Brevet FR3052788A1 — publié le 20171222

TITRE DE L'INVENTION Vecteurs et banques de cellules pour une méthode de criblage d'interaction protéine-protéine DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention est relative au domaine de la caractérisation des interactions protéine-protéine, en vue d'applications multiples dans l'industrie, notamment dans le domaine de la recherche scientifique et dans le domaine médical. ART ANTERIEUR Les interactions protéine-protéine sont détectées et étudiées grâce à diverses approches technologiques. Il existe en effet de nombreuses techniques qui permettent de mettre en évidence l'interaction d'une protéine d'intérêt avec un autre partenaire protéique. In vitro, la technique d'immuno-précipitation permet de détecter la présence d'un complexe protéique composé de deux protéines distinctes, en utilisant un anticorps dirigé contre l'une des protéines. Le complexe est déposé sur un gel et migre en fonction de son poids moléculaire, et peut ensuite être isolé. Cette technique nécessite un isolement du complexe protéique de son environnement cellulaire, afin d'identifier le partenaire protéique de la protéine d'intérêt. La méthode du double hybride, mise en oeuvre dans des levures, permet de détecter des interactions in cellulo dans un environnement eucaryote. Cette méthode présente l'inconvénient de générer de nombreux « faux-positifs », c'est-à-dire des interactions qui ne sont pas physiologiques et qui n'ont lieu que dans l'environnement « levure ». Afin de visualiser les interactions protéine-protéine intervenant au sein de cellules vivantes, notamment de cellules de mammifère, deux méthodes utilisant la GFP (Green Fluorescent Protein), et des protéines fluorescentes dérivées de la GFP, ont été développées. La première technique, dénommée FRET pour « Fluorescence Resonance Energy Transfer », est basée sur la mesure de changement d'intensité de deux fluorophores qui sont rapprochés lors d'une interaction protéine-protéine, ce rapprochement générant un transfert d'énergie entre les deux fluorophores qui changent ainsi d'intensité. La deuxième technique, dénommée BiFC pour « Bimolecular Fluorescence Complementation », est basée sur la formation d'un complexe protéique fluorescent, associant deux fragments complémentaires d'une protéine fluorescente, l'association des deux fragments complémentaires étant provoquée par l'interaction de deux protéines, chacune des deux 3052788 2 protéines étant fusionnée avec l'un des fragments complémentaires. (voir pour revue Kerppola, 2006, 2009, et US 7,588,907). Cette deuxième technique est considérée comme étant plus sensible que la technique basée sur le FRET, car la détection d'un signal de fluorescence de type ON/OFF est 5 plus simple et fiable que la détection d'une modification de l'intensité d'un fluorophore. De plus, avec la technique BiFC, le rapport signal/bruit de fond est meilleur qu'avec la technique basée sur le FRET, du fait qu'aucune fluorescence n'est générée en l'absence de complexes. Cette technique BiFC a été améliorée pour permettre la visualisation d'une pluralité d'interactions protéiques dans des cellules vivantes, ceci grâce à l'utilisation de 10 plusieurs protéines fluorescentes, présentant chacune une couleur différente. Il a été montré qu'il est possible, en utilisant des fragments complémentaires de protéines fluorescentes présentant des caractéristiques spectrales distinctes, de suivre simultanément in cellulo la formation de plusieurs complexes protéiques. Ainsi, lorsqu'une protéine donnée peut s'associer à deux partenaires différents pour donner naissance à des complexes distincts, il est 15 possible de suivre la compétition de liaison des deux partenaires potentiels à cette même protéine donnée, au sein de cellules vivantes (Hu & Kerppola, 2003). La technique BiFC est couramment utilisée pour étudier les interactions entre des partenaires protéiques connus, et pour réaliser des criblages de protéines proies susceptibles d'interagir avec une protéine piège. 20 Des banques génomiques codant des protéines proies fusionnées à des fragments de protéines fluorescentes ont été préparées grâce à des rétrovirus, tels que le vecteur ERM (Enhanced Retroviral Mutagen). Ce vecteur permet d'intégrer dans le génome d'une cellule un gène codant un des fragments complémentaires d'une protéine fluorescente, ce fragment pouvant être intégré dans le même cadre de lecture qu'un gène endogène lors de l'infection. 25 Les cellules transfectées par le plasmide rétrovirus produisent des particules virales qui sont utilisées pour infecter des cellules exprimant de manière stable une protéine piège fusionnée au fragment complémentaire de la protéine fluorescente. L'insertion génomique de l'ADN viral, et en particulier du segment codant pour le fragment de la protéine fluorescente peut entrainer la formation d'une protéine de fusion endogène lorsque l'insertion est en phase avec le cadre 30 de lecture. L'ADN du vecteur ERM contient également un promoteur tetracycline-dépendant qui permet d'induire l'expression de la protéine endogène de fusion. Si cette protéine endogène interagit avec la protéine piège, il y a alors complémentation entre les deux fragments de la protéine fluorescente et apparition de fluorescence. Cette méthode de criblage repose ainsi sur une expression induite de protéines de fusion générées par insertion aléatoire 3052788 3 d'un rétrovirus et pouvant être testées en BiFC avec une protéine piège exprimée de manière constitutive dans la même cellule (Ding et al., 2006 ; Ding et Mills, 2006 ; et WO 2006/017279) Des criblages de plus grande ampleur, utilisant en tant que protéines proies des 5 protéines codées par plus de 12000 cadres de lecture ouverts (ORFs pour Open Reading Frames) issues d'un ORFéome humain, ont également pu être réalisés par la technique de complémentation de fluorescence bimoléculaire. Ce criblage a été réalisé grâce à une banque de rétrovirus dont le génome comprend des gènes codant pour des protéines de fusion, comprenant des protéines proies issues des ORFs fusionnées avec un fragment de protéine 10 fluorescente. La protéine piège fusionnée au fragment complémentaire de la protéine fluorescente est exprimée de manière stable par la cellule hôte. Cette dernière est ensuite infectée avec tous les rétrovirus de la banque. Lors de l'occurrence d'une interaction entre la protéine piège et l'une des protéines proies, les deux fragments complémentaires de la protéine fluorescente sont en contact l'un avec l'autre, le couple protéique résultant étant apte à 15 reconstituer la protéine fluorescente et donc à générer un signal fluorescent (Lee et al., 2011). L'utilisation de rétrovirus pour l'expression cellulaire de multiples protéines proies fusionnées à un fragment de protéine fluorescente pose néanmoins deux problèmes majeurs. Le premier problème, d'ordre pratique, concerne la réalisation des expériences de retro-infection, qui doivent être effectuées dans des conditions de sécurité très strictes, et 20 nécessitent donc d'avoir accès à un laboratoire confiné de sécurité microbiologique classifié `133' (Norme Française). Le second problème est lié au mode d'expression de la protéine proie fusionnée au fragment de la protéine fluorescente : dans la cellule hôte, le gène codant pour cette protéine de fusion a été intégré par infection rétrovirale. De plus, ce gène de fusion est sous le contrôle 25 d'un promoteur constitutif fort. La protéine proie est ainsi surexprimée dans la cellule hôte. Cette forte expression peut affecter la prolifération et la survie de la cellule, empêchant ainsi de visualiser une potentielle interaction dans une cellule vivante. Par ailleurs, la surexpression peut entraîner des « faux positifs » en BiFC : la visualisation d'un signal fluorescent dans ces conditions peut donc éventuellement être dénués de toute signification physiologique. 30 Il existe donc un besoin de nouveaux vecteurs pour améliorer la préparation des banques de cellules exprimant des protéines de fusion comprenant des protéines proies, afin de pouvoir réaliser des criblages dans des conditions plus physiologiques, où les protéines proies sont moins fortement exprimées, et idéalement peuvent être exprimées de manière inductible. 3052788 4 Il existe également un besoin de nouvelles banques de cellules mammifères, ayant intégré de manière stable des vecteurs codant pour des protéines proies fusionnées à un fragment de protéine fluorescente. Ces cellules mammifères pourront être choisies de préférence parmi des cellules humaines, cancéreuses ou non, afin de pouvoir étudier les 5 interactions protéine-protéine dans différents environnements physiologiques, sains ou pathologiques. Les inventeurs ont mis au point un nouveau vecteur, comprenant un promoteur inductible, sous le contrôle duquel est placé un acide nucléique codant une protéine de fusion comprenant le fragment C-terminal d'une protéine fluorescente, et une protéine proie. Ce 10 vecteur peut être maintenu de manière stable dans des cellules mammifères, et permet l'expression inductible, sans surexpression, de ladite protéine de fusion dans des cellules pouvant être utilisées dans une méthode de criblage. Plusieurs banques de cellules humaines, comprenant une collection de vecteurs codant pour des protéines de fusion comprenant le fragment C-terminal d'une protéine 15 fluorescente et une protéine proie, ladite protéine proie étant codée par un polynucléotide issu d'une banque ORFéome humaine, ont ainsi pu être produites. Ces banques de cellules ont été utilisées dans des méthodes de criblage de protéines proies avec une protéine piège, par la technique de complémentation de fluorescence bimoléculaire BiFC. 20 RESUME DE L'INVENTION La présente invention concerne un vecteur eucaryote dit « vecteur proie », incluant une cassette d'expression comprenant un promoteur eucaryote inductible, sous le contrôle duquel est placé un acide nucléique codant une protéine de fusion comprenant un fragment C-terminal d'une protéine fluorescente (A) et une protéine proie (B), ledit acide nucléique 25 comprenant: - un polynucléotide (a) codant pour ledit fragment de la protéine fluorescente, et - un polynucléotide (b) codant pour ladite protéine proie. La présente invention concerne également une collection de vecteurs proies (Vx), comprenant un nombre fini de vecteurs proies tels que définis ci-dessus, caractérisée en ce que: 30 - le promoteur eucaryote inductible est identique dans tous les vecteurs (Vx) de ladite collection de vecteurs proies; - le polynucléotide (a) codant pour le fragment C-terminal d'une protéine fluorescente est identique dans tous les vecteurs Vx de ladite collection de vecteurs proies; et 3052788 5 - dans un vecteur (V,) donné, le polynucléotide (b,) codant pour la protéine proie (Bx) est distinct des autres polynucléotides (b,) compris dans chacun des autres vecteurs (Vx); - x étant un nombre entier compris entre 1 et 30000. 5 La présente invention est aussi relative à une banque de cellules mammifères, dans laquelle chaque cellule comprend de manière stable au moins l'un des vecteurs de la collection de vecteurs (Vx). La présente invention concerne également une méthode de criblage de protéines proie (Bx) susceptibles d'interagir avec une protéine d'intérêt ci-après désignée 10 « protéine piège », comprenant les étapes suivantes : - induction du promoteur inductible compris dans le vecteur proie des cellules de la banque décrite ci-dessus, lesdites cellules ayant intégré de manière transitoire un ou plusieurs vecteur(s) eucaryote(s), dit(s) « vecteur piège », incluant une cassette 15 d'expression comprenant un promoteur eucaryote sous le contrôle duquel est placé un acide nucléique codant une protéine de fusion comprenant un fragment N-terminal (A') complémentaire du fragment C-terminal (A) de la protéine fluorescente, et une protéine piège (B'), ledit acide nucléique comprenant : 20 - un polynucléotide (a') codant pour ledit fragment N-terminal de la protéine fluorescente, et - un polynucléotide (b') codant pour ladite protéine piège ; - isolement de la ou des cellules présentant un signal fluorescent, dans laquelle les fragments (A) et (A') sont mis en contact par l'interaction entre les 25 protéines proie (Bx) et piège (B'); et - identification par séquençage du polynucléotide (bx) codant pour la protéine proie (Bx), compris dans le vecteur proie (Vx), lui-même compris dans ladite cellule présentant un signal fluorescent. Enfin, la présente invention concerne également un kit de détection d'interaction 30 protéine-protéine, comprenant : (i) une banque de cellules mammifères telle que décrite ci-dessus ; (ii) des réactifs permettant l'intégration des vecteurs pièges dans lesdites cellules ; (iii) des réactifs permettant l'induction du promoteur inductible ; 3052788 6 (iv) un protocole décrivant les étapes nécessaires à la détection des interactions protéine-protéine. FIGURES 5 Figure 1. Clonage de polynucléotides (bx), désignés ici (ORFn) issus de l'ORFéome humain v3.1 en fusion avec le fragment C-terminal de la protéine fluorescente Cerulean (CC) et sous contrôle du promoteur inductible Tet-ind, dans un vecteur Ghostblue, afin de créer une collection de vecteurs Ghostblue-CC-ORFn. Figure 2. Tests BiFC du système Ghost-Blue-CC-ORF par transfection transitoire dans des 10 cellules HEK-293 de trois vecteurs : un vecteur proie Ghostblue-CC-ORFn, un vecteur piège comprenant une protéine piège différente selon les cas A, B, C et D, et un vecteur exprimant l'inducteur Tet-A destiné à induire le promoteur Tet-ind du vecteur proie. Figure 3. Production de particules virales avec la collection de vecteurs Ghostblue-CC-ORFn. Figure 4. Production des banques de cellules établies à partir des lignées cellulaires HEK, 15 MDA-MB231 et PC-3, avec la collection de vecteurs Ghostblue-CC-ORFn. Figure 5. Tri d'interactions BiFC avec la protéine piège VNHoxA9 dans les banques de cellules mammifères HEK-293(CC-ORF), MDA-MB231(CC-ORF) et PC-3(CC-ORF). Figure 6. Méthode d'identification des ORF présents dans les cellules fluorescentes. 20 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne un vecteur eucaryote « proie », une collection de vecteurs eucaryotes « proies » comprenant un nombre fini desdits vecteurs eucaryotes, une banque de cellules mammifères dans laquelle chaque cellule comprend de manière stable au 25 moins l'un des vecteurs de la collection, ainsi qu'une méthode de criblage utilisant ladite banque de cellules, et un kit permettant de mettre en oeuvre ladite méthode de criblage. La présente invention propose une amélioration de la technique de criblage par complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC). L'atout principal de la méthode selon l'invention est l'expression à un niveau contrôlé des protéines proies, objets du criblage. Son 30 deuxième avantage est la possibilité de pratiquer cette méthode de criblage sans utiliser des rétrovirus, dont la manipulation est risquée et nécessite des équipements adéquats. Un troisième avantage est l'utilisation d'un promoteur inductible, qui permet de n'exprimer la protéine proie dans les cellules que lors des moments choisis, notamment lors du criblage. 3052788 7 Selon un aspect préféré de l'invention, la méthode de criblage peut être réalisée avec plusieurs protéines pièges, fusionnées à différents fragments complémentaires du fragment C-terminal compris dans la protéine de fusion comprenant la protéine proie. La présence de ces différents fragments permet, lors de l'interaction entre les protéines proie et 5 piège, de générer plusieurs protéines fluorescentes et donc plusieurs couleurs de fluorescence. Ainsi, l'interaction d'une protéine proie avec plusieurs protéines pièges peut être observée simultanément dans une même cellule. Il est ainsi possible d'identifier, pour une même protéine proie, différents partenaires d'interaction et de suivre la formation de différents complexes protéiques, au cours du temps ou en fonction des conditions de culture de la cellule. 10 Vecteur eucaryote La présente invention concerne un vecteur eucaryote dit « vecteur proie », incluant une cassette d'expression comprenant un promoteur eucaryote inductible, sous le contrôle duquel est placé un acide nucléique codant une protéine de fusion comprenant un fragment C- 15 terminal d'une protéine fluorescente (A) et une protéine proie (B), ledit acide nucléique comprenant: - un polynucléotide (a) codant pour ledit fragment de la protéine fluorescente, et - un polynucléotide (b) codant pour ladite protéine proie. Ces deux polynucléotides (a) et (b) sont placés de manière successive dans le sens 20 5'-3', et cet ordre sera de préférence conservé. Il est entendu que ces deux polynucléotides sont transcrits selon un même cadre de lecture. Au sens de l'invention, le terme « vecteur proie » signifie que le vecteur comprend un polynucléotide (b) codant pour une protéine proie, intégré dans une cassette d'expression, laquelle cassette étant décrite en détail ci-dessous. 25 Un vecteur désigne un vecteur de clonage sous la forme d'un plasmide, c'est à dire une molécule d'ADN distincte de l'ADN chromosomique, capable de réplication autonome. Un vecteur eucaryote est destiné à l'expression ou au clonage de gènes dans des cellules eucaryotes. Ce vecteur comprend au moins : 30 - un oligonucléotide servant d'origine de réplication, spécifique des cellules eucaryotes, et plus préférentiellement spécifique des cellules humaines ; - un gène de résistance à un antibiotique, permettant une sélection des cellules ayant intégré le vecteur. 3052788 8 Optionnellement, ce vecteur comprend également des sites spécifiques de coupure par des enzymes de restriction. Selon un aspect préféré de l'invention, ledit vecteur est un vecteur dérivé d'un plasmide codant pour un lentivirus, comprenant les séquences de recombinaison dites « att » 5 adaptées au système de clonage GATEWAY®. Le système de clonage « GATEWAY® » permet de transférer des fragments d'ADN entre des plasmides, en utilisant des séquences recombinantes nommées "Gateway att", ainsi que les enzymes « LR Clonase » et « BP Clonase ». La technique de clonage GATEWAY® permet le transfert de fragments d'ADN entre différents vecteurs sans 10 modification du cadre de lecture desdits fragments d'ADN. Ces séquences « att » sont dénommées différemment en fonction de la chronologie des événements de recombinaison : attLl et attL2 dans les vecteurs d'origine contenant les polynucléotides (b) ; attR1 et attR2 dans le vecteur de destination pGHOSTblue-CC, avant insertion du polynucléotide (b) codant pour la protéine proie ; et attB1 et attB2 après insertion 15 dudit polynucléotide (b) dans le vecteur de destination pGHOSTblue-CC. (Voir figure 1) Le vecteur spécialement mis au point dans le cadre de la présente invention, dérivé d'un plasmide codant pour un lentivirus, et comprenant les séquences de clonage GATEWAY®, a été dénommé « Ghost Blue ». Ce vecteur contient les séquences d'ADN nécessaires à l'encapsidation et à 20 l'intégration du lentivirus dans le génome hôte. Ces séquences ADN issues de lentivirus permettent la génération de particules virales lorsque le vecteur est introduit dans des cellules dites « packaging ». Les particules virales libérées par les cellules « packaging » sont ensuite utilisées pour introduire ledit vecteur dans des cellules hôtes. De préférence, le vecteur selon l'invention comprend également des gènes de 25 sélection positive ou négative, permettant de discriminer les cellules ayant intégré le virus de celles ne l'ayant pas intégré. Selon un aspect particulier, avant introduction du polynucléotide (b), le vecteur d'origine comprend, entre les séquences de recombinaison attR1 et attR2, la cassette ccdB codant pour une cytotoxine létale pour certaines bactéries. Cette cassette est suivie d'une 30 séquence d'entrée de ribosome (IRES) et du gène codant pour la résistance à la puromycine (puro). Un procédé particulier de préparation du vecteur selon l'invention comprend les étapes suivantes : 3052788 9 (i) insertion du polynucléotide (a) codant pour le fragment C-terminal d'une protéine fluorescente dans le vecteur d'origine ; (ii) recombinaison entre un mélange de plasmides comprenant des polynucléotides (b,) codant pour des protéines proies, lesdits 5 polynucléotides étant intégrés entre les séquences attLl et attL2 du vecteur d'origine, ceci permettant le remplacement de la cassette létale ccdB par les polynucléotides (b,) en générant des sites attB1 et attB2 de part et d'autre des polynucléotides (bx) ; (iii) introduction de ces vecteurs recombinants dans des bactéries sensibles à la 10 présence de la cassette ccdB - seules les bactéries comprenant le vecteur de l'invention peuvent survivre. Ce procédé de préparation est schématisé en figure 1, où la collection de vecteurs comprenant des polynucléotides (b,) codant des protéines proies est une collection de vecteurs comprenant 11000 ORFs de l'ORFéome humain v3.1. 15 Selon un aspect particulier de l'invention, le vecteur peut comprendre d'autres polynucléotides que ceux cités précédemment, notamment d'autres gènes de sélection. Le vecteur selon l'invention comprend une cassette d'expression comprenant au moins un promoteur eucaryote inductible, sous le contrôle duquel est placé un acide nucléique codant une protéine de fusion comprenant un fragment C-terminal d'une protéine fluorescente 20 (A) et une protéine proie (B), ledit acide nucléique comprenant: - un polynucléotide (a) codant pour ledit fragment de la protéine fluorescente, et - un polynucléotide (b) codant pour ladite protéine proie. On entend par « promoteur eucaryote inductible » un promoteur de transcription fonctionnel dans des cellules eucaryotes, permettant le démarrage de la transcription des acides 25 nucléiques situés sous son contrôle. Un promoteur est dit « inductible » quand ledit promoteur est inactif en temps normal, le polynucléotide sous son contrôle étant exprimé de façon négligeable, mais qu'il devient opérationnel sous l'action d'un inducteur. Tout promoteur inductible connu de l'Homme du métier peut être utilisé dans le vecteur de l'invention. On peut citer notamment le 30 promoteur inductible au cumate, ou celui inductible par ecdysone Selon un aspect particulier de l'invention, le promoteur inductible est un promoteur Tet-ind inductible à l'activateur Tet-A, ce système ayant été initialement décrit en 1992 dans l'article de Gossen & Bujard, et amélioré depuis. 3052788 10 L'utilisation d'un tel promoteur inductible permet d'induire l'expression de la protéine de fusion comprenant un fragment C-terminal d'une protéine fluorescente (A) et une protéine proie (B) lors du criblage, alors que ladite protéine de fusion ne sera pas exprimée de manière constitutive, notamment lors de l'obtention des cellules ainsi modifiées. Cet outil 5 moléculaire est particulièrement avantageux pour l'étude des protéines létales, ou celles inhibant la prolifération des cellules lors d'une surexpression. Cette cassette d'expression peut comprendre également un polynucléotide codant pour un polypeptide espaceur, localisé entre le fragment de la protéine fluorescente et la protéine proie. La protéine de fusion résultante sera ainsi plus stable et l'encombrement 10 stérique entre les deux fragments fusionnés ne diminuera pas le signal de fluorescence. Le vecteur décrit ci-dessus pourra être introduit dans des bactéries ou dans des cellules eucaryotes, notamment des cellules mammifères, et plus particulièrement dans des cellules humaines. Ainsi, une cellule procaryote ou eucaryote exprimant ledit vecteur est également 15 comprise dans l'invention. Protéine fluorescente La protéine de fusion codée par le vecteur selon l'invention comprend le fragment C-terminal d'une protéine fluorescente. De nombreuses protéines fluorescentes, la plupart dérivées de la GFP (Green 20 Fluorescent Protein), sont connues de l'Homme du métier. Ces protéines peuvent émettre sur différentes longueurs d'onde, et présentent donc différentes couleurs en fonction de leur nature. (Voir pour revue Day & Davidson, 2009) Selon un aspect particulier de l'invention, la protéine fluorescente utilisée est choisie parmi les protéines fluorescentes suivantes : EGFP, CFP, ECFP, Cerulean, EYFP, 25 Venus, Citrine, EBFP, Azurite, GFP-S65T, frGFP, sfGFP, Dronpa, PA-GFP, mRFP, mCherry et mKate. Ces différentes protéines émettent des signaux lumineux dans différentes longueurs d'onde, et peuvent être ainsi classifiées : - EGFP (enhanced GFP), GFP-S65T, frGFP (folding reporter GFP), sfGFP 30 (super folder GFP) : fluorescence verte ; - CFP et ses variants Cerulean et ECFP (enhanced CFP): fluorescence cyan (bleu-vert); - EYFP et ses variants Venus et Citrine : fluorescence jaune (Y pour yellow); 3052788 11 - EBFP et son variant l'Azurite : fluorescence bleue, - Dronpa : fluorescence verte réversible ; - PA-GFP : GFP photo-activable à 405 nm : - mRFP et son variant mCherry: fluorescence rouge (R pour Red). 5 - mKate : fluorescence violette. Selon un aspect préféré de l'invention, la protéine fluorescente est choisie dans la famille des CFP (Cyan fluorescent proteins) et plus préférentiellement est la protéine Cerulean. (Rizzo et al., 2004) La taille du fragment C-terminal de la protéine fluorescente sera déterminée en 10 fonction de la taille du fragment N-terminal complémentaire, ledit fragment étant fusionné avec la protéine « piège ». Selon une mise en oeuvre de l'invention, il sera avantageux de scinder la protéine fluorescente en deux fragments complémentaires de taille égale ou sensiblement égale. Selon d'autres mises en oeuvre de l'invention, les deux fragments N-terminal et C- 15 terminal pourront avoir des tailles significativement différentes, sous réserve qu'ils soient complémentaires, c'est-à-dire que leur rapprochement lors de l'occurrence d'une interaction entre la protéine piège et l'une des protéines proies permette de reconstituer une protéine fluorescente active, et ainsi de générer un signal fluorescent. Le fragment C-terminal de la protéine fluorescente est notamment un fragment 20 peptidique comprenant entre 10 et 250 acides aminés, ou entre 50 et 200 acides aminés, et de préférence comprenant entre 80 et 100 acides aminés. Selon un aspect particulier de l'invention, le fragment de la protéine fluorescente est le fragment C-terminal de la Cerulean, ce fragment comprenant au moins la séquence peptidique telle que présentée en SEQ ID NO. 1. 25 Le fragment C-terminal de la Cerulean présente l'avantage d'être complémentaire avec différents fragments N-terminaux issus de différentes protéines fluorescentes, et ainsi de pouvoir générer plusieurs signaux de fluorescence en fonction du fragment N-terminal qui se joint à lui de manière complémentaire, lors de l'occurrence d'une interaction entre la protéine piège et l'une des protéines proies. 30 Selon un aspect encore plus particulier de l'invention, le fragment C-terminal de la protéine fluorescente est un fragment dont la séquence peptidique consiste en la séquence SEQ ID NO.1. 3052788 12 Tableau 1. Séquences Numéro de Description Séquence séquence SEQ ID Fragment C-terminal MADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDG PVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITL GMDELYKR NO.1 de la Cerulean (87 acides aminés) SEQ ID Cassette d'expression ATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACT TCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCA GCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCG ACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGC ACCCAGTCCaagCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCG CGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCG GGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGagatctaca agtttgtacaaaaaaGTTGGC[bx]CCAACTTTCTTGTACAAA GTGGTgat NO. 2 comprenant un polynucleotide (a) codant pour un fragment CC + les séquences att (en gras) entourant le pylnucléotide (1Dx) de séquence inconnue SEQ ID Fragment N-terminal de Venus (173 aa) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDAT YGKLTLKLICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGLQCFARYPDH MKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEG DTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADK QKNGIKANFKIRHNIE NO. 3 SEQ ID Fragment N-terminal de sfGFP (214 aa) MRKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATI GKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHM KRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGD TLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQ KNGIKANFTVREINVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLP DNHYLSTQTVLSKDPNEK NO.4 SEQ ID Fragment N-terminal MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDAT YGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFARYPDH MKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEG DTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISDNVYIT NO.5 de Cerulean (154 acides aminés) 3052788 13 SEQ ID attB1 oligonucléotide TCTACAAGTTTGTACAAAAAAGTTGGC NO.6 pour amplification PCR de (bx) avant séquençage SEQ ID attB2 oligonucléotide CCAACTTTCTTGTACAAAGTGGT NO.7 pour amplification PCR de (bx) avant séquençage Protéine proie Au sens de l'invention, on entend par « protéine proie » une protéine, dont la faculté d'interaction avec une protéine piège connue est testée, au sein de cellules exprimant 5 lesdites protéines proie et piège. L'identité de cette protéine proie désignée (B) peut être connue ou non. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, l'identité de la protéine proie est inconnue. Selon un aspect préféré de l'invention, la protéine proie est une protéine humaine. Selon un aspect tout à fait préféré, la protéine proie est une protéine humaine dont 10 l'identité est inconnue, issue d'une banque génomique constituée de cadres de lecture ouvert soit « Open Reading Frame » (ORF), ladite banque génomique étant qualifiée « d'ORFéome ». La protéine est désignée (Bx), x représentant le numéro du vecteur comprenant le polynucléotide (bx) codant ladite protéine proie. Collection de vecteurs 15 La présente invention est également relative à une collection de vecteurs proies (Vx) comprenant un nombre fini de vecteurs proies tels que décrits ci-dessus, caractérisée en ce que: - le promoteur eucaryote inductible est identique dans tous les vecteurs (Vx) de ladite collection de vecteurs proies; 20 - le polynucléotide (a) codant pour le fragment C-terminal d'une protéine fluorescente est identique dans tous les vecteurs (Vx) de ladite collection de vecteurs proies; et - dans un vecteur (Vx) donné, le polynucléotide (bx) codant pour la protéine proie (Bx) est distinct des autres polynucléotides (bx) compris dans chacun des 25 autres vecteurs (Vx); - x étant un nombre entier compris entre 1 et 30000. 3052788 14 Le nombre entier 'x' désigne le numéro de chaque polynucléotide (bx) présent dans la collection de vecteurs décrite ci-dessus. Ce nombre est compris entre 1 et 30000. Ce nombre x pourra également être un nombre entier compris entre 1 et 25000, entre 1 et 20000, entre 1 et 15000, entre 1 et 14000, entre 1 et 13000, entre 1 et 12000, entre 1 et 11000, entre 1 5 et 10000, entre 1 et 9500, entre 1 et 9000, entre 1 et 8500, entre 1 et 8000, entre 1 et 7500, entre 1 et 7000, entre 1 et 6500, entre 1 et 6000, entre 1 et 5500 et entre 1 et 5000. Il est entendu que la collection de vecteurs proies comprend un nombre fini de vecteurs, ce nombre étant égal, inférieur ou supérieur à x. En effet, la collection de vecteurs est générée de manière à comprendre, statistiquement, un seul vecteur (Vx) comprenant un 10 polynucléotide (bx). Cependant, il ne peut être exclu que deux, trois, quatre ou un plus grand nombre de vecteurs (Vx) soient identiques, c'est-à-dire qu'ils comprennent le même polynucléotide (bx). De même, il ne peut être exclu qu'un polynucléotide (bx) ne soit pas représenté au sein de la collection de vecteurs, car n'ayant pas été introduit dans au moins un vecteur. 15 L'expression « dans un vecteur (Vx) donné, le polynucléotide (bx) codant pour la protéine proie (13x) est distinct des autres polynucléotides (bx) compris dans chacun des autres vecteurs (Vx)» signifie que, par exemple, le polynucléotide b1 sera contenu dans le vecteur (VI), alors que le polynucléotide b2 sera contenu dans le vecteur (V2), b1 et b2 étant deux polynucléotides distincts. 20 Selon un aspect préféré de l'invention, le promoteur eucaryote inductible identique dans tous les vecteurs (Vx) est un promoteur inductible par l'activateur Tet-A. Selon un autre aspect préféré de l'invention, le polynucléotide (a) codant pour le fragment C-terminal d'une protéine fluorescente, identique dans tous les vecteurs (Vx), est un polynucléotide codant pour le fragment C-terminal de la protéine Cérulean, aussi dénommé 25 'CC', comprenant la séquence telle que présentée en SEQ ID NO. 1. Selon encore un autre aspect préféré de l'invention, le polynucléotide (bx) codant pour la protéine proie (13x) distinct des autres polynucléotides (bx) compris dans chacun des autres vecteurs (Vx) correspond à polynucléotide ayant un cadre de lecture ouvert (ORF) issu d'un ORFéome humain. 30 Un ORFéome humain désigne un ensemble de polynucléotides ayant un cadre de lecture ouvert, aussi appelés « Open Reading Frames », issus du génome humain. Plusieurs versions d'ORFéomes humains existent, par exemple les versions v5.1, v7.1 et v8.1 sont décrites sur ce lien internet : http://horfdb.dfci.harvard.edu/hv5/index.php?page=home. 3052788 15 Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, dans la collection de vecteurs (Vx), les polynucléotides (bx) codant pour les protéines proies (Bx) sont issus d'un ORFéome humain, et plus précisément de l'un des ORFéomes humains suivants : v3.1, v4.1, v5.1, v6.1, v7.1, v8.1 et v9.1. 5 Préférentiellement, les polynucléotides (bx) codant pour les protéines proies (Bx) sont issus de l'un des ORFéomes humains de version : v3.1, v8.1, ou v9.1. La figure 1 présente schématiquement les différentes étapes de la construction d'une collection de vecteurs (Vx), à partir d'un ORFéome humain, grâce aux sites de clonage Gateway®. 10 Avantageusement, dans ladite collection de vecteurs (Vx), tous les polynucléotides (bx) issus d'un ORFéome humain sont présents chacun dans au moins un vecteur proie (Vx) de la collection. Selon un aspect particulier de l'invention, ladite collection de vecteurs est dite « ordonnée », c'est-à-dire que les vecteurs proies (Vx) sont classifiés en fonction de la nature 15 des protéines (Bx) codées par les polynucléotides (bx) présents dans lesdits vecteurs. La nature des protéines est liée à leur structure et/ou à leur fonction, et on trouvera ainsi dans une collection ordonnée de vecteurs les sous-catégories suivantes : - vecteurs (Vx) codant pour des protéines B' impliquées dans le métabolisme de la cellule ; 20 - vecteurs (Vx) codant pour des protéines B' jouant le rôle de facteurs de transcription ; - vecteurs (Vx) codant pour des protéines B' membranaires ; - vecteurs (Vx) codant pour des protéines Bx nucléaires ; - vecteurs (Vx) codant pour des protéines Bx non nucléaires, etc.... 25 Une telle collection de vecteurs sera notamment présentée sous la forme de vecteurs conservés dans l'alcool à -20°C, ou sous la forme de clones bactériens contenant lesdits vecteurs, conservés dans du glycérol à -80°C. Une telle collection de vecteurs peut permettre de nombreuses applications en recherche fondamentale et appliquée. Ainsi, un criblage de protéines proies utilisant une 30 collection de vecteurs proies ordonnée pourra être réalisée sur une seule catégorie de vecteurs codant pour des protéines proies particulières, par exemple en ne criblant que les protéines proies classifiées dans la catégorie des « protéines membranaires ». 3052788 16 Lignées de cellules mammifères La présente invention concerne également une banque de cellules mammifères, dans laquelle chaque cellule comprend de manière stable au moins un des vecteurs de la collection de vecteurs (Vx) telle que définie ci-dessus. 5 Avantageusement, dans cette banque de cellules, toutes les cellules ont intégré un seul vecteur proie (Vx) de la collection de vecteur définie ci-dessus. Avantageusement, dans cette banque de cellules, tous les vecteurs (Vx) d'une collection de vecteurs donnée auront été intégrés dans au moins une cellule de la banque. Ceci permet de tester, lors d'une méthode de criblage utilisant cette banque de cellules, tous les 10 vecteurs proies membres de la collection de vecteurs. Les figures 3 et 4 montrent de manière schématique le procédé de préparation d'une banque de cellules selon l'invention : (i) des cellules dites « packaging » sont transfectées avec tous les vecteurs de la collection, afin de générer des particules virales; 15 (ii) le titre des particules virales produites est calculé à partir d'infections contrôles sur les différentes lignées hôte d'intérêt, en utilisant différents surnageant contenant les particules virales ; une « quantité mimnimum permettant la survie des cellules » est ainsi déterminée ]. Le calcul du titre, basé sur le nombre de cellules hôtes ayant résisté à la présence de 20 l'antibiotique, permet de déterminer le ratio entre les particules virales et les cellules cibles, aussi appelé multiplicité d'infection ou MOI. Le MOI permet de déduire la quantité de particules à utiliser pour l'infection des cellules cibles afin d'obtenir, statistiquement, l'insertion d'une seule particule virale par cellule. 25 (iii) des cellules cibles dites « cellules hôtes » issues de différentes lignées cellulaires sont infectées par les particules virales au ratio MOI tel que calculé précédemment (figure 4) ; (iv) les cellules hôtes ayant intégré au moins une particule virale sont sélectionnées sur un milieu contenant un antibiotique pour lequel le 30 vecteur proie comprend un gène de résistance. Les cellules sont ensuite cultivées sur un milieu comprenant une concentration moindre de l' antibiotique. 3052788 17 Les cellules dites « cellules packaging » sont de préférence des cellules mammifères, préférentiellement des cellules humaines. Il peut s'agir notamment de cellules HEK. Cette technique permet d'obtenir une intégration stable d'un vecteur (V,) dans des 5 cellules hôtes, ledit vecteur (V,) étant capable d'exprimer la protéine de fusion telle que décrite précédemment, sous réserve que le promoteur inductible soit opérationnel, ces cellules hôtes constituant ainsi une banque de cellules dans laquelle chaque cellule comprend de manière stable au moins l'un des vecteurs de la collection de vecteurs. Ainsi, les protéines proies peuvent être exprimées de manière stable, et non 10 transitoire, dans lesdites cellules de la banque, sous réserve que le promoteur inductible ait été activé. Par ailleurs, ce procédé de préparation d'une banque de cellules est réalisé de manière à obtenir une banque de cellules où toutes les cellules ont intégré statistiquement un seul et unique vecteur proie (V,) de la collection de vecteur. 15 Une telle banque est obtenue en calculant le titre de particules virales (appelé aussi MOI) à partir d'infections contrôles. Le calcul du titre permet de déterminer la concentration de particules à utiliser pour obtenir, statistiquement, l'insertion d'une seule particule virale par cellule lors de l'infection, et donc d'un seul vecteur proie. Les cellules hôtes pouvant ainsi être modifiées génétiquement, par introduction 20 des vecteurs proie (V,), afin de créer une banque de cellules selon l'invention, sont nombreuses. Ces cellules hôtes sont issues de lignées cellulaires immortalisées, établies à partir de cellules prélevées dans des tissus animaux ou humains, cancéreux ou non. Selon un aspect préféré, ces lignées cellulaires sont des lignées de cellules humaines. Selon un aspect particulier de l'invention, les lignées cellulaires sont issues de cellules humaines cancéreuses. 25 Selon un autre aspect particulier de l'invention, les lignées cellulaires sont issues de cellules humaines non cancéreuses. Ainsi, les cellules hôtes de la collection de vecteurs (V,), destinées à créer une banque de cellules selon l'invention, pourront notamment être choisies parmi les lignées cellulaires listées dans le tableau 2 ci-dessous : 30 3052788 18 Tableau 2. Exemples de lignées cellulaires d'origine humaine pour constitution d'une banque de cellules Nom N° accès origine Tissu tye Morphologie cellulaire NCI-H23 ATCC® CRL- 5800 Adénocarcinome Poumon epitheliale du poumon non-à petites cellules issu d'un Homme âgé de 51 ans A 549 DSMZ ACC10 Etabli à partir Poumon epitheliale 7 d'une tumeur de poumon issue d'un Homme caucasien âgé de 58 ans NCI- ATCC® CCL- Adénocarcinome Poumon; epitheliale H1299 5803 du poumon non-a e, d rivé d'une petites cellules métastasedans un ganglion lymphatique issu d'un Homme âgé de 43 ans NCI- ATCC® CRL- Issu d'un Poumon; epithelial H2052 5915 mesothelioma de dérivé d'une stade IV; homme métastase âgé de 64 ans dans un ganglion lymphatique HeLa ATCC® CRM- CCL-2 Issu d'un cervix epithelial adénocarcinome prélevée sur une patiente de 31 ans HepG2 ATCC® HB- Carcinome foie epithelial 8065 hepatocellulaire U2-OS ATCC osteosarcome Os epithelial 3052788 19 MG-63 ATCC® CRL1 osteosarcome Os fibroblaste 427 Ca-Kil Cancer à cellules Rein epitheliale claires Ca-Ki2 ATCC® HTB- Cancer à cellules Rein epitheliale 47 claires U-87 MG ATCC® HTB- glioblastome; Cerveau epitheliale 14 astrocytome; classifié grade IV T98G ATCC®CRL- Glioblastome Cerveau fibroblaste 1690 multiforme MCF7 ATCC®HTB- Dérivé d'un site Sein epitheliale 22 métastatique d'épanchement pleural LNCaP ATCC®CRL- Dérivé d'un site prostate carcinome epitheliale 1740 métastatique: ganglion lymphatique gauche supraclaviculaire DU 145 ATCC£HTB- Dérivé d'un site prostate carcinome epitheliale 81 métastatique : cerveau OVCAR 3 ATCC£HTB- adenocarcinome Ovaire epitheliale 161 Y79 ATCC®HTB- retinoblastome Rétine de Amas 18 l'oeil multicellulaire L'Homme du métier choisira quelle est la lignée cellulaire la plus adaptée pour créer une banque de cellules, en fonction de la nature du contexte cellulaire et des interactions protéine-protéine qu'il souhaite étudier. 5 Selon un aspect particulier de l'invention, les cellules hôtes de la collection de vecteurs Vx sont des cellules humaines cancéreuses, et plus particulièrement sont issues de l'une des lignées suivantes : MDA-MB231, PC-3, et SKOV. 3052788 20 La lignée MDA-MB231 est une ligné de cellules humaines établie à partir de cellules épithéliales de cancer de sein. La lignée PC-3 est une ligné de cellules humaines établie à partir de cellules de cancer de la prostate. 5 La lignée SKOV est une ligné de cellules humaines établie à partir de cellules d'un adénocarcinome ovarien. Selon un autre aspect de l'invention, les cellules hôtes de la collection de vecteurs (Vx) sont des cellules humaines non cancéreuses, et sont en particulier issues de la lignée des cellules humaines HEK-293. 10 La lignée HEK-293 est une ligné de cellules rénales humaines (Human Embryonic Kidney 293 cells) non cancéreuses. Avantageusement, plusieurs banques de cellules pourront être créées afin de cribler les interactions possibles d'une seule et même protéine d'intérêt selon différents contextes cellulaires : par exemple dans des cellules cancéreuses en comparaison avec des 15 cellules non cancéreuses, ou dans des cellules issues d'une tumeur primaire, en comparaison avec des cellules issues d'une métastase (tumeur secondaire). Méthode de criblage de protéines proies Les vecteurs et banques de cellules décrites ci-dessus sont destinées à être utilisées 20 dans des méthodes de détection d'interaction protéine-protéine, notamment entre des protéines pièges et des protéines proies. La présente invention concerne également une méthode de criblage de protéines proie (Bx) susceptibles d'interagir avec une protéine d'intérêt ci-après désignée « protéine piège », comprenant les étapes suivantes : 25 - induction du promoteur inductible compris dans le vecteur proie des cellules de la banque définie ci-dessus, lesdites cellules ayant intégré de manière transitoire un ou plusieurs vecteur(s) eucaryote(s), dit(s) « vecteur piège », incluant une cassette d'expression comprenant un promoteur eucaryote sous le contrôle duquel 30 est placé un acide nucléique codant une protéine de fusion comprenant un fragment N-terminal (A') complémentaire du fragment C-terminal (A) de la protéine fluorescente, et une protéine piège (B'), ledit acide nucléique comprenant : 3052788 21 - un polynucléotide (a') codant pour ledit fragment N-terminal de la protéine fluorescente, et - un polynucléotide (b') codant pour ladite protéine piège ; - isolement de la ou des cellules présentant un signal fluorescent, dans laquelle 5 les fragments complémentaires (A) et (A') sont mis en contact par l'interaction entre les protéines proie (B,) et piège (B'); et - identification par séquençage du polynucléotide (b,) codant pour la protéine proie (B,), compris dans le vecteur proie (V,), lui-même compris dans ladite cellule présentant un signal fluorescent. 10 Par « induction du promoteur inductible compris dans le vecteur proie (V,) des cellules », on entend l'action de rendre le promoteur inductible opérationnel afin que les polynucléotides situés sous son contrôle soient transcrits à un niveau suffisant puis traduits en protéine(s) pour les expériences de BiFC. Cette étape d'induction peut être réalisée de plusieurs manières, en fonction de la 15 nature du promoteur inductible : - par addition, dans le milieu de culture des cellules, d'un composé modifiant l'état du promoteur inductible afin de le rendre opérationnel ; ou - par expression, dans les cellules, d'un polypeptide modifiant l'état du promoteur inductible afin de le rendre opérationnel. 20 Plusieurs systèmes de promoteurs inductibles sont disponibles et connus de l'Homme du métier, tels que le promoteur inductible au cumate (https: //www. systembio. com/lentiviral-technology/cumate-switch-vectors/titratable-induction) ou celui inductible par ecdysone (http: //www. genomics. agilent. com/arti cl e. j sp?crumbAction=push&pageId=496& requestid=1 25 0702). Selon un aspect particulier de l'invention, le vecteur (V,) proie comprend le promoteur Tet-ind, inductible par l'activateur Tet-A. L'activation dudit promoteur est réalisée par l'introduction, dans les cellules de la banque définie ci-dessus, d'un vecteur permettant l'expression dans la cellule de l'activateur Tet-A. 30 La présence de ce promoteur inductible permet de n'exprimer la protéine de fusion, comprenant la protéine proie, qu'au moment opportun : ainsi, si la surexpression de la protéine proie est nocive pour la survie des cellules, cette surexpression sera limitée dans le temps. 3052788 22 Par « protéine piège », on entend au sens de l'invention une protéine d'intérêt connue, pour laquelle des partenaires d'interaction sont recherchés. Par « vecteur piège » on entend un vecteur d'expression eucaryote incluant une cassette d'expression comprenant un promoteur eucaryote sous le contrôle duquel est placé un 5 acide nucléique codant une protéine de fusion comprenant un fragment N-terminal (A') complémentaire du fragment C-terminal (A) de la protéine fluorescente, et une protéine piège (B'), ledit acide nucléique comprenant : - un polynucléotide (a') codant pour ledit fragment N-terminal de la protéine fluorescente, et 10 - un polynucléotide (b') codant pour ladite protéine piège. Le promoteur compris dans ce vecteur piège pourra être un promoteur constitutif ou un promoteur inductible. Préférentiellement, il s'agira d'un promoteur constitutif. Les deux polynucléotides (a') et (b') peuvent être indifféremment placés : soit dans l'ordre (a') puis (b') ; soit dans l'ordre (b') puis (a'), dans le sens 5' en 3'. 15 L'introduction, dans les cellules de la banque, de vecteurs pièges peut être réalisée par toute technique de modification génétique transitoire connue par l'Homme du métier. La technique utilisée sera naturellement choisie en fonction de la nature des cellules. Seront plus particulièrement privilégiées les techniques de transfection et d'électroporation. On peut notamment citer les techniques de transfection utilisant des gésicules ou des virus like particles 20 (VLP) tels que décrits respectivement dans (Mangeot et al., 2011) et (Voelkel et al., 2010). Par « expression transitoire », on entend expression non-stable, c'est-à-dire que le vecteur piège exprimant la protéine piège (B') ne sera conservé dans la cellule que pendant quelques cycles de réplication, et ne pourra pas être maintenu dans les cellules pour une durée supérieure à quelques jours. 25 Par « fragment N-terminal (A') complémentaire du fragment C-terminal (A) de la protéine fluorescente», on entend un fragment peptidique permettant de générer un signal fluorescent lorsque ledit fragment (A') interagit avec un autre fragment peptidique C-terminal (A) dit 'complémentaire'. Ce fragment N-terminal complémentaire pourra être issu de la même protéine 30 fluorescente : le fragment C-terminal et le fragment N-terminal de la même protéine fluorescente, quel que soit leur taille respective, sont des « fragments complémentaires » dès que leur association permet de reproduire le signal fluorescent de la protéine fluorescente entière dont sont issus les deux fragments. 3052788 23 Ce fragment N-terminal complémentaire pourra également être issu d'une autre protéine fluorescente, et sera dit complémentaire dès lors qu'un signal fluorescent sera observé lorsque les deux fragments (A) et (A') interagissent. Ainsi, il est notamment possible d'obtenir un signal fluorescent avec les 5 associations des fragments complémentaires suivants : - Le fragment C-terminal de Cerulean comprenant 87 acides aminés (voir SEQ ID NO. 1), et le fragment N-terminal de Cerulean comprenant 154 acides aminés (voir SEQ ID NO. 5) ; le signal observé est de type Cérulean (couleur bleu-vert). 10 - Le fragment C-terminal de Cerulean comprenant 87 acides aminés (voir SEQ ID NO. 1), et le fragment N-terminal de Venus comprenant 173 acides aminés (voir SEQ ID NO. 3) : le signal observé est de type Venus, de couleur jaune. - Le fragment C-terminal de Cerulean comprenant 87 acides aminés (voir 15 SEQ ID NO. 1), et le fragment N-terminal de la sfGFP comprenant 214 acides aminés (voir SEQ ID NO. 4) : le signal observé est de type sfGFP, de couleur verte. Le signal fluorescent peut être observé, au sein de cellules vivantes, par diverses techniques et appareillages. 20 En particulier, la microscopie en fluorescence (ou en épifluorescence) est une technique utilisant un microscope optique en tirant profit du phénomène de fluorescence en plus de l'observation classique par réflexion. Il existe différents types de microscopes permettant de détecter des molécules fluorescentes : 25 - un microscope optique classique peut permettre la visualisation de la fluorescence endogène ; - de manière courante, on utilise un microscope confocal à balayage laser : le microscope confocal atteignant une résolution bien meilleure que le microscope optique classique, et permettant de réaliser des images en trois 30 dimensions. - un microscope de fluorescence par réflexion totale interne. Il permet notamment d'obtenir une meilleure profondeur de champ (200 nm) que la microscopie confocale (600 nm), mais uniquement à la base de 3052788 24 l'échantillon, et plus précisément au niveau de l'interface entre l'échantillon et le support ; - la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) sert à étudier la diffusion de molécules et les interactions moléculaires. Elle est souvent 5 associée à la microscopie confocale à balayage laser. L'étape d'isolement de la ou des cellules présentant un signal fluorescent pourra être réalisée grâce à plusieurs techniques bien connues de l'Homme du métier. Au sens de l'invention, on entend par « cellules présentant un signal fluorescent » des cellules qui émettent des photons dans une longueur d'onde spécifique, ce signal lumineux 10 étant visible grâce à un microscope classique ou un microscope confocal. Selon un aspect particulier de l'invention, les cellules présentant un signal fluorescent pourront être détectées et/ou isolées grâce à un appareillage de cytométrie en flux (aussi dénommé FACS pour Fluorescence-activated cell sorting). Cette technique est basée sur le défilement de cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser, ce qui permet de les 15 compter tout en les caractérisant. Le fluorochrome présent dans la cellule absorbe l'énergie du laser et réémet l'énergie absorbée sous forme de photons d'une longueur d'onde plus élevée. C'est cette lumière réémise qui permet de classer la population cellulaire. La fonction « tri » des cytomètres en flux permet de trier physiquement une population cellulaire définie par ses propriétés optiques, notamment par le fait qu'elle émet une 20 couleur spécifique fluorescente. La troisième étape de la méthode de criblage consiste en l'identification par séquençage du polynucléotide (bx) codant pour la protéine proie (Bx), compris dans le vecteur proie (Vx) exprimé par ladite cellule présentant un signal fluorescent. Comme indiqué précédemment, les cellules présentant un signal fluorescent 25 peuvent être isolées grâce à un cytomètre en flux. Ces cellules peuvent ensuite être amplifiées par culture cellulaire. Il est entendu que ces cellules présentant un signal fluorescent contiennent un vecteur proie (Vx) et expriment une protéine proie (Bx) qui est un partenaire d'interaction de la protéine piège B' testée, l'interaction de ces deux protéines (Bx) et (B') entrainant la 30 complémentation de fluorescence entre les deux fragments complémentaires (A) et (A') définis ci-dessus. L'étape suivante de la méthode de criblage est l'identification de la protéine proie Bx et du polynucléotide bx la codant, contenu dans le vecteur (Vx) proie. 3052788 25 Cette identification se fait par séquençage massif, et peut notamment être réalisée en suivant les étapes ci-dessous : Extraction de l'ADN génomique des cellules fluorescentes, après tri par 5 FACS; Amplification par PCR des cassettes d'expression contenues dans les vecteurs proies contenus dans les cellules fluorescentes, à l'aide d'oligonucléotides s'hybridant de part et d'autre de la cassette sur les sites de clonage attB1 et attB2 ; 10 Optionnellement, migration électrophorétique sur gel d'agarose en présence de bromure d' éthidium des produits d'amplification PCR ; Séquençage sur plateforme Ion Torrent (Thermofisher) des produits PCR ; Identification des ORFs, produits de PCR, par comparaison de type Blast avec les séquences de l'ORFeome humain dont sont issus les 15 polynucléotides (bx). La présente invention concerne également une méthode de criblage de protéines proie (Bx) susceptibles d'interagir avec une protéine piège, comprenant les étapes suivantes : - Préparation d'un ou plusieurs vecteur(s) eucaryote(s), dit(s) « vecteur piège », 20 incluant une cassette d'expression comprenant un promoteur eucaryote sous le contrôle duquel est placé un acide nucléique codant une protéine de fusion comprenant un fragment N-terminal (A') complémentaire du fragment C-terminal (A) de la protéine fluorescente, et une protéine piège (B'), ledit acide nucléique comprenant : 25 - un polynucléotide (a') codant pour ledit fragment N-terminal de la protéine fluorescente, et - un polynucléotide (b') codant pour ladite protéine piège. - introduction, dans les cellules de la banque telle que définie ci-dessus, de manière transitoire, desdits vecteurs pièges ; 30 - induction du promoteur inductible compris dans le vecteur proie des cellules de la banque telle que définie ci-dessus, - isolement de la ou des cellules présentant un signal fluorescent, dans laquelle les fragments (A) et (A') sont mis en contact par l'interaction entre les protéines proie (Bx) et piège (B'); et 3052788 26 - identification par séquençage du polynucléotide (bx) codant pour la protéine proie (B,), compris dans le vecteur proie (Vx) exprimé par ladite cellule présentant un signal fluorescent. 5 Utilisation de plusieurs protéines pièges couplées à des fragments différents La méthode de criblage selon l'invention permet avantageusement d'utiliser plusieurs protéines pièges, connues, pour effectuer le criblage de protéines proies. Ainsi, selon un aspect particulier de l'invention, la méthode de criblage est caractérisée en ce que : 10 - les cellules de la banque ont intégré deux à trois vecteurs pièges, le premier comprenant un polynucléotide (a' i) et un polynucléotide (b'1), le deuxième comprenant un polynucléotide (a'2) et un polynucléotide (b'2) et optionnellement le troisième comprenant un polynucléotide (a'3) et un polynucléotide (b'3), 15 et que - lesdits polynucléotides (b' i) (b'2) et (b'3) codant pour lesdites protéines pièges et lesdits polynucléotides (a' i) (a'2) et (a'3) codant pour lesdits fragments N-terminaux de protéines fluorescentes sont distincts. 20 Selon un aspect particulier de l'invention, la méthode de criblage est caractérisée en ce que : - le premier vecteur piège comprend un polynucléotide (b',) codant pour une protéine piège et un polynucléotide (a' i) codant pour un fragment N-terminal de Venus, ce fragment comprenant la séquence SEQ ID NO. 3, 25 - et le deuxième vecteur piège comprend un polynucléotide (b'2) codant pour une protéine piège et un polynucléotide (a'2) codant pour un fragment N-terminal de SfGFP, ce fragment comprenant la séquence SEQ ID NO. 4. Selon un aspect particulier de l'invention, le polynucléotide (a' i) code pour un fragment N-terminal de la protéine Venus, ce fragment consistant en la séquence présentée en 30 SEQ ID NO. 3. Selon un autre aspect particulier de l'invention, le polynucléotide (a'2) code pour un fragment N-terminal de SfGFP, ce fragment consistant en la séquence présentée en SEQ ID NO. 4. 3052788 27 Selon un autre aspect particulier de l'invention, le polynucléotide (a'3) code pour un fragment N-terminal de la protéine Cerulean, ce fragment consistant en la séquence présentée en SEQ ID NO. 5. Il est entendu que ces trois fragments permettent d'obtenir un signal de 5 fluorescence lorsque qu'ils interagissent avec le fragment C-terminal de la protéine Cérulean, notamment le fragment comprenant la séquence présentée en SEQ ID NO. 1. Ces trois signaux sont de couleurs différentes, ce qui permet de distinguer les complexes formés avec la protéine proie et l'une ou l'autre des protéines pièges, chacune étant fusionnée avec un fragment N-terminal différent. 10 Kit de détection d'interactions protéine-protéine La présente demande concerne également un kit de détection d'interaction protéine-protéine, comprenant : (i) une banque de cellules mammifères telle que décrite ci-dessus; 15 (ii) des réactifs permettant l'intégration des vecteurs pièges dans lesdites cellules ; (iii) des réactifs permettant l'induction du promoteur inductible ; (iv) un protocole décrivant les étapes nécessaires à la détection des interactions protéine-protéine. 20 Les réactifs de ce kit sont bien connus de l'Homme du métier, et comprennent notamment : - des réactifs permettant l'intégration des vecteurs pièges dans lesdites cellules, soit par électroporation soit par transfection, en fonction de la nature des cellules ; 25 - des réactifs permettant l'induction du promoteur inductible, soit par expression d'un facteur inducteur, soit par ajout d'un facteur inducteur dans le milieu cellulaire ; - un protocole décrivant les différentes manières d'utiliser les cellules de la banque cellulaire afin de cribler des interactions protéine-protéine. Les utilisateurs d'un tel kit devront avoir en leur possession des vecteurs pièges 30 adéquats, exprimant des protéines pièges fusionnées à un fragment N-terminal d'une protéine fluorescente, ledit fragment étant complémentaire du fragment C-terminal exprimé par les cellules de la banque cellulaire. Les utilisateurs d'un tel kit devront aussi fournir les milieux de culture adéquats pour permettre la réplication des cellules de la banque. 3052788 28 Les utilisateurs d'un tel kit devront également avoir accès à un appareillage de type FACS pour la détection de la fluorescence, et le tri des cellules sur la base de ce signal fluorescent. De manière avantageuse, le kit selon l'invention contiendra des réactifs et des 5 oligonucléotides spécifiques adaptés à l'amplification par PCR et au séquençage des polynucléotides (bx) exprimés par les cellules de la banque, et un protocole de séquençage adapté permettant d'identifier la protéine proie (Bx) codée par le polynucléotide (bx), ladite protéine proie interagissant avec la protéine cible. 10 EXEMPLES Exemple 1. Clonage de l'ORFéome humain v3.1 en fusion avec le fragment C-terminal de la protéine fluorescente Cerulean (CC) et sous contrôle du promoteur inductible à l'activateur Tet-A - Un vecteur plasmidique appelé « Ghot-Blue-CC » a été construit pour intégrer chaque ORF 15 (open reading frame, cadre de lecture ouvert) provenant de la collection humaine hORFeome v3.1. - Le vecteur contient la séquence nucléique codant le fragment C-terminal de la protéine fluorescente Cerulean (« CC ») suivi de la cassette ccdB létale pour certaines bactéries, laquelle est entourée de séquences spécifiques Gateway® de recombinaison attR1 et attR2. 20 Cette cassette est suivie d'une séquence d'entrée de ribosome (IRES) et du gène codant pour la résistance à la puromycine (puro). L'ensemble est sous contrôle du promoteur inductible à l'activateur Tet-A (Tet-ind). - Le vecteur contient aussi des séquences d'intégration au génome, une séquence d'encapsidation et une séquence de stabilisation de l'ARN du lentivirus. 25 - La réaction de recombinaison (LR, figure 1) a été réalisée entre un mélange de plasmides de la banque hORFéome v3.1, contenant les sites de recombinaison attLl et attL2 autour de chaque ORF, et le vecteur Ghost-Blue-CC. - Le produit de réaction a été électroporé dans des bactéries sensibles à ccdB : seules les bactéries ayant reçu le vecteur recombiné avec l'ORF à la place de la cassette ccdB peuvent 30 survivre. Ces bactéries sont sélectionnées après étalement sur plaques contenant du milieu de culture solide LB agar. Tous les clones bactériens sont alors récupérés en milieu liquide et mis en culture. L'ensemble des plasmides Ghost-Blue-CC-ORF est alors extrait à partir de l'ensemble des clones bactériens par l'homme de métier. 3052788 29 - Le séquençage massif sur la plateforme « Ion Torrent PGM » de la banque plasmidique Ghost-Blue-CC-ORF a permis de démontrer que celle-ci contient 8200 ORFs différents, soit 75 % de l'orféome v3.1, qui contient 11000 ORFs différents après tri in silico des ORFs redondants. 5 Exemple 2. Preuve de concept - Tests BiFC du système Ghost-Blue-CC-ORF par transfection transitoire dans des cellules HEK - Le gène humain Pbxl (pre-B-cell leukemia homeobox 1) a été cloné dans le vecteur GhostBlue-CC. Ce gène code pour un co-facteur connu des protéines Hox. Sa translocation nucléaire 10 repose aussi sur une interaction avec les protéines de la famille Meis (myeloid ecotropic viral integration site 1). Les protéines Hox, Pbx et Meis sont décrites pour former des complexes trimériques de liaison à l'ADN in vitro. Un motif conservé des protéines Hox (appelé hexapeptide, HX) est requis pour l'interaction avec Pbxl. - Les figures 2A, 2B 2C et 2D montrent que l'approche méthodologique permet de mettre en 15 évidence les interactions attendues entre ces différents partenaires. Figure 2A - Une transfection dans les cellules HEK est réalisée avec les réactifs jetprime (PolyPlus), permettant d'introduire de manière transitoire les trois vecteurs suivants : - Ghost-Blue-CC-Pbxl (vecteur proie), 20 - un vecteur piège VN-HoxA9 codant pour la protéine piège HoxA9, fusionnée au fragment N-terminal de Venus, et - un vecteur exprimant Tet-A, sous contrôle du promoteur constitutif CMV, permettant d'induire l'expression de la cassette d'expression contenue dans Ghost-Blue-CC-Pbxl. 25 Cette triple transfection permet d'observer dans le noyau des cellules HEK l'apparition de signaux fluorescents de type Venus (observation 24h après transfection). Figure 2B - Spécificité du système de complémentation en fluorescence Les conditions sont identiques à celles de la Figure 2A, à l'exception de la protéine proie HoxA9 qui ne possède plus ni son domaine de liaison à l'ADN, ni le motif HX (cette 30 construction VN-dNHoxA9 a été réalisée par mutagénèse dirigée). Cette protéine tronquée n'est plus capable d'interagir avec Pbxl et n'entraîne pas de fluorescence avec Pbxl (contrôle négatif, observation 24h après transfection). 3052788 30 Figure 2C - complémentation de fluorescence de type sfGFP Une transfection dans les cellules HEK est réalisée avec les réactifs jetprime (PolyPlus), permettant d'introduire de manière transitoire les trois vecteurs suivants : - Ghost-Blue-CC-Pbxl 5 - sfGFPN-HoxA9 codant pour la protéine piège HoxA9 fusionnée au fragment N-terminal de sfGFP (super folder green fluorescent protein), et - un vecteur exprimant Tet-A, sous contrôle du promoteur constitutif CMV, permettant d'induire l'expression de la cassette d'expression contenue dans Ghost-Blue-CC-Pbxl. 10 Cette triple transfection permet d'observer dans le noyau des cellules HEK l'apparition de signaux fluorescents de type sfGFP (observation 24h après transfection). Figure 2D : complémentation de fluorescence de type Cerulean. Une transfection dans les cellules HEK est réalisée avec les réactifs jetprime (PolyPlus), permettant d'introduire de manière transitoire les trois vecteurs suivants : 15 - Ghost-Blue-CC-Pbxl - CN-Meis codant pour la protéine piège Meis fusionnée au fragment N-terminal de Cerulean, et - un vecteur exprimant Tet-A, sous contrôle du promoteur constitutif CMV, permettant d'induire l'expression de la cassette d'expression contenue dans 20 Ghost-Blue-CC-Pbxl. Cette triple transfection permet d'observer dans le noyau des cellules HEK l'apparition de signaux fluorescents de type sfGFP (observation 24h après transfection). L'ensemble de ces observations est réalisée sous microscope confocal inversé LSM780 (Zeiss) 25 avec les longueurs d'onde d'excitation (ex) et filtres d'émission (em) appropriées. Exemple 3. Production de particules virales avec la banque CC-ORF clonée dans le vecteur Ghost-Blue - La collection de vecteurs CC-ORF est transfectée dans la lignée immortalisée de cellules 30 rénales humaines (HEK-293, pour Human Embryonic Kidney 293 cells) dites cellules « packaging » pour permettre la production de particules virales. - Le titre de particules produites (appelé aussi MOI) est calculé à partir d'infections contrôles sur cellules HEK et sélection en puromycine. Le calcul du titre permet de savoir la 3052788 31 concentration de particules à utiliser pour obtenir, statistiquement, l'insertion d'une particule virale par cellule. - Seules les cellules intégrant la particule peuvent pousser sur un milieu contenant de la puromycme. 5 Exemple 4. Production des lignées cellulaires HEK, MDA et PC3 établies avec la banque CC-ORF - Les particules virales contenant la banque CC-ORF ont été utilisées pour infecter les cellules HEK-293, MDA-MB231 et PC-3. Dans chaque cas, ce sont 6.106 cellules qui ont été infectées 10 avec un MOI de 0,2. - La sélection des cellules ayant intégré une copie du vecteur proie CC-ORF est faite sur milieu avec puromycine (0,51.1g/m1) pendant 15 jours. Cette étape a permis de retenir environ 12.105 cellules, dont 80 % contiennent en théorie une intégration virale. Ces cellules sont ensuite amplifiées sur milieu avec une concentration moindre de puromycine (0,31.1g/m1). 15 - Le séquençage des lignées HEK, MDA et PC3 nouvellement établies indique que celles-ci ont respectivement intégré environ 7000 (85 % de la banque CC-ORF), 5000 (61 % de la banque CC-ORF) et 4000 (49 % de la banque CC-ORF) ORFs différents. Exemple 5. Tri d'interaction BiFC avec la protéine de fusion VN-HoxA9 dans les lignées 20 HEK(CC-ORF), MDA(CC-ORF) et PC3(CC-ORF) - Les lignées ont été transfectées (pour les cellules HEK) ou électroporées (pour les cellules MDA et PC3, appareil Néon, Invitrogen) avec le vecteur piège permettant l'expression constitutive de la protéine de fusion VN-HoxA9, et le vecteur exprimant l'activateur Tet-A. - De nombreuses cellules HEK fluorescentes ont pu être identifiées, par rapport aux autres 25 types de cellules, ceci étant dû à l'efficacité de la transfection, bien meilleure que celle obtenue par électroporation. - Le tri cellulaire a été effectué 48h après la transfection/électroporation par FACS LSRII. Exemple 6. Identification des ORFs contenus dans les cellules fluorescentes 30 - L'ADN génomique (ADNg) des cellules fluorescentes et non fluorescentes est extrait à l'aide du kit Nucleospin Tissue XS (Macherey Nagel). - A partir des différents extraits d'ADNg, les séquences comprenant la cassette CC-ORF sont spécifiquement amplifiées par PCR (40 cycles, enzyme GoTaq, Promega) à l'aide 3052788 32 d'oligonucléotides s'hybridant de part et d'autre de ces cassettes CC-ORF, sur les sites attBl (oligo de séquence SEQ ID NO. 6) et attB2 (oligo de séquence SEQ ID NO. 7). - Les produits d'amplification PCR se distribuent de 200 à 2000 paires de bases par observation après migration électrophorétique sur gel d'agarose en présence de bromure 5 d' éthidium. Pour chaque condition testée (c'est à dire les lignées CC-ORF HEK, MDA et PC3, triées en fluorescence, ou de départ (non triées)), les produits PCR sont séquencés sur la plateforme Ion Torrent PGM. - les données de séquençage sont analysées à l'aide d'un pipeline d'analyses bioinformatiques développé sous Galaxy (https://usegalaxy.org) et permettent ainsi d'identifier les ORFs en 10 présence par comparaison de type Blast avec les séquences de l'ORFeome humain v3.1. - Le tableau 3 ci-dessous montre les résultats obtenus avec cette méthode de criblage utilisant la protéine HoxA9 comme protéine piège ; en sachant que : o L'enrichissement correspond au rapport du nombre de lectures de chaque ORF entre les cellules triées et les cellules non triées pour chaque lignée cellulaire. 15 Plus ce rapport est élevé, plus l'ORF est préférentiellement enrichi dans les cellules triées par fluorescence. Cet enrichissement est le signe d'une probable interaction de la protéine codée par l'ORF avec HoxA9. o Seul un rapport supérieur ou égal à 7 est ici considéré pour sélectionner les interactions les plus significatives (en gras dans le tableau). 20 o « absent » indique que l'ORF n'est pas présent dans la lignée de départ. Cette absence ne permet donc pas de connaître les propriétés d'interaction de la protéine correspondante avec HoxA9. o « présent » indique que l'ORF est présent dans la lignée de départ (non triée) mais non retrouvé enrichi dans les cellules fluorescentes. Le moindre 25 enrichissement (même non significatif) est indiqué par une valeur. o Un ORF retrouvé non enrichi pour chaque lignée est également indiqué (HOP) car celui-ci a servi de contrôle négatif pour les expériences de validation. 3052788 33 Tableau 3. Bilan sur l'enrichissement en protéines de liaison à l'ADN capables d'interagir avec HoxA9 dans les différentes lignées Cellules HEK Cellules MDA Cellules PC3 ATF3 (activating transcription factor 3) x23 présent absent BANF1 (barrier to autointegration factor 1) x0,2 x74 absent BANP (BTG3 associated nuclear protein) présent présent x13 BZW2 (basic leucine zipper and W2 domains 2) x10 absent absent C14orf166 (chromosome 14 open reading frame 166) présent x26 présent CBX8 (chromobox homolog 8 (Pc class homolog, Drosophila) x1,5 absent x21 DLX1 (distal-less homeo box 1) x0,2 absent x14 DLX6 (distal-less homeo box 6) x5 x118 absent E2F3 (E2F transcription factor 3) x8 présent présent ENC2 (BTB/POZ KELCH domain protein) présent présent x11,5 GATA3 (GATA binding protein 3) x7 présent présent HMGN4 (high mobility group nucleosomal binding domain 4) présent x14 x7 HOP (homeodomain-only protein) présent x0,1 x0,1 HOXA9 (homeo box A9) x0,1 présent x9,5 ID2 (inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein) x9,5 présent présent ING3 (inhibitor of growth family, member 3) x0,8 x1,3 x47 KLF4 (Kruppel-like factor 4) x1,8 présent x15 LMX1A (LEVI homeobox transcription factor 1, alpha) présent x1,1 x12 NFYB (nuclear transcription factor Y, beta) x15 présent absent NR5A1 (nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1) présent absent x12 PHF23 (PHD finger protein 23) présent présent x17 PITX1 (paired-like homeodomain transcription factor 1) x1,4 x0,5 x17 POLR2H (polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide H) x11 absent absent POU2AF1 (POU domain, class 2, associating factor 1) présent absent x11 RNF138 (ring finger protein 138) x10 absent absent RNF32 (ring finger protein 32) présent absent x11,5 RUIVXT1 (runt-related transcription factor 1; translocated to, 1 (cyclin D-related)) absent absent x21 SOX6 (SRY (sex detennining region Y)-box 6) présent x44 présent 3052788 34 TCF19 (transcription factor 19 (SC1)) présent présent x15 THAP11 (THAP domain containing 11) présent x0,8 x24,5 ZBTB5 (zinc finger and BTB domain containing 5) présent absent x85 ZCCH4 (zinc finger, CCHC domain containing 4) x20 absent absent ZNF148 (zinc finger protein 148 (pHZ-52)) x16 présent présent ZNF273 (zinc finger protein 273) présent x7 x9 ZNF697 (zinc finger protein 697) x10 présent absent L'analyse des résultats obtenus montre un enrichissement de partenaires spécifique à chaque lignée cellulaire, indiquant donc que les propriétés d'interaction de HoxA9 changent en fonction du contexte cellulaire considéré. 5 Exemple 7. Validation de certaines interactions avec HoxA9 dans différents contextes cellulaires. Les partenaires candidats de HoxA9 sélectionnés à partir du crible dans les différentes lignées ont ensuite été testés de manière individuelle par complémentation de 10 fluorescence, mais dans des conditions légèrement différentes de celles du crible (voir plus loin). Deux ORFs identifiés dans la lignée MDA correspondent aux protéines DLX6 et BANF1. Une ORF correspondant à la protéine HOP est utilisé comme contrôle négatif (car 15 présent mais non enrichi dans chacune des lignées cellulaires criblées). Brièvement, chaque ORF est isolé individuellement de la banque plasmidique ORFeome v3.1 par PCR avec des amorces spécifiques. Le produit de PCR est ensuite cloné dans le vecteur Ghost-Blue en fusion avec CC à l'aide d'enzymes de restriction adéquates. Chaque ORF sélectionné se retrouve donc sous contrôle du promoteur Tet-A inductible (cf 20 Figure 1). Même si toutes les constructions sont testées à partir de vecteurs identiques à ceux utilisés lors du crible, les conditions du test en fluorescence sont malgré tout différentes de celles du crible. Chaque construction CC-ORF est en effet ici sous forme de copies multiples, et non sous forme d'intégration unique dans le génome, lors de l'expression provisoire avec les 25 constructions VN-HoxA9 et Tet-A dans la cellule par électroporation (cellules MDA et PC3) ou transfection (cellules HEK). 3052788 Ce biais expérimental peut expliquer la présence d'une fluorescence faible pour un cofacteur qui n'a pas été révélé lors du crible (due au nombre de copies dans la cellule). Le paramètre significatif reste donc la comparaison du niveau de fluorescence entre les différentes lignées. Les niveaux de fluorescence doivent normalement correspondre à 5 l'enrichissement observé lors du crible. Un vecteur d'expression de la protéine fluorescente rouge, co-électroporé ou cotransfecté avec chaque construction CC-ORF testée, permet de vérifier la qualité d'intégration dans les cellules. Le rapport vert/rouge est utilisé pour comparer les niveaux de fluorescence entre les différents contextes cellulaires. 10 Il a ainsi été montré que : - le partenaire BANF1 interagit environ cinq fois plus fortement avec HoxA9 dans les cellules MDA que les cellules HEK ; - le partenaire DLX6 interagit environ huit fois plus fortement avec HoxA9 dans les cellules MDA que les cellules HEK. 15 Ainsi, l'ensemble des observations obtenu dans cette étape « de vérification » est conforme avec les résultats du crible. 3052788 36 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES US 7,588,907 WO 2006/017279 5 Kerppola TK. Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 Jun;7(6):449-56. 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Vecteur proie selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que le fragment de la protéine fluorescente (A) est le fragment C-terminal de la Cerulean, ce fragment comprenant la séquence SEQ ID NO. 1. 4. Vecteur proie selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit vecteur est un vecteur dérivé d'un plasmide codant pour un lentivirus, comprenant des séquences de recombinaison « att » adaptées au système de clonage GATEWAY®. 5. Collection de vecteurs proies (V.) comprenant un nombre fini de vecteurs proies selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que: - le promoteur eucaryote inductible est identique dans tous les vecteurs (V.) de ladite collection de vecteurs proies; - le polynucléotide (a) codant pour le fragment C-terminal d'une protéine fluorescente est identique dans tous les vecteurs (V. ) de ladite collection de vecteurs proies; et - dans un vecteur (V.) donné le polynucléotide (b.) codant pour la protéine proie (B.) est distinct des autres polynucléotides (b.) compris dans chacun des autres vecteurs (V.); - x étant un nombre entier compris entre 1 et 30000. 6. Collection de vecteurs proies (V.) selon la revendication 5, dans laquelle les polynucléotides (b.) codant pour les protéines proies (B.) sont issus de l'un des ORFéomes humains suivants : v3.1, v4.1, v5.1, v6.1, v7.1, v8.1 et v9.1. 3052788 39 7. Banque de cellules mammifères, dans laquelle chaque cellule comprend de manière stable au moins l'un des vecteurs de la collection de vecteurs (V.) selon l'une des revendications 5 à 6. 8. Banque de cellules selon la revendication 7, caractérisée en ce que les cellules sont des 5 cellules humaines cancéreuses, et plus particulièrement en ce que les cellules sont issues de l'une des lignées suivantes : MDA-MB231, PC-3, et SKOV. 9. Banque de cellules selon la revendication 7, caractérisée en ce que les cellules sont des cellules humaines non cancéreuses, et plus particulièrement en ce que les cellules sont issues de la lignée des cellules humaines HEK-293. 10 10. Méthode de criblage de protéines proie (B.) susceptibles d'interagir avec une protéine d'intérêt ci-après désignée « protéine piège », comprenant les étapes suivantes : - induction du promoteur inductible compris dans le vecteur proie des cellules de la banque selon l'une des revendications 7 à 9, 15 lesdites cellules ayant intégré de manière transitoire un ou plusieurs vecteur(s) eucaryote(s), dit(s) « vecteur piège », incluant une cassette d'expression comprenant un promoteur eucaryote sous le contrôle duquel est placé un acide nucléique codant une protéine de fusion comprenant un fragment N-terminal (A') complémentaire du fragment C-terminal (A) de la 20 protéine fluorescente, et une protéine piège (B'), ledit acide nucléique comprenant : - un polynucléotide (a') codant pour ledit fragment N-terminal de la protéine fluorescente, et - un polynucléotide (b') codant pour ladite protéine piège ; 25 - isolement de la ou des cellules présentant un signal fluorescent, dans laquelle les fragments complémentaires (A) et (A') sont mis en contact par l'interaction entre les protéines proie (B.) et piège (B'); et - identification par séquençage du polynucléotide (b.) codant pour la protéine proie (B.), compris dans le vecteur proie (Vs) compris dans ladite cellule présentant un 30 signal fluorescent. 11. Méthode de criblage selon la revendication 10, caractérisée en ce que : - lesdites cellules ont intégré deux à trois vecteurs pièges, le premier comprenant un polynucléotide (a' 1) et un polynucléotide (b' 1), le deuxième comprenant un 3052788 polynucléotide (a'2) et un polynucléotide (b'2) et optionnellement le troisième comprenant un polynucléotide (a'3) et un polynucléotide (b'3), et que - lesdits polynucléotides (b'i) (b'2) et (b'3) codant pour lesdites protéines pièges et 5 lesdits polynucléotides (a'1) (a'2) et (a'3) codant pour lesdits fragments N- terminaux de protéines fluorescentes sont distincts. 12. Méthode de criblage selon la revendication 11, caractérisée en ce que : - le premier vecteur piège comprend un polynucléotide (b' 1) codant pour une 10 protéine piège et un polynucléotide (a'1) codant pour un fragment N-terminal de Venus, ce fragment comprenant la séquence SEQ ID NO. 3, - et le deuxième vecteur piège comprend un polynucléotide (b'2) codant pour une protéine piège et un polynucléotide (a'2) codant pour un fragment N-terminal de SfGFP, ce fragment comprenant la séquence SEQ ID NO. 4. 15 13. Kit de détection d'interaction protéine-protéine, comprenant : (i) une banque de cellules mammifères selon l'une des revendications 7 à 9 ; (ii) des réactifs permettant l'intégration des vecteurs pièges tels que décrits dans l'une des revendications 10 à 12, dans lesdites cellules ; 20 (iii) des réactifs permettant l'induction du promoteur inductible ; (iv) un protocole décrivant les étapes nécessaires à la détection des interactions protéine-protéine.