Brevet FR3055905A1 — publié le 20180316

La présente invention concerne une méthode de sexage précoce d'esturgeon, notamment sibérien. En aquaculture, la connaissance du sexe des poissons est une problématique importante, notamment pour améliorer les taux de croissance, qui peuvent dépendre du sexe. Pour les éleveurs d'esturgeons, cette question est plus cruciale encore. En effet, l'élevage de l'esturgeon est coûteux car c'est un grand poisson qui demande beaucoup de place et de nourriture. Le commerce de la chair d'esturgeon est donc difficilement rentable. Seul le commerce du caviar, concernant bien entendu les femelles, est lucratif. Il est donc important de pouvoir distinguer très tôt les femelles des mâles : c'est ce que l'on appelle le sexage précoce. Chez les esturgeons, le sexage précoce est difficile, car il n'existe pas de dimorphisme sexuel : les mâles et les femelles sont similaires au niveau morphologique. Il faut attendre entre 2 et 10 ans environ, avant que les gonades des esturgeons soient différentiables. D'ailleurs, les techniques actuelles de sexage nécessitent d'attendre que les gonades soient différenciées ; elles reposent sur l'échographie des gonades, le dosage d'hormones et la biopsie ou la chirurgie des gonades. Ainsi, aucune aquaculture d'esturgeon actuelle, développée dans le monde, ne réalise de sexage précoce (i.e. à quelques mois). La demande US2013/0244261 divulgue une technique de dosage hormonal plus précoce que les techniques actuelles. Elle se base sur la quantification dans le sérum, le plasma ou le sang, d'hormones de la superfamille du TGF-f3, chez des esturgeons âgés de un à plusieurs années. De façon surprenante, les inventeurs ont réussi à mettre en oeuvre une méthode de sexage précoce d'esturgeon, notamment sibérien. Cette méthode est basée sur la mesure de la longueur des télomères, par qPCR. Les télomères jouent un rôle majeur dans le maintien de l'intégrité du génome. Ils sont aux extrémités des chromosomes, et présentent une séquence caractéristique TTAGGG 3055905 2 répétée n fois. Jusqu'à présent, les télomères n'ont jamais été utilisés comme outil de sexage d'une espèce. Or, les inventeurs ont identifié que la longueur des télomères peut être utilisée comme marqueur du sexage précoce des esturgeons. En effet, les valeurs les plus hautes sont 5 observées pour les mâles, tandis que les valeurs les plus basses sont observées pour les femelles. La méthode proposée dans l'invention est ainsi fiable, et peut être mise en oeuvre chez des esturgeons âgés de seulement quelques mois. 10 L'invention se rapporte donc à une méthode de sexage d'esturgeon, notamment sibérien, comprenant : a) une étape d'extraction de l'ADN génomique contenu dans un échantillon sanguin dudit esturgeon âgé de quelques mois, b) une étape de qPCR comprenant la détection et la quantification de la séquence 15 télomérique (TTAGGG)n présente dans l'ADN génomique obtenu en a), c) une étape de qPCR comprenant la détection et la quantification de deux gènes de référence présents dans l'ADN génomique obtenu en a), puis le calcul de leur quantité moyenne, d) le calcul du ratio de la quantité obtenue en b) par rapport à la quantité moyenne 20 obtenue en c), puis e) la comparaison du ratio obtenu en d) à une valeur seuil, dans laquelle lorsque le ratio obtenu en d) est supérieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon est généralement un mâle, et lorsque le ratio obtenu en d) est inférieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon est généralement une femelle. 25 Cette méthode est appelée méthode de sexage selon l'invention. L'esturgeon est un poisson de la famille des Acipenseridae. Cette famille comprend la sous-famille des Acipenserinae, qui inclut elle-même le genre Acipenser, et la sous-famille des Scaphirhynchinae. De préférence, l'esturgeon visé par la méthode selon 30 l'invention est l'esturgeon sibérien (Acipenser baerii). 3055905 3 Par « méthode de sexage » d'un poisson, on entend une méthode visant à déterminer le sexe dudit poisson. La méthode de sexage selon l'invention est une méthode de sexage précoce, i.e. qui vise à déterminer le sexe chez des poissons âgés de quelques mois à partir d'un échantillon sanguin. 5 Par « esturgeon âgé de quelques mois », on entend un esturgeon âgé de quelques mois, de préférence de 2 à 6 mois, de préférence d'environ 3 mois. La méthode de sexage d'esturgeon selon l'invention comprend une étape d'extraction de l'ADN génomique contenu dans un échantillon sanguin dudit esturgeon âgé de quelques 10 mois : c'est l'étape a). L'étape peut se faire par toute méthode connue dans l'art antérieur. Notamment, elle peut être réalisée à l'aide de tout kit commercial à cet effet, notamment contenant de la protéinase K, tel que le kit NucleoSpin 8 Blood de Macherey-Nagel. 15 Puis, une fois l'ADN génomique extrait, s'ensuit une étape b) de qPCR, qui comprend la détection et la quantification de la séquence télomérique (TTAGGG). (n étant un entier) présente dans l'ADN génomique obtenu en a). Classiquement, la technique employée pour mesurer la longueur des télomères est le Southern Blot. Cependant, une telle technique est onéreuse et longue à mettre en oeuvre. 20 La technique de qPCR proposée dans la présente invention apporte une rapidité et une fiabilité des mesures. Cette étape de qPCR est notamment réalisée à l'aide des amorces télomériques Tell et Te12 suivantes : Tell: 5'CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3' (SEQ ID 25 NO :1) et Te12: 5'GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3' (SEQ ID NO :2). Ainsi, de préférence, l'étape b) est effectuée à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO:1 et 2. 30 De préférence, la PCR quantitative (qPCR) utilise la technologie du SYBR Green (marqueur fluorescent), notamment avec le thermocycleur LightCycler 480 de Roche. 3055905 4 Simultanément, antérieurement ou postérieurement à l'étape b), se trouve l'étape c), qui comprend une étape de qPCR comprenant la détection et la quantification de deux gènes de référence présents dans l'ADN génomique obtenu en a), puis le calcul de leur quantité moyenne. De préférence, les étapes b) et c) sont simultanées. 5 Par « gène de référence », on entend un gène constitutionnel qui code principalement pour une protéine essentielle aux fonctions cellulaires de base. De manière préférée, la quantité du gène de référence selon l'invention est représentative de la quantité d'ADN génomique (génome) extrait à l'étape a). Par exemple, le gène de référence peut être le gène codant pour la beta actine, l'alpha actine ou le gène codant pour l'ARN ribosomal 10 18S. De préférence, les deux gènes de référence utilisés dans l'invention sont la beta actine et le gène codant pour l'ARN ribosomal 18S. Ces gènes de référence présentent un intérêt majeur dans le contexte de l'invention. En effet, ils permettent d'obtenir une quantité moyenne de gène, et ainsi de normer la longueur des télomères. 15 De préférence, et comme indiqué ci-dessus, la PCR quantitative (qPCR) utilise la technologie du SYBR Green (marqueur fluorescent), notamment avec le thermocycleur LightCycler 480 de Roche. De préférence, les deux gènes de référence utilisés sont la beta actine et le gène codant 20 pour l'ARN ribosomal 18S (« gène 18S »), et l'étape c) de qPCR est réalisée à l'aide des amorces Actl et Act2 suivantes pour la beta actine, et 18S1 et 18S2 suivantes pour le gène 18S : Actl: 5'TATCCTGACCCTGAAGTACCCAATC-3' (SEQ ID NO :3) et Act2: 5'-CACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTG-3' (SEQ ID NO :4) 25 18S1: 5'-TGAGAAACGGCTACCACATCC-3' (SEQ ID NO :5) et 18S2: 5'-GCCTCGAAAGAGTCCTGTATTG-3' (SEQ ID NO :6). Ainsi, de préférence, l'étape c) est effectuée à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO:3 à 6. 30 De préférence, les conditions d'amplification de l'étape b) et/ou de l'étape c), de préférence des étapes b) et c), sont les suivantes : 3055905 5 - une première phase de chauffage, afin de dénaturer l'ADN (étape de dénaturation initiale) ; suivie par - une seconde phase de plusieurs cycles, chaque cycle comprenant : o une phase de dénaturation, puis 5 o une phase d'hybridation des amorces, et o une phase d'élongation. A la fin de l'étape c), on obtient ainsi la quantité moyenne de chacun des deux gènes de référence. 10 Cette quantité moyenne est alors utilisée pour normer la quantité mesurée relative à la longueur des télomères de l'étape b) : c'est l'étape d). Plus précisément, l'étape d) comprend le calcul du ratio de la quantité obtenue en b) par rapport à la quantité moyenne obtenue en c). Ce ratio correspond à la longueur relative 15 des télomères. Ce ratio est ensuite comparé à une valeur seuil ; c'est l'étape e). Lors de cette comparaison : - si le ratio obtenu en d) est supérieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon est un mâle, 20 et - si le ratio obtenu en d) est inférieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon est une femelle. Par « valeur seuil », on entend ainsi la valeur limite du ratio obtenu en d) au-dessus duquel l'esturgeon duquel provient l'échantillon est sexé comme mâle selon la méthode 25 de l'invention. De préférence, comme indiqué dans l'exemple, la valeur seuil du ratio est égale à 9. L'invention a également pour objet une méthode pour augmenter la proportion de 30 femelles esturgeons (notamment sibériens) présente dans une aquaculture d'esturgeons âgés de quelques mois (notamment sibériens) comprenant la méthode de sexage selon l'invention, suivie d'une étape f) de sélection des femelles. 3055905 6 Une telle méthode pour augmenter la proportion de femelles esturgeons peut comprendre la sélection des femelles dans une population donnée, ou bien l'extraction des mâles présents dans cette population. 5 La méthode pour augmenter la proportion de femelles esturgeons présente dans une aquaculture d'esturgeons âgés de quelques mois, comprend ainsi les étapes suivantes : a) une étape d'extraction de l'ADN génomique contenu dans un échantillon sanguin de chacun des esturgeons âgés de quelques mois, b) une étape de qPCR comprenant la détection et la quantification de la séquence 10 télomérique (TTAGGG)n présente dans l'ADN génomique obtenu en a), c) une étape de qPCR comprenant la détection et la quantification de deux gènes de référence présents dans l'ADN génomique obtenu en a), puis le calcul de leur quantité moyenne, d) le calcul du ratio de la quantité obtenue en b) par rapport à la quantité moyenne 15 obtenue en c), e) la comparaison du ratio obtenu en d) à une valeur seuil, dans laquelle lorsque le ratio obtenu en d) est supérieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon est un mâle, et lorsque le ratio obtenu en d) est inférieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon est une femelle, puis 20 f) sélection des femelles identifiées en e). En effet, comme démontré dans l'exemple, la méthode de sexage selon l'invention permet de sexer les esturgeons, notamment sibériens, de façon précoce, de sélectionner les femelles et d'extraire au moins 40% des mâles. Cela permet in fine, d'augmenter le 25 ratio sexuel femelles : mâles, et ainsi d'augmenter la proportion de femelles présentes dans l'aquaculture. L'invention est illustrée à l'aide de l'exemple ci-dessous. 30 Figure 1. Boîtes à moustache représentant la longueur des télomères entre les jeunes mâles et femelles. 3055905 7 La moyenne est indiquée par la croix, la barre inférieure représente le premier quartile, la barre intermédiaire la médiane et la barre supérieure le troisième quartile. Les moustaches représentent les seuils 5 et 95 %. 5 EXEMPLE : Protocole d'analyse de la longueur des télomères permettant de sexer des esturgeons sibériens juvéniles Le ratio sexuel de l'esturgeon sibérien est de 1 mâle pour 1 femelle. Les aquacultures dédiées à la production de caviar cherchent à déterminer le sexe des individus le plus tôt 10 possible afin de concentrer les efforts de production sur les femelles. Le sexage des esturgeons sibériens est actuellement réalisé sur des individus dont les gonades sont développées par une échographie ou, plus rarement, un dosage hormonal. L'âge de ces poissons, environ 3 ans, dépend des conditions environnementales. Le taux d'erreur du sexage par échographie est d'environ 10 %, en fonction du niveau de maturité 15 des gonades et de l'acuité de l'expérimentateur. La technique de sexage précoce selon l'invention permet d'enrichir en femelles des lots d'esturgeons sibériens âgés de 3 mois. Le prélèvement est réalisé sur des esturgeons sibériens de 3 mois par une prise de sang 20 dans la veine caudale. L'échantillon est centrifugé (10 min, 3000 g), le plasma est éliminé et 1 ml d'éthanol absolu est ajouté au culot d'érythrocytes avant un stockage à -80°C jusqu'à utilisation. L'ADN génomique est extrait à l'aide du kit NucleoSpin 8 Blood (Macherey-Nagel) en suivant les recommandations du fournisseur. La concentration de chaque échantillon est 25 ensuite ajustée à 10 ng.1.11-1, le stockage se fait à -80°C jusqu'à utilisation. L'analyse est réalisée en PCR quantitative relative, utilisant la technologie du SYBR Green sur un thermocycleur en temps réel LightCycler 480 (Roche). Le mélange réactionnel (volume final de 10 .il) est constitué de 5 pl de master mix (Roche), 1 pl de chaque amorce (1 1.1M final), 1 pl d'eau ultra pure et 2 pl d'ADN (20 lag final). Chaque échantillon est traité en 30 duplicata et les plaques 384 puits utilisées contiennent toutes un contrôle négatif et un calibrateur permettant de standardiser les analyses entres elles. 3055905 8 Le protocole d'amplification et les amorces se fixant sur les séquences télomériques (amorces Tel) sont issus de la publication de Cawthon (2002). Ainsi, les amorces Tel sont Tell et Te12, de séquences SEQ ID NO:1 et 2. 5 Deux gènes de références sont utilisés, la B-actine et le 18S, dont les amorces respectives sont Actl et Act2; 18S1 et 18S2, de séquences SEQ ID NO:3 à 6. Pour toutes les plaques, les courbes de fusions de chaque amplifiât, le contrôle négatif et le calibrateur sont contrôlés. Un seul pic doit être observé sur chaque courbe de fusion, 10 aucune amplification ne doit être retrouvée pour le contrôle négatif et une valeur standard sera issue du calibrateur. L'efficacité réelle de chaque couple d'amorces est définie à l'aide de gammes de dilutions issues d'un pool d'échantillons. Ces efficacités permettent de déterminer le signal télomérique qui est exprimé 15 relativement aux deux références. Le ratio obtenu à l'aide du logiciel LC480 software version 1.5 permet d'estimer la longueur relative des télomères pour chaque individu. Afin d'éprouver cette méthodologie, des individus furent prélevés à l'âge de 3 mois, pucés, puis, après le développement de leurs gonades, sexés classiquement par 20 échographie. Un total de 111 mâles et 101 femelles furent ainsi obtenus. La longueur des télomères est globalement plus faible chez les femelles que chez les mâles (test t de Student, p = 0.03 ; Figure 1.A). Ainsi, en fixant un seuil inférieur à 9 pour le ratio, 25 % des individus sont conservés et présentent un ratio sexuel de 3 femelles 25 pour 1 mâle (élimination de 50 % des individus mâles). Une partie de ces individus ont été analysés en double aveugle à un an d'intervalle (Figure 1.B). Une fois encore la longueur des télomères est globalement plus faible chez les femelles que chez les mâles (test t de Student, p = 0.03). Une élimination de 40 % des poissons ayant les télomères les plus longs permet 30 d'extraire immédiatement 50 % des individus mâles pour 28 % des individus femelles, donnant au final un ratio sexuel de 60 % de femelles pour 40 % de mâles. REVENDICATIONS1. Méthode de sexage d'esturgeon, comprenant : a) une étape d'extraction de l'ADN génomique contenu dans un échantillon sanguin dudit esturgeon âgé de quelques mois, b) une étape de qPCR comprenant la détection et la quantification de la séquence télomérique (TTAGGG)n présente dans l'ADN génomique obtenu en a), c) une étape de qPCR comprenant la détection et la quantification de deux gènes de référence présents dans l'ADN génomique obtenu en a), puis le calcul de leur quantité moyenne, d) le calcul du ratio de la quantité obtenue en b) par rapport à la quantité moyenne obtenue en c), e) la comparaison du ratio obtenu en d) à une valeur seuil, dans laquelle lorsque le ratio obtenu en d) est supérieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon est généralement un mâle, et lorsque le ratio obtenu en d) est inférieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon est généralement une femelle. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'esturgeon est un esturgeon sibérien. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'esturgeon est âgé de 2 à 6 mois, de préférence d'environ 3 mois. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'étape b) est effectuée à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO:1 et 2. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'étape c) est effectuée à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO:3 à6. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la valeur seuil du ratio est égale à 9. 3055905 10 7. Méthode pour augmenter la proportion de femelles esturgeons présente dans une aquaculture d'esturgeons âgés de quelques mois, comprend ainsi les étapes suivantes : a) une étape d'extraction de l'ADN génomique contenu dans un échantillon sanguin de chacun des esturgeons âgés de quelques mois, 5 b) une étape de qPCR comprenant la détection et la quantification de la séquence télomérique (TTAGGG)n présente dans l'ADN génomique obtenu en a), c) une étape de qPCR comprenant la détection et la quantification de deux gènes de référence présents dans l'ADN génomique obtenu en a), puis le calcul de leur quantité moyenne, 10 d) le calcul du ratio de la quantité obtenue en b) par rapport à la quantité moyenne obtenue en c), e) la comparaison du ratio obtenu en d) à une valeur seuil, dans laquelle lorsque le ratio obtenu en d) est supérieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon est un mâle, et lorsque le ratio obtenu en d) est inférieur à la valeur seuil, alors ledit esturgeon 15 est une femelle, puis f) sélection des femelles identifiées en e).