Brevet FR3059431A1 — publié le 20180601

LOT DE MILIEUX DE MESURE, OBTENTION ET UTILISATION DE CE LOT POUR PREDIRE LE COMPORTEMENT D'UN NANO1VIATERIAU DANS UN MILIEU NATUREL COMPLEXE Domaine technique La présente invention appartient au domaine technique de la caractérisation des nanomatériaux. Elle se rapporte plus particulièrement à l'amélioration des procédures d'évaluation in vitro des caractéristiques physico-chimiques des nanomatériaux, afin de mieux prédire le comportement réel des nanomatériaux dans un milieu naturel complexe. Art antérieur Les nanomatériaux sont de plus en plus utilisés dans les produits de grande consommation et trouvent de nombreuses applications notamment dans les domaines de la médecine, de la biologie, de la pharmacie et de la cosmétique. Il est 2 0 donc indispensable d'obtenir des analyses précises et fiables de ces matériaux pour étudier leur comportement in vivo afin d'évaluer les mécanismes d'action, les interactions possibles avec un environnement biologique naturel et les risques éventuels pour la santé et l'environnement découlant de leur utilisation. Les nanomatériaux sont par définition constitués de particules dont 2 5 au moins une des trois dimensions (longueur, largeur ou hauteur), et généralement les trois, est comprise entre 1 et 100 nanomètres. Du fait de leur très petite taille, les caractéristiques physico-chimiques de ces nanomatériaux influencent très fortement leurs propriétés ultérieures et leur toxicité. Afin de prédire leur comportement in vivo, on souhaite 3 0 mesurer des caractéristiques telles que leur taille, leur forme, leurs propriétés de surface, leur pureté, leur stabilité, ou autres. Actuellement, la plupart de ces mesures de caractérisation sont réalisées après mise en solution des nanomatériaux dans des milieux liquides 3 5 simples de type solvants organiques, dans du diméthyl-sulfoxyde (DMSO) par exemple. 3059431 2 Cependant, les résultats de ces mesures sont souvent très différents de ceux obtenus dans un milieu complexe naturel et ne reflètent pas du tout le comportement in vivo des nanomatériaux testés. En effet, les milieux complexes naturels, qu'ils soient physiologiques 5 ou environnementaux, sont des milieux biologiques hétérogènes qui contiennent de nombreux constituants différents pouvant interagir avec les nanoparticules. Ainsi par exemple, les protéines contenues dans le sang peuvent venir s'agréger autour des nanoparticules, modifiant ainsi la taille et la forme des nanoparticules par un effet dit « de couronne », ce qui entraîne une modification de leurs propriétés. 10 Or de tels effets ne sont absolument pas prévisibles à partir des mesures réalisées dans des milieux simples. Il est donc très difficile de prédire, à partir de ces résultats, le comportement réel des nanomatériaux lorsqu'ils se trouveront dans un milieu naturel complexe comme le sang ou l'eau d'une rivière par exemple. 15 Pour obtenir des résultats plus proches de la réalité, une autre approche développée dans l'art antérieur consiste à utiliser de véritables milieux biologiques pour réaliser ces mesures. On utilise pour cela des produits sanguins issus d'animaux, le plus souvent du sérum de veau foetal. Le problème avec de tels milieux naturels est qu'il est très difficile d'en connaître exactement la composition. En effet, elle est variable d'un individu à l'autre et est particulièrement compliquée à analyser entièrement. Il est en outre difficile de vérifier la traçabilité métrologique de ces milieux. Il est donc quasiment impossible de garantir la reproductibilité des mesures effectuées par la suite dans ces milieux. Par ailleurs, cette méthode nécessite l'utilisation d'animaux ce qui va à l'encontre de la directive n° 2010/63/UE de l'Union Européenne sur l'expérimentation animale, qui promeut le principe dit des « 3 R » : Réduction, Raffinement et Remplacement et vise à limiter le recours à l'expérimentation animale. L'objectif de l'invention est de pallier les inconvénients de ces deux méthodes de l'art antérieur, tout en améliorant considérablement la prédictibilité du comportement réel des nanomatériaux dans les milieux complexes naturels. 3059431 3 Exposé de l'invention L'invention propose des milieux de mesures qui sont entièrement synthétiques et donc sans aucun produit issu des animaux. Leur composition est parfaitement connue, définie et traçable. 5 De plus, grâce au procédé d'obtention de ces milieux de mesure et au procédé de prédiction de l'invention, il est possible d'obtenir des résultats beaucoup plus fiables et réalistes que ceux obtenus dans l'art antérieur à partir de milieux simples. 10 Pour cela, l'invention enseigne un lot de milieux de mesure, destinés à la réalisation de mesures d'une caractéristique physico-chimique d'un nanomatériau incorporé dans ces milieux de mesure, en vue de la prédiction de ladite caractéristique physico-chimique de ce nanomatériau lorsqu'il est incorporé dans un milieu complexe naturel ou de l'influence de paramètres ou de constituants 15 de ce milieu complexe naturel sur l'évolution de cette caractéristique physico- chimique. Ce lot comprend un ensemble de milieux de culture cellulaire, entièrement synthétiques et de composition connue, qui sont compatibles avec les techniques de mesure envisagées. 20 En outre, l'ensemble de ces milieux de culture cellulaire constitue un panel représentatif de paramètres ou de constituants pouvant être rencontrés dans le milieu complexe naturel ciblé. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, ce panel est sensiblement uniforme, c'est-à-dire qu'il ne comporte ni lacune, ni amas d'un point 25 de vue statistique. Selon un mode de réalisation de l'invention, le lot contient un nombre inférieur ou égal à 20 milieux de culture cellulaire, de préférence entre 5 et 20 milieux de culture cellulaire, plus préférentiellement entre 5 et 15 milieux de culture cellulaire, et encore plus préférentiellement environ 10 milieux de culture 30 cellulaire. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'ensemble des milieux de culture cellulaire constitue un panel représentatif des différents constituants rencontrés dans le sang humain, ou plus spécifiquement des acides aminés ou des vitamines ou des sels minéraux ou des protéines pouvant être rencontrés dans le 35 sang humain. Selon un mode de réalisation de l'invention, le lot contient en outre 3059431 4 un solvant organique simple servant de témoin. L'invention enseigne également un procédé d'obtention d'un tel lot de milieux de mesure, selon lequel : 5 - on recense un ensemble de milieux de culture cellulaire entièrement synthétiques et de composition connue, disponibles commercialement, - on réduit le nombre de milieux recensés en écartant : les milieux de culture cellulaire qui ne sont pas compatibles avec les techniques de mesure envisagées, 10 les milieux de culture cellulaire aberrants par rapport au milieu complexe naturel ciblé, et les amas de milieux de culture cellulaire de composition proche, en ne conservant qu'un seul milieu de culture cellulaire par amas, - on sélectionne parmi cet ensemble réduit de milieux recensés, un nombre 15 limité de milieux de culture cellulaire de manière à former un panel représentatif de paramètres ou de constituants pouvant être rencontrés dans le milieu complexe naturel ciblé. Selon un mode de réalisation du procédé d'obtention selon l'invention, on ajoute dans le lot de milieux de mesure, au moins un milieu de 20 culture cellulaire supplémentaire pour obtenir un panel sensiblement uniforme, ce milieu de culture cellulaire supplémentaire étant entièrement synthétique, de composition connue et compatible avec les techniques de mesure envisagées, et étant soit un milieu composite obtenu par mélange de plusieurs des milieux de culture cellulaire recensés, soit un milieu nouveau élaboré à partir de ses 25 constituants de base. Selon un mode de réalisation du procédé d'obtention selon l'invention, on ajoute dans le lot de milieux de mesure, un solvant organique simple servant de témoin. 30 L'invention enseigne également l'utilisation d'un tel lot de milieux de mesure pour la réalisation de mesures d'une caractéristique physico-chimique d'un nanomatériau incorporé dans ces milieux de mesure. Enfin, l'invention enseigne un procédé de prédiction d'une 35 caractéristique physico-chimique d'un nanomatériau incorporé dans un milieu complexe naturel ou de l'influence de paramètres ou de constituants de ce milieu complexe naturel sur l'évolution de cette caractéristique physico-chimique, au 3059431 5 moyen d'un tel lot de milieux de mesure. Ce procédé de prédiction comprend les étapes suivantes: - planification statistique d'un protocole expérimental de mesure d'une caractéristique physico-chimique du nanomatériau incorporé dans des milieux 5 de mesure dudit lot, qui spécifie : . la nature des milieux de mesure dudit lot à utiliser pour réaliser ces mesures, . le nombre de répétition de chacune des mesures à réaliser, et . l'ordre des mesures à réaliser, 10 - incorporation du nanomatériau dans les milieux de mesure dudit lot spécifiés dans le protocole expérimental ; - réalisation de mesures de la caractéristique physico-chimique du nanomatériau incorporé dans ces milieux de mesure, avec le nombre de répétition et dans l'ordre spécifié dans le protocole expérimental, 15 - analyse statistique des résultats des mesures réalisées et déduction à partir de cette analyse d'une prédiction de la caractéristique physico-chimique du nanomatériau lorsqu'il est incorporé dans le milieu complexe naturel ou de l'influence de paramètres ou de constituants de ce milieu complexe naturel sur l'évolution de cette caractéristique physico-chimique. 20 Pour ce procédé de prédiction, on utilise préférentiellement un lot de milieux de mesure obtenu selon le procédé d'obtention ci-dessus. Dans ce cas, le nombre limité de milieux formant le panel est préférentiellement sélectionné spécifiquement en fonction du phénomène que l'on souhaite prédire. 25 Selon un mode de réalisation de l'invention, le phénomène que l'on souhaite prédire peut être l'effet couronne dû aux interactions entre le nanomatériau et les protéines du milieu naturel complexe dans lequel il est incorporé. La caractéristique physico-chimique du nanomatériau peut être sa 30 taille, sa forme, sa composition, sa pureté, ses propriétés de surface ou sa stabilité. Les mesures peuvent être réalisées par exemple par microscopie, spectroscopie, diffusion dynamique de la lumière, dichroïsme circulaire, résonance magnétique nucléaire, cristallographie, mesure du potentiel zeta, ou par diffusion des rayons X aux petits angles. 35 Le milieu complexe naturel est préférentiellement du sang ou un produit sanguin, ou encore de l'eau de rivière. 3059431 6 Brève description des figures D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui va suivre, description faite en référence aux dessins annexés, dans lesquels : 5 la figure 1 est un schéma de principe illustrant les différentes étapes d'un procédé d'obtention d'un lot de milieux de mesure selon l'invention ; et la figure 2 est un schéma de principe illustrant les différentes étapes d'un procédé de prédiction du comportement d'un nanomatériau à partir d'un lot de milieux de mesure selon l'invention. 10 Exposé détaillé de l'invention Le principe de l'invention consiste à utiliser un nouveau type de milieux pour réaliser des mesures de caractérisation physico-chimique de 15 nanomatériaux. Il ne s'agit plus ni de solvants organiques simples (DMSO par exemple), ni de milieux complexes issus d'animaux (plasma sanguin, sérum de veau foetal...) comme dans l'art antérieur, mais de milieux complexes entièrement synthétiques, c'est-à-dire sans composant animal, et de composition définie, 20 reproductible d'un échantillon à l'autre et parfaitement connue. Les milieux synthétiques utilisés sont des milieux qui sont traditionnellement utilisés pour une application différente dans un domaine technique éloigné. Il s'agit en effet de milieux élaborés et commercialisés pour réaliser des cultures cellulaires. Selon l'invention, on utilise ces milieux de culture 25 cellulaire pour une application différente : la réalisation de mesures de caractérisation de nanomatériaux. En outre, pour réaliser ces mesures, on n'utilise pas un milieu de culture cellulaire unique, mais un ensemble ou lot de milieux de cultures cellulaires judicieusement sélectionnés parmi les milieux de culture cellulaire disponibles 30 commercialement pour être représentatif de l'hétérogénéité du milieu naturel complexe ciblé. Comme on le verra par la suite, un petit nombre de milieux, spécifiquement fabriqués à partir de leurs ingrédients de base, peut être rajouté à ces milieux commerciaux. 35 Ce lot de milieux de cultures cellulaires est spécifiquement sélectionné en fonction de différents critères, tels que la nature du nanomatériau, 3059431 7 du milieu naturel complexe que l'on souhaite simuler, des mesures à réaliser et des appareils devant être utilisés pour cela, et en fonction du type de questions auxquelles on souhaite répondre à l'aide de ces mesures. Ce lot est sélectionné de manière à former un panel représentatif de paramètres ou de constituants pouvant 5 être rencontrés dans le milieu naturel complexe ciblé. L'objectif du procédé de prédiction selon l'invention est d'une part de pouvoir caractériser des écarts de comportement du nanomatériau lorsqu'il se trouve incorporé à un milieu naturel complexe, et d'autre part de pouvoir en plus déterminer le ou les composants biologiques du milieu naturel complexe qui sont à 10 l'origine de ces écarts. Avantageusement, le procédé de prédiction selon l'invention permet de répondre à plusieurs types de questions, notamment : - l'identification de grandes familles biologiques (par exemple : les protéines, les vitamines, les acides aminés, les sels minéraux...) du milieu naturel 15 complexe ciblé, pouvant être responsables de variations significatives des mesures lorsque le nanomatériau est incorporé dans ce milieu naturel complexe ; - l'identification plus précise, parmi les membres de cette famille biologique identifiée, des composants biologiques responsables de ces variations 20 significatives de mesures ; - la prédiction des effets de la concentration de ces composants biologiques sur les caractéristiques physicochimiques mesurées ; - l'analyse raffinée des effets additifs ou synergiques des composants biologiques sur les variations de mesure ; 25 - l'analyse de l'effet couronne dû aux interactions entre le nanomatériau et les différentes protéines du milieu naturel complexe ; - la prédiction des effets de certains paramètres du milieu naturel complexe ciblé, comme par exemple sa viscosité, son pH ou autre, sur les caractéristiques physicochimiques mesurées. 30 Avantageusement, les milieux de culture cellulaires sélectionnés pour former le lot de milieux de mesure selon l'invention sont différents selon la question à laquelle on souhaite répondre et forme un panel adapté à celle-ci. Les différentes étapes du procédé permettant d'obtenir un tel lot de 35 milieu de mesure selon l'invention ont été représentées schématiquement sur la figure 1. La première étape consiste à recenser des milieux de culture 3059431 8 cellulaire disponibles commercialement et qui sont ainsi susceptibles d'être utilisés pour servir de milieux de mesure pour le lot. Pour cela, on peut utiliser des bases de données publiques ou privées listant ces milieux de culture, par exemple les bases de données mises à 5 disposition par les fabricants de milieux de culture cellulaire, ou encore constituer une base de données dédiée à cet usage. On analyse cette base pour en extraire les milieux de culture cellulaire potentiellement utilisables. On ne souhaite garder que les milieux entièrement synthétiques, 10 c'est-à-dire sans aucun constituant animal, et dont la composition est entièrement connue et garantie par le fabricant pour être identique d'un échantillon à l'autre. On veut en effet maîtriser l'incertitude dès le début du procédé, afin de garantir la traçabilité métrologique et obtenir une bonne reproductibilité des résultats des mesures. 15 Les milieux de culture cellulaire cherchent à reproduire les conditions de l'environnement cellulaire in vivo. Ils contiennent des éléments nutritifs, des éléments servant à maintenir les conditions physicochimiques comme le pH ou l'osmolarité, une base permettant la prolifération des cellules. Actuellement, on en trouve deux sortes sur le marché : ceux 20 constitués par l'association d'un milieu artificiel de base et de sérum d'origine animale (le plus performant étant le sérum de veau foetal) et ceux appelés « milieux définis » formés d'un milieu artificiel de base sans sérum enrichi en facteurs rigoureusement contrôlés en vue d'être reproductibles. Seuls les milieux définis seront donc conservés. 25 Parmi les milieux retenus, on élimine encore un certain nombre de milieux de culture qui ne conviennent pas pour l'application considérée. On écarte ainsi les milieux de culture cellulaires qui sont aberrants par rapport au milieu naturel complexe ciblé, c'est-à-dire ceux dont les paramètres 30 ou la composition sont trop éloignés de ceux pouvant être rencontrés dans ce type de milieu naturel complexe. En effet, les milieux naturels ciblés peuvent être de différentes natures. Il peut s'agir d'un milieu biologique physiologique humain ou animal, tel que par exemple du sang, de la lymphe, de la salive, des sécrétions corporelles, du 35 sperme, du lait..., ou d'un milieu biologique environnemental, notamment l'eau d'une rivière, d'un étang ou autre, selon que l'on souhaite étudier l'impact des nanomatériaux sur la santé ou l'environnement. 3059431 9 Les milieux de culture cellulaires définis disponibles sur le marché sont très variés et renferment plus de 14 familles de composants pouvant contenir chacune plusieurs dizaines de composants. Il est donc possible d'obtenir à partir de ces milieux un échantillonnage de l'ensemble des composants potentiellement 5 présents dans le milieu naturel complexe ciblé. On écarte également les milieux de culture cellulaires qui sont incompatibles avec les appareillages ou les techniques de mesure envisagées. Selon la nature des nanomatériaux et des caractéristiques 10 physicochimiques à mesurer (taille, forme, propriétés de surface, composition, pureté, stabilité... du nanomatériau) différents appareillages ou instruments de mesure peuvent être utilisés, notamment un microscope (par exemple un microscope optique en champ proche, microscope électronique à balayage, microscope électronique en transmission, microscope à effet tunnel, microscope à 15 force atomique), un spectroscope (par exemple un spectroscope de corrélation de fluorescence, spectroscope Raman, spectroscope infrarouge, spectroscope de masse), un appareil de résonance magnétique nucléaire, un appareil mesurant la diffusion (la diffusion dynamique de la lumière ou la diffusion des rayons X aux petits angles par exemple), un appareil de mesure du dichroïsme circulaire, un 20 appareil de mesure du potentiel Zeta, un appareil de cristallographie aux rayons X, ou autres. Les milieux de culture cellulaire incompatibles ayant été écartés, les mesures sont réalisables avec pas ou peu de modifications de ces appareillages existants. 25 Afin de limiter le nombre de milieux, on élimine également les milieux redondants, c'est-à-dire les milieux dont les caractéristiques de composition biologique sont proches et qui constituent des « amas » du point de vue statistique. Pour chacun de ces amas, on ne conserve qu'un seul milieu de 30 culture cellulaire. Cette opération d'élimination des amas est effectuée selon des principes d'analyse statistiques en fonction de l'écart minimal de composition que l'on souhaite entre les différents milieux, et par exemple en utilisant l'algorithme de Wootton, Sergent, Phan-Tan-Luu ou l'algorithme d'échange de Fedorov appliqué 35 à un critère d' optimalité de type D ou G. Après avoir mené ces différentes opérations d'élimination, on 3059431 10 dispose d'un ensemble réduit de milieux de culture cellulaire disponibles utilisables. Lorsque cet ensemble réduit comporte des lacunes, c'est-à-dire des zones de composition ou de valeur de paramètres potentiellement rencontrées dans 5 le milieu naturel complexe ciblé qui ne sont pas représentées par les milieux de culture cellulaire de l'ensemble réduit de milieux, il est possible de compléter cet ensemble afin d'obtenir une répartition plus homogène des milieux et ainsi de « réparer » ces lacunes. Pour cela, on définit des milieux supplémentaires qui se trouvent 10 dans la ou les lacunes à réparer, c'est-à-dire dont la composition ou les paramètres appartiennent à la zone non représentée. Lorsque c'est possible, on choisit préférentiellement comme milieux supplémentaires des milieux de culture cellulaire composites, c'est-à-dire pouvant être obtenus par simple mélange de plusieurs milieux de culture déjà existants et 15 disponibles commercialement, préférentiellement choisis parmi l'ensemble réduit des milieux recensés. Dans le cas contraire, on choisit comme milieux supplémentaires des milieux nouveaux qui sont simplement définis par leur composition et qui doivent être obtenus spécifiquement par synthèse directe à partir de leurs constituants de 20 base. La nature et le nombre des milieux supplémentaires à rajouter pour réparer les lacunes, la composition précise de ces milieux lorsqu'ils doivent être synthétisés à partir des ingrédients de base, ou les lois de mélange à respecter pour les obtenir à partir de milieux de culture disponibles commercialement sont 25 déterminés par un algorithme de réparation dont un exemple est donné à titre d'illustration dans le tableau 1 ci-dessous. Ces milieux supplémentaires sont élaborés de manière à respecter les contraintes techniques liées à l'utilisation des appareils de mesure, en terme d'acidité et de viscosité par exemple. 30 Une fois l'ensemble réduit de milieux complété par les milieux supplémentaires ainsi définis, on obtient un ensemble uniforme de milieux de culture cellulaire. On peut alors sélectionner dans cet ensemble, ainsi reconditionné, un panel uniforme présentant les propriétés mathématiques nécessaires pour obtenir la précision recherchée pour les analyses statistiques. 35 3059431 11 Tableau 1 : illustrant les étapes d'un exemple d'algorithme de réparation des lacunes d'un ensemble réduit de milieux recensés et de sélection d'un panel uniforme selon l'invention. No. Opération 1 Générer aléatoirement Na milieux artificiels répartis uniformément dans l'espace des composants biologiques. 2 Ajouter les Na milieux artificiels à la base des milieux existants. 3 Pour i = i- à i+ faire : Sélectionner le meilleur groupe de i milieux dans la base au sens du critère d'optimalité choisi au départ en utilisant l'algorithme de Fedorov. Calculer la valeur du facteur d'inflation de la variance en fonction de i. 4 Choisir le plus petit groupe de milieux tel que : Facteur d'inflation de la variance REVENDICATIONS1. Ensemble de mesure d'une caractéristique physico-chimique d'un nanomatériau, dans lequel le nanomatériau doit être incorporé pour réaliser la mesure, caractérisé : en ce que l'ensemble de mesure est un lot de milieux de mesure ; en ce que ce lot de milieux de mesure comprend plusieurs milieux de culture cellulaire entièrement synthétiques et de composition définie ; et en ce que ces milieux de culture cellulaire constituent un panel représentatif de paramètres ou de constituants d'un milieu naturel complexe. 2. Ensemble de mesure selon la revendication 1 caractérisé en ce que ces milieux de culture cellulaire constituent un panel uniforme, c'est-à-dire ne contenant ni lacune ni amas d'un point de vue statistique. 3. Ensemble de mesure selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il contient un nombre inférieur ou égal à 20 milieux de culture cellulaire, de préférence entre 5 et 20 milieux de culture cellulaire, plus préférentiellement entre 5 et 15 milieux de culture cellulaire, et encore plus préférentiellement environ 10 milieux de culture cellulaire. 4. Ensemble de mesure selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les milieux de culture cellulaire constituent un panel représentatif des différents constituants rencontrés dans le sang humain, ou plus spécifiquement des acides aminés ou des vitamines ou des sels minéraux ou des protéines rencontrés dans le sang humain. 2 5 5. Ensemble de mesure selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le lot de milieux de mesure contient en outre un solvant organique simple servant de témoin. 6. Procédé d'obtention d'un ensemble de mesure selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que : 30 on recense des milieux de culture cellulaire entièrement synthétiques et de composition définie, disponibles commercialement, on réduit le nombre de milieux recensés en écartant : - les milieux de culture cellulaire qui ne sont pas compatibles avec la mesure à réaliser, 3 5 . les milieux de culture cellulaire aberrants par rapport au milieu naturel complexe, et les amas de milieux de culture cellulaire de composition proche, en ne 3059431 18 conservant qu'un seul milieu de culture cellulaire par amas, on sélectionne parmi cet ensemble réduit de milieux recensés, un nombre limité de milieux de culture cellulaire de manière à former un panel représentatif de paramètres ou de constituants du milieu naturel complexe ; 5 - on réalise le lot de milieux de mesure en se procurant ou en réalisant les milieux sélectionnés. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on ajoute dans le lot de milieux de mesure réalisé, au moins un milieu de culture cellulaire supplémentaire pour obtenir un panel uniforme, ce milieu de culture 10 cellulaire supplémentaire étant entièrement synthétique, de composition définie et compatible avec la mesure à réaliser, et étant soit un milieu composite obtenu par mélange de plusieurs des milieux de culture cellulaire recensés, soit un milieu nouveau élaboré à partir de ses constituants de base. 8. Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 7, 15 caractérisé en ce qu'on ajoute dans le lot de milieux de mesure réalisé, un solvant organique simple servant de témoin. 9. Utilisation d'un ensemble de mesure selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour réaliser des mesures d'une caractéristique physico-chimique d'un nanomatériau incorporé dans ces milieux de mesure. 20 10. Procédé de prédiction d'une caractéristique physico-chimique d'un nanomatériau incorporé dans un milieu naturel complexe ou de l'influence de paramètres ou de constituants de ce milieu naturel complexe sur l'évolution de cette caractéristique physico-chimique, au moyen d'un ensemble de mesure selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend les 2 5 étapes suivantes: planification statistique d'un protocole expérimental de mesure d'une caractéristique physico-chimique du nanomatériau incorporé dans des milieux de mesure dudit ensemble, qui spécifie : la nature des milieux de mesure dudit ensemble à utiliser pour réaliser 3 0 ces mesures, le nombre de répétition de chacune des mesures à réaliser, et l'ordre des mesures à réaliser, - incorporation du nanomatériau dans les milieux de mesure dudit ensemble spécifiés dans le protocole expérimental ; 3 5 - réalisation de mesures de la caractéristique physico-chimique du nanomatériau incorporé dans ces milieux de mesure, avec le nombre de répétition et dans l'ordre spécifié dans le protocole expérimental, 3059431 19 analyse statistique des résultats des mesures réalisées et déduction à partir de cette analyse d'une prédiction de la caractéristique physico-chimique du nanomatériau lorsqu'il est incorporé dans le milieu naturel complexe ou de l'influence de paramètres ou de constituants de ce milieu naturel complexe 5 sur l'évolution de cette caractéristique physico-chimique. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la caractéristique physico-chimique du nanomatériau est sa taille, sa forme, sa composition, sa pureté, ses propriétés de surface ou sa stabilité ; et en ce que les mesures sont réalisées par microscopie, spectroscopie, diffusion dynamique de la 10 lumière, dichroïsme circulaire, résonance magnétique nucléaire, cristallographie, mesure du potentiel zeta, ou par diffusion des rayons X aux petits angles. 12. Procédé selon la revendication 10 ou la revendication 11 caractérisé en ce que le milieu naturel complexe est du sang, un produit sanguin, de la lymphe, de la salive, des sécrétions corporelles, du sperme, du lait ou de 15 l'eau d'une rivière ou d'un étang. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12 caractérisé en ce que l'on utilise un ensemble de mesure obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 6 à 8. 14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que l'on 2 0 sélectionne le nombre limité de milieux formant le panel spécifiquement en fonction du phénomène que l'on souhaite prédire. 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que l'on sélectionne le nombre limité de milieux formant le panel en fonction du phénomène que l'on souhaite prédire qui est l'effet couronne dû aux interactions 2 5 entre le nanomatériau et les protéines du milieu naturel complexe.