Brevet FR3051556A1 — publié le 20171124

UTILISATION DE MARQUEURS FLUORESCENTS POUR LA DETECTION DE CIBLE BIOLOGIQUE DANS UN ECHANTILLON DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine des marqueurs fluorescents et, plus spécifiquement, leur utilisation pour la détection de cible biologique dans un échantillon. ART ANTERIEUR L'identification et le comptage de sous-populations cellulaires au sein d'un échantillon biologique sont aujourd'hui un élément critique tant en recherche fondamentale qu'au sein des laboratoires d'analyse médicale à des fins de diagnostic. 10 Pour ce faire, différentes méthodes d'identification ont été développées, dont en particulier la technique de cytométrie en flux (CMF) ou FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) largement utilisée aujourd'hui. La cytofluorométrie en flux (CMF-F) est une technique couramment employée pour l'analyse individuelle de cellules. Elle permet de séparer des sous-populations 15 cellulaires à la fois sur la base de leur taille et sur la base de la présence ou non de marqueurs spécifiques à leur surface. La détection de ces marqueurs de surface est alors réalisée par des ligands spécifiques couplés à des fluorophores. La CMF est en particulier couramment utilisée pour l'analyse immunologique de cellules sanguines avec de nombreuses applications à visée diagnostique comme 20 l'immuno-phénotypage des leucémies et lymphomes. Ces approches nécessitent l'usage de conjugués fluorescents à base d'anticorps monoclonaux (AcMx) et autres sondes spécifiques couplés à des fluorochromes variés couvrant un large éventail de couleurs (longueurs d'ondes) au sein du spectre de lumière visible. Avec la disponibilité de nouvelles sources lasers dans le rouge (e.g. 633 nm ou 25 645 nm) et plus récemment dans le violet (405 nm), d'encombrement réduit et économiquement viables, la technologie de la CMF a évolué vers des instruments couramment équipés de 3 lasers, bleu (488 nm), rouge (645 nm) et violet (405 nm), relançant ainsi la course aux fluorochromes. En effet, ces lasers étant dissociés dans 3051556 2 l'espace et le temps, il est possible de mesurer indépendamment et sans interférence les diverses « couleurs » de fluorescence induites par chaque laser. En parallèle à cette évolution de la technologie, un nombre croissant de nouveaux marqueurs de surface de sous-populations cellulaires ou particulaires d'intérêt ont progressivement été identifiés. Ceci a rendu nécessaire de disposer de fluorophores se différenciant par leurs propriétés optiques, afin de pouvoir distinguer les différentes populations ciblées. L'obtention de nouveaux fluorophores utiles pour un diagnostic différentiel constitue néanmoins un travail de recherche complexe. En effet, un « bon » fluorophore ne s'assimile pas à une simple molécule capable d'absorber la lumière à une longueur d'onde spécifique puis de restituer de la lumière, mais à une molécule répondant à des critères précis, à savoir: 1) Un coefficient d'extinction important 2) Un fort rendement quantique (0,8-0,9) 3) Un faible rendement triplet 4) Une durée de vie de(s) l'état(s) excité(s) courte (3ns) 5) Un grand décalage de Stokes 6) Un faible photo-blanchiment Compte tenu de ces exigences, le panel de fluorophores actuellement disponibles 20 reste encore limité, ce constat se faisant notamment pour certaines longueurs d'onde d'excitation (laser 405 nm). Parmi les fluorophores qui ont été utilisés dès les premières applications de la CMF dans le phénotypage cellulaire, on trouve notamment les phycobiliprotéines. Il s'agit d'une famille de pigments accessoires qui captent la lumière (et qui 25 possèdent en outre des propriétés immuno-modulatrices, anti-inflammatoires, antioxydantes et nutritionnelles), dont les propriétés ont largement été décrites, en particulier dans les brevets US 4,542,104 / US 5,055,556 / US 4,859,582 et EP 0076695 Bl. Aujourd'hui encore, ces fluorophores sont fréquemment utilisés pour les analyses en CMF et autres méthodes de différentiation cellulaire. 3051556 3 En effet, ces molécules sont capables de générer des signaux de fluorescence de spectres complémentaires à celui de la fluorescéine, principal fluorochrome connu comme excitable par le laser bleu 488 nm. Or ce type de laser a longtemps constitué la seule source d'excitation lumineuse dont étaient équipés les premiers cytofluoromètres. 5 Au sein des phycobiliprotéines, la phycoérythrine (PE) en particulier a rapidement présenté un intérêt majeur du fait de son rendement quantique élevé, (très supérieur à celui de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC)), un pic d'excitation secondaire très utile vers 488 nm (en plus d'un pic majeur vers 560 nm) et une excellente complémentarité de son spectre d'émission par rapport à celui du FITC. Ces caractéristiques en ont fait 10 jusqu'à ce jour un fluorochrome incontournable en immuno-phénotypage par CMF. En outre, la demande pressante pour de nouvelles « couleurs » de fluorescence compatibles avec le laser 488 nm a incité le développement de tandems à base de PE (e.g. PE-Texas red ou ECD, PE-Cy5, PE-Cy7 ...) permettant des analyses immunophénotypique à 5 couleurs avec un seul laser. Enfin, à cette application majeure en CMF 15 s'ajoute celle plus récente des immuno-dosages multiplex par CMF où la PE est le plus souvent utilisée comme révélateur de chaque fluoro-immuno-essai individuel sous forme de conjugués AcMx (« reporter conjugates»). La PE est donc depuis de longues années un fluorochrome particulièrement intéressant non seulement pour la CMF, mais plus largement pour toutes les méthodes d'analyse, détection ou séparation basées sur des interactions moléculaires de type récepteur/ligand. Comme illustré par la figure 1, le spectre d'excitation (absorption) de la PE est généralement décrit à partir de 450 nm et comprend d'abord un pic secondaire à 490 nm puis un pic majeur à 560 nm. De ce fait, la PE a toujours été utilisée avec des sources lumineuses d'excitation de longueur d'onde comprise entre 488 et 561 nm, et rien ne permettait d'imaginer qu'elle constituerait un fluorochrome satisfaisant avec une excitation à une longueur d'onde de l'ordre de 405 nm. Or, de façon tout à fait surprenante, les inventeurs de la présente invention ont 30 maintenant mis en évidence qu'il était possible d'utiliser la phycoérythrine comme 3051556 4 fluorochrome, non plus seulement avec des lasers émettant entre 488 et 561 nm, mais aussi avec un laser vers le violet (405 nm). La présente invention porte donc sur une utilisation inédite de la PE et ses dérivés, tels que ses dérivés tandems, en utilisant une longueur d'onde d'excitation proche de 405 5 nm au lieu des classiques 488 nm ou 560 nm. SOMMAIRE DE L'INVENTION Selon un premier objet, l'invention concerne un procédé de détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes de : 10 i) Mise en contact de l'échantillon avec un ligand qui est spécifique de cette molécule d'intérêt et qui est couplé à un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés, ii) Excitation du mélange de l'étape i) par au moins une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 nm et 425 nm, 15 iii) Détection d'une émission de lumière par le mélange consécutivement à l'étape ii) à une longueur d'onde supérieure ou égale à 550 mn, et iv) Détermination de la présence ou non de la molécule d'intérêt dans l'échantillon au regard des résultats obtenus à l'étape iii). Le procédé de l'invention peut ainsi être mis en oeuvre sur un système approprié 20 comprenant au moins un ligand couplé à un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés, au moins une source lumineuse émettant une lumière de longueur d'onde comprise entre 330 nm et 425 nm et au moins un détecteur de la lumière émise par le fluorochrome ainsi excité. Le procédé en question peut viser en outre la détection simultanée d'une seconde, 25 d'une troisième, d'une quatrième, voire d'une cinquième (ou énième) molécule d'intérêt dans un même échantillon. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés pour la détection d'au moins une molécule 3051556 5 d'intérêt dans un échantillon caractérisée en ce que la longueur d'onde d'excitation utilisée est comprise entre 330 nm et 425 nm, préférentiellement à 405 nm. DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 représente les spectres d'absorption/excitation (lignes discontinues en 5 pointillés) et d'émission (lignes continues et aires sous les courbes en grisé) de la phycoerythrine (R-PE) ainsi que de trois de ses tandems R-PE-TexasRed, R-PE-Cy5.5 et R-PE-Cy7 (adapté de Fluorescence SpectraViewer, Thermofisher Scientific). Les longueurs d'onde (en nm) figurent en abscisse et l'axe des ordonnées illustre les intensités relatives d'absorbance ou d'émission (en %). Les courbes ne sont décrites qu'à 10 partir de 400-450 nm avec des pics d'excitation évidents vers 490, 530 et 560 nm pour la R-PE. En plus de ces trois pics d'excitations, des pics supplémentaires d'excitation sont visibles pour la R-PE-Cy5.5 (660 nm) et la R-PE-Cy7 (760 nm). Le spectre d'émission de la R-PE est une gaussienne centrée sur 575 nm. Les spectres d'émission des tandems -sont décalés vers les plus grandes longueurs d'ondes et sont centrés sur 615 nm (R-PE- 15 Texas-Red), 694 nm (R-PE-Cy5.5) et 776 nm (R-PE-Cy7). Les figures 2 à 8 illustrent l'absence de fuite de la phycoerythrine excitée par le laser bleu dans le canal de lecture du laser violet. Des billes de polystyrène recouvertes de quantités croissantes de R-PE servent de calibrant et sont excitées par les lasers bleu et violet. FL2 correspond aux signaux issus du laser bleu (488 nm) et passant au travers 20 d'un filtre 575 BP 30, derrière un miroir dichroïque 595 DC SP. FL10 correspond aux signaux issus du laser violet (405 nm) et passant au travers d'un filtre identique 575 BP 30, après renvoi par un miroir dichroïque 480 DC SP. Les puissances nominales des lasers bleu et violet sont respectivement de 22 mW et 40 mW (figures 2 et 5). Les billes en singlets sont d'abord pré-sélectionnées par la 25 région « beads » dans une analyse double scatter et leurs fluorescences FL2 et FL10 analysées de façon corrélée. La puissance nominale du laser bleu est réduite à 10 mW (figure 3) puis 5mW (figure 4) alors que la puissance nominale du laser violet est maintenue à 40 mW. La puissance nominale du laser violet est réduite à 10 mW (figure 6) puis 5mW (figure 7) 30 alors que la puissance nominale du laser bleu est maintenue à 22 mW. Le laser violet a 3051556 6 été bloqué par un iris en cours d'analyse permettant de faire passer artificiellement sa puissance nominale de 40 mW à 0 mW; la puissance nominale du laser bleu est maintenue constante à 22 mW (figure 8). La figure 9 illustre la capacité de la PE-Cy5.5 excitée par un laser violet à 5 discriminer un échantillon fortement marqué d'un échantillon faiblement marqué. Des billes de capture recouvertes ou non d'une quantité variable d'anticorps de chèvre antisouris sont mises en présence de l'anticorps conjugué anti-CD45-PE-Cy5.5. L'échantillon est excité successivement par les lasers violet et bleu, les séparations dans l'espace et le temps permettant des analyses différenciées des signaux de fluorescence issus de chacun 10 des lasers. FL4 correspond aux signaux issus du laser bleu (488 nm) et passant au travers d'un filtre 695 BP 30, derrière un miroir dichroïque 730 DC SP pour collecter la fluorescence de PE-Cy5.5. FL10 correspond aux signaux issus du laser violet (405 nm) et passant au travers d'un filtre identique (695 BP 30), après renvoi par un miroir dichroïque 480 DC SP. 15 La figure 10 montre l'identification de sous-populations cellulaires du sang par cytométrie en flux de cellules hématopoïétiques normales réalisée sur la base du marqueur CD45. L'excitation du conjugué anti-CD45-PE à 488 nm est illustré par les figures (A), (C) et (E). L'excitation du conjugué anti-CD45-PE à 405 nm est illustré par les figures (B), (D) et (F). Le repérage et la quantification des sous-populations cellulaires 20 du sang sont représentés par les figures (A), (B), (C) et (D). Les figures (E) et (F) sont une représentation en histogrammes mono-paramétriques combinés des 4 sous-populations lymphocytes (Ly), monocytes (Mo), granulocytes (PMN) et globules rouges résiduels (Ery) du sang. La figure 11 montre l'identification de sous-populations cellulaires du sang par 25 cytométrie en flux de cellules hématopoïétiques normales et leucémiques réalisée sur la base du marqueur CD45. Les cellules LP1, servant de modèle de cellules anormales à faible niveau d'expression de CD45, ont été ajoutées à raison de 10% par rapport aux cellules blanches normales. L'excitation du conjugué anti-CD45-PE à 488 nm est illustré par les figures (A), (C) et (E). L'excitation du conjugué anti-CD45-PE à 405 nm est illustré par les figures (B), (D) et (F). Le repérage et la quantification des sous- populations cellulaires du sang complété en cellules LP1 sont représentés par les figures (A), (B), (C) et (D). Les figures (C) et (D) ne laissent apparaitre que les blastes 3051556 7 leucémiques. Les figures (E) et (F) sont une représentation en histogrammes mono-paramétriques combinés des 5 sous-populations lymphocytes (Ly), monocytes (Mo), granulocytes (PMN), globules rouges résiduels (Ery) du sang et les cellules leucémiques de la lignée LP1 (LP1). 5 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention concerne un procédé de détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes de : i) Mise en contact de l'échantillon avec un ligand qui est spécifique de cette molécule d'intérêt et qui est couplé à un fluorochrome consistant en la 10 phycoérythrine ou l'un de ses dérivés, ii) Excitation du mélange de l'étape i) par au moins une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, iii) Détection d'une émission de lumière par le mélange consécutivement à l'étape ii) à une longueur d'onde supérieure ou égale à 550 nm, et 15 iv) Détermination de la présence ou non de la molécule d'intérêt dans l'échantillon au regard des résultats de l'étape iii). Les inventeurs ont mis en évidence, comme démontré dans les exemples ci-après, que la phycoérythrine présente des propriétés de fluorescence suite à son excitation par un laser à 405 nm de nature à permettre son utilisation en tant que fluorochrome en lien 20 avec un tel laser. Par « molécule d'intérêt», on désigne un marqueur biologique dont on suspecte la présence dans un échantillon. Un tel marqueur biologique peut être de nature protéique, nucléique, glucidique, lipidique ou encore glyco-lipidique. De préférence, le marqueur biologique détecté par le procédé de l'invention est 25 une protéine, un lipide, un glucide, une structure lipidique, glycolipidique ou un motif glucidique. De préférence, le marqueur biologique détecté par le procédé de l'invention est une protéine. 3051556 8 Par « échantillon », on désigne tout type d'échantillon notamment biologiques constitués par les tissus (muscle, os, organe, etc...), liquides corporels (sang, salive, urine, larmes, sperme, lait, liquide broncho-alvéolaire, liquide pleural, liquide céphalorachidien, etc...), suspensions liquides contenant des molécules d'intérêt, 5 particulièrement des particules, particulièrement des cellules, eucaryotes ou procaryotes, telles que milieux de culture in vitro ou des liquides de fermentation, des eaux de baignade ou de consommation, des liquides injectables. De préférence, l'échantillon utilisé dans le procédé de détection de l'invention comprend ou est susceptible de comprendre des cellules, procaryotes ou eucaryotes, 10 préférentiellement eucaryotes, préférentiellement issues du corps animal, notamment humain. Dans un tel cas, la molécule d'intérêt à détecter peut être intracellulaire ou ancrée à la membrane plasmique de la cellule. De préférence, la molécule d'intérêt est présente dans l'échantillon à une densité d'au moins 1 000 copies par cellule, plus préférentiellement d'au moins 2 500 copies par 15 cellule, plus préférentiellement encore d'au moins 5 000 copies par cellule. De préférence, la molécule d'intérêt est présente sur/dans les cellules de l'échantillon à une densité variant de 1 000 à plus de 2 000 000 de copies par cellule, plus préférentiellement de 7 500 à 1 500 000 copies par cellule, plus préférentiellement encore de 10 000 à 150 000 copies par cellule. 20 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la molécule d'intérêt est présente sur/dans les cellules de l'échantillon à une densité d'au moins 7 500 copies par cellule. Par « ligand », on désigne une macromolécule capable de se lier physiquement avec la molécule d'intérêt ciblée, et ceci de manière réversible. Cette interaction est 25 rendue possible par l'existence de zones de complémentarité entre la molécule d'intérêt et le ligand qui lui est spécifique. La liaison entre le ligand et la molécule d'intérêt se fait par l'établissement de liaisons non covalentes, par exemples par des liaisons électrostatiques, forces de Van Der Waals, liaisons ioniques ou hydrogène ou encore grâce à des interactions hydrophobes. Lorsque la molécule d'intérêt est une protéine, le 30 ligand peut alors être un anticorps, un fragment d'anticorps ou constructions dérivées 3051556 9 (Fab, Fab'2, nanobody, aptamère, affimère...). Lorsque la molécule d'intérêt est un déterminant glycosylé, le ligand peut être une lectine ou une toxine bactérienne (ex. FLAER pour son affinité pour les ancres glyco-phosphatidyl-inositol de nombreux antigènes membranaires). Lorsque la molécule d'intérêt est un lipide (ex. phosphatidyl- 5 sérine, céramide, GD2, GD3 ...), le ligand peut être une protéine affine telle que (sans limitation) une annexine, la lactadhérine, la toxine cholérique, ... Enfin lorsque la molécule d'intérêt est un haptène (biotine, DNP, poly-His ...), l'avidine, la streptavidine des anticorps anti-haptène peuvent être mis en jeu. Enfin, pour tout ligand, il est envisageable d'utiliser comme sonde l'un de ses récepteurs. Indépendamment de la 10 nature du ligand ou de la molécule d'intérêt, la stabilité d'association entre le ligand et la molécule d'intérêt est quantifiable par la détermination de la constante d'association ou d'équilibre (Ka) caractéristique de cette liaison. Cette constante est égale au rapport entre la concentration du complexe ligand-molécule d'intérêt et le produit de la concentration de ligand libre et de molécule d'intérêt libre. Pour que cette liaison soit qualifiée de 15 spécifique, elle doit être supérieure ou égale à 106 L.mo1-1. De préférence, le ligand mis en contact avec l'échantillon dans le procédé de détection de l'invention est un anticorps. Par « fluorochrome », on désigne tout type de composé capable, après avoir été irradié par un faisceau lumineux dans une gamme de longueurs d'ondes s'échelonnant de 20 l'ultra-violet à l'infra-rouge, d'émettre en retour un photon de moindre énergie. L'irradiation provoque la fluorescence qui est typiquement une illumination. L'émission de photons se produit lors des transitions électroniques d'une molécule d'un état excité résultant de l'absorption de l'énergie lumineuse vers un état fondamental (relaxation). Ainsi, l'absorption d'un photon par un fluorochrome conduit à l'émission d'un autre 25 photon de longueur d'onde plus importante et de plus faible énergie que celles du photon excitateur. En fonction de la longueur d'onde et de l'énergie du faisceau lumineux, le fluorochrome peut éventuellement atteindre différents états excités. Chaque fluorochrome possède un spectre d'absorption, un spectre d'excitation et un spectre d'émission qui lui sont propres. Le spectre d'absorption d'un fluorochrome est 30 défini par sa gamme de longueurs d'ondes absorbées, sans considération de son excitation. Le spectre d'excitation d'un fluorochrome est défini par sa gamme de 3051556 10 longueurs d'ondes induisant effectivement l'excitation et reflète également la gamme d'états excités que le fluorochrome peut atteindre. Lorsqu'on illumine (excite) le fluorochrome à une longueur d'onde correspondant à son maximum d'excitation, l'émission du fluorochrome est alors maximale. Si par contre le fluorochrome est excité à 5 une longueur d'onde différente de son maximum d'excitation, la longueur d'émission est alors la même, mais l'intensité de fluorescence est plus faible. L'efficacité de l'émission de lumière fluorescente pour un fluorochrome donné est déterminée par le rendement quantique phi (4) défini par le rapport entre le nombre de photons de fluorescence émis et le nombre de photons absorbés par le fluorochrome. 10 Ainsi, ce rendement quantique permet de différencier à une longueur d'onde donnée, l'absorption et l'excitation. Typiquement, les fluorochromes ont des rendements quantiques compris entre 0,1 et 1. Le rendement quantique (I) étant indépendant de la longueur d'onde d'excitation (loi de Kasha), la forme du spectre d'émission d'un fluorochrome est invariante quelle que soit la longueur d'onde de la source lumineuse 15 excitatrice. Toutefois, l'intensité du spectre d'émission d'un fluorochrome varie en fonction de la longueur d'onde d'excitation. L'intensité d'absorption, ou coefficient d'extinction c, ou absorbance spécifique, reflète la probabilité d'absorption : plus c est élevée et plus est élevée la fluorescence à intensité lumineuse égale. 20 L'intensité de fluorescence ou brillance d'un fluorochrome est déterminé par le produit du coefficient d'extinction et du rendement quantique. Plus ce produit est élevé et plus le fluorochrome est lumineux. Les termes fluorophore, fluorochrome ou sonde fluorescente sont équivalents et pourront être employés indifféremment. 25 Par « phycoérythrine », on désigne des protéines de la famille des phycobiliprotéines extraites des cyanobactéries, des algues rouges et de certains Cryptophytes. Les phycobiliprotéines sont constituées d'une apoprotéine liée de manière covalente à un chromophore appelé phycobiline. L' apoprotéine possède une structure monomérique comprenant deux polypeptides distincts appelés sous-unités oc et 13, 3051556 11 organisées sous forme de trimère (a(3)3 ou d'hexamère (4)6. Ces complexes typiques peuvent également contenir un troisième type de sous-unité, la chaîne y. Les caractéristiques d'absorbance des phycobiliprotéines sont dues à l'existence de groupes prosthétiques tétrapyrrole à chaine ouverte qui sont liés aux sous-unités a, fl 5 et y au moyen d'une liaison thioéther avec un résidu cystéine de l'un au moins des polypeptides. La phycoérythrobiline (PEB) et la phycourobiline (PUB) constituent les deux principaux types de groupes prosthétiques tétrapyrrole des phycoérythrines extraites à partir des algues rouges. 10 Le nombre de groupes PEB et PUB peut varier en fonction de l'origine cellulaire de la phycoérythrine. Ainsi, cinq classes de phycoérythrine ont été identifiées : la Cphycoérythrine (C-PE) lie deux PEB par sous-unité a et trois PEB par sous-unité (3, la CU-phycoérythrine (CU-PE) lie deux PEB par sous-unité a et trois PEB et une PUB par sous-unité (3, la b-phycoérythrine (b-PE) lie deux PEB par sous-unité a et quatre PEB par 15 sous-unité (3, la B-phycoérythrine (B-PE) lie deux PEB par sous-unité a, trois PEB par sous-unité p et deux PEB et deux PUB par sous-unité y, et la R- phycoérythrine (R-PE) lie deux PEB par sous-unité a, deux PEB et une PUB par sous-unité p et un PEB et trois PUB par sous-unité y. Le rapport entre le nombre de groupes PEB et PUB définit les propriétés 20 spectroscopiques des différentes phycoérythrines. Ainsi, le pic d'excitation maximale des PE varie généralement de environ 545 nm (b-PE) à environ 565 nm (R-PE). Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le fluorochrome est la phycoérythrine-R (R-PE), et de préférence la PE utilisée dans le procédé de détection de l'invention est extraite à partir d'algues rouges. 25 Comme illustré par la figure 1, le spectre d'absorption de la phycoérythrine est mesuré sur une plage de 400-450 nm à 600 nm et montre 3 pics majeurs d'absorption correspondant aux intensités maximales d'absorption situées vers 490 nm, 530 nm et 560 nm. La littérature de CMF et tous les manuels pédagogiques instruisent l'utilisateur de choisir l'un de ces 3 pics d'absorption, en tirant parti des sources lasers les plus 3051556 12 accessibles en CMF que sont le laser bleu à 488 nm, présent dans la quasi-totalité des appareils du marché actuel, vert à 530 nm et, plus récemment un laser jaune à 560 nm. Maintenant, il n'était pas connu que la très faible absorption à 400 nm environ permettrait une excitation satisfaisante de la PE et donc l'obtention d'une fluorescence applicable à 5 l'identification de sous-populations de cellules hématologiques d'intérêt diagnostique potentiel comme les blastes leucémiques dans le sang humain et qui plus est reproductible. En effet, un fluorochrome qui absorbe de la lumière à une longueur d'onde donnée n'est pas forcément excité efficacement à cette longueur d'onde. Le spectre d'excitation d'une substance est obtenu à l'aide d'un spectrofluorimètre en mesurant la 10 fluorescence émise à une longueur d'onde fixe et en laissant varier la longueur d'onde d' excitation. Le spectre d'émission de fluorescence est toujours déplacé vers les grandes longueurs d'onde relativement au spectre d'absorption. Le spectre d'émission d'une substance est obtenu en mesurant la fluorescence émise aux différentes longueurs d'onde 15 d'émission, en excitant avec une longueur d'onde fixe. Contrairement à la plupart des fluorochromes, le spectre d'émission de la PE ne correspond pas à un simple décalage vers des longueurs plus élevées de son spectre d'absorption. Comme illustré par la figure 1, le spectre d'émission de la PE est une gaussienne centrée sur 575 nm, alors que le spectre d'excitation montre une forme complexe avec une multiplicité de maxima. 20 L'émission de la PE est toutefois détectable dès 550 nm. Si la forme du spectre d'émission de fluorescence ne dépend pas de la longueur d'onde d'excitation, l'intensité du rayonnement de fluorescence est directement proportionnelle à la puissance du faisceau d'excitation absorbé par le fluorophore. Sur la base de ce spectre, l'homme de l'art a depuis toujours utilisé les longueurs 25 d'ondes correspondant aux intensités optimales ou légèrement sub-optimales d'excitation de ce fluorophore, avec soit une source lumineuse bleue, avec une longueur d'onde variant de 480 mn à 500 nm, soit une source lumineuse vert/jaune, avec une longueur d'onde variant de 530 à 565 nm. Les chromophores des PE extraites à partir des Cryptophytes contiennent 30 également de la cryptovioline (CV). C'est notamment le cas de la phycoérythrine-544 (PE-544) qui lie deux PEB et deux CV par sous-unité a et un PEB par sous-unité p. Les 3051556 13 phycoérythrine-555 (PE-555) et phycoérythrine-568 (PE-568) lie la PEB aux deux types de sous-unités a et 13. Il semble que les PE extraites à partir des Cryptophytes ne comportent pas de sous-unité y. Le spectre d'excitation des PE extraites à partir des Cryptophytes varie généralement de 544 nm (PE-544) à 568 nm (PE-568). 5 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le fluorochrome est la phycoérythrine-R (R-PE), et de préférence la PE utilisée dans le procédé de détection de l'invention est extraite à partir d'algues rouges. Des formes commerciales de la R-PE sont disponibles sous la forme de lyophilisats d'une forme déjà activée (ex. Lyo (SMCC)-RPE, ref Ll ou Li SM distribuée 10 par FEBICO) ou sous forme liquide (ex. PhycoProTmRPE, ref PB32 distribuée par PROZYME ou R-phycoerythrin, ref. P801 distribuée par INVITROGEN) ou encore le plus souvent sous forme d'un précipité au sulfate d'ammonium (FEBICO, PROZYME) à re-solubiliser et à activer extemporanément lors de l'utilisation. Le couplage du fluorochrome avec le ligand est effectué selon les techniques bien 15 connues de l'homme de l'art (M. Roederer, Conjugation of monoclonal antibodies (August, 2004 ; http://www.drmr.com/abcon/)). Brièvement, après extraction et purification de la PE, celle-ci est activée par voie chimique afin de la rendre réactive envers les groupements thiols. Le ligand subit une étape de réduction qui permet la libération de groupements thiols prêts à réagir. Le couplage covalent du ligand avec la PE 20 peut alors être effectué. Il existe des kits commerciaux contenant tous les réactifs nécessaires pour effectuer la conjugaison de la PE avec le ligand (ex. PhycoLink® R-Phycoerythrin Conjugation Kit, ref. PJ31K commercialisé par PROZYME, R-Phycoerythrin Conjugation Kit , ref. ab102918 commercialisé par AbCAM). 25 Par « dérivés de la phycoérythrine », on désigne les complexes tandems formés entre la PE et un autre composé fluorescent. L'établissement d'une liaison covalente entre la PE et ce second composé fluorescent permet un transfert d'énergie par résonnance de la PE vers ce second composé fluorescent. Dans un tel cas, la PE est appelée fluorochrome donneur et le second composé fluorescent est appelé fluorochrome 30 accepteur. Le but de ces tandems est d'obtenir un transfert d'énergie par résonance 3051556 14 (FRET) et par conséquent un grand déplacement entre l'excitation primaire du fluorochrome donneur et l'émission du fluorochrome accepteur (déplacement de Stokes). Ainsi, les complexes tandems faits sur la PE possèdent un spectre d'excitation/absorption correspondant à celui de la PE et un spectre d'émission correspondant à celui du second 5 composé fluorescent. De tels complexes tandems commerciaux actuellement disponibles sont choisis parmi la PE-TEXAS-REDTm, PE-Cy5TM, PE-Cy5.5TM, PE-Cy7TM, PEAlexafluorTm610, PE-AlexafluorTM647, PE-DyLightTM594, PE-DyomicsTm590 et RT665TM ainsi que tous les tandems PE-X avec X=tout composé fluorescent capable, après excitation par absorption du photon émis par la PE, d'émettre un photon d'une 10 longueur d'onde supérieure à celui émis par la PE seule (i.e. supérieure à 575 nm). De préférence, l'étape de mise en contact de l'échantillon avec le ligand spécifique de la molécule d'intérêt est effectuée en milieu liquide, de préférence en solution aqueuse. Par « source lumineuse », on désigne un dispositif capable d'émettre un faisceau 15 de lumière monochromatique. La source lumineuse peut être un laser, une lampe à arc ou une diode électroluminescente (LED). Les lampes à arc (ex: mercure, xénon-mercure) sont des sources lumineuses qui fournissent une lumière incohérente de quelques milliwatts. Elles émettent à des longueurs d'ondes multiples qui doivent être filtrées pour sélectionner les longueurs d'onde désirées. Pour cette raison, la plupart des cytomètres en 20 flux ont plutôt un laser voire plusieurs lasers pour source(s) lumineuse(s). Un laser fournit une lumière cohérente de quelques milliwatts à plusieurs watts, avec une longueur d'onde étroite, bien définie et spécifique. De nombreux lasers de différents types sont actuellement disponibles. Certains lasers couramment utilisés historiquement en CMF comprennent les lasers à argon (351, 454, 488, 514 nm), au krypton (406, 488, 532, 630 25 nm), hélium-néon (632 nm), hélium cadmium (325, 441 nm), les lasers Yag (532 nm) et les lasers violets (405 nm). Les progrès technologiques récents ont amenés la disponibilité de lasers beaucoup moins encombrants et de temps de vie rallongé avec la technologie dite des lasers « solid-state » ou DPSS (diode-pumped solid state), que l'on trouve aujourd'hui dans une large gamme de longueurs d'ondes proches des classiques 30 lasers à gaz, en particulier laser DPSS à 488 nm, 635 nm et à 405 nm. Les cytofluoromètres de flux du marché sont aujourd'hui couramment équipés de 3 lasers bleu, violet et rouge et cette évolution a entraîné le développement de nouveaux 3051556 15 fluorochromes excités idéalement par les lasers rouge et violet, en plus de la liste historique des fluorochromes excitables par le laser bleu, dont la PE et ses tandems. Enfin l'évolution rapide et récente de la technologie des lecteurs de CD-ROM et DVD a donné essor à des systèmes de diodes laser qui possèdent des caractéristiques et puissances qui 5 les rendent utilisables comme sources d'excitation alternatives aux lasers DPSS, avec un coût très inférieur (ratio 1 :100 voire 1 :1000) du fait de leur production industrielle en grandes séries. On trouve ainsi sur le marché des diodes laser rouges (635 nm, incluses dans les lecteurs de CD-ROM), bleues (450 nm, incluses dans les lecteurs de DVD) et maintenant bleu-violettes (405 nm, incluses dans les lecteurs blue-ray). Il est important de 10 noter qu'il n'existe pas sur le marché de lasers à diode performants et peu chers centrés à 488 nm et que de ce fait, un appareil comprenant uniquement une source laser (alternativement diode laser) à 370 nm ou 405 nm, ou deux sources violette et rouge (405 et 635 nm) sera à la fois plus compact (faible encombrement des diodes laser) et plus économique qu'un appareil réclamant la présence d'une source laser à 488 nm ou 530 nm 15 ou 560 nm. L'utilisation d'un laser à diode bleu-violet (ligne à 405 nm, http://www.lasercomponents. com/fileadmin/userupload/home/Datasheets/kimmon/blueviolet-laser-specs. pdf) peut également être envisagée pour des méthodologies biomédicales diverses, dont par exemple la CMF. Des considérations économiques et industrielles (fiabilité, moindre encombrement, facilité d'intégration) confèrent aux 20 diodes laser rouges et violettes (635 et 405 nm) un intérêt particulier pour la création d'instruments d'analyse bio-médicale. Ceci est d'autant plus intéressant avec le développement de nouveaux tests diagnostiques de type « point of care » destinés à être effectués à proximité directe du patient, en cabinet médical, dans des pharmacies ou d'autres structures médicalisées, à la condition de pouvoir disposer du résultat à bref 25 délai. De tels tests ont pour vocation de favoriser une prise en charge rapide des patients et la prescription immédiate de traitements adaptés. De préférence, ladite au moins une source lumineuse servant à l'excitation du mélange de l'étape i) dans le procédé de l'invention a une longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, de préférence entre 350 et 420 nm, de préférence encore entre 360 et 30 410 nm. 3051556 16 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite au moins une source lumineuse servant à l'excitation du mélange de l'étape i) dans le procédé de l'invention a une longueur d'onde comprise entre 400 et 410 nm et préférentiellement à 405 nm. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, ladite au moins une 5 source lumineuse servant à l'excitation du mélange de l'étape i) dans le procédé de l'invention est un laser violet ou une diode laser violette émettant à une longueur de 405 nm. L'étape ii) d'excitation du mélange de l'étape i) correspond à une illumination de celui-ci par au moins une source lumineuse. 10 Lorsque l'échantillon contient la molécule d'intérêt et que le ligand couplé à un fluorochrome s'est fixé sur celle-ci, la lumière émise par le mélange consécutivement à l'étape ii) est recueillie à une longueur d'onde égale ou supérieure à 550 nm, qui correspond au début du spectre d'émission de la PE seule. A titre d'exemple, les longueurs d'onde d'émission maximale des tandems PE-TEXASREDTM, PE-Cy5TM, PE- 15 Cy5.5TM, PE-Cy7TM, PE-AlexafluorTm610, PE-AlexafluorTM647, PE-DyLightTM594, PEDyomicsTm590 et RT665TM sont respectivement de 613 nm, 670 nm, 690 nm, 775 nm, 628 nm, 665 nm, 618 nm, 599 nm et 680 nm. Ces longueurs d'onde d'émission peuvent varier de quelques nanomètres en fonction de la source et du protocole d'extraction/purification du fluorophore. Elles représentent le centre de la zone de 20 collecte optimale de la fluorescence qui est souvent large de 20 à 50 nm, le plus souvent 30 nm, en fonction de la présence ou l'absence dans l'analyse d'autres fluorochromes de spectres proches. Un avantage significatif de l'excitation de la PE et ses dérivés avec une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 360 et 410 nm, préférentiellement 405 nm, 25 est que cela génère un déplacement de Stokes très important entre la longueur d'onde d'excitation et la longueur d'onde d'émission, permettant ainsi d'utiliser des filtres de fluorescence (pour la PE) beaucoup moins performants et couteux que ceux réclamés par une excitation avec une source lumineuse de longueur d'onde à 488 nm voire encore plus à 530 nm ou 560 nm. 3051556 17 L'étape iii) de détection de la lumière émise par le mélange après son excitation à l'étape ii) est réalisée à l'aide d'un détecteur optique qui peut être un photomultiplicateur (PMT). Dans ce cas, le signal émis sous forme de photons est converti par le photomultiplicateur en un signal électrique quantifiable. 5 Le procédé de l'invention permet en outre l'identification simultanée d'au moins une seconde, mais aussi potentiellement d'au moins une troisième, d'une quatrième, voire d'une cinquième (ou énième) molécule d'intérêt dans l'échantillon. Une telle identification repose notamment sur une utilisation d'un premier ligand couplé à la PE et d'un second, troisième, quatrième, voire cinquième ligand couplé à l'un 10 de ses tandems. La source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 mn, préférentiellement 405 nm, permet d'exciter simultanément la PE et son (ses) tandems, lesquels fournissent des fluorescences de spectres décalés. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'identification simultanée d'une seconde molécule d'intérêt peut être effectuée à l'aide d'un second fluorophore 15 excitable par une source lumineuse de même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter la PE ou l'un de ses dérivés, mais qui possède un spectre d'émission distinct de celui de la PE ou de l'un de ses dérivés. Ainsi, la source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, préférentiellement 405 nm, permet d'exciter simultanément la PE et/ou l'un de ses 20 tandems et des fluorochromes spécifiquement créés pour être excitables à de telles longueurs d'onde. Parmi ces fluorochromes on trouve notamment SYT040, DAPI, DyLight® 405, Brilliant Violet 421TM, HiLyte FluorTM 405, Pacific B1ueTM, Pacific OrangeTM, Cascade® Blue, Alexa Fluor® 405, eFluor® 450, BDTM HorizonTM V450, VioBlue®, VioGreenTM, Krome OrangeTM, Calcein Violet 450 AMTM, Zombie VioletTM, 25 Aminomethylcoumarin (AMCA) ou encore certains Q-dot® 565/605/625/655/705/800. Cette stratégie permet aussi d'associer des fluorochromes libres de droit, comme le DAPI, et la PE voire ses tandems, et donc plus économiques et plus accessibles pour des applications industrielles que des fluorochromes récemment développés pour les travaux avec un laser violet 405 nm. 3051556 18 Selon encore un autre mode de réalisation particulier, l'identification d'une seconde molécule d'intérêt peut être effectuée à l'aide d'un second fluorophore excitable par une source lumineuse de longueur d'onde distincte de celle utilisée pour exciter la PE ou l'un de ses dérivés et qui possède un spectre d'émission décalé de celui de la PE ou de 5 l'un de ses dérivés. Ce mode de réalisation particulier nécessite au moins deux sources lumineuses, l'une de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, préférentiellement 405 nm, permettant d'exciter simultanément la PE et/ou l'un de ses tandems et la seconde source lumineuse de longueur d'onde plus élevée comme par exemple un laser 530 nm ou 560 10 nm ou encore un laser/diode à 635/640 nm, permettant d'exciter un second fluorophore distinct de la PE et/ou l'un de ses dérivés. Dans tous les cas, l'homme de l'art évitera ou minimisera au maximum que le signal lumineux émit par un fluorochrome déborde dans le canal de détection qui est censé enregistrer le signal émis par un autre fluorochrome. La limitation du 15 chevauchement spectral de 2, 3, 4, 5 ou n fluorochromes permet une détection fiable de plusieurs molécules d'intérêt. Ce procédé est actuellement couramment appliqué en particulier avec un laser 488 nm qui permet en routine la mesure de 5 molécules différentes marquées par des Ac et des fluorochromes différents (e.g. FITC, PE, PETexas-Red ou ECD, PE-Cy5, PE-Cy7). 20 L'étape iv) de détermination de la présence ou non de la molécule d'intérêt dans l'échantillon repose sur la comparaison des résultats obtenus à l'étape iii) dans cet échantillon avec ceux obtenus pour un échantillon référence dont on sait qu'il ne contient pas la molécule d'intérêt. Une fois la détermination de la présence de la molécule d'intérêt établie, l'étape 25 iv) peut également servir à calculer le nombre de copies de la molécule d'intérêt dans l'échantillon. Cette étape de quantification peut être effectuée en comparaison avec une gamme étalon contenant des quantités croissantes et connues de la molécule d'intérêt ciblée. Le procédé de détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon 30 selon l'invention peut être mis en oeuvre sur un cytomètre en flux. 3051556 19 Le procédé de de détection de l'invention pourra être utilisé pour la séparation, l'analyse ou la numération de sous-populations cellulaires ou particulaires dans un échantillon biologique. Le procédé de détection de l'invention pourra être utilisé pour la séparation, 5 l'analyse ou la numération de sous-populations cellulaires ou particulaires d'origine hématopoïétique. Un second objet de l'invention concerne l'utilisation d'un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés pour la détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce que la longueur d'onde 10 d'excitation du fluorochrome est comprise entre 330 et 425 nm, de préférence entre 350 et 420 nm, de préférence encore entre 360 et 410 nm. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome est comprise entre 400 et 410 nm et préférentiellement à 405 nm. 15 L'invention est illustrée par les exemples qui suivent sans pour autant que le contenu de leur enseignement ne restreigne la portée de l'invention ni n'en constitue une limitation. EXEMPLES 1- Genèse de l'invention 20 C'est une observation fortuite qui est à l'origine de cette invention. Plus spécifiquement, et lors d'une expérience classique de réglage de compensation de fluorescence réalisée par un expert de ce type de cytomètre en flux à 3 lasers (BC GalliosTM), une fuite parasite de faible niveau dans l'un des détecteurs associés au laser violet (canal FL10) a été remarquée par l'inventeur. En l'espèce, une bille de capture d'Ig 25 de souris, du type de celle décrite dans l'exemple 2 et marquée uniquement par un conjugué PE donnait un niveau de signal non négligeable en FL10 (fluorescence entre 530 et 570 nm, filtre 550 BP40), là où la théorie aurait attendu une absence totale de fluorescence en absence de conjugué marqué au Krome-OrangeTM, fluorophore 3051556 20 compatible avec cette gamme de longueurs d'ondes d'excitation et d'émission. L'inventeur, qui n'a pas trouvé anodine cette observation a souhaité comprendre le pourquoi de cette fuite. Pour ce faire, il a fallu i) disposer d'un système similaire c'est-à-dire une bille 5 marquée uniquement en PE et ii) modifier la structure standard du banc optique de cet appareil en déplaçant des filtres. Les différents filtres du banc optique ont été changés de place manuellement pour faire passer chaque filtre devant le détecteur FL10 lié à l'excitation 405 mn. Ces modifications ont permis de vérifier que le signal maximum était obtenu avec le filtre optimisé pour la PE (575 BP 30), normalement installé en 10 liaison avec le laser bleu 488 nm et sur le détecteur FL2. En conséquence, les résultats de ce test a suggéré qu'il puisse s'agir d'un signal fluorescent issu de la PE, seul fluorochrome présent sur ce type de bille mais dans le contexte inattendu d'une excitation à 405 nm. Pour les vérifications qui ont suivi, des modifications non conventionnelles de 15 l'appareil ont été nécessaires. Ces modifications ont visé à permettre la lecture de la fluorescence de la PE simultanément sur les canaux FL2 (position normale liée à l'excitation à 488 nm, telle qu'enseignée dans les manuels d'utilisation) et FL10 (position anormale, liée à l'excitation à 405 nm), ce qui n'a pu être réalisé que par la disponibilité au même lieu de deux appareils similaires, le filtre PE du second cytomètre GalliosTM 20 étant emprunté ponctuellement pour le placer en position FL10 du premier cytomètre GalliosTM. Ces manipulations anachroniques ont permis, comme le montrent les exemples ci-après, d'illustrer la possibilité de mesurer des niveaux variés de fluorescence PE sous excitation 405 nm avec une efficacité surprenante et une résolution proche de celle obtenue avec l'excitation conventionnelle à 488 nm. 25 2 - Etude de la contamination croisée des fluorescences inter-lasers Certains dispositifs d'analyse, comme les cytomètres en flux ou les trieurs de cellules, peuvent posséder jusqu'à 6 lasers supplémentaires en plus du laser violet à 405 nm. Couramment, ces instruments sont aujourd'hui équipés de 3 lasers à savoir i) un laser bleu 488 nm, considéré comme le laser de référence temporelle et qui analyse les scatters 30 en plus de multiples fluorescences, ii) un laser rouge 640 nm qui illumine les cellules en- dessous/après le point d'illumination de référence, iii) un laser violet à 405 nm qui 3051556 21 illumine les cellules au-dessus/avant le point d'illumination de référence du laser bleu. Ce système d'illumination en points multiples permet une double séparation, optique et temporelle des fluorescences issues de chacun des points d'illumination. En effet, le signal issu de chacun des 3 lasers est i) décalé dans le temps d'un délai de l'ordre de 5 quelques dizaines de micro-secondes (classiquement 30 à 40 gs) et ii) décalé dans l'espace d'une distance de l'ordre de quelques centaines de micromètres (classiquement 100 um) ce qui permet leur focalisation différentielle par l'optique de collecte vers des fibres optiques différentes (une par laser). De ce fait, il est classiquement considéré en CMF multi-couleurs que les fluorescences issues de l'un des trois lasers sont 10 essentiellement dépourvues de contamination optique issue de l'un des deux autres lasers. 2.1 - Principe Le fonctionnement d'un cytomètre multi-lasers met en jeu l'excitation des particules à analyser par chacun des lasers de façon décalée, dans l'espace et dans le temps. Chaque cellule/particule passe successivement au-travers des faisceaux lumineux. 15 Sur cytomètre GALLIOSTM/NAVIOS (Beckman-Coulter, Villepinte, F) à 3 lasers (violet - bleu - rouge soit 405-488-640 nm), l'ordre de passage est violet - bleu - rouge, la distance entre les points d'impact est -100 lam et le délai de -30 its. La lentille de collecte des signaux lumineux à 90° (« pick-up lens ») collecte différentiellement les lumières émises aux 3 points d'impact et les focalise sur 3 entrées de fibres optiques 20 indépendantes, lesquelles conduisent ensuite la lumière vers un système optique capable de dissocier indépendamment les longueurs d'ondes issues de chacune des fibres optiques. Chaque laser travaille en routine à une puissance nominale fixe (violet 40 mWbleu 22 mW - rouge 25 mW). En intervenant dans le module Service du GALLIOSTM, il 25 est possible de modifier volontairement la puissance de chaque laser et d'étudier ainsi l'impact de la puissance d'excitation sur les signaux mesurés par le cytomètre. Ce principe a été mis à profit pour démontrer que la PE est effectivement excitable par un laser violet (405 nm) et éliminer tout risque d'artéfact qui viendrait d'une contamination croisée de fluorescences en inter-laser, en particulier une fuite de 30 fluorescence induite par le laser bleu vers les détecteurs couplés au laser violet. 3051556 22 2.2 - Calibrateurs Des billes de polystyrène d'un diamètre de 10 pm et couvertes de quantités variables de PE servent de calibrateurs : les billes Cl, C2, C3 et C4 possèdent respectivement 900, 7500, 115 000 et 1 250 000 molécules de R-PE/bille. Deux lots de 5 billes ont été synthétisés et mis en suspension dans une solution de PBS + BSA 0,1% + azide de sodium 0,1%. 2.3 - Protocole Le signal du laser bleu donne le to pour une particule et les signaux associés à cette même particule par les autres lasers sont pris à respectivement à to-30 lis (laser 10 violet) et to+30 gs (laser rouge). Outre les analyses de référence faites en conditions standards de puissances lasers (violet 40 mW- bleu 22 mW - rouge 25 mW), on a pu tester des puissances variées de: - Laser bleu : 22- 20-10-5-3-1 mW - Laser violet : 40 - 30 - 20 - 5 - 1 mW 15 Dans certains cas, il est aussi possible de couper le laser violet (via un iris commandé par le logiciel) en cours d'analyse. Maintenant, le laser bleu doit toujours rester fonctionnel puisque servant de to. Il peut être baissé en puissance mais pas totalement bloqué, à la différence des 2 autres lasers. L'agencement des filtres du banc optique a été modifié pour optimiser la détection 20 des signaux de fluorescence de la PE véhiculés par les fibres couplées aux points de focalisation respectifs des lasers bleu et violet. Dans ce montage particulier, deux exemplaires identiques d'un filtre passe-bande 575 BP 30, optimal pour la PE, sont utilisés en parallèle, l'un devant le détecteur FL2 et l'autre devant FL10. Le canal FL2 mesure ainsi le signal PE issu du laser bleu (488 nm) et passant au-travers du filtre 575 25 BP 30, derrière un dichroïque 595 DC SP. FL10 correspond aux signaux de PE issus du laser violet (405 nm) passant au-travers d'un filtre 575 BP 30 identique, après renvoi par un miroir dichroïque 480 DC SP. 2.4 - Résultats 3051556 23 Les puissances nominales des lasers bleu et violet sont respectivement de 22 mW et 40 mW (figure 2, échelle 4 décades et figure 5, échelle 5 décades). Les billes en singlets sont d'abord pré-sélectionnées par la région « beads » dans une analyse double scatter et leurs fluorescences FL2 et FL10 analysées de façon corrélée. 5 - Modulation du laser bleu (488 nm) La puissance nominale du laser bleu est réduite à 10 mW (figure 3) puis 5mW (figure 4) alors que la puissance nominale du laser violet est maintenue à 40 mW. Comme illustré par la Figure 2, on observe une : Très nette séparation des 4 pics en FL2, rapports des médianes égaux ou 10 supérieurs à 10. Séparation effective mais légèrement moins marquée en FL10 (avec rapports des médianes maxi = 8), et spécialement dans les plus bas niveaux de densité de la PE. La chute de puissance du laser bleu de 22 mW à 10 mW (figure 3), puis 5 mW 15 (figure 4) fait baisser l'intensité de tous les pics en FL2 (laser bleu) sans aucun impact sur la fluorescence en FL10 (laser violet). Cet effet se confirme pour des puissances inférieures à 5 mW, en particulier 3mW ou encore 1 mW (non illustré). Des résultats comparables ont été obtenus sur un second lot de billes de calibrateur (non illustré). La chute de puissance maximale du laser bleu (diminué à 1 mW) impose un 20 changement d'échelle sur les histogrammes pour une analyse optimale (5 décades au lieu de 4). - Modulation du laser violet (405 nm) La puissance nominale du laser violet est réduite à 10 mW (figure 6) puis 5mW (figure 7) alors que la puissance nominale du laser bleu est maintenue à 22 mW. 25 La référence (figure 5) reste identique à la figure 2 mais avec utilisation d'échelles à 5 décades. Comme le montrent les figures 6 et 7, la baisse de puissance du laser violet de 40 mW (figure 5) à 10 mW (figure 6) puis à 5 mW (figure 7) fait baisser l'intensité de tous les 3051556 24 pics en FL10 (PE issue du laser violet) sans aucun impact sur la fluorescence en FL2 (PE issue du laser bleu). De plus, le blocage du laser violet à 0 mW par un iris en cours d'analyse (figure 8) conduit à une image rassemblant les fluorescences PE (FL2 et FL10) vues dans les deux 5 conditions, avant et après blocage. On observe bien pour chaque sous-famille de billes PE la chute drastique d'intensité de FL10 pour le laser violet ouvert versus fermé, alors que celle de FL2 demeure inchangée. En conclusion, l'étude de l'impact de la puissance laser sur la répartition de fluorescence PE d'un calibrant à 4 niveaux de charge de PE montre : 10 1) Que les modulations du laser bleu n'impactent que la résolution en FL2 (PE issue du laser bleu) 2) Que les modulations du laser violet n'impactent que la résolution en FL10 (PE issue du laser violet) Ceci permet d'éliminer tout risque d' artéfact qui viendrait d'une contamination 15 croisée de fluorescences en inter-laser, en particulier une fuite de fluorescence PE induite par le laser bleu vers les détecteurs couplés au laser violet. Finalement, la linéarité des profils obtenus permet de valider le fait que la fluorescence de la PE est bien consécutive à une excitation à 405 nm et donc confirme la possible utilisation de la PE en tant que fluorochrome avec un laser à 405 nm. 20 3 - Etude de l'excitation des tandems sur PE avec un laser à 405 nm (et/ou 488 nm) 3.1 - Principe Des billes de capture d'Ig (immunoglobulines) de souris sont marquées par divers conjugués PE et/ou tandems de la PE. Les 3 niveaux de marquage ainsi produits sont 25 analysés en utilisant le même filtre passe-bande sur respectivement FL2, FL4 ou FL5 (excitation 488 nm de référence pour respectivement PE, PE-Cy5 et PE-Cy7) et sur FL10 (excitation 405 nm testée, filtrée avec le même filtre que celui utilisé pour respectivement PE, PE-Cy5 et PE-Cy7). 3051556 25 3.2 - Billes de captures Des billes de capture d'Ig (H+L) de souris d'un diamètre de 7 lim SPHEROCOMPtrol Particles, ref. CMIgP-70-3K commercialisées par SPHEROTECH, Inc. sont utilisées conformément aux instructions du fournisseur. Les trois populations de billes 5 correspondent à un témoin négatif, une bille faiblement chargée et une bille fortement chargée par l'anticorps de chèvre anti-souris et par conséquence par l'Ig de souris conjuguée. 3.3 - Protocole Les billes de capture incubées avec 20 !IL de conjugué (anticorps de souris couplé 10 à la PE ou l'un de ses dérivés PE-Cy5, PE-Cy5.5 ou PE-Cy7) à température ambiante, à l'obscurité pendant lh. Puis, on ajoute 500 lit de tampon PBS-BSA. Le même filtre passe-bande que celui de la FLi optimale du laser bleu (i.e. FL2, 4 ou 5) est pris sur un second cytomètre GalliosTM similaire à celui du test et placé sur le canal F L10. 15 3.4 - Résultats Comme illustré par la figure 9, on observe une nette séparation de tous les 3 pics non seulement en FL4, mais également en FL10 pour un anticorps de souris couplé au tandem PE-Cy5.5. Des résultats comparables ont été obtenus pour des anticorps de souris couplés à la PE, PE-Cy5 et PE-Cy7. 20 Le tableau ci-dessous reprend l'intégralité des résultats obtenus pour les 4 anticorps testés. F12, 4 ou 5 PE PE-CY5 PE-CY5.5 PE-CY7 H 0,3 1,6 0,9 4,7 I 1,6 7,1 8,5 16,9 J 46,3 154,5 194,1 330,1 R1=.1/1 29 22 23 20 R2=I/H 5 4 9 4 R3=J/H 154 97 216 70 3051556 26 F110 PE PE-CY5 PE-CY5.5 PE-CY7 AH 1,4 2,9 1 1,1 Al 2,5 9,3 4,3 3 AJ 41,2 171,2 85 54,3 R1= AJ/A1 16 18 20 18 R2= AI/AH 2 3 4 3 R3= AJ/AH 29 59 85 49 Le calcul des rapports R1, R2 et R3 rend compte respectivement de la capacité à discriminer : - RI : un échantillon fortement marqué vs faiblement marqué, 5 - R2 : un échantillon faiblement marqué vs non marqué, et R3 : un échantillon fortement marqué vs non marqué. Les valeurs des rapports montrent bien que l'excitation de la PE, PE-Cy5, PECy5.5 et PE-Cy7 par un laser violet permet une excellente discrimination entre un échantillon fortement marqué vs faiblement marqué, et à plus forte raison entre un 10 échantillon fortement marqué vs non marqué. Bien que dans une moindre mesure en comparaison de ce qui est observé lors d'une excitation par le laser bleu, il est également possible de discriminer un échantillon faiblement marqué vs non marqué. 4 - Identification de sous-populations cellulaires 4.1 - Echantillon 15 Le modèle utilisé consiste en du sang total (WB) pris sur EDTA contenant un type cellulaire anormal représenté ici par la lignée de myélome multiple LP1. Ce modèle illustre un cas de détection de cellules hématopoïétiques leucémiques qui peuvent être ici assimilées à des blastes. Les cellules LP1 ont été ajoutées à l'échantillon de sang total à une concentration 20 de 10% par rapport aux cellules blanches totales. 4.2 - Marquage des cellules 3051556 27 La caractérisation des différentes populations cellulaires présentes dans l'échantillon a été réalisée grâce à un anticorps monoclonal anti-CD45 couplé à la PE (BioCytex). La densité de CD45 est de l'ordre de 200,000 molécules/lymphocyte versus 120,000 molécules/monocyte, respectivement, 217± 64 x 103 vs 103 ± 44 x 103, selon 5 BIKOUE et al, (Cytometry, 26:137-147 (1996)). La technique consiste à incuber les cellules du sang total en présence de l'antiCD45-PE. Les globules rouges sont ensuite lysés, les cellules restantes (globules blancs) sont lavées pour éliminer le conjugué fluorescent non lié, puis analysées par cytométrie en flux. 10 4.3 - Analyse par cytométrie en flux Dans notre expérience et selon la littérature, les blastes recherchés en routine dans les formules-numérations sanguines seront le plus souvent mieux discriminés par ce système CD45 x SSC que les cellules LP1 de cet exemple, surtout si d'autres paramètres (volume, FSC) y contribuent. 15 Les cellules LP1 n'étant pas totalement isolées des granulocytes normaux (PMN) dans un graphe CD45 x SSC, on a tiré parti ici d'un paramètre complémentaire i.e. une auto-fluorescence bleue des cellules LP1 en FL9 (Ex 405 nm / Em 460/20 nm) supérieure à celles des cellules sanguines normales qui facilite leur repérage et la colorisation des sous-populations illustrées. 20 Classiquement, le paramètre « side scatter » (SS) permet la discrimination des 3 sous-populations majeures de leucocytes -i.e. lymphocytes, monocytes et granulocytes (notés aussi PMN pour polymorpho-nucléaires.). Les cellules LP1 se sur-ajoutent au tableau habituel, positionnées au même niveau de SS que les PMN, et au-dessus des PMN en paramètre « forward scatter » (FS). Le graphe FS x SS aide également à mettre 25 une fenêtre d'analyse sur les globules rouges (GR) résiduels, restés après la lyse. Les cellules marquées ont été analysées sur un cytomètre en flux GalliosTM (Beckman Coulter). L'analyse a été effectuée sur environ 30 id d'échantillon marqué, en acquiérant au minimum 7000 évènements à une vitesse de 60µL/min. pendant 30 secondes. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel informatique KALUZA® 30 (Beckman Coulter). Les voltages des PMTs FL2 et FL10 étaient respectivement de 350 V 3051556 28 et 420 V et les signaux lumineux filtrés par le même type de filtre 575 nm/30 (filtre FL10 standard remplacé par un filtre 575 nm/30) de façon à collecter sur FL2 et FL10 la fluorescence de la PE excitée respectivement par le laser bleu 488 nm et le laser violet 405 nm. 5 La stratégie d'analyse comprend tout d'abord un conditionnement de l'ensemble des cellules dans une fenêtre d'analyse taille/structure. La fluorescence en PE des différentes sous-populations cellulaires peut être visualisée sur un graphe bi-paramétrique représentant l'intensité de fluorescence en ordonnée en fonction d'un paramètre lié à la granularité des cellules (SS) et qui permet une première classification des leucocytes dans 10 l'ordre d'intensité SS, i.e. de gauche à droite lymphocytes, monocytes et granulocytes/PMN (et LP1 dans le cas de la surcharge en LP1) et en abscisse le nombre d'événements. Le logiciel rend une moyenne d'intensité de fluorescence (MFI) pour chaque tube. Les cellules de la lignée LP1 sont d'autre part isolées par l'association de deux 15 paramètres, i.e. leur taille, vue sur le paramètre FS (plus importante que les autres leucocytes) et leur auto-fluorescence détectable en FL9 (460 nm +/- 20 nm). 4.4 - Résultats - Sang normal Comme illustré par les figures 10 (A) à (D), la comparaison des graphes CD45-PE vs SS 20 montre des distributions assez similaires que la PE soit excitée par le laser bleu (488 nm/FL2) ou par le laser violet (405 nm/FL10). Les 2 conditions permettent une bonne discrimination CD45 vs SS des sous-populations cellulaires majeures du sang total. La représentation en histogrammes mono-paramétriques combinés des 4 sous-populations (Lymphocytes, monocytes, granulocytes et globules rouges résiduels, Figures 10 (E) et 25 (F)) montre que l'étagement des intensités de marquage CD45 est respecté. Après excitation de la PE à l'aide de l'un de chacun de ces deux lasers et collecte de la lumière émise sur un filtre optimal pour la PE (condition standard Ex 488 nm / Em 575/30 nm et condition testée Ex 405 nm / Em 575/30 nm), le ratio entre les MFI des sous populations cellulaires est calculé et illustré dans le tableau ci-dessous. 3051556 29 Ratios Laser 488 nm Laser 405 nm Lymphocytes/Monocytes 41/19,7 = 2,1 78,3/39,1 = 2,0 Lymphocytes/PMN 41/5,9 = 7,0 78,3/14 = 5,6 Lymphocytes/GR 41/0,6 = 68,3 78, 3/2,1 = 37,3 Monocytes/PMN 19,7/5,9 = 3,3 39,1/14 = 2,8 Monocytes/GR 19,7/0,6 = 32,7 39,1 /2,1 = 18,6 PMN/GR 5,9/0,6 = 9,8 14/2,1 = 6,7 On voit que, même s'ils sont très légèrement inférieurs dans le système 405 nm, ces ratios sont conservés et que l'étagement des MFI entre les sous-populations est respecté. Cet étagement de MFI similaire entre les deux systèmes 488 nm et 405 nm se traduit par 5 des ratios entre sous-populations assez proches. La plus grande dynamique de mesure du système standard avec excitation de la PE à 488 nm (par rapport au système découvert ici d'excitation de la PE à 405 nm) ne s'observe vraiment que lorsque l'on compare une sous-population non marquée (GR) avec les sous-populations marquées, par ex. 68 vs 37 pour les ratios Lymphocytes/GR. 10 - Sang surchargé avec des blastes leucémiques Lorsque l'analyse CD45 vs SS est pré-conditionnée pour laisser apparaître les blastes leucémiques (LP1), on observe une modification de forme du nuage des PMN, qui est comparable dans les deux systèmes i.e. excitation du CD45-PE à 488 nm (Figure 11 (C)) ou à 405 nm (figure 11 (D)), ce qui suggère que l'un et l'autre système offre la possibilité 15 de détecter des cellules pathologiques présentes dans le sang et caractérisées par un niveau d'expression CD45 anormal. De plus, les modifications sur le graphe CD45 x SS du sang et suggère que les cellules LP1 se situent dans un nuage proche (et en superposition partielle) de celui des granulocytes. La superposition des histogrammes mono-paramétriques de marquage CD45-PE sur 20 l'ensemble des sous-populations de cet échantillon sanguin (Figures 11 (E) et (F)) illustre les similitudes de distribution du marquage dans les 2 systèmes à 488 nm et 405 nm. On y voit que l'histogramme des LP1 se superpose sur celui des PMN. Après excitation de la PE à l'aide de l'un de chacun de ces deux lasers et collecte de la lumière émise sur un filtre optimal pour la PE (condition standard Ex 488 nm / Em 25 575/30 nm et condition testée Ex 405 nm / Em 575/30 nm), le ratio entre les MFI des 3051556 30 sous populations cellulaires normales et leucémique est calculé et illustré dans le tableau ci-dessous. Ratios Laser 488 nm Laser 405 nm Lymphocytes/Monocytes 41/19,7 = 2,1 78,3/39,1 = 2,0 Lymphocytes/PMN 41/5,9 = 7,0 78,3/14 = 5,6 Lymphocytes/GR 41/0,6 = 68,3 78, 3/2,1 = 37,3 Monocytes/PM N 19,7/5,9 = 3,3 39,1/14 = 2,8 Monocytes/GR 19,7/0,6 = 32,7 39,1 /2,1 = 18,6 PMN/GR 5,9/0,6 = 9,8 14/2,1 = 6,7 Lymphocytes/Blastes 41/5,2 = 7,9 78,3/13,4 = 5,8 Monocytes/Blastes 19,7 /5,2 = 3,8 39,1 /13,4 = 2,9 PM N/Blastes 5,9/5,2 = 1,13 14 /13,4 = 1,04 Blastes/GR 5,2/0,6 = 8,7 13,4 /2,1 = 6,4 Là encore, les ratios de MFI entre blastes et cellules sanguines normales sont assez 5 proches dans les 2 systèmes à 488 nm et 405 nm, montrant ainsi que la discrimination de sous-populations de cellules sanguines à valeur diagnostique est faisable même en excitant la PE à 405 nm Au final, les discriminations qui sont observées, après excitation indépendante de la PE par un laser bleu 488 nm (référence) et par un laser violet 405 nm, entre des sous- 10 populations de cellules marquées à des niveaux divers par ce fluorochrome montrent que la PE peut être utilisée comme fluorochrome avec un laser violet, en permettant d'utiles discriminations entre sous-populations cellulaires d'intérêt, comme par exemple les sous-populations de leucocytes sanguins normaux et de cellules leucémiques après un marquage par un anticorps CD45. REVENDICATIONS1. Un procédé de détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes de : i) Mise en contact de l'échantillon avec un ligand qui est spécifique de cette molécule d'intérêt et qui est couplé à un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés, ii) Excitation du mélange de l'étape i) par au moins une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, iii) Détection d'une émission de lumière par le mélange consécutivement à l'étape ii) à une longueur d'onde supérieure ou égale à 550 nm, et iv) Détermination de la présence ou non de la molécule d'intérêt dans l'échantillon au regard des résultats de l'étape iii). 2. Le procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite au moins une molécule d'intérêt est une protéine, un lipide, un glucide, une structure lipidique, glycolipidique ou un motif glucidique. 3. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel l'échantillon comprend ou est susceptible de comprendre des cellules. 4. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le ligand spécifique de ladite au moins une molécule d'intérêt est un anticorps. 5. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le fluorochrome est la R-phycoérythrine (R-PE). 6. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel ladite au moins une source lumineuse servant à exciter le mélange de l'étape i) a une longueur d'onde comprise entre 400 et 410 nm. 7. Le procédé selon la revendication 6, dans lequel ladite au moins une source lumineuse servant à exciter le mélange de l'étape i) est un laser violet ou une diode laser violette émettant à une longueur d'onde de 405 nm. 8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, lequel permet en outre l'identification simultanée d'au moins une seconde molécule d'intérêt dans l'échantillon. 9. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, lequel est mis en oeuvre sur un cytomètre en flux. 3051556 32 10. Une utilisation d'un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés pour la détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce que la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome est comprise entre 330 et 425 nm. 5 11. Une utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la séparation, l'analyse ou la numération de sous-populations cellulaires ou particulaires dans un échantillon biologique. 12. Utilisation selon la revendication précédente caractérisée en ce que les sous-populations cellulaires ou particulaires sont d'origine hématopoiétique. 10 15