Brevet FR3041656A1 — publié le 20170331

La présente invention concerne un procédé de production d'un microfollicule pileux par culture et amplification des cellules de la matrice. Elle concerne, de même, les microfollicules pileux produits par le procédé mentionné ci- dessus et leur utilisation pour le traitement de l'alopécie ainsi que pour évaluer l'effet de produits cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques. L'alopécie est conditionnée par divers facteurs : génétiques, hormonaux et environnementaux, par le régime alimentaire et l'activité physique. Les cheveux tiennent un rôle esthétique et identitaire essentiel. L'alopécie chez la femme ou chez l'homme peut ainsi être à l'origine de souffrance psychique importante. Ainsi des cheveux sains, vigoureux et une chevelure dense tout au long de la vie est recherché par la plupart des femmes et des hommes. De nombreuses techniques sont connues pour le traitement de l'alopécie telles que la thérapie cellulaire, le traitement au laser ou encore les implants sans chirurgie. Cette dernière apporte un résultat immédiat et se trouve être beaucoup moins invasive que la chirurgie. Afin d'obtenir des implants, les follicules pileux humains sont obtenus par la culture de différents types cellulaires présents au niveau du bulbe pilaire. Le bulbe pilaire est en en forme de poire et il est composé : De la papille qui est un bourgeonnement d'origine dermique, située à la base du follicule. C'est un site très vascularisé qui participe à la nutrition et à la régulation de la croissance du cheveu par sa réserve en facteurs de croissance et protéines de la matrice extracellulaire. Ces informations seront transmises aux cellules matricielles, élaborées dans la matrice, pour permettre leur différenciation (Rees JL. Genetics of hair and skin color; Voyage 3D au Coeur du cheveu web site - URL : www.hairscience.com). De la matrice qui est une zone coiffant la papille dermique, constituée d'un amas de cellules matricielles peu différenciées. C'est le siège d'une intense activité mitotique. Les cellules de la matrice, qui sont localisées dans le bulbe pileux et qui forment un petit amas cellulaire autour de la papille dermique, sont majoritairement constituées de précurseurs de kératinocytes qui constituent une assise germinative et qui prolifèrent 3 04 16 5 6 2 rapidement pour se différencier en formant la tige pilaire, jouant ainsi un rôle essentiel dans le cycle pilaire. Du début de la phase anagène jusqu'à la fin de celle-ci, ces cellules matricielles vont proliférer jusqu'à la phase catagène puis disparaître en phase télogène. (Ebling FJ. The biology of hair.Dermatol Clin. 1987 Ju1;5(3):467-81. 5 Review; Saitoh M, Uzuka M, Sakamoto M. Human hair cycle. J Invest Dermatol. 1970 Jan;54(1):65-81). La différenciation cellulaire va permettre la formation des différents types cellulaires de la gaine épithéliale externe (ORS), interne (IRS) puis de la tige pilaire. C'est aussi cette matrice qui conditionne la forme du cheveu. La matrice se répartit de façon homogène autour d'un axe de symétrie pour le cheveu droit alors 10 qu'elle sera plus importante d'un côté pour le cheveu frisé (Voyage 3D au Coeur du cheveu web site - URL : www.hair-science.com; Melissopoulos A et Levacher C. Les annexes cutanées. Dans : La peau : structure et physiologie, édition Lavoisier ; 1998. P.57-99). La matrice comprend également des mélanocytes folliculaires qui sont responsables de la pigmentation du cheveu. La prolifération et la différenciation de ces 15 cellules de la matrice sont contrôlées par la papille dermique (Botchkarev VA, Kishimoto J. Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling. J Invest Dermatol Symp Proc. 2003 Jun;8(1):46-55. Review). Des gaines épithéliales externe et interne qui sont produites par la matrice supérieure du bulbe pileux aussi appelé zone de kératinisation. La gaine épithéliale externe 20 constitue l'enveloppe externe du follicule : il s'agit d'une invagination de l'épiderme. Celle-ci héberge notamment des cellules souches à partir desquelles le follicule pileux sera cycliquement régénéré. La gaine épithéliale interne sépare la gaine épithéliale externe de la tige pilaire. Cette gaine est constituée de trois types cellulaires organisés en couche concentriques kératinisées qui accompagnent la croissance du cheveu. On 25 distingue la couche de Henlé, la couche de Huxley et la cuticule qui est formée de cellules aplaties dirigé vers la matrice pilaire. De la tige pilaire qui est en partie visible, c'est le cheveu. La structure de la tige pilaire se compose de trois couches distinctes de l'extérieur vers l'intérieur. On retrouve la cuticule, le cortex et la médulla, toutes composées de cellules kératinisées. 30 Depuis plusieurs années, des follicules pileux plus ou moins proches du follicule pileux humains ont été mis au point. On peut par exemple citer les follicules pileux obtenus par la 3041656 3 culture de différentes cellules du bulbe pilaire décrits dans les documents suivants : EP 2274419, EP 2447357. Néanmoins aucun de ces modèles ne contient de cellules de la matrice, qui sont les cellules 5 essentielles à la formation de la tige pilaire, en quantité suffisante pour représenter la plupart des caractéristiques d'un microfollicule humain. De façon surprenante, la demanderesse a mis en évidence que la culture des cellules de la matrice en présence de Y27632 permet une prolifération importante de ces cellules et leur 10 différenciation en kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 K35 qui arrivent à confluence en formant des clusters réguliers. Ces cellules, mises en culture 3D, permettent d'obtenir, de manière inattendue, un microfollicule pileux présentant la plupart des caractéristiques d'un microfollicule in vivo, comprenant notamment des kératinocytes et des mélanocytes. 15 Le procédé, selon l'invention, se révèle donc avantageux par le fait qu'il permet d'obtenir un microfollicule en utilisant un seul type cellulaire, celui des cellules de la matrice, qui apporte tous les types cellulaires nécessaire à la formation d'un microfollicule pileux. 20 Ainsi selon un premier de ses objets, la présente invention se rapporte à l'utilisation des cellules de la matrice pour la préparation d'un microfollicule pileux. Utilisation de cellules de la matrice pour la préparation d'un microfollicule pileux. 25 On entend par « cellules de la matrice », les cellules localisées dans le bulbe pileux et qui forment un petit amas cellulaire autour de la papille dermique (Ebling FJ. The biology of hair.Dermatol Clin. 1987 Jul;5(3):467-81. Review; Saitoh M, Uzuka M, Sakamoto M. Human hair cycle. J Invest Dermatol. 1970 Jan;54(1):65-81). Ces cellules pourront être 30 échantillonnées, amplifiées et conservées en banques de tissus en vue d'une utilisation ultérieure. Pour préserver l'intégrité du tissu matriciel, ces cellules pourront être prélevées selon le procédé qui suit : des follicules pileux sont placés dans une boite de Petri contenant un milieu de culture minimum additionné de 2% d'antibiotique et des acides aminés non essentiels. 3041656 4 La région bulbaire est coupée au sommet de la papille dermique ainsi l'épithélium du bulbe est séparé de la papille dermique et de la gaine conjonctive. Les cellules de la matrice apportent toutes les cellules nécessaires à la préparation d'un micofollicule pileux, ainsi, l'utilisation de cellules de la matrice pour la préparation d'un microfollicule pileux ne 5 nécessite aucun autre type de cellule et pourra se faire à l'exclusion de tout apport de cellules exogènes. Afin d'obtenir une quantité suffisante de cellule de la matrice pour l'obtention d'un microfollicule pileux, la demanderesse a mis au point une méthode d'amplification de ces 10 cellules afin qu'elles se différencient en kératinocytes K 85 K35 formant des clusters une fois à confluence. Ainsi la demanderesse a mis au point un procédé de préparation d'un microfollicule pileux comprenant au moins une étape d'amplification des cellules de la matrice en présence d'une 15 quantité efficace d'un inhibiteur de ROCK pendant une période de temps suffisante pour permettre une différentiation desdites cellules en kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 K35. Ce procédé de préparation du microfollicule pileux est caractérisé en ce qu'il comprend les 20 étapes suivantes : a- Isoler un follicule à partir d'un prélèvement de scalp b- Découper sur ledit support immergé dans un milieu de culture la région bulbaire au-dessus de la papille dermique. c- Séparation des cellules de la matrice sous forme d'agrégat cellulaire de la gaine 25 conjonctive et de la papille dermique d- Dépôt de l'agrégat cellulaire sur une couche nourricière de fibroblastes 3t3i bloqué à la mitomycine dans un milieu de green 7F e- Amplification des cellules de la matrice à la surface dudit support en présence d'un inhibiteur de ROCK ; 30 f- Récupération des kératinocytes K85 K35. g- Culture des kératinocytes obtenus à l'étape f) en culture 3D 3041656 5 Microdissection Les cellules de la matrice ne peuvent être prélevées qu'à partir d'un cheveu en phase anagène. 5 La région de la matrice contient un nombre très faible de cellules. Ainsi une difficulté à surmonter réside dans l'obtention des cellules de la matrice de qualité et en quantité suffisante. En effet, dans les conditions normales, lorsqu'un cheveu tombe ou après arrachage, le compartiment papille dermique-cellules de la matrice reste dans le derme du scalp. Ce 10 compartiment initiera le développement d'un nouveau cycle pilaire et redonnera un nouveau microfollicule. Ainsi, l'arrachage d'un cheveu ne permet pas d'obtenir ces cellules matricielles, il faudra donc réaliser une biopsie de cuir chevelu, puis isoler ces cellules par microdissection. 15 Selon l'invention les cellules de la matrice sont obtenues par une nouvelle technique de microdissection qui préserve la quantité et l'intégrité des cellules, car elles ne sont pas séparées les unes des autres. En effet le microfollicule est isolé sur un support, la région bulbaire est découpée au-dessus de la papille dermique et les cellules de la matrice sont récupérées sous forme d'agrégat cellulaire sur le même support. Cette microdissection permet 20 d'isoler et de conserver la totalité des cellules de la matrice. Amplification En plus d'être difficiles à isoler, les cellules de la matrice sont également difficiles à cultiver 25 au moins pour les raisons suivantes : a) leur nombre est particulièrement faible ; b) elles se dissocient facilement donc il est difficile de les repérer lors de la microdissection ; c) elles n'adhèrent pas sur un support plastique ; 30 d) elles sont difficiles à amplifier pures car elles sont souvent contaminées par les fibroblastes de la papille dermique ou de la gaine conjonctive 3041656 6 Certains auteurs ont proposé de cultiver ces cellules en co-culture avec les fibroblastes de la papille. L'inconvénient de cette méthode est que la culture obtenue n'est pas homogène, les cellules de la matrice sont contaminées avec les fibroblastes dermiques de la papille utilisés en co-culture (Reynolds AJ, Lawrence CM, Jahoda CA Human hair follicle germinative 5 epidermal cell culture. J Invest Dermato1.1993 Oct;101(4):634-8). Luo et al. ont proposé une technique de microdissection puis de culture des cellules de la matrice sur support plastique (Luo et al : Methods for culturing hair follicle epithelial matrix cells ; Reg. number: H1610; Nov.5, 1996). Cependant cette technique de microdissection 10 conduit à un très faible rendement en cellules de la matrice. La demanderesse a isolé les cellules de la matrice et mis au point un procédé de mise en culture de ces cellules. En effet en présence du facteur de croissance Y27632, qui est un inhibiteur de ROCK, ces cellules prolifèrent rapidement et se différencient en kératinocytes 15 K85 K35 jusqu'à ce qu'elles arrivent à confluence en formant des clusters réguliers. Les cellules sont amplifiées selon la technique de Rheinwald et Green (Cell, vol 6 , 331344,1975) par culture sur un support nourricier constitué de fibroblastes dans un milieu adapté connu de l'homme du métier, en présence de facteurs de croissance, notamment d'acides 20 aminés, sérum, toxine cholérique, insuline, tri-iodo-thyronine et solution tampon de pH. En particulier, un tel milieu de culture pourra notamment contenir au moins un facteur de croissance mitogénique pour les kératinocytes (par exemple epidermal growth factor (EGF) et/ou keratinocyte growth factor (KGF), en particulier du KGF), de l'insuline, de l'hydrocortisone et facultativement un antibiotique (ex : gentamycine, amphotericine B) 25 auquel a été ajouté un inhibiteur de ROCK le Y27632. Avantageusement, ledit milieu pourra comprendre en outre du sérum ou un extrait pituitaire, par exemple d'origine bovine, de l'épinephrine, de la transferrine et/ou des acides aminés non essentiels. 30 Les fibroblastes utilisés pour cette culture seront plus préférentiellement des fibroblastes 3T3. Les fibroblastes 3T3 sont bien connus de l'homme du métier. C'est une lignée cellulaire de fibroblastes connue depuis 1962. « 3T3 » signifie « 3-day transfer, inoculum 3x105cells ». 3041656 7 La culture des cellules est préférentiellement une culture sur des fibroblastes (préférentiellement des fibroblastes 3T3) dont la prolifération a été préalablement stoppée, préférentiellement en les ayant préalablement irradiés (par exemple, avec des UV) ou préalablement traités à la mitomycine. La mitomycine (en particulier, la mitomycine C) 5 bloque la prolifération de ces cellules sans pour autant les empêcher de produire des substances nutritives utiles pour la prolifération des kératinocytes. Avec cette technique, les cellules de la matrice prolifèrent sur le support sur lequel elles ont 10 été séparées des autres types cellulaires. Ceci permet de conserver un nombre suffisant de cellules de la matrice. Les cellules prolifèrent rapidement en présence de Y27632 jusqu'à confluence et se différencient en cellules positives pour les marqueurs des kératines précoces du cheveu, K35 et K85 en formant des clusters réguliers. 15 Selon l'invention, le terme « quantité efficace » désigne une quantité nécessaire pour obtenir une culture de kératinocytes K85 K35 à confluence. Selon l'invention la quantité efficace de l'inhibiteur de ROCK, Y27632, est comprise entre 1 et 100 1.1M et de préférence comprise entre 5 et 25 1.1M et de manière préférée de 101.1M. Selon l'invention les cellules de la matrice sont cultivées en présence de l'inhibiteur de ROCK, Y27632, pendant au moins 2 jours et de préférence pendant au moins 3 jours. On entend par « clusters » un amas de cellules regroupées ensemble. On entend par « à confluence » un tapis cellulaire ne présentant aucun interstice entre chaque cellule adhérente cultivée en monocouche sur un support approprié. Culture des cellules différenciées K35 et K85 en culture 3D pour l'obtention d'un 30 microfollicules pilleux Les kératinocytes positifs pour les marqueurs K35 et K85, formant des clusters réguliers, une fois à confluence, sont récupérées par traitement enzymatique. 20 25 3041656 8 Les sphères 3D sont obtenus sur microplaque de 96 puits de types Insphero par la méthode de goutte suspendue ou de microplaques pour culture de cellules non adhérentes (système GravityPLUS White paper). 5 Les cellules sont alors mises en culture dans un milieu de green à 37°C, l'apparition du microfollicule pileux est observée après au moins 5 jours de culture. Selon un mode de réalisation les cellules sont maintenues au moins 2 jours en culture et de préférence au moins 5 jours. 10 De manière préférée les cellules sont mises en culture en un nombre de cellules compris entre 1000 et 4000 cellules et de préférence en un nombre de 3000 cellules. 15 Un autre objet de l'invention est un microfollicule pileux susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention. Ces microfollicules pileux permettent d'une part d'être utilisés pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d'un état de pilosité réduite, notamment de l'alopécie et 20 constituent des tests prédictifs de l'activité d'actifs cosmétiques et/ou pharmaceutiques ou encore des effets secondaires d'ingrédients topiques. Traitement prophylactique ou thérapeutique d'un état de pilosité réduite, notamment de 25 l'alopécie. Etant donné que le microfollicule pileux présente les caractéristiques d'un follicule pileux in vivo, il pourra être utilisé comme implant, associé ou non à des substituts cutanés. Le microfollicule pileux selon l'invention trouvera donc également des applications pour la 30 préparation d'implants et/ou de substitut cutané pour traiter un désordre cutané tel qu'une brûlure, un défaut de cicatrisation ou la canitie. Un effet thérapeutique est défini comme un retour à la normale de l'état de pilosité, que ce soit totalement ou partiellement. 3041656 9 Au sens de l'invention, le traitement prophylactique est recommandé si le sujet possède une condition préalable pour la perte de cheveux, comme une disposition familiale. Les conditions d'une quantité réduite de cheveux peuvent être le résultat de l'alopécie, la 5 calvitie héréditaire, des cicatrices, des brûlures ou de blessures accidentelles. Tests prédictifs de l'activité d'actifs cosmétiques et/ou pharmaceutiques. 10 Les équivalents de microfollicules pileux selon l'invention permettront de réaliser notamment des cinétiques de pousse des poils ou cheveux et donc toute étude nécessitant de nombreux cheveux vivants et aussi complets que possibles dans un contexte in vivo tel que l'étude du cycle du cheveu et des facteurs capables d'influencer ce cycle allant jusqu'à l'étude d'actifs favorisant la croissance du cheveu, d'actifs permettant de lutter contre la chute des cheveux 15 ou encore d'actifs ralentissant la pousse des poils. Les procédés de criblage de produit en vue d'identifier de nouveaux actifs comprennent une étape (a) de mise en contact dudit produit à tester avec un équivalent de cuir chevelu selon l'invention puis une étape (b) d'analyse de l'effet dudit produit sur au moins un paramètre de 20 l'équivalent de cuir chevelu et une étape (c) de sélection du produit modifiant ledit paramètre. De préférence, pour la mise en oeuvre de l'étape (a), le produit à tester est appliqué de façon topique, par exemple, formulé dans des formulations topiques classiques ou bien introduit dans le milieu de culture. 25 L'étape (b) pourra, en particulier, être réalisée par l'analyse de l'expression, de la production et/ou de l'activité de marqueurs liés à la qualité et/ou à l'homéostasie du microfollicule pileux comme par exemple des marqueurs épidermiques et/ou dermiques, tels que des protéines de structure. Comme exemple de protéines de structure peuvent être citées les kératines du 30 cheveu. Pour cela, on analysera à l'étape (b) du procédé de criblage l'effet du produit sur la pousse de la tige pilaire. 3041656 10 L'étape (b) d'analyse de l'effet du produit sera préférentiellement une comparaison d'au moins un paramètre mesuré sur le microfollicule pileux mis en contact avec le produit à tester à celui ou ceux mesuré(s) sur un microfollicule pileux témoin cultivé dans les mêmes conditions mais qui n'a pas reçu le produit à tester. 5 L'étape (c) de sélection du produit modifiant le paramètre de l'équivalent de cuir chevelu se fera en fonction d'un critère déterminé à l'avance. La modification de ce paramètre pourra être une stimulation, une diminution ou une inhibition 10 totale ou partielle de l'expression, de la production et/ou de l'activité desdits marqueurs et/ou de la pousse de la tige pilaire. Le critère de sélection dudit produit sera par exemple que ce produit à un effet stimulateur ou inhibiteur du paramètre mesuré. L'équivalent de cuir chevelu selon l'invention peut aussi être utilisé dans des procédés automatisés de criblages de composés cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques pour identifier de nouveaux actifs. Description des figures : Les figures permettent de mieux illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée. 25 Figure 1 : Localisation des cellules de la Matrice Figure 2 : Section au-dessus de la papille dermique Figure 3 : Bulbe contenant les cellules de la matrice Figure 4 : Amas de cellules de la matrice déposé sur un feeder layer de 3T3 Figure 5 : Cellules de la matrice après 3j de culture 30 Figure 6 : Cellules de la matrice à confluence après 10 jours de culture Figure 7 : Culture primaire de cellules de la matrice avec formation de clusters Figure 8 : Sphère de cellules de la matrice après 3j de culture 3D Figure 9 : Formation de bourgeon en culture 3D Figure 10 : Bourgeons sont fortement positifs pour la K85 et la K35 15 20 3041656 11 Figure 11 : sphères présentant un microfollicule pileux. Les exemples figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de l'invention. 5 Exemple 1- Préparation d'un microfollicule pileux Protocole expérimental i. Microdissection des cellules de la matrice. 10 Les follicules pileux sont extraits d'un résidu chirurgical de scalp. Ce dernier est d'abord coupé en portions de 5 mm2 puis sectionné à l'aide d'un scalpel entre le derme et l'hypoderme. Les follicules sont extraits à l'aide de pinces de chirurgie ophtalmique et sont ensuite sectionnés juste au-dessus de la papille avec un scalpel (Fig2). Le bulbe est alors récupéré 15 (fig3 ). A cette étape, le bulbe comprend deux compartiments : Le compartiment dermique (papille dermique et gaine conjonctive). Les cellules de la matrice qui forment une masse cellulaire A l'aide d'aiguilles à perfusion, la partie épithéliale est séparée de la partie dermique 20 ii. Conditions de culture Les conditions de culture ont trois composantes principales : - Le milieu de base : Sauf indication contraire, l'ensemble des milieux et tampons utilisés dans les exemples sont 25 décrits dans Bell et col. 1979, (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984, (British J. of Derm., 111, 219-222) ou Asselineau et col., 1987, (Models in dermato., vol.III, Ed. Lowe & Maibach, 1-7). Le milieu MEM + 10% FCS + 3F (appelé milieu 3F) a la composition suivante : 30 3041656 12 Concentrations finales MEM Sérum de veau foetal (FCS) 10% L-Glutamine 2 mM Sodium pyruvate 1 mM Penicicilline - Steptomycine Penicilline 20 U/ml Streptomycine 20 µg/ml Fungizone Penicilline 10 U/ml Streptomycine 10 µg/ml Amphotericine-B 25 ng/ml Epidermal growth factor (EGF) 10 ng/ml Cholera toxine 10- bo M Hydrocortisone 0.4 1.1g/m1 Adénine hydrochloride 1.8 x 10-4 M Triiodothyonine (T3) 2 x 10-9 M Transferrine humaine 5 1.1g/m1 Insuline bovine 5 1.1g/m1 - Les compléments de culture : facteurs de croissances signalant à la cellule qu'elle doit se diviser ou se différencier. 101.1M de Y27632 5 - La surface d'adhésion : les cellules de la matrice adhèrent et prolifèrent dans le milieu de base Green en présence d'une couche nourricière de fibroblastes murins 3T3 arrêtés dans le cycle cellulaire par un traitement mitomycine. Culture-Amplification des kératinocytes Après microdissection, les amas de cellules de la matrice sont déposés dans des boîtes de Pétri de 60mm de diamètre préalablement ensemencées avec 1 million de 3T3 et recouverte du milieu de culture complet ; on obtient une culture à confluence de cellules de la matrice. 10 15 3041656 13 Afin de générer les sphères, les cellules sont récupérées au stade de sous confluence par un traitement enzymatique. Les sphères peuvent être obtenues de différentes manières avec les techniques classiques déjà décrites (goutte suspendue, centrifugation, support non adhérent). Dans le cas de la goutte suspendue, 3000 cellules sont placées dans les plaques in sphéro. 5 Elles sont récupérées dans des plaques 96 puits après 48h afin de suivre leur évolution. Les amas de cellules de la matrice non dissociées sont isolés et déposés sur un feeder layer de 3T3 (Figure 4). Après 3j de culture les cellules commencent à proliférer sous forme d'une colonie autour de l'amas de matrice (Figure 5). Les cellules atteignent la sub-confluence en 10 10 jours (Figure 6). Elles se caractérisent par une taille très petite et une forte capacité proliférative. Afin d'assurer l'amplification, les cellules sont ensuite ensemencées dans un flask T75. Ainsi, après 3 semaines de culture de 3 bulbes, il est possible de générer environ 40 millions de cellules de la matrice au passage 1. 15 Nous avons pu observer que les cellules de la matrice étaient capables de former très rapidement des agrégats cellulaires in vitro. Ce phénomène semble être dû aux propriétés de tactisme de ces cellules. Dans le milieu de green 7F, ces amas forment un motif régulier rappelant celui des bourgeons folliculaires (Figure 7) 20 De plus, lors de la formation de ces amas, il y a production de nombreuses cellules sphériques en suspension qui peuvent être repiquées pour générer de nouvelles cultures cellulaires. Après caractérisation, les bourgeons représentent une 1èTe phase de différenciation des cellules de la matrice et ils sont positifs pour les kératines précoces du 25 cheveu : K35 et K85. Nous avons également réalisé la culture en 3D avec les cellules de la matrice. Ces cellules forment des sphères après 3j de culture (Figure 8). 30 Après quelques 7 jours de culture, ces sphères changent de conformation en montrant une organisation polarisée. Il apparait un bourgeonnement qui semble indiqué une différenciation des sphères (Figure 9). Ces bourgeons sont fortement positifs pour la K85 et la K35. 3041656 14 Certaines sphères présentent une structure sous forme de fibre qui semble être kératinisée (fig10) 5 REVENDICATIONS1. Utilisation de cellules de la matrice pour la préparation d'un microfollicule pileux. 2. Procédé de préparation d'un microfollicule pileux comprenant au moins une étape de mise en culture des cellules de la matrice en présence d'une quantité efficace d'un inhibiteur de ROCK pendant une période de temps suffisante pour permettre une 10 différentiation desdites cellules en kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 K35. 3. Procédé selon la revendication 2 dans lequel l'inhibiteur de ROCK est Y27632. 15 4. Procédé selon les revendications 2 et 3, dans lequel la quantité efficace de l'inhibiteur de ROCK est de I à 100 4114. 20 5. Procédé selon les revendications .2 à 4, dans lequel la quantité efficace de l'inhibiteur de ROCK est de 5 à.25 p.M. 6. Procédé selon les revendications 2 à 5, dans lequel la quantité efficace de l'inhibiteur de ROCK est de 10 JIM. 7. Procédé selon l'Une quelonqtie des revendications 2 à 6, dans lequel les cellules de la matrice -.Sont cultivées en présence de l'inhibiteur.ROCK pendant au moins 2 jours et de préférence pendant au moins 3 jours. 8. Procédé selon les revendications 2 à 7 caractérisé en ce que les kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 K35 arrivent à confluence en formant des clusters réguliers. 25 30 3041656 16 9. Procédé selon les revendications 2 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a- Isoler le follicule sur uri support b- Découper sur ledit support immergé dans un milieu de culture la région bulbaire au-dessus de la papille dermique: c- Récupérer les cellules de la matrice sous forme d'agrégat cellulaire sur ledit support. d- Amplification des cellules de la matrice en présence d'un inhibiteur de ROCK; e- Récupération des kératinocytes positifs pour les marqueurs K35 K85. f- Culture des kératinocytes obtenus à l'étape e) en culture 3D. 10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que l'étape f), les kératinocytes sont mise en culture en un nombre compris entre 1000 et 4000 cellules et de préférence en un nombre de 3000 cellules. 11. Procédé selon les revendications 2 à 10, caractérisé en ce que le milieu nutritif est un milieu 3F. 12. Microfollicule pileux susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 11. 13. Microfollicule pileux selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il est constitué de cellules issues de l'amplification et de la différentiation de cellules de la matrice en présence d'un inhibiteur de ROCK. '14. Microfollicule pileux selon les revendications 13, caractérisé en ce que l'inhibiteur de ROCK est Y27632 3041656 15. Microfollicule pilleux selon l'une des revendications 12 à 14 pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d'un état de pilosité réduite. 10 16. Microfollicule pilleux selon l'une des revendications 12 à 14 pour le traitement de l'alopécie. 17. Utilisation d'un microfollicule pileux tel que décrit selon l'une des revendications 12 à 15 1.6 pour le test in vitro d'effets d'actifs sur les propriétés pileuses. 18. Utilisation d'un inicrefolliCule pileux selon la revendication 17 pour l'identification de composé.rncidulateur de la pOusse des poils et/ou des cheveux 20 19. Procédé de criblage de produit en vue d'identifier de nouveaux actifs comprenant une étape (a) de mise en contact dudit produit à tester avec un microfollicule pileux selon l'une quelconque des revendications 12 à 16 puis une étape (b) d'analyse de l'effet dudit 25 produit sur au moins un paramètre de l'équivalent de cuir chevelu et une étape (c) de sélection du produit modifiant ledit paramètre. 30 17 5