Brevet FR3047742A1 — publié le 20170818

Domaine technique La mesure de la viabilité et de la prolifération cellulaire constitue la base de nombreux essais in vitro afin d'évaluer la réponse d'une population de cellules à des facteurs extérieurs. La réduction des sels de tétrazolium est un moyen fiable d'examiner la prolifération et/ou la viabilité cellulaire. Art Antérieur Afin de contrôler efficacement la contamination d'une surface, il est fondamental de mesurer la viabilité cellulaire et/ou de vérifier la prolifération cellulaire. Plusieurs méthodes sont actuellement connues et peuvent se classifier comme des méthodes microbiologiques ou non microbiologiques. Les méthodes microbiologiques sont des méthodes exigeant plusieurs jours d'attente avant l'obtention de résultats et demandant le plus souvent un savoir-faire particulier lié à la pratique de laboratoire ou à la stérilité. Pour répondre aux exigences actuelles de diminution des délais de production, il est nécessaire de réduire le temps d'obtention des résultats et cela est souvent possible grâce aux méthodes non microbiologiques qui comprennent des techniques très différentes. 3047742 2 La méthode d'ATPmétrie est une méthode de bioluminescence qui permet d'évaluer la quantité d'adénosine triphosphate en utilisant le couple enzyme/substrat luciférine/luciférase. Il est alors 5 possible d'avoir une estimation rapide de la biomasse totale contenue dans un échantillon. Néanmoins, cette méthode nécessite un appareillage spécifique ainsi qu'un savoir-faire pour l'utiliser. 10 La PCR quantitative est une méthode donnant des résultats fiables et précis mais cette technique a plusieurs inconvénients. En effet, l'utilisation se fait en laboratoire avec un matériel spécifique et il est nécessaire d'avoir une certaine connaissance pour utiliser 15 cette méthode et parfois même pour interpréter ses résultats. De plus, elle ne donne pas d'information sur la viabilité des microorganismes détectés mais seulement sur leur présence. 20 Ainsi, les techniques d'ATPmétrie et de PCR- quantitative se révèlent être des méthodes très difficiles à mettre en oeuvre pour pouvoir tester directement en local, sur site industriel, des échantillons. 25 La détection par colorimétrie est une méthode de détection simple et efficace utilisant des réactifs connus qui détectent le plus souvent des protéines, des lipides ou des acides nucléiques comme par exemple les réactifs mis en jeu dans la méthode de Kjeldahl ou du biuret. 30 Cependant, la présence de protéines, de lipides ou d'acides nucléiques ne signifie pas forcément la présence de cellules et encore moins la présence de cellules 3047742 3 vivantes. De ce fait, tous les réactifs colorimétriques ne permettent pas de détecter la viabilité cellulaire et il est nécessaire de choisir avec précision les types de réactifs à utiliser. Les réactifs les plus intéressants 5 pour détecter la viabilité cellulaire et la prolifération semblent être les sels de tétrazolium. Les protocoles utilisant des sels de tétrazolium sont le plus souvent des protocoles de laboratoire dont les 10 résultats sont obtenus via une mesure par colorimétrie. Cela suppose donc que la composition comprenant le sel de tétrazolium soit liquide. Toutefois, un test de détection comprenant une composition liquide pose des problèmes pour un test d'échantillon en local. 15 En effet, l'obtention des résultats ainsi que l'observation de la coloration due aux sels de tétrazolium doit être rapide, il est donc nécessaire de faire une observation à l'oeil nu. Le fait que l'échantillon puisse se 20 diffuser dans la composition liquide va diminuer la visibilité du signal par dilution. L'utilisation d'une composition gélifiée devrait permettre de résoudre ce problème en concentrant le signal sur un point. 25 De plus, une composition gélifiée devrait permettre une meilleure robustesse du résultat car contrairement à la composition liquide, aucune dilution ne s'effectue entre l'échantillon et la composition gélifiée. Pour finir, un test mettant en jeu une composition gélifiée devrait donner 30 un résultat avec une meilleure reproductibilité en éliminant différents facteurs inhérents à une composition liquide comme l'agitation volontaire ou involontaire. 3047742 4 De ce fait, la gélification d'une composition liquide comprenant un réactif colorimétrique devrait apporter de nombreux avantages notamment dans un kit de détection de viabilité faisant intervenir un ou des sels de tétrazolium. 5 Toutefois, les inventeurs ont constaté que la gélification de compositions contenant des sel(s) de tétrazolium posait des problèmes du fait que certains gélifiants modifient la couleur de base de la composition, 10 donnent un gel cassant ou activent spontanément la coloration du ou des sels de tétrazolium. Après de nombreuses recherches, les inventeurs ont trouvé le moyen de gélifier une composition comprenant un 15 ou des sels de tétrazolium sans rendre inexploitables les résultats de la coloration. Pour cela les inventeurs, plutôt que d'utiliser des gélifiants standards, utilisent de la gomme gellane. 20 La gomme gellane est un polyoside extracellulaire issu de Pseudomonas elodea normalement utilisée en microbiologie dans les milieux de cultures pour sa thermostabilité dans les hautes températures. Il s'avère que ce composé permet une gélification de la composition qui ne dénature pas et 25 n'active pas spontanément le ou les sels de tétrazolium tout en créant un gel non cassant dont la coloration permettra une bonne visualisation du signal à l'oeil nu. Résumé 30 La présente invention concerne donc des compositions gélifiées à partir de gomme gellane comprenant au moins un composé de détection de viabilité cellulaire choisi parmi les sels de tétrazolium, leurs utilisations dans un kit de 3047742 5 détection et des procédés mettant en oeuvre lesdites compositions. Mode de réalisation 5 L'invention a ainsi pour objet une composition gélifiée comprenant au moins un sel de tétrazolium, de la gomme gellane et un tampon. Ladite composition est destinée plus particulièrement à être utilisée dans la détection de 10 microorganismes. Selon l'invention, on entend par microorganismes tout organisme unicellulaire ou pluricellulaire invisible à l'oeil nu, tel que des bactéries, des algues, des 15 champignons ou des levures. Selon l'invention, on entend par sel de tétrazolium tout composé comprenant un anneau de tétrazolium pouvant être réduit. On peut citer à titre d'exemple comme sel de 20 tétrazolium et sans vouloir se limiter le MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazoly1-2)-2,5-diphényltétrazolium), le TTC (chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium), l'INT (2- (4-iodophény1)-3-(4-nitrophény1)-5-phényl-2H-tétrazolium), le MTS (5-[3-(carboxyméthoxy)phény1]-3-(4,5-diméthy1-2- 25 thiazolyl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium), le WST-1 (5- (2,4-disulfophény1)-2-(4-iodophény1)-3-(4-nitrophény1)-2H- tetrazolium sodique), le WST-8 (2-(2-méthoxy-4- nitrophény1)-3-(4-nitrophény1)-5-(2,4-disulfophény1)-2Htétrazolium sodique), le XTT (2,3-bis(2-méthoxy-4-nitro-5- 30 sulfophény1)-5-[(phénylamino)-carbony1]-2H-tétrazolium sodique) ou un mélange de ceux-ci, plus préférentiellement le MTT, le TTC, l'INT, le WST-8 ou un mélange de ceux-ci. 3047742 6 De préférence, la composition gélifiée telle que décrite précédemment est caractérisée en ce que au moins un sel de tétrazolium utilisé est du MTT, du TTC, de l'INT ou du WST-8. 5 Le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazoly1-2)-2,5- diphényltétrazolium ou MTT est un sel de tétrazolium jaune pouvant être réduit notamment par l'action des enzymes déshydrogénases. Ainsi, dans les cellules métaboliquement 10 actives les enzymes vont transformer le MTT jaune en formazan pourpre et générer des équivalents réducteurs tels que le NADH et le NADPH. Le chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium ou TTC 15 est un sel de tétrazolium incolore pouvant être réduit notamment par l'action des enzymes déshydrogénases. Ainsi, dans les cellules métaboliquement actives les enzymes vont transformer le TTC incolore en 1,3,5-triphénylformazan pourpre et générer des équivalents réducteurs tels que le 20 NADH et le NADPH. Le chlorure de 2-(4-iodophény1)-3-(4-nitrophény1)-5- phény1-2H-tétrazolium ou INT est un sel de tétrazolium incolore pouvant être réduit notamment par l'action des 25 enzymes déshydrogénases. Ainsi, dans les cellules métaboliquement actives les enzymes vont transformer l'INT incolore en formazan pourpre et générer des équivalents réducteurs tels que le NADH et le NADPH. 30 Le 2-(2-méthoxy-4-nitrophény1)-3-(4-nitrophény1)-5- (2,4-disulfophény1)-2H-tétrazolium sodique ou WST-8 est un sel de tétrazolium légèrement jaune pouvant être réduit notamment par l'action des enzymes déshydrogénases. Ainsi, 3047742 7 dans les cellules métaboliquement actives les enzymes vont transformer le WST-8 légèrement jaune en formazan orange et générer des équivalents réducteurs tels que le NADH et le NADPH. 5 Le tampon permettra plus particulièrement de maintenir le pH de la composition gélifiée dans la gamme d'environ 6,5 à environ 7,5, plus particulièrement à un pH d'environ 7. 10 De préférence, le tampon utilisé sera un tampon TRISHC1 (solution de TRIS-HC1 dans l'eau) ou un tampon Citrate-Phosphate (solution de Na2HPO4 et d'acide citrique dans l'eau), permettant en particulier d'atteindre un pH dans la 15 gamme d'environ 6,5 à environ 7,5, plus particulièrement un pH d'environ 7. Dans un mode de réalisation, la composition gélifiée selon l'invention peut contenir un composé supplémentaire 20 comme un antibiotique, un substrat colorimétrique d'enzymes intervenant dans la résistance aux antibiotiques, un autre réactif colorimétrique spécifique de microorganismes, un substrat colorimétrique de toxines ayant une activité enzymatique ou une combinaison de ceux-ci. 25 Dans un mode de réalisation préféré, la composition gélifiée selon l'invention peut contenir un antibiotique. On peut citer à titre d'exemple comme antibiotique et sans vouloir se limiter l'ampicilline, kanamycine, tétracycline, 30 chloramphénicol, carbénicilline, streptomycine, gentamicine, amoxicilline, sulfaméthoxazole, sulfachloropyridazine et une combinaison de ceux-ci. 3047742 8 Dans un mode de réalisation préféré, la composition gélifiée selon l'invention peut contenir un substrat colorimétrique d'enzymes intervenant dans la résistance aux antibiotiques. On peut citer à titre d'exemple comme 5 substrat et sans vouloir se limiter la nitrocéfine, la carbapénème et une combinaison de ceux-ci. Dans un mode de réalisation préféré, la composition gélifiée selon l'invention peut contenir un autre réactif 10 colorimétrique spécifique de microorganismes. On peut citer à titre d'exemple comme substrat colorimétrique et sans vouloir se limiter le violet de gentiane, l'orthonitrophényl-P-galactopyranoside et le 4-méthylumbélliféry1- 8-D-glucuronide. 15 Dans un mode de réalisation préféré, la composition gélifiée selon l'invention peut contenir un substrat colorimétrique de toxines ayant une activité enzymatique. On peut citer à titre d'exemple comme réactif 20 colorimétrique et sans vouloir se limiter l'indophénol pour la détection d'activité AMP déaminase, les nanoparticules d'or pour la détection d'activité ribonucléase, le DNAméthyl green pour la détection d'activité DNase et une combinaison de ceux-ci. 25 L'invention a également pour objet un procédé de détection de microorganismes viables sur une surface caractérisé en ce qu'il comprend au moins une fois l'ensemble des étapes successives suivantes : 30 - Collecte d'un échantillon sur la surface à tester, - Mise en contact de l'échantillon avec une composition gélifiée selon l'invention, 3047742 9 - Incubation de la composition gélifiée en contact avec l'échantillon au moins 3 heures, et - Observation de la couleur de la composition gélifiée. 5 La collecte de l'échantillon peut être effectuée par tout système de récupération de matière présente sur une surface tel qu'une éponge, une lingette, un filtre, une mousse, une gélose ou un écouvillon. De préférence, il 10 s'agira d'un écouvillon qui peut être par exemple en coton, en rayonne, en fibre de polyester ou en nylon floqué. La mise en contact de l'échantillon avec la composition gélifiée peut être effectuée par simple mise en contact du système de récupération de matière, après 15 collecte de l'échantillon par frottement sur la surface, avec la composition gélifiée. L'observation de la couleur pourra être effectuée avantageusement à l'oeil nu. Si un changement de couleur ou l'apparition d'une couleur est observée (par rapport à la 20 couleur (ou absence de couleur dans le cas du TTC ou de l'INT) initiale), cela signifie que des microorganismes viables sont présents sur la surface testée. Ce changement ou apparition de couleur se situera plus particulièrement au point de contact de l'échantillon avec la composition 25 gélifiée. De préférence, le procédé de détection de microorganismes viables sur une surface est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une fois l'ensemble des étapes 30 successives suivantes : - Collecte d'un échantillon avec un écouvillon sur la surface à tester, 3047742 10 - Mise en contact dans un tube de l'écouvillon avec une composition gélifiée selon l'invention, - Incubation de la composition gélifiée en contact avec l'échantillon au moins 3 heures, et 5 - Observation de la couleur de la composition gélifiée. Selon l'invention, l'écouvillon peut être tout écouvillon en coton, rayonne, fibre de polyester ou nylon 10 floqué. L'invention a également pour objet un procédé de détection de microorganismes viables dans un fluide caractérisé en ce qu'il comprend au moins une fois 15 l'ensemble des étapes successives suivantes : - Passage du fluide à tester dans un filtre, - Récupération du filtre et mise en contact dudit filtre avec une composition gélifiée selon l'invention, 20 - Incubation de la composition gélifiée en contact avec le filtre au moins 3 heures, et - Observation de la couleur de la composition gélifiée. 25 Selon l'invention, on entend par filtre toute membrane, papier, tissu destiné à filtrer un fluide. Ce filtre peut être mais n'est pas limité à un filtre en nylon, cellulose, polyéthersulfone, poly(fluorure de vinylidène), ou polytétrafluoroéthylène. 30 L'observation de la couleur pourra être effectuée comme indiqué précédemment dans le cadre d'un procédé de 3047742 11 détection de microorganismes viables sur une surface. Si un changement de couleur ou l'apparition d'une couleur est observée, cela signifie que des microorganismes viables sont présents dans le fluide. Ce changement ou apparition 5 de couleur se situera plus particulièrement au point de contact du filtre avec la composition gélifiée. Selon l'invention, les microorganismes détectés par ces procédés (sur une surface ou dans un fluide) peuvent 10 être mais ne sont pas limités à des souches de Bacillus subtilis, Escherichia coll, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Cryptococcus macerans, Gluconobacter oxydans, 15 Mycobacterium, Salmonella ou une combinaison de celles-ci. L'invention a également pour objet l'utilisation de la gomme gellane comme gélifiant d'une solution contenant au moins un sel de tétrazolium. 20 De préférence, la gomme gellane est utilisée comme gélifiant dans une composition selon l'invention dans laquelle le ou les sels de tétrazolium sont le MTT, le TTC, l'INT, le MTS, le WST-1, le WST-8, le XTT ou une 25 combinaison de ceux-ci, de préférence le MTT, le TTC, l'INT, le WST-8 ou une combinaison de ceux-ci. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition gélifiée selon l'invention dans un kit de 30 détection de viabilité cellulaire. Selon l'invention, on entend par kit de détection tout dispositif de prélèvement d'échantillon pouvant mettre en 3047742 12 contact l'échantillon et la composition gélifiée selon l'invention dans le but de détecter la présence ou l'absence de microorganismes viables dans l'échantillon. 5 Le kit de détection pourra ainsi comprendre : un récipient, de préférence un tube, contenant la composition gélifiée selon l'invention, et un dispositif de prélèvement d'échantillon, plus particulièrement sur une surface ou dans un fluide. 10 Le dispositif de prélèvement d'échantillon sur une surface pourra être tout système de récupération de matière présente sur une surface tel qu'une éponge, une lingette, un filtre, une mousse, une gélose ou un écouvillon. De 15 préférence, il s'agira d'un écouvillon qui peut être par exemple en coton, en rayonne, en fibre de polyester ou en nylon floqué. Le dispositif de prélèvement d'échantillon dans un 20 fluide sera en particulier un filtre qui peut être toute membrane, papier, tissu destiné à filtrer un fluide. Ce filtre peut être mais n'est pas limité à un filtre en nylon, cellulose, polyéthersulfone, poly(fluorure de vinylidène), ou polytétrafluoroéthylène. 25 La présente invention a également pour objet un tel kit de détection. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une 30 composition gélifiée selon l'invention en tant que contrôle de contamination. 3047742 13 L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition gélifiée selon l'invention pour la détection de la viabilité cellulaire. 5 Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une composition gélifiée pour la détection de la viabilité cellulaire et le contrôle de résistance à un ou plusieurs antibiotiques lorsque la composition gélifiée selon l'invention comprend en outre un ou 10 plusieurs antibiotiques et un ou plusieurs substrats colorimétriques d'enzymes intervenant dans la résistance audit ou auxdits antibiotiques. Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet 15 l'utilisation d'une composition gélifiée pour la détection de la viabilité cellulaire et de toxines lorsque la composition gélifiée comprend en outre au moins un substrat colorimétrique de toxines ayant une activité enzymatique. 20 Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une composition gélifiée pour la détection de la viabilité cellulaire et de la présence de microorganismes spécifiques lorsque la composition gélifiée comprend en outre au moins un autre réactif colorimétrique 25 spécifique de microorganismes. D'autres aspects, objets, avantages et caractéristiques de l'invention, seront présentés à la lecture de la description non restrictive qui suit et qui 30 décrit différents tests et des modes de réalisations préférés de l'invention donnés par le biais d'exemples. 3047742 14 EXEMPLES EXEMPLE 1 : Préparation des compositions et solutions de base utilisées dans les essais de compositions gélifiées à 5 base de sel de tétrazolium Un grand nombre de composés gélifiants ont été testés afin de pouvoir passer d'un test liquide faisant intervenir un sel de tétrazolium à un test gélifié. Chaque composition permettant de tester les gélifications comprend un tampon 10 (Tris-HC1 ou Citrate-Phosphate), un sel de tétrazolium (MTT, TTC ou INT) ainsi qu'un gélifiant. 1. Préparation du tampon Pour les différents tests, un tampon Tris-HC1 ou un 15 tampon Citrate-Phosphate est utilisé. Le tampon Tris-HC1 (tr) préparé est un tampon Tris-HC1 50mM pH7. Ce tampon est préparé en diluant au 1/20e une solution mère de Tris-HC1 1M (Sigma-Aldrich, solution de chlorhydrate) avec de l'eau déminéralisée stérile. 20 Le tampon Citrate-Phosphate (cp) préparé est un tampon Citrate-Phosphate pH7. Cette préparation est réalisée selon le protocole suivant : Dissoudre 14,195g de Na2HPO4 dans 500mL d'eau déminéralisée (solution B), 25 Dissoudre 1,92g d'acide citrique dans 100mL d'eau déminéralisée (solution A), Ajouter à la solution B de la solution A jusqu'à l'obtention d'un pH 7, et 3047742 15 Filtrer sur filtre stérile à membrane de polyéthersulfone 0,22pm (Thermo Scientific, Unités de filtration stériles avec membrane PES) le mélange des solutions A et B pour obtenir le tampon 5 Citrate-Phosphate. 2. Préparation de la solution mère de sel de tétrazolium Pour les différents tests, une solution mère de MTT, 10 de TTC ou d'INT sont utilisées. 0,0083g de MTT (Sigma-Aldrich référence M2128-1G) sont dissouts dans lOmL d'eau déminéralisée stérile. Cette solution est filtrée sur filtre stérile d'acétate de cellulose de 0,2pm et conservée à 4°C à l'abri de la 15 lumière. 0,0067g de TTC (Sigma-Aldrich référence T8877-5G) sont dissouts dans lOmL d'eau déminéralisée stérile. Cette solution est filtrée sur filtre stérile d'acétate de cellulose de 0,2pm et conservée à 4°C à l'abri de la 20 lumière. 0,0101g d'INT (Sigma-Aldrich référence I10406-1G) sont dissouts dans lOmL d'eau déminéralisée stérile. Cette solution est filtrée sur filtre stérile d'acétate de cellulose de 0,2pm et conservée à 4°C à l'abri de la 25 lumière. 3047742 16 3. Préparation de la composition de gélifiant. Pour préparer les gélifiants, trois protocoles différents sont utilisés et un seul sera sélectionné en fonction du gélifiant et de ses conditions d'utilisations : 5 - Dispersion à froid - Dispersion à chaud - Ajout de composé spécifique Les gélifiants pour lesquels le protocole de 10 dispersion à froid a été utilisé sont la gélatine issue de la peau de porc, le KAPPA carraghénane, la gomme arabique, la méthylcellulose et l'hydroxyéthylcellulose. La préparation des gélifiants par dispersion à froid est réalisée selon le protocole suivant : 15 - Dans un bécher de 250mL à 20°C et sous agitation magnétique, verser 100mL de tampon Tris-HC1 ou de tampon Citrate-Phosphate, - Verser le gélifiant en poudre dans le bécher contenant le tampon jusqu'à l'obtention d'un mélange homogène, 20 et - Chauffer le bécher jusqu'à la température optimale de solubilisation en laissant l'agitation magnétique jusqu'à l'obtention d'un gel. 25 Les gélifiants pour lesquels le protocole de dispersion à chaud a été utilisé sont l'agar agar, la pectine de peau de citron, la gomme xanthane, la gomme gellane et la gomme adragante. 3047742 17 La préparation des gélifiants par dispersion à chaud est réalisée selon le protocole suivant : - Dans un bécher de 250mL à température optimale de solubilisation et sous agitation magnétique, verser 5 100mL de tampon Tris-HC1 ou de tampon Citrate- Phosphate, - Verser le gélifiant en poudre dans le bécher contenant le tampon jusqu'à l'obtention d'un mélange homogène, et 10 - Garder le bécher à la température optimale de solubilisation en laissant l'agitation magnétique jusqu'à l'obtention d'un gel. Le gélifiant pour lequel le protocole de dispersion 15 avec ajout de composé spécifique est utilisé est l'alginate de sodium. La préparation du gélifiant avec ajout de composé spécifique est réalisée selon le protocole suivant : - Dans un bécher de 250mL à 20°C et sous agitation 20 magnétique, verser 50mL de tampon Tris-HC1 ou de tampon Citrate-Phosphate, - Ajouter dans le bécher contenant le tampon 50mL de lactate de calcium à 5g/L, - Verser le gélifiant en poudre dans le bécher jusqu'à 25 l'obtention d'un mélange homogène, et - Chauffer le bécher jusqu'à la température optimale de solubilisation en laissant l'agitation magnétique jusqu'à l'obtention un gel. 3047742 18 Pour plus de simplicité les masses de gélifiants et températures optimales de solubilisation des différents gélifiants ainsi que leur protocole de dispersion sont répertoriées dans le Tableau 1. Le tampon tr correspond au 5 tampon TRIS-HC1 et le tampon cp correspond au tampon Citrate-Phosphate. TABLEAU 1 : Gélifiant Concentration Protocole Température gélifiant de optimale (g/100mL) dispersion Gélatine issue de la peau de porc 2% Dispersion 55-65°C à froid KAPPA Carraghénane 0,5% Dispersion 60-70°C à froid Gomme Adragante 2% Dispersion 60-70°C à chaud Gomme Arabique 2% Dispersion 60-70°C à froid Methylcellulose 3% Dispersion 60-70°C à froid Hydroxyéthylcellulose 3% Dispersion 60-70°C à froid Pectine de peau de citron 2% Dispersion 55-65°C à chaud Gomme Xanthane 2% Dispersion 60-70°C à chaud 3047742 19 Alginate de Sodium 2% Ajout de 60-70°C composé spécifique (lactacte de calcium) Agar agar 2% Dispersion 60-70°C à chaud Gomme gellane 1,25% Dispersion 65-75°C à chaud (cp)* ou 55-65°C (tr)** * température optimale dans le cas de l'utilisation du tampon Citrate-Phosphate (cp) * * température optimale dans le cas de l'utilisation du tampon TRIS-HC1 (tr) 5 EXEMPLE 2 : Essais de compositions gélifiées à base de sel de tétrazolium 1. Variation du gélifiant. Le but de la gélification est d'obtenir un gel inerte 10 par rapport au sel de tétrazolium. Plus précisément, le gélifiant ne doit pas activer spontanément la coloration du sel de tétrazolium et ne doit pas empêcher l'observation de la coloration tout en donnant un gel non friable ou cassant. 15 Pour tester les compositions gélifiées de sel de tétrazolium, un mélange avec des proportions de 5 volumes de mélange tampon (cp)/gélifiant pour 1 volume de solution 3047742 20 mère de sel de tétrazolium est réalisé, les mélanges tampon (cp)/gélifiant et les solutions mères de sel de tétrazolium ayant été préparés selon les protocoles de l'exemple 1. Afin d'être certain que le gélifiant n'active pas le 5 ou les sels de tétrazolium utilisés, un suivi de la coloration des différentes compositions a été réalisé sur plusieurs heures. Au préalable, les compositions gélifiées sont passées à l'autoclave à 110°C pendant 45 minutes pour être certain de leur stérilité. 10 Le Tableau 2 présente les résultats des compositions gélifiées avec différents gélifiants et un tampon TRIS-HC1 (tr). Chaque composition a été évaluée selon trois critères : si la composition s'est bien gélifiée avec obtention d'un gel non friable ou cassant (gélification 15 faible, moyenne ou forte), si le sel de tétrazolium (MTT, INT ou TTC) s'est activé spontanément (activation du sel) et si la composition a une coloration ou une opacité empêchant de voir correctement le signal lié à la coloration du sel de tétrazolium (lisibilité du signal). 20 Les mêmes résultats ont été obtenus quel que soit le sel de tétrazolium testé (MTT, INT ou TTC). 3047742 21 TABLEAU 2 : Gélifiant Gélification Activation Lisibilité du sel du signal Gélatine issue de la peau de porc Moyenne Non Signal lisible KAPPA Carraghénane Moyenne Non Signal lisible Gomme Adragante Moyenne Non Signal illisible Gomme Arabique (cp) Faible Non Signal illisible Méthylcellulose Faible Non Signal lisible Hydroxyéthylcellulose Faible Oui Signal illisible Pectine de peau de citron Faible Oui Signal illisible Gomme Xanthane Forte Non Signal illisible Alginate de Sodium Faible Non Signal lisible Agar agar Forte Oui Signal illisible Gomme gellane Forte Non Signal lisible 3047742 22 Les résultats du Tableau 2 montrent que la gélatine de peau de porc, le KAPPA carraghénane, la gomme adragante, la gomme arabique, la méthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose, la pectine de peau de citron et 5 l'alginate de sodium ne permettent pas d'obtenir une gélification correcte de la composition. Ces composés ne sont donc pas utilisables en tant que gélifiants de la composition selon l'invention. Seul l'agar agar, la gomme xanthane et la gomme gellane permettent une bonne 10 gélification de la composition. Néanmoins, l'agar agar active spontanément la coloration du sel de tétrazolium donc l'agar agar n'est pas non plus utilisable en tant que gélifiant. La gomme xanthane ne permet pas une bonne lecture du 15 signal donc la gomme xanthane n'est pas non plus utilisable en tant que gélifiant. De tous les composés testés seule la gomme gellane permet d'avoir une composition gélifiée ayant de bonnes propriétés de gélification, n'activant pas spontanément la 20 coloration due au sel de tétrazolium et dont le signal reste visible tout en donnant un gel compact. 2. Variation du tampon. Des compositions gélifiées de sel de tétrazolium utilisant la gomme de gellane comme gélifiant ont également 25 été réalisées avec différents systèmes tampon. Pour cela un mélange avec des proportions de 5 volumes de mélange tampon/ gomme gellane pour 1 volume de solution mère de sel de tétrazolium est réalisé, le mélange tampon/gomme gellane et les solutions mères de sel de tétrazolium ayant été 30 préparés selon les protocoles de l'exemple 1. 3047742 23 Le tableau 3 présente les résultats obtenus. TABLEAU 3 : Gélifiant Tampon Gélification Activation Lisibilité du sel du signal Gomme gellane tr Forte Non Signal lisible Gomme gellane cp Forte Non Signal lisible 5 Divers tampons (tr ou cp) peuvent ainsi être utilisés. EXEMPLE 3 : Préparation d'une composition comprenant au moins deux sels de tétrazolium Pour les différentes préparations, des solutions mères 10 de MTT, de TTC et/ou d'INT sont utilisées et seront mélangées entre elles en fonction de la composition de sels de tétrazolium désirée. Pour une composition comprenant deux sels de tétrazolium, le protocole de préparation est le suivant : 15 - Préparer un tampon de Tris-HC1 ou de Citrate-Phosphate selon le protocole de l'exemple 1, - Préparer le gélifiant à partir de gomme gellane selon le protocole de l'exemple 3, - Dissoudre chaque sel de tétrazolium dans 5mL d'eau 20 déminéralisée stérile, 3047742 24 - Filtrer chaque solution de sel de tétrazolium sur filtre stérile d'acétate de cellulose de 0,2pm et conserver à 4°C à l'abri de la lumière, - Mélanger les solutions de sels désirées pour avoir un 5 volume final de lOmL, et - Mélanger et homogénéiser 5mL de la solution contenant les deux sels de tétrazolium à 20mL de solution contenant le mélange tampon/gélifiant. 10 Pour une composition comprenant les trois sels de tétrazolium, le protocole de préparation est le suivant : - Préparer un tampon de Tris-HC1 ou de Citrate-Phosphate selon le protocole de l'exemple 1, - Préparer le gélifiant à partir de gomme gellane selon 15 le protocole présenté dans l'exemple 3, - Dissoudre chaque sel de tétrazolium dans 5mL d'eau déminéralisé stérile, - Filtrer chaque solution de sel de tétrazolium sur filtre stérile d'acétate de cellulose de 0,2pm et 20 conserver à 4°C à l'abri de la lumière, - Mélanger et homogénéiser les solutions de sels désirées pour avoir un volume final de l5mL, et - Mélanger 5mL de la solution contenant les trois sels de tétrazolium à 20mL de solution contenant le mélange 25 tampon/gélifiant. Les compositions des solutions contenant deux ou trois sels de tétrazolium différents, la masse de sels de tétrazolium à peser et les volumes finaux des solutions sont présentés dans le Tableau 4. 30 3047742 25 TABLEAU 4 : Résumé des compositions contenant deux ou trois sels de tétrazolium. Compositions Masse de Masse Masse de Volume MTT d'INT TTC final de la composition MTT/INT 0,0041g 0,0050g / 10mL MTT/TTC 0,0041g / 0,0034g 10mL INT/TTC / 0,0050g 0,0034g 10mL MTT/TTC/INT 0,0014g 0,0034g 0,0022g 10mL MTT/TTC/INT 0,0041g 0,0050g 0,0034g 15mL EXEMPLE 4 : Préparation d'une composition gélifiée pour un 5 kit de détection à base de MTT, TTC ou INT 1. Préparation du gélifiant. 0,3125g de gomme gellane (Sigma-Aldrich référence P8169-100G) sont pesés et mélangés à 20mL de tampon TrisHC1 ou de tampon Citrate-Phosphate. Le mélange est ensuite 10 autoclavé 45 minutes à 110°C pour la dissolution de la gomme gellane et sa stérilisation. 2. Préparation des tubes de test. - Ajouter 5mL de la solution mère de sel de tétrazolium selon le protocole décrit à l'exemple 1 au mélange 15 tampon/gélifiant sorti d'autoclave, afin d'obtenir un volume final de 25mL, - Homogénéiser le mélange et aliquoter en tubes stériles de 5mL, et - Laisser refroidir pour que le mélange se solidifie. 3047742 26 EXEMPLE 5 : Préparation d'une composition gélifiée pour un kit de détection à base de WST-8. 1. Préparation du gélifiant. 0.3g de gomme gellane (Sigma-Aldrich référence P81695 100G) sont pesés et mélangés à l5mL de tampon Tris-HC1. Le mélange est ensuite autoclavé 45 minutes à 110°C pour la dissolution de la gomme gellane et sa stérilisation. 2. Préparation des tubes de test. Préparation d'une solution WST-8 : 0.015g de WST-8 10 (Interchim) sont dissouts dans 5mL de Tampon Tris-HC1 50mM pH7. Cette solution est filtrée sur filtre stérile d'acétate de cellulose de 0,2pm et conservée à 4°C à l'abri de la lumière. Préparation d'une solution de mPMS : 0.00067g de mPMS (115 méthoxy-5-méthylphénazinium méthyl sulfate - SIGMA) sont dissouts dans 2mL de Tris-HC1 50mM pH7. Préparation des tubes tests : préparé selon le protocole - Ajouter à 12.5mL de gélifiant du point 1 : 20 - 5mL de solution WST-8, - 1.5mL de solution de mPMS, - 6mL de tampon Tris-HC1 50mM pH7, volume final de 25mL, - Homogénéiser le mélange et aliquoter 25 par fractions de 2.5mL, et - Laisser refroidir pour que le mélange afin d'obtenir un en tubes stériles se solidifie. REVENDICATIONS1. Composition gélifiée comprenant au moins un sel de tétrazolium, un tampon et de la gomme gellane. 2. Composition gélifiée selon la revendication 1 dans laquelle le tampon est un tampon citrate-phosphate ou un tampon Tris-HC1. 3. Composition gélifiée selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle le ou les sels de tétrazolium sont du MTT, de l'INT, du TTC, du MTS, du WST-1, du WST-8, du XTT ou un mélange de ceux-ci ; de préférence du MTT, de l'INT, du TTC, du WST-8 ou un mélange de ceux-ci. 4. Composition gélifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 comprenant en outre un antibiotique, un substrat colorimétrique d'enzyme de résistance à un antibiotique, un autre réactif colorimétrique spécifique de microorganismes, un substrat colorimétrique de toxines ayant une activité enzymatique ou une combinaison de ceux-ci. 5. Procédé de détection de microorganismes viables sur une surface comprenant au moins une fois l'ensemble des étapes successives suivantes : - Collecte d'un échantillon sur la surface à tester, - Mise en contact de l'échantillon avec une composition gélifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, - Incubation de la composition gélifiée en contact avec l'échantillon au moins 3 heures, et 3047742 28 - Observation de la couleur de la composition gélifiée. 6. Procédé de détection selon la revendication 5, dans 5 lequel : - la collecte de l'échantillon sur la surface à tester est réalisée avec un écouvillon, et - la mise en contact de l'échantillon avec la composition gélifiée selon l'une quelconque des 10 revendications 1 à 4 est réalisée dans un tube. 7. Procédé de détection de microorganismes viables dans un fluide comprenant au moins une fois l'ensemble des étapes successives suivantes : 15 - Passage du fluide à tester dans un filtre, - Récupération du filtre et mise en contact dudit filtre avec une composition gélifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, - Incubation de la composition gélifiée en contact 20 avec le filtre au moins 3 heures, et - Observation de la couleur de la composition gélifiée. 8. Procédé de détection selon l'une quelconque des 25 revendications 5 à 7 dans lequel les microorganismes sont des souches de Bacillus subtilis, Escherichia coll, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, 30 Cryptococcus macerans, Gluconobacter oxydans, Mycobacterium, Salmonella ou une combinaison de celles-ci. 3047742 29 9. Utilisation d'une composition gélifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la détection de viabilité cellulaire. 5 10.Utilisation d'une composition gélifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 en tant que contrôle de contamination. 11.Utilisation d'une composition gélifiée selon la 10 revendication 4 comprenant un ou plusieurs antibiotiques et un ou plusieurs substrats colorimétriques d'enzymes de résistance audit ou auxdits antibiotiques, pour la détection de la viabilité cellulaire et le contrôle de résistance à un 15 ou plusieurs antibiotiques. 12.Utilisation d'une composition gélifiée selon la revendication 4 comprenant un substrat colorimétrique de toxines ayant une activité enzymatique, pour la 20 détection de la viabilité cellulaire et la détection de toxines. 13.Utilisation d'une composition gélifiée selon la revendication 4 comprenant un autre réactif 25 colorimétrique spécifique de microorganismes, pour la détection de la viabilité cellulaire et de la présence de microorganismes spécifiques. 14.Utilisation d'une composition gélifiée selon l'une 30 quelconque des revendications 1 à 4 dans un kit de détection de viabilité cellulaire. 3047742 30 15.Kit de détection de viabilité cellulaire comprenant : un récipient contenant une composition gélifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, et un dispositif de prélèvement d'échantillon.