Brevet FR3060746A1 — publié le 20180622

Procédé de numération de particules dans un échantillon par imagerie sans lentille Description DOMAINE TECHNIQUE L'invention est un procédé optique pour la numération de particules, en particulier des cellules sanguines, disposées dans un échantillon à l'aide d'un dispositif d'imagerie sans lentille. ART ANTERIEUR Dans le domaine de l'hématologie, la numération de cellules sanguines, par exemple les globules rouges ou les globules blancs, est une opération courante. Les laboratoires d'analyse sont équipés d'automates permettant la réalisation d'hémogrammes fiables. Les principes mis en oeuvre par ces automates sont des mesures de cytométrie basées sur une variation d'impédance ou une diffusion d'un faisceau lumineux. Cependant, les automates sont généralement chers et leur usage reste cantonné au laboratoire. Au-delà de l'hématologie, l'identification de particules d'intérêt dans un échantillon et leur 15 comptage sont des opérations couramment pratiquées. Le document W02008090330 décrit un dispositif permettant l'observation d'échantillons comportant des cellules par imagerie sans lentille. L'échantillon est disposé entre une source de lumière et un capteur d'image, sans disposer de lentille de grossissement optique entre l'échantillon et le capteur d'image. Ainsi, le capteur d'image collecte une image d'une onde 20 lumineuse transmise par l'échantillon. Cette image, également appelée hologramme, est formée de figures d'interférence entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et transmise par l'échantillon, et des ondes de diffraction, résultant de la diffraction par l'échantillon de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. Ces figures d'interférences sont généralement formées par une succession d'anneaux concentriques. Elles sont parfois 25 dénommées figures de diffraction, ou désignées par le terme anglais « diffraction pattern ». On acquiert ainsi des images, dont le champ d'observation est nettement plus important que celui d'un microscope. Lorsque la concentration en cellules de l'échantillon est suffisamment faible, à chaque cellule peut être associée une figure d'interférence ; leur dénombrement permet la numération des cellules présentes dans l'échantillon. Mais l'hologramme ne permet pas un 30 comptage fiable des cellules lorsque la concentration augmente. L'hologramme acquis par le capteur d'image peut être traité par un algorithme de reconstruction holographique, de manière à estimer des propriétés optiques de l'échantillon, 3060746 2 par exemple une absorption ou une valeur de déphasage de l'onde lumineuse traversant l'échantillon et se propageant vers le capteur d'image. Ce type d'algorithme est bien connu dans le domaine de la reconstruction holographique. Un exemple d'algorithme de reconstruction holographique est décrit dans la publication Ryle et al, « Digital in-line holography of biological 5 specimens », Proc. Of SPIE Vol.6311 (2006). Cependant, de tels algorithmes peuvent donner lieu à l'apparition d'un bruit de reconstruction, désigné par le terme "twin image", sur l'image reconstruite. Leur application nécessite donc certaines précautions. La demande US2012/0218379 décrit un procédé permettant de reconstruire une image complexe d'un échantillon, cette dernière comportant des informations d'amplitude et de phase. La demande 10 US2012/0148141 applique le procédé décrit dans la demande US2012/0218379 pour reconstruire une image complexe de spermatozoïdes et de caractériser leur mobilité. Les inventeurs ont souhaité proposer une alternative simple et peu onéreuse pour dénombrer des particules d'intérêt dans un échantillon, en tirant profit du champ d'observation important conféré par l'imagerie sans lentille. Appliquée aux échantillons sanguins, l'invention peut constituer une alternative aux automates d'hématologie actuellement disponibles pour la réalisation de numérations de cellules dans du sang. L'invention est notamment adaptée à des échantillons présentant des concentrations élevées en particules, pouvant atteindre plusieurs centaines de milliers de particules par microlitre. EXPOSE DE L'INVENTION Un objet de l'invention est un procédé de numération de particules, notamment des cellules sanguines disposées dans un échantillon, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse, dite onde lumineuse d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image sous l'effet de ladite illumination ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : c) application d'un opérateur de propagation à partir de l'image acquise lors de l'étape b), de façon à calculer une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition selon une surface de reconstruction s'étendant face au plan de détection ; 3060746 3 d) formation d'une image, dite image reconstruite, représentative d'une distribution du module et/ou de la phase de l'expression complexe selon la surface de reconstruction ; e) segmentation de l'image formée lors de l'étape d) pour obtenir une image de segmentation, comportant des régions d'intérêt espacées les unes des autres, tout ou 5 partie des régions d'intérêt étant associées à au moins une particule d'intérêt ; f) détermination d'une taille de régions d'intérêt et classification desdites régions d'intérêt, en fonction de leur taille, entre au moins une des classes suivantes : une classe selon laquelle la région d'intérêt correspond à une unique particule d'intérêt ; 10 une classe selon laquelle la région d'intérêt correspond à un nombre prédéterminé, supérieur à 1, de particules d'intérêt ; g) numération des particules d'intérêt ayant fait l'objet d'une classification lors de l'étape f). La classification permet une quantification plus précise des particules d'intérêt, par rapport à un 15 simple comptage des régions d'intérêt sélectionnées. L'étape f) peut comporter, préalablement à la classification : une détermination d'au moins un critère morphologique pour chaque région d'intérêt; une sélection des régions d'intérêt (ROI) en fonction du critère morphologique, la classification étant réalisée sur les régions d'intérêt sélectionnées. 20 Un critère morphologique peut notamment être choisi parmi un diamètre, une taille ou un facteur de forme de chaque région d'intérêt. Plusieurs critères morphologiques peuvent être combinés. L'étape f) peut comporter une prise en compte d'une taille de référence, et/ou d'une forme de référence, représentative d'un nombre prédéterminé de particules d'intérêt ; la classification 25 est alors réalisée en fonction de ladite taille de référence. L'étape f) peut comporter les sous-étapes suivantes : fi) une première classification des régions d'intérêt, réalisée en fonction d'une première taille de référence, la première taille de référence correspondant à un nombre prédéterminé de particules d'intérêt ; 30 fii) suite la première classification, une détermination d'une deuxième taille de référence, à partir des régions d'intérêt classifiées, lors de la sous-étape fi), comme comportant un nombre prédéfini de particules d'intérêt ; 3060746 4 fiii) une deuxième classification des régions d'intérêt, réalisée en fonction de la deuxième taille de référence (S'f_2) déterminée lors de la sous-étape fii). L'étape f) peut comporter, préalablement à la classification : un calcul d'un rapport signal à bruit de plusieurs régions d'intérêt ; 5 une sélection des régions d'intérêt en fonction du rapport signal à bruit calculé pour chacune d'entre elle, par exemple sur la base d'une comparaison par rapport à un seuil. la classification étant alors réalisée sur les régions d'intérêt sélectionnées. L'échantillon peut être mélangé à un réactif de sphérisation préalablement à l'étape b), pour modifier la forme des particules d'intérêt de façon à la rendre sphérique. 10 L'étape c) peut comporter les sous-étapes suivantes : ci) définition d'une image initiale de l'échantillon dans le plan de détection, à partir de l'image acquise par le capteur d'image ; cii) détermination d'une image complexe de l'échantillon dans une surface de reconstruction en appliquant un opérateur de propagation à l'image initiale de 15 l'échantillon définie lors de la sous-étape ci) ou à l'image de l'échantillon, dans le plan de détection, résultant de l'itération précédente ; ciii) calcul d'un indicateur de bruit à partir de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape cii), cet indicateur de bruit dépendant d'un bruit de reconstruction affectant ladite image complexe ; 20 civ) mise à jour de l'image de l'échantillon dans le plan de détection par un ajustement de valeurs de phase des pixels de ladite image, l'ajustement étant réalisé en fonction d'une variation de l'indicateur calculé lors de la sous-étape ciii) selon lesdites valeurs de phase ; cv) réitération des sous-étapes cii) à civ) jusqu'à l'atteinte d'un critère de convergence, de 25 façon à obtenir une image complexe de l'échantillon dans le plan détection et dans la surface de reconstruction. De préférence, aucune optique de formation d'image ou aucune optique de grossissement n'est disposée entre l'échantillon et le capteur d'image. Les particules d'intérêt peuvent être des cellules sanguines. Selon un mode de réalisation, lors 30 de l'étape d) : - les particules d'intérêt sont des globules rouges ou des globules blancs, l'image reconstruite étant représentative d'une distribution du module l'expression complexe selon la surface de reconstruction; 3060746 5 - les particules d'intérêt sont des plaquettes, l'image reconstruite étant représentative d'une distribution d'une phase de l'expression complexe selon la surface de reconstruction. Un autre objet de l'invention est un dispositif pour la numération de particules d'intérêt 5 disposées dans un échantillon, le dispositif comportant : - une source de lumière apte à émettre une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon; - un support, configuré pour maintenir l'échantillon entre la source de lumière et un capteur d'image ; 10 un processeur, configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image et à mettre en oeuvre les étapes c) à g) du procédé tel que décrit dans cette demande. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. 15 FIGURES La figure 1A représente un exemple de dispositif permettant la mise en oeuvre de l'invention. La figure 1B représente un autre exemple de dispositif permettant la mise en oeuvre de l'invention. La figure 2A est un logigramme montrant les principales étapes d'un procédé selon l'invention. La figure 2B montre une image reconstruite dite d'amplitude, l'échantillon comprenant des 20 globules rouges. La figure 2C montre l'image de la figure 2B après segmentation, cette figure montrant plusieurs régions d'intérêt distribuées dans l'image. La figure 2D montre l'image de la figure 2C après classification de chaque région d'intérêt. La figure 2E représente un histogramme du rapport signal à bruit déterminé pour chaque région d'intérêt. Les figures 3A et 3B représentent des régions d'intérêt respectivement avant et après un 25 seuillage en fonction d'une valeur de rapport signal sur bruit. Les figures 3C et 3D sont des histogrammes des rapports signal à bruit respectivement des images 3A et 3B. La figure 3E montre les principales étapes d'un mode particulier de réalisation. La figure 4A illustre les principales étapes d'un procédé permettant d'obtenir une image complexe de l'échantillon, dite image reconstruite, dans un plan de reconstruction. La figure 4B 30 schématise les étapes décrites en lien avec la figure 4A. Les figures 5A, 5B et 5C sont des courbes représentant des numérations de globules rouges mettant en oeuvre l'invention, en utilisant une diode électroluminescente émettant 3060746 6 respectivement dans des bandes spectrales bleue, verte et rouge, en fonction de numérations effectuées à l'aide d'une méthode de référence. La figure 5D est une courbe représentant des numérations de globules rouges mettant en oeuvre l'invention en utilisant une source de lumière laser, en fonction de numérations effectuées à 5 l'aide d'une méthode de référence. La figure 6A montre une image reconstruite dite d'amplitude, l'échantillon comprenant des globules blancs. La figure 6B montre l'image de la figure 6A après segmentation. La figure 6C montre une image reconstruite dite d'amplitude, l'échantillon comprenant des globules blancs. La figure 6D montre l'image de la figure 6C après segmentation. 10 La figure 7A montre une image reconstruite dite d'amplitude, l'échantillon comprenant des billes de verre. La figure 7B montre l'image de la figure 7A après segmentation. Les figures 8A et 8B sont des histogrammes représentant une distribution de rapports signal à bruit de régions d'intérêt correspondant à des globules rouges. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS 15 La figure 1A représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant vers un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale 4X. L'échantillon 10 est un échantillon comportant des particules, parmi lesquelles des particules 20 d'intérêt 10a que l'on souhaite dénombrer. Par particules, on entend par exemple des cellules, et notamment des cellules sanguines, mais il peut également s'agir de microorganismes, des virus, des spores, ou des microbilles, usuellement mises en oeuvre dans des applications biologiques, ou encore des microalgues. Il peut également s'agir de gouttelettes insolubles dans le milieu liquide 10m, par exemple des gouttelettes d'huile dispersées dans une phase aqueuse. 25 De préférence, les particules 10a ont un diamètre, ou sont inscrites dans un diamètre, inférieur à 100 um, et de préférence inférieur à 50 um ou 20 um. De préférence, les particules ont un diamètre, ou sont inscrites dans un diamètre, supérieur à 500 nm ou 1 um. Dans l'exemple représenté sur la figure 1A, l'échantillon comprend un milieu 10m dans lequel baignent les particules d'intérêt 10a. Les particules 10a sont, dans cet exemple, des cellules 30 sanguines, par exemple des globules rouges (érythrocytes) ou des globules blancs (leucocytes). Le milieu 10m, dans lequel baignent les particules, peut notamment être un liquide, par exemple du plasma sanguin, éventuellement dilué. 3060746 7 L'échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une chambre fluidique de type Countess ® d'épaisseur e=100 um. L'épaisseur e de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation Z varie typiquement entre 10 um et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 um et 500 um. L'échantillon 10 s'étend selon un 5 plan P10, dit plan de l'échantillon, de préférence perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Il est maintenu sur un support 10s à une distance d d'un capteur d'image 16. La distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa 10 diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. La source de lumière 11 peut être une diode électroluminescente comme représenté sur la figure 1A. Elle peut être associée à un diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 um et 1 mm, de préférence entre 50 um et 500 um. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs 15 sous la référence P150S et son diamètre est de 150 um. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Le dispositif peut comporter un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de 20 la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par la source de lumière selon un cône d'angle a. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 80°. La présence d'un tel diffuseur permet de rendre le dispositif plus tolérant à l'égard d'un décentrage de la source de lumière par rapport au diaphragme, et d'homogénéiser l'éclairage de l'échantillon. Le 25 diaphragme n'est pas nécessaire, en particulier lorsque la source de lumière est suffisamment ponctuelle, notamment lorsqu'il s'agit d'une source laser. La source de lumière 11 peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n'est pas utile de lui associer un filtre spatial 18 ou un diffuseur 17. Une telle configuration est représentée sur la figure 18. 30 De préférence, la bande spectrale d'émission 4X de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale. 3060746 8 L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et le capteur d'image 16 précédemment évoqué. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, 5 une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Le capteur d'image 16 est apte à former une image /0 selon un plan de détection P0. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection Po s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice 10 de pixels du capteur d'image 16 est avantageusement comprise entre 50 um et 2 cm, de préférence comprise entre 100 um et 2 mm. On remarque l'absence d'optique de formation d'image, telle qu'une optique de grossissement, entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières 15 n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image. Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les particules présentes dans l'échantillon peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection P0, des interférences avec une partie 12' de l'onde lumineuse incidente 12 transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 20 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, dite onde lumineuse d'exposition, transmise par l'échantillon 10 et à laquelle est exposé le capteur d'image 16, peut comprendre : une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par chaque particule de l'échantillon ; une composante 12' résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par 25 l'échantillon. Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection. Aussi, l'image /0 acquise par le capteur d'image 16 comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction), chaque figure d'interférence étant générée par une particule 10a de l'échantillon 10. Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est configuré pour traiter chaque image /0 30 acquise par le capteur d'image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le 3060746 9 processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20. Comme indiqué en relation avec l'art antérieur, une image /0 acquise sur le capteur d'image 16, également appelée hologramme, ne permet pas d'obtenir une représentation suffisamment 5 précise de l'échantillon observé. On peut appliquer, à chaque image acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation h, de façon à calculer une grandeur représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14. Un tel procédé, désigné par le terme reconstruction holographique, permet notamment de reconstruire une image du module ou de la phase de cette onde lumineuse 14 dans un plan de reconstruction parallèle au plan de détection Po, et 10 notamment dans le plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon. Pour cela, on effectue un produit de convolution de l'image /0 acquise par le capteur d'image 16 par un opérateur de propagation h. Il est alors possible de calculer une expression complexe A de l'onde lumineuse 14 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, et en particulier selon une surface de reconstruction s'étendant face au capteur d'image. La surface de reconstruction peut notamment être un plan 15 de reconstruction Pz situé à une distance I z I du capteur d'image 16, et notamment le plan P10 de l'échantillon, avec : A(x, y, z) = 10(x, y, z) * h, *désignant l'opérateur produit de convolution. Dans la suite de cette description, les coordonnées (x, y) désignent une position radiale dans un plan perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La coordonnée z désigne une coordonnée 20 selon l'axe de propagation Z. L'expression complexe A est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'intensité de l'onde lumineuse 14 à laquelle est exposé le capteur d'image 16. Le produit de convolution de l'image /0 par l'opérateur de propagation h permet d'obtenir une image complexe A, représentant une distribution spatiale 25 de l'expression complexe A dans le plan de reconstruction Pz, s'étendant à une coordonnée z du plan de détection P0. Dans cet exemple, le plan de détection Po a pour équation z = O. L'image complexe A, correspond à une image complexe de l'échantillon dans le plan de reconstruction P. Elle représente également une distribution spatiale bidimensionnelle des propriétés optiques de l'onde lumineuse d'exposition 14. L'opérateur de propagation h a pour 30 fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d'image 16 et un point de coordonnées (x, y, z), situé à une distance I zl du capteur d'image. Il est alors possible de 3060746 10 déterminer le module M (x, y, z) et/ou la phase cf:1 (x, y, z) de l'onde lumineuse d'exposition 14, à cette distance I z I, dite distance de reconstruction, avec : - M(x, y, z) = abs [A (x, y, z)] (1) ; - ço(x, y, z) = arg [A (x, y, z)] (2). 5 Les opérateurs abs et ar g désignent respectivement le module et l'argument. Autrement dit, l'expression complexe A de l'onde lumineuse d'exposition 14 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace est telle que : A(x, y, z) = M (x, y, z)e-nP(x'Y'z) (3). Il est possible de former des images Mz et (pz représentant respectivement une distribution du module ou de la phase de l'expression complexe A dans une surface s'étendant face au plan de 10 détection Po. Une telle surface peut notamment être un plan Pz situé à une distance I z I du plan de détection Po, avec Mz = mod (Az) et (pz = arg(Az). La surface précédemment évoquée n'est pas forcément plane, mais elle s'étend sensiblement parallèlement au plan de détection et est de préférence un plan Pz parallèle au plan de détection. Dans la suite de la description, l'image obtenue à partir du module et/ou de la phase de l'image complexe Az est désignée par 15 le terme "image reconstruite" et est notée I. Les inventeurs ont mis au point un procédé de numération des particules 10a présentes dans l'échantillon selon un procédé décrit en lien avec les figures 2A à 2E. Les principales étapes de ce procédé sont décrites ci-après. Étape 100 : illumination de l'échantillon. Au cours de cette étape, l'échantillon est illuminé par 20 la source de lumière 11. Étape 110: acquisition d'une image /0 de l'échantillon 10 par le capteur d'image 16, cette image formant un hologramme. Un des intérêts de la configuration sans lentille, représentée sur les figures 1A ou 1B, est le large champ observé, permettant d'adresser simultanément un volume d'échantillon élevé. Le champ observé dépend de la taille du capteur, en étant légèrement 25 inférieur à la surface de détection de ce dernier, du fait de l'espacement entre le capteur et l'échantillon. Le champ observé est généralement supérieur à 10 mm2, voire 20 mm2. Étape 120 : calcul d'une image complexe Az dans un plan de reconstruction Pz. L'image complexe comporte des informations de phase et d'amplitude de l'onde lumineuse d'exposition 14 à laquelle est exposé le capteur d'image 16. Le plan de reconstruction est le plan P10 selon 30 lequel s'étend l'échantillon. L'étape 120 peut être effectuée en appliquant l'opérateur de propagation h, précédemment décrit, à une image issue de l'image acquise I. Cependant, l'application de l'opérateur de propagation à l'image acquise peut aboutir à une image complexe 3060746 11 Az affectée d'un bruit de reconstruction important, fréquemment désigné par le terme twin image. Afin d'obtenir une image complexe exploitable, en limitant le bruit de reconstruction, des algorithmes itératifs peuvent être mis en oeuvre. Un de ces algorithmes est décrit par la suite, en lien avec les figures 4A et 4B. 5 A partir de l'image complexe Az, on peut obtenir une image reconstruite iz à partir du module Mz et/ou de la phase (pz de l'onde lumineuse d'exposition 14, dans le plan de reconstruction Pz. La distance de reconstruction par rapport au capteur d'image 16 est déterminée soit a priori, connaissant la position de l'échantillon 10 par rapport au capteur d'image 16, soit sur la base d'un algorithme de focalisation numérique, selon lequel la distance de reconstruction optimale 10 est celle pour laquelle l'image reconstruite Iz est la plus nette. Les algorithmes de focalisation numérique sont connus de l'homme du métier. La figure 2B est un exemple d'une partie d'une image reconstruite iz à partir du module Mz d'une image complexe Az obtenue selon un procédé mettant en oeuvre les étapes décrites en lien avec les figures 4A et 4B. Sur cette figure, le contraste a été inversé. Les particules d'intérêt 15 10a que l'on souhaite dénombrer sont des globules rouges. Ils apparaissent sous la forme de régions d'intérêt ROI distribuées dans l'image reconstruite et isolées les unes des autres. L'échantillon et les conditions expérimentales sont décrits plus précisément ci-après, en lien avec les essais expérimentaux. Étape 130 : segmentation. L'image formée au cours de l'étape 120 fait l'objet d'une 20 segmentation, de façon à isoler les régions d'intérêt ROI correspondant à des particules. Par segmentation d'image, on entend une partition de l'image de façon à regrouper les pixels, par exemple en fonction de leur intensité. La segmentation d'image aboutit à une image de segmentation 1; dans laquelle les régions d'intérêt ROI, espacées les unes des autres, sont délimitées, chaque région d'intérêt pouvant correspondre à une particule, ou à un amas de 25 particules comme décrit par la suite. Différentes méthodes de segmentation sont connues de l'homme du métier. On peut par exemple appliquer un seuillage d'Otsu, consistant à déterminer une valeur d'un seuil d'intensité à partir de l'histogramme de l'image, le seuil permettant une séparation optimale des pixels selon deux classes : une classe de pixels représentant les régions d'intérêt et une classe de pixels représentant le fond de l'image. La figure 2C représente le 30 résultat d'une segmentation de l'image de la figure 2B en appliquant un seuillage selon l'algorithme d'Otsu. L'image obtenue est binarisée, les pixels représentant le fond de l'image 3060746 12 étant sombres (niveau de gris minimal) tandis que les pixels représentant chaque zone d'intérêt ROI sont clairs (niveau de gris maximal). Dans cet exemple, l'image de segmentation 1 * issue de cette étape résulte d'une segmentation de l'image /1/4 du module de l'amplitude complexe AZ de l'onde lumineuse d'exposition 14. En 5 variante, l'image issue de cette étape résulte d'une segmentation de l'image cp, de la phase de l'onde lumineuse d'exposition. L'image de segmentation 1 * peut également combiner les régions d'intérêt apparaissant suite aux segmentations respectives de l'image M , du module ainsi que de l'image cp, de la phase de l'onde lumineuse d'exposition. Une numération des particules d'intérêt par un simple comptage des régions d'intérêt 10 apparaissant sur l'image de segmentation 1 * peut donner un premier ordre de grandeur sur la quantité des particules d'intérêt. Mais les inventeurs ont constaté qu'une telle numération donnait des résultats peu précis. En effet, certaines régions d'intérêt correspondent à des particules différentes des particules que l'on souhaite dénombrer. Par ailleurs, certaines régions d'intérêt rassemblent plusieurs particules d'intérêt, ces dernières formant des amas. Cela 15 provient du fait que certaines particules d'intérêt sont proches les unes des autres, et sont confondues dans une même région d'intérêt. Sur les figures 1A et 1B, on a schématisé des amas 10a2 comportant deux particules et des amas 10a3 comportant trois particules. Ces causes d'erreur sont traitées dans les étapes décrites ci-après. Étape 140 : sélection. Au cours de cette étape, on effectue une sélection des régions d'intérêt 20 déterminées lors de l'étape précédente en fonction de leur morphologie, c'est-à-dire en fonction d'un critère morphologique, ce dernier pouvant être l'aire, la forme ou la taille. Cela permet de sélectionner les régions d'intérêt correspondant aux particules d'intérêt que l'on souhaite dénombrer. Cette étape peut comprendre un filtrage de chaque région d'intérêt en fonction du critère 25 morphologique précédemment évoqué, de façon à sélectionner des régions d'intérêt représentatives des particules d'intérêt. Par exemple, lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, le filtrage permet de sélectionner les régions d'intérêt présentant un diamètre inférieur à 100 um, ou inscrites dans un tel diamètre. Cela permet de ne pas prendre en compte des grosses poussières ou des traces, tout en conservant des amas de globules rouges. 30 Afin de prendre en compte des effets d'agglutination entre des particules d'intérêt, une classification des régions d'intérêt sélectionnées peut être réalisée en fonction de leur aire et de leur forme, notamment en se basant sur une taille de référence S'f, par exemple une aire de 3060746 13 référence, cette dernière étant par exemple représentative d'une région d'intérêt correspondant à une particule d'intérêt unique (singulet). L'aire de référence peut être prédéterminée ou obtenue à partir de l'image de segmentation 4, par exemple en calculant une moyenne, ou une médiane, de l'aire de chaque région d'intérêt ROI, et en faisant l'hypothèse 5 que la majorité des régions d'intérêt correspondent à une particule unique. Lorsque, comme dans cet exemple, le capteur d'image est disposé à proximité de l'échantillon. La taille de chaque région d'intérêt est ensuite comparée à taille de référence, en fonction de quoi chaque région d'intérêt est affectée d'un nombre de particules. Par taille, on entend un diamètre ou une aire ou une autre dimension caractéristique. Par exemple, en lien avec la figure 2D : 10 lorsque la taille d'une région d'intérêt est comprise entre 0.5 fois et 1.5 fois la taille de référence, on considère que la région d'intérêt représente une seule particule d'intérêt, ce qui correspond à un singulet, une telle région d'intérêt étant notée R04.Sur la figure 2D, les singulets sont représentés par des points blancs. Lorsque la taille d'une région d'intérêt est comprise entre 1.5 fois et 2.5 fois la taille de 15 référence, on considère que la région d'intérêt représente deux particules d'intérêt ; sur la figure 2D, une telle région d'intérêt R0/2, correspondant à un doublet, est symbolisée par un contour oval blanc. Lorsque la taille d'une région d'intérêt est comprise entre 2.5 fois et 3.5 fois la taille de référence, on considère que la région d'intérêt représente trois particules ; sur la figure 20 2D, une telle région d'intérêt R0/3 est symbolisée par un cadre blanc. La notation ROIn correspond à une région d'intérêt considérée, suite à l'étape de classification, comme comportant de n particule(s), n étant un entier strictement positif. De façon alternative ou complémentaire, préalablement à la classification, une sélection peut être réalisée en fonction de la forme de chaque région d'intérêt. Par exemple, on détermine, 25 pour chaque région d'intérêt, un plus grand diamètre et un plus petit diamètre. Le ratio entre le plus grand diamètre et le plus petit diamètre permet de quantifier un facteur de forme de la région d'intérêt considérée. Selon cette sélection, on peut identifier les régions d'intérêt dont la forme ne peut pas être considérée comme sphérique, ces régions d'intérêt n'étant pas considérées comme représentatives de particules d'intérêt et n'étant pas prises en compte dans 30 la numération. Ainsi, la sélection peut comprendre une comparaison entre la forme de chaque région d'intérêt et une forme représentative de la particule d'intérêt, ou d'amas de particules d'intérêt, à détecter. 3060746 14 Pour chaque région d'intérêt présente dans l'image de segmentation /,*, un rapport signal sur bruit S/B peut être établi. Un tel rapport signal sur bruit peut être calculé en effectuant un rapport entre une valeur moyenne de pixels, dits centraux, situés au centre de la région d'intérêt, par exemple 9 pixels centraux, et l'écart-type calculé sur un fond de l'image, le fond 5 de l'image correspondant à l'image reconstruite sans les régions d'intérêt. La figure 2E est un histogramme des valeurs des rapports S/B calculés pour les différentes régions d'intérêt identifiées sur l'échantillon illustré sur les figures 2C et 2D. La plupart des régions d'intérêt présentent un rapport S/B supérieur à 4, ce qui traduit une détection fiable et un bon degré de confiance dans la sélection des régions d'intérêt, présageant une numération fiable. L'étape 140 10 peut également comporter un filtrage de régions d'intérêt en fonction de leur rapport signal à bruit S/B. En effet, en dessous d'un certain seuil, on considère que le rapport signal sur bruit est trop faible pour qu'on puisse effectivement considérer qu'une région d'intérêt corresponde à une particule. Les figures 3A et 3B représentent un exemple de filtrage de régions d'intérêt sur la base d'une valeur seuil du rapport signal sur bruit égal à 1.5. Comme on peut le voir sur les 15 histogrammes des rapport signal à bruit des régions d'intérêt représentées sur les figures 3A et 3B, lesdits histogrammes faisant respectivement l'objet des figures 3C et 3D, le seuillage permet d'éliminer les régions d'intérêt à faible rapport signal sur bruit, ces dernières étant entourées par un cercle épais sur la figure 3A. Dans cet exemple, le filtrage de régions d'intérêt sur la base du rapport S/B a été limité aux singulets. 20 Selon un mode de réalisation, l'étape 140 peut comporter la succession d'opérations suivantes, décrites en lien avec la figure 3E étape 141 : filtrage de chaque région d'intérêt ROI selon une plage de diamètre représentative des particules d'intérêt, par exemple 3 um - 12 um dans le cas de globules rouges, et selon un critère de forme. 25 étape 142 : calcul d'une taille moyenne des régions d'intérêt résultant de ce filtrage, cette taille moyenne constituant une première taille de référence Sref_1; étape 143 : classification de chaque région d'intérêt ROI de l'image de segmentation, sur la base de la première taille de référence S'f_i, de façon à affecter un nombre entier n de particules à chaque région d'intérêt ROIn; 30 étape 144 : calcul d'un rapport signal sur bruit S/B de chaque région d'intérêt ROI1 considérée comme étant un singulet ; 3060746 15 étape 145 : calcul d'une taille moyenne des singulets ROI1 présentant un rapport signal sur bruit suffisant, c'est-à-dire supérieur à un seuil, le seuil pouvant être égal à 1.5, cette taille moyenne constituant une deuxième taille de référence S'f_2 étape 146 : classification de chaque région d'intérêt ROI de l'image de segmentation, 5 sur la base de la deuxième taille de référence S'f_2 résultant de l'étape 145 ; étape 147 : affectation, à chaque région d'intérêt ROI, d'un nombre de particules n déterminé durant la classification. Cet algorithme permet un ajustement progressif de la taille de référence sur la base de laquelle la classification des régions d'intérêt est réalisée. Cela permet d'obtenir une classification plus 10 précise. Ainsi, l'étape 140 permet de sélectionner les régions d'intérêt représentatives des particules d'intérêt, et/ou d'attribuer un nombre de particule(s) à chaque région d'intérêt considérée comme représentative de particules d'intérêt. Étape 150 : numération. Au cours de cette étape, on dénombre les régions d'intérêt 15 sélectionnées lors de l'étape 140, c'est-à-dire considérées comme représentatives de particules, en tenant compte d'un nombre de particules éventuellement attribué à chacune d'entre elles. L'étape 120 décrite ci-dessus peut être réalisée en effectuant une convolution entre un opérateur de propagation et l'image acquise par le capteur d'image. Cependant, l'application d'un tel opérateur peut engendrer un bruit de reconstruction significatif. Afin d'optimiser la 20 reconstruction, en limitant le bruit de reconstruction, l'étape 120 peut être mise en oeuvre selon un algorithme tel que décrit dans la demande de brevet FR1652500 déposée le 23 mars 2016. On va décrire à présent, en lien avec les figures 4A et 4B, les principales étapes de cet algorithme. Il s'agit d'un algorithme itératif, les étapes 121 à 125 décrites ci-dessous étant réitérées, k désignant le rang d'une itération. Ce procédé vise à déterminer la phase de l'onde lumineuse 25 d'exposition 14 dans le plan de détection Po, de façon à obtenir progressivement une estimation de l'amplitude complexe Ao = 14=0 dans le plan de détection. Lors de chaque itération k, l'image complexe dans le plan de détection obtenue au cours d'une itération précédente, notée Ar-, est propagée dans le plan de reconstruction Pz, pour former une image complexe AZ dans le plan de reconstruction P. Chaque itération consiste à ajuster la phase q4 de l'image complexe 30 111,:c) dans le plan de détection Po en fonction d'un critère de bruit Ek déterminé à partir de l'image complexe A. Étape 121: propagation du plan de détection vers le plan de reconstruction 3060746 16 Au cours de cette étape, on dispose de l'image formée dans le plan de détection Po. Au cours de la première itération, on détermine une image initiale Air° à partir de l'image /0 acquise par le capteur d'image. Le module Mr° de l'image initiale Aro peut être obtenu en appliquant l'opérateur racine carrée à l'image acquise /0 par le capteur d'image, auquel cas Mr° = j. 5 On attribue une valeur arbitraire, par exemple 0, à la phase (pok=o de l'image initiale. Lors des itérations suivantes, l'image dans le plan de détection est l'image complexe Ar- résultant de l'itération précédente. L'image formée dans le plan de détection Po est propagée dans le plan de reconstruction /3,, par l'application d'un opérateur de propagation h tel que précédemment décrit, de façon à obtenir une image complexe 11,k, représentative de l'échantillon 10, dans le 10 plan de reconstruction Pz. La propagation est réalisée par convolution de l'image Arl- par l'opérateur de propagation h_z, de telle sorte que : 11,k = Arl * h_z, L'indice -z représente le fait que la propagation est réalisée dans un sens opposé à l'axe de propagation Z. On parle de rétropropagation. 15 Etape 122 : Calcul d'un indicateur en plusieurs pixels Au cours de cette étape, on calcule une grandeur Ek (x, y) associée à chaque pixel d'une pluralité de pixels (x, y) de l'image complexe 11,k, et de préférence en chacun de ses pixels. Cette grandeur dépend de la valeur 11,k(x,y) de l'image 11,k , ou de son module, au pixel (x,y) à laquelle elle est calculée. Elle peut également dépendre d'une dérivée dimensionnelle de 20 l'image en ce pixel, par exemple le module d'une dérivée dimensionnelle de cette image.Dans cet exemple, la grandeur Ek (x, y) associée à chaque pixel est un module d'une différence de l'image 11,k, en chaque pixel, et la valeur 1. Une telle grandeur peut être obtenue selon l'expression : Ek (x, y) = ,j(111(x, y) - 1)(11(x, y) - 1)* = 1111(x, y) - 11 25 Etape 123 : établissement d'un indicateur de bruit associé à l'image 11,k . Lors de l'étape 122, on calcule des grandeurs Ek (x, y) en plusieurs pixels de l'image complexe A. Ces grandeurs peuvent former un vecteur Ek, dont les termes sont les grandeurs Ek (x, y) associées à chaque pixel (x, y). Dans l'étape 123, on calcule un indicateur, dit indicateur de bruit, à partir d'une norme du vecteur Ek. La grandeur Ek(x, y) calculée à partir de l'image complexe 3060746 17 11,k, à chaque pixel (x, y) de cette dernière, est sommée de façon à constituer un indicateur de bruit Ek associé à l'image complexe Arkef. Ainsi, Ek = E(x,y)Ek (x, y) Un aspect important de cette étape consiste à déterminer, dans le plan de détection P0, des 5 valeurs de phase (picax, y) de chaque pixel de l'image AIL') dans le plan de l'échantillon , permettant d'obtenir, lors d'une itération suivante, une image reconstruite 11,k+1 dont l'indicateur de bruit Ek+1 est inférieur à l'indicateur de bruit Ek. Lors de la première itération, on ne dispose que d'une information pertinente sur l'intensité de l'onde lumineuse d'exposition 14, mais non sur sa phase. La première image reconstruite 11,k=1 10 dans le plan de reconstruction Pz est donc affectée d'un bruit de reconstruction important, du fait de l'absence d'information pertinente quant à la phase de l'onde lumineuse 14 dans le plan de détection Po. Par conséquent, l'indicateur Ek=1 est élevé. Au cours des itérations suivantes, l'algorithme procède à un ajustement progressif de la phase (picax, y) dans le plan de détection P0, de façon à minimiser progressivement l'indicateur Ek. 15 L'image 4 dans le plan de détection est représentative de l'onde lumineuse 14 dans le plan de détection P0, aussi bien du point de vue de son intensité que de sa phase. Les étapes 120 à 125 visent à établir, de façon itérative, la valeur de la phase (picax, y) de chaque pixel de l'image 4, minimisant l'indicateur Ek, ce dernier étant obtenu sur l'image 11,k obtenue par propagation de l'image Arl- dans le plan de reconstruction P. 20 L'algorithme de minimisation peut être un algorithme de descente de gradient, ou de descente de gradient conjugué, ce dernier étant décrit ci-après. Étape 124 : Ajustement de la valeur de la phase dans le plan de détection. L'étape 124 vise à déterminer une valeur de la phase (picax, y) de chaque pixel de l'image complexe 4 de façon à minimiser l'indicateur Ek+1 résultant d'une propagation de l'image 25 complexe AIL') dans le plan de reconstruction Pz, au cours de l'itération suivante k+1. Pour cela, un vecteur de phase (1)1(f, est établi, dont chaque terme est la phase (picax, y) d'un pixel (x, y) de l'image complexe 111,:c). La dimension de ce vecteur est (Np,x, 1), où Np,x désigne le nombre de pixels considérés. Ce vecteur est mis à jour au cours de chaque itération, par l'expression de mise à jour suivante : (pioc 1( x, 30 (pic(x, y) = + p y) où : 3060746 18 ak est un entier, désigné par le terme « pas », et représentant une distance ; pk est un vecteur de direction, de dimension (Np,x, 1), dont chaque terme p(x, y) forme une direction du gradient VrEk de l'indicateur Ek. Cette équation peut être exprimée sous forme vectorielle, comme suit : 5k 1 o = o akPk pk _vEk pkpk-1 V Ek est un vecteur de gradient, de dimension (Np,x, 1), dont chaque terme représente 10 une variation de l'indicateur Ek en fonction de chacun des degrés de liberté des inconnues du problème, c'est-à-dire les termes du vecteur (pl( ; pk-1 est un vecteur de direction établi lors de l'itération précédente ; flk est facteur d'échelle appliqué au vecteur de direction pk-1. Chaque terme Vsk (x , y) du vecteur de gradient VE, est tel que aek (Arkef - 15 V sk (r' ) = = Im(A10( kr'). * hz (r') aço(; (r ) jA ref ef ) où 1m représente l'opérateur partie imaginaire et r' représente une coordonnée (x, y) dans le plan de détection. Le facteur d'échelle flk peut être exprimé de telle sorte que : jj(k) v c(k) .v c(k) v c(k -1) .v E(k-1) 20 Le pas ak peut varier selon les itérations, par exemple entre 0.03 au cours des premières itérations et 0.0005 lors des dernières itérations. L'équation de mise à jour permet d'obtenir un ajustement du vecteur q4, ce qui entraîne une mise à jour itérative de la phase (ploc (x, y) en chaque pixel de l'image complexe 4 Cette image complexe 111 , dans le plan de détection, est alors mise à jour par ces nouvelles valeurs de la 25 phase associées à chaque pixel. Étape 125 : Réitération ou sortie d'algorithme. Tant qu'un critère de convergence n'est pas atteint, l'étape 125 consiste à réitérer l'algorithme, par une nouvelle itération des étapes 121 à 125 sur la base de l'image complexe 111,:c) mise à jour On peut montrer que : où : 3060746 19 lors de l'étape 124. Le critère de convergence peut être un nombre K prédéterminé d'itérations, ou une valeur minimale du gradient V'Ek de l'indicateur, ou une différence considérée comme négligeable entre deux vecteurs de phase (po-1, (pok consécutifs. Lorsque le critère de convergence est atteint, on dispose d'une estimation considérée comme correcte d'une image 5 complexe de l'échantillon dans le plan de détection Po. Étape 126 : Obtention de l'image complexe dans le plan de reconstruction. A l'issue de la dernière itération, le procédé comprend une propagation de l'image complexe 111,:; résultant de la dernière itération dans le plan de reconstruction Pz, de manière à obtenir une image complexe dans le plan de reconstruction A, = A. . 10 Essais expérimentaux Au cours d'une première série d'essais, le procédé préalablement décrit a été utilisé sur des échantillons de sang dilué pour dénombrer les globules rouges. Les figures 5A à 5D représentent les résultats obtenus par le procédé en fonction de valeurs issues d'un automate d'hématologie ABX Pentra 120 DX. Les conditions expérimentales sont les suivantes : 15 échantillon 10 : sang dilué contenu dans une chambre fluidique Countess® d'épaisseur 100 pm, le volume examiné atteignant 3 mm3, soit 3 pl. source de lumière 11 : diode électroluminescente Cree MC-E Color, comportant trois diodes électroluminescentes émettant respectivement dans les bandes spectrales 4X suivantes : 450 nm - 465 nm ; 520 nm - 535 nm ; 630 nm - 640 nm. Dans cet 20 exemple, une seule diode est activée lors de chaque illumination. Alternativement, une diode laser émettant à une longueur d'onde de 405 nm a été utilisée, selon le mode de réalisation représenté sur la figure 1B. capteur d'image : Capteur CMOS IDS p.Eye monochrome 3840 x 2748 pixels, chaque pixel mesurant 1.67 p.m de côté, la surface de détection s'étendant sur environ 30 mm2; 25 distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 : 8 cm lorsque la source de lumière 11 est la diode électroluminescente et 15 cm lorsque la source de lumière est la diode laser distance d entre l'échantillon 10 et le capteur d'image 16 : 1500 p.m ; épaisseur e de la chambre fluidique 15 : 100 pm ; 30 diamètre de l'ouverture du filtre spatial 18 lorsque la source de lumière 11 est une diode électroluminescente : 150 p.m ; 3060746 20 Dans cette première série d'essais, du sang humain a été dilué dans un réactif sphérisant, permettant une modification de la tension de surface des globules rouges de façon à les rendre sphériques. Une calibration est préalablement réalisée, à l'aide d'un automate de référence, de façon à effectuer, de façon connue par l'homme du métier, un recalage entre la concentration 5 du sang et le nombre de globules rouges comptés. Ce recalage tient compte du facteur de dilution, de l'épaisseur de la chambre et de la surface de l'échantillon exposée au capteur d'image. Le protocole de préparation de l'échantillon a été le suivant : dilution au 1/600'me dans un réactif sphérisant ; 10 prélèvement de 10 ul de sang dilué et injection dans la chambre fluidique disposée en regard du capteur d'image ; Chaque échantillon a fait l'objet d'un comptage par un automate ABX Pentra DX 120, utilisé en tant que méthode de référence. 80 échantillons ont été mesurés. Les figures 5A, 5B, 5C et 5D montrent respectivement les 15 résultats obtenus en mettant en oeuvre l'invention (axes des ordonnées) en fonction des mesures de référence (axes des abscisses), la source de lumière étant : la diode électroluminescente émettant dans la bande spectrale 450nm - 465 nm ; la diode électroluminescente émettant dans la bande spectrale 520nm - 535 nm ; la diode électroluminescente émettant dans la bande spectrale 630nm - 640 nm ; 20 la diode laser. On a établi une régression linéaire pour chacune de ces figures, l'expression de chaque régression étant respectivement : y = 1.017x - 0.04 (r2 = 0.98) ; y = 1.019x - 0,07 (r2 = 0.98) ; 25 y = 1.017x - 0,07 (r2 = 0.98); y = 1.027x - 0,11 (r2 = 0.98). Le coefficient r2 est le coefficient de détermination associé à chaque régression linéaire de type Passing-Bablok. Au cours d'une deuxième série d'essais, on a dénombré les globules blancs dans des échantillons 30 de sang humain, après lyse des globules rouges par ajout d'un réactif de lyse. La segmentation d'image a été réalisée sur la base d'un seuillage basé sur un critère d'entropie maximale. Afin de tenir compte de la densité des globules blancs, le facteur de dilution utilisé a été égal à 10. La 3060746 21 figure 6A représente une image du module de l'image complexe dans le plan de reconstruction Pz, ce dernier étant un plan selon lequel s'étend l'échantillon. La figure 6B représente l'image de la figure 6A après segmentation, binarisation et détection d'amas comprenant deux globules blancs. Ces derniers sont contournés par un anneau blanc. L'identification des singulets et des 5 doublets permet une quantification plus précise des globules blancs, par rapport à un simple dénombrement des régions d'intérêt. Les figures 6C et 6D correspondent respectivement aux figures 6A et 6B sur un autre échantillon. L'acquisition a été réalisée en utilisant une source de lumière de type laser, telle que précédemment décrite. La méthode a également été testée, au cours d'une troisième série d'essais, sur des billes de 10 verre de diamètre 5 um. Il s'agit de billes de référence Bangs laboratories - SS06N, diluées au 1/2000'me dans un tampon salin de type PBS. L'acquisition a été réalisée en utilisant une source de lumière de type laser, telle que précédemment décrite. On observe la détection d'un amas comportant deux billes. La figure 7A représente une image du module de l'image complexe dans le plan de reconstruction Pz, ce dernier étant un plan selon lequel s'étend l'échantillon. La figure 15 7B représente l'image de la figure 7A après segmentation, binarisation et détection d'amas comprenant deux billes, ces amas étant entourés par un contour blanc. Dans le cas de globules rouges, les inventeurs estiment qu'il est préférable que la densité surfacique de particules d'intérêt à dénombrer soit inférieure à 2000 particules par mm2 de surface de détection. Au-delà, les particules sont trop proches les unes des autres, ce qui 20 dégrade le rapport signal à bruit de chaque région d'intérêt. Aussi, il est avantageux d'estimer, selon les différents cas de figure, une densité surfacique maximale, et d'adapter en conséquence la dilution à appliquer à l'échantillon. Une des applications visées est la numération de cellules sanguines, ces dernières pouvant être des globules blancs, des globules rouges ou des plaquettes. Les inventeurs ont constaté que 25 lorsqu'il s'agit de globules blancs ou de globules rouges, lors de l'étape 120, il est préférable que l'image reconstruite 4 représente le module de l'amplitude complexe A, dans le plan de reconstruction P. La définition des bords des régions d'intérêt, correspondant aux cellules, est plus nette. Lorsque les particules d'intérêt sont des plaquettes, il semble en revanche préférable que l'image reconstruite 4 représente la phase de l'amplitude complexe A, dans le plan de 30 reconstruction P. Les figures 8A et 8B représentent un histogramme du rapport signal sur bruit de régions d'intérêt correspondant à des globules rouges, en se basant respectivement sur le module ou la phase de l'image complexe reconstruite. Le nombre de globules rouges considérés 3060746 22 était respectivement égal à 12166 et 12888. On observe un rapport signal sur bruit plus élevé lorsqu'on se base sur une image du module (moyenne de 18.6) que lorsqu'on se base sur une image de phase (moyenne de 13.9). Dans ces essais, les globules rouges ont été illuminés dans une bande spectrale bleue. 5 L'invention peut s'appliquer au dénombrement de particules d'intérêt dans le sang, mais également dans d'autres liquides corporels de type urine, salive, sperme...Elle peut également s'appliquer dans la quantification de microorganismes, par exemple des bactéries ou des colonies bactériennes. Au-delà des applications liées à la biologie ou à la santé, l'invention peut être mise en oeuvre dans le contrôle d'échantillons dans des domaines industriels ou le contrôle 10 de l'environnement, par exemple l'agroalimentaire ou le contrôle de fluides industriels. REVENDICATIONS1. Procédé de numération de particules (10a), dites particules d'intérêt, disposées dans un échantillon (10), le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon (10) à l'aide d'une source de lumière (11), la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (In) de l'échantillon (10), formée dans un plan de détection (P0), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (14), dite onde lumineuse d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image (16) sous l'effet de ladite illumination ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : c) à partir de l'image acquise (In) lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation (h) de façon à calculer une expression complexe (Ai) de l'onde lumineuse d'exposition (14), selon une surface de reconstruction (Pi) s'étendant face au plan de détection (P0) ; d) formation d'une image (4, 11/1,, cp,), dite image reconstruite, représentative d'une distribution du module ou de la phase de l'expression complexe selon la surface de reconstruction ; e) segmentation de l'image formée lors de l'étape d) pour obtenir une image de segmentation (4), comportant des régions d'intérêt (ROI) espacées les unes des autres, tout ou partie des régions d'intérêt étant associées à au moins une particule d'intérêt ; f) détermination d'une taille de régions d'intérêt, et classification desdites régions d'intérêt en fonction de leur taille selon au moins une des classes suivantes : une classe selon laquelle la région d'intérêt comporte une unique particule d'intérêt; une classe selon laquelle la région d'intérêt comporte un nombre entier, supérieur à 1, de particules d'intérêt ; g) numération des particules d'intérêt à partir des régions d'intérêt ayant fait l'objet d'une classification lors de l'étape f). 3060746 24 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape f) comporte, préalablement à la classification : - une détermination d'au moins un critère morphologique pour chaque région d'intérêt; - une sélection des régions d'intérêt (ROI) en fonction du critère morphologique, la 5 classification étant réalisée sur les régions d'intérêt sélectionnées. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel au moins un critère morphologique est choisi parmi un diamètre, une taille ou un facteur de forme de chaque région d'intérêt. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape f) comporte une prise en compte d'une taille de référence (S'f), représentative d'un nombre 10 prédéterminé de particules d'intérêt, la classification est réalisée en fonction de ladite taille de référence. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape f) comporte les sous-étapes suivantes : fi) une première classification des régions d'intérêt, réalisée en fonction d'une première 15 taille de référence (S'f_i), la première taille de référence correspondant à un nombre prédéterminé de particules d'intérêt ; fii) suite la première classification, une détermination d'une deuxième taille de référence (Sre f -2), à partir des régions d'intérêt classifiées, lors de la sous-étape fi), comme comportant un nombre prédéfini de particules d'intérêt ; 20 fiii) une deuxième classification des régions d'intérêt, réalisée en fonction de la deuxième taille de référence (Sref_2) déterminée lors de la sous-étape fii). 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'étape f) comporte, préalablement à la classification : un calcul d'un rapport signal à bruit (S/B) de plusieurs régions d'intérêt (ROI); 25 une sélection des régions d'intérêt (ROI) en fonction du rapport signal à bruit (S/B) calculé pour chacune d'entre elle ; la classification étant réalisée sur les régions d'intérêt ainsi sélectionnées. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon est mélangé à un réactif de sphérisation préalablement à l'étape b), pour modifier la forme des 30 particules d'intérêt (10a) de façon à la rendre sphérique. 3060746 25 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape c) comporte les sous-étapes suivantes : ci) définition d'une image initiale de l'échantillon (Aro) dans le plan de détection, à partir de l'image (In) acquise par le capteur d'image ; 5 cii) détermination d'une image complexe de l'échantillon (11,10 dans une surface de reconstruction (Pi) en appliquant un opérateur de propagation à l'image initiale de l'échantillon (111,:f'-1) définie lors de la sous-étape ci) ou à l'image de l'échantillon (Arl), dans le plan de détection, résultant de l'itération précédente (k - 1); ciii) calcul d'un indicateur de bruit (E") à partir de l'image complexe (11,10 déterminée lors 10 de la sous-étape cii), cet indicateur de bruit dépendant d'un bruit de reconstruction affectant ladite image complexe (11,10 ; civ) mise à jour de l'image de l'échantillon (111(c)) dans le plan de détection(P0) par un ajustement de valeurs de phase ((picax, y)) des pixels de ladite image, l'ajustement étant réalisé en fonction d'une variation de l'indicateur calculé lors de la sous-étape 15 ciii) selon lesdites valeurs de phase ; cv) réitération des sous-étapes cii) à civ) jusqu'à l'atteinte d'un critère de convergence, de façon à obtenir une image complexe de l'échantillon (10) dans le plan détection (P0) et dans la surface de reconstruction (Pi). 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel aucune optique 20 de formation d'image n'est disposée entre l'échantillon (10) et le capteur d'image (16). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les particules d'intérêt sont des cellules sanguines. 11. Procédé selon la revendication 10 dans lequel, lors de l'étape d) : - les particules d'intérêt (10a) sont des globules rouges ou des globules blancs, l'image 25 reconstruite étant représentative d'une distribution du module l'expression complexe (Ai) selon la surface de reconstruction (Pi); - les particules d'intérêt (10a) sont des plaquettes, l'image reconstruite étant représentative d'une distribution d'une phase de l'expression complexe (Ai) selon la surface de reconstruction (Pi). 30 12. Dispositif pour la numération de particules d'intérêt (10a) disposées dans un échantillon (10), le dispositif comportant : 3060746 26 une source de lumière (11) apte à émettre une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) ; un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon (10) entre la source de lumière (11) et un capteur d'image (16) ; 5 un processeur (20), configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image (16) et à mettre en oeuvre les étapes c) à g) du procédé objet de l'une quelconque des revendications 1 à 11.