Brevet FR3043557A1 — publié le 20170519

COMPOSITION A ACTION RAPIDE D'rk:SULIIIE COMPRENANT UN CITRATE SUBSTITUE [0001] La présente invention concerne une composition à action rapide d'insuline comprenant un citrate substitué. L'invention concerne également la composition à action rapide d'insuline comprenant un citrate substitué comprenant en outre un composé polyanionique. [0002] Depuis la production d'insuline par génie génétique, au début des années 80, les patients diabétiques bénéficient d'insuline humaine pour. se traiter. Ce produit a grandement amélioré cette thérapie puisque les risques immunologiques liés à l'utilisation d'insuline non humaine, en particulier de porc, se trouvent éliminés. Cependant, l'insuline humaine injectée par voie sous-cutanée a un effet hypoglycémiant seulement après 60 minutes, ce qui implique que les patients diabétiques traités avec l'insuline humaine doivent procéder à l'injection 30 minutes avant le repas. [0003] Un des problèmes à résoudre pour améliorer la santé et le confort des patients diabétiques est de mettre à leur disposition des formulations d'insuline qui permettent d'apporter une réponse hypoglycémiante plus rapide que celle de l'insuline humaine et si possible s'approchant de la réponse physiologique de la personne saine. La sécrétion d'insuline endogène chez l'individu sain est immédiatement déclenchée par l'augmentation de la glycémie. L'objectif est de réduire le plus possible le délai entre l'injection d'insuline et le début du repas. [0004] Aujourd'hui, il est admis que la mise à disposition de telles formulations est utile pour que la prise en charge de la maladie soit la meilleure possible. [0005] Le génie génétique a permis d'apporter une réponse avec le développement d'insulines analogues rapides. Ces insulines sont modifiées sur un ou deux acides aminés pour être plus rapidement absorbées dans le compartiment sanguin après une injection sous-cutanée. Ces insulines lispro (Humalog®, Lilly), aspart (Novolog®, Novo Nordisk) et glulisine (Apidra®, Sanofi Aventis) sont des solutions stables d'insuline avec une réponse hypoglycémiante plus rapide que celle de l'insuline humaine. Dès lors, les patients traités avec ces insulines analogues rapides peuvent procéder à l'injection d'insuline seulement 15 minutes avant le repas. [0006] Le principe des insulines analogues rapides est de former des hexamères à la concentration de 100 UI/mL pour assurer la stabilité de l'insuline dans le produit commercial tout en favorisant la dissociation très rapide de ces hexamères en monomères après injection sous-cutanée afin d'obtenir une action rapide. 3043557 2 [0007] L'insuline humaine, telle que formulée sous sa forme commerciale, ne permet pas d'obtenir une réponse hypoglycémiante proche en terme de cinétique de la réponse physiologique générée par le début d'un repas (hausse de la glycémie), car à la concentration d'usage (100 UI/mL), en présence de zinc et d'autres excipients tels 5 que le phénol ou le m-crésol, elle s'assemble sous forme d'hexamère alors qu'elle est active sous forme de monomère et de dimère. L'insuline humaine est préparée sous forme d'hexamères pour être stable près de 2 ans à 4°C car sous forme de monomères, elle a une très forte propension à s'agréger puis à fibriller, ce qui lui fait perdre son activité. De plus sous cette forme agrégée, elle présente un risque 10 immunologique pour le patient. [0008] Les dissociations des hexamères en dimères et des dimères en monomères retardent son action de près de 20 minutes comparativement à une insuline analogue rapide (Brange J., et al, Advanced Drug Delivery Review, 35, 1999, 307-335). [0009] En outre, la cinétique de passage des insulines analogues dans le sang, ainsi 15 que leur cinétique de réduction de la glycémie, ne sont pas optimales et il existe un réel besoin d'une formulation ayant un temps d'action encore plus court afin de s'approcher des cinétiques de sécrétion d'insuline endogène chez les personnes saines. [00010] La société Biodel a proposé une solution à ce problème avec une formulation d'insuline humaine comprenant de l'EDTA et de l'acide citrique telle que décrite dans la 20 demande de brevet US200839365. L'EDTA par sa capacité à complexer les atomes de zinc et l'acide citrique par ses interactions avec les zones cationiques présentes à la surface de l'insuline sont décrits comme déstabilisant la forme hexamérique de l'insuline, réduisant ainsi son temps d'action. [00011] Cependant, une telle formulation présente notamment comme inconvénient 25 de dissocier la forme hexamérique de l'insuline qui est la seule forme stable susceptible de répondre aux exigences de stabilité de la réglementation pharmaceutique. [00012] On connait également au nom de la demanderesse, les demandes PCT W02010/122385 et W02013/064787 qui décrivent des formulations d'insuline 30 humaine ou analogue et d'un polysaccharide ou d'un oligosaccharide substitué comprenant des groupes carboxyles. [00013] Cependant, les exigences entraînées par l'usage chronique et intensif voire l'usage pédiatrique de telles formulations conduisent l'homme de l'art à rechercher à utiliser des excipients dont la masse molaire et la taille soient les plus réduites 35 possibles pour en faciliter l'élimination. [00014] Les polysaccharides décrits dans les demandes WO 2010/122385A1 et US 2012/094902A1 comme excipients sont des composés constitués de chaînes dont les longueurs sont statistiquement variables et qui présentent une grande richesse de 3043557 3 sites d'interaction possibles avec des principes actifs protéiques. Cette richesse pourrait induire un manque de spécificité en termes d'interaction et une molécule plus petite et mieux définie pourrait permettre d'être davantage spécifique à ce sujet. [00015] En outre, une molécule avec un squelette bien défini est en général plus 5 facilement traçable (MS/MS par exemple) dans les milieux biologiques lors d'expériences de pharmacocinétique ou d'ADME (administration, distribution, métabolisme, élimination) par rapport à un polymère qui donne généralement un signal très diffus et bruité en spectrométrie de masse. [00016] A contrario, il n'est pas exclu qu'une molécule bien définie et plus courte 10 puisse présenter un déficit de sites d'interaction possibles avec des principes actifs protéiques. En effet, en raison de leur taille réduite, les petites molécules ne présentent pas les mêmes propriétés que les polymères de type polysaccharide car il peut y avoir perte de l'effet polymère. [00017] La demanderesse a cependant réussi à mettre au point des formulations 15 susceptibles d'accélérer l'insuline en utilisant un citrate substitué. [00018] Dans un mode de réalisation, la formulation peut comprendre en outre un composé polyanionique. [00019] De plus, comme dans le cas de l'utilisation de polysaccharides, la nature hexamérique de l'insuline n'est pas affectée, donc la stabilité des formulations n'est 20 pas affectée, comme cela est d'ailleurs confirmé par les exemples d'état d'association d'insuline analogue lispro en dichroïsme circulaire en présence de citrates substitués selon l'invention, et éventuellement de composé polyanionique. [00020] La présente invention permet de résoudre les différents problèmes ci-dessus exposés, en tout ou partie, puisqu'elle peut permettre notamment de réaliser une 25 formulation d'insuline, humaine ou analogue, capable après administration, d'accélérer le passage de l'insuline humaine ou de ses analogues dans le sang et de réduire plus rapidement la glycémie en comparaison des produits commerciaux d'insuline correspondants. 30 [00021] L'invention consiste en une composition, sous forme de solution aqueuse, comprenant de l'insuline sous forme hexamérique et au moins un citrate substitué. [00022] Dans un mode réalisation, la composition comprend en outre, au moins un composé polyanionique différent dudit citrate substitué. 35 [00023] Dans un mode de réalisation, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 3043557 4 [00024] Par « solution aqueuse » on entend une solution au sens de la Pharmacopée Européenne. [00025] La solution selon l'invention peut ainsi répondre à la Pharmacopée Européenne 8.0 qui définit qu'une préparation injectable d'insuline soluble présente les 5 caractères de liquide incolore, non opalescent, exempt de substances étrangères ; des traces de sédiments très fins pouvant se déposer durant la conservation (01/2008 :0834). [00026] La solution selon l'invention peut être un liquide non opalescent, voire limpide. 10 [00027] Selon la Pharmacopée Européenne 8.0 au point 2.2.1. un liquide est considéré comme limpide lorsqu'il présente une opalescence qui n'est pas plus prononcée que celle de la suspension témoin I, qui présente une valeur d'opalescence de 3 UTN. L'opalescence de la solution peut être déterminée par la méthode visuelle et/ou par la méthode instrumentale, dite turbidimétrie. Lesdites méthodes étant 15 définies dans Pharmacopée Européenne 8.0 au point 2.2.1. [00028] Tout particulièrement, la solution selon l'invention présente une turbidité inférieure ou égale à 3 UTN selon les différentes méthodes décrites dans la Pharmacopée Européenne 8.0 au point 2.2.1. [00029] Dans un mode de réalisation les compositions selon l'invention sont 20 stérilisées par filtration sur membrane 0.22 pm par exemple par filtration sur une membrane SLGV033RS, Millex-GV de Millipore, membrane de 0,22 pm en PVDF. [00030] Dans un mode de réalisation le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 25 [00031] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition, sous forme de solution aqueuse, comprenant de l'insuline sous forme hexamèrique, et au moins un citrate substitué de Formule I: 0 R1 0 R2 OH Formule I 30 dans laquelle : R1, R2, R3 identiques ou différents, représentent OH ou AA, au moins un des R1, R2, R3 est un radical AA, 3043557 5 AA est un radical issu d'un acide aminé aromatique naturel ou synthétique comprenant au moins un groupement phényle ou un groupement indole, substitué ou non substitué, ledit radical AA présentant au moins une fonction acide carboxylique libre, 5 les fonctions acide carboxylique sont sous forme de sel d'un métal alcalin choisi parmi Na+ et K+. [00032] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un composé polyanionique différent dudit citrate 10 substitué. [00033] Par « acide aminé aromatique naturel ou synthétique comprenant au moins un groupement phényle ou un groupement indole, substitué ou non substitué », on entend un composé comprenant de 7 à 20 atomes de carbone, un phényle ou un 15 indole, substitué ou non substitué, une fonction amine et une fonction acide carboxylique. [00034] Selon un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle le radical AA 20 est issu d'un acide aminé aromatique naturel ou synthétique comprenant au moins un groupement phényle ou un groupement indole, substitué ou non substitué, choisi parmi les acides alpha- ou béta- aminés. Les acides aminés aromatiques comportant un phényle ou un indole, substitué ou non substitué, peuvent être choisis dans le groupe constitué de la phénylalanine, l'alpha-méthyl phénylalanine, la 3,4- 25 dihydroxyphénylalanine, l'alpha phénylglycine, la 4-hydroxyphénylglycine, la 3,5- dihydroxyphénylglycine, la tyrosine, l'alpha-méthyl tyrosine, la 0-méthyl tyrosine et le tryptophane. [00035] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle le radical AA 30 est issu d'un acide aminé aromatique naturel. [00036] Selon un mode de réalisation, l'acide aminé aromatique naturel est choisi dans le groupe constitué de la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane. [00037] Dans un mode de réalisation préféré, l'acide aminé aromatique naturel est la phénylalanine. 35 [00038] Les acides aminés aromatiques peuvent, le cas échéant, être sous forme lévogyre, dextrogyre ou sous forme racémique. En particulier, ils sont sous forme lévogyre. 3043557 6 [00039] Dans un mode de réalisation préféré, l'acide aminé aromatique est la L- phénylalanine. [00040] Dans un mode de réalisation préféré, l'acide aminé aromatique est le L- tryptophane. 5 [00041] Dans un mode de réalisation préféré, l'acide aminé aromatique est la L- tyrosine. [00042] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle le radical AA est issu d'un acide aminé aromatique synthétique. 10 [00043] Selon un mode de réalisation, l'acide aminé aromatique synthétique est l'alpha phénylglycine. [00044] Selon un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué comprend de 1 à 3 radicaux AA. 15 [00045] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle R1 est un radical AA. [00046] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle R2 est un 20 radical AA. [00047] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle au moins R1 est un radical AA. [00048] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le 25 citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle au moins R2 est un radical AA. [00049] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle au moins R1 et R2 sont un radical AA. 30 [00050] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle au moins R2 et R3 sont un radical AA. [00051] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le 35 citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle R1 est un radical AA et R2 et R3 sont OH. 3043557 7 [00052] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle R2 est un radical AA et R1 et R3 sont OH. [00053] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le 5 citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle R1 est OH et R2 et R3 sont un radical AA. [00054] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le 10 citrate substitué est choisi parmi les composés de formule II suivante : H OH Formule II dans laquelle AA est défini tel que ci-dessus, les fonctions acide carboxylique sont sous forme de sel d'un métal alcalin choisi parmi 15 Na+ et Fe. [00055] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule II dans laquelle AA est issu d'un acide aminé aromatique choisi dans le groupe constitué de la phénylalanine, de la 20 tyrosine et du tryptophane. [00056] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule II dans laquelle AA est issu de la L-phénylalanine. 25 [00057] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle R2 OU R3 est un radical AA, R1 est OH, si R2 = AA alors R3 = OH et si R3 = AA alors R2 est OH. [00058] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule III suivante : 30 01-1 Formule III 3043557 8 dans laquelle AA, R2 et R3 sont définis tel que ci-dessus et, Si R2 = AA, alors R3 = 0H, Si R3 = AA, alors R2 = OH, les fonctions acide carboxylique sont sous forme de sel d'un métal alcalin choisi parmi [00059] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule III dans laquelle AA est issu d'un acide aminé aromatique choisi dans le groupe constitué de la phénylalanine, de la 10 tyrosine et du tryptophane. [00060] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule III dans laquelle AA est issu de la L-phénylalanine. 15 [00061] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R1 est un radical AA, R2 et R3 sont OH et le radical AA est issu de la phénylalanine. [00062] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R1 est un radical AA, R2 et R3 sont 20 OH et le radical AA est issu du tryptophane. [00063] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R1 est un radical AA, R2 et R3 sont OH et le radical AA est issu de la tyrosine. 25 [00064] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R2 est un radical AA, R1 et R3 sont OH et le radical AA est issu de la phénylalanine. [00065] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R2 est un radical AA, R1 et R3 sont 30 OH et le radical AA est issu du tryptophane. [00066] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R2 est un radical AA, R1 et R3 sont OH et le radical AA est issu de la tyrosine. [00067] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le 35 citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R1 est OH, R2 et R3 sont un radical AA, et le radical AA est issu de la phénylalanine. 3043557 9 [00068] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 3 et 400. [00069] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 4 et 350. 5 [00070] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 5 et 300. [00071] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 8 et 250. [00072] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que 10 les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 12 et 200. [00073] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 15 et 150. [00074] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 18 et 128. 15 [00075] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 18 et 64. [00076] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 18 et 36. [00077] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le 20 ratio molaire citrate substitué/insuline est égal à 18, 25, 32, 36, 50 et 64. [00078] Dans les ratios molaires ci-dessus, le nombre de moles d'insuline s'entend comme le nombre de moles de monomère d'insuline. [00079] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 0,5 et 30. 25 [00080] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 0,5 et 20. [00081] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 0,5 et 16. [00082] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que 30 les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 0,6 et 12. [00083] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 1,2 et 10. [00084] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 1,6 et 8. 35 [00085] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 2 et 8. [00086] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 2 et 6. 3043557 10 [00087] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 2 et 4. [00088] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le ratio massique citrate substitué/insuline est 2, 3, 4 ou 6. 5 [00089] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que l'insuline est l'insuline humaine. [00090] On entend par insuline humaine une insuline obtenue par synthèse ou recombinaison dont la séquence peptidique est la séquence de l'insuline humaine, incluant les variations alléliques et les homologues. 10 [00091] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que l'insuline est une insuline humaine recombinante telle que décrite dans la Pharmacopée Européenne et la Pharmacopée américaine. [00092] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que l'insuline est une insuline analogue. 15 [00093] On entend par insuline analogue une insuline recombinante dont la séquence primaire contient au moins une modification par rapport à la séquence primaire de l'insuline humaine. [00094] Dans un mode de réalisation l'insuline analogue est choisie dans le groupe constitué par l'insuline lispro (Humalog()), l'insuline aspart (NovologC), Novorapid()) 20 et l'insuline glulisine (ApidraC)). [00095] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que l'insuline analogue est l'insuline lispro (HumalogC)). [00096] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que l'insuline analogue est l'insuline aspart (Novolog®, Novorapid()). 25 [00097] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que l'insuline analogue est l'insuline glulisine (Apidra®). [00098] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que l'insuline est sous forme hexamérique. [00099] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la 30 composition pharmaceutique est caractérisée en ce que la concentration en insuline est comprise entre 240 et 3000 pM (40 à 500 UI/mL). [000100] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est caractérisée en ce que la concentration en insuline est comprise entre 600 et 3000 pM (100 à 500 UI/mL). 35 [000101] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est caractérisée en ce que la concentration en insuline est comprise entre 600 et 2400 pM (100 à 400 UI/rnL). 3043557 11 [000102] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est caractérisée en ce que la concentration en insuline est comprise entre 600 et 1800 pM (100 à 300 UI/mL). [000103] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la 5 composition pharmaceutique est caractérisée en ce que la concentration en insuline est comprise entre 600 et 1200 pM (100 à 200 UI/mL). [000104] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que elle concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce que la concentration en insuline est 600 pM (100 UI/mL), 1200 pM (200 UI/nnL), 1800 pM (300 UI/mL), 10 2400 pM (400 UI/mL) ou 3000 pM (500 UI/mL). [000105] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le composé polyanionique (composé PNP) présente une affinité pour le zinc inférieure à l'affinité de l'insuline pour le zinc et une constante de dissociation KdCa = [composé 15 PNP]'* [Ca21s/[(composé PNP)r-(Ca2+)s] est inférieure ou égale à 10-1'5. Cette constante de dissociation est la constante de réaction associée à la dissociation du complexe (composé PNP)r-(Ca2+)s, c'est-à-dire à la réaction suivante : (composé PNP)r-(Ca2+)s se dissocie en r(composé PNP) + sCa2+. Dans la présente demande le symbole * étant le signe multiplier. 20 [000106] Les constantes de dissociation (Kd) des différents composés polyanioniques vis-à-vis des ions de calcium sont déterminées par calibration externe à l'aide d'une électrode spécifique aux ions Calcium (Mettler Toledo) et d'une électrode de référence. Toutes les mesures sont effectuées dans 150 mM de NaCl à pH 7. Seules 25 les concentrations en ions calcium libres sont déterminées ; les ions calcium liés au composé polyanionique n'induisent pas de potentiel d'électrode. [000107] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le composé polyanionique est choisi dans le groupe constitué des polyacides 30 carboxyliques et leurs sels de Na+, K+, Ca2+ ou Mg2+. [000108] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le polyacide est choisi dans le groupe constitué de l'acide citrique, l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'acide malique, l'acide tartrique, l'acide succinique, l'acide 35 adipique, l'acide oxalique, le phosphate, les polyacides phosphoriques, comme le triphosphate et leurs sels de Na+, e, Ca2+ ou Mg2+. 3043557 12 [000109] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la molécule anionique est l'acide citrique et ses sels de Na+, le, Ca2+ ou Mg2+. [000110] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la 5 concentration en citrate substitué est comprise entre 1,8 et 100 mg/mL. [000111] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est comprise entre 1,8 et 50 mg/mL. [000112] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est comprise entre 1,8 et 36 mg/mL. 10 [000113] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est comprise entre 1,8 et 36,5 mg/mL. [000114] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est comprise entre 2,1 et 25 mg/mL. [000115] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la 15 concentration en citrate substitué est comprise entre 4,2 et 18 mg/mL. [000116] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est comprise entre 5,6 et 15 mg/mL. [000117] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est comprise entre 7 et 15 mg/mL. 20 [000118] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est 7,3 mg/mL. [000119] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est 10,5 mg/mL. [000120] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la 25 concentration en citrate substitué est 14,6 mg/mL. [000121] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est 21,9 mg/mL. [000122] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la 30 concentration en citrate substitué est comprise entre 1,8 et 100 mg pour 100 UI d'insuline. [000123] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est comprise entre 1,8 et 50 mg pour 100 UI d'insuline. 35 [000124] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est comprise entre 1,8 et 36 mg pour 100 UI d'insuline. 3043557 13 [000125] Dans concentration en d'insuline. [000126] Dans 5 concentration en d'insuline. [000127] Dans concentration en d'insuline. 10 [000128] Dans concentration en d'insuline. [000129] Dans concentration en 15 d'insuline. [000130] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la citrate substitué est comprise entre 1,8 et 36,5 mg pour 100 UI un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la citrate substitué est comprise entre 2,1 et 25 mg pour 100 UI un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la citrate substitué est comprise entre 4,2 et 18 mg pour 100 UI un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la citrate substitué est comprise entre 5,6 et 15 mg pour 100 UI un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la citrate substitué est comprise entre 7 et 15 mg pour 100 UI un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est 7,3 mg pour 100 UI d'insuline. [000131] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est 10,5 mg pour 100 UI d'insuline. 20 [000132] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est 14,6 mg pour 100 UI d'insuline. [000133] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est 21,9 mg pour 100 UI d'insuline. 25 [000134] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 2 et 150 mM. [000135] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 2 et 100 mM. [000136] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la 30 concentration en composé polyanionique est comprise entre 2 et 75 mM. [000137] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 2 et 50 mM. [000138] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 2 et 30 mM. 35 [000139] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 2 et 20 mM. [000140] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 2 et 10 mM. 3043557 14 [000141] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est [000142] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est 5 [000143] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est [000144] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est [000145] Dans un mode de réalisation, la 10 concentration en composé polyanionique est [000146] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est [000147] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est 15 composition est caractérisée en ce que la comprise entre 5 et 150 mM. composition est caractérisée en ce que la comprise entre 5 et 100 mM. composition est caractérisée en ce que la comprise entre 5 et 75 mM. composition est caractérisée en ce que la comprise entre 5 et 50 mM. composition est caractérisée en ce que la comprise entre 5 et 30 mM. composition est caractérisée en ce que la comprise entre 5 et 20 mM. composition est caractérisée en ce que la comprise entre 5 et 10 mM. [000148] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 0,5 et 30 mg/mL. [000149] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 0,5 et 25 mg/mL. 20 [000150] [000210] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 0,5 et 10 mg/mL. [000151] [000210] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 25 0,5 et 8 mg/mL. [000152] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est [000153] Dans un mode de réalisation, la 30 concentration en composé polyanionique est [000154] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est [000155] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est 35 [000156] Dans un mode de réalisation, la concentration en composé polyanionique est composition est caractérisée en ce comprise entre 1 et 30 mg/mL. composition est caractérisée en ce comprise entre 1,5 et 25 mg/mL. composition est caractérisée en ce comprise entre 2 et 25 mg/mL. composition est caractérisée en ce comprise entre 2 et 10 mg/mL. composition est caractérisée en ce comprise entre 2 et 8 mg/mL. que la que la que la que la que la 3043557 15 [000157] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le pH de la composition est compris entre 6 et 8. [000158] Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend de l'insuline, notamment telle que définie ci-dessus, au moins un citrate 5 substitué tel que défini ci-dessus, et de l'acide citrique ou ses sels de Na+, K+, [a2+ ou Mg2+, notamment tels que définis ci-dessus. [000159] Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend de l'insuline, notamment telle que définie ci-dessus, au moins un citrate substitué répondant à la Formule I telle que définie ci-dessus, et de l'acide citrique ou 10 ses sels de Na+, K+, Ca2+ ou Mg2+, notamment tels que définis ci-dessus. [000160] Il est connu de l'homme de l'art que le délai d'action des insulines est dépendant de la concentration en insuline. Seules les valeurs de délai d'action des compositions à 100 UI/mL sont documentées. 15 [000161] Les compositions d'insuline humaine « regular » sur le marché à une concentration de 600 pM (100 UI/mL) ont un délai d'action compris entre 50 et 90 minutes et une fin d'action d'environ 360 à 420 minutes chez l'humain. Le temps pour atteindre la concentration maximale en insuline dans le sang est compris entre 90 et 180 minutes chez l'humain. 20 [000162] Les compositions d'insulines analogues rapides sur le marché à une concentration de 600 pM (100 UI/mL) ont un délai d'action compris entre 30 et 60 minutes et une fin d'action d'environ 240-300 minutes chez l'humain. Le temps pour atteindre la concentration maximale en insuline dans le sang est compris entre 50 et 90 minutes chez l'humain. 25 [000163] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline humaine ayant une concentration en insuline comprise entre 240 et 3000 pM (40 et 500 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur à celui de la composition de référence à la même concentration en insuline en l'absence 30 de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000164] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que 35 l'insuline est sous forme hexamérique. [000165] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 3043557 16 [000166] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline humaine ayant une concentration en insuline comprise entre 600 et 1200 pM (100 et 200 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur à celui de la composition de référence à la même concentration en insuline en 5 l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000167] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme 10 hexamérique. [000168] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. [000169] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une 15 composition d'insuline humaine ayant une concentration en insuline de 600 pM (100 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur à 60 minutes caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. 20 [000170] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. [000171] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 25 [000172] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline humaine ayant une concentration en insuline de 1200 pM (200 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur d'au moins 10% à celui de la composition de l'insuline humaine à la même concentration (200 UI/mL) et en l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle 30 comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000173] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. 35 [000174] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 3043557 17 [000175] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline humaine ayant une concentration en insuline de 1800 pM (300 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur d'au moins 10% à celui de la composition de l'insuline humaine à la même concentration (300 UI/mL) et en 5 l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000176] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme 10 hexamérique. [000177] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. [000178] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une 15 composition d'insuline humaine ayant une concentration en insuline de 2400 pM (400 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur d'au moins 10% à celui de la composition de l'insuline humaine à la même concentration (400 UI/mL) et en l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate 20 substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000179] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. [000180] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est 25 compris entre 6 et 8. [000181] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline humaine ayant une concentration en insuline de 3000 pM (500 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur d'au moins 10% à celui de la 30 composition de l'insuline humaine à la même concentration (500 UI/mL) et en l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. 35 [000182] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. [000183] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 3043557 18 [000184] L'invention consiste en la préparation d'une composition d'insuline humaine dite rapide caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une 5 étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000185] Dans un mode de réalisation, l'insuline est sous forme hexamérique. [000186] Dans un mode de réalisation, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 10 [000187] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline humaine à une concentration de 600 pM (100 UI/mL) dont le délai d'action chez l'humain est inférieur à 60 minutes, de préférence inférieur à 45 minutes, et encore de préférence inférieur à 30 minutes caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate 15 substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000188] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. [000189] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est 20 compris entre 6 et 8. [000190] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline analogue ayant une concentration en insuline comprise entre 240 et 3000 pM (40 et 500 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur à 25 celui de la composition de référence à la même concentration en insuline en l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. 30 [000191] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexa mérique. [000192] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 35 [000193] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline analogue ayant une concentration en insuline comprise entre 600 et 1200 pM (100 et 200 UI/rnL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur à celui de la composition de référence à la même concentration en insuline analogue 3043557 19 en l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique, caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. 5 [000194] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. [000195] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 10 [000196] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline analogue ayant une concentration en insuline de 600 pmol/L (100 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur à 30 minutes, caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à 15 ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000197] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. [000198] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 20 [000199] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline analogue ayant une concentration en insuline de 1200 pM (200 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur d'au moins 10% à celui de la composition de l'insuline analogue en l'absence de citrate substitué et de composé 25 polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000200] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. 30 [000201] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. [000202] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline analogue ayant une concentration en insuline de 1800 pM (300 35 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur d'au moins 1096 à celui de la composition de l'insuline analogue en l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite 3043557 20 composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000203] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. 5 [000204] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. [000205] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline analogue ayant une concentration en insuline de 2400 pM (400 10 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur d'au moins 10% à celui de la composition de l'insuline analogue en l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. 15 [000206] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. [000207] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 20 [000208] L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition d'insuline analogue ayant une concentration en insuline de 3000 pM (500 UI/mL), dont le délai d'action chez l'humain est inférieur d'au moins 10% à celui de la composition de l'insuline analogue en l'absence de citrate substitué et de composé polyanionique caractérisée en ce qu'elle comprend (1) une étape d'addition à ladite 25 composition d'au moins un citrate substitué, et éventuellement en outre (2) une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. [000209] Dans un mode de réalisation de la méthode, l'insuline est sous forme hexamérique. [000210] Dans un mode de réalisation de la méthode, le pH de la composition est 30 compris entre 6 et 8. [000211] L'invention consiste en la préparation d'une composition d'insuline analogue dite très rapide caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'addition à ladite composition d'au moins un citrate substitué, ledit citrate comportant des 35 groupes fonctionnels carboxyles partiellement substitués, les groupes fonctionnels carboxyles non substitués étant salifiables. [000212] Dans un mode de réalisation, la préparation comprend en outre une étape d'addition à ladite composition d'au moins un composé polyanionique. 3043557 21 [000213] Dans un mode de réalisation, l'insuline est sous forme hexamérique. [000214] Dans un mode de réalisation, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. 5 [000215] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un citrate substitué, éventuellement en combinaison avec un composé polyanionique, pour préparer une composition pharmaceutique d'insuline humaine, permettant, après administration, d'accélérer le passage de l'insuline humaine dans le sang et de réduire plus rapidement la glycémie par rapport à une composition exempte de citrate 10 substitué. [000216] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un citrate substitué, éventuellement en combinaison avec un composé polyanionique, pour préparer une composition d'insuline analogue, permettant, après administration, d'accélérer le passage de l'insuline analogue dans le sang et de réduire plus 15 rapidement la glycémie par rapport à une composition exempte de citrate substitué. [000217] Dans un mode de réalisation de l'utilisation, le pH de la composition est compris entre 6 et 8. [000218] L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon 20 l'invention, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par séchage et/ou lyophilisation. [000219] Dans un mode de réalisation, les compositions selon l'invention comprennent en outre l'addition de sels de zinc à une concentration comprise entre O et 500 pM, notamment entre O et 300 pM, et en particulier entre O et 200 pM. [000220] Dans un mode de réalisation, les compositions selon l'invention 25 comprennent des tampons à des concentrations comprises entre 0 et 100 mM, de préférence entre 0 et 50 mM, voire entre 15 et 50 mM. [000221] Dans un mode de réalisation le tampon est le Tris. [000222] Dans un mode de réalisation, les compositions selon l'invention comprennent en outre des conservateurs. 30 [000223] Dans un mode de réalisation, les conservateurs sont choisis dans le groupe constitué par le m-crésol et le phénol seuls ou en mélange. [000224] Dans un mode de réalisation, la concentration des conservateurs est comprise entre 10 et 50 mM, notamment entre 10 et 40 mM. [000225] Les compositions selon l'invention peuvent en outre comprendre des 35 additifs tels que des agents de tonicité comme la glycérine, le chlorure de sodium (NaCI), le mannitol et la glycine. 3043557 22 [000226] Les compositions selon l'invention peuvent en outre comprendre des additifs conformes aux pharmacopées comme des tensioactifs par exemple du polysorbate. [000227] Les compositions selon l'invention peuvent comprendre en outre tous les 5 excipients conformes aux pharmacopées et compatibles avec les insulines utilisées aux concentrations d'usage. [000228] Dans le cas des libérations locale et systémique, les modes d'administration envisagés sont par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire. Tout particulièrement, le mode d'administration est la voie sous-10 cutanée. [000229] Les voies d'administration transdernnique, orale, nasale, vaginale, oculaire, buccale, pulmonaire sont également envisagées. [000230] L'invention concerne également l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la composition d'une solution d'insuline humaine ou analogue de 15 concentration de 100 UI/mL ou 200 UI/mL destinée aux pompes à insuline implantables ou transportables. [000231] Selon un autre de ses aspects, l'invention porte également sur les citrates substitués tels que définis ci-dessus. 20 [000232] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué répond à la Formule I suivante : OH Formule I dans laquelle : 25 - R1, R2, R3 identiques ou différents, représentent OH ou AA, - un seul des R1, R2, R3 est un radical AA, - AA est un radical issu d'un acide aminé aromatique naturel ou synthétique comprenant au moins un groupement phényle ou un groupement indole, substitué ou 30 non substitué, ledit radical AA présentant au moins une fonction acide carboxylique libre. [000233] Selon un mode de réalisation, le citrate substitué est caractérisé en ce que le radical AA est issu d'un acide aminé aromatique naturel ou synthétique 3043557 23 comprenant au moins un groupement phényle ou un groupement indole, substitué ou non substitué, choisi parmi les acides alpha- ou béta- aminés. Les acides aminés aromatiques comportant un phényle ou un indole, substitué ou non substitué, peuvent être choisis dans le groupe constitué de la phénylalanine, l'alpha-méthyl 5 phénylalanine, la 3,4-dihydroxyphénylalanine, l'alpha phénylglycine, la 4- hydroxyphénylglycine, la 3,5-dihydroxyphényiglycine, la tyrosine, l'alpha-méthyl tyrosine, la 0-méthyl tyrosine et le tryptophane. [000234] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué est caractérisé en ce que le radical AA est issu d'un acide aminé aromatique naturel. 10 [000235] Selon un mode de réalisation, l'acide aminé aromatique naturel est choisi dans le groupe constitué de la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane. [000236] Dans un mode de réalisation préféré, l'acide aminé aromatique naturel est la phénylalanine. [000237] Les acides aminés aromatiques peuvent, le cas échéant, être sous forme 15 lévogyre, dextrogyre ou sous forme racémique. En particulier, ils sont sous forme lévogyre. [000238] Dans un mode de réalisation préféré, l'acide aminé aromatique est la L- phénylalanine. [000239] Dans un mode de réalisation préféré, l'acide aminé aromatique est le L- 20 tryptophane. [000240] Dans un mode de réalisation préféré, l'acide aminé aromatique est la L- tyrosine. [000241] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué est caractérisé en ce que le radical AA est issu d'un acide aminé aromatique synthétique. 25 [000242] Selon un mode de réalisation, l'acide aminé aromatique synthétique est l'alpha phénylglycine. [00024]] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué est caractérisé en ce que Ra est un radical AA et R2 et R3 sont OH. 30 [000244] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué répond à la Formule II suivante : HCY OH OH Formule II dans laquelle AA est défini tel que ci-dessus. 3043557 24 [000245] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué est choisi parmi les citrates substitués de formule II dans laquelle AA est issu d'un acide aminé aromatique choisi dans le groupe constitué de la phénylalanine, de la tyrosine et du 5 tryptophane. [000246] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué est choisi parmi les citrates substitués de formule II dans laquelle AA est issu de la L-phénylalanine. [000247] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué est caractérisé en ce que 10 R2 ou R3 est un radical AA, R1 est OH, si R2 = AA alors R3 = OH et si R3 = AA alors R2 est OH. [000248] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué répond à la Formule III suivante : 0 OH P, R2 OH Formule III 15 dans laquelle AA, R2 et R3 sont définis tel que ci-dessus et, - si R2 = AA, alors R3 = OH, - si R3 = AA, alors R2 = OH. [000249] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué est choisi parmi les 20 citrates substitués de formule III dans laquelle AA est issu d'un acide aminé aromatique choisi dans le groupe constitué de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane. [000250] Dans un mode de réalisation, le citrate substitué est choisi parmi les citrates substitués de formule III dans laquelle AA est issu de la L-phénylalanine. 25 3043557 25 Exemples. [000252] Le Tableau 1 ci-après présente, de façon non limitative, des exemples de composés selon l'invention. 5 Tableau 1 citrates substitués A2 Formules Al 3043557 26 Exemple Al : citrate substitué Al Molécule 1 : acide 1,3-diméthyle citrate [000253] Une solution d'acide citrique (50 g, 260 mmol), d'acide borique (1,5 g, 5 24,7 mmol) dans 70 mL de méthanol et 80 mL d'acétone est agitée à température ambiante pendant 3 jours. De l'acétone (80 mL) est ajouté au milieu réactionnel qui est refroidi à 0°C pendant 2 h. Le solide est récupéré par filtration sur fritté, lavé avec un mélange acétone/dichlorométhane (1/1) et séché sous vide. Rendement : 48,8 g (85%) 10 RMN 1-1(DMSO-d6, ppm) : 2,74 (2H) ; 2,85 (2H) ; 3,56 (6H). LC/MS (ESI): 221,2 ; (calculé ([M+H]+): 221,2). Molécule 2 : produit obtenu par la réaction entre la molécule 1 et le sel chlorhydrate de l'éthyle ester de la L-phénylalanine [000254] A une solution de molécule 1 (25 g, 113,5 mmol) dans le THF (1,1 L) à 15 0°C sont ajoutés successivement du dicyclohexyle carbodiimide (DCC) (24,6 g, 119,2 mmol) et du N-hydroxysuccinimide (NHS) (13,72 g, 119,2 mmol). Après 16 h d'agitation à température ambiante, le milieu est refroidi à 0°C pendant 20 min, filtré sur fritté et ajouté à une suspension de sel chlorhydrate de l'éthyle ester de la L-phénylalanine (26,8 g, 113,5 mmol) et de triéthylamine (110,8 mL, 794,8 mmol) dans 20 le THF (150 mL). 50 mL sont ajoutés pour avoir un milieu homogène et la solution est agitée à température ambiante pendant 1 h. Le milieu est évaporé sous vide, dilué avec de l'acétate d'éthyle et lavé avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3. La phase aqueuse est extraite à l'acétate d'éthyle. Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution aqueuse de HC1 10% puis une solution aqueuse saturée en 25 NaCI. Après séchage sur Na2SO4, la phase organique est filtrée, concentrée sous vide et le résidu est purifié par chromatographie flash (cyclohexane, acétate d'éthyle) pour donner une huile incolore. Rendement : 20,4 g (45%) RMN zH (DMSO-d6, ppm) : 1,26 (3H) ; 2,78-2,90 (4H) ; 3,14 (2H) ; 3,70 (6H) ; 4,15 30 (2H) ; 4,82 (1H) ; 4,93 (1H) ; 7,20-7,33 (5H) ; 7,40 (1H). LC/MS (ESI): 396,3 ; (calculé ([M+H]+): 396,4). Citrate substitué Al [000255] A une solution de molécule 2 (20,34 g, 51,44 mmol) dans le méthanol (514 mL) à 0°C est ajoutée une solution aqueuse de soude 2N (128,6 mL). Le 35 mélange est agité à 0°C pendant 2 h puis à température ambiante pendant 2 h. 25,7 mL de soude 2N supplémentaires sont ajoutés et le milieu est agité à température 3043557 27 ambiante pendant 2 h. Le solide formé est filtré sur fritté, azéotropé à l'eau (150 mL) et séché sous vide pour donner un solide blanc de citrate substitué Al. Rendement : 13,6 g (64%) RMN 1-1-1 (DMSO-c15, ppm) : 1,95-2,65 (4H) ; 2,99 (1H) ; 3,20 (1H) ; 4,49 (1H) ; 7,3O- 5 7,42 (5H). LC/MS (ESI): 340,1 ; (calculé ([M+4H-3Nar): 340,2). Exemple A2 : citrate substitué A2 Molécule 3 : tert-butyle ester de la molécule 1 10 [000256] A une solution de la molécule 1 (7 g, 31,8 mmol) dans le dichlorométhane (318 mL) à température ambiante est ajouté le tert-buty1-2,2,2-trichloroacétimidate (9,3 mL). Après 16 h d'agitation, une portion supplémentaire de tert-buty1-2,2,2- trichloroacétimidate (3,09 mL) est ajoutée. Après 6 h d'agitation, une portion supplémentaire de bert-buty1-2,2,2-trichloroacétimidate (3,09 mL) est ajoutée. Après 15 16 h d'agitation, le milieu est évaporé sous vide à sec pourdonnerun solide qui est repris dans l'hexane (100 mL). La suspension est agitée à chaud pendant 30 min, refroidie à 5°C et filtrée sur fritté. Le solide est rincé avec du dichlorométhane (50 mL) et le filtrat est évaporé sous vide pour donner une huile qui est purifiée par chromatographie flash (cyclohexane, acétate d'éthyle). 20 Rendement : 4,76 g (50%) RMN zH (CDC13, ppm) : 1,48 (9H) ; 2,70-2,86 (4H) ; 3,67 (6H) ; 4,02 (1H). RMN 1.3C (CDC13, ppm) : 27,67 ; 43,27 ; 51,75 ; 72,98 ; 83,22 ; 170,04 ; 172,23. Molécule 4 : produit obtenu par saponification de la molécule 3 [000257] A une solution de molécule 3 (3,35 g, 12,13 mmol) dans le méthanol 25 (120 nnL) à 0°C est ajoutée une solution aqueuse de soude 2N (18,2 mL) préalablement refroidie à 0°C. Le milieu est agité à 0°C pendant 15 min puis à température ambiante pendant 5 h. Après évaporation de la phase organique sous vide, le milieu est dilué avec de l'eau (50 mL) et la phase aqueuse est lavée avec de l'acétate d'éthyle (100 mL) puis acidifiée par une solution aqueuse d'HCI 10% et 30 extraite avec de l'acétate d'éthyle (2x150 mL). La phase organique est lavée avec de l'eau (100 mL), une solution aqueuse saturée en NaC1 (150 mL) puis séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide blanc. La phase aqueuse est de nouveau extraite à l'acétate d'éthyle (2x150 nnL), séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous vide pour donner une deuxième portion du produit désiré. 35 Rendement : 15,6 g (86%) RMN 1-1(CD3OD, ppm) : 1,46 (9H) ; 2,71 (2H) ; 2,86 (2H). LC/MS (ESI): 247,1 ; (calculé ([M-H]'): 247,3). Molécule 5 : produit obtenu par la réaction entre la molécule 4 et le DCC 3043557 28 [000258] A une solution de molécule 4 (15,6 g, 62,8 mmol) dans un mélange dichlorométhane/THF (310/100 mL) est ajouté le DCC (14,26 g, 69,1 mnnol) et le milieu est agité pendant 5 h à température ambiante. Après filtration sur célite, le milieu est évaporé à sec. Le résidu est agité à chaud dans un mélange hexane/acétate 5 d'éthyle (320/80 mL) puis refroidi à -20°C sur une nuit. Après filtration sur fritté, un solide orangé est isolé. Rendement : 13,3 g (91%) RMN 1H (CDCI3, ppm) : 1,50 (9H) ; 2,94 (2H) ; 3,03 (2H). Molécule 6 : produit obtenu par la réaction entre la molécule 5 et le sel chlorhydrate 10 du tert-butyle ester de la L-phénylalanine [000259] A une solution de sel chlorhydrate du tert-butyle ester de la L-phénylalanine (16,4 g, 63,55 mmol) dans le dichlorométhane (100 mL) est ajoutée une solution aqueuse saturée de NaHCO3 (150 mL). La phase organique est séparée et la phase aqueuse est extraite au dichlorométhane (50 mL). Les phases organiques 15 combinées sont séchées sur Na2SO4, filtrées et partiellement concentrées sous vide à un volume de 40 mL. La solution obtenue est coulée sur une solution de molécule 5 (13,3 g, 57,8 mnnol) dans le THF (577 mL) à 0°C. Après 3 h d'agitation à 0°C, le milieu est concentré sous vide. Le résidu est solubilisé dans l'acétate d'éthyle (200 mL), filtré sur membrane PTFE (0,45 pm), lavé avec une solution aqueuse saturée en 20 NH4CI (100 mL), de l'eau (100 mL) et une solution aqueuse saturée en NaCI (100 mL). Après séchage sur Na2SO4 et filtration, la phase organique est évaporée sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie flash (cyclohexane, acétate d'éthyle). L'huile obtenue est azéotropée à l'eau et à l'acétone pour donner un solide beige. Rendement : 24,3 g (93%) 25 RMN 1H (CDCI3, ppm) : 1,40 (9H) ; 1,45 (9H) ; 2,60-2,85 (4H) ; 3,08 (2H) ; 4,73 (1H) ; 6,73 (1H) ; 7,15-7,30 (5H). LC/MS (ESI): 453,2 ; (calculé ([M+H]+): 452,5). Citrate substitué A2 [000260] A une solution de molécule 6 (24,3 g, 53,8 mmol) dans le 30 dichlorométhane (110 mL) à 0°C est ajouté de l'acide trifluoroacétique (TFA) (82,4 mL). Le milieu est laissé remonter à température ambiante et est agité pendant 5 h. Après évaporation à sec sous vide, le résidu est solubilisé dans l'acétate d'éthyle (100 mL), refroidi à -20°C pendant 1 h et filtré sur une membrane PVDF (0,45 pm). Le filtrat est concentré sous vide pour donner le citrate substitué A2 sous forme acide. 35 Rendement : 18,4 g (quantitatif) RMN 1H (DMSO-d6, Ppm) : 2,50-2,65 (4H) ; 2,90 (1H) ; 3,02 (1H) ; 4,43 (1H) ; 7,20- 7,30 (5H) ; 8,24 (1H). LC/MS (ESI): 338,0 ; (calculé ([M-H]-): 338,3). 3043557 29 [000261] A une suspension de citrate substitué A2 sous forme acide (18,2 g, 53,6 mmol) dans 250 mL d'eau est ajoutée au goutte à goutte une solution aqueuse de soude 2N (80,5 n'IL). La solution est évaporée. Le résidu est solubilisé dans de l'eau à reflux (40 mL) puis de l'éthanol (400 mL) est ajouté. Le milieu qui prend en masse est 5 agité à chaud pendant 15 min puis est refroidi dans un bain de glace. Le précipité est récupéré par filtration sur fritté puis repris dans de l'eau pour donner un solide. Après 3 traitements eau/éthanol/filtration, un solide blanc de citrate substitué A2 est obtenu. Rendement : 11,74 g (54%) RMN 1-11 (D20, ppm) : 2,10-2,70 (4H) ; 2,90 (1H) ; 3,02 (1H) ; 3,16 (1H) ; 4,48 (1H) ; 10 7,32-7,42 (5H). Exemple A3 : citrate substitué A3 Molécule 7 : produit obtenu par la réaction entre la molécule 4 et le sel chlorhydrate du tert-butyle ester de la L-phénylalanine 15 [000262] A une solution de molécule 4 (1,0 g, 4,03 mmol) dans le THF (40 mL) sont ajoutés successivement du DCC (2,49 g, 12,09 mnnol) et du NHS (1,27 g, 11,08 mmol). Après 4 h d'agitation à température ambiante, le milieu est évaporé sous vide pour donner un solide qui est repris dans du dioxane sec et est refroidi à 0°C. [000263] Le sel chlorhydrate du tert-butyle ester de la L-phénylalanine (2,28 g, 20 8,85 mmol) est solubilisé dans un mélange dichlorométhane/solution aqueuse saturée de NaHCO3 (15/20 mL). Après séparation des phases, la phase aqueuse est extraite par le dichlorométhane. Les phases organiques sont séchées sur Na2SO4 et filtrées. La solution obtenue est ajoutée au goutte à goutte à la solution de molécule 4 activée à 0°C. Le mélange est laissé revenir à température ambiante et est agité pendant 16 h. 25 Trois équivalents supplémentaires d'amine libre préparée comme ci-dessus dans 20 mL de dichlorométhane sont alors ajoutés à 24 h d'intervalle. Le milieu réactionnel est filtré sur fritté et les solvants organiques sont évaporés sous vide. Le milieu est dilué avec de l'acétate d'éthyle (100 nnL)/ lavé avec une solution aqueuse de HCI 10% (50 mL), une solution aqueuse saturée de NaHCO3 (50 mL) et une solution aqueuse 30 saturée en NaCl (50 mL). Après séchage sur Na2SO4, la phase organique est filtrée et concentrée sous vide pour donner une huile. Le résidu est purifié par chromatographie flash (cyclohexane, acétate d'éthyle) pour donner une huile jaune qui est reprise dans de l'acétate d'éthyle (20 mL). La solution est refroidie à -20°C pendant 1 h, filtrée sur membrane PVDF (0,45 pm). Le filtrat est évaporé sous vide pour donner une laque 35 jaune. Rendement : 1,84 g (70%) RMN 11-1 (CDCI3, ppm) : 1,43 (18H) ; 1,47 (9H) ; 2,49 (1H) ; 2,60 (3H) ; 2,95-3,10 (4H) ; 4,68 (2H) ; 5,02 (1H) ; 7,13 (1H) ; 7,19-7,30 (12H). 3043557 30 LC/MS (ESI): 655,5 ; (calculé ([M+H]+): 655,8). Citrate substitué A3 [000264] A une solution de molécule 7 (1,72 g, 2,63 mmol) dans le dichlorométhane (13 mL) à 0°C est ajouté du TFA (5,7 mL). Le milieu est laissé 5 remonter à température ambiante et est agité pendant 5 h. Le milieu est refroidi à - 20°C pendant une nuit puis remis à température ambiante et 2 mL supplémentaires de TFA sont ajoutés. Après 1 h d'agitation et évaporation sous vide à 30°C, le milieu est azéotropé à l'eau (50 mL). Le résidu est solubilisé dans l'acétate d'éthyle (20 mL) et la phase organique est extraite avec une solution aqueuse de soude 1N (20 mL). La 10 phase aqueuse est acidifiée avec une solution aqueuse de HCI 10% et extraite à l'acétate d'éthyle (30 mL). La phase organique est lavée avec de l'eau (25 mL), une solution aqueuse saturée en NaCl (2x25 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous vide pour donner le citrate substitué A3 sous forme acide. Rendement : 0,83 g (64%) 15 RMN 1H (DMSO-da, Ppm) : 2,44-2,56 (4H) ; 2,87 (2H) ; 2,99 (2H) ; 4,41 (2H) ; 7,19- 7,30 (10H) ; 8,19 (2H). LC/MS (ESI): 487,2 ; (calculé ([M+H]+): 487,5). [000265] Après un azéotrope à l'eau (2x50 mL), le citrate substitué A3 sous forme acide (828 mg, 1,7 mmol) est dissout dans 50 mL d'eau et une solution de soude 2N 20 est ajoutée au goutte à goutte jusqu'à pH 7,27. La solution est évaporée à sec et le solide obtenu est trituré dans un mélange éthanol/eau (10/1 mL) à chaud pendant 30 min. Après refroidissement à l'aide d'un bain de glace, la suspension est filtrée sur fritté. Le solide obtenu est azéotropé dans l'eau (150 mL). Après séchage sous vide, le solide est dissout dans 2,5 mL d'eau à chaud puis 25 mL d'éthanol sont ajoutés à 25 chaud. Après refroidissement à -20°C pendant 1 h, le précipité formé est récupéré par filtration sur fritté et azéotropé dans l'eau (50 mL). Après séchage sous cloche (16 h, 55°C, 0,2 mbar), un solide blanc de citrate substitué A3 est obtenu. Rendement : 396 mg (42%) RMN 1H (D20, ppm) : 2,22-2,31 (2H) ; 2,50 (2H) ; 2,94-3,01 (2H) ; 3,20 (2H) ; 4,48 30 (2H) ; 7,26-7,39 (10H). Partie B : Préparation des solutions Bl. Solution d'insuline analogue rapide Novoloo® à 100 UI/mL [000266] Cette solution est une solution commerciale d'insuline aspart de Novo ® 35 Nordisk vendue sous le nom de Novolog. Ce produit est une insuline analogue rapide. 3043557 31 82. Solution d'insuline analogue rapide Humalog® à 100 UI/mL [000267] Cette solution est une solution commerciale d'insuline lispro de Eli Lilly vendue sous le nom de Humalog® U100. Ce produit est une insuline analogue rapide. Dans le présent texte lorsque le terme Humalog est utilisé sans autre précision, il fait 5 référence à l'Humalog® U100 et lorsque l'expression « la formulation commercial d'insuline lispro » est utilisée sans autre précision, elle fait référence à la formulation commerciale d'insuline lispro à 100 UI/ml. B3. Solution d'insuline humaineHumulin® R à 100 UI/mL 10 [000268] Cette solution est une solution commerciale d'insuline humaine de Bi Lilly vendue sous le nom d'Humulin® R. Ce produit est une composition d'insuline humaine. 84. Solution d'insuline analogue rapide Apidra® à 100 UI/mL [000269] Cette solution est une solution commerciale d'insuline glulisine de Sanofi 15 vendue sous le nom d'Apidra®. Ce produit est une insuline analogue rapide. Prenaration d'ne solution de citrate de sodiuu? à .1,188 [000270] La solution de citrate de sodium est obtenue en solubilisant 9,0811 g de citrate de sodium (30,9 mmol) dans 25 mL d'eau dans une fiole jaugée. Le pH est 20 ajusté à 7,4 par ajout de 1 mL d'HCI 1M. La solution est filtrée sur 0,22 pnn. BG. Préparation d'une solution d'insi.di analoque (insuline lispro) à 200 UI/mL. [000271] La formulation commerciale d'insuline lispro (Humalog® U100) a été 25 concentrée en utilisant des tubes de centrifugation AMICON Ultra-15 avec une coupure à 3 kDa. Les tubes amicon ont tout d'abord été rincés avec 12 mL d'eau déionisée. 12 mL de la formulation commerciale ont été centrifugés pendant 35 minutes à 4000 g à 20°C. Le volume du rétentat a été mesuré et la concentration ainsi estimée. Tous les rétentats ont été mis en commun et la concentration globale a été estimée (> 200 30 UI/mL). [000272] La concentration de cette solution d'insuline lispro concentrée a été ajustée à 200 UI/mL par addition de la formulation commerciale d'insuline lispro (HumalogC)). La formulation d'insuline lispro concentrée présente les mêmes concentrations en excipients (m-crésol, glycérine, phosphate) que la formulation 35 commerciale à 100 UI/mL. [000273] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 3043557 32 B7. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 200 UI/mL. [000274] La formulation commerciale d'insuline humaine (Humulin® R) a été concentrée en utilisant des tubes de centrifugation AMICON Ultra-15 avec une coupure à 3 kDa. Les tubes annicon ont tout d'abord été rincés avec 12 mL d'eau déionisée. 12 5 mL de la formulation commerciale ont été centrifugés pendant 35 minutes à 4000 g à 20°C. Le volume du rétentat a été mesuré et la concentration ainsi estimée. Tous les rétentats ont été mis en commun et la concentration globale a été estimée (> 200 UI/mL). [000275] La concentration de cette solution d'insuline humaine concentrée a été 10 ajustée à 200 UI/mL par addition de la formulation commerciale d'insuline humaine (Humulin® R). La formulation d'insuline humaine concentrée présente les mêmes concentrations en excipients (m-crésol, glycérine) que la formulation commerciale à 100 UI/mL. [000276] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une 15 membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B8. Préparation d'une solution d'insuline aspart à 200 UI/mL. [000277] La formulation commerciale d'insuline aspart (NovologC)) a été concentrée en utilisant des tubes de centrifugation AMICON Ultra-15 avec une coupure 20 à 3 kDa. Les tubes amicon ont tout d'abord été rincés avec 12 mL d'eau déionisée. 12 mL de la formulation commerciale ont été centrifugés pendant 35 minutes à 4000 g à 20°C. Le volume du rétentat a été mesuré et la concentration ainsi estimée. Tous les rétentats ont été mis en commun et la concentration globale a été estimée (> 200 UI/mL). 25 [000278] La concentration de cette solution d'insuline aspart concentrée a été ajustée à 200 UI/mL par addition de la formulation commerciale d'insuline aspart (Novolog®). La formulation concentrée d'insuline aspart concentrée présente les mêmes concentrations en excipients (m-crésol, glycérine) que la formulation commerciale à 100 UI/mL. 30 [000279] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 69. Préparation d'une solution d'insuline ululisine à 200 111/rn [000280] La formulation commerciale d'insuline glulisine (Apidra®) a été 35 concentrée en utilisant des tubes de centrifugation AMICON Ultra-15 avec une coupure à 3 kDa. Les tubes amicon ont tout d'abord été rincés avec 12 mL d'eau déionisée. 12 mL de la formulation commerciale ont été centrifugés pendant 35 minutes à 4000 g à 20°C. Le volume du rétentat a été mesuré et la concentration ainsi estimée. Tous les 3043557 33 rétentats ont été mis en commun et la concentration globale a été estimée (> 200 UI/mL). [000281] La concentration de cette solution d'insuline glulisine concentrée a été ajustée à 200 UI/mL par addition de la formulation commerciale d'insuline glulisine 5 (Apidra®). La formulation d'insuline glulisine concentrée présente les mêmes concentrations en excipients (m-crésol, NaCI, TRIS) que la formulation commerciale à 100 UI/nriL. [000282] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 10 1310. Préparation d'une solution d'insuline humaine, d'insuline lispro, d'insuline asoart ou d'insuline olulisine à 300, 400 et 500 UI/mL. [000283] Des formulations concentrées d'insuline humaine, d'insuline lispro, d'insuline aspart ou d'insuline glulisine à 300 UI/mL, 400 UI/mL ou 500 UI/mL (ainsi 15 qu'à toutes concentrations intermédiaires) sont préparées sur la base du protocole de l'exemple B9 relatif à la préparation d'une solution d'insuline glulisine à 200 UI/mL. La formulation commerciale d'insuline est concentrée en utilisant des tubes de centrifugation AMICON Ultra-15 avec une coupure à 3 kDa. Les tubes amicon sont tout d'abord rincés avec 12 mL d'eau déionisée. 12 mL de la formulation commerciale sont 20 centrifugés à 4000g et 20°C. En jouant sur le temps de centrifugation il est possible d'ajuster le volume final et donc la concentration finale en insuline dans la formulation. Le volume du rétentat est mesuré et la concentration ainsi estimée. Tous les rétentats sont mis en commun et la concentration globale est estimée (> 300, 400 ou 500 UI/mL). 25 [000284] La concentration de cette solution d'insuline concentrée est ajustée à la concentration désirée (e.g. 300 UI/mL, 400 UI/mL ou 500 UI/nnL) par addition de la formulation d'insuline (Humulin® R, Novolog®, HumalogC) ou Apidra®). La formulation concentrée d'insuline concentrée présente les mêmes concentrations en excipients que la formulation commerciale à 100 UI/mL. 30 [000285] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B11, Préparation d'une solution d' nsuline lispro à 100 UT/mL en présence du citrate substitué Al et de citrate 35 [000286] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 9,3 nnM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 3043557 34 Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 730 mg Solution commerciale d'Humalog® 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 783 pL [000287] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. 5 [000288] La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 812, Préparation d'une solution d'insuline hurnaii e à 100 1JI/n11._ en presence du citrate substitué Al et de citrate 10 [000289] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 9,3 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 730 mg 15 Solution commerciale d'Humulin® R 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 783 pL [000290] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. [000291] La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 20 1313. Pré aration d'une solution d'insuline as a en présence du citrate substitué Al et de citrate [000292] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline aspart] de 2,0 et une concentration de 9,3 mM de 25 citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 730 mg Solution commerciale de Novolog® 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 783 pL 30 [000293] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. E314. Préparation d'une solution d'insuline plulisine à 100 en présence du citrate substitué Al et de citrate 35 [000294] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline glulisine] de 2,0 et une concentration de 9,3 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : rt à 100 g 3043557 35 - Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 730 mg - Solution commerciale d'Apidra® 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1,188M 783 pL [000295] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. 5 [000296] La solution limpide est filtré sur une membrane 0,22 pnn et stockée à 4°C. B15. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 200 UrjrnL en présence du citrate substitué Al et de citrate. [000297] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique 10 [citrate substitué Al]/[insuline lispro] de 2 et une concentration de 18,6 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 1460 mg - Insuline lispro à 200 UI/mL 100 mL 15 - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 1566 pL [000298] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4.La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. p16. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 200 UT/mL en présence 20 du citrate substitué Al et de citrate. [000299] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline humaine] de 2 et une concentration de 18,6 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 25 - Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 1460 mg - Insuline humaine à 200 UI/mL 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1.188 M 1566 pL [000300] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 30 Bi7 Préparation d'une solution d'insuline aspart 200 tffirnt, en présence du citrate substitué Al et de citrate. [000301] Pour un volume final de 100 nnL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline aspart] de 2,0 et une concentration de 18,6 nnM de 35 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 1460 mg 100 mL Insuline aspart à 200 UI/mL 3043557 36 Solution de citrate de sodium à 1.188 M 1566 pL [000302] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 5 B18. Préparation d'une solution d'insuline giulisine à 200 UI/rnt. en présence du citrate substitué Al et de citrate. [000303] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline glulisine] de 2 et une concentration de 18,6 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et 10 dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 1460 mg Insuline glulisine à 200 UI/mL 100 mL Solution de citrate de sodium à 1.188 M 1566 pL [000304] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une 15 membrane 0,22 pnn et stockée à 4°C. B19. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 300 UI/m1._ en présence du citrate substitué Al et de citrate. [000305] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique 20 [citrate substitué A1]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 27,9 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 2190 mg Insuline lispro à 300 UI/mL 100 mL 25 Citrate de sodium 720 mg [000306] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B20. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 300 IJI/mi en présence 30 du citrate substitué Al et de citrate. [000307] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 27,9 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 35 Composé lyophilisé (citrate substitué A1) Insuline humaine à 300 UI/rinL Citrate de sodium 2190 mg 100 mL 720 mg 3043557 37 [000308] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B21. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 400 ili/ralL en présence du 5 citrate substitué Al et de citrate. [000309] Pour un volume final de 100 nnL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 37,2 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 10 Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 2920 mg Insuline lispro à 400 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 960 mg [000310] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 15 B22_1:t_er _ration d'une solution (J'inauGne humaine à 400 IJI/rnt. en présence du citrate substitué Al et de citrate. [000311] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 37,2 mM de 20 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 2920 mg Insuline humaine à 400 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 960 mg 25 [000312] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B23. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 500 UI/rnL en »résence du citrate substitué Al et de citrate. 30 [000313] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 46,5 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 3650 mg 35 Insuline lispro à 500 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 1200 mg [000314] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 3043557 38 824. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 500 ILII/rrit_ en présence du citrate substitué Al et de citrate. [000315] Pour un volume final de 100 naL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 46,5 mM de 5 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 3650 mg Insuline humaine à 500 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 1200 mg 10 [000316] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B25 Préparation d'une solution d'insuline asear 00 tirfniL rii-sence 15 du citrate substitué Al et de citrate. [000317] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline aspart] de 2,0 et une concentration de 46,5 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 20 Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 3650 mg Insuline aspart à 500 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 1200 mg [000318] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4 La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 25 B26. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 100 Vira. en presenre citrate substitué Al à 14,6 mg/ml. [000319] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline lispro] de 4,0, les différents réactifs sont additionnés 30 dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 1460 mg - Solution commerciale d'Humalog® 100 mL [000320] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. [000321] La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 35 4°C. 3043557 39 827. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 100 UI/mL en présence du citrate substitué Al à 14,6 ma/ml. [000322] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline humaine] de 4,0, les différents réactifs sont 5 additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 1460 mg - Solution commerciale d'Humulin® R 100 mL [000323] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. [000324] La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 10 4°C. 828. préparation d'une solution d'insuline aspar à 100 ta/mi cn prLsence du citrate substitué Al à 14,6 ma/ml. [000325] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique 15 [citrate substitué Al]/[insuline aspart] de 4,0, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiés ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 1460 mg Solution commerciale de Novolog® 100 mL [000326] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. 20 [000327] La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 829. Préparation d'une solution d'insuline glulisine à 100 Minn. en présence du citrate substitué Al à 14,6 ma/ml. 25 [000328] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline glulisine] de 4,0, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 1460 mg - Solution commerciale d'Apidra® 100 mL 30 [000329] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. [000330] La solution limpide est filtré sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B30. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 200 0I/m1._ en présence du citrate substitué Al à 29,2 ma/ml. 35 [000331] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline lispro] de 4, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 2920 mg 3043557 - Insuline lispro à 200 UI/mL 100 mL [000332] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4.La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 5 B31. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 200 Ur/rytt. en présence du citrate substitué Al à 29,2 ma/ml. [000333] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline humaine] de 4, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 10 Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 2920 mg Insuline humaine à 200 UI/mL 100 mL [000334] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 15 B32 Préparation d'une solution d'insuline mspari 200 Ulf/rni_ en résence du citrate substitué Al à 29,2 ma/ml. [000335] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline aspart] de 4,0 les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 20 Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 2920 mg Insuline aspart à 200 UI/mL 100 mL [000336] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 25 B32. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 300 UI/ini en présence du citrate substitué Al à 43,8 ma/ml. [000337] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline lispro] de 4,0 les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 30 Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 4380 mg Insuline lispro à 300 UI/mL 100 mL [000338] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 35 3043557 41 B33. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 300 UI/mL en presence du citrate substitué Al à 43,8 mg/ml. [000339] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline humaine] de 4,0 les différents réactifs sont additionnés 5 en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 4380 mg Insuline humaine à 300 UI/mL 100 mL [000340] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 10 1334 Préparation d'une solution d'insuline liste() à 400 LII/rni en présence du citrate substitué Al à 58,4 mg/ml. [000341] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline lispro] de 4,0 les différents réactifs sont additionnés en 15 quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué Al) 5840 mg Insuline lispro à 400 UI/mL 100 mL [000342] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 20 B35, Prion d'une solution d'insuline humaine à 400 tll/rpL en présence du citrate substitué Al à 58,4 mg/ml. [000343] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline humaine] de 4,0 les différents réactifs sont additionnés 25 en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) Insuline humaine à 400 UI/mL 5840 mg 100 mL [000344] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 30 B36. Pré ration d'une solution d'insuline lis_pro à 500 ILJI/ml en presence citrate substitué Al à 73 md/ml. [000345] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A1]/[insuline lispro] de 4,0 les différents réactifs sont additionnés en 35 quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 7300 mg Insuline lispro à 500 UI/mL 100 mL 3043557 42 [000346] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B37. Préparation d'une solution d'insuli e humaine à 500 en pre,,, ce 5 du citrate substitué Al à 73 mu/ml. [000347] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline humaine] de 4,0 les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 7300 mg 10 Insuline humaine à 500 UI/mL 100 mL [000348] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 15 B38. Préparation d'une solution d insulim, J':1 ' 0 U%/n`_ en présence du citrate substitué Al à 73 ma/ml. [000349] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué Al]/[insuline aspart] de 4,0 les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 20 Composé lyophilisé (citrate substitué A1) 7300 mg Insuline aspart à 500 UI/mL 100 mL [000350] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 25 B39. Préparation d'une solutIon d'insuline lispro à 100 en présence du citrate substitué A2 et de citrate [000351] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 9,3 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous 30 et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A2) 730 mg Solution commerciale d'Humalog® 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 783 pL [000352] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. 35 [000353] La solution limpide est filtré sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 3043557 43 840. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 100 Ui/mL. en présence du citrate substitué A2 et de citrate [000354] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 9,3 mM de 5 citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué A2) 730 mg - Solution commerciale d'Humulin® R 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 783 pL 10 [000355] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. [000356] La solution limpide est filtré sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B41. Préparation d'une solution d'insuline aspait 00 liiirrit' ect pyésenc.é du citrate substitué A2 et de citrate 15 [000357] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline aspart] de 2,0 et une concentration de 9,3 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiés ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué A2) 730 mg 20 - Solution commerciale de Novolog® 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 783 pL [000358] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. [000359] La solution limpide est filtré sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 25 B42, Préparation d'une solution d'insuline lispro à 200 UT raL en orésence du citrate substitué A2 et de citrate. [000360] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 18,6 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous 30 et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué A2) 1460 mg - Insuline lispro à 200 UI/mL 100 nnL Solution de citrate de sodium à 1,188 M 1566 pL [000361] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4.La solution limpide est filtrée sur une 35 membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 3043557 44 1343. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 200 Ui/mL en présence du citrate substitué A2 et de citrate. [000362] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 18,6 mM de 5 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué A2) 1460 mg - Insuline humaine à 200 UI/mL 100 mL [0001] Solution de citrate de sodium à 1.188 M 1566 pL 10 [000363] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B,14, Pr_éparation d'une solution d'insuline aspart à 200 tll/m1.. en présence du citrate substitué A2 et de citrate. 15 [000364] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline aspart] de 2,0 et une concentration de 18,6 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A2) 1460 mg 20 Insuline aspart à 200 UI/mL 100 mL Solution de citrate de sodium à 1.188 M 1566 pL [000365] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 25 1345. Préparation d'une solution d'insuline lisim-o à 300 tilinil. en présence du citrate substitué A2 et de citrate. [000366] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 27,9 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et 30 dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A2) 2190 mg Insuline lispro à 300 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 720 mg [000367] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une 35 membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 3043557 046. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 300 III/rnL en présence du citrate substitué A2 et de citrate. [000368] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 27,9 mM de 5 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A2) Insuline humaine à 300 UI/mL Citrate de sodium 2190 mg 100 mL 720 mg 10 [000369] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B47 Préerwation d'une solution d'insuline lispro à 400 UI/rnIL en présence du citrate substitué A2 et de citrate. 15 [000370] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 37,2 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 20 Composé lyophilisé (citrate substitué A2) Insuline lispro à 400 UI/mL Citrate de sodium 2920 mg 100 nnl_ 960 mg [000371] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pnn et stockée à 4°C. 25 B48 Préparation d'une solution spro à 500 lin_ en présence du citrate substitu44 A2 o-Jioe [000372] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 46,5 mM de 30 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A2) 3650 mg Insuline lispro à 500 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 1200 mg 35 [000373] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pnn et stockée à 4°C. 3043557 46 i349. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 500 UI/mIL en présence du citrate substitué A2 et de citrate. [000374] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 46,5 mM de 5 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A2) 3650 mg Insuline humaine à 500 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 1200 mg 10 [000375] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 850. Préparation d'une solution d'insuline aspart à 500 UI/rril_ en_présence du citrate substitué A2 et de citrate. 15 [000376] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A2]/[insuline aspart] de 2,0 et une concentration de 46,5 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 20 Composé lyophilisé (citrate substitué A2) Insuline aspart à 500 UI/mL Citrate de sodium 3650 mg 100 mL 1200 mg [000377] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pnn et stockée à 4°C. 25 851. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 100 en présence du citrate substitué A3 et de citrate [000378] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué A3]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 9,3 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous 30 et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué A3) 730 mg - Solution commerciale d'Humalog® 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 783 pL [000379] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. 35 [000380] La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 3043557 47 1352. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 100 UI/m1.. en présence du citrate substitué A3 et de citrate [000381] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué A3]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 9,3 mM de 5 citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué A3) 730 mg - Solution commerciale d'Humulin® R 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 783 pL 10 [000]82] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. [000383] La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 1353. Prépai-ation d'une solution d'insuline as 3" rt à 100 UI/nik. en présence 15 du citrate substitué A3 et de citrate [000384] Pour un volume final de 100 mL de composition, avec un ratio massique [citrate substitué A]]/[insuline aspart] de 2,0 et une concentration de 9,3 nnM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 20 - Composé lyophilisé (citrate substitué A3) 730 mg - Solution commerciale de Novolog® 100 nnL - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 783 pL [000385] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. [000386] La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 25 4°C. 1354. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 200 UI/ml_ en présence du citrate substitué A3 et de citrate. [000387] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique 30 [citrate substitué A3]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 18,6 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué A3) 1460 mg - Insuline lispro à 200 UI/mL 100 mL 35 - Solution de citrate de sodium à 1,188 M 1566 pL [000388] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 3043557 48 B55. Préparation d'une solution d'insu humaine à 200 til/rni_ en présence du citrate substitué A3 et de citrate. [000389] Pour un volume final de 100 nnL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A3]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 18,6 mM de 5 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Composé lyophilisé (citrate substitué A3) 1460 mg - Insuline humaine à 200 UI/mL 100 mL - Solution de citrate de sodium à 1.188 M 1566 pL 10 [000390] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B56. Preoaration d'une solution d'insuline asi)art à 200 UI/mL _puésence du citrate substitué A3 et de citrate. 15 [000391] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A3]/[insuline aspart] de 2,0 et une concentration de 18,6 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 20 Composé lyophilisé (citrate substitué A3) Insuline aspart à 200 UI/mL 1460 mg 100 mL Solution de citrate de sodium à 1.188 M 1566 pL [000392] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 25 857. Préparation d'une solution d'insuline lispro à 300 UI/rnl en présence du citrate substitué A3 et de citrate. [000393] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A3]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 27,9 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et 30 dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A3) 2190 mg Insuline lispro à 300 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 720 mg [000394] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une 35 membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 3043557 49 B58. Préparation d'une solution d'insuline lisnro à 400 U".if EnL en présence du citrate substitué A3 et de citrate. [000395] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A3]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 37,2 mM de 5 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A3) 2920 mg 100 mL 960 mg Insuline lispro à 400 UI/mL Citrate de sodium 10 [000396] Le pH final est ajusté à 7,4 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. B59. Pru?),iration d'une ,oltrtion d'insuline Iis -o 500 LITirrit_ en présence du citrate substitué A3 et f',e citrate. 15 [000397] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A3]/[insuline lispro] de 2,0 et une concentration de 46,5 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : 20 Composé lyophilisé (citrate substitué A3) Insuline lispro à 500 UI/mL Citrate de sodium 3650 mg 100 mL 1200 mg [000398] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 25 1360. Préparation d'une solution d'insuline humaine à 500 Iii/mt. en présence du citrate substitué A3 et de citrate. [000399] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A3]/[insuline humaine] de 2,0 et une concentration de 46,5 mM de citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et 30 dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A3) 3650 mg Insuline humaine à 500 UI/mL 100 mL Citrate de sodium 1200 mg [000400] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une 35 membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. 3043557 B61. Préparation d'une solution d'insuline aspart a 5Q WI/mILeo présence du citrate substitué A3 et de citrate. [000401] Pour un volume final de 100 mL de formulation avec un ratio massique [citrate substitué A3]/[insuline aspart] de 2,0 et une concentration de 46,5 mM de 5 citrate, les différents réactifs sont additionnés en quantités précisées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Composé lyophilisé (citrate substitué A3) 3650 mg 100 mL 1200 mg Insuline aspart à 500 UI/mL Citrate de sodium 10 [000402] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. C Pharmacodynamie et pharmacocinétique 15 Cl : Protocole de mesure de la Pharmacodynamie et de la pharmacocinétique des solutions d'insuline [000403] Des porcs domestiques d'environ 50 kg, préalablement cathétérisés au niveau de la jugulaire, sont mis à jeun 2,5 heures avant le début de l'expérience. Dans 20 l'heure précédant l'injection d'insuline, 3 prélèvements sanguins sont réalisés afin de déterminer le niveau basal de glucose et d'insuline. [000404] L'injection d'insuline à la dose de 0,125 UI/kg pour l'insuline lispro est réalisée en sous-cutané au niveau du flanc de l'animal à l'aide d'un stylo à insuline (Novo, Sanofi ou Lilly) équipé d'une aiguille 31 G. 25 [000405] Des prélèvements sanguins sont ensuite réalisés toutes les 4 minutes pendant 20 minutes puis toutes les 10 minutes jusqu'à 3 heures. Après chaque prélèvement, le cathéter est rincé avec une solution diluée d'héparine. [000406] Une goutte de sang est prélevée pour déterminer la glycémie au moyen d'un glucomètre. 30 [000407] Les courbes de pharmacodynamie du glucose exprimées en pourcent du niveau basal sont ensuite tracées. Le temps nécessaire pour atteindre le taux minimum de glucose dans le sang et 50% du taux minimum de glucose dans le sang pour chaque porc sont déterminés et reportés comme Tmin glucose et T50%Rmin glucose, respectivement. Les moyennes des Tmin glucose et des T50%Rmin glucose 35 sont ensuite calculées. [000408] Le sang restant est collecté dans un tube sec et est centrifugé pour isoler le sérum. Les taux d'insuline dans les échantillons de sérum sont mesurés par la méthode immuno-enzymatique ELISA en sandwich pour chaque porc. 3043557 51 [000409] Les courbes de pharmacocinétique exprimées en delta du niveau basal sont ensuite tracées. Le temps nécessaire pour atteindre la concentration maximale et le temps nécessaire pour atteindre 50% de la concentration maximale d'insuline dans le sérum pour chaque porc sont déterminés et reportés comme Tmax insuline et 5 T50%Cmax insuline, respectivement. Les moyennes des Tmax insuline et des T50%Cmax insuline sont ensuite calculées. C2 : Résultats de Pharmacodynamie et de Pharmacocinétique des solutions d'insulines des exemples B2 et B11 [000410] Les résultats de pharmacodynamie obtenus avec les compositions décrites dans les exemples B2 et B11 sont présentés sur la figure 1. L'analyse de ces courbes montre que la composition de l'exemple B11 comprenant le citrate substitué Al et le 15 citrate comme excipient (courbe tracée avec les carrés correspondant à l'exemple B11, Tmin glucose = 44 ± 18 min et T50%Rmin glucose = 15 ± 3 min) permet d'obtenir une action plus rapide que celle de la composition commerciale Humalog® de l'exemple B2 (courbe tracée avec les triangles correspondant à l'exemple B2, Tmin glucose = 61 ± 23 min et T50%Rmin glucose = 26 ± 9 min). 20 [000411] Les résultats de pharmacocinétique obtenus avec les compositions décrites dans les exemples B2 et B11 sont présentés sur la figure 2. L'analyse de ces courbes montre que la composition de l'exemple B11 comprenant le citrate substitué Al et le citrate comme excipient (courbe tracée avec les carrés correspondant à l'exemple B11, Tmax insuline = 20 ± 23 min et T50%Cmax insuline = 6 ± 5 min) 25 induit une absorption plus rapide de l'insuline lispro que la composition commerciale Humalog® de l'exemple B2 (courbe tracée avec les triangles correspondant à l'exemple B2, Tmax insuline = 39 ± 18 min et T50%Cmax insuline = 24 ± 14 min). 10 Al Citrate 9 3 mM 10 Exemple Insuline lispro lis ro Citrate substitué Nombre de porcs 9 Excipient 3043557 52 C3 : Résultats de Pharmacodynamie et de Pharmacocinétique des solutions d'insulines des exemples B2 et B26 5 [000412] Les résultats de pharmacodynamie obtenus avec les compositions décrites dans les exemples B2 et B26 sont présentés sur la figure 3. L'analyse de ces courbes montre que la composition de l'exemple B26 comprenant le citrate substitué Al à 14,6 mg/mi (courbe tracée avec les carrés correspondant à l'exemple B26, Tmin glucose = 37 ± 18 min et T50%Rmin glucose = 14 ± 3 min) permet d'obtenir une action plus 10 rapide que celle de la composition commerciale Humalog® de l'exemple B2 (courbe tracée avec les triangles correspondant à l'exemple B2, Tmin glucose = 61 ± 23 min et T50%Rmin glucose = 26 ± 9 min). [000413] Les résultats de pharmacocinétique obtenus avec les compositions décrites dans les exemples B2 et B26 sont présentés sur la figure 4. L'analyse de ces 15 courbes montre que la composition de l'exemple B26 comprenant le citrate substitué Al à 14,6 mg/m1 (courbe tracée avec les carrés correspondant à l'exemple B26, Tmax insuline = 22 ± 17 min et T50%Cmax insuline = 5 ± 3 min) induit une absorption plus rapide de l'insuline lispro que la composition commerciale Humalog® de l'exemple 82 (courbe tracée avec les triangles correspondant à l'exemple B2, Tmax insuline = 39 ± 20 18 min et T50°/0Cmax insuline = 24 ± 14 min). C4 : Résultats de Pharmacodynamie et de Pharmacocinétique des solutions d'insulines des exemples B2 et B39 Exemple Insuline Citrate substitué Excipient Nombre de porcs B2 lispro 14 B39 lispro 42 Citrate 9,3 mM 12 25 [000414] Les résultats de pharmacodynamie obtenus avec les compositions décrites dans les exemples B2 et B39 sont présentés sur la figure 5. L'analyse de ces courbes montre que la composition de l'exemple B39 comprenant le citrate substitué A2 et le citrate comme excipient (courbe tracée avec les carrés correspondant à l'exemple 30 B39, Tmin glucose = 37 ± 12 min et T50%Rmin glucose = 14 ± 3 min) permet Nombre de porcs Exemple Insuline Excipient Citrate substitué B2 lispro 9 B26 lispro Al 14,6 mg/mi 12 3043557 53 d'obtenir une action plus rapide que celle de la composition commerciale Humalog® de l'exemple 82 (courbe tracée avec les triangles correspondant à l'exemple B2, Tmin glucose = 76 ± 40 min et T50%Rm{n glucose = 29 ± 13 min). [000415] Les résultats de pharmacocinétique obtenus avec les compositions 5 décrites dans les exemples B2 et B39 sont présentés sur la figure 6. L'analyse de ces courbes montre que la composition de l'exemple B39 comprenant le citrate substitué A2 et le citrate comme excipient (courbe tracée avec les carrés correspondant à l'exemple B39, Tmax insuline = 34 ± 26 min et T50%Cmax insuline = 9 ± 6 min) induit une absorption plus rapide de l'insuline lispro que la composition commerciale 10 Humalog® de l'exemple B2 (courbe tracée avec les triangles correspondant à l'exemple 82, Tmax insuline = 43 ± 24 min et T50%Cmax insuline = 20 ± 19 min). 15 D Dichroïsme circulaire D1 Etat d'association de l'insuline lispro évalué par dichroïsme circulaire en présence de différents citrates substitués et de citrate [000416] Le dichroïsme circulaire permet d'étudier la structure secondaire et quaternaire de l'insuline. Les monomères d'insuline s'organisent en dimères et en 20 hexamères. L'hexamère est la forme de l'insuline la plus stable physiquement et chimiquement. Il existe deux formes hexamèriques, la forme R6 et la forme T6. L'insuline Lispro présente un signal fort à 240 nm caractéristique de la forme hexamèrique R6 (forme la plus stable). La perte du signal à 240 nm est reliée à une déstabilisation de l'hexamère et au passage de R6 à T6. 25 Préparation d'une solution de citrate de sodium à 1,010 M [000417] Une solution de citrate de sodium est obtenue en solubilisant 14,90 g de citrate de sodium (50,69 mmol) dans 50 mL d'eau dans une fiole jaugée. Le pH est ajusté à 7,4 par ajout de 0,21 mL d'HCI 1M. 30 Préparation des solutions d'insuline lispro à 100 LII/rul_ en présence de citrate substitué et de citrate [000418] Pour un volume final de 100 mL de formulation, avec une concentration en citrate substitué à 7,3 mg/mL et une concentration de 9,3 mM de citrate, les 35 différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Citrate substitué lyophilisé 730 mg - Solution commerciale Humalog® 100 UI /mL 100 mL 3043557 54 - Solution de citrate de sodium à 1,010 M 921 pL [000419] Pour le citrate, on peut utiliser la forme acide ou la forme basique de sel de sodium, de potassium ou d'un autre sel compatible avec une formulation injectable. [000420] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4 5 [000421] La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. Préparation de la solution d'insuline lispro à 100 Mi en présence de citrate substitué à 14,6 me/m1 10 [000422] Pour un volume final de 100 mL de formulation, avec une concentration en citrate substitué à 7,3 rng/mL, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : - Citrate substitué lyophilisé 1460 mg - Solution commerciale Humalog® 100 UI /mL 100 mL 15 [000423] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une membrane 0,22pm et stockée à 4°C. Préparation de ',olution d'insuline lispro à 1001111/mi en pre5ence d'EDIA [000424] Pour un volume final de 100 mL de formulation, avec une concentration 20 de 300 pM d'EDTA, les différents réactifs sont additionnés dans les quantités spécifiées ci-dessous et dans l'ordre suivant : Solution commerciale Humalog® 100 UI /mL 100 mL - Solution commerciale d'EDTA à 0,5 M 60 pL [000425] Le pH final est ajusté à 7,4 ± 0,4. La solution limpide est filtrée sur une 25 membrane 0,22 pm et stockée à 4°C. [000426] Deux séries de mesures ont été réalisées. Les résultats obtenus sont présentés en Figure 9 et en Figure 10. 30 [000427] La figure 9 décrit en ordonnée le signal CD à 240 nm (deg.cm2.dmo1-1) et en abscisse: - A : insuline lispro 100 UI/ml - B : insuline lispro 100 UI/ml + 7,3 mg de citrate substitué Al - B' : insuline lispro 100 UI/ml + 7,3 mg de citrate substitué Al et citrate à 9,3 35 mM C : insuline lispro 100 UT/mi + 7,3 mg de citrate substitué A2 C' : insuline lispro 100 UT/mi + 7,3 mg de citrate substitué A2 et citrate à 9,3 mM 3043557 - D : insuline lispro 100 UI/ml + 7,3 mg de citrate substitué A3 D' : insuline lispro 100 UI/m1 + 7,3 mg de citrate substitué A3 et citrate à 9,3 mM E : insuline lispro + EDTA à 300 pM 5 [000428] La figure 10 décrit en ordonnée le signal CO à 240 nm (deg.cm2.dmo1-1) et en abscisse: - A : insuline lispro 100 UI/ml - F : insuline lispro 100 UI/ml + 14.6 mg de citrate substitué Al 10 E : Insuline Lispro + EDTA à 300 pM [000429] L'EDTA déstructure complétement la forme R6 de l'insuline Lispro. L'EDTA a donc un effet marqué sur l'hexamère. [000430] Au contraire, les mélanges composés anioniques substitués/citrate n'ont 15 que très peu d'impact sur le signal CD à 240 nm. Ces composés ont donc pas ou peu d'impact sur la structure R6 de l'hexamère, et à fortiori sur la structure hexamèrique de l'insuline lispro. Dans les compositions selon l'invention l'insuline est donc considérée comme étant sous forme héxamérique. 20 REVENDICATIONS1. Composition, sous forme de solution aqueuse, comprenant de l'insuline sous forme hexamèrique, et au moins un citrate substitué de Formule I: R2 Formule I OH dans laquelle : - R1, R2, R3 identiques ou différents, représentent OH ou AA, au moins un des R1, R2, R3 est un radical AA, AA est un radical issu d'un acide aminé aromatique naturel ou synthétique comprenant au moins un groupement phényle ou un groupement indole, substitué ou non substitué, ledit radical AA présentant au moins une fonction acide carboxylique libre, les fonctions acide carboxylique sont sous forme de sel d'un métal alcalin choisi parmi Na+ et K+. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un composé polyanionique différent dudit citrate substitué. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle le radical AA est issu d'un acide aminé aromatique naturel. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle au moins R1 est un radical AA 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle au moins R2 est un radical AA. 3043557 57 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle au moins R1 et R2 sont un radical AA. 5 7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le citrate substitué est choisi parmi les composés de formule I dans laquelle au moins R2 et R3 sont un radical AA. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, 10 caractérisée en ce que le citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R1 est un radical AA, R2 et R3 sont OH et le radical AA est issu de la phénylalanine. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R2 est 15 un radical AA, R1 et R3 sont OH et le radical AA est issu de la phénylalanine. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le citrate substitué répond à la Formule I dans laquelle R1 est OH, R2 et R3 sont un radical AA, et le radical AA est issu de la phénylalanine. 20 11. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les ratios molaires citrate substitué/insuline sont compris entre 3 et 400. 25 12. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les ratios massiques citrate substitué/insuline sont compris entre 0,5 et 30. 13. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, 30 caractérisée en ce que la concentration en citrate substitué est comprise entre 1,8 et 100 mg/mL. 14. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que l'insuline est une insuline analogue choisie dans le groupe constitué par l'insuline lispro (Humalog®), l'insuline aspart (Novolog®, Novorapie i Novorapid®) et l'insuline glulisine (Apidra®). 3043557 58 15. Composition phamaceutique comprenant une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la concentration en insuline est comprise entre 240 et 3000 pM (40 à 500 UI/mL). 5 16. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé polyanionique est choisi dans le groupe constitué des polyacides carboxyliques et leurs sels de Na+, K+, Ca2+ ou Mg2+. 17. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, 10 caractérisée en ce que la concentration en composé polyanionique est comprise entre 2 et 150 mM. 18. Formulation pharmaceutique comprenant une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes. 15