Brevet FR3061297A1 — publié le 20180629

Procédé de comptage et de caractérisation de particules dans un fluide en mouvement Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est le comptage de particules circulant dans une chambre fluidique à l'aide d'une méthode optique. ART ANTERIEUR Plusieurs procédés optiques ont déjà été mis en oeuvre pour compter des particules circulant dans un fluide, le fluide étant un gaz ou un liquide. Un principe très répandu est basé sur l'illumination, à l'aide d'un faisceau lumineux d'un fluide dans lequel des particules circulent. Lorsqu'une particule traverse le faisceau, une partie de la lumière est diffusée et peut être détectée par un photodétecteur. Ce principe a été mis en oeuvre pour la détection de particules dans l'air, ou pour la détection de cellules dans des liquides, par exemple des liquides biologiques. D'autres procédés reposent sur l'analyse d'images, par exemple à l'aide d'un microscope, mais les images ne fournissent qu'une information bidimensionnelle quant à la position des particules. Le document W02008090330 décrit un dispositif permettant l'observation d'échantillons comportant des cellules par imagerie sans lentille. L'échantillon est disposé entre une source de lumière et un capteur d'image, sans disposer un système optique de formation d'image entre l'échantillon et le capteur d'image. Ainsi, le capteur d'image collecte une image, également appelée hologramme, formée de figures d'interférence entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et transmise par l'échantillon, et des ondes de diffraction, résultant de la diffraction par l'échantillon de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. Ces figures d'interférences sont généralement formées par une succession d'anneaux concentriques. Elles sont parfois dénommées figures de diffraction, ou désignées par le terme anglais « diffraction pattern ». On acquiert ainsi des images, dont le champ d'observation est nettement plus important que celui d'un microscope. Lorsque la concentration en cellules de l'échantillon est suffisamment faible, à chaque cellule peut être associée une figure d'interférence ; leur dénombrement permet la numération des cellules présentes dans l'échantillon. Mais l'hologramme ne permet pas un comptage fiable des cellules lorsque la concentration augmente, et/ou lorsque les particules sont en mouvement. Le procédé montre également des 3061297 2 limites lorsque l'hologramme présente un faible rapport sur bruit, par exemple lorsque la taille d'une particule est faible ou lorsqu'une particule présente un indice de réfraction proche de celui du milieu formant l'échantillon. La demande de brevet US2012/148141 décrit un procédé reprenant les principes de 5 W02008090330, en implémentant un algorithme de reconstruction holographique à une succession d'images acquises pour reconstruire des images complexes de spermatozoïdes. L'objectif est de caractériser leur motilité. Il s'agit d'un procédé basé sur un suivi individuel de trajectoires de particules mobiles, dans un fluide immobile, sur la base de coordonnées tridimensionnelles des particules, obtenues par la reconstruction holographique. En effet, une 10 telle reconstruction permet d'apporter une estimation d'une distance entre un capteur d'image et une particule, permettant d'accéder à une information dite de profondeur, complétant l'information bidimensionnelle obtenue par les capteurs d'image classiques. Par ailleurs, le procédé permet de déterminer un modèle de déplacement de chaque particule, le modèle de déplacement étant un résultat obtenu par la mise en oeuvre du procédé. 15 Par ailleurs, de nombreux procédés d'imagerie d'écoulements, désignés par l'acronyme anglosaxon "Particle Imaging Velocimetry" mettent en oeuvre des procédés de détection optique de particules de façon à caractériser leur mouvement, qui est représentatif du mouvement du fluide étudié. Les inventeurs de la présente invention ont proposé un procédé permettant une localisation et 20 un comptage de particules circulant dans une chambre fluidique, pouvant être automatisé et mis en oeuvre dans un fluide en mouvement. Le procédé peut être mis en oeuvre automatiquement, et adresser des vitesses ou quantités de particules élevées. De plus, lorsque des particules de différents types sont présentes dans la chambre fluidique, le procédé peut permettre une discrimination entre différents types de particules, de façon à compter le nombre 25 de particules de différents types, en se basant sur leurs déplacements respectifs. EXPOSE DE L'INVENTION Un objet de l'invention est un procédé de comptage de particules en mouvement dans un fluide, circulant dans une chambre fluidique, le procédé comportant les étapes suivantes : a) disposition de la chambre fluidique entre une source de lumière et un capteur d'image, 30 le capteur d'image s'étendant selon un plan de détection ; b) illumination de la chambre fluidique par la source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente se propageant selon un axe de propagation et 3061297 3 acquisition, par le capteur d'image, d'une image, dite première image, représentative d'une onde lumineuse, dite onde d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image, le capteur d'image comportant différents pixels, à chaque pixel étant associé une coordonnée radiale dans le plan de détection ; 5 c) à partir de l'image acquise, obtention de coordonnées, notamment tridimensionnelles, de particules, dans la chambre fluidique, à un premier instant, d) obtention de coordonnées, notamment tridimensionnelles, de particules dans la chambre fluidique à un deuxième instant, postérieur au premier instant ; e) à partir des coordonnées des particules obtenues au premier instant et au deuxième 10 instant, détermination de déplacements potentiels des particules entre lesdits instants. f) prise en compte d'un modèle de déplacement du fluide dans la chambre fluidique ; g) à partir du modèle de déplacement du fluide considéré lors de l'étape f), validation de déplacements parmi les déplacements potentiels calculés lors de l'étape e) ; h) à partir des déplacements validés lors de l'étape g), détermination d'un nombre de 15 particules et/ou des coordonnées des particules au premier instant et/ou au deuxième instant. Les étapes f) et g) sont optionnelles. Lorsqu'elles ne sont pas mises en oeuvre, le procédé comporte une étape de détermination d'un nombre de particules et/ou des coordonnées des particules au premier instant et/ou au deuxième instant à partir des déplacements potentiels 20 déterminés lors de l'étape e). L'étape c) peut comporter : l'obtention d'une première image d'intérêt à partir de la première image acquise lors de l'étape b), et l'application d'un opérateur de propagation numérique à première image d'intérêt, selon au moins une distance de reconstruction, le long de l'axe de 25 propagation, de façon à obtenir au moins une image complexe reconstruite ; à partir de chaque image complexe reconstruite, l'obtention de coordonnées radiales de particules dans la chambre fluidique au premier instant. L'étape c) peut comporter les sous-étapes suivantes : ci) obtention d'une première image d'intérêt à partir de la première image acquise lors de 30 l'étape b), et application d'un opérateur de propagation numérique à la première image d'intérêt, selon une pluralité de distances de reconstruction, selon l'axe de propagation, de façon à obtenir une première pile d'images complexes reconstruites, dite première pile d'images, comportant autant d'images complexes reconstruites que de distances de 3061297 4 reconstruction, chaque image complexe reconstruite étant représentative d'une onde lumineuse d'exposition à laquelle est exposé le capteur d'image; cii) pour au moins une coordonnée radiale définie par la première image d'intérêt, détermination d'une distance de reconstruction maximisant l'évolution d'une 5 composante de chaque image complexe formant la première pile d'images, le long d'un axe parallèle à l'axe de propagation et passant par ladite coordonnée radiale, ladite distance de reconstruction déterminée formant une coordonnée transversale associée à ladite coordonnée radiale, la valeur de la composante calculée à ladite distance de reconstruction étant une valeur dite maximale associée à ladite coordonnée radiale, la 10 sous-étape cii) étant réalisée pour tout ou partie de coordonnées radiales associées aux pixels de la première image d'intérêt; ciii) établissement d'une liste de positions tridimensionnelles, chaque position tridimensionnelle comportant une coordonnée radiale et la coordonnée transversale associée, déterminée lors de la sous-étape cii), à chaque position tridimensionnelle 15 étant associée la valeur maximale obtenue lors de la sous-étape cii) ; civ) sélection de positions tridimensionnelles en fonction de la valeur maximale qui leur est associée. La première image d'intérêt peut être : la première image acquise lors de l'étape b) ; 20 ou la première image acquise lors de l'étape b), à laquelle est soustraite une image de la chambre fluidique, acquise par le capteur d'image, antérieurement ou postérieurement à l'acquisition de la première image, la soustraction étant pondérée par un terme de pondération, le terme de pondération pouvant être un réel compris entre 0 et 1; 25 ou la première image acquise lors de l'étape b), à laquelle est soustraite une moyenne d'images acquises respectivement antérieurement et postérieurement à l'acquisition de la première image. La composante considérée lors de la sous-étape cii) peut comporter la partie réelle, ou la partie imaginaire, ou le module, ou la phase de chaque image complexe formant la pile d'images. 30 La sous-étape civ) peut comporter : une formation d'une image, dite première image des maximas, dont chaque pixel est associé à une position tridimensionnelle déterminé lors de la sous-étape ciii), et est 3061297 5 affecté de la valeur maximale déterminée, lors de la sous-étape ciii), pour ladite position tridimensionnelle ; une sélection, dans la première image des maximas, de pixels dont la valeur est maximale dans une zone de voisinage définie autour de chaque pixel ; 5 un calcul, pour chaque pixel sélectionné, d'un rapport signal sur bruit en fonction de ladite valeur maximale et de la valeur de pixels de la première image des maximas situés dans une zone de calcul s'étendant autour dudit pixel ; de telle sorte que chaque position tridimensionnelle est sélectionnée en fonction du rapport signal à bruit calculé pour le pixel de la première image des maximas qui lui est associé. L'étape 10 de sélection de pixels est facultative, mais préférable, et le rapport signal sur bruit peut être calculé sur tous les pixels de l'image des maximas. Une position dont le pixel associé, sur la première image des maximas, n'est pas sélectionné, est invalidée. Selon un mode de réalisation, l'étape d) peut comporter une acquisition, par le capteur d'image, d'une deuxième image, dont chaque pixel est associé à une coordonnée radiale dans le plan de 15 détection (P0). Selon ce mode de réalisation, l'étape d) comporte les sous-étapes suivantes : di) obtention d'une deuxième image d'intérêt à partir de la deuxième image acquise et application d'un opérateur de propagation numérique à la deuxième image d'intérêt, selon une pluralité de distances de reconstruction, selon l'axe de propagation, de façon à obtenir une deuxième pile d'images complexes reconstruites, dite deuxième pile 20 d'images, comportant autant d'images complexes reconstruites que de distances de reconstruction, chaque image complexe reconstruite étant représentative d'une onde lumineuse d'exposition à laquelle est exposé le capteur d'image au deuxième instant ; dii) pour au moins une coordonnée radiale définie par la deuxième image d'intérêt, détermination d'une distance de reconstruction maximisant l'évolution d'une 25 composante de chaque image complexe formant la deuxième pile d'images, le long d'un axe parallèle à l'axe de propagation et passant par ladite coordonnée radiale, ladite distance de reconstruction formant une coordonnée transversale associée à ladite coordonnée radiale, la valeur de la composante calculée à ladite distance de reconstruction étant une valeur dite maximale associée à ladite coordonnée radiale, la 30 sous étape dii) étant réalisée pour tout ou partie de coordonnées radiales associées aux pixels de la deuxième image d'intérêt; diii) établissement d'une liste de positions tridimensionnelles, chaque position tridimensionnelle comportant une coordonnée radiale et la coordonnée transversale 3061297 6 associée, déterminée lors de la sous-étape dii), à chaque position tridimensionnelle étant associée la valeur maximale obtenue lors de la sous-étape dii) ; div) sélection de positions tridimensionnelles en fonction de la valeur maximale qui leur est associée. 5 Lors de la sous-étape di), la deuxième image d'intérêt peut être : la deuxième image acquise ; ou la deuxième image acquise, à laquelle est soustraite une image de la chambre fluidique, acquise par le capteur d'image, antérieurement ou postérieurement à l'acquisition de la deuxième image, la soustraction étant pondérée par un terme de 10 pondération ; ou la deuxième image acquise, à laquelle est soustraite une moyenne d'images acquises respectivement antérieurement et postérieurement à l'acquisition de la deuxième image. Lors de la sous-étape dii), la composante peut comporter la partie réelle, ou la partie imaginaire, 15 ou le module, ou la phase de chaque image complexe formant la pile d'images. La sous-étape div) peut comporter: une formation d'une image, dite deuxième image des maximas, dont chaque pixel est associé à une position tridimensionnelle déterminé lors de la sous-étape diii), et est affecté de la valeur maximale déterminée, lors de la sous-étape diii), pour ladite position 20 tridimensionnelle ; une sélection, dans la deuxième image des maximas, de pixels dont la valeur est maximale dans une zone de voisinage définie autour de chaque pixel ; un calcul, pour chaque pixel sélectionné, d'un rapport signal sur bruit en fonction de ladite valeur maximale et de la valeur de pixels de la deuxième image des maximas 25 situés dans une zone de calcul s'étendant autour dudit pixel ; de telle sorte que chaque position tridimensionnelle est sélectionnée en fonction du rapport signal à bruit calculé pour le pixel de la deuxième image des maximas qui lui est associé. L'étape de sélection est facultative, mais préférable, et le rapport signal sur bruit peut être calculé sur tous les pixels de l'image des maximas. Une position dont le pixel associé, sur la deuxième image 30 des maximas, n'est pas sélectionné, est invalidée. Selon un mode de réalisation : 3061297 7 l'étape b) comporte deux illuminations successives de la chambre fluidique par la source de lumière, au premier instant et au deuxième instant, de telle sorte que la première image (I) représente l'onde d'exposition (14) à chacun des instants ; les étapes c) et d) sont confondues en une même étape d'obtention des coordonnées 5 de particules au premier instant et au deuxième instant. Le procédé peut comporter l'une des caractéristiques prises isolément ou selon les combinaisons techniquement réalisables : l'étape e) peut comporter une comparaison des coordonnées des particules dans la chambre fluidique déterminées au premier instant et au deuxième instant, de manière 10 à établir une liste de déplacements potentiels des particules entre lesdits instants. l'étape g) comporte une détermination d'une plage de déplacements à l'aide du modèle de déplacement pris en compte lors de l'étape f), les déplacements potentiels étant validés lorsqu'ils sont compris dans ladite plage de déplacement. l'étape g) comporte une soustraction, à chaque déplacement potentiel, d'un 15 déplacement selon le modèle de déplacement. Selon un mode de réalisation, le fluide comporte des particules, chaque particule présentant et se déplaçant, par rapport au fluide, selon un modèle de déplacement, dit modèle de déplacement particulaire, dépendant de ladite propriété. Selon ce mode de réalisation, le procédé comporte, à partir de déplacements validés lors de l'étape g), une étape i) de prise en 20 compte d'au moins un modèle de déplacement particulaire, de façon à compter les particules en fonction d'une valeur de ladite propriété. Selon une variante, le procédé comporte, à partir de déplacements potentiels déterminés lors de l'étape e), une étape e') de prise en compte d'au moins un modèle de déplacement particulaire, de façon à compter les particules en fonction d'une valeur de ladite propriété. La propriété est une masse ou une charge électrique, ou une 25 aptitude à se déplacer dans le fluide. Selon ce mode de réalisation, le procédé peut comporter : une prise en compte d'un modèle de déplacement particulaire pour une valeur prédéterminée de la propriété ; un calcul d'écarts des déplacements de chaque particule par rapport au modèle de 30 déplacement particulaire ; de telle sorte que la propriété de chaque particule est déterminée en fonction desdits écarts ainsi que de ladite valeur prédéterminée de la propriété. 3061297 8 Le fluide peut s'écouler selon une direction d'écoulement, et le déplacement particulaire peut s'effectuer selon une autre direction non parallèle à ladite direction d'écoulement. Le procédé peut être tel qu'aucune optique de formation d'image n'est disposée entre le capteur d'image et la chambre fluidique. Il peut également être tel que le capteur d'image comporte une 5 optique de formation d'image entre le capteur d'image et la chambre fluidique, l'image formée lors de l'étape b) étant une image défocalisée. Un autre objet de l'invention est un dispositif pour de comptage de particules circulant dans une chambre fluidique, le dispositif comportant : une source de lumière configurée pour illuminer la chambre fluidique ; 10 un capteur d'image s'étendant dans un plan de détection, la chambre fluidique étant interposée entre le capteur d'image et la source de lumière, le capteur d'image étant configuré pour acquérir une pluralité d'images de la chambre fluidique illuminée par la source de lumière, à un instant ou à des instants successifs ; le dispositif comportant un processeur apte à mettre en oeuvre les étapes c) à e) ou c) à 15 h) d'un procédé tel que décrit dans cette demande, à partir d'au moins une image acquise par le capteur d'image. Un autre objet de l'invention est un dispositif pour l'observation de particules circulant dans une chambre fluidique comportant les étapes suivantes : disposition de la chambre fluidique entre une source de lumière et un capteur d'image, 20 le capteur d'image s'étendant selon un plan de détection ; illumination de la chambre fluidique par la source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente se propageant selon un axe de propagation et acquisition, par le capteur d'image, d'une image, représentative d'une onde lumineuse, dite onde d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image, le capteur d'image 25 comportant différents pixels, à chaque pixel étant associé une coordonnée radiale dans le plan de détection ; sélection d'une image, acquise à un instant d'acquisition, et formation d'une image d'intérêt par soustraction, à l'image sélectionnée, d'une image acquise à un instant postérieur et/ou d'une image acquise à un instant antérieur à l'instant d'acquisition, la 30 soustraction pouvant être pondérée par un terme de pondération, par exemple compris entre 0 et 1; 3061297 9 application d'un opérateur de propagation numérique à l'image d'intérêt, selon une pluralité de distances de reconstruction, de façon à obtenir une pile d'images complexes reconstruites, dite pile d'images, comportant autant d'images complexes reconstruites que de distances de reconstruction, chaque image complexe reconstruite étant 5 représentative d'une onde lumineuse d'exposition à laquelle est exposé le capteur d'image; pour au moins une coordonnée radiale définie par l'image d'intérêt, détermination d'une distance de reconstruction maximisant l'évolution d'une composante de chaque image complexe formant la pile d'images, le long d'un axe parallèle à l'axe de 10 propagation et passant par ladite coordonnée radiale, la composante comportant la partie réelle de chaque image complexe, ou son opposé, ladite distance de reconstruction déterminée formant une coordonnée transversale associée à ladite coordonnée radiale, la valeur de la composante calculée à ladite distance de reconstruction étant une valeur dite maximale associée à ladite coordonnée radiale, 15 cette étape étant réalisée pour tout ou partie de coordonnées radiales associées aux pixels de l'image d'intérêt; établissement d'une liste de positions tridimensionnelles, chaque position tridimensionnelle comportant une coordonnée radiale et la coordonnée transversale associée, déterminée lors de l'étape précédente, à chaque position tridimensionnelle 20 étant associée la valeur maximale obtenue lors de l'étape précédente ; sélection de positions tridimensionnelles en fonction de la valeur maximale qui leur est associée. La sélection de positions tridimensionnelles peut être réalisée en formant une image des maximas et en déterminant un rapport signal sur bruit à chaque pixel de l'image des maximas, 25 comme précédemment décrit. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. FIGURES 30 La figure 1A représente un exemple de dispositif permettant la mise en oeuvre de l'invention. La figure 1B est un détail de la figure 1A. 3061297 10 La figure 2A illustre une succession d'étapes permettant une mise en oeuvre d'un premier mode de réalisation du procédé. Les figures 2B, 2C et 2D montrent des profils d'une partie d'une image acquise s'étendant autour d'un hologramme correspondant à une particule, à trois instants successifs. La figure 2E montre un profil correspondant à une composante fixe, obtenus en 5 combinant les profils des figures 2B à 2D. La figure 2F montre un profil correspondant à une composante mobile, ce profil étant obtenu par une soustraction de la composante fixe, représentée sur la figure 2D, au profil de la figure 2C. La figure 2G représente un profil modélisant l'évolution du module d'une image complexe reconstruite à partir d'une image correspondant au profil représenté sur la figure 2F. La figure 2H représente un profil modélisant 10 l'évolution de l'opposé de la partie réelle d'une image complexe reconstruite à partir d'une image correspondant au profil représenté sur la figure 2F. La figure 3A montre une chambre fluidique mise en oeuvre au cours d'un premier essai expérimental. La figure 3B est un tracé de résultats obtenus au cours du premier essai expérimental. La figure 3C montre l'impact d'une valeur d'un seuil sur les performances du 15 comptage. La figure 4A illustre une succession d'étapes permettant une mise en oeuvre d'un deuxième mode de réalisation du procédé. La figure 4B montre des résultats obtenus d'un deuxième essai expérimental. La figure 5 montre des résultats obtenus d'un troisième essai expérimental, mettant en oeuvre 20 une variante de l'invention. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS La figure 1A représente un exemple de dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant vers un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde 25 lumineuse est émise selon une bande spectrale 4X. L'échantillon 10 est un échantillon comportant des particules 10a que l'on souhaite dénombrer, les particules étant disposées dans un milieu fluidique porteur transparent ou translucide 10b. Les particules sont des éléments de petite taille, et sont inscrites dans un diamètre compris entre 0.1 um et 100 um; ou entre 1 um et 100 um. Les particules sont solides ou liquides. Il peut s'agir 30 de poussières, ou de cellules ou de microorganismes ou des microbilles, usuellement mises en oeuvre dans des applications biologiques, ou encore des microalgues. Il peut également s'agir de gouttelettes insolubles dans le fluide 10b, par exemple des gouttelettes d'huile dispersées dans une phase aqueuse. Le milieu porteur 10b est un fluide, par exemple de l'air ou un liquide, 3061297 11 par exemple de l'eau ou un liquide biologique. L'échantillon peut être par exemple un aérosol, comportant des particules en suspension dans un gaz, ce dernier pouvant notamment être de l'air. L'échantillon 10 est contenu dans une chambre fluidique 15. L'épaisseur e de l'échantillon 10, 5 selon l'axe de propagation varie typiquement entre 10 um et 2 cm ou 3 cm, et est de préférence comprise entre 20 um et 1 cm. L'échantillon s'étend selon un plan, dit plan de l'échantillon, de préférence perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La chambre fluidique 15 est maintenue sur un support 10s face au capteur d'image 20. Les particules 10a sont mobiles dans la chambre fluidique 15, en étant portées par le fluide 10b, 10 ce dernier étant mobile dans la chambre fluidique 15. Dans cet exemple, le fluide s'écoule, dans la chambre fluidique 15, selon un axe d'écoulement longitudinal X. Les particules 10a sont alors entraînées par le mouvement fluidique du milieu 10b, ce dernier agissant en tant que milieu porteur, et formant un courant fluidique à l'intérieur de la chambre fluidique 15. Le déplacement du milieu est modélisable. Les particules 10a peuvent également être mobiles par rapport au 15 milieu 10b, le mouvement des particules par rapport au fluide qui les porte étant désigné par le terme mouvement particulaire. Ainsi, le déplacement des particules 10a dans la chambre fluidique 15 n'est pas aléatoire et obéit à un modèle de déplacement prédéterminé, combinant le mouvement fluidique du milieu 10b et, éventuellement, le mouvement particulaire des particules par rapport au fluide. 20 La distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. Dans l'exemple représenté, la source de lumière 11 est une 25 diode laser. Selon une variante, la source de lumière 11 est une source de lumière blanche ou une diode électroluminescente. Dans ce cas, un filtre spatial est avantageusement disposé entre la source de lumière et l'échantillon, de façon à ce que la source de lumière apparaisse comme ponctuelle. Le filtre spatial peut être un sténopé ou une fibre optique. Un filtre en longueur d'onde est également préférentiellement placé entre la source de lumière et l'échantillon, pour 30 ajuster la bande spectrale d'émission 4X de l'onde lumineuse incidente 12. De préférence, la bande spectrale d'émission 4X de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 3061297 12 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale. La chambre fluidique 15 est disposée entre la source de lumière 11 et le capteur d'image 20 précédemment évoqué. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement 5 parallèlement au plan selon lequel s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 200 ou 100 étant admise. Le capteur d'image 20 est apte à former une image / selon un plan de détection /30. Comme représenté sur la figure 1B, le capteur d'image comporte une matrice de pixels, à chaque pixel étant associée des coordonnées 10 (x,y), dites coordonnées radiales, dans le plan de détection /30. Le capteur d'image peut notamment être un capteur de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection P0 s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. La distance entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 20 est comprise entre une distance minimale dmin et une distance maximale dmax. L'épaisseur e de la chambre 15 fluidique correspond à la différence entre dmax et dmin. dmm peut être comprise entre 50 um et 2 cm, de préférence comprise entre 100 um et 2 mm. L'épaisseur de la chambre fluidique est généralement comprise entre 100 um et 5 cm. On remarque l'absence de système optique de formation d'image, en particulier d'optique de grossissement entre le capteur d'image 20 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence 20 éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 20, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image. Le capteur d'image 20 est ainsi placé selon une configuration dite d'imagerie sans lentille. Une telle configuration permet d'obtenir un champ d'observation élevé. D'autres configurations sont néanmoins envisageables, en particulier une configuration selon laquelle 25 une optique de focalisation est interposée entre le capteur d'image 20 et la chambre fluidique 15. Dans une telle configuration, le capteur d'image acquiert une image défocalisée de l'échantillon 10. Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les particules présentes dans la chambre fludique 15 peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de 30 détection P0, des interférences avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12 transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 3061297 13 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, dite onde lumineuse d'exposition, transmise par l'échantillon 10 et à laquelle est exposé le capteur d'image 20, peut comprendre : une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par chaque particule de l'échantillon ; 5 une composante 12 résultant de l'absorption de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon. Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection. Aussi, l'image I acquise par le capteur d'image 20 comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction), chaque figure d'interférence étant générée par une particule 10a de l'échantillon 10. 10 Un processeur 30, par exemple un microprocesseur, est configuré pour traiter chaque image / acquise par le capteur d'image 20. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 32 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 34 permettant l'affichage d'images acquises par le 15 capteur d'image 20 ou calculées par le processeur 30. La chambre fluidique 15 est fixe par rapport au capteur d'image 20. Ainsi, le milieu fluidique 10b et les particules 10a circulant dans la chambre fluidique sont en mouvement par rapport au capteur d'image 20. Comme indiqué en relation avec l'art antérieur, on peut appliquer, à chaque image acquise par 20 le capteur d'image, un opérateur de propagation h, de façon à calculer une grandeur complexe représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14. Il est alors possible de calculer une expression complexe A de l'onde lumineuse 14 en tout point de coordonnées (x,y,z) de l'espace, et en particulier selon une surface de reconstruction s'étendant face au capteur d'image 20. La surface de reconstruction est usuellement un plan /3,, dit plan de reconstruction, 25 s'étendant parallèlement au capteur d'image 20, à une coordonnée z du plan de détection /30. Le plan de reconstruction /3, est alors parallèle au plan de détection /30. On obtient alors une image, dite image complexe Az, représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14 dans le plan de reconstruction P. L'image complexe A, est obtenue par une convolution de l'image I acquise par le capteur d'image 20 par l'opérateur de propagation h, selon l'expression : A, = I * h. 30 L'opérateur de propagation h décrit la propagation de la lumière entre le plan de détection P0 et le plan de reconstruction P. Dans cet exemple, le plan de détection P0 a pour équation z = 0. 3061297 14 L'opérateur de propagation est par exemple un opérateur dit de Fresnel, défini selon irr 2 2 l'expression suivante : hz (x, y) = -erz`x +31 ( 1) Une particularité de l'invention est que les particules 10a se déplacent, en étant entraînées par le fluide 10b. Le fluide se déplace entre une entrée et une sortie de la chambre fluidique 15, 5 selon un axe d'écoulement X. Afin de procéder à leur comptage, il est nécessaire d'obtenir des positions tridimensionnelles des particules à un premier instant t1 et à un deuxième instant t2, postérieur au premier instant, le décalage temporel At = t2 - t1 entre les deux instants dépendant d'une vitesse maximale Vmax du fluide dans la chambre fluidique 15 ainsi que de la dimension de la partie de la chambre fluidique vue par le capteur. Si L désigne une dimension 10 de la chambre fluidique 15, vue par le capteur d'image 20, selon l'axe de propagation X du fluide, il est préférable que : At O. Cela prend en compte le fait que les positions tridimensionnelles de l'image acquise 15 sont susceptibles de correspondre à des positions de particules au premier instant ou au deuxième instant. [tape 410: prise en compte d'un modèle de déplacement, de façon analogue à l'étape 210. [tape 420 : validation de déplacements, sur la base d'un modèle de déplacement, comme décrit en lien avec l'étape 220. Sur la figure 4B, on a représenté un modèle de déplacement (courbe 20 M3). [tape 430 : définition des positions et/ou du nombre particules correspondant à des déplacements validés lors de l'étape 420. Selon ce deuxième mode de réalisation, le procédé peut comporter une étape 450 d'ajustement du seuil de rapport signal sur bruit utilisé, de façon similaire à l'étape 250 précédemment 25 décrite. Un avantage de ce mode de réalisation est d'éviter le recours des capteurs d'images ayant une fréquence d'acquisition trop élevée. Par exemple, lorsque l'intervalle temporel entre le premier instant et le deuxième instant est de 5 ms, le premier mode de réalisation, basé sur une acquisition de deux images successives, imposerait une cadence d'acquisition de 200 images par 30 secondes, ce qui n'est pas à la portée de capteurs d'images usuels. Ce mode de réalisation est donc adapté à des particules présentant des vitesses élevées. 3061297 27 Ce mode de réalisation a fait l'objet d'un deuxième essai expérimental, les particules étant des billes de polystyrène de diamètre 2 um se déplaçant dans l'air. La figure 4B représente les déplacements ainsi qu'une bordure modélisée. Une limitation de ce mode de réalisation est qu'il ne prend en compte que les particules 5 présentes dans le champ d'observation du capteur d'image aux deux instants considérés. Les inventeurs ont estimé qu'en appliquant un facteur de pondération à chaque déplacement détecté, le nombre de particules compté est plus fiable. Le facteur de pondération pour chaque déplacement Ak, est déterminé selon une approche probabiliste. La probabilité de détection pk (LX-I AX kl)X (LY-13^Ykl) de coordonnées AXk, AYk est telle que : pk = LxxLy , ou LX et LY désignent les 10 dimensions du champ observé par le détecteur 20 dans la chambre fluidique 15, respectivement selon l'axe X et l'axe Y. Si K désigne le nombre de déplacements Ak validés, chaque déplacement ayant pour coordonnées AXk et AYk, le nombre de particules dans la chambre fluidique peut être estimé par : N = Yk=K vk=K LXXLY Z,k=1 Pk(LX-IAXkl)X lAYkl) 15 Cela ne reste valable que si IAXk I REVENDICATIONS1. Procédé de dénombrement de particules (10a) en mouvement dans un fluide (10b), circulant dans une chambre fluidique (15), le procédé comportant les étapes suivantes : a) disposition de la chambre fluidique (15) entre une source de lumière (11) et un capteur d'image (20), le capteur d'image s'étendant selon un plan de détection (P0); b) illumination de la chambre fluidique par la source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant selon un axe de propagation (Z), et acquisition, par le capteur d'image (20), d'une première image (1, 1 (t1)), représentative d'une onde d'exposition (14) à laquelle est exposé le capteur d'image (20), le capteur d'image comportant différents pixels, à chaque pixel étant associé une coordonnée radiale (x, y) dans le plan de détection (P0); c) à partir de la première image acquise, obtention de coordonnées tridimensionnelles ((x, y, z)(t1)) de particules, dans la chambre fluidique, à un premier instant (t1), d) obtention de coordonnées tridimensionnelles ((x, y, z)(t2)) de particules dans la chambre fluidique à un deuxième instant (t2), postérieur au premier instant ; e) à partir des coordonnées des particules obtenues au premier instant et au deuxième instant, détermination de déplacements potentiels (4) des particules entre lesdits instants; f) prise en compte d'un modèle de déplacement (mod) du fluide dans la chambre fluidique; g) à partir du modèle de déplacement du fluide considéré lors de l'étape f), validation de déplacements parmi les déplacements (A) potentiels calculés lors de l'étape e) ; h) à partir des déplacements validés (4v) lors de l'étape g), détermination d'un nombre (N) de particules et/ou des coordonnées des particules au premier instant et/ou au deuxième instant. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape c) comporte : l'obtention d'une première image d'intérêt (1'(t1)) à partir de la première image acquise (1, 1 (t1)) lors de l'étape b), et l'application d'un opérateur de propagation numérique (h) à la première image d'intérêt, selon au moins une distance de reconstruction (zj), le long de l'axe de propagation, de façon à obtenir au moins une image complexe reconstruite (Azj); 3061297 32 à partir de chaque image complexe reconstruite (Azj), l'obtention de coordonnées radiales (x, y) de particules dans la chambre fluidique au premier instant. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 dans lequel l'étape c) comporte les sous-étapes suivantes: 5 ci) obtention d'une première image d'intérêt (/(t1)) à partir de la première image acquise (1 , 1 (ti)) lors de l'étape b), et application d'un opérateur de propagation numérique (h) à la première image d'intérêt selon une pluralité de distances de reconstruction (zj), le long de l'axe de propagation (Z), de façon à obtenir une première pile d'images complexes reconstruites, dite première pile d'images, comportant autant d'images 10 complexes reconstruites (Azj) que de distances de reconstruction, chaque image complexe reconstruite (Azj) étant représentative d'une onde lumineuse d'exposition (14) à laquelle est exposé le capteur d'image (20) ; cii) pour au moins une coordonnée radiale (x, y) définie par la première image d'intérêt, détermination d'une distance de reconstruction (zzy) maximisant l'évolution d'une 15 composante (comp (11,1(x, y)) , -Re (A, j(x, y)) de chaque image complexe (Azj) formant la première pile d'images, le long d'un axe parallèle à l'axe de propagation et passant par ladite coordonnée radiale, ladite distance de reconstruction ainsi déterminée (zzy) formant une coordonnée transversale associée à ladite coordonnée radiale, la valeur de la composante calculée à ladite distance de reconstruction étant 20 une valeur dite maximale Ainax(x, y) associée à ladite coordonnée radiale (x, y), la sous-étape cii) étant réalisée pour tout ou partie de coordonnées radiales associées aux pixels de la première image d'intérêt ; ciii) établissement d'une liste de positions tridimensionnelles, chaque position tridimensionnelle comportant une coordonnée radiale (x, y) ainsi que la coordonnée 25 transversale (zzy) associée, déterminée lors de la sous-étape cii), à chaque position tridimensionnelle étant associée la valeur maximale (Amax(x, y)) obtenue lors de la sous-étape cii) ; civ) sélection de positions tridimensionnelles (x, y, z zy) en fonction de la valeur maximale (Ainc,(X, y)) qui leur est associée. 30 4. Procédé selon la revendication 2 ou la revendication 3, dans lequel la première image d'intérêt (1'(t1)) est : - la première image ( /(t1)) acquise lors de l'étape b) ; 3061297 33 ou la première image ( /(t1)) acquise lors de l'étape b), à laquelle est soustraite une image de la chambre fluidique, acquise par le capteur d'image, antérieurement ou postérieurement à l'acquisition de la première image, la soustraction étant pondérée par un terme de pondération ; 5 ou la première image acquise ( /(t1)) lors de l'étape b), à laquelle est soustraite une moyenne d'images acquises respectivement antérieurement et postérieurement à l'acquisition de la première image. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, dans lequel lors de la sous-étape cii), la composante (comp (11 (x, y)) considérée comporte la partie réelle, ou la partie 10 imaginaire, ou le module, ou la phase de chaque image complexe (Azj) formant la pile d'images. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel la sous-étape civ) comporte: une formation d'une image (Amax), dite première image des maximas, dont chaque pixel est associé à une position tridimensionnelle (x, y, zzy) déterminé lors de la sous- 15 étape ciii), et est affecté de la valeur maximale (Amax(x, y)) déterminée, lors de la sous- étape ciii), pour ladite position tridimensionnelle ; une sélection, dans la première image des maximas, de pixels (xinax, yinax)dont la valeur (Amax(x, y)) est maximale dans une zone de voisinage définie autour de chaque pixel ; 20 un calcul, pour chaque pixel sélectionné, d'un rapport signal sur bruit (SN R(xn,ax, v )1 en fonction de ladite valeur maximale (Amax(x, y)) et de la valeur de pixels de la première image des maximas (Ainax) situés dans une zone de calcul s'étendant autour dudit pixel ; de telle sorte que chaque position tridimensionnelle est sélectionnée en fonction du rapport 25 signal à bruit calculé pour le pixel de la première image des maximas qui lui est associé. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape d) comporte une acquisition, par le capteur d'image (20), d'une deuxième image ( /(t2)), dont chaque pixel est associé à une coordonnée radiale (x, y) dans le plan de détection (P0). 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel l'étape d) comporte les sous-étapes suivantes : 30 di) obtention d'une deuxième image d'intérêt (4(t2)) à partir de la deuxième image acquise ( /(t2)) et application d'un opérateur de propagation numérique (h) à la 3061297 34 deuxième image d'intérêt, selon une pluralité de distances de reconstruction, le long de l'axe de propagation (Z), de façon à obtenir une deuxième pile d'images complexes reconstruites (Azj), dite deuxième pile d'images, comportant autant d'images complexes reconstruites que de distances de reconstruction (zj), chaque image 5 complexe reconstruite étant représentative d'une onde lumineuse d'exposition (14) à laquelle est exposé le capteur d'image (20) au deuxième instant ; dii) pour au moins une coordonnée radiale (x, y) définie la deuxième image d'intérêt, détermination d'une distance de reconstruction (zxy) maximisant l'évolution d'une composante de chaque image complexe formant la deuxième pile d'images, le long d'un 10 axe parallèle à l'axe de propagation et passant par ladite coordonnée radiale, ladite distance de reconstruction formant une coordonnée transversale associée à ladite coordonnée radiale, la valeur de la composante calculée à ladite distance de reconstruction étant une valeur dite maximale associée à ladite coordonnée radiale, la sous étape dii) étant réalisée pour tout ou partie de coordonnées radiales associées aux 15 pixels de la deuxième image d'intérêt ; diii) établissement d'une liste de positions tridimensionnelles, chaque position tridimensionnelle comportant une coordonnée radiale (x, y) ainsi que la coordonnée transversale associée, déterminée lors de la sous-étape dii), à chaque position tridimensionnelle étant associée la valeur maximale obtenue lors de la sous-étape dii) ; 20 div) sélection de positions tridimensionnelles en fonction de la valeur maximale qui leur est associée. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel lors de la sous-étape étape di) la deuxième image d'intérêt (/,(t2)) est : la deuxième image acquise ( /(t2)) ; 25 ou la deuxième image acquise ( /(t2)), à laquelle est soustraite une image de la chambre fluidique, acquise par le capteur d'image, antérieurement ou postérieurement à l'acquisition de la deuxième image, la soustraction étant pondérée par un terme de pondération, pouvant être compris entre 0 et 1; ou la deuxième image acquise ( /(t2)), à laquelle est soustraite une moyenne d'images 30 acquises respectivement antérieurement et postérieurement à l'acquisition de la deuxième image. 3061297 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, dans lequel lors de la sous-étape dii), la composante comporte la partie réelle, ou la partie imaginaire, ou le module, ou la phase de chaque image complexe formant la pile d'images. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel la sous-étape div) 5 comporte: une formation d'une image (Am'), dite deuxième image des maximas, dont chaque pixel est associé à une position tridimensionnelle (x, y, zzy) déterminé lors de la sous-étape diii), et est affecté de la valeur maximale (Amax(x, y)) déterminée, lors de la sous-étape diii), pour ladite position tridimensionnelle ; 10 une sélection, dans la deuxième image des maximas, de pixels (xm 1 dont la ax, Jv max, valeur (Amax(x, y)) est maximale dans une zone de voisinage définie autour de chaque pixel ; un calcul, pour chaque pixel sélectionné, d'un rapport signal sur bruit (SNR(xmax, yinax)) en fonction de ladite valeur maximale (Amax(x, y)) et de la valeur 15 de pixels de la deuxième image des maximas (Amax) situés dans une zone de calcul s'étendant autour dudit pixel ; de telle sorte que chaque position tridimensionnelle est sélectionnée en fonction du rapport signal à bruit calculé pour le pixel de la deuxième image des maximas qui lui est associé. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel : 20 l'étape b) comporte deux illuminations successives de la chambre fluidique par la source de lumière, au premier instant et au deuxième instant, de telle sorte que la première image (/) représente l'onde d'exposition (14) à chacun des instants ; les étapes c) et d) sont confondues en une même étape d'obtention des coordonnées de particules au premier instant et au deuxième instant. 25 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape e) comporte une comparaison des coordonnées des particules dans la chambre fluidique déterminées au premier instant et au deuxième instant, de manière à établir une liste de déplacements potentiels (4) des particules entre lesdits instants. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape g) 30 comporte une détermination d'une plage de déplacements à l'aide du modèle de déplacement pris en compte lors de l'étape f), les déplacements potentiels étant validés lorsqu'ils sont compris dans ladite plage de déplacement. 3061297 36 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape g) comporte une soustraction, à chaque déplacement potentiel, d'un déplacement selon le modèle de déplacement (mod). 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : 5 le fluide comporte des particules, chaque particule présentant une propriété et se déplaçant, par rapport au fluide, selon un modèle de déplacement, dit modèle de déplacement particulaire ; le modèle de déplacement particulaire dépend de ladite propriété des particules ; le procédé comportant, à partir de déplacements validés lors de l'étape g), une étape i) de prise 10 en compte d'au moins un modèle de déplacement particulaire, de façon à compter les particules en fonction d'une valeur de ladite propriété. 17. Procédé selon la revendication 15, dans lequel la propriété est une masse ou une charge électrique, ou une aptitude à se déplacer dans le fluide. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17, comportant : 15 une prise en compte d'un modèle de déplacement particulaire pour une valeur prédéterminée de la propriété ; un calcul d'écarts des déplacements de chaque particule par rapport audit modèle de déplacement particulaire ; de telle sorte que la propriété de chaque particule est déterminée en fonction desdits écarts 20 ainsi que de ladite valeur prédéterminée de la propriété. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, dans lequel le fluide s'écoule selon une direction d'écoulement, et dans lequel le déplacement particulaire s'effectue selon une autre direction non parallèle à ladite direction d'écoulement. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel aucune 25 optique de formation d'image n'est disposée entre le capteur d'image et la chambre fluidique. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans lequel le capteur d'image comporte une optique de formation d'image entre le capteur d'image et la chambre fluidique, l'image formée lors de l'étape b) étant une image défocalisée. 22. Dispositif pour le comptage de particules circulant dans une chambre fluidique, le dispositif 30 comportant : une source de lumière (11) configurée pour illuminer la chambre fluidique (15) ; 3061297 37 un capteur d'image (20) s'étendant dans un plan de détection (P0), la chambre fluidique étant interposée entre le capteur d'image et la source de lumière, le capteur d'image étant configuré pour acquérir au moins une image de la chambre fluidique illuminée par la source de lumière ; 5 le dispositif comportant un processeur (30) apte à mettre en oeuvre les étapes c) à h) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 à partir d'au moins une image acquise par le capteur d'image.