Brevet FR3042507A1 — publié le 20170421

La présente invention concerne un procédé d'analyse d'un échantillon, notamment d'un échantillon de vin, pour la présence éventuelle de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis résistantes aux sulfites, ainsi qu'un kit pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. L'invention concerne également l'utilisation, pour l'analyse de la présence éventuelle, dans un échantillon, de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis résistantes aux sulfites, d'un couple d'amorces apte à amplifier une séquence nucléotidique spécifique des levures appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques de l'espèce Brettanomyces bruxellensis. Les levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis (également nommée Dekkera bruxellensis) constituent une des sources d'altération majeures des boissons fermentées, telles que le vin, la bière, le cidre, etc., et, plus particulièrement, la première cause de contamination des vins. Ces levures produisent en particulier des quantités importantes de phénols volatils, qui confèrent au vin un goût et une odeur désagréables, dont la description couramment utilisée est « odeurs d'écurie » ou « sueur de cheval ». Cette contamination peut être la cause de pertes économiques importantes, surtout lorsqu'elle touche les vins rouges élevés en fûts de bois. L'altération par Brettanomyces bruxellensis touche en effet environ 25 % des vins rouges, et elle entraîne un rejet quasi-systématique des vins par les consommateurs. Les praticiens chargés de l'élaboration des vins disposent à l'heure actuelle de plusieurs méthodes pour lutter contre l'altération des vins par Brettanomyces bruxellensis. Parmi ces méthodes, on peut citer les méthodes de prédiction de la présence de ces levures dans le vin, au moyen de logiciels tels que ceux commercialisés sous les noms de Bret'Less® et Brett Scoring®, qui évaluent, pour un vin donné, le risque de contamination en fonction de la composition des moûts et du vin, et des pratiques oenologiques sur le lieu d'élaboration du vin ; les méthodes de détection quantitatives ou semi-quantitatives de la présence de telles levures, notamment par étalements sur milieu sélectif de cette espèce, réaction de polymérisation en chaîne, ou cytométrie de flux, l'outil 3042507 2 semi-quantitatif Veriflow® Brett, qui permet de préciser les niveaux de population de Brettanomyces bruxellensis dans un échantillon, pouvant être cité en particulier ; ou encore les méthodes curatives, dont le but est d'éliminer les phénols volatils produits, par exemple au moyen d'adsorbants tels que des 5 écorces de levure, des charbons actifs, etc. Aucune de ces méthodes ne s'avère cependant réellement satisfaisante. Les méthodes curatives, par exemple, ont généralement un impact organoleptique sur les vins traités. Un autre type de méthodes couramment mises en oeuvre pour se prémunir de la présence de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis 10 dans le vin sont les méthodes de lutte contre ces levures. Parmi elles, on peut citer la filtration, les traitements au chitosane, etc. Ces méthodes présentent cependant les inconvénients d'une mise en oeuvre complexe, et de nécessiter des investissements coûteux, et elles ont souvent un impact négatif sur la qualité organoleptique des vins. 15 La méthode de lutte contre les levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis la plus répandue, car la moins contraignante à mettre en oeuvre, est la méthode connue sous le nom de sulfitage, qui consiste à ajouter du dioxyde de soufre dans le vin, de sorte à tirer notamment profit des propriétés antioxydantes et antimicrobiennes du soufre. Cette méthode s'avère cependant 20 inefficace lorsque les souches de Brettanomyces bruxellensis présentes dans le vin sont résistantes aux sulfites. Il a en effet été montré par l'art antérieur, comme notamment décrit dans la publication de Curtin et al., 2012, dans Letters in Applied Microbiology, 55: 56-61, que chez l'espèce Brettanomyces bruxellensis le trait phénotypique de résistance aux sulfites est souche- 25 dépendant La mise en oeuvre de la méthode de sulfitage s'avère en outre risquée car l'utilisation systématique de dioxyde de soufre à forte dose favorise l'émergence de nouvelles souches résistantes aux sulfites. Par exemple, il a été rapporté, dans la publication de Curtin et al., 2012, ci-dessus mentionnée, 30 qu'en Australie, après une dizaine d'années d'usage intensif du sulfitage pour lutter contre Brettanomyces bruxellensis, 85 % des isolats sont aujourd'hui 3042507 3 résistants aux sulfites. Par ailleurs, depuis quelques années, la politique générale en agriculture a pour objectif la diminution des intrants. En oenologie, cela se traduit par une forte pression sociétale pour la réduction des doses de sulfites employées, associée à une législation de plus en plus restrictive. 5 Ainsi, il existe à l'heure actuelle un besoin pour une méthode permettant la mise en place d'une stratégie d'utilisation raisonnée des sulfites pour le sulfitage du vin, c'est-à-dire une utilisation ciblée aux seuls vins contenant des levures Brettanomyces bruxellensis qui sont sensibles aux sulfites, pour lesquels le sulfitage présente une utilité. 10 A l'effet de proposer une telle méthode, diverses études ont été menées par l'art antérieur pour tenter de déterminer une relation entre le génotype des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis, et leurs traits phénotypiques, et plus particulièrement leur capacité de résistance aux sulfites. C'est le cas par exemple de l'étude décrite dans la publication de Curtin et al., 15 2012, ci-dessus mentionnée, qui vise à identifier, à partir de nombreux isolats de Brettanomyces bruxellensis, une relation éventuelle entre le phénotype de résistance aux sulfites et des marqueurs génotypiques de ces levures. Aucune étude n'a cependant permis à ce jour d'identifier un lien entre trait phénotypique de résistance aux sulfites et trait génotypique chez 20 Brettanomyces bruxellensis. La présente invention vise ainsi à proposer un procédé permettant de détecter de manière fiable, dans un échantillon susceptible de contenir des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis, en particulier un échantillon d'un vin, la présence de levures résistantes aux sulfites, et le cas échéant leur 25 proportion par rapport à la population totale de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis présentes, de sorte à pouvoir éviter, ultérieurement, de traiter par sulfitage des vins dont on saurait alors qu'ils contiennent des levures résistantes aux sulfites, pour lesquels un tel traitement par sulfitage s'avèrerait inefficace. 30 Un objectif supplémentaire de l'invention est que ce procédé soit 3042507 4 simple et rapide à mettre en oeuvre, et qui plus est à coût réduit et au moyen de dispositifs couramment présents dans les laboratoires d'analyse oenologique. A l'origine de la présente invention, il a été découvert par les présents 5 inventeurs que, de manière tout à fait inattendue, alors que les travaux de l'art antérieur suggéraient une relation d'interdépendance entre résistance aux sulfites et génotype des levures, la résistance aux sulfites des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis est liée non pas à un génotype particulier de ces levures, mais à leur ploïdie, c'est-à-dire non pas à la qualité des gènes 10 de ces levures, mais au nombre d'exemplaires de chromosomes qu'elles présentent. Plus particulièrement, il a été découvert par les présents inventeurs que parmi les trois groupes génétiques de l'espèce Brettanomyces bruxellensis décrits à ce jour, c'est-à-dire le groupe diploïde, le groupe triploïde oenologique et le groupe triploïde de bière, les souches de levures du groupe génétique 15 triploïde oenologique, et elles seules, sont résistantes aux sulfites. Ainsi, la présence, dans un échantillon, notamment un échantillon dont la composition en microorganismes est représentative de celle d'un vin, de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques, est indicative d'une résistance aux sulfites de levures 20 contenues dans cet échantillon, alors que l'absence de telles levures est indicative d'une sensibilité aux sulfites des levures de cet échantillon. C'est dans ce dernier cas particulier que le traitement par sulfitage s'avère d'intérêt. On entend dans la présente description, par groupe génétique des levures triploïdes oenologiques, de manière classique en elle-même, le groupe 25 des levures triploïdes dont le substrat est majoritairement le vin, en particulier le vin rouge, le jus de raisin ou le raisin, ou le matériel vitivinicole. Par groupe génétique des levures triploïdes de bière, on entend le groupe des levures triploïdes dont le substrat est majoritairement la bière, ainsi que d'autres boissons fermentées telles que le cidre, la kombucha, la téquila, etc. Des 30 exemples de souches appartenant à ces groupes, avec, pour chacune, le substrat associé, et la collection dans laquelle elle est conservée, et auprès de 3042507 5 laquelle il est possible de se la procurer, sont indiquées dans la publication d'Albertin et al., 2014, dans Food Microbiology, 42: 188-195. Ainsi, selon un premier aspect, il est proposé selon la présente invention un procédé d'analyse d'un échantillon, notamment d'une fraction d'un 5 milieu liquide tel qu'une boisson fermentée, et en particulier un vin, ou déposé sur un support solide ou semi-solide, pour la présence éventuelle de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis résistantes aux sulfites. Selon ce procédé : - on procède à une étape de détection de la présence éventuelle, 10 dans l'échantillon, de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques, - et, si on détecte une telle présence de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques, on déduit que l'échantillon contient des levures de 15 l'espèce Brettanomyces bruxellensis résistantes aux sulfites. Au contraire, si on ne détecte aucune telle présence de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques, on déduit, si l'échantillon contient des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis, que ces levures sont sensibles aux 20 sulfites. Par levures résistantes aux sulfites, on entend selon la présente invention des levures présentant la capacité de croitre en présence d'une concentration de sulfite(s) correspondant à la pratique en oenologie, c'est-à-dire de 0,4 mg/L de dioxyde de soufre moléculaire (H2503) dans le milieu. La 25 sensibilité aux sulfites correspond quant à elle à l'incapacité des levures de croitre en présence d'une concentration de dioxyde de soufre moléculaire correspondant à une quantité supérieure ou égale à 0,4 mg/L dans le milieu. Par le terme sulfites, on désigne la fraction active moléculaire du dioxyde de soufre présente dans un milieu donné. Cette fraction active peut 30 notamment résulter de l'addition dans le milieu, notamment dans le jus de 3042507 6 raisin ou le vin, de sels ou esters de l'acide sulfureux, tels que l'anhydride sulfureux, le sulfite de sodium, le bisulfite de sodium, le métabisulfite de sodium, le métabisulfite de potassium, le sulfite de potassium, le sulfite de calcium, le bisulfite de calcium, le bisulfite de potassium, etc., ainsi que de 5 dioxyde de soufre. A l'issue de la mise en oeuvre du procédé d'analyse selon l'invention, le résultat du diagnostic ainsi obtenu permet avantageusement aux praticiens d'adapter leurs pratiques oenologiques visant à éviter l'altération du vin, en particulier concernant le sulfitage, et notamment de limiter l'usage du dioxyde 10 de soufre en vinification aux cas pour lesquels cet usage s'avère vraiment utile. L'échantillon sur lequel est mis en oeuvre le procédé selon l'invention peut être un échantillon liquide, tel qu'une fraction d'un vin. Il peut autrement s'agir d'un échantillon ayant été prélevé à partir d'une surface telle qu'un sol, la paroi d'un matériel mis en oeuvre pour la vinification, par exemple une cuve, 15 etc., et déposé sur ou contenu dans un support solide ou semi-solide. De tels supports solides ou semi-solides peuvent notamment consister en des boites, lames de contact, le cas échéant gélosées, écouvillons, chiffonnettes, éponges, etc. Selon des modes de mise en oeuvre particuliers, le procédé selon 20 l'invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, mises en oeuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes. Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, l'étape de détection comprend la détection, pour des levures contenues dans l'échantillon, notamment dans un échantillon de vin, d'un marqueur moléculaire 25 spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis du groupe génétique des levures triploïdes oenologiques. Tout marqueur moléculaire spécifique de telles levures peut être visé par l'étape de détection du procédé selon l'invention. Il est du ressort de l'homme du métier d'identifier les marqueurs moléculaires permettant de 30 discriminer les levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis du groupe 3042507 7 génétique des levures triploïdes oenologiques, de celles des groupes génétiques diploïdes oenologiques et triploïdes de bière, notamment sur la base de ces connaissances générales et des données publiées concernant ces levures, notamment des données génotypiques. 5 En particulier, il a été découvert par les présents inventeurs que la séquence protéique SEQ ID No: 1 (numéro d'accession Genbank : ElF47840.1) est spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis du groupe des levures triploïdes oenologiques. La protéine présentant cette séquence, produite notamment par la souche AWRI1499 de Brettanomyces 10 bruxellensis, est connue sous le nom de « putative histone acétyl transférase saga complex component ». La souche AWRI1499 est disponible dans la collection AWMCC (AWRI Wine Microorganism Culture Collection, Glen Osmond, Australie) Ainsi, dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, 15 l'étape de détection du procédé d'analyse comprend la détection, pour des levures contenues dans l'échantillon, d'un marqueur moléculaire associé à la protéine de séquence d'acides aminés SEQ ID No: 1. Par marqueur moléculaire associé à la protéine, on entend que le marqueur moléculaire peut être constitué par la protéine elle-même, ou par tout 20 fragment de cette dernière, notamment tout fragment de taille supérieure ou égale à 30 acides aminés, ou encore par tout acide nucléique associé à cette protéine, notamment tout segment du gène codant cette protéine, ou tout segment situé en amont ou en aval de ce gène, et contenant des séquences promotrices et/ou régulatrices de ce gène. 25 En particulier, le choix d'un marqueur moléculaire de nature nucléotidique s'avère tout à fait avantageux, car le procédé d'analyse selon l'invention permet alors de réaliser une évaluation particulièrement fiable de la capacité de résistance aux sulfites des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis contenues dans l'échantillon, par analyse génétique de ces 30 levures. 3042507 8 Le marqueur moléculaire, spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis du groupe des levures triploïdes oenologiques, peut notamment être constitué par tout segment d'au moins 90 nucléotides successifs de la séquence nucléotidique de séquence SEQ ID No: 2 ou de 5 toute séquence nucléotidique présentant avec cette séquence SEQ ID No: 2 un degré d'homologie supérieur ou égal à 90 % sur 80 % ou plus de la séquence. La séquence nucléotidique SEQ ID No: 2 inclut le gène codant la protéine « putative histone acetyl transferase saga complex component » mentionnée ci-avant, ainsi que les séquences contenant les séquences promotrices et 10 régulatrices de ce gène, situées en amont et en aval de ce dernier, d'une taille d'environ 1 Kb chacune. Ainsi, dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, l'étape de détection du procédé d'analyse comprend la détection, notamment à partir d'un extrait d'acides nucléiques obtenu à partir de levures contenues 15 dans l'échantillon, d'un segment d'au moins 90 nucléotides successifs de la séquence nucléotidique de séquence SEQ ID No: 2 ou de toute séquence nucléotidique présentant avec cette séquence SEQ ID No: 2 un degré d'homologie supérieur ou égal à 90 % sur 80 % ou plus de la séquence. Toute technique de détection d'un marqueur moléculaire classique en 20 elle-même peut être mise en oeuvre dans le cadre de l'invention. Lorsque le marqueur moléculaire visé par l'étape de détection du procédé d'analyse selon l'invention est un peptide ou une protéine, cette étape de détection peut par exemple mettre en oeuvre la technique connue sous le nom d'immunoabsorption enzymatique ELISA (pour l'anglais Enzyme-linked 25 Immunosorbent Assay). Lorsque ce marqueur moléculaire est une séquence nucléotidique, l'étape de détection du procédé d'analyse selon l'invention peut en particulier mettre en oeuvre la technique de réaction de polymérisation en chaine (PCR). Ainsi, dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, 30 l'étape de détection comprend : 3042507 9 - l'extraction d'acides nucléiques de levures contenues dans l'échantillon, - l'amplification, par réaction de polymérisation en chaine, d'un locus contenant le marqueur moléculaire spécifique des levures de l'espèce 5 Brettanomyces bruxellensis du groupe des levures triploïdes oenologiques visé, - et la détection dudit marqueur moléculaire dans l'ADN ainsi amplifié, par exemple par séparation des amplicons par électrophorèse, notamment en gel d'agarose ou capillaire, et analyse de taille. A titre d'exemple, la réaction de polymérisation en chaine peut mettre 10 en oeuvre au moins une amorce nucléotidique dont la séquence nucléotidique contient une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID No: 3 et SEQ ID No: 4. Elle met de préférence en oeuvre un couple d'amorces nucléotidiques dont les séquences nucléotidiques contiennent respectivement les séquences SEQ ID No: 3 et SEQ ID No: 4. Lorsque le couple d'amorces 15 nucléotidiques mis en oeuvre présente les séquences respectives SEQ ID No: 3 et SEQ ID No: 4, il permet d'amplifier la séquence nucléotidique de séquence SEQ ID No: 7, de 263 paires de bases. Le procédé d'analyse selon l'invention peut être mis en oeuvre à partir d'acides nucléiques extraits aussi bien d'un mélange de levures contenues 20 dans l'échantillon, que de colonies individuelles de levures isolées de cet échantillon. Ainsi, dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, l'étape de détection comprend : - l'isolement, à partir de l'échantillon, de colonies de levures de 25 l'espèce Brettanomyces bruxellensis ; ceci peut par exemple être réalisé par étalement et culture des levures sur un milieu sélectif de l'espèce Brettanomyces bruxellensis, par exemple sur un milieu dit NS, pour Non-Saccharomyces ; de tels milieux sont bien connus de l'homme du métier ; - l'extraction d'acides nucléiques, notamment de l'ADN génomique, de 30 chacune de ces colonies, 3042507 10 - et la détection, dans chacun des extraits d'acides nucléiques ainsi obtenus, dudit marqueur moléculaire. Cette détection peut notamment mettre en oeuvre la technique de réaction de polymérisation en chaine, comme explicité ci-avant. 5 Un tel mode de mise en oeuvre de l'invention s'avère particulièrement avantageux, notamment en ce qu'il permet, facilement et rapidement, de comptabiliser les colonies pour lesquelles ledit marqueur moléculaire peut être détecté, par rapport au nombre total de colonies analysées, et d'en déduire la proportion approximative de levures présentes dans l'échantillon qui sont 10 résistantes aux sulfites. La connaissance d'une telle proportion approximative s'avère notamment utile pour les praticiens chargés de l'élaboration des vins, dans leur prise de décision de procéder ou non au sulfitage lors de la vinification. En effet, dans les cas où les levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis qui sont résistantes aux sulfites sont présentes en quantité 15 majoritaire dans l'échantillon, dont le contenu en levures est représentatif de celui du vin, il pourra être décidé de ne pas avoir recours au sulfitage, qui serait de peu d'efficacité et qui serait en outre associé à un risque de renforcement de la résistance aux sulfites de l'espèce. Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, le 20 procédé d'analyse comprend en outre une étape de vérification que les levures, pour lesquelles est mise en oeuvre la détection du marqueur moléculaire spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis du groupe des levures triploïdes oenologiques, appartiennent bien à l'espèce Brettanomyces bruxellensis. Cette étape peut être réalisée préalablement, ou 25 de manière concomitante, à l'étape de détection de la présence éventuelle dans l'échantillon de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe des levures triploïdes oenologiques. Elle peut notamment être mise en oeuvre par détection d'une séquence nucléotidique spécifique de l'espèce Brettanomyces bruxellensis, par exemple par 30 amplification par réaction de polymérisation en chaine au moyen d'amorces nucléotidiques appropriées, et analyse de la taille des amplicons obtenus, 3042 50 7 11 après séparation par électrophorèse par exemple. A titre d'exemple, la réaction de polymérisation en chaine, pour la vérification de l'appartenance des levures à l'espèce Brettanomyces bruxellensis, peut mettre en oeuvre au moins une amorce nucléotidique dont la 5 séquence nucléotidique contient une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID No: 5 et SEQ ID No: 6. Elle met de préférence en oeuvre un couple d'amorces nucléotidiques de séquences nucléotidiques contenant respectivement les séquences SEQ ID No: 5 et SEQ ID No: 6. Le couple d'amorces de séquences respectives SEQ ID No: 5 et SEQ ID No: 6, qui est 10 décrit dans la publication de Ibeas et al., 1996, dans Applied and Environmental Microbiology, 62: 998-1003, comme spécifique de l'espèce Brettanomyces bruxellensis, permet d'amplifier pour cette espèce une séquence nucléotidique de 470 paires de bases. A titre d'exemple, le procédé d'analyse selon l'invention peut 15 comprendre la mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaine, à partir d'ADN génomique extrait de levures contenues dans l'échantillon, au moyen de deux couples d'amorces nucléotidiques, dont un couple d'amorces spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis, et un couple d'amorces nucléotidiques spécifique des levures de cette espèce appartenant 20 au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques. Le premier couple d'amorces nucléotidiques peut notamment être le suivant : Amorce Db1 : 5' AGAAGTTGAACGGCCGCATTTGCAC 3' (SEQ ID No: 5) Amorce Db2 : 5' AGGATTGTTGACACTCTCGCCGAGG 3' (SEQ ID No: 6) 25 Le deuxième couple d'amorces nucléotidiques peut notamment être le suivant : Amorce F1 : 5' TCTTCCTCCGATCCTTTATCA 3' (SEQ ID No: 3) Amorce R1 : 5' TTGCACGATTTGTCAGAATCC 3' (SEQ ID No: 4) Lorsque ces deux couples d'amorces nucléotidiques sont mis en 3042507 12 oeuvre simultanément, après séparation des amplicons par électrophorèse, par exemple en gel d'agarose ou capillaire, le procédé selon l'invention comprend l'analyse de la taille des fragments obtenus. L'amplification d'une bande à environ 470 paires de bases (pb) confirme l'appartenance à l'espèce 5 Brettanomyces bruxellensis. L'amplification de cette seule bande à 470 pb indique en outre l'appartenance au groupe génétique des levures diploïdes ; l'amplification d'une bande supplémentaire à 356 pb indique l'appartenance au groupe génétique des levures triploïdes de bière ; et l'amplification d'une bande supplémentaire à 263 pb indique l'appartenance au groupe génétique des 10 levures triploïdes oenologiques. Le procédé selon l'invention permet ainsi avantageusement, en une seule analyse et de manière rapide, qui plus est au moyen de matériel couramment mis en oeuvre dans les laboratoires d'analyse oenologiques, tels qu'un thermocycleur et un dispositif d'électrophorèse, de déterminer la capacité 15 de résistance aux sulfites des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis contenues dans l'échantillon, et notamment de la population majoritaire de telles levures. Lorsque l'étape de détection et/ou l'étape de vérification du procédé d'analyse selon l'invention font appel à la technique de réaction de 20 polymérisation en chaine, cette technique est mise en oeuvre de manière classique en elle-même pour un homme du métier. Ainsi, elle peut être réalisée par exemple à partir de 50 à 500 ng d'ADN, au moyen de 1,5 à 3 ul\A de chaque amorce nucléotidique. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, l'étape de 25 détection du procédé d'analyse comprend la détermination de la quantité de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques présentes dans l'échantillon analysé. Cette détermination peut être mise en oeuvre par toute méthode classique en elle-même pour l'homme du métier, notamment par réaction de 30 polymérisation en chaine quantitative (qPCR), au moyen d'un couple d'amorces apte à amplifier le marqueur moléculaire spécifique des levures de 3042507 13 l'espèce Brettanomyces bruxellensis du groupe génétique des levures triploïdes oenologiques, par exemple un couple d'amorces nucléotidiques de séquences contenant respectivement les séquences SEQ ID No: 3 et SEQ ID No: 4. 5 Le procédé d'analyse selon l'invention peut en outre comprendre une étape de détermination de la quantité totale de levures à l'espèce Brettanomyces bruxellensis présentes dans l'échantillon analysé, notamment également par qPCR. Dans de tels modes de mise en oeuvre, le procédé selon l'invention 10 permet avantageusement de quantifier précisément, d'une part la population totale de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis présente dans l'échantillon, et d'autre part la proportion de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis qui sont résistantes aux sulfites. Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation, pour 15 l'analyse de la présence éventuelle, dans un échantillon, de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis résistantes aux sulfites, d'un couple d'amorces nucléotidiques apte à amplifier, par réaction de polymérisation en chaine, une séquence nucléotidique spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures 20 triploïdes oenologiques. Ce couple d'amorces nucléotidiques peut notamment être apte à amplifier un segment d'au moins 90 nucléotides successifs de la séquence nucléotidique de séquence SEQ ID No: 2 ou de toute séquence nucléotidique présentant avec cette séquence SEQ ID No: 2 un degré d'homologie supérieur 25 ou égal à 90 % sur 80 % ou plus de la séquence. Ce couple d'amorces nucléotidiques peut notamment être le suivant : Amorce F1 : 5' TCTTCCTCCGATCCTTTATCA 3' (SEQ ID No: 3) Amorce R1 : 5' TTGCACGATTTGTCAGAATCC 3' (SEQ ID No: 4) ou consister en un couple d'amorces de séquences nucléotidiques 3042507 14 contenant respectivement ces séquences SEQ ID No: 3 et SEQ ID No: 4. Un autre aspect de la présente invention concerne un kit pour la mise en oeuvre d'un procédé d'analyse selon l'invention, répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant. Ce kit comprend : 5 - un couple d'amorces nucléotidiques pour l'amplification, par réaction de polymérisation en chaine, d'une séquence nucléotidique spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques ; - et un couple d'amorces nucléotidiques pour l'amplification, par 10 réaction de polymérisation en chaine, d'une séquence nucléotidique témoignant de l'appartenance d'une levure à l'espèce Brettanomyces bruxellensis, spécifique de cette espèce. En particulier, le kit selon l'invention peut comporter : - un couple d'amorces nucléotidiques pour l'amplification, par réaction 15 de polymérisation en chaine, d'un segment d'au moins 90 nucléotides successifs de la séquence nucléotidique de séquence SEQ ID No: 2 ou de toute séquence nucléotidique présentant avec cette séquence SEQ ID No: 2 un degré d'homologie supérieur ou égal à 90 % sur 80 % ou plus de la séquence, par exemple un couple d'amorces nucléotidiques de séquences nucléotidiques 20 contenant respectivement les séquences SEQ ID No: 3 et SEQ ID No: 4 ; - et/ou un couple d'amorces nucléotidiques de séquences nucléotidiques contenant respectivement les séquences SEQ ID No: 5 et SEQ ID No: 6. Le kit selon l'invention peut également comporter au moins un, en 25 particulier plusieurs, et par exemple la totalité, des composants suivants : - un réactif de réaction de polymérisation en chaine, tel qu'une Taq polymérase, le cas échéant associée à un tampon adapté, - un réactif pour qPCR, tel qu'un réactif SYBR® Green ou une sonde moléculaire marquée pour système TaqManO, 3042507 15 - un témoin de taille moléculaire d'acides nucléiques, notamment pour analyse par électrophorèse, - un réactif d'extraction d'acides nucléiques de levures, - et/ou des instructions de mise en oeuvre des étapes d'un procédé 5 selon la présente invention. Les caractéristiques et avantages du procédé selon l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en oeuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui de la figure 1, qui représente un gel d'électrophorèse réalisé sur des 10 produits d'amplification par PCR, selon un protocole conforme à l'invention, pour : pistes 1 à 6, des clones de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis obtenus à partir d'un échantillon de vin rouge élevé en barriques ; piste 7, un témoin connu pour son appartenance au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques ; piste 8, un témoin connu pour son 15 appartenance au groupe génétique des levures triploïdes de bière ; piste 9, un témoin connu pour son appartenance au groupe génétique des levures diploïdes oenologiques ; piste 10, un témoin négatif ; la première piste correspondant au marqueur de poids moléculaire (MW). 20 EXEMPLE 1 Il est mis en oeuvre le procédé suivant, pour déterminer, pour 27 souches différentes, leur répartition dans les trois groupes génétiques : diploïde oenologique, triploïde oenologique et triploïde de bière. Pour chacune de ces 27 souches, des cellules sont prélevées à partir 25 d'un étalement sur boite de Petri, diluées individuellement dans une solution de NaOH 2OmM à une concentration d'environ 108 cellules/mL, puis la solution obtenue est chauffée pendant 10 min à 94 °C. Cette matrice, qui contient l'ADN, est utilisée pour l'étape subséquente d'amplification PCR. 3042507 16 L'étape d'amplification par PCR est réalisée conformément à l'invention, en utilisant le mélange suivant : - 311M d'amorce M13-F1 (SEQ ID No: 8 : ACGACGTTGTAAAACGACTCTTCCTCCGATCCTTTATCA) 5 - 3 i_iM d'amorce R1 (SEQ ID No: 4 : TTGCACGATTTGTCAGAATCC) - 1,5 i_iM d'amorce Db1 (SEQ ID No: 5 : AGAAGTTGAACGGCCGCATTTGCAC) - 1,5 i_iM d'amorce Db2 (SEQ ID No: 6 : AGGATTGTTGACACTCTCGCGGAGG) 10 - Taq polymerase + tampon adapté (1X Taq-&GO® de MP Biomedicals) - 1111 de matrice d'ADN en solution de NaOH (comportant entre 50 et 500 ng d'ADN). L'amorce M13-F1 contient la séquence SEQ ID No: 3, ainsi que, en 15 son extrémité 5', la séquence d'une queue M13 de 18 nucléotides. Le programme PCR est le suivant : - 5 min à 95 °C, - 35 cycles de (30 s à 95 °C ; 30 s à 57 °C ; 1 minà 72 °C), - 10 min à 72 °C. 20 A l'issue de l'étape d'amplification par PCR, les amplicons sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 2 %. A titre de témoin, il est également réalisé une réaction PCR avec le seul couple d'amorces Db1/Db2. L'apparition sur le gel d'agarose d'une seule bande à environ 470 pb, pour l'ensemble des souches testées, confirme que 25 ces souches appartiennent bien toutes à l'espèce Brettanomyces bruxellensis. Les différentes souches de Brettanomyces bruxellensis sont classées en trois groupes : les souches pour lesquelles apparait, après PCR avec les deux couples d'amorces ci-avant, la seule bande à environ 470 pb, sont 3042507 17 classées comme appartenant au groupe des levures diploïdes oenologiques ; les souches pour lesquelles apparait, en plus de cette bande à environ 470 pb, une bande supplémentaire à 356 pb, sont classées comme appartenant au groupe des levures triploïdes de bière ; et les souches pour lesquelles apparait, 5 en plus de la bande à environ 470 pb, une bande supplémentaire à 281 pb, sont classées comme appartenant au groupe des levures triploïdes oenologiques. Les 27 souches testées sont ainsi réparties en : 16 souches du groupe génétique des levures diploïdes oenologiques, 6 souches du groupe génétique 10 des levures triploïdes oenologiques et 5 souches du groupe génétique des levures triploïdes de bière. La corrélation entre la triploïdie des souches de Brettanomyces bruxellensis et leur sensibilité/résistance aux sulfites est confirmée de la façon suivante. 15 Les 27 souches de Brettanomyces bruxellensis sont cultivées dans un milieu en absence ou en présence de différentes concentrations de dioxyde de soufre SO2 dans le milieu de culture (0 mg/L, 0,2 mg/L, 0,4 mg/L et 0,6 mg/L). Après 14 jours de culture, la capacité des souches à croître dans les différents milieux est évaluée. Les résultats obtenus sont indiqués dans le 20 tableau 1 ci-dessous. Nombre de souches capables de croître Concentration en SO2 actif dans le 0 0,2 0,4 0,6 milieu de culture (mg/L) Diploïde oenologique (16 souches) 16 5 0 0 Triploïde bière (5 souches) 5 0 0 0 Triploïde oenologique (6 souches) 6 6 6 2 Tableau 1 - Evaluation de la capacité des souches de chaque groupe génétique à croître en présence de dioxyde de soufre La relation entre le groupe génétique et la capacité de résistance aux sulfites est confirmée pour toutes les souches testées. 3042 507 18 EXEMPLE 2 Un procédé conforme à l'invention est mis en oeuvre à partir d'un échantillon d'un grand vin du Châteaux X en élevage. Le prélèvement de cet échantillon avait été effectué en octobre 2014 5 sur barrique. Plusieurs volumes de cet échantillon (10 ml et 100 g sont étalés sur milieu sélectif dit NS (pour « Non-Saccharomyces »), contenant : extrait de levure (10 g/1), BactoPeptone (10 g/1), glucose (20 g/I), agar (20 g/I), chloramphénicol (0,1 mg/ml), biphényle (0,15 mg/ml), actidione (0,5 mg/ml). 10 Après 7 jours d'incubation à 30 °C, on observe, pots l'échantillon « 10 ml », la présence d'un tapis cellulaire, et, pour l'échantillon « 100 Ill », des clones isolés. Six de ces clones isolés sont prélevés, dilués individuellement dans une solution de NaOH 20 mM à une concentration d'environ 108 cellules/mL, 15 puis la solution est chauffée pendant 10 min à 94 °C. Chaque matrice d'ADN ainsi obtenue est soumise à une étape d'amplification par PCR, selon les conditions opératoires décrites dans l'Exemple 1 ci-avant. A l'issue de cette étape, chaque solution obtenue est diluée au 1/2, et 20 analysée par électrophorèse en capillaire (MultiNA, Shimadzu). Des souches témoins connues pour leur appartenance à un groupe génétique donné sont soumises au même procédé : témoin triploïde oenologique, témoin triploïde bière, témoin diploïde oenologique, de même qu'un témoin négatif, dans lequel la matrice d'ADN est remplacée par de l'eau 25 distillée. Le gel d'électrophorèse obtenu est montré sur la figure 1. Comme on peut l'observer, sur les 6 clones testés, 3 clones appartiennent au groupe diploïde oenologique (sensible aux sulfites) (pistes 1 à 3) et 3 clones appartiennent au groupe triploïde oenologique (résistant aux 3042507 19 sulfites) (pistes 4 à 6). 50 % des souches de B. bruxellensis sont ainsi résistantes aux sulfites, et 50 % y sont sensibles. EXEMPLE 3 - Test quantitatif 5 Un procédé conforme à l'invention est mis en oeuvre à partir de l'échantillon de vin de l'Exemple 2. Une extraction d'ADN total de l'échantillon est tout d'abord réalisée à l'aide du kit commercial VINEO® Extract DNA Kit de Biorad. La matrice d'ADN ainsi obtenue est soumise à une PCR quantitative. 10 A cet effet, il est mis en oeuvre le mélange suivant : - 1 à 10 i_iM de chacune des amorces M13-F1 et R1, et le cas échéant des amorces Db1 et Db2, - 1X Taq polymerase + tampon adapté + SYBR® Green PCR Supermix de Bio-Rad 15 - 50-100 ng d'ADN extrait. Une gamme étalon est également réalisée, à partir d'un échantillon de concentration connue en une souche de Brettanomyces bruxellensis connue pour appartenir au groupe triploïde oenologique. La quantité de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis 20 appartenant au groupe triploïde oenologique, donc résistantes aux sulfites, présentes dans l'échantillon de vin initial, est ainsi déterminée. En parallèle, la quantité totale de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis présentes dans l'échantillon de vin peut également être déterminée, par exemple, de manière classique en elle-même, au moyen du kit 25 VINE00 Brettanomytest Kit PCR de la société Biorad. REVENDICATIONS1. Procédé d'analyse d'un échantillon pour la présence éventuelle de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis résistantes aux sulfites, caractérisé en ce que : - on procède à une étape de détection de la présence éventuelle, 5 dans ledit échantillon, de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques, - et, si on détecte une telle présence, on déduit que ledit échantillon contient des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis résistantes aux sulfites. 10 2. Procédé d'analyse selon la revendication 1, selon lequel ladite étape de détection comprend la détection, pour des levures contenues dans ledit échantillon, d'un marqueur moléculaire spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis du groupe génétique des levures triploïdes oenologiques. 15 3. Procédé d'analyse selon la revendication 2, selon lequel ledit marqueur moléculaire est associé à la protéine de séquence d'acides aminés SEQ ID No: 1. 4. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 3, selon lequel ledit marqueur moléculaire est constitué par tout segment d'au 20 moins 90 nucléotides successifs de la séquence nucléotidique de séquence SEQ ID No: 2 ou de toute séquence nucléotidique présentant avec ladite séquence SEQ ID No: 2 un degré d'homologie supérieur ou égal à 90 % sur 80 % ou plus de la séquence. 5. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 25 4, selon lequel ladite étape de détection comprend : 3042507 21 - l'extraction d'acides nucléiques de levures contenues dans ledit échantillon, - l'amplification d'un locus contenant ledit marqueur moléculaire par réaction de polymérisation en chaine, - et la détection dudit marqueur moléculaire dans l'ADN ainsi amplifié. 6. Procédé d'analyse selon la revendication 5, selon lequel la réaction de polymérisation en chaine met en oeuvre au moins une amorce nucléotidique de séquence contenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID No: 3 et SEQ ID No: 4. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, selon lequel ladite étape de détection comprend : - l'isolement, à partir dudit échantillon, de colonies de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis, - l'extraction d'acides nucléiques de chacune de ces colonies, - et la détection, dans chacun des extraits d'acides nucléiques ainsi obtenus, dudit marqueur moléculaire. 8. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, comprenant une étape de vérification que les levures pour lesquelles est mise en oeuvre la détection dudit marqueur moléculaire appartiennent à 20 l'espèce Brettanomyces bruxellensis. 9. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, selon lequel ladite étape de détection comprend la détermination de la quantité de levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques présentes dans ledit 25 échantillon. 10. Procédé d'analyse selon la revendication 9, selon lequel ladite détermination est mise en oeuvre par réaction de polymérisation en chaine 3042 50 7 22 quantitative. 11. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant une étape de détermination de la quantité de levures à l'espèce Brettanomyces bruxellensis présentes dans ledit échantillon. 5 12. Utilisation d'un couple d'amorces nucléotidiques apte à amplifier, par réaction de polymérisation en chaine, une séquence nucléotidique spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques, pour l'analyse de la présence éventuelle, dans un échantillon, de levures de l'espèce 10 Brettanomyces bruxellensis résistantes aux sulfites. 13. Utilisation selon la revendication 12, selon laquelle ledit couple d'amorces nucléotidiques est apte à amplifier un segment d'au moins 90 nucléotides successifs de la séquence nucléotidique de séquence SEQ ID No: 2 ou de toute séquence nucléotidique présentant avec ladite 15 séquence SEQ ID No: 2 un degré d'homologie supérieur ou égal à 90 % sur 80 % ou plus de la séquence. 14. Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend : - un couple d'amorces nucléotidiques pour l'amplification, par réaction de polymérisation en chaine, d'une séquence nucléotidique spécifique des levures de l'espèce Brettanomyces bruxellensis appartenant au groupe génétique des levures triploïdes oenologiques ; - et un couple d'amorces nucléotidiques pour l'amplification, par réaction de polymérisation en chaine, d'une séquence nucléotidique 25 témoignant de l'appartenance d'une levure à l'espèce Brettanomyces bruxellensis. 15. Kit selon la revendication 14, comportant : - un couple d'amorces nucléotidiques pour l'amplification, par réaction 3042507 23 de polymérisation en chaine, d'un segment d'au moins 90 nucléotides successifs de la séquence nucléotidique de séquence SEQ ID No: 2 ou de toute séquence nucléotidique présentant avec ladite séquence SEQ ID No: 2 un degré d'homologie supérieur ou égal à 90 % sur 80 % ou plus de la 5 séquence ; - et/ou un couple d'amorces nucléotidiques de séquences contenant respectivement les séquences SEQ ID No: 5 et SEQ ID No: 6.