Brevet FR3049347A1 — publié le 20170929

Procédé d'observation d'un échantillon par calcul d'une image complexe Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est lié à l'observation d'un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par imagerie sans lentille. ART ANTERIEUR L'observation d'échantillons, et en particulier des échantillons biologiques, par imagerie sans lentille connaît un développement important depuis ces dix dernières années. Cette technique permet d'observer un échantillon en le disposant entre une source de lumière et un capteur d'image, sans disposer de lentille de grossissement optique entre l'échantillon et le capteur d'image. Ainsi, le capteur d'image collecte une image de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon. Cette image est formée de figures d'interférence entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et transmise par l'échantillon, et des ondes de diffraction, résultant de la diffraction par l'échantillon de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. Ces figures d'interférences sont parfois dénommées figures de diffraction, ou désignées par le terme anglais « diffraction pattern ». Le document W02008090330 décrit un dispositif permettant l'observation d'échantillons biologiques, en l'occurrence des cellules, par imagerie sans lentille. Le dispositif permet d'associer, à chaque cellule, une figure d'interférence dont la morphologie permet d'identifier le type de cellule. L'imagerie sans lentille apparaît alors comme une alternative simple, et peu onéreuse, à un microscope classique. De plus, son champ d'observation est nettement plus important que ne peut l'être celui d'un microscope. On comprend alors que les perspectives d'application liées à cette technologie sont importantes. D'une façon générale, l'image formée sur le capteur d'image, comportant des figures d'interférence, peut être traitée par un algorithme de reconstruction holographique, de manière à estimer des propriétés optiques de l'échantillon, par exemple un facteur de transmission ou une phase. De tels algorithmes sont bien connus dans le domaine de la reconstruction holographique. Pour cela, la distance entre l'échantillon et le capteur d'image étant connue, on applique un algorithme de propagation, prenant en compte cette distance, ainsi que la longueur 3049347 2 d'onde de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. On peut alors reconstituer une image d'une propriété optique de l'échantillon. L'image reconstruite peut, en particulier, être une image complexe de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon, comportant des informations sur les propriétés optiques d'absorption ou de variation de phase de l'échantillon. 5 Mais les algorithmes de reconstruction holographiques peuvent induire un bruit de reconstruction dans l'image reconstruite, désigné par le terme de « twin image ». Cela est essentiellement dû au fait que l'image formée sur le capteur d'image ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde lumineuse atteignant ce capteur. De ce fait, la reconstruction holographique s'effectue sur la base d'une information optique partielle, basée 10 uniquement sur l'intensité de l'onde lumineuse collectée sur le capteur d'image. L'amélioration de la qualité de la reconstruction holographique fait l'objet de nombreux développements, en mettant en oeuvre des algorithmes fréquemment dénommés « Phase retrieval », permettant une estimation de la phase de l'onde lumineuse auquel le capteur d'image est exposé. 15 Un algorithme de reconstruction numérique est par exemple décrit dans US2012/0218379. Les inventeurs proposent un procédé d'observation d'un échantillon par une méthode d'imagerie holographique, le procédé comprenant une étape de reconstruction d'une image complexe de l'échantillon. Cette étape de reconstruction permet d'obtenir une image complexe de bonne qualité, donnant des informations sur les propriétés optiques de l'échantillon. 20 EXPOSE DE L'INVENTION Un objet de l'invention est un procédé d'observation d'un échantillon comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, apte à émettre une onde lumineuse se propageant vers l'échantillon ; 25 b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse transmise par l'échantillon sous l'effet de ladite illumination ; c) calcul d'une image complexe représentative de l'échantillon ; 30 le procédé étant caractérisé en ce que le calcul de ladite image complexe comporte les sous étapes suivantes : 3049347 3 i) définition d'une image initiale de l'échantillon dans le plan de détection, à partir de l'image acquise par le capteur d'image ; ii) détermination d'une image complexe de l'échantillon dans un plan de reconstruction en appliquant un opérateur de propagation à l'image initiale de l'échantillon définie 5 lors de la sous-étape i) ou l'image de l'échantillon, dans le plan de détection, résultant de l'itération précédente ; iii) calcul d'un indicateur de bruit à partir de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape ii), cet indicateur de bruit dépendant, de préférence selon une fonction croissante ou décroissante, d'un bruit de reconstruction affectant ladite image complexe ; 10 iv) mise à jour de l'image de l'échantillon dans le plan de détection par un ajustement de valeurs de phase des pixels de ladite image, l'ajustement étant réalisé en fonction d'une variation de l'indicateur calculé lors de la sous-étape iii) selon lesdites valeurs de phase ; v) réitération des sous-étapes ii) à iv) jusqu'à l'atteinte d'un critère de convergence, de façon à obtenir une image complexe de référence de l'échantillon dans le plan 15 détection, ou dans le plan de reconstruction. Selon un mode de réalisation, la sous-étape iii), comporte : pour différents pixels, le calcul d'une grandeur associée à chaque pixel, en fonction de la valeur de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape ii) audit pixel, ou d'une dérivée dimensionnelle de ladite image complexe audit pixel ; 20 la combinaison des grandeurs calculées , en différents pixels (x, y), de façon à obtenir l'indicateur de bruit (Ek). La norme calculée ek (x, y) en chaque pixel est de préférence une norme d'ordre inférieur ou égal à 1. Elle peut être obtenue à partir d'une dérivée dimensionnelle de l'image complexe, cette dérivée étant calculée en plusieurs pixels de l'image, voire à chaque pixel de l'image. Elle peut 25 également être obtenue à partir de la valeur de l'image complexe en plusieurs pixels de l'image, voire à chaque pixel de l'image. L'indicateur de bruit peut être une norme d'ordre inférieur ou égal à 1 calculée à partir des grandeurs associées à chaque pixel. La grandeur associée à chaque pixel peut être calculée à partir du module d'une dérivée 30 dimensionnelle, audit pixel, de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape ii). Elle peut être obtenue à partir d'une dérivée dimensionnelle de l'image complexe, cette dérivée étant calculée en plusieurs pixels de l'image, voire à chaque pixel de l'image. Elle peut également 3049347 4 être obtenue à partir de la valeur de l'image complexe en plusieurs pixels de l'image, voire à chaque pixel de l'image. Selon un mode de réalisation, lors de la sous-étape i), l'image initiale de l'échantillon est définie par une normalisation 5 de l'image acquise par le capteur d'image, par une image représentative de l'onde lumineuse émise par la source de lumière ; lors de la sous-étape iii), la grandeur associée à chaque pixel est calculée en fonction de la valeur de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape ii), audit pixel, soustraite d'un nombre strictement positif, par exemple le nombre 1. 10 Le procédé peut comprendre l'une des caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison : lors de la sous-étape iii), l'indicateur est une somme, éventuellement pondérée, de la grandeur associée à chaque pixel de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape ii) ; 15 lors de la sous-étape iv), l'ajustement de la valeur de la phase de chaque pixel est réalisé en constituant un vecteur, dit vecteur de phase, dont chaque terme correspond à la valeur de la phase d'un pixel de l'image de l'échantillon dans le plan de détection , ce vecteur étant mis à jour, au cours de chaque itération, de façon soit à minimiser, soit à maximiser l'indicateur de bruit calculé lors de la sous-étape iii), en se basant sur un 20 gradient de l'indicateur de bruit selon chaque terme dudit vecteur de phase. La mise à jour du vecteur de phase peut être réalisée par un algorithme de minimisation ou de maximisation basé sur un gradient de l'indicateur de bruit (selon chaque terme dudit vecteur de phase. Le plan de reconstruction peut s'étendre de préférence parallèlement, ou sensiblement 25 parallèlement au plan de détection. De préférence, le plan de reconstruction est un plan selon lequel s 'étend l'échantillon. Selon un mode de réalisation, aucune optique de grossissement n'est interposée entre l'échantillon et le capteur d'image. Le procédé peut comporter une étape d) de caractérisation de l'échantillon en fonction de 30 l'image complexe calculée. L'échantillon peut notamment comporter des particules en suspension dans un milieu continu. Par caractérisation, on entend par exemple : 3049347 5 - une détermination de la nature d'une particule, c'est-à-dire une classification de cette particule parmi une ou plusieurs classes prédéterminées ; - une détermination de l'état d'une particule, parmi un ou plusieurs états prédéterminés ; - une estimation de la taille d'une particule, ou de sa forme, ou de son volume ou tout 5 autre paramètre géométrique ; - une estimation d'une propriété optique d'une ou plusieurs particules, par exemple l'indice de réfraction ou une propriété de transmission optique ; - un dénombrement desdites particules. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre 10 de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés aux dessins listés ci-dessous. FIGURES La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. La figure 2A illustre les principales étapes d'un procédé permettant le calcul d'une image 15 complexe de l'échantillon dans un plan de reconstruction. Les figures 2B, 2C, 2D et 2E représentent respectivement : - un hologramme acquis par le capteur d'image ; - une image reconstruite dans un plan de reconstruction lors d'une première itération du procédé représenté sur la figure 2A ; 20 - une image représentant une grandeur associée à chaque pixel de l'image représentée sur la figure 2C ; - une représentation d'une image reconstruite après plusieurs itérations du procédé représenté sur la figure 2A. Les figures 3A et 3B schématisent un profil du module ou de la phase d'une image complexe 25 obtenue par reconstruction holographique, respectivement en présence et sans bruit de reconstruction. La figure 4 résume le fonctionnement d'un procédé mettant en oeuvre l'invention. La figure 5A est un hologramme acquis par un capteur d'image, l'échantillon comportant des cellules dispersées dans une phase continue aqueuse. Les figures 5B et 5C représentent 30 respectivement le module et la phase d'une image complexe dans le plan de l'échantilllon, cette image complexe étant formée en mettant en oeuvre l'invention. La figure 6A est un hologramme acquis par un capteur d'image, l'échantillon comportant des globules rouges dispersées dans une phase continue aqueuse ; Les figures 6B et 6C représentent 3049347 6 respectivement le module et la phase d'une image complexe dans le plan de l'échantilllon, cette image complexe étant formée en mettant en oeuvre l'invention. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS 5 La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale 4X, comportant une longueur d'onde X. Cette longueur d'onde peut être une longueur d'onde centrale de ladite bande spectrale. 10 L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Il peut notamment s'agir d'un milieu 10a comportant des particules 10b. Les particules 10b peuvent être des particules sanguines, par exemple des globules rouges. Il peut également s'agir de cellules, de microorganismes, par exemple des bactéries ou des levures, des microalgues, des microbilles, ou des gouttelettes insolubles dans le milieu liquide, par exemple des nanoparticules lipidiques. 15 De préférence, les particules 10b ont un diamètre, ou sont inscrites dans un diamètre, inférieur à 1 mm, et de préférence inférieure à 100 um. Il s'agit de microparticules (diamètre inférieur à 1 mm) ou de nanoparticules (diamètre inférieur à 1 um). Le milieu 10a, dans lequel baignent les particules, peut être un milieu liquide, par exemple une phase liquide d'un liquide corporel, d'un milieu de culture ou d'un liquide prélevé dans l'environnement ou dans un procédé industriel. Il 20 peut également s'agir d'un milieu solide ou ayant la consistance d'un gel, par exemple un substrat de type gélose, propice à la croissance de colonies bactériennes. L'échantillon 10 est contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une micro-cuvette, d'utilisation courante dans les dispositifs de type point of care, dans laquelle l'échantillon 20 pénètre, par exemple par capillarité. L'épaisseur e de l'échantillon 10, 25 selon l'axe de propagation varie typiquement entre 20 um et 1 cm, et est de préférence comprise entre 50 um et 500 um, par exemple 150 um. L'échantillon s'étend selon un plan P10, dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation. Il est maintenu sur un support 10s. La distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 est de préférence supérieure à 1 30 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. De préférence, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre 3049347 7 l'échantillon et la source de lumière. Ainsi, de préférence, la lumière parvient à l'échantillon sous la forme d'ondes planes, ou pouvant être considérées comme telles. La source de lumière 11 peut être une diode électroluminescente ou une diode laser. Elle peut être associée à diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement 5 comprise entre 5 um et 1 mm, de préférence entre 50 um et 500 um. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 um. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée face à l'échantillon 10. 10 Le dispositif comporte de préférence un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11,, (13) selon un cône d'angle a, a étant égal à 30° dans le cas présent. De préférence, l'angle 15 de diffusion a varie entre 10° et 80°.. De préférence, la bande spectrale d'émission 4X de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et un capteur d'image 16. Ce dernier 20 s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au plan selon lequel s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Le capteur d'image 16 est apte à former une image selon un plan de détection Po. Dans 25 l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Les CMOS sont les capteurs préférés car la taille des pixels est plus faible, ce qui permet d'acquérir des images dont la résolution spatiale est plus favorable. Le plan de détection P0 s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. 3049347 8 La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 um et 2 cm, de préférence comprise entre 100 um et 2 mm. On remarque l'absence d'optique de grossissement entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 5 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image. Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, l'échantillon 10 peut engendrer une onde diffractée, susceptible de produire, au niveau du plan de détection Po, des interférences, en 10 particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12 transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde lumineuse 22, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 20, peut comprendre : une composante résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par 15 l'échantillon ; une composante résultant de l'absorption de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon. Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image acquise par le capteur d'image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire 20 programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20. Une image acquise sur le capteur d'image 16, également appelée hologramme, ne permet pas 25 d'obtenir une représentation suffisamment précise de l'échantillon observé. Comme décrit en lien avec l'art antérieur, on peut appliquer, à chaque image acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation h, de façon à calculer une grandeur représentative de l'onde lumineuse 22 transmise par l'échantillon 10, et à laquelle est exposé le capteur d'image 16. Un tel procédé, désigné par le terme reconstruction holographique, permet notamment de 30 reconstruire une image du module ou de la phase de cette onde lumineuse 22 dans un plan de reconstruction parallèle au plan de détection Po, et notamment dans le plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon. Pour cela, on effectue un produit de convolution de l'image /0 acquise par 3049347 9 le capteur d'image 16 par un opérateur de propagation h. Il est alors possible de reconstruire une expression complexe A de l'onde lumineuse 22 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, et en particulier dans un plan de reconstruction Pz situé à une distance I z I du capteur d'image 16, ce plan de reconstruction pouvant être le plan de l'échantillon P10. L'expression 5 complexe A est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'intensité de l'onde lumineuse 22 à laquelle est exposé le capteur d'image 16. Le produit de convolution de l'image /0 par l'opérateur de propagation h permet d'obtenir une image complexe A, représentant une distribution spatiale de l'expression complexe A dans un plan, dit plan de reconstruction Pz, s'étendant à une coordonnée z du plan 10 de détection P0. Dans cet exemple, le plan de détection Po a pour équation z = O. Cette image complexe correspond à une image complexe de l'échantillon dans le plan de reconstruction P. Elle représente également une distribution spatiale bidimensionnelle des propriétés optiques de l'onde 22 à laquelle est exposée le capteur d'image 16. L'opérateur de propagation h a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le 15 capteur d'image 16 et un point de coordonnées (x, y, z), situé à une distance I z I de ce dernier. Il est alors possible de déterminer le module M(x, y, z) et/ou la phase (p(x,y,z) l'onde lumineuse 22, à cette distance I z I, dite distance de reconstruction, avec : - M(x, y, z) = abs [A(x, y, z)] (1) - ço(x, y, z) = arg [A(x, y, z)] (2) 20 Les opérateurs abs et arg désignent respectivement le module et l'argument. Autrement dit, l'amplitude complexe A de l'onde lumineuse 22 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace est telle que : A(x, y, z) = M(x, y, z)e JÇP(x'Y (3). Cependant, une telle reconstruction s'accompagne d'un bruit de reconstruction pouvant être important, du fait que la propagation est réalisée sur la base d'une image /0 ne comportant pas 25 d'information relative à la phase. On va à présent décrire un algorithme permettant d'obtenir une image complexe, notée A, représentant une distribution spatiale de l'amplitude complexe A(x, y, z) à une distance I z i, en lien avec la figure 2A, les images obtenues au cours de certaines étapes étant illustrées sur les figures 2B à 2E. Une telle image est représentative de l'onde lumineuse 22, à laquelle est exposé 30 le capteur d'image 16 et permet notamment d'accéder au module ou à la phase de cette onde lumineuse. Etape 100: acquisition d'image : 3049347 10 Au cours de cette étape, le capteur d'image 16 acquiert une image /0 de l'échantillon 16, et plus précisément de l'onde lumineuse 22 transmise par ce dernier, à laquelle est exposé le capteur d'image. Une telle image, ou hologramme, est représentée sur la figure 2B. Cette image a été réalisée en utilisant un échantillon 10 comportant de cellules CHO (cellules 5 ovariennes de hamster) baignant dans un tampon salin, l'échantillon étant contenu dans une chambre fluidique d'épaisseur 100 p.m disposé à une distance d de 1500 p.m d'un capteur CMOS. L'échantillon a été illuminé par une diode électroluminescente 11 dont la bande spectrale d'émission est centrée sur une longueur d'onde de 450 nm et située à une distance D=8 cm de l'échantillon. 10 Etape 110: initialisation : Au cours de cette étape, on définit une image initiale 111,:cc° de l'échantillon, à partir de l'image /0 acquise par le capteur d'image 16. Cette étape est une initialisation de l'algorithme itératif décrit ci-après en lien avec les étapes 120 à 180, l'exposant k désignant le rang de chaque itération. Le module Mt -° de l'image initiale 111,:f'-° peut-être obtenu en appliquant l'opérateur 15 racine carrée à l'image acquise /0 par le capteur d'image, auquel cas Mr° = j. Il peut également être obtenu par une normalisation de l'image /0 par un terme représentatif de l'intensité de l'onde lumineuse 12 incidente à l'échantillon 16. Ce dernier peut être : la racine carrée d'une moyenne /0 de l'image /0, auquel cas chaque pixel /0(x, y) de ( 10 ,jx ,y) l'image acquise est divisé par ladite moyenne, de telle sorte que Mbc-° = _ (4) /0 20 une image sans échantillon /12 acquise par le capteur d'image 16 en l'absence d'échantillon entre la source de lumière 11 et le capteur d'image, auquel cas la valeur de chaque pixel /0(x, y) de l'image acquise de l'échantillon est divisée par la valeur de 1 chaque pixel /12(x, y) de l'image sans échantillon : Mok=° = /102((xx, y,y) ) (4') une moyenne /12 de ladite image sans échantillon, auquel cas chaque pixel /0(x, y) de 25 l'image acquise est divisé par ladite moyenne : Mk=° = ,j/0(x,Y) (4") ° La phase (pir° de l'image initiale Air° est soit considérée comme nulle en chaque pixel (x, y), soit prédéterminée selon une valeur arbitraire. En effet, l'image initiale Air° résulte directement de l'image /0 acquise par le capteur d'image 16. Or, cette dernière ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde lumineuse 22 transmise par l'échantillon 10, le 30 capteur d'image 16 n'étant sensible qu'à l'intensité de cette onde lumineuse. 3049347 11 La phase (pir° de l'image initiale Air° est soit considérée comme nulle en chaque pixel (x, y), soit prédéterminée selon une valeur arbitraire. En effet, l'image initiale Air°résulte directement de l'image /0 acquise par le capteur d'image 16. Or, cette dernière ne comporte pas 5 d'information relative à la phase de l'onde lumineuse 22 transmise par l'échantillon 10, le capteur d'image 16 n'étant sensible qu'à l'intensité de cette onde lumineuse. Étape 120: propagation : Au cours de cette étape, l'image Ar' obtenue dans le plan de l'échantillon est propagée dans un plan de reconstruction Pz, par l'application d'un opérateur de propagation tel que 10 précédemment décrit, de façon à obtenir une image complexe 11,k, représentative de l'échantillon, dans le plan de reconstruction Pz. Le terme image complexe désigne le fait que chaque terme de cette image est une grandeur complexe. La propagation est réalisée par convolution de l'image Arl- par l'opérateur de propagation h_z, de telle sorte que : AZ = Arl * h-z (5), 15 le symbole * désignant un produit de convolution. L'indice -z représente le fait que la propagation est réalisée dans un sens opposé à l'axe de propagation Z. On parle de rétro-propagation. L'opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : h(x, y, z) = - j eJ27 Âexp(jn-xAz ) (6) Az 20 La convolution est généralement réalisée dans le domaine fréquentiel, ou elle se ramène à un produit, auquel cas on utilise la transformée de Fourier de cet opérateur, cette dernière étant : H(µ, v, = ef274exp(-Àz(u2 + v2)) (6') où X désigne la longueur d'onde centrale de la bande spectrale d'émission de la source de lumière 11. 25 Ainsi, AZ (x, y) = AZ jAz Az ) = - e 277 fr . Ak -1 o exp - ) dr' (7) (r-r' )2 où r et r' désignent respectivement des coordonnées radiales, c'est-à-dire dans le plan de reconstruction Pz et dans le plan de détection Po. 3049347 12 Lors de la première itération (k =1), Air° est l'image initiale déterminée lors de l'étape 110. Au cours des itérations suivantes, Ar- est l'image complexe dans le plan de détection P0 mise à jour au cours de l'itération précédente. Le plan de reconstruction Pz est un plan distant du plan de détection P0, et de préférence 5 parallèle à ce dernier. De préférence, le plan de reconstruction Pz est un plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon 10. En effet, une image reconstruite dans ce plan permet d'obtenir une résolution spatiale généralement élevée. Il peut également s'agir d'un autre plan, situé une distance non nulle du plan de détection, et de préférence parallèle à ce dernier, par exemple un plan s'étendant entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. 10 La figure 2C représente une le module d'une image Azk=1 reconstruite à une distance de 1440 p.m du plan de détection P0 en appliquant l'opérateur de propagation défini ci-dessus à l'hologramme de la figure 2B. Cette image représente l'image complexe, dans le plan de reconstruction, établie lors de la première itération. Étape 130: Calcul d'une grandeur en plusieurs pixels de l'image complexe : 15 Au cours de cette étape, on calcule une grandeur ek (x, y) associée à chaque pixels d'une pluralité de pixels (x, y) de l'image complexe 11,k , et de préférence en chacun de ces pixels. Cette grandeur dépend de la valeur AZ (x, y) de l'image 11,k , ou de son module, au pixel (x, y) à laquelle elle est calculée. Elle peut également dépendre d'une dérivée dimensionnelle de l'image en ce pixel, par exemple le module d'une dérivée dimensionnelle de cette image. 20 Dans cet exemple, la grandeur associée à chaque pixel (x, y) est basé sur le module d'une dérivée dimensionnelle, telle que : 2 + akk (x, y) 2 a (8) aiLli: (x, y) ay L'image étant discrétisé en pixels, les opérateurs de dérivée peuvent être remplacés par des opérateurs de Sobel, de telle sorte que : 25 Ek (x, y) = \ i (S x * Alzc (x, Y)) (Sx * Alzc (x, y))* + (Sy * 111(x, Y)) (Sy * ilize (X , 37))* (9) OÙ : ( )* désigne l'opérateur complexe conjugué ; Sx et Sy désignent des opérateurs de Sobel selon deux axes orthogonaux X et Y du plan de reconstruction P. 3049347 13 1 0 -1 Selon cet exemple, S, = 2 0 -2 (10) et Sy est la matrice transposée de Sx. 1 0 -1 La figure 2D représente, sous la forme d'une image, la valeur du module Ek (x, y) en chaque pixel de l'image 11,k=1- représentée sur la figure 2C. Étape 140: établissement d'un indicateur de bruit associé à l'image AZ . 5 Lors de l'étape 130, on a calculé des grandeurs Ek (x, y) en plusieurs pixels de l'image complexe A. Ces grandeurs peuvent former un vecteur Ek, dont les termes sont les grandeurs Ek (x, y) associées à chaque pixel (x, y). Dans cette étape, on calcule un indicateur, dit indicateur de bruit, à partir d'une norme du vecteur Ek. D'une façon générale, à une norme est associée un ordre, de telle sorte que la norme 10 IlxIlp d'ordre p d'un vecteur x de dimension n de coordonnées (x1,x2, x',) est telle que : IIxIIp = IP)1/P, avec p 0. (12) Dans le cas présent, on utilise une norme d'ordre 1, autrement dit p = 1. Les inventeurs ont en effet estimé que le recours à une norme d'ordre 1, ou d'ordre inférieur ou égal à 1, est particulièrement adapté à cet algorithme, pour les raisons expliquées ci-après en lien les figures 15 3A et 3B. Au cours de cette étape, la grandeur Ek (x, y) calculée à partir de l'image complexe AZ, à chaque pixel (x, y) de cette dernière, est sommée de façon à constituer un indicateur de bruit Ek associé à l'image complexe AZ. Ainsi, Ek = E(',y) Ek (x, y) (15). 20 Cet indicateur de bruit Ekcorrespond à une norme de variation totale de l'image complexe AZ En se rapportant à l'exemple de la figure 2D, l'indicateur de bruit Ek=1 est obtenu, lors de la première itération, par une sommation de la valeur des pixels de cette image. De façon alternative à une norme d'ordre 1, une somme pondérée des grandeurs Ek (x, y), ou autre combinaison arithmétique, est également envisageable. 25 Du fait de l'utilisation d'une norme d'ordre 1, ou d'ordre inférieur ou égal à 1, la valeur de l'indicateur de bruit Ek diminue lorsque l'image complexe AZ est de plus en plus représentative de l'échantillon. En effet, lors des premières itérations, la valeur de la phase (picax, y), en chaque 3049347 14 pixel (x, y) de l'image 111,:c) est mal estimée. La propagation de l'image de l'échantillon du plan de détection P0 vers le plan de reconstruction Pz s'accompagne alors d'un bruit de reconstruction important, comme évoqué en lien avec l'art antérieur. Ce bruit de reconstruction se présente sous la forme de fluctuations apparaissant sur l'image reconstruite. Du fait de ces fluctuations, 5 un indicateur de bruit Ek, tel que précédemment défini est d'autant plus élevé que la contribution du bruit de reconstruction, sur l'image reconstruite, est importante. En effet, les fluctuations dues au bruit de reconstruction tendent à augmenter la valeur de cet indicateur. Les figures 3A et 3B schématisent un profil radial du module (ou d'une phase) d'une image reconstruite, en étant affectée d'un bruit de reconstruction respectivement fort et faible. On a 10 considéré ici un échantillon comportant une dispersion de particules 10b dans un milieu homogène transparent 10a. Les profils schématisés comportent deux fluctuations importantes, chacune étant représentative d'une particule 10b. Le profil de la figure 3A comporte également des fluctuations d'amplitude plus faible, et de fréquence élevée, de représentatives d'un bruit de reconstruction. L'indicateur de bruit Ek, tel que précédemment défini, est plus important sur 15 la figure 3A que sur la figure 3B. L'utilisation d'un indicateur Ek basé sur une norme d'ordre supérieur à 1 pourrait également convenir, mais une telle norme a tendance à atténuer les fluctuations d'amplitude faible, représentatives du bruit de reconstruction, par rapport à aux fluctuations importantes, représentatives de l'échantillon. A l'inverse, une norme d'ordre 1, ou d'ordre inférieur à 1, n'atténue pas les faibles fluctuations par rapport aux fluctuations 20 importantes. C'est pourquoi les inventeurs préfèrent un indicateur de bruit de reconstruction Ek basé sur une norme d'ordre 1 ou inférieur à 1. Un aspect important de cette étape consiste à déterminer, dans le plan de détection P0, des valeurs de phase (picax, y) de chaque pixel de l'image de l'échantillon 111,:c) , permettant d'obtenir, lors d'une itération suivante, une image reconstruite 11,k+1 dont l'indicateur Ek+1 est inférieur à 25 l'indicateur Ek. Lors de la première itération, comme précédemment expliqué, on ne dispose que d'une information pertinente sur l'intensité de l'onde lumineuse 22 mais non sur sa phase. La première image reconstruite 111-1-dans le plan de reconstruction Pz est donc affectée d'un bruit de reconstruction important, du fait de l'absence d'information pertinente quant à la phase de 30 l'onde lumineuse 22 dans le plan de détection Po. Par conséquent, l'indicateur Ek=1 est élevé. Au cours des itérations suivantes, l'algorithme procède à un ajustement progressif de la phase (picax, y) dans le plan de détection P0, de façon à minimiser progressivement l'indicateur Ek. 3049347 15 L'image 4 dans le plan de détection est représentative de l'onde lumineuse 22 dans le plan de détection P0, aussi bien du point de vue de son intensité que de sa phase. Les étapes 120 à 160 visent à établir, de façon itérative, la valeur de la phase (picax, y) de chaque pixel de l'image 4 , minimisant l'indicateur Ek, ce dernier étant obtenu sur l'image 11,k obtenue par propagation de 5 l'image Arl- dans le plan de reconstruction P. L'algorithme de minimisation peut être un algorithme de descente de gradient, ou de descente de gradient conjugué, ce dernier étant décrit ci-après. Étape 150 : Ajustement de la valeur de la phase dans le plan de détection. L'étape 150 vise à déterminer une valeur de la phase (picax, y) de chaque pixel de l'image 10 complexe 4 de façon à minimiser l'indicateur Ek+1 résultant d'une propagation de l'image complexe AIL') dans le plan de reconstruction Pz, au cours de l'itération suivante k+1. Pour cela, un vecteur de phase (pl(f, est établi, dont chaque terme est la phase (picax, y) d'un pixel (x, y) de l'image complexe A. La dimension de ce vecteur est (Np,x, 1), où Np,x désigne le nombre de pixels considérés. Ce vecteur est mis à jour au cours de chaque itération, par l'expression de 15 mise à jour suivante : 49ô(x,Y) = 491C11(x,Y) akPl REVENDICATIONS1. Procédé d'observation d'un échantillon (10) comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), apte à émettre une onde lumineuse (12) se propageant vers l'échantillon ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (In) de l'échantillon (10), formée dans un plan de détection (P0), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (22) transmise par l'échantillon sous l'effet de ladite illumination ; c) calcul d'une image complexe (AZ, Alcf,,) représentative de l'échantillon ; le procédé étant caractérisé en ce que le calcul de ladite image complexe de l'échantillon comporte les sous étapes suivantes : i) définition d'une image initiale de l'échantillon (Aro) dans le plan de détection, à partir de l'image (In) acquise par le capteur d'image ; ii) détermination d'une image complexe de l'échantillon (11,10 dans un plan de reconstruction (Pi) en appliquant un opérateur de propagation à l'image initiale de l'échantillon (Aro) définie lors de la sous-étape i) ou à l'image de l'échantillon (AU), dans le plan de détection, résultant de l'itération précédente ; iii) calcul d'un indicateur de bruit (el') à partir de l'image complexe (11,10 obtenue lors de la sous-étape ii) cet indicateur de bruit dépendant d'un bruit de reconstruction affectant ladite image complexe (11,10 ; iv) mise à jour de l'image de l'échantillon (Ain dans le plan de détection(P0) par un ajustement de valeurs de phase ((picax, y)) des pixels de ladite image, l'ajustement étant réalisé en fonction d'une variation de l'indicateur de bruit calculé lors de la sous- étape iii) selon lesdites valeurs de phase ; v) réitération des sous-étapes ii) à iv) jusqu'à l'atteinte d'un critère de convergence, de façon à obtenir une image complexe de l'échantillon (10) dans le plan détection (P0), ou dans le plan de reconstruction (Pi). 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la sous-étape iii), comporte : pour différents pixels (x, y), le calcul d'une grandeur (Ek (x, y)) associée à chaque pixel, en fonction de la valeur de l'image complexe (11,10 déterminée lors de la sous-étape ii) audit pixel, ou d'une dérivée dimensionnelle de ladite image complexe audit pixel ; 3049347 22 la combinaison des grandeurs (ek (x, y)) calculées en différents pixels (x, y), de façon à obtenir l'indicateur de bruit (ek). 3. Procédé selon la revendication 2 dans lequel dans lequel l'indicateur de bruit (ek) est une norme d'ordre inférieur ou égal à 1 calculée à partir des grandeurs ek (x, y) associées à chaque 5 pixel. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, dans lequel lors de la sous-étape iii), la grandeur (Ek (x, y)) associée à chaque pixel (x, y) est calculée à partir du module d'une dérivée dimensionnelle, audit pixel, de l'image complexe (11,10 déterminée lors de la sous-étape ii). 10 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, dans lequel lors de la sous-étape iii), la norme (el') est calculée à partir de la valeur de l'image complexe (11,10 en une pluralité de pixels. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel : lors de la sous-étape i), l'image initiale de l'échantillon (Ar-) est définie par une 15 normalisation de l'image (In) acquise par le capteur d'image (16) par une image (112) représentative de l'onde lumineuse (12) émise par la source de lumière ; lors de la sous-étape iii), la grandeur (Ek (x, y)) associée à chaque pixel est calculée en fonction de la valeur de l'image complexe (11,10 déterminée lors de la sous-étape ii), audit pixel, soustraite d'un nombre strictement positif, notamment le nombre 1. 20 7. Procédé selon l'une quelconque des 2 à 6, dans lequel lors de la sous-étape iii), l'indicateur de bruit (el') est une somme, éventuellement pondérée, de la grandeur (Ek (x, y)) associée à chaque pixel (x, y) de l'image complexe (11,10 dans le plan de reconstruction. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, lors de la sous-étape iv), l'ajustement de la valeur de la phase de chaque pixel est réalisé en constituant un vecteur, dit 25 vecteur de phase (4), dont chaque terme correspond à la valeur de la phase ((picax, y)) d'un pixel de l'image de l'échantillon dans le plan de détection (P0), ce vecteur étant mis à jour, au cours de chaque itération, de façon soit à minimiser, soit à maximiser l'indicateur de bruit (el') calculé lors de la sous-étape iii), en se basant sur un gradient (Vek) de l'indicateur de bruit (el') selon chaque terme dudit vecteur de phase. 3049347 23 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la mise à jour du vecteur de phase est réalisée par un algorithme de minimisation ou de maximisation basé sur un gradient (Vek) de l'indicateur de bruit (Ek) selon chaque terme dudit vecteur de phase. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le plan de 5 reconstruction (Pi) s'étend parallèlement au plan de détection (P0). 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le plan de reconstruction (Pi) est un plan (P10) selon lequel s'étend l'échantillon (10). 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel aucune optique de grossissement n'est interposée entre l'échantillon (10) et le capteur d'image (20). 10 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le procédé comportant une étape d) de caractérisation de l'échantillon (10) en fonction de l'image complexe calculée. 14. Dispositif permettant l'observation d'un échantillon, comportant : une source de lumière (11) apte à émettre une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) ; 15 un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon (10) entre ladite source de lumière (11) et un capteur d'image (16) ; un processeur (20), configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image (16) et à mettre en oeuvre le procédé objet de l'une quelconque des revendications 1 à 13. 20