Brevet FR3050738A1 — publié le 20171103

MICROORGANISMES TÉMOINS DE DÉCONTAMINATION DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne la validation de procédés de décontamination, et en 5 particulier de nouveaux organismes témoins, ainsi que des mélanges de ces microorganismes, employés pour valider les procédés de décontaminatipn. ETAT DE LA TECHNIQUE Les procédés de pasteurisation sont appliqués dans de multiples domaines, qu'il 10 s'agisse de la stérilisation de matériel ou de la décontamination d'aliments, en particulier d'aliments secs. Ces procédés consistent en des étapes spécifiques de décontamination/stérilisation, ou bien sont le résultat concomitant d'une étape d'un procédé de traitement, comme par exemple une étape de cuisson d'un aliment, par exemple la torréfaction de produits d'origine végétale. 15 Les produits d'origine végétale, comme les amandes ou les épices sont souvent contaminés par des microorganismes pathogènes présents dans leur environnement de culture, de stockage et d'utilisation qui nécessite une étape de décontamination avant leur usage pour la consommation humaine. Souvent, cette décontamination est effectuée comme un traitement par la température de ces aliments, comme une cuisson, une 20 torréfaction ou un séchage. Toutefois, certains pathogènes peuvent être résistants à certaines conditions de décontamination et il faut bien s'assurer, avant la mise en oeuvre du procédé que l'objectif de décontamination sera bien atteint. Cette validation ne peut pas se faire avec un microorganisme pathogène à cause des risques de contamination. Pour ce faire, on emploie des microorganismes témoins 25 dits « substituts », dont le comportement face aux conditions de traitement doit être proche de celui de l'organisme pathogène. De préférence, les substituts seront choisis pour être plus résistants aux conditions de traitement que les pathogènes, sans pour autant avoir un comportement trop éloigné de celui de ces pathogènes cibles. Ces substituts sont généralement spécifiques d'un pathogène particulier dans un 30 procédé de décontamination, comme par exemple Enterococcus faecium (ATCC 8459) recommandé pour la validation de procédés de pasteurisation des amandes susceptibles d'être contaminées par des salmonelles pathogènes. Les substituts ne sont pas forcément les microorganismes plus proches philogénétiquement des pathogènes cibles, comme par exemple le genre Citrobacterium, 35 genre plus roche d'un point de voie évolutive de Salmonella, n'est pas décrit comme substitut de ce pathogène. Ainsi, comme substitut de Salmonelle, certains qnt employé Geobacillus stearothermophilus (ATCC 12980) pour la validation d'un procédé d'extrusion 3050738 2 d'aliments pour animaux (Okelo et al., 2006 et 2008), Enterococcus faecium (NRRL B2354) pour la pasteurisation des liquides (Annous, 1998), des amandes (ABC, 2007) ou l'extrusion des aliments (Bianchit, 2014), Pantoea agglomerans (SPS 2F-1) pour le grillage des amandes (ABC, 2007), Pediococcus spp. et Pediococcus acidilactici pour la préparation de bandes de boeuf séché (Berewski, 2009), la préparation de dinde séchée (Williams, 2010) ou l'extrusion d'aliments pour animaux (Ceylan and Bautista, 2015), et Staphylococcus carnosus (CS-299) pour la préparation de boeuf haché et de chair à saucisse (Vasan et al., 2014). Comme substituts de Clostridium botulinium, certains ont employé Bacillus 10 amyoliquefaciens pour la préparation de purée de carottes (Marogosch et al., 2004) ou Clostridium sporogenes (PA3679, 3676 et 3678) pour des aliments peu acides (Larson and Johnson. 2003 ; Parket et al., 2015). Comme substituts de Listeria monocytogenes, certains ont employé Listeria innocua dans un procédé de pasteurisation de saucisses (Sommers et al., 2008) ou Escherichia 15 cou/ K12 dans un procédé de stérilisation par irradiation des melons (Rodrigues et al., 2006). Divers E. cou non pathogènes ont été décrits comme substituts de E. cou 0157:H7 dans le traitement de jus (Gurtler, 2010) ou de boeuf (Garcia Hernandez et al., 2015). Cependant que la souche Enterococcus faecium (NRRL B-2354) a été utilisée pour 20 la validation de procédés thermiques pour plusieurs aliments à faible activité de l'eau, cette souche montre une thermorésistance beaucoup plus élevée qu'un grand nombre de pathogènes, notamment la Salmonelle. Il reste un besoin de substituts mieux adaptés aux procédés de décontamination et aux pathogènes cibles, pouvant être employés seuls ou en mélanges, qui ont des 25 comportements de résistance plus proche du ou des pathogènes cibles et apportent des informations plus pertinentes quant au procédé de décontamination de manière à valider des procédés plus économes en énergie et plus respectueux des propriétés structurelles et/ou organoleptiques des produits traités. Les inventeurs ont mis en évidence plusieurs groupes de microorganismes non 30 pathogènes répondant à ce besoin. EXPOSE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de contrôle d'un procédé de décontamination dans lequel on met en oeuvre le procédé de décontamination en 35 présence d'au moins un microorganisme témoin, ou un mélange de microorganismes témoins, et on observe le comportement du ou des microorganismes témoins au cours dudit procédé de décontamination, caractérisé en ce que le microorganisme témoin est un 3050738 3 microorganisme non pathogène choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter, du genre Erwinia ou du genre Pantoea. La présente invention concerne aussi des microorganismes témoins susceptibles d'être employés comme substituts dans un procédé de contrôle d'un procédé de 5 décontamination, choisis parmi Enterobacter hormaechei CNCM 1-5058, Pantoea agglomerans CNCM 1-5059, Enterobacter mori CNCM 1-5060, Pantoea calida CNCM I5061, Erwinia persicina CNCM 1-5062, Erwinia persicina CNCM 1-5063, Pantoea agglomerans CNCM 1-5054, Pantoea agglomerans CNCM 1-5055, Pantoea calida CNCM 1-5056, Pantoea gaviniae CNCM 1-5057. Elle concerne également un kit de contrôle d'un procédé de décontamination, comprenant au moins un microorganisme témoin selon l'invention et un support approprié pour son utilisation dans le procédé de décontamination. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de contrôle d'un procédé de décontamination dans lequel on met en oeuvre le procédé de décontamination en présence d'au moins un microorganisme témoin, ou un mélange de microorganismes témoins, et on observe le comportement dudit du ou des un microorganismes témoins au cours dudit procédé de décontamination, caractérisé en ce que le microorganisme témoin est un microorganisme non pathogène choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter, du genre Erwinia ou du genre Pantoea. Par « microorganisme » on entend un ensemble de plusieurs individus de microorganismes d'une même espèce. On citera notamment les bactéries choisies parmi les espèces Enterobacter hormaechei, Enterobacter mori, Erwinia persicina, Pantoea agglomerans, Pantoea calida, et Pantoea gaviniae, plus particulièrement choisies parmi les espèces suivantes, déposées à la CNCM selon le Traité de Budapest : Enterobacter hormaechei CNCM I5058, Pantoea agglomerans CNCM 1-5059, Enterobacter mon CNCM 1-5060, Pantoea calida CNCM 1-5061, Erwinia persicina CNCM 1-5062, Erwinia persicina CNCM 1-5063, Pantoea agglomerans CNCM 1-5054, Pantoea agglomerans CNCM 1-5055, Pantoea calida CNCM 1-5056, Pantoea gaviniae CNCM 1-5057. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, au moins un microorganisme témoin est choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter ou du genre Erwinia et leurs mélanges. De manière avantageuse, on emploie un mélange d'au moins 2 microorganismes témoins (validation multiplexe), en particulier au moins 2 microorganismes témoins choisis parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter ou du genre Erwinia 3050738 4 et leurs mélanges. Selon un mode plus particulier de réalisation de l'invention, le mélange comprend au moins un microorganisme témoin choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter ou du genre Erwinia et au moins un microorganisme témoin choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Pantoea. 5 Parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter, du genre Erwinia ou du genre Pantoea, on citera notamment les bactéries choisies parmi les espèces Enterobacter hormaechei, Enterobacter mofi, Erwinia persicina, Pantoea agglomerans, Pantoea calida, et Pantoea gaviniae, plus particulièrement choisies parmi les espèces suivantes, déposées à la CNCM selon le Traité de Budapest : Enterobacter 10 hormaechei CNCM 1-5058, Pantoea agglomerans CNCM 1-5059, Enterobacter mori CNCM 1-5060, Pantoea calida CNCM 1-5061, Erwinia persicina CNCM 1-5062, Erwinia persicina CNCM 1-5063, Pantoea agglomerans CNCM 1-5054, Pantoea agglomerans CNCM 1-5055, Pantoea calida CNCM 1-5056, Pantoea gaviniae CNCM 1-5057. Ces microorganismes témoins non pathogènes ont pour avantage de montrer une 15 résistance aux conditions de mise en oeuvre de différents procédés de décontamination supérieure à celle d'au moins un organisme pathogène cible. Ces organismes pathogènes cibles sont des microorganismes responsables de contaminations, en particulier les bactéries pathogènes des genres Salmonella, Escherichia, Bacillus, Listeria, Campylobacter, Cronobacter, etc. Le procédé de décontamination qui fait l'objet 20 du contrôle a pour but d'éliminer l'ensemble de ces pathogènes dans l'éventualité où ils seraient présents dans le produit traité. De manière avantageuse, les microorganismes témoins ont une résistance thermique supérieure à Salmonella en conditions de faible aw et conditionnés sur une matrice inerte. 25 Par « faible aw », on entend de préférence une activité de l'eau inférieur à 0.85 (CAC/RCP 75-2015, Codex Alimentarius). Par « matrice inerte » on entend de préférence un support approprié pour la conservation et l'emploi des microorganismes témoins, en particulier sous forme sèche. Le support est inerte, c'est à dire n'interagit pas avec le métabolisme des bactéries sous 30 forme sèche permettant une conservation optimale dans le temps. Dans le procédé de décontamination, le microorganisme témoin sera employé sous une forme appropriée, correspondant à la forme du pathogène ciblé susceptible d'être présent dans le produit à décontaminer, en particulier sous forme de spores, forme végétative et/ou forme végétative sèche. 35 Par « forme sèche » on entend bactéries sous végétative qui ont suivi un procédé de séchage permettant leur conservation pour une durée déterminée sans modification de ses caractéristiques de résistance 3050738 5 Les procédés de décontamination comprennent généralement une ou plusieurs étapes de pasteurisation, séchage, extrusion, torréfaction, cuisson, stérilisation, autoclavage et traitements à la vapeur. Ces procédés sont bien connus de l'homme du métier, notamment pasteurisation, 5 séchage, extrusion, torréfaction, cuisson, stérilisation, autoclavage, traitements à la vapeur, lumière pulsée, traitements à haute pression, ou irradiation, la stérilisation par les gaz (EtO, ppo, ozone) et par des désinfectants (eau de javel, acide peracétique...), en particulier pour le traitement de produits naturels ou manufacturés, comme les fruits à coques, herbes aromatiques, graines, épices, poudres alimentaires, aliments pour 10 animaux de compagnie et bétail, céréales, etc. Les substituts, et mélanges de substituts, selon l'invention pourront être employés, selon les aliments et procédés sélectionnés, pour valider les décontaminations de pathogènes tels que Salmonella, Escherichia co/i, Bacillus, Listeria, Campylobacter, Cronobacter sakazakii, etc. 15 A cet effet, le microorganisme témoin sera employé avec un support approprié, bien connu de l'homme du métier, de préférence inerte, par exemple avec des cryoprotecteurs comme la maltodextrine et/ou poudre du lait et des supports solides comme le talc, la silice et/ou le charbon actif. Le support peut aussi comprendre un marqueur qui permet de retrouver facilement les produits contaminés (par exemple un colorant dans le visible ou 20 fluorescent à une source UV/IR), en particulier tout marqueur permettant de distinguer les zones contaminées des autres (marquage magnétique, isotopique, chimique etc.). L'usage d'un support approprié permet une standardisation en l'utilisation des microorganismes sur différents matrices en apportent à la fois une meilleure stabilité des microorganismes et évite d'avoir à valider la stabilité de chaque microorganisme témoin 25 sur chaque support après inoculation. Il facilite la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. De manière générale, les microorganismes témoins avec leur support sont ajoutés aux produits à décontaminer en quantité appropriée pour permettre la vérification de l'efficacité du procédé de décontamination. 30 Les microorganismes et leur support pourront, le cas échéant, subir un traitement préalable à la décontamination, similaire à celui subi par le produit à décontaminer, c'est à dire qui va mimer les processus connus de contamination des produits. Par exemple, dans le cas de produits naturels qui sont broyés (épices notamment) il est possible de les broyer après ajout des microorganismes témoins sur leur support pour arriver à des 35 poudres en recréant les conditions classiques de contamination des produits naturels. Le procédé de contrôle selon l'invention peut être mis en oeuvre avant toute mise en oeuvre d'un procédé de décontamination sur le produit à décontaminer, pour valider 3050738 6 l'efficacité du procédé de décontamination (procédé de validation). Il peut aussi être mis en oeuvre pendant les opérations de décontaminations sur le produit à décontaminer, comme témoin de décontamination ou comme témoin de conformité de mise en oeuvre du procédé de décontamination (procédé de contrôle). 5 Le procédé selon l'invention, qu'il s'agisse d'un procédé de validation ou de contrôle peut être mis en oeuvre sous la responsabilité de celui qui réalise la décontamination ou encore sous celle d'un organisme de contrôle ou d'homologation. Les microorganismes de contrôle seront avantageusement fournis sous forme de kit, avec leur support d'utilisation, et le cas échéant une notice d'emploi. 10 L'observation du comportement du microorganisme témoin consiste généralement à contrôler la présence d'individus viables, en cours de procédé de décontamination et/ou à son terme. Les méthodes employées sont connues de l'homme du métier : dénombrement des colonies sur gélose et/ou méthodes moléculaires comme la PCR et/ou qRT-PCR, ou des tests de détection de microorganismes comme les tests 15 immunologique, par exemple les tests utilisant des technologies de SPR, comme ceux développés par la société PRESTODIAG, ou encore des tests de détection par phages. La présente invention concerne également un microorganisme témoin susceptible d'être employé comme substitut dans un procédé de contrôle d'un procédé de décontamination, choisi parmi Enterobacter hormaechei CNCM 1-5058, Pantoea 20 agglomerans CNCM 1-5059, Enterobacter mon CNCM 1-5060, Pantoea calida CNCM I5061, Erwinia persicina CNCM 1-5062, Erwinia persicina CNCM 1-5063, Pantoea agglomerans CNCM 1-5054, Pantoea agglomerans CNCM 1-5055, Pantoea calida CNCM 1-5056, Pantoea gaviniae CNCM 1-5057. Elle concerne plus particulièrement ces microorganismes isolés, ou sous forme de spores, forme végétative et/ou forme 25 végétative sèche. L'invention concerne également un mélange de microorganismes comprenant au moins 2 des espèces de microorganismes ci-dessus, dans toutes leurs combinaisons 2 à 2, jusqu'à un mélange comprenant les 10 espèces de microorganismes ci-dessus. L'invention concerne aussi une composition comprenant un microorganisme ci-dessus ou un mélange desdits microorganismes et un support approprié, en particulier un 30 support inerte tel que définit plus haut. L'invention concerne aussi un kit de contrôle d'un procédé de décontamination, caractérisé qui comprend au moins un microorganisme ci-dessus et un support approprié tel que défini ci-dessus pour son utilisation dans le procédé de décontamination, et le cas échéant une notice d'utilisation. 35 L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un microorganisme choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter, du genre Erwinia ou du genre Pantoea tels que définis ci-dessus, ou un kit selon l'invention, pour le 3050738 7 contrôle d'un procédé de décontamination, notamment pour une validation préalable ou un contrôle en cours d'exploitation. DESCRIPTION DES FIGURES 5 Les figures 1 à 4 représentent les courbes de résistances de différents microorganismes substituts en comparaison aux pathogènes Salmonella et Cronobacter sakazakii. EXEM PLES 10 Exemple I. Isolation et sélection des microorganismes. 1. Isolement d'enterobacteriaceae environnementales 0.5 g d'échantillon de produits secs a été mis dans un Eppendorf de 1.5 mL et traité thermiquement dans un bain sec pendant 15 min à 95 °C. Après un refroidissement jusqu'à température ambiante, 1 mL de PBS concentré (aw= 0.950) a été ajouté avant 15 d'effectuer un mélange pendant 30 s grâce à un vortex. Des dilutions successives au I Oième ont été réalisées dans du PBS (aw = 0.995) avant étalement sur une gélose Violet Red Bile Glucose Agar (VRBG, biokar) à raison de 100 pL par boîte. Après incubation à 37°C pendant 24 - 48 h, les colonies ont été isolées sur des géloses Tryptic Soya Agar (TSA, Sigma-Aldrich) et incubées de nouveaux à 37°C pendant 24 h. 20 2. Identification d'enterobacteriaceae environnementales Des amplifications de l'ADNr 16S de chaque isolat ont été effectuées directement en repiquant les colonies dans le mix PCR. Les amorces utilisées étaient : 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') et 1492R (5'-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3'). Pour réaliser les réactions PCR, le kit « Taq core kit » (Quiagen, France) a été utilisé. 25 Brièvement, le mix PCR (50pL par réaction) pour une colonie est composé de 0.5 pM de chaque amorce, de 0.2 mM de mix dNTP, de 0.75 U de Taq polymérise et de 1 X de tampon contenant du MgC12. L'amplification a été vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% avant de séquencer les produits PCR par la méthode de Sanger. Les séquences obtenues ont été blastées dans la base de données du NCBI (BLASTn) et 30 ainsi les isolats ont pu être identifiés. Douze isolats ont ensuite été sélectionnés. 3. Challenge thermique a. Conditions de culture des souches Toutes les cultures ont été conservées dans du Tryptic Soy Broth (TSB, Sigma-Aldrich) avec 20% glycérol (Sigma-Aldrich) à -80°C. Pour la reprise des cultures, les 35 bactéries ont été inoculées sur gélose TSA pendant 24 h à 37°C puis cinq colonies de chaque bactérie ont été repiquées dans 50 mL de TSB avant d'être incubées à 37°C pendant 8 h. Ces suspensions bactériennes sont ensuite diluées dans 50 mL de TSB 3050738 8 neuf pour atteindre une densité optique (DO) de 0.01 à 600 nm. Des cultures en phase stationnaires de croissance sont ainsi obtenues après 20 h à 37°C. b. Inoculation de la poudre de lait Pour chaque bactérie, les 50 mL de cultures sont centrifugées (3400 g, 10 min at 5 25°C) puis lavées deux fois dans 25 mL de PBS. Finalement, une dernière centrifugation est effectuée, le surnageant est retiré et les culots sont pesés. La poudre de lait (26% de matière grasse, Regilait, Saint-Martin-Belle-Roche, France) est ajoutée sur chaque culot avec un ratio de 1:20 (mcubt:mpoudre) et le tout est homogénéisé à l'aide d'un mortier. Une poudre de lait inoculée est ainsi obtenue. 10 c. Procédé de séchage Pour la poudre de lait inoculée, des boîtes hermétiques, contenant des solutions saturées en sel permettant de contrôler l'activité de l'eau et donc l'humidité relative de l'atmosphère, sont utilisées. Le chlorure de lithium, le potassium acétate, le potassium carbonate et le bromure de sodium (tous de Sigma-Aldrich) ont été utilisés pour obtenir 15 une activité de l'eau de 0.11, 0.25, 0.44 and 0.58. Les atmosphères ainsi obtenues sont maintenues sous convection en utilisant un ventilateur (Sunon, Radiospare, France). Pour chaque souche, la poudre inoculée est étalée dans des boîtes de Petri (environ 5 g par boîte). Ces boîtes sont ensuite places sans couvercle dans les boîtes hermétiques pendant 16 h pour atteindre l'activité de l'eau d'équilibre. Tous les séchages ont été 20 effectués à température ambiante. d. Traitement thermique 0,1 g de poudre de lait inoculée séchée est placé dans un tube de 0.2 mL et traité à différentes températures (85°C, 90°C, 95°C et 100°C) pendant un temps donné (0 s, 30 s, 60 s, 90s, 120 s, 150s and 180 s) grâce à un thermocycleur (Bioer, France) avant d'être 25 refroidi à 4°C. Les échantillons sont réhydratés par addition de 1 mL de PBS avant agitation au vortex pendant 30 s. Un dénombrement des UFC a été réalisé après incubation sur TSA pendant 24 h à 37°C. Les résultats sont exprimés en log1o(N/N0), où N représente les UFC après traitement and No représente les UFC initiale de la poudre de lait avant traitement (t = 0 s). 30 Espèce N° Dépôt D-value Enterococcus faecium ATCC 8459 23.69 Enterobacter hormaechei CNCM 1-5058 4.36 Pantoea agglomerans CNCM 1-5059 1.81 Enterobacter mori CNCM 1-5060 3.95 Pantoea calida CNCM 1-5061 2.03 3050738 9 Erwinia persicina CNCM I-5062 1.74 Erwinia persicina CNCM I-5063 1.96 Pantoea agglomerans CNCM 1-5054 1.27 Pantoea agglomerans CNCM 1-5055 1.33 Pantoea calida CNCM 1-5056 1.14 Pantoea gaviniae CNCM 1-5057 1.24 Salmonella Typhimurium DSM 10506 1.21 Cronobacter sakazakii CIP 103183T 1.13 Exemple II. Validation d'un procédé de décontamination. La technologie la plus communément utilisée dans le secteur de la décontamination, aussi bien en industries agroalimentaires que pharmaceutiques, reste 5 les autoclaves. Il est ainsi possible de chauffer le produit dans une chambre, statique ou en mouvement, simplement par condensation de vapeur sur ce dernier. Le séchage du produit peut ensuite se faire par une combinaison de chauffage et de mise sous vide. Il existe des centaines de fabricants d'autoclaves dans le monde, dont un certain nombre travaille sur la pasteurisation des produits alimentaires secs. 10 Le cycle classique de pasteurisation de ces équipements se compose des étapes suivantes : Phase 1 : Elimination de l'air. Plusieurs cycles sont réalisés afin d'éliminer autant d'air que possible. Cette étape est nécessaire pour permettre à la vapeur de pénétrer à travers le produit. 15 Phase 2 : Chauffage. La vapeur est injectée dans le but de chauffer le produit. L'enceinte de la chambre est aussi chauffée par des résistances électriques pour éviter tout phénomène de condensation. Phase 3 : Pasteurisation. Une fois que le produit a atteint une température cible, il y a un pallier de maintien à cette température. Le couple temps-température de traitement 20 est défini en amont du travail de validation. Le couple temps-température est crucial pour l'efficacité du traitement. Phase 4 : Séchage. La vapeur est évacuée par un séchage sous vide. Phase 5: Aération. La chambre est aérée par un flux d'air filtré à pression atmosphérique 25 Le produit est ensuite évacué de la chambre dans le sens de production, il ne peut croiser la matière non traitée. Selon le cycle choisi, sa température de fin de procédé varie de 30 à 50°C. Le produit n'est pas conditionné avant de n'être revenu à température 3050738 10 ambiante car tout ensachage trop chaud pourrait provoquer un développement de germes. La validation d'un procédé de décontamination in-situ comprend en général trois étapes principales : 5 Phase préparatoire : évaluation du procédé, évaluation des risques, qualification du germe modèle, élaboration du protocole de validation in-situ Phase d'exécution : inoculation du produit à tester, exécution des « lots » de validation, récupération des échantillons Phase de synthèse : dénombrement des germes modèles, rédaction du rapport 10 d'analyse et / ou rapport de validation Lors de l'élaboration du protocole de validation sont définis, entre autres : La nécessité ou non de procéder à un pré-traitement du produit à tester (par exemple : irradiation) Le nombre de lots de validation ainsi que la durée de chaque lot de validation à 15 réaliser La quantité de produit à inoculer (de 25g à >10t en fonction des procédés de décontamination et de la méthode de validation sélectionnée) Le niveau d'inoculation souhaité ainsi que la quantité de germe modèle à utiliser La méthode d'inoculation du produit avec le germe modèle (différentes possibilités 20 existent, incluant l'inoculation en laboratoire, directement en usine, chez un prestataire de service...) La méthode d'échantillonnage en sortie de ligne de production (incluant entre autres le nombre et la taille des échantillons) La méthode de dénombrement du germe modèle (entre autres : milieu sélectif ou non) 25 Les réponses à ces différentes questions dépendent essentiellement de trois paramètres : type de procédé à valider, pathogène cible, produit à inoculer. Ainsi, le « kit » de validation fourni peut varier en particulier en : Niveau de mélange du germe modèle avec le produit à tester (le germe modèle peut-être fourni sous forme concentrée à inoculer ou sous forme pré-mélangée avec le 30 produit) Niveau de concentration en germe modèle Quantité fournie (de plusieurs kgs / dizaines de kgs pour la forme concentrée à plusieurs tonnes pour le version pré-mélangée) 3050738 11 REFERENCES Fudge, James, Dunn, Michael, Pike, Oscar, Robison, Richard, Steele, Frost, The Isolation and Identification of Pantoea dispersa strain JFS as a Non-Pathogenic Surrogate for Salmonella Typhimurium Phage Type 42 in Flour, International Journal 5 of Food Microbiology (2015), doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2015.11.012 S. E. Niebuhr, A. Laury, G. R. Acuff, and J. S. Dickson. Evaluation of non-pathogenic surrogate bacteria as process validation indicators for Salmonella enteric for selected antimicrobial treatments, cold storage and fermentation in meat. Niebuhr SE, Laury A, Acuff GR, Dickson JS. Evaluation of nonpathogenic surrogate 10 bacteria as process validation indicators for Salmonella enterica for selected antimicrobial treatments, cold storage, and fermentation in meat. J Food Prot. 2008 Apr;71(4):714-8. Joshua B. Gurtler, Rebecca B. Rivera, Howard Q. Zhang, David J. Geveke. Selection of surrogate bacteria in place of E. cosi 0157:H7 and Salmonella Typhimurium for 15 pulsed electric field treatment of orange juice. International Journal of Food Microbiology 139 (2010) 1-8. Andreia Bianchini, Jayne Stratton, Steve bleier, Timothy Hartter, Brian Plattner, Galen Rokey, Gerry Hertzel, Lakshmi Gompa, Bis Marck Martinez and Kent M. Eskridge. Use of Enterococcus faecium as a Surrogate for Salmonella enterica during Extrusion 20 of a Balanced Carbohydrate-Protein Meal. J. Food Prot., Vol. 77, No. 1 ERDOGAN CEYLAN AND DERRICK A. BAUTISTA. Evaluating Pediococcus acidilactici and Enterococcus faecium NRRL B-2354 as Thermal Surrogate Microorganisms for Salmonella for In-Plant Validation Studies of Low-Moisture Pet Food Products. Journal of Food Protection, Vol. 78, No. 5, 2015, Pages 934-939. 25 Guidelines for Using Enterococcus faecium NRRL B-2354 as a Surrogate Microorganism in Almond Process Validation. Almond Board of California Guideline. Safety of the Surrogate Microorganism Enterococcus faecium NRRL B-2354 for Use in Thermal Process Validation. Lauren M. Kopit, Eun Bae Kim, Roland J. Siezen, Linda J. Harris, Maria L. Marco. Appl. Environ. Microbiol. 2014, 80(6):1899. 30 D01:10.1128/AEM.03859-13. - Elena Enache, Ai Kataoka, D. Glenn Black, Carla D. Napier, Richard Podolak, And Melinda M. Hayman. Development of a Dry Inoculation Method for Thermal Challenge Studies in Low-Moisture Foods by Using Talc as a Carrier for Salmonella and a Surrogate (Enterococcus faecium). Journal of Food Protection, 2015. 78: 1106- 35 1112 REVENDICATIONS1. Procédé de contrôle d'un procédé de décontamination dans lequel on met en oeuvre le procédé de décontamination en présence d'au moins un microorganisme témoin et on observe le comportement dudit au moins un microorganisme témoin au cours dudit procédé de décontamination, caractérisé en ce que le au moins un microorganisme témoin est choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter ou du genre Erwinia et leurs mélanges. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce l'on emploie un 10 mélange d'au moins 2 microorganismes témoins. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le mélange d'organismes témoins comprend au moins 2 microorganismes témoins choisis parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter ou du genre Erwinia et leurs mélanges. 15 4. Procédé de contrôle selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les microorganismes témoins choisis parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes sont choisis parmi Enterobacter hormaechei CNCM 1-5058, Pantoea agglomerans CNCM 1-5059, Enterobacter mon CNCM 1-5060, Pantoea calida CNCM 1-5061, Erwinia persicina CNCM 1-5062, Erwinia persicina CNCM 1-5063 et leurs mélanges. 20 5. Procédé de contrôle selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le mélange d'au moins 2 microorganismes témoins comprend au moins un microorganisme témoin choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Enterobacter ou du genre Erwinia et au moins un microorganisme témoin choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Pantoea. 25 6. Procédé de contrôle selon la revendication 5, caractérisé en ce que le au moins un microorganisme témoin choisi parmi les Enterobacteriaceae non pathogènes du genre Pantoea est choisi parmi Pantoea agglomerans CNCM 1-5054, Pantoea agglomerans CNCM 1-5055, Pantoea calida CNCM 1-5056, Pantoea gaviniae CNCM I5057 et leurs mélanges. 30 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les microorganismes témoins sont employés sous forme de spores et/ou sous forme végétative sèche. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les microorganismes témoins sont employés secs sur un support inerte. 35 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le procédé de décontamination comprend une ou plusieurs étapes de pasteurisation, 3050738 13 séchage, extrusion, torréfaction, cuisson, stérilisation, autoclavage et traitements à la vapeur. 10. Procédé de contrôle selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le procédé de décontamination contrôlé a pour objet l'élimination d'un ou plusieurs 5 microorganismes pathogènes cibles, choisis parmi Salmonella, Escherichia co/i, Bacillus, Listeria, Campylobacter, Cronobacter sakazakii. 11. Microorganismes témoins susceptibles d'être employés comme substituts dans un procédé de contrôle d'un procédé de décontamination, caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi Enterobacter hormaechei CNCM 1-5058, Pantoea agglomerans CNCM 1-5059, Enterobacter mon CNCM 1-5060, Pantoea calida CNCM 1-5061, Erwinia persicina CNCM 1-5062, Erwinia persicina CNCM 1-5063, Pantoea agglomerans CNCM 1-5054, Pantoea agglomerans CNCM 1-5055, Pantoea calida CNCM 1-5056, Pantoea gaviniae CNCM 1-5057. 12. Mélange de microorganismes témoins, caractérisé en ce qu'il comprend au 15 moins 2 espèces de microorganismes selon la revendication 11. 13. Kit de contrôle d'un procédé de décontamination, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un microorganisme selon la revendication 11 et un support approprié pour son utilisation dans le procédé de décontamination. 14. Utilisation d'au moins un microorganisme selon la revendication 11 ou d'un 20 mélange selon la revendication 12 ou d'un kit de contrôle selon la revendication 13 pour le contrôle d'un procédé de décontamination.