Brevet FR3060418A1 — publié le 20180622

Puce micro fluidique, système utilisant une telle puce et procédé PCR pour la détection de séquences ADN. L'invention concerne une puce micro fluidique constituée d'un bloc de matériau dans lequel se trouve une cavité pouvant contenir au moins un fluide, cette cavité comportant au moins un orifice d'entrée et au moins un orifice de sortie, l'orifice d'entrée de fluide étant reliée à au moins deux canaux d'injection de fluide. io Elle concerne également un système utilisant une telle puce pour le changement rapide de température d'échange thermique avec un échantillon contenant de l'ADN ainsi qu'un procédé PCR pour la détection de séquences ADN dans un échantillon. 15 Un état de la technique détaillé concernant les différents procédés et dispositifs de permettant la détection de séquences d'ADN dans un échantillon liquide en utilisant une réaction nécessitant des cycles de température répétés (que l'on appellera ci-après « cyclage » thermique d'échantillons ADN 20 pour la réalisation d'une réaction de type « PCR » (« Polymerase chain reaction» en anglais) ou plus simplement « cyclage thermique ») est décrit par exemple dans la demande de brevet W02009/105499. Parmi ces procédés de cyclage thermique, certains utilisent 25 avantageusement un liquide caloporteur que l'on fait circuler à proximité de l'échantillon pour contrôler sa température. 3060418 - 2 - L'utilisation d'un liquide caloporteur permet d'obtenir une température de thermalisation de l'échantillon très homogène, car la convection limite l'apparition de gradients de température dans le liquide, contrairement aux solutions 5 basées sur un chauffage local ou pompage local de chaleur avec un élément thermoélectrique, qui peuvent créer localement des gradients de températures. L'utilisation d'un liquide caloporteur permet également un transfert de chaleur vers l'échantillon très efficace car il ne dépend que de la io proximité thermique de l'échantillon avec le liquide caloporteur et du coefficient de convection du liquide caloporteur qui peut être très important lorsque ce liquide est transporté dans des canalisations de faibles dimensions (canaux micro fluidiques). Par ailleurs, l'utilisation d'un liquide caloporteur permet 15 d'obtenir rapidement un contrôle précis et homogène de la température d'un échantillon ayant un volume important (supérieur au microlitre) car quelle que soit sa taille, la température de l'échantillon tend rapidement vers la température du liquide caloporteur lorsqu'il est à proximité, 20 contrairement aux systèmes basés sur l'injection d'une énergie thermique comme le chauffage par effet joule pour lesquels il est difficile de contrôler de manière homogène la température sur la seule base du contrôle de la puissance injectée. US-A-5508197 décrit la thermalisation de puits aux parois très 25 fines contenant des échantillons de PCR en faisant circuler successivement autour de ces puits des liquides caloporteurs 3060418 - 3 - préalablement « thermalisés » (c'est à dire amenés à une température précise et homogène) à différentes températures, à l'aide d'une série de vanne qui redirige les liquides provenant de réservoirs thermalisés vers plusieurs échantillons. Ce 5 système, qui. permet un changement de la température de l'échantillon en environ 8 secondes, est limité en vitesse par le transfert de la chaleur à travers les puits et le volume de 15 pl de l'échantillon, dont la géométrie et la taille ne permettent pas un transfert plus rapide. Dans ce système, le volume de liquide io utilisé pour thermaliser les échantillons est important (-150 mL), si bien que les débits de liquide sont importants (-10 L/min), les volumes de liquides dans les réservoirs doivent être importants (-25 L) pour assurer une bonne stabilité de la température. Ces contraintes de volume rendent le système 15 encombrant et très consommateur d'énergie. De plus un tel système est difficilement transportable compte tenu de sa taille. EP-A-2415855 décrit une réaction de PCR en faisant circuler successivement deux liquides caloporteurs à températures 20 différentes pour thermaliser un échantillon dans un puit réalisé dans une feuille d'aluminium fine permettant d'obtenir avec une forme aplatie des puits, des changements de température très rapides (jusqu'à 0.3 s). Les volumes de liquide utilisés dans ce système restent importants, de l'ordre de plusieurs dizaines de 25 millilitres et le débit également (plus de 60 mL/min) ce qui en 3060418 - 4 - fait encore un système encombrant et consommateur d'énergie. WO 2011/138748 décrit une puce micro fluidique et un système de régulation de la température d'un échantillon 5 comportent une pluralité de canaux micro fluidiques disposés au fond d'une cavité de forme généralement parallélépipédique et comportant une paroi inférieure de faible conductivité thermique pour éviter les pertes thermiques lors de son utilisation et une paroi supérieure de forte conductivité lo thermique sur laquelle est déposée un échantillon à analyser , permettant un bon échange thermique entre le liquide caloporteur circulant dans les canaux et l'échantillon. Le liquide caloporteur est injecté à travers un orifice d'entrée dans les canaux micro fluidiques et récupéré à travers un 15 orifice de sortie à l'autre extrémité des canaux micro fluidiques. La température du liquide caloporteur est régulée en amont de l'orifice d'entrée à l'extérieur et à distance de la puce. Un exemple d'un procédé de fabrication d'une puce de ce type est décrit sur le site internet de la société ELVESYS à l'adresse 20 www.elveflow.com dans l'article intitulé « la micro fluidique et les puces micro fluidiques : Revue ». Ce type de puce a été utilisé par les auteurs Houssin et al. d 'un article publié en 2016 par « The royal society of chemistry 2016 » sous le titre « Ultrafast sensitive and large volume on- 25 chip real time PCR for the molecular diagnosis of bacterial and viral infections », dans lequel ils décrivent la mise en oeuvre 3060418 - 5 -- d'un procédé de « cyclage » thermique pour réaliser une réaction de PCR qui n'est pas entièrement satisfaisant : le changement de température de l'échantillon est réalisé en faisant circuler alternativement dans la puce micro fluidique, 5 qui contient une zone d'échange de chaleur avec l'échantillon, deux liquides caloporteurs thermalisés auparavant à l'aide de deux modules thermoélectriques (dispositifs à effet Peltier). Par échange thermique entre la puce et l'échantillon, on réalise cette alternance de température de l'échantillon liquide, lo permettant ainsi d'amplifier une séquence d'ADN présente dans l'échantillon. Si ce système permet de réaliser des thermalisations rapides (de l'ordre de 2s. également) avec un débit de liquide faible (de l'ordre de 10 mL/min ou 160 pL/s), les performances de ce 15 système restent limitées par le volume et la thermalisation des canalisations alimentant la puce. En effet, lorsque le liquide ne circule pas dans la puce, la température des canalisations (le diamètre d'une canalisation micro fluidique varie du micron à plusieurs centaines de microns) qui ont un faible volume, donc 20 une faible inertie thermique, tend en quelques secondes vers la température ambiante. Lorsque le liquide circule à nouveau, il faut tout d'abord évacuer tout le liquide à température proche de l'ambiante qui se trouve dans la canalisation (ce qui d'après les expériences conduites par les inventeurs prend environ 0.5 25 seconde), puis « thermaliser » la canalisation, c'est à dire l'amener à une température stable, ce qui d'après les 3060418 - 6 - expérimentations conduites par les inventeurs, prend de quelques secondes à quelques dizaines de secondes. Avant d'atteindre cette stabilité, la température du liquide injecté dans la puce est perturbée par le transfert de chaleur vers la 5 canalisation. Ainsi, il faut environ deux secondes pour réaliser 95% du changement de température souhaité mais une dérive de la température pouvant atteindre plusieurs degrés est observée sur un temps plus long en fonction des conditions, typiquement de l'ordre de la dizaine de secondes. Cette dérive io de température n'étant pas reproductible puisqu'elle dépend de la température de la canalisation avant le changement imposé de température, il n'est donc pas possible avec ce système d'obtenir un contrôle rapide et précis de la température d'un échantillon avec de petits débits permettant la miniaturisation 15 du système et le rendant ainsi aisément transportable. Les différentes solutions de changement de température rapide proposées dans l'art antérieur utilisant des liquides caloporteurs ne permettent donc pas à ce jour, un contrôle rapide de la 20 température d'un échantillon(c'est à dire en moins de cinq secondes environ), précis, homogène, reproductible et peu consommateur d'énergie et utilisant un appareillage peu encombrant. Pourtant, les besoins actuels de tests rapides d'orientation du 25 diagnostic nécessitent de pouvoir réaliser des réactions telles que la PCR en quelques minutes dans un dispositif léger et peu 3060418 - 7 - consommateur d'énergie, qui puisse fonctionner éventuellement sur le site (« on-site ») c'est à dire ayant d'une part une petite taille et pouvant éventuellement d'autre part être alimenté par une batterie. 5 Sachant qu'une analyse de type PCR nécessite entre 30 et 40 cycles de température dont la durée minimale pour chaque cycle est de l'ordre de 8 s, chaque seconde gagnée sur la durée du changement de température de l'échantillon est un gain significatif sur la durée totale de ce type de test. lo Par ailleurs, la complexification des kits de détection moléculaires basés sur la PCR, notamment pour la détection multiplexe, impose le contrôle précis des températures aux différentes phases du cycle pour fonctionner correctement. 15 La puce micro fluidique, le système et le procédé selon l'invention permettent de résoudre le problème ainsi posé. La puce micro fluidique selon l'invention est constituée d'un bloc de matériau dans lequel sont disposées successivement : - une zone d'injection de fluide (201) comportant au moins un 20 canal micro fluidique d'injection de fluide (4, 5), - une cavité (202) de forme parallélépipédique ayant une face supérieure comprenant une zone d'échange thermique (204) munie d'une zone de thermalisation (22) de surface S au niveau de la face supérieure de la cavité, la zone de 25 thermalisation (22) comprenant au moins un canal micro- fluidique (11) de circulation de fluide, cette cavité (202) étant 3060418 - 8 - munie d'au moins un orifice d'entrée de fluide (10) issu de la zone d'injection de fluide (201) et d'au moins un orifice de sortie de fluide (30), entre lesquels s'étend la zone d'échange thermique (204) caractérisée en ce qu'elle comporte en outre 5 au moins un canal micro fluidique (6, 7) de contournement de la cavité (202), relié par une première extrémité à l'un au moins des canaux micro fluidiques d'injection de fluide (4, 5), l'embranchement (8, 9) du canal de contournement (6, 7) sur le canal d'injection de fluide (4, 5) étant situé à une distance L de l'orifice d'entrée de fluide (10) de la cavité, la distance L entre chaque embranchement (8, 9) et l'orifice d'entrée de fluide étant telle que : L La puce comportera de préférence au moins deux canaux micro fluidiques d'injection du fluide (4, 5). Selon un mode préférentiel de réalisation, la puce comportera le même nombre, de préférence deux, de canaux d'injection et de canaux de contournement, chaque canal de contournement étant relié à un seul canal d'injection. 3060418 - 9 - Avantageusement, la cavité comportera une pluralité de canaux de circulation de fluides disposés parallèlement pour éviter la formation de bulles. Selon un autre mode de réalisation la puce est caractérisée en 5 ce que la cavité comporte en outre une zone d'homogénéisation d'entrée (203) située entre l'orifice d'entrée (10) et l'entrée de fluide (10 bis) dans les canaux micro fluidiques (11) de circulation de fluide correspondant à la zone d'échange thermique (204) de manière à homogénéiser lo notamment la vitesse du fluide avant son injection dans les canaux de circulation de fluide (11). Cette zone d'homogénéisation d'entrée (203) pourra par exemple comporter un arbre d'homogénéisation créant une pluralité de chemins d'écoulement pour le fluide entre l'orifice 15 d'entrée (10) et l'entrée de fluide (10 bis), ces chemins étant sensiblement de même longueur. Selon une autre variante, la puce sera constituée par un bloc de matériau parallélépipédique dont la cavité (202) est fermée par une plaquette supérieure (41), solidaire ou indépendante 20 des parois latérales de la cavité (202) cette plaquette (41) ayant une face supérieure destinée à être en contact avec l'échantillon et ayant de préférence une épaisseur inférieure à 0,002 m. La plaquette supérieure est soit intégrée à la puce, soit indépendante et rajoutée sur la puce lors de l'utilisation. 25 Cette plaquette supérieure (41) pourra par exemple être en verre et/ou en métal. 3060418 - 10 - Selon encore une autre variante, la cavité pourra comporter en outre une zone d'homogénéisation de sortie (205) située entre la sortie de fluide (30 bis) des canaux micro fluidiques (11) et l'orifice de sortie de fluide (30) de la cavité (202), de manière à 5 homogénéiser notamment la température du fluide avant son injection dans l'orifice de sortie (30) de fluide. Selon un mode préférentiel de réalisation, la zone d'homogénéisation de sortie (205) comportera un arbre d'homogénéisation créant une pluralité de chemins 10 d'écoulement pour le fluide entre la sortie de fluide (30 bis) des canaux micro fluidiques (11) et l'orifice de sortie de fluide de la cavité (30), ces chemins étant sensiblement de même longueur. De préférence, l'épaisseur de la cavité (202) parallélépipédique 15 sera inférieure à 0,001 m, de préférence inférieure ou égale à 500 micromètres. Selon encore une autre variante, la puce comportera au moins une vanne disposée dans au moins un de ses canaux d'injection et/ou de contournement. 20 De préférence, une vanne distributrice à trois voies de type 3/2 est positionnée à l'entrée de la cavité permettant de commuter la source du liquide entrant dans la cavité entre deux entrées de liquides à températures différentes, tandis que deux vannes de type 2/2 situées respectivement sur les deux canaux de 25 contournement permettent de fermer ces canaux lorsque le liquide d'un canal est orienté vers la zone de thermalisation 3060418 dans la cavité. Dans cette configuration, la voie commune (sortie) de la vanne 3/2 est reliée à l'entrée de la cavité et les deux autres voies (entrées) sont reliées respectivement aux canaux d'injection de fluide (4,5). Une vanne distributrice 5 possédant n positions (n supérieur à deux) associée à n vannes de type 2/2 pourra être utilisée suivant le même schéma pour commuter la source de liquide entrant dans la cavité entre les canaux. Selon une autre variante de réalisation, il est possible d'utiliser lo plusieurs vannes de type 3/2 positionnées sur les embranchements ( 8,9) permettant de rediriger le liquide en provenance des canaux d'injections (4,5) soit vers la cavité, soit vers les canaux de contournement (6,7). Dans cette configuration, la voie commune de chaque vanne de type 3/2 15 est reliée au canal d'injection de liquide (4,5) correspondant et les 2 autres voies de ces mêmes vannes sont reliés à la cavité d'une part et à la voie de contournement correspondante d'autre part. Un autre mode de réalisation consiste à positionner des vannes 20 2/2 sur chacune des voies de contournement (6,7) et des portions de canal situés entre la zone de thermalisation (22) et les embranchements (21,24) de manière à pouvoir rediriger les liquides injectés soit dans la zone de thermalisation, soit dans les canaux de contournements. 25 Préférentiellement, les vannes sont intégrées à la puce. Pour cela, des vannes miniatures de type à montage sur embase 3060418 - 12 - (par exemple des vannes de la série LVM09 du fabricant SMC) peuvent être montées directement sur la puce, ou des vannes à commande par pression ou par solénoïde peuvent être intégrées dans la puce de manière à minimiser la longueur des 5 chemins fluidiques (21, 24) situés entre la zone de thermalisation (22) et les embranchements (8,9) avec les canaux de contournement. L'invention concerne également un système microfluidique comportant une puce telle que décrite ci-avant, ayant de lo préférence un premier film conducteur thermique disposé au- dessus de la cavité et fermant celle-ci de manière étanche sur lequel est fixé, de préférence collé un porte échantillon destiné à recevoir le réactif de PCR mélangé à l'échantillon d'ADN à analyser 15 Le film de matériau conducteur de la chaleur pourra par exemple être disposé au moins partiellement sur la surface plane de la puce et maintenu, par exemple, sous pression sur celle-ci de manière à assurer l'étanchéité au niveau du liquide caloporteur au contact du film. 20 Selon une variante, le porte échantillon comportera un second film de matériau conducteur de la chaleur dans sa partie inférieure, destiné à être au contact du premier film. De préférence, le système selon l'invention comportera également des moyens pour faire circuler au moins un liquide 25 caloporteur sous pression dans les canaux. 3060418 - 13 - Selon un mode préférentiel de réalisation, le système selon l'invention comportera des moyens pour faire circuler une pluralité, de préférence deux liquides caloporteurs à différentes températures dans les canaux d'injection et/ou les canaux de 5 contournement et alimenter alternativement la cavité avec l'un de ces liquides tandis que les autres liquides caloporteurs, de préférence un seul, circuleront dans les canaux d'injection jusqu'à l'embranchement puis dans les canaux de contournement associés. 10 En règle générale mais sans que cela soit cependant nécessaire, l'alimentation alternative de la cavité par différents liquides caloporteurs s'effectuera en faisant varier les pressions respectives des liquides caloporteurs. Selon une variante, l'alimentation alternative de la cavité par 15 différents liquides caloporteurs s'effectuera à l'aide de vannes disposées dans les différentes canalisations. L'invention concerne également un procédé pour réaliser une réaction de type PCR utilisant de préférence la puce décrite ci-avant, avec ou sans le porte échantillon décrit ci-avant, dans 20 lequel on place un échantillon d'ADN alternativement en contact thermique indirect avec au moins un premier et un second liquides caloporteurs à températures différentes circulant dans des canaux micro fluidiques et alimentant alternativement une cavité permettant un échange thermique 25 avec l'échantillon, procédé dans lequel lorsque l'un des liquides est envoyé vers la cavité, l'autre liquide contourne la cavité et 3060418 - 14 - vice-versa, les deux liquides pénétrant alternativement dans la cavité par une canalisation d'alimentation possédant un embranchement permettant au liquide d'aller soit dans la cavité, soit de contourner la cavité, la distance entre 5 l'embranchement et l'entrée de la cavité étant inférieure à 0,02 mètre. De préférence ce procédé utilisera une puce et/ou un système tels que décrit dans cette demande. D'une manière générale, l'entrée et/ou la sortie de la cavité 10 comporteront un réseau d'équilibrage des pressions (arbre d'homogénéisation) en entrée (et/ou en sortie) de la zone de thermalisation (échange de chaleur avec l'échantillon), constitué d'une succession de divisions du canal entre les orifices d'entrée et/ou de sortie et les entrées et/ou sorties de 15 fluide des canaux de circulation de fluide de manière à ce que le chemin parcouru par le fluide entre les orifices et/ou les entrées/sorties de fluide,( donc la résistance à l'écoulement du fluide) soit sensiblement identique sur toute la distance séparant les orifices d'entrée et/ou de sortie de fluide. Cet 20 arbre d'homogénéisation permet un flux sensiblement parallèle de fluide de vitesse homogène sur toute la surface S, ce qui permet une convection homogène sur toute la surface d'échange S permettant une vitesse, et plus précisément une cinétique (courbe de l'évolution dans le temps) du changement 25 de température spatialement homogène. 3060418 - 15 - Le matériau choisi pour réaliser la puce pourra être très varié dès lors que l'on peut créer le réseau de canaux nécessaire par usinage, moulage, à l'aide d'une imprimante 3D, etc...De préférence il pourra être choisi notamment parmi les 5 polymères, tels que le PDMS ou le polycarbonate, la céramique, le verre et/ou une combinaison de ceux-ci. Selon un mode préférentiel, le bloc constituant la puce comportera au moins une cavité dont les parois définissent une surface supérieure plane sur laquelle débouchent une pluralité io de canaux de préférence disposés sensiblement parallèlement entre eux et constituant la cavité, tandis que, selon une variante de réalisation, la surface plane sera surmontée d'une plaquette mince ou d'un film de matériau bon conducteur de la chaleur, de préférence en métal ou en verre, de manière à 15 fermer la cavité. Cette plaquette et/ou ce film seront soit solidaires des parois latérales de la cavité soit posés sur les bords supérieurs de ces parois et maintenus par pression et/ou par gravité de façon à être mobiles et séparables de la puce proprement dite. 20 Selon une autre variante de réalisation, la puce comportera au moins une vanne disposée dans au moins un de ses canaux. De préférence, elle comportera une vanne par canal d'alimentation en liquide et une vanne par canal de contournement. Bien entendu ces vannes ne sont pas nécessairement intégrées dans 25 la puce et peuvent être localisées hors de la puce, dans les 3060418 - 16 - canalisations d'alimentation de fluide ou dans les canalisations de contournement. L'invention concerne également un système micro fluidique comportant une puce telle que décrite ci-avant, un premier film 5 conducteur thermique disposé sur la cavité de façon à fermer celle-ci et un porte échantillon posé sur ce film (ou plaquette) destiné à recevoir l'échantillon d'ADN à analyser. Selon une première variante, l'alimentation alternative de la cavité par différents liquides caloporteurs s'effectue en faisant lo varier les pressions respectives des liquides caloporteurs. Ainsi, lorsque les canaux d'alimentation en liquide caloporteur se rejoignent, avant l'entrée dans la cavité, c'est le liquide ayant la pression la plus élevée qui forcera le passage vers cette cavité, le ou les autres liquides se trouvant stoppés et détournés vers 15 l'embranchement correspondant permettant leur circulation continue (avec ou sans retour vers les réservoirs d'alimentation en liquide caloporteur). En général, le liquide caloporteur qui pénètre dans la cavité s'écoulera simultanément dans le canal de contournement qui lui est associé. 20 Selon une seconde variante du système selon l'invention, l'alimentation alternative de la cavité par différents liquides caloporteurs s'effectuera à l'aide de vannes disposées dans les différentes canalisations. On disposera alors généralement mais pas nécessairement, au 25 moins une vanne dans chaque canal d'alimentation en liquide caloporteur, en aval de chaque embranchement, mais en 3060418 - 17 - amont de l'embranchement entre les différents canaux d'alimentation en liquide caloporteurs lorsque ceux ci se rejoignent avant d'atteindre la cavité. Cette vanne pourra éventuellement être une vanne de type 3/2 située au niveau de 5 l'embranchement et permettant, pour chaque canal d'alimentation, d'orienter le liquide soit vers le canal le contournement, soit vers la cavité. Le système pourra également comporter de préférence plusieurs sources de liquides caloporteurs dont les lo températures respectives sont contrôlées indépendamment par des moyens de contrôle de la température du liquide caloporteur. Les sources de liquide caloporteur comportent en outre un moyen de circulation du liquide (pression, pompe, etc..), qui peut être disposé en amont ou en aval des moyens 15 de contrôle de température. Le système pourra également comporter des canalisations de transfert permettant de transporter le liquide caloporteur d'une source de liquide caloporteur aux entrées d'injection de la puce. 20 Les moyens de contrôle de la température du liquide caloporteur peuvent être constitués par un bain de liquide contrôlé en température ou un contrôleur de température en ligne utilisant, l'un et l'autre un système de chauffage à effet joule ou un dispositif thermoélectrique pour modifier la 25 température du liquide circulant ainsi qu'un capteur de température permettant de contrôler la température 3060418 - 18 - précisément en boucle fermée à l'aide d'un contrôleur (par exemple de type PID). Préférentiellement, les moyens de circulation du liquide sont disposés en amont de la puce de manière à éviter un transfert 5 de chaleur parasite entre les moyens de circulation et le liquide caloporteur, qui pourrait modifier de manière imprévisible la température du liquide avant qu'il ne pénètre dans la zone d'échange. Ces moyens de circulation peuvent être communs à l'ensemble des sources de liquide caloporteur. Ils peuvent être lo constitués par une source de pression permettant de pousser le liquide caloporteur dans un réservoir ou une pompe, qui permet avantageusement la recirculation du liquide. Le système comportera en outre de préférence des moyens de commutation du chemin pris par le liquide caloporteur de 15 manière à ce que chaque liquide caloporteur passe soit par la zone d'échange, soit par le canal de contournement. Dans toute la description, les termes suivants auront en outre la signification suivante : -Thermalisation d'un échantillon (ou thermaliser en général) 20 signifie en modifier la température de manière à ce que la température de l'échantillon atteigne une température voulue. -Vitesse de changement de température d'un échantillon d'une température T1 à une température T2 différente de T1, signifie le temps nécessaire pour que l'échantillon passe de la 25 température T1 à une température effective T2eff tel que (T2- T2eff)/(T2-T1) e 5%. 3060418 - 19 - -Un changement de température est dit reproductible si les profils de changement de température dans le temps pour deux changements de températures successifs peuvent se 5 superposer quelque soient les conditions précédentes de changement de température (superposition sur l'axe des températures à 5% près du différentiel de température ou superposition sur l'axe du temps à 5% près de la vitesse de changement de température). o -Arbre d'homogénéisation signifie un réseau microfluidique, typiquement constitué d'une série de division d'un canal, permettant d'homogénéiser le débit suivant sur le grand axe de la section d'une chambre de taille importante par rapport à la taille d'une entrée (ou sortie) de liquide dans cette chambre. 15 Il est important de noter que la zone d'homogénéisation ou arbre d'homogénéisation fait partie de la longueur L(autrement dit, que la zone d'échange thermique ou de thermalisation de surface S n'englobe pas les zones éventuelles d'homogénéisation) 20 L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples de 25 réalisation suivants donnés à titre non-limitatif conjointement avec les figures qui représentent : 3060418 - 20 - - la figure 1, un exemple de réalisation d'une puce micro fluidique selon l'invention, - les figures 2a, 2b et 2c, une variante de réalisation de la puce de la figure 1, dans laquelle on a intégré des vannes de commutation de fluide, - La figure 3, représente sur les figures 3a, 3b, 3c d'autres variantes de la puce associées à un porte échantillon 10 contenant un échantillon à analyser, selon le système de l'invention, - Les figures 4a et 4b, deux variantes du système selon l'invention dans lesquelles les différents liquides caloporteurs circulent alternativement grâce à un ensemble 15 de vannes (fig. 4a) ou grâce aux variations de pression imposées aux liquides (fig. 4b) - La figure 5, une autre variante du système selon l'invention dans laquelle tous les liquides des canaux de contournement sont récupérés dans le même récipient, 20 - La figure 6, une autre variante avec un système de thermalisation des liquides caloporteurs à l'aide de pompes, - Les 7a à 7d, une autre variante avec une puce de thermalisation représentée en trois dimensions et équipée 25 des vannes miniatures de type à montage sur embase. 3060418 - 21 - Les figure 8a et 8b, la réalisation d'un cycle de PCR et le signal de fluorescence obtenu. Sur l'ensemble des figures, les mêmes éléments portent les mêmes références. 5 Sur la figure 1, est représentée schématiquement une puce micro fluidique 1 d'échange de chaleur entre les liquides caloporteurs lorsque ceux-ci sont injectés dans la puce et l'échantillon (ADN par exemple), non représenté sur cette lo figure, en contact avec la puce. La puce 1 est constituée d'un bloc de matériau en forme de parallélépipède ayant une face supérieure, comprenant une zone d'échange thermique 204 munie d'une zone de thermalisation (échange de chaleur) 22 de surface S (entourée d'un trait en pointillés sur les figures) 15 vers laquelle convergent des canaux d'injection 4, 5 de liquide caloporteur. La zone d'injection de fluide 201 comporte une canalisation 15 d'un premier liquide caloporteur reliée à la puce 1 par l'intermédiaire d'un premier port de connexion 2 tandis qu'une 20 seconde canalisation 14 est reliée à la puce 1 par l'intermédiaire d'un second port de connexion 3. Les ports d'entrée 2 et 3 sont respectivement reliés aux canaux d'alimentation 4 et 5 se prolongeant respectivement jusqu'aux embranchements 8 et 9, auxquels sont reliés également 25 respectivement les canaux de contournement 6 et 7 qui se prolongent respectivement jusqu'aux ports de sortie 16 et 17 3060418 - 22 - permettant l'évacuation de liquide caloporteur vers les canalisations de contournement 18 et 19 respectivement. (les canaux d'alimentation peuvent être les canaux de contournement et vice-versa). 5 Chaque embranchement 8, 9 se prolonge par une portion de canal d'alimentation 20, 21 respectivement qui se rejoignent en leurs autres extrémités à l'entrée 10 de la cavité 202 pour introduire le liquide caloporteur dans la zone d'homogénéisation d'entrée 203 qui comporte un arbre o d'homogénéisation du liquide 29a (afin de lui conférer une bonne homogénéité de débit à l'entrée de la zone de thermalisation 22). La zone d'échange thermique 204 comprend la zone de thermalisation 22 proprement dite, de préférence constituée d'une pluralité de canaux parallèles 11, 15 de préférence régulièrement répartis sur sensiblement toute la largeur de la puce, dans la zone 22 destinée au contact avec l'échantillon à analyser. A l'autre extrémité de ces canaux 11, le liquide caloporteur est récupéré à la sortie 30 bis de la zone de thermalisation 22 (qui fait partie de la zone d'échange 20 thermique 204 ) puis après passage dans la zone d'homogénéisation de sortie 205 comportant un arbre d'homogénéisation 29b semblable de préférence à celui 29a disposé dans la zone d'homogénéisation d'entrée 203, est récupéré au niveau de la zone de sortie de fluide 206 via le 25 port de connexion 12 de la puce 1 dans la canalisation de sortie 3060418 - 23 - 13 (les canalisations 13, 14, 15, 18 et 19 ne font pas partie dans cet exemple de la puce 1). Selon une variante de réalisation, on prévoit une sortie indépendante par liquide à différentes températures, par 5 exemple à l'aide d'une ou plusieurs vannes après le port de connexion 12 permettant d'orienter le liquide dans différents réservoirs afin de limiter le mélange entre les liquides de différentes températures). Chaque canal d'injection 4, 5 comporte un embranchement 8, 9 vers une sortie 16, 17 de o liquide supplémentaire permettant de faire circuler le liquide caloporteur en continu dans la canalisation 18, 19 en amont de la puce 1 et stabiliser ainsi la température de ce liquide afin d'éviter de créer des perturbations dues au changement de température de liquide caloporteur. 15 La distance L entre les embranchements 8 et 9 et la zone de thermalisation 22 dépend des caractéristiques thermiques de la puce et doit être tel que : L REVENDICATIONS1 - Puce micro fluidique constituée d'un bloc de matériau dans lequel sont disposées successivement : - une zone d'injection de fluide (201) comportant au moins un canal micro fluidique d'injection de fluide (4, 5), - une cavité (202) de forme parallélépipédique ayant une face supérieure comprenant une zone d'échange thermique (204) lo munie d'une zone de thermalisation (22) de surface S au niveau de la face supérieure de la cavité (202), la zone de thermalisation (22) comprenant au moins un canal micro-fluidique (11) de circulation de fluide, cette cavité (202) étant munie d'au moins un orifice d'entrée de fluide (10) issu de la 15 zone d'injection de fluide (201) et d'au moins un orifice de sortie de fluide (30), entre lesquels s'étend la zone d'échange thermique (204) caractérisée en ce qu'elle comporte en outre au moins un canal micro fluidique (6, 7) de contournement de la cavité (202), relié par une première extrémité à l'un au 20 moins des canaux micro fluidiques d'injection de fluide (4, 5), l'embranchement (8, 9) du canal de contournement (6, 7) sur le canal d'injection de fluide (4, 5) étant situé à une distance L de l'orifice d'entrée de fluide (10) de la cavité, la distance L entre chaque embranchement (8, 9) et l'orifice d'entrée de 25 fluide étant telle que : L 2-Puce micro fluidique selon la revendication 1, caractérisée en 5 que L 3-Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que chaque canal d'injection de fluide (4, 5) est relié à au moins un canal de contournement (6, 7). 4-Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins deux canaux micro fluidiques d'injection du fluide (4, 5). 5-Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte le même nombre, de préférence deux, de canaux d'injection (4, 5) et de canaux de contournement (6, 7), chaque canal de contournement étant relié à un seul canal d'injection. 6-Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la cavité comporte en outre une zone d'homogénéisation d'entrée (203) située entre l'orifice d'entrée (10) et l'entrée de fluide (10 bis) dans les canaux micro fluidiques (11) de circulation de fluide correspondant à la zone d'échange thermique (204) de manière à homogénéiser notamment la température du fluide avant son injection dans les canaux de circulation de fluide (11). 7-Puce selon la revendication 6, caractérisée en ce que la zone d'homogénéisation d'entrée (203) comporte un arbre 3060418 - 45 d'homogénéisation créant une pluralité de chemins d'écoulement pour le fluide entre l'orifice d'entrée (10) et l'entrée de fluide (10 bis), ces chemins étant sensiblement de même longueur. 5 8-Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la puce est constituée par un bloc de matériau parallélépipédique dont la cavité (202) est fermée par une plaquette supérieure (41), solidaire ou indépendante des parois latérales de la cavité (202) cette plaquette (41) ayant une face o supérieure destinée à être en contact avec l'échantillon et ayant de préférence une épaisseur inférieure à 0,002m. 9-Puce selon la revendication 8, caractérisée en ce que la plaquette supérieure (41) est en verre et/ou en métal. 15 10-Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la cavité comporte en outre une zone d'homogénéisation de sortie (205) située entre la sortie de fluide (30 bis) des canaux micro fluidiques (11) et l'orifice de sortie de fluide (30) de la cavité (202), de manière à 20 homogénéiser notamment la température du fluide avant son injection dans l'orifice de sortie (30) de fluide. 11-Puce selon la revendication 10, caractérisée en ce que la zone d'homogénéisation de sortie (205) comporte un arbre d'homogénéisation créant une pluralité de chemins 25 d'écoulement pour le fluide entre la sortie de fluide (30 bis) des canaux micro fluidiques (11) et l'orifice de sortie de fluide de la 3060418 - 46 - cavité (30), ces chemins étant sensiblement de même longueur. 12-Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'épaisseur de la cavité (202) 5 parallélépipédique est inférieure à 0,001 m, de préférence inférieure ou égale à 500 micromètres. 13-Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une vanne disposée dans au moins un de ses canaux d'injection et ou de io contournement. 14-Puce selon la revendication 13, caractérisée en ce que au moins une vanne est à commande pneumatique. 15-Système micro fluidique caractérisé en ce qu'il comporte une puce selon l'une des revendications précédentes, un 15 premier film conducteur thermique disposé au-dessus de la cavité et un porte échantillon destiné à recevoir l'échantillon d'ADN à analyser 16-Système selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comporte un film de matériau conducteur de la chaleur disposé 20 au moins partiellement sur la surface plane de la puce et maintenu sur celle-ci de manière à assurer l'étanchéité au niveau du liquide caloporteur au contact du film. 17-Système selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce que le porte échantillon comporte un second 25 film de matériau conducteur de la chaleur dans sa partie inférieure, au contact du premier film. 3060418 - 47 - 18-Système selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il comporte également des moyens pour faire circuler au moins un liquide caloporteur sous pression dans les canaux. 19-Système selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il 5 comporte des moyens pour faire circuler une pluralité, de préférence deux liquides caloporteurs à différentes températures dans les canaux d'injection et les canaux de contournement et alimenter alternativement la cavité avec l'un de ces liquides tandis que les autres liquides caloporteurs, de io préférence un seul, circulent dans les canaux d'injection jusqu'à l'embranchement puis dans les canaux de contournement associés. 20-Système selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'alimentation alternative de la cavité par différents liquides 15 caloporteurs s'effectue en faisant varier les pressions respectives des liquides caloporteurs. 21-Système selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que l'alimentation alternative de la cavité par différents liquides caloporteurs s'effectue à l'aide de vannes 20 disposées dans les différentes canalisations. 25 3060418 48 22-Procédé pour réaliser une réaction de type PCR dans lequel on utilise une puce et/ou un système selon l'une revendications 1 à 21,dans lequel on place un échantillon d'ADN alternativement en contact thermique indirect avec au moins un premier et un second liquides caloporteurs à températures différentes circulant dans des canaux micro fluidiques et alimentant alternativement une cavité permettant un échange thermique avec l'échantillon, caractérisé en ce que lorsque l'un des liquides est envoyé vers la cavité, l'autre liquide contourne la cavité et vice-versa, les deux liquides pénétrant alternativement dans la cavité par une canalisation d'alimentation possédant un embranchement permettant au liquide d'aller soit dans la cavité, soit de contourner la cavité, la distance entre l'embranchement et l'entrée de la cavité étant inférieure à 0,02 mètre.