Brevet FR3061913A1 — publié le 20180720

Milieu de culture sélectif polyvalent pour l'isolement et la sélection de bactéries résistantes à la colistine et à la vancomycine. La présente invention concerne un nouveau milieu de culture permettant la croissance de bactéries multi-résistantes de fort intérêt clinique. Il est en effet capable d'isoler et de sélectionner les bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine telles que des entérobactéries ainsi que les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine telles que des entérocoques, à partir d'échantillons cliniques ou de souches bactériennes. Ce milieu présente également la propriété de pouvoir isoler des souches bactériennes à Gram-négatif habituellement présentes dans les prélèvements pulmonaires des patients atteints par la mucoviscidose. Les infections causées par des entérobactéries multi-résistantes et les Entérocoques résistants à la vancomycine représentent un problème majeur de santé publique à travers le monde. Les Entérobactéries (à savoir la famille des Enterobacteriaceae) sont fréquemment rencontrées en pathologie infectieuse. Elles sont les hôtes de l'homme et des animaux chez lesquels elles résident principalement au niveau de l'intestin. On peut cependant les retrouver dans la cavité buccale, les régions humides de la peau en particulier le périnée, les fosses nasales et les voies génitales féminines dans lesquelles elles peuvent constituer une flore transitaire. L'espèce Escherichia coli y joue un rôle prépondérant en raison de sa présence constante et de sa large prédominance sur les autres espèces. D'autres espèces comprennent des Entérobactéries pathogènes des genres Proteus et Klebsiella ainsi que Citrobacter, Hafnia, Pro videncia, Enterobacter, Morganella, et Yersinia. Klebsiella pneumoniae et Escherichia coli à elles deux représentent 90% des infections par des entérobactéries. L'émergence mondiale d'Entérobactéries multirésistantes, en particulier des bactéries productrices de carbapénèmases, a conduit à la réutilisation de la colistine en tant que traitement antibiotique de dernier recours (1-3) contre les Entérobactéries pathogènes. La colistine (ou polymyxine E), un produit obtenu par fermentation de Paembacillus polyrnyxa, est constituée de composés peptidiques polycationiques à savoir la Colistine A de formule (la) laquelle comprend une chaine d'acide gras: (S)-6-methyloctanoyl et la colistine B de formule (lb) ci-après laquelle comprend (chaine d'acide gras: 6-methylheptanoyI)(4). Il s'agit d'une classe d'antibiotique développée dans les années 1950. La Colistine est 3061913 2 administrée soit par voie parentérale sous la forme d'une prodrogue inactive : le colistiméthate de sodium (CMS), soit par voie orale ou topique sous forme de sulfate de colistine. Au cours des 10 dernières années, l'utilisation de la colistine s'est généralisée, 5 entraînant l'apparition de résistances à la colistine (1, 3). Ce phénomène s'est particulièrement illustré chez les animaux en raison de l'utilisation intensive de la colistine dans les aliments vétérinaires dans de nombreux pays (2, 5, 6). On a constaté l'émergence de résistances acquises par mutation chromosomique spontanée vis à vis de la colistine. La colistine est un antibiotique qui possède un fort pouvoir d'induction spontanée de mutants 10 résistants au sein d'une même population bactérienne. Le mécanisme de résistance des souches intrinsèquement résistantes à la colistine est différent de celui de souches non intrinsèquement résistantes à la colistine mais résistantes à la colistine de façon acquise par mutation chromosomique spontanée (non transférable) ou par l'acquisition d'un plasmide de résistance (transférable de bactérie à bactérie). Les 15 différents mécanismes conférant la résistance aux polymyxines, notamment à la colistine aboutissent à la modification du lipide A, un constituant du lipopolysaccharide (LPS), entraînant une réduction de l'affinité des polymyxines aux agents pathogènes (7). Jusqu'à récemment, tous les gènes de résistance à la colistine connus étaient d'origine chromosomique (8). 20 Liu et ses collègues ont rapporté le premier mécanisme de résistance à la colistine à médiation plasmidique, qu'ils ont appelé gène mcr-1 (6), suivi récemment par le gène mcr-2 et les variants de mcr-1 (9). Ces gènes plasmidiques codent pour une phosphoéthanolamine transférase capable de modifier le lipide A en lui ajoutant une phosphoéthanolamine, réduisant ainsi les 25 interactions électrostatiques entre la colistine et le LPS (6). L'étude originale a rapporté la forte capacité de transfert in vitro de mcr-1, suggérant que ce gène de résistance est susceptible de se propager rapidement parmi les principaux pathogènes humains (10-12). Cette découverte soulève ainsi des inquiétudes en raison de l'absence de mise sur le marché de nouveaux antibiotiques. La recherche du gène mcr-1 a été effectuée sur des souches 30 dont le mécanisme de résistance était inconnu et un nombre important d'entre elles le possédait (13-14). Il est important de détecter cette résistance à la colistine car le cas échéant les 3061913 3 cliniciens doivent adapter le traitement et isoler le patient. Le développement d'une méthode efficace de détection précoce de ces souches résistantes à la colistine est ainsi devenu une priorité (15-17). La majorité des bactéries possédant le gène mcr-1 ont une faible Concentration 5 Minimale Inhibitrice (CMI) de colistine, de l'ordre de 4 - 8 pg/mL (5). Les bactéries intrinsèquement résistantes à la colistine ont une CMI supérieure à 16 pg/mL. Actuellement, les milieux de culture pour sélectionner les bactéries résistantes à la colistine sont adaptés pour isoler des bactéries intrinsèquement résistantes (à l'exception du milieu Superpolymyxin), c'est à dire fortement résistantes à une CMI supérieure à 16 pg/mL 10 et ils n'ont pas de caractère polyvalent, ils ne permettent pas de sélectionner les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine en particulier. En outre, les milieux sélectifs pour Entérobactéries comprennent du lactose afin de les sélectionner sélectivement par rapport aux autres bactéries à Gram-négatif (non fermentantes). 15 Les milieux de culture commerciaux disponibles contenant des polymyxines ne permettent pas l'isolement de bactéries faiblement résistantes à résistance acquise du type mcr-1 (voir Tableau 1 ci-après en annexe), excepté un nouveau milieu de culture sélectif pour l'isolement des bactéries à Gram-négatif résistantes aux polymyxines, nommé SuperPolymyxin, comprenant une gélose EMB (éosine et bleu de méthylène) et contenant 20 3,5 pg/mL de colistine, 10 pg/mL de daptomycine et 5 pg/mL d'amphotéricine B et 10 g/ de lactose(23) (voir Tableau 1 ci-après en annexe). La quasi-totalité des bactéries à Gram-positif sont résistantes à la colistine. En conséquence, pour sélectionner sélectivement les bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine notamment ayant le gène de résistance mcr-1, le milieu de culture SuperPolymyxin 25 comprend un antibiotique anti-Gram-positif, à savoir la daptomycine (18). Un inconvénient du milieu Superpolymyxin est qu'il ne permet pas d'isoler et sélectionner les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine du fait que la daptomycine inhibe la plupart des bactéries résistantes à la vancomycine. En outre, si on remplace la daptomycine par la vancomycine dans le milieu 30 SuperPolymyxin, les bactéries Escherichla coli possèdant le gène mcr-1 ne poussent plus. Le milieu perd donc la capacité de sélection des principales bactéries résistantes à la colistine 3061913 4 que sont les E. coli ce qui explique le choix de la daptomycine dans le milieu Superpolymyxin. Les auteurs Nordmann et al (18) suggèrent que la combinaison de colistine et vancomycine inhibe la sélection de bactéries à Gram-négatif. Un premier but de la présente invention est de fournir un milieu de culture amélioré 5 de sensibilité suffisante pour isoler non seulement les bactéries à Gram-négatif, notamment les Entérobactéries, fortement et intrinsèquement résistantes à la colistine mais également les bactéries plus faiblement résistantes à résistance acquise à la colistine. Un autre but de la présente invention est également de fournir un milieu de culture apte à détecter en outre des bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine, 10 notamment les Entérocoques sans nuire à l'aptitude du milieu à détecter les bactéries résistantes à la colistine. Il est important de détecter ces deux résistances car la colistine et la vancomycine sont des antibiotiques de dernier recours et si des souches résistantes à ces deux antibiotiques se propagent dans un hôpital on risque de ne plus pouvoir traiter les patients. Il est donc primordial de détecter ces bactéries afin de pouvoir isoler les patients 15 porteurs. Les milieux sélectifs pour les bactéries à Gram-positif sont en général des géloses enrichies au sang sans chromogène sans sucre et additionné d'antibiotique anti Gram-négatif tels que le milieu étudié ci-après :CNA ( colistine-acide nalidixique)/esculine). Un autre inconvénient du milieu Superpolymyxin est qu'il ne permet pas d'isoler et de 20 sélectionner efficacement certaines bactéries à Gram négatif présentes dans les prélèvements pulmonaires de patients atteints de mucoviscidose (voir tableau E ci-après). Un autre but de la présente invention est de fournir un milieu de culture sélectif qui permet d'isoler les bactéries retrouvées dans les prélèvements pulmonaires de patients atteints de mucoviscidose de façon plus performante. 25 D'autre part, certaines des souches naturellement résistantes à la colistine testées comme contrôle ont été inhibées sur le milieu SuperPolymyxin, notamment des souches de Morganella morganii et Providencia alcalifaciens. Un autre inconvénient du milieu Superpolymyxin est qu'il ne permet de bien visualiser les colonies car celles-ci apparaissent en rose sur fond rouge du fait du chromogène EMB. 30 Un autre but de la présente invention est de fournir un milieu de culture qui fournisse une meilleure visibilité des colonies de bactéries après culture, et de surcroit une visibilité 3061913 5 différentiée entre les bactéries à Gram-positif et bactéries à Gram-négatif. Dans Nordmann et al (18) les auteurs n'ont pas démontré la capacité de sélection sur les dites bactéries par culture d'échantillons biologiques directement sans préparation préalable des bactéries et notamment des échantillons de selles. 5 Un autre but de la présente invention est de fournir un milieu qui permettent d'isoler et de sélectionner les dites bactéries par culture d'échantillons biologiques directement sans préparation préalable des bactéries et notamment des échantillons de selles pour la sélection des Entérobactéries résistantes à la colistine et des Entérocoques résistants à la vancomycine. 10 Pour ce faire, la présente invention fournit un milieu de culture solide sélectif polyvalent pour isoler et sélectionner, à partir d'échantillons en contenant, des bactéries choisies parmi (a) les bactéries à Gram-négatif fermentantes et non fermentantes résistantes à la colistine et (b) les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine, caractérisé en ce qu'il est constitué essentiellement d'une gélose d'agar additionnée d'un agent 15 chromogène consistant dans du pourpre de bromocrésol, un sucre et de deux composés antibiotiques consistant dans la vancomycine et la colistine. La présence de vancomycine permet d'éviter la contamination des cultures par des souches à Gram-positif présentes dans des échantillons cliniques et confère aussi une 2ième sélectivité très intéressante au milieu à savoir l'isolement des bactéries résistantes à la 20 vancomycine. On a découvert de façon surprenante et non élucidée que la mise en oeuvre d'une combinaison de colistine et vancomycine dans un milieu de culture permet la double sélectivité revendiquée avec les propriétés avantageuses conformes à tous les buts de l'invention sous réserve de mettre en oeuvre un agent chromogène spécifique à savoir 25 l'agent chromogène le Pourpre de Bromocrésol. En particulier, avec les autres chromogènes et cette combinaison d'antibiotiques, certaines des bactéries sensibles à la colistine ou à la vancomycine concernées poussaient et/ou certaines bactéries résistantes à la colistine ou à la vancomycine concernées étaient inhibées. Le pourpre de bromocrésol, ou bromocrésol pourpre, ou violet de bromocrésol, ou 30 « purple » nommé plus complètement « 5',5"-dibromo-o-crésolsulfonephthaléine », est un colorant de la famille des sulfonephtaléines. 3061913 6 De préférence, dans le milieu selon l'invention, le dit sucre est du glucose. L'agent chromogène pourpre de bromocrésol combiné au glucose dans de l'agar permet en outre de mieux identifier les colonies de bactéries à Gram négatif aussi bien les bactéries fermentantes (Entérobactéries) que les bactéries non fermentantes ainsi que les 5 bactéries à Gram-positif par une couleur contrastée jaune sur fond violet plus contrastée dans tous les cas. En outre, le glucose comme substrat glucidique de fermentation permet une différenciation de l'aspect des colonies des bactéries à Gram-négatif, notamment d'Entérobactéries, celles-ci étant de tailles plus importantes, à savoir de 2-3mm, que les 10 colonies d'Entérocoques de tailles plus petites à savoir de 0.1-1mm. Plus particulièrement, un milieu de culture selon l'invention comprend dans de l'eau des concentrations de: - 2 à 10% en poids en agar contenant de 0.01 à 0.1% de dit agent chromogène pourpre de bromocrésol, 15 - 0.1 à 10% en poids de sucre, de préférence de glucose, - 2 à 8 pg/mL de sulfate de colistine, et - 25 à 100 pg/mL de vancomycine. Plus particulièrement encore, un milieu de culture selon l'invention comprend : - 3.1% en poids en agar contenant de 0.065% de bromocrésol pourpre, 20 - 0.75% de glucose, - 4.pg/mL de sulfate de colistine, et - 50.pg/mL de vancomycine. La présente invention fournit également une méthode d'isolement et de sélection de bactéries choisies parmi (a) les bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine, (b) les 25 bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine, caractérisé en ce qu'on réalise une culture d'un d'échantillon biologique en contenant, de préférence un échantillon de prélèvement clinique, à l'aide d'un milieu de culture sélectif polyvalent solide selon l'invention. 3061913 7 Dans un premier mode de réalisation, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont des Entérobactéries. Plus particulièrement, les dites entérobactéries pathogènes sont choisies parmi les bactéries suivantes Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Providencia, 5 Morganella, Citrobacter, Hafnia et Yersinia Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine comprennent Escherichia co/i, Klebsiella pneurnoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Salmonella enterica, Proteus rnirabilis, Proteus vulgaris, Providencia alcalifaciens, Providencia rettgen; Morganella 10 rnorganllet Serratia rnarcescens. Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine comprennent Escherichia coli. Dans un autre mode de réalisation, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont des bactéries présentes dans les prélèvements cliniques, de préférence des 15 prélèvements pulmonaires, de patients atteints par la mucoviscidose. Plus particulièrement, les dites bactéries présentes dans les prélèvements cliniques des patients atteints par la mucoviscidose sont choisies parmi : - les bactéries naturellement résistantes à la colistine suivantes : Burkholderia cepacia, Chtyseobacteriurn gleurn, Chtyseobacteriurn oranirnense, Chtyseobacteriurn 20 indologenes, Inquilinus limosus, Pandoraea pulrnonicola, Brevundirnonas &minuta, Shewanella xianernensis, Shewanella putrefaciens et Ochrobactrurn anthropi ; et - les bactéries ayant une résistance acquise à la colistine suivantes : Acinetobacter pitti; Acinetobacter nosocornialis, Achrornobacter xylosoxidans, Stenotrophornonas rnaltophilia, Pseudornonas aeruginosa et Acinetobacter baurnannll 25 Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont choisies parmi (il) des bactéries naturellement résistantes à la colistine, (i2) des bactéries résistantes à la colistine de façon acquise par mutation chromosomique spontanée et (i3) des bactéries résistantes à la colistine par l'acquisition d'un plasmide de résistance contenant le gène mcr-1 ou un autre gène pouvant conférer la résistance à la 30 Colistine. 3061913 8 Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont choisies parmi des bactéries résistantes à la Colistine par l'acquisition d'un plasmide de résistance contenant le gène mcr-1. Dans un autre mode de réalisation, les dites bactéries sont des bactéries à Gram- 5 positif résistantes à la vancomycine choisies parmi : - les bactéries ayant une résistance acquise à la vancomycine des genres Staphylococcus et Enterococcus, et - les bactéries naturellement résistantes à la vancomycine des genres Pediococcus, Weissela, Lactobacillus et Leuconostoc. 10 Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram positif résistantes à la vancomycine sont choisies parmi les bactéries des genres suivants : Staphylococcus aureus, Enterococcus faechirn, Enterococcus faecalis, Enterococcus gallinarurn, Leuconostoc lactis, Weissela clbarla et Weissela confusa. Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-positif résistantes à la 15 vancomycine sont des Entérocoques. Plus particulièrement encore, on réalise une culture d'un échantillon de prélèvement clinique, de préférence de selles. Plus particulièrement encore, un procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes consistant à: 20 a) inoculer ledit milieu de culture avec un échantillon comprenant des dites bactéries; b) incuber ledit milieu de culture inoculé dans des conditions appropriées pour la croissance des dites bactéries présentant une dite résistance à la colistine ou à la vancomycine, de préférence pendant 24 heures à 48 heures, de préférence de 24 à 36 heures, et 25 c) détecter les colonies formées sur ledit milieu inoculé et cultivé, lesdites colonies contenant lesdites bactéries qui présentent une dite résistance. Selon la présente invention, il a été démontré que le milieu selon l'invention est capable d'isoler toutes les souches à Gram-négatif résistantes à la colistine que ce soit de 3061913 9 haut niveau (CMI élevée) ou de bas niveau (CMI faible) et ayant une résistance intrinsèque ou acquise et avec une sensibilité de 100%. Le milieu selon l'invention peut être utilisé comme outil de dépistage sur des échantillons de selles positifs en PCR pour le gène mcr-1, et permet ainsi l'isolement de 5 nouvelles souches résistantes porteuses du gène mcr-1. Cet isolement est facilité sur le milieu selon l'invention, en raison de la couleur jaune des colonies correspondant aux Entérobactéries recherchées. La culture sur le milieu selon l'invention de ces échantillons permet d'isoler des bactéries à Gram-positif naturellement résistantes à la vancomycine telles que Pediococcus, 10 Lactobacillus, Weissela, mais également des Entérocoques résistants à la vancomycine qui constituent des bactéries d'intérêt clinique. Le milieu selon l'invention a également montré une sensibilité de 100% pour l'isolement de ces bactéries, reconnaissables par leurs colonies, de couleur contrastée avec le glucose (jaune sur fond violet) également, mais plus petites (0.1-1mm) que les entérobactéries (2-3mm). 15 Sur le milieu SuperPolymyxin, seules les E. coli sont efficacement différenciables avec un reflet métallique, toutes les autres souches sont rouges/rosées sur gélose rouge. Ce milieu de culture permet l'isolement des bactéries dans les prélèvements pulmonaires des patients atteints de mucoviscidose d'efficacité comparable au milieu Cepacia de référence pour ces bactéries. 20 Enfin, en termes de couts, la comparaison des prix des géloses est inférieure pour le milieu selon l'invention par rapport aux milieux SuperPolymyxin et Cepacia. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lumière de la description détaillée qui va suivre faite en référence à la figure 1 qui illustre les aspects des colonies obtenues par culture d'un échantillon clinique de selle (écouvillon rectal) 25 sur milieu LBJMR selon l'invention pour les bactéries A= E. coli; B= K. pneurnonlae et C= E. faecium. Les espèces des colonies ayant différents aspects A (2 grosses colonies d' E. col') et B (15 colonies de tailles moyennes de K. pneumoniae) sont résistantes à la colistine (CMI de 2 et 64 pg/mL, respectivement), et C ( toutes les petites colonies d' .E. faeciurn) est résistante à la vancomycine avec une CMI>256 pg/mL. 30 1- Matériels et méthodes 1-1 Souches bactériennes et échantillons 3061913 10 Un ensemble de 102 souches d'Entérobactéries a été utilisé, parmi lesquelles 76 souches possèdent une résistance acquise à la colistine (1, 19-21) dont 33 souches avec le gène mcr-1 (22-25), 6 souches sont naturellement résistantes et 20 souches sont sensibles à la colistine (Tableau 2 ci-après en annexe). Cet ensemble de 102 souches comprend 31 5 souches de E. coli, 35 souches de Klebsiella pneumoniae. Les gènes de résistance connus éventuellement impliqués ont été séquences comme décrit précédemment (1). La détection par PCR du gène mcr-1 a été réalisée comme décrit par Chabou et al. (15). Cet ensemble comprenait également 26 souches de bactéries à Gram-positif, incluant 8 Entérocoques résistants à la vancomycine (ERV) (26), 3 genres intrinsèquement résistants 10 et 15 souches sensibles (27) (Tableau 2 ci-après en annexe). Les gènes de résistance à la vancomycine vanA et vanB ont été recherchés par PCR comme précédemment décrit sur les souches résistantes (28). Un ensemble de 1073 échantillons de selles a été utilisé, dont 899 d'origine humaine et provenant de différentes régions du monde : Marseille, France (212), Angers, France 15 (128), Thaïlande (212), Laos (189), Nigeria (143), Sénégal (15). Les autres échantillons étaient d'origine animale : poulets d'Algérie (10), rongeurs du Cambodge (21) et du Laos (60), cochons (16) et chèvres (46) du Laos ; et quelques-uns (21) issus de l'environnement du Laos (eau, sol). 1-2 Tests de sensibilité aux antibiotiques 20 Les CMI de la colistine et de la vancomycine ont été déterminées par la méthode des E-test (bioMérieux, Marcy-l'Étoile, France) et évaluées en suivant les recommandations du système expert de l'EUCAST (http://www/eucast.org). Les CMI de la Daptomycine ont également été déterminées par cette méthode pour les 4 souches de référence Enterococcus faecium (DSM 17050, 25698, 25697 et 13590). Des colonies fraîches ont été repiquées sur le 25 milieu Trypticase Soy Agar (TSA, Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne) puis mises en suspension dans l'eau stérile afin d'obtenir une densité optique égale à 0,5 MacFarland (1,5X108 UFC/mL) comme recommandé par l'EUCAST. Dans les premières expérimentations concernant la mise au point du milieu de culture, 10 microlitres de la solution ont été directement étalés avec une ôse sur les différents milieux afin d'obtenir un inoculum 30 bactérien de 106 UFC. Afin d'évaluer les limites de détection de chaque bactérie, des dilutions au dixième en cascade ont été effectuées dans du tampon phosphate (PBS), et 10 pL de chaque dilution ont été déposés sur les géloses. La concentration bactérienne viable a 3061913 11 été calculée par comptage de colonies en les étalant en parallèle sur une gélose TSA pour contrôle. Ces expérimentations ont été menées en duplicat. La croissance ou l'inhibition de ces bactéries a été observée après 24H d'incubation à 37°C. 5 1-3 Développement du milieu LBJMR selon l'invention 1-3-1 Choix de la base d'agar Afin de choisir le milieu le plus adapté à la sélection d'Entérobactéries résistantes à la colistine, dont les souches possédant le gène mcr-1, 8 espèces représentatives ont été cultivées à la quantité de 106 UFC sur cinq milieux de culture additionnés de différentes 10 concentrations de sulfate de colistine (MP Biomedicasl, Illkirch, France), allant de 0 à 32 pg/mL. Les espèces cultivées comprenaient 4 souches de Klebsiella pneumoniae et 4 souches d'Escherichia coli, dont 2 souches sensibles et 2 souches résistantes à la colistine pour chacune de ces deux espèces, comprenant 2 souches d'E. coli possédant le gène mcr-1 (24). 15 Les géloses suivantes ont été préparées en suivant les recommandations du fabricant : Drigalski Lactose Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France), DifcoTM Violet Red Bile Agar (VRBL) (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne), BBLTM Eosin Methylen Blue Agar (EMB) (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne), BBLTM MacConkey II Agar (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne), le DifcoTM Purple Agar Base additionné de 20 lactose (BCP), et le DifcoTM Purple Agar Base additionné de glucose. Il s'agit de milieux de culture bactérienne sélectifs et chromogéniques utilisés habituellement pour l'isolement des Entérobactéries. Leur différenciation est basée sur la fermentation lactique. La composition de ces 5 géloses est explicitée ci-après. a) Milieu Drigalski Lactose Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France) : 25 - agar + bleu de bromothymol et cristal violet ou violet de gentiane + lactose. b) Milieu VRBL (Violet Red Bile Agar) (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne) : - agar+ rouge neutre-cristal violet ou violet de gentiane+ sels biliaires+ lactose. c) Milieu EMB (Eosin Methylen Blue Agar) (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne) : 3061913 12 - agar+ Eosine et bleu de méthylène+ lactose. d) Milieu MacConkey II Agar (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne) : - agar+ cristal violet et rouge neutre +lactose le colorant différentie les bactéries lactose + et lactose - et 5 e) Milieu BCP (Purple Agar Base (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne)) additionné de lactose : - agar + pourpre de bromocresol + lactose. f) Milieu Purple Agar Base (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne)) additionné de glucose : 10 - agar +pourpre de bromocresol + glucose. On entend dans la présente description par « agar », un polymère d'agar-agar à savoir un polymère de galactose (galactane) contenu dans la paroi cellulaire de certaines espèces d'algues rouges appartenant aux familles des Gelidiacées (Gelidhirn et Pterocladia) et des Gracilariacées (Graciaria). 15 1-3-2 Développement du milieu sélectif : choix du sucre fermenté et ajustement de la sélectivité. Pour permettre la sélectivité de toutes les souches résistantes à la colistine, la concentration en colistine a été ajustée à l'aide de 24 souches représentatives de la plupart des résistances à la colistine (5 souches bactériennes intrinsèquement résistantes, 8 souches 20 d'Entérobactéries comportant des résistantes acquises, 7 souches sensibles servant de contrôle et 4 souches à Gram-positif sensibles à la vancomycine). Ces différentes souches ont été inoculées sur gélose Purple agar base additionnée de 7.5 g/L de glucose ou de 10 g/L de lactose (laboratoires Humeau, La Chapelle-sur-Erdre, France), et à des concentrations différentes de colistine (0, 4 ou 8 pg/mL) et de 25 vancomycine (0 ou 50 pg/mL). Pour la sélectivité des souches résistantes à la vancomycine, la concentration de vancomycine a ensuite été adaptée en utilisant 26 souches représentatives de la résistance à la vancomycine (3 genres bactériens intrinsèquement résistants, è souches d'Entérocoques résistantes (VRE), et 15 souches sensibles) (Tableau 2 en annexe), sur des géloses calibrées 3061913 13 à 4 pg/mL de colistine et avec des concentrations croissantes de vancomycine (0, 12.5, 25, 50 et 100 pg/mL). Ces différentes concentrations ont également été évaluées avec l'ensemencement de 10 selles. 1-3-3 Isolement de souches mcr-1 à partir d'échantillons de selles. 5 Dix échantillons de selles de poulet en provenance d'Algérie, précédemment criblés en RT-PCR pour le gène mcr-1 (5 selles positives et 5 selles négatives) ont été utilisées (12, 13). Une étape préalable d'enrichissement a été effectuée en inoculant environ 1 g de selle dans un bouillon Trypticase Soja (TSB) (bioMérieux, Marcy-l'Étoile, France), ensuite incubé pendant 24h à 37°C (1). 100 pL de chaque bouillon pur ou dilué ont été déposés puis étalés 10 au râteau sur la gélose Purple agar base additionnée de 7,5 g/L de glucose, 4 pg/mL de colistine et 0, 25, 50, 100 ou 200 pg/mL de vancomycine, incubée à 37°C. Chaque colonie présentant une morphologie différente a été isolée sur TSA, puis les espèces ont été identifiées par spectrométrie de masse du type MALDI-TOF MS. Pour chaque entérobactérie, la CMI de la colistine a été déterminée par E-test. La présence de mcr-1 a 15 été recherchée par PCR pour chaque isolat résistant à la colistine. 1-4 Évaluation du milieu LBJMR selon l'invention. 1-4-1 Sensibilité et Spécificité La sensibilité et la spécificité du milieu LBJMR à détecter toutes les Entérobactéries résistantes à la colistine que ce soit naturellement ou pas acquisition de cette résistance, ont 20 été évaluées sur 76 souches d'Entérobactéries résistantes à la colistine figurant dans la Table 2. Pour la sélectivité du milieu à détecter les souches à Gram-positifs résistantes à la vancomycine, 11 souches de bactéries à Gram-positifs résistantes à la vancomycine ont été utilisées. 25 Et, pour l'analyse des souches des espèces bactériennes présentes dans la mucoviscidose, 15 souches ont été utilisées. Les bactéries ont été ensemencées à 104 UFC sur le milieu LBJMR et sur le milieu TSA en parallèle comme témoin de croissance. 1-4-2 Dépistage sur des prélèvements cliniques. 3061913 14 Les ADN de 1063 selles ont été analysés par PCR en temps réel, les positifs ont ensuite été confirmés par PCR standard. Les échantillons dont les ADN ont été positifs pour mcr-1 ont ensuite été ensemencés sur milieu LBJMR. Les souches positives obtenues ont été conservées à -80°C. 5 1-5 Comparaison entre le milieu LBJMR et d'autres milieux sélectifs contenant des polymyxines. 1-5-1 Sensibilité et spécificité. Pour effectuer ces tests, 30 souches possédant le gène mcr-1, 10 souches d'Entérobactéries sensibles à la colistine et 41 souches résistantes (intrinsèque et acquise) 10 ont été utilisées. Les milieux de culture LBJMR et SuperPolymyxin (19), ont été comparés à d'autres milieux de culture dont le milieu Columbia ANC + 5% de sang de mouton (bioMérieux, Marcy-l'Étoile, France) utilisé pour l'isolement des streptocoques, le milieu Cepacia utilisé pour l'isolement de Bulkhoderla cepacia et le milieu EMB (Sigma-Aldricht, Saint-Louis, USA) qui est ici utilisé comme contrôle et qui sert usuellement à l'isolement des 15 coliformes. Les limites de détection ont été déterminées comme décrit précédemment (19). Enfin, 8 souches d'Entérocoques résistantes à la vancomycine, 3 souches d'espèces bactériennes intrinsèquement résistantes à la vancomycine, 10 souches d'Entérocoques sensibles à la vancomycine, ainsi que les 20 souches bactériennes correspondantes aux prélèvements de patients atteints de mucoviscidose ont été inoculées sur le milieu LBJMR et 20 le milieu SuperPolymyxin de la même manière. 1-5-2 Dépistage sur des prélèvements. Afin de comparer la sélectivité des milieux SuperPolymyxin et LBJMR, 10 selles humaines en provenance de Thaïlande ont été mises en culture. 5 d'entre elles ont donné des cultures positives sur le milieu LBJMR, 5 d'entre elles sont négatives par PCR. 25 1-5-3 Analyse comparative du milieu LBJMR et du milieu SuperPolymyxin. Afin d'évaluer et de comparer la composition des milieux LBJMR et SuperPolymyxin, 3 géloses de milieu LBJMR ont été modifiées en mélangeant les composants de ces deux milieux : remplacement de la base Purple agar base par l'EMB, remplacement de la vancomycine par la daptomycine (10pg/mL), ajout de l'amphotéricine B (5pg/mL) afin 30 d'étudier leurs effets sur la croissance des Entérobactéries. 30 souches mcr-1 ont été 3061913 15 ensemencées sur ces trois milieux en parallèle du milieu LBJMR, du milieu Superpolymyxin et du milieu EMB seul. Un test complémentaire a ensuite été effectué pour étudier le changement de base d'agar en créant un milieu SuperPolymyxin modifié avec remplacement de l'EMB par le 5 Purple agar base. Ce milieu a été comparé par l'ensemencement de 8 souches mcr-1 (6 souches E. collet 2 souches K. pneurnoniae), avec le milieu LBJMR, le milieu SuperPolymyxin et le milieu LBJMR modifié par remplacement de son agar. Enfin, différentes souches ont été inoculées à 104 UFC sur les géloses des milieux LBJMR, SuperPolymyxin et EMB seul ou additionné soit de colistine (4 pg/mL), soit de 10 vancomycine (50 pg/mL), soit des deux. Ces souches étaient composées de 15 souches possédant le gène mcr-1 (5 souches de K. pneurnoniae et 10 souches d' E. cou), 5 souches résistantes à la colistine mais par un autre mécanisme (5 souches d'E. coli) et 10 souches sensible à la colistine afin de voir si toutes les souches résistantes à la colistine étaient présentes sur les 2 géloses. En parallèle, ont été testées 7 souches d'Entérocoques résistants 15 à la vancomycine et 10 souches d'Entérocoques sensibles à la vancomycine afin de voir si les géloses permettent une sélectivité des souches résistantes à la vancomycine. 1-5-4 Analyses statistiques. Les données ont été analysées par un test du Chi2 pour une comparaison appariée de la nouvelle gélose sélective et du milieu Cepacia. La signification a été évaluée à p 2 pg/mL) ne l'étaient pas (Tableau 3 en annexe). Les autres milieux testés ont été éliminés car avec 8 pg/mL de colistine, le milieu MacConkey a permis la croissance des souches sensibles, et certaines 30 souches résistantes ont été inhibées sur les milieux Drigalski, EMB et VRBL. 3061913 16 Les différentes couleurs des colonies sur la gélose Purple agar base, violet ou jaune, en fonction de la fermentation du glucose étaient intéressantes pour une identification rapide des Entérobactéries présentes dans les échantillons cliniques (Figure 1). Les essais ont ensuite été réalisés sur gélose Purple agar base avec l'ajout de 4 ou 8 pg/mL de colistine et 5 de vancomycine afin d'inhiber les bactéries Gram-positives. 2-1-2 Développement du milieu sélectif. Les tests réalisés sur les 24 souches ont donné les résultats recherchés uniquement pour le Purple agar base ajouté à 4 pg /mL de colistine et 50 pg/ml de vancomycine. En effet, les souches résistantes à la colistine ne sont pas affectées par la présence des deux 10 antibiotiques, alors que les souches sensibles le sont (Tableau A). Tableau A: Développement du milieu sélectif pour les souches résistantes à la colistine. (+) Croissance (-) Pas de croissance Souches bactériennes CMI de Agar Purple agar base additionné de colistine + colistine vancomycine (pg/mL) (1..tg/mL) 0 0+50 4 + 0 4 + 50 8 + 0 8 + 50 Souches naturellement résistantes à la colistine M. morganii PM102 >256 P. mirabilis FH112 >256 + + + + + + P. vulgaris >256 + + + + + + P. alcalifaciens TH44 >256 + + + + + + S. marcescens El3 128 + + + + + + Résistance acquise à la colistine E. aerogenes 1509 >256 + + + + + + E. asburiae LH74 >256 + + + + + + E. cloacae NH52 >256 + + + + + + K. pneumonia LH140 96 + + + + + + K. pneumonia TH224 4 + + + + + + E. cou i LH257 6 + + + + + + E. coli P17 4 + + + + + + S. enterica 100RC3 8 + + + + + + Souches sensibles à la colistine K. 16neumonia TH20 0.125 + + P. vulgaris P100 0.94 + + S. enterica 0.94 + + 3061913 17 E. asburiae P113 0.19 + + E. cloacae NH151 0.50 + + E. cloacae NH74 0.38 + + E. cou i 169 0.096 + + Souches à Gram-positif Staphylococcus aureus >256 + - + - + Enterococcus faecium >256 + - + - + Enterococcus faecalis >256 + - + - + Enterococcus gallinarum >256 + - + - + Pour la mise au point de la sélectivité des souches résistantes à la vancomycine, la vancomycine a été fixée à 50 pg/mL après le test sur les 17 souches d'Entérocoques. En effet, à cette concentration la croissance des souches à Gram-positifs résistantes à la 5 vancomycine (CMI>4 pg/mL) est réalisée mais permet l'inhibition des souches sensibles. Le glucose a été choisi comme substrat glucidique de fermentation en raison de sa meilleure différenciation entre les différentes espèces (les colonies résistantes étaient jaunes contrastées sur fond violet). La préparation finale du milieu LBJMR selon l'invention est présentée dans le tableau 10 B. Tableau B: Composition du milieu LBJMR. Concentration Composés Solutions Quantité finale Purple Agar Base 31 g 31 g/L (3,10%) Glucose 7,5 g 7,5 g/L (0,75 °h) Eau distillée 991 mL Sulfate de Colistine 1 mg/mL 4 mL 4 pg/mL Vancomycine 10 mg/mi 5 mL 50 pg/mL 2-1-3 Isolement de souches mcr-1 à partir d'échantillons de selles. 3061913 18 La mise en culture sur le milieu LBJMR des 10 selles de poulets en provenance d'Algérie a permis l'isolement de souches d'E. coli positives au gène mcr-1 par PCR à partir de 3 des 5 selles positives pour mcr-1. Les seuils de positivité (Ct) des échantillons étaient 26.32, 29.09 et 30.56 avec le système d'amorces PE1, 26,56, 29,8 et 31 avec PE2 (12), et 5 les CMI en colistine de 4, 3 et 4 pg/ml, respectivement pour les souches isolées. Parmi elles, seul l'isolat 235 avait préalablement été détecté sur le milieu Cepacia (13). Les 2 autres selles positives pour mcr-1, avec des valeurs de Ct largement supérieures à 30 cycles obtenues avec les deux systèmes PCR, n'ont pas permis l'isolement d'Entérobactérie, comme pour les dix selles négatives en PCR. 10 Un test de Fischer a été réalisé pour mettre en évidence la corrélation entre les résultats positifs obtenus par les deux méthodes de détection: RT-PCR et la culture. Le résultat est significatif d'une valeur de 0,02. Il était également important si l'on considère comme positif seulement les deux échantillons positifs avant 30 cycles, avec une valeur p de 0,03. 15 2-2 Évaluation du milieu LBJMR. 2-2-1 Sensibilité et Spécificité. Les 76 Entérobactéries résistantes aux polymyxines ont poussé sur le milieu LBJMR et toutes les bactéries sensibles y ont été inhibées, ce qui lui donne une sensibilité et une spécificité de 100% pour l'isolement des bactéries à Gram-négatifs résistantes à la colistine. 20 L'aspect de ces souches sur le milieu LBJMR est présenté dans la Figure 1. Les 8 Entérocoques résistants à la vancomycine ont pu être détectées sur le milieu LBJMR, contrairement aux Gram-positifs sensibles à la vancomycine ce qui démontre bien la sélectivité du milieu à isoler aussi les bactéries résistantes à la vancomycine. Des souches provenant de prélèvements de patients atteints par la mucoviscidose, 25 ont poussé ce qui confirme bien la possibilité de pouvoir isoler ce type de bactéries également sur le milieu LBJMR (à l'exception des Chlyséobacteriurn qui sont sensibles à la vancomycine). 2-2-2 Dépistage sur des prélèvements cliniques. Parmi les 1063 selles testées, 84 étaient positives en RT-PCR et confirmées en PCR 30 standard. Parmi elles, nous avons mis en culture sur LBJMR les 27 selles qui étaient positives avant 30 cycles en RT-PCR, ainsi que les 24 selles positives entre 30 et 35 cycles et dont les 3061913 19 migrations sur gel après PCR standard étaient les plus marquées. Sur 51 échantillons ainsi mis en culture, 13 sont revenus positifs, permettant l'isolement de 14 souches avec le gène mcr-1, dont 12 souches d'E coll et 2 souches de K pneurnonlae. L'un des échantillons, FHM128, a en effet permis l'isolement de deux souches, une souche d'E collet une souche 5 de K. pneurnonlae. Parmi ces isolats, 4 étaient connus, les souches de K. pneumoniae FHA60 et FHM128, et les souches d'E. coli TH99 et P6, isolées lors de précédentes études sur milieu Cepacia (1,18,19). Le milieu LBJMR nous a permis d'isoler 10 nouvelles souches possédant le gène mcr-1, démontrant ainsi son efficacité supérieure au milieu Cepacia dans la détection des souches résistantes à la colistine même à CMI basses. En effet, les CMI de 10 la colistine de ces souches allaient de 2 à 6 pg/mL. (Le fait qu'il y ait si peu de cultures positives en comparaison du nombre de PCR positives s'explique par le fait que les échantillons ont été conservés à -80°c depuis 3 à 4 ans, les bactéries sont possiblement modes.). 2-3 Comparaison entre le milieu LBJMR selon l'invention et d'autres milieux sélectifs 15 contenant des polymyxines. 2-3-1 Sensibilité et Spécificité par rapport aux autres milieux. Les résultats de tous les milieux testés sont résumés dans le Tableau C. Sur les 33 souches possédant le gène mcr-1, toutes les souches ont poussé sur le milieu LBJMR, le milieu SuperPolymyxin, et le milieu EMB avec une limite de détection de 101 UFC/mL. Les 20 souches sensibles ont été inhibées sur chaque gélose. En revanche, les germes intrinsèquement résistants M. morganii et P. alcalifaciens utilisés comme contrôle ont été inhibés sur SuperPolymyxin. À 104 UFC de bactéries, seulement la moitié des souches possédant le gène mcr-1 sont cultivées sur le milieu Cepacia (tableau D). En considérant les 21 souches possédant le gène mcr-1 mais présentant une CMI faible ( 8 9 (100%) 9(100%) 9(100%) 30 30(100%) 14 (46,7%) 30(100%) Autres* 41 41(100%) 41(100%) 41(100%) * souches résistantes à la colistine mais par un autre mécanisme différent de mcr-1. 2-3-2 Analyse comparative du milieu LBJMR et du milieu SuperPolymyxin. Concernant les Entérocoques résistants à la vancomycine, ils ont été inhibés sur le 5 milieu SuperPolymyxin (car présence de daptomycine) mais pas sur le milieu LBJMR (tableau E). Le milieu LBJMR possède donc comme avantage par rapport au milieu SuperPolymyxin de pouvoir également isoler spécifiquement les souches résistantes à la vancomycine. Enfin, les résultats de culture de selles sur les 2 milieux avaient la même sensibilité pour les souches Gram-négatives résistantes à la colistine mais seul le milieu LBJMR 10 permettait la détection des Gram-positifs résistants à la vancomycine. (Tableau E). Exemple Figure 1: à partir d'un prélèvement biologique positif à Entérococcus faeciurn résistant à la vancomycine, nous avons pu isoler 2 souches d'Entérobactéries sur le milieu LBJMR uniquement et surtout nous avons pu aussi détecter la présence 2 souches dont une de K. pneumoniae et une souche d'E. coll résistantes à la colistine. Le milieu LBJMR a donc permis 15 à partir d'un même prélèvement clinique de détecter à la fois 2 souches à Gram-négatif résistantes à la colistine et une souche à Gram-positif résistante à la vancomycine. Les avantages du milieu LBJMR en comparaison avec le milieu SuperPolymyxin sont : - Sensibilité de 100% pour l'isolement des Entérocoques résistants à la vancomycine ; - Visualisation facile et rapide de la croissance des bactéries d'intérêt ; 20 - Isolement des bactéries présentes chez les patients atteints de mucoviscidose ; - Visualisation facilitée des souches d'E. coll; - Spécificité de 100% pour les germes résistants à la colistine ; et - Possibilité d'isoler sur la même gélose des Entérocoques résistants à la vancomycine et des Bacilles à Gram-négatif résistants à la colistine (Figure 1). 25 Tableau E : Comparaison des géloses et limite de détection des Gram-positifs (UFC/mL) 3061913 22 Souches bactériennes Isolats CMI (pg/mL) : LBJMR Superpolymyxin Gram-positifs résistants à la vancomycine vancomycine E. faecium DSM 17050 >256 10' >105 E. faecium DSM 13590 >256 10' >105 E. faecium DSM 25698 >256 102 >105 E. faecium DSM 25697 >256 10' >105 E. faecium VRE 24 104 >105 E. faecium FHM-VRE1 >256 103 >105 E. faecium FHM-VRE2 >256 10' >105 E. faecalis JH2-2 : Tn 1549 64 103 >105 W. ciba ria P18A >256 10' >105 W confusa P18B >256 10' >105 L. lactis P18C >256 10' >105 Gram-positifs sensibles à la vancomycine vancomycine S. aureus CF_Marseille 1 >105 >105 S. aureus FHM-SA NC >105 >105 E. faecium TH26 0.75 >105 >105 349 0.75 >105 >105 E. faecium TH12 2 >105 >105 E. faecium LH165 0.75 >105 >105 E. faecium A17 0.75 >105 >105 E. faecium TH43 0.75 >105 >105 E. faecium TH95 0.75 >105 >105 E. faecium 282 0.75 >105 >105 E. faecalis JH2-2 : C2 3 >105 >105 E. faecalis JH2-2S 2 >105 >105 E. gallinarum SE3 1.5 >105 >105 E. casseliflavus SE3 1 >105 >105 E. hirae LH111 1.5 >105 >105 Gram-négatifs non-fermentants liés à la mucoviscidose résistantes à la colistine Colistine B. cepacia FHM-BC1 >256 10' 101 B. cepacia FHM-BC2 24 10' 105 A. xylosoxidans FHM-AX 3 10' >105 O. anthropi FHM-OA NC 102 >105 I. limosus FHM-IL >256 104 104 S. maltophilia FHM-SM 12 103 >105 P. pulmonicola FHM-PP >256 10' 103 3061913 23 P. aeruginosa FHM-PACOLR1 >256 101 101 P. aeruginosa FHM-PACOLR2 NC 105 >105 P. aeruginosa FHM-PACOLR3 NC 102 >105 S. put refaciens FHM-SP NC 103 >105 A. baumannii AB-COLR1 8 102 10' Gram-négatifs non-fermentants liés à la mucoviscidose sensibles à la colistine P. aeruginosa FHM-PA4 2 >105 >105 P. aeruginosa FHM-PA5 0.50 >105 >105 P. aeruginosa FHM-PA6 0.38 >105 >105 S. xianemensis 111P 0.125 >105 >105 S. xianemensis 111A 0.094 >105 >105 2-3-3 Mise en évidence de la synergie. Les cultures sur les différents milieux composés ont mis en évidence une inhibition systématique des souches d'E. coli positives pour le gène mcr-1 sur la gélose EMB ajoutées à 5 de la colistine et de la vancomycine, alors que les K. pneumoniae étaient bien présentes. Pour les autres milieux LBJMR modifiés, la sensibilité était de 100% pour les souches résistantes à la colistine. Ainsi, une potentielle synergie a été mise en évidence entre les composants de la gélose EMB (éosine et/ou bleu de méthylène) avec les antibiotiques testés (vancomycine et/ou colistine), empêchant la croissance des souches E coli possédant le 10 gène mcr-1 (Tableaux C et F). En explorant cette piste, ce résultat a été imputé à l'effet de la colistine ou de la vancomycine seule. En effet la sensibilité de la gélose EMB additionnée de colistine était de 100% également, tandis que celle qui ne contient que la vancomycine seule a permis la croissance de toutes les Entérobactéries. En revanche, l'addition des deux antibiotiques à la 15 gélose EMB a de nouveau montré l'inhibition des souches d'if. coi/ mcr-1 positive, mais pas de souches d'E coll résistantes à la colistine mais possédant un mécanisme différent (Tableau F). La synergie est donc efficace sur les souches ayant une CMI basse de la colistine, et concerne l'addition de colistine et de vancomycine ensemble avec la gélose EMB. Si l'on ne peut imputer cette inhibition à la seule présence de la vancomycine, on remarque 20 que les souches d'E coll ne donnent plus leur aspect métallique (vert scarabée), mais sont roses comme les souches K. pneurnonlae. Il existe donc une altération due à la vancomycine. Concernant les Gram-positifs, les résultats sont confirmés : le milieu LBJMR est 3061913 24 sensible à 100% pour l'isolement des Entérocoques résistants à la vancomycine, alors que le milieu SuperPolymyxin les inhibe tous (sensibilité des souches à la daptomycine). On relève une sensibilité diminuée de la gélose EMB additionnée de vancomycine seule ou associée avec la colistine. En effet seuls les Entérocoques résistants à la vancomycine avec une 5 CMI>256 pg/mL ont pu être détectées. Enfin, l'ajout seul de colistine n'a pas affecté leur croissance. La composition du milieu LBJMR apparait donc supérieure ici. Tableau F: Étude de synergie entre la colistine, la vancomycine et la gélose EMB. La colistine est la vancomycine ont été ajoutés, seuls ou ensemble, aux mêmes 10 concentrations que dans le LBJMR, 4 et 50 pg/mL, respectivement. Les nombres indiquent le nombre de souches ayant poussé sur les géloses dans chaque catégorie. Souches Nombre LBJMR SP EMB EMB EMB EMB VCN CT VCN CT K pneumoniae mcr-1 5 5 5 5 5 5 5 E. cou i mcr-1 10 10 10 9 9 2 10 E. cou i R non mcr-1 5 5 5 4 4 4 5 E. cou i sensibles 10 0 0 8 0 0 10 E. faecium ERV 6 6 0 4 6 4 6 E. faecalis ERV 1 1 0 0 1 0 1 E. faecium sensible 8 0 0 0 8 0 8 E. faecalis sensible 2 0 0 0 2 0 2 W. cibaria 1 1 0 1 1 1 1 SP : SuperPolymyxin, EMB: Eosine - Methylene Blue, VCN: Vancomycine, 15 CT: Colistine ANNEXE : TABLEAUX 1 à 3 Tableau 1. Comparaison des différents milieux de culture contenant des polymyxines. Composition en antibiotiques : Polymyxine B (B), Colistine (C), Amphotéricine B (AB), 20 Anisomycine (A) Cycloheximide (CH), Nystatine (N) Milieux Composition en agents sélectifs (pg/mL) Utilisation Référence Gram-négatifs Gram- Levures Polymyx Autres positifs me LBJM Ra 4 (C) Vancomycine Gram-négatifs Cette étude 50 colistine- résistants Gram-positifs vancomycine- résistants SuperPolymyxin 3,5 (C) Daptomycine 5 (AB) Entérobactérie Nordmann et 10 s colistine- al., 2016 3061913 25 Bleu de résistantes méthylène 65 Éosine 400 Martin-Lewis Agar 7,5 (C) Triméthoprime 5 Vancomycine 4 20 (A) Neisseria sp. Martin and Lewis, 1977 Thayer-Martin Agar 7,5 (C) Vancomycine 3 2,57(N) Ne/sser/asp. Thayer and Martin, 1966 MTMh Agar 7,5 (C) Triméthoprime 5 Vancomycine 3 2,57 (N) Neisseria sp. Martin and Lester, 1971 NYC` Agar 7,5 (C) Triméthoprime 3 Vancomycine 2 20 (A) Neisseria sp. Fauer et al., 1973 Cepacia 35,7 (B) Ticarcilline 100 Bulkhoderia cepacia Gilligan et al., 1985 OFPBLd Agar 35,7 (B) Bacitracine 2,7 Bulkhoderia cepacia Welch, 1987 Bulkhoderia Cepacia 17.8 (B) Gentamicine 5 Ticarcilline 100 Bulkhoderia cepacia Gillian et al., Agar 1985 Bulkhoderia Cepacia 71.4 (B) Gentamicine 10 Vancomycine 2.5 Bulkhoderia cepacia Henry, 1997 Agar Selectif CNAe 10 (C) Acide nalidixique Streptococcus Ellner et al., 10 sp. et autres 1966 Gram-positifs BCYE f Selective Agar 9,4 (B) Glycine 3000 Vancomycine 1 80 (CH) Legionella sp. Dennis et al., with GPVC9 1984 BCYE Selective Agar with CCVCh 16 (C) Vancomycine 0,5 80 (CH) Legionella sp. Bopp et al., Cefalotine 4 1981 BCYE Agar Selectif avec GPVAI 11,9 (B) Glycine 3000 Vancomycine 1 80 (A) Legionella sp. Ta et al., 1995 BCYE Agar Selectif avec PAVJ 4.76 (B) Vancomycine 0,5 80 (A) Legionella sp. Stout et al., 1982 BCYE Agar Selectif avec PACk 9.52 (B) Cefamandole 2 80 (A) Legionella sp. Edelstein, 2007 BCYE Agar Selectif avec DGVPI 9.4 (B) Glycine 3000 Vancomycine 1 Legionella sp. Murray, 2007 CPCm 66.34 (C) Vibrio sp. Vanderzant and Splittstoesser, 1992 11.9 (B) Campylobacter Agar Butzler 0.3 (C) Novobiocine 5 Cephazoline 15 50 (CH) Campylobacter sp. Butzler, 1973 Bacitracin 337.8 Campylobacter Agar Skirrow 0.3 (B) Triméthoprime 5 Vancomycine 10 Campylobacter sp. Skirrow, 1977 Campylobacter Agar Blaser-Wang 0.3 (B) Triméthoprime 5 Vancomycine 10 2 (AB) Campylobacter sp. Blaser et al, Cefalotine 15 1978 Campylobacter Agar Preston 0.3 (B) Triméthoprime 5 Rifampicine 5 50 (CH) Campylobacter sp. Bolton and Robertson, 1982 Brucella selectif 1 (B) Bacitracine 100 (CH) Brucella spp. Jones and 500 Brinley, 1958 3061913 26 Oxford 20 (C) Fosfomycine 10 Cefotetan 2 400 (CH) Listeria Acriflavine 5 monocytogene Oxford modifié 10 (C) Moxalactam 20 Listeria monocytogene PALCAM n 10 (B) Ceftazidime 8 Listeria spp. Acriflavine 5 MYP° 11.9 (B) Bacillus cereus Middlebrook 7H11 Agar 2.38 (B) Triméthoprime 20 Carbenicilline 50 20 (AB) Mycobacteriac eae SPS° Agar 10 (B) Sulfadiazine 120 Clostridium perfringens TSN° Agar 20 (B) Néomycine 50 Clostridium perfringens SFPr Agar 3,57 (B) Kanamycine 12 Clostridium perfringens LB modifié 2 (C) Vancomycine 50 Gram-négatifs colistine- résistants MacConkey modifié 2 (C) Gram-négatifs colistine- résistants Curtis et al, 1989 Lee et al, 1989 van Nerren et al., 1989 Mossel, 1967 Cohn et al, 1968 Angelotti et al, 1962 Marshall et al, 1965 Shahidi and Ferguson, 1971 Von Wintersdorff et al, 2016 Meinersmann et al., 2016 a LBJMR : Notre milieu de culture, bMTM : Modified Thayer-Martin, NYCc : New York City, d0FPBL : Oxidation/Fermentation, Polymyxine B, Bacitracine, Lactose, eCNA : Colistine, Acide nalidixique, fBCYE : Buffered Charcoal, Yeast Extract, gGPVC : Glycine, Polymyxine B, Vancomycine et Cycloheximide, hCCVC : Cephalotine, Colistine, Vancomycine et Cycloheximide, iGPVA : Glycine, Polymyxine B, Vancomycine et Anisomycin, jPAV : 5 Polymyxine B, Anisomycine, Vancomycine, kPAC : Polymyxine B, Anisomycine, Céfamandole, IDGVP : Dyes, Glycine, Vancomycine, Polymyxine B, mCPC : Cellobiose, Polymyxine B, Colistine, nPALCAM : Polymyxine B, Acriflavine, Lithium, Ceftazidime, Esculine, Mannitol, oMYP : Mannitol, Egg Yolk, Polymyxine B, pSPS : Sulfite, Polymyxine B, Sulfadizine, qTSN : Trypticase , Sulfite, Néomycine, rSFP : Shahidi Ferguson Perfringens. 10 Tableau 2. Liste des souches étudiées et leurs Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) pour la colistine (Gram-négatifs) ou la vancomycine (Gram-positifs). Souches bactériennes Isolats Origine Echantillons CMI Mécanismes Références de résistance Entérobactéries avec une résistance acquise à la colistine Escheri chia colt SE65 Algérie Humain 4 mcr-1 (Berrazeg et al., 2016) 117R Arabie saoudite Humain 4 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) 1R Arabie saoudite Humain 4 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) 1R 2104 Arabie saoudite Humain 4 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) 44A Arabie saoudite Humain 4 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) 6R Arabie saoudite Humain 4 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) 85R Arabie saoudite Humain 4 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) 95R Arabie saoudite Humain 4 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) 96R Arabie saoudite Humain 4 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) 134R Arabie saoudite Humain 3 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) 3061913 27 143R Arabie saoudite Humain 3 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) LH121 Laos Humain 16 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) LH140 Laos Humain 12 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) PhoP E375K LH257 Laos Humain 12 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) LH57 Laos Humain 8 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) PhoP E375K LH1 Laos Humain 6 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) LH30 Laos Humain 6 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) TH214 Thaïlande Humain 6 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) TH99 Thaïlande Humain 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) FHA102 France Humain 12 pmrA A159V (Olaitan et al., 2016) FHM19 France Humain 12 pmrA P7-Q12 (Olaitan et al., 2016) (del 6aa) FHA113 France Humain 12 pmrA T156K (Olaitan et al., 2016) NH94 Nigeria Humain 12 pmrA 192 (Olaitan et al., 2016) insertion TH176 Thaïlande Humain 6 Inconnu (Olaitan et al., 2016) LB4 France Humain 16 Inconnu De cette étude 235 Algérie Poulet 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) SA9 Algérie Poulet 3 mcr-1 De cette étude SE3 Algérie Poulet 3 mcr-1 De cette étude P6 Laos Cochon 6 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) P10 Laos Cochon 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) P17 Laos Cochon 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2016) Klebsiella pneumoniae FHA60 France Humain 8 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain et al., 2016) FHM128 France Humain 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain et al., 2016) 119R Arabie saoudite Humain 3 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016) LH131 Laos Humain 32 mcr-1 mgrB Stop (Olaitan et al., 2014; Rolain et al., 2016) LH61 Laos Humain 24 mcr-1 mgrB Sub (Olaitan et al., 2014; Rolain et al., 2016) LH17 Laos Humain 12 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain et al., 2016) pmrB T157P LH92 Laos Humain 12 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain et al., 2016) LB1 France Humain 32 mgrB Stop Non publié FHM169b France Humain 8 mgrB Stop (Olaitan et al., 2014) LH12 Laos Humain 32 mgrB Stop (Olaitan et al., 2014) pmrA E35A LH74 Laos Humain 12 mgrB sub (Olaitan et al., 2014) NH53 Nigeria Humain 4 mgrB Sub (Olaitan et al., 2014) TH20 Thaïlande Humain 32 mgrB IS1 (Olaitan et al., 2014) TH196 Thaïlande Humain 8 mgrB IS1 (Olaitan et al., 2014) TH28 Thaïlande Humain 8 mgrB IS2 (Olaitan et al., 2014) TH213 Thaïlande Humain 12 mgrB IS3 (Olaitan et al., 2014) LH70 Laos Humain 12 pmrA G53C (Olaitan et al., 2014) TH34 Thaïlande Humain 24 pmrB 5205P (Olaitan et al., 2014) 3061913 28 TH54 Thaïlande Humain 16 pmrB T157P (Olaitan et al., 2014) TH224 Thaïlande Humain 4 pmrB T157P (Olaitan et al., 2014) FHM120b France Humain 64 Inconnu (Olaitan et al., 2014) FHA105 France Humain 24 Inconnu (Olaitan et al., 2014) FHM77 France Humain 8 Inconnu (Olaitan et al., 2014) LH140 Laos Humain 16 Inconnu (Olaitan et al., 2014) LH94 Laos Humain 16 Inconnu (Olaitan et al., 2014) LH375 Laos Humain 12 Inconnu (Olaitan et al., 2014) LH102 Laos Humain 8 Inconnu (Olaitan et al., 2014) TH205 Thaïlande Humain 64 Inconnu (Olaitan et al., 2014) TH68 Thaïlande Humain 64 Inconnu (Olaitan et al., 2014) TH176 Thaïlande Humain 12 Inconnu (Olaitan et al., 2014) TH21 Thaïlande Humain 12 Inconnu (Olaitan et al., 2014) TH114 Thaïlande Humain 8 Inconnu (Olaitan et al., 2014) TH164 Thaïlande Humain 6 Inconnu (Olaitan et al., 2014) TH166 Thaïlande Humain 3 Inconnu (Olaitan et al., 2014) LB3 France Humain 64 Inconnu De cette étude Klebsiella oxytoca FHA41 France Humain 12 mgrB IS 1 (Olaitan et al., 2014; Olaitan and Rolain, 2015) FHA124 France Humain 6 Inconnu (Olaitan et al., 2014) Enterobacter aerogenes EA15090 France Humain >256 PmrA (Diene et al., 2013) Enterobacter asburiae LH74 Laos Humain > 256# Inconnu Non publié Enterobacter cloacae NH131 Nigeria Humain 64# Inconnu Non publié NH132 Nigeria Humain > 256# Inconnu Non publié NH52 Nigeria Humain > 256# Inconnu Non publié SB1 France Humain 2 mcr-1 Non publié Salmonella enterica 65RC Arabie saoudite Humain 16 Inconnu (Olaitan et al., 2015) 10ORC3 Arabie saoudite Humain 8 Inconnu (Olaitan et al., 2015) Entérobactéries avec une résistance intrinsèque à la colistine Proteus mirabilis FH112 France Humain >256 Intrinsèque Proteus vulgaris PV148 France Humain >256 Intrinsèque Providencia alcalifaciens TH44 Thaïlande Humain >256 Intrinsèque Providencia rettgeri H1734 France Humain >256 Intrinsèque Morganella morganii FM102 France Humain >256 Intrinsèque Serratia marcescens E13 Laos Environne ment 128 Intrinsèque Gram-négatifs non fermentants liés à la mucoviscidose Burkholderia cepacia FHM-BC1 France Humain 24 Inconnu FHM-BC2 France Humain >256 Inconnu Chryseobacterium gleum FHM-CG France Humain >256 Intrinsèque Chryseobacterium oranimense FHM-CO France Humain >256 Intrinsèque Chryseobacterium indologenes FHM-CI France Humain >256 Intrinsèque 3061913 29 Brevundimonas diminuta FHM-BD France Humain 32 Inconnu Achromobacter xyloso xidans FHM-AX France Humain 3 Inconnu Stenotrophomonas maltophilia FHM-SM France Humain 12 Inconnu Inquilinus limosus FHM-IL France Humain >256 Intrinsèque Pandoraea pulmonicola FHM-PP France Humain >256 Inconnu Shewanella putrefaciens FHM-SP France Humain NC Intrinsèque Ochromobacter anthropi FHM-OA France Humain NC Intrinsèque Pseudomonas aeruginosa FHM- PACOLR1 France Humain >256 Inconnu FHM- France Humain NC Inconnu PACOLR2 FHM- France Humain NC Inconnu PACOLR3 Autres gram-négatifs non-fermentants résistant à la colistine Acinetobacter baumannii AB-COLR1 France Humain 8 Inconnu AB-COLR2 France Humain NC Inconnu Acinetobacter nosocomia lis ABG13R France Humain NC Inconnu Gram-négatifs sensibles à la colistine Enterobacter asburiae P113 France Humain 0,19 Sensible Enterobacter cloacae NH151 Nigeria Humain 0,50 Sensible NH74 Nigeria Humain 0,38 Sensible Klebsiella pneumoniae CIP 82.91 Humain 0,125 Sensible LB2 France Humain 0,128 Sensible TH2OS Thaïlande Humain 0,125 Sensible TH285 Thaïlande Humain 0,125 Sensible Proteus vulga ris P100 Algérie Humain 0,94 Sensible Salmonella enterica 108R Arabie saoudite Humain 1 Sensible (Olaitan et al., 2015) 122R Arabie saoudite Humain 0,5 Sensible (Olaitan et al., 2015) Escherichia coli ATCC25922 0,094 Sensible CIP 76.24 161 Algérie Poulet 0,094 Sensible 169 Algérie Poulet 0,094 Sensible FHM885 France Humain 0,125 Sensible De cette étude TH134S France Humain 0,094 Sensible De cette étude LH535 Laos Humain 0,094 Sensible De cette étude LH1655 Laos Humain 0,074 Sensible De cette étude TH775 Thaïlande Thaïlande 0,064 Sensible De cette étude 282S Algérie Poulet 0,074 Sensible De cette étude FHM19S France Humain 0,125 Sensible De cette étude Pseudomonas aeruginosa FHM-PA4 France Humain 2 Sensible FHM-PA5 France Humain 0,50 Sensible FHM-PA6 France Humain 0,38 Sensible Shewanella xianemensis 111P France Humain 0,125 Sensible 3061913 30 111A France Humain 0,094 Sensible Acinetobacter nosocomia lis ABG13S France Humain 0,064 Sensible Acinetobacter pitti MK France Humain 0,125 Sensible Gram-positifs résistants à la colistine Enterococcus faecium D5M17050 Allemagne Humain >256 vanA DSM13590 Allemagne Humain >256 vanA DSM25698 Corée du Sud Humain >256 vanA DSM25697 Corée du Sud Humain >256 vanA FHMVRE1 France Humain >256 Sensible De cette étude FHMVRE2 France Humain >256 Inconnu De cette étude VRE France Humain 24 Inconnu Non publié Enterococcus faecalis JH2-2: Tn France Humain 64 vanB (Launay et al., 2006) 1549 Weissela ciba ria P18A Laos Cochon >256 Inconnu De cette étude Weissela confusa P18B Laos Cochon >256 Inconnu De cette étude Leuconostoc lactis P18C Laos Cochon >256 Inconnu De cette étude Gram-positifs sensibles à la vancomycine Staphylococcus aureus CF_Marseill France Humain 1 Sensible (Rolain et al., 2009) FHM-S A France Humain NC Sensible Non publié Enterococcus faecium TH26 Thaïlande Humain 0,75 Sensible De cette étude 349 Algérie Poulet 0,75 Sensible De cette étude TH12 Thaïlande Humain 2 Sensible De cette étude LH165 Laos Humain 0,75 Sensible De cette étude Al7 Algérie Poulet 0,75 Sensible De cette étude TH43 Thaïlande Humain 0,75 Sensible De cette étude TH95 Thaïlande Humain 0,75 Sensible De cette étude 282 Algérie Poulet 0,75 Sensible De cette étude Enterococcus faecalis JH2-2 : C2 Thaïlande Humain 1,5 Sensible De cette étude JH2-25 Thaïlande Humain 1,5 Sensible De cette étude Enterococcus gallinarum 5E3 Algérie Poulet 1,5 Sensible De cette étude Enterococcus casse liflavus 5E3 Algérie Poulet 1,5 Sensible De cette étude Enterococcus hirae LH111 Laos Humain 1 Sensible De cette étude Tableau 3. Comparaison de différentes bases d'agar additionné de colistine à différentes concentrations permettant la détection de souches résistantes à la colistine en incluant les souches ayant une CMI basse. INIZBL , + - + - 0- Géloses testées Purple Agar Base + Glucose MacConkey Drigalski EMB Souches Résistance CMI de 32 0 2 4 8 16 32 0 2 4 8 16 32 0 2 4 8 16 32 colistine à la 0 2 4 8 16 colistine (11g/m1-) E. cou i P17 Ra (mer-1) 4 + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + - E. cou i TH214 R (mcr-1) 6 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - E. cou i 161 Sb 0,128 + - - + + + - + - + - - E. cou i 169 S 0,094 + - + + - - + - + - K. pneumoniae TH28 R (mgrB) 8 +++++ + +++++ + ++- +++++ K. pneumoniae LB1 R 32 + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + K pneumoniae TH2OS S 0,128 + - + + + + - + - + - - K.pneumoniae LB2 S 0,128 + - + + - + - + - a Souches résistantes à la colistine b Souches sensibles à la colistine (+) Croissance bactérienne (-) Pas de croissance bactérienne 3061913 32 Références bibliographiques 1. 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Rolain J-M, François P, Hernandez D, Bittar F, Richet H, Fournous G, Mattenberger Y, Bosdure E, Stremler N, Dubus J-C, Sarles J, Reynaud-Gaubert M, Boniface S, Schrenzel J, Raoult D. 2009. Genomic analysis of an emerging multiresistant Staphylococcus aureus strain rapidly spreading in cystic fibrosis patients revealed the presence of an antibiotic inducible bacteriophage. Biol Direct 4:1. 25 28. Domingo MC, Huletsky A, Giroux R, Boissinot K, Picard FJ, Lebel P, Ferraro MJ, Bergeron MG. 2005. High prevalence of glycopeptide resistance genes vanB, vanD, and vanG not associated with enterococci in human fecal flora. Antimicrob Agents Chemother 49:4784-4786. REVENDICATIONS1. Milieu de culture solide sélectif polyvalent pour isoler et sélectionner, à partir d'échantillons en contenant, des bactéries choisies parmi (a) les bactéries à Gram-négatif fermentantes et non fermentantes résistantes à la colistine et (b) les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine, caractérisé en ce qu'il est constitué essentiellement d'une gélose d'agar additionnée d'un agent chromogène consistant dans du pourpre de bromocrésol, un sucre et de deux composés antibiotiques consistant dans la vancomycine et la colistine. 2. Milieu de culture selon la revendication 1 caractérisé en ce que le dit sucre est du glucose. 3. Milieu de culture selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il comprend dans de l'eau des concentrations de: - 2 à 10% en poids en agar contenant de 0.01 à 0.1% de dit agent chromogène pourpre de bromocrésol, - 0.1. à 10% en poids de sucre, de préférence de glucose, - 2 à 8 pg/mL de sulfate de colistine, et - 25. à 100 pg/mL de vancomycine. 4. Milieu de culture selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comprend : - 3.1% en poids en agar contenant de 0.065% de pourpre de bromocrésol, - 0.75% de glucose, - 4.pg/mL sulfate de colistine, et - 50.pg/mL de vancomycine. 5. Méthode d'isolement et sélection de bactéries choisies parmi (a) les bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine, (b) les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine, caractérisé en ce qu'on réalise une culture d'un d'échantillon de bactéries en contenant, de préférence un échantillon de prélèvement clinique, à l'aide d'un milieu de culture sélectif polyvalent solide selon l'une des revendications 1 à 4. 3061913 36 6. Méthode selon la revendication 5 caractérisé en ce que les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont des Entérobactéries. 7. Méthode selon la revendication 6 caractérisé en ce que les dites Entérobactéries pathogènes sont choisies parmi les bactéries suivantes Escherichia, Shigella, Salmonella, 5 Klebsiella, Enterobacter, Pro videncia, Morganella, Citrobacter, Hafnia et Yersinia 8. Méthode selon la revendication 7 caractérisé en ce que les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine comprennent Escherichia ce Klebsiella pneurnoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Salmonella enterica, Proteus rnirabills, Proteus vulgaris, Prowdencia alcalifaciens, Prowdencia 10 rettgeri, Morganella rnorganllet Serratia rnarcescens. 9. Méthode selon la revendication 8 caractérisé en ce que les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine comprennent Escherichia coli. 10. Méthode selon la revendication 5 caractérisé en ce que les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont des bactéries présentes dans les prélèvements 15 cliniques, de préférence des prélèvements pulmonaires, de patients atteints par la mucoviscidose. 11. Méthode selon la revendication 10 caractérisé en ce que les dites bactéries présentes dans les prélèvements cliniques des patients atteints par la mucoviscidose sont choisies parmi : 20 - les bactéries naturellement résistantes à la colistine suivantes : Burkholderia cepacia, Chlyseobacteriurn gleurn, Chtyseobacteriurn oranirnense, Chtyseobacteriurn indologenes, Inquilinus limosus, Pandoraea pulrnonicola, Brevundirnonas &minuta, Shewanella xianernensis, Shewanella putrefaciens et Ochrobactrurn anthropi ; et - les bactéries ayant une résistance acquise à la colistine suivantes : Acinetobacter 25 pet Acinetobacter nosocornialis Achrornobacter xylosoxidans, Stenotrophornonas rnaltophilia Pseudornonas aeruginosa et Acinetobacter baurnannil 12. Méthode selon l'une des revendications 5 à 11 caractérisé en ce que les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont choisies parmi (il) des bactéries naturellement résistantes à la Colistine, (i2) des bactéries résistantes à la colistine de façon acquise par mutation chromosomique spontanée et (i3) des bactéries résistantes à la colistine par l'acquisition d'un plasmide de résistance contenant le gène mcr-1. 3061913 37 13. Méthode selon la revendication 12 caractérisé en ce que les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont choisies parmi des bactéries résistantes à la Colistine par l'acquisition d'un plasmide de résistance contenant le gène mcr-1. 14. Méthode selon la revendication 5 caractérisé en ce que les dites bactéries sont 5 des bactéries à Gram positif résistantes à la vancomycine choisies parmi : - les bactéries ayant une résistance acquise à la vancomycine des genres Staphylococcus et Enterococcus, et - les bactéries naturellement résistantes à la vancomycine des genres Pediococcus, Weissela, Lactobacillus et Leuconostoc. 10 15. Méthode selon la revendication 14 caractérisé en ce que les dites bactéries à Gram positif résistantes à la vancomycine sont choisies parmi les bactéries suivantes : Staphylococcus aureus, Enterococcus faeciurn, Enterococcus faecalls, Enterococcus gallinarurn, Weissela clbarla et Weissela confusa. 16. Méthode selon la revendication 15 caractérisé en ce que les dites bactéries à 15 Gram-positif résistantes à la vancomycine sont des Entérocoques. 17. Méthode selon l'une des revendications 5 à 11 caractérisé en ce qu'on réalise une culture d'échantillon de prélèvement clinique, de préférence de selles.