Brevet FR3044766A1 — publié le 20170609

Système de mesure optique et son utilisation. La présente invention concerne la mesure optique de la réflexion et de la fluorescence à partir d'une source de lumière polychromatique, permettant de maximiser la sensibilité de la mesure en fluorescence et le contraste de la mesure en réflexion. Elle se rapporte plus particulièrement à un système de mesure optique de la réflexion et de la io fluorescence d'un échantillon de taille micrométrique, comportant notamment : -au moins une source lumineuse incidente émettant un faisceau lumineux incident, -des moyens de transmission du faisceau lumineux incident et 15 de séparation du faisceau réfléchi par l'échantillon, -des moyens de transmission du faisceau lumineux incident et de séparation du signal de fluorescence dans le faisceau réfléchi par l'échantillon -des moyens optiques pour conduire le faisceau incident 20 jusqu'à l'échantillon et pour conduire le faisceau réfléchi par l'échantillon. De préférence, l'échantillon est un échantillon de fluide, pouvant contenir notamment des particules solides. La mesure simultanée de la réflexion et de la 25 fluorescence d'un échantillon microscopique est une demande particulièrement importante du marché aujourd'hui dans le 3044766 2 domaine médical et en biochimie afin de pouvoir notamment identifier et doser des substances présentes dans un faible volume de fluide. Dans ce domaine, la fluorescence est couramment utilisée pour quantifier une cible, par exemple 5 pour marquer la présence d'ADN avec des brins complémentaires munis d'une sonde fluorescence, ou en encore pour détecter la présence de certaines molécules comme des protéines à l'aide d'anticorps conjugués à un fluorophore. Pour multiplier le débit d'analyse, l'opération de o marquage est souvent confinée sur ou dans une particule de taille micrométrique, afin de réaliser de nombreuses mesures avec une quantité limitée de réactifs et dans un espace réduit. Ces particules peuvent être par exemple des gouttes, des billes en polymère ou encore des billes magnétiques. Ces analyses se 15 font parfois dans des particules naturelles comme des cellules animales ou des bactéries. Dans de nombreux cas, il est alors nécessaire de pouvoir identifier la particule indépendamment de tout marquage fluorescent et de mesurer sa fluorescence simultanément pour réaliser une quantification du marquage 20 fluorescent de ladite particule. La mesure de la réflexion lumineuse de la particule est un bon moyen d'identifier la présence d'une particule indépendamment de sa fluorescence. La mesure de la réflexion peut également être utilisée pour mesurer un autre paramètre optique du fluide en 25 fonction de la configuration de la mesure. Les paramètres qui peuvent être mesurés sont par exemple la diffusivité optique 3044766 3 du liquide, la densité optique ou la réflexion sur une surface en contact avec le liquide qui dépend de l'indice de réfraction du liquide. Couplé à la fluorescence, la réflexion peut apporter une information supplémentaire. Par exemple, Il est possible de 5 mesurer la quantité de bactéries par unité de volume et leur niveau d'expression d'un marqueur fluorescent dans un capillaire en mesurant simultanément le signal réfléchi par les bactéries par diffusion de la lumière et leur fluorescence au sein de ce capillaire. Pour de nombreuses applications, la mesure optique doit être réalisée à l'aide d'une sonde peu encombrante, soit parce que la mesure doit être réalisée in situ, par exemple dans le corps (endoscopie), dans un élément d'une machine ayant d'autres fonctions, dans un environnement naturel comme une rivière pour l'analyse de la qualité de l'eau, soit parce que plusieurs mesures doivent être réalisées dans un espaces réduit, si bien que la taille de chaque sonde doit être réduite, soit parce que la mesure est réalisée sur un élément d'un système miniaturisé comme un laboratoire sur puce, si bien que la sonde de détection optique doit être elle-même de très petites dimensions pour limiter son encombrement autour de la puce. Par exemple, des puces microfluidiques sont couramment utilisées pour manipuler des échantillons dans des micro-gouttes, dont il est nécessaire de mesurer la fluorescence, par exemple pour réaliser une réaction d'amplification d'ADN de type PCR (pour l'appellation anglo-saxonne « Polymerase Chain 3044766 4 Reaction ») digitale. Pour ces raisons, on utilise couramment dans de nombreux domaines, notamment dans le domaine médical (endoscopie) une fibre optique pour transporter le signal lumineux. 5 Le document US5239998 décrit un système de mesure de fluorescence d'un échantillon de fluide à l'aide d'une fibre optique, dans lequel une fibre optique unique est utilisée pour véhiculer le faisceau lumineux incident issu d'une source 10 lumineuse cohérente (un laser HeNe) ainsi que le faisceau émis par le corps fluorescent présent dans l'échantillon de fluide (sous l'action du rayonnement incident), cette fluorescence ainsi émise étant dirigée vers un photomultiplicateur ou une photodiode produisant un signal représentatif des changements 15 de fluorescence dans l'échantillon de fluide. Le document EP 1410000 décrit également un système d'analyse par fluorescence utilisant une source de lumière cohérente et applicable à l'endoscopie. Ces deux documents sont muets sur le signal réfléchi par 20 l'échantillon de fluide. Le document intitulé « Dual mode fibre bundle confocal endomicroscopy : combining reflectance and fluorescence imaging » de Michael Hughes et al., Imperial college London-Proc.of OSA-SPIE Vol.8797 - 879708-2 décrit 25 un endo- microscope fonctionnant en mode dit « dual », capable d'engendrer un signal de fluorescence et un signal de 3044766 5 réflexion, utilisant une source lumineuse cohérente (diode laser) et une fibre optique unique pour les faisceaux incident et réfléchi. 5 Toutes les solutions développées dans l'art antérieur rappelées ci-dessus, font appel à l'utilisation d'une source lumineuse de lumière cohérente pour obtenir une forte intensité d'excitation de la fluorescence en donc une bonne sensibilité en utilisant une fibre optique. L'utilisation d'une 10 source de lumière cohérente monochromatique (laser), présente cependant de nombreux inconvénients : ces sources ne sont pas disponibles dans toute la gamme du spectre visible, ce qui limite considérablement la possibilité d'utilisation du système d'analyse qui les incorpore, notamment pour ce qui 15 concerne la mesure de fluorescence. En outre, ces sources de lumière cohérente sont souvent chères et encombrantes ou limitées en longueurs d'onde accessible pour les technologies à semi-conducteur (diode laser) qui sont plus compactes et bon marché. 20 L'utilisation d'une source polychromatique de type LED serait à priori possible pour la mesure de fluorescence, à condition d'utiliser un filtre d'excitation placé devant les moyens de séparation du signal de fluorescence du signal réfléchi issus de l'échantillon, comme c'est le cas dans 25 les dispositifs de détection de fluorescence usuels. Toutefois cette solution n'est pas applicable lorsqu'on veut également 3044766 6 mesurer les informations présentes dans le signal réfléchi car le contraste de celui-ci est très affaibli après ledit filtre. En effet, le filtre réfléchit une part importante de la lumière issue de la source lumineuse, si bien que le signal reçu par le moyen de 5 séparation de la lumière réfléchie est issu majoritairement de la réflexion de la lumière sur le filtre, de sorte que le contraste de la réflexion de la lumière issue de l'échantillon est faible. En effet, les filtres diélectriques passe-bandes utilisés pour filtrer la lumière d'excitation ont la propriété de transmettre les io longueurs d'onde de la bande d'excitation et de réfléchir les autres longueurs d'ondes. Le document US6704109 décrit l'utilisation d'une source polychromatique de type diode électroluminescente LED pour des applications de mesure sur 15 des fluides à très haute température (au delà de 200°C) dans laquelle l'illumination est réalisée à l'aide d'une fibre optique à branchement multiple. Un tel système présente au moins deux inconvénients : d'une part, une partie de la lumière issue de la fluorescence de l'échantillon est perdue au niveau de 20 l'embranchement des fibres, ce qui affecte la sensibilité de la mesure de fluorescence et d'autre part, un tel système requiert l'utilisation de fibres optiques spécifiques, peu courantes et dont il existe peu de variantes disponibles sur le marché (diamètre, ouverture numérique, matériaux). D'une manière 25 générale, l'utilisation de fibres branchées ou couplées au sein desquelles les rayons lumineux issus d'au moins deux fibres se 3044766 7 mélangent, est un moyen couramment utilisé pour injecter de la lumière dans une fibre optique servant à réaliser une détection optique. Mais ce type de système a toujours l'inconvénient qu'au moins une partie de la lumière émise par 5 l'échantillon est redirigée vers la source lumineuse et non vers le moyen de séparation de la fluorescence, en vertu de la réciprocité des rayons optiques. L'utilisation de ce type de fibre n'est donc pas adaptée à une mesure sensible de la fluorescence. 10 Il existe aujourd'hui un besoin notamment dans le domaine de la micro-fluidique de détecter simultanément la réflexion et la fluorescence de petites particules avec une bonne sensibilité en fluorescence, ce qui implique d'une part une puissance d'excitation importante, de préférence 15 supérieure à 1 kW/m2, plus préférentiellement supérieure à 10 kW/m2 et une forte ouverture numérique de détection, de préférence supérieure ou égale à 0,3 et d'autre part un bon contraste en réflexion, autrement dit une capacité à mesurer les variations de la lumière réfléchie par l'échantillon (de 20 préférence supérieure à 0,03, plus préférentiellement supérieure ou égale à 0,2) tout en utilisant une source de lumière non cohérente, compacte et bon marché de type LED. On recherche en effet aujourd'hui des systèmes permettant d'obtenir notamment un meilleur contraste pour pouvoir 25 détecter des objets peu réfléchissants. 3044766 8 Le système selon l'invention permet de répondre au problème posé. Le système de mesure optique selon l'invention de la réflexion et de la fluorescence d'un échantillon de taille micrométrique, comportant notamment : 5 - au moins une source lumineuse incidente émettant un faisceau lumineux incident, - des moyens de transmission du faisceau lumineux incident et de séparation du faisceau réfléchi par l'échantillon, - des moyens de transmission du faisceau lumineux incident et 10 de séparation du signal de fluorescence dans le faisceau réfléchi par l'échantillon, - des moyens optiques pour conduire le faisceau incident jusqu'à l'échantillon et pour conduire le faisceau réfléchi par l'échantillon, est caractérisé en ce que la source lumineuse est 15 une source de lumière non cohérente et en ce que au moins un filtre d'excitation est disposé entre la source lumineuse et les moyens de transmission du faisceau lumineux incident et de séparation d'un faisceau réfléchi par l'échantillon, ce filtre limitant le spectre de fréquences du faisceau incident de 20 lumière non cohérente à un spectre de fréquences correspondant au moins en partie au spectre d'excitation d'au moins un corps fluorescent présent dans l'échantillon. De préférence, la largeur du spectre de fréquences ainsi limité est de l'ordre de 30 nm pour au moins une longueur d'onde 25 d'excitation d'au moins un corps fluorescent. 3044766 9 Lorsque plusieurs sources lumineuses sont utilisées, leurs lumières peuvent être combinées par tout moyen de mélange de rayons lumineux, comme des miroirs semi-réfléchissants, des fibres branchées et/ou encore la simple 5 juxtaposition des sources. De préférence des miroirs dichroïques sont utilisés, ce qui permet de superposer les rayons lumineux de longueurs d'onde différentes sans en augmenter la dispersion angulaire et spatiale si bien que la puissance de chaque source qui peut être concentrée dans les 10 moyens optiques pour conduire le faisceau incident jusqu'à l'échantillon peut rester optimale. Ainsi, pour obtenir un contraste élevé sur le signal de réflexion, une bonne sensibilité en fluorescence, avec en outre une bonne sélectivité en longueur d'onde d'excitation, 15 l'invention propose un agencement particulier des éléments optiques du système de mesure. Selon un mode préférentiel de réalisation, le système selon l'invention utilise une fibre optique fonctionnant en mode duplex, dans lequel le faisceau incident et le faisceau 20 réfléchi passent par la même fibre. Ceci permet d'une part une intégration simple (pas d'alignement entre deux fibres comme pour les systèmes utilisant des fibres différentes pour la source de lumière et sa captation) et d'autre part une grande efficacité optique de mesure : comme les rayons d'illumination et captés 25 passent par la même fibre, une grande ouverture numérique est accessible pour la mesure optique comme pour 3044766 10 l'illumination car ces 2 sources de lumière partagent le même angle solide autour de l'échantillon pour leurs trajectoires. Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, on utilisera une fibre optique capable de 5 fonctionner en mode duplex, ayant une forte ouverture numérique, de préférence supérieure à 0,3. L'utilisation d'une forte ouverture numérique permet de transmettre un nombre plus important de rayons lumineux d'angles d'incidence plus grands qui ne seraient pas transmis si l'ouverture de la fibre 10 était plus faible, ce qui permet d'augmenter la puissance transmise pour l'illumination, l'ouverture numérique de captation de la lumière émise par l'échantillon et donc augmenter la sensibilité du système. Lorsqu'on utilise une diode électroluminescente 15 (LED) comme source de lumière non cohérente selon l'invention, il est préférable également d'utiliser des moyens optiques de concentration de la lumière (par exemple une ou plusieurs lentilles) qui aient un fonctionnement optimal compte tenu du fait que la densité de puissance (spatiale ou angulaire) 20 d'une source LED est faible (dispersion spatiale et angulaire de la lumière importante). On entend par optimal un chemin optique permettant une illumination de l'entrée de la fibre sur une surface minimale et avec une ouverture numérique des rayons lumineux incident supérieur ou égal à l'ouverture 25 numérique de la fibre. Un moyen de concentration optimal de la source lumineuse dans une fibre optique est, par exemple, 3044766 11 un schéma optique composé d'une ou plusieurs lentilles convergentes permettant de focalisant le foyer de la source lumineuse sur l'entrée de la fibre optique, ce schéma étant caractérisé en ce que son coefficient de magnification est de 5 préférence inférieur à 1/ONF (ou ONF est l'ouverture numérique de la fibre) et en ce que la taille et la position de la (les) lentille(s) soit telle que l'intégralité des rayons lumineux focalisés sur la fibre optique sur toute l'ouverture de la dernière lentille puisse être issue de la source lumineuse, ce qui est le 10 cas lorsque les éléments du schéma sont suffisamment rapprochés. De cette manière, la dernière lentille refocalisant la lumière sur la fibre peut reconcentrer la lumière avec une ouverture numérique supérieur ou égale à ONF. 15 Selon une première variante de réalisation de l'invention, les moyens de séparation de la réflexion sont constitués par un miroir semi-réfléchissant tandis que les moyens de séparation de la fluorescence sont constitués par un ensemble de deux fibres couplées. 20 Selon une seconde variante de réalisation de l'invention, les moyens de séparation de la réflexion sont constitués par un ensemble de deux fibres couplées, tandis que les moyens de séparation de la fluorescence sont constitués par un ensemble de deux fibres couplées. 25 Selon une autre variante de réalisation de l'invention, les moyens de séparation de la réflexion sont 3044766 12 constitués par un miroir semi-réfléchissant, tandis que les moyens de séparation de la fluorescence sont constitués par un miroir dichroïque. Afin d'éviter la détection des réflexions internes sur 5 le faisceau réfléchi notamment, et améliorer ainsi le contraste de la mesure de réflexion, l'invention prévoit selon un mode préférentiel de réalisation des moyens de polarisation de la source lumineuse. Ces moyens peuvent par exemple, comporter un polariseur entre la source lumineuse et le 10 système de séparation de la réflexion combiné avec un analyseur croisé positionné entre le système de séparation de la réflexion et le capteur de la réflexion et/ou avantageusement, cet ensemble polariseur/séparateur/analyseur peut être un séparateur de 15 faisceau polarisant composé de deux prismes cimentés par une couche diélectrique (par exemple un séparateur polarisant vendu sous la dénomination commerciale « Edmund #48998 ») qui permet, dans un unique dispositif, de polariser la lumière transmise suivant la direction P et de ne réfléchir à 90° 20 que la lumière polarisée suivant la direction S. En effet, ces séparateurs polarisant permettent de transmettre jusqu'à deux fois plus de lumière issue de la source de lumière, en comparaison de moyens de polarisation utilisant des polariseurs classiques et sur un miroir semi-réfléchissant, ce qui augmente 25 la puissance lumineuse d'excitation, donc la sensibilité en fluorescence. Par ailleurs, ils n'ont pas besoin d'alignement 3044766 13 comme pour un couple polariseur/analyseur, ce qui simplifie leur mise en oeuvre. Selon un autre mode de réalisation le système selon l'invention comporte un capteur de fluorescence de type diode 5 à avalanche, de dénomination MPPC (pour l'appellation anglo- saxonne »Multi-Pixel Photon Counter ») et/ou un photomultiplicateur permettant une grande sensibilité de mesure de la lumière incidente pouvant aller jusqu'à la détection de photons individuels pour certains capteurs. lo Préférentiellement, le capteur de fluorescence aura un bruit de mesure de la puissance lumineuse inférieur ou égal à 1 fW/Hz^ 1/2. Selon encore un autre mode de réalisation, le système selon l'invention comporte un capteur à gain variable 15 pour la mesure de la réflexion de manière à ce que l'échelle de mesure du capteur soit toujours adaptée à l'intensité lumineuse de la lumière captée par le capteur. Avantageusement, le gain d'un tel capteur à gain variable peut être ajusté en fonction de la puissance lumineuse de la source de lumière si bien que la 20 puissance de ladite source lumineuse peut être modifiée sans modifier la sensibilité au contraste de la mesure de la réflexion. En effet, dans la majorité des cas, la précision et le bruit de l'électronique d'acquisition du signal est l'élément limitant la mesure de faibles variations de la lumière réfléchie. Pour 25 maximiser la sensibilité de détection de petites variations de puissance lumineuse réfléchie, le signal de sortie du capteur 3044766 14 pour la réflexion doit être maximal, ce qui n'est possible qu'avec un capteur à gain variable dont le gain peut être ajusté en fonction de la puissance de la source lumineuse. Selon un autre mode de réalisation, le signal de sortie 5 analogique du capteur de réflexion et/ou du capteur de fluorescence est traité par un moyen électronique analogique de manière à en soustraire tout d'abord une valeur fixe, puis à être amplifié. La soustraction au signal d'une valeur fixe permet une amplification importante des variations du signal tout en lo évitant la saturation du signal. De cette manière, les petites variations de signal peuvent être amplifiées et le contraste de mesure amélioré. Avantageusement, le signal peut être filtré de manière concomitante afin de limiter la bande passante du signal et de cette manière limiter le bruit de mesure, ce qui 15 permet d'augmenter la sensibilité de mesure de la fluorescence et d'augmenter la capacité de discernement d'une petite variation de réflexion. Selon un autre mode de réalisation, le signal de sortie est numérisé pour être traité par un moyen logiciel. 20 Avantageusement, cette numérisation est réalisée à une cadence élevée pour permettre la détection d'évènements courts dans le temps et/ou à des fréquences élevées, par exemple, si les échantillons à détecter sont des particules circulant à une vitesse et/ou une cadence élevée. 25 Selon un autre mode de réalisation, la puissance de la source lumineuse est modulée et la fluorescence est détectée 3044766 15 et amplifiée de manière synchrone (« lock-in amplification » en anglais), ce qui permet d'une part d'éliminer le bruit de fond de la mesure et d'autre part de limiter le bruit dans la détection en fluorescence en limitant la bande passante de la mesure de 5 manière plus efficace qu'en utilisant des filtres analogiques ou numériques standards. De cette manière, la sensibilité de la détection de la fluorescence est accrue. Selon un autre mode de réalisation, un filtre d'émission laissant passer plusieurs bandes de fréquence est utilisé en 10 combinaison avec une ou plusieurs sources lumineuses filtrées à des bandes de fréquences différentes, si bien que plusieurs fluorophores ayant des spectres d'émission et d'excitation différents peuvent être détectés de manière indépendante en utilisant la source d'excitation adaptée. 15 L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples de réalisation suivants, donnés conjointement avec les figures qui représentent : 20 -La figure 1, une vue schématique du système selon l'invention, -La figure 2, différentes variantes de réalisation de l'invention -La figure 3, une variante de l'invention utilisant 25 un faisceau de lumière polarisée 3044766 16 -La figure 4, un exemple de réalisation du système selon l'invention -La figure 5, une variante du système de la figure 1 appliqué à la détection de particules fluorescente dans une 5 canalisation capillaire. Sur l'ensemble des figures, les mêmes moyens portent les mêmes références. Dans toute la description de la présente 10 invention, les termes suivants auront la signification ci-après donnée : Le terme « sensibilité » d'un senseur optique est défini ici comme la capacité de ce senseur à capter un maximum de photons issus de l'échantillon à analyser. 15 Le terme « contraste » est défini ici comme le rapport entre la variation relative de la réflexivité du point mesuré (en % de réflexivité du point mesuré) et la variation relative effective mesurée au niveau du capteur (en % de la pleine échelle de mesure). 20 Le système selon l'invention et décrit sur la figure 1 utilise de préférence pour la mesure simultanée en réflexion et en fluorescence les éléments suivants (en suivant le chemin retour de la lumière) : 25 - Une fibre optique 6 utilisée en duplex (La source de lumière 20 et la lumière captée en retour 30 passent par la 3044766 17 même fibre 6), ce qui a plusieurs avantages et permet notamment une intégration simple (pas d'alignement entre deux fibres comme pour les systèmes utilisant un fibre différente pour la source de lumière et sa captation) ainsi 5 qu'une grande efficacité optique de mesure : les rayons d'illumination 20 et captés 30 passant par la même fibre, une grande ouverture numérique est accessible pour la mesure optique comme pour l'illumination car ces deux sources de lumière partagent le même angle solide autour de l'échantillon 10 7 (sur lequel s'effectuent les mesures de fluorescence et de réflexion) pour leurs trajectoires. - Un moyen de focalisation de la lumière dans la fibre, tel qu'une lentille 40. - Un système de séparation 5 de la lumière 15 fluorescente permettant de séparer dans le faisceau 30 la lumière émise 32 par la fluorescence de l'échantillon de la lumière réfléchie 31 par l'échantillon 7 aux autres longueurs d'onde, ce faisceau composé de ces longueurs d'onde 32 étant dirigé vers un capteur de lumière/détecteur de fluorescence 8 20 (photodiode, ou photomultiplicateur, spectromètre, etc.) qui peut être muni d'un filtre d'émission permettant de sélectionner précisément les longueurs d'ondes mesurées. Ce système de séparation peut être, par exemple, un miroir dichroïque, une paire de fibres couplées ou une fibre branchée qui permet de 25 diviser le flux lumineux en deux faisceaux et dont une sortie est 3044766 18 munie d'un filtre qui permet de sélectionner les longueurs d'onde réservées à la fluorescence qui doivent être détectées. - Un système de séparation 4 de la lumière réfléchie 31, qui peut être un miroir semi-réfléchissant ou une fibre 5 branchée, ou deux fibres couplées, la lumière réfléchie 31 étant dirigée vers un capteur de lumière/détecteur de réflexion 9 (photodiode, photomultiplicateur, spectromètre, etc.). - Un filtre d'excitation 3 permettant de sélectionner les longueurs d'onde d'excitation de la fluorescence à partir du lo faisceau 2 pour engendrer le faisceau 20 à l'entrée du système de séparation 4, - Une source lumineuse non-cohérente 1, par exemple une diode électroluminescente (LED), une lampe à incandescence ou une lampe plasma (lampe à mercure, xénon 15 ou deutérium) engendrant le faisceau 2 La figure 2, sur ses sous-figures 2A, 2B, 2C représente diverses variantes de mise en oeuvre de l'invention représentée sur la figure 1. 20 Sur ces figures 2A, 2B, 2C les termes suivants signifient : « FO » : Fibre Optique, « Ex » : Filtre d'Excitation, « Em » : Filtre d'émission, 25 « MS » : miroir semi-réfléchissant, « MD » : Miroir Dichroïque, 3044766 19 « DR » : détecteur de Réflexion, « DF » : Détecteur de Fluorescence, « SL « : Source Lumineuse non cohérente) : 5 Sur la variante représentée sur la figure 2A, les moyens de séparation de la réflexion 4 prennent la forme d'un miroir semi-réfléchissant MS tandis que deux fibres couplées 50 et 51 cette dernière associée à un filtre d'émission Em 52 10 constituent les moyens de séparation de la fluorescence 5. Sur la variante représentée sur la figure 2B, les moyens de séparation de la réflexion 4 sont constitués de deux fibres couplées 53, 54 et les moyens de séparation de la fluorescence 5 sont constitués de deux fibres couplées 54, 55 , 15 la fibre 54 étant commune aux deux moyens. Sur la figure 2C est représentée sous une forme semblable à celle des figures 2A et 2B, la variante de la figure 1, avec un miroir semi-réfléchissant MS comme moyen de séparation de la réflexion 4 et un miroir dichroïque comme 20 moyen de séparation de la fluorescence 5. La figure 3 représente une variante de réalisation de l'invention, dans laquelle sont prévus des moyens de polarisation de la source lumineuse 1 permettant d'éviter 25 de détecter les réflexions internes du système. Ces moyens peuvent par exemple comporter un polariseur (par exemple 3044766 20 horizontal) 10 entre la source lumineuse 1 et les moyens de séparation de la réflexion 4 associé à un analyseur croisé (par exemple polariseur vertical) 11 positionné entre les moyens de séparation de la réflexion 4 et le détecteur/capteur de la 5 réflexion 9. (on peut également utiliser un séparateur de faisceau polarisé (prisme) comme moyen de séparation de la réflexion). Avantageusement, la fibre optique 6 et la lentille de collimation 10 de la lumière dans la fibre auront une ouverture numérique importante (par exemple supérieure à environ 0,3) pour maximiser la quantité de lumière pouvant entrer dans la fibre et la quantité de lumière captée en sortie de fibre. Avantageusement, la ou les lentille(s) 40 de refocalisation de la 15 lumière sur l'échantillon auront une forte ouverture numérique (de préférence supérieure à 0,3) pour maximiser la quantité de lumière échangée entre la fibre et l'échantillon. 20 La figure 4 représente un exemple de réalisation de l'invention permettant la mesure simultanée de la fluorescence et de la réflexion sur un échantillon. Une source LED 100 émet un faisceau lumineux de lumière non cohérente qui est focalisé par la lentille 101 (lentille plano 25 convexe, f=25 mm) puis traverse un premier diaphragme 102 permettant de limiter l'ouverture de la lumière incidente dans la 3044766 21 fibre (diaphragme d'ouverture) puis un second diaphragme 103 permettant de limiter le champ d'illumination de la fibre (diaphragme de champ), le faisceau issu de ces diaphragmes traversant le filtre d'excitation 104 qui limite les longueurs 5 d'onde transmises à la bande de fréquences adaptées au fluorophore à détecter. Le faisceau est ensuite focalisé grâce à la lentille 105 et pénètre dans les moyens de séparation de la réflexion 106 dans lesquels est disposé le miroir semi-réfléchissant 107 qui 10 laisse passer le faisceau incident et réfléchit le faisceau réfléchi vers la lentille de focalisation 108 (lentille plano convexe-f=15 mm), puis le détecteur de réflexion 109 (de type « APDHammamatsu C12703 »), le faisceau incident pénétrant dans les moyens de séparation de fluorescence 110 dans lesquels un 15 filtre dichroïque 111 réfléchit ce faisceau incident vers une lentille 115 (diamètre 1,8 mm-f=2 mm) qui concentre le faisceau dans la fibre 114 (destinée à être au contact de l'échantillon à mesurer à son autre extrémité), le filtre 111 laissant passer le faisceau réfléchi issu de l'échantillon via la 20 fibre 114, ce faisceau, après avoir traversé le filtre d'émission 116 étant focalisé grâce à la lentille 112 (plano convexe-f=15 mm) sur le détecteur de fluorescence 113 (Hammamatsu C12703-01) 25 La figure 5 représente un montage expérimental utilisant le système de la figure 1 pour identifier et/ou compter 3044766 22 des particules fluorescentes 42 présentes dans un liquide circulant dans un tube capillaire 41 représentant l'échantillon 7. 5 Grace à l'agencement particulier des différents moyens constituant le système selon l'invention, celui-ci permet d'obtenir un contraste élevé sur le signal de réflexion, une bonne sensibilité en fluorescence, avec en outre une bonne sélectivité en longueur d'onde d'excitation. Dans cet o agencement, d'une part, les moyens de séparation de la lumière fluorescente sont positionnés entre la fibre optique et la les moyens de séparation du faisceau réfléchi, pour qu'un maximum de photons issus de la fluorescence soient captés par le détecteur de fluorescence, ce qui n'est pas le cas dans les 15 systèmes antérieurs, qui mesurent simultanément reflexion et fluorescence. D'autre part, une source lumineuse non-cohérente est utilisée et filtrée avec un filtre d'excitation qui limite le spectre de l'illumination afin d'optimiser l'excitation spécifique d'un fluorochrome. Dans les dispositifs classiques de 20 mesure de fluorescence, ce filtre est disposé dans le bloc de séparation de la fluorescence, mais dans ce cas, la réflexion sur le filtre perturbe la mesure de la réflexion (les longueurs d'ondes filtrées dans les filtres diélectriques, qui représentent une forte puissance lumineuse, sont réfléchies et redirigées 25 vers le capteur de la réflexion). Selon l'invention, le filtre d'excitation est positionné entre la source lumineuse et le bloc 3044766 23 de séparation de la réflexion pour éliminer ce problème. En outre, la présence d'un système de polarisation permet de limiter les réflexions internes. REVENDICATIONS1- Système de mesure optique de la réflexion et de la fluorescence d'un échantillon de taille micrométrique, de préférence un échantillon de fluide pouvant contenir notamment des particules, comportant notamment : o -une source lumineuse incidente(1) émettant un faisceau lumineux incident(2), -des moyens de transmission(4) du faisceau lumineux incident(20) et de séparation du faisceau réfléchi(30) par l'échantillon(7), 15 -des moyens de transmission(5) du faisceau lumineux incident(20) et de séparation du signal de fluorescence(32) dans le faisceau réfléchi(30) par l'échantillon(7) -des moyens optiques(6) pour conduire le faisceau incident(20) 20 jusqu'à l'échantillon(7) et pour conduire le faisceau réfléchi(30) par l'échantillon(7), caractérisé en ce que la source lumineuse(1) est une source de lumière non cohérente et en ce qu'au moins un filtre d'excitation(3) est disposé entre la source lumineuse(1) et les moyens de transmission(4) du faisceau 25 lumineux incident et de séparation d'un faisceau réfléchi par l'échantillon, ce filtre(3) limitant le spectre de fréquences du 3044766 25 faisceau incident(2) de lumière non cohérente à un spectre de fréquences correspondant au moins en partie au spectre d'excitation d'au moins un corps fluorescent présent dans l'échantillon(7). 5 2- Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que la largeur du spectre de fréquences limitée par le filtre d'excitation est de l'ordre de 30 nm pour au moins une longueur d'onde d'excitation d'au moins un corps fluorescent. 3- Système selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il o utilise une fibre optique fonctionnant en mode duplex, dans lequel le faisceau incident et le faisceau réfléchi passent par la même fibre. 4 - Système selon la revendication 3, caractérisé en ce que la fibre optique possède une forte ouverture numérique, de 15 préférence supérieure ou égale à 0,3. 5- Système selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la source lumineuse est une diode électroluminescente (LED) de préférence associée à des moyens optiques de concentration de la lumière. 20 6 - Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens de séparation de la réflexion sont constitués par un miroir semi-réfléchissant tandis que les moyens de séparation de la fluorescence sont constitués par un ensemble de deux fibres couplées. 25 7 - Système selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les moyens de séparation de la réflexion sont 3044766 26 constitués par un ensemble de deux fibres couplées, tandis que les moyens de séparation de la fluorescence sont constitués par un ensemble de deux fibres couplées. 8 - Système selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé 5 en ce que les moyens de séparation de la réflexion sont constitués par un miroir semi-réfléchissant, tandis que les moyens de séparation de la fluorescence sont constitués par un miroir dichroïque. 9 - Système selon l'une des revendications précédentes, o caractérisé en ce qu'il comporte également des moyens de polarisation de la lumière émise par la source lumineuse. - Système selon la revendication 9, caractérisé en ce que les moyens de polarisation comportent un polariseur entre la source lumineuse et le système de séparation de la réflexion combiné avec un analyseur croisé positionné entre le système de séparation de la réflexion et le capteur de la réflexion et/ou un séparateur de faisceau polarisé tel qu'un prisme comme système de séparation de la réflexion. 11 - Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte un capteur à gain variable pour la mesure de la réflexion. 12- Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte un filtre d'émission laissant passer plusieurs bandes de fréquences en combinaison avec plusieurs sources lumineuses filtrées à des bandes de fréquences différentes. 3044766 27 13 - Utilisation du système selon l'une des revendications précédentes pour la mesure simultanée de la réflexion et de la fluorescence d'un échantillon.