Brevet FR3043914A1 — publié le 20170526

UTILISATION D'OLIGONUCLEOTIDES ANTISENS POUR PRODUIRE DES IG TRONQUEES PAR SAUT D'EXON POUR LE TRAITEMENT DE MALADIES IMPLIQUANT DES CELLULES DE LA LIGNEE B. La présente invention a trait au traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B, lymphocytes B ou plasmocytes. Elle concerne en particulier l'utilisation d'oligonucléotides antisens (AON) capable d'induire un saut d'exon dans les régions variables ou constantes des chaînes lourdes ou légères des immunoglobulines pour traiter des maladies impliquant des cellules de la lignée B, ainsi que des mélanges de tels AON. Enfin, l'invention concerne une méthode de sensibilisation au traitement par la voie des inhibiteurs du protéasome dans le cadre du traitement du myélome multiple. ART ANTERIEUR Le myélome multiple Le myélome multiple (MM) est un cancer incurable caractérisé par la présence dans la moelle osseuse d'un clone tumoral de cellules plasmocytaires. Il représente environ 1% des cancers et 10 % des hémopathies malignes, faisant de cette néoplasie B le second cancer d'origine hématopoïétique après les lymphomes (Kyle and Rajkumar, 2009). L'incidence du MM présente une grande variation allant de 0,4 à 6,3 cas pour 100 000 personnes. Le risque de développer un MM augmente avec l'âge avec un âge médian au diagnostic > 65 ans. L'incidence du MM est également plus élevée chez l'homme que chez la femme. Les personnes exposées à des niveaux élevés de radiations (radiations ionisantes, nucléaires) et aux pesticides semblent également présenter des risques plus élevés de développer un MM. Chez la majorité des patients atteints de MM, la maladie débute par un stade asymptomatique appelé MGUS (Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance), avant de progresser vers le myélome (Landgren, 2013). Les manifestations cliniques communément rencontrées chez les patients atteints de MM sont : une hypercalcémie, une insuffisance rénale, une anémie et des lésions osseuses. D'autres symptômes tels que des douleurs osseuses, une grande fatigabilité, des infections récurrentes et une perte de poids sont fréquemment constatés (Bird et al, 2011; Rajkumar, 2011). Ces manifestations cliniques sont provoqués par la production anormale d'une Ig monoclonale (historiquement appelée protéine M) par le clone plasmocytaire. 3043914 2 Bien que le MM demeure encore une maladie incurable, les récentes avancées en cancérologie et l'apparition de nouveaux agents thérapeutiques ont permis d'améliorer la survie globale des patients (Kumar et al, 2014). Le diagnostic d'un MM est basé sur la détection et l'évaluation d'un composent monoclonal (protéine M) par électrophorèse et immunofixation sur sérum et/ou urine de patients, la caractérisation et la quantification des Ig (par exemple : lgM, lgG, IgA, chaînes légères Igx ou IgX, taux chaînes légères « libres »...). Des biopsies de moelle osseuse sont réalisées pour évaluer l'infiltration plasmocytaire en tant que marqueur de progression et d'agressivité de la maladie. Les lésions osseuses sont évaluées par imagerie (radiographie, RMN, tomographie). La concentration sérique d'autres facteurs biologiques ((32-microglobuline, albumine, protéine C réactive, créatinine, hémoglobine, calcium, lactate déshydrogénase) permet de classifier le stade de la maladie et de pronostiquer son évolution. La recherche d'anomalies chromosomiques (translocation, délétion, hypo/hyperdiploïdie) permet également de classifier les risques de progression de la maladie. La majorité de ces critères sont utilisés dans les systèmes internationaux de classification du MM : « International Staging System : ISS » (Greipp et al., 2005) et « The Mayo Stratification of Myeloma and Risk-Adapted Therapy : mSMART (Mikhael et al., 2013). Le traitement des patients atteints de myélome inclut souvent trois étapes : Une phase d'induction : destinée à réduire la masse tumorale avant une autogreffe de cellules souches. Cette chimiothérapie inclut généralement des agents immunomodulateurs (comme le Thalidomide), des inhibiteurs du protéasomes (comme le Bortezomib commercialisé sous le nom de Velcade®) et de la Dexaméthasone. Une éventuelle autogreffe de cellules souches, réalisée chez les patients éligibles ayant répondu de façon satisfaisante à la phase d'induction. Une phase de maintenance : consistant en une combinaison de chimiothérapie et d'agents immunomodulateurs pouvant inclure les agents alkylants et le Lenalidomide. Ce traitement est maintenu jusqu'à la rechute des patients. Différents traitements peuvent être ensuite administrés chez les patients en rechute (Dispenzieri et al., 2009). Les agents utilisés dans le traitement du MM se divisent en 5 classes principales : les agents alkylants, les anthracyclines, les corticostéroides, les agents immunomodulateurs et les inhibiteurs du protéasome. 3043914 3 La réponse immunitaire humorale La réponse immunitaire humorale implique d'abord la forme membranaire des immunoglobulines (Ig) et repose ensuite sur la sécrétion d'Ig solubles : les anticorps. Les Ig sont des protéines hétérodimériques composées de 4 chaînes polypeptidiques dont 2 chaînes légères identiques et 2 chaînes lourdes identiques réunies entre elles par un nombre variable de ponts disulfures. Les Ig possèdent des régions variables porteuses de la spécificité antigénique et des régions constantes qui, pour les chaînes lourdes, déterminent la fonction effectrice des anticorps sécrétés. D'après la structure des régions constantes, on distingue deux types de chaînes légères (kappa ou lambda) et 5 types majeurs de chaînes lourdes (ii, 8,y, c ou a) définissant la classe des Ig. S'ils s'avèrent fonctionnels, les réarrangements successifs des gènes codant les régions variables (VJ pour les chaînes légères ; DJ, puis V(D)1 pour les chaînes lourdes) forment un exon variable qui pourra être transcrit et épissé sur les gènes codant les régions constantes. Au niveau du locus des chaînes lourdes, cet exon s'exprime d'abord avec le gène constant Cg situé immédiatement en aval. Ensuite, un second type de réarrangement appelé « commutation de classe » ou « commutation isotypique » peut intervenir. Il entraîne la délétion du gène Cg et permet l'expression d'un nouveau gène constant (par exemple Cy) avec la même région variable réarrangée. Ces multiples étapes de recombinaison des gènes d'Ig sont finement régulées au cours du la maturation des lymphocytes B, allant du stade de progéniteurs lymphoïdes B à celui de plasmocytes sécréteurs d'anticorps. Organisation des gènes d'Ig : Les gènes codant les différentes chaînes des immunoglobulines occupent 3 loci situés sur des chromosomes distincts. Ils présentent une structure générale commune et sont spécifiquement exprimés dans la lignée lymphocytaire B. Chacun est constitué de multiples segments de gènes codant pour la partie variable des récepteurs pour l'antigène et de un ou plusieurs gènes codant la partie constante. Dans leur disposition germinale, les gènes des chaînes lourdes et légères d'Ig ne sont pas directement fonctionnels. Pour devenir complètement fonctionnels, ces gènes doivent subir des modifications internes ou réarrangements intra-géniques. Ces réarrangements ont lieu aux stades précoces de l'ontogénie B, entre les segments codant la partie variable des chaînes lourdes et légères, on parle de recombinaisons V(D)J. - Locus humain des chaînes lourdes d'Ig (chr. 14) : les gènes des chaînes lourdes comprennent de très nombreux segments V (variables) et D (ces segments dits « de diversité » sont propres au locus de chaînes lourdes) et un groupe de 6 segments 1, on trouve ensuite 9 gènes codant des régions constantes. Chaque gène constant est composé de multiples exons codant les domaines structuraux 3043914 4 propres à chaque chaîne lourde. Lors des recombinaisons V(D)J, un segment est associé au hasard avec un des 6 segments J, puis le réarrangement de cette association D-JH s'effectue avec un segment V. La partie variable est associée à la région constante par épissage de l'ARN messager. Le passage de la forme membranaire à la forme sécrétée des Ig s'effectue par épissage alternatif d'un même transcrit primaire de chaîne lourde. - Locus des chaînes légères kappa (chr. 2) : les gènes des chaînes légères x comprennent de nombreux segments V et 5 segments J fonctionnels, on trouve ensuite un seul gène constant Oc Lors des réarrangements des gènes des chaînes légères, un segment V est accolé au hasard à un des 5 segments J. - Locus des chaînes légères lambda (chr. 22) : les gènes de chaînes légères X. présentent une architecture relativement différente des deux autres locus, dite groupée. On dénombre de nombreux segments V (29-33) et 4-5 segments J et C fonctionnels. Différenciation des lymphocytes B en plasmocytes L'origine du clone plasmocytaire est un lymphocyte B post-centre germinatif. La différentiation des lymphocytes B s'effectuent selon deux phases : une phase indépendante de l'antigène dans la moelle osseuse et une phase dépendante de l'activation antigénique dans les organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions lymphatiques...). Au cours de la phase indépendante de l'antigène, les précurseurs B subissent des réarrangements de leurs gènes d'Ig. Ces recombinaisons se font par un assemblage ordonné des segments V (variable), D (diversité) et J (jonction) pour les chaînes lourdes d'Ig et des segments V et J pour les loci des chaînes légères. Ces jonctions V(D)J sont hautement diversifiées et permettent l'expression d'une multitude d'Ig capables de reconnaître un nombre quasi infini d'antigènes. Chaque cellule B synthétisant une Ig unique, généralement dépourvue de réactivité vis-à-vis des antigènes du soi, est sélectionnée positivement. Après différentes étapes de prolifération, cette cellule B donnera naissance à des clones exprimant la même Ig. La reconnaissance de l'antigène par l'immunoglobuline de surface aboutit ensuite à l'entrée des lymphocytes B activés dans les centres germinatifs où plusieurs processus de modifications génétiques se produisent. Les lymphocytes B activés peuvent notamment subir des réarrangements au niveau des gènes constants de chaînes lourdes. Ces recombinaisons génétiques sont influencées par de nombreuses cytokines et permettent l'expression de classes nouvelles d'immunoglobulines autres qu'IgM. Les mécanismes de commutation de classe sont fondés sur l'accolement des régions Switch situées en 5' des segments constants et l'élimination des régions intervenantes, sous forme d'ADN circulaire extrachromosomique. Dans les centres germinatifs, des mutations somatiques, qui 3043914 correspondent à des modifications nucléotidiques ponctuelles ou à de courtes insertions ou délétions situées essentiellement au niveau des segments variables, permettent d'augmenter l'affinité du récepteur des cellules B pour l'antigène et de constituer un pool de cellules B mémoire de haute affinité. Les lymphocytes B activés peuvent également se différencier en plasmocytes qui synthétisent et sécrètent dans le sérum des quantités très importantes d'immunoglobulines. Les plasmocytes peuvent ensuite rejoindre la moelle osseuse où ils reçoivent des signaux de survie tels que l'interleukine-6 produite par les cellules stromales. Ces plasmocytes à longue durée ce vie peuvent persister plusieurs mois voire plusieurs années dans l'organisme. En accord avec leur statut post-centre germinatif, les cellules de myélome produisent des IgG et IgA, plus rarement des IgD et IgE, et présentent des taux élevées d'hypermutations somatiques au niveau de leur gènes d'immunoglobuline (Anderson et Carrasco, 2011). La synthèse massive d'Ig par les plasmocytes doit être finement régulée afin d'éviter une surcharge du réticulum endoplasmique (RE) préjudiciable à la survie des plasmocytes. Les inventeurs ont maintenant obtenu des résultats innovants soulignant la toxicité des Ig tronquées au cours de la différenciation physiologique des plasmocytes (Srour et al., J Exp Med, 2015, publication acceptée). De façon intéressante, la production d'Ig tronquées par les plasmocytes induit un stress cellulaire et provoque l'apoptose de ces plasmocytes. Sur la base de ces résultats, les inventeurs ont mis au point une nouvelle approche thérapeutique qui consiste à induire la production d'Ig tronquées pour éliminer les plasmocytes pathologiques à l'aide d'oligonucléotides antisens (AON « ou OAS en français »). Ces AON sont capables de provoquer un saut d'exon au niveau de l'ARN des chaines lourdes ou légères des Ig, se traduisant par l'expression d'Ig tronquées. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet une méthode de traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B comprenant l'administration chez un patient d'au moins un AON capable d'induire un saut d'exon dans l'une des régions variables ou constantes de l'une des chaînes lourdes ou légères des immunoglobulines. Par « cellules de la lignée B », on entend les lymphocytes B et les plasmocytes. Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'un AON permettant l'élimination de la région variable des chaînes légères ou lourdes des Ig. 3043914 6 Les résultats de la partie expérimentale illustrent une telle approche, notamment à l'Exemple 3. En particulier, les inventeurs ont montré qu'en transfectant une lignée myéloïde avec un AON capable de s'hybrider spécifiquement avec la séquence du site donneur d'épissage de l'exon VJ de la chaîne légère exprimée par ce clone, les cellules produisent des Ig tronquées qui provoquent leur mort par apoptose. Ce résultat constitue la preuve de concept de la présente invention. La présente invention concerne donc l'utilisation d'un AON ciblant la partie variable VJ des chaînes légères des Ig pour éliminer un clone de la lignée B. Une telle approche est illustrée à l'Exemple 4.1. Dans un mode préféré de réalisation, l'invention consiste à utiliser un AON dirigé contre le site donneur d'épissage de l'exon variable situé sur la chaîne légère 2. Un AON préféré pour cette utilisation est l'AON de séquence SEQ ID NO.5. De même, la présente invention peut être mise en oeuvre en utilisant un AON capable d'induire un saut d'exon de sorte que l'Ig produite soit dépourvue de la partie variable VDJ des chaînes lourdes. Une telle stratégie est illustrée à l'Exemple 4.2.2. Par « AON capable d'induire un saut d'exon », on entend tout AON se liant spécifiquement à la région ciblée de sorte que l'ARMm mature obtenu après épissage ne permette pas la traduction du domaine protéique que l'on souhaite éliminer. Par « domaine à éliminer », on entend soit la région variable d'une chaîne lourde ou légère, soit au moins une partie de la région constante d'une chaîne lourde. La séquence ciblée par l'AON peut contenir le site donneur d'épissage, le site accepteur d'épissage ou des séquences régulatrices d'épissage, par exemple activatrices (dites « enhancer »), situées dans les régions introniques ou exoniques. De plus, un AON selon l'invention est capable d'induire un saut d'exon en s'hybridant avec une séquence qui comprend un site donneur d'épissage, un site accepteur d'épissage ou des séquences régulatrices d'épissage situées dans les régions introniques ou exoniques des régions variables ou constantes des chaînes des immunoglobulines. Cet AON peut être utilisé dans le traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B. L'approche thérapeutique visant à faire produire par les cellules de la lignée B une Ig dépourvue de domaine variable peut être mise en oeuvre dans le cadre d'une médecine personnalisée. Une fois que le clone B responsable de la maladie a été identifié, un séquençage de la région variable est effectué et un AON capable de s'hybrider spécifiquement à cette séquence peut être sélectionné et administré en tant que médicament. Par exemple, dans le cas du MM, l'Ig monoclonale produite par le clone tumoral (par exemple : IgG, IgA, chaînes légères ID REVENDICATIONS1. Oligonucléotide antisens ou mélange d'oligonucléotides antisens capable d'induire un saut d'exon au niveau de l'ARN des chaines lourdes ou légères des immunoglobulines, pour son utilisation dans le traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B. 2. Oligonucléotide antisens selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est capable d'induire un saut d'exon dans la région variable Vi de la chaîne légère ou Val de la chaîne lourde. 3. Oligonucléotide antisens selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est capable d'induire un saut d'exon dans la région constante de la 10 chaîne lourde. 4. Oligonucléotide antisens selon l'une des revendications 1 à 3, pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est capable d'induire un saut d'exon en s'hybridant avec une séquence qui comprend un site donneur d'épissage, un site accepteur d'épissage ou des séquences régulatrices d'épissage situées dans les régions introniques ou 15 exoniques des régions variables ou constantes des chaînes des immunoglobulines. 5. L'oligonucléotide antisens selon la revendication 2, pour son utilisation selon la revendication 2, dans laquelle les maladies impliquant des cellules de la lignée B sont choisies parmi le myélome multiple, l'amylose AL, les lymphomes non Hodgkiniens, la leucémie lymphoïde chronique, la maladie de Waldenstrôm et de tout autre type de cancers touchant les cellules 20 de la lignée B et impliquant la production d'une tg monoclonale. 6. L'oligonucléotide antisens selon la revendication 3, pour son utilisation self la revendication 3, dans laquelle les maladies impliquant des cellules de la lignée B sont choisies parmi (i) l'allergie immédiate en ciblant les cellules B produisant des IgE, (ii) certaines pathologies immuno-allergiques impliquant des dépôts cl'IgA ou impliquant des propriétés 25 immunopathologiques spécifiques des IgA, (iii) les maladies auto-Immunes spécifiques de tissus, (iv) les pathologies liées à des dépôts tissulaires de chaînes d'immunoglobulines monoclonales et (y) en transplantation. 7. Mélange d'OAN capable d'induire un saut d'exon au niveau de l'ARN des chaînes lourdes ou légères des immunoglobulines. 30 8. Oligonucléotide antisens ou mélange d'oligonucléotides antisens capable d'induire un saut d'exon au niveau de l'ARN des chaînes lourdes ou légères des immunoglobulines, pour son utilisation dans le traitement du myélome multiple en combinaison avec un inhibiteur de la voie du protéasome.