Brevet FR3053968A1 — publié le 20180119

REACTIFS POUR LA PROTECTION REVERSIBLE DE MOLECULES BIOLOGIQUES La présente invention concerne des réactifs pour la protection réversible des molécules biologiques. Elle porte en particulier sur des composés dérivés d'anhydride aza-isatoïque et leurs utilisations pour la protection de molécules biologiques, notamment les enzymes en vue de bloquer leur activité. L'invention vise également les molécules biologiques ainsi protégées et les procédés de mise en oeuvre de ces réactifs. ETAT DE LA TECHNIQUE Les tests modernes de diagnostic in-vitro, utilisant des techniques de biologie moléculaire 10 en vue de la détection spécifique, rapide et quantitative d'acides nucléiques cibles présents dans un échantillon biologique utilisent le plus souvent des enzymes polymérases permettant l'amplification d'acides nucléiques cibles à partir d'amorces spécifiques. Des polymérases dites « hot-start » ont été développées car elles présentent de nombreux avantages par rapport à leur version native et donnent en particulier de meilleures 15 performances de sensibilité aux tests de diagnostic. Le principe de fonctionnement d'une polymérase « hot-start » est de bloquer son activité de façon transitoire soit par un anticorps, un aptamère ou par un agent chimique puis de restaurer l'activité dès l'élévation de température pendant l'amplification PCR. Le blocage par un agent chimique est tout particulièrement avantageux en raison de son 20 coût peu élevé. L'inactivation des polymérases par une acylation des fonctions amine des résidus lysine a été décrite dans l'état de la technique (voir par exemple : Enzyme and Microbial Technology 36 (2005) 947-952 « Thermally reversible inactivation of Taq polymerase in an organic solvent for application in hot start PCR » Ariel Louwrier, Anne van der Valk). Lors de l'étape de dénaturation à 95°C pendant le premier cycle de PCR ou 25 pendant une étape de préactivation à température élevée, les groupes protecteurs sont clivés et l'activité de l'enzyme est restaurée. Les brevets US5677152 et US5773258 décrivent l'utilisation d'anhydride citraconique et ses dérivés en milieu aqueux pour protéger temporairement les groupements NH2 des 3053968 2 lysines de la Taq polymérase. L'amide générée après réaction de l'anhydride et d'une amine est ensuite hydrolysable par le milieu rendu acide après traitement thermique en présence de tampon Tris utilisés dans les réactions PCR. Il a été par ailleurs démontré que les dérivés d'anhydride isatoïque sont capables de réagir 5 avec des groupements nucléophiles tels que les amines présentes sur les protéines. En 1982, Moorman A.R. et al. ont décrit l'acylation d'une protéine, la chymotripsine a, par l'anhydride isatoïque (Moorman A.R., Abeles R.H. J. Am. Chem. Soc., 1982, 104, 67856786). Cette réaction entraîne l'inactivation de la protéine en générant des dérivés anthraniliques stables. Plus récemment, Hooker et al. ont utilisé la réactivité de l'anhydride 10 isatoïque pour modifier les résidus lysines de molécules de lysozyme et ainsi introduire des motifs anilines qui peuvent ensuite être fonctionnalisés via un couplage oxydant (Hooker J. M., Esser-Kahn A. B., B. Francis M. B. J. Am. Chem. Soc., 2006, 106, 1558-1559). L'acylation du groupement amine présent sur la chaîne latérale des lysines par l'anhydride isatoïque conduit ainsi à la formation de liaisons amides très stables. 15 La demande de brevet FR1257526 décrit par ailleurs des agents acylants, dérivés d'anhydride isatoïques pour la fonctionnalisation, le marquage, la capture ou la séparation d'acide ribonucléiques (ARN) ou d'acide nucléiques chimériques (ARN/ADN). Les agents acylants sont plus spécifiquement décrits en vue de la fixation de groupement d'intérêt sur ces molécules biologiques. 20 La présente invention se propose de fournir de nouveaux réactifs pour la protection réversible de molécules biologiques, et notamment pour la préparation d'enzymes dites « Hot Start », c'est-à-dire qui peuvent être aisément déprotégées par un traitement thermique, lesdits nouveaux réactifs présentant de préférence un ou plusieurs des avantages suivants : 25 - ils sont bon marchés, - ils sont stables, - ils sont solubles en milieu aqueux, - ils sont efficaces quant à leur vitesse de réaction, mais également quant à leur vitesse de déprotection, 30 - le produit de leur réaction avec une biomolecule est stable, 3053968 3 - ils ne nécessitent pas l'utilisation de tampon Tris pour la déprotection à chaud et/ou, - ils ne génèrent pas de réactions secondaires indésirables. Les réactifs décrits dans la présente demande sont ainsi particulièrement appropriés pour 5 inactiver transitoirement des enzymes impliquées dans la polymérisation des acides nucléiques comme la Taq polymérase ou certaines transcriptase inverses, et plus généralement des enzymes utilisées dans les techniques de diagnostic in vitro. RE SUIVIE Ainsi, la présente invention a pour objet un composé de formule (I) suivante: (I) dans laquelle X est une liaison covalente ou un alkyle en Cl à C4, Y est un radical nucléophile, de préférence O, S, NR4, 0-NR4, NH-0, ou NH-NR4, et R4 est H ou un groupe alkyle en Ci à C4, Z1, Z2, Z3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre, N ou C, de préférence Z3 représente C, plus préférentiellement Z3 est C et R3 est en position Z3, R1 est H, un groupe alkyle en Cl à C6, substitué ou non, un alcényle substitué ou non, un groupe aryle substitué ou non, ou un hétérocycle substitué ou non, de préférence R1 est un groupe méthyle ou éthyle. R2 est un groupement protecteur thermolabile et/ou acidolabile, 3053968 4 R3 est H, un groupe alkyle en C1 à C12 substitué ou non, par exemple, un groupe isopropyle, isobutyle, sec-butyle, tert-butyle, isopentyle ou 2,2-diméthylpropyle, un groupe aryle substitué ou non, un hétérocycle substitué ou non, un groupe acyle, un groupe alcényle substitué ou non, un halogène (e.g. F, Cl, Br et I), ou un groupe cyano. 5 Dans un mode de réalisation préféré, le composé selon l'invention est de formule (II) suivante : Dans laquelle X, Y, Z1, Z2, Z3, R1, R2 et R3 sont tels que définis plus haut pour la formule (I). 10 Dans un mode de réalisation spécifique, le groupement thermolabile et/ou acidolabile R2 dans les formules (I) et (II) ci-dessus est choisi parmi les groupements tert-butoxycarbonyl (BOC), phénoxyacétyle substitué ou non, trityle, méthoxytrityle, diméthoxytrityle ou citraconyle. Dans un autre mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les précédents 15 modes de réalisation, R1 est un groupe méthyle. Dans un autre mode de réalisation particulier, éventuellement combiné avec les précédents modes de réalisation, R3 est l'iode. Dans un autre mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les précédents modes de réalisation, Zi est N et Z2 est C. 20 En particulier, l'invention porte sur l'un des composés de structures suivantes : 3053968 5 N N 0 I (V) o 0 N N 0 I (IV) 1/0,e0 I H N I 0 N N 0 I (VI) o L'invention vise également un procédé de préparation d'une molécule biologique protégée, comprenant la mise en contact d'un composé selon l'invention tel que décrit ci-dessus avec 5 une molécule biologique comprenant un ou plusieurs groupes nucléophiles dans des conditions permettant l'acylation d'un ou plusieurs groupes nucléophiles de ladite molécule biologique, pour former une molécule biologique protégée. Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, la molécule biologique comprend des fonctions amines. En particulier, la molécule biologique est une protéine qui 10 comprend des fonctions nucléophiles et notamment les fonctions amines de ses résidus lysines ou de l'acide aminé terminal, les fonctions alcools des sérines, et/ou les fonctions thiols des cystéines. L'invention porte en particulier sur une molécule biologique protégée, et représentée par la formule (III) suivante : e Biomol 15 R1 dans laquelle 3053968 6 Biomol est une molécule biologique ; W est un radical nucléophile de la molécule biologique, de préférence NH, S ou O; et, X est une liaison covalente ou un alkyle en C1 à C4, 5 Y est un radical nucléophile, de préférence O, S, NR4, 0-NR4, NH-0, ou NH- NR4, et R4 est H ou un groupe alkyle en C1 à C4, Z1, Z2 Z3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre, N ou C, de préférence Z3 représente C, plus préférentiellement Z3 est C et R3 est en position Z3, 10 R1 est H, un groupe alkyle en C1 à C6, substitué ou non, un alcényle substitué ou non, un groupe aryle substitué ou non, ou un hétérocycle substitué ou non, de préférence R1 est un groupe méthyle ou éthyle, R2 est H ou un groupement protecteur thermolabile et/ou acidolabile, R3 est H, un groupe alkyle en C1 à C12 substitué ou non, par exemple un groupe 15 iso-propyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, isopentyl ou 2,2-diméthylpropyl, un groupe aryle substitué ou non, un hétérocycle substitué ou non, un groupe acyle, un groupe alcényle substitué ou non, un halogène (e.g. F, Cl, Br et I), ou un groupe cyano. Dans un mode de réalisation spécifique, Biomol est choisie parmi les protéines et 20 notamment, les enzymes. Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, Biomol est une enzyme destinée à être utilisée dans une réaction de polymérisation d'acide nucléique, par exemple une ADN polymérase. Sont également décrits des procédés de déprotection des groupes nucléophiles d'une 25 molécule biologique protégée par les composés selon l'invention, ledit procédé comprenant une étape de clivage du ou des groupements thermolabiles et/ou acidolabiles 3053968 7 R2, par traitement thermique et/ou acide respectivement et la déprotection concomitante des groupes nucléophiles de la molécule biologique. Ainsi, l'invention concerne également les utilisations d'un composé selon l'invention pour l'inactivation réversible d'une enzyme. Dans un mode préféré, le composé selon 5 l'invention est utilisé pour l'inactivation réversible d'une enzyme destinée à être utilisée dans une réaction de polymérisation d'acide nucléique, par exemple une ADN polymérase. L'invention vise en outre un procédé d'amplification d'un acide nucléique comprenant la mise en oeuvre d'une enzyme polymérase inactivée par les composés selon l'invention, et au moins une étape de traitement thermique à une température permettant le clivage du ou 10 des groupements thermolabiles R2 et la déprotection des groupes nucléophiles, ladite étape de traitement thermique précédant ladite étape d'amplification d'acide nucléique. Définitions Le terme « substitué ou non » signifie qu'un ou plusieurs hydrogène(s) présent(s) dans un groupe peut être substitué par un groupe fonctionnel, par exemple choisi parmi les groupes 15 amine, imine, nitrile, cyano, amide, imide, hydroxyle, alcoxyle, carbonyle, carboxyle, ester, thiol, thioéther, thioester et halogénure. Le terme « un groupe alkyle en Cx à Cy » désigne une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, ou un cycloalkyle, ayant x à y atomes de carbone. Comme exemple de chaîne alkyle linéaire on peut citer: méthyle, éthyle, n-propyle, n-butyle, n-pentyle, n-hexyle, n-heptyle, 20 n-octyle, n-nonyle et n-décyle. Comme exemple de chaîne alkyle ramifiée, on peut citer: iso-propyle, isobutyle, sec-butyle et tert-butyle, isopentyle, 2,2-diméthylpropyle, isooctyle, iso-nonyle et iso-décyle. Comme exemple de cycloalkyle, on peut citer cyclopentyle, cyclohexyle, cycloheptyle et cyclooctyle. Le terme « aryle » désigne des hydrocarbures cycliques aromatiques ne comprenant pas d'hétéroatomes dans le cycle. Par exemple, le groupe aryle peut comprendre entre 6 et 14 atomes de carbones dans la partie cycle aromatique. Comme exemple de group aryle, on peut citer : phényle, biphényle, phénanthrényle, pyrényle, chrysényle, anthracényle et naphtyle. 3053968 8 Le terme « hétérocycle » désigne un groupe comprenant au moins un cycle, saturé ou insaturé, dont au moins un des atomes du cycle est un hétéroatome, comme par exemple N, O ou S. Un hétérocycle peut être composé de plusieurs cycles condensés. Par exemple, l'hétérocycle peut comprendre entre 6 et 14 atomes dans la partie cyclique. 5 Le terme « acyle » désigne un groupe comprenant un groupe carbonyle, le groupe acyle étant lié à la molécule via l'atome de carbone du carbonyle. Cet atome de carbone est également lié à un autre atome de carbone appartenant à un groupe alkyle substitué ou non, un groupe aryle substitué ou non ou un hétérocycle substitué ou non. Par exemple, le groupe acyle comprend entre 2 et 12 atomes de carbone. 10 Le terme « alcényle » désigne une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée, ou un cycloalkyle, comprenant au moins une double liaison carbone-carbone. Comme exemple de groupes alcényle, on peut citer : vinyle, -CH=CH(CH3), -CH=C(CH3)2, -C(CH3)=CH2, - C(CH3)=CH(CH3), -C(CH2CH3)=CH2, cyclohexényle, cyclopentényle, cyclohexadiényle, butadiényle, pentadiényle, et hexadiényle. Par exemple, le groupe alcényle comprend entre 15 2 et 12 atomes de carbone. Le terme « nucléophile » ou « groupe nucléophilique » désigne un groupe capable de former une liaison covalente avec un site réactif (électrophile) en donnant les deux électrons nécessaires à la création de la liaison, dans des conditions de réaction appropriées. Un ou plusieurs groupes nucléophiles peuvent être naturellement présents sur 20 une molécule biologique, par exemple le groupe amine d'une lysine, l'amine terminale d'une chaine polypeptidique, l'alcool d'une sérine ou encore le groupe thiol d'une cystéine présente sur une protéine ou une enzyme. Le terme « groupement protecteur » désigne un groupe fonctionnel introduit dans une molécule à partir d'une fonction chimique pour masquer tout ou partie de sa réactivité. Le 25 masquage (protection) d'une fonction chimique sur la molécule améliore ainsi la sélectivité des réactions suivantes. Le terme « protection » ou « protégé » fait ainsi référence à l'état de la molécule après réaction avec un groupement protecteur. Une « molécule biologique protégée » est une molécule biologique qui présente une ou plusieurs fonctions chimiques protégées par des groupements protecteurs. S'agissant d'une enzyme, une enzyme protégée peut alors être inactive. La déprotection fait référence à l'étape de 3053968 9 libération de tout ou partie des groupements protecteurs d'une molécule protégée et, de préférence, l'obtention de la molécule dans son état original, avant sa protection par les composés selon l'invention. Le terme « groupement protecteur thermolabile » désigne un groupement protecteur qui est 5 stable à température ambiante, par exemple entre 15°C et 25°C, et qui est clivé, dissocié ou relargué d'une molécule à laquelle il est lié, par un traitement thermique (étape de chauffage), par exemple par traitement à une température comprise entre 50 et 100°C, notamment en présence d'un tampon approprié pour le fonctionnement optimal d'une molécule biologique, par exemple, d'une enzyme. 10 Des groupements protecteurs thermolabiles incluent en particulier ceux décrits par Koukhareva et al, Anal. Chem., 2009, 81, 4955-4962 ; ou Trinlink Biotechnologies (W02012/09434 et US8,133,669). Des exemples de groupements protecteurs thermolabiles incluent de manière générale les amides, les éthers, les esters, les acétals, les carbonates, les thioéthers, les thioesters, 15 thioacétals, thiocarbonates et notamment ceux décrits dans Koukhareva et al, Anal. Chem., 2009, 81, 4955-4962 , ou encore, le monométhoxy trityle (MMT), le diméthoxy trityle (DMT), et/ou le phenoxyacétate, substitué ou non. Le terme « groupement protecteur acidolabile » désigne un groupement protecteur qui est stable en condition neutre ou basique et qui est clivé, dissocié ou relargué, en condition 20 acide à température ambiante, par exemple par traitement à un pH inférieur à 6,0, ou encore inférieur à 5,0. Des exemples de groupements protecteurs acidolabiles incluent en particulier le citraconyl, le tert-butoxycarbonyl (BOC), le benzyloxycarbonyl, le trityl (Trt), le méthoxytrityl, le diméthoxytrityl, le benzyloxymethyl (Bom) ou encore le tButoxymethyl (Bum). D'autres exemples de groupements protecteurs acidolabiles sont 25 décrits notamment dans Chem. Rev., 2009, 109 (6), pp 2455-2504 et plus particulièrement dans les pages 2467 et 2493 selon qu'il s'agit d'un groupement protecteur d'une fonction amine ou hydroxyle. Le terme « molécule biologique » s'entend au sens large comme incluant l'ensemble des macromolécules synthétisables par des organismes biologiques. En particulier, le terme 3053968 10 inclut les polymères d'acides nucléiques et notamment l'ADN ou l'ARN, les polysaccharides, les peptides, polypeptides et les protéines, notamment les enzymes. Les termes "polypeptide", "peptide", et "protéine" sont interchangeables, et font référence aux polymères ou oligomères d'acides aminés. Les acides aminés d'un tel polymère sont 5 reliés entre eux par une liaison peptidique entre un groupe carboxyl et un groupe amine de deux acides aminés. Une protéine peut comprendre plusieurs polypeptides reliés entre eux par des liaisons non-covalentes et/ou des ponts disulfures. Au sens de l'invention, le terme "acides aminés" incluent les acides aminés naturels ou non naturels ou leurs dérivés substitués. 10 Les Réactifs Pour la Protection de Molécules Biologiques Les composés selon l'invention ou réactifs pour la protection de molécules biologiques sont des dérivés de l'anhydride isatoïque utiles pour protéger transitoirement (protection « réversible ») les groupements nucléophiles, par exemple les amines, d'une molécule biologique, par exemple une protéine. 15 Les composés selon l'invention réagissent avec le groupe nucléophile d'une molécule biologique et notamment d'une protéine. Par exemple, ils peuvent réagir avec l'amine s d'une lysine d'une protéine (ou enzyme) ou l'amine N-terminale d'une protéine (ou enzyme), l'alcool d'une sérine d'une protéine (ou enzyme) ou encore le thiol d'une cystéine d'une protéine pour former respectivement une liaison amide, ester, ou thioester. 20 Parmi les fonctions nucléophiles d'une protéine ou d'une enzyme, de préférence au moins une contribue de manière essentielle au maintien de la conformation de la protéine et/ou de la fonction enzymatique. La protection de ladite fonction nucléophile essentielle (par exemple, une lysine, sérine ou cystéine) entraine ainsi l'inactivation de la protéine ou de l'enzyme. 25 Avantageusement, la liaison amide, ester et/ou thioester ainsi obtenue entre les molécules biologiques et les composés selon l'invention est particulièrement stable, à basse température ou température ambiante. Des molécules biologiques peuvent être rendues inactives avec les composés selon l'invention par exemple dans des conditions de stockage ou de transport à température ambiante. Plus particulièrement, il est possible de maitriser le 3053968 11 point de départ d'une réaction enzymatique en induisant les conditions pour la déprotection d'une enzyme, selon le principe ci-dessous : - Dans un premier temps, on fait réagir les composés selon l'invention par réaction d'acylation des groupements nucléophiles d'une enzyme avec le composé et on 5 obtient une enzyme protégée. - Dans un deuxième temps, on déprotège par traitement acide et/ou thermique une fonction nucléophile du composé selon l'invention par clivage d'un groupement protecteur thermolabile et/ou acidolabile présent sur le composé selon l'invention et protégeant ladite fonction nucléophile du composé selon l'invention. 10 - Dans un troisième temps, on obtient la cyclisation entre la fonction nucléophile déprotégée du composé selon l'invention et le carbonyl de l'amide, l'ester ou thioester obtenu par l'acylation de l'enzyme, qui de façon concomitante permet la réversion de l'acylation, la déprotection de l'enzyme et la restauration de l'activité enzymatique. 15 Sauf précision ci-après dans le texte qui suit, l'expression « composés selon l'invention » fait référence aux composés de formule (I) ci-dessous ainsi qu'à toutes leurs sous-formules spécifiquement décrites (et en particulier les formules (II) à (VI), les sels de ces composés, leurs stéréoisomères (incluant les diastéréoisomères et les énantiomères), les tautomères et les composés marqués par des isotopes (incluant les substitutions au deutérium et par des 20 isotopes radioactifs). Le composé selon l'invention de formule (I) ci-dessous (I) présente en particulier 3053968 12 - un motif anhydride azaisatoïque permettant l'acylation des groupements nucléophiles d'une molécule, - une fonction nucléophile Y protégée par un groupement thermolabile et/ou acidolabile R2 et permettant une fois libérée, le clivage de la liaison amide générée 5 par l'acylation, - un bras de liaison X entre l'anhydride isatoïque et la fonction nucléophile conçu de telle sorte qu'il favorise la cyclisation après déprotection de la fonction nucléophile, - un groupement protecteur thermolabile et/ou acidolabile R2 du groupement nucléophile Y permettant de libérer la fonction nucléophile Y lors de l'étape de 10 chauffage et/ou de traitement acide et permettant ainsi la cyclisation intra- moléculaire, - de préférence, un groupement encombrant R3 permettant un encombrement stérique autour du nucléophile et l'accélération de la cinétique de cyclisation intramoléculaire. En effet il a été découvert de façon fortuite que la présence d'un 15 tel encombrement stérique apportait beaucoup de bénéfice à la cinétique de cyclisation intramoléculaire et donc à la vitesse de déprotection des groupements nucléophiles des molécules biologiques. Ainsi, la présente invention a pour objet un composé de formule (I) suivante : R2 Y.., X R3 6 z3 Il Z2, 7 Zi 8 03 N 0 RI (I) 20 dans laquelle X est une liaison covalente ou un alkyle en C1 à C4, Y est un radical nucléophile, Z1, Z2, Z3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre, N ou C, de préférence Z3 représente C, plus préférentiellement Z3 est C et R3 est en position Z3, 3053968 13 R1 est H, un groupe alkyle en C1 à C6, substitué ou non, un alcényle substitué ou non, un groupe aryle substitué ou non, ou un hétérocycle substitué ou non, de préférence R1 est un groupe méthyle ou éthyle. R2 est un groupement protecteur thermolabile et/ou acidolabile, 5 R3 est H, un groupe alkyle en C1 à C12 substitué ou non, par exemple un groupe isopropyle, isobutyle, sec-butyle, tert-butyle, isopentyle ou 2,2-diméthylpropyle, un groupe aryle substitué ou non, un hétérocycle substitué ou non, un groupe acyle, un groupe alcényle substitué ou non, un halogène (e.g. F, Cl, Br et I), ou un groupe cyano. De préférence, un seul des radicaux Z1, Z2 et Z3 est N. 10 Dans un mode de réalisation particulier, X est un alkyle non substitué en C1 à C3, par exemple un méthyle. R3 est placé de sorte à favoriser la cinétique de cyclisation. Par exemple, dans un mode de réalisation, R3 est de préférence en position 6. Dans un mode de réalisation particulier, R3 est un groupe tert-butyle, un groupe iso15 propyle, un groupe cyano ou un atome d'iode. Dans un mode de réalisation particulier, Y est différent de S-S. Dans un autre mode de réalisation particulier, le radical divalent nucléophile Y est choisi parmi O, S, NR4, 0-NR4, NH-O, NH-NR4, C(0)-0-NR4, C(0)-NH-O, C(0)-NH-NR4, 0-C(0)-NH-NR4, NH-C(0)NH-NR4, 0-C(0)-NH-0, NH-C(0)-NH-O, 0-C(0)-0-NR4, NH-C(0)-0-NR4, C(0)-S et 20 R4 est H ou un groupe alkyle en C1 à C4 De préférence, Y est choisi parmi O, S et NH. Dans ce cas, X n'est pas une liaison. Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, le composé selon l'invention est de formule (II) suivante : 3053968 14 R1 Dans un mode de réalisation spécifique, le groupement thermolabile ou acidolabile R2 dans les formules (I) et (II) ci-dessus est choisi parmi les groupements tert-butoxycarbonyle (BOC), phénoxyacétyle substitué ou non, trityle, méthoxytrityle, diméthoxytrityle ou 5 citraconyle. Le caractère thermolabile des groupements phénoxyacétate a été démontré par Lebedev A. et al. (Koukhareva I., Lebedev A. Anal. Chem., 2009, 81, 4955-4962). Dans un mode de réalisation particulier, le groupement protecteur R2 est le groupement protecteur thermolabile phénoxyacétyle, substitué ou non, de préférence, il s'agit d'un 10 phénoxyacétyle substitué par un halogène, par exemple le fluorophénoxyacétyle. L'homme du métier sera à même d'identifier d'autres groupements protecteurs R2 thermolabiles et/ou acidolabiles particulièrement adaptés à la fonction recherchée comme décrit par exemple dans W02012/094343, US8,133,669, ou dans les livres suivants : - Greene's Protective Groups in Organic Synthesis de Peter G. M. Wuts Editeur : 15 Wiley-Blackwell; Édition : 5th Edition (23 décembre 2014) ou - Protecting Groups de P.J. Kocienski Editeur : Thieme Publishing Group; Édition : 3rd Revised edition (1 janvier 2005). Dans un autre mode de réalisation particulier du composé selon la formule (II), qui peut être combiné avec les précédents modes de réalisation, R1 est un groupe méthyle. 20 Dans un autre mode de réalisation particulier du composé selon la formule (II), éventuellement combiné avec les précédents modes de réalisation, R3 est un halogène, par exemple, l'iode. 3053968 15 Dans un autre mode de réalisation particulier du composé selon la formule (II), qui peut être combiné avec les précédents modes de réalisation, Zi est N et Z2 est C. En particulier, l'invention porte sur l'un des composés de structures suivantes, également décrits en exemples : 5 0 0 N N 0 I (IV) 0 ^ N N,' 0 I (VI) 0 ^ N N 0 I (V) Procédé de préparation des composés selon l'invention Les composés selon l'invention peuvent être aisément synthétisés selon les procédés décrits en exemples ou d'autres procédés de synthèse connus dans l'état de la technique. 10 Par exemple, certains des composés selon l'invention de formule (II) peuvent être synthétisés à partir du composé hydroxylé précurseur 6 dont la synthèse est décrite en exemple 1. Le composé précurseur 6 peut ensuite être modifié par réaction d'un groupement thermolabile ou acidolabile R2 sur la fonction hydroxyle du précurseur. Il est également possible de faire réagir sur ces composés précurseurs ou leurs dérivés les 15 groupements R1 et/ou R3 par des méthodes conventionnelles de chimie. Le composé selon l'invention de formule (II) peut être finalement obtenu par cyclisation par substitution nucléophile, comme décrit par exemple à l'étape (i) du schéma 3 en Exemple 1 ci-dessous pour donner les composés selon l'invention. Procédé de protection de molécules biologiques 3053968 16 Les composés selon l'invention sont utiles pour la protection, la modification ou l'inactivation réversible des enzymes, des protéines et plus généralement de molécules biologiques comprenant un ou plusieurs groupes nucléophiles, par exemple, des molécules biologiques comprenant une ou plusieurs amines. 5 L'invention vise notamment un procédé de préparation d'une molécule biologique comprenant un ou plusieurs groupes nucléophiles protégés, comprenant la mise en contact d'un composé selon l'invention tel que décrit ci-dessus avec une molécule biologique dans des conditions permettant l'acylation d'un ou plusieurs groupes nucléophiles de ladite molécule biologique, pour former une molécule biologique comprenant un ou plusieurs 10 groupes nucléophiles protégés (également appelée ci-après « molécule biologique protégée »). L'acylation se fait par substitution nucléophile sur une des fonctions carbonyle de l'anhydride avec addition du groupe nucléophile de la molécule biologique et élimination de CO2 15 Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, la molécule biologique comprend des fonctions amines. En particulier, la molécule biologique est une protéine qui comprend les fonctions s-amines de résidus lysines ou amine de l'acide aminé terminal. Dans ces modes de réalisation, l'acylation des fonctions s-amines de résidus lysines ou de l'amine terminale permet de former des liaisons amides très stables, en particulier dans des 20 conditions de stockage à long terme (par exemple sur plus de 24 heures, voire plusieurs jours à température ambiante). A titre d'illustration, la réaction d'acylation est représentée dans le schéma 1 ci-dessous avec un réactif préféré de formule (II) dans laquelle R1 est un groupe méthyle, Zi est N, Z2 est C et R3 est un atome d'iode. R2 Biomol-WH 25 3053968 17 Schéma 1: Réaction d'acylation du composé selon l'invention sur une molécule biologique Dans le cas où la molécule biologique comprend plusieurs groupes nucléophiles à protéger, on pourra ajuster la quantité de réactifs utilisée en fonction du degré de modification 5 (protection) souhaité. En particulier, dans le cas d'une enzyme, avantageusement, le degré de modification souhaité correspond au seuil de modification au-delà duquel l'enzyme est inactivée. Ce seuil peut se déterminer de manière empirique par de simples essais. Le tampon utilisé pour la réaction de protection est en général un tampon avec un pH compris entre 6 et 9, de préférence entre 7 et 9, plus préférentiellement entre 7 et 8. Des 10 exemples de tampons incluent notamment les tampons phosphates, et les tampons non nucléophiles opérant dans cette zone de pH, pouvant contenir jusqu'à 50% de DMSO. De tels tampons sont connus de l'homme du métier comme indiqué dans http://www. sigmaaldrich. com/life- sci ence/core-bioreagents/bi ologi c al-buffers . html La réaction d'acylation, notamment d'acylation d'une enzyme avec au moins un composé 15 de formule (I) ou (II) est de préférence obtenue dans un tampon phosphate, par exemple à pH 7,4. Le procédé de protection est de préférence mis en oeuvre à une température comprise entre 4°C et 40°C, par exemple une température comprise entre 4°C et 25°C. Les molécules biologiques comprenant un ou plusieurs groupes nucléophiles protégés, 20 susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus font également partie de la présente invention. En particulier, une enzyme peut comprendre plusieurs groupements amines protégées du fait de la présence de multiples lysines dans sa séquence polypeptidique, ou encore des groupes OH ou SH du fait de la présence de sérine ou cystéine respectivement. L'invention porte par conséquent sur une molécule biologique protégée, et représentée par 25 la formule (III) suivante : 3053968 R2 e Biomol 18 X R3 Z3 Il Z2 ,Z/Zi/ N H Ri dans laquelle Biomol est une molécule biologique, W est un groupe nucléophile de la molécule biologique, de préférence NH, S ou O, 5 X est une liaison covalente ou un alkyle en C1 à C4, Y est un radical nucléophile, de préférence O, S, NR4, 0-NR4, NH-0, ou NHNR4, et R4 est H ou un groupe alkyle en C1 à C4, Z1, Z2, Z3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre, N ou C, de préférence Z3 représente C, plus préférentiellement Z3 est C et R3 est en position 10 Z3, R1 est H, un groupe alkyle en C1 à C6, substitué ou non, un alcényle substitué ou non, un groupe aryle substitué ou non, ou un hétérocycle substitué ou non, de préférence R1 est un groupe méthyle ou éthyle, R2 est H ou un groupement protecteur thermolabile et/ou acidolabile, 15 R3 est H, un groupe alkyle en C1 à C12 substitué ou non, par exemple un groupe iso-propyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, isopentyl ou 2,2-diméthylpropyl, un groupe aryle substitué ou non, un hétérocycle substitué ou non, un groupe acyle, un groupe alcényle substitué ou non, un halogène (e.g. F, Cl, Br et I), ou un groupe cyano. 20 Bien entendu, lorsque la molécule biologique comprend plusieurs groupes nucléophiles, par exemple une protéine comprenant plusieurs lysines, une même molécule biologique 3053968 19 peut comprendre tout ou partie de ces groupes nucléophiles ainsi protégés par acylation avec le réactif selon l'invention. En particulier, lorsque le réactif de formule (II) est mis à réagir avec une molécule biologique comprenant un ou plusieurs groupes nucléophile, on obtient une molécule 5 biologique protégée de formule (VII) suivante : ,Biomol (VII) En choisissant l'un des réactifs de formule (IV), (V) et (VI) ci-dessus, on obtient des molécules biologiques protégées selon l'une des formules (VIII), (IX) et (X) respectivement. 10 (VIII) N NH I (IX) 0 ,Biomol W 0y0 HN I W,Biomol N NH I (X) Dans un mode de réalisation spécifique, la molécule biologique (ou Biomol) est choisie parmi les enzymes. Le procédé est applicable à tout type d'enzyme. Parmi les enzymes d'intérêt, on citera plus 15 particulièrement les enzymes utilisées dans les techniques de biologie moléculaire, pour 3053968 20 l'ingénierie génétique ou la polymérisation des acides nucléiques, et plus particulièrement les enzymes utilisées dans les techniques de diagnostic in vitro. Ces enzymes comprennent, à titre d'illustration, les lipases, les protéases, les glycolases ou les nucléases. 5 En particulier, les enzymes d'intérêt comprennent les enzymes de restriction, les ligases, les ARN polymérases, les ADN polymérases, tels que les l'ADN polymérase I, II ou III, ou l'ADN polymérase a, 13, ou y, la terminal désoxynucléotidyl transferase (TdT) ou la télomérase, l'ARN polymérase ADN dépendante, la primase, ou encore l'ADN polymérase ARN dépendante (transcriptase inverse). 10 Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, la molécule biologique selon l'invention est une enzyme destinée à être utilisée dans une réaction de polymérisation d'acide nucléique, par exemple une ADN polymérase. Les polymérases utilisables pour la polymérisation des acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. La réaction de polymérisation est en particulier une réaction de polymérisation dans le cadre d'une 15 amplification par polymérisation en chaine (PCR). Dans un mode de réalisation, une enzyme d'intérêt mise en oeuvre dans le procédé de protection selon l'invention est choisie parmi les polymérases suivantes : l'ADN polymérase T7, l'ADN polymérase Kornberg, l'ADN polymérase Klenow, l'ADN polymérase Taq, l'ADN polymérase Micrococcal, l'ADN polymérase alpha, l'ADN 20 polymérase Pfu, la transcriptase inverse AMV, la transcriptase inverse MMLV, l'ARN polymérase d'E.coli, l'ARN polymérase SP6, T3 ou T7. En particulier, dans un mode de réalisation, des ADN polymérases thermostables et/ou présentant une activité exonucléase (par exemple 3'5' exonucléase) sont utilisées dans le procédé selon l'invention pour préparer des polymérases protégées. 25 Ces polymérases ainsi protégées sont plus particulièrement utiles pour des applications de démarrage à chaud « Hot-Start ». La protection des polymérases empêche l'amplification non-spécifique d'ADN à basse température et favorise ainsi une meilleure efficacité de la réaction d'amplification, l'enzyme étant déprotégée uniquement à haute température, par clivage du groupement thermolabile. 3053968 21 Parmi ces polymérases thermostables, on citera notamment celles qui ne sont pas sujettes à une dénaturation de leur structure et/ou une inactivation de leur activité enzymatique entre 50 °C et 100°C, celles qui fonctionnent et sont actives une fois qu'elles sont déprotégées, entre 50°C et 100°C. Plus particulièrement, les polymérases : TAQ 5 Polymerase et KLen TAQ polymerase. D'autres enzymes thermostables peuvent être dérivées des organismes biologiques suivants : Thermus antranikianii, Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus 10 silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax, Bacillus stearothermophilus, etc.. Procédés d'utilisation des composés selon l'invention Les molécules biologiques protégées selon la présente invention peuvent être 15 avantageusement déprotégées par un simple traitement thermique et/ou acide selon groupement R2 choisi. Le principe de la déprotection par traitement thermique ou acide est décrit dans le schéma 2 qui suit avec une molécule biologique (enzyme) protégée, selon la formule (VII) dans laquelle R1 est un groupe méthyle, Zi est N, Z2 est C et R3 est un atome d'iode: R2 Y ,Biomol f\r NH 20 N H Biomol-WH N' ,Biomol I H LW HY traitement thermique ou acide Schéma 2 : Exemple de procédé de déprotection d'une molécule biologique protégée selon l'invention Un traitement thermique ou acide permet de libérer la fonction nucléophile du composé selon l'invention par clivage du groupement thermolabile ou acidolabile. Cette fonction 3053968 22 nucléophile ainsi libérée peut alors permettre la réversion de l'acylation par cyclisation et déprotection de la molécule biologique. Avantageusement, le sous-produit généré par la réaction de déprotection n'est pas réactif. De plus, la présente réaction de déprotection ne nécessite pas l'emploi d'un tampon Tris, ou d'un tampon qui génère des conditions acides 5 à haute température. En particulier, l'étape de déprotection peut être effectuée par traitement thermique dans des conditions de pH compris entre 6,5 et 9,5, de préférence entre 8 et 9,0, plus préférentiellement encore entre 8,5 et 9,0. Ainsi, sont également décrits des procédés de déprotection des groupes nucléophiles d'une molécule biologique protégée par les composés selon l'invention, ledit procédé 10 comprenant une étape de clivage du ou des groupements thermolabiles et/ou acidolabiles R2, par traitement thermique et/ou acide respectivement, et la déprotection concomitante des groupes nucléophiles. Un des avantages du procédé décrit ci-dessus est qu'il permet d'inactiver des enzymes. Par « inactivation » il faut comprendre que l'activité catalytique d'une enzyme protégée par le 15 procédé de l'invention est fortement réduite voire nulle par rapport à son activité catalytique avant protection dans des conditions optimales d'activité. Le procédé de déprotection décrit ci-dessus permet alors de restaurer l'activité enzymatique des enzymes protégées. Ainsi, l'invention concerne également les utilisations d'un composé selon l'invention pour 20 l'inactivation réversible d'une enzyme. Dans un mode préféré, le composé selon l'invention est utilisé pour l'inactivation réversible d'une enzyme destinée à être utilisée dans une réaction d'amplification d'acide nucléique, par exemple une polymérase. L'invention est particulièrement appropriée pour des applications de démarrage à chaud (« Hot Start ») des enzymes, par exemple les polymérases utilisées dans une réaction 25 d'amplification d'acide nucléique (réaction dites « PCR »). Par conséquent, l'invention vise également un procédé d'amplification d'un acide nucléique comprenant (i) la mise en oeuvre d'une enzyme polymérase protégée ou inactivée par les composés selon l'invention, (ii) au moins une étape pour la déprotection de la polymérase, par exemple par un traitement thermique à une température permettant le 3053968 23 clivage du ou des groupements thermolabiles R2, (iii) une étape d'amplification d'acide nucléique à l'aide de la polymérase déprotégée à l'étape (ii). Dans un mode de réalisation spécifique, le procédé d'amplification est mis en oeuvre à l'aide d'une ADN polymérase, telle que la Taq polymérase, la Pfu polymérase, la T7 5 polymérase, le fragment Klenow d'ADN polymérase d'E. coli et/ou une transcriptase inverse, ou tout autre polymérase telle que décrite plus haut. Dans un autre mode de réalisation qui peut être combiné avec le précédent, le procédé d'amplification est une réaction d'amplification en chaine par polymérase (réaction PCR), bien connue de l'homme du métier. Le protocole PCR comprend par exemple, 20 à 40 10 cycles, chaque cycle comprenant au moins (i) une phase de dénaturation de l'ADN à amplifier à une température généralement comprise entre 90°C et 95°C, (ii) une phase d'hybridation des amorces avec l'ADN à amplifier à une température généralement comprise entre 55°C et 65°C et (iii) une phase d'extension à une température généralement comprise entre 68°C et 75°C. 15 La polymérase protégée selon l'invention est dans ce cas de préférence une polymérase thermostable protégée, par exemple une Taq (Thermus aquaticus) polymérase protégée, une Pfu (Pyrococcus furiosus) polymérase protégée, Vent ou Tli (Thermococcus litoralis) polymérase protégée ou leurs variantes, notamment recombinantes. De préférence, un nombre suffisant d'amines de ladite polymérase sont protégées de sorte que la polymérase 20 protégée est inactive ou quasi-inactive à température ambiante et peut être déprotégée à une température équivalente ou supérieure à la température d'hybridation des amorces (primer) utilisées pour l'amplification PCR. Les enzymes et polymérases protégées selon l'invention sont également avantageusement mises en oeuvre dans des variantes de procédés d'amplification nucléique par PCR. On 25 citera en particulier la PCR emboitée (Nested PCR), les PCR quantitatives (ou qPCR), semi-quantitatives ou temps réel, les PCR « error-prone », ou la PCR après transcription inverse (RT-PCR). 3053968 24 Kits et Trousses de mise en oeuvre L'invention vise également des kits ou trousses de mise en oeuvre comprenant les enzymes protégées selon l'invention, et éventuellement des réactifs, des tampons, des contrôles et/ou une notice d'instructions de mise en oeuvre. 5 En particulier, l'invention concerne une trousse pour l'amplification d'acide nucléique en démarrage à chaud « Hot-start », comprenant i) une ADN polymérase thermostable protégée selon l'invention, par exemple de formule (III), (VII), (VIII), (IX) ou (X) dans lesquelles Biomol est une ADN polymérase thermostable, 10 ii) le cas échéant, des réactifs de détection d'acide nucléique, par exemple un réactif fluorescent, iii) le cas échéant, un tampon, des dNTP... Ces kits sont utiles notamment pour la mise en oeuvre de procédés d'amplification tel que décrits ci-dessus. 15 L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples détaillés ci-dessous et au regard des figures annexées. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Suivi par HPLC du clivage du dérivé aza-anthranylate phénoxyacétate 10 et de la libération de phényléthylamine. 20 Figure 2 : Suivi par HPLC du clivage du dérivé aza-anthranylate fluoro-phénoxyacétate 14 et de la libération de phényléthylamine. Figure 3 : Suivi par HPLC du clivage du dérivé aza-anthranylate N -Boc 19 et de la libération de phényléthylamine. Figure 4: Acylation de l'hémoglobine par le composé 13 utilisé à différentes 25 concentrations. Figure 5: Réversion de l'acylation de l'hémoglobine suite à un traitement thermique. 3053968 25 Figure du haut (A) : Hémoglobine dans GuHC 8M Figure du milieu (B) : Hémoglobine acylée par le composé 13 puis reprise dans GuHCL 8M Figure du bas (C) : Hémoglobine acylée par le composé 13 puis chauffée à 95°C dans du 5 Tris pH9 et reprise dans GuHC1 8M. Figure 6: Inactivation de la Taq polymerase suite à son acylation par le composé 0 et restauration de son activité après traitement thermique à 95°C pendant 15 min dans des conditions de PCR (expériences réalisées en duplicat, la moyenne est représentée). En pointillé clair à gauche : sans activation ; en pointillé grisé à droite : après 15 minutes 10 d'activation à 95°C. EXEMPLES Dans les exemples décrits ci-après, les abréviations suivantes seront utilisées : - ACN : Acétonitrile, - AcOEt : acétate d'éthyle, 15 - Boc2O : dicarbonate de di-tert-butyle, - CCM : chromatographie sur couche mince, - CDC13 : Chloroforme deutéré, - d : doublet, - DCM : dichlorométhane, 20 - dd : doublet dédoublé, - DIVII : diméthylformamide, - DMSO: diméthylsulfoxide, - DMSO-d6 : diméthylsulfoxide deutéré, - Eau MilliQ : Eau ultrapure (Millipore, Molsheim, France), 25 - EDC : N-Ethyl-N'-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide - éq : équivalents, - EP : éther de pétrole, - Et20 : éther diéthylique, - HPLC : chromatographie liquide haute performance, 30 - LCMS : Appareil de chromatographie liquide couplé à un spectromètre de masse - HOBt : hydroxybenzotriazole, 3053968 26 - IA : anhydride isatoïque, - m : multiplet, - nd : non déterminé, - NIS : N-iodosuccinimide, 5 - q : quadruplet, - Rdt : rendement, - Rf ou TR : temps de rétention, - RMN : résonance magnétique nucléaire, - s : singulet, 10 - t : triplet, - ta : température ambiante - TBDMS : tert-butyldiméthylsilyle - TEA : triéthylamine - THF : tétrahydrofurane. 15 Conditions générales Les conditions générales pour l'analyse et la synthèse des composés chimiques utilisées dans les exemples ci-après sont décrites ci-dessous: Les analyses LC-MS ont été effectuées avec une chaîne HPLC WATERS Alliance 2795 équipée d'un détecteur à barrette de diodes PDA 996 (Waters), d'un détecteur par 20 spectrométrie de masse ZQ 2000 (Waters), d'un logiciel Empower version 2 et d'une colonne WATERS XTerra MS C18 (4,6 x 30 2,5 i.tm) utilisée avec un débit de 1 ml/minute à 30°C (détection à 260 nm ou en max plot). Le spectromètre de masse ZQ 2000 possède une source d'ionisation Electrospray. Les ionisations ont été réalisées en mode positif avec une tension de cône de 20V et une tension au niveau du capillaire de 3,5kV. 25 3053968 27 Les conditions utilisées pour les analyses HPLC sont les suivantes: Eluant A Eluant B Eluant C (Formiate Gradient linéaire d'ammonium : AF) Eau milliQ ACN AF 500 mM, pH 7 98% de A / 0% de B à 24% de A /74% de B en 18 min avec 2% de l'éluant C en mode isocratiq ue Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Jeol Lambda 400 MHz. Les déplacements chimiques (Ô) sont donnés en ppm par rapport au pic du solvant pris comme référence interne (CDC13 : 7,26 ppm ; DMSO-d6 : 2,49 ppm). Les spectres sont décrits avec 5 les abréviations ci-dessus : s, d, t, q, qu et m. Les constantes de couplage (J) sont exprimées en hertz (Hz). Les chromatographies sur colonne ont été réalisées sur gel de silice Macherey-Nagel Kieselgel 60, 0,063-0,2 mm / 70-230 mesh ou Merck LiChroprep® RP-18 40-63 iam. Les analyses par chromatographie sur couche mince ont été effectuées sur des plaques 10 Macherey-Nagel POLYGRAM® SIL G/UV254, 0,20 mm ou ALUGRAM® RP-18 W/UV254 0,15 mm. Exemple 1 : Synthèse d'une molécule d'anhydride aza-isatoique selon l'invention dotée d'un groupement protecteur thermolabile O-phénoxyacétate (9) On décrit dans cet exemple la synthèse d'un composé selon l'invention (selon le schéma 15 3). Un premier composé hydroxyle précurseur 6 est tout d'abord synthétisé en 6 étapes. Il peut servir de composé de départ pour la synthèse d'autres composés selon l'invention. Le composé 6 est alors phénoxyacétylé pour donner le composé 7, puis iodé pour donner le composé 8 et enfin cyclisé afin d'obtenir le composé 9 aza-isatoique attendu à même de réagir avec une protéine ou tout autre molécule biologique pour la protéger de façon 20 transitoire. 3053968 Schéma 3 : Synthèse du composé 9 O-phenoxyacetylé . a) LiTMP, THF, 3h, -50°C; 1h30, -80°C à ta; HC1 pH2. b) NEt3, DCM, 10 min, ta; t-BuBr, Ag20, 2h, ta. c) NaBH4, EtOH, 30 min, -10°C. d) TBDMSC1, imidazole, DCM, 4h, ta. e) MeNH2, H20, t-BuOH, 24 5 h, 100°C. f) TBAF, AcOH, DCM, 15h, ta. g) chlorure de phénoxyacétyle, HOBt, DCM, 5 min, ta puis 6, 24h, ta. h) NIS, DCM, AcOH, 2-3h, ta i) COC12, TEA, Et20, 30 min, ta. Exemple 1.1: Synthèse du 4-chloro-1-hydroxyfuro[3,4-c]pyridine-3(1H)-one (1) 10 C71i4C1NO3 M = 185,56 g/mole Dans un tube de Shlenk de 500 mL sous azote, 19,30 mL de 2,2,6,6-tétramethylpiperidine (114,24 mmoles, 3 éq) sont mis en solution dans 150 mL de THF. A -10°C, 60,13 mL de 15 n-BuLi (1.9 M dans l'hexane, 114,24 mmoles, 3 éq) sont ajoutés et le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 10 min. A -80 °C, 6,00 g d'acide 2-chloronicotinique (38,08 mmoles, 1 éq) sont ajoutés et la réaction est laissée sous agitation pendant 3h à 50°C. 17,69 mL de DIVII (228,48 mmoles, 6 éq) sont alors introduits à -80°C et le mélange 1,69% OH a) N Cl TBDMSO i) h) 7, 70% 8, 91% 9, 90% O d) 4, 95% 2, 67% 28 6, 92% 5, 79% 3053968 29 réactionnel est laissé sous agitation pendant 1h30. Après retour à température ambiante, 100 mL d'eau sont ajoutés et la solution est extraite avec de l'AcOEt (3x150 mL). La phase aqueuse est ensuite acidifiée à pH 2 avec une solution d'HC1 concentrée puis extraite avec de l'AcOEt (3x200 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur 5 MgSO4, filtrées et enfin évaporées. L'huile obtenue est ensuite purifiée sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (DCM à DCM/AcOEt 85/15). Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 69% (4,88 g, 26,30 mmoles). Pf = 191-193°C; IR (KBr): y, 3100 (OH), 2913, 2766, 1776 (C=0), 1609, 1584, 1408, 10 1194, 1136, 1093, 1047, 925, 755 cm-'; RMN 11I (400MHz, DMSO-d6): S 6,67 (bs, 1H); 7,79 (d, 1H, 3J= 5,0 Hz); 8,50 (bs, 1H); 8,74 (d, 1H, 3J= 5,0 Hz); R1VIN 13C (100 MHz, DMSO-d6): S 96,9; 118,8; 120,4; 147,0; 154,6; 159,3; 164,6. Exemple 1.2: Synthèse du 2-chloro-4-formylnicotinate de tert-butyle (2) ok 15 C11H12C1NO3 M = 241,67 g/mole Dans un ballon de 250 mL, à température ambiante, sont introduits 3,50 g de 1 (18.86 mmoles, 1 éq), 35 mL de DCM et 2,62 mL de TEA (18.86 mmoles, 1 éq). Le mélange est laissé sous agitation pendant 10 min à température ambiante. 8,54 mL de t-BuBr (75.45 20 mmoles, 4 éq) et 8,74 g d'Ag20 (37.72 mmoles, 2 éq) sont alors ajoutés par portions à 0°C. La réaction est laissée sous agitation à température ambiante pendant 2h. Le mélange est filtré sur célite, évaporé et purifiée sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (cyclohexane/AcOEt 95/5 à cyclohexane/AcOEt 90/10). Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 67% (3.07 g, 12,70 mmoles). 25 Pf = 97-99°C; IR (KBr): y, 3077, 1732 (C=0), 1708 (C=0), 1578, 1370, 1294, 1261, 1178, 1133, 847 cm-'; RMN 11I (400MHz, CDC13): S 1,64 (s, 9H); 7,65 (d, 1H, 3J= 5,0 Hz); 8,65 (d, 1H, 3J= 5,0 Hz); 10,06 (s, 1H); R1VIN 13C (100 MHz, CDC13): S 27,9 (3C); 85,1; 121,0; 130,1; 140,6; 149,1; 150,9; 163,0; 188,2. 3053968 30 Exemple 1.3: Synthèse du 2-chloro-4-(hydroxyméthyl)nicotinate de tert-butyle (3) C11H14C1NO3 M = 243,69 g/mole 5 Dans un ballon de 100 mL, 3,00 g de 2 (12,41 mmoles, 1 éq) sont mis en solution dans 35 mL d'EtOH. A -10°C, 0,51 g de NaBH4 (13,65 mmoles, 1,1 éq) sont ajoutés par portions et le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 30 min. 50 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec du DCM (3x75 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, lavées avec une solution saturée en NaC1 (2x50 mL), séchées sur 10 MgSO4 et évaporées. Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 97% (2.94 g, 12,06 mmoles). Pf = 122-124°C; IR (KBr): v, 3263 (OH), 3003, 2980, 1717 (C=0), 1592, 1387, 1365, 1299, 1170, 1131, 1080, 1063, 869, 846 cm-'; RMN 11I (400MHz, CDC13): S 1,60 (s, 9H); 15 2,89 (t, 1H, 3J= 6,3 Hz); 4,69 (d, 2H, 3J= 6,3 Hz); 7,39 (d, 1H, 3J= 5,0 Hz); 8,37 (d, 1H, 3J= 5,0 Hz); RMN 13C (100 MHz, CDC13): S 27,9 (3C); 61,3; 84,3; 120,6; 128,6; 147,2; 149,8; 150,8; 164,8. Exemple 1.4: Synthèse du 4-(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)-2-chloronicotinate de tert-butyle (4) TBDMSO 20 N CI C171128C1NO3Si O M = 357,95 g/mole 3053968 31 Dans un ballon de 100 mL à température ambiante, sont introduits 2,25 g de 3 (9,23 mmoles, 1 éq), 30 mL de DCM, 1,88 g d'imidazole (27,70 mmoles, 3 éq) et 2,78 g de TBDMSC1 (18,47 mmoles, 2 éq). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 4h à température ambiante. 50 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec 5 du DCM (3x75 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, lavées avec une solution saturée en NaC1 (2x50 mL), séchées sur MgSO4 et évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP à EP/Et20 95/5). Le produit final est obtenu sous forme d'huile incolore avec un rendement de 95% (3,15 g, 8,80 mmoles). 10 IR (KBr): v, 2956, 2931, 2859, 1717 (C=0), 1584, 1369, 1291, 1259, 1168, 1127, 840 cm-1; R1VIN 111 (400MHz, CDC13): S 0,10 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 1,60 (s, 9H); 4,74 (s, 2H); 7,50 (d, 1H, 3J= 5,0 Hz); 8,39 (d, 1H, 3J= 5,0 Hz); RMN 13C (100 MHz, CDC13): S -5,6 (2C); 18,2; 25,7 (3C); 27,9 (3C); 61,1; 83,6; 119,7; 127,6; 146,7; 149,7; 151,0; 164,1. Exemple 1.5: Synthèse du 4-(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)-2-méthylamino) 15 nicotinate de tert-butyle (5) C181132N203Si M = 352,54 g/mole Dans un tube scellé à température ambiante sont introduits 4,00 g de 4 (11,17 mmoles, 1 20 éq), 15 mL de t-BuOH et 4,83 mL de MeNH2 (40% w/w dans H2O, 55,87 mmoles, 5 éq). Le mélange réactionnel est alors laissé sous agitation pendant 24h à 100°C. Après évaporation, 50 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec du DCM (3x75 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur Mg504 et évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en 25 utilisant un gradient d'éluant (EP à EP/Et20 90/10). Le produit final est obtenu sous forme d'huile incolore avec un rendement de 79% (3,10 g, 8,79 mmoles). 3053968 32 IR (KBr): v, 3377 (N-H), 2931, 2857, 1732 (C=0), 1584, 1370, 1291, 1259, 1190, 1169, 1127, 1112, 839 cm-'; R1VIN111 (400MHz, CDC13): S 0,11 (s, 6H); 0,96 (s, 9H); 1,59 (s, 9H); 3,02 (d, 3H, 3J= 4,9 Hz); 4,90 (s, 2H); 6,97 (d, 1H, 3J= 5,2 Hz); 7,87 (bs, 1H); 8,25 (d, 1H, 3J= 5,2 Hz); RMN 13C (100 MHz, CDC13): S -5,4 (2C); 18,4; 25,9 (4C); 28,4 5 (3C); 63,9; 82,2; 104,9; 109,0; 151,8; 154,6; 159,5; 167,8. Exemple 1.6: Synthèse du 4-(hydroxyméthyl)-2-(méthylamino)nicotinate de tert-butyle (6) M = 238,28 g/mole 10 Dans un ballon de 100 mL, 3,00g de 5 (8,51 mmoles, 1 éq) sont mis en solution dans 30 mL de DCM. 0,97 mL d'AcOH (17,02 mmoles, 2 éq) et 17,02 mL de TBAF (1M dans le THF, 17,02 mmoles, 2 éq) sont ajoutés simultanément. La réaction est laissée sous agitation à température ambiante pendant 15h. 70 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec du DCM (3x70 mL). Les phases organiques sont alors 15 rassemblées, séchées sur Mg504 et évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d' éluant (EP/AcOEt 80/20 à EP/AcOEt 60/40). Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 92% (1,86 g, 7,81 mmoles). 20 IR (KBr): v, 3348 (N-H), 3242 (0-H), 2980, 2944, 1667 (C=0), 1596, 1557, 1530, 1367, 1242, 1165, 1126, 1074, 1061, 805 cm-'; R1VIN111 (400MHz, CDC13): S 1,60 (s, 9H); 3,01 (d, 3H, 3J= 4,9 Hz); 4,73 (s, 2H); 6,73 (d, 1H, 3J= 5,2 Hz); 7,58 (bs, 1H); 8,22 (d, 1H, 3J = 5,2 Hz); R1VIN 13C (100 MHz, CDC13): S 28,3 (3C); 28,4; 64,0; 83,0; 106,4; 110,7; 151,8; 153,2; 159,2; 167,5. 25 Exemple 1.7: 2-(méthylamino)-4-((2-phénoxyacétoxy)méthyl)nicotinate de tert-butyl (7) C12H18N203 3053968 33 C20H24N205 M = 372,41 g/mole Dans un ballon de 50 mL, 204 IAL de chlorure de phénoxyacétyle (1,47 mmoles, 1 éq) sont 5 mis en solution dans 5 mL de DCM. 198 mg d'HOBt (1,47 mmoles, léq) sont ajoutés et le milieu réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante. Après 10 min, 350 mg de 6 (1,47 mmol, 1 éq) sont ajoutés et la réaction est ensuite agitée à température ambiante pendant 24h. 40 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec de l'Et20 (4x30 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et 10 évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP à EP/AcOEt 8/2). Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 70% (385 mg, 1,03 mmoles). Pf = 149-151°C; IR (KBr): y, 3365, 2970, 1760, 1668, 1583, 1192, 752; R1VIN 1H (CDC13, 15 400 MHz): b 1,59 (s, 9H); 3,01 (d, 3H, 3J= 4,9 Hz); 4,75 (s, 2H); 5,45 (s, 2H); 6,53 (d, 1H, 3J= 5,1 Hz); 6,94 (m, 2H); 7,01 (t, 1H, 3J= 7,3 Hz); 7,30 (m, 2H); 7,89 (d, 1H, 3J= 4,2 Hz); 8,18 (d, 1H, 3J= 5,12 Hz); R1VIN 13C (CDC13, 100 MHz): b 28,3 (4C); 65,2; 65,4; 83,1; 105,6; 108,9; 114,6 (2C); 121,8; 129,6 (2C); 147,4; 152,0; 157,6; 159,6;. 167,1; 168,6. 20 Exemple 1.8: 5-iodo-2-(méthylamino)-4-((2-phénoxyacétoxy)méthyl)nicotinate de tertbutyle (8) C2oH231N205 (M = 498,31 g/mole) 3053968 34 Dans un ballon de 25 mL, sont introduits 280 mg de 7 (0,75 mmoles, 1 éq), 5 mL de DCM, 253 mg de NIS (1,12 mmoles, 1,5 éq) et 500 IAL d'acide acétique. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 3h à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite neutralisé avec 20 mL d'une solution aqueuse saturée de thiosulfate de sodium, 5 repris dans 20 mL d'une solution saturée de NaHCO3, puis extrait avec de l'Et20 (4x30 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d' éluant (EP à EP/AcOEt 9/1). Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaune avec un rendement de 91% (340 10 mg, 0,68 mmoles). Pf = 127-129°C; IR (KBr) v, 3424, 2934, 1755, 1704, 1576, 1193, 752; RMN 1H (CDC13, 400 MHz): 8 1,56 (s, 9H); 2,97 (d, 3H, 3J= 4,6 Hz); 4,64 (s, 2H); 5,4 (s, 2H); 6,90 (d, 2H, 3J= 7,8 Hz); 6,99 (t, 1H, 3J= 7,3 Hz); 7,27 (m, 2H); 8,50 (s, 1H); le signal N-H est manquant; RMN 13C (CDC13, 100 MHz): 8 28,1 (3C); 28,4; 65,0; 68,7; 82,5; 83,7; 112,7; 15 114,6 (2C); 121,8; 129,5 (2C); 144,6; 157,5; 157,7; 158,3; 166,5; 168,3. Exemple 1.9: (6-iodo-1-méthy1-2,4-dioxo-2,4-dihydro-1H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazine-5- yl)méthyl 2-phénoxyacétate (9) C17H131N206 20 M = 468,20 g/mole Dans un ballon de 50 mL sous atmosphère d'azote, 300 mg de 8 (0,60 mmoles, 1 éq) sont mis en solution dans 10 mL de DCM. 951 IAL de phosgène (20% dans le toluène, 1,80 mmoles, 3 éq) et 251 IAL de TEA (1,80 mmoles, 3 éq) sont ajoutés simultanément et la réaction est laissée sous agitation à température ambiante. Cette opération est répétée à 25 trois reprises pour convertir la totalité de la matière première. 40 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec de l'Et20 (5x50 mL). Les phases organiques sont 3053968 alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le mélange réactionnel est évaporé à sec et directement purifié sur une colonne de gel de silice greffée C18, en utilisant un gradient d'éluant (H20/ACN 95/5 à H20/ACN 5/95). Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 90% (255 mg; 0,54 mmoles). 5 Pf = 162-164°C; IR (KBr) v (cm-') : 3439, 2935, 1787, 1757, 1728, 1450, 1176, 756; RMN 11I (CDC13, 400 MHz): b 3,65 (s, 3H); 4,65 (s, 2H); 5,79 (s, 2H); 6,86 (d, 2H, 3J= 8,5 Hz); 6,96 (t, 1H, 3J= 7,5 Hz); 7,27 (m, 2H); 9,00 (s, 1H); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 31,2; 64,8; 66,7; 94,7; 107,7; 114,6 (2C); 121,8; 129,5 (2C); 146,8; 150,0; 153,3; 155,1; 157,5; 162,7; 168,2. 10 Exemple 2 : Synthèse d'un type de molecule d'anhydride aza-isatoique selon l'invention doté d'un groupement protecteur thermolabile O- Fluoro phenoxy acetate 13 On décrit ici la synthèse d'un autre exemple de composé selon l'invention (selon le schéma 4). Le composé précurseur 6 est fluoro-phénoxyacétylé (un groupement pouvant être plus 15 thermolabile) pour donner le composé 11, puis iodé pour donner le composé 12 et enfin cyclisé afin d'obtenir le composé 13 aza-isatoique. Schéma 4: Synthèse du composé 13 0-fluoro phenoxyacetylé. g) X=F, acide 4- fluorophénoxyacétique, EDC, HOBt, 5 min, ta puis 6, 3h, ta. h) NIS, DCM, AcOH, 2-3h, 20 ta i) COC12, TEA, Et20, 30 min, ta. Exemple 2.1: 44(2-(4-fluorophénoxy)acétoxy)méthyl)-2-(méthylamino)nicotinate de tertbutyle (11) i) 3053968 36 C20H23FN205 M = 390,40 g/mole Dans un ballon de 50 mL, sont introduits 149 mg d'acide 4-fluorophénoxyacétique (0,88 5 mmoles, 1,05 éq), 5 mL de DCM, 169 mg d'EDC (0,88 mmoles, 1,05 éq) et 119 mg d'HOBt (0,88 mmoles, 1,05 éq). Après 5 min à température ambiante, 200 mg de 6 (0,84 mmoles, 1 éq) sont ajoutés et la réaction est laissée sous agitation à température ambiante pendant 3h. 30 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec de l'Et20 (3x30 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et 10 évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP/AcOEt 9/1 à EP/AcOEt 8/2). Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaunâtre avec un rendement de 57% (190 mg, 0.49 mmoles). Pf = 151-153°C; IR (KBr) y, (cm-1) : 3376, 2977, 2935, 1758 (CO), 1683 (CO), 1586, 15 1189, 831; RMN 1H (CDC13, 400 MHz): b 1,60 (s, 9H); 3,02 (d, 3H, 3J = 4,6 Hz); 4,71 (s, 2H); 5,45 (s, 2H); 6,54 (d, 1H, 3J = 5,2 Hz); 6,88 (m, 2H); 6,99 (t, 2H, 3J = 8,3 Hz); 7,88 (s, 1H); 8,20 (d, 1H, 3J = 5,2 Hz); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 28,1; 28,3 (3C); 65,4; 65,9; 83,1; 105,6; 109,0; 115,9 (d, 3JC-F = 8 Hz, 2C); 116,0 (d, 2JC-F = 23 Hz, 2C); 147,3; 152,0; 153,8 (d, 4JC-F = 2 Hz, 1C); 157,8 (d, 1JC-F = 239 Hz, 1C); 159,5; 167,1; 20 168,4. Exemple 2.2: (6-iodo-l-méthy1-2,4-dioxo-2,4-dihydro-1H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazine-5- yl)méthyl 2-(4-fluorophénoxy)acétate (12) 3053968 37 C20H22FEN-205 M = 516,30 g/mole Dans un ballon de 25 mL, 200 mg de 11 (0,51 mmoles, 1 éq) sont mis en solution dans 3 5 mL de DCM. 172 mg de NIS (0,77 mmoles, 1,5 éq) et 150 1.1L d'acide acétique sont ajoutés et le milieu réactionnel est laissé sous agitation pendant 2h. Le mélange réactionnel est ensuite neutralisé avec 20 mL d'une solution aqueuse saturée de thiosulfate de sodium, repris dans 20 mL d'une solution saturée de NaHCO3, puis extrait avec de l'Et20 (4x30 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le 10 brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP à EP/AcOEt 9/1). Le produit final est obtenu sous forme d'huile jaune avec un rendement de 68% (180 mg, 0,35 mmoles). IR (KBr): v, 3413, 2926, 1763, 1688, 1506, 1183, 828; RMN 1H (CDC13, 400 MHz): 1,56 (s, 9H); 2,97 (d, 3H, 3J = 4,64 Hz); 4,60 (s, 2H); 5,37 (s, 2H); 6,85 (m, 2H); 6,96 (m, 15 2H); 8,50 (s, 1H); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 28,1 (3C); 28,4; 65,7; 68,7; 82,4; 83,7; 112,7; 115,9 (d, 2JC-F = 23 Hz, 2C); 116,0 (d, 3JC-F = 8 Hz, 2C); 144,5; 153,7; 157,7; 157,8 (d, 1JC-F = 239 Hz, 1C); 158,3; 166,4; 168,2. Exemple 2.3: (6-iodo-l-méthy1-2,4-dioxo-2,4-dihydro-1H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazine-5- yl)méthyl 2-(4-fluorophenoxy)acétate (13) 20 Ci7H12FIN206 3053968 38 M = 486,19 g/mole Dans un ballon de 50 mL sous atmosphère d'azote, 160 mg de 12 (0,31 mmoles, 1 éq) sont mis en solution dans 3 mL de DCM. 489 pt de phosgène (20% dans le THF, 0,98 mmoles, 9 éq) et 129 pt de TEA (0,98 mmoles, 9 éq) sont ajoutés simultanément et la réaction est 5 laissée sous agitation pendant 30 min. 30 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec de l'Et20 (3x30 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le mélange réactionnel est évaporé à sec et directement purifié sur une colonne de gel de silice greffée C18, en utilisant un gradient d'éluant (H20/ACN 95/5 à H20/ACN 5/95). 10 Le produit final est obtenu sous forme de poudre blanche avec un rendement de 77% (115 mg; 0,24 mmoles). Pf = 150-152°C; IR (KBr) v (cm-1) : 3454, 3078, 2934, 1787, 1745, 1504, 1194, 825; RMN 1H (CDC13, 400 MHz): b 3,66 (s, 3H); 4,62 (s, 2H); 5,78 (s, 2H); 6,83 (m, 2H); 6,95 (m, 2H); 9,01 (s, 1H); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 31,2; 65,6; 66,8; 94,7; 107,7; 15 115,9 (d, 2JC-F = 23 Hz, 2C); 115,9 (d, 3JC-F = 8 Hz, 2C); 146,7; 150,0; 153,4; 153,7 (d, 4JC-F = 2 Hz, 1C); 155,2; 157,8 (d, 1JC-F = 239 Hz, 1C); 162,8; 168,1. Exemple 3 : Synthèse d'un type de molecule d'anhydride aza-isatoique selon l'invention doté d'un groupement protecteur acido/thermolabile N-Boc 18 On décrit ici la synthèse d'un autre exemple de composé selon l'invention (selon le 20 schéma 5). Le composé précurseur 6 est tout d'abord transformé en composé azido 15 précurseur d'une composé aminé sur laquelle fonction amine sera couplée le groupement protecteur BOC pour accéder au composé 16. Une réaction d'iodation donne le composé 17 et enfin de cyclisation permet d'accéder au composé 18 aza-isatoique. 3053968 Schéma 5: Synthèse du composé N-boc 18. k) MeS02C1, NEt3, DCM, 3h, 0°C à ta puis NaN3, TEA, DCM, 3h, ta. 1) Boc2O, NaOH, PCy3, THF, 2h, ta. m) NIS, DCM, AcOH, 12h, ta. n) COC12, TEA, Et20, 30 min, ta. 5 Exemple 3: 4-(azidométhyl)-2-(méthylamino)nicotinate de tert-butyle (15) C12H17N502 M = 263,30 g/mole Dans un ballon de 100 mL sous azote, 1.40 g de 6 (5,88 mmoles, 1 éq) sont mis en solution 10 dans 20 mL de DMF. A 0°C, 0,91 mL de MeS02C1 (11.76 mmoles, 2 éq) et 4,08 mL de TEA (29.3 mmol, 5 éq) sont ajoutés simultanément. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante et le suivi est réalisé par CCM (EP/Et20 1/1). Après formation complète du dérivé mésylate correspondant, 1.15 g de NaN3 (17,64 mmoles, 3 éq) sont ajoutés et le mélange est laissé sous agitation pendant 3h à température ambiante. 15 50 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec de l'Et20 (3x60 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient 39 16, 59% 6 I) n) 0 H 17, 67% 18 3053968 d'éluant (EP/ Et20 9/1 à EP/ Et20 8/2). Le produit final est obtenu sous forme d'huile jaune avec un rendement de 73% (1,13 g, 4,29 mmoles). IR (KBr): y, 3374, 2978, 2104 (N3), 1679, 1586, 1425, 1125, 847, 655; RMN 1H (CDC13, 400 MHz): b 1,60 (s, 9H); 3,01 (d, 3H, 3J = 5,0 Hz); 4,58 (s, 2H); 6,61 (d, 1H, 3J = 5,0 5 Hz); 7,73 (s, 1H); 8,24 (d, 1H, 3J = 5,0 Hz); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 28,3 (3C); 53,9; 77,0; 83,1; 106,7; 111,5; 146,8; 152,0; 159,5; 167,1. Exemple 3.1 : 4-(((tert-butoxycarbonyl)amino)méthyl)-2-(méthylamino)nicotinate de tertbutyle (16) 10 C17H27N3 04 M = 337,41 g/mole Dans un ballon de 25 mL, 180 mg de 15 (0,68 mmoles, 1 éq) et 447 mg de Boc2O (2,05 mmoles, 3 éq) sont mis en solution dans 5 mL de THF. 750 !IL d'une solution aqueuse de NaOH (0,75 mmoles, 1,1 éq, 1M dans H2O) et 230 mg de PCy3 sont ajoutés 15 successivement. La réaction est laissée sous agitation à température ambiante pendant 2h. 30 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec de l'Et20 (3x30 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP/ AcOEt 9/1 à EP/ AcOEt 8/2). Le produit final est obtenu sous forme d'huile 20 jaune avec un rendement de 59% (135 mg, 0,40 mmoles). RMN 1H (CDC13, 400 MHz): b 1,44 (s, 9H); 1,60 (s, 9H); 3,01 (d, 3H, 3J = 4,6 Hz); 4,40 (d, 2H, 3J = 6,1 Hz); 5,02 (sl, 1H); 6,57 (d, 1H, 3J = 5,1 Hz); 7,52 (sl, 1H); 8,18 (d, 1H, 3J = 5,1 Hz); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 28,4 (6C); 28,5; 43,9; 79,6; 83,0; 107,6; 111,6; 150,5; 151,5; 155,7; 159,2; 167,4. 25 Exemple 3.2 : 4-(((tert-butoxycarbonyl)amino)méthyl)-5-iodo-2-(méthylamino)nicotinate de tert-butyl (17) 3053968 41 Ci7H2611\1304 M = 463,31 g/mole Dans un ballon de 25 mL, 130 mg de 16 (0,39 mmoles, 1 éq) sont mis en solution dans 4 5 mL de DCM. 225 mg de NIS (0,58 mmoles, 1,5 éq) et 200 IAL d'acide acétique sont ajoutés et le milieu réactionnel est laissé sous agitation pendant 12h. Le mélange réactionnel est ensuite neutralisé avec 10 mL d'une solution aqueuse saturée de thiosulfate de sodium, repris dans 10 mL d'une solution saturée de NaHCO3, puis extrait avec de l'Et20 (4x30 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et 10 évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP à EP/AcOEt 9/1). Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaune avec un rendement de 67% (121 mg, 0,26 mmoles). RMN 1H (CDC13, 400 MHz): b 1,44 (s, 9H); 1,60 (s, 9H); 2,95 (d, 3H, 3J = 4,6 Hz); 4,39 15 (d, 2H, 3J = 5,2 Hz); 4,82 (sl, 1H); 6,67 (sl, 1H); 8,48 (s, 1H); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 28,1 (3C); 28,3 (4C); 47,6; 79,5; 82,9; 83,9; 113,1; 147,7; 154,9; 157,5; 158,3; 166,7. Exemple 3.4 : (6-iodo-1-méthy1-2,4-dioxo-2,4-dihydro-1H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazine-5- y1) méthyl carbamate de tert-butyle (18) 20 3053968 42 Dans un ballon de 25 mL sous atmosphère d'azote, 100 mg de 17 (0,22 mmoles, 1 éq) sont mis en solution dans 3 mL de DCM. 342 µL de phosgène (0,65 mmoles, 20% dans le toluène, 3 éq) et 90 µL de TEA (0,65 mmoles, 3 éq) sont ajoutés simultanément et la réaction est laissée sous agitation à température ambiante pendant 30 min. Cette opération 5 est répétée à trois reprises pour convertir la totalité de la matière première. 30 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec du DCM (3x30 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. L'anhydride azaisatoïque 18 ainsi obtenu a été directement mis en réaction sans étape de purification supplémentaire. 10 Exemple 4: Réaction des molécules dérivées de l'anhydride aza-isatoique selon l'invention avec un composé aminé Cet exemple démontre que les molécules synthétisées dans les exemples 1 à 3, soit respectivement les molécules 9, 13, et 18 réagissent avec un composé aminé tel que la phényl éthyl amine. Schéma 6: Ouverture des anhydrides azaisatoïques 9, 13, et 18 selon l'invention par la phényléthylamine. j) phényléthylamine, DCM, lh, ta. Exemple 4.1 : (5-iodo-2-(méthylamino)-3-(phénéthylcarbamoyl)pyridine-4-yl)méthyl 2- phénoxyacétate (10) J) 15 18 19 0 N 'N 9 X=H 13 X=F N H 10 X=H 14 X=F l) 3053968 43 C241-12411\1304 M = 545,37 g/mole Dans un ballon de 10 mL, sont introduits 65 mg de 9 (0,13 mmoles, 1 éq), 1 mL de DCM 5 et 17,4 IAL de phényléthylamine (0,13 mmoles, 1 éq). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 1h à température ambiante. 15 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec de l'Et20 (5x20 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP/AcOEt 9/1 à EP/AcOEt 10 7/3). Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaunâtre avec un rendement de 71% (50 mg, 0,09 mmoles). Pf = 164-166°C; IR (KBr) v (cm-1) : 3428, 3296, 2924, 1761, 1627, 1433, 1170, 754; RMN 1H (CDC13, 400 MHz): b 2,86 (s, 3H); 2,88 (d, 2H, 3J = 7,1 Hz); 3,69 (m, 2H); 4,57 15 (s, 2H); 4,98 (s, 2H); 5,58 (d, 1H, 3J = 4,5 Hz); 6,54 (t, 1H, 3J = 5,6 Hz); 6,88 (d, 2H, 3J = 8,8 Hz); 7,00 (t, 1H, 3J = 7,6 Hz); 7,21 (m, 2H); 7,28 (m, 5H); 8,40 (s, 1H); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 28,4; 35,2; 40,6; 64,9; 67,3; 80,3; 114,6 (2C); 118,6; 122,0; 126,8; 128,6 (2C); 128,7 (2C); 129,7 (2C); 138,1; 140,7; 156,3; 156,8; 157,5; 166,5; 168,3. Exemple 4.2 : (5-iodo-2-(méthylamino)-3-(phénéthylcarbamoyl)pyridine-4-yl)méthyl 220 (4-fluorophénoxy)acétate (14) 3053968 44 C24H23FIN304 M = 563,36 g/mole Dans un ballon de 10 mL, sont introduits 50 mg de 13 (0,10 mmoles, 1 éq), 1 mL de DCM et 12,9 µL de phényléthylamine (0,10 mmoles, 1 éq). La réaction est laissée sous agitation 5 à température ambiante pendant 1h. 10 mL d'eau sont ensuite ajoutés et la solution est extraite avec de l'Et20 (5x15 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d' éluant (EP/AcOEt 7/3 à EP/AcOEt 6/4). Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaunâtre avec un rendement de 87% (50 mg, 0,09 mmoles). 10 Pf = 165-167°C; IR (KBr): v, 3388, 3376, 2924, 1742, 1661, 1577, 1504, 1191, 824; RMN 1H (CDC13, 400 MHz): b 2,86 (d, 3H, 3J = 4,64 Hz); 2,89 (t, 2H, 3J = 6,84 Hz); 3,72 (m, 2H); 4,51 (s, 2H); 4,99 (s, 2H); 5,55 (d, 1H, 3J = 4,6 Hz); 6,51 (t, 1H, 3J = 8,0 Hz); 6,83 (m, 2H); 6,97 (m, 2H); 7,21 (m, 3H); 7,30 (m, 2H); 8,40 (s, 1H); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 28,4; 35,1; 40,5; 65,6; 67,3; 80,2; 115,9 (d, 3JC-F = 8 Hz, 2C); 116,1 (d, 2JC-F = 15 23 Hz, 2C); 118,6; 126,8; 128,6 (2C); 128,7 (2C); 138,1; 140,7; 153,6 (d, 4JC-F = 2 Hz, 1C); 156,3; 156,8; 157,9 (d, 1JC-F = 222 Hz, 1C); 166,5; 168,1. Exemple 4.3: ((5-iodo-2-(méthylamino)-3-(phénéthylcarbamoyl)pyridine-4- yl)méthyl)carbamate de tert-butyle (19) 20 C2111271N403 M = 510,37 g/mole Dans un ballon de 10 mL, l'anhydride azaisatoïque 18 est mis en solution dans 1 mL de DCM. 27,6 µL de phényléthylamine (0,22 mmoles, 1 éq) sont alors ajoutés et le milieu réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 1h. 10 mL d'eau sont 25 ensuite ajoutés et la solution est extraite avec de l'Et20 (4x20 mL). Les phases organiques sont alors rassemblées, séchées sur MgSO4 et évaporées. Le brut réactionnel est ensuite 3053968 purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'éluant (EP/AcOEt 7/3 à EP/AcOEt 4/6). Le produit final est obtenu sous forme de poudre jaunâtre avec un rendement de 54% (61 mg, 0,12 mmoles). 5 RMN 1H (CDC13, 400 MHz): b 1,34 (s, 9H); 2,79 (d, 3H, 3J = 4,6 Hz); 2,88 (t, 2H, 3J = 7,1 Hz); 3,67 (m, 2H); 3,87 (d, 2H, 3J = 6,5 Hz); 5,47 (sl, 1H); 5,72 (sl, 1H); 7,18 (m, 5H); 8,27 (s, 1H); 8,98 (sl, 1H); RMN 13C (CDC13, 100 MHz): b 28,3 (3C); 28,4; 30,0; 40,6; 44,9; 80,0; 80,6; 118,9; 126,4; 128,4 (2C); 128,7 (2C); 138,8, 143,1; 156,1; 156,2; 156,7; 166,7. 10 Exemple 5: Procédé de déprotection des composés aza-anthranylates et libération de la phényléthyl amine en conditions de PCR « hot-start » Nous démontrons ici que les dérivés 10, 14, et 19 synthétisés à l'exemple 3 peuvent se cliver dans des conditions de PCR « hot-start » et libérer la phényléthyle amine qui mime une protéine. 15 Procédure générale: Dans un tube de 1,5 mL, sont introduits : 20 !IL d'une solution d'amide (10, 14 ou 19) à 2,5 mM dans le DMSO et 180 !IL d'un tampon utilisé de façon classique dans une réaction d'amplification de matériel génétique (60 mM Tris pH 9, KC1 50 mM, MgC12 1 mM) . Le mélange est alors laissé sous agitation à 95°C dans un thermomixer. Des suivis LCMS 20 (condition 1) ont été réalisés à t = 15 min, 30 min et 1h. Exemple 5.1: Evaluation du clivage à 95°C du dérivé aza-anthranylate phénoxyacétate 10 N N H 10 N N H alcool intermédiaire + H2N Ithvlamine 0 HO 95°C Tampon PCR I Schéma 7: Clivage du composé aza-anthranylate 10 dans des conditions de PCR « Hot- start » 3053968 46 La déprotection thermique du groupement phénoxyacétate conduit à la formation de l'alcool benzylique correspondant (cf Schéma 7). L'attaque nucléophile de l'alcool sur le carbonyle mis en jeu dans la liaison amide permet alors de relarguer la phényléthylamine dans le milieu en générant la lactone correspondante. 5 Cette cascade réactionnelle est représentée sur les chromatogrammes HPLC de la Figure 1. Après 15 minutes à 95°C, on remarque la formation de l'alcool déprotégé et de la lactone attendue ce qui indique la libération de phényléthylamine. Ce résultat montre bien le caractère thermolabile du groupement phénoxyacétate conduisant à la formation de l'alcool correspondant. Après cyclisation, on retrouve la présence de la lactone attendue 10 témoignant du clivage de la liaison amide et donc du relargage de la phényéthylamine dans le milieu. Après lh à 95°C, la population d'amide de départ et d'alcool ont quasiment totalement disparu au profit de la lactone. Ce résultat démontre la possibilité de cliver une liaison amide à 95°C par ce système de cyclisation intramoléculaire. 15 Exemple 5.2: Evaluation du clivage à 95°C du dérivé aza-anthranylate fluoro phénoxyacétate 14 Schéma 8: Clivage du composés aza-anthranylate 14 dans des conditions de PCR «Hot-20 start» Le procédé de déprotection a également été mis en oeuvre à partir du dérivé fluorophenoxyacétate 14. Après 15 minutes à 95°C, la population d'amide est très faible. En particulier, elle est plus faible par comparaison au résultat observé avec le dérivé 10 (voir Figure 2). La présence de l'atome de fluor accélère le clivage du groupement 95°C Tampon PCR I i+ H2N .. iN N N H H o alcool intermédiaire lactone ho énvléthvlamine 3053968 47 phénoxyacétate. Ainsi, après 30 minutes, cette population d'amide a quasiment totalement disparu au profit de l'alcool et de la lactone très majoritaire indiquant la libération de phényléthylamine. Exemple 5.3 : Evaluation du clivage à 95°C du dérivé aza-anthranylate N-Boc 19 Schéma 9: Clivage du composés aza-anthranylate N-Boc 19 dans des conditions de PCR « Hot-start » Dans ce cas, la déprotection du groupement N-boc conduit au dérivé amine benzylique 10 intermédiaire. Ce dernier peut alors cycliser pour former le lactame correspondant en libérant la phényléthylamine dans le milieu (Schéma 9 ci-dessus). Le suivi par HPLC montrant les différents composés intermédiaires est représenté sur la Figure 3. Pour ce dérivé, la forme déprotégée non cyclisée (amine intermédiaire) n'est pas détectée. 15 Cet exemple démontre donc la cyclisation immédiate après déprotection du groupement Nboc pour former la phényléthylamine. Ceci confirme l'avantage de la fonction amino en position 5 par rapport à la fonction alcool, pour la vitesse de cyclisation. L'homme du métier saura donc trouver le groupement protecteur approprié de la fonction NH2 en position 5 du cycle aromatique pour obtenir une déprotection suffisamment rapide 20 conduisant à une cyclisation instantanée, et à la libération de la phényléthylamine. Exemple 6: Protection réversible de l'hémoglobine par le composé aza-isatoique 13 tel que décrit dans l'invention 5 NH + H2N N 'N H lactame phénvléthvlamine HN 95°C I~IN Tampon PCR N N H 19 amine intermédiaire 3053968 48 Nous démontrons ici que le dérivé aza-isatoique 13 doté du groupement thermolabile fluoro-phenoxy est capable de réagir avec une protéine dans des conditions douces et en milieu aqueux pour former un dérivé protéine-aza anthranylate fluoro-phenoxy. L'élimination de ce groupement protecteur suite à un traitement thermique à 95°C permet 5 de régénérer la protéine native. Protocole: On réalise les mélanges tels que décrits ci-dessous où les expériences AL600 lx à AL 600 0.25X correspondent respectivement à 341g d'hémoglobine mis en réaction avec des concentrations croissantes du composé aza-isatoïque dans un mélange de DMSO et de PBS 10 à pH 7.4 (PBS = Phosphate buffered Saline issu de la dissolution d'une pastille de la référence Sigma P4417 dans 200 ml d'eau (pH 7,4)). Les mélanges sont mis à incuber à température ambiante pendant 2 heures avant de prélever un aliquot pour analyse par HPLC sur une colonne Waters (Milford, USA) XBridge BEH 300 C4 avec un gradient de 20 à 72% d' acétonitrile dans une solution d'acide trifluoroacetique à 10 mM en 120 min. Hémoglobine Humaine PBS pH 7 4 DMS 0 13 (Sigma H7379) , (41 mM 6.611g/111 dans le dans PBS DMSO) le EXPERIENCES ial ial ial ial AL 600 0.25x 5 5 8,75 1,25 AL 600 0.5x 5 5 7,5 2,5 AL 600 lx 5 5 5 5 CTRLES SANS Réactif acvlant 20 AL 602 CTRLE 0.25X 5 5 10 0 Tableau 1: Concentration relative en réactifs pour réaliser l'acylation réversible de l'hémoglobine Sur la Figure 4, le chromatogramme AL602 CTRLE 0.25X montre l'hémoglobine de 25 contrôle n'ayant pas réagi avec le composé 13. On y visualise l'hème et les 2 sous unités 3053968 49 alpha et beta de la partie protéique. Les 3 chromatogrammes suivants (AL 600 0.25 X-1X) montrent la disparition de la partie protéique au profit d'un massif décalé vers la droite correspondant aux sous unités alpha et béta acylé par le composé aza-isatoique 13. L'élargissement du pic correspond à l'acylation aléatoire des sites réactifs de la protéine. 5 On démontre ainsi que le composé aza-isatoique tel que décrit selon l'invention peut réagir avec une protéine. Lorsque le milieu réactionnel AL 600 1X est soumis à un traitement thermique à 95°C pendant 15 min dans un tampon de PCR (constitué pour partie principale de Tris pH9), on observe une hydrolyse de la partie benzylamide qui conduit à restaurer le profil 10 chromatographique de l'hémoglobine native. Ceci est visible sur la Figure 5 où le chromatogramme du haut (A) représente l'hémoglobine native et reprise dans du GuHC1 8M, le chromatogramme du milieu (B) représente l'hémoglobine acylée par le composé 0 et reprise dans du GuHC1 8M et, où le chromatogramme du bas (C) représente l'hémoglobine acylée par le composé 13 puis chauffée dans du tampon Tris pH8 et reprise 15 dans du GuHC1 8M. On voit distinctement comme précédemment que l'acylation de l'hémoglobine conduit à la formation d'un massif de protéine acylé puis que ce massif disparaît suite à un traitement thermique pour régénérer la protéine native. A noter que les milieux réactionnels ont été repris après réaction dans du GuHC1 8M afin de solubiliser la partie protéique qui aurait précipité lors du traitement thermique. Cet 20 exemple démontre l'acylation réversible d'une protéine modèle par le composé 0 tel que décrit dans l'invention. Exemple 7: Démonstration de l'acylation reversible de la TAQ polymerase par le composé aza-isatoique 13 tel que décrit dans l'invention Nous démontrons ici que le dérivé aza-isatoique 13 doté du groupement thermolabile 25 fluoro-phenoxy est capable de réagir avec une polymerase thermostable (Taq) dans des conditions douces et en milieu aqueux pour former un dérivé Taq-aza anthranylate fluorophenoxy. L'élimination de ce groupement protecteur suite à un traitement thermique à 95°C dans des conditions de PCR permet de restaurer l'activité de la polymérase, ce qui est démontré par le dosage de son activité. 3053968 Le concept d'utiliser des anhydrides aza-isatoique convenablement modifiés pour masquer transitoirement l'activité d'une polymérase et la restaurer ensuite après un traitement thermique est ainsi démontré. Protocole : 5 Nous avons utilisé la Taq Genscript (2500 u /1041 REF E00012), mais afin d'éliminer toutes traces de nucléophiles dans cette enzyme nous avons effectué préalablement un changement de tampon par passage sur un microcon 10 KD Amicon (n° 42407). La suspension enzymatique est ainsi déposée sur le microcon et centrifugée jusqu'à épuisement du tampon. Cinq lavages sont effectués avec 100 1.11 de PBS pH 7,4, puis le 10 dernier retentât est récupéré par inversion du tube et complété à QSP 241 avec du PBS pour obtenir une suspension à 125 u/1.11. Nous avons ainsi démontré que le Tris et le glycérol était éliminé de façon très satisfaisante par cette méthode. On réalise ensuite les mélanges tels que décrit dans le Tableau 2 où les expériences AL604 0.25x à AL 604 0.375X correspondent respectivement à 625 unités de Taq polymerase mis 15 en réaction avec des concentrations croissantes du composé aza-isatoïque dans un mélange de DMSO et de PBS à pH 7.4 (PBS = Phosphate buffered Saline issu de la dissolution d'une pastille de la référence Sigma P4417 dans 200 ml d'eau (pH 7,4)). Les mélanges sont mis à incuber à température ambiante pendant 3 heures sous vortex léger avant d'évaluer leur activité enzymatique dans des conditions de PCR « hot-start ». Taq PBS pH DMSO 13 mM (41 Concentration en Genscript 7,4 dans le TAQ] finale (20 1.11 à (125 u/1.11) DMSO) 50/50 PBS/DMSO) EXPERIENCES Unités/pl 1.11 ill 1.11 u/1.11 AL 604 0.25x 625 u/5 1.11 5 8,75 1,25 31 AL 604 0,375x 625 u/5 1.11 5 8,1 1,9 31 20 Tableau 2: Concentration re ative en réactifs pour réaliser l'acylation réversible de la TAQ polymérase 3053968 51 Dosage de l'activité polymérase de la TAQ modifiée par le composé 13: L'activité de polymérisation de la TAQ polymérase est réalisée à l'aide d'une sonde oligonucléotidique de 45 bases terminée par une structure en « épingle à cheveux ». Celle-ci est caractérisée par la présence d'un quencher de fluorescence en début de structure et 5 par un fluorophore en fin de séquence de la sonde, de telle manière à ce que le quencher se retrouve spatialement proche du fluorophore et qu'aucun signal de fluorescence ne puisse être mesuré dans cette configuration. Sous l'action de l'activité polymérase, cette sonde est élonguée à l'aide d'un oligonucléotide de 19 bases complémentaire au début de la sonde précédente. Sous l'action de l'élongation, la structure en épingle à cheveux de la sonde se 10 déplie et le fluorophore peut émettre et une fluorescence est alors mesurable. Cette mesure de fluorescence est effectuée à une température de 60°C pendant 20 minutes en présence des réactifs nécessaires à l'activité de l'enzyme, c'est-à-dire des dNTP, du MgC12 et un tampon basique à pH 9.5. L'augmentation de la fluorescence est linéaire en début de mesure et permet de calculer 15 une vitesse initiale correspondant à la quantité de fluorescence émise par minutes d'élongation. En mesurant cette vitesse initiale pour différentes concentrations d'une polymérase donnée ayant une activité connue en U/uL, il est possible d'établir une droite étalon permettant de mesurer l'activité d'une enzyme similaire et d'activité inconnue. La modification chimique de la polymérase afin de la rendre inactive est mesurée par cette 20 méthode. En mesurant le niveau d'activité résiduelle après modification de l'enzyme, il est possible de déterminer l'efficacité de la protection mise en place. Une polymérase totalement inactivée par modification chimique ne doit plus générer d'activité sans activation thermique à des températures supérieures à 90°C. La capacité à restaurer l'activité de l'enzyme après chauffage de 15 min à 95°C par 25 exemple est facilement mesurable par la même méthode. La Figure 6 démontre donc qu'en fonction de la concentration choisie en agent acylant, on peut inactiver totalement l'activé polymérase de la Taq et la restaurer suite à un traitement à 95°C pendant 15 min dans des conditions de « Hot-start » PCR (voir colonne correspondant à AL 604 0,375X). REVENDICATIONS1. Composé de formule (I) suivante : (I) dans laquelle X est une liaison covalente ou un alkyle en C1 à C4, Y est un radical nucléophile, de préférence O, S, NR4, 0-NR4, NH-0, ou NHNR4, et R4 est H ou un groupe alkyle en C1 à C4, Z1, Z2 Z3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre, N ou C, de préférence Z3 représente C, plus préférentiellement Z3 est C et R3 est en position Z3, R1 est H, un groupe alkyle en C1 à C6, substitué ou non, un alcényle substitué ou non, un groupe aryle substitué ou non, ou un hétérocycle substitué ou non, de préférence R1 est un groupe méthyle ou éthyle, R2 est un groupement protecteur thermolabile et/ou acidolabile, R3 est H, un groupe alkyle en C1 à C12 substitué ou non, par exemple un groupe iso-propyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, isopentyl ou 2,2-diméthylpropyl, un groupe aryle substitué ou non, un hétérocycle substitué ou non, un groupe acyle, un groupe alcényle substitué ou non, un halogène (e.g. F, Cl, Br et I), ou un groupe cyano. 3053968 53 2. Composé selon la revendication 1 de formule (II) suivante : 3. Composé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le groupement thermolabile et/ou acidolabile R2 est choisi parmi les groupements tert-butoxycarbonyl (BOC), phénoxyacétyle substitué ou non, trityle, méthoxytrityle, diméthoxytrityle ou citraconyle. 4. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que R1 est un groupe méthyle. 5. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que R3 est l'iode. 6. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que Zi est N et Z2 est C. 7. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé par l'une des structures suivantes : 3053968 54 N N 0 I (V) 0 0 N N 0 I (IV) 0 8. Procédé de préparation d'une molécule biologique protégée, comprenant la 5 mise en contact d'un composé selon l'une des revendications 1 à 7 avec une molécule biologique comprenant un ou plusieurs groupes nucléophiles, dans des conditions permettant l'acylation d'un ou plusieurs groupes nucléophiles de ladite molécule biologique, pour former une molécule biologique protégée. 10 9. Molécule biologique protégée, susceptible d'être obtenue par le procédé de la revendication 8. 10. Molécule biologique protégée, de formule (III) suivante : R2 Y X e Biomol W R1 15 dans laquelle Biomol est une molécule biologique W est un groupe nucléophile de la molécule biologique, par exemple NH, S ou 0, X est une liaison covalente ou un alkyle en C1 à C4, 3053968 55 Y est un radical nucléophile, de préférence O, S, NR4, 0-NR4, NH-0, ou NHNR4, et R4 est H ou un groupe alkyle en C1 à C4, Z1, Z2, Z3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre, N ou C, de préférence Z3 représente C, plus préférentiellement Z3 est C et R3 est en 5 position Z3, R1 est H, un groupe alkyle en C1 à C6, substitué ou non, un alcényle substitué ou non, un groupe aryle substitué ou non, ou un hétérocycle substitué ou non, de préférence R1 est un groupe méthyle ou éthyle, R2 est H ou un groupement protecteur thermolabile et/ou acidolabile, 10 R3 est H, un groupe alkyle en C1 à C12 substitué ou non, par exemple un groupe iso-propyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, isopentyl ou 2,2-diméthylpropyl, un groupe aryle substitué ou non, un hétérocycle substitué ou non, un groupe acyle, un groupe alcényle substitué ou non, un halogène, ou un groupe cyano. 15 11. Molécule biologique protégée selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que Biomol est choisi parmi les enzymes. 12. Molécule biologique protégée selon la revendication 11 caractérisée en ce que Biomol est une enzyme destinée à être utilisée dans une réaction de 20 polymérisation d'acide nucléique, par exemple une ADN polymérase. 13. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 7 pour l'inactivation réversible d'une enzyme. 14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'enzyme est une enzyme destinée à être utilisée dans une réaction de polymérisation d'acide nucléique, par exemple une ADN polymérase. 15. Utilisation d'une molécule biologique protégée selon la revendication 12, dans une réaction d'amplification d'acide nucléique, par exemple pour des applications de démarrage à chaud « Hot Start ». 16. Procédé de déprotection des groupes nucléophiles d'une molécule biologique protégée selon l'une des revendications 9 à 12, ledit procédé comprenant une 3053968 56 étape de clivage du ou des groupements thermolabiles et/ou acidolabiles R2, par traitement thermique et/ou acide respectivement, et la déprotection concomitante des groupes nucléophiles. 5 17. Procédé de polymérisation d'un acide nucléique comprenant (i) la mise en oeuvre d'une molécule biologique protégée selon la revendication 12, (ii) au moins une étape pour la déprotection de ladite molécule biologique, par exemple par un traitement thermique à une température permettant le clivage du ou des groupements thermolabiles R2, (iii) une étape de polymérisation d'acide 10 nucléique à l'aide de la polymérase déprotégée à l'étape (ii).