Brevet FR3037244A1 — publié le 20161216

La présente invention concerne l'utilisation d'extraits d'une plante très répandue, notamment en Europe, dans des compositions cosmétiques, pharmaceutiques, nutraceutiques ou vétérinaires. Plus précisément, elle se rapporte à de nouvelles applications du péricarpe de noisette pour traiter la peau humaine ou animale. Le Noisetier ou Coudrier (Corylus avellana L.) est un arbrisseau de 3 à 8 mètres de hauteur et appartenant à la famille des Bétulacées. C'est une plante des bois, des haies et des jardins qui donne un fruit comestible apprécié, la noisette. Il a un bois souple. Il est parfois appelé Avelinier. L'arbrisseau forme une touffe de 10 à 12 branches pouvant atteindre 3 à 4 m de haut, multigaule (composé de plusieurs troncs fins). Son écorce est marron et peut se détacher en fines lamelles selon les variétés. Ses feuilles cordiformes caduques sont dentées avec un sommet en pointe. Les fleurs mâles, jaunâtres, forment des épis pendants ou chatons de 6 cm, et les fleurs femelles, très condensées, forment des épis dressés. La noisette est un akène doté d'un péricarpe ligneux appelé « écale » et renfermant une seule graine (l'amande) qui occupe toute la cavité interne du péricarpe. Ce fruit à coque, de forme plus ou moins ovoïde, peut atteindre 3 cm de long et 2 de diamètre; il est protégé avant maturité complète par une enveloppe de forme tubulaire, l'involucre (bractée), d'aspect foliacé et divisée en lobes irréguliers à son extrémité, elle est plus ou moins enveloppante selon les variétés. Le péricarpe est un déchet de l'industrie agro-alimentaire et se trouve en grande quantité. La plupart du temps, il a subi une étape de torréfaction. Le péricarpe de noisette a été étudié pour ses propriétés anti-oxydantes compte tenu des tannins qu'il renferme (Alasalvar et al, Antioxidant activity of haselnut skin phenolics, J. agric. Food. Chem. (2009)57 p. 4645). Diverses publications scientifiques décrivent également les tannins qu'il renferme (Del Rio et al, Phenolic composition of haselnut skin, J. Agric. Food Chem. (2011)59 p. 9935) ou des sucres (Montella et al, Identification and characterisation of water alkali soluble oligosaccharides from haselnut skin (C. avellana L.) Food Chemistry 140 (2013) 717725. La présente invention met en évidence de nouvelles applications des extraits du péricarpe de noisette pour dépigmenter au moins partiellement les peaux normales ou pour supprimer au moins partiellement les taches brunes inesthétiques 35 liées à l'âge ou à des expositions répétées au soleil par exemple. Mais, en outre, les Version n°-09/06/15 3037244 2 extraits de péricarpe de noisette améliorent significativement la fonction barrière de l'épiderme pour lutter contre les agressions externes et joue donc un rôle de protecteur cutané. Ces extraits de péricarpe de noisette jouent aussi un rôle favorable dans les compositions anti-âge. 5 Selon l'invention on a découvert que les extraits de péricarpe de noisette permettaient de diminuer l'expression de la tyrosinase, enzyme clé de la pigmentation dans les mélanocytes humains normaux. Ce résultat permet d'envisager des actions dépigmentantes sur des peaux naturellement pigmentées ou sur des taches pigmentaires induites par le soleil, le vieillissement ou toutes autres agressions 10 externes. La présente invention vise donc à proposer de nouvelles compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, nutraceutiques ou vétérinaires capables de diminuer la pigmentation naturelle ou induite de la peau d'un animal vivant et notamment d'un sujet humain. Selon l'invention on a également découvert que les extraits de péricarpe 15 de noisette permettaient de stimuler l'expression de différents marqueurs protéiques essentiels dans la formation du stratum comeum ou couche cornée, dont l'enzyme-clé, la transglutaminase TGK. Le stratum comeum est la partie la plus superficielle de la peau et représente l'aboutissement du processus de différenciation des kératinocytes. Au 20 cours de cette différenciation, les kératinocytes issus de l'assise basale subissent une série de remaniements métaboliques et structuraux tout au long de leur migration vers la surface de la peau. Le dernier stade est leur transformation en cornéocytes dont l'accumulation en une structure cohésive constitue le stratum comeum qui assure une fonction de barrière. Tout au long du processus de différenciation, 25 plusieurs protéines interviennent. L'une d'elles, la TGK, de la famille des glutaminases, catalyse l'établissement de liaisons peptidiques covalentes du type c(g-glutamy1)-lysine entre divers précurseurs protéiques qui forment le stratum corneum et lui confère cette capacité à protéger la peau vis-à-vis d'agressions extérieures et à limiter la diffusion de l'eau provenant de l'intérieur. La transglutaminase forme des polymères 30 de protéines généralement insolubles. Ces polymères biologiques sont indispensables à l'organisme pour créer des barrières et structures stables. La présente invention vise précisément à offrir de nouvelles compositions cosmétiques, pharmaceutiques, nutraceutiques ou vétérinaires capables de stimuler les facteurs intervenant dans la différenciation, appelés facteurs pro-différenciants comme la TGK, et permettant ainsi d'améliorer les états de la peau, des phanères et des muqueuses, sains ou lésés. Version n°-09/06/15 3037244 3 Selon l'invention, lesdites compositions comprennent, à titre de principe actif, au moins un extrait de péricarpe de noisette. On entend par « extrait de péricarpe de noisette », un extrait ou un mélange d'extraits de plante du genre Corylus sp de la famille des Bétulacées. Il s'agit 5 plus spécialement d'un extrait ou d'un mélange d'extraits de cellules de Corylus sp. Ce matériel cellulaire peut être obtenu par culture in vitro ou in vivo. Par culture in vitro, on entend l'ensemble des techniques connues de l'homme du métier, qui permettent, de manière artificielle, l'obtention d'un végétal ou d'une partie de végétal. Ainsi, l'extrait peut être un extrait ou un mélange d'extraits d'organe (racine, tige, feuille, 10 écorce), voire de cellules d'organe, d'au moins une plante du genre Corylus sp de la famille des Bétulacées, ou encore un extrait de cellules indifférenciées d'au moins une telle plante. Les applications selon l'invention s'étendent au traitement de la peau, des phanères et des muqueuses. Par phanères, on inclut notamment les ongles et le 15 système pileux, en particulier les cheveux. Par muqueuses, on entend les tissus de revêtement des cavités anatomiques, qui se raccordent à la peau par des orifices naturels, comme la bouche, l'estomac, l'intestin, ainsi que ceux de cavités naturelles externes comme les narines ou les oreilles. Ainsi, la présente invention a pour objet une utilisation d'un extrait de 20 péricarpe de noisette pour dépigmenter et/ou protéger la peau, les phanères et les muqueuses des agents extérieurs physiques, chimiques ou biologiques, et/ou pour améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau et/ou renforcer les phanères et les muqueuses. Elle a aussi pour objet un procédé de traitement cosmétique de lutte 25 contre la sécheresse d'une peau ou de traitement cosmétique d'une peau sèche, ledit procédé comprenant une étape selon laquelle on applique au moins un extrait de péricarpe de noisette sur la peau, pour lui redonner souplesse et/ou élasticité. L'invention porte aussi sur un procédé de traitement cosmétique anti-âge de la peau ou de traitement cosmétique d'une peau âgée, comprenant une étape 30 selon laquelle on applique au moins un extrait de péricarpe de noisette sur la peau. Ce traitement permet de retarder les phénomènes de pigmentation et/ou de vieillissement de la peau, mais aussi de réparer une peau âgée en lui redonnant souplesse et élasticité. Dans toute application cosmétique de l'invention, un extrait de péricarpe 35 de noisette peut être associé à un autre ou d'autres agents prodifférenciants de la Version n°-09/06/15 3037244 4 peau, comme le calcium, la vitamine D et leurs dérivés ou au moins un autre agent dépigmentant complémentaire connu de l'homme de métier. Selon un autre aspect, l'invention concerne les applications pharmaceutiques ou vétérinaires d'un extrait de péricarpe de noisette, telles que 5 présentées ci-après. Un des objets selon l'invention est donc une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un extrait de péricarpe de noisette, pour restaurer la fonction barrière de l'épiderme d'une peau lésée. Cet état peut résulter de l'action d'un agent extérieur physique, chimique ou biologique et/ou d'un trouble ou 10 d'une maladie, comme par exemple du psoriasis ou une dermatose atopique. Un autre objet selon l'invention est une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un extrait de péricarpe de noisette, pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière d'une muqueuse ou pour restaurer la fonction barrière d'une muqueuse lésée. A titre d'exemple, il peut s'agir de la muqueuse intestinale. La 15 lésion de la muqueuse peut résulter d'un trouble ou d'une maladie ; dans le cas de la muqueuse intestinale, la lésion peut être provoquée par le syndrome du colon irritable. Dans la visée thérapeutique de l'invention, l'extrait de péricarpe de noisette peut être administré par voie topique ; il peut aussi être administré par voie 20 orale. Selon un aspect de l'invention, l'extrait est administré après que le processus inflammatoire est terminé, notamment en traitement réparateur par reconstruction du stratum comeum. Dans une composition de l'invention, l'extrait de péricarpe de noisette 25 peut aussi être associé à un ou plusieurs agents anti-inflammatoires et/ou immunosuppresseurs utilisés dans le traitement de l'inflammation cutanée, tels que les cyclosporines et leurs dérivés, les biothérapies anti-cytokines et les corticoïdes. Un extrait de péricarpe de noisette selon l'invention peut être obtenu par toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier. On peut 30 en particulier, citer les procédés d'extraction solide-liquide en milieux alcooliques (notamment éthanoliques), aqueux, ainsi qu'en milieux utilisant des solvants tels que les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités, comme les milieux hydroalcooliques. Avantageusement, un extrait est obtenu par extraction de péricarpe de 35 noisette, broyé ou non, en milieu aqueux hydroalcoolique ou alcoolique, notamment Version n'-09/06/15 3037244 5 avec une solution aqueuse d'éthanol. La concentration de l'éthanol peut varier de 10 à 90% (v/v). Des méthodes alternatives aux solvants peuvent aussi être envisagées comme le CO2 supercritique ou les micro-ondes... 5 Ces extraits peuvent être utilisés tels quels, sous forme liquide ou en poudre, non purifiés ou purifiés. Si l'extrait est en poudre, son séchage peut être conduit par toute technique bien connue de l'homme du métier. L'extrait peut être séché par atomisation, évaporation ou lyophilisation. La poudre ainsi obtenue peut être 10 encapsulée dans des liposomes ou autres vecteurs et supports pour une meilleure homogénéité de la composition et une meilleure diffusion du principe actif notamment sur la peau. L'extrait est de préférence obtenu à partir des péricarpes de noisettes broyés ou non et rôtis ou non. 15 On a observé que les extraits obtenus par macération hydroalcoolique des péricarpes de noisettes présentent une forte activité biologique et ceci quel que soit le pourcentage d'éthanol dans le solvant d'extraction. Des résultats similaires sont observés dans l'eau ou dans l'éthanol. Les extraits de péricarpe de noisette peuvent être associés dans les 20 compositions selon l'invention avec des substances augmentant la protection cutanée. A titre d'exemple mais de manière non limitative, on peut citer les associations avec des mucopolysaccharides, des vitamines, des céramides, des substances antiradicalaires ou des filtres U.V. De même, l'activité réparatrice des extraits selon l'invention est 25 particulièrement intéressante quand ils sont associés avec des substances ayant un effet cicatrisant comme des protéines, l'acide hyaluronique, des acides aminés, et/ou avec des substances anti-inflammatoires, anti-âge, après-solaire ou avec des actifs anti-acné et anti-dermatoses. L'activité protectrice des extraits de l'invention vis-à-vis des radicaux 30 libres et des U.V. est également très intéressante dans le domaine capillaire, notamment dans le cas d'association avec des substances facilitant le bon état du cuir chevelu et de celui du cheveu, comme des minéraux, des vitamines, des céramides, des extraits protéiques, des mucopolysaccharides, des acides de fleurs ou de fruits. Les compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées à 35 une application topique pour prévenir et/ou traiter de nombreuses altérations cutanées. Version n°-09/06/15 3037244 6 L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation dermo-cosmétique d'une composition contenant au moins un extrait de péricarpe de noisette, comme agent dépigmentant d'une peau naturellement pigmentée ou partiellement pigmentée, afin d'homogénéiser le teint, ou pour réduire les taches brunes liées à l'âge ou aux agents 5 externes comme le soleil. L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation dermocosmétique d'un extrait de péricarpe de noisette, comme agent réparateur et/ou protecteur de la peau et du système pileux comme les cheveux, notamment pour lutter contre les agressions externes, telles que celles liées à la pollution, au soleil, au stress oxydatif, au vieillissement et aux pathologies cutanées entrainant un 10 dysfonctionnement de l'homéostasie de l'épiderme ou des cheveux. C'est pourquoi, une application directe des compositions de l'invention concerne la lutte contre le vieillissement et la mort cellulaire induits par les U.V. Pour une utilisation cosmétique, les compositions de l'invention peuvent se présenter sous la forme de crèmes, gels, lotions, laits, émulsions H/E et E/H, 15 solutions, onguents, pulvérisateurs, huiles corporelles, lotions capillaires, shampooings, lotions après-rasage, savons, bâtons protecteur des lèvres, bâtons et crayons pour maquillage. Les compositions peuvent comprendre tous excipients nécessaires à leur formulation. Ainsi, lorsqu'elles sont sous la forme de gel, elles comprennent des excipients appropriés tels que les esters de cellulose ou d'autres 20 agents gélifiants, tels que le Carbopol®, la gomme de guar, ou analogues. Ces compositions cosmétiques peuvent aussi prendre la forme de lotion ou solution dans laquelle les extraits et/ou molécules sont sous forme encapsulée, par exemple dans des microsphères. Ces microsphères peuvent par exemple être constituées de corps gras, d'agar-agar et d'eau. Les agents actifs peuvent être aussi 25 incorporés dans des vecteurs de type liposomes, glycosphères, dans des chylomicrons, des macro-, micro-, nano-particules ainsi que les macro-, micro- et nano-capsules et peuvent aussi être adsorbés sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux. Ces émulsions jouissent d'une bonne stabilité et peuvent être conservées pendant le temps nécessaire pour une utilisation à des 30 températures comprises entre 0 et 50 °C sans qu'il y ait sédimentation des constituants ou séparation des phases. Les compositions cosmétiques de l'invention comprennent de l'ordre de 0,01 à 5% en poids, préférentiellement entre 0,1 et 2,5%, d'extrait de péricarpe de noisette lorsqu'elles sont sous forme de poudre et de l'ordre de 0,01 à 25% en poids, 35 préférentiellement entre 0,5 et 10%, lorsqu'elles sont sous forme encapsulée. Les Version n°-09/06/15 3037244 7 pourcentages donnés ci-dessus sont exprimés en poids d'extrait sec de péricarpe de noisette par rapport au poids de la composition finale. Pour la préparation de ces compositions, les extraits de péricarpe de noisette sont mélangés aux excipients généralement employés en cosmétique. 5 Les compositions cosmétiques de l'invention peuvent aussi contenir des additifs ou des adjuvants usuels en cosmétologie, comme par exemple des agents antibactériens ou des parfums, mais aussi des lipides d'extraction et/ou de synthèse, polymères gélifiants et viscosants, des tensio-actifs et émulsifiants, des principes actifs hydro ou liposolubles, des extraits de plantes, des extraits tissulaires, des extraits 10 marins et des actifs de synthèse. L'utilisation cosmétique ou dermocosmétique d'extraits comprend tous les soins du corps et de la peau y compris les produits solaires, protecteurs et bronzants, les produits anti-âge, anti-seborrhéïques, toniques, les produits assurant l'amélioration de l'aspect de la peau y compris le traitement acnéique, les rougeurs 15 cutanées, le traitement du cuir chevelu et celui de la chute des cheveux. Les compositions cosmétiques de la présente invention peuvent aussi comprendre d'autres principes actifs complémentaires choisis pour leur action, par exemple pour la protection solaire, l'effet anti-rides, l'activité antiradicalaire et antioxydante, l'activité anti-irritante, la nutrition cellulaire, la respiration cellulaire, 20 l'hydratation et la régénération cellulaire, les traitements anti-séborrhéïques, ainsi que d'autres principes actifs ayant une action sur la tonicité cutanée, la protection du cheveu. Les compositions cosmétiques de la présente invention sont de préférence à utiliser quotidiennement en les appliquant une ou plusieurs fois par jour. 25 Les compositions cosmétiques de la présente invention sont très bien tolérées, elles ne présentent aucune phototoxicité et leur application sur la peau, pour des périodes de temps prolongées, n'implique aucun effet systémique. L'invention concerne aussi l'utilisation d'extraits de péricarpe de noisette pour la préparation de compositions dermocosmétiques présentant une activité anti30 inflammatoire et dermoprotectrice. Ces compositions sont utiles pour prévenir et/ou traiter notamment des maladies dermatologiques liées à des activités séborrhéiques, acnéiques et/ou inflammatoires. Ces compositions dermocosmétiques se présentent sous forme liquide, de poudre, de pâte ou d'émulsion, seuls ou en combinaison avec d'autres substances. Elles comprennent de l'ordre de 0,01 à 25% en poids d'extrait de 35 péricarpe de noisette. Les pourcentages sont exprimés en poids d'extrait sec de péricarpe de noisette par rapport au poids de la composition finale. Pour la Version n°-09/06/15 3037244 8 préparation de ces compositions dermocosmétiques, les extraits de péricarpe de noisette sont mélangés à des excipients. En conséquence, de manière générale, l'invention se rapporte notamment à l'utilisation d'un extrait de péricarpe de noisette, pour la préparation d'une composition pharmaceutique, vétérinaire, nutraceutique, dermatologique ou cosmétique destinée à prévenir et/ou traiter les pathologies et désordres résultant : - du vieillissement naturel ou prématuré de la peau ou des cheveux, - de dermatoses, comme le psoriasis, la dermatite atopique..., 5 - d'états inflammatoires des systèmes cutanés ou pileux, induisant des démangeaisons, irritations, rougeurs chroniques, irritations et démangeaisons persistantes et des troubles fonctionnels de la fragilité capillaire, - de la pigmentation cutanée. 10 Une composition pharmaceutique selon l'invention comprend, outre au moins un agent actif comme défini précédemment, un vecteur, ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. La présente invention est maintenant illustrée, de manière non limitative, par les exemples 1 à 4 suivants. 15 L'exemple 1 illustre des procédés de préparation d'extraits de péricarpe de noisette selon l'invention. Les exemples 2 et 3 illustrent les propriétés biologiques revendiquées selon l'invention. L'exemple 2 montre les effets dépigmentants de certains extraits selon l'invention. L'exemple 3 illustre les propriétés des extraits de l'exemple 2, qui ont 20 été évaluées par la capacité de ces extraits à stimuler l'expression de marqueurs-clé de la différenciation épidermique. Les marqueurs choisis, tous impliqués dans l'arrangement des filaments de kératine et dans la formation de l'enveloppe de la couche cornée, sont la transglutaminase K (TGK), la filaggrine et la cytokératine 10 (KRT10). La TGK catalyse l'établissement de liaisons peptidiques du type e(g-glutamyI)- 25 lysine entre divers précurseurs protéiques. La filaggrine et la KRT10 sont peu exprimées dans les monocouches de kératinocytes primaires et sont considérés comme des marqueurs de différenciation terminale de l'épiderme. Ces résultats témoignent de la capacité des extraits à agir sur les peaux âgées ou lésées. Ces propriétés peuvent être étendues aux autres organes du corps humain ou animal. 30 Version n°-09/06/15 3037244 9 Exemple 1 : Obtention des extraits de péricarpe de noisette Une série d'extractions a été réalisée avec les solvants suivants : - hexane ; 5 - acétate d'éthyle ; - éthanol/eau : 90/10; - éthanol/eau : 60/40; - éthanol/eau : 30/70; - eau. 10 Les extractions ont été réalisées à température ambiante (sauf pour l'eau à 50°C), après un broyage préalable de la matière végétale. Le ratio plante/solvant est de 1/10. Le temps de macération (sous agitation) est de 24 heures. Pour chaque extrait, une partie a été traité sur charbon actif avec un ratio 15 charbon/plante de 1/10, l'autre a été gardé brut. Les rendement d'extraction sont rassemblés dans le tableau ci-dessous : Solvant extraction Extrait brut Rendement Extrait sur charbon Rendement d'extraction d'extraction (%) (%) Hexane EX5MF1173 9,1 EX12MF1173 7,8 Acetate d'éthyle EX6MF1173 12,0 EX13MF1173 8,1 Ethanol 90% EX1MF1173 12,9 EX8MF1173 11;5 Ethanol 60% EX2M F1173 16,1 EX9MF1173 12,8 Ethanol 30% H20 50°C EX3M F1173 EX4M F1173 7,3 EX1OMF1173 2,4 3,1 EX11MF1173 1,1 L'aspect des extraits obtenu est décrit dans le tableau ci-dessous : 20 Extrait brut Solvant extraction Aspect Couleur Extrait sur charbon Aspect Couleur D6M F1173 Hexane huile marron vert vert EX12MF1173 huile jaune jaune EX6MF1173 Acetate d'éthyle huile marron marron EX13MF1173 huile jaune jaune EX1MF1173 Ethanol 90% , poudre fine marron marron EX9MF1173 poudre fine marron marron DQMF1173 Ethanol 60% poudre fine marron marron foncé EX9MF1173 poudre fine marron marron EX3MF1173 Ethanol 30% poudre fine marron marron foncé EX1OMF1173 poudre fine marron marron On constate tout d'abord que les extraits hexane et acétate d'éthyle présentent des rendement voisins de 10 %, ce qui semble indiquer la présence d'une forte proportion de matière grasse. Ceci est confirmé par la nature huileuse de ces 25 extraits. Il faut noter que les extrait aqueux et à 30 % d'éthanol ont été très difficiles à Version n°-09/06/15 3037244 10 filtrer. Il est possible que ces difficultés aient engendré des pertes qui diminuent de manière artificielle les rendements. Le rendement semble optimum pour l'éthanol à 60 %: 16 % brut et 13 % traité sur charbon. Lorsque l'on diminue la quantité d'éthanol, la diminution de rendement engendrée par le traitement sur charbon 5 augmente fortement. Ceci est cohérent avec les fortes teneurs en composés phénoliques décrite dans le paragraphe suivant. On constate que le traitement sur charbon est, mis à part pour les huiles, assez peu efficace pour diminuer la couleur des extraits. Les analyses phytochimiques de ces extraits sont les suivantes: 10 Nous avons dosé les composés phénoliques totaux et les tanins par la méthode de Folin-Ciocalteu en équivalent acide chlorogénique. Les résultats sont rassemblés dans le tableau ci-dessous : 15 Extraits Bruts Extraits Charbons Solvant Extraits % composés Phénolique totaux %Tannins seuls % composés Extraits % composés Phénolique totaux % Tannins seul % composés Phénoliques Phénoliques non taniques non taniques H20 50°C EX4MF1173 20,12 6,67 13,45 EX11MF1173 42,1 42,1 0,0 Eth/Eau 30/70 EX3MF1173 58,7 4,6 54,1 EX1OMF1173 45,2 8,2 37,0 Eth/Eau 60/40 EX2MF1173 87,9 11,3 76,6 EX9MF1173 95,0 24,5 70,6 Eth/Eau 90/10 EX1MF1173 83,3 12,0 71,3 EX8MF1173 98,5 25,4 73,1 Acetate d'Ethyl EX6MF1173 8,9 8,2 0,7 EX13MF1173 2,4 2,3 0,1 Hexane EX5MF1173 7,6 6,9 0,8 EX12MF1173 2,1 2,2 -0,1 On constate que : - plus le solvant d'extraction est riche en éthanol, plus l'extrait est riche en composés phénoliques ; 20 - parmi les composés phénoliques, les tanins sont minoritaires ; - à partir de 60 % d'éthanol, le traitement sur charbon permet d'enrichir l'extrait en composés phénoliques et en tanins ; - les extraits éthanol 90 % et 60 %, traités sur charbon contiennent respectivement 98 % et 95 % de composés phénoliques ; dont respectivement 25 % et 25 24 % de tanins. Version n°-09/06/15 3037244 11 Exemple 2: Evaluation de la cytotoxicité et de l'activité dépigmentante des extraits Nous avons évalué l'activité inhibitrice de la tyrosinase pour les extraits 5 éthanol 30 % (Ex3MF1173) et éthanol 90 % (Ex1MF1173) non traités sur charbon. Cytotoxicité Nous avons dans un ler temps évalué la cytotoxicité des extraits sur mélanocytes. 10 - Type cellulaire : NHEM en milieu de culture. - Temps d'incubation : 72 heures. - Paramètres d'évaluation : réduction du MTT et observations morphologiques au microscope. A la fin du traitement, les cellules ont été incubées en présence de MTT (sel de tétrazolium) dont la transformation en cristaux bleus de 15 formazan est proportionnelle à l'activité de la succinate deshydrogénase (enzyme mitochondriale). Après dissociation des cellules et solubilisation du formazan par ajout de DMSO, la densité optique (DO), représentative du nombre de cellules vivantes et de leur activité métabolique, a été mesurée avec un lecteur de microplaques à 540 nm (VERSAmax, Molecular Devices). 20 Des résultats présentés dans le tableau ci-dessous on conclut que la dose maximale non cytotoxique est de 31.1g/mL pour Ex1MF1173 et de 101..tg/mL pour Ex3MF1173. Version n0-09/06/15 3037244 12 Témoin EX11.11F1173 Unité : gfml Solution st à 100 mg+ml en DAIS° 0.3 10 30 100 1000 101 97 89 89 95 87 76 36 70 Viilité (%) 100 99 99 95 91 87 81 47 101 O 101 102 98 93 93 90 82 43 66 O Moyenne 100 95 92 88 80 42 79 o esm 2 2 11 O Observations morphologiques + g op Témoin EX3MF1173 Unité : pg1m1 Solution stock préparée à 50 mg/mlen DfASO 0.1 0.3 1 5 10 50 150 500 100 102 103 104 102 99 95 83 50 131 Viabilité (%) 99 97 105 102 102 96 93 86 44 159 101 102 101 106 100 98 94 80 38 90 Moyenne 100 103 104 102 98 94 83 44 127 osai 1 1 1 1 1 0 2 3 20 Observations morphologiques g , 9 Légendes + :population normale ; : réduction de croissance ; : toxicité ; 0: mortalité cellulaire Q :grains de composé : op opacité due au composé; - : modifications morphologiques ; : cellules agglutinées mon erreur standard de la moyenne (déviation standard divisée par la racine carrée de la talle de l'échantillon) Activité tvrosinase Les mélanocytes ont été ensemencés et cultivés en milieu de culture 5 pendant 24 heures. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu contenant ou non (témoin) les composés ou la référence (acide lipoïque à 5 tg/ml) et les cellules ont été incubées pendant 72 heures. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=3. A la fin de l'incubation, le milieu de culture a été retiré et les cellules 10 lavées avec une solution de PBS. Pour chaque condition, l'enzyme tyrosinase a été extraite en solution PBS-Triton X-100, puis incubée avec le substrat (L-DOPA à 2 mM) pendant 1 heure à 37°C. L'activité enzymatique des différents extraits cellulaires a été évaluée par mesure de la densité optique (DO) à 540 nm (Lecteur de microplaques Versamax, 15 Molecular Devices) et en utilisant une gamme standard de tyrosinase de champignon (0.39 à 400 WH). Version n°-09/06/15 3037244 13 L'activité de la tyrosinase a été évaluée après 72 heures de culture des NHEM en présence de la référence ou des composés à l'essai. Dans ce type de protocole, la mesure de l'activité enzymatique permet de rendre compte de la quantité de tyrosinase présente dans les mélanocytes. Toutefois, il ne peut pas être 5 exclu que les composés, incorporés dans les cellules ou liés de façon covalente à l'enzyme, puissent inhiber directement l'activité enzymatique de la tyrosinase. Après 72 heures de culture, une activité tyrosinase était détectée dans les NHEM de la condition Témoin. Le traitement des NHEM par l'acide lipoïque, testé à 5 mg/mi, a induit une très forte inhibition de l'activité de la tyrosinase (90% d'inhibition). 10 Ces résultats étaient attendus et ont permis de valider l'essai. L'extrait EX3MF1173, testé à 10 lig/mi, a inhibé l'activité de la tyrosinase (25% d'inhibition). Aux plus faibles concentrations testées, ce composé n'a pas eu d'effet. L'effet aqueux a montré également une activité dépigmentante. L'extrait EX1MF1173, testé à 3 concentrations, n'a pas modulé l'activité 15 de la tyrosinase. Il faut cependant noter que l'extrait Ex1MF1173 a, du fait de sa plus grande cytotoxycité, été testé à une concentration trois fois plus faible que Ex3MF1173. A cette même concentration Ex3MF1173 n'a pas non plus d'effet. Il est donc possible que la seule différence entre Ex1MF1173 et Ex3MF1173 ne réside que dans leurs teneurs maximales non cytotoxiques. Version n°-09/06/15 3037244 14 Traitement Données de base Données normalisées Composés testés Concentration Tyrosinase TMyrclosYeinnnasee esm T ' %oin esm P(1) Inhilion esm Fie (u/mi) (u/mi) (Lump (%) 1%) 222,8 Témoin - 246,1 228,5 9,0 100 4 - 0 4 - 216,7 25,4 Acide lipoïque 5 pg/ml 23,9 23,3 1,4 10 1 .- 90 1 20,7 171,0 IBM 200 pM 173,8 170,4 2,2 75 1 25 1 166,3 86,5 Dibutyryl AMPc 5 mg/m1 108,9 104,6 9,4 46 4 54 4 118,3 220,2 0.333 pg/ml 234,5 225,9 4,4 99 2 ns 1 2 ns 223,0 231,3 EX1MF1173 1 pg/ml 229,1 228,5 1,8 100 1 ns 0 1 ns 225,2 221,0 3 mg/mi 216,5 214,2 4,8 94 2 ns 6 2 ns 205,0 280,4 1.1 pg/ml 193,4 230,6 25,9 101 11 ns -1 -Il ns 217,9 253,8 EX3MF1173 3.3 pg/m1 191,3 213,6 20,2 93 9 ns 7 9 ns 195,5 178,0 10 pg/ml 160,2 170,8 5,4 75 2 25 2 174,1 (1) : Seuil de significativité statistique ns : > 0.05, Non significatif * : 0.01 à 0.05, Significatif ** : 0.001 à 0.01, Très significatif *** : REVENDICATIONS1. Composition destinée à, au moins partiellement, dépigmenter et/ou protéger la peau, les muqueuses et les phanères d'un animal vivant, ladite 5 composition contenant au moins un agent actif renfermant au moins un extrait de péricarpe de noisette. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle protège la peau ou les muqueuses en améliorant et/ou renforçant leur fonction barrière. 10 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle améliore et/ou renforce l'hydratation de la peau. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, utilisée pour le traitement de la peau d'un sujet humain, caractérisée en ce qu'elle dépigmente la peau en diminuant l'expression de la tyrosinase dans les mélanocytes humains 15 normaux. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est utilisée pour le traitement d'une peau naturellement pigmentée ou pour le traitement de taches pigmentaires induites. 6. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle 20 est utilisée pour le traitement d'une peau sèche ou âgée par application(s) sur ladite peau en vue d'augmenter sa souplesse et/ou son élasticité. 7. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est utilisée pour restaurer la fonction barrière d'une peau lésée par un agent extérieur physique, chimique ou biologique et/ou par une maladie telle qu'une dermatose, une 25 dermatite atopique ou un psoriasis. 8. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est utilisée pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière d'une muqueuse par application topique ou par voie orale. Version n°-09/06/15 3037244 21 9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est utilisée par voie orale pour améliorer ou renforcer la fonction barrière d'une muqueuse intestinale lésée. 10. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que 5 l'extrait de péricarde de noisette est associé à au moins un autre agent prodifférenciant de la peau, notamment le calcium, la vitamine D et leurs dérivés et/ou à au moins un autre agent dépigmentant de la peau. 11. Composition selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un agent anti-inflammatoire et/ou 10 immunodépresseur utilisé(s) dans le traitement de l'inflammation cutanée, notamment les cyclosporines et leurs dérivés, les biothérapies anti-cytokines et les corticoïdes et/ou au moins un agent dépigmentant autre qu'un extrait de péricarde de noisette. 12. Composition selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée 15 en ce que l'extrait de péricarde de noisette est obtenu par extraction solide/liquide dudit péricarde de noisette en milieu aqueux, hydroalcoolique ou alcoolique. 13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'extraction solide/liquide est réalisée dans un mélange eau/alcool dans une proportion variant de 10% à 90% en volume. 20 14. Composition selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que l'extrait de péricarde de noisette est obtenu par une extraction solide/liquide dans un milieu solvant comportant au moins un solvant pris dans le groupe formé par les cétones, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et le CO2 supercritique. 25 Version n°-09/06/15