Brevet FR3041655A1 — publié le 20170331

NOUVELLES SOUCHES BACTERIENNES POUR LA PRODUCTION DE VANILLINE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine de la production de la vanilline. Elle concerne particulièrement une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926, son procédé d'obtention, et sa cassette d'intégration. ARRIÈRE PLAN TECHNIQUE La vanilline est l'un des composants majeur constituant l'extrait de vanille qui est un puissant arôme naturel obtenu à partir de la gousse d'une orchidée. L'extraction de cette molécule à partir de gousses de vanille est très onéreuse, les quantités produites sont limitées et ne couvrent pas la demande du marché. D'autres voies d'obtention de la vanilline ont ainsi été recherchées. Il est par exemple possible d'obtenir de la vanilline à partir d'acide férulique par une 15 réaction de bioconversion grâce à des bactéries. Dans la présente demande de brevet nous nous intéressons uniquement à la voie de bioconversion de l'acide férulique en vanilline par les bactéries. La production de vanilline par des bactéries se fait par déacétylation de l'acide férulique au moyen des 3 étapes suivantes : 20 1. activation de l'acide férulique en feruloyl-CoA, l'activation étant catalysée par une enzyme, la Feruloyl-CoA Synthétase, ci-après FCS ; 2. hydroxylation de la Feruloyl-CoA en 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-P- hydroxypropionyl-CoA, l'hydroxylation étant catalysée par une enzyme, l'EnoylCoA-Hydratase/Aldolase, ci-après ECH ; 25 3. déacétylation du 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-P-hydroxypropionyl-CoA permettant l'obtention de vanilline, catalysée également par l'enzyme ECH. La vanilline obtenue peut ensuite être oxydée en acide vanillique par une enzyme, la Vanilline DéHydrogénase, ci-après VDH. Toutefois la conversion de la vanilline en acide vanillique n'est pas souhaitée car seule la vanilline présente les caractéristiques 30 aromatiques recherchées. Selon la nomenclature EC des enzymes (Enzyme Commission number) : -l'enzyme FCS a le code EC 6.2.1.34, -l'enzyme ECH a les codes EC 4.2.1.101 et EC 4.1.2.41, -l'enzyme VDH a le code EC 1.2.1.67. 3041655 2 EP 2 721 148 Al décrit un microorganisme du genre Amycolatopsis ne comprenant pas le gène codant la vdh, ledit microorganisme permettant de produire de la vanilline à partir d'acide férulique. EP 1 611 244 Al décrit un procédé de production de vanilline n'utilisant pas de solvants 5 organiques car ils sont désormais considérés comme non souhaitables dans l'industrie agro-alimentaire, lors de la purification afin d'obtenir une vanilline dite « naturelle ». Au cours dudit procédé de production de vanilline la biotransformation de l'acide férulique en vanilline est réalisée par la souche Amycolatopsis IM1390106, appelée également souche Zyl 926 ou souche Amycolatopsis Zyl 926. 10 Le livre « Practical Streptomyces Genetics », 2000, Kieser, et al. publié par The John Innes Foundation, ISBN 0-7084-0623-8, dans son chapitre 10, décrit une méthode de conjugaison entre Escherichia coli et Streptomyces permettant l'intégration d'ADN au niveau de sites spécifiques. Toutefois, les souches de l'art antérieur utilisées lors de la réaction de bioconversion ne permettent pas une conversion optimale de l'acide férulique en vanilline. Etant donné le coût de l'acide férulique, il existe toujours un besoin de nouvelles souches de bactéries assurant une meilleure conversion de l'acide férulique en vanilline. RE SUME DE L'INVENTION Le demandeur a ainsi développé de nouvelles souches de bactéries grâce un procédé de transformation original, permettant d'avoir un rendement molaire amélioré lors de la réaction de bioconversion. L'invention a ainsi pour objet une souche Amycolatopsis dérivée de la souche 25 Amycolatopsis Zyl 926, possédant au moins une copie supplémentaire des gènes fcs et ech intégrée au niveau du site d'intégration du phage (pC31. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 par conjugaison interspécifique. L'invention a également pour objet une cassette d'intégration comprenant la cassette 30 d'expression des gènes ech et fcs. L'invention a également pour objet l'utilisation desdites souches dans un procédé d'obtention de la vanilline. L'invention a également pour objet un procédé de production de la vanilline. 3041655 3 DESCRIPTION DETAILLEE La présente invention a pour objet de nouvelles souches de bactéries en particulier du genre Amycolatopsis utilisables lors de la réaction de bioconversion de l'acide férulique en vanilline. 5 Les inventeurs ont développé après de longues recherches de nouvelles souches Amycolatopsis dérivées de la souche Amycolotapsis Zyl 926 permettant d'avoir un rendement molaire amélioré par rapport à l'état de la technique, lors de la réaction de bioconversion de l'acide férulique en vanilline grâce à la surexpression des gènes fcs et ech dans le génome de la souche Amycolotapsis Zyl 926. 10 Un rendement molaire de bioconversion se définit comme étant le rapport entre le nombre de moles de produit obtenu, dans notre cas la vanilline, divisé par le nombre de moles de substrat mis en oeuvre, dans notre cas l'acide férulique. Lorsqu'il est sous forme de pourcentage ce rapport est multiplié par 100. Par « rendement molaire amélioré par rapport à l'état de la technique », on entend un 15 rendement molaire de bioconversion supérieur ou égal à 80%, de préférence supérieur ou égal à 85%, et encore plus de préférence égal à 90%. La souche Amycolatopsis Zyl 926 a été déposée au CABI Bioscience, UK science centre à Egham, sous le numéro IMI 390106 le 2 mars 2003. Les termes « souche Zyl 926 », « souche Amycolatopsis Zyl 926 », « souche 20 Amycolatopsis IMI 390106 », « souche Amycolatopsis déposée au CABI Bioscience sous le numéro IMI 390106 » sont ici synonymes. Par « souche(s) Amycolatopsis dérivée(s) de la souche Amycolotapsis Zyl 926 », on entend toutes souches obtenues après transformation de la souche Zyl 926 par conjugaison interspécifique permettant l'intégration d'au moins une copie supplémentaire 25 des gènes lès et ech. Les inventeurs ont en outre mis en évidence que les nouvelles souches selon l'invention permettent également d'améliorer la productivité et la consommation de la quasi-totalité de l'acide férulique lors de la réaction de bioconversion. Par « consommation de la quasi-totalité de l'acide férulique », on entend qu'au moins 30 98% de l'acide férulique soit consommé lors de la réaction de bioconversion, de préférence au moins 99%, et encore plus de préférence 100%. 3041655 4 La présente invention a donc pour objet une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 comprenant : - au moins une copie supplémentaire du gène fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence protéique SEQ ID NO : 1 ou toute séquence 5 identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1, et - au moins une copie supplémentaire du gène ech codant l'Enoyl-coAHydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence protéique SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore 10 plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2, lesdites copies supplémentaires des gènes fcs et ech étant intégrées spécifiquement au niveau du site d'intégration du phage (pC31, également appelé site attB. L'article de Keravala et al. (Methods Mol Biol. 2008) mentionne l'utilisation de l'intégrase du phage (pC31 comme médiateur pour une intégration chromosomique site 15 spécifique. Elle permet ainsi d'effectuer une recombinaison unidirectionnelle entre deux sites att appelés attP et attB. Par « copie supplémentaire du gène », on entend toute copie d'un gène d'intérêt intégrée dans le génome d'une souche en plus des copies du gène d'intérêt présentes initialement dans le génome. 20 Une séquence protéique ou nucléique est dite identique à une autre lorsque l'alignement entre les deux séquences est parfait c'est-à-dire lorsqu'il y a une parfaite correspondance respectivement entre les acides aminés ou acides nucléiques de chaque séquence. Le pourcentage d'identité de séquence se calcule en donnant un score de 0 ou 1 pour chaque acide aminé ou base de la séquence selon qu'il y ait identité ou non. Les expressions « gène ech codant l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase » et « gène fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase » ne doivent pas être interprétées de manière stricte mais elles doivent englober également les séquences codant les variants fonctionnels de ces enzymes. Typiquement, des variants fonctionnels de ces enzymes FCS et ECH ont une séquence 30 protéique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80%, de préférence d'au moins 90% et plus particulièrement de préférence d'au moins 95% avec les séquences protéiques SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2. 3041655 5 De façon avantageuse, la présente invention a pour objet une souche Amycolatopsis dont les copies supplémentaires des gènes fcs et ech sont placées sous la dépendance du promoteur fort ermE* associé à un site d'association du ribosome, appelé RBS. Le promoteur ermE* correspond au promoteur ermE modifié de façon à lui donner une 5 expression forte et constitutive. Le promoteur ermE* a pour séquence la séquence nucléique SEQ ID NO : 6 ou toute séquence identique à au moins 90%, de préférence au moins 95% et encore plus de préférence au moins 99% à la séquence SEQ ID NO : 6. La séquence du promoteur ermE* est celle décrite dans l'article de Bibb et al. (Mol 10 Microbiol. 1994 Nov;14(3):533-45) Pour obtenir de nouvelles souches originales selon l'invention surexprimant les gènes ech et fcs les inventeurs ont mis en évidence après de nombreuses recherches et expérimentations que la méthode de conjugaison interspécifique permettait d'obtenir des transformants ayant intégré au moins une copie supplémentaire des gènes ech et fcs et 15 que la réussite de cette méthode d'intégration de gènes était locus dépendante. On entend par « locus dépendante », le fait que les copies supplémentaires des gènes d'intérêt doivent être intégrées spécifiquement au niveau du site d'intégration du phage (pC31. La présente invention a donc pour objet un procédé d'obtention d'une souche 20 Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 telle que décrite ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : a. amplification par PCR des gènes fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence 25 SEQ ID NO : 1 et ech codant l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2, isolés d'une souche Amycolatopsis; b. construction d'un vecteur portant les séquences protéiques obtenues à l'étape a., à partir du plasmide pSET152 possédant : i. le gène int codant l'intégrase du phage (pC31 ayant pour séquence la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% de la séquence SEQ ID NO : 3, 3041655 6 ii. le site de fixation du phage (pC31, ci-après site attP ayant pour séquence la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4, et iii. l'origine de conjugaison oriT fonctionnelle ayant pour séquence la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 ou toute séquence identique à au moins 90%, de 5 préférence au moins 95% et encore plus de préférence au moins 99% à la séquence SEQ ID NO : 5 ; c. transformation par électroporation de la souche Escherichia coli ET12567 avec un plasmide conjuguant comprenant tous les gènes codant la machinerie de conjugaison dont l'origine de conjugaison oriT rendue non fonctionnelle, et le vecteur construit à 10 l'étape b. ; d. sélection des souches Escherichia coli ET12567 transformées à l'étape c. par culture sur un milieu contenant la néomycine et une bêta-lactamine ; e. conjugaison interspécifique entre les souches Escherichia coli ET12567 transformées et sélectionnées aux étapes c. et d. et la souche Amycolatopsis Zyl 926, par mise en co- 15 culture ; f. sélection des souches Amycolatopsis Zyl 926 ayant intégré au moins une copie supplémentaire du gène fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 20 1 et au moins une copie supplémentaire du gène ech codant l'enoyl-coA-hydratase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 selon l'étape e., par culture sur un milieu contenant de l'apramycine. 25 Les gènes fcs et ech ont été isolés et amplifiés à partir d'une souche Amycolatopsis par une technique PCR qui est une technique connue de l'homme du métier. En raison des particularités propres au génome d' Amycolatopsis, le kit « Phusione High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer » de New England Biolabs a été préférentiellement utilisé avec le tampon GC Buffer. 30 Les séquences des amorces utilisées sont les séquences suivantes : - SEQ ID NO : 7 : Van-ECH-F : 5' GAAGCTTGAGCGATGCATGAGCACAGC 3' - SEQ ID NO : 8 : Van-ECH-R : 5' GTCTAGACTGGTTGCGCACTACTTCTC 3' 3041655 7 De manière préférentielle les gènes fcs et ech ont été isolés de la souche Amycolatopsis Zyl 926. Le plasmide pSET152 est porteur de la résistance à l'apramycine. La construction du vecteur selon l'étape b. est réalisée par clonage des copies 5 supplémentaires des gènes fcs et ech amplifiés à l'étape a. dans le plasmide pSET152 (Bierman et al., Gene, 116 (1) : 43-49, 1992). Le produit de PCR contenant les gènes ech et fcs a été obtenu en utilisant comme matrice l'ADN génomique de la souche Zy1926 et les amorces Van-ECH-F (SEQ ID NO : 7) et Van-ECH-R (SEQ ID NO : 8). Le fragment à intégrer a été obtenu par digestion HindIII (+ Klenow) et XbaI. Les fragments HindIIl (+ 10 Klenow) et XbaI ont été clonés dans les sites EcoRV et XbaI de pSET152. Par gène int, on entend le gène codant l'intégrase du phage (pC31 ayant pour séquence la séquence protéique SEQ ID NO : 3 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% de la séquence 15 SEQ ID NO : 3. Le site de fixation du phage (pC31, également appelé site attP, présent dans le plasmide pSET152, a pour séquence la séquence SEQ ID NO : 4. La séquence SEQ ID NO : 4 est la suivante : GCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGG 20 La sélection des souches Escherichia coli ET12567 transformées à l'étape c est réalisée sur la base de l'acquisition par ces souches transformées de la résistance à la néomycine et à une bêta-lactamine. La mise en co-culture, pour la réalisation de la conjugaison interspécifique de l'étape e., est réalisée dans des conditions classiques connues de l'homme du métier (Bierman et al., 25 1992 cf supra) et préférentiellement par mise en contact durant plusieurs heures d'une part des Escherichia coli ET12567 obtenues à l'étape d. transformées préalablement et rendues compétentes pour la transformation, et d'autre part des cellules d' Amycolatopsis Zyl 926 préalablement synchronisées pour la germination par chauffage. La souche Escherichia coli ET12567 est la souche ATCC BAA-525 (MacNeil et al., Gene 30 111: 61-68, 1992). La sélection selon l'étape f des souches Amycolatopsis Zyl 926 ayant intégré au moins une copie supplémentaire des gènes fcs et ech est réalisée sur la base de l'acquisition par ces souches de la résistance à l'apramycine. 3041655 8 Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a encore plus particulièrement pour objet un procédé d'obtention d'une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape supplémentaire b'., entre les étapes b. et c., d'amplification et de clonage du promoteur fort ermE* dans le 5 vecteur construit à l'étape b., ledit promoteur ermE* étant associé à un site d'association du ribosome, appelé RBS. Le promoteur ermE* a pour séquence la séquence SEQ ID NO : 6 ou toute séquence identique à au moins 90%, de préférence au moins 95% et encore plus de préférence au moins 99% à la séquence SEQ ID NO : 6. 10 Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a particulièrement pour objet un procédé d'obtention d'une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 tel que décrit ci-dessus, dans lequel le plasmide conjuguant de l'étape c. est le plasmide pUZ8002 décrit dans le livre « Practical Streptomyces Genetics », 2000, Kieser, 15 et al., chapitre 10, publié par The John Innes Foundation, ISBN 0-7084-0623-8, Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'obtention d'une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 tel que décrit ci-dessus, dans lequel la bêta-lactamine de l'étape d. est 20 1 ' ampicilline. La présente invention a également pour objet une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 susceptible d'être obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus. 25 La présente invention a également particulièrement pour objet une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926, susceptible d'être obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus, qui est choisie parmi la souche déposée à la CNCM sous le numéro I-4922, la souche déposée à la CNCM sous le numéro I-4923, et la souche déposée à la 30 CNCM sous le numéro I-4924. Les souches I-4922, I-4923 et I-4924 sont des souches Amycolatopsis sp. déposées en vertu du Traité de Budapest le 11 décembre 2014 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France. 3041655 9 La présente invention a également pour objet une cassette d'intégration comprenant : i. une cassette d'expression des gènes fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 5 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1 et ech codant l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 ; 10 ii. des moyens permettant l'intégration de la cassette dans le génome de la souche Amycolatopsis Zyl 926, comprenant le gène int du phage (pC31 ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 3 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% de la séquence SEQ ID NO : 3 et le site de fixation du phage cpC31, appelé site attP ayant 15 pour séquence la séquence SEQ ID NO : 4 ; iii. des moyens de sélection des souches Escherichia coli ET12567 transformées comprenant la néomycine et une bêta-lactamine ; iv. des moyens de sélection des souches Amycolatopsis Zy1926 ayant intégré ladite cassette d'intégration, comprenant un marqueur de résistance à l'apramycine. 20 Une cassette d'intégration est une construction génétique comprenant les outils nécessaires à l'intégration d'un ou plusieurs gènes d'intérêt dans le génome d'un organisme, ici la souche Amycolatopsis Zyl 926. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les gènes codant la Feruloyl-coA- 25 Synthétase et l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase de la cassette d'expression décrite ci-dessus sont placés sous la dépendance du promoteur fort ermE* ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 6 ou toute séquence identique à au moins 90%, de préférence au moins 95% et encore plus de préférence au moins 99% à la séquence SEQ ID NO : 6 ledit promoteur ermE* étant associé à un site d'association du ribosome, également appelé 30 RBS. Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a plus particulièrement pour objet une cassette d'intégration telle que décrite ci-dessus, dans laquelle la bêta-lactamine est 1' ampicilline. 3041655 10 L'invention a également pour objet, l'utilisation des nouvelles souches Amycolatopsis sp dérivées de la souche Amycolatopsis Zyl 926 telles que décrites ci-dessus, dans un procédé de production de vanilline. 5 La présente invention a également pour objet un procédé de production de vanilline comprenant les étapes suivantes : a. disposer d'une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 déposée au CABI Bioscience sous le numéro IMI 390106 le 2 mars 2003, 10 comprenant au moins une copie supplémentaire des gène fcs codant la Feruloyl- coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1. et ech codant l'EnoylcoA-Hydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou 15 toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 et dont lesdites copies supplémentaires sont intégrées spécifiquement au niveau du site d'intégration du phage (pC31 ; b. mettre en culture la nouvelle souche Amycolatopsis dérivée de l'étape a. ; 20 c. mettre en présence l'acide férulique avec ladite culture de la souche Amycolatopsis de l'étape b. et incuber ; d. extraire la vanilline du milieu de culture. La mise en culture des nouvelles souches Amycolatopsis dérivées est effectuée préférentiellement sur des milieux contenant tous les nutriments nécessaires à la bonne 25 croissance de la bactérie, notamment une source de carbone, à des températures et pH régulés dans des fermenteurs. Une source de carbone peut par exemple être du glycérol. L'incubation selon l'étape c. du procédé de production de vanilline est réalisée jusqu'à la consommation de la quasi-totalité de l'acide férulique et à une température comprise 30 entre 37°C et 41°C. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé de production de vanilline est le procédé décrit dans la demande EP 1 611 244 Al. 3041655 11 La réaction de bioconversion lors du procédé de production de vanilline est donc réalisée dans un milieu comprenant une nouvelle souche Amycolatopsis sp. dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 selon l'invention. 5 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 mise en oeuvre dans le procédé de production de vanille à l'étape a., est choisie parmi la souche déposée à la CNCM sous le numéro I4922, la souche déposée à la CNCM sous le numéro I-4923, et la souche déposée à la CNCM sous le numéro I-4924. 10 L'invention a plus particulièrement pour objet, un procédé de production de vanilline tel que décrit ci-dessus dans lequel le rendement molaire est supérieur ou égal à 80%, de préférence supérieur ou égal à 85%, et encore plus de préférence égal à 90%. 15 L'invention a plus particulièrement pour objet, un procédé de production de vanilline tel que décrit ci-dessus dans lequel au moins 98% de l'acide férulique est consommé, de préférence au moins 99%, et encore plus de préférence 100%. Les inventeurs mettant en oeuvre ledit procédé de production de vanilline tel que décrit ci-20 dessus avec les nouvelles souches Amycolatopsis selon l'invention ont ainsi remarqué de manière étonnante que : la quasi-totalité de l'acide férulique est consommée lors de la réaction de bio conversion ; la productivité est améliorée; 25 le rendement molaire est amélioré ; et cela sans que le flux de vanilline déshydrogénase transformant la vanilline en acide vanillique ne soit augmenté. La présente invention a également pour objet une nouvelle souche Amycolatopsis telle 30 que décrite ci-dessus dont le gène vdh codant la Vanilline DésHydrogénase n'est pas supprimé. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une nouvelle souche Amycolatopsis tel que décrit ci-dessus ne comportant pas d'étape de suppression du gène vdh codant la Vanilline DésHydrogénase. 3041655 12 EXEMPLES EXEMPLE 1 : Clonage de copies supplémentaires des gènes ech et fcs dans Zyl 926 au niveau du site d'intégration du phage (pC31 Matériel et méthode 5 Souches bactériennes : - Escherichia coli ET12567 - Amycolatopsis Zyl 926 Plasmides : - p SET152 : porteur d'un gène de résistance à l'ampicilline - pUZ8002 : porteur d'un gène de résistance à la néomycine a. amplification 10 Les gènes ech et fcs ont été amplifiés à partir de la souche Amycolatopsis Zyl 926 en utilisant le kit « Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer »avec un tampon GC Buffer Les amorces utilisées sont les suivantes : - SEQ ID NO : 7 : Van-ECH-F : 5' GAAGCTTGAGCGATGCATGAGCACAGC 3' 15 - SEQ ID NO : 8 : Van-ECH-R : 5' GTCTAGACTGGTTGCGCACTACTTCTC 3' b. clonage Le fragment à intégrer est obtenu par digestion HindIII (+ Klenow) et XbaI. Le fragment HindIII (+ Klenow) et XbaI est ensuite cloné dans les sites EcoRV et XbaI de pSET152. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pLSFOla. 20 Le plasmide pSET152 possède le système d'intégration du phage (pC31 à savoir : - le gène int codant l'intégrase du phage (pC31 ; - le site attP de fixation phage (pC31 ; Le plasmide pSET152 possède également l'origine de conjugaison oriT fonctionnelle permettant sa mobilisation et son transfert de E. coli à Amycolatopsis par la souche E. coli 25 ET12567 + pUZ8002. b'. amplification et clonage du promoteur ermE* L'ajout du promoteur ermE* et du gène de résistance au chloramphénicol a été réalisé par recombinaison in vivo entre de courtes séquences identiques (PCR-targeting) comme décrit par Yu et al. (2000) (Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 May 23;97(11):5978-83). 30 Pour cela une séquence correspondant au gène de résistance au chlroramphénicol, au promoteur ermE* et au RBS du gène tipA a été obtenue par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSV605 et comme amorces les oligonucléotides LGO01 et LGO02.Les séquences des amorces utilisées sont les suivantes : 3041655 13 - SEQ ID NO : 9 : LGO01 : 5' CAGCTAT GAC AT GAT TAC GAAT TC GATAGCT TAGCGAT GCTCACGC AGT TA GACACTCAC 3' - SEQ ID NO : 10 : LGO02 : 5 5' GCTCCGTCCGGACCCGCCCGTTGCCGACCGCTGTGCTCATATGTCCGCTC CCTTCTCCCGCGAATTCACTAGTGATT 3' Ceci a permis d'obtenir un fragment présentant à chaque extrémité des séquences identiques à celles de deux régions proches sur le plasmide pLSFO1a : 10 - l'une dans la partie du vecteur en amont du gène ech, - l'autre à l'extrémité 5' du gène ech. La recombinaison a eu lieu in vivo dans la souche DY330 (Yu et al. 2000) contenant le plasmide pLSF01, après transformation par le produit PCR. Les clones ayant intégré le promoteur ermE* ont été sélectionnés sur la base de 15 l'acquisition de la résistance au chloramphénicol. Les clones sélectionnés sont appelés plasmides pLSF02. c. transformation La souche ET12567 contenant le plasmide pUZ8002 est transformée par électroporation avec le plasmide pLSFO2issu des étapes b. et b'., comprenant les copies supplémentaires 20 des gènes ech et fcs et le promoteur fort ermE* associé au RBS. d. sélection des transformants La sélection des transformants possédant le plasmide pLSF02 se fait sur un milieu contenant de l'apramycine. e. conjugaison interspécifique 25 Les cellules d'Amycolatopsis Zyl 926 sont synchronisées pour la germination par un chauffage à 50°C pendant 10 minutes. Les transformants (E. coli ET12567+ pUZ8002+pLSF02) et les cellules d'Amycolatopsis Zyl 926 ainsi préparées sont ensuite mis en contact par une co-culture durant plusieurs heures pour la réalisation de la conjugaison interspécifique. 30 f sélection des souches Zyl 926 transformées La sélection des souches Amycolatopsis Zyl 926 ayant intégré des copies supplémentaires des gènes ech et fcs se fait sur un milieu contenant de l'apramycine. 3041655 14 Résultats Cette dernière étape a permis notamment de sélectionner les souches déposée à la CNCM sous les numéros I-4922, I-4923, et I-4924 ayant intégré les copies supplémentaires des gènes ech et fcs au niveau du site d'intégration du phage (pC31. 5 EXEMPLE 2 : Clonage de copies supplémentaires des gènes ech et fcs dans Zyl 926 au niveau du site d'intégration du phage (pBT1 Matériel et méthode Souches bactériennes : - Escherichia coli ET12567 10 - Amycolatopsis Zyl 926 Plasmides : - pOSV408 : porteur d'un gène de résistance à la kanamycine. - pUZ8002 : porteur d'un gène de résistance à la néomycine a. amplification Les gènes ech et fcs ont été amplifiés à partir de la souche Amycolatopsis Zyl 926 en 15 utilisant le kit « Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer »avec un tampon GC Buffer Les amorces utilisées sont : - SEQ ID NO : 7 : Van-ECH-F : 5' GAAGCTTGAGCGATGCATGAGCACAGC 3' - SEQ ID NO : 8 : Van-ECH-R : 5' GTCTAGACTGGTTGCGCACTACTTCTC 3' 20 b. clonage Le fragment à intégrer est obtenu par digestion HindIII (+ Klenow) et XbaI. Le fragment HindIII (+ Klenow) et XbaI est ensuite cloné dans les sites EcoRV et XbaI de pOSV408. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pLSFOlb Le plasmide pOSV408 (KanaR) possède le système d'intégration du phage (pBT1 à 25 savoir : - le gène int codant l'intégrase du phage (pBT1 ; - le site attP de fixation phage (pBT1 ; Le plasmide pOSV408 possède également l'origine de conjugaison oriT fonctionnelle permettant sa mobilisation et son transfert de E. coli à Amycolatopsis par la souche E. coli 30 ET12567 + pUZ8002. b'. amplification et clonage du promoteur ermE* 3041655 15 L'ajout du promoteur ermE* et du gène de résistance au chloramphénicol a été réalisé par recombinaison in vivo entre de courtes séquences identiques (PCR-targeting) comme décrit par Yu et al. (2000) (Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 May 23;97(11):5978-83). Pour cela une séquence correspondant au gène de résistance au chlroramphénicol, au 5 promoteur ermE* et au RBS du gène tipA a été obtenue par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSV605 et comme amorces les oligonucléotides LGO01 et LGO02 ayant respectivement pour séquences les séquences SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. Ceci a permis d'obtenir un fragment présentant à chaque extrémité des séquences identiques à celles de deux régions proches sur le plasmide pLSFO1b : 10 - l'une dans la partie du vecteur en amont du gène ech, - l'autre à l'extrémité 5' du gène ech. La recombinaison a eu lieu in vivo dans la souche DY330 (Yu et al. 2000) contenant le plasmide pLSFO1b, après transformation par le produit PCR. Les clones ayant intégré le promoteur ermE* ont été sélectionnés sur la base de 15 l'acquisition de la résistance au chloramphénicol. Les clones sélectionnés sont appelés plasmides pLSF07. c. transformation La souche ET12567 contenant le plasmide pUZ8002 est transformée par électroporation avec le plasmide pLSF07 issu des étape précédentes, comprenant les copies 20 supplémentaires des gènes ech etfcs et le promoteur fort ermE* associé au RBS . d. sélection des transformants La sélection des transformants ayant intégré le plasmide pLSF07 se fait sur un milieu comprenant de la kanamycine. e. Conjugaison interspécifique 25 Les cellules d'Amycolatopsis Zyl 926 sont synchronisées pour la germination par un chauffage à 50°C pendant 10 minutes. Les transformants et les cellules d'Amycolatopsis Zyl 926 ainsi préparées sont ensuite mis en contact par une co-culture durant plusieurs heures pour la réalisation de la conjugaison interspécifique. 30 f Sélection des souches Zyl 926 transformées La sélection des souches Amycolatopsis Zyl 926 ayant intégré des copies supplémentaires des gènes ech etfcs se fait sur un milieu contenant de la kanamycine. 3041655 16 Résultats Cette dernière étape a permis de sélectionner les souches déposées à la CNCM le 11 décembre 2014 sous les numéros I-4925, I-4926 et I-4927 ayant intégré les copies supplémentaires des gènes ech etfcs au niveau du site d'intégration du phage (pBT1. 5 EXEMPLE 3 : Production de vanilline par la souche Amycolatopsis sp. I-4922 Matériel et méthode Souches bactériennes : - CNCM-I-4922 - Zyl 926 10 Le procédé de production de vanilline mis en oeuvre dans cet exemple est le procédé cité dans la demande EP 1 611 244 Al. La productivité maximale est calculée selon l'équation suivante : Concentration en vanilline produite (g/Kg) Temps écoulé pour la produire (heures) Le rendement molaire est calculé selon l'équation suivante : concentration molaire de vanilline 100 x concentration molaire d'acide férulique Le rendement massique global vanilline/acide férulique est calculé selon l'équation 15 suivante : 100 x concentration massique d'acide férulique Résultats Les résultats obtenus en utilisant le procédé de production de vanilline de la demande EP 1 611 244 avec la souche selon l'invention I-4922 et la souche Zyl 926 sont présentés 20 dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 I-4922 Zyl 926 (EP 1 611 244) Concentration initiale en acide férulique 25,5 g/Kg 25 g/L Productivité maximale 0,52 g/Kg.h Non défini Résiduel d'acide férulique 0,1 g/Kg 1.01 g/L Vanilline produite 17,1 g/Kg 13.8 g/L Acide vanillique produit 0,8 g/Kg Non défini concentration massique de vanilline 3041655 17 Rendement molaire 86% 73% Rendement massique global 67% 55% vanilline/acide férulique A noter que la densité étant proche de 1, l'unité g/Kg est équivalente à g/L. Conclusion Les résultats obtenus montrent que la souche selon l'invention I-4922 permet d'obtenir une plus grande quantité de vanilline, un rendement molaire amélioré, et la 5 consommation de la quasi-totalité de l'acide férulique par rapport à la souche Zyl 926 de l'état de la technique. EXEMPLE 4 : Comparaison de la production de vanilline en utilisant les souches I-4922 et I-4926 10 Matériel et méthode Souches bactériennes : - CNCM-I-4922 ((pC31) - CNCM-I-4926 ((pBT1) - Zyl 926 Le procédé de production de vanilline mis en oeuvre dans cet exemple est le procédé cité 15 dans la demande EP 1 611 244 Al. Résultats Les résultats obtenus en utilisant le procédé de production de vanilline de la demande EP 1 611 244 avec les souches I-4922, 14926 et Zyl 926 sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. 20 Tableau 2 Zyl 926 I-4926 I-4922 Concentration 25 g/L 24.8 g/Kg 25.5 g/Kg initiale en acide férulique Vanilline produite 13.8 g/L 14.4 g/Kg 17.5 g/Kg Conclusion Les résultats montrent que la souche selon l'invention I-4922 ayant intégré au moins une copie supplémentaire des gènes ech et fcs au niveau du site d'intégration du phage (pC31 permet de produire plus de vanilline par rapport à la souche de l'art antérieur Zyl 926. 3041655 18 Les résultats montrent également que la souche I-4926 ayant intégré au moins une copie supplémentaire des gènes ech et fcs au niveau du site d'intégration du phage (pBT1 n'améliore pas la production de vanilline par rapport à la souche de l'art antérieur Zyl 926. 5 L'intégration d'au moins une copie supplémentaire des gènes ech et fcs selon l'invention dans la souche Zyl 926 est donc locus dépendante. REVENDICATIONS1. Souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 déposée au CABI Bioscience sous le numéro IMI 390106 le 2 mars 2003, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une copie supplémentaire du gène fcs codant la Feru- loyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence protéique SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1, et au moins une copie supplémentaire du gène ech codant l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence protéique SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 et en ce que lesdites copies supplémentaires des gènes fcs et ech sont intégrées spécifiquement au niveau du site d'intégration du phage (pC31. 2. Souche Amycolatopsis selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites co- pies supplémentaires des gènes fcs et ech sont placées sous la dépendance du promoteur fort ermE*associé à un site d'association du ribosome. 3. Procédé d'obtention d'une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 déposée au CABI Bioscience sous le numéro IMI 390106 le 2 mars 2003, comprenant au moins une copie supplémentaire du gène fcs codant la Feru- loyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute sé- quence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1, et du gène ech codant l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et en- core plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 et dont les- dites copies supplémentaires des gènes fcs et ech sont intégrées spécifiquement au niveau du site d'intégration du phage (pC31, comprenant les étapes suivantes : a. amplification par PCR des gènes fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1 et ech codant l'Enoyl-coAHydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore 3041655 20 plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2, isolés d'une souche Amycolatopsis ; b. construction d'un vecteur portant les séquences protéiques obtenues à l'étape a., à partir du plasmide pSET152 ; 5 c. transformation par électroporation de la souche Escherichia coli ET12567 avec un plasmide conjuguant comprenant tous les gènes codant la machinerie de conjugaison dont l'origine de conjugaison oriT rendue non fonctionnelle, et le vecteur construit à l'étape b. ; d. sélection des souches Escherichia coli ET12567 transformées à l'étape c. par 10 culture sur un milieu contenant la néomycine et une bêta-lactamine ; e. conjugaison interspécifique entre les souches Escherichia coli ET12567 transformées et sélectionnées aux étapes c. et d. et la souche Amycolatopsis Zyl 926 déposée au CABI Bioscience sous le numéro IMI 390106 le 2 mars 2003, par mise en co-culture ; 15 f sélection des souches Amycolatopsis Zyl 926 ayant intégré au moins une copie supplémentaire du gène fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1 et au moins une copie supplémentaire du gène 20 ech codant l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 selon l'étape e., par culture sur un milieu contenant de l'apramycine. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend une étape sup- 25 plémentaire b'. entre les étapes b. et c., d'amplification et de clonage du promo- teur fort ermE* ayant pour séquence la séquence nucléique SEQ ID NO : 6 ou toute séquence identique à au moins 90%, et de préférence au moins 95%, à la séquence SEQ ID NO : 6 dans le vecteur construit à l'étape b., ledit promoteur ermE* est associé à un site d'association du ribosome. 30 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le plasmide conjuguant de l'étape c. est le plasmide pUZ8002. 6. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la bêtalactamine de l'étape d. est l'ampicilline. 3041655 21 7. Souche Amycolatopsis sp. dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 3 à 6. 8. Souche Amycolatopsis sp. selon l'une des revendications 1 à 2 ou 7 choisie parmi la souche déposée à la CNCM sous le numéro I-4922, la souche déposée à la 5 CNCM sous le numéro I-4923, et la souche déposée à la CNCM sous le numéro I- 4924. 9. Cassette d'intégration caractérisée en ce qu'elle comprend : i. une cassette d'expression des gènes fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique 10 à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1 et ech codant l'Enoyl-coAHydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 ; 15 ii. des moyens permettant l'intégration de la cassette dans le génome de la souche Amycolatopsis Zy1926, comprenant le gène int du phage (pC31 ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 3 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 3 et le site attP de fixation du phage 20 (pC31 ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 4 ; iii. des moyens de sélection des souches Escherichia coli ET12567 transformées comprenant la néomycine et une bêta-lactamine ; iv. des moyens de sélection des souches Amycolatopsis Zy1926 ayant intégré ladite cassette d'intégration, comprenant un marqueur de résistance à 25 l'apramycine. 10. Cassette d'intégration selon la revendication 9, caractérisée en ce que les gènes fcs et ech codant la Feruloyl-coA-Synthétase et l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase de la cassette d'expression sont placés sous la dépendance du promoteur ermE* ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 6 ou toute séquence identique à au 30 moins 90%, et de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 6, ledit promoteur ermE* étant associé à un site d'association du ribosome. 11. Cassette d'intégration selon l'une des revendications 9 à 10, caractérisée en ce que la bêta-lactamine est l'ampicilline. 3041655 22 12. Utilisation dans un procédé de production de vanilline d'une souche Amycolatopsis sp. dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 selon l'une des revendications 1 à 2 et/ou 7 à 8. 13. Procédé de production de vanilline caractérisé en ce que la réaction de bioconver- 5 sion est réalisée dans un milieu comprenant une souche Amycolatopsis sp. dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 selon l'une des revendications 1 à 2 et/ou 7 à 8.