Brevet FR3048000A1 — publié le 20170825

METHODE POUR IDENTIFIER DES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une méthode pour identifier des perturbateurs endocriniens, laquelle méthode utilise une lignée cellulaire transformée par une cassette d'expression spécifique. ART ANTERIEUR Le système endocrinien, par le biais de la sécrétion d'hormones essentielles au métabolisme, à la croissance, au développement, au sommeil et à l'humeur, est l'un des systèmes de régulation clé qui contribue au maintien de l'homéostasie chez un individu. Au sein de ce système, la sécrétion d'hormones est assurée par un ensemble de glandes endocrines et exocrines qui sont disséminées dans l'organisme. Maintenant, un certain nombre de substances chimiques d'origine naturelle (hormones et phytoestrogènes) ou artificielle (produits issus de l'industrie chimique contenus dans des objets de consommation courante, produits de traitement des cultures, médicaments, cosmétiques, etc ...), et présentes dans l'environnement, ont été identifiées comme interférant avec le bon fonctionnement du système endocrinien. Ces substances, qualifiées de « perturbateurs endocriniens », induisent alors des effets néfastes sur l'organisme d'un individu et/ou sur ses descendants. Les mécanismes d'action associés à ces perturbations reposent le plus souvent sur la capacité de ces substances à imiter l'action d'une hormone naturelle, à se fixer sur les récepteurs de ces hormones naturelles, et/ou encore à gêner ou à bloquer le mécanisme de production ou de régulation des hormones ou des récepteurs ; ces actions modifiant ainsi les concentrations d'hormones présentes dans l'organisme. Des études réalisées chez l'animal ont notamment contribué à mettre en évidence l'existence d'interactions entre ces composés et des récepteurs hormonaux et à mieux comprendre certains de leurs mécanismes d'action. 3048000 2 Agissant à faible dose pour certains d'entre eux, les perturbateurs endocriniens sont aujourd'hui suspectés d'être responsables chez l'Homme de dysfonctionnements de la fonction de reproduction, notamment par le biais de la baisse de la qualité du sperme et de l'augmentation de la fréquence d'anomalies survenant lors du développement du 5 tractus génital dont une augmentation a été observée ces dernières années. A noter en outre que leur implication dans l'étiologie de cancers hormono-dépendants (sein, utérus, prostate, testicules) et de maladies neurodégénérarives (Alzheimer, Parkinson, autisme) a également été rapportée. Aussi, il est particulièrement critique aujourd'hui de pouvoir identifier de tels 10 perturbateurs pour en empêcher, ou à minima en encadrer, la commercialisation. Maintenant, l'identification de tels perturbateurs endocriniens est rendue particulièrement délicate, dans la mesure où ces substances sont susceptibles d'agir à très faible dose, qui plus est souvent selon un effet cumulatif et/ou synergique. De plus, la sensibilité d'un organisme aux perturbateurs endocriniens peut également varier 15 selon les périodes de la vie, ce qui complique encore leur identification rigoureuse. Bien qu'un certain nombre de ces perturbateurs endocriniens aient déjà été identifiés et fassent l'objet d'une surveillance accrue (Directives 2000/60/CE et 2013/39/UE), la toxicologie classique réalisée sur les animaux se heurte aux spécificités de ces composés (action à faible dose, effet cumulatif, effet trans-générationnel, ...). Par ailleurs, 20 l'apparition chaque année sur le marché mondial de 700 nouveaux composés chimiques rend impossible leur criblage à grande échelle. Récemment, des modèles cellulaires ont été mis au point dans le but de cribler des composés interférant avec le développement du système nerveux. Il s'agit soit de lignées immortalisées, de cultures primaires, de cellules souches pluripotentes ou 25 encore de progéniteurs neuronaux multipotents (BREIER et al., Neurotoxicology and teratology 2010, vol. 32, pp4-15). Toutefois, la mise en culture de lignées cellulaires ou de cultures primaires conduit rapidement à la perte du phénotype de cellules neuronales différenciées, rendant incertain l'extrapolation des résultats obtenus sur de tels modèles avec l'in vivo. S'agissant des cellules souches pluripotentes, leur 3048000 3 approvisionnement pose un problème éthique, en particulier chez l'homme. L'unique modèle commercial de progéniteur neuronal actuellement disponible sont les lignées ReNceIITM VM et ReNcellTM CX dérivées de la région mésencéphalique d'un cerveau humain en développement (BREIER et al., Toxicological Sciences 2008, vol.105, n°1, 5 pp119-138 / DONATO et al., BMC Neuroscience 2007, vol.8, n°36, pp1-11). Il existe par conséquent un réel besoin de développer de nouveaux outils permettant le criblage, in vitro et à grande échelle, des composés dont on soupçonne qu'ils possèdent un effet de perturbateur endocrinien et, plus particulièrement, de ceux liés à la perturbation de la fonction de reproduction. 10 RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs ont maintenant mis au point un nouveau procédé qui, malgré son apparente simplicité, permet tout à la fois d'opérer un criblage de potentiels perturbateurs endocriniens in vitro et à grande échelle, le tout en faisant fi des 15 problèmes de stabilité sur le long terme du phénotype nerveux des modèles cellulaires. Pour se faire, l'invention a pour objet une cassette d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un oncogène liée de manière opérationnelle à un promoteur inductible, ledit promoteur inductible comprenant (i) une région promotrice minimale et (ii) au moins une séquence régulatrice GBS (Gli-binding site), et, 20 optionnellement, une séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène et/ ou une séquence régulatrice 3' UTR placée à l'extrémité 3' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène. De la sorte, la cassette d'expression selon l'invention présente un profil d'expression correspondant à celui du gène Sox2, lequel gène est caractéristique des cellules 25 pluripotentes. Cette cassette d'expression permet le maintien en culture des cellules transformées par celle-ci tant qu'elles se trouvent sous une forme indifférenciée. En fonction des besoins en termes de criblage, il est alors possible d'induire la 3048000 4 différenciation de ces cellules transformées en cellules nerveuses et, alors, de tester sur ces dernières l'action d'éventuels perturbateurs endocriniens. De préférence, l'oncogène est spécifique des progéniteurs neuronaux. De la sorte, l'oncogène utilisé permet l'amplification cellulaire et, simultanément, l'activation des 5 gènes de multipotence de ces cellules. Ainsi, le système d'amplification des progéniteurs neuronaux en culture limite, autant que faire se peut, la perturbation du profil d'expression spécifique de ces progéniteurs, et contribue donc à maintenir la nature même de ces progéniteurs et des cellules qui pourraient en être issues. Cet élément est d'autant plus important que ce système a vocation à être un modèle de ces cellules in 10 vivo. L'invention a également pour objet un vecteur d'expression comprenant la cassette d'expression selon l'invention, une cellule hôte comprenant une cassette ou un vecteur selon l'invention. L'invention est également relative à une cassette d'expression, un vecteur ou une cellule 15 hôte pour leur utilisation dans le criblage de composés perturbateurs endocriniens. L'invention se rapporte encore à un procédé d'amplification cellulaire comprenant l'étape de : a) Mise en culture de progéniteurs neuronaux, transformés par une cassette d'expression selon l'invention, dans un milieu de culture approprié. 20 Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape a), une étape de transformation de ces progéniteurs neuronaux par une telle cassette d'expression selon l'invention, ou par un vecteur la comprenant. 25 Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il vise, en outre, à l'obtention de cellules nerveuses différenciées et en ce qu'il comprend une étape supplémentaire b) de différenciation des progéniteurs neuronaux en neurones et/ou en cellules gliales choisies parmi les astrocytes et les 3048000 5 oligodendrocytes, laquelle différenciation est induite par une modification de la composition du milieu de culture utilisé à l'étape a). Selon encore un autre mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'il vise le criblage d'un composé perturbateur endocrinien et en ce 5 qu'il comprend en outre les étapes de : c) Mise en contact des cellules obtenues à l'issue de l'étape b) du procédé avec au moins un composé, d) détermination de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules résultant de la mise en contact avec ledit au moins un composé lors de l'étape c), et 10 e) Identification, en tant que composé perturbateur endocrinien, de tout composé ayant entrainé un changement métabolique et/ou phénotypique à l'issue de l'étape d). Un autre aspect de l'invention concerne enfin un kit pour le criblage de composés perturbateurs endocriniens comprenant une cassette d'expression selon l'invention. 15 DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 est une représentation schématique du plasmide Sox2p-Myc. La figure 2 est une représentation schématique du plasmide lentiviral d'expression pLV.EF1.MCS 20 La figure 3 est une représentation schématique du plasmide lentiviral d'expression pLV.Sox2prom.N-Myc-3'UTRSOX2. La figure 4 illustre l'engagement des cellules de la placode oflactive dans le lignage neuronal (antigène Tuj-1) ou glial (antigène GFAP) après leur transduction avec le transgène pSOX2-Nmyc. La détection est réalisée par immunodétection à l'aide 25 d'anticorps spécifiques. 3048000 6 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention concerne un procédé d'amplification cellulaire comprenant les étapes de : a) Mise en culture de progéniteurs neuronaux transformés par une cassette 5 d'expression comprenant : - une séquence d'acide nucléique codant pour un oncogène liée de manière opérationnelle à un promoteur inductible, ledit promoteur inductible comprenant : (i) une région promotrice minimale, et 10 (ii) au moins une séquence régulatrice GBS (Gli-binding site), - et, optionnellement, une séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène et/ ou une séquence régulatrice 3' UTR placée à l'extrémité 3' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène, 15 dans un milieu de culture approprié. Par « amplification cellulaire », on désigne le processus par lequel une cellule-mère engendre deux cellules-filles identiques entre elles et à la cellule-mère dont elles dérivent. Ce processus est induit par des signaux mitogènes présents dans l'environnement immédiat de la cellule. Des divisions cellulaires successives permettent 20 de produire un grand nombre de cellules. Par « progéniteurs neuronaux », on désigne des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes capables de renouveler leur population et de s'engager dans le lignage neuronal. Les progéniteurs neuronaux utilisés dans le procédé selon l'invention peuvent provenir de différents tissus embryonnaires de mammifères non humains. Par 25 définition, ces progéniteurs neuronaux ont la capacité de se différencier en neurones et en cellules gliales. L'état de progéniteurs neuronaux peut être évalué par de techniques in vitro bien connues de l'homme de l'art et qui incluent notamment des tests de différenciation in vitro. De telles cellules expriment un certain nombre de marqueurs 3048000 7 caractéristiques de leur origine neurale. Il s'agit notamment des gènes Sox2 (sex determining region Y-box 2), GFAP (glial fibrillary acidic protein), et DCX (doublecortin). Par « milieu de culture approprié », on entend un milieu de culture permettant d'éviter la différenciation des progéniteurs neuronaux. La supplémentation du milieu de culture 5 par une combinaison des facteurs de croissance EGF (Epidermal Growth Factor) et bFGF (Fibroblast Growth Factor 2) permet le maintient des progéniteurs neuronaux à l'état prolifératif, bloquant ainsi leur différenciation (REYNOLDS et al., Science 1992, vol. 27: pp1707-1710). Cet environnement s'étend non seulement au milieu de culture en tant que tel mais 10 également aux matrices recouvrant le support de culture utilisé. Il est entendu que ni le milieu de culture, ni la matrice ne doivent entrainer les progéniteurs neuronaux dans un processus de différenciation. De préférence, le milieu de culture doit contenir tous les éléments nutritionnels indispensables à la multiplication des cellules (acides aminés, bases azotées, minéraux, 15 facteurs de croissances, ions, ...). Dans un mode de réalisation particulier, les facteurs de croissance bFGF (basic fibroblast growth factor) et EGF (epidermal growth factor) sont présents dans le milieu de culture des progéniteurs neuronaux de l'étape a). Dans un mode de réalisation particulier, les progéniteurs neuronaux sont maintenus en 20 suspension dans le milieu de culture. La culture des progéniteurs neuronaux peut également être envisagée sur un support de culture pourvu d'une matrice de nature protéique, comprenant un mélange de glycoprotéines de structure (laminine, entactine), de collagènes et de protéoglycannes de type héparane sulfate. Le but de cette matrice est de recréer un environnement 25 proche de celui observé à l'état physiologique. Il existe des préparations commerciales de ce type de matrice qui sont bien connues de l'homme de l'art. Toutefois, l'adhésion des progéniteurs neuronaux sur un tel support de culture ne devra pas entrainer leur différenciation. 3048000 8 Dans un mode de réalisation particulier, une matrice synthétique de type MatrigelTM est utilisée pour recouvrir le support de culture des progéniteurs neuronaux. De préférence, les cellules souches pluripotentes sont issues de la culture d'expiants de placodes olfactives d'embryons de mammifères non humains. Les placodes olfactives 5 sont des épaississements ectodermiques qui participent à la formation des organes des sens et des ganglions sensitifs des nerfs crâniens. Les placodes olfactives sont situées symétriquement de part et d'autre de la ligne médiane, au rebord antério-inférieur, du bourgeon frontal de l'embryon. De préférence, les expiants de placodes olfactives sont prélevés sur des embryons de 10 mammifères non humains à un stade de développement précoce qui correspond au début de l'invagination des cavités nasales. Ce stade pourra varier en fonction du mammifère non humain. Ainsi, les expiants de placodes olfactives sont prélevés sur des embryons de souris de 11,5 jours (stade E11.5 du développement embryonnaire) alors qu'ils seront prélevés plus tardivement notamment chez le rat (stade E15), le mouton 15 (stade E30) ou le singe rhésus (stade E35). La mise en culture des expiants de placodes olfactives est réalisée selon la méthode décrite par CONSTANTIN et al. (Endocrinology 2009, vol.150 n°7:pp3221-3227). Brièvement, les fosses nasales issues d'embryons de mammifères non humains sont prélevées de manière stérile au stade E11.5 et placées dans un mélange de milieu SFM 20 et de solution tamponnée enrichie en glucose. Puis, les cellules des placodes olfactives sont dissociées de manière mécanique, filtrées, centrifugées et le culot cellulaire est finalement remis en suspension dans du milieu SFM. Le milieu SFM est un mélange 50/50 des milieux de culture BME (Basal Medium Eagle) et Ham's F-12, dans lequel sont ajoutés 1% de BSA (bovin serum albumin), 0,1 mM de 25 putrescine, 5pg/ml d'insuline, 100 pg/ml de transferrine, 3.10-8M de sélénium, 2 mM de glutamine, 5mg/ml de glucose, 38 pM de de vitamine C et un cocktail d'antibiotiques pénicilline (50 gg/m1)-streptomycine (50 gg/m1)-néomycine (100 pg/ml). Les concentrations indiquées sont les concentrations finales. 3048000 9 Les conditions de mise en culture d'explants de la placode olfactive permettent l'obtention de cellules caractéristiques de l'ectoderme, et, en particulier, du neuroectoderme. Ces cellules, qualifiées de progéniteurs neuronaux, sont un mélange de neuroblastes et de glioblastes qui leur confère un caractère multipotent, c'est-à-dire 5 qu'elles permettent d'obtenir différents lignages cellulaires. Ainsi, en fonction des conditions de cultures, les progéniteurs neuronaux se différencient respectivement en neurones ou en cellules gliales. Les cellules gliales comportent des astrocytes (cellules protectrices et nourricières des neurones) et des oligodendrocytes qui forment un manchon isolant de myéline autour des axones des neurones. Il est donc possible 10 d'obtenir un mélange de cellules différenciées à partir de progéniteurs neuronaux. Les cellules pluripotentes issues de la placode olfactive possèdent la capacité de s'engager dans le lignage neurogénique et, ainsi, de se différencier en neurones et/ou en cellules gliales incluant des astrocytes et des oligodendrocytes. Le procédé selon l'invention permet ainsi d'aboutir à des cultures multicellulaires, permettant de réaliser 15 des tests toxicologiques in vitro s'approchant au plus près de la réalité de l'in vivo. Compte tenu de leur origine embryonnaire, les progéniteurs neuronaux sont des cellules qui possèdent un fort taux d'expression du gène Sox2 (pour Sex determining region Y-box 2). Ce facteur de transcription a la capacité de s'autoréguler et, en s'associant avec d'autres facteurs de transcription, de réguler un groupe de gènes conduisant au 20 maintien du caractère multipotent des progéniteurs neuronaux. De la sorte, par le choix d'un promoteur inductible s'approchant de ce gène, on limite autant que possible l'amplification des cellules en culture à celles exprimant ce gène et bénéficiant donc effectivement du caractère multipotent des progéniteurs neuronaux. Au sens de la présente invention, une cellule est dite « transformée » lorsqu'une 25 séquence d'acide nucléique exogène a été transférée dans cette cellule par toute méthode bien connue de l'homme de l'art, où lorsque qu'une cellule-fille est issue d'une cellule parente ayant hérité de cette séquence d'acide nucléique. Les termes « transformée », « transfectée », « transduite » et « génétiquement modifiée » sont équivalents au sens de la présente invention et peuvent être employés indifféremment. 3048000 10 La séquence d'acide nucléique comporte généralement une séquence codante d'un gène d'intérêt dont on cherche à obtenir un fort niveau d'expression dans la cellule transformée. Selon la technique utilisée, la transformation peut conduire à l'intégration de l'acide nucléique exogène dans le génome de la cellule ou bien le maintenir sous 5 forme épisomale en tant qu'entité reproductive autonome dans le cytoplasme de la cellule. De préférence, la technique de transformation utilisée pour le procédé d'amplification cellulaire selon l'invention conduit à l'intégration de l'oncogène dans le génome des progéniteurs neuronaux. Ainsi, l'oncogène sera transmis à toutes les cellules filles issues 10 des progéniteurs neuronaux permettant, de ce fait, l'obtention d'une lignée stable. Par « oncogène », on désigne un gène capable d'accroître les capacités mitotiques des cellules dans lesquelles il s'exprime et ainsi de stimuler continuellement la division cellulaire. Les oncogènes ont été largement décrits dans la littérature. Dans le cadre de l'invention, l'oncogène peut être choisi parmi les gènes HRAS / KRAS et NRAS, Her2, 15 Hdm2, N-myc, TAL1, Fli-1, MLL, C cycline D1, RET, PML, Abl ou C-myc. De préférence, l'oncogène est spécifique de la lignée neurale et, en particulier, des progéniteurs neuronaux. Le terme « acide nucléique codant pour un oncogène » désigne la séquence d'acide nucléique résultant de l'association de l'intégralité des exons, ou phase ouverte de 20 lecture (ORF) qui permet la transcription et la traduction de la protéine oncogène sous sa forme entière. De préférence, l'oncogène est le gène N-myc. Les séquences de N-myc sont bien connues pour différentes espèces animales et sont définies par les séquences SEQ ID NO : 1 (NM_008709.3, Mus musculus), SEQ ID NO : 2 (NM_005378.5, Homo sapiens), 25 SEQ ID NO : 3 (NM_001013096.1, Rattus norvegicus), SEQ ID NO : 4 (NM_212614.1, Danio rerio) et SEQ ID NO : 5 (NM_001031091.2, Gallus gallus). Dans un mode de réalisation particulier, l'oncogène N-myc est d'origine murine et est codé par la séquence de SEQ ID NO : 1 (NM_008709.3) ou un dérivé de celle-ci. 3048000 11 Dans un mode de réalisation plus particulier, l'oncogène N-myc utilisé dans l'invention correspond aux nucléotides 295 à 1683 de la séquence SEQ ID NO : 1 (NM_008709.3). Selon l'invention, le terme "dérivé de" correspond à une séquence d'acide nucléique ayant au moins 90% d'identité avec une séquence de référence, particulièrement au 5 moins 95% d'identité et préférentiellement au moins 99% d'identité. Le terme « pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique » fait référence au pourcentage de nucléotides identiques entre deux séquences comparées, ledit pourcentage étant obtenu par le meilleur alignement de la séquence entière. Le terme « meilleur alignement » correspond à l'alignement qui permet d'obtenir le pourcentage 10 d'identité le plus élevé. Il peut être obtenu en utilisant différents algorithmes bien connus de l'homme de l'art (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, GENETICS COMPUTER GROUP, 575 Science Dr., Madison, WI USA). N-myc permet d'accroitre les capacités mitogènes des seuls progéniteurs neuronaux transformés par la cassette telle que précédemment décrite. 15 Le terme « promoteur » est bien connu de l'homme de l'art et se réfère à une région de l'ADN située en amont de la région 5' d'un gène sur laquelle se fixe l'ARN polymérase, et permettant ainsi d'initier la transcription. Selon l'invention, le promoteur est lié à l'oncogène de manière opérationnelle. Généralement, l'expression « lié de manière opérationnelle » signifie que la séquence 20 promotrice est positionnée, par rapport à la séquence codante de l'oncogène, de manière à ce que la transcription de ce dernier puisse être initiée. Cela signifie que le promoteur est positionné en amont de cette région codante et à une distance permettant la transcription de cette dernière. Il existe différents types de promoteurs tels que les promoteurs constitutifs ou les 25 promoteurs inductibles. En ce qui concerne les promoteurs inductibles, qui sont ceux qui nous intéressent, il s'agit de promoteurs dont l'activité est contrôlée par des conditions environnementales particulières, notamment par la présence ou l'absence 3048000 12 d'un composé particulier. De la sorte, ces promoteurs permettent, outre l'expression du gène placé en aval, le contrôle de cette expression. Les promoteurs utilisés dans le cadre de l'invention peuvent être dérivés de gènes natifs, ou composés de différents éléments dérivés de différents promoteurs naturels, 5 ou encore peuvent comprendre des segments d'ADN synthétiques. De préférence, le promoteur utilisé selon l'invention est dérivé de celui du gène Sox2. Les séquences de Sox2 sont bien connues pour différentes espèces animales et sont définies par les séquences SEQ ID NO : 6 (NM_011443.3, Mus musculus), SEQ ID NO : 7 (N M_003106.3, Homo sapiens), SEQ ID NO: 8 (NM_001109181.1, Rattus 10 norvegicus), SEQ ID NO : 9 (NM_213118.1, Danio rerio) et SEQ ID NO : 10 (NM_205188.2, Gallus gallus). Le promoteur dérivé de celui du gène Sox2 utilisé dans l'invention contient les 4 kb en amont du gène murin Sox2 et a pour séquence SEQ ID NO : 11. Cette séquence est contenue dans la séquence NC_000069.6 correspondant à l'ADN génomique du 15 chromosome 3 de la souris. Séquence de 4 kb du GCACTTCGTTTGGTTAAAGCTGGTTCCCAATATATTTAACCAGTTCCAGAATTA promoteur de Sox2 (SEQ GAAAGCCTTTCTGTACATTTTCTCTTATTTTTCTTGCTACTTTTCCTTATGTAATG AAATTAAAACTTTTGGAACCCACAGTTGACATTTTTCAGAAAATTGAGTTATCA ID NO : 11) AGGCAGTAATTATTTCTCGGGGAGATAAAACTCTCATAGCCCTAACTGTCAAAT AGGGCCCTTTTCAGATTTTAATTACAAAATAAAATTAGTCTGCTCTTCCTCG GA ATGGTTGGCG AGTGGTTAAACAGAGCTTTCCCCCAATACTGGTGGTCGTCAAA CTCTGCTAATTAGCAATGCTGAGAAATTCCAGTTAACAAGGGCATTCTCCGAG ACTCTGCAGGTCCCCTGCCGTTCGCCTTCATTTCCATAAGGAGATTAGGAGAG GAGG GGAACCCACTCAAATGCAGATGCAGGAGCGAAGCGTTTTTAACAAGCA TCATAATAGTAAGATGCTTG GCTAGTTCTCGCTAATTACTGCAACTTAAACCTC TATTTGCCACTAAGAAGAAAAAAATAAGTCTACAGTCCGCACCTCCACAACATT GTCAGTTGGCTTCAGATATAATACTCGTCGAGGAGAGAAAAATGTAAAAGATT TTTAAATAAAATTGGGTTATGCTTGGCAGTTAAGGCTTCTGGCTTGGGCCAATA GCAGAACAAAATAAAATCTGATTACTCCAGGCATATGCTAATCACTAATGCTG GTCTAAAAGTGTATAGCIIIIIGCTGCCCATGAAGGGAAGTATTACATTAGAT GAAGCACTTCCAATTTTCATAAACTATGCCAGTAGCAACATTTTAAATTCTCAG 3048000 13 AGGATGAAGCACCCTGTTCCAAGTCTCTTTCTGCTAGTCAATAGTGTATTGTTG CTGGTACTGTAGTCAGCTATTATAACCCCAAAAGAG G CTTG CCTCTGTCATG G G CTG G G G CTGTCATAGTTATTATTATACTTAGG G G ACTATGATG GTGTTG GAT TGAAATCGGTGGCCAGTGATCTAA 1 1 1 1 1 1 1 CAATATGTTCTAAAAATATTCTAA TGAGAAAATAGGTTTTGCTACCGCCATCTTCTTTAATCTTATTTTCGTCGCAAAT TATTATGCATAAACACCAGCCACCATTAGTTTATTGCCTCTGATAAGTACAGTA GACTTAATTAAAATAAAGCTGCAAATAAATACCACAAATGATAACACGACTGT AATGCACTCCCATAGTTTATTCATATGATAAAGCAATTAACAAGAGACCTAGCC AGACCCCCTTACCCTCTTTAAGTAGATTATTACAGAGTTCAGGTGCAAACACAC ATTG G AG AG G TTCAGA CTATC CCCATTG GG G GAA G G AAAAAAAATCTG C CTCC TACTAACCTTGAAAGAAAGATATCAAGATTTCAAGAGATGTTCTTTTATCGTCA TCCATTATCAGTATTTATATTAATAAATATTCGCCACCGTTGTCCACATCAACTC GTTGGGG 11111111 CTTCAAACTTAATGATCCATAAACTTTTTCTAAGTTTTCA GAAAAAAGTGCTATTAAG CACCTACAGATACATACACAATCACAAAGTGAATG CTCG G CCTG CCCTTCGTG GCG CG CGGACAATCATAATTCATTCATACTTTGAAT CTCATAATTTATACCTATTTTCCCCTCGCTTAACCTCCCACTTATCTG G CG GTTCT ATGTACATTTCTAAGTTAAGCAAATTAAATTTGATTCTTATGATTTCGTCCCACG GCTTATATGATATGTTAACTTTTCTTTTGTTTAGATTATGTGTAATTAGTTTGAT CTTCCATCCTCCTCGG iiiiiiiii il i i AACTTTA iiiii ACACACCTTCTTTTAA AG GTAAAAG CACTCTAGTAAAAG CAAGTCCACCAGCAG GGGG CG CAG CAG CC ACATCTCAGAAACTAGGCGCGCTGAAAAGTCGGTGGCCGCCTTCCCTGGCTCA A CCTTTG CTCTG GTCTCCAG AG ATTC GTG TTG AG C G TAATA GTACAC CCC G ATT AAGGAGAAAACAATGCTTTAATTTGAAGAGTCCCAAATATTTACGCGTTTCTAT AAGTCCTTTCCGGGTTCCCAAGAACTAAAGCAACCAAAACTTAAGGAGAACCT G G GG CAGTGAGAG G G GTG GACTAGAGAAGAAATTATTTATTTCAAGTTTACA GAATTTCTTTACCACAA IIIII CTGGGTCTAAAGTGGGCATAGTTAGCTGAGTG TGACAATAACAGCCAAGCCTG G GAGAATG G G GATTG GAGATGTG G G G GTG G GGAAGAG G CGTTG GTG G G CAGAGAG G GAAG GATAAACAG G GCAGTTTGTAA GG A CAATG AG CG GAG C GTG G CCG G CAGATACC CTTGTG AAC GTTTTCTTTAG G CAGAGTTGGGGTAGATGAGGGGAGGAGGGGCCGCGAGAGTATTGCAGGGA AAAAAAAGAAAGAAAGAAAGAAAATAAGTAACCCTGATGGTTTAAGCTCTTTA TTTAAAAAAAAAAAAAAAATGGCATCAGGACTTTCTTCCTTCTCTCCCCTCTTTT GTACCCAAGTGCATTTTAGCCACAAAGGTTCCAACAAGAGAGTGGAAGGAAA CTTAGACG G G G CTTTGTTTGACTCCGTGTAGCGACAACAAGAGAAACAAAACT ACCTATTTGTAACGGACGTGGGGCTGTGGCTCTGGGC 11111 GAGCGCCTGCC GATTGAAATCTTTACG TCTG G ACAATG G G AGATC G G CTAAAATTACCCTCTCG GGTCCTG G G CAG G CAAGATTCTTGAACCCCTACCCCCG CCCCCAG CCCATTCTC 3048000 14 CCACAGCCTGGGCTTGCTTGGTGCCGGCTCCTCGGGTTCGGCGGGCCTTCTCT CCGCCTGCACCTGCACCTCTGGACCCCGCGCGCTTCCCAGGCCCCGGCGCCTCT CGGCCG GGCCTTCGTGACTACCACCGTG CCTGTCAGCAG GGG CAATGCCGGCT GCGCTGCCCCATCCTGAGAACGCTGCGTGGGAGGGAGTTTGTGAGCGCAGCC CAAATGCCACCTCCGCGCCTCGCGGTGGGATGCCAGGAAGTTGCGTGACCCTC CCCCCATCCCCTGCACTCGGGAGCTTCTTTCCGTTGATGCTTTCGTCCCCAAGG TTTCCTCTGAAACTGCCACCACTAAAAATCCTCTTGTGTCAGGGTTGGGAGTTA GAAAGAGCGGGAGCAGAGTTCCAGCTTTGCCTTTGCACCCTTTGGATGGGGC AGGTTGGTGGAGTAGGGAATTAGGGGTTGAGGACACGTGCTGCGGTTCCTTG AGCCACACCTGAGTCGGCCTAGGAAAAGGCTGGGAACAAGGCCTGGTCCTAG CTCTGCTCTACAGTCAGCTACATGGGCAGAG GACTCGTGTTTG GGAACCGAGC CGATGACACGGAAGCCAGGAGGGCGCTGAGGCCCGAGGCTTGGGTCTAACTT CTCGTCTGTACGGTGAGAAGAGGGGGTGAGTGGGTGCTGGCGACAAGGTTG GAAGAGGGGCTGCGACAGAGCGCAGTGCCGCGGATGAGCGCAGAAACAATG GCACACCACCTCCGGCTCTG CCAGCTTCCTGAAATACTAGTTGGACAGTCG CCC TGAACCACCCATGGGCCTTGCCCCACCCTGGCCCCAGCTTCCCGCGcCCCATCC ACCCTTATGTATCCAAGAGAGAGCCAATATTCCGTAGCATGGG GGAAAG GAG CTGTCGTCTTGGTGCTGTTTACCCACTTCCTTCGAACAGGCGTGCGCCGTGACC TGTTGCTGAAAACGGGGGGCGGGGGGGGGGGATACAAAGGTTCCCCAGCGG CCGGCTGCGGGCCCGCCTCCCCCGCGCGGTTCGGGGCACAGCGCTCTGCTGG GCTCGGCTCGGCGGCGCG GCAGGCCCCGCCCCCTTTCATGCAAAACCCTCTG G CGAGGCTGGGCTCGGGCGCAGGAGCCGGCGCTCGCTGATTGGCCGCCGGAA ACCCATTTATTCCCTGACAGCCCCCATCACATGGATGGTTGT Le terme « région promotrice minimale » désigne des sites de fixations spécifiques de facteurs de transcription, un site d'initiation de la transcription ainsi que des sites de fixation du complexe d'initiation de la transcription (TATA-box) fonctionnels dans une 5 cellule ou un organisme hôte. De préférence, la région promotrice minimale du gène Sox2 utilisée dans le procédé selon l'invention correspond à la région s'étendant de la position -528 à la position +238 du gène murin Sox2 ou à un dérivé de celle-ci ; laquelle région permet l'expression de l'oncogène placé en aval, dans des cellules de mammifères. A noter que la position +1 3048000 15 correspondant au site d'initiation de la transcription du gène Sox2. Cette région promotrice minimale est définie par la séquence SEQ ID NO : 12. Séquence région CGTCCCCAAGGTTTCCTCTGAAACTGCCACCACTAAAAATCCTCTTGTGTCAGGGTT GGGAGTTAGAAAGAGCGGGAGCAGAGTTCCAGCTTTGCCTTTGCACCCTTTGGAT GGGGCAGGTTGGTGGAGTAGGGAATTAGGGGTTGAGGACACGTGCTGCGGTTCC TTGAGCCACACCTGAGTCGGCCTAGGAAAAGGCTGGGAACAAGGCCTGGTCCTAG CTCTGCTCTACAGTCAGCTACATGGGCAGAGGACTCGTGTTTGGGAACCGAGCCG ATGACACGGAAGCCAGGAGGGCGCTGAGGCCCGAGGCTTGGGTCTAACTTCTCGT CTGTACGGTGAGAAGAGGGGGTGAGTGGGTGCTGGCGACAAGGTTGGAAGAGG GGCTGCGACAGAGCGCAGTGCCGCGGATGAGCGCAGAAACAATGGCACACCACC TCCGGCTCTGCCAGCTTCCTGAAATACTAGTTGGACAGTCGCCCTGAACCACCCAT GGGCCTTGCCCCACCCTGGCCCCAGCTTCCCGCGCCCCATCCACCCTTATGTATCCA AGAGAGAGCCAATATTCCGTAGCATGGGGGAAAGGAGCTGTCGTCTTGGTGCTGT TTACCCACTTCCTTCGAACAGGCGTGCGCCGTGACCTGTTGCTGAAAACGGGGGG CGGGGGGGGGGGATACAAAGGTTCCCCAGCGGCCGGCTGCGGGCCCGCCTCCCC CGCGCGGTTCGGGGCACAGCGCTCTGCTGGGCTCGGCTCGGCGGCGCGGCA promotrice minimale -528/+238 de Sox2 (SEQ ID NO :12) La présence des séquences de la région promotrice minimale du gène Sox2 et du gène 5 N-myc peut être mise en évidence par PCR en utilisant le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 13 (GCGGTAACCACTTTCACGAT) et SEQ ID NO: 14 (TCTAGTCGGCATCACGGTTT). Par « séquence régulatrice GBS (pour Gli-Binding Site) », on désigne toute séquence d'acide nucléique cible de la voie de signalisation Hh/Gli2 capable de lier le facteur de 10 transcription Gli2 (pour Glioma-Associated Oncogene 2). Dans cette voie de signalisation, le facteur de transcription Gli2 se lie à des séquences spécifiques GBS pour moduler la transcription de gènes cibles en réponse à l'activation de la voie Hedgehog (fixation de Hh sur le complexe récepteur Ptc/ co-récepteur lhog, puis translocation de Smo à la membrane plasmique et au cilium primaire où il régule le 15 processing et l'activation de Gli2) (ROBBINS et al., Sci Signal. 2013; 5(246): re6. doi:10.1126/scisignal.2002906). 3048000 16 Les séquences régulatrices GBS ont été décrites pour la première fois dans les années 1990 (KINZLER et al., MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Feb. 1990, pp634-642). Depuis lors, des séquences régulatrices GBS ont été identifiées dans les régions promotrices de gènes impliqués notamment dans les processus de prolifération, 5 différenciation cellulaire ou carcinogénèse. Il s'agit notamment des gènes RegIV, (regenerating islet-derived family member 4), Slfn-4 (Schiafen IV), Sox9-crel, Sox2, insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6), Bd-2, cyclin D2, OPN (ostéopontine), et pkbg (plakoglobine). La région activatrice R1 du gène Sox2, située en 5'UTR, contient deux sites de liaisons 10 GBS1 et GBS2 (Gli-binding sites 1 et 2) du facteur de transcription Gli2. Les deux sites GBS1 et GBS2 sont situés respectivement en position -3364/-3357 et -3239/-3230 du gène murin Sox2 et ont pour séquences respectives TGGTGGTC (SEQ ID NO: 15) et GAACCCACTCA (SEQ ID NO : 16) (TAKANAGA et al., Stem Cells 2009, vol.27, pp165-174). Les sites GBS1 et GBS2 occupent respectivement les positions 34646277 à 34646284 et 15 34646402 à 34646412 de la séquence NC_000069.6. Plus particulièrement dans le cadre de l'invention, la au moins une séquence régulatrice GBS présente dans la cassette d'expression comprend ou consiste en la séquence GBS1 ou GBS2 du gène Sox2, ou un dérivé de celle-ci. 20 De préférence, le promoteur inductible de la cassette d'expression de l'invention comprend deux ou plusieurs copies d'une séquence régulatrice GBS1 ou GBS2 du gène Sox2. Séquence GBS1 du gène Sox2 (SEQ ID NO : 15) TGGTGGTC Séquence GBS2 du gène Sox2 (SEQ ID NO : 16) GAACCCACTCA 3048000 17 Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le promoteur inductible de la cassette d'expression selon l'invention comprend au moins une copie de la séquence régulatrice GBS1 et au moins une copie de la séquence régulatrice GBS2 du gène Sox2. La structure dudit promoteur inductible est alors optimale pour une expression dans les 5 cellules neuronales multipotentes. Le promoteur inductible peut comporter, en sus des séquences régulatrices GBS, d'autres séquences régulatrices indépendantes du facteur de transcription Gli. Ces autres séquences régulatrices peuvent être activées par d'autres facteurs de transcription, notamment des facteurs associés à des voies de signalisation distinctes de 10 celles de la voie Hh/Gli2. La présence dans le milieu de culture d'inducteurs peut encore accroitre le niveau d'inductibilité du promoteur. De tels inducteurs peuvent être des facteurs de croissance, des antibiotiques, des métaux, des acides aminés, ...et sont bien connus de l'homme de l'art. 15 Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'induction du promoteur du gène Sox2 est renforcé par la présence des facteurs de croissance dans le milieu de culture, en particulier la combinaison bFGF (basic fibroblast growth factor) et EGF (epidermal growth factor). Le terme « séquence régulatrice 3' UTR » désigne des séquences d'acide nucléique 20 situées en aval du codon stop de la séquence codante d'un gène. Ce type de séquence permet notamment de stabiliser un transcrit d'ARNm par la présence de régions riches en adénine et en uridine (AU-rich) ou encore de le déstabiliser par la présence de structures particulières. Les séquences régulatrices 3'UTR participent ainsi activement à la régulation de l'expression des gènes après leur transcription, notamment par le biais 25 de la fixation de miRNA sur des sites spécifiques. Le terme « séquence régulatrice 5' UTR » désigne des séquences d'acide nucléique situées en amont du codon d'initiation de la traduction d'un gène. Ce type de séquence permet de stabiliser un transcrit d'ARNm par la présence de structure type tige-boucles. 3048000 18 Les séquences régulatrices 5'UTR réguleraient ainsi l'efficacité de l'initiation de la traduction. Dans la cassette d'expression selon l'invention, la séquence régulatrice 5'UTR est placée à l'extrémité 5' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène. 5 Les séquences régulatrices 5' UTR et 3' UTR désignent des séquences transcrites mais non traduites. Dans le procédé d'amplification cellulaire de l'invention, pour que l'action des séquences régulatrices 5'UTR et 3'UTR soit optimale, on préfèrera qu'elles soient issues du même gène. 10 De préférence, la séquence régulatrice 3'UTR est issue du gène Sox2. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence régulatrice 3'UTR issue du gène Sox2 comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 17, correspondant aux nucléotides 1371 à 2426 de la séquence NM_011443.3, ou un dérivé de celle-ci. De préférence, la séquence régulatrice 5'UTR est issue du gène Sox2. 15 Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence régulatrice 5'UTR issue du gène Sox2 comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 18, correspondant aux nucléotides 1 à 411 de la séquence NM_011443.3, ou un dérivé de celle-ci. Séquence 3' UTR de Sox2 (SEQ ID NO: 17) GGGCTGGACTGCGAACTGGAGAAGGGGAGAGATTTTCAAAGAGATACAAGGGAATTG GGAGGGGTGCAAAAAGAGGAGAGTAGGAAAAATCTGATAATGCTCAAAAGGAAAAAA AATCTCCGCAGCGAAACGACAGCTGCGGAAAAAAACCACCAATCCCATCCAAATTAACG CAAAAACCGTGATGCCGACTAGAAAACTTTTATGAGAGATCTTGGGACTTCTTTTTGGGG GACTATTTTTGTACAGAGAAAACCTGAGGGCGGCGGGGAGGGCGGGGGAATCGGACC ATGTATAGATCTGGAGGAAAAAAACTACGCAAAACIIIIIIIIAAAGTTCTAGTGGTACG TTAGGCGCTTCGCAGGGAGTTCGCAAAAGTCTTTACCAGTAATATTTAGAGCTAGACTCC GGGCGATGAAAAAAAAGTTTTAATATTTGCAAGCAACTTTTGTACAGTATTTATCGAGAT AAACATGGCAATCAAATGTCCATTGTTTATAAGCTGAGAATTTGCCAATATTTTTCGAGG AAAGGGTTCTTGCTGGGTTTTGATTCTGCAGCTTAAATTTAGGACCGTTACAAACAAGGA AGGAGTTTATTCGGATTTGAACATTTTAGTTTTAAAATTGTACAAAAGGAAAACATGAGA 3048000 19 GCAAGTACTGGCAAGACCGTTTTCGTGGTCTTGTTTAAGGCAAACGTTCTAGATTGTACT AAATTTTTAACTTACTGTTAAAGGCAAAAAAAAAATGTCCATGCAG GTTGATATCGTTG G TAATTTATAATAGCTTTTGTTCAATCCTACCCTTTCATTTTGTTCACATAAAAAATATGGAA TTACTGTGTTTGAAATATTTTCTTATGGTTTGTAATATTTCTGTAAATTGTGATATTTTAAG GIIIII CCCCCCTTTTATTTTCCGTAGTTGTATTTTAAAAGATTCGGCTCTGTTATTGGAAT CAGGCTGCCGAGAATCCATGTATATATTTGAACTAATACCATCCTTATAACAGCTACATTT TCAACTTAAG IIIii ACTCCATTATGCACAGTTTGAGA Séquence 5' UTR CTATTAACTTGTTCAAAAAAGTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAGAAGAGAGTGTTTGCA de Sox2 (SEQ ID AAAAG GGAAAAGTAC1TFGCTGCCTCTTTAAGACTAG G GCTG GGAGAAAGAAGAGGAG AGAGAAAGAAAGGAGAGAAGTTTGGAGCCCGAGGCTTAAGCCTTTCCAAAAACTAATC NO : 18) ACAACAATCGCGGCGGCCCGAGGAGGAGAGCGCCTG IIIIII CATCCCAATTGCACTTC GCCCGTCTCGAGCTCCGCTTCCCCCCAACTATTCTCCG CCAGATCTCCGCGCAGGGCCGT GCACGCCGAGGCCCCCGCCCGCGGCCCCTGCATCCCGGCCCCCGAGCGCGGCCCCCACA GTCCCGGCCGGGCCGAGGGTTGGCGGCCGCCGGCGGGCCGCGCCCGCCCAGCGCCCGC Dans ce mode de réalisation préféré, la cassette d'expression de l'invention comprend plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 19 correspondant à la séquence d'acide nucléique codant pour N-Myc (région 295-1683 de SEQ ID NO : 1), le promoteur du gène 5 Sox2 (SEQ ID NO : 11) comprenant les régions GBS1 (SEQ ID NO : 15) et GBS2 (SEQ ID NO : 16) et les séquences régulatrices 5'UTR (SEQ ID NO : 18) et 3'UTR (SEQ ID NO : 17) du gène Sox2 . Cassette d'expression (SEQ ID NO :19) GCACTTCGTTTGGTTAAAG CTGGTTCCCAATATATTTAACCAGTTCCAGAATTAGAA AGCCTTTCTGTACATTTTCTCTTATTTTTCTTGCTACTTTTCCTTATGTAATGAAATTA AAACTTTTGGAACCCACAGTTGACATTTTTCAGAAAATTGAGTTATCAAGGCAGTA ATTATTTCTCGGGGAGATAAAACTCTCATAGCCCTAACTGTCAAATAGGGCCCTTTT CAGATTTTAATTACAAAATAAAATTAGTCTGCTCTTCCTCGGAATGGTTGGCGAGT GGTTAAACAGAGCTTTCCCCCAATACTGGTGGTCGTCAAACTCTGCTAATTAGCAA TGCTGAGAAATTCCAGTTAACAAGGGCATTCTCCGAGACTCTGCAGGTCCCCTGCC GTTCGCCTTCATTTCCATAAGGAGATTAGGAGAGGAGGGGAACCCACTCAAATGC AGATGCAGGAGCGAAGCGTTTTTAACAAGCATCATAATAGTAAGATGCTTGGCTA GTTCTCGCTAATTACTGCAACTTAAACCTCTATTTGCCACTAAGAAGAAAAAAATAA GTCTACAGTCCGCACCTCCACAACATTGTCAGTTGGCTTCAGATATAATACTCGTCG 3048000 20 AG G AGAGAAAAATGTAAAAG ATTTTTAAATAAAATTG G GTTATG CTTG G CA GTTA AG G CTTCTG G CTTG G GCCAATAGCA GAACAAAATAAAATCTGATTACTCCA G G CAT ATGCTAATCACTAATGCTGGTCTAAAAGTGTATAGC IIII1 GCTGCCCATGAAGGG AAGTATTACATTAGATGAA G CACTTCCAATTTTCATAAACTATG CCA GTA G CAACAT TTTAAATTCTCA GA G GATGAA G CACCCTGTTCCAAGTCTCTTTCTG CTAGTCAATA G TGTATTGTTGCTG GTACTGTAGTCA G CTATTATAACCCCAAAA GAG G CTTGCCTCT GTCATG G G CTG G G G CTGTCATAGTTATTATTATACTTAG G GGA CTATGATG GTGTT GGATTGAAATCGGTGGCCAGTGATCTAA IIIIIIi CAATATGTTCTAAAAATATTCT AATGAGAAAATA G GTTTTG CTACCG CCATCTTCTTTAATCTTATTTTCGTCG CAAAT TATTATG CATAAA CA CCA G CCA CCATTAGTTTATTG CCTCTGATAAGTACAGTAGAC TTAATTAAAATAAA G CTG CAAATAAATA CCA CAAATGATAA CA CGACTGTAATGCA CTCCCATA GTTTATTCATATGATAAAG CAATTAACAAGA GACCTA G CCAGACCCCCT TACCCTCTTTAA G TA GATTATTACAGAGTTCAG GTG CAAA CA CACATTG GA GA G GT TCAGACTATCCCCATTG G GG GAA G GAAAAAAAATCTGCCTCCTACTAACCTTGAAA GAAAGATATCAAGATTTCAAGAGATGTTCTTTTATCGTCATCCATTATCAGTATTTA TATTAATAAATATTCGCCACCGTTGTCCACATCAACTCGTTGGGG IIIIIIII CTTCA AACTTAATGATCCATAAACTTTTTCTAAGTTTTCA GAAAAAAGTG CTATTAAG CACC TACA GATACATACA CAATCA CAAA GTGAATG CTCGG CCTG CCCTTCGTG G CG CG CG GACAATCATAATTCATTCATACTTTGAATCTCATAATTTATACCTATTTTCCCCTCGC TTAACCTCCCACTTATCTGGCGGTTCTATGTACATTTCTAAGTTAAGCAAATTAAAT TTGATTCTTATGATTTCGTCCCACGGCTTATATGATATGTTAALIIIICTTTTGTTTA GATTATGTGTAATTAGTTTGATCTTCCATCCTCCTCGGTTTT IIIIIIIII AACTTTAT TTTTACACACCTTCTTTTAAAG GTAAAA G CACTCTA GTAAAA G CAAGTCCACCAG CA GGGGG CGCAG CA G CCACATCTCAGAAACTA GG CG CG CTGAAAAGTCGGTG G CCG CCTTCCCTG G CTCAACCTTTG CTCTGGTCTCCAGAGATTCGTGTTGAGCGTAATAGT ACACCCCGATTAAGGAGAAAACAATGCTTTAATTTGAAGAGTCCCAAATATTTACG CGTTTCTATAAGTCCTTTCCG G GTTCCCAAGAACTAAAG CAACCAAAA CTTAA G GA GAACCTG G G G CA GTGAGAG G G GTG GA CTAGA GAAGAAATTATTTATTTCAAGTTT ACAGAATTTCTTTA CCA CAATTTTTCTG G GTCTAAAGTG G GCATAGTTAGCTGAGT GTGACAATAACAG CCAAGCCTG G GAGAATG G G GATTGGAGATGTG G G G GTG G G GAAGAGGCETTGGTGGGCAGAGAGGGAAGGATAAACAGGGCAGTTTGTAAGGA CAAT GA G CG GAG CGTG G CCG G CAGATA CCCTTGTGAACGTTTTCTTTAG G CAGA G TTGGGGTAGATGAGGGGAGGAGGGGCCGCGAGAGTATTGCAGGGAAAAAAAAG AAAGAAAGAAAGAAAATAAGTAACCCTGATG GTTTAAGCTCTTTATTTAAAAAAAA AAAAAAAATGGCATCAGGACTTTCTTCCTTCTCTCCCCTL 1 1 I GTACCCAAGTGCA TTTTAG CCACAAAG GTTCCAACAAGAGAGTGGAAG GAAACTTA GACG G G G CTTTG TTTGACTCCGTGTAGCGACAACAAGAGAAACAAAACTACCTATTTGTAACGGACGT 3048000 21 GGGGCTGTGGCTCTGGGCTTTTTGAGCGCCTGCCGATTGAAATCTTTACGTCTGGA CAATG G GAGATCG G CTAAAATTACCCTCTCGG GTCCTG G G CAG G CAAGATTCTTG AACCCCTACCCCCGCCCCCAGCCCATTCTCCCACAGCCTG G G CTTG CTTGGTGCCG G CTCCTCG G GTTCG G CG G G CCTTCTCTCCG CCTG CACCTG CACCTCTG GACCCCG C GCGCTTCCCAGGCCCCGGCGCCTCTCGGCCGGGCCTTCGTGACTACCACCGTGCCT GTCAG CAG G G G CAATG CCGG CTG CG CTG CCCCATCCTGAGAACG CTG CGTG G GA GGGAGTTTGTGAGCGCAGCCCAAATGCCACCTCCGCGCCTCGCGGTGGGATGCCA GGAAGTTGCGTGACCCTCCCCCCATCCCCTGCACTCGGGAGCTTCTTTCCGTTGAT G CTTTCGTCCCCAAG GTTTCCTCTGAAACTGCCACCACTAAAAATCCTCTTGTGTCA GG GTTG G GAGTTAGAAAGAG CG G GAG CAGAGTTCCAG CTTTG CCTTTG CACCCTT TGGATGGGGCAGGTTGGTGGAGTAGGGAATTAGGGGTTGAGGACACGTGCTGCG GTTCCTTGAG CCACACCTGAGTCG G CCTAG GAAAAG G CTG G GAACAAG G CCTG GT CCTAG CTCTG CTCTACAGTCAG CTACATG G G CAGAG GACTCGTGTTTG G GAACCG AGCCGATGACACGGAAGCCAGGAGGGCGCTGAGGCCCGAGGCTTGGGTCTAACT TCTCGTCTGTACGGTGAGAAGAGGGGGTGAGTGGGTGCTG G CGACAAGGTTGGA 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GGGTTGGCGGCCGCCGGCGGGCCGCGCCCGCCCAGCGCCCGCATGCCCAGCTGC ACCGCGTCCACCATGCCGGGGATGATCTGCAAGAACCCAGACCTCGAGTTTGACTC ACTGCAGCCCTGOTCTACCCGGACGAAGATGACTTCTACTTCGGCGGTCCCGACTC GACCCCACCGGGGGAGGACATCTGGAAGAAGTTTGAGCTGCTGCCCACGCCCCCG TTGTCGCCCAGCCGCGCCTTCCCAGAGCACAGCCCGGAGCCTTCGAATTGGGCTAC GGAGATGCTGCTGCCGGAGGCCGACCTGTGGGGCAACCCGGCCGAGGAGGATGC 3048000 22 GTTCGGTCTCGGGGGCCTGGGTGGCCTCACTCCTAATCCGGTCATCCTTCAGGACT GCATGTGGAGCGGCTTCTCTGCCCGCGAGAAGCTAGAGCGCGCAGTGAACGAAAA ACTACAGCACGGCCACGGGCCCCCGGGCGTCAGCTCAGCCTGCTCGGCTCCCGGA GTGGGTGCCAGCAGCCCCGGGGGCCGTGCCCTTGGTGGGTCGTCGAGTGCTAGCC ACACCGGGGCCACCCTGCCTACCGACCTCTCCCACCCGGCTGCCGAATGTGTGGAC CCCGCCGTGGTCTTCCCCTTCCCGGTGAACAAGCGAGAGTCGGCGTCGGTGCCCGC TGCCCCCACTAGCGCCCCGGCGACCAGCGCTGCGGTCACTAGTGTGTCTGTTCCAG CTACTGCCCCGGTGGCTGCTCCTGCTCGTGCAGGCGGCCGTCCTGCCAGCAGTGGG GAGGCCAAGGCCCTCAGCACCTCCGGAGAGGATACCTTGAGCGACTCAGATGATG AGGATGACGAGGAGGAAGATGAAGAGGAGGAAATCGATGTGGTCACCGTAGAG AAGAGACGTTCCTCCTCTAACAACAAGGCGGTAACCACTTTCACGATCACTGTGCG TCCCAAGACCTCCGCTCTGGGCCTGGGGCGAGCACAGCCTGGCGAGCTGATCCTCA AGCGCTGTGTTCCCATCCATCAGCAGCACAACTATGCTGCACCCTCACCCTACGTGG AGAGCGAGGACGCGCCCCCGCAGAAAAAGATCAAGAGCGAGGCTTCTCCACGCCC CCTCAAAAGTGTTGTTCCAGCAAAAGCGAAGAGCCTGAGCCCCCGAAACTCAGACT CGGAGGACAGCGAGCGCCGCCGCAACCACAACATCCTGGAGCGTCAACGCCGGAA CGACCTGCGCTCCAGCTTCCTGACGCTCAGGGACCATGTGCCTGAGCTGGTGAAGA ACGAGAAGGCCGCCAAGGTGGTCATCTTGAAAAAGGCCACCGAGTACGTGCACGC CCTACAGGCCAACGAGCACCAGCTCCTGCTGGAAAAGGAGAAACTGCAGGCGAG GCAGCAGCAGTTGCTAAAGAAGATCGAACACGCTCGGACTTGCTAAGGGCTGGAC TG CGAACTG GAGAAG G G GAGAGATTTTCAAAGAGATACAAG G GAATTG G GAG G GGTGCAAAAAGAGGAGAGTAGGAAAAATCTGATAATGCTCAAAAGGAAAAAAAA TCTCCGCAGCGAAACGACAGCTGCGGAAAAAAACCACCAATCCCATCCAAATTAAC GCAAAAACCGTGATGCCGACTAGAAAACTTTTATGAGAGATCTI-GGGACTTCTTTT TGGGGGACTA 11111 GTACAGAGAAAACCTGAGGGCGGCGGGGAGGGCGGGGG AATCGGACCATGTATAGATCTGGAGGAAAAAAACTACGCAAAAC IIIIIIII AAAG TTCTAGTG GTACGTTAG G CG CTTCG CAG G GAGTTCG CAAAAGTCTTTACCAGTAAT ATTTAGAGCTAGACTCCGGGCGATGAAAAAAAAGTTTTAATATTTGCAAGCAACTT TTGTACAGTATTTATCGAGATAAACATGGCAATCAAATGTCCATTGTTTATAAGCTG AGAATTTGCCAATA CGAGGAAAGGGTTCTTGCTGGGTTTTGATTCTGCAGC TTAAATTTAGGACCGTTACAAACAAGGAAGGAGTTTATTCGGATTTGAACATTTTA GTTTTAAAATTGTACAAAAGGAAAACATGAGAGCAAGTACTGGCAAGACCGTTTT CGTGGTCTTGTTTAAG GCAAACGTTCTAGATTGTACTAAATTTTTAACTTACTGTTA AAGGCAAAAAAAAAATGTCCATGCAGGTTGATATCGTTGGTAATTTATAATAGCTT TTGTTCAATCCTACCCTTTCATTTTGTTCACATAAAAAATATGGAATTACTGTGTTTG AAATATTTTCTTATGGTTTGTAATATTTCTGTAAATTGTGATATTTTAAGGIIIIICC CCCCTTTTATTTTCCGTAGTTGTATTTTAAAAGATTCGGCTCTGTTATTGGAATCAG 3048000 23 GCTGCCGAGAATCCATGTATATATTTGAACTAATACCATCCTTATAACAGCTACATT TTCAACTTAAGTTTTTACTCCATTATGCACAGTTTG AGA Selon un mode de réalisation particulier, le procédé d'amplification cellulaire de l'invention comprend préalablement à l'étape a) une étape de transformation des progéniteurs neuronaux par ladite cassette d'expression. 5 Les méthodes de transformation cellulaires sont bien connues de l'homme de l'art et reposent notamment sur l'utilisation de solution de chlorure de calcium, de lipides et polycations naturels ou synthétiques, ou de virus. La magnétofection, l'électroporation, la biolistic, ou encore l'infection virale constituent les principales méthodes de transformation couramment utilisées pour obtenir l'expression exogène d'un gène 10 d'intérêt dans une cellule de mammifère. Dans le cadre de la présente invention, la méthode de transformation cellulaire doit être compatible avec la nature des progéniteurs neuronaux. Selon un mode de réalisation particulier, la transformation des progéniteurs neuronaux par la cassette d'expression de l'invention s'effectue par infection virale. 15 Selon un mode de réalisation plus particulier, la transformation des progéniteurs neuronaux s'effectue à l'aide d'un lentivirus recombinant, lequel comprend la cassette d'expression de l'invention. La sélection des progéniteurs neuronaux transformés par la cassette d'expression de l'invention est basée sur la détection du transgène N-myc/Sox2 (e.g.. par la technique 20 PCR) intégré à l'ADN génomique des progéniteurs neuronaux, leur capacité à proliférer puis à se différencier en neurones et/ou en cellules gliales. D'autres modes de sélection des progéniteurs neuronaux transformés par la cassette d'expression de l'invention sont également envisageables. A titre d'exemple, l'introduction d'un gène de sélection en sus de la cassette d'expression dans un vecteur 3048000 24 viral permet de conférer un avantage phénotypique aux seuls progéniteurs neuronaux transformés avec succès. D'une autre manière, la sélection des progéniteurs neuronaux transformés par la cassette d'expression de l'invention peut être effectuée par sélection clonale en réalisant des dilutions limites des progéniteurs neuronaux après leur 5 transformation. De telles techniques de sélection sont bien connues de l'homme du métier. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé est caractérisé en ce qu'il vise l'obtention de cellules nerveuses différenciées et en ce qu'il comprend en outre une étape supplémentaire b) de différenciation induite par une modification de 10 la composition du milieu de culture utilisé à l'étape a) des progéniteurs neuronaux en neurones et/ou en cellules gliales choisies parmi les astrocytes et les oligodendrocytes. Dans le procédé selon l'invention, les progéniteurs neuronaux se différencient en neurones et en cellules gliales. Les cellules gliales comportent des astrocytes (cellules protectrices et nourricières des neurones) et des oligodendrocytes qui forment un 15 manchon isolant de myéline autour des axones des neurones. Il est donc possible d'obtenir un mélange de cellules différenciées à partir des progéniteurs neuronaux. La présence de cellules gliales est nécessaire pour assurer une maturation fonctionnelle des neurones, en particulier des neurones à GnRH, à partir des progéniteurs neuronaux. De préférence, la différenciation des progéniteurs neuronaux est induite par une 20 modification de la composition du milieu de culture des progéniteurs neuronaux utilisée à l'étape a) du procédé de l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, la différenciation des progéniteurs neuronaux est initiée par le retrait de tous les facteurs mitogènes du milieu de culture. Ainsi, les facteurs de croissance, en particulier le bFGF et/ou l'EGF sont retirés du milieu de 25 culture. L'initiation de la différenciation conduit à une extinction progressive de l'expression du gène Sox2 dans les progéniteurs neuronaux en cours de différenciation. Cette diminution de l'expression du gène Sox2 est aussi associée à celle de l'oncogène 3048000 25 également sous contrôle du promoteur Sox2 de la cassette d'expression. L'oncogène n'est par conséquent plus exprimé dans les progéniteurs neuronaux qui ont initié leur différenciation ; le processus mitotique cessant au profit du processus de différenciation dans le cadre du procédé selon l'invention. 5 D'autres facteurs secondaires de différenciation peuvent également être ajoutés au milieu de culture des progéniteurs neuronaux ayant entamé leur différenciation. De tels facteurs permettent de favoriser la différenciation en certaines sous-populations cellulaires et ainsi de réguler la proportion de cellules neuronales et/ou gliales ou, plus finement, la proportion respective d'astrocytes et d'oligodendrocytes. 10 La caractérisation des cellules différenciées peut être réalisée selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, incluant des analyses morphologiques, des analyses par immunocytochimie, par RT-PCR et par des tests électrophysiologiques. Cette caractérisation a pour but de distinguer, au sein d'une population cellulaire hétérogène, les différents types cellulaires présents. Ainsi, les progéniteurs qui ne seront pas 15 parvenus à entrer en différenciation, soit parce qu'ils n'ont pas été transformés par la cassette d'expression, soit parce qu'ils l'ont perdu, seront porteurs de marqueurs spécifiques de multipotence, en particulier de Sox2. Au cours de la différenciation, l'aspect morphologique des progéniteurs neuronaux évolue. Les cellules perdent leur aspect sphérique ou fibroblastique au profit de cellules 20 possédant un corps cellulaires, des dendrites et un axone caractéristiques des neurones, et/ou au profit de cellules étalées, pavimenteuses ou dendritiques (les astrocytes), ou encore en cellules plus petites que les astrocytes (les oligodendrocytes). Les corps cellulaires des neurones possèdent une taille variant de 10 à 20 lm et ont une forme ovale ou fusiforme. Les dendrites émergent de l'un ou des deux pôles du corps 25 cellulaires du neurone et l'axone nait soit à partir du soma, soit à partir des dendrites. Parmi des marqueurs cellulaires caractéristiques des différents lignages cellulaires, on peut citer : 3048000 26 pour les neurones : Tubb3 (betalll-tubuline), microtubule-associated protein 2 (Map2), TuJ-1 (Neuron-specific class III beta-tubulin), pour les cellules gliales : glial fibrillary acidic protein (GFAP), fatty acid binding protein 7 (BLBP), 5100 calcium binding protein B (5100beta) (astrocytes), 04 5 (oligodendrocytes). La proportion des différentes populations cellulaires résultant de la différenciation des progéniteurs neuronaux peut être déterminée à l'aide d'un cytomètre en flux ou par immunocytochimie sur la base des marqueurs des différents lignages pré-cités. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention est caractérisé en ce 10 qu'il vise en outre le criblage d'un composé perturbateur endocrinien et en ce qu'il comprend en outre les étapes de : c) mise en contact des cellules obtenues à l'issue de l'étape b) du procédé avec au moins un composé, i.e. potentiel perturbateur endocrinien, d) détermination de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules 15 résultant de la mise en contact avec ledit au moins un composé lors de l'étape c), et e) identification, en tant que composé perturbateur endocrinien, de tout composé ayant entrainé un changement métabolique et/ou phénotypique à l'issue de l'étape d). La contamination de l'environnement par des perturbateurs endocriniens constitue un véritable problème de santé publique. Les sources d'exposition aux perturbateurs 20 endocriniens pour un individu sont multiples et interviennent notamment par les aliments ou les boissons qu'il consomme, les médicaments qu'il absorbe, les pesticides et les cosmétiques qu'il emploie. Ainsi, l'exposition aux perturbateurs endocriniens peut se faire par le régime alimentaire, l'air, l'eau et la peau. Bien que la présence de tels composés chimiques dans l'eau, l'air ou les sols et leurs 25 effets délétères soient largement documentés, il existe un réel besoin de mettre au point des méthodes permettant leur détection et éventuellement la quantification de leurs effets pour mieux en appréhender leur incidence en termes de santé publique. 3048000 27 Par « perturbateur endocrinien », on désigne une substance exogène ou un mélange de substances exogènes qui modifie les fonctions du système endocrinien et qui par conséquent induit des effets secondaires sur les organismes vivants, ou leur descendance. Généralement, ces substances sont des composés chimiques qui 5 perturbent l'action hormonale. Leur structure leur permet soit de se fixer directement sur les récepteurs hormonaux, soit d'interférer avec des protéines qui participent à la maturation (i.e., aromatase) ou au guidage (i.e., sodium/iodide symporter, cortisol binding protein) des hormones vers leur cible. Des listes non exhaustives de composés possédant un potentiel effet de perturbateur 10 endocrinien ont été établies par l'OMS (cf. liste annexe Il, pp 253-257 du document State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012), et par l'Union Européenne (cf. liste annexe X de la Directive 2013/39/UE). Par « criblage », on désigne l'ensemble des étapes qui permettent la mise en évidence des effets physiologiques d'un perturbateur endocrinien. Le terme criblage doit être 15 entendu au sens de la présente invention comme l'identification, la détection mais aussi la quantification des effets de composés perturbateurs endocriniens. Les progéniteurs neuronaux dérivés de la placode olfactive se différencient en neurones de type neurones à GnRH (gonadotropin-releasing hormone). Le GnRH est un décapeptide qui régule la sécrétion des gonadotrophines hypophysaires, en particulier 20 de la FSH (Follicle Stimulating Hormone) et de la LH (Luteinizing Hormone) qui contrôlent la production de gamètes par les gonades et la synthèse d'hormones stéroïdes comme la progestérone ou les oestrogènes. Les taux de FSH et de LH augmentent à la puberté, sous l'influence de la LH-RH hypothalamique. Les taux de testostérone ou d'oestrogènes et de progestérone sont retro-inhibiteurs sur la FSH et la 25 LH. Les neurones à GnRH jouent par conséquent un rôle essentiel dans la fonction de reproduction chez le mammifère. Le GnRH, synthétisé par les neurones à GnRH, se fixe sur des récepteurs transmembranaires présents à la surface des cellules gonadotropes. Cette fixation induit la transduction du signal aboutissant à la sécrétion hormonale. La présence d'un 3048000 28 composé perturbateur endocrinien dans l'environnement des neurones à GnRH peut modifier la sécrétion des hormones sexuelles et ainsi être à l'origine d'un dysfonctionnement de la fonction reproductrice. La « mise en contact » des cellules dérivées des progéniteurs neuronaux résultant de 5 l'étape b) du procédé selon l'invention avec au moins un composé suspecté d'être un perturbateur endocrinien signifie que ce composé est placé directement dans le milieu de culture de ces cellules. La mise en contact peut être effectuée pendant un temps variant de quelques minutes à plusieurs jours, et en présence de concentrations variables du composé à tester. 10 De préférence, le composé à tester est incubé pendant 24-72 heures avec les cellules différenciées dérivées des progéniteurs neuronaux. Par « changement métabolique et/ou phénotypique », on désigne toute modification détectable dans l'apparence, la présence de marqueurs spécifiques, les fonctions effectrices des cellules différenciées dérivées de progéniteurs neuronaux. Il s'agit 15 notamment d'une modification de la morphologie cellulaire ou de la capacité à synthétiser du GnRH. La viabilité cellulaire pourra également être évaluée. L'identification de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules différenciées dérivées des progéniteurs neuronaux mises en contact avec un composé suspecté d'être un perturbateur endocrinien est réalisée en les comparant avec ces 20 mêmes cellules non traitées par ce composé. Selon un mode de réalisation particulier, l'identification de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules différenciées dérivées des progéniteurs neuronaux mises en contact avec un composé suspecté d'être un perturbateur endocrinien est réalisée en les comparant avec ces mêmes cellules traitées avec un 25 composé déjà connu pour ces effets de perturbateurs endocriniens vis-à-vis des neurones à GnRH. 3048000 29 Compte tenu du fait que les perturbateurs endocriniens peuvent avoir des effets toxiques cumulatifs, l'incubation des cellules différenciées dérivées des progéniteurs neuronaux pourra être effectuée en présence de deux ou plusieurs composés suspectés d'être des perturbateurs endocriniens. Si les effets de ces composés sont synergiques 5 alors les changements métaboliques ou phénotypiques seront d'autant plus accentués. En cas d'effet antagoniste des composés, il sera alors plus délicat d'obtenir une analyse tranchée. Un autre objet de l'invention concerne une cassette d'expression comprenant : - une séquence d'acide nucléique codant pour un oncogène liée de manière 10 opérationnelle à un promoteur inductible, ledit promoteur inductible comprenant : (i) une région promotrice minimale, et (ii) au moins une séquence régulatrice GBS (Gli-binding site), - et, optionnellement, une séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène et/ou une séquence régulatrice 3' UTR placée 15 à l'extrémité 3' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène. De préférence, l'oncogène de la cassette d'expression est choisi parmi les gènes HRAS / KRAS et NRAS, Her2, Hdm2, N-myc, TAL1, Fli-1, MLL, C cycline D1, RET, PML, Abl ou CMyc. Selon un mode de réalisation particulier, l'oncogène est le gène N-myc tel que défini 20 précédemment par les séquences de référence SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :5. Selon un mode de réalisation plus particulier, l'oncogène N-myc utilisé dans la cassette selon l'invention est d'origine murine et correspond aux nucléotides 295 à 1683 de la séquence SEQ ID NO :1. 25 La région promotrice minimale du promoteur inductible doit pouvoir être induite dans des progéniteurs neuronaux ou toute autre cellule possédant des éléments trans susceptibles d'activer cette région promotrice minimale. 3048000 Selon un mode de réalisation particulier, la région promotrice minimale du promoteur inductible est issue du gène Sox2 et est définie par la séquence SEQ ID NO : 12 ou un dérivé de celle-ci. La séquence régulatrice GBS (Gli-binding site) doit pouvoir être activée dans le contexte 5 cellulaire des progéniteurs neuronaux. De telles cellules expriment fortement la protéine SOX2 dont on sait qu'elle participe à l'autorégulation du gène permettant son expression. Selon un mode de réalisation particulier, la au moins une séquence régulatrice GBS comprend ou consiste en une séquence GBS 1 (SEQ ID NO :15) ou GBS2 (SEQ ID NO : 16) 10 du gène Sox2, ou un dérivé de celle-ci. Lors du développement embryonnaire, une régulation optimale du gène Sox2 est obtenue par l'action conjointe des éléments situés en régions 5' et 3' UTR. Dans le contexte de la cassette d'expression selon l'invention, une expression optimale de l'oncogène (p. ex. N-myc) pourra être obtenue en incluant une séquence régulatrice 3' 15 UTR placée en aval du codon stop de la région codante de l'oncogène. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence régulatrice 3' UTR placée en aval du codon stop de la région codante de l'oncogène N-myc est issue du gène Sox2 et a pour séquence SEQ ID NO : 17, ou un dérivé de celle-ci. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence régulatrice 5' UTR placée en 20 amont du codon d'initiation de la traduction de la région codante de l'oncogène N-myc est issue du gène Sox2 et a pour séquence SEQ ID NO : 18, ou un dérivé de celle-ci. Selon un mode de réalisation plus particulier, la cassette d'expression de l'invention comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 19. En particulier, cette cassette d'expression résulte de l'association des éléments suivants : une séquence régulatrice 25 GBS 1 (SEQ ID NO : 15) et une séquence régulatrice GBS2 (SEQ ID NO : 16) du gène Sox2, la région promotrice minimale Sox2 et définie par la séquence SEQ ID NO: 12, la séquence codante de l'oncogène N-myc définie par les nucléotides 295 à 1683 de la séquence SEQ ID NO : 1 et les séquences régulatrices 5'UTR et 3' UTR issues du gène 3048000 31 Sox2 et ayant pour séquences SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 17 placées respectivement en amont de la région promotrice minimale et en aval du codon stop de la région codante de l'oncogène N-myc. L'invention a également pour objet un vecteur comprenant une cassette d'expression 5 selon l'invention. Il peut s'agir d'un vecteur lipidique, d'un vecteur plasmidique ou encore d'un vecteur viral. Il peut être éventuellement associé à une ou plusieurs substances améliorant l'efficacité transfectionnelle et/ou la stabilité du vecteur. Ces substances sont largement documentées dans la littérature accessible à l'homme de l'art (voir par exemple 10 FELGNER et al., Proc. West. Pharmacol. Soc. 1987, 32, pp115- 121; HODGSON & SOLAIMAN, Nature Biotechnology 1996, 14, pp339-342 ; REMY et al. , Bioconjugate Chemistry 1994, 5, pp647-654). A titre illustratif, mais non limitatif, il peut s'agir de polymères, de lipides, notamment cationiques, de liposomes, de protéines nucléaires ou encore de lipides neutres. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en 15 combinaison. Une combinaison envisageable est un vecteur recombinant plasmidique associé à des lipides cationiques (DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol etc.) et des lipides neutres (DOPE). Le choix des plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention est vaste. Il peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression. D'une manière générale, ils sont 20 connus de l'homme de l'art et nombre d'entre eux sont disponibles commercialement mais il est également possible de les construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On peut citer à titre d'exemples les plasmides dérivés de pBR322 (GIBCO BRL), pUC (GIBCO BRL), pBluescript (STRATAGENE), pREP4, pCEP4 (IN VITROGEN) ou encore p Poly (LATHE et al., Gene 1987, 57, pp193-201). De préférence, 25 un plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention contient une origine de réplication assurant l'initiation de la réplication dans une cellule productrice et/ou une cellule hôte (par exemple, on retiendra l'origine CoIEI pour un plasmide destiné à être produit dans E. coli et le système oriP/EBNAI si l'on désire qu'il soit autoreplicatif dans une cellule hôte mammifère, LUPTON & LEVINE, Mol. Cell. Biol. 1985, 5, pp2533- 3048000 32 2542 ; YATES et al., Nature 1985, 313, pp812-815). Il peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées (complémentation d'une mutation d'auxotrophie, gène codant pour la résistance à un antibiotique...). Il peut aussi comprendre des éléments supplémentaires améliorant son 5 maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence cer qui favorise le maintien monomérique d'un plasmide, séquences d'intégration dans le génome cellulaire). S'agissant d'un vecteur viral, on peut envisager un vecteur dérivant d'un adénovirus, d'un lentivirus, d'un rétrovirus, d'un virus associé à l'adénovirus (AAV), d'un virus de 10 l'herpès, d'un alphavirus, d'un parvovirus, d'un poxvirus (fowipox, canaripox, virus de la vaccine notamment de la souche MVA (Modified Virus Ankara) ou Copenhagen...) ou d'un foamyvirus. On aura de préférence recours à un vecteur non réplicatif. Les rétrovirus ont la propriété d'infecter et de s'intégrer majoritairement dans les cellules en division et à cet égard sont particulièrement appropriés pour le procédé 15 d'amplification cellulaire de l'invention. Un vecteur rétroviral convenant à la mise en oeuvre de la présente invention comporte les séquences terminales LTR (Long Terminal Repeat) et une région d'encapsidation. Il peut dériver d'un rétrovirus d'une origine quelconque (murin, primate, félin, humain etc.) et en particulier peut dériver d'un rétrovirus choisi parmi le groupe comprenant MoMuLV (Moloney murine leukemia 20 virus), MVS (Murine sarcoma virus) ou Friend murine rétrovirus (Fb29). Il est propagé dans une lignée d'encapsidation capable de fournir en trans les polypeptides viraux gag, pol et/ou env nécessaires à la constitution d'une particule virale. De telles lignées sont décrites dans la littérature (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 etc.). Le vecteur rétroviral selon l'invention peut comporter des modifications notamment au niveau des LTRs 25 (remplacement de la région promotrice par un promoteur eucaryote) ou de la région d'encapsidation (remplacement par une région d'encapsidation hétérologue, par exemple de type VL30) (voir les demandes de brevet français FR94/08300 et Fr 97/ 05203). En particulier, le choix du type de vecteur sera lié au choix des progéniteurs neuronaux. 3048000 33 Selon un mode de réalisation particulier, le système du lentivirus est utilisé. Cette technique a l'avantage de permettre l'infection de cellules en division et de cellules quiescentes (non prolifératives) et est ainsi compatible avec le procédé d'amplification cellulaire de l'invention. De plus, un vecteur lentiviral permet au matériel génétique qu'il 5 contient de s'intégrer dans le génome de la cellule cible ce qui facilite une expression à long terme de la protéine d'intérêt et facilite l'obtention de lignée stable. Selon un mode de réalisation avantageux, le vecteur viral utilisé selon l'invention peut être sous la forme de vecteur ADN ou de particule virale infectieuse. La présente invention concerne également une cellule hôte comprenant un vecteur ou 10 une cassette selon l'invention. Aux fins de la présente invention, une telle cellule est constituée par toute cellule susceptible d'être transformée par un vecteur tel que décrit ci-avant. En particulier, une cellule de mammifère, peut être utilisée comme cellule hôte. Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine quelconque, notamment les 15 cellules souches de mammifères non humains ou les cellules issues de neuroblastome. De préférence, la cellule hôte est un progéniteur neuronal. La présente invention a également pour objet un kit pour le criblage de composés perturbateurs endocriniens comprenant une cassette d'expression selon l'invention, et/ou un vecteur comprenant une telle cassette et/ou une cellule hôte transformée par 20 une telle cassette ou un tel vecteur. Enfin l'invention est également relative à l'utilisation d'une cassette d'expression, d'un vecteur, et/ou d'une cellule hôte transformée tels que définis précédemment pour le criblage de composés perturbateurs endocriniens ou de composés suspectés d'être des perturbateurs endocriniens, en particulier de composés perturbateurs endocriniens ou 25 de composés suspectés d'être des perturbateurs endocriniens ciblant les neurones issus de la placode olfactive (neurones olfactifs et neurones à GnRH). 3048000 34 L'invention est illustrée par les exemples suivants sans pour autant que le contenu de leur enseignement ne restreigne la portée de l'invention ni n'en constitue une limitation. EXEMPLES 5 1- Constructions de la cassette Sox2-N-Myc La cassette Sox2-Nmyc a été entièrement synthétisée par extension d'amorces et clonée dans pKS-Bluescript. Des oligonucléotides de 40 mers chevauchants sur une longueur de 20 bases et couvrant la longueur du transgène ont été synthétisés puis assemblés par réaction de PCR. 10 La séquence de la cassette Sox2-Nmyc correspond à SEQ ID NO :19. 2 - Clonage de la cassette dans un vecteur d'expression Le clonage de la cassette Sox2-Nmyc correspondant à SEQ ID NO :19 dans un plasmide d'expression lentiviral a été réalisé en trois étapes. Un premier insert correspondant à l'extrémité 5' du promoteur Sox2 a été obtenu par 15 coupure du plasmide Sox2p-Myc (figure 1) par les enzymes de restriction Mlul et Xhol. La ligation de cet insert dans le vecteur d'expression lentiviral pLV.EF1.MCS (figure 2) a été réalisée après la double digestion de celui-ci par les enzymes de restriction Mlul et Xhol. Cette première étape aboutit à l'obtention du plasmide pLV.5'prom.MCS. Un amplicon correspondant à l'extrémité 3' de N-myc +3'UTR de Sox2 a été obtenu par 20 amplification du plasmide pKS-Sox2-Nmyc à l'aide des amorces sens 5'- CTTGGTGGGTCGTCGAGTGCTAGCCACAC -3' (SEQ ID NO: 20) et anti-sens 5'- TACGCGTCGACTCTCAAACTGTGCATAATGGAGTAA -3' (SEQ ID NO :21). Ces amorces permettent également d'introduire respectivement les sites de clonage Nhel (GCTAGC) et Sall (gtcgac) dans l'amplicon. La ligation de l'amplicon ainsi obtenu est réalisée dans le 25 plasmide pLV.5'prom.MCS. Cette seconde étape aboutit à l'obtention du plasmide pLV.5'Sox2prom.MCS.3'N-Myc. 3048000 Un second insert correspondant à l'extrémité 3' du promoteur Sox2 et à l'extrémité 5' de N-Myc a été obtenu par coupure du plasmide pKS-Sox2-Nmyc par les enzymes de restriction Nhel et Mlul. La ligation de cet insert dans le vecteur d'expression lentiviral pLV.5'Sox2prom.MCS.3'N-Myc a été réalisée après la double digestion de celui-ci par les 5 enzymes de restriction Nhel et Mlul. Cette troisième étape aboutit à l'obtention du plasmide pLV.SOX2prom.N-Myc-3'UTRSOX2 (figure 3). A chacune des étapes, les clones candidats sont sélectionnés et criblés par PCR. Les clones positifs sont mis en culture dans 4 ml de milieu LB+ampicilline puis séquencés entre les deux sites de clonages utilisés à chacune des étapes de la construction. 10 3 - Culture des progéniteurs neuronaux 3.1 - Isolement L'isolement des progéniteurs neuronaux à partir de placodes olfactives est effectué selon la méthode décrite par CONSTANTIN et al., Endocrinology 2009, vol.150 n°7:pp3221-3227. 15 20 à 25 placodes olfactives d'embryons E11,5 sont placées dans un tubes de 2 mL avec 1mL de PBS ou HBSS ou milieu Gey supplémenté en glucose (5mg/mL). 1 mL de milieu SFM est alors ajouté. Le milieu SFM est un mélange 50/50 des milieux de culture BME (Basal Medium Eagle, Invitrogen ref. 41010-026) et Ham's F-12 (Invitrogen ref. 11765-054), dans lequel sont ajoutés 1% de BSA (bovin serum albumin, Sigma ref.A- 20 9430/A-8806), 0,1 mM de putrescine (Sigma ref.P-7505), 5µg/ml d'insuline (Sigma ref.1- 5500), 100 pg/m1 de transferrine (Sigma ref.T-0178), 3.10-8M de sélénium (Sigma ref.S1382), 2 mM de glutamine (Invitrogen ref.25030-081), 5mg/m1 de glucose (Sigma ref.G7021), 38 µM de de vitamine C (Sigma ref.A-4034) et un cocktail d'antibiotiques (Invitrogen ref. 15640-055) pénicilline (50 pg/mI)-streptomycine (50 gg/m1)-néomycine 25 (100 pg/ml). Les concentrations indiquées sont les concentrations finales. La dissociation des cellules des placodes olfactives est effectuée par pipetages répétés : 50 pipetages avec P1000 et cône coupé (section plus grande), puis 50 pipetages avec P100 et cône non coupé, puis 50 pipetages avec P200 et cône non 3048000 36 coupé. Le contenu du tube est filtré avec un filtre de 40ffl. Le tamisa est récupéré et transféré dans un tube à centrifuger de 50 ML. 3 mL de milieu SFM sont ajoutés dans le filtre afin d'améliorer le rendement du tamisage. Le tube de 50 ml contenant le tamisa est centrifugé à 155g pendant 5 minutes à température ambiante. Le surnageant est 5 jeté et le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 mL de milieu SFM. 3.2 - Transduction Les cellules fraichement dissociées de placodes olfactives sont ensemencées à une densité de 200 000 cellules/mL. Ces cellules sont infectées par un lentivirus comprenant la cassette d'expression Sox2-Nmyc de l'invention selon une MOI égale à 10 10 en présence de polybrène (411g/mL) dans du milieu SFM. Après 24 heures d'incubation à 37°C et 5% CO2, la totalité du milieu de culture est renouvelée par du milieu SFM supplémenté en sérum de poulet 1% (Sigma C5405), en bFGF 2Ong/mL (Preprotech AF100-15) et EGF 2Ong/mL (Gibco 13256). 4 - Différenciation des progéniteurs neuronaux en neurones et cellules gliales 15 La différenciation des progéniteurs neuronaux en neurones et cellules gliales est induite par un remplacement progressif du milieu de culture SFM supplémenté en sérum de poulet (1%), en bFGF (20ng/mL) et EGF (20ng/mL) par du milieu Neurocult : DMEM/F12 (Gibco 21041); B27 (Gibco 17504) 1X ; péni-strepto (Gibco 150170) ; Insuline 25µg/mL (Sigma 15500) ; D-Glucose 6g/L (Sigma G7021) ; EGF 2Ong/mL (Preprotech 20 AF100-15) ; bFGF 2Ong/mL (Gibco 13256). La cinétique de remplacement est effectuée selon le schéma suivant : % milieu SFM - 1/4 milieu Neurocult pendant 24 heures puis 1/2 milieu SFM - 1/2 milieu Neurocult pendant 24 heures puis 1/4 milieu SFM - 34 milieu Neurocult pendant 24 heures. Après 24 heures de culture en milieu Neurocult, les facteurs de croissance EGF et bFGF sont retirés. 25 La caractérisation des cellules différenciées est effectuée par immunohistochimie. La détection des antigènes Tuj-1 (protéine spécifique de neurones) et GFAP (protéine spécifique des cellules gliales) est réalisée après 10 jours de culture en condition de différenciation d'un clone de progéniteur neuronal transduit avec le 3048000 37 transgène pS0X2-Nmyc. Comme le montre la figure 4 (grossissement : panneaux A, B et C : X20 ; panneaux D,E et F : X40), la présence des neurones est vérifiée par immunodétection de l'antigène Tuj-1 (B et E). La présence de cellules gliales est réalisée par l'immunodétection de l'antigène GFAP (C et D). La densité cellulaire est indiquée par 5 la détection de l'ADN nucléaire après révélation au Dapi. 5 - Criblage de composés perturbateurs endocriniens sur les cellules dérivées de progéniteurs neuronaux - Prolifération cellulaire : 10 Ces tests pourront être réalisés sur les cellules en condition de prolifération ou de différenciation. Les tests couramment utilisés en toxicologie réglementaire sont : - incorporation d'iodure de propidium, - marquage Ki67, PCNA, BrdU après incorporation. - Viabilité cellulaire : 15 Ces tests pourront être réalisés sur les cellules en condition de prolifération ou de différenciation. Les tests couramment utilisés en toxicologie réglementaire sont : - relargage de Bleu Trypan, - incorporation de rouge neutre. - Mortalité cellulaire : 20 Ces tests pourront être réalisés sur les cellules en condition de prolifération ou de différenciation. Les tests couramment utilisés en toxicologie réglementaire sont : - mesure d'Annexin V par cytométrie en flux, - TUNEL. 3048000 38 - Vitesse de différenciation cellulaire : L'impact du xénobiotique à tester sur la vitesse de différenciation sera mesurée à partir de la cinétique d'apparition des neurones et cellules gliales (détectables après marquage Tuj-1 et GFAP). 5 Le ratio neurones/cellules gliales pourra être déterminé. - Morphologie des cellules différenciées : La morphologie (taille et forme) globale sera évaluée, la taille des prolongements neuronaux et gliaux sera mesurée ainsi que leur ramification. - Activité électrique et sécrétrice : 10 Par des mesures électrophysiologiques, la fonction neuronale pourra être évaluée. Une mesure de calcium intracellulaire permettra d'évaluer l'activité sécrétrice des neurones. - Transcriptome/épigénome : Les gènes dont l'expression sera perturbée seront détectés par des techniques de transcriptome. 15 Les modifications de marques épigénétiques (méthylation de l'ADN, modification post- traductionnelle des histones) pourront être évaluées. REVENDICATIONS1. Une cassette d'expression comprenant : - une séquence d'acide nucléique codant pour un oncogène liée de manière opérationnelle à un promoteur inductible, ledit promoteur inductible comprenant : (i) une région promotrice minimale, et (ii) au moins une séquence régulatrice GBS (Gli-bindIng site), - et, optionnellement, une séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène et/ ou une séquence régulatrice 3' UTR placée à l'extrémité 3' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène. 2. La cassette d'expression selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'oncogène est choisi parmi les gènes HRAS / KRAS et NRAS, Her2, Firim2, N- Myc, TAL1, Fil-1, MLL, C cycline 191, RET, PML, Abi ou C-Myc, en particulier l'oncogène est N-Myc. 3. La cassette d'expression selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la région promotrice minimale du promoteur inductible est Issue du gène Sox2 et est définie par la séquence SEQ ID NO :12, ou un dérivé de celle-ci. 4. La cassette d'expression selon l'une quelconques des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite au moins une séquence régulatrice GBS comprend ou consiste en la séquence GBS 1 (SEQ ID NO :15) ou GBS2 (SEQ ID NO :16) du gène Sox2, ou un dérivé de celle-ci. 5. La cassette d'expression selon l'une quelconques des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence régulatrice 3' UTR placée à l'extrémité 3' de l'oncogène est Issue du gène Sox2 et comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 17, ou un dérivé de celle-ci. 3048000 40 6. La cassette d'expression selon l'une quelconques des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène est issue du gène Sox2 et comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 18, ou un dérivé de celle-ci 5 7. La cassette d'expression selon l'une quelconques des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO : 19. 8. Un vecteur comprenant la cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Une cellule hôte transformée par la cassette d'expression telle que définie à 10 l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou par le vecteur tel que défini à la revendication 8, de préférence la cellule hôte transformée est un progéniteur neuronal. 10. Un procédé d'amplification cellulaire comprenant une étape de : a) Mise en culture de progéniteurs neuronaux transformés par une 15 cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans un milieu de culture approprié. 11. Le procédé selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape a), une étape de transformation desdits progéniteurs neuronaux par ladite cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque 20 des revendications 1 à 7 ou par le vecteur tel que défini selon la revendication 8, 12. Le procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il vise à l'obtention de cellules nerveuses différenciées et en ce qu'il comprend en outre une étape de : 25 b) différenciation Induite par une modification de la composition du milieu de culture utilisé à l'étape a) des progéniteurs neuronaux en neurones et/ou en cellules gliales choisies parmi les astrocytes et les oligodendrocytes, ladite modification de composition dudit milieu de culture utilisé à l'étape a) pouvant consister en le retrait de tous les facteurs mitogènes dudit milieu de culture. 3048000 41 13. Le procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il vise en outre le criblage d'un composé perturbateur endocrinien et en ce qu'il comprend en outre les étapes de : c) Mise en contact des cellules obtenues à l'issue de l'étape b) avec au 5 moins un composé, d) détermination de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules résultant de la mise en contact avec ledit au moins un composé lors de l'étape c), et e) Identification, en tant que composé perturbateur endocrinien, de tout composé ayant entralné un changement métabolique et/ou phénotypique à l'issue de l'étape d). 14. Une utilisation de la cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 7, du vecteur tel que défini à la revendication 8 ou de la cellule hôte transformée telle que définie à la revendication 9 pour le criblage 15 de composés perturbateurs endocriniens, en particulier de composés perturbateurs endocriniens des neurones à GnRH. 15. Un kit pour le criblage de composés perturbateurs endocriniens comprenant une cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 7, et éventuellement un vecteur telle que défini à la 20 revendication 8 et/ou une cellule hôte transformée telle que définie à la revendication 9.