Brevet FR3056991A1 — publié le 20180406

La présente invention concerne une méthode de détection, de discrimination et identification d'espèce de borrélies présentes dans un échantillon, tel qu'un tissu ou un fluide, d'origine humaine ou animale, ainsi qu'un kit pour la mise en oeuvre d'une telle méthode. La borrélie est un genre de bactéries appartenant à la famille des spirochètes et comprenant plusieurs espèces que l'on peut classer en deux groupes en fonction de la pathologie qu'elles provoquent : un groupe responsable de la maladie de Lyme et un groupe responsable de fièvres récurrentes. La maladie de Lyme est notamment transmise à l'homme ou l'animal suite à une morsure de tique infectée par des borrélies. Les bactéries vont alors se retrouver dans la salive de la tique et peuvent atteindre la circulation sanguine. Les symptômes de la maladie de Lyme sont une rougeur cutanée au niveau de la morsure évoluant en dehors de tout traitement vers des symptômes tels qu'un état grippal, une atteinte neurologique, une fatigue intense ou encore des troubles du rythme cardiaque. Parmi les borrélies responsables de la maladie de Lyme, on recense les espèces suivantes : B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. spielmanii, B. valaisiana, B. bissettii, B. americana, B. andersonii, B. carolinensis, B. japonica, B. lusitaniae, B. sinica, B. tanukii et B. turdi. Les fièvres récurrentes sont des infections bactériennes transmises par l'intermédiaire de morsures de poux et de tiques. Les fièvres peuvent être très intenses et provoquer des symptômes sévères tels que des frissons, des douleurs, des complications pulmonaires, voire des hémorragies cérébrales. Parmi les borrélies responsables de fièvres récurrentes, on recense les espèces suivantes : B. anserina, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. miyamotoi, B. parkeri, B. persica, B. recurrentis, B. turicatae, B. lonestari, B. microti et B. theileri. Les traitements des pathologies induites par les borrélies reposent essentiellement sur la prise d'antibiotiques adaptés. De nombreux tests de détection des borrélies sont décrits dans la 30 littérature mais beaucoup sont basés sur la technique de « polymorphisme de 3056991 2 longueur des fragments de restriction », sur la détection d'anticorps par tests ELISA généralement confirmés par Western Blot ou par des méthodes d'amplification de séquences cibles d'ADN. Cependant, les tests aujourd'hui disponibles sont soit peu fiables avec un nombre de faux négatifs important, ne 5 concernent que la détection de certaines espèces ou encore ne sont pas suffisamment discriminants pour distinguer des bactéries étroitement apparentées. Par ailleurs, la détection d'anticorps ne permet pas de distinguer entre une contamination ancienne ou une contamination en cours, les IgG pouvant persister plusieurs années après la guérison. 10 Enfin, les tests aujourd'hui proposés se montrent peu sensibles et sont ainsi à l'origine de résultats faussement négatifs. Or, de l'efficacité de la méthode de détection des borrélies et de l'identification des espèces présentes dans un échantillon contaminé, ainsi que de la sensibilité de la méthode, vont dépendre la rapidité de la mise en place du traitement ainsi que la spécificité du traitement en 15 fonction de l'espèce identifiée. Le but de la présente invention est ainsi de proposer une méthode de détection de borrélies, dans un échantillon d'origine humaine ou animale, qui soit sensible, efficace, reproductible, spécifique des borrélies et qui permette en outre la discrimination des espèces de borrélies entre elles, la méthode étant facile à 20 mettre en oeuvre. A cet effet, l'invention concerne une méthode de détection de la présence de Borrélies dans un échantillon humain ou animal, de discrimination et d'identification d'espèces de borrélies, par PCR multiplexes quantitatives, comprenant : 25 (a) une étape de détection de la présence de borrélies dans l'échantillon et de distinction desdites borrélies entre le groupe provoquant la maladie de Lyme et le groupe provoquant des fièvres récurrentes, ladite étape consistant en : - l'extraction d'ADN dudit échantillon, - l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :1 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :2 et de deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4, dans des conditions permettant la production d'amplicons, et, 3056991 3 - la détection de la présence ou l'absence de borrélies du groupe provoquant la maladie de Lyme ou du groupe provoquant des fièvres récurrentes par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, puis, 5 si un signal est détecté à l'étape (a) indiquant la présence de borrélies du groupe de la maladie de Lyme, (b) une étape de détection et de distinction, dans l'échantillon, de la présence des espèces B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii ou B. afzelii et des espèces B. valaisiana ou B. bissettii, ladite étape consistant en : 10 - à partir de l'ADN extrait dudit échantillon, - (b1) l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide de paires d'amorces formées par l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 et les amorces antisens de séquences SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10 et de trois sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12 et SEQ ID NO :13, dans 15 des conditions permettant la production d'amplicons, et, -(b2) la détection de la présence ou l'absence de borrélies appartenant aux espèces B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii ou B. afzelii par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, et - (b3) l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide 20 de paires d'amorces formées par l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :14, l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :15 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :16, et de deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :18, dans des conditions permettant la production d'amplicons, et, - (b4) la détection de la présence ou l'absence de borrélies appartenant 25 aux des espèces B. valaisiana ou B. bissettii par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, ou, si un signal est détecté à l'étape (a) indiquant la présence de borrélies du groupe des fièvres récurrentes, (c) une étape de détection et de distinction, dans l'échantillon, de la 30 présence des espèces B. hermsii et B. recurrentis, et des espèces B. duttonii ou B. crocidurae du groupe provoquant les fièvres récurrentes, ladite étape consistant en : - à partir de l'ADN extrait dudit échantillon, 3056991 4 -(c1) l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :19 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :20 et d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :21 et l'amorce antisens de séquence SEQ 5 ID NO :22, et de deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :23 et SEQ ID NO :24, dans des conditions permettant la production d'amplicons, et -(c2) la détection de la présence ou l'absence de borrélies appartenant aux espèces B. hermsii et B. recurrentis, par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, et, 10 -(c3) l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :25 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :26 et d'une sonde consistant en la séquence SEQ ID NO :27 , dans des conditions permettant la production d'amplicons, et, 15 -(c4) la détection de la présence ou l'absence de borrélies appartenant aux espèces B. duttonii ou B. crocidurae par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, (d) l'analyse des résultats des amplifications, étant entendu que ladite méthode inclut les séquences présentant au moins 20 90% d'homologie avec les séquences SEQ ID NO : 1 à 4 et 8 à 27. La méthode selon l'invention permet de détecter les borrélies présentes dans un échantillon et de les classer soit dans le groupe des fièvres récurrentes (B. anserina, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. miyamotoi, B. 25 parkeri, B. persica, B. recurrentis, B. turicatae, B. lonestari, B. microti et B. theileri) soit dans le groupe de la maladie de Lyme (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. spielmanii, B. valaisiana, B. bissettii, B. americana, B. andersonii, B. carolinensis, B. japonica, B. lusitaniae, B. sinica, B. tanukii et B. turdi) par PCR quantitative multiplexe en temps réel. En outre, la méthode 30 permet encore d'identifier l'espèce à laquelle appartiennent les bactéries présentes, de manière précise. Enfin, la sensibilité de la méthode est telle qu'elle permet de détecter une à dix copies dans un échantillon. Pour cela, lors d'une première étape (a), le gène codant l'ARN ribosomique 16S des bactéries est ciblé, à l'aide d'un couple d'amorce commun à toutes les 3056991 5 espèces. Des sondes spécifiques au groupe des borrélies responsables de la maladie de Lyme et des borrélies responsables des fièvres récurrentes, respectivement, sont utilisées afin de classer dans l'un de ces groupes les borrélies présentes dans l'échantillon. 5 Si cette première étape a révélé la présence de borrélies responsables de la maladie de Lyme, l'étape suivante (b) permettra de distinguer et d'identifier les borrélies burgdorferi sensu stricto, garinii et afzelii, ainsi que valaisiana et bissettii, en ciblant le gène codant la flagelline de ces espèces. Des couples d'amorces communs entre les borrélies burgdorferi sensu stricto, B. garinii et B. 10 afzelii, et des couples d'amorces communs entre les espèces B. valaisiana et B. bissettii, sont utilisés. Des sondes spécifiques de chaque espèce sont utilisées afin d'identifier la ou les espèces détectées. Si, par contre, la première étape a révélé la présence de borrélies appartenant au groupe des borrélies responsables des fièvres récurrentes, 15 l'étape suivante (c) permettra d'identifier les borrélies des espèces B. hermsii et B. recurrentis en ciblant, respectivement, les gènes codant la flagelline et l'ARN ribosomique 16S de ces espèces ou d'identifier les espèces B. duttonii ou B. crocidurae en ciblant le gène codant la protéine RecA de ces espèces. Des couples d'amorces communs entre les borrélies B. hermsii et B. recurrentis, et des 20 couples d'amorces communs entre les espèces B. duttonii ou B. crocidurae, sont utilisés. Des sondes spécifiques de chaque espèce sont utilisées afin d'identifier la ou les espèces détectées. La méthode peut bien entendu être mise en oeuvre à l'aide de toute séquences présentant au moins 90%, préférentiellement au moins 95%, plus 25 préférentiellement au moins 98%, d'homologie avec les séquences SEQ ID NO : 1 à 4 et 8 à 27. Avantageusement, l'étape (a) inclut l'amplification de séquences nucléotidiques codant l'actine de l'hôte à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :5 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID 30 NO :6 et d'une sonde consistant en la séquences SEQ ID NO :7, ou de séquences présentant au moins 90% d'homologie avec les séquences SEQ ID NO : 5 à 7, dans des conditions permettant la production d'amplicons, puis la détection de la présence ou de l'absence de ladite séquence nucléotidique codant l'actine par 3056991 6 détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons. La détection du gène de l'actine de l'hôte permet un contrôle de la qualité de l'extraction des acides nucléiques. 5 Selon un mode de réalisation de l'invention, les étapes (b1) et (b2) comprennent : - une étape (b1a) consistant en l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 et les amorces 10 antisens de séquences SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10 et deux sondes SEQ ID NO :12 et SEQ ID NO :13, -(b2a) la détection de la présence ou l'absence de Borrélies appartenant aux espèces B. garinii ou B. afzelii par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation 15 d'amplicons, et - une étape (b1b) consistant en l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 et les amorces antisens de séquences SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10 et une sonde 20 SEQ ID NO :11. -(b2b) la détection de la présence ou l'absence de borrélies appartenant aux espèces B. burgdorferi sensu stricto par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons. Dans ce mode de réalisation, les détections des espèces B. garinii ou 25 B. afzelii, d'une part, et de l'espèce B. burgdorferi sensu stricto, d'autre part, sont réalisées séparément. Avantageusement selon l'invention, l'étape (d) inclut le séquençage des amplicons générés à l'issue de chacune des étapes, c'est à dire aux étapes (a), (b) et/ou (c). 30 Le potentiel informatif du séquençage des amplicons obtenus peut permettre d'identifier des espèces supplémentaires par rapport à celles ciblées par les PCR multiplexes quantitatives. Notamment, peuvent être identifiées par séquençage les espèces suivantes : B. anserina, B. coriceae, B. lonestari, B. spielmanii, B. andersonii, B. japonica, B. lusitaniae, B. sinica et B. turdi. 3056991 7 Selon un mode de réalisation de l'invention, les conditions de l'amplification réalisée à l'étape (bl) ou (blb) et à l'étape (cl) sont une dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et 5 élongation à 58°C durant 45 sec. Préférentiellement, les conditions d'amplification réalisées à l'étape (b la) sont une dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 62°C durant 45 sec. 10 Préférentiellement, les conditions d'amplification réalisées à l'étape (c3) sont une dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 60°C durant 45 sec. Préférentiellement encore, les conditions d'amplification réalisées à l'étape 15 (b3) sont une dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 64°C durant 45 sec. Selon un mode de réalisation, les sondes de séquence SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO 20 :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24 et SEQ ID NO :27 sont marquées avec une molécule quencher sur l'extrémité 3' et un fluorophore sur l'extrémité 5', la détection d'un signal de fluorescence témoin d'une amplification étant réalisée lors de la dissociation du fluorophore et de la molécule quencher, les sondes utilisées au cours d'une même étape (a), (bl), (b3), (cl), (c3) sont 25 marquées par des fluorochromes différents. Avantageusement, les fluorophores sont choisis parmi 6-FAM, VIC, CyS, HEX et l'inhibiteur de fluorescence est le BlackBerry Quencher (BBQ) ou une molécule MGB (Minor Groove Binder) associée à un quencher non fluorescent (NFQ, Eclipse). 30 Selon une caractéristique de l'invention, l'échantillon est du sang, de l'urine, de la salive, un tissu cellulaire. L'invention concerne encore une séquence nucléotidique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :5 SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :14, SEQ ID 3056991 8 NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO : 37, ou toute séquence présentant une homologie d'au 5 moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites séquences, ainsi que leur séquence complémentaire respective. L'invention concerne encore une sonde comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO :7, SEQ ID 10 NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24 et SEQ ID NO:27, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites séquences, ainsi que leur séquence complémentaire respective. 15 Selon un mode de réalisation, les extrémités 5' des sondes sont marquées par le 6-FAM, le VIC, le CY5 ou le HEX. L'invention concerne encore un kit pour la détection de la présence de borrélies dans un échantillon humain ou animal et la discrimination et l'identification des espèces de borrélies, par PCR multiplexes quantitatives, 20 comprenant : (i) une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :1 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :2 et deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus 25 préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites séquences, ou toute séquence complémentaire, (ii) des paires d'amorces formées par l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 et les amorces antisens de séquence SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10, et trois sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12 et SEQ ID NO 30 :13, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites séquences, ou toute séquence complémentaire, (iii) des paires d'amorces formées par l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :14, l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :15 et l'amorce antisens de 3056991 9 séquence SEQ ID NO :16, et deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :18, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites séquences, ou toute séquence complémentaire, 5 (iv) une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :19 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :20 et une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :21 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :22, et deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :23 et SEQ ID NO :24, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, 10 préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites séquences, ou toute séquence complémentaire, (v) une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :25 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :26 et une sonde consistant en la séquence SEQ ID NO :27, ou toute séquence présentant une homologie d'au 15 moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites séquences, ou toute séquence complémentaire, (vi) ainsi que tous réactifs nécessaires à la réalisation de PCR quantitative multiplexe, les sondes étant marquées avec une molécule quencher sur l'extrémité 3' et 20 un fluorophore sur l'extrémité 5'. L'invention concerne enfin, l'utilisation d'un kit tel que défini précédemment pour la détection de la présence de borrélies dans un échantillon humain ou animal et de discrimination des espèces de borrélies par PCR multiplexes quantitatives. 25 Le kit selon l'invention est utilisé pour la détection des espèces de borrélies B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. valaisiana et B. bissettii du groupe provoquant la maladie de Lyme, et des espèces B. hermsii, B. recurrentis, B. duttonii ou B. crocidurae du groupe provoquant les fièvres récurrentes. En outre, il permet également l'identification des espèces B. anserina, B. coriceae, B. 30 lonestari, B. spielmanii, B. andersonii, B. japonica, B. lusitaniae, B. sinica et B. turdi, par la technique de séquençage. A titre d'exemples non limitatifs, l'échantillon peut provenir de l'homme ou d'animaux tels que des animaux domestiques, d'élevage ou encore sauvages. 3056991 10 L'invention est illustrée dans ce qui suit, à l'aide d'un exemple de réalisation de l'invention qui se veut illustratif mais non limitatif. 5 EXEMPLE Etape (a) L'étape (a) permet de détecter la présence de borrélies dans un échantillon 10 et de déterminer si elles appartiennent au groupe des fièvres récurrentes (B. anserina, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. miyamotoi, B. parkeri, B. persica, B. recurrentis, B. turicatae, B. lonestari, B. microti et B. theileri) ou au groupe de la maladie de Lyme (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. spielmanii, B. valaisiana, B. bissettii, B. americana, B. 15 andersonii, B. carolinensis, B. japonica, B. lusitaniae, B. sinica, B. tanukii et B. turdi). L'étape (a) est réalisée par PCR quantitative multiplexe en temps réel. Pour cela le gène codant l'ARN ribosomique 16S de ces bactéries est ciblé. Le gène de l'actine de l'hôte est utilisé comme standard interne. Un travail de recherche a été effectué afin de déterminer des amorces 20 permettant une détection spécifique des bactéries borrélies et qui soit commune à toutes les espèces citées ci-dessus. Des sondes permettant la distinction entre le groupe des fièvres récurrentes (« sonde Fièvres ») et le groupe de la maladie de Lyme (« sonde Lyme ») ont été déterminées. Pour cela, 84 séquences du gène codant l'ARN 16S de 25 espèces de borrélies ont été alignées. Dix amorces sens et 25 7 amorces anti-sens ont été déterminées, et le meilleur couple en termes de spécificité, d'absence de formation de dimères d'amorces, de taille d'amplicon généré a été choisi puis validé en Q-PCR. Deux sondes spécifiques des deux sous-groupes de borrélies ont été définies et testées. Par ailleurs, le séquençage de l'amplicon du gène codant l'ARN 16S produit 30 à cette étape (a) peut permettre d'identifier trois espèces de borrélies non recherchées dans les étapes ultérieures. Ces espèces sont B. anserina, B. coriceae et B. lonestari. 3056991 11 Séquences des amorces et sondes spécifiques des borrélies à l'étape (a): Les séquences du couple d'amorces et des sondes spécifiques des deux groupes de borrélies sont indiquées dans le Tableau 1. 5 Tableau 1 Gène cible N° Nom de la séquence séquence ARN 16S SEQ ID NO :1 Borrelia A sens 5'- CGT TGT TCG GGA TTA TTG G -3' SEQ ID NO :2 Borrelia A anti-sens 5'- CAG ATT CCA CCC TTA CAC CAG -3' SEQ ID NO :3 Sonde Lyme 5'- 6-FAM - ATA GAG GAA GTT A - NFQ/MGB 3' SEQ ID NO :4 Sonde Fièvres 5'- VIC - CAT GAC TAG AGT CT - NFQ/MGB -3' actine SEQ ID NO :5 Actine sens: 5'- ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA -3' SEQ ID NO :6 Actine anti-sens 5'- CTT GAT GTC ACG CAC GAT TT -3' SEQ ID NO :7 Sonde actine 5'- Cy5- GGC TAC AGC TTC ACC ACC AC -BBQ 3' Matériel et méthode : 10 1-Préparation des échantillons : L'ADN servant aux Q-PCR est extrait à partir du prélèvement (sang, liquide céphalorachidien, urines, liquide articulaire, biopsies de tissu...) avec le kit QIAamp DNA Mini Kit (Réf. 51304, Qiagen, France) selon le protocole indiqué 15 dans le manuel d'utilisation. Les ADN sont élues dans l'eau et dosés par spectrométrie avant utilisation. La qualité de l'extraction est vérifiée par le rapport D.0.260/D.0.280. 2-Conditions de Q-PCR : 20 Deux contrôles positifs ont été réalisés, ils correspondent aux séquences nucléiques des borrélies amplifiées par les amorces définies ici et contenues dans un vecteur plasmidique PexA. Ils ont été produits par une synthèse de gène par envoi des séquences à la société Eurofins. Une gamme de calibration à 7 points 3056991 12 allant de 0,25 ng (108 copies) à 0,25 ag (0.1 copie) de ces contrôles positifs permet d'obtenir une quantification en nombre de copies des borrélies présentes dans un échantillon. 5 3- Le mix nécessaire à la réaction de Q-PCR de l'étape (a) est préparé comme indiqué dans le Tableau 2: Tableau 2 Quantité Concentration finale Borrelia A sens, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Borrelia A anti-sens, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Sonde Lyme, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Sonde Fièvres, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Mix iTAQ supermix (Réf. 1725131, Biorad) 12,5 lui 1X Eau (Réf. BE51200, Lonza) qsp 20 lui - 10 Par réaction (point de gamme, échantillons ou contrôle négatif), 20 tl de mix ainsi que 5 tl d'échantillon (50 ng à 200 ng), d'eau (pour le contrôle négatif) ou de point de gamme sont déposés (volume réactionnel final de 25 u1). Les conditions d'amplification sont les suivantes : dénaturation initiale à 15 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 58°C durant 45 sec. La détection des fluorochromes FAM et VIC est sélectionnée. Le mix nécessaire à la réaction de Q-PCR pour la détection de l'actine est 20 préparé comme suit: Tableau 3 Quantité Concentration finale Actine sens, 20 IuM 0,125 lui 100 nM Actine anti-sens, 20 IuM 0,125 lui 100 nM Sonde Actine, 20 IuM 0,125 lui 100 nM 3056991 13 Mix iTAQ supermix (Réf. 1725131, Biorad) 12,5 ill 1X Eau (Réf. BE51200, Lonza) qsp 20 ill - Par réaction (point de gamme, échantillons ou contrôle négatif), 20 ul de mix ainsi que 5 ul d'échantillon (50 ng à 200 ng), d'eau (pour le contrôle négatif) ou de point de gamme sont déposés (volume réactionnel final de 25 u1). 5 Les conditions d'amplification sont 95°C, 5 minutes puis 40 cycles, 94°C, 15 sec - 58°C, 30 sec. La détection du fluorochrome Cy5 est sélectionnée. 4-Résultats 10 Dans ces conditions, la limite de détection des borrélies du groupe de la maladie de Lyme et des borrélies du groupe des Fièvres récurrentes est de 1 copie (soit 2.5 ag). Les amplicons des borrélies du groupe de la maladie de Lyme et des borrélies du groupe des fièvres récurrentes obtenus sont de 153 paires de bases. 15 Les séquences de ces produits de Q-PCR sont les suivantes (Tableau 4): Tableau 4 N° Nom de la séquence séquence SEQ ID NO :28 amplicon des 5'-CGTTGTTCGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTAGGCGGATA TATAAGTCTATGCATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGAACTA TGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATAGAGGAAGTTAGAATTTC TGGTGTAAGGGTGGAATCTG- 3' borrélies du group e maladie de Lyme SEQ ID NO :29 amplicon des 5'- CGTTGTTCGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTAGGCGGATAT GCAAGTCTATGCGTAAAATACCACAGCTCAACTGTGGAACTAG CTGGAAACTGCATGACTAGAGTCTGATAGGGGAAGTTAGAATTCCTG GTGTAAGGGTGGAATCTG- 3' borrélies du group e des Fièvres récurrentes 20 3056991 14 Etape (b) Si l'étape (a) a permis de déterminer la présence de borrélies du groupe de 5 la maladie de Lyme alors l'étape (b) est réalisée pour déterminer, respectivement, la présence des espèces B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii ou B. afzelii (étapes (b1), (b1a), (b1b) ou (b2)), et des espèces B. valaisiana ou B. bissettii (étapes (b3) et (b4)), appartenant à ce groupe, par PCR quantitative multiplexe en temps réel. Pour cela le gène codant la flagelline de ces bactéries 10 est ciblé. Afin de mettre en place les étapes (b1) ou (b la) et (b1b), un travail de recherche a été effectué pour déterminer un couple d'amorces permettant la détection des espèces B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii et B. afzelii ainsi que 3 sondes permettant la reconnaissance spécifique de chacune de ces espèces. Ces 15 3 sondes sont nommées « sonde Burdg ss », « sonde Garinii » et « sonde Afzelii ». Ce travail s'est initialement basé sur les différences de séquences de ces 3 espèces dans le gène codant la flagelline, qui sont décrites l'article de Picken R. (1992, Journal of Clinical Microbiology, 30:99-114). Pour cela, 57 séquences du gène codant la flagelline de 11 espèces de 20 borrélies ont été alignées. Les meilleures séquences d'amorces et de sondes en termes de spécificité, d'absence de formation de dimères d'amorces, de taille d'amplicon généré ont été choisies puis validées en Q-PCR. Les sondes ainsi déterminées ici ne ciblent pas les mêmes différences de séquences que celles de Picken R.. Les sondes décrites par Picken R. étant en revanche très longues (de 25 49 à 52 paires de bases), les sondes Burdg ss et Afzelii décrites ici ont, respectivement, 5 et 8 nucléotides en commun avec celles de Picken R. (c'est-à-dire que les extrémités 3' des sondes de Picken R. ont 5 à 8 bases communes avec les extrémités 5' de deux de nos sondes). Les deux sondes permettant la reconnaissance de l'espèce garinii n'ont aucune base commune. 30 Le séquençage des amplicons du gène de la flagelline produit à l'étape (b1) ou (b1a) et (b1b) peut permettre de reconnaître 6 espèces de borrélies non recherchées dans les étapes suivantes. Ces espèces sont B. spielmanii, B. andersonii, B. japonica, B. lusitaniae, B. sinica et B. turdi. 3056991 15 En parallèle, un travail de recherche a été effectué pour déterminer un couple d'amorces permettant la détection des espèces B. valaisiana ou B. bissettii ainsi que 2 sondes (« sonde Valaisiana » et « sonde Bissettii ») permettant la reconnaissance spécifique de chacune de ces espèces pour la mise en oeuvre de 5 l'étape (b3) et (b4). Ce travail s'est inspiré des différences de séquences de ces 2 espèces dans le gène codant la flagelline qui sont décrites dans l'article de Jauhlac B. (2000, Journal of Clinical Microbiology, 38:1895-1900). Pour cela, 57 séquences du gène codant la flagelline de 11 espèces de borrélies ont été alignées. Les meilleures séquences d'amorces et de sondes en termes de 10 spécificité, d'absence de formation de dimères d'amorces, de taille d'amplicon généré ont été choisies puis validées en Q-PCR. La sonde déterminée ici et permettant la reconnaissance de l'espèce valaisiana a 15 bases en commun avec celles de Jauhlac B. qui en fait 27. Les deux sondes permettant la reconnaissance de l'espèce bissetti n'ont aucune base commune. 15 Séquences des amorces et sondes spécifiques des espèces de borrélies du groupe de la maladie de Lyme pour les étapes (b1) ou (b1a) et (b1b) : Les séquences du couple d'amorces et des sondes spécifiques des espèces B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii ou B. afzelii sont indiquées dans la Tableau 20 5. Tableau 5 Gèn N° Nom de la séquence séquence e cible flagelline SEQ ID NO :8 Borrelia B sens 5'- GGA GCA AAT CAA GAT GAR GC -3' SEQ ID NO :9 Borrelia B anti-sens 5'-ACA GGA GAA TTA ACT CCA CCY TG -3' n1 SEQ ID NO :10 Borrelia B anti-sens 5'- AGG AGA ATT AAC TCC GCC TTG -3' n2 SEQ ID NO :11 Sonde Burgd ss 5'- Cy5 - TCA AGA GGG TGT TCA ACA GGA AGG AGC - BBQ -3' flagelline SEQ ID Sonde Afzelii 5'- VIC -AGG GTG CTC AAG AAG A - 3056991 16 NO :12 NFQ/MGB -3' SEQ ID NO :13 Sonde Garinii 5'- 6-FAM - CAG GCT GCT CAG ACT GCA CCT GTT CAA GAA G - ECLIP -3' Les séquences du couple d'amorces et des sondes spécifiques des espèces B. valaisiana ou B. bissettii pour l'étape (b3) sont indiquées dans le Tableau 6: 5 Tableau 6 Gène cible N° Nom de la séquence séquence flagelline SEQ ID Borrelia C sens n1 5'- ACC AAG ATG AAG CTA TTG CTG TAA -3' NO :14 SEQ ID Borrelia C sens n2 5'- AAG ATG AGG CGA TTG CTG TAA -3' NO :15 SEQ ID Borrelia C anti-sens 5'- CAG GTG CTG GYT GTT GAG C -3' NO :16 SEQ ID Sonde Valaisiana 5'- VIC - CTA CAC CTG TTC AAG AA - NFQ/MGB 3' NO :17 flagelline SEQ ID Sonde Bissettii 5'- 6-FAM - TCG CAA ATC TTT TCT CT NFQ/MGB -3' NO :18 Protocole: 1-Préparation des échantillons 10 La préparation des échantillons est identique à celle réalisée à l'étape (a). 2-Conditions de Q-PCR Cinq contrôles positifs ont été réalisés. Ils correspondent aux séquences nucléiques des borrélies amplifiées par les deux couples d'amorces définies ici et 15 contenues dans un vecteur plasmidique PexA. Une gamme de calibration à 7 points allant de 0,25 ng (108 copies) à 0,25 ag (0.1 copie) de ces contrôles positifs permet d'obtenir une quantification en nombre de copies des borrélies présentes dans un échantillon. 3056991 17 3-Etapes (b1a) et (b1b) Les étapes (b1a) et (b1b) ont pour but la détection de la présence ou l'absence de borrélies appartenant aux espèces B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii ou B. afzelii par détection de la présence ou absence d'un signal de 5 fluorescence résultant de la formation d'amplicons. L'étape (b la) a pour but l'amplification de séquences nucléotidiques cibles à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 et les amorces antisens de séquence SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10 et de deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :12 et SEQ ID NO :13. 10 Le mix nécessaire à la réaction de Q-PCR de l'étape (b la) est préparé comme suit: Tableau 7 15 Quantité Concentration finale Borrelia B sens, 20 iiM 0,25 ill 200 nM Borrelia B anti-sens nl, 20 iiM 0,25 p.1 200 nM Borrelia B anti-sens n2, 20 iiM 0,25 p.1 200 nM Sonde Afzelii, 20 iiM 0,25 p.1 50 nM Sonde Garinii, 20 iiM 0,25 p.1 200 nM Mix iTAQ supermix (Réf. 1725131, Biorad) 12,5 p.1 1X Eau (Réf. BE51200, Lonza) qsp 20 p.1 - Par réaction (point de gamme, échantillons ou contrôle négatif), 20 tl de mix ainsi que 5 tl d'échantillon, d'eau (pour le contrôle négatif) ou de point de gamme sont déposés (volume réactionnel final de 25 u1). 20 Les conditions d'amplification sont les suivantes : dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 62°C durant 45 sec. La détection des fluorochromes FAM, Cy5 et VIC est sélectionnée pour 25 mettre en oeuvre l'étape (b la). 3056991 18 L'étape (b1b) a pour but l'amplification de séquences nucléotidiques cibles à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 et les amorces antisens de séquence SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10 et d'une sonde consistant en la séquence SEQ ID NO :11. Le mix nécessaire à la réaction de Q-PCR de l'étape (b1b) est préparé comme suit: Tableau 8 Quantité Concentration finale Borrelia B sens, 20 iiM 0,25 ill 200 nM Borrelia B anti-sens nl, 20 iiM 0,25 ill 200 nM Borrelia B anti-sens n2, 20 iiM 0,25 ill 200 nM Sonde Burdorferi ss, 20 iiM 0,25 ill 50 nM Mix iTAQ supermix (Réf. 1725131, Biorad) 12,5 ill ix Eau (Réf. BE51200, Lonza) qsp 20 p.1 - Par réaction (point de gamme, échantillons ou contrôle négatif), 20 tl de mix ainsi que 5 tl d'échantillon, d'eau (pour le contrôle négatif) ou de point de gamme sont déposés (volume réactionnel final de 25 u1). 15 Les conditions d'amplification sont les suivantes : dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 58°C durant 45 sec. La détection des fluorochromes FAM, Cy5 et VIC est sélectionnée pour 20 mettre en oeuvre l'étape (b1b). Dans une variante de l'invention, les étapes b1a et b1b sont réalisées concomitamment en une seule étape b1. 25 4- étapes (b3) et (b4) L'étape (b3) a pour but l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ 5 10 3056991 19 ID NO :14, l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :15 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :16 et de deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :18, dans des conditions permettant la production d'amplicons. 5 L'étape (b3) a pour but la détection de la présence ou l'absence de Borrélies appartenant aux espèces B. valaisiana ou B. bissettii par détection de la présence ou absence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons. 10 Le mix nécessaire à la réaction de Q-PCR de l'étape (b3) est préparé comme suit: Tableau 9 Quantité Concentration finale Borrelia C sens nl, 20 uM 0,25 ul 200 nM Borrelia C sens n2, 20 uM 0,25 ul 200 nM Borrelia C anti-sens, 20 uM 0,25 ul 200 nM Sonde Valaisiana, 20 uM 0,25 ul 200 nM Sonde Bissettii, 20 uM 0,25 ul 200 nM Mix iTAQ supermix (Réf. 1725131, Biorad) 12,5 ul 1X Eau (Réf. BE51200, Lonza) qsp 20 ul 15 Par réaction (point de gamme, échantillons ou contrôle négatif), 20 ttl de mix ainsi que 5 ttl d'échantillon, d'eau (pour le contrôle négatif) ou de point de gamme sont déposés (volume réactionnel final de 25 ttl). Les conditions d'amplification sont les suivantes : dénaturation initiale à 20 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 64°C durant 45 sec. La détection des fluorochromes FAM et VIC est sélectionnée à l'étape (b4). 3056991 20 5-Résultats Dans ces conditions, la limite de détection des espèces B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii et B. afzelii est de 1 copie (soit 2.5 ag) et celle des espèces B. valaisiana et B. bissettii est de 1 copie (soit 2.5 ag). 5 Les amplicons des espèces de borrélies burgdorferi sensu stricto, afzelii et garinii obtenus sont de 180 ou 182 paires de bases. Les amplicons des espèces de borrélies valaisiana et bissettii obtenus sont de 135 et 138 paires de bases, respectivement. Les séquences de ces produits de Q-PCR sont les suivantes (Tableau 10): 10 Tableau 10 N° Nom de la séquence séquence SEQ ID NO :30 amplicon des borrélies burgdorferi sensu stricto 5'- GGAGCAAACCAAGATGAAGCTATTGCTGTAAATATTTATGCAGCT AATGTTGCAAATCTTTTCTCTGGTGAGGGAGCTCAAACTGCTCAGGC TGCACCGGTTCAAGAGGGTGTTCAACAGGAAGGAGCTCAACAGCCAG CACCTGCTACAGCACCTTCTCAAGGCGGAGTTAATTCTCCT(GT) - 3' SEQ ID NO :31 amplicon des borrélies afzelii 5'-GGAGCAAATCAAGATGAAGCAATTGCTGTAAATATTTATTCAGC TAATGTTGCAAATCTTTTTGCTGGTGAGGGAGCTCAAGCTGCTCAGG CTGCACCTGTTCAAGAGGGTGCTCAAGAAGAAGGAGCTCAGCAACCA ACACCTGCTACAGCACCTACTCAAGGTGGAGTTAATTCTCCT(GT) - 3' SEQ ID NO :32 amplicon des borrélies garinii 5'-GGAGCAAATCAAGATGAAGCGATTGCTGTAAATATTTATGC TCTAATGTTGCAAATCTATTCTCTGGTGAAGGAGCTCAGGCTGCT CAGACTGCACCTGTTCAAGAAGGTGCTCAACAAGAAGGAGCTCAA CAACCAGCACCTGCTACAGCGCCTTCTCAGGGTGGAGTTAATTCTC CT(GT) - 3' SEQ ID NO :33 amplicon des borrélies valaisiana 5'-AAGATGAGGCGATTGCTGTAAATATTTATGCAGCTAA TGTTGCAAATCTGTTTTCTGGTGAGGGAGCTCAAACTGCTCAGGCTA ACCTGTTCAAGAAGGTGCTCAACAGGAAGGAGCTCAACAACCAGCAC CTG - 3' SEQ ID NO :34 amplicon des borrélies 5'- ACCAAGATGAAGCTATTGCTGTAAATATTTATGCAGCTAA TGTCGCAAATCTTTTCTCTGGTGAGGGAGCTCAAACTGCTCAGGCT 3056991 21 bis s ettii G CAC CTGTTCAAGAAGGTGTTCAGCAAGAAGGAGCTCAACAG CCAG CACCTG - 3' Etape (c) 5 Si l'étape (a) a permis de déterminer la présence de borrélies du groupe des fièvres récurrentes, alors l'étape (c) est réalisée pour déterminer, respectivement, la présence des espèces B. hermsii et B. recurrentis (étapes (cl) et (c2)), et des espèces B. duttonii ou B. crocidurae (étape (c3) et (c4)), par PCR quantitative multiplexe en temps réel. 10 B. hermsii est distingué en ciblant le gène codant la flagelline et B. recurrentis en ciblant celui codant l'ARNr 16S. B. duttonii ou B. crocidurae sont identifiés en ciblant le gène RecA (protéine de réparation de l'ADN). Afin de mettre en place l'étape (cl), un travail de recherche a été effectué pour déterminer un couple d'amorces (Borrelia D fia sens et anti-sens) et une 15 sonde spécifique (« sonde Hermsii ») permettant la détection de l'espèce B. hermsii. Pour cela 59 séquences du gène codant la flagelline de 12 espèces de borrélies ont été alignées et comparées. Egalement, un couple d'amorces (Borrelia D 16S sens et anti sens) et une sonde spécifique permettant la détection de l'espèce B. recurrentis (« sonde Recurrentis ») ont été déterminés. Pour cela 20 61 séquences du gène codant l'ARNr 16S de 23 espèces de borrélies ont été alignées. Les meilleures séquences d'amorces et de sondes en termes de spécificité, d'absence de formation de dimères d'amorces, de taille d'amplicons générés ont été choisies puis validées en Q-PCR. Sur la base de polymorphismes décrits dans le gène RecA de B. duttonii par 25 Cutler S., un travail de recherche a également été effectué sur le gène RecA afin de déterminer un couple d'amorces et une sonde spécifique (« sonde Dut/Croc ») pour la détection des espèces B. duttonii ou B. crocidurae et la mise en oeuvre de l'étape (c3). Ce travail est basé sur l'alignement de 62 séquences du gène RecA provenant de 10 espèces de borrélies. Les meilleures séquences d'amorces et de 30 sondes en termes de spécificité, d'absence de formation de dimères d'amorces, de taille d'amplicon généré ont été choisies puis validées en Q-PCR. 3056991 22 Séquences des amorces et sondes spécifiques des espèces de borrélies du groupe des fièvres récurrentes: Les séquences des couples d'amorces et des sondes spécifiques des espèces 5 B. hermsii ou B. recurrentis pour l'étape (cl) sont indiquées dans la Tableau 11 : Tableau 11 Gène cible N° Nom de la séquence séquence flagelline SEQ ID NO :19 Borrelia D fia sens: 5'- AAA TCT TTT TGC AGG TGA AGG -3' SEQ ID NO :20 Borrelia D fia anti-sens 5'- CAT CAA CAG CGG TTG TAA CAT -3' ARNr16S SEQ ID NO :21 Borrelia D 16S sens 5'- GGA AAT GAC AAG GTG ATG ACG -3' SEQ ID NO :22 Borrelia D 16S anti-sens 5'- GCA GTT TCT AGC ATA GCT CCA CA -3' flagelline SEQ ID NO :23 Sonde Hermsii 5'- 6-FAM - AAG AGA TAG GAC AGC A NFQ/EQ -3' ARNr16S SEQ ID NO :24 Sonde Recurrentis 5'- HEX - AGT CCC GGC TAA TT - NFQ/EQ -3' Les séquences du couple d'amorces et de la sonde spécifique des espèces B. duttonii et B. crocidurae pour l'étape (c3) sont indiquées dans la Tableau 12 : 10 15 Tableau 12 Gène cible N° Nom de la séquence séquence RecA SEQ ID Borrelia E sens: 5'- GAT GGC GAG ATG GGT GAT ACT -3' NO :25 3056991 23 SEQ ID Borrelia E anti-sens 5'- GCA TTT CCT CCA GTA GTA GTC TCT G -3' NO :26 SEQ ID Sonde Dut/Croc 5'- HEX - AGC CAT ACT TTC A - NFQ/EQ -3' NO :27 Protocole: 1-Préparation des échantillons La préparation des échantillons est identique à celle réalisée à l'étape (a). 5 2-Conditions de Q-PCR Trois contrôles positifs ont été réalisés. Ils correspondent aux séquences nucléiques des borrélies amplifiées par les trois couples d'amorces définies ici et contenues dans un vecteur plasmidique PexA. Ils ont été produits par une 10 synthèse de gène par envoi des séquences à la société Eurofins. Une gamme de calibration à 7 points allant de 0,25 ng (108 copies) à 0,25 ag (0.1 copie) de ces contrôles positifs permet d'obtenir une quantification en nombre de copies des borrélies présentes dans un échantillon. 15 3-Etapes (cl) et (c2) : L'étape (cl) a pour but l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :19 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :20 et d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :21 et l'amorce antisens 20 de séquence SEQ ID NO :22 et de deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :23 et SEQ ID NO :24. L'étape (c2) a pour but la détection de la présence ou l'absence de borrélies appartenant aux espèces espèces B. hermsii et B. recurrentis, par détection de la présence ou absence d'un signal de fluorescence résultant de la formation 25 d'amplicons. Le mix nécessaire à la réaction de Q-PCR de l'étape (cl) est préparé comme suit: 30 Tableau 13 3056991 24 Quantité Concentration finale Borrelia D fia sens, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Borrelia D fia anti-sens, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Borrelia D 16S sens, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Borrelia D 16S anti-sens, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Sonde Hermsii, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Sonde Recurrentis, 20 IuM 0,25 lui 200 nM Mix iTAQ supermix (Réf. 1725131, Biorad) 12,5 lui 1X Eau (Réf. BE51200, Lonza) qsp 20 i1 - Par réaction (point de gamme, échantillons ou contrôle négatif), 20 ul de 5 mix ainsi que 5 ul d'échantillon, d'eau (pour le contrôle négatif) ou de point de gamme sont déposés (volume réactionnel final de 25 u1). Les conditions d'amplification sont une dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 58°C durant 45 sec. 10 La détection des fluorochromes FAM et HEX est sélectionnée à l'étape (c2). 4-Etapes (c 3) et (c4) L'étape (c3) a pour but l'amplification de séquences nucléotidiques cibles à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :25 et 15 l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :26 et d'une sonde consistant en la séquence SEQ ID NO :27, dans des conditions permettant la production d'amplicons. L'étape (c4) a pour but la détection de la présence ou l'absence de borrélies appartenant aux espèces B. crocidurae par détection de la présence ou 20 absence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons. Le mix nécessaire à la réaction de Q-PCR de l'étape (c3) est préparé comme suit: 25 Tableau 14 3056991 25 Quantité Concentration finale Borrelia E sens, 20 IuM 0,25 pl 200 nM Borrelia E anti-sens, 20 IuM 0,25 pl 200 nM Sonde Dut/Croc, 20 IuM 0,25 pl 200 nM Mix iTAQ supermix (Réf. 1725131, Biorad) 12,5 pl 1X Eau (Réf. BE51200, Lonza) qsp 20 pl - Par réaction (point de gamme, échantillons ou contrôle négatif), 20 ul de mix ainsi que 5 ul d'échantillon, d'eau (pour le contrôle négatif) ou de point de 5 gamme sont déposés (volume réactionnel final de 25 u1). Les conditions d'amplification sont 95°C, 5 minutes puis 45 cycles, 94°C, 15 sec - 60°C, 45 sec. A l'étape (c4), la détection du fluorochrome HEX est sélectionnée. 10 5-Résultats Dans ces conditions, la limite de détection des espèces B. hermsii et B. recurrentis est de 10 copies (soit 25 ag) et celle des espèces B. duttonii et B. crocidurae est de 10 copies (soit 25 ag). Les amplicons des espèces de borrélies hermsii et recurrentis obtenus sont 15 de 146 et 184 paires de bases, respectivement. Les amplicons des espèces de borrélies duttonii et crocidurae obtenus sont de 176 paires de bases. Les séquences de ces produits de Q-PCR sont les suivantes: Tableau 15 N° Nom de la séquence séquence SEQ ID NO : 35 amplicon des 5'- AAATCTTTTTGCAGGTGAAGGCGCTCAGGCTGCTCCAG TGCAAGAGATAGGACAGCAAGAGGAAGGTCAAGCAGCTCCAGCTCCA GCAGCAGCTCCAGCTCAAGGTGGAGTTAATTCCCCAATTAATGTTAC AACCGCTGTTGATG - 3' borrélies hermsii SEQ ID NO : 36 amplicon des 5'- GGAAATGACAAGGTGATGACGTTAATTTATGAATAAGT 3056991 26 borrélies CCCGGCTAATTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGC recurrentis GTTGTTC GGGATTATTG GG C GTAAAG GGTGAGTAGGC GGATATGCAA GTCTGTGCGTAAAATACCACAGCTCAACTGTGGAGCTATGCTAGAAA CTGC - 3' SEQ ID NO : 37 amplicon des 5'- GATGGCGAGATGGGTGATACTCAAATTGGACT borrélies TCAAGCAAGACTTATGAGTAAGGCTTTAAGGAAAATTACAGCCATAC duttonii et TTTCAAAATCTAATACTTGTATTATGTTTATTAATCAAATAAGAATG crocidurae AAAATTGGTTTAGTCTTTGGTAGTCCAGAGACTACTACTGGAGGAAA TGC - 3' REVENDICATIONS1) Méthode de détection de la présence de Borrélies dans un échantillon humain ou animal et d'identification d'espèces de borrélies, par PCR multiplexes 5 quantitatives, comprenant : (a) une étape de détection de la présence de borrélies dans l'échantillon et de distinction desdites borrélies entre le groupe provoquant la maladie de Lyme et le groupe provoquant des fièvres récurrentes, ladite étape consistant en - l'extraction d'ADN dudit échantillon, 10 - l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :1 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :2 et de deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4, dans des conditions permettant la production d'amplicons, et, - la détection de la présence ou l'absence de Borrélies du groupe provoquant 15 la maladie de Lyme ou du groupe provoquant des fièvres récurrentes par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, puis, si un signal est détecté à l'étape (a) indiquant la présence de Borrélies du groupe de la maladie de Lyme, (b) une étape de détection et de distinction, dans l'échantillon, de la présence 20 des espèces B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii ou B. afzelii et des espèces B. valaisiana ou B. bissettii, ladite étape consistant en : - à partir de l'ADN extrait dudit échantillon, (1)1) l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide de paires d'amorces formées par l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 et les amorces 25 antisens de séquences SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10 et de trois sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12 et SEQ ID NO :13, dans des conditions permettant la production d'amplicons, et, 3056991 40 -(b2) la détection de la présence ou l'absence de Borrélies appartenant aux espèces B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii ou B. afzelii par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, et - (b3) l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide de paires d'amorces formées par l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :14, l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :15 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :16, et de deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :18, dans des conditions permettant la production d'amplicons, et, - (b4) la détection de la présence ou l'absence de Borrélies appartenant aux des espèces B. valaisiana ou B. bissettii par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, ou, si un signal est détecté à l'étape (a) indiquant la présence de Borrélies du groupe des fièvres récurrentes, (c) une étape de détection et de distinction, dans l'échantillon, de la présence des espèces B. hermsii et B. recurrentis, et des espèces B. duttonii ou B. crocidurae du groupe provoquant les fièvres récurrentes, ladite étape consistant en : - à partir de l'ADN extrait dudit échantillon -(c1) l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :19 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :20 et d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :21 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :22, et de deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :23 et SEQ ID NO :24, dans des conditions permettant la production d'amplicons, et -(c2) la détection de la présence ou l'absence de Borrélies appartenant aux espèces B. hermsii et B. recurrentis, par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, et, -(c3) l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :25 et l'amorce 3056991 41 antisens de séquence SEQ ID NO :26 et d'une sonde consistant en la séquence SEQ ID NO :27 , dans des conditions permettant la production d'amplicons, et, -(c4) la détection de la présence ou l'absence de Borrélies appartenant aux espèces B. duttonii ou B. crocidurae par détection de la présence d'un signal de 5 fluorescence résultant de la formation d'amplicons, (d) l'analyse des résultats des amplifications, étant entendu que ladite méthode inclut les séquences présentant au moins 90% d'homologie avec les séquences SEQ ID NO : 1 à 4 et 8 à 27. 10 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'étape (a) inclut l'amplification de séquences nucléotidiques codant l'actine de l'hôte à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :5 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :6 et d'une sonde consistant en la séquences SEQ ID NO :7, ou de séquences présentant au moins 90% d'homologie avec les séquences SEQ ID NO 15 5 à 7. dans des conditions permettant la production d'amplicons, puis la détection de la présence ou de l'absence de ladite séquence nucléotidique codant l'actine par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons. 20 3) Méthode selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que les étapes (b1) et (b2) comprennent : une étape (b1a) consistant en l'amplification de séquences nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 et les amorces antisens de 25 séquences SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10 et deux sondes SEQ ID NO :12 et SEQ ID NO :13, 3056991 42 -(b2a) la détection de la présence ou l'absence de Borrélies appartenant aux espèces B. garinii ou B. afzelii par détection de la présence d'un signal de fluorescence résultant de la formation d'amplicons, et une étape (b1b) consistant en l'amplification de séquences 5 nucléotidiques cibles dudit ADN à l'aide d'une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 et les amorces antisens de séquences SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10 et une sonde SEQ ID NO :11. -(b2b) la détection de la présence ou l'absence de Borrélies appartenant aux espèces B. burgdorferi sensu stricto par détection de la présence d'un signal de 10 fluorescence résultant de la formation d'amplicons. 4) Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'étape (d) inclut le séquençage des amplicons générés à l'issue des étapes (a), (b)et/ou (c). 15 5) Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les conditions d'amplification réalisées à l'étape (b1) ou (blb) et à l'étape (ci) sont une dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 58°C durant 45 sec. 20 6) Méthode selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que les conditions d'amplification réalisées à l'étape (bla) sont une dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 62°C durant 25 45 sec. 7) Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les conditions d'amplification réalisées à l'étape (c3) sont une dénaturation initiale à 3056991 43 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 60°C durant 45 sec. 5 8) Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les conditions d'amplification réalisées à l'étape (b3) sont une dénaturation initiale à 95°C durant 5 minutes puis la mise en oeuvre de 45 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C durant 15 sec puis une hybridation et élongation à 64°C durant 45 sec. 10 9) Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les sondes de séquence SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24 et SEQ ID NO :27 sont marquées avec une molécule quencher sur l'extrémité 3' et un 15 fluorophore sur l'extrémité 5', la détection d'un signal de fluorescence témoin d'une amplification étant réalisée lors de la dissociation du fluorophore et de la molécule quencher, les sondes utilisées au cours d'une même étape (a), (hl), (b3), (cl), (c3) sont marquées par des fluorochromes différents. 20 10) Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que lesfluorophores sont choisis parmi 6-FAM, VIC, CyS, HEX et l'inhibiteur de fluorescence peut être le BlackBerry Quencher ou une molécule MGB associée à un quencher non fluorescent tel que le NFQ. 25 11) Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'échantillon est du sang, de l'urine, de la salive, un tissu cellulaire. 3056991 44 12) Sonde comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24 et SEQ ID NO:27, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 5 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites sequences, ainsi que leur séquence complémentaire respective. 13) Sonde selon la revendication 12, caractérisée en ce que les extrémités 5' des séquences sont marquées par le 6-FAM, le VIC, le CY5, le HEX. 10 14) Kit pour la détection de la présence de Borrélies dans un échantillon humain ou animal et la discrimination et identification des espèces de borrélies, par PCR multiplexes quantitatives, comprenant : (i) une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :1 et 15 l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :2 et deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites sequences, ou toute sequence complémentaire, (ii) des paires d'amorces formées par l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :8 20 et les amorces antisens de séquence SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10, et trois sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12 et SEQ ID NO :13, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites sequences, ou toute sequence complémentaire, 25 (iii) des paires d'amorces formées par l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :14, l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :15 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :16, et deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :18, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement 3056991 45 d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites sequences, ou toute sequence complémentaire, (iv) une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :19 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :20 et une paire d'amorces incluant l'amorce 5 sens de séquence SEQ ID NO :21 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :22, et deux sondes consistant en les séquences SEQ ID NO :23 et SEQ ID NO :24, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites sequences, ou toute sequence complémentaire, 10 (v) une paire d'amorces incluant l'amorce sens de séquence SEQ ID NO :25 et l'amorce antisens de séquence SEQ ID NO :26 et une sonde consistant en la séquence SEQ ID NO :27, ou toute séquence présentant une homologie d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, plus préférentiellement d'au moins 98%, avec l'une desdites sequences, ou toute sequence complémentaire, 15 (vi) ainsi que tous réactifs nécessaires à la réalisation de PCR quantitative multiplexe, les sondes étant marquées avec une molécule quencher sur l'extrémité 3' et un fluorophore sur l'extrémité 5', 20 15) Utilisation d'un Kit tel que défini dans la revendication 14 pour la détection de la présence de Borrélies dans un échantillon humain ou animal et l'identification des espèces de borrélies, par PCR multiplexes quantitatives.