Brevet FR3051555A1 — publié le 20171124

La présente invention se situe dans le domaine du diagnostic ou d'aide au diagnostic et du suivi de la maladie résiduelle des hémopathies malignes et a pour objet un procédé de détection de cellules plasmocytaires tumorales et un procédé de diagnostic ou d'aide au diagnostic et de suivi de gannnnapathies monoclonales. Le myélome multiple (MM) ou maladie de Kahler est une hémopathie maligne caractérisée par l'accumulation de plasmocytes tumoraux (lymphocytes B) dans la moelle osseuse, et l'accumulation d'une immunoglobuline monoclonale complète ou d'une chaîne légère monoclonale. Cette pathologie touche 2 000 nouveaux patients par an en France, 19 000 en Europe, 19 000 aux Etats-Unis. L'espérance de survie médiane des patients d'âge inférieur ou égal à 65 ans est de 6-7 ans. Le diagnostic du MM inclut des signes osseux, une vitesse de sédimentation augmentée, la présence d'une immunoglobuline monoclonale et par un myélogramme montrant : - la présence de plasmocytes dystrophiques (cytoplasme normal mais anomalies cytologiques nucléaires (cellules multinuclées, mitose multiple ou atypique)) ; et - une plasmocytose, à savoir soit l'existence d'une plasmocytose supérieure ou égale à 10 % (critère mineur), soit dans certains cas une plasmocytose supérieure à 30 % (critère majeur, pathologie sévère). Le MM est précédé dans tous les cas d'une gammapathie monoclonale bénigne (MGUS de l'anglais Monoclonal Gammapathy of Undeternninated Significance). Les MGUS sont détectées chez 2 à 4% des sujets de 60 ans, 10% des sujets de 70 ans, 20% des sujets de 80 ans. Les MGUS évoluent vers un MM avec un taux de transformation de 1% par an, indépendant de la date de diagnostic de la MGUS. Le MM représente 1% des nouveaux cas de cancer par an, 10 à 15% des hémopathies 25 malignes et est la seconde hémopathie maligne la plus fréquente après le lymphome non-Hodgkinien. De plus, les coûts associés à son traitement sont parmi les plus élevés. Les données récentes de la littérature montrent que l'identification et la 30 caractérisation des cellules plasmocytaires tumorales et normales chez un patient atteint de MM fournissent un marqueur fiable de la réponse au traitement. Le groupe du Pr San Miguel (Paiva et al., 2014) a montré que, lorsqu'il y a moins d'1 cellule plasmocytaire tumorale pour 10 000 cellules leucocytaires totales (avec une 3051555 2 sensibilité de 10-4) trois mois après une chimiothérapie à haute dose suivie d'une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques, les patients ont une survie significativement augmentée. Le ratio plasmocytes tumoraux/plasmocytes normaux est un facteur pronostique indépendant des marqueurs pronostiques usuels (Mateo et 5 al., 2008). L'index de prolifération des plasmocytes tumoraux, calculé par cytométrie de flux, est également un puissant facteur pronostique. Il peut être décisif pour évaluer si un patient est en rechute active ou non. Le taux médian de cellules en phase S est de 1% chez un malade (Paiva et al., 2012) et est augmenté chez les patients en rechute. 10 Par ailleurs, la maladie résiduelle du myélome multiple (MRD - ou en Anglais Minimal Residual Disease ») désigne la persistance de cellules tumorales résiduelles après traitement. Les plasmocytes représentent jusqu'à 5% des cellules dans la moelle, et la présence de MRD est définie par la présence d'au moins 50 cellules plasmocytaires tumorales pour 500 000 cellules leucocytaires totales, soit 0,01% des 15 cellules (Rawstron et al., 2013). La durée de survie médiane d'un patient est de 7 mois sans traitement, de 3 à 4 ans avec un traitement par chimiothérapie conventionnelle et de 6 à 7 ans par un traitement avec chimiothérapie à haute dose et autogreffe. Ainsi, le suivi de la MRD après traitement est également très important afin de détecter au plus tôt la 20 rechute et améliorer la prise en charge thérapeutique. A ce jour, il existe différentes méthodes pour détecter la MRD, par exemple le - Deep Sequencing », la PCR (« Polymerase Chain Reaction ») quantitative avec des amorces spécifiques et la cytométrie en flux multiparamétrique (MFC - Multiparannetric Flow Cytonnetry ») (Martinez-Lopez et al., 2014; Paiva et al., 25 2008). Les deux premières méthodes ont une sensibilité importante, cependant elles restent très couteuses, longues et sont difficilement automatisables. Ainsi, la cytométrie en flux multicouleurs est à l'heure actuelle la méthode la plus adaptée pour évaluer la réponse des patients, pour détecter précocement la rechute et améliorer la prise en charge thérapeutique afin de maximiser le ratio bénéfice/coût 30 du traitement. Etant donné la très faible quantité de plasmocytes normaux présents dans la moelle osseuse, soit en valeur médiane 0,44% des cellules mononuclées chez un donneur sain, ceci nécessite d'acquérir un grand nombre d'événements cellulaires pour minimiser les erreurs statistiques. 3051555 3 Actuellement, une méthodologie mise en place par le laboratoire STI (Caraux et al., 2010, 2012) prend 2 jours, soit 16 heures de travail, pour rendre un résultat aux cliniciens. Il existe donc un réel besoin de développer de nouveaux procédés et 5 compositions pour le diagnostic et le suivi de l'évolution de cette maladie, et notamment d'améliorer la sensibilité et la fiabilité des tests de détection des plasmocytes tumoraux, tout en diminuant les coûts. Les inventeurs ont mis au point une méthode de détection des plasmocytes tumoraux présentant une très grande sensibilité, reproductibilité et fiabilité. 10 La méthode selon l'invention permet, grâce à l'utilisation d'une combinaison particulière de marqueurs de cellules plasmocytaires tumorales et normales, d'obtenir des résultats de détection des plasmocytes normaux et tumoraux étant au moins équivalent à ceux obtenus à partir des méthodes de détection déjà connues dans l'état de l'art. 15 Par rapport aux méthodes de l'état de l'art, le procédé selon l'invention présente l'avantage de pouvoir être réalisé dans un contenant unique, tel qu'un tube ou un puits d'une plaque à puits, comprenant l'échantillon à analyser et les différents marqueurs. Ceci présente en particulier l'avantage d'être moins coûteux, de diminuer la durée et la complexité des différentes étapes expérimentales, et de 20 réduire le délai d'obtention des résultats. Ainsi, la méthode selon l'invention permet de diminuer les besoins en personnel qualifié et les risques d'erreurs associés, augmentant ainsi dans le même temps la fiabilité de la méthode. De plus, la diminution de la complexité des différentes étapes expérimentales du procédé selon l'invention permet d'améliorer la reproductibilité et d'augmenter la productivité. L'invention a pour objet un procédé de détection par cytométrie en flux de la présence de cellules plasmocytaires normales et de cellules plasmocytaires tumorales dans un échantillon de cellules d'un patient, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a) la mise en contact dudit échantillon de cellules avec : - un marqueur de la chaîne K, un marqueur de la chaîne X, et un marqueur choisi parmi : un marqueur de CD38 et un marqueur de CD138, chacun des trois marqueurs émettant un signal différent, 3051555 4 - un ou plusieurs marqueur(s) de cellules plasmocytaires tumorales, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des trois premiers signaux, - un ou plusieurs marqueur(s) de cellules plasmocytaires normales, chacun de ces 5 un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des quatre premiers signaux, b) la détection des cellules plasmocytaires caractérisées par : - un signal positif avec un marqueur de CD38 ou un marqueur de CD138, et - un signal positif avec un marqueur de la chaîne K ou un marqueur de la chaîne 10 X, c) la détection des cellules plasmocytaires tumorales parmi les cellules plasmocytaires détectées à l'étape b) avec au moins un des critères suivants (les autres plasmocytes étant considérés comme normaux) : - signal positif avec au moins un marqueur spécifique de cellules plasmocytaires 15 tumorales, et/ou - un signal négatif ou significativement réduit avec au moins un marqueur de cellules plasmocytaires normales, d) l'analyse des résultats obtenus lors des étapes b) et c) et la quantification des cellules plasmocytaires normales et des cellules plasmocytaires tumorales. 20 Préférentiellement, le marqueur de cellules plasmocytaires selon l'invention est un marqueur d'antigène de cellules plasmocytaires, préférentiellement un marqueur de cluster de différenciation (CD) de cellules plasmocytaires. 25 Par - marqueur » on entend toute(s) molécule(s) permettant la reconnaissance de la cible et sa détection par l'émission d'un signal détectable. Avantageusement, pour un marquage de séquence peptidique, les marqueurs selon l'invention sont des aptamers ou des anticorps conjugués à des fluorochromes, préférentiellement les fluorochromes sont sélectionnés parmi PE-Cy5.5, PE-CF594, 30 PE-Cy7, PE, APC et FITC. Alternativement, pour un marquage de l'ADN, les marqueurs selon l'invention peuvent également être des analogues de base, des molécules autofluorescentes lorsqu'elles se lient ou s'intercalent à l'ADN (par exemple le DAPI ; fluorescence bleue à environ 456nm) ou des molécules conjuguées à des fluorochromes (par exemple des anticorps) pouvant se lier ou s'intercaler à l'ADN. 3051555 5 Ainsi, la quantité de signal émis par un marqueur selon l'invention est liée à la quantité de complexes marqueur/cible, et donc au niveau d'expression de séquences peptidiques et/ou à la quantité d'ADN cible. Par - signal», on entend tout signal émis avec des propriétés qui permettent 5 de recouvrer ce signal après transmission. Ces propriétés peuvent par exemple être des fréquences, des modulations, des encodages. Préférentiellement, les signaux détectables sont émis dans des bandes de fréquences qui leur sont allouées, plus préférentiellement des couleurs du spectre visible dans une transmission optique. Aussi, différents marqueurs qui émettent différents signaux détectables dans des 10 bandes de fréquences proches peuvent être détectés par un même détecteur, ou différents marqueurs qui émettent un même signal détectable unique peuvent être détectés par un même détecteur. Par - détecteur » on entend tout système/dispositif permettant de recouvrer un des signaux détectables parmi les autres, sa détection et/ou sa quantification. 15 Préférentiellement, le détecteur utilise un filtre pour isoler le signal qu'il détecte. Plus préférentiellement, ce filtre est de type passe-bande. Préférentiellement, la détection et/ou la quantification est réalisée par un convertisseur photonique/électronique, par exemple des photodiodes, photodiodes à avalanche, photomultiplicateurs (PMT). 20 Par - plasmocyte normal » on entend des plasmocytes, cellules plasmatiques ou plasmatocytes présentant les antigènes (Cluster de différenciation ; CD) sélectionnés parmi, CD19, CD27, CD38, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99, CD138, CD163, et ne présentant pas les antigènes CD20, CD28, CD52, CD56, CD117 et CD200. Les plasmocytes 25 normaux présentent les chaînes intra cytoplasmiques kappa ou lambda avec des proportions respectives de 2/3 et 1/3. Par - plasmocyte tumoral » on entend des plasmocytes, cellules plasmatiques ou plasmatocytes présentant au moins une altération par rapport au profil normal : - perte d'au moins un CD parmi CD19, CD27, CD45, CD52 et CD81, 30 - gain d'au moins un CD parmi CD20, CD28, CD56, CD117, CD200 et CD229, - changement du niveau d'expression d'au moins un CD parmi CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99, CD138 et CD163, sous-exprimés dans les plasmocytes tumoraux, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, CD109, CD138, CD300a et CD320, surexprimés dans les 35 plasmocytes tumoraux et/ou 3051555 6 - altération du ratio kappa/lambda (monoclonalité). L'expression - signal positif » signifie selon l'invention que le signal est dit positif lorsque les marqueurs spécifiques de cellules plasmocytaires utilisés se lient à leurs cibles et émettent un signal significativement détectable. Le - signal 5 positif » montre ainsi que la ou les cellule(s) plasmocytaire(s) détectée(s) à l'étape b) du procédé selon l'invention présente(nt) un niveau d'expression significativement augmenté de la molécule reconnue par le(s) marqueur(s) utilisé(s) par la ou les cellule(s) plasmocytaire(s) détectée(s). Par - signal négatif » on entend que le signal est dit négatif lorsque les 10 marqueurs spécifiques de cellules plasmocytaires utilisés ne se lient pas, ou se lient faiblement, à leurs cibles et n'émettent donc pas de signal significativement détectable. Le - signal négatif » de ces marqueurs spécifiques montre ainsi que la ou les cellule(s) plasmocytaire(s) détectée(s) à l'étape b) du procédé selon l'invention présente un niveau d'expression négatif ou significativement réduit de la molécule 15 reconnue par le(s) marqueur(s) utilisé(s). Préférentiellement, l'échantillon de cellules utilisé pour le procédé selon l'invention est choisi parmi, ou obtenu à partir de la moelle osseuse, du sang, du sérum, d'un extrait sanguin, des PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), du liquide céphalorachidien, du liquide pleural et des ganglions lymphatiques, 20 préférentiellement de la moelle osseuse d'un patient. Selon un mode de réalisation particulier, l'échantillon de cellules du procédé selon l'invention provient d'un patient atteint de gammapathie monoclonale, ou d'une personne susceptible d'être atteinte d'une gammapathie monoclonale. Selon un mode de réalisation préféré, les CD spécifiques de cellules 25 plasmocytaires normales du procédé selon l'invention sont choisis parmi : CD19, CD27, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99 et CD163, préférentiellement CD19, CD27, CD45 et CD81 plus préférentiellement CD19, CD27. Selon un mode de réalisation préféré, les CD spécifiques de cellules 30 plasmocytaires tumorales du procédé selon l'invention sont choisis parmi : CD56, CD117, CD200, CD20, CD28, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, CD109, CD229, CD300a et CD320, préférentiellement CD56, CD117, CD200, CD20, et CD28, plus préférentiellement CD56, CD117, CD200. Préférentiellement, le procédé selon l'invention comprend en outre l'analyse 35 des signaux du FSC (« Forward Scatter ») et du SSC (« Side Scatter »). FSC et SSC 3051555 7 correspondent à des mesures simultanées réalisées par cytométrie de flux permettant de déterminer les caractéristiques physiques et biologiques de cellules isolées. Par définition, le FSC correspond à l'intensité de la lumière diffractée de la source d'excitation dans l'axe (angle REVENDICATIONS1. Procédé de détection par cytométrie en flux de la présence de cellules plasmocytaires normales et de cellules plasmocytaires tumorales dans un échantillon 5 de cellules d'un patient, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a) la mise en contact dudit échantillon de cellules avec : - un marqueur de la chaîne K un marqueur de la chaîne X, et un marqueur choisi parmi : un marqueur de CD38 et un marqueur de CD138, chacun des trois marqueurs émettant un signal différent, 10 - un ou plusieurs marqueur(s) de cellules plasmocytaires tumorales, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent desdits trois premiers signaux, - un ou plusieurs marqueur(s) de CD de cellules plasmocytaires normales, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des 15 quatre premiers signaux, b) la détection des cellules plasmocytaires caractérisées par : - un signal positif avec un marqueur de CD38 ou un marqueur de CD138, et - un signal positif avec un marqueur de la chaîne K ou un marqueur de la chaîne X, 20 c) la détection des cellules plasmocytaires tumorales parmi les cellules plasmocytaires détectées à l'étape b) avec au moins un des critères suivants: - signal positif avec au moins un marqueur spécifique de cellules plasmocytaires tumorales, et/ou - un signal négatif ou significativement réduit avec au moins un marqueur de 25 cellules plasmocytaires normales, d) l'analyse des résultats obtenus lors des étapes b) et c) et la détermination de la présence de cellules plasmocytaires normales et de cellules plasmocytaires tumorales. 30 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que : - les CD spécifiques de cellules plasmocytaires normales du procédé selon l'invention sont choisis parmi : CD19, CD27, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99 et CD163, préférentiellement CD19, CD27, CD45 et CD81 plus préférentiellement CD19, 35 CD27, et 3051555 26 les CD spécifiques de cellules plasmocytaires tumorales du procédé selon l'invention sont choisis parmi : CD56, CD117, CD200, CD20, CD28, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, CD109, CD229, CD300a et CD320, préférentiellement CD56, CD117, CD200, CD20, et CD28, plus préférentiellement CD56, CD117, CD200. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédente, dans lequel le marqueur CD38 ou CD138 est respectivement un anticorps anti-CD38 ou anti-CD138 conjugué au fluorochrome PE-Cy5.5, le marqueur de ta chaîne K est l'anticorps anti10 chaîne I( conjugué au fluorochrome PE-CF594 et le marqueur de ta chaîne X est un anticorps anti-chaîne X conjugué au fluorochrome FITC. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les marqueurs CD19 et CD27 sont des anticorps anti-CD19 et anti-CD27 conjugués au fluorochromes PE-Cy7, 15 et les marqueurs CD56, CD117 et CD200 sont des anticorps anti-CD56, anti-CD117 et anti-CD200 conjugués aux fluorochrome PE. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre la détermination de l'index de prolifération des plasmocytes tumoraux 20 comprenant les étapes suivantes : A. mise en contact dudit échantillon de cellules avec un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement deux marqueurs, de prolifération cellulaire, émettant un signal différent des autres marqueurs utilisés; B. détection des plasmocytes tumoraux en prolifération par analyse du signal 25 émis par ledit ou lesdits marqueur(s); C. détermination du pourcentage de cellules tumorales et de plasmocytes normaux étant en phase S ; D. optionnellement détermination de la diploïdie (GO/G1 ou G2/M) lorsque au moins un du ou desdits marqueur(s) de prolifération cellulaire est un marqueur 30 de l'ADN. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'échantillon de cellules est choisi parmi des cellules de la moelle osseuse, du sang, du sérum, d'un extrait sanguin, des PBMCs, du liquide céphalorachidien, du liquide pleural et des ganglions lymphatiques, et préférentiellement de la moelle osseuse 35 d'un patient. 3051555 27 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ledit patient est atteint de gammapathie monoclonale. 5 8. Procédé de diagnostic in vitro ou de suivi de gammapathie monoclonale, à partir d'un échantillon de cellules d'un patient comprenant les étapes suivantes : 1) la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 7, et 2) mise en évidence d'un risque de développer une gammapathie monoclonale : a) si la proportion de cellules plasmocytaires tumorales parmi les cellules leucocytaires totales, d'après les résultats de l'analyse de l'étape d) du procédé selon l'invention, dépasse un seuil prédéfini à partir de résultats obtenus par le procédé selon l'invention sur des sujets contrôle sains; et/ou b) si le nombre de plasmocytes tumoraux par unité de volume dépasse un seuil prédéfini. 9. Procédé de suivi in vitro de l'évolution de la maladie d'un patient atteint d'une gammapathie monoclonale, à partir d'un premier et d'un second échantillon de cellules du patient, comprenant les étapes suivantes : i) la mise en oeuvre d'un procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 7 dans un premier échantillon de cellules du patient ii) la mise en oeuvre d'un procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 7 dans un second échantillon de cellules du patient, ledit second échantillon ayant été prélevé après le prélèvement dudit premier échantillon, et iii) la comparaison de l'analyse des résultats de l'étape d) obtenus avec le premier et le second échantillon, et iv) le suivi de l'évolution de ladite gammapathie monoclonale dudit patient d'après les résultats de l'analyse de l'étape iii). 10. Composition comprenant au moins : - un marqueur de la chaîne K et un marqueur de la chaîne X, émettant chacun un signal différent, 3051555 28 - un marqueur choisi parmi : un marqueur de CD38 ou un marqueur de CD138, ledit marqueur émettant un signal différent des deux premiers signaux, - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux 5 marqueurs, de CD spécifiques de cellules plasmocytaires normales sélectionnés parmi tes marqueurs de CD19, CD27, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99 et CD163, préférentiellement les marqueurs de CD19, CD27, CD45 et CD81, plus préférentiellement un marqueur de CD19 et un marqueur de CD27, 10 chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des trois premiers signaux, et - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs, plus préférentiellement au moins trois marqueurs de CD spécifiques de cellules plasmocytaires tumorales sélectionnés parmi les 15 marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, CD28, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, CD109, CD229, CD300a et CD320, préférentiellement les marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, et CD28, plus préférentiellement un marqueur de CD56, un marqueur de CD117 et un marqueur de CD200, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des 20 quatre premiers signaux. 11. Utilisation d'une composition comprenant au moins : - un marqueur de la chaîne I( et un marqueur de la chaîne 2t. émettant un signal différent, 25 - un marqueur choisi parmi : un marqueur de CD38 et un marqueur de CD138, ledit marqueur émettant un signal différent des deux premiers signaux, - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs de CD de cellules plasmocytaires normales sélectionnés parmi 30 les marqueurs de CD19, CD27, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99 et CD163, préférentiellement les marqueurs de CD19, CD27, CD45 et CD81, plus préférentiellement un marqueur de CD19 et un marqueur de CD27, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des trois premiers signaux, et 3051555 29 - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs, plus préférentiellement au moins trois marqueurs de CD de cellules plasmocytaires tumorales sélectionnés parmi tes marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, CD28, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, 5 CD109, CD229, CD300a et CD320, préférentiellement les marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, et CD28, plus préférentiellement un marqueur de CD56, un marqueur de CD117 et un marqueur de CD200, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des quatre premiers des signaux, 10 pour mettre en oeuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 12. Kit pour mettre en oeuvre te procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant au moins : - un marqueur de la chaîne x, et un marqueur de la chaîne ?, émettant chacun un 15 signal différent ; - un marqueur de CD38 ou un marqueur de CD138 émettant un signal différent des deux premiers signaux; - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs de CD de cellules plasmocytaires normales sélectionnés parmi tes marqueurs de CD19, 20 CD27, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99 et CD163, préférentiellement tes marqueurs de CD19, CD27, CD45 et CD81, plus préférentiellement un marqueur de CD19 et un marqueur de CD27, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des trois premiers signaux; et 25 - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs, plus préférentiellement au moins trois marqueurs de CD de cellules plasmocytaires tumorales sélectionnés parmi les marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, CD28, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, CD109, CD229, CD300a et CD320, préférentiellement les marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, et CD28, plus 30 préférentiellement un marqueur de CD56, un marqueur de CD117 et un marqueur de CD200, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des quatre premiers signaux. 13. Kit selon ta revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un 35 marqueur de prolifération cellulaire sélectionné parmi: 3051555 30 des analogues de bases de type BrdU et un anticorps anti-BrdU conjugué à l'APC ou EdU et un azoture couplé à un fluorochrome, préférentiellement l'Alexa Fluor® 647 ; et/ou des marqueurs de protéines du cycle cellulaire actif, par exemple un 5 anticorps anti-Ki67 conjugué à un fluorochrome, préférentiellement l'Alexa Fluor 647®; et/ou des marqueurs d'acides désoxyribonucléiques (ADN), tel que le DAPI, PI, colorant Hoeschst (33342 ou 33258), chacun du ou desdits marqueur(s) de prolifération cellulaire émettant un signal 10 différent des signaux émis par les autres marqueurs présents dans ledit kit, en particulier différent des cinq premiers signaux.