Brevet FR3045158A1 — publié le 20170616

Dispositif de test immunochromatographique à flux latéral, sans effet Hook La présente invention concerne un dispositif de test immunochromatographique à flux latéral et une méthode de test y associée, permettant notamment de s'affranchir de l'effet Hook qu'on soit en détection d'immunoglobuline ou d'antigène et/ou de lutter contre les phénomènes de compétition entre différentes classes d'immunoglobulines (par exemple IgG et IgM) et/ou au sein d'une même classe d'immunoglobuline (par exemple IgG, IgE) lors d'un dosage sérologique. Dans les tests immunochromatographiques à flux latéral (Lateral Flow Immuno Assay) classiques, destinés à la détection d'un anticorps ou d'un antigène (analyte), le conjugué marqué entre en contact avec l'échantillon susceptible de contenir l'analyte recherché, avant d'atteindre la ligne de test, sur laquelle le complexe conjugué-analyte va venir se fixer en interagissant avec un antigène ou anticorps fixé sur cette ligne test. La lecture de la réaction, positive ou négative, est réalisée visuellement ou au moyen d'un système adapté, par exemple optique ou magnétique. Du fait des quantités limitées de conjugué pouvant être engagées sur ce type de test et/ou des différentiels de vitesse de migration, lorsque l'échantillon contient une grande quantité d'analyte, la ligne de test peut se trouver rapidement saturée ou fortement occupée par de l'analyte ne s'étant pas combiné au conjugué marqué. Ainsi, malgré une forte charge en analyte, le résultat sur la ligne de test apparaît négatif. C'est ce qu'on appelle l'effet Hook ou encore prozone. Pour pallier cet inconvénient, il a été proposé d'augmenter la quantité de conjugué, ce qui peut entraîner des difficultés de remise en suspension du conjugué et donc des difficultés de migration, d'augmenter la quantité d'anticorps ou d'antigène sur la membrane, ce qui augmente le coût global du test et risque de dégrader la spécificité, ou de réaliser le test en deux étapes, échantillon et conjugué ou éluant d'un conjugué pré-déposé à l'état sec sur la bandelette de test, étant déposés en deux temps pour atteindre la ligne de test avec un décalage temporel. Dans WO 00/07015, la zone de dépôt d'échantillon est placée entre la zone de conjugué et la ligne test, ou les deux zones sont disposées de part et d'autre de la ligne de test. Ceci permet de faire migrer l'analyte vers la ligne de test avant de faire migrer le conjugué. Ces solutions présentent divers inconvénients. La première solution peut entraîner une migration d'échantillon dans les deux directions, vers la ligne test comme vers la zone de conjugué et, en outre, implique que le conjugué va migrer au travers d'une zone déjà parcourue par l'échantillon, ce qui peut gêner cette migration et réduire la quantité disponible de conjugué à l'endroit de la ligne test. La seconde solution 3045158 2 complexifie les problèmes de migration, en imposant des directions de migration opposées et se croisant. US 7,871,781 décrit également un dispositif de test comprenant, dans l'ordre, une zone de dépôt d'éluant, une zone de conjugué, une zone de dépôt d'échantillon, puis la 5 ligne de test. L'utilisation prévoit de déposer d'abord l'échantillon, de le laisser migrer, puis d'apporter l'éluant permettant d'entraîner le conjugué vers la ligne de test. Cette solution est confrontée aux mêmes inconvénients que ceux mentionnés à propos de WO 00/07015. Dans un test sérologique de détection d'IgG et/ou d'IgM, l'utilisation d'antigènes 10 spécifiques d'un pathogène et d'anticorps anti-IgG et/ou d'anticorps anti-IgM, induit différents phénomènes de compétition qui peuvent limiter la performance du test. Indépendamment de la localisation des antigènes et ou des anti-IgM et/ou des anti-IgG, conjugués ou immobilisés sur membrane, dans un test en une étape, les anti-IgG sont susceptibles de capturer aussi bien les IgG spécifiques du pathogène que les IgG non 15 spécifiques. Il en va de même des anti-IgM qui sont susceptibles de capturer aussi bien les IgM spécifiques que les non spécifique. Le taux basal des IgG est d'environ 16g/I (1216 g/1) et d'environ 2g/I (0,6-2g/1) pour les IgM. De son côté, l'antigène capturera les IgG et IgM spécifiques du pathogène. Tout ceci entraîne une compétition entre les IgG et IgM d'une même pathologie pour l'antigène utilisé. Il y a donc plusieurs compétitions possibles 20 dans la mise en oeuvre d'un test sérologique en une étape qui, en plus du risque d'effet Hook, peuvent entraîner une baisse de sensibilité du test. La présente invention a pour objectif de résoudre ou de restreindre les inconvénients mentionnés ci-dessus, notamment la problématique de l'effet Hook, sans 25 avoir les inconvénients de l'art antérieur. Un autre objectif de l'invention est de proposer une telle solution qui soit facilement réalisable compte tenu des techniques de fabrication des bandelettes utilisées dans les tests immunochromatographiques, sans en augmenter le coût de manière significative. Un autre objectif de l'invention est de proposer une telle solution qui soit facile à 30 utiliser tant sur le terrain qu'au laboratoire. Un autre objectif de l'invention est de proposer une telle solution qui permette de déposer échantillon et éluant sans avoir à attendre la fin de la migration de l'échantillon. Un autre objectif de l'invention est de proposer une telle solution qui permette la préparation de l'échantillon in situ. 3045158 3 Un autre objectif de l'invention est de proposer une telle solution qui puisse être utilisée pour la détection d'immunoglobulines (IgG, IgM, IgE, IgA, etc.) et pour la détection d'antigènes (virus, bactéries, etc.) ou autres marqueurs (protéines, glycoprotéines, etc.). Un autre objectif de l'invention est de proposer une telle solution qui permette 5 d'améliorer la spécificité et/ou la sensibilité du test. Un autre objectif de l'invention est de proposer une telle solution qui permette, dans un test de sérologie, de lutter contre une compétition entre différentes classes d'immunoglobulines, notamment entre IgG et IgM vis-à-vis de leur capture par un conjugué antigénique ou par un conjugué anti-IgG ou anti-IgM. 10 Un autre objectif de l'invention est de proposer une telle solution qui permette de restreindre le phénomène de compétition sur la membrane, notamment entre différentes classes d'immunoglobulines (par exemple IgG et IgM) et au sein d'une même classe d'immunoglobuline (par exemple IgG, IgE) lors d'un dosage sérologique. Un autre objectif est donc de proposer une telle solution permettant une détection 15 performante d'IgM et/ou d'IgG. Un autre objectif de l'invention est de proposer une telle solution qui permette de lutter contre l'effet Hook quelle que soit la matrice utilisée (sang, plasma, sérum, urine, matière fécale, matrice alimentaire, salive, etc.). Un autre objectif de l'invention est de permettre une tolérance sur le volume 20 d'échantillon déposé, en particulier le dépôt d'un volume d'échantillon excessif ne remettant pas en cause la conduite du test. Un autre objectif encore de l'invention est de pouvoir combiner cette solution avec une préparation de l'échantillon et/ou du conjugué directement sur le dispositif de test. 25 Ces objectifs ainsi que d'autres sont atteints par un dispositif de test immunochromatographique à flux latéral pour la détection d'un analyte dans un échantillon, comprenant un support poreux (par exemple membrane de nitrocellulose) portant à sa face supérieure au moins une ligne test, un premier tampon poreux, de réception de l'échantillon, dont une extrémité est en contact fluidique avec le support 30 poreux, un deuxième tampon poreux, pour le conjugué. Le deuxième tampon est placé au-dessus ou au-dessous du premier tampon dont il est séparé par un élément imperméable (pas de contact fluidique entre les deux tampons). Le deuxième tampon a une extrémité qui est en contact fluidique avec le support poreux en un emplacement situé entre le contact du premier tampon avec le support poreux et la ligne de test. 35 Le « contact fluidique » signifie comme cela est usuel que les deux éléments sont en contact physique, de manière à permettre la migration d'un liquide du premier élément 3045158 4 dans le deuxième. De manière préférée, ce contact est réalisé par chevauchement d'un élément sur l'autre. Dans la configuration préférée, l'extrémité aval du premier tampon et, de préférence, du deuxième tampon chevauchent la face supérieure du support poreux. Suivant un mode de réalisation, le dispositif de test immunochromatographique à 5 flux latéral pour la détection d'un analyte dans un échantillon, comprend le support poreux portant à sa face supérieure au moins une ligne test séparant une partie amont d'une partie aval du support poreux, le premier tampon poreux, de réception de l'échantillon, le deuxième tampon poreux, pour le conjugué (également appelé conjugué de révélation), tampon de réception de l'échantillon et tampon pour conjugué étant placés côté amont du 10 support poreux, par rapport à la ligne test. Le tampon de réception de l'échantillon est placé au contact fluidique de la partie amont du support poreux. De préférence, ce tampon est disposé de manière que sa partie au contact du support poreux s'étende au-dessus de ce dernier (en pratique, il suffit que l'extrémité aval du tampon chevauche le support poreux, mais rien n'empêche que l'ensemble du tampon chevauche le support en 15 amont de la ligne test). Suivant une première modalité, préférée, un premier film de matière imperméable (on se réfère ici à des liquides généralement aqueux), notamment matière plastique, est déposé, de préférence adhère, à la face supérieure du tampon de réception de l'échantillon, s'étendant sur une partie de celui-ci et laissant une partie amont non 20 recouverte de ce film (la partie du tampon non recouverte formant la zone de dépôt d'échantillon sur le tampon). Le premier film est aussi au contact, de préférence adhère, à la face supérieure d'une partie du support poreux et se termine par un bord aval de film positionné en amont de la ligne test. Le tampon pour conjugué est disposé de manière à s'étendre en partie au-dessus de la face supérieure de ce premier film et en partie au 25 contact du support poreux, avec un bord aval situé entre le bord aval du premier film et la ligne test. Un deuxième film de matière imperméable peut être placé au contact de la face supérieure du tampon pour conjugué, sur une partie amont de celui-ci, la partie non recouverte formant la zone de dépôt d'éluant pour conjugué. Le bord aval de ce deuxième film est situé en aval de la ligne test peut recouvrir totalement ou partiellement le support 30 poreux et également une partie du tampon absorbant. Un troisième film de matière imperméable peut être placé au contact de la face supérieure du tampon pour conjugué sur une partie en amont de la zone de dépôt de l'éluant du conjugué. La zone de dépôt est située entre ces deux films. Suivant une deuxième modalité, un premier film de matière imperméable, 35 notamment matière plastique, est déposé, de préférence adhère, à la face inférieure du tampon de réception de l'échantillon et du support poreux (ou seulement du support 3045158 5 poreux, si le premier tampon est entièrement placé sur le support). Ce film s'étend sous une partie amont du support poreux et se termine par un bord aval de film positionné en amont de la ligne test (mais au contact de la face opposée du support poreux). Le tampon pour conjugué est disposé au-dessous de cette feuille imperméable. Son extrémité amont 5 forme la zone la plus amont de l'ensemble et se trouve exposée à l'air libre pour présenter une zone de dépôt d'éluant pour conjugué. Son extrémité aval s'étend au-delà du bord aval de la feuille imperméable et se trouve en contact fluidique avec le support poreux en amont de la ligne test (mais au contact de la face opposée du support poreux). Le test de l'invention peut être utilisé aussi bien pour la détection 10 d'Immunoglobulines (IgG, IgM, IgE, IgA....) que pour la détection d'antigènes (virus, bactéries,..) ou autres marqueurs (protéines...). Le test vise plus particulièrement la détection d'Ig, comme il sera illustré plus loin. Le test de l'invention permet de réduire le cout du test : dans un test en 1 étape, un moyen de lutter contre l'effet Hook est d'augmenter la quantité de conjugué et 15 d'anticorps ou d'antigène répartie sur la membrane. Cette augmentation de la quantité des matières premières impacte significativement le cout du test. Le test de l'invention permet d'améliorer la spécificité du test : traditionnellement, une solution pour améliorer la spécificité d'un test en 1 étape est d'ajuster le test en diminuant la quantité de conjugué et ou la quantité d'anticorps ou antigène sur la 20 membrane, mais ceci est incompatible avec la lutte de l'effet Hook. Le test de l'invention permet d'améliorer la sensibilité du test en supprimant les faux négatifs ou les signaux faiblement positifs liés à un effet Hook total ou partiel: un test en 1 étape peut perdre entre 2 et 5 points de signal suivant la quantité d'échantillon positif utilisé allant jusqu'à rendre un résultat négatif. Un test selon l'invention permet d'atteindre 25 une intensité maximale de 9 sur une échelle allant de 0 à 9 (0 correspond à une ligne test non visible, 9 à une ligne test de couleur intense, foncée et homogène) En outre, de manière remarquable, l'augmentation du volume d'échantillon de 5 !IL à 80pL n'entraîne pas de baisse de l'intensité contrairement au test en une étape. Suivant une caractéristique de l'invention, le tampon pour conjugué est en contact 30 fluidique avec le support poreux par simple juxtaposition des deux éléments. Si le dispositif est placé dans une cassette, on ne prévoit de préférence pas de point de pression sur cette zone de contact. Le principe du test selon l'invention avec le flux d'échantillon précédant le flux de conjugué apporte un supplément d'efficacité. L'échantillon et son éventuel éluant 35 progressent par capillarité vers le support poreux, notamment membrane de nitrocellulose, avide d'humidité, le flux étant en outre renforcé par l'effet d'un éventuel 3045158 6 tampon absorbant placé en aval et qui prend le relais du support poreux pour entretenir la migration par capillarité. Quand le conjugué est élue, il suit ce flux de liquide initié par le support et de préférence entretenu par le tampon absorbant avantageusement prévu. Le support est déjà mouillé en amont et en aval du point d'arrivée du conjugué sur le support 5 et le flux de liquide entretenu vers le tampon absorbant fait que le conjugué est principalement attiré dans la bonne direction de progression par capillarité. Par ailleurs, la faible surface (par exemple d'environ 3 à environ 5 mm2, notamment environ 4 mm2) de contact et l'absence préférée de pression de la cassette entre le tampon pour conjugué et le support poreux, notamment compte tenu de l'existence d'un flux principal en direction 10 de la ligne test, est de nature à empêcher l'échantillon de migrer vers l'amont dans le tampon pour conjugué. Dans un mode de réalisation, le film imperméable déposé à la surface du tampon de réception d'échantillon et/ou du tampon pour conjugué et s'étendant sur une partie du support poreux adhère sur ces surfaces. Il peut s'agir d'une couche de matériau 15 appliquée par pulvérisation ou spray, par pinceau, ou toute autre méthode permettant d'appliquer et former une couche mince de film imperméable. Peuvent être utilisés, par exemple, des matériaux choisis parmi polyester, polypropylène, PVC, polyimide ou polyuréthane. Il peut aussi s'agir d'une feuille (préconstituée), souple, semi-rigide ou rigide, avantageusement souple. Avantageusement cette feuille est collée ou est 20 adhésive, afin d'adhérer à la surface du tampon de réception d'échantillon et du support poreux. On peut utiliser un ruban, de préférence adhésif, en polyester, en polypropylène, en PVC, en polyimide ou en polyuréthane. Des exemples de rubans adhésifs réalisés dans ces différentes matières, sont connus, par exemple ceux commercialisés par la société 3M®. On peut également employer de tels rubans qui sont adhésifs sur leurs deux 25 faces (double face), comme ceux commercialisés par 3M®, ce qui peut faciliter la fabrication du dispositif avec un maintien des différentes couches lors des manipulations. Dans un mode de réalisation, le tampon de réception d'échantillon présente une surface exposée à l'air libre, formant la zone de dépôt d'échantillon. Celle-ci se situe idéalement en amont du test, c'est-à-dire à l'opposé de la ligne test du support poreux. 30 Dans un mode de réalisation, la face supérieure du tampon pour conjugué est exposée au milieu extérieur, formant la zone de dépôt d'éluant pour conjugué. Dans un mode de réalisation, la face supérieure du tampon pour conjugué et plus précisément au moins la zone de dépôt d'éluant pour conjugué, est recouverte d'un film de matière hydrosoluble, de préférence de matière plastique hydrosoluble. Il peut s'agir 35 d'un film de matière déposé par spray, pulvérisation, pinceau, ou autre méthode permettant d'appliquer et former une couche mince de film hydrosoluble. Il peut aussi 3045158 7 s'agir d'une feuille (préconstituée) de matière hydrosoluble, de préférence adhésive ou que l'on colle. De manière avantageuse, ce film hydrosoluble est conçu pour se dissoudre au contact d'un liquide ou éluant aqueux en un temps prédéterminé, notamment compris entre environ 1 et environ 10 min, notamment entre environ 2 et environ 8 min, de 5 préférence entre environ 3 et environ 7 min. Le film hydrosoluble permet de s'affranchir du temps d'attente entre les deux dépôts (e.g. dépôt de l'échantillon + éluant et dépôt de l'éluant pour élution du conjugué). Dans ce cas l'opérateur dépose le volume d'échantillon et d'éluant si nécessaire dans la fenêtre de dépôt de l'échantillon et, sans attendre, le volume d'éluant préconisé dans la fenêtre d'élution du conjugué. Le film se dissout en un 10 temps déterminé et permet ainsi l'élution du conjugué au moment opportun. Ce mode de réalisation est avantageusement associé à la présence d'un puits dans le boîtier ou cassette, dont il sera question plus loin, permettant de recueillir le volume d'éluant. Comme matériau utilisable pour les films hydrosolubles utilisés dans le dispositif de l'invention, on peut mentionner ceux décrits dans US2008/0124381. Il s'agit de films 15 adhésifs désintégrables (délitement) en présence d'un milieu aqueux, la durée de désintégration ou de dissolution pouvant être ajustée en jouant notamment sur la composition et/ou l'épaisseur du film. La composition peut comprendre un mélange de composants hydrosolubles de haut et de bas poids moléculaire, éventuellement un composé à base d'amidon et/ou d'un polysaccharide, éventuellement un plastifiant et/ou 20 un humectant. Comme composant hydrosoluble, on peut citer : hydroxypropylméthylcellulose, hydroxyéthyle cellulose, hydroxypropyle cellulose, polyvinyle pyrrolidone, carboxyméthylcellulose, sodium carboxyle méthyl cellulose, méthyl cellulose, alcool polyvinylique, alginate de sodium, polyéthylène glycol, gomme xanthane, gomme de guar, gomme d'acacia, gomme arabique, carraghénane, acide polyacrylique, 25 etc. L'homme du métier pourra se référer à ce document, lequel est incorporé ici par référence. Dans un mode de réalisation, le tampon pour conjugué contient ledit conjugué sprayé séché. Dans un mode de réalisation, le film hydrosoluble, de préférence une feuille, qui 30 est placée à la face supérieure du tampon pour conjugué, contient ledit conjugué. Le tampon lui-même n'a pas besoin de contenir du conjugué dans ce cas de figure. L'application de l'éluant sur le film hydrosoluble entraîne sa dissolution et la remise en suspension du conjugué. Comme précédemment, le film hydrosoluble, dont on a proposé des types de composition ci-dessus, peut être conçu pour se dissoudre au contact d'un 35 éluant aqueux en un temps prédéterminé, notamment compris entre environ 1 et environ 10 min, notamment entre environ 2 et environ 8 min, de préférence entre environ 3 et 3045158 8 environ 7 min. Ce mode de réalisation est avantageusement associé à la présence d'un puits dans le boîtier ou cassette, dont il sera question plus loin, permettant ce traitement. Dans un mode de réalisation, la zone de dépôt d'échantillon à la surface du tampon d'échantillon est recouverte d'un film de matière hydrosoluble, de préférence de 5 matière plastique hydrosoluble. Ce film peut être déposé par spray ou pulvérisation, au pinceau, ou autre méthode. Il peut aussi s'agir d'une feuille de matière, de préférence adhésive ou que l'on colle. De manière avantageuse, ce film hydrosoluble est conçu pour se dissoudre au contact d'un milieu aqueux en un temps prédéterminé, notamment compris entre environ 5 s et environ 5 min, notamment entre environ 10 s et environ 3 10 min, de préférence entre environ 30 s et environ 3 min. Sa fonction est de permettre à l'opérateur de traiter l'échantillon directement à sa surface. Ce mode de réalisation est avantageusement associé à la présence d'un puits dans le boîtier ou cassette, dont il sera question plus loin, permettant ce traitement. Ce traitement peut être la dilution de l'échantillon avec un éluant ou diluant. Des compositions pour ce film hydrosoluble sont 15 les mêmes que ci-dessus. Dans un mode de réalisation, un troisième tampon, formant absorbant, est placé au contact de la partie aval du support poreux, en aval de la ligne test. Dans un mode de réalisation, où le tampon pour conjugué est disposé au-dessus du tampon pour échantillon, un deuxième film ou feuille de matière imperméable de 20 maintien, de préférence de matière plastique, est disposé sur, de préférence adhère à, d'une part la face supérieure du tampon pour conjugué, en aval de la zone de dépôt d'éluant, d'autre part à la face supérieure du support poreux et encore d'autre part, de préférence, à la face supérieure d'un tampon absorbant situé au contact du support poreux en aval de la ligne test. Cette feuille ou film est avantageusement transparent ou 25 translucide, pour rendre visible la ligne test et l'éventuelle ligne de contrôle. Dans un mode de réalisation, le test comporte en outre un boîtier allongé logeant les éléments précités, comportant un fond et un couvercle comportant une fenêtre de l'échantillon placé au-dessus de la face supérieure du tampon de réception de l'échantillon, une fenêtre d'élution du conjugué placée au-dessus du tampon pour conjugué et une fenêtre de 30 lecture placée au-dessus de la ligne test. Dans un mode de réalisation, l'ensemble qui vient d'être décrit, qui forme une bandelette de test immunochromatographique, est placé dans un boîtier. Ce dernier est de préférence entièrement fermé, sauf au niveau des ouvertures qui sont prévues. Il comporte notamment à sa partie supérieure au moins deux ouvertures ou fenêtres, 35 disposées l'une après l'autre depuis l'extrémité d'amont. La plus amont est située au- dessus de la zone de dépôt d'échantillon sur le tampon de réception d'échantillon. La 3045158 9 seconde est située au droit de la zone de dépôt d'éluant du tampon pour conjugué. D'autres ouvertures peuvent être prévues si d'autres zones de dépôt sont prévues. Une autre ouverture peut être prévue au droit de la ligne de test et de l'éventuelle ligne contrôle. En variante, pour rendre ces lignes visibles, le boîtier peut être transparent ou 5 muni d'une partie transparente. Dans un mode de réalisation, le boîtier comporte une face supérieure comportant au moins un relief en creux, dont la base vient en appui sur la surface de la bandelette placée dans le boîtier et formant un puits ou volume de dépôt de liquide. En variante, ce relief en creux peut être associé à un rebord saillant vers l'extérieur du boîtier. Le volume 10 du puits est adapté au volume de liquide à déposer. Le volume du puits peut par exemple aller d'environ 40 à environ 200 pl. Dans un mode de réalisation, un tel puits est associé à la fenêtre de dépôt d'échantillon. Dans un mode de réalisation, un tel puits est associé la fenêtre d'élution du conjugué. Un mode de réalisation comprend les deux puits. Dans un mode de réalisation, la ligne test porte un antigène ou un anticorps 15 spécifique de l'analyte recherché (anticorps, respectivement antigène), cet antigène ou anticorps étant immobilisé sur ladite ligne. L'immobilisation peut être effectuée de toute manière connue en soi. Dans un mode de réalisation, la ligne test porte un antigène et le tampon pour conjugué contient un conjugué comprenant un anticorps anti-IgM. De manière optionnelle, 20 le tampon d'échantillon ou le support poreux en amont de la ligne test porte des anticorps anti-IgG, destinés à éliminer des IgG présentes dans l'échantillon. Dans un mode de réalisation, la ligne test porte un antigène et le tampon pour conjugué contient un conjugué comprenant un anticorps anti-IgG. De manière optionnelle, le tampon d'échantillon ou le support poreux en amont de la ligne test porte des anticorps 25 anti-IgM, destinés à éliminer des IgM présentes dans l'échantillon. Dans un mode de réalisation, la ligne test porte un anticorps anti-IgM et le tampon pour conjugué contient un conjugué comprenant un antigène. De manière optionnelle, le tampon d'échantillon ou le support poreux en amont de la ligne test porte des anticorps anti-IgG, destinés à éliminer des IgG présentes dans l'échantillon. 30 Dans un mode de réalisation, la ligne test porte un anticorps anti-IgG et le tampon pour conjugué contient un conjugué comprenant un antigène. De manière optionnelle, le tampon d'échantillon ou le support poreux en amont de la ligne test porte des anticorps anti-IgM, destinés à éliminer des IgM présentes dans l'échantillon. Dans un mode de réalisation, la ligne test porte un antigène et le tampon pour 35 conjugué contient un conjugué comprenant un anticorps anti-IgM et un conjugué comprenant un anticorps anti-IgG. 3045158 10 Dans un mode de réalisation, la ligne test porte un anticorps anti-IgG et un anticorps anti-IgM et le tampon pour conjugué contient un conjugué comprenant un antigène. Dans un mode de réalisation, la ligne test porte un anticorps anti-IgE et le tampon 5 pour conjugué contient un conjugué comprenant un antigène. Dans un mode de réalisation, la ligne test porte un antigène et le tampon pour conjugué contient un conjugué comprenant un anticorps anti-IgE. L'invention a aussi pour objet une méthode de test immunochromatographique à flux latéral pour la détection d'un analyte présent dans un échantillon, sur une ligne test 10 placée sur le support poreux d'un dispositif de test immunochromatographique à flux latéral, méthode du type comprenant le dépôt de l'échantillon sur le dispositif, puis la migration de l'échantillon sur le support poreux vers la ligne test, et le dépôt séparé sur le dispositif d'un éluant ou d'un éluant contenant un conjugué, puis la migration de l'éluant contenant un conjugué sur le support poreux vers la ligne test, le front d'éluant atteignant 15 la ligne de test après le front d'échantillon. L'on fait déboucher (arriver) l'éluant contenant le conjugué sur le support poreux en amont et au plus proche de la ligne test, de préférence d'environ 1 à environ 10 mm, notamment d'environ 1 à environ 3 mm de de la ligne test. Dans un mode de réalisation, une fois que l'échantillon a traversé la ligne test, on 20 fait déboucher l'éluant contenant le conjugué sur le support poreux. Dans un mode de réalisation, échantillon et éluant sont déposés simultanément ou dans un court laps de temps (notamment d'environ 1 à environ 30 s) sur le dispositif de test. Dans un mode de réalisation, l'éluant du conjugué est déposé sur le dispositif de 25 test d'environ 1 à environ 10 min, notamment d'environ 2 à environ 8 min, de préférence d'environ 3 à environ 7 min, après le dépôt de l'échantillon. Dans un mode de réalisation, l'éluant est déposé à la surface d'un film de matière hydrosoluble, de préférence de matière plastique hydrosoluble. Dans un mode de réalisation, le film de matière hydrosoluble se dissout au contact 30 de l'éluant dans un temps déterminé compris notamment entre environ 1 et environ 10 min, notamment entre environ 2 et environ 8 min, de préférence entre environ 3 et environ 7 min. Dans un mode de réalisation, l'on dépose d'environ 40 à environ 200 pl d'éluant. Glossaire : 3045158 11 ^ Test immunochromatographique à flux lateral (Lateral Flow Immuno Assay): test de détection d'analyte (notamment antigène, anticorps,..) en utilisant une réaction immunologique ^ Fenêtre de l'échantillon (Window of sample): fenêtre de dépôt de l'échantillon 5 et de l'éluant de l'échantillon, s'il est nécessaire de diluer l'échantillon ^ Fenêtre de lecture (Window of reading): fenêtre de lecture des résultats ^ Fenêtre d'élution du conjugué (Window of conjugate elution): fenêtre de dépôt de l'éluant pour réaliser un test en 2 étapes. ^ Echantillon (Sample): matrice contenant l'analyte (sang, plasma, sérum, urine, 10 fèces....) ^ Analyte: élément qui est recherché (Anticorps, antigènes, protéine ....) ^ Tampon de l'échantillon (sample pad): tampon de réception de l'échantillon, peut servir de préfiltre. ^ Tampon du conjugué (conjugate pad): tampon contenant le conjugué qui a été 15 préalablement déposé, notamment sprayé, puis séché ; par extension ici, tampon sans conjugué, le conjugué étant présent dans la feuille hydrosoluble. ^ Conjugué (Conjugate): particule, notamment nanoparticule, couplée à un anticorps ou un antigène spécifique de l'analyte recherché, la particule pouvant être colorée (en elle-même ou portant un motif coloré), ou détectable 20 après excitation, par exemple par fluorescence ou excitation magnétique. ^ Support poreux : élément supportant la ligne test. ^ Membrane nitrocellulose: mode habituel pour un support poreux qui supporte la ligne test. ^ Ligne test (Test line): zone sur la membrane contenant un réactif, notamment 25 anticorps ou antigène, spécifique de l'analyte recherché, fixé sur la membrane. ^ Ligne contrôle (Control line): zone contenant sur la membrane un réactif, notamment un anticorps, capable de retenir le conjugué en excès. ^ Absorbant ou tampon absorbant (Absorbent pad): tampon épais qui entretien 30 la migration par capillarité et stock l'excès de liquide. ^ Support (Backing): support rigide ou semi-rigide, notamment cartonné, de préférence collant, servant de support à l'assemblage, et permettant la fabrication du test par lamination et découpe. ^ Bandelette de test : tous les éléments constitutifs, notamment support poreux, 35 tampons absorbant, d'échantillon et de conjugué, éventuellement support (backing), que l'on place dans le boîtier. 3045158 12 ^ Boîtier : Cassette en matière plastique comprenant un fond et un couvercle qui maintient la bandelette. Elle permet également d'effectuer des points de pression sur la bandelette afin de contrôler la vitesse de migration des liquides déposés. 5 ^ Amont et aval se réfèrent à la direction de migration dans le test, cette migration s'effectuant depuis le tampon d'échantillon (à l'extrémité fonctionnelle amont), vers le support poreux et sa ligne test, et se terminant dans le tampon absorbant (à l'extrémité fonctionnelle aval), lorsque ce dernier est présent (ce qui est préféré). 10 Les matériaux utilisables pour les différents tampons sont ceux habituellement utilisés dans le domaine et sont donc parfaitement connus de l'homme du métier. On peut rappeler ce qui suit, à titre d'illustration : tampon échantillon : fibre de coton ou fibre de verre ; tampon conjugué : fibre de verre ou fibre de polyester ; tampon absorbant : fibre de coton. Le tampon échantillon peut être traité pour retenir des molécules ou des protéines 15 spécifiquement ou du fait de sa structure physique peut retenir des protéines ou des cellules par un phénomène de filtration (par exemple rétention des globules rouge durant la migration). Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un film ou feuille hydrosoluble conçue pour se dissoudre au contact d'un liquide aqueux en un temps prédéterminé, notamment 20 compris entre environ 1 et environ 10 min, notamment entre environ 2 et environ 8 min, de préférence entre environ 3 et environ 7 min, pour former, à la surface d'un tampon pour échantillon et/ou d'un tampon pour conjugué d'un dispositif de test immunochromatographique à flux latéral, une barrière temporelle à l'absorption d'un liquide par ledit tampon. Cette utilisation peut concerner non seulement un test en 2 25 étapes, comme il vient d'en être question, mais aussi un test en 1 étape. Dans un test en 1 étape la feuille ou le film hydrosoluble peut être placé sur le tampon d'échantillon pour retenir l'échantillon dans le puits, permettant notamment d'effectuer : - Un traitement de l'échantillon qui est habituellement effectué dans un tube. 30 Par exemple : effectuer une lyse des hématies pour libérer les parasites dans le test malaria ou libérer les antigènes dans le cas des immunocomplexes. ; - Une dilution habituellement effectuée dans un tube dans le but de réduire la viscosité de l'échantillon ce qui faciliterait sa migration ; et/ou - La mise en contact d'un échantillon avec un conjugué. L'utilisation d'un conjugué 35 liquide incubé avec l'échantillon augmente la probabilité de rencontre entre l'analyte et le conjugué avant la migration. 3045158 13 On peut utiliser une telle feuille ou film qui contient un composé utile pour le test, par exemple : - le conjugué, - une ou des molécules de traitement de l'échantillon, et/ou 5 - un ou des colorants ou un ou des éléments indiquant la bonne migration du test. Un autre objet encore de l'invention est donc un dispositif de test immunochromatographique à flux latéral pour la détection d'un analyte dans un échantillon, du type 1 étape, comprenant un support poreux (par exemple membrane de nitrocellulose) portant à sa face supérieure au moins une ligne test, de préférence une 10 ligne contrôle. A son extrémité amont, le dispositif comporte, d'amont en aval, un premier tampon poreux, de réception de l'échantillon, un deuxième tampon poreux, le premier tampon étant en contact fluidique avec le deuxième tampon, lui-même en contact fluidique avec le support poreux, en amont de la ligne test. Le premier tampon est avantageusement placé au-dessus du deuxième tampon. Le dispositif de test comporte 15 avantageusement un boîtier comportant un puits d'un certain volume, notamment d'environ 40 à environ 200 pl. Une feuille ou film hydrosoluble comme indiqué ci-dessus est placée à la surface du tampon pour échantillon. La ligne test peut comprendre un antigène ou un anticorps immobilisé sur ladite ligne, par tout moyen connu. Les autres caractéristiques données pour le test 2 étapes, lorsqu'elles sont compatibles avec un test 20 1 étape, sont applicables à cet objet. Il s'agit notamment du matériau des différents composants du dispositif, de son application à la détection de diverses immunoglobulines, de la structure du boîtier, avec une seule fenêtre ou puits, etc. Le dispositif peut notamment être utilisé dans les tests sérologiques ou dans les tests de détections d'antigènes/protéines. 25 En variante, le dispositif ne comporte pas de tampon pour conjugué. Le tampon de réception de l'échantillon est en contact fluidique avec le support poreux. Dans ce cas de figure, le conjugué est mélangé à l'échantillon par dépôt des deux sur le film ou feuille, ou alors le conjugué est présent dans le film ou feuille. 30 L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se référant au dessin annexé, dans lequel : La figure 1 est une représentation schématique d'un test classique en 1 étape, montrant, de bas en haut, la bandelette de test en coupe, la bandelette de test vue 35 de dessus, la bandelette de test vue en éclaté, le boîtier en vue de trois quarts. 3045158 14 La figure 2 est une représentation schématique d'un test selon un premier mode de réalisation de l'invention, montrant, de bas en haut, la bandelette de test en coupe, la bandelette de test vue de dessus, la bandelette de test vue en éclaté, le boîtier en vue de trois quarts. 5 La figure 3 est une représentation schématique de la fabrication d'un test classique en 1 étape. La figure 4 est une représentation schématique de la fabrication d'un test selon l'invention. Les figures 5, 6, 8 et 9 sont des représentations schématiques de différents tests 10 selon l'invention, montrant, de bas en haut, la bandelette de test en coupe, la bandelette de test vue de dessus, la bandelette de test vue en éclaté, le boîtier en vue de trois quart. La figure 7 est une représentation schématique d'un boîtier muni d'une partie délimitant un puits de dépôt d'échantillon. 15 Le test 2 étapes a permis de résoudre une problématique d'effet Hook (ou effet prozone) apparaissant dans un test en une étape de détection des IgM anti-leptospirose à partir de sérum de patients. Lors de ce test en une étape (principe à l'exemple 1), l'échantillon du patient et 20 l'éluant migrent du tampon d'échantillon vers et au travers le tampon de conjugué (sprayé et séché sur/dans le tampon), libérant le conjugué avec anticorps anti-IgM humaine. Ce conjugué capture les IgM anti-leptospirose provenant de l'échantillon de patient. Ce couple conjugué-IgM migre jusqu'à la ligne test pour être capturé par des antigènes immobilisés sur la ligne test, permettant spécifiquement la capture des IgM humaines anti- 25 leptospirose. En présence d'une forte concentration d'lgM dans l'échantillon, le conjugué et les antigènes de la ligne test peuvent être saturés. L'antigène ne peut donc plus capturer le couple conjugué-IgM et donc induire un résultat faussement négatif ou un résultat faiblement positif, pouvant entraîner un doute sur la positivité. Il faut savoir également que, lors du passage de l'échantillon avec son éluant, un premier front de 30 migration se forme en sortie de tampon de conjugué. Ce premier front peut potentiellement comporter plus d'lgM libres que liées au conjugué, en raison notamment du temps de remise en suspension du conjugué séché. Ceci explique donc que la ligne test puisse également être saturée avant que le couple conjugué/IgM ne l'atteigne. Des premiers essais d'un test en 2 étapes ont été réalisés en effectuant une 35 première migration de l'échantillon sur un test avec tampon d'échantillon et tampon pour conjugué, mais sans conjugué. Après migration de l'échantillon, ce dernier tampon a été 3045158 15 remplacé par un tampon contenant le conjugué sprayé et séché. Après montage, le conjugué sprayé séché a été élué. Ainsi le conjugué qui n'avait pas rencontré les IgM de l'échantillon pouvait révéler les IgM capturées par les antigènes de la ligne test. Ces essais ont montré une augmentation des signaux de façon significative (de 3 à 6) sur une 5 échelle de 0 à 9. Le test en 2 étapes selon l'invention a ensuite été utilisé, dans sa configuration générale de l'exemple 2, avec l'utilisation d'un film plastique qui permet l'absence de contact entre les deux tampons. Cette absence de contact permet à l'échantillon de migrer dans le tampon d'échantillon et sous le tampon de conjugué, sans remettre en 10 suspension le conjugué. Le conjugué est élué dans un second temps. Ce montage a permis d'atteindre des valeurs de 9. Avec ce type de montage le conjugué peut être amené au contact de membrane de nitrocellulose (ou équivalent) au plus proche de la ligne test et ainsi rencontrer qu'une infime quantité d'IgM qui serait restée dans la membrane de nitrocellulose après migration. 15 Exemple 1 Test en 1 étape (soumis à l'effet Hook) - Figure 1 Légende et description de la Figure 1: support 1, tampon d'échantillon 2, tampon de conjugué 3, membrane de nitrocellulose 4, ligne test 5, ligne contrôle 6, tampon absorbant 7, boîtier 8, fenêtre d'échantillon et d'éluant 9, fenêtre de lecture 20 10. Principe et utilisation : - Dépôt de l'échantillon : entre 51..11_ et 100 !IL d'échantillon sont déposés sur le tampon d'échantillon. Suivant le volume d'échantillon, un dépôt d'éluant allant de 40 à 2001..1L peut être réalisé pour initier la migration par capillarité de l'échantillon 25 du tampon d'échantillon vers le tampon de conjugué, puis la membrane de nitrocellulose (de la gauche vers la droite sur la Figure 1). - Migration de l'échantillon dans le tampon de conjugué : le conjugué sprayé et séché sur le tampon de conjugué est remis en suspension par l'éluant et l'échantillon. Si l'analyte recherché est présent, un couple conjugué analyte se 30 crée. - Migration dans la membrane : si l'analyte est présent dans l'échantillon, le couple analyte conjugué est capturé par la ligne test créant une ligne test colorée dont l'intensité sera proportionnelle à la quantité de couple conjugué/ analyte capturé par la ligne test. L'excès de conjugué est ensuite capturé par la ligne contrôle. A 35 contrario de la ligne test l'intensité du signal de la ligne de contrôle doit être constante d'un test à l'autre. 3045158 16 - Migration dans le tampon absorbant : ce tampon absorbant permet quand le front de migration de l'échantillon et de l'éluant arrive de la membrane vers le tampon absorbant, de prolonger la migration par capillarité. Il sert également de réservoir à l'excès d'éluant. 5 L'effet Hook ou effet prozone : Dans des conditions optimales, la formation de complexes analyte-conjugué se produit quand les sites antigéniques et les molécules d'anticorps sont approximativement en quantité égale. C'est la zone d'équivalence. Ce couple est ensuite capturé par la ligne Test. Si les analytes sont en excès, le complexe analyte-conjugué se fera mais l'excès d'analyte peut saturer la ligne test avant le 10 complexe analyte-conjugué soit capturé par celle-ci pouvant rendre un résultat négatif ou faiblement positif. Exemple 2 : Test en 2 étapes : 2 dépôts avec un temps d'attente - Figure 2 Légende et description de la Figure 2: le terme amont signifie côté gauche de la 15 figure, aval désignant le côté droit, ce qui correspond également à la direction de diffusion liquide ; support 11 ; tampon d'échantillon 12 placé à l'extrémité amont du support auquel il adhère, et dont l'extrémité aval vient chevaucher le support poreux (membrane de nitrocellulose) 13 afin d'assurer un bonne continuité de diffusion liquide; une première feuille de matière plastique 14 adhésive par sa face inférieure, appliquée de manière à 20 recouvrir le tampon d'échantillon sauf dans la partie amont de ce dernier (laissant une zone de dépôt 15 d'échantillon exposée à l'air libre), et une partie amont de la membrane de nitrocellulose ; tampon de conjugué 16 recouvrant la feuille 14 et s'étendant au contact de la membrane de nitrocellulose 13 par son extrémité aval 17; une deuxième feuille de matière plastique 18 recouvre la partie amont du tampon de conjugué 16 et l'extrémité 25 amont de la première feuille 14 ; une troisième feuille de matière plastique 19, transparente, recouvre, d'une part, la partie aval du tampon de conjugué 16, laissant une zone de dépôt d'éluant 20 exposée à l'air libre, d'autre part la bande de nitrocellulose, sa ligne test 21 et sa ligne contrôle 22 (visibles par transparence au travers de la feuille 19), ainsi que la partie amont du tampon absorbant 23 ; boîtier 24, fenêtre d'échantillon 25, 30 fenêtre de dépôt d'éluant 26 et fenêtre de lecture 27 (à noter que ces fenêtres sont simplement figurées sur les figures, sans qu'il faille en tirer des conclusions sur leurs dimensions, qui doivent être adaptées aux volumes traités). Principe et utilisation - Dépôt de l'échantillon : entre 5111_ et 100 1..1L d'échantillons sont déposés sur le 35 tampon d'échantillon. Suivant le volume d'échantillon, un dépôt d'éluant allant de à 2001..1L peut être réalisé pour initier la migration par capillarité de l'échantillon 3045158 17 du tampon d'échantillon vers le tampon de conjugué et la membrane de nitrocellulose (de la gauche vers droite) - Migration dans la membrane : Si l'analyte recherché est présent dans l'échantillon, il est capturé par la ligne test. 5 - Migration dans l'absorbent : l'absorbent pad permet quand le front de migration de l'échantillon et de l'éluant arrive de la membrane vers le tampon absorbant de prolonger la migration par capillarité. Il sert également de réservoir à l'excès d'éluant. - Dépôt de l'éluant du conjugué quelques minutes, typiquement de 2 à 7 mn minutes 10 après le début de migration de l'échantillon: dépôt de 40 à 200pL d'éluant dans la fenêtre d'élution du conjugué. Le conjugué sprayé séché sur le tampon de conjugué est solubilisé par l'éluant et atteint la membrane de nitrocellulose juste avant la ligne test. - Migration du conjugué dans la membrane : le conjugué suit le flux de migration de 15 l'échantillon. Si l'analyte est présent dans l'échantillon, le conjugué révèle l'analyte qui est déjà capturé par la ligne test créant une ligne colorée dont l'intensité sera proportionnelle à la quantité de conjugué. L'excès de conjugué est ensuite capturé par la ligne contrôle. A contrario de la ligne test l'intensité du signal de la ligne de contrôle doit être constante d'un test à l'autre. 20 - Migration dans le tampon absorbant: celui-ci permet de prolonger la migration par capillarité de l'excès du conjugué et de réservoir à l'excès d'éluant. Exemple 3 : Test en 2 étapes : 2 dépôts sans temps d'attente avec film dissolvable - Figure 5 25 On a ajouté dans le dispositif de la figure 2, une feuille de matière plastique hydrosoluble 28, placé au contact du tampon de conjugué 16 à l'emplacement de la zone de dépôt d'éluant 20. Le matériau de la feuille d'élution du conjugué est choisie pour se dissoudre en un temps déterminé à partir du moment où l'éluant est déposé. Cette durée est choisie pour permettre à l'échantillon de migrer et atteindre la ligne test avant le 30 conjugué. Ceci permet à l'utilisateur du test de déposer échantillon et éluant sensiblement en même temps, sans attendre un temps de migration. Principe et utilisation : Le principe est le même qu'à l'exemple 2, sauf que ce test ne nécessite pas un temps d'attente entre les dépôts de l'échantillon et de l'éluant. La feuille hydrosoluble qui 35 recouvre le tampon de conjugué peut notamment être sélectionnée pour se dissoudre après environ 1 et environ 10 min, notamment entre environ 2 et environ 8 min, de 3045158 18 préférence entre environ 3 et environ 7 min de contact avec l'éluant et permet la libération de l'éluant qui entraîne la libération du conjugué et sa migration. La matière de la feuille peut être en l'un des matériaux hydrosolubles décrits dans US2008/0124381. 5 Exemple 4 : Test en 2 étapes : 2 dépôts avec temps d'attente et avec un puits permettant la dilution et le traitement de l'échantillon avec film dissolvable Figures 6 et 7. On a ajouté dans le dispositif de la figure 2 une feuille de matière plastique 29 à 10 l'extrémité amont du tampon d'échantillon et une feuille de matière plastique hydrosoluble 30 au contact du tampon d'échantillon. Par ailleurs, comme on peut le voir à la figure 7, le boîtier 24 comporte un relief en creux 31 qui vient s'appuyer sur la région du tampon d'échantillon pour former un puits d'échantillon 32. Plus précisément, l'appui se fait sur les feuilles 18, 29 et 30, de manière étanche. Le principe est le même qu'à l'exemple 2, sauf 15 que ce test permet la dilution de l'échantillon dans le puits. Le dépôt de l'éluant est réalisé après migration de l'échantillon. La figure 7 montre également qu'il est possible d'appliquer le même principe à la fenêtre de dépôt d'éluant pour conjugué, en prévoyant un relief en creux 33 délimitant un puits 34. 20 Exemple 5 : Test en 2 étapes : 2 dépôts sans temps d'attente et avec un puits permettant la dilution et le traitement de l'échantillon avec film dissolvable - Figure 8. Par rapport à l'exemple de la figure 6, on a ajouté une feuille hydrosoluble 28 25 (comme celle de la figure 5) sur le tampon pour conjugué dans la fenêtre de dépôt d'éluant. Le tempsde dissolution de la feuille hydrosoluble 28 au contact de l'éluant est supérieure à celle de la feuille 30 au contact de l'échantillon dilué. On peut facilement disposer de tels matériaux dans le commerce ou utiliser l'enseignement de US2008/0124381. Ceci permet à l'utilisateur du test de déposer échantillon et éluant en 30 même temps ou sans attendre un temps de migration, et de traiter l'échantillon dans le puits comme expliqué au regard de la figure 6. Exemple 6 : Test en 2 étapes: 2 dépôts sans temps d'attente avec le conjugué introduit dans la composition du film dissolvable - Figure 9 35 Par rapport au dispositif de la figure 2, on a ajouté une feuille de matière plastique hydrosoluble 35 appliquée sur le tampon pour conjugué, qui a la particularité de contenir 3045158 19 le conjugué. Dans ce cas, il n'y a pas de conjugué sprayé et séché dans le tampon lui-même. Quand le film se dissout il libère le conjugué. Le conjugué ainsi libéré migrera dans le tampon pour conjugué 16, en direction de la membrane de nitrocellulose 13. On peut encore combiner à cette solution des caractéristiques des autres 5 exemples, comme la présence de la feuille hydrosoluble 30 sur le tampon d'échantillon, et une vitesse de dissolution plus rapide pour cette dernière que pour la feuille 35. Exemple 7 : Fabrication d'un test en 1 étape selon l'art antérieur représenté à la figure 1 - 10 On se réfère à la Figure 3. Les étapes de lamination et de découpage : - Etape 1 : Collage de la membrane de nitrocellulose ou support poreux 4 sur le support 1 - Etape 2 : Collage du tampon absorbant 7 sur le support 1 avec un chevauchement sur la membrane de nitrocellulose 4. 15 - Etape 3: Collage du tampon pour conjugué 3 sur le support 1 avec un chevauchement sur la membrane de nitrocellulose 4. - Etape 4: Collage du tampon d'échantillon 2 sur le support 1 avec un chevauchement sur le tampon pour conjugué 3. - Etape 5 : Découpage du montage pour obtenir des bandelettes 20 Exemple 8: Fabrication d'un test en 2 étapes selon le mode de réalisation représenté à la figure 2 - On se réfère à la Figure 4. Les étapes de lamination et de découpage : - Etape 1 : Collage de la membrane de nitrocellulose 13 sur le support 11. 25 Etape 2: Collage du tampon absorbant 23 sur le support 11 avec un chevauchement sur la membrane de nitrocellulose 13 et collage du tampon d'échantillon 12 sur le support 11 avec un chevauchement sur la membrane de nitrocellulose 13. - Etape 3 : Collage d'un film plastique 14 sur la membrane de nitrocellulose 13 et le 30 tampon d'échantillon 12. - Etape 4 : Dépôt du tampon de conjugué 16 sur le film plastique 14 avec un petit chevauchement sur la membrane de nitrocellulose 13. - Etape 5 : Collage des films plastiques 18 et 19 aux bords du tampon de conjugué 16 pour le fixer. 35 - Etape 6 : Découpage du montage pour obtenir des bandelettes 3045158 20 Le test 2 étapes est industrialisable : sa fabrication suit le même procédé de fabrication qu'un test en 1 étape. Le test 2 étapes comprend uniquement des étapes de lamination supplémentaires liées à l'ajout du film plastique, de préférence autocollant, séparant les tampons d'échantillon et de conjugué. La lamination du test en 1 étape 5 comprend 4 étapes avant d'être découpé. En fonction de la longueur du support (backing), on obtient après découpage entre 50 et 100 tests par support. La lamination du test en 2 étapes comprend 6 étapes avant le découpage. Une fois l'assemblage et la découpe réalisés, on obtient pour une même longueur de support, le même nombre de test qu'un test en 1 étape. Les étapes de lamination peuvent être manuelles, semi- 10 automatiques ou automatiques. Le nombre d'étapes pourrait être réduit via l'utilisation d'un film plastique autocollant double face. Dans ce cas le tampon de conjugué pourrait être maintenu au niveau de son interface avec le tampon d'échantillon par le film plastique double face autocollant et par un design intérieur du couvercle de la casette (boîtier). 15 Exemple 9 : Démonstration de l'efficacité du test en 2 étapes (test 1 étape selon exemple 1 versus test 2 étapes selon exemple 2 en augmentant le volume d'échantillon jusqu'à visualiser un effet Hook en 1 étape) - Composition des tests utilisés pour la démonstration 20 Les tests en 1 étape et 2 étapes sont fabriqués à partir des mêmes composants : Tampon d'échantillon: Ahlstrom ref 1662 ayant été en plus traité à la caséine. Tampon de conjugué: Fibre de verre millipore GFCP001000 avec un conjugué d'or colloïdale 40 nm couplé à un anticorps polyclonal dirigé contre les IgM, réparti à une DO de 30 et à 3µL/cm. 25 Membrane nitrocellulose: Membrane HFC135 de millipore avec un LPS de Leptospira Biflexia dilué à 25%. Tampon absorbant: Ahlstrom grade 222 Support: Lohmann 7 cm ref GL-57856 Film plastique imperméable : Adhésive research ARcare 7759 (uniquement pour le 30 test en 2 étapes). L'antigène immobilisé sur la ligne test est un LPS de Leptospira Biflexia dilué à 25%. L'échantillon est du sérum de patient atteint de la leptospirose, la présence d'anticorps étant démontrée par ELISA (IgM) et WIDAL (IgG+IgM). 35 - Mise en oeuvre de la démonstration 3045158 21 Test 1 étape : un volume variable d'échantillon de 0,5 à 80111 a été déposé sur le tampon d'échantillon suivi d'un volume d'éluant R-80 de 135g. La lecture du test a été effectuée 15 minutes après le début de la migration. Test 2 étapes : un volume variable d'échantillon de 0,5 à 80111 a été déposé sur le 5 tampon d'échantillon suivi d'un volume d'éluant R-80 de 100g. 5 min après le début de la migration, 1001..1L d'éluant R-80 ont été déposés dans la fenêtre d'élution du conjugué. La lecture du test a été effectuée 15 minutes après le début de la migration. - Résultats 10 Pour visualiser un effet Hook, le volume d'échantillon a été augmenté jusqu'à diminution du signal du test en 1 étape et on a évalué ces mêmes volume d'échantillon sur un test en 2 étapes. Le tableau ci-dessous représente les résultats obtenus avec un test de détection des IgM anti-leptospirose. Les valeurs de lecture des tests sont issues d'une carte de 15 contrôle qui comporte des intensités de ligne de couleur allant de 0 (pas de ligne visible) à 9 (ligne foncée et intense). On considère qu'un test est positif si son résultat est supérieur ou égal à 3. test Test 1 étape Test 2 étapes lot du test 150223BM06 150223BM04 Sample Résultat ligne Test Résultat ligne Test P2243 801..1L 4* 9 401..1L 4* 9 201..1L 9 101..1L 5 9 51..11_ 9 1µL 7 4 0,51..11_ 6 4 P2244 801..1L 2,5* 9 401..1L 9 201..IL 5,5 NT 101..1L 5,5 7 51..11_ 6 8 1µL 6 6 0,51..11_ 6 6 P2265 801..1L 2* 9 401..1L 0* 9 20µL 3 NT 101..1L 4* 9 51..11_ 9 1µL 6 9 3045158 22 0,5pL 6 9 P2272 80pL 9 40pL 4 9 20pL 4 9 10pL 9 5pL 9 1pL 8 4 0,5pL 7 NT * effet Hook observé Le test en 1 étape subit bien un effet Hook : pour 3 échantillons, la diminution du signal s'effectue à partir de 5pL d'échantillon et le dernier à partir de 40pL. Le test 2 5 étapes n'est pas soumis à l'effet Hook (aucune diminution de signal en augmentant le volume d'échantillon). En 2 étapes, la baisse observée avec un volume inférieur à 5p1 n'a pas de conséquence car, en pratique, le volume minimal pouvant être prélevé avec une pipette en soufflage ou avec une anse ou oese ou autre support de prélèvement, est de 5p1. Les volumes d'échantillons utilisés en pratique sont entre 5 et 100 pl. 10 Exemple 10 : Test en 1 étape On a décrit l'utilisation du film hydrosoluble dans le test en 2 étapes, ce film étant positionné sur le tampon d'échantillon et ou sur le tampon pour conjugué. Un tel film peut aussi être utilisé dans un test en 1 étape s'il est positionné sur le tampon d'échantillon. Un 15 mode de réalisation consiste à placer cette feuille ou film à la surface du tampon d'échantillon 2 sur le dispositif de la Figure 1. Le film ou feuille peut être maintenue par deux feuilles adhésives du type de celles que l'on a rencontrées dans les exemples précédents, par exemple une feuille 29 (figure 6) et une feuille 14 (figure 2 et 6). Dans un test en 1 étape le film hydrosoluble est placé sur le tampon d'échantillon 20 pour retenir l'échantillon dans le puits, pour: effectuer une lyse des hématies sur un test sang total pour effectuer la dilution de l'échantillon par dépôt de l'échantillon et d'un diluant ou éluant, ou pour mettre en contact l'échantillon avec un conjugué (celui-ci n'étant alors pas déjà dans le tampon pour conjugué. Dans ce dernier cas, on peut retirer du dispositif de la figure 1, le tampon pour conjugué, et le tampon d'échantillon est alors lui- 25 même en contact fluidique avec le support poreux 4. REVENDICATIONS1.- Dispositif de test immunochromatographique à flux latéral pour la détection d'un analyte dans un échantillon, comprenant un support poreux (13) portant à sa face supérieure au moine une ligne test (21), un premier tampon poreux (12), de réception de l'échantillon, dont une extrémité est en contact fluidique avec le support poreux (13), un deuxième tampon poreux (16), pour le conjugué, caractérisé en ce que le deuxième tampon (16) est placé au-dessus ou au-dessous du premier tampon (12) dont il est séparé par un élément imperméable (14), et en ce que le deuxième tampon (16) a une extrémité (17) qui est en contact fluidique avec le support poreux (13) en un emplacement situé entre le contact du premier tampon (12) avec le support poreux (13) et la ligne de test (21). 2.- Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un premier film (14) de matière imperméable est appliqué sur, de préférence adhère à, la face supérieure du premier tampon (12), s'étendant sur une partie de celui-ci et laissant une partie (15) non recouverte, et à la face supérieure d'une partie du support poreux (13) et se termine par un bord-àvardê film positionné en amont de la ligne test (21). 3.- Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que le deuxième tampon (16) est disposé de manière à s'étendre en partie au-dessus de la face supérieure du premier film (14) et en partie au contact du support poreux (13), avec un bord aval (17) situé entre le bord aval du premier film et la ligne test (21). 4.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la zone (15) de réception d'échantillon sur le premier tampon (12) et/ou la zone (20) de réception d'éluant du deuxième tampon (16) est recouverte d'un film (28) de matière hydrosoluble, de préférence conçu pour se dissoudre au contact d'un liquide en un temps prédéterminé. 5.- Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que la zone (20) de réception d'éluant du deuxième tampon (16) est recouverte d'un film (35) de matière hydrosoluble qui contient le conjugué, ce film (35) étant de préférence conçu pour se 30 dissoudre au contact d'un liquide aqueux en un temps prédéterminé. 6.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la ligne test (21) porte un antigène ou un anticorps spécifique de I'analyte recherché, immobilisé sur ladite ligne. 7.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé 35 en ce qu'un deuxième film (19) de matière imperméable, de préférence transparent ou translucide, est appliqué sur, de préférence adhère à, la face supérieure du deuxième 3045158 24 tampon (16), en aval d'une zone (20) de dépôt d'éluant, à la face supérieure du support poreux (13) et à la face supérieure d'un tampon absorbant (23) situé au contact du support poreux (13) en aval de la ligne test (21). 8.- Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé 5 en ce qu'il comporte en outre un boîtier allongé logeant les éléments précités, comportant un fond et un couvercle comportant une première fenêtre (25) placée au-dessus du premier tampon (12) , une deuxième fenêtre (26) placée au-dessus du deuxième tampon (16) et une troisième fenêtre (27) placée au-dessus de la ligne test (21). 9.- Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que la première et/ou la 10 deuxième fenêtre délimite au contact du tampon (12, 16) placé au-dessous, un volume allant d'environ 40 à environ 200 pl. 10.- Méthode de test immunochromatographique à flux latéral pour la détection d'un analyte présent dans un échantillon, sur une ligne test placée sur le support poreux d'un dispositif de test immunochromatographique à flux latéral, méthode .du type 15 comprenant le dépôt de l'échantillon sur le dispositif, puis la migration de l'échantillon sur le support poreux vers la ligne test, et le dépôt séparé sur le dispositif d'un éluant ou d'un éluant contenant un conjugué, puis la migration de l'éluant contenant un conjugué sur le support poreux vers la ligne test, le front d'éluant atteignant la ligne de test après le front d'échantillon, caractérisée en ce que l'on fait déboucher l'éluant contenant le conjugué sur 20 le support poreux en un emplacement situé entre le débouché de l'échantillon sur le support poreux et la ligne de test. 11.- Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que, une fois que l'échantillon a traversé la ligne test, on fait déboucher l'éluant contenant le conjugué sur le support poreux. 25 12.- Méthode selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que : - échantillon et éluant sont déposés simultanément ou dans un court laps de temps (de préférence d'environ 1 à environ 30 s) sur le dispositif de test, ou - l'éluant du conjugué est déposé sur le dispositif de test d'environ 1 min à environ 10 min, notamment d'environ 2 min à environ 8 min, de préférence d'environ 3 à environ 7 minutes après le dépôt de l'échantillon. 13.- Utilisation d'un film ou feuille hydrosoluble dans un dispositif ou une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ce film ou feuille hydrosoluble étant conçu pour se dissoudre au contact d'un liquide aqueux en un temps prédéterminé, notamment compris entre environ 1 et environ 10 min, notamment entre environ 2 et environ 8 min, de préférence entre environ 3 et environ 7 min, pour former, à la surface d'un tampon pour échantillon et/ou d'un tampon pour conjugué d'un dispositif de test 3045158 25 immunochromatographique à flux latéral, une barrière temporelle à l'absorption d'un liquide par ledit tampon.