Brevet FR3061205A1 — publié le 20180629

Modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire différencié à partir de sébocytes humains primaires La présente invention concerne un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire. Les troubles de la peau grasse/sèche sont principalement dus à un dysfonctionnement de l'unité pilosébacée, incluant une production anormale de sébum. Identifier des solutions à ces troubles implique la conception de modèles biologiques compatibles avec le criblage de composés chimiques ou biologiques, en particulier des modèles in vitro d'épithélium sébocytaire. Toutefois, de par leur fonction in vivo, les sébocytes primaires tendent in vitro à se différencier rapidement par l'accumulation de gouttelettes lipidiques et finalement dégénérer, ce qui rend leur culture et leur amplification, pourtant indispensable pour obtenir une quantité de matériel biologique suffisante pour préparer des modèles d'épithélium reconstruit sébocytaire, très difficile in vitro et limite donc leur utilisation dans le cadre du criblage d'actifs. La technique la plus utilisée dans la littérature pour contourner ce problème de différenciation des sébocytes est leur immortalisation ou la génération de lignées. Ainsi, la lignée SZ95 a été développée dans Zouboulis et aL (1999) J. investig. DermatoL 113:1011-1020, la lignée SEB-1 a été développée dans Thiboutot et al. (2003) J. investig. DermatoL 120:905-914 et la lignée SEB0662 a été développée dans Barrault et al. (2012) Exp. DermatoL 21:314-316. Ce sont ces lignées qui ont été utilisées jusqu'à présent pour produire des modèles cellulaires. Toutefois, utiliser des sébocytes immortalisés présente de nombreux désavantages puisqu'il s'agit de cellules génétiquement modifiées, assez éloignées physiologiquement de sébocytes primaires. Par ailleurs, la majorité des travaux de modélisation de la fonction sébacée est réalisée jusqu'à présent à partir de modèles cellulaires cultivés en 2 dimensions, en particulier à partir des lignées immortalisées SZ95 et SEB-1. Actuellement, très peu d'études ont montré la production de modèles cellulaires en 3 dimensions. On peut toutefois citer l'article Guy et aL (1996) J. investig. DermatoL 106:454-460 qui décrit des modèles de glandes en survie, l'article Yoshida et aL (2013) Biochem. Biophys. Res. Com. 438:640-646 qui décrit des micro-tissus fabriqués avec des sébocytes immortalisés et les articles Barrault et aL (2012) Exp. DermatoL 21:314-316 et Lo Celso et aL (2008) Stem Cells 26:1241-1252 qui décrivent des épithéliums reconstruits à partir de sébocytes immortalisés. Toutefois, ces trois types de modèles présentent des inconvénients 3061205 2 importants. En effet, dans le modèle de glandes en survie, la préparation de modèles est fortement limitée par l'approvisionnement en glandes en survie et les modèles obtenus présentent une grande variabilité inter et intra-donneur. Pour les deux autres types de modèles, l'utilisation de lignées cellulaires et donc de cellules génétiquement modifiées 5 est peu physiologique. Il existe donc un besoin important de nouvelles méthodes de préparation de modèles in vitro d'épithélium reconstruit sébocytaire, mettant en oeuvre des cellules les plus proches possible des cellules de la glande sébacée in vivo, tout en étant disponible dans une quantité suffisante et permettant de produire un modèle 3D avec des sébocytes 10 différenciés chargés en lipides apolaires dont le métabolisme lipidique se rapproche le plus possible de celui de la glande sébacée in vivo. Il existe également un besoin d'obtenir un modèle in vitro d'épithélium reconstruit sébocytaire dont la durée de vie est suffisante pour étudier dans le temps la modulation de sa synthèse lipidique, et ainsi cribler de nouvelles molécules. 15 La présente invention résulte de la combinaison par les inventeurs de solutions techniques innovantes : - l'amplification de sébocytes primaires non-immortalisés par culture dans un milieu de culture spécifique comprenant 7 facteurs permettant la croissance des 20 sébocytes et un inhibiteur de ROCK, de manière à obtenir un stock suffisant de sébocytes sans nécessiter leur immortalisation, ce qui permet de conserver tout leur potentiel de différenciation, - la culture d'un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire en 3 dimensions sur un support de matrice extracellulaire avec une phase de culture à l'interface air-liquide, et 25 l'ajout d'un mélange d'induction pour optimiser la différenciation en sébocytes matures chargés en lipides apolaires, ce mélange comprenant de l'acide linoléique comme précurseur et un agoniste de PPAR, dans un milieu de culture comprenant seulement 3 facteurs permettant la croissance et/ou la différenciation des sébocytes, dont de l'EGF à une concentration élevée, ce qui permet de pousser les sébocytes à se différencier et à 30 produire un mélange de lipides apolaires se rapprochant de la composition du sébum et à obtenir un modèle pouvant être cultivé jusqu'à 17 jours, autorisant une fenêtre d'utilisation plus longue que les modèles décrits dans l'état de la technique. La présente invention a donc pour objet un procédé, de préférence in vitro, 35 d'amplification de sébocytes primaires comprenant une étape de culture, en présence de 3061205 3 cellules nourricières, de sébocytes primaires, de préférence de sébocytes humains primaires non-immortalisés, dans un milieu de culture "G7F-sebo2D" comprenant : (i) de l'adénine hydrochloride, (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), 5 (iii) de l'hydrocortisone, (iv) de l'insuline, (v) de l'isoprotérénol, (vi) de la transferrine, et (vii) de la triiodothyronine, 10 ledit milieu de culture comprenant en outre un inhibiteur de ROCK. Un autre objet de l'invention concerne un procédé, de préférence in vitro, de préparation d'un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire comprenant les étapes consistant à : a) ensemencer, sur un biomatériau pour épiderme reconstruit (BPER) 15 éventuellement recouvert de protéine de matrice extracellulaire, des sébocytes primaires non-immortalisés en suspension dans un milieu de culture "G7F-ERS" comprenant: (i) de l'adénine hydrochloride, (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), 20 (iii) de l'hydrocortisone, (iv) de l'insuline, (v) de l'isoprotérénol, (vi) de la transferrine, et (vii) de la triiodothyronine ; 25 b) cultiver les sébocytes ensemencés à l'étape a) en immersion sur ledit BPER dans du milieu G7F-ERS pendant 1 à 4 jours ; c) cultiver les sébocytes obtenus à l'étape b) à l'interface air - liquide sur ledit BPER au-dessus d'un milieu de culture "G3F-ERS" comprenant : (I) du facteur de croissance épidermique (EGF), 30 (Il) de l'hydrocortisone, et (III) de l'insuline, ledit milieu G3F-ERS comprenant en outre de l'acide linoléique et un agoniste de PPAR, pendant une durée appropriée pour permettre la différenciation des sébocytes et la 35 synthèse lipidique, 3061205 4 ledit modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire étant obtenu à l'issue de l'étape c). La présente invention concerne également un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire susceptible d'être obtenu par le procédé de préparation selon l'invention. 5 La présente invention a enfin pour objet un procédé, de préférence in vitro, de criblage d'un composé candidat pour traiter la peau grasse et/ou luisante comprenant la mise en contact dudit composé candidat avec le modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention. 10 Description détaillée de l'invention Sébocytes De préférence, les sébocytes utilisés et/ou amplifiés dans le cadre de l'invention sont des sébocytes primaires non immortalisés. 15 Par "sébocytes primaires non immortalisés", on entend ici des sébocytes qui n'ont pas été immortalisés, quelle que soit la technique d'immortalisation utilisée, ou qui ne proviennent pas de lignées cellulaires de sébocytes immortalisés. En particulier, les sébocytes utilisés et/ou amplifiés dans le cadre de l'invention ne sont pas des sébocytes de la lignée SZ95 (décrite dans Zouboulis et al. (1999) J. Investig. Dermatol. 113:1011- 20 1020), ni des sébocytes de la lignée SEB-1 (décrite dans Thiboutot et aL (2003) J. Investig. Dermatol. 120:905-914) ni des sébocytes de la lignée SEB0662 (décrite dans Barrault et al. (2012) Exp. Dermatol. 21:314-316). Le fait d'utiliser des sébocytes primaires non-immortalisés est particulièrement avantageux car il permet de conserver tout le potentiel de différenciation des sébocytes, 25 et en particulier leur capacité à synthétiser un équivalent de sébum in vitro présentant une composition proche de celle du sébum in vivo, incluant en particulier la majorité des grandes familles de lipides apolaires présentes dans le sébum in vivo. Les sébocytes primaires utilisés dans le cadre de l'invention sont de préférence des sébocytes humains. 30 Ces sébocytes primaires peuvent être obtenus par toute technique bien connue de l'homme du métier. Les inventeurs ont toutefois développé une technique particulière d'obtention de ces sébocytes à partir de glandes sébacées issues de préférence de déchets opératoires. Ainsi dans un mode de réalisation particulier, les sébocytes primaires utilisés dans 35 le cadre de l'invention sont des sébocytes primaires, de préférence des sébocytes 3061205 5 humains primaires non-immortalisés, provenant de glandes sébacées issues par exemple de déchets opératoires, tels que des déchets de lifting. De préférence, les sébocytes primaires utilisés dans le cadre de l'invention sont obtenus par une méthode d'extraction comprenant les étapes suivantes : 5 1) récupérer un morceau de peau, tel qu'un morceau de lifting, et éventuellement enlever les cheveux de la surface de la peau, 2) éventuellement découper le morceau de peau en morceaux de l'ordre de 0,5 cm2 de surface, et le(s) traiter avec des antibiotiques, par exemple dans du milieu de culture tel que du milieu DMEM, de préférence pendant 15 à 30 min, typiquement pendant 10 20 min, 3) recouvrir les morceaux de peau avec de la dispase, de préférence de la dispase Il, et les incuber pendant une durée appropriée pour que le derme puisse ensuite être séparé de l'épiderme par microdissection, par exemple en les incubant pendant une nuit à 4°C, ou pendant 2 h à 37°C, 15 4) rincer les morceaux de peau et les mettre en milieu de culture "G7F-sebo2D" tel que défini ci-dessous, 5) séparer l'épiderme du derme du morceau de peau par microdissection et conserver l'épiderme prélevé, 6) prélever les glandes sébacées des follicules pileux présents sous l'épiderme et 20 les déposer dans du milieu de culture "G7F-sebo2D" tel que défini ci-dessous, 7) incuber les glandes sébacées prélevées dans de la trypsine, de préférence pendant 5 à 10 min, puis inhiber la trypsine, par exemple par ajout de milieu de culture "G7F-sebo2D" tel que défini ci-dessous, 8) centrifuger les glandes sébacées trypsinées, de préférence à 190 g, les 25 resuspendre et les ensemencer sur cellules nourricières préalablement ensemencées, par exemple sur fibroblastes irradiés tels que des fibroblastes 3T3i, en milieu de culture "G7Fsebo2D" tel que défini ci-dessous comprenant en outre un inhibiteur de ROCK tel que défini ci-dessous, de préférence le composé Y-27632, typiquement à 101..1M. 30 Procédé d'amplification Comme indiqué ci-dessus, les inventeurs ont mis au point un procédé qui permet d'amplifier des sébocytes primaires non-immortalisés, de manière à conserver leur potentiel de différenciation lors de la préparation du modèle in vitro d'épithélium reconstruit sébocytaire. 35 Ce procédé implique l'utilisation d'un inhibiteur de ROCK en présence de cellules nourricières dans un milieu de culture comprenant 7 facteurs permettant la croissance des 3061205 6 sébocytes. Cette utilisation permet de conserver le pouvoir prolifératif des sébocytes primaires en bloquant de manière réversible leur différenciation, et ainsi, de constituer des stocks importants de sébocytes primaires. La présente invention concerne ainsi un procédé, de préférence in vitro, 5 d'amplification de sébocytes primaires, tels que définis dans la section "Sébocytes" ci- dessus, comprenant une étape de culture, en présence de cellules nourricières, de sébocytes primaires, tels que définis à la section "Sébocytes" ci-dessus, de préférence de sébocytes primaires non-immortalisés, en particulier de sébocytes humains primaires non-immortalisés, dans un milieu de culture "G7F-sebo2D" comprenant : 10 (i) de l'adénine hydrochloride, (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), (iii) de l'hydrocortisone, (iv) de l'insuline, (v) de l'isoprotérénol, 15 (vi) de la transferrine, et (vii) de la triiodothyronine, ledit milieu de culture comprenant en outre un inhibiteur de ROCK. Par "amplification", on entend ici la prolifération ou multiplication de cellules. De préférence, les sébocytes primaires cultivés sont des sébocytes humains 20 primaires non-immortalisés, de préférence provenant de glandes sébacées issues par exemple de déchets opératoires, tels que des déchets de lifting. Dans un mode de réalisation particulier, les sébocytes primaires cultivés sont issus du procédé d'extraction défini dans la section "Sébocytes" ci-dessus. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le procédé d'amplification selon 25 l'invention comprend, avant l'étape de culture, une étape d'extraction de sébocytes, en particulier à partir de déchets opératoires, mettant en oeuvre le procédé d'extraction défini dans la section "Sébocytes" ci-dessus. Par "cellule nourricière", on entend ici des cellules utilisées en culture avec d'autres types de cellules et qui assistent leur croissance. Les cellules nourricières ont 30 leur croissance arrêtée, par exemple par irradiation, mais sont viables et forment un substrat sur lequel les autres cellules peuvent pousser. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules nourricières sont des fibroblastes, tels que des fibroblastes de lignées fibroblastiques, par exemple des fibroblastes 313, de manière préférée entre toutes des fibroblastes 313 irradiés. 3061205 7 Le milieu de culture "G7F-sebo2D" utilisé dans le procédé d'amplification selon l'invention est un milieu nutritif comprenant un milieu de base et les 7 facteurs permettant la croissance des sébocytes suivants : (i) de l'adénine hydrochloride, 5 (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), (iii) de l'hydrocortisone, (iv) de l'insuline, (v) de l'isoprotérénol, (vi) de la transferrine, et 10 (vii) de la triiodothyronine, Le milieu de base peut en particulier être du milieu DMEM, du milieu DMEM/F12, MEM, RPMI, du milieu de William's, du milieu KGM, du milieu dermalife-K, du milieu keratinocyte-SFM, ou du milieu de Glasgow. De préférence, le milieu de base est du milieu DMEM/F12. De préférence, le milieu de base contient en outre de la L-glutamine. 15 De préférence, le milieu de base comprend en outre du sérum de veau foetal, de préférence à une concentration de 5 à 20%, et plus préférentiellement à une concentration de 10%. Le milieu de culture "G7F-sebo2D" comprend les 7 facteurs permettant la croissance des sébocytes suivants : 20 (i) de l'adénine hydrochloride, de préférence à une concentration de 1x10-4 M à 2x10-4 M, en particulier à une concentration de 1,4x10-4 à 1,9x10-4 M, plus particulièrement de 1,5x10-4 à 1,8x10-4 M ou de 1,6x10-4 à 1,7x10-4 M, (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), par exemple de l'EGF recombinant humain, de préférence à une concentration de 5 à 25 ng/ml, en particulier à 25 une concentration de 7 à 20 ng/ml, plus particulièrement de 8 à 15 ng/ml, encore plus particulièrement de 9 à 12 ng/ml ou de 10 à 11 ng/ml, (iii) de l'hydrocortisone, par exemple de l'hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium, de préférence à une concentration de 0,1 à 1 pg/ml, en particulier à une concentration de 0,2 à 0,9 pg/ml, plus particulièrement de 0,3 à 0,8 pg/ml, de 0,4 à 0,7 pg/m1 ou de 0,5 à 30 0,6 pg/ml, (iv) de l'insuline, par exemple de l'insuline humaine recombinante, de préférence à une concentration de 1 à 10 pg/ml, en particulier à une concentration de 2 à 9 pg/ml, plus particulièrement de 3 à 8 pg/ml, de 4 à 7 pg/m1 ou de 5 à 6 pg/ml, (v) de l'isoprotérénol (aussi appelé isoprénaline), par exemple du (-)-isoprotérénol 35 hydrochloride, de préférence à une concentration de 5x10-7 à 5x10-6 M, en particulier à 3061205 8 une concentration de 6x10-7 à 4x10-6 M, plus particulièrement de 7x10-7 à 3x10-6 M, de 8x10-7 à 2x10-6 M ou de 9x10-7 à 1x10-6 M, (vi) de la transferrine (aussi appelée sidérophiline), de préférence de la transferrine humaine, par exemple de l'apo-transferrine humaine, de préférence à une concentration 5 de 1 à 10 pg/ml, en particulier à une concentration de 2 à 9 pg/ml, plus particulièrement de 3 à 8 pg/ml, de 4 à 7 pg/m1 ou de 5 à 6 pg/ml, et (vii) de la triiodothyronine (aussi appelée 3,3',5-triiodo-L-thyronine ou 13), par exemple de la 3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium, de préférence à une concentration de 1x10-9 à 5x10-9 M, en particulier à une concentration de 1,5x10-9 à 4x10-9 M, plus 10 particulièrement de 1,75x10-9 à 3x10-9 M ou de 2x10-9 à 2,5x10-9 M. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture "G7F-sebo2D" comprend : (i) de 1x10-4 à 2x10-4 M d'adénine hydrochloride, (ii) de 5 à 25 ng/ml d'EGF, 15 (iii) de 0,1 à 1 pg/mld'hydrocortisone, (iv) de 1 à 10 pg/m1 d'insuline, (v) de 5x10-7 à 5x10-6 M d'isoprotérénol, (vi) de 1 à 10 pg/m1 de transferrine, de préférence de transferrine humaine, et (vii) de 1x10-9 à 5x10-9 M de triiodothyronine. 20 Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture "G7F-sebo2D" comprend : (i) de 1,5x10-4 à 1,8x10-4 M d'adénine hydrochloride, (ii) de 9 à 12 ng/ml d'EGF, (iii) de 0,4 à 0,7 pg/m1 d'hydrocortisone, 25 (iv) de 4 à 7 pg/m1 d'insuline, (v) de 8x10-7 à 2x10-6 M d'isoprotérénol, (vi) de 4 à 7 pg/m1 de transferrine, de préférence de transferrine humaine, et (vii) de 1,75x10-9 à 3x10-9 M de triiodothyronine. Dans le procédé d'amplification selon l'invention, le milieu de culture "G7F- 30 sebo2D" comprend en outre un inhibiteur de ROCK. Par "inhibiteur de ROCK", on entend ici une protéine, un acide nucléique, une petite molécule, un anticorps ou un autre agent qui empêche l'expression de ROCK ou diminue à la baisse l'activité de ROCK telle que son activité kinase. Les inhibiteurs de ROCK sont bien connus de l'homme du métier et incluent le composé Y-27632 et les 3061205 9 composés H-1 152, Y-30141, Wf-536, HA-1077, hydroxyl-HA-1077, GSK269962A et SB772077-B. De préférence, l'inhibiteur de ROCK est le composé Y-27632. L'inhibiteur de ROCK, en particulier le composé Y-27632, est de préférence 5 présent dans le milieu de culture "G7F-sebo2D" à une concentration de 5 à 15 1..1M, de préférence de 6 à 14 1..1M, plus préférentiellement de 7 à 13 1..1M, de 8 à 12 1..1M, de 9 à 11 1..1M, de manière préférée entre toutes à une concentration de 101.1M. Le milieu de culture est de préférence changé régulièrement pendant la culture des sébocytes, par exemple tous les 1, 2 ou 3 jours. 10 Les sébocytes primaires ainsi amplifiés peuvent être trypsinés et ré-ensemencés dès qu'un niveau de confluence élevé est obtenu, par exemple un niveau de confluence de 70%. Procédé de préparation d'un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire 15 Comme indiqué ci-dessus, les inventeurs ont en outre mis au point un procédé de préparation d'un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire mettant en oeuvre des sébocytes primaires non-immortalisés permettant l'obtention d'un modèle tridimemsionnel plus pertinent physiologiquement par rapport aux modèles décrits jusqu'à présent. Un autre objet de l'invention concerne ainsi un procédé, de préférence in vitro, de 20 préparation d'un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire comprenant les étapes consistant à : a) ensemencer, sur un biomatériau pour épiderme reconstruit (BPER) éventuellement recouvert de protéine de matrice extracellulaire, des sébocytes primaires non-immortalisés en suspension dans un milieu de culture "G7F-ERS" 25 comprenant: (i) de l'adénine hydrochloride, (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), (iii) de l'hydrocortisone, (iv) de l'insuline, 30 (v) de l'isoprotérénol, (vi) de la transferrine, et (vii) de la triiodothyronine ; b) cultiver les sébocytes ensemencés à l'étape a) en immersion sur ledit BPER dans du milieu G7F-ERS pendant 1 à 4 jours ; 35 c) cultiver les sébocytes obtenus à l'étape b) à l'interface air - liquide sur ledit BPER au-dessus d'un milieu de culture "G3F-ERS" comprenant : 3061205 10 (I) du facteur de croissance épidermique (EGF), (Il) de l'hydrocortisone, et (III) de l'insuline, ledit milieu G3F-ERS comprenant en outre de l'acide linoléique et un agoniste 5 PPAR, pendant une durée appropriée pour permettre la différenciation des sébocytes et la synthèse lipidique, ledit modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire étant obtenu à l'issue de l'étape c). 10 Par " biomatériau pour épiderme reconstruit" ou "BPER", on entend ici un équivalent dermique, utilisé comme support et intégrant des ingrédients naturellement présents dans le derme. De préférence, le BPER est une matrice de collagène, en particulier de collagènes de type I et/ou IV. De préférence, le BPER est recouvert de protéine de matrice extracellulaire. 15 Les protéines de matrice extracellulaire sont bien connues de l'homme du métier et incluent le collagène, tel que le collagène de type IV ou de type VII, la fibronectine et la laminine. De préférence, le BPER est recouvert de fibronectine, en particulier de fibronectine humaine. Les sébocytes primaires non-immortalisés ensemencés à l'étape a) sont tels que 20 définis à la section "Sébocytes" ci-dessus. De préférence, ce sont des sébocytes humains primaires non-immortalisés, de préférence pré-amplifiés par le procédé d'amplification tel que défini à la section "Procédé d'amplification" ci-dessus mais en l'absence d'inhibiteur de ROCK. 25 Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation selon l'invention comprend, avant l'étape a) d'ensemencement, une étape pré-a) de pré-amplification des sébocytes primaires non-immortalisés, mettant en oeuvre de préférence le procédé d'amplification tel que défini à la section "Procédé d'amplification" ci-dessus mais en l'absence d'inhibiteur de ROCK, autrement dit dans du milieu de culture « G7F- 30 Sebo2D » tel que défini à la section "Procédé d'amplification" ne comprenant pas d'inhibiteur de ROCK. Le milieu de culture "G7F-ERS" utilisé dans le procédé de préparation selon l'invention est un milieu nutritif comprenant un milieu de base et les 7 facteurs permettant la croissance des sébocytes suivants : 35 (i) de l'adénine hydrochloride, (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), 3061205 11 (iii) de l'hydrocortisone, (iv) de l'insuline, (v) de l'isoprotérénol, (vi) de la transferrine, et 5 (vii) de la triiodothyronine, Le milieu de base peut en particulier être du milieu DMEM, du milieu DMEM/F12, MEM, RPMI, du milieu de William's, du milieu KGM, du milieu dermalife-K, du milieu keratinocyte-SFM ou du milieu de Glasgow. De préférence, le milieu de base est du milieu DMEM/F12. De préférence, le milieu de base contient en outre de la L-glutamine. De 10 préférence, le milieu de base comprend en outre du sérum de veau foetal, de préférence à une concentration de 5 à 20%, de manière davantage préférée à une concentration de 10%. Le milieu de culture "G7F-ERS" comprend les 7 facteurs permettant la croissance des sébocytes suivants : 15 (i) de l'adénine hydrochloride, de préférence à une concentration de 1x10-4 M à 2x10-4 M, en particulier à une concentration de 1,4x10-4 à 1,9x10-4 M, plus préférentiellement de 1,5x10-4 à 1,8x10-4 M ou de 1,6x10-4 à 1,7x10-4 M, (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), par exemple de l'EGF recombinant humain, de préférence à une concentration de 30 à 75 ng/ml, en particulier à 20 une concentration de 35 à 70 ng/ml, plus préférentiellement de 40 à 65 ng/ml, de 45 à 60 ng/ml ou de 50 à 55 ng/ml, (iii) de l'hydrocortisone, par exemple de l'hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium, de préférence à une concentration de 0,1 à 1 pg/ml, en particulier à une concentration de 0,2 à 0,9 pg/ml, plus préférentiellement de 0,3 à 0,8 pg/ml, de 0,4 à 0,7 pg/m1 ou de 0,5 à 25 0,6 pg/ml, (iv) de l'insuline, par exemple de l'insuline humaine recombinante, de préférence à une concentration de 1 à 10 pg/ml, en particulier à une concentration de 2 à 9 pg/ml, plus préférentiellement de 3 à 8 pg/ml, de 4 à 7 pg/m1 ou de 5 à 6 pg/ml, (v) de l'isoprotérénol (aussi appelé isoprénaline), par exemple du (-)-isoprotérénol 30 hydrochloride, de préférence à une concentration de 5x10-7 à 5x10-6 M, en particulier à une concentration de 6x10-7 à 4x10-6 M, plus préférentiellement de 7x10-7 à 3x10-6 M, de 8x10-7 à 2x10-6 M ou de 9x10-7 à 1x10-6 M, (vi) de la transferrine (aussi appelée sidérophiline), de préférence de la transferrine humaine, par exemple de l'apo-transferrine humaine, de préférence à une concentration 35 de 1 à 10 pg/ml, en particulier à une concentration de 2 à 9 pg/ml, plus préférentiellement de 3 à 8 pg/ml, de 4 à 7 pg/m1 ou de 5 à 6 pg/ml, et 3061205 12 (vii) de la triiodothyronine (aussi appelée 3,3',5-triiodo-L-thyronine ou 13), par exemple de la 3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium, de préférence à une concentration de 1x10-9 à 5x10-9 M, en particulier à une concentration de 1,5x10-9 à 4x10-9 M, plus préférentiellement de 1,75x10-9 à 3x10-9 M ou de 2x10-9 à 2,5x10-9 M. 5 Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture "G7F-ERS" comprend : (i) de 1x10-4 à 2x10-4 M d'adénine hydrochloride, (ii) de 30 à 75 ng/ml d'EGF, (iii) de 0,1 à 1 pg/mld'hydrocortisone, 10 (iv) de 1 à 10 pg/m1 d'insuline, (v) de 5x10-7 à 5x10-6 M d'isoprotérénol, (vi) de 1 à 10 pg/m1 de transferrine, de préférence de transferrine humaine, et (vii) de 1x10-9 à 5x10-9 M de triiodothyronine. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture "G7F-ERS" 15 comprend : (i) de 1,5x10-4 à 1,8x10-4 M d'adénine hydrochloride, (ii) de 45 à 65 ng/ml d'EGF, (iii) de 0,4 à 0,7 pg/m1 d'hydrocortisone, (iv) de 4 à 7 pg/m1 d'insuline, 20 (v) de 8x10-7 à 2x10-6 M d'isoprotérénol, (vi) de 4 à 7 pg/m1 de transferrine, de préférence de transferrine humaine, et (vii) de 1,75x10-9 à 3x10-9 M de triiodothyronine. Après l'étape d'ensemencement, les sébocytes sont avantageusement cultivés en immersion dans du milieu G7F-ERS, tel que défini ci-dessus, pendant 1 à 4 jours, de 25 préférence pendant 3 jours. Pendant cette étape b) de culture, le milieu de culture G7F-ERS peut être remplacé régulièrement, par exemple tous les jours ou tous les 2 jours. Cette étape de culture permet la prolifération des sébocytes. Cette étape b) de culture en immersion est suivie par une étape c) de culture des 30 sébocytes à l'interface air - liquide sur le BPER au-dessus d'un milieu de culture "G3F- ERS" comprenant : (I) du facteur de croissance épidermique (EGF), (Il) de l'hydrocortisone, et (III) de l'insuline, 35 et comprenant en outre de l'acide linoléique et un agoniste de PPAR. 3061205 13 Le milieu de culture "G3F-ERS" utilisé dans le procédé de préparation selon l'invention est un milieu nutritif comprenant un milieu de base et les 3 facteurs permettant la croissance et/ou la différenciation des sébocytes suivants : (I) du facteur de croissance épidermique (EGF), 5 (Il) de l'hydrocortisone, et (III) de l'insuline. Le milieu de base peut en particulier être du milieu DMEM, du milieu DMEM/F12, MEM, RPMI, du milieu de William's, du milieu KGM, du milieu dermalife-K, du milieu keratinocyte-SFM ou du milieu de Glasgow. De préférence, le milieu de base est du milieu 10 DMEM/F12. De préférence, le milieu de base contient en outre de la L-glutamine. De préférence, le milieu de base comprend en outre du sérum de veau foetal, de préférence à une concentration de 5 à 20%, de manière davantage préférée à une concentration de 10%. Le milieu de culture "G3F-ERS" comprend les 3 facteurs permettant la croissance 15 et/ou la différenciation des sébocytes suivants : (I) du facteur de croissance épidermique (EGF), par exemple de l'EGF recombinant humain, de préférence à une concentration de 30 à 75 ng/ml, en particulier à une concentration de 35 à 70 ng/ml, de 40 à 65 ng/ml, de 45 à 60 ng/ml ou de 50 à 55 ng/ml, 20 (Il) de l'hydrocortisone, par exemple de l'hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium, de préférence à une concentration de 0,1 à 1 pg/ml, en particulier à une concentration de 0,2 à 0,9 pg/ml, de 0,3 à 0,8 pg/ml, de 0,4 à 0,7 pg/m1 ou de 0,5 à 0,6 pg/ml, et (III) de l'insuline, par exemple de l'insuline humaine recombinante, de préférence à une concentration de 1 à 10 pg/ml, en particulier à une concentration de 2 à 9 pg/ml, de 3 25 à 8 pg/ml, de 4 à 7 pg/m1 ou de 5 à 6 pg/ml. Le milieu "G3F-ERS" a ainsi la particularité de comprendre seulement 3 facteurs permettant la croissance et/ou la différenciation des sébocytes. De préférence, le milieu "G3F-ERS" est dépourvu d'adénine hydrochloride, d'isoprotérénol, de transferrine humaine et/ou de triiodothyronine. 30 Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture "G3F-ERS" comprend : (I) de 30 à 75 ng/ml d'EGF, (Il) de 0,1 à 1 pg/m1 d'hydrocortisone, et (III) de 1 à 10 pg/m1 d'insuline. 35 Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture "G3F-ERS" comprend : 3061205 14 (I) de 45 à 65 ng/ml d'EGF, (Il) de 0,4 à 0,7 pg/mld'hydrocortisone, et (III) de 4 à 7 pg/mld'insuline. Le milieu "G3F-ERS" peut en outre comprendre de la vitamine C, de préférence à 5 une concentration de 0,05 à 0,5 mg/ml, en particulier à une concentration de 0,06 à 0,4 mg/ml, de 0,07 à 0,3 mg/ml, de 0,08 à 0,2 mg/ml, ou de 0,09 à 0,1 mg/ml. Le milieu "G3F-ERS" tel que défini ci-dessus comprend en outre de l'acide linoléique et un agoniste de PPAR. Ces deux composés agissent dans le procédé de préparation selon l'invention 10 comme des inducteurs de la différenciation et de la synthèse lipidique. Par "agoniste de PPAR (récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes)" ou "inducteur de PPAR", on entend ici un composé activant le voie de signalisation médiée par PPAR. Par "PPAR" ou "récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes", on 15 entend ici une protéine de la superfamille des récepteurs nucléaires liant naturellement les lipides et agissant comme facteur de transcription de gènes impliqués notamment dans le métabolisme et l'adipogenèse. Trois types de PPAR ont été identifiés : alpha, gamma et delta (bêta). Comme tous les récepteurs nucléaires, PPAR est structuré en quatre régions distinctes. Un domaine N-terminal possède une fonction trans-activatrice 20 indépendante du ligand (AF-1). Le domaine de liaison à l'ADN ou DBD est constitué de deux doigts de zinc caractéristique de la superfamille des récepteurs nucléaires. PPAR possède une région charnière ou hinge précédant le domaine de liaison du ligand ou LBD possédant une fonction trans-activatrice dépendante du ligand (AF-2). L'agoniste de PPAR utilisé dans le cadre de l'invention peut être un agoniste de 25 pan-PPAR (c'est-à-dire un inducteur des trois types de PPAR, alpha, gamma et beta/delta), un agoniste sélectif de PPAR-alpha ou un agoniste sélectif de PPAR-delta. Des exemples d'agonistes de PPAR sont bien connus de l'homme du métier et incluent, comme agoniste de pan-PPAR, l'aleglitazar, le muraglitazar, le saroglitazar et le tesaglitazar, comme agoniste sélectif de PPAR-delta, le composé GW501516 ({4-[({4- 30 methy1-2[4-(trifluoromethyl)pheny1]-1,3-thiazol-5-yeethypsulfanyl]-2- methylphenoxy}acetic acid), et le composé GW0742 ([4-[[[213-fluoro-4- (trifluoromethyl)pheny1]-4-methy1-5-thiazolyeethyl]thio] -2-methylphenoxeacetic acid), comme agoniste sélectif de PPAR-alpha, les dérivés de l'acide fibrique comme le cofibrate d'aluminium, le beclobrate, le bezafibrate, le binifibrate, le ciprofibrate, le 35 clinofibrate, le clofibrate, l'acide clofibrique, le clofibride, le dulofibrate, l'eniclobrate, 3061205 15 l'éthofibrate, le clofibrate d'étofylline, le fénofibrate, l'acide fénofibrique, le gemfibrozil, le nicofibrate, le pirifibrate, le ronifibrate, le simfibrate et le theofibrate. De préférence, l'agoniste de PPAR utilisé dans le cadre de l'invention est le composé GW0742. 5 De manière avantageuse, le milieu "G3F-ERS" ne contient qu'un agoniste de PPAR, de préférence l'agoniste de PPAR est le composé GW0742. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu "G3F-ERS" comprend de 1x10-7 à 2,5x10-5 M d'acide linoléique, de préférence de 5x10-7 à 2x10-5 M, de 1x10-6 à 1,5x10-5 M, de 5x10-6 à 1x10-5 M, ou de 9x10-6 à 1x10-5 M. 10 Dans un autre mode de réalisation particulier, le milieu "G3F-ERS" comprend de 1x10-6 à 5x10-6 M d'un agoniste de PPAR, en particulier de composé GW0742, de préférence de 1,5x10-6 à 4x10-6 M, de 2x10-6 à 3,5x10-6 M ou de 2,5x10-6 à 3x10-6 M. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu "G3F-ERS" comprend de 5x10-6 à 2.5x10-5 M d'acide linoléique et de 1x10-6 à 5x10-6 M d'un agoniste de PPAR, ledit 15 agoniste de PPAR étant de préférence le composé GW0742. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu "G3F-ERS" comprend de 8x10-6 à 2x10-5 M d'acide linoléique et de 2x10-6 à 3,5x10-6 M d'un agoniste de PPAR, ledit agoniste de PPAR étant de préférence le composé GW0742. C'est au cours de cette phase c) de culture à l'interface air-liquide que les 20 sébocytes se différencient et produisent un mélange de lipides neutres (tels que les glycérides, le cholestérol, des esters de cholestérol et des acides gras libres). Ainsi, l'étape c) de culture à l'interface air-liquide est mise en oeuvre pendant une durée appropriée pour permettre la différenciation des sébocytes et la synthèse lipidique. De préférence, l'étape c) de culture à l'interface air-liquide est mise en oeuvre 25 pendant 5 à 25 jours, de préférence pendant 7 à 20 jours, pendant 8 à 17 jours ou pendant 10 à 15 jours. En particulier, l'étape c) de culture à l'interface air-liquide peut être continuée une fois les sébocytes différenciés, par exemple pour utiliser le modèle obtenu dans des tests de criblage. 30 Pendant l'étape c) de culture à l'interface air-liquide, le milieu de culture G3F-ERS peut être remplacé régulièrement, en partie ou totalement, par exemple tous les jours, tous les 2 jours ou tous les 3 jours. Le modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire est obtenu à l'issue de l'étape c). Ce modèle se différencie des modèles d'épithélium sébocytaire de l'état de la 35 technique par le fait que les sébocytes qui le constituent ne sont pas immortalisés et que 3061205 16 son histologie est très proche de celle de la glande sébacée in vivo. En particulier, la quasi-totalité des grandes familles de lipides apolaires (glycérides, cholestérol, acides gras, esters de cholestérol) présentes dans le sébum sont présentes dans le modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire obtenu avec le procédé de préparation selon 5 l'invention La présente invention concerne donc également un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire susceptible d'être obtenu par le procédé de préparation selon l'invention. 10 Utilisations Les inventeurs ont montré que la synthèse lipidique du modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention pouvait être modulée en utilisant des composés connus pour moduler cette activité in vivo tels que l'acide 13-cis rétinoique. Le modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention peut donc être 15 utilisé pour identifier des composés modulant la synthèse lipidique des sébocytes. La présente invention concerne ainsi un procédé, de préférence in vitro, de criblage de composés modulant la synthèse lipidique des sébocytes comprenant la mise en contact d'un composé candidat avec le modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention. 20 La présente invention a également pour objet un procédé, de préférence in vitro, de criblage de composés pour traiter la peau grasse et/ou luisante comprenant la mise en contact d'un composé candidat avec le modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention. Les procédés de criblage selon l'invention peuvent en outre comprendre une étape 25 d'analyse des lipides synthétisés par les sébocytes du modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire en présence du composé candidat, par exemple par marquage des lipides neutres, par exemple au BODIPY, Lipidtox ou à l'oil-red-o. La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci- 30 dessous. 3061205 17 Brève description des figures Figure 1: Schéma d'extraction de sébocytes humains primaires obtenus à partir d'une biopsie. 5 Figure 2 : Observations au microscope de sébocytes extraits de glandes sébacées après 6 jours de culture sur plastique. Partie A: culture en milieu G7F-sebo2D - Partie B: culture en milieu G7F-sebo2D en présence d'un inhibiteur de ROCK (Y27632). 10 Figure 3 : A: Exemple de coupe histologique d'une glande sébacée in vivo adaptée de Woldow et aL (2009) Dermatology Online Journal 15:14. B: Schéma représentatif d'une glande sébacée in vivo adapté de Niemann et al. (2012) Seminars in Cell & Developmental Biology23:928-936. 15 Figure 4 : Partie gauche : exemples de coupes histologiques du modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention à J13 colorées en HES. Partie droite : pour comparaison, exemple d'une coupe histologique du modèle d'épiderme EPISKIN colorés en HES. 20 Figure 5 : Compilation de 3 études de modulation de la synthèse des lipides neutres sur le modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention réalisées par marquage BODIPY et analyse d'images IMAGEJ. 4 molécules évaluées : isotretinoïne (= acide 13- cis-rétinoïque) à 1 1..1M (lm), composé A à 50 1..1M (A), composé B à 20 pg/m1 (B) et composé C à 10 pg/m1 (C). Deux témoins ont été effectués : un témoin non traité (NT) et 25 un témoin traité avec le solvant DMSO (DMSO). Les histogrammes représentent la surface marquée au BODIPY normalisée par rapport à des témoins non traités, le pourcentage indiqué au-dessus des histogrammes correspondant au pourcentage de surfaces marquées par rapport au témoin DMSO. ** p 0,05 vs DMSO, *** p 0,005 vs DMSO, test T de Student 30 3061205 18 Exemples Exemple 1 : Extraction de sébocytes humains primaires obtenus à partir d'une biopsie Cet exemple décrit l'extraction de sébocytes humains primaires effectuée en 5 utilisant le protocole d'extraction selon l'invention. Des morceaux de lifting comprenant beaucoup de cheveux ont été utilisés. Le milieu dans lequel les morceaux de lifting ont été conservés et le sang ont été éliminés. 10 Les morceaux de lifting ont été sélectionnés et placés dans une boite de Pétri comprenant du PBS. La surface de la peau a été rasée à l'aide d'un scalpel afin d'enlever les cheveux. Les morceaux ont ensuite été découpés en morceaux de 0,5 cm2 environ et placés dans un bain d'antibiotiques (milieu à 10% d'antibiotiques) pendant 20 min. 15 Des fibroblastes irradiés 3T3i ont été décongelés et ensemencés dans du milieu « G7F-sebo2D » comprenant 101..1M de Y-27632. Les morceaux de peau ont été recouverts de Dispase Il, et incubés à 4°C pendant la nuit ou 2h à 37°C. La dispase a ensuite été retirée, les morceaux rincés en PBS, et l'épiderme a été 20 retiré du derme des morceaux en utilisant des pinces par microdissection. Le derme a été éliminé. La glande sébacée de chaque follicule pileux trouvé sous l'épiderme a été retirée et déposée dans un puits comprenant du milieu « G7F-sebo2D ». Le milieu comprenant les glandes a ensuite été récupéré et centrifugé 8 min à 190 g. Le surnageant a été éliminé et les glandes ont été resuspendues dans de la trypsine. 25 Après 5 à 10 min d'incubation, les tubes ont été vortexés pour dissocier les glandes. La trypsine a ensuite été inhibée par ajout de milieu « G7F-sebo2D ». L'ensemble a ensuite été centrifugé pendant 8 min à 190 g et le culot a été remis en suspension. Les cellules ont été comptées au bleu trypan puis ensemencées sur les 30 fibroblastes en culture en milieu « G7F-sebo2D » comprenant 101..1M de Y-27632. Ce procédé d'extraction est représenté sur la Figure 1. 35 3061205 19 Exemple 2 : Méthode d'amplification de sébocytes humains non-immortalisés Cet exemple décrit l'amplification de sébocytes humains primaires effectuée en utilisant le procédé d'amplification selon l'invention. 5 Composition du milieu G7F-sebo2D pour un volume final de 500 ml: Produit Volume ou Référence concentration finale DMEM Glutamax 333 ml Gibco n° 31966 F12 Glutamax 111 ml Gibco n° 31765 Sérum FetalClone II 10% Hyclone n°5H30066.03 Antibiotiques-antimycotiques 1c)/0 Gibco n° 15240-062 Adenine hydrochloride 1,5x10-4 - 1,8x10-4 M Sigma n° A-9795 EGF 5 - 25 ng/ml Chemicon internai ref. GF144 Hydrocortisone 0,4- 0,7 pg/m1 Sigma n° H-4881 Insuline 4 - 7 pg/m1 Sigma n° 1-9278 lsoproterenol 8x10-7 - 2x10-6 M Sigma n° 1-6504 Transferrine humaine 4 - 7 pg/m1 Sigma n° T-2252 Triiodothyronine 1,75x10-9 - 3x10-9 M Sigma n° T-2752 101..1M de Y-27632 ont été ajoutés au milieu « G7F-sebo2D ». La veille, ou 2 heures avant l'ensemencement des sébocytes, des fibroblastes 3T3i 10 ont ensemencés dans du milieu G7F-sebo2D + Y27632, à raison de 40000 cellules / cm2. Les sébocytes primaires humains non-immortalisés ont été mis en suspension dans du milieu G7F-sebo2D + Y27632, et ensemencés sur les fibroblastes à raison de 2400 cellules / cm2. Le milieu de culture a été changé toutes les 48h. 15 Au bout de 5 jours de culture, les cellules sont arrivées à confluence et environ 5 millions de sébocytes ont pu être récupérés par trypsination. La Figure 2 montre des observations microscopiques de sébocytes après 6 jours de culture sur plastique en milieu G7F-sebo2D avec et sans Y27632. 20 Exemple 3: Procédé de préparation d'un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire Cet exemple décrit la préparation d'un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire 25 à partir de sébocytes humains primaires non-immortalisés en utilisant le procédé de préparation selon l'invention. 3061205 20 Préparation des BPER Les BPER EPISKIN commerciaux ont été rincés 2 fois en PBS et une fois en milieu de base DMEM/F12 Glutamax 3:1 + antibiotiques. Les BPER ont ensuite été coatés à la fibronectine la veille de l'inoculation des 5 sébocytes. Amplification des sébocytes Les fibroblastes 3T3i et les sébocytes ont été soit coensemencés, soit ensemencés séquentiellement, les sébocytes étant alors ensemencés au moins 2h après 10 les fibroblastes. Le milieu de culture « G7F-sebo2D » a été utilisé : Composition du milieu « G7F-sebo2D » pour un volume final de 500 ml: Produit Volume ou Référence concentration finale DMEM Glutamax 333 ml Gibco n° 31966 F12 Glutamax 111 ml Gibco n° 31765 Sérum FetalClone II 10% Hyclone n°5H30066.03 Antibiotiques-antimycotiques 1c)/0 Gibco n° 15240-062 Adenine hydrochloride 1,5x10-4 - 1,8x10-4 M Sigma n° A-9795 EGF 5 - 25 ng/ml Chemicon internai ref. GF144 Hydrocortisone 0,4- 0,7 pg/ml Sigma n° H-4881 Insuline 4 - 7 pg/ml Sigma n° 1-9278 lsoproterenol 8x10-7- 2x10-6 M Sigma n° 1-6504 Transferrine humaine 4 - 7 pg/ml Sigma n° T-2252 Triiodothyronine 1,75x10-9 - 3x10-9 M Sigma n° T-2752 La flasque comprenant les cellules a été incubée à 37°C avec 5% de CO2pendant 15 6 jours, en changeant de milieu tous les deux jours. Ensemencement des sébocytes sur BPER Du milieu « G7F-ERS » a été déposé sous les inserts de BPER. Composition du milieu « G7F-ERS » pour un volume final de 500 ml: Produit Volume ou Référence concentration finale DMEM 318m1 Gibco n° 11960 HAM/F12 106 ml Gibco n° 11765 Foetal bovine serum 10% Hyclone n°5H30406.03 Gentamicine (50 mg/mi) 250 pl Gibco n° 15750 Pyruvate de Na (100 mM) 5 ml Gibco n° 11360 AANE (x100) 5 ml Gibco n° 11140 L-glutamine (200 mM) 11,5 ml Gibco n° 25030 Adenine hydrochloride 1,5x10-4 - 1,8x10-4 M Sigma n° A-9795 EGF 45 - 65 ng/ml Chemicon internai ref. GF144 3061205 21 Hydrocortisone 0,4- 0,7 pg/ml Sigma n° H-4881 Insuline 4 - 7 pg/ml Sigma n° 1-9278 lsoproterenol 8x10-7 - 2x10-6 M Sigma n° 1-6504 Transferrine humaine 4 - 7 pg/ml Sigma n° T-2252 Triiodothyronine 1,75x10-6 - 3x10-6 M Sigma n° T-2752 Les sébocytes amplifiés ont été trypsinés, centrifugés à 190 g et repris en milieu « G7F-ERS » de manière à obtenir une suspension à 0,8.106 cellules/ml. 500 pl de suspension cellulaire ont été déposés sur chaque BPER (JO) et incubés 5 à 37°C, 5`)/0 CO2. Culture en immersion de JO à J3 : A J1, le milieu de culture a été remplacé par du milieu "G7F-ERS" sur et sous chaque insert. Culture en émersion de J3 à J13 : A J3, J6, J8 et J10, le milieu de culture sur et sous les inserts a été aspiré. Du milieu « G3F-ERS » a été déposé sous chaque insert. Composition du milieu G3F-ERS pour un volume final de 500 ml: Produit Volume ou Référence concentration finale DMEM 318m1 Gibco n° 11960 HAM/F12 106 ml Gibco n° 11765 Foetal bovine serum 10% Hyclone n°5H30406.03 Gentamicine (50 mg/mi) 250 pl Gibco n° 15750 Pyruvate de Na (100 mM) 5 ml Gibco n° 11360 AANE (x100) 5 ml Gibco n° 11140 L-glutamine (200 mM) 11,5 ml Gibco n° 25030 Vitamine C 0,08 à 0,2 mg/mi Sigma n° A-8960 EGF 45 - 65 ng/ml Chemicon internai ref. GF144 Hydrocortisone 0,4- 0,7 pg/ml Sigma n° H-4881 Insuline 4 - 7 pg/ml Sigma n° 1-9278 lsoproterenol 8x10-7 - 2x10-6 M Sigma n° 1-6504 Transferrine humaine 4 - 7 pg/ml Sigma n° T-2252 Triiodothyronine 1,75x10-6 - 3x10-6 M Sigma n° T-2752 GW0742 2x10-6 - 3,5x10-6 M Sigma n° G3295 Acide linoléique 8x10-6 - 2x10-6 M Sigma n° L1376 Ils ont ensuite été incubés à 37°C, 5% CO2. C'est pendant cette phase de la culture en particulier que les sébocytes se différencient et produisent un mélange de lipides neutres (glycérides, cholestérol, ester de cholestérol, acides gras libres). 10 15 20 3061205 22 La Figure 4 montre des coupes histologiques du modèle obtenu à l'issue de ce protocole, comparé à un modèle d'épiderme Episkin et à une glande sébacée in vivo (Figure 3). 5 Exemple 4: Etude de la modulation de la synthèse des lipides neutres par différentes molécules dans un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention Cet exemple montre que la synthèse lipidique du modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention peut être modulée en utilisant des composés connus pour 10 moduler cette activité in vivo tels que l'acide 13-cis rétinoique et que le modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon l'invention peut donc être utilisé pour identifier des composés modulant la synthèse lipidique des sébocytes. Matériel et méthodes 15 Marquage des lipides au BODIPY Le BODIPY® (493/503) est un fluorochrome qui a une affinité particulière pour les lipides neutres. Produits : BOD I PY® (493/503) Molecular Probes Ref: D3922 Hoechst 33258 10 mg.mL Solution in water Sigma Ref: H3569 Dako pen DAKO Ref: S200230 Fluoromount G CLINISCIENCES SA Ref: 0100-01 Formaldéhyde 4% en solution aqueuse (= 10% formol), VWR Ref: 9713.1000 PBS BioMérieux sa Ref: 75511 Eau Versylène Fresenius Ref: B230531 BSA Sigma Ref: A7906 SVF chèvre Sigma Ref: G9053 DMSO Sigma Ref: D2650 20 Ce marquage est réalisé sur des coupes de 10 lm d'épaisseur obtenues à partir de coupes au cryomicrotom d'échantillons congelés en OCT (Optimal Cutting Temperature). Le protocole suivant a été mis en oeuvre : - Sortir les lames à marquer du congélateur, les laisser sécher à plat environ 30 min. - Fixation : Bain de formaldehyde 4% 20 min à Température ambiante 25 - Laisser sécher sous sorbonne jusqu'à ce qu'il ne reste plus de formaldéhyde - Entourer les coupes de Dako pen, (bien laisser sécher) - Rinçage PBS 5 min à +4°C 3061205 23 - Incubation PBS + SVF chèvre 10% + BSA 1% : 100p1 /coupe, 20 min à Température Ambiante dans une chambre humide, à l'obscurité - Préparation PBS + BSA 1%: lOg BSA + 1 litre PBS histo - Préparation PBS + BSA 1%+SVF chèvre 10% : 1000p1 SVF Chèvre + 9000p1 PBS+BSA 5 1% - Rinçage PBS 5 min à +4°C - Incubation Bodipy lh à Température ambiante dans une chambre humide, à l'obscurité, 100p1 /coupe - Préparation PBS + SVF chèvre 10%: 1,5m1SVF Chèvre + 13,5m1 PBS. 10 - Préparation Bodipy à 25pg/m1 (dilution au 1/40eme d'aliquots préalablement préparé à 1mg/m1 DMSO), 250p1 Bodipy 1mg/m1 + 9750 pl PBS + SVF de Chèvre. - Rinçage PBS 5min à +4°C - Incubation au Hoechst 1/1000e 5 min à Température ambiante dans une chambre humide, à l'obscurité, 100p1 /coupe 15 - Préparation Hoechst: 15p1 Hoechst + 15 ml PBS - 2 Rinçages PBS 5 min à +4°C - Montage des lamelles couvre objet avec du Fluoromount G. Acquisition et analyse du marquage : 20 L'acquisition des images de fluorescence doit se faire dans des conditions standardisées (temps d'exposition, réglages white-black...) et avec un grossissement permettant de visualiser l'épithélium dans toute son épaisseur. Les images acquises en fluorescence doivent être enregistrées dans un format compatible avec le logiciel d'analyse d'images et avec l'échelle des tailles. 25 Analyse des images réalisée sous IMAGEJ : définir l'échelle, et les différents seuils d'analyse pour filtrer la zone désirée (saturation, brightness,...) Sélectionner le marquage et réaliser le calcul de surface. Pour avoir une évaluation plus robuste, cette analyse est réalisée sur plusieurs champs par coupe histologique, et sur plusieurs coupes histologiques par échantillon 30 biologique. Pour chaque échantillon les mesures sont moyennées, et pour chaque condition de test la moyenne des réplicats par condition de traitement est réalisée. Si un actif a été testé sur plusieurs études, les résultats peuvent être normalisés par rapport au témoin non traité pour pouvoir exprimer une significativité sur l'ensemble des tests réalisés. 35 3061205 24 Résultats La figure 4 montre les résultats obtenus par marquage au BODIPY et analyse d'image sous IMAGEJ. Pour chaque condition les résultats de surface ont été obtenus en compilant 3 différentes études après normalisation des valeurs par rapport aux témoins 5 non traités. L'ensemble des composés testés étant solubilisés en DMSO, un témoin solvant a été intégré dans chaque étude. L'isotrétinoïne a été utilisée comme référence pharmaceutique ou contrôle positif de la fonctionnalité du modèle, et a permis de valider les études. 3 composés cosmétiques ont été évalués en parallèle (composés A, B et C). Les composés A et B ont permis de diminuer la synthèse de lipides neutres, 10 contrairement au composé C qui n'a pas montré d'activité dans ce test. REVENDICATIONS1. Procédé in vitro d'amplification de sébocytes primaires comprenant une étape de culture, en présence de cellules nourricières, de sébocytes primaires, de préférence de sébocytes humains primaires non-immortalisés, dans un milieu de culture "G7F-sebo2D" comprenant : (i) de l'adénine hydrochloride, (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), (iii) de l'hydrocortisone, (iv) de l'insuline, (v) de l'isoprotérénol, (vi) de la transferrine, et (vii) de la triiodothyronine, ledit milieu de culture comprenant en outre un inhibiteur de ROCK. 2. Procédé d'amplification selon la revendication 1, dans lequel l'inhibiteur de ROCK est le composé Y-27632, le composé Y-27632 étant de préférence présent dans le milieu de culture à une concentration de 101..1M. 3. Procédé d'amplification selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le milieu de culture « G7-sebo2D » comprend : (i) de 1x10-4 à 2x10-4 M d'adénine hydrochloride, (ii) de 5 à 25 ng/ml d'EGF, (iii) de 0,1 à 1 pg/m1 d'hydrocortisone, (iv) de 1 à 10 pg/m1 d'insuline, (v) de 5x10-7 à 5x10-6 M d'isoprotérénol, (vi) de 1 à 10 pg/m1 de transferrine, de préférence de transferrine humaine, et (vii) de 1x10-6 à 5x10-6 M de triiodothyronine. 4. Procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les sébocytes primaires sont des sébocytes primaires humains non-immortalisés provenant de glandes sébacées issues de déchets opératoires. 5. Procédé in vitro de préparation d'un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire comprenant les étapes consistant à: 3061205 26 a) ensemencer, sur un biomatériau pour épiderme reconstruit (BPER) éventuellement recouvert de protéine de matrice extracellulaire, des sébocytes primaires non-immortalisés en suspension dans un milieu de culture "G7F-ERS" comprenant: 5 (i) de l'adénine hydrochloride, (ii) du facteur de croissance épidermique (EGF), (iii) de l'hydrocortisone, (iv) de l'insuline, (v) de l'isoprotérénol, 10 (vi) de la transferrine, et (vii) de la triiodothyronine ; b) cultiver les sébocytes ensemencés à l'étape a) en immersion sur ledit BPER dans du milieu « G7F-ERS » pendant là 4 jours ; c) cultiver les sébocytes obtenus à l'étape b) à l'interface air - liquide sur ledit 15 BPER au-dessus d'un milieu de culture "G3F-ERS" comprenant : (I) du facteur de croissance épidermique (EGF), (Il) de l'hydrocortisone, et (III) de l'insuline, ledit milieu G3F-ERS comprenant en outre de l'acide linoléique et un agoniste 20 PPAR, pendant une durée appropriée pour permettre la différenciation des sébocytes et la synthèse lipidique, ledit modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire étant obtenu à l'issue de l'étape c). 25 6. Procédé de préparation selon la revendication 5, dans lequel les sébocytes primaires non-immortalisés ensemencés à l'étape a) sont des sébocytes primaires non-immortalisés amplifiés par le procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 mais en l'absence d'inhibiteur de ROCK. 30 7. Procédé de préparation selon la revendication 5 ou 6, dans lequel le milieu de culture « G7F-ERS » comprend : (i) de 1x10-4 à 2x10-4 M d'adénine hydrochloride, (ii) de 30 à 75 ng/ml d'EGF, (iii) de 0,1 à 1 pg/mld'hydrocortisone, 35 (iv) de 1 à 10 pg/m1 d'insuline, (v) de 5x10-7 à 5x10-6 M d'isoprotérénol, 3061205 27 (vi) de 1 à 10 pg/m1 de transferrine, de préférence de transferrine humaine, et (vii) de 1x10-9 à 5x10-9 M de triiodothyronine. 8. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel le 5 milieu de culture « G3F-ERS » comprend : (I) de 30 à 75 ng/ml d'EGF, (Il) de 0,1 à 1 pg/m1 d'hydrocortisone, et (III) de 1 à 10 pg/m1 d'insuline, ledit milieu G3F-ERS comprenant en outre de 1x10-7 à 2,5x10-9 M d'acide linoléique et de 10 1x10-6 à 5x10-6 M d'un agoniste PPAR, ledit agoniste PPAR étant de préférence le composé GW0742. 9. Modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire susceptible d'être obtenu par le procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 5 à 8. 10. Procédé in vitro de criblage d'un composé candidat pour traiter la peau grasse et/ou luisante comprenant la mise en contact dudit composé candidat avec un modèle d'épithélium reconstruit sébocytaire selon la revendication 9. 15 20