Brevet FR3050936A1 — publié le 20171110

Composé utile pour le traitement d'un déficit du catabolisme des acides gras à très longue chaine et composition pharmaceutique comprenant ledit composé La présente invention concerne un composé pour son utilisation dans le traitement, la prévention ou le diagnostic des maladies génétiques provoquant un déficit de catabolisme par oxydation des acides gras à très longue chaîne (AGTLC) dans toutes les cellules de l'organisme et par conséquent une accumulation de ces acides gras, tels que les acides béhénique (acide lo docosanoïque, C22:0), lignocérique (acide tétracosandique, C24:0) et cérotique (acide hexacosanoïque, C26:0). La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant ledit composé. Les acides gras contenant plus de 22 atomes de carbone (C24:0 et C26:0) ont deux sources : une origine alimentaire et une synthèse endogène. La synthèse 15 des acides gras de taille supérieure à 16 hydrates de carbone est due à un système d'élongation présent à la fois dans les mitochondries et dans les microsomes. Le catabolisme des AGTLC est assuré par le peroxysome, organelle cellulaire dans lequel on retrouve toutes les enzymes assurant la bêta-oxydation des AGTLC. 20 Il existe des pathologies provoquées par une mauvaise biogénèse du peroxysome empêchant le catabolisme des AGTLC. On les regroupe sous le terme de syndrome de Zellweger (Steinberg et al. 2003). Le syndrome de Zellweger est provoqué par une mutation dans l'une des protéines du peroxysome (peroxines) : PEX1, PEX2, PEX3, PEX5, PEX6, PEX10, PEX12, PEX13, PEX14, 25 PEX16, PEX19, ou PEX26. On distingue parfois dans cette famille des variants phénotypiques comme l'adrénoleucodystrophie néonatale et le syndrome de Refsum infantile. Ces pathologies se caractérisent et sont diagnostiquées par une accumulation d'AGTLC dans l'organisme. D'autres pathologies sont provoquées par la perte de fonction d'une seule 30 enzyme peroxysomale. C'est le cas par exemple pour l'adrénoleucodystrophie liée à l'X (Steinberg et al. 1999), provoquée par la perte de fonction du transporteur ABC peroxysomal codé par le gène ABCD1 ; la déficience en ACOX1 (Vanderver et al. 2014) est provoquée par une mutation dans le gène codant pour l'Acyl-CoA 3050936 2 oxidase de type 1 ; la déficience en protéine bi-fonctionnelle peroxysomale (HSD17B4) est provoquée par une mutation dans l'enzyme peroxysomale portant les activités énoyl-CoA hydratase et 3-hydroxyacyl-00A déshydrogénase (Vanderver, op. cit.). La perte de fonction d'une de ces enzymes du peroxysome 5 provoque l'accumulation d'AGTLC dans l'organisme. L'accumulation des AGTLC porte sur toutes les cellules de tous les tissus. On retrouve alors les AGTLC à des niveaux trop élevés dans la circulation sanguine et leur dosage plasmatique fait d'ailleurs partie du diagnostic de ces pathologies. L'accumulation des AGTLC dans certains organes comme par exemple le cerveau, la moelle épinière, les nerfs périphériques ont un impact clinique important. Les symptômes sont notamment neurodégénératifs. Il n'existe aucun traitement curatif de ces pathologies. Les seuls traitements disponibles sont symptomatiques. Une étude, menée chez des garçons atteints d'adrénoleucodystrophie liée à l'X présymptomatique, a montré que l'administration d'huile de Lorenzo provoque une réduction de l'acide hexacosanoïque (C26:0) et réduit le risque de développer des anomalies cérébrales décelables à l'IRM (Kaplan et al. 1993). Des essais de traitement par thérapie génique sont également en cours d'expérimentation chez l'homme (Cartier et al. 2012). Le but de la présente invention est de proposer un composé qui permet de rétablir la fonction catabolique des AGTLC (acides gras en C22, C24 et C26), de réduire ainsi leur accumulation en augmentant les quantités d'acides palmitique et stéarique et de rétablir des quantités normales des acides béhénique, lignocérique et cérotique dans les cellules de l'organisme. Ce composé est susceptible d'être utilisé pour le traitement ou la prévention des maladies causées par l'accumulation d'AGTLC. La présente invention propose donc un composé pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie causée par un défaut de la fonction catabolique des AGTLC du peroxysome, lui-même causé, exclusivement ou non, par une mutation sur les gènes codant pour les peroxines et plus particulièrement sur les gènes codant pour PEX1, PEX2 - PXMP3, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11A, PEX11B, PEX11G, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, PEX26, PEX28, PEX30 ou PEX31, ou sur les gènes codant une enzyme impliquée dans le catabolisme ou le transport d'AGTLC dont la perte de 3050936 3 fonction entraîne une accumulation d'AGTLC, et plus particulièrement les gènes ABCD1, ACOX1 ou le gène codant pour la protéine bi-fonctionnelle peroxysomale HSD17B4 (énoyl-CoA hydratase et 3-hydroxyacyl-00A déshydrogénase), ledit composé étant de formule (I) suivante : HO NO2 5 (I). L'invention propose également un sel, solvate, clathrate, hydrate ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable du composé de formule (I) pour l'utilisation susmentionnée, ainsi qu'un composé susceptible d'être métabolisé par un organisme vivant en un composé de formule (I) ou en sel, solvate, clathrate, 10 hydrate ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé de formule (I), toujours pour l'utilisation susmentionnée. Le composé selon la présente invention permet de traiter ou de prévenir une maladie causée partiellement ou totalement par un défaut du catabolisme des AGTLC du peroxysome, lui-même causé, exclusivement ou non, par une mutation 15 sur les gènes codant pour les peroxines et plus particulièrement sur les gènes codant pour PEX1, PEX2 - PXMP3, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11A, PEX11B, PEX11G, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, PEX26, PEX28, PEX30 ou PEX31, ou sur les gènes codant une enzyme impliquée dans le catabolisme ou le transport d'AGTLC dont la perte de fonction entraîne une 20 accumulation d'AGTLC, et plus particulièrement les gènes ABCD1, ACOX1 ou le gène codant pour la protéine bi-fonctionnelle peroxysomale (énoyl-CoA hydratase et 3-hydroxyacyl-00A déshydrogénase). Le composé selon l'invention permet de supprimer ou d'atténuer un ou plusieurs symptômes de cette maladie. Le composé selon l'invention peut être administré à tout patient atteint d'une 25 maladie telle que définie ci-dessus. 3050936 4 Le terme « patient » englobe, au sens de la présente invention, tout être vivant, animal, notamment un mammifère et en particulier un être humain. Le composé de formule (I) répond au nom chimique de 5-chloro-N-(2-chloro4-nitrophény1)-2-hydroxybenzamide (CAS n° 50-65-7), et sa dénomination 5 commune internationale est niclosamide. La préparation de ce composé est décrite dans le brevet US 3 079 297. Le composé de formule (I) peut être utilisé sous la forme de sels avec notamment une base minérale ou organique non toxique, de préférence pharmaceutiquement acceptable. Parmi les bases minérales, on peut utiliser par 10 exemple les hydroxydes de sodium, de potassium, de magnésium ou de calcium. Parmi les bases organiques, on peut utiliser par exemple les amines, les aminoalcools, des acides aminés basiques tels que la lysine ou l'arginine ou encore des composés porteurs d'une fonction ammonium quaternaire tels que par exemple la béta'ine ou la choline. Les sels du composé de formule (I) avec une 15 base minérale ou organique peuvent être obtenus de façon classique, en utilisant les méthodes bien connues de l'homme de métier, par exemple en mélangeant des quantités stoechiométriques de composé de formule (I) et de la base dans un solvant, tel que par exemple l'eau ou un mélange hydroalcoolique, et en lyophilisant ensuite la solution obtenue. 20 De manière avantageuse, le composé de formule (I) se présente sous la forme d'un sel avec l'éthanolamine. La préparation de ce sel est décrite par exemple dans le brevet US 3 113 067. Le terme « polymorphe » désigne, selon la présente invention, toute forme ou mélange de formes amorphe ou cristalline de la molécule active. 25 Le composé selon l'invention est généralement administré sous la forme d'une composition pharmaceutique en association ou mélange avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables afin d'obtenir des formes administrables par exemple par voie parentérale ou par voie orale. Dans le cas de formes injectables, on utilisera avantageusement le 30 composé de formule (I) sous forme de sel soluble dans un milieu aqueux. Comme indiqué précédemment, le sel est préférentiellement formé entre un composé de formule (I) et une base non toxique pharmaceutiquement acceptable. La composition peut être soit une solution du composé dans un milieu aqueux 3050936 5 isotonique en présence d'excipients solubles, soit un lyophilisat du composé auquel le solvant de dilution est ajouté de façon extemporanée. Ces compositions pourront être injectées sous forme de perfusion ou en bolus en fonction des besoins du patient. 5 Les formes administrables par voie orale seront de préférence présentées sous forme d'une gélule ou d'un comprimé contenant le composé de l'invention broyé finement ou mieux, micronisé, et mélangé avec des excipients connus de l'homme du métier, tels que par exemple du lactose, de l'amidon prégélatinisé et du stéarate de magnésium. Dans un mode de réalisation avantageux de forme 10 administrable par voie orale, on utilisera le composé de formule (I) sous forme de sel soluble dans un milieu aqueux. Ainsi, selon un second aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une maladie causée par une accumulation d'acides gras à très 15 longue chaîne dans l'organisme, ladite composition comprenant, en tant que molécule active, un composé de formule (I) ou un sel, solvate, clathrate, hydrate, ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. L'homme du métier est à même de déterminer si une maladie est causée par 20 un défaut de catabolisme des acides gras à très longue chaîne (et donc une accumulation de ces acides gras dans l'organisme). Il est en effet possible d'étudier le catabolisme des acides gras à très longue chaîne par un dosage sanguin des AGTLC et sur une culture de cellules primaires provenant d'une biopsie réalisée chez le patient. Ces tests sont largement décrits dans la littérature 25 et réalisés dans le cadre du diagnostic de telles maladies. L'invention concerne en outre une méthode de traitement ou de prévention d'une maladie causée par une accumulation d'acides gras à très longue chaîne qui comprend l'administration, à un sujet en ayant besoin, d'une quantité thérapeutiquement efficace, d'un composé de formule (I) ou d'un sel, solvate, 30 clathrate, hydrate, ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé. 3050936 6 La présente invention, ses caractéristiques et les divers avantages qu'elle procure sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent et des figures annexées dans lesquelles : - la Figure 1 illustre les quantités intracellulaires, rapportées au nombre de 5 cellules, des acides gras de longueur C16 à C24 marqués par 4 atomes de deutérium et provenant de la bêta-oxydation de l'acide cérotique exogène marqué au deutérium et ajouté dans le milieu de culture à une concentration de 20 11M. Les barres noires correspondent aux quantités d'acides gras dans des fibroblastes sains n'ayant aucun défaut de fonction du peroxysome. Les barres grises 10 correspondent aux quantités d'acides gras dans des cellules d'un patient possédant une dysfonction de l'Acyl-CoA oxydase 1 peroxysomale provoquée par une mutation génétique. En gris foncé, les cellules ont été traitées par le DMSO (véhicule), en gris clair, les cellules ont été traitées par le niclosamide à une concentration supérieure à 1011M. 15 - la Figure 2 illustre l'effet dose-dépendant du niclosamide sur les quantités intracellulaires des acides gras de longueur C16 à C24 provenant de la bêta-oxydation de l'acide cérotique marqué au deutérium (triangles) ainsi que l'effet du niclosamide sur la quantité intracellulaire d'acide cérotique naturellement présent (ronds). 20 - la Figure 3 illustre les ratios mesurés des quantités intracellulaires d'acides gras C24/C16, C24/C18 et C24/C22 qui sont le reflet de la fonction de bêta-oxydation peroxysomale permettant le catabolisme des AGTLC en acides gras plus courts (C16 et C18). Les barres noires correspondent aux ratios mesurés dans des fibroblastes sains, les barres gris foncé et gris clair correspondent aux 25 ratios mesurés dans des cellules d'un patient possédant une dysfonction de l'Acyl- CoA oxydase 1 peroxysomale provoquée par une mutation génétique, traitées respectivement par du DMSO (véhicule) ou du niclosamide à une concentration supérieure à 1011M. - la Figure 4 illustre l'effet du niclosamide en fonction de la dose sur les ratios 30 d'acides gras C24/C16, C24/C18 et C24/C22. - la Figure 5 illustre l'effet du niclosamide sur les ratios d'acides gras C24/C16 et C24/C18 dans des cellules ayant perdu leur fonction peroxysomale (triangles) ou dans des cellules saines (ronds). 3050936 7 EXEMPLES Les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, ont été mis en oeuvre sur des cellules humaines non modifiées issues d'hommes sains (contrôles) d'une 5 part, et d'hommes souffrant d'un défaut de fonction peroxysomale (noté MAP007) d'autre part. Exemple 1 Des fibroblastes primaires de peau de patient ont été cultivées dans un 10 milieu de culture contenant du DMEM / HAM F10 50/50, 10% FBS (sérum foetal bovin) et 1% d'antibiotiques. Lors du premier changement de milieu, le niclosamide, sous forme d'une solution dans le DMSO à 10mM (ou le DMSO pour les contrôles) a été ajouté une première fois au milieu de culture aux concentrations désirées. Les cellules saines n'ont pas été traitées. Après 48h 15 d'incubation, le milieu de culture a été changé à nouveau et complété par de l'acide cérotique marqué au deutérium à la concentration de 2011M et de l'alphacyclodextrine aidant à la solubilisation de l'acide cérotique à la concentration de 0,3mg/mL. Le niclosamide a été ajouté une seconde fois aux concentrations désirées. Les cellules ont été incubées 48h. Après la période d'incubation, les 20 cellules ont été lavées au PBS, comptées par imagerie après marquage des noyaux et lysées par des cycles de congélation-décongélation. Les échantillons ont été dérivatisés par du diméthylaminoéthanol et repris dans de l'acétonitrile avant d'être analysés par LC-MS/MS. Les transitions MRM (acronyme de l'anglais « Multiple Reaction Monitoring ») spécifiques des acides gras dérivatisés par le 25 diméthylaminoéthanol permettent leur détection et leur quantification par spectrométrie de masse. Comme le montre la figure 1, le niclosamide est capable de rétablir des quantités normales des acides gras les plus longs (C24 et C22) et d'augmenter les quantités d'acides gras à 16 et 18 atomes de carbone, preuve que les AGTLC ne 30 s'accumulent plus dans les cellules. Le non-retour à la normale des taux de C16 et C18 peut être expliqué par l'effet découplant des mitochondries ayant pour effet une augmentation de l'oxydation des acides gras longs (C16 et C18) dans les cellules. 3050936 8 La figure 2 montre que l'effet observé sur la figure 1 est dépendant de la dose de niclosamide. La figure 2 montre en effet que le niclosamide est capable de diminuer la quantité d'acide cérotique C26 non marqué et d'en rétablir une quantité normale mesurée sur des cellules saines (0,2 sur l'échelle). 5 La figure 3 montre que dans le cas d'une perte de fonction peroxysomale, les rapports C24/C16, C24/C18 et C24/C22 sont augmentés par rapport à ceux issus de cellules saines. Le niclosamide, capable de corriger la fonction peroxysomale, diminue significativement ces 3 ratios. La figure 4 montre que le niclosamide rétablit la fonction peroxysomale des 10 cellules atteintes avec un effet dépendant de la dose. Exemple 2 Des fibroblastes primaires ont été cultivés dans un milieu DMEM-HAM F10 50/50, 10% FBS, 1% d'antibiotiques, 211M d'acide cérotique marqué au deutérium 15 et méthyl-bêta-cyclodextrine (6 équivalents par rapport à l'acide cérotique). Les cellules ont été amplifiées pendant 3 jours. Le milieu de culture a été renouvelé une première fois et le niclosamide, sous forme d'une solution dans le DMSO à 10mM (ou le DMSO pour les contrôles) a été ajouté aux concentrations désirées. Les cellules ont été incubées 48h, puis le milieu de culture a été renouvelé une 20 seconde fois avec un nouvel ajout de niclosamide aux concentrations désirées. Les cellules ont été incubées 48h. Après la période d'incubation, les cellules ont été lavées au PBS, comptées par imagerie après marquage des noyaux et lysées par des cycles de congélation-décongélation. Les échantillons ont été dérivatisés par du diméthylaminoéthanol, repris dans l'acétonitrile avant d'être analysés par 25 LC-MS-MS. Les transitions MRM spécifiques des acides gras dérivatisés par le diméthylaminoéthanol permettent leur détection et leur quantification par spectrométrie de masse. La figure 5 montre que l'effet du niclosamide est spécifique des cellules ayant perdu leur fonction peroxysomale. Des cellules possédant une fonction 30 peroxysomale normale ne sont pas sensibles au niclosamide. Le niclosamide permet de rétablir des ratios d'acides gras proches de ceux des cellules saines. 3050936 9 BIBLIOGRAPHIE 1. Steinberg S, Raymond G, Braverman N, Moser A. Peroxisome Biogenesis Disorders, Zellweger Syndrome Spectrum. In: Pagon R et al., editors. 5 GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993- 2016. 2003 Dec 12 [Updated 2012 May 10]. 2. Steinberg S, Moser A, Raymond G. X-Linked Adrenoleukodystrophy. 1999 Mar 26 [Updated 2015 Apr9]. In: Pagon R et al., editors. GeneReviews0 [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2016. Disponible à l'adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1315/. 3. Vanderver A, Tonduti D, Schiffmann R, Schmidt J, van der Knaap M. Leukodystrophy Overview. 2014 Feb 6. In: Pagon R et al., editors. GeneReviews0 15 [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2016. 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Composé pour l'utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, où la maladie causée par une accumulation d'acides gras à très longue chaîne dans l'organisme est choisie parmi les différents variants phénotypiques du syndrome de Zellweger, l'adrénoleucodystrophie liée à l'X, la déficience en Acyl-CoA oxidase de type 1 et la déficience en protéine bifonctionnelle peroxysomale. zo 4. Composition pharmaceutique pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une maladie causée par une accumulation d'acides gras à très longue chaîne dans l'organisme, ladite composition comprenant, en tant que molécule active, un composé de formule (I) ou un sel, solvate, clathrate, hydrate, ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé, tel que défini à la 25 revendication 1 ou 2, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. 3050936 11 5. Composition pharmaceutique pour l'utilisation selon la revendication 4, où la maladie causée par une accumulation d'acides gras à très longue chaîne dans l'organisme est choisie parmi les différents variants phénotypiques du syndrome 5 de Zellweger, l'adrénoleucodystrophie liée à l'X, la déficience en Acyl-CoA oxidase de type 1 et la déficience en protéine bifonctionnelle peroxysomale.