Brevet FR3054547A1 — publié le 20180202

La présente invention se rapporte à une protéine de fusion comprenant successivement les fragments suivants : a) optionnellement, un peptide signal ; b) une protéine ou un peptide d'intérêt ; c) un domaine coiled-coil qui ne provient pas d'un virus ; et d) un domaine d'ancrage dans la membrane plasmique, constitué par un segment transmembranaire et un segment cytosolique, de préférence un domaine d'ancrage dans une membrane plasmique dont au moins une partie est typique des radeaux lipidiques. Elle est également relative aux particules pseudo-virales (VLP) obtenues avec une telle protéine de fusion, ladite protéine étant ancrée dans leur membrane. Alors qu'il y a plus de 100 ans que l'immunothérapie allergénique a été décrite par Noon et Freeman (1,2), très peu de progrès ont été réalisés en matière de désensibilisation, à l'exception du mode d'administration des traitements avec le remplacement progressif des traitements par injection par une désensibilisation par la voie sublinguale. Ainsi, depuis janvier 2011, il existe par exemple en France pour les allergies aux pollens de graminées une désensibilisation en comprimé sublingual. L'arrivée sur le marché de ces comprimés de désensibilisation a contribué à diminuer l'invasivité de l'immunothérapie allergénique, mais elle n'en n'a pas accru l'efficacité. En effet, ce sont encore des extraits allergéniques « naturels », peu concentrés en allergènes et peu représentatifs de la diversité des allergènes contenus dans la source allergénique, qui sont utilisés pour le traitement curatif par la voie orale. Toutefois, au cours de la dernière décennie, de nouvelles stratégies ont été proposées pour augmenter l'efficacité et réduire la durée des traitements d'immunothérapie allergénique. Ces stratégies de désensibilisation sont basées sur l'utilisation : d'extraits allergéniques naturels modifiés pour réduire leur allergénicité tout en conservant leur immunogénicité (Henmar et al), d'allergènes recombinants natifs ou modifiés pour les rendre hypoallergéniques (Valenta et al), de peptides correspondant aux épitopes des allergènes de cellules T, sous forme libre ou en fusion avec des protéines porteuses (Larche M., Patel D. et al, Chen et al), d'adjuvants, ou encore d'allergènes fusionnés à des nanoparticules ou à des pseudo-particules virales (Kundig 3054547 2 et al, Bachmann MI, Jennings GT, Henmar et al). Les stratégies faisant appel à des extraits allergéniques modifiés restent cependant d'une efficacité limitée en raison de leur mauvaise représentativité de la diversité des allergènes 5 contenus dans la source. Les allergènes recombinants, modifiés ou non, ou les peptides, sont faiblement immunogéniques sous forme soluble en l'absence d'adjuvants. Mais de nombreux adjuvants sont mal tolérés et, comme pour les vaccins, leur utilisation n'est pas recommandée en immunothérapie allergénique. 10 L'utilisation d'allergènes fusionnés à des nanoparticules ou à des particules pseudo-virales (VLP) est en revanche une stratégie particulièrement attrayante pour l'immunothérapie allergénique. Les particules pseudo-virales s'auto-assemblent à partir d'antigènes viraux. Elles ne contiennent aucun matériel génétique, elles sont donc non infectieuses et incapables 15 de se multiplier. En revanche, elles miment la structure originale d'un virus, ce qui leur permet d'être reconnues facilement par le système immunitaire et d'activer de façon très efficace la mémoire immunologique. Des vaccins à base de VLP contre l'hépatite B, les infections à papillomavirus, la grippe (Garland et al, Paavonen et al, D'Aoust et al) illustrent l'efficacité vaccinale d'antigènes lorsqu'ils sont présentés au système immunitaire à la surface 20 de VLP ou de nanoparticules. Ainsi les VLP ont le potentiel d'être utilisées comme des structures présentatrices d'antigènes et en particulier d'allergènes permettant d'induire une forte réponse immunogénique chez l' homme. Les VLP sont de deux grands types: celles qui sont fabriquées à partir de protéines de capside 25 virale (VLP CP) et celles qui sont fabriquées à partir de virus enveloppés (VLP Env). La structure et la composition de ces deux types diffèrent sensiblement. Les VLP CP sont généralement fabriquées en produisant la protéine recombinante de la capside qui s'autoassemble dans des cellules-hôtes selon des mécanismes similaires à ceux des virus natifs. La production de VLP Env se produit quand une protéine d'enveloppe Env est synthétisée et 30 modifiée par le système endomembranaire d'une cellule-hôte, puis migre vers les radeaux lipidiques (lipid rafts) de la membrane plasmique, où elle se concentre et déclenche le bourgeonnement extracellulaire de tout l'assemblage membrane/protéine. La particule résultante, la VLP, porte à sa surface des épitopes immunogènes de la protéine Env. 3054547 3 L'utilisation d'allergènes sous forme de particules pseudo-virales semble donc un critère de réussite important pour l'immunothérapie. Les résultats obtenus avec des VLP fusionnées à un peptide de l'allergène majeur d' acarien (Der p 1) ou à l'allergène majeur de chat (Fel d 1) ont illustré la très grande immunogénicité de ces fusions chez la souris et chez l'homme 5 (Schmitz et al, Kundig et al). Cette immunogénicité est si élevée qu'une seule injection de ces VLPs induit une production d'IgG suffisante pour une protection contre une réaction allergique de type I. Cependant, la préparation de ces VLPs est malheureusement d'une complexité extrême et 10 comprend de nombreuses étapes dont certaines sont difficilement standardisables. Notamment, les VLPs sont produites d'une part chez E. coli, après expression de la protéine d'enveloppe du bactériophage Qbeta. D'autre part l'allergène est exprimé sous forme recombinante chez E .coli, purifié puis solubilisé et purifié à nouveau en plusieurs étapes. Une fois ces deux constituants produits et purifiés, ils sont couplés in vitro. Cette technique de 15 production est évidemment trop complexe, trop coûteuse et trop difficilement standardisable pour que le produit final puisse être disponible un jour pour le traitement des patients allergiques. Il existe donc un besoin pour une structure non immunogène en tant que telle et polyvalente, 20 qui s'auto-assemble dans des cellules eucaryotes, qui soit facile à synthétiser, et qui puisse supporter des protéines ou des peptides sur sa surface. Une telle structure pourrait être utilisée pour le traitement de patients allergiques, mais également dans d'autres cadres cliniques. La Demanderesse a maintenant mis au point une telle structure, qui s'auto-assemble et permet 25 une utilisation en thérapie. En particulier, les caractéristiques uniques d'une telle structure sont: - une immunogénicité indétectable de la structure en tant que telle; - sa capacité à s'assembler en oligomères, comme des trimères ou des tétramères ; - sa membrane contenant des lipides uniques, typiques des radeaux lipidiques ; 30 - sa membrane pauvre en protéines de la membrane de la cellule-hôte ; - sa capacité à être exprimée à des rendements élevés dans de nombreux types de cellules eucaryotes (levures, insectes ou plantes) ; et - sa facilité de préparation. 3054547 4 Selon un premier aspect, l'invention consiste en une protéine de fusion transmembranaire de type I ou de type II comprenant successivement les fragments suivants : a) optionnellement, un peptide signal ; b) une protéine ou un peptide d'intérêt ; 5 c) un domaine coiled-coil (ou séquence d'oligomérisation) qui ne provient pas d'un virus ; et d) un domaine d'ancrage dans la membrane plasmique et plus particulièrement dans les radeaux lipidiques, constitué par un segment transmembranaire et un segment cytosolique. Une telle protéine de fusion se comporte comme une protéine de surface virale lors de son 10 expression dans des cellules eucaryotes. Sans être limité par une quelconque théorie, cette protéine est synthétisée dans le réticulum endoplasmique puis transportée via l'appareil de Golgi jusqu'à la membrane plasmique. Une fois qu'elle atteint des zones spécialisées de la membrane plasmique, de préférence des radeaux lipidiques, cette protéine de fusion transmembranaire provoque la courbure de ladite 15 membrane, qui forme finalement un bourgeon qui se sépare de la membrane cellulaire et est libéré dans l'espace extracellulaire. Lors du bourgeonnement, la protéine ou le peptide d'intérêt porté par le domaine coiled-coil (ou séquence d'oligomérisation) est exposé à la surface extérieure de la particule nouvellement formée. Le domaine transmembranaire reste ancré dans la membrane et n'est pas exposé à la surface. On obtient ainsi une particule 20 pseudo-virale (VLP), illustrée en Figure 8A, comprenant une membrane plasmique dont la composition est de préférence typique des radeaux lipidiques, dans laquelle les protéines de fusion selon l'invention sont fixées au niveau de leur domaine d'ancrage, et qui expose la protéine ou le peptide d'intérêt à sa surface, sous forme oligomérisée (grâce à la séquence d' oligomérisation). 25 La structure des protéines de fusion assemblées à la surface de la VLP est illustrée en Figure 8B. Selon un second aspect, l'invention consiste en une particule pseudo-virale (VLP) comprenant : 30 - une enveloppe constituée d'une membrane plasmique dont au moins une partie est typique des radeaux lipidiques ; et - au moins une protéine de fusion transmembranaire de type I ou II ancrée dans ladite membrane (i.e. ladite enveloppe), ladite protéine de fusion comprenant successivement les fragments suivants: 3054547 5 b) une protéine ou un peptide d'intérêt ; c) un domaine coiled-coil (ou séquence d' oligomérisation) qui ne provient pas d'un virus ; et d) un domaine d'ancrage dans la membrane plasmique, constitué par un segment transmembranaire et un segment cytosolique, de préférence un domaine d'ancrage dans une 5 membrane plasmique dont au moins une partie est typique des radeaux lipidiques, les fragments b) et c) étant exposés à la surface de la VLP. Dans la VLP selon l'invention, la protéine de fusion est ancrée dans la membrane (et donc dans l'enveloppe) par le biais de son domaine d'ancrage d). 10 Par particule pseudo-virale (ou VLP), on entend une nanoparticule constituée d'une enveloppe de membrane plasmique dans laquelle sont ancrées une ou plusieurs protéines, qui ne contient aucun matériel génétique, qui est non infectieuse et incapable de se multiplier, et qui s'auto-assemble pour mimer la structure originale d'un virus. La structure d'une VLP est 15 illustrée en Figure 8A : l'enveloppe membranaire comprend des protéines ancrées et exposées à sa surface. Une telle particule pseudo-virale selon l'invention présente les propriétés intéressantes indiquées ci-dessus. En outre, lorsque la protéine ou le peptide d'intérêt b) de la protéine de 20 fusion est un allergène ou un fragment d'allergène, ou plus généralement un antigène, la particule pseudo-virale est efficace dans la présentation d'antigènes, et présente une grande capacité d'activation des cellules du système immunitaire. Cela permet une désensibilisation efficace de patients allergiques. En outre, la particule pseudo-virale selon l'invention stimule la production d'IgG spécifiques de l'allergène tout en minimisant l'accessibilité aux 25 basophiles. Les particules pseudo-virales selon l'invention ont typiquement un diamètre compris entre 120 et 200 nm. Selon un troisième aspect, l'invention se rapporte à un procédé de production d'une particule 30 pseudo-virale, comprenant l'expression de la protéine de fusion selon l'invention dans des cellules eucaryotes, de préférence dans des cellules de plante. En effet, de préférence, le procédé développé comprend l'expression, dans une cellule végétale, des protéines de fusion selon l'invention. Après leur synthèse au niveau du réticulum endoplasmique et leur transport dans le système endomembranaire de sécrétion de 3054547 6 la cellule végétale, ces protéines de fusion ont la capacité de former des vésicules lorsqu'elles sont intégrées à la membrane plasmique. Ce processus est identique au bourgeonnement d'un virus à la surface des cellules qu'il infecte. L'un des grands avantages de cette technologie est qu'elle est simple, puisqu'après expression 5 des protéines de fusion et extraction, les VLP portant à leur surface l'allergène d'intérêt sont de préférence purifiées en deux étapes. Ces VLPs formées in planta présentent à leur surface une densité constante d'allergènes ou de fragments d'allergènes. La qualité du produit est donc facilement standardisable et sa composition est constante. 10 La protéine de fusion transmembranaire de type I ou II selon l'invention comprend successivement les fragments suivants : a) optionnellement, un peptide signal ; b) une protéine ou un peptide d'intérêt ; c) un domaine coiled-coil (ou séquence d' oligomérisation) qui ne provient pas d'un virus ; et 15 d) un domaine d'ancrage dans la membrane plasmique, constitué par un segment transmembranaire et un segment cytosolique, de préférence un domaine d'ancrage dans une membrane plasmique dont au moins une partie est typique des radeaux lipidiques. Par « protéine de fusion », on entend une protéine comprenant les différents fragments b) à d), 20 et optionnellement a), lesdits fragments étant d'origine différente. En d'autres termes, les fragments b) à d), et optionnellement a), ne sont jamais présents fusionnés comme tels dans la nature. Par « successivement », on entend que les fragments a) à d) (ou b) à d)) sont présents dans l'ordre a)-b)-c)-d) (ou b)-c)-d) ou d)-c)-b)). Ces différents fragments peuvent être directement 25 fusionnés les uns aux autres, ou bien fusionnés les uns aux autres via un ou plusieurs linker(s). De préférence, la protéine de fusion selon l'invention comprend un linker présent entre les séquences b) et c), et/ou entre les séquences c) et d). La protéine de fusion contient initialement les fragments a) à d) : la présence du peptide signal permet l'adressage correct de ladite protéine dans le réticulum endoplasmique. Le peptide 30 signal est ensuite clivé. Ainsi, lors du bourgeonnement et de la formation des VLP selon l'invention, la protéine de fusion ne contient plus le peptide signal a), mais seulement les fragments b) à d). Par conséquent, les VLP selon l'invention ne contiennent pas de peptide signal a). En revanche, la description des fragments b) à d) qui suit est applicable aux VLP. 3054547 7 Par protéine transmembranaire de type I ancrée dans une membrane, on entend une protéine transmembranaire dont l'extrémité N-terminale est extracellulaire et l'extrémité C-terminale est cytosolique. Par conséquent, la protéine transmembranaire de type I comprend de l'extrémité N-terminale à C-terminale, optionnellement le peptide signal a), puis la protéine 5 ou le peptide d'intérêt b), puis le domaine coiled-coil c) et enfin le domaine d'ancrage d). Par protéine transmembranaire de type II ancrée dans une membrane, on entend une protéine transmembranaire dont l'extrémité C-terminale est extracellulaire et l'extrémité N-terminale est cytosolique. Par conséquent, la protéine transmembranaire de type II comprend de l'extrémité N-terminale à C-terminale, le domaine d'ancrage d), puis le domaine coiled-coil c) 10 et enfin la protéine ou le peptide d'intérêt b). De préférence, la protéine de fusion selon l'invention est une protéine transmembranaire de type I. Peptide signal a) 15 Le peptide signal a) est tout peptide signal reconnu par une cellule eucaryote. De préférence, le peptide signal est choisi parmi le peptide signal naturel de la pectate lyase et le peptide signal de la chitinase de tabac. De préférence, le peptide signal est celui de la chitinase du tabac, de séquence SEQ ID NO : 21. 20 Protéine ou peptide d'intérêt b) La protéine ou le peptide d'intérêt utilisable selon l'invention peut être toute séquence d'acides aminés qui a un intérêt en thérapie ou en prophylaxie. La protéine ou le peptide d'intérêt utilisable selon l'invention peut être toute séquence 25 d'acides aminés qui gagnerait à être entièrement ou partiellement exposée à la surface d'une particule pseudo-virale, et susceptible d'être reconnue par des cellules immunitaires, et/ou de déclencher une réaction biologique. Par « protéine d'intérêt », on entend une séquence ayant au moins 51 acides aminés, de préférence au moins 100, de préférence au moins 200. 30 Par « peptide d'intérêt », on entend une séquence comprenant de 2 à 50 acides aminés, de préférence de 5 à 45 acides aminés. La protéine ou le peptide d'intérêt utilisable selon l'invention est de préférence choisi parmi: - les allergènes et leurs fragments. L'application majeure d'une particule pseudo-virale contenant une telle protéine ou peptide est l'immunothérapie, 3054547 8 - les protéines virales et leurs fragments. L'intérêt principal d'une particule pseudo-virale contenant une telle protéine ou peptide est la vaccination, - les protéines de surface cellulaire et leurs fragments. L'intérêt principal d'une particule pseudo-virale contenant une telle protéine ou peptide peut notamment être de restaurer une 5 activité immunitaire, - les protéines et les peptides accumulés dans les maladies chroniques ou neurodégénératives, - les protéines et peptides impliqués dans l'hypertension (tels que l'angiotensinogène, l'angiotensine I et l'angiotensine II), - les immunoglobulines, leurs fragments (tels que les Fab) et leurs dérivés (tels que les scFv), 10 - les cytokines et leurs fragments, et - les hormones et leurs fragments. De préférence, la protéine ou le peptide d'intérêt utilisable selon l'invention est un allergène. De préférence, elle est choisie parmi les allergènes responsables d'allergies respiratoires issus 15 d'acariens domestiques, tels que Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus ou Euroglyphus manei, les allergènes d'acariens de stockage tel que Blomia tropicalis, les allergènes d'acariens de type Acarus siro (autrefois nommé Tyroglyphus farinae), les allergènes de blattes, les allergènes de pollens d'arbres ou de graminées, les allergènes d'animaux (chat, chien cheval), les allergènes de moisissures, les allergènes responsables 20 d'allergies de contact comme ceux du latex d'hévéa ou encore les allergènes responsables d'allergies alimentaires (lait, oeuf, poisson, fruits). Parmi les allergènes de Dermatophagoides farinae, on peut citer Der f 10, Der f 11, Der f 13, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18, Der f 2, Der f 2.0101, Der f 2.0102, Der f 2.0103, Der f 2.0104, Der f 2.0105, Der f 2.0106, Der f 2.0107, Der f 2.0108, Der f 2.0109, 25 Der f 2.0110, Der f 2.0111, Der f 2.0112, Der f 2.0113, Der f 2.0114, Der f 2.0115, Der f 2.0116, Der f 2.0117, Der f 20, Der f 3, Der f 4, Der f 5, Der f 6, Der f 7, Der f 8, Der f 9 et Der f HSP70. Parmi les allergènes de Dermatophagoides pteronyssinus, on peut citer Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 15, Der p 18, Der p 2, Der p 2.0101, Der p 2.0102, Der p 2.0103, Der p 30 2.0104, Der p 2.0105, Der p 2.0106, Der p 2.0107, Der p 2.0108, Der p 2.0109, Der p 2.0110, Der p 2.0111, Der p 2.0112, Der p 2.0113, Der p 20, Der p 21, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8, Der p 9. 3054547 9 Parmi les allergènes d'animaux, on peut citer les allergènes issus du liquide séminal, de l'épithélium, du lait, de la salive, de la transpiration et/ou de l'urine desdits animaux. Les animaux sont de préférence les chiens, les chats ou les chevaux. Parmi les allergènes de chat (Felis domesticus), on peut citer Fel d 1, Fel d 1.0101, Fel d 2, 5 Fel d 2.0101, Fel d 3, Fel d 3.0101, Fel d 4, Fel d 4.0101, Fel d 5 , Fel d 5.0101, Fel d 6 , Fel d 6.0101, Fel d 7, Fel d 7.0101, Fel d 8, Fel d 8.0101, Fel d Hp, Fel d IgG ou Fel d S100. Parmi les allergènes de chien (Canis familiaris), on peut citer Can f 1, Can f 1.0101, Can f 2, Can f 2.0101, Can f 3, Can f 3.0101, Can f4, Can f 4.0101, Can f 5, Can f 5.0101, Can f 6, Can f 6.0101, Can f 7, Can f 7.0101, Can f 8, Can f Feldl-like, Can f Homs2-like, Can f 10 Phosvitin ou Can f TCTP. Parmi les allergènes de cheval (Equus caballus), on peut citer Equ c 1, Equ c 1.0101, Equ c 2, Equ c 2.0101, Equ c 2.0102, Equ c 3, Equ c 3.0101, Equ c 4, Equ c 4.0101, Equ c PRVB, Equ c 10, Equ c 11, Equ c 12, Equ c 8, Equ c 9, Equ c ALA ou Equ c BLG. 15 Les séquences de ces allergènes sont connues, notamment dans la base Uniprot. De préférence, la protéine ou le peptide d'intérêt utilisable selon l'invention est un allergène de séquence SEQ ID NO : 22 (séquence mature de Der p 2) ou SEQ ID NO :32 (séquence de la chaîne CH1 de l'allergène félin Fel d 1). 20 De préférence, la protéine ou le peptide d'intérêt utilisable selon l'invention est une protéine virale ou un de ses fragments. Parmi les protéines virales, on peut citer notamment les protéines d'enveloppe du virus Zika, ainsi que les protéines des virus de la grippe, comme les hémagglutinines et les 25 neuraminidases. De préférence, la protéine ou le peptide d'intérêt utilisable selon l'invention est la chaîne HA1 de l'hémagglutinine de séquence SEQ ID NO : 34 ou la protéine d'enveloppe du virus Zika de séquence SEQ ID NO :35. De préférence, la protéine ou le peptide d'intérêt utilisable selon l'invention est une protéine 30 de surface cellulaire ou un de ses fragments. Parmi les protéines de surface, on peut citer notamment les antigènes de surface des tumeurs. De telles protéines et leurs fragments trouvent leur application notamment dans la restauration d'une activité immunitaire, par exemple dans le traitement des tumeurs. 3054547 10 De préférence, la protéine ou le peptide d'intérêt utilisable selon l'invention est une protéine accumulée dans les maladies neurodégénératives ou chroniques. Parmi les peptides accumulés dans les maladies chroniques, on peut citer notamment le peptide amyloïde R impliqué dans la maladie d'Alzheimer, la protéine alpha-synucléine 5 impliquée dans la maladie de Parkinson, ainsi que les protéines CD 20, TNF-alpha ou HLA (human leucocyte antigen) impliquées dans les polyarthrites rhumatoïdes. Domaine coiled-coil (ou séquence d'oligomérisation) c) Le domaine coiled-coil, ou séquence d'oligomérisation, comprend plusieurs motifs d'alpha 10 hélice sens ou antisens qui sont parallèles les uns aux autres et forment une matrice organisée qui a plusieurs fonctions biologiques bien caractérisées. Ces domaines sont omniprésents et se trouvent en tant que domaines spécifiques de nombreux types de protéines de la plupart des organismes. Des domaines coiled-coil de différentes sources peuvent s'assembler pour former des formes allant du dimère à l'heptamère; certains domaines coiled-coil adopteront des 15 niveaux de polymérisation différents suivant les mutations ponctuelles de leur séquence d'acides aminés. Un domaine coiled-coil est typiquement constitué d'un motif répété de 7 acides aminés, de type « hxxhcxc », où « h » est un acide aminé hydrophobe, « c » est un acide aminé chargé, et « x » est un acide aminé quelconque. 20 Le domaine coiled-coil utilisable selon l'invention ne provient pas d'un virus ; il n'est pas viral. Parmi les domaines coiled-coil utilisables selon l'invention, on citera de préférence ceux issus de la cortexilline, la vimentine, le tétrabrachion, les golgines, des protéines de la superfamille 25 des "Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF) Attachment protein REceptor" ou SNARE, ou encore des facteurs de transcription comme le GCN4 ou d'un de ses variants, tels que GCN4-pLI ou GCN4-pII. De préférence, le domaine coiled-coil est celui issu du facteur de transcription GCN4, GCN4- pLI ou GCN4-pII. 30 De préférence, le domaine coiled-coil est choisi parmi SEQ ID NO : 24 (séquence de trimérisation GCNA-pII du facteur de transcription GCN4 de levure), SEQ ID NO :27 (séquence de tétramérisation GCN4-pLI du facteur de transcription GCN4 de levure), SEQ ID NO :28 (séquence d'heptamérisation GCN4-pAA du facteur de transcription GCN4 de levure), SEQ ID NO :29 (séquence d'oligomérisation glycosylée IZN4 du facteur de 3054547 11 transcription GCN4 de levure), SEQ ID NO : 33 (séquence synthétique mimant un coiledcoil) et SEQ ID NO : 30 (séquence d'oligomérisation de SNARE). Domaine d'ancrage dans la membrane plasmique (ou domaine transmembranaire) d) 5 Le domaine transmembranaire est une courte séquence d'acides aminés lipophiles qui interagit avec les lipides spécifiques des composants de la membrane plasmique. De préférence, la membrane plasmique comprend au moins une partie typique des radeaux lipidiques. Ces domaines d'ancrage sont communs (mais pas par une séquence consensus) aux protéines de surface des virus, mais aussi à des protéines qui sont naturellement intégrées dans la 10 membrane des cellules vivantes. Chaque domaine transmembranaire participe à la courbure et au bourgeonnement de la membrane plasmique. Parmi les domaines d'ancrage utilisables selon l'invention, on citera de préférence ceux issus des protéines listées dans le Tableau lA : 15 Tableau 1A : protéines transmembranaires Protéines transmembranaires (TM) Exemples (références Uniprot) Nombre de domaines TM Leucine-rich repeat receptor-like protein Q9M7A8 1 kinase NtTMK1 Cavéoline Q03135 1 BRI1-associated receptor kinase 1 (BAK1) Q94F62 1 Receptor kinases Q9LDGO, Q9ZT08, Q8LD58, Q7XHW7' Q8H811, Q9SUQ3, Q5ZBNO 1 Calcium-dependent protein kinases Q6KC54, Q6EE26, Q5EDD1, P28582, Q9ARI5, Q7XZK4, Q8GSB1, Q9FWFO, Q94KH6 1 NtRac2/NTGP3 Q9ZRD2 1 ARF1-like GTP-binding protein Q9M7P4 1 Stomatine Q93VP6, Q60634 1 Ascorbate péroxidase Q8W4V7 1 LAT 043561 1 VIP36 P49256 1 Elicitor-inducible protein (EIG-J7) Q9FXT1 1 Chaperone Hsp90-2 Q6UJX5 1 Syntaxine Q9SF29, Q9SRV7, Q9ZSD5 1 Phragmoplastine Q9SMB6 1 Fasciclin-like arabinogalactan protein 8 022126 1 (précurseur) Ras-related protein RAB8-3 Q8W3J3 2 3054547 12 Ras-related protein RAB8-5 Q8W3J2 2 Flotilline Q501E6, 075955 2 Harpin-inducing protein 1 Q6L7J8, Q6L7J7 2 Pectine sterase-like Q9FHN6 2 Protein kinase Q9SH35 3 Endo-1,4-5-glucanase 004890 3 MAL P21145 4 Synatophysine Q62277 4 Prominine 043490 5 Aquaporine 009224, 009222, Q40595, Q8W506, 6 024662, Q9FPZ6, ,Q9FPZ7 NADPH oxidase NtrbohD Q8RVJ9 6 Respiratory burst oxidase homolog StrbohB Q948T9 6 Lysine- and histidine-specific transporteur 024405 8 LHT1 glucan synthase Q9SJMO, Q8S8D4, Q5VS25, Q9ZT82' Q9SFU6 8 callose synthase Q8H046, Q9LXT9, Q9LTG5, Q9XEG1 9 Plasma membrane ATPase Q42932, Q08436, Q03194, Q5U9D4 10 ' Q9SWH2, Q9SWHO calcium-transporting ATPase Q9LU41 10 Ammonium transporter P58905 11 MDR-like ABC transporter mdr8 Q7FMW3 12 P-glycoprotein-like protein pgp3 Q9SY12 12 ABC transporter 080725, Q9FWX8 12 Phosphate transporter Q9ST22, Q9LLS5, Q9AYT1 12 Transmembrane protein PT3 Q8W4W9 12 H+/monosaccharide co-transporter MST1 Q06312 12 High affinity nitrate transporter protein Q84MZ8 12 PDR-type ABC transporter 1 NtPDR1 Q76CU2 12 Parmi les domaines d'ancrage utilisables selon l'invention, on citera également de préférence ceux issus des protéines d'enveloppe virales listées dans le Tableau 1B ci-dessous : Famille Exemples Protéines d'enveloppe Flavivirus le virus de la dengue Protéine E le virus de la fièvre jaune le virus de l'encéphalite de Saint Louis le virus de l'encéphalite japonaise le virus du Nil occidental le virus Zika le BYD virus (identifié en Chine en 2010, qui affecte les canards) Togavirus le virus de Sindbis GP 3054547 13 le virus de l'encéphalite équine de l'est le virus de l'encéphalite équine de l'ouest le virus de Ross River Le virus O'nyong'nyong Retrovirus oncovirus (5 genres) GP41/120 lentivirus (tel que VIH) Spumavirus Coronavirus Coronavirus canin P (hémagglutinine et estérase) Coronavirus félin virus de la gastroentérite transmissible du porc Protéine S et protéine HE virus respiratoire porcin coronavirus bovin coronavirus humain virus des hépatites murines Virus de silodacryonite du rat Filovirus Le virus Ebola glycoprotéine Le virus de Marburg Rhabdovirus le virus de la rage GP Fièvre hémorragique virale VSV-EBOV maladie de la betterave Bunyavirus virus hantaan Gn/Gc Dugbe virus Fièvre de la vallée du Rift Virus de la maladie bronzée de la tomate Orthomyxovirus Influenza virus (myxoinfluenza) Hémagglutinine/ neuraminidase Paramyxovirus le virus des oreillons Protéine F de fusion Protéine d'attachement (HN,H ou G) le virus sendaï le virus SV5 le virus de la maladie de Newcastle le virus de la rougeole le virus de la maladie de Carré le virus de la peste bovine le virus respiratoire syncytial (VRS) le virus respiratoire syncytial bovin (VRSB) parainfluenza Arenavirus la fièvre de Lassa GP la fièvre hémorragique d'Argentine la fièvre hémorragique de Bolivie la fièvre hémorragique du Brésil la fièvre hémorragique du Venezuela 3054547 14 Hepadnavirus le virus de l'hépatite B (VHB) GPL, S ou M Herpesvirus Herpes simplex virus (HSv) Glycoprotéine gD,gB, gH, gL, gC EHV-1 (equine herpes virus) le virus de l'herpès génital Poxvirus Orthopoxvirus; type d'espèce: virus de la Vaccine; GP41/120 Maladie: cowpox, vaccine, smallpox Parapoxvirus; type d'espèce: Orf virus Avipoxvirus; type d'espèce: Fowlpox virus Capripoxvirus; type d'espèce: Sheeppox virus Leporipoxvirus; type d'espèce: Myxoma virus Suipoxvirus; type d'espèce: Swinepox virus Molluscipoxvirus; type d'espèce: Molluscum contagiosum virus Yatapoxvirus; type d'espèce: Yaba monkey tumor virus De préférence, le domaine d'ancrage utilisable selon l'invention est choisi parmi la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :26) et la séquence d'ancrage de la protéine PDLP1 (A0A0D3D8S3) (SEQ ID NO :31). 5 Linkers De préférence, la protéine de fusion selon l'invention comprend un linker présent entre les fragments b) et c), et/ou entre les fragments c) et d). Les linkers sont de courtes séquences d'acides aminés (2 à 10 acides aminés, de préférence 2 à 10 6) qui créent un bras flexible. Ils peuvent être utiles pour créer un espacement flexible entre le domaine d'ancrage et l'enroulement en spirale du domaine coiled-coil, si une trop grande proximité entre les deux domaines interfère avec un assemblage correct. Ils ne sont pas nécessaires dans des conditions où un lien direct entre les deux domaines (d'ancrage et coiledcoil) n'interfère pas avec la structure tridimensionnelle globale de la protéine de fusion. 15 De préférence, le linker est une séquence de type -(GGGS)n-, où n est un entier. De préférence, le linker est choisi parmi SEQ ID NO : 23 (n=2) et SEQ ID NO :25 (n=1). Ainsi, de préférence, la protéine de fusion selon l'invention est telle que : a) le peptide signal optionnel a pour séquence SEQ ID NO : 21 ; 20 b) la protéine ou le peptide d'intérêt est choisi parmi : - les allergènes et leurs fragments, - les protéines virales et leurs fragments, - les protéines de surface cellulaire et leurs fragments, 3054547 15 - les protéines et les peptides accumulés dans les maladies chroniques ou neurodégénératives, - les protéines et peptides impliqués dans l'hypertension, - les immunoglobulines et leurs fragments, - les cytokines et leurs fragments, et 5 - les hormones et leurs fragments ; c) le domaine coiled-coil est choisi parmi SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 30 ; et d) le domaine d'ancrage est choisi parmi la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :26) et la séquence d'ancrage de la protéine PDLP1 10 (SEQ ID NO :31). Ainsi, de préférence, la protéine de fusion selon l'invention comprend, de préférence consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :18 et SEQ ID 15 NO :20. De la même façon, de préférence, la VLP selon l'invention comprend : - une enveloppe constituée d'une membrane plasmique dont au moins une partie a une composition typique des radeaux lipidiques ; et 20 - au moins une protéine de fusion transmembranaire de type I ou II ancrée dans ladite membrane, ladite protéine de fusion comprenant successivement les fragments suivants : b) la protéine ou le peptide d'intérêt choisi parmi : - les allergènes et leurs fragments, - les protéines virales et leurs fragments, 25 - les protéines de surface cellulaire et leurs fragments, - les protéines et les peptides accumulés dans les maladies chroniques ou neurodégénératives, - les protéines et peptides impliqués dans l'hypertension, - les immunoglobulines et leurs fragments, - les cytokines et leurs fragments, et 30 - les hormones et leurs fragments ; c) le domaine coiled-coil choisi parmi SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 30 ; et 3054547 16 d) le domaine d'ancrage choisi parmi la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :26) et la séquence d'ancrage de la protéine PDLP1 (SEQ ID NO :31), les fragments b) et c) étant exposés à l'extérieur de la VLP. 5 La présente invention a également pour objet l'acide nucléique (ou séquence nucléotidique) codant la protéine de fusion. Une fois que la séquence nucléotidique a été obtenue, cette dernière est placée dans un vecteur d'expression par des méthodes classiques. La présente invention a donc également 10 pour objet un vecteur comprenant l'acide nucléique codant la protéine de fusion. La sélection d'un vecteur d'expression approprié dépendra de la méthode d'introduction du vecteur d'expression dans des cellules hôtes. Un vecteur d'expression typique contient des éléments d'ADN eucaryotes comme une séquence d'initiation de la transcription du gène exogène, comme un promoteur, et des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, 15 comme des séquences de terminaison / polyadénylation et une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing. Il contient également des séquences telles que des t-DNA qui sont nécessaires pour l'intégration d'un morceau d'ADN dans la plante ou dans la cellule végétale. De préférence, le vecteur d'expression comprend : 20 - au moins une séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion, de préférence liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S ; - une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing, de préférence p19 ; et - des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquences 25 de terminaison / polyadénylation, de préférence la séquence Tnos (séquence de terminaison de la nopaline synthase). De préférence, le vecteur d'expression est pAGO1 Les promoteurs utilisés pour contrôler l'expression de la protéine de fusion sont des 30 promoteurs forts, et peuvent être des promoteurs de gènes de plantes, tels que par exemple, le promoteur de l'ubiquitine, le promoteur de la petite sous-unité de la ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase, des promoteurs d'Agrobacterium tumefaciens, les promoteurs de la nopaline-synthase et de l'octopine synthase, ou encore des promoteurs viraux comme les 19S 3054547 17 et 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV). De préférence, le promoteur fort est le 35S. La présente invention a également pour objet une cellule-hôte comprenant au moins un acide 5 nucléique codant la protéine de fusion. La cellule-hôte peut être une cellule végétale. La présente invention a également pour objet un procédé de production de particules pseudovirales (VLP), comprenant l'expression de l'acide nucléique codant la protéine de fusion dans des cellules eucaryotes, de préférence des cellules végétales. 10 Les méthodes générales de culture de plantes, ainsi que les procédés pour introduire des vecteurs d'expression dans un tissu végétal, sont à la disposition de l'homme de l'art. Ils sont variés et dépendent de la plante sélectionnée. De préférence, les plantes seront cultivées selon les techniques propres à la plateforme Allergopur. Ce procédé de production de protéines recombinantes est décrit dans la demande FR1255510, et comprend une première étape de 15 culture de la plante, en aéroponie ou en hydroponie et sous éclairage LEDs. Après cette première étape, l'agroinfiltration des plantes est réalisée sous vide, par des agrobactéries comprenant un fragment d'ADN codant pour la protéine de fusion selon l'invention. Cette étape d'agroinfiltration peut être mise en oeuvre par tout moyen permettant de faire le vide. De préférence, dans le procédé utilisé selon l'invention, elle est réalisée sous vide par effet 20 Venturi. Parmi les agrobactéries utilisables selon l'invention, on peut citer de préférence, les souches LBA4404, GV3101, EHA 101/105 ou C58. Une fois l'étape d'agroinfiltration réalisée, les plantes sont remises en culture, typiquement 3 à 6 jours, idéalement en assurant une brumisation fréquente de ces dernières pendant les 6 premières heures de culture qui suivent l'agroinfiltation. Puis, les VLP sont extraites et 25 purifiées comme décrit ci-dessous. L'extraction des VLP peut être effectuée par extraction enzymatique. Cette méthode est une adaptation de la méthode décrite notamment dans la demande W02014/153674. De préférence, l'extraction enzymatique des VLP est effectuée par les étapes suivantes : - infiltration sous vide (notamment comme il a été décrit ci-dessus pour 30 l'agroinfiltration) de la partie aérienne des plantes (i.e. les feuilles), dans une solution enzymatique contenant des enzymes pecto-cellulosiques, qui ne présente pas d'activité protéolytique. De préférence, un mélange de pectinases et de cellulases formulé à 4% dans un milieu comprenant 50mM de citrate de sodium pH5.2, 0.5M NaC1 et 0.04% métabisulfite. De préférence, la macérozyme est formulée à 0.5% dans un milieu 3054547 18 comprenant 50mM de citrate de sodium, pH5.2, 0.5M NaC1 et 0.04% métabisulfite, - les feuilles sont ensuite prélevées puis incubées dans la solution enzymatique, - le mélange est placé sous agitation sur un agitateur orbital entre 20 et 30 rpm à température ambiante (i.e. environ 20-23°C) pendant une durée comprise entre 30 5 minutes et 2h, - le digestat est ensuite filtré, de préférence sur une toile de 2-3mm puis 2501.1m, puis éventuellement centrifugé en continu (par exemple à 1000xg pendant 2-5 minutes), le surnageant est récupéré afin d'effectuer une filtration tangentielle. 10 Un tel procédé est illustré en figure 7. Ainsi, de préférence, l'invention a également pour objet un procédé de production de particules pseudo-virales (VLP) selon l'invention dans une cellule végétale ou une plante, comprenant les étapes suivantes : 15 a) transformation d' agrobactéries avec un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion selon l'invention liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort ; et b) transfection de la cellule végétale ou de la plante avec les agrobactéries obtenues à l'étape a). 20 La transformation de l'étape a) se fait typiquement par des méthodes connues de l'art antérieur, par exemple par chocs thermiques avec passages successifs à 4°C, -80°C et 37°C. La transfection de l'étape b) comprend de préférence les étapes suivantes : 25 b1) culture de la cellule végétale ou de la plante, en aéroponie ou en hydroponie, et sous éclairage LEDs, de préférence pendant quatre à six semaines, b2) agroinfiltration de la cellule végétale ou plante obtenue en b 1) sous vide, par les agrobactéries obtenues à l'étape a). Cette étape d'agroinfiltration est, de préférence, réalisée sous vide par effet Venturi. 30 b3) remise en culture de la cellule végétale ou de la plante obtenue en b2), typiquement pendant 3 à 6 jours pour obtenir les particules pseudo-virales. Enfin, les VLP obtenues sont extraites et purifiées notamment par extraction enzymatique tel que décrit ci-dessus. 3054547 19 La présente invention a également pour objet une particule pseudo-virale comprenant : - une enveloppe constituée d'une membrane plasmique dont au moins une partie a une composition typique des radeaux lipidiques ; et - au moins une protéine de fusion selon l'invention sans peptide signal a), ancrée dans ladite 5 membrane. Une telle particule pseudo-virale (VLP) comprend ainsi : - une enveloppe constituée d'une membrane plasmique dont au moins une partie est typique des radeaux lipidiques ; et - au moins une protéine de fusion transmembranaire de type I ou II ancrée dans ladite 10 membrane, ladite protéine de fusion comprenant successivement les fragments suivants : b) une protéine ou un peptide d'intérêt ; c) un domaine coiled-coil (ou séquence d' oligomérisation) qui ne provient pas d'un virus ; et d) un domaine d'ancrage dans la membrane plasmique, constitué par un segment transmembranaire et un segment cytosolique, de préférence un domaine d'ancrage dans une 15 membrane plasmique dont au moins une partie est typique des radeaux lipidiques, les fragments b) et c) étant exposés à l'extérieur de la VLP. Par « partie de membrane plasmique typique des radeaux lipidiques », on entend une bicouche phospholipidique (i.e. membrane plasmique) retrouvée dans les microdomaines des 20 radeaux lipidiques (ou lipid rafts en anglais). Une telle bicouche est riche en cholestérol et en phospholipides, de préférence en phosphatidylcholine et en phosphatidyléthanolamine, et en sphingolipides, tel que la sphingomyéline, mais pauvre en acide docosahexaénoïque. En outre, elle présente une faible densité, et est insoluble dans les détergents doux (par exemples les polysorbates). 25 Les caractéristiques uniques d'une telle VLP sont une immunogénicité indétectable (hormis la protéine ou le peptide d'intérêt b), sa capacité à s'assembler spontanément, son contenu spécifique en lipides, de préférence typiques des radeaux lipidiques, le fait que sa membrane soit très pauvre en protéines de la membrane de la cellule-hôte, sa capacité à être exprimée à 30 des rendements élevés dans de nombreux types de cellules eucaryotes (levures, insectes ou plantes) et sa facilité de préparation. La VLP selon l'invention peut être utilisée en thérapie. Elle peut être utilisée comme médicament. Elle peut également être utilisée en immunothérapie allergénique (ITA). 3054547 20 Les séquences listées dans la présente demande sont résumées dans le tableau ci-dessous : SEQ ID NO : Définition 1 ADNc codant la forme naturelle de Der p2 2 Protéine Der p2 3 à 20 ADNc et protéines de fusion selon l'invention 21 Peptide signal de la chitinase du tabac 22 Séquence mature de Der p2 23 Linker 24 Domaine coiled-coil GCN4-pII 25 Linker 26 Séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 27 Domaine coiled-coil GCN4-pLI 28 Domaine coiled-coil GCN4-pAA 29 Domaine coiled-coil IZN4 30 Domaine coiled-coil SNARE 31 Séquence d'ancrage de la protéine PDLP1 32 Séquence de la chaîne CH1 de l'allergène félin Fel dl 33 Domaine coiled-coil synthétique 34 Chaîne HA1 de l'hémagglutinine Protéine d'enveloppe du virus Zika Les exemples qui suivent, illustrent, mais ne visent pas à limiter la portée de l'invention. Il 5 sera évident pour l'homme de l'art que des variantes et modifications sont possibles et entrent dans le cadre et l'esprit de l'invention. Les légendes des figures sont les suivantes : 3054547 21 Figure 1 : Représentation schématique des différentes cassettes d'expression permettant de produire un allergène associé à une séquence d'oligomérisation et à une séquence d'ancrage dans la membrane plasmique, de préférence au niveau des radeaux lipidiques A) L'ADNc codant la séquence de Der p2 (DP2, SEQ ID NO :22) optimisé, de préférence 5 harmonisé, est associé à 1) l'ADNc codant le peptide signal de la chitinase de tabac (PS Chit, SEQ ID NO :21), 2) une séquence d'oligomérisation (coiled-coil) issue d'un facteur de transcription (GCN4-pII/forme trimérique, B - GCN4-PLI/forme tétramérique, C - GCN4- IZN4/forme glycosylée, E - GCN4-pAA/forme heptamérique, D) ou de toute autre famille de protéines présentant une séquence coiled-coil (SNARE, Golgin, Fibritin, G) ou une séquence 10 synthétique mimant une séquence coiled-coil (F), et enfin 3) une séquence d'ancrage issue de protéine d'enveloppe de virus enveloppé (TM/CT de H5 influenza, B à I) ou de protéine de type I ancrée dans les radeaux lipidiques (« lipid raft ») (J). B) Schéma représentant la structure de la séquence d'oligomérisation ou coiled-coil. Cette séquence est constituée d'un motif répété de 7 acides aminés, de type « hxxhcxc », où « h » 15 est un acide aminé hydrophobe, « c » est un acide aminé chargé, et « x » est un acide aminé quelconque. Figure 2 : La plateforme AllergoPur utilisée pour l'expression et la production des différentes formes de VLP 20 Figure 3 : Production des protéines décrite Figure lA Les protéines extraites de plantes transfectées sous vide pour l'expression des protéines DP2 (piste 1), DP2-Tri (pistes 2-3) DP2-Tetra (pistes 4-5) ou FD1-Tri (pistes 6-7) ont été analysées par immmunodétection avec un anticorps dirigé contre l'allergène Der p2 ou Fel dl. 25 L'analyse par immunodétection met en évidence la production spécifique des protéines dont la masse moléculaire correspond à la masse attendue. Deux clones d' agrobactéries (C1.1 et C1.2) ont été analysés pour chaque construction. Figure 4: Purification et Caractérisation des VLP portant les allergènes par 30 chromatographie d'exclusion stérique Des extraits protéiques de feuilles produisant DP2-Tri (panneau D), DP2-Tetra (Panneau E) et FD1-Tri (panneau G) ont été séparés par chromatographie sur une colonne S-500/HR calibrée. La teneur en protéines solubles totales de chaque fraction a été évaluée en spectrométrie (panneau A) et coloration par Bleu de Coomassie après séparation par SDS- 3054547 22 PAGE (panneau B). La teneur en allergènes des fractions d'élution a été révélée par détection immunologique utilisant des anticorps anti-Der p 2 ou anti-Fel d 1. Des extraits protéiques de feuilles produisant l'hémagglutinine sous forme de VLP de H5N1 (panneau C), ont été séparés par filtration sur gel sur une colonne S-500/HR calibrée et sont utilisés comme 5 contrôles. Figure 5: Caractérisation des VLP portant les allergènes isolés par examen en microscopie électronique et coloration négative Les VLP portant les allergènes présentent une morphologie et une taille très proches de celles 10 décrites pour des virions de la grippe. La barre représente 50 nm. Figure 6: Réactivité des allergènes produits sous forme de VLP avec des sérums de patients allergiques à Der p2 15 Les protéines extraites de plantes transfectées sous vide pour l'expression des protéines DP2 (piste 1), DP2-Tri (pistes 2) et DP2-Tetra (pistes 3) ont été analysées par immunodétection avec des sérums de patients allergiques à Der p2. L'analyse par immunodétection met en évidence la reconnaissance des allergènes portés par des VLP par les IgE des sérums de patients. 20 Figure 7: Procédé de production des VLP à grande échelle Figure 8: Structure des VLP et des protéines de fusion assemblées selon l'invention A) Structure d'une VLP selon l'invention. La VLP est constituée d'une enveloppe de 25 membrane plasmique, dans laquelle sont fixées les protéines de fusion selon l'invention. La protéine ou le peptide d'intérêt (par exemple l'allergène) est ainsi exposé à sa surface. B) Structure des protéines de fusion selon l'invention, assemblées au sein de la VLP. Les séquences d' oligomérisation permettent aux protéines de fusion de former des polymères (par exemple ici l'allergène, A) à la surface de la VLP. 30 Figure 9: Structure des VLP et des protéines de fusion selon l'invention utilisées lorsque la protéine ou le peptide d'intérêt est l'hémagglutinine (HM) ou la protéine d'enveloppe du virus Zika (Zika) La séquence de la chaîne HA1 de l'hémagglutinine est SEQ ID NO :34. 3054547 23 La séquence de la protéine d'enveloppe du virus Zika est SEQ ID NO :35. EXEMPLES : 5 Exemple 1 : Design moléculaire et synthèse des gènes Les ADNc sont synthétisés en optimisant puis en harmonisant l'usage des codons pour leur reconnaissance par le système végétal. Dans le cadre de cette invention, l'optimisation 10 préférée est l'optimisation pour une expression chez Nicotiana benthamiana. Les constructions sont illustrées en Figure 1. En particulier : A: ADNc codant pour la forme naturelle de la protéine (SEQ ID NO :1). Cet ADNc pourra être ou non fusionné à des signaux d'adressage décrits dans le brevet WO/2008/056265. La 15 protéine correspondante a pour séquence SEQ ID NO :2. B: ADNc codant pour la forme mature de l'allergène Der p2 (SEQ ID NO :22) fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. 1996), à la séquence de trimérisation GCN4-pII du facteur de transcription GCN4 de levure et à la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :3) . La protéine 20 correspondante a pour séquence SEQ ID NO :4. C: ADNc codant pour la forme mature de l'allergène Der p2 (SEQ ID NO :22) fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. 1996), à la séquence de tétramérisation GCN4-pLI du facteur de transcription GCN4 de levure et à la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :5) . La 25 protéine correspondante a pour séquence SEQ ID NO :6. D: ADNc codant pour la forme mature de l'allergène Der p2 (SEQ ID NO :22) fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. 1996), à la séquence d'heptamérisation GCN4-pAA du facteur de transcription GCN4 de levure et à la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :7). La protéine 30 correspondante a pour séquence SEQ ID NO :8. E: ADNc codant pour la forme mature de l'allergène Der p2 (SEQ ID NO :22) fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. 1996), à la séquence d'oligomérisation glycosylée IZN4 du facteur de transcription GCN4 de levure et à la 3054547 24 séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1(SEQ ID NO :9). La protéine correspondante a pour séquence SEQ ID NO :10. F: ADNc codant pour la forme mature de l'allergène Der p2 (SEQ ID NO :22) fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. 1996), à une séquence synthétique 5 mimant un coiled-coil et à la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :11). La protéine correspondante a pour séquence SEQ ID NO :12. G: ADNc codant pour la forme mature de l'allergène Der p2 (SEQ ID NO :22) fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. 1996), à une séquence 10 d'oligomérisation de SNARE et à la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :13). La protéine correspondante a pour séquence SEQ ID NO :14. H: ADNc codant pour deux fragments de Der p2 (SEQ ID NO :22) fusionnés à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. 1996) à la séquence de trimérisation GCN4-pII 15 du facteur de transcription GCN4 de levure et à la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :15). La protéine correspondante a pour séquence SEQ ID NO :16. I: ADNc codant pour la chaîne CH1 de l'allergène Fel dl (SEQ ID NO :32) fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. 1996) à la séquence de trimérisation 20 GCN4-pII du facteur de transcription GCN4 de levure et à la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :17). La protéine correspondante a pour séquence SEQ ID NO :18. J: ADNc codant pour la forme mature de l'allergène Der p2 (SEQ ID NO :22) fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. 1996), à la séquence de trimérisation 25 GCN4-pII du facteur de transcription GCN4 de levure et à la séquence d'ancrage de la protéine PDLP1 (A0A0D3D8S3) de radeaux lipidiques (SEQ ID NO :19). La protéine correspondante a pour séquence SEQ ID NO :20. Exemple 2 : Préparation des plasmides 30 Des sites de restriction Xba I/kpn I et Sal I/Sac I sont respectivement intégrés aux extrémités 5' et 3' de l'ADNc lors de la synthèse. Ces sites sont ensuite utilisés afin de cloner les ADNc dans le vecteur binaire d'expression pAG01. Les ADNc sont clonés en amont d'un promoteur 35S (35S) et en aval d'une séquence de terminaison de la nopaline synthase (tnos), le vecteur 3054547 25 pAGO1 contient en outre une cassette d'expression permettant d'exprimer l'inhibiteur de silencing p19 simultanément de la protéine recombinante afin d'augmenter les rendements de production. Les vecteurs sont ensuite utilisés pour transformer la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens. 5 Exemple 3 : Expression transitoire de Der p 2 produit sous forme de VLP dans des feuilles de Nicotiana benthamiana - Utilisation de la plateforme AllergoPur Pour la production par expression transitoire, Agrobacterium tumefaciens LBA4404 est utilisé 10 pour le transfert d'un ADNc codant Der p 2 associé à une séquence d'oligomérisation et à une séquence d'ancrage sans que le gène d'intérêt soit intégré dans le génome de la cellule végétale. On parle ici de transfection et non de transgénèse. Les plantes sont cultivées en condition hydroponique en présence d'un milieu nutritif (GHE, floragrow, floramicro, florabloom, 10mL/15mL/5mL pour 10L d'eau osmose) et sous éclairage LED. 15 L'agrobactérie est transférée dans le tissu foliaire par agro-infiltration selon deux procédés. Pour la production de petits lots de protéases destinés au criblage de prototypes, les agrobactéries sont injectées manuellement grâce à une seringue appliquée contre l'épiderme de la face inférieure de la feuille. Des disques foliaires prélevés dans les feuilles 4 à 6 jours après l'agro-infiltration sont utilisés pour l'analyse des différents prototypes de VLP. Cette 20 étape de criblage permet de définir le vecteur d'expression qui sera utilisé pour l'obtention de l'allergène Der p 2 ancré dans la membrane de qualité optimale. Le même procédé est utilisé pour la production à grande échelle mais dans ce cas, l'agro-infiltration s'effectue sous vide, dans des enceintes contenant plusieurs litres d'une culture d'agrobactéries et où plusieurs dizaines de plantes sont infiltrées simultanément. Ces plantes sont ensuite remises en culture 25 pendant 3-6 jours avant la purification des VLP portant l'allergène (Figure 2). Exemple 4 : Production des VLP portant l'allergène Der p2 L'expression des protéines produites à l'exemple 3 ainsi que les rendements sont 30 respectivement analysés par Western blotting et ELISA. Les résultats sont illustrés pour 3 allergènes produits sous forme de VLP (DP2-tri; DP2-tetra et FD1-tri) (Figure 3). Exemple 5 : Evaluation de la formation de VLP / analyse de distribution de tailles 3054547 26 Une analyse de la distribution de la taille des structures porteuses des allergènes Der p2 (DP2- tri/DP2-tetra) ou Fel dl (FD1-Tri) a été réalisée. Après infiltration sous vide de plantes N. benthamiana avec la souche d'Agrobacterium LBA4404, comme décrit à l'exemple 3, les extraits protéiques totaux ont été séparés par chromatographie d'exclusion de taille sur une 5 colonne haute résolution S-500 (HR) (GE Healthcare Bio-Science Corporation). Les fractions d'élution ont été contrôlées pour leur teneur en protéines totales et pour leur teneur en VLPallergènes par Western blotting avec des anticorps anti-allergènes. Pour tous les extraits analysés, la concentration en protéines solubles dans l'éluât atteint un maximum dans les fractions 14-16 (Figure 4). En revanche, l'analyse par Western blotting met en évidence une 10 accumulation des allergènes dans les fractions 6 et 7 (c'est-à-dire avant l'élution du Bleu Dextran utilisé comme marqueur) ce qui montre l'association des allergènes à des structures de très haut poids moléculaire dans la zone de 2 MDa. Les colonnes de 32 ml de Sephacryl S-500/HR (GE Healthcare Bio-Science Corporation) ont été équilibrées avec 50 mM, PBS, pH 7,4, NaC1 150 mM. Des échantillons d'extrait de 15 protéines totales de 1,5 mL ont été chargés puis élues avec le tampon d'équilibration. Vingt- quatre fractions d'élution de 1,5 ml ont été recueillies et analysées pour la teneur en protéines mesurées par spectrophotométrie de l'absorbance à 280 nm. Les protéines de chaque fraction ont été concentrées par précipitation à l'acétone puis remises en solution dans un même volume de tampon avant l'analyse par SDS-Page et Western blotting. Les profils d'élution du 20 Bleu Dextran 2000 et des protéines solubles ont été comparés pour chaque chromatogramme afin de s'assurer de la reproductibilité de cette technique de séparation. Exemple 6 : Morphologie des VLP - Analyse par microscopie électronique 25 La microscopie électronique à transmission du produit purifié (issu de la production à l'exemple 3 puis purifié) indique que les structures de haut poids moléculaire isolées par chromatographie de tamisage sont des VLP auxquelles sont liées des allergènes. A la fois par leur taille, par leur morphologie, comprenant une membrane phospholipidique couverte de pointes, ces VLP ressemblent beaucoup à des virions de la grippe (Figure 5). 30 Exemple 7: Production d'allergènes ou d'hypoallergènes portés par des VLP Le couplage d'un allergène à une VLP réduit considérablement sa réactivité in vivo avec les IgE de sérums de patients. 3054547 27 Toutefois, l'utilisation d'hypoallergènes réduit encore la réactivité avec les IgE et par là les risques de réaction anaphylactique. La réduction de réactivité d'une forme hypoallergénique de l'allergène Der p 2 portée par des VLP est illustrée en figure 6. 5 Exemple 8 : Production des VLP Le procédé de production détaillé des VLP, jusqu'à leur purification (comme cela est décrit à l'exemple 6), est illustré en figure 7. 10 Exemple 9 : Pouvoir immunogène des VLP en comparaison aux allergènes solubles La présentation d'un antigène dans un réseau hautement ordonné et répétitif provoque normalement de fortes réponses immunitaires , alors que le même antigène présenté en tant que monomère est non immunogène. 15 Pour comparer la réponse immunitaire de l'allergène lorsqu'il est présenté sous forme de réseau hautement ordonné, des souris sont immunisées avec l'allergène Der p2 sous forme de monomère soluble ou porté par des VLP. Les titres en IgG contre l'allergène Der p2 sont déterminés par ELISA. 20 Protocole Le protocole est illustré comme suit : Sa crifïce J7 J14 J22 J21 J23 Analys s Paramètres étudiés: DOSE Cr al'ergènes .nécessaire Mode d'admiristreon Atjuvar Analyses après le sacrifice : - La perte de poids et le changement de comportement 3054547 28 - La fonction pulmonaire (flexiVent, plesthismographie) - Réponse sérologique à l'allergène (IgG sérique, IgE, blot) - Test d'activation des basophiles Histopathologie et d'autres résultats sérologiques (par exemple: isoformes IgG1) dans 5 les phases ultérieures Exemple 10 : Désensibilisation/Vaccination utilisant les VLP Les paramètres clés d'un vaccin efficace sont les suivants: une induction rapide d'un titre 10 élevé d'anticorps en absence d'adjuvants et l'absence d'effets secondaires majeurs. Protocole Le protocole est illustré comme suit : ahor J-7 Jt7 J14 A!' er ei doses RoJte a' sensitizatior AdAivant 15 3054547 29 Références bibliographiques Les références citées dans la présente demande sont les suivantes : 5 1-Noon L. Prophylactic inoculation against hay fever Lancet 1911 ; 1 :1572-3 2-Freeman J. Further observation on the treatment of hay fever by hypodermic inoculations of pollen vaccine. Lancet 1911 ;2 :814-817 3-Henmar et al Clin Exp Immunol 2008 ;153 : 316-323 4-Valenta et al J Allergy Clin Immunol 2007 ;119 :826_830 10 5-Larche M. 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Particule pseudo-virale comprenant : - une enveloppe constituée d'une membrane plasmique dont au moins une partie est typique des radeaux lipidiques ; et - au moins une protéine de fusion transmembranaire de type I ou II ancrée dans ladite membrane, ladite protéine de fusion comprenant successivement les fragments suivants : b) une protéine ou un peptide d'intérêt ; c) un domaine coiled-coil ou séquence d'oligomérisation, qui ne provient pas d'un virus ; et d) un domaine d'ancrage dans la membrane plasmique, constitué par un segment transmembranaire et un segment cytosolique, de préférence un domaine d'ancrage dans une membrane plasmique dont au moins une partie est typique des radeaux lipidiques, les fragments b) et c) étant exposés à la surface de la particule pseudo-virale. 2. Particule pseudo-virale selon la revendication 1, dans laquelle un linker est présent entre les fragments b) et c), et/ou entre les fragments c) et d). 3. Particule pseudo-virale selon l'une des revendications 1 à 2, dans laquelle : b) la protéine ou le peptide d'intérêt est choisi parmi : - les allergènes et leurs fragments, - les protéines virales et leurs fragments, - les protéines de surface cellulaire et leurs fragments, - les protéines et les peptides accumulés dans les maladies chroniques ou neurodégénératives, - les protéines et peptides impliqués dans l'hypertension, - les immunoglobulines et leurs fragments, - les cytokines et leurs fragments, et - les hormones et leurs fragments ; c) le domaine coiled-coil est choisi parmi SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 30 ; et d) le domaine d'ancrage est choisi parmi la séquence d'ancrage de l'hémagglutinine H5 du virus de l'influenza H5N1 (SEQ ID NO :26) et la séquence d'ancrage de la protéine PDLP1 (SEQ ID NO :31). 3054547 31 4. Protéine de fusion transmembranaire de type I ou II comprenant successivement les fragments suivants : a) optionnellement, un peptide signal ; b) une protéine ou un peptide d'intérêt ; c) un domaine coiled-coil ou séquence d'oligomérisation, qui ne provient pas d'un virus ; et d) un domaine d'ancrage dans la membrane plasmique, constitué par un segment transmembranaire et un segment cytosolique, de préférence un domaine d'ancrage dans une membrane plasmique dont au moins une partie est typique des radeaux lipidiques. 5. Acide nucléique codant une protéine de fusion selon la revendication 4. 6. Cellule-hôte ou vecteur comprenant au moins un acide nucléique selon la revendication 5. 7. Particule pseudo-virale selon l'une des revendications 1 à 3 pour son utilisation en thérapie. 8. Particule pseudo-virale selon l'une des revendications 1 à 3 pour son utilisation pour l'immunothérapie allergénique. 9. Procédé de production de particules pseudo-virales selon l'une des revendications 1 à 3, comprenant l'expression de l'acide nucléique selon la revendication 5 dans des cellules eucaryotes. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les cellules eucaryotes sont des cellules végétales, et en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformation d'agrobactéries avec un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 5 lié de manière fonctionnelle à un promoteur fort ; et b) transfection des cellules végétales avec les agrobactéries obtenues à l'étape a), ladite transfection comprenant les étapes suivantes : bl) culture des cellules végétales, en aéroponie ou en hydroponie, et sous éclairage LEDs, de préférence pendant quatre à six semaines en hydroponie, b2) agroinfiltration des cellules végétales obtenues en b 1) sous vide, par les agrobactéries obtenues à l'étape a), de préférence réalisée sous vide par effet Venturi, b3) remise en culture des cellules végétales obtenues en b2), typiquement pendant 3 à 6 jours, pour obtenir les particules pseudo-virales, 3054547 32 puis extraction des particules pseudo-virales obtenues et purification notamment par extraction enzymatique.