Brevet FR3037340A1 — publié le 20161216

Méthode de pronostic d'hémopathies lymphoïdes La présente invention concerne une méthode de pronostic d'hémopathies lymphoïdes, notamment des leucémies lymphoïdes et des lymphomes. Les anticorps monoclonaux ont révolutionné la prise en charge thérapeutique dans 5 un grand nombre de pathologie incluant les cancers et les maladies dysimmunitaires. Le rituximab (MabThera0) a permis par exemple d'améliorer la survie des patients atteints d'un lymphome ou d'une leucémie lymphoïde chronique et la qualité de vie des patients atteints d'une maladie dysimmunitaire. Le rituximab est une immunoglobuline IgG1 chimérique reconnaissant le CD20 10 exprimé par les lymphocytes B du stade pro-lymphocyte au stade plasmocytaire. Différents mécanismes d'action du rituximab ont été décrits in vitro, les uns dépendants de sa portion variable Fv (apoptose), les autres de sa portion constante Fc (ADCC, CDC, phagocytose). FcyRIlla est exprimé par les cellules tueuses naturelles (cellules NK) et les macrophages, cellules effectrices de la cytotoxicité à médiation cellulaire 15 dépendante des anticorps (ADCC). Il a été montré qu'un polymorphisme du gène FCGR3A conduisant à une substitution de l'acide aminé 158 sur le récepteur (FcgammaRIlla-158VF) permettait de distinguer les patients bons répondeurs (homozygote 158-V) au rituximab des patients moins bons répondeurs (homozygote 158-F et hétérozygote). 20 En particulier, il est connu de la demande de brevet W02003035904 que la détermination du génotype FCGR3A d'un sujet peut être utilisée pour des patients souffrant de tumeurs malignes, notamment de lymphome, et convient à la sélection des meilleurs sujets répondants et/ou à l'ajustement de condition de traitement ou de protocole pour les sujets répondants à profil de réponse faible. 25 Malgré tout, les mécanismes d'action des anti-CD20 in vivo restent mal compris et pourrais être différents en fonction de la pathologie. De plus, il est important de noter que la prédiction de l'efficacité par l'analyse du polymorphisme FcgammaRIlla-158VF n'est actuellement pas d'usage clinique puisque 67% des patients avec un phénotype défavorable répondent quand même au rituximab. Il existe donc un intérêt à mieux 30 comprendre les mécanismes d'action afin de proposer de nouvelles stratégies d'amélioration du traitement mais aussi pour mieux sélectionner les patients qui pourraient ne pas répondre à ce type de traitement onéreux afin de les orienter vers d'autres alternatives thérapeutiques. Il existe parmi les cellules de l'immunité des lymphocytes B sécréteurs 35 dl'interleukine-10 (IL-10) (cellules B10), une cytokine immunomodulatrice ayant notamment pour fonction de limiter la réponse T cytotoxique. Ces cellules sont présentes chez la souris et chez l'homme. Les lymphocytes B tumoraux peuvent 3037340 - 2 - présenter une fonction B10, à savoir sécréter de l'IL-10. Il a été montré que la présence de cellules B10 dans les lymphomes interférait avec la réponse au traitement par un anti-CD20 murie- il-iorikawa et al. J Clin Invest. 2011 Nov 1; 121(11): 4268-4280). Toutefois, la quantité de cellules B10 n'a pas été reliée à 5 la réponse thérapeutique des patients traités avec un anticorps anti CD20 dans la mesure où l'étude a été menée chez la souris. Par ailleurs l'activité biologique des différents isotypes d'immunoglobulines ainsi que l'expression des récepteurs à la portion Fc des immunoglobulines sont très différentes entre l'homme et la souris. L'extrapolation des résultats obtenus chez la souris à l'homme n'est donc pas possible 10 et en aucun cas les résultats obtenus dans un modèle murin ne sont applicables à l'homme sans démonstration en clinique. La compréhension de la réponse à l'immunothérapie demeure, et il est nécessaire de disposer d'éléments permettant d'adapter le traitement des patients. Un des buts de l'invention est de palier ces inconvénients. 15 Un autre but de l'invention est de fournir une méthode de pronostic permettant simplement et rapidement de déterminer quel protocole thérapeutique appliquer dans une situation pathologique donnée, en tenant compte des chances de succès et en vue de limiter les coûts liés aux échecs thérapeutiques. Encore un autre but de l'invention est de fournir une trousse ou un kit de pronostic 20 permettant de mettre en oeuvre ladite méthode. L'invention concerne une méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie, ledit anticorps étant un anticorps déplétant les cellules de ladite hémopathie, 25 la méthode comprenant la détermination in vitro de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10 dans ledit échantillon tumoral, de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral, ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 inférieure à 5% de la quantité totale de cellule du dit échantillon aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des 30 cellules de ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique. L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs d'une part que les hémopathies susmentionnées présentent une population de cellules B sécrétant de l'IL-10, et d'autre part que la quantité de ces cellules influe sur le pronostic du patient s'il est traité avec un anticorps thérapeutique. En outre, les inventeurs ont 35 constaté que plus la quantité de cellules sécrétant de l'IL-10 est faible avant le traitement, meilleure sera la réponse au traitement, et donc meilleur sera le pronostic du patient. 3037340 - 3 - En particulier, les inventeurs ont pu montrer que si la quantité de cellules sécrétant de l'IL-10 est inférieure à 5% du nombre total des cellules circulantes de l'hémopathie, le pronostic du patient après traitement sera favorable dans plus de la moitié des cas. Dans le cadre de l'invention on entend par « échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie », un prélèvement de sang, ou une biopsie dont tout ou partie de du prélèvement ou de la biopsie comprend des cellules tumorales. L'échantillon tumoral susmentionné est obtenu chez le patient avant le début du traitement visant à éradiquer l'hémopathie. Les hématies, cellules anucléées, ne sont pas prises en considération. La méthode de pronostic de l'invention concerne des anticorps thérapeutiques ou plus généralement anticorps. Les deux appellations seront utilisées ci-après, à moins de précisions spécifiques. On considère comme « anticorps thérapeutique » un anticorps dont la fonction est de d'éliminer des cellules cibles déterminées chez un individu ou un patient. Les exemples de cellules cibles sont des cellules tumorales, des cellules infectées par un ou plusieurs virus, des cellules immunocompétentes pathologiques (par exemple des lymphocytes B ou T, des cellules présentatrices d'antigènes...) impliquées dans les allergies, les maladies autoimmunes... voire même des cellules normales (cas des cellules endothéliales dans une stratégie thérapeutique anti angiogénique). Les cellules cibles préférées sont les cellules tumorales et les cellules infectées. Les anticorps thérapeutiques d'isotype IgG1 tel que le rituximab peuvent médier une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps ou ADCC, mais aussi une phagocytose cellulaire dépendante des anticorps ou ADPC et une lyse cellulaire complément dépendante ou CDC. Les anticorps thérapeutiques selon l'invention peuvent être produits par des hybridomes ou par génie génétique, et sont avantageusement d'isotype IgG1 ou IgG3. Les anticorps thérapeutiques préférés dans l'invention sont des anticorps, d'isotype susmentionné, dirigés contre des antigènes tumoraux (molécules exprimées à la surface des tumeurs) tels que les CD20, CD22, CD25, ou plus généralement les antigènes tumoraux hématopoïétiques, de préférence lymphoïdes. Par anticorps « déplétant » on entend dans l'invention un anticorps qui est capable d'induire la déplétion des cellules cibles, c'est à dire leur réduction ou leur appauvrissement. Le pronostic de l'invention est basé sur la détermination de la quantité de cellules B 35 de la tumeur qui sont capables de sécréter de l'interleukine 10 ou IL-10. L'IL-10 a un effet inhibiteur de la réponse immunitaire, en inhibant la production de certaines cytokines, comme l'interleukine 2, l'interleukine 3, le TNF et certains interférons. L'IL-10 3037340 - 4 - agit également sur l'immunité en modulant le nombre des différentes cellules intervenant dans le système immunitaire (mastocytes, lymphocytes, etc...). En quantifiant le nombre de lymphocytes B sécrétant de l'IL-10 dans les hémopathies, les inventeurs ont constaté que les tumeurs présentant moins de 5% de 5 ces cellules avant le traitement avaient une meilleure réponse à un traitement avec un anticorps thérapeutique, ce qui conduit à un meilleur pronostic pour le patient. Il est alors possible d'envisager pour le patient une thérapie basée sur ce seul anticorps thérapeutique, ou en association avec d'autres protocoles (chimiothérapie, radiothérapie, etc...). Au-delà du seuil de 5% de lymphocytes B sécrétant de l'IL-10, le 10 pronostic du patient traité avec un seul anticorps thérapeutique ne sera probablement pas très bon, et il est donc recommandé d'envisager un autre schéma thérapeutique plus adapté. Aussi, le pronostic de l'invention permet de déterminer la chance de réussite d'un traitement à l'aide d'un anticorps thérapeutique, et de déterminer la meilleure thérapie à 15 offrir au patient, tout en rationnalisant les coûts, en évitant de donner des traitements lourds et couteux à des patients qui ne répondront pas bien, voire pas du tout. Avantageusement, l'invention concerne la méthode de pronostic susmentionnée, qui comprend en outre la détermination de l'acide aminé se trouvant en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou 20 en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral, ayant une valine en position en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, Ou en position 158 25 de la séquence du récepteur FcyRIlla tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et - ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% des cellules totales de l'échantillon avant traitement aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de 30 ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique. En d'autres termes, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie, ledit anticorps étant un anticorps déplétant les cellules de ladite hémopathie, la méthode comprenant la détermination in 35 vitro dans les cellules dudit échantillon: - de l'acide aminé se trouvant en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 3037340 -5- 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 et - la détermination de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10 avant traitement, 5 de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral, - ayant une valine en position en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et 10 - ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% des cellules totales de l'échantillon aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique. Les inventeurs ont fait une seconde constatation surprenante : si l'on combine la 15 détermination de la quantité de lymphocytes B sécrétant de l'IL-10 avec la détermination d'un polymorphisme particulier du récepteur FcyRIlla, le pronostic du patient en sera nettement amélioré. En effet, comme le montre l'exemple ci-après, la détermination du seul polymorphisme du récepteur FcyRIlla ne permet pas de disposer d'informations 20 suffisantes pour prédire une réponse correcte des patients au traitement avec un anticorps thérapeutique. Le polymorphisme du récepteur FcyRIlla a déjà été décrit dans l'état de la technique et notamment dans la demande internationale W02003035904. Selon que l'acide aminé en position 176 de la protéine, ou en position 158 de la protéine mature ayant 25 subi une modification, est une phénylalanine (F) ou une valine (V), la réponse thérapeutique à un anticorps thérapeutique sera différente. Dans l'invention, la protéine constituée de la séquence SEQ ID NO: 1 correspond à la protéine FcyRIlla, et la protéine de constituée de la séquence SEQ ID NO: 2 correspond à la protéine FcyRIlla mature. 30 L'Homme étant diploïde, il existe donc trois génotypes possibles concernant ce polymorphisme : 176V/V (ou 158VN), 176V/F (ou 158V/F) et 176F/F (ou 158F/F). Dans le cadre du procédé susmentionné, les individus ou patients ayant une valine en position 176, ou 158, sur leurs deux allèles du gène FCGR3A sont considérés comme les patients homozygotes VN. (Ainsi, un patient qui est homozygote VN en 35 position 176 (158) du récepteur FcyRIlla et qui a un niveau de lymphocytes B sécrétant de l'IL-10 inférieur à 5% par rapport aux cellules totales de la tumeur avant le traitement aura plus de 50% de chances de bien répondre au traitement avec l'anticorps 3037340 - 6 - thérapeutique, et de présenter une déplétion de plus de 90% des cellules tumorales après le traitement. Il est avantageux que le taux de cellules B sécrétant de l'IL-10 soit inférieur à 5% de la quantité totale de cellules dans la tumeur. Cela signifie que des taux de 4,9%, 4,8%, 5 4,7%, 4,6%, 4,5%, 4,4%, 4,3%, 4,2%, 4,1%, 4%, 3,9%, 3,8%, 3,7%, 3,6%, 3,5%, 3,4%, 3,3%, 3,2%, 3,1%, 3%, 2,9%, 2,8%, 2,7%, 2,6%, 2,5%, 2,4%, 2,3%, 2,2%, 2,1%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% ou 0,1% de cellules sécrétant de l'IL-10 sont particulièrement avantageux. 10 Avantageusement, l'invention concerne la méthode de pronostic susmentionnée, dans laquelle l'hémopathie est une hémopathie dont les cellules expriment le marqueur de surface CD20, c'est-à-dire dont les cellules tumorales expriment le marqueur de surface CD20. Le CD20 est le premier antigène de différenciation des lymphocytes B humains à 15 avoir été identifié à l'aide d'anticorps monoclonaux. Il est un marqueur spécifique des cellules B au cours de leur développement du stade pré-B au stade du lymphocyte B mature. Il est néanmoins absent de la surface des plasmocytes. Le gène codant est localisé dans le chromosome 11. Le CD20 appartient à une famille de molécules comprenant le CD20, la chaîne f3 du récepteur à haute affinité des IgE et la molécule 20 HTm4 présente à la surface des cellules hématopoïétiques lymphoïdes et myéloïdes et dont la fonction est inconnue. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode de pronostic susmentionnée, dans laquelle l'hémopathie est choisie parmi la leucémie lymphoïde chronique B (LLC), les lymphomes diffus à grande cellules B et tous ces 25 variants histologiques exprimant le CD20, les lymphomes folliculaires et les lymphomes du manteau, les lymphomes de la zone marginale, les lymphomes du MALT (en anglais mucosa-associated lymphoid tissue), les lymphomes de Burkitt, les lymphomes lymphoplasmocytaire, la maladie de Waldenstrôm, la leucémie prolymphocytaire B, et tous les lymphomes B CD20+ inclassables 30 Aussi, avantageusement, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro susmentionnée de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une leucémie lymphoïde chronique. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de 35 pronostic telle que définie ci-dessus, dans laquelle la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure est mesurée par cytométrie de flux, après activation de la sécrétion de l'IL10, ou par mesure du taux circulant d'IL-10 dans le 3037340 7 sérum. Bien qu'il existe plusieurs moyens de déterminer la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon tumorale, la méthode avantageuse de l'invention consiste en la détection par cytométrie de flux. 5 Pour ce faire, les cellules nucléées isolées à partir d'un patient, sont mises en culture et traitées avec des composés stimulant la sécrétion de l'IL-10. Il est alors possible soit de déterminer la quantité d'IL-10 sécrété dans le milieu de culture, ce qui n'est pas une bonne information quantitative dans la mesure où la stimulation est artificielle, soit de procéder à une étape de blocage de la sécrétion, de sorte que l'IL-10 10 produite est séquestrée dans les cellules B sécrétrices. Les cellules peuvent alors être marquées avec un anticorps anti IL-10, et quantifiées par cytométrie de flux. Des détails expérimentaux sont donnés dans l'exemple ci-après. Les inventeurs ont également montré qu'il existait une corrélation entre la quantité de cellules B sécrétrices d'IL-10 dans la tumeur d'un patient atteint d'une hémopathie 15 telle que définie ci-dessus et la quantité d'IL-10 circulante dans le plasma desdits patients (voir aussi exemple ci-après). Aussi, par un simple dosage de l'IL-10 dans le sérum, il est possible de déterminer, certes plus approximativement, la proportion de cellules B sécrétant de l'IL-10 chez le patient. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode de 20 pronostic susmentionnée, dans laquelle la détermination in vitro de l'acide aminé en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 est réalisée par réaction de polymérisation en chaine (PCR), telle que la PCR, la PCR couplée à une transcription inverse (RT- 25 PCR) ou la PCR nichée (nested PCR), en utilisant des méthodes conventionnelles et des oligonucléotides (amorces) spécifiques. Le génotypage du gène codant le récepieur FcyRIIIA peut être réalisé par différentes techniques comprenant l'analyse des acides nucléiques ou des protéines. Les analyses peuvent être réalisées par digestion spécifique par des enzymes de restriction, des 30 hybridations, ou de manière avantageuse de l'amplification/séparation/séquençage. Il peut même être envisagé de déterminer et d'identifier le polymorphisme à partir des ARN. Les techniques décrites dans la demande W02003035904 s'appliquent mutatis mutandis. Dans le cadre de l'utilisation de réaction d'amplification, telles que les techniques de 35 PCR, les oligonucléotides utilisés comme amorces seront préférentiellement des oligonucléotides simple brin comprenant 50 nucléotides, avantageusement environ 30 nucléotides, de préférence de 17 à 25 nucléotides. Il est préférable que les 3037340 - 8 - oligonucléotides possèdent au moins 5, voire au moins 8 nucléotides strictement complémentaires de la séquence cible à amplifier, et en particulier le nucléotide en position 3' dudit oligonucléotide. Pour déterminer des oligonucléotides avantageux, l'homme du métier pourra utiliser la séquence du gène FCGR3A humain, accessible dans les bases de données, notamment sous le numéro AL590385 dans la base de données GenBank, ou encore la séquence de l'ADN complémentaire accessible dans la base de donnée GenBank sous le numéro NM_000569. Des oligonucléotides particulièrement avantageux pour déterminer le pronostic selon l'invention sont les oligonucléotides représentés par les séquences SEQ ID NO: 3, 10 SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5. Bien évidemment, l'invention n'est pas limitée à ces oligonucléotides spécifiques, et l'homme du métier est capable de concevoir d'autres oligonucléotides spécifiques. Dans encore un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode susmentionnée, où ledit anticorps thérapeutique est une immunoglobuline IgG1 ou 15 IgG3, notamment un anticorps anti CD20, en particulier le rituximab. L'anticorps thérapeutique qui est utilisé dans le cadre de la méthode de l'invention est donc avantageusement un anticorps anti CD20, et en particulier le rituximab. Dans cette configuration la méthode de l'invention vise avantageusement à proposer un pronostic de réponse pour les patients traités par cet anticorps pour une leucémie 20 lymphoïde chronique B ou un lymphome B. Le rituximab est un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre la molécule de surface CD20. La partie variable Fab du rituximab se lie à l'antigène CD20 des lymphocytes B, et sa partie constante Fc peut générer des fonctions d'effecteurs immunitaires qui entraînent la lyse de ces lymphocytes. Les mécanismes possibles de 25 la lyse cellulaire induite par les effecteurs sont une cytotoxicité dépendante du complément (CDC), faisant intervenir la liaison du fragment C1q, une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), passant par un ou plusieurs des récepteurs Fcy de la surface des granulocytes, des macrophages et des cellules NK et une phagocytose (ou ADPC) passant aussi par l'interaction avec les récepteurs Fcy de 30 la surface des granulocytes, des macrophages. Il a aussi été démontré que le rituximab, en se liant à l'antigène CD20 des lymphocytes B, induit une mort cellulaire par apoptose. Aussi, dans cet aspect avantageux, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique anti CD20 d'isotype IgG1 ou IgG3 dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une leucémie lymphoïde chronique ou d'un lymphome B, la méthode comprenant la détermination in vitro dans les cellules dudit échantillon: 3037340 - 9 - - de l'acide aminé se trouvant en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 et 5 - la détermination de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleuke 10, de sorte qu'un patient, dont est dont est issu l'échantillon tumoral, ayant une valine en position en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 10 de la séquence du récepteur FcyRIlla tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% des cellules totales de l'échantillon aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules 15 de ladite leucémie ou ledit lymphome après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique anti-CD20. Dans un autre aspect, l'invention concerne un kit pour le pronostic in vitro d'un patient atteint d'une hémopathie susceptible d'être traitée avec un anticorps thérapeutique, notamment pour le pronostic de la leucémie lymphoïde chronique ou 20 d'un lymphome B, comprenant: - des moyens de détection de l'acide aminé en position 176 du récepteur FcyRIlla tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, - des moyens de détermination de la quantité de B sécrétant de l'IL-10, et 25 - un ou plusieurs échantillons contrôles. Le kit ou la trousse de pronostic de l'invention fournit les moyens de mesurer les deux paramètres qui sont essentiels de la méthode susmentionnée : le polymorphisme du récepteur et la quantité de cellules B sécrétrices d'IL-10. Afin de normaliser le pronostic, le kit ou la trousse contient également des échantillons contrôles qui 30 correspondent à des échantillons issus d'individus sains (témoins négatifs) et/ou d'individus malades de mauvais pronostic (témoins positifs) et/ou d'individus ayant été diagnostiqués de mauvais pronostic (témoins positifs). Ce ou ces échantillons contrôles peuvent également être des indications ou des données informatiques sur un support physiques permettant un calibrage d'un 35 cytomètre de flux pour déterminer la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10. Comme mentionné plus haut, les moyens de détection de la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 peuvent être des anticorps pour une évaluation par cytométrie de 3037340 - 10 - flux des cellules, mais également des drogues pour stimuler la production d'IL-10. Il peut s'agir également d'anticorps permettant de mesurer le taux d'IL-10 circulant dans le plasma. Avantageusement, l'invention concerne un kit pour le pronostic tel que défini ci- 5 dessus, dans lequel les moyens de détection de l'acide aminé en position 176 du récepteur FcyRIlla tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 2, comprennent les oligonucléotides de séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5. 10 Bien évidemment, l'homme du métier peut proposer d'autres oligonucléotides pour amplifier par PCR la région correspondant au polymorphisme, et déterminer quels sont les allèles portés par le patient qui est testé. Dans un autre aspect, l'invention concerne un produit programme d'ordinateur sur un support approprié pour la détection in vitro de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans un 15 échantillon d'un patient atteint d'une hémopathie. Un autre aspect de l'invention porte sur un logiciel ou un produit programme d'ordinateur conçu pour mettre en oeuvre la détection des cellules B sécrétant de l'IL-10 par cytométrie de flux et/ou comprenant des portions/moyens/instructions de code de programme pour l'exécution de ladite détection lorsque ledit programme est exécuté sur 20 un ordinateur, notamment relié à un cytomêtre de flux. Avantageusement ledit programme est compris dans un support d'enregistrement de données lisible par ordinateur. Un tel support n'est pas limité à un support d'enregistrement portable tel qu'un CD-ROM mais peut également faire part d'un dispositif comprenant une mémoire interne dans un ordinateur (par exemple des RAM et/ou ROM), ou de dispositif à 25 mémoires externes tels des disques durs ou des clefs USB, ou un serveur à proximité ou à distance. Ce programme d'ordinateur permet notamment d'effectuer des réglages automatiques, et normalisés, de sorte que l'utilisateur n'a plus qu'à charger les informations dans le cytométre et passer les cellules de la tumeur pour obtenir, de 30 manière reproductible, la détermination de la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10. Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode visant à améliorer le traitement des hémopathies par des anticorps thérapeutiques comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de la sécrétion ou de l'activité de l'IL-10 par les lymphocytes. En particulier, l'invention concerne une méthode visant à améliorer le traitement des 35 hémopathies par un anticorps anti-CD20, notamment le rituximab comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de la sécrétion ou de l'activité de l'IL-10 par les lymphocytes. 3037340 Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode visant à améliorer le traitement des hémopathies par des anticorps thérapeutiques comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de lymphocytes sécrétant de l'IL-10. En particulier, l'invention concerne une méthode visant à améliorer le traitement des 5 hémopathies par un anticorps anti-CD20, notamment le rituximab comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur des cellules B sécrétant de l'IL-10. Par inhibiteur des cellules B sécrétant de l'IL-10, ou des lymphocytes sécrétant de l'IL-10, on entend dans l'invention des composés ou molécules, ou mélanges de ceux-ci, capable d'interférer avec l'activité des lymphocytes B10, soit en inhibant leur 10 capacité de sécréter de l'IL-10, soit en inhibant leur prolifération, ou encore en induisant leur mort, notamment par apoptose. Comme les inventeurs ont identifié l'influence des cellules B10 sur l'efficacité du rituximab, et la corrélation entre la sécrétion de l'IL-10, il est avantageux de proposer une méthode qui vise justement : 15 soit à inhiber la production d'IL-10 par les lymphocytes B, par exemple en inhibant la synthèse ou la sécrétion, - soit à inhiber l'activité biologique de l'IL-10. Des inhibiteurs de la sécrétion comme la bréfeldine A peuvent être utilisé. Il est également envisageable d'utiliser des inhibiteurs de l'IL-10 comme des anticorps 20 dirigés contre l'IL10, ou l'utilisation de peptides mimétiques qui vont saturer les cibles de l'interleukine et ainsi inhiber l'action de la protéine native. L'homme du métier, avec ses connaissances générales peut aisément proposer une méthode pour cribler des molécules inhibitrices de l'IL-10, ou des molécules inhibant sa sécrétion. 25 L'invention concerne aussi l'utilisation d'inhibiteurs de l'activité ou de la sécrétion de l'IL-10 pour la préparation d'un médicament visant à favoriser le traitement d'hémopathies par des anticorps thérapeutiques, notamment un anti-CD20 ou le rituximab. L'invention concerne un inhibiteur de l'activité ou de la sécrétion de l'IL-10 pour son 30 utilisation dans le cadre du traitement des hémopathies traitées avec au moins un anticorps thérapeutique, notamment un anticorps anti-CD20 ou le rituximab. L'invention sera mieux comprise à la lumière des quatre figures et de l'exemple qui suivent : Légende des figures : 35 La figure 1 représente la un graphique montrant que la fréquence des cellules B leucémiques (LLC) IL-10 compétentes corrèle avec le taux d'IL-10 plasmatique au jour JO, c'est-à-dire avant le traitement (p=0,0166, r=3969). L'axe des abscisses représente 3037340 - 12 - la quantité d'IL-10 dans le plasma en pg/mL et l'axe des ordonnées représente le pourcentage de cellules B10 exprimé en %. La figure 2 représente un graphique montrant que la déplétion lymphocytaire observée après le traitement par rituximab seul (J22) est statistiquement influencée par 5 la fréquence des cellules B LLC IL-10 compétentes à JO (p=0,004). L'axe des abscisses représente le pourcentage de lymphodéplétion en % et l'axe des ordonnées représente le pourcentage de cellules B10 exprimé en %. La figure 3 représente un graphique montrant que la déplétion lymphocytaire est statistiquement plus importante pour les patients portant l'allèle FcyRIlla-158V 10 La figure 4 représente des courbes de ROC (en anglais Receiver operating curve) générées par régression logistique pour le pourcentage de cellules B LLC IL-10 compétentes seul (A) (AUC=0,763), les porteurs des allèles V vs F/F pour le polymorphisme FCGR3A (B) (AUC=0,675) et une combinaison du pourcentage de cellules B LLC IL-10 compétentes et des porteurs des allèles V vs F/F pour le 15 polymorphisme FCGR3A (C) (AUC=0,855). EXEMPLE Les mécanismes d'action du rituximab (commercialisé sous les marques MabThera®, Rituxania) restent inconnus et pourraient être différents selon le sous-type de désordre lymphoprolifératif B. Le rituximab est connu pour induire in vitro 20 l'apoptose, la lyse médiée par le complément (CDC), la cytotoxicité cellulaire médiée par les anticorps (ADCC) et la phagocytose dépendante des anticorps (ADPC), et certains résultats tendent à impliquer ces mécanismes in vivo. Certains facteurs affectant la réponse au rituximab ont récemment été décrits Les inventeurs avaient précédemment observé que le polymorphisme du récepteur 25 FcyRIlla V/F affecte la réponse clinique au traitement rituximab. Comme ce polymorphisme modifie l'affinité de la partie constante des IgG1 pour le récepteur FcyRIlla, (exprimé à la surface des cellules NK et des macrophages), les inventeurs ont émis l'hypothèse que le mécanisme d'ADCC devait être important dans le cadre du traitement des lymphomes folliculaires traités au rituximab. 30 Des cellules B régulatrices ont récemment été identifiées chez l'homme et la souris en tant que sous type cellulaire capable de sécréter de l'IL-10. Ces cellules B, également appelées cellules B10 ou B10, sont caractérisées par leur capacité à moduler l'inflammation, l'auto-immunité et la réponse immune innée ou adaptative du fait de la production d'IL-10. Dans un modèle murin, les cellules B10 seraient capable 35 d'inhiber l'élimination des cellules de lymphomes induite par un anticorps anti CD20, en agissant sur les fonctions nnonocytaires médiées par les parties constantes des immunoglobulines (parties Fc). 3037340 - 13 - Plus récemment, il a été montré que les cellules d'une leucémie lymphoïde chronique clonale (LLC) présentaient des propriétés immunosuppressives et une compétence pour l'IL-10. Les inventeurs ont alors considéré que les cellules IL-10 compétentes des LLC 5 pourraient avoir une influence sur l'efficacité du traitement au rituximab des patients atteints de ce type de leucémie. Patients et traitement Les patients. Une étude prospective et randomisée de phase II a été conduite dans 59 centres 10 français incluant 140 patients entre Juin 2012 et Janvier 2013. Les patients n'ayant reçus aucun traitement au préalable (âgés de 18 à 65 ans) et dont le diagnostic de leucémie lymphoïde chronique a été confirmé par immunophénotypage selon les critères IWCLL 2008 (Binet de stade C, ou binet de stade A ou B avec une maladie active), ont été enrôlés dans cet essai. Un critère additionnel d'inclusion a été pris en 15 compte : l'absence de délétion 17p, évaluée par FISH ( Lymphodéplétion 0.5 d'obtenir une 30 14 lymphodéplétion >90% (vrais positifs) (faux positifs) Probabilité 90% (faux négatifs) (vrais négatifs) Sensibilité = 100% Spécificité = 0% Légende du tableau 2. Sensibilité et spécificité pour une lymphodéplétion de 90% obtenues en utilisant les probabilités prédites calculées. On constate que de très nombreux faux positifs sont identifiés (environ 33%). 2- Données obtenues à partir du nombre de cellules B10 seul a. Avec un seuil de 4,34 % Sur la base de population utilisée lors de l'analyse multivariée (n=44), AUC=0,779, 95%CI=0,652-0,905, les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 3 Lymphodéplétion > Lymphodéplétion 0.5 d'obtenir une 21 2 lymphodéplétion >90% (vrais positifs) (faux positifs) Probabilité 90% (faux négatifs) (vrais négatifs) Sensibilité = 70,00% Spécificité = 85,71% 10 Légende du tableau 3: identique à la légende du tableau 2. b. Avec un seuil de 3 % Sur la base de population utilisée lors de l'analyse multivariée (n=44), AUC=0,729, 95%CI=0,598-0,589, les résultats obtenus sont les suivants : 3037340 - 18 - Tableau 4 Lymphodéplétion > Lymphodéplétion 0.5 d'obtenir une 18 2 lymphodéplétion >90% 12 12 Probabilité 90% Sensibilité = 60,00% Spécificité = 85,71% Légende du tableau 4: identique à la légende du tabféau 2. c. Avec un seuil de 5 l'/0 Sur la base de population utilisée lors de l'analyse multivariée (n=44), AUC=0,726, 5 95%CI=0,586-0,866, les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 5 Lymphodéplétion > Lymphodéplétion 0.5 d'obtenir une 21 3 lymphodéplétion >90% 9 11 Probabilité 90% Sensibilité = 70,00% Spécificité = 78,57% Légende du tableau 5: identique à la légende du tableau 2. On constate qu'en imposant le seuil à moins de 5% de cellules B10, le taux de faux positifs tombe à environ 5%. La détection des B10 améliore significativement le pronostic par rapport au polymorphisme. 10 3- Données obtenues à partir du génotypage du récepteur FcyRIIIA et B10 Sur la base de population utilisée lors de l'analyse multivariée (n=44) (Aire sous la courbe (AUC=0,0855), 95%CI=0,732-0,978, les résultats obtenus sont les suivants Tableau 6 Lymphodéplétion > Lymphodéplétion 0.5 d'obtenir une 26 5 lymphodéplétion >90% 4 9 Probabilité 90% Sensibilité = 86,67% Spécificité = 64,29% Légende du tableau 6: identique à la légende du tableau 2. 3037340 - 19 - Dans les tableaux 2 à 6 précédents, la sensibilité est la mesure de la capacité du test à identifier une condition quand elle est présente. C'est la proportion de vrais positifs (VP) qui est détectée par le test comme ayant la « condition » [Se = VP/(VP+FN)]. Les faux négatifs sont les patients ayant la « condition » mais non 5 détectés par le test. Une forte sensibilité est préférée dans un criblage, car il est plus facile d'écarter les patients n'ayant pas la condition. La spécificité est la capacité du test d'exclure une condition quand elle est absente. C'est la proportion de vrais négatifs (VN) qui est détectée par le test comme n'ayant pas la « condition » [Sp = VN/(VN+FP)]. Les faux positifs sont les patients n'ayant pas 10 la « condition », mais détectés par le test comme étant positifs. En combinant la détection du polymorphisme et du nombre de cellules B10, on constate une amélioration du pronostic, et notamment une réduction très significative du nombre de patients considérés comme faux négatifs. En outre, la double détection 15 permet d'obtenir, pour des seuils inférieurs à 5% de B10 une bonne sensibilité (environ 86%). Les inventeurs ont donc déterminé une population B10 chez des patients atteints de leucémie lymphoïde chronique et recevant du rituximab. Dans le même temps ils ont déterminé le phénotype FcgammaRIlla-158VF de ces patients. Ils ont pu ainsi montrer 20 que la fréquence des cellules B10 et le polymorphisme FcgammaRIlla-158VF influençaient la réponse au rituximab chez des patients atteints de leucémie lymphoïde chronique. L'analyse de ces deux facteurs combinés permet d'améliorer la sensibilité et la spécificité de prédiction de la réponse pronostic. Lymphodéplétion >90% Lymphodéplétion 590% Analyse i Analyse unvariée (n=44) (n=23) multivariée Tableau 1 Médiane (IQR) N (%) N (%) A OR Médiane OR Valeur UC Valeur (IQR) [95% IC] de p [95% (95% Cl] de p CI] 55.72 23 53.99 (52.07- Age (années) 44 (100.00) (51.31-58.12) (100.00) 57.41) hommes 31 (70.45) 18 (78.26) Stade Binet AB 36 (81.82) 16 (69.57) ECOG 0 31 (70.45) 5 (21.74) IGHV on muté 25 (56.82) 16 (72.73) Anomalies cytogéntiques Del(13q) 18 (51.43) 8 (44.44) Del(11q) 7 (16.67) 6 (26.09) 0.560 0.57 [0.16-2.07] 0.68 [0.19,216] 0.51 [0.15-1.73] 1.50 [0.41-6.29] 0.50 [0.15-1.50] 1.31 [0.41-4.29] 0.848 0.792 0.693 0.404 0.572 0.324 Trisomie 12 2 (6.06) 2 (14.29) 0.40 0.572 [0.03-6.04] f32 microglobuline 2.90 (2.33- 2.76 (mg/L) 3.66) 39 (88.64) 22 (95.65) (2.33-4.29) 0.857 Tableau 1 Lymphodéplétion >90% Lymphodéplétion 590% Analyse univariée Analyse multivariée (suite) (n=44) (n=23) N (%) Médiane (IQR) N (%) Médiane (IQR) OR Valeur de p AU OR Valeur de p [95% IC] C [95% Cl] [95% Cl] CD38+ (%) 34 (77.27) 2.00 17 (73,91) 10.50 4.23 0.133 0.763 0.83 0.002 NJ ._) 32 (72.73) (0.00-23.00) 15 (65.22) (1.75-26.00) [1.43- 0.004 [0.604- [0.72- 0.043 Cellules IL-10 5(11.91) 2.30 1 (4 55) 9.51 13.42] 0.028 0.921] 0.93] compétentes rio) 25 (59.52) (0.68-6.47) 7(31.82) (5.35-15.70) 0.014 0.675 4.95 FCGR3A 12 (28.57) _ 14 (63.63) [0.551- [1.07- V/V VIF F/F 30 (71.43) 8(36.36) 0.799] 27.48] Porteurs FCGR3A V Tableau 1 : Paramètres influençant la lymphocytose induite par le rituximab en monothérapie chez 68 patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC). Le groupe des patients ayant une inhibition lymphocytaire de moins de 90% a été utilisé comme référence pour les rapports des chances (odds ratio). REVENDICATIONS1. Méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie, ledit anticorps étant un anticorps déplétant les cellules de ladite hémopathie, la méthode comprenant la détermination in vitro de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10 dans ledit échantillon, de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral, ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 inférieure à 5% de la quantité totale de cellule dudit échantillon aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique. 2. Méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie, ledit anticorps étant un anticorps déplétant les cellules de ladite hémopathie, la méthode comprenant la détermination in vitro dans les cellules dudit échantillon: - de l'acide aminé se trouvant en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRII la, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 et - la détermination de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10 avant le traitement, telle que defini dans la revendication 1, de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral, - ayant une valine en position en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et - ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% des cellules totales de l'échantillon aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique. 3. Méthode de pronostic selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'hémopathie est une hémopathie dont les cellules expriment le marqueur de surface CD20. 3037340 - 23 - 4. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l'hémopathie est choisie parmi la leucémie lymphoïde chronique B (LLC), les lymphomes diffus à grande cellules B et tous ces variants histologiques exprimant le CD20, les lymphomes folliculaires et les lymphomes du manteau, les lymphomes de la zone marginale, les lymphomes du MALT (en anglais mucosa-associated lymphoid tissue), les lymphomes de Burkitt, les lymphomes lymphoplasmocytaire, la maladie de Waldenstrôm, la leucémie prolymphocytaire B, et tous les lymphomes B CD20+ inclassables. 5. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% est mesurée par cytométrie de flux, après activation de la sécrétion de l'IL10, ou par mesure du taux circulant d'IL-10 dans le sérum. 6. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle la détermination in vitro de l'acide aminé en position 176 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 est réalisée par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), telle que la PCR, la PCR couplée à une transcription inverse (RT-PCR) ou la PCR nichée (nested PCR). 7. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, où ledit anticorps est une IgG1 ou un IgG3, notamment un anticorps anti CD20, en particulier le rituximab. 8. Kit pour le pronostic in vitro d'un patient atteint d'une hémopathie susceptible d'être traitée avec un anticorps thérapeutique comprenant : - des moyens de détection de l'acide aminé en position 176 du récepteur FcyRIlla tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, - des moyens de détermination de la quantité de B sécrétant de l'IL-10, et - un ou plusieurs échantillons contrôles. 9. Kit pour le pronostic selon la revendication 8, dans lequel les moyens de détection des de l'acide aminé en position 176 du récepteur FcyRIlla tel que 3037340 - 24 - représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou en position 158 de la séquence du récepteur FcyRIlla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO: 2, comprennent les oligonucléotides de séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5.