Brevet FR3058835A1 — publié le 20180518

La présente invention se rapporte au domaine des biocapteurs qui fournissent une réponse électrochimique détectable après oxydation directe d'un métabolite rédox à la surface d'une électrode. L'invention fournit une nouvelle bioélectrode pour la détection et la mesure en continu de métabolites à l'interface de cellules ou de tissus humains ou animaux, sans endommager leur intégrité, ni leur fonctionnement. L'invention concerne également une méthode de fabrication d'une telle bioélectrode par dépôt de couches successives, aussi appelée méthode « bio-stack ». Un dispositif de détection et/ou de mesure de métabolites comprenant une bioélectrode selon l'invention fait également partie de l'invention. ETAT DE L'ART ANTÉRIEUR ET BUT DE L'INVENTION Les techniques de bio-fonctionnalisation consistent à immobiliser un élément de bio-reconnaissance sur la surface active d'un capteur pour permettre la détection de molécules cibles via l'apparition d'un signal de transduction. Ces techniques permettent de fonctionnaliser la surface de dispositifs médicaux avec des biomolécules pour en améliorer la biocompatibilité et faciliter l'intégration dans des systèmes vivants pour des applications in vitro et in vivo. Une technique de bio-fonctionnalisation est décrite dans la publication de X. Strakosas et al., Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545. D'autres stratégies de bio-fonctionnalisation sont résumées dans l'article de X. Strakosas et al., Journal of Materials Chemistry B, 2016, 4, 4952-4968. Le transfert direct d'électrons entre une enzyme et la surface d'une électrode est d'un grand intérêt puisqu'il permet d'effectuer des mesures électrochimiques sans addition d'un médiateur à la solution d'analyte. Toutefois, l'électrochimie des protéines s'avère difficile du fait de la faible vitesse de transport (masse trop élevée) et la forte adsorption des protéines à la surface de l'électrode. Bien qu'il existe des exemples de réponse électrochimique détectable basée sur l'oxydation directe d'une protéine rédox à la surface d'une électrode, la détection reste difficile. Il a également été suggéré que le transfert direct d'électrons puisse être facilité sur des surfaces d'électrodes présentant un environnement similaire à celui de la protéine d'on/do-réduction à détecter, mais cette pratique a jusqu'à présent eu un succès limité du fait de la dénaturation des protéines. 3058835 2 US 5,225,064 décrit des biocapteurs utilisant la glucose oxydase (G0x) comme enzyme de détection pour détecter le glucose. Ces biocapteurs comprennent une couche de peroxydase de raitfort (HRP) déposée directement sur la surface conductrice, puis une couche de glucose oxydase (G0x). Ces électrodes permettent un 5 transfert direct des électrons entre la solution d'analyte et la surface de l'électrode, mais les taux de transfert s'avèrent trop faibles pour permettre une détection électrochimique efficace. L'efficacité de transduction ion-électron (conductivité mixte électronique/ionique) des biocapteurs a été améliorées grâce à l'utilisation de 10 polymères conducteurs. D. Mackey et al. ont par exemple décrit la biofonctionnalisation d'électrodes par adsorption électrostatique d'enzymes à leur surface, les bio-électrodes étant tout d'abord revêtues d'un polymère conducteur PANI/PVS, puis d'une couche de glucose oxydase (G0x), et d'une couche de peroxydase de raitfort (HRP) utile pour convertir le peroxyde d'hydrogène libéré lors de l'oxydation du 15 glucose en gluconate (D. Mackey et al., Dublin Institute of Technology, 2007, Optimising the ratio of horseradish peroxidase and glucose oxidase on a bienzyme electrode: comparison of a theoretical and experimental approach). La biofonctionnalisation par adsorption électrostatique présente l'inconvénient de ne pas être stable, notamment à concentrations élevées. Elle peut aussi modifier la conformation, 20 et donc l'activité, des protéines. De manière surprenante, les Inventeurs ont réussi à améliorer cette technique en intégrant dans le biocapteur des couches de polypeptides intermédiaires porteurs de charges ioniques opposées à celles des enzymes oxydoréductase et peroxydase. Ils ont observé que ces couches de polypeptides intermédiaires permettaient d'éviter les 25 interférences entre les enzymes. L'espacement entre les enzymes créé par les couches de polypeptides chargées évite que l'activité d'une enzyme ne soit altérée par le fonctionnement d'une autre enzyme. Ceci a pour effet direct une amélioration de la détection et de la mesure des métabolites. Les Inventeurs ont également observé que le dépôt de polypeptides intermédiaires rendait le biocapteur fonctionnel dans des 30 gammes de concentrations beaucoup plus larges que celles des biocapteurs existants, et permettait d'élargir leurs domaines d'application. 3058835 3 DESCRIPTION DE L'INVENTION Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet une bioélectrode comprenant : (a) un substrat conducteur comprenant des nanoparticules de platine, 5 (b) une couche d'au moins un composé organosilane déposée sur le substrat (a), (c) une couche d'un premier polypeptide porteur de charges ioniques, déposée sur la couche (b), (d) une couche d'enzyme oxydoréductase ayant des charges ioniques opposées 10 à celles du premier polypeptide, déposée sur la couche (c), (e) une couche d'un deuxième polypeptide ayant des charges ioniques opposées à celles de l'enzyme oxydoréductase, déposée sur la couche (d), et (f) une couche d'enzyme peroxydase ayant des charges ioniques opposées à celles du deuxième polypeptide, déposée sur la couche (e). 15 La présence simultanée d'enzymes oxydoréductase et peroxydase sur le biocapteur de l'invention permet la détection électrochimique des métabolites qui entrent en contact avec l'électrode, et l'élimination du peroxyde d'hydrogène formé en excès dans le milieu. Il est essentiel de supprimer le peroxyde d'hydrogène en excès formé dans le milieu, lors des expériences in vitro et in vivo, le peroxyde d'hydrogène 20 s'avérant extrêmement toxique pour les cellules environnantes. Les différentes couches (a), (b), (c), (d), (e) et (f) constituants la bioélectrode de l'invention sont liées les unes aux autres par des liaisons covalentes. Le substrat conducteur (a) comprend avantageusement un polymère conducteur, de préférence ayant une conductivité mixte ionique/électronique. Le 25 paramètre qui décrit cette relation est la transconductance, définie par gm = AId/AVg, où gm est la transconductance, AId est le changement de courant de drain, et AVg est le changement de potentiel au niveau de la grille (D. Khodagholy et al., Nature communications 4: 2133 (2013), DOI : 10.1038/ncomms3133). Avantageusement, le polymère conducteur de l'invention comprend des groupes sulfonés -S03H. Les 30 polymères conducteurs préférés sont le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - poly(styrènesulfonate) (PEDOT : PSS) et le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - tosylate (PEDOT : TOS). Le PEDOT : PSS présente l'avantage d'être biocompatible, utilisable en 3058835 4 solution, et d'être un bon conducteur ionique (interface améliorée pour les applications biologiques), ce qui le rend particulièrement avantageux. Selon un mode de réalisation préféré, le substrat conducteur (a) comprend un polymère conducteur et des groupes hydroxy -OH pendants. Les groupes hydroxy -OH 5 peuvent être générés : - soit en appliquant sur le substrat conducteur (a) un mélange de polymère conducteur et d'alcool tel que l'alcool polyvinylique, et de préférence un mélange de PEDOT : PSS et d'alcool polyvinylique comme décrit dans l'article de X. Strakosas et al., Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545, 10 - soit en traitant en surface, par exemple avec un plasma oxygène, le substrat conducteur (a) comprenant un polymère conducteur pour générer des groupes hydroxy -OH (R-X. He et al., Journal of Materials Chemistry, 2012, 22, 2207222076). Les groupes hydroxy -OH à la surface du substrat conducteur (a) permettent la 15 silanisation, et donc la fixation du composé organosilane de la couche (b) sur le substrat conducteur (a). Les nanoparticules de platine présentes dans le polymère conducteur ont pour effet d'améliorer les performances électro-catalytiques de l'électrode en catalysant la réaction entre le peroxyde d'hydrogène et l'enzyme peroxydase (S.B. Hall et al., 20 Electrochimica Acta, 43(5), pp. 579-588; J.J. Lingane, Journal of Electroanalytical Chemistry (1959), 2(4), pp. 296-309). La présence de nanoparticules de platine au sein du polymère conducteur permet d'améliorer le transfert d'électrons entre les couches supérieures et le substrat conducteur (a). Les Inventeurs ont en particulier observé que la topographie des nanoparticules de platine permettait de promouvoir le transport 25 des électrons au sein de la bioélectrode. Le composé organosilane utilisé pour former la couche (b) réagit avec les groupes fonctionnels du premier polypeptide porteur de charges ioniques déposé sur la couche (b). Avantageusement, le composé organosilane utilisé pour former la couche (b) répond à la formule R-Y-Si(X)3, dans laquelle : 30 - R est un groupe organique réactif, de préférence choisi parmi les groupes vinylique, (méth)acrylate, époxy, isocyanate, amino, - Y est un groupe alkyle ou aryle, et 3058835 5 - X est un groupe hydrolysable qui, une fois hydrolysé, se lie de manière covalente au substrat conducteur (a), X étant de préférence un atome d'halogène ou un groupe de formule OR' dans lequel R' est un groupe alkyle. Au sens de la présente invention, on entend par : 5 - Alkyle : un groupe aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, en C1-C20, de préférence en C1-C12, plus préférentiellement en C1-C6, et encore plus préférentiellement en C1-C4. Le terme « ramifié » signifie qu'au moins un groupe alkyle inférieur tel qu'un méthyle ou un éthyle est porté par une chaîne alkyle linéaire. A titre de groupe alkyle, on peut mentionner par exemple les groupes méthyle, éthyle, n- 10 propyle, i-propyle, n-butyle, t-butyle et n-pentyle. - Aryle : tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'au moins un cycle aromatique ; un cycle aromatique correspond à tout groupe mono- ou polycyclique plan comportant un système 7C délocalisé dans lequel chaque atome du cycle comporte une orbitale p, lesdites orbitales p se recouvrant les unes les autres ; parmi de tels 15 groupes aryle, on peut mentionner les groupes phényle, biphényle, naphthalène et anthracène. Les groupes aryles de l'invention comprennent de préférence de 4 à 12 atomes de carbone, et de manière encore plus préférée de 5 ou 6 atomes de carbone. De manière encore plus préférée, le groupe aryle de l'invention est un groupe phényle. Selon un mode de réalisation préféré, le composé organosilane utilisé pour 20 former la couche (b) est choisi parmi le 3-glycidyloxypropyltriéthoxysilane, le 3- glycidyloxypropyltriméthoxysilane, le 3-méthacryloxypropyltriméthoxysilane, l'aminoéthylaminopropyltriméthoxysilane, le vinyltriéthoxysilane, le tétraméthoxysilane, le tétraéthoxysilane, le méthyltriméthoxysilane, ou leur mélange. Au sens de l'invention, on entend par polypeptide une chaîne d'acides aminés 25 reliés entre eux par des liaisons peptidiques. Ledit polypeptide comprend de préférence entre 100 et 1500 acides aminés. Le premier polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (c) est de préférence un polypeptide chargé positivement. Il a de préférence une masse moléculaire allant de 50.103 à 150.103 g.mori. Avantageusement, il est choisi parmi la 30 poly-L-lysine, la poly-D-lysine, la poly-L-arginine ou la poly-D-arginine. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit de la poly-L-lysine. Le polypeptide porteur de 3058835 6 charges ioniques de la couche (c) permet d'ajuster l'espacement entre la couche d'enzyme oxydoréductase (d) et le substrat conducteur (a). L'enzyme oxydoréductase de la couche (d) est de préférence une enzyme oxydase, enzyme spécifique du métabolite d'intérêt. Au sens de l'invention, on entend 5 par métabolites les molécules biologiques produites par des organismes biologiques pendant le métabolisme. Les métabolites d'intérêt sont généralement des protéines. L'enzyme oxydoréductase de la couche (d) est de préférence une enzyme oxydoréductase de classe EC 1 (nomenclature IUBMB), et encore plus préférentiellement une enzyme oxydase choisie parmi les enzymes glucose oxydase 10 (G0x), cholestérol oxydase, xanthine oxydase (XO), amino-acide oxydase (AAO), lactate oxydase (L0x), glycolate oxydase, pyridoxa1-4-oxydase, sorbose oxydase, gluconolactone oxydase ou galactose oxydase. Les enzymes glucose oxydase (G0x) et lactate oxydase (L0x) sont les enzymes les plus préférées. Avantageusement, la concentration en enzyme oxydoréductase de la couche (d) 15 dépend de la nature de l'enzyme oxydoréductase utilisée, et varie de préférence de 0,2 à 10 gr. Le deuxième polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (e) peut être le même ou différent du premier polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (c). Il a de préférence une masse moléculaire allant de 50.103 à 150.103 g.mol- 20 1. Le deuxième polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (e) est de préférence choisi parmi la poly-L-lysine, la poly-D-lysine, la poly-L-arginine ou la polyD-arginine. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit de la poly-L-lysine. L'enzyme peroxydase de la couche (f) transforme le peroxyde d'hydrogène en un produit non toxique. L'enzyme peroxydase de la couche (f) est de préférence la 25 peroxydase de raitfort (HRP) ou la catalase, et encore plus préférentiellement la peroxydase de raitfort (HRP). L'invention vise également un procédé de fabrication d'une bioélectrode selon l'invention comprenant les étapes suivantes : (i) dépôt d'une couche d'au moins un composé organosilane (b) sur un 30 substrat conducteur (a), (ii) dépôt d'une couche d'un premier polypeptide porteur de charges ioniques (c) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (i), 3058835 7 (iii) dépôt d'une couche d'enzyme oxydoréductase (d) ayant des charges ioniques opposées à celles du premier polypeptide sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (ii), (iv) dépôt d'une couche d'un deuxième polypeptide porteur de charges ioniques 5 (e) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iii), (v) dépôt d'une couche d'enzyme peroxydase (f) ayant des charges ioniques opposées à celle du deuxième polypeptide sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iv). Le substrat conducteur (a) mis en oeuvre lors de l'étape (i) est préparé au 10 préalable par dépôt d'un polymère conducteur sur un substrat tel qu'un substrat en verre, en silicium, en oxyde métallique, ou un substrat polynnérique comme par exemple un substrat en résine SU-8, et de préférence sur un substrat en verre. Le polymère conducteur est tel que défini ci-dessus, il est avantageusement choisi parmi le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - poly(styrènesulfonate) (PEDOT : PSS) et le 15 poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - tosylate (PEDOT : TOS). Le polymère conducteur est par ailleurs avantageusement utilisé en mélange avec un alcool tel que l'alcool polyvinylique, l'incorporation de l'alcool au sein du polymère conducteur pouvant être réalisée comme décrit dans la publication de X. Strakosas et al, Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545. 20 Les nanoparticules de platine peuvent être ajoutées au polymère conducteur par électrodéposition. L'étape (i) de dépôt peut être réalisée par application d'un composé organosilane de formule R-Y-Si(X)3 tel que décrit ci-dessus sur le substrat conducteur (a), ce dépôt étant de préférence réalisée par dépôt chimique en phase vapeur (CVD). 25 L'étape (i) de dépôt est avantageusement réalisée à une température allant de 50 à 150°C, et de préférence de 80 à 120°C. Avantageusement cette étape de dépôt est réalisée pendant une durée de 15 minutes à 2 heures, et de préférence pendant une durée de 30 à 90 minutes. Durant l'étape (ii) de dépôt, le composé organosilane de la couche (b) réagit 30 avec la fonction amine du premier polypeptide porteur de charges ioniques. Avantageusement, le dépôt du premier polypeptide porteur de charges ioniques sur la couche (b) comprenant le composé organosilane peut être réalisé par synthèse 3058835 8 chimique en solution, électropolymérisation ou polymérisation en phase vapeur. Ce dépôt peut être réalisé pendant une durée allant de 30 minutes à 5 heures, et de préférence pendant une durée allant de 1 à 3 heures. Avantageusement, le dépôt du premier polypeptide sur le composé organosilane est réalisé à une température allant 5 de 15 à 27°C. L'étape (iii) de liaison de l'enzyme oxydoréductase (d) sur le premier polypeptide porteur de charges ioniques (c) est réalisée par ajout d'un activateur d'acides carboxyliques tel que le N-hydroxysuccinimide (NHS) ou le Nhydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) en mélange avec le 1-éthy1-3-(3- 10 diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Acadennic Press, San Diego, 1996). L'enzyme oxydoréductase (d) est laissée à réagir sur le premier polypeptide (c) pendant une durée pouvant aller de 1 à 3 heures. L'étape (iv) de dépôt de la couche de deuxième polypeptide (e) sur la couche d'enzyme oxydoréductase (d) est réalisée en déposant une solution comprenant le 15 deuxième polypeptide (e) sur la couche d'enzyme oxydoréductase (d) et en laissant l'enzyme oxydoréductase réagir sur le deuxième polypeptide pendant une durée allant de 30 minutes à 5 heures, et de préférence pendant une durée allant de 1 à 3 heures. L'étape (iv) de dépôt de l'enzyme peroxydase (f) sur le deuxième polypeptide porteur de charges ioniques (c) est réalisée de la même façon qu'à l'étape (iii) par 20 ajout d'un activateur d'acides carboxyliques tel que le N-hydroxysuccinimide (NHS) ou le N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) en mélange avec le 1-éthy1-3-(3- diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC). L'enzyme peroxydase (f) est laissée à réagir sur le premier polypeptide (c) pendant une durée pouvant aller de 1 à 3 heures. La bioélectrode obtenue selon le procédé de l'invention est ensuite de 25 préférence stockée dans des conditions stériles, par exemple dans un tampon phosphate salin (PBS), à une température allant de 0 et 10°C, et de préférence de 2 à 60°C. Un autre objet de l'invention vise un dispositif de détection et de mesure de métabolites capable de reconnaître des métabolites tels que le glucose, le lactate, le 30 cholestérol, et plus particulièrement le glucose et le lactate, ledit dispositif comprenant au moins une bioélectrode selon l'invention. Ce dispositif peut être utilisé pour détecter la présence de métabolites, ou mesurer in situ l'activité métabolique de cellules 3058835 9 vivantes sans les endommager. Le dispositif de détection et de mesure de l'invention peut être utilisé : pour des applications cliniques, i.e. mesures en électroencéphalographie (EEG) ou en électrocardiographie (ECG), par exemple pour comprendre les pathoogies 5 d'hyper utilisation de nutriments avec risque de crise d'épilepsie, - pour des mesures in vitro, i.e. intégrité de barrière cellulaire, monitoring de métabolites pour des suivis toxicologiques, de diagnostic, - pour des mesures in vivo, i.e. mesures en électrocorticographie (ECoG), monitoring de métabolites pour des suivis toxicologiques, de diagnostic, et 10 - pour des mesures in toto (stimulation électrique d'un réseau neuronal). Le dispositif de détection et de mesure de l'invention est avantageusement un transistor organique à couche mince (OTFT), et plus particulièrement un transistor électrochimique organique (OECT) ou un transistor organique à effet de champ commandé par un électrolyte (EGOFET). De manière préférée, le dispositif de détection 15 et de mesure de l'invention est un transistor électrochimique organique (OECT). Dans le dispositif de détection et de mesure de l'invention, c'est la grille qui est biofonctionnalisée (les nanoparticules de platine étant déposées uniquement sur la grille). Ledit transistor OECT peut être fabriqué selon la méthode décrite par D. Khodagholy et ai, Nature communications 4: 2133 (2013), DOI : 10.1038/ncomms3133. 20 Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à la préparation d'une bioélectrode selon l'invention, et aux Figures 1 à 9 qui mettent en évidence la meilleure sensibilité des biolélectrodes de l'invention. 25 EXEMPLES Exemple 1: Cet exemple décrit la fabrication d'un transistor électrochimique organique 30 (OECT) selon l'invention. 3058835 10 Préparation du substrat conducteur : Le substrat conducteur est fabriqué selon la même méthode que celle décrite par X. Strakosas et al. dans Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545. De l'acide dodécylbenzènesulfonique (DBSA) à une concentration de 0,5 5 pL.mL-1 et de l'éthylène glycol (Sigma Aldrich) à une concentration de 50 mL.mL-1 sont ajouté au PEDOT : PSS (Heraeus, Clevios PH 1000) pour améliorer la formation du film. Le mélange est soumis à une sonication et filtré pour éliminer les agrégats. Une solution à 5% en poids d'alcool polyvinylique (M,' moyenne = 130 000 g.mo1-1) est chauffé pendant 30 secondes au four à micro-ondes jusqu'à obtention 10 d'une solution claire. La solution d'alcool polyvinylique est ensuite ajoutée au mélange de PEDOT : PSS. Une solution à 25% en poids de PEDOT : PSS a été préparée, mélangée et filtrée avant dépôt par spin-coating sur un substrat en verre. L'échantillon est chauffé à 140°C pendant 30 minutes, sous conditions atmosphériques. 15 Fabrication du transistor OECT : Le transistor OECT est fabriqué comme décrit dans l'article de D. Khodagholy et al., Nature communications 4: 2133 (2013), DOI : 10.1038/ncomms3133. Sur une lame de verre, sont déposés successivement de l'or, du parylène et le substrat conducteur PEDOT: PSS/PVA précédemment préparé. 20 Tout d'abord, les contacts de source et de drain sont positionnés en utilisant un procédé « lift-off » et une résine photorésistante S1813, exposé à la lumière UV à travers un appareil SUSS MicroTec MJB4, et développé en utilisant un développeur MF-26. Une couche de 5 nm de chrome et une couche de 100 nm d'or sont 25 successivement déposées sur le substrat en utilisant un évaporateur thermique (BOC Edwards Auto 500). Les interconnexions métalliques sont isolées en déposant dessus 2 pm de parylène C et 50 pL 3-(méthacryloyloxy)propyltriméthcowsilane comme promoteur d'adhésion silané, avec un SCS Labcoater® 2. Une solution diluée d'un nettoyant industriel (Micro-90) est ensuite déposé à la tournette à une vitesse de 1500 30 tours/minute pendant 30 secondes. Une couche de 5 pm d'une résine photorésistante AZ9260 est ensuite appliquée. Ensuite, une couche de PEDOT : PSS/PVA en solution est appliquée à la tournette à une vitesse de 3000 tours/minute, puis chauffé à 100°C 3058835 11 pendant 90 secondes. La couche de parylène C est enlevée, puis après rinçage à l'eau déionisée le substrat est à nouveau chauffé à 140°C pendant 30 minutes. Dépôt des nanoparticules de platine : 5 Des nanoparticules de platine sont déposées au sein du polymère conducteur par électrodéposition. Pour se faire, trois électrodes reliées à un potentiostat Metrohm sont plongées dans une solution comprenant 5 mM d'acide chloroplatinique (H2PtC16) et 50 mM d'acide sulfurique (H2SO4). L'électrode de référence est une électrode Ag/AgCI, la contre-électrode est une électrode à mailles en platine, la grille plane du transistor 10 OECT jouant le rôle d'électrode de travail. La méthode voltampérométrique est utilisée avec un potentiel initial Nice = + 0,7 vs Ag/AgCI pendant 60 secondes, puis un potentiel final Von = - 0,2 vs Ag/AgC1 est appliqué pendant 10 secondes au cours desquelles se produit le dépôt des nanoparticules de platine. Le dispositif est ensuite mis à tremper pendant une nuit dans de l'eau déionisée. 15 La Figure 1 est une photographie des nanoparticules de platine au sein du polymère conducteur prise au microscope électronique à balayage (SEM) (Carl Zeiss AG - Ultra 55) (grossissement : 194,50 k X (194,500 x)). Dépôt de la couche de composé organosilane : 20 200 pL de 3-glycidyloxypropyltriméthoxysilane (GOPS) (Sigma Aldrich) est déposé par dépôt chimique en phase vapeur (CVD) sur le substrat conducteur préparé précédemment. Un dessiccateur avec une base aluminium est placé en haut d'une plaque chauffante et chauffé à une température de 90°C. Le transistor OECT ainsi que 200 pL de GOPS sont placé dans le dessiccateur en aluminium. L'opération de dépôt 25 est réalisée sous vide en continue, pendant une heure. Le dispositif est ensuite rincé à l'eau déionisée, et l'étape de cuisson poursuivie pendant 30 minutes supplémentaires à 90°C. Dépôt de la première couche de polypeptide intermédiaire : 30 1 pL d'une solution de poly-L-lysine à 0,1% en poids (Sigma Aldrich) est coulé au goutte-à-goutte sur la couche de 3-glycidyloxypropyltriméthoxysilane précédemment déposée. La réaction entre les deux couches se fait pendant 3 heures, 3058835 12 puis le dispositif est placé sous haute pression de vapeur pour évaporer les gouttelettes restantes. Le dispositif est ensuite rincé avec de l'eau déionisée. La Figure 2 illustre les étapes de dépôt de la couche de composé 5 organosilane et de dépôt de la couche de polypeptide intermédiaire, décrites ci-dessus. Dépôt de la couche d'enzyme oxvdoréductase : 10 mg/mL de glucose oxydase (G0x) (Sigma Aldrich) sont mélangés avec 50 mM d'hydrochlorure de N-(3-diméthylaminopropyI)-N'-éthylcarbodiimide (EDC) et de 10 sulfo-NHS (Sigma Aldrich) dans une solution tampon d'acide 2-(Nmorpholino)éthanesulfonique (MES). Le pH de la solution tampon est porté à 6 en ajoutant de la soude (NaOH). Le mélange est laissé à température ambiante pendant une heure, le temps de laisser les fonctions acides carboxyliques des polypeptides s'activer et s'estérifier avec le sulfo-NHS. Une solution de PBS 10X (solution saline 15 tamponnée au phosphate) est ensuite ajoutée au mélange pour porter le pH à 7,4. Enfin, 1 pL de l'enzyme activée est ajouté au goutte-à-goutte sur la couche de poly-Llysine appliquée précédemment, et laissé à réagir à température ambiante pendant 3 heures (pendant lesquelles les groupes S-NHS de l'enzyme activée se lient aux groupes -NH2 de la poly-L-lysine). Un rinçage minutieux est réalisé (trois rinçages au PBS 10X, 20 suivis de trois rinçages à l'eau déionisée). Dépôt de la deuxième couche de polypeptide intermédiaire : 1 pL d'une solution de poly-L-lysine à 0,1% en poids (Sigma Aldrich) est coulé au goutte-à-goutte sur la couche de 3-glycidyloxypropyltriméthoxysilane 25 précédemment déposée. La réaction entre les deux couches se fait pendant 3 heures, puis le dispositif est placé sous haute pression de vapeur pour évaporer les gouttelettes restantes. Le dispositif est ensuite rincé avec de l'eau déionisée. Dépôt de la couche d'enzyme peroxydase : 30 10 mg/mL d'enzyme peroxydase (Sigma Aldrich) sont mélangés avec 50 mM d'hydrochlorure de N-(3-dirnéthylaminopropyI)-N'-éthylcarbodiimide (EDC) et de sulfoNHS (Sigma Aldrich) dans une solution tampon d'acide 2-(N- 3058835 13 morpholino)éthanesulfonique (MES). Le pH de la solution tampon est porté à 6 en ajoutant de la soude (NaOH). Le mélange est laissé à température ambiante pendant une heure, le temps de laisser les fonctions acides carboxyliques des polypeptides s'activer et s'estérifier avec le sulfo-NHS. Une solution de PBS 10X (solution saline 5 tamponnée au phosphate) est ensuite ajoutée au mélange pour porter le pH à 7,4. Enfin, 1 pL de l'enzyme activée est ajouté au goutte-à-goutte sur la couche de poly-Llysine appliquée précédemment, et laissé à réagir à température ambiante pendant 3 heures (pendant lesquelles les groupes S-NHS de l'enzyme activée se lient aux groupes -NH2 de la poly-L-lysine). Un rinçage minutieux est réalisé (trois rinçages au PBS 10X, 10 suivis de trois rinçages à l'eau déionisée). La Figure 3 illustre les étapes de dépôt de la couche d'enzyme oxydoréductase, de la couche de polypeptide intermédiaire et de la couche d'enzyme peroxydase. 15 Le transistor OECT est ensuite relié à un système National Instrument PXIe1062Q pour effectuer les mesures. Exemple 2: 20 Un transistor OECT est fabriqué de la même manière qu'à l'exemple 1, sauf que la couche de polymère conducteur n'est pas présente. Une couche de platine est appliquée sur la couche d'or, en lieu et place de la couche de parylène. Une couche de glucose oxydase (G0x) est ensuite directement déposée sur la couche de platine. L'absence de polymère conducteur empêche tout attachement de l'enzyme. Le 25 transistor OECT ne détecte aucunement la présence de glucose. Exemple 3: Un transistor OECT est fabriqué de la même manière qu'à l'exemple 1 par évaporations d'une couche d'or, suivie d'une couche d'un mélange de PEDOT : PSS et 30 d'alcool polyvinylique. Des nanoparticules de platine sont déposées par électrodéposition au sein du mélange de polymère conducteur. Une couche de glucose 3058835 14 oxydase (G0x) est ensuite directement déposée sur la couche de polymère conducteur. Dans ce cas, le transistor OECT est fonctionnel et détecte l'activité enzymatique. Toutefois, l'enzyme oxydoréductase est simplement « coincée » dans le 5 dispositif, et le dispositif devient de moins en moins sensible (voir la Figure 3). Exemple 4: Un transistor OECT est fabriqué de la même manière qu'à l'exemple 1 par évaporations successives d'une couche d'or, suivie d'une couche d'un mélange de 10 PEDOT : PSS et d'alcool polyvinylique. Des nanoparticules de platine sont déposées par électrodéposition au sein du mélange de polymère conducteur. Une couche de poly-Llysine est ensuite déposée directement sur la couche de polymère conducteur. Une couche de glucose oxydase (G0x) est ensuite directement déposée sur la couche de poly-L-Iysine. 15 La Figure 4 montre que la présence de poly-L-lysine intermédiaire augmente la sensibilité de la réponse à une concentration identique en métabolite. La présence du polypeptide intermédiaire porteur de charges ioniques permet d'espacer de façon optimale la couche de polymère conducteur de celle de l'enzyme de glucose oxydase (G0x) afin que leurs fonctions respectives n'interagissent pas entre elles. 20 Enfin, la Figure 5 met en évidence une meilleure stabilité du transistor OECT et une meilleure reproductibilité des mesures. La Figure 5 montre que la bioélectrode réagit de manière reproductible et stable à des concentrations identiques et évolutives, et que les étapes de rinçage ne suppriment pas l'enzyme. 25 Exemple 5: Cet exemple étudie l'effet de la couche de deuxième polypeptide porteur de charges ioniques et de la couche d'enzyme peroxydase utilisée pour neutraliser le peroxyde d'hydrogène diffusé lors de l'oxydation du glucose. Un transistor OECT est préparé comme décrit à l'exemple 4. Une couche de 30 poly-L-lysine est déposée directement sur la couche de glucose oxydase (G0x) du transistor OECT de l'exemple 4, puis une couche de peroxydase de raitfort (HRP) est ensuite directement déposée sur la couche de poly-L-lysine. La deuxième couche de 3058835 15 poly-L-lysine et la couche de peroxydase de raitfort (HRP) sont déposées comme décrit à l'exemple 1. La Figure 6 montre que l'utilisation de peroxydase de raitfort (HRP) permet de convertir le peroxyde d'hydrogène diffusé et de contrôler la reproductibilité de la 5 mesure. Sur la Figure 6a (sans HRP), une différence de courant zI existe et correspond au peroxyde d'hydrogène diffusé qui se consomme. Plusieurs concentrations d'analyte (glucose) ont été testées (a = 2 pM, b = 4 pM, c = 8 pM, d = 15 pM, e = 30 pM, f = 62 pM, g = 125 uM, h = 250 uM, i = 500 uM, j = 1 mM, k = 5 mM). La Figure 6b (avec HRP) montre que le peroxyde d'hydrogène a été consommé 10 et que les mesures sont reproductibles. En l'absence de peroxyde de raitfort (HRP), le peroxyde d'hydrogène risque de diffuser dans le milieu et d'endommager les tissus/cellules vivantes. La quantité de peroxyde d'hydrogène converti a également été mesurée avec le transistor OECT fonctionnalisé en l'absence et en présence de poly-L-lysine 15 intermédiaire sous la couche de peroxyde de raitfort (HRP). Les valeurs mesurées sont les suivantes : - en l'absence de poly-L-lysine : 53,5% d'H202 converti, et - en présence de poly-L-lysine : 73,6% d'H202 converti. Ces résultats montrent que la couche de poly-L-lysine intermédiaire sous la 20 couche de peroxyde de raitfort (HRP) améliore l'efficacité de neutralisation du peroxyde d'hydrogène. La Figure 7 montre également que la présence de poly-L-Iysine intermédiaire (dispositif B) entre l'enzyme oxydoréductase et le peroxyde de raitfort (HRP) améliore la sensibilité du transistor OECT par rapport au dispositif A, qui lui ne comprend pas de 25 poly-L-lysine intermédiaire (la réponse normalisée NR est sensiblement diminuée en présence de poly-L-lysine intermédiaire entre les couches de glucose oxydase (G0x) et d'enzyme peroxydase (HRP)). Exemple 6: 30 Un transistor OECT est préparé comme décrit à l'exemple 5, en faisant varier le ratio enzyme oxydoréductase / enzyme peroxydase. Cet exemple étudie l'effet du 3058835 16 ratio de concentration entre l'enzyme oxydoréductase (G0x ou L0x) et l'enzyme peroxydase (HRP). Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 8 et montrent que le ratio de concentration entre l'enzyme oxydoréductase et l'enzyme peroxydase agit sur 5 la sensibilité du biocapteur. Exemple 7: Cet exemple a pour objectif de valider l'utilisation de la bioélectrode de l'invention pour la mesure in vitro de l'activité métabolique de cellules provenant de la 10 lignée cellulaire de l'épithélium rénal Madin-Darby Canine Kidney (MDCK1) (en provenance de l'Institut de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire, Valbonne, France). Le transistor OECT utilisé pour réaliser cette mesure est le même que celui décrit à l'exemple 4, à l'exception du fait que la glucose oxydase (G0x) est remplacée par du lactate oxydase (L0x). Du gel est ajouté entre les différentes couches pour 15 éviter que les cellules MDCK1 ne poussent sur la grille du transistor OECT. Le gel utilisé est préparé comme suit :10% en poids de polyéthylène glycol diacrylate (PEG-DA, M,, - 6000) est mélangé avec de l'eau déionisée, puis soniqué pendant 10 minutes jusqu'à obtention d'une solution claire. 2% en poids de l'initiateur 2-hydroxy-2- méthylpropiophénone (Sigma Aldrich) est ensuite ajouté à la solution, puis mélangé. 1 20 pL de l'hydrogel formé est ensuite ajouté au goutte-à-goutte sur le transistor OECT et photo-polymérisé sous une lampe UV à 405 nm pendant 3 minutes. L'ajout de PEG-DA sert à empêcher la croissance des cellules. Enfin, le dispositif est rincé une fois avec du PBS et une fois avec de l'eau déionisée, puis stocké dans du PBS à une température de 4°C. 25 Les cellules MDCK1 sont ensemencées sur le transistor OECT, dans un puit qui entoure la surface active du transistor OECT. Elles sont ensuite maintenues à une température de 37°C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 et en milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 10% de sérum de veau foetal, et Pen/Step (5000 [U/mL] penicilline - 5000 [pg/mL] streptomycine). Les cellules MDCK1 sont 30 incubées à une densité de 6.104 cellules/support Transwell® (taille des pores : 0,4 pm, et surface : 0,33 cm2). 3058835 17 La bioélectrode de l'invention est ensuite plongée dans la solution de cellules MDCK1, ainsi qu'une bioélectrode de contrôle préparée de la même façon que celle de l'invention, à l'exception du fait que l'enzyme oxydoréductase et le peroxyde de raitfort (HRP) sont remplacés à concentration identique par du BSA (albumine de sérum 5 bovin). La différence de courant entre le dispositif de contrôle et le dispositif fonctionnalisé de l'invention, telle qu'elle apparaît sur la Figure 9, marque la mesure du métabolite relargué lors de la croissance cellulaire. REVENDICATIONS1. Bioélectrode caractérisée en ce qu'elle comprend : (a) un substrat conducteur comprenant des nanoparticules de platine, (b) une couche d'au moins un composé organosilane déposée sur le substrat (a), (c) une couche d'un premier polypeptide porteur de charges ioniques, déposée sur la couche (b), (d) une couche d'enzyme oxydoréductase ayant des charges opposées à celle du premier polypeptide, déposée sur la couche (c), (e) une couche d'un deuxième polypeptide porteur de charges ioniques ayant des charges opposées à celles de l'enzyme oxydoréductase, déposée sur la couche (d), et (f) une couche d'enzyme peroxydase ayant des charges opposées à celles du deuxième polypeptide, déposée sur la couche (e). 2. Bioélectrode selon la revendication 1 caractérisée en ce que le substrat conducteur (a) comprend un polymère conducteur, ledit polymère conducteur étant de préférence choisi parmi le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - poly(styrènesulfonate) (PEDOT : PSS) ou le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - tosylate (PEDOT : TOS). 3. Bioélectrode selon la revendication 2 caractérisée en ce que le substrat conducteur (a) comprend un polymère conducteur et des groupes hydroxy -OH pendants. 4. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le composé organosilane de la couche (b) répond à la formule R-Y-Si(X)3 dans laquelle : Y est un groupe alkyle ou aryle, R est un groupe organique réactif, de préférence choisi parmi les groupes vinylique, (méth)acrylate, époxy, isocyanate, amino, et 3058835 19 - X est un groupe hydrolysable qui peut être hydrolysé pour former des liaisons covalentes avec le substrat conducteur (a), et de préférence X est un atome d'halogène ou un groupe de formule OR' dans lequel R' est un groupe alkyle en C1-C6. 5 5. Bioélectrode selon la revendication 4 caractérisée en ce que le composé organosilane de la couche (b) est choisi parmi le 3-glycidyloxypropyltriéthcowsilane, le 3-glycidyloxypropyltriméthoxysilane, le 3-méthacryloxypropyltriméthoewsilane, Vaminoéthylaminopropyltriméthoxysilane, le vinyltriéthoxysilane, le tétraméthoxysilane, le tétraéthoewsilane, le méthyltriméthoxysilane, ou leur mélange. 10 6. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le premier polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (c) est un polypeptide chargé positivement. 15 7. Bioélectrode selon la revendication 6 caractérisée en ce que le premier polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (c) est choisi parmi la poly-Llysine, la poly-D-lysine, la poly-L-arginine ou la poly-D-arginine, et de préférence est la poly-L-lysine. 20 8. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que l'enzyme oxydoréductase de la couche (d) est une enzyme oxydase, de préférence choisie parmi les enzymes glucose oxydase (G0x), cholestérol oxydase, xanthine oxydase (XO), amino-acide oxydase (AAO), lactate oxydase (L0x), glycolate oxydase, pyridoxa1-4-oxydase, sorbose oxydase, gluconolactone oxydase ou galactose oxydase, 25 et encore plus préférentiellement est l'enzyme glucose oxydase (G0x) ou l'enzyme lactate oxydase (L0x). 9. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le deuxième polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (e) est choisi parmi la 30 poly-L-lysine, la poly-D-lysine, la poly-L-arginine ou la poly-D-arginine, et de préférence est la poly-L-lysine. 3058835 20 10. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce que l'enzyme peroxydase de la couche (f) est la peroxydase de raitfort (HRP). 11. Procédé de fabrication d'une bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 5 10 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) dépôt d'une couche d'au moins un composé organosilane (b) sur un substrat conducteur (a) comprenant des nanoparticules de platine, ledit dépôt étant réalisé de préférence par dépôt chimique en phase vapeur (CVD), (ii) dépôt d'une couche d'un premier polypeptide porteur de charges ioniques 10 (c) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (i), (iii) dépôt d'une couche d'enzyme oxydoréductase (d) ayant des charges opposées à celles du premier polypeptide sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (ii), (iv) dépôt d'une couche d'un deuxième polypeptide porteur de charges ioniques (e) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iii), 15 (v) dépôt d'une couche d'enzyme peroxydase (f) ayant des charges opposées à celles du deuxième polypeptide sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iv). 12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que le substrat conducteur (a) mis en oeuvre lors de l'étape (i) est obtenu par dépôt d'un polymère 20 conducteur sur un substrat, ledit dépôt étant de préférence réalisé par synthèse chimique en solution, électropolymérisation ou polymérisation en phase vapeur. 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement au dépôt du polymère conducteur sur le substrat, une étape 25 d'électrodéposition de nanoparticules de platine au sein du polymère conducteur. 14. Dispositif de détection et de mesure de métabolites comprenant au moins une bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 10 ou obtenue selon l'une des revendications 11 à 13, ledit dispositif étant de préférence un transistor 30 électrochimique organique (OECT).