Brevet FR3057665A1 — publié le 20180420

La présente invention concerne un appareil pour la coloration automatique des échantillons biologiques sur lames de microscope permettant de réaliser des protocoles de coloration très divers, incluant la phase de déparaffinage des lames, la distribution de réactifs, la pose et la dépose de lamelles sur l'échantillon, et le montage final. L'observation d'échantillons au microscope à des fins d'analyses biologiques nécessite des colorations adaptées à l'examen envisagé. L'objet de l'invention est un automate réalisant la totalité des phases des protocoles de coloration, et permettant d'utiliser des très faibles quantités de réactifs. Il trouve ainsi son application en immunochimie et pour les colorations spéciales. L'appareil selon l'invention est représenté figure 1.11 se compose d'un plateau au-dessus duquel une tête (1) se déplace selon deux axes horizontaux. La tête est munie d'un dispositif de prélèvement à aiguille (7) et d'un dispositif de manipulation à ventouse (8). Le plateau porte les échantillons à colorer (2) ainsi que les réactifs (3). Une zone technique comporte des magasins contenant des lamelles (4), des couvercles (5) et des aiguilles (6). L'une des caractéristiques de l'invention est la possibilité d'utiliser différentes aiguilles pour le prélèvement et la distribution des réactifs. Les aiguilles ont des contenances et des diamètres différents et il est ainsi possible d'optimiser la distribution selon la quantité à délivrer et la viscosité. Le dispositif est illustré par la figure 2. Le tube de prélèvement (1) est relié par un tuyau souple à une seringue motorisée (non figurée). Il est solidaire à son extrémité d'un électroaimant à pôles concentriques (2) pouvant attirer une plaque métallique (3) qui supporte l'aiguille. L'orifice du tube fait face à un joint souple (4) et à l'aiguille. Lorsque l'électroaimant est activé, l'écrasement du joint assure l'étanchéité et permet l'aspiration des liquides à travers l'aiguille. Lorsque l'aimantation cesse, la force exercée par le joint libère la plaque métallique malgré l'aimantation rémanente qui tend à maintenir la plaque collée à l'électroaimant. La figure 3 montre une variante de cette réalisation avec un électroaimant d'une forme différente. Une autre caractéristique de l'invention est le fait que l'une des aiguilles est destinée au prélèvement du liquide de montage, qui est une résine transparente durcissant rapidement à l'air. Selon l'invention, cette aiguille se trouve plongée dans un récipient empli d'un solvant qui dissout la résine et évite son durcissement lorsqu'elle repose à sa position de rangement. Pour minimiser la pollution de l'aiguille, il faut éviter de la plonger profondément dans le réactif prélevé et le dispositif permettant de détecter le niveau de ce liquide est une autre caractéristique de l'invention. Un capteur de pression mesure la pression dans le circuit d'aspiration. Quand l'aiguille descend dans le flacon de prélèvement, la seringue motorisée commence à aspirer. Le capteur de pression détecte la variation de pression qui se produit dès 3057665 - 2 - que le liquide pénétre dans l'aiguille et la descente cesse. Cette variation de pression dépend de la viscosité du liquide et elle est facilement mesurable si l'on a choisi une aiguille du diamètre 5 adéquat. L'aiguille doit être nettoyée après chaque opération. Ce nettoyage est obtenu par aspiration d'eau et injection d'un jet d'air. Une des caractéristiques de l'invention est que le circuit l'aiguille peut être déconnecté de la seringue motorisée et connectée à une source d'air comprimé par l'intermédiaire d'une électrovanne. 10 Le bon fonctionnement de l'appareil et particulièrement le changement d'aiguille supposent un grande précision des mouvements. Un système de positionnement peu coûteux est également une caractéristique de l'invention. Les deux axes horizontaux sont sont munis d'une règle constituée d'une fine feuille en acier portant une série de fentes régulièrement espacés, d'une largeur de l'ordre du millimètre, c'est-à-dire nettement plus grand que la précision recherchée, 15 mais facile à obtenir par exemple par découpe laser. Les axes sont actionnés par des moteur pas- à-pas fonctionnant par micropas, et portent deux capteurs optiques en forme de fourche chevauchant la règle et espacés d'une distance approximativement égale à un nombre impair de fois le demi-intervalle entre deux fentes. La machine connaît ainsi sa position chaque fois qu'un des capteurs passe sur le bord d'une fente. Elle tient à jour une position précise en fonction du 20 nombre de micropas effectuées ensuite. L'accélération et la décélération des moteurs se font en modifiant la durée du micropas chaque fois que l'un des capteurs détecte le bord d'une fente. Lorsqu'on dépose de très petites quantités de réactifs sur une lame, celui-ci doit s'étaler sur l'échantillon et il faut éviter son évaporation. Pour cela, la machine dépose une lamelle sur le réactif. Cette lamelle sera ôtée à l'étape suivante. La pose de la lamelle doit se faire selon un 25 mouvement précis, la lamelle étant légèrement inclinée d'un côté de façon qu'elle vienne progressivement se coucher sur la lame afin de permettre un parfait étalement sans formation de bulles d'air. Le dispositif permettant de manipuler les lamelles est une autre caractéristique de l'invention, illustrée par la figure 4. Le dispositif de préhension comporte une ventouse mobile 30 verticalement (4) reliée à une pompe aspirante et à une électrovanne de mise à l'air libre. Le mouvement vertical de la ventouse entraîne une pièce en forme de U inversé (1) dont la largeur est comprise entre la taille d'une lame et la celle d'une lamelle. Cette pièce pose sur une butée (2) solidaire du tube (3) portant la la ventouse, mais peut remonter librement. La butée est positionnée de manière que la pièce en U soit légèrement plus basse que la ventouse lorsqu'elle 35 repose sur la butée. 3057665 - 3 - Pour prendre une lamelle dans le magasin, la tête se positionne de façon qu'un côté de la pièce en U repose sur le bord de la lamelle (5). L'aspiration démarre et la ventouse descend. Dès 5 qu'elle touche la lamelle, un capteur de pression détecte la diminution de pression et arrête la descente. En remontant, la lamelle prend l'angle désiré jusqu'à ce que le U touche la butée et la montée se poursuit en conservant le même angle. La lamelle est ensuite posée sur la lame en respectant un certaine distance (6) par rapport au bord de la lame. Pour ôter la lamelle, il est nécessaire de maintenir la lame lorsque la ventouse tire sur la 10 lamelle car celle-ci tend à rester collée à la lame Pour cela, la tête se positionne comme indiqué sur la figure 5 de façon que les deux côtés du U touchent la lame sans toucher la lamelle. Le U est alors immobilisé par un électroaimant solidaire de la tête indiqué en (1) figure 6 et empêche la lame de monter avec la lamelle. La pièce en U peut également être immobilisée plus haut pour manipuler librement les 15 bouchons des flacons de réactifs et les couvercles. Il est nécessaire de chauffer les lames pour faire fondre la paraffine dans laquelle les échantillons sont généralement englobés et on doit également pouvoir les maintenir à une température précise pour certains protocoles qui nécessitent des incubations. Pour cela, les lames sont disposées dans des supports illustrés figure 7 contenant une résistance chauffante (1) et un 20 capteur de température (2) surmontés par une plaque plane conductrice de la chaleur (non figurée) qui favorise la diffusion de la chaleur sous la lame. La tête pose un couvercle (3) en utilisant le système de préhension à ventouse, ce qui clôt le volume de la chambre et garantit une température homogène et stable. Des couvercles sont posés sur les flacons contenant les réactifs (figure 8). Selon 25 l'invention, le bouchon normalement fourni avec le flacon (3) est remplacé par un insert creux (2) dont la face supérieure est usinée avec une qualité de surface qui permet une bonne étanchéité par le simple poids de l'opercule (1) posé par la machine. Dans une variante, l'une des deux pièces est aimantée et attire l'autre pièce pour augmenter la force d'appui de l'opercule sur son siège. REVENDICATIONS1) Appareil pour la coloration automatique des lames de microscope caractérisé en ce qu'il comporte des portoirs individuels dans lesquels les lames sont posées horizontalement et où les réactifs sont distribués par l'intermédiaire de différentes aiguilles de prélèvement pouvant être changées automatiquement. 2) Appareil selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il monte les aiguilles de 1 0 prélèvement grâce à un électro-aiment attirant une plaque métallique sous laquelle est installée l'aiguille en réalisant une jonction étanche par l'écrasement d'un joint. 3) Appareil selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'une des aiguilles pouvant être montées sur le tube porte-aiguille repose dans un liquide dissolvant le liquide de montage des lamelles. 15 4) Appareil selon la revendication 1 caractérisé en ce que le tube porte-aiguille peut être connecté soit à une seringue motorisée, soit à une source d'air comprimé pour son nettoyage interne. 5) Appareil selon la revendication 1 caractérisé en ce que le circuit d'aspiration de l'aiguille est équipé d'un capteur de pression qui détecte la présence de liquide quand l'aiguille arrive au 20 niveau du liquide prélevé. 6) Appareil selon la revendication I caractérisé en ce que les mouvements de la tête se font selon deux axes munis de règles portant des fentes régulièrement espacées d'une taille supérieure à la précision recherchée et de deux capteurs optiques qui permettent une relocalisation précise des coordonnées et déclenchent la modification de la durée du pas lors des phases d'accélération- 25 décélération. 7) Appareil selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est doté d'un système de préhension à ventouse pouvant poser des lamelles sur les lames et et les en ôter. 8) Appareil selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il est équipé d'une pièce mobile partiellement solidaire de la ventouse permettant, selon l'endroit où cette pièce est posée, 30 d'incliner la lamelle en appuyant sur l'une de ses extrémités lorsqu'il la saisit pour la poser sur la lame et de presser sur la lame lorsqu'il retire la lamelle. 9) Appareil selon la revendication 1 caractérisé en ce que les flacons contenant les réactifs sont obturés par une pièce composée d'un siège usiné sur lequel est posé un opercule ajusté assurant l'étanchéité et manipulé par le système de préhension, la pression de l'opercule sur 3057665 - 5 - son siège pouvant être augmentée par l'action d'un aimant qui crée une attraction entre l'opercule et l'insert. 5 10) Appareil selon la revendication 1 caractérisé en ce que les portoirs contenant les lames peuvent être être fermés par des couvercles afin de créer autour de la lame un volume isotherme.