Brevet FR3047180A1 — publié le 20170804

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un extrait de Vitex Negundo riche en polyphénols ainsi qu'un extrait directement obtenu par un tel procédé. ART ANTERIEUR Vitex Negundo, également appelé muguet bleu ou Troène de Chine, est un arbuste de la famille des Verbenaceae selon la classification classique. Vitex Negundo est connu comme une plante tonique puissante présentant de nombreuses propriétés biologiques bénéfiques pour la santé. Toutes les parties de Vitex Negundo, y compris les feuilles, les fleurs, les racines et les graines, ont été couramment utilisées en médecine populaire depuis de nombreuses années, surtout dans les pays asiatiques. Du fait de ses très nombreuses propriétés biologiques et de ses usages traditionnels, la composition phytochimique de la plante est très connue. Plus de 150 composés ont ainsi été identifiés dans la bibliographie, à partir d'extraits de différentes parties de plantes (C.J. ZHENG et al., Phytother. Res. 29 : 633-647 (2015)). D'après ces études, les flavonoïdes, les lignanes et les terpénoïdes s'avèrent être les trois principaux métabolites contenus dans Vitex Negundo. Jusqu'à ce jour, la teneur maximale observées en acides dicaféoylquiniques totaux est d'environ 1 % en poids, par rapport au poids total de l'extrait sec (M Huang et al., 20 Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 108(2015) 11-20). RESUME DE L'INVENTION Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont développé un procédé de préparation d'un extrait de Vitex Negundo particulièrement riche en polyphénols, notamment en acides dicaféoylquiniques (DCQ). En particulier, les inventeurs ont 25 découvert que la culture de Vitex Negundo dans des conditions particulières permettent d'obtenir un extrait de Vitex Negundo comprenant de manière inattendue une très forte teneur en polyphénols, notamment en acides dicaféoylquiniques, et une teneur quasi-nulle en flavonoïdes, usuellement présents en grande quantité dans la plante. Le procédé d'extraction selon l'invention a également pour avantage de permettre la réalisation 30 d'extractions successives à partir des racines de la plante sans la détruire, ni altérer sa survie, tout en maximisant l'extraction des molécules d'intérêt. 3047180 2 Dans un premier aspect, la présente invention concerne donc un procédé de préparation d'un extrait de Vitex Negundo comprenant les étapes successives suivantes : a) culture de Vitex negundo en aéroponie ; b) extraction par exsudation racinaire des plantes ; et 5 c) purification et concentration de l'extrait ainsi obtenu par filtrations successives, en particulier par nanofiltration et/ou filtration stérilisante. Dans un second aspect, l'invention concerne un extrait de Vitex Negundo obtenu par le procédé décrit ci-dessus. 10 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Définitions Par "acide dicaféoylquinique" (pouvant être abrégé en « DCQ » dans la présente description), on entend un diester composé d'une molécule d'acide quinique dont deux des quatre fonctions alcools ont été estérifiées par une molécule d'acide caféique. Les acides 15 dicaféoylquiniques sont donc des acides de formule générale (I) : OH (I) dans laquelle deux quelconques des radicaux R2, R3, R4 et R5 représentent un groupement caféyl, les deux autres représentant un atome d'hydrogène. Les différents isomères de DCQ sont donc des acides de formule générale (I), avec R2, R3, R4 et R5 tels que définis dans le Tableau 1 ci-dessous. Acides dicaféoylquiniques (DCQ) R2 R3 R4 R5 1,3-dicaféoylquinique (1,3-DCQ) Caféyl Caféyl H H 1,4-dicaféoylquinique (1,4-DCQ) Caféyl H Caféyl H 1,5-dicaféoylquinique (1,5-DCQ) Caféyl H H Caféyl 3,4-dicaféoylquinique (3,4-DCQ) H Caféyl Caféyl H également appelé acide isochlorogénique B 3,5-dicaféoylquinique (3,5-DCQ) H Caféyl H Caféyl également appelé acide isochlorogénique A OR5 OR4 3047180 3 4,5-dicaféoylquinique (4,5-DCQ) H H Caféyl Caféyl également appelé acide isochlorogénique C Tableau 1. Structure des acides dicaféoylquiniques. Par « groupement caféyl », on entend un radical de formule générale (II), issu de l'acide caféique : 5 On entend par « partie » d'une plante toute partie constitutive d'une plante telle que les racines, la tige, les feuilles, le fruit, la peau, les graines ou le noyau. Par « exsudation racinaire », on entend, au sens de la présente invention, la 10 récupération des métabolites contenus dans les racines des plantes au moyen d'un liquide mis en contact par percolation, aspersion ou immersion avec les racines, encore accrochées à la plante vivante ou fraichement coupées (depuis moins de 24 heures, et de préférence le plus tôt possible après coupage, idéalement juste après coupage). En particulier, l'exsudation racinaire peut être effectuée grâce à une étape de macération des racines des 15 plantes, fraichement coupées et/ou encore accrochées à la plante vivante, dans un solvant approprié et pendant une durée appropriée. Dans le cadre de l'invention, on entend par « culture des plantes en aéroponie », un mode de culture hors sol pour lequel les racines des plantes ne sont en contact ni avec un milieu solide, ni même avec un milieu liquide : elles sont alimentées par un brouillard 20 nutritif obtenu par brumisation (via un brumisateur) de la solution nutritive dans un milieu fermé. Procédé de préparation d'un extrait de Vitex Negundo selon l'invention La présente invention concerne un procédé de préparation d'un extrait de Vitex Negundo riche en polyphénols, notamment en acides dicaféoylquiniques, à partir de plantes cultivées en aéroponie et alimentées par une solution nutritive et/ou aspergées par un liquide de lessivage, ladite solution et/ou ledit liquide étant ensuite récupéré(e)(s) et traitéee(s) pour en extraire les molécules d'intérêts qui ont été libérées par les racines desdites plantes. Ce type de procédé correspond au procédé développé par la société Plant Advanced technologies (PAT) sous le nom de «PAT Plantes à Traire® » et décrit dans la 3047180 4 demande internationale WO 01/33942. Le contenu de la demande internationale WO 01/33942 est incorporé par référence à la présente description. Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de 5 préparation d'un extrait de Vitex Negundo comprenant les étapes successives suivantes : a) culture de Vitex negundo en aéroponie ; b) extraction par exsudation racinaire des plantes ; et c) purification et concentration de l'extrait ainsi obtenu par filtrations successives, en particulier par nanofiltration et/ou filtration stérilisante. 10 Lors de l'étape a), les plantes cultivées en aéroponie sont alimentées par pulvérisation racinaire d'une solution nutritive de sels minéraux essentiels (Azote - N, Phosphore - P, Potassium - K), afin d'obtenir un développement racinaire maximum et une concentration maximum en molécules d'intérêt, sans altérer à la survie de la plante. 15 L'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales, sait comment adapter les proportions et concentrations des différents sels minéraux pour optimiser le développement racinaire et la concentration des molécules d'intérêt. Les concentrations en sels minéraux des solutions nutritives sont avantageusement comprises dans une gamme d' électroconductivité allant de 0,2 à 1,6mS. 20 L'étape a) est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 1 semaine et huit semaines. Les plantes ainsi cultivées sont ensuite soumises à une étape b) d'extraction par exsudation racinaire dans des conditions déterminées en termes de solvant d'extraction, pH 25 et durée d'extraction, afin d'obtenir un extrait riche en molécules d'intérêts, c'est-à-dire en polyphénols, notamment en acides dicaféoylquiniques. Cette étape b) permet la récupération des métabolites (DCQ) libérés par les racines des plantes au moyen d'un liquide mis en contact par percolation ou immersion avec les racines. Ainsi, de manière avantageuse, dans le procédé selon l'invention, l'étape b) d'exsudation racinaire est effectuée par macération des racines dans un solvant choisi parmi l'eau, la glycérine, les glycols, et leurs mélanges, en particulier parmi les mélanges binaires eau/glycérine et eau/glycols, plus particulièrement parmi les mélanges binaires 3047180 5 eau/propanediol et eau/propylène glycol. Ces solvants permettent de favoriser l'extraction d'une forte teneur en acides dicaféoylquiniques. Avantageusement, l'étape b) d'exsudation racinaire est effectuée par macération des racines pendant une durée comprise entre 30 minutes à 96 heures, notamment entre 12 5 heures et 72 heures, plus particulièrement entre 24 heures et 48 heures. La durée d'exsudation racinaire est choisie de manière à favoriser l'extraction d'une forte teneur en composés d'intérêt tout en altérant pas la survie de la plante et sans mener à l'épuisement des ressources. L'extraction est avantageusement réalisée à pH acide. Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, avant l'étape b), une étape 10 a') de stimulation des racines des plantes, en particulier avec une solution comprenant des sels, des tensioactifs, des détergents, des solvants, des éliciteurs d'origine fongique ou bactérienne, des dérivés de l'acide jasmonique, des générateurs d'éthylène, des chitines, des chitosans ou leurs mélanges. Cette étape de stimulation permet d'augmenter de manière significative la teneur des métabolites dans les racines et ainsi favoriser le flux 15 comprenant les métabolites sortant des racines vers le solvant choisi pour la macération et ce, sans perte totale de la viabilité de la plante afin qu'elle puisse être réutilisée. En d'autres termes, l'étape de stimulation de la plante permet de favoriser la teneur et la sécrétion des molécules d'intérêt. Avantageusement, l'étape a') de stimulation des racines est réalisée par 20 pulvérisation de la plante avec une solution d'éliciteurs choisie parmi les dérivés d'acide jasmonique, les générateurs d'éthylène, les chitines, les chitosans et leurs mélanges. En outre, l'étape a') est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 1 jour et deux semaines. L'étape a') peut être effectuée de manière simultanée ou après l'étape a). Dans le 25 cas où l'étape a') est effectuée de manière simultanée à l'étape a) (dans ce cas, de préférence à la fin de l'étape a), plus longue), la solution de stimulation peut être introduite dans la solution nutritive. Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, après l'étape b), une étape 30 b') d'isomérisation des acides dicaféoylquiniques obtenus en acide 4,5-dicaféoylquinique. Cette étape d'isomérisation est réalisée selon des techniques connues de l'homme du métier, notamment par réajustement successifs de pH de l'extrait (extraction à pH acide, réajustement à pH basique par une solution de base forte et réajustement final à pH acide 3047180 6 par l'ajout d'un acide fort). L'étape b') permet d'obtenir un extrait de Vitex Negundo caractérisé en ce que la majorité des acides dicaféoylquiniques qu'il comprend sont sous la forme de l'isomère 4,5-O-dicaféylquinique. Enfin, l'extrait obtenu à la suite de l'étape b) ou b') est soumis à une dernière étape 5 c) de purification et concentration par filtrations successives, en particulier par nanofiltration et/ou filtration stérilisante. Cette étape permet d'obtenir l'extrait final de Vitex Negundo riche en polyphénols, notamment en DCQ. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir un extrait de Vitex Negundo 10 particulièrement riche en polyphénols, notamment en acides dicaféoylquiniques, en particulier en un mélange des différents isomères d'acides dicaféoylquiniques dont maj oritairement l'acide 4, 5-dicaféoylquinique (acide isochlorogénique C). Avantageusement, l'extrait obtenu par le procédé selon l'invention comprend au moins 5%, en particulier au moins 6 %, plus particulièrement au moins 7 %, en poids de 15 polyphénols, exprimé en équivalent d'acide gallique, par rapport au poids total de l'extrait sec. Ces pourcentages sont obtenus par un dosage de Folin-Ciocalteu. Dans un dosage de Folin-Ciocalteu, l'ensemble des composés phénoliques est oxydé par le réactif de Folin-Ciocalteu (disponible dans le commerce). Ce dernier comprend un mélange d'acide phosphotungstique (H3PW12040) et d'acide 20 phosphomolybdique (H3PMo12040) qui est réduit, lors de l'oxydation des substances phénoliques, en un mélange d'oxydes bleus de tungstène (W8023) et de molybdène (Mo8023). La coloration bleue produite possède une absorption maximum aux environs de 750-760 nm. Elle est proportionnelle à la quantité de composés phénoliques oxydés. Le phénol de référence utilisé dans cette méthode est l'acide gallique. Les résultats obtenus par 25 ce dosage sont donc exprimés en « % en poids de polyphénols, exprimé en équivalent d'acide gallique, par rapport au poids total de l'extrait sec ». Avantageusement, l'extrait obtenu par le procédé selon l'invention comprend au moins 1,5 %, en particulier au moins 2,5 %, plus particulièrement au moins 4 %, notamment au moins 6 %, en poids d'acides dicaféoylquiniques, par rapport au poids total 30 de l'extrait sec. Cet extrait « sec » est obtenu par évaporation du solvant à l'étuve à 105°C, jusqu'à obtention d'un extrait à poids constant. L'extrait « sec » ainsi obtenu est donc essentiellement dépourvu de substances volatiles, notamment les solvants et en particulier l'eau. Lesdits acides dicaféoylquiniques sont notamment les isomères d'acide 3,4- 3047180 7 dicaféoylquinique (3,4-DCQ), 3,5-dicaféoylquinique (3,5-DCQ) et 4,5-dicaféoylquinique (4,5-DCQ). De préférence, au moins 40 % en poids desdits acides dicaféoylquiniques sont sous la forme de l'isomère 4,5-dicaféoylquinique (4,5-DCQ), par rapport au poids total d'acides dicaféoylquiniques. 5 L'extrait obtenu par le procédé selon l'invention a également pour particularité de présenter une très faible teneur en flavonoïdes, usuellement présents en grande quantité dans les extraits de Vitex Negundo de l'art antérieur. Notamment, la plante Vitex Negundo cultivée dans les conditions du procédé selon l'invention synthétise et sécrète une très faible quantité des flavonoïdes extrêmement décrites dans l'art antérieur que sont la 10 vitexine et ses dérivés. Ainsi, l'extrait par le procédé selon l'invention peut être caractérisé en ce qu'il comprend moins de 0,2 %, en particulier moins de 0,1 %, plus particulièrement moins de 0,05 %, notamment moins de 0,01 %, en poids de flavonoïdes, par rapport au poids total de l'extrait sec. 15 La présente invention a également pour objet un extrait de Vitex Negundo obtenu par le procédé selon l'invention, c'est-à-dire le procédé décrit ci-dessus. Ledit extrait est alors caractérisé comme défini ci-dessus. Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention. EXEMPLES Exemple 1 : Préparation d'un extrait de Vitex Negundo à l'aide du procédé selon l'invention et caractérisation de l'extrait ainsi obtenu Un extrait polyphénolique de Vitex negundo, riche en dérivés DCQ est obtenu selon le procédé suivant : a) Culture de Vitex negundo en aéroponie selon le procédé breveté PAT avec une solution nutritive définie (de composition N/P/K 15/10/30 à une électroconductivité 30 comprise entre 0,2 et 1,6mS) ; b) Stimulation de la plante pendant une durée d'une semaine avec un éliciteur tel que décrit ci-dessus ; c) Extraction des molécules d'intérêt par macération des racines de la plante dans un mélange Propylène glycol / eau 70/30, pendant une durée de deux fois 48 heures à température ambiante et à un pH de 1,6 ; 20 25 3047180 8 d) A la fin de l'extraction la concentration en propylène glycol est ré-ajusté à 60% ; e) La solution obtenue subit des étapes d'ajustements successifs du pH pour aboutir à un pH final de 3,5 ; f) L'extrait est purifié (élimination des sels par nanofiltration) et concentré par 5 filtrations successives dont nanofiltration et filtration stérilisante. L'extrait polyphénolique liquide ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes (% sur Extrait Sec, obtenu par évaporation du solvant à l'étuve ventilée à 105°C jusqu'à obtention d'un extrait à poids constant) : - Extrait sec : 1,8% (m/m) 10 - Teneur en polyphénols totaux (équivalent d'acide gallique) : 9,5% / ES - Teneur en acides dicaféoylquiniques totaux (HPLC) : 6,5% / ES - Teneur en 4,5-DCQ (HPLC) : 3,3% / ES - Teneur en cendres : 14,5%. 15 Exemple 2 : Comparaison de la composition d'un extrait « classique » de Vitex Negundo et d'un extrait de Vitex Negundo obtenu par le procédé selon l'invention Procédé selon l'invention : a) Culture de Vitex negundo en aéroponie selon le procédé breveté PAT avec une 20 solution nutritive définie (de composition N/P/K 15/10/30 à une Ec comprise entre 0,2 et 1,6mS) ; b) Stimulation la plante pendant une semaine avec un éliciteur tel que décrit ci-dessus ; c) Extraction des molécules d'intérêt par macération des racines de la plante dans un 25 mélange Glycérol/eau 70/30 ou propylène glycol/eau 70/30 à pH 1,6 et à température ambiante. Procédé de « culture traditionnelle » : Un extrait de racines sèches ou de feuilles sèches issues d'un plant de Vitex negundo cultivé en terre selon les techniques classiques, mais dans le même environnement 30 (serre) est obtenu selon les modalités suivantes : a) Les racines ou les feuilles sèches de Vitex negundo sont broyées ; b) Les matières premières obtenues sont extraites séparément à température ambiante dans un mélange glycérol/eau 70/30 pH 1,6 ; c) L'extrait est purifié par filtrations. 3047180 9 Les valeurs de dosages obtenues par HPLC sont les suivantes (%, concentration des molécules d'intérêt/extrait sec de l'extrait total obtenu) : Culture PAT Culture traditionnelle Racines Racines Racines Feuilles (Propylène (glycérol) (glycérol) (glycérol) glycol) Flavonoïdes 0 0 1,7 1,1 DCQ totaux 6,5 8,6 5,0 2,2 Tableau 2. Teneurs en flavonoïdes et DCQ totaux des extraits testés. 5 Cette étude démontre que les extraits obtenus par le procédé selon l'invention ne contiennent pas de flavonoïdes. En outre, de manière spécifique, l'extrait obtenu par le procédé selon l'invention contient une concentration beaucoup plus importante de DCQ (augmentation d'au moins 40 %) qu'un extrait de Vitex Negundo cultivée en terre selon les techniques classiques. 10 En outre, cette étude démontre que l'extraction des molécules d'intérêt dans les conditions selon l'invention, c'est-à-dire ici dans un mélange glycérol/eau 70/30 à pH 1,6 ou dans un mélange Propylène glycol /eau 70/30 à pH 1,6 et à température ambiante, permet d'obtenir un extrait de Vitex Negundo comprenant une plus forte teneur en DCQ totaux que la teneur 15 maximale observée jusqu'à ce jour dans l'art antérieur (environ 0,6 % en poids, par rapport au poids total de l'extrait sec (M Huang et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 108(2015) 11-20)). REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 20 M. HUANG ET AL., JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS 108(2015) 11-20 C.J. ZHENG ET AL., PHYTOTHER. RES. 29 : 633-647 (2015) 25 WO 01/33942 REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un extrait de Vitex Negundo comprenant les étapes successives suivantes : a) culture de Vitex negundo en aéroponie ; b) extraction par exsudation racinaire des plantes ; et c) purification et concentration de l'extrait ainsi obtenu par filtrations successives, en particulier par nanofiltration et/ou filtration stérilisante. 2. Procédé de préparation selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape b) d'exsudation racinaire est effectuée par macération des racines dans un solvant choisi parmi l'eau, la glycérine, les glycols, et leurs mélanges, en particulier parmi les mélanges binaires eau/glycérine et eau/glycols, plus particulièrement parmi les mélanges binaires eau/propanediol et eau/propylène glycol. 3. Procédé de préparation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape b) d'exsudation racinaire est effectuée par macération des racines pendant une durée comprise entre 30 minutes à 96 heures, notamment entre 12 heures et 72 heures. 4. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape a') de stimulation des racines des plantes, en particulier avec une solution comprenant des sels, des tensioactifs, des détergents, des solvants, des éliciteurs d'origine fongique ou bactérienne, des dérivés de l'acide jasmonique, des générateurs d'éthylène, des chitines, des chitosans ou de leurs mélanges. 5. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape b') d'isomérisation des acides dicaféoylquinique obtenus en acide 4,5-dicaféoylquinique. 6. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'extrait de Vitex Negundo obtenu comprend au moins 5% en poids de polyphénols, exprimé en équivalent d'acide gallique, par rapport au poids total de l'extrait sec. 3047180 11 7. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'extrait de Vitex Negundo obtenu comprend au moins 1,5 % en poids des acides dicaféoylquiniques, par rapport au poids total de l'extrait sec. 8. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que dans l'extrait de Vitex Negundo obtenu, au moins 40 % en poids des acides dicaféoylquiniques sont sous la forme de l'isomère 4,5-dicaféoylquinique, par rapport au poids total d'acides dicaféoylquiniques. 9. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'extrait de Vitex Negundo obtenu comprend moins de 0,2 % en poids de flavonoïdes, par rapport au poids total de l'extrait sec. 15 10. Extrait de Vitex Negundo obtenu par le procédé selon l'une quelconques des revendications 1 à 9 5 10