Brevet FR3057267A1 — publié le 20180413

PROCÉDÉ DE DIAGNOSTIC/DÉTERMINATION DE L'EFFICACITÉ DE TRAITEMENT DE LA DÉPRESSION Domaine technique La présente invention se rapporte à notamment à des anticorps polyclonaux dirigés contre des peptides, notamment dérivés du propeptide de séquence QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPRGGRWRR, ci-après nommé PE. La présente invention se rapporte également à des anticorps polyclonaux dirigés contre des peptides, notamment ceux dérivés du propeptide de séquence QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPRGGRWRR à l'exception du fragment 12-18 dudit propeptide, ci-après nommé Mini15 Spadine. La présente invention se rapporte également à un procédé de détection de la dépression et à un procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement anti-dépresseur. La présente invention permet avantageusement d'utiliser le 20 dosage de peptides pour le diagnostic de la réponse au traitement antidépresseur dans la dépression majeure sans être affecté par le traitement avec la Mini-Spadine mature ou avec ses extrémités modifiées. La présente invention trouve une application notamment dans l'industrie pharmaceutique et notamment dans le développement d'outils de 25 diagnostic utilisés dans la prévention et / ou la surveillance des maladies psychiatriques, en particulier des patients souffrant ou ayant souffert de la dépression. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. 30 État de la technique 3057267 2 Les maladies psychiatriques représentent un réel problème de Santé Publique. Les travaux les plus récents ont confirmé la forte prévalence de la dépression : sur leur vie entière, 20% des femmes et 10% des hommes ont fait, font ou feront un épisode dépressif [1]. De tels 5 chiffres sont à l'évidence marquants ; ils le sont plus encore lorsqu'on s'intéresse à la complication majeure de la dépression, le suicide, qui se chiffre à 12000 décès par an dans des pays comme la France [2]. La dépression est une maladie très fréquente et souvent handicapante. Elle peut toucher jusqu'à 20% de la population dans les 10 pays industrialisés. Ses origines sont diverses et multiples. Cette pathologie affecte aussi bien le psychisme que le comportement et la physiologie des patients. Les traitements de la dépression sont également multiples et les mécanismes d'action des médicaments utilisés ne sont pas clairement établis. L'organisation mondiale de la santé (OMS) prévoit que la dépression unipolaire sera la deuxième cause de handicap en 2020. A la souffrance personnelle et familiale que représente la dépression s'ajoute le poids social important de cette pathologie. La dépression représente déjà l'une des premières causes d'arrêt du travail, avec une charge économique qui s'élève à plus de 30 milliards d'euros par an. Malgré l'arsenal thérapeutique mis à disposition du corps médical, en particulier les SSRI (« selective serotonin reuptake inhibitors ») et SNRI (« serotonin norepinephrine reuptake inhibitors »), 30% de la population dépressive n'a pas de traitement. Par ailleurs, le délai d'action des antidépresseurs est de l'ordre de 3 à 6 semaines et les effets secondaires sont souvent importants. D'une façon générale, on estime que 15% des patients déprimés décèdent par suicide. Chez la plupart des malades, la dépression est due à l'interaction entre une prédisposition génétique et des facteurs environnementaux comme le stress ou les traumatismes émotionnels [3] . La maladie est fréquente et le marché des antidépresseurs (AD) est immense (au moins 10 milliards d'euros par an). 3057267 3 Néanmoins, si ces antidépresseurs améliorent l'état des patients dans environ 70% des cas, ils n'entraînent une rémission complète de la maladie que chez 30 à 40% d'entre eux. De plus, près d'un tiers des sujets traités résiste aux traitements existants. Cet état de fait oblige donc à 5 envisager de nouveaux traitements, capables de prendre en compte les mécanismes de la dépression [3]. Dans l'arsenal thérapeutique mis à disposition du corps médical, les antidépresseurs tricycliques (TCA) avec l'amitriptyline et l'imipramine ont été les premiers découverts, suivis par les inhibiteurs de la monoamine 10 oxydase (IMAO), irréversibles et non sélectifs comme la phénelzine et la pargyline. Les effets indésirables, en particulier la cardiotoxicité des TCA (surtout en cas de surdosage) et les crises hypertensives des IMAO (interactions avec la tyramine alimentaire, le fameux « cheese effect ») ont poussé la recherche vers de nouvelles molécules d'efficacité thérapeutique 15 identique mais de meilleure acceptabilité. La notion de sélectivité est alors apparue avec les inhibiteurs spécifiques de la recapture de la noradrénaline (NA) ou de la sérotonine (5-hydroxytryptamine ou 5HT). Les essais cliniques de phase III ont démontré pour ces nouvelles molécules une efficacité équivalente aux 20 antidépresseurs de première génération et une meilleure sécurité, notamment en cas de surdosage. Les inhibiteurs spécifiques de la recapture de la sérotonine (SSRI) et les inhibiteurs spécifiques de la recapture de la noradrénaline (SNRI) sont actuellement les molécules les plus utilisées [4-5]. Les AD 25 sont ainsi le plus souvent associés à une facilitation de la transmission des systèmes monoaminergiques. Bien que la sérotonine, la noradrénaline et la dopamine sont impliquées de façon certaine, il est admis aujourd'hui que les modifications des taux de monoamines produites par les AD et les processus adaptatifs 30 qui en découlent, en particulier l'altération de la sensibilité de certains de leurs récepteurs, ne peuvent expliquer à eux seuls le mécanisme d'action des antidépresseurs. 3057267 4 Ainsi, il est difficile de corréler le délai de 3 à 6 semaines nécessaire à l'obtention des AD avec l'augmentation des taux synaptiques de monoamines, qui intervient dès la première administration du produit. En près d'un demi-siècle, le nombre d'hypothèses sur la pathogénèse de la 5 dépression et son traitement n'a cessé d'évoluer. Par exemple, des concentrations élevées de glucocorticoïdes sont généralement associées à un effet négatif de l'humeur, ainsi que des altérations structurelles de l'hippocampe, par l'intermédiaire d'une diminution de la synthèse de BDNF (« brain-derivated neurotrophic 10 factor »), d'une sécrétion excessive d'acide glutamique et/ou d'une diminution de la capture du glucose [6]. Conformément à ces observations, des inhibiteurs de la synthèse des glucocorticoïdes et des antagonistes des récepteurs de glucocorticoïdes exercent des effets de type AD [7]. 15 Des antagonistes agissant sur les récepteurs de la substance P, en particulier le NK1, ou le récepteur CRF (« corticotropin-releasing factor »), ainsi que des antagonistes des récepteurs du NMDA ont été développés avec une certaine efficacité [8-10]. Diverses études récentes réalisées dans des situations de 20 stress et des modèles de dépression ont impliqué la neurogenèse dans l'étiologie des troubles dépressifs majeurs [11-13]. Il a été démontré que tous les traitements chroniques AD, y compris l'électrochoc, stimulent la prolifération des cellules progénitrices à l'origine des neurones de la couche granulaire de l'hippocampe. 25 On sait également que les AD modulent l'expression de différents facteurs impliqués dans la survie et la croissance des cellules, tels que la CREB, le BcI2 ou les MAP-kinases. Toutefois, l'importance fonctionnelle de ces neurones néoformés dans la physiopathologie des troubles de l'humeur reste controversée [14]. 30 L'ensemble de ces indications montrent que la dépression est une maladie complexe dont la physiopathologie est multifactorielle et, en conséquence, le traitement d'une telle pathologie reste un challenge. 3057267 5 Depuis plus de quarante ans, la recherche sur la dépression et le développement de médicaments efficaces a été dominée par l'hypothèse monoaminergique. Bien que les neurotransmetteurs monoaminergiques (sérotonine, noradrénaline et dopamine) sont impliqués 5 de façon indiscutable, le nombre d'hypothèses sur la physiopathologie de la dépression et les mécanismes d'action des AD n'a cessé d'évoluer. Les médicaments AD utilisés aujourd'hui produisent une gamme d'effets indésirables, parmi lesquels la sécheresse de la bouche, la vision floue et l'altération de la fonction intestinale (diarrhée ou constipation). 10 Même si beaucoup d'effets secondaires sont passagers (comme la nausée), certains semblent être constants au fil du temps (comme les effets sexuels) et risquent d'affecter l'assiduité au traitement à long terme. C'est la raison pour laquelle la recherche de nouvelles molécules agissant sur des récepteurs ou canaux nouvellement identifiés dans la dépression 15 est cruciale. Certaines protéines, récepteurs et canaux, ont été impliqués dans les mécanismes moléculaires de la dépression. C'est notamment le cas du récepteur 3 de la neurotensine (NTRS3), originellement appelé sortiline, dont l'inactivation chez la souris produit un phénotype de 20 résistance à la dépression, analogue à celui qui a été observé chez des souris invalidées pour le canal potassique de fond TREK-1. L'étude récente STAR*D (Sequenced Treatment Alternatives to Relieve Depression) [1 5] , a identifié de manière pharmacogénétique TREK-1 comme le gène impliqué dans la réponse antidépressive chez 25 l'homme. Cette étude suggère également l'utilité d'un modèle animal pour la recherche de traitements antidépresseur dans l'identification de gènes candidats pour une étude chez l'homme. Des bloqueurs des canaux TREK-1 représentent donc un nouveau concept dans le domaine de la conception de médicaments antidépresseurs. 30 Les épisodes de trouble dépressif majeur (TDM) sont traités avec différentes classes de médicaments. Cependant, les traitements principaux actuels, après plusieurs semaines, permettent environ 35% de 3057267 6 remissions, et environ 30% des patients TDM sont classés comme souffrant de dépression résistante à un traitement (DRT) [1, 16, 17]. En dépit des efforts importants de recherche visant à comprendre les fondements neurobiologiques de TDM les traitements sont encore basés 5 uniquement sur l'évaluation relativement subjective des symptômes. En raison du faible taux de rémission, l'identification de marqueurs biologiques solides prédisant l'évolution clinique de TDM et caractérisant l'étendue du résultat du traitement apparait donc obligatoire [3]. Des études cliniques et précliniques ont identifié un certain nombre de facteurs qui peuvent servir 10 en tant que biomarqueurs putatifs pour le diagnostic et le traitement de TDM. Cependant, l'utilité d'un quelconque marqueur donné pour servir en tant que biomarqueur cliniquement utile de TDM est limitée par un manque de sensibilité et de spécificité [18-19]. Des études récentes ont identifié le facteur neurotrophique 15 dérivé du cerveau (« Brain Derived Neurotrophic Factor » (BDNF)) en tant que biomarqueur potentiel de la réponse clinique dans la pharmacothérapie antidépressive et du devenir clinique [20-21]. La sortiline est connue pour contrôler la régulation du trafic intracellulaire de la voie sécrétoire du facteur neurotrophique BDNF [22]. 2 0 En outre, les taux sériques accrus de sortiline ont été indiqués comme associés à des TDM et corrélées avec le facteur neurotrophique BDNF [23-24]. Des protéines ont été également identifiées en liaison avec la dépression. La spadine est un peptide partiel (12-28) du propeptide de 44 25 acides aminés (PE) générée à partir de la maturation de la sortiline [25], également appelé récepteur de la neurotensine-3 [26]. Lorsqu'ils sont injectés par la voie intraveineuse ou intrapéritonéale chez des souris, la spadine et le propeptide ont démontré de puissantes activités antidépressives (AD) par inhibition de l'activité du canal potassique TREK- 30 1 [27] qui est une cible pour le traitement de la dépression [28]. 3057267 7 Toutefois, malgré d'intenses recherches sur les mécanismes sous-jacents de la physiopathologie dépressive, des biomarqueurs fiables pour évaluer la réponse au traitement antidépresseur font encore défaut. Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen palliant ces 5 défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant de détecter physiologiquement un état dépressif, en particulier un trouble dépressif majeur. Il existe également un réel besoin de trouver un moyen palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, notamment un 10 procédé permettant d'évaluer l'efficacité d'un traitement de la dépression, afin notamment réduire les coûts et d'améliorer l'efficacité du traitement de la dépression, en particulier un trouble dépressif majeur. Description de l'invention 15 La présente invention permet précisément de résoudre et de surmonter les obstacles et inconvénients de l'art antérieur précités en fournissant des anticorps polyclonaux se liant notamment à la spadine et à son propeptide. Les inventeurs sont les premiers à avoir élaboré des anticorps 20 permettant de mesurer la concentration de spadine et du propeptide et ses fragments dans un échantillon biologique. En particulier, les inventeurs ont démontré que deux peptides humains, à savoir le Propeptide et/ou la Spadine et la Mini-Spadine peuvent être indépendamment mesurés à partir d'échantillons de sérums humains. En outre, les inventeurs ont également 25 démontré de manière surprenante que la spadine et le propeptide sont des marqueurs biologiques efficaces de la dépression, en particulier du trouble dépressif majeur. La présente invention a notamment pour objet un anticorps polyclonal anti-peptidique dérivé du PE à l'exception du fragment 12-18 et un anticorps dirigé contre la séquence 12-18 du PE. 30 En particulier, la présente invention a pour objet des anticorps polyclonaux (AB1) dirigés contre le peptide de séquence APLPRWSGPIGVSWGLR (Spadine et/ou PE) et des anticorps 3057267 8 polyclonaux (AB2) dirigés contre les peptides comprenant la séquence GVSWGLR (Mini-Spadine). Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que l'anticorps polyclonal AB1 se lie aux peptides choisis dans le groupe 5 comprenant : QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPRGGRWRR, APLPRWSGPIGVSWGLR, APLPRWSGPIGVSWGL, LPRWSGPIGVSW et WSGPI à l'exception du peptide GVSWGLR seul. Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante 10 que l'anticorps polyclonal AB2 se lie aux peptides se lie aux peptides choisis dans le groupe comprenant : QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPRGGRWRR, APLPRWSGPIGVSWGLR et GVSWGLR. Dans la présente par propeptide ou PE on entend le peptide de 15 séquence :QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPRGGR WRR. Dans la présente par PE 12-28 ou spadine on entend le fragment peptidique des peptides 12 à 28 du propeptide à savoir APLPRWSGPIGVSWGLR. Dans la présente par PE 12-27 on entend le 20 fragment peptidique des peptides 12 à 27 du propeptide à savoir: APLPRWSGPIGVSWGL. Dans la présente par PE 14-25 on entend le fragment peptidique des peptides 14 à 25 du propeptide à savoir: LPRWSGPIGVSW. Dans la présente par PE 1-16 ou pro-spadine on 25 entend le fragment peptidique des peptides 1 à 16 du propeptide à savoir: QDRLDAPPPPAAPLPR. Dans la présente par PE 22-28 ou spadine (1218) ou mini-spadine on entend le fragment peptidique des peptides 22 à 28 du propeptide ou le fragment peptidique des peptides 12 à 18 de la spadine à savoir: GVSWGLR. 30 La présente invention a notamment pour objet un procédé de fabrication des anticorps polyclonaux de l'invention. 3057267 9 Le procédé de fabrication des anticorps polyclonaux de l'invention peut comprendre les étapes suivantes : a. administration d'une composition comprenant un peptide de séquence APLPRWSGPIGVSWGLR ou un peptide de 5 séquence GVSWGLR à un animal b. récupération de l'anticorps dudit animal, et c. isolement dudit anticorps. Dans la présente la composition comprenant un peptide de séquence APLPRWSGPIGVSWGLR ou un peptide de séquence 10 GVSWGLR peut être une composition immunogénique. Il peut s'agir par exemple d'une composition comprenant au moins un adjuvant. Il peut s'agir par exemple de toute composition immunogénique connue de l'homme du métier adapté. Dans la présente, par adjuvant on entend tout adjuvant 15 immunogénique connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un adjuvant de Freund, de l'Alun. Dans la présente, les anticorps de l'invention peuvent être produits par tout procédé adapté par exemple le procédé décrit dans Lee, B.S., Huang, J.S., Jayathilaka, L.P., Lee, J., Gupta, S. 2016. Antibody 2 0 production with synthetic peptides. High resolution imaging of cellular proteins, vol 1474 of the series Methods in Molecular Biology, 25-47. [29] La présente invention a notamment pour objet l'utilisation in-vitro des anticorps de l'invention pour la détection/dosage de la spadine dans un échantillon biologique. 25 Dans la présente, les anticorps de l'invention peuvent être utilisés dans tout procédé de dosage/détection adapté connu de l'homme du métier. Il peut s'agir d'un procédé d'immunodosage, par exemple un dosage ELISA ou AlphaLISA. La présente invention a notamment pour objet l'utilisation in-vitro 30 des anticorps de l'invention pour la détection d'un état dépressif à partir d'un échantillon biologique d'un individu. 3057267 10 Dans la présente par « état dépressif » on entend un individu présentant un trouble de l'humeur accompagné de tristesse et de souffrance morale. Il peut s'agir par exemple de tout état dépressif connu de l'homme du métier, par exemple un trouble dépressif majeur (TDM). 5 Selon l'invention, par « individu » on entend un mammifère choisi dans le groupe comprenant l'ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, 10 Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea. Il peut s'agir par exemple d'un humain ou d'un animal. Dans la présente, par « échantillon biologique », on entend 15 tout échantillon obtenu à partir de mammifères, par exemple un mammifère choisi dans le groupe comprenant l'ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par 20 exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea. Il peut s'agir par exemple d'un humain ou d'un animal. Selon l'invention, l'échantillon biologique peut être tout liquide 25 biologique, par exemple, il peut s'agir d'un échantillon de sang, de plasma, de sérum, de liquide céphalorachidien (LCR), de mucus vaginal, de mucus nasal, de salive, d'urine et/ou de lait. De préférence l'échantillon biologique est un échantillon de sang ou un échantillon de sérum. La présente invention a également pour objet un procédé in-30 vitro de détection/détermination de la dépression chez un patient comprenant les étapes suivantes 3057267 11 a. Mesure de la concentration (Cm) du peptide de séquence QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPRG GRWRR dans un échantillon biologique d'un individu depressif, 5 b. Comparaison de la concentration (Cm) du peptide mesurée à l'étape a) avec une concentration de référence (Cref) d'un individu sain et calcul d'un score (Si) selon la formule suivante : 51= Cm/Cref 10 une valeur de S1 inférieur à 1 indiquant que l'individu à partir duquel a été obtenu l'échantillon est dépressif. Selon l'invention la mesure de la concentration du peptide de séquence QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPRGGRWRR peut 15 être réalisée selon le procédé décrit dans [27] incorporé ici par référence et/ou avec des procédés immunologiques connus de l'homme métier en utilisant les anticorps polyclonaux de l'invention définie ci-dessus Selon l'invention la « concentration de référence du peptide » (Cref) peut-être la concentration dudit peptide chez un sujet sain et/ou 20 groupe de sujets sains de référence. Dans la présente par « sujet sain de référence », on entend un mammifère, par exemple un être humain, ne présentant pas d'état dépressif et/ou n'ayant pas présenté d'état dépressif et/ou ne présentant pas de trouble dépressif majeur et/ou n'ayant pas présenté de trouble 25 dépressif majeur. Selon l'invention par « groupe de sujets de référence » on entend un groupe permettant de définir une valeur de référence fiable. Il peut s'agir par exemple d'un groupe comprenant au moins 2 sujets de référence tel que définis ci-dessus, par exemple au moins 40 sujets de 30 référence. Il peut s'agir par exemple d'un groupe comprenant de 40 à 200 sujets de référence. 3057267 12 Selon l'invention lors de l'étape de comparaison de la concentration (Cm) du peptide mesurée avec une concentration de référence du peptide (Cref), la concentration de référence du peptide (Cref) de préférence correspond à une concentration mesurée à partir d'un 5 échantillon biologique d'un sujet ou groupe de sujets sains de référence avec des caractéristiques physiologiques similaires par exemple choisies dans le groupe comprenant l'âge, le poids, le sexe, la masse corporelle, abus de drogues, tabac, alcool. 10 La présente invention a en outre pour objet un procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement sur la dépression comprenant : a) Mesure de la concentration Cl du peptide de séquence QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPR GGRWRR dans un échantillon biologique d'un individu 15 b) Mesure de la concentration C2 du peptide de séquence QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPR GGRWRR dans un échantillon biologique dudit individu après ledit traitement, c) Comparaison des valeurs de concentration et calcul d'un 20 score (S2) selon la formule suivante : S2 = C2/ Ci, une valeur de S2 supérieure à 1,2 indiquant que le traitement est un antidépresseur efficace. Dans la présente par « traitement » on entend par exemple un 25 traitement médical, par exemple allopathique, faisant intervenir la prise de molécules, par exemple des molécules chimiques, par exemple des molécules obtenues par synthèse organique, des molécules d'origines biologiques, par exemple des protéines, des molécules provenant d'organismes vivants, par exemple de mammifères, de microorganismes, 30 de plantes et/ou synthétisées par des organismes vivant, par exemple des protéines, des molécules d'acides nucléique, ou tout autre traitement non chimique, par exemple la rééducation, ou tout autre traitement basé sur la 3057267 13 thérapie cellulaire, par exemple l'injection de cellules souches, l'injection de cellules neuronales dédifférenciées. Dans la présente le traitement peut être tout traitement antidépresseur connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple de 5 traitement utilisant des SSRI (« selective serotonin reuptake inhibitors »), des SNRI (« serotonin norepinephrine reuptake inhibitors »), les antidépresseurs tricycliques (TCA), les inhibiteurs de la monoamine oxydase (IMAO), irréversibles et non sélectifs, des antagonistes agissant sur les récepteurs de la substance P, des antagonistes des récepteurs du 10 NMDA Avantageusement, la présente invention permet de mesurer la quantité de peptides dérivés de la Sortiline dans un échantillon biologique, par exemple un échantillon de sang issu d'un mammifère tout en évitant de doser la mini-spadine qui peut correspondre à la molécule active utilisé 15 dans un traitement antidépresseur. En outre, la présente invention permet avantageusement, lorsque la mini-spadine (12-18) est utilisée comme médicament antidépresseur, de surveiller et de contrôler les doses efficaces dans chaque patient. En d'autres termes, les anticorps de l'invention permettent 20 avantageusement de différencier les peptides endogènes dérivés de la Sortiline de peptides exogènes, la mini-spadine (12-18), récupérés dans le sérum humain. L'utilisation des anticorps dans des procédés de mesure de concentrations selon l'invention et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement 25 antidéprésseur permet avantageusement avec AB1 de mesurer les niveaux sériques de peptides dérivés de Sortiline de contrôles/individus sains et des individus/patients dépressifs même si ils sont traités avec la mini-Spadine (12-18), et de mesurer l'efficacité de la biodisponibilité miniSpadine (12-18) avec la différence obtenue entre les peptides mesurées 30 avec AB2 et les peptides mesurées avec AB1 comme décrit dans la figure 1A. 305 726 7 14 Brève description des figures : Figure 1 : la figure 1A est un diagramme représentant les relations structure-reconnaissance des anticorps AB1 et AB2 en fonction des différents fragments. Sur cette figure + signifie que l'anticorps reconnait le 5 fragment et - signifie qu'il n'est pas reconnu, n.t. correspond a non testé Les figures 1B et 1C) représentent les affinités relatives pour la Spadine, le PE et des analogues dosés par la méthode de détection. Tel que montré sur la figure 1B, les deux Spadines (Spadine et miniSpadine) et l'ensemble du PE ont été reconnus par des anticorps anti- 10 Spadine avec un IC50 respectivement de 2,50 nM (IC à 95%: 1,85 à 3,37; n = 6) et de 2,18 nM (IC à 95%: 1,53 à 3,09; n = 3), neurotensine (NT, carrés noirs) et la somatostatine-14 (SS14, carrés blancs) n'ont pas été reconnues par les anticorps. Tel que montré sur la figure 1C le fragment 14-25 du PE est liée aux 15 anticorps avec un IC50 de 1,73 nM, alors que l'IC50 du fragment 12-27 du PE était de 3,44 nM, le fragment 22-28 du PE (carrés blancs) et fragment 1-16 du PE (carrés noirs) ne sont pas reconnues par les anticorps. Chaque point correspond à la moyenne ± SEM de 3 à 6 expériences indépendantes. 20 La figure 1D représente les résultats de tests de la nage forcée de Porsolt (FST). Les souris traitées avec la Spadine ou des peptides partiels avaient un temps plus court d'immobilité par rapport à ceux obtenus avec une solution saline. (D'une façon ordinaire ANOVA, F5,54 =20,21, **** p non Non (pro- spadine) 1000 détectable LPRWSGPIGVSW PE14-25 3,44 0,8 - 300 Oui 3057267 22 (2,44- 4,85) APLPRWSGPIGVSWGL PE12-27 1,73 1,5 - 400 Oui (1,34- 2,24) GVSWGLR PE22-28 > Non Oui 1000 détectable Pour mieux comprendre les variations des niveaux de PE dans la pathologie de la dépression, l'ensemble des sérums humains provenant d'un centre clinique de l'Italie ont été recueillis. 5 Dans la cohorte, il a été déterminé que la concentration de PE était significativement plus faible chez les patients atteints de trouble dépressif majeur (TDM) (18,9 ± 1,3 nM) que chez les témoins sains (23,7 ± 1,5 nM) (z = -2,11, p = 0,035) (Figure 2). Les patients avec un trouble dépressif majeur traités pendant 12 semaines avec des antidépresseurs 10 ont montré un niveau de PE significativement plus élevé qu'avant le traitement (21,0 ± 1,5 nM) (z = -1,98, p = 0,047) (figure 2). L'efficacité du traitement a été confirmée par la diminution significative de la MADRS (figure 2). 15 Discussion Tel que démontré dans cet exemple l'anticorps utilisé reconnaît qu'une série de peptides dérivés du PE humain, ainsi que le PE lui-même et pas des peptides non-apparentés comme la neurotensine ou la somatostatine. 20 Tel que démontré, les peptides reconnus par l'anticorps ont des activités antidépresseurs tels que démontré par le test de la nage forcée chez la souris (figure 1 D). Cet exemple démontre clairement que la concentration de PE de sérum est régulée à la baisse, c'est-à-dire est inférieure chez les 25 patients avec un trouble dépressif majeur (TDM) en comparaison avec des 3057267 23 sujets sains. Cet exemple démontre également clairement que la concentration de PE varie avec un traitement antidépresseur et permet notamment chez des patients présentant une concentration de propeptide inférieure à la normale un retour à la normale en corrélation avec 5 l'évolution clinique du traitement de la dépression. Cet exemple démontre donc clairement que la concentration de propeptide est un marqueur de l'état dépressif et peut être utilisé pour détecter/déterminer un état dépressif, par exemple un trouble majeur dépressif, et également pour déterminer/suivre l'efficacité d'un traitement 10 antidépresseur. La concentration sérique de PE est un marqueur supplémentaire au marqueur niveau sérique connu, par exemple le BDNF [31]. La concentration sérique de PE est significativement plus faible chez les patients TDM, et en tenant compte du fait que les peptides 15 mesurés dans le présent exemple ont été générés à partir de sortiline, une étude de la corrélation éventuelle avec le niveau et / ou l'expression sortiline a été effectuée. Fait intéressant, la variation de l'expression de la sortiline dans le sang a déjà été observée chez les patients atteints de TDM. Tout d'abord, dans les cellules mononucléaires du sang, l'expression 20 génétique de la sortiline diminue avec l'amélioration clinique [23], tandis que la sortiline est surexprimée chez les patients troubles dépressifs majeurs, notamment chez les non-répondeurs [32]. D'autre part, dans le sérum humain, l'augmentation du niveau de la sortiline est associée à l'état de dépression [24]. 25 Les résultats obtenus démontrent que la concentration sérique du PE varie en fonction des symptômes de l'humeur chez l'homme, et est un biomarqueur supplémentaire de la dépression en addition ou remplacement du BDNF et/ou le VEGF [24]. De plus, la possible utilisation ultérieure de Spadine comme une thérapie efficace contre la pathologie, un 30 peptide pour lequel le taux sérique pourrait également être contrôlé, va certainement grandement améliorer les perspectives de nouvelles stratégies pour gérer efficacement la dépression dans le monde. 3057267 24 Exemple 2: procédé d'obtention des anticorps AB1 et AB2 et détermination de leurs spécificités Les deux anticorps ont été préparés à partir de lapin et les 5 volumes obtenus sont environ 200 ml de chaque. Dans les protocoles expérimentaux, ces anticorps sont utilisés à des dilutions de 1/1000 et 1/5000. Les techniques utilisées pour mesurer le niveau du pro-peptide dans le sang sont multiples, immunologique ou fluorescence. Le dosage du peptide peut être obtenu avec 100 pl de sang et reproductible. 10 La figure 1 indique les spécificités de liaisons en fonctions des anticorps. 3057267 25 Liste de références 1. Wong, M. & Licinio, J. Research and treatment approaches to depression. Nat Rev Neurosci. 2, 343-351 (2001). 5 2. Moller HJ. Suicide, suicidality and suicide prevention in affective disorders. Acta Psychiatr Scand; 418 (suppl) : 73-80 (2003). 3. Nestler, E. et al. Neurobiology of depression. Neuron 34, 13-25 (2002). 4. Baghai TC, Volz HP, Moller HJ. Drug treatment of depression in the 10 2000s: An overview of achievements in the last 10 years and future possibilities.World J Biol Psychiatry; 7(4):198-222 (2006). 5. Weilburg JB. An overview of SSRI and SNRI therapies for depression. Manag Care. Jun; 13 (6 Suppl Depression): 25-337 (2004). 15 6. Manji HK, Gottesman II, Gould TD. 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Procédé de fabrication des anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3 comprenant : a. administration d'une composition comprenant un peptide de séquence APLPRWSGPIGVSWGLR à un animal b. récupération de l'anticorps dudit animal, et c. isolement dudit anticorps. 6. Procédé de fabrication des anticorps selon l'une quelconque des revendications 2 ou 4 comprenant : a. administration d'une composition comprenant un peptide de séquence GVSWGLR à un animal b. récupération de l'anticorps dudit animal, et c. isolement dudit anticorps 3057267 30 7. Utilisation in-vitro des anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la détection/dosage de la spadine dans un échantillon. 5 8. Utilisation in-vitro des anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la détection d'un état dépressif à partir d'un échantillon biologique d'un individu. 10 9. Procédé in-vitro de détection /détermination de la dépression chez un patient comprenant les étapes suivantes a. Mesure de la concentration (Cm) du peptide de séquence QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPRGGR WRR dans un échantillon biologique d'un individu dépressif, 15 b. Comparaison de la concentration du peptide mesurée à l'étape a) avec une concentration de référence (Cref) d'un individu sain et calcul d'un score (Si) selon la formule suivante : S1= Cm/Cref une valeur de S1 inférieur à 1 indiquant que l'individu à partir duquel a été 2 0 obtenu l'échantillon est dépressif. 10. Procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement sur la dépression comprenant : d) Mesure de la concentration C1 du peptide de séquence 25 QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPR GGRWRR dans un échantillon biologique d'un individu, e) Mesure de la concentration C2 du peptide de séquence QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPR GGRWRR dans un échantillon biologique dudit individu 30 après ledit traitement, f) Comparaison des valeurs de concentration et calcul d'un score (S2) selon la formule suivante : 3057267 31 S2 = C2 / Ci, une valeur de S2 supérieure à 1,2 indiquant que le traitement est un antidépresseur efficace. 5