Brevet FR3047666A1 — publié le 20170818

La présente invention a pour objet : Une nouvelle composition aqueuse stérile injectable, stérilisée à la chaleur, comprenant au moins de l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, et un ou plusieurs oses non réducteurs Un procédé de préparation de ladite composition L'utilisation de ladite composition pour des applications esthétiques et thérapeutiques La matrice extracellulaire, également appelée ciment intercellulaire, désigne chez les êtres vivants l'ensemble des macromolécules extracellulaires du tissu conjonctif et des autres tissus. Elle est constituée en grande partie de glycoprotéines (collagène, fibronectine et laminine), de protéines (élastine) et de glycosaminoglycanes (dont l'acide hyaluronique est le plus connu). Le collagène est une famille de protéines, le plus souvent présente sous forme fibrillaire, ayant notamment pour fonction de conférer aux tissus une résistance mécanique à l'étirement. Il est largement présent dans la matrice extracellulaire des organismes vivants humains et animaux :- c'est d'ailleurs la famille de protéines la plus abondante chez l'être humain. Le collagène est sécrété par les cellules des tissus conjonctifs : les fibroblastes, les kératinocytes, les chondrocytes, - les ostéoblastes et les cellules endothéliales. L'élastine est une macromolécule de la famille des protéines fibreuses de type structural possédant des propriétés élastiques. Elle est sécrétée dans la peau par les fibroblastes. L'acide hyaluronique est un polysaccharide formé par la répétition d'une unité disaccharidique composée d'acide D-glucuronique et de N-acétylglucosamine. Sa structure est linéaire et sans spécificité d'espèce. L'acide hyaluronique est largement distribué dans les organismes vivants humains et animaux, dans lesquels il joue de nombreuses fonctions biologiques comme par exemple le contrôle du taux d'hydratation ou le maintien de la viscoélasticité de fluides ou de tissus. On le retrouve notamment en concentration élevée dans le liquide synovial, le corps vitreux de l'oeil et dans le derme. Un être humain de 70 kg possède environ 15 g d'acide hyaluronique dont la moitié est contenue dans la peau et cette quantité diminue avec le vieillissement. Dans la peau, l'acide hyaluronique est synthétisé par les fibroblastes et les kératinocytes. Ces macromolécules clés de la matrice extracellulaire, que sont le collagène, l'élastine et l'acide hyaluronique, sont donc toutes produites par les cellules qui sont à leur contact dans les tissus; cellules (fibroblastes, kératinocytes, chondrocytes, ostéoblastes, ...) spécialisées dans la synthèse 3047666 2 de ces différents constituants. La « centrale énergétique » de ces cellules s'appelle la mitochondrie. Son rôle physiologique est primordial, puisque c'est dans les mitochondries que l'énergie fournie par les molécules organiques (issues de la digestion d'oses) est récupérée sous forme d'ATP, la source principale d'énergie pour les cellules eucaryotes, par le processus 5 d'oxydation phosphorylante. Avec l'âge, l'accumulation des dommages oxydatifs sur les enzymes est responsable d'une diminution de l'efficacité des mitochondries qui sont plus pauvrement équipées en antioxydants et en systèmes de réparation de l'ADN. Le vieillissement (ou sénescence) est un processus physiologique attribué à la lente dégradation 10 des fonctions de l'organisme. Il est déterminé génétiquement et il est d'une grande variabilité inter-individuelle. En général, le vieillissement cutané s'installe à partir de 25-30 ans mais il s'accélère et devient manifeste vers l'âge de 50 ans. On parle de vieillissement intrinsèque. De nombreux facteurs extrinsèques peuvent également être responsables d'un vieillissement précoce. On peut évoquer le tabac, les carences nutritionnelles, les maladies et les agressions 15 environnementales comme le soleil, la pollution, le vent, le froid et la sécheresse. Ces facteurs intrinsèques et extrinsèques agissent avec le même impact négatif final sur les cellules de la peau : les kératinocytes et les fibroblastes ne peuvent plus se développer parfaitement et ainsi ils ne synthétisent plus aussi bien la matrice extracellulaire, milieu essentiel à la vie : moins de collagène, d'élastine et d'acide hyaluronique donnent un aspect moins tendu à 20 la peau. Au niveau du derme par exemple, les fibroblastes diminuent en nombre et en volume et leur capacité de synthèse protéique est détériorée. Les faisceaux de fibres de collagène se désorganisent et les fibres d'élastine s'amincissent et se raréfient. Le derme perd les capacités de résistance et d'élasticité qu'il offrait à la peau, ce qui induit une apparition de rides et des 25 dommages sur la fermeté et la tonicité cutanée. D'autre part, la qualité et la quantité du gel de protéoglycanes diminuent, ce qui amoindri les fonctions d'hydratation cutanée, provoquant ainsi un desséchement de la peau. Ainsi, le vieillissement est lié à une altération des mécanismes de réparation et/ou de maintenance des cellules. Il est déterminé, d'une part, par une sorte d'horloge biologique 30 individuelle génétiquement programmée, et d'autre part, par les capacités de résistance des cellules aux dégâts oxydatifs causés par des substances délétères, les radicaux libres. 3047666 3 L'agression des cellules par les radicaux libres entraîne des modifications au niveau des mitochondries, notamment une perte d'efficacité comme décrit précédemment, engendrant une diminution de la production de l'énergie vitale pour les cellules. Dans ce contexte, la présente invention concerne, selon un premier de ses aspects, une nouvelle 5 composition aqueuse stérile injectable, stérilisée à la chaleur, sous forme de gel, comprenant au moins de l'acide hyaluronique réticulé ou non réticulé, ou l'un de ses sels, et un ou plusieurs oses non réducteurs. Cette nouvelle composition a pour objectif principal les deux points suivants ayant un bénéfice direct sur l'efficacité clinique d'un traitement par injection dans les tissus mous, et en particulier 10 dans les tissus de la peau : - Stimuler la production d'énergie par les mitochondries des cellules sénescentes, ceci afin qu'elles accroissent leur activité de synthèse de collagène, d'élastine et d'acide hyaluronique, permettant ainsi de redonner, dans le cas du traitement de la peau, de là souplesse, de la résistance, de l'élasticité et de l'hydratation cutanée, limitant ainsi les 15 signes visibles de vieillissement tels que les rides ou le dessèchement de la peau - Compenser directement les effets négatifs liés à la diminution de la production de collagène, d'élastine et d'acide hyaluronique en comblant le manque de ces molécules par l'administration d'un gel aux propriétés biomécaniques de viscoélasticité adaptées à la matrice extracellulaire, et permettant par exemple dans le cas du traitement de la peau, 20 de combler des rides ou de restaurer/augmenter des volumes au niveau du visage ou du corps Cette composition est constituée d'une combinaison de deux ingrédients clés, l'acide hyaluronique réticulé ou non réticulé, ou l'un de ses sels, et un ou plusieurs oses non réducteurs. De manière très intéressante et surprenante, ces deux ingrédients, de nature chimique similaire, 25 possèdent une forte affinité l'un pour l'autre, sans pour autant être en mesure de réagir entre eux, et ceci, sans vouloir se lier à un explication, du fait de la grande stabilité et de l'inertie des oses non réducteurs qui ne sont pas susceptibles de participer aux réactions de Maillard (contrairement aux oses réducteurs) empêchant ainsi le développement de composés indésirables (au cours du procédé de fabrication et/ou au cours de la durée de péremption du 30 produit selon l'invention) pouvant être colorés, odorants et potentiellement toxiques. 3047666 4 Dans cette composition, l'acide hyaluronique permet de supplémenter les tissus de la peau (ou les autres tissus visés) par injection notamment dans la matrice extracellulaire dermique ou sous-cutanée, sur une longue période allant de quelques jours à plus de 18 mois. Cette supplémentation par une molécule naturellement présente dans la peau, possédant des 5 propriétés de viscoélasticité et de longévité (c'est-à-dire de durabilité in vivo) remarquables en particulier lorsqu'elle est réticulée, permet d'apporter un bénéfice clinique immédiat au patient traité en améliorant la qualité de la peau et/ou en réduisant les rides et/ou en restaurant/augmentant les volumes du visage ou du corps. Les oses non réducteurs, eux, permettent aux cellules sénescentes du derme et des tissus sous- 10 cutanés (en particulier les fibroblastes) de stimuler la production endogène de collagène, d'élastine et d'acide hyaluronique en leur apportant l'énergie nécessaire pour produire à nouveau ou pour produire davantage. Une fois injectée dans les tissus, la composition selon l'invention libère les oses non réducteurs au niveau de la zone traitée, au cours du temps : ces derniers, du fait de leur caractère non 15 réducteur, ne réagiront pas avec les protéines ou acides aminés environnants dans le milieu extracellulaire, tout comme dans le milieu intracellulaire (via des réactions de Maillard), conservant ainsi toute la nature et la fonctionnalité de ces molécules d'intérêt biologique. De ce fait, il est primordial de noter que les oses non réducteurs (contrairement aux oses réducteurs) présentent un niveau de toxicité négligeable vis-à-vis de l'environnement in vivo dans lequel ils 20 sont administrés, et donc permettent de conférer aux gels injectables issus de l'invention un haut niveau de sécurité absolument indispensable pour ce type de produits injectables. Après libération des oses non réducteurs au niveau de la zone traitée, le mécanisme d'action suivant peut être mis en avant : les oses sont hydrolysés par les enzymes osidases (clivant les liaisons osidiques) qui les dégradent en mono-oses (oses à un cycle) qui correspondent aux 25 substrats énergétiques. Les enzymes hexokinases phosphorylent ensuite ces différents mono-oses sur le carbone numéro 6, permettant alors à ces composés de rejoindre la glycolyse au niveau du fructose après épimérisation ou isomérisation. C'est ainsi que les oses donnent la possibilité de nourrir/alimenter les cellules sénescentes en manque d'énergie, et ainsi stimuler/favoriser la synthèse endogène de collagène, d'élastine et d'acide hyaluronique. Dans les conditions de 30 l'invention, les oses agissent comme un actif « bio-énergisant » pour stimuler les cellules présentes au niveau de la zone traitée. 3047666 Il est important de préciser que l'affinité chimique entre l'acide hyaluronique réticulé ou non réticulé et les oses non réducteurs, dans les conditions de l'invention, peut permettre de viser des cinétiques de libération des oses hors du gel sur des périodes de temps particulièrement longues afin de maximiser la performance long terme du traitement par un produit injectable issu de la 5 présente invention. La combinaison d'acide hyaluronique réticulé ou non réticulé et d'oses non réducteurs selon l'invention permet également de bénéficier d'une synergie précieuse vis-à-vis de l'efficacité clinique du produit. En effet, l'acide hyaluronique réticulé ou non réticulé, en particulier réticulé, lui, permet une libération retardée des oses au niveau de la zone dans laquelle le gel a été injecté 10 (il joue ainsi le rôle de réservoir de molécules à visée énergétique, et il est directement en contact avec les cellules à stimuler, appliquant même une pression sur celles-ci; pression bénéfique à la sécrétion des composés de la matrice extracellulaire par les cellules) alors que les oses non réducteurs, eux, sont en mesure d'agir au niveau des cellules, pour les renforcer, et notamment pour stimuler leur capacité antioxydante; capacité permettant alors de limiter la dégradation dé 15 l'acide hyaluronique administré (et donc la libération des oses non réducteurs qui n'ont pas encore été relargués) en neutralisant partiellement ou totalement les radicaux libres (ces entités ayant un fort potentiel de dégradation de l'acide hyaluronique par coupure de chaînes) présents au niveau de la zone traitée. Cette synergie, induite par la composition selon l'invention, génère donc un métabolisme amélioré aux niveaux cellulaires et une durabilité/longévité plus importante 20 de l'acide hyaluronique réticulé ou non réticulé afin d'obtenir une efficacité clinique améliorée du produit sur le plus long terme. Il est également important de préciser que, de façon tout à fait surprenante et inattendue, il a été observé par des tests expérimentaux que la composition selon l'invention possède des propriétés rhéologiques de viscoélasticité améliorées, après stérilisation à la chaleur, par rapport à une 25 composition de l'art antérieur ne contenant pas d'oses non réducteurs. En effet, il a été constaté que le module élastique G', bien connu par l'homme de l'art car fournissant une indication fiable sur la capacité du produit à créer du volume en projetant les tissus (par exemple, Sundaram et al., Piast Reconst Surg, 2013, 132:5S-21S), est plus important dans le cas d'un produit selon l'invention. Sans vouloir se lier à une explication, on suppose que les oses non réducteurs jouent 30 le rôle de stabilisateur thermique de l'acide hyaluronique réticulé ou non réticulé au cours de la stérilisation à la chaleur; stabilisation permettant alors à la composition selon l'invention de bénéficier d'un acide hyaluronique réticulé ou non réticulé stérile, stérilisé à la chaleur (donc bénéficiant d'un très haut niveau de stérilité pour une sécurité maximale du dispositif injectable), 3047666 6 moins dégradé et donc moins dénaturé que dans le cas d'un produit de l'art antérieur ne contenant pas d'oses non réducteurs. Il est à noter que ce même constat n'a pas été observé avec l'utilisation d'un ose réducteur, composé bien moins stable qu'un ose non réducteur. Selon un aspect de l'invention, les oses non réducteurs sont utilisés en tant qu'agent de 5 réticulation de l'acide hyaluronique réticulé dans la composition selon l'invention; l'ose non réducteur étant alors formulé seul en tant que réticulant dans la composition ou alors en combinaison avec des oses non réducteurs à « l'état libre », c'est-à-dire simplement dispersés (et non réticulés/greffés) au sein de la matrice d'acide hyaluronique réticulé. Selon un aspect avantageux de l'invention, l'acide hyaluronique est réticulé. Dans ce cas, le ou les 10 agents réticulants qui interviennent généralement dans la réticulation de l'acide hyaluronique sont des composés bi- ou poly-fonctionnels de différents types et ils peuvent par exemple être sélectionnés parmi la divinylsulfone, les époxy bi- ou poly-fonctionnels, les carbodiimides et le formaldéhyde. Les agents de la famille des époxy bi- ou poly-fonctionnels et notamment le 1,4- butanedioldiglycidyléther (BDDE), le diépoxy-octane ou le 1,2-bis-(2,3-époxypropyl)-2,3-éthylène 15 sont avantageusement choisis. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'agent de réticulation bi ou poly-fonctionnel est un dérivé d'ose non réducteur possédant au moins deux fonctions réactives vis-à-vis des fonctions hydroxyles et carboxylates de l'acide hyaluronique (en milieu aqueux (alcalin ou acide), ou en milieu organique). 20 Les fonctions réactives greffées aux oses non réducteurs sont choisies parmi les époxydes (préférentiellement glycidyl éther), les halides, les amines, les vinyles, les cétones, les aldéhydes, les thiocyanates, les isocyanates, les halosiliciums, les nitriles ou les sultanes. Ce sont ces fonctions réactives qui transforment l'ose non réducteur en réticulant. Chaque réticulant à base d'ose non réducteur possède ainsi une fonction réactive à l'extrémité de 25 la chaîne principale d'ose. La fonction réactive (R) peut être fixée préférentiellement sur l'alcool primaire de l'ose (0-ose-0), soit directement soit via un bras espaceur (S), suivant l'enchaînement R-S-O-ose-O-S-R. De manière alternative, la fonction réactive peut être attachée sur une fonction organique de l'ose autre que l'alcool primaire, via un bras espaceur (c'est-à-dire, dans le cas d'une fonction 30 réactive époxyde, la fonction époxyde ne doit pas être attachée directement sur l'ose). 3047666 7 Dans les deux cas ci-dessus, la longueur du bras espaceur S doit être assez courte, afin d'avoir notamment une toxicité la plus faible possible (on peut citer, par exemple, le méthyl ou l'éthyl glycidyl éther). La liaison créée entre l'ose et le bras espaceur (ou l'ose et la fonction réactive dans le cas d'une 5 fonction réactive directement greffée sur l'alcool primaire de l'ose) doit être stable en milieu aqueux neutre, acide ou alcalin (par exemple, une liaison éther sera préférée à une liaison ester). De manière avantageuse, le réticulant dérivé d'un ose, pour la réticulation de l'acide hyaluronique réticulé selon un aspect de l'invention, est le Tréhalose DiGlycidyl Ether (TDGE), de formule C18H30013, caractérisé en ce que deux fonctions réactives glycidyl éther sont greffées sur les 10 alcools primaires du tréhalose par création de liaisons éther. Selon l'invention, la composition contient de l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels, et en particulier ses sels acceptables d'un point de vue physiologique comme les sels de sodium, calcium, zinc, potassium, avantageusement le sel de sodium. L'acide hyaluronique peut être d'origine animale ou obtenu par fermentation bactérienne. Il peut avoir une masse moléculaire 15 de quelques daltons à plusieurs millions de daltons, avantageusement d'environ 0.01 à 5 millions de daltons, encore avantageusement d'environ 0.1 à 3.5 millions de daltons. Selon un aspect de l'invention, la composition peut être à base d'un dérivé de l'acide hyaluronique, c'est-à-dire à base d'une molécule obtenue en modifiant par voie chimique, ou par toute autre voie, la molécule d'acide hyaluronique. 20 Selon l'invention, la concentration totale en acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, est comprise entre 0.001 et 70 mg/ml, entre 0.01 et 50 mg/ml, entre 1 et 40 mg/ml, entre 5 et 35 mg/ml, entre 8 et 33 mg/ml, entre 9 et 30 mg/ml, entre 10 et 29 mg/ml, entre 11 et 28 mg/ml, entre 12 et 27 mg/ml, entre 13 et 26.5 mg/ml, avantageusement entre 14 et 26 mg/ml. Selon un aspect avantageux de l'invention, l'acide hyaluronique contenu dans la composition est 25 réticulé, au moins partiellement, et ceci préférentiellement selon les techniques de réticulation décrites dans l'art antérieur. Les températures de réticulation sont généralement comprises entre environ 15°C et 60°C et les durées de réticulation sont généralement de plusieurs heures, avantageusement de plus de 1h jusqu'à environ 24h. En terme d'agents de réticulation, comme décrit précédemment, l'acide hyaluronique peut être 30 ponté avec les réticulants de l'art antérieur ou, selon un aspect de l'invention, en utilisant un réticulant dérivé d'un ose non réducteur qui a été rendu bi- ou poly-fonctionnel par voie chimique 3047666 8 ou par toute autre voie. De manière avantageuse, le réticulant choisi est le BDDE (réticulant de l'art antérieur) ou le tréhalose diglycidyl éther (réticulant selon l'invention). Selon l'invention, la composition contient une proportion massique en ose non réducteur supérieure à 0.001% de la masse totale, supérieure à 0.01% de la masse totale, supérieure à 5 0.05% de la masse totale, supérieure à 0.1% de la masse totale, supérieure à 0.15% de la masse totale, supérieure à 0.5% de la masse totale, supérieure à 0.75% de la masse totale, supérieure à 1% de la masse totale, supérieure à 2% de la masse totale, supérieure à 3% de la masse totale, supérieure à 4% de la masse totale. Selon l'invention, la composition contient une proportion massique en ose non réducteur 10 inférieure à 20% de la masse totale, inférieure à 10% de la masse totale, inférieure à 8% de la masse totale, inférieure à 6% de la masse totale, inférieure à 5% de la masse totale. Selon un aspect de l'invention, le ratio massique entre la concentration massique en acide hyaluronique [HA] et la concentration massique en oses non réducteurs [Ose NR], c'est-à-dire lé ratio [HA]/[Ose NR], est compris entre 0.01 et 250 15 Selon l'invention, la composition contient un ou plusieurs oses non réducteurs, simples ou modifiés par ajout de fonctions réactives. Par oses non réducteurs simples, on entend les oses non réducteurs qui n'ont pas été modifiés/dérivés au préalable, par voie chimique ou par toute autre voie. On peut citer par exemple les oses non réducteurs simples suivants : 20 Disaccha rides : sucrose, tréhalose Trisaccharides : melezitose, gentianose, raffinose, erlose, umbelliferose, kestose, isokestose, lactosucrose, théanderose Tétrasaccharides : stachyose Pentasaccharides : verbascose 25 Ainsi que tous les oligo-saccharides non réducteurs jusqu'au icosa-saccharide soit 20 unités saccharidiques De manière avantageuse, l'ose non réducteur simple est le sucrose ou le tréhalose. Par oses non réducteurs modifiés par ajout de fonctions réactives, on entend les oses non réducteurs qui ont été transformés chimiquement ou par toute autre voie au préalable pour 30 intégrer des fonctions réactives leur permettant de jouer le rôle de réticulant de l'acide 3047666 9 hyaluronique, comme décrit précédemment et illustré par l'exemple avec le Tréhalose DiGlycidyl Ether (TDGE). Selon l'invention, la composition a pour ingrédient majoritaire l'eau (en proportion massique), d'où le qualificatif de composition aqueuse pour la nouvelle composition selon l'invention. La 5 masse en eau dans la composition selon l'invention est supérieure à 51% de la masse totale, avantageusement supérieure à 60% de la masse totale, avantageusement supérieure à 70% de la masse totale, avantageusement supérieure à 75% de la masse totale, avantageusement supérieure à 80% de la masse totale, avantageusement supérieure à 85% de la masse totale. Une solution tampon est avantageusement utilisée notamment pour mieux contrôler le pH et 10 l'osmolarité de la formulation tout au long de sa durée de péremption. On peut par exemple citer l'utilisation d'un tampon à base de chlorure de sodium et d'ions phosphates. Selon l'invention, la composition est stérile. Elle est stérilisée selon les techniques décrites dans l'art antérieur. Elle est avantageusement stérilisée à la chaleur, préférentiellement à la chaleur humide (également appelée autoclavage à la vapeur). 15 De manière préférée, la stérilisation à la chaleur humide est effectuée à une température supérieure à 100°C, avantageusement supérieure à 110°C, avantageusement supérieure à 120°C. De manière générale, la durée de stérilisation peut aller de quelques secondes à plusieurs minutes. On peut citer par exemple les cycles de stérilisation à la chaleur humide suivants : 121°C pendant 20 minutes ou 125°C pendant 7 minutes ou 127°C pendant 4 minutes ou encore 130°C 20 pendant 3 minutes. Il est important de noter que la stérilisation à la chaleur est avantageusement sélectionnée car elle octroie notamment un très haut niveau de stérilité à la composition choisie, ce qui permet alors de viser un haut niveau de sécurité pour le patient traité. Selon l'invention, la composition est injectable. Elle est préférentiellement conditionnée dans une 25 seringue ou dans un vial, afin de pouvoir être facilement administrée à travers une aiguille ou une canule. Selon l'invention, les molécules d'oses non réducteurs sont dispersées dans l'hydrogel de manière homogène ou relativement homogène. Selon un aspect de l'invention, la composition selon l'invention contient une ou plusieurs 30 substances actives d'origine naturelle ou synthétique à action pharmacologique ou non, comme 3047666 10 par exemple les antioxydants, les anti-inflammatoires, les antiseptiques, les antibactériens, les antifongiques, les anticancéreux, les anesthésiques locaux, les protéines, les hormones, seuls ou en combinaison. Ces substances actives sont soit dispersées dans l'hydrogel, soit greffées à un ou plusieurs des polymères de l'hydrogel, soit contenues/encapsulées dans des liposomes/niosomes 5 dispersés dans l'hydrogel, soit contenues/encapsulées dans un autre matériau lui-même dispersé au sein de l'hydrogel. Selon un aspect avantageux de l'invention, la composition selon l'invention contient de la lidocaïne (ou tout autre anesthésique) dispersée au sein de l'hydrogel. Selon un aspect de l'invention, la composition selon l'invention contient un ou plusieurs 10 composés d'origine biologique comme des cellules, des plaquettes enrichies, des gènes, des fragments d'ADN ou des facteurs de croissance. Ces composés sont préférentiellement dispersés dans l'hydrogel, mais ils peuvent également être greffés à un ou plusieurs des polymères de l'hydrogel ou contenus/encapsulés dans des liposomes/niosomes dispersés dans l'hydrogel ou contenus/encapsulés dans un autre matériau lui-même dispersé au sein de l'hydrogel. 15 Selon un aspect de l'invention, la composition selon l'invention contient des polymères qui sont- dispersés au sein de la matrice réticulée de l'hydrogel. On peut citer par exemple les polymères de la famille des polysaccharides (et notamment de l'acide hyaluronique non réticulé), les polyesters, les polyanhydrides, les polyphosphazenes, les poly-E-caprolactones, les acides polylactiques et leurs dérivés, les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, la N-vinyl pyrrolidone 20 et les polymères acryliques et dérivés biologiquement acceptables. Selon un aspect de l'invention, la composition selon l'invention contient des substances minérales qui sont dispersées au sein de la matrice réticulée de l'hydrogel. On peut citer par exemple l'hydroxyapatite ou les phosphates tricalciques comme le fi tricalcium phosphate. La présente invention concerne, selon un deuxième de ses aspects, un procédé de préparation de 25 la nouvelle composition aqueuse stérile injectable décrite précédemment. Le procédé de préparation de la composition selon l'invention se caractérise par les étapes successives suivantes : a) préparation d'un gel à base d'acide hyaluronique réticulé ou non réticulé, ou l'un de ses sels 30 b) ajout du ou des oses non réducteurs dans le gel avec opération de mélange 3047666 11 c) stérilisation Dans le cas plus complexe de la présence d'acide hyaluronique réticulé dans la composition, les détails suivants peuvent être fournis pour la réalisation de l'étape (a). L'étape (a) débute généralement par la mise en solution de l'acide hyaluronique puis par sa 5 réticulation, à l'aide d'un réticulant, et elle se termine généralement par la purification de l'hydrogel obtenu. On entend par étape de réticulation de l'acide hyaluronique, l'étape permettant de ponter les chaînes d'acide hyaluronique les unes aux autres par des liaisons covalentes. De manière générale, l'étape de réticulation de l'acide hyaluronique commence lorsque le réticulant est mis 10 en contact avec l'acide hyaluronique et se termine lorsque l'homme de l'art considère que la cinétique de réaction de pontage des chaînes d'acide hyaluronique par le réticulant a atteint un niveau négligeable. La purification de l'hydrogel, elle, permet de retirer les molécules indésirables du gel préparé et en particulier les résidus de réticulant, suite à la réticulation. Cette purification est effectuée selon 15 les techniques bien connues par l'homme de l'art comme par exemple par bains de dialyse, par lavage par flux d'eau continu ou par précipitation. La préparation d'un hydrogel à base d'acide hyaluronique réticulé est effectuée avantageusement selon les méthodes décrites dans l'art antérieur. On pourra par exemple citer les demandes WO 97/04012, WO 2004/092222, WO 2005/085329 et WO 2009/071697 pour la fabrication d'un 20 hydrogel à base d'acide hyaluronique réticulé. L'étape (b) consiste à ajouter un ou plusieurs oses non réducteurs dans le gel à base d'acide hyaluronique préalablement préparé. Cet ajout du ou des oses non réducteurs s'accompagne d'une opération de mélange ayant vocation à homogénéiser le ou les oses non réducteurs au sein de l'hydrogel. Le mélange peut se 25 faire pendant l'ajout et/ou après l'ajout. L'opération de mélange est effectuée par les techniques bien connues par l'homme de l'art comme par exemple par mélange mécanique au sein d'une cuve de mélange. Le mélange peut être effectué à une température supérieure à la température ambiante et/ou sous pression et/ou sous ultra-sons afin d'optimiser l'homogénéisation de la composition. 3047666 12 L'étape (c) consiste à stériliser la composition par les techniques bien connues par l'homme de l'art; la stérilisation étant avantageusement réalisée à la chaleur par autoclavage. Dans le cas d'une composition aqueuse stérile injectable selon l'invention contenant de l'acide hyaluronique non réticulé, un procédé avantageux selon l'invention pour la fabrication de cette 5 composition comprend au moins les étapes suivantes : a) préparation d'un gel à base d'acide hyaluronique non réticulé, ou l'un de ses sels b) ajout du ou des oses non réducteurs dans le gel avec opération de mélange c) stérilisation Un autre procédé avantageux selon l'invention pour la fabrication de cette composition aqueuse 10 stérile injectable selon l'invention comprend au moins les étapes suivantes : a) préparation d'un gel à base d'acide hyaluronique non réticulé, ou l'un de ses sels, avec ajout d'oses non réducteurs dans la solution aqueuse utilisée pour hydrater l'acide hyaluronique b) stérilisation 15 Dans le cas d'une composition aqueuse stérile injectable selon l'invention contenant de l'acide hyaluronique réticulé, un procédé avantageux selon l'invention pour la fabrication de cette composition comprend au moins les étapes suivantes : - préparation d'une solution aqueuse d'acide hyaluronique réticulation de l'acide hyaluronique 20 - purification de l'hydrogel, par exemple par dialyse dans une solution physiologique - ajout d'un ou plusieurs oses non réducteurs avec opération de mélange conditionnement en seringues stérilisation Un autre procédé avantageux selon l'invention pour la fabrication de cette composition aqueuse 25 stérile injectable selon l'invention comprend au moins les étapes suivantes : - préparation d'une solution aqueuse d'acide hyaluronique réticulation de l'acide hyaluronique purification de l'hydrogel, par exemple par dialyse dans une solution contenant un ou plusieurs oses non réducteurs suivi par une opération de mélange 30 conditionnement en seringues 3047666 13 - stérilisation Selon un aspect de l'invention, comme décrit précédemment, la réticulation de l'acide hyaluronique peut être réalisée en utilisant un réticulant dérivé d'un ose non réducteur selon l'invention au lieu d'un réticulant de l'art antérieur. 5 Dans ce cas, le procédé de préparation de la composition selon l'invention se caractérise par les étapes successives suivantes : préparation d'un gel à base d'acide hyaluronique réticulé, ou l'un de ses sels, en utilisant un dérivé d'un ose non réducteur transformé au préalable en composé bi- ou polyfonctionnel par voie chimique ou par toute autre voie, en tant qu'agent de réticulation 10 ajout optionnel d'un ou de plusieurs oses non réducteurs dans le gel avec opération de mélange stérilisation La présente invention concerne, selon un troisième de ses aspects, l'utilisation chez l'homme ou chez l'animal de la nouvelle composition aqueuse stérile injectable décrite précédemment, pour 15 des applications esthétiques ou thérapeutiques. La composition aqueuse stérile injectable selon l'invention est notamment utilisée pour : combler des volumes générer des espaces au sein de certains tissus, favorisant ainsi leur fonctionnement optimal 20 remplacer des liquides physiologiques ou des tissus déficients stimuler ou favoriser la régénération des tissus hydrater et protéger des tissus délivrer des substances susceptibles d'apporter un bénéfice à l'organisme et notamment des substances actives et/ou des biologiques 25 A titre d'exemple, on peut citer les utilisations de l'hydrogel dans les cas suivants : la formulation d'une composition injectable en intradermique ou en sous-cutané pour l'amélioration de la qualité de la peau ou le comblement des rides ou la restauration des volumes du visage (pommettes, menton, lèvres, nez, ...) ou du corps 3047666 14 la formulation d'une composition injectable à usage dentaire par exemple pour combler des poches parodontales et/ou pour stimuler la régénération des tissus autour de la dent la formulation d'une composition injectable en intra-oculaire, notamment pour des 5 applications au cours de la chirurgie de la cataracte, du glaucome, de la presbytie ou du vitré la formulation d'une composition injectable en intra-articulaire pour des applications en orthopédie ou en rhumatologie, notamment dans le cadre de la viscosupplémentation du liquide synovial déficient pour le traitement de l'arthrose 10 mais également de la reconstruction osseuse ou de la régénération du cartilage la formulation d'une composition injectable en urologie pour des applications dans le traitement de l'incontinence urinaire ou fécale la formulation d'une composition injectable utilisée en médecine ou chirurgie générale dans le cadre du traitement de la fibrose ou pour améliorer la cicatrisation 15 des plaies la formulation d'une composition pharmaceutique injectable permettant la libération contrôlée de substances actives et/ou de biologiques pour différentes applications médicales 20 EXEMPLES L'invention va maintenant être illustrée, de manière non limitative, par les exemples suivants. Le hyaluronate de sodium, les oses et l'ensemble des autres composés utilisés dans les exemples suivants possèdent un haut niveau de pureté. Les propriétés rhéologiques (mesure du module élastique G' à 0.7 Hz) des gels sont mesurées à 25 25°C à l'aide d'un rhéomètre à contrainte imposée (TA AR2000) et d'une géométrie cône/plan 4 cm-2° avec un entrefer de 1000 micromètres. Exemple 1: Préparation d'un gel G1 selon l'invention et des gels X1 et REF1 (comparatif) On pèse 2.5 g d'une poudre de hyaluronate de sodium (NaHA), de masse moléculaire environ 30 égale à 1.8 MDa, avec un taux d'humidité de 5.2%, auxquels on ajoute 21 g d'une solution 3047666 15 aqueuse de NaOH à 0.25 N. L'hydratation de la poudre dure 1h30, avec une homogénéisation manuelle régulière à la spatule. 1.1 g d'une solution de 1,4-butanedioldiglycidyléther (BDDE) dilué au 1/Sème dans la soude 0.25 N sont ajoutés au milieu réactionnel, suivi d'une homogénéisation mécanique de 15 minutes avant immersion dans un bain thermostaté à 50°C pendant 2h30. On 5 ajoute une solution de tampon phosphate contenant du HCI dans le réticulat obtenu afin d'obtenir un pH=7.3 et une concentration en acide hyaluronique égale à 36 mg/g. On laisse le gel gonfler pendant 24h à température ambiante dans cette solution et, à la fin de ce temps, on l'homogénéise manuellement à la spatule pendant 10 minutes avant de le purifier par dialyse pendant 24h en utilisant une membrane à base de cellulose (seuil de rétention = 10 000 Da) dans 10 une solution de tampon phosphate. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit REF1A le gel ainsi obtenu. La concentration en acide hyaluronique de REF1A est de 27 mg/g. On partage ensuite le gel REF1A en 3 fractions de masses égales. Dans la fraction 1, on ajoute du tréhalose (TH), un ose non réducteur. 15 Pour cela, on prépare une solution aqueuse de tréhalose à 120 mg/g dans une solution de tampon- phosphate. On dilue ensuite la fraction 1 du gel REF1A afin d'obtenir un gel avec une concentration en acide hyaluronique de 20 mg/g et une concentration en tréhalose de 30 mg/g (ratio massique [HA]/[TH] égal à 0.67). On homogénéise ensuite pendant 10 minutes à la spatule. Soit G1A le gel ainsi obtenu. 20 Dans la fraction 2, on ajoute du lactose (L), un ose réducteur. Pour cela, on prépare une solution de lactose à 120 mg/g dans une solution de tampon phosphate. On dilue ensuite la fraction 2 du gel REF1A afin d'obtenir un gel avec une concentration en acide hyaluronique de 20 mg/g et une concentration en lactose de 30 mg/g (ratio massique [HA]/[L] égal à 0.67). On homogénéise ensuite pendant 10 minutes à la spatule. 25 Soit X1A le gel ainsi obtenu. Dans la fraction 3, on ajoute une solution de tampon phosphate afin d'obtenir une concentration en acide hyaluronique de 20 mg/g. On homogénéise ensuite pendant 10 minutes à la spatule. Soit REF1AA le gel ainsi obtenu. 3047666 16 Les gels G1A, X1A et REF1AA sont conditionnés en seringues de 1 ml puis stérilisés à l'autoclave à 121°C pendant 18 minutes. Soit G1 (= gel selon l'invention), X1 et REF1 les gels stérilisés issus des gels G1A, X1A et REF1AA. La nouvelle composition G1 selon l'invention, stérile, stérilisée à la chaleur, est facilement 5 injectable à travers une aiguille fine de 27G 1/2, la rendant tout à fait compatible avec des injections dans les tissus mous d'un organisme vivant animal ou humain pour des applications esthétiques ou médicales. Exemple 2 : Préparation des gels G2, G3 et G4 selon l'invention 10 On prépare un gel REF1A selon le même mode opératoire que celui décrit dans l'exemple 1. On partage ensuite le gel REF1A en 3 fractions de masses égales. Dans la fraction 1, on ajoute du tréhalose (TH), un ose non réducteur, et du chlorhydrate de lidocaïne. Pour cela, on prépare une solution de tréhalose à 40 mg/g dans une solution de tampon 15 phosphate. On dilue ensuite la fraction 1 du gel REF1A afin d'obtenir un gel avec une concentration en acide hyaluronique de 20 mg/g et une concentration en tréhalose de 2 mg/g (ratio massique [HA]/[TH] égal à 10). On ajoute ensuite 3 mg/g d'une poudre de chlorhydrate de lidocaïne et on homogénéise pendant 10 minutes à la spatule. Soit G2A le gel ainsi obtenu. Dans la fraction 2, on ajoute du stachyose (SC), un ose non réducteur, et du mannitol. 20 Pour cela, on prépare une solution de stachyose à 40 mg/g dans une solution de tampon phosphate. On dilue ensuite la fraction 2 du gel REF1A afin d'obtenir un gel avec une concentration en acide hyaluronique de 20 mg/g et une concentration en stachyose de 2 mg/g (ratio massique [HA]/[SC] égal à 10). On ajoute ensuite 30 mg/g d'une poudre de mannitol et on homogénéise pendant 10 minutes à la spatule. Soit G3A le gel ainsi obtenu. 25 Dans la fraction 3, on ajoute du sucrose (S), un ose non réducteur. Pour cela, on prépare une solution de sucrose à 670 mg/g dans une solution de tampon phosphate. On dilue ensuite la fraction 3 du gel REF1A afin d'obtenir un gel avec une 3047666 17 concentration en acide hyaluronique de 5 mg/g et une concentration en sucrose de 500 mg/g (ratio massique [HA]/[S] égal à 0.01). Soit G4A le gel ainsi obtenu. Les gels G2A, G3A et G4A sont conditionnés en seringues de 1 ml puis stérilisés à l'autoclave à 131°C pendant 8 minutes. Soit G2, G3 et G4 (= 3 gels selon l'invention), les gels stérilisés issus des 5 gels G2A, G3A et G4A. Exemple 3 : Préparation des gels G5A et G5B selon l'invention On prépare un gel selon le même mode opératoire que celui décrit dans l'exemple 1, mais on remplace le réticulant BDDE de l'art antérieur par un nouveau réticulant selon l'invention à base 10 d'ose non réducteur, le Tréhalose DiGlycidyl Ether (TDGE). Le TDGE est synthétisé via une allylation par voie directe du tréhalose. Soit REF5A le gel ainsi obtenu. La concentration en acide hyaluronique de REF5A est de 27 mg/ml. On partage ensuite le gel REF5A en 2 fractions de masses égales. Dans la fraction 1, on ajoute du tréhalose (TH), un ose non réducteur. 15 Pour cela, on prépare une solution aqueuse de tréhalose à 120 mg/ml dans une solution de tampon phosphate. On dilue ensuite la fraction 1 du gel REF5A afin d'obtenir un gel avec une concentration en acide hyaluronique de 20 mg/g et une concentration en tréhalose de 30 mg/g (ratio massique [HA]/[TH] égal à 0.67). On homogénéise ensuite pendant 10 minutes à la spatule. Soit G5AA le gel ainsi obtenu. 20 Dans la fraction 2, on ajoute une solution de tampon phosphate afin d'obtenir une concentration en acide hyaluronique de 20 mg/g, après homogénéisation manuelle de 10 minutes à la spatule. Soit G5BB le gel ainsi obtenu. Les gels G5AA et G5BB sont conditionnés en seringues de 1 ml puis stérilisés à l'autoclave à 121°C pendant 18 minutes. Soit G5A et G5B (= 2 gels selon l'invention), les gels stérilisés issus des gels 25 G5AA et G5BB. 3047666 18 Exemple 4 : Caractérisation des propriétés rhéologiques des produits de l'exemple 1 Les propriétés rhéologiques de viscoélasticité (mesure du module élastique G' à 0.7 Hz) sont mesurées (6 mesures par gel dont la moyenne est présentée dans les tableaux ci-dessous) pour les gels de l'exemple 1 avant stérilisation et après stérilisation à l'autoclave. Avant stérilisation à l'autoclave : Gel Description G' à 0.7 Hz (Pa) G1A NaHA réticulé à 20 mg/ml + tréhalose à 30 mg/m1 (ose non réducteur) - non stérile 252 X1A NaHA réticulé à 20 mg/ml + lactose à 30 mg/ml (ose réducteur) - non stérile 256 REF1AA NaHA réticulé à 20 mg/ml - non stérile 249 Avant stérilisation, on constate que les gels G1A, X1A et REF1AA ont des modules élastiques-similaires. Après stérilisation à l'autoclave : Gel Description G' à 0.7 Hz (Pa) G1 NaHA réticulé à 20 mg/ml + tréhalose à 30 mg/ml (ose non réducteur) - stérile 179 (selon l'invention) X1 NaHA réticulé à 20 mg/ml + lactose à 30 mg/mi (ose réducteur) - stérile 141 REF1 NaHA réticulé à 20 mg/m1- stérile 156 Après stérilisation à la chaleur (stérilisation permettant d'atteindre un haut niveau de stérilité pour assurer un très haut niveau de sécurité du dispositif injectable), on constate de manière 15 intéressante et surprenante que le produit G1 selon l'invention possède un module élastique G' significativement plus élevé que pour le produit REF1 de l'art antérieur (ne contenant pas d'ose) et que le produit X1 qui lui contient un ose réducteur. On constate d'ailleurs pour ce dernier 5 10 3047666 19 (produit X1 avec l'ose réducteur) que le module élastique G' mesuré est inférieur à celui du produit référence REF1 de l'art antérieur ne contenant pas d'ose. Détermination du pourcentage de perte du module élastique G' lors de la stérilisation à l'autoclave : Gel Description Variation de G' à la stérilisation G1 NaHA réticulé à 20 mg/mi + tréhalose à 30 mg/ml (ose non réducteur) - stérile -29% (selon l'invention) X1 NaHA réticulé à 20 mg/ml + lactose à 30 mg/ml (ose réducteur) - stérile -45% REF1 NaHA réticulé à 20 mg/ml - stérile -37% 5 Pour l'ensemble des produits testés, on observe une diminution du module élastique G' à la stérilisation. Cette observation est en parfaite corrélation avec la littérature qui décrit que l'acide hyaluronique est sensible à la température et que, par conséquent, il se dégrade par coupure dé chaînes au cours d'un événement thermique. 10 Par contre, on constate que le pourcentage de diminution du module élastique G' est significativement inférieur pour le produit G1 selon l'invention par rapport aux autres produits REF1 et X1. Cela confère un avantage clinique conséquent en termes de sécurité et performance au produit selon l'invention, en parallèle de l'ensemble des autres bénéfices clés décrit précédemment. En 15 effet, cela permet de viser des modules élastiques G' plus élevés et donc une meilleure capacité à créer du volume dans les tissus en les projetant/poussant davantage (ce qui est clé dans le domaine de l'esthétique, par exemple pour formuler des produits injectables dédiés à la restauration des volumes du visage ou en médecine, pour formuler des produits dédiés au traitement de l'incontinence). D'autre part, d'un point de vue sécurité, il est important de préciser 20 que cette moins forte diminution du module élastique G' est synonyme d'une dégradation/dénaturation moins importante de l'acide hyaluronique, et donc d'une apparition plus faible des petites masses moléculaires inférieures à 50 000 Da; masses moléculaires étant décrites comme potentiellement pro-inflammatoires et donc susceptibles de générer des effets indésirables. 3047666 20 Exemple 5 : Préparation d'un gel G6 selon l'invention On pèse 1 g d'une poudre de hyaluronate de sodium (NaHA), de masse moléculaire environ égale à 1.8 MDa, avec un taux d'humidité de 5.2%, auquel on ajoute 20 g d'une solution de tampon phosphate qui contient également 0.2 mg/g de tréhalose. On mélange manuellement le gel à la 5 spatule pendant 10 minutes puis on mélange à nouveau pendant 10 minutes supplémentaires après avoir laissé le gel s'hydrater pendant 24 heures à la température de 5°C. Soit G6A le gel ainsi obtenu. La concentration en acide hyaluronique de G6A est de 50 mg/g et la concentration en tréhalose est de 0.2 mg/g (ratio massique (HAW[THI égal à 250). Le gel G6A est conditionné en seringues de 1 ml puis stérilisé à l'autoclave à 121°C pendant 15 10 minutes. Soit G6 (= gel selon l'invention), le gel stérilisé issus du gel G6A. 15 20 25 REVENDICATIONS1- Composition aqueuse stérile injectable, stérilisée à la chaleur, sous forme de gel, comprenant au moins de l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, et un ou plusieurs oses non réducteurs, caractérisée en ce que : o la proportion massique en eau est supérieure à 51% de la masse totale o la proportion massique en ose non réducteur est supérieure à 0.001% de la masse totale 2 - Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'acide hyaluronique est réticulé 3 - Composition selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que la composition est stérilisée à la chaleur humide 4 - Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la concentration totale en acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, est comprise entre 9 et 30 mg/ml 5 - Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la proportion massique en eau est supérieure à 80% de la masse totale 6 - Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la proportion massique en ose non réducteur est inférieure à 10% de la masse totale 7 - Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le ou les oses non réducteurs sont choisis parmi le sucrose ou le tréhalose 8 - Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le ratio massique entre la concentration massique en acide hyaluronique [HA] et la concentration massique en oses non réducteurs [Ose NR], c'est-à-dire le ratio [HA]/[Ose NR], est compris entre 0.01 et 250 9 - Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le réticulant utilisé pour réticuler l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, est un dérivé d'un ose non réducteur qui a été rendu bi- ou poly-fonctionnel par voie chimique ou par toute autre voie 10 - Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le réticulant utilisé pour réticuler l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, est le tréhalose diglycidyl éther (TOGE) 3047666 22 11 - Procédé de préparation d'une composition aqueuse stérile injectable comprenant au moins de l'acide hyaluronique réticulé, ou l'un de ses sels, et un ou plusieurs oses non réducteurs, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes successives suivantes : préparation d'un gel à base d'acide hyaluronique réticulé, ou l'un de ses sels 5 ajout du ou des oses non réducteurs dans le gel avec opération de mélange stérilisation par autoclavage 12 - Procédé de préparation d'une composition aqueuse stérile injectable comprenant au moins de l'acide hyaluronique réticulé, ou l'un de ses sels, et un ou plusieurs oses non réducteurs, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes successives suivantes : 10 préparation d'un gel à base d'acide hyaluronique réticulé, ou l'un de ses sels, en utilisant un dérivé d'un ose non réducteur transformé au préalable en composé bi- ou polyfonctionnel par voie chimique ou par toute autre voie, en tant qu'agent de réticulation ajout optionnel d'un ou de plusieurs oses non réducteurs dans le gel avec opération de mélange 15 stérilisation par autoclavage 13 - Utilisation de la composition selon l'une des revendications 1 à 10 pour des applications esthétiques 14 - Composition selon l'une des revendications 1 à 10, pour utilisation dans le cadre d'un traitement thérapeutique 20