Brevet FR3051192A1 — publié le 20171117

METHODE DE PURIFICATION DE PROTEINES RECOMBINANTES PAR AFFINITE BASEE SUR L'ACTIVITE LECTINIQUE DU DOMAINE CRD D'UNE GALECTINE DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de purification en une seule étape de protéines recombinantes d'intérêt par affinité basée sur l'activité lectinique de tout ou partie du domaine lectinique, de préférence le domaine CRD (Carbohydrate Recognition Domain), d'une galectine. La présente invention trouve ses applications principalement dans les laboratoires de recherche publics et privés, ainsi que dans l'industrie pharmaceutique ayant la nécessité de produire des protéines recombinantes dans le but d'études fondamentales ou d'intérêt thérapeutique. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (11) renvoient à la liste de références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Afin de produire à faible coût des protéines d'intérêt pures qui s'avèrent indispensables dans de nombreuses applications des sciences de la vie, il est essentiel de produire des quantités importantes de protéines recombinantes d'intérêt dans un hôte et de simplifier les étapes de traitement en aval. Il existe de nombreuses méthodes de purification de protéines recombinantes d'intérêt de manière native (sans partenaire de fusion, i.e. tag), mais ce type de purification demeure complexe pour un rendement faible et une pureté parfois incomplète. 3051192 2 Aussi, des méthodes d'expression et de purification de protéines recombinantes fusionnées à un tag ont été proposées. Parmi les tags couramment utilisés figurent le tag histidine (composé d'au moins six histidines), la maltose binding protein (MBP) et la glutathione S-transférase (GST), les deux dernières étant des protéines. Le tag histidine est utilisé dans le cadre de la technologie IMAC (Immobilized Metal Affinity). Cette méthode consiste à purifier une protéine recombinante fusionnée au tag histidine via l'interaction des noyaux imidazole avec des ions métalliques divalents (principalement le nickel) immobilisés sur une résine. La protéine de fusion est ensuite éluée avec une solution d'imidazole. Toutefois, du fait de sa faible spécificité, cette méthode de purification entraine de manière systématique une co-purification de contaminants et nécessite par la suite des étapes complémentaires. En outre, d'une part, le nickel est allergisant, foetotoxique et néfaste pour l'environnement, et d'autre part, l'imidazole est également un composé foetotoxique et reprotoxique. Ainsi, la présence possible de traces de nickel et d'imidazole dans les solutions de protéines recombinantes purifiées par IMAC en limite l'utilisation pour les applications in vitro I in vivo. De plus, les procédés à base d'ions métalliques peuvent conduire à des modifications de certains résidus des protéines ainsi purifiées (Stadtman et al., Free Radic. Biol. Med., 9(4) : 315-325, 1990 ; Chen et al., Mol. Cell. Biol., 26(10) : 3728-3737, 2006) [1, 2]. Quant à la MBP et la GST, elles sont utilisées pour purifier des protéines recombinantes par affinité pour l'amylose ou le glutathion respectivement. Du fait de l'encombrement stérique dû à la masse moléculaire de MBP, les protéines de fusion sont difficiles à cliver ce qui peut diminuer le rendement de production final de la protéine recombinante purifiée. La GST présente quant à elle, une faible affinité pour la résine de glutathion Sepharose (Andberg et al., Protein Sci., 16: 1751-1761, 2007; Ortiz-Salmeron et al., Eur. J. Biochem., 268: 4307-4314, 2001) [3, 4]. 305 1 1 9 2 3 D'autres méthodes d'expression de protéines d'intérêt permettant une purification facile et efficace par chromatographie d'affinité sur des résines à faible coût, basée sur l'utilisation de lectines comme tag, ont été développées. L'avantage des lectines est qu'elles se lient spécifiquement et de façon réversible à certains polysaccharides. En effet il existe plusieurs classes de lectines différant par leur séquence d'acides aminés, leur structure tridimensionnelle mais également par la nature du site de fixation aux sucres. Ainsi des méthodes d'expression et de purification de protéines d'intérêt ont été développées à partir de lectines telles que la lectine LSL de champignon (Demande internationale WO 2009121994) [5] ou la discoïdine provenant d'une amibe (Demande internationale WO 9966053) [6] sur des colonnes de chromatographie constituées de Sepharose 4B. Toutefois, dans ces méthodes, l'utilisation d'une résine non greffée entraine un risque de fixation non spécifique sur la résine et de ce fait une contamination par des protéines bactériennes. On connait également une méthode de purification de protéines d'intérêt utilisant une résine greffée avec du mannose reconnue par la lectine LecB de P. aeruginosa (Tielker et al., Biotechniques, 41(3): 327-332, 2006) [7]. Toutefois le mannose est un sucre dont la synthèse est complexe et onéreuse. Il existe un besoin de méthode d'expression et de purification de protéines d'intérêt palliant les inconvénients des procédés de l'art antérieur. Description de l'invention La solution proposée par les Inventeurs pour exprimer et purifier des protéines d'intérêt présente l'avantage de ne pas modifier et/ou nuire à l'activité de la majorité des protéines. Les inventeurs ont ainsi mis au point un nouveau procédé permettant de purifier des protéines recombinantes en une seule étape, avec une haute spécificité et un haut rendement. Ledit procédé de l'invention utilise le domaine lectinique d'une galectine ou partie dudit domaine conservant la 3051192 4 capacité de lier le lactose, par exemple le domaine CRDsAT d'une galectine, par exemple de la galectine-3 humaine, en tant que partenaire de fusion de la protéine d'intérêt. Ce tag lectinique permet ainsi la purification de la protéine d'intérêt en une seule étape de chromatographie d'affinité utilisant une résine de Sepharose greffée avec des molécules de lactose. La présente invention a donc pour objet une protéine de fusion comprenant tout ou partie du domaine lectinique d'une galectine fusionnée avec une protéine d'intérêt, via une séquence comprenant un site de clivage par la protéase TEV (deux options de clivage possibles voir Fig. 7). Par « domaine lectinique ou domaine GLECT » au sens de la présente invention, on entend le domaine des galectines liant les dérivés 13-galactosyl comme par exemple le lactose et ses dérivés, et dont l'activité ne dépend pas de cations divalents. Le numéro d'accès dans la banque de données Conserved Domain du NCBI, du domaine consensuel GLECT, est cd00070. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la partie du domaine lectinique utilisée lie le lactose, préférentiellement, il s'agit du domaine CRD d'une galectine, tout préférentiellement il s'agit du domaine CRDsAT d'une galectine, par exemple comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 1. Le domaine CRDsAT est un domaine extrêmement conservé (entre environ 83 et 99% d'homologie de séquence chez les mammifères) (cf. Fig. 9). Il fait partie de la superfamille de domaine GLECT (Galactose binding LECTin) capable de lier spécifiquement les p-galactosides tels que le lactose et ses dérivés. La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression d'une protéine de fusion, ledit vecteur comprenant les éléments suivants liés de manière fonctionnelle : a) un promoteur placé en 5' des éléments b), c), d) et e) décrits ci-après; b) une séquence codant pour tout ou partie du domaine lectinique d'une galectine ; 3051192 c) une séquence codant pour un bras espaceur contenant le site de clivage par TEV d) un site de clonage recevant une séquence codant pour une protéine d'intérêt ; e) des signaux de terminaison de la transcription. Par « promoteur » au sens de la présente invention, on entend une séquence ADN agissant en cis localisée en 5' du site d'initiation de la transcription de la séquence codant pour un polypeptide à laquelle une séquence ADN d'une ARN polymérase peut se lier et initier une transcription correcte, et comprenant éventuellement des activateurs. Dans le vecteur d'expression de la présente invention, la séquence correspondant à tout ou partie du domaine lectinique d'une galectine est par exemple localisée à proximité, en amont du site de clonage, et en aval du promoteur. Une alternative est de placer ladite séquence à proximité, après le site de clonage. Dans les deux cas, la fusion de ladite séquence avec celle de la molécule d'intérêt permet la purification sur résine. De préférence, la séquence b) code pour une partie du domaine lectinique liant le lactose, préférentiellement, pour le domaine CRDsAT d'une galectine, tout préférentiellement pour le domaine CRDsAT comprenant la séquence SEQ ID NO : 1. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le site de clivage par protéase est reconnu par la protéase TEV. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le vecteur d'expression est le vecteur d'expression pCARGHO (pour CArbohydrate Recognition domain of Galectine 3 from HOmo sapiens) dérivé du plasmide pET. La présente invention a également pour objet un procédé de production d'une protéine d'intérêt purifiée, ledit procédé comprenant : a) la préparation d'un vecteur d'expression selon la présente invention ; b) la transformation d'une cellule hôte avec ledit vecteur d'expression ; 3051192 6 c) la culture de ladite cellule hôte transformée dans des conditions permettant l'expression et la traduction de la protéine de fusion comprenant la séquence d'acides aminés de tout ou partie du domaine lectinique de la galectine et la séquence d'acides aminés de la protéine d'intérêt ; d) l'isolement de la protéine d'intérêt de la cellule hôte ou du milieu de culture. Dans le procédé de la présente invention, l'étape d'isolement d) est réalisée par exemple par liaison de la protéine de fusion via le domaine lectinique de la galectine ou partie dudit domaine à un support de chromatographie greffé avec des molécules de lactose, de préférence à une résine d'agarose ou de Sepharose greffée avec des molécules de lactose, puis (i) clivage par protéase pour retirer le domaine lectinique de la galectine ou partie dudit domaine (i.e. séquence tag), élution et séparation de la molécule d'intérêt et de la protéase, ou (ii) élution de la protéine de fusion, clivage par protéase en solution, et séparation de la protéine d'intérêt et de la protéase. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l'étape de séparation de la protéase et de la protéine d'intérêt est réalisée par chromatographie d'échanges d'ions ou chromatographie d'exclusion stérique. La présente invention a également pour objet un procédé de purification d'une molécule d'intérêt, ledit procédé comprenant : Option n°1 : a) la liaison de la protéine de fusion de la présente invention sur un support de chromatographie greffé avec des molécules de lactose, de préférence une colonne de résine d'agarose ou de Sepharose greffée avec des molécules de lactose ; b) le clivage par protéase de la protéine de fusion au niveau du site de clivage spécifique ; c) l'élution de la molécule d'intérêt purifiée ; 3051192 7 d) la séparation de la protéase, de la protéine d'intérêt ainsi purifiée. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l'étape d) est réalisée par chromatographie d'échanges d'ions ou chromatographie d'exclusion stérique. Le domaine lectinique ou partie dudit domaine (i.e. le tag) est éliminé de la colonne par élution par compétition avec une solution de lactose, et la colonne est régénérée. Option n°2 : a) la liaison de la protéine de fusion de la présente invention sur un support de chromatographie greffé avec des molécules de lactose, de préférence une colonne de résine d'agarose ou de Sepharose greffée avec des molécules de lactose ; b) l'élution de la protéine de fusion par compétition avec une solution de lactose ; c) le clivage par protéase de la protéine de fusion au niveau du site spécifique, en solution ; d) la séparation du domaine lectinique ou partie dudit domaine (i.e. le tag) et de la protéase TEV, de la molécule d'intérêt ainsi purifiée. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l'étape d) est réalisée par chromatographie d'échanges d'ions ou chromatographie d'exclusion stérique. Le procédé de l'invention présente l'avantage de n'utiliser aucun composé toxique, cancérogène ou tératogène. En outre, l'activité lectinique du domaine CRD de la galectine-3 est bien plus spécifique que toutes les autres méthodes de purification et ne nécessite qu'une seule étape pour obtenir un degré de pureté supérieur à 95%. Par ailleurs les protéases TEV sont dans des conditions optimales pour effectuer le clivage du tag. Les agents réducteurs sont acceptés sans limite. Le tag CRD, en particulier CRDsAT, est de très faible poids moléculaire (17,3 kDa, 18,8kDa pour la forme obtenue après clivage par la protéase TEV), ce qui permet son 3051192 8 élimination facile par chromatographie d'exclusion de taille. En outre il est fortement structuré en feuilletsp ; ce qui lui confère une très grande stabilité. Enfin son point isoélectrique est très basique (p1=9,3, p1=8,7 pour la forme obtenue après clivage par la protéase TEV), ce qui permet sa capture facile sur une colonne échangeuse de cations. Il est possible de conjointement éliminer le CRD et la protéase TEV dont le point isoélectrique est également basique (p1=8,8) en les fixant sur colonne échangeuse de cations. La protéine d'intérêt est alors éluée pure dans la fraction non retenue par la résine (figure 10). La présente invention a également pour objet le partenaire de fusion CRDsAT (ou tag) dérivé d'une galectine. De préférence, la séquence en acides aminés du domaine CRDsAT comprend la séquence SEQ ID NO : 1, dans laquelle l'acide aminé en position 36 peut être une arginine ou une lysine, tout préférentiellement une lysine, et/ou dans laquelle l'acide aminé en position 152 peut être une arginine ou une thréonine, tout préférentiellement une thréonine. Brève description des figures La figure 1 représente un schéma circulaire et linéaire du vecteur pCARGHO. La figure 2 représente les principales caractéristiques du vecteur pCARGHO (SEQ ID NOs : 2 et 3). La figure 3 représente une structure schématique de la galectine-3 humaine. La figure 4 représente la séquence protéique de la galectine-3 humaine et des 3 CRD conçus (SEQ ID NO : 4). La figure 5 représente la structure 3D du domaine lectinique CRD de la galectine-3 en interaction avec le lactose. La figure 6 représente le suivi de purification de la galectine-3 humaine par chromatographie d'affinité pour le lactose. ^ ^ ^ ^ ^ ^ 3051192 9 La figure 7 représente le schéma de la méthode de purification de la présente invention par affinité pour le lactose. La figure 8 représente le suivi de purification de 3 formes de galectine-3 humaine tronquée par chromatographie d'affinité pour le lactose. Les CRDLmL (A), CRDoovv (B) et CRDsAT (C) ont été exprimés dans des bactéries E. cou Rosetta2 (DE3). Les bactéries ont été lysées et des tests de purification ont été effectués sur colonne de lactose-agarose. À chaque étape de purification, un échantillon a été prélevé pour être déposé sur gel d'acrylamide (SDSPAGE). Après migration électrophorétique, le gel a été coloré au bleu de Coomassie. SSO : surnageant d'extrait bactérien avant passage sur colonne d'affinité lactose. CSO : culot d'extrait bactérien avant passage sur colonne d'affinité lactose. SPR : surnageant après le passage sur la colonne d'affinité lactose. E : fraction d'élution. REVENDICATIONS1. Protéine de fusion comprenant tout ou partie du domaine lectinique d'une galectine fusionné avec une molécule d'intérêt, avec un site de clivage par protéase inséré entre les deux. 2. Protéine de fusion selon la revendication 1, où la partie du domaine lectinique est le domaine CRDsAT d'une galectine, de préférence le domaine CRDsAT comprenant la SEQ ID NO : 1. 3. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, où le site de clivage est un site de clivage par la protéase TEV. 4. Vecteur d'expression d'une protéine de fusion telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit vecteur comprenant les éléments suivants liés de manière fonctionnelle : a) un promoteur placé en 5' des éléments b), c) et d) ; b) une séquence codant pour le domaine lectinique d'une galectine ou une partie dudit domaine ; c) un site de clonage recevant une séquence codant pour une protéine d'intérêt ; d) des signaux de terminaison de la transcription ; et dans lequel un site de clivage par protéase est localisé entre la séquence b) et le site de clonage c). Vecteur d'expression selon la revendication 4, où la séquence b) est placée à proximité du site de clonage c), en 3' du promoteur. 6) Vecteur d'expression selon la revendication 4 ou 5, où la séquence b) code pour le domaine CRDsAT d'une galectine, de préférence le domaine CRDsAT comprenant la séquence SEQ ID NO : 1. 305 1 1 9 2 23 7) Vecteur d'expression selon l'un quelconque des revendications 4 à 6, où le site de clivage par protéase est un site de clivage par la protéase TEV. 8) Vecteur d'expression selon l'une des quelconques revendications 4 à 7, où ledit vecteur est le vecteur d'expression pCARGHO dérivé du vecteur pET20b(+) et comprenant les éléments suivants : une origine de réplication en position 1944 ; un promoteur T7 en position 797-813 un site de fixation au ribosome (RBS) en position 742-747 ; la séquence du CRDsA-r en position 242-736 ; une séquence site de reconnaissance TEV en position 221-241 ; un site de clonage multiple en position 159-215 ; un terminateur T7 en position 26-72 ; une origine F1 en position 3694-4149 ; et un gène bla dé résistance à l'ampicilline en position 2705-3562. 9) Procédé de production d'une protéine d'intérêt purifiée, ledit procédé comprenant : a) préparation d'un vecteur d'expression tel que défini dans l'une quelconque des revendications 4 à 8 ; b) la transformation d'une cellule hôte avec ledit vecteur d'expression ; c) la culture de ladite cellule hôte ainsi transformée dans des conditions permettant l'expression de la protéine de fusion dans le milieu de culture ; et d) la purification de la molécule d'intérêt. 10) Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'étape de purification d) est réalisée par : 3051192 24 (i) liaison de la protéine de fusion via le domaine lectinique de la galectine ou partie dudit domaine sur un support de chromatographie greffé avec des molécules de lactose, de préférence sur une colonne de résine d'agarose ou de sepharose greffée avec des molécules de lactose ; (ii) clivage par protéase de la protéine d'intérêt ; (iii) élution de la protéine d'intérêt ; (iv) séparation de la protéase et de la protéine d'intérêt. 11) Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'étape de purification d) est réalisée par : (i) liaison de la protéine de fusion via le domaine lectinique de la galectine ou partie dudit domaine sur un support de chromatographie greffé avec des molécules de lactose, de préférence sur une colonne de résine d'agarose ou de sepharose greffée avec des molécules de lactose ; (ii) élution de la protéine de fusion ; (iii) clivage par protéase de la protéine d'intérêt en solution ; (iv) séparation de la protéase et du domaine lectinique ou partie dudit domaine, de la protéine d'intérêt. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, où l'étape de séparation (iv) est réalisée par chromatographie d'échanges d'ions ou chromatographie d'exclusion stérique. 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, où l'étape d'élution est réalisée avec une solution de lactose. 14) Domaine CRDsAT comprenant la séquence en acides aminés SEQ ID NO : I.