Brevet FR3060745A1 — publié le 20180622

PROCEDE DE MISE EN SUSPENSION DES ANALYTES CONTENUS DANS UN ECHANTILLON SANGUIN PREALABLEMENT SECHE SUR UN PAPIER BUVARD La présente invention concerne le domaine médical en général, et en particulier le domaine du diagnostic in vitro. Elle a trait plus spécifiquement à l'extraction des analytes contenus dans un échantillon sanguin préalablement séché sur papier buvard comme utilisé dans la technologie DBS. Il y a maintenant plus d'un siècle, Ivar Bang décrivait une méthode de prélèvement sanguin capillaire non invasive séché sur papier buvard pour l'estimation de la teneur en glucose comme alternative au prélèvement sanguin classique, veineux, stockés dans des tubes. Cette technologie, appelée le « Dried Blood Spot » ou DBS, est basée sur le dépôt d'une goutte de sang sur un papier buvard adapté et qui est séché avant conservation et analyse. En 1963, Robert Guthrie et al. (A simple phenylalanine method for detecting 15 phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics.1963; 32: 338-343) ont utilisé cette technologie pour développer le dépistage néonatal systématique de la phénylcétonurie. Mise en place pour la première fois en Ecosse, l'utilisation du DBS a été étendue chez le nourrisson au Royaume-Uni dans les années 70, principalement pour détecter les erreurs innées du métabolisme qui peuvent faire l'objet d'une prise en charge 20 thérapeutique. Actuellement, l'utilisation du DBS reste presque exclusivement limitée au dépistage néonatal. En France, le prélèvement capillaire et sa préservation sur papier buvard a été mis en place en 1978 par l'Association française de dépistage et de prévention des handicaps de l'enfant. Le prélèvement de sang capillaire chez les nouveau-nés permet en plus de la 25 détection de la phénylcétonurie, la détection de l'hypothyroïdie congénitale, l'hyperplasie congénitale des surrénales, la mucoviscidose ou encore de la drépanocytose. Ainsi, le principe de la technologie DBS repose sur le prélèvement d'un échantillon sanguin, l'application de l'échantillon prélevé sur un papier buvard, sa conservation puis l'extraction des analytes contenus dans cet échantillon séché sur papier buvard pour effectuer 30 une analyse de ces analytes. A l'heure actuelle, il s'agit d'un prélèvement capillaire qui se fait au niveau du doigt ou du talon chez le nourrisson. La peau est percée à l'aide d'un outil tel qu'une lancette stérile puis des gouttes de sang sont placées sur le papier buvard afin de remplir la zone. Une 3060745 2 fois que tous les cercles imprimés sur le papier buvard requis sont remplis, il est séché pendant quelques heures à température ambiante. Une fois séchés, pour leur conservation les papiers buvards sont placés dans un sac plastique étanche, éventuellement avec un sachet de dessicant et un indicateur d'humidité. Le 5 dessicant vise à parachever le processus de séchage afin de réduire tout risque d'infection lié au prélèvement sanguin. Le temps de conservation possible à température ambiante varie selon la nature de l'analyte, d'une semaine pour les protéines à un an ou plus pour les acides nucléiques. L'extraction des analytes des papiers buvards doit être réalisée en utilisant une 10 procédure standardisée. Un ou plusieurs disques de papier buvard de diamètres variables sont découpés avec un emporte-pièce spécifique. Ces disques sont alors placés dans un tampon d'élution pendant une durée variable selon la procédure d'extraction. La nature du tampon d'élution joue un rôle majeur dans la resolubilisation des analytes à tester. Une grande variété de tampons d'élution a été décrite dans la littérature dont les plus communs sont des tampons salins, souvent supplémentés avec des détergents (tween, triton), des protéines porteuses (albumine) et des chélateurs (EDTA). Les solvants organiques (acétonitrile, méthanol ou éthanol) sont aussi de bons tampons d'élution pour l'extraction des protéines par exemple. Par la suite, la technologie DBS peut être le support de plusieurs analyses. En effet, à partir de cette technologie des analyses telles qu'un sérodiagnostic, un diagnostic moléculaire pédiatrique précoce, une quantification de la charge virale circulante mais également un génotypage de résistance, peuvent être réalisées. Dans le cadre d'un sérodiagnostic, la détection des anticorps peut être réalisée par ELISA ou tests rapides après élution des DBS dans un tampon. Cette procédure est surtout utilisée pour les études épidémiologiques. Ce type d'analyse nécessite de petites quantités d'échantillons, de l'ordre de 50 pL. L'augmentation des demandes de diagnostics biologiques a favorisé l'apparition d'automates de plus en plus rapides et fiables au sein des laboratoires d'analyses médicales. Les automates d'immunoanalyse permettent le dosage de marqueurs cardiaques, thyroïdiens, tumoraux, de fertilité, d'anémie ou encore la détermination des sérologies infectieux. L'utilisation de ces automates d'immunoanalyse nécessite de plus grands volumes de sang que ne le permet un prélèvement sanguin capillaire. En effet dans ces automates d'immunoanalyse les volumes d'échantillon sanguin peuvent aller d'une centaine jusqu'à plusieurs centaines de microlitres pour une analyse. 3060745 3 En effet, il important de noter que les échantillons de sang recueillis pour effectuer un DBS sont de l'ordre de quelques microlitres. Cette quantité est suffisante pour certaines analyses sur l'ADN en général mais s'avère insuffisant pour l'analyse sur automates d'immunoanalyse. Le principal inconvénient de la technologie DBS est lié aux faibles 5 quantités de sang collecté disponible pour le tests, et aux difficultés rencontrées au niveau des laboratoires pour en extraire le maximum de matériel possible sans risque de contamination (Dachraoui R et al., RNA amplification of the HIV-1 Pol and env regions on dried serum and plasma spots, HIV MED , 2008 ; 9:557-61). Par conséquent pour pouvoir être analysé sur des automates d'immunoanalyse 10 l'utilisation du papier buvard comme dans la technologie DBS nécessite des adaptations. Tout d'abord pour récupérer des volumes importants d'échantillon pour l'analyse sur automate il faut que le volume initial d'échantillon soit suffisant. Ainsi il est nécessaire pour que cela fonctionne que le papier puisse être capable d'absorber mais également de restituer un volume suffisant d'échantillon. 15 Un volume plus important d'échantillon a pour conséquence une absorption plus importante et plus en profondeur de l'échantillon à analyser. Les analytes se retrouvent par conséquent piégés entre les fibres du papier buvard. Ainsi la principale difficulté réside dans l'extraction de ces analytes emprisonnés dans le papier buvard, après séchage de l'échantillon, de manière efficace sans dénaturer ces analytes à analyser permettant ainsi de conserver le 20 statut clinique de l'échantillon initial. Conserver un statut clinique signifie que si l'échantillon initial, avant séchage sur papier buvard, est positif pour une infection virale donnée l'échantillon récupéré après une extraction comme utilisé dans la technologie DBS doit rester positif pour cette même infection. Et de la même manière si l'échantillon initial est négatif pour une infection, l'échantillon récupéré après extraction doit l'être aussi. 25 Ainsi pour pouvoir conserver le statut clinique, le procédé doit permettre de réaliser une extraction aussi bien quantitative que qualitative des analytes absorbés dans le papier buvard. De plus, il est important de noter également que le sang est un tissu conjonctif, milieu complexe constitué de liquide (plasma), de cellules (globules rouges, globules blancs 30 et plaquettes), et de fibres (le fibrinogène qui a un rôle dans la coagulation du sang). Cette constitution a un impact sur la structure des analytes contenus dans l'échantillon sanguin. Ainsi le statut clinique risque également d'être impacté par la constitution de l'échantillon récupéré après extraction. En effet l'échantillon récupéré après extraction doit avoir une 3060745 4 constitution similaire à l'échantillon sanguin initial. Autrement dit l'échantillon récupéré doit mimer la matrice sanguine de l'échantillon initial. L'environnement des analytes dans la solution d'extraction doit être chimiquement proche de leur environnement dans l'échantillon sanguin. Cela permet de conserver la conformation dans l'espace de ces analytes. Ceci revêt 5 une importance capitale dans le cadre d'un immunodosage lorsque que l'épitope est dit conformationnel. Il existe ainsi un réel besoin de disposer d'un procédé permettant l'extraction efficace et sans dénaturation des analytes contenus dans un échantillon sanguin séché sur papier buvard à des fins d'analyses sur des automates présents dans les laboratoires d'analyses 10 médicales tout en conservant le statut clinique de l'échantillon initial. Ainsi la présente invention a pour objet un procédé de mise en suspension des analytes contenus dans un échantillon sanguin préalablement séché sur un papier buvard, dans lequel : on dispose d'un papier buvard sur lequel un échantillon sanguin, d'un volume initial supérieur ou égal à 100 1.1L, est séché, ledit papier buvard ayant une capacité 15 d'absorption dudit échantillon d'au moins 60 1.1L.cm-2 et un grammage compris entre 200 g.m-2 et 800 g.m-2 ; on transfert ledit papier buvard dans un récipient ; on ajoute une solution d'extraction liquide dans ledit récipient, ladite solution d'extraction étant choisie parmi : 20 o un tampon phosphate salin de 10 mmol.L-1 à 150 mmol.L-i et ayant une concentration en chlorure de sodium comprise entre 150 mmol.L-1 et 350 mmol.L-1 et o un tampon tris salin de 10 mmol.L-1 à 150 mmol.L-1 et ayant une concentration en chlorure de sodium comprise entre 150 mmol.L-1 et 25 350 mmol.L-1 ; on laisse imprégner ledit papier buvard dans la solution d'extraction ; on exerce une action mécanique d'essorage sur le papier contenu dans le récipient ; et - on récupère la solution d'extraction comprenant les analytes contenus dans 30 l'échantillon sanguin initial. La demanderesse a donc montré, contre toute attente, que le procédé selon l'invention facile à mettre en oeuvre et ergonomique, permet le rendu d'un résultat conservant le statut clinique (positif, négatif ou équivoque) de l'échantillon. 3060745 5 Avant d'aller plus loin dans la description de l'invention, les définitions ci-après sont données afin d'en faciliter la compréhension. D'une manière générale, le terme « échantillon » se réfère à une partie ou à une quantité, plus particulièrement une petite partie ou une petite quantité, prélevée à partir d'une 5 ou plusieurs entités aux fins d'analyse. Cet échantillon peut éventuellement avoir subi un traitement préalable, impliquant par exemple des étapes de mélange ou de dilution. L'échantillon dans le cadre du procédé de l'invention est un échantillon biologique, d'origine humaine (ou animale), correspondant à des prélèvements de fluide biologique sanguin (sang total ou dérivés tels que sérum ou plasma). 1() L'échantillon analysé est, en général, susceptible, ou suspecté, de contenir au moins un analyte représentatif de la présence de microorganismes ou d'une maladie à détecter, caractériser ou suivre. L'objectif de la présente invention est la mise en suspension des analytes contenus dans un échantillon sanguin séché dans un papier buvard selon la technologie Dried Blood 15 Spot (DBS). Le terme analyte désigne une substance d'origine biologique, contenue dans un échantillon, détectée, identifiée et/ou quantifiée par une analyse. Il doit être compris, au sens large, comme désignant une substance chimique, biologique ou biochimique qui fait l'objet d'une ou plusieurs analyses. A titre d'exemple d'analytes, on peut citer une protéine ou un 20 peptide. L'analyte sera représentatif d'un état pathologique. Par état pathologique, on entend tout état de santé altéré d'un patient, dû à des maladies causées par de nombreux facteurs tels que les facteurs environnementaux (infectieux). A titre d'exemples de maladies, on peut citer les maladies infectieuses, dues à des microorganismes tels que virus de la grippe, de la dengue 25 ou encore Ebola. Les analytes sont alors associés aux diverses maladies. A titre d'exemple d'analyte, on peut citer l'antigène p24 et les anticorps anti VIH-1 et VIH-2 utiles en tant qu'analytes pour le virus du SIDA ou encore l'antigène HBs et l'anticorps anti HBs en tant qu'analytes du virus de l'hépatite B. L'analyte présent dans un échantillon est destiné à être détecté, quantifié, analysé, 30 caractérisé ou encore évalué. Au sens de la présente invention le papier buvard est un papier poreux capable d'absorber par capillarité une certaine quantité de liquide. 3060745 6 Un papier buvard, selon la présente invention, s'entend par un matériau fibreux constitué en partie ou en totalité de fibres. Ces fibres peuvent être assemblées de manière ordonnée ou aléatoire (c'est-à-dire un tissé ou un non-tissé). Ce matériau qui a la capacité d'absorber les liquides aqueux peut être composé d'un seul type de fibre, d'un mélange de 5 fibres appartenant ou non à la même classe. Les fibres peuvent être classées selon leur composition chimique (minérale ou organique) et de leur origine (naturelle ou artificielle). A titre d'exemple on peut citer la fibre de verre comme fibre minérale artificielle ou encore la fibre cellulosique (coton) comme fibres organiques naturelles d'origine végétale. 10 Dans le cadre de l'invention le papier buvard a une capacité d'absorption d'un échantillon sanguin d'au moins 60 1.1.L.cm-2. On considère selon l'invention que le papier buvard doit être capable d'absorber une composition liquide ayant les propriétés physiques de viscosité d'un échantillon de sang fraichement prélevé. Par exemple la viscosité de l'échantillon sanguin est comprise entre de 4 à 25 x 10-3 pascal-secondes (Pa. s). 15 Selon le procédé de l'invention le papier buvard a un grammage compris entre 200 g.m-2 et 800 g.m-2. Le grammage, également appelé « force du papier », est une grandeur caractérisant un papier ou un carton, correspondant à sa masse surfacique, c'est-à-dire à sa masse par unité de surface. Le grammage est défini par les normes ISO 536 et 4046. Par « solution d'extraction », on entend une solution permettant la mise en solution 20 des analytes à partir échantillon sanguin séché dans un papier buvard. Cette solution, dans le cadre de l'invention, a une double fonction. Dans un premier temps elle a pour rôle d'extraire les analytes absorbés dans le papier buvard sans les dénaturer. Puis cette solution d'extraction, de par sa constitution, doit permettre de mimer la matrice sanguine dans le but in fine d'en permettre une analyse sur automates. Le tout permettant de conserver le statut clinique de 25 l'échantillon initial. Selon la présente invention la solution d'extraction est choisie parmi le tampon phosphate salin (PB S) et le tampon tris salin (TB S). La préparation de ce type de solution est largement connue de l'homme. A titre d'exemple, on peut préparer une solution phosphate salin de 50 mmol.L-1 ayant une concentration en chlorure de sodium de 150 mmol.L-1 d'un 30 pH 7,4, en mélangeant : 7,6 ml de phosphate dipotassique (K2HPO4) de concentration 1 mol/L, 3060745 7 42,4 ml de phosphate de monopotassium (KH2PO4) de concentration 1 mol/L, - 30 ml de chlorure de sodium de concentration (NaC1) de concentration 5 mol/L, et - 920 ml d'eau (H2O). 5 Le terme « essorage » selon présente invention s'entend par l'opération consistant à retirer d'un papier buvard un liquide qui l'imprègne, par une action mécanique. Enfin l'expression « exercer une action d'essorage sur le papier buvard », fait référence à une action mécanique à distance ou de contact qui peut être localisée ou répartie susceptible de déformer un corps tel qu'un matériau fibreux. 10 Comme expliqué précédemment la solution d'extraction, dans le cadre de l'invention, a deux fonctions distinctes qui agissent de façon synergique dans le but de permettre la conservation du statut clinique. Le premier étant de permettre la mise en solution des analytes contenus dans un échantillon préalablement séché sur un papier buvard sans les dénaturer. Et le second étant de mimer la matrice sanguine pour permettre son analyse sur 15 automates d'immunoanalyse. Les éléments qui constituent cette solution d'extraction lui permettent de remplir ces deux fonctions dans le but in fine de conserver le statut clinique. Comme illustrer dans les exemples, le tampon salin a pour mission principale la mise en suspension des analytes sans les dénaturer quand le chlorure de sodium à des concentrations comprises entre 150 mmol.L-1 et 350 mmol.L-1 permet de reproduire des 20 conditions physiologiques. Avantageusement et selon l'invention la solution d'extraction a un pH compris entre 7,2 et 7,5 et de préférence entre 7,3 et 7,4. Dans un premier mode de réalisation la solution d'extraction comprend en outre un ou plusieurs éléments choisis parmi la liste suivante : un détergent, une protéine porteuse, un 25 chélateur d'ions et de la poudre de lait. Les détergents utilisés dans les laboratoires de biologie et de biochimie sont des tensioactifs doux utilisés pour la lyse des membranes cellulaires et la dissolution du matériel intracellulaire en une forme soluble. Leurs applications principales sont la dissociation des interactions protéine-protéine, protéine-lipide et lipide-lipide, la dénaturation de la structure 30 protéique et la prévention des liaisons non spécifiques dans les approches immunochimiques et de cristallisation de protéines. Plusieurs types de détergents existent et sont regroupés selon 3060745 8 leurs propriétés. Dans le cadre de l'invention le choix d'un détergent est crucial, il doit permettre la mise en solution des analytes, contenus dans un échantillon séché, piégés dans les fibres du papier buvard. Cette mise en solution doit se faire sans dénaturer les analytes. Selon un mode de réalisation préférentielle de l'invention, le détergent est un 5 détergent non-ionique et est choisi parmi ceux utilisés habituellement dans les tampons d'élution et largement connu de l'homme du métier. A titre d'exemple on peut citer le polyéthylène glycol sorbitan monolaurate, également appelé Tween 20, ou encore le Triton X100. Dans le cadre de l'invention, la protéine porteuse a pour rôle de recréer dans 10 l'échantillon extrait du papier buvard la viscosité d'un échantillon sanguin. A titre d'exemple on peut citer l'albumine de sérum bovin (B SA). Quant aux réactifs chélateurs de métaux tels que 1'EDTA ou 1'EGTA, ils se lient aux ions Mg2+ et, ainsi, empêchent le clivage des protéines par des métalloprotéases contaminantes. Ainsi elles ont pour rôle de permettre de conserver la conformation des 15 analytes qui seront repris dans la solution d'extraction. Ceci a pour but in fine de conserver le statut clinique de l'échantillon initial. Dans une alternative de l'invention, la solution d'extraction comprend un solvant organique. Les solvants organiques utilisés en tant que tampon d'élution sont largement connu de l'homme du métier. A titre d'exemple on peut citer l'acétonitrile, le méthanol ou 20 encore éthanol. Dans un mode de réalisation de l'invention, la durée de ré-imprégnation du papier par la solution d'extraction est comprise entre 1 minute et 3 minutes, de préférence est de 2 minutes. Avantageusement, le volume de solution d'extraction est équivalent au volume 25 d'échantillon initial avant séchage dans le papier buvard. Ceci ayant pour avantage d'éviter une dilution de la concentration en analytes entre l'échantillon initial et l'échantillon obtenu par le procédé selon l'invention ce qui permet d'améliorer ainsi la sensibilité du procédé. Par « équivalent » on entend que le rapport entre le volume le moins élevé et celui le plus élevé est compris entre 0,8 et 1. 30 Selon une variante de réalisation de l'invention, le papier buvard est un matériau fibreux non tissé comprenant des fibres choisies parmi les fibres de celluloses et les fibres de verres, préférentiellement des fibres de celluloses. 3060745 9 Avantageusement, le papier buvard a une épaisseur comprise entre 0,8 mm à 2,50 mm. Dans un mode de réalisation de l'invention, le papier buvard est sous forme de disque. 5 De manière préférée, le papier est séché à des températures comprises entre 25 et 45°C et à des pourcentages d'humidité compris entre 10 et 30%. Selon l'invention l'action mécanique est exercée sur le papier buvard a une force comprise entre 80 N et 120 N. Avantageusement, l'action mécanique d'essorage sur le papier se fait par 10 centrifugation, par sonication ou par pression mécanique automatique ou manuelle, de préférence par pression mécanique manuelle. Dans le cadre de l'invention, l'action mécanique d'essorage doit être réalisée tout en conservant l'intégrité du papier. Autrement dit cette action mécanique d'essorage doit se faire dans délitement du papier. Selon un mode de réalisation de l'invention, le récipient est apte à coopérer avec un 15 moyen coulissant à l'intérieur dudit récipient, ledit moyen étant imperméable aux liquides et assurant une étanchéité avec les parois latérales du récipient. De manière préférentielle, le papier buvard comprenant l'échantillon sanguin séché est conservé dans un contenant étanche et ce dernier peut contenir un absorbeur d'humidité. Selon un nouveau mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend en outre 20 une analyse de l'échantillon récupéré comprenant les analytes par immunoessai. La détermination de la dose d'un analyte dans un échantillon biologique peut se faire selon les techniques largement connues de l'homme du métier pour déterminer la quantité, ou dose, de cette analyte dans un échantillon biologique. A titre d'exemples, on peut citer les dosages par immunoessais, tels qu'ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 25 ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) et RIA (Radio Immuno Assay). Le dosage par immunoessai est une méthode bien connue de l'homme du métier et largement utilisée dans le domaine de l'analyse d'échantillons biologiques. Il permet de détecter des analytes dans des échantillons sous forme notamment de protéines (antigènes/anticorps), de peptides et d'haptènes, comme par exemple les stéroïdes ou les 30 vitamines, impliquant des réactions immunologiques entre l' analyte à détecter, et un ou des partenaire(s) de liaison à cet analyte. Ces méthodes d'immunoessai sont basées sur des mesures permettant de quantifier les signaux émis au cours de l'analyse de l'échantillon biologique. La quantité de signaux détectée est généralement proportionnelle à la quantité, ou 3060745 10 dose, d'analyte à mesurer (par exemple lors d'un dosage en sandwich) ou inversement proportionnelle à la quantité, ou dose, d'analyte à mesurer (par exemple dosage en compétition). Selon un dernier mode de réalisation l'analyse de l'échantillon de la solution 5 d'extraction comprenant les analytes se fait par une technologie choisie parmi la chimiluminescence, la fluorescence, ELISA, EIA, par multiplexage, par biopuces, immunochromatographique, billes magnétiques et radio-immunoanalyse. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description qui va suivre et des exemples développés ci-après, qui se réfèrent aux figures 10 annexées et dans lesquelles : - les Figures 1 et 2 sont des représentations schématisées d'un dispositif 1 permettant d'exercer l'action mécanique d'essorage sur le papier selon le procédé de l'invention, et de son principe général d'utilisation ; - la Figures 3 est une représentation schématisée d'un autre dispositif 2 15 permettant également d'exercer l'action mécanique d'essorage , et de son principe général d'utilisation. Ces exemples ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention, sa mise en oeuvre et son utilisation. Ces exemples sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention. 20 L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants qui sont donnés à titre illustratif et non limitatif. EXEMPLES 25 I. Faisabilité avec le virus de la varicelle La varicelle est une maladie infantile très contagieuse à forte prévalence en France (> 98%). A titre illustratif, l'analyse des échantillons a été effectuée à l'aide de l'automate d'immunoanalyse commercialisé par l'entreprise bioMérieux, le système VIDAS®. 30 Le test VIDAS® VZG (virus varicelle-zona) est une aide au diagnostic d'une infection au virus de la varicelle, il permet la détection de l'immunoglobuline G. Le VIDAS® est un automate multiparamétrique d'immunoanalyses. Il s'agit d'un système fermé pour tests unitaires, offrant une grande flexibilité. Cet automate se 3060745 11 caractérise par sa robustesse, sa flexibilité, sa facilité d'utilisation et est destiné aux laboratoires de petite et moyenne taille. Il permet de réaliser des tests de routine, de confirmation et des tests à forte valeur médicale. La détection se fait par la technique ELFA (Enzyme Linked Fluorescent 5 Assay) dans le sérum ou le plasma. Le principe de dosage ELFA correspond à la combinaison de réactions immunoenzymatiques à une détection en point final en fluorescence. L'enzyme utilisée est la phosphatase alcaline qui catalyse la réaction d'hydrolyse du substrat, le 4- méthyl-ombelliferyl phosphate en un produit ; le 4-méthyl-ombellierone. Le produit émet à une longueur d'onde de 450 nm après excitation à 370 nm. Les résultats sont analysés 10 automatiquement par le VIDAS® et exprimés en intensité de fluorescence relative ou RFV (pour « Relative Fluorescent Value »). Cette valeur de RFV est déterminée en soustrayant la valeur du bruit de fond (BKG) à la valeur brute obtenue. Dans un premier temps, il a été étudié les caractéristiques du papier et de la 15 solution d'extraction nécessaire au bon déroulement du procédé selon l'invention. Dans cette partie, l'objectif sera la mise en solution des analytes d'intérêt dans la solution d'extraction pour la mise en oeuvre dans un test VIDAS® VZG. Pour permettre sa mise en place dans des conditions difficiles de prélèvement, de stockage, de transport et enfin d'analyse ce procédé selon l'invention doit être facile à 20 mettre en oeuvre, ergonomique et permettre le rendu d'un résultat conservant le statut clinique (positif, négatif ou équivoque) de l'échantillon. a) Capacité d'absorption des papiers Le papier 903 de chez Whatman® est classiquement utilisé lors de l'application sur 25 papier buvard, dans le cadre de la technologie DBS, en biologie moléculaire. Ce papier très fin est adapté à la manipulation d'une à trois gouttes de sang. Dans ce cas de figure, un faible volume est suffisant car les acides nucléiques à rechercher sont soumis à une amplification par PCR. Dans un contexte de diagnostic sérologique utilisant un automate d'immunoanalyse 30 il est nécessaire de travailler avec un papier permettant de déposer et de récupérer un volume plus important de prélèvement sanguin. Les tests VIDAS®, par exemple, nécessitent 100 [IL de sérum pour le test sur le virus de l'hépatite C (HCV), 150 [IL pour le test sur le virus de 3060745 12 l'hépatite B (HBV) et 200 tL pour les test sur le virus du SIDA (HIV). Ces volumes sont sensiblement équivalents pour les autres tests sur automates présents sur le marché. Ainsi, le papier doit donc être capable d'absorber mais aussi de restituer un volume suffisant d'échantillon, immédiatement après séchage ou après un temps de stockage. 5 Afin de sélectionner le papier le plus adapté à la méthode, une étude est réalisée sur 6 types de papier fournis par l'entreprise Ahlstrom® (TNF, 226, 222, 350, 270 et 320). Ces papiers se caractérisent par leur grammage, leur poids et leur épaisseur. Les papiers TNF et 226 ont des caractéristiques similaire au papier 903 de chez Whatman® qui est classiquement utilisé dans le cadre de la technologie DBS. 10 Référence (Grade) Composition Grammage (g/m2) Epaisseur (mm) 167L Coton 360 1 226 Coton 179 0,52 222 Coton 291,3 0,82 270 Coton 438,8 1,81 320 Coton 702 2,47 350 Coton 224,6 1,39 TNF Coton 179 0,48 Tableau 1 : Caractéristiques des papiers et représentation schématique des épaisseurs Le papier doit posséder certaines caractéristiques. En effet, il doit être de surface plane et homogène, permettant une diffusion uniforme de l'échantillon sanguin sur toute sa 15 surface au moment du dépôt. De plus, le papier doit être facilement manipulable, avec une durée de séchage raisonnable estimée à deux heures, donc ne pas être d'une trop grande épaisseur. Le diamètre des disques est un facteur important. Chaque papier présente un volume limite à ne pas dépasser car au-delà, le papier n'absorbe plus l'échantillon. Il faut 20 donc définir précisément le diamètre des disques. Le tableau ci-dessous représente le volume maximum absorbable pour les papiers de grades 222 et 270. Grade papier 222 270 Diamètre des disques (mm) 20 19,5 20 19,5 Volume de sérum déposé (e) 300 250 500 450 Tableau 2 : Volume absorbable par les papiers en fonction du diamètre 3060745 13 Les résultats montrent qu'une variation de 0,5 mm sur le diamètre a pour conséquence une diminution de la capacité d'absorption maîtrisée. Le volume déposé doit imprégner la totalité du papier mais sans débordement. Pour la suite des expérimentations, un papier sous forme de disque de 20 mm de 5 diamètre qui permet de déposer au-delà 200 !AL d'échantillon sanguin sera recherché. En effet la manipulation de disques de diamètre supérieur, 30 à 50 mm peut vite devenir délicate. Ainsi le papier buvard selon l'invention doit avoir une capacité d'absorption d'au moins 60 µL. cm-2. Les différents papiers mentionnés dans le tableau 1 sont testés avec trois volumes 10 de sérums différents : 100, 200 et 500 !IL. Ces volumes peuvent correspondre aux prises d'essai nécessaires pour un test sur automate d'immunoanalyse. Référence (Grade) 100 ni 200 nL 500 nL 270 11 14 18 320 12 15 19 350 13 17 25 167L 13 17 26 222 14 19 29 226 16 24 36 TNF 16 23 37 Tableau 3 : Diamètre de diffusion (mm) selon le papier et le volume déposé Après dépôt du sérum, le diamètre de diffusion pour chaque papier a été mesuré. 15 Compte tenu du diamètre choisi pour le papier, au-delà 20 mm de diamètre de diffusion il est considéré que le papier n'est plus capable d'absorber le sérum. Autrement dit le papier doit avoir une capacité d'absorption d'au moins 60 1.1L.cm-2d'un échantillon de sang. Les résultats montrent que le grades 270, 320, 350, 167L et 222 répondent aux exigences de l'invention. Alors que pour les grades correspondants au 903 Whatman® 20 classiquement utilisé en DB S, c'est-à-dire le 226 et TNF, ce n'est pas le cas. b) Solution d'extraction Ensuite la solution d'extraction qui permet la récupération des analytes qui ont été absorbés dans les fibres du papier buvard durant le séchage, a été étudiée. 25 Comme indiqué précédemment, cette solution a une double fonction à savoir de permettre l'extraction des analytes initialement présents dans l'échantillon de départ sans les dénaturer et de mimer la matrice sanguine de l'échantillon initial pour en permettre l'analyse 3060745 14 sur automate d'immunoanalyse. Le tout permettant de conserver le statut clinique de l'échantillon de départ. Ainsi dans le cadre de l'invention une solution d'extraction de formulation simple, la plus physiologique possible, ne dégradant pas les analytes piégés, est recherchée. 5 Dix formulations de solution d'extraction sont testées. Dans un premier temps l'impact de ces différentes solutions sur un sérum avec mise en évidence de leur performance de diluant non toxique sur la structure des analytes, est observé. L'étude de la non toxicité de la solution d'extraction est effectuée par des tests sur sérums purs et dilués au demi dans chaque solution d'extraction. La non toxicité d'une 10 solution est confirmée si le rapport entre le signal en RFV du sérum pur et celui du dilué au demi est inférieur à deux. Ces solutions d'extraction sont testées sur des différents échantillons de sérum ayant des quantités en analytes différentes. Le tableau ci-dessous représente le signal obtenu sur VIDAS® pour chaque échantillon de sérum pur et dilué dans une solution d'extraction. 3060745 15 Sérum 1 (>500 RFV) Sérum 2 (>500 RFV) Sérum 3 (>1000 RFV) 1 1/2 rapport (sérum 1 1/2 rapport (sérum 1 1/2 rapport (sérum purs/sérum dilué) purs/sérum dilué) purs/sérum dilué) PBS 50mM NaC1 154mM Tween20 0.05% BSA 5% 758 495 1,53 695 401 1,73 1003 810 1,24 PBS 50mM NaC1 154mM Triton 1% BSA 5% 758 555 1,37 695 515 1,35 1003 940 1,07 PBS 50mM NaC1 154mM Urée 1M BSA 5% 758 476 1,59 695 396 1,76 1003 751 1,34 PBS 50mM NaC1308 mM Tween20 0.05% BSA 5% 758 459 1,65 695 435 1,60 1003 784 1,28 PBS 50mM NaC1 154 mM Tween20 0.5% BSA 5% 758 524 1,45 695 414 1,68 1003 799 1,26 PBS 50mM NaC1 154 mM Tween20 5% BSA 5% 758 505 1,50 695 407 1,71 1003 805 1,25 PBS 10mM NaC1 154 mM Tween20 0.05% BSA 5% 758 503 1,51 695 389 1,79 1003 779 1,29 PBS 150mM NaC1 154 mM Tween20 0.05% BSA 5% 758 469 1,62 695 398 1,75 1003 853 1,18 Tris 10mM NaC1 154 mM Régilait 0.3% 758 421 1,80 695 358 1,94 1003 764 1,31 PBS 50mM NaC1 154 mM Tween20 0.05% 758 401 1,89 695 377 1,84 1003 751 1,34 Sérum 4 (>1000 RFV) 1 1/2 rapport (sérum purs/sérum dilué) PBS 50mM NaC1 154mM Tween20 0.05% BSA 5% 1019 598 1,70 PBS 50mM NaC1 154mM Triton 1% BSA 5% 1019 673 1,51 PBS 50mM NaC1 154mM Urée 1M BSA 5% 1019 621 1,64 PBS 50mM NaC1308 mM Tween20 0.05% BSA 5% 1019 590 1,73 PBS 50mM NaC1 154 mM Tween20 0.5% BSA 5% 1019 647 1,57 PBS 50mM NaC1 154 mM Tween20 5% BSA 5% 1019 671 1,52 PBS 10mM NaC1 154 mM Tween20 0.05% BSA 5% 1019 625 1,63 PBS 150mM NaC1 154 mM Tween20 0.05% BSA 5% 1019 573 1,78 Tris 10mM NaC1 154 mM Régilait 0.3% 1019 625 1,63 PBS 50mM NaC1 154 mM Tween20 0.05% 1019 549 1,86 Tableau 4 : Composition et efficacité des tampons d'extraction Au vu de ce qui précède, les solutions d'extractions n'ont pas d'effet toxique sur les sérums. Ainsi ces solutions ne dénaturent pas les analytes contenus dans l'échantillon 5 tout en reproduisant des conditions physiologiques permettant ainsi leur analyse sur automates d'analyse. c) Dispositifs d'extraction 3060745 16 Dans le but de résoudre le problème technique, à savoir extraire les analytes absorbés dans un papier buvard sans les dénaturer mais tout en conservant le statut clinique de l'échantillon de départ, le procédé de l'invention comprend une étape d'action mécanique d'essorage. 5 Afin d'illustrer l'invention et uniquement à titre d'exemple deux dispositifs sont utilisés pour exercer l'action mécanique sur le papier selon le procédé de l'invention. Les deux dispositifs basés sur une extraction par pression permettent de récupérer un volume suffisant pour un test VIDAS®. Le premier dispositif, représenté à la figure 1, comprend un levier 1 et un élément 10 faisant office de piston 2, imperméable aux liquides et assurant une étanchéité avec les parois latérales d'un récipient 3, apte à coopérer avec ledit récipient 3. Comme représenté à la figure 1, l'actionnement du levier 1 permet à l'élément faisant office de piston 2 d'exercer une action mécanique d'essorage sur le papier buvard 3 imprégné de la solution d'extraction dans le récipient 4. La solution d'extraction 5 issue de 15 l'action d'essorage comprenant les analytes contenus dans l'échantillon sanguin initial est récupéré dans un contenant 6. Le deuxième dispositif, représenté aux figures 2 et 3, comprend : - un récipient 7 adapté pour contenir au moins un papier buvard 8 et une solution liquide, ledit récipient ayant un fond plat comprenant un trou 20 d'évent 9 situé sur sa partie inférieure pour laisser passer la solution d'extraction 14, - un élément supérieur 10 faisant office de piston, imperméable aux liquides et assurant une étanchéité avec les parois latérales du récipient 7, comprenant une manette de serrage 11 et pourvu d'un filetage 12 25 adapté pour coopérer par vissage avec le récipient 7, et - un élément inférieur 13 permettant de récupérer la solution d'extraction 14 comprenant les analytes contenus dans l'échantillon sanguin initial. Comme représenté à la figure 3A, le récipient 7, comprenant le papier buvard 8 et 30 la solution d'extraction 14, coopère d'une part avec l'élément supérieur 10 faisant office d'extraction 14. Une fois ces trois éléments assemblés, la manette de serrage 11 est abaissée, 3060745 17 comme illustré à la figure 3B, pour permettre le vissage de l'élément supérieur 10 avec le récipient 7 et multipliant ainsi la force exercée. La figure 3C montre la solution d'extraction récupérée 14 suite à l'action mécanique d'essorage exercé sur le papier buvard 8 par l'élément supérieur 10. 5 Les deux dispositifs basés sur une extraction par pression permettent de récupérer un volume suffisant, supérieur ou égal à 100 !IL, pour un test VIDAS®. Le premier système, qui sera appelé Dispositif 1 par la suite, est une sauterelle à serrage vertical permettant d'appliquer une pression uniforme de 100 N, permet de récupérer au moins 70% du volume de solution déposé, soit plus de 400 pL extraits pour 600 pL déposés. Il permet une extraction 10 reproductible car il fonctionne indépendamment de la force de l'utilisateur. Le second système, qui sera appelé Dispositif 2 par la suite, permet quant à lui de récupérer au moins 50% des volumes. de piston et d'autre part avec l'élément inférieur 13 permettant de récupérer la solution 15 Dispositif 1 Dispositif 2 Volume récupéré (11E) Rapport Volume récupéré (11E) Rapport Volume déposé 600 g, Tableau 5 : Volume de solution d'extraction récupéré en fonction du dispositif utilisé Le Dispositif 1 et les papiers, d'un diamètre de 20 mm, de grades 222, 350 et 270 seront utilisés pour l'expérience suivante. 20 L'échantillon sérique d'un patient séropositif à la varicelle, autrement dit dont le statut clinique est positif pour la varicelle, est testé dans un premier temps sur le VIDAS® afin d'établir la valeur de son signal. On l'appellera par la suite signal initial. En second lieu, on réalise selon l'invention l'étape de dépôt et de séchage sur papier avant de mettre en oeuvre l'étape d'extraction, à l'aide de la solution d'extraction et du Dispositif 1, puis le test 25 VIDAS®. Le résultat donné par le VIDAS® sera le signal récupéré. La valeur du signal initial et celles des signaux récupérés en RFV, le statut clinique et le pourcentage de signal sont présentés dans le tableau ci-dessous. 424 0.71 322 0.54 3060745 18 Test de récupération du signal et de conservation du statut clinique Grade Papier 222 350 270 Durée de séchage 1h30 2h 2h Température de séchage 25°C Solution d'extraction PBS 50mM NaC1 154 mM Tween20 0.05% Volume de sérum déposé 2 600 700 1000 disques (e) Volume de solution 600 700 1000 d'extraction 2 disques (e) Temps réimprégnation 2 (min) Signal Statut 1428 positif 1428 positif 1428 positif initial clinique (RFV) initiale RFV Statut 1413 positif 1195 positif 1195 positif récupéré clinique (RFV) récupéré Signal récupéré (%) 98 95 83 68 83 68 Tableau 6 : Test de récupération du signal et de conservation du statut clinique Les résultats montrent que l'échantillon extrait, à l'aide de la solution d'extraction et du dispositif 1, est en volume suffisant pour permettre le test VIDAS®VZG. Sans dilution 5 de l'échantillon, c'est-à-dire que le volume initiale d'échantillon est exactement le même que le volume de solution d'extraction (volume déposé = volume de solution d'extraction), le signal récupéré reste important. En effet il reste supérieur à 80% du signal initial. De plus le statut clinique de l'échantillon récupéré est le même que celui de l'échantillon initial, c'est-à-dire positif. Autrement dit l'échantillon récupéré suite à l'étape 10 d'extraction reste séropositif à la varicelle tout comme l'échantillon initial. Ainsi le statut clinique est bien conservé. Ces résultats montrent également que deux minutes de temps de ré-imprégnation du papier par la solution d'extraction sont suffisantes pour obtenir un signal satisfaisant (supérieur à 80%). Ce temps permet à la solution d'extraction de diffuser dans les fibres du 15 papier qui est ainsi mieux réhydraté, ce qui améliore la libération des analytes piégés. Les différents essais réalisés en parallèle avec les autres solutions d'extraction, citées dans le tableau 4, montrent qu'elles permettent elles également d'obtenir un signal supérieur à 80% du signal initial (non montré). Par conséquent le procédé de l'invention permet de conserver le statut clinique d'un 20 échantillon initial dans le cadre de l'utilisation de la technologie DBS sur automate 3060745 19 d'immunoanalyse. En effet malgré les volumes élevés déposés sur papier buvard (300, 350 et 500 !IL), 80% des analytes contenus initialement dans l'échantillon de départ sont présents dans les échantillons récupérés ce qui permet de conserver le statut clinique de l'échantillon initial. 5 Dans le but de montrer la reproductibilité du procédé selon l'invention, les inventeurs ont prouvé qu'il fonctionne également dans le cadre de détections d'autres types d'infections. Pour les tests suivants, les mêmes conditions expérimentales que celles montrées 1() dans le tableau 6 sont utilisées. II. Transposition du procédé selon l'invention sur le test du VIH Dans le but de montrer la reproductibilité du procédé, le diagnostic du virus du SIDA est étudié. 15 Les virus de l'immunodéficience humaine (VIH1 et VIH2), sont des rétrovirus à ARN. Il s'agit d'une infection des cellules CD4+ (lymphocytes T, macrophages). Le diagnostic d'une infection à ce virus repose sur la détection simultanée de l'antigène p24 du VIH-1, présent les trois premières semaines entre le moment de la contamination et l'apparition des premiers anticorps et la détection des anticorps anti VIH-1 20 et VIH-2, ce qui permet une surveillance de la fenêtre de séroconversion. Au vu des résultats précédents, le procédé selon l'invention permet le diagnostic pour les échantillons positifs nets. En effet, avec un procédé permettant la récupération de 6070% d'échantillon extrait et plus de 80% de réponse RFV, le risque d'un changement 25 d'interprétation clinique, du statut de positif à négatif est improbable. La situation est différente pour les échantillons positifs faibles et équivoques qui sont plus facilement susceptibles de changer de statut clinique, ce qui est le cas dans le cadre d'un diagnostic du virus du SIDA. A titre illustratif, des analyses des échantillons à l'aide de l'automate 30 d'immunoanalyse commercialisé par l'entreprise bioMérieux, le système VIDAS®, sont effectuées. Le kit VIDAS®HIV DUO Quick, qui permet le diagnostic de ce virus, nécessite 3060745 20 une forte prise d'essai (200 pL) et est adapté à la détection des très faibles quantités d' analytes. On cherche à pouvoir dépister l'infection au plus près de la contamination, donc lorsque le taux en anticorps est encore faible. Pour le kit VIDAS®HIV DUO Quick, l'indice 5 limite (cut off) qui correspond au seuil de positivité est de 125 RFV. Autrement dit un échantillon ayant un indice supérieur à 125 RFV est diagnostiqué comme étant séropositif au virus du SIDA. Pour cette expérience, 500 !IL de sérums sont déposés sur du papier, de diamètre 20 mm et de grade 222, et séchés pendant 1h30 à 30°C. Pour l'étape d'extraction, on laisse 10 imprégner le papier dans 500 !IL de solution d'extraction (PBS 50mM NaC1 154 mM Tween20 0,05%) pendant une durée de 2 minutes. Les deux dispositifs sont utilisés pour l'étape d'action mécanique d'essorage sur le papier. L'échantillon sérique utilisé pour l'expérience est séropositif pour au VIH. La valeur du signal initial et celles des signaux récupérés en RFV, le statut clinique et le 15 pourcentage de signal sont présentés dans le tableau ci-dessous. Dispositif 1 Dispositif 2 Signal Statut 196 Positif 196 Positif 196 Positif 196 Positif initial clinique (RFV) initiale RFV Statut 148 Positif 147 Positif 138 Positif 134 Positif récupéré clinique (RFV) récupéré Signal récupéré (%) 76 75 70 67 Tableau 7 : Etude de la limite de détection -pour l'HIV Les résultats montrent que le signal récupéré tourne autour de 70% après utilisation 20 du procédé selon l'invention. Le signal récupéré est inférieur à celui obtenu dans VIDAS® VZG néanmoins il permet toujours de conserver le statut clinique d'origine. En effet, les échantillons récupérés suite à l'étape d'extraction reste séropositifs au VIH. III. Transposition du procédé selon l'invention sur les tests du HBV et HCV 25 Le virus de l'hépatite B (HBV) est un virus à ADN se composant d'une enveloppe lipidique externe et d'une nucléocapside protéique renfermant l'ADN viral. L'enveloppe 3060745 21 contient des protéines HBs qui sont ancrées et exposées à la surface du virus afin de permettre les étapes de fixation et de pénétration dans les hépatocytes. Suite à une infection au virus HBV, l'antigène HBs (Ag HBs) apparait après plusieurs jours et peut persister plusieurs mois (= infection chronique). Habituellement, la 5 disparition de l'Ag HBs est suivie par l'apparition d'anticorps anti-HBs. La recherche des anticorps s'effectue dans les suivis des patients infectés mais aussi pour vérifier l'efficacité de la vaccination HBV. Les analyses des échantillons sont réalisées à l'aide de l'automate 10 d'immunoanalyse commercialisé par l'entreprise bioMérieux le système VIDAS® et le test VIDAS® HBs Ag. Pour une détection des antigènes HBs du virus de l'hépatite B avec le kit VIDAS® HBs Ag, 150 pL de sérum sont nécessaires. Le test utilisé est le kit VIDAS HBs Ag Ultra, commercialisé par l'entreprise bioMérieux, qui définit un indice seuil de positivité à 80 RFV. 15 Le seuil est donc très bas dans l'échelle de lecture RFV du VIDAS®. 500 !IL de sérums sont déposés sur du papier, de diamètre 20 mm et de grade 222, et séchés pendant 1h30 à 30°C. L'étape d'imprégnation du papier se fait dans 500 !IL de solution d'extraction (PBS 50mM NaC1 154 mM Tween20 0,05%) pendant une durée de 2 minutes. Les dispositifs 1 et 2 sont utilisés pour l'étape d'action mécanique d'essorage sur le 20 papier. L'échantillon sérique utilisé pour l'expérience est séropositif pour au virus de l'hépatite B. La valeur du signal initial et celles des signaux récupérés en RFV, le statut clinique et le pourcentage de signal sont présentés dans le tableau ci-dessous. Dispositif 1 Dispositif 2 Signal Statut 117 Positif 117 Positif 117 Positif 117 P initial clinique (RFV) initiale RFV Statut 98 Positif 96 Positif 97 Positif 93 P récupéré clinique (RFV) récupéré Signal récupéré (%) 84 82 83 79 25 Tableau 8 : Etude de la limite de détection pour l'HBV 3060745 22 Les résultats montrent que sur un échantillon sérique caractérisé comme étant proche du seuil de positivité, le statut clinique reste positif pour le virus HBV dans tous les cas de figures. 5 IV. Transposition du procédé de l'invention sur le test du HCV Le virus de l'hépatite C (HCV) découvert par des méthodes de biologie moléculaire, affecte tous les pays. L'infection par le HCV évolue souvent en une hépatite C chronique (environ 80%), exposant la personne infectée aux risques de complications hépatiques. Le kit VIDAS® Anti-HCV, commercialisé par bioMérieux, est un test qualitatif 10 permettant la détection des anticorps immunoglobulines G dirigés contre ce virus. Pour ce test l'indice du seuil de positivité est très élevé, il est défini à 1745 RFV. Pour cette expérience, 500 !IL de sérums sont déposés sur du papier, de diamètre 20 mm et de grade 222, et séchés pendant 1h30 à 30°C. Pour l'étape d'extraction, on laisse imprégner le papier dans 500 !IL de solution d'extraction (PBS 50mM NaC1 154 mM 15 Tween20 0,05%) pendant une durée de 2 minutes. Les deux dispositifs sont utilisés pour l'étape d'action mécanique d'essorage sur le papier. L'échantillon sérique utilisé pour l'expérience est séropositif pour au virus de l'hépatite C. La valeur du signal initial et celles des signaux récupérés en RFV, le statut clinique et le pourcentage de signal sont présentés dans le tableau ci-dessous. Dispositif 1 Dispositif 2 Signal Statut 1921 P 1921 P 1921 P initial clinique (RFV) initiale RFV Statut 1898 P 1856 P 1978 P récupéré clinique (RFV) récupéré Signal récupéré (%) 99 97 91 103 20 Tableau 9 : Etude de la limite de détection pour l'HCV Dans ce cas de figure l'indice limite est très élevé (1745 RFV), néanmoins nous pouvons remarquer que le statut demeure identique entre l'échantillon initial et l'échantillon récupéré suite au procédé selon l'invention. Ce dernier est donc applicable. REVENDICATIONS1. Procédé de mise en suspension des analytes contenus dans un échantillon sanguin préalablement séché sur un papier buvard, dans lequel : on dispose d'un papier buvard sur lequel un échantillon sanguin, d'un volume initial supérieur ou égal à 100 1.1L, est séché, ledit papier buvard ayant une capacité d'absorption dudit échantillon d'au moins 60 1.1L.cm-2 et un grammage compris entre 200 g.m-2 et 800 g.m-2 ; on transfert ledit papier buvard dans un récipient, on ajoute une solution d'extraction liquide dans ledit récipient, ladite solution d'extraction étant choisie parmi : o un tampon phosphate salin de 10 mmol.L-1 à 150 mmol.L-1 et ayant une concentration en chlorure de sodium comprise entre 150 mmol.L-1 et 350 mmol.L-1 et o un tampon tris salin de 10 mmol.L-1 à 150 mmol.L-1 et ayant une concentration en chlorure de sodium comprise entre 150 mmol.L-1 et 350 mmol.L-1; et on laisse imprégner ledit papier buvard dans la solution d'extraction, on exerce une action mécanique d'essorage sur ledit papier buvard ; et on récupère la solution d'extraction comprenant les analytes contenus dans l'échantillon sanguin initial. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le pH de la solution d'extraction est compris entre 7,2 et 7,5, de préférence entre 7,3 et 7,4. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la solution d'extraction a un volume équivalent au volume d'échantillon initial. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la solution d'extraction comprend en outre des détergents et/ou des protéines porteuses et/ou des chélateurs d'ions et/ou de la poudre de lait. 3060745 24 5. 56. 7. 10 8. 15 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'étape d'imprégnation du papier dans la solution d'extraction a une durée comprise entre 1 minute et 3 minutes, de préférence est de 2 minutes. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le papier buvard est un matériau fibreux non tissé comprenant des fibres choisies parmi les fibres de celluloses et les fibres de verres. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le papier buvard a une épaisseur comprise entre 0,8 mm à 2,50 mm. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le papier buvard est sous forme de disque. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'action mécanique d'essorage sur le papier buvard se fait par pression mécanique manuelle. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le récipient est apte à coopérer avec un moyen coulissant à l'intérieur dudit récipient, ledit moyen étant 20 imperméable aux liquides et assurant une étanchéité avec les parois latérales du récipient.