Brevet FR3060018A1 — publié le 20180615

La présente invention concerne un procédé servant à améliorer les conditions de culture de cultures de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou d'équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions, dans lequel tout d'abord une culture de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou d'équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions est préparée avec 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares et un diamètre de 100 à 6 000 pm puis celles-ci sont cultivées dans un milieu de culture contenant au moins un neurotransmetteur et/ou au moins 11 ng/ml de facteur de croissance. La culture de ces cellules et modèles dans un milieu de culture contenant au moins un neurotransmetteur et/ou au moins 11 ng/ml de facteur de croissance entraîne une augmentation des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares comparé à la culture sans addition de neurotransmetteur(s) et/ou d'au moins 11 ng/ml de facteur(s) de croissance. Cela permet d'éviter une perte de fonction des cellules cultivées, qui se produit si ces marqueurs sont absents ou ne sont que faiblement exprimés. En outre, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un neurotransmetteur et/ou d'au moins un facteur de croissance pour améliorer les conditions de culture de cultures de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou d'équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions. L'addition de ces composés permet d'obtenir une augmentation des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares et cela permet ainsi d'éviter une perte de fonction des cellules cultivées. Le lavage, le nettoyage et le soin de son propre corps constitue un besoin primaire de l'être humain et l'industrie moderne tente en permanence de satisfaire ces besoins de l'être humain de diverses manières. L'élimination continue, ou au moins la réduction, des odeurs corporelles et de la transpiration axillaire est particulièrement importante pour l'hygiène quotidienne. Chez l'être humain, la transpiration axillaire et les odeurs corporelles proviennent de la sécrétion des glandes sudoripares eccrines et apocrines au niveau des aisselles. Tandis que les glandes eccrines servent à la thermorégulation du 3060018 2 corps et sont responsables de la production de la transpiration axillaire, les glandes apocrines génèrent une sécrétion visqueuse en réaction au stress, d'où proviennent des odeurs corporelles désagréables après décomposition bactérienne. 5 Les premiers travaux de recherche sur les glandes sudoripares eccrines et apocrines natives ont été réalisés dès le début du 20ème siècle pour classer ces phanères appartenant au groupe des glandes exocrines. Selon ces travaux, les glandes sudoripares peuvent être réparties en glandes sudoripares 10 apocrines et eccrines, et une forme hybride de glandes sudoripares apocrines et eccrines (également connue sous le nom de glande sudoripare apocrine). Les formes mentionnées ci-dessus peuvent être différenciées à l'aide d'éléments morphologiques et caractéristiques. 15 La glande sudoripare eccrine, en particulier la glande sudoripare eccrine humaine, fait partie des glandes tubulaires sinueuses non ramifiées et peut être divisée en extrémité sécrétoire (également désignée par canal spiralé), canal excréteur dermique (également désigné par conduit) ainsi que canal excréteur épidermique (également désigné par acrosyringium). Les cellules présente 20 dans ces parties de glande ont différentes tâches et fonctions, par exemple, la sécrétion dans le canal spiralé, la réabsorption d'ions dans le conduit, ainsi que la distribution de la sécrétion, en particulier de la transpiration, sur la peau environnante par I'acrosyringium. Les glandes sudoripares eccrines sont principalement stimulées par l'acétylcholine (ACh), mais une stimulation 25 purinergique (par exemple, par l'ATP / UTP) et a(3-adrénergique (par exemple par la noradrénaline) est également possible. En vue d'éviter la transpiration axillaire et/ou les odeurs corporelles, il est donc souhaitable de réduire et/ou d'éviter la sécrétion des glandes sudoripares 30 eccrines et/ou apocrines. Ceci peut par exemple être réalisé en bouchant les canaux excréteurs des glandes sudoripares eccrines par desdits bouchons. À cette fin, des sels d'aluminium et/ou d'aluminium-zirconium antisudoraux sont 3060018 3 utilisés dans l'état de la technique, lesquels sont toutefois vus d'un oeil critique par le consommateur. En outre, l'état de la technique utilise des agents antibactériens qui empêchent la dégradation bactérienne de la transpiration. Toutefois, ces agents peuvent altérer négativement la microflore naturelle de la 5 peau sous l'aisselle. Il est donc souhaitable de proposer des agents cosmétiques qui sont en mesure d'empêcher la transpiration axillaire et/ou les odeurs corporelles de manière fiable et qui sont exempts de sels d'aluminium et/ou de sels d'aluminium-zirconium, ainsi que de composés à effet antibactérien. Une solution pour fournir ces agents consiste à utiliser des 10 substances qui inhibent efficacement la stimulation et/ou les processus biologiques des glandes sudoripares et réduisent ou empêchent ainsi la sécrétion de transpiration. Pour identifier ces substances, des tests in vivo peuvent être réalisés avec des participants aux essais. Cependant, ces tests sont coûteux et ne permettent pas des procédures de sélection avec des 15 cadences élevées. En outre, des tests in vitro peuvent être effectués en utilisant des cultures de cellules et/ou des modèles cellulaires de glandes sudoripares sur lesquels l'influence des substances à tester sur la stimulation des glandes sudoripares peut être examinée. 20 Pour que les résultats des tests obtenus in vitro soient bien transférables à la situation in vivo, les cellules ou modèles cellulaires de glandes sudoripares utilisés doivent reproduire la situation in vivo aussi fidèlement que possible. Pour cela, il est souhaitable qu'une quantité aussi élevée que possible de protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares soit exprimée dans 25 les cultures de cellules et/ou modèles cellulaires de glandes sudoripares. Or, les conditions connues à ce jour dans l'état de la technique pour la culture de cellules de glandes sudoripares et leurs modèles cellulaires résultent en une expression faible des protéines marqueurs susmentionnées. Il existe donc un besoin de procédés d'optimisation des conditions de culture de 30 cellules et/ou de modèles cellulaires de cellules de glandes sudoripares pour augmenter l'expression des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares. 3060018 4 La présente invention avait donc pour objectif de fournir un procédé d'optimisation des conditions de culture de cellules et/ou de modèles cellulaires de cellules de glandes sudoripares. 5 L'on a découvert avec surprise que l'ajout d'au moins un neurotransmetteur et/ou d'au moins 11 ng/ml de facteur de croissance au milieu de culture pendant la culture des cellules de culture et/ou des modèles cellulaires de cellules de glandes sudoripares entraîne une augmentation de l'expression des 10 protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares. Ainsi, une perte de fonction de ces protéines marqueurs peut être évitée dans la culture et la reproduction de la situation in vivo peut être améliorée. Un premier objet de la présente invention est donc un procédé servant à 15 améliorer les conditions de culture de cultures de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou d'équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions, comprenant les étapes de procédé suivantes : a) préparer au moins une culture de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou au moins un équivalent de glandes sudoripares en trois 20 dimensions, avec 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares et un diamètre de 100 à 6 000 pm, b) cultiver l'au moins une culture cellulaire de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou l'au moins un équivalent de glandes sudoripares en trois dimensions préparés à l'étape a) dans un milieu de culture, contenant 25 b1) au moins un neurotransmetteur et/ou b2) 11 ng/ml à 100 ng/ml d'au moins un facteur de croissance. L'addition d'au moins un neurotransmetteur et/ou de 11 à 100 ng/ml d'au moins un facteur de croissance pendant la culture des cellules de glandes sudoripares 30 et/ou des équivalents de glandes sudoripares entraîne une augmentation de l'expression des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares, telles que l'Aquaporin-5. L'Aquaporine 5 (AQP5) est une protéine de canal 3060018 5 hydrique, qui joue un rôle dans la formation de la transpiration. L'augmentation de l'expression de ces protéines permet d'éviter une perte de fonction dans les cultures cellulaires ce qui permet de mieux reproduire la situation in vivo. Ainsi, les résultats obtenus avec ces cultures peuvent être mieux transposés à la 5 situation in vivo à l'égard de l'efficacité des composés antisudoraux. Par le terme « Amélioration des conditions de culture », l'on entend selon l'invention l'augmentation de l'expression des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares, comme par exemple l'Aquaporine 5, par l'utilisation de 10 neurotransmetteurs et/ou de 11 à 100 ng/ml d'au moins un facteur de croissance. À cet effet, l'on préfère des cultures qui ont été traitées avec les composés susmentionnés pendant la mise en culture, aux cultures qui ont été cultivées sans addition de ces composés. 15 En outre, par équivalent de glandes sudoripares en trois dimensions, l'on entend un modèle cellulaire de cellules de glandes sudoripares présentant un volume dans les trois directions spatiales et dans lequel les cellules présentent une fonction analogue, en particulier une fonction identique, aux cellules d'une glande sudoripare native. 20 De plus, par milieu de culture, également désigné par milieu nutritif, l'on entend un milieu de préférence liquide servant à la culture des cellules de glandes sudoripares primaires et/ou des équivalents des glandes sudoripares en trois dimensions. 25 Par neurotransmetteur, l'on entend selon l'invention un composé qui est en mesure de stimuler ou d'inhiber un neurorécepteur (également désigné par protéine réceptrice de membrane). Du fait de la structure et la répartition de charge des neurotransmetteurs, une liaison spécifique est établie avec les 30 protéines de membrane correspondantes. La liaison du neurotransmetteur déclenche une transformation de la protéine réceptrice. Cette transformation entraîne soit directement (désignée également par ionotrope) soit indirectement 3060018 6 (également désignée par métabotrope) l'ouverture de certains canaux ioniques de la cellule dans cette région. L'intensité des courants ioniques dépend ici du nombre de neurotransmetteurs liés. En général, la liaison des neurotransmetteurs aux molécules réceptrices de la membrane est réversible, 5 de sorte que seule une ouverture temporaire des canaux ioniques a lieu. Enfin, par facteurs de croissance l'on entend selon l'invention des protéines servant à la transmission des signaux entre les cellules. La transmission des signaux est réalisée par la liaison du facteur de croissance à un récepteur 10 spécifique sur la surface de la membrane cellulaire. Les facteurs de croissance peuvent soit être libérés par la cellule dans l'environnement soit être membranaires. Lors de la liaison du facteur de croissance au récepteur correspondant, la conformation de ce récepteur est modifiée. Cette modification de la conformation déclenche des signaux à l'intérieur de la cellule lesquels 15 entraînent par exemple l'activation ou la désactivation de gènes par d'autres transferts de signaux. À l'étape de procédé a) du procédé selon l'invention, une culture de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou un équivalent de glande sudoripare en trois 20 dimensions sont préparés. Cet équivalent de glande sudoripare en trois dimensions présente un certain nombre de cellules et un certain diamètre. À cet égard, il est avantageux selon l'invention que la culture des cellules de glandes sudoripares primaires corresponde à des cultures bien précises. Des 25 modes de réalisation préférés de la présente invention sont donc caractérisés en ce que l'au moins une culture de cellules de glandes sudoripares primaires préparée à l'étape de procédé a) correspond à une culture monocouche de ces cellules de glandes sudoripares. L'utilisation de ces cultures monocouches entraîne, lorsqu'on y ajoute des neurotransmetteurs et/ou 11-100 ng/ml de 30 facteurs de croissance, une expression particulièrement élevée des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares. 3060018 7 Afin de garantir une bonne comparaison avec la situation in vivo, l'on utilise de préférence des cultures monocouches à l'étape de procédé a), lesquelles ont été réalisées à partir de glandes sudoripares humaines eccrines et/ou apocrines. Il est donc avantageux selon l'invention que l'au moins une culture 5 de cellules de glandes sudoripares primaires préparée à l'étape de procédé a) corresponde à une culture monocouche eccrine et/ou apocrine humaine primaire de ces cellules de glandes sudoripares. Ces cultures peuvent être obtenues, par exemple en isolant des glandes sudoripares eccrines et/ou apocrines natives issues de biopsies de peau humaine à l'aide de la digestion 10 enzymatique et en fabriquant une préparation cellulaire à partir de ces glandes sudoripares isolées. Cette préparation cellulaire est ensuite utilisée pour réaliser les cultures monocouches utilisées à l'étape de procédé a). À l'étape de procédé a) du procédé selon l'invention, l'on peut également 15 prévoir la préparation d'au moins un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions à la place ou en plus de la culture de cellules de glandes sudoripares primaires. Ces équivalents de glandes sudoripares présentent un diamètre allant de 100 à 6 000 pm. Toutefois, il s'est avéré avantageux dans le cadre de la présentation invention que les équivalents de glandes sudoripares 20 en trois dimensions préparés présentent un diamètre plus faible. L'on préfère donc selon l'invention que l'au moins un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions préparé à l'étape a) présente un diamètre de 100 à 4 000 pm, de préférence de 100 à 2 000 pm, en particulier de 200 à 1 500 pm. Le diamètre des équivalents de glandes sudoripares de préférence de forme 25 sphérique peut par exemple être déterminé par mesure microscopique en utilisant le logiciel « CellSens », les valeurs ci-dessus se rapportant au diamètre à l'endroit le plus large ou le plus long d'un seul équivalent de glande sudoripare. 30 Dans le cadre de la présente invention, l'on préfère que les équivalents de glandes sudoripares préparés à l'étape de procédé a) soient exempts de composés matriciels et/ou de supports. Par composés matriciels, l'on entend 3060018 8 des composés qui sont en mesure de former des réseaux dans l'espace. Toutefois, cela n'inclut pas les substances excrétées et produites par les cellules des équivalents elles-mêmes, qui sont en mesure de former des réseaux dans l'espace. En outre, l'on entend par supports au sens de la 5 présente invention des substances autoportantes, pouvant servir de support ou de structure pour les cellules de glandes sudoripares. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'au moins un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions préparé à l'étape de procédé a) est donc exempt de composés matriciels et/ou de supports, en particulier est exempt de 10 composés matriciels et de supports. Par le terme « exempt de », l'on entend selon l'invention que les équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions contiennent moins de 1 % en poids de composés matriciels et/ou de supports, par rapport au poids total de l'équivalent 15 de glande sudoripare en trois dimensions. Il est donc avantageux dans le cadre de la présente invention que les équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions préparés à l'étape de procédé a) contiennent 0 % à 1 % en poids, de préférence 0 à 0,5 % en poids, préférablement 0 % à 0,2 % en poids, en particulier 0 % en poids de composés matriciels et de supports, par rapport au 20 poids total de l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions. Dans ce contexte, il est particulièrement avantageux que les équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions préparés à l'étape de procédé a) soient exempts de certains composés matriciels et supports. L'on préfère donc 25 que l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions ne contienne aucun composé matriciel et/ou support sélectionné dans le groupe comprenant des collagènes, en particulier le collagène de type I et/ou de type III et/ou de type IV, des scléroprotéines, des gélatines, des chitosanes, des glucosamines, des glycosaminoglycanes (GAG), des protéoglycanes à sulfate d'héparane, des 30 glycoprotéines sulfatées, des facteurs de croissance, des polysaccharides réticulés, des polypeptides réticulés ainsi que des mélanges de ceux-ci. 3060018 9 L'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions préparé à l'étape de procédé a) est de manière particulièrement préférée un équivalent de glande sudoripare eccrine et/ou apocrine humaine. Des modes de réalisation préférés de la présente invention sont donc caractérisés en ce que l'au moins un 5 équivalent de glande sudoripare en trois dimensions préparé à l'étape de procédé a) est un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions de glande sudoripare eccrine et/ou apocrine humaine. Ces équivalents de glandes sudoripares permettent de reproduire particulièrement bien la situation in vivo dans la glande sudoripare humaine. 10 En outre, l'on préfère particulièrement selon l'invention que l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions préparé à l'étape de procédé a) soit réalisé à partir de glandes sudoripares humaines eccrines et/ou apocrines. Il est donc avantageux dans le cadre de la présente invention que l'au moins un 15 équivalent de glande sudoripare en trois dimensions préparé à l'étape de procédé a) soit un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions obtenu à partir de cellules de glandes sudoripares eccrines et/ou apocrines natives humaines. 20 En outre, il s'est avéré avantageux selon l'invention que les équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions préparés à l'étape de procédé a) présentent au moins un type de cellule bien précis. L'utilisation de ces équivalents résulte en une simulation particulièrement bonne de la situation in vivo. Des modes de réalisation préférés de la présente invention sont donc 25 caractérisés en ce que l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions préparé à l'étape de procédé a) contient au moins un type de cellule sélectionné dans le groupe comprenant (i) des cellules spiralées, en particulier des cellules claires, des cellules sombres telles que les cellules myoépithéliales, (ii) des cellules de conduit et (iii) des mélanges de celles-ci. Par le terme 30 « cellules claires », on entend selon l'invention des cellules présentant un cytoplasme clair ou incolore lorsqu'elles sont colorées avec des colorants, en particulier avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Ces « cellules claires » sont de 3060018 10 préférence des cellules sécrétoires de l'épithélium, qui se trouvent de préférence en contact avec la lumière. La membrane plasmique de ces cellules est fortement pliée au niveau de la surface apicale et latérale. Le cytoplasme de ces « cellules claires » contient de grandes quantités de glycogène et de 5 nombreuses mitochondries. Le composant aqueux de la transpiration, qui contient des électrolytes et des substances inorganiques, est de préférence sécrété par ce type de cellule. En revanche, les « cellules sombres » susmentionnées sont des cellules dont les vésicules présentent une coloration positive avec l'acide mucopolysaccharidique et dont le cytoplasme peut donc 10 être coloré par des colorants. Ces « cellules sombres » sont en contact avec la membrane basale et n'ont que peu de mitochondries comparé aux « cellules claires ». Des macromolécules comme par exemple les glycoprotéines, sont isolées de préférence de ces « cellules sombres ». Par le terme « cellules myoépithéliales » figurant ci-dessus, l'on entend des cellules épithéliales 15 contractiles présentant un cytosquelette avec des jonctions dites d'écartement et qui peuvent donc être resserrées. De cette manière, la sécrétion est prise en charge à partir des extrémités des glandes. De telles cellules se trouvent de préférence entre la membrane basale et les « cellules claires » et « cellules sombres » mentionnées précédemment. Enfin, l'on entend par le terme 20 « cellules du conduit » selon l'invention les cellules qui forment la paroi du conduit et qui présentent un épithélium cubique stratifié. Les types de cellules susmentionnés peuvent également être déterminés à l'aide de colorations immunocytochimiques utilisant des marqueurs spécifiques à ces cellules en plus de la coloration à l'aide de l'hématoxyline et l'éosine. Un marqueur 25 spécifique utilisable pour les cellules myoépithéliales est par exemple l'actine alpha du muscle lisse (également appelée a-SMA). Un marqueur spécifique des « cellules claires » adapté est, par exemple, la Substance P et S100. En outre, l'on peut utiliser pour les « cellules sombres » le marqueur connu sous le nom de PRGC (peptide relié au gène calcitonine) et pour les cellules du conduit les 30 marqueurs spécifiques cytokératine 10 (également désigné par CK10) et CD200. 3060018 11 Des équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions préparés à l'étape de procédé a) particulièrement préférés sont décrits ci-après. En conséquence, un mode de réalisation particulièrement préféré de cette 5 étape de procédé consiste à préparer un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions de la glande sudoripare eccrine et/ou apocrine humaine, comprenant 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares, dans lequel l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions présente un diamètre de 200 à 1 500 pm. 10 En outre, un mode de réalisation particulièrement préféré de cette étape de procédé consiste à préparer un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions obtenu à partir de cellules de glandes sudoripares eccrines et/ou apocrines natives humaines, comprenant 500 à 500 000 cellules de glandes 15 sudoripares, dans lequel l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions présente un diamètre de 200 à 1 500 pm. De plus, un mode de réalisation particulièrement préféré de cette étape de procédé consiste à préparer un équivalent de glande sudoripare en trois 20 dimensions, comprenant 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares, dans lequel l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions présente un diamètre de 200 à 1 500 pm, et contient au moins un type de cellule sélectionné dans le groupe comprenant des cellules claires, cellules sombres, cellules myoépithéliales, cellules de conduit ainsi que des mélanges de celles-ci. 25 Qui plus est, un mode de réalisation particulièrement préféré de cette étape de procédé consiste à préparer un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions obtenu à partir de cellules de glandes sudoripares eccrines et/ou apocrines natives humaines, comprenant 500 à 500 000 cellules de glandes 30 sudoripares, dans lequel l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions présente un diamètre de 200 à 1 500 pm et contient au moins un type de cellule 3060018 12 sélectionné dans le groupe comprenant des cellules claires, cellules sombres, celles myoépithéliales, cellules de conduit ainsi que des mélanges de celles-ci. En outre, un mode de réalisation particulièrement préféré de cette étape de 5 procédé consiste à préparer un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions de la glande sudoripare eccrine et/ou apocrine humaine, comprenant 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares, dans lequel l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions présente un diamètre de 200 à 1 500 pm et contient 0 % en poids de composés matriciels et de supports 10 par rapport au poids total de l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions. De plus, un mode de réalisation particulièrement préféré de cette étape de procédé consiste à préparer un équivalent de glande sudoripare en trois 15 dimensions de la glande sudoripare eccrine et/ou apocrine humaine, comprenant 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares, dans lequel l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions présente un diamètre de 200 à 1 500 pm et contient 0 % en poids de composés matriciels et de supports par rapport au poids total de l'équivalent de glande sudoripare en trois 20 dimensions, les composés matriciels et/ou supports étant sélectionnés dans le groupe comprenant des collagènes, en particulier le collagène de type I et/ou de type III et/ou de type IV, des scléroprotéines, des gélatines, des chitosanes, des glucosamines, des glycosaminoglycanes (GAG), des protéoglycanes à sulfate d'héparane, des glycoprotéines sulfatées, des facteurs de croissance, 25 des polysaccharides réticulés, des polypeptides réticulés ainsi que des mélanges de ceux-ci. Les cultures monocouches préparées à l'étape de procédé a) de cellules de glandes sudoripares et les équivalents de glandes sudoripares en trois 30 dimensions peuvent être réalisés par exemple par les étapes de procédé décrites ci-après. 3060018 13 Dans une première étape, des glandes sudoripares isolées pouvant être obtenues par biopsies de la peau ou des méthodes équivalentes et qui ont été retirées de leur environnement naturel, sont d'abord préparées. Ces glandes sudoripares peuvent être obtenues de préférence en isolant des glandes 5 sudoripares natives, en particulier des glandes sudoripares natives eccrines et/ou apocrines, de la peau humaine, l'isolement des glandes sudoripares natives s'effectuant de préférence par digestion enzymatique de la peau humaine en utilisant un mélange de 2 à 3 mg/ml de collagénase 11 et 0,1 à 0,2 mg/ml de thermolysine pendant 3 à 6 heures à 35 à 40 °C, en particulier à 10 37 °C. À partir de ces glandes sudoripares isolées, une culture cellulaire est réalisée par mise en culture. Une mise en culture particulièrement bonne des glandes sudoripares isolées est obtenue quand un mélange de DMEM et HAM F12, 15 lequel contient en plus 10 % en poids de sérum de veau foetal (SFV) par rapport au poids total du mélange, est utilisé comme milieu nutritif dans un rapport pondéral de 3:1. La culture de ces glandes sudoripares dans le milieu nutritif décrit ci-dessus est effectuée de préférence pendant 7 à 28 jours, en particulier pendant 14 jours, à une température de 36 à 38 °C et une teneur en 20 CO2 de 5 % en poids, par rapport au poids total de l'atmosphère utilisée pour la mise en culture. Pour obtenir les cultures de cellules de glandes sudoripares primaires préparées à l'étape de procédé a), les cellules de glandes sudoripares se 25 développant à partir des glandes sudoripares isolées sont détachées et cultivées à leur tour. Pour réaliser les équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions, une préparation cellulaire qui est obtenue par détachement des cellules de glandes 30 sudoripares se développant à partir des glandes sudoripares isolées, par culture de ces cellules dans des cultures monocouches et détachement et mise en suspension dans le milieu nutritif. La préparation cellulaire contient de 3060018 14 préférence un nombre de cellules de glandes sudoripares primaires allant de 50 à 250 000 cellules par pL de milieu nutritif, en particulier de 400 à 600 cellules par pL de milieu nutritif. Pour obtenir l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions, 10 à 100 pL, en particulier 40 à 60 pL de cette préparation 5 cellulaire sont donc cultivés à l'état suspendu, donc sous forme d'une goutte qui est suspendue à une surface en flottant librement. Dans ce contexte, l'utilisation desdits Hanging-Drop-Wells, telles que commercialisées par l'entreprise Insphero sous le nom de plaque d'ensemencement GravityPLUS® avec système d'introduction par insert SureDrop® et plaque de récolte 10 GravityTRAP® s'est avérée avantageuse. L'on préfère à cet égard que 40 % en volume du milieu nutritif de la préparation cellulaire, par rapport au volume total de la préparation cellulaire susmentionnée, soit remplacé par un nouveau milieu nutritif pendant la durée de la culture, en particulier au bout de 1 à 3 jours. Les équivalents obtenus sont isolés par addition de 50 à 200 pl de milieu nutritif et 15 peuvent être cultivés selon l'étape de procédé b). Cependant, il peut également être prévu que les équivalents isolés sont d'abord remis en culture avant que l'étape de procédé b) ne soit effectuée. Les équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions préparés à l'étape 20 de procédé a) sont de préférence préparés en utilisant exclusivement des méthodes in vitro. Ainsi, ces équivalents peuvent également être utilisés pour tester des substances prévues pour un usage cosmétique. En outre, ce procédé de fabrication permet une production à moindre coût d'équivalents standardisés qui peuvent être utilisés dans des procédures de sélection ave 25 des cadences élevées. De plus, ce procédé de fabrication donne des équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions qui forment des structures ordonnées et présentent des cellules diversement différenciées. Cela permet ainsi de bien reproduire la situation in vivo. 30 Un procédé de fabrication des équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions préparés à l'étape de procédé a) du procédé selon l'invention est 3060018 15 divulgué par exemple dans la demande de brevet allemand DE 10 2015 222 279, dont le contenu est incorporé par référence aux présentes en intégralité. À la deuxième étape b) du procédé selon l'invention a lieu la mise en culture de 5 la culture cellulaire de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou des équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions préparés à l'étape de procédé a), le milieu de culture utilisé pour cette mise en culture contenant au moins un neurotransmetteur et/ou 11 à 100 ng/ml d'au moins un facteur de croissance. La quantité de 11 à 100 ng/ml se réfère ici à la concentration totale 10 de facteur(s) de croissance dans le milieu nutritif. Il s'est avéré particulièrement avantageux dans le cadre de la présente invention qu'un neurotransmetteur ou 11 à 100 ng/ml d'au moins un facteur de croissance exclusivement soit ajouté au milieu de culture utilisé à l'étape de 15 procédé b). Des modes de réalisation préférés de la présente invention sont donc caractérisés en ce que le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) contient exactement un neurotransmetteur ou 11 à 100 ng/ml d'exactement un facteur de croissance. L'utilisation d'un milieu de culture qui contient exclusivement un neurotransmetteur ou 11 à 100 ng/ml d'exactement un facteur 20 de croissance s'est avérée particulièrement avantageuse à l'égard de l'expression des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares des cellules ou équivalents mis(es) en culture. L'on utilise de préférence comme milieu de culture un mélange de DMEM 25 (également désigné par milieu Eagle modifié de Dulbecco) et de Ham's F12 dans un rapport volumique de 3: 1, lequel contient en plus 10 % en poids de sérum de veau foetal (SVF). Ce milieu de culture peut de plus comprendre d'autres constituants sélectionnés dans le groupe comprenant l'hydrocortisone, l'insuline, la toxine du choléra, l'adénine, la gentamicine, la pénicilline G, la 30 triiodothyronine et le phosphate de 2-ascorbyle et des mélanges de ceux-ci. L'addition de ces constituants supplémentaires s'est avérée avantageuse dans le cadre de la présente invention à l'égard de la croissance des cellules de 3060018 16 glandes sudoripares primaires et des équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions. Dans le cadre de la présente invention, l'on préfère que le milieu de culture 5 utilisé à l'étape de procédé b) contienne des neurotransmetteurs bien précis. L'on préfère donc selon l'invention que l'au moins un neurotransmetteur, en particulier l'exactement un neurotransmetteur, soit sélectionné dans le groupe comprenant des composés qui se lient à des récepteurs métabotropes et/ou ionotropes, en particulier dans le groupe comprenant des transmetteurs 10 muscariniques, des transmetteurs ce-adrénergiques, des transmetteurs purinergiques et des mélanges de ceux-ci. L'utilisation des neurotransmetteurs susmentionnés s'est avérée particulièrement avantageuse à l'égard de l'augmentation de l'expression des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares. Par récepteurs métabotropes, l'on entend des récepteurs 15 situés à la surface de la membrane cellulaire lesquels entraînent indirectement l'ouverture des canaux ioniques lors de liaison du neurotransmetteur. En revanche, la liaison de ces neurotransmetteurs à des récepteurs ionotropes conduit à une ouverture immédiate des canaux ioniques en raison de la liaison de neurotransmetteur. 20 Dans ce contexte, il est particulièrement avantageux que le neurotransmetteur muscarinique soit sélectionné parmi l'acétylcholine et ses analogues. Des modes de réalisation préférés de la présente invention sont donc caractérisés en ce que le transmetteur muscarinique est sélectionné dans le groupe 25 comprenant l'acétylcholine, les analogues de l'acétylcholine et des mélanges de ceux-ci, en particulier l'acétylcholine. Par le terme d'analogues de l'acétylcholine, l'on entend des composés chimiques selon l'invention, qui présentent une similitude structurelle ou fonctionnelle avec l'acétylcholine et qui déclenchent donc également une ouverture des canaux ioniques lorsqu'ils sont liés aux 30 récepteurs susmentionnés. Des exemples d'analogues de l'acétylcholine utilisables selon l'invention sont la pilocarpine et le carbachol. Cependant, l'on préfère particulièrement selon l'invention que le milieu de culture utilisé à l'étape 3060018 17 de procédé b) contienne au moins un, en particulier exactement un neurotransmetteur du groupe des transmetteurs muscariniques, en particulier l'acétylcholine. L'utilisation exclusive de l'acétylcholine à l'étape de procédé b) s'est avérée particulièrement avantageuse à l'égard de l'augmentation de 5 l'expression des protéines marques spécifiques aux glandes sudoripares et entraîne ainsi une amélioration particulièrement marquée des conditions de culture des cellules de glandes sudoripares primaires et des équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions. 10 En outre, il peut également être prévu dans ce contexte que le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) contienne un transmetteur ce-adrénergique spécifique. L'on peut donc préférer selon l'invention que le transmetteur a(3-adrénergique soit sélectionné dans le groupe des catécholamines, des analogues de la catécholamine, et de mélanges de ceux-ci, en particulier la 15 noradrénaline. Par le terme d'analogues de la catécholamine, l'on entend selon l'invention des composés chimiques, qui présentent une similitude structurelle ou fonctionnelle avec les catécholamines. L'on obtient des résultats particulièrement bons à l'égard de l'amélioration des conditions de culture dans le cadre de l'invention quand le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) 20 contient au moins un, en particulier exactement un neurotransmetteur du groupe des transmetteurs ap-adrénergiques, en particulier la noradrénaline. De plus, il peut être également prévu dans ce contexte que le transmetteur purinergique soit sélectionné parmi des nucléosides et nucléotides 25 phosphorylés bien précis. Des modes de réalisation préférés de la présente invention sont donc caractérisés en ce que le transmetteur purinergique est sélectionné dans le groupe comprenant des nucléosides et des nucléotides phosphorylés, en particulier l'adénosine, le diphosphate d'adénosine (ADP), le triphosphate d'adénosine (ATP), le diphosphate d'urinosine (UDP), le 30 triphosphate d'urinosine (UTP) ainsi que le glucose de diphosphate d'urinosine (glucose d'UDP), et des mélanges de ceux-ci. Par nucléosides, l'on entend des composés chimiques selon l'invention, qui sont constitués d'une base nucléique 3060018 18 et d'un pentose et qui ne contiennent pas de radical phosphate contrairement aux nucléotides. Citons comme exemple l'adénosine, qui est constituée de la base nucléique adénine et du pentose 8-D-ribose. Au contraire, les nucléotides correspondent selon l'invention à des composés qui contiennent au moins un 5 radical phosphate en plus d'une base nucléique et d'un pentose. Citons comme exemples le diphosphate d'adénosine (ADP), le triphosphate d'adénosine (ATP), le diphosphate d'urinosine (UDP), le triphosphate d'urinosine (UTP) ainsi que le glucose de diphosphate d'urinosine (glucose d'UDP). Dans le cadre de la présente invention, il s'est avéré avantageux à l'égard de l'augmentation de 10 l'expression des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares et donc à l'égard de l'amélioration des conditions de culture que le milieu nutritif contienne du triphosphate d'adénosine (ATP) comme unique transmetteur purinergique. 15 En outre, il s'est avéré avantageux dans le cadre de la présente invention que le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) contienne l'au moins un neurotransmetteur dans une concentration totale bien précise. L'on préfère donc selon l'invention que le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) contienne l'au moins un neurotransmetteur dans une concentration totale allant 20 de 2,0 pM à 30 mM, de préférence de 2,0 pM à 28 mM, préférablement de 2,0 pM à 25 mM, en particulier de 2,0 pM à 20 mM. Les concentrations indiquées ci-dessus se rapportent ici au total des neurotransmetteurs utilisés, c'est-à-dire que si l'on utilise un mélange de divers neurotransmetteurs, les concentrations ci-dessus se rapportent à la concentration totale du mélange utilisé. Lorsque 25 l'on utilise les concentrations totales de neurotransmetteur(s) susmentionnées dans le milieu de culture de l'étape de procédé b), l'on obtient une augmentation particulièrement élevée de l'expression des gènes des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares comparé aux cultures qui ont été cultivées sans addition de neurotransmetteur(s). Cela permet ainsi d'éviter 30 la perte de fonction des cellules, qui peut se produire lors d'une faible expression de ces protéines marqueurs. 3060018 19 Si l'on utilise comme neurotransmetteur un transmetteur muscarinique, en particulier l'acétylcholine, et/ou un transmetteur purinergique, en particulier le triphosphate d'adénosine (ATP), il s'est avéré avantageux dans ce contexte que ces transmetteurs soient présents dans les plages de concentrations 5 susmentionnées dans le milieu nutritif de l'étape de procédé b). L'on préfère donc selon l'invention que l'exactement un neurotransmetteur muscarinique, en particulier l'acétylcholine, soit présent dans une concentration totale allant de 2,0 pM à 50 pM. En outre, l'on préfère selon l'invention que l'exactement un neurotransmetteur purinergique, en particulier le triphosphate d'adénosine 10 (ATP), soit présent dans une concentration totale allant de 0,3 à 20 mM. Les milieux de culture préférés utilisés à l'étape de procédé b) sont donc décrits par les modes de réalisation suivants AF1 à AF10 : - AF1 : Le milieu de culture contient au moins un neurotransmetteur, 15 sélectionné dans le groupe des transmetteurs muscariniques, des transmetteurs ce-adrénergiques, des transmetteurs purinergiques et de mélanges de ceux-ci, - AF2 : Le milieu de culture contient au moins un neurotransmetteur, sélectionné dans le groupe des transmetteurs muscariniques, des 20 transmetteurs ap-adrénergiques, des transmetteurs purinergiques et de mélanges de ceux-ci dans une concentration totale allant de 2,0 pM à 30 pM, de préférence de 2,0 pM à 28 mM, préférablement de 2,0 pM à 25 mM, en particulier de 2,0 pM à 20 mM, - AF3 : Le milieu de culture contient exactement un neurotransmetteur 25 sélectionné parmi des transmetteurs muscariniques, - AF4 : Le milieu de culture contient exactement un neurotransmetteur sélectionné parmi des transmetteurs muscariniques dans une concentration totale allant de 2,0 pM à 50 pM, - AF5 : Le milieu de culture contient exactement un neurotransmetteur 30 sélectionné parmi des transmetteurs muscariniques dans une concentration totale allant de 2,0 pM à 50 pM, dans lequel le transmetteur muscarinique est l'acétylcholine, 3060018 20 - AF6 : Le milieu de culture contient exactement un neurotransmetteur sélectionné parmi les neurotransmetteurs ce -adrénergiques, - AF7 : Le milieu de culture contient exactement un neurotransmetteur sélectionné parmi les neurotransmetteurs ce -adrénergiques, le transmetteur 5 c(3-adrénergique étant la noradrénaline, - AF8 : Le milieu de culture contient exactement un neurotransmetteur sélectionné parmi les transmetteurs purinergiques, - AF9 : Le milieu de culture contient exactement un neurotransmetteur sélectionné parmi des transmetteurs purinergiques dans une concentration 10 totale de 0,3 à 20 mM, - AF10 : Le milieu de culture contient exactement un neurotransmetteur sélectionné parmi des transmetteurs purinergiques dans une concentration totale de 0,3 à 20 mM, dans lequel le transmetteur purinergique est le triphosphate d'adénosine (ATP). 15 En plus ou à la place de l'au moins un neurotransmetteur, le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) contient 11 à 100 ng/ml d'au moins un facteur de croissance. L'utilisation de facteurs de croissance bien précis s'est avérée préférée dans le cadre de la présente invention. Des modes de réalisation 20 préférés de la présente invention sont donc caractérisés en ce que l'au moins un facteur de croissance, en particulier l'exactement un facteur de croissance, est sélectionné dans le facteur de croissance épidermique (epidermal growth factor, EGF). L'utilisation d'EGF, en particulier l'utilisation exclusive d'EGF, dans une concentration totale de 11 à 100 ng/ml dans le milieu de culture de l'étape 25 de procédé b) s'est avérée particulièrement avantageuse à l'égard de l'augmentation de l'expression des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares et ainsi à l'égard de l'amélioration des conditions de culture de cellules de glandes sudoripares primaires et d'équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions. 30 Dans le cadre de la présente invention, l'on préfère en outre que le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) contienne l'au moins un facteur de 3060018 21 croissance dans des concentrations totales plus faibles. L'on préfère donc selon l'invention que le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) contienne l'au moins un facteur de croissance, en particulier le facteur de croissance épidermique (EGF), dans une concentration totale allant de 11 ng/ml à 80 ng/ml, 5 de préférence de 11 ng/ml à 60 ng/ml, préférablement de 11 ng/ml à 40 ng/ml, en particulier de 15 ng/ml à 25 ng/ml. Les concentrations indiquées ci-dessus se rapportent ici au total des facteurs de croissance utilisés ou à l'utilisation d'EGF comme facteur de croissance. Lorsque l'on utilise les concentrations totales de facteur(s) de croissance susmentionnées dans le milieu de culture de 10 l'étape de procédé b), l'on obtient une augmentation particulièrement élevée de l'expression des gènes des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares comparé aux cultures qui ont été cultivées sans addition de facteur(s) de croissance. Cela permet ainsi d'éviter la perte de fonction des cellules, qui peut se produire lors d'une faible expression de ces protéines 15 marqueurs. La mise en culture à l'étape de procédé b) du procédé selon l'invention s'effectue de préférence pendant une période de temps bien précise. Il s'est avéré avantageux selon l'invention que la culture à l'étape de procédé b) 20 s'effectue pendant une période de 4 h à 25 jours, en particulier de 4 h à 72 h. Dans le cadre de la présente invention, il peut en outre être prévu que lors de la mise en culture à l'étape de procédé b) une certaine fraction volumique du milieu de culture est remplacé par un nouveau milieu de culture au bout d'un 25 certain temps. Par nouveau milieu de culture, l'on entend ici un milieu ne contenant aucune cellule mais au moins un neurotransmetteur et/ou 11 à 100 ng/ml d'au moins un facteur de croissance. La fraction volumique se réfère ici au volume total du milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b). Il est donc avantageux selon l'invention que pendant la mise en culture à l'étape de 30 procédé b), 20 à 60 % en volume, en particulier 40 à 50 % en volume du milieu de culture soit remplacé au bout de 24 h à 48 h, en particulier au bout de 24 h, par un nouveau milieu de culture, contenant au moins un neurotransmetteur 3060018 22 et/ou 11 à 100 ng/ml d'au moins un facteur de croissance. Les neurotransmetteurs et facteurs de croissance utilisés de préférence et les quantités ou concentrations totales préférées sont les transmetteurs, facteurs de croissance, quantités ou concentrations totales indiqués ci-avant. 5 Un deuxième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un neurotransmetteur et/ou d'au moins un facteur de croissance pour améliorer les conditions de culture de cultures de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou d'équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions avec 500 à 10 500 000 cellules de glandes sudoripares et un diamètre de 100 à 6 000 pm. L'utilisation selon l'invention entraîne une augmentation de l'expression des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares dans ces cultures. De cette façon, une perte de fonction, qui se produit en l'absence ou à des concentrations faibles de ces protéines, est évitée pendant la culture. 15 Des modes de réalisation particulièrement préférés de cet objet de l'invention sont caractérisés en ce qu'au moins un neurotransmetteur ou au moins un facteur de croissance, en particulier exactement un neurotransmetteur ou exactement un facteur de croissance, est utilisé. 20 En ce qui concerne les neurotransmetteurs et facteurs de croissance utilisés selon l'invention et en ce qui concerne la quantité totale de neurotransmetteurs utilisés, ce qui a été exposé sur le procédé selon l'invention s'applique mutatis mutandis. 25 En ce qui concerne les quantités totales de facteur(s) de croissance, il s'est avéré avantageux que l'au moins un facteur de croissance, en particulier le facteur de croissance épidermique (EGF), soit utilisé dans une concentration totale allant de 1,0 ng/ml à 30 ng/ml, de préférence de 3,0 ng/ml à 20 ng/ml, 30 préférablement de 5,0 ng/ml à 15 ng/ml, en particulier de 8,0 ng/ml à 12 ng/ml. 3060018 23 Concernant d'autres modes de réalisation préférés de l'utilisation selon l'invention, ce qui a été exposé sur le procédé selon l'invention s'applique mutatis mutandis. 5 Les exemples suivants explicitent la présente invention, sans pour autant en limiter la portée : Exemples : 10 1 Préparation de la culture de cellules de glandes sudoripares primaires ainsi que les équivalents de glandes sudoripares tridimensionnels (étape de procédé a)) 1.1 Isolation des glandes sudoripares 15 Les glandes sudoripares natives ont été obtenues à partir d'échantillons de tissus humains, dites biopsies, provenant d'interventions de chirurgie plastique de patients qui ont accepté que ces tissus soient utilisés à des fins de recherche. Le tissu utilisé a été prélevé lors de liftings des bras et de liftings du 20 visage. À partir de lui, les glandes sudoripares eccrines et apocrines de la région des aisselles ont été isolées. Pour cela, la biopsie correspondante a été divisée en petits morceaux, puis a été découpée en morceaux d'environ 1 cm x 1 cm maximum. Ensuite, la 25 digestion de la peau a été effectuée avec un mélange à proportions identiques de collagénase II (5 mg/ml) et de thermolysine (0,25 mg/ml) à 37 °C dans l'incubateur pendant environ 3,5 à 5 heures, jusqu'à ce que le tissu conjonctif a été presque entièrement digéré. Ce mélange a été ensuite centrifugé à 1200 tr/min pendant 5 minutes et le surnageant a été éliminé pour retirer la solution 30 d'enzyme et l'excès de graisse. Les granules en résultant ont été intégrées dans une solution DMEM et la solution a été transférée dans une boîte de Pétri. 3060018 24 À l'aide d'un microcapillaire, des glandes sudoripares intactes ont été isolées sous un binoculaire et transférées dans un nouveau milieu DMEM. 1.2 Mise en culture des glandes sudoripares natives isolées et réalisation de 5 la culture de cellules de glandes sudoripares primaires Les glandes sudoripares isolées à l'étape 1.1 ont été placées dans des flacons de culture enduits de collagène I puis ajoutées à 25 ml de milieu nutritif. Après une mise en culture pendant 7 à 21 jours dans l'incubateur à 37 °C et 5 % de 10 CO2, les cellules de glandes sudoripares en croissance ont été détachées et ont été remises en culture sur des flacons de culture enduits de collagène I jusqu'à confluence (culture monocouche des cellules de glandes sudoripares primaires). 15 La composition du milieu nutritif utilisé est la suivante : Composants du milieu Mélange nutritif DMEM/ Ham's F12 3 : 1 Sérum de veau foetal (SVF) 10 % EGF 10 ng/ml Hydrocortisone 0,4 pg/ml Insuline 0,12 Ul/ml Toxine du choléra 10-10 M Adénine 2,43 g/ml Gentamicine 25 pg/ml Pénicilline G 100 UI/ml Triiodothyronine 2*10-9 M Phosphate de 2-ascorbyle 1 mM 1.3 Réalisation des équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions Après avoir déterminé le nombre de cellules exact des cultures monocouches 20 ci-dessus des cellules de glandes sudoripares primaires, celui-ci a été ajusté à 3060018 25 l'aide du milieu de culture ci-dessus à un nombre de cellules de 10 à 5 000 cellules par pI puis 50 pI de cette suspension cellulaire respectivement a été transférée à l'aide du système d'introduction « SureDrop® Inlet » dans les puits d'une plaque d'ensemencement « GravityPLUSO » (respectivement de la 5 société lnsphero SA, Suisse). La culture est effectuée à une température de 36 à 38 °C et une teneur en CO2 de 5 % en poids, par rapport au poids total de l'atmosphère utilisée pour la mise en culture. Au bout de 1 à 3 jours, 40 % en volume du milieu se trouvant dans les puits de la plaque d'ensemencement « GravityPLUSO » est respectivement remplacé par un nouveau milieu nutritif. 10 Au bout de 2 à 7 jours de culture, les équivalents de glandes sudoripares en 3D sont récoltés en ajoutant 50 à 200 pL de milieu de culture et sont transférés dans une plaque « GravityTRAPO » (société InSphero SA, Suisse). Avant la récolte, la plaque « GravityTRAPO » est humidifiée avec 60 à 100 pL de milieu kératinocyte à l'aide d'une pipette à canaux multiples, afin de minimiser la 15 formation de bulles d'air et d'éviter la perte des équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions. Après la récolte, la plaque est centrifugée pendant 1 à 5 minutes à 100 à 300 xg pour éliminer les bulles d'air. Une partie des équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions a été analysée, tandis qu'une autre partie a été mise en culture pendant 1 à 6 jours 20 supplémentaires dans les puits de la plaque de récolte à 37 °C et 5 % en poids de CO2, par rapport au poids total de l'atmosphère utilisée pour la mise en culture. 2 Culture des cellules de glandes sudoripares primaires et/ou des 25 équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions (étape de procédé b)) La culture cellulaire réalisée aux étapes 1.2 et 1.3 ci-dessus de cellules de glandes sudoripares primaires ou les équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions ont été chacun mis en culture après ajout des milieux de 30 culture K1 et K2 pendant 48 h à 37 °C et 5 % en poids de CO2, par rapport au poids total de l'atmosphère utilisée pour la mise en culture. Au bout de 24 h, 3060018 26 40 % en volume du milieu de culture respectif K1 ou K2 a été remplacé par un nouveau milieu de culture K1 ou K2 et la culture a été poursuivie. Milieu de culture K1 : correspond au milieu de culture utilisé au point 1.2, mais 5 contient en plus 2,0 à 50 pM d'acétylcholine comme neurotransmetteur muscarinique Milieu de culture K2 : correspond au milieu de culture utilisé au point 1.2, mais contient en plus 0,3 à 20 mM d'adénosine triphosphate (ATP) en tant que 10 neurotransmetteur purinergique 3 Identification et analyse de l'expression des gènes de protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares 15 La preuve des protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares indiquées ci-dessous peut par exemple être déterminée à l'aide de méthodes de biologie moléculaire. Ici, l'ARNm est d'abord isolé à l'aide du « RNeasy Micro Kits » (Qiagen) selon les instructions du fabricant, puis analysé à l'aide d'une PCR en temps réel quantitative (Bellas et al. : « In Vitro 3D Full-Thickness Skin- 20 Equivalent Tissue Model Using Silk and Collagen Biomaterials » ; Macromolecular Bioscience, 2012, 12, pages 1627-1636). Cependant, il est également possible d'analyser les protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares indiquées ci-dessous à l'aide de méthodes de biochimie des protéines, telles que les analyses Western Blot ou la méthode immuno- 25 enzymatique ELISA (enzyme-linked immonosorbent assay). Dans les cultures réalisées au point 2, l'on a démontré, à l'aide des méthodes susmentionnées, des quantités nettement plus élevées de protéines marqueurs spécifiques aux glandes sudoripares Aquaporine 5 (AQP5), Cystic Fibrosis 30 Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), Ca2+-activated chloride channel (AN01), Natrium-Kalium-Chlorid Cotransporter 1 (NKCC1), carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 (CEACAM5), 3060018 27 muscarinic acetylcholine receptor M3 (Chrm3) comparé à des cultures qui ont été traitées seulement avec le milieu de culture décrit au point 1.2. REVENDICATIONS1. Procédé servant à améliorer les conditions de culture de cultures de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou d'équivalents de glandes 5 sudoripares en trois dimensions, comprenant les étapes de procédé suivantes : a) préparer au moins une culture de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou au moins un équivalent de glandes sudoripares en trois dimensions, avec 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares et un diamètre de 100 à 6 000 pm, 10 b) cultiver l'au moins une culture cellulaire de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou l'au moins un équivalent de -glandes sudoripares en trois dimensions préparés à l'étape a) dans un milieu de culture, contenant b1) au moins un neurotransmetteur et/ou 15 b2) 11 à 100 ng/ml d'au moins un facteur de croissance. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'au moins une culture de cellules de glandes sudoripares primaires préparée à l'étape de procédé a) correspond à une culture monocouche de ces cellules de glandes 20 sudoripares. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que l'au moins un équivalent de glande sudoripare en trois dimensions préparé à l'étape de procédé a) est un équivalent de glande sudoripare en trois 25 dimensions de la glande sudoripare eccrine et/ou apocrine humaine. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'équivalent de glande sudoripare en trois dimensions préparé à l'étape de procédé a) contient au moins un type de cellule 30 sélectionné dans le groupe comprenant des cellules claires, des cellules sombres, des cellules myoépithéliales, des cellules de conduit et des mélanges de celles-ci. 3060018 29 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'au moins un neurotransmetteur, en particulier l'exactement un neurotransmetteur, est sélectionné dans le groupe comprenant des composés qui se lient à des récepteurs métabotropes et/ou ionotropes, en particulier dans le groupe comprenant des transmetteurs muscariniques, des transmetteurs c(3-adrénergiques, des transmetteurs purinergiques et des mélanges de ceux-ci. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) contient l'au moins un neurotransmetteur dans une concentration totale allant de 2,0 pM à 30 mM, de préférence de 2,0 pM à 28 mM, préférablement de 2,0 pM à 25 mM, en particulier de 2,0 pM à 20 mM. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'au moins un facteur de croissance, en particulier l'exactement un facteur de croissance, est le facteur de croissance épidermique (epidermal growth factor, EGF). 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le milieu de culture utilisé à l'étape de procédé b) contient l'au moins un facteur de croissance, en particulier le facteur de croissance épidermique (epidermal growth factor, EGF), dans une concentration totale allant de 11 ng/ml à 80 ng/ml, de préférence de 11 ng/ml à 60 ng/ml, préférablement de 11 ng/ml à 40 ng/ml, en particulier de 15 ng/ml à 25 ng/ml. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la culture à l'étape de procédé b) s'effectue pendant une période de 4 h à 25 jours, en particulier de 4 h à 72 h. 3060018 30 10. Utilisation d'au moins un neurotransmetteur et/ou d'au moins un facteur de croissance pour améliorer les conditions de culture de cultures de cellules de glandes sudoripares primaires et/ou d'équivalents de glandes sudoripares en trois dimensions avec 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares et un 5 diamètre de 100 à 6 000 pm.