paroi latérale 4 par l'intermédiaire de quatre butées discrètes 6. 30 Au cours d'une troisième étape, les cellules sont mises en culture dans des conditions physiques qui permettent leur multiplication. Les conditions 3056224 9 physiques peuvent notamment comprendre l'ajout d'un milieu de culture, la mise dans un incubateur à une température d'environ 37 °C, éventuellement dans un air enrichi en CO2.. Pour cela, la boîte de Pétri peut par exemple être placée dans un 5 incubateur. Dans le cas de cellules comprenant un ovocyte et des spermatozoïdes, l'étape de multiplication permet d'obtenir un embryon de mammifère, de préférence un embryon de mammifères humains. La culture des cellules doit pouvoir avoir lieu pendant au moins cinq jours, de préférence 10 au moins six jours. Lors de cette troisième étape, un opérateur peut alors surveiller l'évolution des cellules dans la boîte de Pétri sans avoir besoin de l'ouvrir, par exemple en plaçant un microscope 7 sous la plaque de fond 2. REVENDICATIONS1. Boîte de Pétri pour une culture cellulaire in vitro, ladite boîte de Pétri comportant : - une plaque de fond, et - au moins un logement formé dans la plaque de fond et configuré pour recevoir des cellules en culture, la boîte de Pétri étant réalisée dans un matériau inerte. 2. Boîte de Pétri selon la revendication 1, dans laquelle le logement présente une forme concave. 3. Boîte de Pétri selon la revendication 2, dans laquelle le logement 15 présente une forme hémisphérique. 4. Boîte de Pétri selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle le logement présente un volume interne compris entre 1 pt et 40 pLL, de préférence entre 20 III_ et 30 1.11_. 20 5. Boîte de Pétri selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle la plaque de fond présente une épaisseur, au niveau du logement, inférieure ou égale à 1.2 mm, de préférence inférieure ou égale à 1.0 mm. 25 6. Boîte de Pétri selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant en outre une paroi latérale fixée sur la plaque de fond et un couvercle configuré pour venir en appui sur la paroi latérale, la paroi latérale, la plaque de fond et le couvercle définissant ensemble une chambre interne de la boîte de Pétri. 30 7. Boîte de Pétri selon la revendication 6, comprenant en outre au moins une butée formée sur l'un parmi le couvercle et la paroi latérale de sorte que lorsque le couvercle vient en appui sur la paroi latérale, un jeu 3056224 11 subsiste entre ledit couvercle et ladite paroi latérale de manière à permettre une circulation de fluide entre un milieu externe à la boîte de Pétri et la chambre interne. 5 8. Boîte de Pétri selon la revendication 7, comprenant au moins une butée discrète, de préférence au moins deux butées discrètes, par exemple entre trois et quatre butées discrètes, fixées sur le couvercle de sorte que, lorsque le couvercle est placé sur la paroi latérale, lesdites butées discrètes viennent en appui contre ladite paroi latérale. 10 9. Boîte de Pétri selon l'une des revendications 6 à 8, dans laquelle la paroi latérale et le couvercle présentent chacun une largeur maximale, la largeur maximale du couvercle étant plus grande que la largeur maximale de la paroi latérale. 10. Boîte de Pétri selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle le matériau inerte comprend l'un au moins des matériaux suivants : verre borosilicate, verre sodocalcique, verre de quartz, verre d'aluminosilicate, polycarbonate, polyméthacrylate de méthyle. 20