Brevet FR3051191A1 — publié le 20171117

Polypeptide dérivé de la tropoélastine et matériau biocompatible le comprenant. La présente invention a pour objet un polypeptide dérivé de la tropoélastine et un matériau biocompatible composite comprenant ledit polypeptide. Elle a également pour objet un procédé de synthèse d'un tel matériau biocompatible ainsi que les applications de ce matériau, notamment dans le domaine biologique et médical, et en particulier pour la culture cellulaire et l'ingénierie tissulaire. L'invention se situe donc dans le domaine de la biochimie des polypeptides et des biomatériaux composites à base de protéines. Les supports connus d'ingénierie tissulaire, qui peuvent être élaborés à partir de composants naturels tels que notamment le chitosan, le collagène, l'acide hyaluronique ou l'alginate, ou bien de composants synthétiques, tels que les polymères organiques, connaissent tous la même limite due à l'impossibilité actuelle de reproduire un tissu avec des propriétés élastiques analogues aux tissus recherchés. Cette limite résulte notamment de l'absence de supports matriciels adaptés pour créer le microenvironnement présentant un rapport adéquat entre les composants élastiques et viscoélastiques des tissus néosynthétisés et de leurs matrices support. Les supports commerciaux connus à ce jour n'incorporent pas de composante élastique en leur sein, ce qui a pour conséquence immédiate une contraction du tissu implanté, qui résulte en une modification du phénotype cellulaire et une variabilité des réponses biologiques induites. Dans les applications d'ingénierie tissulaire, les biomatériaux à base de protéines offrent une alternative intéressante aux polymères synthétiques pour leur utilisation potentielle comme structure tridimensionnelle. Le microenvironnement cellulaire influence le comportement des cellules par l'intermédiaire de facteurs biophysiques, mécaniques et biochimiques, spécifiques au tissu. Les biomatériaux doivent donc répondre à de nombreux critères et doivent notamment être capables de reproduire les propriétés des tissus natifs, tout en étant biocompatibles, non immunogènes et biodégradables. Ils doivent également imiter étroitement la fonction de la matrice extracellulaire afin de favoriser l'attachement, la migration et la prolifération cellulaire. L'ingénierie des tissus mous est particulièrement complexe car elle requiert en outre des propriétés d'élasticité fonctionnelle. 3051191 2 On connaît des biomatériaux comprenant des polypeptides dérivés de l'élastine qui incorporent des polypeptides composés de séquences penta-peptidiques répétées, préparés par synthèse chimique, ou bien des protéines synthétisées par voie recombinante (Annabi et al, 2013). Ces matériaux présentent des propriétés 5 mécaniques et biochimiques adaptées à des applications d'ingénierie tissulaire en général, cependant leurs propriétés in vivo n'ont pas été étudiées en détail ni de manière spécifique à un ou plusieurs tissus. On connaît aussi un polypeptide dérivé de la tropolélastine humaine, associé à un 10 groupement RGD (Arginine-Glycine-Acide Aspartique) (Wise et al, 2014). Toutefois, afin d'obtenir une tenue structurale suffisante en 3D, ces molécules doivent être mélangées et façonnées avec d'autres polymères plus rigides, naturels ou non, et les biomatériaux résultants sont donc confrontés aux limites citées précédemment, c'est-à-dire la biocompatibilité, la structure, les propriétés mécaniques, l'« informativité biologique » 15 de la charpente, la production en « chimie verte » et la standardisation de la production. Le brevet EP 1 007 555 décrit un dérivé de la tropoélastine humaine dont la séquence en acides aminés dérive de la séquence de la tropoélastine native. La séquence en acides aminés de ce dérivé est homologue, c'est-à-dire présente au moins 65% 20 d'identité, avec la séquence de la tropoélastine native prise dans son ensemble. Le polypeptide est capable de se lier aux glycosaminoglycanes et son utilisation dans le domaine médical, sous forme liée à un support, notamment un implant, est mentionnée. On connaît aussi des protéines dérivées de l'élastine comprenant des répétitions de 25 séquences pentapeptidiques VPGXG où X représente n'importe quel acide aminé naturel ou modifié à l'exception de la proline (Yeo et al, 2015). Ces protéines et leurs produits de dégradation sont biocompatibles, présentent des capacités d'auto-assemblage et des propriétés mécaniques similaires à la protéine native, ainsi qu'une capacité de coacervation. La possibilité d'insérer des séquences bioactives à ces protéines afin de 30 leur conférer des fonctions biologiques est mentionnée. In vitro, les gels formés à partir de ces protéines se sont révélés être une matrice extracellulaire pour des fibroblastes et des neuroblastes (Jeon et al, 2011). Les inventeurs ont maintenant conçu, synthétisé et caractérisé in vitro et in vivo une 35 nouvelle protéine dérivée de la tropoélastine, inspirée par la structure de la tropoélastine humaine et qui présente l'avantage de ne pas comporter de motifs 3051191 3 exogènes. Un polypeptide dérivé de l'élastine (ou PDE) selon l'invention comporte des domaines hydrophobes mais également des domaines de réticulation, inspirés eux aussi de la tropoélastine humaine. Un polypeptide selon l'invention est à ce jour le seul polypeptide dérivé de l'élastine (ou PDE) comprenant la région C-terminale de la 5 tropoélastine humaine (ou domaine 36) qui contient à la fois le motif RKRK (SEQ ID N°4), connu pour se lier à des cellules sur l'intégrine aVt33, et un pont disulfure destiné à faciliter l'assemblage des fibres élastiques. Contrairement aux PDE de l'état de l'art, qui sont formés par la répétition de pentapeptides, les domaines hydrophobes d'une PDE selon l'invention consistent en la répétition d'hexapeptides. Un tel motif 10 hexapeptidique est très conservé dans la tropoélastine humaine et possède une activité biologique par l'intermédiaire du récepteur membranaire liant l'élastine (Elastin Binding Protein ou EBP). Les inventeurs ont démontré qu'une protéine dérivée de l'élastine selon l'invention 15 possède des propriétés d'auto-assemblage et de biodégradabilité. Les structures réticulées comprenant un polypeptide selon l'invention et un agent réticulant, d'une part, ainsi que les structures réticulées comprenant un polypeptide selon l'invention, un agent réticulant bifonctionnel et un polymère hydrophile, d'autre part, possèdent les caractéristiques d'un matériau élastique, bénéficiant ainsi de la contribution 20 biomimétique de la PDE, et sont biocompatibles et biodégradables. De plus, la grande vascularisation et la faible réaction inflammatoire induites lors de l'implantation in vivo de structures réticulées comprenant un polypeptide selon l'invention et un polymère synthétique démontrent le fort potentiel de ces matériaux biocompatibles pour l'ingénierie des tissus élastiques. 25 Un polypeptide et un matériau biocompatible selon l'invention permettent donc de disposer de biomatériaux modulables et façonnables industriellement. La modulation de la séquence en acides aminés et du poids moléculaire du polypeptide, ainsi que des paramètres mécaniques du matériau permet de reproduire les propriétés mécaniques 30 de tissus élastiques humains ciblés. Un matériau selon l'invention peut être préparé en n'utilisant que des produits et des procédés dits « de chimie verte » et selon un procédé aisément standardisé, qui ne génère pas de composés toxiques ou dangereux, même après dégradation, et ne nécessite pas d'équipement particulier. Enfin, la porosité modulable et la biodégradabilité inattendue d'un matériau biocompatible selon 35 l'invention sont des atouts permettant de faciliter sa colonisation cellulaire et son 3051191 4 remplacement par un néo-tissu, qui sont deux critères favorables en médecine régénérative. Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un polypeptide isolé dérivé de la 5 tropoélastine humaine. Dans un mode de réalisation préféré, un polypeptide selon l'invention comprend la séquence en acides aminés SEQ ID N°8 ou consiste en la séquence en acides aminés SEQ ID N°9. L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'invention. 10 Selon un deuxième aspect, l'invention a pour objet une structure réticulée biocompatible comprenant un polypeptide dérivé de la tropoélastine selon l'invention. Dans un premier mode de réalisation préféré, une telle structure réticulée comprend un polypeptide selon l'invention et un agent réticulant. Dans un second mode de réalisation préféré, une telle structure réticulée comprend un polypeptide selon l'invention, un 15 agent réticulant et un polymère hydrophile. Selon un troisième aspect, l'invention a pour objet un procédé de synthèse d'une structure réticulée selon l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, un tel procédé comprend le mélange d'un polypeptide dérivé de l'élastine selon l'invention, d'un agent 20 réticulant et d'un polymère hydrophile, suivi du coulage dudit mélange dans un moule approprié et dans des conditions conduisant à la génération de pores au sein du biomatériau, notamment en présence d'un matériau porogène adapté. Selon un quatrième aspect, l'invention a pour objet un support de culture cellulaire 25 constitué par un matériau biocompatible selon l'invention, et son utilisation in vitro pour la culture de différents types de cellules. Enfin, selon un cinquième aspect, l'invention a pour objet un matériau biocompatible selon l'invention pour son utilisation pour l'ingénierie tissulaire, et de façon préférée 30 pour la régénération des tissus mous. 3051191 5 DESCRIPTION DETAILLEE La présente invention a pour premier objet un polypeptide isolé dérivé de la 5 tropoélastine, dont la séquence en acides aminés comprend successivement, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale dudit polypeptide : - Un domaine comprenant au moins 2 et au plus 40 répétitions d'une unité comprenant - Une région hydrophobe (A) comprenant successivement au moins 6 et au plus 80 séquences 10 XiGX2X3PG (SEQ ID N°1) dans lesquelles Xi, X2 et X3 représentent un acide aminé hydrophobe indépendamment choisi dans le groupe consistant en : Alanine, Valine, Leucine et Isoleucine ; lesdites SEQ ID N°1 étant identiques ou différentes, ou une région hydrophobe (A') comprenant une séquence présentant au 15 moins 65% d'identité avec la séquence de ladite région hydrophobe (A), et - Une région (B) comprenant au moins la séquence AAAKAAK (SEQ ID N°2) et de préférence comprenant la séquence 20 AAAKAAAKAAK (SEQ ID N°3) ou une région (B') d'au moins 8 acides aminés, comprenant au moins la séquence AAAKAAK (SEQ ID N°2) et présentant au moins 65% d'identité avec la séquence SEQ ID N°3, - Un domaine hydrophobe (C) comprenant successivement au moins 6 et au plus 80 25 séquences X4GX5X6PG (SEQ ID N°4) dans laquelle X4, X5 et X6 représentent tout acide aminé hydrophobe à l'exception de la proline ; lesdites SEQ ID N°4 étant identiques ou différentes, ou un domaine hydrophobe (C') comprenant une séquence présentant au moins 65% 30 d'identité avec la séquence dudit domaine hydrophobe (C), et - Un domaine (D) comprenant au moins deux acides aminés cystéine, non consécutifs, et la séquence RKRK (SEQ ID N°5), et de préférence comprenant la séquence 35 GGACLGKACGRKRK (SEQ ID N°6), 3051191 6 ou une séquence comprenant obligatoirement la séquence SEQ ID N°5 et présentant au moins 65% d'identité avec ladite séquence SEQ ID N°6. Le terme « tropoélastine » désigne un polypeptide d'un poids moléculaire d'environ 72 5 kDa et dont la séquence en acides aminés est publiquement accessible sous la référence AAC98394 (version AAC98394.1 GI:182020, datée du 8 mars 2002. Banque NCBI « Protein »). La tropoélastine est codée par un gène unique ELN (GID : 2006, MIM : 130160. Banque NCBI « Gene ») dont l'épissage alternatif lors de l'expression de la protéine conduit à l'existence de nombreux variants (ou polymorphes) de la 10 tropoélastine. Le terme de « coacervation » désigne l'agrégation non-covalente des monomères de tropoélastine sous la forme de sphérules, notamment par l'intermédiaire de ses domaines hydrophobes. La liaison covalente de multiples molécules de tropoélastine conduit à la formation de polymères insolubles d'élastine. Les termes « dérivé de la tropoélastine » et « dérivé de l'élastine » sont utilisés dans les documents 15 de l'état de la technique et sont considérés comme équivalents lorsqu'ils désignent un polypeptide non auto-agrégé de façon covalente. L'expression « dérivé de la tropoélastine » désigne un polypeptide dont la séquence en acides aminés est organisée en domaines successifs comprenant des motifs répétés, 20 cette organisation et ces motifs répétés étant inspirés de la tropoélastine humaine native. Les dérivés de la tropoélastine se distinguent de la tropoélastine native en ce que leur séquence en acides aminés est altérée par rapport à la tropoélastine native par substitution, addition et/ou délétion d'acides aminés. 25 Le terme « polypeptide isolé » désigne un polypeptide obtenu par une méthode connue par un homme du métier, et notamment par voie recombinante ou par synthèse chimique, ledit polypeptide étant ensuite séparé, par purification partielle ou totale, de son environnement initial. De même, le terme « acide nucléique isolé » désigne un acide nucléique obtenu par une méthode connue par un homme du métier, et 30 notamment selon toute méthode connue du génie génétique ou par synthèse chimique, suivie d'une purification dudit acide nucléique. Un polypeptide isolé selon l'invention diffère donc d'un polypeptide naturel, mais n'est pas limité à une méthode particulière de préparation ou de synthèse. De même, un acide nucléique isolé selon l'invention diffère d'un acide aminé naturel tout en n'étant pas limité à une méthode particulière 35 de synthèse. 3051191 7 De préférence, un polypeptide selon l'invention est produit par voie recombinante, selon des techniques bien connues de l'homme du métier spécialisé dans ce domaine. La production d'une protéine recombinante inclut notamment le choix de l'hôte destiné à la production, par exemple une bactérie, une cellule eucaryote de levure ou de 5 mammifère ou un animal transgénique, et la conception d'une séquence nucléotidique synthétique adaptée à ladite production, notamment par le choix d'un vecteur de production et le choix des codons utilisés afin d'optimiser la production. Une protéine recombinante peut être produite sous la forme d'une protéine de fusion, qui associé la protéine d'intérêt à un domaine « étiquette » (ou « Tag ») destiné à permettre 10 l'identification et/ou la purification de ladite protéine d'intérêt. La purification de la protéine d'intérêt est ensuite réalisée selon une méthode parmi les nombreux protocoles accessibles à l'homme du métier. L'invention a pour premier objet un polypeptide dérivé de la tropoélastine présentant au moins une des caractéristiques mécanique ou biologique de la tropoélastine prise à 15 l'état naturel, notamment en ce qu'il est capable d'exercer une activité physiologique, même partielle, de la tropoélastine, telle que notamment : - propriété d'élasticité, incluant notamment le retour à une forme repliée après une distension de la molécule, appliquée dans des conditions appropriées, et/ou - capacité de coacervation et/ou 20 - capacité d'auto-agrégation non-covalente, et/ou - capacité d'agrégation covalente à des molécules d'élastine, et/ou - capacité d'adhésion cellulaire in vitro et/ou - capacité d'adhésion cellulaire in vivo et/ou - capacité à stimuler la prolifération cellulaire et/ou 25 - capacité d'adhésion à l'intégrine aVt33 et/ou - capacité d'adhésion aux glycosaminoglycanes, et/ou - sensibilité à la dégradation par une métalloprotéine connue pour dégrader l'élastine, en particulier par la métallo-protéine matricielle-12 (MMP-12). 30 Ces propriétés peuvent être observées ou mesurées par toute technique de mesure adaptée connue de l'homme du métier. Selon un aspect particulier, la structure réticulée d'un polypeptide selon l'invention présente des propriétés élastiques, mesurables et quantifiables par un homme du 35 métier mettant en oeuvre un ou plusieurs moyens connus pour déterminer les propriétés 3051191 8 mécaniques d'un composé. Les tests des propriétés d'élasticité comprennent, sans s'y limiter, un test d'indentation tel que décrit dans la présente demande et tout test appliqué à une telle structure réticulée permettant de déterminer le module d'Young. 5 De son extrémité N-terminale à son extrémité C-terminale, un polypeptide selon l'invention comprend trois domaines qui sont maintenant décrits de façon détaillée. Le premier domaine comprend les régions désignées par (A) et (B), le second et le troisième domaine correspondent respectivement aux régions (C) et (D). Les termes « polypeptide » et « protéine » sont équivalents et désignent un polymère d'acides 10 aminés. Les termes « région » et « domaine » désignent une séquence primaire d'acides aminés. Chaque acide aminé est désigné par son nom ou par son abréviation à trois lettres ou à une lettre selon l'IUPAC. L'expression « acide aminé » inclut les acides aminés naturels, les analogues d'acides aminés, les isomères (D) et (L) d'acides aminés et les dérivés d'acides aminés, comme par exemple les acides aminés protégés. 15 Un polypeptide selon l'invention comprend une séquence reprenant les caractéristiques uniques de la tropoélastine humaine, à savoir des domaines hydrophobes et des domaines de réticulation plus hydrophiles, dont l'alternance est responsable des propriétés de coacervation et d'élasticité. Un polypeptide selon l'invention comprend 20 également, dans sa partie C-terminale, un domaine codé par l'exon 36, ou un domaine présentant au moins 65% d'identité avec celui-ci, contribuant à l'assemblage des fibres élastiques chez l'homme, et comprenant la séquence RKRK (SEQ ID N°5) qui est impliquée dans la liaison à l'intégrine aVt33. 25 L'expression « région hydrophobe » relative à la séquence en acides aminés d'un polypeptide désigne une séquence riche en acides aminés dont la chaîne latérale présente un caractère hydrophobe ou apolaire. Les acides aminés hydrophobes présentent une chaîne aliphatique composée uniquement d'atomes de carbone et d'hydrogène et peuvent être choisis dans le groupe constitué par : alanine, valine, 30 leucine, isoleucine, méthionine, phénylalanine, tryptophane, proline, et leurs analogues Le caractère hydrophile ou hydrophobe de la chaîne latérale d'un acide aminé est défini par son index d'hydropathie, qui permet de déterminer la nature hydrophobe d'une région d'une protéine grâce à la séquence d'acides aminés. Plus un groupement est 35 hydrophobe, plus l'index d'hydropathie est fort. Le profil d'hydropathie représente la valeur moyenne de l'index d'hydropathie d'un segment de vingt acides aminés centré 3051191 9 autour d'une position. Une valeur positive de l'index correspond à un comportement hydrophobe du segment et une valeur négative correspond à un comportement hydrophile. 5 Selon des aspects particuliers, dans un polypeptide selon l'invention le premier domaine comprend, ou consiste en, au moins 2 et au plus 40, de préférence au moins 2 et au plus 35, au moins 2 et au plus 30, au moins 2 et au plus 20, au moins 2 et au plus 15, au moins 2 et au plus 10, et plus préférentiellement 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 répétitions d'une unité comprenant : 10 - une région hydrophobe (A), ou une région hydrophobe (A') dont la séquence en acides aminés présente au moins 65% d'identité avec ladite région hydrophobe (A), et - une région (B), ou une région (B') dont la séquence en acides aminés présente au moins 65% d'identité avec ladite région (B). 15 Selon un aspect particulier d'un polypeptide selon l'invention, la région hydrophobe (A) comprend, ou consiste en, au moins 6 et au plus 80 séquences hexapeptidiques XiGX2X3PG (SEQ ID N°1) répétées, de préférence au moins 6 et au plus 70, au moins 6 et au plus 60, au moins 6 et au plus 40, au moins 6 et au plus 30, au moins 6 et au 20 plus 20, et plus préférentiellement 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 répétitions de séquences hexapeptidiques XiGX2X3PG (SEQ ID N°1), lesdites SEQ ID N°1 étant identiques ou différentes. Dans la séquence SEQ ID N°1, Xi, X2 et X3 représentent un acide aminé hydrophobe indépendamment choisi dans le groupe consistant en : Alanine, Valine, Leucine et Isoleucine. 25 Selon un aspect particulier, dans un polypeptide selon l'invention la séquence en acides aminés de la région hydrophobe (A') présente au moins 65 % d'identité avec la séquence de la région (A) et présente un caractère globalement hydrophobe. 30 Dans l'expression « présente au moins 65% d'identité avec ladite région », le pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences nucléotidiques ou en acides aminés peuvent être réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le pourcentage d'identité de séquence entre deux séquences est défini après l'alignement des séquences à comparer. Quand une position dans l'une des séquences 35 est occupée par la même base ou le même acide aminé, les molécules sont identiques à cette position. Un degré d'identité entre deux séquences est une fonction du nombre 3051191 10 de positions identiques entre les deux séquences. Les comparaisons de séquence peuvent être effectuées en utilisant tout algorithme à cet effet connu de l'homme du métier. 5 Selon un aspect particulier d'un polypeptide selon l'invention, la séquence en acides aminés d'une région hydrophobe (A') présente au moins 65%, de préférence au moins 70%, au moins75 %, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, au moins 99% ou 100% d'identité avec la séquence en acides aminés de la région hydrophobe (A). 10 Dans un polypeptide selon l'invention, la région (B) est impliquée dans la réticulation du polypeptide et comprend au moins la séquence AAAKAAK (SEQ ID N°2). Selon un aspect particulier d'un polypeptide selon l'invention, la région (B) de réticulation comprend au moins la séquence AAAKAAAKAAK (SEQ ID N°3) ou une région (B') d'au 15 moins 8 acides aminés et dont la séquence en acides aminés présente au moins 65% d'identité avec la séquence SEQ ID N°3. De préférence, la région (B') d'un polypeptide selon l'invention comprend au moins un, de préférence au moins deux, et notamment trois acides aminés lysine, ces lysines étant séparées par deux ou trois, et de préférence par trois, acides aminés. La région (B) est capable de former une structure secondaire 20 de type hélice alpha, de préférence la région (B') est capable de former une structure secondaire de type hélice alpha. Selon un aspect particulier, dans un polypeptide selon l'invention la séquence en acides aminés de la région (B') présente au moins 65% d'identité avec la séquence (B), de 25 préférence au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% /0 au moins 99% ou 100% d'identité avec la séquence en acides aminés de la région (B). Un polypeptide selon l'invention comprend un second domaine (C), défini par son 30 caractère hydrophobe et comprenant successivement, ou consistant en, au moins 6 et au plus 80 séquences répétées X4GX5X6PG (SEQ ID N°4) dans lesquelles X4, X5 et X6 représentent tout acide aminé à l'exception de la proline ; lesdites SEQ ID N°4 étant identiques ou différentes. X4, X5 et X6 sont donc choisis indépendamment parmi les acides aminés suivants : alanine, arginine, asparagine, acide aspartique, glutamine, 35 acide glutamique, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, tryptophane, sérine, thréonine, tyrosine et valine, et leurs analogues. 3051191 11 Selon un aspect plus particulier, un polypeptide selon l'invention comprend un second domaine hydrophobe (C) comprenant successivement au moins 6 et au plus 80 séquences répétées X3GX4X5PG (SEQ ID N°4) dans lesquelles X4, X5 et X6 représentent 5 un acide aminé hydrophobe indépendamment choisi dans le groupe consistant en : Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine ; lesdites SEQ ID N°4 étant identiques ou différentes. Selon un aspect particulier, dans un polypeptide selon l'invention la séquence en acides 10 aminés de la région (C') présente au moins 65% d'identité avec la séquence (C), de préférence au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% /0 au moins 99% ou 100% d'identité avec la séquence en acides aminés de la région (C). 15 Un polypeptide selon l'invention comprend un troisième domaine (D) qui comprend au moins deux acides aminés cystéine non consécutifs et la séquence RKRK (SEQ ID N°5). De préférence ledit domaine (D) : - comprend, ou consiste en, la séquence GGACLGKACGRKRK (SEQ ID N°6), ou - comprend, ou consiste en, une séquence comprenant obligatoirement la 20 séquence SEQ ID N°5 et présentant au moins 65% d'identité avec ladite séquence SEQ ID N°6. Selon un aspect particulier, dans un polypeptide selon l'invention les deux acides aminés cystéine du domaine (D) sont séparées par 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 acides aminés et de 25 préférence sont séparées par 4 acides aminés ; lesdites cystéines sont capables de former un pont-disulfure intra-chaîne. La séquence SEQ ID N°6 est codée par l'exon 36 du gène codant pour la tropoélastine humaine, ce domaine est reconnu pour faciliter l'assemblage des fibres élastiques, et 30 pour jouer un rôle dans la signalisation cellulaire et la propriété de liaison aux GAGs de la protéine. Selon un aspect plus particulier, un polypeptide selon l'invention comprend un domaine (D) comprenant obligatoirement la séquence SEQ ID N°5 et dont la séquence en acides 35 aminés présente au moins 65 % d'identité, de préférence au moins 70%, au moins 3051191 12 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% au moins 99 % ou 100% d'identité avec la séquence SEQ ID N°6. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un polypeptide 5 synthétique dérivé de la tropoélastine, dont la séquence en acides aminés comprend successivement, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale dudit polypeptide, ou consiste en : - Un domaine comprenant au moins 2 et au plus 40 répétitions d'une unité comprenant 10 - Une région hydrophobe (A) comprenant successivement au moins 6 et au plus 80 séquences VGVX7PG (SEQ ID N°7) dans lesquelles X7 représente un acide aminé hydrophobe choisi dans le groupe consistant en : Alanine et Leucine; lesdites SEQ ID N°7 étant identiques ou différentes, ou une région hydrophobe (A') comprenant une séquence présentant au moins 65% d'identité avec la séquence de ladite région 15 hydrophobe (A), et - Une région (B) comprenant au moins la séquence AAAKAAK (SEQ ID N°2), et de préférence comprenant la séquence AAAKAAAKAAK (SEQ ID N°3) ou une région (B') d'au moins 8 acides aminés, comprenant au moins la séquence AAAKAAK (SEQ ID N°2) et présentant au moins 65% d'identité avec la séquence SEQ ID N°3, et 20 - Un domaine hydrophobe (C) comprenant successivement au moins 6 et au plus 80 séquences VGX7PG (SEQ ID N°7) dans laquelle X7 représente un acide aminé hydrophobe choisi dans le groupe consistant en : Alanine et Leucine ; lesdites SEQ ID N°7 étant identiques ou différentes, ou un domaine hydrophobe (C') comprenant 25 une séquence présentant au moins 65% d'identité avec la séquence dudit domaine hydrophobe (C), et - Un domaine (D) comprenant au moins deux acides aminés cystéine non consécutifs et la séquence RKRK (SEQ ID N°5), et de préférence comprenant la séquence 30 GGACLGKACGRKRK (SEQ ID N°6) ou une séquence comprenant obligatoirement la séquence SEQ ID N°5 et présentant au moins 65% d'identité avec ladite séquence SEQ ID N°6. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un polypeptide 35 synthétique dérivé de la tropoélastine, dont la séquence en acides aminés comprend successivement, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale dudit polypeptide: 3051191 13 - Un domaine comprenant 6 répétitions d'une unité comprenant : - Une région hydrophobe (A) comprenant successivement au moins 3 et au plus 40 séquences VGVAPGVGVLPG (SEQ ID N°10), de préférence au moins 3 et au plus 35, au moins 3 et au plus 30, au moins 3 et au plus 20, au moins 4 et au 5 plus 15, au moins 5 et au plus 10, et plus préférentiellement 6, 7, 8 ou 9 répétitions d'une séquence en acides aminés VGVAPGVGVLPG (SEQ ID N°10), - Une région (B) comprenant la séquence AAAKAAAKAAK (SEQ ID N°3) ou une région (B') d'au moins huit acides aminés comprenant au moins la séquence AAAKAAK (SEQ ID N°2) et présentant au moins 65% d'identité avec la séquence 10 SEQ ID N°3, - Un domaine hydrophobe (C) comprenant successivement au moins 3 et au plus 40 séquences VGVAPGVGVLPG (SEQ ID N°10), de préférence au moins 3 et au plus 35, au moins 3 et au plus 30, au moins 3 et au plus 20, au moins 4 et au plus 15, au moins 5 et au plus 10, et plus préférentiellement 6, 7, 8 ou 9 répétitions d'une 15 séquence en acides aminés VGVAPGVGVLPG (SEQ ID N°10), et - Un domaine (D) comprenant la séquence GGACLGKACGRKRK (SEQ ID N°6). Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un polypeptide synthétique dérivé de la tropoélastine, dont la séquence en acides aminés comprend 20 successivement, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale dudit polypeptide: - Un domaine comprenant, ou consistant en, 6 répétitions d'une unité comprenant : - Une région hydrophobe (A) comprenant, ou consistant en, 6 séquences VGVAPGVGVLPG (SEQ ID N°10), - Une région (B) comprenant, ou consistant en, la séquence AAAKAAAKAAK (SEQ 25 ID N°3), - Un domaine hydrophobe (C) comprenant, ou consistant en, 6 séquences VGVAPGVGVLPG (SEQ ID N°10), et - Un domaine (D) comprenant, ou consistant en, la séquence GGACLGKACGRKRK (SEQ ID N°6). 30 Selon cet aspect particulier, un polypeptide selon l'invention est caractérisé par une taille, exprimée en poids moléculaire (kDa) qui est proche, ou du même ordre de grandeur que celle de la trophoélastine native, soit 72 KDa, et un point isoélectrique basique, de préférence très basique, et proche du point isoélectrique de la tropoélastine native, soit 10,4. 35 3051191 14 Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un polypeptide synthétique dérivé de la tropoélastine, dont la séquence en acides aminés comprend, ou consiste en, la séquence SEQ ID N°8. 5 Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un polypeptide synthétique dérivé de la tropoélastine tel que défini précédemment associé, sous la forme d'une protéine de fusion, à un polypeptide-étiquette pouvant être aisément identifié et/ou lié par un ligand connu, notamment lors de la production et de la purification du polypeptide dérivé de la tropoélastine, dans la mesure où l'adjonction dudit polypeptide 10 étiquette n'altère pas les propriétés dudit polypeptide dérivé de la tropoélastine. De préférence, un tel polypeptide-étiquette possède les propriétés suivantes : faible charge électrique, pas d'influence sur la structure du polypeptide dérivé de l'élastine selon l'invention, et est notamment choisi parmi les polypeptides suivants : Flag, polyHistidine, HA, GST, c-Myc, Glu-Glu, V5, biotine, S15. L'homme du métier peut aisément 15 choisir un polypeptide-étiquette parmi ses connaissances générales et les publications accessibles dans le domaine. Selon un aspect particulier, un polypeptide selon l'invention comprend, de son extrémité N-terminale à son extrémité C-terminale, un polypeptide étiquette et un polypeptide dérivé de la tropoélastine. Plus particulièrement, un polypeptide selon l'invention comprend, de son extrémité N-terminale à son 20 extrémité C-terminale, un acide aminé, notamment une cystéine ou tout autre acide aminé, un polypeptide étiquette et un polypeptide dérivé de la tropoélastine. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un polypeptide synthétique dérivé de la tropoélastine, dont la séquence en acides aminés comprend ou 25 consiste en la séquence SEQ ID N°9. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une séquence nucléotidique isolée codant pour un polypeptide selon l'invention. 30 Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet une séquence nucléotidique isolée comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID N°11 codant pour le polypeptide selon l'invention de séquence SEQ ID N°8. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une séquence nucléotidique 35 isolée comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID N°12 codant pour le polypeptide selon l'invention de séquence SEQ ID N°9. 3051191 15 Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un vecteur nucléotidique comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide, selon l'invention Par « vecteur » on désigne une molécule d'acide nucléique capable de transporter une 5 séquence nucléotidique à laquelle elle est liée, ou bien de permettre l'expression de la protéine codée par une séquence nucléotidique à laquelle elle est liée de façon opérationnelle (vecteur d'expression). Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un vecteur nucléotidique 10 comprenant la séquence SEQ ID N°11 codant pour le polypeptide selon l'invention de séquence SEQ ID N°8. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un vecteur nucléotidique comprenant la séquence SEQ ID N°12 codant pour le polypeptide selon l'invention de 15 séquence SEQ ID N°9. La présente invention a pour second objet un matériau biocompatible comprenant un polypeptide selon l'invention. 20 La présente invention a pour second objet un matériau biocompatible comprenant un polypeptide selon l'invention, caractérisée en ce que ledit polypeptide est réticulé. En d'autres termes, ledit polypeptide est auto-assemblé par des liaisons covalentes. La présente invention a pour second objet un matériau biocompatible comprenant un 25 polypeptide selon l'invention et un agent réticulant. Le terme « matériau biocompatible » selon l'invention désigne une structure tridimensionnelle, ou réticulée pouvant être acceptée par un être vivant, autrement dit pouvant remplir sa fonction sans effet adverse sur l'environnement biologique dans 30 lequel il est implanté. Un matériau biocompatible selon l'invention est de préférence un hydrogel, c'est-à-dire un matériau comportant une composante solide, constituée par une matrice de chaînes polypeptidiques comprenant éventuellement des chaînes polymère, et une composante liquide constituée par une forte proportion d'eau, d'un liquide aqueux ou d'un fluide biologique. 35 3051191 16 De préférence, un matériau biocompatible selon l'invention est non-toxique et non-cancérigène. De préférence, un matériau biocompatible selon l'invention est biodégradable, ou résorbable. Le terme « biodégradable » désigne la capacité d'un produit à être dégradé sous l'action d'au moins un organisme vivant, la biodégradabilité 5 s'appréciant en tenant compte du degré de décomposition et du temps nécessaire pour obtenir cette décomposition. Selon un premier aspect, un matériau biocompatible selon l'invention comprend au moins un polypeptide selon l'invention. Selon un autre aspect, un matériau 10 biocompatible selon l'invention comprend au moins un polypeptide selon l'invention et un agent réticulant. Selon un deuxième aspect, un matériau biocompatible selon l'invention comprend au moins un polypeptide selon l'invention et un polymère, de préférence hydrophile. Selon 15 un autre aspect, un matériau biocompatible selon l'invention comprend au moins un polypeptide selon l'invention, un polymère, de préférence hydrophile, et un agent réticulant. Le terme « agent réticulant » désigne un agent capable de créer des liaisons entre les 20 constituants pour former une structure ou un arrangement en réseau. Dans un matériau biocompatible selon l'invention, ledit agent réticulant est choisi parmi les agents non-toxiques et biocompatibles. Selon le premier aspect d'un matériau biocompatible selon l'invention, dans lequel celui- 25 ci comprend un polypeptide selon l'invention et un agent réticulant, l'agent réticulant peut être une enzyme, un composé chimique réactif ou un agent réticulant traditionnel réagissant sur les amines primaires. Un tel agent réticulant est de préférence choisi dans le groupe constitué par : aldéhydes (tel que glutaraldéhyde), enzymes (transglutaminases, lysyls oxydases), agents réticulant naturels (génipine), ou tout 30 agent homofonctionnel ou hétérofonctionnel dont les groupements réactifs peuvent être les esters activés, les aldéhydes, les carbodiimides, les isothiocyanates, les époxydes, les groupements photoactivables. L'espaceur entre les groupements réactifs est traditionnellement, mais non exclusivement, une chaine polyéthylène glycol ou une chaine aliphatique. Selon un aspect plus particulier, un biomatériau selon l'invention 35 comprend un agent réticulant de préférence choisi dans le groupe constitué par : un agent réticulant naturel (génipine) ou enzymes (lysyls oxydases, transglutaminases), 3051191 17 ou les agents bifonctionnels à base de polyéthylène glycol (NHS-PEG-NHS), présentant généralement une faible toxicité. Selon un second aspect particulier, la présente invention a pour objet un matériau 5 biocompatible comprenant un polypeptide selon l'invention et un polymère hydrophile. Selon cet aspect particulier, ledit polymère hydrophile comprend des groupements réactionnels destinés à permettre la formation de liaisons covalentes avec le polypeptide. Par exemple, ledit polymère peut comprendre des groupements photosensibles (acryliques ou métacryliques), la réticulation du gel ayant lieu, en 10 présence du polypeptide, sous l'effet d'une source lumineuse. Selon un autre aspect particulier, ledit polypeptide et ledit polymère hydrophile sont réticulés par l'intermédiaires d'agents de type « chimie-click ». La chimie click, de type acétylèniqueazido ou de type thiol maléimide, nécessite une modification en amont du polymère, cette modification est bien connue de l'homme de l'art. 15 Le terme « hydrophile » désigne la capacité de créer des liaisons hydrogène avec les molécules d'eau. L'expression « polymère hydrophile » désigne un polymère capable de créer de nombreuses liaisons avec les molécules d'eau, et par conséquent de comprendre une forte proportion de phase aqueuse. 20 Selon un second aspect particulier, la présente invention a pour objet un matériau biocompatible comprenant un polypeptide selon l'invention, un agent réticulant et un polymère hydrophile. 25 Dans un matériau biocompatible selon l'invention, ledit polymère hydrophile et l'agent réticulant permettent une réticulation contrôlée autour du polypeptide selon l'invention, il ne s'agit pas de l'adsorption non spécifique du polypeptide à la surface d'un matériau constitué par le polymère hydrophile réticulé. 30 Selon un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet un matériau biocompatible comprenant un polypeptide selon l'invention, un agent réticulant et un polymère hydrophile et ramifié. Le terme « ramifié » est ici équivalent du terme « arborescent » et désigne un polymère dont la structure n'est pas linéaire mais est tridimensionnelle. 35 3051191 18 Un polymère adapté à un matériau biocompatible selon l'invention présente idéalement les propriétés suivantes : procédé de synthèse standardisé, bon rendement de synthèse, homogénéité, comportement mécanique activité biologique adaptés, possibilités importantes de réactivité chimique, biocompatibilité et permettant une 5 bonne adhérence des cellules. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible comprenant un polypeptide selon l'invention, un agent réticulant et un polymère hydrophile, ledit polymère hydrophile étant de préférence ramifié et choisi 10 parmi les polymères de lysine, et notamment parmi les dendrimères de polylysine ou d'autres polymères aminés les polyéthylènes imines(PEI), les polyamidoamines (PAMAM), les kératines, le chitosan. Au sens de la présente invention, on entend par « dendrimères de polylysine », des 15 polymères arborescents de L-lysine tels ceux décrits par Denkewalter et al (1981, 1983) et par Rodriguez-Hernandez et al (2003) et Klok et al (2002) ainsi que ceux à base de D- ou de L-lysine décrits dans la demande internationale W02006/114528 et appelés dendrimères greffés de polylysine (DGL). Tous ces dendrimères sont soit constitués uniquement de lysine, la lysine étant soit sous la forme (D) soit sous la forme 20 (L), soit constitués de plus de 30% en mole de lysine et contenant également des unités d'autres aminoacides. Dans le cas où les dendrimères sont constitués uniquement de (D)-Lysine ou de (L)-Lysine on parle d'homopolylysine, dans les autres cas on parle d'hétéropolylysines. 25 Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, on utilise des dendrimères greffés de polylysine (DGL) de génération 1 à 7, natifs ou modifiés, de préférence des DGL de génération 2, 3, 4 ou 5, et plus préférentiellement des DGL de génération 3. Compte tenu de la très faible taille des DGL de génération 1 (DGL-1), les concentrations de DGL-1 à utiliser pour l'obtention d'un hydrogel conduiraient à un matériau de rigidité 30 plus importante que celle de matériau préparés à partir de DGL de génération 2 ou 3, et présentent donc peu d'intérêt pour l'invention, alors que des dendrimères de générations supérieures à 7 ont tendance à former des agrégats qui rendent difficile leur utilisation. 35 On entend par dendrimères greffés de polylysine natifs des dendrimères dans lesquels les fonctions amines sont libres. On entend par dendrimères greffés de polylysine 3051191 19 modifiés, des dendrimères dont tout ou partie des fonctions amines sont liées de manière covalente ou non à un autre acide aminé, à des fonctions chimiques électropositives (amines quaternaires, guanidine), à des fonctions hydrophobes telles que les chaines (C2-Cia)alkyles, des fonctions cholestérols, ou des poly-éthylène-glycol. 5 L'homme du métier saura réaliser les modifications de ces groupes amines en faisant appel à ses connaissances générales ou aux techniques décrites dans la littérature, comme par exemple celles décrites par Rossi J.C. et al (2012). Il saura également choisir le type de modifications à apporter en fonction du matériau biocompatible à synthétiser. 10 Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible comprenant un polypeptide selon l'invention, un agent réticulant et un polymère hydrophile, ledit polymère hydrophile étant un dendrimère greffé de polylysine, constitué uniquement de L-lysine, c'est-à-dire un homopolymère de L-lysine 15 et qui constitue une charpente polycationique, de préférence arborescente. Selon un aspect encore plus particulier, un polymère d'un matériau biocompatible selon l'invention est un dendrimère greffé de polylysine préparé selon le procédé décrit dans la demande internationale publiée sous le numéro WO 2006/114528. Ce polymère est 20 modulable en taille, selon son niveau de génération, un comportement mécanique et une activité biologique spécifiques pouvant être attribués aux différents polymères selon leur taille. De préférence, dans un matériau selon l'invention, le dendrimère greffé de polylysine 25 est un dendrimère de génération 3, préparé selon le procédé décrit dans la demande internationale publiée sous le numéro WO 2006/114528, avec un poids moléculaire moyen d'environ 15000 à environ 30000 Da, de préférence environ 21500 Da, plus préférentiellement d'environ 22000 Da, une polydispersité d'environ 1,4 et d'environ 80 à environ 170, notamment environ 123 groupements -NH2 externes libres. Ce 30 dendrimère greffé de polylysine présente l'avantage d'offrir un bon rendement de synthèse, une homogénéité, un bon comportement mécanique et une bonne activité biologique lorsqu'il il est réticulé avec un polypeptide selon l'invention. Il permet une réactivité chimique importante par la présence de multiples fonctions amines primaires. Il est biocompatible et totalement non immunogène, contrairement à la polylysine non 35 linéaire. Il permet une bonne adhérence et un bon étalement des cellules, entraînant très peu de différentiation et permettant une activation de la transcription d'un gène 3051191 20 codant pour une protéine de surface, la sous-unité a5 des intégrines. De plus, il est furtif vis-à-vis du système immunitaire, il n'induit donc pas la production d'anticorps dirigés contre les dendrimères de lysine. 5 Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible selon l'invention comprenant un polypeptide selon l'invention, un agent réticulant et un polymère hydrophile, dans lequel ledit agent réticulant est un agent homo-bifonctionnel ou hétéro-bifonctionnel. 10 Selon un aspect plus particulier, un matériau selon l'invention comprend un agent réticulant bifonctionnel comprenant une chaîne de polyéthylène glycol, de longueur variable, de préférence comprise entre 200 Da et 20000 Da, de préférence 2000 Da, fonctionnalisée à chacune de ses extrémités par un groupement capable d'interagir avec les fonctions de type amine primaire, et notamment avec la chaîne latérale d'une lysine. 15 Selon un aspect plus particulier, un matériau selon l'invention comprend un agent réticulant bifonctionnel, fonctionnalisé à chacune de ses extrémités par une fonction ester activée, par 2-(N-Succinimidyl-succinylamino)ethyl (NHS) ou par toute autre fonction chimique capable d'interagir avec les fonctions de type amine primaire. 20 Selon un aspect encore plus particulier, un matériau selon l'invention comprend un agent réticulant comprenant une chaîne de PEG fonctionnalisée à chacune de ses extrémités par une fonction ester activée, par 2-(N-Succinimidyl-succinylamino)ethyl (PEG-NHS). 25 Selon un aspect encore plus particulier de l'invention, ledit matériau biocompatible est caractérisé en ce que : - ledit polypeptide comprend la séquence en acides aminés SEQ ID N°8, et de préférence comprend la séquence SEQ ID N°9 30 - ledit polymère est un dendrimère greffé de polylysine de génération 3, et - ledit agent réticulant est bifonctionnel et comprend une chaîne de polyéthylène glycol (PEG) fonctionnalisée à chacune de ses extrémités, de préférence par une fonction ester activée, par 2-(N-Succinimidyl-succinylamino)ethyl (PEG-NHS). 3051191 21 La présente invention a pour troisième objet un procédé de préparation d'un matériau biocompatible selon l'invention, ledit procédé comprenant une étape de mélange d'un polypeptide selon l'invention et d'un agent réticulant. 5 L'homme du métier déterminera aisément, selon le choix dudit agent réticulant, qu'il soit de nature chimique ou enzymatique, les conditions réactionnelles nécessaires pour que la réticulation ait lieu. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, le mélange d'un polypeptide 10 selon l'invention et d'un agent réticulant est réalisé dans les conditions suivantes : - Concentration en agent réticulant d'au moins 10 mM, et de préférence de 50 mM, l'agent réticulant étant notamment la génipine ou un agent comprenant une chaîne de PEG fonctionnalisée à chacune de ses extrémités par 2-(NSuccinimidyl-succinylamino)ethyl (PEG-NHS ou NHS-PEG-NHS). 15 - Concentration en polypeptide selon l'invention, d'au moins 1 mg/ml, de préférence comprise entre 1 et 100 mg/ml, et de préférence de 50 mg/ml. - Milieu réactionnel constitué par un tampon, tel que du PBS (NaCI 150 mM, pH 7,4), - Température comprise entre 35 et 45°C, de préférence comprise entre 36 et 20 44°C, de préférence d'environ 42°C, et préférentiellement de 42°C, - Durée de réaction de durée comprise entre plusieurs minutes et plusieurs heures, la réaction comprenant typiquement une phase de mise en contact du polypeptide et de l'agent réticulant, d'une durée comprise entre 5 et 20 minutes, et de préférence d'environ 15 minutes pour un agent de type PEG-NHS, ou d'une 25 durée comprise entre 1 et 24 heures, et de préférence 16 heures pour un agent de type génipine, suivie d'un lavage, le matériau obtenu est ensuite déposé dans tout solvant ou solution adaptée, notamment du PBS à pH 7,4. - Optionnellement, le matériau peut être séché ou lyophilisé, puis héhydraté dans tout solvant ou solution adaptée, notamment du PBS à pH 7,4. 30 La concentration des différents composants permet de moduler les différentes propriétés du matériau biocompatible. Le taux d'agent réticulant permet de varier la rigidité du biomatériau, le taux de polypeptide élastique permet de moduler la composante élastique du matériau. 35 3051191 22 Le mélange d'un polypeptide selon l'invention et d'un agent réticulant conduit à la gélification de l'ensemble, pour générer un matériau de type élastomère, un élastomère étant défini comme un polymère présentant des propriétés élastiques, obtenues après réticulation. Le contrôle de la gélification permet de manipuler les éléments à l'état 5 soluble pour imposer une forme au matériau. De plus, la concentration des différents composants permet de moduler les différentes propriétés des structures réticulées obtenues par la mise en oeuvre du procédé. Le taux de polypeptide élastique permet de moduler la composante élastique de la structure. La préparation des élastomères s'effectue généralement dans des conditions très douces, la gélification s'effectuant à 10 température ambiante et pression atmosphérique et le recours aux solvants organiques est rarement requis. Selon un aspect encore plus particulier d'un procédé selon l'invention, un hydrogel est préparé par le mélange d'un polypeptide selon l'invention et d'un agent réticulant, en 15 présence d'un polymère hydrophile. Selon un autre aspect d'un procédé selon l'invention, le mélange d'un polypeptide selon l'invention et d'un agent réticulant est réalisé en présence d'un polymère hydrophile et ramifié. Ledit polymère hydrophile est choisi notamment parmi : les polymères de lysine, les polyéthylènes imines(PEI), les polyamidoamines (PAMAM), les kératines et le chitosan. La préparation des hydrogels 20 s'effectue généralement dans des conditions très douces, la gélification s'effectuant à température ambiante et pression atmosphérique et le recours aux solvants organiques est rarement requis. 25 Selon un aspect encore plus particulier d'un procédé selon l'invention, ledit polymère est un dendrimère greffé de polylysine, de préférence de génération 3, préparé selon le procédé décrit dans la demande internationale publiée sous le numéro WO 2006/114528. 30 Selon cet aspect particulier d'un procédé selon l'invention de préparation d'un matériau biocompatible, un polypeptide selon l'invention et un polymère hydrophile sont mélangés en présence d'un agent réticulant, ledit agent réticulant étant un agent bifonctionnel choisi parmi les agents comprenant une chaîne de taille variable fonctionnalisée à chacune de ses extrémités par un groupement capable d'interagir avec 35 les fonctions de type amine primaire, et notamment avec la chaîne latérale d'un acide aminé lysine. Selon cet aspect particulier d'un procédé selon l'invention, ledit agent 3051191 23 réticulant comprend une chaîne de PEG fonctionnalisée à chacune de ses extrémités par une fonction ester activée par 2-(N-Succinimidyl-succinylamino)ethyl (PEG-NHS). Le mélange d'un polypeptide selon l'invention, d'un polymère hydrophile et d'un agent 5 réticulant conduit à la gélification de l'ensemble. Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention de préparation d'un matériau biocompatible, le mélange d'un polypeptide selon l'invention, d'un agent réticulant et d'un polymère est réalisé dans les conditions suivantes : - Durée de réaction comprise entre 15 secondes et 10 minutes 10 - Concentration en agent réticulant d'au moins 20 mg/ml, et de préférence comprise entre 50 et 100 mg/ml - Concentration en polypeptide selon l'invention, d'au moins 0,1 mg/ml, de préférence comprise entre 1 et 20 mg/ml, et de préférence de 3,75 mg/ml, - Concentration en polymère d'au moins 25 mg/ml et de préférence comprise entre 15 25 et 100 mg/ml. Le taux (ou concentration) d'agent réticulant et de polymère permet de varier la rigidité du biomatériau, le taux (ou concentration) de polypeptide élastique permet de moduler la composante élastique du matériau. 20 Selon un autre aspect plus particulier d'un procédé selon l'invention, la préparation d'un matériau biocompatible comprend : - une étape de mélange d'un polypeptide selon l'invention et d'un agent réticulant, en présence ou en absence d'un polymère hydrophile, pour obtenir un matériau 25 biocompatible, - une étape de coulage dudit matériau biocompatible dans un moule d'une forme définie. L'étape de coulage permet d'imposer la forme souhaitée au biomatériau. 30 Selon un autre aspect plus particulier d'un procédé selon l'invention, la préparation d'un matériau biocompatible comprend en outre une étape de génération de pores au sein dudit matériau, les étapes de génération de pores et de coulage pouvant être successives, dans n'importe quel ordre, ou simultanées. 35 L'organisation macro-environnementale générée par la taille des pores permet d'utiliser le matériau biocompatible en tant que matrice de guidage pour les cellules ou comme 3051191 24 matrice provisoire de comblement. Le terme « porosité » désigne le rapport entre le volume des régions vides et le volume total du matériau. Une porosité modulable peut ainsi être réalisée autour de porogènes développés à façon et selon des procédés adaptés. Les pores du gel permettent la diffusion de nutriments vers les cellules ainsi 5 que celle des produits de dégradation du métabolisme cellulaire vers l'extérieur du gel. Les pores au sein du matériau peuvent être générés par tout procédé connu de l'homme du métier. Selon un premier aspect de l'invention, les pores peuvent être générés par tout procédé chimique ou physique connu de l'homme du métier. Selon un aspect 10 particulier, le matériau biocompatible peut être mélangé à un matériau porogène qui sera ensuite retiré du mélange, selon un procédé connu de l'homme du métier, générant ainsi un matériau biocompatible poreux. Selon un aspect encore plus particulier d'un procédé selon l'invention, la préparation du 15 matériau biocompatible comprend une étape de coulage dudit matériau biocompatible dans un moule d'une forme définie, en présence d'un matériau porogène, et une étape d'extraction, ou de retrait, dudit matériau porogène. Selon cet aspect, le procédé permet de réticuler l'hydrogel autour d'échafaudages 20 temporaires, ou porogènes, qui seront retirés ensuite pour laisser place à des lacunes interconnectées à travers lesquelles des cellules pourront migrer librement. Cette formulation permet donc la colonisation de l'hydrogel par des cellules résidentes (in vivo) ou par des cellules isolées dans le cadre de la reconstruction tissulaire in vitro. 25 Selon cet aspect particulier de l'invention, l'étape de coulage du matériau biocompatible en présence d'un matériau porogène est réalisée dans des conditions permettant la réticulation dudit matériau biocompatible autour dudit matériau porogène. Dans un procédé selon l'invention, ledit matériau porogène est constitué par tout 30 matériau adapté, choisi notamment parmi les alcanes linéaires ou ramifiés, et notamment la paraffine, et parmi les polymères aliphatiques ou aromatiques. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, ledit matériau porogène est constitué par de la paraffine, de préférence celle-ci se présente sous la forme de billes 35 de taille calibrée. Le porogène établi consiste donc en un assemblage compact de billes de paraffine aux dimensions calibrées, de 1 micron à 1 millimètre, de préférence entre 3051191 25 10 microns et 500 microns, de préférence de 50 à 250 microns, notamment de 50 à 100 microns, de 100 à 180 microns, et de 180 à 250 microns. Ces assemblages compacts sont réalisés par fusion contrôlée des billes, par une incubation à des températures et des temps contrôlés, ou par centrifugation. L'extraction de la paraffine 5 est réalisée par des bains consécutifs dans de l'alcool éthylique bouillant. Il en résulte des structures poreuses et interconnectées. Ces différentes conditions réactionnelles permettent de moduler finement les propriétés structurelles d'un matériau selon l'invention (porosité, taille des pores, taux et taille d'interconnexion entre les pores). 10 L'invention a également pour objet un procédé comprenant le coulage d'un matériau composite en présence d'un matériau porogène tel que défini précédemment. L'invention a donc pour objet un matériau biocompatible tel qu'obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, ledit matériau résultant de la réaction entre un 15 polypeptide selon l'invention et un agent réticulant, selon un premier aspect, ou bien ledit matériau résultant de la réaction entre un polypeptide selon l'invention, un polymère hydrophile et un agent réticulant, selon un second aspect. La présente invention a pour quatrième objet un support de culture cellulaire in vitro 20 comprenant un matériau biocompatible obtenu par un procédé selon l'invention. Selon un aspect plus particulier, un support de culture cellulaire selon l'invention comprend, ou consiste en, un biomatériau comprenant un polypeptide selon l'invention et un agent réticulant. 25 Selon un aspect plus particulier, un support de culture cellulaire selon l'invention comprend, ou consiste en, un biomatériau comprenant un polypeptide selon l'invention, un polymère hydrophile et un agent réticulant. Selon cet aspect, ledit polypeptide est comprend la séquence SEQ ID N°8 ou SEQ ID N°9 et/ou ledit polymère est un 30 dendrimère greffé de polylysine de génération 3, obtenu par un procédé décrit dans WO 2006/114528 et/ou ledit agent réticulant est PEG-NSS. De préférence, selon cet aspect ledit support de culture est poreux. L'organisation macro-environnementale générée par la taille des pores permet d'utiliser 35 la structure réticulée, notamment l'hydrogel, en tant que matrice de guidage pour les cellules ou comme matrice provisoire de comblement. Les inventeurs ont montré les 3051191 26 capacités de contrôle de pénétration cellulaire ainsi que de biocompatibilité et de biorésorption d'un matériau selon l'invention. En effet, la comparaison du contrôle de colonisation par des fibroblastes humains de matériaux de différente porosité montre qu' une taille de pore unique (100-180 ou 50-100 dam) offre une colonisation cellulaire 5 moins prononcée qu'un mélange de taille de pores de ratio 50/50 ou 75/25 (100- 180/50-100, après 14 jours. Selon un aspect plus particulier, l'invention a pour objet l'utilisation d'un matériau biocompatible selon l'invention, ou obtenu par un procédé selon l'invention, en tant que 10 support de culture cellulaire in vitro, lesdites cellules pouvant être des cellules isolées ou en suspension dans tout type de milieu, naturel ou synthétique, ou des cellules comprises dans un tissu ou un fragment de tissu, ou des cellules de lignée cellulaire ou dans un environnement particulier. En effet, ce support de culture n'induit pas de mort cellulaire, et permet l'adhésion de tout type de cellule adhérente. 15 Un support de culture cellulaire selon l'invention peut être utilisé pour cultiver tous types de cellules eucaryotes, d'origine humaine ou animale, et de préférence pour cultiver des cellules choisies dans le groupe suivant : cellules de peau, notamment les cellules du derme, de l'épiderme et/ou de l'hypoderme, kératinocytes, fibroblastes, notamment 20 fibroblastes cutanés, cellules osseuses, chondrocytes, cellules de la paroi vasculaire, notamment cellules endothéliales et cellules musculaires lisses, cellules nerveuses, et toutes cellules présentes dans les tissus mous. Un support de culture cellulaire selon l'invention peut également être utilisé pour cultiver des cellules souches, notamment des cellules souches pluripotentes, des cellules souches multipotentes, des cellules 25 souches unipotentes, ainsi que des cellules progénitrices. Un support de culture cellulaire selon l'invention peut être ensemencé par des cellules par tout moyen connu. 30 Un support de culture cellulaire selon l'invention peut être utilisé pour toute application dans le domaine de l'étude de l'organisation matricielle des cellules et/ou des tissus, et notamment dans les domaines de la pharmacologie, de la toxicologie et de la cosmétologie. 35 La présente invention a pour cinquième objet un matériau biocompatible selon l'invention, ou tel qu'obtenu par un procédé selon l'invention, pour son utilisation chez 3051191 27 l'homme ou chez l'animal pour l'ingénierie tissulaire ou pour la stimulation de la régénération tissulaire. La présente invention a également pour objet un matériau biocompatible selon 5 l'invention, ou tel qu'obtenu par un procédé selon l'invention, pour son utilisation chez l'homme ou chez l'animal pour l'ingénierie tissulaire, et de préférence pour l'ingénierie des tissus mous. Par « ingénierie tissulaire » on entend la substitution, le renforcement, l'induction et/ou 10 la stimulation d'un tissu, ainsi que le conditionnement de cellules multipotentes préalablement à une implantation. Il est entendu que le terme « conditionnement » a pour objet la mise en contact desdites cellules multipotentes avec le matériau biocompatible, ce dernier servant de support ou de véhicule auxdites cellules multipotentes. Le but de l'ingénierie tissulaire consiste à synthétiser, à partir de 15 matrices contenant les ingrédients nécessaires, un tissu remplaçant un tissu endommagé ou manquant. Par « tissus mous », on entend les tissus présentant des propriétés élastiques, et notamment, sans que cette liste soit limitative, les tissus de la peau, les tissus 20 cardiovasculaires, notamment les tissus des valves cardiaques et/ou des vaisseaux sanguins, les fibres nerveuses, les tissus ostéo-articulaires, notamment les tissus des ligaments, des disques intervertébraux et du cartilage élastique, les plis vocaux. Une fois implanté à l'endroit souhaité de l'organisme hôte, le matériau doit résister aux 25 diverses contraintes mécaniques et conserver son volume pendant une durée suffisante, tout en transmettant ces contraintes aux cellules encapsulées. De façon idéale, dans le cas de la régénération tissulaire, il est souhaitable que le matériau se dégrade spontanément pour laisser la place au tissu formé. 30 Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible selon l'invention pour l'ingénierie d'un tissu mou choisi dans le groupe des tissus de la peau, des tissus cardiovasculaires et nerveux, des tissus ostéo-articulaires, des tissus des plis vocaux. 35 De préférence, un matériau biocompatible selon l'invention est caractérisé par des propriétés mécaniques et biologiques en adéquation avec le tissu pour lequel il sera 3051191 28 utilisé. En particulier, l'élasticité du matériau utilisé, caractérisée notamment par son module d'Young, sera compatible, et de préférence proche, de l'élasticité du tissu ciblé. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible pour 5 l'ingénierie cellulaire cutanée, et notamment pour la stimulation de la cicatrisation cutanée. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible pour la stimulation de la cicatrisation cutanée de sujets atteints de 10 brûlures importantes et/ou de sujets âgés atteints de plaies chroniques. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible pour le traitement d'une pathologie relative à l'élastogenèse imparfaite ou d'une pathologie liée à un défaut du tissu conjonctif. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible pour le comblement tissulaire, à visée cosmétologique ou en chirurgie réparatrice, en particulier suite à un curetage profond suivant l'ablation d'une tumeur ou pour la réparation des plis vocaux. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible selon l'invention pour la stimulation de la reconstitution osseuse, pour la stimulation de la synthèse de fibres vasculaires ou pour le remplacement de vaisseaux sanguins. 25 Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un matériau biocompatible selon l'invention pour le traitement de pathologies induisant une hyper calcification ou pour la stimulation de la calcification de tissus élastiques, notamment les tissus cardio-vasculaires et ostéoarticulaires. 30 Les exemples 1 à 5 et les figures 1 à 10 qui suivent illustrent l'invention. La Figure 1 montre une représentation schématique d'un mode de réalisation particulier d'un polypeptide selon l'invention, selon lequel ledit polypeptide comprend, de son extrémité N-terminale à son extrémité C-terminale : une cystéine ; un polypeptide- 35 étiquette, représenté par un rectangle ; un premier domaine comprenant la répétition d'une unité, ladite unité comprenant une région hydrophobe (A) répétée, représentée 15 20 3051191 29 par des chevrons, et une région de réticulation (B), représentée par une spirale ; un second domaine hydrophobe (C), représenté par des chevrons ; et un domaine (D) correspondant au domaine codé par l'exon 36 du gène codant pour la tropoélastine, représenté par une ligne courbe. Le polypeptide Elactiv est l'un des modes de réalisation 5 encore plus particulier de l'invention, sa séquence en acides aminés est également représentée dans la Figure 1. Le polypeptide Elactiv' comprend, de son extrémité N-terminale à son extrémité C-terminale : une cystéine ; un polypeptide-étiquette Flag ; un premier domaine comprenant six répétition d'une unité, ladite unité comprenant une région hydrophobe répétée 6 fois, et une région de réticulation ; un second domaine 10 hydrophobe répété 6 fois ; et un domaine correspondant au domaine codé par l'exon 36 du gène codant pour la tropoélastine. La Figure 2 montre la caractérisation thermique du polypeptide et le profil de 15 coacervation d'une solution d'Elactiv' 1 mg/ml dans du PBS (pH 7,4) dans la plage de température 20-60°C. Les Figures 3A et 3B montrent l'auto-assemblage de coacervats d'Elactiv'. La figure 3A correspond aux images de microcopie électronique à transmission illustrant les 20 coacervats formés à partir de solutions d'Elactiv' à 120 pg/ml (a), 240 pg/ml (b) et 2 mg/ml (c) dans du PBS (Figure 3A). La figure 3B correspond aux images de microscopie électronique à balayage de coacervats d'Elactiv' formés à partir d'une solution d'Elactiv' à 2 mg/ml dans du PBS et illustrant un ensemble de structures (a), de monomères (b et c) et de sphères coalescentes (d-f). 25 Les Figures 4A et 4B correspondent aux images de microscopie électronique à balayage illustrant des structures d'Elactiv' formées à partir de solutions d'Elactiv' à 2 mg/ml contenant de la génipine 50 mM (Figure 4A) et formées à partir de solutions d'Elactiv' à 50 mg/ml contenant de la génipine 50 mM (Figure 4B). 30 Les Figures 5A, 5B et 5C montrent le résultat de tests d'indentation sur des hydrogels d'Elactiv' réticulé par la génipine avec une charge normale appliquée de 2 mN (Figure 5Ai) ou 4 mN (Figure 5Aii), l'énergie restituée par l'hydrogel Elactiv' après le test d'indentation avec une charge normale de 2 mN et de 4 mN sur un hydrogel (Figure 35 5B) et le module d'Young (MPa) de l'hydrogel d'Elactiv' défini selon la charge normale appliquée à l'échantillon pendant le test (Figure 5C). 3051191 30 La Figure 6 montre le nombre de cellules adhérentes sur une surface recouverte par Elactiv' en présence ou en absence d'anticorps anti-intégrine aVt33 et de L-Lactose. 5 La Figure 7A représente le module complexe (E*) d'hydrogels de différentes compositions de DGL/PEG-NHS, exprimées en rapport de concentrations en mg/ml, en présence (-) ou absence (À) de PDE à 3,75 mg/ml. La figure 7B représente le module de stockage (E') en présence (^) ou absence (X) de PDE à 3,75 mg/ml, et de perte (E") en présence (-) ou absence (*) de PDE à 3,75 mg/ml, et tan delta d'hydrogels de 10 différentes compositions de DGL/PEG-NHS exprimées en rapport de concentrations en mg/ml, en présence (y) ou absence (À) de PDE à 3,75 mg/ml. La Figure 8 représente des billes de paraffine de différentes granulométrie (rangée du haut : 250-180 microns, 180-100 microns et 100-50 microns respectivement) et les 15 hydrogels poreux résultant colorés au bleu de coomassie (rangée du bas). La Figure 9 représente des peaux-reconstruites obtenues avec des hydrogels (DGL/PEGNHS 50/50 mg/ml) de porosités différentes : 75 % 100-50 pm/25% 180-100 pm (haut de la figure), et 100 % 180-100 pm (bas de la figure). Les fibroblastes ont colonisé les 20 pores de l'hydrogel et les kératinocytes ont formé une couche cornée en surface. La Figure 10 présente la cicatrisation de plaies cutanées après 2 semaines, plaies laissées vides (haut de la figure) ou comblées par des hydrogels (DGL/PEG-NHS 50/50 mg/ml, contenant 0,875 mg/ml de PDE) poreux (180-100 pm) de 4 mm d'épaisseur 25 (bas de la figure). Les hydrogels (astérisque noire) sont intégralement envahis par des cellules et apparaissent fragmentés dans les limites de la plaie originelle (pointillés). EXEMPLE 1 : PREPARATION ET CARACTERISATION MECANIQUE DU 30 POLYPEPTIDE Matériel et méthodes Le polypeptide Elactiv 'a été conçu pour se conformer à la structure unique de la tropoélastine humaine. Il comporte une alternance de domaines hydrophobes et de 35 réticulation de la tropoélastine, ainsi que sa région C-terminale (domaine 36) selon la séquence primaire en acides aminés suivante : H2N-C-DYKDDDDK-[(VGVAPG- 3051191 31 VGVLPG)6-(AAAKAAAKAAK)]6-(VGVAPG-VGVLPG)6-GGACLGKACGRKRK-COOH (SEQ ID N°9) Le gène codant pour Elactiv ' a été conçu pour se conformer à la structure unique de la tropoélastine humaine. Il code pour une protéine identifiée par une alternance de 5 domaines hydrophobes et de réticulation de la tropoélastine, ainsi que sa région C- terminale (domaine 36) selon la séquence primaire en acides aminés suivante : H2NC-DYKDDDDK-[(VGVAPG-VGVLPG)6-(AAAKAAAKAAK)]6-(VGVAPG-VGVLPG)6- GGACLGKACGRKRK-COOH (SEQ ID N°9). La synthèse du gène codant pour Elactiv' a été confiée à la société GenScript (Piscataway, États-Unis). La séquence d'ADN (1794 10 pb) a été optimisée pour une expression en système procaryote E. coli (SEQ ID N°12). Pour la construction du vecteur d'expression pET30a-Elactiv', le gène codant pour Elactiv' a été cloné dans le vecteur d'expression procaryote pET30a, entre les sites Ndel et SaII. Pour ce faire, le vecteur pET30a a été digéré avec les endonucléases de restriction Ndel, Sali (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) et le vecteur linéarisé 15 résultant a été conservé et purifié. Le fragment Ndel/Sall d'Elactiv' et le vecteur linéarisé ont été ligaturés en utilisant l'ADN ligase T4 (Promega) par incubation pendant une nuit à 4 ° C. Le vecteur recombinant pET30a-Elactiv' a été amplifié dans des bactéries compétentes 3M109, comme décrit précédemment, puis isolé en utilisant le kit Endofree Plasmid Maxi (Qiagen, Courtaboeuf,France). La digestion des vecteurs recombinants 20 avec l'enzyme de restriction EcoRV a permis de valider la purification du plasmide avant le séquençage. Le vecteurs pET30a- Elactiv' a été stocké à -20°C. L'expression d'Elactiv' a été réalisée comme suit : le vecteur recombinant pET30aElactiv a été utilisé pour transformer des bactéries compétentes BL21 (DE3) (Life Technologies, Saint-Aubin, France). Les bactéries transformées ont été ensemencées 25 sur des plaques Luria-Broth (LB)/agar contenant 50 pg/ml de kanamycine (Sigma- Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France). Une colonie unique a été utilisée pour inoculer 5 ml de LB contenant 50 pg/ml de kanamycine durant la nuit à 37°C sous agitation constante. La culture a été diluée à 1:100 et l'expression d'Elactiv' a été induite lors de la phase exponentielle de croissance par l'addition de 1 mM d'isopropy1-13-D- 30 thiogalactopyranoside (IPTG) (Sigma-Aldrich) pendant 4 h à 30°C sous agitation constante. Les bactéries ont ensuite été récoltées par centrifugation (10 000 g pendant 10 min à 4°C) et le culot cellulaire résultant congelé pendant une nuit à -80°C. Les bactéries ont été remises en suspension dans du tampon Tris-HCI 50 mM pH 8 et incubées 45 min à 80°C. Après incubation 1 h dans de la glace, les fractions solubles et 35 insolubles ont été récoltées par centrifugation (15 000 g, 20 min à 4 ° C) et analysées sur un gel de polyacrylamide - sodium dodécylsulfate (SDS-PAGE) coloré au bleu de 3051191 32 coomassie G-250. Ce protocole a donné lieu à environ 20 mg de Elactiv' par litre de culture, dosée à l'aide du kit de dosage de protéines Quant -iT (Life Technologies). La protéine Elactiv' a été purifiée partir du lysat soluble de E. coli par une méthode température de transition inverse (Tt), tel que rapporté précédemment [Yeo et al, 5 2011]. Le procédé de purification implique au moins un cycle répété de solubilisation d'Elactiv' dans du tampon phosphate salin (PBS) à 4°C, suivi d'une précipitation et une centrifugation à 42°C. La pureté du Elactiv' a été évaluée par visualisation sur gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) coloré au nitrate d'argent. Elactiv' purifié est passé à travers un filtre de 0,2 dam pour assurer une stérilité, et 10 stocké à - 80°C jusqu'à une utilisation ultérieure. La caractérisation biochimique d'Elactiv' a été réalisée comme suit : la masse moléculaire théorique (Mw) et le point isoélectrique (pI) d'Elactiv' ont été calculés à partir de sa séquence primaire en acides aminés (Vector NTI Advance 11, Life Technologies). La spectrométrie de masse par Electron Transfert Dissociation (ETD) a 15 été réalisée par la plate-forme de Protein Science Facility (PSF) (Institut de Biologie et Chimie des Protéines, Lyon, France) pour confirmer la présence de la liaison disulfure dans la région C-terminale (domaine 36) d'Elactiv'. Pour cela, une fragmentation du peptide [579-594] a été générée en mode ETD, en utilisant la spectrométrie de masse en tandem avec la chromatographie liquide (LC-MS / MS). 20 Les spectres de Dichroïsme circulaire (DC) en UV lointains d'Elactiv' et de la tropoélastine humaine recombinante (hTE) (Sigma-Aldrich) ont été enregistrés avec un spectromètre Chirascan (Applied photophysique, Leatherhead, Royaume-Uni) calibré avec l'acide 1S-(+)-10-camphosulfonique. Les mesures ont été effectuées de 20°C à 60°C dans une cuve en quartz de 0,1 cm de long (Hellma, Müllheim, Allemagne), avec 25 des concentrations d'Elactiv' et de hTE à environ 0,2 mg.m1-1 dans du PBS à pH 7,4. Les spectres ont été mesurés dans une fenêtre de longueurs d'ondes de 180 nm à 260 nm. Les spectres ont été traités avec le logiciel Chirascan pour corriger et lisser la ligne de base. Les unités spectrales ont été exprimées en ellipticité molaire moyenne par résidu. La coacervation d'Elactiv' et la taille des agrégats en solution ont été mesurées par 30 diffusion dynamique de la lumière (DLS) en utilisant un dispositif Malvern-DLS Zatasizer Nano S ZEN1600 (Malvern Instrument), pour une gamme de températures comprises entre 20°C et 60°C, avec un temps de stabilisation de 5 min. Les échantillons d'Elactiv' ont été préparés à 1 mg / ml dans du PBS à pH 7,4. Onze essais ont été effectués par échantillon pour déterminer la taille des agrégats de particules, afin d'obtenir une valeur 35 moyenne finale à température constante. 3051191 33 Pour l'observation par microscopie électronique à transmission, Elactiv' a été dissout à différentes concentrations (de 120 dag / ml à 2 mg / ml) dans du PBS froid (4°C). Toutes les solutions ont été équilibrées à 42° C pendant 15 min pour induire la coacervation. Une grille formvar-carbon (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Royaume-Uni) a été 5 déposée sur une goutte de chaque échantillon à 42°C. Au bout de 2 minutes, les solutions en excès sur la grille ont été transférées et les échantillons adsorbés ont été fixés avec une solution de glutaraldéhyde à 2%, pendant 2 min à 42°C. Les échantillons ont été lavés trois fois avec de l'eau distillée, et colorés pendant 10 secondes avec de l'acide tungstique phosphoré 2% à pH 7 (KOH 1 M) et séchés à l'air. Les observations 10 ont été réalisées avec un microscope électronique à transmission Philips CM120, équipé d'une caméra numérique CDD (Gatan), au Centre technique des microstructures (Université Lyon 1). Pour la microscopie électronique à balayage, une solution froide de génipine (Sigma-Aldrich) a été ajoutée à des solutions similaires d'Elactiv' à 4°C (2 mg / ml dans du PBS) 15 pour atteindre une concentration finale de 2 et 50 mM. Toutes les solutions ont été équilibrées à 42°C pendant 15 minutes pour faciliter la coacervation et la réticulation, puis étalées sur des lamelles de verre (Braunschweig, Allemagne), et séchées à l'air à 42°C pendant 15 min. Les lamelles résultantes ont été ensuite lavées plusieurs fois dans du PBS avant la déshydratation dans des solutions d'éthanol graduelles (de 50% à 20 100%). Les échantillons ont ensuite été trempés dans de l'hexaméthyldisilazane 100% pendant 3 minutes et transférés dans un dessicateur pendant au moins 2 heures pour éviter une contamination de l'eau et évaporer le solvant résiduel. Tous les échantillons ont été montés sur des talons d'aluminium et pulvérisés d'une couche mince (- 3 nm) de cuivre (Bal-tec MED 020, Leica Microsystèmes SAS, Nanterre, France). L'imagerie a 25 été réalisée à l'aide d'un microscope électronique à balayage Hitachi S800 FEG au Centre Technique des microstructures (Université Lyon 1). Les hydrogels d'Elactiv' réticulés à la génipine ont été préparés comme suit : Elactiv' purifié a été dissout dans du PBS (NaCI 150 mM, pH 7,4) à une concentration finale de 50 mg.m1-1, à 4°C. L'échantillon a été coacervé à 42°C et culotté par centrifugation à 30 300g dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml à fond plat jusqu'à une hauteur de 1 mm. Le culot a été recouvert avec 200 pl de génipine 50 mM (Sigma-Aldrich) et réticulé pendant une nuit à 42°C. Le gel a été récupéré et réhydraté dans du PBS à pH 7,4. Les propriétés mécaniques d'Elactiv' ont été déterminées notamment à l'aide d'un 35 dispositif original d'indentation de faible charge, basée sur la technique développée précédemment pour les tissus biologiques in vivo et in vitro (Pailler-Mattei et ai, 2013). 3051191 34 Le test d'indentation consiste à enregistrer la profondeur de pénétration d'un indenteur rigide en fonction de la charge normale appliqué, au cours d'une expérience de chargement / déchargement. Dans la présente étude, les tests d'indentation sont effectués en mode de déplacement contrôlé. Le déplacement en Z est obtenu à partir 5 de la table de déplacement National Instrument, et commandé par un capteur de déplacement. Le déplacement maximum au cours du cycle de chargement / déchargement peut atteindre environ 500 pm avec une résolution de 1 pm. Le dispositif expérimental offre une large gamme de vitesses indentation de 1 à 100 pm.s-1. Dans la présente étude, deux charges normales différentes ont été appliquées, F, =2 10 mN et F, =4mN, pour une vitesse d'indentation constante V = 20 pm.s-1. L'indenteur utilisé était un indenteur sphérique en acier, avec un rayon de courbure R = 1,6 mm. Il n'y avait pas de période d'attente entre le chargement et le déchargement et un seul cycle de chargement a été effectué pour chaque essai. Les tests d'indentation ont été répétés cinq fois sur l'échantillon Elactiv'. L'échantillon a été déposé dans un cristallisoir 15 en verre pour les essais. Les tests d'indentation sont effectués en immersion totale dans du sérum physiologique afin d'éviter ou de minimiser l'effet d'adhérence dû à des phénomènes capillaires entre l'échantillon et l'indenteur. Résultats 20 Synthèse : Elactiv' a été conçu en se conformant à la structure unique de la tropoélastine humaine. Il comporte une alternance de domaines hydrophobes (VGVAPG-VGVLPG) et de réticulation (AAAKAAAKAAK) correspondant à des motifs hautement conservés parmi les espèces, ainsi qu'une région C-terminale (domaine 36) comprenant un pont disulfure et une séquence chargée positivement RKRK. Ce domaine 25 est reconnu pour faciliter l'auto-assemblage de la tropoélastine et son incorporation dans les fibres élastiques. Par ailleurs, un octapeptide FLAG a été ajouté à la région N-terminale pour faciliter la détection d'Elactiv' sans influer sur la structure globale de la protéine ni sur son activité biologique (Figure 1). Le gène codant pour Elactiv' a été cloné dans le vecteur d'expression procaryote pET30a. Le vecteur recombinant pET30a- 30 Elactiv' a été utilisé pour transformer des bactéries E. coli BL21 (DE3) compétentes. Les bactéries ont été stimulées avec 1 mM d'IPTG pour induire l'expression d'Elactiv'. Après analyse par SDS-PAGE, Elactiv' a été détectée dans les fractions cellulaires solubles et insolubles du lysat bactérien avec un poids moléculaire apparent d'environ 55 kDa. Les résultats sont comparés pour des cultures induites et non-induites. La purification 35 d'Elactiv' a été faite à partir du lysat E.Coii soluble par des cycles successifs de transition inverse (ITC), comme indiqué précédemment (Yeo et ai, 2011). Les échantillons ont été 3051191 35 analyses par SDS-PAGE et le gel a été coloré au nitrate d'argent. Elactiv' a pu être formellement identifiée par western-blot en utilisant un anticorps anti-FLAG. Caractérisation physico-chimique d'Elactiv Elactiv' a un poids moléculaire théorique de 50,6 kDa et un point isoélectrique très 5 basique de 10.31, du même ordre de grandeur que la tropoélastine humaine (10.4). La LC-MS / MS analysée par ETD a permis de confirmer la présence du pont disulfure dans la région C-terminale. Le dichroïsme circulaire (CD) a été utilisé pour déterminer les structures secondaires d'Elactiv' en comparaison avec la tropoélastine humaine recombinante (hTE). Les 10 spectres ont été enregistrés dans une solution de PBS à 20, 40 et 60°C, pour une concentration de 0,2 mg / ml. A 20°C, les profils d'Elactiv' et de hTE sont caractérisés par un pic négatif à 198 nm et un épaulement négatif inférieur à 220 nm, ce qui suggère une conformation en hélice gauche polyproline II (PPII), bien que l'épaulement soit moins prononcé dans Elactiv'. En augmentant la température de 20 à 60°C, le pic est 15 légèrement décalé vers le rouge, en particulier pour Elactiv', résultant d'une diminution de la stabilité de l'hélice PPII. Caractérisation thermique Le profil thermique a révélé que la coacervation d'une solution Elactiv' dans du PBS commence à apparaître lorsque la température atteint 30°C, correspondant à la 20 température de transition (Tt), et une coacervation maximale a été obtenue à 60°C (Figure 2). La figure 2 montre le profil de coacervation d'une solution d'Elactiv' 1 mg/ml dans du PBS (pH 7.4) dans la plage de température 20-60°C. La variation de la turbidité de la solution à chaque temperature est exprimée en pourcentage d'un maximum. Par ailleurs, l'analyse en DLS a confirmé une variation de la taille des agrégats d'Elactiv' en 25 suspension qui augmente au-dessus de la Tt dépendant de la température, provoquant une brusque augmentation de la turbidité (Tableau 1). Température (°C) 20 60 20 Taille (nm) 62,8 1,3.104 81,9 Tableau 1 30 La taille de ces agrégats varie de 60 nm (20°C) à 1104 nm à 60°C. Lorsque la solution d'Elactiv' est refroidie de nouveau à 20°C, les agrégats retrouvent une taille de 80 nm, du même ordre que la condition initiale démontrant la réversibilité du phénomène. Les résultats sont exprimés par la moyenne ± ESM de 3 replicats. 3051191 36 Auto-assemblage des molécules d'Elactiv' Pour étudier davantage les propriétés d'agrégation d'Elactiv', des solutions de 120 pg à 2 mg / ml ont été préparées dans du PBS et chauffées à une température (42°C) supérieure à la température de transition pour induire coacervation. Elactiv' a ensuite 5 été visualisée par coloration négative en microscopie électronique à transmission (TEM) A 120 pg/ ml, Elactiv' forme de petites sphères individuelles de faible densité électronique interne (flèches blanches dans la figure) indiquant de très probables sphères creuses (Figure 3Aa). À partir de 240 pg / ml, les sphères ne restent plus individualisées, mais commencent à fusionner formant des agrégats allant jusqu'à 200 10 nm de diamètre (Figure 3Ab). A 2 mg / ml, les agrégats montrent une densité électronique externe plus élevée en raison de la fusion des sphères individuelles d'Elactiv' (flèches blanches dans la Figure 3Ac). Cette fusion est également observable en microscopie électronique à balayage de coacervats d'Elastiv' formés à partir de différentes structures d'Elactiv' (3Ba), monomères (3Bb-c) et sphères coalescentes 15 (3Bd-f) formées avec Elactiv' dans du PBS. Les bords des sphères ne sont pas réguliers (Figure 3Bc). En plus de s'organiser dans les sphères, à une échelle supérieure, les sphères fusionnent ensemble et se connectent comme des perles sur une chaîne (Figure 3Bd), formant ainsi des formes géométriques variées (Figure 3Be-Bf). Réticulation des structures d'Elactiv' 20 Lors de l'observation par microscopie électronique à balayage, en présence de génipine 50mM, les agrégats d'Elactiv' (à 2 mg/ml dans du PBS) forment un réseau très dense ces structures forment des fibres (Figure 4A), avec des diamètres similaires à ceux des fibres élastiques in vivo. L'interconnexion de ces ensembles fibrilaires fait également apparaître de nouvelles structures vides assimilables à des pores. Lorsque la 25 concentration d'Elactiv' est augmentée à 50 mg / ml avec la génipine 50 mM, la plupart des sphères d'Elactiv' ont déjà coalescé pour former une structure poreuse, mais une petite quantité de sphères isolées peuvent encore être observées sur la surface du réseau, ainsi qu'à l'intérieur des pores (Figure 4B). Propriétés mécaniques d'Elactiv' 30 Pour étudier les propriétés mécaniques, des tests d'indentation ont été réalisé à partir des structures 3D réticulées précédemment. Les courbes d'indentation ont été enregistrées en immersion totale dans du PBS avec une charge normale appliquée de 2 mN (Figure 5Ai) ou 4 mN (Figure 5Aii), pour une vitesse de pénétration constante V = 20 dam s-1. 35 Les tests d'indentations permettent de déterminer un module d'Young réduit E* du réseau d'Elactiv', à partir de la mesure de la raideur de contact normale, K, 3051191 37 correspondant à la pente de la partie initiale de la courbe de décharge. Pour un matériau en volume en contact avec un pénétrateur rigide à symétrie axiale, la raideur normale est liée au module d'Young réduit par [35]: E* 717 K, 2 VA 5 où A est la surface de contact projetée. E * est définie comme suit : -El* = 1-11j_ E1 E2 avec E1, v1 et E2,v2, le module d'Young et le coefficient de Poisson du pénétrateur et de la structure d'Elactiv' respectivement. Dans cette étude, étant donné que El (acier) « E2 (Elactiv'), il peut être considéré que E * est la réduction de module apparent d'Young de la structure d'Elactiv' - = 1-v11 E* E1 10 L'analyse énergétique de la courbe d'indentation permet d'estimer le rapport d'énergie restituée par la structure d'Elactiv' pendant la phase de déchargement. Le rapport de l'énergie restituée a été noté y,et défini comme suit : f0 =1 nz I unloading dz X 100 zmax 111 j- zmax 0 nz I loading dz 15 où Fzboading correspond à la variation de charge normale pendant le chargement, et FzIunloading Cl i est la variation de charge normale pendant le déchargement. Zmax est la profondeur de pénétration maximale. Les résultats indiquent que dans la plage de charge normale utilisée, la structure d'Elactiv' présente le même comportement mécanique : Le module d'Young réduit de la 20 structure est compris entre 1,4 MPa et 1,5 MPa (Figure 5C, module d'Young (MPa) de l'hydrogel d'Elactiv' défini selon la charge normale appliquée à l'échantillon pendant le test) quelle que soit la charge normale utilisée. Le rapport de l'énergie restaurée est d'environ 80% (Figure 5B, énergie restaurée par l'hydrogel Elactiv' après le test d'indentation avec une charge normale de 2 mN et de 4 mN sur un hydrogel). 25 EXEMPLE 2 : Caractérisation des réponses cellulaires au polypeptide Matériels et méthodes Pour la culture cellulaire, des fibroblastes dermiques normaux humains (NHDF) isolés à 30 partir de prépuce juvénile (Promocell, Heidelberg, Allemagne) ont été cultivés à 37°C, 5% de CO2 dans un milieu complet: DMEM/F-12 ratio 1:1 (Invitrogen, Cergy Pontoise, 3051191 38 France) complété avec 10% de sérum de veau foetal (SVF) (Sigma-Aldrich), 100 ug / ml de pénicilline et 0,1 mg / ml de streptomycine (Sigma-Aldrich). Les cellules ont été ensemencées dans des boîtes Optilux 100 x 20 mm (BD Biosciences Labware, Brumath, France) à une densité minimale de 4 000 cellules.cm-2 pour la sous-culture. Les cellules 5 ont été utilisées après un nombre limité de sous-cultures (passage 5-6). Le kit de dosage de prolifération cellulaire CyQuant (Molecular Probes, Invitrogen, Saint-Aubin, France) a été utilisé conjointement avec un lecteur de microplaque (Infinite® M1000 lecteur de microplaques PRO Tecan, Mânnedorf, Suisse) pour évaluer l'effet d'Elactiv' sur la viabilité (en phase homogène) et la prolifération (en phase hétérogène) 10 des NHDF. Avant le test de prolifération, les microplaques ont été adsorbées à 10 ug / ml dans du PBS pendant 2 h à 4°C avec Elactiv', hTE (Sigma-Aldrich), collagène I (Gibco, Invitrogen) ou de l'albumine bovine (BSA fraction V, Euromedex, Souffelweyersheim, France). Les plaques ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS. Pour les essais, les 15 cellules ont été ensemencées à une densité de 6000 cellules.cm-2 et mises en incubation pendant une nuit dans du milieu complet pour permettre l'adhésion cellulaire. Pour les tests de viabilité, diverses concentrations d'Elactiv'ou du peptide d'élastine VGVAPG (GenScript) dilués dans un milieu complet, ont été ajoutées 24 heures après l'ensemencement des cellules. La viabilité et la prolifération ont été suivies pendant 10 20 jours. Les milieux de culture ont été rafraîchis tous les 2 jours et pour chaque temps d'arrêt, le milieu a été éliminé et les plaques congelées à -80°C avant analyse selon les recommandations du fabriquant. L'adhérence cellulaire a été mesurée ainsi : Elactiv' a été adsorbé à la surface de lames de verre à 8 puits Millicell EZ (Millipore Merck) à 10 pg / ml dans du PBS à température 25 ambiante pendant 2 h, puis les lames ont été lavées trois fois dans du PBS. Des NHDF à confluence ont été récoltés par incubation avec de l'EDTA 1 mM à 37 C pendant 5 min. La suspension cellulaire a été centrifugée à 300 g pendant 5 min et le culot cellulaire a été remis en suspension dans 1 ml de milieu sans sérum. La densité cellulaire a été ajustée à 4 x 104 cellules / ml dans du milieu de croissance des fibroblastes 30 (PromoCell). Avant l'ensemencement, les cellules ont été pré-incubées 45 min avec un anticorps bloquant l'intégrine aVt33 (clone LM609, Merck Millipore, Saint-Quentin en Yvelines, France) à 20 pg / ml et/ou en présence de L-lactose 10 mM (Euromedex). Les cellules ont ensuite été ensemencées pendant 90 minutes sur les lames préalablement fonctionnalisées. Le milieu a été aspiré et les puits ont été doucement rincé une fois 35 avec du PBS. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) 4% (y / y) pendant 20 minutes et rincées 3 fois avec du PBS. Le Hoechst (Sigma-Aldrich) 3051191 39 et la phalloïdine-TRITC (Sigma-Aldrich) ont été ajoutés aux cellules à 1 pg / ml dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Les cellules ont été rincées 3 fois avec du PBS et les lames ont été montées avec une solution de Permafluor (LabVision, Thermo-scientifique, Illkirch, France). Les cellules ont été visualisées par microscopie à 5 fluorescence avec un microscope Axioplan Imaging (Cari Zeiss, Le Pecq, France) et des photos ont été prises sur un appareil photo fx Coolsnap (Photometrics, Tucson, AZ, USA) pour la quantification des cellules. Pour la mesure de la cinétique de la dégradation par la protéine MMP-12, la MMP-12 recombinante humaine a été diluée à 50 pg / ml dans du tampon d'essai (Tris 50 mM, 10 CaCl2 10 mM, NaCI 150 mM, Brij-35 0,05% (p / y) de, pH 7,5) et activée par addition d'acétate de p-aminophénylmercurique (Calbiochem, Molsheim, France) à une concentration finale de 1 mM à 37°C pendant 4 heures. 1 pg d'Elactiv' ou de hTE a été incubé à 30°C en présence de 5 pg / ml de MMP-12 activée seule ou en combinaison avec de l'EDTA 10 mM (contrôle négatif inhibiteur de l'activité MMP). Après 0, 15, 30, 15 60 et 120 minutes, les réactions ont été arrêtées en ajoutant 10 mM d'EDTA. La capacité de la MMP-12 à dégrader Elactiv' et l'hTE a été évaluée par une analyse Western-Blot en utilisant un anticorps anti-alpha élastine (ab21607, Abcam, Paris, France). Résultats 20 La biocompatibilité d'Elactiv' a été évaluée en présence de fibroblastes dermiques humains normaux (NHDFs) par des analyses de prolifération cellulaire (quantification de l'ADN) soit en phase homogène (en solution), soit en phase hétérogène (fonctionnalisation de surface). En solution, le polypeptide est dispersé directement dans le milieu de culture cellulaire 25 dans une gamme de concentration de 0,1 à 10 pg/ml. Pour la fonctionnalisation de surface, il s'agit de l'absorption du polypeptide à la surface des plaques de culture cellulaire. L'adsorption est réalisée à 10pg/mIdans du PBS pendant 2h à 4°C. La plaque est ensuite rincée 3 fois avec du PBS avant l'ensemencement des cellules. Dans une première expérimentation, les NHDFs ont été incubés de 2 à 10 jours en 30 phase homogène avec du milieu seul ou supplémenté en Elastiv' ou en peptide de l'élastine VGVAPG à 1 pg/ml et 10 pg/ml. Les résultats sont présentés sous la forme : moyenne ± EMS de triplicats. Un test ANOVA suivi d'un post-test Bonferroni ont été réalisés pour la détermination de valeurs p (* p REVENDICATIONS1. Polypeptide isolé dérivé de la tropoélastine, dont la séquence en acides aminés comprend successivement, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale dudit polypeptide : - Un domaine comprenant au moins 2 et au plus 40 répétitions d'une unité comprenant : - Une région hydrophobe (A) comprenant successivement au moins 6 et au plus 80 séquences XiGX2X3PG (SEQ ID N°1) dans lesquelles Xi, X2 et X3 représentent un acide aminé hydrophobe indépendamment choisi dans le groupe consistant en : Alanine, Valine, Leucine et Isoleucine ; lesdites SEQ ID N°1 étant identiques ou différentes, ou une région hydrophobe (A') comprenant une séquence présentant au moins 65% d'identité avec la séquence de ladite région hydrophobe (A), et - Une région (B) comprenant au moins la séquence AAAKAAK (SEQ ID N°2), et de préférence comprenant la séquence AAAKAAAKAAK (SEQ ID N°3) ou une région (B') d'au moins 8 acides aminés, comprenant au moins la séquence AAAKAAK (SEQ ID N°2) et présentant au moins 65% d'identité avec la séquence SEQ ID N°3, - Un domaine hydrophobe (C) comprenant successivement au moins 6 et au plus 80 séquences X4GX5X6PG (SEQ ID N°4) dans laquelle X4, X5 et X6 représentent tout acide aminé à l'exception de la proline ; lesdites SEQ ID N°4 étant identiques ou différentes, ou un domaine hydrophobe (C') comprenant une séquence présentant au moins 65% d'identité avec la séquence dudit domaine hydrophobe (C), et - Un domaine (D) comprenant au moins deux acides aminés cystéine non consécutifs et la séquence RKRK (SEQ ID N°5), 3051191 50 et de préférence comprenant la séquence GGACLGKACGRKRK (SEQ ID N°6), ou bien une séquence comprenant obligatoirement la séquence SEQ ID N°5 et présentant au moins 65% d'identité avec la séquence SEQ ID N°6. 5 2. Polypeptide selon la revendication 1, comprenant la séquence en acides aminés SEQ ID N°8. 3. Matériau biocompatible comprenant un polypeptide selon l'une des revendications 10 1 ou 2. 4. Matériau biocompatible selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un polymère hydrophile. 15 5. Matériau biocompatible selon la revendication 4 caractérisé en ce que : - ledit polypeptide comprend la séquence en acides aminés SEQ ID N°8, - ledit polymère est un dendrimère greffé de polylysine de génération 3, et - ledit agent réticulant est bifonctionnel et comprend une chaîne de polyéthylène glycol (PEG). 20 6. Procédé de préparation d'un matériau biocompatible selon l'une des revendications 3 à 5, comprenant une étape de mélange d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 2 et d'un agent réticulant. 25 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ledit agent réticulant est un agent bifonctionnel et dans lequel ladite étape de mélange du polypeptide et de l'agent réticulant est réalisée en présence d'un polymère hydrophile. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7 comprenant une étape de coulage 30 dudit matériau biocompatible dans un moule de forme définie, et une étape de génération de pores au sein dudit matériau, les deux étapes pouvant être successives, dans n'importe quel ordre, ou simultanées. 35 9. Support de culture cellulaire in vitro comprenant un matériau biocompatible obtenu par un procédé selon la revendication 8. 3051191 51 10. Matériau biocompatible selon l'une des revendications 3 à 5, ou tel qu'obtenu par un procédé selon l'une des revendications 6 à 8, pour son utilisation chez l'homme ou chez l'animal pour l'ingénierie tissulaire ou pour la stimulation de la régénération 5 tissulaire, et notamment pour la stimulation de la cicatrisation cutanée.