Brevet FR3046716A1 — publié le 20170721

METHODES ET COMPOSITIONS POUR LE CONTROLE DES FOURMIS CHAMPIGNONNISTES DOMAINE DE L'INVENTION L'invention se rapporte au domaine du contrôle des nuisibles. Elle propose un nouveau procédé de lutte contre les fourmis champignonnistes ainsi qu'une nouvelle composition formicide capable de détruire spécifiquement les colonies de fourmis champignonnistes. La présente invention propose également une méthode de préparation d'une telle composition ou d'un kit pouvant être utilisé dans ledit procédé. ETAT DE LA TECHNIQUE Les fourmis champignonnistes de type fourmis « coupe feuille » appartenant par exemple aux genres Atta ou Acromyrmex sont essentiellement présentes en Amérique Centrale et en Amérique du Sud. La particularité principale de la tribu Attini, regroupant notamment les genres Atta ou Acromyrmex, est le fait qu'elle cultive, au sein même de la fourmilière, un champignon basidiomycète saprophyte de l'espèce Leucoagaricus gongylophorus. Les fourmis assurent sa croissance tandis que le champignon assure l'apport de nutriments pour la colonie en dégradant des molécules complexes, non assimilables par les fourmis (Richard et al, 2005). Le champignon, alimenté en matière première par les fourmis, peut également constituer une source nutritive puisque des auteurs ont observé que le champignon était consommé par certaines fourmis (Qinlan et al., 1978, Fisher et al., 1994) et le champignon est une source d'enzymes assurant la dégradation de la matière végétale. Les fourmis champignonnistes « coupe feuilles » représentent un nuisible pour les cultures agricoles et forestières. En effet, elles se retrouvent sans prédateur lorsqu'elles envahissent des monocultures développées par l'homme (phénomène accentué avec la déforestation) ce qui entraine une forte présence non régulée. Elles y collectent feuilles, fleurs, fruits et graines et ravagent ainsi la plupart des cultures agricoles : les cultures vivrières (manioc, patate douce, maïs, fruits à pain...), fruitières (citronniers, orangers, manguiers, avocatiers...), maraîchères (piments, 1 3046716 haricots, salades...) et ornementales (rosiers, hibiscus...). Les dégâts provoqués par les fourmis champignonnistes représentent 30% des coûts de gestion des cultures d'eucalyptus au Brésil. Une colonie mature peut provoquer la destruction de 3 tonnes de canne à sucre par an, soit une perte estimée à 60 millions de dollars. Aux Etats- 5 Unis, et plus particulièrement au Texas, les dégâts annuels sont estimés à plusieurs millions de dollars alors qu'ils sont de plusieurs centaines de millions de dollars dans l'état de Sao Paulo (Brésil). Les traitements utilisés pour contrôler leur expansion, principalement basés sur des produits chimiques pesticides, ont entrainé pollution et détérioration des sols. 10 Ces composés sont aujourd'hui peu à peu retirés du marché car ils présentent un risque pour l'homme et l'environnement. Dans le cadre de la lutte contre Acromyrmex octospinosus, commencée dès la fin des années cinquante, de nombreux produits chimiques (produits organochlorés utilisés en tant qu'insecticides) ont été utilisés. Après l'aldrine (1,2,3,4,10,10-hexachloro-1,4,4a,5,8,8a-hexahydro- 15 1,4-endo,exo-5,8- dimétha-nonaphtalène), qui aujourd'hui est considéré comme un polluant organique persistant, le Mirex® (1,1a,2,2,3,3a,4,5, 5,5a,5b,6- dodecachlorooctahydro-1H-1,3,4-methanetriAcyclobuta[cd] pentalene) a été utilisé avant d'être à son tour interdit à cause de son impact néfaste sur l'environnement. Un autre produit nommé Blitz (fipronil) a été employé, mais son champ d'action étant 20 trop large, il a été retiré de la vente en Europe (2013) et n'est donc plus utilisé. La plupart de ces insecticides avaient comme point commun de cibler le système nerveux des insectes en général et pas seulement celui des fourmis champignonnistes. Ainsi ces composés, non spécifiques, affectent d'autres espèces vulnérables (e.g. abeilles). Par ailleurs, l'action contre le système nerveux des 25 insectes est généralement assez rapide et cible l'insecte en tant que tel. Or, contre les insectes sociaux, il est préférable de cibler la colonie dans sa globalité notamment via une action contre conjointement les fourmis et leur champignon symbiotique. De plus, ces composés insecticides classiques sont généralement difficilement biodégradables et entrainent une activité toxique persistante dans les 30 sols et les eaux. Il existe d'autre moyen de lutte contre les fourmis champignonnistes comme des composés chimiques fongicides ou encore des champignons pathogènes 2 3046 716 (W02012050857) ciblant les fourmis (entomopathogènes) ou le champignon poussant sur la meule (mycopathogène). Néanmoins, ces solutions ne se sont pas révélées suffisamment efficaces. D'une part la combinaison doit être appliquée directement sur le nid et d'autre part elle ne présente une efficacité que de 50% en 9- 5 10 jours. Les moyens locaux incluent également l'utilisation de plantes répulsives afin d'éloigner les nids de fourmis champignonnistes. Une telle utilisation présente toutefois une efficacité réduite et n'ont pas de conséquence sur le nid ou la colonie. Actuellement il n'existe aucun moyen de lutte efficace et le problème d'infestation 10 par les fourmis champignonnistes reste capital. Ainsi, les recherches actuelles ont eu pour objectif de trouver un moyen innovant de lutte contre les fourmis champignonnistes qui serait peu couteux, peu nocif pour l'environnement et spécifique de ces fourmis. Dans ce contexte, la présente invention propose une nouvelle méthode et composition associée visant à cibler la 15 colonie et son environnement plutôt que la fourmi elle-même. DESCRIPTION DETAILLEE : Les inventeurs ont découvert que la laccase est une enzyme largement 20 exprimée chez les fourmis champignonnistes ainsi que dans la meule et qu'une composition comprenant un inhibiteur de laccase entraine, en quelques jours, l'abandon des nids situés autour de l'emplacement des appâts. De plus, conformément à la présente invention, une composition comprenant un inhibiteur de laccase additionné d'un composé antibactérien ayant une activité bactéricide ou 25 bactériostatique contre les actinomycètes permet de détruire les colonies en quelques jours autour de l'emplacement des appâts et cela sans réapparition des colonies. Ces nouvelles méthodes de lutte contre les fourmis et les compositions associées étant spécifiques des fourmis champignonnistes, elles présentent un 30 impact plus faible sur l'environnement que les compositions formicide classiques. De 3 3046716 plus, dans certains modes de réalisation, ces compositions sont rapidement dégradées. Sauf indication contraire, les termes scientifiques et techniques utilisés dans le 5 cadre de la présente invention auront les significations qui sont communément admises par l'homme du métier. Par « Fourmis champignonnistes », on entend désigner ici les fourmis appartenant à la tribu des Attini et en particulier aux genres Atta ou Acromyrmex. Ces fourmis ont 10 la particularité de cultiver au sein même de la fourmilière, un champignon basidiomycète saprophyte de l'espèce Leucophorus gongylophorus. Les fourmis assurent sa croissance tandis que le champignon assure l'apport de nutriments pour la colonie en dégradant des molécules complexes. Au sein de cette famille, les fourmis appartenant aux genres Atta ou Acromyrmex forment une sous-catégorie 15 appelée fourmis « coupe feuille ». Les espèces les plus représentées sont Acromyrmex heyeri, Acromyrmex echinatior, Acromyrmex lobicomis, Acromyrmex crassispinus, Acromyrmex laticeps, Acromyrmex striatus, Acromyrmex lundii, Acromyrmex octospinosus, Acromyrmex rugosus, Acromyrmex subterraneus brunneus, Acromyrmex subterraneus molestans, Acromyrmex subterraneus 20 subterraneus, Acromyrmex volcanus, Acromyrmex Balzani, Atta capiguara, Atta cephalotes, Atta colombica, Atta sexdens, Atta sexdens srubropilosa, Atta laevigata, Atta bisphaerica, Atta texana et Atta vollenweideri. Au sens de l'invention, l'expression « lutte contre les fourmis champignonnistes » correspond ici à une action conduisant à l'abandon du nid ou à la destruction de la 25 colonie. Les termes « fourmilière » et « nid » peuvent être utilisés ici de manière interchangeable. Ils correspondent à la structure abritant la colonie de fourmis champignonnistes. 4 3046716 Par « colonie », il faut comprendre ici un groupe de fourmis, autre qu'un couple unique et comprenant au moins une reine, construisant des nids pour y élever une progéniture de manière coopérative. Par « meule » également appelée « jardin à champignon » (ie fungus garden) 5 dans la littérature, il faut comprendre ici la structure fongique cultivée par les fourmis champignonnistes et composée majoritairement par le champignon basidiomycète saprophyte de l'espèce Leucophorus gongylophorus. Par « Composition formicide », il faut comprendre ici une composition formulée de façon à cibler spécifiquement les fourmis. Ainsi, contrairement à une composition 10 insecticide, la composition formicide selon l'invention n'entrainera pas la mort des abeilles ou des autres arthropodes. La composition formicide selon l'invention peut entrainer un abandon du nid par la colonie de fourmis champignonistes ou la destruction de ladite colonie. 15 Au sens de l'invention, l'expression « Composé antibactérien » correspond ici à un composé ayant une activité bactéricide ou bactériostatique. Le terme « Activité bactéricide » est utilisé dans le cas où le composé est capable de tuer la bactérie tandis que le terme « Activité bactériostatique » correspond à une inhibition de la croissance de la bactérie. Un même composé antibactérien peut avoir un effet 20 bactéricide ou bactériostatique sur une même souche bactérienne en fonction de sa concentration. Par « Actinomycètes », il faut comprendre toute bactérie appartenant au groupe des actinomycètes. Les actinomycètes sont des bactéries à Gram positives 25 généralement aérobies. Les actinomycètes les plus fréquemment retrouvés en relation avec des fourmis champignonnistes sont les Pseudonocardia et les Streptomyces. Les bactéries appartenant aux genres Gordonia, Tsukamurella, Amycolatopsis, Kribbella, et Nocardioides peuvent également être retrouvées. 30 Par « Laccase », il faut comprendre des enzymes de type polyphénol oxydases. Elles permettent de dégrader la lignine et apportent une protection contre la toxicité 5 3046716 de certains polyphénols. Dans la nomenclature relative aux enzymes, les laccases sont regroupées sous le code EC 1.10.3.2. Par « Inhibiteur de laccase », il faut comprendre un composé inhibant l'activité des 5 laccases telle que mesurée par exemple par le substrat ABTS (2,2'-azino-bis (3- ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid) selon la méthode publiée par Bourbonnais et. al (1990). Par « Molécule antioxydante », il faut comprendre le sens commun donné à ce 10 terme à savoir une molécule capable de diminuer ou d'empêcher l'oxydation d'autres substances chimiques. Le potentiel antioxydant d'une molécule peut être vérifié par exemple via l'utilisation des radicaux ABTS (Bourbonnais et. al 1990). Par « Appétant » ou «appât», il faut comprendre un composé ayant un pouvoir 15 attractif sur les fourmis champignonnistes et augmentant ainsi la quantité de composition selon l'invention récoltée par lesdites fourmis. Par appétant glucidique, il faut comprendre une molécule appartenant à la famille des glucides. Par appétant oligosaccharidique ou polysaccharidique, il faut comprendre une molécule de type oligosaccharidique ou polysaccharidique comme par exemple les fructanes, 20 glucanes, galactanes, mannanes ou hémicelluloses. Comme cela est montré dans les exemples, les inventeurs ont découvert que la laccase est une enzyme largement exprimée chez les fourmis champignonnistes ainsi que dans la meule et qu'une composition comprenant un inhibiteur de laccase 25 entraine, en quelques jours, l'abandon des nids situés autour de l'emplacement des compositions. Une telle méthode permet de protéger les récoltes en empêchant le développement de nids aux abords des champs à protéger. Ainsi selon un premier aspect, l'invention porte sur une méthode de lutte contre 30 les fourmis champignonnistes comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de laccase. 6 3046716 Il existe une grande variété d'inhibiteur de laccase. L'homme du métier peut sélectionner un inhibiteur de laccase grâce à des tests de routine tel que celui présenté dans les exemples et basé sur la méthode publiée par Bourbonnais et al (1990). 5 En particulier, est considéré comme étant un inhibiteur de laccase toute molécule qui, dans le cadre de la méthode mentionnée ci-dessus, entraine une diminution de l'activité de la laccase de plus de 50%, de préférence de plus de 75 %, de façon plus préférée de plus de 90%. De préférence, ces inhibitions de l'activité de la laccase sont obtenues à des concentrations inférieures à 5mM. De manière encore plus 10 préférée, ces inhibitions de l'activité de la laccase sont obtenues à des concentrations inférieures à 1 mM. Toutes les molécules anti-oxydantes ont la capacité d'inhiber l'activité d'une laccase. Néanmoins, il existe des inhibiteurs de laccases ne présentant pas une activité anti-oxydante. Parmi les molécules présentant une activité anti-laccase et 15 n'étant pas des molécules anti-oxydantes, il est possible de citer les chélateurs, les détergents, les acides organiques non oxydants et les métaux cationiques. Par exemple, les molécules suivantes sont également des molécules présentant une activité anti-laccase sans être des molécules antioxydantes : acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), chlorure de calcium (CaCl2), acide rhodotorulique, 20 entérobactine, acide thioglycolique, acide diethyldithiocarbamique, azoture de sodium, bromure de cetyltrimethylammonium, Fe2+, Cu2+, Ag+, Li+, Sn+, Hg+, Mn2+, Zn2+, Al3+, laurylsulfate de sodium, cyanure de sodium (NaCN), thiosulphate de sodium, acide oxalique, beta-mercaptoethanol. Ainsi, typiquement, la méthode de lutte contre les fourmis champignonnistes 25 comprend l'utilisation d'au moins un inhibiteur de laccase sélectionné parmi : une molécule anti-oxydante, un chélateur, un détergent, un acide organique non oxydant et un métal cationique. Les molécules préférées pour leur utilisation en tant qu'inhibiteur de laccases sont : 30 pour les chélateurs : EDTA, acide rhodotorulique, entérobactine pour les détergents : laurylsulfate de sodium, 7 3046716 pour les métaux cationiques : Fe2+, Cu2+, Ag+, Li+, Sn+, Hg+, Mn2+, Zn2+, Al3+, pour les acides organiques non oxydants : acide oxalique, acide thioglycolique, acide diethyldithiocarbam igue. 5 De manière préférée, l'inhibiteur de laccase est une molécule anti-oxydante. De telles molécules anti-oxydantes sont généralement connues de l'homme du métier (Lü et al. 2010). Il pourra par ailleurs, vérifier cette activité via des tests classiques de mesure du potentiel antioxydant tel que celui décrit dans Bourbonnais et al. (1990). 10 Les molécules présentant une activité anti-laccase et une activité anti-oxydante peuvent par exemple être sélectionnées parmi : acide ascorbique (E300), acide citrique (E330), acide coumarique, acide ferulique, acide gallique, acide palmityl 6-1-ascorbique (E304), acide syringique, ascorbates de sodium/calcium/potassium 15 (E301)/(E302)/(E303), butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxytoluol, cystéine, gallates d'octyle (E311) ou de dodécyle (E312), glutation, lactates de sodium (E325), de potassium (E326) ou de calcium (E327), Lécithines (E322), Lipoate, des caraténoides comme la Lutéine, Lutéoline, des caraotènes comme la Lycopène, Tartrates de sodium (E335)/potassium (E336) ou de sodium et de potassium (E337), 20 thiosulfate de sodium, Vitamine E (tocophérols naturels (E306), a-tocophérol de synthèse (E307), y-tocophérol de synthèse (E308) et Ô-tocophérol de synthèse (E309), sélénium E160 et chlorure d'hydroxylammonium. En particulier, l'inhibiteur de laccases est sélectionné parmi l'un des composés suivants : Acide ascorbique, Acide citrique (E330), Acide coumarique, Acide palmityl 25 6-1-ascorbique (E304), Ascorbates de sodium/calcium/potassium (E301)/(E302)/(E303), Cystéine, Gallates d'octyle (E311) ou de dodécyle (E312), Glutation, Lactates de sodium (E325), de potassium (E326) ou de calcium (E327), Lécithines (E322), des caraténoides comme la Lutéine, Lutéoline, des caraotènes comme la Lycopène, Tartrates de sodium (E335)/potassium (E336) ou de sodium et 30 de potassium (E337), thiosulfate de sodium, Vitamine E (tocophérols naturels (E306), a-tocophérol de synthèse (E307), y-tocophérol de synthèse (E308) et Ô-tocophérol de synthèse (E309), sélénium E160 et chlorure d'hydroxylammonium. 8 3046716 L'inhibiteur de laccase a de préférence peu d'impact sur l'environnement et y est rapidement dégradé. Ainsi, de façon préférée l'inhibiteur de laccases est sélectionné parmi l'un des composés suivants : Acide ascorbique, Ascorbates de sodium/calcium (E301)/ (E302), Lactates de sodium (E325), de potassium (E326) ou de calcium 5 (E327), Lutéine, Lycopène, Tartrates de sodium (E335)/potassium (E336) ou de sodium et de potassium (E337), thiosulfate de sodium, Vitamine E (tocophérols naturels (E306), a-tocophérol de synthèse (E307), y-tocophérol de synthèse (E308) et Ô-tocophérol de synthèse (E309). 10 De préférence, l'inhibiteur de laccases est sélectionné parmi l'un des composés suivants : L-cystèine, acide coumarique, thiosulfate de sodium, acide ferulique, acide syringique, acide ascorbique, acide gallique. En outre, les molécules préférées sont des molécules naturelles ou facilement 15 dégradables et respectent donc l'environnement contrairement aux insecticides les plus répandus. Ainsi, de manière encore plus préférée, l'inhibiteur de laccases est sélectionné parmi l'un des composés suivants : L-cystéine, thiosulfate de sodium, acide ferulique, acide syringique, acide ascorbique, acide gallique. 20 Cet inhibiteur de laccase est utilisé à une concentration suffisante pour entrainer une inhibition de l'activité des laccases présentes dans la meule et chez les fourmis. Typiquement, la concentration en inhibiteur de laccases est comprise entre 1 et 200 g/kg de composition formicide. De préférence elle est comprise entre 10 g/kg et 150 g/kg de composition formicide et de manière plus préférée entre 50 g/kg et 120 g/kg 25 de composition formicide. L'utilisation d'une composition comprenant au moins un inhibiteur de laccase entraine l'abandon du nid mais dans certains cas un nouveau nid est reconstruit à proximité du nid abandonné. Ils ont également isolé de nombreux actinomycètes de la cuticule des fourmis champignonnistes. Suite à ces observations, les inventeurs 30 ont montré qu'une composition comprenant au moins un inhibiteur de laccase additionné d'au moins un composé antibactérien ayant une activité bactéricide ou 9 3046716 bactériostatique contre les actinomycètes permet de détruire les colonies en quelques jours autour de l'emplacement des appâts et cela sans réapparition des colonies. Ainsi l'ajout d'au moins un composé antibactérien permet d'augmenter l'effet de l'inhibiteur de laccase et entraine une destruction de la colonie. 5 Ainsi, la combinaison d'un inhibiteur de laccase avec une molécule antibactérienne ayant une activité bactéricide et/ou bactériostatique contre les actinomycètes permet d'une part d'optimiser la disparition de la colonie et d'autre part d'éviter l'apparition de nouvelles colonies. Cela est d'autant plus vrai lorsque le traitement est appliqué avant l'essaimage. En effet la destruction du nid ne permettra 10 pas l'envol (essaimage) des fourmis ailées à l'origine de la fondation de nouvelles colonies limitant ainsi leur propagation. Alors que l'inhibiteur de laccase pris individuellement permet un contrôle des fourmis champignonnistes (e.g. abandon du nid) sans destruction de la colonie, la combinaison de ces deux composés entraine une destruction de la colonie. Cette 15 action est en outre spécifique des fourmis champignonnistes et n'aura pas ou peu d'impact sur l'environnement. Ainsi, de manière préférée, l'invention porte sur une méthode de lutte contre les fourmis champignonnistes comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de laccase et d'au moins un composé antibactérien. 20 De façon préférée, l'invention porte sur une méthode de lutte contre les fourmis champignonnistes découpeuses de feuille appartenant aux genres Atta ou Acromyrmex comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de laccase et d'au moins un composé antibactérien. Il existe une très grande diversité de composés antibactériens actifs contre les 25 actinomycètes. Il existe des tests de routine permettant de détecter et de quantifier cette activité tels que ceux présentés dans les exemples (Anti-biogramme en boîte de Pétri ie disques imprégnés sur gélose) qui peuvent être mis en oeuvre sur des souches d'actinomycètes de collection (e.g. ATCC23345, ATCC19727) ou sur des souches directement isolées de fourmis champignonnistes (cf. exemples). 30 En particulier, l'invention est caractérisée en ce que le composé antibactérien est un antibiotique. 10 3046716 Plus particulièrement l'antibiotique peut être sélectionné parmi les classes d'antibiotiques suivantes : 13-lactamines, Aminosides, Macrolides et apparentés, Glycopeptides, Tétracyclines et Quinolones. Par exemple, cet antibiotique peut être sélectionné parmi la liste suivante : Chloramphenicol, Erythromycine, Josamycine, 5 Tétracycline, Gentamycine, Streptomycine, et Penicilline. Par ailleurs, les inventeurs ont identifié des composés naturels provenant de végétaux ayant une activité bactériostatique ou bactéricide contre les actinomycètes. Ces composés naturels issus de végétaux ont l'avantage d'être dégradé rapidement et présentent pour la plupart une activité bactéricide ou bactériostatique contre les actinomycètes visés aussi forte que celle d'un antibiotique. En outre, les molécules préférées sont des molécules naturelles ou facilement dégradables et respectent donc l'environnement contrairement aux insecticides ou antibactériens les plus répandus. 15 De préférence, le composé antibactérien utilisé n'est pas un antibiotique utilisé en thérapeutique (humaine ou animale). L'exclusion d'un tel antibiotique a pour but de limiter l'émergence potentielle de résistance ayant une conséquence sur les stratégies thérapeutiques. De préférence le composé antibactérien utilisé est une molécule naturelle extraite 20 de plante. Ce composé antibactérien est utilisé pur ou peut être présent au sein d'un mélange de composés dans une huile essentielle. Ainsi, plus particulièrement, l'invention est caractérisée en ce que le composé antibactérien est sélectionné parmi la liste suivante : Carvacrol, Thymol, Eugénol, Cinnamaldéhyde, a-terpineol, Terpinène-4-ol. 25 De préférence, le composé antibactérien est sélectionné parmi la liste suivante : Carvacrol, Thymol, Eugénol et Cinnamaldéhyde. Le composé antibactérien selon l'invention peut également être caractérisé en ce qu'il consiste en une huile essentielle sélectionné parmi les huiles essentielles provenant des végétaux suivants : Origan, Marjolaine, Thym, Clou de girofle, 30 Cannelle, Arbre à thé (Malaleuca alternifolia), Pin, Géranium, citron, citronnelle et Ail. 11 3046716 De préférence, le composé antibactérien est sélectionné parmi la liste suivante d'huile essentielle suivante : Origan, Thym, Clou de girofle et Cannelle. Ce composé antibactérien est utilisé à une concentration suffisante pour entrainer 5 une activité bactéricide et/ou bactériostatique contre les actinomycètes présents dans la meule et sur les fourmis. Cette concentration peut être déterminée par l'homme du métier grâce à des tests conventionnels d'évaluation de la concentration minimale inhibitrice ou de la concentration minimale bactéricide tels que ceux mis en oeuvre dans les exemples. 10 Typiquement, la concentration en composé antibactérien est comprise entre 1 et 200 g/kg de composition formicide. De préférence elle est comprise entre 10 g/kg et 150 g/kg et de manière plus préférée entre 50 g/kg et 120 g/kg de composition formicide. En outre, l'homme du métier sait comment préparer de telles compositions formicide 15 et les compositions ou méthodes selon l'invention peuvent fonctionner avec un ou plusieurs inhibiteurs de laccase de préférence en combinaison avec un ou plusieurs composés antibactériens. Les inventeurs ont également montré que l'ajout d'un appétant oligosaccharidique ou polysaccharidique à une composition formicide permet d'attirer plus efficacement 20 les fourmis champignonnistes. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention porte sur une méthode de lutte contre les fourmis champignonnistes comprenant l'utilisation d'au moins un appétant oligosaccharidique ou polysaccharidique. Avantageusement, l'invention porte sur une méthode de lutte contre les fourmis 25 champignonnistes comprenant l'utilisation d'au moins un appétant oligosaccharidique ou polysaccharidique et combinaison avec au moins un inhibiteur de laccase et au moins un composé antibactérien. En particulier, l'appétant oligosaccharidique ou polysaccharidique peut être choisi parmi : amidon, amylose, amylopectine, glycogène, maltodextrine, polymères de 12 3046716 cyclodextrine, polymères d'isomaltose, icodextrines, dextrane, maltoheptose, maltohexose, maltopentose, maltotetrose, maltotriose et leurs dérivés. De manière préférée, l'appétant oligosaccharidique ou polysaccharidique est choisi parmi : amidon, amylose, maltodextrine et glycogène. 5 De manière encore plus préférée l'appétant est de l'amidon. Les inventeurs ont montré qu'une composition formicide comprenant au moins un inhibiteur de laccase et au moins un composé antibactérien permet de détruire les colonies de fourmis champignonnistes. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention porte sur une composition formicide 10 comprenant au moins un inhibiteur de laccase et au moins un composé antibactérien comme composés actifs contre les fourmis champignonnistes. De préférence, ces deux composés sont les seuls composés actifs contre les fourmis champignonnistes. Pour la composition de l'invention, les composés antibactériens et les inhibiteurs de laccases sont les mêmes (y compris les composés préférés) que ceux décrits plus 15 haut relativement à la méthode de l'invention. Typiquement, la concentration en composé antibactérien est comprise entre 1 et 200 g/kg de composition formicide. De préférence elle est comprise entre 10 g/kg et 150 g/kg et de manière plus préférée entre 50 g/kg et 120 g/kg de composition formicide. Typiquement, la concentration en inhibiteur de laccases est comprise entre 1 et 200 20 g/kg de composition formicide. De préférence elle est comprise entre 10 g/kg et 150 g/kg et de manière plus préférée entre 50 g/kg et 120 g/kg de composition formicide. La composition selon l'invention peut être un produit de combinaison d'au moins un inhibiteur de laccase et au moins un composé antibactérien pour une utilisation simultanée, étalée ou séparée dans le temps. 25 La composition peut également comprendre au moins un appétant. De préférence, l'appétant est un appétant glucidique. L'appétant est de façon plus préférée sélectionné parmi les appétants oligosaccharidiques ou polysaccharidiques décrits plus haut relativement à la méthode de l'invention (y compris les composés préférés). 30 13 3046716 Il n'est pas nécessaire d'ajouter à la composition formicide des composés toxiques pour les fourmis champignonnistes. Ainsi, typiquement, la composition formicide selon l'invention ne comprend pas de composés ciblant le système nerveux des insectes (e.g. Fipronil). 5 Contrairement à des insecticides ou des formicides classiques, la composition selon l'invention est spécifique des fourmis champignonnistes. Ainsi, son utilisation est prévue dans un procédé de lutte contre les fourmis champignonnistes et plus particulièrement pour la destruction des colonies de fourmis champignonnistes. 10 Contrairement à d'autres insecticides ou formicides, cette composition n'ayant pas un effet immédiat, elle n'est pas obligatoirement dispersée sur la colonie. Il est possible de la placer dans les champs à protéger ou bien au niveau des colonnes de récolte. Les fourmis champignonnistes vont amener la composition au nid où elle sera en contact avec l'ensemble de la colonie et du champignon. Dans ce mode de 15 réalisation, l'utilisation d'un appétant est particulièrement avantageux. La composition selon l'invention peut être dispersée directement sur ou autour du nid lorsque ce dernier est localisé (par exemple à moins de 5 mètres) ou de préférence à proximité des colonnes de récoltes (par exemple à moins de 2 mètres) 20 La méthode selon l'invention peut comprendre la dispersion de 20 g à 500 g de composition formicide selon l'invention par jour. La méthode selon l'invention peut comprendre la dispersion de 10 g à 100 g de composition formicide selon l'invention par jour, sur 5 à 30 jours consécutifs. 25 La méthode selon l'invention peut également comprendre la dispersion de 200 g à 500 g de composition formicide selon l'invention en une seule fois. FIGURES 30 Figure 1 présente une mesure de l'activité anti-laccase de la L-cystéine sur un échantillon de meule (A) et de fourmi (B). 14 3046716 EXEMPLES 1. Matériels et Méthodes 5 1.1. Mesure de l'activité enzymatique Echantillonnage et conditionnement Sur un total de 18 nids, des échantillons de meules et des échantillons de fourmis ont été prélevés puis conservés à -20°C. 10 Obtention des extraits enzymatiques Les broyages ont été faits dans des mortiers placés sur de la glace, à l'aide de pilons. Les fourmis (2g) et la meule (2g) ont été broyées dans 10m1 d'eau distillée réfrigérée à 4°C. Après avoir obtenu un broyat de texture homogène, le tout a été 15 centrifugé. La centrifugation a été effectuée à 4°C, 15 000 tours/min pendant 20min. Pour la précipitation des protéines, le surnageant a été saturé à 80% en sulfate d'ammonium ((NH4)2504). Après dissolution totale du sulfate d'ammonium, la solution obtenue est placée à 4°C durant 12 heures. La solution a été ensuite centrifugée à une température de 4°C, à 15 000tours/min, pendant 20min. Le culot 20 obtenu est re-dissout dans un minimum d'eau distillée froide puis dialysé contre 5 litres d'eau distillé à 4°C pendant 12 heures. L'extrait ainsi obtenu constitue l'extrait enzymatique brut. Ces extraits ont été aliquotes puis conservés à -20°C. Substrats enzymatiques analysés L'activité enzymatique a été évaluée par rapport à la capacité de dégradation de 16 25 substrats : - cinq oligosaccharides naturels (cellobiose, gentiobiose, lactose, maltose, saccharose) ; - six hétérosides synthétiques (PNPa- et 3-glucopyranosydes, PNP-a- et [3- galactopyranoside, PNP-p-xyloside et PNP-N-acétyl-glucosamine) ; 15 3046 716 - quatre polysaccharides (amidon, carboxyméthylcellulose (CMC), pullulane et xylane). Analyses enzymatiques Les solutions enzymatiques ont été incubées avec les substrats à 37°C, pendant 5 30min dans une solution tampon Mac Ilvain de pH=5,2. Tous les essais enzymatiques et de témoins ont été réalisés en 3 réplicats, pour s'assurer d'avoir une répétabilité des résultats. Pour exprimer les résultats, la moyenne des trois répétitions a été prise en compte. L'activité oligosaccharidase a été déterminée par la méthode de dosage par la glucose oxydase (GOD), selon Werner et al. (1970). L'activité hétérosidase a été évaluée indirectement, par mesure de la quantité de para-nitrophénol (PNP) libéré, d'après la méthode décrite par Nunan et al., (2015). Les sucres réduits produits par l'hydrolyse des polysaccharides sont appréciés par la méthode de microdosage Somogyi-Nelson au réactif cupro-alcalin (Williams et al., 15 1978) L'activité laccase a été évaluée en utilisant le 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6- sulphonic acid) (ABTS) en tant que substrat, témoin d'oxydation. De façon succincte, l'ABTS est diluée à 27,4 mg/L dans une solution de tampon MacIlvain à pH=5,2. 150 pL de la solution d'ABTS est incubée avec 100 pL d'une solution à tester puis 20 incubée pendant 30 min à 37°C. La mesure de la DO à 405 nm permet de déterminer la quantité d'ABTS oxydée en utilisant la loi de Beer-Lambert (epsilon = 36000mM). Les protéines sont dosées par la méthode utilisant le réactif BioRad®. Pour réaliser la gamme étalon l'albumine de sérum bovin a été utilisée. 25 Inhibition des laccases Le dosage de l'activité laccase est basé sur une méthode colorimétrique ou le substrat ABTS (2,2'-AZINO-bis (3-ETHYLBENZ-THIAZOLINE-6-SULFONIC ACID) sous forme réduite (incolore) est oxydée (coloration verte) en présence de l'enzyme 30 La méthode a été publiée par Bourbonnais et al. en 1990. Pour tester l'inhibition de l'activité laccase, la molécule testée est ajoutée au mélange réactionnel avec des 16 3046716 quantités pouvant varier de 0,1 mM à 100 mM. Les inhibiteurs choisis pour faire les analyses sont des composés ayant un pouvoir antioxydant. 1.2. Evaluation de l'activité antibactérienne 5 1.2.1. Prélèvement Les souches bactériennes adhérant à la cuticule des fourmis ont été prélevées grâce à l'utilisation d'une solution dispersante correspondant à une solution de NaCI 0.9% contenant 10% de Tween 80. 10 1.2.2. Isolement Les souches d'actinomycètes ont été isolées par repiquages successifs sur des milieux gélose NA (composition : 2,5 g de K2HPO4 ; 0,5g de Nitrate de sodium ; 7,5 g d'agar ; 2 g de N-acetyl-glucosamine ; Qsp 500 ml ; pH : 6.5) ou PCA (composition : 15 Peptone de caséine 5,0 g ; Extrait de levure 2,5 g ; D(+)-glucose 1,0 g ; Agar 14,0 g ; Qsp1000 ml pH 7) et vérification de la morphologie par microscopie optique. 1.2.3. Vérification de l'identité des souches Extraction d'ADN 20 Les souches isolées de la surface extérieure des corps de fourmis et sélectionnées ont été réactivées dans 9 ml de milieu de culture (5 g peptone ; 2,5 g d'extrait de levure et 1 g de glucose). La culture a été incubée sous agitation à 27°C pendant une nuit. Après croissance bactérienne, des prélèvements de 2 mL de culture ont été effectués sur chaque 25 échantillon et placés respectivement dans des tubes eppendorf puis centrifugés à 10000 g pendant 10 min. La lyse des bactéries a été effectuée en utilisant le FastPrep®-24 (MP Biomedicals) et les tubes « Powerbead » inclus dans le kit. Les conditions étaient les suivantes : Fréquence 4.0 ms-1, temps 45 s. Le kit PowerSoil DNA isolation (Mobio Laboratories) a été utilisé pour extraire l'ADN total à partir des 30 culots obtenus après centrifugation. Le protocole appliqué est celui recommandé par le fournisseur. L'ADN a été élue dans 70 pL de tampon Tris-HCI fourni avec le kit. La concentration de l'ADN total extrait a été déterminée par spectrophotométrie en utilisant le Nanodrop et conservé à -20°C avant analyses ultérieures. 17 3046716 Amplification d'une région du gène 16S ARNr spécifique aux bactéries Une région spécifique au gène 16S ARNr spécifique aux bactéries a été amplifiée par PCR dans les conditions suivantes : 5 Les amorces utilisées étaient : 27F et 1390R (Mao et al. 2012). La vérification des amplicons avait été faite par électrophorèse sur gel d'agarose à 1`)/0 (poids/volume de tampon TAE 0,5X) contenant 0,5X de Sybersafe. La présence des bandes a été visualisée en exposant le gel à la lumière ultraviolette (UV). 10 Séquençage et affiliation phylogénétique des souches Le séquençage de type Sanger des amplicons était effectué par la société Beckman Coulter Genomics. Le logiciel BioEdit a été utilisé pour aligner les séquences obtenues. La comparaison entre ces séquences et celles disponibles dans les banques de données a été réalisée en utilisant le logiciel BLAST sur NCBI. 15 1.2.4. Mesure de l'activité antibactérienne en boîte de pétri sur disque Le principe général est de tester en milieu solide la culture de la souche en présence 20 de disque de papier imprégné de la molécule à tester. Pour chaque molécule testée au moins trois dilutions ont été réalisées. En présence d'une molécule, une auréole dont le diamètre est en relation avec l'intensité de l'effet inhibiteur apparait autour du disque de papier. Cette approche permet de manière simple de sélectionner les molécules antibactériennes et de déterminer la concentration minimale d'inhibition 25 (CMI) de la croissance bactérienne. La mesure de l'activité antibactérienne peut être réalisée en milieu liquide (dans une culture bactérienne liquide) ou en milieu solide (sur une boîte de pétri gélosée) en ajoutant une concentration connue d'antibiotique. En milieu liquide l'inhibition est 30 mesurée par une Densité Optique (DO), en milieu solide (technique utilisée lors du projet de maturation) l'inhibition de la croissance est estimée par le diamètre de l'auréole correspondant à la zone où aucune croissance n'est observée. 18 3046716 A partir des isolats, un prélèvement est réalisé. Celui-ci est mis en suspension dans 1 ml de sérum physiologique sans mesure de la DO. L'ensemencement est réalisé avec 100 pl de suspension à l'aide d'un râteau. Pour les tests d'huile essentielle sans dilution, un disque trempé dans l'huile essentielle 5 est placé au centre de la boîte. Pour les dilutions (1/2 ; 1/5) les deux disques sont placés dans une même boîte. Les dilutions ont été réalisées en diluant les huiles essentielles dans de l'huile de tournesol. Une boîte témoin a été réalisée et consiste en un inoculât en l'absence d'huile essentielle. Un deuxième témoin cette fois ci avec un disque imprégné avec de l'huile de tournesol a également été effectué afin de vérifier l'absence d'un effet. Tous les produits ont été stérilisés et les expérimentations réalisées sous hotte en conditions stériles. Après 4 jours de croissance, les diamètres d'inhibition ont été mesurés. Pour cette étude et celle concernant l'utilisation de molécules, l'érythromycine a été utilisée. L'érythromycine est un antibiotique macrolide qui a un spectre antimicrobien 15 similaire ou légèrement plus large que celui des pénicillines. Cette molécule sert de référant. 1.3. Evaluation de l'efficacité contre les fourmis champignonnistes 20 1.1.1. Préparation de la composition La préparation des boulettes (ou appât) a été réalisée en incorporant à une pâte de farine de blé 10% de thiosulphate de sodium ou d'acide ascorbique. La pâte ainsi obtenue a été transformée en boulette ayant la forme d'un grain de riz. Ces boulettes ont ensuite été séchées à une température maximum de 28°C dans une étuve. 25 1.1.2. Essais contre les fourmis champignonnistes 1.1.1.1. Anti-laccase 30 Des premiers essais ont été réalisés afin d'acquérir de premières données concernant l'utilisation de boulettes imprégnées de différents inhibiteurs de laccase. 19 3046716 Deux jours après avoir déposé les boulettes, les nids sont visités pour la première fois puis à 4, 6, 8, 9, 10, 12 et 14 jours. On observe la présence ou non de boulettes (10 g) qui placées dans un petit sac plastique ont été déposées à proximité d'un dôme. A chaque visite le sachet est remplacé que les boulettes ou non aient été 5 récoltées par les fourmis. Les boulettes imprégnées d'acide ascorbique ou de thiosulfate de sodium sont alternées lors de chaque visite. Un test d'activité de la colonie est réalisé à l'aide d'une tige en bois. Celle-ci est enfoncée dans le sol à différents endroits autour du cône et lorsque l'on ne ressent aucune résistance cela signifie que la tige est enfoncée au niveau de la cavité 10 contenant la meule. En quelques secondes plusieurs dizaines de fourmis dérangées par l'introduction de la tige dans la cavité de la meule remontent le long de la tige attestant ainsi de la vitalité de la colonie. 1.1.1.2. Anti-laccase + antibactérien 15 Les boulettes peuvent également contenir un mélange de molécule anti-laccase et antibactérienne. 20 25 30 20 3046716 2. Résultats 5 2.1. Mesure de l'activité enzymatique Les résultats des mesures d'activité enzymatique sont présentés dans le tableau 1. Tableau 1 Activités enzymatiques mesurées chez la fourmi champignoniste Acromyrmex octospinosus et le champignon Leucophorus qonqulophorus Oligosaccharidases Fourmi Champignon (pg de glucose mn-' mg 1 protéines) Cellobiase 41,3 4,5 Gentiobiase 62,4 8,8 Lactase 12,0 5,0 Maltase 988,7 5,2 Saccharase 790,7 0,9 Hétérosidases Fourmi Champignon (pg phénol mn-' mg-1 protéines) a-galactosidase 48,5 14,2 13-galactosidase 12,0 10,3 a-glucosidase 2706,5 9,3 13-glucosidase 46,9 12,9 13-Xylosidase 22,1 14,0 N-acétyl-glucosaminidase 23,5 3,2 Polysaccharidase Fourmi Champignon (pg équivalent glucose 1 1 , mn mg protéines) Amylase 385,6 26,5 Cellulase 75,9 1,7 Pullulanase 14,1 0,8 Xylanase 96,6 13,1 Phénol oxydase Fourmi Champignon (pg fluoresceine mn-' mg 1 - protéines Laccase 38830,5 8538,1 10 21 3046716 Le résultat majeur de ce criblage enzymatique est la mise en évidence d'une très forte activité laccase à la fois dans la meule et chez les fourmis. En effet, cette enzyme représente plus de 90% de l'ensemble des activités mesurées. Les laccases 5 ou polyphénol oxydases catalysent l'oxydation des substances phénoliques (Thurston, 1994). Chez les champignons, les laccases outre leur action oxydative sur les composés polyphénoliques (implication dans la dégradation de la lignine) auraient également un rôle de détoxification vis-à-vis des substances défensives des plantes. 10 Les résultats de l'étude du spectre osidasique montrent que celui des fourmis est caractérisé par une activité amylolytique. Ainsi, l'activité maltase (dimère de l'amidon) des fourmis est non seulement très largement supérieure à celle détectée dans la meule mais elle est également l'une des enzymes majoritaires. Il en va de 15 même pour les activités mesurées sur l'a-glucoside. Ces fortes activités liées à la dégradation de l'amidon sont confirmées par de fortes activités amylases. L'amidon apparaît donc comme une source carbonée importante pour Acromyrmex octospinosus contrairement à ce que l'on peut observer au niveau de la meule. 2.2. Mesure de l'activité anti-laccase 20 Les résultats de mesure de l'activité anti-laccase sur des échantillons de fourmi ou de meule sont présentés dans le tableau 2. Tableau 2 IC50 Acromyrmex 1050 Leucophorus octospinosus gongylophorus L-cystèine REVENDICATIONS1. Méthode de lutte contre les fourmis champignonnistes comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de laccase. 2. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend l'utilisation d'au moins un composé antibactérien et d'au moins un inhibiteur de laccase. 3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que l'inhibiteur de laccase est une molécule anti-oxydante, un chélateur, un détergeant, un acide organique non oxydant ou un métal cationique, de préférence une molécule anti-oxydante. 4. Méthode selon l'une des revendications 2 ou 3 caractérisée en ce que le composé antibactérien est sélectionné parmi les molécules appartenant à l'un des familles suivantes : plactamines, tétracyclines, quinolones, macrolides, glycopeptides, aminosides et molécules actives d'huiles essentielles. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que l'inhibiteur de laccase est sélectionné parmi les molécules suivantes : acide ascorbique, acide citrique, acide coumarique, acide ferulique, acide syringique, acide gallique, acide lactique, acide tartrique, Cystéine, Glutation, Lécithines (E322), Lipoate, Lutéine, Lutéoline, Lycopène, Thio-sulphate de sodium, Vitamine E, a-tocophérol, y-tocophérol et Ô-tocophérol, sélénium et hydroxylammonium chloride. 6. Méthode selon l'une des revendications 2 à 5 caractérisée en ce que le composé antibactérien est sélectionné parmi les molécules suivantes cinnamaldéhyde, thymol, l'eugénol et le carvacrol. 29 3046716 7. Composition formicide susceptible d'être mise en oeuvre dans la méthode selon l'une des revendications 2 à 6 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé antibactérien et au moins un inhibiteur de laccase. 5 8. Composition formicide selon la revendication 7 comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, étalée ou séparée dans le temps. 9. Composition formicide selon l'une des revendications 7 ou 8 caractérisée en ce que la concentration en composé antibactérien est comprise entre 1 et 200 10 g/kg et la concentration en inhibiteur de laccase est comprise entre 1 et 200 g/kg. 10. Composition formicide selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un appétant, de préférence un appétant de type 15 oligosaccharide ou polysaccharide. 30