Brevet FR3056108A1 — publié le 20180323

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne l'harringtonine, l'homoharringtonine et ses dérivés, notamment les composés de formule la à Ig tels que définis dans le tableau 1, plus particulièrement sous forme de sel, de préférence cristallin, pour utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer du sein, en particulier le cancer du sein « triple- négatif » (CSTN). ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Les harringtonines 1 sont des esters de céphalotaxine 2 de nature alcaloïdique à propriétés cytotoxiques, présents dans la plupart des espèces de conifères asiatiques appartenant au genre Cephalotaxus. Deux de ces alcaloïdes l'harringtonine la et l'homoharringtonine lb ont été utilisés principalement en Chine dans le traitement des leucémies. O 0.05). Figure 4. Effet de l'HHT sur le cycle cellulaire. Après 48h d'exposition à des concentrations croissantes d'HHT, l'accumulation de cellules CAL-51 et MDA-MB-157 20 en phase S et G0/G1 a été observée dès 20 nM et 50 nM, respectivement. Les cellules MDA-MB-468 ou MDA-MB-231 ont été arrêtées en phase G2/M par 20 nM ou 50 nM d'HHT, et en phase S par 100 nM du produit. Figure 5. Effet de l'HHT sur l'apoptose. L'HHT a induit l'apoptose des cellules CAL-51, MDA-MB-468 et MDA-MB-157 de façon dépendante de concentration et du temps, 25 tandis que dans les cellules de MDA-MB-231 il n'a pas été observé d'apoptose significative, quelle que soit la concentration de l'HHT ou le temps d'incubation. Figure 6. Effet de l'HHT sur l'expression des protéines régulatrices de l'apoptose. Les tests ont été conduits à une concentration de 100 nM de HHT. Comme déjà publié dans le cas des cellules leucémiques [8], l'HHT induit, dans toutes lignées analysées 30 sauf MDA-MB-231, une baisse très rapide et forte du taux de Md-1, l'une des protéines-clés anti-apoptotiques. Le même effet a été observé pour BcI-2, dans la lignée MDA-MB-468, et pour la survivine, dans CAL-51. La réduction du taux de XIAP a été plus modeste et s'est produite plus tardivement. La réduction du taux de Md-1 a été observée avant la réduction du taux de PARP1 totale (PARP1-t) ou de la caspase- 35 3 totale (caspase 3-t), et avant l'apparition de PARP-1 clivée, produite lors de 3056108 10 l'apoptose. Nous concluons que l'H HT induit l'apoptose des cellules CAL-51, MDA-MB468 et MDA-MB-157 en passant par la réduction du taux des protéines antiapoptotiques, probablement par l'inhibition de leur synthèse. Par contre, aucun effet de l'HHT sur le taux de ces protéines n'a pas été observé dans la lignée MDA-MB-231, 5 ce qui corresponde à l'absence d'apoptose de cette lignée. EXEMPLES L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés à 10 titre purement illustratifs et ne devraient pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention. Exemple 1 : méthode d'étude Lignées cellulaires : CAL-51 (PIK3CA muté) et MDA-MB-157 (sans altération génomique apparente de l'axe PI3K-AKT-mTOR ; NF1, TP53 mutés) ont été cultivées 15 dans du DM EM+10%SVF+200pg/m1 de gentamycine, en atmosphère humidifiée, à 5% de CO2. MDA-MB-468 (PTEN, RB1, SMAD4, TP53 mutés, EGFR/ERBB1 amplifié) et MDA-MB-231 (hautement métastatique, sans altération de PI3K-Akt-mTOR ; KRAS, BRAF, CDKN2A, PDGFRA, NF2, TP53 mutés) ont été cultivées dans le milieu de Liebowitz+10% SVF+200pg/ml de gentamycine, en atmosphère dépourvue de CO2. 20 Médicament : L'HHT commercial (Sigma-Aldrich), purifié par recristallisation selon la technique de Liu [7], a été fourni gracieusement par LeukePharma (Houston, TX, USA). La solution-mère de citrate d'HHT à 20 mM a été obtenue par dissolution dans de l'acide citrique (Sigma-Aldrich), en quantité équimolaire ou bien par dissolution direct du sel d'homoharringtonine cristallin dans l'eau purifiée stérile.. Les dilutions 25 suivantes de cette solution mère ont été réalisées à l'aide de tampon PBS stérile. L'ensemble des solutions a été conservé à -80°C. Viabilité cellulaire : Les cellules ont été ensemencées dans les plaques de 96 puits à la concentration de 5000 cellules/puits (3.3 x 104/m1) pour les lignées MDA-MB-, et à la concentration de 1000 cellules/puits (6.6x10 3/ml) pour CAL-51. Après 24h de repos, à 30 la confluence de 50-60%, les cellules ont été traitées par des concentrations croissantes d'HHT pendant 24h, 48h et 72h. Après lavage 2 fois au PBS stérile et repos de 48h, les cellules ont été fixées à l'acide trichloracétique. Après le rajout de sulforhodamine blue (SRB), l'absorbance a été mesurée à 540 nm (photomètre de plaques Multiskan TM FC, Thermo Scientific). Les IC50 ont été calculées par CompuSyn 35 (Chou & Talalay, ComboSyn Inc., Paramus, NJ, USA). 3056108 11 Cycle cellulaire et apoptose : Le nombre de cellules en différentes phase du cycle cellulaire ou en apoptose a été déterminé par cytométrie en flux, en utilisant FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences) et en suivant les recommandations du fabricant. En bref, 3x104 cellules de chaque lignée ont été 5 ensemencées dans des plaques à 6 puits et, après repos de 24h, traitées par des concentrations croissantes d'HHT pendant 6 à 72h, puis lavées et incubées avec de l'iodure de propidium et/ou avec du FITC annexine V). La fluorescence a été mesurée à l'aide d'un cytofluoromètre BD LSH II (BD Biosciences). Western blot : 5x105 cellules, dans 10 ml de milieu, ont été ensemencées dans les 10 boites de Petri de 100 mm. Après 24h de repos, les cellules ont été incubées avec 100 nM d'HHT pendant différents temps, échelonnés de 2h et 48h. Ensuite, les cellules ont été lavées et lysées directement dans les boites (sans détachement par trypsinisation) à l'aide de tampon RIPA (Pierce-ThermoScientific), contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases (Sigma). La concentration en protéines a été déterminée par la méthode 15 de Bradford. L'électrophorèse des protéines a été réalisée en gels de polyacrylamide à 12-15%. Après transfert sur la membrane de PVDF, la révélation a été effectuée par ECL Plus (Amersham). Exemple 2 A l'aide des méthodes décrites dans l'exemple 1, l'homoharringtonine lb a été testée 20 sur la lignée CAL-51 (PIK3CA muté). Exemple 3 A l'aide des méthodes décrites dans l'exemple 1, l'harringtonine la a été testée sur la lignée CAL-51 (PIK3CA muté). Exemple 4 25 A l'aide des méthodes décrites dans l'exemple 1, l'homoharringtonine lb a été testée sur la lignée MDA-MB-157. Exemple 5 A l'aide des méthodes décrites dans l'exemple 1, l'homoharringtonine lb a été testée sur la lignée NF1. 30 Exemple 6 A l'aide des méthodes décrites dans l'exemple 1, l'homoharringtonine lb a été testée sur la lignée TP53. Exemple 7 A l'aide des méthodes décrites dans l'exemple 1, l'homoharringtonine lb a été testée 35 sur la lignée MDA-MB-458. 3056108 12 Exemple 8 A l'aide des méthodes décrites dans l'exemple 1, l'homoharringtonine lb a été testée sur la lignée MDA-MB-231. Conclusion 5 Les résultats obtenus dans les exemples 2 à 8 sont décrits dans les figures 3 à 6. Cette étude est la première à démontrer que l'HHT induit in vitro l'apoptose et/ou la cytostase des lignées cellulaires du CSTN. Le mécanisme d'action probable de l'HHT est l'inhibition de la synthèse des protéines anti-apoptotiques à demi-vie courte, comme Md-1, BcI-2 et/ou la survivine. Ainsi, le retrait du frein anti-apoptotique 10 déclenche rapidement l'apoptose des cellules hautement sensibles à l'HHT. Cet effet peut potentialiser l'action apoptotique des anti-cancéreux actuellement utilisés dans le traitement du CSTN. Les études des associations de l'HHT et de tels médicaments sont en cours. 15 Références PMID siginfie "Pub Med Identifier", et représente le numéro de reference de l'article sur la base de donnée "PubMed". 1 -Liedke et al. J Clin Oncol. 2008 Mar 10;26(8):1275-81 (PMID 18250347) 2 -Sharma Oncologist. 2016 Sep;21(9):1050-62 (PMID 27401886) 20 3 -Millis et al. Clin Breast Cancer. 2015 Dec; 15(6):473-481.e3 (PMID 26051240) 4 - Tujebajeva et al. Biochim Biophys Acta. 1992 Jan 6;1129(2):177-82 (PMID 1730056) 5 -Gürel et al. J Mol Biol. 2009 May 29;389(1):146-56 (PMID 19362093) 6 - Ghandhi et al. Clin Cancer Res. 2014 Apr 1;20(7):1735-40 (PMID 24501394) 25 7 - brevet N° 62,073,14/5/1987 8 - Tang et al. Mol Cancer Ther. 2006 Mar;5(3):723-31 (PMID 16546987) REVENDICATIONS1. Homoharringtonine pour utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer du sein. 2. Homoharringtonine pour utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le cancer du sein est le cancer du sein « triple-négatif » (CSTN). 3. Homoharringtonine pour utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'homoharringtonine est sous forme de sel. 4. Homoharringtonine pour utilisation comme inhibiteurs de la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses N F1, TP53, CAL-51, MDA-MB-157, MDA-MB-468 et/ou MDAMB-231, de préférence CAL-51, MDA-MB-157, MDA-MB-468 et/ou MDA-MB-231. 5. Homoharringtonine pour utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'homoharringtonine est sous forme de sel. 6. Homoharringtonine pour utilisation selon la revendication 3 ou 5, caractérisée en ce que le sel d'homoharringtonine est un sel d'addition avec l'acide fumarique, malique, lactique, tartrique, citramalique, itaconique, succinique, maléique, malonique, tartronique, citrique, salicylique et chlorhydrique. 7. Composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif l'homoharringtonine, avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, pour utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer du sein, notamment le cancer du sein est le cancer du sein « triple-négatif » (CSTN). 8. Composition pharmaceutique pour utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'homoharringtonine est sous forme de sel, notamment un sel d'addition avec l'acide fumarique, malique, lactique, tartrique, citramalique, itaconique, succinique, maléique, malonique, tartronique, citrique, salicylique et chlorhydrique. 3056108 14 9. Kit comprenant : a) une première composition comprenant à titre de principe actif l'homoharringtonine, avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, et b) une deuxième composition comprenant un agent thérapeutique 5 supplémentaire, notamment utile dans un traitement contre le cancer, typiquement choisi parmi le groupe constitué d'un agent chimiothérapeutique ou antiprolifératif, en tant que produit de combinaison pour utilisation séparée, concomitante ou étalée dans le temps pour utilisation pour le traitement du cancer du sein, notamment le cancer du sein triple négatif (CSTN). 10 10. Kit pour utilisation selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'homoharringtonine est sous forme de sel, notamment un sel d'addition avec l'acide fumarique, malique, lactique, tartrique, citramalique, itaconique, succinique, maléique, malonique, tartronique, citrique, salicylique et chlorhydrique. 15