Brevet FR3055994A1 — publié le 20180316

ETAT DE LA TECHNIQUE Le séquençage de nouvelle génération (NGS) a profondément bouleversé les approches et les applications de l'étude du génome, du fait de l'augmentation massive des capacités de séquençage conjointement à une réduction des temps de production et des coûts. En contrepartie, cela s'est accompagné d'un accroissement considérable des données à traiter rendant indispensable le recours à des outils informatiques puissants et innovants. En ce sens les problématiques rencontrées sont proches de celles communément regroupées sous le terme « big-data ». Une des applications du NGS en santé humaine est la recherche de mutations du génome dans le cadre de maladies ayant une composante génétique ou de susceptibilité/ou réponse à un médicament, par exemple dans le contexte de personnalisation du traitement des pathologies tumorales. Typiquement l'analyse d'un exome humain (uniquement les 3% du génome humain codant pour des protéines), produit approximativement 50 000 variants par individu séquencé. A partir de ces listes de variants l'objectif pour le biologiste et/ou le médecin est d'identifier la/les mutations associées au phénotype d'intérêt (par exemple une pathologie). En pratique cela implique de pouvoir comparer ces listes de variants sur un grand nombre d'échantillons proches ou au contraire différents d'un point de vue phénotypique. Le document WO 2013/070634 décrit des filtres pour trouver des variants, ces filtres étant associés à des informations biologiques. Mais le procédé décrit ne présente pas comment les données sont traités pour l'ensemble des variants du génome et ne permet pas de traiter en temps réel ou dans 25 un temps très rapide, par exemple durant la durée continue d'une connexion de téléchargement en moins de deux minutes. 30 3055994 2 EXPOSE DE L'INVENTION Polyweb est une suite logicielle destinée à aider le biologiste dans la réalisation de ces différentes opérations de manière interactive et dans l'interprétation biologique 5 de ces variants à partir de différentes bases de connaissance. Polyweb permet de répondre à la fois aux deux principales problématiques du NGS, l'organisation et la gestion des données (PolyProject), ainsi que l'analyse et l'interprétation des résultats de séquençage d'exome (Polyquery) et/ou de 10 reséquençage ciblé (polyDiag). Polyquery est une interface graphique qui va permettre au biologiste de composer lui-même ses requêtes sur ses données de séquençages. Les filtres peuvent porter sur la nature et les annotations associées au variant (conséquence sur la protéine, 15 fréquences dans des populations de référence). En utilisant Polyquery le biologiste pourra également composer facilement et graphiquement des filtres entre les échantillons basés sur le croisement des phénotypes et des variants (intersection, exclusion, modèle de transmission génétique : récessif, denovo). 20 Le biologiste peut, au travers de l'interface, sauvegarder des requêtes, exporter ses résultats, et visualiser les alignements.Polyquery est également connecté à d'autres outils d'annotation (Alamut), de visualisation (IGV) et de base d'annotation publiques (Ensembl, DBsnp). L'invention est un procédé de traitement de données issues du séquençage haut débit pour traiter/analyser les séquences d'acides nucléiques correspondant à l'exome ou au génome de plusieurs échantillons biologiques, afin de trouver, parmi les dites séquences d'acides nucléiques, au moins un gène possiblement impliqué dans un phénotype d'intérêt, à partir des variants Vj dans un chromosome donné, j prenant les 3055994 3 valeurs de 1 à T, T étant égal au nombre total de variants détectés dans le chromosome. De façon remarquable, pour réaliser des requêtes sur les variants dans le procédé on calcule des vecteurs de bits, les bits étant utilisés pour noter l'appartenance 5 de ces variants Vi à des catégories d'annotation de façon à permettre des opérations logiques entre les catégories d'annotation, l'appartenance de ces variants Vi étant indexée par la position génomique des variants Vi. Avantageusement, il est calculé plusieurs tailles de vecteurs de bits. 10 Avantageusement, le procédé comprend une première étape (a), préalable à la création des vecteurs de bits, dans laquelle : - on calcule une première table de référence décrivant les différentes régions génomiques Ri de tous les chromosomes, chaque région génomique étant décrite par 15 une position initiale et une position finale sur un chromosome, - pour chaque chromosome, on calcule une seconde table de référence contenant l'ensemble des variants Vi classés suivant leur position sur le génome du chromosome, les variants Vj étant définis suivant un libellé unique des variants Vj. 20 Avantageusement, le procédé comporte une deuxième étape (b) dans laquelle: -on calcule des catégories d'annotation Ai qui sont représentées par des vecteurs de bits VA, de taille T, I étant un entier naturel supérieur ou égal à 1, - on note dans les vecteurs VA', par un bit et à la position j du vecteur VA, l'appartenance ou non de ce variant Vi à ces catégories Ai. 25 Avantageusement, dans lequel dans la deuxième étape (b) pour optimiser les requêtes et la mémoire pour chaque région génomique Ri: - on définit des secondes catégories d'annotation Bi spécifiques des régions génomiques Ri, 3055994 4 -on calcule des sous- vecteurs de bits VBi de taille inférieure à la taille T des vecteurs VAI, la première position du vecteur VBi indique par un bit l'appartenance du premier variant présent dans la région génomique Ri ; et la dernière position du vecteur VBi indique 5 par un bit l'appartenance du dernier variant présent dans la dite région génomique Ri. Dans une quatrième étape (d) les résultats sont sélectionnés et affichés en comptant le nombre de bit signalant l'appartenance ou non des variants dans les vecteurs de bits VAI VBi et VBik des premières et secondes catégories sélectionnés 10 AI, Bi, Bik. Avantageusement, on réalise une opération logique entre des vecteurs de différentes tailles: - entre les vecteurs de bits VAI et les sous-vecteurs de bits VBi et/ou VBik, 15 les sous-vecteurs VBi et/ou VBik étant complétés par des bits supplémentaires signalant la non appartenance aux catégories Bi et /ou Bik des variants supplémentaires Vj associés aux bits supplémentaires, pour avoir une taille égale à T afin de permettre l'opération logique. 20 DESCRIPTION DES FIGURES D'autres objectifs, caractéristiques et avantages sortiront de la description détaillée qui suit en référence aux dessins donnés à titre illustratif et non limitatif parmi 25 lesquels : la figure 1 représente les étapes du procédé de l'invention ; la figure 2 représente un tableau permettant d'étiqueter les variants ; les figures 3a et 3b représentent l'index réalisé dans l'invention et un grand vecteur de bits contenant tous les variants d'un projet donné ; 3055994 5 - les figures 4a et 4b représentent les grands vecteurs; - les figures 5a à 6b représentent des exemples de petits vecteurs de bits utilisés dans l'invention ; - les figures 7a à 8c représentent schématiquement le fonctionnement du 5 procédé et les opérations logiques entre les différents vecteurs de bits ; - les figures 9 à 10 représentent des copies d'écran du logiciel et montre des recherches sur les variants et de gènes via l'interface du logiciel. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION 10 La présente invention concerne un procédé de traitement de données issues du séquençage haut débit pour traiter/analyser les séquences d'acides nucléiques correspondant à l'exome ou au génome de plusieurs échantillons biologiques, pour trouver, parmi les dites séquences d'acides nucléiques, au moins un gène 15 possiblement impliqué dans un phénotype d'intérêt, le gène d'intérêt étant lié à un ou plusieurs variants Vi, j prenant les valeurs de 1 à T, T étant égal au nombre total de variants détectés par chromosome. T est un nombre entier naturel supérieur à 1. 20 Le procédé s'applique ainsi sur chaque chromosome, qui présente chacun un nombre total spécifique de variants Vj différents. Les variants sont des variations des séquences d'acides nucléiques par rapport à des 25 séquences nucléiques de référence. Dans une réalisation, le phénotype d'intérêt est une maladie rare. Dans ce cas, un échantillon peut être une personne saine/malade. 30 Dans une autre réalisation, le phénotype d'intérêt est un cancer, et les échantillons sont des cellules saines et des cellules malades d'un ou de plusieurs individus. 3055994 6 Par exemple, la table de référence comporte au moins, pour l'ensemble de variants - plusieurs dizaines de milliers variants Vi par individu pour l'exome ; -plusieurs millions de variants Vi par projet pour le génome 5 Par exemple, le nombre d'échantillons n est supérieur ou égal à 50 génomes, ou 150 exomes. Le procédé est spécifique, car pour réaliser des requêtes sur les variants Vj, il est 10 calcule des vecteurs de bits, les bits étant utilisés pour noter l'appartenance de ces variants Vj à des catégories d'annotation de façon à permettre des opérations logiques entre les catégories d'annotation, l'appartenance de ces variants Vj étant indexée par la position génomique des variants Vj. 15 Le mot 'vecteur de bits' signifie ici que les vecteurs comprennent dans leurs colonnes des valeurs binaires, par exemple la valeur 0 ou la valeur 1. Il est pris ici dans les exemples la valeur 1 pour noter que les variants sont présents dans les vecteurs de bits associés à des catégories d'annotation données. 20 Avantageusement, il est calculé plusieurs tailles différentes de vecteurs de bits. Les vecteurs de bits sont ici des vecteurs dit 'lignes' ont une ligne et P colonnes, et dans chaque colonne, la présence/l'absence des variants Vi dans la catégorie 25 d'annotation est signalée par la présence d'un bit égal à 1 pour signaler la présence du variant V1 dans la catégorie et un bit égal à 0 pour signaler l'absence des variants Vi dans la catégorie. 30 Dans une étape (a) préalable de la création des vecteurs de bits, dans laquelle : 3055994 7 - on calcule une première table de référence décrivant les différentes régions génomiques Ri, chaque région génomique Ri étant décrite par une position initiale et une position finale sur un chromosome, - pour chaque chromosome, on calcule une seconde table de référence contenant 5 l'ensemble des variants Vj classés suivant leur position sur le génome du chromosome, les variants Vi étant définis suivant un libellé unique des variants Vj ; ainsi un index est créé ; cet index (ou position des variants les uns par rapport aux autres) sert de 'colonne vertébrale' à tout le procédé dans lequel il va être catégorisé tous les variants en autant de catégories d'annotation que possibles qui permettront une liste exhaustive 10 des requêtes de l'utilisateur, tout en gardant en mémoire de quel variant il s'agit et pour de quelle catégorie d'annotation associée à ce variant il s'agit, au vu de sa position dans l'index. Une région génomique RI est une région définie par un début et une fin sur le 15 chromosome. Elle peut correspondre, par exemple à titre illustratif et non limitatif, à un gène, une région intergénique, une région régulatrice, ou autres. Ces régions peuvent se chevaucher ou non, comme il est connu de l'état de l'art et de la littérature scientifique. Ainsi par exemple, des variants peuvent être co-localisés sur plusieurs régions génomiques à la fois. 20 Le procédé est réalisé sur chaque chromosome, et peut être lancé en parallèle sur les calculateurs sur chaque chromosome, pour optimiser le temps de calcul. Le libellé des variants Vj est composé de leur emplacement sur le chromosome, l'allèle, 25 l'acide nucléique du dit variant et peut être défini comme représenté sur la figure 2. Par exemple, l'individu P1 présente : -l'allèle de référence A sur le premier brin du chromosome 1 à la position 1500 ; -l'allèle muté T qui s'est substitué à l'allèle de référence A sur le deuxième brin du 30 chromosome 1 à la position 1500, ce qui est indiqué par 0/1. 3055994 8 Par exemple, l'individu P2 ne présente aucun allèle muté sur le chromosome 1 à la position 1500, ce qui est indiqué par 0/0. Par exemple, l'individu P3 présente sur la figure 2 : 5 -l'allèle muté T sur le premier brin du chromosome 1 à la position 1500, -l'allèle muté T sur le deuxième brin du chromosome 1 à la position 1500, ce qui est indiqué par 1/1. Il arrive qu'il y ait une insertion pour au moins un premier individu en même temps 10 qu'une substitution pour au moins un autre individu, voire plus de deux variations différentes au même endroit chez des individus différents. Dans ce cas-là, par exemple, comme représenté sur la figure 2 : - l'individu P1 présente l'allèle muté T par insertion de CG sur le deuxième brin du 15 chromosome 1 à la position 1516, ce qui est indiqué par 0/1, -l'individu P 2 présente lui l'allèle muté T par substitution d'AT par AG sur les deux brins du chromosome 1 à la position 1516, ce qui est indiqué par 2/2. Dans la deuxième étape (b) de la création des vecteurs de bits, il est : 20 -défini des premières catégories d'annotation Ai et calculé (déterminé, réalisé) des vecteurs de bits VA' de taille T, avec I entier naturel supérieur à 1, représentants et associés à ces premières catégories d'annotation Ai ; - noté dans les vecteurs VAi, par un bit égal à 1 ou 0 (ou égal à 0 ou 1) et à la position j du vecteur VA' , l'appartenance ou non de ce variant Vi à ces catégories A. 25 Avantageusement, les vecteurs de bits VAi sont décrits par l'appartenance d'un variant Vj aux premières catégories d'annotation Ai suivantes : hétérozygote pour un échantillon donné ; homozygote pour un échantillon donné ; 30 appartenance à un échantillon ; appartenance à un groupe d'échantillons, tel qu'une famille ; 3055994 9 - fréquence des variants Vi dans des bases de données. La fréquence des variants Vi dans des bases de données peut être définie comme suit 5 - REVENDICATIONS1. Procédé de traitement de données issues d'un séquençage haut débit pour traiter/analyser les séquences d'acides nucléiques correspondant à l'exome ou au génome de plusieurs échantillons biologiques, afin de trouver, parmi les dites séquences d'acides nucléiques, au moins un gène possiblement impliqué dans un phénotype d'intérêt, à partir des variants Vj dans un chromosome donné, j prenant les valeurs de 1 à T, T étant égal au nombre total de 10 variants détectés dans le chromosome, caractérisé en ce que pour réaliser des requêtes sur les variants Vj, on calcule des vecteurs de bits, les bits étant utilisés pour noter l'appartenance de ces variants V1 à des catégories d'annotation de façon à permettre des opérations logiques entre les 15 catégories d'annotation, l'appartenance de ces variants NA étant indexée par la position génomique des variants Vi. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel il est calculé plusieurs tailles de 20 vecteurs de bits. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant une première étape (a), préalable à la création des vecteurs de bits, dans laquelle : - on définit une première table de référence décrivant les différentes régions 25 génomiques Ri de tous les chromosomes, chaque région génomique étant décrite par une position initiale et une position finale sur un chromosome, - pour chaque chromosome, on définit une seconde table de référence contenant l'ensemble des variants Vi classés suivant leur position génomique, les variants Vi étant définis suivant un libellé unique des variants 30 3055994 19 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, comprenant une deuxième étape (b) dans laquelle on calcule des vecteurs de bits VA de taille T, I étant un entier naturel supérieur ou égal à 1, associés à des premières catégories d'annotation AI, en notant dans les vecteurs VA;, par un bit à la position j du vecteur VAi l'appartenance ou non 5 de ce variant Vi à ces catégories Ai. 5. Procédé selon la revendication 4, comprenant une deuxième étape (b) dans laquelle les premières catégories d'annotation Ai sont les suivantes : appartenance à un échantillon ; hétérozygote pour un échantillon donné ; homozygote pour un échantillon donné ; appartenance à un groupe d'échantillons, tel qu'une famille ; fréquence des variants Vi dans des bases de données. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 à 5, dans lequel dans la deuxième étape (b) pour optimiser les requêtes et la mémoire pour chaque région génomique Ri: - on définit des secondes catégories d'annotation Bi spécifiques des régions génomiques Ri, -on calcule des sous- vecteurs de bits VI3; de taille inférieure à la taille T des vecteurs 20 VA', la première position du vecteur VE3; indique par un bit l'appartenance du premier variant présent dans la région génomique R1 ; et la dernière position du vecteur VB; indique par un bit l'appartenance du dernier variant présent dans la dite région génomique R. 25 7. Procédé selon la revendication 6, dans laquelle pour chacun de ces sous-vecteurs VI3i, on calcule un sous- vecteur Vak représentant une seconde catégorie d'annotation Bik spécifique à la région génomique Ri, et pour chaque variant Vj présent dans cette région génomique Ri, on note l'appartenance de ce variant yjà cette catégorie Bk dans le sous-vecteur Vak par un bit , à la j - JO position, JO étant la position du premier 30 variant de la région génomique R1 dans la seconde table de référence. 3055994 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel les secondes catégories d'annotation Bik sont les suivantes: - non synonyme et synonyme, -mutation génétique causée par insertion/délétion changement ou non du cadre de 5 lecture, - région intronique, - région d'épissage accepteur donneur, ..., - Micro ARN , -gain ou perte de stop, 10 -RNA non codant, -pseudogène, -région non traduite, -outil de prédiction de pathogénicité ; - décalage ou non du cadre de lecture. 15 9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, dans lequel dans une troisième étape (c), les requêtes simples et/ou des requêtes complexes de filtres sur les variants sont décomposées en une ou plusieurs opérations logiques portant sur les différents vecteurs VA' et sur les différents sous-vecteurs de bits VBi et VBik. 20 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel dans une quatrième étape (d) les résultats sont sélectionnés et affichés en comptant le nombre de bit signalant l'appartenance ou non des variants dans les vecteurs de bits VA' VB; et Val 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel les requêtes sont réalisées sur plusieurs millions de variants. 12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel on réalise une opération 30 logique entre des vecteurs de même taille: - entre les vecteurs de bits VA ; ou 3055994 21 -entre les sous-vecteurs de bits VB1 et/ou VBik 13. Procédé selon l'une des revendications 9 à 12, dans lequel on réalise une opération logique entre des vecteurs de différentes tailles: 5 - entre les vecteurs de bits VA' et les sous-vecteurs de bits VBi et/ou VBik, les sous-vecteurs Va et/ou VBik étant complétés par des bits supplémentaires signalant la non appartenance aux catégories Bi et /ou Bik des variants supplémentaires Vj associés aux bits supplémentaires, pour avoir une taille égale à T afin de permettre l'opération logique. 10 14. Procédé selon l'une des revendications 12 à 13, dans lequel l'opération logique est une intersection ou une différence. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel le phénotype d'intérêt 15 est une maladie rare. 16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, dans lequel le phénotype d'intérêt est un cancer, et les échantillons sont une cellule saine et une cellule malade d'un individu ou plusieurs individus. 20 25 35