Brevet FR3056753A1 — publié le 20180330

PROCÉDÉ DE DÉTERMINATION DE L'AFFINITÉ ENTRE DES LIGANDS ET UNE CIBLE DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne la caractérisation de l'affinité de ligands avec une cible telle qu'une enzyme. Elle concerne en particulier un procédé permettant de quantifier cette affinité. ART ANTÉRIEUR Dans les domaines de la médecine, de la cosmétique ou de l'agrobiologie, il est nécessaire de pouvoir déterminer si un ligand a une affinité avec une cible, par exemple avec une enzyme. Lorsqu'on a déterminé que le ligand avait une affinité avec la cible, on peut alors l'utiliser dans une composition pour par exemple inhiber l'effet de l'enzyme. Que les ligands soient obtenus par synthèse ou par extraction de plantes, ils se présentent en grandes variétés et il est utile de pouvoir isoler rapidement ceux qui peuvent avoir une action intéressante. Le document EP 1 944 610 Al montre par exemple une méthode basée sur la technique de laboratoire appelée exposition sur phage, ou « phage display » en anglais, pour isoler une famille de ligands selon laquelle : p. on prépare une bibliothèque de ligands de nature polypeptidique fixés à la surface de bactériophages à l'aide de la technique d'exposition sur phage ; p. on prépare un mélange avec une molécule cible et un échantillon formé d'un mélange de ligands analogues de nature polypeptidique fixés à des bactériophages pour que les ligands s'accrochent à la cible; p. on sépare les bactériophages pour lesquels des ligands de nature polypeptidique fixés se sont accrochés à une cible ; 3056753 2 p. on provoque la séparation des cibles de l'ensemble ligands-bactériophage ; p. on amplifie les bactériophages séparés de leur cible à l'étape précédente ; p. on détermine les séquences peptidiques de ligands de nature polypeptidique fixés aux bactériophages amplifiés. 5 Cette méthode permet d'identifier tous les ligands de nature polypeptidique qui étaient présents dans la bibliothèque préparée au départ et qui présentent une affinité avec la molécule cible. Cependant, même s'il est possible de déterminer quels sont les ligands qui ont une forte affinité, il n'est pas possible de les classer en fonction de leur affinité afin de sélectionner les plus efficaces. 10 Dans le document US 2003/148269, on suggère de réaliser un classement par affinité entre les ligands candidats pour une macromolécule. Un mélange comportant des complexes des différents ligands candidats et de la macromélocule est centrifugé de telle sorte que les complexes sont répartis du centre au bord. La mise en oeuvre de cette méthode est délicate, en particulier pour sépa- 15 rer physiquement les complexes après centrifugation. De plus la classification obtenue reste approximative, avec un classement indiquant des liaisons faibles, moyennes ou fortes. Elle ne peut s'appliquer qu'à de petites populations de ligands. Dans l'article « Micro-Scale Frontal Affinity Chromatography with Mass 20 Spectrometric Detection : A New Method for the Screening of Compound Libraries », David C. Schriemer, David R. Bundle, Liang Li, and Ole Hindsgaul dans Angewandte Chemie International Edition, 1998, 37, No.24, pages 33833387, il est proposé de faire passer un échantillon contenant des ligands dans une colonnesur la phase stationnaire de laquelle sont fixés des molécules d'une cible. A la sortie de la colonne, le mélange est analysé. Les ligands qui arrivent le plus tardivement sont ceux qui ont été fixés par la cible. Il est ainsi possible de classer les ligands par affinité avec la cible. Cependant, on constate que la fixation de la cible sur la phase stationnaire de la colonne dénature l'activité de la cible de sorte que les résultats sont au moins partiellement impactés. L'article « Screening of DHFR-binding drugs by MALDI-TOFMS », Paul 3056753 3 Hannewald & Benoît Maunit & Jean-François Muller dans Anal Bioanal Chem (2008) 392 :1335-1344, montre une méthode de test de la liaison de molécules avec une cible dihydrofolate réductase. Le procédé comprend les étapes suivantes : 5 D préparation d'un mélange avec la cible et un échantillon formé d'un mé- lange de molécules à caractériser ; D rinçage et filtration du mélange pour ne conserver que les complexes cible-molécules ; D une partie des complexes cible-molécules sont directement analysés en 10 MALDI-TOF pour analyser les ligands faiblement liés qui vont se détacher naturellement de la cible lors de la réception du laser ; D dénaturation de la dihydrofolate réductase pour libérer les ligands de l'autre partie des complexes cible-molécules ; D analyse en MALDI-TOF des ligands libérés ; 15 D évaluation d'un rapport représentatif de l'affinité de chaque molécule avec la cible. Cette méthode permet d'identifier tous les ligands qui étaient présents au départ et qui présentent une affinité avec la molécule cible. Il est aussi possible de déterminer quels sont les ligands qui ont la plus forte affinité, afin de 20 sélectionner les plus efficaces. Cependant cette méthode est complexe car elle nécessite de réaliser deux analyses en MALDI-TOF. De plus le MALDI-TOF est une technique nécessitant une matrice créant un bruit de fond rendant délicat l'identification des ligands et qui ne permet pas la discrimination d'isomères présentant la même masse. 25 OBJECTIFS DE L'INVENTION Pour résoudre ces problèmes l'invention vise à fournir un procédé de déter- mination de l'affinité entre des ligands et une cible qui soit simple à mettre en oeuvre, fiable et précis. 3056753 4 DESCRIPTION DE L'INVENTION Avec ces objectifs en vue, l'invention a pour objet un procédé de détermination de l'affinité entre des ligands et une cible selon lequel : 5 D on prépare un mélange avec une cible et un échantillon formé d'un mé- lange de ligands pour que les ligands ayant une affinité avec la cible s'y accrochent ; D on filtre le mélange pour ne conserver que les complexes cible-ligands; D on provoque la séparation des complexes cible-ligands, 10 p. on sépare les ligands et les cibles, on récupère par filtration les ligands séparés de la cible dans une solution traitée et on analyse ladite solution traitée pour identifier la présence des ligands, caractérisé en ce que le mélange de ligands initial comprend les ligands en proportions ne dépassant pas un rapport de 5 pour 1, et en ce que l'analyse de 15 la solution traitée comprend la quantification relative des ligands, les ligands en quantité plus importante comportant la plus grande affinité avec la cible. L'utilisation d'un échantillon de ligands en proportions contrôlées permet d'éliminer une variabilité dans les résultats du procédé. Les variations dans les quantités de ligands identifiés après le traitement ne résultent que de la diffé- 20 rence d'affinité entre la cible et lesdits ligands. Par ailleurs, la quantification des ligands dans la solution traitée donne une valeur chiffrée à l'affinité, ce qui est beaucoup plus précis que la classification connue dans l'art antérieur. Elle permet en outre de comparer des ligands non présents dans l'échantillon, mais dans celui d'une expérience menée indépendamment dans les mêmes condi- 25 tions. Le nombre de variétés de ligands dans l'échantillon n'est pas limité et on peut traiter un grand nombre de ceux-ci dans une seule expérience. On peut ainsi obtenir en un jour une classification d'un grand nombre de ligands, 3056753 5 sans avoir à conduire un essai d'activité de chaque ligand vis-à-vis de la cible. Seuls des essais avec les ligands identifiés comme les plus intéressants seront conduits. Le procédé peut s'appliquer également à des cibles qui ne présentent pas d'activité telles que des protéines n'ayant pas d'activité enzymatique, alors 5 qu'un essai d'activité serait inopérant. Par ailleurs, la cible reste libre dans la solution, contrairement aux méthodes qui nécessitent sa fixation à un support solide. La cible n'est donc pas modifiée et les résultats ne sont pas influencés par ce biais De préférence, les ligands dans le mélange initial sont en proportions ne dé- 10 passant pas un rapport de 3 pour 1, et de préférence encore sont en proportions équimolaires. L'échantillon est préparé par exemple avec un solvant choisi dans le groupe comprenant des glycols, le diméthylsulfoxide, l'éthanol, et leurs mélanges à l'eau. La concentration de chaque ligand est par exemple comprise entre 0,1 15 et 10 mM, préférentiellement entre 0,75 et 1 mM. La cible est par exemple dissoute dans une solution d'ammonium acétate avec un pH adapté à la cible. Les conditions sont adaptées afin de favoriser l'activité de la cible, et peuvent donc évoluer en fonction de ladite cible. Selon un perfectionnement, la quantification relative des ligands comprend 20 en outre une étape d'analyse de l'échantillon par la même méthode d'analyse que celle de la solution traitée, la comparaison des ligands entre eux étant effectuée par les rapports de la quantité mesurée dans la solution traitée sur la quantité mesurée dans l'échantillon. Ainsi, on s'affranchit de la variation de la réponse du ligand à la méthode d'analyse. Le différentiel de réponse sur 25 l'échantillon d'un ligand à l'autre est compensé sur les résultats sur la solution traitée. Selon une disposition des préparatifs, on forme un échantillon de référence en diluant l'échantillon de 10 à 20 fois pour l'étape d'analyse de l'échantillon. Selon un mode de réalisation, l'analyse des ligands de la solution traitée est 3056753 6 réalisée par chromatographie en phase liquide ou en phase supercritique. On obtient en sortie un diagramme d'intensité sur un temps de rétention appelé chromatogramme. Cette analyse utilise des moyens très répandus en laboratoire et reste très abordable. 5 Selon cette technique, chaque ligand est identifié par un pic sur un chro- matogramme, la quantité associée à chaque ligand étant choisie parmi l'aire du pic ou l'intensité maximale du pic. Selon un perfectionnement, on ajoute à l'échantillon un ligand de référence dont l'affinité avec la cible est connue. Ainsi, l'affinité des ligands de l'échan- lo avec la cible peut être comparée à un niveau d'affinité connu. De manière préférentielle, on calcule pour chaque ligand un rapport d'affinité RACE, tel que : RACEi= NFeq,cEi avec : ISeq,cE, NFeq,CEi = 15 et I STB,CEi NFTB,CEi = LDTB,REF où : NF est un facteur de normalisation ; ISeq,cEi est l'intensité du signal analytique pour le ligand CEi dans l'échantillon ; 20 ISeq,REF est l'intensité du signal analytique pour le ligand de référence REF dans l'échantillon ; I STB,cEi est l'intensité du signal analytique pour le ligand CEi dans la solution traitée des ligands détachés TB; NFTB,CEÏ Se REF 3056753 7 I STB,REF est l'intensité du signal analytique pour le ligand de référence REF dans la solution traitée des ligands détachés TB; le rapport d'affinité représentant une affinité avec la cible croissante avec la valeur du facteur d'affinité. 5 De manière particulière, les ligands de l'échantillon sont obtenus par ex- traction d'une plante auxquels on ajoute un ligand de référence connu pour son affinité avec la cible. On peut ainsi repérer rapidement quelles molécules produites par des plantes peuvent avoir une activité vis-à-vis de la cible. De manière complémentaire, avant de séparer les complexes cible-ligands, 10 on rince le mélange avec un solvant et on sépare les complexes du solvant par filtration et centrifugation. Cette étape permet d'éliminer les ligands qui n'auraient pas suffisamment d'affinité avec la cible. Pour le rinçage, on peut utiliser de l'eau purifiée ou un solvant dans lequel l'enzyme est stable, tel qu'une solution d'acétate d'ammonium. 15 De manière particulière, pour séparer les ligands et les cibles, on ajoute de l'acétonitrile au mélange. On provoque ainsi la coagulation et la précipitation des cibles et la libération des ligands qui s'y sont liés précédemment. Les agglomérats sont simples à éliminer par filtration et les ligands sont récupérés dans le surnageant. 20 Typiquement, la cible est une enzyme. Les ligands qui ont une affinité avec l'enzyme permettent en général d'inhiber l'action de celle-ci. Le procédé permet donc de sélectionner des ligands pour leur potentielle activité inhibitrice de l'enzyme cible. On s'intéressera aux ligands qui ont les plus grands facteurs d'affinité. D'autres cibles possibles sont des protéines solubles naturellement, 25 c'est à dire les protéines non membranaires. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES Pour une meilleure compréhension de l'invention, il est fait référence à la 3056753 8 description qui suit et aux dessins annexés, parmi lesquels : p. la figure 1 est un chromatogramme correspondant à l'analyse d'un échantillon de ligands ; p. la figure 2 est un chromatogramme similaire à la figure 1 de l'échantillon 5 après traitement selon le procédé de l'invention ; DESCRIPTION DÉTAILLÉE Un procédé de détermination de l'affinité entre des ligands et une cible repose sur le principe de la mise en contact en phase liquide des ligands et 10 de la cible pour que les ligands qui ont une affinité avec la cible s'y lient, de l'élimination des ligands non fixés, de la séparation des complexes pour récupérer les ligands qui étaient fixés, puis de la quantification de ces derniers. Un échantillon de composés à tester est préparé avec des proportions contrôlées, y compris un ligand de référence dont l'affinité avec la cible existe et est connue. 15 Dans une première étape du procédé, l'échantillon et la cible sont mélangés. Les composés se font concurrence pour accéder aux sites de liaison de la cible. Les composés les plus forts déplacent les plus faibles et sont retenus de manière plus efficace par la cible. Par la suite, on procède aux étapes suivantes : 20 i) séparation des complexes ligand-cible du mélange ; ii) élimination des composés non liés ; iii) dénaturation des complexes ligand-cible pour relâcher les ligands ; iv) élimination de la cible dénaturée par précipitation et centrifugation ; v) analyse du surnageant : comparaison des signaux analytiques des ligands 25 du surnageant avec les signaux analytiques des ligands de l'échantillon. 3056753 9 EXEMPLE 1 : TYROSINASE DE CHAMPIGNON 1.1. Préparation de l'échantillon Une solution de travail de tyrosinase de champignon à 1.25 mg/mL est 5 préparée en dissolvant de la poudre de l'enzyme lyophilisée dans 50 mM d'acé- tate d'ammonium, avec un pH de 7.0. L'échantillon est préparé en utilisant l'un des solvants suivants : des glycols, DMSO (diméthylsulfoxide), l'éthanol, pur ou en solution dans l'eau. La concentration dans l'échantillon des ligands initiaux est équimolaire et doit être dans la gamme de 0,75 à 1 mM. Les ligands 10 choisis étaient des inhibiteurs connus de la tyrosinase isolés depuis des racines de murier noir (Morus nigra) : la moracénine A, moracénine B et la kuwanone C. Un échantillon de référence est préparé également en diluant l'échantillon de 10 à 20 fois dans une solution d'eau et d'un quart de volume d'acétonitrile. 1.2. Analyse de l'échantillon 15 1. Étape de préconditionnement - Des puits à membrane filtrante sont pré- conditionnées avec un volume de 500 pI d'une solution à 850/0 d'acétate d'ammonium et 15% d'éthanol qui est passé à travers la membrane avec une centrifugation de 14000 g pendant 60 secondes. 2. Étape de liaison - La préparation de tyrosinase (1.25 mg/mL, 75 pL) est 20 mélangée avec 5 pI de l'échantillon dans un tube d'Eppendorf en plastique, puis est incubée pendant 5 min. 3. Étape de lavage - le mélange de l'enzyme et de l'échantillon est déposé dans un puits préconditionné à l'étape de préconditionnement, puis centrifugé à 14000 g jusqu'à l'élimination de l'essentiel du solvant. Les 25 complexes enzyme-ligands restent à la surface de la membrane du filtre puis sont à nouveau suspendu dans un volume de 100 pL de la même solution à 85% d'acétate d'ammonium et 15% d'éthanol et centrifugé à 14000 g jusqu'à élimination du solvant. Cette procédure est répétée trois fois et élimine tous les composés qui ne sont pas liés à l'enzyme. 3056753 10 4. Étape de séparation - Les complexes enzyme-ligands retenus dans le filtre sont à nouveau suspendus dans un volume de 10 pL d'eau ultra-pure, puis sont mélangés avec un volume de 40 pL d'acétonitrile pour dénaturer et précipiter l'enzyme et, en même temps libérer les ligands. Le mélange 5 est centrifugé à 21000 g pendant 10 min pour séparer le précipité du surnageant. 5. Étape d'analyse - Ledit surnageant formant la solution traitée est analysé par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrométrie de masse, connue également par l'acronyme UPLC-MS. L'échantillon de ré- 10 férence est analysé également de la même manière, en utilisant les mêmes conditions d'analyse. Les affinités relatives sont calculées selon la méthode décrite ci-après. De préférence, l'échantillon de référence et la solution traitée sont analysés séquentiellement pour éliminer des dispersions dues aux réglages de l'appareillage. 15 EXEMPLE 2 : COLLAGÉNASE ISSUE DE CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM 2.1. Préparation de l'échantillon Une solution de travail de collagénase issue de Clostridium histolyticum à 20 6.25 mg/mL est préparée en dissolvant de la poudre de l'enzyme lyophilisée dans 50 mM d'acétate d'ammonium, avec un pH de 7.5, ajusté par une solution aqueuse d'ammoniac. L'échantillon est préparé en utilisant l'un des solvants suivants : des glycols, le DMSO (diméthylsulfoxide), l'éthanol, pur ou en solution dans l'eau. La concentration dans l'échantillon des ligands initiaux est 25 équimolaire et doit être dans la gamme de 0,75 à 1 mM. Les ligands choisis étaient des isomères d'acide 3,5-dicaféoylquinique (noté 3,5-DCQ par la suite) et des isomères d'esters d'acide 3,5-dicaféoylquinique et de dipropylène glycol (noté 3,5-DCQ-DPG par la suite). Un échantillon de référence est préparé également en diluant l'échantillon de 10 à 20 fois dans une solution d'eau et d'un 30 quart de volume d'acétonitrile. 3056753 11 2.2. Analyse de l'échantillon 1. Étape de préconditionnement - Des puits à membrane filtrante sont pré-conditionnées avec un volume de 500 pI d'acétate d'ammonium 50mM pH 7,5 qui est passé à travers la membrane avec une centrifugation de 5 14000 g pendant 60 secondes. 2. Étape de liaison - Un volume de 75 pI de la solution de collagénase à une concentration de 6,25mg/ml dans 50 mM d'acétate d'ammonium, avec un pH de 7.5 est mélangé avec 10 pI de l'échantillon pendant 10 min dans un tube d'Eppendorf en plastique. 10 3. Étape de lavage - Le mélange de l'enzyme et de l'échantillon est dé- posé dans un puits préconditionné à l'étape de préconditionnement, puis centrifugé à 14000 g jusqu'à l'élimination de l'essentiel du solvant. Les complexes enzyme-ligands restent à la surface de la membrane du filtre puis sont à nouveau suspendu dans un volume de 100 pL de la même so- 15 lutionà 50 mM d'acétate d'ammonium, avec un pH de 7.5 et centrifugé à 14000 g jusqu'à élimination du solvant. Cette procédure est répétée trois fois et élimine tous les composés qui ne sont pas liés à l'enzyme. 4. Étape de séparation - Les complexes enzyme-ligands retenus dans le filtre sont à nouveau suspendus dans un volume de 10 pL d'eau ultra-pure, puis 20 sont mélangés avec un volume de 40 pL d'acétonitrile pour dénaturer et précipiter l'enzyme et, en même temps libérer les ligands. Le mélange est centrifugé à 21000 g pendant 10 min pour séparer le précipité du surnageant. 5. Étape d'analyse - Ledit surnageant formant la solution traitée est ana- 25 lysé par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrométrie de masse. L'échantillon de référence est analysé également de la même manière, en utilisant les mêmes conditions d'analyse. Les affinités relatives sont calculées selon la méthode décrite ci-après. Le résultat est sur la première ligne du tableau 2. 3056753 12 EXEMPLE 3 : COLLAGÉNASE ISSUE DE CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM 3.1. Préparation de l'échantillon 5 Plusieurs échantillons sont préparés comme dans l'exemple 2, mais avec une proportion entre les ligands 3,5-DCQ et 3,5-DCQ-DPG non plus équimolaire mais déséquilibrée, comme indiqué dans le tableau 2 ci-après. 3.2. Analyse de l'échantillon L'analyse est conduite de la même manière que dans l'exemple 2. Les ré- 10 sultats sont de la deuxième à la quatrième ligne du tableau 2. EXEMPLE 4 : INHIBITION DE LA COLLAGÉNASE ISSUE DE CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM L'activité inhibitrice de la collagénase issue de Clostridium histolyticum a 15 été expérimentée en mettant en présence de la collagénase et du substrat synthétique FALGPA (N-(3-[2-Furyl]acryloyl)-Leu-Gly-Pro-Ala) préparé à une concentration de 1 mM, du tampon tris-HCI seul pour établir une référence, et en présence respectivement de tampon tris-HCI additionné de 3,5-DCQ et 3,5-DCQ-DPG en concentration à 5pM. La référence montrant une activité de 20 la collagénase de 100%, on a mesuré une activité de la collagénase de 94% en présence de 3,5-DCQ et une activité de 50% en présence de 3,5-DCQ-DPG. A cette concentration, la collagénase de Clostridium histolyticum est inhibée de manière significative par le 3,5-DCQ-DPG, tandis qu'elle ne l'est que très peu par le 3,5-DCQ. 25 INTERPRÉTATION DES DONNÉES 3056753 13 Une analyse par chromatographie en phase liquide fournit un chromatogramme tel que montré par les figures 1 et 2. Le chromatogramme représente une intensité de signal en fonction du temps de rétention dans une colonne. Le signal présente différents pics d'intensité variable. Chaque pic est associé à 5 l'un des ligands présent dans l'échantillon et la solution traitée. 1. Normalisation de l'intensité du signal analytique pour les ligands dans l'échantillon de référence. Pour chaque chaque ligand CEi dans l'échantillon de référence, on établit des facteurs de normalisation NFq dudit ligand CEi par comparaison au ligand e 10 de référence REF, selon l'équation suivante : ISeq,cEi NFeq,CEi = où : NF est un facteur de normalisation ; /Seq,cE, est l'intensité du signal analytique pour le ligand CEi dans l'échantillon ; 15 ISeq,REF est l'intensité du signal analytique pour le ligand de référence REF dans l'échantillon. L'intensité peut être choisie parmi l'aire du pic ou la valeur maximale du pic. Le facteur de normalisation du ligand de référence vaut toujours 1. 2. Normalisation de l'intensité du signal analytique pour les ligands dans la 20 solution traitée. Pour chaque ligand CEi dans la solution traitée, on établit des facteurs de normalisation NE' dudit ligand CEi par comparaison au ligand de référence iSe REF (1) 3056753 14 REF, selon l'équation suivante : NFTB,Ei = I ST B,CEi I ST B,REF (2) où : I STB,cEi est l'intensité du signal analytique pour le ligand CEi dans la solution traitée ; et 5 I ST B,REF est l'intensité du signal analytique pour le ligand de référence REF dans la solution traitée. Le facteur de normalisation du ligand de référence vaut toujours 1. 3. Affinités relatives des ligands en rapport avec le ligand de référence. Ensuite, on calcule pour chaque ligand un rapport d'affinité RACE, tel que : 10 RAcEi= NFeq,cEi Le rapport d'affinité représente une affinité du ligand avec la cible, cette affinité étant croissante avec la valeur du facteur d'affinité. Les ligands ayant les rapports d'affinité les plus élevés seront les candidats privilégiés pour une inhibition de l'activité de la cible. 15 L'invention n'est pas limitée aux exemples donnés. On peut par exemple ajouter à la cible des ligands qui se fixent sur certains sites de manière à identifier des ligands qui seraient adaptés aux sites restants libres. RÉSULTATS 20 Dans l'exemple 1 de la tyrosinase, le ligand moracénine B a été considéré comme le ligand de référence. Les figures 1 et 2 montrent les chromatogrammes en ultraviolet, à une longueur d'onde de 270 nm, respectivement sur l'échan- N FTB,CEÏ (3) 3056753 15 tillon de référence et sur la solution traitée. Le chromatogramme de l'échantillon de référence sur la figure 1 comporte trois pics Bl, Cl, Al correspondant respectivement à la moracénie B, à la kuwanone C et à la moracénine A. Le chromatogramme de la solution traitée sur la figure 2 comporte trois pics B2, 5 C2, A2 correspondant respectivement à la moracénie B, à la kuwanone C et à la moracénine A. La surface des pics issue de ces diagrammes de tous les ligands est utilisée pour calculer les facteurs de normalisation selon l'équation 1 et l'équation 2. Sur la base de ces valeurs, les facteurs d'affinité sont calculés selon l'équation 3 pour 10 tous les ligands compris dans l'échantillon de référence. Le tableau 1 montre la synthèse des résultats et comprend en dernière colonne la comparaison avec des valeur expérimentales issues de la littérature indiquant l'indice /C50 de réduction d'activité de l'enzyme de 50% en présence du ligand. Facteur de Facteur de normalisation, normalisation, Affinités relatives 1G50 échantillon de solution traitée référence moracénine B NFeq,REF 1,00 NFTB,REF 1,00 RAREF 1,00 200 à 300 [IM kuwanone C NFeq,kuwc 0,73 NFTB,kuwC 0,78 RAkuwc 1,07 50 à 100 [IM [1] moracénine A NFeq,morA 0,86 NFTB,morA 1,29 RAmorA 1,50 10,3 [IM [2] 15 Tableau 1 [1] J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 5368-5373 [2] Molecules 2015, 20, 8730-8741 On constate que les résultats du procédé selon l'invention sont corrélés aux résultats connus de l'activité des ligands testés. 20 Dans le tableau 2, on évalue la sensibilité de la méthode à l'écart de concen- trations des ligands par rapport à l'équimolarité. La première ligne du tableau 2 concerne le résultat avec des concentrations entre 3,5-DCQ et 3,5-DCQDPG égales, donc avec un mélange équimolaire, et correspond aux résultats 15 3056753 16 de l'exemple 2. On montre que l'ester 3,5-DCQ-DPG présente l'affinité la plus grande pour la cible par rapport au 3,5-DCQ de référence. Ceci est cohérent avec la littérature qui indique que l'indice /C50 de 3,5-DCQ vis-à-vis de la collagénase issue de Clostridium histolyticum est de 23.6 pM (J. Nat. Prod. 5 2005, 68, 794-796) alors que celui de l'ester 3,5-DCQ-DPG est d'environ 5 pM, comme l'a montré l'exemple 4. Le site actif de la collagénase est bloqué par l'ester à une plus faible concentration que pour le 3,5-DCQ. Les résultats de l'exemple 3 montrent par ailleurs que, même si l'affinité relative du 3,5-DCQ-DPG évolue avec le déséquilibre de concentration, cette 10 évolution reste dans la même orientation, en indiquant à chaque fois que le 3,5-DCQ-DPG est plus efficace pour inhiber la collagénase que le 3,5-DCQ. Toutefois, l'exemple 3.2 montre que la sensibilité de l'essai diminue sérieusement avec un rapport molaire de 5 :1. On considère ainsi que les objectifs de l'invention ne seraient pas atteints avec un écart plus important. Rapport molaire 3,5-DCQ-DPG/ 3,5-DCQ (réf) N° Concentration Facteur de Facteur de Affinités ex. dans normalisation, normalisation, relatives l'échantillon échantillon de solution traitée (NM) référence 3,5- 3,5- 3,5- 3,5- 3,5- 3,5- 3,5- 3,5- DCQ- DCQ DCQ- DCQ DCQ- DCQ DCQ- DCQ DPG (réf) DPG (réf) DPG (réf) DPG (réf) 1/1 2 58,8 58.8 1,16 1,00 6,03 1,00 5,21 1,00 (équimolaire) 0,5/1 3.1 29,4 58,8 0,62 1,00 2,49 1,00 4,05 1,00 0,2/1 3.2 11,8 58,8 0,27 1,00 0,81 1,00 3,01 1,00 3/1 3.3 58,8 19,6 3,33 1,00 13,64 1,00 4,09 1,00 Tableau 2 REVENDICATIONS1. Procédé de détermination de l'affinité entre des ligands et une cible selon lequel p. on prépare un mélange avec une cible et un échantillon formé d'un mélange de ligands pour que les ligands ayant une affinité avec la cible s'y accrochent ; p. on filtre le mélange pour ne conserver que les complexes cible-ligands ; p. on provoque la séparation des complexes cible-ligands, p. on sépare les ligands et les cibles, on récupère par filtration les ligands dans une solution traitée et on analyse ladite solution traitée pour identifier la présence des ligands, caractérisé en ce que le mélange de ligands initial comprend les ligands en proportions ne dépassant pas un rapport de 5 pour 1, et en ce que l'analyse de la solution traitée comprend la quantification relative des ligands, les ligands en quantité plus importante comportant la plus grande affinité avec la cible. 2. Procédé selon la revendication 1, selon lequel les ligands dans le mélange initial sont en proportions ne dépassant pas un rapport de 3 pour 1, de préférence sont en proportions équimolaires. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, selon lequel la quantification rela- tive des ligands comprend en outre une étape d'analyse de l'échantillon par la même méthode d'analyse que celle de la solution traitée, la comparaison des ligands entre eux étant effectuée par les rapports de la quantité mesurée dans la solution traitée sur la quantité mesurée dans l'échantillon. 4. Procédé selon la revendication 3, selon lequel on forme un échantillon de référence en diluant l'échantillon de 10 à 20 fois pour l'étape d'analyse de l'échantillon. 5. Procédé selon la revendication 3, selon lequel chaque ligand est identifié par un pic sur un chromatogramme, la quantité associée à chaque ligand étant choisie parmi l'aire du pic ou l'intensité maximale du pic. 3056753 18 5 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel on ajoute à l'échantillon un ligand de référence dont l'affinité avec la cible est connue. 7. Procédé selon les revendications 5 et 6 prises en combinaison, selon lequel on calcule pour chaque ligand un rapport d'affinité RACE, tel que : NFTB,CEÏ RACE?, = NFeq,CEi avec : I Seq,cEi ISeq,REF et N FTB ISTB,CEi ISTB,REF ou : NF est un facteur de normalisation ; io /Seq,cE, est l'intensité du signal analytique pour le ligand CEi dans l'échantillon ; ISeq,REF est l'intensité du signal analytique pour le ligand de référence REF dans l'échantillon ; ISTB,cEI, est l'intensité du signal analytique pour le ligand CEi dans la 15 solution traitée ; ISTB,REF est l'intensité du signal analytique pour le ligand de référence REF dans la solution traitée ; le rapport d'affinité représentant une affinité avec la cible croissante avec la valeur du facteur d'affinité. 20 8. Procédé selon l'une des revendications 3 à 7, selon lequel la chromato- graphie est couplée à la spectrométrie de masse. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les ligands de l'échantillon sont obtenus par extraction d'une plante. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, selon lequel avant de 25 séparer les complexes cible-ligands, on rince le mélange avec un solvant et on sépare les complexes du solvant par filtration et centrifugation. N 3056753 19 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, selon lequel pour séparer les ligands et les cibles, on ajoute de l'acétonitrile au mélange. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, selon lequel la cible est une enzyme.