Brevet FR3058525A1 — publié le 20180511

Procédé de détermination de la teneur en hémoglobine F d'une cellule érythroïde Domaine technique L'invention concerne un nouveau procédé de détermination in vitro de la teneur en hémoglobine F (HbF) de chaque cellule érythroïde d'un ensemble de cellules érythroïdes, de préférence de chaque globule rouge d'un ensemble de globules rouges, par cytométrie de flux. L'invention concerne également un nouveau procédé de détermination in vitro de la quantité de globules rouges transfusés chez un patient et un procédé de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement de la drépanocytose ou de la 13-thalassémie. Arrière-plan technologique La drépanocytose est une maladie génétique de l'hémoglobine qui a été historiquement caractérisée par la déformation des globules rouges (GR) en réponse à une diminution de la pression partielle en oxygène. Les globules rouges perdent leur forme biconcave (ou discocyte) et se présentent sous forme allongée, pointue ou en faucille d'où l'appellation anémie falciforme ou « sickle cell disease » en anglais. La drépanocytose est due à une mutation d'un seul nucléotide (GAG-GTG) sur le codon 6 du gène 13 localisé sur le bras court du chromosome 11 (11p 15.5). Cette mutation se traduit par une modification structurale de la chaîne [3 de l'hémoglobine qui consiste en un remplacement de l'acide glutamique en position 6 par une valine pour former l'HbS. Le syndrome drépanocytaire majeur comprend 3 génotypes : une forme homozygote (SS), et 2 formes hétérozygotes (Sehal et SC qui associe la mutation B5 et une mutation C caractérisée par la substitution de l'acide glutamique en position 6 par une lysine). Le phénotype clinique de la drépanocytose est caractérisé par une grande variabilité interindividuelle d'une part et d'autre part par une variabilité entre chaque évènement pour un même patient. Les principales causes d'hospitalisation sont les crises vasoocclusives (CVO) et le syndrome thoracique aigu (STA) qui peuvent se présenter à tout âge. Le STA peut toucher jusqu'à 40% des patients drépanocytaires et représente l'une des principales causes de mortalité chez l'adulte. Les globules rouges denses ou « dense red blood cells » (DRBC) en anglais et les « irreversibly sickled cells » (ISC) constituent une sous population de globules rouges SS très pathogène de par leur forte concentration en HbS qui est le principal facteur déterminant de la polymérisation. Les DRBC ont une forte tendance à se polymériser et sont des acteurs majeurs des mécanismes 3058525 2 physiopathologiques de la drépanocytose. Par leur faible déformabilité associée à une augmentation importante de la viscosité, les DRBC contribuent principalement à l'occlusion des capillaires et des veinules post capillaires et au ralentissement du flux sanguin favorisant l'apparition des phénomènes vaso-occlusifs. 5 En 2010, environ 5 millions de porteurs du trait drépanocytaire et 312 000 enfants drépanocytaires ont été recensés à l'échelle mondiale, avec une forte densité retrouvée dans les régions africaines. En 2011, l'OMS a estimé une prévalence des porteurs du trait drépanocytaire allant jusqu'à 5% de la population mondiale. La drépanocytose représente aujourd'hui la maladie génétique la plus répandue en France avec une fréquence allant 10 jusqu'à une naissance sur 700 en Métropole et 1/2300 avec les départements d'Outre-Mer (Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire 3 juillet 2012/ 12 mai 2015). Les taux de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans ont nettement diminué depuis les dernières décennies grâce au dépistage néonatal et à l'introduction des traitements préventifs des infections qui constituent les principales causes de mortalité. En France, une amélioration 15 de l'espérance de vie des patients drépanocytaires a été également observée durant les 20 dernières années avec un taux de mortalité réduit à 35% (Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire 10 mars 2015). Cependant, le manque de dépistage précoce et l'accès limité aux traitements et soins de qualité continuent à faire augmenter les incidences de mortalité chez les enfants dans les pays en voie de développement. 20 L'observation d'une forme asymptomatique de la drépanocytose chez des patients SS a conduit à différentes études dans le but de déterminer l'effet protecteur de l'hémoglobine F (HbF). En effet, l'expression clinique de la drépanocytose est atténuée en période périnatale au cours de laquelle l'HbF représente la forme prédominante. On observe également une forme bénigne chez l'adulte présentant des traits génétiques conduisant à 25 une surexpression de l'HbF. Ces patients présentent rarement une manifestation clinique sévère et bénéficient d'une meilleure espérance de vie. L'effet protecteur de l'HbF consiste principalement en l'inhibition de la formation du polymère de désoxy HbS. Puisque la polymérisation dépend essentiellement de la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH), la réduction de la concentration intracellulaire en HbS 30 constitue le principal facteur améliorant l'expression clinique. Les études in vitro effectuées sur des solutions d'hémoglobines ont permis de déterminer les mécanismes d'inhibition de la polymérisation par les différents variants d'hémoglobine (HbA, HbA2, HbF, ...). Un effet inhibiteur plus important est obtenu avec l'HbF. A cet effet antipolymérisant s'ajoute une forte affinité de l'HbF à l'oxygène qui fournit une meilleure 3058525 3 protection des globules rouges. Chez les patients drépanocytaires, l'HbF est exprimée de manière hétérogène, l'effet protecteur de l'HbF procure aux globules rouges contenant un taux élevé en HbF une durée de vie plus longue, jusqu'à environ 90 jours, tandis que les globules rouges SS qui contiennent peu d'HbF sont rapidement éliminés de la circulation 5 générale. A ce jour, l'augmentation de l'HbF constitue donc l'un des principaux objectifs thérapeutiques dans la prise en charge de la drépanocytose. Néanmoins, l'augmentation de la teneur moyenne en HbF n'est pas toujours associée à une amélioration clinique chez les patients drépanocytaires. A l'inverse, une amélioration 10 clinique peut être observée à de faibles teneurs moyennes en HbF. Ces observations suggèrent l'existence d'une teneur seuil en HbF dans chaque globule rouge permettant d'inhiber la polymérisation de l'HbS et évoquent la nécessité d'obtenir un dépassement de ce seuil avec comme résultante une distribution plus homogène de l'HbF dans les globules rouges, afin que chaque globule rouge bénéficie de l'effet protecteur de l'HbF. Il a par 15 ailleurs été montré qu'en l'absence de traitement, la distribution de l'HbF dans les globules rouges SS est hétérogène. La détermination de la teneur en HbF de chaque globule rouge revêt donc une importance capitale. Depuis quelques décennies plusieurs techniques ont été développées afin de déterminer la teneur en HbF de chaque globule rouge. Ces techniques étaient basées initialement sur 20 des méthodes chimiques (Betke K, Marti HR, Schlicht I. Estimation of small percentages of foetal haemoglobin. Nature. 1959;184(Suppl 24):1877-8), puis sur des méthodes immunologiques (Navenot JM, Merghoub T, Ducrocq R, Muller JY, Krishnamoorthy R, Blanchard D. New method for quantitative determination of fetal hemoglobin-containing red blood cells by flow cytometry: application to sickle-cell disease. Cytometry. 25 1998;32(3):186-90), avaient pour but de détecter une population particulière de globules rouges contenant un taux élevé en HbF appelés « cellules F ». Bien que très utilisées dans le diagnostic des incompatibilités foeto-maternelles et dans la compréhension des hémoglobinopathies, ces méthodes sont peu sensibles et se limitent à une mesure qualitative des cellules F (globules rouges positifs en microscopie par 30 immunofluorescence, immunodiffusion ou en cytométrie de flux, quel que soit le niveau d'expression de l'HbF). Jusque-là, l'étude de la teneur en HbF dans chaque globule rouge était basée sur cette définition approximative des cellules F. Il existe donc un réel besoin de mettre au point une méthode facile à mettre en oeuvre pour déterminer précisément la teneur en HbF dans chaque globule rouge d'un ensemble 3058525 4 de globule rouge afin de pouvoir expliquer les variabilités de réponse clinique, anticiper ces variabilité de réponse clinique et ainsi adapter le traitement. Cela permettrait également de développer de nouvelles approches thérapeutiques de la drépanocytose ou de la 13-thalassémie visant à augmenter la teneur en HbF dans chaque globule rouge et 5 pas seulement la teneur moyenne en HbF chez un patient. Résumé de l'invention La présente invention vise à proposer un nouveau procédé de détermination de la teneur en hémoglobine F (HbF) de chaque cellule érythroïde d'un ensemble de cellules 10 érythroïdes, de préférence de chaque globule rouge d'un ensemble de globules rouges, utile dans le diagnostic et le suivi thérapeutique de la drépanocytose ou de la (3- thalassémie. Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de détermination in vitro de la teneur en hémoglobine F (HbF) de chaque cellule érythroïde d'un ensemble de cellules 15 érythroïdes comprenant les étapes de : a) isoler des cellules érythroïdes à partir d'un échantillon ; b) perméabiliser la membrane des cellules érythroïdes isolées ; c) marquer l'HbF des cellules érythroïdes obtenus à l'étape b) avec un anticorps anti- HbF conjugué à un fluorochrome ; 20 d) mesurer par cytométrie de flux l'intensité de fluorescence (MFI) de chaque cellule érythroïde d'un ensemble de cellules érythroïdes ; e) déterminer la teneur en hémoglobine F de chaque cellule érythroïde de l'ensemble de cellules érythroïdes. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne un procédé de détermination in vitro de la 25 quantité de globules rouges transfusés chez un patient, comprenant : a) l'obtention d'un échantillon contenant des globules rouges à partir d'un patient ; b) la détermination de la teneur en hémoglobine F (HbF) de chaque globule rouge d'un ensemble de globules rouges dudit échantillon selon le procédé de l'invention ; c) l'utilisation des résultats de l'étape b) pour déterminer la quantité de globules 30 rouges transfusés chez un patient, lesdits globules rouges transfusés ayant une teneur en HbF substantiellement égale à zéro (= 0 pg). Selon un troisième aspect, l'invention concerne un procédé in vitro de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement de la drépanocytose ou de la 13-thalassémie comprenant : 3058525 5 a) l'obtention d'un échantillon contenant des globules rouges à partir d'un patient ayant subi un traitement de la drépanocytose ; b) la détermination de la teneur en hémoglobine F (HbF) de chaque globule rouge d'un ensemble de globules rouges dudit échantillon selon le procédé de l'invention 5 appliqué aux globules rouges ; c) l'utilisation des résultats de l'étape b) dans la détermination de l'efficacité thérapeutique du traitement de la drépanocytose ou de la 13-thalassémie, dans lequel une efficacité thérapeutique est observée lorsqu'au moins un pourcentage prédéterminé des globules rouges de l'ensemble de globules rouges ont une teneur en HbF qui dépasse un 10 seuil de référence et/ou lorsqu'on observe une diminution de la quantité de globules rouges ayant une teneur en HbF 0 pg) et une catégorie de globules rouges ne contenant pas d'HbF (correspondant aux globules rouges_transfusés, quantité = 0 pg). Dans un mode de réalisation particulier, le patient est drépanocytaire ou 3-thalassémique. Avantageusement, la quantité de globules rouges transfusés permet de déterminer un 20 pourcentage de globules rouges transfusés par rapport aux globules rouges totaux du patient. Cela permet notamment de suivre l'évolution de la quantité de globules rouges transfusés (ou du pourcentage globules rouges transfusés) et ainsi d'aider au diagnostic dans certains cas particuliers comme par exemple la distinction entre des allo anticorps ou des auto anticorps dirigés contre des globules rouges, transfusé ou du patient. 25 Suivi de l'efficacité thérapeutique de la drépanocytose ou de la 13-thalassémie L'invention concerne également un procédé in vitro de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement de la drépanocytose ou de la 13-thalassémie comprenant : a) l'obtention d'un échantillon contenant des globules rouges à partir d'un patient ayant subi un traitement de la drépanocytose ou de la 13-thalassémie ; 30 b) la détermination de la teneur en hémoglobine F (HbF) de chaque globule rouge d'un ensemble de globules rouges dudit échantillon selon le procédé de l'invention appliqué aux globules rouges ; c) l'utilisation des résultats de l'étape b) dans la détermination de l'efficacité thérapeutique du traitement de la drépanocytose ou de la 13-thalassémie, dans lequel une 3058525 15 efficacité thérapeutique est observée lorsqu'au moins un pourcentage prédéterminé des globules rouges de l'ensemble de globules rouges ont une teneur en HbF qui dépasse un seuil de référence et/ou lorsqu'on observe une diminution de la quantité de globules rouges ayant une teneur en HbF 0 ,9999) ni sur les AG/GR mesurées après 11 décongélations (p= 0,73). De même, l'analyse de la variabilité des données obtenues sur les billes de quantifications n'a révélée aucune différence 5 significative (n=11, p=0,99). 3. Méthode de mesure de la teneur en HbF dans chaque globule rouge La gamme de TCMHbF obtenue chez les patients présentant une distribution des teneurs en HbF par globule rouge homogène a été associée aux intensités de fluorescences puis aux quantités antigéniques par globule rouge à l'aide des billes de calibration. Une courbe 10 standard (ou droite de régression) a été déterminée à partir des moyennes des AG/GR obtenues après 11 décongélations et les TCMHbF de chaque patient (figure 5). Un coefficient de corrélation à 97.18% (r2=0.9444) a été obtenu entre les TCMHbF et les moyennes des quantités antigéniques d'HbF (marquée par l'anticorps fluorescent) par globule rouge, pour les différents patients. Cette courbe standard permet de déterminer la 15 teneur en HbF par GR pour une valeur de fluorescence donnée. La précision des mesures est fournie par un intervalle de confiance à 95% déterminée à partir de la courbe standard « moyenne », des écart-types entre chaque régression et du nombre de modèle de régression ayant servi à calculer la moyenne. 20 Exemple 3 : Etude de la distribution de l'HbF au cours du traitement par Hydroxyurée 1. Patients Une étude prospective, longitudinale et monocentrique a été menée sur une cohorte de 29 patients drépanocytaires adultes (age18ans) présentant une mutation homozygote SS, débutant un traitement par hydroxyurée, suivis régulièrement au Centre de référence 25 des syndromes drépanocytaires majeurs au Centre Hospitalier Universitaire Henri Mondor à Créteil. Les patients ayant eu une crise nécessitant une hospitalisation et/ou un programme d'échange transfusionnel durant les 3 derniers mois avant l'inclusion ainsi que les patientes présentant une grossesse en cours ou ayant un désir de grossesse ont été exclus de l'étude. 30 Les patients présentant les critères d'éligibilité ont été suivis à différents temps avant et pendant le traitement par hydroxyurée : JO (avant le début du traitement par hydroxyurée), à 15 jours, 1 mois, 3 mois, 4 mois et 6 mois ou plus après la mise en place du traitement par hydroxyurée (J15, Ml, M3, M4 et 1'16 respectivement). 3058525 27 En accord avec la déclaration d'Helsinki sur les principes éthiques applicables à la recherche médicale impliquant des êtres humains (Association Médicale Mondiale, Texte en vigueur 2008, paragraphe 24), tous les patients recrutés ont été informés des risques et des bénéfices de cette étude et ont fourni un consentement écrit avant l'inclusion. 5 Conformément aux législations en vigueur (articles L.1121-3 et R.5121-13 du code de la santé publique), les informations relatives aux patients ont été protégées par l'anonymat afin d'assurer la confidentialité pendant toute la durée de l'étude. Ce protocole de recherche a obtenu l'avis favorable du Comité de Protection des Personnes Île-de-France IV sis à l'Hôpital Saint-Louis (n° IRB 00003835). 10 2. Méthodes Lors de chaque visite au centre (30, J15, Ml, M3, M4 et 1'16), environ 16mL de sang ont été prélevés et collectés dans 4 tubes contenant de l'EDTA. 2.1. Prétraitement des échantillons globulaires Les échantillons ont été traités dans les 24h suivant les prélèvements. Il s'agit de la 15 séparation des globules rouges en fonction de leur densité et de la cryoconservation des fractions globulaires et des globules rouges totaux ou non fractionnés. 3. Analyse des échantillons globulaires Les différentes mesures réalisées sur chaque fraction globulaire ou sur les GR totaux ont été composées de : 20 - la numération et formule sanguine ou hémogramme sanguin par une automate de numération ; - la mesure du pourcentage moyen en HbF (%HbF) par HPLC ; et - la mesure par cytométrie de flux de l'intensité de fluorescence de chaque GR marqués avec un anticorps dirigé contre l'HbF conformément au protocole 25 détaillé à l'Exemple 1. 3.1. Numération et formule sanguine, mesure du pourcentage moyen en HbF (%HbF) par HPLC Ces analyses ont été effectuées sur les GR frais et après décongélation selon les mêmes techniques que celles décrites à l'Exemple 1. 30 3.2. Mesure de la teneur en l'HbF de chaque GR par cytométrie en flux Cette analyse a été effectuée après décongélation des GR conservés à -80°C selon la technique décrite dans l'Exemple 1. La détermination de la teneur en HbF de chaque GR a été réalisée en utilisant la courbe standard décrite dans l'Exemple 1 à partir des intensités de fluorescence de chaque 3058525 28 globule rouge transformées en AG/GR par les billes QuantiBRITE PE. Les mesures ont été effectuées à chaque stade du traitement (JO, J15, Ml, M3, M4 et 1'16) dans les différentes fractions globulaires : globules rouges non denses, denses et totaux. 4. Analyses statistiques 5 Chez les patients SS sous hydroxyurée, les pourcentages de GR contenant des teneurs en HbF regroupées en classes définies arbitrairement (0 à 2 pg, 2 à 4 pg, 4 à 6 pg etc...) ont été comparés au cours du suivi longitudinal afin de déterminer les variations de la distribution de l'HbF avant et au cours du traitement par hydroxyurée. Les comparaisons entre chaque stade du traitement ont été effectuées au moyen d'une ANOVA mesure 10 répétée entre JO, J15-M3 et 1'16 dans les globules rouges totaux. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism®Version 6 (RITME Informatique Paris France). 5. Résultats 5.1. Données démographiques et indications de l'Hydroxyurée 15 Au total, 29 patients SS adultes ont été inclus. Sur l'ensemble de la cohorte, 10 patients ont été suivis entre JO et 1'16, les échantillons de GR d'un patient ont hémolyse, 9 patients ont été analysés. Les données démographiques des patients inclus sont résumées dans le tableau 3. Hommes Femmes N 13 16 Age 33 [28,50 ; 45] 36 [31 ; 44,25] Age exprimé en Médiane [25erne percentile ; 75erne percentile] 20 Tableau 3 : Données démographiques des patients SS sous hydroxyurée L'hydroxyurée a été administrée avec une dose moyenne de 15mg/Kg/jour pour les indications suivantes : prévention des CVO, atteintes viscérales chroniques, ulcères de jambes, néphropathie drépanocytaire, hémolyse importante avec anémie, priapisme, AVC. 25 5.2. Données biologiques Le pourcentage moyen en HbF (%HbF) augmente d'environ 3 fois après 6 mois de traitement par hydroxyurée. Les données sont présentées dans le tableau 4. 3058525 29 JO J15-M1 M3-M4 M6 p (JO et M6) Globules 10,05 2,65 4,9 7 rouges [3,33- 0,03 [1,8-6,35] [1,85-8,4] [2,4-17,80] totaux 19,13] Données exprimées en Médiane [25eme percentile ; 75eme percentile] Tableau 4: Variation des %HbF au cours du traitement par Hydroxyurée Une augmentation significative du Volume globulaire moyen (VGM) et de la teneur 5 moyenne en hémoglobine par globule rouge (TCMH) a été observée après 6 mois de traitement par Hydroxyurée indiquant une bonne conformité des patients et l'efficacité du traitement malgré le faible effectif. Le pourcentage de globules rouges denses présente une tendance à diminuer, cependant cette diminution n'est pas significative. De même pour la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH), les leucocytes et 10 les plaquettes, aucune variation significative n'a été observée. Les résultats sont présentés dans le tableau 5. 0.18 JO M6 p Hémoglobine 8 9,35 (g/dl) [6,65-9,05] [7,30-10,10] Leucocytes 10,70 9 (Giga/L) [9,45-12,20] [5,35-11,58] VGM (fento 87 100,50 litre) [83-95] [87,75-115] 3 CCMH (g/dl) 32,60 34,40 [32,05-35,10] [32,43-35,70] TCMH (pg) 29,70 33,80 [25,30-32,85] [30,70-39,65] 0,2 0,11 0,03 0,08 0,008 Plaquettes 359 318 (giga/L) [288-548] [257-438.80] Données exprimées en Médiane [25eme percentile ; 75eme percentile] Tableau 5 : Données biologiques avant et au cours du traitement par hydroxyurée 15 5.3. Distribution de l'HbF au cours du traitement par Hydroxyurée L'analyse qualitative par cytométrie de flux de la réponse au traitement par hydroxyurée montre une distribution hétérogène de l'HbF avant le début du traitement chez 8 patients. Après 6 mois de traitement par Hydroxyurée, l'HbF suit une distribution homogène chez 6 patients. La distribution de l'HbF devient homogène à partir de M2 chez 1 patient et après 20 1'14 chez 5 patients. La figure 6 illustre les variations de la distribution de l'HbF au cours du traitement par Hydroxyurée dans les globules rouges totaux. 3058525 30 La distribution de l'HbF a été analysée quantitativement grâce à la méthode décrite dans l'Etude 1. Le nombre de globules rouges par intervalle de teneur en HbF (pg) a été déterminé pour chaque patient. L'analyse de la répartition des globules rouges au cours du temps sous Hydroxyurée a été effectuée chez 9 patients. Les résultats montrent une 5 variation significative des globules rouges présentant les plus faibles teneurs en HbF (0 et 2pg) avec une diminution d'environ 25% entre JO et M6. Les globules rouges présentant une teneur en HbF supérieure à 20g augmentent de façon importante, jusqu'à 3 fois, après 6 mois de traitement par hydroxyurée, toutefois cette variation est non significative. Les globules rouges présentant des teneurs moyennement élevées présentent des 10 variations beaucoup plus faibles. HbF (pg) JO (Vo GR) J15-M3 (V° >rvi6 (Vo GR) p GR) [0 ; 2[ 71,13 (23,16) 65,63 (25,13) 53,17 (30,63) 0,0083 [2 ; 4[ 9,14 (7,44) 11,32 (6,80) 15,05 (10,11) 0,1868 [4 ; 6[ 4,54 (3,86) 4,88 (2,90) 6,70 (4,39) 0,2226 [6 ; 8[ 3,16 (2,92) 3,42 (2,52) 3,92 (2,44) 0,5186 [8 ; 10[ 2,42 (2,32) 2,65 (2,18) 2,72 (1,83) 0,6932 [10 ; 15[ 1,94 (1,84) 2,41 (2,73) 2,55 (2,57) 0,3926 [15 ; 20[ 3,66 (3,35) 4,42 (4,27) 4,29 (3,42) 0,474 k20 4,01 (4,35) 5,27 (8,56) 11,60 (18,64) 0,1626 Les données sont exprimées en moyenne (écart-type) Tableau 6: Répartition des globules rouges par intervalle de teneur en HbF sous traitement par hydroxyurée 15 La mesure des intensités de fluorescence de chaque globule rouge par cytométrie de flux a permis de classer chaque globule rouge en fonction de leur teneur en HbF. L'analyse de la répartition des globules rouges en fonction de leur teneur en HbF permet d'identifier différents profils de réponse au traitement. A titre d'exemple les patients 11 et 24 (Tableaux 7 et 8), exprimant des %HbF identiques à JO (6%) et à M6 (18 %) avec une 20 TCMH à J0= 33,6 et 34,5 pg et à M6 38,9 et 42 pg (patients 11 et 24 respectivement), présentent 2 répartitions différentes. Chez le patient 11, on note un plus faible nombre de globules rouges avec une teneur en HbF de moins de 2pg avec une diminution d'environ 73% à M6 alors que le patient 24 présente un plus grand nombre de globules rouges avec une teneur en HbF de moins de 2pg avec une diminution d'environ 40% à M6. La 25 distribution de l'HbF chez le patient 11 est décrite par une courbe bimodale à JO et à M6 tandis que la distribution du patient 24 présente une distribution relativement homogène 3058525 31 sur les faibles quantités d'HbF avec un net décalage de l'ensemble vers des quantités plus importantes. Patient 11 HbF (pg) JO (% GR) J15-M1 M3-M4 (% M6 (% (% GR) GR) GR) [0 ; 2[ 48,44 55,38 48,83 12,93 [2 ; 4[ 26,27 23,31 31,73 17,62 [4 ; 6[ 8,13 6,25 9,30 11,85 [6 ; 8[ 3,77 3,07 4,32 8,05 [8 ; 10[ 2,69 2,55 2,04 6,08 [10 ; 15[ 2,41 2,24 0,72 6,13 [15 ; 20[ 4,21 4,42 2,46 9,77 k20 4,08 2,78 0,59 27,57 5 JO (% GR) J15-M1 (% GR) M3-M4 (% GR) k M6 (% Patient 24 GR) HbF (pg) [0 ; 2[ 60,82 53,17 44,56 36,98 [2 ; 4[ 9,38 11,57 24,93 25,28 [4; 6[ 4,83 6,69 12,53 13,64 [6 ; 8[ 4,01 5,58 5,81 6,92 [8 ; 10[ 3,63 4,50 3,09 3,93 [10 ; 15[ 3,83 3,89 1,87 2,70 [15 ; 20[ 6,38 7,56 3,81 5,36 k20 7,12 7,04 3,41 5,20 Tableaux 7 et 8: répartition de chaque globule rouge en fonction de leur teneur en classes d'HbF (par rapport aux globules rouges totaux) avant et au cours du traitement par 10 hydroxyurée Un autre exemple de répartition en fonction de la teneur en HbF de chaque globule rouge est représenté par le patient 2. Le patient 2 présente avant le traitement par Hydroxyurée une relative homogénéité de répartition de la teneur en HbF. Cependant à M6 la 15 distribution se caractérise par une nette augmentation des globules rouges contenant une teneur supérieure à 20pg au détriment de toutes les autres classes Tableau 9. A noter que le %HbF varie de 6 à 25% entre JO et M6, ce qui est similaire aux 2 exemples précédents. 3058525 32 HbF (pg) JO (% J15-M1 (% GR) M3-M4 M6 (% GR) GR) (% GR) [0 ;2[ 22,43 9,21 5,29 4,98 [2 ;4[ 15,76 14,72 8,62 7,04 [4 ;6[ 12,85 9,52 10,61 5,53 [6 ;8[ 10,04 8,47 10,39 4,85 [8 ;10[ 7,84 7,35 8,75 4,56 [10 ;15[ 5,79 9,03 8,50 7,48 [15 ;20[ 11,05 14,27 14,54 9,75 k20 14,24 27,43 33,30 55,81 Tableau 9: répartition des globules rouges en fonction de leur teneur en classes d'HbF (par rapport aux globules rouges totaux) avant et au cours du traitement par hydroxyurée pour le patient 2 5 6. Conclusion Les données montrent que les globules rouges présentant une teneur en HbF très basse diminuent fortement et que les globules rouges ayant une teneur en HbF supérieure à 20 pg augmentent de façon importante, jusqu'à 3 fois, après 6 mois de traitement par hyd roxyu rée. 10 REVENDICATIONS1. Procédé de détermination in vitro de la teneur en hémoglobine F (HbF) de chaque cellule érythroïde d'un ensemble de cellules érythroïdes comprenant les étapes de : a) isoler des cellules érythroïdes à partir d'un échantillon ; b) perméabiliser la membrane des cellules érythroïdes isolées ; c) marquer l'HbF des cellules érythroïdes obtenues à l'étape b) avec un anticorps 10 anti-HbF conjugué à un fluorochrome ; d) mesurer par cytométrie de flux 'Intensité de fluorescence (MFI) de chaque cellule érythroïde d'un ensemble de cellules érythroïdes ; e) déterminer la teneur en hémoglobine F de chaque cellule érythroïde de l'ensemble de cellules érythroïdes. 15 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la membrane des cellules érythroïdes isolées est fixée avant l'étape de perméabilisation. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel ledit 20 échantillon est un échantillon sanguin, de préférence un échantillon sanguin humain. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ledit fluorochrome est la phycoérythrine (PE). 25 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit anticorps anti-HbF est dirigé contre la chaine gamma de l'HbF. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la membrane des cellules érythroïdes isolées est perméabilisée avec du dodécylsulfate de 30 sodium. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel la membrane des cellules érythroïdes isolées est fixée avec de l'azoture de sodium et/ou du formaldéhyde. 35 3058525 2 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la teneur en hémoglobine F est déterminée pour chaque cellule érythroïde d'un ensemble d'au moins 10 000 cellules érythroïdes, de préférence d'au moins 100 000 cellules érythroïdes, de préférence entre 50 000 et 100 000 cellules érythroïdes. 5 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel les cellules érythroïdes sont des globules rouges. 10. Procédé de détermination in vitro de la quantité de globules rouges transfusés chez un patient, comprenant : a) la détermination de la teneur en hémoglobine F (HbF) de chaque globule rouge d'un ensemble de globules rouges d'un échantillon de globules rouges d'un patient selon le procédé de la revendication 9 ; b) l'utilisation des résultats de l'étape a) pour déterminer la quantité de globules rouges transfusés chez un patient, lesdits globules rouges transfusés ayant une teneur en HbF substantiellement égale à zéro (= 0 pg). 11. Procédé in vitro de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement de la drépanocytose ou de la (3-thalassémie, comprenant : a) la détermination de la teneur en hémoglobine F (HbF) de chaque globule rouge d'un ensemble de globules rouges d'un échantillon de globules rouges d'un patient ayant subi un traitement de la drépanocytose ou de la (3-thalassémie selon le procédé de la revendication 9 ; b) l'utilisation des résultats de l'étape a) dans la détermination de l'efficacité thérapeutique du traitement de la drépanocytose ou de la p-thalassémie, dans lequel une efficacité thérapeutique est observée lorsqu'au moins un pourcentage prédéterminé des globules rouges de l'ensemble de globules rouges a une teneur en HbF qui dépasse un seuil de référence et/ou lorsqu'on observe une diminution de la quantité de globules rouges ayant une teneur en HbF 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel le seuil de référence est de 2 pg ou plus, par exemple 3 pg, par exemple 4 pg, par exemple 5 pg, par exemple 6 pg, par exemple 7 pg, par exemple 7,5 pg.