Brevet FR3061207A1 — publié le 20180629

La présente invention concerne un procédé réalisé « in vitro » de production d'un microfollicule pileux par culture et amplification des cellules germinales. Elle concerne, de même, les microfollicules pileux produits par le procédé mentionné ci- dessus et leur utilisation pour le traitement de l'alopécie ainsi que pour évaluer l'effet de produits cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques. L'alopécie est conditionnée par divers facteurs : génétiques, hormonaux et environnementaux, par le régime alimentaire et l'activité physique. Les cheveux tiennent un rôle esthétique et identitaire essentiel. L'alopécie chez la femme ou chez l'homme peut ainsi être à l'origine de souffrance psychique importante. Ainsi des cheveux sains, vigoureux et une chevelure dense tout au long de la vie est recherché par la plupart des femmes et des hommes. De nombreuses techniques sont connues pour le traitement de l'alopécie telles que la thérapie cellulaire, le traitement au laser ou encore les implants sans chirurgie. Cette dernière apporte un résultat immédiat et se trouve être beaucoup moins invasive que la chirurgie. Afin d'obtenir des implants, les follicules pileux humains sont obtenus par la culture de différents types cellulaires présents au niveau du bulbe pilaire. Le bulbe pilaire est en en forme de poire et il est composé : - De la papille qui est un bourgeonnement d'origine dermique, située à la base du follicule. C'est un site très vascularisé qui participe à la nutrition et à la régulation de la croissance du cheveu par sa réserve en facteurs de croissance et protéines de la matrice extracellulaire. - De la matrice qui est une zone coiffant la papille dermique, constituée d'un amas de cellules matricielles peu différenciées. C'est le siège d'une intense activité mitotique. Les cellules de la matrice, qui sont localisées dans le bulbe pileux et qui forment un petit amas cellulaire autour de la papille dermique, sont majoritairement constituées de précurseurs de kératinocytes qui constituent une assise germinative et qui prolifèrent rapidement pour se différencier en formant la tige pilaire, jouant ainsi un rôle essentiel dans le cycle pilaire. Du début de la phase anagène jusqu'à la fin de celle-ci, ces cellules matricielles vont proliférer jusqu'à la phase catagène puis disparaître en phase 3061207 2 télogène. (Ebling FJ. The biology of hair.Dermatol Clin. 1987 Juk5(3):467-81. Review; Saitoh M, Uzuka M, Sakamoto M. Human hair cycle. J Invest Dermatol. 1970 Jan;54(1):65-81). La différenciation cellulaire va permettre la formation des différents types cellulaires de la gaine épithéliale externe (ORS), interne (IRS) puis de 5 la tige pilaire. C'est aussi cette matrice qui conditionne la forme du cheveu. La matrice se répartit de façon homogène autour d'un axe de symétrie pour le cheveu droit alors qu'elle sera plus importante d'un côté pour le cheveu frisé (Voyage 3D au Coeur du cheveu web site - URL : www.hair-science.com; Melissopoulos A et Levacher C. Les annexes cutanées. Dans : La peau : structure et physiologie, édition Lavoisier ; 1998. 10 P.57-99). La matrice comprend également des mélanocytes folliculaires qui sont responsables de la pigmentation du cheveu. La prolifération et la différenciation de ces cellules de la matrice sont contrôlées par la papille dermique (Botchkarev VA, Kishimoto J. Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling. J Invest Dermatol Symp Proc. 2003 Jun;8(1):46-55. Review). 15 Des gaines épithéliales externe et interne qui sont produites par la matrice supérieure du bulbe pileux aussi appelé zone de kératinisation. La gaine épithéliale externe constitue l'enveloppe externe du follicule : il s'agit d'une invagination de l'épiderme. Celle-ci héberge notamment des cellules souches à partir desquelles le follicule pileux sera cycliquement régénéré. La gaine épithéliale interne sépare la gaine épithéliale 20 externe de la tige pilaire. Cette gaine est constituée de trois types cellulaires organisés en couche concentriques kératinisées qui accompagnent la croissance du cheveu. On distingue la couche de Henlé, la couche de Huxley et la cuticule qui est formée de cellules aplaties dirigé vers la matrice pilaire. De la tige pilaire qui est en partie visible, c'est le cheveu. La structure de la tige pilaire 25 se compose de trois couches distinctes de l'extérieur vers l'intérieur. On retrouve la cuticule, le cortex et la médulla, toutes composées de cellules kératinisées. Durant sa vie, le cheveu connaît trois phases de développement de durées très inégales : La phase anagène est la phase active du cheveu, celle pendant laquelle il vit et pousse régulièrement. Elle dure de 4 à 7 ans. Les cellules germinales qui entourent la papille 30 du bulbe de la racine du cheveu fabriquent continuellement la matière permettant au cheveu de vivre et de pousser. Ensuite, la multiplication des cellules germinales 3061207 3 s'arrête au fond du follicule. La phase active du cheveu est alors terminée ; une autre commence, qui est beaucoup plus courte. La phase catagène : En 15 jours à peine, le bulbe du cheveu disparait (car il n'est plus alimenté à cause de l'interruption des cellules germinatives) et se transforme à une 5 vitesse accélérée. La papille disparaît, c'est-à-dire que le bulbe creux devient plein ; il se kératinise, se durcit et devient corné. Le cheveu est alors mort ; le follicule se resserre pour expulser le cheveu mort. La phase télogène est la phase qui dure trois mois environ et pendant laquelle le cheveu mort est en attente de tomber. Afin de tomber, le cheveu doit être poussé dehors par le nouveau 10 cheveu qui pousse à son tour dans le même follicule et qui va expulser l'ancien. La régénération du follicule pileux se fait alors à partir des cellules-souches, appelées cellules germinales situées dans le " bulge ". Le " bulge " est formé par une sous-population cellulaire de la gaine épithéliale externe, appelée cellules germinales, localisée au niveau de la portion moyenne du follicule pileux, et 15 plus exactement au niveau de la zone d'insertion du muscle arrecteur du poil. Ces cellules représentent la partie la plus inférieure de la portion permanente du follicule. Au niveau du " bulge ", les kératinocytes sont relativement indifférenciés, biochimiquement et ultrastructurellement. Ce " bulge " est en position stratégique pour interagir durant la phase télogène tardive, avec 20 l'ascendante papille dermique et initier un nouveau follicule en anagène. Les cellules germinales sont donc des cellules essentielles pour le renouvellement du cheveu. Les cellules germinales (cellules germinatives ou cellules pluripotente ou cellules souches) du cheveu télogène sont impliquées dans la sortie de la phase de dormance du follicule pileux et donc la repousse du cheveu. 25 Au sens de l'invention, on entend par cellules germinales, les cellules souches présentes au niveau du « bulge ». Depuis plusieurs années on a mis en culture des cellules du follicule pileux issues des compartiments qui sont facile d'accès par microdissection EP 2274419, EP 2447357. 30 Cependant la dissection du follicule télogène est particulièrement difficile, en particulier à cause de sa rareté, qui représente moins de 15% de la totalité des follicules présents au niveau du scalp. La dissection du follicule télogène est, de plus, particulièrement difficile, en particulier à cause de son environnement dermique. Une des difficultés est donc d'obtenir les 3061207 4 cellules germinales en quantité suffisante pour régénérer un follicule pileux capable de se renouveler. L'équipe de S.Lyle, en 2005, a réalisé une primoculture de ces cellules par une amplification en partant de follicule télogène préparé par digestion à la dispase puis arraché, ce qui ne permet pas extraire la totalité des cellules germinales en quantité suffisante pour les 5 mettre en culture et de maintenir in vitro l'expression de marqueurs spécifiques des cellules germinales afin de régénérer un follicule pileux (Roh C, Tao Q, Photopoulos C, Lyle S. J Invest Dermatol. 2005, 125 :1099-1105). Concernant la thérapie cellulaire, la société Replicel utilise les cellules de gaines conjonctives 10 pour obtenir une tige fine mais qui se trouve être non pigmentée et qui ne se recycle pas ; parce que les cellules de gaine conjonctive vont recruter les kératinocytes de la peau (méthode utilisée par Jahoda,1999; Higgins, 2013). Aucun de ces modèles ne contient de cellules germinales, dont la présence et la quantité sont essentielles à la formation d'un microfollicule présentant la plupart des caractéristiques d'un 15 microfollicule humains et notamment sa capacité de renouvellement. De manière surprenante, les inventeurs ont réussi à obtenir des cellules germinales en quantité suffisante afin que, lorsqu'elles sont mis en contact avec les fibroblastes de la papille dermique ainsi que les fibroblastes de la gaine conjonctive, une structure tubulaire à l'origine 20 d'un microfollicule pileux se forme et, du fait de la présence des cellules germinales, est susceptible de se recycler. En effet, la demanderesse a mis en évidence que la culture des cellules germinales en présence de l'inhibiteur de Rock Y27632 permet une prolifération importante de ces cellules 25 et leur différenciation en kératinocytes positifs pour les marqueurs CD200, CD29 et K15. On peut par ailleurs noter que ces cellules sont de petites tailles, présentent un rapport nucléocytoplasmique élevé et un phénotype homogène. Lorsque ces cellules sont mises en contact avec les fibroblastes de la gaine conjonctive ainsi que les fibroblastes de la papille dermique, on observe la formation d'une structure tubulaire 30 qui sera à l'origine de la formation d'un microfollicule pilleux Le mélange des cellules obtenues avec des fibroblastes de la gaine conjonctive ainsi que les fibroblastes de la famille dermique mises en culture 3D, permet d'obtenir, de manière inattendue, la formation d'un bourgeon à partit des sphéroïdes mixtes constitué des cellules 3061207 5 germinales et des fibroblastes de la papille dermique ainsi que les fibroblastes de la gaine conjonctive. Ce bourgeonnement se présente sous la forme d'une structure tubulaire qui sera à l'origine de la formation du follicule pileux. 5 Au sens de l'invention on entend par « stucture tubulaire», un bourgeonnement qui se forme à partir des sphéroides mixtes. Au sens de l'invention, on entend « par sphéroïdes mixtes » la culture 3D des cellules germinales et des fibroblastes de la papille dermique ainsi que les fibroblastes de la gaine 10 conjonctive. Au sens de l'invention on entend par structure tubulaire, le bourgeonnement observé après culture 3D des cellules germinales et des fibroblastes de la papille dermique ou les fibroblastes de la gaine conjonctive. Cette structure tubulaire constituée d'une part des 15 cellules souches épithéliales du cheveu et d'autre part des cellules mésenchymateuse du cheveu, sera à l'origine de la formation du microfollicule. Le procédé, selon l'invention, se révèle donc avantageux par le fait qu'il permet d'obtenir un follicule pileux en utilisant 7 les fibroblastes du cheveu et cellules germinales nécessaire à la 20 formation d'un follicule pileux présentant la plupart des caractéristiques d'un microfollicule humains et notamment susceptible de se régénérer. Ainsi selon un premier de ses objets, la présente invention se rapporte à l'utilisation des cellules germinales pour l'obtention d'un follicule pileux. 25 Utilisation de cellules germinales pour la préparation d'un microfollicule pileux. Les cellules germinales pourront être prélevées selon le procédé qui suit : des follicules pileux 30 en phase télogène sont placés dans une boite de Petri contenant un milieu de culture minimum additionné de 2% d'antibiotique et des acides aminés non essentiels. La région des cellules germinales, appelée le bulge, est extraite de la gaine conjonctive et ensuite placée dans une boite de petri contenant une couche nourricière de fibroblastes 3T3i. 30612 0 7 6 Afin d'obtenir une quantité suffisante de cellules germinales pour l'obtention d'un microfollicule pileux, la demanderesse a mis au point une méthode d'amplification de ces cellules afin qu'elles se différencient en kératinocytes CD200, CD29 et K15. 5 Ainsi la demanderesse a mis au point un procédé de préparation d'un microfollicule pileux comprenant au moins une étape d'amplification des cellules germinales en présence d'une quantité efficace d'un inhibiteur de ROCK pendant une période de temps suffisante pour permettre une différentiation desdites cellules en kératinocytes positifs pour les marqueurs 10 CD200, CD29 et K15. Ce procédé de préparation du microfollicule pileux est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a- Isoler un follicule pileux en phase télogène à partir d'un prélèvement de scalp 15 b- Séparation des cellules germinales de la gaine conjonctive c- Dépôt de l'agrégat cellulaire sur une couche nourricière de fibroblastes 3t3 irradiés ou bloqués à la mitomycine dans un milieu Green 7F d- Amplification des cellules germinales à la surface dudit support en présence d'un inhibiteur de ROCK; 20 e- Récupération des kératinocytes présentant les marqueurs CD200, CD29 et K15. f- Culture des kératinocytes obtenus à l'étape e) en culture 3D en présence de fibroblastes de la gaine conjonctive et/ou de la papille dermique. La culture des cellules germinales en culture 3D en présences de fibroblastes de la gaine 25 conjonctive et/ou de la papille dermique permet d'obtenir une structure pilaire à l'origine du microfollicule pileux, susceptible de se renouveler grâce à la présence des cellules germinales. Le microfollicule pileux obtenu à partir de la culture des cellules germinales est donc susceptibles de se renouveler. 30 3061207 7 En particulier le microfollicule pileux obtenu à partir de la culture des cellules germinales en présences de fibroblastes de la gaine conjonctive et/ou de la papille dermique est susceptible de se renouveler. 5 Microdissection Une des difficultés à surmonter réside dans l'obtention des follicules pileux en phase télogène par microdissection. 10 En effet, dans les conditions normales, lorsqu'un cheveu tombe, le compartiment bulge contenant les cellules souches appelées cellule germinales permettra d'initier le développement d'un nouveau cycle pilaire et redonnera un nouveau follicule. Ainsi, l'arrachage d'un cheveu télogène ne permet pas d'obtenir ces cellules germinales, il faudra donc une biopsie de cuir chevelu, puis isoler ces cellules par microdissection. 15 Selon l'invention les cellules germinales sont obtenues par une nouvelle technique de microdissection qui préserve la quantité et l'intégrité des cellules, car elles ne sont pas séparées les unes des autres. En effet le cheveu en phase télogène est isolé sur un support, et on extrait la tige télogène contenant les cellules germinales situées au niveau du bulge. Cette 20 microdissection permet d'isoler et de conserver la totalité des cellules germinales. Au sens de l'invention on entend par télogène le follicule qui contenait le cheveu en phase télogène. 25 Amplification En plus d'être difficiles à isoler, les cellules germinales sont également difficiles à cultiver au 30 moins pour les raisons suivantes : a) leur nombre est particulièrement faible ; b) elles sont difficiles à amplifier ; 3061207 8 La demanderesse a isolé les cellules germinales et mis au point un procédé de mise en culture de ces cellules. En effet en présence du facteur de croissance Y27632, qui est un inhibiteur de ROCK, ces cellules prolifèrent rapidement et se différencient en kératinocytes CD200, CD29 5 K15 jusqu'à ce qu'elles arrivent à confluence. Les cellules sont amplifiées selon la technique de Rheinwald et Green (Cell, vol 6 , 331344,1975) par culture sur un support nourricier constitué de fibroblastes dans un milieu adapté connu de l'homme du métier, en présence de facteurs de croissance, notamment d'acides 10 aminés, sérum, toxine cholérique, insuline, tri-iodo-thyronine et solution tampon de pH. En particulier, un tel milieu de culture pourra notamment contenir au moins un facteur de croissance mitogénique pour les kératinocytes (par exemple epidermal growth factor (EGF) et/ou keratinocyte growth factor (KGF), en particulier du KGF), de l'insuline, de l'hydrocortisone et facultativement un antibiotique (ex : gentamycine, amphotericine B) 15 auquel a été ajouté un inhibiteur de ROCK le Y27632. Avantageusement, ledit milieu pourra comprendre en outre du sérum ou un extrait pituitaire, par exemple d'origine bovine, de l'épinephrine, de la transferrine et/ou des acides aminés non essentiels. 20 Les fibroblastes utilisés pour cette culture seront plus préférentiellement des fibroblastes 3T3. Les fibroblastes 3T3 sont bien connus de l'homme du métier. C'est une lignée cellulaire de fibroblastes connue depuis 1962. «3T3 » signifie « 3-day transfer, inoculum 3x105cells ». 25 La culture des cellules est préférentiellement une culture sur des fibroblastes (préférentiellement des fibroblastes 3T3) dont la prolifération a été préalablement stoppée, préférentiellement en les ayant préalablement irradiés (par exemple, aux rayons gamma) ou préalablement traités à la mitomycine. La mitomycine (en particulier, la mitomycine C) bloque la prolifération de ces cellules sans pour autant les empêcher de produire des 30 substances nutritives utiles pour la prolifération des kératinocytes. Avec cette technique, les cellules germinales prolifèrent sur le support sur lequel elles ont été séparées des autres types cellulaires. Ceci permet de conserver un nombre suffisant de cellules 3061207 9 germinales. Les cellules prolifèrent rapidement en présence de Y27632 jusqu'à confluence et se différencient en cellules positives pour les marqueurs CD200, CD29 et K15. Selon l'invention, le terme « quantité efficace » désigne une quantité nécessaire pour obtenir 5 une culture de kératinocytes CD200, CD29 et K15 à confluence. Selon l'invention la quantité efficace de l'inhibiteur de ROCK, Y27632, est comprise entre 1 et 100 1.11\4 et de préférence comprise entre 5 et 25 1.11\4 et de manière préférée de 10p.M. 10 Selon l'invention les cellules germinales sont cultivées en présence de l'inhibiteur de ROCK, Y27632, pendant au moins 2 jours et de préférence pendant au moins 3 jours. De manière préférée les cellules sont mises en culture en un nombre de cellules compris entre 1000 et 4000 cellules et de préférence en un nombre de 3000 cellules par cm2. On entend par « à confluence » un tapis cellulaire ne présentant aucun interstice entre chaque cellule adhérente cultivée en monocouche sur un support approprié, tel qu'une boite de culture. Culture des cellules CD200, CD29, K15 en culture 3D pour l'obtention de microfollicules pileux Les sphères 3D sont obtenues per ensemencement des cellules sur microplaque de 96 puits de 25 types Insphero par la méthode de goutte suspendue ou de microplaques pour culture de cellules non adhérentes (système GravityPLUS White paper). Les cellules germinales et les fibroblastes de la gaine conjonctive et/ou de la papille dermique sont alors mises en culture dans un milieu de green à 37°C, l'apparition du microfollicule 30 pileux est observée après au moins 3 jours de culture. Selon un mode de réalisation les cellules sont maintenues au moins 3 jours en culture et de préférence au moins 5 jours. 15 20 3061207 10 De manière préférée les cellules sont mises en culture en un nombre de cellules compris entre 1000 et 4000 cellules et de préférence en un nombre de 3000 cellules par cm2. 5 Un autre objet de l'invention est un microfollicule pileux susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention. Ces microfollicules pileux permettent d'une part d'être utilisés pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d'un état de pilosité réduite, notamment de l'alopécie et 10 constituent, d'autre part, des tests prédictifs de l'activité d'actifs cosmétiques et/ou pharmaceutiques ou encore des effets secondaires d'ingrédients topiques. Traitement prophylactique ou thérapeutique d'un état de pilosité réduite, notamment de 15 l'alopécie. Etant donné que le microfollicule pileux présente les caractéristiques d'un follicule pileux in vivo, il pourra être utilisé comme implant, associé ou non à des substituts cutanés. Le microfollicule pileux selon l'invention trouvera donc également des applications pour la 20 préparation d'implants et/ou de substitut cutané pour traiter un désordre cutané tel qu'une brûlure, un défaut de cicatrisation ou la canitie. Un effet thérapeutique est défini comme un retour à la normale de l'état de pilosité, que ce 25 soit totalement ou partiellement. Au sens de l'invention, le traitement prophylactique est recommandé si le sujet possède une condition préalable pour la perte de cheveux, comme une disposition familiale. 30 Les conditions d'une quantité réduite de cheveux peuvent être le résultat de l'alopécie, la calvitie héréditaire, des cicatrices, des brûlures ou des blessures accidentelles. Tests prédictifs de l'activité d'actifs cosmétiques et/ou pharmaceutiques. 3061207 11 Les équivalents de microfollicules pileux selon l'invention permettentde réaliser notamment des cinétiques de pousse des poils ou cheveux et donc toute étude nécessitant de nombreux cheveux vivants et aussi complets que possibles dans un contexte in vivo tel que l'étude du 5 cycle du cheveu et des facteurs capables d'influencer ce cycle allant jusqu'à l'étude d'actifs favorisant la croissance du cheveu, d'actifs permettant de lutter contre la chute des cheveux ou encore d'actifs ralentissant la pousse des poils. Les procédés de criblage de produit en vue d'identifier de nouveaux actifs comprennent une 10 étape (a) de mise en contact dudit produit à tester avec un microfollicule pileux selon l'invention puis une étape (b) d'analyse de l'effet dudit produit sur au moins un paramètre du microfollicule pileux et une étape (c) de sélection du produit modifiant ledit paramètre. De préférence, pour la mise en oeuvre de l'étape (a), le produit à tester est appliqué de façon 15 topique, par exemple, formulé dans des formulations topiques classiques ou bien introduit dans le milieu de culture. L'étape (b) pourra, en particulier, être réalisée par l'analyse de l'expression, de la production et/ou de l'activité de marqueurs liés à la qualité et/ou à l'homéostasie du microfollicule pileux 20 comme par exemple des marqueurs folliculaires des protéines de structure. Comme exemple de protéines de structure peuvent être citées les kératines du cheveu. Pour cela, on analysera à l'étape (b) du procédé de criblage l'effet du produit sur la pousse de la tige pilaire. L'étape (b) d'analyse de l'effet du produit sera préférentiellement une comparaison d'au moins un paramètre mesuré sur le microfollicule pileux selon l'invention mis en contact avec le produit à tester à celui ou ceux mesuré(s) sur un microfollicule pileux témoin cultivé dans les mêmes conditions mais qui n'a pas reçu le produit à tester. 25 30 L'étape (c) de sélection du produit modifiant le paramètre de du microfollicule pileux fera en fonction d'un critère déterminé à l'avance. 3061207 12 La modification de ce paramètre pourra être une stimulation, une diminution ou une inhibition totale ou partielle de l'expression, de la production et/ou de l'activité de marqueurs et/ou de la pousse de la tige pilaire. 5 Le critère de sélection dudit produit sera par exemple que ce produit à un effet stimulateur ou inhibiteur du paramètre mesuré. Le microfollicule pileux selon l'invention peut aussi être utilisé dans des procédés automatisés de criblages de composés cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques 10 pour identifier de nouveaux actifs. Description des figures : 15 Les figures permettent de mieux illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée. Figure 1 : Localisation des cellules germinales Figure 2 : séparation des cellules de la gaine conjonctive et des cellules germinales avec une 20 aiguille Figure 3 : isolement d'un follicule télogène contenant les cellules germinales Figure 4 : Follicule telogène déposé sur un feeder layer de 3T3 et migration des premières cellules cellules germinales autour du follicule télogène Figure 5 : Cellules germinales à confluence après 10 jours de culture 25 Figure 6 : Caractérisation des cellules à confluence, kératinocytes K15+, CD29+ et CD200+ Figure 7 : Prolifération des cellules germinales avec inhibiteur de Rock (Figure 7a) et sans inhibiteur de Rock (Figure 7b) Figure 8 : Formation de la structure tubulaire à l'origine du follicule pileux après 3, 7 et 10 jours de culture 30 Les exemples figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de l'invention. 3061207 13 Exemple 1 - Préparation des cellules germinales Protocole expérimental La région des cellules germinales, appelée le bulge (Figure 1), est extraite de la gaine 5 conjonctive (Figure 2) et ensuite placée dans une boite de petri contenant des 3T3i (Figure 3) i. Microdissection des cellules germinales Les follicules pileux sont extraits d'un résidu chirurgical de scalp. Ce dernier est d'abord 10 coupé en portions de 5 mm2 puis sectionné à l'aide d'un scalpel entre le derme et l'hypoderme. Les follicules sont extraits à l'aide de pinces de chirurgie ophtalmique et sont ensuite sectionnés juste au-dessus de la papille avec un scalpel. Le bulbe est alors récupéré. A cette étape, le bulbe comprend deux compartiments : le compartiment dermique (papille dermique 15 et gaine conjonctive) et les cellules germinales qui forment une masse cellulaire A l'aide d'aiguilles à perfusion, la partie épithéliale est séparée de la partie dermique. Uniquement la partie épithéliale est mise en culture. ii. Conditions de culture 20 Les conditions de culture ont trois composantes principales : - Le milieu de base : Sauf indication contraire, l'ensemble des milieux et tampons utilisés dans les exemples sont décrits dans Bell et col. 1979, (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984, 25 (British J. of Derm., 111, 219-222) ou Asselineau et col., 1987, (Models in dermato., vol.III, Ed. Lowe & Maibach, 1-7). Le milieu MEM + 10% FCS + 7F (appelé milieu Green 7F) a la composition suivante : 30 Concentrations finales 3061207 14 MEM Sérum de veau foetal (FCS) 10% L-Glutamine 2 mM Sodium pyruvate 1 mM Penicicilline - Steptomycine Penicilline 20 U/ml Streptomycine 201.1g/m1 Fungizone Penicilline 10 U/ml Streptomycine 10 tg/ml Amphotericine-B 25 ng/ml Epidermal growth factor (EGF) 10 ng/ml Cholera toxine 10-101','4 Hydrocortisone 0.4 1.1g/m1 Adénine hydrochloride 1.8 x 10-4 M Triiodothyonine (T3) 2 x 10-9 M Transferrine humaine 5 1.1g/m1 Insuline bovine 5 1.1g/m1 - Les compléments de culture : facteurs de croissances et par exemple 10 1.1M de Y27632 - La surface d'adhésion : les germ cells prolifèrent dans le milieu de base Green en présence 5 d'une couche nourricière de fibroblastes murins 3T3 arrêtés dans le cycle cellulaire par un traitement mitomycine. Culture-Amplification des kératinocytes 1 0 Après microdissection, les follicules pileux en phase télogène sont déposés dans des boîtes de Pétri de 60mm de diamètre préalablement ensemencées avec 1 million de 3T3 et recouvertes du milieu de culture complet Green 7F ; on obtient une culture à confluence de cellules germinales 15 Afin de générer les sphères, les cellules sont récupérées au stade de sous confluence par un traitement enzymatique. Les sphères peuvent être obtenues de différentes manières avec les 3061207 15 techniques classiques déjà décrites (goutte suspendue, centrifugation, support non adhérent). Dans le cas de la goutte suspendue, 3000 cellules sont placées dans les plaques in sphéro. Elles sont récupérées dans des plaques 96 puits après 48h afin de suivre leur évolution. 5 Le cheveu télogène avec l'amas de cellules germinales non dissociées sont isolés et déposés sur un feeder layer de 3T3 (Figure 3). Après 3j de culture les cellules commencent à proliférer sous forme d'une colonie autour de l'amas germ (Figure 4). Les cellules atteignent la confluence en 7 jours (Figure 5). Elles se caractérisent par une taille très petite et une forte capacité proliférative. Afin 10 d'assurer l'amplification, les cellules sont ensuite ensemencées dans un flask T75. Ainsi, après 3 semaines de culture de 3 bulbes, il est possible de générer environ 40 millions de cellules germinales au passage 1. Nous avons pu observer que les cellules germinales sont capables d'atteindre très 15 rapidement la confluence dans le milieu de green 7F en présence de l'inhibiteur de Rock Y27632 à une concentration dell) 1.1M (Figure 7a)), alors, que dans le même milieu sans ajout de l'inhibiteur de rock, les cellules ne prolifèrent pas (Figure 7b)). Ainsi les cellules germinales cultivées en milieu 7F contenant l'inhibiteur de rock permettent 20 d'obtenir des kératinocytes positifs pour les marqueurs K15, CD29, CD200 (Figure 6) en quantité suffisantes. Par ailleurs ces cellules sont de petites tailles, présentent un rapport nucléo-cytoplasmique élevé et un phénotype homogène. Les cellules étant obtenues en quantité suffisante et présentant les marqueurs K15, CD29, 25 CD200 de manière homogène et reproductible sont alors mises en culture 3D en présence des fibroblastes de la gaine conjonctive et/ou de la papille dermique. Ces cellules forment des sphères après 3j de culture. Après quelques 3 jours de culture supplémentaires, ces sphères changent de conformation en 30 montrant une organisation polarisée. Il apparait un bourgeonnement qui semble indiquer une différenciation des sphères en structure tubulaire à l'origine de la formation du follicule pileux. 35 REVENDICATIONS1. Utilisation de cellules germinales issues du bulge d'un follicule pileux pour la préparation d'un microfollicule pileux. 2: Utilisation selon là revendicatiOn 1 caractérisé en ce que, le microfollicule pileux est susceptible de se renouveler. 3. Utilisation selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que lesdites cellules germinales sont cultivées en présence des fibroblastes de la gaine conjonctive et/ou de fibroblastes de la papille dermique. 4. Procédé de préparation d'un microfollicule pileux comprenant au moins une étape de mise en culture des cellules des cellules germinales issues du bulge d'un follicule pileux en présence d'une quantité efficace d'Un inhibiteur de. ROCK pendant une période de temps suffisante pour permettre, une différentiation desdites cellules en kératinocytes positifs pour les.marqueius 0D200, CD29 et K15. 5. Procédé selon la revendication 4 dans lequel l'inhibiteur de ROCK est Y27632. 6. Procédé selon les revendications 4 et 5, dans lequel la quantité efficace de l'inhibiteur de ROCK est de 1 à 100 p.M. 7. Procédé selon les revendications 4 à 6, dans lequel la quantité efficace de l'inhibiteur de ROCK est de 5à 25 1.1.1\4. 8. Procédé selon les revendications 4 à 7, dans lequel la quantité efficace de l'inhibiteur de ROCK est de 101.11^4. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, dans lequel les cellules germinales sont cultivées en présence de l'inhibiteur ROCK pendant au moins 2 jours et de préférence pendant au moins 3 jours. 3061207 17 10. Procédé selon les revendications 4 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a- Isoler un follicule pileux enphase télogène à partir d'un- prélèvement de scalp 5 b- séparer des cellules germinales de la gaine conjonctive c- Déposer l'agrégat cellulaire sur une couche nourricière de fibroblastes 3t3i bloqué à la mitomycine dans un milieu de green 7F d- Amplifier des cellules germinales à la surface dudit support en présence d'un inhibiteur de ROCK; 10 e- Récupérer des kératinocytes positifs pour les marqueurs CD200, CD29 et K15. f- Cultiver des kératinocytes obtenus à l'étape e) en culture 3D avec des fibroblastes de la gaine conjonctive et/ou des fibroblastes de la papille dermique. 15 11. Procédé selon les revendications 4 à 10 dans lequel lesdits kératinocytes positifs pour les marqueurs CD200, CD29 et K15 sont récupérés lorsqu'ils arrivent à confluence en formant des clusters réguliers. 12. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que à l'étape f), les kératinocytes 20 sont mis en culture en un nombre compris entre 1000 et 4000 cellules par cm2 et de préférence en un nombre de 3000 cellules par cm2. 13. Microfollicule pileux susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, 25 14, Microfollicule pileux selon la revendication 13 caractérisé en .ce qu'il est _cônstitué de cellules' issues de l'amplification et de la différentiation de cellules germinales issues du bulge d'un follicule pileux en présence d'un inhibiteur dé ROCK. 30 15. Microfollicule pileux selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'inhibiteur de ROCK est Y27632 3061207 18 16. MicrofOilicule pileux selon l'une des revendications 13 à 15 pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d'un état depiosité réduite. 5 17. Microfollicule pileux selon l'une des revendications 13 à 15 pour le traitement de l'alopécie. 18. Utilisation d'un microfollicule pileux selon l'une des revendications 13 à 15 pour le test 10 in vitro d'effets d'actifs sur les propriétés pileuses. 19. Utilisation d'un naicrofollicule pileux selon la revendication 18 pour l'identification de composé modulateur de la pousse des poils et/ou des cheveux 15 20. Procédé de criblage de produit en vue d'identifier de nouveaux actifs comprenant une étape (a) de mise en contact dudit produit à tester avec un microfollicule pileux tel que défini selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 puis une étape (b) d'analyse de 20 l'effet dudit produit sur au moins un paramètre de du rnicrofollicule pileux et une étape (c) de sélection du produit modifiant ledit paramètre.