Brevet FR3059781A1 — publié le 20180608

La présente invention concerne un procédé de diagnostic. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour diagnostiquer, déterminer le type ou évaluer la sévérité d'une maladie articulaire affectant un mammifère, notamment l'arthrose. Les maladies articulaires, ou arthropathies, touchent les articulations et comprennent notamment l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et les arthralgies. Parmi ces maladies articulaires, l'arthrose aussi dénommée ostéo-arthrite est la plus répandue. La prévalence de l'arthrose est en constante augmentation dans le monde, car elle est liée au vieillissement et au surpoids de la population. Elle se manifeste le plus souvent par des douleurs mécaniques et/ou une gêne, lors des mouvements d'une articulation. De nombreuses articulations peuvent être touchées par l'arthrose. Les principales sont les cervicales et les lombaires (entre 70 et 75 %), le genou (40%), le pouce (30%), la hanche et la cheville (10%) et les épaules (2%). L'arthrose a longtemps été présentée comme une « usure » du cartilage alors qu'il s'agit bien d'un syndrome destructeur et inflammatoire, associé à différents facteurs de risque. Les scientifiques ne parlent plus d'arthrose en général mais « des arthroses » en fonction du profil du patient : arthrose liée à l'âge, arthrose liée à une obésité, arthrose liée à une maladie de l'articulation, etc. L'objectif à l'heure actuelle est d'individualiser la prise en charge et les traitements en fonction de ces différents profils. Les lésions du cartilage ne régressent pas au cours du temps et leur évolution n'est pas linéaire. Elle peut être très rapide et rendre nécessaire la pose d'une prothèse en moins de 5 ans. L'arthrose peut également évoluer lentement, sur plusieurs années, sans induire de handicap majeur. Le diagnostic de la maladie s'établit généralement par (i) l'observation par le patient lui-même d'une douleur ou d'une gêne dans une articulation, et (ii) une radiographie de l'articulation en question qui permet de constater de visu l'état de dégradation du cartilage. Toutefois, il n'y a pas de relation entre l'importance des lésions radiologiques et l'importance de la douleur arthrosique. 3059781 2 Des critères de diagnostic clinique ont été développés par l'ACR (American College of Rheumatology), basés sur la description des douleurs et/ou gênes (Litwic et al., 2013). Les radiographies peuvent montrer des signes très caractéristiques de l'arthrose 5 telles que : - le pincement articulaire, - l'ostéophyte, c'est-à-dire un surplus d'os autour de l'articulation, - la condensation de l'os sous le cartilage. - les géodes dans l'os qui correspondent à des « trous ». 10 La sévérité de la maladie est le plus généralement mesurée selon l'échelle de Kellgren & Lawrence, qui ont établi une échelle de scores de sévérité radiologique K/L allant de 0 à 4, cette échelle ayant été maintenant adoptée par l'OMS. Il n'existe à ce jour que des traitements symptomatiques pour soulager la douleur. Aucune thérapeutique anti-arthrosique capable de protéger le cartilage n'est 15 actuellement disponible. La recherche sur les maladies articulaires se focalise actuellement sur deux objectifs principaux, d'une part trouver des cibles thérapeutiques, et d'autre part identifier des biomarqueurs (i) permettant de diagnostiquer la maladie avant l'apparition des symptômes invalidants, (ii) permettant de déterminer le type de maladie afin de 20 personnaliser le traitement, et (iii) permettant de déterminer le stade de la maladie, ainsi de prédire au plus juste l'évolution de la maladie. La présente invention concerne la réalisation de ce deuxième objectif. Actuellement, et comme indiqué précédemment, le diagnostic s'effectue sur la base de l'examen clinique et des images radiologiques. Les chercheurs s'emploient à 25 identifier des molécules dont la présence ou la concentration dans le sérum ou l'urine pourrait servir de biomarqueur, sans que toutefois à l'heure actuelle aucune molécule candidate ne permette de catégoriser les patients (Lotz et al., 2013). Il a cependant été mis en évidence un lien entre la présence de certains micro-ARN circulants dans le sérum, et la sévérité de l'arthrose du genou ou de la hanche (Beyer et al., 2015) 30 Lors d'une poussée avec un épanchement de liquide intra-articulaire aussi appelé liquide synovial, l'analyse de ce liquide recueilli lors d'une ponction de l'articulation peut aider à confirmer et/ou affiner le diagnostic. 3059781 3 En analysant la composition du liquide synovial pathologique par spectroscopie Raman, l'équipe du Dr Esmonde-White a identifié un lien entre ledit spectre Raman du liquide synovial et la sévérité, selon le score K/L, de l'arthrose du genou. En particulier, des ratios d'intensité de bandes Raman ont été corrélés de manière significative 5 avec la sévérité radiographique de la maladie (Esmonde-White et al., 2009). Dans la demande US 2007/0082409, l'analyse du spectre Raman du liquide synovial a permis de déterminer la présence de certaines molécules, tel que l'acide hyaluronique (HA). Ce « biomarqueur » reste toutefois difficile à mettre en oeuvre, un équipement 10 permettant d'effectuer une spectroscopie Raman étant nécessaire. Les inventeurs ont mis en évidence un lien entre les caractéristiques morphologiques d'une goutte de liquide synovial et la présence, le type ou la sévérité d'une maladie articulaire touchant le mammifère dont est issu le liquide synovial. Le procédé tel que présenté ci-dessous permet de diagnostiquer une maladie 15 articulaire et/ou d'obtenir des informations sur son type ou sa sévérité de manière simple, rapide et à faible coût. RE SUME DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une 20 maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou évaluer la sévérité de ladite maladie, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ; 25 b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ; c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de 30 référence représentative d'un liquide synovial de référence. 3059781 4 De préférence, le paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte. Par ailleurs, selon un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé peut 5 comprendre de plus les étapes suivantes : e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman représentatif d'un liquide synovial de référence. 10 La présente invention concerne également un procédé in vitro de suivi d'un mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Ii, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ; 15 b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ; c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur 20 obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu à un instant 10 antérieur à l'instant La présente invention concerne également un procédé in vitro pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un mammifère atteint de ladite 25 maladie et auquel est administré ledit traitement, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ; b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ; 30 c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et 3059781 5 d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence. La présente invention concerne également un procédé de criblage in vivo chez 5 un mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats audit mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que 10 du verre ; b) séchage de la goutte déposée à l'étape a); c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et 15 d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence. FIGURES Figure 1. Représentation schématique du protocole de dépôt de gouttes (DDRS). 20 Figure 2. Images obtenues par la technique DDRS : (a) Images prises au microscope à lumière blanche d'une goutte sèche de liquide synovial (LS) montrant des structures typiques dans deux régions distinctes : une zone périphérique translucide présentant des cracks radiaux et une zone centrale avec des dépôts cristallins de forme dendritiques. Les acquisitions Raman ont été réalisées dans les zones cardinales 25 périphériques et sont représentées par des rectangles. (b) L'image supérieure mesurée avec un interféromètre montre que les quatre ROI (Region of Interest) sont positionnées dans des zones où les solutés sont concentrés. Figure 3. Exemples d'images 2D et 3D pour un LS sain (partie supérieure de la figure) et un LS arthrosique (LS OA - partie inférieure de la figure) : la goutte de LS sain est de 30 taille inférieure à celle de LS OA ; sur la goutte de LS sain, un cercle noir est visible entre la périphérie extérieure et le centre, et la hauteur maximale du bourrelet est de l'ordre de 12 jam (la hauteur est représentée par les variations de couleur noir/blanc) ; sur la goutte de 3059781 6 LS OA, on voit clairement un bourrelet en périphérie, dont la hauteur maximale est de l'ordre de 25 iam et est plus large que sur la goutte de LS sain. Figure 4. A) Boîtes à moustache (ie. « box plot ») (représentant médianes, quartiles et valeurs minimales et maximales) des surfaces des gouttes (partie gauche de la Figure 4A) 5 et des hauteurs de bourrelet entre gouttes (partie droite de la Figure 4A) de LS sains et arthrosiques : les étoiles témoignent des différences significatives* (p REVENDICATIONS1. Procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou évaluer la sévérité de ladite 5 maladie, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ; b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ; c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques 10 morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence. 15 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte. 20 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le procédé comprend de plus les étapes suivantes : e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence. 25 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape c) de mesure est réalisée par une méthode d'interférométrie à lumière blanche. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la maladie articulaire est l'arthrose. 30 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la sévérité de la maladie articulaire correspond à des symptômes cliniques importants et/ou à un capital cartilagineux faible et/ou à une synovite et/ou à un remodelage osseux. 3059781 36 7. Procédé in vitro de suivi d'un mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Ii, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ; b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ; c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu à un instant Io antérieur à l'instant II. 8. Procédé in vitro pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un mammifère atteint de ladite maladie et auquel est administré ledit traitement, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ; b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ; c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence. 9. Procédé de criblage chez un mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats audit mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ; b) séchage de la goutte déposée à l'étape a); 3059781 37 c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de 5 référence représentative d'un liquide synovial de référence.