Brevet FR3050448A1 — publié le 20171027

[DOMAINE TECHNIQUE] La présente invention concerne le domaine technique de l'encapsulation, et en particulier l'encapsulation de protéines. Plus précisément, la présente invention a pour objet des nanoparticules à base de monomères d'encapsuline spécifiques ayant une grande capacité à encapsuler des protéines, les moyens pour produire ces nanoparticules, ainsi que leur utilisation dans des compositions immunogènes. [ETAT DE LA TECHNIQUE] Le domaine de l'encapsulation connaît un essor important depuis plusieurs années. L'encapsulation consiste à enfermer une substance dans une « capsule », pour l'isoler du milieu extérieur et/ou la transporter jusqu'à l'endroit désiré où elle sera libérée pour agir. Cette technologie est notamment mise à profit pour encapsuler des protéines, qui peuvent être sensibles à certains facteurs environnementaux et se dégrader (par exemple, sous l'action d'enzymes ou dans certaines conditions de pH), et préserver ainsi leur activité biologique et/ou prolonger leur effet thérapeutique. Elle peut être aussi mise en oeuvre pour différer ou prolonger le relargage des protéines à travers la capsule. Dans le domaine vaccinal, elle est également mise à profit pour délivrer la protéine vaccinale aux cellules du système immunitaire (Bungener L. et coll. Vaccine (2002); 20: 2287-2295). Plusieurs techniques ont été décrites dans la littérature pour l'encapsulation de protéines, conduisant à des systèmes de type microparticules ou nanoparticules, par exemple à base de polymères (Amidi M et Coll. Advanced Drug Delivery Reviews (2010); 62 :59-82), des systèmes à base de lipides, tels que des émulsions, des nanoparticules lipidiques solides ou des liposomes (Martins S et Coll., Int J Nanomedicine (2007) ; 2(4) : 595-607), ou encore des systèmes de type virosomes (Bungener L. et coll. Vaccine (2002); 20: 2287-2295) ou utilisant des Virus-Like-Particles (Patterson DP et Coll, ACS Chem Biol ( 2014) ; 9(2) : 359-365). Récemment, Sutter et Coll. ont décrit une famille de protéines bactériennes, les encapsulines, ayant la capacité de s'auto-assembler pour former un nano-compartiment (ou nanoparticule) contenant des protéines enzymatiques particulières appartenant à la famille des DyP (dyedecolorizing peroxydase) ou des Flp (ferritin-like protein) (Sutter M et Coll., Nat Struct Mol Biol (2008) ; 15(9) : 939-947). Cette structure pourrait servir de micro-réacteur à l'intérieur de la bactérie, dans lequel des réactions enzymatiques se produisent dans un espace confiné. Le nano- 3050448 2 compartiment a une taille généralement comprise entre 10 et 40 nm, en fonction de la taille et du nombre de monomères d'encapsuline qui se sont auto-assemblés. Par exemple, les encapsulines provenant de Thermotoga maritima (ou de Rhodococcus jostii RHA1) s'assemblent pour former des nanoparticules ayant une taille d'environ 24 nm et composées de 60 monomères 5 d'encapsuline. A partir d'une banque de données, Sutter a analysé les séquences des protéines enzymatiques appartenant à la famille des DyP et montré que celles qui sont présentes à l'intérieur des nano-compartiments d'encapsuline étaient codées par des gènes qui se trouvent sur le même opéron que celui qui code pour l'encapsuline. Par ailleurs, en alignant les séquences de leurs extrémités C-terminales, Sutter a également montré qu'il existait une séquence 10 conservée d'acides aminés. Cette séquence conservée d'acides aminés est également retrouvée sur l'extension C-terminale d'autres protéines enzymatiques qui sont encapsulées dans les nanocompartiments d'encapsuline telles que celles qui appartiennent à la famille des Flp. Très récemment, Tamura et Coll dans Biotechnology and Bioengineering (2015) ; 1 : 13-20 ont montré que l'on pouvait encapsuler des protéines hétérologues, telles que l'eGFP (Enhanced 15 Green Fluorescent Protein) ou la luciférase, dans des nanoparticules d'encapsuline provenant de Rhodococcus erythropolis N771. Ces protéines hétérologues ont été modifiées par addition à leur extrémité C-terminale, d'une séquence correspondant aux 37 derniers acides aminés C-terminaux de la peroxydase DypB provenant de R. erythropolis N771. Toutefois, le rendement d'encapsulation était relativement faible, puisque tout au plus une molécule d'eGFP ou de 20 luciférase était encapsulée par nanoparticule. [PROBLEME TECHNIQUE] Aussi, le but de l'invention est de proposer des nanoparticules à base d'encapsuline, dans lesquelles une plus grande quantité de protéines peuvent être encapsulées. 25 [RESUME DE L'INVENTION] A cet effet, la présente invention a pour objet une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé 30 dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne. 3050448 3 Selon un mode de réalisation de l'invention, le peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline. Dans un autre mode de réalisation, le site externe du domaine A est constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du domaine A et de la séquence d'acides 5 aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%. 10 Selon encore un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide a été inséré entre deux acides aminés consécutifs de la séquence Ki381139E140C141G142S143, lorsque la séquence du 15 monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7, ou entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 7, après alignement des deux séquences monomériques. Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nombre total d'acides aminés du peptide 20 inséré est compris entre 4 et 55 (bornes incluses). Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). Selon un autre mode de réalisation très particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline après insertion du peptide est la séquence ID NO : 30. 25 Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, de la séquence d'acides aminés de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel : a. I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon 3050448 4 préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses) ; b. M est la séquence X1GSLX5X6GX8LX10 (SEQ ID NO : 36), dans laquelle X1 est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et X10 est K ou Y, la 5 séquence X1APX4DGSLX9X10GSLKG (SEQ ID NO : 37), dans laquelle X1 et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et X10 est I ou V, ou la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38) et, c. T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée 10 entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). Selon un mode de réalisation de l'invention, la protéine interne est une protéine de fusion selon laquelle l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à 15 l'enchainement d'acides aminés du type I-M-T. La présente invention a également pour objet un vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la 20 séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet [3, et une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 25 et 30 (bornes incluses) de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). 30 Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique tel que décrit précédemment. Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant un premier vecteur qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide 3050448 5 a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet [3, et un deuxième vecteur qui comprend une séquence d'acide 5 nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ 10 ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). L'invention a aussi pour objet un procédé de production de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, telles que définies dans les différents modes de 15 réalisation précédents, selon lequel: a. On cultive des cellules hôtes telles que décrites précédemment dans des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la protéine interne ; et b. On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne résultant de 20 l'auto-assemblage des monomères d'encapsuline. L'invention a encore pour objet un procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline selon lequel : a. On clarifie un broyat de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline; 25 b. On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ; c. On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ; d. On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes 30 contenus dans l'éluat au moyen d'une solution biphasique; e. On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et 3050448 6 f. On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline. L'invention a également pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules telles que définies dans leurs différents modes de réalisation précédents. 5 L'invention a aussi pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du 10 domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). Selon ce mode de réalisation particulier de l'invention, la réponse immune est dirigée contre le 15 virus grippal. Un autre objet de l'invention est un monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré, dans sa séquence d'acides aminés, un peptide comprenant la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). Selon un mode de réalisation, le peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du 20 premier feuillet (3 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p. L'invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline tel que décrit précédemment. Selon un mode de réalisation, la séquence d'acide nucléique codant pour un monomère 25 d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO: 43 ou une séquence dérivée ayant un degré d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID NO : 43. Enfin, l'invention a pour objet un vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique telle que décrite précédemment. 3050448 7 La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit. [DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION] Les inventeurs ont montré de façon surprenante qu'une nanoparticule comprenant un 5 assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, est capable d'encapsuler une plus grande quantité de protéines qu'une nanoparticule ayant les mêmes caractéristiques excepté qu'aucun peptide n'a été inséré dans la séquence d'acides aminés des monomères d'encapsuline, comme illustré dans l'Exemple 2. En outre, selon la nature du peptide inséré et de 10 la protéine interne, ces nanoparticules peuvent être immunogènes et induire de façon surprenante une réponse humorale contre le peptide inséré et/ou contre la protéine qui a été encapsulée, mais pas contre l'encapsuline. La nanoparticule selon l'invention peut également être utilisée pour conserver et/ou stabiliser la protéine interne, notamment lorsque celle-ci se trouve dans un milieu défavorable, tel qu'une 15 température trop élevée et/ou un pH incompatibles avec le maintien de l'intégrité de la protéine, ou lorsque le milieu contient des enzymes ou des agents qui altèrent ou dégradent rapidement la protéine. Dans le cadre d'une utilisation à des fins thérapeutiques ou préventives, l'encapsulation d'une protéine dans la nanoparticule selon l'invention peut aussi être avantageuse pour diminuer sa toxicité, ou prolonger sa demi-vie en retardant son relargage. 20 Dans la présente demande, les termes « un », « une », « le », « la » doivent être interprétés de façon large en désignant indifféremment le singulier ou le pluriel (« des », « les »...), sauf s'il est clairement indiqué dans le texte que le terme « un », « une », « le » ou « la » doit être compris dans un sens excluant le pluriel. En particulier, ce terme désigne uniquement le singulier lorsqu'il est précédé ou suivi d'une mention excluant le pluriel, telle que « seul » ou « seulement ». 25 Par « nanoparticule », on entend une particule de matière, dont au moins une des dimensions se situe à l'échelle nanométrique (c'est-à-dire, inférieure à 200 nm environ). De préférence, ses trois dimensions sont à l'échelle nanométrique. Dans le cas de la présente invention, la nanoparticule ou le nano-compartiment est formé suite à l'auto-assemblage de monomères d'encapsuline tels que décrits dans l'invention. La 30 nanoparticule peut contenir jusqu'à 60, 120, 180 ou 240 monomères d'encapsuline, en fonction de l'origine du monomère. Classiquement, la nanoparticule a une forme icosaédrique, dont le 3050448 8 diamètre externe est typiquement compris entre 10 et 40 nm, plus particulièrement entre 20 et 40 nm. Les techniques permettant de mesurer la taille de ce type de particules (représentée par exemple par son diamètre externe ou interne) sont bien connues de l'homme du métier. On peut citer, par exemple, la microscopie électronique à transmission (MET) ou encore la diffusion 5 dynamique de la lumière (Dynamic Light Scattering ou DLS). La MET permet de déterminer le diamètre interne et/ou externe des nanoparticules. La DLS, basée sur le principe de la diffusion de Rayleigh, permet de mesurer le rayon hydrodynamique d'une particule (c'est-à-dire le rayon d'une sphère théorique qui aurait le même coefficient de diffusion que la particule considérée). Par « monomère d'encapsuline », on entend une protéine appartenant à la famille des 10 encapsulines, qui sont des protéines bactériennes et qui possèdent 3 domaines structuraux : le domaine périphérique P (domaine P), le domaine axial A (domaine A) et la boucle allongée E (boucle E). Hormis les encapsulines de Thermotoga maritima (T. maritima), Pyrococcus furiosus (P. furiosus), Brevibacterium linens (B. linens), Rhodococcus jostii (R. jostii), Rhodococcus erythropolis (R. erythropolis) et Myxococcus xanthus (M. xanthus) déjà décrites, Radford dans « Prediction and 15 Characterization of Phage Capsid-like Nanocompartments in Prokaryotes », Rapport de thèse (2015), Faculté de Médecine, Université de Toronto, a identifié 590 encapsulines provenant de nombreuses espèces bactériennes. Outre leurs propriétés d'auto-assemblage, les monomères d'encapsuline au sens de la présente invention, possèdent en commun une très forte homologie structurale, que l'on peut définir au moyen du RMSD (Root Mean Square Deviation), en particulier 20 au niveau des domaines P et A. D'autre part, le domaine P contient une cavité interne dans laquelle se trouvent des acides aminés ayant la capacité de se lier au moyen de liaisons non covalentes, via des interactions ioniques et/ou hydrophobes à l'extrémité C-terminale d'au moins une des protéines appartenant à la famille des iron-dependent peroxidases (notamment les Dyp), des ferritin-like protéines (Flp), des ferredoxins, des Dps-bacterioferritin-like protéines, des 25 hemerythrin-like protéines, ou des rubrerythrin-like protéines. Le RMSD permet de comparer la ressemblance structurale de deux monomères d'encapsuline. Pour chacun des N atomes comparés, l'atome i de coordonnées (x,, y,, z,) du premier monomère est mis en correspondance avec l'atome i' de coordonnées (x,,, z,,) du second monomère, et le RMSD est obtenu par la formule suivante : 30 RMSD =i711 - xif)2 + (Yi - yif)2 + (zi zif)2] 3050448 9 L'homme du métier peut identifier un logiciel pertinent permettant de réaliser cette mise en correspondance, et de calculer le RMSD. A titre d'exemple, on cite les logiciels Multiprot, SuperPose, jFATCAT, Dalilite, C-alphamatch, Pymol. Tout monomère d'encapsuline ayant : 5 1) la capacité de s'auto-assembler, 2) un RMSD au niveau des domaines P et A inférieur à 5 Â par rapport aux domaines correspondants P et A d'au moins un des monomères des encapsulines de référence choisies parmi les encapsulines de T. maritima, P. furiosus, B. linens, R. jostii, R. erythropolis, et M. xanthus, telles que définies par leurs séquences respectives SEQ ID 10 NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, telles que mentionnées ci-dessous, en particulier un RMSD au niveau des domaines P et A inférieur à 5 Â par rapport aux domaines correspondants P et A du monomère d'encapsuline de T. maritima (SEQ ID NO : 1), en utilisant le logiciel jFATCAT, et 3) dont le domaine P possède une cavité interne capable de se lier au moyen de liaisons 15 non covalentes via des interactions ioniques et/ou hydrophobes à l'extrémité C- terminale d'au moins une des protéines appartenant à la famille des iron-dependent peroxidases (notamment les Dyp), des ferritin-like protéines (Flp), des ferredoxins, des Dps-bacterioferritin-like protéines, des hemerythrin-like protéines, ou des rubrerythrin-like protéines ; 20 convient à l'objet de l'invention. MVNM EFLKRSFAPLTEKQWQE I D N RARE IFKTQLYG RKFVDVEG PYGWEYAAH PLG EVEVLSDE N EVVKWG L RKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGS TPKD LLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGD FKLIL GQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO : 1) 25 M LSI NPTLIN RDKPYTKEELM El LRLAI IAELDAI NLYEQMARYSEDENVRKI LLDVAREEKAHVGEFMALLLNLDP EQVTELKGGFEEVKELTGI EAH IN DN KKEESNVEYFEKLRSALLDGVN KGRSLLKHLPVTRIEGQSFRVDII KFEDG VRVVKQEYKPIPLLKKKFYVGIRELN DGTYDVSIATKAGELLVKDEESLVIREILSTEGI KKM KLSSWDNPEEALNDL M NALQEASNASAGPFGLII NPKRYAKLLKIYEKSGKM LVEVLKEIFRGGI IVTLNI DEN KVII FANTPAVLDVVVGQ DVTLQELGPEGDDVAFLVSEAIGIRIKNPEAIVVLE (SEQ ID NO : 2) 30 MNNLYRELAPIPGPAWAEIEEEARRTFKRNIAGRRIVDVAGPTGFETSAVTTGHIRDVQSETSGLQVKQRIVQE Y IELRTPFTVTRQAIDDVARGSGDSDWQPVKDAATTIAMAEDRAILHGLDAAGIGGIVPGSSNAAVAIPDAVEDF 3050448 10 ADAVAQALSVLRTVGVDGPYSLLLSSAEYTKVSESTDHGYPIREHLSRQLGAGEIIWAPALEGALLVSTRGGDY EL HLGQDLSIGYYSHDSETVELYLQETFGFLALTDESSVPLSL (SEQ ID NO : 3) MSDSSNLHRNLAPVTEVAWQQIGEEAARTFKRHVAGRRVVDVAGPFGYSYSAHNLGRVTPIKTSDSRIRAQQR QVNPLVELRFPFTLSRAEVDDVARGSLDSDWQPVKDAAKAVAFAEDQSIFQGFDEAGIRGLGPSSDNPVLSLPE 5 DPLLIPDAVASALSALRLAGVEGPYSVVLDADAYTAVSETRDEGHPVFHHLRDLVAGDIIWAPAISGGYVLSTR G GDNQLTLGTDLSIGYDSHTATDVTLYLEETFTFASLTAEAAVVLAR (SEQ ID NO : 4) MTNLHRDLAPISAAAWAEIEEEASRTFKRHVAGRRVVDVEGPSGDDLAAIPLGHQVPINPLADGVIAHARQSQ PVIELRVPFTVSRQAIDDVERGAKDSDWQPVKDAAKQIAFAEDRAIFEGYPAASITGVRASGSNPELKLPIDAK D YPEAISQAITSLRLAGVNGPYSLLLNADAFTAINETSDHGYPIREHLRRVLDGEIIWAPAIDGAFLLSTRGGDY ELHL 10 GQDLSIGYLSHDANSVELYFQESMTFLMYTSEAVVSLA (SEQ ID NO : 5) MPLEPHFMPDFLGHAENPLREEEWARLNETVIQVARRSLVGRRILDIYGPLGAGVQTVPYDEFQGVSPGAVD1 VG EQETAMVFTDARKFKTI PI IYKDFLLHWRDI EAARTH NM PLDVSAAAGAAALCAQQEDELI FYG DARLGYEG LMTANGRLTVPLG DWTSPGGG FQAIVEATRKLN EQG H FG PYAVVLSPRLYSQLH RIYEKTGVLE I ETI RQLASDG VYQSN RLRGESGVVVSTG REN M DLAVSM D MVAAYLGASRM N H PFRVLEALLLRIKH PDAICTLEGAGATE RR 15 (SEQ ID NO : 6) En particulier, les acides aminés de la cavité interne du domaine P qui sont impliqués dans ces interactions sont conservés ou les modifications éventuelles sont limitées à des substitutions conservatives, selon lesquelles les acides aminés sont remplacés par des acides aminés du même sous-groupe. 20 Les monomères d'encapsuline de T. maritima (SEQ ID NO : 1), P. furiosus (SEQ ID NO : 2), B. linens (SEQ ID NO : 3), R. jostii (SEQ ID NO : 4), R. erythropolis (SEQ ID NO : 5), et M. xanthus (SEQ ID NO : 6) conviennent particulièrement à l'objet de l'invention. En outre, un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline qui forment le nano-compartiment selon l'invention. Le nano- 25 compartiment peut donc être constitué d'un ensemble de monomères d'encapsuline identiques entre eux et au moins un monomère d'encapsuline différent, se distinguant par l'insertion de la séquence d'acides aminés du peptide. Le nano-compartiment peut également être constitué d'un mélange de deux ensembles de monomères ; un premier ensemble constitué de monomères d'encapsuline tous identiques entre eux et un deuxième ensemble constitué de monomères 30 d'encapsuline, également tous identiques entre eux, mais se distinguant des monomères du premier ensemble par l'insertion de la séquence d'acides aminés du peptide. De manière 3050448 11 préférée, la nanoparticule selon l'invention comprend un assemblage de monomères d'encapsuline tous identiques entre eux, selon laquelle la séquence d'acides aminés d'un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline. De plus, le peptide est inséré dans un site externe du monomère d'encapsuline, notamment dans 5 un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline que l'on localise en alignant la séquence du monomère d'encapsuline avec la séquence d'un monomère d'encapsuline de référence dont la structure cristallisée est connue, comme celle du monomère d'encapsuline de T. maritima. Cet alignement peut se faire structurellement si la structure de l'encapsuline cible est connue, comme celle de P. furiosus, ou simplement par alignement des séquences protéiques 10 lorsque la structure de l'encapsuline cible n'est pas connue, comme celle de R. erythropolis. A titre d'exemple, on cite le logiciel Pymol (Schrôdinger) pour l'alignement structurel et l'application Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) pour l'alignement des séquences protéiques. Structurellement, le domaine A du monomère d'encapsuline comprend des hélices a et des feuillets [3, ces structures étant reliées entre elles par des séquences d'acides aminés qui 15 n'ont pas de structure secondaire caractéristique (structures dépliées). On a identifié que la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du domaine A et la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée qui se situe entre ce premier feuillet (3 et la première hélice a du domaine A, représentent un site externe du domaine A et sont particulièrement appropriées pour insérer le peptide selon l'invention, comme indiqué sur la 20 figure 1, où ont été représentées à titre indicatif les structures tridimensionnelles des monomères d'encapsuline de T. Maritima, et de P. furiosus. On peut par exemple insérer le peptide entre deux acides aminés consécutifs de la séquence K216 M217 K218 L219 5220 5221, qui correspond à la séquence d'acides aminés du premier feuillet (3 et de la première structure dépliée du domaine A du monomère d'encapsuline de P. furiosus. 25 En particulier, le monomère d'encapsuline peut provenir d'une bactérie thermophile ou extrêmophile, telle que T. maritima. La séquence d'acides aminés du monomère à partir de laquelle on insère la séquence peptidique selon l'invention peut correspondre à la séquence de l'encapsuline de T. Maritima, (SEQ ID NO : 1), ou à une séquence d'acides aminés dérivée de celle-ci. 30 Par « séquence d'acides aminés dérivée d'une séquence d'acides aminés de référence d'un monomère d'encapsuline », on entend une séquence d'acides aminés contenant des variations par rapport à la séquence de référence, mais celles-ci ne doivent pas modifier significativement la structure tridimensionnelle du monomère d'encapsuline, de sorte que le RMSD au niveau des 3050448 12 domaines P et A est inférieur à 5 Â par rapport aux domaines correspondants P et A d'au moins un des monomères choisis parmi ceux de l'ensemble constitué par les monomères d'encapsuline de T. maritima (SEQ ID NO : 1), P. furiosus (SEQ ID NO : 2), B. linens (SEQ ID NO : 3), R. jostii (SEQ ID NO : 4), R. erythropolis (SEQ ID NO : 5), et M. xanthus (SEQ ID NO : 6) en utilisant le logiciel 5 jFATCAT, et ne doivent pas altérer sa fonctionnalité, à savoir sa capacité à s'auto-assembler et à se lier au moyen de liaisons non covalentes, c'est-à-dire au moyen d'interactions ioniques et/ou hydrophobes, à l'extrémité C-terminale d'au moins une des protéines appartenant à la famille des iron-dependent peroxidases (notamment les Dyp), des ferritin-like protéines (Flp), des ferredoxins, des Dps-bacterioferritin-like protéines, des hemerythrin-like protéines, ou des 10 rubrerythrin-like protéines. Ces variations de séquence peuvent être des variations se produisant naturellement, ou être introduites par des techniques de génie génétique, connues de l'homme du métier (telles que celles décrites dans Sambrook J et Coll, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2ème Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, p. 9.31-9.57, ou dans Current Protocols in Molecular 15 Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6). Les variations incluent une ou des délétion(s), une ou des substitution(s), ou une insertion d'un acide aminé, par exemple après la méthionine N-terminale de la séquence d'acides aminés de référence, ainsi que des combinaisons de ces variations. Comme exemples de séquences d'acides aminés dérivées des séquences SEQ ID NO : 2 à 6, on peut citer des séquences dans lesquelles une glycine est insérée en deuxième 20 position des séquences SEQ ID NO : 2 à 6, juste après la méthionine N-terminale. Généralement, le pourcentage d'identité entre une séquence d'acides aminés de référence et une séquence d'acide aminés dérivée de cette séquence est d'au moins 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%. Dans le cadre de la présente invention, lorsqu'une première séquence d'acides aminés est 25 identique à X% à une seconde séquence d'acides aminés, cela signifie que ce X% représente le nombre d'acides aminés de la première séquence qui sont identiques aux acides aminés correspondants de la seconde séquence, après alignement optimal des deux séquences, par rapport à la longueur totale de la seconde séquence d'acides aminés. Les deux séquences sont alignées de façon optimale lorsque la valeur de X% est maximale. L'alignement des séquences et 30 la détermination du pourcentage d'identité peuvent être faits manuellement ou de façon automatique en utilisant l'algorithme de Needleman et Wunsch (Needleman et Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48 :443-453), en utilisant comme paramètres, la matrice de comparaison Blossum 62 de 3050448 13 Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 : 10915-10919, une pénalité de 8 lorsqu'il y a un trou, et une pénalité de 2 lorsqu'il y a une différence de longueur entre les deux séquences. Lorsqu'un acide aminé est substitué par un autre acide aminé, on le remplace de préférence par un acide aminé du même groupe ou du même sous-groupe, comme indiqué dans le tableau ci- 5 dessous (substitutions dites « conservatives »). Tableau 1. Classification des acides aminés en fonction de leur groupe et de leur sous-groupe Groupe d'acides aminés Sous-groupe d'acides aminés Acides aminés Chaînes latérales non Hydrophobes M, A, V, L, I polaires Résidus qui influent sur G, P l'orientation de la chaîne peptidique Aromatiques F, W Chaînes latérales polaires non chargées Hydrophiles neutres S, T, N, Q, C Aromatique Y Chaînes latérales polaires chargées Acides D, E Basiques K, R, H Pour le choix des substitutions, il est également possible d'utiliser par exemple l'index 10 d'hydropathie des acides aminés, qui prend en compte leurs propriétés d'hydrophobicité. Ces index sont les suivants (du plus hydrophobe au plus hydrophile) : isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phénylalanine (+2.8); cystéine (+2.5); méthionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (0.4); thréonine (-0.7); sérine (-0.8); tryptophane (-0.9); tyrosine (-1.3); proline (-1.6); histidine (3.2); glutamate (-3.5); glutamine (-3.5); aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9); et arginine 15 (-4.5). L'importance de ces index hydropathiques par rapport à l'activité d'une protéine est connue de l'homme du métier (Kyte et Coll., J. Mol. Biol. (1982) ; 157: 105-31). De préférence, on choisira une substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé d'index d'hydropathie proche (écart entre les index d'hydropathie inférieur à 2, de préférence inférieur à 1, et de manière encore plus préférée inférieur à 0.5). 20 Comme exemples de séquences dérivées de la SEQ ID NO: 1, on cite des séquences d'acides aminés identiques à la séquence SEQ ID NO : 1, mais dans lesquelles les extrémités N-terminales comportent des délétions de 1 à 3 acides aminés, puisque ces 3 premiers acides aminés ne sont pas impliqués dans l'interaction avec la protéine interne. D'autre part, ces séquences dérivées 3050448 14 conservent bien leur capacité à s'auto-assembler et les RMSD des domaines P et A sont inférieurs à 5 Â par rapport aux domaines P et A de la SEQ ID NO : 1 de T. maritima, en utilisant le logiciel j FATCAT. En particulier, la séquence d'acides aminés du monomère à partir de laquelle a été inséré un 5 peptide selon l'invention est une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 1 dans laquelle les 3 premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale ont été délétés, et qui comprend la substitution C200S. Ainsi, selon un aspect particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline à partir de laquelle on insère un peptide selon l'invention est la séquence : 10 MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSL PLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGSTPKD LLEA1 VRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEESLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLIL GQDLS IGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO : 7), ou une séquence dérivée ayant une identité de séquence d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% par 15 rapport à la séquence SEQ ID NO : 7. Lorsque la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline correspond à la séquence de T. maritima (SEQ ID NO : 1) ou à une séquence dérivée, l'insertion du peptide a lieu de préférence entre deux acides aminés consécutifs de la séquence K141 1142 E143 C144 G145 5146, ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante 20 après alignement des deux séquences monomériques. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'insertion du peptide a lieu entre les acides aminés K141 et 1142, ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre les acides aminés de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. Lorsque la séquence d'acides aminés est la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée, l'insertion du peptide a lieu de préférence entre deux acides aminés 25 consécutifs de la séquence K138 1139 [140 C141 G142 5143 ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. Selon un mode de réalisation particulier, l'insertion du peptide a lieu entre les acides aminés K138 et 113g, ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre les acides aminés de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. 30 Typiquement, le nombre total d'acides aminés de la séquence du peptide inséré, incluant éventuellement un ou plusieurs bras de liaison, est compris entre 4 et 55 (bornes incluses), en particulier entre 9 et 55 (bornes incluses), plus particulièrement entre 13 et 55 (bornes incluses), 3050448 15 ou entre 4 et 28 (bornes incluses), en particulier entre 9 et 28 (bornes incluses), plus particulièrement entre 13 et 28 (bornes incluses), ou entre 4 et 13 (bornes incluses), en particulier entre 9 et 13 (bornes incluses). Ainsi, le nombre total d'acides aminés insérés peut donc être notamment de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 5 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, ou de 55. Le peptide inséré peut éventuellement contenir une ou plusieurs chaînes saccharidiques ou lipidiques. L'insertion du peptide, se faisant typiquement au moyen de liaisons peptidiques, entraine donc un 10 allongement de la séquence du monomère d'encapsuline du nombre d'acides aminés contenus dans la séquence dudit peptide, cet allongement étant de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55 acides aminés. Dans un souci de clarté, tout monomère d'encapsuline qui, après insertion du peptide selon 15 l'invention, aurait une séquence d'acides aminés qui serait identique à une quelconque séquence d'encapsuline déjà décrite, en particulier à l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 6 serait purement fortuite et devrait être exclu de l'objet de l'invention. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence du peptide inséré comprend ou consiste en la séquence EVETPX6RX8X9 (SEQ ID NO : 8), où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 20 est E ou G. Plus particulièrement, la séquence du peptide inséré peut comprendre ou consister en une séquence choisie dans l'ensemble des séquences suivantes : EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), EVETPIRNG (SEQ ID NO : 10), EVETPIRSE (SEQ ID NO : 11), EVETPIRSG (SEQ ID NO : 12), EVETPIRTE (SEQ ID NO : 13), EVETPIRTG (SEQ ID NO : 14), EVETPIRRE (SEQ ID NO : 15), EVETPIRRG (SEQ ID NO : 16), EVETPTRNE (SEQ ID NO : 17), EVETPTRNG (SEQ ID NO : 18), EVETPTRSE (SEQ ID NO : 19), 25 EVETPTRSG (SEQ ID NO: 20), EVETPTRTE (SEQ ID NO: 21), EVETPTRTG (SEQ ID NO: 22), EVETPTRRE (SEQ ID NO : 23), EVETPTRRG (SEQ ID NO : 24). Selon un mode de réalisation très particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés insérée comprend ou consiste en la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). On peut également insérer une séquence comprenant ou consistant en la séquence des 24 acides aminés N-terminaux de la protéine M2 provenant d'un 30 virus grippal de type H1N1, telle que MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID NO : 25) ou une séquence répétée de celle-ci, avec éventuellement un bras de liaison entre les deux séquences, comme par exemple la séquence 3050448 16 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID NO :26 ) qui comporte le motif GGG entre les deux séquences répétées de MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID NO : 25). La séquence du peptide inséré peut comporter en outre un bras de liaison (linker) en N-terminal 5 et/ou C-terminal. Les bras de liaison sont des séquences de quelques acides aminés, bien connues de l'homme du métier, et choisies en fonction du degré de flexibilité recherché. On peut par exemple citer les bras de liaison de type Gly, Gly/Ser, ou encore Gly/Ala (Reddy Chichili VP et Coll., Protein Sci. (2013) ; 22(2) : 153-167). Les bras de liaison situés en N-terminal et C-terminal peuvent être identiques ou différents entre eux. Selon un mode de réalisation particulier, les bras 10 de liaison situés en N-terminal et en C-terminal consistent en la séquence GG. Dans ce cas, la séquence du peptide inséré est par exemple la séquence GGEVETPIRNEGG (SEQ ID NO : 27), la séquence GGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGG (SEQ ID NO : 28) ou la séquence GGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGG (SEQ ID NO : 29). Selon un aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la 15 séquence SEQ ID NO : 27 est la séquence : MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSL PLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKGGEVETPIR NEG GIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEESLRGGKIITTPRIED ALVVSE RGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO : 30). 20 Selon un autre aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SEQ ID NO : 28 est la séquence : MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSL PLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKGGMSLLTEV ETP IRNEWGCRCNGSSDGGIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEE SLR 25 GGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO: 31). Selon encore un autre aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SEQ ID NO : 29 est la séquence : M EFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSL 30 PLIELRATFTLDLWELDN LERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVI FRGCEKSGVKGLLSFEERKGGMSLLTEVETP I RNEWGCRCNGSSDGGGMSLLTEVETPIRN EWGCRCNGSSDGGI ECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTL 3050448 17 VINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEESLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRL FITE TFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO : 32). Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence du peptide inséré comprend ou 5 consiste en la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33 ). Selon un mode de réalisation particulier, cette séquence comprend en N-ter et en C-ter deux bras de liaisons GG, si bien que la séquence du peptide inséré est la séquence GGDAEFRHDSGGG (SEQ ID NO : 34). Selon un autre aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SED ID NO : 34 est la séquence : 10 MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSL PLIELRATFTLDLWELDN LERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVI FRGCEKSGVKGLLSFEERKGGDAEFRH DSG GGIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEESLRGGKIITTPRIE DALVV SERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO : 35). La nanoparticule selon l'invention comprend également une protéine interne, c'est-à-dire une 15 protéine qui se trouve sur la face interne de la surface de la nanoparticule ou à l'intérieur du nano-compartiment, sans être liée à sa surface au moyen d'une liaison covalente. Dans le cas de la présente invention, le terme de « protéine interne » englobe à la fois un oligopeptide, un peptide, un polypeptide ou une protéine, pouvant contenir éventuellement une ou plusieurs chaînes saccharidiques ou lipidiques. Cette protéine interne peut être sous forme monomérique 20 ou multimérique. Toute protéine capable de se lier par son extrémité N ou C-terminale, au moyen de liaisons non covalentes, c'est-à-dire au moyen d'interactions ioniques et/ou hydrophobes, à la cavité interne du domaine P d'un monomère d'encapsuline, est considérée comme une protéine interne, au sens de la présente invention, puisqu'elle se trouve à l'intérieur de la nanoparticule. L'extrémité N ou C-terminale de la protéine interne doit contenir un nombre suffisant d'acides 25 aminés capables d'interagir au moyen d'interactions ioniques et/ou hydrophobes, avec les acides aminés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline. Sutter et Coll puis Radford ont montré en effet qu'une vingtaine d'acides aminés de la cavité interne du domaine P interagissent avec les acides aminés de l'extrémité C-terminale d'une protéine appartenant à l'une des familles suivantes : iron-dependent peroxidases (comprenant les Dyp), ferritin-like 30 protéines (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like protéines, hemerythrin-like protéines, rubrerythrin-like protéines. Spatialement, cette vingtaine d'acides aminés se trouvent à 5 Â ou moins de l'extrémité C-terminale de la protéine interne et sont bien conservés indépendamment 3050448 18 de l'origine du monomère d'encapsuline. De façon corollaire, il a été montré que les séquences des acides aminés qui se situent au niveau des extrémités C- terminales des protéines appartenant aux familles ci-dessus étaient également bien conservées. Radford a identifié un motif de 10 acides aminés (X1GSLX5X6GX8LX10, SEQ ID NO : 36, dans laquelle X1 est D ou K, X5 est T, 5 G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et X10 est K ou Y) dans le domaine C-terminal de ces protéines, comme étant étroitement impliqués dans les interactions avec la vingtaine d'acides aminés conservés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline (tel qu'explicité dans la Figure 2.16 du Rapport de thèse de Radford, 2015), à partir duquel a été défini un motif consensus de 15 acides aminés ayant pour séquence : X1APX4DGSLX9X10GSLKG (SEQ ID NO : 37) 10 (X1 et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et X10 est I ou V) retrouvé dans la majorité des séquences d'acides aminés C-terminales des protéines appartenant à l'une des familles suivantes : iron-dependent peroxidases (comprenant les Dyp), ferritin-like protéines (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like protéines, hemerythrin-like protéines, rubrerythrin-like protéines, interagissant avec les monomères d'encapsuline. D'autre part, Sutter 15 et Coll ont identifié un motif minimal GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38) se trouvant dans la séquence d'acides aminés de l'extrémité C-terminale d'une protéine appartenant à la famille des ferritinlike protéines (Flp), qui interagit avec les acides aminés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline provenant de T. maritima. Selon un mode de réalisation préféré, la séquence d'acides aminés de la partie C-terminale ou N- 20 terminale, respectivement, de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel : I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), 25 M est la séquence XiGSLX5X6GX8LX10 (SEQ ID NO : 36), dans laquelle X1 est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et X10 est K ou Y, la séquence X1APX4DGSLX9X10GSLKG (SEQ ID NO : 37), dans laquelle X1 et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et X10 est I ou V, ou la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38), et 30 T désigne une séquence d'acides aminés de terminaison dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). 3050448 19 Hormis les protéines appartenant à l'une des familles suivantes : iron-dependent peroxidases (comprenant les Dyp), ferritin-like protéines (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like protéines, hemerythrin-like protéines, rubrerythrin-like protéines, qui peuvent naturellement se terminer 5 par un enchaînement du type I-M-T au niveau de leur extrémité C-terminale, l'enchainement du type I-M-T est généralement fusionné à l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt. Selon la structure de la protéine d'intérêt et selon que l'enchainement I-M-T est fusionné respectivement à l'extrémité C-terminale ou N-terminale de la protéine d'intérêt, la séquence I ou la séquence T, respectivement, peut avantageusement commencer ou se terminer, 10 respectivement, par une séquence d'acides aminés exerçant un rôle de bras de liaison, pour faciliter l'insertion de la protéine dans la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline. Généralement, le nombre total d'acides aminés de l'enchainement I-M-T n'excède pas 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, ou 60 acides aminés. 15 Les acides aminés en positions 1 et 4 de la séquence SEQ ID NO: 37 n'ayant pas de rôle déterminant, ils peuvent être n'importe quel acide aminé choisi parmi les 20 acides aminés naturels ou même être un acide aminé modifié. Le choix des acides aminés en position 1 et 4 peut servir éventuellement à ajuster plus finement les interactions de la séquence SEQ ID NO : 37 avec les acides aminés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline. 20 Lorsque le monomère d'encapsuline servant à l'insertion de la séquence peptidique selon l'invention provient de T. Maritima, notamment lorsque sa séquence d'acides aminés est la séquence SEQ ID NO : 1 ou la SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée, notamment lorsque le degré d'identité de la séquence dérivée vis-à-vis de la séquence ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 7 est d'au moins 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, la partie C-terminale ou N- 25 terminale, respectivement, de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 à 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38), la séquence X1GSLX5X6GX8LX10 (SEQ ID 30 NO : 36), dans laquelle X1 est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et X10 est K ou Y, ou la séquence X1APX4DGSLX9X10GSLKG (SEQ ID NO : 37), dans laquelle X1 et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et X10 est I ou V, et T désigne une séquence d'acides aminés de terminaison dans laquelle le nombre total d'acides aminés est 3050448 20 compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). De façon préférée, lorsque M est la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38), I est la séquence GGSENT, ou, de façon encore plus préférée, la séquence IEEETSGGSENT, de sorte que l'enchaînement I-M est la séquence 5 GGSENTGGDLGIRK (SEQ ID NO : 39) ou la séquence IEEETSGGSENTGGDLGIRK (SEQ ID NO: 40). Dans une variante, l'enchaînement 1-M-T est la séquence GGSENTGGDLGIRKL (SEQ ID NO : 41), ou, de façon encore plus préférée, la séquence IEEETSGGSENTGGDLGIRKL (SEQ ID NO : 42). Typiquement, la protéine interne selon l'invention est une protéine de fusion (c'est-à-dire une protéine artificielle) obtenue par recombinaison génétique, selon laquelle l'extrémité C-terminale 10 ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à l'enchainement I-M-T. La protéine de fusion se présente donc sous la forme NH2-I-M-T-Pr-COOH ou NH2-Pr-I-M-T-COOH dans laquelle Pr désigne la protéine d'intérêt. A titre d'exemple, la protéine d'intérêt est une enzyme, telle que la Glutathion S-transférase (GST), plus particulièrement la Glutathion S-transférase de Schistosoma japonicum, ou une 15 protéine fluorescente, telle que l'eGFP. L'invention concerne également un vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline, dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la 20 séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet [3, et une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchainement du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes 25 incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). 30 Ce vecteur bicistronique est préférentiellement un vecteur d'expression. Le vecteur peut être, par exemple, un plasmide, un phage, un virus, un baculovirus, un cosmide, un phagemide, un transposon, un chromosome artificiel bactérien ou un chromosome artificiel de levure. 3050448 21 Classiquement, le vecteur est un plasmide. Il contient les éléments nécessaires qui permettent la transcription et/ou la traduction des acides nucléiques d'intérêt en protéines. Il inclut au minimum un promoteur inductible ou constitutif approprié à la cellule hôte, un système de sélection (antibiotique, complémentation..), une séquence SD/kozac, un ou plusieurs sites de 5 fixation des ribosomes, une séquence d'arrêt de la transcription, un codon stop et un codon initiateur. Classiquement, outre les séquences d'acide nucléique d'intérêt, on retrouve dans le plasmide une ou plusieurs origines de réplication (ori), un ou plusieurs promoteurs, un ou plusieurs sites de liaison aux ribosomes (RBS), un ou plusieurs codons « start », un ou plusieurs codons « stop », une ou plusieurs séquences de terminaison, un ou plusieurs marqueurs de 10 sélection, tels que des gènes de résistance à un antibiotique, et/ou un ou plusieurs sites de restriction. Des exemples de plasmides pouvant être utilisés pour insérer les séquences d'acide nucléique d'intérêt, incluent les plasmides pKK (Clontech), pUC, pET (Novagen), pRSET, pREP (Invitrogen), pMAL (New England Biolabs), pVAX1 (Life Technology). Les séquences d'acides nucléiques codant respectivement pour la protéine monomérique 15 d'encapsuline, dans laquelle un peptide a été inséré, et pour la protéine interne, peuvent être sous le contrôle d'un seul et même promoteur. Plus spécifiquement, le vecteur d'expression bicistronique selon l'invention peut être un plasmide comprenant : un promoteur opérationnel approprié à la cellule hôte, un premier site de fixation aux ribosomes (RBS), un codon d'initiation, une première séquence d'acide nucléique codant pour 20 une séquence d'acides aminés d'un monomère d'encapsuline, telle que la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ou 7, ou codant pour une séquence d'acides aminés dérivée de cette séquence, dans laquelle a été inséré un peptide, ainsi qu'un codon stop, un deuxième site de fixation aux ribosomes, un deuxième codon d'initiation, une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une seconde protéine (protéine interne) dont l'extrémité C-terminale ou 25 N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés de type I-M-T, et un codon stop. Ce vecteur d'expression bicistronique, après introduction dans une cellule hôte, permet l'expression simultanée dans une même cellule, des protéines monomériques d'encapsuline selon l'invention et de la protéine interne, ce qui facilite l'encapsulation de la protéine interne dans la 30 nanoparticule. Le vecteur d'expression peut être également un vecteur polycistronique. Selon une première alternative, il comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour une protéine 3050448 22 monomérique d'encapsuline selon l'invention et deux séquences d'acides nucléiques ou plus, codant pour des protéines internes différentes que l'on souhaite encapsuler, dans lesquelles les extrémités C-terminales ou N-terminales, respectivement, se terminent ou commencent, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, tel que décrit 5 précédemment. Selon une deuxième alternative, le vecteur polycistronique comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour une première protéine monomérique d'encapsuline, une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une seconde protéine monomérique d'encapsuline se distinguant de la première protéine en ce qu'un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, en particulier dans celui 10 constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet [3, et une ou plusieurs séquences codant pour une ou plusieurs protéines internes que l'on souhaite encapsuler, les extrémités C-terminales ou N-terminales, respectivement, de ces protéines se terminant ou commençant, respectivement, par un 15 enchaînement d'acides aminés du type I-M-T. Ce type de vecteur permet d'obtenir des nanoparticules dont la surface est constituée d'un mélange de deux ensembles de monomères ; un premier ensemble constitué de monomères d'encapsuline tous identiques entre eux et un deuxième ensemble constitué de monomères d'encapsuline, également tous identiques entre eux, mais se distinguant des monomères du premier ensemble par l'insertion dans leurs 20 séquences d'acides aminés de la séquence peptidique additionnelle au niveau du domaine A des monomères d'encapsuline. Ces nanoparticules contiennent en outre une ou plusieurs protéines internes. L'invention a également pour objet une cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique ou polycistronique tels que décrits précédemment. 25 L'invention a encore pour objet une cellule hôte comprenant deux ou plusieurs vecteurs d'expression, permettant de produire les nanoparticules de l'invention. A titre d'exemple, on peut citer une cellule hôte contenant deux vecteurs, le premier vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, en particulier dans celui 30 constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet (3, et le deuxième vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, 3050448 23 respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID 5 NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Parmi les cellules procaryotes convenant à l'invention, on cite les eubactéries, telles que les bactéries Gram+ ou 10 Gram-, les agrobacterium, et les archéobactéries. Parmi les bactéries Gram-, on cite comme hôtes de choix les souches BL21(DE3), JM109, FB850, Shuffle, Lemo21, rosetta, K12 et origami d'E. coli. Parmi les bactéries Gram+, on cite comme hôte de choix la souche RIK 1285 de Bacillus subtilis. Parmi les cellules eucaryotes, on cite comme exemples des cellules de mammifères telles que les cellules d'une lignée CHO, des cellules d'insectes (par exemple, les cellules de la lignée 15 Sf9), des cellules de levures provenant de Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris ainsi que toute autre cellule eucaryote unicellulaire, et des cellules de plantes. La nature du vecteur d'expression est choisie en fonction du type de cellule hôte. Les méthodes utilisées pour introduire un ou plusieurs vecteur(s) d'expression selon l'invention dans des cellules hôtes sont bien connues de l'homme de métier. Lorsque le vecteur est par exemple un plasmide, 20 un cosmide, un chromosome artificiel de bactérie ou de levure, on peut par exemple utiliser les méthodes d'électroporation, de transfection chimique ou de choc thermique. Lorsque le vecteur est infectieux, il est introduit par infection et/ou transduction des cellules hôtes, comme par exemple en infectant des cellules Sf9 par le baculovirus, des cellules de plantes avec le virus de la mosaïque du tabac (VMT), ou des bactéries avec des bactériophages. Selon un aspect particulier, 25 la souche BL21(DE3) d'E. coli est transformée par choc thermique avec un vecteur d'expression bicistronique tel que décrit ci-dessus. L'invention a également pour objet un procédé de production de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, le site d'insertion du 30 peptide étant situé dans un site externe du domaine A, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides 3050448 24 aminés du premier feuillet [3, et comprenant en outre une ou des protéine(s) interne(s), selon lequel : - On cultive des cellules hôtes telles que décrites précédemment, dans des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la ou des protéine(s) 5 interne(s) ; et - On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne, résultant de l'auto-assemblage des monomères d'encapsuline. Les nanoparticules peuvent être récupérées à partir du culot cellulaire ou du surnageant, en mettant en oeuvre des moyens classiques tels que la centrifugation, la clarification, la 10 microfiltration, ou la nanofiltration. Selon un mode de réalisation, lorsque la cellule hôte est une bactérie, le vecteur peut contenir un opéron inductible (par exemple, un opéron lactose (Lacl) inductible par l'ajout d'Isopropyl (3-D-1- thiogalactopyranoside, ou IPTG). Selon un autre mode de réalisation, lorsque les cellules hôtes sont des cellules eucaryotes, par 15 exemple des cellules de mammifères, d'insectes ou de levures, et si la séquence du monomère d'encapsuline, dans laquelle a été inséré un peptide, selon l'invention, contient un ou plusieurs sites potentiels de glycosylation (notamment, N-glycosylation, 0-glycosylation ou fucosylation), un ou plusieurs acides aminés au niveau d'un ou plusieurs de ces sites peuvent être mutés, de façon à ce que le monomère d'encapsuline ne soit plus glycosylée au niveau du(des) site(s) 20 muté(s). Dans encore un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lequel : - On clarifie un broyat de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline; 25 - On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ; - On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline, de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ; - On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes contenus dans 30 l'éluat au moyen d'une solution biphasique; 3050448 25 - On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et - On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline. 5 Les inventeurs ont montré de façon surprenante que ce procédé de purification, réalisable à l'échelle industrielle, permettait d'obtenir une solution contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, avec un degré de pureté généralement d'au moins 85 %. Selon un mode de réalisation du procédé de purification, les nanoparticules comprenant un 10 assemblage de monomères d'encapsuline ont été produites par des bactéries Gram + ou Gram -, notamment par E.coli, et plus particulièrement par la souche BL21(DE3) d'E. coli. Les méthodes pour obtenir un broyat de cellules à partir d'un culot ou d'une suspension cellulaire et les méthodes de clarification sont bien connues de l'homme du métier (voir, par exemple : Effio & Hubbuch, Biotechnol. J (2015); 10(5) : 715-727). Le broyat de cellules peut par exemple être 15 obtenu par des techniques de broyage, de lyse enzymatique, de casse mécanique ou de choc osmotique. Dans l'étape de chromatographie de type multimodale, la séparation se fait en combinant au moins deux modes différents, sélectionnés dans l'ensemble des modes suivants : exclusion de taille, affinité, échange d'ions, interaction hydrophobe, ou encore des interactions hydrogène ou 20 7I-7t, avec un seul et même support de chromatographie. Avantageusement, le support de chromatographie multimodale est choisi de telle sorte que la séparation se fait en combinant les modes d'exclusion de taille, d'interactions hydrophobes et basés sur la charge. La résine multimodale CaptoTM Core 700 (GE Healthcare) convient à cet usage, mais d'autres résines pourraient être utilisées. Selon un mode de réalisation, la résine multimodale est utilisée pour 25 garnir une colonne. Les dimensions et le nombre de colonnes, ainsi que les conditions expérimentales à utiliser, peuvent être optimisées par l'homme du métier. L'étape de séparation de phase est réalisée au moyen d'une solution biphasique, par exemple à base de détergent et d'une solution aqueuse, ou à base de polymère et d'une solution aqueuse (Effio & Hubbuch, Biotechnol. J (2015); 10(5) : 715-727) ; la solution aqueuse peut par exemple 30 être une solution saline de type tampon phosphate. Le détergent peut être non ionique ou ionique. Il doit avoir une température de séparation de phase suffisamment basse, de façon à ne pas dénaturer les protéines. Selon un mode de réalisation particulier, le détergent utilisé est non 3050448 26 ionique, et plus particulièrement le Triton X-114. Le procédé de purification selon l'invention peut comporter une, deux, trois, ou plus, étapes de séparation de phase. Dans le cas où la cellule hôte utilisée pour produire l'encapsuline est E.coli, cette étape de séparation de phase est particulièrement utile pour éliminer un contaminant hydrophobe majoritaire, la protéine OmpF 5 (Outer membrane protein F). Cette étape permet aussi de diminuer le taux d'endotoxines bactériennes. Parmi les méthodes convenant à l'étape de polissage, on peut citer la chromatographie par exclusion de taille (appelée également filtration sur gel), la filtration sur membrane, la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie multimodale, ou toute autre méthode 10 pouvant être sélectionnée par l'homme du métier. L'utilisation d'une colonne de filtration sur gel Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare) est particulièrement adaptée pour cette étape de polissage. Cette étape permet d'isoler la fraction purifiée correspondant aux nanoparticules d'encapsuline. La solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères 15 d'encapsuline, peut être concentrée par des méthodes connues de l'homme du métier. Le procédé de purification est également utilisable pour purifier des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, dans lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, et comprenant éventuellement une protéine interne. 20 Ce procédé de purification peut également être utilisé pour purifier des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, dans lesquelles un peptide comprenant la séquence EVETPX6RX8X9 (SEQ ID NO : 8) où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G, en particulier la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), ou comprenant la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO: 33), a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un 25 desdits monomères d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne. L'invention a également pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A, en 30 particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée 3050448 27 contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet (3 et comprenant en outre une protéine interne, et telles que décrites dans leurs différents modes de réalisation. Avantageusement, lorsque le peptide inséré et/ou la protéine interne provien(nen)t d'un agent pathogène ou représente(nt) une cible immunothérapeutique potentielle, la composition 5 contenant les nanoparticules selon l'invention induit, après administration à un individu, une réponse immune spécifique à l'encontre du peptide inséré et/ou de la protéine interne. Par composition immunogène (ou immunogénique) au sens de la présente invention, on entend une composition capable d'induire après administration chez un individu une réponse humorale (c'est-à-dire médiée par les anticorps) et/ou cellulaire (c'est-à-dire médiée par les lymphocytes T) 10 spécifique(s) dirigée(s) contre au moins le peptide qui a été inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline et/ou contre la protéine qui se trouve à l'intérieur des nanoparticules. Typiquement, la composition immunogène induit une réponse humorale spécifique à l'encontre du peptide qui a été inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline, et pas contre l'encapsuline elle-même. 15 Le terme d'individu désigne aussi bien un sujet sain qu'un sujet malade et concerne aussi bien l'homme que l'animal. La réponse immunitaire (ou immune) peut inclure un ou plusieurs des effets suivants : la production d'anticorps spécifiques (par exemple, IgA, IgG, IgM) par les lymphocytes B ; et/ou l'activation de lymphocytes T régulateurs, cytotoxiques ou auxiliaires, et/ou des lymphocytes T 20 dirigés spécifiquement contre une protéine présente dans la composition immunogène. Elle peut inclure également l'activation des cellules impliquées dans le développement de l'immunité innée, telles que les monocytes/macrophages, les neutrophiles, les éosinophiles, les cellules dendritiques et plus généralement les cellules présentatrices de l'antigène. Bien que la composition immunogène selon l'invention soit capable en tant que telle d'induire 25 une réponse humorale spécifique à l'encontre du peptide qui a été inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline, on peut renforcer la réponse immune spécifique à l'encontre de ce peptide en y ajoutant un adjuvant. Par adjuvant, on entend toute substance capable d'augmenter la réponse immune spécifique à l'encontre du peptide inséré et/ou de la protéine interne, qu'elle soit d'ordre humorale et/ou cellulaire. A titre d'exemple, on cite les adjuvants à base d'émulsions, 30 telles que les émulsions huile dans eau ou eau dans huile, les sels de calcium ou d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium et/ou le phosphate d'aluminium, les agonistes du TLR ou les cytokines. Le(s) adjuvant(s) peu(ven)t être choisi(s) en fonction de l'orientation de la réponse 3050448 28 immune spécifique que l'on souhaite renforcer. Il peut s'agir notamment d'un adjuvant de type Th1 ou de type Th2. La composition immunogène peut être administrée par n'importe quelle voie utilisée pour induire une réponse immune à un antigène, incluant notamment la voie intradermique, sous-cutanée, 5 intramusculaire, parentérale, mucosale (par exemple, nasale) ou trans-cutanée. Lorsque le peptide inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline comprend la séquence EVETPX6RX8X9 (SEQ ID NO : 8) où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G, ou plus particulièrement la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), la composition immunogène selon l'invention induit une réponse immune humorale et/ou cellulaire spécifique(s) à l'encontre de la 10 protéine M2 du virus grippal, et plus globalement à l'encontre du virus grippal de type A, qu'il soit d'origine animale ou humaine, notamment contre le virus grippal de type A H1N1, puisque cette séquence comprend un épitope du domaine extracellulaire de la protéine M2 du virus grippal qui est un antigène universel de la grippe de type A (Neirynck S et Coll, Nature Medicine (1999) ; 5(10) :1157-1163 ; Fiers W et Coll., Virus Res (2004) ; 103 (1-2) :173-176 ; Deng L et Coll, Vaccines 15 (2015) ; 3 :105-136). Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la réponse immune est dirigée contre le virus grippal. Dans un aspect particulier, l'invention a pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des 20 monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p. L'invention a également pour objet un monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré, dans sa 25 séquence d'acides aminés, un peptide comprenant la séquence EVETPX6RX8X9 (SEQ ID NO : 8) où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G, plus particulièrement la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), ou un peptide comprenant la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33). Selon un mode de réalisation de cet objet, le peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés 30 constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p. 3050448 29 Selon un mode de réalisation très particulier, la séquence du monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré un peptide selon l'invention est la séquence SEQ ID NO : 30, la séquence SEQ ID NO : 31, ou la séquence SEQ ID NO : 32. L'invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique codant pour : 5 1. une protéine monomérique d'encapsuline, telle que celle correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 ou 7, dans laquelle a été insérée une séquence peptidique comprenant la séquence EVETPX6RX8X9 (SEQ ID NO : 8) où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G, plus particulièrement la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), ou une séquence peptidique comprenant la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33), 10 ou pour 2. une protéine monomérique d'encapsuline ayant la séquence SEQ ID NO: 30, la séquence ID NO: 31, ou la séquence ID NO: 32, ou une protéine dérivée de l'une de ces séquences. La séquence d'acide nucléique objet de l'invention peut également être un vecteur comprenant 15 l'une des séquences d'acides nucléiques telles que définies en 1. et 2. Les séquences d'acides nucléiques codant pour l'une des protéines monomériques d'encapsuline peuvent être des ADN ou des ARN, simple brin ou double brin. Elles peuvent être obtenues au moyen de procédures de clonage classiques, comprenant par exemple l'excision de ladite séquence puis son isolement, par exemple sur gel d'agarose. 20 Selon un mode de réalisation très spécifique, la séquence d'acide nucléique codant pour une protéine monomérique d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 43 : ATGGAATTTCTGAAACGCAGCTTTGCGCCGCTGACCGAAAAACAGTGGCAGGAAATTGATAACCGCGCGC GCGAAATTTTTAAAACCCAACTGTATGGCCGCAAATTTGTGGATGTGGAAGGCCCGTATGGCTGGGAATAT GCGGCGCATCCGCTGGGCGAAGTGGAAGTGCTGAGCGATGAAAACGAAGTGGTGAAATGGGGCCTGCGC 25 AAAAGCCTGCCGCTGATTGAACTGCGCGCGACCTTTACCCTGGATCTGTGGGAACTGGATAACCTGGAACG CGGCAAACCGAACGTGGATCTGAGCAGCCTGGAAGAAACCGTGCGCAAAGTGGCGGAATTTGAAGATGA AGTGATTTTTCGCGGCTGCGAAAAAAGCGGCGTGAAAGGCCTGCTGAGCTTTGAAGAACGCAAAGGAGG CGAAGTGGAGACTCCGATTCGCAACGAAGGTGGCATTGAATGCGGCAGCACCCCGAAGGATCTGCTGGAA GCGATTGTGCGCGCGCTGAGCATTTTTAGCAAAGATGGCATTGAAGGCCCGTATACCCTGGTGATTAACAC 30 CGATCGCTGGATTAACTTTCTGAAAGAAGAAGCGGGCCATTATCCGCTGGAAAAACGTGTGGAAGAAAGC CTGCGCGGCGGCAAAATTATTACCACCCCGCGCATTGAAGATGCGCTGGTGGTGAGCGAACGCGGCGGCG 3050448 30 ATTTTAAACTGATTCTGGGCCAGGATCTGAGCATTGGCTATGAAGATCGCGAAAAAGATGCGGTGCGCCT GTTTATTACCGAAACCTTTACCTTTCAGGTGGTGAACCCGGAAGCGCTGATTCTGCTGAAATTT, ou une séquence d'acide nucléique dérivée de celle-ci comprenant une séquence d'acide nucléique ayant une identité de séquence d'au moins 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 5 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% avec la SEQ ID NO : 43. La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être produite par des technologies d'ADN recombinant, des méthodes synthétiques, ou une combinaison de ces méthodes, bien connues de l'homme du métier. Les codons de la séquence d'acide nucléique d'intérêt peuvent aussi être optimisés de façon à 10 permettre une meilleure transcription et/ou traduction dans la cellule hôte. L'optimisation des codons dans une séquence d'ADN ou d'ARN, est basée sur l'existence de la dégénérescence du code génétique, et consiste par exemple à remplacer un ou plusieurs codons par des codons plus fréquemment utilisés par la cellule hôte, comme décrit dans US 2004/0209241, et/ou à optimiser le ratio du contenu en G/C, comme décrit dans US 2011/0269950. L'optimisation des codons des 15 séquences d'acides nucléiques est mise en oeuvre de façon à ne pas modifier de façon significative la séquence des acides aminés, et donc en utilisant préférentiellement des codons synonymes (c'est-à-dire, codant pour le même acide aminé). On peut également introduire des mutations dans la séquence d'acide nucléique selon l'invention, de manière par exemple à supprimer des sites de glycosylation (N-glycosylation, 0-glycosylation 20 ou fucosylation) éventuels. Le vecteur peut être, par exemple, un plasmide, un phage, un virus, un baculovirus, un cosmide, un phagemide, un transposon, un chromosome artificiel bactérien ou un chromosome artificiel de levure. Classiquement, le vecteur est un plasmide. Il contient les éléments nécessaires qui permettent la transcription et/ou la traduction des acides nucléiques d'intérêt en protéines. Il 25 inclut au minimum un promoteur inductible ou constitutif approprié à la cellule hôte, un système de sélection (antibiotique, complémentation..), une séquence SD/kozac, un ou plusieurs sites de fixation des ribosomes, une séquence d'arrêt de la transcription, un codon stop et un codon initiateur. Classiquement, outre les séquences d'acide nucléique d'intérêt, on retrouve dans le plasmide une ou plusieurs origines de réplication (ori), un ou plusieurs promoteurs, un ou 30 plusieurs sites de liaison aux ribosomes (RBS), un ou plusieurs codons « start », un ou plusieurs codons « stop », une ou plusieurs séquences de terminaison, un ou plusieurs marqueurs de sélection, tels que des gènes de résistance à un antibiotique, et/ou un ou plusieurs sites de 3050448 31 restriction. Des exemples de plasmides pouvant être utilisés pour insérer les séquences d'acide nucléique d'intérêt, incluent les plasmides pKK (Clontech), pUC, pET (Novagen), pRSET, pREP (Invitrogen), pMAL (New England Biolabs), pVAX1 (Life Technology). 5 D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif mais nullement limitatif. [BREVE DESCRIPTION DES FIGURES] 10 Figure 1 : Structure du monomère d'encapsuline de A) Thermotoga maritima (PDB ID : 3DKT) et de B) Pyrococcus furiosus (PDB ID : 2E0Z). Le site d'insertion externe correspondant au premier feuillet (3 du domaine A et à la structure dépliée contiguë au premier feuillet (3 est présenté en noir sur les structures et cerclé de pointillés. - Figure 2 : Représentation schématique du plasmide utilisé pour le clonage (dérivé du 15 plasmide pET28b). Figure 3: Analyse SDS-PAGE après les différentes étapes-clés du protocole de purification pour chacune des nanoparticules XIP1, XIP2 et XIP3. (M) marqueur de poids moléculaire (en kDa) ; (1) fraction totale ; (2a) fraction soluble ; (2b) fraction soluble filtrée ; (3) fraction après passage sur CaptoTM Core 700 ; (4a, b, c) phase 20 aqueuse après une première, une deuxième et éventuellement une troisième extraction différentielle au triton X-114, respectivement ; (5) assemblage purifié après chromatographie d'exclusion de taille et concentration de l'échantillon. La flèche noire pleine correspond au monomère d'encapsuline et la flèche en pointillé à l'eGFP. - Figure 4 : Analyse de la distribution de taille (nm) des nanoparticules XIP1 (en haut), 25 XIP2 (au milieu) et XIP3 (en bas), par Diffusion dynamique de la lumière (DLS). Figure 5: Observation des nanoparticules d'encapsuline-M2e contenant l'eGFP (encapsuline-M2e + eGFP, ou XIP2), par microscopie électronique à transmission (MET). 3050448 32 Figure 6 : Analyse des réponses anticorps IgG1 (A) et IgG2a (B) dans chaque groupe de souris avant immunisation (J0) et après immunisation (J42), avec l'une des compositions suivantes : encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), avec ou sans adjuvant, ovalbumine-M2e avec adjuvant, eGFP avec adjuvant, ou une composition contrôle 5 PBS avec adjuvant, vis-à-vis du contrôle tampon, l'eGFP, la streptavidine, la streptavidine-M2e, l'ovalbumine, l'ovalbumine-M2e, l'encapsuline et l'encapsulineM2e + eGFP (XIP2). - Figure 7 : Production d'anticorps IgG1 chez les groupes de souris immunisées avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), avec adjuvant (symboles pleins) ou sans adjuvant 10 (symboles creux), mesurée par ELISA sur les sérums prélevés à J42. Le test ELISA permet d'estimer la capacité des anticorps à reconnaître l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) (symboles ronds), l'encapsuline (symboles triangles pointe en bas), la streptavidine-M2e (symboles carrés) et la streptavidine (symboles triangles pointe en haut). 15 - Figure 8 : Production d'anticorps IgG1 contre l'eGFP à J42, dans le sérum de chacune des 7 souris du groupe immunisé avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) avec adjuvant. [EXEMPLES] Exemple 1 : Production de nanoparticules d'encapsuline contenant une protéine fluorescente 20 (eGFP) Trois préparations de nanoparticules d'encapsuline ont été préparées et évaluées pour leur capacité à encapsuler une protéine fluorescente, l'eGFP. L'eGFP correspond à de la GFP (L29345 ; GI : 606383 ; product : green-fluorescent protein ; protéine ID : AAA58246), modifiée par l'introduction des 6 mutations Q25H, F64L, S65T, M141L, P157Q, K172E. 25 La première préparation, dite de référence, contenait des nanoparticules d'encapsuline dont la séquence du monomère (dit monomère de référence) a été dérivée de la séquence native de Thermotoga maritima. Elle contenait la séquence correspondant aux acides aminés 4 à 254 de la séquence native de T. maritima (NC_000853 ; Gl:15642775 gène locus TM0785, product « bactériocine », protéine ID : NP_228594) à laquelle ont été rajoutés les acides aminés 30 FQVVNPEALILLKF en C-terminal, en concordance avec la structure cristallisée de la protéine (PDB 3050448 33 code : 3DKT) telle que décrite par Sutter et Coll. 2008. Elle contenait également une substitution C1975 (C2005 par rapport à la numérotation de l'encapsuline native de T. maritima). La deuxième préparation contenait des nanoparticules d'encapsuline, dont la séquence du monomère correspondait à celle du monomère de référence, hormis l'insertion de la séquence 5 GGEVETPIRNEGG entre les acides aminés K138 et 1139. La séquence EVETPIRNE, que l'on retrouve dans la séquence d'acides aminés consensus de l'ectodomaine de la protéine M2 du virus Influenza A H1N1 humain (GI:21693176 ; gène locus AF389121.1 ; product « matrix protein M2 », UniProt ID : P06821 ; souche Puerto Rico 8/1934) a été encadrée par deux linkers GG. La séquence a été insérée dans le site externe du domaine A constitué de la séquence d'acides 10 aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p. La troisième préparation contenait des nanoparticules d'encapsuline, dont la séquence du monomère correspondait à celle du monomère de référence, hormis l'insertion de la séquence 15 GGGGGGHHHHHHGGGGG (boucle His) entre les acides aminés P42 et Y43. La séquence a été insérée dans un site interne du monomère d'encapsuline se trouvant dans le domaine P. Ces 3 préparations de nanoparticules contenant eGFP ont été produites par des bactéries E.coli transformées au moyen de plasmides bicistroniques obtenus par insertion de constructions nucléotidiques spécifiques (C1 à C3, voir ci-dessous). Ces constructions contenaient notamment 20 dans le sens la séquence codant pour l'un des monomères d'encapsuline tels que décrits ci-dessus et la séquence codant pour l'eGFP qui a été fusionnée à la séquence codant pour la séquence peptidique IEEETSGGSENTGGDLGIRKL qui correspond au domaine C-terminal (C-ter) conservé de la protéine Flp de T. maritima (NC_000853 ; GI:15642775 gène locus TM0786, product « ferritin/ribonucleotide reductase-like protein », protéine ID : NP_228595). Un codon 25 supplémentaire (CTT, codant pour une Leucine) a été inséré entre l'extrémité 3' terminale de la séquence codant pour l'eGFP et l'extrémité 5' terminale de la séquence codant pour le domaine C-ter de la protéine Flp, afin d'introduire un site de restriction Hind111. Préparation des plasmides bi-cistroniques 30 Les séquences, ainsi que le tableau indiquant les positions des différents éléments (inserts) dans les séquences nucléotidiques de ces 3 constructions, sont indiquées ci-dessous : 3050448 34 - Construction Cl : Construction bicistronique Encapsulin_eGFP-FloCter TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAATTTCTGAAACGCAGCTTTGCGCCGC TGACCGAAAAACAGTGGCAGGAAATTGATAACCGCGCGCGCGAAATTTTTAAAACCCAACTGTATGGCCG 5 CAAATTTGTGGATGTGGAAGGCCCGTATGGCTGGGAATATGCGGCGCATCCGCTGGGCGAAGTGGAAGT GCTGAGCGATGAAAACGAAGTGGTGAAATGGGGCCTGCGCAAAAGCCTGCCGCTGATTGAACTGCGCGC GACCTTTACCCTGGATCTGTGGGAACTGGATAACCTGGAACGCGGCAAACCGAACGTGGATCTGAGCAGC CTGGAAGAAACCGTGCGCAAAGTGGCGGAATTTGAAGATGAAGTGATTTTTCGCGGCTGCGAAAAAAGCG GCGTGAAAGGCCTGCTGAGCTTTGAAGAACGCAAAATTGAATGCGGCAGCACCCCGAAGGATCTGCTGGA 10 AGCGATTGTGCGCGCGCTGAGCATTTTTAGCAAAGATGGCATTGAAGGCCCGTATACCCTGGTGATTAACA CCGATCGCTGGATTAACTTTCTGAAAGAAGAAGCGGGCCATTATCCGCTGGAAAAACGTGTGGAAGAAAG CCTGCGCGGCGGCAAAATTATTACCACCCCGCGCATTGAAGATGCGCTGGTGGTGAGCGAACGCGGCGGC GATTTTAAACTGATTCTGGGCCAGGATCTGAGCATTGGCTATGAAGATCGCGAAAAAGATGCGGTGCGCC TGTTTATTACCGAAACCTTTACCTTTCAGGTGGTGAACCCGGAAGCGCTGATTCTGCTGAAATTTTAACTGA 15 CTAGGGATCCAAGGAGATATCATATGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGT GGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCTA TGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGCAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCA CCCTGACCTATGGCGTGCAGTGCTTTAGCCGCTATCCGGATCACATGAAACGCCATGATTTTTTTAAAAGCG CGATGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGCACCATTTTTTTTAAAGATGATGGCAACTATAAAACCCGCGCG 20 GAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGCATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATG GCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTATAACAGCCATAACGTGTATATTATGGCGGATAAACAG AAAAACGGCATTAAAGTGAACTTTAAAATTCGCCATAACATTGAAGATGGCAGCGTGCAACTGGCGGATC ATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGGCCCGGTGCTGCTGCCGGATAACCATTATCTGAGCACCCAG AGCGCGCTGAGCAAAGATCCGAACGAAAAACGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGG 25 GCATTACCCACGGCATGGATGAACTGTATAAGCTTATTGAAGAAGAAACCAGCGGCGGCAGCGAAAACAC CGGCGGCGATCTGGGCATTCGCAAACTGTAACTAAGTAACTCGAG (SEQ ID NO : 44) - Construction C2 : Construction bicistronique Encapsulin_M2e_eGFP-FloCter TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAATTTCTGAAACGCAGCTTTGCGCCGC TGACCGAAAAACAGTGGCAGGAAATTGATAACCGCGCGCGCGAAATTTTTAAAACCCAACTGTATGGCCG 30 CAAATTTGTGGATGTGGAAGGCCCGTATGGCTGGGAATATGCGGCGCATCCGCTGGGCGAAGTGGAAGT GCTGAGCGATGAAAACGAAGTGGTGAAATGGGGCCTGCGCAAAAGCCTGCCGCTGATTGAACTGCGCGC GACCTTTACCCTGGATCTGTGGGAACTGGATAACCTGGAACGCGGCAAACCGAACGTGGATCTGAGCAGC CTGGAAGAAACCGTGCGCAAAGTGGCGGAATTTGAAGATGAAGTGATTTTTCGCGGCTGCGAAAAAAGCG 3050448 GCGTGAAAGGCCTGCTGAGCTTTGAAGAACGCAAAGGAGGCGAAGTGGAGACTCCGATTCGCAACGAAG GTGGCATTGAATGCGGCAGCACCCCGAAGGATCTGCTGGAAGCGATTGTGCGCGCGCTGAGCATTTTTAG CAAAGATGGCATTGAAGGCCCGTATACCCTGGTGATTAACACCGATCGCTGGATTAACTTTCTGAAAGAAG AAGCGGGCCATTATCCGCTGGAAAAACGTGTGGAAGAAAGCCTGCGCGGCGGCAAAATTATTACCACCCC 5 GCGCATTGAAGATGCGCTGGTGGTGAGCGAACGCGGCGGCGATTTTAAACTGATTCTGGGCCAGGATCTG AGCATTGGCTATGAAGATCGCGAAAAAGATGCGGTGCGCCTGTTTATTACCGAAACCTTTACCTTTCAGGT GGTGAACCCGGAAGCGCTGATTCTGCTGAAATTTTAACTGACTAGGGATCCAAGGAGATATCATATGAGCA AAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAA ATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCTATGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACC 10 ACCGGCAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGACCTATGGCGTGCAGTGCTTTAGCCG CTATCCGGATCACATGAAACGCCATGATTTTTTTAAAAGCGCGATGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGCA CCATTTTTTTTAAAGATGATGGCAACTATAAAACCCGCGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTG AACCGCATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAA CTATAACAGCCATAACGTGTATATTATGGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGTGAACTTTAAAATTC 15 GCCATAACATTGAAGATGGCAGCGTGCAACTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGG CCCGGTGCTGCTGCCGGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGCGCTGAGCAAAGATCCGAACGAAAAA CGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCATGGATGAACTGTATA AGCTTATTGAAGAAGAAACCAGCGGCGGCAGCGAAAACACCGGCGGCGATCTGGGCATTCGCAAACTGTA ACTAAGTAACTCGAG (SEQ ID NO : 45) 20 - Construction C3 : Construction bicistronique Encapsulin_Hisloop_eGFP-FlpCter TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAATTTCTGAAACGCAGCTTTGCGCCGC TGACCGAAAAACAGTGGCAGGAAATTGATAACCGCGCGCGCGAAATTTTTAAAACCCAACTGTATGGCCG CAAATTTGTGGATGTGGAAGGTCCGGGCGGTGGAGGCGGAGGTCATCACCATCACCATCACGGCGGTGG CGGAGGGTATGGCTGGGAATATGCGGCGCATCCGCTGGGCGAAGTGGAAGTGCTGAGCGATGAAAACGA 25 AGTGGTGAAATGGGGCCTGCGCAAAAGCCTGCCGCTGATTGAACTGCGCGCGACCTTTACCCTGGATCTGT GGGAACTGGATAACCTGGAACGCGGCAAACCGAACGTGGATCTGAGCAGCCTGGAAGAAACCGTGCGCA AAGTGGCGGAATTTGAAGATGAAGTGATTTTTCGCGGCTGCGAAAAAAGCGGCGTGAAAGGCCTGCTGA GCTTTGAAGAACGCAAAATTGAATGCGGCAGCACCCCGAAGGATCTGCTGGAAGCGATTGTGCGCGCGCT GAGCATTTTTAGCAAAGATGGCATTGAAGGCCCGTATACCCTGGTGATTAACACCGATCGCTGGATTAACT 30 TTCTGAAAGAAGAAGCGGGCCATTATCCGCTGGAAAAACGTGTGGAAGAAAGCCTGCGCGGCGGCAAAA TTATTACCACCCCGCGCATTGAAGATGCGCTGGTGGTGAGCGAACGCGGCGGCGATTTTAAACTGATTCTG GGCCAGGATCTGAGCATTGGCTATGAAGATCGCGAAAAAGATGCGGTGCGCCTGTTTATTACCGAAACCTT TACCTTTCAGGTGGTGAACCCGGAAGCGCTGATTCTGCTGAAATTTTAACTGACTAGGGATCCAAGGAGAT ATCATATGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGT 3050448 36 GAACGGCCATAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCTATGGCAAACTGACCCTGAA ATTTATTTGCACCACCGGCAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGACCTATGGCGTGC AGTGCTTTAGCCGCTATCCGGATCACATGAAACGCCATGATTTTTTTAAAAGCGCGATGCCGGAAGGCTAT GTGCAGGAACGCACCATTTTTTTTAAAGATGATGGCAACTATAAAACCCGCGCGGAAGTGAAATTTGAAGG 5 CGATACCCTGGTGAACCGCATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATA AACTGGAATATAACTATAACAGCCATAACGTGTATATTATGGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGTG AACTTTAAAATTCGCCATAACATTGAAGATGGCAGCGTGCAACTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCC GATTGGCGATGGCCCGGTGCTGCTGCCGGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGCGCTGAGCAAAGAT CCGAACGAAAAACGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCATGG 10 ATGAACTGTATAAGCTTATTGAAGAAGAAACCAGCGGCGGCAGCGAAAACACCGGCGGCGATCTGGGCAT TCGCAAACTGTAACTAAGTAACTCGAG (SEQ ID NO : 46) Tableau 2. Position nucléotidique des différents éléments constituant les inserts pour les trois constructions. Xbal RBS 1 NcoI ATG 1 Construction 1 Construction 2 Construction 3 1-6 29-35 40-45 42-44 Encapsuline 42-836 42-875 42-887 M2e 456-494 Boude His 168-218 Codon stop 1 837-839 876-878 888-890 RBS 2 854-860 893-899 905-911 ATG 2 867-869 906-908 918-920 eGFP 867-1580 906-1619 918-1631 HindlIl 1578-1583 1617-1622 1629-1634 FlpCter 15844646 1623-1685 1635-1697 Codon stop 2 16474649 1686-1688 1698-1700 Xhol 1658-1663 1697-1702 1709-1714 15 Ces 3 constructions ont été clonées dans un plasmide qui a été dérivé du plasmide pET28b (Novagen), par introduction de la séquence stabilisatrice Cer, telle que décrite dans Summer et Coll. (Cell (1984); 36 (4) : 1097-103). Ce plasmide, dont la structure est reproduite dans la Figure 2, contient le promoteur T7, un gène de résistance à la kanamycine (kana) et la séquence Cer. Les constructions bicistroniques ont été introduites au niveau des sites de restriction Xbal et Xhol du 20 plasmide par double digestion enzymatique. 3050448 37 Transformation des bactéries et production des nanoparticules 50 p.I d'une suspension de bactéries d'E. cou BL21 (DE3) chimio-compétentes ont été transformées avec 1 p.g de plasmide, en utilisant le kit « BL21(DE3) Competent E. coli » (Ref : 5 C2527H, New England Biolabs), en suivant les recommandations du fournisseur. La transformation bactérienne a été effectuée par incubation dans la glace pendant 15 minutes, suivie d'un choc thermique de 45 secondes à 42 °C. Les bactéries transformées ont été ensuite incubées dans la glace pendant 15 minutes, puis 1 heure à 37°C dans un milieu enrichi (milieu Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) : 2% Tryptone, 0,5 %, 8,56 mM NaCI, 2,5 10 mM KCI, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose). La sélection des bactéries transformées a été réalisée sur un milieu LB-agar contenant de la kanamycine (kana) à 50 p.g.mL-1 (Sigma Life Science). Après incubation pendant une nuit à 37°C, les colonies de bactéries transformées par le plasmide ont été prélevées et mises en pré-culture dans un milieu LB (LB Broth Base, Ref : 12780029, Invitrogen) contenant 50 p.g/mL de kana à 37°C sous agitation pendant une nuit. Ces pré- 15 cultures ont servi à ensemencer des volumes de culture de 50 mL à 2 L de milieu LB contenant 50 p.g/mL de Kana. Lorsque la concentration bactérienne de la culture a atteint une concentration correspondant à une densité optique à 600 nm (D0600,m) comprise entre 0.4 et 0.6, la production des nanoparticules a été induite par ajout de 100 p.M d'IPTG (Isopropyl (3-D-1- thiogalactopyranoside) dans le milieu de culture. L'induction a été effectuée pendant une nuit à 20 18°C. Purification des nanoparticules Les culots issus des cultures bactériennes après induction ont été re-suspendus dans du tampon phosphate salin 1X PBS pH 7,5 (137 mM NaCI ; 2.7 mM KCI ; 10 mM Na2HPO4 ; 1.76 mM KH2PO4) 25 contenant 0,1 p.g.mL-1 de désoxyribonucléase I. La lyse bactérienne a été effectuée par casse mécanique de 30 secondes à 4,5 m.s-1 avec des billes de silice de 0,1 mm (Matrice B, réf : 116911050, MP Biomedicals), en utilisant l'appareil Fast Prep (MP Biomedicals). Le lysat a été ensuite clarifié par centrifugation pendant 45 minutes à 7000 g, suivie d'une filtration du surnageant à travers une membrane en polyéthersulfone de porosité 0,8 p.m (Réf : 190-2580 30 Nalgène®, ThermoScientific). Dans une première étape, la purification des différentes préparations de nanoparticules a été réalisée à l'aide du système chromatographique AKTA Pure 25M (GE Healthcare), en utilisant une 3050448 38 ou plusieurs colonnes HiTrap CaptoTM Core 700 (GE Healthcare Life Sciences ; réf : 17-5481-51) montées en série. Le système a été équilibré avec du PBS lx puis on a chargé les colonnes avec le lysat clarifié à raison de 0,2 mL.min-1. Les protéines contenues dans le lysat clarifié ont été éluées en tampon PBS et recueillies par fractions de 1 mL. 5 Les fractions contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm (protéines d'intérêt) ont été collectées et une à trois extractions différentielles successives (en fonction de la concentration du contaminant majoritaire) ont été effectuées avec du Triton X-114 à 0,1 %. L'extraction différentielle de protéines hydrophobes a été effectuée de la manière suivante : 0,1 % de Triton X-114 a été ajouté au mélange de fractions d'intérêt et mis à 4 10 °C jusqu'à homogénéisation de la solution. La solution homogénéisée a été ensuite incubée à 37°C pendant 15 minutes, ce qui a entrainé la formation de micelles de Triton et la séparation de la solution en deux phases. Une centrifugation à 15000 g pendant 20 minutes à 37°C a été effectuée pour séparer la phase aqueuse de la phase détergente hydrophobe contenant une grande quantité de contaminants. 15 Une fois le contaminant majoritaire éliminé, la fraction aqueuse a été récupérée puis soumise à une dernière étape de purification par chromatographie d'exclusion de taille selon laquelle on a chargé, à raison de 0,5 mL.min-1, une colonne de gel filtration Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare; réf : 28990944) préalablement équilibrée avec du PBS 1X. Les fractions contenant les nanoparticules d'encapsuline ont été ensuite concentrées sur concentrateurs Sartorius (Réf : 20 VS2021) retenant les protéines de plus de 30 kDa. Le degré de pureté des différentes préparations de nanoparticules : XIP1 (encapsuline + eGFP, correspondant à la construction C1), XIP2 (encapsuline-M2e + eGFP, correspondant à la construction C2) et XIP3 (encapsuline-His + eGFP, correspondant à la construction C3) a été contrôlé par SDS-PAGE durant les différentes étapes de purification (voir figure 3). La figure 3 25 montre une disparition progressive des bandes correspondant aux produits contaminants au cours des étapes de purification. Le degré de pureté est estimé, de manière semi-quantitative, par évaluation de l'intensité de la bande correspondant à l'encapsuline, rapporté à l'intensité de toutes les bandes présentes, au moyen du logiciel Image Lab (BioRad). Après la dernière étape de purification (colonne 5 sur la figure 3), ce degré de pureté est d'environ 85-90%, au minimum, 30 pour chacune des préparations de nanoparticules XIP1, XIP2 et XIP3. On a vérifié également par une technique de western-blot au moyen d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'ectodomaine de la protéine M2 (Réf : MA1-082, ThermoScientific) dilué au 1000ieme 3050448 39 dans un tampon PBST (PBS lx supplémenté par 0,05% de Tween-20, Réf : P9416, Sigma-Aldrich) que la séquence peptidique GGEVETPIRNEGG a bien été insérée dans le monomère d'encapsuline de la préparation XIP2. On a retrouvé effectivement une bande spécifique qui correspond à la bande du monomère d'encapsuline (bande à 31 758 Da). 5 Exemple 2: Caractérisation des nanoparticules d'encapsuline contenant une protéine fluorescente (eGFP) Analyse structurale des nanoparticules d'encapsuline La taille moyenne des nanoparticules contenues dans les différentes préparations purifiées (XIP1, 10 XIP2 et XIP3) a été mesurée par DLS au moyen de l'appareillage Zetasizer Nano de Malvern. Après filtration d'une aliquote de 200 p.I de chacune des préparations purifiées sur un filtre d'acétate de cellulose 0,22 p.M (Réf : 8161, Costar Spin-X), les échantillons ont ensuite été placés dans une cuve compatible UV et analysés par mesure spectroscopique à corrélation de photons (laser He-Ne 633 nm) des rayonnements de diffusion des nanoparticules à un angle fixe de 173°. Les mesures ont 15 été effectuées en duplicate à 25°C après une équilibration de 2 minutes puis analysées à l'aide du logiciel DTS. Les résultats (voir figure 4) montrent que seule la préparation purifiée de nanoparticules XIP2, dont la surface du nano-compartiment est constituée de monomères d'encapsuline dans lesquels la séquence du monomère de référence a été modifiée par insertion de la séquence 20 GGEVETPIRNEGG dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, a une population majoritaire de nanoparticules dont la taille moyenne, d'environ 24 nm, correspond à celle qui est classiquement décrite pour les nanoparticules d'encapsuline de Thermotoga maritima (Sutter M et Coll., Nat Struct Mol Biol (2008) ; 15(9) : 939-947), ce qui est un bon indicateur de l'efficacité de l'assemblage des monomères entre eux. 25 L'analyse en microscopie électronique à transmission en champs clairs faite à l'aide d'un MET Tecnai Spirit (FEI, Eindhoven, The Netherlands) avec un objectif Biotwin à 120 kV, a confirmé l'efficacité de l'assemblage. 15 p.I de la préparation purifiée XIP2 a été déposée sur une grille de cuivre prétraitée au bleu Alcian 1 %. Après incubation pendant 10 minutes suivie d'un rinçage deux fois à l'eau, la préparation sur la grille a été ensuite colorée avec une goutte d'acétate 30 d'uranyle à 2 % (Agar Scientific) pendant 10 secondes, puis séchée à l'air libre à température ambiante. Les micrographes enregistrés ont été analysés via un récepteur à transfert de charge 3050448 4*4 K CCD (Eagle, FEI) à un grossissement de 30 000 fois. L'image telle que représentée dans la figure 5 montre de nombreuses nanoparticules, d'allure icosaédrique, ayant une taille d'environ 23,2 nm ± 0,5 nm dans lesquelles on retrouve une masse dense, ce qui indique la présence de la protéine fluorescente à l'intérieur des nanoparticules. 5 Mesure de la quantité d'eGFP par nanoparticule Une droite d'étalonnage mesurant l'intensité relative de fluorescence (exprimée en RFUs, où RFU signifie : unité relative de fluorescence) en fonction de la concentration en eGFP, a été établie en mesurant l'intensité de fluorescence émise par une solution d'eGFP taggée His (SEQ ID NO : 47) 10 purifiée, dans un tampon PBS 1X dans une gamme de concentration allant de 0 à 30 p.g.mL-1. La mesure a été faite à l'aide de l'appareil CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) en utilisant les filtres FAM pour l'excitation (450-490 nm) et pour l'émission (510-530 nm). La droite d'étalonnage obtenue avait pour équation : Y= 2000,4X -170,55, avec un coefficient de corrélation R2 de 0,9838, Y désignant le nombre de RFUs et X désignant la concentration en eGFP 15 en p.g.m L-1. La concentration en eGFP (CGFP) dans chaque préparation de nanoparticules purifiées a été déterminée en calculant l'intensité moyenne de fluorescence sur trois mesures, puis en se référant à la droite d'étalonnage pour déterminer la concentration en eGFP (en p.g.mL-1). La concentration en eGFP (en p.M) a alors été déduite en utilisant le poids moléculaire de l'EGFP 20 (PM EGFP 27000g/mol). En parallèle, une mesure de la densité optique à 280 nm a été réalisée à l'aide du NanoDrop (Thermoscientific) afin de déterminer la concentration d'encapsuline (Cencapsuline), en utilisant la loi de Beer-Lambert : D0280,' = EencapsuhneX/XCencapsuline EGFpX/XCGFP ; où 1= longueur du trajet optique (en cm); C = concentration (en M) et £ = coefficient d'extinction molaire (en L. mol-1 .cm- 25 1), avec Eencapsuline= 36500 L.mo1-1. cm-1 et EGFp= 21950 L.mol-l.cm-1. Le ratio Cencapsulme/CGFp (ou [encapsuline] M/[eGFP] M) obtenu pour chaque préparation permet d'évaluer la capacité des nanoparticules à encapsuler la protéine fluorescente. Plus le ratio est faible et plus la capacité d'encapsulation de la protéine fluorescente par les nanoparticules est importante. Considérant qu'une nanoparticule à base de monomères d'encapsuline de T. 30 maritima est constituée classiquement de 60 monomères, on peut estimer le nombre de molécules d'eGFP qui ont été encapsulées par nanoparticule dans chacune des préparations. Les 3050448 41 résultats du tableau ci-dessous montrent que les nanoparticules de la préparation XIP2 dans lesquelles la séquence du monomère de référence a été modifiée par insertion de la séquence GGEVETPIRNEGG dans un site externe du monomère d'encapsuline, a une capacité d'encapsulation de l'ordre de 46 fois plus grande que les nanoparticules de la préparation XIP3 5 dans lesquelles la séquence du monomère de référence a été modifiée par insertion de la séquence GGGGGGHHHHHHGGGGG dans un site interne du monomère d'encapsuline, et encore plus grande vis-à-vis des nanoparticules de la préparation XIP1 résultant de l'assemblage des monomères de référence dont la capacité d'encapsulation de la protéine fluorescente est négligeable. 10 Tableau 3. Estimation du nombre d'eGFP encapsulés par nanoparticule. Construction Concentration Concentration Concentration [encapsulinelM Estimation du nombre d'eGFP eGFP (mg/m1) eGFP (M) encapsuline (M) Ratio[eGFP]M encapsulés par nanoparticules XIP 1 0,003 1,0.107 6,1.105 600,4 0, 1 XIP 2 2,6 9,9.10-6 1,83.104 1,85 32, 4 XIP 3 0,11 3,8.106 3,3.104 86,8 0, 7 Exemple 3: Etude de l'immunogénicité des nanoparticules d'encapsuline contenant une 15 protéine fluorescente (eGFP) Le peptide « M2e » ayant pour séquence la séquence GGEVETPIRNEGG et le peptide « M2e biotinylé en C-terminal » [NH2]GGEVETPIRNEGG[CH2CH2Biotin] ont été synthétisés à façon par ThermoFisher scientific. L'ovalbumine (Sigma référence : A5503-1G) a été couplée au peptide M2e (Ovalbumine-M2e) par un couplage amine/amine à l'aide de bis[sulfosuccinimidyl] suberate 20 (1353); Thermo référence : 21580). L'ovalbumine, le peptide M2e, et l'agent de couplage BS3, ont été incubés pendant 30 minutes à 25 °c en solution dans le PBS, dans les proportions molaires respectives de 1 :10 :10. La streptavidine (Thermo référence : 21122) a été mise en présence d'un excès du peptide M2e biotinylé en C-terminal (dans des proportions 1 :10) et incubée 1 heure à 25°C. Pour bloquer les réactions et éliminer les peptides et BS3 non couplés, les protéines 25 ont été dessalées immédiatement après incubation sur colonnes PD10 (GE Healhcare référence : 17-0851-01) équilibrées en PBS. 3050448 42 Quatre groupes de 7 souris femelles de souche BaIB/c ont été immunisées par injection sous-cutanée avec l'un des antigènes suivants : l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), l'eGFP, l'OvalbumineM2e, ou du PBS (contrôle négatif). Trois injections ont été réalisées, à J0, J14 et J28. La première injection (J0) a été effectuée avec 50 lig d'antigène mélangé volume à volume avec de l'adjuvant 5 complet de Freund (CFA), tandis que la deuxième (J14) et la troisième injection (J28) ont été réalisées avec la même quantité d'antigène mais avec de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA). Un cinquième groupe de 7 souris, a été immunisé avec l'encapsuline-M2e + eGFP, en suivant le même protocole, mais sans l'utilisation d'adjuvant pour les 3 injections. Pour chaque souris de chaque groupe, on a collecté 50 pi de sérum avant la première 10 immunisation (J0), puis 14 jours, 28 jours et 42 jours après (J14, J28 et J42). La réponse anticorps IgG1 et IgG2a a été dosée par ELISA direct. Les puits des plaques ELISA Nunc® 96 puits (Sigma, Ref M9410) ont été recouverts par 200 ng de l'un des antigènes suivants : 1) de l'eGFP purifiée par affinité sur colonne chargée avec la résine HisPur Ni-NTA (Thermo référence 88221) , 2) de la streptavidine (Thermo référence : 21122), 3) de la streptavidine couplée avec le peptide M2e 15 biotinylé en C-terminal, 4) de l'ovalbumine (Sigma référence : A5503), 5) de l'ovalbumine couplée chimiquement avec le peptide M2e, 6) de l'encapsuline + eGFP (XIP1) et 7) de l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), dilués en tampon bicarbonate 0,2 M pH 9,4 (Thermo référence : 10331414), à 4°C pendant une nuit. Des puits, utilisés comme « contrôle négatif » ont également été incubés pendant une nuit à 4°C avec un tampon bicarbonate. 20 Après saturation pendant 1 heure à température ambiante avec une solution de PBS 1X - Lait 25 % (Sigma-Aldrich références : D8537, et 70166), suivie de trois lavages successifs avec du PBS additionné de Tween 20 à 0,05 % (Sigma-Aldrich références : D8537 et P9416), les plaques ont été incubées pendant 1h30 avec les « pools » de sérums représentatifs des différents groupes de souris immunisées, dilués au centième dans du PBS-1% BSA (Sigma-Aldrich références : D8537 et 25 A4503), chaque pool de sérum ayant été constitué en mélangeant les sérums des 7 souris d'un même groupe. Les plaques ont alors de nouveau été lavées en PBS-Tween 20 comme décrit précédemment, puis incubées pendant 30 minutes avec 100 ng d'anticorps de révélation qui est soit un anticorps de rat anti IgG1 de souris couplé à la HRP (Thermo référence : 10097462), soit un anticorps de rat anti IgG2a de souris couplé à la HRP (Thermo référence : 10777993). Après 30 trois lavages en PBS-Tween 20 comme précédemment, 100 pl de TMB (Thermo référence : 11869260) ont été ajoutés par puits et les plaques ont été incubées 5 minutes à température ambiante. Pour stopper la réaction, 100 pl d'acide sulfurique à 0,2 M (Sigma référence : 320501- 3050448 43 1L-D) a été ajouté dans chaque puits. La plaque a ensuite été lue avec le lecteur de plaque TECAN à une absorbance de 450 nm. Les résultats (Figures 6A et 6B) montrent que les anticorps produits par les souris immunisées avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) en présence d'adjuvant sont dirigés contre M2e, mais, de 5 façon surprenante, pas contre l'encapsuline elle-même, comme en témoigne la reconnaissance par les anticorps de l'encapsuline-M2e, de la streptavidine-M2e et de l'ovalbumine-M2e, et pas de l'encapsuline, de la streptavidine et de l'ovalbumine. De même, après immunisation avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) sans adjuvant, les anticorps produits sont dirigés contre l'encapsuline-M2e, mais pas contre l'encapsuline seule. Par opposition, les anticorps produits par 10 les souris immunisées avec l'ovalbumine-M2e en présence d'adjuvant, reconnaissent l'ovalbumine-M2e, mais également l'ovalbumine seule, et ne reconnaissent ni l'encapsuline-M2e ni la streptavidine-M2e. Les anticorps produits sont donc essentiellement dirigés contre l'ovalbumine mais pas contre M2e. Les anticorps produits lors de l'immunisation avec l'encapsuline-M2e, avec ou sans adjuvant, sont majoritairement de type IgG1, mais des anticorps 15 de type IgG2a sont également produits. Suite à l'immunisation avec l'ovalbumine-M2e, il n'y a quasiment pas d'anticorps de type IgG2a produits. Afin d'estimer le titre d'anticorps chez les groupes immunisés avec l'encapsuline-M2e +eGFP (XIP2), avec et sans adjuvant, les pools de sérums provenant de ces deux groupes ont été dilués en cascade au demi à partir d'une dilution au centième. La streptavidine, la streptavidine-M2e, 20 l'encapsuline + eGFP (XIP1) et l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) ont été adsorbées au fond des puits de la même manière que décrite précédemment. La révélation a été faite à l'aide de l'anticorps de rat anti IgG1 de souris couplé à la HRP (Thermo référence : 10097462). Les résultats (Figure 7) confirment que, de façon surprenante, la présence d'adjuvants n'est pas nécessaire pour obtenir une réponse anticorps spécifique de M2e : les serums des souris immunisées 25 reconnaissent l'encapsuline-M2e, la streptavidine-M2e, mais ne reconnaissent pas la streptavidine ou l'encapsuline seule. La réponse anticorps dirigée contre la protéine interne, eGFP, a été analysée à J42 dans les sera individuels des 7 souris immunisées avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) en présence d'adjuvant. Les dilutions au 1/50 eme au 1/100 ' et au 1/200 ' de chacun des sera ont été 30 analysées par ELISA sur des plaques sensibilisées par de l'eGFP diluée en tampon bicarbonate 0,2M, pH=9 à raison de 200 ng par puits et en utilisant comme anticorps de révélation le même anticorps de rat anti IgG1 de souris couplé à la HRP que précédemment. Les résultats de la Figure 8 montrent que 3 des 7 souris ont développé une réponse anti-eGFP significative REVENDICATIONS1. Une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne. 2. La nanoparticule selon la revendication 1, selon laquelle le peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline. 3. La nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, selon laquelle le site externe du domaine A est constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p. 4. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 3, selon laquelle la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%. 20 5. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 4, selon laquelle la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%. 6. La nanoparticule selon la revendication 5, selon laquelle le peptide a été inséré entre deux 25 acides aminés consécutifs de la séquence Ki381139E140C141G1425143, lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO: 7, ou entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 7, après alignement des deux séquences monomériques. 30 15 7. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 6, selon laquelle le nombre total d'acides aminés du peptide inséré est compris entre 4 et 55 (bornes incluses). 3050448 45 8. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 7, selon laquelle le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). 9. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 8, selon laquelle la séquence d'acides 5 aminés du monomère d'encapsuline après insertion du peptide est la séquence SEQ ID NO : 30. 10. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 9, selon laquelle l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, de la séquence d'acides aminés de la protéine interne se 10 termine ou commence, respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel : a. I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses) ; b. M est la séquence X1GSLX5X6GX8LX10 (SEQ ID NO : 36), dans laquelle X1 est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et X10 est K ou Y, la séquence X1APX4DGSLX9X10GSLKG (SEQ ID NO: 37), dans laquelle X1 et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et X10 est I ou V, ou la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38) et, c. T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). 11. La nanoparticule selon la revendication 10, selon laquelle la protéine interne est une protéine de fusion selon laquelle l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à l'enchainement d'acides aminés du type I-M-T. 12. Un vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet 13, et une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, 3050448 46 respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses) de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou 5 SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). 13. Une cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique selon la revendication 12. 10 14. Une cellule hôte comprenant un premier vecteur qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du domaine A et de la séquence 15 d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet [3, et un deuxième vecteur qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre 20 total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses, de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée 25 entre 0 et 5 (bornes incluses). 15. Un procédé de production de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline telles que définies selon l'une des revendications 1 à 10, selon lequel : a. On cultive des cellules hôtes telles que définies selon la revendication 13 ou 14 dans 30 des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la protéine interne ; et b. On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne, résultant de l'auto-assemblage des monomères d'encapsuline. 3050448 47 16. Un procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lequel : a. On clarifie un broyat de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline; 5 b. On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ; c. On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ; d. On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes contenus dans 10 l'éluat au moyen d'une solution biphasique ; e. On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et f. On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline. 15 17. Une composition immunogène comprenant des nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 11. 18. Une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un 20 assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la 25 séquence d'acides aminés du premier feuillet p. 19. La composition immunogène selon la revendication 17 ou 18, selon laquelle le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). 30 20. La composition immunogène selon la revendication 19, selon laquelle la réponse immune est dirigée contre le virus grippal. 21. Un monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré dans sa séquence d'acides aminés un peptide comprenant la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). 3050448 48 22. Le monomère d'encapsuline selon la revendication 21, selon lequel le peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence 5 d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p. 23. Une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline selon la revendication 21 ou 22. 10 24. La séquence d'acide nucléique selon la revendication 23, qui est la séquence SEQ ID NO : 43 ou une séquence dérivée ayant un degré d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID NO : 43. 15 25. Un vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 23 ou 24.