Brevet FR3040396A1 — publié le 20170303

La présente invention se rapporte à un procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur, comprenant les étapes suivantes : i) culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, comprenant des étapes spécifiques, ii) mélange d'au moins un échantillon obtenu à l'étape i) avec une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et c) au moins deux ingrédients choisis parmi le DMSO, la L-cystéine, le coenzyme Q10 et les alcanediols en C3-05, puis iii) congélation du mélange obtenu à l'étape ii). La cryoconservation est un processus dans lequel des échantillons biologiques sont stockés à très basse température. La cryoconservation de matériel biologique est généralement effectuée par la congélation dudit matériel, dans un support approprié, tel qu'un tube ou une ampoule en verre ou en matière plastique (généralement appelé "paillette" ou tube de congélation dans le domaine de la cryoconservation), ledit support étant adapté pour le stockage à long terme et à basse température. La cryoconservation pose cependant un certain nombre de problèmes et de contraintes techniques. Notamment, des lésions cellulaires peuvent se produire lors de la décongélation, entraînant l'apoptose ou l'éclatement des cellules. En outre, la survie des cellules cryoconservées peut dépendre des conditions et des techniques employées lors de la congélation. Le contrôle de la vitesse de refroidissement est important : un refroidissement à faible vitesse permet une cristallisation ordonnée de l'eau congelable à l'extérieur des cellules - les cellules se déshydratent, se rétrécissent et l'eau sort de la cellule. Dans le cas contraire, la formation de glace intracellulaire entraîne la destruction des structures membranaires qui est létale pour la cellule. Pour la plupart des cellules de mammifères, comme cela est le cas pour les produits et médicaments de thérapie cellulaire, que les cellules soient ou non génétiquement 3040396 2 modifiées, il est en outre indispensable d'utiliser des cryoprotectants pour préserver l'intégrité et la fonctionnalité cellulaires. Actuellement, la fabrication à une échelle industrielle (européenne ou mondiale 5 notamment) de produits de thérapie cellulaire pose de nouvelles problématiques, telles que la stabilité du produit fini administré et la variabilité liée à la matière biologique de départ. Dans la plupart des cas, le produit fini est conditionné : frais dans un milieu liquide (type albumine ou solution saline) avec une 10 conservation limitée à quelques heures ou jours, ou bien congelé dans une formulation simple à base de DMSO, peu stable et peu efficace à long terme. La quantité non négligeable de cellules mortes, de débris aux effets potentiellement immunogènes et la toxicité pour le patient des excipients couramment utilisés sont autant de limites. La plupart du 15 temps, un lavage des cellules pour retirer ces éléments toxiques (biologiques ou non) est indiqué : ces solutions ne sont pas compatibles avec une distribution industrielle. De plus, elles offrent peu de flexibilité d'administration et de stockage, au contraire des autres classes de médicaments « classiques ». 20 11 existe donc un besoin pour le développement d'un produit et/ou médicament de thérapie cellulaire qui soit stable à long terme (i.e. pendant plusieurs mois), qui soit facile à utiliser, directement injectable et non toxique. 25 La présente invention permet de répondre à ce besoin. En effet, le procédé de cryoconservation selon l'invention permet d'obtenir des produits de thérapie cellulaire comprenant des lymphocytes infiltrant la tumeur, prêts à l'emploi (i.e. prêts à être injectés sans lavage, ce qui évite toutes manipulations supplémentaires provoquant une baisse de viabilité et une perte de cellules), stables à long terme, 30 faciles à utiliser et non toxiques. 3040396 3 La présente invention se rapporte donc à un procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur, comprenant les étapes suivantes : i) culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase issu d'un patient atteint d'un 5 mélanome de stade 3 ou 4, comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés, afin d'obtenir au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur, 10 ii) mélange d'au moins un échantillon obtenu à l'étape i) avec une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et c) au moins deux ingrédients choisis parmi le DMSO, la L-cystéine, le 15 coenzyme Q10 et les alcanediols en C3-05, puis iii) congélation du mélange obtenu à l'étape ii). La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : 20 a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et c) au moins deux ingrédients choisis parmi le DMSO, la L-cystéine, le coenzyme Q10 et les alcanediols en C3-05, pour la cryoconservation d'au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur (appelés également « TILs » pour 25 « Tumor Infiltrating Lymphocytes »), ledit échantillon étant obtenu par culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement 30 de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés. 3040396 4 Par lymphocytes infiltrant la tumeur (appelés également « TILs » pour « Tumor Infiltrating Lymphocytes »), on entend des lymphocytes infiltrant la tumeur qu'ils soient ou non génétiquement modifiés. 5 La composition utilisée dans le procédé de cryoconservation selon l'invention (étape ii)) comprend donc, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et 10 c) au moins deux ingrédients choisis parmi le DMSO, la L-cystéine, le coenzyme Q10 et les alcanediols en C3-05. Par « milieu physiologiquement acceptable », on entend un milieu aqueux comprenant des électrolytes. Les électrolytes sont par exemple des sels de sodium, de 15 potassium, de magnésium et/ou de calcium avec des anions de type chlorure, carbonate, hydroxyde ou caprylate. De préférence, le milieu pharmaceutiquement acceptable est un milieu aqueux comprenant du chlorure de sodium et du caprylate de sodium. 20 La composition utilisée dans le procédé de cryoconservation selon l'invention comprend la sérum albumine humaine (composé a)). Cette protéine est une protéine plasmatique de haut poids moléculaire (environ 65 kDa). C'est la protéine la plus abondante du plasma ; sa concentration moyenne normale est de 38 à 48 g/l. Elle permet de tamponner le pH et de maintenir l'osmolarité. Sa pureté est de préférence 25 de 95%. On peut également utiliser un ou plusieurs fragments et/ou dérivés de la sérum albumine humaine, lesdits fragments ou dérivés étant non immunogènes et ayant une propriété oncotique similaire à la sérum albumine humaine. De préférence, la sérum albumine humaine, ses fragments et/ou dérivés, est présente en quantité comprise entre 2 et 10% en poids par rapport au poids total de 30 composition, de préférence entre 2.5 et 6% en poids, de préférence entre 3.5 et 4.5% en poids. 3040396 5 Dans la présente demande, sauf mention contraire, les quantités sont mentionnées en poids par rapport au poids total de composition. La composition utilisée dans le procédé de cryoconservation selon l'invention 5 comprend également au moins un saccharide (composé b)). Le saccharide améliore la survie et la fonction des cellules en préservant l'équilibre osmotique. Une fraction pénètre les cellules et permet de stabiliser les structures membranaires. Le saccharide est de préférence choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides et les trisaccharides. 10 Les monosaccharides sont de préférence choisis parmi le glucose, le galactose, le fructose et le mannose. Le disaccharide a de préférence pour formule A-B, dans laquelle A et B sont chacun indépendamment choisis parmi le glucose, le fructose et le mannose. Le saccharide est de préférence un disaccharide. Le disaccharide est de préférence un dimère de 15 glucose. Plus préférentiellement, le disaccharide est choisi parmi le tréhalose et le saccharose. Plus préférentiellement, le disaccharide est le tréhalose. Les trisaccharides sont de préférence choisis parmi le raffinose (trimère de galactose, glucose et fructose), le maltotriose et l'isomaltotriose (trimères de glucose). Le saccharide est de préférence présent dans la composition selon l'invention en 20 concentration comprise entre 0.05M et 1M, de préférence entre 0.07M et 0.5M, de préférence entre 0.08M et 0.12M. La composition utilisée dans le procédé de cryoconservation selon l'invention comprend enfin au moins deux ingrédients choisis parmi le DMSO, la L-cystéine, le 25 coenzyme Q10 et les alcanediols en C3-05 (composés c)). Le DMSO, ou diméthylsulfoxyde, est un solvant polaire organique aprotique de formule CH3-SO-CH3. C'est un cryoprotectant intracellulaire qui a pour but principal de remplacer le liquide intracellulaire, et qui permet ainsi de prévenir la formation de cristaux de glace et le stress osmotique inhérent aux phases de 30 congélation/décongélation qui font éclater les structures membranaires. Il est de préférence présent dans la composition selon l'invention en quantité comprise entre 2 et 15% en poids, de préférence entre 2.5 et 4.5% en poids. 3040396 6 La L-cystéine est un acide aminé présentant un groupement thiol -SH. Elle est de préférence présente dans la composition en concentration comprise entre 0.05mM et 5mM, de préférence entre 0.5mM et 2mM. Le coenzyme Q10, également appelé ubiquinone, est un composé chimique 5 comprenant un groupement quinone. Son nom chimique est le 2,3-diméthoxy-5- méthy1-6-décaprénylbenzoquinone. 11 est de préférence présent dans la composition en quantité comprise entre 0.005 et 1% en poids, de préférence entre 0.007 et 0.5% en poids, de préférence entre 0.007 et 0.1% en poids. L'alcanediol en C3-05 est de préférence un alcane linéaire, ramifié ou cyclique 10 comprenant de 3 à 5 atomes de carbone, et 2 groupements hydroxyl. De préférence, il est choisi parmi les alcanes linéaires comprenant de 3 à 5 atomes de carbone, et 2 groupements hydroxyl. Plus préférentiellement, il est choisi parmi le propane-1,2- diol, le pentane-1,5-diol et le butane-2,3-diol. L'alcanediol en C3-05 est de préférence le propane-1,2-diol (également appelé propylène glycol). 15 L'alcanediol en C3-05 est de préférence présent dans la composition en quantité comprise entre 3 et 10% en volume, de préférence entre 3 et 7% en volume. De préférence, la composition utilisée dans le procédé de cryoconservation selon l'invention comprend au moins les deux ingrédients suivants comme composés c) : 20 du DMSO et de la L-cystéine, ou du coenzyme Q10 et un alcanediol en C3-05, de préférence le propylène glycol. De préférence, la composition utilisée dans l'étape ii) du procédé de 25 cryoconservation selon l'invention comprend, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, de préférence en quantité comprise entre 2.5 et 6% en poids, b) un saccharide, de préférence du tréhalose, de préférence en concentration 30 comprise entre 0.07M et 0.5M, et c) du DMSO et de la L-cystéine, de préférence respectivement en quantité comprise entre 2 et 5% en poids, et en concentration comprise entre 0.5mM et 2mM. 3040396 7 Alternativement, de préférence, la composition utilisée dans l'étape ii) du procédé de cryoconservation selon l'invention comprend, dans un milieu physiologiquement acceptable : 5 a) de la sérum albumine humaine, de préférence en quantité comprise entre 2.5 et 6% en poids, b) un saccharide, de préférence du tréhalose, de préférence en concentration comprise entre 0.07M et 0.5M, et c) du coenzyme Q10 et du propane-1,2-diol, de préférence respectivement en 10 quantité comprise entre 0.007 et 0.1% en poids, et en quantité comprise entre 3 et 10% en volume. Le procédé de cryoconservation selon l'invention est particulièrement intéressant, et vise à cryoconserver au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur. En 15 effet, comme démontré en exemple, la composition utilisée dans l'étape ii) du procédé de cryoconservation selon l'invention permet de cryoconserver les TILs, de façon durable et efficace (notamment jusqu'à 4 mois après décongélation). Les lymphocytes infiltrant la tumeur (ou TILs) sont des lymphocytes typiquement 20 retrouvés dans des nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase de patients atteints de mélanome à un stade avancé (stade 3 ou 4). Ils sont impliqués dans la mort des cellules tumorales, et sont actuellement testés dans différents essais cliniques comme produits de thérapie cellulaire. Les TILs proviennent en général de patients eux-mêmes ; ils sont autologues. Pour cela, ils sont prélevés du patient, 25 isolés de la tumeur et sont multipliés in vitro. Plus précisément, l'échantillon de TILs utilisé dans le procédé selon la présente invention est obtenu par une étape i) de culture in vitro comprenant les étapes suivantes : émergence de lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans un prélèvement 30 de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase. Cette émergence est également appelée « culture primaire » ou « sortie » ; c'est l'étape au cours de laquelle les lymphocytes infiltrant la tumeur, initialement contenus dans le 3040396 8 prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, passent dans le milieu de culture et sont cultivés in vitro, stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin 5 amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape de stimulation. L'étape d'émergence des TILs est de préférence réalisée par culture primaire du prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint 10 d'un mélanome de stade 3 ou 4, de préférence dans un récipient de culture clos. La source de TILs est en effet un échantillon de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase du patient atteint de mélanome de stade 3 ou 4 : elle peut être prélevée par biopsie (prélèvement tumoral). La culture primaire se fait de préférence dans un milieu de culture sélectif sans sérum de type X-VIVO 15® (commercialisé par 15 Cambrex Corp) supplémenté en interleukine-2 (IL-2). Par « récipient de culture clos », on entend un système permettant d'entretenir des cellules en culture dans un milieu adapté, sans que celles-ci ne soient directement au contact avec l'environnement extérieur. Ainsi, le récipient est clos, i.e. son volume intérieur n'est pas en contact avec l'air ambiant, notamment lors de la culture, lorsque 20 les TILs et le milieu de culture sont introduits dans le récipient. Après émergence des TILs, ces derniers subissent une étape de stimulation de préférence dans un récipient de culture clos compartimenté. Cela permet une augmentation quantitative significative du rendement global des TILs (jusqu'à 2,5 25 fois) par comparaison avec la même technique mise en oeuvre dans un système ouvert ou non compartimenté. Elle permet également une augmentation qualitative des TILs produits. En effet, parmi les TIL produits, la proportion de TIL CD8+ est supérieure à celle produite (85% versus 60%) en condition classique, et présente une activité cytotoxique spécifique vis-à-vis de la lignée tumorale autologue plus 30 importante (14% versus 2%). Selon une mise en oeuvre préférée, les TILs sont stimulés en présence au moins de cellules nourricières allogéniques irradiées non proliférantes. Ces cellules 3040396 9 nourricières allogéniques sont rendues non proliférantes par exemple par irradiation. De préférence, on stimule les TILs par co-culture avec un mélange formé de cellules mononucléées issues de sang de donneur humain sain (non proliférantes) et de cellules B transformées par le virus d'Epstein Barr (non proliférantes), de préférence 5 la lignée LAZ388. De préférence, on co-cultive les cellules nourricières allogéniques non proliférantes et les TILs dans un milieu de culture sélectif sans sérum de type X-VIVO 15® (commercialisé par Cambrex Corp) supplémenté en interleukine-2 (IL-2). En outre, au cours de l'étape de stimulation, on introduit de préférence dans le récipient de 10 stimulation clos, parallèlement aux lymphocytes, un agent mitotique tel que la PHA- L (phytohémagglutinine de type L) favorable à l'amplification des lymphocytes. Généralement, le récipient de culture clos compartimenté comporte au moins deux compartiments, dits l'un chambre technique, l'autre chambre de tranquillisation, communiquant entre eux, et au moins une voie d'accès débouchant dans l'un des 15 compartiments. On introduit les TILs et les cellules nourricières allogéniques irradiées non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire de ladite voie d'accès, et on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire de la ou d'une autre voie d'accès. 20 L'étape de stimulation des TILs est suivie d'une étape d'amplification. Typiquement, les TILs stimulés sont récoltés puis transférés en système de culture. Les poches sont incubées, et 2 fois par semaine, du milieu neuf additionné d'IL-2 est ajouté à chaque poche. On obtient ainsi des poches dont la concentration en TILs est comprise entre 1.106 et 25 3. 106 lymphocytes/ml. II est possible de mettre en oeuvre les étapes d'émergence, de stimulation et d'amplification dans un récipient de culture clos différent d'une étape à une autre. Dans ce cas, le transfert d'un récipient clos à un autre est réalisé de façon stérile, par 30 exemple en connectant, à l'aide d'un appareil de connexion stérile de type SCD® de Terumo, les tubulures servant de voies d'accès. En variante, les récipients clos 3040396 10 d'émergence, de stimulation et d'amplification sont pré-connectés entre eux au moment de la fabrication, de sorte à former un système clos. Un tel système permet de réaliser la culture complète des lymphocytes T en système clos, limitant ainsi le risque de contamination. 5 Dans le procédé de cryoconservation selon l'invention, l'étape de mélange ii) de l'échantillon de TILs avec la composition décrite ci-dessus se fait typiquement par dilution. De préférence, l'échantillon de TILs est repris dans le composé a) sous forme liquide, de préférence pour 50% du volume, puis les composés b) et c), de 10 préférence précédemment mélangés entre eux pour obtenir une solution de concentration 2x, sont ajoutés. Le mélange de l'étape i) peut se faire aux alentours de 4°C, ou à température ambiante (i.e. 20°C). De préférence, l'échantillon de TILs subit une centrifugation, le surnageant est retiré et le culot est suspendu dans la composition décrite ci-dessus. 15 Quant à la congélation (étape iii)) du procédé de cryoconservation selon l'invention, elle est de préférence effectuée sur une descente en température de +4°C ou température ambiante jusqu'à une température comprise entre -100°C et -160°C. L'étape de congélation (étape ii)) est de préférence effectuée jusqu'à une température 20 comprise entre -100°C et -180°C, de préférence comprise entre -140°C et -160°C. L'échantillon est ensuite stocké à une température inférieure à -130°C en général. De préférence, la congélation iii) est réalisée en plaçant le mélange obtenu dans l'étape ii) dans un récipient immergé dans un mélange d'isopropyl alcool à +4°C, le tout étant mis à une température comprise entre -70°C et -100°C. Ce système 25 (« congélation en boîte Nalgène ») permet, grâce au refroidissement lent de l'alcool, une descente en température quasi-linéaire comprise entre -1°C et -2°C par minute. Alternativement, de préférence, la congélation iii) est effectuée à l'aide d'un congélateur programmé. De tels congélateurs sont notamment commercialisés par Air Liquide ou Cryobiosystem. Ils permettent notamment une descente en 30 température plus reproductible et des schémas plus complexes. De préférence, la congélation iii) se fait, notamment à l'aide d'un congélateur programmé, selon les étapes suivantes : 3040396 11 placer le mélange obtenu à l'étape ii) à une température de +4°C ; puis diminuer la température de 1°C par minute, de +4°C à -40°C ; puis diminuer la température de 10°C par minute, de -40°C à -150°C, pour atteindre une température finale de stockage d'environ -150°C en moyenne, 5 en conteneur d'azote liquide ou gazeux. Le produit ainsi obtenu, congelé, peut être conservé pendant quelques mois à -150°C environ. 10 L'invention va maintenant être exemplifiée à l'aide des exemples qui suivent, qui ne sont pas limitatifs. Exemple 1: préparation et cryoconservation d'un échantillon de TILs selon le procédé de l'invention 15 Le produit TILs constitue un Médicament de Thérapie Innovante (MTI) de nature autologue. Il est constitué de cellules vivantes exclusivement destinées au patient, donneur de la matière de départ (en l'occurrence le ganglion prélevé sur le patient). Les TILs d'un patient, après amplification ex vivo, seront réinjectées à ce même 20 patient : c'est un système autologue. Le procédé est le suivant : La matière première de départ est constituée de lymphocytes infiltrant les tumeurs métastatiques isolées de ganglions de patients atteints de mélanome malin cutané. 25 Les patients subissent préalablement un criblage virologique (CMV, hépatites B et C, HIV, HTLV, EBV et parvovirus B19). Etape i) du procédé : obtention d'un échantillon de TILs : 30 Le(s) morceau(x) de prélèvements (cutanés, pulmonaires et/ou ganglionnaires) envahis de cellules de mélanome au stade métastatique sont recueillis aseptiquement 3040396 12 en per-opératoire, puis placés « à sec » (sans conditionnement dans un milieu de transport) dans des contenants stériles. Ils sont ensuite découpés en fragments de 1 à 2 mm. Les fragments de chaque prélèvement tumoral sont ensuite congelés en cryotube, dans l'attente de leur 5 préparation. Etape d'émergence de TILs : Les cryotubes de fragments tumoraux sont décongelés et placés dans des puits de plaques de culture 12 puits contenant du milieu de culture X VIVO 15® et de l'IL-2. 10 Les plaques sont incubées à 37°C, à 5% de CO2. Les puits sont examinés au microscope inversé et le milieu de culture additionné d'IL-2 est renouvelé par moitié du volume 2 fois par semaine. Au bout de 10-12 jours de culture, la totalité des TILs en sortie des morceaux tumoraux est récoltée, et une quantité définie de ces TILs est utilisée pour 15 stimulation. Etape de stimulation de TILs : Les TILs viables obtenus précédemment sont mis en co-culture, en présence de PHA-L, avec des cellules nourricières irradiées composées de lymphocytes 20 allogéniques (issus d'une banque sécurisée de cellules mononucléées constituée à partir de résidus d'anneau de kit de don de CPA de 3 donneurs sains) et de cellules LAZ irradiées (lignée B allogénique transformée par le virus d'Epstein Barr : lignée LAZ388). L'irradiation des cellules nourricières est nécessaire pour bloquer la prolifération de 25 ces cellules sans nuire à leurs effets nourriciers (production de facteurs solubles, expression de marqueurs à leur surface...) importants dans l'activation et la prolifération des TILs. TILs (1,8.106 cellules) et cellules nourricières (lymphocytes allogéniques : 240.106 cellules; LAZ388 : 120.106 cellules) sont mis en culture dans 60 plaques 96 puits 30 dans un milieu de culture X VIVO 15® et de l'IL-2. Les plaques sont incubées à 37°C, à 5% de CO2. 3040396 13 2 fois par semaine, le tiers supérieur du milieu présent dans les puits est éliminé et remplacé par du milieu neuf et de l'IL-2. Après 10 à 13 jours, les TILs ont proliféré et forment une pastille opaque au fond des puits. Le contenu de tous les puits est alors recueilli. 5 Etape d'amplification de TILs : Les TILs récoltés à partir des plaques 96 puits sont transférés en poche de culture et la concentration cellulaire réajustée. Les poches sont incubées et 2 fois par semaine, du milieu neuf X VIVO 15® et de l'IL-2 sont ajoutés à chaque poche, de manière à 10 ajuster la concentration des TILs dans les poches à 1.106 lymophocytes/ml. Etape ii) du procédé : mélange de l'échantillon de TILs avec la composition de cryoconservation : 15 Après 10 jours de culture en poche (étape d'amplification), le volume de suspension cellulaire récolté à partir des poches de TILs est réduit par centrifugation pour concentrer les TILs, qui sont lavés en eau physiologique tamponnée (NaC1 0.9%). Le culot contenant les cellules est ensuite mélangé avec l'une des compositions suivantes : 20 la « composition A », comprenant 3.5% de DMSO, 1mM de L-cystéine, 0.1M de tréhalose et 4% de sérum albumine humaine (AH) ; ou la « composition B », comprenant 5% de propylène glycol, 0.01% de coenzyme Q10, 0.1M de tréhalose et 4% de sérum albumine humaine (AH). 25 Etape iii) du procédé : congélation du mélange obtenu : Chaque mélange obtenu à l'issue de l'étape ii) est congelé à -150°C. Chaque produit est conservé sous forme congelée en conteneur d'azote gazeux à une température inférieure à -150°C, en attendant la décongélation et l'administration au 30 patient. Chaque cryotube réalisé contient : 3040396 14 1. 75x106 cellules viables 2. Une concentration cellulaire constante fixée à 75x106 cellules viables/mL. 3. Le volume du produit est de 1 ml 4. Sa composition cellulaire est la suivante : 5 a. Substance active : i. Plus de 99% de cellules CD45±. ii. Plus de 50% de lymphocytes T CD45+ CD3+ CD8+ immunocompétents co-exprimant l'IFNg et CD107a en réponse à une activation CD3+ CD25+ (= test de potentialité). 10 b. Impuretés : i. Traces de cellules tumorales HMB45+ ( REVENDICATIONS1. Procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur, comprenant les étapes suivantes : i) culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase issu d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés, afin d'obtenir au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur, ii) mélange d'au moins un échantillon obtenu à l'étape i) avec une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et c) au moins deux ingrédients choisis parmi le DMSO, la L-cystéine, le coenzyme Q10 et les alcanediols en C3-05, puis iii) congélation du mélange obtenu à l'étape ii). 2. Procédé de cryoconservation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le saccharide est choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides et les trisaccharides. 3. Procédé de cryoconservation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le saccharide est un disaccharide choisi parmi le tréhalose et le saccharose. 4. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'alcanediol C3-05 est choisi parmi le propane-1,2-diol, le pentane-1,5-diol et le butane-2,3-diol. 3040396 27 5. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la sérum albumine humaine est présente en quantité comprise entre 2 et 10% en poids par rapport au poids total de composition, de préférence entre 2.5 et 6% en poids. 5 6. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le saccharide est présent en concentration comprise entre 0.05M et 1M, de préférence entre 0.07M et 0.5M. 10 7. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition utilisée à l'étape ii) comprend : a) de la sérum albumine humaine, de préférence en quantité comprise entre 2.5 et 6% en poids, b) du tréhalose, de préférence en concentration comprise entre 0.07M et 0.5M, et 15 c) du DMSO et de la L-cystéine, de préférence respectivement en quantité comprise entre 2 et 15% en poids, et en concentration comprise entre 0.5mM et 2mM. 8. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition utilisée à l'étape ii) comprend : 20 a) de la sérum albumine humaine, de préférence en quantité comprise entre 2.5 et 6% en poids, b) du tréhalose, de préférence en concentration comprise entre 0.07M et 0.5M, et c) du coenzyme Q10 et du propane-1,2-diol, de préférence respectivement en quantité comprise entre 0.007 et 0.1% en poids, et en quantité comprise entre 3 et 25 10% en volume. 9. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la congélation iii) est effectuée jusqu'à une température comprise entre -100°C et -180°C, de préférence comprise entre -140°C et -160°C. 30 10. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la congélation iii) est réalisée en plaçant le mélange obtenu en ii) dans un 3040396 28 récipient immergé dans un mélange d' isopropyl alcool à +4°C, le tout étant mis à une température comprise entre -70°C et -100°C. 11. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en 5 ce que la congélation iii) est effectuée à l'aide d'un congélateur programmé. 12. Utilisation d'une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, 10 b) au moins un saccharide, et c) au moins deux ingrédients choisis parmi le DMSO, la L-cystéine, le coenzyme Q10 et les alcanediols en C3-05, pour la cryoconservation d'au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur, ledit échantillon étant obtenu par culture in vitro de lymphocytes infiltrant la 15 tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase issu d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin 20 l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés. 13. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 11, ou utilisation selon la revendication 12, dans lequel la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence se fait en présence au moins de cellules 25 nourricières allogéniques irradiées non proliférantes. 14. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 11 ou 13, ou utilisation selon la revendication 12 ou 13, dans lequel la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence se fait par co-culture 30 avec un mélange formé de cellules mononucléées issues de sang de donneur humain sain et de cellules B transformées par le virus d'Epstein Barr, de préférence la lignée LAZ388, toutes non proliférantes.