Brevet FR3047080A1 — publié le 20170728

PROCEDE DE DIAGNOSTIQUE DE LA CIVD DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique et à un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique. La présente invention se rapporte également à un procédé de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique. La présente invention trouve une application notamment dans le domaine médical et vétérinaire. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Le choc septique est un syndrome caractérisé par une réaction inflammatoire de l'hôte en réponse à un agent pathogène responsable d'une hypotension résistante à l'expansion volémique et nécessitant l'introduction de vasopresseurs (noradrénaline) et s'accompagnant de défaillances viscérales. La coagulation est activée de manière constante au cours du choc septique et participe à la défense de l'hôte. Toutefois, cette activation peut être « dérégulée » avec une thrombopénie, une stimulation leucocytaire et endothéliale ainsi qu'une consommation des facteurs de la coagulation et de ses inhibiteurs, se traduisant par des microthromboses et responsable d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). L'association entre CIVD, gravité et défaillance multiviscérale est connue de longue date, rationnel de l'utilisation de traitements anticoagulants au 3047080 2 cours du choc septique en plus des traitements étiologiques et de défaillances d'organes. Toutefois, les études cliniques portant sur des traitements ayant un impact sur la coagulation - qui n'ont jamais ciblé spécifiquement les patients présentant une CIVD - se sont révélées 5 décevantes car ne permettant pas d'améliorer le pronostic des patients. À l'échelle de la France, 80000 cas de sepsis sont observés chaque année, défini comme une réponse inflammatoire systémique que l'organisme développe en réponse à l'invasion par un micro-organisme pathogène, et qui se traduit par une hypoperfusion des organes et une 10 dette en oxygène, pouvant évoluer vers un tableau de défaillance multiviscérale. L'hypotension artérielle y est persistante malgré un remplissage vasculaire adapté et nécessite le recours à des vasopresseurs (noradrénaline, adrénaline). Il s'agit donc d'une maladie grave et assez fréquente. 15 Cet état est lié à une activation cellulaire intense via l'induction de cytokines pro-inflammatoires et des modifications phénotypiques de l'endothélium vasculaire, qui prend alors un caractère pro-adhésif, pro-inflammatoire et pro-thrombotique. Il a été montré dans l'état de la technique, qu'après invasion par 20 un agent pathogène, la réponse de l'hôte se fait par la mise en jeu des systèmes d'immunité innée et d'immunité adaptative. L'immunité innée constitue la première ligne de défense, en libérant un grand nombre de chimiokines et cytokines (Aziz et al., 2013). Les polynucléaires neutrophiles (PNN) sont des cellules de 25 l'immunité innée. Ces cellules ont longtemps été considérées comme des cellules ayant pour seule fonction la phagocytose des pathogènes extra-cellulaires. Au cours des dernières années, l'évolution des connaissances sur la physiologie et la place des PNN a progressé dans un schéma plus complexe associant immunité innée, immunité adaptative, et hémostase 30 (Môcsai, 2013). Si les PNN ont un rôle majeur dans la défense antibactérienne par l'intermédiaire de la phagocytose, leur rôle ne s'y limite pas et il a été démontré depuis le début des années 2000 un rôle dans la 3047080 3 protection vis-à-vis des germes intracellulaires (virus, mycobactéries) mais aussi dans la régulation de la réponse immunitaire adaptative, en particulier par l'interaction avec les lymphocytes B de la zone marginale au sein de la rate. Ainsi, les PNN sont capables de relarguer le contenu de 5 leur noyau, ADN et histones, formant un maillage de fragments d'ADN et d'histones qui supportent des enzymes comme la myéloperoxidase, (MPO) ou l'élastase. Ces structures, décrites pour la première fois en 2004, sont appelées NETs (Neutrophil Extracellular Traps) et sont capables de capturer des pathogènes dans leur réseau macromoléculaire (Brinkmann 10 et al., 2004). Deux mécanismes de NETose sont décrits : l'un aboutit au suicide cellulaire et dure quelques heures, l'autre, la NETose "vitale", plus rapide permet la survie du PNN sous forme anucléée capable de phagocytose, fonction qui ne dépend pas de la synthèse de nouvelles protéines donc de la présence d'un noyau (Fuchs et al., 2007). 15 Les deux mécanismes s'accompagnent de modifications morphologiques des PNN décrites en microscopie électronique après induction de NETose in-vitro par du PMA ou phorbol-myristate-acetate (Brinkmann and Zychlinsky, 2012) : D'abord, la chromatine se décondense, le noyau perd ses lobulations, le cytoplasme se dégranule et 20 les NETs sont expulsés par la cellule. La voie de la NETose vitale semble impliquée au cours des infections par bactéries gram-positives. Les NETs sont relargués à partir des vésicules contenant la chromatine décondensée et les protéines anti-bactériennes. Les NETs exercent une fonction anti-microbienne en piégeant 25 bactéries et mycètes, mais pourraient également avoir un rôle dans la thrombinoformation. Ainsi, les NETs pourraient être un acteur majeur d'un nouveau concept appelé immunothrombose (Kessenbrock K, Krumbholz M, Schônermarck U, Back W, Gross WL, Werb Z, Grône HJ, Brinkmann V, Jenne DE. Nat. Med. 2009;15:623-625 ; Hashiba M, Huq A, Tomino A, 30 Hirakawa A, Hattori T, Miyabe H, Tsuda M, Takeyama N J Surg Res. 2015; 194(1):248-54). 3047080 4 A ce jour, la rapidité du processus de NETose, sa focalisation au site de l'infection et la dégradation de l'ADN nu par les nucléases circulantes sont des obstacles à la détection directe in vivo dans le sang circulant. Toutefois, il existe des marqueurs indirects de NETose, 5 notamment l'association de taux élevés de nucléosomes, d'histones citrullinées et de MPO circulants (Abrams et al., 2013)'(Kessenbrock et al., 2009). La NETose a pu être associée par l'intermédiaire de ces marqueurs à différentes pathologies notamment thrombotiques, infectieuses, cancéreuses ou auto-immunes (Kessenbrock et al., 2009)'(Demers et al., 10 2012). Il est connu un procédé de détection des leucocytes et neutrophiles à l'aide de la cytotmétrie en flux tel que décrit dans la demande de brevet américaine publiée sous le numéro US 2013/0101996. Les NETs jouent donc non seulement un rôle dans les 15 mécanismes de défense de l'hôte, mais participent aussi à l'interaction entre inflammation et coagulation durant les processus infectieux (Branzk and Papayannopoulos, 2013). Deux scores biologiques combinant les paramètres sanguins accessibles dans l'état de l'art actuel ont été proposés pour le diagnostic 20 de CIVD. Une des difficultés de l'élaboration de scores réside dans le fait qu'il n'existe pas à ce jour de « définition biologique » consensuelle de la CIVD. Le premier test de détection décrit en 2001 émane de l'International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH), le second de la Japanese Association for Acute Medicine (JAAM) en 2005 et revu en 2006. 25 Le score de l'ISTH est basé sur la présence d'une thrombopénie sévère, d'une diminution du taux de prothrombine (allongement du temps de Quick), d'une consommation du fibrinogène et d'une élévation des D-dimères, marqueurs de la fibrinolyse. Il permet de diagnostiquer les CIVD survenant au cours des pathologies néoplasiques, des traumatismes, de la 30 pathologie obstétricale mais apparait déficient au cours du choc septique en raison de l'importance du syndrome inflammatoire avec une thrombocytose, une élévation du fibrinogène et la présence de D-dimères. 3047080 5 Il semble donc peu adapté à une détection de CIVD lors d'un choc septique. Le score JAAM a été développé afin de diagnostiquer la CIVD lors de choc septique, et ne retient pas le fibrinogène comme critère 5 diagnostic tout en utilisant des valeurs seuil plus « cohérentes » dans le cadre d'un sepsis pour les D-dimères et les plaquettes. Ces différences ont conduit à des discussions au niveau du comité CIVD de l'ISTH pour redéfinir l'entité CIVD en séparant coagulopathies obstétricales, traumatiques, septiques ou oncologiques. 10 Toutefois, les scores précités ne peuvent être calculés, mis en oeuvre qu'à partir d'échantillons particuliers et nécessitent un temps important pour l'obtention des résultats générant ainsi un coût important dans la prise en charge. En outre, il n'existe pas actuellement de procédé permettant de 15 détecter de manière sure et systématique une CIVD. Il n'existe pas non plus de procédé et/ou de moyen permettant de prédire la survenue, par exemple à partir d'un échantillon biologique, d'une coagulation intravasculaire disséminée. Il n'existe pas dans l'état de la technique de procédé permettant 20 de déterminer chez un individu présentant un choc septique si celui-ci va déclencher/présenter dans un futur proche une coagulation intravasculaire disséminée. En revanche, il existe un procédé capable d'établir une prédiction d'un diagnostic négatif de CIVD chez un individu présentant un choc septique. Il s'agit d'un score combinant 3 paramètres : La 25 concentration de microparticules circulantes membranaires exposant la phosphatidylsérine et l'antigène CD105, la numération plaquettaire et le taux de prothrombine avec une spécificité de 71.2%, sensibilité de 71.0%, et une valeur prédictive négative de 93.1% (ajouter ici la référence du CCM lorsqu'elle sera publiée après la révision). Ce procédé, même 30 efficace, n'est pas technologiquement d'une mise en oeuvre facile et rapide. 3047080 6 Il existe donc un réel besoin de trouver un procédé et/ou un moyen palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé simple, rapide et efficace permettant de détecter la CIVD, afin d'améliorer le pronostic vital des individus et de réduire ainsi les 5 coûts de sa prise en charge. Description de l'invention La présente invention a pour but de surmonter les inconvénients de l'art antérieur en fournissant un procédé de prédiction et/ou de détection 10 de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant une mesure de la fluorescence des neutrophiles circulants. En particulier, les inventeurs de la présente invention montrent que le procédé de l'invention permet de déterminer la présence d'une 15 CIVD chez un individu présentant un choc septique et/ou d'identifier un individu susceptible de développer une CIVD à partir d'un échantillon sanguin. Dans la présente, par « marqueur biologique », on entend au moins un marqueur biologique choisi dans le groupe comprenant la 20 fluorescence des neutrophiles, la numération plaquettaire, la concentration en microparticules sanguines exposant la phosphatidylsérine et reconnues par un anticorps anti CD105 et le taux de prothrombine. Selon l'invention, par « neutrophiles activés», on entend tout neutrophile dont la décompaction de l'ADN permet le marquage par un 25 fluorochrome. Selon l'invention est appelée « intensité de fluorescence » tout signal mesuré à la longueur d'onde de réémission du fluorophore après excitation par exemple à 630 nm. L'intensité de fluorescence est proportionnelle à l'état de décompaction de l'ADN. 30 Le fluorochrome est appliqué à l'échantillon sanguin après une étape de lyse des globules rouges par un premier réactif qui agit également sur la membrane des leucocytes en la perméabilisant 3047080 7 permettant ainsi sa fixation. Le fluorochrome est un agent sans perméation membranaire à base ou non de polyméthine qui se lie aux acides nucléiques et ne diffuse dans le cytoplasme qu'au travers de la membrane leucocytaire perméabilisée et fixée. Les différentes populations 5 leucocytaires peuvent être identifiées sur la base de leur granulométrie ou de leur taille. Dans la présente, par « échantillon biologique », on entend tout échantillon obtenu à partir de mammifères, par exemple un mammifère choisi dans le groupe comprenant l'ordre Monotremata, Didelphimorphia, 10 Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, 15 Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea. Il peut s'agir par exemple d'un humain ou d'un animal. Il peut s'agir par exemple d'un animal d'élevage, d'un animal de compagnie, d'un animal en voie de disparition ou de tout autre animal. Selon l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon de 20 sang. Selon l'invention, l'échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique ou un risque de choc septique. Selon l'invention la mesure de la concentration du marqueur biologique choisi peut être réalisée par tout procédé adapté connu de 25 l'homme du métier. Par exemple, la mesure de la fluorescence peut être réalisée par tout procédé adapté connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basée sur la reconnaissance de sondes fluorescentes, Les sondes fluorescentes peuvent être par 30 exemple des intercalants s'insérant entre les bases de l'ADN ou des sondes spécifiques d'histones citrullinées comme des anticorps, ou des 304 70 80 8 sondes spécifiques d'une conformation des histones ou des nucléosomes induite par la décompaction de l'ADN ou par la NETose. En particulier, la présente invention a pour objet un procédé de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) comprenant 5 une mesure à partir d'un premier échantillon biologique de la fluorescence des neutrophiles. Selon l'invention, le procédé de détection peut comprendre en outre une étape de comparaison de l'intensité de la fluorescence mesurée avec une valeur de référence de fluorescence. 10 Selon l'invention l'intensité de fluorescence de référence peut être l'intensité de fluorescence des neutrophiles mesurée chez un sujet ou la moyenne de la valeur de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence. Dans la présente par « sujet sain de référence », on entend un 15 mammifère, par exemple un être humain ou un animal, n'ayant pas subi d'infection, de choc, d'hémorragie, de choc septique et/ou toute autre atteinte corporelle susceptible d'entrainer une Coagulation Intravasculaire Disséminée telle que définie ci-dessus. Selon l'invention par « groupe de sujets de référence » on 20 entend un groupe permettant de définir une valeur de référence fiable. Il peut s'agir par exemple d'un groupe comprenant au moins 2 sujets de référence tel que définis ci-dessus, par exemple au moins 10, au moins 40, au moins 60, au moins 100 sujets de référence. Il peut s'agir par exemple d'un groupe comprenant de 30 à 500 sujets, de 40 à 200, de 45 à 110 25 sujets de référence. Selon l'invention, la valeur de référence fluorescence des neutrophiles peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC obtenue, à partir d'analyse statique de valeurs obtenues à partir d'un sujet de référence et/ou groupe de sujets de référence 30 Selon l'invention la valeur de référence RNeut SFL ou Rneutfl peut être une fluorescence supérieure à 57 unités arbitraires. 3047080 9 Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la fluorescence des neutrophiles permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 91 % et une spécificité 5 supérieure ou égale à 81 % Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration RCD105 de microparticules membranaires porteuses du le 10 cluster de différenciation 105 (CD105) et exposant la phosphatidylsérine. Selon l'invention, le second échantillon biologique est un échantillon biologique tel que défini ci-dessus. Selon l'invention, le second échantillon biologique peut être identique ou différent du premier échantillon biologique. 15 Selon l'invention, le premier et second échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, le premier et/ou le second échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de 2 0 la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison de la concentration R0CD105 mesurée avec une valeur de référence RCD105. Selon l'invention la valeur de référence RCD105 peut être la valeur de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD105 mesurée chez un sujet ou la moyenne de la valeur 25 de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence. Selon l'invention, la valeur de référence RCD105 peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC. Selon l'invention, la valeur de référence RCD105 peut être une concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation 30 supérieure à 0,6 nM ou 0,65 nM équivalent PhtdSer ou PS. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la 3047080 10 détermination de la concentration RMCD105 permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 69%, avantageusement à 72 % et une spécificité supérieure ou égale à 48 %. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de 5 la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure de la concentration plaquettaire ROPIt. Selon l'invention, la mesure de la concentration plaquettaire dans un échantillon peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. 10 Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison de la concentration ROPIt mesurée avec une valeur de référence RPIt. Selon l'invention la valeur de référence RPIt peut être une concentration de plaquette égale à127 G/L ou une concentration inférieure 15 à 127 G/L. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration RPIt permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 64 %, avantageusement à 68% et une 20 spécificité supérieure ou égale à 90 %. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure du taux de prothrombine RoTP. 25 Selon l'invention, la mesure du taux de prothrombine dans un échantillon peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison du taux de 30 prothrombine ROTP mesurée avec une valeur de référence RTP. Selon l'invention la valeur de référence RTP peut être un taux de prothrombine inférieur à 58%. 3047080 11 Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration RoTp permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 73 avantageusement à 82 % et une 5 spécificité supérieure ou égale à 60%. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont également montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la combinaison de la fluorescence et du CD105, des plaquettes et du taux de prothrombine permet une détection avec une 10 sensibilité supérieure ou égale à 74% avantageusement à 85% et une spécificité supérieure ou égale à 74%, avantageusement à 86%. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont également montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la 15 détermination de la combinaison de la fluorescence, de la numération plaquettaire et du taux de prothrombine permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 66% avantageusement à 74% et une spécificité supérieure ou égale à 85% avantageusement à 95%. Dans la présente la valeur de fluorescence des neutrophiles 20 mesurée RONeut SFL est indépendamment désignée ROneutfl, la valeur Vneutfl peut être également désignée Vneutsfl et la valeur de référence RNeut SFL est indépendamment désignée RNeutfl. Aussi, la présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire 25 disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la Fluorescence des neutrophiles b. comparaison de la valeur mesurée ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl 30 c. Affectation d'une valeur Vneutfl égale 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur RNeutf ou d'une valeur Vneutfl égale 0 si ROneutfl est inférieure à la valeur RNeutfl 3047080 12 d. Calcul du score S selon la formule suivante : Si = E + Vneutfl x a + VCD105 X13 + Vplaquettes X 0+ VTp X e dans laquelle E est compris de -4.345 à -2.108 ou -4.345 à -2.108, a est compris de 0,027 à 1.912, 13 est compris entre 0.125 à 2.056, 5 est compris entre 1.735 à 3.647, e est compris entre -0.224 à 1.673, ou S1 = -3.2263 + 0.9697x Vneutfl + 1.0904xVcd105 + 2.6913xVplq + O. 7245xVtp En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés 10 avec le devenir du mammifère dont il provient. En outre, les inventeurs ont montré que lorsque la valeur de S1 est supérieure à -1,28 le procédé permet avantageusement une prédiction avec une sensibilité supérieure ou égale à 74% et une spécificité supérieure ou égale à 74%. 15 e. Calcul du score S2 selon la formule suivante : S2= -2,8257 + 1,0109 *Vneutfl - 2,5909 *Vpi,z, - (0,9583 *VTp), ou S2 = E + Vneutfl x a + Vplaquettes X 0+ VTp X e dans laquelle E est compris de -3.8204 à -1.831, a est compris de 0,091072 à 1,930728, S2 est compris entre 1,6893 à 3,4925, e est compris 20 entre 0,03992 à 1,86468. En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés avec le devenir du mammifère dont il provient. En outre, les inventeurs ont montré que lorsque la valeur de S2 est 25 supérieure à -0,54 le procédé permet avantageusement une prédiction avec une sensibilité supérieure ou égale à 74% et une spécificité supérieure ou égale à 85%. La présente invention a également pour objet un procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire 30 disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : 3047080 13 a. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), b. comparaison de la valeur mesurée R0CD105 avec une valeur 5 de référence RCD105 c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt e. mesure du taux de prothrombine RoTP 10 f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP g. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si R0CD105 est inférieur à la valeur RCD105 15 h. affectation d'une valeur Vpiq égale à 1 si RoPlt est inférieure à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpiq égale à 0 si RoPlt est supérieure à la valeur RPIt i. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est 20 supérieure à la valeur RTP j. calcul du score S3 selon la formule suivante : S3 = c-F a x Vcd105 +13 x VPIq + y x VTP dans laquelle c est compris entre -3,977516 et -2,273884 a entre 0,295144 et 1,887056 25 13 entre 2,504668 et 4,098932 y entre 0,374724 et 1,837276 En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés avec le devenir du mammifère dont il provient. En outre, les inventeurs ont montré 30 que lorsque la valeur de S3 est supérieure à -0,35 le procédé permet avantageusement une prédiction de CIVD avec une sensibilité supérieure ou égale à 70% et une spécificité supérieure ou égale à 90%." 3047080 14 La présente invention a également pour objet un procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : 5 a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutfl b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur 10 de référence RPIt e. mesure du taux de prothrombine RoTP f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP g. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles 15 Vneutfl égale à 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur Rneutfl OU d'une valeur Vneutfl égale à 0 si ROneutfl est inférieure à la valeur Rneutfl h. affectation d'une valeur Vpic, égale à 1 si RoPlt est inférieure à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpic, égale à 0 si RoPlt est 20 supérieure à la valeur RPIt i. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est supérieure à la valeur RTP j. calcul du score S2 selon la formule suivante : 25 S2= -2,8257 + 1,0109 * Vneutfl - 2,5909 *Vpi,z, - (0,9583 *VTP), ou S2 = c + Vneutfl x a + Vplaquettes x VTP x 0 dans laquelle c est compris de -3.8204 à -1.831, a est compris de 0,091072 à 1,930728, Q est compris entre 1,6893 à 3,4925, 0 est compris entre 0,03992 à 1,86468. 30 La présente invention a également pour objet un procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire 3047080 15 disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la fluorescence des neutrophiles ROneutfl b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des 5 neutrophiles ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl c. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), d. comparaison de la valeur mesurée R0CD105 avec une valeur 10 de référence RCD105 e. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt f. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt g. mesure du taux de prothrombine RoTP 15 h. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP i. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutfl égale à 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur RNeutfl ou d'une valeur Vneutfl égale à 0 si ROneutfl est 20 inférieure à la valeur RNeutfl j. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si R0CD105 est inférieur à la valeur RCD105 k. affectation d'une valeur VPIq égale à 1 si RoPlt est inférieure 25 à la valeur RPIt ou d'une valeur VPIq égale à 0 si RoPlt est supérieure à la valeur RPIt I. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est supérieure à la valeur RTP 30 m. calcul du score S1 selon la formule suivante : Si = E + Vneutfl x a + VCD105 X 13 + Vplaquettes X 0+ VTP X e 3047080 16 dans laquelle c est compris de -4.345 à -2.108 ou -4.345 à -2.108, a est compris de 0,027 à 1.912, 13 est compris entre 0.125 à 2.056, S2 est compris entre 1.735 à 3.647, 0 est compris entre -0.224 à 1.673, ou 5 S1 = -3.2263 + 0.9697x Vneutfl + 1.0904xVcd105 + 2.6913xVplq + O. 7245xVtp En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés avec le devenir du mammifère dont il provient. En outre, les inventeurs ont montré que lorsque la valeur de S3 est supérieure à -0,35 le procédé permet 10 avantageusement une prédiction de CIVD avec une sensibilité supérieure ou égale à 70% et une spécificité supérieure ou égale à 90%. La présente invention a également pour objet un examen de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant des moyens de mesure de la Fluorescence des 15 neutrophiles. Selon l'invention par moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence des neutrophiles on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la mesure de la décompaction de l'ADN des neutrophiles. Il peut s'agir par exemple des molécules choisies dans le groupe 20 comprenant des intercalants de l'ADN, des sondes de décompaction ou de marqueurs d'une activité enzymatique associée à l'ADN lors de la Netose, insolubilisés ou non sur tout type de support combinés ou non. Il peut s'agir par exemple de iodure de propidium, anticorps, substrats fluorescents d'élastase leucocytaire. 25 L'invention a également pour objet un procédé de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) comprenant une étape d'analyse morphologique des neutrophiles sur un frottis sanguin. Celle-ci peut comprendre une étape de comparaison entre la morphologie anormale des neutrophiles et la morphologie normale des neutrophiles 30 chez un sujet sain et permettre d'établir un score cytologique d'anormalité cytologique. 3047080 17 Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont également montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la comparaison morphologique des neutrophiles permet une association significative entre un score cytologique élevé et la CIVD (p-Value 5 est considéré 25 comme un frottis d'échantillon anormal. Tableau 6. Score cytologique 0 points 1 points Condensation Condensée Décondensée chromatinienne Granule Nombre et Diminués en nombre ou 3047080 18 densité avec une répartition Vésicules normales polaire Absence Nombreuses vésicules sous membranaires D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. 5 Brève description des figures La Figure 1 représente une fluorescence des PNN (NEUT-FL) plus élevée et significativement associée à la CIVD. Les résultats sont montrés par des boîtes à moustaches rouges (CIVD) ou bleue (absence de CIVD). 10 La ligne horizontale dans la boîte correspond à la médiane. Les limites, supérieure et inférieure, de la boîte correspondent respectivement aux 25ème et 75ème percentiles et les barres supérieure et inférieure aux 10ème et 90ème percentiles. Les lignes pointillées correspondent à des valeurs de référence. Les analyses statistiques représentent les 15 différences entre les mesures répétées entre les patients avec ou sans CIVD. A. NEUT-FL chez 100 patients en choc septique. B. Courbe ROC (Receiver-operating characteristic) de NEUT-FL au cours du choc septique. C. Microparticules neutrophiliques rapportées au taux de neutrophiles chez 100 patients en choc septique. 20 La figure 2 représente un diagramme en bâton de la concentration moyenne des microparticules membranaires plasmatiques en phosphatidylSérine équivalent (ordonnée) en fonction du temps lors d'une CIVD (en gris) ou non (blanc). Les lignes en pointillées représentent les 25 valeurs normales. Les analyses statistiques représentent les différences des mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps. 3047080 19 Figure 2A représente un diagramme en bâton de la concentration moyenne des microparticules membranaires en phosphatidylSérine équivalent (ordonnée) lors d'un choc septique (en gris) ou non (blanc). Les résultats représentés sont la concentration totale de Microparticules 5 membranaires (PhtdSer-microparticules). Figure 2B représente les concentrations des microparticules membranaires dérivées des leucocytes (CD11a-microparticules) rapportées aux leucocytes circulants et Figure 2C des microparticules membranaires dérivées des cellules endothéliales CD105-microparticules et Figure 2D des microparticules membranaires 10 dérivées des cellules endothéliales CD31-microparticules. Figure 3 représente des diagrammes en bâton des résultats obtenus en fonction de la présence d'une CIVD (gris) ou pas de CIVD (blanc). Les lignes en pointillés représentent les valeurs normales. L'ordonné 15 représente la concentration des leucocytes en G/L, des plaquettes en G/L, le rapport microparticules membranaires portant le CD11a sur le nombre de leucocytes en nM/G, le taux de prothrombine en %, le taux d'antithrombine en %, la concentration en D-Dimères en mg/L, les taux circulants de microparticules CD-105 et microparticules CD-31. L'abscisse 20 représente la condition et le jour de mesure : 1er (D1), 3ème (D3). Les analyses statistiques représentent les différences des mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps. Figure 4 représente en A. les courbes ROC de CD-105 - 25 microparticules, le taux de prothrombine, numération plaquettaire et le score prédictif de CIVD, en B, l'arbre décisionnel des patients en option de traitement . N+ renvoie au nombre de patients avec CIVD, N- est le nombre de patients sans CIVD. 30 La figure 5 : complète la figure 4, avec en A la représentation des fenêtres enregistrées par le cytomètre automatique et utilisées pour l'analyse du paramètre NEUT-FL. En C les variations des 3047080 20 « scattergrammes » chez les sujets contrôles, ou en sepsis sans ou avec DIC. En D. Les modifications morphologiques observées sur des frottis sanguins après coloration MGG 5 Exemple 1. Utilisation d'un score combinant CD105+-MPs, le taux de prothrombine et la numération plaquettaire Résumé : Objectifs: la stratification des patients en choc septique est insuffisante et peut entraîner une allocation inappropriée de traitement dans les essais 10 cliniques randomisés (ECR), en particulier en ce qui concerne les traitements anticoagulants. Nous montrons que les microparticules dérivées de l'endothélium CD-105 sont les biomarqueurs pertinents de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans le choc septique. Étude prospective observationnelle chez les patients en choc septique 15 hospitalisés dans quatre unités de réanimation. Patients et méthodes: 265 patients atteints de choc septique consécutivement hospitalisés, la CIVD a été diagnostiquée selon JAAM score 2006. Principaux résultats: 259 patients ont été analysés. 61 avaient une CIVD 20 à l'admission (CIVD-J1) et 32 une CIVD développée durant les 24 premières heures après l'admission (CIVD-J2). Plusieurs modèles de régression logistique ont confirmé que les MP dérivées des cellules endothéliales ont été associées à la CIVD: CD105+-MPs (OR 2,13) et CD31+-MPs (OR 0,65) (p 0,60 nM éq. PhtdSer, OR 1,67, p 38°C [0] 90/min * fréquence respiratoire > 20/min ou PaCO2 12000/mm3, 10 % des cellules) [0] > 120 Plaquettes (G/L) [1] 80-119 ou -30% [3] 64 Taux de prothrombine (%) [1] 15,0 Diagnostic de CIVD Score a 4/8 Dosage des microparticules : 10 L'activité pro-coagulante des MPs a été dosée par test fonctionnel prothrombinase sur plaque multi-puits streptavidinée (Roche®, France) par capture sur Annexine V ou grâce à des anticorps spécifiques de l'origine cellulaire pour le phénotypage microparticulaire. Ceci a été réalisé aux différents temps de prélèvement. 15 La méthode de dosage fonctionnel des MPs mise au point par l'équipe utilise un test enzymatique pro-thrombinase effectué dans une plaque multi-puits. Le dosage est réalisé après capture des MPs sur de l'Annexine 3047080 25 V biotinylée insolubilisée au fond des puits recouverts de streptavidine. Le test utilise, d'une part, la haute affinité de l'Annexine V (AV) pour la Phosphatidylsérine (PhtdSer) exprimée à la surface des MPs, et d'autre part celle de la biotine pour la streptavidine. La streptavidine est fixée de 5 manière covalente au fond des puits et l'AV biotinylée se fixe à la streptavidine. Pour le phénotypage des MPs, l'AV est remplacée par différents anticorps (Ac) monoclonaux biotinylés spécifiques de différentes cibles spécifiques de l'origine cellulaire des MPS. Nous utilisons ainsi un Ac anti-CD105 -endogline - (R&D Systems, Mineapolis, USA) pour 10 caractériser les MPs d'origine endothéliale, un Ac anti-CD11a (Leinco Technologies, St Louis, USA) pour caractériser les MPs d'origine leucocytaire, et un Ac anti-CD66b -CEACAM8- (BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA) pour caractériser spécifiquement les MPs d'origine neutrophilique. Les normes chez des volontaires sains ont été établies au 15 cours de travaux préalables 145. Les échantillons de plasma (100 pL/puits) contenant les microparticules sont ensuite déposés en double dans les puits et incubés pendant 30 minutes à 37°C. Après capture des MPs au fond des puits et lavage extensif, la réaction enzymatique prothrombinase est réalisée. Les 20 quantités de calcium et des facteurs de coagulation II, Va et Xa ajoutées sont déterminées afin que la phosphatidylserine fixée sur les MPs soit le facteur limitant de la transformation de la thrombine en prothrombine. La quantité de thrombine générée est révélée par son action lytique sur un substrat chromogénique (pNAPEP0216, 1,52mM, Cryopep, Montpellier, 25 France). L'absorbance est mesurée grâce à un spectrophotomètre (VersaMax Molecular Devices, Sunnylavale, Calfornie, USA) à la longueur d'onde de 405 nm. L'absorbance mesurée est proportionnelle à la quantité de PhtdSer exposée par les MPs. Les résultats sont exprimés en nanomolaires équivalents phosphatidylserine (nMeq. PhtdSer) par 30 référence à une courbe de calibration réalisée avec des vésicules synthétiques aux quantités connues de PhtdSer. 304 70 80 26 Statistique. Les variables ont été décrites comme des fréquences, et la comparaison a été faite par un test de x2 ou un test exact de Fisher. Les données quantitatives ont été données en moyennes et déviations standards et 5 analysées avec le test de Kruskall-Wallis. Les mesures répétées ont été analysées par ANOVA pour mesures répétées ou avec un modèle linéaire mixte. Les analyses post-hoc ont été réalisées en utilisant le test t avec correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples. Avant de procéder à cette analyse, les variables ont été évaluées pour leur normalité 10 et les variables dont la distribution n'est pas normale ont été transformées en utilisant soit une transformation logarithmique, racine carrée, inverse ou exponentielle. Plusieurs modèles de régression logistique ont été effectués pour expliquer la survenue d'une CIVD. Toutes les statistiques ont été réalisées avec le logiciel R version 3.1.3 software (R Core Team (2012). R: 15 A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. http://www.Rproject.org/ ). Une valeur de p 0,60 nM éq. PhtdSer, OR 1,67, p 3 166 (100.0) 32 (100.0) 61 (100.0) SOFA 10.2±2.9*# 12.3±2.4* 13.5±2.8# SAPS II 53.3±18.0*# 62.4±19.9* 63.5±17.1# Mortalité à J28 - N 48 (28.3)e 13 (41.9)* 29 (46.8)# (%) a" CIVD-J2": patients présentant les critères de CIVD à J2 et pas à J1; "CIVDJ1": Patients présentant les critères de CIVD à J1 *p 0.6 71.70 48.19 nM 2.33] eq. PS Numération 0.99 [0.98 0.25) 5 REFERENCES EXEMPLE 1 1. Fourrier F. Severe sepsis, coagulation, and fibrinolysis: dead end or one way? Crit Care Med 2012;40(9):2704-2708. 2. Gando S, Iba T, Eguchi Y, et al. A multicenter, prospective validation 10 of disseminated intravascular coagulation diagnostic criteria for critically iII patients: comparing current criteria. Crit Care Med 2006;34(3):625-631. 3. Taylor FB, Jr., Toh CH, Hoots WK, et al. Towards definition, clinical and laboratory criteria, and a scoring system for disseminated intravascular coagulation. Thromb Haemost 2001;86(5):1327-1330. 15 4. Delabranche X, Boisrame-Helms J, Asfar P, et al. Microparticles are new biomarkers of septic shock-induced disseminated intravascular coagulopathy. Intensive Care Med 2013;39(10):1695-1703. 3047080 31 5. Chung S, Kim JE, Park S, et al. Neutrophil and monocyte activation markers have prognostic impact in disseminated intravascular coagulation: in vitro effect of thrombin on monocyte CD163 shedding. Thromb Res 2011; 127(5):450-456. 5 6. Engelmann B, Massberg S. Thrombosis as an intravascular effector of innate immunity. Nature reviews Immunology 2013;13(1):34-45. 7. Zonneveld R, Molema G, Plotz FB. Analyzing Neutrophil Morphology, Mechanics, and Motility in Sepsis: Options and Challenges for Novel Bedside Technologies. Crit Care Med 2015. 10 8. Matsumoto H. The technology of reagents in the automated hematology analyzers Sysmex XE-2100TM - Red fluorescence technology. Sysmex J Int 1999;9:179-185. 9. Park SH, Park CJ, Lee BR, et al. Sepsis affects most routine and cell population data (CPD) obtained using the Sysmex XN-2000 blood cell 15 analyzer: neutrophil-related CPD NE-SFL and NE-WY provide useful information for detecting sepsis. International journal of laboratory hematology 2015;37(2):190-198. Exemple 2 Exemple d'un score combinant la fluorescence des 20 neutrophiles, le taux de prothrombine, la numération plaquettaire et les microparticules CD105-MP Patients 150 patients consécutifs d'âge adulte, tous remplissant les critères de 25 choc septique à l'admission aux soins intensifs, ont été inclus dans l'étude. Les patients atteints de maladies chroniques à un stade terminal ainsi que les patients souffrant de neutropénie ont été exclus de l'étude Selon le score JAAM, 35% des patients présentent une CIVD Les patients présentant une CIVD précoce induite par le choc septique étaient plus 30 gravement malades avec des scores de gravité SOFA (Sequential Organ 3047080 32 Failure Assesment Score) et SAPS2 (Simplified Acute Physiology Score) ainsi qu'une mortalité plus élevée statistiquement dans le groupe CIVD (tableau 5). Les numérations des leucocytes et des neutrophiles sont significativement inférieures chez les patients atteints de CIVD tandis la 5 quantification de l'Hémoglobine et du sodium n'est pas altérée, excluant de fait un effet de dilution du plasma. Prélèvements sanguins : En sus des prélèvements présentés dans l'exemple 1, des tubes sont 10 prélevés pour les analyses nécessaires aux soins des patients, dont un tube EDTA (VacutainerTM, Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France) et utilisés pour la détection de la fluorescence liée à la décompaction de l'ADN. Au cours du processus de validation, nous avons analysé, depuis des 15 échantillons prélevés sur des volontaires sains, l'activation ex- vivo des neutrophiles stimulés par une concentration de 4 pM d'ionomycine (Calbiochem, Merck Biodeveloppement, Martillac, France) Numérations et formules sanguines 20 L'intensité du marquage par l'intercalant de l'ADN qui témoigne de l'accessibilité du double brin (cellule immature, activation cellulaire... ), est identifiée comme NEUT-FL. La norme du paramètre NEUT-FL a été établie à partir de 1300 bilans, soit à partir de l'ensemble des patients majeurs ayant eu un bilan biologique pendant une période de 24 heures au CHU de 25 STRASBOURG sur les deux sites hospitaliers regroupant l'ensemble des spécialités médicales et chirurgicales adultes. Analyse de la morphologie des cellules Des frottis sanguins ont été effectués sur les patients et échantillonnés en 30 sur tube EDTA (7,2mg/4mL) / citrate (0,129M) puis soumis à une coloration de May-Grunwald-Giemsa. L'échantillonnage des volontaires sains a quant à lui été effectué depuis un prélèvement sanguin veineux périphérique. Un 3047080 33 score cytologique a été établi pour quantifier les anomalies observées (table 6) Statistique : 5 Les variables catégorielles (ou qualitatives) ont été analyses par le test exact de Fisher et les variables continues par le test des rangs signés de Wilcoxon. La normalité de la distribution a été analysée par le test de Shapiro-Wilk. La méthode de Bonferroni-Holm a été utilisée pour obtenir les « p-values » ajustées pour les comparaisons multiples. L'analyse des 10 aires sous les courbes ROC (Receiver-operating characteristic) a été réalisée et le coefficient de corrélation de Spearman déterminé. On considère statistiquement significatif une « p-value » inférieure à 0,05. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel R version 3.1.3 software (R Core Team (2012). R: A language and 15 environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. http://www.Rproject.org/ ). Les variables asymétriques sont présentés sous la forme de valeurs médianes avec interquartiles grâce au logiciel GraphPad Prism® version 6 (La Jolla, CA, USA). 20 Résultats : Numérations leucocytaires Les numérations leucocytaires et des neutrophiles sont significativement plus basses chez les patients présentant une CIVD. La fluorescence des neutrophiles est augmentée 25 chez l'ensemble des patients en choc septique (p REVENDICATIONS1. Procédé in-vitro de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un premier échantillon biologique comprenant une mesure de la fluorescence de neutrophiles. 2. Procédé de détection selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de comparaison de la valeur mesurée avec une valeur de référence. 3. Procédé de de détection selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'échantillon biologique est choisi dans le groupe comprenant un échantillon de sang. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration RMCD105 de microparticules membranaires porteuses du le cluster de différenciation 105 (CD105). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques sont un seul et même échantillon. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques proviennent d'un patient présentant un choc septique. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la valeur de référence fluorescence de neutrophiles est supérieure à 57 UA. 3047080 40 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, dans lequel la valeur de référence RCD105 est supérieure à 0,6 nM eq PS. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel lesdits premier, 5 second et troisième échantillons biologiques sont un seul et même échantillon. 10. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon 10 biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), b. comparaison de la valeur mesurée R0CD105 avec une valeur 15 de référence RCD105 c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt e. mesure du taux de prothrombine RoTP 20 f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP g. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si R0CD105est inférieur à la valeur RCD105 25 h. affectation d'une valeur Vpiq égale à 1 si RoPlt est inférieure à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpiq égale à 0 si RoPlt est supérieure à la valeur RPIt i. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est 30 supérieure à la valeur RTP j. calcul du score S3 selon la formule suivante : S3 = c-F a x Vcd105 + x VPIq + y x VTP 3047080 41 dans laquelle c est compris entre -3,977516 et -2,273884, a entre 0,295144 et 1,887056, 13 entre 2,504668 et 4,098932, y entre 0,374724 et 1,837276 OU 5 S3= 1,342 + (0,515 x [Vc01o5]) - (0,012 x [Vpic]) - (0,018 x [VTP]) 11. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : 10 a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutfl b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur 15 de référence RPIt e. mesure du taux de prothrombine RoTP f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP g. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles 20 Vneutfl égale à 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur Rneutfl OU d'une valeur Vneutfl égale à 0 si ROneutfl est inférieure à la valeur Rneutsfl h. affectation d'une valeur VP,q égale à 1 si RoPlt est inférieure à la valeur RPIt ou d'une valeur VP,q égale à 0 si RoPlt est 25 supérieure à la valeur RPIt i. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est supérieure à la valeur RTP j. calcul du score S2 selon la formule suivante : 30 S2= -2,8257 + 1,0109 *Vneutfl - 2,5909 *Vpi,z, - (0,9583 *VTP), Ou S2 = c + Vneutfl x a + Vpiaquettes x VTP x e 3047080 42 dans laquelle c est compris de -3.8204 à -1.831, a est compris de 0,091072 à 1,930728, S2 est compris entre 1,6893 à 3,4925, 0 est compris entre 0,03992 à 1,86468. 5 12. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutfl b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des 10 neutrophiles ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl c. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), d. comparaison de la valeur mesurée R0CD105 avec une valeur 15 de référence RCD105 e. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt f. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt g. mesure du taux de prothrombine RoTP 20 h. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP i. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutfl égale à 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur Rneutfl OU d'une valeur Vneutfl égale à 0 si ROneutfl est 25 inférieure à la valeur Rneutfl j. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si R0CD105 est inférieur à la valeur RCD105 k. affectation d'une valeur Vpiq égale à 1 si RoPlt est inférieure 30 à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpiq égale à 0 si RoPlt est supérieure à la valeur RPIt 3047080 43 I. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est supérieure à la valeur RTP m. calcul du score S1 selon la formule suivante : 5 Si = E + Vneutfl x a + VCD105 x 13 + Vplaquettes x 0+ VTP x dans laquelle c est compris de -4.345 à -2.108 ou -4.345 à -2.108, a est compris de 0,027 à 1.912, 13 est compris entre 0.125 à 2.056, S2 est compris entre 1.735 à 3.647, 0 est compris entre -0.224 à 1.673, ou 10 51 = -3.2263 + 0.9697x Vneutfl + 1.0904xVcd105 + 2.6913xVplq + O. 7245xVtp 13. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon 15 biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Ron'tfi b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl c. mesure de la concentration ROCD105 de microparticules 20 membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), d. comparaison de la valeur mesurée ROCD105 avec une valeur de référence RCD105 e. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt 25 f. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt g. mesure du taux de prothrombine RoTP h. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP 30 i. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutfl égale à 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur 3047080 44 Rneutsfl Ou d'une valeur Vneutfl égale à 0 si ROneutfl est inférieure à la valeur Rneutfl j. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale 5 à 0 si R0CD105 est inférieur à la valeur RCD105 k. affectation d'une valeur VPIq égale à 1 si RoPlt est supérieur à la valeur RPIt ou d'une valeur VPIq égale à 0 si RoPlt est inférieur à la valeur RPIt I. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est supérieur 10 à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est inférieur à la valeur RTP m. calcul du score S1 ou S2 ou S3 ou S4 selon la formule suivante : S1 = -3.2263 + 0.9697x Vneutfl + 1.0904xVcd105 + 2.6913xVplq + 15 0.7245xVtp, S2= -2,8257 + 1,0109 * Vneutfl - 2,5909 *VPIq - (0,9583 *Vtp), S3= 1,342 + (0,515 x [VCD105]) - (0,012 x [VPIq]) - (0,018 x [VTP]) 14. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une 20 coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration [CD105+-MPs] de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), 25 b. mesure de la concentration plaquettaire [Plt] c. mesure du taux de prothrombine [PT] d. calcul du score S4 selon la formule suivante : S4 = 1,342 + (0,515 x [CD105+-MPs]) - (0,012 x [Plt]) - (0,018 x [PT])