Brevet FR3038713A1 — publié le 20170113

DISPOSITIF DE SPECTROSCOPIE, NOTAMMENT SPECTROSCOPIE RAMAN, ET PROCEDE ASSOCIE Domaine technique L'invention concerne un dispositif de spectroscopie et un procédé mettant en oeuvre un tel dispositif de spectroscopie. Bien que décrite en référence à l'application principale visée, la spectroscopie Raman, le dispositif de spectroscopie selon l'invention peut être mis en oeuvre pour faire des analyses spectrales différentes, par exemple, une spectroscopie infrarouge, une spectroscopie de fluorescence, etc... à la condition de modifier certains des éléments du dispositif, tels que la source de lumière d'analyse, le spectromètre et/ou les éléments optiques. Une utilisation particulièrement visée par l'invention est l'analyse optique par spectroscopie Raman de biopsies issues de prélèvements tissulaires, qui sont fixées sur des substrats transparents. Art antérieur La spectroscopie Raman, aussi appelée spectrométrie Raman, et la microspectroscopie Raman, sont des méthodes non destructives pour l'analyse de la composition et de la structure chimique moléculaire d'un matériau afin de le caractériser. Elle exploite le phénomène physique selon lequel un milieu modifie la fréquence de la lumière y circulant. Ce décalage en fréquence correspond à un échange d'énergie entre le rayon lumineux et le milieu, et donne des informations sur l'échantillon lui-même. La spectroscopie Raman consiste ainsi à envoyer une lumière monochromatique sur l'échantillon et à analyser la lumière diffusée. La figure 1 illustre, à titre d'exemple, un dispositif connu de spectroscopie de type Raman 10. Ce dispositif 10 comprend essentiellement un module d'analyse Raman 12, couplé à un microscope 14 standard. Ce dispositif connue est parfois appelé « micro-Raman». Sur le microscope 14 est monté un porte-échantillon 16 destiné à porter l'échantillon à analyser. Ce porte-échantillon 16 peut être déplacé par rapport au microscope 14 pour modifier la zone de visualisation de l'échantillon. Le microscope 14 est également équipé d'une caméra vidéo 18 pour enregistrer les observations réalisées avec le microscope 14. Le microscope 14 comporte une ou plusieurs sources lumineuses, de sorte qu'il est possible d'observer en transmission ou en réflexion selon la nature de l'échantillon (transparent ou pas). Le microscope 14 comporte encore un système de lentilles optiques ou, mieux, plusieurs systèmes de lentilles optiques interchangeables couplé à 3038713 2 des objectifs pour modifier le grossissement avec lequel les observations de l'échantillon à analyser sont réalisées. Par ailleurs, le microscope 14 est couplé optiquement au module d'analyse Raman 12. Le module d'analyse Raman 12 comprend essentiellement une source lumineuse 20, 5 ici un laser 20, pour émettre un faisceau lumineux afin de sonder l'échantillon. Le microscope 14 est équipé de moyens tels qu'un ensemble constitué d'un miroir 22, d'une lame semi-réfléchissante, d'un filtre coupe-bande 24, et de lentilles de focalisation 26, par exemple, permettant de diriger le faisceau lumineux émis par le laser vers l'échantillon à analyser et pour diriger le faisceau lumineux émis en retour par l'échantillon à analyser vers le module 10 d'analyse Raman 12. Dans le filtre coupe-bande 24, le faisceau lumineux émis par l'échantillon est filtré pour supprimer la composante spectrale du faisceau lumineux correspondant à la fréquence propre d'émission du laser. Le faisceau lumineux filtré traverse ensuite une fente 26 pour le focaliser, puis un 15 dispositif diffractant 28. Le faisceau diffracté est finalement capté au moyen d'un capteur lumineux 30, ici un capteur CCD (pour « Charge-Coupled Device », ou « dispositif à transfert de charge »). Dans les procédures standards d'analyse, les observations de l'échantillon sont faites: soit par imagerie en microscopie avec un éclairage en lumière blanche ; 20 soit par l'imagerie Raman. Une imagerie Raman implique nécessairement d'éteindre l'éclairage en lumière blanche, car le faisceau d'excitation et l'éclairage en lumière blanche utilisent le même chemin optique et donc l'utilisation de l'un exclut de fait celle de l'autre, ou au pire se perturbent mutuellement. 25 Le changement d'une imagerie à l'autre implique de fait un changement de focus qui peut conduire à des défaillances de performances dans les observations réalisées. Avec un faible grossissement, typiquement 5 fois, les observations peuvent permettre d'observer l'ensemble de la surface de l'échantillon à analyser, typiquement de l'ordre de lmm2, pour déterminer les zones d'intérêt de l'échantillon. Cependant, un faible grossissement ne permet 30 d'atteindre une résolution suffisante pour permettre d'atteindre les détails de l'échantillon, comme par exemple les cellules issues d'un prélèvement tissulaire. Avec un grossissement plus important, typiquement 50 fois, il est possible de visualiser les détails mêmes de l'échantillon en train d'être analysé, comme les cellules uniques de dimension comprise entre 10 et 200 iam issues d'un prélèvement tissulaire, et de placer le faisceau laser d'analyse de l'échantillon de manière précise. 3038713 3 Ainsi, l'utilisation d'un système d'imagerie connu, intégrant le dispositif 10, demande à un opérateur de changer constamment de mode de grossissement pour trouver des zones d'intérêt en faible grossissement et ensuite placer le faisceau laser précisément avec l'image obtenue en fort grossissement. Ce va-et-vient entre les faible et fort grossissements demande à 5 l'opérateur de faire correspondre mentalement les deux images. Ce travail est fastidieux et peut provoquer des biais d'observation, c'est-à-dire des erreurs d'observation. Outre l'inconvénient d'obliger un opérateur à passer constamment du faible grossissement au fort grossissement, avec le risque inhérent d'erreurs d'observations, le dispositif de spectroscopie de Raman 10 illustré sur la figure 1 est encombrant et également pas simple 10 d'utilisation du fait des réglages optiques préliminaires nécessaires pour mettre en oeuvre l'analyse proprement dite, ces réglages consistant par exemple en des alignements, la recherche de la position focale optimale qui n'est pas la même entre un bon focus pour la visualisation en microscopie et un bon focus pour l'analyse Raman. Il existe donc un besoin pour améliorer les dispositifs de spectroscopie, en particulier 15 ceux mettant en oeuvre une spectroscopie Raman, afin de pallier au moins certains des inconvénients susmentionnés. Le but de l'invention est de répondre au moins en partie à ce besoin. Exposé de l'invention Pour ce faire, l'invention propose un dispositif de spectroscopie comprenant : 20 un premier ensemble comprenant : - un porte-échantillon, de préférence plan, pour recevoir l'échantillon à analyser par spectroscopie, le porte-échantillon étant au moins partiellement translucide, - une source lumineuse d'éclairage de l'échantillon, apte à éclairer l' échantillon, 25 - un premier capteur de lumière pour recevoir la lumière émise par une source lumineuse d'éclairage de l'échantillon et traversant l'échantillon et le porte-échantillon, le premier capteur de lumière étant de préférence associé à un dispositif d'affichage de l'image captée par le premier capteur de lumière, - un deuxième ensemble comprenant : 30 - une source lumineuse d'analyse de l'échantillon, et/ou un deuxième capteur de lumière adapté à capter la lumière transmise à travers ou réfléchie par l'échantillon à analyser, - des moyens de collecte de la lumière diffusée par l'échantillon à analyser, excité par la lumière émise par la source lumineuse d'analyse, associés à un spectromètre pour analyser la lumière diffusée par l'échantillon à analyser. 3038713 4 Les éléments du premier ensemble sont montés solidaires en translation selon au moins une direction, de préférence selon deux directions comprises dans un plan parallèle au porte-échantillon, de préférence encore selon trois directions dont deux sont comprises dans un plan parallèle au porte-échantillon et la troisième est perpendiculaire aux deux autres, 5 Les éléments du deuxième ensemble sont montés solidaires en translation. Selon l'invention, le deuxième ensemble est indépendant en translation relative du premier ensemble selon au moins une direction, de préférence au moins deux directions comprises dans un plan parallèle au porte-échantillon, de préférence encore selon trois directions dont deux sont comprises dans un plan parallèle au porte-échantillon et la troisième est perpendiculaire aux 10 deux autres. Ainsi, l'invention consiste essentiellement à rendre l'ensemble intégrant le porte-échantillon, la source d'éclairage de l'échantillon et le détecteur (capteur de lumière) mobile par rapport à l'ensemble de mesure intégrant les éléments d'excitation de l'échantillon, de préférence un laser, et les éléments de collecte de cette lumière. 15 Autrement dit, selon l'invention, on découple le déplacement de la partie d'excitation de l'échantillon par rapport à celui de la partie d'imagerie proprement dite dans un dispositif de spectroscopie. Avantageusement et comme il apparaitra plus clairement à la lecture de la description qui va suivre, le dispositif de spectroscopie selon l'invention facilite grandement l'utilisation car, 20 contrairement avec les dispositifs selon l'état de l'art, un opérateur peut visualiser un échantillon simultanément en faible grossissement et en fort grossissement. Par ailleurs, le dispositif selon l'invention présente un encombrement plus faible que les dispositifs de spectroscopie de l'art antérieur, notamment dans la direction perpendiculaire au porte-échantillon. 25 En outre, un tel système est simple aussi bien en termes de réalisation que d'utilisation, et robuste. De préférence, le dispositif selon l'invention présente une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises seules ou en combinaison : - la source lumineuse d'éclairage de l'échantillon est apte à éclairer l'échantillon avec 30 une lumière d'incidence rasante, notamment avec un angle d'incidence compris entre 0° et 30°, - la source lumineuse d'éclairage de l'échantillon est intégrée au porte-échantillon. - la source lumineuse d'éclairage de l'échantillon comprend une ou plusieurs diodes situées, d'un même côté du plan du porte-échantillon, de préférence fixées sur le porte-échantillon, de préférence encore de part et d'autre d'une zone adaptée à recevoir l'échantillon à 35 analyser. 3038713 5 Avantageusement, le premier ensemble comprend en outre un premier système de lentilles optiques disposé entre le porte-échantillon et le premier capteur de lumière. Ce premier système de lentilles présente de préférence un grossissement compris entre 1 et 20, en particulier égal à 10. 5 Selon un mode de réalisation avantageux, le deuxième capteur de lumière est associé à un deuxième système de lentilles optiques disposé entre le porte-échantillon et le deuxième capteur de lumière, le deuxième système de lentilles optiques présentant de préférence un grossissement différent, notamment supérieur, au grossissement du premier système de lentilles optiques. Ce deuxième système de lentilles présente de préférence un grossissement compris entre 10 20 et 100, en particulier égal à 50. De préférence, la source lumineuse d'analyse de l'échantillon est un laser, associé de préférence à un collimateur du faisceau émis par le laser, disposé entre le laser et le porte-échantillon. Le deuxième système de lentilles optiques est avantageusement disposé entre le laser 15 de préférence entre le collimateur, et le porte-échantillon. Selon une variante de réalisation avantageuse, les moyens de collecte comprennent au moins l'un parmi un séparateur du faisceau provenant de l'échantillon à analyser, un filtre coupe-bande et une lentille de collimation. De préférence au moins l'un, de préférence encore les deux capteurs de lumière sont 20 des capteurs CMOS, de préférence encore reliés à des écrans d'affichage. Selon un autre aspect, l'invention se rapporte à un procédé de spectroscopie notamment procédé de spectroscopie Raman, mis en oeuvre au moyen d'un dispositif de spectroscopie décrit précédemment, comprenant les étapes consistant à : (i) exciter un échantillon à analyser au moyen d'un faisceau émis par la source 25 lumineuse d' analyse, (ii) collecter la lumière diffusée par l'échantillon à analyser suite à l'excitation par le faisceau émis par la source lumineuse d'analyse, et (iii) analyser la lumière collectée à l'aide du spectroscope. De préférence, le procédé comprend deux étapes préalables à l'étape (i) et consistant 30 à: a) déterminer une zone d'intérêt de l'échantillon à analyser éclairé à l'aide de la source lumineuse d'éclairage de l'échantillon, notamment à partir de l'image affichée par le dispositif d'affichage de l'image captée par le premier capteur de lumière, et b) éteindre la source lumineuse d'éclairage de l'échantillon. 3038713 6 Les avantages du dispositif selon l'invention sont nombreux. En particulier, le dispositif selon le mode intégrant le deuxième capteur de lumière, le deuxième système de lentilles optiques à grossissement supérieur, au grossissement du premier système de lentilles optiques présente de nombreux avantages parmi lesquels : 5 - la possibilité de visualiser en simultanée le faisceau laser, l'échantillon et ce avec deux grossissement différents, ce qui n'a jamais été réalisé pour un dispositif de spectroscopie Raman, ni même pour le seul système d'imagerie; - une visualisation en faible grossissement avec un éclairage, avantageusement en lumière rasante, de l'échantillon, qui est indépendante des déplacements selon les trois directions 10 X, Y, Z. Cette configuration est donc robuste parce qu'elle ne nécessite pas de vérification d'alignement des optiques. Un tel système n'a jamais été réalisé dans un dispositif de spectroscopie Raman selon l'état de l'art, dans lequel au contraire le champ de visualisation, change avec le déplacement en X et Y et la focale change avec le déplacement en Z; - une visualisation en fort grossissement, avantageusement en lumière rasante de 15 l'échantillon, qui permet de suivre les déplacements selon deux directions X et Y sur l'échantillon tout en étant dépendante de la position selon la direction restante Z. Cette visualisation fort grossissement associée à une image grand champ évite un va et vient incessant entre les deux grossissements comme sur les dispositifs selon l'état de l'art; - une analyse Raman possible en choisissant une région d'intérêt soit à partir de 20 l'image faible grossissement, soit à partir de l'image fort grossissement. En choisissant l'image faible grossissement, il est possible de choisir des régions d'analyse sans être limité par le champ dimensionné par le choix du grossissement via l'objectif choisi et en ayant toujours la région d'intérêt comprise dans l'image. Cette possibilité n'est pas envisageable avec les dispositifs selon l'état de l'art dans lesquels l'analyse Raman se fait exclusivement à partir d'une image fort 25 grossissement dimensionné par le choix de l'objectif utilisé in fine pour l'analyse Raman. Une application importante du dispositif selon ce mode de réalisation de l'invention est l'analyse de tissus sur lame. En effet, une image en grand champ permet de localiser plus facilement et rapidement les zones tumorales ou non sur la lame, de définir des régions d'investigation, à l'aide de l'image en fort grossissement si nécessaire, de positionner précisément 30 le faisceau laser d'excitation sur les zones d'intérêt afin de les analyser par une spectroscopie Raman. Le dispositif selon l'invention est avantageusement compact, robuste, simple d'utilisation et automatisé de sorte qu'il peut être installé comme outil d'analyse dans les hôpitaux, les laboratoires d'analyse et les cabinets médicaux privés. 35 3038713 7 Description détaillée L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, à l'appui des dessins ci-annexés, sur lesquels : - la figure 1 représente schématiquement en vue partiellement arrachée un dispositif 5 de spectroscopie connu ; - la figure 2 représente schématiquement un exemple de dispositif de spectroscopie selon l'invention ; - la figure 3 représente schématiquement un porte-échantillon avec un système pour l'éclairage rasant intégré, pouvant être mis en oeuvre dans le dispositif de spectroscopie de la 10 figure 2 ; - les figures 4 à 7 illustrent des observations réalisées sur des prélèvements de tissus issus de biopsie, au moyen du dispositif de spectroscopie de la figure 2 ; - la figure 8 représente un exemple de spectre Raman acquis avec le dispositif de spectroscopie de la figure 2, à partir de l'observation de la figure 6. 15 La figure 1 a déjà été décrite en préambule, elle n'est donc pas détaillée ci-après. Sur la figure 2, il est représenté un dispositif de spectroscopie 100 selon l'invention. Ce dispositif de spectroscopie comporte essentiellement un système d'imagerie 102 et un spectromètre 104 relié optiquement au système d'imagerie 102, par exemple au moyen d'une fibre optique 106. La fibre optique 106 est par exemple une fibre commercialisée sous la dénomination 20 « Thorlabs M18L01, 105pm 0,22NA », tandis que le spectromètre est par exemple un spectromètre « Tornado Spectral System HyperFlux Ul ». Tel qu'illustré, le système d'imagerie 102 comporte tout d'abord un porte-échantillon 108 destiné à recevoir un échantillon à analyser. Il est à noter ici que l'échantillon à analyser est de préférence une biopsie, c'est-à-dire obtenu par prélèvement, le dispositif de spectroscopie de la 25 figure 2 ne visant pas a priori l'analyse in vivo directement sur patient. Typiquement, l'échantillon peut avoir une épaisseur comprise entre 5 et 200pm, correspondant à l'épaisseur de la biopsie. Le porte-échantillon 108 peut prendre la forme d'une lame, translucide ou, mieux, transparente, au moins par endroits, notamment à des endroits où elle reçoit l'échantillon à 30 analyser. Notamment, la lame porte-échantillon 108 peut être translucide ou transparente dans une portion centrale, par exemple au niveau d'un disque central, le reste de la lame porte-échantillon 108 étant quant à lui opaque. La lame porte-échantillon 108 peut être munie de moyens pour fixer, au moins temporairement, l'échantillon à analyser en position sur la lame porte-échantillon 108. Ces moyens de fixation peuvent par exemple prendre la forme de languettes métalliques, pliées 35 pour contraindre l'échantillon à analyser contre la lame porte-échantillon 108. La lame porte- 3038713 8 échantillon 108 est par exemple réalisée au moyen d'un substrat transparent ou semi-transparent présentant un taux de transmission d'au moins 30% dans la gamme spectrale 400-700 nm. Un exemple de lame porte-échantillon 108 est représenté schématiquement sur la figure 3. Cette lame porte échantillon 108 a sensiblement la forme d'une lame sensiblement plane 5 1081 présentant un sillon central 1082 formant un logement de réception de l'échantillon à tester. Le fond du sillon central 1082 définit un plan de la lame porte-échantillon 108. En son centre, le sillon central 1082 présente un trou traversant 1083. Ce trou traversant 1083 permet de fixer le porte-échantillon à un objectif par exemple un objectif de type grand angle comme celui commercialisé sous la dénomination « NAVITAR NMV-6WA 6 mm F/1.4 1/2" M30.5 Wide 10 Angle ». Autour de ce trou central 1083, la lame porte-échantillon 108 présente deux bourrelets 1084 présentant des ouvertures 1085 conformées pour recevoir des diodes électroluminescentes (LED), de telle sorte que ces diodes électroluminescentes éclairent l'échantillon avec une lumière d'incidence rasante. Ces diodes électroluminescentes forment une première source lumineuse 110 du 15 système d'imagerie 102. Cette première source lumineuse 110 permet d'éclairer l'échantillon à analyser avec une lumière d'incidence rasante. Par incidence rasante, on entend une lumière présentant un angle d'incidence, mesuré dans un plan perpendiculaire au plan de la lame porte-échantillon 108 - c'est-à-dire le plan de la figure 2 - sur l'échantillon à analyser ou la lame porte-échantillon 108 compris entre 0° et 30°, de préférence compris entre 0° et 15°, de préférence 20 encore compris entre 0° et 5°. Ici, comme indiqué précédemment, cette première source lumineuse 110 est réalisée sous la forme de diodes électroluminescentes, orientée sensiblement parallèlement au plan du porte-échantillon 108. Les LED sont toutes disposées d'un même côté de la lame porte-échantillon 108, c'est-à-dire dans un même demi-espace délimité par le plan de la lame porte- 25 échantillon 108. Cependant, les LED sont de préférence disposées de part et d'autre de la lame porte-échantillon 108, pour pouvoir éclairer l'échantillon avec des angles d'incidence différents, mesurés cette fois-ci dans un plan parallèle au plan de la lame porte-échantillon 108. La première source lumineuse 110 est par exemple réalisée par 4 LED « Nichia 30 NSPW510DS » disposées en parallèle qui éclairent à la droite de l'échantillon sur la figure 2, et de 4 LED « Nichia NSPW510DS » disposées en parallèle qui éclairent à la gauche de l'échantillon sur la figure 2. Le système d'imagerie 102 comporte encore un premier capteur de lumière 112 pour recevoir la lumière émise par l'échantillon à analyser suite à l'excitation par la première source 35 lumineuse 110. Ici, ce premier capteur de lumière 112 est disposé du côté opposé de la lame 3038713 9 porte-échantillon 108 par rapport à la première source lumineuse pour capter la lumière émise par la première source lumineuse 110 qui a traversé l'échantillon à analyser. En d'autres termes, le premier capteur de lumière 112 et la source lumineuse 110 sont disposés dans deux demi-espaces distincts, délimités par le plan de la lame porte-échantillon 108. 5 Le premier capteur de lumière 112 peut être relié à un écran d'affichage (non représenté) pour afficher l'image captée. L'opérateur peut ainsi visualiser en continu l'image captée par ce premier capteur de lumière 112. Pour être facilement relié à un écran d'affichage, le premier capteur de lumière 112 peut notamment être du type CMOS (de l'anglais «Complementary Metal Oxide Semiconductor »). Le premier capteur de lumière est par exemple 10 un capteur CMOS « Mightex BCN-0050-U Color 5MP USB2.0 de 2592 X 1944 pixels » (2,2 pm X 2,2 pm pixel size). Avantageusement, un premier système de lentilles optiques 114 est interposé entre la lame porte-échantillon 108 et le premier capteur de lumière 112, notamment pour permettre de visualiser l'échantillon à tester avec un grandissement donné, éventuellement réglable. 15 Ici, on choisit un premier système de lentilles optiques 114 permettant au premier capteur de lumière 112 de capter une image étendue, notamment complète, de l'échantillon à analyser. En d'autres termes, on choisit le premier système de lentilles optiques 114 de telle sorte qu'il présente un grossissement relativement faible, et donc un grand champ. Notamment, le grossissement du premier système de lentilles optiques 114 peut être compris entre 1 et 20, et plus 20 particulièrement être égal à 2. Le premier système de lentilles optiques 114 est par exemple constitué par un objectif grand angle « NAVITAR NMV-6WA 6 mm F/1.4 1/2" M30.5 Wide Angle », placé en dessous de l'échantillon à analyser, comme représenté à la figure 2, et à une distance de travail de 6 mm de cet échantillon à analyser. Tel qu'illustré à la figure 2 et de manière particulièrement avantageuse la lame porte- 25 échantillon 108, la première source lumineuse 110, le premier capteur de lumière 112 et le premier système de lentilles optiques 114 forment un premier ensemble 116 solidaire, notamment solidaire en translation. Ici, ce premier ensemble 116 est solidaire en translation selon trois directions, deux directions étant parallèles au plan de la lame porte-échantillon 108, et la troisième étant 30 perpendiculaire aux deux autres. Ceci est réalisé ici en fixant les éléments susmentionnés de l'ensemble 116 les uns par rapport aux autres, et en montant l'ensemble 116 sur une platine 118 de translation selon trois directions telles que décrites ci-avant. Une telle platine peut par exemple être réalisée par la combinaison d'une platine motorisée « PI micos P-622.Z PIHera® Precision Z-Stage » pour assurer les déplacements selon 35 l'axe perpendiculaire au plan de la lame porte-échantillon 108, fixée sur deux platines « PI micos 3038713 10 Translation Stage VT-80, 50 mm travel range » pour réaliser les translations dans un plan parallèle au plan de la lame porte-échantillon. Une telle platine de translation 118 permet de déplacer tout l'ensemble 116 de manière solidaire, sans mouvement d'un élément de l'ensemble 116 par rapport à un autre. Ceci permet notamment au premier capteur de lumière 112 de capter 5 une image identique de l'échantillon, quels que soient les déplacements de l'échantillon à analyser réalisés à l'aide de la platine de translation 118. Le système d'imagerie 102 comprend par ailleurs une source lumineuse d'analyse de l'échantillon 120. Ici, cette source lumineuse d'analyse de l'échantillon prend la forme d'un laser 120, en particulier d'un laser « Spectra-Physics EXLSRONE-532FC-80, 80 mW monomode » 10 longitudinal à 532 nm, modulable entre 0 et 80 mW monomode. Cette source lumineuse d'analyse de l'échantillon 120 est ici distincte de la première source lumineuse 110. Ce laser 120 est ici associé à un premier dispositif de collimation 122 pour diriger le faisceau lumineux émis par le laser 120 vers une lame semi-réfléchissante 124. La lame semiréfléchissante 124 permet de diriger le faisceau laser vers l'échantillon à analyser, via un 15 deuxième système de lentilles optiques 126. Ici, le deuxième système de lentilles optiques 126 prend la forme d'un objectif, pouvant éventuellement être changé, d'un microscope 128 incluant la lame semi-réfléchissante 124. À titre d'exemple, la lame semi-réfléchissante 124 peut être une lame « OPTOPRIM RazorEdge Dichroic beamsplitter LPD01-532RU-25x36x1.1 », le premier dispositif de 20 collimation 122 un collimateur « Micro Laser Systems F-H10-VIS-APC », et le deuxième de système de lentilles optiques 126 un objectif « Olympus 50x LMPLFLN, NA 0,5 - WD 10,6 mm - FN 26.5 ». La lumière émise par l'échantillon à analyser suite à l'excitation au moyen du faisceau émis par le laser 120 traverse la lame semi-réfléchissante 124, puis est collecté par des 25 moyens de collecte 130. Ces moyens de collecte 130 peuvent notamment comporter au moins l'un parmi une lame divisant le faisceau collecté, notamment la lame semi-réfléchissante 124, un filtre coupe-bande, pour atténuer voire supprimer la longueur d'onde correspondant à celle du laser 120, et une lentille de collimation. Le filtre coupe-bande est par exemple un filtre « OPTOPRIM StopLine 30 single-notch filter NF03-532E-25 », la lentille de collimation est connue sous la dénomination « Thorlabs AC254-030-ML ». Les moyens de collecte 130 sont reliés optiquement, par l'intermédiaire d'une fibre de collection, au spectromètre 104, lequel peut ainsi mesurer l'intensité des différentes longueurs d'onde présentent dans la lumière émise par l'échantillon et en déduire le spectre d'émission. 3038713 11 Par ailleurs, le système d'imagerie 102 tel qu'illustré sur la figure 2, comporte un deuxième capteur de lumière 132 adapté à capter la lumière émise par la première source lumineuse 110 et/ou le laser 120 et réfléchie par l'échantillon à analyser. Pour pouvoir effectivement capter ces lumières, le deuxième capteur de lumière 132 5 est associé à la lame semi-réfléchissante 124 qui permet d'orienter une partie du faisceau lumineux provenant de l'échantillon à analyser vers le deuxième capteur de lumière 132. Ce deuxième capteur de lumière 132 peut également être du type CMOS et relié à un écran d'affichage pour permettre à un opérateur de visualiser en temps réel l'image captée par ce deuxième capteur de lumière 132. Le deuxième capteur de lumière 132 est par exemple également 10 un capteur CMOS « Mightex BCN-0050-U Color 5MP USB2.0 de 2592 X 1944 pixels » (2,2 pm X 2,2 pm pixel size). De préférence, le deuxième capteur de lumière 132 est associé au système de lentilles optiques 126 ici formé par l'objectif du microscope 128, disposé optiquement entre l'échantillon à analyser et le deuxième capteur de lumière 132. Ce deuxième système de lentilles optique 126 15 permet d'appliquer un grossissement fixe ou réglable à l'image effectivement captée par le deuxième capteur de lumière 132. Ce grossissement est de préférence choisi différent du grossissement du premier système de lentilles optiques 114, pour permettre à l'opérateur d'afficher deux images distinctes, notamment présentant un grossissement différent, de l'échantillon à analyser. Le deuxième 20 système de lentilles optiques 126 présente par exemple un plus fort grossissement que le premier système de lentilles optiques 114 et donc, un champ réduit mais avec une meilleure résolution. À titre d'exemple, le deuxième système de lentilles optiques 126 présente un grossissement compris entre 5 et 100, par exemple égal à 50. Un tel grossissement permet de capter au moyen du deuxième capteur de lumière 132 une image agrandie, et donc plus résolue, de 25 l'échantillon à analyser, notamment une image permettant de différencier les cellules de l'échantillon à analyser. Un système de collimation 134, notamment une lentille de collimation, est ici prévue entre le deuxième système à lentilles optiques 126 et le deuxième capteur de lumière 132 pour focaliser la lumière transmise par la lame semi-réfléchissante 124 vers le deuxième capteur de lumière 132. Ce système de collimation 134 peut notamment prendre la forme d'une 30 lentille de collimation « Thorlabs AC254-050-ML». Le deuxième ensemble 136 comportant notamment le laser 120, le dispositif de collimation 122, la lame semi-réfléchissante 124, le deuxième système de lentilles optiques 128, les moyens de collecte 130, le deuxième capteur de lumière 132 et le système de collimation 134 est solidaire, notamment solidaire en translation selon une direction comprise dans un plan 35 parallèle au plan de la lame porte-échantillon 108, de préférence dans deux directions comprises 3038713 12 dans ce plan, de préférence encore dans trois directions, dont deux sont comprises dans un plan parallèle au plan de la lame porte-échantillon 108 et une est perpendiculaire à ces deux directions. Ce deuxième ensemble 136 peut être déplacé, au moins selon une direction, de préférence selon deux, de préférence encore selon trois directions, par rapport à l'ensemble 116. On peut ainsi 5 déplacer le faisceau émis par le laser 120 par rapport à l'échantillon à analyser et/ou améliorer la netteté de l'image captée par le deuxième capteur de lumière 132 et déplacer la position de la fibre de collecte, afin d'améliorer la qualité du signal Raman. Ainsi, dans le dispositif de spectroscopie 100 de la figure 2, le premier capteur de lumière 112 capte un signal sensiblement constant provenant de l'échantillon à analyser, quels que 10 soient les déplacements du deuxième ensemble 136 par rapport au premier ensemble 116, tandis que le deuxième capteur de lumière 132, lui, capte un signal qui varie en fonction de ces déplacements. Le dispositif de spectroscopie 100 permet ainsi de fournir à l'utilisateur simultanément une vue grand champ (par exemple un champ de l'ordre de 1 x 1 cm2) de 15 l'échantillon à analyser pour définir les zones d'intérêt (qui ont des dimensions de l'ordre de 100 x 1001=2), et une vue en fort grossissement (par exemple un champ de l'ordre 100 x 100 i_tm2) pour placer le faisceau laser d'excitation très précisément sur les zones d'intérêt. Le dispositif de spectroscopie 100 est en outre compact, simple d'utilisation, robuste et automatisable, permettant ainsi de le mettre en oeuvre comme outil d'analyse dans les hôpitaux, 20 les laboratoires d'analyse, et les cabinets médicaux privés comme outil de complément et d'aide rapide au diagnostic et/ou de détermination d'un traitement. Le dispositif de spectroscopie 100 permet de mettre en oeuvre le procédé de spectroscopie comprenant les étapes suivantes : (i) exciter un échantillon à analyser au moyen d'un faisceau émis par la source 25 lumineuse d'analyse, (ii) collecter la lumière émise par l'échantillon à analyser suite à l'excitation par le faisceau émis par la source lumineuse, et (iii) analyser de la lumière collectée à l'aide du spectroscope. Dans le cas d'un procédé de spectroscopie Raman, la lumière collectée est filtrée pour 30 supprimer la longueur d'onde de la source de lumière d'analyse. Cependant, d'autres procédés de spectroscopies peuvent également être mises en oeuvre dans un tel dispositif. Par exemple, la lumière émise par l'échantillon à analyser peut être une lumière de fluorescence. Selon un autre exemple, la source de lumière d'analyse émet une longueur d'onde infrarouge. Le procédé de spectroscopie peut en outre comprendre deux étapes préalables à 35 l'étape (i) ci-dessus, consistant à : 3038713 13 a) déterminer une zone d'intérêt de l'échantillon à analyser éclairé à l'aide de la source lumineuse 110 d'éclairage de l'échantillon, notamment à partir de l'image affichée par le dispositif d'affichage de l'image captée par le premier capteur de lumière 112, et b) éteindre la source lumineuse 110 d'éclairage de l'échantillon. 5 Ainsi, un opérateur peut visualiser une image grand champ de l'échantillon, invariable, éclairé en permanence par la source lumineuse 110 d'éclairage de l'échantillon et déterminer à l'aide de l'image affichée correspondante, les zones d'intérêt de l'échantillon à analyser. Le déplacement de l'échantillon à analyser (en fait du porte-échantillon) par rapport à la source lumineuse d'analyse 120 est également réalisé en conservant allumée la source lumineuse 10 110 d'éclairage de l'échantillon, l'image grand champ affichée restant identique. Il est ainsi plus facile pour l'opérateur de repérer les zones d'intérêt et de disposer correctement l'échantillon par apport à la source lumineuse d'analyse 120. Cette source lumineuse d'analyse 120 peut également être allumée durant la recherche de zones d'intérêt de l'échantillon, afin d'assurer un positionnent correct de l'échantillon. Ensuite, une fois ce positionnement correct de l'échantillon à tester avec 15 une zone d'intérêt excité par la source lumineuse d'analyse 120, l'opérateur peut éteindre la source lumineuse 110 d'éclairage de l'échantillon et procéder à une analyse spectroscopique à l'aide de la source lumineuse d'analyse. Une fois l'analyse terminée, la source lumineuse 110 peut être allumée à nouveau afin de permettre un nouveau cycle d'analyse. 20 Le dispositif de spectroscopie 100 a été mis en oeuvre pour réaliser la collection en simultané de l'image grand champ et des images petit champ (respectivement avec un objectif de grossissement 20x et 50x) des figures 4 et 5. Sur la figure 6, le laser est en fonctionnement, l'analyse par spectrométrie étant en cours de réalisation. Ces figures illustrent des analyses par spectrométrie Raman de biopsies de la 25 prostate. Comme cela est visible sur ces figures, l'image grand champ, à gauche sur ces figures, est la même dans les trois cas, tandis que l'image à fort grossissement est différente. Ce dernier point s'explique par un déplacement de l'échantillon à analyser par rapport à l'objectif du microscope utilisé, ce déplacement pouvant notamment permettre d'aligner précisément le faisceau Laser sur les cellules ou tissus à analyser. 30 La figure 7 illustre un exemple de visualisation d'un prélèvement de tissu chez une souris implantée avec carcinome HNSCC (« Head and Neck Squamous Cell Carcinoma »). La figure 8 représente le spectre Raman de cette visualisation. Il est à noter que l'objectif ici est la caractérisation des lames de biopsie par spectroscopie Raman. Cependant, grâce aux premier et/ou au deuxième capteurs de lumière, il est 35 envisageable de coupler l'information du spectre avec une caractérisation morphologique 3038713 14 parallèle, à partir de l'analyse soit de l'image grand champ, soit plutôt de l'image petit champ selon la résolution atteinte. La présente invention ne se limite cependant pas au seul exemple décrit ci-avant en regard de la figure 2 et de nombreuses variantes peuvent être réalisées. 5 Par exemple, on peut imaginer de réaliser une analyse Raman avec uniquement le premier capteur de lumière, à l'exclusion du deuxième capteur de lumière. Cette solution peut rendre le dispositif de spectroscopie encore plus compact et simple à mettre en oeuvre. À la place du deuxième capteur de lumière, un deuxième système d'analyse peut être prévu. Ce deuxième système d'analyse est ainsi couplé avec le spectromètre Raman. Ce deuxième 10 système d'analyse peut notamment être du type à imagerie de phase, à imagerie de fluorescence, notamment d'imagerie d'auto-fluorescence, à spectroscopie infrarouge, LIB S (de l'anglais « Laser Induced Breakdown Spectroscopy »), à spectroscopie UV. En outre, le spectromètre ici mis en oeuvre est adapté à réaliser une spectroscopie de type Raman. Il peut cependant être remplacé par tout dispositif permettant de réaliser une analyse 15 par spectroscopie infrarouge ou par spectroscopie de fluorescence, notamment. REVENDICATIONS1. Dispositif de spectroscopie (100) comprenant : un premier ensemble (116) comprenant : - un porte-échantillon (108), de préférence plan, pour recevoir l'échantillon à analyser par spectroscopie, le porte-échantillon (108) étant au moins partiellement translucide, - une source lumineuse (110) d'éclairage de l'échantillon, apte à éclairer l'échantillon, - un premier capteur de lumière (112) pour recevoir la lumière émise par une source lumineuse (110) d'éclairage de l'échantillon et traversant l'échantillon et le porte- échantillon (108), le premier capteur de lumière (112) étant de préférence associé à un dispositif d'affichage de l'image captée par le premier capteur de lumière (112), un deuxième ensemble (136) comprenant : - une source lumineuse d'analyse de l'échantillon (120), et/ou un deuxième capteur de lumière (132) adapté à capter la lumière transmise à travers ou réfléchie par l'échantillon à analyser, - des moyens (130) de collecte de la lumière diffusée par l'échantillon à analyser, excité par la lumière émise par la source lumineuse d'analyse (120), associés à un spectromètre (104) pour analyser la lumière diffusée par l'échantillon à analyser, dispositif dans lequel les éléments du premier ensemble (116) sont montés solidaires en translation selon au moins une direction, de préférence selon deux directions comprises dans un plan parallèle au porte-échantillon (108), de préférence encore selon trois directions dont deux sont comprises dans un plan parallèle au porte-échantillon (108) et la troisième est perpendiculaire aux deux autres, dans lequel les éléments du deuxième ensemble (136) sont montés solidaires en translation, et dans lequel le deuxième ensemble (136) est indépendant en translation relative du premier ensemble (116) selon au moins une direction, de préférence au moins deux directions comprises dans un plan parallèle au porte-échantillon (108), de préférence encore selon trois directions dont deux sont comprises dans un plan parallèle au porte-échantillon (108) et la troisième est perpendiculaire aux deux autres. 2. Dispositif de spectroscopie selon la revendication 1, dans lequel la source lumineuse (110) d'éclairage de l'échantillon est apte à éclairer l'échantillon avec une lumière d'incidence rasante, notamment avec un angle d'incidence compris entre 0° et 30°. 3038713 16 3. Dispositif de spectroscopie selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la source lumineuse (110) d'éclairage de l'échantillon est intégrée au porte-échantillon. 5 4. Dispositif de spectroscopie selon l'une des revendications précédentes, la source lumineuse (110) d'éclairage de l'échantillon comprenant une ou plusieurs diodes situées, d'un même côté du plan du porte-échantillon (108), de préférence fixées sur le porte-échantillon (108), de préférence encore de part et d'autre d'une zone adaptée à recevoir l'échantillon à analyser. 10 5. Dispositif de spectroscopie selon l'une des revendications précédentes, le premier ensemble (116) comprenant en outre un premier système de lentilles optiques (114) disposé entre le porte-échantillon (108) et le premier capteur de lumière (112). 6. Dispositif de spectroscopie selon la revendication 5, dans lequel le premier 15 système de lentilles (114) présente un grossissement compris entre 1 et 20, en particulier égal à 10. 7. Dispositif de spectroscopie selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le deuxième capteur de lumière (132) est associé à un deuxième système de lentilles 20 optiques (126) disposé entre le porte-échantillon (108) et le deuxième capteur de lumière (132), le deuxième système de lentilles optiques (126) présentant de préférence un grossissement différent, notamment supérieur, au grossissement du premier système de lentilles optiques (114). 8. Dispositif de spectroscopie selon la revendication 7, dans lequel le deuxième 25 système de lentilles (126) présente un grossissement compris entre 20 et 100, en particulier égal à 50. 9. Dispositif de spectroscopie l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la source lumineuse d'analyse de l'échantillon est un laser (120), associé de préférence à un 30 collimateur (122) du faisceau émis par le laser (120), disposé entre le laser (120) et le porte- échantillon (108). 10. Dispositif de spectroscopie selon les revendications 7 et 9, dans lequel le deuxième système de lentilles optiques (126) est disposé entre le laser (120), de préférence entre le collimateur, et le porte-échantillon (108). 3038713 17 11. Dispositif de spectroscopie selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens de collecte (130) comprennent au moins l'un parmi un séparateur du faisceau provenant de l'échantillon à analyser, un filtre coupe-bande et une lentille de collimation. 5 12. Dispositif de spectroscopie selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel au moins l'un, de préférence les deux capteurs de lumière (112 ; 132) sont des capteurs CMOS, de préférence encore reliés à des écrans d'affichage. 10 13. Procédé de spectroscopie, notamment procédé de spectroscopie Raman, mis en oeuvre au moyen d'un dispositif de spectroscopie selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant les étapes consistant à : (i) exciter un échantillon à analyser au moyen d'un faisceau émis par la source lumineuse d'analyse (120), 15 (ii) collecter la lumière diffusée par l'échantillon à analyser suite à l'excitation par le faisceau émis par la source lumineuse d'analyse (120), et (iii) analyser la lumière collectée à l'aide du spectroscope (104). 14. Procédé de spectroscopie selon la revendication 13, comprenant deux 20 étapes préalables à l'étape (i) et consistant à : a) déterminer une zone d'intérêt de l'échantillon à analyser éclairé à l'aide de la source lumineuse (110) d'éclairage de l'échantillon, notamment à partir de l'image affichée par le dispositif d'affichage de l'image captée par le premier capteur de lumière (112), et b) éteindre la source lumineuse (110) d'éclairage de l'échantillon. 25