Brevet FR3037806A1 — publié le 20161230

PP001297FR 1 La présente invention est relative à un procédé de préparation de matériaux macroporeux monolithiques biocompatibles à macroporosité contrôlée à basse température permettant en particulier d'accéder à des monolithes à base d'un matériau biocéramique silice/hydroxyapatite ayant une macroporosité ouverte et 5 contrôlée avec une taille de macropores homogène (monodispersité) allant de la dizaine de microns à quelques centaines de microns, ainsi qu'à l'utilisation de ces matériaux, notamment pour le comblement osseux, comme support solide pour la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène, ou bien encore comme matériau fonctionnel pour des applications dans le domaine de 10 l'environnement (piégeage de métaux lourds par exemple). Les matériaux se présentant sous la forme de monolithes macroporeux à porosité ouverte, en fonction de leur nature chimique, constituent des matériaux de choix pour de nombreuses applications telles que la chimie séparative comme par exemple la chromatographie, la filtration, l'adsorption, la catalyse en phase 15 hétérogène, la fabrication d'électrodes et le stockage de l'énergie en raison de leur grande surface spécifique, de leur grand volume de pores et de leurs excellentes propriétés mécaniques. Au sens de la présente invention, une porosité ouverte est une porosité à laquelle on accède depuis l'extérieur du matériau et qui participe au transport de 20 matière. Ces matériaux comprennent une surface spécifique élevée et une structure hiérarchisée. L'os est un matériau hybride constitué principalement par des cellules, du collagène de type I qui constitue une trame organique protéique et une phase minérale constituée de cristaux de phosphates de calcium de structure apatitique 25 (ou apatites) de taille nanométrique. Cette association organique/minéral à grande échelle en trois dimensions confère à la fois de l'élasticité et de la dureté au tissu osseux lui permettant de résister aux forces qui lui sont appliquées. L'os est donc dur, dense et très résistant. En pratique, peut être considéré comme substitut osseux, tout biomatériau 30 d'origine humaine, animale, végétale ou synthétique, destiné à l'implantation chez l'homme, dans la perspective d'une reconstitution du stock osseux, par le renforcement d'une structure osseuse ou le comblement d'une perte de substance osseuse d'origine traumatique ou orthopédique. La présente invention s'intéresse en particulier aux matériaux d'origine 35 synthétique. Plusieurs classes de matériaux synthétiques (désignés par "matériaux d'implants") sont proposés dans l'art antérieur. Les matériaux d'implants sont 3037806 PP001297FR 2 généralement bio inertes, c'est-à-dire simplement tolérés par l'organisme, ou biocompatibles, c'est-à-dire qu'ils s'intègrent parfaitement à l'organisme hôte. Ces matériaux synthétiques doivent répondre à un cahier des charges bien spécifique. Le premier critère obligatoire est celui de la biocompatibilité et de la bonne tolérance par l'organisme du substitut et de ses produits de dégradation. Ces matériaux doivent également présenter une macroporosité favorable à la réhabilitation et à l'ostéoconduction. En particulier, la taille des pores du substitut osseux conditionne sa colonisation par des cellules osseuses : les micropores (taille inférieure à 100 !am) sont propices à la diffusion des ions et des liquides nourriciers et les macropores (tailles de l'ordre de 100-600 !am) sont propices à la colonisation cellulaire osseuse et donc à l'ostéoconduction. Les substituts osseux peuvent également être biodégradables avec une résorption lente et progressive. D'autres propriétés peuvent être souhaitées telles que bioactivité, induction osseuse, qualité mécanique (résistance mécanique), etc... En particulier, la bioactivité est définie comme la propriété de permettre des réactions chimiques spécifiques, à l'interface implant - tissu receveur. Elle dépend directement des propriétés chimiques et physico-chimiques du matériau, et s'oppose à la bioinertie (matériaux biocompatibles mais inertes). Dans le cadre des substituts osseux, le but de la bioactivité est la néoformation osseuse pour aboutir à une véritable liaison chimique avec l'os. Les différents substituts osseux d'origine synthétique actuellement disponibles sur le marché satisfont plus ou moins complètement aux critères souhaités. Parmi ces substituts osseux, on peut en particulier mentionner les biocéramiques poreuses à base de phosphate de calcium qui ont une composition chimique similaire à la phase minérale de l'os, et en particulier les biocéramiques d'hydroxyapatite (HAp) obtenues par des procédés classiques de frittage de poudres à hautes températures, généralement entre 1100 et 1300°C (Dj. Veljovic et al., Ceramics International, 2011, 37(2), 471-479) ou par des procédés haute température à partir d'émulsions de Pickering. Notamment, Fujii S. et al. (Journal of Colloid and Interface Science, 2007, 315(1), 287-296) ont décrit un procédé de préparation de biocéramiques poreuses d'HAp consistant, dans une première étape à préparer une émulsion huile-dans-eau ayant un pH compris entre 6,1 et 7,7, en utilisant le myristate de méthyle comme phase huileuse et des nanoparticules d'HAp comme émulsifiant particulaire, puis dans une deuxième étape, à effectuer le frittage de l'émulsion ainsi obtenue à une température de l'ordre de 800°C pour obtenir une biocéramique poreuse à base d'hydroxyapatite. Les matériaux ainsi 3037806 PP001297FR 3 obtenus ne présentent cependant pas toujours une résistance mécanique suffisante et n'ont pas les propriétés physico-chimiques et biologiques de biocéramiques obtenues à basse température. On observe en particulier une diminution de la biorésorbabilité et la bioactivité. De plus, l'utilisation de hautes températures de 5 frittage n'est pas compatible avec la fonctionnalisation des matériaux par des biomolécules (protéine, peptide, facteur de croissance...) dont le rôle sur l'adhésion et/ou la prolifération cellulaire est connu. On peut également mentionner les matériaux composites macroporeux préparés par évaporation de solvant à partir d'émulsions de Pickering. Par exemple, 10 Yang H et al. (Macromolecular Materials and Engineering, 2014, 299, 1070-1080) décrivent un procédé de préparation de tels matériaux consistant tout d'abord à préparer une émulsion huile dans eau dans laquelle la phase huileuse dispersée est constituée de dichlorométhane, tandis que la phase continue est une solution aqueuse d'acide polylactique (PLLA) dans l'eau, ladite émulsion étant stabilisée 15 par des particules d'HAp fonctionnalisées par de l'acide polylactique, lesdites particules étant adsorbées à l'interface huile/eau, puis à évaporer l'émulsion pour obtenir un matériau macroporeux constitué d'une matrice composite HAp/PLLA comportant des macropores interconnectés. La taille des macropores dans ces matériaux est de l'ordre de la centaine de microns. Ces matériaux présentent par 20 ailleurs un module de Young pouvant varier entre 0,16 MPa pour les plus faibles concentrations en particules d'HAp (5,1 % en masse) à 8,40 MPa pour les plus hautes concentrations en particules d'HAp (21,7 % en masse). Cependant, ce procédé ne donne pas non plus entière satisfaction dans la mesure où leur résistance mécanique n'est pas suffisante. De plus, les particules d'hydroxyapatite utilisées 25 sont des particules modifiées par du PLLA, ce qui conduit à un matériau hybride organique/inorganique aux applications limitées. En effet la conception d'un biomatériau ostéoinducteur passe par une fonctionnalisation de la surface des cristaux d' apatites par adsorption ou greffage de la biomolécule (protéine, peptide, facteur de croissance...) sur le matériau minéral. 30 Dans un domaine technique totalement différent, qui est celui de la chimie séparative et de la filtration, ou de la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène, il a par ailleurs déjà été proposé, notamment dans la demande de brevet FR 2 965 807, un procédé de préparation de matériaux monolithiques inorganiques macroporeux permettant d'accéder à des monolithes de silice ayant 35 une macroporosité ouverte et contrôlée avec une taille de macropores allant du micron à quelques centaines de microns. Ces matériaux sont préparés selon un procédé comprenant au moins une étape de minéralisation d'une émulsion huile- 3037806 PP001297FR 4 dans-eau formée de gouttelettes d'une phase huileuse dispersées dans une phase aqueuse continue et dans laquelle des particules solides colloïdales sont présentes à l'interface formée entre la phase aqueuse continue et les gouttelettes de phase huileuse dispersées. Les particules solides colloïdales peuvent être minérales ou 5 organiques. Selon cette demande antérieure, les particules solides colloïdales sont de préférence des particules minérales choisies dans le groupe des oxydes, hydroxydes et sulfates de métaux. A titre tout à fait préférentiel, ce sont des particules de silice. Les matériaux obtenus selon ce procédé ne peuvent cependant pas être utilisés à titre de substitut osseux dans la mesure où ils ne renferment dans 10 leur structure aucun matériau biocompatible proche du minéral osseux. Il existe donc un besoin pour un matériau monolithique poreux répondant à l'ensemble du cahier des charges relatifs aux matériaux utilisables à titre de substituts osseux, c'est-à-dire qui présentent une macroporosité suffisante à la colonisation des macropores par le tissu osseux, et qui soit biocompatible, 15 résorbable de façon lente et continue dans le temps, ainsi que pour un procédé de préparation permettant d'accéder de façon simple et à basses températures à un tel matériau. La présente invention a donc pour premier objet un procédé de préparation d'un matériau poreux minéral biocompatible se présentant sous forme d'un 20 monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice comprenant des macropores interconnectés ayant une dimension moyenne dA allant de 100 ium à 500 ium et des micropores de dimension moyenne dI de 0,7 à 2 nm, et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est recouverte de particules d'hydroxyapatite, ledit procédé comprenant au moins une étape de minéralisation d'une émulsion 25 huile-dans-eau formée de gouttelettes d'une phase huileuse dispersées dans une phase aqueuse continue et dans laquelle des particules solides colloïdales sont présentes à l'interface formée entre la phase aqueuse continue et les gouttelettes de phase huileuse dispersées, ledit procédé étant caractérisé et en ce que : - la fraction volumique de la phase huileuse est supérieure ou égale à 64 %, 30 - les particules solides colloïdales sont des particules d'hydroxyapatite, - la quantité de particules d'hydroxyapatite varie de 0,05 à 50 mg de particules/mL de phase huileuse, et - ladite étape de minéralisation est réalisée sans agitation, à un pH compris entre 6 et 9, en présence d'au moins un précurseur d'oxyde de silice en une quantité 35 supérieure ou égale à 10% en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. 3037806 PP001297FR 5 Selon l'invention, le terme « biocompatible » utilisé dans la présente description pour qualifier un matériau ou une substance, telle que par exemple une huile, signifie que ledit matériau ou ladite substance n'interfère pas et ne dégrade pas le milieu biologique dans lequel il/elle est utilisé(e). 5 Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la quantité de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite au sein de l'émulsion varie de 1 mg de particules/mL de phase huileuse à 40 mg de particules/mL de phase huileuse, et encore plus préférentiellement de 5 mg/mL à 20 mg/mL de phase huileuse. La mise en oeuvre de ce procédé se fait à basse température (c'est-à-dire à 10 température ambiante, en général entre 20 et 25°C) et permet, de façon surprenante, d'accéder à des monolithes de silice comportant un réseau macroporeux dans lequel les pores sont interconnectés (porosité ouverte) et ont une taille calibrée et homogène pouvant varier entre 100 et 500 ium et dont la biocompatibilité est suffisante pour permettre son utilisation, notamment à titre de substitut osseux. Il 15 est en effet possible, grâce à la présence des particules solides colloïdales d'hydroxyapatite à l'interface de la phase huileuse et de la phase aqueuse, de stabiliser l'émulsion et de permettre une minéralisation homogène de la phase aqueuse conduisant de façon simple et reproductible à un monolithe de silice à macroporosité ouverte dans lequel la taille des macropores découle directement la 20 quantité de particules adsorbées à l'interface huile/eau (procédé de coalescence limitée) et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est tapissée par des particules d'hydroxyapatite dont la présence favorise la colonisation par les cellules du tissu osseux. De plus, la présence des particules solides colloïdales d'hydroxyapatite dans les proportions indiquées ci-dessus, favorise la croissance 25 hétérogène de la silice à l'interface formée entre la phase aqueuse continue et les gouttelettes de phase huileuse lors de l'étape de minéralisation conduisant à un matériau cohésif autour des gouttes d'huile alors que la liaison P-O-Si se fait en principe plus difficilement que la liaison Si-O-Si. Enfin les particules d'hydroxyapatite conserve leur caractère biocompatible bien qu'elles soient 30 utilisées à une taille nanométrique ce qui n'est pas le cas pour tout type de matériau, comme par exemple le carbone qui devient cytotoxique lorsqu'il est utilisé sous forme de nanotubes. Au sens de la présente invention, on entend par monolithe, un objet solide ayant une dimension moyenne d'au moins 1 mm. Bien entendu dans le cadre de 35 l'utilisation du matériau obtenu selon le procédé de l'invention, c'est-à dire à titre de substitut osseux, lesdits monolithes peuvent avoir des tailles et formes variées en fonction du volume de tissu osseux à remplacer. 3037806 PP001297FR 6 Selon l'invention, les micropores sont présents dans l'épaisseur des parois des macropores, les rendant alors microporeuses. Selon une forme de réalisation particulière et préférée du procédé conforme à l'invention, le procédé comprend, dans cet ordre, les étapes suivantes : 5 i) la dispersion de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite dans une phase aqueuse ayant un pH allant de 6 à 9 environ pour obtenir une dispersion aqueuse de particules d'hydroxyapatite ; ii) la préparation d'une solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice, le pH de ladite solution étant de 2 à 5 environ ; 10 iii) le maintien de la solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice sous agitation pendant une durée allant de 5 minutes à 10 heures environ pour obtenir une solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice hydrolysé ; iv) l'ajout, à ladite dispersion aqueuse obtenue ci-dessus à l'étape i), de la phase huileuse, sous agitation mécanique jusqu'à obtention d'une émulsion huile-15 dans-eau, v) l'ajout, à ladite émulsion obtenue ci-dessus à l'étape iv), de la solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice hydrolysé obtenue ci-dessus à l'étape iii) pour obtenir une émulsion huile-dans-eau stabilisée par des particules d'hydroxyapatite et dans laquelle la phase aqueuse comprend ledit précurseur de 20 silice hydrolysé ; vi) la mise au repos de l'émulsion résultant de l'étape v) jusqu'à obtention d'un matériau solide, puis vii) l'élimination de la phase huileuse présente dans le matériau solide obtenu ci-dessus à l'étape vi) pour obtenir le matériau attendu sous la forme d'un 25 monolithe de silice macroporeux dans lequel la surface des macropores est tapissée de particules d'hydroxyapatite. Selon cette forme de réalisation particulière du procédé de l'invention, l'étape iii) provoque l'hydrolyse du précurseur d'oxyde de silice, l'étape v) conduit à la formation de l'émulsion huile-dans-eau dans laquelle les particules solides 30 colloïdales d'hydroxyapatite s'adsorbent à l'interface eau/huile, tandis que l'étape vi) conduit à la minéralisation de l'émulsion, et donc à l'obtention d'un matériau solide macroporeux, par condensation des précurseurs d'oxyde de silice hydrolysés. La phase huileuse de l'émulsion est de préférence constituée par une ou plusieurs huiles liquides à température ambiante, pouvant notamment être choisies 3037806 PP001297FR 7 parmi les esters d'acides gras, les huiles végétales, les huiles essentielles ou toute huile que l'on peut dissoudre avec des solvants organiques volatils tels que le tetrahydrofurane (THF), l'acétone ou l'éthanol. De préférence pour des applications biomédicales, les huiles liquides sont choisies parmi les huiles biocompatibles. 5 A titre d'exemple d'esters d'acides gras, on peut en particulier citer les esters d'acides gras en C8/Cio tels que l'huile de glycérine (ou tricapryline), les triglycérides d'acide caprique et d'acide caprylique, les triglycérides d'acide caprique, d' acide caprylique et d'acide linoléique, les esters de propylène glycol dicaprilate/dicaprate, les esters de butylène glycol dicaprilate/dicaprate, les 10 monoglycérides diacétylés, le décyloléate, etc... Parmi les esters d'acides gras, on préfère tout particulièrement les triglycérides à chaine courte pour éviter toute cristallisation de l'huile à température ambiante, tels que le produit vendu sous la dénomination commerciale Stelliesters MCT 55/45 par la société Stéarine Dubois. 15 La quantité de phase huileuse présente au sein de l'émulsion peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir pour le monolithe de silice, étant entendu que plus la fraction volumique huile/eau sera élevée, plus le diamètre des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion sera faible et plus le diamètre des macropores sera faible également. 20 Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la fraction volumique de la phase huileuse de l'émulsion varie de 64 à 90 %, et encore plus préférentiellement de 70 % à 82 %. Ces quantités de phase huileuse permettent d'obtenir un monolithe de silice macroporeux dans lequel les pores sont interconnectés. 25 Pour être colloïdales, les particules solides d'hydroxyapatite présentent généralement une taille inférieure à quelques micromètres. Ainsi les particules d'hydroxyapatite présentent généralement une taille moyenne comprise entre 5 et 5000 nm inclusivement, et de préférence entre 5 et 500 nm inclusivement. Elles peuvent être de forme sphérique ou non, par exemple sous la forme d'aiguilles. 30 Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les particules d'hydroxyapatite sont de forme sphérique. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les particules solides colloïdales d'hydroxyapatite sont choisies parmi les nanoparticules vendues sous les dénominations Hydroxyapatite par la société Sigma Aldrich (CAS N° 1216735 74-7), Hydroxyapatite Nanopowder par la société MK Nano. Les particules 3037806 PP001297FR 8 vendues par la société MK Nano sont des particules en forme d'aiguilles dont la largeur est d'environ 20 nm et de longueur environ 60 nm. Les particules solides colloïdales d'hydroxyapatite peuvent également être obtenues par une méthode classique de synthèse par double décomposition 5 consistant à mélanger une solution de nitrate de calcium et une solution de phosphate de diammonium à pH basique selon la réaction chimique suivante : 10 Ca(NO3)2 + 6 (NH4)2HPO4 + 8 NH4OH Calo(PO4)6(OH)2 + 20 NH4NO3 + 6 H2O Selon cette réaction, un précipité blanc se forme immédiatement après mélange des deux solutions et sédimente. Le milieu réactionnel est laissé à mâturer 10 pendant environ 24 heures, puis le précipité est filtré, lavé et l'eau et lyophilisé. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, les particules solides colloïdales d'hydroxyapatite utilisées selon le procédé sont des particules d'hydroxyapatite synthétisées par double décomposition par mélange d'une solution de nitrate de calcium et d'une solution de phosphate de 15 diammonium à pH basique. La quantité de particules d'hydroxyapatite (à quantité d'huile fixée) présente au sein de l'émulsion peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir pour le monolithe de silice, étant entendu que plus la quantité de particules sera élevée, plus le diamètre des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion sera faible et plus le diamètre des 20 macropores sera faible également. Avantageusement, la quantité de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite présentes dans la phase aqueuse continue varie en fonction de la taille moyenne en volume souhaitée des gouttelettes de la phase huileuse dans l'émulsion et par voie de conséquence, de la taille souhaitée pour les macropores 25 du matériau. Le ou les précurseur(s) d'oxyde de silice sont de préférence choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane (TMOS), le tetraéthoxyorthosilane (TEOS), le diméthyldiéthoxysilane (DMDES) et les mélanges du DMDES avec le TEOS ou le TMOS. 30 Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, le précurseur de silice est le TEOS. La concentration en précurseur(s) d'oxyde de silice au sein de la phase aqueuse de l'émulsion varie de préférence de 10 à 40 % environ en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. 3037806 PP001297FR 9 Egalement selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la durée de l'étape iii) varie de 3 à 5 heures environ. L'agitation mécanique réalisée lors l'étape iv) peut notamment être réalisée dans un dispositif destiné à émulsionner tel que par exemple dans des dispositifs 5 vendus sous les dénominations commerciales Ultra-Turrax® ou Rayneri. L'étape vi) (étape de minéralisation) est effectuée avantageusement à une température proche de la température ambiante. La durée de cette étape peut varier de quelques heures (2 à 3 heures) à quelques semaines (2 à 3 semaines) en fonction du pH du milieu réactionnel. 10 Le lavage du matériau lors de l'étape vii) permet d'éliminer les résidus organiques provenant de la phase huileuse et se trouvant essentiellement dans les macropores. Ce lavage peut être réalisé à l'aide d'un solvant organique volatil tel que l'acétone, le tetrahydrofurane (THF) ou leurs mélanges. A l'issue de l'étape vii), le matériau obtenu est de préférence séché à une 15 température comprise entre 15 et 40°C, pendant 10 à 20 jours. Le séchage du matériau peut par exemple être effectué dans un dessiccateur à une température de 25°C environ pendant 10 jours. Le monolithe de silice obtenu par la mise en oeuvre du procédé tel que défini selon le premier objet de l'invention, est nouveau en soi et constitue à ce titre le 20 deuxième objet de l'invention. L'invention a donc également pour objet le matériau poreux minéral biocompatible obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, ledit matériau étant caractérisé en qu'il se présente sous forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice comprenant des macropores 25 interconnectés ayant une dimension moyenne dA allant de 100 ium à 500 ium et des micropores de dimension moyenne dI de 0,7 à 2 nm, et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est recouverte par des particules d'hydroxyapatite. Dans ce matériau, les parois des macropores ont généralement une épaisseur 30 allant de 0,1 à 10 ium environ, et de préférence de 0,5 à 1 ium environ. Selon l'invention, les micropores sont présents dans l'épaisseur des parois des macropores, les rendant alors microporeuses. La surface spécifique du matériau conforme à l'invention varie généralement de 100 à 400 m2/g environ, préférentiellement de 150 à 300 m2/g environ. 3037806 PP001297FR 10 Comme indiqué précédemment, la nature même du matériau (silice), et la présence des particules d'hydroxyapatite à la surface des macropores du matériau conforme à l'invention permet de favoriser la colonisation des macropores par les tissus osseux, ce qui rend son utilisation à titre de substitut osseux particulièrement 5 avantageuse. Par conséquent, le troisième objet de l'invention est le matériau tel qu'obtenu par le procédé tel que défini selon le premier objet de l'invention ou tel que défini dans le second objet de l'invention, pour une utilisation à titre de substitut osseux, c'est-à-dire comme matériau de comblement osseux. 10 La présente invention est illustrée par les exemples de réalisation suivants, auxquels elle n'est cependant pas limitée. EXEMPLES Les matières premières utilisées dans les exemples qui suivent sont listées ci-après : 15 - Tetraéthoxyorthosilane à 98 % (TEOS) : société Aldrich ; - Huile biocompatible : ester d'acide caprylique et de triglycérides capryliques, vendue sous la dénomination commerciale Stelliesters MCT 55/45° par la société Stéarinerie Dubois ; - Particules sphériques d'hydroxyapatite de diamètre 50 à 200 nm vendues 20 sous la dénomination commerciale Hydroxyapatite par la société Sigma Aldrich ; - Tetrahydrofurane ; - NaC1 ; Acide chlorhydrique ; ammoniaque (Sigma Aldrich) - phosphate de diammonium (Sigma Aldrich) ; - nitrate de calcium (Sigma Aldrich) 25 - Eau déminéralisée. Ces matières premières ont été utilisées telles que reçues des fabricants, sans purification supplémentaire. Dans les exemples qui suivent, chacune des émulsions préparées avait un volume total de 20 mL, la phase aqueuse de l'émulsion étant constituée par une 30 solution aqueuse de NaC1 à 0,5M. 3037806 PP001297FR 11 La macroporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique MEB à l'aide du microscope TM-1000 de la société Hitachi. Les échantillons ont été revêtus d'or ou de carbone par dépôt plasma avant leur caractérisation. Les analyses de diffraction des rayons X ont été réalisées sur des particules 5 d'hydroxyapatite à l'aide d'un diffractomètre à compteur courbe vendu sous la référence INEL CPS 120 utilisant le rayonnement Kal émis par une anticathode au cobalt (À,=1,78892A). Les analyses Infrarouge à transformée de Fourier (IFTR) ont été réalisées dans l'intervalle de longueur d'onde allant de 400 cm-1 à 4000 cm-1, à l'aide d'un 10 spectromètre Thermo Nicolet 5700 sur des pastilles constituées de 1 mg de produit à analysé, dispersé dans 300 mg de KBr. Le nombre de scans a été réglé à 64 par spectre avec une résolution de 4 cm-1. Exemple 1 Préparation d'un matériau macroporeux selon le procédé conforme à 15 l'invention Dans cet exemple, on a préparé un monolithe de silice macroporeux conforme à l'invention à partir d'une émulsion huile-dans-eau stabilisée par des particules d'hydroxyapatite. Le protocole général suivant a été utilisé : 20 1) la solution aqueuse de précurseur de silice a été préparée en mélangeant 1 équivalent massique de TEOS pour 2 équivalents massiques d'une solution d'HCl à 10-3 M contenant 0,5 M de NaC1 qui a été laissée sous agitation à température amiante pendant 5 heures. 2) la dispersion de particules d'hydroxyapatite a été préparée en dispersant 25 1 g de particules dans 10 mL d'eau à 0,5 M en NaCl. 3) l'émulsion huile-dans-eau a été préparée en dispersant 8 ml de Stelliesters 55/45° (soit 7,6 grammes d'huile), dans 2 mL de la dispersion de particules d'hydroxyapatite obtenue ci-dessus à l'étape 2), soit 26,3 mg d'hydroxyapatite par gramme d'huile. L'émulsion a été préparée sous agitation à l'Ultra Turrax @ 30 (vendu par la société Janke-Kunkel IKA Labortechnik) à 24 000 tours/min pendant 1 minute. 4) Ajout de la solution aqueuse de précurseur de silice préparée à l'étape 1) dans l'émulsion huile-dans-eau préparée à l'étape 3). La fraction volumique en 3037806 PP001297FR 12 huile (c13) de l'émulsion était de 65 % (volume d'huile/volume totale de l'émulsion) à l'issue de l'étape 4). 5) la solidification des émulsions s'est faite au repos pendant 10 jours pour permettre la polycondensation du précurseur de silice (TEOS) au sein de la phase 5 continue de l'émulsion sous la forme d'un monolithe de silice. 6) les monolithes de silice ainsi obtenus ont été lavés pendant 3 fois en 24 H dans des bains contenant un mélange acétone/THF (50/50: v/v) afin d'éliminer l'huile résiduelle présente au sein des macropores et séchés dans un dessiccateur à température ambiante pendant 15 jours. 10 Dans cet exemple, les monolithes ont été préparés en utilisant les quantités suivantes : - Solution aqueuse de précurseur de silice à 33 % en masse de TEOS : 2 mL ; pH = 3 - Ajout de 2 mL de cette solution de TEOS préhydrolysé à l'émulsion. 15 Le monolithe ainsi obtenu (M65) a été examiné en microscopie électronique à balayage (MEB) à l'aide d'un microscope vendu sous la référence TM-1000 par la société Hitachi. La figure 1 annexée est la photographie MEB du monolithe M65 ainsi obtenu. 20 Cette figure montre que le monolithe M65 se présente sous la forme d'un matériau macroporeux dont les pores sont interconnectés et ont un diamètre supérieur à 100 itim, compatible avec l'application envisagée et dont la surface est tapissée de particules d'hydroxyapatite. Exemple 2 25 Préparation de matériaux macroporeux selon le procédé conforme à l'invention Dans cet exemple, on a préparé des monolithes de silice macroporeux conformes à l'invention à partir d'émulsions huile-dans-eau stabilisées par des particules d'hydroxyapatite. 30 Dans cet exemple on a tout d'abord procédé à la synthèse des particules d'hydroxyapatite selon le protocole suivant : La synthèse a été réalisée en ajoutant au goutte à goutte 433,3 mL d'une solution aqueuse de phosphate de diammonium 1.5 M dans 1100 mL d'une solution 3037806 PP001297FR 13 aqueuse de nitrate de calcium 1 M. L'ajout de la solution de phosphate de diammonium a été réalisé en maintenant le pH du milieu réactionnel à 10 par ajout d'ammoniaque et en maintenant la température de réaction à 100°C. Après formation du précipité, la solution a été filtrée sur Buchner, le précipité a été lavé à 5 chaud avec de l'eau décarbonatée. Le gel récupéré a ensuite été lyophilisé et la poudre obtenue stockée au congélateur. On a ainsi obtenu des particules d'hydroxyapatite agglomérées allongées dans le sens de la longueur de rapport Ca/P = 1,66 ± 0,01, de longueur moyenne de 250 nm et de largeur inférieure à 100 nm. Les agglomérats ont été tamisés à 10 125 ium. Le diagramme de diffraction des rayons X de ces particules est donné à la figure 2 annexée. Sur cette figure l'intensité est fonction de l'angle 20. La courbe correspond aux points expérimentaux relevés pour les particules d'hydroxyapatite synthétisées dans cet exemple et les traits verticaux correspondent aux pics indexés 15 sur les valeurs théoriques de l'hydroxyapatite. Ce diagramme montre que les particules synthétisées sont bien des particules d'hydroxyapatite et qu'aucune impureté n'a été détectée. Le spectre IFTR des particules synthétisé est donné par la figure 3 annexée, sur laquelle l'absorbante est fonction du nombre d'onde en cm-1. 20 Les résultats présentés sur cette figure montrent les bandes IR caractéristiques de l'hydroxyapatite, avec notamment des bandes de vibration vers 1000-1100 cm-1 et 600 cm-1, caractéristiques des groupements orthophosphate, et 3560 cnil et 630 cnil attribuables aux groupements OH. Les particules d'hydroxyapatite ainsi synthétisées ont ensuite été utilisées 25 pour la stabilisation des émulsions huile-dans-eau préparées dans cet exemple. Les monolithes de silice ont été préparés selon le protocole général donné ci-dessus à l'exemple 1, seule la fraction volumique en huile de l'émulsion de départ a été modifiée, de la manière suivante : Monolithe M80/20 30 La fraction volumique en huile de l'émulsion de départ est de 80% (d'où la notation M80/20), ce matériau correspond au protocole donné dans l'exemple 1. 3037806 PP001297FR 14 Monolithe M85/10 La fraction volumique en huile de l'émulsion de départ est de 85% (augmentation de la taille des interconnexions). Les photographies MEB des monolithes M80/20 et M85/10 ainsi obtenus 5 sont données par les figures 4 et 5 annexées. Exemple 3 Etude de la biocompatibilité des matériaux conformes à l'invention 1) Protocole des tests de cytotoxicité Afin d'étudier la biocompatibilité des matériaux conformes à l'invention, les 10 monolithes M80/20 et M85/10 tels que préparés ci-dessus à l'exemple 2 ont été réduits en poudre (dénommées respectivement P-M80/20 et P-M85/10). Les poudres ont été stérilisées pendant 25 minutes sous rayonnement UV. La quantité de chacune des poudres nécessaire au recouvrement de 25 %, 50 % et 100 % de la surface des puits a été déterminée par pesée afin d'assurer une bonne 15 reproductibilité des résultats. Les tests de cytotoxicité ont été effectués sur les poudres P-M80/20 et P-M85/10 en présence d'ostéoblastes humains : - Type de cellules : Les cellules testées sont des cellules issues d'implants d'os fémoral humain, 20 cultivées dans un milieu Iscove's Modified Dulbecco (IMDM) supplémenté en sérum de veau foetal 10% et contenant de la protéine BMP2 (facteur de croissance ostéo-inducteur) à raison de 10 ng/mL Les cellules ont été placées dans une étuve à 37°C en présence de CO2, dans des boites de 24 puits. - Préparation des puits : 25 La quantité de chaque poudre nécessaire à l'expérimentation (25 %, 50 % ou 100 % de recouvrement de la surface des puits) a été pesée. La quantité nécessaire au recouvrement de la moitié (1/2) d'un puits a été déterminée par pesée, elle est égale à 0.02 g pour la poudre notée P-M85/10 et à 0,04 g pour la poudre P-M80/20. Les quantités pour couvrir 1/4 ou la totalité de la surface d'un puits ont été 30 déterminées au pro rata de la surface. Les puits ont été complétés par la solution cellulaire. Des plaques de 24 puits ont été utilisées, chaque puits ayant un volume de 1 mL 3037806 PP001297FR 15 - Tests de cytotoxicité : Deux jours avant l'ajout des poudres aux puits, les cellules sont ensemencées dans le milieu de culture à raison de 50 000 cellules / puits afin de permettre leur adhésion et démarrer la phase de prolifération. 5 A TO le milieu de culture est alors remplacé par le milieu expérimental. Les tests en présence des poudres sont arrêtés à J1, J3 et J7. Chaque test est répété 3 fois. Des puits ensemencés avec cellules mais en l'absence des poudres servent de contrôle positifs. Pour chaque temps expérimental (JO, J1, J3, J7), un test colorimétrique au 10 bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-y1)-2,5-diphényl tetrazolium (MTT) est réalisé à l'aide d'un spectrophotomètre UV (570 nm) afin de mesurer la viabilité des cellules (seules les cellules vivantes sont détectées). 2) Protocole des tests de prolifération : Parallèlement un test de prolifération a été réalisé non pas sur les poudres 15 P-M80/20 et M-P85/10 mais sur les matériaux M80/20 conservés sous forme de monolithes, préalablement stérilisés à l'oxyde d'éthylène. Ces monolithes ont été placés dans des puits de culture dont le fond avait été préalablement recouvert d'agarose 1% afin d'empêcher l'adhésion des cellules sur le fond. Les ostéoblastes ont alors été ensemencées à raison de 40 000 cellules / puits dans un volume de 20 50 µL de milieu de culture afin de permettre leur pénétration complète dans le monolithe poreux. Après 3 heures d'incubation 1,5 mL de milieu de culture est alors ajouté avec précaution. Des observations au microscope électronique à balayage (MEB) ont alors été effectuées à J2 afin de vérifier la présence de cellules en surface et donc leur 25 adhésion sur les monolithes (en surface ou à l'intérieur des macropores). 3) Résultats obtenus 3.1) Résultats des tests de cytotoxicité Les résultats des dosages MTT sont exprimés en fonction du pourcentage de survie des cellules. Ce pourcentage est obtenu à partir de la valeur moyenne issue 30 des trois expériences pour chaque poudre de monolithe testée. Le 100% est déterminé en l'absence de poudre. Les résultats obtenus au bout de 1, 3 et 7 jours de culture (J1, J3 et J7) sont respectivement donnés par les figures 6, 7 et 8 annexées sur lesquelles le pourcentage de survie des cellules est donné pour chaque surface de recouvrement. 3037806 PP001297FR 16 Sur ces figures les barres de gauche correspondent à la poudre P-M85/10 et les barres de droite à la poudre P-M80/20. Les résultats montrent peu d'altération de la survie cellulaire pour les 2 matériaux testés. La poudre P-M80/20 montre très peu d'altération de la survie 5 cellulaire particulièrement à des temps courts (J1) puis la poudre P-M85/10 présente une meilleure survie à J7. 3.2) Résultats des tests de prolifération La figure 9 est une photographie MEB d'un monolithe M80/20 à l'issue du test de prolifération et montrent des cellules osseuses adhérées à la paroi des 10 macropores. Ces résultats sont encourageants pour le développement de biocéramiques bioactives qui guideraient l'adhésion des cellules osseuses au travers de la macroporosité et aideraient la repousse osseuse. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un matériau poreux minéral biocompatible se présentant sous forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice comprenant des macropores interconnectés ayant une dimension moyenne dA 5 allant de 100 ium à 500 ium et des micropores de dimension moyenne ch de 0,7 à 2 nm, et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est tapissée de particules d'hydroxyapatite, ledit procédé comprenant au moins une étape de minéralisation d'une émulsion huile-dans-eau formée de gouttelettes d'une phase huileuse dispersées dans une phase aqueuse continue et dans laquelle des particules 10 solides colloïdales sont présentes à l'interface formée entre la phase aqueuse continue et les gouttelettes de phase huileuse dispersées, ledit procédé étant caractérisé et en ce que : - la fraction volumique de la phase huileuse est supérieure ou égale à 64 %, - les particules solides colloïdales sont des particules d'hydroxyapatite, 15 - la quantité de particules d'hydroxyapatite varie de 0,05 à 50 mg de particules/mL de phase huileuse, - ladite étape de minéralisation est réalisée sans agitation, à un pH compris entre 6 et 9, en présence d'au moins un précurseur d'oxyde de silice en une quantité supérieure ou égale à 10 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. 20 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite au sein de l'émulsion varie de 1 mg de particules/mL de phase huileuse à 40 mg de particules/mL de phase huileuse. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend, dans cet ordre, les étapes suivantes : 25 i) la dispersion de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite dans une phase aqueuse ayant un pH allant de 6 à 9 pour obtenir une dispersion aqueuse de particules d'hydroxyapatite, ii) la préparation d'une solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice, le pH de ladite solution étant de 2 à 5, 30 iii) le maintien de la solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice sous agitation pendant une durée allant de 5 minutes à 10 heures pour obtenir une solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice hydrolysé, 3037806 PP001297FR 18 iv) l'ajout, à ladite dispersion aqueuse obtenue ci-dessus à l'étape i), de la phase huileuse, sous agitation mécanique jusqu'à obtention d'une émulsion huiledans-eau, v) l'ajout, à ladite émulsion obtenue ci-dessus à l'étape iv), de la solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice hydrolysé obtenue ci-dessus à l'étape iii), pour obtenir une émulsion huile-dans-eau stabilisée par des particules d'hydroxyapatite et dans laquelle la phase aqueuse comprend ledit précurseur de silice hydrolysé, vi) la mise au repos de l'émulsion résultant de l'étape v) jusqu'à obtention 10 d'un matériau solide, puis vii) l'élimination de la phase huileuse présente dans le matériau solide obtenu ci-dessus à l'étape vi) pour obtenir le matériau attendu sous la forme d'un monolithe de silice macroporeux dans lequel la surface des macropores est tapissée de particules d'hydroxyapatite. 15 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la phase huileuse de l'émulsion est constituée par une ou plusieurs huiles choisies parmi les esters d'acides gras, les huiles végétales et les huiles essentielles. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 20 caractérisé en ce que la fraction volumique de la phase huileuse de l'émulsion varie de 64 à 90 %. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les particules d'hydroxyapatite présentent une taille moyenne comprise entre 5 et 5000 nm inclusivement. 25 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les particules d'hydroxyapatite sont de forme sphérique ou en aiguille. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les précurseurs d'oxyde de silice sont choisis parmi le 30 tetraméthoxyorthosilane, le tetraéthoxyorthosilane, le diméthyldiéthoxysilane et les mélanges du diméthyldiéthoxysilane avec le tetraéthoxyorthosilane ou le tetraméthoxyorthosilane. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en précurseur(s) d'oxyde de silice au sein de 3037806 PP001297FR 19 la phase aqueuse de l'émulsion varie de 10 à 40 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que la durée de l'étape iii) varie de 3 à 5 heures. 5 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce qu'à l'issue de l'étape vii), le matériau obtenu est séché à une température comprise entre 15 et 40°C, pendant 10 à 20 jours. 12. Matériau poreux minéral biocompatible obtenu par la mise en oeuvre du procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, ledit matériau étant caractérisé en qu'il se présente sous forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice comprenant des macropores interconnectés ayant une dimension moyenne dA allant de 100 µm à 500 µm et des micropores de dimension moyenne dI de 0,7 à 2 nm, et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est recouverte par des particules d'hydroxyapatite. 13. Matériau selon la revendication 12, caractérisé en ce que les parois des macropores ont une épaisseur allant de 0,1 à 10 ium. 14. Matériau selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que la surface spécifique dudit matériau varie de 100 à 400 m2/g. 15. Matériau poreux minéral biocompatible tel qu'obtenu selon le 20 procédé défini à l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou tel que défini à l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour une utilisation à titre de matériau de comblement osseux.