Brevet FR3045046A1 — publié le 20170616

STÉRÉO-ISOMÈRE DE CONFIGURATION DE LA BROMADIOLONE, COMPOSITION ET APPÂT RODONTICIDE LE COMPRENANT ET PROCÉDÉ DE LUTTE CONTRE DES RONGEURS CIBLES NUISIBLES L'invention concerne un stéréo-isomère de configuration de 5 la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. L'invention concerne donc le domaine technique de la lutte contre des populations de rongeurs cibles nuisibles. Il est connu d'utiliser des poisons sous forme d'appâts 10 rodonticides contre des rongeurs cibles nuisibles. On sait de EP 2 090 164 que la bromadiolone est un anticoagulant de deuxième génération agissant à simple dose. On connait aussi un appât comprenant de la bromadiolone, la proportion de la bromadiolone dans l'appât étant de 50 ppm. Un tel appât est susceptible d'être consommé par des 15 animaux autres que des rongeurs cibles nuisibles lorsqu'il est mis à la disposition de rongeurs cibles nuisibles. Il peut être consommé directement (consommation primaire) par des animaux domestiques ou des animaux de compagnie. Il peut aussi être consommé accidentellement par des humains. Une telle consommation peut produire chez ces animaux domestiques, chez ces animaux de compagnie ou 20 chez des humains un empoisonnement qui peut être létal. En outre, une fraction de la bromadiolone de ces appâts rodonticides peut être ingérée (consommation secondaire) par des animaux -notamment par des oiseaux- prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé un tel appât rodonticide ou par des animaux charognards de 25 rongeurs nuisibles morts d'avoir consommé un tel appât rodonticide. Cette consommation secondaire est susceptible d'entrainer à terme la mort de ces animaux prédateurs ou charognards qui peuvent être des animaux -notamment des oiseaux- appartenant à des espèces protégées. L'invention vise donc à pallier ces inconvénients en 30 proposant un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de 3045046 2 configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont en même temps efficaces pour contrôler les populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement d'animaux non-cibles -notamment des animaux domestiques, des animaux de compagnie ou des humains- consommant accidentellement un tel appât rodonticide. L'invention vise aussi à pallier ces inconvénients en proposant un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont en même temps efficaces pour contrôler les populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement secondaire d'animaux domestiques (animaux de compagnie ou d'élevage) ou sauvages -par exemple des renards ou des oiseaux- prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé de l'appât rodonticide ou charognards de rongeurs cibles nuisibles morts empoisonnés. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dont la mise en oeuvre est en accord avec les règles de bon usage -notamment vis à vis de la protection des oiseaux, et en particulier des rapaces-. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui soit respectueux de l'environnement, de la santé humaine et des animaux non cibles -notamment des oiseaux, et en particulier des rapaces-. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de 30 configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un 3045046 3 procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui ne nécessitent pas, pour contrôler une population de rongeur cibles nuisibles, d'utiliser des doses massives d'agent rodonticide. L'invention vise donc à proposer une alternative à des 5 appâts rodonticides connus. Pour ce faire, l'invention concerne un stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E4, de la bromadiolone présentant par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des 10 conditions décrites ci-après, un temps de rétention t4 de valeur telle que t1 250,1 et m/z 525,1 -> 181 correspondant au signal de la 20 bromadiolone. Un exemple de chromatogramme est présenté en figure 1. Les valeurs des temps de rétention de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone sont de : - pour l'énantiomère El dudit diastéréoisomère D1,2, t1 = 4,3 min ; - pour l'énantiomère E2 dudit diastéréoisomère D1,2, t2 = 5,0 min ; 25 - pour l'énantiomère E3 dudit diastéréoisomère D3,4, t3 = 6,3 min, et ; - pour l'énantiomère E4 dudit diastéréoisomère D3,4, t4 = 8,8 min. Les valeurs de temps de rétention t1, t2, t3 et t4 sont susceptibles de varier selon les conditions chromatographiques. Cependant, en tout état de cause, dans ces conditions (choix de ces phases stationnaire et 30 mobile), l'ordre d'élution des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone reste inchangé. À titre indicatif, les valeurs des temps de rétention 3045046 27 de chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone peuvent varier avec une variation de quelques degrés Celsius de la température de la colonne de chromatographie. Pour ledit énantiomère E1, le temps de rétention (t1) peut varier entre 4,1 min et 4,4 min. Pour ledit énantiomère E2, le temps de rétention (t2) 5 peut varier entre 4,8 min et 5,2 min, Pour ledit énantiomère E3, le temps de rétention (t3) peut varier entre 6,0 min et 6,6 min. Pour ledit énantiomère E4, le temps de rétention (t4) peut varier entre 8,3 min et 9,0 min. Extraction de la bromadiolone de foies de rats traités à la bromadiolone 10 Homogénéisation de l'échantillon de foie On pèse avec précision de l'ordre de 0,525 g (±0,025 g) de foie de rat que l'on place dans un tube en polypropylène de 50 mL On ajoute 10 mL d'acétone et on soumet la suspension à une homogénéisation au moyen d'un homogénéisateur/disperseur Ultra-Turrax® pendant une durée de l'ordre de 15 30 sec. On rince la tige de l'homogénéisateur/disperseur à l'eau chaude puis 2 fois avec 20 mL d'acétone dans un tube en polypropylène. On centrifuge l'homogénat pendant 5 min à une vitesse de centrifugation de 3000 rpm (rotation par minute). On collecte et on transvase le surnageant dans un tube à essai. On soumet l'échantillon à une évaporation sous un flux d'azote (N2) à la température 20 de 40°C de façon à former un extrait sec. Élimination des lipides Dans le tube contenant l'extrait sec, on ajoute 1 mL d'acétonitrile de façon à solubiliser l'extrait sec. On lave la solution d'acétonitrile 2 fois successivement avec 1 mL d'hexane. L'extrait débarrassé 25 des lipides est séché sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C, puis repris avec 0,5 mL de méthanol et solubilisé par agitation sous vortex. On ajoute ensuite 0,5 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q). L'échantillon est homogénéisé sous vortex. 3045046 28 Extraction de la bromadiolone sur phase solide (« SPE, Solid Phase Extraction ») On fait passer 1 mL de dichlorométhane (CH2Ct2), puis 1 mL de méthanol (CH3OH), puis 1 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q) sur une 5 cartouche Oasis HLB 1cc (WAT094225, Waters). On dépose ensuite l'extrait de foie débarrassé des lipides (1mL Me0H/H20 Milli-Q) et contenant la bromadiolone en tête de la cartouche préalablement conditionnée. L'extrait de foie pénètre dans la cartouche par gravité au contact de la phase solide de la cartouche. On dépose en tête de cartouche 1 mL de solution de lavage formée de 10 méthanol (CH3OH) et d'eau ultra-pure (H2O) en proportion volumique de 90/10. On sèche la cartouche par aspiration sous vide connectée en partie basse de la cartouche. On dépose ensuite en tête de cartouche 1 mL de solution d'élution formée de dichlorométhane (CH2Ct2) et de méthanol (CH3OH) en proportion volumique de 90/10 et on collecte en bas de cartouche un éluat comprenant la 15 bromadiolone. On évapore le solvant de l'éluat sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C. On reprend l'échantillon dans 0,5 mL d'acétonitrile et on filtre la solution d'acétonitrile contenant la bromadiolone sur filtre 0,2 ium. Rémanence des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone dans le foie de rats 20 On administre par gavage ("per os") à des rats SD « Sprague Dawley » mâles et femelles, âgés de 8 semaines et pesant de l'ordre de 200 g, un mélange de diastéréoisomères (diastéréoisomère D12 et diastéréoisomère D3,4) de la bromadiolone en solution dans un mélange d'huile végétale et de DMSO à 5 %. La proportion molaire dudit diastéréoisomère D1,2 25 est de 56% et la proportion molaire dudit diastéréoisomère D3,4 est de 44%. On administre (à JO) de la solution de gavage de façon que la quantité de bromadiolone ingérée par chaque rat soit de l'ordre de 13 mg par kilogramme de rat. Pour éviter l'hémorragie, les rats gavés sont traités quotidiennement par administration par voie sous cutanée d'une dose de vitamine 30 K1 (à titre d'antidote vis-à-vis de l'hémorragie) à raison de 0,1U pour 200g de poids de rat vif. 3045046 29 À J1 (J+1), J3 (J+3) et J7 (J+7) après le gavage, on euthanasie 4 rats préalablement anesthésiés à l'isoflurane, on prélève le foie des rats euthanasiés puis on extrait la bromadiolone du foie comme décrit ci-dessus et on dose la quantité de chacun des stéréo-isomères de configuration de la 5 bromadiolone par analyse par chromatographie liquide haute pression comme décrit ci-dessus. On mesure l'aire sous les pics du chromatogramme obtenu et on quantifie chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone. Les résultats sont représentés en figure 2. La concentration dudit diastéréoisomère D1,2 dans le foie est représentée par des colonnes noires et 10 la concentration dudit diastéréoisomère D3,4 dans le foie est représentée par des colonnes blanches. Ledit diastéréoisomère D3,4 est moins rémanent que ledit diastéréoisomère D12 dans le foie des rats. La figure 3 représente l'évolution de la concentration de l'énantiomère El dudit diastéréoisomère D12 de la bromadiolone (colonne 15 blanche), de la concentration de l'énantiomère E2 dudit diastéréoisomère D12 de la bromadiolone (colonne noire), de la concentration de l'énantiomère E3 dudit diastéréoisomère D3,4 de la bromadiolone (colonne à hachures obliques) et de la concentration de l'énantiomère E4 dudit diastéréoisomère D3,4 de la bromadiolone (colonne à hachures horizontales) dans le foie de rats. Dès J+3, 20 seul subsiste l'énantiomère El dans le foie des rats. Pouvoir anticoagulant de chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone On administre par gavage à JO à des rats de laboratoire (OFA, Sprague Dawley de 200 g) mâles, soit : 25 - une composition comprenant de l'énantiomère El dudit diastéréoisomère D1,2 à raison de 1,5 mg dudit énantiomère El par kilogramme de rat, soit ; - une composition comprenant de l'énantiomère E2 dudit diastéréoisomère D1,2 à raison de 1,5 mg dudit énantiomère E2 par kilogramme de 30 rat, soit ; 3045046 30 - une composition comprenant de l'énantiomère E3 dudit diastéréoisomère D3,4 à raison de 1,5 mg dudit énantiomère E3 par kilogramme de rat, soit ; - une composition comprenant de l'énantiomère E4 dudit 5 diastéréoisomère D3,4 à raison de 1,5 mg dudit énantiomère E4 par kilogramme de rat. Les rats reçoivent quotidiennement de la vitamine K1 à raison de 0.1 unités de vitamine pour 200 g de rat de façon à les maintenir en vie pendant 7 jours ou 14 jours. Néanmoins, l'administration de vitamine K1 est 10 arrêtée 48h avant l'euthanasie des rats afin de permettre une évaluation du temps de quick sans interférence avec la supplémentation par gavage. Sur ces rats, on prélève du sang à J1, J3, J7 et J14 et on réalise une mesure du temps de coagulation (temps de Quick, exprimé en secondes) du plasma au moyen du kit "Neoplastine CI Determination of 15 Prothrombin Time" (Diagnostica Stago, Asnière, France) par mesure sur un appareil Thrombotimer option 2 plus (Behnk Electronik, Norderstedt, Allemagne). Les résultats obtenus sont donnés en figure 4 dans laquelle : 20 - les barres d'histogramme blanches correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère El ; - les barres d'histogramme noires correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère E2 ; - les barres d'histogramme à hachures obliques correspondent au temps 25 de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère E3, et ; - les barres d'histogramme à hachures horizontales correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère E4 selon l'invention. À titre indicatif, la valeur normale du temps de coagulation de rats non traités est de l'ordre de 10 à 20 secondes. 30 L'ingestion d'une dose de 1,5 mg dudit énantiomère E4 selon l'invention par kilogramme de rat est suffisant pour maintenir un effet 3045046 31 anticoagulant au moins jusqu'à J3, contrairement à l'ingestion de 1.5 mg dudit énantiomère E3. Il va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et applications. En particulier, une composition, un appât 5 rodonticide et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles sont sujets à des infinités de variantes tant dans la formulation de l'appât rodonticide que dans les modes de mise en oeuvre du procédé. REVENDICATIONS1/ - Stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E4, de la bromadiolone présentant par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention t4 de valeur telle que t1