Brevet FR3061714A1 — publié le 20180713

COMPLEXES DE LANTHANIDES À BASE DE DENDRIMÈRES La présente invention a pour objet des complexes de lanthanides à base de dendrimères. En particulier, la présente invention a pour objet des composés dendrimériques, greffés à une antenne, pouvant se complexer aux lanthanides. Les méthodes liées à la fluorescence (microscopie et macroscopie) io présentent les avantages d'être très sensibles, de permettre des mesures en temps réel, peu dangereuses pour les milieux biologiques (en raison de la faible quantité d'agents d'imagerie nécessaires à la condition d'utiliser des longueurs d'onde d'excitation adaptées) et très accessibles (en terme de coûts de fabrication et d'utilisation), de temps expérimentaux, de mobilité et de niveau de spécialisation 15 des utilisateurs. La grande majorité des fluorophores organiques commerciaux sont fortement photosensibles et se dégradent en présence de lumière d'excitation. Les rapporteurs fluorescents basés sur des nanocristaux semi-conducteurs 20 constituent une autre gamme de choix d'agents d'imagerie optique. Un autre facteur limitant est la forte toxicité des métaux qui constituent ces nanoparticules (cadmium, tellure et sélénium) dans le cas où ces dernières se dissocient. La famille des lanthanides inclut 14 éléments aux propriétés optiques 25 extrêmement intéressantes et uniques, caractérisées par des bandes d'émissions précises et étroites, allant du visible au proche infrarouge (> 1 200 nm). Chaque lanthanide possède des propriétés spectrales distinctes et identifiables. Il est ainsi possible de décliner, sur la base d'une même technologie, toute une gamme de longueurs d'ondes différentes par le simple choix de la nature du lanthanide à 30 incorporer dans la molécule. Ces bandes d'émission sont beaucoup plus étroites que celles des fluorophores organiques et des nanoparticules fluorescentes (quantum dots), ce qui autorise une meilleure discrimination spectrale et des essais multiplexes. De plus, la position (en nm) de ces bandes d'émission ne varie pas en fonction de l'environnement (cellulaire, pH, températures, sites 35 hydrophiles/hydrophobes...) ce qui facilite leurs détections et minimise l'adaptation de l'équipement (filtre unique pour un lanthanide donné). 3061714 2 En dépit de la forte demande des chercheurs en biologie et des médecins, il n'existe cependant à ce jour aucune sonde fluorescente compatible avec des applications biologiques et fonctionnant en conversion inférieure en énergie à base 5 de lanthanides qui soient idéalement excitables et émetteurs au-dessus de 600 nm, correspondant ainsi à la fenêtre biologique. Globalement, les sondes proches infrarouges actuelles sont de nature organique, les commerciales sont peu nombreuses et souffrent de limitations comme la tendance au photoblanchiment et des déplacements de Stokes restreints. La présente invention a donc pour but de fournir un complexe dendrimérique polymétallique de lanthanide, émettant dans le proche infrarouge et pouvant être excité dans le proche infrarouge. Un autre but de l'invention consiste à fournir un système luminescent absorbant et émettant dans le proche infrarouge et permettant d'observer divers systèmes biologiques sans les détruire ou interférer avec leurs fonctionnements. Un autre but de l'invention consiste à fournir un système luminescent permettant de limiter les signaux parasites de fluorescence/luminescence générés par les matières biologiques (autofluorescence). Ainsi, la présente invention concerne un complexe comprenant au moins un dendrimère (D) et au moins un lanthanide (Ln), dans lequel le dendrimère (D) comprend un motif de formule (I) suivante : A2-N AN (I) \ /j12 - 2 4 dans laquelle : - Cl est un groupe de valence 4 de formule >1\1-CH2-CH2-N 650 nm) interagit extrêmement faiblement avec les fluides et tissus biologiques) et ainsi accroitre l'intensité et la qualité du signal collecté. 25 La structure des dendrimères permet de grouper sur une même molécule une grande densité de lanthanides et d'antennes permettant d'accroître la quantité de photons émis par unité de volume, ce qui augmente l'intensité du signal par molécule et donc la sensibilité de la détection. 30 La présente invention concerne donc une entité obtenue par complexation entre un dendrimère (D) tel que défini ci-dessus et au moins un lanthanide. Les complexes ainsi obtenus sont des molécules luminescentes. Les lanthanides sont encapsulés à l'intérieur du dendrimère en raison de la 35 présence d'atomes d'oxygène et d'azote. L'agencement des branches du 3061714 4 dendrimère autour des lanthanides les protège partiellement des interactions directes avec les molécules de solvant et d'eau en particulier. De préférence, les complexes selon l'invention sont obtenus par mise en 5 présence d'un dendrimère (D) avec une solution de lanthanides. Le dendrimère (D) est dissous par exemple dans une solution de DMSO et une solution de sel de lanthanide est ajoutée à la solution contenant le composé (D) notamment dans un rapport huit pour un. Selon un mode de réalisation, le mélange réactionnel a été mélangé et le conjugué dendrimère-lanthanide obtenu a été isolé par dialyse. 10 Selon un mode de réalisation, dans le composé (D), le motif de formule (I) est relié par l'intermédiaire d'au moins un bras à au moins une antenne telle que définie ci-dessus. De préférence, parmi les 16 atomes d'azote en périphérie dans la formule (I), 15 l'un au moins est relié de façon covalente à un moins une antenne, par l'intermédiaire d'un bras. Selon l'invention, le terme "antenne" désigne une entité capable d'absorber une grande quantité de lumière d'excitation de transférer l'énergie correspondante 20 aux lanthanides et /ou d'émettre directement par fluorescence. De préférence, l'antenne est choisie dans le groupe constitué des anthraquinones, des cyanines, notamment des cyanines 5, cyanines 5,5 et des cyanines 7, des aza-BODIPY, des pérylènediimides, des porphyrines, des sels de phénothiazine et de leurs dérivés. 25 Parmi les antennes, on peut également utiliser des composés de type « IR dyes » bien connus de l'homme du métier. Parmi ces antennes, on peut par exemple citer les composés suivants : 30 3061714 5 CI N+ 'CH3 H3C' CI 5 CH CH3 CH3 H3C 10 3061714 6 5 Ces antennes sont fixées sur les dendrimères via le chlore par substitution et donc dans la forme finale il n'y a pas de chlore mais soit un C, N, S et O. 10 Selon l'invention, le terme "bras" désigne une entité permettant de relier de façon covalente le motif de formule (I) et l'antenne. Selon un mode de réalisation, l'antenne est reliée au motif de formule (I) de façon covalente par l'intermédiaire d'au moins un bras répondant à la formule (Il) 15 suivante : -A4-X-[A5-Z]i-((A6);-Y)k (Il) dans laquelle : - A4 est un groupe de formule -(CH2)2-X'-(CH2)2-, X' représentant un groupe C(0)-NH- ou un groupe -NH-C(0)-, et étant de préférence un groupe de formule - 20 (CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2- ; - X est un groupe de formule -NH-C(0)- ; 3061714 7 - i est un nombre entier compris entre 1 et 3 ; - j est 0 ou 1 ; - k est 0 ou 1 ; 5 - A5 et A6 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les radicaux (cyclo)alkylènes, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone ; - Z est choisi parmi les groupes -0-, -NH-, -S-, amide, ester, triazole, amine, éther, thioéther, urée, thiourée, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, 10 amidine, phosphoramidate, disulfure et sulfonyle ; et - Y est choisi parmi les groupes -0-, -NH-, -S-, alkylène, amide, ester, triazole, amine, éther, thioéther, urée, thiourée, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, amidine, phosphoramidate, disulfure et sulfonyle. Dans la formule (II) telle que définie ci-dessus, c'est par l'intermédiaire du radical A4 que le bras se lie au dendrimère (en particulier au motif de formule (I) susmentionnée) et c'est par l'intermédiaire de Y, ou de Z lorsque k=0, que le bras se lie à l'antenne. Selon un mode de réalisation préféré, le dendrimère répond à la formule suivante : (A4-R')2)2]2}4 (III) ) ) 1 1 dans laquelle : 25 - Cl est un groupe de valence 4 de formule >N-CH2-CH2-N . ......',.".',,,,,,..>. 10 3061714 11 5 Lorsque l'antenne répond à la formule celle-ci peut contenir un métal, notamment choisi parmi Ag, Al, As, Au, Cd, Co, Cu, Fe, Ir, Mg, Mn, Ni, Os, Pd, Pt, Rh, Ru, Sb, Sn, V, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb et Lu. De préférence, le dendrimère (D) selon l'invention répond à la formule suivante : L2'N - 1 Z Fi Ner...NH 0 NH j>.:l HN or ç o jk0 NI-1 ° Li INI-1 0 .'el.1,1 H HN rN 0 '34'1. 1-2-U 0 NI-NH HN) NH 0 NH f NH N. HN Sj....piej C,? ...N..1 ES Hdl, HN 04 0 N ? rj L.22.N.N1'....,t '.**NH \ --N ? 0,NH 0.1,N H .../... 0 Fri...1.N..t ,,,[1..e jï S ,s,..NH , [1...P>r,t.IFI'N HN 0 1r.N./...« 1-2..N.,r1rl 0 HN"--% /---11../1' 11...eH ji ri r.r. \ ^NI-L. o 1j,..0 NH^f 0 HN - L2 0 ji...'...').....1 ,,,,,... H .."\N'./.../ e N-N,,N . r-' H .....,,N NH N ...N HN/si 0 NH ( N.N....k 0 ryoNr.'eNnr'N1 .r.I.ICHN,^,..L2 L,..N.:.N 0 0 p'./...N r.N...N .. 0 ,.../N..er0 '....y'....., ri... N H , H ...r. Hre-ooe:iN ...".. El 1 i'lsr '''''Lei. rer/IS ri . 1...,:iN . H? ° "NT S 0 %..""),.N.....-,.0 4 0 1 H HN 0 N N.." \ .14 -".'1:2, irri H f N I-1/.2 ° ° N NH HN OàNH HN \ N...\_4 L2 HN 0 HNnL' ZN r^ril NS 1 N HN ( 0 i c^ NIN 0 Irsl r'rrl, °Yr ° °e 1 HN NH HN NH NH HN N. N N Neri Ne NH NH 10 3061714 12 dans laquelle L2 est l'une des antennes suivantes : -------e-ve\e /\/\/^.>' 5 De préférence, le dendrimère (D) selon l'invention répond à la formule suivante : 3061714 13 dans laquelle R est répond à la formule suivante : 5 De préférence, le dendrimère (D) selon l'invention répond à la formule suivante : HN O NH C j\T N HN HN ..-N ° NH '1/4(....J H 0 NH o.N.2e( 1 ONH-r N ° J H '-,-^--" HN-ci 0 NH NH - HNf . (NH "N 5 H.N' N NH HN «,N ° HN HN NH NH HN NH NH NH *rr15' L2 NH H HN O N 0 NH lHN HNr, 0jN 0 0 HN H î HN NH N 0 . oes NM ) 04.1) 1.N Nsk.fo NH NH HN HN O I '1.2e: O . ryN ) e O O dans laquelle L2 est l'une des antennes suivantes : nro 0 10 3061714 14 De préférence, le dendrimère (D) selon l'invention répond à la formule suivante : R2 N R2 R2.N N. s t s NH HN r,...N.R2 rsZ- r«.NH i HN loz...i. HÇN. okiï?........ NH NH ° Li NH 0 /".N N f) R2.,ser,c7....1.N,- HN0 04.1...N) Fi 0y\ H ...rH Rre10 R2.N.ly'...,'Ne.L...,[14L Nr.N N..1,1 0 ,,,Ny- ,,,sfri ^ e../ \- N "N...NH \ H 0))-\- HN HN 0 0 NHf ° 04.'1. i---1'1...riç 0 N IHI.."..N...."'"« 0 NH N H . mr, 0 ...N. '1',,Ç HN .1.-1 FINj'Id:N.14 L.,..N....ey I,' rir1/4------N-R2 -14,----Lie. 0 HN..' ,:,-)1 NH sh, 0 N..../..N.1.(..., H N',.....N . c?r\^N,,,N'i 0 ,../ HN H tvoN,,N r-)..NH Or HN ° H...rN 0 N'\)4 N r,NN......N H O NH 0 0 yi....,r.N M''%..N H ° /..... NirN'.....\11 HN.../...m.../..N,,e.NL'esN.de'M i):, H r) ° NH rerl! HN ° 0 N«..),,O''N R2'NeN..N HNrl °0 r-I HN .4.:.O ? N.."\..ji ,=(-/-1 ris,i_e 0 \,0 HN Ok, "N\N-\4 ?,,, sN, Ns 0 05,N, HN-'_N ,N., RrN,,,,.NH .. NI r'...,-1 oy ,,,, 0,5 ii ., HNI, HN iO R2'N-re HN H HNz NH .1 NH NH NH LI NH Hi:i HN NH 5 dans laquelle : - L2 répond à l'une des formules suivantes : er".10r R2". H,7tN -4-.1 es1 N:N Lw IJ-N-N L,ÉN',s7.,N R2 N:N IV,R2 R2 R2 R2 Q - R2 répond à l'une des formules suivantes : OH 10 3061714 15 Selon un mode de réalisation, dans les complexes selon l'invention, le lanthanide est choisi dans le groupe constitué de Yb, Nd, Ho, Tm, Sm, Dy, Eu, Pr et Er. 5 La présente invention concerne également un conjugué comprenant une molécule biologique et un complexe tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit complexe est lié à la molécule biologique par l'intermédiaire d'un linker, ladite molécule biologique étant choisie dans le groupe constitué des anticorps, des 10 protéines, des peptides, des glucides, des lipides, des polysaccharides, des acides gras, des acides aminés, des acides désoxyribonucléiques, des acides ribonucléiques, des oligonucléotides, des médicaments et des ligands. La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe tel que 15 défini ci-dessus, comme chromophore fluorescent. Selon l'invention, le terme "chromophore fluorescent" désigne une molécule pouvant réémettre de la lumière après excitation avec un rendement quantique supérieur à 10-6 (10-4%). 20 Les complexes selon l'invention peuvent notamment être utilisés dans le domaine de l'imagerie cellulaire, de l'imagerie vétérinaire, des analyses sanguines, des biopsies, des analyses de coupes histologiques, des analyses de criblage à haut débit, des essais bioanalytiques sur plaques 96, 396 et 1536 puits ou encore de la chirurgie assistée (guidée) par imagerie. 25 La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe tel que défini ci-dessus, comme agent de thérapie photodynamique (PDT). 3061714 16 DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente le spectre 1H NMR (DMSO, TFA, 40°C) du dendrimère 5 G3P-(TPP)32. La Figure 2 représente le spectre 1H RMN (DMSO, température ambiante, suspension dans l'eau) du dendrimère G3P-(TPP)32. io La Figure 3 représente les spectres d'absorption d'une solution du composé 9 à une concentration de 101.IM et de (Ln8-) G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3±) mesurés à température ambiante dans le DMSO. Dans un souci de comparaison, le spectre d'absorption du composé 9 est multiplié par un facteur correspondant au nombre de chromophores attachés au branches du dendrimère, 15 exemple, par 16 pour (Ln8-) G3P-(Bodipy1)18et par 32 pour (Ln8-)G3P-(Bodipy1)32. La Figure 4 représente les spectres d'excitation (A' = 750 nm, graphique gauche) et d'émission (Àex = 650 nm, graphique droit) normalisés d'une solution de concentration 101.IM de composé 9 et de (Ln8-)G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32 ; Ln = 20 Yb3+, Nd3±) mesurés dans le DMSO à température ambiante. La Figure 5 représente les résultats d'une expérience de photoblanchiment pour le composé 9 et (Ln8-)G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3±). Les expériences ont été réalisées pour une solution à 101.IM dans le DMSO et sous une 25 illumination ininterrompue à 670 nm, l'émission étant collectée à 735 nm. La Figure 6 représente les résultats des tests de cytotoxicité à l'Alamar Blue réalisés pour différentes concentration de chromophores (composé 9) et de dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3±) après 24h 30 d'incubation sur des cellules HeLa. La Figure 7 représente les résultats d'imagerie par microscopie confocale. Cellules HeLa après 30 minutes d'incubation avec une solution de 1.5 1.1M de composé 9 et de dendrimère (Ln8-)G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3±). 35 L'émission de l'aza-BODIPY (Aex : 633nm ; A' : 650-800 nm) a été observée sous excitation à 633 nm (puissance laser à 6%). (Haut) Yb8-G3P-(Bodipy1)16 (A), Nd8- 3061714 17 G3P-(Bodipy1)16 (B), G3P-(Bodipy1)16 (C), composé 9 (D) et (bas) Yb8-G3P(Bodipy1)32 (A), Nd8-G3P-(Bodipy1)32 (B), G3P-(Bodipy1)32 (C), cellules non traitées (D). Les images sont prises dans le plan du noyau cellulaire. Les flèches blanches indiquent la localisation spécifique des dendrimères dans les lysosomes et les 5 flèches jaunes indiquent les filopodes. Objectif de grossissement 63x. La Figure 8 représente les résultats de l'étude de l'internalisation cellulaire par cytométrie en flux. Des cellules HeLa ont été incubées pendant 30 minutes avec une solution de concentration 1,5 ptM de chromophores et de dendrimères 10 (Ln8-)G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3±) comme contrôle. Afin de bloquer les voies de transport actives et passives, les cellules HeLa ont été traitées avec du NaN3 (inhibiteur de l'internalisation active) ou pré-incubées à 4°C pour 30 minutes (inhibition des voies actives et passives) avant incubation avec les dendrimères. 15 La Figure 9 représente des résultats d'imagerie en microscopie par épifluorescence sur des cellules HeLa après 30 minutes d'incubation avec une solution 1.5 ptM de composé 9 et de dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3±). Le signal émis par le chromophore aza-Bodipy a été collecté (Àex: 655 nm ± 40 nm; 'le,: filtre passe long 785 nm, 8 s d'exposition). (Haut) Yb8-G3P- 20 (Bodipy1)16 (A), Nd8-G3P-(Bodipy1)16 (B), G3P-(Bodipy1)16 (C), Composé 9 (D) et (bas) Yb8-G3P-(Bodipy1)32 (A), Nd8-G3P-(Bodipy1)32 (B), G3P-(Bodipy1)32 (C), cellules non traitées (D). La Figure 10 représente des spectres d'absorption et d'émission du G3P- 25 (Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10) dans DMSO à température ambiante. La Figure 11 représente les résultats des tests de photostabilité des complexes (Ln8-)G3P-(Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10, Ln = Yb, Nd) sous excitation à 665 nm (DMSO, température ambiante, Àem = 725 nm). 30 La Figure 12 représente les résultats d'imagerie de microscopie d'épifluorescence sur des cellules HeLa. (Haut) Après 3h d'incubation avec une solution 2,5 ptM de (Nd8-)G3P-(Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10) et (bas) cellules non traitées. A: image obtenue dans la lumière blanche. B: image de 35 luminescence (Aex: 655 de bande passante de 40nm; Aem: 750 de bande passante 3061714 18 de 50 nm; durée d'exposition de (secondes). C: Image résultant de la fusion de A et B. La Figure 13 représente le spectre d'absorption du Yb8-G3P-(TPP)32 (1,0 pM) 5 dans le DMSO et dans le mélange DMSO / (Opti-MEM: FCS) (2,2 pM) à 298 K. La Figure 14 représente le spectre d'émission dans le visible de Yb8-G3- (TPP)32 (37 pM) dans le DMSO sous excitation à 520 nm, 298K. io La Figure 15 représente les spectres d'émission dans le proche-infrarouge de Yb8-G3-(TPP)32 (37 pM) et de G3-(TPP)32 (37 pM) dans du DMSO sous excitation à 520 nm, 298K. La Figure 16 représente les spectres d'absorption et d'excitation (À' = 977 15 nm) du complexe Yb8-G3-(TPP)32 dans le DMSO normalisés sur l'intensité de la bande à 650 nm. La Figure 17 représente les images obtenues par microscopie d'épifluorescence de cellules HeLa. (A) Après 1 h et 30 min d'incubation avec une 20 solution 1 pM de complexe de dendrimère Yb-G3P-TPP. (B) Les mêmes cellules après 2 min d'exposition à la lumière sélectionnée avec un filtre à bande passante centrée à 417 nm : formation des vésicules. (C) cellules non incubées avec Yb8-G3- (IP P)32. 25 3061714 19 EXEMPLES Exemple 1 : Synthèse de dendrimères (D) selon l'invention 5 1. Préparation d'antennes de type aza-BODIPY 1.1. Préparation du tert-butyl N-12-112-14-[(2Z)-2-[1-difluoroboranyl-3-(4- méthoxyphény1)-5-phényl-pyrrol-2-yi]imino-5-phényl-pyrrol-3-yehénoxyl 10 acétyljaminoléthylparbamate (10) Cette antenne (10) est obtenue selon le schéma réactionnel ci-dessous : 0 )LPh 0 CH3NO2 Et2 N H EtOH 95% CHO Ph MeO EtOH, NaOH aq. MeO 67% 15 MeO CICH2CO2Me K2CO3 DMF KBr cat. 58% Ph 02N 0 1. KOH, Me0H/THF 2. Me0H, H2SO4 Ph 3. NH4OAc, AcOH 60% 2 Ph 4 BBr3, DCM 96% 3061714 COOH Ph Ph Ac20 AcOH reflux 87% BF3.Et20 DIPEA DCM reflux 99% H3PO4/THF/eau reflux, overnight quant. 7 8 20 NaNO2 HCI EtOH 74% Ph HBTU H2NCH2CH2NHBoc DCM 1 nuit H NHBoc 71% Synthèse de (E)-3-(4-méthoxyphényI)-1-phénylprop-2-èn-1-one (1) Dans un ballon sont dissous 8,94 mL de para-anisaldéhyde (10 g, 73,45 5 mmol, 1 eq.) et 8,58 mL d'acétophénone (8,825 g, 73,45 mmol, 1 eq.) dans 150 mL d'éthanol. Le ballon est plongé dans un bain de glace et 5,876 g de soude (149,9 mmol, 2 eq.) dissouts dans 50 mL d'eau sont ajoutés goutte à goutte. On laisse la solution remonter à température ambiante et être agitée toute la nuit. Le lendemain, le ballon est mis dans un bain de glace et de l'eau froide est ajoutée au mélange. io Un précipité jaune se forme et le mélange est filtré sur fritté et lavé à l'eau. Le précipité est ensuite recristallisé dans l'éthanol fournissant 11,698 g de la chalcone 1 (49.1 mmol, 67%) sous forme de cristaux blancs. 1H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) b 8,06 - 7,97 (m, 2H), 7,79 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,64 - 7,59 (m, 2H), 7,58-7,45 (m, 3H), 7,42 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 6,98-6,91 15 (m, 2H), 3,86 (s, 3H). 3061714 21 Synthèse de 3-(4-méthoxyphényI)-4-nitro-1-phénylbutan-1-one (2) Dans un ballon sont dissous 0,546 g (2,29 mmol, 1 eq.) de 1, 0,621 mL de nitrométhane (11,46 mmol, 5 eq.) et 1,185 mL de diéthylamine (11,46 mmol, 5 eq.) dans 150 mL de méthanol. La solution est chauffée à reflux toute la nuit. Une fois la 5 réaction terminée, le solvant est évaporé sous vide et le résidu dissous dans le dichlorométhane. La solution est lavée avec une solution de KHSO4 1M puis NaCI saturée. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrée et concentrées sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur silice avec éther de pétrole/acétate d'éthyle fournissant la nitrobutanone 2 (0,654 g, 2,18 mmol, 10 95%) sous forme d'un huile visqueuse jaune pâle. 1H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) b 7,96 - 7,88 (m, 2H), 7,63 - 7,53 (m, 1H), 7,51 - 7,41 (m, 2H), 7,25 - 7,16 (m, 2H), 6,91 - 6,81 (m, 2H), 4,80 (ddd, J = 12,3, 6,7, 0,5 Hz, 1H), 4,65 (ddd, J = 12,3, 7,9, 0,4 Hz, 1H), 4,18 (p, J = 7,0 Hz, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,42 (dd, J= 7,0, 2,1 Hz, 2H). 15 Synthèse de 4-(4-méthoxyphény1)-2-phény1-1H-pyrrole (3) Dans un ballon sont dissous 3,5 g de nitrobutanone 2 (11.69 mmol, 1 eq.) et 5 eq. de KOH dans 100 mL d'un mélange Me0H/THF (1 :2). La solution est agitée à température ambiante durant une heure et est ensuite ajoutée goutte à goutte à une 20 solution de H2SO4 concentré (2 mL/mmol) dissoute dans 100 mL de Me0H à 0°C. Une fois l'addition terminée, le bain de glace est enlevé et la solution agitée à température ambiante pendant 1 h. Le mélange est ensuite versé dans un erlenmeyer contenant de l'eau et de la glace et la solution est neutralisée en ajoutant une solution de soude 4M. Une fois neutralisée, le mélange est extrait avec 25 du dichlorométhane et la phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et le solvant évaporé sous pression réduite. Le résidu est dissous dans 100 mL d'acide acétique glacial et 5 eq. d'acétate d'ammonium sont ajoutés. La solution est chauffée à reflux durant une heure pendant laquelle la couleur de la solution évolue du jaune au bleu profond. La solution est ramenée à température ambiante et 30 l'acide acétique évaporé sous pression réduite. Le solide noir est alors dissous dans le dichlorométhane et la solution est lavée plusieurs fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium et de saumure. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu est ensuite dissous dans un minimum de dichlorométhane et de l'éther de pétrole est ajouté lentement 35 jusqu'à ce que se forme un précipité. Le précipité est filtré sur Büchner et lavé 3061714 22 plusieurs fois à l'éther de pétrole. Le pyrrole 3 est obtenu avec un rendement de 60% (1.742 g, 6.99 mmol) sous forme d'une poudre légèrement colorée. 1H RMN (250 MHz, DMSO-d6) b 11,32 (s, 1H), 7,66 (dt, J = 7,7, 1,1 Hz, 2H), 7,57 - 7,48 (m, 2H), 7,36 (dd, J = 8,4, 7,0 Hz, 2H), 7,21 (dd, J = 2,8, 1,7 Hz, 1 H), 5 7,20 - 7,12 (m, 1H), 6,94 - 6,84 (m, 3H), 3,75 (s, 3H). Synthèse de 4-(5-phény1-1H-pyrrol-3-yl)phénol (4) Dans un ballon sous argon sont dissous 0,546 g de pyrrole 3 (2,19 mmol, 1 eq.) dans 100 mL de dichlorométhane anhydre. La solution est refroidie à -78°C et 10 5,48 mL d'une solution de BBr3 1M dans le dichlorométhane (5,48 mmol, 2,5 eq.) sont ajoutés lentement. La réaction est agitée 3 h à -78°C puis toute la nuit à température ambiante. Le lendemain, la solution est refroidie à -78°C et du Me0H est ajouté au mélange. La solution est agitée pendant une heure puis elle est diluée dans du dichlorométhane et lavée avec du NaCI saturé. La phase organique est 15 séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu est dissout dans un minimum de dichlorométhane et le produit est précipité par ajout lent d'éther de pétrole. Le précipité est filtré sur Büchner et lavé à l'éther de pétrole fournissant 0,495 g (2,10 mmol, 96%) du pyrrole 4 sous forme d'une poudre blanche légèrement violacée. 20 1H RMN (250 MHz, DMSO-d6) b 11.25 (s, 1H), 9.15 (s, 1H), 7.69 - 7.61 (m, 2H), 7.43 - 7.31 (m, 4H), 7.20 - 7.11 (m, 2H), 6.81 (dd, J = 2.7, 1.7 Hz, 1H), 6.77 6.69 (m, 2H). 1H RMN (250 MHz, acétone-d6) b 10,48 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,71 - 7,65 (m, 2H), 7,49 - 7,41 (m, 2H), 7,41 - 7,31 (m, 2H), 7,21 - 7,14 (m, 2H), 6,85 (dd, J = 2,8, 25 1,7 Hz, 1H), 6,84 - 6,80 (m, 2H). 13C RMN (63 MHz, Acetone) b 156,27, 134,16, 133,40, 129,58, 128,76, 126,92, 126,80, 126,55, 124,38, 116,24, 115,94, 104,14. LRMS : calculé : 235,0997, mesuré [M+H]+ : 236,1 IR (cm-1) : 3443, 3300, 1600, 1581, 1494, 1244, 1132, 921, 834, 804, 778, 30 751, 717, 690, 609. Mp : 209 °C 3061714 23 Synthèse de méthyl 2-(4-(5-phény1-1H-pyrrol-3-yl)phénoxy)acétate (5) Dans un ballon sont dissous 0,725 g de 4 (3,08 mmol, 1 eq.) dans 60 mL de DMF. 1,278 g de K2003 (9,24 mmol, 3 eq.), 1,08 mL de chloroacétate de méthyle (12,33 mmol, 4 eq.) et une quantité catalytique de bromure de potassium sont 5 ajoutés à la solution qui est agitée à température ambiante toute la nuit. La solution est ensuite extraite à l'éther diéthylique et lavée trois fois avec de la saumure. La phase aqueuse est ensuite extraite trois fois avec de l'éther diéthylique. Les phases organiques sont rassemblées et séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant évaporé sous vide. Le résidu est dissous dans un minimum de dichlorométhane et de l'éther io de pétrole est ajouté jusqu'à formation d'un précipité. Le précipité est filtré sur Büchner et lavé à l'éther de pétrole pour obtenir 0,553 g de 5 sous forme d'une poudre blanc cassé. 1H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) b 8,43 (s, 1H), 7,55 - 7,46 (m, 4H), 7,44 7,35 (m, 2H), 7,25 - 7,19 (m, 1H), 7,07 (dd, J = 2,7, 1,7 Hz, 1H), 6,97 - 6,88 (m, 15 2H), 6,76 (dd, J= 2,8, 1,7 Hz, 1H), 4,66 (s, 2H), 3,82 (s, 3H). 130 RMN (63 MHz, CDCI3) b 169,57, 156,10, 133,02, 132,51, 129,56, 128,93, 126,45, 126,38, 126,11, 123,83, 114,98, 114,94, 103,86, 65,58, 52,25. LRMS : calculé : 307,1208, mesuré [M+H]+ : 308,4 IR (cm-1) : 3430, 2941, 1759, 1600, 1581, 1496, 1438, 1212, 1178, 1131, 20 1075, 834, 801, 774, 758, 719, 693. Mp : 165°C. Synthèse de 3-(4-méthoxyphény1)-2-nitroso-5-phény1-1H-pyrrole (6) Dans un ballon à température ambiante sont dissous 0,593 g de pyrrole 3 25 (2,38 mmol, 1 eq.) dans 50 mL d'éthanol et 0,48 mL d'HCI concentré (0,2 mL/mmol). 0,189 g de nitrite de sodium (2,74 mmol, 1,15 eq.) dissous dans de l'eau (concentration 0,6 mol/L) sont ajoutés goutte à goutte. La solution est agitée 30 minutes et est ensuite refroidie à 0°C. Une deuxièrre portion d'HCI concentré (2,38 mL, 1 mL/mmol) est ajoutée. La solution est agitée une heure puis, elle est dissoute 30 dans du dichlorométhane et lavée avec de la saumure. La phase organique est séchée, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu est dissous dans un volume minimal d'éthanol et un excès de solution aqueuse d'acétate de sodium et de glace sont ajoutés et le mélange est agité une heure. La solution est ensuite extraite au dichlorométhane et lavée avec de la saumure. La phase organique est 35 séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu est ensuite dissous dans un volume minimal de dichlorométhane est le produit est précipité par addition 3061714 24 lente d'éther de pétrole. Le solide est filtré sur Büchner et lavé avec de l'éther de pétrole. 0,503 g de nitrosopyrrole 6 (1,81 mmol, 76%) sont obtenus sous forme d'une poudre verte. 1H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) b 8,20 - 8,13 (m, 2H), 7,79 (dd, J = 6,9, 5 3,0 Hz, 2H), 7,51 (dd, J = 5,1, 1,8 Hz, 3H), 7,07 (s, 1H), 7,02 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 3,89 (s, 3H). Synthèse de (Z)-méthyl 2-(4-(2-((3-(4-méthoxyphényl)-5-phényl-1 H-pyrrol2-ypi mi no)-5-phény1-2H-pyrrol-3-yl)phénoxy)acétate (7) io Dans un ballon sont dissous dans 20 mL d'acide acétique glacial 0,112 g de nitrosopyrrole 6 (0,40 mmol, 1 eq.), 0,124 g de pyrrole 5 (0,40 mmol, 1 eq. et 0,40 mL d'anhydride acétique. La solution est agitée et chauffée à reflux pendant une heure durant laquelle la coloration passe au bleu foncé. La solution est ensuite refroidie et le solvant évaporé sous pression réduite. Le résidu est ensuite dissous 15 dans du dichlorométhane et la solution est lavée avec NaHCO3 saturé et NaCI saturé. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu est ensuite dissous dans un minimum de dichlorométhane et de l'éther de pétrole est ajouté jusqu'à formation d'un précipité qui est filtré sur Büchner et lavé à l'éther de pétrole. L'azadipyrrométhène 7 est obtenu sous forme d'une poudre bleu 20 foncé (0,197 g, 0,35 mmol, 87%). 1H RMN (250 MHz, Chloroform-d) b 8,05 - 7,98 (m, 4H), 7,93 (ddd, J = 7,8, 6,4, 1,5 Hz, 4H), 7,58 - 7,44 (m, 7H), 7,11 (s, 1H), 7,09 (s, 1H), 6,96 (dd, J = 8,9, 1,8 Hz, 4H), 4,71 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,85 (s, 3H). IR (cm-1) : 3426, 2948, 1758, 1597, 1495, 1211, 1175, 1075, 1002, 902, 833, 25 801, 772, 759, 745, 718, 692, 637, 605. Mp : 230 °C. HRMS (ESI) : m/z calculé pour [C36H30N304] : 568,223083, mesuré 568,222834 (-0,4 ppm) 30 Synthèse de (Z)-méthyl 2-(4-(24(1-(difluorobory1)-3-(4-méthoxyphény1)-5- phényl-1H-pyrrol-2-ypimino)-5-phényl-2H-pyrrol-3-yl)phénoxy)acétate (8) Dans un ballon sous argon sont dissous 0,183 g d'azadipyrrométhène 7 (0,32 mmol, 1 eq.) et 0,548 mL de DIPEA (3,22 mmol, 10 eq.) dans du dichlorométhane fraîchement distillé. Après quelques minutes d'agitation à température ambiante, 35 0,613 mL de BF3.Et20 distillé (4,84 mmol, 15 eq.) sont ajoutés et la solution est portée à reflux durant deux heures. La solution est ensuite refroidie à température 3061714 25 ambiante et la phase organique est lavée avec de la saumure trois fois. La phase aqueuse est ensuite réextraite trois fois avec du dichlorométhane et les phases organiques combinées sont séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur silice avec un gradient de PE/DCM. 5 L'azabodipy 8 est obtenu sous forme d'une poudre bleu foncé iridescente (0,196 g, 0,318 mmol, 99%). 1H RMN (400 MHz, Acétone-d6) b 8,23 (dd, J= 8,8, 6,2 Hz, 4H), 8,18 - 8,09 (m, 4H), 7,58 - 7,46 (m, 6H), 7,33 (d, J = 1,4 Hz, 2H), 7,14 (dd, J = 9,0, 7,2 Hz, 4H), 4,88 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,79 (s, 3H). 10 130 RMN (101 MHz, Acétone) b 169,66, 162,39, 160,53, 132,72, 131,94, 131,87, 131,70, 131,62, 130,55, 130,51, 129,36, 125,87, 118,92, 115,83, 115,26, 65,70, 55,88, 52,29. 19F RMN (235 MHz, Acétone-d6) b -130,38 (dd, J= 62,8 - 31,4 Hz). HRMS (ESI) : m/z calculé pour [C36H29BF2N304] : 616,221996, mesuré 15 616,221217 (-1,3 ppm) Mp : 179°C IR (cm-1) : 3288, 2918, 2584, 1758, 1728, 1601, 1504, 1487, 1454, 1388, 1277, 1252, 1228, 1175, 1129, 1100, 1068, 1024, 999, 970, 929, 904, 868, 836, 818, 767, 742, 690, 641, 615. 20 Synthèse de l'acide (Z)-2-(4-(24(1-(difluorobory1)-3-(4-méthoxyphény1)-5- phényl-1 H-pyrrol-2-y') im no)-5-phény1-2H-pyrrol-3-yl)phénoxy)acétiq ue (9) Dans un ballon est dissous 0,308 g d'azabodipy 8 (0,5 mmol, 1 eq.) dans un mélange THF/eau/H3PO4 (50 mL : 25 mL : 10 mL). La solution est agitée sous reflux 25 20h jusqu'à ce qu'aucune trace de l'ester ne soit visible par CCM. Après refroidissement, la solution est extraite au dichlorométhane. La phase organique est lavée avec de la saumure puis, les phases aqueuses sont réextraites au dichlorométhane jusqu'à ce qu'aucune coloration bleue ne soit observée dans la phase aqueuse. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée 30 sous pression réduite. On peut éventuellement purifier le résidu par chromatographie avec DCM/MeOH si de l'ester est encore présent dans le brut. L'azabodipy 9 est obtenu sous forme d'un solide bleu foncé (0,294 g, 0,49 mmol, 98%). 1H RMN (250 MHz, Acétone-d6) b 8,27-8,18 (m, 4H), 8,18-8,09 (m, 4H), 7,57- 35 7,48 (m, 6H), 7,32 (d, J= 1,8 Hz, 2H), 7,19-7,08 (m, 4H), 4,86 (s, 2H), 3,91 (s, 3H). 3061714 26 HRMS (ESI) : m/z calculé pour [C35H27BF2N304] : 602,206329, mesuré 602,205753 (1,0 ppm) Synthèse de tert-butyl N-[2-[[2-[4-[(2Z)-2-[1-difluoroborany1-3-(4- 5 méthoxyphény1)-5-phényl-pyrrol-2-yl]imino-5-phényl-pyrrol-3-yllphénoxy] acétyllaminoléthyllcarbamate (10) Dans un ballon sous argon sont dissous 0,080 g de 9 (0,13 mmol, 1 eq.), 0,070 mL de DIPEA (0,40 mmol, 3 eq.) et 0,076 g de HBTU (0,20 mmol, 1,5 eq.) dans 5 mL de dichlorométhane et 1 mL d'acétonitrile distillés. La réaction est agitée 10 15 minutes puis on ajoute 0,032 g de Boc-éthylène diamine (0.20 mmol, 1.5 eq.) dissouts dans 2 mL de dichlorométhane anhydre. La réaction est agitée 1h30. Ensuite, la solution est extraite au dichlorométhane et lavée successivement avec KHSO4 1 M, NaHCO3 sat. et NaCI sat. Les phases organiques sont rassemblées et séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous vide. Le résidu est ensuite purifié 15 par chromatographie sur silice avec un mélange PE/EA fournissant 0,069 g d'un solide bleu profond aux reflets métalliques (0,093 mmol, 71%). 1H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) b 8,10 - 7,98 (m, 8H), 7,51 - 7,44 (m, 6H), 7,02 (dd, J = 9,0, 8,1 Hz, 4H), 6,94 (d, J = 1,1 Hz, 2H), 4,88 (s, 1H), 4,58 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,50 (q, J= 5,6 Hz, 2H), 3,35 (dd, J= 12,1, 6,0 Hz, 2H), 2,80 (s, 3H), 20 1,43 (s, 9H). 130 RMN (101 MHz, CDCI3) b 131,13, 131,08, 130,96, 130,79, 129,66, 128,69, 125,36, 117,98, 117,94, 115,03, 114,42, 67,41, 55,65, 38,76, 28,49. HRMS : [M+H]+ C24H4113F2N505 m/z calculé 744,317054, mesuré 744316900 (0.2 ppm). 25 3061714 27 1.2. Préparation du 2-14-[(2Z)-2-15-14-14-(tert-butoxycarbonylamino) butoxylphényl] -1-difluoroboranyl-3-phényl-pyrrol-2-yllimino-5-phényl-pyrrol-3- yehénoxylacétate de méthyle (19) Cette antenne (19) est obtenue selon le schéma réactionnel ci-dessous : 0 CH3NO2 11--Ph Et2NH EtOH Et0H, NaOH aq. 85% MeO OMe 85% 10' 1. KOH, Me0H/THF Ph 2. Me0H, H2SO4 BBr3, DCM 3. NH40Ac, AcOH - MeO 89% OMe 62% 11 12 15 0"----\co2me CO2Me Ac20 AcOH reflux 89% BF, Et20 DIPEA DCM 85% Ph Ph 17 18 N3 Boc-ON PMe3 THF rt 3h 91% NHBoc 19 0 HO 13 NaN3 DMF 60% Ph 66% N3 \../"N 0 Ph dibromoéthane K2CO3 DMF 14 Ph 15 16 Ph NaNO2 HCI EtOH 62% Ph N, 0 N, 0 NO Ph 3061714 28 Synthèse de (E)-1-(4-méthoxyphényI)-3-phényl-prop-2-èn-1-one (10') Dans un ballon sont dissous 15 g de paraméthoxyacétophénone (0,1 mol, 1 eq.), 10,1 mL de benzaldéhyde (0,1 mol, 1 eq.) et 400 mg de NaOH (10 mmol, 0,1 5 eq.) dans du méthanol. La solution est agitée à reflux toute la nuit. De l'eau froide est ensuite ajoutée au mélange et le précipité formé est filtré et lavé à l'eau. La chalcone 10' est recristallisée dans le méthanol sous forme de cristaux blancs avec un rendement de 85% (20,254 g, 85 mmol). RMN 1H (CDCI3, 250 MHz): 8,08-8,01 (tt, 2H), 7,80 (d, J = 15,7 Hz, 1H), 7,67- 10 7,61 (m, 2H), 7,54 (d, J = 15,7 Hz, 1H), 7,44-7,37 (m, 3H), 7,01-6,94 (tt, 2H), 3,87 (s, 3H). Synthèse de 1((4-méthoxyphényI)-4-nitro-3-phényl-butan-1-one (11) Ce composé est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la 15 préparation du composé 2. Masse obtenue : 3,205 g ; 10,71 mmol Rendement 85%. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) : 7,88-7,86 (d, 2H), 7,31-7,21 (m, 5H), 6,90-6,88 (d, 2H), 4,80 (ddd, J = 12,6 Hz, 6,4 Hz, 1,3 Hz, 1H), 4,65 (ddd, J = 12,6 Hz, 8,3 Hz 20 1,3 Hz), 4,18 (p, J= 7,1 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,42-3,29 (m, 2H). RMN 130 (CDCI3, 101 MHz) : 195,39, 163,88, 139,39, 130,39, 129,52, 129,06, 127,83, 127,51, 113,93, 79,68, 55,56, 41,22, 39,49. Synthèse de 2-(4-méthoxyphény1)-4-phény1-1H-pyrrole (12) 25 Ce composé est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 3. Masse obtenue : 1,917 g ; 7,69 mmol Rendement : 62% RMN 1H (CDCI3, 250 MHz): 8,37 (s, 1H), 7,57 (dd, J = 8,4 Hz, 1,3 Hz, 2H), 30 7,48-7,42 (m, 2H), 7,36 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 7,23-7,16 (m, 1H), 7,11 (dd, J = 2,6 Hz, 1,7 Hz, 1H), 6,98-6,91 (m, 2H), 6,71 (dd, J= 2,7 Hz, 1,7 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H). RMN 130 (CDCI3, 63 MHz) : 158,63, 135,79, 133,27, 128,77, 126,64, 125,79, 125,73, 125,46, 125,31, 115,00, 114,55, 103,14, 55,51. 35 3061714 29 Synthèse de 4-(4-phényl -1H-pyrrol-2-yl)phénol (13) Ce composé est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 4. Masse obtenue : 180 mg, 0,77 mmol 5 Rendement : 89% Mp: > 300°C HRMS : [M+H]+: 236,1070. IR (cm-1) : u = 3215, 1495, 1249, 1171, 1101, 832, 763, 696 RMN 1H (Acétone-d6, 250 MHz) : 10,41 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 7,62-7,58 (m, 10 2H), 7,55-7,51 (m, 2H), 7,33-7,27 (m, 2H), 7,22 (dd, J = 2,8 Hz, 1,7 Hz, 1H), 7,15- 7,08 (m, 1H), 6,89-6,85 (m, 2H), 6,77 (dd, J = 2,8 Hz, 1,8 Hz, 1H). Synthèse de 2-[4-(4-bromobutoxy)phényl]-4-phényl-1 H-pyrrole (14) Dans un ballon à température ambiante sont dissous 0,450 g de 13 (1,91 15 mmol, 1 eq.), 0,794 g de K2003 (5,74 mmol, 3 eq.) et 0,69 mL de 1,4- dibromobutane (5,74 mmol, 3 eq.) dans du DMF. La réaction est agitée vigoureusement à température ambiante une nuit. Le lendemain, de l'eau est ajoutée à la réaction et le mélange est extrait à l'éther diéthylique, la phase organique est lavée 3 fois avec NaCI sat puis les phases aqueuses sont réextraites 20 avec de l'éther diéthylique. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous vide. Le résidu est dissous dans un minimum de dichlorométhane, et le produit est précipité par ajout d'éther de pétrole, filtré sur Büchner et lavé avec de l'éther de pétrole fournissant 0,466 g de 14 (1,26 mmol, 66%) sous forme d'une poudre blanche. 25 Mp : 160-162°C HRMS : [M(79Br)+H]+: 371,1813, [M(81Br)+H]+ : 373,0814, [M+H]+ : 372,0781. IR (cm-1) : u = 3395, 1497, 1247, 830, 802, 751, 692. RMN 1H (DMSO-d6, 250 MHz) : 11,28 (s, 1H,), 7,61-7,57 (m, 4H), 7,34-7,31 (d, 2H), 7,28-7,25 (dd, 1H), 7,14-7,07 (tt, 1H), 6,95 (d, J = 2,8 Hz, 2H), 6,80 (dd, J = 30 2,7 Hz, 1,7 Hz, 1H), 4,02 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,62 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,01-1,94 (m, 2H), 1,88-1,81 (m, 2H). RMN 130 (DMSO-d6, 63 MHz): 156,82, 135,86, 132,27, 128,48, 125,59, 124,88, 124,76, 124,49, 124,33, 115,71, 114,71, 101,94, 66,59, 34,86, 29,11, 27,42. 35 3061714 30 Synthèse de 2-[4-(4-azidobutoxy)phényl]-4-phényl-1 H-pyrrole (15) Dans un ballon sont dissous 0,450 g de 14 (1,22 mmol, 1 eq.) et 0,395 g d'azoture de sodium (6,08 mmol, 5 eq.) dans du DMF. La réaction est agitée à température ambiante une nuit. Le mélange est dissous dans du dichlorométhane 5 est lavé plusieurs fois avec NaCI sat. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. Après dilution dans un minimum de dichlorométhane, le produit 15 est précipité par addition d'éther de pétrole. Le solide est filtré sur Büchner et on obtient 243 mg de 15 (0,73 mmol, 60%) sous forme d'une poudre blanche. 10 Mp : 177-180°C HRMS : [M+H]+: 333,1707. IR (cm-1) : u = 3394, 2948, 2875, 2080, 1496, 1246, 831, 752, 692. RMN 1H (CDCI3, 250 MHz) : 8.38 (s, 1H), 7,59-7,55 (m, 2H), 7,45-7,39 (m, 2H), 7,37-7,33 (m, 2H), 7,23-7,17 (m, 1H), 7,10-7,08 (m, 1H), 6,94-6,88 (m, 2H), 15 6,72 (dd, J = 2,6 Hz, 1,5 Hz, 1H), 4,01 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,38 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 1,89-1,80 (m, 4H) RMN 130 (CDCI3, 63 MHz) : 157,86, 135,76, 133,21, 128,77, 126,57, 125,89 , 125,77, 125,41, 125,27, 116,09, 115,09 , 103,09, 67,41, 51,34, 26,66, 25,90. 20 Synthèse de 5-[4-(4-azidobutoxy)phényl]-2-nitroso-3-phényl-1 H-pyrrole (16) Ce composé (poudre ocre-dorée) est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 6. Masse obtenue : 67 mg, 0,186 mmol 25 Rendement : 62% Point de fusion : 125-126°C HRMS : [M+H]+ : 362,1612. IR (cm-1) : u = 3280, 2918, 2850, 2092, 1603, 1360, 1258, 1164, 1038, 828, 768, 695, 668. 30 RMN 1H (CDCI3, 250 MHz) : 8,14-8,11 (m, 2H), 7,84 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,46 (dd, J = 5,2 Hz, 1,9 Hz, 3H), 7,15 (s, 1H), 6,99 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 4,06 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,39 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 1,93-1,78 (m, 4H). RMN 130 (CDCI3, 63 MHz): 163,72, 162,05, 142,84, 131,91, 129,71, 129,57, 129,29, 128,93, 122,19, 115,47, 115,03, 67,67, 51,27, 26,53, 25,82. 35 3061714 31 Synthèse de méthyl 2-[4-[(2Z)-2-[[544-(4-azidobutoxy)phény11-3-phény1- 1H-pyrrol-2-ylli mi no]-5-phényl-pyrrol-3-yl] phénoxylacétate (17) Ce composé (poudre bleue intense) est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 7. 5 Masse obtenue : 0,080 g, 0,123 mmol Rendement : 89%. Mp : 150-152 °C HRMS : [M+H]+ : 651,2717. IR (cm-1) : u = 2094, 1759, 1600, 1496, 1241, 1166, 903, 806, 764, 694, 675. 10 RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) : 8,00 (d, J = 7,8 Hz, 4H), 7,92 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,80 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,48 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,39 (dd, J = 12,8 Hz, 6,9 Hz, 4H), 7,17 (s, 1H), 6,99 (d, 3H), 6,93 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 4,69 (s, 2H), 4,06 (t, J= 6,1 Hz, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,40 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 1,91 (dt, J = 11,4 Hz, 6,1 Hz, 2H), 1,82 (p, J= 6,8 Hz, 2H). 15 RMN 130 (CDCI3, 101 MHz) : 169,49 , 161,27 , 160,76 , 157,61, 153,83, 148,27, 145,30, 145,27, 138,66, 133,76, 131,94, 130,36, 129,28, 129,22, 129,00, 128,32, 128,22, 128,15, 125,91, 125,50, 117,43, 115,16, 114,52, 111,16, 67,56, 65,53, 52,45, 51,32, 26,61, 25,87. 20 Synthèse de 2-[4-[(2Z)-2-[544-(4-azidobutoxy)phény11-1-difluoroborany1- 3-phényl-pyrrol-2-yllimino-5-phényl-pyrrol-3-yllphénoxylacétate de méthyle (18) Ce composé (solide vert intense d'aspect métallique) est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 8. 25 Masse obtenue : 0,065 g, 0,093 mmol Rendement : 85% 1H RMN (400 MHz, Acétone-d6) : Ô 8,27 - 8,19 (m, 6H), 8,16 - 8,11 (m, 2H), 7,60 - 7,46 (m, 7H), 7,29 (s, 1H), 7,14 - 7,08 (m, 4H), 4,87 (s, 2H), 4,24 - 4,17 (m, 2H), 3,78 (d, J = 2,1 Hz, 3H), 3,47 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 1,98 - 1,89 (m, 2H), 1,83 (q, J 30 = 7,4 Hz, 2H). 130 RMN (101 MHz, Acétone) : Ô 133,16, 131,74, 131,33, 130,48, 130,43, 130,29, 129,60, 129,34, 118,67, 115,76, 115,65, 68,49, 65,69, 52,28, 51,76, 27,13, 26,32. HRMS : [M+H]+ C36H3413F2N604 m/z calculé 699,270390 ; mesuré 699,270354 35 (0,1 ppm) 3061714 32 Synthèse de 2-[4-[(2Z)-2-[5-[4-[4-(tert-butoxycarbonylamino)butoxy] phény11-1-difl uoroborany1-3-phényl-pyrrol-2-ylp mi no-5-phényl-pyrrol-3- yllphénoxylacétate de méthyle (19) Dans un ballon sous argon à température sont dissous 0,061 g de 18 (0,087 5 mmol, 1 eq.) et 0,024 g de Boc-ON (0,096 g, 1,1 eq.) dans du THF anhydre. A cette solution sont ajoutés 0,096 mL d'une solution 1M de triméthylphosphine dans le toluène (0,096 mmol, 1,1 eq.). La solution est agitée une nuit à température ambiante. Le lendemain, la solution est contrôlée par CCM et si du produit de départ est encore visible, on ajoute 1 eq. supplémentaire de PMe3 et de Boc-ON afin de io terminer la réaction en une heure. La solution est ensuite lavée avec NaCI sat. et extraite au dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur silice (PE/EA) et 0,061 g de 19 (0.079 mmol, 91%) sont obtenus sous forme d'un solide vert foncé iridescent. 15 1H RMN (400 MHz, Acetone-d6) ô 8,26 - 8,17 (m, 6H), 8,15 - 8,09 (m, 2H), 7,52 (td, J = 9,6, 8,9, 4,8 Hz, 7H), 7,25 (s, 1H), 7,11 - 7,05 (m, 4H), 6,00 (s, 1H), 4,85 (s, 2H), 4,16 (dt, J = 6,6, 3,4 Hz, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,17 (td, J = 7,6, 3,8 Hz, 2H), 1,84 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,69 (p, J = 7,4 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H). 130 RMN (101 MHz, Acetone) ô 169,64, 163,11, 160,51, 160,29, 158,35, 20 156,72, 146,61, 145,53, 144,69, 143,18, 133,12, 133,07, 133,04, 131,70, 131,27, 130,44, 130,41, 130,37, 130,26, 129,55, 129,31, 126,86, 124,28, 120,79, 118,57, 115,71, 115,62, 78,39, 68,77, 65,66, 52,28, 41,83, 40,75, 28,68, 27,43, 27,21, 24,44. HRMS : [M+H]+ C42H41 BF2N505 calculé 744,317054, mesuré 744,316900 (0,2 25 ppm). 3061714 33 2. Préparation d'antennes de type pérylènediimide Synthèse du dérivé pérylènebisimide clickable Composés 20a-20b Le mélange 1,7- et 1,6-dibromopérylène-3,4,9,10-tétracarboxylique 10 dianhydride (1,03 g ; 1,8 mmol ; 1,0 éq) est solubilisé sous argon dans 20 mL de NMP. A cette solution sont ajoutés l'hexylamine (0,546 g ; 5,4 mmol ; 700pL ; 7,3 éq) et l'acide acétique (0,432 g ; 7,2 mmol ; 412 pL ; 4,0 éq). Le mélange réactionnel est agité à 85°C sous atmosphère inerte pendant 2h. Après retour à température ambiante, le mélange réactionnel est versé dans l'éthanol. Le précipité 15 rouge est filtré sous vide et lavé plusieurs fois à l'éthanol. Le mélange P1a et P1b désiré est obtenu sous la forme d'une poudre rouge que l'on utilise directement dans la réaction suivante. Composé 21 20 Le mélange obtenu précédemment (20a, 20b) est solubilisé dans la pyrrolidine. La solution est agitée sous atmosphère inerte à 85°C pendant 16h. A la fin de la réaction, la solution est refroidie et une solution d'HCI 1M est ajoutée jusqu'à pH=2. La phase aqueuse est extraite trois fois avec du dichlorométhane. Les phases organiques sont regroupées, séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées 25 sous pression réduite. Le brut réactionnel est purifié sur colonne chromatographique NMP, 16h, 85°C 1. KOH, tBuOH 95°c, 2h 2. AcOH, 25°C, 1h 3. HCI, 25°C, 1h 21 22 23 23 24 25 CNH 80°C, 16h Br 20b 5 Hexylamine, 3eq NMP, 2h, 85°C N O O Hex-N CH2C12 Et,N, 16h O 3061714 34 sur gel de silice (Eluant : Hexane / Acétate d'éthyle (7/3)) pour donner l'isomère 1,7 (P2) sous la forme d'une poudre verte. 1H RMN (600MHz, CDCI3) :8,37 (s, 2H), 8,31 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,53 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 4,21 (dd, J= 8,6, 6,6 Hz, 2H), 3,68 (brs, 4H), 2,75 (brs, 4H), 2,04 (brs, 5 4H), 1,94 (brs, 4H), 1,75 (m, 4H), 1,46 (m, 4H), 1,37-1,34 (m, 8H), 0,90 (t, J= 7,0 Hz, 6H). 130 RMN (151MHz, CDCI3) : 164,05, 146,39, 134,10, 129,82, 126,55, 123,71, 122,03, 121,66, 120,66, 119,00, 117,98, 52,14, 40,54, 31,65, 28,16, 26,87, 25,80, 22,61, 14,11. 10 Composé 22 Le composé 21 (180 mg, 2,58.10-4 mol, 1,0eq) est solubilisé dans tBuOH (25 mL). A cette solution est ajouté le KOH broyé (73 mg, 1.29.10-3, 5.0 eq). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à 95°C pendant 3h. 15 L'avancement de la réaction est suivi par CCM. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est refroidi et 10 mL d'acide acétique sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité pendant 1h supplémentaire, puis une solution d'HCI 1M (10mL) est ajoutée. Le mélange réactionnel est agité pendant une heure supplémentaire. Du dichlorométhane est ensuite ajouté et la phase organique est lavée trois fois à 20 l'eau. La phase organique est ensuite séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le brut réactionnel est purifié sur colonne chromatographique (Eluant : Hexane / Acétate d'éthyle (6/4)) pour donner le composé P3 sous la forme d'une poudre verte. 1H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,49 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 8,42 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 25 8,40 (d, J= 8,06 Hz, 2H), 7,69 (d, J=8,01 Hz, 2H), 7,55 (d, J= 8,03 Hz, 2H), 4,22 (m, 2H), 3,74 (brs, 4H), 2,83 (brs, 4H), 2,11 (brs, 4H), 2,00 (brs, 4H), 1,76 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,36-1,30 (m, 8H), 0,90 (t, J= 6,98 Hz, 3H) Composé 23 30 Le composé 22 (180 mg, 2,58.10-4mol, 1,0eq) est solubilisé dans 10mL de NMP et le 6-amino-1-hexanol (87mg, 1,4.10-4 mol, 1,0eq) est ajouté. Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à 85°C pendant 16h. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est refroidi et du dichlorométhane est ensuite ajouté. La phase organique est lavée trois fois à l'eau. La phase organique est 35 ensuite séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le brut 3061714 35 réactionnel est purifié sur colonne chromatographique (Eluant : Hexane / Acétate d'éthyle (7/3)) pour donner le composé P4 sous la forme d'une poudre verte. 'H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,51 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,45 (dd, J=8,1, 1,8 Hz, 2H), 7,74 (dd, J=8,0, 6,9 Hz, 2H), 4,23 (m, 4H) 3,77 (brs, 4H), 2,85 (brs, 4H), 2,38 (t, 5 J= 8,1 Hz, 2H), 2,10 (brs, 4H), 2,00 (brs, 4H), 1,79-17,6 (m, 4H),1,57 (m, 4H), 1,49- 1,44 (m, 4H), 1,38-1,35 (m, 4H), 0,9 (t, J= 7,0 Hz, 3H). Composé 24 Le composé 23 (135 mg, 1,9.10-4 mol, 1,0eq) est solubilisé dans du 10 dichlorométhane sec (20mL). A cette solution sont ajoutés de la triéthylamine (256 pL, 1,9 mmol, 10,0eq) et le chlorure de 4-toluènesulfonyle (366 mg, 1,9 mmol, 10,0 eq). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 16h. A la fin de la réaction, de l'eau est ajoutée et la phase organique est lavée trois fois à l'eau. La phase organique est ensuite séchée 15 sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le brut réactionnel est purifié sur colonne chromatographique (Eluant : Hexane / Acétate d'éthyle (8/2)) pour donner le composé P5 sous la forme d'une poudre verte. 'H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,50 (d, J= 6,5 Hz, 2H), 8,44 (dd, J= 8,09, 6,9 Hz, 2H), 7,79 (m, 2H), 7,73 (t, J= 7,8 Hz, 2H), 7,35 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 4,22 (dt, J= 22,9, 20 7,6 Hz, 4H), 4,03 (t, J= 6,5 Hz, 2H), 3,77 (br s, 4H), 2,85 (br s, 4H), 2,44 (s, 3H), 2,10 (br s, 4H), 1,99 (br s, 4H), 1,77-1,66 (m, 6H), 1,45 (t, J= 7,6 Hz, 2H), 1,40-1,33 (m, 8H), 0,90 (t, J= 7,0Hz, 3H). 130 RMN (151MHz, CDCI3) : 164,18, 146,58, 144,76, 134,23, 133,34, 129,99, 129,95, 128,01, 126,73, 126,69, 123,91, 123,84, 122,19, 121,86, 120,82, 119,20, 25 119,01, 118,21, 118,05, 70,71, 52,30, 40,67, 40,30, 31,77, 28,89, 28,29, 28,05, 26,99, 26,61, 25,93, 25,29, 22,74, 21,77, 14,24. Composé 25 Le composé 24 (68 mg, 78.10-3 mol, 1,0 eq) est solubilisé dans 20mL de DMF. 30 A cette solution est ajouté l'azoture de sodium (51 mg, 7,8.10-3 mol, 10,0 eq). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à 50°C pendant 12h. A la fin de la réaction le mélange réactionnel est refroidi et de l'eau est ajoutée. La phase aqueuse est extraite trois fois avec du dichlorométhane. Les phases organiques sont regroupées, séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous pression réduite 35 pour mener au produit P6 désiré sans autre purification. 3061714 36 1H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,38 (d, J= 2,3 Hz, 2H), 8,33 (dd, J=8,0, 6,4 Hz, 2H), 7,55 (dd, J= 12,3, 8,0Hz, 2H), 4,22 (q, J= 7,4 Hz, 4H), 3,69 (brs, 4H), 3,28 (t, J= 7,0 Hz, 2H), 2,76 (br s, 4H), 2,05 (br s, 4H), 1,95 (br s, 4H), 1,84-1,72 (m, 6H), 1,65 (t, J= 7,0Hz, 3H), 1,48 (m, 7H), 1,36 (m, 5H), 0,90 (t, J= 7,0 Hz, 3H). 5 130 RMN (151 MHz, CDCI3) : 164,20, 146,56, 134,31, 134,20, 129,96, 126,73, 123,89, 122,18, 122,16, 121,85, 121,29, 120,80, 119,19, 119,02, 118,19, 118,05, 52,29, 51,54, 40,68, 40,39, 31,77, 29,83, 29,65, 28,88, 28,29, 28,13, 27,00, 26,81, 26,63, 25,93, 22,74, 14,24. 10 3. Préparation de groupes hvdrosolubilisants Synthèse du composé 27 ',...0'.'....".. ..---,,,....0 ,0,,,,... ..-^,,,O.,----.. II 50°C 0 ...`"--0H 0 O-S -0-0a 0 NaN3 DMF 8 Et3NH, CH2Cl2 16h 26 27 15 Composé 26 Le triéthylène glycol mono méthyl éther (2,0 g, 1,22.10-2 mol, 1,0 eq) est solubilisé dans 120 mL de CH2012 sec. A cette solution sont ajoutés sous argon le chlorure de 4-toluènesulfonyle (4,64 g, 2,43.10-2 mol, 2,0 eq) et la triéthylamine (2,68 g, 2,43.10-2 mol, 2,0 eq). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère 20 inerte à température ambiante pendant 16h. A la fin de la réaction, de l'eau est ajouté au mélange réactionnel et la phase organique est lavée trois fois à l'eau, séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous vide. Le brut réactionnel est purifié par colonne chromatographie sur gel de silice (Eluant : CH2C12/Me0H (0.5%)) pour donner le produit désiré sous la forme d'une huile incolore. 25 1H RMN (600MHz, CDC13) : 7,79 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,33 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 4,20-4,10 (m, 2H), 3,72-3,64 (m, 2H), 3,63-3,56 (m, 6H), 3,55-3,49 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 2,44 (s, 3H). 130 RMN (151 MHz, CDC13) : 144,90, 133,14, 129,93, 121,10, 72,03, 70,87, 70,69, 70,67, 69,35, 68,80, 59,15, 21,76. 30 Composé 27 Le composé 26 (2,87 g, 9,02 mmol, 1,0 eq) est solubilisé dans 90mL de DMF sec. A cette solution est ajouté sous atmosphère inerte, le NaN3 (4,70 g, 72,0 mmol, 8eq). Le mélange réactionnel est agité à 50°C pendait 16h. Après retour à 35 température ambiante, de l'eau est ajoutée au mélange réactionnel et la phase 25 3061714 37 aqueuse est extraite au CH2Cl2. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le produit désiré est obtenu sous la forme d'une huile sans autre purification. 1H RMN (600MHz, CDCI3) : 3,69-3,65 (m, 8H), 3,57-3,55 (m, 2H), 3,40-3,39 5 (m, 5H). 130 RMN (151 MHz, CDCI3) : 72,09, 70,86, 70,82, 70,77, 70,19, 59,19, 50,84. 4. Préparation d'antennes de type porphyrine La tétraphénylporphyrine (TPPH, composé 28) a été synthétisée en io suivant la méthode de Alder-Rothemund à partir d'un mélange de benzaldéhyde et de pyrrole dans l'acide propionique, chauffé à 130°C pendant deux heures. Le produit cristallin a été isolé par filtration avec un rendement de 6%. Le faible rendement est en accord avec la littérature et la voie de synthèse employée. L'étape suivante est une substitution électrophile aromatique, appelée 15 aussi nitration aromatique. Ce dernier est contrôlable de façon régiosélective en position para du phényle, en faisant varier la quantité de nitrite de sodium et le temps de réaction dans le TFA. En effet, après avoir concentré la TPPH dans du TFA, cette dernière a été traitée par 1.8 équivalent de nitrite de sodium pendant exactement 3 minutes. Le mélange réactionnel a été ré-engagé sans purification 20 intermédiaire afin de réduire le groupement nitro en groupement amino en présence d'excès de chlorure d'étain et d'acide chlorhydrique. La porphyrine dissymétrique mono-amino (composé 29) a été isolée par chromatographie sur colonne (silice, DCM/Hexane, 9:1). H NH2 N (1.2 eq) acide propionique 1) NaNO2 (1.8 eq) TFA 0 2) SnC12.2H20 (11.5 eq) HCI cone 130 °C - 2h (1.0 eq) Composé 28 Composé 29 5,10,15,20-Tetraphenylporphyrine (TPPH, composé 28) On a ajouté du benzaldéhyde (5,0 ml, 49,1 mmoles, 1,2 équiv.) et du pyrrole (4,0 ml, 57,6 mmoles, 1,0 équiv.) dans 250 mL d'acide propionique. La solution a été agitée à 130°C pendant 2 h. Le mélange réactionnel a ensute été refroidi à température 3061714 38 ambiante puis filtré. Le solide pourpre a été lavé avec du Me0H et de l'eau chaude pour donner le produit désiré sous la forme d'une poudre pourpre (1.70 g, 2.76 mmol, rendement = 5%). 1H RMN (600 MHz, CDCI3) b ppm = -2.76 (s, 2H, H1); 7.76 (m, 12H, H4 and H5); 5 8.22 (d, J = 7 Hz, 8H, H3); 8.85 (s, 8H, H2) 130 RMN (150 MHz, CDCI3) b ppm = 120.28 (Cq); 126.83 (C4); 127.85 (C5); 134.70 (C3); 142.32 (Cq) ESI-MS m/z calc. for [C44H30N4] = 614.3; trouvé: [M+HT = 615.3, [M+2H12+ = 308.1 io 4'-Amino-5,10,15,20-tetraphenylporphyrin (composé 29) On a dissous de la TPPH (906 mg, 1,5 mmol, 1,0 équiv.) dans 70 mL de TFA, puis on a ajouté du nitrite de sodium (181 mg, 2,6 mmoles, 1,8 équiv.). La solution a été agitée à température ambiante pendant exactement 3 minutes. Le mélange réactionnel a ensuite été désactivé par 200 mL d'eau. La solution aqueuse a été 15 extraite avec du DCM. La couche organique a été lavée avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3, séchée sur du Na2SO4 anhydre, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide pourpre. Ce dernier a été dissous sans purification dans 50 mL de HCI concentré. Du chlorure d'étain(II) dihydraté (3,88 g, 17,0 mmol, 11,5 équiv.) a été ajouté à cette solution. Le mélange a été agité à 65°C pendant 2 h. Le 20 mélange réactionnel a été désactivé avec 100 mL d'eau froide. La solution aqueuse a été basifiée à pH 14 par addition d'une solution d'hydroxyde d'ammonium, puis extraite avec du DCM jusqu'à ce qu'elle soit incolore. La couche organique combinée a été déshydratée sur Na2SO4 anhydre, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide pourpre, qui a été purifié par chromatographie sur colonne (silice, 25 DCM) a donné le composé souhaité TPP-NH2 sous la forme d'une poudre pourpre (443 mg, 7,05.104 moles, rendement = 51%). 1H RMN (600 MHz, CDCI3) b ppm = -2.75 (s, 2H, H1); 7.08 (d, J = 8.9 Hz, 2H, H7 or H8); 7.78- 7.73 (m, 9H, H4 and H5); 8.01 (d, J = 8.3 Hz, 2H, H7 or H8); 8.22 (d, J = 6 Hz, 6H, H3); 8.83 (s, 6H, H2); 8.94 (d, J = 4.45 Hz, 2H, H6) 30 130 RMN (150 MHz, CDCI3) b ppm = 113.61 (C8 or C7); 126.80 (C4); 127.50 (C5); 134.71(C3); 135.85 (C7 or C8) ESI-MS m/z calc. for [C44H31N5] = 629.3; trouvé: [M+HT = 630.3; [M+2H]2+ = 315.6 35 3061714 39 5. Procédure générale de fonctionnalisation des dendrimères PAMAMG3-NH2-121321 Dans un ballon sous argon sont dissouts n équivalents de 9 (4 eq./NH2 pour 5 une fonctionnalisation totale soit 128 eq. ou 0.5 eq./NH2 pour une hémifonctionnalisation soit 16 eq.), n éq. de HBTU et n eq. de DIPEA dans 10 mL de DMF sec et dégazé. La solution est agitée à température ambiante durant 15 minutes. Pendant ce temps, 1 eq. de G3P-(NH2)32 (typiquement, 0.100 mL d'une solution de G3P-(NH2)32 à 12.44% dans le Me0H soit 1.8 !mol de dendrimère) sont io dissous dans 10 mL de DMF anhydre. Ensuite, on fait buller de l'argon dans la solution de dendrimère durant 5 minutes avant de l'ajouter à la solution d'azabodipy activée. On laisse la réaction agiter pendant une nuit à température ambiante à l'abri de la lumière. Le lendemain, la solution est concentrée sous pression réduite de façon à évaporer le maximum de DMF et de DIPEA. Le résidu bleu pâteux est 15 ensuite dissous dans du DMSO de qualité pour analyse. et placé dans un sachet de membrane pour dialyse (10 kDa) fermé hermétiquement par des pinces. Le boudin de dialyse est plongé dans du DMSO p.a. dans un erlenmeyer de 500 mL et agité doucement dans l'obscurité. Durant la dialyse, on change le DMSO de dialyse toutes les heures le premier jour, puis toutes les demi-journées les jours suivants. 20 Après une semaine de dialyse, plus aucune coloration bleue n'est observée dans le solvant de dialyse, on récupère la solution de dendrimère fonctionnalisé à l'intérieur du boudin et on évapore le maximum de DMSO par évaporation sous vide. Le dendrimère fonctionnalisé G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32) est récupéré sous forme d'une poudre bleu intense avec un rendement quantitatif. 25 Dans le but de conjuguer le dérivé porphyrine (29) au dendrimère PAMAM- G3 par des liaisons amide, les trente-deux acides succiniques monoamide en surface du dendrimère sont activés par un mélange de HATU et DIPEA dans le DMF. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 30 minutes, puis la porphyrine monoamino (29) est ajoutée. Le mélange réactionnel 30 est agité pendant 3 jours. Le produit final est purifié par dialyse dans le DMSO, grâce à une membrane de type cut-off MWCO 10kDa. Le produit (G3-(TPP)32) est caractérisé par 1H RMN dans le DMSO-d6 et permet de démontrer la substitution complète du dendrimère par trente-deux porphyrines (Figures 1, 2). 35 3061714 6. Préparation de dendrimères selon l'invention 5 6.1. Composé G3P-(Alcyne)32 G3P-MHI, NH : '7 'Ni" »'' o NH o .f-71 ( N ° 0 o o 0 ,±5 -->s,-P-z-P N 0 N j" 0 %r,IC' 0 0 NH NH HN 0 o N rs._7_,;)i___/-1s1 ' G3P-(Alcyne),, L'acide hexynoique (428 mg, 3.8 10-4 mol, 40.0 eq), N-(3- dimethylaminopropyI)-N'-éthylcarbodiimide chlorhydrique (592 mg, 3,8 10-4 mol, 40,0 eq), HOBT (516 mg, 3,8 10-4 mol, 40,0 eq) et le DIPEA sont solubilisés dans 40 10 mL de DMF distillé. La solution est agitée sous atmosphère inerte pendant 30min. A cette solution est ajoutée une solution de G3P-(NH2)32 (660 mg, 9.5 10-5 mol, 1.0 eq). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à 25°C pendant 48h. A la fin de la réaction, le DMF est évaporé sous pression réduite. Le produit brut réactionnel est purifié par dialyse dans le DMSO pendant 24h. Le solvant est 15 ensuite évaporé sous pression réduite. Le composé G3P-(Alcyne)32 est obtenu sous la forme d'une huile orange. 1H RMN (600MHz, DMSO-d6) : 7,97 (brs), 7,87 (brs), 312-3,07 (m), 2,72-2,69 (m), 2,47 (brs), 2,22-2,20 (brs), 2,16-2,12 (m), 1,64 (q). 130 RMN (MHz, DMSO-d6) : 172,20, 171,89, 171,64, 84,31, 71,56, 52,18, 20 49,62, 40,43, 39,24, 36,86, 34,41, 33,06, 24,37, 17,58. 3061714 41 6.2. Procédure générale pour la synthèse de G3P-(L2)32 G3P-(Alcyne)32 (20 mg, 2,0.10-6 mo1,1.0 eq) et le chromophore porteur d'une fonction azoture (composé 25 (Perylène))(8,0.10-6 mol, 40 eq) sont solubilisés dans 5 1 ml de DMF distillé. La solution est dégazée sous argon pendant 20min. A cette solution est ensuite ajoutée une solution de CuS045H20 et d'ascorbate de sodium dans un mélange H20/DMF (1 ml ; 1/1, v/v). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à température ambiante pendant 24h. A la fin de la réaction, les solvants sont évaporés sous pression réduite et une solution d'EDTA est ajoutée au io brut réactionnel. La solution est agitée pendant 12h puis dialysée dans l'eau pendant 24h. Le solvant est ensuite évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu est dialysé dans le DMSO pendant 24h. A la fin de la purification, le DMSO est évaporé sous pression réduite et le produit désiré (G3P-(Perylène)32) est obtenu sous la forme d'une poudre. 15 Avec composé 25 à titre de chromophore azoture : G3P-(Perylène)32 1H RMN (600MHz, CDC13) : 8,47 (s), 8,42 (d), 8,06-7,99 (brs), 7,725 (t), 7,54 (brs), 7,17-7,09 (brs), 4,85 (brs), 4,57 (brs), 4,30 (brs), 4,194,14 (br m), 3,47 (brs), 3,29 (brs), 2,34 (brs), 2,24 (brs), 1,89 (brs), 1,69 (brs), 1,40 20 (brs), 1,31 (brs), 0,85-0,81 (m). G3P-(Alcyne)' G3P-(1.2)3, '"7"*Ir --- \e-' Cu5045 H20, ascorbate de sodium H20/DMF (1rnL;1/1y/) \r',Ï S i ti e-, 3061714 42 6.3. Procédure générale pour la synthèse d'un dendrimère G3P- (Alcyne),-(L2)y i\I 11%. 1. /7 ,s" i -----,,r ., 1., h.r (-.,-"" 'À_,--e e.-...-r-',_t. 1., ? ,/-"' ç' e---),- - ,.....,,.5:,,,,,..ri-k.-', -`7K5 -, --''-r ' iu5o0a .,5nribirevidverd'u' ',J-47' ----,,,,LL, ,-5- e''' 'f'L'i f''f" ', ' \(--e, 'çe e-r4 '? f ,.\_4 4, '-'"---^.e t t it i G3P-(Alcyne),, G3P-(Alcynek(L.2), 5 G3P-(Alcyne)32 (20 mg, 2,0 10-6 mol, 1,0 eq) et le chromophore azoturé (1,6.10-5 mol, 8,0 eq) sont solubilisés dans 1 mL DMF. La solution est dégazée sous argon pendant 20 min. Une solution de CuSO4.5H20 (7.10-6 mol, 3.5 eq) et d'ascorbate de sodium (7.10-6 mol, 3,5 eq) (1 mL, DMF/H20 (1/1, v/v)) est ensuite ajoutée. Le mélange réactionnel est agité sous argon à 25°C pendant 12 h. A la fin io de la réaction, les solvants sont évaporés sous pression réduite. Le brut réactionnel est trituré dans une solution aqueuse d'EDTA pendant 5h puis dialysé dans l'eau (MW 2 kDa). A la fin de la dialyse, les solvants sont évaporés sous vide et le composé G3P-(Alcyne),-(L2)y (x = 22-24, y = 8-10). 15 Avec composé 25 à titre de chromophore azoturé, G3P-(Alcyne),-(Perylène)y (x = 22-24, y = 8-10) 1H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,16-8,09 (br m), 7,48 (brs), 7,19 (brs), 4,32 (brs), 4,18-4,13 (brsm), 3,53 (brs), 3,33 (brs), 2,70 (brs), 2,58 (brs), 2,26 (brs), 1,94 (brs), 1,84 (brs), 1,74 (brs), 1,44 (br m), 1,34 (brs m), 0,89 (brs) 20 Avec une cyanine à titre de chromophore azoturé, G3P-(Alcyne),-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10) 3061714 43 1H RMN (600MHz, DSMO-d6) : 7,95 (brs), 7,88 (brs), 7,74 (brs), 7,42 (brm), 7,27 (brm), 7,17 (brm), 7,04 (brm), 5,64 (m), 4,51 (brs), 3,93 (brs), 3,77 (brs), 2,75 (brm), 2,68 (brs), 2,20 (brs), 2,14 (brs), 1,76 (brs), 1,65 (brs), 1,57 (brs). 5 Avec le composé 18 à titre de chromophore azoturé G3P-(Alcyne),-(Bodipy2)y (x = 22-24, y = 8-10) 1H RMN (600MHz, DSMO-d6) : 7,95 (brs), 7,89 (brs), 7,55-7,41 (m), 7,12 (brm), 6,92 (brm), 4,93-4,73 (m), 4,37 (brs), 3,51 (brs), 3,39 (brs), 3,08 (brs), 2,75 (brs), 2,67 (brs), 2,21 (brs), 2,15 (brs), 1,76 (brs), 1,65 (t). 10 6.4. Procédure générale pour la synthèse d'un dendrimère G3P-(R2),- (L2)y '7 ,- .5 1. , 2»20')1-1,0 -)>.-,5(2;)( j,. 5 22 .t 1)0/DIVIF (1 rn 1/1, v/ v) rr_:',)r5 w-ne f' ejl" "5-`1'Z. t, ti 1, S -e .rn5" 15 2. )12, Cu50.)51,0 ascorbate cle sodium 1,0/1212IF (1 mL' 1/1, v/v) G3P-(R2)'-(1.2), Le dendrimère G3P-(Alcyne),-(L2)y (x = 22-24, y = 8-10) est solubilisé dans 1 mL de DMF. A cette solution est ajouté le composé 27, le groupe hydrosolubilisant azoturé (4,0.10-5 mol, 20,0 eq). La solution est dégazée sous argon pendant 20 min. 20 Une solution de CuSO4.5H20 (2.0.10-5 mol, 10.0 eq) et d'ascorbate de sodium (2.0.10-5 mol, 10.0 eq) (1 mL, DMF/H20 (1/1, v/v)) est ensuite ajoutée. Le mélange réactionnel est agité sous argon à 25°C pendant 12 h. A la fin de la réaction, les solvants sont évaporés sous pression réduite. Le brut réactionnel est trituré dans une solution aqueuse d'EDTA pendant 5h puis dialysé dans l'eau (MW 2 kDa). A la 25 fin de la dialyse, les solvants sont évaporés sous pression réduite et le résidu est solubilisé dans le DMSO puis dialysé dans le DMSO (MW 10 kDa). A la fin de la dialyse le DMSO est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré G3P-(R2),-(L2)y (x = 22-24, y = 8-10) est obtenu sous la forme d'une poudre. 3061714 44 Avec le composé 25 à titre de chromophore azoture et le composé 27 à titre de groupe hydrosolubilisant azoturé, G3P-(PEG),-(Perylène)y (x = 22-24, y = 8-10) 1H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,16-80,9 (brm), 7,45 (brs), 7,56 (s), 7,49 (brs), 5 7,13 (brs), 4,49 (s), 4,33 (brs), 4,19-4,14 (brm), 3,84(s), 3,61 (s), 3,61 (s), 3,36 (s), 3,32 (brs), 2,71 (s), 2,35 (brs), 2,25(brs), 1,95 (brs), 1,85 (brs), 1,74 (brs), 1,44 (brs), 1,34 (brs). Avec le composé 18 à titre de chromophore azoture et le composé 27 à titre io de groupe hydrosolubilisant azoturé, G3P-(PEG),-(Bodipy2)y (x = 22-24, y = 8-10) 1H RMN (600MHz, DSMO-d6) : 7,96 (brs), 7,86 (brs), 7,81 (s), 7,47-7,36 (brsm), 7,00 (brm), 6,70-6,65 (brm), 5,16 (brs), 4,89 (brs), 4,45 (s), 3,78 (s), 3,78 (s), 3,50 (s), 3,46 (brs), 3,39 (brs), 3,34 (brs), 3,31 (brs), 3,08 (brs), 2,78 (brs), 2,65 (brs), 2,59-2,56 (brm), 2,42 (brs), 2,19 (brs), 2,11 (t), 1,79 (t). 15 Exemple 2 : Synthèse de complexes selon l'invention Pour préparer des complexes de dendrimères contenant les cations 20 lanthanide, une solution de dendrimère dans le DMSO a été traitée avec 8 éq. de nitrate de lanthanide pendant 7 jours à température ambiante. Exemple 3 : Propriétés des complexes selon l'invention 25 Propriétés photophysiques des molécules à bases d'aza-Bodipy Le spectre d'absorption du chromophore Bodipy (composé 9) mesuré dans une solution de DMSO présente une bande large allant jusqu'à 770 nm avec une bande principale à basse énergie située à 672 nm (e = 2.1.105 M-1 cm-1, Figure 3). 30 Le fait d'attacher ce chromophore à la surface du dendrimère G3 PAMAM (G3P- (Bodipy1),, n = 16, 32) ainsi que l'encapsulation des ions Ln3+ à l'intérieur de ses branches n'affectent pas la position et la forme des bandes d'absorption à basse énergie. D'autre part, le coefficient molaire d'absorption augmente avec le nombre d'unités chromophore Bodipy attachées. 35 3061714 Sous excitation centrée à 650 nm, correspondant au maximum d'absorption du chromophore, le composé 9 ainsi que les dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3±) montrent de larges bandes d'émission très similaires avec un maximum à -735 nm provenant des niveaux d'énergie centrés sur le 5 chromophore aza-Bodipy (Figure 4). (Ln8-)G3P-(Bodipy1)32 (Ln = Yb3+, Nd3±) montre un léger élargissement des bandes d'émission ainsi qu'un décalage vers des longueurs d'ondes à plus basses énergies. Les formes des spectres d'excitation mesurés sous observation de l'émission à 760 nm correspondent à celles des spectres d'absorption (Figure 4 vs. 3). La luminescence caractéristique sous formes io de bandes étroites des ions Yb3+ ou Nd3+ n'a pu être observée dans le proche infrarouge sous excitation du chromophore. Ce résultat peut s'expliquer par une capacité insuffisante du chromophore Bodipy à sensibiliser les lanthanides testés ou un rapport déséquilibré entre le nombre de groupes chromophores et le nombre de Ln3+ qui pourrait induire le masquage des signaux caractéristiques du Nd3+ or Yb3+ 15 sous une large bande d'émission provenant des groupements organiques. Les rendements quantiques absolus d'émission du chromophore (composé 9) et des dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3±) sont résumés dans le Tableau 1. On a observé des diminutions significatives (6 et 3,4 fois) des 20 rendements quantiques d'émission provenant des fragments chromophores aza- BODIPY-COOH pour les dendrimères fonctionnalisés, G3P-(aza-BODIPY)32 et G3P-(aza-BODIPY)16, respectivement. Un tel effet est probablement causé par l'auto-extinction des chromophores localisés sur le dendrimère G3P PAMAM. La présence des Ln3+ à l'intérieur des branches des G3P-(aza-BODIPY)16 n'affecte pas 25 les valeurs de rendements quantiques qui restent les mêmes en tenant compte de l'erreur expérimentale. D'autre part, les valeurs Q sont augmentées de 1,7 et 1,4 fois pour G3P-(Bodipyl )32 lors de l'encapsulation des cations lanthanide Yb3+ et Nd3+, respectivement. Ce résultat peut être expliqué par la formation des différentes conformations de dendrimères dans Ln8-G3P-(Bodipy)32 avec des interactions 30 réduites entre unités chromophores modulant ainsi l'auto-extinction. 3061714 46 Tableau 1. Rendements quantiques (Q) d'une solution de concentration 101.1M de composé 9 et de (Ln8-)G3P-(Bodipyl), (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3±) mesurés dans le DMSO à température ambiante. a Composé Q (%) Composé 9 8.04(8) G3P-(Bodi pyl )32 1.33(3) Yb8-G3P-(Bodipyl )32 2.25(3) Nd8-G3P-(Bodi pyl )32 1.85(1) G3P-(Bodipyl )16 2.40(3) Yb8-G3P-(Bodipyl )16 2.53(7) Nd8-G3P-(Bodipyl )16 2.27(3) a Les valeurs 2a sont indiquées entre parenthèses. Erreurs expérimentales: Q, 5 ±10%. Rendements quantiques (Q) mesurés sous excitation à 650 nm en collectant l'émission dans la plage de 660 à 850 nm. Pour tester la photostabilité du système, le chromophore (composé 9) et les dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipyl )n (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3±) ont été illuminés en continu avec de la lumière à 670 nm et le signal d'émission a été suivi à 735 nm. io Les résultats (Figure 5) ont révélé des comportements significativement différents pour (Ln8-)G3P-(Bodipy1)32 et pour (Ln8-)G3P-(Bodipy1)18. Les dendrimères entièrement fonctionnalisés et leurs complexes formés avec Yb3+ et Nd3+ présentent une photostabilité très similaire avec une diminution de seulement 28-34% de l'intensité de luminescence initiale après 3h d'illumination. Dans les mêmes 15 conditions, le dendrimère partiellement fonctionnalisé, le G3P-(Bodipy1)18 perd complètement son signal d'émission (Figure 5, à droite). Cependant, la photostabilité de G3P-(Bodipy1)18 pourrait être améliorée par l'incorporation des Ln3±. De plus, il s'est avéré être dépendant de la nature des lanthanides. Ainsi, l'intensité de Nd8-G3P-(Bodipyl )16 est diminuée de 40% après 3h d'illumination alors 20 que le signal d'émission de Yb8-G3P-(Bodipy1)18 après une légère augmentation du signal d'émission retourne à sa valeur d'intensité initiale après 200 min de traitement. Comme pour le chromophore initial, le composé 9 (Figure 5) perd 75% de son intensité de luminescence après 3h d'illumination. Par conséquent, en général, la fixation des fragments chromophores sur la structure des dendrimères et 25 la présence des Ln3+ peuvent être utilisée avantageusement pour assurer et améliorer la photostabilité de la sonde. 3061714 47 Cytotoxicité des molécules à base d'aza-Bodipy Afin de déterminer la potentielle toxicité des dendrimères décrits, un test à l'Alamar Blue a été réalisé sur la lignée de cellules humaines de carcinome ovarien HeLa (Figure 6). Différentes concentrations de chromophores (composé 9) et de 5 dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3±) ont été testées. Le chromophore n'induit pas de toxicité jusqu'à la concentration de 2 ptM avec -100`)/0 de viabilité cellulaire observée. Microscopie confocale de fluorescence des composés à base de Bodipy Des expériences de microscopie confocale ont été réalisées afin de confirmer io la localisation intracellulaire des dendrimères (Figure 7). Dans ce but, des cellules HeLa ont été incubées durant 30 minutes avec une solution de concentration de 1,5 pM, ce qui correspond à -89-100`)/0 de viabilité cellulaire. La fluorescence des dendrimères a été observée en utilisant un laser à 633 nm comme source d'excitation et l'émission de l'aza-BODIPY a été collectée entre 650 et 800 nm avec 15 une coupe optique d'1 lm dans l'axe-z. Une même puissance de laser a été utilisée pour les différentes expériences afin de comparer les variations d'intensité de signal entre les différents dendrimères. Le signal le plus intense a été observé pour Yb8- G3P-(aza-BODIPY)18 alors que les images acquises pour les cellules HeLa incubées avec Nd8-G3P-(aza-BODIPY)18 présentent une intensité relativement 20 moins intenses (Figure 11, haut : (A) et (B)). Dans le cas des dendrimères G3P- (aza-BODIPY)16 et (Ln8-)G3P-(aza-BODIPY)32 le signal observé était relativement faible avec les mêmes réglages du laser (puissance réglée à 6%) (Figure 7, haut : (C) et bas : (A) et (B)). Les cellules HeLa incubées avec l'aza-BODIPY-COOH montrent un signal de plus faible intensité que celui observé pour Yb8-G3P-(aza- 25 BODIPY)16 (Figure 7, top : (A) vs. (D)), malgré un rendement quantique de l'aza- BODIPY-COOH 3,4 fois plus élévé que celui de Yb8-G3P-(aza-BODIPY)18 (Tableau 2). Les différences d'intensité de signaux émis dans le cas des cellules incubées avec un dendrimère entièrement ou partiellement fonctionnalisés, avec ou sans Ln3+ 30 encapsulés, peuvent être attribuées à l'importance de l'internalisation cellulaire qui varie en fonction des différences de solubilité dans l'eau ou des conformations des macromolécules. Cependant, dans tous les cas, la distribution du signal intracellulaire a été observé dans le cytoplasme et plus spécifiquement dans les 3061714 48 lysosomes, avec un signal particulièrement intense pour le dendrimère Yb8-G3P(aza-BODIPY)16 De plus, une formation de plusieurs filipodes longs et fins, des structures dérivées des membranes plasmiques riche en actine F ont été observés pour les différents dendrimères étudiés et les molécules d'aza-BODIPY-COOH 5 (Figures 7, flèches jaunes). Des expériences seront nécessaires pour confirmer ce marquage spécifique, en particulier des expériences de colocalisation avec des sondes commercialement disponibles, de types AlexaFluor conjuguées à une phalloidine (peptide spécifique pour le marquage de l'actine). Il convient de noter que dans ces conditions expérimentales utilisées, aucun io signal d'autofluorescence n'a été détecté, ce qui démontre une nouvelle fois les avantages d'utiliser des sondes possédant des longueurs d'ondes d'excitation et d'émission dans la fenêtre d'imagerie biologique. Expériences de cytométrie en flux avec les molécules à base de Bodipy 15 La cytométrie en flux a été utilisée afin de quantifier l'internalisation cellulaire des dendrimères et de mieux comprendre les différences d'intensités de signal observées en microscopie confocale. Les mécanismes d'internalisation cellulaire passifs (énergie non dépendant) et actif (énergie dépendant) ont été étudiés. Le transport actif a été inhibé avec de l'azoture de sodium (NaN3), tandis qu'une 20 incubation à 4°C a permis d'inhiber les voies de transport actives et passives en augmentant la rigidité de la membrane plasmique des cellules HeLa (S. Vranic, N. Boggetto, V. Contremoulins, S. Mornet, N. Reinhardt, F. Marano, A. Baeza-Squiban, S. Boland, Deciphering the mechanisms of cellular uptake of engineered nanoparticles by accurate evaluation of internalization using imaging flow cytometry, 25 Particle and Fibre Toxicology, 10 (2013) 1-16). Les résultats obtenus permettent de conclure sans ambiguïté que les dendrimères partiellement fonctionnalisés (Ln8-)G3P-(Bodipy1)16 (Ln = Yb3+, Nd3±) sont significativement plus internalisés par les cellules par comparaison avec les dendrimères entièrement fonctionnalisés (Ln8-)G3P-(Bodipy1)32 (Ln = Yb3+, Nd3±) 30 (Figure 8). Cependant, pour les deux types de dendrimères, l'internalisation est systématiquement plus importante pour ceux contenant de l'Yb3+ que pour ceux contenant du Nd3±. En effet, l'incubation avec le dendrimère Yb8G3P-(Bodipy1)16 montre une internalisation cellulaire plus importante que le dendrimère Nd8G3P(Bodipy1)16 Ces résultats peuvent s'expliquer par la meilleure solubilité et par 3061714 49 conséquent une agrégation moindre dans le milieu cellulaire des dendrimères partiellement fonctionnalisés ainsi qu'une conformation plus favorable à l'internalisation des dendrimères ayant encapsulé des Ln3+ (particulièrement pour Ln = Yb3±). Pour le chromophore composé 9, un signal d'émission relativement fort a 5 été observé et correspondant à 65% d'internalisation de Yb8G3P-(Bodipy1)16. Par ailleurs, l'internalisation du dendrimère Nd8-G3P-(Bodipy1)16 plus faible que celle du dendrimère Yb8-G3P-(Bodipy1)16 est compensée par un rendement quantique plus élevé (Tableau 2) permettant d'observer des intensités d'émission comparables en microscopie confocale (Figure 7, haut (A), (B) vs (D)). Les dendrimères pénètrent io dans les cellules par des voies de transport actives et passives (Figure 8). Les résultats correspondants à l'inhibition de l'internalisation cellulaire sont présentés dans le Tableau 2. Les pourcentages relatifs d'internalisation active ou passive varient en fonction du nombre de chromophore Bodipy et de la présence de Ln3±. Le chromophore composé 9 montre 19% d'internalisation par transport actif. 15 Cependant, des études plus poussées sont nécessaires pour clarifier les mécanismes exacts de transport actif. L'endocytose est le mécanisme principal actif permettant l'entrée dans la cellule (B.D. Grant, J.G. Donaldson, Pathways and mechanisms of endocytic recycling, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 10 (2009) 597-608 ; L. Kou, J. Sun, Y. Zhai, Z. He, The endocytosis and intracellular 20 fate of nanomedicines: implication for rational design, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 8 (2013) 1-10 ; D. Vercauteren, R.E. Vandenbroucke, A.T. Jones, J. Rejman, J. Demeester, S.C. De Smedt, N.N. Sanders, K. Braeckmans, The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls, Molecular Therapy, 18 (2010) 561-569 ; D.A. Kuhn, D. 25 Vanhecke, B. Michen, F. Blank, P. Gehr, A. Petri-Fink, B. Rothen-Rutishauser, Different endocytotic uptake mechanisms for nanoparticles in epithelial cells and macrophages, Beilstein Journal of Nanotechnology, 5 (2014) 1625-1636), des mesures de cytométrie en flux pourront être réalisées après inhibition des différentes voies d'endocytoses avec des molécules appropriées telles que : (D. 30 Dutta, J.G. Donaldson, Search for inhibitors of endocytosis: intended specificity and unintended consequences, Cell Logist, 2 (2012) 203-208) monodansylcadaverine (H.T. McMahon, E. Boucrot, Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 12 (2011) 517-533), Filipin III (J.E. Schnitzer, P. Oh, E. Pinney, J. Allard, Filipin-sensitive 35 caveolae-mediated transport in endothelium-reduced transcytosis, scavenger endocytosis, and capillary-permeability of selected macromolecules, Journal of Cell 3061714 Biology, 127 (1994) 1217-1232) ou Amiloride (S. Gold, P. Monaghan, P. Mertens, T. Jackson, A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells, PLoS One, 5 (2010) e11360), inhibiteurs respectifs de l'endocytose clathrine- et caveoline- dépendante ou la 5 micropinocytose. Tableau 2. Pourcentage d'inhibition cellulaire de l'internalisation par mécanisme de transport actif et passif des composé 9 et dendrimères (Ln8-)G3P(Bodipy1), (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3±) (cellules HeLa). Les valeurs ont été io obtenues par cytométrie en flux. Composés Internalisation cellulaire Active Passivea Yb8-G3P-(Bodipyi )16 42±8 53±4 Nd8-G3P-(Bodipyi )16 68±20 29±3 G3P-(Bodipyi )16 35±19 57±2 Yb8-G3P-(Bodipyi )32 72±8 22±7 Nd8-G3P-(Bodipyi )32 57±17 38±6 G3P-(Bodipyi )32 40±5 51±7 Composé 9 18±4 81±1 a Les pourcentages d'inhibition des mécanismes passifs sont présentés comme la différence de pourcentage entre l'internalisation inhibée à 4°C et celle inhibée à l'azoture de sodium 15 Microscopie d'épifluorescence avec les molécules à base de Bodipy La capacité de détection du signal émis dans le proche infrarouge par les composé 9 et les dendrimères (Ln8-) G3P-(Bodipy1), (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3±) a été confirmé en microscopie d'épifluorescence après 30 minutes d'incubation de cellules HeLa avec une solution de 1,5 ptM de complexe de dendrimère 20 correspondant. En raison de la largeur de bande d'émission en proche infrarouge du chromophore aza-Bodipy, le signal a été collecté par épifluorescence avec un filtre passe long de 785 nm à l'émission et un filtre 655 ± 40 nm à l'excitation (Figure 9). Les résultats obtenus concordent avec ceux obtenus par microscopie confocale (Figure 7). Les cellules HeLa incubées avec le dendrimère. Ln8-G3P-(Bodipy1)16 25 (Figure 9, haut: (A) et (B)) présentent le signal émis le plus intense après 8 secondes d'exposition. Les images obtenues pour les autres dendrimères montrent un signal plus faible voir non détectable dans le cas du G3P-(Bodipy1)32. 3061714 51 Les résultats peuvent à nouveau s'expliquer par les différences d'internalisation cellulaire (Tableau 2) et les intensités d'émission (Tableau 1) pour les différents dendrimères étudiés. Propriétés photophysiques des molécules à base de Cyanine 5 Le dendrimère G3P-(Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10) et ses complexes formés avec Nd et Yb montrent une large bande d'absorption centrée à 665 nm (Figure 10). L'excitation sur les bandes centrées sur le ligand se traduit par une intense émission à large bande centrée à 725 nm. Aucune bande d'émission étroite caractéristique du Nd ou du Yb n'a pu être observée dans le proche- io infrarouge. L'illumination continue de G3P-(Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10) avec une lumière centrée à 665 nm permet d'estimer la photostabilité des dendrimères qui apparaît comme étant assez faible (Figure 11). 15 Microscopie par épifluorescence des molécules à bases de cyanine Afin d'établir la preuve de principe que l'émission de ce dendrimère peut être détecté par microscopie d'épifluorescence après incubation avec des cellules HeLa. Un signal de fluorescence a été observé en utilisant un filtre d'excitation 655 ±40 nm 20 ainsi qu'un filtre d'émission 750 ± 50 nm (Figure 12). Propriétés photophysiques des molécules à base de porphyrine Les spectres d'absorption du complexe Yb8-G3P-(TPP)32 ont été enregistrés dans le DMSO et dans le mélange DMSO/(Opti-MEM/ FCS, 6:94%) (Figure 13). Le spectre d'absorption du Yb8-G3P-(TPP)32 mesuré dans une solution de 25 DMSO présente les bandes d'absorbance de porphyrine typiques : la bande de Soret centrée à 420 nm (c-5.9.106 M-1.cm-1), la bande Q IV centrée à 517 nm (c-29.1.104 M-1.cm-1), la bande Q III centrée à 553 nm (c-16.6.104 M-1.cm-1), la bande Q II centrée à 592 nm (c-8.5.104 M-1.cm-1), et la bande Q I centrée à 648 nm (c-9.1 .104 M-1.cm-1). 30 Les bandes présentes sur le spectre d'absorption du Yb8-G3P-(TPP)32 dans le mélange DMSO / (Opti-MEM: FCS) sont légèrement décalées vers le rouge, par 311 nm. Il faut noter ici que dans notre cas, nous avons été limité par la faible 3061714 52 solubilité de Yb8-G3P-(TPP)32 dans le milieu de culture cellulaire et, par conséquent, la diffusion de la lumière est importante. Avec une excitation centrée à 520 nm, Yb8-G3P-(TPP)32 montre une émission 5 de porphyrine typique : deux bandes dans la région visible : centrées à 664 nm et 717 nm, Figure 14. Une bande étroite correspondant à la transition 2F512 -> 2F712 de l'Yb3+ dans le proche-infrarouge a été observée, Figure 15. Cependant, le signal semble être superposé à l'émission résiduelle du chromophore tétraphénylporphyrine. Ce résultat peut s'expliquer par une faible capacité du 10 chromophore à sensibiliser l'Yb3+ ou un rapport déséquilibré entre le nombre de groupes chromophores et celui des cations lanthanide. Le spectre d'excitation de Yb8-G3-(TPP)32 montre des bandes comparables à celles observées sur le spectre d'absorption, indiquant ainsi que la sensibilisation de 15 Yb3+ se produit par le transfert d'énergie du chromophore tétraphénylporphyrine vers le cation lanthanide, Figure 16. Le rendement quantique de l'émission de Yb3+ dans le complexe Yb8-G3- (TPP)32, 37 pM dans une solution de DMSO n'a pas pu être déterminé en raison de la trop faible intensité du signal d'émission. Néanmoins, les courbes de 20 décroissance de la luminescence ont été mesurées et peuvent être déconvoluées par des fonctions bi-exponentielles avec des valeurs de temps de vie individuels de 68 (1) ps (48 (5)%) et 17,4 (1) ps (52 (5)%). Microscopie d'épifluorescence des molécules à base de porphyrine et 25 activité potentielle en thérapie photodynamique La capacité du complexe Yb8-G3-(TPP)32 à être utilisé comme agent d'imagerie dans la région proche-infrarouge a été confirmée par des expériences de microscopie d'épifluorescence. Des signaux intenses ont été détectés dans le proche-infrarouge sous une excitation à 417 nm (filtre de bande passante 60 nm) 30 dans des cellules HeLa incubées avec le complexe Yb8-G3-(TPP)32 (Figure 17A). Après 2 minutes d'irradiation avec une lumière sélectionnée avec un filtre à bande passante centrée à 417 nm, nous avons observé la formation de vésicules. Ce résultat est une indication typique d'un processus de stress oxydatif résultant de la production d'espèces réactives d'oxygène par Yb8-G3-(TPP)32 sous irradiation 35 lumineuse (Figure 17B). 3061714 53 Dans le cas des cellules non incubées avec Yb8-G3-(TPP)32, nous n'avons pas observé d'autofluorescence dans la région proche-infrarouge (Figure 17C). Les images de microscopie d'épifluorescence montrent un certain niveau d'agrégation des dendrimères Yb8-G3-(TPP)32 dans les conditions biologiques utilisées. 5 REVENDICATIONS1. Complexe comprenant au moins un dendrimère et au moins un lanthanide, dans lequel le dendrimère comprend un motif de formule (I) suivante : (I) Cl N 2 4 dans laquelle : - Cl est un groupe de valence 4 de formule >N-CH2-CH2-N 2. Complexe selon la revendication 1, dans lequel l'antenne est choisie dans le groupe constitué des anthraquinones, des cyanines, notamment des cyanines 5 et des cyanines 7, des aza-BODIPY, des pérylènediimides, des porphyrines, des sels de phénothiazine et de leurs dérivés. 3. Complexe selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'antenne est reliée au motif de formule (I) de façon covalente par l'intermédiaire d'au moins un bras répondant à la formule suivante : -A4-X-[A5-Z];-((A6);-Y)k- dans laquelle : - A4 est un groupe de formule -(CH2)2-X'-(CH2)2-, X' représentant un groupe - C(0)-NH- ou un groupe -NH-C(0)-, et étant de préférence un groupe de formule - (CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2- ; - X est un groupe de formule -NH-C(0)- ; - i est un nombre entier compris entre 1 et 3 ; - j est 0 ou 1 ; - k est 0 ou 1 ; 3061714 55 - A5 et A6 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les radicaux (cyclo)alkylènes, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone ; 5 - Z est choisi parmi les groupes -0-, -NH-, -S-, amide, ester, triazole, amine, éther, thioéther, urée, thiourée, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, amidine, phosphoramidate, disulfure et sulfonyle ; et - Y est choisi parmi les groupes -0-, -NH-, -S-, alkylène, amide, ester, triazole, 10 amine, éther, thioéther, urée, thiourée, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, amidine, phosphoramidate, disulfure et sulfonyle. 4. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le dendrimère répond à la formule suivante : 15 C1-{Al-N[A2-N(A3-N(A4-R )111 dans laquelle : - C1 est un groupe de valence 4 de formule >N-CH2-CH2-N 5. Complexe selon la revendication 4, dans lequel l'un au moins des groupes R' répond à la formule (1') suivante : -NH-C(0)-A5-Z-L A5 et Z étant tels que définis dans la revendication 3, et L étant tel que défini dans la revendication 4. 15 6. Complexe selon la revendication 5, dans lequel l'un au moins des groupes R' répond à la formule (1") suivante : H N A L.. 5 `rt N 20 0 N L A5 étant tel que défini dans la revendication 3, et L étant tel que défini dans la revendication 4. 25 7. Complexe selon la revendication 5, dans lequel l'un au moins des groupes R' répond à la formule (1"') suivante : -NH-C(0)-A5-O-L A5 étant tel que défini dans la revendication 3, et L étant tel que défini dans la revendication 4. 30 8. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l'antenne répond à l'une des formules suivantes : 0 '>. 3061714 9. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le lanthanide est choisi dans le groupe constitué de Yb, Nd, Ho, Tm, Sm, Dy, Eu, Pr et Er. 10 10. Utilisation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comme chromophore fluorescent. 5 ,-.,/,,,,',y.,- 57