Brevet FR3039428A1 — publié le 20170203

DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION La présente invention concerne de manière générale le domaine des émulsions et notamment le domaine des émulsions multiples (ou « doubles ») eau-dans-huile-dans-eau (E/H/E). Elle concerne plus particulièrement une émulsion double alimentaire, notamment obtenue à partir de produits laitiers. Elle concerne encore le procédé d'obtention de ladite émulsion double ainsi que son utilisation pour encapsuler une matière première hydrophile d'intérêt et pour fabriquer un produit alimentaire. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Les émulsions doubles eau-dans-huile-dans-eau (E/H/E), également appelées « émulsions multiples », sont des émulsions dans lesquelles de petites gouttelettes d'eau (formant une phase aqueuse interne) sont formées dans des gouttelettes d'huile de taille supérieure, elles-mêmes dispersées dans une phase aqueuse continue (ou externe). Les émulsions doubles ont de nombreuses applications dans l'industrie agroalimentaire, pharmaceutique ou cosmétique, où elles sont utilisées pour encapsuler des matières d'intérêt dans les gouttelettes d'eau constituant la phase aqueuse interne. De telles émulsions doubles sont généralement obtenues par dispersion de gouttelettes d'eau dans une phase huileuse en utilisant un émulsifiant lipophile de façon à former une émulsion primaire inverse eau-dans-huile (E/H), puis par dispersion de ladite émulsion primaire inverse dans une phase aqueuse continue. On connaît un certain nombre d'émulsifiants lipophiles susceptibles d'être utilisés pour obtenir des émulsions doubles, comme par exemple les esters de sorbitan et d'acides gras, les mono- ou di-glycérides, les copolymères actifs de surface comme le PluronicTM, ou encore le polyglycérol polyricinoléate (ou PGPR). Cependant, les normes en vigueur dans le domaine alimentaire, ainsi que la vigilance des consommateurs quant aux additifs alimentaires, rendent nécessaires le développement d'émulsions doubles dont la stabilité est assurée par des émulsifiants lipophiles qui sont satisfaisants sur le plan de l'innocuité et de l'activité tensioactive. Par exemple dans le domaine des produits laitiers, il serait 3039428 2 particulièrement profitable de disposer d'émulsions contenant principalement (voire exclusivement) des ingrédients issus de matières premières laitières, et notamment un émulsifiant lipophile naturel, de préférence issu de matières premières alimentaires et notamment laitières. 5 A cet égard, le document FR-2 828 378 préconise de stabiliser des émulsions multiples avec des tensioactifs lipophiles naturels, tels que les phytostérols, les phytostanols, les phospholipides, les acides gras mono-ou polysaturés, les vitamines liposolubles (A, E, D, K), les antioxydants (extraits de romarin) ou dérivés. 10 Le document EP 0 997 075 propose des émulsions multiples E/H/E, dans lesquelles l'émulsion eau-dans-huile comprend un émulsifiant lipophile comprenant une fraction insoluble dans l'alcool de lécithine végétale. Toutefois, en pratique, la demanderesse a constaté que de tels tensioactifs ou émulsifiants lipophiles ne sont pas toujours efficaces pour stabiliser des émulsions multiples. Il 15 existe par conséquent un besoin de nouvelles émulsions multiples naturelles, de préférence comestibles, qui soient stabilisées efficacement dans le temps, au moyen d'émulsifiants lipophiles naturels. OBJET DE L'INVENTION 20 La présente invention répond parfaitement aux besoins énoncés ci- dessus, puisqu'elle propose une émulsion double E/H/E comprenant une phase aqueuse continue dans laquelle est dispersée une émulsion primaire inverse eaudans-huile (E/H), laquelle émulsion primaire inverse comprend une phase aqueuse interne et une phase huileuse, stabilisée par au moins un émulsifiant 25 lipophile. Et conformément à l'invention, ledit au moins un émulsifiant lipophile comprend au moins 70 % de phosphatidyléthanolamines (PE) (notamment au moins 80 % de PE, de préférence au moins 90 % de PE et de préférence encore au moins 95 % de PE) en poids, par rapport au poids total de l'émulsifiant. 30 Sans vouloir se limiter à une quelconque théorie, la demanderesse pense que l'utilisation d'un tel émulsifiant, riche en PE, contribue fortement à améliorer la stabilité de l'émulsion résultante, par rapport aux émulsions de l'art antérieur (voir notamment EP 0 997 075) dans lesquels les ratios entre les PE et 303 942 8 3 les autres phospholipides étaient bien inférieurs. La demanderesse a démontré qu'une telle émulsion multiple présente une stabilité optimale dans le temps, grâce à une excellente activité tensioactive des PE. 5 Un tel émulsifiant peut être obtenu à partir de matière première laitière comme par exemple le babeurre. Il permet ainsi de résoudre le problème des additifs alimentaires, qui sont de moins en moins acceptés par les consommateurs, tout en valorisant un coproduit de l'industrie laitière riche en phospholipides (le babeurre). 10 D'autres caractéristiques non limitatives et avantageuses de l'émulsion conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes : - ledit au moins un émulsifiant lipophile possède une valeur HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) inférieure à 6 et de préférence comprise entre 2 et 15 4; - la teneur en émulsifiant lipophile varie de 0,5 à 20 % de préférence de 1 à 10 % et de préférence encore de 2 à 8 % en poids, par rapport au poids total de l'émulsion primaire inverse E/H ; - la phase aqueuse interne est dispersée dans la phase huileuse sous la 20 forme de gouttelettes dont le diamètre moyen varie se situe entre 0,1 et 1 pm, de préférence entre 0,2 et 0,6 pm ; - la phase aqueuse continue comprend au moins un émulsifiant hydrophile ayant une valeur HLB allant de 8 à 18 ; - ledit émulsifiant hydrophile est choisi parmi les protéines laitières ou les 25 protéines végétales ; - ledit au moins un émulsifiant hydrophile est présent dans l'émulsion à une teneur allant de 5 à 20 %, notamment de 8 à 15 % en poids par rapport au poids total de la phase aqueuse continue ; - la phase aqueuse continue de ladite émulsion est sous forme d'un gel, 30 de préférence sous forme d'un gel de protéines, notamment d'un gel de protéines laitières ; en effet la demanderesse a démontré que la gélification de la phase aqueuse continue est particulièrement avantageuse car elle limite le phénomène de crémage de ladite émulsion et contribue à augmenter significativement la stabilité de l'émulsion double au cours du temps ; 3039428 4 - la phase aqueuse interne et la phase aqueuse continue présentent des valeurs d'osmolarité et de pH équilibrées ; la demanderesse a également constaté qu'un tel équilibrage contribue à la stabilité de l'émulsion ; avantageusement, ces paramètres sont adaptés aux paramètres gastriques afin d'augmenter la 5 résistance de l'émulsion de l'invention aux conditions retrouvées dans l'estomac ; - la phase aqueuse interne encapsule au moins une matière hydrophile d'intérêt, notamment une protéine hydrophile ; - ledit au moins un émulsifiant lipophile, notamment lesdites PE, ladite phase huileuse externe, et ledit émulsifiant protéique, sont des composés issus 10 d'une matière première laitière ; un tel produit est ainsi parfaitement adapté à une utilisation alimentaire dans le domaine des produits laitiers en particulier. Un produit alimentaire contenant l'émulsion de l'invention est également un objet de l'invention. L'invention se rapporte également à un procédé de préparation d'une 15 émulsion multiple de type eau-dans-huile-dans-eau (E/H/E) composée d'une phase aqueuse continue et d'une émulsion primaire inverse eau-dans-huile (E/H) dispersée, comprenant une phase aqueuse interne et une phase huileuse, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : - dispersion de la phase aqueuse interne dans une phase huileuse 20 contenant un émulsifiant lipophile comprenant au moins 70 % de phosphatidyléthanolamines (PE), en poids de PE par rapport au poids total dudit émulsifiant lipophile, jusqu'à obtenir une émulsion primaire inverse E/H stabilisée ; - dispersion de ladite émulsion primaire dans une seconde phase aqueuse dite phase aqueuse continue, de manière à obtenir ladite émulsion 25 multiple. La phase aqueuse continue est avantageusement sous forme d'un gel, notamment d'un gel de protéines, dont l'opération de gélification est mise en oeuvre : - préalablement à la dispersion de l'émulsion primaire inverse E/H dans 30 ladite phase aqueuse continue, ou - après la dispersion de l'émulsion primaire inverse E/H dans ladite phase aqueuse continue. Un tel procédé est avantageux en particulier dans le cadre de l'obtention d'une émulsion double à partir de matière première laitière, car il utilise des 303 942 8 5 procédés de fabrication courant dans l'industrie laitière. Il peut donc être mis en oeuvre aisément et à moindre coût. En outre comme indiqué précédemment, il permet avantageusement de valoriser des coproduits de l'industrie laitière, ordinairement considérés comme des déchets (comme le babeurre et/ou le 5 lactosérum). L'invention se rapporte également à l'utilisation d'une émulsion multiple selon l'invention pour encapsuler au moins une matière hydrophile d'intérêt et/ou pour préparer un produit alimentaire. Elle se rapporte également à l'utilisation d'une émulsion multiple selon 10 l'invention pour encapsuler au moins une matière hydrophile d'intérêt et pour la libération ciblée de ladite au moins une matière hydrophile d'intérêt dans le tractus digestif d'un sujet, de préférence dans l'intestin grêle. L'invention concerne encore une émulsion inverse comprenant une phase aqueuse interne et une phase huileuse, stabilisée par au moins un 15 émulsifiant lipophile comprenant au moins 70 % de phosphatidyléthanolamines (PE) (notamment au moins 80 % de PE, de préférence au moins 90 % de PE et de préférence encore au moins 95 % de PE) en poids, par rapport au poids total dudit au moins un émulsifiant. 20 FIGURES Sur les dessins annexés : - la figure 1 A illustre les résultats de granulométrie obtenus à JO (jour de l'obtention de l'émulsion - courbe gris foncé) et à J1 (24 h après - courbe gris claire) obtenus avec une préparation d'émulsion double réalisée en utilisant une 25 lécithine de soja en tant qu'émulsifiant lipophile. La figure 1B illustre les résultats obtenus avec une préparation d'émulsion double réalisée en utilisant un mélange de phospholipides PE/PS en tant qu'émulsifiant lipophile à JO (courbe gris foncé) et à J1 (courbe gris claire). - la figure 2: illustre les résultats obtenus avec une préparation 30 d'émulsion double réalisée en utilisant un mélange de phospholipides PE/PS en tant qu'émulsifiant lipophile et une phase aqueuse continue gélifiée, à JO (courbe gris foncé) et à J2 (courbe gris claire). 3039428 6 DESCRIPTION DETAILLEE D'UN EXEMPLE DE REALISATION La description qui va suivre en regard des résultats expérimentaux, donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée. 5 Les différents modes de réalisation envisagés dans la présente description détaillée de l'invention peuvent être pris chacun individuellement ou selon toutes les combinaisons envisageables. De manière générale, la présente invention concerne une émulsion multiple de type eau-dans-huile-dans-eau (E/H/E) comprenant une phase aqueuse 10 continue dans laquelle est dispersée une émulsion primaire inverse eau-dans- huile (E/H), laquelle émulsion primaire inverse comprend une phase aqueuse interne et une phase huileuse. Pour cela, selon l'invention, cette émulsion multiple est stabilisée par au moins un émulsifiant lipophile qui consiste très majoritairement en un composé 15 appartenant à la famille des phosphoglycérides : la phosphatidyléthanolamine (PE). Définitions Par « émulsion », on entend un milieu hétérogène constitué par la 20 dispersion sous forme de fins globules, ou gouttelettes, d'un liquide dans un autre liquide. Un émulsifiant est un composé amphiphile dont la structure chimique comporte des fonctions hydrophiles ainsi que des fonctions hydrophobes. Un émulsifiant lipophile (ou émulsifiant hydrophobe) est un émulsifiant 25 soluble dans l'huile (ou insoluble dans l'eau), qui permet de stabiliser une émulsion primaire inverse E/H. Un émulsifiant hydrophile est un émulsifiant soluble dans l'eau qui permet de stabiliser une émulsion huile dans eau (H/E), ou de stabiliser une émulsion eau-dans-huile dans une phase aqueuse continue pour obtenir une 30 émulsion double eau-dans-huile-dans-eau (E/H/E). Un phosphoglycéride est un phospholipide constitué de deux résidus d'acides gras estérifiant un résidu glycérol lui-même estérifié par un résidu phosphate. L'ensemble forme un acide phosphatidique lié, à travers une liaison 3039428 7 phosphodiester, au groupe hydroxyle d'une molécule polaire formant ainsi un lipide polaire. Cette molécule polaire peut être l'éthanolamine, la sérine, la choline, l'inositol ou le glycérol, pour former respectivement une phosphatidyléthanolamine 5 (PE), une phosphatidylsérine (PS), une phosphatidylcholine (PC), un phosphatidylinositol (PI) ou un phosphatidylglycérol (PG). Une lysophosphatidylcholine (LPC) est une phosphatidylcholine dont l'un des deux résidus d'acide gras a été hydrolysé, typiquement par une phospholipase, sur le carbone en position 1 ou 2 du résidu glycérol. 10 Une sphingomyéline (SM) est un sphingolipide constitué d'une unité céramide liée à un résidu de choline ou d'éthanolamine par une liaison phosphodiester. Par « matière grasse », on entend un substrat constitué majoritairement de triglycérides. 15 On entend par « protéines sériques » les protéines contenues dans le sérum, notamment les protéines globulaires solubles représentées par les albumines et les globulines. On entend par « protéines laitières » les protéines obtenues soit directement à partir du lait, soit lors de la valorisation de coproduits de l'industrie 20 laitière tels que le lactosérum. Les protéines laitières comprennent les caséines et les protéines sériques laitières. Le lactosérum correspond à la partie liquide issue de la coagulation du lait et comprend les protéines sériques laitières. Par ailleurs, sauf précision contraire, les intervalles indiqués dans la présente demande incluent également les bornes mentionnées. 25 Emulsion multiple L'invention se rapporte à une émulsion multiple (ou « émulsion double ») de type « eau-dans-huile-dans-eau » (E/H/E) dans laquelle l'émulsion primaire inverse « eau-dans-huile » (E/H) est dispersée sous forme de gouttelettes dans la 30 phase aqueuse continue (ou phase aqueuse externe). L'émulsion primaire inverse E/H, encore simplement appelée « émulsion primaire » dans cette description, comprend une phase aqueuse (ou phase aqueuse interne) dispersée dans une phase huileuse. 3039428 8 Emulsifiant lipophile L'émulsion primaire est stabilisée par au moins un émulsifiant lipophile qui consiste principalement en des PE. Par « l'émulsifiant lipophile », on englobe : 5 - l'émulsifiant lipophile constitué uniquement de PE, ou - l'émulsifiant lipophile comprenant une proportion très majoritaire de PE. Ainsi, l'émulsifiant lipophile de l'émulsion selon l'invention comprend au moins 70 % de PE, de préférence au moins 80 %, notamment au moins 85 %, au moins 90 % de PE, en poids, par rapport au poids total de l'émulsifiant. 10 L'émulsifiant lipophile peut encore comprendre au moins 95 %, 96 %, 98 %, ou encore au moins 99 % de PE, en poids, par rapport au poids total de l'émulsifiant. Les PE en question comportent avantageusement au moins 50 % (et notamment de 50 à 90 %, notamment de 60 % à 80 % et de préférence de 60 à 15 75 %) en poids d'acides gras insaturés par rapport au poids total des acides gras des PE. De préférence, les PE comportent au moins 20 % (et notamment au moins 30 %, au moins 35 % et de préférence encore au moins 40 %) d'acides gras monoinsaturés, en poids par rapport au poids total des acides gras des PE. 20 Plus précisément, les PE contiennent avantageusement de 30 à 60 % (et de préférence encore de 40 à 50 %) d'acides gras monoinsaturés en poids, par rapport au poids total des acides gras des PE. Les PE sont de préférence choisies parmi les PE comportant des acides gras contenant de 12 à 22 atomes de carbone. 25 De préférence, au moins 95 % en poids des acides gras des PE contiennent de 12 à 22 atomes de carbone. De préférence, l'acide oléique (C18 :1) représente de 30 à 60 % en poids (notamment de 30 à 45 % en poids) des acides gras totaux des PE. L'émulsifiant lipophile peut comprendre au moins un autre lipide polaire, 30 notamment au moins un autre phosphoglycéride ou un sphingolipide en combinaison avec la PE. L'émulsifiant lipophile peut ainsi comporter une proportion de PS allant jusqu'à 30 % du poids total de l'émulsifiant lipophile. Par exemple, l'émulsifiant lipophile peut comprendre une proportion de 3039428 9 PS allant de 10 à 30 % (notamment de 10 à 25 %, notamment de 10 à 20 % ou encore de 10 à 15 %) en poids, par rapport au poids total de l'émulsifiant lipophile. L'émulsifiant lipophile peut encore comprendre moins de 10 % (notamment moins de 5 % ou encore moins de 2 %) en poids de PS, par rapport 5 au poids total de l'émulsifiant lipophile. L'émulsifiant lipophile est ainsi avantageusement un mélange de PE et de PS, avec au moins 70 % en poids de PE par rapport au poids total de l'émulsifiant lipophile. De préférence encore, l'émulsifiant lipophile contient moins de 30 % 10 (notamment moins de 25 %, moins de 15 %, moins de 10 %, moins de 5 % et de préférence encore moins de 2 %) en poids d'une fraction phospholipidique constituée de PC et de PI, par rapport au poids total de l'émulsifiant lipophile. Encore de préférence, l'émulsifiant lipophile comporte moins de 10 % (notamment moins de 5 %, moins de 2 % et de façon particulièrement préférée 15 moins de 1 %, voire moins de 0,5%) de PC en poids par rapport au poids total de l'émulsifiant lipophile. De préférence également, l'émulsifiant lipophile contient moins de 30 % (notamment moins de 25 %, moins de 15 %, moins de 10 %, moins de 5 % et de préférence encore moins de 2 %) en poids d'une fraction de phospholipides 20 constituée de LPC et de SM, par rapport au poids total de l'émulsifiant lipophile. De façon générale, l'émulsifiant lipophile de l'invention comprend avantageusement la composition suivante (les proportions étant exprimées en poids par rapport au poids total dudit émulsifiant lipophile) : - de 70 à 100 % (notamment de 70 à 90 % ou de 85 à 100 °/0) de PE; 25 - de 0 à 30 % (notamment de 0 à 25 %, ou encore de 1 à 25 % en particulier de 1 à 20 %, par exemple de 5 à 15 %, notamment de 10 à 15 % ou encore de 1 à 5 %) de PS ; - moins de 10 % (notamment moins de 5 % et de préférence moins de 2 %) de PC. 30 L'émulsifiant lipophile est avantageusement adapté à une utilisation alimentaire et/ou pharmaceutique de l'émulsion double de l'invention. L'émulsifiant lipophile de l'invention peut être obtenu à partir de substrats d'origine végétale ou animale, en particulier à partir de substrats dérivés d'animaux. 303 942 8 10 Parmi les substrats végétaux préférés, on peut citer le soja, le colza, le tournesol, l'avoine ou encore le lupin et notamment les graines de colza ou de tournesol et les semences de colza. Parmi les substrats d'origine animale ou dérivés d'animaux, on peut citer 5 les produits laitiers et/ou les dérivés de produits laitiers, et notamment le lait et le babeurre, ou encore les jaunes d'oeufs. L'émulsifiant lipophile peut être obtenu par extraction de la fraction lipidique à partir du ou des substrats sélectionnés, puis par séparation des classes de phospholipides. La fraction PE/PS obtenue peut avantageusement être utilisée 10 en tant qu'émulsifiant lipophile conformément à l'invention. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier (voir Contarini & Povolo, Int. J. Mol. Sci. 2013 (14) : 2808-2831 ou Foch et al., J. Biol. Chem. 1957 (226): 497-509, mais aussi Christie WW (1987) Prelude to analysis: Extraction, storage and preliminary fractionation of lipids. Dans: HPLC and Lipids, 15 a Practical Guide (Christie WW, ed) Pergamon Press, Oxford, 71-86). De tels protocoles pour l'extraction de la fraction lipidique et la séparation des classes de phospholipides sont encore fournis dans la partie relative aux résultats expérimentaux. Avantageusement, un émulsifiant lipophile riche en PE selon l'invention 20 peut être obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - une phase d'extraction lipidique, depuis une matière première contenant des PE, par exemple du babeurre, - une phase d'extraction des phospholipides en phase solide, avantageusement sur colonne de silice, adaptée de la méthode de Christie (voir 25 références ci-dessus). Un émulsifiant lipophile bien adapté à l'invention possède une valeur HLB (balance hydrophile - lipophile) inférieure à 6, notamment comprise entre 2 et 4, et typiquement comprise entre 3 et 4. De préférence, l'émulsion double comporte une teneur en émulsifiant 30 lipophile (en poids par rapport au poids total de l'émulsion primaire inverse) allant de 0,5 à 20 % et typiquement de 1 à 10 % et notamment supérieur ou égal à 2 %. Des teneurs particulièrement appropriées sont comprises entre 1 et 8 %, notamment entre 2 et 8 %. 3039428 11 Phase aqueuse interne La phase aqueuse interne comprend avantageusement des solutés pour ajuster l'osmolarité et le pH. De préférence, la phase aqueuse interne de l'émulsion primaire inverse 5 représente de 10 à 40 % en poids (notamment de 15 à 30 % en poids) par rapport au poids total de l'émulsion primaire inverse E/H. De préférence, la phase aqueuse interne est dispersée dans la phase huileuse sous la forme de gouttelettes, dont le diamètre moyen se situe entre 0,1 et 1 pm (de préférence entre 0,2 et 0,6 pm), pour former l'émulsion primaire 10 inverse E/H. Dans certains mode de réalisation, l'invention se rapporte également à une émulsion inverse E/H, telle que décrite précédemment. 15 Encapsulation dans la phase aqueuse interne Dans certains modes de réalisation, la phase aqueuse interne comprend au moins une matière ou une molécule hydrophile d'intérêt, notamment une protéine hydrophile. En effet, très souvent les molécules d'intérêt, notamment les substances 20 nutritives, sont des molécules fragiles qu'il faut protéger d'un environnement extérieur agressif (pH inadapté, sensibilité à la lumière, oxydation au contact d'autres, ingrédients, etc.). Dans ces conditions, l'ajout de ces molécules dans la phase aqueuse interne permet de les encapsuler afin de les protéger du milieu extérieur. 25 On peut également envisager, par le biais de cette encapsulation, de masquer un faux goût. En introduisant un ingrédient qui induit un faux goût dans la phase interne de l'émulsion multiple, la perception du faux goût en est significativement atténuée. 30 Phase huileuse de l'émulsion primaire inverse De préférence, la phase huileuse de l'émulsion primaire inverse comprend au moins une matière grasse d'origine végétale (comme par exemple les huiles végétales) ou animale, comme par exemple le saindoux, le suif, les huiles de poissons, les matières grasses laitières comme le beurre et les matières 3039428 12 grasses anhydres (comme les matières grasses laitières anhydres ou MGLA). De préférence, la phase huileuse est adaptée à une utilisation alimentaire et/ou pharmaceutique de l'émulsion double de l'invention. De façon générale, les matières grasses alimentaires (c.-à-d. présentes 5 dans les aliments) peuvent être utilisées en tant que phase huileuse pour constituer l'émulsion primaire inverse de l'invention. De préférence, l'émulsion primaire inverse E/H est dispersée dans la phase aqueuse continue sous forme de globules dont la taille moyenne se situe entre 5 et 20 pm, notamment entre 8 et 15 pm. 10 Phase aqueuse continue La phase aqueuse continue comprend avantageusement des solutés pour ajuster l'osmolarité et le pH, et un émulsifiant hydrophile assurant de préférence également la gélification. 15 La phase aqueuse continue est avantageusement adaptée à une utilisation alimentaire et/ou pharmaceutique de l'émulsion double de l'invention. Cette phase aqueuse continue peut contenir exclusivement l'émulsion primaire inverse. De manière alternative, la phase aqueuse continue peut contenir des 20 gouttelettes lipidiques en plus de celles formées par l'émulsion primaire inverse. Ces gouttelettes lipidiques « simples » sont alors dépourvues d'une phase aqueuse interne. Ces gouttelettes lipidiques peuvent par exemple être constituées d'au moins une matière grasse d'origine végétale (comme par exemple les huiles végétales) ou animale, comme par exemple le saindoux, le suif, les huiles de 25 poissons, le beurre et les matières grasses laitières, comme les matières grasses laitières anhydres (MGLA). De préférence, dans un tel mode de réalisation, la phase aqueuse continue comprend moins de 20 % en poids de matière grasse (représentée par les gouttelettes lipidiques telles que décrites ci-dessus), notamment moins de 10 % ou moins de 5 % et de préférence encore moins de 30 2 %. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, la phase aqueuse continue est un produit alimentaire, et notamment un produit laitier ou dérivé de produit laitier, comme par exemple du lait ou du yaourt. 3039428 13 Emulsifiant hydrophile La phase aqueuse continue de l'émulsion double contient avantageusement au moins un émulsifiant hydrophile. Cet émulsifiant hydrophile est présent, de préférence, à une teneur allant 5 de 5 à 20 % (notamment de 8 à 15 %) en poids par rapport au poids total de la phase aqueuse continue La valeur HLB d'un tel émulsifiant hydrophile est avantageusement supérieure à 8. Les émulsifiants hydrophiles ayant une valeur HLB variant de 8 à 18 sont particulièrement adaptés à la présente invention. 10 Des émulsifiants hydrophiles convenant à l'invention peuvent être choisis par exemple parmi les lécithines, les phospholipides, les sels d'acides gras, les sucroesters d'acides gars, les esters polyglycériques d'acides gras, les polysorbates, les gommes (arabique, caroube, cassia, gellane, guar, karaya, konjac, tara, tragacanthe, xanthane), les pectines, les amidons, les 15 carraghénanes, les alginates, les agars, les gélatines, ou les émulsifiants protéiques, notamment les caséines, les protéines sériques (comme les protéines sériques laitières) et les protéines végétales (comme les protéines de soja). Sont particulièrement adaptés à l'invention, les émulsifiants hydrophiles choisis parmi les émulsifiants protéiques. 20 On pourra par exemple choisir, en tant qu'émulsifiant protéique, des protéines laitières, notamment les caséines et/ou les protéines sériques. Ces protéines laitières peuvent être avantageusement incorporées sous forme de poudre de lait écrémée, de poudre de lait entier, de babeurre en poudre, d'un concentré ou d'un isolat de protéines (de préférence issues de produits 25 laitiers ou de produits dérivés de produits laitiers), ou encore des protéines de soja par exemple sous forme d'un concentré ou d'un isolat de protéines de soja. De préférence, ledit au moins un émulsifiant hydrophile sélectionné est adapté à une utilisation alimentaire et/ou pharmaceutique de l'émulsion double de l'invention. 30 Phase aqueuse continue sous forme de gel Dans un mode de réalisation préféré, la phase aqueuse continue de l'émulsion double se trouve sous forme d'un gel. La gélification de la phase aqueuse continue permet ainsi d'obtenir une 3039428 14 émulsion dont la stabilité est améliorée en limitant le phénomène de crémage. Le module élastique de cisaillement G' de la phase aqueuse continue sous forme de gel varie avantageusement de 200 à 20 000 Pa, de préférence de 1000 à 10 000 Pa. 5 Ce module élastique G' peut être estimé selon des méthodes dérivées des normes NF EN 14770 ou ASTM D4440, ou encore dans le cas des émulsions alimentaires selon des méthodes adaptées d'après le livre de James F. Steffe (Freeman Press; 2ème édition, 1996) « Rheological methods in food process engineering ». 10 Un tel gel est obtenu par l'introduction d'un agent gélifiant (ou « gélifiant ») dans la phase aqueuse continue. L'agent gélifiant est avantageusement choisi parmi les protéines ou les polysaccharides. Par exemple, lorsque le gélifiant est un polysaccharide, il peut être choisi 15 parmi les gommes (arabique, caroube, cassia, gellane, guar, karaya, konjac, tara, tragacanthe, xanthane), les pectines, les amidons, les carraghénanes, les alginates et les agars. Il peut être avantageux de choisir : - au moins une protéine ou au moins un lipide (tels qu'exemplifiés ci- 20 dessus), en tant qu'émulsifiant hydrophile de la phase aqueuse continue, et - au moins un polysaccharide (tel que décrit ci-dessus) en tant que gélifiant. Alternativement, dans un mode de réalisation préféré, on choisit au moins un émulsifiant hydrophile ayant également des propriétés gélifiantes de la 25 phase aqueuse continue. Un tel émulsifiant hydrophile/gélifiant comprend avantageusement une ou plusieurs protéines, notamment choisie(s) parmi les caséines, les protéines sériques (typiquement les protéines sériques laitières) ou les protéines végétales (comme les protéines de soja). 30 Dans ces conditions, les protéines ajoutées à la phase aqueuse continue permettent la gélification de cette dernière et la dispersion de l'émulsion primaire inverse dans ladite phase aqueuse continue. De préférence, cet émulsifiant hydrophile/gélifiant est, lors de son introduction, sous forme de poudre de lait écrémée, de poudre de lait entier, de 3039428 15 babeurre en poudre, d'un concentré ou d'un isolat de protéines, notamment de caséines, de protéines sériques (classiquement de protéines sériques laitières) ou de protéines végétales (notamment les protéines de soja). Les concentrés ou les isolats de protéines sériques laitières sont 5 particulièrement adaptés à l'invention. pH et osmolarité Le pH et l'osmolarité de la phase aqueuse externe sont de préférence adaptés au pH et à l'osmolarité du milieu dans lequel l'émulsion double de 10 l'invention est destinée à être plongée ou à cheminer. Par exemple, le pH et l'osmolarité de la phase aqueuse continue d'une émulsion selon l'invention peuvent être adaptés au pH et à l'osmolarité gastrique. Dans ces conditions, l'émulsion double de l'invention (et en particulier l'émulsion primaire inverse) résiste aux conditions physiologiques retrouvées dans 15 l'estomac et permet éventuellement une libération ciblée dans l'intestin de la molécule encapsulée (suite à la déstabilisation de ladite émulsion primaire inverse). Ainsi, dans certains modes de réalisation, la phase aqueuse continue présente un pH acide, en particulier un pH allant de 3 à 6,5, notamment de 3 à 20 5,5. Egalement, la phase aqueuse continue présente avantageusement une osmolarité allant de 150 à 400 mOsmol/L, et notamment 150 à 350 mOsmol/L. De préférence, les pH et les osmolarité des phases aqueuses interne et externe sont équilibrés. 25 En particulier, pour garantir une stabilité optimale de l'émulsion double, les phases aqueuses interne et externe présentent généralement : - une différence de pH inférieure ou égale à une unité pH, et - une différence d'osmolarité inférieure ou égale à 20 %, et notamment inférieure ou égale à 10 %. 30 Compte tenu de cette variabilité et en vue d'une résistance aux conditions gastriques, les phases aqueuses de l'émulsion double selon l'invention présentent de préférence : - un pH situé entre 3 et 5, et - une osmolarité allant de 150 à 350 mOsmol/L. 3039428 16 Les phases aqueuses interne et externe peuvent être additionnées par des solutés pour équilibrer leur l'osmolarité. Ces solutés sont avantageusement présents à une teneur allant de 1 à 10 % en poids (de préférence de 4 à 8 % en poids, et de préférence encore de 4 à 5 6 % en poids), par rapport au poids respectivement des phases aqueuses interne et continue. Les solutés peuvent être choisis parmi les sels minéraux et les sucres, de préférence compatibles avec une utilisation alimentaire. On peut ainsi utiliser par exemple des perméats de lait. 10 De préférence, le pH est ajusté avec des réactifs adaptés à une utilisation pharmaceutique et/ou alimentaire de l'émulsion double de l'invention. A titre d'exemple, le pH peut être ajusté avec de l'acide acétique, de l'acide citrique ou encore de l'acide lactique. 15 Additifs De façon générale, de nombreux additifs peuvent être introduits dans les phases aqueuses et/ou la phase huileuse de l'émulsion double de l'invention, afin d'augmenter les qualités de celle(s)-ci, comme des agents de saveur, des colorants, des conservateurs, des acidifiants, des antioxydants ou encore des 20 composés nutritionnels. Par exemple, lorsque l'émulsion double est destinée à former et/ou à être incluse dans un produit alimentaire, la phase aqueuse externe peut être additionnée de sucre. La concentration de ces additifs peut être aisément déterminée par 25 l'homme du métier en fonction des caractéristiques recherchées. Composés laitiers Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, l'émulsion double de l'invention est adaptée à une utilisation alimentaire, 30 autrement dit, une telle émulsion est comestible. L'émulsion double peut alors être obtenue principalement, ou uniquement/exclusivement, à partir de produits alimentaires et notamment à partir de produits laitiers (ou matière première laitière) ou de dérivés de produits laitiers. Ainsi, avantageusement, dans certains modes de réalisation l'émulsion double de 3039428 17 l'invention est un produit laitier. Dans de tels modes de réalisation, les émulsifiants lipophile et/ou hydrophile, ainsi que les éventuels solutés utilisés, sont de préférence obtenus à partir de produits laitiers ou dérivés de produits laitiers. 5 De même, les phases aqueuses et/ou la phase huileuse peuvent être obtenues à partir de produits laitiers ou dérivés de produits laitiers. Ainsi dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention : - ledit au moins un émulsifiant lipophile, et notamment lesdites PE, 10 - ladite phase huileuse et - ledit au moins un émulsifiant hydrophile, et notamment ledit au moins un émulsifiant hydrophile protéique ayant des propriétés gélifiantes, sont des composés issus de produits laitiers, ou dérivés de produits laitiers. 15 Par exemple, dans un mode de réalisation particulier : - ledit au moins un émulsifiant lipophile peut être extrait à partir de babeurre, - la phase huileuse est constituée de MGLA et - ledit au moins un émulsifiant hydrophile comprend des protéines 20 laitières ayant des propriétés gélifiantes, à savoir notamment des protéines sériques. De préférence l'osmolarité des phases aqueuses interne et externe d'une telle émulsion double est équilibrée avec du perméat de lait. Dans un mode de réalisation, la phase aqueuse continue est également 25 un produit alimentaire, notamment un produit laitier, comme le lait, le yaourt, etc., de sorte que l'émulsion double consiste en elle-même en un produit alimentaire. Composition massique Dans un mode préféré de réalisation : 30 - la phase aqueuse interne représente de 10 à 40 % et notamment de 15 à 30 % en poids de l'émulsion primaire inverse E/H, et - le ratio émulsion primaire inverse / phase aqueuse continue varie de 1 :20 à 1 :5 et notamment de 1 :10 à 1 :4. 3039428 18 Procédé d'obtention de l'émulsion double : L'invention concerne encore un procédé de préparation d'une émulsion double selon l'invention. Ce procédé comprend au moins les étapes suivantes : 5 - une première dispersion (ou émulsification) de la phase aqueuse interne dans une phase huileuse contenant ledit émulsifiant lipophile, à savoir au moins 70 % (notamment au moins 80 % et de préférence au moins 90 % ou encore au moins 95 %) en poids de PE par rapport au poids total dudit émulsifiant lipophile, jusqu'à obtenir une émulsion primaire inverse E/H stabilisée ; 10 - une seconde dispersion (ou émulsification) de ladite émulsion inverse primaire dans une seconde phase aqueuse (dite « phase aqueuse continue »), contenant au moins un émulsifiant hydrophile, de manière à obtenir ladite émulsion multiple. Dans certains modes de réalisation, l'émulsion primaire inverse est 15 dispersée dans une phase aqueuse alimentaire, comme un produit laitier ou un dérivé de produit laitier, comme le lait ou le yaourt par exemple. Le procédé de l'invention permet ainsi d'obtenir une émulsion double comestible, notamment sous forme d'un produit laitier. Un tel procédé permet avantageusement de diminuer le contenu total en 20 matière grasse d'une émulsion classique huile dans eau (H/E) en incorporant une phase aqueuse dans la phase huileuse dispersée, permettant ainsi le remplacement d'une partie de la phase huileuse par une phase aqueuse, sans affecter, en théorie, les qualités physiques ou organoleptiques de l'émulsion finale obtenue. 25 Chaque étape de dispersion (ou d'émulsification) est généralement réalisée à une température comprise entre 20 et 50 °C (notamment entre 30 et 50 °C, et de préférence entre 35 et 45 °C). Elle peut être réalisée par un dispositif de type rotor/stator. La vitesse d'émulsification est typiquement comprise entre 10 000 et 30 20 000 rpm (rotations par minute). Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'obtention de l'émulsion double de l'invention comprend l'ajout d'au moins une matière hydrophile d'intérêt dans la phase aqueuse interne avant la formation de l'émulsion primaire inverse (c'est-à-dire avant la première dispersion). 3039428 19 De préférence ladite matière hydrophile d'intérêt est une protéine. Une telle étape permet d'encapsuler ladite matière hydrophile d'intérêt dans ladite émulsion double de l'invention. Par ailleurs, dans le cas d'une phase aqueuse continue sous forme d'un 5 gel (notamment d'un gel de protéines, et en particulier d'un gel de protéines laitières), l'opération de gélification est alors mise en oeuvre : - préalablement à la dispersion de l'émulsion primaire inverse E/H dans ladite phase aqueuse continue, ou - après la dispersion de l'émulsion primaire inverse E/H dans ladite 10 phase aqueuse continue. L'opération de gélification est typiquement mise en oeuvre par chauffage de la solution constituant la phase aqueuse additionnée de gélifiant tel que précité (notamment par chauffage de la solution additionnée d'au moins une protéine gélifiante). 15 La température de chauffage dépend de la nature du gélifiant sélectionné. Comme décrit précédemment, on utilise de préférence au moins un émulsifiant hydrophile ayant des propriétés gélifiantes (et notamment au moins un émulsifiant hydrophile protéique ayant des propriétés gélifiantes). 20 On utilise ainsi de préférence une solution aqueuse additionnée d'un émulsifiant/gélifiant consistant en des protéines de lait. La gélification peut être obtenue en trois étapes : - une étape d'augmentation de la température, depuis une température ambiante de l'ordre de 20 °C jusqu'à une température comprise entre 25 70 et 100 °C (et notamment entre 75 et 90 °C), typipement pendant une durée allant de 10 à 25 min (et notamment de 10 à 20 min) ; - une étape de maintien de la température entre 70 et 100 °C (et notamment entre 75 et 90 °C), typiquement pendant me durée allant de 10 à 80 min et notamment de 10 à 60 min ; 30 - une étape de diminution de la température de la solution aqueuse à une température comprise entre 25 et 50°C notamment entre 25 et 35 °C, pendant une durée allant de 40 min à 80 min, notamment de 40 min à 60 min. Lorsqu'une protéine est encapsulée au sein de l'émulsion primaire 3039428 20 inverse de l'émulsion double, l'étape de gélification de la solution aqueuse est avantageusement réalisée avant l'étape de dispersion de l'émulsion primaire inverse E/H dans ladite solution aqueuse. Dans ces conditions, la structure et les propriétés de la protéine encapsulée sont préservées. 5 De préférence, le procédé de l'invention comprend encore une étape dans laquelle les osmolarités et le pH des phases aqueuses interne et continue sont équilibrés. De préférence encore, les osmolarités et le pH des phases aqueuses (interne et continue), sont ajustés avant toute opération d'émulsif ication. L'osmolarité est typiquement équilibrée par ajout de solutés, par exemple 10 du perméat de lait, tels que décrits précédemment. De préférence, l'osmolarité est ajustée, notamment avec du perméat de lait, avant l'étape de gélification de la phase aqueuse continue. Dans certains modes de réalisation de l'invention, le pH et l'osmolarité des phases internes et externes de l'émulsion double sont ajustés de façon à 15 correspondre au moins approximativement aux paramètres gastriques. Utilisations de l'émulsion double L'émulsion double de l'invention peut être utilisée en tant que telle pour remplacer les émulsions huile-dans-eau (H/E), en particulier les produits laitiers 20 qui sont des émulsions H/E. Alternativement, une émulsion E/H/E de l'invention peut être utilisée en tant qu'ingrédient dans des produits alimentaires afin d'y incorporer une molécule hydrophile d'intérêt encapsulée. L'utilisation d'une émulsion double de l'invention peut également 25 permettre de donner à des produits alimentaires une sensation crémeuse tout en réduisant la teneur totale en matière grasse. De tels produits alimentaire sont typiquement, les produits laitiers et leurs dérivés comme les yaourts, les crèmes et les fromages, les boissons et desserts lactés, les milkshakes, les sauces, la mayonnaise, etc. 30 De préférence, les « produits alimentaires », sont des produits laitiers ou dérivés de produits laitiers, comme le lait, le yaourt, le fromage, la crème, etc. Un tel produit alimentaire comporte une teneur en matière grasse qui peut varier de 0 à 40 % et notamment de 0,1 à 30 %, de 1 à 20 % notamment de 1 à 10 % ou encore de 1 à 5 %. Dans certains modes de réalisation, la teneur totale 3039428 21 en matière grasse d'un tel produit alimentaire est inférieure à 5 % en poids. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une émulsion double selon l'invention, encapsulant de préférence une matière hydrophile d'intérêt, pour la préparation d'un médicament ou d'un produit 5 alimentaire. Dans un mode de réalisation préféré, l'émulsion double de l'invention, éventuellement sous forme d'un médicament ou d'un produit alimentaire, est utilisée pour la libération ciblée d'une matière hydrophile d'intérêt (notamment d'une protéine) encapsulée dans ladite émulsion double, dans le tractus digestif 10 d'un sujet. De préférence, ladite matière hydrophile d'intérêt est destinée à être libérée dans l'intestin grêle. De préférence encore dans une telle utilisation, le pH et l'osmolarité des phases aqueuses interne et externe correspondent au moins approximativement 15 aux paramètres gastriques. Une telle correspondance augmente la stabilité de l'émulsion double dans l'estomac. 3039428 22 RESULTATS EXPERIMENTAUX MATERIEL ET METHODE a. Extraction des lipides 5 Les ingrédients utilisés pour la réalisation de l'émulsion double sont issus de produits laitiers. En particulier, le tensioactif (ou émulsifiant) riche en PE choisi pour la stabilisation de l'émulsion primaire est issu du babeurre. Le babeurre utilisé est un babeurre de chez CORMAN contenant 12 à 16 % de lipides et 6 à 8 % de phospholipides. Les échantillons de babeurre sont hydratés avec de l'eau 10 millipore avant d'être soumis au procédé d'extraction. Les solvants d'extraction sont réalisés à partir de chloroforme (CHCI3) ou dichlorométhane (CH2Cl2) et de méthanol (CH3OH). En plus de ces solvants d'extraction, l'acide acétique est utilisé lors de l'étape de séparation des classes de phospholipides. Il est utilisé afin de pouvoir faciliter la fixation de l'échantillon 15 sur la colonne. Une solution de chlorure de sodium à 0,73 % est aussi utilisée lors de ce procédé d'extraction afin de pouvoir séparer les sucres et les protéines des lipides. Deux méthodes d'extraction lipidique ont été testées : la méthode de Clark et la méthode de Folch. 20 La méthode de Clark est une méthode d'extraction par solvants. Elle peut être réalisée selon les étapes suivantes : Première décantation : - Dans une ampoule à décanter, mélanger 20 ml de l'échantillon hydraté à 180 ml de solvant d'extraction (CH2Cl2/MeOH, 2/1, v/v). 25 - Agiter puis dégazer le contenu à plusieurs reprises. - Laisser décanter une nuit dans une chambre froide à 4 °C. - Soutirer et conserver la phase organique (phase inférieure). Deuxième décantation : - Ajouter 200 ml de solvant d'extraction (CH2Cl2/MeOH, 4/1, v/v) dans 30 l'ampoule à décanter (contenant la phase non soutirée). - Agiter puis dégazer le contenu à plusieurs reprises. - Laisser décanter une nuit dans une chambre froide à 4 °C. - Soutirer la phase organique et l'ajouter à la première. 3039428 23 Troisième décantation (NaCI) : - Mesurer le volume total des deux phases organiques regroupées. - Dans une ampoule à décanter, mélanger la phase organique à une solution de NaCI (0,73 %) de manière à ce que le rapport phase organique/NaCI 5 soit de 4/1, v/v. - Ajuster le volume de méthanol de façon à se rapprocher d'un ratio CH2Cl2/MeOH égal à 2/1, v/v. - Agiter puis dégazer le contenu à plusieurs reprises. - Laisser décanter une nuit à 4 °C. 10 - Tarer le ballon de récupération puis soutirer et conserver la phase organique sur du sulfate de sodium anhydre. Evaporation des solvants : - Evaporer à sec le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif dont la température de l'eau du bain est de 45 °C. 15 - Sécher l'extrait lipidique sous courant d'azote. - Peser le ballon afin d'obtenir la quantité de lipides extraite. - Conserver les lipides dans du dichlorométhane à -20°C. La méthode de Folch est plus rapide que la méthode de Clark. Elle peut 20 être réalisée après hydratation de l'échantillon suivant les étapes suivantes : - Dans un bécher, mélanger l'échantillon hydraté à 230 ml de solvant d'extraction. - Filtrer sous vide le mélange - Récupérer le filtrat 25 - Dans une ampoule à décanter, mélanger la phase organique (filtrat) à une solution de NaCI (0,73 %) de manière à ce que le rapport phase organique/NaCI soit de 4/1, v/v - Agiter puis dégazer le contenu à plusieurs reprises - Laisser décanter une nuit à 4 °C 30 - Soutirer sur du sulfate de sodium anhydre - Evaporer le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif sous vide - Sécher sous flux d'azote - Reprendre la fraction dans un volume connu de chloroforme et conserver à 3039428 24 -20 °C. b. Séparation des classes de phospholipides Pour la stabilisation de l'émulsion primaire (E/H), seule une classe de 5 phospholipides est nécessaire, à savoir la classe contenant les PE et les PS. Une première méthode d'extraction se décompose en deux grandes étapes. La première étape permet de séparer les lipides neutres (triglycérides) 10 des lipides polaires (phospholipides). Elle peut être réalisée suivant les sous-étapes suivantes : Lavages à l'acétone froid - Evaporer sous azote le solvant. - Ajouter 30 ml d'acétone froid. 15 - Vortexer pendant une minute. - Laisser le mélange sous agitation pendant une heure à +4 °C. - Centrifuger pendant 10 min à 1 000 g à 10 °C. - Tarer le ballon de récupération puis prélever et conserver le surnageant (tout le liquide) représentant les lipides neutres. 20 - Ajouter 30 ml d'acétone froid aux lipides polaires (partie solide restant dans le tube). - Renouveler les étapes de vortex, d'agitation et de centrifugation. - Prélever le surnageant et l'ajouter au précédent. - Effectuer un troisième lavage si nécessaire. 25 Lipides neutres : - Evaporer le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif sous vide. - Sécher sous flux d'azote. - Peser le ballon afin de connaitre la quantité de lipides polaires extraite. Lipides polaires : 30 - Dissoudre les lipides polaires dans du chloroforme. - Tarer un ballon, puis y verser les lipides polaires. - Evaporer le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif sous vide. - Sécher sous flux d'azote. 3039428 25 - Peser le ballon afin de connaitre la quantité de lipides polaires extraite. - Reprendre les fractions dans un volume connu de chloroforme et les conserver à -20 °C. La deuxième grande étape permet la séparation des classes de 5 phospholipides. Pour cela une méthode d'extraction en phase solide (SPE), réalisée sur cartouche de silice (SEP-PAK) a été utilisée. Elle peut être réalisée suivant les sous-étapes suivantes, adaptées de la méthode de Christie WW (1987) Prelude to analysis: Extraction, storage and preliminary fractionation of lipids. Dans: HPLC 10 and Lipids, a Practical Guide (Christie WW, ed) Pergamon Press, Oxford, 71-86) : - Conditionner les cartouches en les rinçant dans un premier temps au méthanol. - Effectuer un deuxième rinçage mais cette fois avec du chloroforme. - Veiller à ne pas laisser les cartouches sécher entre les deux étapes. 15 - L'échantillon est alors déposé sur les cartouches tout en respectant les quantités maximales, soit environ 100 mg. - Une fois déposé, l'échantillon est dans un premier temps lavé avec un mélange chloroforme/méthanol dans les proportions 80:20 (v/v), (20 ml). Cette étape permet l'extraction de la fraction contenant les PE 20 (phosphatidyléthanolamines) et les PS (phosphatidylsérines). - Laver ensuite l'échantillon avec un mélange chloroforme/méthanol dans les proportions 50:50 (v/v), (20 ml). Cette étape permet l'extraction de la fraction PI (phosphatidylinositol)/PC (phosphatidylcholine). 25 - Laver ensuite l'échantillon avec du méthanol (20 ml). Cette étape permet l'extraction de la fraction contenant les SM (sphyngomyélines) et les LPC (lysophosphatidylcholines). - Récupérer ensuite les différentes fractions dans des ballons préalablement tarés. 30 - Evaporer le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif sous vide. - Sécher sous flux d'azote. - Peser le ballon afin de connaitre la quantité de phospholipides extraite. - Reprendre les fractions dans un volume connu de chloroforme et les 303 942 8 26 conserver à -20 °C. Une seconde méthode a également été testée afin de diminuer le nombre d'étapes. 5 Dans cette seconde méthode, les lipides neutres sont séparés des lipides polaires parallèlement à la purification des phospholipides. Pour cela, on utilise une méthode d'extraction sur phase solide (SPE), mais sur colonne et non sur cartouche. On prépare un mélange de Silice, préalablement activée, et de célite auquel on ajoute du chloroforme acidifié ainsi 10 que l'échantillon, le tout filtré sous vide. Cette étape permet de fixer l'échantillon sur la colonne et de séparer les lipides neutres des lipides polaires. La silice est alors placée dans la colonne de verre et le premier solvant d'élution est alors déposé, toujours selon la méthode de Christie. Cette méthode peut être réalisée suivant les étapes suivantes : 15 - Préparer 10 g d'acide silicique activé et 5 g de célite dans un bêcher ; - Ajouter du chloroforme (-100 ml) puis les lipides ; - Filtrer le mélange sous vide ; - Récupérer la poudre et la placer dans une colonne ; - Eluer l'échantillon avec 200 ml du solvant CH3CI3/MeOH (80/20), puis 20 (70/30) et enfin (50/50) ; - Evaporer le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif sous vide ; - Sécher sous flux d'azote ; - Reprendre la fraction dans un volume connu de chloroforme et conserver à -20 °C. 25 c. Les émulsions Les ingrédients utilisés dans la réalisation de l'émulsion double sont issus de produits laitiers. Pour cette raison, la Matière Grasse Laitière Anhydre (MGLA) a été choisie comme phase huileuse. Un tampon phosphate (NaH2PO4) 30 10mM est utilisé pour la réalisation des phases aqueuses de chacune des émulsions. Du perméat de lait est également présent dans les phases aqueuses afin que l'osmolarité de ces phases soit proche de celle des solutions de digestions. 3039428 27 Deux types d'émulsifiants sont utilisés : - Un mélange de phospholipides obtenus par extraction à partir du babeurre et contenant environ 88 % de PE et environ 12 % de PS, pour stabiliser l'émulsion primaire E/H 5 - Des protéines laitières pour stabiliser l'émulsion double E/H/E Les protéines laitières utilisées sont des protéines Prolacta-95 de chez Lactalis. Emulsion Primaire (E/H) 10 - Ajouter l'émulsifiant lipophile à la phase huileuse. - Pour une bonne dispersion, mélanger à l'aide du polytron à 10 000 rpm pendant environ 1 min. - Ajouter progressivement la phase aqueuse, tout en "agitant" à 20 000 rpm. - Une fois la phase aqueuse ajoutée, disperser le mélange pendant 3 min à 15 20 000 rpm. Emulsion Double (E/H/E) - Ajouter les protéines à la phase aqueuse, laisser sous agitation jusqu'à ce que la totalité des protéines soient dissoutes. 20 - Vérifier le pH et l'ajuster si nécessaire (pH voulu : 7). - Effectuer le traitement thermique afin d'obtenir un gel (à l'aide d'un bain). Traitement thermique: montée à 80 °C, maintien à 80 °C pendant 15 min, descente et stabilisation à 40 °C. 25 - Ajouter l'émulsion primaire, tout en agitant à 10 000 rpm. - Une fois l'émulsion primaire ajoutée, émulsionner le mélange pendant 3 min à 15 000/20 000 rpm. Pour éviter la cristallisation de la matière grasse, ces étapes se réalisent dans un bain-marie à 40 °C. 30 RESULTATS 1. Extraction et séparation des phospholipides a. Extraction lipidique 3039428 28 Les deux méthodes d'extraction ont été testées sur 4 échantillons de 10 g de babeurre. On estime (d'après les informations du fournisseur), que 10 g de babeurre contiennent de 1,2 à 1,6 g de lipides. (% massique) Méthode de Clark Méthode de Folch Rendement (1,2g) 82,3 ± 12 80 ± 11 Rendement (1,6g) 62 ± 9 60 ± 8 5 On observe que les quantités de lipides obtenues avec les deux méthodes sont similaires. b. Séparation des classes de phospholipides 10 Pour la stabilisation de l'émulsion primaire (E/H), seule une classe de phospholipides est nécessaire, à savoir la classe contenant les PE et les PS. Les deux méthodes d'extraction ont été testées. On estime (d'après les informations du fournisseur), que 10 g de babeurre contiennent environ 0,6 à 0,8 g de phospholipides soient entre 0,3 et 0,5 g de phospholipides de la classe 15 recherchée (fraction PE/PS). (% massique) Première méthode Deuxième méthode Rendement (0,4g) 70,2 ± 10 87,4 ± 5 Les deux méthodes produisent des résultats appropriés. On constate cependant, que le rendement est légèrement meilleur avec la deuxième méthode. 20 La méthode d'extraction des phospholipides a donc été réalisée comme suit : - Une extraction lipidique en suivant la méthode de Folch - Une séparation des classes de phospholipides en suivant la 25 méthode de Christie sur colonne de silice. Les méthodes de séparation des classes de phospholipides décrites précédemment permettent de séparer la classe de phospholipides contenant les PE et les PS par rapport aux autres classes de phospholipides (les PC, les PI, les SM et les LPC). 30 II est ainsi possible d'obtenir une composition (ou un mélange) de phospholipides contenant au moins 70 %, notamment au moins 80 % de PE, qui 0,00 P 33,70 39,16 30,14 18,56 19,80 24,21 23,78 39.58 73,58 100.00 100,00 1.047 1,032 1,084 3,278 °% PE Quant,té PC 1,782 1,669 1,374 1,537 14,12 85,88 3039428 29 est utilisée en tant qu'émulsifiant lipophile pour la préparation de l'émulsion primaire inverse. Plusieurs extractions ont été réalisées à partir d'échantillons de babeurre, les proportions respectives des différents phospholipides recueillis sont 5 récapitulées dans le tableau ci-après. Les fractions PE+PS, Pl+PC et SM+LPC ont été recueillies. Leurs proportions sont en accord avec celles décrites dans la littérature (Contarini & Povolo, Int. J. Mol. Sci. 2013 (14) : 2808-2831). 10 Deux extractions (N°2 et 3) ont permis d'obtenir ure fraction pure de PE (100 %). Lorsque la fraction de PE recueillie comprend également de la PS, cette dernière représente entre 14 et 26 % de la fraction. En pratique, les 4 extraits PE+PS ont été mélangés, ce qui donne une proportion moyenne PE : 88 % / PS : 12 %. 15 Ce mélange PE/PS a ensuite été utilisé en tant qu'émulsifiant lipophile pour réaliser des émulsions primaires inverse E/H puis les émulsions multiples. Toutes les émulsions obtenues avec un tel émulsifiant lipophile étaient stables. 2. Les émulsions 20 Les émulsions suivantes ont été réalisées : 3039428 30 - une émulsion primaire : émulsion E/H - une émulsion double : émulsion E/H/E a. L'émulsion primaire (E/H) 5 L'émulsifiant lipophile utilisé pour stabiliser cette émulsion est un mélange de phospholipides extraits du babeurre, tel que mentionné précédemment. Afin de pouvoir déterminer la quantité de phospholipides à insérer dans la formulation de l'émulsion primaire, une émulsion de référence a été réalisée en utilisant un émulsifiant standard : une lécithine de soja. 10 La formulation de cette émulsion de référence est la suivante : (g) MGLA Eau Emulsifiant Lécithine de soja Quantité 7,6 2 0,4 D'après le fournisseur, la lécithine de soja contient environ 7 % massique de phospholipides, on en déduit alors la formulation de l'émulsion primaire 15 suivante : (g) MGLA Eau Emulsifiant Phospholipides Quantité 7,97 2 0,03 Une telle émulsion est peu stable. Pour améliorer la stabilité de l'émulsion, deux autres formulations ont donc été testées avec des quantités de phospholipides (PE+PS) plus importantes. 20 (g) MGLA Eau Emulsifiant Phospholipides Formulation 2 7,9 2 0,1 Formulation 3 7,8 2 0,2 Ces deux émulsions sont plus stables que la précédente. La formulation 3 présente une stabilité particulièrement avantageuse. Une teneur d'émulsifiant lipophile s'élevant à 2 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion primaire 25 inverse a donc été utilisée dans la suite des expérimentations menées. b. L'émulsion double L'émulsion double est réalisée à partir de l'émulsion primaire. En effet, 3039428 31 l'émulsion primaire représente la phase dispersée de l'émulsion double. La formulation des émulsions doubles est la suivante : (g) Emulsion primaire Eau Emulsifiant Protéines de lait Quantité 1 17,1 1,9 5 Deux émulsions doubles sont réalisées : - Une dont la phase dispersée est l'émulsion primaire de référence - Une autre dont la phase dispersée est l'émulsion primaire contenant 200 mg du mélange de phospholipides extraits du babeurre et décrite précédemment (soit une teneur en émulsifiant de 2 % en poids par rapport au 10 poids total de l'émulsion primaire). Ces émulsions ont été analysées et caractérisées au microscope et au granulomètre le jour de l'émulsification, ainsi que 24 h après. On constate, d'après les résultats de granulométrie de la Figure 1A, la formation d'une émulsion double en utilisant la lécithine de soja. Le premier jour 15 (JO), deux pics sont observés : le premier entre 0,2 et 0,8 pm et le second aux alentours de 10 pm. Après 24 h, les deux pics se sont légèrement décalés vers les petites tailles, ce qui suggère une déstabilisation partielle de l'émulsion double par crémage. La figure 1B montre qu'une émulsion double est également obtenue 20 lorsque la fraction PE+PS est utilisée en tant qu'émulsifiant lipophile au lieu de la lécithine de soja. Une telle émulsion double est stable pendant au moins 24 h. Le premier jour (JO), deux pics sont observés : le premier entre 0,2 et 2 pm et le second aux alentours de 20 ilm. Le même phénomène de crémage est identifié. Afin d'augmenter la stabilité de l'émulsion double au cours du temps, la 25 phase aqueuse externe de l'émulsion double a été gélifiée. Cette gélification permet de ralentir significativement le phénomène de déstabilisation. Par ailleurs, l'osmolarité et le pH des phases aqueuses ont été ajustés afin de correspondre à ceux des solutions de digestion et d'anticiper ainsi une éventuelle déstabilisation lors de la digestion, liée aux paramètres gastriques. 30 (milliosmols) Solution gastrique Solution intestinale Souhaitée Osmolarité 177 340 260 3039428 32 Les osmolarités des solutions de digestion étant très différentes l'une de l'autre, on a choisi d'ajuster l'osmolarité des phases aqueuses à l'osmolarité moyenne, c'est-à-dire 260 milliosmols. Pour réguler l'osmolarité, du perméat de lait a été ajouté dans chacune 5 des phases aqueuses de l'émulsion double. Les résultats suivants ont été obtenus : (g) Emulsion primaire (remplace les 2g d'eau) Emulsion double (remplace les 17,1g d'eau) Eau 1,888 16,275 Perméat 0,112 0,835 Le perméat de lait jouant également un rôle dans la gélification de la phase aqueuse externe de l'émulsion double, l'osmolarité a été ajustée avant la 10 gélification de la phase aqueuse continue. Les différents essais réalisés ont montré que des émulsions particulièrement stables ont été obtenues avec les valeurs suivantes : PE+PS (g) MGLA (g) Perm éat (g) Eau (g) Emulsion 0,2 7,8 0,112 1,888 primaire Protéines (g) Perm g Eau (g) Emulsion primaire (g) Emulsion 1,9 0,83 16,27 multiple Le procédé de gélification en lui-même ne demande pas de manipulations particulières, il suffit simplement de traiter thermiquement la solution protéinée pour obtenir un gel. 20 La température de gélification d'une solution aqueuse de protéine est de l'ordre de 80°C. Le procédé est le suivant : - Préparation de la solution protéinée (eau, protéines et perméat/ pH 7) ; - Immersion de la solution dans un bain-marie à température 25 ambiante, soit à environ 20°C ; - Programmation du bain pour une montée à 80°C pendant une durée d'environ 15 à 17 min ; - Maintien du bain à 80°C pendant 15 min à 1 h 15 3039428 33 - Programmation du bain pour une descente à 40°C (température à laquelle on émulsifie), pendant une durée de 45 min à 56 min. Afin ne pas endommager la protéine encapsulée, la gélification de la phase aqueuse continue se fait de préférence avant la réalisation de l'émulsion 5 double. On constate, comme illustré dans la figure 2, qu'un pic supplémentaire apparaît aux grandes tailles par rapport aux émulsions doubles non gélifiées. Ceci est probablement dû à la mesure de morceaux de gel. Cependant, on retrouve les deux pics aux petites tailles, en accord avec ceux de la figure 1 B, légèrement 10 décalés vers la gauche, ce qui montre que l'émulsification est plus efficace dans le cas gélifié. Comme indiqué précédemment, on constate sur la figure 2 que la gélification contribue à augmenter la stabilité de l'émulsion double, puisque les pics ne se décalent pas après 48 h. Seul le pic aux grandes tailles disparaît, ce qui correspond à un gel plus homogène. 15 REVENDICATIONS1. Emulsion multiple de type eau-dans-huile-dans-eau (E/H/E) comprenant une phase aqueuse continue dans laquelle est dispersée une émulsion primaire inverse eau-dans-huile (E/H), laquelle émulsion primaire inverse comprend une phase aqueuse interne et une phase huileuse, stabilisée par au moins un émulsifiant lipophile, caractérisée en ce que ledit au moins un émulsifiant lipophile comprend au moins 70 % de phosphatidyléthanolamines (PE) en poids, par rapport au poids total dudit au moins un émulsifiant. 2. Emulsion selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit au moins un émulsifiant lipophile possède une valeur HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) inférieure à 6 et de préférence comprise entre 2 et 4. 3. Emulsion selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la teneur en émulsifiant lipophile varie de 0,5 à 20 % de préférence de 1 à 10 % et de préférence encore de 2 à 8 % en poids, par rapport au poids total de l'émulsion primaire inverse E/H. 4. Emulsion selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la phase aqueuse interne est dispersée dans la phase huileuse sous la forme de gouttelettes dont le diamètre moyen varie entre 0,1 et 1 pm, de préférence entre 0,2 et 0,6 pm. 5. Emulsion selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la phase aqueuse continue comprend au moins un émulsifiant hydrophile ayant une valeur HLB allant de 8 à 18. 6. Emulsion selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la phase aqueuse continue est sous forme d'un gel, de préférence sous forme d'un gel de protéines. 7. Emulsion selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la phase aqueuse interne et la phase aqueuse continue présentent des 30 valeurs d'osmolarité et de pH équilibrées, de préférence adaptées aux paramètres gastriques. 8. Emulsion selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la phase aqueuse interne encapsule au moins une matière hydrophile d'intérêt, notamment une protéine hydrophile. 303 942 8 35 9. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisée en ce que : - ledit au moins un émulsifiant lipophile, notamment lesdites PE, - ladite phase huileuse, et 5 - ledit émulsifiant hydrophile, consistent en des composés issus d'une matière première laitière. 10. Produit alimentaire comprenant une émulsion selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Procédé de préparation d'une émulsion multiple de type eau-dans- 10 huile-dans-eau (E/H/E) composée d'une phase aqueuse continue et d'une émulsion primaire inverse eau-dans-huile (E/H) dispersée comprenant une phase aqueuse interne et une phase huileuse, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : - dispersion de la phase aqueuse interne dans une phase huileuse 15 contenant un émulsifiant lipophile comprenant au moins 70 % de phosphatidyléthanolamines (PE), en poids par rapport au poids total dudit au moins un émulsifiant lipophile, jusqu'à obtenir une émulsion primaire inverse E/H stabilisée ; - dispersion de ladite émulsion primaire inverse dans une seconde phase 20 aqueuse, dite phase aqueuse continue, de manière à obtenir ladite émulsion multiple. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la phase aqueuse continue est sous forme d'un gel, notamment d'un gel de protéines, dont l'opération de gélification est mise en oeuvre : 25 - préalablement à la dispersion de l'émulsion primaire inverse E/H dans ladite phase aqueuse continue, ou - après la dispersion de l'émulsion primaire inverse E/H dans ladite phase aqueuse continue. 13. Utilisation d'une émulsion multiple selon l'une des revendications 1 à 9, ou obtenue par un procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, pour encapsuler au moins une matière hydrophile d'intérêt et/ou pour préparer un produit alimentaire. 14. Utilisation d'une émulsion multiple selon l'une des revendications 1 à 9, ou obtenue par un procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, pour 3039428 36 encapsuler au moins une matière hydrophile d'intérêt et pour la libération ciblée de ladite au moins une matière hydrophile d'intérêt dans le tractus digestif d'un sujet, de préférence dans l'intestin grêle.