Brevet FR3061204A1 — publié le 20180629

i La présente invention concerne un procédé de production du champignon Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. Etat de la technique La morphologie des champignons filamenteux est un paramètre important à prendre en compte lors de la mise en oeuvre de ces champignons dans les bioprocédés. En effet, la morphologie des champignons filamenteux a une influence sur la rhéologie du milieu dans lequel ils se développent et par voie de conséquence sur les phénomènes de transfert de matière et de chaleur, et notamment le transfert des nutriments et de l'oxygène. Ainsi le contrôle de la morphologie permet d'améliorer la productivité du champignon et/ou faciliter sa mise en culture dans un bioréacteur. On distingue classiquement deux types de morphologie: une morphologie non agrégée dite "mycélium libre" en opposition à une morphologie agrégée ("pellet" selon la terminologie anglo-saxonne). Pour des raisons d'accessibilité de l'oxygène et des nutriments (c'est-à-dire éviter les limitations diffusionnelles), il est préférable de mettre en oeuvre dans un bioréacteur les champignons filamenteux sous forme mycélium libre. Il est connu de la littérature scientifique que l'utilisation de microparticules de talc dans le milieu de culture permettait de contrôler la morphologie du champignon Aspergillus terreus (Joanna Gonciarz, Marcin Bizukojc, Engineering in Life Sciences, 2014, 14, 190-200) et donc d'obtenir un gain de productivité lorsque que ces champignons sont cultivés pour produire des enzymes dans un milieu de culture contenant du talc. Le champignon Aspergillus oryzae présente également un intérêt industriel en raison de sa capacité à produire par exemple des enzymes, du type cellulases ou amylases, utiles dans l'industrie des biocarburants. Plusieurs publications ont également montré son intérêt dans le domaine de la chimie verte car le champignon est également capable de produire, dans certaines conditions, des acides dicarboxyliques en 04 (comme par exemple l'acide malique, l'acide fumarique et encore l'acide succinique). Elle peut donc servir de souche-plateforme pour produire de nombreuses enzymes et molécules d'intérêt dans l'industrie de la fermentation. Un but de l'invention est de fournir un procédé de production, notamment à l'échelle industrielle, du champignon Aspergillus oryzae avec une morphologie du type mycélium libre. 3061204 2 Résumé de l'invention Ainsi l'invention se rapporte à un procédé de production du champignon Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre, comprenant au moins les étapes suivantes: a) on prépare dans un bioréacteur un milieu de culture stérilisé A adapté à la croissance du 5 champignon Aspergillus oryzae contenant au moins 0,5 g/L de talc; b) on ajoute au milieu de culture stérilisé A des spores d'Aspergillus oryzae à raison d'au moins 10 spores/ mL de milieu de culture; c) on incube en présence d'oxygène le milieu de culture stérilisé A issu de l'étape b) à une température comprise entre 15 et 45°C pendant au mcins 6 heures de manière à obtenir 10 un milieu de culture A contenant des champignons de l'espèce Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. La demanderesse a observé de manière surprenante qu'il est possible de favoriser le développement du champignon Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre à partir de 15 spores en réalisant une culture dans un milieu aqueux, compatible avec ledit champignon et qui contient par ailleurs des microparticules de talc. Les microparticules de talc ont une taille généralement comprise entre 2 à 20 lm et de préférence comprise entre 5 et 10 De préférence la teneur en talc est comprise entre 5 et 20 g/L de milieu de culture et de manière plus préférée entre 8 et 15 g/L de milieu de culture. 20 Dans un mode de réalisation préféré, à l'étape b) le milieu de culture A est ensemencé avec 102 à 105 spores/mL de culture. Il est à noter que cette étape de mise en culture des spores du champignon Aspergillus oryzae est conduite dans un bioréacteur et qui inclut des réacteurs de petit volume tel que par exemple une fiole. 25 Selon un mode de réalisation préféré, le milieu de culture obtenu après l'étape c) est utilisé comme préculture du champignon Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre pour réaliser au moins une première étape de propagation qui inclut au moins les étapes suivantes : 30 d) on transfert toute ou partie du milieu de culture A issu de l'étape c) dans un bioréacteur contenant un milieu de culture stérilisé B exempt de talc, avec un rapport volumique (V milieu A ajouté)/(V milieu B) compris entre 0,1% et 10%, de manière à produire un milieu de culture B contenant des champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre; 3061204 3 e) on cultive en présence d'oxygène le milieu de culture B issu de l'étape d) à une température comprise entre 15 et 45°C pendant au mcins 6 heures de manière à obtenir un milieu de culture B contenant des champignons Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. 5 De manière surprenante, il a été constaté par la demanderesse que le champignon Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre obtenus à l'issue de l'étape c) peut être mis en culture dans un milieu exempt de talc et continuer à croître dans ledit milieu tout en conservant sa morphologie mycélium libre. En effet lorsqu'on réalise la même expérience avec les champignons Aspergillus figer et Aspergillus terreus, on constate que ces derniers 10 reprennent la forme « pellets » une fois transférés dans un milieu de culture exempt de talc. Ce mode de réalisation est avantageusement mis en oeuvre pour la production à l'échelle industrielle du champignon Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. Ainsi le procédé selon l'invention utilise le milieu de culture produit à l'étape c) comme inoculum à partir duquel on peut réaliser une étape de propagation/croissance mycélienne 15 du champignon. Etant donné que l'étape de croissance mycélienne est effectuée dans un milieu ne nécessitant pas l'ajout de talc, le protocole de production selon l'invention présente l'avantage d'être également économique tant du point de vue des coûts en matières premières que des coûts liés au retraitement des résidus solides chargés en déchets minéraux qui sont difficiles voire impossibles à éliminer par un procédé d'incinération. 20 Selon un mode de réalisation préférée, le milieu de culture issu de l'étape e) est utilisé pour conduire une seconde étape de propagation. A cette fin, on opère au moins les étapes suivantes : f) on transfert tout ou partie du milieu de culture B issu de l'étape e) dans un bioréacteur 25 contenant un milieu de culture stérilisé C exempte de talc, avec un rapport volumique (V milieu B ajouté)/(V milieu C) compris entre 0,1% et 10%, de manière à produire un milieu de culture C contenant des champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre; g) on cultive en présence d'oxygène le milieu de culture C issu de l'étape f) à une 30 température comprise entre 15 et 45°C pendant au mcins 6 heures de manière à obtenir un milieu de culture C contenant des champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. Dans le cadre de l'invention, on peut également procéder à une étape h) dite de production 35 (bioconversion) de molécules d'intérêt par le champignon. Cette étape h) peut être menée de 3061204 4 façon concomitante à l'étape e) ou à l'étape g). Cette étape h) peut alternativement être réalisée après les étapes e) ou g). Par exemple les molécules d'intérêts susceptibles d'être produites par Aspergillus oryzae sont choisies parmi des enzymes, des alcools, des acides organiques, des esters. Les 5 enzymes peuvent être des cellulases parmi lesquelles des endoglucanases, des exoglucanases, des p-glucosidases, des amylases ou encore des asparaginases ou tout autre enzyme. Description détaillée de l'invention 10 Les autres caractéristiques et avantages de l'invention vont apparaître à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre uniquement illustratif et non limitatif, en se référant aux figures annexées et décrites ci-après: - la figure 1 montre les images des cultures des champignons Aspergillus terreus et Aspergillus ozyzae dans un milieu Sabouraud complémenté avec 10 g/L de talc, 15 après 24 heures de culture; - la figure 2 montre les images des cultures des champignons Aspergillus terreus et Aspergillus ozyzae, après transfert des cultures de la figure 1 dans un milieu Sabouraud exempt de talc et après 72 heures d'incubation. - la figure 3 montre les images des cultures des champignons Aspergillus terreus, 20 Aspergillus figer et Aspergillus ozyzae, après 48 heures de culture dans différentes conditions en milieu YPDP (Yeast Extract Potatoes Dextrose Peptone). L'invention se rapporte donc à un procédé de production du champignon Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre qui comprend au moins les étapes suivantes: 25 a) on prépare dans un bioréacteur de culture un milieu de culture A adapté à la croissance du champignon Aspergillus oryzae et contenant au moins 0,5 g/L de talc; b) on ajoute au milieu de culture A des spores d'Aspergillus oryzae à raison d'au moins 10 spores/mL de milieu de culture; c) on incube le milieu de culture A issu de l'étape b) à une température comprise entre 30 15 et 45°C pendant au moins 6 heures de manière à dptenir un milieu de culture A contenant des champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. Les étapes a) à c) du procédé permettent de fournir in fine un milieu de culture dans lequel le champignon Aspergillus oryzae s'est développé sous forme de mycélium libre à partir de 3061204 5 spores. La souche de champignon mise en oeuvre dans le procédé peut être naturelle ou bien une souche modifiée par mutation, par sélection ou par recombinaison génétique. Selon l'invention, l'étape a) consiste à préparer dans un bioréacteur qui inclut notamment des réacteurs de petit volume, par exemple en fiole, un premier milieu de culture A optimisé 5 dans lequel les spores d'Aspergillus oryzae après inoculation sont susceptibles de se développer. Tout milieu de culture aqueux connu de l'homme de l'art qui contient au moins une source de carbone, d'azote et de phosphore et éventuellement des oligoéléments peut être utilisé comme milieu de culture des spores. Conformément à l'invention, le milieu de culture contient en outre des microparticules de talc 10 (3Mg0.45i02.H20). La teneur en talc est d'au moins 0,5 g/L de milieu de culture, de préférence comprise entre 5 et 20 g/L de milieu de culture et de manière plus préférée comprise entre 8 et 15 g/L de milieu de culture. On peut utiliser toute source de talc disponible sur le marché et dont le diamètre moyen des particules est généralement compris entre 2 et 20 lm et de préférence compris entre 5 et 10 1 5 L'étape b) d'inoculation des spores d'Aspergillus oryzae est réalisée de manière à obtenir un milieu de culture A contenant au moins 10 spores/mL et de préférence entre 102 et 105 spores/mL de milieu de culture. Après inoculation des spores, le milieu de culture est mis en incubation (étape c) de manière à permettre la croissance cellulaire mycélienne d'Aspergillus oryzae. 20 L'étape c) est réalisée en présence d'oxygène dans les conditions opératoires suivantes: - Température : entre 15 et 45°C, et de préférence entre 24 et 30°C; - Durée : au moins 6 heures, de préférence au moins 24 heures; - pH: entre 2,5 et 8, de préférence compris entre 4 et 7. - Volume du milieu de culture : entre 50mL et 5L 25 Pour l'étape c), on peut également assurer une agitation du milieu de culture et avec ou sans contrôle de la teneur en oxygène dissous dans le milieu. A l'issue de l'étape c), le milieu de culture A contient généralement au moins 2 g/L de biomasse, de préférence entre 7 et 12 g/L de biomasse. 30 Afin de limiter au maximum les risques de contamination, les bioprocédés industriels, qui peuvent mettre en jeu des bioréacteurs de plusieurs dizaines, voire centaines de mètres cubes, font appel à des étapes successives et croissantes de propagation pour accroître la masse cellulaire tout en limitant la durée de la phase de latence observée lors de la phase 35 de croissance. Dans ce contexte, le milieu de culture contenant Aspergillus oryzae sous 3061204 6 forme mycélium libre constitue l'inoculum avec lequel on opère au moins la première étape de propagation. L'étape de propagation selon l'invention met en oeuvre au moins les étapes suivantes : d) on transfère tout ou partie du milieu de culture A issu de l'étape c) dans un 5 bioréacteur contenant un milieu de culture stérilisé B exempte de talc, avec un rapport volumique (V milieu A ajouté)/(V milieu B) compris entre 0,1% et 10%, de manière à produire un milieu de culture B contenant des champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre; e) on cultive en présence d'oxygène le milieu de culture B issu de l'étape d) à une 10 température comprise entre 15 et 45°C pendant au mcins 6 heures de manière à obtenir un milieu de culture C contenant des champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. Conformément à ce mode de réalisation, le milieu de culture A issu de l'étape c) est avantageusement employé comme inoculum pour conduire l'étape dite de propagation. En 15 effet de manière surprenante, il a été observé que la morphologie mycélium libre du champignon Aspergillus oryzae est conservée lorsque le champignon est transféré dans un milieu ne contenant pas de talc. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux pour la production à l'échelle industrielle du champignon Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre car il est plus économique (coûts en matières premières et pour le 20 retraitement des résidus solides). L'étape de mise en culture e) est généralement effectuée dans les mêmes conditions que celles mentionnées précédemment pour l'étape c), à savoir : - Température : entre 15 et 45°C, et de préférence entre 24 et 30°C; - Durée : au moins 6 heures, de préférence au moins 24 heures; 25 - pH: entre 2,5 et 8, de préférence compris entre 4 et 7. Le rapport volumique ou taux d'ensemencement est un paramètre important car il conditionne la durée de la phase de latence (phase initiale après ensemencement, qui précède le début de la phase de croissance, au cours de laquelle aucune activité biologique n'est mesurée). Plus l'inoculum est important et plus la phase de croissance sera courte, 30 limitant ainsi les risques de contamination sur l'étape en question. Selon l'invention, le rapport volumique (V milieu B ajouté)/(V milieu C) est compris entre 0,1% et 10% et de préférence compris entre 1 et 10% Dans le cadre de l'invention, l'étape e) de culture du champignon peut être conduite selon différents modes pour alimenter et soutirer le milieu de culture du bioréacteur. 3061204 7 Ainsi on peut mettre en oeuvre l'étape e) selon un mode batch dans lequel le bioréacteur est rempli avec le milieu de culture stérilisé, avant ajout de l'inoculum. L'étape f) se déroule ensuite sans addition supplémentaire de milieu. Alternativement, l'étape e) peut être menée selon un mode fed-batch (ou alimentation semi- 5 continue) dans lequel le milieu de culture est apporté au fur et à mesure de la multiplication du champignon. Enfin, l'étape e) peut être mis en oeuvre en mode continu, avec ou sans confinement des champignons, dans lequel l'ajout du milieu de culture et le soutirage sont effectués aux mêmes débits. 10 Comme indiqué ci-avant, les bioprocédés industriels peuvent comporter N étapes successives de propagation. A cette fin, on peut transférer tout ou partie du milieu de culture obtenu à l'issue de la première étape de propagation pour réaliser une seconde étape de propagation dans un bioréacteur de volume plus important contenant un milieu de culture stérile exempt de talc. 15 Si le procédé industriel met en oeuvre plus de deux étapes de propagation, on utilisera tout ou partie de milieu de culture issu d'une étape X précédente de propagation pour ensemencer le bioréacteur de l'étape suivante X+1 de propagation. Ces étapes successives de croissantes de propagation se font généralement dans un rapport volumique (V milieu X)/(V milieu X+1)) compris entre 0,1% et 10%. Après transfert, on met en culture le nouveau 20 milieu ensemencé dans les conditions décrites ci-avant pour permettre la croissance du champignon en bioréacteur. Dans le cadre de l'invention, la croissance des champignons pendant la phase de propagation du champignon peut s'accompagner d'une étape de production de molécules 25 d'intérêt par le champignon. Cette étape de production h) peut se faire de façon concomitante à la croissance du champignon dans le milieu de culture. Dans ce cas de figure, les molécules d'intérêt sont généralement des métabolites dits "primaires" qui sont des composés produits par le champignon et utiles à sa croissance dans un milieu de culture donné. Les métabolites primaires peuvent être des enzymes, des acides aminés, des acides 30 organiques, des alcools, des lipides, des nucléotides, des sucres. Il est également possible d'induire la synthèse par le champignon de métabolites dits "secondaires" pendant ou après la phase de croissance. Ces métabolites secondaires peuvent être choisis parmi des enzymes, des acides aminés, des acides organiques, des alcools, des lipides, des nucléotides, des sucres. 3061204 8 Par exemple on peut ajouter au milieu de culture un substrat inducteur qui en s'accumulant dans le milieu de culture va provoquer une modification du comportement physiologique du champignon. La méthode selon l'invention de production du champignon Aspergillus oryzae peut 5 avantageusement être intégrée dans un procédé de production de bio-solvant, par exemple d'alcools (éthanol, butanol et/ou isopropanol), dit de seconde génération qui fait intervenir une étape d'hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique au moyen d'enzymes de type cellulases sécrétés par des champignons. De manière préférée, les cellulases sont choisies parmi les endoglucanases, les exoglucanases et les p-glucosidases. 10 Dans ce type d'application, l'étape de production de cellulases peut être induite en ajoutant dans le milieu de culture un ou plusieurs substrats carbonés choisis parmi le lactose, le sophorose, le xylose, le gentiobiose, le cellobiose. Exemple 15 Exemple 1 Une première série de tests en fioles Erlenmeyer de 250 mL a été menée afin de comparer la croissance et le comportement morphologique de deux souches d'Aspergillus en milieu Sabouraud exempt de talc et en milieu Sabouraud contenant du talc. On a d'abord préparé un milieu Sabouraud liquide complémenté avec 10g/L de talc à 10pm. 20 50 mL du milieu Sabouraud complémenté avec du talc sont versés dans des fioles Erlenmeyer de 250 mL et mis en stérilisation 20 min à 121°C. Des spores d'Aspergillus terreus (souche NRRL 1960) et d'Aspergillus oryzae (souche NRRL 3488) ont été ensemencées à raison de 105 spores/mL dans le milieu Sabouraud stérilisé. Les fioles sont mises en incubation à une température de 24°C pendant 24 heures. 25 Au bout de 24 heures d'incubation, on observe que les spores d'Aspergillus terreus (Fig. 1A) d'Aspergillus oryzae (Fig. 1B) se sont développées en adoptant la forme de mycélium libre non agrégé. 1mL de chacune des cultures obtenues après 24 heures d'incubation ont été ensuite transféré en fioles Erlenmeyer de 250 mL contenant 49 mL d'un milieu Sabouraud stérilisé et 30 ne contenant pas de talc. Les fioles sont mises en incubation pendant 72 heures à 24°C. Les figures 2A et 2B sont les photographies des fioles après 72 heures d'incubation. On constate qu'en milieu exempt de talc Aspergillus terreus s'est développé en adoptant une morphologie agrégée du type pellets (Fig. 2A). Au contraire et de manière surprenante chez Aspergillus oryzae, la 3061204 9 croissance dans un milieu sans talc s'est faite en conservant une morphologie du type mycélium libre (Fig. 2B). Parallèlement, un test témoin a été effectué qui confirme qu'en absence de talc dans le milieu de culture Sabouraud, la croissance d'Aspergillus oryzae à partir de spores produit un 5 champignon sous forme agrégée. La figure 3-A3 est une image de la fiole témoin prise après 48 heures d'incubation à 24°C d'un milieu Sabouraud stérilisé et ensemencé à 105 spores/mL. Exemple 2 10 Une autre série de tests a été réalisée afin de confirmer que la croissance d'Aspergillus oryzae à partir d'un inoculum prélevé d'un milieu additionné de talc sous forme de mycélium libre se fait avec conservation de la morphologie mycélium libre. Ainsi des spores d'Aspergillus terreus (souche NRRL 1960), d'Aspergillus figer (souche ATCC 11414) et d'Aspergillus oryzae (souche NRRL 3488) ont été mis en culture dans du 15 milieu YPDP (Yeast Extract Potatoes Dextrose Peptone) contenant : - 24 g/L de Potatoes Dextrose - 4 g/L d'extrait de levure - 4 g/L de Bacto Peptone 20 Les figures 3-Al, 3-A2 et 3-A3 sont des images des Erlenmeyers après incubation du milieu YPDP sans talc ensemencé avec 105 spores/mL avec des spores d'Aspergillus terreus, d'Aspergillus figer et d'Aspergillus oryzae, respectivement. On observe qu'après 48 heures de mise en culture dans un milieu exempt de talc, les trois souches d'Aspergillus se développent en adoptant une morphologie du type pellets. 25 Les figures 3-B1, 3-B2 et 3-B3 montrent les fioles après 48 heures d'incubation à 24°C en milieu YPDP complémenté avec 10g/L de talc et ensemencé avec 105 spores/mL d'Aspergillus terreus, d'Aspergillus figer et d'Aspergillus oryzae, respectivement. On remarque donc que les spores d'Aspergillus terreus et Aspergillus oryzae croissent en 30 prenant une morphologie du type mycélium libre tandis qu'Aspergillus figer adopte une conformation agrégée. Des inoculum (1 mL) prélevés sur les cultures (milieu YPDP comprenant 10g/L de talc) des trois souches d'Aspergillus obtenues après 24 heures d'incubation à 24°C ont été transférés 35 en milieu YPDP sans talc (49 mL). Les figures 3-C1, 3-C2 et 3-C3 montrent les cultures en 3061204 10 Erlenmeyers après 48 heures d'incubation. On observe que seule la souche Aspergillus oryzae (Fig. 3-03) est capable de croitre en conservant la morphologie mycélium libre dans un milieu ne comprenant pas de talc. Les souches Aspergillus terreus (Fig. 3-C1), Aspergillus figer (Fig. 3-C3) au contraire perdent la morphologie mycélium libre au profit de 5 la morphologie agrégée en pellets. Une autre série de test a été réalisée en milieu YPDP supplémenté avec 0,2 g/L de talc, cette teneur en talc correspondant à la teneur dans le milieu après transfert de l'inoculum. Les spores d'Aspergillus terreus, d'Aspergillus figer et d'Aspergillus oryzae ont été 10 ensemencés à 105 spores/mL dans le milieu et ensuite mis en culture à 24°C pendant 48 heures. On observe un développement des spores avec une morphologie agrégée chez les trois souches d'Aspergillus (Fig. 3-D1, 3-D2 et 3-D3). On en conclut que la présence de talc résiduel (0,2 g/L) apporté par l'inoculum n'est pas à l'origine de la morphologie fluide obtenue 15 pour Aspergillus oryzae. REVENDICATIONS1) Procédé de production de champignons de l'espèce Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre, comprenant au moins les étapes suivantes: a) on prépare dans un bioréacteur un milieu de culture stérilisé A adapté à la croissance du champignon Aspergillus oryzae contenant au moins 0,5 g/L de talc; b) on ajoute au milieu de culture stérilisé A des spores d'Aspergillus oryzae à raison d'au moins 10 spores/ mL de milieu de culture; c) on incube en présence d'oxygène le milieu de culture stérilisé A issu de l'étape b) à une température comprise entre 15 et 45°C pendant au mcins 6 heures de manière à obtenir un milieu de culture A contenant des champignons de l'espèce Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. 2) Procédé selon la revendication 1, comprenant au moins une première étape de propagation incluant les étapes suivantes : d) on transfère tout ou partie du milieu de culture A issu de l'étape c) dans un bioréacteur contenant un milieu de culture stérilisé B exempt de talc, avec un rapport volumique (V milieu A ajouté)/(V milieu B) compris entre 0,1% et 10%, de manière à produire un milieu de culture B contenant des champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre; e) on cultive en présence d'oxygène le milieu de culture B issu de l'étape d) à une température comprise entre 15 et 45°C pendant au mcins 6 heures de manière à obtenir un milieu de culture B contenant des champignons Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. 3) Procédé selon la revendication 2, comprenant en outre une seconde étape de propagation incluant les étapes suivantes: f) on transfère tout ou partie du milieu de culture B issu de l'étape e) dans un bioréacteur contenant un milieu de culture stérilisé C exempt de talc, avec un rapport volumique (V milieu B ajouté)/(V milieu C) compris entre 0,1% et 10%, de manière à produire un milieu de culture C contenant des champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre; g) on cultive en présence d'oxygène le milieu de culture C issu de l'étape f) à une température comprise entre 15 et 45°C pendant au mcins 6 heures de manière à obtenir un milieu de culture C contenant des champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. 3061204 12 4) Procédé selon les revendications 2 ou 3, comprenant en outre une étape h) de production de molécules d'intérêt par les champignons du genre Aspergillus oryzae sous forme de mycélium libre. 5) Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'étape h) de production de molécules 5 d'intérêt est conduite de façon concomitante à l'étape e) ou g). 6) Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'étape h) de production de molécules d'intérêt est conduite après les étapes e) ou g). 7) Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, dans lequel les molécules d'intérêts sont choisies parmi des enzymes, des alcools, des acides organiques, des esters. 10 8) Procédé selon la revendication 7, dans lequel les enzymes sont des cellulases. 9) Procédé selon la revendication 8, dans lequel les cellulases sont choisies parmi les endoglucanases, les exoglucanases, et les p-glucosidases 10) Procédé selon la revendication 7, dans lequel les enzymes sont des amylases. 11) Procédé selon la revendication 7, dans lequel les enzymes sont des asparaginases. 15 12) Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le milieu de culture A contient entre 5 et 20 g/L de talc. 13) Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel à l'étape b) le milieu de culture A est ensemencé avec au moins 102 à 105 spores/mL.