Brevet FR3044685A1 — publié le 20170609

PUCE MICROFLUIDIQUE POUR LA CRISTALLISATION DE MOLECULES, PROCEDE DE PREPARATION, DISPOSITIF LA COMPRENANT ET PROCEDE DE CRISTALLISATION DE MOLECULES DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une puce microfluidique pour la cristallisation de molécules, avantageusement de macromolécules biologiques, en particulier de protéines. Ainsi, la présente invention concerne le domaine de la cristallisation de molécules, avantageusement de macromolécules biologiques, telles que des protéines. L'activité biologique de la plupart des protéines est déterminée par leur structure 3D, c'est à dire la manière dont les acides aminés de la chaîne polypeptidique sont agencés les uns par rapport aux autres dans l'espace. Par exemple, un nombre important de maladies moléculaires est causé par des modifications de structure de protéine. Les médicaments fonctionnent en se liant à des protéines, ce qui induit une modification de leur structure fonctionnelle en affectant ainsi leur activité biologique. La conception et l'amélioration des médicaments sont grandement facilitées par la connaissance des structures 3D de leurs cibles macromoléculaires. L'élucidation de la structure 3D des protéines est ainsi d'une importance primordiale pour comprendre les mécanismes sous-jacents des maladies moléculaires. Afin d'étudier cette structure 3D, on a essentiellement recours à des techniques de diffraction aux rayons X. La technique de diffraction nécessite que les macromolécules à étudier se trouvent sous la forme cristalline, et plus avantageusement sous la forme de monocristaux de bonne qualité et de volume suffisant. Dans le cadre de la présente invention, on entend par monocristal de bonne qualité, un cristal unique présentant : - une faible mosaïcité, - un pouvoir de diffraction important (à savoir inférieur à 2 angstrôm), - une taille comprise entre 1 et 100 lm. Pour obtenir des monocristaux de bonne qualité et de volume suffisant, il est essentiel de contrôler la cristallisation des macromolécules (à savoir la cristallogenèse). Le processus de cristallisation traite à la fois des caractéristiques thermodynamiques et cinétiques dans les espaces de phase multidimensionnels. Les données thermodynamiques sont les courbes de solubilité, la présence de phases métastables, les polymorphes, la séparation liquide-liquide... Et elles dépendent de plusieurs paramètres tels que la température, le pH, le solvant, les impuretés, etc. En outre, les trajectoires cinétiques dans le diagramme de phase 3044685 2 sont pertinentes pour contrôler la plupart des propriétés finales des cristaux synthétisés. Le chemin suivi dans le diagramme de phase contrôle la nucléation et la croissance des cristaux, et donc leur nombre, la taille et la morphologie. La cristallogenèse comporte deux étapes : 5 - une première étape, dite de nucléation, consistant en l'apparition de germes cristallins à partir d'une solution de cristallisation. - une deuxième étape, dite de croissance, consistant en la croissance cristalline des germes de cristaux obtenus lors de la nucléation. Pour une meilleure compréhension de la cristallisation il est important de réaliser un 10 diagramme de phases de la molécule à cristalliser qui est établi en fonction de la température, de la concentration en soluté, et/ou de la concentration en agent précipitant. On distingue sur un tel type de diagramme quatre zones: - La zone métastable, dans laquelle la solution est faiblement sursaturée, et peut se maintenir ainsi très longtemps sans formation de cristaux, mais les cristaux 15 ensemencés y grossissent ; - La zone de sous-saturation: La nucléation n'a pas lieu et les cristaux ensemencés sont dissous; - Le zone de nucléation spontanée : L'excès de la molécule à cristalliser se sépare de la solution de la molécule à cristalliser sous la forme de germes de cristaux (ou 20 autrement dit de nucléis). Les cristaux ensemencés y grossissent. - La zone de précipitation : zone dans laquelle la sursaturation est tellement importante que la formation des agrégats et des précipités y est favorisée avant la formation des cristaux. Les structures formées sont désordonnées. Il s'agit d'agrégats et/ou de précipités. 25 Les zones métastable, de nucléation spontanée et de précipitation forment ensemble la zone dite « zone de sursaturation ». La limite supérieure de la zone métastable (à savoir la frontière entre la zone métastable et la zone de nucléation spontanée) est aussi dénommée « limite de métastabilité » ou « courbe de supersolubilité ». Il a été d'abord supposé que toute protéine qui pourrait être solubilisée et purifiée serait 30 relativement facile à cristalliser. Cependant, les résultats ont indiqué que la solubilité et la pureté des protéines, bien que constituant des facteurs importants, ne garantissent pas un rendement de cristaux utiles. Le comportement des protéines en cristallisation s'avère très complexe. Néanmoins, la croissance des cristaux macromoléculaires, et ainsi la production 35 croissante des cristaux des protéines, des acides nucléiques, et des virus, est aujourd'hui un 3044685 3 outil des biologistes moléculaires et structurales. La corrélation structure-fonction est désormais de rigueur en enzymologie, de même que la conception des médicaments basée sur les structures cristallines des complexes devient indispensable. L'exploitation des résultats cristallographiques pour expliquer et décrire les phénomènes naturels continu à 5 croître, l'extension des méthodes aux problèmes structuraux plus compliqués mène à accroitre des tentatives pour cristalliser encore plus de macromolécules. Cela, à son tour, inspire un besoin en techniques plus efficaces et plus rapides pour croître ces cristaux. La mise en place des essais de cristallisation de protéines et l'analyse des résultats est devenue en grande partie automatisée. Le laboratoire de cristallisation peut ainsi comprendre 10 l'utilisation : - de robots de distribution : distribution de solution de réservoir, distribution de goutte de cristallisation, distribution de solution de réservoir et de goutte de cristallisation - de robots d'imagerie variant des microscopes semi-automatiques aux incubateurs entièrement automatisés. 15 Lorsque les cristaux sont trouvés, une évaluation doit être faite pour déterminer si les cristaux sont en effet des cristaux de protéines ou de type non-protéinique (e.g. des cristaux de sel). Et la qualité du cristal doit être évaluée ainsi que son utilité pour la collecte des données de diffraction. Cette analyse s'effectue de préférence in situ. Ces dernières années, trois nouvelles techniques ont été développées dans ce domaine : l'analyse de diffraction in 20 situ (Skarzynski, 2009 ; Le Maire et al., 2011), la détection UV (Judge et al., 2005; Debois et al., 2013) et la microscopie de la deuxième/seconde harmonique (SONICC ; Wampler et al., 2008 ; Kissick et al., 2011). En parallèle avec l'automatisation concernant de nombreux laboratoires de cristallisation, le dernier maillon dans « la pipeline » de l'analyse des protéines est l'analyse 25 de diffraction dans le faisceau des rayons X. Et cette partie est devenue aussi automatisée. De nos jours, le montage et la congélation des cristaux est même envisageable à partir des plaques de cristallisation standard au format SBS, à l'aide d'une pince en kapton attachée sur un bras robotisée (Heidari Khajepour et al. ; 2012). Les cristaux montés au laboratoire de l'utilisateur sont emballés dans un Dewar spécifique, leur montage étant compatible avec le 30 bras du robot de la ligne de lumière où les cristaux vont être analysés, et ils sont envoyés au synchrotron. Des plateformes de cristallisation qui comprennent les plaques de diffusion de vapeur (Bingel-Erlenmeyer et al., 2011; Axford et al., 2012; Cipriani et al., 2012), les puces microfluidiques (Pinker et al., 2013; Heymann et al., 2014; Perry et al., 2014), les boucles 35 accoustiquement chargées (Yin et al., 2014), les microcapillaires (Pineda-Molina et al., 2012) 3044685 4 et avec les nanogouttes (Maeki et al., 2012) permettent au moins en principe, de tester les cristaux in situ, une considération importante lors du dépistage de la qualité de diffraction aux rayons X. Grâce au rayonnement synchrotron intense, la cryocristallographie et les méthodes 5 directes de phasage, un seul cristal peut suffire. Mais il faut que ce soit un très bon cristal (cristal de très bonne qualité cristalline), même s'il est petit (de l'ordre de 10pm). Le rayonnement intense peut détruire un cristal de protéine, même s'il est congelé. La congélation elle-même peut fissurer un cristal en morceaux ou en augmenter la mosaïcité. Des méthodes directes ne peuvent pas être utilisées si le cristal ne diffracte pas à très haute 10 résolution. Donc, des problèmes demeurent, même pour les structures moins exigeantes. Vers la miniaturisation de la cristallisation : cristallisation en microfluidique Les outils miniaturisés fluidiques permettent un contrôle unique des voies cinétiques subies dans un diagramme de phase ainsi qu'un aperçu approfondi dans les processus de 15 nucléation et de croissance des cristaux de molécules inorganiques et biologiques. Les avantages de la microfluidique sont d'étudier la cristallisation avec des objectifs spécifiques : nous pouvons vouloir recueillir des données thermodynamiques et cinétiques, ou cultiver des cristaux exploitables dans le but d'effectuer des études de diffraction. En fait, la microfluidique offre une gamme d'outils qui sont utiles pour multiplier les 20 expériences et/ou mettre l'accent sur un point précis pour dévoiler les mécanismes fondamentaux. La technologie microfluidique est une boîte à outils pour manipuler des liquides dans les réseaux de microcanaux avec les échelles de 1-100 pm en longueur. Ces réseaux imitent les expériences classiques effectuées dans un laboratoire, mais avec un contrôle inégalé du point de vue des phénomènes de transport (Squires & Quake, 2005 ; 25 Vilkner et al., 2004 ; Stone et al., 2004). Dans le contexte spécifique de la cristallisation (Van der Woerd et al., 2003 ; Sauter et al., 2007), ces outils microfluidiques permettent essentiellement la manipulation de solutions aqueuses autour de la température ambiante. A l'origine, le domaine d'application était assez limité mais les progrès constants de la technologie microfluidique offrent désormais des fonctionnalités originales qui permettent au 30 chercheur de: 1. Effectuer l'acquisition de données à haut débit en utilisant des tests de cristallisation avec un volume aussi faible que 1 nL ; 2. Concevoir les voies cinétiques spécifiques en utilisant un excellent contrôle de transfert de masse et transfert de chaleur dues à la réduction des échelles de longueur et à l'intégration, 35 sur puce, des capteurs et des actionneurs ; 3044685 5 3. Apporter des nouvelles conditions expérimentales pour étudier la cristallisation, sans turbulences, sans ou avec peu d'effet de gravité, le confinement, et grand rapport surface/volume. En outre, les faibles volumes V utilisés en microfluidique ont un intérêt particulier pour la nucléation. Le temps moyen de nucléation (oc 1/V) peut dépasser la 5 cinétique de croissance des cristaux (Kashchiev et al., 1991) et un seul événement de nucléation est donc statistiquement observé. Ce mécanisme mononucléaire est essentiel pour estimer la cinétique de nucléation et d'étudier le polymorphisme. Beaucoup de cibles médicamenteuses sont des protéines membranaires intégrales qui 10 sont expérimentalement particulièrement exigeantes. Pour de tels objets difficiles, peu de plateformes de cristallisation existent et peu de structures sont résolues (Huang et al., 2015). Des centaines de très petits cristaux sont souvent testés avant qu'un jeu des données complet puisse être collecté en raison des dégâts causés par l'irradiation ou par la congélation. La qualité des données ainsi obtenues est souvent inférieure à celle qui pourrait 15 l'être avec des cristaux plus gros (Rice et al., 2000) ou non congelés, testés par la diffraction in-situ à température ambiante. En fusionnant des données de diffraction incomplètes, obtenues à partir de plusieurs cristaux isomorphes à température ambiante, un ensemble complet des données peut être obtenu pour la détermination de la structure 3D. Cette approche élimine la nécessité de récupérer les cristaux et les congeler, et évite en même 20 temps les effets néfastes dus à l'irradiation avec une collecte des données de diffraction en série à température ambiante. Par conséquent, il est donc nécessaire de pouvoir augmenter la taille, la qualité du cristal ainsi que de concevoir des supports de croissance de ces cristaux éliminant toute manipulation postérieure des cristaux et permettant les expériences de diffraction in-situ, pour rendre les expériences de diffraction significativement plus faciles, 25 plus rapides et pour un coût moins important. La dialyse est un procédé de séparation par membrane des molécules ou des ions en solution au même titre que l'osmose inverse, l'ultrafiltration et l'électrodialyse. Ces techniques diffèrent par la force utilisée pour que les espèces chimiques ou les ions puissent traverser la 30 membrane semi-perméable, c'est-à-dire la barrière relativement mince séparant deux milieux liquides. Ces forces sont un gradient de concentration dans la dialyse. L'avantage de cette dernière réside dans le fait qu'elle n'entraîne aucune consommation d'énergie, et empêche l'accumulation de constituants dans la membrane, ce qui permet d'envisager un fonctionnement en continu. La dialyse est une forme de filtration moléculaire : elle permet de 35 séparer les molécules selon leur taille, en utilisant des membranes semi-perméables dont les 3044685 6 pores ont une taille inférieure aux dimensions macromoléculaires. Ces pores laissent diffuser les petites molécules, telles que celles du solvant, des sels, et de petits métabolites, au travers de la membrane mais bloquent le passage de molécules plus grandes. La cristallisation par dialyse implique la mise en place de la molécule à cristalliser dans 5 un dispositif qui est scellé au moyen d'une membrane de dialyse. Cela permet alors à l'eau, des agents de cristallisation, des additifs ou encore des tampons de diffuser de part et d'autre de la membrane de dialyse tout en conservant la molécule à cristalliser dans le dispositif. Le dispositif est placé dans un conteneur approprié qui renferme les agents de cristallisation, les additifs et les tampons. Cette technique par dialyse tient compte aussi bien des effets « 10 salting in » (à basse force ionique, la solubilité de la molécule à cristalliser augmente lorsque la force ionique augmente) et des effets « salting out » (à haute force ionique, la solubilité de la molécule à cristalliser diminue lorsque la force ionique augmente) que du pH. La demande W02012/035268 décrit un dispositif de cristallisation, dans lequel la cristallisation est mise en oeuvre en faisant varier de manière contrôlée et in situ la 15 composition de la solution de cristallisation. Cette mise en oeuvre de la cristallisation présente l'intérêt de nécessiter un volume de l'échantillon de la molécule à cristalliser utilisé dans une seule expérimentation réduit par rapport aux techniques classiques de cristallisation avec la possibilité de le réutiliser ultérieurement. En effet, l'échantillon n'est pas consommé au cours de la cristallisation et les conditions de cristallisation peuvent être 20 changées de façon réversible, et ceci autant de fois que la protéine n'est pas endommagée (e.g. dénaturée) dans les conditions de cristallisation sélectionnées. Ce dispositif comprend une cellule à dialyse et un réservoir permettant la dialyse en flux continue contre une solution de composition contrôlée, permettant le contrôle de composition chimique (e.g. concentration du précipitant, pH, additifs,...). Le dispositif permet également le contrôle précis de la 25 température avec l'observation en temps réel des solutions de cristallisation. Le système permet l'exploration d'une multitude de conditions de cristallisation avec le même échantillon de protéine (15 pL de protéine par expérience). Cette approche permet des expériences en série au lieu d'expériences parallèles. 30 L'objectif de la présente invention consiste à miniaturiser un tel dispositif, sous la forme d'une puce microfluidique et d'accéder ainsi à un procédé de cristallisation de macromolécules performant. Cette puce pourra être directement placée dans le rayonnement d'un synchrotron, ce qui permet de collecter les données de diffraction sur nombreux cristaux isomorphes résidant 35 dans la puce et de s'affranchir de l'obtention de gros cristaux. La diffraction des rayons X 3044685 7 peut se faire directement sur la puce, à température contrôlée (le plus souvent à température ambiante), permettant ainsi de s'affranchir d'une étape de congélation ; la congélation pouvant en outre dégrader le cristal. Le procédé de cristallisation par dialyse, mis en oeuvre avec la puce selon l'invention, 5 permet en outre: - d'identifier le moment où on approche des conditions de cristallisation - de connaître le comportement des germes cristallins une fois formés et présents dans une solution de molécule à cristalliser. Nous visons à miniaturiser l'optimisation de la cristallisation des macromolécules 10 notamment biologiques tout en permettant la diffraction in situ. La miniaturisation permettra de revisiter différents phénomènes sous de nouvelles conditions expérimentales et d'intégrer les éléments de contrôle précis (e.g. température, concentration du précipitant), et donc de maîtriser le chemin cinétique suivant le diagramme de phase, et ceci avec une grande précision. Cette plateforme microfluidique de cristallisation automatisée permet d'accélérer 15 l'obtention de cristaux et d'augmenter la qualité cristalline en réduisant les manipulations que ceux-ci subissent tout en minimisant le volume d'échantillon nécessaire. Au-delà de l'apport de ce travail de microfabrication et notamment en ce qui concerne l'intégration de membranes de dialyse, la réussite du projet concerne avant tout la biologie structurale. La capacité de la plateforme microfluidique à recueillir des données 20 cristallographiques in situ d'un grand nombre de cristaux de protéines offre la possibilité d'utiliser le rayonnement synchrotron non seulement pour la cristallographie en série mais aussi pour la cristallographie résolue dans le temps (la diffraction Laue) et, par conséquent pour l'étude structurale de la dynamique des réactions biochimiques. L'enjeu majeur vient de l'intégration des capacités du traitement des fluides permettant au flux continu de déclencher 25 les réactions enzymatiques pour une analyse cristallographique dynamique. La définition de microfluidique que l'on peut trouver dans le dictionnaire Larousse est la suivante : « Branche de la mécanique des fluides étudiant ceux qui circulent dans des canaux de quelques micromètres de diamètre. ». On peut considérer qu'un système 30 microfluidique peut être défini comme tel à partir du moment où une de ses longueurs caractéristique est comprise entre lpm et lmm. Écoulement en micro-canal : En microfluidique, il est nécessaire de tenir compte des effets des écoulements dans les micro-canaux. Cependant au vu des dimensions de travail, de l'ordre du micromètre 3044685 8 jusqu'au millimètre, la physique classique est de rigueur même si les forces de contact jouent un rôle plus important à cette échelle qu'à l'échelle macroscopique. Le mouvement d'un fluide monophasique dans l'approche hydrodynamique est régi par 2 équations. L'équation de conservation de la quantité de mouvement (1) et l'équation de 5 conservation de la masse (2). Dû p -v-r+F Dt (1) Avec : p= p(.5c , t) masse volumique (kg.m-3) t> = û , t) vitesse (m.s-1) r=r( x, t)=(1- ) 10 tenseur des contraintes visqueuses F forces extérieures (N) Dp Dt (2) D Di est la dérivée particulaire que l'on peut retrouver en considérant une fonction f de l'espace et du temps. Lors d'un mouvement d'une particule fluide durant dt selon x la 15 particule aura parcouru dx=x+vdt, on aura donc : , a df = f (x + vdt ,t +dt)- f (x ,t )= f af x dv+ t dt df = fan vdt +fa dt Df =8 f v+8 a t Dt ax êt Donc u d'où (3) En hydrodynamique on considère souvent que le fluide est incompressible lorsque sa 20 vitesse est bien inférieure à la vitesse du son. Cependant il peut arriver dans certains cas qu'il ne soit pas possible de considérer le fluide comme incompressible. Ce système d'équation peut être complété par des équations d'états thermodynamiques ou d'autres équations de conservation en fonction du système étudié. Dans le cas des fluides Newtoniens on peut modifier l'équation de conservation de la 25 quantité de mouvement de la sorte : DU pDt - + Ait+É (4) 3044685 9 Ici le tenseur des contraintes visqueuses est relié de manière simple à la vitesse car il s'agit d'un cas particulier, p désigne la viscosité dynamique du fluide. L'équation (4) est appelée équation de Navier-Stokes. Dans le cas d'un canal de section rectangulaire de largeur w, de hauteur h et de 5 longueur L (très grande devant w et h), si on considère le fluide comme incompressible et que l'on est dans un écoulement permanent avec une vitesse d'écoulement selon x, alors on en déduit que : dp (82 dx a y2 a z2 (5) La pression varie longitudinalement et on peut introduire la perte de charge Ap pour une 10 longueur L du canal : A p p p0 a2u ±a2u _Ap L x-x0 a y2 a z 2 L (6) Or dans notre cas particulier on obtient pour la vitesse, en résolvant (6), le résultat de Poiseuille plan. En intégrant sur la section rectangulaire on trouve une relation entre le débit volumique Q et la perte de charge. 15 On a alors : Q= (p h' 141_, (7) Par analogie avec les circuits électriques on peut donc enfin définir la notion de résistance hydrodynamique en considérant que Q=R Ap U=Ri 20 L'objectif de l'invention consiste à concevoir une puce microfluidique intégrant une membrane de dialyse parmi les plus largement utilisées en cristallisation des protéines, à savoir en cellulose régénérée. Cette puce doit aussi répondre à plusieurs contraintes, elle doit : - être conçue dans un matériau « transparent » pour les rayons X dans les énergies 25 utilisées au synchrotron (ne provoquant pas de diffusion ni d'absorption significatives des rayons X) - être compatible avec le matériel biologique - permettre de contenir un faible volume de protéine, de l'ordre ou inférieur au microlitre - posséder un canal par lequel on puisse introduire et modifier la solution permettant la 30 mise en oeuvre du procédé de cristallisation pour travailler dans de nouvelles conditions - être contrôlée en température 3044685 10 En effet, cette invention a pour but de concevoir un outil microfluidique pour la cristallisation des protéines qui serait une miniaturisation d'un instrument existant permettant le contrôle et l'optimisation de la croissance cristalline [dispositif décrit dans la demande W02012/035268]. 5 L'invention a pour objectif le développement d'une plateforme microfluidique séquentielle pour la cristallisation des macromolécules telles que des protéines qui combine le contrôle de température et de composition chimique de la solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation par la méthode de dialyse dans une installation conviviale assurant : i) la recherche de conditions de cristallisation et leur optimisation, ii) le suivi de la 10 cristallisation in situ basé sur les diagrammes de phases déterminés expérimentalement, iii) l'analyse des cristaux in situ par diffraction des rayons X et iv) la résolution de la structure des protéines via la diffraction « on chip » des cristaux isomorphes aux rayons X. L'objectif est notamment de contrôler précisément et de façon réversible la cristallisation via la microdialyse et le contrôle de la température. Cela aura d'énormes avantages, en 15 particulier pour la cristallisation des protéines membranaires où à la fois la protéine et le détergent sont coûteux. Un tel dispositif sera également extrêmement précieux pour la cristallisation en phase cubique, où la compréhension approfondie de l'espace de phases permettrait de trouver la meilleure façon d'obtenir des cristaux. 20 BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention a pour objet une puce microfluidique (1) comprenant au moins une cellule (11) de cristallisation à dialyse, ladite cellule (11) comprenant : - un support (1111) en PMMA - un premier étage comprenant un réservoir (111) délimité au moins en partie 25 par ledit support (1111) et par une paroi externe (1112) de la cellule, ledit réservoir (111) étant en communication fluidique avec un canal d'entrée et un canal de sortie d'une solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation, - un second étage comprenant une chambre de dialyse (113) délimitée au 30 moins en partie par une paroi interne (1113) de la cellule sans contact avec le support (1111) et par une membrane de dialyse (112) formant une interface entre le réservoir (111) et la chambre de dialyse (113), la paroi interne (1113) comprenant au moins une portion d'un seul tenant dans laquelle la périphérie de ladite membrane (112) est maintenue scellée. 3044685 11 Avantageusement, la chambre de dialyse contient une solution de molécule à cristalliser et en ce que la chambre de dialyse est scellée par une couche de polymère en PMMA (1115). Il existe avantageusement un espace entre les parois externes (1112) et internes (1113) débouchant sur une surface principale (1114) de la puce et en ce que cet espace, en surface 5 de la puce, est connecté via un raccord au système de contrôle des écoulements des fluides (1116), La membrane de dialyse est avantageusement en cellulose, plus avantageusement en cellulose régénérée. Le volume de la chambre de dialyse est avantageusement compris entre 0,1 et 1 pL. 10 La puce microfluidique (1) selon l'invention comprend avantageusement plusieurs cellules de cristallisation à dialyse alignées en lignes et colonnes. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une puce microfluidique (1) selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : - Réaliser deux blocs structurés en polymère réticulé perméable à l'air PL pour 15 obtenir les tampons 3D en ledit polymère PL de la partie haute qui définira la chambre de dialyse et de la partie basse de la puce qui définira les canaux et le(s) réservoir(s), - Sur le bloc structuré avec les canaux et le(s) réservoir(s) déposer une ou plusieurs membrane(s) de dialyse sèche(s), 20 - Placer le bloc structuré sans canaux en coïncidence avec le bloc structuré avec les canaux de manière à prendre en sandwich la membrane, - Déposer une résine photosensible NOA81® sur 3 côtés entre les deux blocs structurés puis initier la réticulation de ladite résine NOA81®, - Retirer la partie supérieure du bloc structuré avec l'assemblage en résine 25 réticulée en décollant le tout du bloc structuré du bas, - Refermer la partie visible (sans PL) avec une lamelle de PMMA, - Finaliser la réticulation de ladite résine NOA81®, - Retirer le dernier bloc structuré 30 L'invention a aussi pour objet un dispositif de cristallisation d'une molécule à cristalliser qui comprend - Au moins une puce microfluidique selon l'invention - Au moins un moyen d'ajout agencé pour ajouter dans la chambre de dialyse une solution S1 comprenant la molécule à cristalliser et éventuellement au 35 moins un tampon 3044685 12 - Au moins un moyen d'ajout / prélèvement agencé d'agent de cristallisation et/ou d'additif(s) et/ou tampon(s) et ainsi de la composition de la solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation dans les canaux menant à la chambre du réservoir 5 - Au moins un moyen de contrôle de la composition chimique de la solution dans le réservoir, par exemple un moyen de dosage, de variation de la concentration des tampons, des agents de cristallisation et des additifs - Au moins un moyen de contrôle et de variation de la température de la puce microfluidique selon l'invention 10 - Eventuellement au moins un moyen de mesure de la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 - Au moins un moyen d'acquisition d'images L'invention a également pour objet un procédé de cristallisation d'une molécule à cristalliser, 15 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : a) On ajoute une solution S1 comprenant la molécule à cristalliser dans la chambre de dialyse (113) de la puce microfluidique (1) selon l'invention puis on l'encapsule. b) Le cas échéant, on injecte en continu une solution S2 dans les 20 canaux de ladite puce microfluidique (1), ladite solution S2 contenant uniquement le tampon, la pression d'injection au niveau du canal microfluidique est maintenue inférieure à 400 mbar. c) On injecte en continu une solution S3 de cristallisation, dans les canaux de ladite puce microfluidique (1), la pression d'injection au 25 niveau du canal microfluidique est maintenue inférieure à 400 mbar. La solution S3 de cristallisation contient au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs, et éventuellement un tampon. Lorsque l'étape b) du procédé est mise en oeuvre, la solution S3 comprend le tampon de la solution S2 et au moins un agent de 30 cristallisation le cas échéant un ou plusieurs additifs. Avantageusement, lors de l'étape a) la chambre de dialyse est encapsulée par dépôt d'une lamelle de PMMA, puis revêtement KAPTON®. Avantageusement : - Lors de l'étape a), le cas échéant lors de l'étape b), la solution contenue dans 35 la chambre de dialyse, comprenant ladite molécule à cristalliser, est à une 3044685 13 première température T1 et à une concentration Cl de la molécule à cristalliser de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de sous-saturation (en dessous de la courbe de solubilité) du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la 5 concentration de la molécule à cristalliser et de la température. Lors de l'étape b), le tampon présent dans la solution S2 diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et la molécule à cristalliser se trouve toujours dans ladite zone de sous-saturation - Lors de l'étape c), ladite solution de cristallisation S3 contient, le cas échéant 10 en plus du tampon, au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs à une concentration P constante, de manière à ce que l'agent de cristallisation et le cas échéant l'additif diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite 15 supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser et qu'apparaissent des germes de la molécule à cristalliser ; Et le procédé comprend ensuite les étapes successives suivantes : d) on augmente la température de la cellule de cristallisation (11) à une température T2 de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve 20 dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser, e) s'il y a la formation de trop nombreux cristaux pendant l'étape c), la température de la cellule de cristallisation (11) peut-être augmentée à une température >T2 de telle manière que la molécule à cristalliser se retrouve dans la zone de sous-saturation, juste en dessous de la courbe de solubilité, à nouveau et que l'excès de petits 25 cristaux soient complètement dissout. Quelques cristaux sélectionnés, de tailles supérieures vont subir une dissolution partielle en évitant la dissolution complète et vont ensuite croitre dans la zone métastable par la baisse de température à la température T2 f) On laisse grossir les germes de cristaux à la température T2 jusqu'à l'obtention d'un 30 premier point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C2, g) On abaisse la température de la cellule de cristallisation (11) à une température T3, de telle sorte que les cristaux présents dans la chambre de dialyse (113) se situent 3044685 14 toujours dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser h) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la température T3 jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure 5 constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C3 i) On répète éventuellement les étapes f) à h) j) On récupère la puce contenant les cristaux obtenus à l'issue de l'étape h) ou i) pour l'expérience de diffraction aux rayons X in situ. 10 Avantageusement : - Lors de l'étape a), le cas échéant lors de l'étape b), la solution contenue dans la chambre de dialyse est à une température constante T de la cellule de cristallisation (11) et à une concentration Cl de la molécule à cristalliser de 15 telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de sous- saturation (en dessous de la courbe de solubilité) du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la concentration en agent de cristallisation et le cas échéant de la concentration en additif(s); lors de l'étape 20 b), le tampon présent dans la solution S2 diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et la molécule à cristalliser se trouve toujours dans ladite zone de sous-saturation - Lors de l'étape c), ladite solution de cristallisation S3 contient, le cas échéant en plus du tampon au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou 25 plusieurs additifs à une concentration P1 dans le réservoir de la cellule de cristallisation, de manière à ce que l'agent de cristallisation et le cas échéant l'additif diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de 30 phases de ladite molécule à cristalliser et qu'apparaissent des germes de la molécule à cristalliser ; - Pour obtenir la nucléation spontanée contrôlée des cristaux la procédure suivante est employée : à l'aide du système de contrôle des écoulements des fluides la solution de cristallisation S3 est injectée en flux continu avec un 35 gradient de concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant l'additif 3044685 15 de manière à ce que, à la concentration P1, seulement quelques cristaux se forment. et le procédé comprend ensuite les étapes successives suivantes : d) On diminue la concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant de 5 l'additif à une concentration P2, de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser e) On laisse grossir les germes de cristaux à la concentration P2 de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif jusqu'à l'obtention d'un premier 10 point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C2 f)On augmente la concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif à une concentration P3, de telle sorte que les cristaux présents dans 15 la cellule de cristallisation (11) se situent toujours dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser, g) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la concentration P3 de l'agent de cristallisation et le cas échéant l'additif jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure constante, la 20 concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte est la concentration C3, h) On répète éventuellement les étapes d) à f) i)On récupère la puce contenant les cristaux obtenus à l'issue de l'étape g) ou h) pour l'expérience de diffraction aux rayons X in situ. 25 BREVE DESCRIPTION DES DESSINS Fig. 1 cellule de cristallisation à dialyse (11) selon l'invention Fig.2 mode de réalisation particulier de la cellule de cristallisation à dialyse (11) selon l'invention 30 Fig. 3 cellule de cristallisation à dialyse selon l'exemple comparatif 1 Fig 4. Schéma des étapes de remplissage du réservoir de protéine d'une cellule de cristallisation à dialyse selon l'exemple comparatif 2. Les croix représentent une entrée fermée. Fig. 4A : remplissage avec une solution comprenant la molécule à cristalliser. 35 Fig 4B. la cellule est remplie de la solution comprenant la molécule à cristalliser 3044685 16 Fig 4C. on fait circuler l'huile de paraffine dans un premier côté de la cellule Fig 4D. on fait circuler l'huile de paraffine dans l'autre côté de la cellule Fig 5 schéma de représentation de la puce microfluidique selon l'invention déposée sur des éléments Peltier : d'un module Peltier à l'autre la température peut être différente. 5 1 :puce selon l'invention - 2 module Peltier - 21 : bloc cuivre - 211 :échangeur à eau - 212 : câblage Peltier DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention a pour objet une puce microfluidique (1), comprenant au moins une cellule 10 (11) de cristallisation à dialyse, ladite cellule (11) comprenant : - un support (1111) en PMMA - un premier étage comprenant un réservoir (111) délimité au moins en partie par ledit support (1111) et par une paroi externe (1112) de la cellule, ledit réservoir (111) étant en communication fluidique avec un canal d'entrée et un 15 canal de sortie d'une solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation, - un second étage comprenant une chambre de dialyse (113) délimitée au moins en partie par une paroi interne (1113) de la cellule sans contact avec le support (1111) et par une membrane de dialyse (112) formant une interface 20 entre le réservoir (111) et la chambre de dialyse (113), la paroi interne (1113) comprenant au moins une portion d'un seul tenant dans laquelle la périphérie de ladite membrane (112) est maintenue scellée. Une caractéristique nécessaire de la puce (1) est qu'elle permet l'analyse et le suivi 25 de la cristallisation des macromolécules par la microscopie optique d'une part et l'analyse des cristaux par RX d'autre part. Ainsi, elle doit être constituée de matériaux transparents vis à vis de la microscopie optique et des rayons X, au moins dans les zones qui seront observées au microscope d'une part et placées dans le rayonnement synchrotron d'autre part. 30 Le support de la puce est en PMMA (poly(méthacrylate de méthyle)). Le PMMA est choisi pour ses propriétés de transparence à la microscopie optique et aux rayons X. Ce polymère peut également être utilisé pour sceller la chambre de dialyse (113) après dépôt de la solution comprenant la macromolécule à cristalliser. Avantageusement, la puce microfluidique (1) selon l'invention est caractérisée en ce 35 que la chambre de dialyse contient une solution de molécule à cristalliser et en ce que la 3044685 17 chambre de dialyse est scellée par une couche de polymère transparent aux rayons X et à la microscopie optique (1115), du PMMA. Cette molécule est avantageusement une macromolécule, plus avantageusement une macromolécule biologique, en particulier une protéine. Cependant, la puce et le procédé 5 selon l'invention peuvent également être utilisés pour d'autres molécules, comme par exemple des particules colloïdales ou une molécule difficile à cristalliser. Le PMMA possède de nombreux avantages dont trois principaux : il est transparent, imperméable à l'air et résistant : - très grande transparence, très limpide ; 10 - propriété optique excellente (transmission lumineuse supérieure à celle du verre jusque dans le proche UV, transparence, limpidité, brillance). Indice de réfraction de 1,49 ; il est transparent aux rayons X (ne provoque pas de diffusion ni d'absorption significatives des rayons X) - excellente résistance aux agents atmosphériques ; 15 - excellente tenue aux rayons ultraviolets et à la corrosion. Sur ce support, les motifs, à savoir le réservoir (111), les canaux, la chambre de dialyse (113), sont avantageusement formés dans une résine photosensible transparente à la microscopie optique. 20 A ce jour, on utilise la NOA81®. La Norland Optical Adhesive 81® ou NOA81® est une résine photosensible qui réticule en quelques secondes. Elle est transparente et son avantage dans notre cas provient du fait que l'oxygène inhibe la polymérisation des radicaux libres utilisé pour construire le réseau du polymère. Cette propriété permet d'envisager des puces à plusieurs étages ou de refermer la puce à l'aide d'une fine lame de PMMA par 25 dessus de laquelle on applique avantageusement une fine couche de Kapton adhésif. Le réservoir (111) est destiné à recevoir une solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation. Une telle solution comprend au moins un constituant choisi dans le groupe constitué par les agents de cristallisation, les additifs et les tampons. 30 Dans le cadre de la présente invention, on entend par agent de cristallisation, des agents qui favorisent la cristallisation de la molécule à cristalliser. Il peut s'agir de : - sels, tels que le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium, le phosphate de potassium ; - composés organiques, tels que l'isopropanol et le 2-methyl- 2,4-pentanediol (MPD) ; 35 - polyéthylène glycol, tels que le PEG 4000, le PEG 6000, ou encore le PEG 8000. 3044685 18 Dans le cadre de la présente invention, on entend par additif, des constituants permettant d'augmenter la stabilité de la molécule à cristalliser et/ou l'homogénéité de sa conformation. Il peut s'agir de détergents, d'agents réducteurs, de substrats, et de cofacteurs tels que les nalkyl-glucosides ou n-alkyl-maltosides, le dithiotreitol (DTT), des lipides, des sous-unités ou 5 des groupes prosthétiques. Dans le cadre de la présente invention, on entend par tampon, un constituant permettant de maintenir à un pH fixe une solution dans laquelle il a été ajouté. Il peut s'agir du 2-(Nmorpholino) Ethane Sulfonique Acide (ci-après abrégé « MES »), du 2-amino-2- hydroxyméthy1-1, 3-propanediol (ci-après abrégé « Tris »), du 2-(Bis(2- 10 hydroxyethyl)amino)acetique acide (abrégé « Bicine » ), de l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1- pipérazine éthane sulfonique (abrégé « Hepes ») ou du citrate de sodium, de l'acétate de sodium ou encore du cacodylate de sodium. La solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation comprend avantageusement des sels. En effet, Il a été mis en évidence que le transfert des solutés 15 neutres (e.g. PEGs) à travers des membranes en présence de sel est significativement affecté par rapport à leur transfert lorsqu'ils sont seuls en solution (Escoda et al., 2010; Savignac, 2010). Les effets de salting-out et de gonflement de pores doivent être pris en compte dans les procédés de dialyse, car ils sont susceptibles d'affecter l'exclusion stérique des solutés neutres, tels que des PEGs, si des solutions utilisées dans ces procédés 20 contiennent des sels, notamment à des concentrations de sel élevées. Le réservoir (111) est en communication avec un canal d'entrée et un canal de sortie permettant de faire circuler, avantageusement sous la forme d'un flux continu, une solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation. Lorsque la puce (1) comprend plusieurs cellules de cristallisation à dialyse (11), celles-ci peuvent être connectées entre 25 elles et alors les différents réservoirs (111) sont reliés par un même canal principal. La solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation est avantageusement injectée en flux continu à l'aide d'un système de contrôle des écoulements des fluides vers les réservoirs par débit ou pression imposée, une fois que l'assemblage microfluidique complet est réalisé. 30 La pression d'injection maintenue au niveau du canal microfluidique, au cours du procédé de cristallisation, est avantageusement inférieure à 400 mbar, elle varie avantageusement de 100 à 300 mbar. Si la pression d'injection est supérieure à 400-450 mbar, il y a un risque de déchirement ou de décollement de la membrane de dialyse. 3044685 19 La membrane de dialyse est avantageusement en cellulose (par exemple en cuprophane, à savoir une cellulose régénérée), en cellulose modifiée telle que l'acétate de cellulose, l'hémophane, ou encore en cellulose modifiée synthétiquement. Une membrane en cellulose présente les propriétés suivantes : finesse, pores de petit 5 diamètre permettant l'élimination de substances de poids moléculaire faible, un faible coût, une forte réactivité chimique (du fait des groupes hydroxyle), une faible biocompatibilité. La cellulose modifiée présente les propriétés suivantes : une réactivité chimique moindre, une bonne biocompatibilité, une substitution des groupes hydroxyle, une augmentation de la taille des pores, une augmentation de la perméabilité hydraulique, une 10 élimination de substances de plus grand poids moléculaire. Comme la cellulose régénérée (CR) standard se compose d'un polymère de cellulose naturelle provenant de bourres de coton, ces membranes sont parfaitement adaptées à une large gamme de dialyses de laboratoire. Ce type de membrane transparente et flexible avec une porosité symétrique est économique et résistant; idéal pour le dessalage, les échanges 15 tampon, les purifications macromoléculaires et d'autres applications d'ordre général. Grâce à leur large plage de compatibilité chimique, les membranes CR standard peuvent être utilisées avec des acides et des bases forts dilués, des acides et des bases faibles concentrés, la plupart des alcools et certains solvants organiques moyens ou dilués, y compris le DMSO. La CR peut être utilisée dans un pH de 2 à 12 et à des températures comprises entre 4°C et 20 121°C. Dans le cas des membranes organiques, la structure poreuse résulte des espaces entre les chaînes de polymère. La porosité d'une membrane est définie comme le rapport du volume des espaces vides sur le volume total de la matrice. Cette grandeur dépend de la taille des constituants élémentaires de la matrice mais également du procédé d'élaboration 25 de la membrane. Une membrane poreuse doit posséder une très bonne résistance mécanique tout en permettant un débit de perméation élevé. La séparation dépend des effets stériques (c'est-à-dire d'une discrimination en fonction de la taille de l'espèce à retenir), mais aussi des effets de charges électriques découlant de la nature chimique du matériau membranaire. 30 Dans le cadre de l'invention, la porosité de la membrane va être choisie en fonction de la taille de molécule à cristalliser. La membrane de dialyse doit permettre un passage de l'agent de cristallisation mais bloquer la molécule à cristalliser. La membrane est intégrée dans la paroi interne (1113), avantageusement dans la résine NOA81®, avantageusement sans collage chimique. Aux pressions mentionnées 35 ultérieurement, on n'observe pas de fuites ni d'altération des pores de la membrane. 3044685 20 Au sens de l'invention, la périphérie de la membrane est scellée dans une partie d'un seul tenant de la paroi interne ; ce qui signifie que la périphérie de la membrane est insérée dans un seul bloc, avantageusement qui se forme lors de la réticulation de la résine coulée dans le moule. Ce mode de réalisation s'oppose aux modes dans lesquels une membrane 5 est maintenue coincée entre deux blocs distincts, maintenus serrés l'un contre l'autre. La chambre de dialyse (113) est destinée à recevoir la molécule à cristalliser, avantageusement sous la forme d'une solution S1. Cette molécule est avantageusement une macromolécule. 10 On entend aussi dans le cadre de la présente invention par macromolécules, des molécules ayant un poids moléculaire de plusieurs milliers de Daltons à plusieurs centaines de milliers de Daltons. Il peut s'agir de séquences d'acides nucléiques d'ADN ou d'ARN, de fragments de virus, de protéines, de complexes de protéines, de complexes protéine-ARN, de complexes protéine-ligand, ou encore de polypeptides. De plus, la présente invention peut 15 être appliquée avec succès à la cristallisation d'autres types de molécules telles que les particules colloïdales. Avantageusement, la molécule à cristalliser est choisie parmi des séquences d'acides nucléiques d'ADN ou d'ARN, de fragments de virus, de protéines, en particulier de protéines membranaires, de complexes des protéines, de complexes protéine-ARN, de complexes 20 protéine-ligand, ou encore de polypeptides. La puce selon l'invention est particulièrement adaptée pour la cristallisation de protéines difficiles à cristalliser telles que les protéines membranaires et les complexes macromoléculaires, ou encore pour des projets pour lesquels l'optimisation de qualité de diffraction du cristal reste difficile. 25 A titre d'exemple de protéine cristallisée dans le cadre de l'invention, on peut citer le lysozyme du blanc d'oeuf de poule. A titre d'exemple, le lysozyme est solubilisé dans un tampon : l'acétate de sodium, à concentration de 100 mM. Cela permet de maintenir un pH de la solution à 4. La concentration du lysozyme est de 30mg/mL. La solution permettant la mise en oeuvre du 30 procédé de cristallisation est une solution comprenant 0,9M NaCI, et 100mM de tampon Na acétate de pH 4. Après dépôt de la solution de molécule à cristalliser, la chambre de dialyse (113) est avantageusement scellée par une couche de polymère transparent au RX, avantageusement 35 de PMMA. 3044685 21 L'espace entre les parois externes (1112) et internes (1113), débouchant sur une surface principale (1114) de la puce, est avantageusement connecté via un raccord, situé en surface de la puce, au système de contrôle des écoulements des fluides (1116). Par ce 5 connecteur pourra être injectée dans la puce la solution des agents de cristallisation. Ce raccord peut être en élastomère ou métallique (e.g. une aiguille). Cette surface ne sera pas analysée par RX, et il est donc possible d'utiliser un matériau non transparent aux RX. Afin de protéger les chambres de dialyse, il est possible, après avoir introduit la solution comprenant la macromolécule à cristalliser, avantageusement d'avoir déposé une 10 couche de PMMA, de déposer une couche supplémentaire (1116) adhésive, par exemple en Kapton®. Cette couche adhésive Kapton® permet d'assurer l'étanchéité à l'air des chambres de dialyse. Le Kapton® est un film de polyimide (polymère à base d'imide) développé par DuPont qui peut rester stable dans une plage étendue de température : 15 Le volume de la chambre de dialyse est avantageusement compris entre 0,1 et 1 pL. Le volume du réservoir est le même que celui de la chambre de dialyse. Avantageusement, son contenu est renouvelé grâce au flux continu pour atteindre un volume 20 centaines voire milliers de fois supérieur et pour améliorer le procédé de dialyse. De par l'emploi de l'expression « est compris de X à XX », les bornes, X et )0(, sont incluses. Selon une variante avantageuse de l'invention, la puce microfluidique comprend 25 plusieurs cellules de cristallisation à dialyse alignées en lignes et colonnes. On peut ainsi envisager de faire varier, d'une ligne à l'autre, la concentration en agent de cristallisation et/ou additifs dans la solution de précipitation et de faire varier, d'une colonne à l'autre, la température. On pourra ainsi analyser l'effet de la température, à concentration constante, ou l'effet de la concentration, à température constante, ou l'effet 30 combiné d'une variation de température et de concentration. 3044685 22 Pour permettre de faire varier la température d'une cellule à l'autre, le dispositif de cristallisation comprend, outre la puce microfluidique (1), un système de contrôle de température, permettant de contrôler la température et de la faire varier ; en particulier d'appliquer une température constante différente d'une colonne à l'autre. Dans un mode de 5 réalisation de l'invention, le système de contrôle de la température est basé sur la technologie Peltier. Il peut s'agir d'une Cellule à Effet Peltier (CEP), appelée aussi module thermoélectrique. Un tel exemple est représenté sur la figure 5. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une puce 10 microfluidique (1) selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : - Réaliser deux blocs structurés PDMS pour obtenir les tampons 3D en PDMS de la partie haute qui définira la chambre de dialyse et de la partie basse de la puce qui définira les canaux et le(s) réservoir(s), 15 - Sur le bloc de PDMS avec les canaux et le(s) réservoir(s) déposer une ou plusieurs membrane(s) de dialyse sèche(s), - Placer le bloc de PDMS structuré sans canaux en coïncidence avec le bloc de PDMS avec les canaux de manière à prendre en sandwich la membrane, - Déposer la NOA81® sur 3 côtés entre les deux blocs de PDMS, 20 - Initier la réticulation de la NOA81®, - Retirer la partie supérieure en PDMS avec l'assemblage en NOA81® en décollant le tout du bloc du PDMS du bas, - Refermer la partie visible (sans PDMS) avec une lamelle de PMMA, - Finaliser la réticulation de la NOA81®, 25 - Retirer le dernier bloc de PDMS L'étape d'initiation de la réticulation de la NOA81® doit permettre de polymériser suffisamment la NOA81® pour obtenir un matériau manipulable tout en la durcissant au minimum. En effet, la réticulation doit être la plus faible possible afin de permettre un collage de la membrane et une bonne cohésion de la membrane dans la résine. Le procédé se 30 caractérise en ce que la membrane est intégrée dans la résine. On peut ainsi parler de collage non chimique. L'ajout ultérieur de la lamelle de PMMA suivi d'un temps de réticulation supplémentaire de la résine vient aider au collage de la membrane. Le poly(dimethylsiloxane), aussi appelé PDMS, est un polymère qui se présente sous la forme d'un liquide visqueux et transparent à Sa formule chimique est représentée ci- 35 dessous : 3044685 23 H3C H3C CH3 CH CH H3C 1 ^ 3 Si 0 Si H3C O CH3 -n Une fois réticulé (solidifié), il a la particularité d'être perméable à l'air et d'être suffisamment élastique. Il existe deux types de PDMS, le PDMS RTV-615 et le PDMS Sylgard 184 de Dow 5 Corning. Dans les deux cas il est nécessaire de le mélanger à un agent réticulant puis de le chauffer pour activer la réticulation du matériau. Le mélange se fait généralement dans les proportions massiques 1:10 (agent réticulant:PDMS), ce ratio peut toutefois varier en fonction de l'utilisation du PDMS. 10 L'invention a également pour objet un dispositif de cristallisation d'une molécule à cristalliser qui comprend - Au moins une puce microfluidique selon l'invention - Au moins un moyen d'ajout agencé pour ajouter dans la chambre de dialyse une solution S1 comprenant la molécule à cristalliser et éventuellement au 15 moins un tampon (puis finalisation de la puce par encapsulation des chambres de dialyse, tel que décrit précédemment) - Eventuellement au moins un moyen de contrôle et de variation de la température de la puce microfluidique selon l'invention - Eventuellement au moins un moyen d'ajout / prélèvement agencé d'agent de 20 cristallisation et/ou d'additif(s) et/ou tampon(s) (et ainsi de la composition chimique de la solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation dans les canaux menant à la chambre du réservoir) - Eventuellement au moins un moyen de contrôle de la composition chimique de la solution dans le réservoir, par exemple un moyen de dosage, de variation 25 de la concentration des tampons, des agents de cristallisation et des additifs - Au moins un moyen d'acquisition d'images Grâce au moyen d'ajout et/ou au moyen de prélèvement, la nature des constituants que contient la solution injectée dans le réservoir (les agents de cristallisation, les additifs, les tampons) ainsi que la concentration de ces constituants peut varier au cours de la 30 cristallisation. La composition de la solution injectée dans le réservoir peut être ajustée 3044685 24 précisément par l'opérateur qui réalise la cristallisation. Pour décider des variations de la composition de la solution injectée dans le réservoir, l'opérateur s'en réfère notamment à des concepts physico-chimiques déterminés d'après les diagrammes de phases de la molécule à cristalliser. 5 La solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation est avantageusement injectée en flux continu à l'aide d'un système de contrôle des écoulements des fluides vers les réservoirs par débit ou pression imposée, une fois que l'assemblage microfluidique complet est réalisé. Grâce au dispositif de cristallisation selon l'invention, une optimisation de la nucléation 10 et de la croissance cristalline peut être obtenue en combinant une méthode de dialyse avec des variations précises de la température et de la composition de la solution injectée dans le réservoir qui sont décidées par l'opérateur à partir de contrôles des paramètres de la cristallisation (la température, la concentration de la molécule à cristalliser et la composition de la solution injectée dans le réservoir) effectués au cours de la cristallisation. 15 L'invention permet ainsi d'offrir une plate-forme pour la cristallisation unique, permettant un contrôle précis de tous les paramètres et leur automatisation, favorisant un processus de miniaturisation par la technologie microfluidique. Sa réalisation apporte d'importantes réductions du coût de la détermination de la structure tridimensionnelle des macromolécules biologiques, étant une étape cruciale dans l'approche multi-échelle des 20 processus biologiques. Préalablement à la mise en oeuvre du procédé de cristallisation, il est possible de conditionner la puce microfluidique selon l'invention. Par exemple, il est possible de déposer la puce exempte de tout liquide dans un plasma pour la nettoyer : dépression (en utilisant par 25 exemple une pompe à vide), pour évacuer l'air de la chambre puis une fois atteinte la pression recherchée (dans le cadre de l'invention, une dépression à 0,7 mbar est adaptée) la bobine électrique crée le plasma. Le plasma est un gaz partiellement ionisé composé d'électrons, des ions et des atomes ou molécules neutres. Le plasma crée des espèces réactives à la surface de certains matériaux (e.g. verre et PDMS) qui, lorsque mis ensemble 30 peuvent former une liaison permanente. Dans le cadre de l'invention, le plasma va transformer les surfaces des membranes pour faciliter le mouillage hydrophile, ce qui facilite l'ajout de liquides. De plus, le plasma stérilise les dispositifs microfluidiques. La puce pourra par exemple être traitée au plasma pendant 1 minute. 3044685 25 Ce conditionnement préalable de la puce permet d'augmenter la mouillabilité de la surface de la membrane et de garantir une bonne adhésion avec la solution de molécule à cristalliser. 5 L'invention concerne également un procédé de cristallisation d'une molécule à cristalliser, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : a) On ajoute une solution S1 comprenant la molécule à cristalliser dans la chambre de dialyse (113) de la puce microfluidique (1) selon l'invention puis avantageusement on ferme la chambre de dialyse (113). 10 b) Le cas échéant, on injecte en continu une solution S2 dans les canaux de ladite puce microfluidique (1), ladite solution S2 contenant uniquement le tampon, la pression d'injection au niveau du canal microfluidique est maintenue inférieure à 400 mbar. c) On injecte en continu une solution S3 de cristallisation, dans les canaux de 15 ladite puce microfluidique (1), la pression d'injection au niveau du canal microfluidique est maintenue inférieure à 400 mbar. La solution S3 de cristallisation contient au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs, et éventuellement un tampon. Lorsque l'étape b) du procédé 20 est mise en oeuvre, la solution S3 comprend le tampon de la solution S2 et au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs. Lors de l'étape b), le tampon présent dans la solution S2 diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse Préalablement à l'étape b), le tampon est choisi en fonction de la molécule à 25 cristalliser, en prenant en particulier en considération les paramètres de solubilité. Lors de l'étape a) la chambre de dialyse (113) est avantageusement fermée par encapsulation, c'est-à-dire par dépôt d'une couche (1115) telle qu'une lamelle de PMMA. Suite à l'étape a), et avantageusement avant l'injection d'une solution dans le réservoir, la chambre de dialyse (113), et avantageusement la couche de PMMA (1115), est 30 avantageusement recouverte d'une couche d'adhésif de KAPTON® (1116). Au cours du procédé, la composition de la solution injectée dans le réservoir de la cellule de cristallisation peut commodément varier (ou autrement dit être ajustée) en fonction des quantités requises en agents de cristallisation, le cas échéant en additifs, éventuellement en tampons au fur et à mesure du procédé. Elle peut donc évoluer au cours 3044685 26 de la cristallisation, et ce de manière réversible, du fait de la diffusion au travers de la membrane de dialyse des constituants de la solution injectée. Le procédé selon l'invention permet de faire varier la concentration en précipitant dans la solution de concentration ou la température dans chaque cellule de cristallisation à 5 dialyse (11). Selon une première variante du procédé de cristallisation, dans le cas d'un système protéique avec la solubilité directe (solubilité de la protéine augmentant avec la température) : - Lors de l'étape a), le cas échéant lors de l'étape b), la solution contenue dans la chambre de dialyse est à une température constante T de la cellule de 10 cristallisation (11) et à une concentration Cl de la molécule à cristalliser de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de sous-saturation (en dessous de la courbe de solubilité) du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la concentration en agent de 15 cristallisation et le cas échéant d'un ou de plusieurs additifs ; lors de l'étape b), le tampon présent dans la solution S2 diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et la molécule à cristalliser se trouve toujours dans ladite zone de sous-saturation Lors de l'étape c), ladite solution de cristallisation S3 contient, le cas échéant 20 en plus du tampon, au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs à une concentration P constante, de manière à ce que l'agent de cristallisation et le cas échéant l'additif diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite 25 supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser et qu'apparaissent des germes de la molécule à cristalliser ; Et le procédé comprend ensuite les étapes successives suivantes : d) on augmente la température de la cellule de cristallisation (11) à une température T2 de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve 30 dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser, e) s'il y a la formation de trop nombreux cristaux pendant l'étape c), la température de la cellule de cristallisation (11) peut-être augmentée à une température >T2 de telle manière que la molécule à cristalliser se retrouve dans la zone de sous-saturation, juste en dessous de la courbe de solubilité, à nouveau et que l'excès de petits 35 cristaux soient complètement dissout. Quelques cristaux sélectionnés, de tailles 3044685 27 supérieures vont subir une dissolution partielle en évitant la dissolution complète et vont ensuite croitre dans la zone métastable par la baisse de température à la température T2 f) On laisse grossir les germes de cristaux à la température T2 jusqu'à l'obtention d'un 5 premier point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C2, g) On abaisse la température de la cellule de cristallisation (11) à une température T3, de telle sorte que les cristaux présents dans la chambre de dialyse (113) se situent 10 toujours dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser h) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la température T3 jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue 15 dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C3 i) On répète éventuellement les étapes f) à h) j) On récupère la puce contenant les cristaux obtenus à l'issue de l'étape h) ou i) pour l'expérience de diffraction aux rayons X in situ. 20 Selon une deuxième variante du procédé de cristallisation : Lors de l'étape a), le cas échéant lors de l'étape b), la solution contenue dans la chambre de dialyse est à une température constante T de la cellule de cristallisation (11) et à une concentration Cl de la molécule à cristalliser de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de sous- 25 saturation (en dessous de la courbe de solubilité) du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la concentration en agent de cristallisation et le cas échéant en additif ; lors de l'étape b), le tampon présent dans la solution S2 diffuse dans la solution contenue dans la chambre de 30 dialyse et la molécule à cristalliser se trouve toujours dans ladite zone de sous-saturation Lors de l'étape c), ladite solution de cristallisation S3 contient, le cas échéant en plus du tampon, au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs à une concentration P1 dans le réservoir de la cellule de 35 cristallisation, de manière à ce que l'agent de cristallisation et le cas échéant 3044685 28 l'additif diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser et qu'apparaissent des germes de la 5 molécule à cristalliser ; Pour obtenir la nucléation spontanée contrôlée des cristaux la procédure suivante est employée : à l'aide du système de contrôle des écoulements des fluides la solution de cristallisation S3 est injectée en flux continu avec un gradient de concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant d'additif 10 de manière à ce que à la concentration P1 seulement quelques cristaux se forment. et le procédé comprend ensuite les étapes successives suivantes : d) On diminue la concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif à une concentration P2, de telle sorte que la nucléation est arrêtée et 15 que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser e) On laisse grossir les germes de cristaux à la concentration P2 de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif jusqu'à l'obtention d'un premier point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la 20 concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C2 f) On augmente la concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif à une concentration P3, de telle sorte que les cristaux présents dans la cellule de cristallisation (11) se situent toujours dans la zone métastable 25 dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser, g) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la concentration P3 de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution 30 contenue dans la chambre de dialyse atteinte est la concentration C3, h) On répète éventuellement les étapes d) à f) i) On récupère la puce contenant les cristaux obtenus à l'issue de l'étape g) ou h) pour l'expérience de diffraction aux rayons X in situ. 3044685 29 Ces procédés pourraient être utilisés en parallèle sur la puce (1), dans des cellules de cristallisations (11) différentes contenues dans la puce. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans la limiter. 5 EXEMPLES Les méthodologies suivantes ont été utilisées : Conception de moule SU8 : 10 Ici est expliqué un protocole pour réaliser un moule en SU8 à deux niveaux. Ce moule servira ensuite à la préparation des blocs structurés en PDMS. Design d'un masque pour la lithographie : Pour réaliser un moule en SU8 il est nécessaire de disposer d'un ou plusieurs masques qui serviront à définir le motif du moule. Pour cela le logiciel CleWin3 a été utilisé. Il permet de 15 concevoir des réseaux de canaux qui peuvent être imprimés sur feuille transparente en négatif ou en original. Si plusieurs masques sont créés pour une même puce il est possible de réaliser un moule à plusieurs couches. Une technique pour aligner les masques facilement peut-être utilisée sous clewin en dessinant des carrés sur un niveau et des carrés plus petits sur un autre niveau, ainsi lors de 20 l'alignement il suffit de superposer les carrés SU-8 : La SU8 est une résine photosensible négative qui est un polymère se présentant sous la forme d'un liquide visqueux. Pour déclencher le processus de réticulation il faut l'exposer aux UV puis le chauffer. Après chauffage il faut le développer dans un bain de PGMEA. Toutes 25 les parties insolées se seront solidifiées, les parties non exposées disparaîtront avec le développement. Sa formule chimique est représentée ci-dessous : 3044685 La SU8 existe sous différentes séries, parmi elles il y a notamment les séries SU8-20XX et SU8-30XX. La résine est étalée sur une tournette avant exposition. En fonction de la résine choisie et de l'épaisseur de SU8 désiré il existe différents programmes donnés par le 5 fabricant. Cette résine sert généralement dans la conception de moule mais peut aussi être utilisé pour réaliser des puces complètes. Conception du moule : En premier lieu il faut sortir la SU8 3000 du réfrigérateur à l'avance, de préférence entre 1 à 2h de manière à ce qu'elle soit à température ambiante. 10 La première étape, qui est assez récurrente, est de nettoyer une tranche (wafer) de silicium à l'aide d'isopropanol, acétone puis isopropanol à nouveau. Il faut ensuite activer la surface de la tranche (wafer) au plasma pour augmenter la mouillabilité de la surface et garantir une bonne adhésion avec la SU8. Pour cela il faut déposer la tranche (wafer) dans le plasma 45sec en High Exposure. Mettre le vide jusqu'à 500mTorr. Faire entrer un peu d'azote afin 15 que le vide oscille entre 500mTorr et 1000mTorr. Déposer la tranche (wafer) sur la tournette (SPIN 150) et le centrer. Disposer 1mL de SU8 et ajuster le SPIN 150 de manière à obtenir la hauteur voulue (cf. Protocole Microchem SU-8 3000). Récupérer la tranche (wafer) + SU8 et le mettre à chauffer (« Soft Bake », cf. Protocole 20 Microchem SU-8 3000). Le temps dépend de l'épaisseur. Il faut savoir qu'avec les résines SU8 2000 un palier de température à 65°C était nécessaire afin d'éviter le craquement de la résine. Dans le cadre de la SU8 3000 ce palier n'est pas nécessaire. Toutefois pour tous les chauffages on évite de déposer directement la résine à la température maximum. On se place donc au dessus de la plaque chauffante à 1-2cm et on attend 1 minute avant de 0-7 30 3044685 31 déposer complètement la tranche (wafer) sur la plaque à température finale. Attendre le refroidissement (5-15min). Scotcher le 1er masque sur une plaque de verre (en dessous) de manière à avoir les écritures dans le bon sens au dessus sur l'aligneur. 5 Mettre la plaque dans l'exposeur aux UV et déposer la tranche (wafer) sous cette plaque. Il faut dans un premier temps diminuer le WEC (Wedge Error Compensation) puis monter la tranche (wafer) à l'aide d'un levier dédié. La suite concerne l'ajustement du WEC. Ajuster le WEC dans le programme « Settings » « WEC settings ». Monter la plaque en utilisant le bouton du WEC jusqu'à ce que le réglage soit complet. 10 Choisir ensuite « Align and expose » avec l'option « Soft Contact » et le temps d'exposition en fonction du protocole (cf. Protocole Microchem SU-8 3000). Pour ce faire il faut multiplier la puissance par cm2 de la lampe par le temps d'exposition pour connaître l'énergie par cm2 que l'on dépose. Exemple pour obtenir 350mJ/cm2 avec une puissance de 35mW/cm2 on applique un temps de 10 secondes : 35mW/crn2 x lOs = 350mJ/cm2. 15 Récupérer la tranche (wafer) pour le « Post exposure bake ». Temps indiqué sur le protocole (cf. Protocole Microchem SU-8 3000). On observe l'apparition du motif dès 15sec de chauffage. L'étape suivante consiste à recommencer toutes les étapes depuis le début sur la nouvelle couche de SU8 (en ayant laissé un peu reposer après le chauffage). 20 Une fois arrivé à l'étape de l'exposition aux UV il y a des modifications : Aligner les masques, pour cela placer grossièrement le second masque au mieux comme celui d'avant. Abaisser « un peu » le WEC pour que le bloc de SU8 ne colle pas au masque. Descendre le microscope (il devrait y avoir écrit : microscope is down). Aligner le microscope de gauche et de droite en jouant sur : la focale globale, les 2 focales indépendantes de 25 chaque microscope, la position x et y, la position x indépendante de chaque microscope, la rotation des 2 microscopes selon z. Une fois ce réglage fait, monter la tranche (wafer) et observer les motifs dans la SU8 à travers le nouveau masque. L'objectif étant d'utiliser l'astuce de dessin sous CleWin3 en superposant les marques d'alignement. 30 Remonter le WEC par la même procédure que précédemment. Exposer le temps adéquat, chauffer « Post exposure bake » et développer dans du PGMEA (Attention bien travailler sous hotte !) (cf. Protocole Microchem SU-8 3000). Attention : il ne faut pas trop développer sinon il peut y avoir un décollement de la SU8, mais il faut suffisamment développer tout de même pour qu'il n'y ait pas de traces blanches. Pour 3044685 32 arrêter le processus, sortir la tranche (wafer) du bain et appliquer « abondamment » de l'isopropanol. Sécher à l'azote. Analyse des lithographies : 5 Les épaisseurs des lithographies ont été analysées avec un profilomètre Dektak. L'appareil possède 2 dynamiques maximum susceptible de nous intéresser : 65pm ou 252pm. Il faut alors choisir la longueur à analyser, le temps d'analyse, et le type de profil de surface envisagé « collines » ou « vallées ». 10 Exemple 1 : Micropuce selon l'invention Un design a été réalisé permettant l'utilisation en parallèle de plusieurs conditions et d'envisager des tests avec gradient de température. La solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation est introduite dans les canaux et la protéine est déposée dans le réservoir directement « par dessus » la puce. 15 Dans cette puce, on ne cherche pas à encapsuler la protéine mais on cherche à faire couler la solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation en continu au détriment de l'encapsulation de la protéine qui se retrouve dorénavant déposée à la main ou avec l'assistance d'un robot. Pour éviter toute évaporation à partir de la solution de protéine, la chambre de dialyse est avantageusement enfermée par encapsulation rapidement, c'est-à- 20 dire par dépôt d'une couche de PMMA recouverte d'une couche d'adhésif de KAPTON®, ou toute la procédure de remplissage de la puce doit être effectuée dans une enceinte avec atmosphère contrôlée (taux de l'humidité et température). Un protocole de préparation d'une puce selon l'invention est décrit ci-après : 25 Tout d'abord on réalise deux blocs structurés en PDMS. Ces blocs peuvent être préparés par des procédés classiques. A titre d'illustration, lè procédé suivant pourra être utilisé. Procédé de préparation des blocs structurés en PDMS : Il existe 2 types de PDMS de caractéristiques similaires : le Sylgard 184 de Dow Corning et le RTV 615 de Bayer Silicones. 30 Mélanger un ratio 10:1 en masse de PDMS:agent réticulant (généralement pour une boîte de pétri 20g:2g) Agiter le mélange avec une baguette de manière à homogénéiser et former des bulles. Placer le tout sous cloche à vide jusqu'à dégazage complet. Faire monter les bulles puis attendre 10-20 min. Remettre un vide plus poussé et dégazer au fur et à mesure. Enfin 35 attendre que les bulles disparaissent. 3044685 33 Couler le PDMS dans le moule Laisser à l'étuve 1h environ. Le moule est le moule SU8 dont le procédé de préparation est décrit en préambule des exemples. 5 On réalise deux blocs de PDMS pour obtenir les tampons 3D en PDMS de la partie haute et de la partie basse de la puce. Poser sur une lame de verre le bloc avec les canaux. Sur le bloc de PDMS avec les canaux, déposer une membrane de dialyse sèche (ou plusieurs en fonction de la géométrie). Le volume de la chambre de dialyse est 0,7pL, la 10 hauteur du canal est 100pm, la largeur du canal est de 500pm. Le bloc de PDMS sur lequel se trouve la membrane doit être plus grand que le bloc qui va s'appuyer sur lui. Placer le bloc sans canaux en coïncidence avec le bloc à canaux de manière à prendre en sandwich la membrane. 15 Mettre le tout sous la cloche à vide pendant 30 minutes. Récupérer le tout et déposer ensuite la NOA810 sur 3 côtés dans l'espacement entre les 2 blocs de PDMS. Laisser la NOA81® remplir l'espace par capillarité. Une fois l'espace rempli (quelques minutes), déposer le tout sous la lampe UV. 20 Faire un Flood Exposure, 6 sec (lampe 35mW/cm2, lambda 385nm) (soit 210nrkl/cm2 d'exposition). Découper les bourrelés de NOA81®. Retirer la partie supérieure en PDMS avec l'assemblage en NOA810 en décollant le tout du bloc du PDMS du bas. 25 Refermer la partie « visible » (sans PDMS) avec une lamelle PMMA en chassant les bulles progressivement. Attention cette étape peut être longue car il faut être très patient pour ne pas capturer de bulles. Flood Exposure, 60 sec (mêmes conditions de lampe). Retirer le dernier bloc de PDMS. 30 Nettoyer ensuite les tampons en appliquant abondamment à la pissette de l'isopropanol, de l'acétone puis de l'isopropanol à nouveau. Utiliser du scotch pour retirer les éventuelles traces restantes. Lors de l'étape où l'on dépose la membrane il faut faire coïncider les deux blocs de PDMS. Cependant en pratique il est très difficile voire impossible de les faire coïncider 35 parfaitement et ceci d'autant plus que le motif de la puce se complexifie. Pour cette raison les 3044685 34 deux blocs sont alignés d'abord à l'oeil puis au microscope optique. Toutefois il subsiste toujours un décalage non préjudiciable entre les deux parties. Exemple comparatif 1 : Micropuce avec une membrane non intégrée dans la hauteur 5 des parois internes Dans cette méthode, on utilise un seul bloc de PDMS structuré, celui permettant de définir les canaux et le(s) réservoir(s). Au préalable il faut avoir préparé sa lithographie et y avoir déposé du PDMS réticulé. Un deuxième bloc de PDMS coulé sur une tranche (wafer) nu est nécessaire. 10 Découper le PDMS de la tranche (wafer) moulé et un bloc de PDMS « plat » plus large que le bloc avec motif. Déposer une membrane de dialyse par dessus faisant approximativement la taille du réservoir central sur le bloc de PDMS plat, lui même posé sur une lame de verre. Mettre le bloc de PDMS avec motif par dessus en faisant coïncider le trou central et la membrane. Laisser dégazer pendant 30min pour faciliter l'étape d'après. 15 Introduire la NOA81 sur 3 des bords de la puce pour la faire entrer par capillarité. Insoler ensuite 6 sec en « flood exposure ». Récupérer le tout et décoller le bloc de PDMS du dessus (celui avec les motifs). Découper les bourrelés de NOA81. Mettre une lame de verre par dessus et exposer le tout 60 sec en « flood exposure ». Décoller la lame de verre du PDMS. On obtient un système comme représenté sur la Fig 3. 20 Ce système n'est toutefois pas satisfaisant car on a observé que la membrane ne résistait pas (se décollait) lorsque l'on fait couler du liquide dans la puce. Exemple comparatif 2 : Micropuce avec encapsulation des molécules à cristalliser Pour répondre à tous les objectifs énoncés plus avant, un premier design, consistant à 25 utiliser les propriétés d'écoulement dans les canaux et en particulier l'augmentation de la résistance hydrodynamique lorsque la dimension du canal diminue, a été conçu. Cette puce est donc différente dans le sens où on cherche à encapsuler la protéine afin de la protéger, notamment pour éviter toute évaporation. La puce est réalisée avec deux niveaux, il est donc nécessaire d'avoir 2 masques. Les 30 canaux ont des dimensions de 0,5mm de large avec une longueur de canal du trou d'entrée au réservoir central d'environ 18,6mm. Le canal alimentant le réservoir central a une largeur de 0,4mm et une longueur de 0,1mm. Le réservoir central fait 3mm de diamètre. Deux lithographies différentes ont été réalisées, la première possède une hauteur de SU8 de 50pm par couche soit un total de 100pm, la deuxième 25pm par couche pour une épaisseur totale 35 de 50pm. 3044685 35 Ce design a été choisi avec pour objectif de délivrer la protéine selon le schéma de la Fig 4. Dans un premier temps il faut remplir le réservoir de protéine. Pour cela on obture deux entrées diagonalement opposées et on introduit le liquide. Une fois le réservoir rempli on 5 obture deux entrées situées du même côté et on injecte de l'huile de paraffine pour « fermer » un côté de la puce. On réitère le processus pour l'autre côté de la puce. Au final on devrait se retrouver avec une goutte de protéine encapsulée dans le réservoir central. On sait d'après la théorie que la résistance hydrodynamique, dans le cas de canaux rectangulaires, est proportionnelle à l'inverse du produit largeur par hauteur au cube. On a 10 donc : Roc co- h3 avec w largeur du canal en pm h hauteur du canal en pm Si on fait un calcul qualitatif ne prenant en compte que ces paramètres on peut calculer 15 le rapport de résistance entre le canal d'entrée de la solution Rsol et le canal d'entrée dans le réservoir Rres. En assumant une hauteur de 100pm et en reprenant les largeurs précédemment citées pour cette puce, on obtient alors : Rres 1.25 Rsor Ce rapport pourrait être grandement augmenté en diminuant la hauteur de la puce au 20 niveau du canal du réservoir mais cela complique fortement la fabrication. En pratique nous avons obtenu des résultats différents. Tout d'abord le réservoir de protéine ne se remplit pas sans capturer de bulles, une fois ces bulles formées il devient quasiment impossible de les faire partir du réservoir. De plus le remplissage d'un seul canal comme sur le schéma Fig 4.B n'est pas possible 25 dû à la compressibilité de l'air. Tous les canaux vont donc se remplir avec toutefois une préférence pour les canaux non bouchés. Enfin lors de l'étape de fermeture, les lignes de courants de l'huile de paraffine passent par le réservoir central et remplacent la solution de protéine (solution de colorant dans notre schéma) par l'huile. Cet effet peut être interprété en terme de mouillage. En effet en déposant 30 une goutte d'eau et une goutte d'huile à la surface d'une puce en NOA8111) on observe clairement que l'angle de contact e(huile) est plus faible que l'angle de contact 0(eau). Ceci se traduit par une meilleure affinité de l'huile par rapport à la NOA81® que l'eau. De cette manière l'huile aura toujours préférence à épouser au maximum la NOA810 par rapport à l'eau et va donc chasser l'eau du réservoir central. REVENDICATIONS1. Puce microfluidique (1) comprenant au moins une cellule (11) de cristallisation à dialyse, ladite cellule (11) comprenant : un support (1111) en PMMA un premier étage comprenant un réservoir (111) délimité au moins en partie par ledit support (1111) et par une paroi externe (1112) de la cellule, ledit réservoir (111) étant en communication fluidique avec un canal d'entrée et un canal de sortie d'une solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation, un second étage comprenant une chambre de dialyse (113) délimitée au moins en partie par une paroi interne (1113) de la cellule sans contact avec le support (1111) et par une membrane de dialyse (112) formant une interface entre le réservoir (111) et la chambre de dialyse (113), la paroi interne (1113) comprenant au moins une portion d'un seul tenant dans laquelle la périphérie de ladite membrane (112) est maintenue scellée. 2. Puce microfluidique (1) selon la revendication 1, caractérisée en ce que la chambre de dialyse contient une solution de molécule à cristalliser et en ce que la chambre de dialyse est scellée par une couche de polymère en PMMA (1115). 3. Puce microfluidique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'il existe un espace entre les parois externes (1112) et internes (1113) débouchant sur une surface principale (1114) de la puce et en ce que cet espace, en surface de la puce, est connecté via un raccord au système de contrôle des écoulements des fluides (1116), 4. Puce microfluidique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la membrane de dialyse est en cellulose, avantageusement en cellulose regénérée. 5. Puce microfluidique (1) selon la revendication 1, caractérisée en ce que le volume de la chambre de dialyse est compris entre 0,1 et 1 pL. 3044685 37 6. Puce microfluidique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend plusieurs cellules de cristallisation à dialyse alignées en lignes et colonnes. 5 7. Procédé de préparation d'une puce microfluidique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : - Réaliser deux blocs structurés en polymère réticulé perméable à l'air PL pour obtenir les tampons 3D en ledit polymère PL de la partie haute qui définira la 10 chambre de dialyse et de la partie basse de la puce qui définira les canaux et le(s) réservoir(s), Sur le bloc structuré avec les canaux et le(s) réseivoir(s) déposer une ou plusieurs membrane(s) de dialyse sèche(s), - Placer le bloc structuré sans canaux en coïncidence avec le bloc structuré 15 avec les canaux de manière à prendre en sandwich la membrane, Déposer une résine photosensible NOA81® sur 3 côtés entre les deux blocs structurés puis initier la réticulation de ladite résine NOA81®, - Retirer la partie supérieure du bloc structuré avec l'assemblage en résine réticulée en décollant le tout du bloc structuré du bas, 20 - Refermer la partie visible (sans PL) avec une lamelle de PMMA, Finaliser la réticulation de ladite résine NOA81®, - Retirer le dernier bloc structuré 8. Dispositif de cristallisation d'une molécule à cristalliser qui comprend 25 - Au moins une puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à6 - Au moins un moyen d'ajout agencé pour ajouter dans la chambre de dialyse une solution S1 comprenant la molécule à cristalliser et éventuellement au moins un tampon 30 Au moins un moyen d'ajout / prélèvement agencé d'agent de cristallisation et/ou d'additif(s) et/ou tampon(s) dans les canaux menant à la chambre du réservoir - Au moins un moyen de contrôle de la composition chimique de la solution dans le réservoir, par exemple un moyen de dosage, de variation de la concentration des tampons, des agents de cristallisation et des additifs 3044685 38 - Au moins un moyen de contrôle et de variation de la température de la puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications précédentes - Eventuellement au moins un moyen de mesure de la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 5 - Au moins un moyen d'acquisition d'images 9. Procédé de cristallisation d'une molécule à cristalliser, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : a) On ajoute une solution S1 comprenant la molécule à cristalliser 10 dans la chambre de dialyse (113) de la puce microfluidique (1) telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 6 puis on l'encapsule. b) Le cas échant, on injecte en continu une solution S2 dans les canaux de ladite puce microfluidique (1), ladite solution S2 contenant 15 uniquement le tampon, la pression d'injection au niveau du canal microfluidique est maintenue inférieure à 400 mbar. c) On injecte en continu une solution S3 de cristallisation, dans les canaux de ladite puce microfluidique (1), la pression d'injection au niveau du canal microfluidique est maintenue inférieure à 400 mbar ; 20 La solution S3 de cristallisation contient au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs, et éventuellement un tampon. Lorsque l'étape b) du procédé est mise en oeuvre, la solution S3 comprend le tampon de la solution S2 et au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs 25 additifs. 10. Procédé de cristallisation selon la revendication 9, caractérisé en ce que lors de l'étape a) la chambre de dialyse est encapsulée par dépôt d'une lamelle de PMMA, puis revêtement KAPTON®. 30 11. Procédé de cristallisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 10, caractérisé en ce que Lors de l'étape a), le cas échéant lors de l'étape b), la solution contenue dans la chambre de dialyse, comprenant ladite molécule à cristalliser, est à une 35 première température T1 et à une concentration C1 de la molécule à 3044685 39 cristalliser de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de sous-saturation (en dessous de la courbe de solubilité) du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la température ; lors de l'étape 5 b), le tampon présent dans la solution S2 diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et la molécule à cristalliser se trouve toujours dans ladite zone de sous-saturation Lors de l'étape c), ladite solution de cristallisation S3 contient, les cas échéant en plus du tampon au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou 10 plusieurs additifs à une concentration P constante, de manière à ce que l'agent de cristallisation et le cas échéant l'additif diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule 15 à cristalliser et qu'apparaissent des germes de la molécule à cristalliser ; et le procédé comprend ensuite les étapes successives suivantes : d) on augmente la température de la cellule de cristallisation (11) à une température T2 de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser, 20 e) s'il y a la formation de trop nombreux cristaux pendant l'étape c), la température de la cellule de cristallisation (11) peut-être augmentée à une température >T2 de telle manière que la molécule à cristalliser se retrouve dans la zone de sous-saturation, juste en dessous de la courbe de solubilité, à nouveau et que l'excès de petits cristaux soient complètement dissout. Quelques cristaux sélectionnés, de tailles 25 supérieures vont subir une dissolution partielle en évitant la dissolution complète et vont ensuite croitre dans la zone métastable par la baisse de température à la température T2 f) On laisse grossir les germes de cristaux à la température T2 jusqu'à l'obtention d'un premier point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la 30 concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C2, g) On abaisse la température de la cellule de cristallisation (11) à une température T3, de telle sorte que les cristaux présents dans la chambre de dialyse (113) se situent toujours dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à 35 cristalliser 3044685 h) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la température T3 jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C3 5 i) On répète éventuellement les étapes f) à h) j) On récupère la puce contenant les cristaux obtenus à l'issue de l'étape h) ou i) pour l'expérience de diffraction aux rayons X in situ. 12. Procédé de cristallisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 10, 10 caractérisé en ce que Lors de l'étape a), le cas échéant lors de l'étape b), la solution contenue dans la chambre de dialyse est à une température constante T de la cellule de cristallisation (11) et à une concentration Cl de la molécule à cristalliser de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de sous- 15 saturation (en dessous de la courbe de solubilité) du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la concentration en agent de cristallisation et le cas échéant en additif ; lors de l'étape b), le tampon présent dans la solution S2 diffuse dans la solution contenue dans la chambre de 20 dialyse et la molécule à cristalliser se trouve toujours dans ladite zone de sous-saturation Lors de l'étape c), ladite solution de cristallisation S3 contient, le cas échéant en plus du tampon, au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs à une concentration P1 dans le réservoir de la cellule de 25 cristallisation, de manière à ce que l'agent de cristallisation et le cas échéant l'additif diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser et qu'apparaissent des germes de la 30 molécule à cristalliser ; - Pour obtenir la nucléation spontanée contrôlée des cristaux la procédure suivante est employée : à l'aide du système de contrôle des écoulements des fluides la solution de cristallisation S3 est injectée en flux continu avec un gradient de concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant 3044685 41 d'additif de manière à ce qu'à la concentration P1 seulement quelques cristaux se forment. et le procédé comprend ensuite les étapes successives suivantes : d) On diminue la concentration de l'agent de cristallisation et le échéant de 5 l'additif à une concentration P2, de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser e) On laisse grossir les germes de cristaux à la concentration P2 de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif jusqu'à l'obtention d'un premier 10 point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C2 f)On augmente la concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif à une concentration P3, de telle sorte que les cristaux présents dans 15 la cellule de cristallisation (11) se situent toujours dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser, g) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la concentration P3 de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure 20 constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte est la concentration C3, h) On répète éventuellement les étapes d) à f) i)On récupère la puce contenant les cristaux obtenus à l'issue de l'étape g) ou h) pour l'expérience de diffraction aux rayons X in situ. 25