Brevet FR3046796A1 — publié le 20170721

PROCEDE DE CLASSIFICATION DE MICROORGANISMES Domaine technique La présente invention se rapporte à procédé de détermination de la capacité de production de biofilm par un microorganisme La présente invention se rapporte également à un procédé de classification de microorganisme en fonction de leur capacité de production de biofilm. La présente invention trouve une application notamment dans les domaines analytiques, de la recherche biologique, enzymologique, dans le domaine pharmaceutique, dans le domaine du diagnostic et/ou dans le domaine médical. La présente invention trouve également une application dans les domaines clinique, environnemental ou agro -alimentaire. Dans la description ci-dessous, les références (auteur, année) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique La formation d'un biofilm est une propriété clé de bactéries, elle permet la survie à long terme à la fois dans les écosystèmes naturels et des animaux hôtes (Hoiby, 2010b). En fait, les bactéries qui se développent dans une matrice biofilm sont intrinsèquement plus résistantes aux agents de l'environnement ainsi qu'aux antimicrobiens par rapport aux cellules planctoniques en croissance. Les biofilms bactériens représentent un sérieux problème dans l'industrie et la médecine, y compris la chirurgie et la médecine dentaire, où ils causent souvent des infections chroniques et récurrentes (Lindsay, 2006). Les bactéries à Gram positif et à Gram négatif sont toutes les deux capables de former un biofilm (Donlan, 2001). Il a été estimé que jusqu'à 80% des maladies infectieuses humaines qui ont un impact significatif sur la morbidité et de la santé coûts pour les patients (Romling, 2012; NIH Parent Grant Announcement, 2002) 3046796 2 sont liés à des biofilms. La formation de biofilms sur les dispositifs médicaux implantables provoque des infections persistantes, qui représentent plus de 60% des infections nosocomiales rapportées (Darouiche, 2004). Dans ce cadre, les infections liées aux cathéters 5 représentent l'événement indésirable le plus grave et coûteux causés par un biofilm produit par des bactéries, aboutissant fréquemment à l'échec du traitement et exigeant le retrait du dispositif médical (Costerton et al, 2003). Des exemples typiques de maladies associées au biofilm comprennent les infections «difficiles» telles que les infections osseuses et articulaires, 10 causées par Staphylococcus aureus qui est une bactérie fortement productrice de biofilm (Kurtz, et al., 2012, Jacqueline, 2014, Gbejuade, 2015), les endocardites infectieuses causées principalement par des staphylocoques ou les streptocoques, qui sont associés à des taux de mortalité élevés (Furuya, 2003) et les infections affectant les patients 15 atteints de mucoviscidose, où P. aeruginosa provoque des infections pulmonaires chroniques et une défaillance respiratoire (Singh, 2000; Hoiby, 2010a). Le traitement antibiotique, soit empirique ou sur la base de tests de sensibilité aux médicaments, est souvent incapable de contrôler des 20 infections difficiles liées au biofilm comme dans le cas d'infection sur dispositifs médicaux (Hoiby, 2010a). En effet, les profils de résistance aux antibiotiques traditionnels sont réalisés sur des micro-organismes à croissance planctonique. Ainsi, la sensibilité aux antibiotiques in vitro ne prend pas en compte la production de biofilm et pourrait ne pas être 25 représentative de la résistance aux médicaments des bactéries in vivo (Costerton et al., 1999). Par conséquent, de nouveaux tests de laboratoire capables d'évaluer la production de biofilm et la sensibilité de la formation du biofilm aux antibiotiques des microorganismes sont nécessaires et souhaitables en plus à des tests de microbiologie de routine afin de cibler 30 efficacement les agents infectieux difficiles. 3046 796 3 Il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau procédé permettant d'évaluer la production de biofilm par un microorganisme ainsi que sa sensibilité éventuelle dans la formation du biofilm ou du biofilm formé aux antibiotiques. 5 En outre, il existe un réel besoin de trouver un procédé facile à mettre en oeuvre et permettant de caractériser rapidement la capacité productrice de biofilm du microorganisme. Une technique de diagnostic idéale doit être capable de fournir une identification rapide du micro-organisme (s), pour aider à orienter une 10 thérapie antimicrobienne appropriée. Une variété de méthodes quantitatives, directes ou indirectes, ont été développées pour évaluer la capacité des souches bactériennes à adhérer aux surfaces (Peeters, 2008), basées soit sur la colorimétrie (Stepanovic, 2000; Joseph, 2004) ou sur des techniques microscopiques (Sangetha, 15 2009;. Benoit, 2010; Müsken, 2010). À l'heure actuelle, la coloration au cristal violet (CV) est la méthode la plus largement utilisée pour la quantification in vitro de biofilm, en raison de sa relative simplicité et sa sensibilité (Christensen, 1985; Stepanovic, 2000). Cette méthode présente cependant des limitations importantes. En fait, il faut habituellement au 20 moins 24/48 heures d'incubation et des mesures répétées de traitement, qui conduisent à des résultats avec un grand écart-type, et rendent la méthode ni facilement réalisable pour la normalisation, ni adaptable à du criblage à grande échelle dans le cadre clinique. En outre, cette méthode donne des résultats de CMI pour éradiquer un biofilm après 24/48 heures 25 impliquant de très fortes concentrations d'antibiotiques sans pertinence clinique. En d'autres termes les concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont tellement importantes qu'elles ne peuvent être utilisées en clinique. Récemment, une nouvelle technologie, à savoir le Biofilm Ring Test® (BFRT), a été proposée pour l'évaluation de biofilm bactérien. Le principe 30 est basé sur l'immobilisation de billes magnétiques par la matrice de film biologique en croissance in vitro (Chavant, 2007). Ce procédé ne nécessite 3046796 4 pas de manipulation extensive (par exemple ne nécessite pas d'étapes de lavage ni de coloration), ce qui assure ainsi une reproductibilité des résultats et réduit l'écart-type, un critère positif pour la normalisation des procédures. Ainsi, le BFRT représente un outil prometteur pour la détection 5 d'un biofilm dans le cadre clinique. Toutefois, ce procédé permet uniquement de déterminer la présence ou non d'un biofilm. En outre, ce procédé ne permet pas, notamment dans une seule détermination, de fournir des informations directes sur la "dynamique" et la "force" d'un micro-organisme à produire du biofilm, en particulier par rapport à une 10 norme de référence d'isolats microbiens. En effet, la procédure initiale peut nécessiter des mesures répétées, effectuées à différents temps, afin d'estimer la formation du biofilm microbien, constituant une autre limitation importante pour une utilisation de routine dans des tests de laboratoire. 15 Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen/procédé permettant de déterminer la dynamique / capacité de production de biofilm d'un microorganisme. Il existe également des procédés, notamment pour application en diagnostic permettant de déterminer la capacité d'antibiotique à inhiber la 20 formation de biofilm. Il s'agit notamment du procédé antibiofilmogram (marque déposée) dans un format où par exemple 11 antibiotiques, à 8 doses différentes sont prêts à l'emploi dans des microplaques (Olivares, 2015). Toutefois, ce procédé connu et couramment utilisé en diagnostique ne permet pas de caractériser ni de déterminer les capacités productrices 25 de biofilm de microorganismes. Il existe donc un réel besoin de trouver un procéder palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant notamment de déterminer la production de biofilm et de déterminer les capacités de production de biofilm d'un microorganisme 30 permettant par exemple d'adapter les procédés de traitement en fonction des caractéristiques du microorganisme. 3046796 5 En outre, il existe un réel besoin de trouver un procédé simple, peu couteux et applicable en clinique permettant d'évaluer, notamment la capacité éventuelle de production de biofilms par un microorganisme. Il existe également un réel besoin de trouver un moyen/procédé 5 permettant de déterminer dans un temps court la capacité de production de biofilm par un microorganisme. Description de l'invention La présente invention permet de résoudre ces problèmes et 10 inconvénients de l'état de la technique en fournissant un procédé de détermination de la capacité de production de biofilm par un microorganisme comprenant les étapes suivantes: a) Introduire dans des contenants de culture comprenant un milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme 15 au moins deux particules, lesdites particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, b) Introduire et ensemencer indépendamment le milieu de culture des contenants obtenus à l'étape a) avec ledit microorganisme à une concentration comprise préférentiellement de 1x10-1 à 1x10-6 2 0 McFarland (McF), chaque milieu comprenant indépendamment une concentration différente de microorganismes, c) maintenir les milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme, d) appliquer un champ capable de mettre en mouvement 25 lesdites au moins deux particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, afin qu'elles s'agrègent préférentiellement sous forme d'un spot e) détermination de la capacité de production de biofilm par le microorganisme par observation et/ou mesure de l'agrégation desdites 30 particules comme suit : 3046796 6 - l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à une concentration comprise de 1x10-6 à 1x10-4 McF correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm, - l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir 5 d'une concentration supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, - l'absence d'agrégation apparaissant à partir d'une concentration supérieure ou égale à 1x10-2 McF correspondant à un 10 microorganisme faible producteur de biofilm, - une agrégation desdites particules quelle que soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que le procédé 15 selon l'invention permet avantageusement et dans un temps très court, par exemple inférieur à 6 heures, de déterminer la capacité de production de biofilm d'un microorganisme et/ou de classifier les microorganismes en fonction de leur capacité de production de biofilm. En particulier, les inventeurs ont démontré, conformément aux 20 connaissances générales, qu'il y a au moins quatre catégories de microorganismes, à savoir notamment des microorganismes ne produisant pas de biofilm, des microorganismes produisant peu de biofilm (faibles producteurs), des microorganismes moyen producteur de biofilm (producteurs intermédiaires), et des microorganismes fort producteurs de 25 biofilm. Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que le procédé selon l'invention repose sur la mesure de la formation de biofilm à un stade précoce. En particulier, ils ont démontré que, dans une période de temps donnée, par exemple 5 heures, plus les concentrations initiales 3 0 de microorganismes, par exemple de cellules bactériennes, qui peuvent inhiber le mouvement/agrégation des particules sont faibles, plus forte est 3046796 7 leur capacité à produire un biofilm. Inversement, si des concentrations élevées de microorganismes, par exemple de bactéries, ne sont pas en mesure d'empêcher le mouvement/agrégation des microparticules, ils sont considérés comme à faible risque/non producteurs de biofilm. En outre, les 5 inventeurs ont évalué et démontré la caractérisation/capacité de formation de biofilm de deux isolats cliniques à Gram positif et à Gram négatif et l'ont comparée à celle des souches de laboratoire avec des phénotypes de biofilms connus ainsi que pour les témoins négatifs, utilisé comme référence interne, pour assurer l'exactitude et la reproductibilité des 10 résultats. La reproductibilité inter-essai a été déterminée par comparaison avec le test de coloration au Cristal Violet (CV).Les inventeurs ont démontré que les résultats obtenus concernant la caractérisation des microorganismes sont cohérents avec ceux obtenus par les techniques usuelles telle que la coloration Cristal Violet dans un temps bien plus court, 15 par exemple 5 à 10 fois plus court. En outre, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que le procédé de l'invention permet d'obtenir un résultat fiable et reproductible avec une spécificité similaire voir supérieure à celle des procédés usuels. De plus le procédé selon l'invention permet avantageusement de 20 s'affranchir de résultats non spécifiques liés notamment à la production de mucus par les microorganismes contrairement aux procédés usuels, notamment basés sur une révélation avec des colorants tels que le Cristal Violet, qui est connu pour colorer le mucus et les bactéries, surestimant ainsi la présence de biofilm et/ou à l'origine de résultats faux positifs. En 25 particulier, les procédés basés sur une révélation avec des colorants tels que le Cristal Violet ne quantifient donc pas précisément la biomasse bactérienne. La présente invention a également pour objet un procédé de classification de microorganismes comprenant les étapes suivantes: 30 a) Introduire dans des contenants de culture comprenant un milieu de culture liquide approprié au développement dudit 3046796 8 microorganisme au moins deux particules, lesdites particules reposant sur une surface immergées dans le milieu de culture, b) Introduire et ensemencer indépendamment le milieu de culture des contenants obtenus à l'étape a) avec ledit microorganisme à 5 une concentration comprise de 1x10-1 à 1x10-6 McF, chaque milieu comprenant indépendamment une concentration différente de microorganismes, c) maintenir les milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme, 10 d) appliquer un champ capable de mettre en mouvement lesdites au moins deux particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, afin qu'elles s'agrègent préférentiellement sous forme d'un spot e) classification du microorganisme par observation et/ou mesure de 15 l'agrégation desdites particules comme suit: - catégorie I : absence d'agrégation des particules apparaissant à une concentration comprise de 1x10-6 à 1x10-4 McF, correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm - catégorie II : absence d'agrégation des particules 20 apparaissant à partir d'une concentration supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, - catégorie III : absence d'agrégation apparaissant à partir d'une concentration supérieure ou égale à 1x10-2 McF 25 correspondant à un microorganisme faible producteur de biofilm, - catégorie IV : agrégation des particules quelle que soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm. 30 3046796 9 Dans la présente, par unité McFarland (McF) on entend l'unité internationale connue de l'homme du métier, par exemple tel que décrit notamment dans le document « National Commitee for Clinical Laboratory Standards », 2001 et 2003. 5 Dans la présente, une unité McFarland correspond à environ 3.108 bactéries/ml, une dilution de 1x10-8 McF correspond donc à environ 3.102 bactéries/ml. Par exemple quantitativement de l'ordre de 60 bactéries pour 2000, par exemple utilisés pour ensemencer des puits de microplaques dans le procédé décrit. 10 Selon l'invention, par « fort producteur de biofilm » on entend un microorganisme capable de synthétiser une quantité de biofilm suffisante pour empêcher l'agrégation des particules lors de l'application du champ, après maintien du milieu de culture pendant un temps donné. Il peut s'agir par exemple d'un microorganisme capable de synthétiser une quantité de 15 biofilm suffisante pour empêcher l'agrégation des particules, à partir d'un inoculum de l'ordre de 60 à 6000 bactéries, considéré comme très faible par l'homme du métier. Selon l'invention, par «producteur intermédiaire de biofilm » on entend un microorganisme capable de synthétiser une quantité de biofilm 20 suffisante pour empêcher l'agrégation des particules lors de l'application du champ, après maintien du milieu de culture, pendant un temps donné après maintien du milieu de culture, à partir d'un inoculum de l'ordre de 6000 (6.108) à 6.105 bactéries, considéré standard par l'homme du métier. Selon l'invention, par « faible producteur de biofilm » on entend un 25 microorganisme capable de synthétiser une quantité de biofilm suffisante pour empêcher l'agrégation des particules après maintien du milieu de culture, pendant un temps donné, à partir d'un inoculum supérieur à 6x107 bactéries, considéré fort par l'homme du métier. 30 En d'autres termes, un microorganisme « fort producteur de biofilm » est un microorganisme qui après culture à partir d'une faible concentration 3046796 10 de microorganismes, par exemple comprise de 1x10-6 à 1x10-4 McF, empêche/entrave le mouvement des particules lors de la mise en oeuvre du procédé empêchant leur regroupement/agrégation, notamment sous la forme d'un spot. 5 En d'autres termes, un microorganisme « producteur intermédiaire de biofilm » est un microorganisme qui après culture à partir d'une concentration intermédiaire de microorganismes, par exemple comprise supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF, empêche/entrave le mouvement des particules lors de la mise en oeuvre du procédé 10 empêchant leur regroupement/agrégation, notamment sous la forme d'un spot. En d'autres termes, un microorganisme « faible producteur de biofilm » est un microorganisme qui après culture à partir d'une forte concentration de microorganismes, par exemple à partir d'une 15 concentration supérieure ou égale à 1x10-2 McF, empêche/entrave le mouvement des particules lors de la mise en oeuvre du procédé empêchant leur regroupement/agrégation, notamment sous la forme d'un spot. En d'autres termes, un microorganisme « non producteur de biofilm » 20 est un microorganisme qui après culture quelque soit la concentration de microorganismes n'a aucun effet sur le mouvement des particules lors de la mise en oeuvre du procédé et permet une agrégation des particules. Selon l'invention le maintien des milieux de culture ensemencés peut être réalisé pendant 1 à 24 heures, de préférence 1 à 8 heures, de 25 préférence 4 à 6 heures. L'homme du métier de part ces connaissances générales saura adapter le temps de maintien en fonction du microorganisme. Avantageusement, le maintien des milieux de culture ensemencés peut être réalisé de 4 à 6 heures. 30 Avantageusement, le maintien des milieux de culture pendant 4 à 6 heures permet lors de la mise en oeuvre du procédé de l'invention de 3046796 11 conclure quant à la capacité de production du microorganisme et/ou de sa classification selon l'invention. Avantageusement, les inventeurs ont démontré que le maintien des milieux de culture à l'étape c) pendant 4 à 6 heures permet 5 avantageusement lorsque le microorganisme a été ensemencé à une concentration comprise de de 1x10-1 à 1x10-6 McF de conclure quant à la capacité de production du microorganisme et/ou de sa classification selon l'invention. Selon l'invention, le maintien des milieux de culture ensemencés peut 10 être réalisé pendant 5 à 12 temps de génération du microorganisme, de préférence de 6 à 10 temps de génération du microorganisme. L'homme du métier, de par ces connaissances générales, connait le temps de génération, c'est-à-dire le temps de doublement d'une population de microorganismes. Par exemple, il peut s'agir du temps mentionné dans 15 le document « Microbiochimie et alimentation », Alain Branger, Educagri Editions, 2012.Par exemple le temps de génération d'une bactérie peut être en moyenne de 30 minutes. Selon l'invention, le contenant de culture peut être tout contenant de 20 culture connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce adapté. Il peut s'agir par exemple d'un puit d'une plaque 96 puits et/ou de tout réacteur de culture connu de l'homme du métier. Préférentiellement, le contenant de culture peut être constitué par un matériau favorable à l'adhésion des microorganismes, par exemple en polystyrène (Thermo 25 Scientific Technical Bulletin B06a Principles in adsorption to polystyrene, 2010), peut être modifié afin de favoriser son adhésion, par exemple par irradiation du contenant de culture, par exemple par irradiation d'un contenant en polystyrène (Biofiles, issue3.8, 21-24). Le contenant de culture peut être avantageusement un contenant 30 plan et/ou à fond plat. Avantageusement lorsque le contenant de culture 3046796 12 est plan et/ou à fond plat, l'agrégation des particules est réalisée sur le plan et/ou le fond plat. Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être réalisé dans une pluralité de contenants de culture. Par exemple, le procédé de l'invention 5 peut être réalisé dans au moins 6 contenants de culture, par exemple des puits de microplaques 96 puits, ou d'un autre format. Il peut s'agir par exemple de contenant de culture en polystyrène en polypropylène, en polycarbonate ou en verre. L'homme du métier de par ses connaissances générales saura 10 adapter/choisir le contenant en fonction du microorganisme. Selon l'invention, lorsque le procédé comprend 6 contenants de culture, il peut comprendre indépendamment dans chaque contenant un milieu de culture identique comprenant différente concentration de microorganismes. Par exemple, lesdits contenant peuvent comprendre 15 respectivement une concentration de microorganisme de 1x10-6 McF, 1x10- 5 McF, 1x10-4 McF, 1x10-3 McF, 1x10-2 McF et 1x10-1 McF. Un contenant additionnel peut également être ajouté, contenant tous les constituants du milieu, à l'exception du microorganisme, représentant ainsi un contrôle d'agrégation des particules, ou référence. 20 Selon l'invention par milieu de culture liquide on entend tout milieu de culture liquide connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce dans lequel au moins un microorganisme est susceptible de se développer. Il peut s'agir par exemple d'un milieu naturel ou synthétique. Il 25 peut s'agir par exemple de BHI (Brain Heart Infusion ; Bouillon Coeur Cerveau), de milieu Mueller-Hinton, de bouillon glucosé. L'homme du métier de part ces connaissances générales saura choisir le milieu de culture adapté en fonction du microorganisme. Selon l'invention le microorganisme peut être tout microorganisme 30 connu de l'homme du métier. Il peut s'agir d'une cellule procaryote, par exemple d'une bactérie ou d'une cellule eucaryote, par exemple un 3046796 13 champignon, une levure. Il peut s'agir par exemple de Candida, Cryptococcus, Malassezia, Pityrosporum, Pneumocystis, Epidermo-phyton, Microsporum, Trichophyton. Il peut s'agir également de protozoaires, par exemple Entamoeba histolytica, Acanthamoeba castellanii, Naegleria 5 fowleri. Parmi les cellules procaryotes, il peut s'agir par exemple de toute bactérie connu de l'homme du métier, par exemple les bactéries comprises dans le groupe, sans être limité à celui-ci, constitué de Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium 10 tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella 15 pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, 20 Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium welchii, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Coxiella burnetii Ehrlichia chaffeensis, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, 25 Enterococcus maloratus, Escherichia coli, Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus vaginalis, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis-klebsiella oxytoca, Lactobacillus 3 0 acidophilus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, 3046796 14 Micrococcus luteus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis , Mycoplasma 5 fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides Pasteurella multocida, Pasteurella tularensis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophilia, Rhizobium radiobacter, Rickettsia prowazekii, Rickettsia mooseri, 10 Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia trachomae, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, 15 Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus 20 rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica,Yersinia pestis et Yersinia pseudotuberculosis, etc. Selon l'invention dans le cas d'utilisation de bactéries anaérobies, les 25 conditions de culture anaérobie du microorganisme pourront être obtenues par obturation de l'extrémité ouverte du réacteur de culture par exemple à l'aide de parafilm, d'un bouchon etc. ou en mettant ledit réacteur dans des conditions permettant le développement des bactéries anaérobies. Il peut s'agir par exemple de jarres d'anaérobiose, sachets générant une 30 atmosphère appauvrie en oxygène et enrichie en dioxyde de carbone, 3046796 15 enceintes anaérobies avec atmosphère contrôlée et/ou tout moyen connu de l'homme du métier adapté. Selon l'invention, lesdites, au moins deux, particules, peuvent être choisies dans le groupe comprenant une particule chargée électriquement, 5 une particule magnétique, une particule revêtue d'au moins une couche magnétique, une particule magnétisable, une particule revêtue d'une couche magnétisable, ou un mélange de deux ou plusieurs de ces particules. En fait, il peut s'agir de toute particule permettant de mettre en oeuvre la présente invention. 10 Selon l'invention, les particules peuvent reposer sur une surface immergée dans le milieu de culture. Lesdites particules sont en position stables, c'est-à-dire au repos, en l'absence du champ magnétique, ou électrique, ou électromagnétique. Avantageusement, lesdites particules peuvent être des particules de toute forme adaptée à la mise en oeuvre de 15 la présente invention, par exemple sous forme de bille, de palet, de forme géométrique asymétrique, par exemple avec une face plane, etc. Toute taille appropriée de particule magnétique ou magnétisable peut être utilisée. La taille peut être choisie par exemple en fonction de la taille du microorganisme, et/ou de la taille du compartiment contenant le milieu 20 de culture pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention et/ou du microorganisme. La taille peut être par exemple de taille sensiblement identique à la taille du microorganisme générant le biofilm de manière à ce que les, au moins deux, particules puissent être incorporées dans un biofilm, par exemple formé par ledit microorganisme, l'objectif étant 25 d'utiliser les particules magnétiques ou magnétisables comme un équivalent inerte du microorganisme. Quand ces particules sont mobiles, les microorganismes de même taille peuvent aussi se mouvoir. Quand ces particules sont immobilisées, les microorganismes de même taille ne peuvent pas non plus se déplacer. D'autre part, des particules de tailles 30 variées peuvent permettre une analyse plus fine de la structure du biofilm : dimension des espaces au sein de la structure, organisation 3046796 16 tridimensionnelle, stabilité de l'adhérence à la surface, par exemple au fond du tube ou de la cupule de la plaque de microdilution, dans laquelle le test est réalisé. En effet, les biofilms tendent à se détacher par lambeaux (squames) de leur support en vieillissant. Dans ce cas, on observe alors 5 une première phase d'immobilisation des, au moins deux, particules lors du développement du biofilm. Puis une phase de dégénérescence du biofilm avec libération des, au moins deux, particules. Par exemple les particules magnétiques ou magnétisables peuvent présenter une taille de, par exemple de 10nm à 100pm, par exemple de 10 0,1 à 10um (taille des microorganismes les plus courants). Lorsque les particules sont incorporées dans un biofilm, notamment dans la matrice complexe générée par la croissance des microorganismes, composée de corps cellulaires, des systèmes d'adhésion desdits microorganismes, par exemple des filaments, pili, fimbriae, etc., de 15 substances plus ou moins visqueuses, par exemple des polysaccharides, alginates, etc. sécrétées par lesdits microorganismes, l'application du champ magnétique, ou électrique, ou électromagnétique ne permet pas de provoquer de mouvement desdites particules incorporées dans ledit biofilm. 20 Lorsque les particules ne sont pas incorporées dans ledit biofilm, par exemple lorsque la mobilité des particules n'est pas entravée par la présence de corps de microorganismes dont la taille est voisine de celles des particules, par exemple de l'ordre un à plusieurs micromètres, par exemple lorsque la mobilité des particules n'est pas entravée par la 25 présence des systèmes d'adhésion desdits microorganismes, par exemple les filaments, pili, fimbriae, etc. générant un enchevêtrement bloquant la progression des particules, par exemple lorsque la mobilité des particules n'est pas entravée par la présence de substances plus ou moins visqueuses sécrétées par lesdits microorganismes, par exemple des 30 polysaccharides, alginates, etc., par exemple lorsque la mobilité des particules n'est pas entravée par des molécules liées au développement 3046 796 17 du biofilm de microorganismes, l'application du champ magnétique, ou électrique, ou électromagnétique provoque le mouvement desdites particules. Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre 5 avec une pluralité de particules, par exemple de 2 à 10 000 000, de 1000 à 1 000 000, de de 10 000 à 1 000 000, de 100 000 à 1 000 000, de 10 000 à 100 000. La pluralité de particules permet avantageusement de détecter directement, sans dispositif complexe de visualisation et sans colorant, l'interaction entre lesdites substances au contraire des procédés de l'art 10 antérieur utilisant une seule particule et nécessitant pour la détection de l'interaction des dispositifs complexes de visualisation ou des colorants. Selon l'invention, les particules peuvent être éclairées, par exemple au moyen d'une source lumineuse. L'éclairage permet avantageusement d'augmenter le contraste entre les particules et la solution. 15 Selon l'invention, l'observation de peut être réalisée par tout moyen connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un dispositif optique, par exemple un microscope, un appareil photo, d'un scanner de document, par exemple un scanner EPSON Perfection V600 Photo, une observation visuelle. 20 Selon l'invention, l'observation peut permettre de mesurer, par exemple l'intensité, le contraste, la variance, d'image, par exemple via tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple un logiciel d'imagerie, par exemple ImageJ permettant, par exemple de mesurer, par exemple des différences de contrastes, d'intensités, correspondant par exemple aux 25 particules, dans des zones d'une image à une autre et ainsi de déterminer les différences d'une observation à une autre. Il peut s'agir, par exemple de comparer les images obtenues avant et après application de l'action mécanique, hydrodynamique ou physique, par exemple en faisant une soustraction entre des images, par exemple en mesurant le coefficient de 3 0 corrélation entre les images. 3046796 18 Selon l'invention, l'utilisation de particules émettrices d'un signal, par exemple des particules colorées, excitables, fluorescentes, phosphorescentes, luminescentes, radioactives peut permettre, par exemple une observation automatisée 5 Selon l'invention, les conditions de réalisation du procédé de l'invention, en particulier de culture du microorganisme, sont des conditions de cultures standardisées, par exemple le pH, la température, l'oxygénation, etc. 10 Selon l'invention le maintien des milieux de culture ensemencés peut être réalisé à une température comprise de 10 à 45 °C, de préférence de 25°C à 42°C, par exemple égale à 37°C Selon l'invention le maintien des milieux de culture ensemencés peut être réalisé sous une atmosphère naturelle, dans un incubateur classique 15 par exemple, ou sous atmosphère contrôlée pour les microorganismes microanaérophiles ou anaérobies stricts, selon tout moyen connu de l'homme du métier Selon l'invention, le champ peut être un champ magnétique, ou 2 0 électrique ou électromagnétique. Selon l'invention l'application du champ magnétique peut être réalisé par tout moyen connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce et/ou adapté. Selon l'invention, le champ magnétique, ou électrique ou 25 électromagnétique peut être tout champ permettant de mettre en mouvement lesdites, au moins deux particules sur ladite surface immergée dans ladite solution, par exemple un champ électromagnétique ou un champ magnétique. Le champ magnétique, ou électrique ou électromagnétique peut être généré, par exemple par un aimant ou par un 3 0 solénoïde. L'aimant peut être par exemple sous forme de barreau, de pointe, de pièce, etc. ou toute forme appropriée pour la mise en oeuvre de 3046796 19 la présente invention. Le champ peut, par exemple être appliqué par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par impulsion, par augmentation progressive du champ électromagnétique, par variations de champ électromagnétique ou par une combinaison ces applications. 5 Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape e') préalable/postérieure ou remplaçant l'étape e) de détermination de la valeur de l'Index Biofilm (BFI) pour chacun des milieux ensemencés et calcul de l'indice de formation potentielle du biofilm par contenant (BPc) 10 selon la formule (I) suivante : BPc= [1-(BFle / BFIn)] (I) dans laquelle BFIe correspond à la valeur de l'index biofilm dans le milieu ensemencé et BFIn correspond à la valeur de l'index biofilm dans un contenant ne comprenant pas de microorganismes. 15 Selon l'invention, la valeur de BFIn correspond au contrôle négatif. Dans ce mode de réalisation, la formation de biofilm peut être identifiée lorsque la valeur de BPc est supérieure à une valeur Seuil (S). Selon l'invention, la valeur seuil (S) peut être calculée selon la formule (II) suivante 20 S= 1 - [(mBFln -3 X stmBFln)/2] / mBFln (II) dans laquelle mBFln est égale à la moyenne des BFI des contrôles négatifs, stmBFln est également à la déviation standard de la moyenne des BFI des contrôles négatifs calculée. Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape e") 25 postérieure ou simultanée à l'étape e') de détermination de la valeur seuil (S) selon la formule (II) suivante : S= 1 - [(mBFln -3 X stmBFln)/2] / mBFln (II) dans laquelle mBFln est égale à la moyenne des BFI des contrôles négatifs, stmBFln est également à la déviation standard de la moyenne 30 des BFI des contrôles négatifs calculée. 3046796 20 L'homme du métier de part ces connaissances générales saura calculer la moyenne des BFI des contrôles négatifs ainsi que la déviation standard de la moyenne. Dans la présente, le procédé de l'invention peut comprendre pour 5 chaque mesure au moins trois contrôles négatifs à partir desquels la valeur mBFln et la valeur stmBFln sont calculées. Par exemple, pour chaque calcul de BPc, le procédé peut comprendre au moins trois valeurs de BFIn à partir desquels la moyenne des BFI des contrôles négatifs (mBFln) ainsi que la déviation standard de la moyenne (stmBFln) peuvent être calculées. 10 L'homme du métier de par ses connaissances générales saura adapter le nombre de contrôle négatif pour le calcul de la moyenne des BFI des contrôles négatifs (mBFln) ainsi que la déviation standard de la moyenne (stmBFln) peuvent être calculées. Selon l'invention, lorsque plusieurs contrôles négatifs sont utilisés 15 pour calculer la valeur de mBFln dans la formule (II), la valeur de BFIn dans la formule (I) peut être égale à la valeur de mBFln. Selon l'invention, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la capacité de production de biofilm peut être déterminée 20 comme suit : - une valeur de BPc supérieure ou égale à la valeur seuil S à partir d'une concentration de microorganismes comprise de 1x10-6 à 1x10-4 McF correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm, 25 - une valeur de BPc supérieure ou égale à la valeur seuil S à partir d'une concentration de microorganismes supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, - une valeur de BPc supérieure ou égale à la valeur seuil S à 30 partir d'une concentration de microorganismes de 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme faible producteur de 3046796 21 biofilm, - une valeur de BPc inférieure à la valeur seuil S quelle que soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm. 5 Dans la présente l'Index Biofilm (BFI) est obtenu par analyse des composantes de couleurs rouge vert bleu des pixels de l'image afin de déterminer la densité de particules par pixel, puis par calcul de la corrélation entre les particules pour déterminer la densité d'agrégation des 10 particules exprimée par une valeur BFI. L'index BFI est décrit notamment dans le document Chavant et al. 2007 [5]. Brève description des figures : La Figure 1 est une photographie de plaque 96 puits. Elle représente 15 la formation de biofilm sur des plaques polystyrène 96 puits par des bactéries à Gram négatif: A) P. aeruginosa (Pa), B) K. pneumonie (Kp) et C) R. mannitolilytica isolée de l'hôpital IFO. Les images ont été obtenues après aimantation des plaques sur le block test et la numérisation avec le lecteur de plaque. Les souches de laboratoire de référence sont indiquées 20 en gras. L'absence de formation de biofilm est révélée par la présence du point noir central dans les puits correspondant au regroupement des particules. La présence de biofilm est révélée par l'absence de point noir au centre des puits. Les puits correspondant aux contrôles négatifs (Ctr (-)) contenant seulement du milieu BHI et les microparticules magnétiques 25 correspondent à la ligne inférieure de puits. La Figure 2 est une photographie de plaque 96 puits. Elle représente la formation de biofilm de formation de biofilm sur des plaques polystyrène 96 puits pour les bactéries à Gram positif: A) S. aureus (SA), B) S. epidermidis (SE) et C) différentes bactéries à Gram positif isolées à 30 l'hôpital IFO. Les images ont été obtenues après aimantation des plaques sur le Block test et la numérisation avec un lecteur de plaque. Les souches 3046796 22 de laboratoire de référence sont indiquées en gras. L'absence de formation de biofilm est révélée par la présence du point noir central dans les puits correspondant au regroupement des particules. La présence de biofilm est révélée par l'absence de point noir au centre des puits. Les puits 5 correspondant aux contrôles négatifs (Ctr (-)) contenant seulement du milieu BHI et les microparticules magnétiques sont entourés en rouge. La Figure 3 est un diagramme en bâton représentant le pourcentage d'isolats cliniques de chaque espèce classés en fonction de leur capacité de la production de biofilm mesurée par le procédé à savoir fort producteur 10 (zone gris foncé), producteur intermédiaire (zone blanche), faible producteur (zone gris claire) et non producteur/non adhérent (zone en noir). La Figure 4 est un diagramme en bâton représentant les résultats de l'analyse quantitative de la formation de biofilm par coloration au Cristal 15 Violet (CV) d'isolats cliniques de P. aeruginosa, K. pneumoniae, R. mannitolilytica, S. aureus, S epidermidis et d'autres bactéries à Gram positif. Les isolats ont été classés selon leurs valeurs seuil lors de la mesure de la densité optique (DO) à une longueur de 570nm (D0570) du milieu. Lorsque la valeur de la D0570 était 4 x ODc = fort producteur de biofilm. Tous les dosages ont été effectués en triplicats, avec des souches de 15 référence et des isolats cliniques testés à trois reprises pour évaluer des variations éventuelles dans les conditions de dosage du biofilm. Méthodes statistiques Le test de coefficient kappa a été utilisé pour déterminer la cohérence 20 entre les résultats obtenus avec le procédé de caractérisation et le Cristal Violet (CV). La cohérence a été calculée selon Vieia (Viera, 2005): kappa = 0,81 - 1, très bonne; kappa = de 0,61 à 0,80, bonne; kappa 0 0,41 à 0,60, modérée; kappa = 0,21 au 0,40, équitable; kappa 0,20, faible. Les résultats de la formation de biofilm obtenus avec les deux méthodes ont 25 été comparés en utilisant en outre le test de McNemar. Les valeurs de p REVENDICATIONS1. Procédé de détermination de la capacité de production de biofilm par un microorganisme comprenant les étapes suivantes: a) Introduire dans des contenants de culture comprenant un milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme au moins deux particules, lesdites particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, b) Introduire et ensemencer indépendamment le milieu de culture des contenants obtenus à l'étape a) avec ledit microorganisme à une concentration comprise de 1x10-1 à 1x10-6 McFarland (McF), chaque milieu comprenant indépendamment une concentration différente de microorganismes, c) maintenir les milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme, d) appliquer un champ capable de mettre en mouvement lesdites au moins deux particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, e) détermination de la capacité de production de biofilm par le microorganisme par observation et mesure de l'agrégation desdites particules comme suit : l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à une concentration comprise de 1x10-6 à 1x104 McF correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm, l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir d'une concentration supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir d'une supérieure ou égale à 1x102 McF correspondant à un microorganisme faible producteur de biofilm, une agrégation desdites particules quelle que soit la 3046796 56 concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le procédé 5 comprend une étape e') de détermination de la valeur de l'Index Biofilm (BFI) pour chacun des milieux par : analyse des composantes des couleurs rouge, vert bleu des pixels de l'image permettant de déterminer la densité de particules par pixel, 10 calcul de la corrélation entre les particules, calcul de la densité d'agrégation des particules exprimée en BFI, et détermination de l'indice de formation potentielle du biofilm par contenant (BPc) selon la formule (I) suivante : 15 BPc= [1-(BFle / BFIn)] (I) dans laquelle BFIe correspond à la valeur de l'index biofilm dans le milieu ensemencé et BFIn correspond à la valeur de l'index biofilm dans un contenant ne comprenant pas de microorganismes (contrôle négatif). 20 3. Procédé selon la revendication 2, comprenant une étape e") postérieure ou simultanée à l'étape e') de la détermination de la valeur seuil (S) selon la formule (II) suivante : S= 1 - [(mBFIn - 3 X stmBFln)/2] / mBFIn (II) dans laquelle mBFIn est égale à la moyenne des BFI des contrôles 25 négatifs, stmBFln est également à la déviation standard de la moyenne des BFI des contrôles négatifs calculée. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la capacité de production de biofilm par le microorganisme est déterminée par 30 comparaison de la valeur de BPc en fonction de la concentration de microorganismes comme suit : - une valeur de BPc supérieure ou égale à la valeur seuil S à 3046796 57 partir d'une concentration de microorganismes comprise de 1x10-6 à 1x1 McF correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm, une valeur de BPc supérieure ou égale à la valeur seuil S à 5 partir d'une concentration de microorganismes supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, une valeur de BPc supérieure ou égale à la valeur seuil S à partir d'une concentration de microorganismes de 1x102 McF 10 correspondant à un microorganisme faible producteur de biofilm, une valeur de BPc inférieure à la valeur seuil S quelque soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm. 15 5. Procédé de classification de microorganismes comprenant les étapes suivantes: a) Introduire dans des contenants de culture comprenant un milieu de culture liquide approprié au développement dudit 20 microorganisme au moins deux particules, lesdites particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, b) Introduire et ensemencer indépendamment le milieu de culture des contenants obtenus à l'étape a) avec ledit microorganisme à une concentration comprise de 1x10-1 à 1x10-6McF, chaque milieu 2 5 comprenant indépendamment une concentration différente de microorganismes, c) maintenir les milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme, d) appliquer un champ capable de mettre en mouvement lesdites au 30 moins deux particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture préférentiellement dans le but d'obtenir une agrégation, préférentiellement sous forme de spot, desdites au 3046796 58 moins deux particules, e) classer le microorganisme par observation de l'agrégation desdites particules comme suit : catégorie I : absence d'agrégation desdites particules 5 apparaissant à une concentration comprise de 1x10-6 à 1x10-4 McF correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm catégorie II : absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir d'une concentration supérieure à 1x10-4 10 et inférieure à 1x102 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, catégorie III : absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir d'une concentration supérieure ou égale à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme faible 15 producteur de biofilm, catégorie IV : agrégation desdites particules quelle que soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm. 20 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant six contenants de culture dans lesquels la concentration de microorganismes à l'étape b) est respectivement de 1x10- 6 McF, 1x10-5 McF, 1x10-4 McF, 1x10-3 McF, 1x10-2 McF et 1x10-1 McF. 25 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le maintien des milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme est réalisé pendant 1 à 8 heures, de préférence 4 à 6 heures. 30 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel le maintien des milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme est réalisé 3046796 59 pendant 5 à 12 temps de génération dudit microorganisme. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux particules sont des 5 particules chargées électriquement, magnétiques ou magnétisables ou recouvertes d'au moins une couche magnétique ou magnétisable. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont soumises 10 à un champ électromagnétique, éventuellement appliqué par impulsion. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont soumises à une augmentation progressive du champ. électromagnétique. 15 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit champ est magnétique et est généré par des moyens générateurs de champ en mouvement. 20 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont éclairées au moyen d'une source lumineuse pour détecter son mouvement. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont génératrices d'un signal. 15. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont excitables, fluorescentes ou 30 phosphorescentes ou radioactives ou chimioluminescentes. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3046796 60 précédentes, dans lequel l'un desdits compartiments ne comprend pas ledit microorganisme, ledit compartiment représentant un témoin du milieu.