Brevet FR3039166A1 — publié le 20170127

PROGENITEURS DE MEGACARYOCYTES CD34+CD41DIM ET LEURS UTILISATIONS POUR PRODUIRE DES PLAQUETTES ET/OU DES MK PORTANT DES PROPLAQUETTES L'invention concerne un procédé pour produire des cellules progénitrices de mégacaryocytes (MK) CD34+CD41d1m, et une population cellulaire essentiellement pure de cellules précurseurs de mégacaryocytes obtenues par ledit procédé. L'invention concerne aussi un procédé pour produire des MK portant des proplaquettes et/ou des plaquettes utilisant les cellules CD34±CD41 dim. ARRIERE-PLAN Les plaquettes sanguines jouent un rôle crucial tant en physiologie qu'en pathologie, et il est par conséquent d'une importance majeure de comprendre les mécanismes contrôlant leur production. Chez les adultes, les plaquettes sont produites par des mégacaryocytes (MK) de moelle osseuse, qui proviennent eux-mêmes de cellules progénitrices et de cellules souches hématopoïétiques. La production in vitro de plaquettes pour transfusion a fait l'objet de nombreuses études ces dernières années. Des améliorations continues des conditions de culture en font un but réalisable, tout comme la génération récente de globules rouges humains transfusables. Néanmoins, nous sommes toujours incapables de reproduire efficacement le processus natif qui peut générer plus de 1000 plaquettes par MK (Reems JA et al., Transfusion medicine reviews. 2010 ; 24 : 33-43). Un moyen pour améliorer la production de plaquettes in vitro pourrait consister à isoler et amplifier des progéniteurs de MK ayant une plus forte capacité à mûrir jusqu'au stade des proplaquettes. Dans la carte hiérarchique acceptée de l'hématopoïèse, les MK s'écartent d'un progéniteur d'érythroïdes/MK (MEP) bipotent commun (Chen L et al., Science. 2014 ; 345: 1251033). Bien que l'existence d'un progéniteur de MK séparé ait été suggérée, aucun tel progéniteur univoque n'a encore été clairement identifié ou expansé à partir de cellules hématopoïétiques adultes humaines. De rares populations humaines qui s'avèrent avoir une capacité accrue à produire des MK portant des proplaquettes ont été observées, mais ces cellules n'ont pas été amplifiées ou évaluées pour la production de plaquettes in vitro (Debili N. et al., Blood. 1992; 80: 3022-3035; Dercksen MW et al., Blood. 1995; 85 : 3313-3319; Norol F. et al., Blood. 1998; 91: 830-843). En particulier, des cellules CD41 positives ont été décrites parmi les cellules CD34+ humaines isolées directement à partir de moelle osseuse ou après culture dans des conditions favorisant les MK (Debili N. et al., Blood. 1992 ; 80 : 3022-3035; Dercksen MW et al., Blood. 1995 ; 86 : 3771-3782). Toutefois, ces populations étaient fortement polyploïdes et incapables de proliférer (Dercksen MW et al., Blood. 1995 ; 3039166 2 86 : 3771-3782). Des cellules CD34+CD41+ ont aussi été observées après co-culture de cellules CD34+ dérivées de moelle osseuse sur des hMSC sans TPO, mais aucune preuve d'une sous-population de CD41dIm distincte n'a été apportée (Cheng L. et al., Journal of cellular physiology. 2000 ; 184 : 58-69). Des cellules ayant un phénotype CD34+CD411" 5 représentant une population très mineure ont récemment été identifiées dans des cultures dérivées de sang périphérique, mais elles n'ont pas été davantage caractérisées (Debili et al., Blood, 2001, 97 (7), 2023-2030. Classiquement, les MK humains sont différenciés en culture à partir de cellules CD34+, une population contenant des cellules souches hématopoïétiques et un mélange de cellules 10 progénitrices ayant divers potentiels. Depuis la disponibilité de la TPO, de nombreux protocoles ont été imaginés pour raffiner la différenciation des MK, utilisant des combinaisons par étapes de cytokines et de facteurs de croissance avec ou sans cellules stromales (Sullenbarger B. et al., Experimental hematology. 2009; 37: 101-110; Panuganti S. et al. Tissue engineering Part A. 2013 ; 19 : 998-1014 ; Pineault N. et al., Cytotherapy. 15 2011 ; 13 : 467-480). En résultat, des améliorations ont été rapportées dans l'aptitude à augmenter le nombre de cellules CD34+ participantes et à différencier des MK, mis en évidence par leur taille et leurploïdie plus élevées, l'apparition de marqueurs spécifiques des plaquettes (CD41 et CD42), et leur capacité à produire des proplaquettes. En dépit de ce progrès, le pourcentage de MK atteignant le stade des proplaquettes reste faible, et la 20 production de plaquettes est bien inférieure à celle de MK différenciés in situ dans la moelle osseuse. Des bases de données transcriptomiques ont révélé que le récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) est bien exprimé tout le long de la voie conduisant aux MK (HSC, CMP, MEP et MK) (Smith BW et al., Blood. 2013; 122 : 376-385). Il a en outre été rapporté que 25 StemRegenin 1 (SRI), un antagoniste d'AhR de forte affinité récemment développé, favorise l'expansion de cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) (Boitano AE et al., Science. 2010 ; 329: 1345-1348). Des procédés pour la production in vitro de MK ou de plaquettes à partir de cellules souches hématopoïétiques, comprenant une étape de mise en contact avec des 30 modulateurs d'AhR, ont été divulgués. Le document WO 2012/129109 divulgue un procédé en trois étapes ex vivo pour produire des plaquettes, qui comprend une première étape de génération d'une population de cellules progénitrices de mégacaryocytes par culture de cellules souches en présence d'une pluralité de facteurs de croissance choisis dans un groupe de 29 facteurs de 35 croissance ou familles de facteurs de croissance, comprenant SR1, et co-culture avec des cellules souches mésenchymateuses. Le procédé comprend en outre la maturation des 3039166 3 cellules progénitrices de mégacaryocytes ayant proliféré dans des conditions de plus forte concentration d'oxygène et en présence d'une pluralité de facteurs de croissance, et la culture des mégacaryocytes matures dans une matrice tridimensionnelle, dans des conditions de plus forte concentration d'oxygène et en présence d'une pluralité de facteurs 5 de croissance, pour produire des plaquettes. Le document WO 2014/028749 divulgue un procédé pour produire une cellule progénitrice de mégacaryocytes/érythroïdes (MEP), comprenant la différenciation d'une cellule précurseur de MEP en une MEP en culture en présence d'un modulateur d'AhR. Le procédé comprend en particulier la culture de cellules précurseurs de MEP en présence d'un 10 antagoniste d'AHR, et ensuite la culture de cellules précurseurs de MEP en présence d'un agoniste d'AHR. Le document WO 2014/138485 divulgue un procédé en deux étapes ex vivo, qui comprend une première étape de génération de mégacaryocytes par différenciation dirigée de cellules souches hématopoïétiques et de cellules progénitrices (HSPC), utilisant un 15 antagoniste de récepteur de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) et une combinaison de cytokines TPO, IL-6, Flt3-L et SCF, et une deuxième étape qui favorise la biogenèse des plaquettes à partir des mégacaryocytes, utilisant un antagoniste d'AhR et de la TPO, de l'IL-6, du F1t3-L et du SCF, ou un antagoniste d'AhR et de la TPO, et éventuellement en outre un inhibiteur de métalloprotéinase de matrice (MMP). 20 RESUME DE L'INVENTION L'invention concerne un procédé ex vivo pour produire des plaquettes et/ou des mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes, comprenant a) la culture d'une population isolée de cellules CD34+CD41d" de progéniteurs de MK 25 dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la thrombopoïétine (TPO), en présence d'un antagoniste du récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par co-culture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes ; et 30 b) la collecte de ladite population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes. L'invention met en outre à disposition un procédé pour produire des cellules progénitrices de mégacaryocytes (MK) comprenant : 35 a0) la culture de cellules souches hématopoïétiques (HSC) dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la lipoprotéine de basse densité (LDL), du facteur des cellules 3039166 4 souches (SCF), de la TPO, de l'IL-6 et de l'IL-9, en présence d'un antagoniste du récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par co-culture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des cellules CD34+CD41 ; et 5 al) l'isolation desdites cellules CD34+CD41d1m à partir de ladite population de cellules. Dans un autre aspect, l'invention concerne une population cellulaire essentiellement pure de progéniteurs de mégacaryocytes (MK), dans laquelle au moins 80 °A des cellules dans la population sont des cellules CD34+CD41 dim. 10 Il est également mis à disposition une composition comprenant une population cellulaire de plaquettes et/ou de mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes et un tampon de perfusion pour utilisation en transfusion, dans laquelle ladite utilisation comprend la préparation de plaquettes et/ou de mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes par un 15 procédé selon l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les inventeurs ont trouvé que SR1 , un antagoniste d'AhR, a amélioré significativement la production d'éléments analogues à des plaquettes et de MK portant des proplaquettes 20 dans une culture en deux étapes de cellules souches hématopoïétiques (HSC) de sang périphérique. Ce qui est plus important est que la culture avec SRI conduit à un enrichissement d'une population de CD34+CD41dim qui, suite à un tri cellulaire, présente une capacité sans précédent à mûrir jusqu'au stade des proplaquettes. On a observé un enrichissement similaire de cellules CD34+CD41d1m présentant un 25 potentiel mégacaryocytaire similaire dans des HSC co-cultivées avec des cellules souches mésenchymateuses (MSC) humaines. Une co-culture avec des MSC, tout comme le traitement au SRI, conduit à une répression de l'AhR. De plus, les effets de SRI et des MSC sont tous deux empêchés par un agoniste d'AhR, ce qui indique que l'amplification de précurseurs mégacaryocytaires de 30 CD34+CD41dini se déroule par répression de la voie d'AhR. Production de cellules prociénitrices de mégacarvocvtes (MK) L'invention met à disposition un procédé pour produire des cellules progénitrices de mégacaryocytes (MK) comprenant : 35 a0) la culture de cellules souches hématopoïétiques (HSC) dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la lipoprotéine de basse densité (LDL), du facteur des 3039166 5 cellules souches (SCF), de la TPO, de l'IL-6 et de l'IL-9, en présence d'un antagoniste du récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par co-culture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des cellules CD34+CD41dim ; et 5 al) l'isolation desdites cellules CD34+CD41 chni à partir de ladite population de cellules. Les "cellules souches hématopoïétiques" (HSC), telles qu'utilisées ici, désignent des cellules sanguines immatures ayant la capacité de s'auto-renouveler et de se différencier en cellules sanguines plus matures, comprenant les granulocytes, les érythrocytes, les 10 plaquettes, et les monocytes. Les HSC sont décrites de façon interchangeable comme étant des cellules souches dans toute la description. Dans un mode de réalisation, les HSC sont des cellules CD34+. Il est supposé que les cellules CD34+ comprennent une sous-population de cellules ayant les propriétés des cellules souches définies ci-dessus. Il est bien connu dans la technique que les HSC comprennent des cellules souches pluripotentes, des 15 cellules souches multipotentes (par exemple une cellule souche lymphoïde), et/ou des cellules souches dédiées à des lignées hématopoïétiques spécifiques. Les sources de HSC comprennent la moelle osseuse non fractionnée, le cordon ombilical, et le sang périphérique. Par exemple, les cellules de sang périphérique normales peuvent être mobilisées avec du GCSF [cellules de leucaphérèse (LK)], et les cellules CD34+ sont isolées des cellules LK par 20 sélection cellulaire. Les HSC comprennent aussi des cellules souches pluripotentes induites (iPS) dédiées à la lignée hématopoïétique. Les cellules iPS sont bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, des cellules iPS peuvent être obtenues en suivant les enseignements de Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126 : 663-676 et de Yamanaka et al. (2007) Nature 448 : 313-317. De préférence, les HSC sont des cellules humaines. 25 La population de HSC de départ peut de préférence contenir au moins 60 % de cellules CD34+, dans certains modes de réalisation plus de 80 'Vo de cellules CD34+, ou même plus de 90 % de cellules CD34+. La population de HSC de départ peut comprendre entre 105 et 109 cellules nucléées. Pour la mise en culture, les HSC sont typiquement ensemencées à une densité 30 cellulaire de 1 à 10 x 104 par ml de milieu de culture, par exemple de 2 à 6 x 104 par ml. Tel qu'utilisé ici dans toute la présente demande, un "milieu de culture" désigne un "milieu de base" qui est complémenté avec un mélange de cytokines, de facteurs de croissance, et d'antagoniste d'AhR qui est spécifié à chaque étape du procédé. De préférence, le milieu de base n'est pas complémenté avec, c'est-à-dire que le milieu de 35 culture ne comprend pas, de quelconque composant additionnel en plus du mélange de cytokines, de facteurs de croissance, et d'antagoniste d'AhR qui est spécifié à chaque étape. 3039166 6 De préférence, des cytokines et des facteurs de croissance humains sont utilisés dans le cadre de l'invention. Un "milieu de base" est un milieu sans sérum synthétique qui comprend typiquement des acides aminés, des sources de carbone, des vitamines, des protéines sériques (par 5 exemple l'albumine), des sels inorganiques, des cations divalents, des tampons et tout autre élément utilisable dans la culture de cellules, et des HSC en particulier. Le milieu de base peut typiquement contenir ou être complémenté avec des antibiotiques destinés à empêcher une contamination durant la culture des cellules, et de la glutamine. Les facteurs de croissance et les cytokines ne sont typiquement pas présents dans un milieu de base. 10 Des exemples d'un tel milieu de base approprié pour un procédé de culture de HSC comprennent, sans s'y limiter, le milieu d'expansion sans sérum (SFEM) StemSpan Tm (StemCell Technologies, Vancouver, Canada), le milieu défini H3000 StemSpan0 (StemCell Technologies, Vancouver, Canada), CellGro0 SCGM. Le milieu d'expansion sans sérum (SFEM) StemSpanTM a été développé pour la 15 culture et l'expansion in vitro de cellules hématopoïétiques humaines. Ce milieu contient de la sérumalbumine bovine pré-testée, de l'insuline et de la transferrine, et des suppléments dans du milieu MDM d'Iscove. Les facteurs de croissance hématopoïétiques recombinés, requis pour une croissance et une expansion optimales des cellules hématopoïétiques, ne sont pas présents dans le SFEM StemSpan TM. 20 Pour la production des cellules progénitrices de MK, le milieu de base est complémenté avec de la lipoprotéine de basse densité (LDL), du facteur des cellules souches (SCF), de la TPO, de l'IL-6 et de l'IL-9. Dans un mode de réalisation, le milieu de culture comprend du CSF, de la TPO, de l'IL- 25 6 et de l'IL-9, présents chacun à une concentration de 1 à 100 ng/ml, telle que 25 à 100 ng/ml, en particulier 10 à 50 ng/ml, 40 à 50 ng/ml, ou 20 à 30 ng/ml. Le milieu de base est de préférence complémenté avec 1 à 40 pg/ml de LDL, par exemple 10 à 30 pg/ml, ou 15 à 25 pg/ml. En particulier, le milieu de culture peut comprendre 10 à 30 pg/ml de LDL, 25 à 30 100 ng/ml de SCF, 40 à 50 mg/mi de TPO, 20 à 30 ng/ml d'IL-6, et 20 à 30 ng/ml d'IL-9. Dans un mode de réalisation, les SCF, TPO, IL-6 et IL-9 sont ajoutés au milieu de base par addition du supplément d'expansion de mégacaryocytes StemSpan Tm (antérieurement connu sous l'appellation CC220) (StemCell Technologies, Vancouver, Canada). Le supplément d'expansion de mégacaryocytes StemSpan Tm est fourni sous la forme d'un 35 concentré 100X et il contient une combinaison de cytokines humaines recombinantes (SCF, IL-6, IL-9 et TPO) formulée pour favoriser sélectivement l'expansion et la différenciation de 3039166 7 cellules progénitrices de mégacaryocytes humains dans des cultures liquides initiées avec des cellules CD34+ de sang de cordon ombilical (CB) ou de moelle osseuse (BM). La culture de HSC pour produire une population cellulaire comprenant des cellules 5 0D34+CD41dun se déroule en outre en présence d'un antagoniste du récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par co-culture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC). Dans un mode de réalisation, l'antagoniste d'AhR est un composé synthétique ajouté au milieu de base, qui est de formule (I) : 10 R3 ou un sel pharmaceutiquement acceptable, ou encore un stéréoisomère de celui-ci ; formule dans laquelle L est choisi parmi -NR50(CH2)2-3-, -NR5a(CI-12)2NR5b-, -NR50(0H2)2S-, -NR50CH2CH(OH)- et - NR5aCH(CH3)CH2- ; où Rsa et Rgb sont indépendamment choisis parmi l'hydrogène et les 15 radicaux alkyle en C1 à C4; R1 est choisi parmi les radicaux thiophényle, furanyle, benzimidazolyle, isoquinolinyle, imidazopyridinyle, benzothiophényle, pyrimidinyle, pyrazolyle, pyridinyle, imidazolyle, pyrrolidinyle, pyrazinyle, pyridazinyle, pyrrolyle et thiazolyle ; où lesdits thiophényle, furanyle, benzimidazolyle, isoquinolinyle, imidazopyridinyle, benzothiophényle, pyrimidinyle, 20 pyrazolyle, pyridinyle, imidazolyle, pyrrolidinyle, pyrazinyle, pyridazinyle, pyrrolyle et thiazolyle de R1 sont éventuellement substitués par 1 à 3 radicaux indépendamment choisis parmi halogéno, cyano, alkyle en C1 à 04, halogénoalkyle en Ci à C4, alcoxy en C1 à C4, - S(0)0-2R8a, et -0(0)0R8a, où Rga est choisi parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à C4; 25 R2 est choisi parmi -S(0)2NR60R6b, -NR60C(0)NR6bR6c, phényle, pyrrolopyridinyle, indolyle, thiophényle, pyridinyle, triazolyle, 2-oxoimidazolidinyle, pyrazolyle, et indazolyle ; où R6a, Rgb et R6, sont indépendamment choisis parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à 04; et 30 ledit phényle, pyrrolopyridinyle, indolyle, thiophényle, pyridinyle, triazolyle,oxoimidazolidinyle, pyrazolyle, ou indazolyle de R2 est éventuellement substitué par 1 à 3 radicaux indépendamment choisis parmi hydroxy, halogéno, 3039166 8 méthyle, méthoxy, amino, -0(CH2),NR7aR7b, -0S(0)2NR7aR7b et -NR7aS(0)2R7b ; où R7a and R7b sont indépendamment choisis parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à C4; R3 est choisi parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à C4 et biphényle ; et 5 R4 est choisi parmi les radicaux alkyle en C1 à C10, alcényle en C1 à C4, oxétanyle, tétrahydrofuranyle, cyclohexyle, (oxopyrrolidinyl)éthyle, tétrahydropyranyle, phényle, et benzyle, où lesdits alkyle en C1 à C10, alcényle en C1 à C4, oxétanyle, tétrahydrofuranyle, cyclohexyle, (oxopyrrolidinyl)éthyle, tétrahydropyranyle, phényle, et benzyle de R4 peuvent être éventuellement substitués par 1 à 3 radicaux indépendamment choisis parmi hydroxy, 10 alkyle en C1 à C4 et halogénoalkyle en C1 à C4. Dans un mode de réalisation, l'antagoniste d'AhR de formule (I) est StemRegenin 1 (S Ri), c'est-à-dire le 4-(2-(2-(benzo[b]thiophén-3-y1)-9-isopropy1-9H-purin-6- ylamino)éthyl)phénol. Durant l'étape a0), l'antagoniste d'AhR est typiquement présent dans le milieu de 15 culture à une concentration de 10 nM à 10 pM, par exemple de 100 nM à 7,5 pM, en particulier de 1 à 5 pM. Dans un autre mode de réalisation, les HSC sont co-cultivées avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC) dans le milieu de culture comprenant de la 20 LDL, du SCF, de la TPO, de l'IL-6 et de l'IL-9. Comme le montrent les inventeurs dans l'exemple qui suit, l'effet de la co-culture avec des hMSC est inversé par l'addition de l'agoniste d'AhR FICZ, et la co-culture avec des hMSC diminue considérablement la transcription de CYP1B1, une cible en aval d'AhR. Ces résultats étayent donc qu'une coculture avec des hMSC a un effet antagoniste sur la voie d'AhR. 25 Conformément à un mode de réalisation, lesdites hMSC sont obtenues par un procédé comprenant : i) l'isolation de cellules mononucléaires de moelle osseuse (BM-MNC) à partir d'un sujet humain en bonne santé par gradient de densité Ficoll ; ii) l'ensemencement des BM-MNC isolées dans un milieu de culture comprenant 30 5 à 15 % de sérum de veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de facteur 2 de croissance des fibroblastes (FGF-2), par exemple 1 ng/ml de FGF-2 ; iii) la culture des cellules ensemencées pendant deux jours, la mise au rebut des cellules non adhérentes et l'ensemencement des cellules adhérentes collectées ; 35 iv) la culture des cellules adhérentes dans un milieu de culture comprenant 10 % de sérum de veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de FGF-2 (par exemple 4 ng/ml), 3039166 9 avec remplacement du milieu de culture deux fois par semaine par du milieu de culture frais jusqu'à confluence ; et la récolte des hMSC, l'ensemencement et la culture des cellules récoltées jusqu'à confluence dans un milieu de culture comprenant 10 % de sérum de 5 veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de FGF-2. A l'étape ii), les BM-MNC sont ensemencées par exemple à une densité cellulaire de 104 cellules/cm2. La récolte des hMSC est effectuée typiquement en utilisant de la trypsine. Les cellules sont ensuite typiquement ensemencées à une densité cellulaire de 500 cellules/cm2 et elles 10 sont cultivées jusqu'à confluence (premier passage, P1). Les hMSC présentent une absence d'expression de CD45, CD14, CD34 et CD31, conjointement avec une forte expression de CD73, CD90 et CD105. Les hMSC peuvent être maintenues dans un milieu de culture comprenant 10 % de sérum de veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de FGF-2, par exemple 2 ng/ml de FGF-2. 15 Les hMSC sont utilisées dans une couche confluente et les cellules CD34 + sont typiquement ajoutées à la densité cellulaire spécifiée ci-dessus. Le milieu de culture utilisé pour la production et le maintien des hMSC est n'importe quel milieu de culture convenant pour la culture de cellules mésenchymateuses, tel qu'a-MEM. 20 Pour produire des cellules progénitrices de MK, dans l'étape a0), la culture des HSC est menée pendant 6 à 8 jours, de préférence 7 jours. Les cultures sont typiquement incubées à 37°C, dans des conditions normoxiques (c'est-à-dire 20-21 % d'02) et avec 5 % de CO2. A la fin de la période de culture, la culture comprend des cellules CD34+CD41dim qui 25 sont isolées à partir de la culture cellulaire par tout procédé convenable connu de l'homme du métier. Typiquement, les cellules en suspension sont récoltées et lavées avec un tampon convenable tel que le PBS. Des procédés pour isoler la population de cellules CD34+CD41d", basés sur les 30 marqueurs CD34 et CD41, utilisent une cytométrie en flux, plus spécifiquement une technologie de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). A cette fin, les cellules en suspension récoltées à partir de la culture cellulaire sont incubées avec un mélange d'anticorps anti-CD34 et anti-CD41 marqués. L'incubation peut typiquement être effectuée pendant 20 à 40 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées avant tri cellulaire par 35 FACS. 3039166 10 Seules les cellules CD34+CD41dim viables sont sélectionnées à partir de la population cellulaire récoltée. Conformément à ce mode de réalisation, les cellules lavées sont encore incubées avec un marqueur fluorescent de viabilité cellulaire, tel que la 7-aminoactinomycine D (7-AAD) ou Hoechst, qui sont des marqueurs d'ADN. L'incubation est typiquement 5 effectuée pendant 20 à 40 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées avant tri cellulaire par FACS. Les grilles de morphologie et de tri FACS sont typiquement positionnées comme suit : - CD34 : de 1002 à 101,2; - CD41 : de log 101 à log102. 10 La population de cellules CD34+CD41dim peut être facilement identifiée puisqu'une culture en présence d'un antagoniste d'AhR, tel que SRI, conduit à une population de cellules CD34+CD41+ présentant une intensité de fluorescence moyenne inférieure aux conditions témoins et qui peut être identifiée comme représenté sur la Figure 10. Les cellules CD34+CD41dim sélectionnées sont caractérisées par l'une quelconque des 15 caractéristiques suivantes, ou leur combinaison : -une petite taille, typiquement FSC : 200-400, SSC : 200; - une faible ploklie, typiquement 2n-4n ; - une forte capacité de maturation en MK purs ; typiquement, une cellule CD34+CD41dim peut générer 2 à 3 MK. 20 Le procédé décrit ici produit au moins 150 000 cellules CD34+CD41dim par HSC ensemencée, en particulier par cellule CD34+. L'invention concerne en outre une population cellulaire essentiellement pure de progéniteurs de MK, dans laquelle au moins 80 %, de préférence au moins 85 ci/o, 90 °/0, 95 25 % des cellules de la population sont des cellules CD34+CD41 dim. Dans un mode de réalisation, ladite population cellulaire essentiellement pure de progéniteurs de MK comprend au moins 150 000 cellules CD34+CD41 dim. Ladite population cellulaire essentiellement pure de progéniteurs de MK peut être obtenue, ou est obtenue, par le procédé de production de cellules progénitrices de 30 mégacaryocytes (MK). Production de plaquettes et/ou de méqacarvocvtes (MK) portant des proplaquettes L'invention met en outre à disposition un procédé pour produire des plaquettes et/ou des mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes, comprenant : 35 c) la culture de ladite population isolée de cellules CD34+CD41d" de progéniteurs de MK dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la thrombopoïétine (TPO), en 3039166 11 présence d'un antagoniste du récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par coculture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes ; et 5 d) la collecte de ladite population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes. Pour la culture, les cellules CD34+CD41d" sont typiquement ensemencées à une densité cellulaire de 1 à 10 x 104 parmi de milieu de culture sans sérum, par exemple 2 à 6 x 10 104 parmi. Pour la production de plaquettes et/ou de MK portant des proplaquettes, le milieu de base est complémenté avec de la TPO et la culture se déroule en présence d'un antagoniste d'AhR. Les expressions "milieu de culture sans sérum", "milieu de base" et "antagoniste du 15 récepteur d'hydrocarbures aromatiques(AhR)" sont telles que définies précédemment. Dans un mode de réalisation, le milieu de culture comprend 20 à 100 ng/ml de TPO, de préférence 25 à 65 ng/ml, mieux encore 40 à 60 ng/ml. Dans l'étape a), un antagoniste d'AhR, en particulier un composé de formule (I) : L2 R3 R N 1 R4 20 telle que définie ci-dessus, ou une co-culture avec des hMSC, est utilisé indépendamment de l'antagoniste d'AhR ou de la co-culture avec des hMSC, utilisé dans l'étape a0) pour produire des cellules CD34+CD41 dim. Par conséquent, pris tous ensemble, les modes de réalisation suivants sont envisagés par l'invention : 25 - dans les deux étapes a0) et a), un antagoniste d'AhR est utilisé, en particulier un composé de formule (I), ou une co-culture avec des hMSC est effectuée; - dans l'étape a0), un antagoniste d'AhR est utilisé, en particulier un composé de formule (I), tandis que dans l'étape a) une co-culture avec des hMSC est effectuée; et - dans l'étape a0), une co-culture avec des hMSC est effectuée, et dans l'étape a), un 30 antagoniste d'AhR est utilisé, et en particulier un composé de formule (I). 3039166 12 Les cultures sont typiquement incubées à 37°C dans des conditions normoxiques (c'est-à-dire 20 à 21 % d'02) et avec 5 °A de CO2. Dans un mode de réalisation, l'étape a) de culture se déroule pendant 5 à 9 jours, de préférence pendant 6 à 8 jours, mieux encore pendant environ 7 jours. 5 A la fin de la période de culture, les cellules en suspension sont récoltées à partir de la culture, et des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes présents dans la culture cellulaire sont ainsi collectés. Les MK portant des proplaquettes peuvent être identifiés par microscopie avec contraste de phases, par détection des cellules rondes et portant des proplaquettes. 10 Dans un mode de réalisation, le procédé comprend en outre la sélection de cellules CD41/CD61+ et CD42c+ à partir de la population cellulaire collectée comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes. Les plaquettes ou les particules analogues à des plaquettes sont identifiées comme des événements positifs doubles CD41 15 et CD42c, ayant les mêmes propriétés de diffusion que les plaquettes sanguines humaines. Après tri cellulaire basé sur les marqueurs CD41 et CD42c, la population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes comprend typiquement au moins 75 %, de préférence 80 °/0, 85 %, 90 %, 92 % ou 95 % de plaquettes et/ou MK portant des proplaquettes. 20 De préférence, la population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes comprend au moins 50 000 cellules CD41+ CD42c+, obtenues à partir de 20 000 cellules ensemencées CD34+CD41dim. Environ 90 % des MK produits par utilisation d'un antagoniste d'AhR tel que SR1, et environ 50 % des MK produits par utilisation d'une co-culture avec des hMSC, sont des MK portant des proplaquettes. 25 Le procédé décrit ici produit donc au moins 2, de préférence au moins 2,5, par exemple 2,7 MK portant des proplaquettes par cellule CD34+CD41d" ensemencée. On obtient environ 1.106 plaquettes à partir de 20 000 cellules CD34+CD41dim, donc environ 50 plaquettes par cellule CD34+CD41dim ensemencée. 30 Le procédé pour produire des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes peut en outre comprendre un lavage des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes collectés, et la mise en suspension des cellules lavées dans un tampon de perfusion. Cela peut facilement être réalisé en culottant les cellules par centrifugation, par exemple pendant 10 minutes à 1000 g, et en remettant les cellules en suspension dans du 35 tampon de perfusion, par exemple du HSA à 5 % (Baxter) à une concentration comprise entre 107 et 1010 plaquettes et/ou MK portant des proplaquettes par ml. , 3039166 13 Le procédé de l'invention peut produire des plaquettes d'une manière spécifique du patient par utilisation de cellules CD34+ appariées à un HLA. Compositions et traitements thérapeutiques 5 L'invention concerne en outre une composition comprenant une population cellulaire de plaquettes et/ou de mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes, en particulier de cellules CD41 et CD42c+, et un tampon de perfusion pouvant être obtenu, ou obtenu, par le procédé de l'invention. L'invention concerne aussi ladite composition pour son utilisation pour une transfusion 10 allogénique ou autologue. Dans un mode de réalisation, dans la composition pour utilisation en transfusion, ladite utilisation comprend la préparation de plaquettes et/ou de mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes par un procédé selon l'invention. Il est en outre mis à disposition un procédé de transfusion d'un patient en ayant besoin, qui comprend : 15 a) la préparation d'une composition comprenant une population cellulaire de plaquettes et/ou de mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes et un tampon de perfusion par le procédé de l'invention ; b) la transfusion de ladite composition à un patient en ayant besoin. Le sujet selon l'invention est un mammifère, tel qu'un rongeur, un canidé, un félidé ou 20 un primate. De préférence, le sujet est un humain. Le nombre de cellules transfusées prend typiquement en considération des facteurs tels que le sexe, l'âge, le poids, le type de maladie ou trouble, le stade du trouble, le pourcentage des cellules souhaitées dans la population cellulaire et la quantité de cellules nécessaire pour produire un bénéfice thérapeutique. Dans un mode de réalisation particulier, 25 la composition est administrée par perfusion intraveineuse et comprend au moins 108 plaquettes/kg, de 109 à 1019 plaquettes/kg ou plus si nécessaire. Une dose de perfusion est typiquement d'environ 3 à 5 x 1011 plaquettes. L'invention va être davantage illustrée au vu des figures et exemples qui suivent. 30 FIGURES Figure 1 : Préservation de l'expression de CD34 dans des MK cultivés en présence de SRI. (A) Protocole de différenciation de MK. Des cellules CD34+ de sang périphérique ont été cultivées en l'absence (Ctrl) ou en présence de SRI (1 pM) dans un 35 milieu sans sérum contenant un cocktail de cytokines CC220 du jour 0 au jour 7 et avec de la TPO (30 ng/ml) du jour 7 au jour 14. (B) Niveau de prolifération. Les cellules viables ont 3039166 14 été comptées les jours 7 et 10 de la culture au moyen d'un compteur de cellules automatique et le facteur d'augmentation par rapport à l'introduction de cellules CD34+ le jour 0 a été calculé. (C) Proportion de cellules CD34+. La proportion de cellules CD34+ a été déterminée les jours indiqués par cytométrie en flux après marquage avec un mAb anti-CD34 conjugué à 5 R-PE-Cy5. Les expériences ont été effectuées au moins trois fois (moyenne ± erreur-type sur la moyenne (SEM) ; ANOVA bilatérale et post-test de Bonferroni, n.s. P> 0,05, *** P 20 0,05). Figure 3 : Emergence d'une population CD34+CD41dim en présence de SR1. Des cellules CD34+ ont été cultivées comme pour la Figure 1A et des analyses ont été effectuées les jours 7 et 10. (A) Evolution de l'expression de CD34 et CD41. Tracés de points de cytométrie en flux représentatifs en l'absence (Ctrl) ou en présence de SR1. Le jour 7, ont 25 été observées trois populations principales qui étaient CD34+CD41" (violet), CD34+CD41+ (rouge) et CD34-CD41+ (bleu) et qui représentaient respectivement 23,1 ± 1,3 %, 59,9 ± 2,3 % et 9,7 ± 1,1 % de la composition totale pour le témoin, contre 22,4 ± 1,5%, 68,9 ± 1,8% et 3,6 ± 0,3% en présence de SR1. Le jour 10, les deux populations principales étaient CD34- CD41+ et CD34+CD41+. Les cellules CD34-CD41+ représentaient 51,6 ± 4,9 % des cellules 30 pour le témoin contre 26,7 ± 4,5 % en présence de SR1. La population CD34+CD41+ (en rouge) était plus abondante dans les cultures traitées au SR1 (55,1 ± 4,9 °/0) que dans les conditions témoins (32,1 ± 0,7 %). Une sous-population CD34+CD41+ (région R2) avec un niveau intermédiaire d'expression de CD41, définie comme étant CD34+CD41dIm, était prédominante dans les cultures avec SR1. (B) Proportion de cellules CD34+CD41dun. 35 Diagramme en bâtons représentant le pourcentage de cellules CD34+CD41d" triées dans R2, qui était de 16,8 ± 1,4 % des cellules totales dans le témoin contre 36,8 ± 1,9 % après 3039166 15 traitement au SRI (moyenne ± SEM de 8 expériences ; test t de Student, ***P 0,05). (C) Quantification de plaquettes dérivées de la culture. La suspension cellulaire a été soumise à de multiples pipetages le jour 14 de la culture et les éléments analogues à des plaquettes ont été détectés et comptés par cytométrie en flux (moyenne ± SEM de 3 expériences : test t de Student, * P 90 %) des 3039166 23 produits de transcription de CYP1B1, reproduisant l'effet de SRI (Figure 5E), cet effet étant inversé par l'addition de FICZ (Figure 7B). Ces résultats indiquent que les MSC, d'une manière similaire à SR1, favorisent la maturation des MK et la production des plaquettes en agissant sur l'AhR. 5 Cette réponse ressemble à celle obtenue avec SR1, permettant ainsi de déterminer le phénotype CD34/CD41 des cellules. Une population ayant le profil CD34+CD41d" était clairement apparente au jour 10 de la co-culture (Figure 8A), et représentait 30,37 ± 1,98 % des cellules totales, en comparaison avec 18,95 ± 1,75 °A dans les cultures témoins sans MSC (Figure 8B). Cette population présentait une faible ploïdie (Figure 8C). 10 Il a ensuite été recherché si i) les cellules CD34+CD41dim dérivées de SRI et de MSC avaient le même potentiel pour produire des MK matures et ii) une co-culture avec des MSC ou en présence de SR1 favorisait de façon similaire cette maturation. Des cellules CD34+ ont été cultivées avec SR1 ou sur des MSC et les cellules CD34+CD41dim correspondantes ont été triées le jour 10 (Figure 9). Ces cellules ont ensuite été sous cultivées pendant 7 jours 15 avec de la TPO, avec de la TPO et du SR1, ou avec de la TPO et des MSC. Les résultats montrent que les cellules CD34+CD41dim dérivées de MSC présentaient une plus forte capacité à produire des MK portant des plaquettes quand elles étaient cultivées en présence de SR1 (Figure 9A, cadre de gauche), mais avec moins d'efficacité que les cellules dérivées de SR1 (Figure 9B, cadre de gauche) (49,5 ± 10,5 % contre 91,0 ± 2,4 `)/0, respectivement, n 20 = 4). De plus, une co-culture avec des MSC amplifiait la maturation des MK de cellules CD34+CD41dIm tant dérivées de MSC (Figure 9A) que dérivées de SRI (Figure 9B) (53,3 ± 10,7 % contre 67,5 ± 12,6 %, respectivement), en comparaison avec une culture avec de la TPO seule (%).Des profils similaires ont été observés pour la capacité à libérer des particules analogues à des plaquettes (Figures 9A-B, cadres de droite). Ainsi, une co-culture 25 avec des MSC phénocopie les réponses obtenues par addition de SR1 à des cultures cellulaires. En conclusion, il est rapporté ici l'identification et l'enrichissement d'une population discrète de progéniteurs hématopoïétiques adultes amorcés pour la différenciation des MK 30 qui peuvent efficacement mûrir en MK portant des proplaquettes. Cette population, identifiée au moyen de sa signature CD34+CD41dim, a été amplifiée quand des cellules CD34+ adultes ont été cultivées en présence de SR1, un antagoniste de l'AhR, ou d'une monocouche de MSC. La culture avec SR1 ou des MSC, en plus de favoriser l'apparition de ce progéniteur de MK, améliore fortement le rendement en MK produisant des proplaquettes et la libération 35 d'éléments analogues à des plaquettes. 3039166 24 Plusieurs caractéristiques de la population CD34+CD41d'm identifiée ici dans le système humain, telles que la petite taille et la faible ploklie des cellules ainsi que leur forte capacité à mûrir en MK purs capables d'étendre efficacement des proplaquettes, s'avèrent correspondre à la définition d'un progéniteur ayant une préférence pour les plaquettes. Son 5 phénotype distinctif combine une signature de progéniteur CD34+ avec une expression intermédiaire ou faible du marqueur mégacaryocytaire CD41. Des cellules positives à CD41 ont été décrites parmi les cellules CD34+ humaines isolées directement à partir de moelle osseuse ou après culture dans des conditions favorisant les MK (Debili N. et al., Blood. 1992 ; 80 : 3022-3035 ; Dercksen MW et al., Blood. 1995 ; 86 : 3771-3782). Toutefois, ces 10 populations ne récapitulaient par complètement le phénotype CD34÷CD41dir" puisqu'elles s'avéraient exprimer des niveaux plus élevés de CD41 et qu'elles étaient fortement polyploïdes et incapables de proliférer (Dercksen MW et al., Blood. 1995; 86 : 3771-3782). Des cellules CD34+CD41+ ont aussi été observées après co-culture de cellules CD34+ dérivées de moelle osseuse sur des hMSC sans TPO, mais aucune preuve d'une sous- 15 population CD41d1m distincte n'a été apportée (Cheng L. et al., Journal of cellular physiology. 2000 ; 184 : 58-69). Des cellules ayant un phénotype CD34+CD41'" représentant une population très mineure ont été récemment identifiées dans des cultures dérivées de sang périphérique, mais elles n'ont pas été caractérisées davantage. La population CD34+CD41dim présentait une fréquence similairement faible dans nos cultures standard (Fig. 3A), et ne 20 devenait apparente qu'après l'addition de SRI ou une co-culture avec des MSC. Une population mégacaryoblastique CD31+CD34+CD41+ ressemblant aux cellules décrites ici a été récemment observée dans des cellules iPS reprogrammées, cultivées dans un système sans sérum en trois étapes. Cette population s'avérait exprimer des niveaux faibles de CD41 et était négative pour CD42. REVENDICATIONS1. Procédé ex vivo pour produire des plaquettes et/ou des mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes, comprenant : a) la culture d'une population isolée de cellules CD34*CD41d" de progéniteurs de MK dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la thrornbopoïétine (TPO), en présence d'un antagoniste de récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par coculture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des 10 MK portant des proplaquettes ; et b) la collecte de ladite population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape a) de culture est 15 effectuée pendant 5 à 9 jours. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le milieu de culture sans erum comprend 20 à 100 ng/ml de TPO. 20 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, lequel procédé comprend, avant l'étape a) : a0) la culture de cellules souches hématopoïétiques (HSC) dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la lipoprotéine de basse densité (LDL), du facteur des cellules souches (SCF), de la TPO, de l'IL-6 et de l'IL-9, en présence d'un antagoniste de 25 récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par co-culture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des cellules CD34+CD41dim ; et al) l'isolation desdites cellules CD34+CD4ldim à partir de ladite population de cellules. 30 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le milieu de culture sans sérum de l'étape a0) comprend 10 à 30 pg/m1 de LDL, 25 à 100 ng/ml de SCF, 40 à 50 ng/ml de TPO, 20 à 30 ng/ml d'IL-6 et 20 à 30 ng/ml d'IL-9. 35 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel l'étape a0) de culture est effectuée pendant 6 à 8 jours. 7. Procédé selon l'une quelconque aes revedications 1 à 6, dans lequel, dans les étapes a) et a0), indépendamment, l'antagoniste d'AhR est un-composé de formule (I) ,R -,geet .2 1 R4 L est choisi parmi -NR5a(C1-102-3-, -NR5a(CH2)2NR5b-, -NR5,(CH2)2S-, -NR5aCH2CH(CM1)- et - NR5aCH(CH3)CH2- ; où R5a et R5b sont indépendamment choisis parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à C4; Ri est choisi parmi les radicaux thiophényle, furanyle, benzimidazolyle, isoquinolinyle, imidazopyridinyle, benzothiophényle, pyrimidinyle, pyrazolyle, pyridinyle, imidazolyle, 10 pyrrolidinyle, pyrazinyle, pyridazinyle, pyrrolyle et thiazolyle ; où lesdits thiophényle, furanyle, benzimidazolyle, isoquinolinyle, imidazopyridinyle, benzothiophényle, pyrimidinyle, pyrazolyle, pyridinyle, imidazolyle, pyrrolidinyle, pyrazinyle, pyridazinyle, pyrrolyle et thiazolyle de R1 sont éventuellement substitués par 1 à 3 radicaux indépendamment choisis parmi halogéno, cyano, alkyle en C1 à C4, halogénoalkyle en C1 à C4, alcoxy en C1 à C4, - 15 S(0)0-2R8a, et -C(0)0R8a, où R5a est choisi parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à C4 R2 est choisi parmi -S(0)2NR6aReb, -NR6,C(0)NR6bRec, phényle, pyrrolopyridinyle, indolyie, thiophényle, pyridinyle, triazolyle, pyrazolyle, et indazolyle ; où R6b et R6, sont indépendamment choisis parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à 20 C4; et ledit phényle, pyrrolopyridinyle, indolyle, thiophényle, pyridinyle, triazolyle, oxoimidazolidinyle, pyrazolyle, ou indazolyle de R2 est éventuellement substitue Of 1 à 3 radicaux indépendamment choisis parmi hydroxy, halogéno, méthyle, méthoxy, 25 amino, -0(CH2)nNR7aR7b, -0S(0)2NR7aR7b et -NR7aS(0)2R7b ; OÙ R7a and R7b sont indépendamment choisis parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en Cl à C4; R3 est choisi parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à C4 et biphényle ; et R4 est choisi parmi les radicaux alkyle en C1 à Clo, alcényle en Ci à C4, oxétanyle, tétrahydrofuranyle, cyclohexyle, (oxopyrrolidinyl)éthyle, tétrahydropyranyle, phényle, et 30 benzyle, où lesdits alkyle en C1 à C10, alcényle en C1 à C4, oxétanyle, tétrahydrofuranyle, cyclohexyle, (oxopyrrolidinyl)éthyle, tétrahydropyranyle, phényle, et benzyle de R4 peuvent 3039166 27 être éventuellement substitués par 1 à 3 radicaux indépendamment chesis pare hydroxy, alkyle en C1 à C4 et halogénoalkyle en C1 à C4- 8. Procédé selon l'une quelconque des revendibâtini '1 à 7, dans lece.101,4ans l'étape a) et/ou a0), l'antagoniste d'AhR est StemRegenin 1 (SRI). 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l'étape a) et/ou l'étape a0) sont effectuées par co-culture avec des hMSC. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel lesdites hMSC sont obtenues par un procédé comprenant : I) l'isolation de cellules mononucléaires de moelle osseuse (BM-MNC) à partir d'un sujet humain par gradient de densité Ficoll ; ii) l'ensemencement des BM-MNC isolées dans un milieu de culture comprenant 5 à 15 % de sérum de veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de facteur 2 de croissance des fibroblastes (FGF- 2) , iii) la culture des cellules ensemencées pendant deux jours, la mise au rebut des cellules non adhérentes et l'ensemencement des cellules adhérentes collectées ; iv) la culture des cellules adhérentes dans un milieu de culture comprenant 10 % de sérum de veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de FGF-2, avec remplacement du milieu de culture deux fois par semaine par du milieu de culture frais jusqu'à confluence ; et v) la récolte des hMSC, l'ensemencement et la culture des cellules récoltées jusqu'à confluence dans un milieu de culture comprenant 10 % de sérum de veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de FGF-2. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, qui comprend en outre la sélection de cellules CD41/CD61+ et CD42c+ à partir de la population cellulaire collectée comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, qui comprend en outre le lavage des plaquettes et/ou des mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes et la mise en suspension des cellules lavées dans un tarr1pon de perfusion. 13. Procédé pour produire des cellules progénitrices de mégacaryocytes (MK), comprenant : 28 a0) la culture de cellules souches hématopoïétiques (HSC) dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la lipoprotéine de basse densité (LDL), du facteur des cellules souches (SCF), de la TPO, de l'IL-6 et de l'IL-9, en présence d'un antagoniste de récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par co-culture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des cellules CD34+C041de ; et al) l'isolation desdites cellules CD34+CD41dim à partir de ladite population de cellules. 14. Procède- selon la revendication 13, dans lequel l'étape a0) est effectuée 10 comme défini dans les revendications 5à 11. 15. Population cellulaire es_sentiellement pure de progéniteurs de mégacaryocytes (MK), dans laquelle au moins 80 % des cellules dans la population sont des cellules CD34+CD41d", laquelle population cellulaire peut être obtenue par le procédé de la 15 revendication 13 ou 14. 16. Composition comprenant une population cellulaire de plaquettes et/ou de mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes et un tampon de perfusion pour utilisation en transfusion, dans laquelle ladite utilisation comprend la préparation de plaquettes et/ou de 20 mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes par un procédé selon la revendication 12.