Brevet FR3040178A1 — publié le 20170224

Méthode prédictive pour caractériser la sensibilité d'une tumeur en réponse à un traitement cassant l'ADN Domaine technique de l'invention L'invention concerne le domaine de la radiobiologie médicale, et plus particulièrement le domaine des méthodes de laboratoire radiobiologiques. L'invention concerne une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité cellulaire, tissulaire et clinique, qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques appliqués à la réponse tumorale. Plus particulièrement l'invention concerne une méthode prédictive pour caractériser la sensibilité d'une tumeur en réponse à un traitement radiothérapique, chimiothérapique ou radio-chimiothérapique cassant l'ADN. Etat de la technique Les traitements anti-cancéreux non-chirurgicaux visent en règle générale à provoquer la mort cellulaire des cellules cancéreuses : la plupart de ces traitements provoquent des cassures de l'ADN qui provoque ensuite l'apoptose de ces cellules. Cela est vrai notamment pour les traitements d'une tumeur par rayonnement ionisant (radiothérapie), pour les traitements par chimiothérapie, ainsi que pour les traitements qui combinent la chimiothérapie avec la radiothérapie (radio-chimiothérapie). Il existe cependant peu de méthodes pour prédire la réponse d'une tumeur à un tel traitement anti-tumoral, et leur fiabilité n'est pas suffisante pour orienter la stratégie d'un traitement anti-tumoral dans la pratique clinique (pour la radiothérapie voir : « Radiation Biology, A Handbook for Teachers and Students », IAEA, 2010, p. 107/108). On sait que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celles des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité. Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au 3040178 2 cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue). Cette 5 dernière affirmation est valable quelle que soit la nature du tissu, qu'il soit normal ou tumoral. On sait également que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » 10 a été conceptualisée par Fertil et Malaise (« lnherent cellular radiosensibility as a basic concept for human tumor radiotherapy », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 7, p.621629 (1981) ; « Intrincsic radiosensitivity of human cell fines is correlated with radioresponsiveness of human tumors : Analysis of 101 published survival curves », I nt.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 11, p.1699-1707 (1985)). Ainsi, les diverses études sur les 15 effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, on pense 20 que la radiosensibilité découle d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. De même, les tumeurs montrent un large spectre de radiosensibilité qui dépend à la fois de l'individu mais aussi de la nature du tissu. Par exemple, les lymphomes sont 25 généralement plus radiosensibles que les sarcomes, et ce généralement quel que soit le statut génétique de l'individu : pour les tumeurs, le « facteur individu » peut s'effacer derrière le facteur « tissu ». Afin d'évaluer le rapport bénéfice/risque d'un traitement anticancer, il serait donc désirable de disposer d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer la dose minimale cumulée qu'une tumeur doit recevoir pour être stérilisée. 30 Cette question de pose en premier lieu en radiothérapie dans un contexte de fortes doses ionisantes, mais concerne également les associations radio-chimiothérapique, et les chimiothérapies seules. Toutefois, cette question est également susceptible de se poser pour toute autre exposition à de fortes doses ionisantes, équivalentes à celles utilisées en radiothérapie. 35 Plusieurs critères cliniques sont utilisés par les praticiens pour quantifier la réponse tumorale à la suite d'un traitement anti-cancéreux. La plupart de ces critères sont relatifs à 3040178 3 la diminution du volume tumoral (ou contrôle local) après le traitement ou à la dose de radiations pour diminuer ce volume. Pourtant aucun de ces critères n'est consensuel : Les critères TCD50 et TCD95 (Tumour Control Dose) représentent les doses pour lesquelles on a respectivement 50% et 95% de contrôle tumoral. Utilisé fréquemment 5 dans les années 80 où les traitements standards permettaient une certaine uniformisation dans la délivrance de dose pour un type de tumeur donné, il n'est plus valable aujourd'hui pour les affections cancéreuses qui sont traitées de façon différente suivant les centres avec une grande variété dans l'étalement de la dose. Le critère TCP (Tumour Control Probability) permet de prédire théoriquement la 10 probabilité de contrôler une tumeur. Ce critère est basé sur des études radiobiologiques qui ont pris en compte la survie clonogénique des cellules tumorales irradiées in vitro. Mathématiquement, la TCP est basée sur le modèle Linéaire-Quadratique : TCP = exp-No exp (yT-aD-pD 2 ) où a et [3 sont les paramètres du modèle linéaire quadratique, y la constante de prolifération des cellules et T la durée du traitement en jours. 15 Le critère RECIST (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) est l'un des critères les plus utilisés actuellement pour décrire l'évolution de la tumeur solides après un traitement par radiothérapie. Il a été publié en février 2000 par une collaboration internationale et révisé en 2009 (Eisenhauer et al., « New response evaluation criteria in solid tumours : Revised RECIST guideline (version 1.1) », European J Cancer 45 (1009), p.228-247). Ce 20 critère est basé sur la diminution de la somme des plus grands diamètres des tumeurs : - Complete Response (CR) : disparition totale des tumeurs - Partial Response (PR) : au moins 30% de diminution de la somme des plus grands diamètres des tumeurs - Stable disease (SD) : pas de changement notable 25 - Progressive Disease (PD) : au moins 20% d'augmentation de la somme des plus grands diamètres des tumeurs. De plus, deux critères d'imagerie sont utilisés par les cliniciens, en particulier les critères relatifs à la variation de l'intensité du signal après le traitement par radiothérapie. Cette intensité est généralement mesurée par PetScan ou IRM de perfusion. Cette intensité 30 peut être corrélée à un nombre de cellules survivantes puisque seule la partie de la tumeur contenant des cellules vivantes va émettre un signal car cette partie sera toujours vascularisée. Par ailleurs, le critère de Choi permet de corréler le volume de la tumeur à l'intensité du signal (Choi et al 2007, «Correlation of Computed Tomography and Positron 3040178 4 Emission Tomography in Patients With Metastatic Gastrointestinal Stroma/ Tumor Treated at a Single Institution With imatinib Mesylate: Proposai of New Computed Tomography Response Critera » J Clin Oncol 25:1753-1759.). L'homme du métier connaît également des paramètres cellulaires permettant de décrire 5 les tumeurs. Un de ce paramètres est la survie cellulaire : En 1956, Puck et Marcus proposèrent d'utiliser le test in vitro des colonies pour quantifier la radiosensibilité : après ensemencement d'un nombre connu de cellules irradiées, la mesure du nombre de colonies (amas macroscopique de cellules survivantes prolifératives après 5-6 10 générations) formées par les cellules que l'irradiation n'avait pas stérilisées devint la méthode de référence pour évaluer la fraction survivante des cellules irradiées in vitro. Les courbes de survie sont établies en représentant dans un graphe semi-logarithmique la relation dose (abscisse) - survie (ordonnée logarithmique) par une série de tests à différentes doses, chacune délivrée en générale en une seule fraction. Ces courbes sont 15 décrites par le modèle Linéaire-Quadratique : SF (D) = exp(-aD - /3D2) où a et [3 sont des paramètres d'ajustements. Dans le cas d'un fractionnement de dose, la survie sera décrite par la formule suivante : SF (d, D) = exp(-aD - fidD ) Ou : d est la dose en Gy par fraction 20 La fraction survivante à 2 Gy (SF2) est souvent utilisée pour prédire la radiosensibilité d'une tumeur. Une relation linéaire a été trouvée entre la TCD95 et la SF2 par Fertil et Malaise en 1981 (voir la publication citée ci-dessus): TCD95 = 142.8 x SF2 + 8.57 Plusieurs groupes de recherche ont tenté de relier la SF2 aux différents critères cliniques de réponse tumorale précitée, mais cela n'a pas abouti à un modèle général et assez 25 simple pour développer des tests prédictifs. Un autre paramètre est le nombre de cellules survivantes : Le nombre de cellules survivantes après une irradiation est un paramètre quantifiable permettant de définir le contrôle tumoral et la réduction du volume. Il va être directement corrélé à la survie cellulaire et le nombre de cellules initiales dans la tumeur No: N = NoSF(d, D) 3040178 5 Au niveau moléculaire, l'état de la technique fait état d'analyses utilisant le marqueur H2AX pour prédire l'efficacité de la radiothérapie. Ainsi Mahrhofer et al. ("Radiation induced DNA damage and damage repair in human tumour and fibroblast cell fines assessed by histone HAX phosphotylation", Int J Oncol Biol Phys, 2006. 64(2): p. 573-80) 5 ont montré sur cinq lignées cancéreuses qu'il n'existait pas de corrélation entre le marqueur H2AX et une radiosensibilité de la tumeur déterminée par la survie clonogénique à 2 Gy (SF2). Cependant, leur étude ne prend pas en compte le nombre de foci de H2AX réel (normalisation des résultats) et elle se base uniquement sur la SF2. De la même façon, Koch et al. (« Residual yH2AX foci predict local tumour control alter 10 radiotherapy", Radiotherapy and Oncology, 2013, 108. p. 434-9) ont proposé un modèle basé sur la corrélation entre le nombre de foci de H2AX normalisés et la TCD50. Cependant cette étude a été menée sur des xénogreffes ce qui ne reflète pas la réalité physiologique de la tumeur. La demande de brevet EP 2 466 310 Al (Helmholtz Zentrum München) décrit la 15 réparation de ruptures de l'ADN de type double brin en présence de la forme phosphorylée de l'histone H2AX (appelée gamma-H2AX ou g-H2AX). Les demandes de brevet US 2008/234946 et US 2012/041908 (University of South Florida et al.) décrivent une méthode pour la prédiction de la radiosensibilité de cellules cancéreuses, et non pas de cellules saines ; elle est en plus basée sur des données 20 génomiques et non des tests fonctionnels. La demande de brevet W02014/154854 (Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier) décrit une méthode pour la prédiction de la radiosensibilité d'un sujet via l'utilisation d'au moins un biomarqueur de radiosensibilité. Cette méthode ne détecte pas des marqueurs directement reliés à l'endommagement ou à la réparation de l'ADN ; elle est en plus 25 basée sur des données protéomiques. De plus, cette demande de brevet ne décrit pas de relation quantitative entre les données radiobiologiques et la sévérité des réactions tissulaires. La demande de brevet WO 2013/187973 (University of California) décrit des systèmes et des méthodes de détermination de la radiosensibilité de cellules et/ou d'un sujet au 30 regard d'une population contrôle. Plus particulièrement cette méthode inclut l'irradiation d'un échantillon biologique, la détection et la quantification de foci radioinduits au sein de cellules erythrocytes, lymphocytes ou de cellules primaires, résultant d'un prélèvement sanguin via l'utilisation d'un ou plusieurs marqueurs de détection parmi un ensemble de marqueurs dont l'anti-pH2AX, l'anti-MRE1 1 et l'anti-ATM. La quantification des foci 35 radioinduits à différents temps d'observation post-irradiation inférieurs à 2 h permet de déterminer leur cinétique de réparation qui est corrélée de manière empirique à la 3040178 6 radiosensibilité du sujet. Toutefois, l'analyse des foci dans des cellules de type lymphocyte est très difficile du fait de leur petit noyau. De plus, cette méthode ne permet cependant pas au praticien de prendre des décisions quant au traitement du patient. La demande de brevet WO 2010/88650 (University of Texas) décrit des méthodes et 5 compositions pour identifier les cellules cancéreuses qui sont soit sensibles soit résistantes à un traitement de radiothérapie particulier ; elle n'est donc pas applicable à tout traitement radiothérapeutique. La demande de brevet WO 2010/109357 décrit un procédé et un appareil pour la planification de protocole de radiothérapie adaptative basée sur l'optimisation de la 10 probabilité de complication des tissus normaux et la probabilité de contrôle tumoral selon des marqueurs spécifiques à chaque patient. Les valeurs des marqueurs associées à des tissus normaux comprennent des valeurs de tests in vitro, les signatures par spectrométrie de masse des protéines, des données de l'anamnèse et les antécédents du patient. Les valeurs d'essai in vitro peuvent être d'origine cellulaire, protéomique et 15 génétique tel que, mais sans s'y limiter, divers comptages de cellules, HB, CRP, PSA, TNF-alpha, ferritine, transferrine, LDH, IL-6, l'hepcidine, créatinine, glucose, HbAlc, et la longueur des télomères. Les marqueurs de l'anamnèse et des antécédents du patient incluent la chirurgie abdominale antérieure, les médicaments hormonaux ou de anticoagulants, le diabète, l'âge, et les mesures liées à la croissance tumorale. Les 20 biomarqueurs non liés à la radiotoxicité sont également envisagés, tels que les biomarqueurs associés à diverses formes d'ablation ou agents chimiothérapeutiques. Toutefois, la radiosensibilité individuelle n'y est pas prise en compte. Malgré ce vaste état de la technique, la demanderesse constate que les brevets décrits 25 ci-dessus ne décrivent pas une méthode de quantification de la sensibilité tumorale à un traitement cassant l'ADN permettant d'évaluer quantitativement l'efficacité d'un traitement anti-cancer, qui puisse être employé pour tout patient et tout type de traitement susceptible d'induire des CDB, et notamment pour tout type de rayonnement ionisant, pour la chimiothérapie et pour la combinaison des deux. Le problème de fournir une 30 méthode prédictive de la sensibilité des tumeurs et de prévoir le contrôle tumoral quel que soit les paramètres cliniques utilisés reste donc sans solution opérationnelle. La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive de la sensibilité tumorale à un traitement cassant l'ADN. 35 3040178 7 Objet de l'invention Les inventeurs ont trouvé une corrélation entre la survie cellulaire à une dose D et un fractionnement de dose d et le nombre de foci de H2AX soit : xNH2Ax(d,24h)-Figdp) SF (d, D) = e 5 Où: NH2AX représente le nombre de foci de H2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation, e représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D est la dose en Gy, d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de fractions, 10 fl : paramètre en Gy-2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. Sur la base de ce constat, les inventeurs ont trouvé des corrélations entre des paramètres cliniques et certains paramètres moléculaires et/ou cellulaires Pour le paramètre TCD95 : 15 1) En fonction du nombre de cellules survivantes : Gy) 2 TCD95 = 142.8 x N( + 8.57 No 2) En fonction du nombre de foci yH2AX (NH2Ax (2Gy,24h) +40)\ TCD95 = 142.8 x e I" + 8.57 Pour le paramètre TCP : 1) En fonction du nombre de cellules survivantes après traitement avec une dose D : TCP(D) = e-N(D) 20 sachant que cette corrélation est déduite de la corrélation connue suivante (Zaider and Minerbo, « Tumour control probability: a formulation applicable to any temporal protocol of dose delivety », Phys Med Biol. 2000 Feb;45(2):279-93): TCP(D) = e-N 0SF (D) 3040178 8 2) En fonction du nombre de foci yH2AX (71 XNH2AX(C1,24h) TCP(D) = e-Noie ` e +I3dD) Les inventeurs ont constaté que ces paramètres de la TCD95 et de la TCP tels que déterminés selon l'invention donnent certes une description prédictive plus précise que 5 les méthodes selon l'état de la technique, mais que la description prédictive sur la base des paramètres cellulaires et/ou moléculaires peut être améliorée de manière significative si l'on caractérise la sensibilité de la tumeur en réponse à un traitement cassant l'ADN par l'évaluation de la fraction cellulaire survivante à une dose D et un fractionnement de dose d, ou par le volume de la tumeur. Ce mode de réalisation présente aussi l'avantage que : 10 - La SF(d,D) peut être aisément déterminée à partir du nombre de foci de H2AX - le volume étant un facteur géométrique, il peut être corrélé à tous les autres critères cliniques utilisés par les praticiens selon l'état de la technique pour décrire l'état et l'évolution d'une tumeur, tel que le critère RECIST, mentionné ci-dessus. 15 Pour la fraction cellulaire survivante à une dose D Les inventeurs ont également trouvé une corrélation entre le nombre de foci yH2AX à 24h et la survie cellulaire. Pour une dose de 2Gy, la survie cellulaire est : NH2Ax(2Gy,24h)e , SF(2Gy) = e ' e +) ou pour une dose D et un fractionnement de dose d: in xNH2Ax(d,24h)+ fiVD) S F (d, D) = e ' e 20 où : NH2AX représente le nombre de foci de H2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation, 0 représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D est la dose en Gy, d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de fractions, 25 fl représente le paramètre en Gy-2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. 3040178 9 Pour le volume de la tumeur : 1) En fonction de la survie : Vo V(D) = 1 + e-a.No(sF(D)-sF(D50)) sachant que V(D) exprime le volume de la tumeur qui survit à une dose D. 2) En fonction du nombre de cellules survivantes : V(D) = 1 + e-a(N(D)-N(D50)) vo 5 3) En fonction du nombre de foci yH2AX V (d, D) = 1 + e-CtiVC)(e- 0 -e (71 x N H2AX(d,24h) +13dD.,' (n50 x NH2Ax(d,24h) Vo +13dD50)\ Dans ces formules reliées au volume de la tumeur: No représente le nombre de cellules tumorales initiales, 0 représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D50 est la dose pour laquelle on trouve éduction du volume de la tumeur de 50%, 10 n50 est le nombre de fractions pour lequel on trouve réduction du volume de la tumeur de 50%, a est une constante de variation du volume par nombre de cassures, fl est un paramètre (en Gy-2) du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. 15 De plus cette fraction survivante à une dose D (fractionnée en n doses d) est proportionnelle au rapport d'intensités des signaux recueillis par imagerie avant et après le traitement par radiothérapie selon la formule : Ii = c X SF(d, D)=cxe xNH2Ax (01,24h) - olD) où : 20 If est l'intensité du signal dans le volume traité à la fin du traitement, est l'intensité du signal dans le volume traité avant le traitement, 3040178 10 C est une constante de proportionnalité. Toutes ces corrélations selon l'invention peuvent être utilisées pour une dose de rayonnement ionisant. Dans un mode de réalisation la dose d est la dose par fraction du traitement radiothérapeutique (typiquement 2 Gy) et D est la dose totale du traitement 5 radiothérapique administré. Ainsi, l'objet de la présente invention est un procédé d'évaluation de la réponse d'une tumeur à un traitement cassant l'ADN à partir d'un prélèvement de cellules de ladite tumeur (de préférence par biopsie), dans lequel : 10 (a) on prépare un échantillon cellulaire à partir des cellules prélevées sur ladite tumeur ; (b) on soumet ledit échantillon cellulaire à un traitement cassant l'ADN caractérisé par une dose D ; (c) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires 15 obtenus avec un marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t)), lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état avant administration de ladite dose D) et au moins un temps d'observation sélectionné parmi t = t1, t2, t3 et t4 après administration de ladite dose absorbée D; 20 (d) on détermine au moins un paramètre ou score permettant de caractériser la réponse de l'échantillon audit traitement cassant l'ADN, en utilisant au moins les nombres moyens NpH2Ax(t), et dans lequel procédé 25 - t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être dans ce cas être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ; 30 - t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et 3040178 11 est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ; - t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, 5 et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1, mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préférentiellement environ 60 minutes ; - t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB 10 reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes. 15 Ledit traitement cassant l'ADN peut être une irradiation avec un rayonnement ionisant, ou un traitement avec au moins un principe actif pharmaceutique, ou encore un traitement qui combine une irradiation avec un rayonnement ionisant et un traitement avec au moins un principe actif pharmaceutique. Ladite tumeur peut être une tumeur solide ou liquide. 20 Dans un mode de réalisation du procédé selon l'invention on détermine les nombres moyens NpH2Ax(t) à t= tO, t1, t2, t3 et t4. Dans un autre mode de réalisation on détermine comme paramètre ou score de la réponse de la tumeur à un traitement cassant l'ADN au moins un paramètre sélectionné dans le groupe formé par : la fraction cellulaire survivante après une dose D fractionnée 25 en n doses d (SF(d,D)) le paramètre TCD50, le paramètre TCD95, le paramètre TCP, le volume de la tumeur. Dans le cas où ledit traitement cassant l'ADN est un rayonnement ionisant, on établit avantageusement le paramètre TCD95 à partir du nombre de cellules survivantes au 30 traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation Gy) 2 TCD95 = 142.8 x N( + 8.57 No où No représente le nombre de cellules tumorales initiales, 3040178 12 N(2 Gy) représente le nombre de cellules survivantes à t4 après irradiation avec un rayonnement ionisant d'une dose de 2 Gy de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant comprise entre 0,5 Gt et 5 Gy, de préférence entre 1 Gy et 3 Gy, et encore plus préférentiellement de 2 5 Gy. Dans ce même cas, on peut établir le paramètre TCD95 à partir du nombre de foci yH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation TCD95 = 142.8 x e ) (NH2Ax(29Gy,24h.)+4', I" + 8.57 où NH2Ax(2Gy,24h) représente le nombre de foci H2AX au temps t4 après une 10 dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy, e représente la tolérance de la cellule (exprimée en nombre de cassures double-brin) et ig le paramètre en Gy-2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. Dans ce même cas, on peut établir le paramètre TCP à partir du nombre de cellules 15 survivantes après traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation TCP(D) = e-NAD) où N représente le nombre de cellules survivantes après une dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy. 20 Dans ce même cas on peut établir le paramètre TCP à partir du nombre de nombre de foci yH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D de traitement cassant l'ADN, de préférence par la relation (nxNH2Ax(d,24h)+13dD) TCP(D) = e-Noxe ` e où NH2Ax(d, 24h) représente le nombre de foci de H2AX dans les cellules survivantes au temps t4 après une dose d de traitement cassant l'ADN, ladite dose 25 étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy. Dans un mode de réalisation on établit la survie des cellules de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D fractionnée en n doses d de préférence par la relation : 3040178 13 xNH2Ax(d,24h)+fivD) SF (d, D) = e où : NH2AX représente le nombre de foci de H2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation, 0 représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D est la dose en Gy, d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de 5 fractions, ig est le paramètre en Gy-2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. On peut établir la proportionnalité de ladite fraction cellulaire survivante après une dose D fractionnée en n doses d avec le rapport d'intensités des signaux recueillis par imagerie 10 avant et après le traitement par radiothérapie selon la formule : Ii = cxSF(d,D)=cxe xNH2AX(d,24h) + [MD) où If est l'intensité du signal dans le volume traité à la fin du traitement, I, est l'intensité du signal dans le volume traité avant le traitement, C est une constante de proportionnalité. 15 Dans un mode de réalisation avantageux on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D (ce volume étant exprimé par le paramètre V(D)) à partir de la survie des cellules de la tumeur, de préférence par la relation V(D) = 1 +a.No(SF (D)-SF(D50)) où : 20 - N est de nombre de cellules survivantes après une irradiation avec une dose D, - VO est le volume initial de la tumeur, - SF(D) est la fraction de cellules survivantes à une dose D, - a est la constante de variation du volume par nombre de cassures de l'ADN, Vo 3040178 14 - D50 est la dose en Gy pour laquelle il est observé une réduction de 50% du volume de la tumeur. Dans un autre mode de réalisation avantageux on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D (ce volume étant exprimé par le paramètre 5 V(D)) à partir du nombre de cellules survivantes, de préférence par la relation V (D) = 1 + e-a(N(D)-N(D50)) où : - N est de nombre de cellules survivantes après une irradiation avec une dose D, - VO est le volume initial de la tumeur, - N(D) est le nombre de cellules survivantes à une dose D, 10 - a est la constante de variation du volume par nombre de cassures de l'ADN, - D50 est la dose en Gy pour laquelle il est observé une réduction de 50% du volume de la tumeur. Dans un autre mode de réalisation on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN à une dose D fractionnée en n doses d et ce à partir du nombre de foci 15 yH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN, de préférence par la relation V (d, D) = Vo (71 x NH2AX(d,24h) +13dD., ,n50 x NH2Ax(d,24h) -Ff3dD50)\ 1 + e-CtiVC)(e- 0 j-e e J où : No représente le nombre de cellules tumorales initiales, 0 représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D50 est la dose pour laquelle on trouve une réduction du volume de la tumeur de 20 50%, n50 est le nombre de fractions pour lequel on trouve une réduction du volume de la tumeur de 50% a est une constante de variation du volume par nombre de cassures, fi représente le paramètre en Gy-2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de 25 tissu tumoral. Vo 3040178 15 Description détaillée Dans le cadre de la présente invention, le traitement cassant l'ADN est quantifié par sa dose D. Dans le cas où ledit traitement cassant l'ADN est un rayonnement ionisant 5 (radiothérapie), ladite dose D correspond à la dose absorbée dudit rayonnement ionisant (couramment exprimée en Gy). Dans le cas où ledit traitement cassant l'ADN est l'administration d'un ou plusieurs principe(s) actif(s) pharmaceutique(s) (chimiothérapie), ladite dose D correspond à la dose administrée pour chacun desdits principes actifs. Dans le cas où ledit traitement cassant l'ADN est la combinaison d'une radiothérapie avec une 10 chimiothérapie (radio-chimiothérapie), ladite dose D est caractérisée par les doses individuelles qui caractérisent chacun desdits traitements. Nous décrivons ici un mode de réalisation avec plusieurs variantes qui convient pour un patient humain. 1. Préparation de l'essai 15 Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prélevées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d'analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d'infection éventuelle du patient par HIV ou hépatite C pour que les opérateurs puissent prendre les mesures appropriées de sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la 20 culture cellulaire. Puis, l'opérateur prélève au patient un échantillon de tumeur. L'échantillon cellulaire est placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau foetal stérile. L'échantillon est transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, sachant que l'échantillon ne doit pas rester plus de 38 h à la température ambiante. 25 L'étape suivante représente l'isolation et /ou l'amplification du tissu prélevé. Dans un mode de réalisation, dès réception, l'échantillon cellulaire (typiquement la biopsie) est établie sous la forme d'une lignée cellulaire amplifiable, de manière très préférée via une culture sélective par cytométrie de flux ou via l'utilisation de milieux de culture sélectifs et ce, sans agent de transformation virale ou chimique suivant une 30 procédure ancillaire et bien connue modulable en fonction du type de tumeur (Krônig et al, « Ce// type specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity » Oncotarget. 2015 Jan 20;6(2):1302-14; Hristozova et al, «A simple multicolor flow cytometry protocol for detection and molecular characterization of circulating tumor cells in epithelial cancers » Cytometry A. 2012 Jun;81(6):489-95. doi: 3040178 16 10.1002/cyto.a.22041. Epub 2012 Mar 21.; Wang et al, « Identification and characterization of cells with cancer stem cell properties in human primary lung cancer cell lines » PLoS One. 2013;8(3):2013 Mar 4.). Dès que le nombre de cellules est suffisant (1 - 3 semaines), Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des 5 boîtes de Petri. Une partie de ces lamelles sont irradiées sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D (par exemple 2 Gy). Une autre partie n'est pas irradié ; elle représente l'état spontané (dose absorbée 0 Gy). L'irradiation peut être effectuée par exemple avec un accélérateur médical qui délivre des photons de 6 MV avec un débit de dose absorbée de 3 Gy min-1. Après l'irradiation et 10 pour subir les temps de réparation mentionnés ci-dessous, les cellules restent dans l'incubateur de culture à 37°C. Pour les cellules irradiées, on acquiert des caractéristiques correspondant à l'état radio-induit après plusieurs temps de réparation (temps de réparation post-irradiation). On 15 acquiert de préférence au moins deux et encore plus préférentiellement au moins trois points, à savoir : t1, t2, t3 et t4. Lesdites caractéristiques sont représentées par les foci correspondant au marqueur pH2AX. Les cellules sur lamelles de verre sont ensuite fixées, lysées et hybridées. La procédure suivante, connue en tant que telle (voir la publication citée de Bodgi et al.), peut être 20 utilisée : les cellules ont été fixés dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgCl2, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule t-OctC6H4-(OCH2CH2)x0H avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1, fourni par Sigma Aldrich) pendant 25 3 minutes. Puis les lamelles de couverture ont été lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additionné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par Sigma Aldrich) et a été suivi par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX ont été utilisés à une concentration de 1 :800. 30 Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souris ou TRITC anti-lapin (1:100, fournis par Sigma Aldrich) ont été effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes. On a traité des lamelles de verre avec du VectashieldTM contenant du DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole) pour marquer le noyau. La coloration avec du DAPI permet aussi, de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase G1 35 (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase S (noyaux avec de nombreux foci 3040178 17 pH2AX), en phase G2 (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et métaphases (chromosomes visibles). L'acquisition des résultats est effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus par exemple). La lecture peut être directe 5 (typiquement par comptage des foci sur au moins 50 cellules en Go/Gi pour chaque point) ou par logiciel d'analyse d'image dédié, ou encore sur un microscope automatisé ; de préférence les méthodes par logiciel ou microscope automatisé sont calibrées avec des déterminations manuelles. Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base 10 d'un diagnostic, au plus 3 séries d'expériences (irradiation) indépendantes sont effectuées et la moyenne de chacun des nombres de foci pour les temps définis est calculée. 2. Détermination des paramètres biologiques et cliniques 2.1 Généralités et marqueurs utilisés 15 L'invention est basée entre autres sur l'utilisation de données acquises pour le marqueur pH2AX sur des cellules non-irradiées (état spontané) et irradiées (état radioinduit). La méthode est basée sur l'étude cinétique du marquage par ce marqueur en fonction de la durée de réparation : on marque les échantillons après un laps de temps déterminé à 20 compter de l'arrêt de l'irradiation, et on étudie leur immunofluorescence. On peut mesurer les courbes cinétiques complètes, par exemple représentées par 5 points se situant avantageusement à tO, t1 (de préférence 10 minutes), t2 (de préférence 1h), t3 (de préférence 4h) et t4 (de préférence 24h), sachant que tO correspond à l'état avant irradiation (état spontané). 25 Mais la demanderesse s'est rendue compte que certains points (correspondant à certains temps de réparation) sont plus importants que d'autres, et que certains points ne sont pas prédictifs. Grâce à la sélection judicieuse des paramètres déterminés à des temps donnés, on peut ainsi diminuer le nombre de mesures et donc diminuer le coût global du 30 diagnostic, sans diminuer le pouvoir prédictif de la méthode. Les moyennes de chaque point et chaque dose avec chaque marqueurs sont calculées avec les erreurs écart-types de la moyenne (appelé « SEM ») vu que l'échantillonnage est n=3 (pas d'écart-type gaussien de type « standard error SE »). 35 3040178 18 (i) pH2AX désigne les formes phosphorylées en sérine 439 du variant X de l'histone H2AX qui marque, selon les constatations de la demanderesse, le nombre de cassures double-brin de l'ADN (CDB) qui sont reconnues par le mode de réparation majoritaire et fidèle, la suture. Le marqueur pH2AX est essentiellement nucléaire sous forme 5 uniquement de foci nucléaire et seuls le nombre et la taille des foci seront analysés. La contre-coloration au DAPI (un marqueur d'ADN connu de l'homme du métier) permet de localiser le noyau pour situer la localisation nucléaire. 10 2.2 Paramètres biologiques On définit et détermine comme indiqué : - NpH2Ax(t), le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX, 15 aux temps d'observations tO (non irradié) ou t1, t2, t3, t4 après irradiation (dose absorbée: 2 Gy), sachant que la détermination du paramètre NpH2Ax(t) est obligatoire dans le cadre de la méthode selon l'invention; 2.3 Evaluation prédictive 20 Elle vise la prédiction de paramètres cliniques ou radiothérapiques à partir des données biologiques mesurées. Plusieurs niveaux de diagnostic sont proposés : A) Un diagnostic quantitatif directement issu de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques Elle vise la prédiction de paramètres cliniques ou radiothérapiques à partir des données 25 biologiques mesurées. Plusieurs niveaux de diagnostic sont proposés : - Le paramètre TCD95 ,NH2Ax (2Gy,24h) +4 0\ TCD95 = 142.8 x e + 8.57 - Pour le paramètre TCP : (71xN H2AX(c1,24h)+13dD) TCP(D) = e-N oxe - Pour la fraction cellulaire survivante à une dose D et à un fractionnement de dose d: xlVH2A6ix(d,24h) +flcID) SF (d, D) = e 3040178 19 où : NH2AX représente le nombre de foci de H2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation, 0 représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), 5 D est la dose en Gy, d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de fractions, ig représente le paramètre en Gy-2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. De plus cette fraction survivante à une dose D (fractionnée en n doses d) est proportionnelle au rapport d'intensités des signaux recueillis par imagerie avant et après 10 le traitement par radiothérapie selon la formule : Ii = c X SF(d, D)=cxe xNH2Ax (01,24h) - olD) où If est l'intensité du signal dans le volume traité à la fin du traitement, I, est l'intensité du signal dans le volume traité avant le traitement, C est une constante de proportionnalité. 15 - Pour le volume de la tumeur : Vo V (d, D) = x NH2AX(d,24h)+13dD) 7150 x NH2Ax(d,24h) +13dDso)) 1 + e-a'N 0 (e -e Dans ces formules reliées au volume de la tumeur: No représente le nombre de cellules tumorales initiales, 20 0 représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D50 est la dose pour laquelle on trouve éduction du volume de la tumeur de 50%, n50 est le nombre de fractions pour lequel on trouve réduction du volume de la tumeur de 50%, a est une constante de variation du volume par nombre de cassures, 3040178 20 fi représente le paramètre en Gy-2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. B) un diagnostic plus qualitatif, influencé par le diagnostic quantitatif mais qui tient compte 5 d'éventuels éléments cliniques portés à la connaissance du praticien. 2.5 Les niveaux et méthodes d'analyse Dans un premier mode de réalisation, on utilise tout ou partie des valeurs NpH2Ax(t) déterminées dans un algorithme conduisant à un paramètre ou score permettant de 10 caractériser la réponse de l'échantillon à ladite dose D dudit traitement cassant l'ADN. Dans un deuxième mode de réalisation, on tient compte du constat que certaines valeurs ne sont pas prédictifs pour aucun score : tel est le cas par exemple des points NpH2Ax(t3). C'est pourquoi on peut envisager une analyse restreinte où seulement les points tO, t1, t2 et t4 sont utilisés parmi les valeurs NpH2Ax(t) déterminées. 15 REVENDICATIONS1. Procédé d'évaluation de la réponse d'une tumeur à un traitement cassant l'ADN à partir d'un prélèvement de cellules de ladite tumeur (de préférence par biopsie), dans lequel : (a) On prépare un échantillon cellulaire à partir des cellules prélevées sur ladite tumeur ; (b) On soumet ledit échantillon cellulaire à un traitement cassant l'ADN caractérisé par une dose D, (c) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec un marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t)), lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état avant administration de ladite dose D) et au moins un temps d'observation sélectionné parmi t = t1, t2, t3 et t4 après administration de ladite dose D; (d) on détermine au moins un paramètre ou score permettant de caractériser la réponse de l'échantillon audit traitement cassant l'ADN, en utilisant au moins les nombres moyens NpH2Ax(t), et dans lequel procédé - t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être dans ce cas être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ; - t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ; - t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1, mais qui doit dans 3040178 22 ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préférentiellement environ 60 minutes ; - t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB 5 reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes. 10 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit traitement cassant l'ADN est sélectionné dans le groupe formé par : - une irradiation avec un rayonnement ionisant ; - un traitement avec au moins un principe actif pharmaceutique, - un traitement qui combine une irradiation avec un rayonnement ionisant et un 15 traitement avec au moins un principe actif pharmaceutique. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel ladite tumeur est une tumeur solide ou liquide. 20 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel on détermine les nombres moyens NpH2Ax(t) à t= tO, t1, t2, t3 et t4. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel on détermine comme paramètre ou score de la réponse de la tumeur à un traitement cassant l'ADN 25 au moins un paramètre sélectionné dans le groupe formé par : la fraction cellulaire survivante après une dose D fractionnée en n doses d (SF(d,D)) le paramètre TCD50, le paramètre TCD95, le paramètre TCP, le volume de la tumeur. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel on établit le 30 paramètre TCD95 à partir du nombre de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation Gy) 2 TCD95 = 142.8 x N( + 8.57 No où No représente le nombre de cellules tumorales initiales, N(2 Gy) représente le nombre de cellules survivantes à t4 après irradiation avec un rayonnement ionisant d'une dose de 2 Gy de traitement cassant l'ADN, ladite 35 dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant comprise entre 0,5 Gt 3040178 23 et 5 Gy, de préférence entre 1 Gy et 3 Gy, et encore plus préférentiellement de 2 Gy. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, dans lequel on établit le paramètre TCD95 à partir du nombre de foci yH2AX de cellules survivantes au 5 traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation TCD95 = 142.8 x e ) (NH2Ax(29Gy,24h.)+4', I" + 8.57 où NH2Ax(2Gy,24h) représente le nombre de foci H2AX au temps t4 après une dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy, 0 représente la tolérance de la cellule (exprimée en nombre de cassures double-brin) et fl le paramètre en Gy-2 du modèle linéaire 10 quadratique relatif au type de tissu tumoral. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel on établit le paramètre TCP à partir du nombre de cellules survivantes après traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation TCP(D) = e-NAD) 15 où N représente le nombre de cellules survivantes après une dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 dans lequel on établit le paramètre TCP à partir du nombre de nombre de foci yH2AX de cellules survivantes 20 au traitement cassant l'ADN avec une dose D de traitement cassant l'ADN, de préférence par la relation (71 XNH2AX(C1,24h) TCP(D) = e-Noie ` e +13dD) où NH2Ax(d, 24h) représente le nombre de foci de H2AX dans les cellules survivantes au temps t4 après une dose d de traitement cassant l'ADN, ladite dose 25 étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel on établit la survie des cellules de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D fractionnée en n doses d de préférence par la relation : 3040178 24 xNH2Ax(d,24h)+,6vD) SF (d, D) = e où : NH2AX représente le nombre de foci de H2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation, 0 représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D est la dose en Gy 5 d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de fractions, fi est le paramètre en Gy-2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. 10 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, dans lequel on établit la proportionnalité de ladite fraction cellulaire survivante après une dose D fractionnée en n doses d avec le rapport d'intensités des signaux recueillis par imagerie avant et après le traitement par radiothérapie, de préférence selon la formule : Ii I F = cxSF(d,D)=cxe (71 xNH2AX(d,24h)-EfiVD) 15 où : If est l'intensité du signal dans le volume traité à la fin du traitement, I, est l'intensité du signal dans le volume traité avant le traitement, C est une constante de proportionnalité. 20 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, dans lequel on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D (ce volume étant exprimé par le paramètre V(D)) à partir de la survie des cellules de la tumeur, de préférence par la relation V(D) = 1 + e-a.No(SF(D)-SF(D50)) où : 25 - N est de nombre de cellules survivantes après une irradiation avec une dose D, Vo 3040178 25 - VO est le volume initial de la tumeur, - SF(D) est la fraction de cellules survivantes à une dose D, - a est la constante de variation du volume par nombre de cassures de l'ADN, - D50 est la dose en Gy pour laquelle il est observé une réduction de 50% du 5 volume de la tumeur. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, dans lequel on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D (ce volume étant exprimé par le paramètre V(D)) à partir du nombre de cellules survivantes, de 10 préférence par la relation V (D) = 1 + e-a(N(D)-N(D50)) où : - N est de nombre de cellules survivantes après une irradiation avec une dose D, - VO est le volume initial de la tumeur, - N(D) est le nombre de cellules survivantes à une dose D, 15 - a est la constante de variation du volume par nombre de cassures de l'ADN, - D50 est la dose en Gy pour laquelle il est observé une réduction de 50% du volume de la tumeur. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, dans lequel on établit le 20 volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN à une dose D fractionnée en n doses d et ce à partir du nombre de foci yH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN, de préférence par la relation V (d, D) = Vo (71 x N H2AX(d,24h) +13dD., ,n5o x N H2Ax(d,24h) +13dD5o), 1 + e- a'l \ j°(e- 0 )-e e J où : No représente le nombre de cellules tumorales initiales, 25 0 représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), Vo 3040178 26 D50 est la dose pour laquelle on trouve une réduction du volume de la tumeur de 50%, n50 est le nombre de fractions pour lequel on trouve une réduction du volume de la tumeur de 50% 5 a est une constante de variation du volume par nombre de cassures, fl représente le paramètre en Gy-2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral.