Brevet FR3037657A1 — publié le 20161223

INTRODUCTION L'alcool est un tératogène physique et comportemental. Chez l'Homme, l'exposition prénatale à l'alcool peut conduire à des altérations du développement cérébral. Ainsi, la consommation d'alcool au cours de la grossesse (alcoolisation foetale) constitue la première cause de handicap et notamment de retard mental d'origine non génétique au monde mais également en France. Les dommages varient selon la période où le foetus a été exposé, les taux d'alcoolémie, les facteurs génétiques et environnementaux, le mode de consommation (chronique, binge drinking). Le Syndrome d'Alcoolisation Foetale (SAF) constitue la manifestation la plus extrême et invalidante des troubles causés par l'alcoolisation foetale (TCAF). Elle associe des anomalies physiques comme une hypotrophie (retard de croissance), une dysmorphie cranio-faciale et des anomalies neurocomportementales se traduisant par des troubles des fonctions cognitives (troubles de l'attention, de la motricité, de l'apprentissage ou encore de la mémorisation). Le diagnostic des enfants SAF est relativement aisé. Sur la base des anomalies morphologiques, il peut être établi in utero ou à la naissance. En revanche, de nombreux enfants TCAF ne présentent pas les anomalies morphologiques des enfants SAF, ce qui compromet un diagnostic précoce. Pour autant, ces enfants ne sont pas dépourvus d'atteintes. Ces incapacités/handicaps seront décelé(e)s dans les premières années de vie (hyperactivité, troubles de l'attention) alors que des mois précieux de prise en charge auraient pu être valorisés dès la première année de vie. Ces déficits vont à plus long terme être associés à des inaptitudes sociales, professionnelles et familiales. Le devenir de ces enfants et leur insertion professionnelle sont donc sérieusement hypothéqués. Un diagnostic dès la naissance permettrait une prise en charge précoce de ces enfants essentielle pour réduire au maximum les incapacités associées à l'alcoolisation foetale. A ce jour des efforts importants ont été entrepris pour identifier des biomarqueurs d'exposition à l'alcoolisation foetale, c'est-à-dire des marqueurs permettant de répondre à la question : l'enfant a-t-il été exposé à l'alcool durant sa vie foetale ? Or, cette information bien qu'importante n'est pas en mesure d'améliorer à elle seule la prise en charge des nourrissons et pour plusieurs raisons. Tout d'abord, il 3037657 2 n'existe pas de seuil de toxicité à l'alcool. Autrement dit une exposition avérée ne sera pas nécessairement associée à des troubles développementaux de l'enfant. En contrepartie, une exposition épisodique à un moment clé du neurodéveloppement ne sera pas pour autant sans conséquences et la notion de fenêtre de vulnérabilité est 5 maintenant clairement admise. En outre, les modes de consommation ont fortement changé. Ainsi, chez les adolescents la consommation épisodique, comme les ivresses associées aux week-ends, est en nette augmentation aussi bien chez les filles que chez les garçons. Enfin, les biomarqueurs d'exposition développés jusqu'alors étant le plus souvent ciblés sur une exposition chronique, il existe un risque réel de faux- 10 négatifs. Il y a donc un besoin de mettre au point des biomarqueurs qui permettent de suivre les effets de l'alcoolisation in utero. DESCRIPTION La présente invention offre l'opportunité de développer un biomarqueur placentaire 15 d'atteinte cérébrale de l'alcoolisation foetale. Ce type de biomarqueur n'a jamais été développé à ce jour. En effet, les biomarqueurs actuels de l'alcoolisation foetale sont des biomarqueurs dit d'exposition qui permettent de déterminer si la mère a consommé de l'alcool au cours de la grossesse ou si l'enfant a été exposé in utero. Mais, hormis les cas les plus sévères (Syndrome d'Alcoolisation Foetale, SAF), un 20 biomarqueur d'exposition ne permet pas de conclure sur un impact cérébral d'une alcoolisation in utero. A ce jour, la majorité des enfants TCAF échappe à un diagnostic précoce. Par ailleurs, et pour des raisons économiques évidentes, il n'est pas envisageable de prendre en charge tous les enfants dont la mère aurait consommé de l'alcool pendant la grossesse. 25 La présente invention permet, contrairement aux biomarqueurs de l'art antérieur, de suivre les effets de l'alcoolisation foetale. En effet, les inventeurs ont montré que le dosage du PIGF permet d'identifier, chez les enfants exposés in utero à l'alcool, ceux qui ont subi des atteintes cérébrales. Notamment, le niveau de PIGF indique quels sont les enfants dont le système vasculaire cérébral est désorganisé, résultant 30 d'une angiogénèse cérébrale altérée. Or ces enfants, à ce jour, échappent à un diagnostic précoce. La présente invention pallie donc au déficit de diagnostic précoce observé pour les enfants TCAF, qui représentent en France 9 cas pour 1000 naissances et dont les signes cliniques (hyperactivité, troubles de l'attention...) ne 3037657 3 sont décelés que tardivement (par exemple entre 4 et 5 ans, lors de la scolarisation). La présente invention permet donc de mettre en oeuvre précocement une prise en charge adaptée de ces enfants. Cette prise en charge va notamment consister à stimuler les fonctions motrices, sensorielles et cognitives de l'enfant à une période 5 (petite enfance) où la plasticité cérébrale est maximale. Selon un premier aspect, l'invention a pour objet une méthode in vitro de diagnostic de troubles de l'alcoolisation foetale (TCAF) chez un sujet, ladite méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la quantité de PIGF dans un échantillon biologique et 10 b) détermination d'un trouble de l'alcoolisation foetale. On entend par - PIGF » ou - Placental growth factor » ou - facteur de croissance placentaire » (tous ces termes sont synonymes) une protéine de la famille des facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF). Plus particulièrement, PIGF au sens de l'invention est une protéine de 149 acides aminés hautement 15 similaire à VEGF-A qui est reconnue par le même récepteur que ce dernier, le VEGF- R1. PIGF est fortement exprimé par le placenta, mais pas par le cerveau foetal. PIGF glycosylé en N-terminus est sécrété et fonctionne en dimère pour stimuler l'angiogénèse. Le terme - PIGF » se réfère notamment à l'ensemble des 4 isoformes PIGF1-4 : PIGF-1 et PIGF-3 sont des isoformes qui ne lient pas l'héparine tandis que 20 PIGF-2 et PIGF-4 contiennent des domaines supplémentaires qui permettent de fixer l'héparine. Encore plus préférentiellement, on entend par PIGF une protéine murine dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NP_001258634 ou une protéine humaine dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NP_001193941.1. 25 On entend par - Troubles Causés par l'Alcoolisation Foetale (TCAF) » l'ensemble des troubles chez l'enfant résultant de l'exposition à l'alcool durant la gestation. Ce terme comprend entre autre l'ensemble des troubles comportementaux qui vont se révéler progressivement avec l'âge. Les enfants présentant ces troubles sont appelés des - enfants TCAF. » Dans leur version la plus sévère, les TACF correspondent au 30 syndrome d'alcoolisation foetale (SAF). Celui-ci se traduit par une dysmorphie craniofaciale (comprenant des fentes palpébrales raccourcies, un sillon naso-labial lisse, allongé, effacé et une lèvre supérieure mince) ; un retard de croissance non spécifique (taille ou poids ou périmètre crânien) prénatal ou postnatal ou les deux ; 3037657 4 et des troubles du développement neurologique s'exprimant parfois par un retard mental et plus souvent par des difficultés d'apprentissage. Les enfants atteint de SAF sont appelés des - enfants SAF. » Les inventeurs ont montré que l'exposition à l'alcool cause des atteintes vasculaires 5 cérébrales. Par - atteinte vasculaire cérébrale », on entend ici toute altération du système vasculaire cérébral, notamment une altération entrainant un fonctionnement altéré, voire défectueux dudit système. Une atteinte vasculaire cérébrale au sens de l'invention peut notamment être une désorganisation du système vasculaire cérébral. Plus particulièrement, l'alcoolisation foetale induit une 10 orientation aléatoire des vaisseaux cérébraux. Selon un mode de réalisation particulier, le trouble de l'alcoolisation foetale est lié à une atteinte vasculaire cérébrale. Encore plus particulièrement, ledit trouble de l'alcoolisation foetale est lié à une désorganisation du système vasculaire cérébral. On entend par - sujet » selon l'invention un humain, et de préférence un embryon, 15 un foetus ou un enfant. Un - embryon », tel qu'on l'entend ici, correspond à un ovocyte fécondé de moins de trois mois. Par - foetus », on entend ici un individu pris avant la naissance et dont l'âge gestationnel est compris entre 3 et 9 mois. Après l'accouchement, le sujet devient un enfant. Par - enfant », on entend selon l'invention un individu dont l'âge est inférieur à 3 ans. Sont ainsi compris dans la 20 catégorie des enfants selon l'invention, les nouveau-nés, dont l'âge est compris entre 0 et 1 mois, les nourrissons, qui ont entre 1 mois et 2 ans, et les enfants proprement dits, qui sont âgés d'au moins 2 ans. Un - nouveau-né », comme on l'entend ici, peut aussi bien être né à terme qu'être prématuré. L'expression - un sujet avec des troubles d'alcoolisation foetale » ou - sujet TCAF » 25 telle qu'utilisée ici se rapporte à un embryon, un foetus ou un sujet, en particulier humain, qui est exposé à l'alcool in utero et qui souffre de troubles d'alcoolisation foetale ou qui est en danger de développer en raison de la consommation maternelle d'alcool une des conditions liées aux troubles d'alcoolisation foetale, y compris les effets décrits ci-dessus. En particulier, un sujet TCAF possède un réseau vasculaire 30 cérébral désorganisé, ladite désorganisation étant notamment liée à une orientation aléatoire des vaisseaux cérébraux. La méthode de l'invention est particulièrement utile parce qu'elle permet de prédire de façon non invasive les déficits cérébraux. Elle permet en effet de détecter à 3037657 5 partir d'un échantillon biologique, notamment un échantillon placentaire, les sujets qui risquent de souffrir de TCAF, ce qui permet de les prendre en charge. On entend par - échantillon biologique » selon l'invention tout échantillon qui peut être prélevé à partir d'un sujet. Alternativement, l'échantillon biologique est un 5 échantillon provenant du placenta, notamment du cordon ombilical. En effet, le PIGF est exprimé par des cellules du placenta tout au long de la grossesse. Cela permet de doser le PIGF sans attenter à l'intégrité du sujet, en particulier quand celui-ci est un embryon ou un foetus. De façon générale, l'échantillon biologique doit permettre la détermination du niveau d'expression du marqueur biologique de l'invention. 10 L'échantillon à tester peut être utilisé comme obtenu directement à partir de la source biologique ou la suite d'un prétraitement pour modifier le caractère de l'échantillon. Par exemple, un tel prétraitement peut inclure la préparation de plasma à partir de sang, la dilution de fluides visqueux et ainsi de suite. Des procédés de prétraitement peuvent aussi impliquer la filtration, la précipitation, la dilution, la 15 distillation, le mélange, la concentration, l'inactivation de composants perturbateurs, l'addition des réactifs, une lyse, etc. En outre, il peut être bénéfique de modifier un échantillon d'essai solide pour former un milieu liquide ou pour libérer l'analyte. La protéine PIGF est une protéine sécrétée (DeFalco, Exp Mol Med. 44(1): 1-9, 2012). 20 Les échantillons biologiques préférés pour la détermination du niveau d'expression dudit biomarqueurs comprennent en particulier les échantillons de sang, de plasma, ou de lymphe. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de sang. De façon encore plus préféré, l'échantillon biologique est un échantillon de sang du placenta ou de sang de cordon. Celui-ci est en effet habituellement recueilli lors de 25 l'accouchement. Le sang des vaisseaux placentaires peut alors être obtenu pour mesurer le niveau de PIGF dans le sang. Cela permet ainsi un diagnostic non invasif d'un trouble de l'alcoolisation foetale, notamment d'une atteinte cérébrale. En effet, le simple dosage du PGIF dans le sang permet de déterminer si l'exposition in utero à l'alcool a entrainé des TCAF, notamment à cause d'une désorganisation 30 vasculaire cérébrale. Les inventeurs ont ainsi montré que le PIGF permet de déterminer qu'une atteinte cérébrale a eu lieu, à la différence des biomarqueurs de l'art antérieur qui ne détectaient que l'exposition du foetus à l'alcool. Le PIGF est donc un biomarqueur 3037657 6 fiable des TCAF. Par - biomarqueur », on entend au sens de la présente demande une caractéristique qui est objectivement mesurée et évaluée comme indicateur de processus biologiques normaux, de processus pathogéniques, ou de réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique. Un biomarqueur désigne donc 5 toute une gamme de substances et de paramètre divers. Par exemple, un biomarqueur peut être une substance dont la détection indique un état pathologique particulier (par exemple la présence de la protéine C activée en tant que marqueur d'une infection), ou au contraire une substance dont la détection indique un état physiologique spécifique. Le biomarqueur selon l'invention est préférentiellement un 10 gène, les produits d'un gène tels que ses transcrits et les peptides issus de ses transcrits, un lipide, un sucre ou un métabolite. Selon un mode de réalisation de la présente invention, le biomarqueur est un gène, les produits d'un gène tels que des transcrits ou des peptides, un lipide, un sucre ou un métabolite dont les changements d'expression, en particulier de niveau 15 d'expression, corrèlent avec un état physiologique de l'enfant résultant d'une exposition in utero à l'alcool. Selon un mode de réalisation particulier, le biomarqueur est un peptide ayant une activité de facteur de croissance. Le biomarqueur candidat selon l'invention est préférablement un marqueur génique, un marqueur protéique, un marqueur lipidique ou un marqueur métabolique. Pour 20 chacun de ces types de marqueurs, de nombreuses méthodes sont à la disposition de l'homme du métier pour mesurer l'expression dudit biomarqueur et ainsi identifier une différence d'expression entre les enfants exposés in utero à l'alcool et les enfants sains, c'est-à-dire n'ayant pas été exposés à l'alcool. Dans un premier mode de réalisation, ledit marqueur est un marqueur génique ou un 25 marqueur protéique. Dans ce cas, la méthode de l'invention peut comprendre une ou plusieurs étapes intermédiaires entre le prélèvement de l'échantillon de cellules cutanées et la mesure de l'expression de PGLF, lesdites étapes correspondant à l'extraction à partir dudit échantillon de placenta d'un échantillon d'ARNm (ou de l'ADNc correspondant) 30 ou d'un échantillon de protéine. Celui-ci peut ensuite être directement utilisé pour mesurer l'expression de PGLF. La préparation ou l'extraction d'ARNm (ainsi que la rétrotranscription de celui-ci en ADNc) ou de protéines à partir d'un échantillon cellulaire ne sont que des procédures de routine bien connues de l'homme du métier. 3037657 7 Une fois qu'un échantillon d'ARNm (ou d'ADNc correspondant) ou de protéine est obtenu, l'expression de PGLF, au niveau soit des ARNm (c'est-à-dire dans l'ensemble des ARNm ou des ADNc présents dans l'échantillon), soit des protéines (c'est-à-dire dans l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon), peut être mesurée. La 5 méthode utilisée pour ce faire dépend alors du type de transformation (ARNm, ADNc ou protéine) et du type d'échantillon disponible. Quand l'expression de PGLF est mesurée au niveau de l'ARNm (ou d'ADNc correspondant), n'importe quelle technologie habituellement utilisée par l'homme du métier peut être mise en oeuvre. Ces technologies d'analyse du niveau 10 d'expression des gènes, comme par exemple l'analyse du transcriptome, incluent des méthodes bien connues telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction, si on part d'ADN), la RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, si on part d'ARN) ou la RT-PCR quantitative ou encore les puces d'acides nucléiques (dont les puces à ADN et les puces à oligonucléotides) pour un plus haut débit. 15 Par - puces d'acides nucléiques », on entend ici plusieurs sondes d'acides nucléiques différentes qui sont attachées à un substrat, lequel peut être une micropuce, une lame de verre, ou une bille de la taille d'une microsphère. La micropuce peut être constituée de polymères, de plastiques, de résines, de polysaccharides, de silice ou d'un matériau à base de silice, de carbone, de métaux, de verre inorganique, ou de 20 nitrocellulose. Les sondes peuvent être des acides nucléiques tels que les ADNc (« puce à ADNc »), les ARNm (« puce à ARNm ») ou des oligonucléotides (« puce à oligonucléotides »), lesdits oligonucléotides pouvant typiquement avoir une longueur comprise entre environ 25 et 60 nucléotides. 25 Pour déterminer le profil d'expression d'un gène particulier, un acide nucléique correspondant à tout ou partie dudit gène est marqué, puis mis en contact avec la puce dans des conditions d'hybridation, conduisant à la formation de complexes entre ledit acide nucléique cible marqué et les sondes attachées à la surface de la puce qui sont complémentaires de cet acide nucléique. La présence de complexes 30 hybridés marqués est ensuite détectée. Ces technologies permettent de suivre le niveau d'expression d'un gène en particulier ou de plusieurs gènes voire même de tous les gènes du génome (full 3037657 8 genome ou full transcriptome) dans un échantillon biologique (cellules, tissus..). Ces technologies sont utilisées en routine par l'homme du métier et il n'est donc pas besoin de les détailler ici. Des exemples de mises en oeuvre de l'invention basées sur l'analyse d'expression génique (puces à ADNc) et sur la PCR quantitative sont décrits 5 dans la section expérimentale. Alternativement, il est possible d'utiliser toute technologie actuelle ou future permettant de déterminer l'expression des gènes sur la base de la quantité d'ARNm dans l'échantillon. Par exemple, l'homme du métier peut mesurer l'expression d'un gène par hybridation avec une sonde d'acide nucléique marquée, comme par 10 exemple par Northern blot (pour l'ARNm) ou par Southern blot (pour l'ADNc), mais aussi par des techniques telles que la méthode d'analyse sérielle de l'expression des gènes (SAGE) et ses dérivés, tels que LongSAGE, SuperSAGE, DeepSAGE, etc. Il est aussi possible d'utiliser des puces à tissu (aussi connues en tant que TMAs : - tissue microarrays »). Les tests habituellement employés avec les puces à tissu 15 comprennent l'immunohistochimie et l'hybridation fluorescente in situ. Pour l'analyse au niveau de l'ARNm, les puces à tissu peuvent être couplées avec l'hybridation fluorescente in situ. Enfin, il est possible d'utiliser le séquençage massif en parallèle pour obtenir déterminer la quantité d'ARNm dans l'échantillon (RNA-Seq ou - Whole Transcriptome Shotgun Sequencing »). À cet effet, plusieurs méthodes de 20 séquençage massif en parallèle sont disponibles. De telles méthodes sont décrites dans, par exemple, US 4,882,127, U.S. 4,849,077; U.S. 7,556,922; U.S. 6,723,513; WO 03/066896; WO 2007/111924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B11141399; Shendure Et Ji, Nat Biotechnol., 26(10): 1135-45. 2008; Pihlak et al., Nat 25 Biotechnol., 26(6) : 676- 684, 2008 ; Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11): 1013- 1023, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4): 40, 2009; Metzker, Nature Rev. Genet., 11(1): 31-46, 2010. Quand l'expression du marqueur est mesurée au niveau protéique, il est possible d'employer des anticorps spécifiques, en particulier dans des technologies bien 30 connues telles que l'immunoprécipitation, l'immunohistologie, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l'immunohistochimie. Parmi les autres techniques qui peuvent être utilisées sont comprises les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d'histochimie, dont notamment les méthodes de 3037657 9 microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l'utilisation d'une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltammétrie et d'annpéronnetrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de 5 radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non- confocale, détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, ou - surface plasmon resonance » en anglais, par ellipsometry, par méthode de miroir résonnant, tec.), 10 cytonnétrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrophotométrie HPLC-Mass, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier et il n'est pas nécessaire de les détailler ici. 15 De préférence, l'expression du PIGF est mesurée au niveau protéique. Plus préférablement, l'expression du PIGF est mesurée à l'aide d'un test employant des anticorps spécifiques reconnaissant ledit biomarqueur, en particulier dans des technologies bien connues telles que l'innnnunoprécipitation, l'innnnunohistologie, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à 20 anticorps, ou les puces à tissu couplées à l'immunohistochimie. Des anticorps dirigés contre PIGF sont disponibles commercialement (voir par exemple, REtD Systems, Danta Cruz, Abcam, etc.) et peuvent être utilisés dans les méthodes de l'invention. Encore plus préférablement, l'expression du PIGF est mesurée par Western Blot ou par ELISA. 25 Dans un mode préférentiel de l'invention, il peut être utile de comparer le niveau de PIGF obtenu à l'étape a) de la méthode avec un niveau de référence. Par - un niveau d'expression de référence d'un marqueur biologique », on entend au sens de la présente demande tout niveau d'expression dudit marqueur utilisé à titre de référence. Par exemple, un niveau d'expression de référence peut être obtenu en 30 mesurant le niveau d'expression du marqueur d'intérêt dans un échantillon biologique d'un sujet sain, par exemple un placenta d'un sujet sain, c'est-à-dire un sujet qui n'a pas été exposé à l'alcool in utero. Dans ce cas, un niveau de PIGF de l'étape a) inférieur au niveau de référence indique un TCÂF. En particulier, les 3037657 10 inventeurs ont montré qu'un niveau de PIGF inférieur à celui d'un sujet sain signale une organisation vasculaire cérébrale défectueuse. Selon un mode avantageux de réalisation de la présente invention, l'expression du marqueur candidat est normalisée par rapport à l'expression d'un marqueur témoin. 5 Un - marqueur témoin » selon la présente invention est un marqueur dont l'expression est identique quels que soient le type cellulaire considéré et l'âge du donneur. Selon un mode de réalisation particulier, quand le biomarqueur candidat est un marqueur génique ou un marqueur protéique, le marqueur témoin est un gène qui est exprimé dans tous les types cellulaires, indépendamment de l'âge du sujet, 10 ou son produit protéique. Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit marqueur témoin est un gène de ménage ou le produit protéique dudit gène de ménage. Un gène de ménage est un gène qui est exprimé dans tous les types cellulaires et qui fournit une fonction de base qui est nécessaire pour la survie de la cellule. Une liste de gènes de ménage humain peut par exemple être trouvée dans 15 Eisenberg et al. (Trends in Genetics 19: 362-365, 2003). Un gène de ménage préféré selon l'invention est un gène sélectionné dans le groupe constitué de B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IP08 et HMBS. La méthode de l'invention est particulièrement utile parce qu'elle permet 20 d'effectuer un diagnostic non invasif dès un âge précoce. Les enfants qui ont été diagnostiqué comme ayant subi des dommages cérébraux à la suite d'une exposition utérine à l'alcool peuvent ainsi être pris en charge précocement et rapidement. Or il a été montré que plus la prise en charge est précoce et meilleure est la récupération fonctionnelle et cognitive (Toutain et al., Pychotropes, 13 : 49-68, 2007). 25 Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode de traitement de troubles de l'alcoolisation foetale chez un sujet. Ladite méthode comprend des étapes de : a) diagnostic de TCAF chez ledit sujet par l'une quelconque des méthodes ci-dessus ; et 30 b) traitement dudit sujet si l'étape a) conclut que ledit sujet présente des TCAF. Par - traitement », on entend ici toute action permettant de diminuer ou d'éradiquer les symptômes ou les cause des TCAF. Un traitement au sens de 3037657 11 l'invention peut comprendre l'administration d'une substance pharmacologique et/ou un suivi psychothérapeutique. L'invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous. Lesdits exemples sont fournis ici à titre d'illustration et ne sont pas, sauf indication 5 contraire, destinés à être limitatifs. LÉGENDES DES FIGURES Figure 1. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'angiogénèse corticale chez les embryons E20 de Souris. A,B: Effets de l'exposition alcoolique foetale de 10 GD15 à GD20 sur l'organisation des microvaisseaux corticaux chez des animaux témoin (A) et exposés à l'alcool (B). Les microvaisseaux du cerveau ont été visualisés par immunohistochimie contre CD31. Les flèches indiquent les microvaisseaux du cerveau présentant une orientation radiale dans le groupe « Témoin ». Il faut noter une perte de l'organisation radiale dans le groupe - Alcool ». I-VI: Couches 15 corticales; CC: Corpus callosum. C: Distribution de l'orientation (catégories d'angles) des microvaisseaux corticaux dans le cortex immature de foetus GD20. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du test x2. D: Quantification par western blot des effets de l'exposition alcoolique foetale durant la dernière semaine de gestation sur l'expression corticale de CD31 à GD20. ns vs le groupe - Témoin » à l'aide d'un test t 20 non-apparié. Figure 2. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'expression des membres de la famille VEGF/PIGF chez les embryons E20 de Souris. A-E: Quantification par western blot des niveaux protéiques de VEGFA (A), PIGF (B), sVEGF-R1 (C), mVEGF-R1 (D) et VEGF-R2 dans le cortex des groupes - Témoin » et - Alcool ». F: Comparaison 25 par western blot des niveaux protéiques de PIGF dans le cortex et le placenta des embryons E20 du groupe - Témoin ». ***p REVENDICATIONS1) Méthode in vitro de diagnostic de trouble de l'alcoolisation foetale (TCAF) chez un sujet comprenant des étapes de : a) mesure de la quantité de Placental growth factor (PIGF) dans un échantillon biologique dudit sujet et ; b) détermination d'un TCAF chez ledit sujet. 2) La méthode de la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape supplémentaire de comparaison de la quantité de PIGE de l'étape a) avec une référence. 3) La méthode de l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la référence est une mesure de la quantité de PIGE dans un individu sain. 4) La méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'une quantité de PIGF de l'étape a) inférieure à la référence indique que le sujet souffre de TCAF. 5) La méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'une quantité de PLU de l'étape a) inférieure à la référence indique une désorganisation vasculaire cérébrale chez le sujet. 6) La méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit échantillon biologique provient du placenta, notamment du sang de cordon. 7) La méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que La quantité de PIGE est déterminée en mesurant la quantité d'acide nucléique PIGF. 8) La méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la quantité de PIGE est mesurée par une méthode sélectionnée parmi le Northern blot, le Southern blot, ta PCR, la RT-PCR, ta RT-PCR quantitative, le SAGE et ses dérivés, les puces d'acides nucléiques, notamment les puces à ADNc, les puces à oligonucléotides et les puces à ARNm, tes puces à tissu et le RNA-Seq. 9) La méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la quantité de PIGF est déterminée en mesurant la quantité du polypeptide. 3037657 21 10) La méthode de la revendication 9, caractérisée en ce que la quantité de PIGF est mesurée par une méthode sélectionnée parmi l'immunohistologie, l'immunoprécipitation, te western blot, te dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou , tes puces à tissu couplées à 5 l'immunohistochimie, les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d'histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, tes méthodes basées sur l'utilisation d'une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (tes techniques de voltammétrie et 10 d'ampérometrie), le microscope à force atomique, et tes méthodes de radiofréquence, comme ta spectroscopie résonance multipolaire, confocale et nonconfocale, détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, et biréfringence ou index de réfraction (notamment par résonance des plasmons de surface, par ellipsometry ou par 15 méthode de miroir résonnant), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrophotométrie HPLC-Mass, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS). 11) La méthode de l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce 20 que la quantité de PIGF est déterminée par une méthode choisie parmi l'immunoprécipitation, l'immunohistologie, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, tes puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l'immunohistochimie. 12) La méthode de l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce 25 que la quantité de PIGF est déterminée par western blot ou par ELISA. 13) La méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que la quantité de PIGF est normalisée par rapport à un marqueur témoin. 14) La méthode de la revendication 13, caractérisée en ce que le marqueur témoin est un gène sélectionné dans le groupe constitué de B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, 30 GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IP08 et HMBS, ou un polypeptide choisi parmi le produit desdits gènes.