Brevet FR3037402A1 — publié le 20161216

Procédé de discrimination des bactéries Escherichia cou i et Shigella par spectrométrie R1VIN La présente invention concerne le domaine de la bactériologie. Plus précisément, l'invention concerne la discrimination entre les bactéries de l'espèce Escherichia cou et celles du genre Shigella. Depuis la découverte des microbes par Pasteur, les microorganismes sont étudiés par microscopie et analyses biochimiques et quantifiés par cultures quantitatives. Ces méthodes traditionnelles sont souvent longues et fastidieuses et des alternatives analytiques ont très tôt été recherchées. La détection rapide et l'identification précise des microorganismes et en particulier des bactéries représentent donc un enjeu majeur, tant pour le diagnostic clinique que pour le contrôle microbiologique. Le développement des technologies a permis de disposer de nouveaux outils de diagnostic. Ainsi, l'on a pu voir l'émergence de l'analyse génomique par séquençage, l'identification par spectrométrie de masse, spectrométrie infrarouge ou encore spectrométrie Raman. La spectrométrie RMN a également fait l'objet de développements dans le domaine de la microbiologie. Ainsi, Delpassand et al. [1] a décrit l'utilisation de la spectrométrie RMN du proton pour identifier différentes espèces bactériennes. En particulier, Delpassand a mis en évidence qu'il était possible d'identifier des bactéries par analyse de molécules intracellulaires, à partir d'une analyse des empreintes spectrales sur quelques suspensions bactériennes. Plus récemment, Boume et al. [2] a confirmé qu'il était possible d'identifier des bactéries du genre Enterococcus, Streptococcus et Staphylococcus par analyse multivariée d'empreintes spectrales obtenues sur l'endométabolome bactérien, à partir d'une centaine de suspensions de bactéries Gram positives. Récemment, il a été démontré que les bactéries du genre Shigella sont très proches des 3037402 2 bactéries de l'espèce Escherichia cou i [3]. En effet, Shigella appartient à la famille des Enterobacteriaceae et comprend 4 espèces. D'un point de vue génétique, les 4 espèces de Shigella (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii et S. sonnei) et Escherichia coui appartiennent au même groupe génomique. Cette similitude est source de 5 problématiques de santé publique et vétérinaire. En effet, les espèces de Shigella sont généralement toujours considérées comme des espèces pathogènes alors que Escherichia cou i peut être pathogène ou commensale selon les souches. Leur différenciation est donc déterminante pour la mise en place d'un traitement. Il existe à ce jour des méthodes biochimiques ou sérologiques pour différencier ces deux bactéries 10 qui sont complémentaires aux techniques de microbiologie traditionnelles. Néanmoins, ces tests complémentaires sont longs, ce qui augmente de manière significative le temps de rendu des résultats et accentue le risque pour le patient ou l'animal. Le domaine de la microbiologie est donc dans l'attente d'une méthode permettant de 15 différencier de manière sure et rapide, Escherichia cou i de Shigella. Les inventeurs proposent de mettre en oeuvre une nouvelle méthode de différenciation Escherichia cou i I Shigella basée sur l'analyse de l'exométabolome bactérien par spectrométrie RMN. 20 L'invention concerne de façon particulière, un procédé de différenciation par spectrométrie RMN du proton entre une bactérie de l'espèce Escherichia cou i et une bactérie du genre Shigella, ledit procédé comportant les étapes consistant à : a. Obtenir au moins un surnageant d'au moins une suspension de bactéries 25 susceptibles d'être Escherichia cou i ou Shigella ; b. Préparer au moins un échantillon adapté à une analyse en spectrométrie RMN du proton, par mélange d'au moins une fraction du au moins un surnageant avec un tampon deutéré ; c. Obtenir au moins un spectre RMN du au moins un échantillon, 30 d. Analyser les pics dudit au moins un spectre correspondant aux métabolites suivant : acétate, alanine, aspartate, éthanol, lactose, lysine, Na-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine et valine ; 3037402 3 e. Déterminer s'il s'agit d'une bactérie Escherichia cou i ou Shigella. Le procédé selon l'invention consiste à analyser l'exométabolome bactérien. Par exométabolome, on entend l'ensemble des métabolites d'un système biologique tel 5 qu'une cellule, un tissu, un organe ou un organisme, excrétés dans le milieu extracellulaire ou dans le milieu de culture. Selon un mode particulier du procédé selon l'invention, si la bactérie Escherichia coui ne métabolise pas le lactose, les pics analysés à l'étape d), sont préférentiellement ceux 10 correspondant aux métabolites suivant : acétate, aspartate, lysine, Na-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine. De façon avantageuse, l'étape a) du procédé selon l'invention comporte les sous-étapes suivantes : 15 al) Préparer au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia cou i ou Shigella à partir d'une ou plusieurs colonies de la même bactérie, de façon à obtenir un concentration bactérienne suffisante ; a2) Incuber la au moins une suspension de bactéries à une température et pendant 20 une durée suffisantes pour obtenir des bactéries en phase exponentielle de croissance. Par phase exponentielle de croissance, on entend la phase de croissance pendant laquelle les bactéries se multiplient le plus rapidement. De façon avantageuse, les conditions opératoires du procédé selon l'invention sont adaptées pour que lors de 25 l'analyse RMN, les bactéries soient à la moitié de leur phase exponentielle de croissance La température d'incubation est quant à elle préférentiellement de 37°C. 30 De façon avantageuse, le temps d'incubation de suspension de bactéries est compris entre 1 et 2 heures, préférentiellement égal à une heure et demie, lorsque la température d'incubation est de 37°C. 3037402 4 La méthode spectrométrique utilisée est la spectrométrie RMN du proton. De manière préférentielle, la fréquence de résonance utilisée est supérieure ou égale 600 mégahertz (MHz). Une fréquence particulièrement avantageuse est de 600,55 MHz. 5 Un spectromètre RMN adapté pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention est par exemple celui commercialisé par la société Bruker sous la référence AVANCE III, couplé à une cryosonde TCI CryoProbeTM 5 millimètres (mm) et un système de gestion des échantillons haut débit SampleJet. 10 D'autres diamètres de tubes RMN peuvent également être utilisés. Ainsi, il est possible d'utiliser des tubes de diamètre 1,7 mm ou 3 mm, en adaptant le volume d'échantillon utilisé. Si une sonde cryogénique est préférée dans le procédé selon l'invention, il est toutefois 15 envisageable d'utiliser d'autres types de sonde RMN, telle qu'une sonde chaude. De telles sondes sont bien connues de l'homme du métier, versé dans l'analyse RMN. La séquence d'impulsions pour l'acquisition des spectres RMN 1D du proton préférentiellement utilisée est une séquence NOESY (nuclear Overhauser 20 spectroscopy) avec gradients-z. Toutefois, d'autres séquences d'impulsions peuvent également être utilisées: par exemple, l'acquisition directe avec présaturation de l'eau (zgpr'), NOESY sans gradient-z, séquence CPMG (Carr Purcell Meiboom Gill)... La température pour l'acquisition des spectres RMN est avantageusement supérieure à 25 0 et peut aller jusqu'à 40°C. Selon un mode préféré de réalisation, le composé de référence utilisé dans la procédé est l'acide 3-(trimethylsily1)-2,2',3,3'-tetradeuteropropionique (TMSP-d4). 30 Le procédé selon l'invention peut néanmoins fonctionner sans ajout de composé de référence, en utilisant l'un des signaux des métabolites présents dans le milieu pour calibrer les spectres (doublet du glucose à 5,23 ppm par exemple). 3037402 5 Le traitement du signal peut être fait sans apodisation ou avec une fonction d'apodisation non exponentielle, un élargissement des raies différent, inférieur ou égal à 1Hz. 5 La réduction des spectres peut se faire en utilisant des segments dont la largeur peut être inférieure à 0,001 ppm et aller jusqu'à 0,05 ppm. L'intégration peut être faite en considérant la résolution digitale complète des spectres, sans réduction des données. La région exclue pour le signal de l'eau peut avantageusement aller de 4,3 à 5,1 ppm. 10 Les expériences peuvent être réalisées dans des conditions de pH différentes dans une gamme allant de 6,0 à 8,0. La valeur de pH préférentiellement utilisée est 7,4. Selon l'invention, le tampon deutéré utilisé est avantageusement un tampon à base de 15 KH2PO4. Toutefois, cette solution tampon peut être remplacée par une solution pure de D20 (dans cette condition, l'utilisation d'une méthode de réalignement des signaux RMN pourra être nécessaire). De même, si selon le mode réalisation préféré, la solution tampon contient du NaN3, ce composé peut, selon une alternative technique, être absent du tampon deutéré. 20 La concentration de la solution tampon peut être modifiée, pour une molarité du mélange final pouvant aller jusqu'à 250 mM. La quantité de surnageant utilisée est comprise entre 200 et 550 pL, pour un volume total après dilution en solution tampon conservé, et à molarité finale du mélange 25 équivalente. Avantageusement, le volume de surnageant utilisé est égal à 5401.1.L. Les données de spectrométrie RMN obtenues sont analysées en analyse multivariée supervisée. Une méthode d'analyse supervisée particulièrement adaptée est la méthode OPLS-DA (Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis) décrite 30 par Trygg et Wold [4]. Toutefois, il est possible d'utiliser d'autres méthodes d'analyse supervisée, telles que la méthode PLS-DA. La méthode OPLS-DA est utilisée pour produire un modèle robuste de classification 3037402 6 des échantillons, qui s'associe à une signature métabolique spécifique pour chaque classe d'échantillons considérée. L'analyse OPLS-DA exploite un matrice X des données RMN réduites (N échantillons x M variables RMN considérées) ainsi qu'une matrice supplémentaire Y contenant l'information de classe des échantillons 5 (Escherichia cou Lactose + ; Escherichia cou Lactose - ; Shigella) sur laquelle est effectuée la régression. Les données sont visualisées sous forme de « score plots », dans lesquels chaque point représente la projection d'un unique échantillon sur les deux premières composantes du 10 modèle (composante prédictive horizontale associée à la classification, et première composante orthogonale). Les « loadings plots » représentent la contribution des variables RMN (correspondant aux métabolites) sur la composante prédictive. La qualité du modèle OPLS-DA obtenu est évaluée à l'aide des paramètres R2 et Q2 qui 15 sont respectivement reliés à la proportion de variance expliquée et prédite par le modèle, calculée par validation croisée des données (par « 7-fold cross-validation » : 6/7 de l'échantillon de taille N est utilisé comme échantillon d'apprentissage et 1/7 de l'échantillon est utilisé comme échantillon test; d'autres valeurs k pour une validation croisée de type k-fold peuvent être utilisées pour valider le modèle ; d'autres méthodes 20 classiques de validation croisée connues de l'homme du métier peuvent être utilisées). Une validation supplémentaire des modèles est effectuée en ré-échantillonnant le modèle 1000 fois, sous hypothèse nulle, par permutations aléatoires de la matrice Y. Les analyses multivariées ont été conduites en utilisant le logiciel SIMCA-P 13 25 (Umetrics). D'autres plateformes de traitements statistiques équivalentes peuvent toutefois être utilisées. L'invention sera mieux comprise à la lumière de l'exemple qui suit en lien avec les figures. Cet exemple a pour but d'illustrer l'invention mais n'a aucun caractère 30 limitatif. La figure 1 A est un graphique permettant de comparer les données présentées sous 3037402 7 forme de « score plots », obtenues à partir de suspensions d' Escherichia cou i Lactose + et de suspensions de Shigella. La figure 1B est un graphique permettant de comparer les données liées aux 5 métabolites d'intérêt, présentées sous forme de « loading plots », obtenues à partir des mêmes suspensions d' Escherichia cou i Lactose + et de suspensions de Shigella que pour la figure 1A. La figure 2A est un graphique permettant de comparer les données sous forme de 10 « score plots », obtenues à partir de suspensions d' Escherichia cou i Lactose - et de suspensions de Shigella. La figure 2B est un graphique permettant de comparer les données liées aux métabolites d'intérêt, présentées sous forme de « loading plots », obtenues à partir des 15 mêmes suspensions d' Escherichia cou i Lactose - et de suspensions de Shigella que pour la figure 2A. Exemple : 1. Sélection des souches : 20 Dans cette exemple, les inventeurs ont cherché à discriminer par analyse en spectrométrie RMN du proton deux familles d'Escherichia cou, une famille d'Escherichia cou i fermentant le lactose (dite « Escherichia cou i Lactose + ») et une famille d'Escherichia cou i ne fermentant pas le lactose (dite « Escherichia cou i Lactose - »), de Shigella. 25 Ainsi 48 souches provenant de la souchotèque bioMérieux, (site de La Balme les Grottes, France) ont été sélectionnées : - 16 souches d'Escherichia cou i Lactose + - 16 souches d'Escherichia cou i Lactose - 30 - 16 souches de Shigella 3037402 8 Le tableau 1 ci-après reprend pour chaque type bactérien, le numéro et la référence bioMérieux (N° API) des souches testées : N° de la souche Espèce N'API 1 Shigella boydii 9511152 2 Shigella boydii 9211058 3 Shigella boydii 9103021 4 Shigella boydii 8518292 5 Shigella boydii 8401004 6 Shigella flexneri 9811048 7 Shigella flexneri 9511143 8 Shigella flexneri 9211059 9 Shigella flexneri 8804032 10 Shigella sonnei 9304068 11 Shigella sonnei 9211060 12 Shigella sonnei 9103146 13 Shigella sonnei 9007037 14 Shigella sonnei 8604102 15 Shigella flexneri 8518293 16 Shigella sonnei 8807097 17 Escherichia cou i Lactose + 0208040 18 Escherichia cou i Lactose + 7308009 19 Escherichia cou i Lactose + 8145303 20 Escherichia cou i Lactose + 8147304 21 Escherichia cou i Lactose + 8610007 22 Escherichia cou i Lactose + 9009100 23 Escherichia cou i Lactose + 9012042 24 Escherichia cou i Lactose + 9030345 25 Escherichia cou i Lactose + 9203096 26 Escherichia cou i Lactose + 9204120 27 Escherichia cou i Lactose + 9207041 28 Escherichia cou i Lactose + 9306055 3037402 9 29 Escherichia cou i Lactose + 9702027 30 Escherichia cou i Lactose + 1301204 31 Escherichia cou i Lactose + 1301205 32 Escherichia cou i Lactose + 1301206 33 Escherichia cou i Lactose - 1006021 34 Escherichia cou i Lactose - 1109131 Escherichia cou i Lactose - 9304017 36 Escherichia cou i Lactose - 1307049 37 Escherichia cou i Lactose - 0007027 38 Escherichia cou i Lactose - 8211054 39 Escherichia cou i Lactose - 8306016 Escherichia cou i Lactose - 8312075 41 Escherichia cou i Lactose - 8402177 42 Escherichia cou i Lactose - 8406013 43 Escherichia cou i Lactose - 8408062 44 Escherichia cou i Lactose - 8410015 Escherichia cou i Lactose - 8410016 46 Escherichia cou i Lactose - 8410045 47 Escherichia cou i Lactose - 8410048 48 Escherichia cou i Lactose - 8410062 Tableau 1 2. Culture des bactéries et préparation de l'échantillon : 5 La préparation des échantillons est faite de manière à étudier l'exométabolome bactérien et donc le profil métabolique des bactéries décrites ci-dessus. Ainsi, les étapes de préparation des échantillons sont les suivantes : - Préculture des bactéries sur gélose Columbia (Ref bioMérieux 43041) supplémentée à 5% en sang de mouton. Cette étape est réalisée à deux 10 reprises par repiquage de colonies ; 3037402 10 - Ensemencement d'un milieu Mueller-Hilton liquide (Muller Hinton II Broth Cation Adjusted, Ref. Becton Dickinson 212322) à partir d'une ou plusieurs colonies obtenues à partir des précultures sur gélose Columbia, de manière à obtenir une concentration bactérienne finale des suspensions correspondant 5 à une turbidité de 2 unités McFarland ; - Incubation des suspensions à 37°C pendant 1h30; - Centrifugation des suspensions bactériennes pendant 10 min à 4000g; 10 - Collecte des surnageants dans des tubes Eppendorf et stockage à -80°C. Les 48 souches bactériennes préparées sont analysées en triplicata. Par ailleurs, un échantillon de milieu de culture Mueller Hinton sans inoculation bactérienne est 15 également analysé en triplicata, après un temps d'incubation identique au temps d'incubation des suspensions bactériennes. Ce qui fait un total de 147 surnageants à analyser en spectrométrie RMN. 20 3. Analyse RMN : a. Préparation des échantillons pour la RMN : Un tampon est utilisé pour réduire la dispersion de déplacement chimique des signaux RMN qui peuvent se produire du fait des variations de pH ou de force ionique entre les échantillons. 25 La préparation optimisée est la suivante : 60pt d'un mélange contenant 1,25M de tampon phosphate KH2PO4 (pH 7,4) dans le D20 avec 2mM de NaN3 et 0,1% de trimethylsilyl propionate (TMSP) est ajouté à 540 [iL de surnageant. 30 Le mélange est agité vigoureusement et 550 !IL du mélange est transféré dans un tube RMN 5mm. Chaque tube est placé dans un rack 96 tubes. 3037402 11 L'ensemble des étapes de pipetage, de mélange et de transfert sont réalisées à l'aide d'une plateforme automatisée de gestion de liquide Freedom EVO 75, commercialisée par TECAN. 5 Les racks sont stockés à +4°C jusqu'aux mesures en RMN. b. Mesures RMN : Toutes les mesures sont réalisées sur un spectromètre Bruker AVANCE III fonctionnant à une fréquence de résonance protonique de 600,55 MHz, couplé à une 10 cryosonde TCI CryoProbeTM 5 millimètres (mm) et un système de gestion des échantillons haut débit SampleJet, qui permet de maintenir la température des échantillons à +4°C jusqu'à mesure RMN proprement dite. La température est alors régulée à 300 Kelvins (K) tout au long des mesures 15 RMN. Une séquence d'impulsions standard de RMN 1D 1F1 du proton, la séquence NOESY (nuclear Overhauser spectroscopy) avec gradients-z, a été appliquée sur chaque échantillon afin de recueillir le profil métabolique correspondant. 128 acquisitions du signal de précession libre (FID : Free Induction Decays) ont été collectées pour chaque expérience sur une largeur spectrale de 20 ppm. Un délai de 20 récupération de 4 secondes (s), un temps de mélange NOESY de 10 millisecondes (ms), ainsi qu'un gain du récepteur de 40,3 ont été utilisés. La durée de l'impulsion 90°, proche d'une valeur de 14,5 microsecondes (ps) a été calibrée automatiquement sur chaque échantillon. Une série d'expériences de RMN bidimensionnelle (1F1-13C HSQC, 1H-1H TOCSY et 1F1 J-Résolue) a été enregistrée pour un sous-ensemble d'échantillons 25 afin de permettre l'annotation des signaux des différents métabolites. c. Analyse des données de spectres RMN 1F1 Une fonction d' apodisation exponentielle, correspondant à un élargissement des raies de 0,3 Hz a été utilisée pour le traitement des signaux de précession libre, 30 avant transformation de Fourier. Une correction de phase manuelle a été appliquée sur les spectres RMN 1F1 obtenus, qui ont été référencés par rapport au signal du TMSP 3037402 12 calibré à = - 0,016 ppm à pH 7,4, sous Topspin 3,1 (Bruker GmbH, Rheinstetten, Allemagne). Les spectres ont été réduits pour intégration en segments de largeur constante 5 (0,01 ppm) sur la gamme de déplacement chimique [0,30; lOppm]. La région [4,50; 5,01 pm] correspondant au signal résiduel de l'eau a été exclue de l'analyse. Cette réduction des données a été réalisée sous le logiciel AMIX (Bruker), sans normalisation. 10 Les données sont ensuite exportées dans SIMCA-P 13 (Umetrics, Umea, Suède), pour analyse statistique. L'analyse par OPLS-DA est effectuée avec une répartition selon la méthode Pareto. 4. Analyse des résultats : discrimination Escherichia cou i I Shigella 15 16 souches différentes ont été analysées par type bactérien (Escherichia cou i Lactose +, Escherichia cou i Lactose -, Shigella). Les variations entre les souches d'un même type pouvant être importantes, une analyse multivariée supervisée par OPLS-DA a été mise en oeuvre afin de ne se focaliser que sur les différences primaires. 20 - Discrimination Escherichia cou i Lactose + / Shigella : Comme explicité supra, la qualité du modèle OPLS-DA choisi pour l'analyse des données de RMN est évaluée et validée à l'aide des paramètres R2, Q2, mais également la valeur p du test CV-ANOVA. Les valeurs correspondantes ainsi que le nombre de composantes prises en compte pour l'évaluation de la qualité du modèle 25 OPLS-SA choisi, sont regroupés dans le tableau 2 ci-dessous : Nombre de composantes dans R2 Q2 Valeur p du le modèle test CV- ANOVA 1 composant prédictive 0.904 0.906 1.23 e-33 + 6 composantes orthogonales Tableau 2 3037402 13 Comme on peut le voir sur la figure 1A, l'analyse par modèle OPLS-DA permet d'obtenir une bonne séparation entre les souches d'Escherichia cou Lactose + et les souches de Shigella. 5 Lorsqu'on se reporte à la figure 1B, l'analyse « loading plot » nous permet de mettre en évidence les métabolites présents dans les surnageants de culture, et donc faisant partie de l'exométabolome bactérien, qui permettent la discrimination entre les types bactériens, car présents en quantité bien supérieure dans un type bactérien par rapport à l'autre. 10 L'analyse de variables (pics repérés par le déplacement chimique proton en ppm) correspondant aux métabolites discriminants pour la différenciation Escherichia cou Lactose + / Shigella est reprise dans le tableau 3 ci-dessous : Déplacement chimique (ppm) Métabolites Dominant chez 1,9 Acetate Escherichia cou i Lac+ 1,46 Alanine Escherichia coli Lac+ 2.66; 2.67; 2.69; 2.78; 2.81; 3.88; 3.89; 3.90 Aspartate Shigella sp. 1,17 Ethanol Escherichia coli Lac+ 3.81; 3.82; 3.87; 3.92; 3.93; 3.94; 3.95; 3.96 Lactose Shigella sp. 1.41; 1.42; 1.49; 1.50; 1.51; 1.86; 1.87; 1.88; 1.89; 1.91; 3.03; Lysine Shigella sp. 3.73; 3.74; 3.75 1.44; 1.45; 1.68; 1.69; 1.70; 1.71; 2.99; 3.00; 3.01; 3.02 Na-Acetyllysine Escherichia coli Lac+ 1.04; 1.05; 2.16; 2.17 Propionate Escherichia coli Lac+ 2.38; 2.39 Succinate Escherichia coli Lac+ 1.31; 1.32; 3.57; 3.58; 4.23; 4.24 Threonine Shigella sp. 0.98; 1.03 Valine Escherichia coli Lac+ 15 Tableau 3 Cette analyse montre que 11 métabolites sont discriminants dans la différenciation Escherichia cou Lactose + / Shigella. Ces métabolites sont : l'acétate, l'alanine, 20 l'aspartate, l'éthanol, le lactose, la lysine, la Na-acétyllysine, le propionate, le succinate, la thréonine et la valine. 3037402 14 Discrimination Escherichia cou i Lactose - / Shigella : Comme explicité supra, les valeurs des paramètres R2, Q2, mais également la valeur p du test CV-ANOVA, ainsi que le nombre de composantes prises en compte pour l'évaluation de la qualité du modèle OPLS-SA choisi pour la discrimination 5 Escherichia cou i Lactose - / Shigella , sont regroupés dans le tableau 4 ci-dessous : Nombre de composantes dans R2 Q2 Valeur p du le modèle test CV- ANOVA 1 composant prédictive 0.927 0.838 2.7 e-23 + 7 composantes orthogonales Tableau 4 10 Comme on peut le voir sur la figure 2A, l'analyse par modèle OPLS-DA permet d'obtenir une bonne séparation entre les souches d'Escherichia cou i Lactose - et les souches de Shigella. Lorsqu'on se reporte à la figure 2B, l'analyse « loading plot » nous permet de 15 mettre en évidence les métabolites présents dans les surnageants de culture, et donc faisant partie de l'exométabolome bactérien, qui permettent la discrimination entre les types bactériens, car présents en quantité bien supérieure dans un type par rapport à l'autre. 20 L'analyse de variables (pics repérés par le déplacement chimique proton en ppm) correspondant aux métabolites discriminants pour la différenciation Escherichia coui Lactose - / Shigella est reprise dans le tableau 5 ci-dessous : 3037402 15 Déplacement Métabolites Dominant chez chimique (ppm) 1,9 Acetate Escherichia coui 2.66; 2.67; 2.69; 2.78; 2.81; 3.88; 3.89; 3.90 Aspartate Shigella sp. 1.41; 1.42; 1.49; 1.50; 1.51; 1.52; 1.86; 1.87; 1.88; 1.89; 1.91; Lysine Shigella sp. 1.92; 3.03; 3.73; 3.74; 3.75 1.44; 1.45; 1.68; 1.69; 1.70; 2.99; 3.00; 3.02 Na-Acetyllysine Escherichia coui 1.04; 1.05; 2.15; 2.16; 2.17; 2.18 Propionate Escherichia coui 3.82; 3.83; 3.84; 3.91; 3.92; 3.94; 3.95; 3.96; 3.97; 3.99 Serine Shigella sp. 2.38; 2.39 Succinate Escherichia coui 1.30; 1.31; 1.32; 3.57; 3.58; 4.23; 4.24; 4.25 Threonine Shigella sp. Tableau 5 5 Cette analyse montre que 8 métabolites sont discriminants dans la différenciation Escherichia cou Lactose - / Shigella. Ces métabolites sont : l'acétate, l'aspartate, la lysine, la Na-acétyllysine, le propionate, la sérine, le succinate et la thréonine. Cet exemple permet donc de montrer qu'en analysant par spectrométrie RMN du 10 proton, l'exométabolome bactérien, et en particulier en mesurant la quantité d'un nombre réduit de métabolites issus de cet exométabolome, il est possible de différencier aisément Escherichia cou de Shigella Le procédé selon l'invention apporte donc un réel intérêt clinique, en diminuant 15 sensiblement le temps nécessaire habituellement pour réaliser une telle différenciation et ainsi permettre la mise en place d'un traitement antibiotique, lorsqu'il se justifie. 3037402 16 Références bibliographiques [1] Escherichia S. Delpassand et al., Journal of Clinical Microbiology, May 1995, p. 1258-1262 5 [2] R. Boume et al., Journal of Clinical Microbiology, August 2001, p. 2916-2923 [3] Di Martino, M.L., et al., Molecular evolution of the nicotinic acid requirement within the Shigella/EIEC pathotype. International Journal of Medical Microbiology, 2013.303(8): p. 651-661. [4] Johan Tryg and Svante Wold, Journal of Chemometrics, Volume 16, Issue 3, pages 10 119-128, March 2002 REVENDICATIONS1. Procédé de différenciation par spectrométrie RMN du proton entre une bactérie Escherichia cou i et une bactérie Shigella, ledit procédé comportant les étapes consistant à: a) Obtenir au moins un surnageant d'au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia cou i ou Shigella ; b) Préparer au moins un échantillon adapté à une analyse en spectrométrie RMN du proton, par mélange d'au moins une fraction du au moins un surnageant avec un tampon deutéré ; c) Obtenir au moins un spectre RMN du au moins un échantillon, d) Analyser les pics dudit au moins un spectre correspondant aux métabolites suivant : acétate, alanine, aspartate, éthanol, lactose, lysine, Na-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine et valine ; e) Déterminer s'il s'agit d'une bactérie Escherichia cou i ou Shigella. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, si la bactérie Escherichia cou i ne métabolise pas le lactose, les pics analysés à l'étape d), sont ceux correspondant aux métabolites suivant : acétate, aspartate, lysine, Na-acétyllysine, propionate, sérine, succinate, thréonine. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape a), comporte les sous-étapes suivante : al) Préparer au moins une suspension de bactéries susceptibles d'être Escherichia cou i ou Shigella à partir d'une ou plusieurs colonies de la même bactérie, de façon à obtenir un concentration bactérienne suffisante ; a2) Incuber la au moins une suspension de bactéries à une température et pendant une durée suffisantes pour obtenir des bactéries en phase exponentielle de croissance. 3037402 18 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le temps d'incubation de la au moins une suspension de bactéries est compris entre 1 et 2 heures, préférentiellement une heure et demie. 5 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel la température d'incubation est de 37°C. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la fréquence de résonnance utilisée est supérieure ou égale à 600 MHz. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la fréquence de résonnance utilisée est égale à 600,55 MHz 10 15