Brevet FR3055339A1 — publié le 20180302

METHODE DE DETECTION ET D'IDENTIFICATION IN VITRO D'UN OU PLUSIEURS PATHOGENES CIBLES PRESENTS DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE. DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne une méthode à haut débit de détection et d'identification in vitro d'un ou plusieurs pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Depuis l'identification au XIXe siècle des micro-organismes comme l'une des principales sources de morbidité et de mortalité, des efforts ont été réalisés pour surveiller et contrôler la propagation des maladies infectieuses. Au )0(e siècle, l'avènement des antibiotiques, la vaccination de masse et les traitements antiviraux ont offert un niveau de contrôle sans précédent sur la propagation de ces maladies. Néanmoins, les maladies infectieuses restent l'une des principales causes de décès dans le monde, avec une succession incessante de «nouveaux» tueurs microbiens qui apparaissent chaque année. Actuellement les systèmes disponibles pour le dépistage de la présence de micro- organismes dans un échantillon prélevé chez un hôte (par exemple un patient ou un animal) sont des systèmes à faible débit. Généralement un seul micro-organisme est testé pour chaque échantillon, à moins que des indications médicales montrent que l'hôte pourrait souffrir de plusieurs maladies microbiennes. Cela signifie qu'une seule infection ne peut être détectée par test, ce qui a un impact significatif sur le prix et le temps d'essai. En outre, chez un hôte asymptomatique, il est souvent difficile de décider pour quel microorganisme le patient doit être testé. Les résultats négatifs pour deux ou trois organismes infectieux peuvent donner un faux sentiment de sécurité. Les systèmes de détection modernes utilisent des tests basés sur l'ADN pour détecter une infection due à des micro- organismes pathogènes. Les méthodes les plus courantes sont basées sur la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) appliquée directement après extraction des acides nucléiques ou suite à un isolement ou un enrichissement des micro-organismes. Les approches culturales présentent un certain nombre de limites avec notamment des milieux de cultures adaptés pour l'isolement de chaque micro-organisme, voire l'absence de milieu d'isolement. En outre, pour certains micro-organismes, les phases de croissance peuvent être fastidieuses conduisant à des étapes d'isolements de plusieurs jours. Ainsi, ces approches moléculaires et culturales permettent difficilement de détecter simultanément plusieurs agents pathogènes en utilisant un seul échantillon prélevé dans 3055339 2 l'organisme hôte. Ces problèmes d'identification fiables subsistent pour d'autres approches, telles que les biopuces ADN, le séquençage direct et les approches de diagnostic, telles que les tests immunologiques, les observations microscopiques ou la spectrométrie de masse. 5 Par conséquent, il apparait nécessaire de disposer d'une méthode fiable, automatisable et peu couteuse permettant la détection et l'identification in vitro d'un ou plusieurs pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique, même si ce ou ces pathogènes cibles sont présents en faible quantités dans l'échantillon biologique. La demande internationale W02015/105993 (AgBiome Inc) décrit une méthode 10 d'identification de gènes d'intérêts mettant en oeuvre une étape de capture de gènes par hybridation suivie d'une étape de séquençage pour identifier lesdits gènes d'intérêts. Toutefois, la méthode décrite dans la demande internationale W02015/105993 nécessite l'utilisation de sondes chevauchantes déduites de séquences connues pour procéder à la capture de fragments d'ADN et est limitée à la capture de courts fragments d'ADN ayant 15 une longueur maximale de 1800 paires de bases, adaptés aux capacités de la technique de capture et aux capacités actuelles des séquenceurs de nouvelles génération. De plus, l'approche ne permet pas forcément d'identifier des gènes complets et encore moins des séquences nucléiques comprenant plusieurs gènes, voire de nouveaux gènes ou des génomes complets. La méthode décrite dans la demande internationale W02015/105993 20 ne permet que d'identifier des gènes proches des gènes ciblés, ni même d'identifier de gènes divergents, voire de nouveaux gènes. Par conséquent, il apparaît nécessaire de disposer d'une méthode à haut débit de détection et d'identification in vitro plus résolutive d'un ou plusieurs pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique, permettant d'identifier à la fois les variants 25 connus et inconnus des gènes d'intérêts appartenant aux pathogènes cibles responsables de maladies infectieuses chez un organisme hôte, mais également de détecter de nouveaux pathogènes porteurs de gènes de virulences ciblés et ainsi de déterminer avec précision l'absence ou la présence du ou des pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique donné. 30 DESCRIPTION DETAILLEE Les demandeurs proposent donc une nouvelle méthode de détection et d'identification in vitro d'un ou plusieurs pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique. 3055339 3 Cette méthode, tout en étant plus sensible que les méthodes existantes, permet d'identifier à la fois les variants connus et inconnus des gènes d'intérêts appartenant aux pathogènes cibles responsables de maladies infectieuses chez un organisme hôte, mais également de détecter de nouveaux pathogènes porteurs de gènes de virulences ciblés et 5 ainsi de déterminer avec précision l'absence ou la présence du ou des pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique donné. Un objet de l'invention est donc une méthode de détection et d'identification in vitro d'un ou plusieurs pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique, la méthode comprenant les étapes suivantes : 10 a) la préparation d'un mélange de sondes capables de cibler spécifiquement un ensemble de séquences de gènes d'intérêts appartenant aux pathogènes cibles, b) la préparation d'une banque de fragments d'ADN à partir de l'échantillon biologique, lesdits fragments d'ADN contenus dans la banque ayant une longueur 15 d'au moins 6 000 paires de bases, c) l'hybridation des fragments d'ADN obtenus à l'étape b) par mise en contact desdits fragments d'ADN avec le mélange de sondes de l'étape a), d) la capture des complexes d'hybridation de l'étape c), e) le séquençage des fragments d'ADN capturés à l'étape d), et 20 f) l'identification du ou des pathogènes cibles présents dans l'échantillon biologique. La méthode selon l'invention permet de capturer des fragments d'ADN ayant une longueur d'au moins 6 000 paires de bases. Grâce à cette nouvelle méthode, les inventeurs sont capables d'identifier à la fois les séquences connues et inconnues des 25 gènes d'intérêts appartenant aux pathogènes cibles responsables de maladies infectieuses chez un organisme hôte. En outre, les inventeurs par le biais de cette méthode mettent en évidence des gènes présents dans les régions adjacentes aux gènes cibles permettant de révéler de nouvelles souches pathogènes et ainsi de déterminer avec précision l'absence ou la présence du ou des pathogènes cibles présents dans un 30 échantillon biologique donné. Cette méthode, tout en permettant d'explorer de manière exhaustive la diversité génétique de gènes d'intérêts, présente l'avantage d'assurer l'identification des régions flanquantes associées aux séquences ciblées. Il est alors 3055339 4 possible, par la caractérisation de grandes régions d'ADN, de mettre en évidence des organisations génomiques connues ou inconnues et donc d'identifier des gènes pouvant avoir un rôle dans le développement, la survie et l'adaptation des pathogènes. Il est également possible de reconstruire les génomes portant les séquences ciblées pouvant 5 contribuer à l'amélioration du diagnostic, mais également d'apporter des informations pouvant faciliter l'isolement de ces pathogènes, tout en mettant en évidence de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques. Ainsi, grâce à la reconstruction de grandes régions flanquantes aux gènes ciblés et la détection simultanée de plusieurs séquences, l'identification des pathogènes est possible jusqu'au niveau de l'espèce, voire de la 10 souche ou de l'individu, représentant le niveau d'identification le plus résolutif. Enfin, la présente méthode permet de s'affranchir de l'utilisation de sondes chevauchantes. La méthode selon l'invention est capable de détecter et d'identifier un ou plusieurs pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique. Par « pathogènes cibles », il est entendu tout agent biologique infectieux capable d'induire une maladie infectieuse 15 chez un organisme hôte. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les pathogènes cibles peuvent être tous types d'agents infectieux. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les pathogènes cibles peuvent être choisis dans le groupe comprenant: les bactéries, les archées, les virus, les viroïdes, les champignons, en particulier les levures, 20 les unicellulaires eucaryotes (classiquement dénommés protistes) en particulier les protozoaires et les vers. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les pathogènes cibles peuvent être des bactéries. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les bactéries peuvent être des bactéries à paroi de type monoderme (classiquement appelées Gram positif), de type diderme (classiquement appelées Gram 25 négatif), ou montrant des résistances particulières telles que les BAAR (Bactéries Acido Alcoolo Résistantes) comme les mycobactéries voire des bactéries sans paroi comme les mycoplasmes. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, les bactéries cibles peuvent être choisies dans le groupe comprenant : Bacillus anthracis, Clostridium 30 botulinum, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Brucella, Burkholderia, Campylobacter jejuni, Chlamydiophila psittaci, Coxiella bumetii, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Vibrio, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Rickettsia, Yersinia enterocolitica, Mycobacterium tuberculosis, Anaplasma phagocytophilum, Bartonella henselae, Bordetella pertussis, Borrelia miyamotoi, Clostridium difficile, 3055339 5 Ehrlichia, Enterococcus, Leptospira, Borrelia burgdorferi, Streptococcus pyogenes, Legionella, Mycoplasma, Nocardia, Pneumocystis, Candida, ou un mélange de deux ou plusieurs de ces bactéries cibles. Par « échantillon biologique », on entend tout échantillon provenant d'un organisme hôte 5 ayant au moins des acides nucléiques d'une autre espèce, les acides nucléiques de l'autre espèce pouvant être des acides nucléiques de type ADN ou ARN pouvant être converti en ADN complémentaire (ADNc), comme par exemple un ADN ou un ARN viral, un ADN ou un ARN bactérien, un ADN ou un ARN d'archée, un ADN ou un ARN fongique, comme un ADN ou un ARN de levure, un ARN de viroïde, un ADN ou ARN 10 d'unicellulaires eucaryotes, un ADN ou un ARN de vers ou un ADN ou un ARN de protozoaires. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'échantillon biologique peut être obtenu à partir d'un fluide corporel ou d'un tissu prélevé chez l'animal ou chez l'Homme. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, l'échantillon 15 biologique peut être choisi dans le groupe comprenant: un échantillon de sang total, un échantillon de plasma, un échantillon de sérum, un échantillon de salive, un échantillon de sécrétion nasale, un échantillon d'urine, un échantillon de selles, un échantillon de liquide céphalo-rachidien, un échantillon de sperme, un échantillon de sécrétion vaginale et un échantillon de biopsie. 20 La méthode mise au point par les inventeurs ne nécessite pas au préalable d'échantillons purifiés en pathogènes, mais est capable d'identifier des séquences homologues aussi bien à partir d'organismes isolés, que directement à partir de mélanges non caractérisés de populations d'organismes comprenant le ou les pathogènes ciblés, prélevés directement à partir d'échantillons biologiques bruts et non soumis à une purification. De 25 cette manière, la méthode selon l'invention est capable d'identifier des séquences de gènes et des variants de ceux-ci, à partir de pathogènes non cultivables ou difficiles à cultiver, mais également faiblement représentés au sein de l'échantillon étudié. 3055339 6 Gènes d'intérêts Des séquences connues de gènes d'intérêts ou des variants de celles-ci, mais également des séquences inconnues de gènes d'intérêts ou des variants de celles-ci peuvent être détectées et identifiées par la méthode selon l'invention. Au sens de la présente invention, 5 il est entendu par « séquence de gène d'intérêt », la séquence de gène connu ou inconnu. Dans un mode de réalisation selon l'invention, les séquences des gènes d'intérêts peuvent être des séquences correspondant aux gènes de virulence des pathogènes, aux gènes de résistance aux antibiotiques, à des marqueurs phylogénétiques comme par 10 exemple l'ADNr 16S, à des marqueurs fonctionnels, ou à des séquences répétées. Le tableau 1 ci-après donne des exemples de pathogènes et de gènes cibles qui peuvent être détectés et identifiés dans la méthode selon l'invention. Il est important de noter que ces pathogènes et gènes cibles sont fournis uniquement à titre d'exemples. Pathogènes Gènes cibles Bacillus anthracis acpB, atxA, bsIA, capA, capB, capC, capD, cya, lef, pagA, rpoB, sap, vrrA, vrrB Clostridium botulinum bontA, bonB, bonC, bonD, bonE, bonF, bonG, flaA, flaB, ntnH, sigE, sigG, sigK, spoûA Francisella tularensis acpA, asd, capB, capC, fopA, fsaP, galE, igIC, pdpD, pepO, tul4 Yersinia pestis ail, caf1, glpD, hmsF, hmsH, hmsR, lcrV, pla, rpoB, yihN, ymt, yopT Brucella alkB, BCSP31, BMEI1162, bp26, I5711, omp25, omp31, rpsL, wobA Burkholderia bimA, fliC, fliP, motB, mprA Campylobacterjejuni cadF, cdtA, cdtB, cdtC, ceuB, ceuC, ceuD, ceuE, ciaB, ciaC, hipO, mapA Chlamydiophila psittaci enoA, envB, incA, ompA Coxiella burnetii adaA, cbbE, cbhE, com1, htpB, icd 3055339 7 Escherichia coli aggR, astA, bfpA, bfpB, cadA, eaeA, ehxA, eltA, eltB, escV, hlyA, rfbE, saa, sta, stx1A, stx1B, stx2A, stx2B, vt1 Clostridium perfringens cpa, cpb, cpb2, cpe, etx, iap, netB, tpeL Listeria monocytogenes actA, aut, bsh, fbpA, gtcA, hlyA, iap, inlA, in/B, mpl, oatA, pgdA, picA, picB, prfA, svpA, vip Vibrio ace, ctxA, ctxB, hlyA, tih, trh, vvhA, zot Salmonella cdtB, invA, misL, Tek, sipB, sipC, spvC, stn Shigella ial, ipaB, ipaH, set1A, set1B, stxA, stxB, virA Staphylococcus aureus coa, etaA, nuc, sea, seb, sec, seg, she, sei, sej, sel, tst Rickettsia prowazekii gtIA, ompB Yersinia enterocolitica ail, blaA, foxA, myf, nuc, rfbB, virF, wbbU, wbcA, yadA, ystA, ystB Rickettsia gtIA, ompA, ompB Mycobacterium tuberculosis katG, gyrB, erp, hspX, lepB, mtp40, pncA, embB, gyrA Ana plasma ank, msp2, msp4 Bartonella henselae badA, gitA, groEL, htrA, pap31 Bordetella pertussis bapC, cyaA, dnt, prn, ptxA, tcfA Borrelia miyamotoi flaB, glpQ, ospA, recG Clostridium difficile cdtA, cdtB, gdh, tcdA, tcdB, tcdC Ehrlichia dsb, groEL, map1, rpoB, sodB Enterococcus faecium ace, asa1, cylA, ddl, efaA, esp, gelE, hyl Leptospira gyrB, Ifb1, lig, lipL32, ompL1, secY Borrelia burgdorferi ospA, ospB, p66 3055339 8 Tableau 1 : Exemple de pathogènes et de gènes cibles. La méthode selon l'invention peut identifier des variants de séquences connues ou inconnues provenant de plusieurs familles de gènes d'intérêts. Au sens de la présente invention, le terme « variants » ou « gène variant » se réfère aux gènes montrant des 5 similarités de séquence plus ou moins importantes. Bien que l'expression d'un variant puisse être modifiée par rapport à celui du gène d'intérêt, le variant peut conserver la même fonction que le gène d'intérêt ou aboutir à de nouvelles fonctions. Par exemple, un variant peut avoir une expression accrue, une expression réduite, un spectre d'expression différent (par exemple, pour un gène de toxine insecticide), ou toute autre modification de 10 l'expression par rapport au gène d'intérêt ciblé. De manière générale, par « variant » il est entendu des séquences sensiblement similaires. Pour des polynucléotides, un variant comprend une délétion et/ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides à un ou plusieurs sites dans le polynucléotide natif, ou une substitution d'un ou plusieurs nucléotides à un ou plusieurs sites dans le polynucléotide natif voire des modifications 15 chimiques de type méthylation ou autres. Il est entendu par « polynucléotide natif » ou « polynucléotide de type sauvage », un polynucléotide qui comprend une séquence nucléotidique naturelle. Pour les séquences codant des protéines, les variants peuvent être des variants dits « conservateurs », qui en raison de la dégénérescence du code génétique codent pour la séquence d'acides aminés native du produit du gène d'intérêt ; 20 des variants alléliques naturels, tels que ceux qui peuvent être identifiés par des techniques bien connues de l'homme du métier, comme par exemple par amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou les techniques d'hybridation ou de séquençage direct sans a priori; des variants obtenus de manière artificielle, comme notamment ceux générés par mutagénèse aléatoire ou dirigée mais codant toujours pour 25 le produit du gène d'intérêt ou montrant des similarité de séquence et de structure. Avantageusement, le variant présente au moins environ 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité avec la séquence nucléotidique du gène d'intérêt. Streptococcus pyogenes sagA, slo, smeZ, spec, speg, speh, spei, spej, spem, ssa 3055339 9 Sondes Dans un mode de réalisation de l'invention, la méthode utilise des sondes de capture spécifiques des gènes d'intérêts ou des variants connus ou inconnus de ceux-ci. Au sens de la présente invention, il est entendu par « sonde », un polynucléotide capable de 5 s'hybrider avec la séquence du gène d'intérêt ou un variant connu ou inconnu de celui-ci. Les sondes peuvent être des séquences d'ARN ou d'ADN, chevauchantes, contiguës ou séquentielles. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les sondes sont des séquences d'ARN simple brin capables de s'hybrider à la séquence du gène d'intérêt par complémentarité des nucléotides. A titre d'exemple, la séquence d'ARN de la sonde 10 est complémentaire de la séquence ADN ou ARN du fragment du gène d'intérêt. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les sondes selon l'invention sont des séquences d'ARN simple brin non chevauchantes. Dans un mode de réalisation avantageux, les sondes sont capables de cibler spécifiquement un ensemble de séquences connues ou inconnues de gènes d'intérêts, les séquences connues ou 15 inconnues de gènes d'intérêts pouvant être des séquences d'ADN ou d'ARN ou d'ADNc. Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, les sondes ont une longueur d'au moins 20 nucléotides contigus, avantageusement d'au moins 30 nucléotides contigus, avantageusement d'au moins 40 nucléotides contigus, avantageusement d'au moins 50 nucléotides contigus, avantageusement d'au moins 60 nucléotides contigus, 20 avantageusement d'au moins 70 nucléotides contigus, avantageusement d'au moins 80 nucléotides contigus, avantageusement au moins 90 nucléotides contigus, avantageusement au moins 100 nucléotides contigus, avantageusement au moins 110 nucléotides contigus, avantageusement au moins 120 nucléotides contigus, avantageusement au moins 130 nucléotides contigus, avantageusement au moins 140 25 nucléotides contigus, avantageusement au moins 150 nucléotides contigus. Avantageusement, la séquence des sondes peut comprendre 20 à 150 nucléotides contigus, avantageusement 70 à 150 nucléotides contigus, avantageusement 100 à 140 nucléotides contigus, avantageusement 110 à 120 nucléotides contigus, avantageusement 70 à 90 nucléotides contigus. De manière particulièrement 30 avantageusement, les sondes ont une longueur de 80 nucléotides contigus. Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, les sondes peuvent être complémentées avec un marqueur détectable pour permettre la capture du complexe d'hybridation comprenant la sonde hybridée au fragment d'ADN ou d'ARN ou d'ADNc du gène d'intérêt ou du variant connu ou inconnu de celui-ci. Dans un mode de réalisation 3055339 10 particulièrement avantageux, les sondes sont marquées avec de la biotine, un haptène ou un marqueur d'affinité, ou sont générées par polymérisation ou transcription en utilisant des oligonucléotides. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, les sondes ARN sont biotinylées. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, les sondes 5 sont des sondes ARN simple brin biotinylées ayant une longueur de 80 nucléotides. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, les sondes ARN simple brin sont biotinylées aléatoirement sur la totalité de leur séquence. Les sondes oligonucléotidiques peuvent inclure des adaptateurs nécessaires pour l'amplification par PCR, et/ou l'ajout d'un promoteur T7 pour la transcription de la sonde en ARN. Dans un mode de réalisation 10 particulièrement avantageux, les sondes comprennent un adaptateur A de séquence SEQ ID No.1 et un adaptateur B de séquence SEQ ID No.2, l'adaptateur A étant placé à l'extrémité 5' de la séquence de la sonde et l'adaptateur B étant placé l'extrémité 3' de la séquence de la sonde. La sonde peut également inclure un promoteur, en position 5' de l'adaptateur A, ou en 3' de l'adaptateur B, comme par exemple le promoteur T7, de 15 séquence SEQ ID No.3. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les sondes peuvent être conçues pour reconnaitre des séquences d'ADNr 16S, ou toute autre séquence différentielle phylogénétique (autres marqueurs phylogénétiques). Cette construction permet de 20 capturer des portions suffisantes de l'ADNr 16S ou des ADNr 16S complets ou des portions suffisantes ou complètes des autres marqueurs phylogénétiques ou des séquences répétées, nécessaires à l'estimation de la répartition et l'identification des taxa bactériens présents dans l'échantillon biologique. Dans un autre mode de réalisation avantageux selon l'invention, les sondes sont conçues 25 pour capturer les séquences correspondantes aux gènes de virulence des pathogènes, des gènes de résistance aux antibiotiques, des marqueurs fonctionnels ou phylogénétiques, notamment des ADNr 16S, ou des séquences répétées, et ainsi permettre leur identification. Dans un mode de réalisation selon l'invention, les sondes oligonucléotidiques, une fois 30 synthétisées, sont amplifiées à l'aide des adaptateurs A et B pour rajouter le promoteur T7, puis purifiées. L'homme du métier saura utiliser toutes les méthodes adéquates pour l'amplification et la purification. Avantageusement, les sondes peuvent être amplifiées en utilisant le kit Platinium Taq DNA Polymerase High Fidelity commercialisé par la société Invitrogen et peuvent être purifiées en utilisant le kit MinElute PCR purification 3055339 11 commercialisé par la société Qiagen. Les sondes sont ensuite transcrites in vitro grâce au promoteur T7, afin d'obtenir les sondes ARN biotinylées. L'homme du métier saura utiliser toutes les méthodes adéquates pour transcrire les sondes bioyinylées et les purifier. Avantageusement, la transcription in vitro peut être réalisée en utilisant le kit MEGAScript 5 commercialisé par la société Ambion et des dUTP biotinylés commercialisés par la société Tebu-Bio. Les sondes ARN biotinylées peuvent ensuite être purifiées en utilisant le kit RNeasy plus commercialisé par la société Qiagen. Dans un mode de réalisation selon l'invention, des sondes spécifiques de différents gènes et/ou différents pathogènes peuvent être utilisées de manière simultanée pour s'hybrider 10 avec les fragments d'ADN ou ARN ou d'ADNc préparés à partir de l'échantillon biologique. Par exemple, pour l'analyse d'un échantillon biologique, des sondes conçues pour chaque gène d'intérêt peuvent être combinées pour former un mélange de sondes, en amont ou au moment de la mise en contact des sondes avec la banque de fragments d'ADN obtenus à partir de l'échantillon biologique. 15 Au sens de la présente invention, un « mélange de sondes » se réfère à un ensemble de sondes conçues pour être spécifiques d'un ou de différents gènes d'intérêts et ses variants connus ou inconnus appartenant à un pathogène cible particulier et / ou un ensemble de sondes conçues pour être spécifiques d'un ou de différents gènes d'intérêts appartenant à des pathogènes cibles différents. 20 Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le mélange de sondes peut comprendre au moins une sonde, avantageusement au moins 2 sondes, différentes, avantageusement au moins 10 sondes différentes, avantageusement au moins 20 sondes différentes, avantageusement au moins 30 sondes différentes, avantageusement au moins 40 sondes différentes, avantageusement au moins 50 sondes 25 différentes, avantageusement au moins 60 sondes différentes, avantageusement au moins 70 sondes différentes, avantageusement au moins 80 sondes différentes, avantageusement au moins 90 sondes différentes, avantageusement au moins 100 sondes différentes, avantageusement au moins 200 sondes différentes, avantageusement au moins 300 sondes différentes, avantageusement au moins 400 sondes différentes, 30 avantageusement au moins 500 sondes différentes, avantageusement au moins 600 sondes différentes, avantageusement au moins 700 sondes différentes, avantageusement au moins 800 sondes différentes, avantageusement au moins 900 sondes différentes, avantageusement au moins 1000 sondes différentes, avantageusement au moins 1200 sondes différentes, avantageusement au moins 1400 sondes différentes, 3055339 12 avantageusement au moins 1500 sondes différentes, avantageusement au moins 1600 sondes différentes, avantageusement au moins 1700 sondes différentes, avantageusement au moins 1800 sondes différentes, avantageusement au moins 1900 sondes différentes, avantageusement au moins 2000 sondes différentes, 5 avantageusement au moins 3000 sondes différentes, avantageusement au moins 5000 sondes différentes. Avantageusement, au moins 1000 sondes différentes sont présentes dans le mélange de sondes de l'étape a). De manière encore plus avantageuse, au moins 1500 sondes différentes sont présentes dans le mélange de sondes de l'étape a). De manière encore plus avantageuse, 2000 10 sondes différentes sont présentes dans le mélange de sondes de l'étape a). Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le mélange de sondes comprend entre 1 et 5000 sondes différentes, avantageusement entre 100 et 4500 sondes différentes, avantageusement entre 500 et 4000 sondes différentes, avantageusement entre 1000 et 4000 sondes différentes, avantageusement entre 1500 et 15 3000 sondes différentes, avantageusement entre 1600 et 2500 sondes différentes, avantageusement entre 1900 et 2100 sondes différentes. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le mélange de sondes peut être spécifique d'au moins 1, avantageusement au moins 2, avantageusement au moins 10, avantageusement au moins 50, avantageusement au 20 moins 100, avantageusement au moins 150, avantageusement au moins 200, avantageusement au moins 250, avantageusement au moins 300, avantageusement au moins 500, au moins 750, avantageusement au moins 800, avantageusement au moins 900, avantageusement au moins 1 000, ou tout autre nombre de gènes d'intérêts. Avantageusement, le mélange de sondes est spécifique d'au moins 100 gènes d'intérêt. 25 Avantageusement, le mélange de sondes est spécifique d'au moins 200 gènes d'intérêt. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le nombre de gènes d'intérêt ciblés par le mélange de sondes est compris entre 1 et 1000, avantageusement entre 10 et 500 gènes d'intérêt, avantageusement entre 50 et 4500 gènes d'intérêt, avantageusement entre 100 et 400 gènes d'intérêt, avantageusement 30 entre 200 et 300 gènes d'intérêt, avantageusement de 300 gènes d'intérêt. Au sens de la présente invention, une sonde spécifique d'un gène et de l'ensemble de ses variants connus ou inconnus est conçue pour hybrider l'ensemble des gènes et des variants connus ou inconnus de ce gène présents au sein de l'échantillon biologique. Une 3055339 13 sonde est donc spécifique de l'ensemble des variants d'un gène d'intérêt. Dans un mode de réalisation avantageux, les séquences des sondes sont conçues pour cibler les gènes d'intérêts et leurs variants connus ou inconnus en utilisant des outils logiciels tels que KASpOD ou HiSpOD. 5 Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, la sonde est capable de s'hybrider avec un fragment d'ADN ou d'ARN ou d'ADNc du gène d'intérêt et de ses variants connus ou inconnus d'une longueur d'au moins 6 000 nucléotides, avantageusement 20 000 nucléotides encore plus avantageusement 50 000 nucléotides, jusqu'à la longueur totale de la séquence nucléotidique du génome d'intérêt. 10 Préparation d'une banque de fragments d'ADN à partir de l'échantillon biologique Pour obtenir la banque de fragments d'ADN capable d'être hybridée par les sondes telles que décrites ci-dessus, l'échantillon biologique contenant les ADNs pathogènes doit être préparé en vue de l'étape d'hybridation. L'extraction de l'ADN à partir de l'échantillon 15 biologique peut être réalisée par n'importe quelle technique bien connue de l'homme du métier, permettant d'extraire de l'ADN de taille compatible avec la taille des fragments à capturer en vue de l'étape d'hybridation. Avantageusement, l'extraction de l'ADN à partir de l'échantillon biologique peut être réalisée en utilisant des kits d'extraction d'ADN disponibles dans le commerce, comme par exemple les kits QlAamp DNA Blood ou 20 DNeasy Blood & Tissu commercialisé par QIAGEN, et UltraClean Tissue & Cells ou UltraClean BloodSpin commercialisés par MoBio. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'ADN extrait est ensuite fragmenté en fragments d'ADN de longueur spécifique. Avantageusement l'ADN est fragmenté en fragments ayant une longueur d'au moins 6 000 paires de bases, 25 avantageusement d'au moins 20 000 paires de bases, avantageusement d'au moins 50 000 paires de bases. La fragmentation de l'ADN peut être réalisée par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier permettant d'obtenir des fragments d'ADN ayant la longueur désirée. Avantageusement, les fragments d'ADN selon l'invention sont obtenus en utilisant le kit g-TUBE commercialisé par la société Covaris. Dans un mode de 30 réalisation particulièrement avantageux de l'invention, les fragments d'ADN ont soit une longueur de 6 000 paires de bases, soit une longueur de 20 000 paires de bases d'ADN, soit une longueur de 50 000 paires de bases d'ADN. Au sens de la présente invention, il est entendu par « banque de fragments d'ADN » ou « banque », un ensemble de 3055339 14 fragments d'ADN ayant la même longueur, lesdits fragments d'ADN étant obtenus à partir de l'échantillon biologique. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, trois banques de fragments d'ADN peuvent être obtenues à partir de l'échantillon biologique : une banque dite « 6kb » comprenant des fragments d'ADN ayant une longueur moyene 5 de 6 000 paires de bases, une banque dite « 20kb » comprenant des fragments d'ADN ayant une longueur moyenne de 20 000 paires de bases et une banque dite « 50kb » comprenant des fragments d'ADN ayant une longueur moyenne de 50 000 paires de bases. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la banque de fragments d'ADN comprend des fragments d'ADN ayant une longueur d'au moins 6 10 000 paires de bases, avantageusement au moins 20 000 paires de bases, avantageusement au moins 50 000 paires de bases. Dans un mode de réalisation avantageux, la méthode selon l'invention peut en outre comprendre une étape de sélection de taille des ADN fragmentés. Avantageusement, l'étape de sélection peut être réalisée avec le système BluePippin en utilisant les kits 15 0,75% Agarose Gel Cassette Mid Range Targets, 0,75% Agarose Gel Cassette Low Range Targets ou 0,75% Agarose Gel Cassette 50kb commercialisés par la société SageScience. Avantageusement, cette étape de sélection permet de conserver uniquement les fragments d'ADN ayant soit une longueur moyenne de 6 000 paires de bases, soit une 20 longueur moyenne de 20 000 paires de bases, soit une longueur moyenne de 50 000 paires de bases d'ADN. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les banques de fragments d'ADN peuvent être enrichies par amplification, notamment par amplification isotherme par déplacement de brin, permettant d'enrichir d'au moins 1,5 fois, avantageusement au 25 moins 2 fois, avantageusement au moins 5 fois, avantageusement au moins 10 fois, avantageusement au moins 20 fois, avantageusement au moins 50 fois, avantageusement au moins 100 fois, avantageusement au moins 1000 fois la population cible de fragments d'ADN. Avantageusement, l'amplification de la banque peut être réalisée avec le kit IllustraGenomPhi V2 DNA Amplification commercialisé par la société 30 GE Healthcare. Dans un mode de réalisation avantageux, la méthode selon l'invention peut en outre après l'étape d'amplification, comprendre une étape sélection de la taille des banques de fragments d'ADNs amplifiées. Avantageusement, l'étape de sélection de la taille des banques de fragments d'ADNs amplifiées peut être réalisée avec le système BluePippin 3055339 15 en utilisant les kits 0,75% Agarose Gel Cassette Mid Range Targets, 0,75% Agarose Gel Cassette Low Range Targets ou 0,75% Agarose Gel Cassette 50kb commercialisés par la société SageScience. Avantageusement, cette étape de sélection de la taille des banques de fragments d'ADNs 5 amplifiées permet de conserver uniquement les fragments d'ADN amplifiés ayant soit une longueur moyenne de 6 000 paires de bases, soit une longueur moyenne de 20 000 paires de bases, soit une longueur moyenne de 50 000 paires de bases d'ADN. Hybridation et capture des fragments d'ADN Hybridation 10 Les sondes peuvent être mélangées à la banque de fragments d'ADN préalablement à l'étape d'hybridation par n'importe quel moyen connu de l'homme du métier. La quantité de sondes ajoutées à la banque de fragments d'ADN doit être suffisante pour permettre l'hybridation de tous les fragments d'ADN portant les gènes d'intérêts ou ses variants connus ou inconnus. Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, la 15 quantité de sondes introduite dans le mélange est supérieure à la quantité de fragments dans la banque. Le rapport sonde/banque pour l'hybridation est d'environ 1 :1, avantageusement d'environ 250 :1, avantageusement d'environ 1 000 :1, avantageusement d'environ 20 000 :1 ou supérieur. Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, l'étape c) d'hybridation est 20 réalisée en solution ou sur support solide. Avantageusement, l'étape d'hybridation est réalisée en solution. Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, l'étape d'hybridation est réalisée dans des conditions stringentes. Dans un mode de réalisation particulier, la banque de fragments d'ADN est hybridée avec les sondes pendant une durée d'au moins 16 heures, avantageusement d'au moins 20 25 heures, encore plus avantageusement d'au moins 24 heures, et à une température d'au moins 45°C, avantageusement d'au moins 50°C, avantageusement d'au moins 55°C, avantageusement d'au moins 60°C, encore plus avantageusement d'au moins 65°C. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la banque de fragments d'ADN est hybridée avec les sondes pendant 24 heures à une température de 65°C. 30 Avantageusement, le tampon d'hybridation peut comprendre un tampon à base d'un mélange de chlorure de sodium, d'EDTA et de phosphate, commercialisé sous le nom tampon SSPE (« Saline-Sodium Phosphate-EDTA Hybridization Buffer »), une solution Denhardt's, de l'EDTA, un tampon SDS, de l'EDTA et de l'eau. Avantageusement, le 3055339 16 tampon d'hybridation utilisé dans la présente invention pour l'étape d'hybridation comprend du SSPE 20X à une concentration de 10X, du Denhardt's 50X à une concentration de 10X, de l'EDTA 0,5mM pH 8 à une concentration de 10mM, du SDS 10% à une concentration de 0,2% et de l'eau. 5 Capture Après l'hybridation, les sondes biotinylées peuvent être séparées en fonction de la présence du marqueur détectable, et les sondes et les fragments d'ADN non liés sont éliminés dans des conditions de lavage appropriées. Seuls sont conservés les fragments d'ADN qui se sont hybridés spécifiquement avec les sondes biotinylées. Les complexes 10 d'hybridation peuvent être capturés et purifiés à partir du mélange de sondes non liées et des fragments d'ADN non liés de la banque. Par exemple, les complexes d'hybridation peuvent être capturés à l'aide d'une molécule de streptavidine fixée à une phase solide, telle qu'une bille ou une bille magnétique. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, les complexes d'hybridation sont capturés au moyen de 15 billes magnétiques recouvertes de streptavidine, avantageusement en utilisant 500 ng de billes Dynabeads M-280 (Life technologies). Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, l'étape d) de capture est suivie de trois étapes de lavage pour éliminer les sondes et les fragments d'ADN non liés, ces trois étapes de lavage mettant en oeuvre trois tampons de lavage différents. 20 Avantageusement, le premier lavage est réalisé en utilisant un tampon de lavage comprenant du chlorure de sodium, avantageusement à une concentration comprise entre 0,5M et 1,5M, avantageusement à une concentration de 1M, du Tris-HCI, avantageusement à une concentration comprise entre 5mM et 15mM, avantageusement à une concentration de 10mM, et de l'EDTA, avantageusement à une concentration 25 comprise entre 0,5mM et 1,5mM, avantageusement à une concentration de 1 mM. Avantageusement, le premier lavage est réalisé à température ambiante, avantageusement à une température comprise entre 25°C et 30°C. Avantageusement, le premier lavage est réalisé à un pH compris entre 7,0 et 8,0, avantageusement à un pH de 7,5. 30 Avantageusement, le deuxième lavage est réalisé en utilisant un second tampon d'élution comprenant du SSC 20X (SSC 20X = 3M NaCI, 0,3M citrate de sodium), avantageusement à une concentration comprise entre 0,5X et 1,5X, avantageusement à une concentration de 1X et du SDS 10%, avantageusement à une concentration comprise 3055339 17 entre 0,05% et 0,15%, avantageusement à une concentration de 0,1%. Avantageusement, le second lavage est réalisé à température ambiante, avantageusement à une température comprise entre 25°C et 30°C. Avantageusement, le troisième lavage est réalisé en utilisant un troisième tampon 5 d'élution comprenant du SSC 20X, avantageusement à une concentration comprise entre 0,05X et 0,15X, avantageusement à une concentration de 0,1 X et du SDS 10%, avantageusement à une concentration comprise entre 0,05% et 0,15%, avantageusement à une concentration de 0,1%. Avantageusement, le troisième lavage est réalisé à une température comprise entre 30°C et 80°C, avantageusement à une température comprise 10 entre 40°C et 75°C, avantageusement à une température comprise entre 50 °C et 70°C, avantageusement à une température de 65°C. Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, les étapes de lavage de capture peut être suivie d'une étape d'élution par dénaturation chimique à la soude, permettant de séparer les complexes d'hybridation et ainsi libérer les fragments d'ADN 15 capturés. Avantageusement, cette étape permet de séparer les sondes des fragments d'ADN capturés, en sédimentant les billes magnétiques recouvertes de streptavidine sur lesquelles sont fixées les sondes. Les fragments d'ADN capturés sont ensuite récupérés dans le surnageant. Dans un mode de réalisation avantageux, l'étape d'élution peut être réalisée en incubant 20 les billes magnétiques recouvertes de streptavidine sur lesquelles sont fixés les complexes d'hybridation en présence de soude à une concentration comprise entre 0,01M et 1M, avantageusement entre 0,05M et 0,5 M, avantageusement 0,1M, pendant au moins 5 minutes, avantageusement 10 minutes, à température ambiante. Les billes magnétiques recouvertes de streptavidine sédimentent et le surnageant est ensuite 25 récupéré. Un tampon Tris-HCI, avantageusement à une concentration comprise entre 0,5 M et 1,5M, avantageusement à une concentration de 1M, à pH 7,5 est ensuite ajouté au surnageant. Dans un mode de réalisation avantageux selon l'invention, l'étape d'élution peut être suivie d'une étape de purification des fragments d'ADN capturés. Avantageusement, 30 l'étape de purification peut être réalisée avec le kit Microcon DNA fast flow PCR grade, centrifugal filters, dual cycle ETO treated, commercialisé par la société Merck Millipore. 3055339 18 Amplification des fragments d'ADN capturés Dans un mode de réalisation avantageux, la méthode selon l'invention peut en outre comprendre une étape d'amplification des fragments d'ADN résultant de l'étape c) de capture. Avantageusement, l'amplification de la banque peut être réalisée avec le kit 5 IllustraGenomPhi V2 DNA Amplification commercialisé par la société GE Healthcare. Sélection des fragments d'ADN capturés en fonction de leur taille Dans un mode de réalisation avantageux, la méthode selon l'invention peut en outre comprendre une étape de sélection des fragments d'ADN capturés en fonction de leur 10 taille résultant de l'étape c) de capture. Avantageusement, l'étape de sélection peut être réalisée avec avec le système BluePippin utilisant les kits 0,75% Agarose Gel Cassette Mid Range Targets, 0,75% Agarose Gel Cassette Low Range Targets ou 0,75% Agarose Gel Cassette 50kb commercialisés par la société SageScience. Avantageusement, cette étape de sélection permet de conserver uniquement les fragments d'ADN ayant soit une 15 longueur moyenne de 6 000 paires de bases, soit une longueur moyenne de 20 000 paires de bases, soit une longueur moyenne de 50 000 paires de bases d'ADN ou d'ARN converti en ADNc. La distribution de la taille des ADNs capturés peut ensuite être évaluée en utilisant le kit Agilent DNA 12000 commercialisé par la société Agilent. 20 Séquençage des fragments d'ADN capturés Les fragments d'ADN capturés peuvent ensuite être séquences par n'importe quelle technique bien connue de l'homme du métier. Le séquençage des fragments d'ADN capturés peut être réalisé en utilisant les systèmes de séquençage à haut débit 25 commercialisé par la société Illumina Inc., par exemple le système MiSeq ou HiSeq. Toutes les plates-formes connues de l'homme du métier, telles que les plates-formes de première génération telle que Sanger, de deuxième génération telle que Illumina (MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq, Synthetic Long Read, 10X Genomics) ou 454 (Roche) ou SOLiD (Thermo Fisher) ou Ion Torrent (Thermo Fisher) ou Gene Reader (Qiagen) ou 30 Complete Genomics (GGI) et de troisième génération telles que Pacific BioSciences (RSII ou Sequel) ou Oxford Nanopore (MinION ou PromethlON) tout comme les nouvelles plates-formes en développement (GenapSys, Genia, Firefly, NanoString Technologies, 3055339 19 GnuBio, Electron Optica) peuvent être utilisées pour séquencer les fragments d'ADN capturés. Selon la méthode de séquençage utilisée, l'homme du métier sera en mesure de construire les banques adaptées à partir des fragments d'ADN capturés. Reconstruction de grands fragments de génome 5 Les séquences des différents fragments d'ADN de gènes d'intérêt peuvent être assemblées par tout moyen connu de l'homme du métier. Les séquences des différents fragments d'ADN des gènes d'intérêt peuvent être assemblées pour reconstruire la séquence totale du gène d'intérêt, ou un variant connu ou inconnu de celui-ci. Les séquences des différents fragments d'ADN des gènes d'intérêt peuvent être assemblées 10 pour reconstruire la séquence totale du gène d'intérêt, ou un variant connu ou inconnu de celui-ci et les régions flanquantes associées aux séquences ciblées voire la totalité du génome dans lequel est localisé le gène d'intérêt, permettant ainsi son identification. Dans certains modes de réalisation, les séquences sont assemblées à l'aide des outils de bioinformatiques, comme par exemple IDBA-UD, Spades, MetaVelvet. Après l'assemblage, 15 les séquences des gènes d'intérêts, ou des variants connus ou inconnus de ceux-ci, sont confirmées par comparaison des séquences contre des bases de données de séquences connues, telle que la base GenBank du NCBI ou ENA de l'EMBL, afin de caractériser les niveaux de similarité avec les séquences connues du gène d'intérêt, ou un variant de celui-ci. 20 Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la méthode de détection et d'identification in vitro d'un ou plusieurs pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique, comprend les étapes suivantes : a) la préparation d'un mélange d'au moins 1000 sondes capables de cibler spécifiquement un ensemble de séquences de gènes d'intérêts appartenant aux 25 pathogènes cibles, b) la préparation d'une banque de fragments d'ADN à partir de l'échantillon biologique, lesdits fragments d'ADN contenus dans la banque ayant une longueur d'au moins 6 000 paires de bases, c) l'hybridation des fragments d'ADN obtenu à l'étape b) par mise en contact 30 desdits fragments d'ADN avec le mélange de sondes de l'étape a), d) la capture des complexes d'hybridation de l'étape c), e) le séquençage des fragments d'ADN capturés à l'étape d), et 3055339 20 f) l'identification du ou des pathogènes cibles présents dans l'échantillon biologique. Les exemples qui suivent illustrent l'invention. EXEMPLES 5 Exemple 1 : Identification de pathogènes cibles présents dans l'échantillon biologique Préparation des sondes : Un jeu de 1685 sondes ARN simple brin biotinylées ayant une longueur de 80 nucléotides ont été déterminées et préparées afin de de reconnaitre 245 gènes marqueurs de 30 10 pathogènes différents. Les sondes ont été déterminées en utilisant les logiciels KASpOD (K-mer based Algorithm for high-Specific Oligonucleotide Design) (Parisot N. et al., 2012, vol 28, pages 3161-3162) et HiSpOD (High Specific Oligo Design) (Dugat-Bony Elet al., 2011, vol 27, pages 641-648). Un jeu de 15 sondes ayant une longueur de 28 à 50 nucléotides ont été déterminées et 15 préparées afin de reconnaitre l'ADNr 16S ou l'ARNr16S de tous les procaryotes dont les pathogènes. Pathogènes cibles Nombre de Nombre de Séquences concernées biomarqueurs sondes ciblés préparées Bacillus anthracis 14 126 SEQ ID No. 4 à SEQ ID No. 129 Clostridium botulinum 14 185 SEQ ID No. 130 à SEQ ID No. 314 Francisella tularensis 11 84 SEQ ID No. 315 à SEQ ID No. 398 Yersinia pestis 12 86 SEQ ID No. 399 à SEQ ID No. 484 Brucella species 9 38 SEQ ID No. 485 à SEQ ID No. 522 Burkholderia species 5 19 SEQ ID No. 523 à SEQ ID No. 541 Campylobacterjejuni 12 65 SEQ ID No. 542 à SEQ ID No. 606 Chlamydiophyila psittaci 4 25 SEQ ID No. 607 à SEQ ID No. 631 Coxiella bumetii 6 38 SEQ ID No. 632 à SEQ ID No. 669 Escherichia coli 19 121 SEQ ID No. 670 à SEQ ID No. 790 Clostridium perfringens 8 66 SEQ ID No. 791 à SEQ ID No. 856 Listeria monocytogenes 17 124 SEQ ID No. 857 à SEQ ID No. 980 Vibrio species 8 46 SEQ ID No. 981 à SEQ ID No. 1026 Salmonella species 8 58 SEQ ID No. 1027 à SEQ ID No.1084 Shigella species 8 38 SEQ ID No. 1085 à SEQ ID No. 1122 Staphylococcus aureus 12 57 SEQ ID No. 1123 à SEQ ID No. 1179 Rickettsia prowazekii 2 33 SEQ ID No. 1180 à SEQ ID No. 1212 Yersinia enterocolitica 12 53 SEQ ID No. 1213 à SEQ ID No. 1265 3055339 21 Rickettsia species 3 28 SEQ ID No. 1266 à SEQ ID No. 1293 Anaplasma phagocytophilum 3 29 SEQ ID No. 1294 à SEQ ID No. 1322 Mycobacterium tuberculosis 9 55 SEQ ID No. 1323 à SEQ ID No. 1377 Bartonella henselae 5 35 SEQ ID No. 1378 à SEQ ID No. 1412 Bordetella pertussis 6 65 SEQ ID No. 1413 à SEQ ID No. 1477 Borrelia burgdorferi 3 14 SEQ ID No. 1478 à SEQ ID No. 1491 Borrelia miyamotoi 3 16 SEQ ID No. 1492 à SEQ ID No. 1507 Clostridium difficile 3 26 SEQ ID No. 1508 à SEQ ID No. 1533 Ehrlichia species 5 17 SEQ ID No. 1534 à SEQ ID No. 1550 Enterococcus species 8 65 SEQ ID No. 1551 à SEQ ID No. 1615 Leptospira species 6 32 SEQ ID No. 1616 à SEQ ID No. 1647 Streptococcus pyogenes 10 41 SEQ ID No. 1648 à SEQ ID No. 1688 ARN 16S 1 15 SEQ ID No. 1688 à SEQ ID No. 1703 Tableau 2 : Exemple de pathogènes cibles et sondes associées Les séquences des adaptateurs A (SEQ ID No.1), et B (SEQ ID No.2) ont été ajoutées à chaque extrémité des sondes en vue de l'amplification par PCR. Le promoteur T7 (SEQ ID No.3) a été ajouté en amont de l'adaptateur A par PCR avec le kit Platinium Taq DNA 5 Polymerase High Fidelity (Invitrogen) en utilisant des amorces s'hybridant sur les Adaptateurs A et B (SEQ ID No. 1 et 2). Les produits PCR obtenus ont été purifiés avec le kit MinElute PCR purfication (Qiagen). Les sondes ARN simple brin biotinylées ont été synthétisées par transcription in vitro en utilisant le kit MEGAScript commercialisé par la société Ambion et des dUTP biotinylés (Tebu-Bio), et ont été purifiées avec le kit RNeasy 10 plus (Qiagen). Echantillons biologiques : Les échantillons biologiques sont obtenus par aspiration bronchique ou lavage bronchoalvéolaire, en injectant dans les bronches et alvéoles dudit patient une solution de liquide physiologique stérile à 37°C ou par aspiration bronchique, afin d'aspirer du mucus. Le 15 liquide ainsi obtenu est ensuite utilisé. Préparation des banques de fragments d'ADN : Isolement de l'ADN : L'ADN génomique contenu dans l'échantillon biologique est extrait par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier, notamment en utilisant QlAamp DNA kit 20 (Qiagen). 3055339 22 Banques de 6kb, 20 kb et 50 kb: 4 pg d'ADN obtenu à partir de l'échantillon de sol sont fragmentés à une taille de 6 et 20 kb en utilisant le kit g-TUBE (Covaris). Les fragments d'une taille de 6, 20 et 50 kb (+/2kb) sont sélectionnés avec le système BluePippin (Sage Science). Les fragments sont 5 amplifiés en utilisant le Kit Illustra GenomPhi V2 DNA Amplification (ref 25-6600-32, GE Healthcare). Les fragments amplifiés d'une taille de 6, 20 et 50 kb (+/- 2kb) sont à nouveau sélectionnés avec le système BluePippin (Sage Science). Hybridation et Capture Pour chaque capture, 2,5 pg d'ADN de sperme de saumon fragmenté (Salmon Sperm 10 DNA, sheared (ref AM9680, Ambion)) et 2 pg de banque sont mélangés, dénaturés pendant 5 minutes à 95°C, incubés pendant 5 minutes à 65°C avant l'ajout de 13pL de tampon d'hybridation préchauffé à 65°C (SSPE 10 mol/L, Denhardt's 10 mol/L, EDTA 10 mM, pH8 et SDS 0,2%) et de 500 ng de sondes ARN biotinylées également préchauffées à 65°C. Après l'hybridation à 65°C pendant 24 heures, les complexes d'hybridation 15 (sonde/banque) sont capturés en utilisant 500 ng de billes de magnétiques recouvertes de streptavidine (Dynabeads M-280 Streptavidin (ref 11205D, Life Technologies) préalablement lavées. Les billes sont sédimentées en utilisant un banc magnétique (Ambion) et lavées trois fois à température ambiante avec 500 pl de 1 mol/L SSC/0,1% SDS et puis trois fois à 65°C avec 500p1 de 0,1 mol/L SSC/0,1% SDS préchauffé. Les 20 fragments d'ADN capturés sont élues avec 50p1 de NaOH à 0,1M. Après la sédimentation des billes, le surnageant contenant l'ADN est transféré dans un tube stérile contenant 70p1 de Tris-HCI à 1M, pH 7,5. Les fragments d'ADN capturés sont ensuite purifiés en utilisant le Kit Microcon DNA Fast Flow PCR Grade, Centrifugal Filters, Dual Cycle ETO Treated (ref MRCFOR100ET, Merck Millipore). Les fragments d'ADN sont ensuite 25 amplifiés en utilisant le Kit Illustra GenomPhi V2 DNA Amplification (ref 25-6600-32, GE Healthcare). Séquençage des fragments d'ADN capturés Les fragments d'ADN capturés sont séquences en utilisant les plate-formes de 2ème génération de type Illumina et/ou de 3ème génération de type PacBio après la construction 30 de la banque en accord avec les instructions du fabricant. La méthode décrite ci-dessus a permis de détecter et d'identifier de façon exhaustive les pathogènes présents dans l'échantillon avec une fiabilité égale voire supérieure aux REVENDICATIONS1. Méthode de détection et d'identification in vitro d'un ou plusieurs pathogènes cibles présents dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) la préparation d'un mélange de sondes capables de cibler spécifiquement un ensemble de séquences de gènes d'intérêts appartenant aux pathogènes cibles, b) la préparation d'une banque de fragments d'ADN à partir de l'échantillon biologique, lesdits fragments d'ADN contenus dans la banque ayant une longueur d'au moins 6 000 paires de bases, c) l'hybridation des fragments d'ADN obtenu à l'étape b) par mise en contact desdits fragments d'ADN avec le mélange de sondes de l'étape a), d) la capture des complexes d'hybridation de l'étape c), e) le séquençage des fragments d'ADN capturés à l'étape d), et f) l'identification du ou des pathogènes cibles présents dans l'échantillon biologique. 2. Méthode de détection et d'identification selon la revendication 1, dans laquelle le ou les pathogènes cibles sont choisis dans le groupe comprenant : les bactéries, les virus, les viroïdes, les champignons, les unicellulaires eucaryotes et les vers. 3. Méthode de détection et d'identification selon la revendication 2, dans laquelle le ou les bactéries cibles sont choisis dans le groupe comprenant : Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Brucella, Burkholderia, Campylobacter jejuni, Chlamydiophila psittaci, Coxiella bumetii, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Vibrio, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Rickettsia, Yersinia enterocolitica' Mycobacterium tuberculosis, Anaplasma phagocytophilum, Bartonella henselae, Bordetella pertussis, Borrelia miyamotoi, Clostridium difficile, Ehrlichia, Enterococcus, Leptospira, Borrelia burgdorferi, Streptococcus pyogenes, Legionella, Mycoplasma, Nocardia, Pneumocystis ou un mélange de deux ou plusieurs de ces bactéries cibles. 3055339 25 4. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l'échantillon biologique peut être obtenu à partir d'un fluide corporel ou d'un tissu prélevé chez l'animal ou chez l'Homme. 5 5. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle les séquences de gènes d'intérêts sont des séquences correspondantes aux gènes de virulence, aux gènes de résistance aux antibiotiques, à des marqueurs phylogénétiques, à des marqueurs fonctionnels ou à des séquences répétées. 10 6. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle les sondes de l'étape a) sont des sondes ARN simple brin. 7. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 15 1 à 6, dans laquelle les sondes de l'étape a) ont une longueur d'au moins 60 nucléotides contigus. 8. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle les sondes de l'étape a) sont des sondes ARN biotinylées. 20 9. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle les sondes de l'étape a) comprend un adaptateur A de séquence SEQ ID No.1 et un adaptateur B de séquence SEQ ID No.2, l'adaptateur A étant placé à l'extrémité 5' de la séquence de la sonde et l'adaptateur B étant placé 25 l'extrémité 3' de la séquence de la sonde. 10. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle le mélange de sondes de l'étape a) comprend au moins 1000 sondes différentes. 30 11. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle le mélange de sondes est spécifique d'au moins 100 gènes d'intérêts. 12. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle la banque de fragments d'ADN comprend des fragments 3055339 26 d'ADN ayant une longueur d'au moins 20 000 paires de bases, avantageusement au moins 50 000 paires de bases. 13. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 5 1 à 12, dans laquelle l'étape c) d'hybridation est réalisée en solution. 14. Méthode de détection et d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle l'étape d) de capture des complexes d'hybridation est réalisée au moyen de billes magnétiques recouvertes de streptavidine. 10