Brevet FR3056227A1 — publié le 20180323

METHODE D'EVALUATION DU POTENTIEL D'IRRITATION OCULAIRE DE PRODUITS CHIMIQUES La présente invention concerne une méthode d'évaluation et de catégorisation du potentiel d'irritation oculaire de 5 produits chimiques. Pour évaluer l'innocuité de produits chimiques au niveau de l'oeil, on connait le test de Draize qui est un test toxicologique invasif basé sur un protocole d'expérimentation animale, mis au point en 1944 par John H. 10 Draize et Jacob M. Spines, toxicologues de la Food and Drug Administration (FDA). Le test consiste à tester un produit dans l'oeil d'un animal afin d'évaluer son innocuité oculaire. En pratique, il consiste à appliquer 0,1 millilitre ou 0,1 15 gramme d'une substance dans l'oeil d'un animal conscient, souvent un lapin, pendant une à vingt-quatre heures. On observe ensuite, pendant une durée qui peut aller jusqu'à 21 jours, l'éventuelle apparition d'une opacité de la cornée, d'une conjonctivite, d'un oedème, ou encore de 20 sécrétions. L'utilisation d'animaux en laboratoire dans le cadre du test de Draize est un sujet combattu par les défenseurs des animaux. Au sein de l'Union européenne, l'expérimentation animale est encadrée par la directive 25 2010/63, qui encourage le développement de méthodes de tests alternatives. Les produits chimiques sont classifiés selon un système globalisé et mis en place par les Nations Unies connu sous le terme United Nations Globally Harmonized Sytem et 30 concernant les propriétés d'irritation oculaire, les 1 3056227 produits sont classés en plusieurs catégories. La catégorie 1 concerne les produits causant des dommages dont on ne constate pas la réversibilité après 21 jours, la catégorie 2A concerne les produits irritants pour les yeux de manière 5 réversible avant 21 jours et la catégorie 2B concerne les produits moyennement irritants pour les yeux de manière réversible avant 21 jours. Les produits non irritants ne sont pas classifiés. La législation Européenne combine les catégories 2A et 2B en une seule catégorie 2 qualifiée 10 d'irritante de manière réversible pour les yeux. On connaît aussi un procédé pour estimer l'inconfort oculaire ou le potentiel irritant d'un produit chimique tel qu'un produit cosmétique. Ce procédé comprend la culture in vitro d'un modèle d'épiderme, le dépôt du produit que l'on 15 souhaite étudier sur modèle d'épiderme cultivé, et la quantification du nombre de cellules vivantes survivantes afin d'évaluer l'inconfort oculaire ou le potentiel irritant de celui-ci. Un tel procédé, développé en remplacement de l'expérimentation animale, présente 20 l'inconvénient d'être long et coûteux et peu discriminant. De plus cette méthode ne constitue pas une méthode de remplacement intégrale, puisqu'elle ne permet pas de détecter de façon fiable toute la gamme d'irritations intermédiaires. 25 Ainsi, il apparait qu'il existe un besoin en un test ou méthode permettant d'une part de remplacer le test de Draize et de fournir en particulier une méthode permettant de différencier et de catégoriser rapidement les composés causant une irritation oculaire irréversible à 21 jours de 30 ceux dont les effets sont réversibles avant 21 jours. 2 3056227 Les inventeurs de la présente demande se sont donc penchés sur le développement d'un test in vitro pour la détection du potentiel irritant de produits chimiques combinant un modèle cellulaire cornéal à une sélection de marqueurs moléculaires prédictifs et qualitatifs permettant de classifier les composés en 3 catégories, à savoir dommages non réversibles aux yeux 21 jours après application (catégorie 1), dommages réversibles aux yeux 21 jours après application (catégorie 2) et non irritation (no Catégorie). De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que la réponse consécutive à l'action d'une substance irritante se fait directement sur un épithélium cornéal reconstruit in vitro, et que le degré d'irritation, et la qualification de cette irritation d'une molécule, peut être déterminé grâce à l'utilisation de biomarqueurs spécifiques de l'irritation oculaire. Il est notable de remarquer, et cela constitue une caractéristique surprenante de la présente méthode, que les marqueurs moléculaires mise en oeuvre n'ont jamais été décrits ou divulgués en relation avec l'irritation oculaire. Les Inventeurs ont mis en évidence qu'un epithélium cornéal reconstruit in vitro constitue un modèle suffisant pour mettre en évidence des biomarqueurs spécifiques de l'irritation oculaire chez l'homme, et que ces biomarqueurs permettent en outre de prédire le degré d'irritation et donc de classifier de manière prédictive les produits testés selon les 3 catégories telles qu'indiquées plus avant. 3 3056227 Ainsi, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, comprenant les étapes de: a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon 5 cornéal reconstruit in vitro; b) mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, 10 COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAST, IRF1, CYR61. De préférence, la méthode selon la présente invention peut comprendre en outre une étape c) de détermination d'un index d'irritation oculaire d'un composé test. Préférentiellement, la méthode comprend aussi une étape d) 15 de catégorisation dudit composé comme présentant un potentiel d'irritation oculaire selon la valeur de l'index d'irritation oculaire obtenu. De préférence, la méthode selon la présente invention est une méthode in vitro. 20 Tel qu'utilisé ici, le terme « échantillon cornéal reconstruit in vitro » se réfère à un échantillon de cellules épithéliales de cornée cultivées en milieu de culture défini ou tout modèle utilisant des cellules épithéliales squameuses humaines et présentant une 25 morphologie similaire à la cornée humaine, tels que les modèles de cornée in vitro du type de ceux commercialisés sous la marque EpiOcular®. Plus particulièrement encore, cet « échantillon cornéal reconstruit in vitro » est un échantillon comprenant, ou 4 3056227 constitué par, des cellules épithéliales de cornée immortalisées, cultivées en milieu de culture défini et disposées en couche fine sur une membrane synthétique à l'interface eau-air. 5 De préférence, lesdites cellules épithéliales de cornée immortalisées sont des cellules humaines. Dans un mode de réalisation particulier, cet « échantillon cornéal reconstruit in vitro » est un échantillon HCE SkinEthic® commercialisé par la société Episkin (Lyon, 10 France) qui est un épithélium de cornée reconstruit constitué de kératinocytes de cornée humaine, particulièrement des cellules transformées pour être rendues immortelles. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la 15 mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous la forme solide, par exemple en poudre. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée 20 avec le composé test sous la forme liquide. Au sens de la présente invention, la mesure de l'expression dudit au moins un gène de l'étape b) permet de déterminer le niveau d'expression dudit gène. 25 Le composé test peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc. 5 3056227 Le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé test peut être défini en termes de structure et/ou 5 de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé test peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou 10 plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée. La présente invention est particulièrement adaptée à l'identification d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps 15 de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée. 20 De préférence, dans la méthode selon la présente invention, le niveau d'expression dudit gène est évalué par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par mesure du niveau 25 d'expression de l'ARNm dudit gène ou d'un fragment de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré, l'expression dudit au moins un gène est effectuée par analyse de l'expression de 30 transcrits d'ARNm ou de précurseurs d'ARNm, tel qu'un ARN 6 3056227 natif, dudit gène. Ladite analyse peut être réalisée en préparant l'ARNm/ADNc de cellules d'un échantillon biologique d'un patient, et hybridation de l'ARNm /ADNc avec un polynucléotide de référence. L'ARNm/ADNc préparé 5 peut être utilisé dans une analyse par hybridation ou amplification qui inclut, sans s'y limiter, les analyses Southern et Northen, les analyses par PCR (« polymerase chain reaction »), telle que la PCR quantitative (Taqman) et l'utilisation de sondes (« probes arrays ») telles que 10 les matrices ADN GeneChipED(AFFYMETRIX). Avantageusement, l'analyse de l'expression du niveau d'ARNm transcrit dudit au moins un gène implique un procédé d'amplification des acides nucléiques, comme par exemple la RT-PCR (mode de réalisation expérimental décrit dans le 15 Brevet US 4,683,202), la réaction en chaîne par la ligase (BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991), la réplication de séquences auto-entretenue (« self sustained sequence replication ») (GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p: 1874-1878, 1990), le 20 système d'amplification transcriptionnelle. (KWOH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989), la « Q-Beta Replicase » (LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988), la « rolling circle replication » (U. S. Patent No. 5,854,033) ou toute autre méthode 25 d'amplification d'acides nucléiques, suivie d'une étape de détection des molécules amplifiées par des techniques bien connues de l'homme du métier. Ces modes de détection sont particulièrement utiles pour la détection de molécules d'acides nucléiques en très faibles quantités. 30 Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la méthode selon la présente invention comprend une étape supplémentaire d'amplification de l'ARNm ou de l'ADNc dudit 7 3056227 gène, de la séquence complémentaire de celle-ci ou d'un fragment de celle-ci. Telles qu'utilisées ici, les amorces d'amplifications sont 5 définies comme étant une paire de molécules d'acides nucléiques qui peuvent s'apparier respectivement aux régions 3' et 5' d'un gène de façon spécifique (brins positif et négatif, ou inversement) et encadrent une courte région dudit gène. De manière générale, les amorces 10 d'amplification ont une longueur de 10 à 30 nucléotides et permettent l'amplification d'une région d'une longueur comprise entre 50 et 200 nucléotides. Dans un autre mode de réalisation préféré, la mesure de 15 l'expression dudit au moins un gène est réalisée par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène. Ladite analyse peut être réalisée en utilisant un anticorps (par exemple, un anticorps radiomarqué, marqué avec un chromophore, un fluorophore, ou une enzyme), un dérivé 20 d'anticorps (par exemple un anticorps conjugué à un substrat ou à une protéine ou un ligand d'une protéine d'un couple ligand/protéine (par exemple biotine-streptavidine)) ou un fragment d'anticorps (par exemple un anticorps à une seule chaîne, un domaine hypervariable d'un anticorps 25 isolé, etc.) qui se lie spécifiquement au polypeptide codé par ledit gène. Lesdites analyses peuvent être réalisées par de nombreuses techniques à la portée de l'homme du métier incluant, sans s'y limiter, les tests immunologiques basés sur l'utilisation d'activité enzymatique (« enzyme 30 immunoassay » EIA), les tests immunologiques basés sur l'utilisation d'isotopes radioactifs (RIA), l'analyse par 8 3056227 Western blot et les tests ELISA (« enzyme linked immunoabsorbant assay »). Au sens de la présente invention, on entend par 5 « polypeptide » une séquence comprenant au moins deux acides aminés, et les termes « polypeptide », « peptide » et « protéine » peuvent être indifféremment utilisés. Par « fragment de l'ARNm ou de l'ADNc », on entend une 10 séquence d'au moins 50 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides nucléiques, de préférence d'au moins 200 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides nucléiques, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 15 acides nucléiques. Par « fragment du polypeptide », on entend une séquence d'au moins 50 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides aminés, de préférence d'au moins 200 20 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides aminés, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides aminés. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans 25 laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, 9 3056227 IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans 5 laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins trois gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, 10 MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins quatre gènes choisis dans le groupe constitué par : 15 HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le 20 potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins cinq gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, 25 IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au 30 moins six gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, 10 3056227 CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le 5 potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins sept gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, 10 IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au 15 moins huit gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. 20 Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins neuf gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, 25 CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans 30 laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins dix gènes choisis dans le groupe constitué par : 11 3056227 HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. 5 Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins onze gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, 10 CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans 15 laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins douze gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, 20 MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins treize gènes choisis dans le groupe constitué par : 25 HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. 30 12 3056227 Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à 5 l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1. 10 Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de 15 l'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en 20 particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test SOUS forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins trois gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, 25 SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme 30 liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins quatre gènes choisis dans le groupe 13 3056227 constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en 5 particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins cinq gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, 10 HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme 15 liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins six gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le 20 potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins sept gènes choisis dans le groupe 25 constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à 30 l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de 14 3056227 l'expression d'au moins huit gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le 5 potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins neuf gènes choisis dans le groupe 10 constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à 15 l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression des gènes du groupe constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1. 20 Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de 25 l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en 30 particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme 15 3056227 solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. 5 Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de 10 l'expression d'au moins trois gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en 15 particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins quatre gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, 20 HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme 25 solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins cinq gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le 30 potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à 16 3056227 l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins six gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, 5 CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme 10 solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins sept gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le 15 potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins huit gènes choisis dans le groupe 20 constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à 25 l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins neuf gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. 30 Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en 17 3056227 particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins dix gènes choisis dans le groupe 5 constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à 10 l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins onze gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. 15 Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de 20 l'expression d'au moins douze gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le 25 potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression des gènes du groupe constitué par : IL-24, IL- 30 23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. 18 3056227 Dans un mode de réalisation particulier de la méthode, lors de l'étape a), le composé test mis en contact avec l'échantillon cornéal reconstruit in vitro est sous la forme liquide ou solide. Lorsque le composé test est 5 liquide, il peut être utilisé pur ou dilué. Le composé peut être dilué dans un solvant physiologiquement acceptable, tel qu'un tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) par exemple, et est donc présent à une concentration massique comprise entre 0.1 % et 100%. 10 Lorsque le composé est dilué il est présent à une concentration massique comprise entre 10 et 60%, plus particulièrement entre 20 et 50%, plus particulièrement entre 25 et 40% et plus particulièrement encore 30%. 15 L'étape c) de la méthode comprend la détermination d'un index d'irritation oculaire du composé. Plus particulièrement, la détermination de l'index d'irritation oculaire du composé comprend l'attribution d'une valeur seuil de surexpression à chaque gène dont 20 l'expression est mesurée. La valeur seuil de surexpression correspond à un facteur d'augmentation de l'expression du gène lors de la mise en contact avec le composé à tester par rapport à l'expression dudit gène lors de la mise en contact avec un témoin. 25 De préférence, la méthode selon la présente invention comprend en outre une étape de comparaison du niveau d'expression dudit gène avec une valeur de référence. Cette valeur de référence peut servir de contrôle positif et/ou négatif. 19 3056227 Un contrôle positif peut par exemple être effectué en comparant le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test avec le niveau d'expression dudit 5 au moins un gène en présence d'un composé connu comme irritant oculaire. Par exemple, si le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test est supérieur ou égal au 10 niveau d'expression dudit au moins un gène en présence d'un composé dont le potentiel irritant est connu, on pourra en conclure au potentiel irritant dudit composé. 15 Un contrôle négatif peut être réalisé en l'absence du composé test ou en présence d'un composé connu comme non irritant comme par exemple l'huile d'olive, le 1, 9- decadiene (CAS * 1647-16-1), le triclobarban (cas * 101- 20 20-2 ) ou le tampon dans lequel le produit à tester est dissout ou dilué lors de son utilisation dans la méthode. Dans le cadre de la présente invention, on pourra conclure qu'un composé test présente un potentiel irritant oculaire 25 si une surexpression dudit gène est observée par rapport à son niveau d'expression en l'absence dudit composé test. 20 3056227 On entend par « surexpression », un niveau d'expression significativement plus élevé dudit gène par rapport à son niveau d'expression normal. De préférence, on entend par surexpression un niveau d'expression dans un échantillon 5 biologique qui est supérieur à au moins 20% du niveau normal d'expression dudit gène (c'est-à-dire 1,2 fois plus), de préférence supérieur à au moins 50% du niveau normal d'expression dudit gène (c'est-à-dire 1,5 fois plus), et de manière particulièrement préférée supérieur 10 d'au moins 90% au niveau normal d'expression dudit gène (c'est-à-dire aussi 1,9 fois plus). Le « niveau d'expression en l'absence dudit composé test » ou « niveau normal » est le niveau d'expression dudit gène dans un échantillon contrôle correspondant potentiellement 15 à l'échantillon biologique d'un tissu ne présentant pas de réaction de d'irritation ou, de préférence, à la moyenne du niveau d'expression dudit gène dans différents échantillons contrôle non exposé au composé test. 20 De préférence, l'étape b) est réalisé entre 2 et 24 heures après l'étape a), de manière encore préférée entre 4 et 18 heures après l'étape a), de manière particulièrement préférée entre 5 et 7 heures après l'étape a) et de manière encore plus préférée 6 heures après l'étape a). 25 Le témoin présentant un niveau d'expression normal consiste à la mise en contact de l'échantillon cornéal reconstruit in vitro avec un liquide physiologiquement acceptable non 30 irritant, tel que par exemple le liquide dans lequel est 21 3056227 dissout ou dilué le composé à tester, par exemple un tampon, plus particulièrement par exemple un tampon PBS. La valeur seuil indiquant une surexpression significative du gène dont l'expression est mesurée peut être comprise en 5 1,1 et 10, plus particulièrement entre 1,1 et 7, plus particulièrement entre 1,4 et 6, plus particulièrement encore entre 2 et 5, plus particulièrement encore entre 2 et 4. Comme indiqué plus avant dans un des groupes de gènes 10 sélectionnés, dans le cas de composés test mis en contact à l'étape a) sous la forme liquide, les gènes préférés sont choisis dans le groupe comprenant au moins, ou consistant en, HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1. 15 Pour HSP9OAA1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement 1,4. Pour CASP1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1,5. Pour DLK1, la valeur seuil de surexpression est comprise 20 entre 3 et 8, plus particulièrement environ 5, plus particulièrement encore 5,25. Pour CLEC4D, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 4, plus particulièrement environ 3,6. Pour IL-24, la valeur seuil de surexpression est comprise 25 entre 3 et 8, plus particulièrement environ 6,2. Pour SLIT2, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1,3. 22 3056227 Pour HSPA1A, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 5, plus particulièrement environ 3. Pour FSHR, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 4, plus particulièrement environ 2,6. 5 Pour IL-1R2, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1,3. Pour CCND1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1,5. 10 Comme indiqué plus avant pour un autre groupe de gènes possibles, dans le cas de composés test mis en contact à l'étape a) sous la forme solide, les gènes préférés sont choisis dans le groupe comprenant au moins, ou consistant en, IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAST, CYR61, IL-1R2 15 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Pour IL-24, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,5 et 15, plus particulièrement entre 2 et 10, plus particulièrement 2,3. Pour IL-24, la valeur seuil de surexpression peut aussi 20 être comprise entre 5 et 15, plus particulièrement 10. Pour IL-23R, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,5 et 3, plus particulièrement environ 1,9. Pour DDIT3, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1.5 et 3, plus particulièrement environ 5, plus 25 particulièrement encore 2. Pour MMP8, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2.5, plus particulièrement environ 1.4. 23 3056227 Pour DLK1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 2 et 8, plus particulièrement environ 4. Pour HAST, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,5 et 5, plus particulièrement environ 3. 5 Pour CYR61, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1.3. Pour IL-1R2, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,4 et 3, plus particulièrement environ 2. Pour CLEC4D, la valeur seuil de surexpression est comprise 10 entre 1,5 et 3.5, plus particulièrement environ 2.8. Pour ICAM2, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 3 et 5, plus particulièrement environ 4. Pour CASP1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1.1 et 2, plus particulièrement environ 1.4. 15 Pour MUC13, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1.4 et 3, plus particulièrement environ 1.8. Pour MUC4, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 2 et 4, plus particulièrement environ 2.5. 20 La valeur de seuil de surexpression significative peut, pour chaque gène, être évaluée et déterminée aisément par un homme du métier. 25 Plus particulièrement encore, la détermination de l'index d'irritation oculaire comprend l'attribution d'une valeur 24 3056227 de poids à chaque gène si la valeur seuil de surexpression dudit gène est atteinte suite à la mesure de l'expression. Ainsi lorsque le seuil de surexpression significative d'un gène donné est atteint, ce gène se voit attribuer une 5 valeur de poids qui peut être différente ou identique selon le gène. Cette valeur de poids peut prendre des valeurs discrètes ou continues, préférentiellement des valeurs discrètes échelonnées entre 1 et 10, à savoir choisies dans le groupe consistant en les valeurs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 9 et 10. Plus particulièrement, les valeurs discrètes pourront être choisies dans le groupe consistant en les valeurs 1, 2, 3, 4, 5. Plus particulièrement, lesdites valeurs discrètes pourront être 1 ou 2. A titre illustratif et sans être nullement limitatif, la 15 valeur de poids pourra être limitée à deux valeurs, 1 ou 2, valeur qui sera attribuée au gène lorsque son seuil de surexpression significative sera atteint ou dépassé. Le choix d'attribuer une valeur de poids plus ou moins élevée dépend de la nature du gène considéré et de son 20 implication qui dans la réponse cellulaire au stress, qui dans la voie métabolique de l'interleukine, qui dans le processus inflammatoire, qui dans la régulation de la croissance cellulaire, qui dans la cicatrisation, qui dans le remodelage cellulaire, par exemple mais aussi de la 25 valeur de seuil de surexpression du gène. Aussi à titre purement illustratif et pour les gènes ici sélectionnés choisis dans le groupe comprenant, ou consistant en, HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1 ; la valeur de poids pourra 30 prendre un valeur choisie entre 1 et 2. 25 3056227 Pour HSP9OAA1, la valeur de poids pourra être de 2. Pour CASP1, la valeur de poids pourra être de 2. Pour DLK1, la valeur de poids pourra être de 2. Pour CLEC4D, la valeur de poids pourra être de 2. 5 Pour IL24, la valeur de poids pourra être de 1. Pour SLIT2, la valeur de poids pourra être de 1. Pour HSPA1A, la valeur de poids pourra être de 2. Pour FSHR, la valeur de poids pourra être de 2. Pour IL-1R2, la valeur de poids pourra être de 1. 10 Pour CCND1, la valeur de poids pourra être de 2. De la même façon, et pour les gènes ici sélectionnés choisis dans le groupe comprenant, ou consistant en, IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAST, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, 15 ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4 ; la valeur de poids pourra prendre un valeur choisie entre 1 et 4. Pour IL-24, avec une valeur seuil surexpression de 2.3, la valeur de poids pourra être de 1. Pour IL-24, avec une valeur seuil de surexpression de 10, 20 la valeur de poids pourra être de 4. Pour IL-23R, la valeur de poids pourra être de 4. Pour DDIT3, la valeur de poids pourra être de 2. Pour MMP8, la valeur de poids pourra être de 1. Pour DLK1, la valeur de poids pourra être de 2. 26 3056227 Pour HAST, la valeur de poids pourra être de 2. Pour CYR61, la valeur de poids pourra être de 1. Pour IL-1R2, la valeur de poids pourra être de 4. Pour CLEC4D, la valeur de poids pourra être de 2. 5 Pour ICAM2, la valeur de poids pourra être de 4. Pour CASP1 la valeur de poids pourra être de 2. Pour MUC13, la valeur de poids pourra être de 3. Pour MUC4, la valeur de poids pourra être de 4. 10 Plus particulièrement, l'index d'irritation oculaire est déterminé par l'addition des valeurs de poids des gènes dont l'expression dépasse la valeur seuil de surexpression. 15 La méthode selon l'invention peut aussi comprendre une étape de catégorisation du composé test comprenant l'attribution d'une catégorie d'irritation au composé test en fonction de la valeur de l'index d'irritation oculaire obtenu. 20 La méthode selon l'invention met ainsi à disposition de l'homme du métier un méthode prédictive permettant de classifier un composé selon son potentiel d'irritation oculaire en suivant la classification Européenne, à savoir non irritant, irritant réversible ou irritant non 25 réversible. 27 3056227 Les résultats exposés dans la partie expérimentale de la présente demande démontre cet avantage de l'invention et la supériorité de cette méthode par rapport à celles existantes ressort à l'évidence de ces résultats. 5 EXEMPLES Matériels et Méthodes 10 Modèle d'épithélium de cornée humaine reconstruit (SkinEthid HCE) Le modèle d'épithélium de cornée humaine reconstruit, (SkinEthicTM HCE) a été acheté chez Episkin à Lyon. Le modèle est constitué de cellules épithéliales de cornée 15 humaine immortalisées cultivées dans un milieu défini à la jonction air-liquide. La structure tissulaire obtenue est un épithélium multi-couche similaire à la structure tissulaire naturelle de la cornée humaine comprenant 5 -7 couches pour une surface de 0,5 cm2. Les cellules 20 polyédriques et les cellules ailées sont également présentes. Le tissu comprend aussi des ultra-structures spécifiques comme les filaments intermédiaires, les hémidesmosomes matures et les desmosomes. La cytokératine de 65 kD (K3) a également été détectée (Nguyen et al., 2003). Les 25 tissus sont expédiés sur une couche semi-solide de milieu de culture en agarose. A réception, les tissus sont transférés dans du milieu de maintenance (1 ml/puit) dans des plaques 6 puits et incubés dans une étuve humide à 37°C, 5% CO2. Les tissus sont utilisés 24h plus tard. 28 3056227 Produits chimiques Tous les produits chimiques testés ont été achetés chez Sigma, France. La pureté était de plus de 87% pour tous les 5 produits chimiques testés qui couvraient un large champ des potentiels irritants oculaires possibles. Préparation des produits chimiques liquides Les produits liquides sont testés pour leur solubilité dans 10 du tampon PBS (tampon phosphate salin) ou dans de l'huile d'olive. En résumé, 100 pl du produit à tester est mélangé à 200 pl de PBS ou d'huile d'olive. L'échantillon est mélangé sur un vortex. La turbidité et la séparation de phase éventuelle sont évaluées à l'oeil. Les produits sont 15 testés purs ou dilués à 30%. Les produits qui ne sont pas solubles dans le PBS ou l'huile d'olive ne peuvent pas être testé à 30%. 20 Protocole de traitement pour les produits liquides La procédure d'application des produits liquides sur les tissus a été optimisée de la façon suivante : les produits 25 chimiques sont testés à deux concentrations 100% et 30%. En résumé, la surface du tissu est humidifiée par l'addition de 20 pl de PBS à 37°C et une incubation pendant 10 mn à 29 3056227 37°C / 5% CO2. Les épithéliums cornéens sont ensuite traités topiquement avec 50 ± 2 pL du produit testé (ce qui correspond à 100 pL/cm2) puis incubé pendant 10 mn à température ambiante. Les tissus sont ensuite lavés avec du 5 PBS stérile (2 X 25 ml) à 37°C. Le PBS est déposé sur le rebord de l'insert (pas directement sur le tissu) pour créer un vortex doux qui enlève le produit chimique. Les tissus sur leurs inserts sont ensuite « noyés » dans 5 ml de milieu de maintenance à température ambiante pendant 30 10 mn afin d'enlever le maximum le produit restant à la surface du tissu. Le milieu est ensuite retiré en tapotant doucement l'insert sur du papier absorbant et on ajoute 50 pl de milieu de maintenance à 37°C. Les inserts sont ensuite incubés pendant 6 hr à 37°C / 5% CO2. 15 Protocole de traitement pour les produits solides La procédure d'application des produits solides (en poudre) sur les tissus a été optimisée de la façon suivante. Dans un premier temps les produits sont réduits dans la poudre 20 la plus fine possible au moyen d'un mortier. Les produits chimiques sont testés à une seule dose. En résumé, la surface du tissu est humidifiée par l'addition de 20 pl de PBS à 37°C et une incubation pendant 10 mn à 37°C / 5% CO2. Les épithéliums cornéens sont ensuite traités topiquement 25 avec 30 ± 2 mg (représentant 60 mg/cm2) puis incubé pendant 30 mn à température ambiante. Les tissus sont ensuite lavés avec du PBS stérile (2 X 25 ml) à 37°C. Le PBS est déposé sur le rebord de l'insert (pas directement sur le tissu) pour créer un vortex doux qui enlève le produit chimique. 30 Les tissus sur leurs inserts sont ensuite « noyés » dans 5 ml de milieu de maintenance à température ambiante pendant 30 3056227 30 mn afin d'enlever le maximum le produit restant à la surface du tissu. Le milieu est ensuite retiré en tapotant doucement l'insert sur du papier absorbant et on ajoute 50 pl de milieu de maintenance à 37°C. Les inserts sont 5 ensuite incubés pendant 6 hr à 37°C / 5% 002. Purification des ARNs totaux 10 Le procédé de purification des ARNs totaux a été décrit par Cottrez et al., 2015. En résumé, les tissus de cornée sont récupérés avec des pinces et placé dans des tubes pour une congélation rapide dans de l'azote liquide. Les ARNs sont 15 ensuite extraits par la technique du Qiazol (Qiagen, Courtaboeuf, France) avec un kit « RNeasy Mini Kit » selon les instructions du fabricant. En résumé les tissus sont placés dans 1 ml de Qiazol et homogénéisés en utilisant le TissueLyser II (Qiagen, Courtaboeuf, France) avec 2 billes 20 d'acier. Après centrifugation le surnageant est recueilli et 0.2 ml de bromochloro propane (Sigma, France) sont ajoutés, puis l'ensemble est mélangé vigoureusement. L'homogénat est centrifugé à 12'000 g pendant 15 mn à 4 °C. La phase supérieure (phase aqueuse) est ajoutée à 600 pl 25 d'éthanol à 70% et immédiatement mélangée par pipetage. Le mélange est transféré dans une colonne RNeasy spin placée sur un tube de collecte de 2 ml et l'ARN est recueilli selon les instructions du fabricant (Qiagen, Courtaboeuf, France). 31 3056227 Analyse par RT-PCR quantitative La procédure de RT-PCR quantitative a été décrite par 5 Cottrez et al., 2015. En résumé, la transcription de l'ARN total est réalisée avec 1 pg d'ARN total dans volume final de 20 pl en utilisant des « Random Primers » (Invitrogen, France) et la « SuperScript III Reverse Transcriptase » (Invitrogen, France) selon les instructions du fabricant. 10 La RT-PCR quantitative utilise un mélange réactif de PCR : le SYBR Green real time PCR Master Mix (ROCHE, France) avec 0.4 pM de chaque primer nucléotidique dans un volume final de 25 pl. La réaction est réalisée dans un LC480 System (ROCHE, France). Le programme d'amplification comprend un 15 cycle à 95°C pendant 1 mn, suivi de 40 cycles avec une dénaturation à 95°C pendant 15s, une phase d'hybridation et d'amplification à 60°C pendant 15s, suivi d'une phase d 'élongation finale à 72°C pendant 40s. La quantité relative de chaque transcrit est normalisée par 20 rapport à la quantité moyenne d'expression de 5 « housekeeping » gènes (Glucuronidase 8-GUSB, vacuolar ATPase-ATP6V0E1, H2A Histone Family, Member Y- H2AFY, Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase-G6PD and « non-POU domain containing, octamer-binding »-NON0). 25 Analyse des données Mesure de l'expression de gènes 32 3056227 Le taux d'expression des gènes est mesuré par une méthode d'analyse de quantification absolue par la méthode utilisant un algorithme basé sur le maximum de la dérivée seconde développé par Roche. Le taux de surexpression 5 relative (fold increase) est ensuite calculé par rapport aux tissus traités avec du PBS seul. Définition du modèle de prédiction du test d'irritation oculaire pour les liquides 10 L'expression de 10 gènes (i.e.: HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, CCND1 (marqués par des étoiles dans la Figure 1) est mesurée dans les modèles d'épithélium cornéen après application soit d'une 15 dose de 100% soit d'une dose de 30% du produit à tester comme indiqué plus haut. Les valeurs de surexpression significative a été fixé pour chacun des gènes à respectivement : 1.4; 1.5; 5.25; 3.6; 6.2; 1.3; 3; 2.6; 1.3 et 1.5. Chaque gène surexprimé reçoit ensuite une valeur 20 fixe de respectivement : 2; 2; 2; 2; 1; 1; 2; 2; 1 ou 2. Un index d'irritation oculaire pour les substances liquides (LII : Liquid Irritation Index) est ensuite calculé par l'addition des valeurs attribuées à chaque gène surexprimé pour une valeur maximale de 17. Lorsque qu'après 25 traitement des tissus par le produit testé la destruction tissulaire est jugée trop importante (l'ARN total collecté représente moins de 10% de la quantité d'ARN collectée dans les tissus traités par le PBS) on attribue une valeur de LII de 20. 33 3056227 Le modèle de prédiction et de classification fonctionne de la façon suivante. Chaque produit est testé à 100% et 30% (voir ci-dessus). Si LII 10 à 100% et 30%, le produit testé est classé "Cat I". Si LII 10 à 100% et 10. Chaque produit chimique est testé deux fois sur deux lots différents de tissu d'épithélium de cornée. Si ces deux analyses ont donné la même classification le test est 20 considéré comme valide, sinon une troisième ou une quatrième analyse sont effectuées. Critères d'acceptabilité pour les solides Deux produits chimiques « contrôle » sont testés en 25 parallèle aux produits testé. Un non-irritant : le triclobarban (cas * 101-20-2 ) et un produit de Catégorie 2 : le naphthalene dione (cas * 83-56-7). L'essai est considéré comme valide si la valeur de SII obtenus pour le 3056227 triclobarban est REVENDICATIONS1. Méthode d'évaluation du potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, comprenant les étapes de: mise en contact d'un composé test avec un échantillon cornéal reconstruit in vitro; mesure de l'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous la forme solide et dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2, CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous la forme liquide et dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP9OAA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape supplémentaire c) de détermination d'un index d'irritation oculaire d'un composé test. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d) de catégorisation dudit composé comme présentant un potentiel d'irritation oculaire selon la valeur de l'index d'irritation oculaire obtenu. 78 3056227 6. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en que l'échantillon cornéal reconstruit in vitro est un échantillon comprenant des cellules épithéliales de cornée immortalisées, cultivées en milieu de culture défini et disposées en couche fine sur une membrane synthétique -à l'interface eau-air. 7. Méthode selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que la détermination de l'index d'irritation oculaire du composé comprend l'attribution d'une valeur seuil de surexpression à chaque gène dont l'expression est mesurée. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que la valeur seuil indiquant une surexpression significative du gène dont l'expression est mesurée peut être comprise en 1,1 et 10. 9. Méthode selon l'une des revendications 7 ou 8 caractérisée en ce que la détermination de l'index d'irritation oculaire comprend l'attribution d'une valeur de poids à chaque gène si la valeur seuil de surexpression dudit gène est atteinte. 10. Méthode selon la revendication 9 caractérisée en ce que la valeur de poids est choisie dans le groupe de valeurs discrètes échelonnées entre 1 et 10, à savoir choisies dans le groupe consistant en les valeurs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10. 11. Méthode selon la revendication 9 ou 10 caractérisée en ce que l'index d'irritation oculaire est déterminé par l'addition des valeurs de poids des gènes dont l'expression dépasse la valeur seuil de surexpression. 12. Méthode selon l'une des revendications 5 à 11, caractérisée en ce que l'étape de catégorisation comprend l'attribution d'une catégorie d'irritation au composé test en fonction de la valeur de l'index d'irritation oculaire obtenu. 79