Brevet FR3061494A1 — publié le 20180706

PROCEDE DE SYNTHESE DE DITHIOCARBAMATES CYCLIQUES FONCTIONNALISES Domaine de l'invention L'invention concerne le domaine des dithiocarbamates cycliques et plus spécifiquement un procédé de synthèse de dithiocarbamates cycliques, et plus particulièrement de dithiocarbamates cycliques fonctionnalisés. Art antérieur Les dithiocarbamates sont des composés organiques pouvant être utilisés en tant que précurseurs de radicaux, intermédiaires de synthèse organique, agents de vulcanisation, chélateurs ou inhibiteurs d'enzyme. Leurs domaines d'application sont divers et ils peuvent par exemple entrer dans la composition de fongicides, de désherbants, de pesticides ou d'insecticides dans le domaine agricole, être utilisés dans l'industrie du caoutchouc ou encore dans l'industrie pharmaceutique dans le traitement de maladies telles que le cancer ou le VIH. De par la multitude d'applications des dithiocarbamates, il existe diverses techniques de synthèses de ces composés. Ainsi, l'article de Entesar A. Hassan, Dithiocarbamates as precursors in organic chemistry, synthesis and uses, Phosphorus, Sulfur and Silicon, vol. 189, 2014, p. 300-323, décrit différents procédés de synthèse des dithiocarbamates. Il est par exemple divulgué la synthèse de N,N-dialkyldithiocarbamate par réaction d'un sel de dithiocarbamate avec un alkyle d'halogénure ou avec un phosphate de dialkyle, ou par addition d'oléfines électron-déficientes. Cet article décrit également l'obtention de dithiocarbamates par acylation d'amines par du chlorodithioformate. Il est aussi divulgué la préparation de dithiocarbamates cycliques par réaction de disulfures avec (i) du 2-aminoethanol, de sulfate de 2- aminoethyl et un halogénure de 2-aminoethyl, (ii) des amines primaires et du 1,2- dibromoethane en présence d'une base, (iii) des aziridines et (iv) des 2- iminothiazolidines. Les dithiocarbamates cycliques peuvent également être 3061494 2 préparés par cyclisation de p-hydroxyalkyldithiocarbamates par traitement avec du chlorure de mésyle dans de la pyridine, ou encore par cyclisation du 2- alkylaminoethanethiol avec du thiophosgène en présence d'une base. Par ailleurs, la demande CN 103804258 décrit la synthèse de 5 dithiocarbamates à partir de carbamide et de disulfure de carbone et la demande CN 103804257 divulgue la préparation de diéthyldithiocarbamates également à partir de carbamide et de disulfure de carbone. Quant à la demande US 2046876, cette dernière décrit la synthèse de N- diaryl dithiocarbamates par ajout de disulfure de carbone sur des composés de 10 diarylam ines. On comprendra facilement que, de par la multitude des applications possibles des dithiocarbamates, il existe toujours un besoin pour en disposer de nouveaux, fonctionnalisés pour les applications en polymérisation (notamment 15 pour un greffage éventuel sur un support organique) ou dévulcanisation et autres, voire optiquement actifs pour les applications en biologie. On comprendra aussi par la description des méthodes de synthèse qu'il existe aussi un besoin pour des synthèses de dithiocarbamates avec des 20 procédés que l'on peut qualifier de durables, c'est-à-dire réalisables avec des conditions douces de température et de pression, en solution aqueuse avec des pH proches de la neutralité, et avec des matières premières d'origine renouvelable. 25 Il a maintenant été découvert qu'il était possible de répondre aux critères définis ci-dessus en mettant en oeuvre le procédé selon l'invention et tel que décrit ci-après. 30 Description détaillée de l'invention La présente invention concerne un procédé de synthèse d'un dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) : 3061494 3 S ( \N-R1 X-R2 (I) dans laquelle Ri est un hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée ramifiée ou non, saturée ou insaturée, linéaire ou cyclique, aromatique ou non, comportant de 1 à 20 atomes de carbone, et pouvant comporter un ou plusieurs 5 hétéroatomes choisis parmi O, S, N, P et Si ; X représente -C(=0)- ou -CH2- ou -CN ; R2 est (i) soit nul (quand X représente -CN), (ii) soit un hydrogène, (iii) soit -0R3, R3 étant un hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée ramifiée ou non, saturée ou insaturée, linéaire ou cyclique, aromatique ou non, comportant de 1 10 à 20 atomes de carbone, et pouvant comporter ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S, N, P et Si, (iv) soit -NR4R5 avec R4 et R5, différents ou non, étant un hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée ramifiée ou non, saturée ou insaturée, linéaire ou cyclique, aromatique ou non, comportant de 1 à 20 atomes de carbone, et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes choisis 15 parmi O, S, N, P et Si ; n est égal à 0, 1 ou 2, de préférence 1 ; et * représente un carbone asymétrique ; ledit procédé comprenant les étapes de : a/ fourniture d'au moins un composé de formule (II) : 20 G-(CH2)n-C*H(NHR1)-X-R2 (II) dans laquelle n, Ri, R2, X, et * sont tels que définis précédemment ; G représente soit (i) Re-C(=0)-0-CH2-, soit (ii) (R70)(R80)-P(=0)-0-CH2-, soit (iii) R70-S02-0-CH2- ; R6 est un hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée ramifiée ou non, 25 saturée ou insaturée, linéaire ou cyclique, aromatique ou non, comportant de 1 à 20 atomes de carbone, et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S, N, P et Si ; R7 et R8, identiques ou différents, étant un proton H, un alcalin, un alcalino-terreux ou un ammonium, de préférence un proton H ou un alcalin, et plus 30 particulièrement un proton H ou Na ; 3061494 4 b/ fourniture d'au moins un trithiocarbonate inorganique ; c/ réaction entre ledit au moins composé de formule (II) et ledit au moins trithiocarbonate inorganique en présence d'au moins une enzyme choisie parmi les sulfhydrylases, et de préférence une sulfhydrylase associée audit composé 5 de formule (II) ; d/ obtention d'au moins un dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) ; e/ séparation et isolation dudit au moins un dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) ; 10 f/ de façon optionnelle, fonctionnalisation supplémentaire du dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) obtenu à l'étape d/ ; les étapes a/ et b/ étant, ou non, effectuées de manière simultanée. Il a été observé que la configuration du carbone asymétrique est conservée 15 tout au long de la réaction. Le dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) obtenu selon le procédé selon l'invention est un dithiocarbamate énantiomériquement pur. Par « dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé », on entend tout type de 20 dithiocarbamate cyclique de formule (I) dont l'atome d'azote porte un groupement fonctionnel (sauf lorsque Ri représente l'atome d'hydrogène) et/ou l'atome de carbone en alpha de l'atome d'azote porte un groupement fonctionnel (sauf lorsque -X- représente -CH2_ et que R2 l'atome d'hydrogène). 25 L'invention sera mieux comprise au regard de la description et des exemples qui suivent mais n'est en aucun cas limitée aux dits exemples. Selon un mode de réalisation de l'invention, Ri représente l'atome d'hydrogène. 30 Selon un autre mode réalisation de l'invention, -X- représente -C(=0)-. Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, R2 représente -0R3 avec R3 étant l'atome d'hydrogène. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, n est égal à O. 3061494 5 Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, n est égal à 1. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, au sein de la formule (I), Ri représente l'atome d'hydrogène, -X- représente -C(=0)-, -R2 représente -OR3 avec R3 étant un hydrogène, n est égal à 0, et le composé de formule (I) est 5 l'acide L-raphanusamique. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, au sein de la formule (I), Ri représente l'atome d'hydrogène, -X- représente -C(=0)-, -R2 représente -OR3 avec R3 étant l'atome d'hydrogène, n est égal à 1, et le composé de formule (I) est l'acide L-homoraphanusamique. 10 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, au sein de la formule (II), Ri représente l'atome d'hydrogène, -X- représente -C(=0)-, -R2 représente -OR3 avec R3 étant un hydrogène, n est égal à 0, et le composé de formule (II) est un dérivé de la L-sérine. 15 Le dérivé de la L-sérine utilisé dans le procédé selon l'invention peut, par exemple et de manière non limitative, être choisi parmi l'O-phospho-L-sérine, l'Osuccinyl-L-sérine, l'O-acétyl-L-sérine, l'O-acétoacétyl-L-sérine, la O-propio-Lsérine, la O-coumaroyl-L-sérine, la O-malonyl-L-sérine, l'O-hydroxyméthylglutarylL-sérine, la O-pimélyl-L-sérine et la O-sulfato-L-sérine. 20 De manière préférée, le dérivé de L-sérine est choisi parmi l'O-phospho-L- sérine, l'O-succinyl-L-sérine, l'O-acétyl-L-sérine et la O-sulfato-L-sérine. De manière tout particulièrement préférée, le dérivé de L-sérine est l'O-acétyl-L-sérine. 25 Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, au sein de la formule (II), Ri représente l'atome d'hydrogène, X représente la fonction C=O, R2 représente -OR3 avec R3 étant un hydrogène, n est égal à 1, et le composé de formule (II) est un dérivé de la L-homosérine. Le dérivé de L-homosérine utilisé dans le procédé selon l'invention peut, par 30 exemple et de manière non limitative, être choisi parmi l'O-phospho-L-homosérine, l'O-succinyl-L-homosérine, l'O-acétyl-L-homosérine, l'O-acétoacétyl-L-homo-sérine, la O-propio-L-homosérine, la O-coumaroyl-L-homosérine, la O-malonyl-L- 3061494 6 homosérine, l'O-hydroxyméthylglutaryl-L-homosérine, la O-pimélyl-L-homosérine et la O-sulfato-L-homosérine. De manière préférée, le dérivé de L-homosérine est choisi parmi l'O- phospho-L-homosérine, l'O-succinyl-L-homosérine, l'O-acétyl-L-homosérine et la 5 0-sulfato-L-homosérine. De manière tout particulièrement préférée, le dérivé de L-homosérine est l'O-acétyl-L-homosérine (OAHS). Le dérivé de la L-sérine et le dérivé de la L-homosérine sont soit disponibles 10 dans le commerce, soit obtenus par toute technique connue de l'homme du métier. Ils peuvent par exemple être obtenus par fermentation d'une matière première renouvelable. La matière première renouvelable peut être choisie parmi le glucose, le saccharose, l'amidon, la mélasse, le glycérol, le bioéthanol, de 15 préférence le glucose. Le dérivé de la L-sérine peut également être produit à partir de l'acétylation de la L-sérine, la L-sérine, pouvant elle-même être obtenue par fermentation d'une matière première renouvelable. La matière première renouvelable peut être choisi parmi le glucose, le saccharose, l'amidon, la mélasse, le glycérol, le bioéthanol, de 20 préférence le glucose. Le dérivé de la L-homosérine peut également être produit à partir de l'acétylation de la L-homosérine, la L-homosérine, pouvant elle-même être obtenue par fermentation d'une matière première renouvelable. La matière première renouvelable peut être choisi parmi le glucose, le saccharose, l'amidon, 25 la mélasse, le glycérol, le bioéthanol, de préférence le glucose. Le trithiocarbonate inorganique utilisé dans le procédé selon l'invention peut être choisi parmi un trithiocarbonate d'alcalin, un trithiocarbonate d'alcalino-terreux ou un trithiocarbonate d'ammonium. 30 De manière préférée, le trithiocarbonate inorganique est choisi parmi le trithiocarbonate de sodium, le trithiocarbonate de potassium, le trithiocarbonate de calcium et le trithiocarbonate d'ammonium. 3061494 7 De manière particulièrement préférée, le trithiocarbonate inorganique est le trithiocarbonate de sodium. Au cours du procédé selon l'invention, la réaction entre ledit au moins 5 composé de formule (II) et ledit au moins trithiocarbonate inorganique s'effectue en présence d'au moins une enzyme, ladite enzyme étant de préférence une sulfhydrylase associée au dit composé de formule (II). Ainsi, lorsque le composé de formule (II) est un dérivé de la L-sérine, l'enzyme utilisée peut être choisie parmi l'O-phospho-L-sérine sulfhydrylase, 10 l'O-succinyl-L-sérine sulfhydrylase, l'O-acétyl-L-sérine sulfhydrylase, l'O-acétoacétyl-L-sérine sulfhydrylase, l'O-propio-L-sérine sulfhydrylase, l'O-coumaroyl-L-sérine sulfhydrylase, l'O-malonyl-L-sérine sulfhydrylase, l'O-hydroxyméthylglutaryl-L-sérine sulfhydrylase, l'O-pimélyl-L-sérine sulfhydrylase et l'O-sulfato-L-sérine sulfhydrylase. 15 De manière préférée, l'enzyme associée au dérivé de la L-sérine est choisie parmi l'O-phospho-L-sérine sulfhydrylase, l'O-succinyl-L-sérine sulfhydrylase, l'O-acétyl-L-sérine sulfhydrylase et l'O-sulfato-L-sérine sulfhydrylase. De manière tout particulièrement préférée, l'enzyme associée au dérivé de la L-sérine est l'O-acétyl-L-sérine sulfhydrylase. 20 Par ailleurs, lorsque le composé de formule (II) est un dérivé de la L-homosérine, l'enzyme qui utilisée peut être choisie parmi l'O-phospho-Lhomosérine sulfhydrylase, l'O-succinyl-L-homosérine sulfhydrylase, l'O-acétyl-Lhomosérine sulfhydrylase, l'O-acétoacétyl-L-homosérine sulfhydrylase, l'O-propio- L-homosérine sulfhydrylase, l'O-coumaroyl-L-homosérine sulfhydrylase, 25 l'O-malonyl-L-homosérine sulfhydrylase, l'O-hydroxyméthylglutaryl-L-homosérine sulfhydrylase, l'O-pimélyl-L-homosérine sulfhydrylase et l'O-sulfato-L-homosérine sulfhydrylase. De manière préférée, l'enzyme associée au dérivé de la L-homosérine est choisie parmi l'O-phospho-L-homosérine sulfhydrylase, l'O-succinyl-L-homosérine 30 sulfhydrylase, l'O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase et l'O-sulfato-L-homosérine sulfhydrylase. De manière tout particulièrement préférée, l'enzyme associé au dérivé de la L-homosérine est l'O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase. 3061494 8 Ces dites enzymes présentent un fonctionnement optimal, comme cela est bien connu de l'homme du métier, lorsqu'elles sont utilisées en présence d'un cofacteur, tel que par exemple le pyridoxa1-5'-phosphate. L'enzyme et son cofacteur associé sont généralement dissous dans de l'eau 5 avant d'être ajoutés au milieu réactionnel. La proportion d'enzyme par rapport à la masse du composé de formule (II), sera comprise entre 0,1 à 10% en poids, de préférence entre 1 et 5% en poids, et la quantité de cofacteur par rapport au composé de formule (II) sera comprise entre 0,1 et 10% en poids, de préférence entre 0,5 et 5% en poids. 10 En ce qui concerne les conditions de pH, de températures, de milieu de synthèse, on peut se référer à celles décrites dans les demandes WO 2008/013432 et WO 2013/029690. Ainsi, le pH réactionnel est de préférence compris entre 5 et 8, de préférence 15 entre 6 et 7,5, et plus particulièrement entre 6,2 et 7,2. Ledit pH est fonction du domaine de fonctionnement de l'enzyme et peut être régulé suivant l'optimum de l'enzyme, par ajout du trithiocarbonate basique ou en ajoutant de l'acide sulfurique dilué ou de l'ammoniaque dilué. De manière préférée, le pH est ajusté par régulation de l'ajout du trithiocarbonate basique. 20 Ainsi, la température au cours de la réaction est comprise entre 10 et 45°C, de préférence entre 20 et 40°C, et plus particulièrement entre 25 et 35°C. Ladite température est choisie suivant le domaine de fonctionnement de l'enzyme. La réaction se déroule en milieu aqueux ou en présence de solvants organiques si ces derniers sont compatibles avec les enzymes utilisées. De 25 manière préférée, la réaction se déroule en milieu aqueux. La réaction peut être menée en batch, en semi-continu ou en continu. Tout type de réacteurs, connu de l'homme de métier, peut convenir à ce type de réactions. Selon un mode de réalisation de l'invention, la séparation et l'isolation du 30 dithiocarbamate obtenu peuvent s'effectuer selon toute technique connue de l'homme du métier, en particulier par précipitation et filtration. 3061494 9 L'étape f/ optionnelle du procédé selon l'invention permet d'obtenir des fonctions supplémentaires et différentes de celles obtenues après l'étape d/. En effet, le dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) obtenu à l'issue de l'étape d/ peut de nouveau être fonctionnalisé au cours de cette étape f/. 5 Par exemple, si X-R2 représente une fonction carboxylique, cette dernière peut être estérifiée, réduite en aldéhyde, réduite en alcool puis éthérifiée, amidifiée, nitrilée ou autres. Toutes les fonctions peuvent être obtenues selon des techniques bien connues de l'homme de métier, en fonction de l'utilisation finale que l'on destine au dithiocarbamate. 10 Ainsi, le dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) obtenu à l'issue de l'étape d/ peut être soumis à une ou plusieurs réactions chimiques supplémentaires pour obtenir un ou plusieurs dithiocarbamate avec des fonctions différentes, les dites réactions chimiques étant toutes réactions connues de l'homme du métier. 15 Selon un mode de réalisation de l'invention, on met en présence un dérivé de L-sérine tel que l'O-acétyl-L-sérine, une enzyme telle que l'O-acétyl-L-sérine sulfhydrylase, un cofacteur, tel que le pyridoxal-phosphate (PLP), et du trithiocarbonate basique, tel que le trithiocarbonate de sodium, il s'avère de façon 20 surprenante qu'un des produits principaux obtenu est un dithiocarbamate cyclique répondant au nom d'acide L-raphanusamique : s s)( NH OH O Acide raphanusam igue 25 Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on met en présence un dérivé de L-homosérine tel que l'O-acétyl-L-homosérine, une enzyme telle que l'O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase, un cofacteur, tel que le Pyridoxalphosphate (PLP), et du trithiocarbonate basique, tel que le trithiocarbonate de sodium, il s'avère de façon surprenante que un des produits principaux obtenu est 3061494 10 un dithiocarbamate cyclique répondant au nom d'acide L-homoraphanusamique (homologue supérieur cyclique de l'acide L-raphanusamique) : //s NH OH O Acide homoraphanusamique 5 Il a été observé que la synthèse du dithiocarbamate peut s'accompagner de la production d'un mercaptan de formule (III) : HS-CH2(CH2)n-C*H(NHR1)-X-R2 dans laquelle n, Ri, R2, X et * sont tels que définis précédemment. Ce mercaptan peut avantageusement servir de matière première pour la synthèse du 10 dithiocarbamate par réaction avec du disulfure de carbone en milieu basique. Par exemple, dans le cas de la synthèse de l'acide homoraphanusamique, le mercaptan produit est l'homocystéine qui réagit avec du disulfure de carbone selon le schéma suivant : NH2 HS CS2 OH NaOH [Na+ S NH2 + H2O S OH OH NaSH 3061494 11 Le composé entre crochets est un composé intermédiaire qui apparaît au cours du procédé. Ce composé est nouveau, et à ce titre fait partie de la présente invention. Ce composé est dénommé dans la suite trithiocarbonate sodique de 5 l'homocystéine. De manière plus générale, le composé intermédiaire peut être un composé de formule (IV) : X2+S--C=(S)-S-CH2-(CH2)nC*H(NHR1)-X-R2 (IV) dans laquelle Ri, R2, X, * et n sont tels que définis précédemment et X2 peut 10 être Na, K, NH4, Ca, de préférence Na. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, du disulfure de carbone peut être ajouté en continu ou en batch au cours de la réaction. 15 L'ajout de disulfure de carbone permet notamment d'augmenter le rendement de synthèse du dithiocarbamate. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le dérivé de la L-sérine est l'O-acétyl-L-sérine, le trithiocarbonate est le trithiocarbonate de sodium et 20 l'enzyme utilisée est la O-acétyl-L-sérine sulfhydrylase. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) obtenu selon le procédé est l'acide L-raphanusam igue. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le dérivé de la 25 L-homosérine est l'O-acétyl-L-homosérine, le trithiocarbonate est le trithiocarbonate de sodium et l'enzyme utilisée est la O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) obtenu selon le procédé est l'acide 30 L-homoraphanusamique. Comme indiqué précédemment, la configuration du carbone asymétrique est conservée tout au long de la réaction. Ceci permet d'obtenir un énantiomère 3061494 12 particulier ce qui peut présenter un avantage pour certaines applications, notamment dans le domaine médical ou pharmaceutique. De plus, l'acide carboxylique présent sur le dithiocarbamate fonctionnalisé de formule (I) peut permettre d'accrocher une large diversité de composé ou 5 molécule rendant possible un greffage sur support organique ou inorganique. Les dithiocarbamates cycliques fonctionnalisés de formule (I) préparés selon le procédé selon l'invention peuvent être utilisés en tant que précurseurs de radicaux, intermédiaires de synthèse organique, agents de vulcanisation, 10 chélateurs ou inhibiteurs d'enzyme. Leurs domaines d'application sont divers et ils peuvent par exemple entrer dans la composition de fongicides, de désherbants, de pesticides ou d'insecticides dans le domaine agricole, être utilisés dans l'industrie du caoutchouc ou encore dans l'industrie pharmaceutique dans le traitement de maladies telles que le cancer ou le VIH. 15 Exemples Exemple 1 : Synthèse enzymatique de l'acide L-homoraphanusamique 20 Etape 1 : L'O-acétyl-L-homosérine a été synthétisée à partir de L-homosérine et d'anhydride acétique selon Sadamu Nagai, « Synthesis of O-acetyl-Lhomoserine », Academic Press, (1971), vol.17, p. 423-424. Etape 2 : 25 Dans un réacteur thermostaté en verre de 250mL, sont introduits 10g (62mmol) d'OAHS, précédemment synthétisés, dans 140mL d'eau distillée. La solution est portée à 35°C sous agitation mécanique. Le pH du milieu réactionnel est de 4,8. Avant de mettre l'enzyme, le pH est fixé à 6,5 par quelques gouttes de la solution de trithiocarbonate de sodium (4,78 g - 31 mmol - dissous dans 20 mL 30 d'eau distillée). On effectue un prélèvement (t = 0) de 1mL du milieu réactionnel. Une solution de Pyridoxal phosphate (10mmol, 0,4g) et l'enzyme, l'O-acétyl-Lhomosérine sulfhydrylase, (0,6g) sont dissous dans 10mL d'eau puis ajoutés dans le réacteur. La réaction commence ce qui engendre une diminution du pH. Le 3061494 13 milieu réactionnel est maintenu à un pH de 6,5 par ajout de trithiocarbonate de sodium lentement via l'ampoule de coulée. Des prélèvements (1mL) sont effectués au cours de la réaction. Les analyses par potentiométrie, CCM, HPLC et UPLC/UV-masse montrent une disparition progressive des réactifs (DANS et 5 Na2CS3) et l'apparition progressive, en quantités de plus en plus importantes, du composé suivant : s NH2 O Na+ OH Ce composé intermédiaire disparaît à son tour progressivement pour donner en quantité équimolaires : 10 - l'acide L-homoraphanusamique (le dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé) //S NH OH - et la L-homocystéine NH2 O HS OH 15 Les seuls autres produits observés après la disparition totale de l'OAHS sont des traces d'homosérine (hydrolyse de l'OAHS). Etape 3 : Séparation et isolation du dithiocarbamate : Le milieu réactionnel est concentré par évaporation partielle de l'eau (de 20 façon à éviter la précipitation de l'acétate de sodium présent dans le milieu réactionnel) sous pression réduite à 30°C. Un précipité se forme car le dithiocarbamate s'avère être le moins soluble des composés présents dans le milieu réactionnel. Après filtration et séchage, on obtient 4,9 g de dithiocarbamate. Le rendement isolé global de dithiocarbamate est de 4,9 g sur 11 g théoriques soit 3061494 14 45%. Des analyses complémentaires sur ce produit sec ont montré que ce solide ne contient que des traces d'homocystéine. Exemple 2 : Synthèse de dithiocarbamate (sans enzyme ni coenzyme) 5 L'exemple 1 a été répété à la seule différence que la solution de Pyridoxal phosphate (10mmol, 0,4g) et l'enzyme, l'O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase (0,6g) dissout dans 10mL d'eau n'ont pas été ajoutées dans le réacteur. Il s'avère que la réaction n'a jamais démarré et qu'il n'a jamais été possible d'ajouter continuellement la solution de trithiocarbonate si on souhaitait conserver un pH de 10 6,5. En augmentant à pH 8, puis à pH 12, par ajout de solution de trithiocarbonate de sodium, la seule réaction observée est un début d'hydrolyse de l'OAHS en homoserine. Cet exemple montre que la synthèse de dithiocarbamate doit être catalysée par une enzyme pour être performante. 15 Exemple 3 : Synthèse enzymatique du dithiocarbamate (avec ajout de CS2 en fin de réaction) Etape 1 : La synthèse de l'O-acétyl-L-homoserine (DANS) à partir de L-homosérine a été réalisée selon un protocole tiré de la littérature (Sadamu Nagai, « Synthesis 20 of 0-acetyl-homoserine », Academic Press, (1971), vol.17, p. 423-424. Etape 2 : Dans un réacteur thermostaté en verre de 250mL, sont introduits 10g (62mmol) d'OAHS dans 140mL d'eau distillée. La solution est portée à 35°C sous agitation mécanique. Le pH du milieu réactionnel est de 4,8. Avant de mettre 25 l'enzyme, le pH est fixé à 6,5 par ajout de quelques gouttes de la solution de trithiocarbonate de sodium (la quantité totale ajoutée tout au long de la réaction est égale à 4,78g - 31mmol - dissous dans 20mL d'eau distillée). On effectue un prélèvement (t = 0) d'1 mL du milieu réactionnel. On prépare une solution de 10mL d'eau distillée contenant 400pL d'une 30 solution de pyridoxal phosphate (10mmol/L) et de 0,6g d'enzyme (O-acétyl-L- homosérine sulfhydrylase). Une diminution du pH indiquant la formation d'acide acétique permet de dire que la réaction commence. Il est nécessaire de maintenir le milieu réactionnel à un pH égal à 6,5. Pour cela la solution de trithiocarbonate 3061494 15 de sodium est ajoutée lentement via l'ampoule de coulée. Des prélèvements (1mL) sont effectués au cours de la réaction. Lorsque les analyses par potentiométrie indiquent une conversion de 50% de l'OAHS en homocystéine, 1,87mL de disulfure de carbone (3lmmol) sont ajoutés au milieu réactionnel. Le 5 pH du milieu réactionnel est ajusté à 10 avec une solution de soude à 1M. Le milieu réactionnel est alors porté à 50°C. Une disparition de la cystéine par analyse potentiomètrique est observée. Une solution d'acide chlorhydrique (2N) est ensuite utilisée pour abaisser à 5 le pH du milieu réactionnel. Les analyses complémentaires par CCM, HPLC et UPLC/UV-masse 10 montrent la formation d'un produit principal l'acide L-homoraphanusamique. Les seuls autres produits observés après la disparition totale de l'OAHS sont des traces d'homoserine (hydrolyse de l'OAHS) ainsi que des traces d'homocystéine. Etape 3 : Séparation et isolation du dithiocarbamate Le milieu réactionnel est concentré par évaporation partielle de l'eau (de 15 façon à éviter la précipitation de l'acétate de sodium et des autres sels présents dans le milieu réactionnel) sous pression réduite à 30°C. Ainsi un précipité se forme car le dithiocarbamate s'avère être l'espèce la moins soluble dans l'eau. Après filtration et séchage, on obtient 9,2g de dithiocarbamate. Le rendement isolé global de dithiocarbamate est de 9,2g sur 11g théoriques soit 84%. 20 Exemple 4: Synthèse enzymatique du dithiocarbamate (avec ajout de CS2 pendant la réaction) Etape 1 : La synthèse de l'O-acétyl-L-homosérine (DANS) à partir de L-homosérine 25 a été réalisée selon un protocole tiré de la littérature (source : « Sadamu Nagai, Synthesis of 0-acetyl-homoserine », Academic Press, (1971), vol.17, p. 423-424). Etape 2 : Dans un réacteur thermostaté en verre de 250mL, sont introduits 10g (61mmol) d'OAHS précédemment synthétisés dans 140mL d'eau distillée. La 30 solution est portée à 35°C sous agitation mécanique. Le pH du milieu réactionnel est de 4,8. Avant de mettre l'enzyme, le pH est fixé 7,2 par ajout de quelques gouttes de la solution de trithiocarbonate et de disulfure de carbone (4,78g de trithiocarbonate - 3lmmol - 1,87mL de disulfure de carbone ; 31 mmol - dissous 3061494 16 dans 20mL d'eau distillé). On effectue un prélèvement (t = 0) d'1 mL du milieu réactionnel. On prépare une solution de 10 mL d'eau distillé contenant 400 pL d'une solution de pyridoxal phosphate (10mmol/L) et de 0.6g d'enzyme (0-acétylL-homosérine sulfhydrylase). Une diminution du pH indiquant la formation d'acide 5 acétique permet de dire que la réaction commence. Il est nécessaire de maintenir le milieu réactionnel à un pH égal à 7,2. Pour cela la solution de trithiocarbonate de sodium est ajoutée lentement via l'ampoule de coulée. Des prélèvements (1mL) sont effectués au cours de la réaction. Les analyses par potentiométrie, CCM, HPLC et UPLC/UV-masse (après dérivatisation) montrent une disparition 10 progressive des réactifs (DANS et Na2CS3) et l'apparition progressive en quantité de plus en plus importante de l'acide L-homoraphanusamique. Lorsque la totalité de I'OAHS a réagi, le pH du milieu est descendu à 5 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 2M. On obtient l'acide L-homoraphanusamique (le dithiocarbamate). 15 La dérivatisation pour la méthode UPLC/UV-Masse a été faite par la même méthode décrite dans l'exemple 1. Les seuls autres produits observés après la disparition totale de I'OAHS sont des traces d'homoserine (hydrolyse de I'OAHS) ainsi que des traces d'homocystéine. Etape 3 : Séparation et isolation du dithiocarbamate 20 Le milieu réactionnel est concentré par évaporation partielle de l'eau (de façon à éviter la précipitation de l'acétate de sodium et des autres sels présents dans le milieu réactionnel) sous pression réduite à 30°C. Ainsi un précipité se forme car le dithiocarbamate s'avère être l'espèce la moins soluble dans l'eau. Après filtration et séchage, on obtient 8,3 g de dithiocarbamate. Le rendement 25 isolé global de dithiocarbamate est 8,3g sur 11g théoriques soit 75,4%. REVENDICATIONS1. Procédé de synthèse d'un dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) : N-R1 )r, X-R2 (I) dans laquelle R1 est un hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée ramifiée ou non, saturée ou insaturée, linéaire ou cyclique, aromatique ou non, comportant de 1 à 20 atomes de carbone, et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S, N, P et Si ; X est égal à -C=0 ou -CH2- ou -CN ; R2 est (i) soit nul (quand X représente -CN), (ii) soit un hydrogène, (iii) soit -0R3, R3 étant un hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée ramifiée ou non, saturée ou insaturée, linéaire ou cyclique, aromatique ou non, comportant de 1 à 20 atomes de carbone, et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S, N, P et Si, (iv) soit -NR4R5 avec R4 et R5, différents ou non, étant un hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée ramifiée ou non, saturée ou insaturée, linéaire ou cyclique, aromatique ou non, comportant de 1 à 20 atomes de carbone, et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S, N, P et Si ; n est égal à 0, 1 ou 2, de préférence 1 ; et * représente un carbone asymétrique ; ledit procédé comprenant les étapes de : a/ fourniture d'au moins un composé de formule (II) : G-(CH2)n-C*H(NHR1)-X-R2 (II) dans laquelle n, R1, R2, X, et * sont tels que définis précédemment ; G représente soit (i) R6-C(=0)-0-CH2-, soit (ii) (R70)(R80)-P(=0)-0-, soit (iii) R70-S02-0- ; R6 est un hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée ramifiée ou non, saturée ou insaturée, linéaire ou cyclique, aromatique ou non, comportant de 1 à 20 atomes de carbone, et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S, N, Pet Si; 3061494 18 R7 et R8, identiques ou différents, étant un proton H, un alcalin, un alcalino-terreux ou un ammonium, de préférence un proton H ou un alcalin, et plus particulièrement un proton H ou Na ; b/ fourniture d'au moins un trithiocarbonate inorganique ; 5 c/ réaction entre ledit au moins composé de formule (II) et ledit au moins trithiocarbonate inorganique en présence d'au moins une enzyme choisie parmi les sulfhydrylases, et de préférence une sulfhydrylase associée audit composé de formule (II) ; d/ obtention d'au moins un dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) ; 10 e/ séparation et isolation dudit au moins dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) ; les étapes a/ et b/ étant, ou non, effectuées de manière simultanée. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le dithiocarbamate cyclique 15 fonctionnalisé de formule (I) est énantiomériquement pur. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) est choisi parmi l'acide Lraphanusamique et l'acide L-homoraphanusamique. 20 4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel le dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) est l'acide L-raphanusamique. 5. Procédé selon la revendication 3 dans lequel le dithiocarbamate cyclique 25 fonctionnalisé de formule (I) est l'acide L-homoraphanusamique. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le composé de formule (II) est choisi parmi les dérivés de la L-sérine et les dérivés de la Lhomosérine. 7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel le dérivé de la L-sérine est choisi parmi l'O-phospho-L-sérine, l'O-succinyl-L-sérine, l'O-acétyl-L-sérine, l'acétoacétyl-L-sérine, la propio-L-sérine, la coumaroyl-L-sérine, la malonyl-Lsérine, l'hydroxyméthylglutaryl-L-sérine, la pimelyl-L-serine et la O-sulfato-L- 3061494 19 sérine, de préférence l'O-phospho-L-sérine, l'O-succinyl-L-sérine, I'O-acétyl-Lsérine et la O-sulfato-L-sérine, et plus particulièrement l'O-acétyl-L-sérine. 8. Procédé selon la revendication 6 dans lequel le dérivé de la L-homosérine est 5 choisi parmi l'O-succinyl-L-homosérine, l'O-acétyl-L-homosérine, l'acétoacétyl-L- homosérine, la propio-L-homosérine, la coumaroyl-L-homosérine, la malonyl-Lhomosérine, l'hydroxyméthylglutaryl-L-homosérine, la pimélyl-L-homosérine, l'Ophospho-L-homosérine et la O-sulfato-L-homosérine, de préférence l'O-succinylL-homosérine, l'O-acétyl-L-homosérine, l'O-phospho-L-homosérine et la O- 10 sulfato-L-homosérine, et plus particulièrement l'O-acétyl-L-homosérine. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la sulfhydrylase est choisie parmi les sulfhydrylases associées aux dérivés de la L-sérine et les sulfhydrylases associées aux dérivés de la L-homosérine. 15 10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel la sulfhydrylase associée au dérivé de la L-sérine est choisie parmi l'O-phospho-L-sérine sulfhydrylase, l'O-succinylL-sérine sulfhydrylase, l'O-acétyl-L-sérine sulfhydrylase, l'acétoacétyl-L-sérine sulfhydrylase, la propio-L-sérine sulfhydrylase, la coumaroyl-L-sérine 20 sulfhydrylase, la malonyl-L-sérine sulfhydrylase, l'hydroxyméthylglutaryl-L-sérine sulfhydrylase, la pimélyl-L-serine sulfhydrylase et la O-sulfato-L-sérine sulfhydrylase, de préférence l'O-phospho-L-sérine sulfhydrylase, l'O-succinyl-Lsérine sulfhydrylase, l'O-acétyl-L-sérine sulfhydrylase et la O-sulfato-L-sérine sulfhydrylase, et plus particulièrement l'O-acétyl-L-sérine sulfhydrylase. 25 11. Procédé selon la revendication 9 dans lequel la sulfhydrylase associée au dérivé de la L-homosérine est choisie parmi l'O-phospho-L-homosérine sulfhydrylase, l'O-succinyl-L-homosérine sulfhydrylase, l'O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase, l'acétoacétyl-L-homosérine sulfhydrylase, la propio-L-homosérine sulfhydrylase, la 30 coumaroyl-L-homosérine sulfhydrylase, la malonyl-L-homosérine sulfhydrylase, l'hydroxyméthylglutaryl-L-homosérine sulfhydrylase, la pimélyl-L-homosérine sulfhydrylase et la O-sulfato-L-homosérine sulfhydrylase, de préférence l'Ophospho-homosérine sulfhydrylase, l'O-succinyl-L-homosérine sulfhydrylase, l'Oacétyl-L-homosérine sulfhydrylase et la O-sulfato-L-homosérine sulfhydrylase, et plus particulièrement l'O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase. 3061494 20 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le trithiocarbonate inorganique est choisi parmi un trithiocarbonate d'alcalin, un trithiocarbonate d'alcalino-terreux ou un trithiocarbonate d'ammonium, de 5 préférence le trithiocarbonate de sodium, le trithiocarbonate de potassium, le trithiocarbonate de calcium et le trithiocarbonate d'ammonium, et plus particulièrement le trithiocarbonate de sodium. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comportant une 10 étape f/ optionnelle de fonctionnalisation supplémentaire du dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) obtenu à l'étape d/. 14. Dithiocarbamate cyclique fonctionnalisé de formule (I) préparé selon le procédé décrit dans les revendications 1 à 13. 15 15. Acide L-raphanusamique ou acide L-homoraphanusamique préparé selon le procédé décrit dans les revendications 1 à 13. 16. Trithiocarbonate sodique de l'homocystéine de formule (IV) : 20 X2+S--C=(S)-S-CH2-(CH2)nC*H(NHR1)-X-R2 (IV) dans laquelle R1, R2, X et * sont tels que définis précédemment, n est égal à 1 et X2 représente Na.