Brevet FR3048614A1 — publié le 20170915

CELLULES SOUCHES STROMALES DERIVEES DU TISSU ADIPEUX POUR UNE UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DES FISTULES PERI-ANALES COMPLEXES REFRACTAIRES DANS LA MALADIE DE CROHN Domaine de l'invention Cette invention concerne des cellules souches dérivées du tissu adipeux pour une utilisation dans le traitement des fistules péri-anales complexes réfractaires chez des patients souffrant de la maladie de Crohn. Contexte de l'invention De façon générale, une fistule est une communication ou un passage anormal entre des organes ou des vaisseaux qui normalement ne communiquent pas. Les fistules peuvent se développer dans diverses parties du corps. Par exemple, les types de fistules, nommées selon les zones du corps dans lesquelles elles apparaissent, comprennent la fistule ano-rectale ou la fistule anale ou la fistule stercorale (entre le rectum ou une autre zone ano-rectale et la surface de la peau), la fistule artério-veineuse ou fistule A-V (entre une artère et une veine), la fistule biliaire (entre les canaux biliaires et la surface de la peau, fréquemment provoquée par une chirurgie de la vésicule biliaire), la fistule cervicale (orifice anormal dans le col de l'utérus), la fistule cranio-sinusale (entre l'espace intracrânien et un sinus paranasal), la fistule entéro-entérale (entre deux parties de l'intestin), la fistule entéro-cutanée (entre l'intestin et la surface de la peau, à savoir depuis le duodénum ou le jéjunum ou l'iléon), la fistule entéro-vaginale (entre l'intestin et le vagin), la fistule gastrique (entre l'estomac et la surface de la peau), la fistule métro-péritonéale (entre l'utérus et la cavité péritonéale), la fistule périlymphatique (une déchirure entre les membranes situées entre l'oreille moyenne et l'oreille interne), la fistule artério-veineuse pulmonaire (entre une artère et une veine des poumons, provoquant une dérivation du sang), la fistule recto-vaginale (entre le rectum et le vagin), la fistule ombilicale (entre l'ombilic et l'intestin), la fistule trachéo-oesophagienne (entre les voies respiratoires et la voie alimentaire) et la fistule vésico-vaginale (entre la vessie et le vagin). Les causes des fistules comprennent un traumatisme, des complications dues à un traitement médical et une maladie. Le traitement des fistules varie selon la cause et l'étendue de la fistule, mais il 3048614 2 implique généralement une intervention chirurgicale. Diverses procédures chirurgicales sont couramment utilisées, le plus souvent une fistulotomie, le placement d'un séton (une mèche qui est passée à travers l'orifice de la fistule pour le maintenir ouvert en vue d'un drainage), ou une procédure de volet endo-rectal (où du tissu sain est tiré sur le côté 5 interne de la fistule pour empêcher les matières fécales ou autres de réinfecter le canal). La chirurgie pour des fistules ano-rectales n'est pas sans effets secondaires, y compris une récurrence, une réinfection, et une incontinence. Les maladies inflammatoires de l'intestin, telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont les causes principales des fistules ano-rectales, entéro- 10 entérales, et entéro-cutanées. L'incidence rapportée d'une fistule dans la maladie de Crohn se situe dans la plage de 17 % à 50 %. La prise en charge des fistules chez les patients souffrant de la maladie de Crohn continue à présenter un problème ardu puisqu'un grand nombre de ces fistules ne répondent pas aux traitements disponibles. De telles fistules et leur récurrence représentent une complication très pénible qui réduit 15 significativement la qualité de vie des patients touchés. Les récentes améliorations dans le traitement médical (par exemple, le traitement par Infliximab®) et la prise en charge chirurgicale experte ont diminué le besoin d'une chirurgie compliquée. Toutefois, de nombreux patients ne sont pas guéris. Le défaut de cicatrisation des fistules est probablement dû à la qualité sous-optimale des tissus qui ont été touchés par la maladie 20 de Crohn. En effet, les fistules de Crohn fournissent un système modèle pour la cicatrisation dans certaines des pires conditions. Les fistules péri-anales sont une complication courante de la maladie de Crohn,A1 qui sont estimées comme touchant jusqu'à 28 % des patients au cours des deux décennies suivant le diagnostic, A2' A3 particulièrement ceux avec une maladie du côlon et une 25 implication rectale. A4 Elles altèrent sévèrement la qualité de vie des patients et provoquent une morbidité considérable. A5, A6 Approximativement 70 à 80 % des fistules péri-anales sont complexes, A3 et celles-ci sont difficiles à traiter puisqu'elles sont particulièrement réfractaires aux stratégies thérapeutiques traditionnelles (antibiotiques, immunosuppresseurs) et aux traitements anti-facteur de nécrose tumorale (anti-TNF). A8- 30 Al2 En outre, 60 à 70 % des patients rechutent à l'arrêt du traitement, A13-A17 et seulement une minorité des patients obtiennent une rémission à long terme. A18 L'échec du ou l'intolérabilité au traitement médical peuvent entraîner finalement des approches chirurgicales invalidantes, telles qu'une stomie de diversion ou une 3048614 3 proctectomie. A19 Par conséquent, il demeure un énorme besoin insatisfait de variantes de traitements médicaux. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules stromales non hématopoïétiques, qui sont capables de se différencier en tissus mésenchymateux tels que 5 les os, le cartilage, les muscles, les ligaments, les tendons, et le tissu adipeux. Les CSM peuvent être facilement isolées à partir de tissus tels que la moelle osseuse ou le tissu adipeux et être rapidement expansées en culture. Le document WO-A-2006/136244 décrit le traitement des fistules en utilisant des compositions contenant des cellules stromales dérivées du tissu adipeux. Les cellules stromales mésenchymateuses dérivées 10 du tissu adipeux représentent une nouvelle approche thérapeutique prometteuse, qui peut être utile pour le traitement des fistules péri-anales complexes grâce à leur potentiel anti-inflammatoire et régénérateur tissulaire. A20-A22 La preuve initiale du concept a été obtenue auparavant dans une étude clinique ouverte en phase 1/2a de cellules souches dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées (CSAe, Cx601) chez 24 patients 15 souffrant de la maladie de Crohn avec des fistules péri-anales complexes avec 56,3 % des patients présentant une fermeture complète de l'orifice externe et l'absence de collections mesurées par IRM de la fistule traitée 24 semaines après le traitement. A23 Les fistules péri-anales complexes dans la maladie de Crohn sont particulièrement difficiles à traiter et il demeure un besoin d'établir des traitements cliniquement éprouvés 20 pour le traitement des fistules péri-anales dans la maladie de Crohn. Résumé de l'invention L'invention concerne la fourniture de traitements cliniquement éprouvés pour le traitement des fistules péri-anales complexes réfractaires dans la maladie de Crohn, basés 25 sur les résultats d'une étude multicentrique, en double aveugle, contre un placebo qui a évalué l'efficacité et l'innocuité des CSAe chez 212 adultes souffrant de la maladie de Crohn et présentant des fistules péri-anales complexes s'écoulant, réfractaires au traitement. Les exemples ici décrivent la première étude contre un placebo en phase 3 évaluant l'efficacité et l'innocuité de cellules souches dérivées du tissu adipeux 30 allogéniques, expansées seules ou ajoutées à un traitement médical en cours pour les fistules péri-anales complexes réfractaires au traitement chez des patients souffrant de la maladie de Crohn. Les résultats rapportés ici sont les critères principaux et secondaires 3048614 4 sur 24 semaines. Les données du nouvel essai clinique ont révélé de façon surprenante que les cellules souches dérivées du tissu adipeux traitent les fistules péri-anales complexes à voies multiples de façon spécialement efficace. Les données montrent également que le 5 plus grand effet numérique des cellules a été observé chez des patients qui ne recevaient ni un traitement anti-TNF ni un traitement immunosuppresseur ni les deux traitements au moment de la préparation de la fistule. En outre, la rémission clinique a été obtenue de façon surprenante peu après le traitement, avec un temps médian jusqu'à la rémission clinique dans le groupe du traitement de 6,7 semaines. De façon similaire, le temps 10 médian jusqu'à une réponse a été de 6,3 semaines. L'amélioration de l'indice d'activité de la maladie péri-anale (IAIVIP) a été significativement supérieure aux semaines 6, 12 et 18. Globalement, les données révèlent que les CSAe allogéniques représentent un traitement étonnamment efficace pour les fistules péri-anales complexes chez les patients souffrant de la maladie de Crohn, grâce auxquelles une seule administration peut fournir 15 un effet thérapeutique rapide et prolongé même dans les fistules très complexes les plus difficiles à traiter, où un traitement médicamenteux antérieur avait échoué. Un premier aspect de l'invention fournit des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation dans une méthode de traitement d'une fistule péri-anale complexe réfractaire chez un patient souffrant de la 20 maladie de Crohn. Un deuxième aspect de l'invention fournit l'utilisation de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées dans la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une fistule péri-anale complexe réfractaire chez un patient souffrant de la maladie de Crohn. 25 Un troisième aspect de l'invention fournit une méthode de traitement d'une fistule péri-anale complexe réfractaire chez un patient souffrant de la maladie de Crohn, chez un patient ayant besoin d'un tel traitement, comprenant l'étape d'administration de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques expansées, à la fistule. Sont également divulguées ici, entre autres choses, des compositions contenant 30 des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux. Les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux décrites ici ont un phénotype distinct et présentent une homogénéité bénéfique du phénotype, les rendant ainsi plus appropriées 3048614 5 pour une utilisation dans le traitement des fistules. Les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être formulées avec des solutions ou d'autres substances pour servir d'agents pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux, par exemple, comme des sutures ou des adhésifs. En outre, il est fourni des 5 nouvelles méthodes de traitement des fistules péri-anales complexes en utilisant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux, ainsi que des kits pour la mise en pratique de ceux-ci. Brève description des figures 10 La figure 1 représente la structure de l'étude clinique en Phase III. Cx601, cellules souches dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées ; FCE, formulaire de consentement éclairé ; IRM, imagerie par résonance magnétique. La figure 2 résume la répartition des patients. Cx601, cellules souches dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées ; ITT, intention de traiter ; mITT, intention de 15 traiter modifiée ; *Thrombose veineuse profonde, poussée de la maladie de Crohn, occlusion intestinale, maladie de Crohn, abcès anal (n = 3) ; t Fistule, proctalgie, abcès anal (n = 4) ; 1:Absence de cicatrisation ou aggravation des symptômes ; nouveau traitement par antibiotiques ; nouvelle chirurgie dans la région péri-anale ; §Aggravation de la maladie de Crohn nécessitant un changement de traitement. 20 La figure 3 représente le critère principal : rémission clinique et radiologique combinée* à la semaine 24 dans la population ITT (Panel A). Rémission clinique et radiologique combinée* à la semaine 24 dans la population mITT (Panel B). Rémission combinée* dès la semaine 24 selon les facteurs de stratification de la randomisation, c'est-à-dire, les traitements de la maladie de Crohn reçus au moment de la randomisation, 25 dans la population mITT (Panel C). Cx601, cellules souches dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées ; IS, immunosuppresseur ; ITT, intention de traiter ; mITT, intention de traiter modifiée ; TNF, facteur de nécrose tumorale. *Estimation clinique de la fermeture de tous les orifices externes traités qui coulaient au départ et l'absence de collections > 2 cm des fistules péri-anales traitées dans > 2 des 3 dimensions sur 30 l'estimation centrale par IRM en aveugle dès la semaine 24. L'estimation clinique de la fermeture a été définie comme l'absence d'écoulement en dépit d'une légère pression des doigts. 3048614 6 Description détaillée de l'invention 1. Définitions : Tels qu'utilisés ici, les termes et les phrases qui suivent auront les significations 5 présentées ci-dessous. Sauf définition contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle comprise de façon courante d'une personne de compétence moyenne dans le domaine auquel cette invention appartient. Les articles « un » et « une » se rapporte à un ou plus d'un (c'est-à-dire, à au moins 10 un) de l'objet grammatical de l'article. A titre d'exemple, « un élément » signifie un élément ou plus d'un élément. Par « tissu adipeux », il est signifié tout tissu graisseux. Le tissu adipeux peut être du tissu adipeux brun ou blanc, dérivé d'un site tissulaire sous-cutané, épiploïque/ viscéral, mammaire, gonadique, ou d'un autre site de tissu adipeux. Généralement, le tissu 15 adipeux est du tissu adipeux blanc sous-cutané. Ces cellules peuvent comprendre une culture de cellules primaires ou une lignée de cellules immortalisées. Le tissu adipeux peut provenir de tout organisme comportant du tissu graisseux. Généralement, le tissu adipeux provient d'un mammifère, le plus généralement, le tissu adipeux est humain. Une source pratique de tissu adipeux provient de la chirurgie par liposuccion, toutefois, la 20 source du tissu adipeux ou le procédé d'isolement du tissu adipeux n'est pas essentiel à l'invention. « Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux » ou « CSA » se rapporte à des cellules souches mésenchymateuses qui proviennent de la fraction stromale du tissu adipeux, généralement du tissu adipeux humain (hCSA). 25 Le terme « adhésif » se rapporte à toute substance qui unit ou lie des surfaces ensemble ; par exemple, une colle. Le terme « produit médicinal biologique » sera pris pour signifier une substance pharmaceutique à base de protéine ou d'acide nucléique pour un usage thérapeutique, qui est généralement produite par un moyen autre que l'extraction directe à partir d'une source 30 biologique native (non modifiée). Le terme « composition cellulaire » se rapporte à une préparation de cellules, laquelle préparation peut comprendre, en plus des cellules, des composants non 3048614 7 cellulaires tels que le milieu de culture des cellules, par exemple, des protéines, des acides aminés, des acides nucléiques, des nucléotides, des coenzymes, des antioxydants, des métaux et analogues. En outre, la composition cellulaire peut avoir des composants qui n'affectent pas la croissance ou la viabilité du composant cellulaire, mais qui sont utilisés 5 pour fournir les cellules dans un format particulier, par exemple, sous la forme d'une matrice polymère pour l'encapsulation ou d'une préparation pharmaceutique. Une « fistule péri-anale complexe » est une fistule péri-anale présentant une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : (i) origine inter-sphinctérienne haute, trans-sphinctérienne, extra- 10 sphinctérienne ou supra-sphinctérienne ; (ii) > 2 orifices externes ; ou (iii) collections associées. La fistule péri-anale complexe peut présenter éventuellement un maximum de 2 orifices internes et de 3 orifices externes. En outre, la fistule péri-anale complexe peut 15 avoir coulé pendant au moins 6 semaines avant le traitement selon l'invention. Le terme « culture » se rapporte à toute croissance de cellules, d'organismes, d'entités multicellulaires, ou de tissu dans un milieu. Le terme « culture » se rapporte à tout procédé d'obtention d'une telle croissance, et peut comprendre des étapes multiples. Le terme « autre culture » se rapporte à la culture d'une cellule, d'un organisme, d'une 20 entité multicellulaire, ou d'un tissu jusqu'à un certain stade de la croissance, puis à l'utilisation d'un autre procédé de culture pour amener ladite cellule, ledit organisme, ladite entité multicellulaire, ou ledit tissu jusqu'à un autre stade de la croissance. Une « culture cellulaire » se rapporte à une croissance des cellules in vitro. Dans une telle culture, les cellules prolifèrent, mais elles ne s'organisent pas en un tissu en soi. Une 25 « culture tissulaire » se rapporte au maintien ou à la croissance de tissu, par exemple, des explants d'un organe primordial ou d'un organe adulte in vitro de façon à préserver son architecture et sa fonction. Une « culture monocouche » se rapporte à une culture dans laquelle les cellules se multiplient dans un milieu approprié tout en étant principalement fixées les unes aux autres et à un substrat. En outre, une « culture en suspension » se 30 rapporte à une culture dans laquelle les cellules se multiplient tout en étant en suspension dans un milieu approprié. De la même façon, une « culture en flux continu » se rapporte à la culture de cellules ou d'explants dans un flux continu de milieu frais pour maintenir 3048614 8 la croissance des cellules, par exemple, la viabilité. Le terme « milieu conditionné » se rapporte au surnageant, par exemple, exempt des cellules/du tissu en culture, faisant que, après une période de temps en contact avec les cellules cultivées, le milieu a été modifié pour inclure certains facteurs paracrines et/ou autocrines produits par les cellules et 5 sécrétés dans la culture. Une « culture confluente » est une culture cellulaire dans laquelle toutes les cellules sont en contact et ainsi la surface entière du récipient de la culture est recouverte, et cela implique que les cellules ont également atteint leur densité maximale, bien que la confluence ne signifie pas nécessairement que la division cessera ou que la population n'augmentera pas en taille. 10 Le terme « milieu de culture » ou « milieu » est reconnu dans l'art, et se rapporte généralement à toute substance ou préparation utilisée pour la culture de cellules vivantes. Le terme « milieu », tel qu'utilisé en référence à une culture cellulaire, comprend les composants de l'environnement entourant les cellules. Les milieux peuvent être solides, liquides, gazeux ou un mélange de phases et de matériaux. Les milieux comprennent des 15 milieux de croissance liquides ainsi que des milieux liquides qui n'entretiennent pas la croissance cellulaire. Les milieux comprennent également des milieux gélatineux tels que la gélose, l'agarose, la gélatine et des matrices collagéniques. Les exemples de milieux gazeux comprennent la phase gazeuse à laquelle les cellules en développement sur une boîte de Petri ou un autre support solide ou semi-solide sont exposées. Le terme 20 « milieu » se rapporte à tout matériau qui est prévu pour une utilisation dans une culture cellulaire, même s'il n'a pas été encore mis en contact avec des cellules. En d'autres termes, un liquide riche en nutriments préparé pour une culture bactérienne est un milieu. De façon similaire, un milieu en poudre qui lorsqu'il est mélangé avec de l'eau ou un autre liquide devient approprié pour une culture cellulaire, peut être appelé « milieu en 25 poudre ». « Milieu défini » se rapporte à des milieux qui sont faits de composants chimiquement définis (habituellement purifiés). Les « milieux définis » ne contiennent pas des extraits biologiques peu caractérisés tels qu'un extrait de levure et un bouillon de boeuf « Milieu riche » comprend des milieux qui sont conçus pour supporter la croissance de la plupart ou de la totalité des formes viables d'une espèce particulière. Les milieux 30 riches contiennent souvent des extraits biologiques complexes. Un « milieu approprié pour la croissance d'une culture de densité élevée » est un milieu qui permet à une culture cellulaire d'atteindre une D0600 de 3 ou supérieure lorsque d'autres conditions (telles que la température et le taux de transfert d'oxygène) permettent une telle croissance. Le terme 3048614 9 « milieu basal » se rapporte à un milieu qui favorise la croissance de nombreux types de micro-organismes qui ne nécessitent pas des compléments nutritifs spéciaux quelconques. La plupart des milieux basaux sont généralement composés de quatre groupes chimiques basiques : les acides aminés, les glucides, les sels inorganiques, et les 5 vitamines. Un milieu basal sert généralement de base pour un milieu plus complexe, auquel des compléments tels que du sérum, des tampons, des facteurs de croissance, des lipides, et analogues sont ajoutés. Les exemples de milieux basaux comprennent, mais n'y sont pas limités, le milieu basal d'Eagle, le milieu essentiel minimal, le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco, le milieu 199, les mélanges de nutriments, F-10 de Ham et F-12 10 de Ham, 5A de Mc Coy, MEM de Dulbecco/F-12, RPMI 1640, et le milieu de Dulbecco modifié par Iscove (IMDM). Les termes « comprendre » et « comprenant » sont utilisés dans la signification inclusive, à sens ouvert, que des éléments supplémentaires peuvent être inclus. Le terme « Cx601 » se rapporte à une suspension cellulaire dans une solution 15 saline tamponnée aseptique contenant des cellules souches dérivées du tissu adipeux expansées humaines (CSAe) d'origine allogénique. Ces cellules sont fournies dans des flacons jetables sans aucun agent conservateur. Les cellules sont données à une dose de 120 millions de cellules (5 millions de cellules / ml) pour une injection intralésionnelle. Le terme « différenciation » se rapporte à la formation de cellules exprimant des 20 marqueurs connus pour être associés à des cellules qui sont plus spécialisées et plus proches de devenir des cellules en différentiation terminale incapables d'une autre division ou différentiation. Par exemple, dans un contexte pancréatique, une différenciation peut être observée dans la production des grappes de cellules en forme d'îlots contenant une proportion accrue de cellules bêta-épithéliales qui produisent des 25 quantités accrues d'insuline. Les termes « autre différenciation » ou « différenciation supérieure » se rapportent à des cellules qui sont plus spécialisées et plus proches de devenir des cellules en différentiation terminale incapables d'une autre division ou différentiation par rapport aux cellules à partir desquelles elles ont été cultivées. Le terme « différenciation finale » se rapporte à des cellules qui sont devenues des cellules en 30 différentiation terminale incapables d'une autre division ou différentiation. Le terme « expansées » tel qu'utilisé ici en se rapportant à des cellules devra être pris dans sa signification habituelle dans l'art, à savoir des cellules qui ont proliféré 3048614 10 in vitro. Les procédés de préparation des CSAe sont connus dans l'art, par exemple, tels que décrits dans le document WO 2007/039150. Une CSA peut être expansée pour fournir une population de cellules qui conservent au moins une fonction biologique de la CSA, généralement la capacité d'adhérer à une surface en plastique, dans des conditions de 5 culture classiques. La population expansée des cellules peut conserver la capacité de se différencier en un ou plusieurs types cellulaires. Le terme « fistule » se rapporte à un passage ou une communication anormale quelconque, habituellement entre deux organes internes ou menant depuis un organe interne à la surface du corps. Les exemples de fistules comprennent, mais n'y sont pas 10 limités, la fistule ano-rectale ou la fistule anale ou la fistule stercorale, la fistule artério- veineuse ou fistule A-V, la fistule biliaire, la fistule cervicale, la fistule cranio-sinusale, la fistule entéro-entérale, la fistule entéro-cutanée, la fistule entéro-vaginale, la fistule gastrique, la fistule métro-péritonéale, la fistule périlymphatique, la fistule artérioveineuse pulmonaire, la fistule recto-vaginale, la fistule ombilicale, la fistule trachéo- 15 oesophagienne et la fistule vésico-vaginale. L'invention concerne la fistule péri-anale. Le terme « y compris » est utilisé ici pour signifier « y compris mais n'y étant pas limité ». « Y compris » et « y compris mais n'y étant pas limité » sont utilisés de façon interchangeable. « Marqueur » se rapporte à une molécule biologique dont la présence, la 20 concentration, l'activité, ou l'état de phosphorylation peut être détecté et utilisé pour identifier le phénotype d'une cellule. Les « cellules stromales mésenchymateuses » (également appelées ici « CSM ») sont des cellules stromales multipotentes (c'est-à-dire que ce sont des cellules qui sont capables de donner naissance à de multiples types différents de cellules), généralement 25 dérivées du tissu conjonctif, et qui sont des cellules non hématopoïétiques. Les CSM ont la capacité de se différencier en ou vers des cellules somatiques telles que des cellules mésodermiques (par exemple, le tissu adipeux, les chondrocytes, les ostéoblastes) et éventuellement en ou vers des types ou des lignées cellulaires endodermiques et/ou ectodermiques. Généralement, les cellules ont la capacité de se différencier en ou vers au 30 moins deux ou la totalité des types cellulaires choisis dans le groupe constitué de lignées adipocytaires, chondroblastiques et ostéoblastiques. Les CSA sont un type de CSM qui sont obtenues à partir de la fraction stromale du tissu adipeux. Les CSM et les CSA 3048614 11 adhèrent au plastique dans des conditions de culture classiques. Un « patch » est un pansement ou un revêtement appliqué pour couvrir ou protéger une plaie ou une autre lésion. Un « patient », « sujet » ou « hôte » à traiter par le procédé sujet peut signifier soit 5 un être humain soit un animal non humain. La phrase « pharmaceutiquement acceptable » est employée ici pour se rapporter à ces composés, matériaux, compositions et/ou formes galéniques qui sont, au sein de l'étendue d'un bon jugement médical, appropriés pour une utilisation en contact avec les tissus des êtres humains et des animaux sans excès de toxicité, d'irritation, de réponse 10 allergique, ou un autre problème ou une complication, en proportion d'un rapport bénéfice/risque raisonnable. La phrase « support pharmaceutiquement acceptable » tel qu'utilisé ici signifie un matériau, une composition ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable, comme un agent de remplissage liquide ou solide, un diluant, un excipient, ou un solvant encapsulant 15 un matériau, impliqué dans le support ou le transport du composé sujet depuis un organe, ou une partie du corps, vers un autre organe, ou une autre partie du corps. Chaque support doit être « acceptable » dans le sens d'être compatible avec les autres composants de la formulation et non délétère pour le patient. Le terme « phénotype » se rapporte aux caractéristiques observables d'une cellule, comme la taille, la morphologie, l'expression 20 des protéines, etc. Le terme « cellule progénitrice » se rapporte à une cellule qui a la capacité de créer une progéniture qui est plus différenciée qu'elle-même. Par exemple, le terme peut se rapporter à une cellule indifférenciée ou à une cellule différenciée dans une étendue en deçà de la différenciation finale qui est capable de proliférer et de donner naissance à plus 25 de cellules progénitrices ayant la capacité de générer un grand nombre de cellules mères qui peuvent à leur tour donner naissance à des cellules filles différenciées ou différenciables. Dans un mode de réalisation préféré, le terme cellule progénitrice se rapporte à une cellule mère généralisée dont les descendants (progéniture) se spécialisent, souvent dans des directions différentes, par différenciation, par exemple, en acquérant des 30 caractéristiques complètement individuelles, comme cela se produit dans la diversification progressive des cellules et des tissus embryonnaires. La différenciation cellulaire est un processus complexe survenant généralement au travers de nombreuses 3048614 12 divisions cellulaires. Une cellule différenciée peut dériver d'une cellule multipotente qui elle-même est dérivée d'une cellule multipotente, et ainsi de suite. Alors que chacune de ces cellules multipotentes peut être considérée comme une cellule souche, la plage des types cellulaires auxquels chacune peut donner naissance peut varier considérablement. 5 Certaines cellules différenciées ont également la capacité de donner naissance à des cellules d'un potentiel développemental supérieur. Une telle capacité peut être naturelle ou elle peut être induite artificiellement lors d'un traitement avec divers facteurs. Par cette définition, les cellules souches peuvent être également des cellules progénitrices, ainsi que les précurseurs plus immédiats des cellules en différenciation terminale. 10 « Prolifération » se rapporte à une augmentation du nombre des cellules. « Proliférant » et « prolifération » se rapportent à des cellules subissant une mitose. « Réfractaire » sera pris pour signifier ne présentant aucun bénéfice clinique significatif lors d'une utilisation dans le traitement d'une maladie, par exemple, aucune amélioration significative des symptômes. 15 Le terme « rémission » se rapporte au traitement réussi de la fistule. « Rémission clinique » est la fermeture de tous les orifices externes traités qui coulaient au départ, en dépit d'une pression légère des doigts. Le temps jusqu'à la rémission clinique est défini comme le temps depuis le début du traitement jusqu'à la première estimation de patient présentant une rémission clinique. « Rémission combinée » est la rémission clinique plus 20 la confirmation par IRM (imagerie par résonance magnétique) de l'absence de collections supérieures à 2 cm dans les fistules péri-anales traitées, dans au moins 2 des 3 dimensions. Ceci est généralement confirmé par une lecture centrale d'IRM en aveugle. L'absence de collections ou d'abcès est importante, car s'ils ne sont pas guéris, cela mènera à une nouvelle fistule. 25 Le terme « réponse » se rapporte à la fermeture d'au moins 50 % de tous les orifices externes traités qui coulaient au départ, en dépit d'une légère pression des doigts (c'est-à-dire, estimés cliniquement). Par conséquent, la réponse est atteinte lorsque 1 OE est fermé si le nombre des OE au départ est de 1 ou 2, ou est atteinte lorsque 2 OE sont fermés si 3 OE étaient présents au départ. Le temps jusqu'à la réponse est défini comme 30 le temps depuis le début du traitement jusqu'à la première estimation de réponse. Le terme « rechute » se rapporte, chez des patients présentant une rémission clinique à l'estimation précédente, à une réouverture de l'un quelconque des orifices 3048614 13 externes traités avec un écoulement actif estimé cliniquement, ou le développement d'une collection péri-anale supérieure à 2 cm de la ou des fistules péri-anales traitées confirmée par IRM. Tel qu'utilisé ici, le terme « solution » comprend un support ou un diluant 5 pharmaceutiquement acceptable dans lequel les cellules de l'invention demeurent viables. Le terme « sensiblement pures », par rapport aux populations de cellules souches dérivées du tissu adipeux, se rapporte à une population de cellules souches dérivées du tissu adipeux qui est pure à au moins environ 75 %, généralement au moins environ 85 %, plus généralement au moins environ 90 %, et le plus généralement au moins environ 10 95 %, par rapport aux cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux constituant une population cellulaire totale. Enoncé différemment, le terme « sensiblement pure » se rapporte à une population de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux de la présente invention qui contient moins d'environ 20 %, plus généralement moins d'environ 10 %, le plus généralement moins d'environ 5 %, de cellules engagées dans des lignées 15 dans la population originale non amplifiée et isolée avant la culture et l'amplification subséquentes. « Support » tel qu'utilisé ici se rapporte à tout dispositif ou matériau qui peut servir de fondation ou de matrice pour la croissance des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux. 20 Le terme « suture » se rapporte à un fil ou une fibre ou à un autre matériau de fermeture qui peut être utilisé pour recoudre une plaie. Une fistule à « voie » unique ne présente qu'un orifice interne et un orifice externe. Une fistule à « voies multiples » présente plus de 1 orifice externe et/ou plus de 1 orifice interne. Par conséquent, une fistule à voies multiples présente différentes ramifications. 25 Chaque orifice externe représente généralement une voie. Le terme « traitement » tel qu'utilisé ici se rapporte à la réparation d'une fistule ou d'une plaie, ainsi qu'à l'empêchement que la fistule ou la plaie s'aggrave ou réapparaisse. « Agent thérapeutique » ou « thérapeutique » se rapporte à un agent capable d'avoir un effet biologique souhaité sur un hôte. Les agents chimiothérapeutiques et 30 génotoxiques sont des exemples d'agents thérapeutiques qui sont généralement connus comme étant d'origine chimique, par opposition à biologique, ou qui provoquent un effet thérapeutique par un mécanisme d'action particulier, respectivement. Les exemples 3048614 14 d'agents thérapeutiques d'origine biologique comprennent les facteurs de croissance, les hormones, et les cytokines. Divers agents thérapeutiques sont connus dans l'art et peuvent être identifiés par leurs effets. Certains agents thérapeutiques sont capables de réguler la prolifération et la différenciation des cellules. Les exemples comprennent des nucléotides 5 chimiothérapeutiques, des médicaments, des hormones, des protéines non spécifiques (non anticorps), des oligonucléotides (par exemple, des oligonucléotides antisens qui se lient à une séquence d'acide nucléique (par exemple, une séquence d'ARNm)), des peptides, et des peptidomimétiques. 2. Compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux 10 L'invention implique des compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux avec certaines caractéristiques, telles qu'un phénotype particulier. Par exemple, les cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux dans une composition cellulaire de l'invention peuvent être caractérisées par l'expression de marqueurs de la surface cellulaire, la taille, la consommation de glucose, la production de 15 lactate, et le rendement/la viabilité des cellules. Encore un autre aspect de la présente invention concerne des compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux qui comprennent, en tant que composant cellulaire, des préparations sensiblement pures de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux ayant un phénotype particulier, ou leur descendance. Les compositions contenant des cellules 20 souches stromales dérivées du tissu adipeux de la présente invention ne comprennent pas seulement des populations sensiblement pures des cellules progénitrices, mais elles comprennent également des composants de culture cellulaire, par exemple, un milieu de culture comprenant des acides aminés, des métaux, des facteurs de coenzymes, ainsi que des petites populations d'autres cellules stromales, par exemple, dont certaines peuvent 25 provenir d'une différenciation subséquente des cellules de l'invention. En outre, d'autres composants non cellulaires peuvent comprendre ceux qui rendent le composant cellulaire approprié pour supporter dans des conditions particulières, par exemple, une implantation, par exemple, une culture continue, ou approprié pour une utilisation en tant que biomatériau ou composition pharmaceutique. 30 Dans certains modes de réalisation, les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux sont produites par l'intermédiaire de procédés de culture décrits dans la Section 3. 3048614 15 Les CSA préférées sont des cellules Cx601. La dénomination commune internationale proposée (mais pas confirmée) pour ces cellules est « Adalextemcel ». Les CSA adhèrent au plastique dans des conditions de culture classiques. Les CSA expansées (CSAe) présentent une morphologie de type fibroblaste en 5 culture. De façon spécifique, ces cellules sont grosses et sont caractérisées morphologiquement par un corps cellulaire mince avec quelques projections cellulaires qui sont longues et fines. Le noyau est grand et rond avec un nucléole proéminent, donnant au noyau un aspect transparent. La plupart des CSAe affichent cette morphologie en forme de fuseau, mais il est habituel que certaines des cellules acquièrent des 10 morphologies polygonales (Zuk et al., 2002). Les CSAe Cx601 sont positives pour les marqueurs de surface HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, et CD105. Par conséquent, un mode de réalisation fournit une composition contenant des CSAe dans laquelle au moins environ 80 %, au moins environ 90 % ou au moins environ 95 %, ou généralement au moins environ 96 %, 97 %, 15 98 % ou 99 % des CSAe expriment les marqueurs de surface HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, et CD105. Généralement, au moins environ 90 % des CSAe expriment les marqueurs de surface HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, et CD105. Plus généralement, au moins environ 95 % des CSAe expriment les marqueurs de surface HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, et CD105. 20 Les CSAe CX601 sont négatives pour les marqueurs HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 et CD86. Par conséquent, un mode de réalisation fournit une composition contenant des CSAe dans laquelle moins d'environ 5 % des CSAe expriment les marqueurs de surface HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 et CD86. Plus généralement, moins d'environ 4 %, 3 % ou 2 % des CSAe 25 expriment les marqueurs de surface HLAII, CD1 lb, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 et CD86. Dans un mode de réalisation, moins d'environ 1 % des CSAe expriment les marqueurs de surface HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 et CD86. Dans certains modes de réalisation, les CSAe expriment un ou plusieurs (par 30 exemple, deux ou plus, trois ou plus, quatre ou plus, cinq ou plus, six ou sept) des marqueurs HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, et CD105. Dans certains modes de réalisation, les CSAe peuvent ne pas exprimer un ou plusieurs (par exemple, deux ou 3048614 16 plus, trois ou plus, quatre ou plus, cinq ou plus, six ou plus, sept ou huit) des marqueurs HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80. Dans certains modes de réalisation, les CSAe expriment quatre ou plus des marqueurs HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, et CD105 et n'expriment pas quatre ou plus des marqueurs HLAII, 5 CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80. Des CSA humaines expansées selon certains modes de réalisation de l'invention sont décrites dans DelaRosa et al. ("Requirement of IFN-gamma-mediated indoleamine 2,3-dioxygenase expression in the modulation of lymphocyte proliferation by human adipose-derived stem cells."; Tissue Eng Part A. 2009 Oct; 15(10): 2795-806. doi: 10 10.1089/ten.TEA.2008.0630) et dans Lopez-Santalla et al. 2015 ("Human Adipose- Derived Mesenchymal Stem Cells Modulate Experimental Autoimmune Arthritis by Modifying Early Adaptive T Cell Responses." STEM CELLS, 33: 3493-3503. doi: 10.1002/stem.2113). Dans un mode de réalisation (tel que décrit dans Lopez-Santalla et al. 2015), des 15 aspirats de tissus adipeux humains provenant de donneurs en bonne santé ont été lavés deux fois avec de la solution tampon phosphate et digérés avec 0,075 % de collagénase (Type I ; Invitrogen). L'échantillon digéré a été lavé avec 10 % de sérum bovin foetal (FBS), traité avec 160 mM de NH4C1 pour éliminer les érythrocytes restants, et mis en suspension dans du milieu de culture [milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) 20 avec 10 % de FBS. Les cellules ont été ensemencées (2 à 3 - 104 cellules/cm2) dans des flacons de culture tissulaire et expansées (37 °C, 5 % de CO2) avec changement du milieu de culture tous les 3 à 4 jours. Les cellules ont été transférées dans un nouveau flacon (103 cellules/cm2) lorsqu'elles ont atteint 90 % de confluence. Les cellules ont été expansées jusqu'à une duplication de 12 à 14 et congelées. Les expériences ont été 25 effectuées avec des cellules provenant de deux donneurs hommes et de deux donneurs femmes à des doublements de population de 12 à 14. Les CSA ont été décongelées à partir des mêmes cryobanques et ensemencées avant chaque expérience. Les CSA ont été définies selon les critères de l'International Society for Cellular Therapy : comme étant positives pour les marqueurs HLA-I, CD73, CD90, et CD105 et négatives pour les 30 marqueurs CD11b, CD14, CD31, CD34, and CD45. Dans un autre mode de réalisation (tel que décrit par DelaRosa et al. 2009), des lipoaspirats obtenus à partir de tissus adipeux humains provenant de donneurs adultes en bonne santé ont été lavés deux fois avec du PBS, et digérés à 378 C pendant 30 min avec 3048614 17 18 U/ml de collagénase de type I dans du PBS. Une unité de collagénase libère 1 mM d'équivalent de L-leucine à partir du collagène en 5 h à 378 C, pH 7,5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). L'échantillon digéré a été lavé avec 10 % de sérum bovin foetal (FBS), traité avec 160 mM de C1NH4, mis en suspension dans du milieu de culture (DMEM 5 contenant 10 % de FBS), et filtré à travers des mailles en nylon de 40 p.m. Les cellules ont été ensemencées (2 à 3.104 cellules/cm2) sur des flacons de culture tissulaire et expansées à 378 C et 5 % de CO2, en changeant le milieu de culture tous les 7 jours. Les cellules ont été passées sur un nouveau flacon de culture (10008 cellules/cm2) lorsque les cultures ont atteint 90 % de confluence. Les cellules ont été caractérisées pour leur 10 phénotype par leur capacité à se différencier en lignées chondro-, ostéo-, et adipo-gènes. En outre, les hCSA ont été vérifiées par coloration avec des marqueurs de la surface spécifiques. Les hCSA étaient positives pour les marqueurs HLA-I, CD90, et CD105, et négatives pour les marqueurs HLA-II, CD40, CD80, CD86, et CD34. Un groupe provenant de six donneurs en bonne santé (trois hommes et trois femmes, âgés de 35 à 15 47 ans) a été utilisé dans l'étude. Les cellules ont été utilisées aux passages 4 à 6. Dans certains modes de réalisation, les CSA (i) n'expriment pas les marqueurs spécifiques à partir des CPA ; (ii) n'expriment pas l'IDO de façon constitutive, (iii) n'expriment pas significativement le CMH II de façon constitutive. Généralement, l'expression de l'IDO ou du CMH II peut être induite par stimulation avec de l'IFN-y. 20 Dans certains modes de réalisation, les CSA peuvent exprimer un ou plusieurs (par exemple, deux ou plus, trois ou plus, quatre ou plus, cinq ou plus, six ou plus, sept ou plus, huit ou plus, neuf ou plus, ou dix ou plus (par exemple, jusqu'à 13)) des marqueurs CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 et CD105. Par exemple, les CSA peuvent exprimer un ou plusieurs (par 25 exemple, deux, trois ou la totalité) des marqueurs CD29, CD59, CD90 et CD105, par exemple, CD59 et/ou CD90. Dans certains modes de réalisation, les CSM peuvent ne pas exprimer un ou plusieurs (par exemple, deux ou plus, trois ou plus, quatre ou plus, cinq ou plus, six ou plus, sept ou plus, huit ou plus, neuf ou plus, ou dix ou plus (par exemple, jusqu'à 15)) 30 des marqueurs facteur VIII, alpha-actine, desmine, S-100, kératine, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 et CD133, par exemple, les CSM n'expriment pas un ou plusieurs (par exemple, deux, trois ou la totalité) des marqueurs CD34, CD45, CD31 et CD14, par exemple, CD31 et/ou CD34. 3048614 18 Dans un mode de réalisation, il est fourni une composition contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux, dans laquelle au moins environ 50 %, au moins environ 60 %, au moins environ 70 %, au moins environ 80 %, au moins environ 85 %, au moins environ 90 %, au moins environ 95 % ou généralement au moins environ 5 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % des cellules souches expriment les marqueurs CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 et/ou CD105. Dans certains modes de réalisation des compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu, moins d'environ 15 %, environ 10 %, environ 5 %, et généralement environ 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % des cellules souches expriment les 10 marqueurs CD34, CD1 lb, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 et/ou CD133. Dans un autre mode de réalisation, il est fourni une composition contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux, dans laquelle au moins environ 50 %, au moins environ 60 %, au moins environ 70 %, au moins environ 80 %, au moins 15 environ 85 %, au moins environ 90 %, au moins environ 95 % ou généralement au moins environ 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % des cellules souches expriment les marqueurs c-Kit, vimentine et/ou CD90. Dans certains modes de réalisation des compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux, moins d'environ 15 %, environ 10 %, environ 5 %, et généralement environ 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % des cellules souches 20 expriment les marqueurs CD34, facteur VIII, alpha-actine, desmine, S-100 et/ou kératine. Il est également fourni une population de cellules souches stromales dérivées du tissu qui expriment les marqueurs c-Kit, vimentine et CD90 et n'expriment pas les marqueurs CD34, facteur VIII, alpha-actine, desmine, S-100 et kératine. La caractérisation phénotypique d'une population cellulaire par les marqueurs de 25 surface peut être effectuée soit par coloration individuelle des cellules (cytométrie en flux) soit par réalisation de coupes histologiques de la population in situ, effectuées selon des procédés normaux. La détermination du profil d'expression des marqueurs de surface par des anticorps, la caractérisation de l'immunophénotype, peuvent être directes, en utilisant un anticorps marqué ou indirectes, en utilisant un second anticorps marqué dirigé 30 contre l'anticorps spécifique primaire du marqueur cellulaire, obtenant ainsi une amplification du signal. D'autre part, la présence ou l'absence de liaison à l'anticorps peut être déterminée par des procédés différents qui comprennent, mais n'y sont pas limités, la microscopie à immunofluorescence et la radiographie. De façon similaire, il est possible 3048614 19 de réaliser le suivi des taux de liaison de l'anticorps par cytométrie en flux, une technique qui permet de corréler les taux de fluorochrome à la quantité des antigènes présents sur la surface cellulaire liés de façon spécifique aux anticorps marqués. L'expression différentielle d'une série de marqueurs de surface sur une population cellulaire fournit un 5 procédé d'identification et d'isolement de ladite population. Par conséquent, la technique FACS (tri des cellules activées par fluorescence) peut être généralement utilisée. Dans certains modes de réalisation, les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux sont des suspensions de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux dans diverses solutions ou divers matériaux, par 10 exemple, pour une utilisation en tant qu'agents pharmaceutiques ou biomatériaux, comme il est décrit plus en détail ci-dessous. Dans un mode de réalisation, la composition cellulaire comprend une suspension des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux sujettes dans de la solution de Ringer et de la HSA. Dans un autre mode de réalisation, la composition cellulaire comprend une suspension des cellules souches 15 stromales dérivées du tissu adipeux sujettes dans un matériau, comme un polymère, une colle, un gel, etc. De telles suspensions peuvent être préparées, par exemple, par sédimentation des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux sujettes à partir du milieu de culture et leur remise en suspension dans la solution ou le matériau souhaité. Les cellules peuvent être sédimentées et/ou changées de milieu de culture, par exemple, 20 par centrifugation, filtration, ultrafiltration, etc. La concentration des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux sujettes dans les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux sujettes peut être d'au moins environ 5 x 106 cellules/ml, au moins environ 10 x 106 cellules/ml, au moins environ 20 x 106 cellules/ml, au moins environ 30 x 25 106 cellules/ml, ou au moins environ 40 x 106 cellules/ml. Généralement, la concentration se situe entre environ 1 x 106 cellules/ml et 1 x 107 cellules/ml, par exemple, entre environ 5 x 106 cellules/ml et 1 x 107 cellules/ml. Dans les essais cliniques rapportés dans les exemples, les CSAe ont été administrées à une concentration de 5 millions de cellules / ml. Par conséquent, un autre aspect de la présente invention concerne la descendance 30 des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux sujettes, par exemple, ces cellules qui ont été dérivées des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux. Une telle descendance peut comprendre les générations subséquentes des cellules souches 3048614 20 stromales dérivées du tissu adipeux, ainsi que les cellules engagées dans des lignées générées par l'induction d'une différenciation des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux sujettes après leur isolement à partir de l'explant, par exemple, induite in vitro. Dans certains modes de réalisation, les cellules descendantes sont obtenues après 5 environ 2, environ 3, environ 4, environ 5, environ 6, environ 7, environ 8, environ 9, ou environ 10 passages à partir de la population parentale. Toutefois, les cellules descendantes peuvent être obtenues après un nombre quelconque de passages à partir de la population parentale. Dans certains modes de réalisation, les compositions contenant des cellules 10 souches stromales dérivées du tissu adipeux de l'invention seront fournies comme une partie d'une préparation, par exemple, une préparation stérile, exempte de la présence de virus, de bactéries et d'autres pathogènes non souhaités, ainsi qu'exempte de pyrogènes. C'est-à-dire que, pour une administration humaine, les compositions sujettes devront satisfaire des standards de stérilité, de pyrogénicité ainsi que de sécurité générale et de 15 pureté comme il est requis par les standards de l'Office of Biologics de la FDA. Les cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux expansées sont allogéniques par rapport à l'hôte de la transplantation. A cause de difficultés dans l'obtention de cellules souches autologues suffisantes, les cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux provenant d'un donneur allogénique constituent une variante 20 appréciable de source de cellules souches pour un usage thérapeutique. Il est connu dans l'art que les cellules souches stromales de la moelle osseuse et les cellules stromales dérivées du tissu adipeux ne provoquent pas une réponse des lymphocytes in vitro et par conséquent, les cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques dérivées d'un donneur pourront être utilisées pour tout patient, sans tenir compte de 25 l'incompatibilité du C1\41-1. Les procédés d'administration des compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux à des sujets, particulièrement des sujets humains, qui sont décrits en détail ici, comprennent l'injection ou l'implantation des cellules dans des sites cibles chez les sujets. Les cellules peuvent être insérées dans un dispositif 30 d'administration qui facilite l'introduction par injection ou implantation des cellules chez les sujets. De tels dispositifs d'administration comprennent des tubes, par exemple, des cathéters, pour injecter des cellules et des liquides dans le corps d'un sujet receveur. Dans un mode de réalisation préféré, les tubes comportent en outre une aiguille, par exemple, 3048614 21 une seringue, par l'intermédiaire de laquelle les compositions contenant des cellules stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être introduites chez le sujet à un emplacement souhaité. Les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être insérées dans un tel dispositif d'administration, par 5 exemple, une seringue, sous des formes différentes. Par exemple, les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux comprennent des compositions de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux qui sont en suspension dans une solution ou incorporées dans une matrice de support lorsqu'elles sont contenues dans un tel dispositif d'administration. 10 Les supports et les diluants pharmaceutiquement acceptables comprennent le sérum physiologique, les solutions tampons aqueuses, les solvants et/ou les milieux de dispersion. L'utilisation de ces supports et diluants est bien connue dans l'art. La solution est généralement stérile et fluide dans la mesure où une seringabilité aisée existe. Généralement, la solution est stable dans les conditions de fabrication et de stockage et 15 préservée contre l'action contaminante de micro-organismes tels que des bactéries et des champignons par l'utilisation, par exemple, de parabènes, de chlorobutanol, de phénol, d'acide ascorbique, de thimérosal, et analogues. Les solutions qui sont des compositions de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux de l'invention peuvent être préparées en incorporant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux comme 20 il est décrit ici dans un support ou un diluant pharmaceutiquement acceptable et, selon les besoins, d'autres composants énumérés ci-dessus, ceci suivi d'une stérilisation par filtration. Certains exemples de matériaux et de solutions qui peuvent servir de supports pharmaceutiquement acceptables comprennent : (1) des sucres, tels que le lactose, le 25 glucose et le saccharose ; (2) des amidons, tels que l'amidon de maïs et l'amidon de pomme de terre ; (3) la cellulose, et ses dérivés, tels que la carboxyméthylcellulose sodique, l'éthylcellulose et l'acétate de cellulose ; (4) la gomme adragante en poudre ; (5) le malt ; (6) la gélatine ; (7) le talc ; (8) des excipients, tels que le beurre de cacao et des cires de suppositoires ; (9) des huiles, telles que l'huile d'arachide, l'huile de coton, 30 l'huile de carthame, l'huile de sésame, l'huile d'olive, l'huile de maïs et l'huile de soja ; (10) des glycols, tels que le propylène glycol ; (11) des polyols, tels que la glycérine, le sorbitol, le mannitol et le polyéthylène glycol ; (12) des esters, tels que l'oléate d'éthyle et le laurate d'éthyle ; (13) l'agar; (14) des agents tampons, tels que l'hydroxyde de 3048614 22 magnésium et l'hydroxyde d'aluminium ; (15) l'acide alginique ; (16) l'eau apyrogène ; (17) le sérum physiologique isotonique ; (18) la solution de Ringer ; (19) l'alcool éthylique ; (20) des solutions à pH tamponné ; (21) des polyesters, des polycarbonates et/ou des polyanhydrides ; et (22) d'autres substances compatibles non toxiques 5 employées dans des formulations pharmaceutiques. Dans certains modes de réalisation, les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux comprennent en outre un adhésif. Dans certains modes de réalisation, l'adhésif est un adhésif à base de fibrine, comme un gel de fibrine ou une colle de fibrine ou un polymère ou un adhésif à base de fibrine, ou un autre 10 adhésif tissulaire ou une colle chirurgicale, comme, par exemple, le cyanoacrylate, le collagène, la thrombine, et le polyéthylène glycol. D'autres matériaux qui peuvent être utilisés comprennent, mais n'y sont pas limités, l'alginate de calcium, l'agarose, le collagène des types I, II, IV ou une autre isoforme de collagène, un poly-acide lactique/poly-acide glycolique, des dérivés de hyaluronate ou d'autres matériaux (Perka 15 C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49: 305-311 ; Sechriest VF. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49: 534-541 ; Chu CR et al. (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29: 1147-1154 ; Hendrickson DA et al. (1994) Orthop. Res. 12: 485-497). Dans d'autres modes de réalisation, l'adhésif est un bandage liquide, dans lequel des compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux du procédé sont 20 mélangées avec le matériau du bandage liquide. Un « bandage liquide » est une solution comprenant un composé, par exemple, un matériau polymère, qui est appliquée sur une plaie avec un pulvérisateur ou une brosse, ceci suivi de l'élimination du solvant par vaporisation pour fournir un film protecteur sur la plaie. Les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu 25 adipeux de l'invention peuvent être également utilisées pour enrober un support, par exemple, un dispositif médical. Par exemple, le support peut être une suture ou un fil. Le support peut être enrobé avec les cellules d'une façon quelconque connue de l'homme du métier, par exemple, par trempage, pulvérisation, peinture, impression, etc. Dans un mode de réalisation, le support est une suture, une agrafe, un fil 30 absorbable, un fil non absorbable, un fil naturel, un fil synthétique, un fil monofilament ou un fil multifilament (également appelé tresse). Des procédés préférés de préparation de sutures et d'autres supports utilisés pour fermer des plaies enrobés avec les cellules 3048614 23 souches stromales dérivées du tissu adipeux sont divulgués dans la demande de brevet U.S. No. 11/056 241 "Biomaterial for Suturing", déposée le 14 février 2005, laquelle demande est incorporée en référence dans son intégralité. Les compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux divulguées ici représentent de 5 nouvelles compositions qui peuvent être utilisées avec les procédés divulgués dans la demande de brevet U.S. No. 11/056 241. En outre, dans l'une quelconque des compositions contenant des cellules stromales dérivées du tissu adipeux, au moins un agent thérapeutique peut être incorporé dans la composition (bien que pas nécessaire et pouvant être éventuellement exclu). Par exemple, 10 une composition peut contenir un analgésique, pour aider à traiter une inflammation ou une douleur au niveau du site de la fistule, ou un agent anti-infectieux pour prévenir une infection du site traité avec la composition. Plus spécifiquement, les exemples non limitatifs d'agents thérapeutiques utiles comprennent les catégories thérapeutiques suivantes : les analgésiques, tels que les 15 médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens, les agonistes des opiacés et les salicylés ; les agents anti-infectieux, tels que les antihelminthiques, les antianaérobies, les antibiotiques, les antibiotiques aminoglycosides, les antibiotiques antifongiques, les antibiotiques céphalosporines, les antibiotiques macrolides, divers antibiotiques Blactames, les antibiotiques pénicillines, les antibiotiques quinolones, les antibiotiques 20 sulfonamides, les antibiotiques tétracyclines, les antimycobactériens, les antimycobactériens antituberculeux, les antiprotozoaires, les antiprotozoaires antipaludiques, les agents antiviraux, les agents antirétroviraux, les scabicides, les agents anti-inflammatoires, les corticostéroïdes anti-inflammatoires, les antiprurigineux/anesthésiques locaux, les anti-infectieux topiques, les anti-infectieux 25 topiques antifongiques, les anti-infectieux topiques antiviraux ; les agents électrolytiques et rénaux, tels que les agents acidifiants, les agents alcalinisants, les diurétiques, les diurétiques inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, les diurétiques de l'anse, les diurétiques osmotiques, les diurétiques épargneurs de potassium, les diurétiques thiazidiques, les remplacements des électrolytes, et les agents uricosuriques ; les enzymes, telles que les 30 enzymes pancréatiques et les enzymes thrombolytiques ; les agents gastro-intestinaux, tels que les antidiarrhéiques, les antiémétiques, les agents anti-inflammatoires gastro-intestinaux, les agents anti-inflammatoires gastro-intestinaux salicylés, les agents antiulcéreux antiacides, les agents antiulcéreux inhibiteurs de la pompe à protons 3048614 24 gastrique, les agents antiulcéreux de la muqueuse gastrique, les agents antiulcéreux inhibiteurs H2, les agents cholélitholytiques, les agents digestifs, les émétiques, les laxatifs et les émollients fécaux, et les agents procinétiques ; les anesthésiques généraux, tels que les anesthésiques par inhalation, les anesthésiques halogénés par inhalation, les 5 anesthésiques intraveineux, les anesthésiques barbituriques intraveineux, les anesthésiques benzodiazépines intraveineux, et les anesthésiques intraveineux à base d'agonistes des opiacés ; les hormones et les modificateurs hormonaux, tels que les agents abortifs, les agents surrénaliens, les agents corticosurrénaliens, les androgènes, les antiandrogènes, les agents immunobiologiques, tels que les immunoglobulines, les 10 immunosuppresseurs, les anatoxines, et les vaccins ; les anesthésiques locaux, tels que les anesthésiques locaux à base d'amides et les anesthésiques locaux à base d'esters ; les agents musculosquelettiques, tels que les agents anti-inflammatoires antigoutteux, les corticostéroïdes anti-inflammatoires, les agents anti-inflammatoires à base de composés d'or, les agents anti-inflammatoires immunosuppresseurs, les médicaments anti- 15 inflammatoires non stéroïdiens (AINS), les agents anti-inflammatoires salicylés, les minéraux ; et les vitamines, telles que la vitamine A, la vitamine B, la vitamine C, la vitamine D, la vitamine E, et la vitamine K. Les classes préférées d'agents thérapeutiques utiles des catégories ci-dessus comprennent : (1) les analgésiques en général, tels que la lidocaïne ou ses dérivés, et les 20 analgésiques à base de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), y compris le diclofénac, l'ibuprofène, le kétoprofène, et le naproxène ; (2) les analgésiques agonistes des opiacés, tels que la codéine, le fentanyl, l'hydromorphone, et la morphine ; (3) les analgésiques salicylés, tels que l'aspirine (ASA) (ASA entéro-résistante) ; (4) les antihistaminiques inhibiteurs Hi, tels que la clémastine et la terfénadine ; (5) les agents 25 anti-infectieux, tels que la mupirocine ; (6) les anti-infectieux antianaérobies, tels que le chloramphénicol et la clindamycine ; (7) les anti-infectieux antibiotiques antifongiques, tels que l'amphotéricine b, le clotrimazole, le fluconazole, et le kétoconazole ; (8) les anti-infectieux antibiotiques macrolides, tels que l'azithromycine et l'érythromycine ; (9) divers anti-infectieux antibiotiques B-lactames, tels que l'aztréonam et l'imipénem ; 30 (10) les anti-infectieux antibiotiques pénicillines, tels que la nafcilline, l'oxacilline, la pénicilline G, et la pénicilline V ; (11) les anti-infectieux antibiotiques quinolones, tels que la ciprofloxacine et la norfloxacine ; (12) les anti-infectieux antibiotiques tétracyclines, tels que la doxycycline, la minocycline, et la tétracycline ; (13) les anti- 3048614 25 infectieux antimycobactériens antituberculeux, tels que l'isoniazide (INH), et la rifampine ; (14) les anti-infectieux antiprotozoaires, tels que l'atovaquone et la dapsone ; (15) les anti-infectieux antiprotozoaires antipaludiques, tels que la chloroquine et la pyriméthamine ; (16) les anti-infectieux antirétroviraux, tels que le ritonavir et la 5 zidovudine ; (17) les agents anti-infectieux antiviraux, tels que l'acyclovir, le ganciclovir, l'interféron alfa, et la rimantadine ; (18) les anti-infectieux topiques antifongiques, tels que l'amphotéricine B, le clotrimazole, le miconazole, et la nystatine ; (19) les antiinfectieux topiques antiviraux, tels l'acyclovir ; (20) les agents électrolytiques et rénaux, tels que le lactulose ; (21) les diurétiques de l'anse, tels que le furosémide ; (22) les 10 diurétiques épargneurs de potassium, tels que le triamtérène ; (23) les diurétiques thiazidiques, tels que l'hydrochlorothiazide (HCTZ) ; (24) les agents uricosuriques, tels que le probénécide ; (25) les enzymes telles que la RNase et la DNase ; (26) les antiémétiques, tels que la prochlorpérazine ; (27) les agents anti-inflammatoires gastro-intestinaux salicylés, tels que la sulfasalazine ; (28) les agents antiulcéreux inhibiteurs de 15 la pompe à protons gastrique, tels que l'oméprazole ; (29) les agents antiulcéreux inhibiteurs H2, tels que la cimétidine, la famotidine, la nizatidine, et la ranitidine; (30) les agents digestifs, tels que la pancrélipase ; (31) les agents procinétiques, tels que l'érythromycine ; (32) les anesthésiques locaux à base d'esters, tels que la benzocaïne et la procaïne ; (33) les corticostéroïdes anti-inflammatoires musculosquelettiques, tels que 20 la béclométhasone, la bétaméthasone, la cortisone, la dexaméthasone, l'hydrocortisone, et la prednisone ; (34) les immunosuppresseurs anti-inflammatoires musculosquelettiques, tels que l'azathioprine, le cyclophosphamide, et le méthotrexate ; (35) les médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens musculosquelettiques (AINS), tels que le diclofénac, l'ibuprofène, le kétoprofène, le kétorolac, et le naproxène ; (36) les minéraux, tels que le 25 fer, le calcium, et le magnésium ; (37) les composés de vitamine B, tels que la cyanocobalamine (vitamine Bit) et la niacine (vitamine B3) ; (38) les composés de vitamine C, tels que l'acide ascorbique ; et (39) les composés de vitamine D, tels que le calcitriol. Dans certains modes de réalisation, l'agent thérapeutique peut être un facteur de 30 croissance ou une autre molécule qui affecte la différenciation et/ou la prolifération cellulaire. Les facteurs de croissances qui induisent des états de différenciation finale sont bien connus dans l'art, et peuvent être choisis parmi l'un quelconque de ces facteurs qui a été démontré comme induisant un état de différenciation finale. Les facteurs de croissance 3048614 26 pour une utilisation dans des procédés décrits ici peuvent, dans certains modes de réalisation, être des variants ou des fragments d'un facteur de croissance existant à l'état naturel. Par exemple, un variant peut être produit en réalisant des changements conservateurs d'acides aminés et en testant le variant résultant dans l'un des tests 5 fonctionnels décrits ci-dessus ou un autre test fonctionnel connu dans l'art. Les substitutions conservatives d'acides aminés se rapportent à l'interchangeabilité des résidus ayant des chaînes latérales similaires. Par exemple, un groupe d'acides aminés ayant des chaînes latérales aliphatiques est la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, et l'isoleucine ; un groupe d'acides aminés ayant des chaînes latérales aliphatiques hydroxylées est la 10 sérine et la thréonine ; un groupe d'acides aminés ayant des chaînes latérales contenant des amides est l'asparagine et la glutamine ; un groupe d'acides aminés ayant des chaînes latérales aromatiques est la phénylalanine, la tyrosine, et le tryptophane ; un groupe d'acides aminés ayant des chaînes latérales basiques est la lysine, l'arginine, et l'histidine ; et un groupe d'acides aminés ayant des chaînes latérales contenant du soufre est la 15 cystéine et la méthionine. Les groupes de substitutions conservatives d'acides aminés préférés sont : valine-leucine-isoleucine, phénylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, et asparagine-glutamine. Comme il sera compris de l'homme du métier, les variants ou les fragments des facteurs de croissance polypeptidiques peuvent être produits en utilisant des techniques 20 traditionnelles, telles que la mutagenèse, y compris la création d'une ou de plusieurs mutations ponctuelles distinctes, ou par troncature. Par exemple, une mutation peut donner naissance à des variants qui conservent sensiblement la même activité biologique, ou simplement un sous-ensemble de l'activité biologique d'un facteur de croissance polypeptidique à partir duquel il a été dérivé. 25 3. Procédés de préparation des compositions contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux Les procédés d'isolement et de culture de CSA pour fournir les CSAe et les populations cellulaires de l'invention, et des compositions comprenant des populations cellulaires de l'invention sont connus dans l'art. Généralement, les procédés de 30 préparation de compositions comprenant des populations cellulaires comprennent les étapes suivantes : (i) l'isolement des CSA à partir de la fraction stromale du tissu adipeux et la 3048614 27 sélection par adhérence à une surface appropriée, par exemple, du plastique (ii) l'expansion des CSA pour fournir des populations cellulaires de l'invention comprenant des CSAe. Eventuellement, les populations cellulaires de l'invention peuvent être 5 cryoconservées durant et/ou après l'étape d'expansion (ii). Eventuellement, le phénotype des populations cellulaires de l'invention peut être estimé durant et/ou après l'étape d'expansion (ii). Eventuellement, les populations cellulaires de l'invention peuvent être isolées après l'étape d'expansion (ii) et remises en suspension dans un support et/ou des diluants pharmaceutiquement acceptables. 10 Les CSA peuvent être obtenues par tout moyen classique dans l'art. Généralement, lesdites cellules sont obtenues par dissociation des cellules à partir du tissu de la source (par exemple, lipoaspirat ou tissu adipeux), généralement par traitement du tissu avec une enzyme digestive telle que la collagénase. La matière tissulaire digérée est ensuite généralement filtrée à travers un filtre situé entre environ 20 microns et 1 mm. Les 15 cellules sont ensuite isolées (généralement par centrifugation) et cultivées sur une surface adhérente (généralement, des plaques ou des flacons de culture tissulaire). De tels procédés sont connus dans l'art et, par exemple, tels que divulgués dans le brevet U.S. No. 6 777 231. Selon cette méthodologie, les lipoaspirats sont obtenus à partir de tissu adipeux et les cellules en sont dérivées. Au cours de cette méthodologie, les cellules 20 peuvent être lavées pour éliminer les débris contaminants et les érythrocytes, de préférence avec du PBS. Les cellules sont ensuite digérées avec de la collagénase (par exemple, à 37 °C pendant 30 minutes, 0,075 % de collagénase ; Type I, Invitrogen, Carlsbad, CA) dans du PBS. Pour éliminer les érythrocytes restants, l'échantillon digéré peut être lavé (par exemple, avec 10 % de sérum bovin foetal), traité avec 160 mmo1/1 de 25 C1NH4, et finalement mis en suspension dans du milieu complet DMEM (DMEM contenant 10 % de FBS, 2 mmo1/1 de glutamine et 1 % de pénicilline/ streptomycine). Les cellules peuvent être filtrées à travers des mailles en nylon de 40 i.tm. Les cellules sont cultivées dans un récipient de culture tissulaire approprié, comprenant une surface appropriée pour l'adhérence des CSA, par exemple, du plastique. 30 Les cellules non adhérentes sont éliminées, par exemple, par lavage dans un tampon approprié, pour fournir une population isolée de cellules stromales adhérentes (par exemple, des CSA). Les cellules isolées de cette façon peuvent être ensemencées (de 3048614 28 préférence 2 à 3 x 104 cellules/cm') sur des flacons de culture tissulaire et expansées à 37 °C et 5 % de CO2, en changeant le milieu de culture tous les 3 à 4 jours. Les cellules sont de préférence détachées de la surface adhérente (par exemple, au moyen de trypsine) et passées (« soumises à des passages ») sur un nouveau flacon de culture 5 (1000 cellules/cm") lorsque les cultures atteignent autour de 90 % de confluence. L'isolement des cellules est réalisé de préférence dans des conditions stériles ou de BPM. Dans un mode de réalisation, un procédé comprend : (a) le prélèvement de tissu adipeux chez un sujet ; (b) l'obtention d'une suspension cellulaire par digestion 10 enzymatique ; (c) la sédimentation de la suspension cellulaire et la remise en suspension des cellules dans un milieu de culture ; (d) la culture des cellules pendant au moins environ 10 jours ; et (g) l'expansion des cellules pendant au moins deux passages de culture. Les cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux sont allogéniques, c'est- 15 à-dire, non isolées du tissu adipeux du sujet chez lequel la composition contenant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux doit être introduite. Dans certains modes de réalisation, les cellules sont cultivées pendant au moins environ 15, au moins environ 20 jours, au moins environ 25 jours, ou au moins environ 30 jours. Généralement, l'expansion des cellules en culture améliore l'homogénéité du 20 phénotype des cellules dans la population cellulaire, de telle façon qu'il est obtenu une population sensiblement pure ou homogène. Dans certains modes de réalisation, les cellules sont expansées en culture pendant au moins trois passages de culture ou « soumises à des passages au moins trois fois ». Dans d'autres modes de réalisation, les cellules sont soumises à des passages au moins 25 quatre fois, au moins cinq fois, au moins six fois, au moins sept fois, au moins huit fois, au moins neuf fois, ou au moins dix fois. Il est préférable que les cellules soient soumises à des passages plus de trois fois pour améliorer l'homogénéité du phénotype des cellules dans la population cellulaire. En effet, les cellules peuvent être expansées en culture indéfiniment tant que l'homogénéité du phénotype des cellules est améliorée et que la 30 capacité différentielle est maintenue. Dans certains modes de réalisation, les cellules sont multipliées en culture pendant au moins trois doublements de la population. Dans certains modes de réalisation, les 3048614 29 cellules sont expansées en culture pendant au moins quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, 15 ou 20 doublements de la population. Dans certains modes de réalisation, les cellules sont expansées en culture pendant moins de sept, huit, neuf, dix, 15 ou 20 doublements de la population. Dans certains modes de réalisation, les cellules sont expansées en culture 5 entre environ 5 et 10 doublements de la population. Dans certains modes de réalisation, les cellules sont expansées en culture entre environ 10 et 15 doublements de la population. Dans certains modes de réalisation, les cellules sont expansées en culture entre environ 15 et 20 doublements de la population, par exemple, environ 16 doublements de la population. 10 Les cellules peuvent être cultivées par toute technique connue dans l'art pour la culture de cellules souches. Une discussion de diverses techniques de culture, ainsi que leur mise à l'échelle, peut se trouver dans Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4ème Edition, Wiley-Liss 2000. Les cellules peuvent être expansées en utilisant des flacons de culture ou des bioréacteurs appropriés pour une 15 expansion à grande échelle. Des bioréacteurs appropriés pour l'expansion à grande échelle de cellules stromales mésenchymateuses sont disponibles dans le commerce et peuvent comprendre des bioréacteurs d'expansion à la fois bidimensionnels (c'est-à-dire, sensiblement planaires) et tridimensionnels. Les exemples de tels bioréacteurs comprennent, mais n'y sont pas limités, un bioréacteur à écoulement piston, un 20 bioréacteur à perfusion, un bioréacteur à cuve agitée en continu, un bioréacteur à lit stationnaire. Dans certains modes de réalisation, les cellules sont cultivées par culture monocouche. Dans un mode de réalisation, les cellules sont cultivées et soumises à des passages comme il est décrit dans l'exemple A ci-dessous. Tout milieu capable de supporter les cellules stromales en culture tissulaire peut 25 être utilisé. Les formulations des milieux qui supporteront la croissance de fibroblastes comprennent, mais n'y sont pas limitées, le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), le milieu essentiel minimal alpha modifié (alpha.MEM), et le milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (milieu RPMI 1640) et analogues. Généralement, 0 à 20 % de sérum bovin foetal (FBS) ou 1 à 20 % de sérum de cheval seront ajoutés aux milieux 30 ci-dessus afin de supporter la croissance des cellules stromales et/ou des chondrocytes. Toutefois, un milieu défini pourra être utilisé si les facteurs de croissance, les cytokines, et les hormones nécessaires dans du FBS pour des cellules stromales et des chondrocytes sont identifiés et fournis à des concentrations appropriées dans le milieu de croissance. 3048614 30 Les milieux utiles dans les procédés de l'invention peuvent contenir un ou plusieurs composés d'intérêt, y compris, mais n'y étant pas limités, des antibiotiques mitogènes ou des composés de différenciation pour des cellules stromales. Les cellules seront cultivées à des températures situées entre 31 °C et 37 °C dans un incubateur humide. La teneur en 5 dioxyde de carbone sera maintenue entre 2 % et 10 % et la teneur en oxygène entre 1 % et 22 %. Les cellules peuvent rester dans cet environnement pendant des périodes allant jusqu'à 4 semaines. Les antibiotiques qui peuvent complémenter le milieu comprennent, mais n'y sont pas limités, la pénicilline et la streptomycine. La concentration de pénicilline dans le 10 milieu de culture chimiquement défini est 10 à environ 200 unités par ml. La concentration de streptomycine dans le milieu de culture chimiquement défini est d'environ 10 à environ 200 µg/ml. Les cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être transfectées ou transduites de façon stable ou transitoire avec un acide nucléique d'intérêt en utilisant 15 une stratégie de plasmide, de virus ou en variante de vecteur. Les acides nucléiques d'intérêt comprennent, mais n'y sont pas limités, ceux codant pour des produits géniques qui amplifient la production des composants de la matrice extracellulaire trouvés dans le type tissulaire à réparer, par exemple, la paroi intestinale ou la paroi vaginale. La transduction de vecteurs viraux portant des gènes régulateurs dans les cellules 20 souches stromales peut être effectuée avec des vecteurs viraux (adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés, ou un autre vecteur) purifiés par formation de bandes avec du chlorure de césium ou un autre procédé à une multiplicité d'infection (unités virales/cellule) située entre 10/1 et 2000/1. Les cellules seront exposées au virus dans du sérum exempt de ou contenant du sérum en l'absence ou en présence d'un détergent 25 cationique tel que le polyéthylèneimine ou la LipofectamineTM pendant une période de 1 heure à 24 heures (Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9: 2493-2502 ; Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int. 64: 45-49). D'autres procédés appropriés pour le transfert de vecteurs ou de plasmides dans des cellules souches comprennent des complexes lipide/ADN, tels que ceux décrits dans 30 les brevets U.S. No. 5 578 475 ; 5 627 175 ; 5 705 308 ; 5 744 335 ; 5 976 567 ; 6 020 202 ; et 6 051 429. Les réactifs appropriés comprennent la lipofectamine, une formulation liposomique 3/1 (p/p) du lipide polycationique trifluoroacétate de 2,3- 3048614 31 dioléyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)éthy1]-N,N-diméthyl-1-propanaminium (DOSPA) (nom du Chemical Abstracts Registry : trifluoroacétate de N42-(2,5-bis[(3- aminopropyl)amino]-1-oxopentyl amino)éthy1]-N,N-dimethyl-2,3-bis(9- octadécényl-oxy)-1-propanaminium), et du lipide neutre dioléoyl- 5 phosphatidyléthanolamine (DOPE) dans de l'eau filtrée sur membrane. Un exemple est la formulation de Lipofectamine 2000TM (disponible chez Gibco/Life Technologies No. 11668019). D'autres réactifs comprennent : le réactif de transfection FuGENETM 6 (un mélange de lipides sous une forme non liposomique et d'autres composés dans de l'éthanol à 80 %, pouvant être obtenu chez Roche Diagnostics Corp. No. 1814443) ; et le 10 réactif de transfection LipoTAXITM (une formulation lipidique de Invitrogen Corp., No. 204110). La transfection des cellules souches peut être effectuée par électroporation, par exemple, comme il est décrit dans M.L. Roach and J.D. McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185: 1. Les systèmes de vecteurs viraux appropriés pour la production de cellules souches avec des modifications génétiques stables peuvent être basés sur des 15 adénovirus et des rétrovirus, et peuvent être préparés en utilisant des composants viraux disponibles dans le commerce. La transfection des vecteurs plasmidiques portant des gènes régulateurs dans les cellules souches stromales peut être introduite dans les cellules dans des cultures monocouches par l'utilisation d'une précipitation de l'ADN au phosphate de calcium ou 20 des procédés avec des détergents cationiques (LipofectamineTM, DOTAP) ou dans des cultures tridimensionnelles par incorporation des vecteurs à ADN plasmidique directement dans le polymère biocompatible (Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5: 753759). Pour le traçage et la détection des protéines fonctionnelles codées par ces gènes, 25 les vecteurs à ADN viral ou plasmidique contiendront un gène marqueur facilement détectable, comme la protéine fluorescente verte ou l'enzyme bêta-galactosidase, les deux pouvant être tracées par un moyen histochimique. 4. Traitement des fistules péri-anales complexes L'invention concerne le traitement des fistules péri-anales complexes chez des 30 patients souffrant de la maladie de Crohn, en utilisant des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées. Les cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux composent généralement une composition contenant des 3048614 32 cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux décrite ici, parfois appelée « Cx601 ». Toutefois, d'autres préparations de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être utilisées dans les procédés décrits ici, par exemple, tels que ceux décrits dans les brevets U.S. No. 6 777 231 et 6 555 374 et la demande de brevet 5 U.S. No. 11/065 461 "Identification and Isolation of Multipotent Cells From Non- Osteochondral Mesenchymal Tissue", déposée le 25 février 2005. Les exemples montrent que les CSAe allogéniques constituent un traitement étonnamment efficace pour les fistules péri-anales complexes chez les patients souffrant de la maladie de Crohn, grâce auxquelles une seule administration est capable de fournir 10 un effet thérapeutique rapide et prolongé même dans les fistules très complexes les plus difficiles à traiter qui n'ont pas répondu à des traitements antérieurs. Par exemple, un bénéfice est généralement observé à peu près dès 6 semaines, et lequel bénéfice est généralement prolongé jusqu'à 24 semaines à partir du traitement. Dans un mode de réalisation, une méthode de traitement d'une fistule péri-anale 15 complexe réfractaire chez un patient souffrant de la maladie de Crohn comprend l'injection d'environ 120 millions de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées par voie intralésionnelle, dans toutes les voies de la fistule. Pour éviter toute ambiguïté, dans ce mode de réalisation, 120 millions de cellules sont administrées au patient en une seule procédure, avec chaque voie de la fistule recevant au 20 moins une proportion de ce dosage. Approximativement la moitié de la dose est injectée dans le tissu entourant l'orifice ou les orifices internes. L'autre moitié est injectée dans les parois de la fistule (à une profondeur qui n'est pas supérieure à 2 mm) tout le long de la voie ou des voies de la fistule, produisant plusieurs micro-vésicules. Les données dans les exemples montrent que cette seule administration est capable de fournir une rémission 25 combinée en 24 semaines ou moins, même en à peu près 6 semaines ou en à peu près 8 semaines. Par conséquent, dans un mode de réalisation, le traitement est constitué de cette seule administration intralésionnelle de 120 millions de CSAe. L'injection intralésionnelle est généralement réalisée comme dans l'essai clinique illustré, grâce à laquelle la suspension cellulaire est injectée au travers de l'orifice ou des 30 orifices internes (avec la seringue pénétrant par l'anus) et au travers des parois des voies de la fistule (avec la seringue pénétrant au travers de l'orifice externe de la fistule). 3048614 33 Le patient peut être un homme ou une femme. Le patient est généralement un adulte. Dans un mode de réalisation, tous les sétons qui peuvent être présents sont d'abord retirés. Généralement, la fistule est curetée avant l'administration des CSAe. Les orifices 5 internes peuvent être éventuellement suturés. Les CSAe sont ensuite administrées avec une longue aiguille fine. Comme il a été noté ci-dessus, approximativement la moitié de la dose est injectée dans le tissu entourant l'orifice ou les orifices internes. L'autre moitié est injectée dans les parois de la fistule (à une profondeur qui n'est pas supérieure à 2 mm) tout le long de la voie ou des voies de la fistule, produisant plusieurs micro-vésicules. 10 Avant le traitement selon l'invention, une IRM pelvienne peut être effectuée lors du dépistage pour guider les procédures chirurgicales. Les patients peuvent également subir un curetage de la fistule et un placement de sétons comme il est cliniquement indiqué > 2 semaines avant l'administration de produits candidats (figure 1). Si un séton a été placé, il est retiré immédiatement avant l'administration des produits candidats. 15 Le patient à traiter souffre de la maladie de Crohn, généralement de la maladie de Crohn luminale. Généralement, le patient a souffert de la maladie de Crohn luminale non active ou légèrement active, par exemple comme il est défini par un indice d'activité de la maladie de Crohn (IAMC) 2 cm qui n'ont pas été résolus par la procédure de préparation chirurgicale. 25 Les patients sont réfractaires à au moins un traitement médicamenteux antérieur. Le traitement antérieur peut être un médicament à petite molécule ou un produit médicinal biologique. Généralement, le patient a reçu ledit traitement pendant au moins environ 4, 6, 12, 18, 24 ou 36 semaines et présente encore des symptômes de maladie active. En d'autres termes, même après un traitement pendant au moins environ 4, 6, 12, 18, 24 ou 30 36 semaines, la gravité de la fistule n'est pas améliorée. Le traitement antérieur peut être un traitement antibiotique tel que la ciprofloxacine ou le métronidazole, un traitement immunosuppresseur (par exemple, un analogue purique tel que l'azathioprine ou la 6- mercaptopurine, un analogue pyrimidique tel que le fluorouracile, ou un analogue de 3048614 34 l'acide folique tel que le méthotrexate), ou un traitement anti-TNF tel que Adalimumab (Humira), Certolizumab (Cimzia), Etanercept (Enbrel), Golimumab (Simponi), ou Infliximab (Remicade). Les patients admissibles sont généralement réfractaires (aucune réponse) à au moins l'un des traitements suivants : après 1 mois d'antibiotiques (par 5 exemple, ciprofloxacine, métronidazole) ; et/ou après 3 mois d'immunosuppresseurs (par exemple, azathioprine, 6-mercaptopurine) ; et/ou d'induction ou de maintien de traitements anti-TNF (par exemple, infliximab, étanercept, adalimumab, certolizumab, golimumab) à dose stable. Dans un mode de réalisation, le patient est réfractaire à un traitement avec un 10 immunosuppresseur (par exemple, azathioprine, 6-mercaptopurine) et un inhibiteur du TNF-a (par exemple, infliximab ou adalimumab). Par conséquent, un patient type souffre de la maladie de Crohn luminale non active (IAMC 6 mois, définie par un indice d'activité de la maladie de Crohn (IAMC) 2 orifices externes ; ou collections associées) avec un maximum de 2 orifices internes et 3 orifices externes, qui avaient coulé pendant > 6 semaines avant l'inclusion. Les patients ont été exclus s'ils avaient des fistules recto-vaginales, une sténose rectale et/ou anale et/ou une proctite sévère active (définie par la présence 30 d'ulcères superficiels ou profonds), des stomies de diversion, ou un abcès ou des collections > 2 cm qui n'ont pas été résolus par la procédure de préparation chirurgicale. Les patients admissibles devaient être réfractaires à au moins l'un des traitements suivants documentés comme aucune réponse après 1 mois d'antibiotiques (ciprofloxacine, 3048614 43 métronidazole) et/ou après 3 mois d'immunosuppresseurs (azathioprine, 6- mercaptopurine) et/ou d'induction ou de maintien de traitements anti-TNF à une dose stable. Les patients réfractaires uniquement aux antibiotiques devaient représenter 2 semaines avant l'administration des produits candidats (figure 1). Si un séton a été placé, il a dû être retiré immédiatement avant l'administration des produits candidats. Les patients ont été répartis de façon aléatoire dans un rapport de 1/1 aux Cx601 ou au placebo après la visite de préparation de la fistule > 2 semaines avant 25 l'administration des produits candidats (figure 1). Les patients ont été stratifiés en se basant sur la médication simultanée à la randomisation (anti-TNF et/ou immunosuppresseur ou ni l'un ni l'autre). Les traitements ont été répartis en utilisant une liste de randomisation préétablie générée par Department of Biostatistics, Linical. Les patients dans le bras Cx601 ont reçu une seule injection de 120 millions de 30 Cx601 par voie intralésionnelle distribuée dans les voies de la fistule. L'isolement et l'expansion des Cx601 ont été effectués comme il a été décrit auparavant. A23 Les patients dans le bras du placebo ont reçu un volume identique de solution saline. Les traitements de l'étude ont été administrés avec une longue aiguille fine après retrait du ou des sétons, 3048614 44 si présents, et curetage de la fistule. La moitié de la dose a été injectée dans le tissu entourant l'orifice ou les orifices internes suturés. L'autre moitié a été injectée dans les parois de la fistule (à une profondeur qui n'est pas supérieure à 2 mm) tout le long de la voie ou des voies de la fistule, produisant plusieurs micro-vésicules. 5 L'administration des traitements en aveugle n'a pas été possible car la suspension cellulaire était clairement différente de la solution saline. La conception de l'étude en double aveugle a été maintenue par le traitement administré par un chirurgien qui n'était pas en aveugle et un gastro-entérologue et un radiologue en aveugle évaluant la réponse. 10 Procédures et suivi de l'étude La fermeture de la fistule a été cliniquement évaluée aux semaines 6, 12, 18 et 24 par l'investigateur examinant la présence d'un écoulement spontané et après une légère pression des doigts au niveau des orifices externes traités, Al2 et elle a été estimée radiologiquement par une IRM pelvienne lue en aveugle au niveau central à la semaine 15 24 ; aux lecteurs centraux, il a été fourni des chiffres pour identifier les fistules traitées, mais ils étaient en aveugle par rapport aux données des patients, à l'ordre des examens et au traitement reçu. Les événements indésirables liés au traitement (EILT) ont été évalués à toutes les visites de l'étude. La gravité de la maladie de Crohn péri-anale a été estimée au départ et à toutes les visites de l'étude avec l'indice d'activité de la maladie péri-anale 20 (IAMP). A25 La qualité de vie a été estimée avec le questionnaire sur les maladies inflammatoires de l'intestin (QMII) A26 au départ et à la semaine 24 comme l'IAMC. A24 Critères d'efficacité et d'innocuité Le critère principal a été la rémission combinée à la semaine 24 définie comme 25 l'estimation clinique de la fermeture de tous les orifices externes traités qui coulaient au départ, et l'absence de collections > 2 cm des fistules péri-anales traitées dans > 2 des 3 dimensions, confirmée par une lecture centrale en aveugle de l'IRM (Bioclinica GmbH, Munich, Allemagne). L'estimation clinique de la fermeture a été définie comme l'absence d'écoulement en dépit d'une pression légère des doigts. Al2 30 Il y avait deux critères secondaires clés d'efficacité : la rémission clinique (c'est- à-dire, la fermeture de tous les orifices externes traités qui coulaient au départ en dépit d'une légère pression des doigts) et la réponse (c'est-à-dire, la fermeture de > 50 % de tous les orifices externes traités qui coulaient au départ) dès la semaine 24. Les autres 3048614 critères secondaires d'efficacité comprenaient le temps jusqu'à la rémission clinique, le temps jusqu'à la réponse, les scores de l'IAMP, de l'IAMC et du QMII jusqu'à la semaine 24. Les EILT ont été codés selon le Medical Dictionary for Regulatory Activities 5 version 17.0. Analyse statistique La taille prévue de l'échantillonnage à cribler était de 278 patients afin de randomiser > 208 patients (104 dans chaque groupe). La taille de l'échantillonnage était suffisante 10 pour détecter un minimum de 25 % de différence du pourcentage de patients avec une rémission combinée entre les Cx601 et le placebo (les taux minimaux anticipés de rémission combinée étaient de 50 % pour les Cx601 et de 25 % pour le placebo As, Aie, A23, A27) avec une erreur alpha de 0,025, et une puissance de 80 %, et permettait à 20 % des patients d'interrompre l'étude. 15 Les analyses d'efficacité ont été conduites sur la population en intention de traiter (ITT) qui comprenait tous les patients randomisés, la population ITT modifiée (mITT) qui comprenait tous les patients randomisés qui avaient reçu le traitement de l'étude et présentaient une estimation de l'efficacité >1 après le départ, et la population selon le protocole (PP) qui comprenait tous les patients traités sans aucune déviation majeure du 20 protocole. Les EILT ont été analysés dans la population de l'innocuité définie comme tous les patients qui ont reçu le traitement de l'étude. Le critère principal a été analysé en utilisant un test stratifié de Cochran-Mantel- Haenszel, s'ajustant aux strates de la randomisation (c'est-à-dire, les traitements de la maladie de Crohn à la randomisation). L'analyse principale a été réalisée en utilisant la 25 population ITT. Nous avons également fourni des résultats pour la population mITT puisque sa définition ressemble plus étroitement à la population ITT dans d'autres essais cliniques randomisés et fournit une estimation plus fiable des effets du traitement. Les données manquantes ont été imputées en utilisant le procédé de la dernière observation reportée prospectivement (DORP). Une non-réponse/non-rémission a été imputée si une 30 lecture d'IRM après le départ ou une estimation clinique n'a pas été réalisée à la semaine 24. Une non-réponse/non-rémission a été également imputée si un événement de sauvetage a pris place avant la semaine 24. Les effets des événements de sauvetage et les 3048614 46 conventions pour les données manquantes sur l'efficacité ont été explorés dans des analyses de sensibilité du critère principal. Pour aborder le problème de la multiplicité, les deux critères secondaires clés (rémission clinique et réponse dès la semaine 24) ont été groupés dans une famille à court 5 terme, avec un procédé de sentinelle utilisant la procédure d'analyse de HochbergA28 pour contrôler l'erreur globale de type I, avec le critère principal d'efficacité agissant comme sentinelle. La signification statistique a été estimée avec un taux d'erreur bilatérale de type I de 0,05. Aucun ajustement statistique pour la multiplicité n'a été effectué pour les critères secondaires non clés. Les pourcentages et les différences de traitement ont été 10 exprimés avec des intervalles de confiance (IC) à 95 % calculés avec un procédé asymptotique de Wald. Les temps jusqu'à la rémission clinique et la réponse ont été analysés avec les estimations de Kaplan-Meier. Les résultats de l'innocuité ont été présentés avec des statistiques descriptives. Le système SAS v9.1.3 ou ultérieure a été utilisé pour les analyses statistiques 15 (SAS Institute Inc., Cary, NC, Etats-Unis). Résultats Au total, 289 patients ont été criblés, et parmi ceux-ci, 212 ont été randomisés pour les Cx601 ou le placebo (figure 2). Les caractéristiques au départ des 2 groupes étaient 20 similaires (tableau 1). La majorité des patients avaient reçu > 1 traitement pour la maladie de Crohn au cours des 6 derniers mois. Une proportion supérieure de patients dans le groupe des Cx601 présentaient des fistules à plusieurs voies comparativement au groupe du placebo (46,6 % et 30,4 %, respectivement). Au total, 171 patients (80,7 %) ont complété le suivi de 24 semaines. Durant l'étude, 1 patient dans le groupe des Cx601 et 4 25 patients dans le groupe du placebo ont reçu des stéroïdes pour une poussée de la maladie de Crohn. Efficacité Une proportion significativement plus grande de patients traités par les Cx601 ont atteint 30 le critère principal de la rémission combinée à la semaine 24 contre le placebo dans les populations ITT (49,5 % et 34,3 %, respectivement ; différence [IC à 97,5 %] : 15,2 % [0,2 à 30,3] ; p = 0,024]) et mITT (51,5 % et 35,6 % ; 15,8 % [0,5 à 31,2] ; p = 0,021 ; figures 3A et B). Ces résultats ont été confirmés dans les populations PP et dans les 3048614 47 analyses supplémentaires de la sensibilité (tableau Si). L'effet des Cx601 a été supérieur au placebo dans les 4 strates de randomisation, avec l'effet numériquement le plus grand des Cx601 observé chez les patients ne recevant ni l'un ni l'autre traitement ou recevant les traitements à la fois anti-TNF et immunosuppresseurs à la randomisation (différence 5 de traitement de 33,1 % et 20,0 %, respectivement ; figure 3C). Dans la population mITT, une proportion numériquement supérieure de patients dans le groupe des Cx601 contre le placebo ont obtenu une rémission clinique (55,3 % et 42,6 %, respectivement ; différence [IC à 95 %] : 12,8 % [-0,8 à 26,4] ; p = 0,057) et ont eu une réponse (68,9 % et 55,4 %, respectivement ; 13,5 % [0,3 à 26,7] p = 0,045) dès 10 la semaine 24. Le temps médian jusqu'à la rémission clinique était à peu près 2 fois plus court avec les Cx601 contre le placebo (6,7 [IC à 95 %, 6,4 à 11,9] semaines et 14,6 [11,9 à 22,9] semaines), comme l'a été le temps médian jusqu'à la réponse (6,3 [6,0 à 6,6] semaines et 11,7 [6,7 à 12,9] semaines). 15 L'amélioration de l'IAMP avec les Cx601 dans la population mITT a été significativement supérieure au placebo à la semaine 6 (variation depuis le départ de la différence de traitement [IC à 95 %] : -1,0 [-1,7 à -0,3]), semaine 12 (-1,2 [-2,0 à -0,4]), et semaine 18 (-1,2 [-2,0 à -0,3]), mais pas à la semaine 24 (-0,8 [-1,8 à 0,2]). Pour les scores totaux et des sous-domaines QMII et IAMC, il n'y a pas eu de différence 20 significative entre les groupes de traitement (tableau S2). Innocuité Le pourcentage des patients dans les groupes Cx601 et placebo qui ont expérimenté des EILT a été similaire (66,0 % et 64,7 %, respectivement ; tableau 2). Les EILT les plus 25 couramment rapportés ont été une proctalgie, un abcès anal et une rhinopharyngite. Une proportion supérieure de patients dans le groupe du placebo contre les Cx601 ont expérimenté des EILT (29,4 % et 17,5 %, respectivement), dont les plus courants étaient un abcès anal et une proctalgie. La majorité des EILT étaient légers à modérés en intensité. Quelques patients se sont retirés de l'étude à cause des EILT (4,9 % et 5,9 %), 30 tandis qu'une proportion légèrement supérieure de patients dans le groupe des Cx601 ont expérimenté des EILT sérieux (17,5 % et 13,7 %). L'EILT sérieux le plus courant a été un abcès anal (Cx601 : 8,7 % ; placebo : 6,9 %). Il n'y a pas eu de décès. 3048614 48 Discussion et synthèse Il s'agit de la première étude clinique à grande échelle, randomisée, contrôlée par un placebo du traitement des fistules péri-anales complexes réfractaires au traitement chez des patients souffrant de la maladie de Crohn. Dans la population de l'étude difficile à 5 traiter de patients qui avaient des fistules péri-anales complexes et pour lesquels un traitement conventionnel ou biologique avait échoué, 1 patient sur 2 traité avec des Cx601 seules ou ajoutées à un traitement médical en cours ont obtenu une rémission clinique et radiologique combinée à la semaine 24. Ce résultat a été homogène parmi toutes les populations statistiques, en dépit de patients dans le groupe des Cx601 ayant plus de 10 fistules à voies multiples. Par conséquent, les résultats de l'étude montrent que les Cx601 offrent aux patients réfractaires au traitement une première alternative de fermeture réelle pour des fistules péri-anales complexes aux approches chirurgicales radicales. Le critère principal de la rémission clinique et radiologique combinée est plus stringent que celui utilisé dans d'autres études cliniques randomisées de traitement pour 15 des fistules péri-anales dans la maladie de Crohn, qui ont généralement estimé les réponses cliniques (c'est-à-dire > 50 % de réduction du nombre des fistules s'écoulant) ou une rémission clinique. A8, Al2 Il s'agit du premier essai clinique à grande échelle randomisé à utiliser l'estimation clinique de la fermeture des fistules et l'estimation par IRM de l'absence de ces d'abcès comme il est recommandé dans les directives de 20 l'European Crohn's and Colitis Organisation. A29 Les analyses secondaires de l'efficacité renforcent le bénéfice clinique des Cx601. Avec les Cx601, le temps jusqu'à la rémission clinique et la réponse a été rapide, survenant en moitié moins de temps que dans le groupe du placebo. La différence des taux de rémission clinique entre les groupes des Cx601 et du placebo n'a pas atteint une 25 signification statistique à cause d'un effet « placebo » considérablement supérieur (42,6 %) à celui attendu et observé dans des études antérieures (13 à 19 %). A8, Al2, A27 Les effets placebo selon les strates de randomisation (c'est-à-dire, le plus élevé sans un traitement anti-TNF et immunosuppresseur simultané [46,7 %] et le plus bas avec aucun des deux traitements [21,1 %]) suggère que l'effet placebo supérieur dans cette étude peut 30 avoir été dirigé par un usage simultané de médicaments. Le drainage chirurgical et la fermeture de l'orifice interne peuvent avoir également augmenté la réponse au placebo. Tandis que des améliorations bénéfiques des scores d'IAMP ont été observées dans le groupe des Cx601, il n'y a eu aucune différence des scores de QMII et IAMC entre les 3048614 49 groupes de traitement. Ceci a été probablement dû à l'IAMC bas (un critère d'inclusion) et un QMII élevé au départ. Les données d'innocuité montrent que les Cx601 ont été bien tolérées dans la population de l'étude conformément aux résultats de l'étude antérieure en phase 1/2a. A23 5 Les EILT sont apparus plus fréquemment dans le groupe du placebo et ainsi peuvent être associés à l'évolution naturelle de la maladie ou aux procédures chirurgicales de l'étude. Le profil d'innocuité favorable peut représenter un avantage par rapport aux traitements anti-TNF qui sont associés à plusieurs inquiétudes sérieuses quant à l'innocuité résultant de l'immunogénicité au médicament et à un risque accru d'infections, y compris la 10 tuberculose. A30, A31 Les résultats de cette étude sont encourageants, en prenant en considération le besoin de nouvelles options thérapeutiques efficaces et bien tolérées pour les patients souffrant de la maladie de Crohn avec des fistules péri-anales complexes. Cette étude a également des implications majeures pour les soins prodigués aux patients souffrant de la 15 maladie de Crohn avec des fistules péri-anales complexes réfractaires au traitement, car un grand nombre d'entre eux doivent subir actuellement une chirurgie répétée avec le risque d'endommagement des muscles sphinctériens, entraînant une incontinence fécale. Comme conséquence, 12 à 38 % des patients présentant une maladie à fistulisation péri-anale nécessitent une protectomie. A32 A l'opposé, l'administration de Cx601 est invasive 20 de façon minimale et peut être effectuée en consultation externe. Les limitations de cet essai ont été l'exclusion de patients avec plus de 2 orifices internes et 3 orifices externes, ainsi que ceux ayant subi une chirurgie antérieure autre que le drainage et le placement de sétons. En outre, que les EILT soient associés à la procédure chirurgicale n'a pas été établi. 25 En conclusion, les Cx601 représentent un traitement efficace et sans risque pour les fistules péri-anales complexes dans la maladie de Crohn qui n'avaient pas répondu aux traitements traditionnels et/ou biologiques. 3048614 Tableau 1. Caractéristiques des patients (population de l'innocuité). Variable Cx601 Placebo (N= 103) (N= 102) Age - ans 38,9 (13,1) 37,6 (13,2) Genre masculin - nb ( %) 57 (55,3) 54 (52,9) Ethnicité - nb ( %) Caucasiens 96 (93,2) 93 (91,2) Noirs 4 (3,9) 1 (1,0) Autres 0 1 (1,0) Manquants 3 (2,9) 7 (6,9) Poids - kg 73,3 (14,4) 71,4 (15,0) Durée de la MC - ans 11,8 (9,8) 11,4 (9,0) Médication antérieure de la MC au cours des 6 derniers mois - nb ( %) Antibiotiques 78 (75,7) 72 (70,6) Immunosuppresseurs 87 (84,5) 74 (72,5) Anti-TNF 80 (77,7) 82 (80,4) Médication simultanée de la MC (facteur de stratification) - nb ( %) Anti-TNF 36 (35,0) 32 (31,4) Immunosuppresseurs 16 (15,5) 21 (20,6) Anti-TNF + immunosuppresseurs 27 (26,2) 30 (29,4) Aucun 24 (23,3) 19 (18,6) Indice d'activité de la maladie de Crohn péri- anale* 6,7 (2,5) 6,5 (2,9) Orifices des fistules - nb ( %) 0 interne + 1 externe 0 1 (1,0) 1 interne + 1 externe 55 (53,4) 70 (68,6) 1 interne + 2 externes 23 (22,3) 17 (16,7) 1 interne + 3 externes 4 (3,9) 3 (2,9) 2 internes + 1 externe 3 (2,9) 2 (2,0) 2 internes + 2 externes 14 (13,6) 8 (7,8) 2 internes + 3 externes 4 (3,9) 1 (1,0) Indice d'activité de la maladie de Crohnt 87,8 (48,3) 92,5 (55,3) Questionnaire des maladies inflammatoires de l'intestinl: 173,5 (31,6) 169,8 (36,2) Protéine C réactive - mg/1 7,9 (11,5) 6,3 (9,5) Hémoglobine - mmo1/1 8,3 (0,8) 8,3 (0,8) MC, maladie de Crohn ; Cx601, cellules souches dérivées du tissu adipeux allogéniques expansées ; TNF, facteur de nécrose tumorale. Les données sont des moyennes (écart-type) sauf indication contraire. 5 *Les scores pour l'indice d'activité de la maladie de Crohn péri-anale peuvent se situer dans la plage de 0 à 20 ; des scores supérieurs indiquent une maladie plus sévère. tLes scores pour l'indice d'activité de la maladie de Crohn peuvent se situer dans la plage de 0 à 600 ; des scores supérieurs indiquent une maladie plus sévère. 3048614 51 Les scores pour le questionnaire sur les maladies inflammatoires de l'intestin peuvent se situer dans la plage de 32 à 224 ; des scores supérieurs indiquent une meilleure qualité de vie. 5 Tableau 2. Evénements indésirables liés au traitement jusqu'à la semaine 24 (population de l'innocuité). Cx601 (N = 103) 68 (66,0) 5 (4,9) 18 (17,5) 13 (12,6) 12 (11,7) 10 (9,7) 7 (6,8) 4 (3,9) 3 (2,9) 18 (17,5) 6 (5,8) 5 (4,9) 1(1,0) 1(1,0) 0 Placebo (N = 102) 66 (64,7) 6 (5,9) 14 (13,7) 11 (10,8) 13 (12,7) 5 (4,9) 3 (2,9) 6 (5,9) 6 (5,9) 30 (29,4) 9 (8,8) 9 (8,8) 2 (2,0) 2 (2,0) 2 (2 0) EILT - nb (%) Globaux EILT menant à un retrait de l'étude EILT sérieux EILT chez > 5,0 % des patients* Proctalgie Abcès anal Rhinopharyngite Diarrhées Douleur abdominale Fistule EILT EILT chez > 2,0 % des patients* Abcès anal Proctalgie Douleur procédurale Décharge de la fistule Induration EILT, événement indésirable lié au traitement ; Cx601, cellules souches dérivées du tissu adipeux allogéniques expansées ; *Dans l'un ou l'autre groupe de traitement. 3048614 52 Tableau Si. Analyses de soutien et de sensibilité pour le critère principal : rémission combinée. * Type Ensemble Détails du d'analyse d'analyses traitement des données manquantes Soutien ITT Non-réponse/non- rémission imputé pour toutes les données manquantes et après le traitement de sauvetage (aucune DORP) Soutien PPlt DORP appliquée Non-réponse/non- rémission est imputé après le traitement de sauvetage Soutien PP2 Non-réponse/non- rémission est imputé après le traitement de sauvetage Sensibilité ITT Manquantes = non- réponse/non- rémission après DORP appliquée. Médication de sauvetage non considérée comme un échec Sensibilité ITT Manquantes = non- réponse/nonrémission après DORP appliquée. Analyse logistique y compris facteur de stratification et nombre d'orifices externes au départ en tant que facteurs Cx601 Placebo Différence valeur (%) (%) (%) (IC à 97,5 %) 48,6 32,4 16,2 0,014 (1,3-31,1) 57,0 36,9 20,1 0,010 (3,3-36,9) 63,2 39,7 23,4 0,005 (5,6-41,3) 49,5 34,3 15,2 0,024 (0,2-30,3) 49,5 34,3 NA 0,017 IC, intervalle de confiance ; Cx601, cellules souches dérivées du tissu adipeux allogéniques expansées ; ITT, intention de traiter ; DORP, dernière observation reportée 3048614 53 prospectivement ; NA, non applicable ; PP, selon le protocole ; TNF, facteur de nécrose tumorale. Le traitement de sauvetage est défini comme des corticoïdes à 40 mg d'équivalent de prednisone pendant > 12 semaines ; nouvel anti-TNF comparé au traitement de départ 5 pendant > 8 semaines ; nouvel immunosuppresseur comparé au traitement de départ pendant > 12 semaines ; ou intervention chirurgicale pour la fistule traitée. *Estimation clinique de la fermeture de tous les orifices externes traités qui coulaient au départ, et de l'absence de collections > 2 cm des fistules péri-anales traitées dans > 2 des 3 dimensions sur l'estimation centrale en aveugle par IRM dès la semaine 24. 10 L'estimation clinique de la fermeture a été définie comme l'absence d'écoulement en dépit d'une pression légère des doigts. t La population PP1 comprend ceux sans déviation majeure du protocole (Cx601, n = 86 ; Placebo, n = 84). La population PP2 comprend les patients PP1 qui ont complété la visite de la 15 semaine 24 (Cx601, n = 76 ; Placebo, n = 73). 3048614 54 Tableau S2. Résultats rapportés par les patients d'après les scores de l'indice d'activité de la maladie de Crohn (IAMC)* et du questionnaire sur les maladies inflammatoires de l'intestin (QMII)t jusqu'à la semaine 24 (population mITT). IAMC Cx601 Placebo Différence de traitement (N=103) (N=101) (IC à 95 °A) Total Départ 87,8 (48,3) 93,3 (55,0) semaine 24 92,5 (66,5) 94,1 (76,1) Variation depuis le départ 5,7 (62,2) 2,2 (65,5) 1,8 (-16,0 à 19,7) Nb de selles liquides Départ 9,8 (12,3) 9,3 (9,4) semaine 24 9,5 (12,6) 10,0 (12,6) Variation depuis le départ -0,0 (9,5) 0,9 (10,7) -0,7 (-3,4 à 2,1) Douleurs abdominales Départ 1,6 (2,9) 2,0 (3,1) semaine 24 2,7 (4,5) 3,0 (4,1) Variation depuis le départ 1,1 (4,4) 0,9 (4,0) -0,1 (-1,2 à 1,1) Bien-être général Départ 2,7 (3,7) 3,2 (4,1) semaine 24 3,1 (4,6) 3,3 (4,7) Variation depuis le départ 0,6 (4,5) 0,3 (4,5) 0.1 (-1,1 à 1,3) QMII Cx601 Placebo Différence de traitement (N = 103) (N = 101) (IC à 95 °A) Total Départ 1 73,5 (31,6) 169,4 (36,1) semaine 24 1 78,3 (34,6) 174,7 (36,2) Variation depuis le départ 3,8 (25,5) 4,0 (25,6) 0,3 (-6,6 à 7,3) Fonction intestinale Départ 57,1 (9,2) 56,6 (9,9) semaine 24 57,2 (10,2) 56,4 (9,8) Variation depuis le départ 0,0 (7,6) -0,6 (8,2) 0,5 (-1,6 à 2,7) État émotionnel Départ 62,9 (14,5) 61,4 (15,2) semaine 24 64,7 (15,6) 63,9 (15,3) Variation depuis le départ 1,7 (11,3) 2,1 (11,2) -0,3 (-3,3 à 2,7) Symptômes systémiques Départ 25,8 (5,2) 24,9 (6,5) semaine 24 26,2 (5,9) 25,6 (6,3) Variation depuis le départ 0,3 (4,7) 0,6 (5,1) -0,1 (-1,4 à 1,2) Fonction sociale Départ 27,7 (6,9) 26,5 (8,4) semaine 24 29,5 (7,3) 28,4 (8,0) Variation depuis le départ 1,6 (6,4) 1,7 (6,0) 0,3 (-1,3 à 2,0) IC, intervalle de confiance ; Cx601, cellules souches dérivées du tissu adipeux 5 allogéniques expansées ; mITT, intention de traiter modifiée. 3048614 Les données sont des moyennes (écart-type). *Les scores pour l'indice d'activité de la maladie de Crohn (IAMC) peuvent se situer dans la plage de 0 à 600 ; des scores supérieurs indiquent une maladie plus sévère. tLes scores pour le questionnaire sur les maladies inflammatoires de l'intestin (QMII) 5 peuvent se situer dans la plage de 32 à 224 ; des scores supérieurs indiquent une maladie plus sévère. Les modes de réalisation de l'invention comprennent : 1. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées 10 pour une utilisation dans une méthode de traitement d'une fistule péri-anale complexe réfractaire chez un patient souffrant de la maladie de Crohn. 2. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon le mode de réalisation 1, où la fistule comprend un, deux ou les trois parmi : des voies multiples, deux orifices internes et trois orifices externes. 15 3. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon le mode de réalisation 1 ou le mode de réalisation 2, où la fistule est réfractaire à un ou plusieurs d'un traitement (i) antibiotique, (ii) immunosuppresseur et (iii) anti-TNF. 4. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées 20 pour une utilisation selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents, où le patient ne reçoit ni l'un ni l'autre ou reçoit à la fois un traitement anti-TNF et un traitement immunosuppresseur. 5. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents, où le 25 patient : (a) souffre d'une maladie de Crohn non active ou légèrement active ; et/ou (b) d'une maladie de Crohn luminale. 6. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents, où les 30 cellules sont injectées par voie intralésionnelle. 7. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents, où 120 millions de cellules sont administrées en une seule administration. 8. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées 3048614 56 pour une utilisation selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents, où le traitement induit une rémission combinée ou une rémission clinique. 9. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon le mode de réalisation 8, où la rémission combinée ou la 5 rémission clinique est obtenue en 24 semaines, en 18 semaines ou en 12 semaines. 10. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon le mode de réalisation 9, où la rémission combinée ou la rémission clinique est obtenue en 8 semaines ou en 6 semaines. 11. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées 10 pour une utilisation selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents, où la fistule est suivie par IRM. 12. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents, où au moins environ 90 % ou au moins environ 95 % des cellules souches stromales 15 dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées expriment les marqueurs de surface HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, et CD105. 13. Des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents, où moins d'environ 5 % des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux 20 allogéniques, expansées expriment les marqueurs de surface HLAII, CD1 lb, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 et CD86. 14. Utilisation de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées dans la fabrication d'un médicament pour le traitement d'une fistule péri-anale complexe réfractaire chez un patient souffrant dans la maladie de Crohn. 25 15. Une méthode de traitement d'une fistule péri-anale complexe réfractaire chez un patient souffrant de la maladie de Crohn, chez un patient ayant besoin d'un tel traitement, comprenant l'étape d'administration de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées à la fistule. 16. Une utilisation selon le mode de réalisation 14 ou un procédé selon le mode de 30 réalisation 15, comprenant en outre les caractéristiques de l'un quelconque des modes de réalisation 2 à 13. 3048614 57 Références La pratique de la présente invention emploiera, sauf indication contraire des techniques traditionnelles de biologie cellulaire, de culture cellulaire, de biologie moléculaire, de biologie transgénique, de microbiologie, d'ADN recombinant, et 5 d'immunologie, qui se situent au sein des compétences de l'art. De telles techniques sont pleinement expliquées dans la littérature. Voir, par exemple' Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nde Ed., édité par Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) ; DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984) ; Mullis et al. brevet U.S. No : 10 4 683 195 ; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984) ; Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984) ; Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987) ; Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986) ; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; le traité, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.) ; Gene Transfer Vectors For 15 Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Methods In Enzymology, Vol. 154 et 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987) ; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986) ; Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor 20 Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Toutes les publications et tous les brevets mentionnés ici, y compris ceux énumérés ci-dessous, sont incorporés ici en référence dans leur intégralité comme si chaque publication ou brevet individuel était spécifiquement et individuellement indiqué pour être incorporé en référence. En cas de conflit, la présente demande, y compris toutes 25 les définitions qu'elle renferme, prévaudra. 1. American Gastroenterological Association Medical Position Statement: Perianal Crohn's Disease. Gastroenterology (2003) 125: 1503-1507. 2. Levy C, Tremaine WJ. Inflamm Bowel Dis (2002) 8(2): 106-11. 30 3. Pennincke F, D'Hoore A, Filez L. Acta Gastroenterol Belg (2001) 64(2): 223- 226. 4. Rius J, Nessim A, Nogueras JJ, Wexner SD. Eur J Surg (2000) 166(3): 218- 222. 3048614 58 5. Mizuno H, Zuk PA, Zhu M, Lorenz HP, Benhaim P, Hedrick MIL Plastic Reconstr Surg (2002) 109(1): 199-209. 6. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Tissue Eng (2001) 7(2): 211-228. 7. 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De nombreuses variations de l'invention seront évidentes pour l'homme du métier lors de la consultation de ce mémoire. Les revendications 5 annexées ne sont pas prévues pour revendiquer tous ces modes de réalisation et leurs variations, et l'étendue complète de l'invention devra être déterminée en référence aux revendications, accompagnées de leur étendue complète d'équivalents, et du mémoire, accompagné de ces variations. REVENDICATIONS1. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation dans une méthode de traitement d'une fistule péri-anale complexe réfractaire chez un patient souffrant de la maladie de Crohn, dans laquelle : (i) la fistule comprend des voies multiples ; (ii) 120 millions de cellules sont administrées au patient en une seule procédure ; et (iii) le traitement induit une rémission clinique en 8 semaines. 2. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon la revendication 1, dans laquelle la fistule comprend 2 orifices internes. 3. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la fistule comprend 2 ou 3 orifices externes. 4. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le traitement induit une rémission clinique en 6 semaines. 5. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la rémission clinique est prolongée jusqu'à 24 semaines à partir du traitement. 6. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le traitement induit une rémission combinée en 24 semaines, en 18 semaines, en 12 semaines, en 10 semaines, en 8 semaines, ou en 6 semaines. 7. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, 3048614 65 expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle une amélioration de l'indice d'activité de la maladie péri-anale (IAIVIP) est obtenue en 24 semaines, en 18 semaines, en 12 semaines, en 10 semaines, en 8 semaines, ou en 6 semaines. 5 8. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon la revendication 7, dans laquelle l'amélioration de l'IAMP est une amélioration supérieure à 1,5 point d'IAMP. 10 9. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon la revendication 7 ou la revendication 8, dans laquelle l'amélioration de l'IAMP est une amélioration d'au moins deux points d'IAMP. 10. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, 15 expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la fistule est réfractaire à un ou plusieurs traitements (i) antibiotiques, (ii) immunosuppresseurs et (iii) anti-TNF. 11. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, 20 expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le patient ne reçoit ni l'un ni l'autre ou reçoit à la fois un traitement antiTNF et un traitement immunosuppresseur. 12. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, 25 expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le patient : (c) souffre d'une maladie de Crohn non active ou légèrement active ; et/ou (d) d'une maladie de Crohn luminale. 30 13. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la fistule est suivie par imagerie par résonance magnétique (IRM). 3048614 66 14. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle au moins environ 90 % ou au moins environ 95 % des cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées expriment les marqueurs de 5 surface HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, et CD105. 15. Cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux allogéniques, expansées pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle moins d'environ 5 % des cellules souches stromales dérivées du tissu 10 adipeux allogéniques, expansées expriment les marqueurs de surface HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 et CD86.