Brevet FR3061206A1 — publié le 20180629

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de modèle de peau complète de mammifère, au système de culture permettant la mise en oeuvre de ce procédé, au modèle de peau complète obtenu par ce procédé et à son utilisation pour le criblage et/ou l'évaluation d'actifs et d'excipients cosmétiques. Face à l'évolution des réglementations visant à interdire l'expérimentation animale, le développement de modèles de peaux comme méthodes d'évaluation alternatives est un enjeu majeur. La peau est une enveloppe corporelle où siègent de nombreuses fonctions essentielles à la survie de l'organisme. L'une de ses principales fonctions est de protéger l'organisme des agressions extérieures comme les pathogènes, les agents toxiques, les rayons ultraviolets ou encore les agressions mécaniques. La peau est un organe sensoriel également impliqué dans la thermorégulation, la réponse immune et la fonction métabolique. La peau est structurée en trois tissus superposés : l'épiderme, tissu le plus superficiel, l'hypoderme, tissu le plus profond et le derme qui se situe entre ces deux tissus. L'épiderme est majoritairement constitué de kératinocytes disposés en couches superposées qui permettent de prévenir des pertes d'eau. Le derme est principalement constitué de fibroblastes qui sont responsables de la synthèse et de l'homéostasie de la matrice extracellulaire dont le rôle principal est de résister aux forces de tension exercées sur la peau. L'hypoderme est inajoritairement constitué d'adipocytes qui sont organisés en lobules et forment le tissu adipeux (TA) sous-cutané. On y trouve également des cellules progénitrices, des préadipocytes, des cellules endothéliales (réseau vasculaire) et des cellules immunitaires qui constituent la fraction stroma-vasculaire du TA. L'hypoderme est constitué de tissu adipeux blanc qui possède deux fonctions principales au sein de l'organisme. Premièrement, il joue un rôle primordial de réserve énergétique par le stockage des lipides sous forme de triglycérides, la lipogenèse, et leur libération, la lipolyse, sous forme d'acides gras libres et de glycérol. Deuxièmement, c'est un organe endocrinien qui synthétise et sécrète des adipokines qui peuvent agir au niveau local (par voie autocrine ou paracrine) ou systémique et influencer tous les autres organes impliqués dans la physiologie. Les principales aclipokines sécrétées sont la leptine et l'adiponectine. La leptine est une hormone de la satiété régulant l'appétit, elle est également impliquée dans la fonction immunitaire et induit la production de cytokines pro-inflammatoires (Dardeno T.A., Chou S. H., Moon H., Chamberland J. P., Fiorenza C. G., Mantzoros C. S. (2010). Leptin in human physiology and thera.peutics. Frontiers in neuroendocrinology, 3061206 2 301, P. 377-393) (Mantzoros C. S., Magkos F., Brinkoetter M., Sienkiewicz E., Dardeno T. A., Kim S., et al. (2011). Leptin in hurnan physioiogy and pathophysiology. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism, 301, p. E567-E584). L'adiponeetine est majoritairernent produite et sécrétée par les adipocytes, elle améliore la 5 sensibilité à l'insuline par ses effets métaboliques positifs sur le muscle et le foie. Elle est impliquée dans la réduction de l'inflammation et de la fibrose (Sower J. R. (2008). Endocrine Functions of Adipose Tissue: Foeus on Adiponectin. Clinicat Cornerstone, 9(1), p. 32-40). L'interleukine-6 (1L6), majoritairement produite par les cellules de la fraction stroma-vasculaire au sein du TA, est une cytokine qui inhibe la voie de signalisation de 10 l'insuline, favorise l'utilisation d'acides gras oxydés et du glucose par les muscles squelettiques (Galica S., Oakhill J. S., Steinberg G. R. (2010). Adipose tissue as an endocrine organ. Molecular and Cellular Endocrinology, 316(2), p. 129-139), et constitue également un marqueur pro-inflammatoire qui va activer le système immunitaire en favorisant le recrutement et l'accumulation de lymphocytes, monocytes, et de macrophages 15 au sein du TA (Scheller, 2011). Récemment il a été montré que les adipocytes influencent la prolifération et l'expression de certains gènes des fibroblastes du derme, en particulier du collagène I, de l'élastine et de la MMP13 (Ezure, 2011), pouvant ainsi agir sur la qualité du derme et de la peau. Les cellules souches adipeuses présentes dans l'hypoderme sont également impliquées, via leurs sécrétions, dans la structuration du derme et de l'épiderme 20 (Kim WS, 2007 ; Seung Ho Lee, 2010; Sheng L, 2013). Aujourd'hui, plusieurs modèles pour l'étude de la physiologie de la peau ou encore pour la recherche de nouveaux composés actifs dermatologiques ou cosmétiques sont disponibles. 11 existe notamment des modèles in vitro de peau reconstruite ou de cultures ou co-cultures cellulaires et des modèles ex vivo qui utilisent des expiants cutanés 25 d'origine humaine. Chaque modèle permet des applications particulières (Tableau 1) : Modèiés Apperations Epi dermes reconstrurts *Irritation cutanée *Corrosion cutanée *Phototoxicité - Ge n ntoxi cité -Admi niscrati on cutanée *Sensibilisation cutanée - Métabol i sme cutané Epiderrnes reconstruits 4 - Et la Irci ssernent cutanée rnél,anocyres - Plernentati on Full thickness CFT; - Absorption percutanée - Cicatrisation *Adhésion bactérienne *Expression de przélnes mélanogénique5 Evai uati on d'actif s sur le vitiligo *EvaitiatiOn d'allergènes *Rude sur la maturation et la me-anon des cellules d elanee rtia ne --EvaluatiOn rie thérapies anglogéniques +Métabolisme adipeux - Evaiuâtion du développement épidermique *Rude de cicatrisation - Maladies pigmentaires - Permettre latransolantati au tolog,ue - Migration épithéliale *Activation et migrer on rie cellules présentatrices d'antigènes *Impact microbien sur nfl amrnation cutanée *Criblage de composants FT .t rnél an ocytes H Fr+ Langeffians CD . - .. FT+ teliules endotbédiale et sous-cutanées FT* cellules souches Ex- plants - A/bel es standardisés d'étude gmentatarre -Modèles standardisés et commercialisés - Outils relevant pour l'étude des processus de cicatrisation - Utilisable prairie développe Ment d erné dicamen ts contre le vitiligo *Recherche fondamentale suries rné tanogénio ues - Modèl e imm un otompétent pour évalue r le potentiel de sensibilisation *Possibilité d'évaluerl'impact de médicaments sur le tissu adipeux et l'angiogénè se 'Possibilité de culture surie long terme - Permet le développement de modèles de peaux et de maladies avec des cellules connues et standardisées - Coût important * Pas d'étude su r le I on gterme possible *Peu de pertinence pou r le développement de médicament *Modèles n-on standardisés *Pas de standards %tari dés *Modèles non standardisés * IZilisatiori de lignées cellulaires - De s crel clusi ont équivalentes peuvent être urée s rIe modèles stancfardisés *Modèles non standardisés *Pas de standards vaii dés *Technique immature *Faisabilité non prouvée *Techniquement exigeant Pré sence.di-tous !es types tel JI-aires- *--AppcA.-Ti'sionn.eMent en peaux viabie ès limité - Utilisation de peaux atteintes pour de *Variabilité des donneurs developernent de médicament Avantages Dé savant ages *Altération de I fore ion barrière * Modèles vali dés * Peu compl èxe, pas d'intéraction avec tif &rente types celluiaires *Forte reproductibilité *Hautement scandalités - Optimisés pou r des tests d'innocuité. *Période de test très étroite (2 à 3 jours) D'après IViathes S,,er ai> ,{2014), 3061206 4 Les modèles permettant des études de la peau en 3D, c'est-à-dire possédant plusieurs types cellulaires organisés dans une structure en trois dimensions, sont les plus complexes et reflètent des conditions plus proches de la physiologie humaine. Ces modèles permettent d'étudier séparément l'épiderme, le derme et l'hypoderme ou 5 simultanément tout ou partie de ces couches. Il n'existe aujourd'hui que très peu de modèles d'étude de la peau permettant d'étudier simultanément l'épiderme, le derme et l'hypoderme. Ces modèles « tri-couches » s'approchent davantage encore des conditions de la physiologie de la peau humaine ; cependant, aucun des modèles existants, tels que des demandes de brevet 10 FR 2 990 106 et US 2011/0045477, n'est décrit comme permettant la survie et la fonctionnalité des trois couches de l'expiant cutané plus de trois jours ; en conséquence, ces modèles ne décrivent pas la possibilité de réaliser des tests d'application et d'exposition chronique à des produits topiques sur de longues périodes exploitables sur les trois couches de la peau. 15 If subsiste donc un besoin de mettre au point des modèles fonctionnels de peau complète pouvant être maintenus fonctionnels pendant une durée prolongée (pendant au moins 10 jours) afin de pouvoir réaliser une meilleure évaluation de produits topiques (actif seul dans un solvant, actif seul dans une formulation ou actif formulé dans un produit fini en présence d'autres actifs). 20 C'est ce à quoi sont parvenus les Inventeurs par la mise au point d'un nouveau système de culture de peau complète, c'est-à-dire comportant épiderme, derme et hypoderme, permettant la préparation de modèle de peau entière dont l'organisation de la structure tridimensionnelle et la fonctionnalité sont préservées et ainsi de proposer un nouvel outil d'évaluation des effets de produits/actifs formulés sur la biologie de la peau, 25 ainsi que d'étude et d'exploration de la peau et de ses diverses anomalies. Ce modèle permet avantageusement de mimer une application topique d'un produit/actif de façon chronique pendant 10 jours et une caractérisation approfondie de leurs effets biologiques sur les différentes couches qui constituent la peau, et particulièrement au niveau de l'hypoderme. 30 Ainsi la présente invention se rapporte à un système de culture de peau complète comprenant un insert de culture positionné dans un puits tel que l'insert de culture contient un gel consistant en une préparation de lame basale extracellulaire solubilisée et de facteurs de croissance, et le puits contient, outre l'insert, un milieu riche 3061206 pour culture de cellules de mammifère, supplérnenté en au moins un antibiotique et au moins un antifongique. La représentation schématique du système de culture selon l'invention est illustrée à la figure I. 5 Par peau complète, on entend un échantillon de peau comprenant trois couches superposées : l'épiderme, le derme et l'hypoderme. De préférence, l'insert est constitué d'une membrane poreuse, par exemple en polyéthylène téréphtalate (PET), nitrocellulose ou polycarbonate, avec des tailles de pores comprises entre 0,4 et 8 10 Par puits, on entend tout contenant dont la taille est adaptée à la taille de l'insert. De préférence, la surface du puits est comprise entre 0,32 cm2 et 1,95 cm2, de préférence de l'ordre de 0,8 cm2. De préférence, le gel consistant en une préparation de lame basale extracellulaire solubilisée et de facteurs de croissance comprend notamment du collagène 15 IV et de la laminine ; il s'agit de préférence du Matrigel® commercialisé par la Société Corning. Le milieu riche pour culture de cellules de mammifère est de préférence tel qu'il contient les acides aminés alanine, asparagine, acide glutamique, et proline, les vitamines B8 et B12, les acides linoléique et lipoique, le sel énergétique pyruvate de 20 sodium et la base azotée thymidine ; il s'agit de préférence du milieu DMEM/F12 commercialisé par la Société Life Technologies ou du milieu ECBM commercialisé par Promocell. Tout antibiotique peut être ajouté au milieu de culture ; de préférence, l'antibiotique est choisi parmi la pénicilline, la streptomycine, la gentamycine, la 25 ciprofloxaxine ou l'ampicilline. De façon encore plus préférée, l'antibiotique consiste en un mélange de pénicilline et de streptomycine. Tout antifongique peut être ajouté au milieu de culture ; de préférence, l'antifongique est la fungizone. Optionnel] ement, des effecteurs, par exemple 1 ' insuline, des 30 glueocorticoïdes, des agonistes PPAR, peuvent être ajoutés dans le milieu riche pour culture de cellules de mammifère pour améliorer la survie de l'échantillon de peau complète. 3061206 6 Dans le cadre de la mise au point du procédé de culture améliorée d'expiant de peau complète, les Inventeurs ont comparé l'effet de différents milieux pour culture de cellules de mammifère et ont constaté qu'un système de culture comprenant le milieu DMEM/F12 ou le milieu ECBM sont ceux présentant les meilleurs résultats (voir 5 l'exemple C et les figures 8 et 9 ci-après). La présente invention se rapporte également à l'utilisation du système de culture détaillé précédemment pour la culture et/ou la conservation et/ou le maintien en survie d'un expiant de peau complète ; en effet, ce système de culture permet avantageusement le maintien de l'état physiologique et morphologique de l'échantillon de 10 peau complète. La présente invention se rapporte encore à un procédé de préparation de modèle de peau complète comprenant les étapes de : a) positionnement d'un échantillon de peau complète (épiderme, derme, hypoderme) dans un insert tel que défini précédemment ; 15 b) ajout et gélification d'un gel consistant en une préparation de lame basale extracellulaire solubilisée et de facteurs de croissance ; c) positionnement de l'insert dans un puits ; d) ajout du milieu de culture tel que défini précédemment ; e) mise en culture ; de préférence, la mise en culture est réalisée à 5% de 20 CO2 à 37°C ; e) renouvellement du milieu de culture à un intervalle compris entre 1 et 3 jours ; de préférence, toutes les 24h. Par échantillon de peau complète, on entend un échantillon de peau comprenant trois couches superposées : l'épiderme, le derme et l'hypoderme qui peut être 25 préparé à partir de prélèvement de tissu cutané issu de chirurgies esthétiques, plastiques et réparatrices, on parle alors d'expiant de peau, qui est coupé dans des dimensions appropriées à la taille de l'insert. De préférence, l'échantillon de peau est de forme circulaire, a un diamètre compris entre 5 et 23 mm et une épaisseur comprise entre 3 et 15 mm. 30 La présente invention se rapporte à un modèle de peau complète obtenu par le procédé selon l'invention ainsi qu'a un modèle de peau complète composé d'un échantillon de peau complète - comprenant épiderme, derme et hypoderme - stabilisé dans un insert comprenant un gel consistant en une préparation de lame basale extraceIlulaire 3061206 7 solubilisée et de facteurs de croissance, ledit insert étant positionné dans un puits comprenant un milieu riche pour culture de cellules de mammifère tels que définis ci-avant. Le modèle de peau complète selon l'invention permet un maintien en 5 survie des trois couches de la peau pendant au moins 10 jours et ainsi l'étude de différents marqueurs cutanés de pigmentation, de différenciation, de vieillissement et de métabolisme du tissu adipeux, ce modèle de peau complète restant fonctionnel pendant toute cette durée et répondant ainsi aux différents stimuli qui pourront lui être soumis, notamment via l'ajout d'effecteurs métaboliques comme cela est démontré dans la partie expérimentale qui suit. 10 La présente invention se rapporte à l'utilisation du modèle de peau complète pour le criblage de molécules ou de formulations topiques ainsi qu'à un procédé de criblage de molécules ou de formulations topiques comprenant les étapes de : a) préparation d'un modèle de peau complète tel que décrit précédemment en présence ou non de molécules ou de formulations topiques à tester ; la 15 mise en contact de la molécule ou de la formulation topique à tester avec l'expiant peut se faire par mélange dans le milieu de culture ou par application directe sur la surface supérieure (épiderme) de l'expiant ; b) incubation pendant 1 à 10 jours ; de préférence entre 4 et 8 jours ; c) comparaison du modèle de peau complète comprenant la molécule ou 20 la formulation topique à tester avec un modèle de peau complète n'ayant pas été mis en contact avec ladite molécule ou formulation topique à tester. Cette dernière étape de comparaison pourra porter sur différents paramètres : organisation, morphologie d'un ou plusieurs types de cellules ; dosage ou mesure d'expression de marqueurs biologiques choisis selon l'activité à évaluer. 25 Plus spécifiquement, l'évaluation peut consister en l'étude du relargage de glycérol ou d'acide gras ou à mesurer la taille des adipoeytes, par exemple, pour l'évaluation de la lipolyse du tissu adipeux ; de l'expression de marqueurs matriciels dermiques, par exemple, pour l'évaluation de l'effet anti-âge ; de l'expression de marqueurs de prolifération et de différenciation de l'épiderme comme p63, involucrine, 30 filaggrine et loricrine ; de la pigmentation de la peau par dosage de la mélanine ; de l'intégrité structurale de la peau par coloration au Trichrome de Masson, en particulier des différentes couches de l'épideime impliquées dans la fonction barrière de la peau. 3061206 8 De préférence, l'échantillon de peau complète utilisé est un expiant de peau ; de préférence, la comparaison est réalisée à l'aide de modèles préparés avec des expiants de peau ayant la même origine (même donneur). Le modèle de peau complète selon l'invention permet l'étude de la 5 physiologie de la peau et sa réponse à divers facteurs exogènes ; il permet en particulier l'évaluation de toute activité cosmétique de molécules ou de formulations topiques ; il est de préférence destiné à évaluer l'activité lipoiytique de molécules ou de formulations topiques. En effet, les résultats expérimentaux présentés ci-après montrent un 10 excellent maintien de l'activité fonctionnelle des adipocytes de l'hypoderme au cours des jours de maintien en survie et ce pendant au moins 10 jours. Le modèle de peau complète selon l'invention permet encore la réalisation d'analyses cytotoxiques d'actifs et de formulations destinés à être utilisés à des fins cosmétiques, 15 Plus spécifiquement, l'évaluation cytotoxique d'un actif ou d'une formulation cosmétique peut par exemple être réalisée en évaluant leur effet sur la production de lactate déshydrogénase (LDH), marqueur libéré par les cellules aux membranes altérées, par le modèle selon l'invention. Figures 20 La figure 1 est une représentation schématique d'un système de culture selon l'invention. Les figures 2, 3 et 4 comparent deux systèmes de culture : un système simple avec dépôt des expiants directement au fond du puits de culture et le système selon l'invention précédemment décrit ; les figures 2 et 3 présentent respectivement les quantités 25 de lactate déshydrogénase (LDH) et d'IL6 dosées dans les milieux de sécrétion récoltés (quantités exprimées en unité arbitraire UA) ; la figure 4 présente la coloration au Trichrome de Masson de coupes histologiques des expiants après 10 jours de culture ; les flèches ciblent les sites de pyenose et les signes + et ++ indiquent la densité de collagène appréciée visuellement. 30 Les figures 5, 6 et 7 illustrent la fonctionnalité du modèle selon l'invention testée en cultivant les expiants avec le système de culture selon l'invention et en les traitant systémiquement ou non avec des effecteurs afin de modifier le profil de Sécrétion des différentes cytokines et de la lipolyse ; ces figures présentent respectivement 3061206 9 la quantité d'IL6, d'adiponectine et de glycérol dosés dans les milieux de sécrétion récoltés (quantités exprimées en unité arbitraire UA). La figure 8 représente l'évolution d'un marqueur de cytotoxicité (LDH, témoin d'altération des membranes cellulaires et de la cytotoxicité) sécrété par les expiants 5 en fonction du milieu riche pour culture de cellules de mammifère (ECBM, DMEM/F12, DermaLife K ou un mélange 1/1 des milieux DMEM/12 et Dermalife K) utilisé dans le système de culture selon l'invention. La figure 9 représente des clichés d'expiants cultivés avec différents milieux riches pour culture de cellules de mammifère après marquage des noyaux des 10 cellules et de la périlipine présente à la surface des gouttelettes lipidiques contenues dans les adipocytes et témoin de la survie et de la fonctionnalité de l'adipocyte (DMEM/F12, DermaLife K ou un mélange 1/1 des milieux DMEM/12 et Dermalife K). Les flèches ciblent les sites de décollement de l'épiderme ; les signes +, ++ et +++ indiquent l'intensité du marquage de la périlipine appréciée visuellement. 15 La figure 10 représente la taille des adipocytes marqués par la périlipine dans des expiants non traités (Tnt) et dans des explants traités avec une formulation amincissante à base de caféine (Test) ; la taille des adipocytes est évaluée à partir d'une méthode de traitement des images développée en interne. Les exemples ci-après proposent un mode particulier de mise en oeuvre 20 de l'invention. Exemple 1 - préparation d'un modèle de peau complète selon l'invention Matériels et méthodes Les inserts de culture Thincert 12 Puits (012mm PET lim Transparent) et les plaques 12 puits Cellstart proviennent de chez Greiner. 25 La Matrice Matrigel® (constituants de la lame basale) provient de Corning. Les milieux de culture DMEM/F12, ECBM et Dermalife K Keratinocyte® proviennent respectivement de chez Life Technologies, Promocell et LifeLine. La rosiglitazone (réf. 71740) provient de Cayrnan Interchim ; la dexamethasone (réf. D4902), la forskoline (réf. F6886), l'insuline (12643) et l'antibiotique (solution de 30 pénicilline et de streptomycine, réf. P4333) proviennent de chez Sigma. L'anticorps primaire anti-périlipinel (BP5015) provient de chez Acris ; l'anticorps secondaire Alexa Fluor® 488 (ab150185) provient de chez Abcam. La fungizone (réf. 15290-018) provient de Life Technologies. 3061206 10 A-Préparation des expiants Les expiants sont obtenus à partir de prélèvements de tissu cutané humain comprenant l'épiderme, le derme et l'hypoderme. Les expiants sont découpés pour avoir un diamètre compris entre 7 et 15 mm et une épaisseur comprise entre 3 et 10 mm. 5 B- Préparation des milieux de culture Les milieux de culture sont préparés à partir de milieu DMEM/F12, ECBM ou Dermalife K. ils sont complétés par l'ajout d'antibiotiques (Péniciline et Streptomycine) et d'antifongique (Fungizone). Le milieu peut être additionné d'un effecteur : 100 nM de rosiglitazone ou de 10 dexamethasone ou 10 tiM de Forskoline ou 10 nM d'insuline. C- Mise en place du système de culture selon l'invention Les expiants sont déposés dans des inserts de culture de 5 à 40 mm de diamètre avec membrane poreuse en polyéthylène téréphtalate (PET) avec des tailles de pores de 1 pm, eux-mêmes disposés dans des puits de culture de plaque 6 à 48 puits. L'ajout d'un volume 15 de Matrigel à froid (comme préconisé par le fabricant) entourant l'expiant et conservant l'épiderme émergé et au contact de l'air permet la bonne tenue et stabilité de l'expiant. L'ensemble est mis à incuber (comme préconisé par le fabricant) jusqu'à gélification du Matrigel. Un volume de milieu de culture, permettant de laisser émerger l'épiderme au contact de l'air, est ensuite ajouté. Le système est ensuite mis à incuber à 5% CO2 à 37°C. 20 Le milieu de culture est collecté et renouvelé toutes les 24 heures de préférence, pendant toute la période de culture. D- Mesure de la cytolyse Les milieux de sécrétion collectés quotidiennement sont congelés à -80°C, puis dosés pour la lactate déshydrogénase (LDH), témoin de la lyse des cellules, par un kit de réaction 25 enzymatique avec lecture de fluorescence (kit Promega CytotoxOne) comme décrit par le fabricant ; la normalisation de toutes les sécrétions est faite par rapport au poids de l'expiant. E- Mesure de l'activité lipolytique Les expiants sont mis en culture pendant 2 heures dans un milieu contenant soit 0,1% 30 DMSO (condition contrôle), soit 1011M Forskoline (condition de lipolyse stimulée) distribués dans les puits. Le milieu de sécrétion est récupéré puis congelé à -80°C jusqu'au dosage du glycérol libéré avec un kit de détection par colorimétrie (Randox) comme décrit 3061206 11 par le fabricant. La normalisation de toutes les sécrétions est faite par rapport au poids de l'expiant. F- Mesure de la sécrétion des cytokines Le milieu de sécrétion collecté quotidiennement est récupéré puis congelé à -80°C. Chaque 5 échantillon est ensuite traité pour doser la cytokine 1L6 et l'adiponectine par la technique ELISA (DuoSet R&D Systems) comme décrit par le fabricant. La nointalisation de toutes les sécrétions est faite par rapport au poids de l'expiant. G- Techniques d'imnaunofluoreseence Les expiants sont retirés des inserts et fixés dans du formol puis inclus en paraffine. Des 10 coupes histologiques des expiants en paraffine sont réalisées puis immunomarquées pour la périlipine. H- Coloration par Trichrome de Masson Les expiants sont retirés des inserts et fixés dans du formol puis inclus en paraffine. Des coupes histologiques des expiants en paraffine sont réalisées puis colorées par « Trichrome 15 de Masson ». Résultats A. Viabilité du système Deux systèmes de culture sont comparés : un système simple avec dépôt des expiants directement au fond du puits de culture et le système de culture selon l'invention 20 précédemment décrit, comprenant un expiant, un insert de culture et du Matrigel. Ces deux systèmes sont maintenus en culture pendant 10 jours dans de l'ECBM. Les milieux de sécrétion sont récoltés comme décrit précédemment à Ji, J2, J3, J7, J8, J9 et J10. Les expiants sont récoltés comme décrit précédemment. A.1. Cytolyse 25 La figure 2 présente les quantités de lactate déshydrogénase (LDH) dosée dans les milieux de sécrétion récoltés. Pour le système de culture selon l'invention, la quantité de LDH libérée est, dès le premier jour de culture, plus faible que pour le système de culture avec l'expiant disposé directement au fond du puits. Cela indique une moindre cytolyse des expiants avec le système de culture de culture selon l'invention. 30 A.2. Sécrétion d'IL6 La figure 3 présente les quantités d'ELA dosées dans les milieux de sécrétion récoltés. Grâce au système de culture selon l'invention, la quantité d'IL6 est limitée dès le premier jour et jusqu'au dernier jour de culture. L'IL6 étant un marqueur pro-inflammatoire, le 3061206 12 système de culture selon l'invention permet de limiter l'inflammation au sein de l'expiant pouvant être induite suite au stress du geste de préparation des expiants et de sa mise en culture. A.3. Coloration au Trichrome de Masson 5 La figure 4 présente la coloration au Trichrome de Masson de coupes histologiques des expiants après 10 jours de culture. Avec le système de culture selon l'invention, on observe moins d'anomalies cellulaires, comme la pycnose, au niveau de l'épiderme et davantage de densité collagénique, au niveau du derme, par rapport au système simple. B. Fonctionnalité du système 10 Les expiants mis en culture avec le système de culture selon l'invention sont traités systémiquement avec des effecteurs afin de modifier le profil de sécrétion des différentes cytokines et de la lipolyse. La dexamethasone, utilisée à 100nM, est un glucocorticorde aux propriétés anti-inflammatoires ajouté dans le milieu de culture pour diminuer les sécrétions d'It6. La rosiglitazone, utilisée à 100nM, est un agoniste du facteur de transcription 15 PPAR7 impliqué dans la différenciation adipocytaire et qui va entre autres favoriser la sécrétion d'adiponectine. La forskoline est un activateur de l'adénylate cyclase qui va permettre de stimuler la lipolyse. Le système est maintenu en culture pendant 9 jours dans de VECBM. Les milieux de sécrétion sont récoltés comme décrit précédemment à J1, J2, J3, J7, J8 et J9. Les expiants sont récoltés comme décrit précédemment. 20 B.1. Effets de la Dexamethasone sur la production d'IL6 La figure 5 présente la quantité d'IL6 dosée dans les milieux de sécrétion récoltés. Pour les expiants traités avec de la dexamethasone, la quantité d'IL6 sécrétée est, dès le premier jour de culture et jusqu'à J9, plus faible de moitié puis progressivement indétectacle, par rapport aux sécrétions des expiants contrôles. Cela montre bien une réponse des expiants à 25 la dexamethasone dès JI et jusqu'à J9 avec le système de culture selon l'invention, et donc la fonctionnalité maintenue de ce système. B.2. Effets de la Rosiglitazone sur la production d'adiponectine La figure 6 présente la quantité d'adiponectine dosée dans les milieux de sécrétion récoltés. Pour les expiants traités avec de la rosiglitazone, la quantité d'adiponectine sécrétée tend à 30 augmenter, à partir de J7, par rapport aux expiants contrôles non traités à la rosiglitazone. Les taux de sécrétion d'adiponectine restent ensuite constants dans le temps, y compris jusqu'à J9. Cela montre bien une réponse des expiants à la rosiglitazone jusqu'à J9 avec le système de culture selon l'invention. 3061206 13 B.3. Activité lipoIytique stimulée La figure 7 présente la quantité de glycérol libéré et dosé dans les milieux de sécrétion récoltés. Pour les expiants traités avec de la forskoline, la quantité de glycérol libérée est fortement augmentée : +100% à J3 et J7 et +57% à J9, par rapport aux sécrétions des 5 expiants contrôles, non traités avec la forskoline. Cela montre bien une réponse des expla.nts à la forskoline dès J3 et jusqu'à J9 avec le système de culture selon l'invention, et donc une fonctionnalité du système. C. Milieu de culture Les expiants sont mis en culture avec le système de culture selon l'invention dans 10 différents milieux de culture : ECBM, DMEM/F12, DermaLife K ou un mélange 1/1 des milieux DMEM/12 et Dermalife K. Le système est maintenu en culture pendant 9 jours dans les différents milieux de culture. Les milieux de sécrétion sont récoltés comme décrit précédemment à JI, J2, 13, J7, J8 et 19. Les expiants sont récoltés comme décrit précédemment. 15 C.I. Comparaison des réponses cytolytiques des expiants cultivés dans les différents milieux de culture La figure 8 représente l'évolution de marqueurs de cytotoxicité (LDH) sécrétés par les expiants en fonction du milieu de culture utilisé dans le système de culture selon l'invention. 20 Ce graphe montre qu'à plus long terme (entre 7 et 9 jours), la sécrétion des marqueurs de cytotoxicité est plus élevée, signe d'une cytolyse, dans le milieu DermaLife K et le mélange 1/1 des milieux DMEM/12 et Dermalife K alors qu'elle reste très basse dans l'ECBM et le DMEM/F12. C.2. Comparaison des immunomarquages de la périlipine 25 Les clichés réalisés à partir d'expiants cultivés avec les milieux DMEM/F12, DermaLife K ou un mélange 1/1 des milieux DMEM/12 et Dermalife K sont représentés à la figure 9. Ils montrent que l'intégrité structurale cutanée est maintenue au bout de 9 jours avec le milieu DMEM/F12, tant pour la partie épidermique (marquage par DAPI des noyaux des kératinocytes) qu'hypodermique (marquage de la périlipine des adipocytes) ; à l'inverse, 30 l'épiderme (flèche) et les adipocytes (« + » pour DermaLifeK versus « ++ » pour DMEM/F12) sont altérés avec le milieu DermaLifeK. 3061206 14 D. Essai d'application topique d'une formule amincissante à base de caféine Les expiants issus de trois donneurs (4 par donneurs) sont mis en culture avec le système de culture selon l'invention dans le milieu de culture DMEM/F12 supplémenté d'antibiotiques (pénicilline et streptomycine) et d'un antifongique (Fungizone). 5 A Ji, chacun des expiants est traité comme suit Tnt ; Aucun traitement. - Test : Application directe par étalement au pinceau sur l'expiant de 10 pL de la formulation suivante : caféine (5g/100g) dans un véhicule alcoolique (composé de carbomer, trolamine, macrogol 7 glyeeryl cocoate, éthanol et eau). 10 A J8, après avoir changé le milieu de culture tous les 2 à 3 jours, les expiants sont fixés dans 2 mL de paraformaIdéhyde à +4°C pendant 1 à 5 jours et inclus en paraffine. Des coupes de tissu de 5 gm d'épaisseur sont ensuite réalisées à l'aide d'un microtome puis incubées 45 minutes en présence de l'anticorps primaire anti-périlipine puis 45 minutes en présence de l'anticorps secondaire dirigé contre l'anticorps primaire et couplé à un 15 chromophore de type Alexa. Vingt champs de la population tissulaire hypodermique sont pris en photo par condition. Les images de fluorescence indiquent les régions de localisation de la protéine d'intérêt périlipine et permettent d'apprécier la taille des adipocytes. Les clichés photographiques sont analysés par le logiciel d'analyse d'image Visilog (FEI) et les tailles des adipocytes sont comparées par condition. 20 Résultats : La figure 10 représente l'évolution de la taille des adipocytes après marquage de la périlipine. Ce graphe montre une diminution significative de la taille des adipocytes dans l'expiant traité par la formulation à base de caféine. 25 REVENDICATIONS1. Système de culture de peau complète constitué d'un insert de culture positionné dans un puits, caractérisé en ce que l'insert de culture contient un gel consistant en une préparation de lame basale extracellulaire solubilisée et de facteurs de croissance, et en ce que le puits contient un milieu riche pour culture de cellules de mammifère supplémenté en au moins un antibiotique et au moins un antifongique. 2. Système de culture de peau complète selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit insert est constitué d'une membrane poreuse avec des tailles de pores comprises entre 0,4 et 8 Mm. 3. Système de culture de peau complète selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit gel est le Matrigel. 4. Système de culture de peau complète selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit milieu riche pour culture de cellules de mammifère est choisi parmi le milieu DMEM/F12 ou le milieu ECBM. 5. Utilisation du système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la culture et/ou la conservation et/ou le maintien en survie d'un expiant de peau complète. 6. Procédé de préparation de modèle de peau complète comprenant les étapes de : a) positionnement d'un échantillon de peau complète dans un insert tel que défini dans la revendication 1 ; b) ajout et gélification d'un gel consistant en une préparation de lame basale extracellulaire solubilisée et de facteurs de croissance ; c) positionnement de l'insert dans un puits ; d) ajout du milieu riche pour culture de cellules de mammifère ; e) mise en culture ; 3061206 16 e) renouvellement du milieu riche pour culture de cellules de mammifère à un intervalle compris entre 1 et 3 jours. 7. Procédé de préparation de modèle de peau complète selon la 5 revendication 6 caractérisé en ce que ledit échantillon de peau est un expiant de peau. 8. Procédé de préparation de modèle de peau complète selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit échantillon de peau est de forme circulaire, a un diamètre compris entre 5 et 23 mm et une épaisseur comprise entre 3 et 15 mm. 10 9. Modèle de peau complète obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8. 10. Modèle de peau complète selon la revendication 9, composé d'un 15 échantillon de peau complète stabilisé et maintenu dans un insert comprenant un gel consistant en une préparation de lame basale extracellulaire solubilisée et de facteurs de croissance, ledit insert étant positionné dans un puits comprenant un milieu riche pour culture de cellules de manunifère. 20 11. Utilisation du modèle de peau complète selon la revendication 9 ou la revendication 10 pour le criblage de molécule ou de formule topique. 12. Procédé de criblage de molécule ou de formulation topique comprenant les étapes de : 25 a) préparation d'un modèle de peau complète selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 en présence ou non de molécule ou de formulation topique à tester ; b) incubation pendant 1 à 10 jours ; c) comparaison du modèle de peau complète comprenant la molécule ou la formulation topique à tester avec un modèle de peau complète n'ayant pas été mis en 30 contact avec ladite molécule ou formulation topique à tester.