Brevet FR3037804A1 — publié le 20161230

PROCEDE DE PREPARATION DE MATRICES DE COLLAGENE TRANSPARENTES Le collagène est une famille de protéines, largement répandue dans le règne animal, qui représente environ 30% des protéines des vertébrés et est également rencontrée chez certains invertébrés. Le collagène est également ubiquitaire dans un nombre important de tissus d'un même organisme où il participe à la structuration des matrices extracellulaires et assure, en plus d'une protection mécanique, des points d'ancrages aux cellules environnantes. Les collagènes qui s'organisent en fibrilles lors d'un processus nommé fibrillogenèse sont les plus fréquemment rencontrés dans les tissus et représentent -90% de l'ensemble des collagènes. Dans des conditions physiologiques, les fibrilles forment des édifices tridimensionnels ordonnés. Dans les tissus vivants, plusieurs types d'organisation de macromolécules biologiques sont rencontrés en fonction des propriétés mécaniques requises (Hulmes D.J.S., Miller A. 1979. Nature, 282, p. 878-880.). Par exemple, une structure en phase cholestérique est observée dans l'os compact et les travées osseuses de l'os spongieux, cette organisation tridimensionnelle du collagène contribue aux propriétés mécaniques de l'os. Elle peut être recréée et stabilisée in vitro. De même il est bien connu que l'organisation des fibrilles de collagène est unidirectionnelle au niveau des tendons, tandis qu'elle se présente localement sous forme de contreplaqué au niveau de la cornée. La cornée est le premier élément rétractif de l'oeil, elle couvre environ un cinquième de la surface du globe oculaire. Les maladies qui opacifient la cornée sont une cause majeure de cécité. La greffe de cornée, à partir d'une cornée saine prélevée sur un donneur décédé, peut y remédier, mais le taux d'échec est assez élevé en raison du rejet des tissus étrangers par l'organisme receveur. Des substituts de cornée sont utilisés mais ceux-ci sont généralement à base de polymères synthétiques. Des techniques permettant l'obtention de matrices de collagène fibrillé transparentes ont été décrites. La demande W02012/52679 revendique un procédé particulier de fibrillogenèse et la description enseigne que la concentration de la solution de collagène peut être comprise entre 10 et 200 mg/mL, avantageusement entre 10 et 90 mg/mL et plus avantageusement entre 30 et 80 mg/mL. Le procédé est indiqué comme pouvant être utilisé pour la préparation d'une matrice transparente de collagène fibrillé apte à être utilisé comme biomatériau, notamment 3037804 2 comme substitut cornéen. Dans l'Exemple 1, une solution acide de collagène est concentrée par centrifugation jusqu'à une concentration finale comprise entre 27 et 45 mg/mL qui est ensuite dialysée contre du PEG afin d'obtenir la formation des fibrilles. Une période de mûrissement de quelques jours à 2 mois est nécessaire pour obtenir une matrice solide et 5 stable. La demande W02011/151587 décrit un procédé particulier de préparation de matériau homogène à base de collagène par concentration d'une solution de collagène, comprenant une étape de dialyse. De nombreuses valeurs possibles sont indiquées pour la concentration de la 10 solution de collagène : 5, 10, 20, 30, 40 et 250 mg/mL. Dans l'Exemple 1, il est décrit la préparation de matrices de concentration d'environ 250 mg/ml. Dans l'Exemple 2, il est décrit l'implantation intramusculaire de matrices de collagène à 20 mg/mL et 40 mg/mL dont la préparation n'est pas décrite. Dans les deux cas, les matrices obtenues ne sont pas transparentes. 15 La demande W02015/049646 décrit un procédé dans lequel la solution acide de collagène comprend un acide faible et un acide fort et en ce que la concentration se situe entre 10 et 250 mg/mL préférentiellement entre 30 et 200 mg/mL et avantageusement entre 40 et 120 mg/mL. Selon la figure 23, la concentration de 45 mg/mL n'a pas été réalisée et d'après la figure 12, les valeurs préférées de concentration paraissent être de 90 et 120 mg/mL. 20 Aussi, existe-t-il un besoin de mettre au point un procédé simple et rapide qui permette de disposer rapidement d'une matrice transparente de collagène fibrillé présentant la structure la plus proche de la cornée, qui reste transparente sur une longue durée et qui ne nécessite pas de longue période de mûrissement pour être transparente et stable. 25 Au cours de leurs travaux sur les solutions de collagène, les inventeurs ont mis au point un procédé de préparation de matrices de collagène fibrillé permettant d'obtenir une structure proche de celle de la cornée, sans nécessité de temps de stockage. 30 Aussi, la présente invention a-t-elle pour objet un procédé de préparation d'une matrice transparente de collagène fibrillé comprenant les étapes suivantes : a) une étape de préparation d'une solution acide de collagène dans un solvant aqueux b) une étape de concentration de la solution acide de collagène 3037804 3 c) une étape de fibrillogenèse de la matrice de collagène caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite jusqu'à l'obtention d'une concentration en collagène comprise entre 43 et 50 mg/ml. 5 Dans un mode particulier, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une matrice transparente de collagène fibrille comprenant les étapes suivantes: a) une étape de préparation d'une solution acide de collagène dans un solvant aqueux b) une étape de concentration de la solution acide de collagène c) une étape de fibrillogenèse de la matrice de collagène 10 caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite i) de façon à limiter, avantageusement à éviter les contraintes de cisaillement, et ii) jusqu'à l'obtention d'une concentration en collagène comprise entre 43 et 50 mg/mL. Sans vouloir être liés à une théorie particulière, les inventeurs pensent que cette 15 propriété de transparence observée dans cet intervalle est liée à une organisation du collagène sous une forme de cristal-liquide particulière qui s'apparenterait à une « phase bleue », c'est-à-dire une phase du cristal liquide intermédiaire entre une phase isotrope et une phase cholestérique. 20 Conformément à l'invention, le collagène peut être d'origine naturelle, recombinante ou synthétique. Préférentiellement, le collagène est un collagène de type I, II, III, IV et/ou V. Avantageusement, le collagène est de type I, III ou V, seul ou en mélange. Conformément à l'invention, l'étape de concentration peut être réalisée par évaporation ou par dialyse. 25 Dans un premier mode particulier, la concentration est réalisée par évaporation. Cette technique de concentration du collagène, bien connue de l'homme du métier, consiste à mettre à évaporer une solution de volume (ou de masse) et de concentration connues de collagène dilué en conditions stériles, par exemple sous une hotte à flux laminaire. On laisse évaporer la solution jusqu'à la concentration souhaitée (Hélary et al. 2005. Biomaterials, 26, p.1533- 3037804 4 1543). Cette technique permet une estimation assez précise de la concentration en cours d'évaporation par simple pesée. Dans un second mode particulier la concentration est réalisée par dialyse. Dans cette technique, les solutions acides de collagène dont la concentration initiale est généralement 5 inférieure ou égale à 5 mg/mL sont mises en contact avec une membrane de dialyse. Dans des modes particuliers, les solutions de collagène à concentrer peuvent être placées dans un boudin de dialyse (Knight et al. 1998. J Biomed Mater Res. 41, p. 185-191.) ou bien injectées de manière contrôlée dans une cellule de dialyse comme décrit dans le document de brevet W02011/151587. Dans les deux cas, l'ensemble est mis en contact avec une solution de 10 polymère osmotiquement actif dont le poids moléculaire est supérieur à la taille des pores de la membrane de dialyse. L'homme du métier peut aisément déterminer les paramètres de dialyse (type de membrane, concentrations en solutés des liquides de contre-dialyse) en s'appuyant notamment sur les lois régissant les phénomènes de transport à travers les membranes. On peut citer à titre d'exemples de polymère osmotiquement actif le Dextrane et 15 le polyéthylène glycol (PEG). Avantageusement, le polymère est du polyéthylèneglycol dont le poids moléculaire est de 35 000 Da. Au sens de la présente invention l'étape de concentration est conduite de façon à limiter, avantageusement à éviter les contraintes de cisaillement. Dans un mode avantageux de l'invention, l'étape de concentration est conduite jusqu'à 20 l'obtention d'une concentration en collagène comprise entre 43,5 et 47 mg/mL, préférentiellement de l'ordre de 45 mg/mL. Au sens de la présente invention, de l'ordre de 45 signifie par exemple 45 ± 2 mg/mL, préférentiellement 45 ± 1 mg/mL. Conformément à l'invention, la solution acide de collagène peut être préparée selon des techniques connues de l'homme du métier, notamment selon la technique décrite par Gobeaux 25 et al. (Langmuir, 2007, 23, 6411-6417). Dans ces solutions, le collagène est uniquement sous forme de monomère et éventuellement sous forme d'agrégats. Dans un mode préféré de l'invention, la solution acide de collagène est constituée par une solution aqueuse d'acide acétique. Dans un mode particulier de l'invention, la solution acide de collagène est constituée par une solution aqueuse d'acide acétique en l'absence 30 d'acide fort. 3037804 5 Le procédé selon l'invention est avantageusement mis en oeuvre lorsque la concentration de la solution acide initiale, avant l'étape de concentration, est comprise entre 0,01 mg/mL et 5 mg/mL. Lorsque la concentration est réalisée par évaporation, une solution acide de collagène de concentration comprise entre 3 et 5 mg/ml est préférée. Lorsque la 5 concentration est réalisée par dialyse une solution acide de collagène de concentration comprise entre 0,5 et 3 mg/ml est préférée. Conformément à l'invention, la formation des fibrilles, autrement dit l'étape de fibrillogenèse consiste à mettre en contact la matrice de collagène avec une phase gazeuse basique ou un liquide neutre ou basique. Dans le cas où la concentration est réalisée par dialyse, l'étape de fibrillogenèse peut se faire soit in situ en 10 remplaçant le polymère osmotiquement actif par la phase gazeuse ou liquide, soit par immersion de la matrice de collagène dans une phase gazeuse ou liquide. Avantageusement, l'étape de fibrillogenèse est menée de façon à limiter, avantageusement pratiquement éviter les contraintes de cisaillement. Selon un mode particulier de l'invention, l'étape de fibrillogenèse est effectuée par mise en contact de la matrice de collagène avec des vapeurs 15 d'ammoniaque. De façon optionnelle, le procédé selon la présente invention comprend en outre une étape de lavage de la matrice de collagène fibrillé dans une solution tampon, par exemple de solution tamponnée au phosphate. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une matrice 20 de collagène transparente comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'une solution acide de collagène dans une solution aqueuse d'acide acétique à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/mL, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/mL ; b) concentration de la solution acide de collagène par évaporation ou par dialyse 25 jusqu'à obtention d'une concentration en collagène comprise entre 42 et 50 mg/mL, préférablement comprise entre 43 et 47 mg/mL, plus préférentiellement de l'ordre de 45 mg/mL ; c) formation de fibrilles par mise en contact de la matrice de collagène avec une phase gazeuse basique ou un liquide neutre ou basique, avantageusement par mise 30 en contact de la matrice de collagène avec des vapeurs d'ammoniaque. 3037804 6 L'invention a également pour objet une matrice de collagène fibrillé transparente susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention, caractérisée par une transmittance supérieure à 0,6, de préférence supérieure à 0,8 à 700 nm. Selon une forme de réalisation avantageuse de l'invention, la matrice présente des 5 phases bleues, lesdites phases bleues étant observées en MOLP. Dans un mode de réalisation de l'invention, la matrice est de pH supérieur ou égal à 7. Au sens de la présente invention, on entend par matrice transparente une matrice dont la densité d'absorption UV-visible est équivalente à celle d'une solution de collagène concentré non fibrillé. 10 Avantageusement, la matrice selon l'invention est stable. Au sens de la présente invention on entend par matrice transparente de collagène fibrillé stable une matrice qui ne présente pas d'évolution substantielle de sa transparence, préférentiellement de sa transmittance à 700 nm, pendant plusieurs mois. De telles matrices ont par exemple été conservées pendant 4 ans à 4°C dans de l'eau ultrapure stérile sans altération de transparence. 15 L'invention a également pour objet l'utilisation d'une matrice de collagène fibrillé transparente ainsi obtenue comme substitut tissulaire pour la fabrication d'un tissu ou d'un organe artificiel, notamment d'un substitut de cornée. Cette matrice de collagène peut également connaître une utilisation pour la fabrication d'un pansement. 3037804 7 EXEMPLES Les solutions utilisées dans les exemples sont décrites ci-après : -Acide acétique (CH3COOH 500 mM) : 58 mL d'acide acétique glaciale Purex (Carlo 5 Erba®, Pureté >= 99,8%) sont dilués dans 2 L final d'eau distillée. Puis la solution est stérilisée à l'aide d'unité de filtration (Nalgene®, polyethersulfone, taille des pores 0,22[tm). -PEG (50 mg/mL) : 50 g de PEG (Sigma Aldrich®, Réf. catalogue 94646, 35 kDa) sont dilués dans une solution d'acide acétique stérile (500 mM) et complétée à 1L. La solution obtenue est agitée jusqu'à obtention d'une solution homogène et transparente. 10 -PBS 1X : 80 g de NaC1 (Sigma Aldrich®, 142,04 g/mol); 2 g de KC1 (Fluka®, 76,5 g/mol); 28,9 g de Na2HPO4, 12H20 (Sigma Aldrich®, 358,14 g/mol); 2,027 g de NaH2PO4, 1H20 (Sigma Aldrich®, 137,99 g/mol) sont dilués dans de l'eau distillée, puis la solution est complétée à 1L final. Finalement, 100 mL de PBS 10X sont ajoutés à 900 mL d'eau distillée. La solution de 1L de PBS 1X est ensuite stérilisée. 15 Exemple 1: préparation d'une matrice de collagène fibrillé transparente par évaporation Préparation d'une solution initiale de collagène Dans cet exemple, une solution de collagène acido-soluble issue de veau de 20 concentration 5 mg/mL en collagène commercialisée par la société SYMATESE sous la référence ACI (N°Baan : S2132380005), numéro de lot ACI070, est utilisé comme solution initiale de collagène. Le pH de la solution est de 3,5. Concentration de la solution de collagène par évaporation 100 mL de solution initiale de collagène est placé dans un cristallisoir de 200 mL 25 stérile préalablement pesé à vide. Le cristallisoir est laissé ouvert sous une hotte à flux laminaire pendant 12 heures environ. L'évaporation sous hotte permet la concentration du collagène au sein du contenant par l'évaporation de l'eau présente dans la solution. Une matrice de collagène de concentration 45 mg/mL est obtenue. 3037804 8 L'évolution de la concentration en collagène au cours de l'évaporation peut être déterminée en pesant la solution de collagène acido-soluble ou, plus approximativement, en mesurant la baisse de volume au sein du récipient. La solution peut régulièrement être homogénéisée grâce à une pipette pendant 5 l'évaporation. Si un film de surface sec se forme, l'ajout de quelques gouttes d'acide acétique permet d'homogénéiser à nouveau l'ensemble et de reprendre l'évaporation. Une matrice de collagène concentrée en collagène à 45 mg/m1 est ainsi obtenue. Le même procédé a été a été reproduit en plaçant 8 ml de la solution initiale de collagène dans un cristallisoir de 10 ml pendant 48 heures. Une matrice de collagène de 10 concentration 45 mg/m1 est obtenue. Fibrillogenèse de solutions de collagène concentrées en présence de vapeurs d'ammoniaque Le cristallisoir contenant la solution de collagène à une concentration de 45 mg/mL est placée dans un dessiccateur (5L) dans lequel est aussi placé un bécher contenant une solution 15 aqueuse d'ammoniaque (Carlo Erba®, 30 mL, 35,046 g/mol, 28-30%). L'ensemble est laissé sous vapeurs d'ammoniaque dans le dessiccateur fermé hermétiquement, durant 2 h sous hotte chimique. Une matrice de collagène fibrillé de pH 10 est obtenue. Rinçages des matrices de collagène fibrillé Éventuellement, sous la hotte à flux laminaire, la matrice est rincée avec du PBS 1X 20 (100 mL, pH = 7,4, pendant 5 minutes) plusieurs fois de suite jusqu'à obtention d'un pH neutre (pH à évaluer avec du papier pH). La matrice est conservée à 4°C dans un tube Falcon® stérile contenant du PBS 1X (40 mL) jusqu'à utilisation. Le procédé décrit ci-dessus peut être mis en oeuvre avec du collagène extrait de queue de rat. Des matrices transparentes de collagène fibrillé ont été obtenues à partir d'une solution 25 initiale de collagène présentant une force ionique de 153 mM, 500 mM, 669 mM ou 1,2 M. De même, des matrices transparentes de collagène ont été obtenues à partir d'une solution initiale de collagène concentrée en collagène à 1 mg/mL. Exemple 2 : préparation d'une matrice de collagène fibrille transparente par dialyse Préparation d'une solution initiale de collagène 3037804 9 8 mL d'une solution de collagène acido-soluble de Type I (3,2 mg/mL) purifiée à partir de tendons de queues de rats selon Gobeaux et al. (Gobeaux et al. 2007. Langmuir, 23 (11), p. 6411-6417) sont dilués dans 16 mL d'une solution d'acide acétique stérile Purex (500 mM). On obtient 25 mL solution de collagène acido-soluble de concentration 1 mg/mL. Le pH de la 5 solution est de 3,5. Concentration de la solution de collagène par dialyse Cette solution de collagène est injectée dans une cellule de dialyse par un capillaire en téflon (Dupont® PFA tubing, 0,35 mm de diamètre interne) à l'aide d'une seringue stérile (Terumo®, 10 mL, sans aiguille). La poussée sur la seringue est réalisée avec un pousse- 10 seringue (Kdscientific®, KDS 101). La cellule de dialyse est constituée d'un moule (QuixSep® Microdialyzers, volume 1 mL) et d'une membrane de dialyse sèche réhydratée dans l'eau bouillante (Spectra/Pore, regenerated cellulose, MWCO 14000 Da). La dialyse est effectuée contre une solution de polyéthylène glycol (PEG, Sigma Aldrich®, 35 kDa, 60 mg/mL, 500 mL) diluée dans de l'acide acétique stérile Purex (500 15 mM). L'homogénéité de la solution peut être maintenue par agitation. Un volume total de 18 mL de solution de collagène est injecté. Au cours de l'expérience, la vitesse d'injection est réglée autour de 0,2 mL/heure, en fonction du « gonflement » de la membrane de dialyse sous l'effet de la pression. Avec le protocole décrit ci-dessus, le temps pour injecter les 18 mL de solution est de 3 à 4 jours environ. 20 L'injection continue de cette solution sous dialyse permet la concentration du collagène au sein de la matrice. La forme et la taille des matrices dépendent uniquement du moule qui constitue la cellule de dialyse dans laquelle est injectée la solution de collagène au cours du temps. Les conditions opératoires décrites ci-dessus permettent d'obtenir une matrice de 1 cm' et de concentration d'une valeur de 45 mg/mL. Un moule plus gros impliquerait des 25 temps d'injection plus grands. Tout le montage s'effectue sous hotte à flux laminaire afin de préserver l'ensemble en condition stérile. Les bouchons et clips constituant la cellule de dialyse sont préalablement stérilisés par immersion dans un bécher contenant de l'éthanol 90% (30 minutes). Les membranes de dialyse sont coupées à la taille optimale (environ 5 cm de longueur), puis 30 réhydratées par immersion dans de l'eau en ébullition puis refroidies dans de l'eau stérile. 3037804 10 Une seringue stérile (10 mL) est remplie avec 9 mL de la solution de collagène. La cellule de dialyse et la seringue sont reliées à l'aide d'un capillaire, qui permettra une injection progressive du collagène. Afin de rendre le système hermétique un cône stérile dont le bout est ajusté est connecté d'un côté à l'embout de la seringue enroulé de téflon, et de l'autre côté 5 au capillaire. Finalement, la cellule de dialyse est remplie avec la solution de collagène à l'aide de la seringue (ouverture vers le haut), puis la membrane est posée contre la cellule de dialyse en évitant de former des bulles. La cellule est fermée à l'aide d'un opercule qui la constitue. Une fois le montage terminé, l'étanchéité des jonctions bouchon/capillaire et capillaire/cône 10 est assurée avec de la cire fondue à l'aide d'un fer à souder. Les bouchons de dialyse sont plongés dans un bécher muni d'un barreau aimanté contenant la solution de PEG, tout en s'assurant que seule la partie contenant la membrane de dialyse soit immergée. Le bécher est alors placé sur un agitateur magnétique (400-500 rpm, à température ambiante) pour permettre d'homogénéiser la concentration en PEG à travers la membrane de 15 dialyse. Fibrillogenèse de la solution de collagène concentrée Une fois l'injection de la solution de collagène terminée, l'injection est arrêtée. L'auto-assemblage des triples hélices de collagène en fibrilles s'effectue par fibrillogenèse sous vapeurs d'ammoniaque. Pour cela, la cellule de dialyse, sans le capillaire, est placé dans 20 un dessiccateur (5L) dans lequel est aussi placé un bécher contenant une solution aqueuse d'ammoniaque (Carlo Erba®, 60 mL, 35,046 g/mol, 28-30%). La cellule de dialyse est laissée sous vapeurs d'ammoniaque dans le dessiccateur fermé hermétiquement, durant 48h sous hotte chimique. Finalement, sous la hotte à flux laminaire, la matrice est délicatement retirée du 25 bouchon de dialyse à l'aide d'une pince stérile, et rincée plusieurs fois dans un récipient stérile (Corning®, 50 mL, 30x115 mm) contenant du PBS 1X ou de l'eau stérile ultrapure (45 mL, pendant 5 minutes) jusqu'à obtention d'un pH neutre (pH à évaluer avec du papier pH). La matrice est conservée à 4°C dans un tube Falcon® stérile contenant de l'eau stérile (40 mL) jusqu'à utilisation. 3037804 11 Ces conditions expérimentales mènent à la synthèse d'une matrice de collagène fibrillé biphasée composée d'une phase opaque et d'une phase transparente superposées, cette dernière est retirée par découpe à l'aide d'un bistouri stérile et conservée. 5 Exemple 3 : caractérisation des matrices obtenues Des matrices de collagène fibrillé concentrées en collagène à 40 mg/ml, 42 mg/ml, 43,5 mg/mL, 45 mg/mL, 46,8 mg/mL et 48 mg/mL ont été obtenues selon le procédé exposé en Exemple 1 (collagène issu de veau). Observations à l'oeil nu et en microscopie à lumière polarisée (MOLP) 10 La figure 1 synthétise les résultats de l'analyse à l'oeil nu et en microscopie à lumière polarisée de matrices de collagène à différentes concentrations comprises entre 40 mg/ml et 48 mg/m1 en collagène. La figure 2a illustre la présence d'organisations biréfringentes apparentées à des «phases bleues» dans une solution de collagène concentrée à 45 mg/mL. Ces phases 15 cristallines-liquides particulières n'ont, jusqu'à maintenant, été décrites que pour des cristaux liquides thermotropes. En solution, le collagène est un cristal liquide de type lyotrope. L'observation d'une telle « phase bleue » est cohérente dans la mesure où elle est décrite dans la littérature, pour des cristaux liquides thermotropes, comme étant une phase intermédiaire entre la phase isotrope et la phase cholestérique. 20 La figure 2b présente l'obtention d'une texture comparable dans une solution de collagène issu de queues de rat concentrée à 45 mg/mL. La figure 2c illustre la présence d'organisations biréfringentes apparentées à des phases bleues dans une matrice de collagène fibrillé à 45 mg/mL indiquant ainsi que cette organisation particulière a été conservée après fibrillogenèse. 25 Étude de transmittance par ellipsométrie La transmittance des matrices de collagène fibrillé a été étudiée par ellipsométrie (Figures 3 et 4). Les spectres de transmission sont obtenus en utilisant un 3037804 12 Ellipsomètre (Variable angle spectroscopie ellipsometry (VASE) M-2000U Woollam spectroscopie ellipsometer) entre 370 et 1000 nm à un angle d'incidence de 0°. Afin de s'assurer de la planarité des surfaces, les matrices sont placées entre deux lames de verre pour microscopie en prenant comme référence l'air (Faustini et al. ACS Appl. Mater. 5 Interfaces, 2014, 6 (19), pp 17102-17110). La figure 3 représente la transmittance des matrices entre 370 et 1000 nm. On observe, en ordonnée, la transmittance de matrices de concentrations en fonction, en abscisse, de la longueur d'onde en nm : 40 mg/ml (courbe 1), 42 mg/ml (courbe 2), 43,5 mg/mL (Courbe 3), 45 mg/mL (courbe 5), 46,8 mg/mL (courbe 4) et 48 mg/ml (Courbe 7) en fonction de la 10 longueur d'onde (370 à 1000 nm). Les références sont l'air. Pour la matrice à 45 mg/mL, l'eau a également été utilisée comme référence (courbe 6). La transmittance la plus élevée quelle que soit la longueur d'onde est obtenue avec la matrice à 45 mg/mL. La figure 4 représente la transmittance des matrices à 700 nm. On observe que la transmittance atteint un maximum pour des matrices de collagène fibrillé concentrées à 45 15 mg/ml et qu'en s'éloignant de la valeur de 45 mg/mL la transmittance diminue. Les matrices concentrées à 40 mg/ml sont opaques. Exemple 4 : effet d'une contrainte de cisaillement sur une matrice avant fibrillogenèse La figure 5 illustre l'importance de limiter les contraintes de cisaillement avant fibrillogenèse. La Zone 1 représente une zone d'une matrice de collagène fibrillé concentrée à 20 45 mg/ml en collagène ayant seulement subi les contraintes de cisaillement liées aux manipulations lors de l'étape de concentration. La Zone 1 de la matrice de collagène, transparente avant fibrillogenèse, reste transparente après fibrillogenèse. La Zone 2 représente une zone d'une matrice de collagène fibrillé concentrée à 45 mg/ml en collagène ayant subi l'application d'un stress mécanique local sous forme de frottements de surface à l'aide d'un 25 scalpel avant fibrillogenèse. La Zone 2 de cette matrice de collagène, transparente avant fibrillogenèse, devient opaque après fibrillogenèse. La Zone 3 de cette matrice de collagène représente une zone d'une matrice de collagène fibrillé concentrée à 45 mg/mL ayant subi un prélèvement à la spatule ayant entrainé un stress mécanique local avant fibrillogenèse. On observe que seuls les bords de cette Zone 3 de cette matrice sont devenus opaques. La 30 manipulation de la matrice après fibrillogenèse n'entraine pas l'apparition de zones d'opacité. 3037804 13 Exemple 4 : stockage des matrices Des matrices obtenues par le procédé de l'invention à partir de collagène issu de queues de rat ont été conservées pendant 4 ans à 4°C dans de l'eau ultrapure stérile sans 5 altération de transparence. Les inventeurs ont également conservé des matrices obtenues par le procédé de l'invention à partir de collagène de grade clinique dans du PBS à 4°C augmenté d'un milieu de conservation dédié aux cornées (Cornea cold®, Eurobio, Les Ulis, France) pendant 3 semaines sans altération de transparence. 10 Une pellicule de sels peut se former en surface lorsque les matrices sont conservées dans du PBS à froid dans le cas du collagène de « grade clinique » mais il est possible de la retirer. La précipitation de sels peut être évitée et le temps de conservation augmenté dans un milieu de conservation dédié aux cornées (Cornea cold®) toujours à 4°C. 3037804 14 References Hulmes D.J.S., Miller A. 1979. Nature, 282, p. 878-880. Hélary et al. 2005. Biomaterials, 26, p.1533- 1543 Gobeaux et al. 2007. Langmuir, 23 (11), p. 6411-6417 5 Knight et al. 1998. J Biomed Mater Res. 41, p. 185-191 Faustini et al. 2014. ACS Appl. Mater. Interfaces, 6 (19), p. 17102-17110 REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'une matrice transparente de collagène fibrillé comprenant les étapes suivantes: a) une étape de préparation d'une solution acide de collagène dans un solvant aqueux b) une étape de concentration de la solution acide de collagène c) une étape de fibrillogenèse de la matrice de collagène caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite jusqu'à l'obtention d'une concentration en collagène comprise entre 43 et 50 mg/ml. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite de façon à limiter, avantageusement à pratiquement éviter les contraintes de cisaillement. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite jusqu'à l'obtention d'une concentration en collagène comprise entre 43,5 et 47 mg/ml, préférentiellement de l'ordre de 45 mg/mL. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la solution acide de collagène est constituée par une solution aqueuse d'acide acétique. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la concentration de la solution acide initiale, avant l'étape de concentration, est comprise entre 0,01 mg/ml et 5 mg/ml, avantageusement comprise entre 0,5 et 3 mg/ml. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape de concentration est réalisée par évaporation ou par dialyse. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape de fibrillogenèse consiste 30 à mettre en contact la matrice de collagène avec une phase gazeuse basique ou un liquide neutre ou basique.2. 3. 4. 5. 6. 7. 3037804 16 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'étape de fibrillogenèse est effectuée par mise en contact de la matrice de collagène avec des vapeurs d'ammoniaque. 5 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre une étape de lavage de la matrice de collagène fibrillé dans une solution tampon, par exemple de solution tamponnée au phosphate. 10. Procédé de préparation d'une matrice de collagène transparente selon les 10 revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) préparation d'une solution acide de collagène dans une solution aqueuse d'acide acétique à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/mi ; b) concentration de la solution acide de collagène par évaporation ou par dialyse 15 jusqu'à obtention d'une concentration en collagène comprise entre 42 et 50 mg/ml, préférablement comprise entre 43 et 47 mg/ml, plus préférentiellement de l'ordre de 45 mg/mL ; c) formation de fibrilles par mise en contact de la matrice de collagène avec une phase gazeuse basique ou un liquide neutre ou basique, avantageusement par mise 20 en contact de la matrice de collagène avec des vapeurs d'ammoniaque. 11. Matrice de collagène fibrillé transparente susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle présente une transmittance supérieure à 0,6, de préférence supérieure à 0,8, à 700 nm. 25 12. Utilisation de la matrice de collagène fibrillé selon la revendication 11 pour la fabrication d'un tissu ou d'un organe artificiel, notamment d'un substitut de cornée. 13. Utilisation de la matrice de collagène fibrillé selon la revendication 11 pour la fabrication d'un pansement.