Brevet FR3053119A1 — publié le 20171229

Le secteur technique de la présente invention est celui de la détection électrique d'une molécule. Le principe de la détection électrique du transport d'une molécule à travers un nanopore qui peut être un canal protéique ou un nanotube inséré dans une membrane lipidique ou un trou nanométrique percé dans une membrane solide est bien connu. La membrane est soumise à une différence de potentiel qui induit un courant ionique à travers le nanopore en présence d'une solution d'électrolytes. Le passage d'une molécule à travers le nanopore, ou l'interaction de la molécule avec le nanopore, induit une chute du courant mesurable. La profondeur de cette chute de courant et sa durée dépendent, en particulier, de la conformation, de la taille, de la séquence et de la nature chimique de la molécule. Cette sensibilité a été utilisée pour faire du séquençage ultra-rapide d'ADN (Branton et al, 2008, Nat. Biotech ou Karlsson et al, 2015, Scientific reports). Une autre application très prometteuse concerne la possibilité de déterminer la taille ou la masse d'une molécule ou d'un mélange de molécules donc de faire de la spectrométrie de masse à l'aide d'un nanopore couplé à système de détection électrique ultrasensible. Il a été montré la séparation d'un mélange de polymères synthétiques (Roberston et al, 2007, PNAS ; Reiner et al, 2010, PNAS ; Baaken et al, 2011, ACS Nano ; Baaken et al, 2014, ACS Nano) dont une taille de chaîne correspond à une signature électrique de blocage de courant. Il a été également observé récemment la séparation de nucléotides entre 2 et 10 monomères, pour seulement un polydésoxyadénosine, à travers l'aérolysine (Cao et al, 2016, Nat. nanotech). L'utilisation du nanopore aérolysine est bien connue et Wilmsen et al 1990 ont montré que l'aérolysine forme un canal 35 sensible au courant électrique dans une bicouche lipidique. Dans le document Stefureac et al, 2006, on s'est intéressé au transport de peptides à travers des pores d'aérolysine. On a observé des peptides de différentes 3053119 2 longueurs, la différence de temps de blocage de courant mais sans aboutir à une résolution fine à l'échelle d'un acide aminé. Dans les documents Pastoriza-Gallego et al, JACS 2011 et 5 Payet et al, Anal. Chem. 2012, on s'est intéressé à la dynamique des protéines non repliées (conformation) à travers un pore d'aérolysine. Cette étude a porté essentiellement sur la détermination des conformations de grandes protéines (>370 acides aminés) avec l'aérolysine associés à des durées 10 différentes de blocage de courant. Mais, aucune résolution fine n'a été proposée pour distinguer deux peptides différents par un seul acide aminé. L'examen de la littérature abondante disponible dans ce domaine montre que des difficultés existent pour séparer soit 15 des petites chaînes soit des grandes chaînes polypetidiques, séparation qui n'a pas été résolue à ce jour. La seule résolution fine pour visualiser les énantiomères aromatiques (Tryptophane, Phenylalanine, tyrosine) a été possible après modification chimique d'un pore d'alpha-hemolysine (Boersma 20 and Bayley, 2012, Angew. Chem. Int. Ed). Les inventeurs ont donc imaginé l'utilisation d'un canal protéique aérolysine, dans des conditions physico-chimiques précises, pour isoler les petites chaînes de quelques monomères sans recourir à des modifications chimiques 25 couteuses et complexes. Concernant les peptides ou protéines, de nombreux travaux ont été publiés sur la détermination macroscopique de la taille d'une protéine en utilisant le temps de transport (durée de blocage de courant) ou la profondeur de blocage de 30 courant avec des nanopores solides (Han et al, 2006, APL ; Fologea et al, 2007, APL ; Cressiot et al, 2011, ACS Nano ; Plesa et al, 2013, NanoLetters, Freedman et al, 2013, Scientific reports ; Larkin et al, 2014, BJ) ou avec des nanocapillaires en verre (Li et al, 2013, ACS Nano ; Steinbock et al, 2014, Nanoscale). Si ces approches permettent de séparer des protéines natives par leur taille, il faut cependant que les protéines soient différentes par au moins 4kDa pour les petites chaînes et de plus de 50 kDa pour 3053119 3 les grandes chaînes (Li et al, 2013, ACS Nano ; Steinbock et al, 2014). A ce jour, il n'a jamais été montré la possibilité de faire de la séparation en taille et en masse de peptides en 5 utilisant les nanopores aérolysine avec une résolution permettant de déterminer l'ajout d'un acide aminé dans la chaîne. C'est justement l'objet de l'invention que de proposer un procédé permettant d'isoler deux peptides différents par la 10 présence d'un seul acide aminé. L'invention a donc pour objet un procédé de détection électrique de peptides, de protéines distincts d'au moins un acide aminé et d'autres macromolécules comme les polysaccharides, les polyélectrolytes, pour les identifier 15 suivant leur taille et leur masse mettant en oeuvre un nanopore, caractérisé en ce qu'on utilise dans un milieu réactionnel un nanopore d'aérolysine ou un nanotube inséré dans une membrane lipidique que l'on soumet à une différence de potentiel supérieure à -160 mV, en présence d'une solution 20 d'électrolyte halogénure de métal alcalin ayant une concentration inférieure à 6M et à une température inférieure à 40 °C. Selon une caractéristique de l'invention, l'halogénure de métal alcalin est un chlorure de métal alcalin. 25 Avantageusement, l'halogénure de métal alcalin est représenté par LiC1, KC1 ou NaCl. Selon une autre caractéristique de l'invention, la différence de potentiel est comprise entre environ -80 et -10 mV. 30 Avantageusement, la différence de potentiel appliquée à la membrane est de -29 mV. Selon encore une autre caractéristique de l'invention, la concentration de la solution d'électrolyte est comprise entre 0,5 et 5M. 35 Avantageusement, la concentration en LiC1 est égale à 1M. Selon une autre caractéristique de l'invention, la température du milieu réactionnel est comprise entre 3 et 33°C. 3053119 4 L'invention a également pour objet l'utilisation du procédé pour isoler des peptides différenciés par au moins un acide aminé ou d'autres macromolécules comme les Polysaccharides ou polyélectrolytes. 5 L'invention a encore également pour objet la caractérisation de la dégradation enzymatique d'un échantillon de peptides par détermination des produits de dégradation. L'invention a encore pour objet l'obtention d'un peptide 10 unique. Avantageusement le peptide unique peut être constitué par le peptide RR10. L'invention a encore pour objet l'utilisation du procédé pour séparer des séquences différentes de peptides ou 15 protéines. Avantageusement, l'utilisation est mise à profit pour caractériser les modifications chimiques naturelles ou synthétiques de molécules natives telles qu'une protéine, un peptide, un métabolite, un médicament. 20 Avantageusement encore, l'utilisation est mise à profit pour déterminer l'activité enzymatique spécifique et molaire d'une enzyme dans une cellule unique procaryote ou eucaryote. Avantageusement encore, l'utilisation est mise à profit pour identifier et quantifier des molécules dites 25 « métabolites » appartenant à des voies métaboliques ou de signalisations cellulaires. Un tout premier avantage de l'invention réside dans la grande sensibilité et la haute résolution de la technique qui permet de différencier des molécules très proches l'une de 30 l'autre, différentes d'une molécule. Un autre avantage de l'invention réside dans le fait que cette grande sensibilité permette d'effectuer une analyse à partir d'un échantillon en très faible quantité. Un autre avantage de la présente invention réside dans 35 les nombreuses applications offertes comme la réalisation d'un séquençage des peptides. 3053119 5 Un autre avantage de l'invention réside dans la possibilité d'effectuer une certification de qualité 100% pur d'un peptide ou d'une molécule synthétisée. Un autre avantage de l'invention réside dans la 5 possibilité d'identifier et de quantifier des médicaments dans tous les fluides biologiques, dans une cellule unique. Un autre avantage encore de l'invention réside dans la capacité d'identification d'un peptide pour le diagnostique médical biologique. 10 Un autre avantage encore de l'invention réside dans la possibilité de conserver très longtemps un peptide ou un mélange de peptides, une protéine par lyophilisation pour obtenir une poudre. On peut alors insérer cette poudre en la protégeant avec 15 un film pour l'utiliser comme barre code à titre de marquage afin de l'identifier de façon certaine pour montrer son origine ou son unicité, telle l'origine de production d'un produit, la certification d'origine...). Ensuite, le contrôle se fera en mettant la poudre dans une solution tampon. La 20 conservation à température ambiante d'une solution est de quelques jours à quelques mois, par exemple à 4°C la durée est de plusieurs mois, à -20°C la durée est de plusieurs années. On entend par mélange de peptide bien défini un mélange 25 contenant par exemple 95% d'un peptide à 10 AA et 5% à 8 AA. Chacun des lots de ces peptides pouvant être modifié chimiquement (phosphorylation, halogénation, etc.). Il s'agirait d'un code barre invisible et donc discret qui pourrait être lu, en remettant en suspension le mélange 30 de peptides et en le décryptant avec la technologie décrite ici. D'autres caractéristiques, avantages et détails de l'invention seront mieux compris à la lecture du complément de description qui va suivre de modes de réalisation donnés à 35 titre d'exemple en relation avec des dessins sur lesquels : - la figure 1 représente la variation de la différence de potentiel en fonction du temps d'élution correspondant à la détection d'un peptide, 3053119 6 - la figure 2 représente l'analyse d'un mélange de six peptides, - la figure 3 représente les résultats d'analyse d'un échantillon de peptides du commerce, et 5 - la figure 4 illustre la dégradation enzymatique d'un échantillon de peptides de 10 acides aminés par la trypsine. Comme il ressort de ce qui précède, il est possible maintenant, suivant le procédé selon l'invention, de détecter à partir d'une mesure électrique, des peptides individuels et 10 de distinguer des peptides de tailles différentes avec une résolution d'un seul acide aminé. On a donc utilisé un produit vendu dans le commerce renfermant le peptide RR10 afin de déterminer sa composition exacte. Sur la figure 1, on retrouve différentes signatures à 15 des niveaux de courant différents. Ainsi, pour une durée d'expérience de 203,3 s et à une tension de 25 pA, on détecte une chute du courant correspondant au peptide RR10. Toutefois, on voit que la mesure effectuée révèle la présence des peptides RR9, RR8, RR7, RR6 et RR5. 20 A partir de ces mesures, on a construit à l'échelle de la molécule unique le spectrogramme de masse représenté sur la figure 2. On voit que dans l'échantillon analysé le peptide RR10 donné pour une concentration pure à 96% est toutefois accompagné de plusieurs autres peptides. 25 La très haute sensibilité procurée par le procédé selon l'invention révèle la présence de fragments peptidiques quantifiables (de l'ordre de 1% du nombre total de molécules détectées, soit quelques dizaines de molécules) dans un échantillon vendu pur à 96%. Jusqu'à ce jour, les fragments 30 n'étaient pas identifiés par l'analyse de spectrométrie de masse classique de la composition fournie par le vendeur de cet échantillon. On comprend tout l'intérêt de l'invention permettant d'accéder à un niveau de détection de molécules impossible avec les autres techniques d'analyse. 35 Pour obtenir ce résultat, différents facteurs sont à prendre en considération pour obtenir une résolution satisfaisante. 3053119 7 On a donc procédé à divers essais en faisant varier la concentration d'électrolyte, la nature de cet électrolyte, et la température du milieu. On a constaté, par exemple, qu'une augmentation de la concentration en électrolyte ou qu'une 5 diminution de la température favorise la détection des peptides les plus courts et vice versa. Ainsi, sur la figure 3, on a représenté les résultats obtenus en faisant varier la température et la concentration en électrolyte. On a représenté la durée de blocage de 10 courant en fonction de lb qui est l'intensité du courant du canal bloqué du nanopore aérolysine et IO l'intensité du courant du même canal vide du nanopore. Concernant la courbe du haut, la température est de l'ordre de 20 °C et la concentration en électrolyte de 2M. 15 Sur la courbe du milieu, la température est de 20 °C environ et la concentration en électrolyte est de 4M. Sur la courbe du bas, la température est de 5 °C et la concentration en électrolyte de 4M. On a déterminé que la concentration de la solution 20 d'électrolyte pourrait être comprise entre 0,5 et 5M et qu'une concentration de 1 M constitue un bon compromis, par exemple avec l'électrolyte LiCl. On a utilisé différents électrolytes comme par exemple LiC1, NaC1, KC1 ou KBr, RbC1, CsCl, KF, ou chlorure 25 d'ammonium, tétraméthylammonium chloride'). Les résultats obtenus sont globalement du même ordre quel que soit l'électrolyte. Ainsi, la concentration élevée en électrolyte permet d'étudier des molécules de masse moléculaire plus courte, de 30 l'ordre de deux acides aminés, et de manière surprenante un seul acide aminé. Dans ces conditions, le rapport signal/bruit est meilleur et les valeurs de Ib/I0 sont décalées vers la gauche du spectrogramme (plus Ib/I0 se trouve plus à gauche plus la masse du peptide correspondante 35 est plus importante). Ce décalage vers la gauche induit une marge à droite du spectrogramme favorisant ainsi la détection de peptides dont leur longueur est inférieure à trois acides aminés. Compte tenu de la marge à droite du spectrogramme et 3053119 8 à forte concentration en sel, la détection d'un seul acide aminé est accessible. Quant à la température, l'étude de ces trois diagrammes montre que la position des peptides varie en ordonnée et 5 qu'il est plus intéressant de préférer une température de 5 °C et une concentration de 4M. On améliore donc la résolution. De manière générale, la température du milieu réactionnel peut être comprise entre 3 et 33°C. La différence de potentiel appliquée à la membrane 10 nanopore aérolysine ne semble pas avoir d'effet sur la position des raies figurant sur les courbes de la figure 3. Toutefois, en passant par exemple de -10 mV à -80 mV, on a constaté que la durée moyenne de bouchage du courant dépend du voltage pour l'échantillon de peptides RR10. Le choix 15 d'une valeur de courant dépendra donc de la résolution que souhaite obtenir l'utilisateur. Une différence de potentiel appliquée à la membrane de -29 mV permet d'obtenir une excellente résolution. Dans ce qui précède, on a mis en oeuvre un nanopore 20 aérolysine mais il va de soi que d'autres nanopores peuvent être utilisés. Ainsi, un nanopore ou nanotube du type cyclodextrine peut être mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention en adaptant les conditions d'utilisation à savoir la température, la concentration en sel et la nature de 25 l'électrolyte. Un autre intérêt de l'invention repose sur les réactions enzymatiques. On sait que de nombreuses réactions enzymatiques sont déterminantes pour doser un produit important pour le diagnostic d'une maladie ou pour un 30 processus industriel. On peut donc, suivant l'invention, suivre la dégradation enzymatique d'un peptide, par exemple par la trypsine, et les constantes cinétiques ont été bien déterminées. La figure 4 illustre les résultats obtenus en procédant à 35 une analyse suivant l'invention avant et après dégradation enzymatique en mesurant l'intensité lb du courant du canal bloqué et l'intensité IO du courant du même canal de l'échantillon donné pur à 96%. Sur ces diagrammes, la raie la 3053119 9 plus à gauche représente le peptide RR10, les autres peptides étant sous forme de trace. Sur le diagramme du haut, on voit que, avant dégradation, le peptide RR10 est le constituant majeur de l'échantillon. 5 Après dégradation par la trypsine, on voit que l'appauvrissement du peptide RR10 s'effectue au profit des autres peptides RR9, RR8, RR7, RR6, RR5. Ainsi, le procédé selon l'invention permet une analyse fine d'échantillons de molécules comme les peptides en 10 distinguant un peptide différent d'un autre que par la présence d'un seul acide aminé. On a effectué les travaux précédent en s'attachant particulièrement à des échantillons donnés purs à 96% afin d'illustrer l'invention. Mais, on a obtenu la séparation de 15 peptides de différente taille lorsque l'échantillon peptidique est totalement logé dans le nanopore et que chaque monomère (acide aminé) contribue au blocage de courant. On comprend qu'il n'y a pas de limite dans l'analyse d'échantillons de peptide dès lors que la dimension du 20 nanopore recevant les peptides est ajustée. L'invention trouve une application particulièrement importante en métabolomique et enzymologie. Le diagnostic médical biologique doit aujourd'hui évoluer afin de permettre de travailler sur des échantillons précieux 25 et rares ne contenant que quelques cellules ou quelques microvésicules d'intérêt ou encore sur de petits volumes d'échantillon tel que ceux recueillis chez la souris. Les méthodes classiques de dosage qui utilisent la spectrométrie de luminescence, l'absorbance ou encore la 30 fluorescence, nécessitent de grandes quantités d'échantillon pour obtenir un signal suffisant, au-dessus du bruit de fond. Par exemple, un minimum de 500 000 cellules sanguines blanches est nécessaire pour le dosage de l'activité des complexes de la chaîne respiratoire. Ces méthodes classiques 35 interdisent par exemple de réaliser un profil enzymatique sur une cellule tumorale circulante isolée du sang. La technologie nanopore aérolysine mise au point dans l'invention permet de doser l'activité d'un petit nombre de 3053119 10 copies d'enzymes dans une cellule unique, selon un processus industriel, permettant de quantifier l'activité enzymatique d'un faible nombre de molécules d'enzyme qui sont libérées après lyse de la celle d'origine. 5 Ce processus est par exemple le suivant. 1) La cellule est lysée de manière classique pour libérer son contenu enzymatique. 2) Les molécules de l'enzyme d'intérêt et d'autres molécules provenant du contenu de la cellule lysée sont 10 entraînées par l'écoulement d'une solution tampon dans les tubulures du système microfluidique (système permettant de prendre en charge des fluides dont le volume est de 10-9 à 10-18 litres) jusqu'à une chambre réactionnelle. 3) Dans la chambre réactionnelle les molécules de 15 l'enzyme d'intérêt sont capturées sur un support par des sondes spécifiques qui peuvent être des anticorps, des sondes aptamériques, des peptides spécifiques, etc. L'écoulement continu du tampon permet de s'affranchir du phénomène de diffusion. Les autres molécules sont éliminées par diffusion. 20 4) Le substrat spécifique de l'enzyme d'intérêt est ensuite injecté et capturé par les enzymes d'intérêt fixées sur le support. Ces enzymes transforment le substrat en produit qui à son tour diffuse dans le tampon. L'excès de substrat est capturé par des sondes spécifiques en aval. 25 5) Enfin, les molécules de produits passent dans une série de nanopores aérolysine. Chaque passage est détecté et permet de compter chaque molécule et d'en déduire la concentration et l'activité enzymatique. REVENDICATIONS1. Procédé de détection électrique de peptides, de protéines distincts d'au moins un acide aminé et d'autres macromolécules comme les polysaccharides, les polyélectrolytes, pour les identifier suivant leur taille et leur masse mettant en oeuvre un nanopore, caractérisé en ce qu'on utilise dans un milieu réactionnel un nanopore d'aérolysine ou un nanotube inséré dans une membrane lipidique que l'on soumet à une différence de potentiel supérieure à -160 mV, en présence d'une solution d'électrolyte halogénure de métal alcalin ayant une concentration inférieure à 6M et à une température inférieure à 40 °C. 2. Procédé de détection électrique selon la revendication 15 1, caractérisé en ce que l'halogénure de métal alcalin est un chlorure de métal alcalin. 3. Procédé de détection électrique selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'halogénure de métal alcalin est représenté par LiC1, KCl ou NaCl. 20 4. Procédé de détection électrique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la différence de potentiel est comprise entre environ -80 et -10 mV. 5. Procédé de détection électrique selon la revendication 4, caractérisé en ce que la différence de potentiel appliquée 25 à la membrane est de -29 mV. 6. Procédé de détection électrique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration de la solution d'électrolyte est comprise entre 0,5 et 5M. 30 7. Procédé de détection électrique selon la revendication 6, caractérisé en ce que la concentration en LiC1 est égale à 1 M 8. Procédé de détection électrique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la 35 température du milieu réactionnel est comprise entre 3 et 33°C. 9. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes pour isoler des peptides ou autres 3053119 12 macromolécules différenciés par au moins un acide aminé ou un monomère. 10. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour caractériser la dégradation 5 enzymatique d'un échantillon de peptides par détermination des produits de dégradation. 11. Produit peptidique obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 constitué d'un peptide unique. 10 12. Produit peptidique selon la revendication 11 constitué par le peptide RR10. 13. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour séparer des séquences différentes de peptides ou protéines. 14. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour caractériser les modifications chimiques naturelles ou synthétiques de molécules natives telles qu'une protéine, un peptide, un métabolite, un médicament. 15. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour déterminer l'activité enzymatique spécifique et molaire d'une enzyme dans une cellule unique procaryote ou eucaryote. 16. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 8 pour identifier et quantifier des molécules dites « métabolites » appartenant à des voies métaboliques ou de signalisations cellulaires.