Brevet FR3046795A1 — publié le 20170721

PROCEDE DE CLASSIFICATION DE MICROORGANISMES Domaine technique La présente invention se rapporte à procédé de détermination de la capacité de production de biofilm par un microorganisme La présente invention se rapporte également à un procédé de classification de microorganisme en fonction de leur capacité de production de biofilm. La présente invention trouve une application notamment dans les domaines analytiques, de la recherche biologique, enzymologique, dans le domaine pharmaceutique, dans le domaine du diagnostic et/ou dans le domaine médical. La présente invention trouve également une application dans les domaines clinique, environnemental ou agro -alimentaire. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (H) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique La formation d'un biofilm est une propriété clé de bactéries, elle permet la survie à long terme à la fois dans les écosystèmes naturels et des animaux hôtes (Anderson et O'Toole, 2008). En fait, les bactéries qui se développent dans une matrice biofilm sont intrinsèquement plus résistantes aux agents de l'environnement ainsi qu'aux antimicrobiens par rapport aux cellules planctoniques en croissance. Les biofilms bactériens représentent un sérieux problème dans l'industrie et la médecine, y compris la chirurgie et la médecine dentaire, où ils causent souvent des infections chroniques et récurrentes (Lindsay et von Saints, 2006). Les bactéries à Gram positif et à Gram négatif sont toutes les deux capables de former un biofilm (Donlan, 2001). Il a été estimé que jusqu'à 80% des maladies infectieuses humaines qui ont un impact significatif sur la morbidité et de la santé coûts pour les patients (Romling et Balsalobre, 3046795 2 2012; recherche sur les biofilms microbiens, NIH 2002) sont liés à des biofilms. La formation de biofilms sur les dispositifs médicaux implantables provoque des infections persistantes, qui représentent plus de 60% des infections nosocomiales rapportées (Darouiche, 2004). Dans ce cadre, les 5 infections liées aux cathéters représentent l'événement indésirable le plus grave et coûteux causés par un biofilm produit par des bactéries, aboutissant fréquemment à l'échec du traitement et exigeant le retrait du dispositif médical (Costerton et al, 2003). Des exemples typiques de maladies associées au biofilm comprennent les infections «difficiles» telles 10 que les infections osseuses et articulaires, causées par Staphylococcus aureus qui est une bactérie fortement productrice de biofilm (Kurtz, et al., 2012, Jacqueline et Caillon, 2014, Gbejuade, et al., 2015), les endocardites infectieuses causées principalement par des staphylocoques ou les streptocoques, qui sont associés à des taux de mortalité élevés 15 (Furuya et Lowy 2003) et les infections affectant les patients atteints de mucoviscidose, où P. aeruginosa provoque des infections pulmonaires chroniques et une défaillance respiratoire (Singh et al, 2000; Hoiby et al, 2010). Le traitement antibiotique, soit empirique ou sur la base de tests de 20 sensibilité aux médicaments, est souvent incapable de contrôler des infections difficiles liées au biofilm comme dans le cas d'infection sur dispositifs médicaux (Hoiby et al., 2010). En effet, les profils de résistance aux antibiotiques traditionnels sont réalisés sur des micro-organismes à croissance planctonique. Ainsi, la sensibilité aux antibiotiques in vitro ne 25 prend pas en compte la production de biofilm et pourrait ne pas être représentative de la résistance aux médicaments des bactéries in vivo (Costerton et al., 1995). Par conséquent, de nouveaux tests de laboratoire capables d'évaluer la production de biofilm et la sensibilité de la formation du biofilm aux antibiotiques des microorganismes sont nécessaires et 30 souhaitables en plus à des tests de microbiologie de routine afin de cibler efficacement les agents infectieux difficiles. 3046 795 3 Il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau procédé permettant d'évaluer la production de biofilm par un microorganisme ainsi que sa sensibilité éventuelle dans la formation du biofilm ou du biofilm formé aux antibiotiques. 5 En outre, il existe un réel besoin de trouver un procédé facile à mettre en oeuvre et permettant de caractériser rapidement la capacité productrice de biofilm du microorganisme. Une technique de diagnostic idéale doit être capable de fournir une identification rapide du micro-organisme (s), pour aider à orienter une 10 thérapie antimicrobienne appropriée. Une variété de méthodes quantitatives, directes ou indirectes, ont été développées pour évaluer la capacité des souches bactériennes à adhérer aux surfaces (Peeters et al, 2008), basées soit sur la colorimétrie (Stepanovic et al., 2000; Joseph et Wright 2004 ; Moltz et Martin, 2005) ou 15 sur des techniques microscopiques (Sangetha et al 2009;. Benoit et al 2010; Musken et al 2010;. Weiss Nielsen et al, 2001). À l'heure actuelle, la coloration au cristal violet (CV) est la méthode la plus largement utilisée pour la quantification in vitro de biofilm, en raison de sa relative simplicité et sa sensibilité (Christensen et al, 1985; Stepanovic et al., 2000). Cette 20 méthode présente cependant des limitations importantes. En fait, il faut habituellement au moins 24/48 heures d'incubation et des mesures répétées de traitement, qui conduisent à des résultats avec un grand écart-type, et rendent la méthode ni facilement réalisable pour la normalisation, ni adaptable à du criblage à grande échelle dans le cadre clinique. En 25 outre, cette méthode donne des résultats de CMI pour éradiquer un biofilm après 24/48 heures impliquant de très fortes concentrations d'antibiotiques sans pertinence clinique. En d'autre terme les concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont tellement importantes qu'elles ne peuvent être utilisées en clinique. Récemment, une nouvelle technologie, à savoir le 30 Biofilm Ring Test® (BFRT), a été proposée pour l'évaluation de biofilm bactérien. Le principe est basé sur l'immobilisation des billes magnétiques 3046795 4 par la matrice de film biologique en croissance in vitro (Chavant et al., 2007). Le procédé est simple et le BFRT ne nécessite pas de manipulation extensive (par exemple ne nécessite pas d'étapes de lavage ni de coloration), ce qui assure ainsi une reproductibilité des résultats et réduit 5 l'écart-type, un critère positif pour la normalisation des procédures. Ainsi, le BFRT représente un outil prometteur pour l'évaluation d'un biofilm dans le cadre clinique. Cependant, bien que présentant un grand potentiel pour mesurer la production de biomasse de différentes souches bactériennes, la procédure initiale était pas facilement adapté pour des applications 10 cliniques dans l'évaluation de routine en laboratoire. En particulier, ce procédé ne permet pas, dans une seule détermination, de fournir des informations directes sur la "dynamique" et la "force" d'un micro-organisme à produire du biofilm de manière différente à une norme de référence d'isolats microbiens. 15 En effet, la procédure initiale peut nécessiter des mesures répétées, effectuées à différents temps, afin d'estimer la formation du biofilm microbien, constituant une autre limitation importante pour une utilisation de routine dans des tests de laboratoire. Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen/procédé permettant 20 de déterminer la dynamique / capacité de production de biofilm d'un microorganisme. En plus du système d'origine, il a également été développé pour une application de diagnostic l'antibiofilmogram® dans un format où 11 les antibiotiques, à 8 doses sont prêts à l'emploi dans des microplaques, ce 25 qui permet de déterminer leur capacité à inhiber la formation de biofilm (Olivares, 2015 ; Tasse et al., article soumis ; Provot et al, article en préparation). Toutefois, les différents procédés connus et couramment utilisés en diagnostique ne permettent pas de caractériser ni de déterminer les capacités productrices de biofilm de microorganismes. 30 II existe donc un réel besoin de trouver un procéder palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un 3046795 5 procédé permettant notamment de déterminer la production de biofilm et de déterminer les capacités de production de biofilm d'un microorganisme permettant par exemple d'adapter les procédés de traitement en fonction des caractéristiques du microorganisme. 5 En outre, il existe un réel besoin de trouver un procédé simple, peu couteux et applicable en clinique permettant d'évaluer, notamment la capacité éventuelle de production de biofilms par un microorganisme. Description de l'invention 10 La présente invention permet de résoudre ces problèmes et inconvénients de l'état de la technique en fournissant un procédé de détermination de la capacité de production de biofilm par un microorganisme comprenant les étapes suivantes: a) Introduire dans des contenants de culture comprenant un 15 milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme au moins deux particules magnétiques ou magnétisables, lesdites particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, b) Introduire et ensemencer indépendamment le milieu de culture des contenants obtenus à l'étape a) avec ledit microorganisme à 2 0 une concentration comprise préférentiellement de 1x10-1 à 1x10-6 McFarland (McF), chaque milieu comprenant indépendamment une concentration différente de microorganismes, c) maintenir les milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme, 25 d) application d'un champ magnétique capable de mettre en mouvement lesdites au moins deux particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, afin qu'elle s'agrège préférentiellement sous forme d'un spot e) détermination de la capacité de production de biofilm par le 30 microorganisme par observation et/ou mesure de l'agrégation desdites particules comme suit : 3046795 6 - l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à une concentration comprise de 1x10-6 à 1x10-4 McF correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm, - l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir 5 d'une concentration supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, - l'absence d'agrégation apparaissant à partir d'une concentration supérieure ou égale à 1x10-2 McF correspondant à un 10 microorganisme faible producteur de biofilm, - une agrégation desdites particules quelle que soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que le procédé 15 selon l'invention permet avantageusement et dans un temps très court, par exemple inférieur à 6 heures, de déterminer la capacité de production de biofilm d'un microorganisme et/ou de classifier les microorganismes en fonction de leur capacité de production de biofilm. En particulier, les inventeurs ont démontré, conformément aux 20 connaissances générales, qu'il y a au moins quatre catégories de microorganismes, à savoir notamment des microorganismes ne produisant pas de biofilm, des microorganismes produisant peu de biofilm (faibles producteurs), des microorganismes moyen producteur de biofilm (producteurs intermédiaires), et des microorganismes fort producteurs de 25 biofilm. Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que le procédé selon l'invention repose sur la mesure de la formation de biofilm à un stade précoce. En particulier, ils ont démontré que, dans une période de temps donnée, par exemple 5 heures, plus les concentrations initiales de 3 0 microorganismes, par exemple de cellules bactériennes, qui peuvent inhiber le mouvement/agrégation des particules sont faibles, plus forte est 3046795 7 leur capacité à produire un biofilm. Inversement, si des concentrations élevées de microorganismes, par exemple de bactéries, ne sont pas en mesure d'empêcher le mouvement/agrégation des microparticules, ils sont considérés comme à faible risque/non producteurs de biofilm. En outre, les 5 inventeurs ont évalué et démontré la caractérisation/capacité de formation de biofilm de deux isolats cliniques à Gram positif et à Gram négatif et l'ont comparée à celle des souches de laboratoire avec des phénotypes de biofilms connus ainsi que pour les témoins négatifs, utilisé comme référence interne, pour assurer l'exactitude et la reproductibilité des 10 résultats. La reproductibilité inter-essai a été déterminée par comparaison avec le test de coloration au Cristal Violet (CV). Les inventeurs ont démontré que les résultats obtenus concernant la caractérisation des microorganismes sont cohérents avec ceux obtenus par les techniques usuelles telle que la coloration Cristal Violet dans un 15 temps bien plus court, par exemple 5 à 10 fois plus court. En outre, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que le procédé de l'invention permet d'obtenir un résultat fiable et reproductible avec une specificité similaire voir supérieure à celle des procédés usuels. De plus le procédé selon l'invention permet avantageusement de 20 s'affranchir de résultats non spécifiques liés notamment à la production de mucus par les microorganismes contrairement aux procédés usuels, notamment basés sur une révélation avec des colorants tels que le Cristal Violet, qui colore le mucus et les bactéries et ne quantifie donc pas précisément la biomasse bactérienne. 25 La présente invention a également pour objet un procédé de classification de microorganismes comprenant les étapes suivantes: a) Introduire dans des contenants de culture comprenant un milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme au moins deux particules magnétiques ou 30 magnétisables, lesdites particules reposant sur une surface immergées dans le milieu de culture, 3046 795 8 b) Introduire et ensemencer indépendamment le milieu de culture des contenants obtenus à l'étape a) avec ledit microorganisme à une concentration comprise de 1x10-1 à 1x10-8 McF, chaque milieu comprenant indépendamment une concentration différente 5 de microorganismes, c) maintenir les milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme, d) application d'un champ magnétique capable de mettre en mouvement lesdites au moins deux particules reposant sur une 10 surface immergée dans le milieu de culture, afin qu'elle s'agrège préférentiellement sous forme d'un spot e) classification du microorganisme en fonction par observation du mouvement ou de l'absence de mouvement desdites particules comme suit : 15 - catégorie I : absence d'agrégation des particules apparaissant à une concentration comprise de 1x10-8 à 1x10-4 McF, correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm - catégorie II : absence d'agrégation des particules apparaissant à partir d'une concentration supérieure à 1x10-4 20 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, - catégorie III : absence d'agrégation apparaissant à partir d'une concentration supérieure ou égale à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme faible producteur de 25 biofilm, - catégorie IV : agrégation des particules quelle que soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm. Dans la présente, une unité McFarland correspond à environ 3.108 3 0 bactéries/ml, une dilution de 1x10-8 McF correspond donc à environ 3.102 bactéries/ml, soit par exemple quantitativement de l'ordre de 60 bactéries 3046795 9 pour 2000, par exemple utilisés pour ensemencer des puits de microplaques dans le procédé décrit. L'homme du métier, de par ces connaissances générales, connait le temps de génération, c'est-à-dire le temps de doublement d'une population 5 de microorganisme, par exemple d'une bactérie peut être en moyenne de 30 minutes. Selon l'invention, par « fort producteur de biofilm » on entend un microorganisme capable de synthétiser une quantité de biofilm suffisante pour empêcher l'agrégation des particules, pendant un temps donné. Il 10 peut s'agir par exemple d'un microorganisme capable de synthétiser une quantité de biofilm suffisante pour empêcher l'agrégation des particules, à partir d'un inoculum de l'ordre de 60 à 6000 bactéries, considéré comme très faible par l'homme du métier. Selon l'invention, par «producteur intermédiare de biofilm » on entend 15 un microorganisme capable de synthétiser une quantité de biofilm suffisante pour empêcher l'agrégation des particules, pendant un temps donné, à partir d'un inoculum de l'ordre de 6000 (6.10e) à 6.105 bactéries, considéré standard par l'homme du métier. 20 Selon l'invention, par « faible producteur de biofilm » on entend un microorganisme capable de synthétiser une quantité de biofilm suffisante pour empêcher l'agrégation des particules, pendant un temps donné, à partir d'un inoculum supérieur à 6x107 bactéries, considéré fort par l'homme du métier. 25 Selon l'invention, le contenant de culture peut être tout contenant de culture connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce adapté. Il peut s'agir par exemple d'un puit d'une plaque 96 puits et/ou de tout réacteur de culture connu de l'homme du métier. Préférentiellement, le 3 0 contenant de culture peut être constitué par un matériau favorable à l'adhésion des microorganismes, par exemple en polystyrène , peut 3046795 10 être modifié afin de favoriser son adhésion, par exemple par irradiation du contenant de culture, par exemple par irradiation d'un contenant en polystyrène. Le contenant de culture peut être avantageusement un contenant 5 plan et/ou à fond plat. Avantageusement lorsque le contenant de culture est plan et/ou à fond plat, l'agrégation des particules est réalisée sur le plan et/ou le fond plat., Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être réalisé dans une pluralité de contenants de culture. Par exemple, le procédé de l'invention 10 peut être réalisé dans au moins 6 contenants de culture, par exemple des puits de microplaques 96 puits, ou d'un autre format. Il peut s'agir par exemple de contenant de culture en polystyrène en polypropylène, en polycarbonate ou en verre. L'homme du métier de part ses connaissances générales saura 15 adapter/choisir le contenant en fonction du microorganisme. Selon l'invention, lorsque le procédé comprend 6 contenants de culture, il peut comprendre indépendamment dans chaque contenant un milieu de culture identique comprenant différente concentration de microorganismes. Par exemple, lesdits contenant peuvent comprendre est 20 respectivement une concentration de microorganisme de 1x10-6 McF, 1x10- 5 McF, 1x10-4 McF, 1x10-3 McF, 1x10-2 McF et 1x10-1 McF. Un contenant additionnel peut être ajouté, contenant tous les constituants, à l'exception du microorganisme, représentant ainsi un contrôle d'agrégation des particules, ou référence. 25 Selon l'invention par milieu de culture liquide on entend tout milieu de culture liquide connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce dans lequel au moins un microorganisme est susceptible de se développer. Il peut s'agir par exemple d'un milieu naturel ou synthétique. Il 30 peut s'agir par exemple de BHI (Brain Heart Infusion ; Bouillon Coeur Cerveau), de milieu Mueller-Hinton, de bouillon glucosé. L'homme du 3046795 11 métier de part ces connaissances générales saura choisir le milieu de culture adapté en fonction du microorganisme. Selon l'invention le microorganisme peut être tout microorganisme connu de l'homme du métier. Il peut s'agir d'une cellule procaryote, par 5 exemple d'une bactérie ou d'une cellule eucaryote, par exemple un champignon, une levure. Il peut s'agir par exemple Candida, Cryptococcus, Malassezia, Pityrosporum, Pneumocystis, Epidermo-phyton, Microsporum, Trichophyton. Il peut s'agir également de protozoaires, par exemple Entamoeba histolytica, Acanthamoeba castellanii, Naegleria fowleri. 10 Parmi les cellules procaryotes, il peut s'agir par exemple de toute bactérie connu de l'homme du métier, par exemple les bactéries comprises dans le groupe, sans être limité à celui-ci, constitué de Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus 15 anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella abortus, 2 0 Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, 25 Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium welchii, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Coxiella burnetii Ehrlichia chaffeensis, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, Enterococcus maloratus, Escherichia coli, Francisella tularensis, 30 Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus 3046795 12 pertussis, Haemophilus vaginalis, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis-klebsiella oxytoca, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, 5 Micrococcus luteus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis , Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma 10 pneumoniae Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides Pasteurella multocida, Pasteurella tularensis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophilia, Rhizobium radiobacter, Rickettsia prowazekii, Rickettsia mooseri, Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia 15 trachomae, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, 2 0 Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus 25 sobrinus, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica,Yersinia pestis et Yersinia pseudotuberculosis, etc. Selon l'invention dans le cas d'utilisation de bactéries anaérobies, les conditions de culture anaérobie du microorganisme pourront êtres 30 obtenues par obturation de l'extrémité ouverte du réacteur de culture par exemple à l'aide de parafilm, d'un bouchon etc. ou en mettant ledit 3046795 13 réacteur dans des conditions permettant le développement des bactéries anaérobies. Il peut s'agir par exemple de jarres d'anaérobiose, sachets générant une atmosphère appauvrie en oxygène et enrichie en dioxyde de carbone, enceintes anaérobies avec atmosphère contrôlée et/ou tout 5 moyen connu de l'homme du métier adapté. Selon l'invention, lesdites, au moins deux, particules, peuvent être choisies dans le groupe comprenant une particule chargée électriquement, une particule magnétique, une particule revêtue d'au moins une couche magnétique, une particule magnétisable, une particule revêtue d'une 10 couche magnétisable, ou un mélange de deux ou plusieurs de ces particules. En fait, il peut s'agir de toute particule permettant de mettre en oeuvre la présente invention. Selon l'invention, les particules peuvent reposer sur une surface immergée dans le milieu de culture. Lesdite particules sont en position 15 stables, c'est-à-dire au repos, en l'absence du champ magnétique, ou électrique, ou électromagnétique. Avantageusement, lesdites particules peuvent être des particules de toute forme adaptée à la mise en oeuvre de la présente invention, par exemple sous forme de bille, de palet, de forme géométrique asymétrique, par exemple avec une face plane, etc. 20 Toute taille appropriée de particule magnétique ou magnétisable peut être utilisée. La taille peut être choisie par exemple en fonction de la taille du microorganisme, et/ou de la taille du compartiment contenant le milieu de culture pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention et/ou du microorganisme. La taille peut être par exemple de taille sensiblement 25 identique à la taille du microorganisme générant le biofilm de manière à ce que les, au moins deux, particules puissent être incorporées dans un biofilm, par exemple formé par ledit microorganisme, l'objectif étant d'utiliser les particules magnétiques ou magnétisables comme un équivalent inerte du microorganisme. Quand ces particules sont mobiles, 30 les microorganismes de même taille peuvent aussi se mouvoir. Quand ces particules sont immobilisées, les microorganismes de même taille ne 3046795 14 peuvent pas non plus se déplacer. D'autre part, des particules de tailles variées peuvent permettre une analyse plus fine de la structure du biofilm : dimension des espaces au sein de la structure, organisation tridimensionnelle, stabilité de l'adhérence à la surface, par exemple au 5 fond du tube ou de la cupule de la plaque de microdilution, dans laquelle le test est réalisé. En effet, les biofilms tendent à se détacher par lambeaux (squames) de leur support en vieillissant. Dans ce cas, on observe alors une première phase d'immobilisation des, au moins deux, particules lors du développement du biofilm. Puis une phase de dégénérescence du 10 biofilm avec libération des, au moins deux, particules. Par exemple les particules magnétiques ou magnétisables peuvent présenter une taille de, par exemple de 10nm à 100pm, par exemple de 0,1 à 10um (taille des microorganismes les plus courants). Lorsque les particules sont incorporées dans un biofilm, notamment 15 dans la matrice complexe générée par la croissance des microorganismes, composée de corps cellulaires, des systèmes d'adhésion desdits microorganismes, par exemple des filaments, pili, fimbriae, etc., de substances plus ou moins visqueuses, par exemple des polysaccharides, alginates, etc. sécrétées par lesdits microorganismes, l'application du 20 champ magnétique, ou électrique, ou électromagnétique ne permet pas de provoquer de mouvement desdites particules incorporées dans ledit biofilm. Lorsque les particules ne sont pas incorporées dans ledit biofilm, par exemple lorsque la mobilité des particules n'est pas entravée par la 25 présence de corps de microorganismes dont la taille est voisine de celles des particules, par exemple de l'ordre un à plusieurs micromètres, par exemple lorsque la mobilité des particules n'est pas entravée par la présence des systèmes d'adhésion desdits microorganismes, par exemple les filaments, pili, fimbriae, etc. générant un enchevêtrement bloquant la 30 progression des particules, par exemple lorsque la mobilité des particules n'est pas entravée par la présence de substances plus ou moins 3046 795 15 visqueuses sécrétées par lesdits microorganismes, par exemple des polysaccharides, alginates, etc., par exemple lorsque la mobilité des particules n'est pas entravée par des molécules liées au développement du biofilm de microorganismes, l'application du champ magnétique, ou 5 électrique, ou électromagnétique provoque le mouvement desdites particules. Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre avec une pluralité de particules, par exemple de 2 à 10 000 000, de 1000 à 1 000 000, de de 10 000 à 1 000 000, de 100 000 à 1 000 000, de 10 000 10 à 100 000. La pluralité de particules permet avantageusement de détecter directement, sans dispositif complexe de visualisation et sans colorant, l'interaction entre lesdites substances au contraire des procédés de l'art antérieur utilisant une seule particule et nécessitant pour la détection de l'interaction des dispositifs complexes de visualisation ou des colorants. 15 Selon l'invention, les particules peuvent être éclairées, par exemple au moyen d'une source lumineuse. L'éclairage permet avantageusement d'augmenter le contraste entre les particules et la solution. Selon l'invention, l'observation de peut être réalisée par tout moyen connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un dispositif 2 0 optique, par exemple un microscope, un appareil photo, d'un scanner de document, par exemple un scanner EPSON Perfection V600 Photo, une observation visuelle. Selon l'invention, l'observation peut permettre de mesurer, par exemple l'intensité, le contraste, la variance, d'image, par exemple via tout 25 moyen connu de l'homme du métier, par exemple un logiciel d'imagerie, par exemple ImageJ permettant, par exemple de mesurer, par exemple des différences de contrastes, d'intensités, correspondant par exemple aux particules, dans des zones d'une image à une autre et ainsi de déterminer les différences d'une observation à une autre. Il peut s'agir, par exemple 3 0 de comparer les images obtenues avant et après application de l'action mécanique, hydrodynamique ou physique, par exemple en faisant une 3046795 16 soustraction entre des images, par exemple en mesurant le coefficient de corrélation entre les images. Selon l'invention, l'utilisation de particules émettrices d'un signal, par exemple des particules colorées, excitables, fluorescentes, 5 phosphorescentes, luminescentes, radioactives peut permettre, par exemple une observation automatisée Selon l'invention, les conditions de réalisation du procédé de l'invention, en particulier de culture du microorganisme, sont des conditions 10 de cultures standardisées, par exemple le pH, la température, l'oxygénation, etc. Selon l'invention le maintien des milieux de culture ensemencés peut être réalisé pendant 1 à 24 heures, de préférence 1 à 8 heures, de préférence 4 à 6 heures. L'homme du métier de part ces connaissances 15 générales saura adapter le temps de maintien en fonction du microorganisme Selon l'invention le maintien des milieux de culture ensemencés peut être réalisé à une température comprise de 10 à 45 °C, de préférence de 25°C à 42°C, par exemple égale à 37°C 20 Selon l'invention le maintien des milieux de culture ensemencés peut être réalisé sous une atmosphère naturelle, dans un incubateur classique par exemple, ou sous atmosphère contrôlée pour les microorganismes microanaérophiles ou anaérobies stricts, selon tout moyen connu de l'homme du métier 25 Selon l'invention l'application du champ magnétique peut être réalisé par tout moyen connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce et/ou adapté. 30 Selon l'invention, le champ magnétique, ou électrique ou électromagnétique peut être tout champ permettant de mettre en 3046795 17 mouvement lesdites, au moins deux particules sur ladite surface immergée dans ladite solution, par exemple un champ électromagnétique ou un champ magnétique. Le champ magnétique, ou électrique ou électromagnétique peut être généré, par exemple par un aimant ou par un 5 solénoïde. L'aimant peut être par exemple sous forme de barreau, de pointe, de pièce, etc. ou toute forme appropriée pour la mise en oeuvre de la présente invention. Le champ peut, par exemple être appliqué par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par impulsion, par augmentation progressive du champ électromagnétique, par variations de 10 champ électromagnétique ou par une combinaison ces applications. Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape e') préalable/postérieure ou remplacant l'étape e) de détermination de la valeur de l'Index Biofilm (BFI) pour chacun des milieux encemencé et 15 calcul de l'indice de formation potentielle du biofilm par contenant (BPc) selon la formule (I) suivante : BPc= [1-(BFle / BFIn)] (I) dans laquelle BFIe correspond à la valeur de l'index biofilm dans le milieu ensemencé et BFIn correspond à la valeur de l'index biofilm dans un 20 contenant ne comprenant pas de microorganismes, une valeur de BFc supérieure ou égale à 0,26 indiquant la formation de biofilm. Selon l'invention, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la capacité de production de biofilm peut être déterminé comme suit : 25 - une valeur de BPc supérieure ou égale à 0,26 à partir d'une concentration de microorganismes comprise de 1x10-6 à 1x10-4 McF correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm, - une valeur de BPc supérieure ou égale à 0,26 à partir d'une 30 concentration de microorganismes supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme 3046795 18 producteur intermédiaire de biofilm, - une valeur de BPc supérieure ou égale à 0,26 à partir d'une concentration de microorganismes de 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme faible producteur de 5 biofilm, - une valeur de BPc inférieure à 0,26 quelle que soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm. 10 Dans la présente l'Index Biofilm (BFI) est obtenu par analyse des composantes de couleurs rouge vert bleu des pixels de l'image afin de déterminer la densité de particules par pixel, puis par calcul de la corrélation entre les particules pour déterminer la densité d'agrégation des particules exprimée par une valeur BFI. L'index BFI est décrit notamment 15 dans le document Chavant et al. 2007[ 74]. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. 20 EXEMPLES Exemple 1 : Evaluation de la capacité de production de biofilm de microorganisme 25 Dans l'exemple ci-dessous, un exemple de procédé selon l'invention est notamment désigné procédé de caractérisation ou procédé cBFRT. Dans cet exemple les matériaux et méthodes utilisées étaient les suivant : Souches et conditions de croissance 3 0 Souche de référence : Staphylococcus aureus American Type Culture Collection (ATCC) 25923, Staphylococcus aureus ATCC 6538, 3046795 19 Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas aeruginosa PA14, 5 Ralstonia mannitolilytica LMG 6866, Ralstonia mannitolilytica BK931 et les isolats cliniques de bactéries ont été cultivées en aérobie sur une gélose non sélectifs (de gélose au sang, gélose chocolat, agar McConkey) (Oxoid, Hampshire, Royaume-Uni) à 37 ° C. 10 Sélection des isolats Un total de 52 isolats cliniques recueillis auprès de patients atteints d'infections nosocomiales admis à l'hôpital IFO de Rome ont été évalués. Les bactéries ont été collectées à partir de différents matériaux, y compris d'infections chronique (ulcère), de cathéter intraveineux et des voies 15 urinaires, du sang, de l'urine, de crachats et d'échantillons de lavage nasobronchial. Un ulcère a été classé comme chronique s'ilexistait depuis au moins 3 mois (Dissemond, 2006). L'étude comprenait également des souches présentant une résistance accrue aux antibiotiques couramment utilisés comme déterminé selon la norme des tests de sensibilité aux 20 antibiotiques par le système de VITEK2 (bioMérieux, Florence, Italie). En particulier, les souches de P. aeruginosa résistantes à trois, ou plus, classes d'antibiotiques ont été considérés comme des microorganisme multi-résitants (MDR). Les souches K. pneumoniae résistant à la plupart des antibiotiques bêta-lactamines, y compris les pénicillines, 25 céphalosporines et l'aztréonam monobactame se développant sur milieu sélectif chromogène chromlD ESBL (bioMérieux, Florence, Italie) ont été classées à spectre étendu de bêta-lactamase (ESBL). La détection phénotypique des producteurs ESBL a encore été définie à l'aide du test de disque (Oxoid, Royaume-Uni), comme décrit dans De Gheldre et al, 30 2003; Moremi et al, 2014. Les souches K. pneumoniae résistantes aux carbapénèmes et identifiées par un milieu sélectif chromogène chromlD 3046 795 20 CARBA (bioMérieux, Florence, Italie) sont référencés comme K. pneumoniae produisant des carbapénémases (KPC). Les Staphylococcus aureus résistants à la méticilline (MRSA) étaient productrices de la protéine de liaison à la pénicilline (PBP) après confirmation par le test 5 d'agglutination latex PBP2 'kit (OXOID Ltd, Basingstoke, Royaume-Uni). Les Entérocoques résistant à la vancomycine (VRE) sont identifiés par des tests de sensibilité et confirmé par des milieux sélectifs chromogène chromlD VRE (bioMérieux, Florence, Italie). Les taux de sensibilité aux antibiotiques ont été comparés avec ceux définis par la concentration 10 minimale inhibitrice (CMI) selon les critères d'interprétation recommandée par le Comité Européen sur les Tests de Sensibilité aux Antimicrobiens (EUCAST). Le nombre d'espèces et les caractéristiques des souches testées sont signalés dans le tableau 2. Les isolats ont été stockés à -70°C dans des tubes de CRYOBANK (Copan Italia SpA) et cultivés pendant la 15 nuit à 37 ° C sur une boite de gélose spécifique avant le test. Préparation de l'inoculum La formation du biofilm a été évaluée par le BioFilm Ring Test (BFRT) (BioFilm Control, Saint-Beauzire, France) en utilisant le kit disponible dans 20 le commerce (BioFilm Control, Saint Beauzire, France). La solution de toner (TON004) contenant des billes magnétiques a été mélangée dans un milieu Brain Heart Infusion (BHI, Difco, Detroit, MI, USA) selon les instructions du fabricant. Différents paramètres de la méthode originale (Chavant et al., 2007) ont été modifiés afin de développer un test 25 applicable en microbiologie clinique. En particulier, une culture fraîche de bactéries sur gélose, d'une nuit a été utilisée pour chaque souche à tester. Les bactéries cultivées ont ensuite été transférées par une anse d'inoculation stérile dans un tube stérile contenant 2 ml de solution saline à 0,45% à l'équivalent de 1,0 ± 0,3 standard de turbidité McFarland (McF) et 30 bien mélangées. Ensuite, 200 pl de l'inoculum ont été transférés dans les puits d'une plaque de polystyrène à 96 puits. De cet inoculum initial, des 3046795 21 dilutions sérielles d'un facteur 10 ont été réalisées, de 1 x 10-1 à 1 x 10-6 McF en transférant 20 pl de la suspension microbienne dans 200 pl du mélange BHI / TON. Une ou plusieurs souches de laboratoire ont été incluse(s) dans 5 chaque plaque comme référence standard et contrôle de la qualité. Un puits contenant le BHI / TON mix sans cellules microbiennes a été utilisée comme contrôle négatif dans chaque expérience. Après cinq heures d'incubation à 37°C sans agitaticn (culture statique), les puits ont été recouverts de quelques gouttes de liquide de 10 contraste (huile inerte opaque utilisé pour l'étape de lecture, incluse dans le kit BFRT) placé pendant 1 min sur le bloc portant 96 mini-aimants (bloc test) et scanné avec un lecteur de plaque spécialement conçue (Pack BIOFILM, BioFilm Control, Saint Beauzire, France). La force d'adhérence de chaque souche a été exprimée en indice BioFilm (BFI), qui a été calculé 15 par un logiciel spécialisé initialement décrit dans Chavant et al. 2007. Les valeurs de BFI ont été utilisées pour mesurer le potentiel de formation de biofilm (BP) en utilisant la formule: BP = [1-(BFI échantillon/BFI moyen de contrôle négatif)] Ou BPc= [1-(BFle / BFIn)] (I) 20 pour chaque puits. La valeur seuil (CBFA) a été définie comme trois écarts-types au-dessus de la moyenne des puits témoins négatifs. Les valeurs de BP au-dessus de deux fois le cut-off ont été considérés comme des producteurs de biofilm (2BFIc 0,53 ; soit BFIc 0,26). Ainsi, la dernière dilution au- 25 dessus 2BFIc identifie la capacité du micro-organisme pour former un biofilm. En conséquence, les micro-organismes ont été classés dans les catégories suivantes: cellules non adhérentes, producteurs faibles, modérés et forts de biofilm. Chaque culture microbienne a été analysée en double exemplaire, et les expériences ont été répétées au moins 3 fois 30 pour chaque souche afin d'évaluer la reproductibilité, l'exactitude et la précision de la mesure. Les valeurs ont été considérées comme valables si 3046795 22 l'écart type entre les doublons était inférieur à 8%. Les réplicats ont montré une cohérence complète dans le classement/catégorisation des microorganismes. 5 Evaluation de la formation de biofilm avec le test au Cristal Violet Des plaques de polystyrène à 96 puits stériles ont été inoculées avec 200 pl d'une suspension bactérienne initiale (105 CFU / ml) dans du milieu BHI et incubé à 37°C pendant 24 et 48 heures sans agitation. Chaque condition a été réalisée en triplicat. Le milieu a été retiré des puits, qui ont 10 été lavés 3 fois avec 200 pl d'eau distillée stérile. Les plaques ont été séchées à l'air pendant 45 minutes et les cellules adhérentes colorées avec 200 pl de solution de Cristal Violet à 0,1%. Après 20 minutes, le colorant a été éliminé et les puits lavés quatre fois avec 300 pl d'eau distillée stérile pour éliminer l'excès de colorant. Le colorant incorporé par 15 les cellules formant un biofilm a été dissous avec 200 pl d'un mélange , 80/20% éthanol/acétone et l'absorbance de chaque puits a été mesurée par spectrophotométrie à 570 nm (DO570) en utilisant le Système PhD lx TM automatisé (Bio-Rad Laboratories , Hercules, CA, USA). Pour l'analyse comparative des valeurs de DO570 ont été utilisés pour 20 classer semi-quantitativement la production de biofilm pour les souches bactériennes selon le procédé décrit dans Stepanovic et al (Stepanovic et al, 2000). En bref, la Densité Optique seuil (ODC) a été définie comme trois écarts-types au-dessus de la Densité Optique (DO) moyenne du contrôle négatif. Aussi, les souches ont été classées comme suit: DO 25 4 x ODc = fort producteur de biofilm. Tous les dosages ont été effectués en triplicats, avec des souches de référence et des isolats cliniques testés à trois reprises pour évaluer des 30 variations éventuelles dans les conditions de dosage du biofilm. Méthodes statistiques 3046795 23 Le test de coefficient kappa a été utilisé pour déterminer la cohérence entre les résultats obtenus avec le procédé de caractérisation et le Cristal Violet (CV). La cohérence a été calculée selon Altman (Altman, 1991): kappa = 0,81 - 1, très bonne; kappa = de 0,61 à 0,80, bonne; kappa 0 0,41 5 à 0,60, modérée; kappa = 0,21 au 0,40, équitable; kappa 0,20, faible. Les résultats de la formation de biofilm obtenus avec les deux méthodes ont été comparés en utilisant en outre le test de McNemar. Les valeurs de p 0,74). Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard. Lignes en pointillés (- - -) indique les valeurs seuils (cut-off) aux D0570 REVENDICATIONS1. Procédé de détermination de la capacité de production de biofilm par un microorganisme comprenant les étapes suivantes: a) Introduire dans des contenants de culture comprenant un milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme au moins deux particules magnétiques ou magnétisables, lesdites particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, b) Introduire et ensemencer indépendamment le milieu de culture des contenants obtenus à l'étape a) avec ledit microorganisme à une concentration comprise de 1x10-1 à 1x10-6 McFarland (McF), chaque milieu comprenant indépendamment une concentration différente de microorganismes, c) maintenir les milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme, d) application d'un champ magnétique capable de mettre en mouvement lesdites au moins deux particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, e) détermination de la capacité de production de biofilm par le microorganisme par observation et mesure de l'agrégation desdites particules comme suit : - l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à une concentration comprise de 1x10-6à 1x10-4 McF correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm, - l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir d'une concentration supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, - l'absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir d'une concentration supérieure ou égale à 1x10-2 McF 3046795 56 correspondant à un microorganisme faible producteur de biofilm, - une agrégation desdites particules quelle que soit la concentration correspondant à un microorganisme non 5 producteur de biofilm. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le procédé comprend une étape e') de détermination de la valeur de l'Index Biofilm (BFI) pour chacun des milieux par : 10 - analyse des composantes des couleurs rouge, vert bleu des pixels de l'image permettant de déterminer la densité de particules par pixel, - calcul de la corrélation entre les particules, - calcul de la densité d'agrégation des particules exprimée en 15 BFI , et détermination de l'indice de formation potentielle du biofilm par contenant (BPc) selon la formule (I) suivante : BPc= [1-(BFle / BFIn)] (I) 20 dans laquelle BFIe correspond à la valeur de l'index biofilm dans le milieu ensemencé et BFIn correspond à la valeur de l'index biofilm dans un contenant ne comprenant pas de microorganismes, une valeur de BFc supérieure ou égale à 0,26 indiquant la formation de biofilm. 25 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la capacité de production de biofilm par le microorganisme est déterminée par comparaison de la valeur de BPc en fonction de la concentration de microorganismes comme suit : 30 - une valeur de BPc supérieure ou égale à 0,26 à partir d'une concentration de microorganismes comprise de 1x10-6 à 1x10- 3046795 57 4 McF correspondant à un microorganisme fort producteur de biofilm, - une valeur de BPc supérieure ou égale à 0,26 à partir d'une concentration de microorganismes supérieure à 1x10-4 et 5 inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme producteur intermédiaire de biofilm, - une valeur de BPc supérieure ou égale à 0,26 à partir d'une concentration de microorganismes de 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme faible producteur de 10 biofilm, - une valeur de BPc inférieure à 0,26 quelque soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm. 15 4. Procédé de classification de microorganismes comprenant les étapes suivantes: a) Introduire dans des contenants de culture comprenant un milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme au moins deux particules magnétiques ou 20 magnétisables, lesdites particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, b) Introduire et ensemencer indépendamment le milieu de culture des contenants obtenus à l'étape a) avec ledit microorganisme à une concentration comprise de 1x10-1 à 1x10-6 McF, chaque 25 milieu comprenant indépendamment une concentration différente de microorganismes, c) maintenir les milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme, d) appliquer un champ magnétique capable de mettre en 30 mouvement lesdites au moins deux particules reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture dans le but d'obtenir 3046795 58 une agrégation desdites au moins deux particules, e) classer le microorganisme en fonction par observation de l'agrégation desdites particules comme suit : - catégorie I : absence d'agrégation desdites particules 5 apparaissant à une concentration comprise de 1x10-6 à 1x10-4 McF - catégorie II : absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir d'une concentration supérieure à 1x10-4 et inférieure à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme 10 producteur intermédiaire de biofilm, - catégorie III : absence d'agrégation desdites particules apparaissant à partir d'une concentration supérieure ou égale à 1x10-2 McF correspondant à un microorganisme faible producteur de biofilm, 15 - catégorie IV : agrégation desdites particules quelle que soit la concentration correspondant à un microorganisme non producteur de biofilm. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 0 précédentes, comprenant six contenants de culture dans lesquels la concentration de microorganismes à l'étape b) est respectivement de 1x10- 6 McF, 1x10-5 McF, 1x10-4 McF, 1x10-3 McF, 1x10-2 McF et 1x10-1 McF. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 précédentes dans lequel le maintien des milieux de culture ensemencés dans des conditions permettant un développement dudit microorganisme est réalisé pendant 1 à 8 heures, de préférence 4 à 6 heures. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 30 précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux particules sont des particules chargées électriquement, magnétiques ou magnétisables ou 3046795 59 recouvertes d'au moins une couche magnétique ou magnétisable. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont 5 soumises à un champ électromagnétique, éventuellement appliqué par impulsion. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont 10 soumises à une augmentation progressive du champ électromagnétique. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit champ magnétique est généré par des moyens générateurs de champ en mouvement. 15 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont éclairées au moyen d'une source lumineuse pour détecter son mouvement. 20 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites, au moins deux, particules sont génératrices d'un signal. 13. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel 25 lesdites, au moins deux, particules sont excitables, fluorescentes ou phosphorescentes ou radioactives ou chimioluminescentes. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'un desdits compartiments ne comprend pas 30 ledit microorganisme, ledit compartiment représentant un témoin du milieu.