Brevet FR3046180A1 — publié le 20170630

La présente invention concerne un procédé de production d'une protéine dans une cellule de champignon filamenteux, comprenant la surexpression du gène TrAZF] ou d'un de ses variants, dans ladite cellule. La possibilité de produire de l'éthanol à partir de cellulose a reçu beaucoup d'attention en raison de la disponibilité de grandes quantités de matière première ainsi que de l'intérêt de l'éthanol à titre de carburant. Les matières premières naturelles cellulosiques pour un tel processus sont désignées par le terme "biomasse". De nombreux types de biomasse, par exemple le bois, les résidus agricoles, les cultures herbacées et les déchets solides municipaux, ont été considérés comme des matières premières potentielles pour la production de biocarburant. Ces matières sont constituées principalement de cellulose, d'hémicellulose et de lignine. La cellulose est un polymère constitué de molécules de glucose reliées par des liaisons beta 1-4, qui sont très résistantes à la dégradation ou à la dépolymérisation. Une fois la cellulose convertie en glucose, celui-ci est facilement fermenté en biocarburant, par exemple l'éthanol, en utilisant une levure. Les plus anciennes méthodes étudiées pour convertir la cellulose en glucose sont basées sur l'hydrolyse acide. Ce processus peut se faire en présence d'acides concentrés ou dilués. Cependant, plusieurs inconvénients, tels que la mauvaise récupération de l'acide lors de l'utilisation d'acides concentrés et la faible production de glucose dans le cadre de l'utilisation d'acides dilués, nuisent à l'économie du processus d'hydrolyse acide. Pour surmonter les inconvénients du processus d'hydrolyse acide, les processus de conversion de la cellulose ont porté plus récemment sur l'hydrolyse enzymatique, à l'aide d'enzymes de type cellulase. Les microorganismes comportant des enzymes qui hydrolysent la cellulose sont par exemple les champignons Trichoderma, Aspergillus, Humicola et Fusarium. Cette hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique (par exemple, la cellulose), à l'échelle industrielle, présente cependant l'inconvénient d'être coûteuse. 3046180 2 Pour diminuer le coût associé à l'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose, l'industrie est à la recherche constante de procédés plus productifs ou présentant un meilleur rendement. 5 Il existe donc un besoin d'optimisation de la production d'enzymes dans le processus industriel. En particulier, il existe un besoin inassouvi et longtemps attendu de développer un procédé de production d'enzymes amélioré, économiquement avantageux. 10 Les inventeurs ont ainsi développé un procédé amélioré de production d'une protéine d'intérêt dans un champignon filamenteux, dans lequel la protéine est en particulier une enzyme cellulolytique. 15 Aussi, l'invention concerne un procédé de production d'une protéine dans une cellule de champignon filamenteux, comprenant la surexpression du gène TrAZF1 ou d'un de ses variants, dans ladite cellule. L'invention concerne également une souche de champignon filamenteux, de 20 préférence une souche de Trichoderma reesei, surexprimant le gène TrAZF1 ou un de ses variants. Par « surexprimant le gène TrAZF1 ou un de ses variants », on entend que ladite souche possède au moins le gène TrAZF1 ou un de ses variants, ledit gène ou ses variants étant exprimé de manière constitutive. 25 Selon un mode de réalisation, la souche de champignon filamenteux selon l'invention, de préférence Trichoderma reesei, comprend le gène TrAZF1 endogène, ledit gène étant sous la dépendance d'un promoteur constitutif. Dans ce cas, le gène TrAZF1 endogène est présent dans le génome natif de la souche, et le promoteur a été modifié, muté ou remplacé, pour être constitutif. 30 Selon un autre mode de réalisation, la souche de champignon filamenteux selon l'invention, de préférence Trichoderma reesei, comprend, outre le gène TrAZF1 présent dans son génome, une copie supplémentaire du gène TrAZFl, ladite copie étant exprimée de façon constitutive. Elle comprend donc dans ce cas au moins 3046180 3 deux copies du gène TrAZFl, l'une de ces copies étant exprimée de façon constitutive. Cette souche mutée selon l'invention est caractérisée par une amélioration de la production d'enzymes cellulolytiques par rapport à la même souche de T. reesei 5 non modifiée, ou par rapport à une souche de référence de T. reesei. Trichoderma reesei est un champignon filamenteux cellulolytique. Compte tenu de la capacité de T. reesei à sécréter de grandes quantités de cellulases et d'hémicellulases, cette souche est hautement intéressante pour la production 10 d'enzymes pour la transformation des matières de la biomasse végétale en bioproduits utiles à l'industrie, tels que le bioéthanol. Par "souche de référence de T. reesei", on entend une souche de Trichoderma reesei choisie parmi les souches QM6a, NG14, RutC30 et QM9414. Ces souches 15 sont accessibles au public et ont notamment fait l'objet de dépôts, respectivement sous les numéros: ATCC 13631 (souche QM6a); ATCC 56767 (souche NG14); ATCC 56765 (souche RutC30); et 20 ATCC 26921 (souche QM9414). Dans un mode de réalisation particulier, la souche est la souche CL847. Cette souche est une souche hyperproductive. 25 Parmi les champignons filamenteux utilisables selon l'invention, on peut citer certains champignons du phylum des Ascomycètes (Ascomycota), des Basidiomycètes (Basidiomycota) et des Zygomycètes (Zygomycota). Typiquement, les champignons sont choisis dans les classes des orbiliomycètes, des pézizomycètes, des dothideomycètes, des eurotiomycètes, des 30 lecanoromycètes, des léotiomycètes, des sordariomycètes et des saccharomycètes. Notamment, on peut citer Trichoderma reesei, Arthrobotrys oligospora, Tuber melanosporum, Alternaria brassicicola, Baudoinia compniacensis, Cochliobolus heterostrophus, Cochliobolus sativus, Hysterium pulicare, Leptosphaeria maculans, Mycosphaerella pini, Mycosphaerella populorum, Phaeosphaeria 3046180 4 nodorum, Pseudocercospora fijiensis, Pyrenophora teres, Pyrenophora triticirepentis, Rhytidhysteron rufulum, Setosphaeria turcica, Zymoseptoria tritici, Ajellomyces capsulatus, Ajellomyces dermatitidis, Arthroderma benhamiae, Arthroderma gypseum, Arthroderma otae, Aspergillus aculeatus, Aspergillus 5 carbonarius, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus piger, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Emericella nidulans, Neosartorya fischeri, Paracoccidioides brasiliensis, Paracoccidioides sp. lutzii, Penicillium chrysogenum, Penicillium marneffei, Talaromyces stipitatus, Trichophyton 10 equinum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, Uncinocarpus reesii, Cladonia grayi, Botryotinia fuckeliana, Geomyces destructans, Sclerotinia sclerotiorum, Acremonium alcalophilum, Chaetomium globosum, Colletotrichum higginsianum, Cryphonectria parasitica, Epichloe festucae, Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces graminis, Gibberella 15 monihformis, Gibberella zeae, Glomerella graminicola, Magnaporthe grisea, Magnaporthe poae, Myceliophthora thermophila, Nectria haematococca, Neurospora crassa, Neurospora discreta, Neurospora tetrasperma, Podospora anserina, Sordaria macrospora, Thielavia terrestris, Trichoderma atroviride, Trichoderma virens, Verticillium albo-atrum, Verticillium dahliae, Clavispora 20 lusitaniae, Pichia membranifaciens, Scheffersomyces stipitis, Wickerhamomyces anomalus, Ceriporiopsis subvermispora, Fomitopsis pinicola, Phlebiopsis gigantea, Wallemia sebi, Melampsora larici-populina ou Rhizopus oryzae. De préférence, le champignon filamenteux utilisable selon l'invention est Trichoderma reesei. 25 Dans le cadre de la présente invention, par « gène TrAZF1 », on entend le gène de séquence SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :3. Ce gène code pour un facteur de transcription dont la séquence protéique native est représentée en SEQ ID NO :2. Cette séquence est disponible en ligne sous les numéros d'accession GenBank: 30 XM 006961831.1 (souche T. reesei QM6a) et sur le site dédié au génome de T. reesei, sous le numéro ID103275 à l'adresse suivante (hup ://zenome .j gi. doe gov/c i -bin/dispGene Mode I ?db=Trire2 &id= 103275). La séquence SEQ ID NO :1 est la séquence nucléotidique du gène TrAZF1 sans intron. C'est donc la séquence d'ADNc. 3046180 5 La séquence SEQ ID NO :3 est la séquence nucléotidique génomique du gène TrAZF 1. Elle est constituée de quatre exons et de trois introns. Elle est reproduite ci-dessous, et les trois introns sont surlignés: ATGGCCCTCGCAGCTCAACAGCATACTCAGGCCGATTGGGGCCGCTGG 5 TCTCACCAGATTCCACAGAGTTTTCCCATGATGGGCTCTCCAGGATTCA TGTCATACGATCCCAGAGCTCAGGACGGCAGTCAGATGCAGCGTCAG GTGTCTGCTCAGTACCTGGTGAACTCGAACTACAACCAGCCCCCGATG CCCACTGCTTCGTCTCCCCAGTATCAACACGCAGGGCCATTTTCCTATG TGCCTTACCACAGCCCGCCGCCGTCCACTCCTCTTGGTTCCCCATTCAA 10 GAGCGAATTTCCCGAGCACCCTCTTACGCGCATGACACACTCTACGGT CGATCGACACCATTCTCAGGCCATGAGGGACTACCAACCTTATTCTCC TGTATCGAGGAGGGGATCGATTTCTTCAGTCGCCACCAAGCCCTCAGC AGCTCCCGTCACACCAGGTCCAACTACTCCTGGCTCTTTCACTTCAAGT TCCGACGCCCAGAGCCCCAGCACTCCAAACCCCCAGACTGCGTCTCAG 15 CCTGTCAGCTCCAAGACTCTCACTTACAATGAGACCGTTCATCCGGGC GATAGGATCAGCTTCAGAACCGATGTTGATGAACTCATGAAGGCCATC CAGAAGACACAGACGACCGACGAGTGTCAGCAAACACTCACACCTGC GCGAACACCAAAGAACTGTACCACAAGTACTCCCGTACTTCGTACACA AAGCGGGAAGCCGAGAAAACAGTGGGTTTGCGATGGCCCCAACTGCG 20 GCAAGGCCTTTGTCCAGAAGACGCATCGCGACATTCACCGACGCACTC ACACCGGCCATCGACCATACGTACGCGCCCAGCTCCTCTTCACTGCAA CGCCGGCTAATTAAATGTTGATAGGTCTGCACCATGGAAAATTGCGGT CTTACGTTCTCGCAGCGAGGAAACCTCAAGGTAAGCTTCAGCTGCTAA GAATCTCCTTTGAGAATGCGTATACTGACCAGATGGTGTGTGGACAGA 25 CTCACATACGACGCCACACAGGTGAAAAGCCGTTCTCTTGCGCTGCTT GTGGCAAGTGCTTCGCTCAGCGTGGGAATCTTCGATCCCACGAGGAGA CACACAAAGGCCTGAAGCCCTTCGTCTGCCGGCTCGATGATTGCAACA AGTCGTTTTCTCAGCTGGGCAATATGAAGGTATGCAACATCTAGCACA TGAAAGCAGTATGAGAACGCTCTAACGCTGAGGGAACTGCAGACTCA 30 TCAGAACAACTTTCACAAAGAAACGCTCCAGAAACTCACACACATGTT TGTGCAATTCTCGGAGAACGGCGAGGTGCCCAGAGACTATCAGGATCT TTTCGAATACTTCCAGAAGCACTACAAGAATAGCAACAAGGGAGTCA AGGGCCGAGGAAAGACTCGCGCTGTGGCAGCTCGTGGGCCTCAAGAT TCCGCGTTTCGGCAGGCTGCCTCCCCAGTGCCCGCGTTACTGAAGACG CCGGCTACGACTCATTTGCCCCAGATGACAATGCCAGCCCATGATCCC CATGGCAGAATCTCACCATACGCCATGACCCAGGGAGCTGCGAACAC TCTGAGCAATGTCCTGCGCAACCCCAACCCCTCTTACGGCCTTTATGG ACCCACGTTTGCCCCGGGCCCTGTACGAGATGGCGTCTTTCACATGGG CATTGCGAGCCACCTATCCTGA (SEQ ID NO :3) Ainsi, la séquence SEQ ID NO :1 correspond à la séquence SEQ ID NO :3 sans les introns. Une souche selon l'invention comprend donc de préférence soit au moins deux copies de la séquence SEQ ID NO :3, soit au moins une copie de la séquence SEQ 45 ID NO :1. 3046180 6 Par « variant » du gène TrAZFl, on entend un gène codant pour une protéine ayant la même fonction que celle de séquence SEQ ID NO :2, à savoir un facteur de transcription. De préférence, le variant du gène TrAZF] est un orthologue. De préférence, le variant du gène TrAZF] code pour une protéine ayant la même 5 fonction que celle de séquence SEQ ID NO :2. De préférence, le variant du gène TrAZF] code pour une protéine choisie parmi les séquences SEQ ID NO :6 à SEQ ID NO :140. Les inventeurs ont maintenant montré, pour la première fois, que la surexpression 10 du gène TrAZF] conduit à une augmentation significative de la production de protéines cellulolytiques. En particulier, les inventeurs ont mis en évidence que des souches de T.reesei RutC30 et CL847 mutées selon l'invention, i.e. comprenant deux copies du gène TrAZF] dont une exprimée de façon constitutive, présentent une amélioration de 15 la production de protéines extracellulaires, en particulier d'enzymes cellulolytiques. Les protéines produites selon l'invention sont de préférence des enzymes cellulolytiques, plus préférentiellement des cellulases ou des hémicellulases, 20 encore plus préférentiellement il s'agit de cellulases. Le procédé selon l'invention concerne la production d'une protéine dans une cellule de champignon filamenteux, comprenant la surexpression du gène TrAZF] ou d'un de ses variants, dans ladite cellule. Cette surexpression du gène TrAZF] est effectuée de préférence par introduction d'une cassette comprenant ledit gène dans le génome de la cellule. La connaissance de telles méthodes appartient aux connaissances de l'homme du métier. De préférence, cette cassette comprend : a) au moins un promoteur constitutif ; b) le gène de séquence SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :3, ou un de ses variants ; et c) optionnellement, un terminateur. 25 30 3046180 7 Le promoteur constitutif a) est un promoteur fort. Par promoteur constitutif, on entend un promoteur qui n'est pas inductible. Ce promoteur constitutif exprime tout le temps le gène ; ainsi, une production constante et forte de protéines a lieu. 5 Ce promoteur peut notamment provenir de Trichoderma reesei, mais aussi d'Aspergillus nidulans. De préférence, le promoteur constitutif a) est choisi parmi : - le promoteur gpd de Trichoderma reesei (Li J. et al (2012), Achieving efficient protein expression in Trichoderma reesei by using strong constitutive promoters, 10 Microbial cell factories, 11(1), 84. doi:10.1186/1475-2859-11-84). Ce promoteur a pour séquence SEQ ID NO :4, - le promoteur gpd d'Aspergillus nidulans (Penttilà M. et al (1987), A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei, Gene, 61(2), 155-64 ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3127274), et 15 - le promoteur tefl de Trichoderma reesei (Nakari-Setâlà T, Penttihi M., Production of Trichoderma reesei cellulases on glucose-containing media, Applied and Environmental Microbiology. 1995;61(10):3650-3655) De préférence, le promoteur constitutif a) est le promoteur gpd de séquence SEQ 20 ID NO :4. La cassette utilisée dans le procédé de l'invention comprend également l'élément b), i.e. le gène de séquence SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :3 ou un de ses variants. Le variant est tel que décrit ci-dessus. Enfin, la cassette utilisée dans le procédé de l'invention peut comprendre, de manière optionnelle, un terminateur c). Le terminateur est de préférence le terminateur gpd de Trichoderma reesei, de séquence SEQ ID NO :5. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une cassette telle que décrite ci-dessus pour la production de protéines, notamment d'enzymes cellulolytiques. 25 30 3046180 8 La surexpression du gène TrAZF] est effectuée de préférence par introduction d'un fragment d'ADN comprenant le gène TrAZF1 avec un promoteur constitutif, un terminateur et un marqueur de sélection. Cette cassette peut aussi être introduite dans la cellule par un vecteur, tel qu'un plasmide, comprenant la 5 cassette. Selon l'invention, on entend par « vecteur » toute séquence d'ADN dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d'introduire de l'ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les 10 chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Le vecteur selon l'invention pourra également porter un marqueur de sélection. On entend par « marqueur de sélection » un gène dont l'expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il 15 s'agit par exemple d'un gène de résistance aux antibiotiques. Préférentiellement, ledit vecteur est un plasmide. Plus préférentiellement, le plasmide est un plasmide de type pRS426, tel que décrit dans les exemples et en Figure 1. 20 La cassette selon l'invention, une fois insérée dans le génome, permet la traduction du gène d'intérêt TrAZFl, ce qui donne la protéine correspondante. L'invention porte également sur l'utilisation de la souche selon l'invention pour la 25 production d'enzymes cellulolytiques. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une souche de Trichoderma reesei pour la production d'enzymes cellulolytiques, ladite souche surexprimant le gène TrAZF] ou un de ses variants. 30 L'invention porte également sur l'utilisation de la souche selon l'invention pour l'hydrolyse de la cellulose et ses produits de dégradation, dont le cellobiose, en glucose. 3046180 9 L'invention a également pour objet l'utilisation de la souche selon l'invention pour la production de biocarburant. Selon l'invention, le terme "biocarburant" peut être défini comme tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D'une part et sans vouloir se limiter, 5 on peut citer à titre d'exemple des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l'éthanol, le butanol et/ou l'isopropanol selon le type d'organisme fermentaire utilisé), des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes 10 ou longues chaînes, esters d'acides gras), ainsi que l'hydrogène. De manière préférée, le biocarburant selon l'invention est un alcool, par exemple l'éthanol, le butanol et/ou l'isopropanol. Plus préférentiellement, le biocarburant selon l'invention est l'éthanol. Dans un autre mode de réalisation, le biocarburant 15 est du biogaz. L'invention concerne également l'utilisation de la souche selon l'invention pour l'hydrolyse des beta-oligosaccharides. 20 Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. FIGURES 25 Figure 1: Représentation du plasmide pRS426. Figure 2 : Position des amorces utilisées pour vérifier la présence de la cassette de surexpression des souches transformées. 30 Figure 3: Production de protéines extracellulaires par les souches RutC30 transformées selon l'invention et une souche RutC30 de T. reesei non modifiée après 7 jours de culture. 3046180 10 Figure 4: Production de protéines extracellulaires par les souches C1847 transformées selon l'invention et une souche C1847 de T. reesei non modifiée après 7 jours de culture. 5 Figure 5: Vitesse spécifique de production de la souche C1847 et deux transformants en conditions de cultures de type Fioles alimentées. EXEMPLES 10 Exemple 1 : Etudes transcriptomiques en induction lactose des souches de Trichoderma reesei ATCC 56767 et ATCC 56765 Dans cette étude, les inventeurs ont utilisé les souches de Trichoderma reesei 15 suivantes: - ATCC 56767 (NG14), et - ATCC 56765 (RUT C30). La souche RutC30 est issue par mutagénèse de la souche NG14 et a une production de cellulase accrue. 20 Le gène TrAZF] (ID 103275) est un facteur de transcription (protéine impliquée dans la régulation d'autres gènes) identifié comme différentiellement exprimé lors d'une cinétique d'induction sur lactose (Poggi-Parodi et al. 2014). Plus précisément, l'étude transcriptomique montre que l'expression de TrAZF] diminue lors de l'induction dans la souche NG14 alors que dans la RutC30 son 25 expression ne varie pas. Exemple 2: Construction d'une cassette de surexpression pour le gène TrAZF1 30 La cassette de surexpression est composée de trois fragments d'ADN : la région promotrice du gène glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (GPDp) de T. reesei. La taille de la région promotrice a été définie dans l'article de Li et al. 2012 (SEQ ID NO : 141) la région codante du gène d'intérêt (TrAZF1) (SEQ ID NO : 3) 3046180 11 la région terminateur du gène glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (GPDt) de T. reesei. La taille de la région promotrice a été définie dans l'article de Li et al. 2012 (SEQ ID NO : 142). 5 Pour pouvoir sélectionner les transformants, une cassette appelée HygroR (SEQ ID NO: 143) contenant le gène Hph est fusionnée avec la cassette de surexpression. Le gène Hph code pour l'hygromycine B phosphotransférase responsable de la résistance à l'hygromycine B. Il a été isolé d'Escherichia coll. Pour l'expression du gène dans Trichoderma reesei, le gène Hph est placé sous le 10 contrôle du promoteur du gène cpc-1 de Neurospora crassa (NCU04050) et le terminateur du gène trpC d'Aspergillus nidulans ANID 00648) Le plasmide pRS426 (ATCC 77107) a été utilisé comme vecteur pour la construction de la cassette de délétion par recombinaison in vivo dans S. 15 cerevisiae selon une méthode inspirée de la littérature (Schuster et al. 2012). Pour ce faire, le plasmide a été digéré avec EcoRI et XhoI (New England Biolabs) et purifiée par électrophorèse sur gel en utilisant QlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Le plasmide pRS426 est représenté en figure 1. 20 Les parties d'amorces spécifiques du gène d'intérêt TrAZF] ont été conçues sur la base de la prédiction ORF dans la version v2.0 du génome (http://genome.jgipsf.org/Trire2/Trire2.home.html). Amplification de la région promotrice du gène glyceraldehyde-3-phosphate 25 déshydrogénase de T. reesei GPDp Les amorces utilisées pour l'amplification de la région promotrice GPDp à partir de l'ADN de la souche Rut C30 sont décrites ci-après : - L'amorce sens est constituée de deux parties : une partie de 20 nucléotides (nt) homologue de la séquence du vecteur pRS426 (figure 1) à 30 proximité du site de restriction XhoI et une partie de 20 nt homologue à l'extrémité 5' de GPDp (SEQ ID NO : 141), le tout formant la séquence SEQ ID NO : 144 (ATTGGGTACCGGGCCCCCCCGACGCAGAAGAAGGAAATCG). 3046180 12 - L'amorce antisens est constituée de deux parties : une partie de 10 nt homologue à l'extrémité 5' de la région codante du gène TrAZF] (SEQ ID NO : 3) et une partie de 20 nt homologue à l'extrémité 3' de GPDp (SEQ ID NO : 141), le tout formant la séquence SEQ ID NO : 145 5 (CGAGGGCCATTTTGTATCTGCGAATTGAGC) Amplification de la région codante du gène d'intérêt TrAZF] Les amorces utilisées pour l'amplification du gène d'intérêt TrAZF] à partir de l'ADN de la souche Rut C30 sont décrites ci-après : 10 - L'amorce sens est constituée de deux parties : une partie de 10 nt homologue de l'extrémité 3' de GPDp (SEQ ID NO : 141) et une partie de 20 nt homologue à la région codante 5' du gène TrAZF] (SEQ ID NO : 3), le tout formant la séquence SEQ ID NO : 146 (CAGATACAAAATGGCCCTCGCAGCTCAACA). 15 - L'amorce antisens est constituée de deux parties : une partie de 10 nt homologue à l'extrémité 5' de la région GPDt (SEQ ID NO : 142) et une partie de 20 nt homologue à la région codante 3' du gène TrAZF] (SEQ ID NO : 3), le tout formant la séquence SEQ ID NO : 147 (AACACAGCACTCAGGATAGGTGGCTCGCAATG) 20 Amplification de la région terminateur du gène glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogénase de T. reesei GPDt Les amorces utilisées pour l'amplification de la région terminateur GPDp à partir de l'ADN de la souche Rut C30 sont décrites ci-après : 25 - L'amorce sens est constituée de deux parties : une partie de 10 nt homologue à l'extrémité 3' de la région codante du gène TrAZF] (SEQ ID NO : 3) et une partie de 20 nt homologue à l'extrémité 5' de GPDt (SEQ ID NO : 142), le tout formant la séquence SEQ ID NO : 148 (CCTATCCTGAGTGCTGTGTTCCTCAGAATG) 30 - L'amorce antisens est constituée de deux parties : une partie de 10 nt homologue à l'extrémité 5' de la cassette HygroR (SEQ ID NO : 143) et une partie de 20 nt homologue à l'extrémité 3' de GPDt (SEQ ID NO : 142), le tout formant la séquence SEQ ID NO : 149 3046180 13 (GGTACACTTGTTACGGATCTGATCACTCGG) Amplification de la cassette HygroR Les amorces utilisées pour l'amplification de la cassette HygroR sont décrites ci- 5 après : - L'amorce sens est constituée de deux parties : une partie de 10 nt homologue à l'extrémité 3' de GPDt (SEQ ID NO : 142), et une partie de 20 nt homologue à l'extrémité 5' de la cassette HygroR (SEQ ID NO : 143), le tout formant la séquence SEQ ID NO : 150 10 (AGATCCGTAACAAGTGTACCTGTGCATTCTG). - L'amorce antisens est constituée de deux parties : une partie de 20 nt homologue à la séquence de vecteur pRS426 à proximité du site de restriction EcoRI et une partie de 20 nt homologue à l'extrémité 3' de la cassette HygroR (SEQ ID NO : 143), le tout formant la séquence SEQ ID 15 NO : 151 (TGGATCCCCCGGGCTGCAGGGGCAGTGCTAGTGTGTGTAC). Les PCR mises en oeuvre à l'aide des amorces ci-dessus ont donné lieu à des fragments d'ADN à extrémités homologues. Ces fragments d'ADN ainsi que le 20 plasmide pRS426 digéré ont été transformés dans une souche Saccharomyces cerevisiae W303 compétente. Les plasmides pRS426 contenant la cassette de surexpression du gène TrAZF1 et la cassette HygroR ont été extraits de S. cerevisiae et utilisés comme matrice pour amplifier par PCR la cassette de surexpression fusionnée à la cassette HygroR 25 (SEQ ID NO : 154) en utilisant l'amorce sens (SEQ ID NO : 152) et l'amorce antisens (SEQ ID NO : 153). Exemple 3 : Transformation des souches de T. reesei RutC30 et C1847 avec la cassette de surexpression TrAZF1 30 Le produit de la PCR (SEQ ID NO 154) a ensuite été transformé dans les souches de T. reesei RutC30 (ATCC 56765) et C1847 (Durand et al., 1988). Les transformants ont été sélectionnés sur la base de la fonction de gène marqueur de 3046180 14 sélection Hph. Les transformants ont été purifiés à partir des colonies issues de spores individuelles. L'intégration ectopique de la cassette a été confirmée par trois amplifications par PCR. La position des amorces utilisées ainsi que les fragments amplifiés sont 5 indiqués dans la figure 2. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites ci- dessous : - Amorces pour amplification de vérification 1 : Une amorce sens dans le promoteur GPDp (SEQ ID NO: 155): GTCAGAAACGACCAAGCTAAG 10 Une amorce anti-sens dans le gène TrAZF] (SEQ ID NO: 156): GCCTGAGAATGGTGTCGATC - Amorces pour amplification de vérification 2 : Une amorce sens dans le gène TrAZF] (SEQ ID NO: 157) : TCGTGGGCCTCAAGATTC 15 Une amorce anti-sens dans le terminateur GPDt (SEQ ID NO : 158): GACGCCTGAGAGGTCCTA - Amorces pour amplification de vérification 3 : Une amorce sens dans le terminateur GPDt (SEQ ID NO : 159): CCTTCTTAGAGAGCTCTCGG 20 Une amorce anti-sens dans la cassette HygroR (SEQ ID NO : 160) : CGGGTTTACCTCTTCCAGAT Les amplifications ont été réalisées à partir de l'ADN génomique des transformants purifiés : 4 transformants ont été retenus pour chaque souche. 25 Exemple 4 : Culture de la souche de T. reesei RutC30 avec la cassette de surexpression TrAZF1 et analyse des cultures pour la production de protéines 30 Les spores provenant de quatre transformants de la souche RutC30 qui présentent une intégration ectopique de la cassette de surexpression TrAZF] ont été utilisés pour ensemencer une plaque de culture à 24 puits contenant 2 ml de milieu de culture par puits. 3046180 15 Le milieu était composé de K2HPO4 8,7 g.L-1 ; (NH4)2SO4 4,2 g.L-1 ; MgSO4.7H20 0,3 g.L-1 ; cornsteep 1,5 g.L-1 ; Lactose 10 g.L-1 ; Cellulose 10 g.L-1; acide maléique 11,6 g.L-1; CaC12 0,3 g.L-1; FeSO4.7H20 5,0 mg.L-1 ; MnSO4.H20 1,6 mg.L-1; ZnSO4.7H20 1,4 mg.L-1; CoC12.6H20 2,0 mg.L-1 ; 5 pH 6. La culture a été effectuée à 30°C sous agitation à 150 rpm, en double exemplaire. Après 7 jours de culture, le surnageant a été recueilli pour mesurer la concentration en protéines dans le milieu (Méthode Folin). La production de 10 protéines extracellulaires des cultures est présentée dans la Figure 3. Cette figure montre une augmentation de la production de protéines pour les transformants par rapport à la souche de T. reesei non modifiée. Exemple 5 : Culture de la souche de T. reesei C1847 avec la cassette de 15 surexpression TrAZF1 et analyse des cultures pour la production de protéines Les spores provenant de quatre transformants de la souche C1847 qui présentent une intégration ectopique de la cassette de surexpression TrAZF1 ont été utilisés 20 pour ensemencer une plaque de culture à 24 puits contenant 2 ml de milieu de culture par puits. Le milieu était composé de K2HPO4 8,7 g.L-1 ; (NH4)2SO4 4,2 g.L-1 ; MgSO4.7H20 0,3 g.L-1 ; cornsteep 1,5 g.L-1 ; Lactose 10 g.L-1 ; Cellulose 10 25 g.L-1; acide maléique 11,6 g.L-1; CaC12 0,3 g.L-1; FeSO4.7H20 5,0 mg.L-1 ; MnSO4.H20 1,6 mg.L-1; ZnSO4.7H20 1,4 mg.L-1; CoC12.6H20 2,0 mg.L-1 ; pH 6. La culture a été effectuée à 30°C sous agitation à 150 rpm, en double exemplaire. 30 Après 7 jours de culture, le surnageant a été recueilli pour mesurer la concentration en protéines dans le milieu (Méthode Folin). La production de protéines extracellulaires des cultures est présentée dans la Figure 4. Cette figure montre une augmentation de la production de protéines pour les transformants par rapport à la souche de T. reesei non modifiée. 3046180 16 Exemple 6 : Culture de la souche de T. reesei C1847 avec AZF1 surexprimé en fioles alimentés et analyse des cultures pour la production de protéines et la croissance 5 Une culture de deux transformants de la souche T. reesei C1847 ainsi que de la souche non transformée en utilisant la méthode de production de cellulases décrite dans le brevet WO 2013/026964 Al. La production de protéines extracellulaires ainsi que la biomasse ont été mesurée au cours du temps pour obtenir une mesure 10 de la vitesse spécifique de production de la protéine (production de protéine par mg de biomasse fongique par unité de temps, ou qP) à la fin de la culture. Ces valeurs sont présentées en Figure 5. Les données montrent des valeurs qP améliorées chez les mutants par rapport à la souche de T. reesei non modifiée. 15 3046180 17 Bibliographie Durand, H., Clanet, M., & Tiraby, G. (1988). Genetic Improvement of 5 Trichoderma reesei for large scale cellulase production. Enzyme and Microbial Technology, 10, 341-346 Li, Junxin; Wang, Juan; Wang, Shaowen; Xing, Miao; Yu, Shaowen; Liu, Gang (2012) Achieving efficient protein expression in Trichoderma reesei by using strong constitutive promoters. In : Microbial cell factories, vol. 11, p. 84. DOL- 10 10.1186/1475-2859-11-84. Poggi-Parodi, Dante; Bidard, Frédérique; Pirayre, Aurélie; Portnoy, Thomas; Blugeon, Corinne; Seiboth, Bernhard et al. (2014) Kinetic transcriptome analysis reveals an essentially intact induction system in a cellulase hyper-producer Trichoderma reesei strain. In : Biotechnology for biofuels, vol. 7, n° 1, p. 173. 15 DOL- 10.1186/s13068-014-0173-z. Schuster, André; Bruno, Kenneth S.; Collett, James R.; Baker, Scott E.; Seiboth, Bernhard; Kubicek, Christian P.; Schmoll, Monika (2012) A versatile toolkit for high throughput functional genomics with Trichoderma reesei. In : Biotechnology for biofuels, vol. 5, n° 1, p. 1. DOL- 10.1186/1754-6834-5-1. 20 W009026716 (A1) - METHOD FOR CELLULASE PRODUCTION REVENDICATIONS1. Procédé de production d'une protéine dans une cellule de champignon filamenteux, comprenant la surexpression du gène TrAZF] ou d'un de ses variants, dans ladite cellule. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la surexpression du gène TrAZF] est effectuée par introduction d'une cassette comprenant ledit gène dans le génome de la cellule. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la cassette comprend : a) au moins un promoteur constitutif ; b) le gène de séquence SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :3, ou un de ses variants ; et c) optionnellement, un terminateur. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le variant code pour une protéine choisie parmi les séquences SEQ ID NO :6 à SEQ ID NO :140. 20 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine est choisie parmi les enzymes cellulolytiques, préférentiellement les cellulases et les hémicellulases, encore plus préférentiellement les cellulases. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le 25 champignon filamenteux est choisi les classes des orbiliomycètes, des pézizomycètes, des dothideomycètes, des eurotiomycètes, des lecanoromycètes, des léotiomycètes, des sordariomycètes et des saccharomycètes ; de préférence le champignon filamenteux est Trichoderma reesei. 30 7. Cassette comprenant : a) au moins un promoteur constitutif ; b) le gène de séquence SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :3, ou un de ses variants ; et c) optionnellement, un terminateur. 15 3046180 19 8. Utilisation d'une cassette selon la revendication 7 pour la production de protéines, notamment d'enzymes cellulolytiques. 9. Souche de champignon filamenteux, de préférence souche de Trichoderma 5 reesei, surexprimant le gène de séquence SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :3 ou un de ses variants. 10. Souche selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est une souche de Trichoderma reesei comprenant soit au moins deux copies de la séquence SEQ ID 10 NO :3, soit au moins une copie de la séquence SEQ ID NO :1.