Brevet FR3041529A1 — publié le 20170331

COMPOSITIONS UTILES POUR LE TRAITEMENT DES ARBOVIROSES Les arboviroses sont des affections transmises par des arthropodes hématophages. Elles sont dues à des arbovirus, virus habituellement transmis, dans les conditions naturelles, de vertébré à vertébré, par un arthropode hématophage, qui en constitue le vecteur. Elles regroupent des maladies différentes quant à leur symptomatologie et surtout leur épidémiologie. Cent dix virus environ sont pathogènes pour l'homme et une quarantaine d'entre eux est cause de maladies animales identifiées. A la suite de l'injection de salive lors de la piqûre d'un arthropode infestant, le vertébré réceptif va développer une infection arbovirale. Le virus va se répliquer à proximité du point d'inoculation, puis dans les ganglions lymphatiques correspondants : c'est la phase de virémie. Puis, le virus va disséminer dans l'organisme jusqu'aux organes cibles. L'infection entraîne une réponse immune à la fois humorale et cellulaire. La prophylaxie générale des arboviroses repose sur la surveillance des foyers épidémiologiques (humains, vertébrés et vecteurs), la lutte antivectorielle et la protection de la population humaine réceptive par les moustiquaires, les répulsifs et les vaccinations limitées actuellement au vaccin anti-amaril et au vaccin contre l'Encéphalite japonaise. Parmi les arboviroses les plus importantes en terme de santé publique, on retrouve, le chikungunya qui est une maladie infectieuse tropicale, due à l'arbovirus CHIKV (Chikungunya Virus), un alphavirus de la famille des 25 Togaviridae, transmise par des moustiques du genre Aedes. De nombreux foyers endémiques ont été répertoriés lors des cinquantes dernières années dans de nombreux pays d'Afrique, par exemple au Niger, au Sénégal, en République Démocratique du Congo, au Cameroun, au Gabon, en Ouganda, au Zimbabwe et au Nigeria. Le virus est également présent au 30 Pakistan et en Inde où les émergences sont régulières depuis une cinquante d'années. En 2005-2006, une importante épidémie de chikungunya a frappé les îles de l'Océan Indien, notamment l'île de La Réunion, avec plusieurs centaines de milliers de cas. Actuellement, il n'existe ni vaccin ni traitement contre cette maladie. 3041529 2 Aussi existe-t-il un besoin de mettre au point un traitement efficace contre ces arboviroses, notamment contre le CHIKV. Or les Inventeurs se sont aperçus que malgré l'importance de la barrière cutanée comme site d'entrée des arbovirus, les connaissances acquises autour 5 du système immunitaire de la peau vis-à-vis des arbovirus ainsi que les voies empruntées par le virus demeuraient succinctes. Aussi, dans ce cadre, les Inventeurs ont réalisé une étude protéomique comparative de fibroblastes cutanés infectés ou non par le virus chikungunya par la méthode SILAC (stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture) développée par Ong S.E. et 10 ai. (Moi. Cell. Proteomics (2002), 1(5), p 376-386). Ils ont identifié dans cette analyse que les protéines Niemann-Pick type C (NPC1 et NPC2) étaient essentielles à la réplication du CHIKV dans les fibroblastes car quand ces dernières sont mutées les Inventeurs ont observé une réduction drastique de l'infection virale. Lorsque ces protéines sont mutées le transport lipidique 15 intracellulaire est interrompu, conduisant à l'accumulation de cholestérol et de sphingolipides dans les endosomes et les lysosomes. La perte de fonctionnalité de la protéine NPC1 ou de la protéine NPC2 provoque la maladie de Niemann-Pick type C, un désordre rare du stockage lipidique neuroviscéral lié à l'interruption du transport lipidique intracellulaire qui 20 conduit à l'accumulation de cholestérol et de sphingolipides dans les endosomes et les lysosomes. Par ailleurs, le transport intracellulaire du cholestérol contrôlé par la protéine NPC1 est nécessaire à la production efficace de virions de VIH-1 et cette protéine NPC1 semble être indispensable à l'entrée dans la cellule hôte du virus Ebola et du virus Marburg qui sont des filovirus. Cependant à ce jour, aucune étude n'a montré une relation entre les alphavirus et les protéines NPC1 et NPC2. Aussi la présente invention a pour objet une composition comprenant au moins un composé ayant un impact sur le taux cholestérol, ledit composé étant choisi parmi les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol et les inhibiteurs des transporteurs intracellulaires du cholestérol et leurs mélanges pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des infections virales dues à un arbovirus chez un mammifère humain ou non humain. Au sens de l'invention, la composition peut comprendre soit un ou plusieurs inhibiteurs de la synthèse du cholestérol, soit un ou plusieurs inhibiteurs du transport intracellulaire du cholestérol, soit un mélange de un ou plusieurs 3041529 3 inhibiteurs de la synthèse du cholestérol avec un ou plusieurs inhibiteurs du transport intracellulaire du cholestérol. Au sens de la présente invention on entend par inhibiteurs des transporteurs du cholestérol, tout composé qui, soit inhibe au moins l'une des 5 protéines NPC1 et NPC2 intervenant dans le transport intracellulaire des lipides, notamment du cholestérol, soit qui entraîne une déficience d'au moins une des dites protéines, soit qui présente au niveau cellulaire un phénotype proche de celui des cellules présentant des mutations dans la protéine NPC1 et/ou NPC2. Au sens de la présente invention, on entend par mammifère non humain 10 notamment les bovins, les chevaux, les chiens, les ovins et les félins. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol sont choisis dans le groupe comprenant les statines. A titre de statine on peut citer la simvastatine, la pravastatine, la fluvastatine, l'atorvastatine, la rosuvastatine et la cérivastatine. 15 Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les inhibiteurs du transport du cholestérol sont choisis dans le groupe comprenant notamment l'imipramine et ses dérivés. L'imipramine est déjà utilisée en clinique comme antidépresseur, du fait de son action inhibitrice sur la capture neuronale des catécholamines et de la sérotonine. C'est le premier-né de la famille des 20 antidépresseurs tricycliques dont les propriétés ont été découvertes par Roland Kuhn en 1957. Les inventeurs ont montré de manière surprenante que l'imipramine conduit à un phénotype cellulaire proche de celui des cellules possédant des mutations dans les protéines NPC1 et NPC2. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'arbovirus 25 appartient à la famille des Togaviridae ou des Flaviridae et est notamment un alphavirus. On peut citer comme alphavirus le virus du chikungunya, le virus de Sindbis, le virus de la forêt de Semliki, le virus O'nyong'nyong, le virus Mayaro, le virus de la Ross River, le virus de la forêt de Barmah, le virus de l'encéphalite équine de l'Est, le virus de l'encéphalite équine de l'Ouest et le virus de 30 l'encéphalite équine du Venezuela et comme flavivirus le virus de la dengue Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition est une composition pharmaceutique et comprend en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Ces excipients sont ceux classiquement utilisés et l'homme du métier saura choisir l'excipient approprié. 35 On peut citer à titre d'exemple, les agents de désintégration ou délitants, les 3041529 4 liants, les charges et les lubrifiants. Des exemples de délitants comprennent l'agar-agar, les alginates, le carbonate de calcium, la carboxyméthylcellulose, la cellulose, les argiles, le dioxyde de silicium colloïdal, la croscarmellose sodique, la crospovidone, les gommes, le silicate de magnésium et d'aluminium, la 5 méthylcellulose, la polacriline potassium, l'alginate de sodium, l'hydroxypropylcellulose faiblement substituée, la polyvinylpyrrolidone réticulée, l'hydroxypropylcellulose et l'amidon. Des exemples de liants comprennent la cellulose microcristalline, l'hydroxyméthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose et la polyvinylpyrrolidone. Des exemples de charges comprennent le carbonate de 10 calcium, le phosphate de calcium, le phosphate de calcium dibasique, le sulfate de calcium tribasique, la carboxyméthylcellulose de calcium, la cellulose, les dérivés de la dextrine, la dextrine, le dextrose, le fructose, le lactitol, le lactose, le carbonate de magnésium, l'oxyde de magnésium, le maltitol, les maltodextrines, le maltose, le sorbitol, l'amidon, le saccharose et le xylitol. Des 15 exemples de lubrifiants comprennent l'agar, le stéarate de calcium, l'oléate d'éthyle, le lauréate d'éthyle, le glycérol, le palmitostéarate de glycéryle, les huiles végétales hydrogénées, l'oxyde de magnésium, le stéarate de magnésium, le mannitol, le poloxamère, les glycols, le benzoate de sodium, le laurylsulfate de sodium, le stéarylfumarate de sodium, le sorbitol, l'acide stéarique, le talc et le 20 stéarate de zinc. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'imipramine et ses dérivés sont utilisés sous forme de base ou de sels. On peut citer à titre d'exemple de sels d'imipramine, le chlrohydrate et le méthane sulfonate. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention la composition 25 se présente sous une forme adaptée à une administration par voie orale, rectale ou parentérale. Toutes ces formes sont bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple on peut citer pour l'administration par voie orale, les comprimés, les capsules, les gélules, les granules, les granulés, les pastilles, les comprimés à libération prolongée, les solutions, les émulsions, les suspensions, les poudres 30 orales. A titre d'exemple on peut citer pour l'administration par voie rectale les suppositoires et les ovules. A titre d'exemple on peut citer pour l'administration par voie parentérale, les solutions, les suspensions et les perfusions. Toutes ces formes seront adaptées pour une administration journalière en une ou plusieurs doses. La dose varie en fonction du mode d'administration, de 3041529 5 l'âge, du poids et de l'état général du sujet et le médecin ou le vétérinaire saura décider la dose appropriée et le régime d'administration. Les différentes compositions et les différentes formes d'administration sont préparées par des techniques connues de l'homme du métier. 5 La présente invention a également pour objet, une méthode de traitement ou de prévention des infections virales dues à un arbovirus chez un mammifère humain ou non humain comprenant l'administration au dit mammifère d'une dose efficace d'un composé choisi parmi les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol et les inhibiteurs des transporteurs intracellulaires du cholestérol et 10 leurs mélanges. La présente invention a également pour objet une trousse ou un kit comprenant un ou plusieurs récipients, chacun de ses récipients contenant une composition selon l'invention. Conformément à l'invention chaque récipient peut contenir des compositions identiques ou différentes, lesdites compositions 15 comprenant au moins un inhibiteur de la synthèse du cholestérol ou au moins un inhibiteur des transporteurs intracellulaires du cholestérol ou des mélanges de ceux-ci. La trousse ou le kit peut en outre comprendre des instructions pour l'administration desdites compositions pour la prévention et le traitement des arboviroses. 20 Les exemples 1 à 3 et les figures 1 à 5 qui suivent illustrent l'invention. La figure 1 montre les protéines du compartiment endosome/lysosome surexprimées dans les cellules infectées par le CHIKV. CTSB : cathepsine B ; CTSC : cathepsine C ; CTSD : cathepsine D ; CTSZ : cathepsine Z ; SDCBP : Syntenine (Syndecan Binding Protein) ; NCSTN : nicastrine ; LAMP 1 : protéine 25 membranaire 1 associée au lysosome (Lysosomal-associated membrane protein 1); LAMP 2 : protéine membranaire 2 associée au lysosome Lysosomalassociated membrane protein 2 ; NPC 1 protéine Niemann-Pick type C 1 ; NPC 2 protéine Niemann-Pick type C2 ; NAPA : protéine d'attachement au facteur sensible au N-ethylmaleimide (N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment 30 Protein Alpha) ; La figure 2 représente le pourcentage de cellules infectées visualisé par cytométrie en flux après infection par le CHIKV de cellules fibroblastes saines (a) et des cellules ayant des mutations au niveau des protéines NPC1 (b) ou NPC2 (c) selon l'exemple 2. 3041529 6 La figure 3 illustre le nombre de copies d'ARN viral (axe des ordonnées) mesuré par PCR quantitative dans des cellules fibroblastes saines infectées par le virus CHIKV (saines) et des cellules ayant des mutations au niveau des protéines NPC1 ou NPC2 conformément à l'exemple 2. 5 La figure 4 illustre le nombre de cellules fibroblastes infectées par en l'absence d'imipramine (0) ou en présence d'imipramine à 10, 25, 50, 75 et 100 pM mesuré par cytométrie en flux selon l'exemple 3. La figure 5 illustre le nombre de copies d'ARN viral (axe des ordonnées) mesuré par PCR quantitative dans des cellules fibroblastes infectées par le virus 10 CHIKV en l'absence d'imipramine (0) ou en présence d'imipramine à 10, 25, 50, 75 et 100 pM mesuré selon l'exemple 3. Exemple 1: Identification des protéines surexprimées dans des fibroblastes cutanés infectés par le virus chikungunya 15 1.1. Mode opératoire Une étude protéomique (Méthode SILAC) comparative de fibroblastes cutanés infectés ou non par le virus chikungunya a été réalisée. La technique SILAC est une approche de protéomique quantitative basées sur la spectrométrie de masse et le marquage métabolique des protéines. 20 Le principe est le suivant : les cellules sont cultivées dans un milieu contenant soit des acides aminés naturels (synthèse de protéines « légères »), soit leurs équivalents isotopiquement marqués (synthèse de protéines « lourdes »). Les populations cellulaires à comparer sont mélangées et traitées comme un seul échantillon, ce qui permet de préparer les protéines d'intérêt sans risquer 25 d'introduire des erreurs de quantification. Au cours de l'analyse par spectrométrie de masse, l'abondance relative entre les échantillons biologiques peut être calculée pour chaque protéine en comparant l'intensité des peptides légers et lourds. Dans notre étude, les cellules fibroblastes (lignée HFF-1) marquées (milieu 30 lourd) ou non (milieu léger) avec de l'arginine et de la lysine lourdes ont été infectées par le CHIKV (MOI 8). 48h après infection, les protéines des différents échantillons ont été extraites. Les protéines marquées des cellules infectées et les protéines normales des cellules non infectées, ainsi que les protéines normales des cellules infectées et les protéines marquées des cellules non 35 infectées ont été mélangées à un ratio de 1:1. Ensuite, les deux échantillons de 3041529 7 protéines obtenus ont été séparés sur gel SDS-PAGE, les protéines totales ont été coupées en 9 bandes et elles ont été digérées à la trypsine. Enfin, les peptides obtenus ont été analysés au spectromètre de masse et les données obtenues ont été traitées avec le logiciel MaxQuant pour obtenir la quantification 5 relative des protéines. 1.2. Résultats Ils sont donnés dans la figure 1. Parmi les protéines surexprimées dans les cellules infectées on trouve les 10 protéines Niemann-Pick type C (NPC1 et NPC2). Exemple 2 : Influence de la mutation des protéines NPC1 et NPC2 sur la réplication du CHIKV 2.1. Mode opératoire 15 Des cellules saines et des cellules de patients atteints d'une maladie de Niemman-Pick (Niemman-Pick disease) avec soit la protéine NPC1 mutée, soit la protéine NPC2 mutée ont été fournies par la société Cohen Cell Repositories ; http://ccr.corielLorg/). Les cellules sont mises en contact avec le CHIKV (Multiplicité d'infection ou MOI = 0,5) pendant 2h à 37°C puis les cellules sont lavées 3 fois 20 et le milieu de culture est rajouté et les cellules sont mises à 37°C pendant 24H. Le pourcentage de cellules infectées est mesuré par cytométrie en flux et le nombre de copies d'ARN viral est mesuré par PCR quantitative. 2.2. Résultats 25 Ils sont donnés dans les figures 2 et 3. Dans la figure 2, 50,52 % des cellules saines sont infectées, alors que seulement 16,26 % des cellules présentant une protéine NCP1 mutée et 5,28% des cellules présentant une protéine NPC2 mutée sont infectées. Dans la figure 3, on observe une réduction de 72% du nombre de copies 30 d'ARN viral dans les cellules ayant la protéine NPC1 mutée et 92% de l'infection dans les cellules ayant la protéine NPC2 mutée comparativement aux cellules saines. Exemple 3 Effet de l'imipramine sur des cellules fibroblastes 35 infectées par le CHIVK 3041529 8 3.1. Mode opératoire Des fibroblastes cutanés sont traités par de l'imipramine à différentes concentration 10, 25, 50, 75 et 100 pM pendant 2H à 37°C. Les cellules sont ensuite exposées au CHIKV pendant 2h (en présence d'imipramine) puis elles 5 sont lavées et mises en présence de milieu de culture pendant 24H (en présence d'imipramine). L'infection virale a ensuite été évaluée par cytométrie en flux et le nombre de copies d'ARN viral par PCR quantitative. 3.2. Résultats Ils sont donnés dans les figures 4 et 5. 10 Contrairement aux cellules infectées en absence d'imipramine on observe une réduction de l'infection en présence d'imipramine de manière dose dépendante, jusqu'à atteindre 100 % d'inhibition de l'infection des cellules par le CHIKV pour une concentration de 100 pM (Figure 4). De la même manière on observe en présence d'imipramine une diminution 15 de l'infection des cellules de manière dose dépendante et on arrive à totalement bloquer l'infection à partir de 75 pM d'imipramine (Figure 5). Ainsi l'imipramine est efficace sur l'infection au CHIKV à des concentrations où elle n'est pas cytotoxique. 20 REVENDICATIONS1. Composition comprenant au moins un composé ayant un impact sur le taux cholestérol, ledit composé étant choisi parmi les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol et les inhibiteurs du transport intracellulaire du cholestérol et leurs mélanges, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des infections virales dues à un arbovirus chez un mammifère humain ou non humain. 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol sont choisis dans le groupe comprenant les statines. 3. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les inhibiteurs du transport intracellulaire du cholestérol sont choisis dans le groupe comprenant les inhibiteurs de NPC 1 et NPC 2. 4. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les inhibiteurs du transport intracellulaire du cholestérol sont choisis dans le groupe des composés présentant un phénotype cellulaire proche de celui des cellules possédant des mutations dans les protéines NPC1 et NPC2, notamment l'imipramine et ses dérivés. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'arbovirus est un alphavirus ou un flavivirus. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'alphavirus est choisi dans le groupe comprenant le virus du chikungunya, le virus de la dengue, le virus de Sindbis, le virus de la forêt de Semliki, le virus O'nyong'nyong, le virus Mayaro, le virus de la Ross River, le virus de la forêt de Barmah, le virus de l'encéphalite équine de l'Est, le virus de l'encéphalite équine de l'Ouest et le virus de l'encéphalite équine du Venezuela et le flavivirus est le virus de la dengue. 3041529 10 7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 5 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1, ou 4 à 7 caractérisée en ce que l'imipramine est sous forme de base ou de sels. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme adaptée à une 10 administration par voie orale ou parentérale. 10. Trousse ou kit comprenant un ou plusieurs récipients, chacun de ses récipients contenant une composition, ladite comprenant au moins un composé ayant un impact sur le taux cholestérol, ledit composé étant 15 choisi parmi les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol et les inhibiteurs du transport intracellulaire du cholestérol et leurs mélanges avec éventuellement des instructions d'utilisation.