Brevet FR3046847A1 — publié le 20170721

La présente invention concerne le domaine des procédés de détection de la réponse humorale chez un sujet, en réponse à un agent infectieux. L'invention est destinée à des sujets immunodéprimés. En réponse à une substance étrangère, en particulier à un agent infectieux (bactéries, virus, champignons et parasites), l'organisme d'un sujet déclenche une réponse immunitaire. La réponse humorale correspond à la production d'immunoglobulines (anticorps). Ces immunoglobulines se diffusent dans le sang, les tissus ou les muqueuses du sujet et vont permettre à l'organisme de se défendre contre l'agent infectieux. Une telle défense peut se matérialiser par une capacité à neutraliser ou à empêcher la reproduction de l'agent infectieux ou une nouvelle infection par l'agent infectieux Actuellement, une fraction non négligeable de la population est en situation d'immunodépression. Cette immunodépression est la conséquence de diverses situations cliniques regroupant notamment les déficits immunitaires congénitaux, les déficits dus au vieillissement du système immunitaire (immunosénescence) que l'on observe à partir d'un 15 âge supérieur à 65 ans, les déficits reliés à diverses pathologies (diabète, réaction inflammatoire chronique, néoplasie, hémopathie, hépatopathie chronique, infection par VIH, insuffisance rénale chronique'. ), les déficits immunitaires induits par certains traitements médicaux (corticothérapie, interféron, traitement immunosuppresseur accompagnant les acceptations de greffon ...) ou actes chirurgicaux (splénectomie). 20 Le patient immunodéprimé présente une plus grande susceptibilité aux agents infectieux viraux, bactériens et/ou fongiques, et de ce fait nécessite une prise en charge médicale adaptée tant pour les approches et les outils diagnostiques que pour les traitements prophylactiques ou thérapeutiques. Chaque situation d'immunodépression est complexe et se caractérise par un profil immunologique spécifique. 25 Les tests de diagnostic in vitro (IVD) sont un des outils utilisés pour la détection des immunoglobulines (anticorps) spécifiques d'un agent infectieux et pour déterminer la réponse humorale d'un sujet vis-à-vis dudit agent infectieux. Un test IVD rend un résultat de détection négative (absence de réponse humorale correspondant à un résultat considéré comme une absence d'anticorps) ou positive (présence de réponse humorale correspondant 30 à un résultat considéré comme la présence d'anticorps), séparant les résultats négatifs (spécificité du test) et positifs (sensibilité du test) par un seuil de positivité ou signal de référence. En amont d'une immunosuppression programmée (greffe, splénectomie, par exemple), il est possible d'assurer la protection du patient par certaines vaccinations anti-infectieuses. 3046847 2 La qualité de la protection vaccinale est assurée par la présence d'immunoglobulines spécifiques pouvant être évaluée par le résultat du test IVD correspondant. Cependant, il est connu que l'immunosuppression peut être responsable de la régression, voire de la disparition, de la protection immunitaire vaccinale (Haut Conseil de la 5 Santé Publique , Vaccination des personnes immunodéprimées ou aspléniques ; Recommandations ; Rapport 2012). Un suivi de la régression peut être effectué par les résultats successifs de tests IVD. Dans ce suivi spécifique, le test IVD peut être pris en défaut lorsque la situation du patient évolue, faisant sortir ses résultats des valeurs usuellement reconnues pour la population normale. En effet, un test IVD annonce des performances de sensibilité et spécificité validées sur des cohortes d'échantillons, jugés représentatifs de la population normale. Les sérums, ou plus généralement les échantillons, de patients immunodéprimés répondent différemment dans les tests de diagnostic ciblant un agent infectieux. En effet, l'immunosuppression peut être responsable d'une diminution plus ou moins accentuée du taux d'immunoglobulines et ce déficit en immunoglobulines peut être à l'origine d'un défaut de réponse dans le test. La population immunodéprimée n'est pas représentative de la population normale et le seuil de positivité du test, déterminé avec des échantillons de population normale, n'est plus pertinent. Le développement de tests spécifiques pour la population immunodéprimée est difficile car l'immunosuppression est statistiquement non normale, correspond à une situation individuelle, d'intensité quantitativement et qualitativement variable, et, de surcroit transitoire si elle est induite par un traitement immunosuppresseur ponctuel ou une pathologie non chronique. Cependant, les patients immunodéprimés, plus sensibles à l'infection, ont besoin de tests de diagnostic spécifiques dans lesquels le seuil de positivité est également représentatif, malgré la spécificité de la situation. Le problème technique que se propose de résoudre l'invention est de permettre à l'homme du métier d'utiliser une trousse ou un dispositif de détection de la réponse humorale, initialement destiné à une population non immunodéprimée, sur une population immunodéprimée, sans changer les réactifs de détection de la trousse ou dispositif. Dans ce contexte, l'invention concerne un procédé de détermination chez un sujet immunodéprimé d'une réponse humorale due à la présence d'un agent infectieux cible, par détection dans un échantillon biologique El dudit sujet, d'au moins un anticorps cible susceptible d'être produit par ledit sujet, ou plus précisément par l'organisme dudit sujet, 3046847 3 lorsque ce dernier est infecté ou a été infecté par ledit agent infectieux cible, comprenant les étapes suivantes : a) disposer d'un volume Vi de l'échantillon El, b) diluer le volume Vi, avec un volume Dl de diluant, selon le rapport de dilution 5 Ri qui est égal à V1/(Vi+D1), le rapport de dilution Ri étant supérieur au rapport de dilution R2 utilisé dans le cas d'un sujet non immunodéprimé, R2 étant égal à V2/(V2+D2) avec V2 et D2 qui sont respectivement le volume d'échantillon E2 et le volume de diluant utilisés dans le cas d'un sujet non immunodéprimé, de manière à obtenir un échantillon dilué, 10 c) réaliser la détection dudit au moins anticorps cible sur l'échantillon dilué obtenu, de manière à conclure quant à la présence éventuelle de la réponse humorale. L'invention propose d'utiliser une même trousse ou un même dispositif de détection in vitro d'anticorps, validé pour un usage sur une population normale, pour rendre un résultat fiable également chez des patients en situation d'immunodépression. 15 La description détaillée qui va suivre va permettre de mieux comprendre l'invention. Le procédé selon l'invention utilise une trousse ou dispositif adapté à la détection d'anticorps et donc à la détection d'une réponse humorale chez un sujet. Par « trousse », on entend un ensemble de réactifs nécessaires à la détection, devant être mis en oeuvre avec un instrument intégrant ou non des composantes électroniques. Par « dispositif », on entend 20 un ensemble intégrant à la fois les réactifs nécessaires à la détection et l'instrument pour leur mise en oeuvre. Dans le cadre de l'invention, la réponse humorale détectée est due à la présence actuelle ou passé de l'agent infectieux entraînant une telle réponse. Par « agent infectieux », on entend un agent biologique pathogène, responsable d'une infection ou infestation, et 25 donc les virus, les bactéries, les parasites et les champignons, en particulier, les champignons inférieurs (ou microscopiques). Les bactéries pourront être aérobies ou anaérobies. On peut citer, en particulier, les bactéries Clostridium difficile, Helicobacter pylori, Mycoplasme pneumoniae, Treponema pallidum (responsable de la Syphilis) et Borrelia burgdorferi sensu lato (responsable de la 30 maladie de Lyme). A titre d'exemple de virus, on peut citer le virus responsable de la rubéole, le cytomegalovirus (CMV), les virus de l'herpès (HHV-1 à HHV-8), le virus responsable de la rougeole, le virus responsable des oreillons, le virus responsable de la varicelle, les virus hépatiques : HBV, HCV, HAV et HEV, le virus HIV, le virus Epstein-Barr EBV (de la 3046847 4 mononucléose), le virus du Nil occidental,le virus de la dengue et les papillomavirus et en particulier HPV-16 et HPV-18. Les champignons peuvent être unicellulaires (levures) ou pluricellulaires (champignons filamenteux ou moisissures). A titre d'exemple de champignons, on peut citer les Candida et 5 en particulier Candida albicans, les Cryptococcus et en particulier Cryptococcus neoformans, et les Aspergillus et en particulier A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. clavatus. Les parasites, organismes de taille variable qui vivent aux dépens d'un autre organisme, peuvent être des ectoparasites ou des endoparasites, plus précisément, des arthropodes ou des helminthes tels que les oxyures, le Ténia, les Ascaris qui engendrent les 10 ascaridioses, le Schistosome qui engendre la bilharziose, la Douve du foie et les protozoaires. A titre d'exemples plus particuliers de parasites, on peut citer les parasites Toxoplasma gondii (parasite responsable de la toxoplasmose) et Trypanosomia cruzi (parasite responsable de la maladie de Chagas). Dans le cadre de l'invention, la détection d'anticorps est réalisée in vitro. Les anticorps 15 détectés peuvent être des immunoglobulines IgM et/ou IgG et/ou IgE et/ou IgA. Le procédé selon l'invention concerne la détection d'anticorps chez des sujets immunodéprimés. Par « sujet», on entend un sujet animal ou humain. Par « sujet immunodéprimé », on entend un sujet qui présente un déficit immunitaire, par rapport à un patient dit normal. Un sujet immunodéprimé appartient, en général, à l'une ou l'autre des 20 catégories suivantes : sujets présentant un déficit immunitaire congénital. Il peut s'agir : - d'un déficit dit pur, correspondant notamment à un déficit primitif en CD4 ou CD8, un déficit en IL-2 ou un déficit en transduction du signal, - d'un déficit dit combiné, correspondant notamment à une mutation de la 25 chaîne gamma du récepteur de l'IL-2, à un déficit d'expression des molécules CMH-II, à une ataxie-télangiectasie (syndrome de Louis-Bar), à un déficit en enzymes RAG ou en protéine Artemis nécessaire(s) à la recombinaison Va3, - d'un déficit sélectif en IgA ou IgG2, - d'un syndrome hyper IgM, 30 - d'une hypo- ou agammaglobulinémie liée au sexe ou maladie de Bruton, - d'une hypogammaglobulinémie commune d'expression variable, - d'un déficit sélectif en immunoglobulines, - d'une microdélétion 22q11 ou du syndrome de Di George, - du syndrome de Hong et Good, - du syndrome de Nezelof, 3046847 5 - d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, - d'un déficit isolé en Lymphocytes T, - d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase, - d'un syndrome des lymphocytes dénudés, 5 - d'une amégacaryocytose congénitale avec anomalie du développement des lignées T et B, - du syndrome de Wiskott-Aldrich, sujets présentant un déficit immunitaire commun variable. Il peut s'agir notamment : - d'une neutropénie cyclique, 10 - du syndrome de Shwachman-Diamond, - du syndrome myélo-dysplasique, - d'un déficit chimiotactisme, tel que la maladie de Chediak-Higashi ou le syndrome d'hyperlgE (Buckley), - d'un déficit de phagocytose, 15 - d'un déficit bactéricide, tels qu'une granulomatose septique chronique ou un déficit myélopéroxydase, - déficit de l'axe interféron gamma/interleukine 12, sujets présentant une immunosénescence : concerne les hommes et femmes de plus de 65 ans (déclin naturel de la réactivité immunitaire), ou connaissant un stress 20 oxydatif. sujets présentant un stress traumatique, sujets présentant un ou des désordres métaboliques affectant le système immunitaire. Parmi, de tels désordres, on peut citer : - la malnutrition protéino-calorique, 25 - le déficit en oligo-éléments et vitamines, - l'insuffisance rénale chronique, syndrome néphrotique, - les diabètes, - l'inflammation chronique telle que les désordres intestinaux, articulaires, ou la polyarthrite, 30 - la sarcoïdose, maladie non maligne du système lymphoïde (déficit cellulaire), - les hémopathies malignes telles que la leucémie aiguë, la leucémie lymphoïde chronique, le lymphome malin, le myélome multiple et la maladie de Waidenstrôm, - les anomalies thymiques telles que le thymome (tumeur bénigne du thymus) 35 et l'hypoplasie thymique, 3046847 6 - le déficit de l'activité du macrophage et du polynucléaire, tels que le granulomatose septique, le déficit en myéloperoxydase, le syndrome de Chediak Higashi, le dysfonctionnement de ractine et le syndrome de Shwachman, 5 - le déficit en protéines du complément, - les néoplasies (cancers), - la séropositivité HIV (SIDA), sujets ayant subi ou étant sous traitement allopathique inducteur d'un déficit immunitaire, tel qu'une corticothérapie, un traitement inhibiteur du TNF alpha (dit 10 anti-TNF alpha), un traitement inhibiteur de l'un des interférons, une chimiothérapie, une radiothérapie, un traitement immunosuppresseur préparatoire à une allogreffe, un traitement immunomodulateur post-greffe ou un traitement immunosuppresseur des maladies autoimmunes, et sujets ayant subi une splénectomie chirurgicale. 15 Les déficits immunitaires congénitaux sont rares, hétérogènes, précoces et graves. Leur prévalence est de 1 / 50 000. Les seuls traitements sont l'allogreffe et la thérapie génique. De tels sujets sont, par exemple, les enfants diagnostiqués avec un déficit immunitaire congénital ou « l'enfant bulle » ayant besoin d'une greffe de moelle osseuse compatible, susceptible de restaurer une compétence immunologique. 20 Les déficits immunitaires communs variables sont les plus fréquents des DIP (déficits immunitaires primitifs correspondant à un ensemble de plus de 200 maladies dues au dysfonctionnement de certaines composantes du système immunitaire de l'adulte. Leur prévalence est variable en fonction des ethnies et est de 1/ 20 000 en France). En 2014, 8,3% de la population mondiale avait 65 ans ou plus. Ce pourcentage qui va 25 augmenter dans les années à venir, va faire augmenter les cas d'immunosénescence. La détermination de la réponse humorale, et donc la détection d'anticorps, est de haute importance dans le cas de patients immunodéprimés. La détection d'anticorps est classiquement réalisée sur un échantillon biologique issu d'un sujet d'intérêt, après dilution dudit échantillon. L'apport du procédé selon l'invention est de mettre à disposition de 30 l'utilisateur pour une trousse ou un dispositif de détection d'anticorps dirigés contre un agent infectieux, au moins deux rapports de dilution pour obtenir un échantillon dit dilué soumis à la détection : l'un correspondant à une population dite non immunodéprimée, l'autre correspondant à une population dite immunodéprimée. En fonction des informations connues sur le sujet dont est issu l'échantillon biologique, le rapport de dilution adapté au caractère 35 immunodéprimé ou non du sujet, sera sélectionné et utilisé. Lorsque l'échantillon provient 3046847 7 d'un sujet immunodéprimé, le rapport de dilution correspondant à une population dite immunodéprimée sera utilisé. Le procédé de détermination chez un sujet immunodéprimé d'une réponse humorale due à la présence d'un agent infectieux cible selon l'invention comprend donc les 5 caractéristiques suivantes : disposer d'une trousse ou d'un dispositif de détection d'anticorps dirigés contre ledit agent infectieux, capable donc de déterminer la réponse humorale due à la présence dudit agent infectieux cible chez un sujet, disposer d'un diluant pour diluer les échantillons à tester, ledit diluant pouvant faire o partie de la trousse ou du dispositif de détection, disposer d'un rapport de dilution R2 qui est égal à V2/(V2+D2) adapté à une population de sujets non immunodéprimés, disposer d'un rapport de dilution Ri qui est égal à V1/(Vi+D1) adapté à une population de sujets immunodéprimés, avec Ri > R2 15 - choisir le rapport de dilution Ri, compte tenu du caractère immunodéprimé du sujet dont est issu l'échantillon à analyser. L'invention a également pour objet un procédé de détermination d'une réponse humorale due à la présence d'un agent infectieux cible à partir d'un échantillon biologique d'un sujet immunodéprimé ou non immunodéprimé, dans lequel le rapport de dilution de 20 l'échantillon est choisi en fonction du caractère immunodéprimé ou non du sujet concerné. Plus précisément, l'invention concerne également un procédé de détermination d'une réponse humorale due à la présence d'un agent infectieux cible chez un sujet immunodéprimé ou non immunodéprimé, par détection dans un échantillon biologique dudit sujet, d'au moins un anticorps cible susceptible d'être produit par ledit sujet lorsque ce 25 dernier est infecté ou a été infecté par ledit agent infectieux cible, caractérisé en ce qu'il présente les caractéristiques suivantes : disposer d'une trousse ou dispositif de détection d'anticorps dirigés contre un agent infectieux, capable donc de déterminer la réponse humorale due à la présence dudit agent infectieux cible chez un sujet, 30 disposer d'un diluant pour diluer les échantillons à tester, ledit diluant pouvant faire partie de la trousse ou du dispositif de détection, - disposer d'un rapport de dilution R2 qui est égal à V2/(V2+D2) adapté à une population de sujets non immunodéprimés, disposer d'un rapport de dilution Ri qui est égal à Vi/(V1+131) adapté à une 35 population de sujets immunodéprimés, avec Ri > R2, 3046847 8 choisir le rapport de dilution utilisé en fonction du caractère immunodéprimé ou non du sujet dont est issu l'échantillon à analyser : Ri est utilisé si le sujet est immunodéprimé et R2 est utilisé si le sujet est non immunodéprimé. Dans le cadre de l'invention, il est proposé d'adapter le rapport de dilution utilisé dans 5 le cas d'un échantillon issu d'un sujet immunodéprimé, de manière à ce que celui-ci diffère de celui utilisé dans le cas d'un échantillon issu d'un sujet non immunodéprimé. Selon l'invention, un volume V1 d'un échantillon El à tester issu d'un sujet immunodéprimé est dilué avec un volume Di de diluant, selon un rapport de dilution Ri qui est égal à Vi/(V1+Di), le rapport de dilution Ri étant supérieur au rapport de dilution R2 utilisé dans 10 le cas d'un sujet non immunodéprimé. R2 est égal à V2/(V2+D2) avec V2 et D2 qui sont respectivement le volume d'échantillon E2 et le volume de diluant utilisé dans le cas d'un sujet non immunodéprimé. Par contre, le diluant utilisé est le même que l'on soit dans le cas d'un échantillon El à tester issu d'un sujet immunodéprimé ou d'un échantillon E2 issu d'un sujet non immunodéprimé. Un échantillon dilué est ainsi obtenu et c'est sur ce dernier que la 15 détection d'au moins un anticorps cible va être mise en oeuvre, de manière à pouvoir conclure à la présence ou non de la réponse humorale recherchée chez ledit sujet. La détection peut être réalisée sur la totalité de l'échantillon dilué obtenu ou sur une partie seulement de celui-ci. Le sujet duquel est issu l'échantillon est un sujet humain ou animal. Bien entendu, le 20 sujet immunodéprimé dont est issu l'échantillon El et le sujet non immunodéprimé dont est issu l'échantillon E2 appartiendront à la même espèce : en particulier, on utilisera pour une trousse ou un dispositif destiné à un sujet humain, un échantillon humain, et pour une trousse ou un dispositif destiné à un animal, un échantillon d'animal de la même espèce. De manière avantageuse, dans le cadre de l'invention le rapport de dilution Ri dans le 25 cas d'un échantillon El à tester issu d'un sujet immunodéprimé est défini comme suit : 1,5R2 S2, choisir le signal de référence Si utilisé pour apporter une conclusion à l'étape c), du 20 fait du caractère immunodéprimé du sujet dont est issu l'échantillon testé. Dans le cas du procédé de détermination d'une réponse humorale due à la présence d'un agent infectieux cible chez un sujet immunodéprimé ou non, selon l'invention, ce dernier comprendra, selon un mode de réalisation particulier, les caractéristiques suivantes : disposer d'un signal de référence S2 adapté à une population de sujets non 25 immunodéprimés, disposer d'un signal de référence Si adapté à une population de sujets immunodéprimés, avec Si > S2, choisir le signal de référence utilisé pour apporter une conclusion à l'étape c) en fonction du caractère immunodéprimé ou non du sujet dont est issu l'échantillon 30 testé : Si. est utilisé si le sujet est immunodéprimé et S2 est utilisé si le sujet est non immunodéprimé. Le signal de référence S2 sera alors déterminé à partir de résultats obtenus sur une population de sujets non immunodéprimés, alors que le signal de référence Si sera déterminé à partir de résultats obtenus sur une population de sujets immunodéprimés. 3046847 18 Dans la cadre de l'invention, il est donc possible d'utiliser une même trousse ou un même dispositif, en particulier adapté à un procédé automatisé, pour effectuer un diagnostic de la réponse humorale sur population normale et sur population immunodéprimée. Dans ce contexte de double utilisation, le rapport de dilution, voire le signal de référence (seuil de 5 positivité), est(sont) adapté(s), en fonction de l'origine de l'échantillon testé : sujet immunodéprimé ou non immunodéprimé (normal). Selon l'invention, la détection dudit au moins anticorps cible est réalisée en utilisant une trousse ou un dispositif de diagnostic adapté ou initialement destiné à la détection dudit au moins anticorps cible dans un échantillon biologique provenant d'une population de sujets 10 non immunodéprimés. Il n'est pas nécessaire de procéder à une quelconque adaptation de la trousse ou du dispositif pour pouvoir réaliser la détection dudit au moins anticorps cible dans un échantillon provenant d'un sujet immunodéprimé, hormis celle(s) prévue(s) dans le cadre de l'invention, à savoir une augmentation du rapport de dilution, accompagné éventuellement d'une augmentation du signal de référence définissant le seuil de positivité et 15 donc la présence d'une réponse humorale. La détection réalisée à l'étape c) utilise la même trousse ou le même dispositif, et en particulier les mêmes réactifs que ceux utilisés dans le cas d'une détection réalisée à partir d'un échantillon provenant d'un sujet dit normal ou non immunodéprimé, De manière avantageuse, dans le cadre de l'invention, la détection dudit au moins 20 anticorps est réalisée à l'étape c) dans les mêmes conditions que dans le cas d'une détection réalisée à partir d'un échantillon biologique E2 d'un sujet non immunodéprimé. Il est néanmoins possible de faire varier certaines conditions, en fonction de l'échantillon (issu d'un sujet immunodéprimé ou non immunodéprimé), notamment la durée entre le début de la dilution de l'étape b) et l'obtention de la conclusion de l'étape c) et notamment la durée 25 d'incubation, ou la température utilisée à l'étape c), et notamment pendant l'incubation. Dans le cadre de l'invention, la détection et la génération du signal lors de la détection de l'étape c) seront, de préférence, réalisées dans les mêmes conditions que celles utilisées dans le cas d'une détection dudit au moins anticorps cible dans un échantillon provenant d'un sujet non immunodéprimé. De manière avantageuse, seul le rapport de dilution, et 30 éventuellement le signal de référence, est(sont) modifié(s) comme décrit dans le cadre de l'invention, entre une détermination d'une réponse humorale à partir d'un échantillon issu d'un sujet immunodéprimé et une détermination d'une réponse humorale à partir d'un échantillon issu d'un sujet non immunodéprimé. Les conditions de détection mises en oeuvre à l'étape c) seront classiques pour 35 l'homme du métier. En particulier, un volume de l'échantillon dilué de 5 pL à 1 mL, de 3046847 19 préférence 10 à 500 pL, et préférentiellement de 20 à 250 pL, pourra être utilisé. La température utilisée pour l'incubation pourra être classiquement dans la gamme allant de 15 à 40°C, de préférence 18 à 39°C et sera, préférentiellement, égale à 37°C. Le procédé de détermination de la réponse humorale d'un sujet à un agent infectieux, 5 également nommé agent pathogène, proposé dans le cadre de l'invention a notamment les applications suivantes : pour l'aide au diagnostic in vitro ou pour le diagnostic in vitro d'une infection par l'agent pathogène chez un sujet susceptible d'être infecté, pour le suivi thérapeutique d'un sujet infecté par l'agent pathogène, pour faire des études épidémiologiques de la séroprévalence des anticorps anti-agent pathogène dans une 10 population ou dans un territoire géographique donné, pour déterminer si un sujet a besoin d'être vacciné ou revacciné contre l'agent pathogène (les anticorps recherchés sont pour ce dernier cas, des IgG). De manière stricte, on appelle « infection » une maladie occasionnée par une bactérie, un virus ou un champignon et « infestation » une maladie occasionnée par un parasite. Mais dans le cadre de la présente description, par souci de simplification, le 15 terme infecté englobera le terme infesté puisque les parasites sont qualifiés d'agents infectieux. En particulier, le procédé selon l'invention pourra être utilisé pour l'aide au diagnostic in vitro ou pour le diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie, un virus, un champignon ou un parasite listé dans le cadre de l'invention, ou encore pour le suivi thérapeutique d'un sujet infecté par une bactérie, un virus, un champignon ou un parasite 20 listé dans le cadre de l'invention. Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté à la détection d'une réponse humorale, chez un patient immunodéprimé, du fait de la présence (actuelle ou future) d'un agent infectieux choisi parmi les parasites Toxoplasma gond," (parasite responsable de la toxoplasmose), Trypanosomia cruzi (parasite responsable de la maladie de Chagas), les bactéries Clostridium difficile, Helicobacter pylori, Mycoplasma 25 pneumoniae, Treponema pallidum (responsable de la Syphilis), Borrelia burgdorferi sensu lato (responsable de la maladie de Lyme), le virus responsable de la rubéole, le cytomegalovirus (CMV), les virus de l'herpès, le virus responsable de la rougeole, le virus responsable des oreillons, le virus responsable de la varicelle, les virus hépatiques : HBV, HCV, HAV et HEV, le virus HIV, le virus EBV (de la mononucléose), le virus du Nil occidental 30 et le virus de la dengue. L'exemple ci-après permet d'illustrer l'invention mais n'a nullement un caractère limitatif. 3046847 20 EXEMPLE Détection des IgG dirigées contre le virus zona-varicelle (VZV) chez les non immunodéprimés et les immunodéprimés. La varicelle est une maladie infectieuse très fréquente : 90 % des enfants contractant 5 l'infection avant l'âge de 12 ans. Elle est causée par un virus à ADN de la famille des Herpès viridae, le VZV (Virus Zona - Varicelle), qui se transmet uniquement entre humains. La varicelle représente la primo-infection par le virus VZV et cette infection est immunisante. Le zona est l'expression clinique de la réactivation du VZV. L'immunité acquise suite à la primo-infection ou suite à une vaccination persiste pendant de nombreuses années mais peut 10 baisser en cas d'immunodépression ou encore de manière liée à l'âge. Dans des populations à risque, il convient de rechercher les IgG anti-VZV afin de pouvoir évaluer leur statut immunitaire. De telles populations à risque sont : les personnels de soin, les femmes enceintes, les nouveau-nés, les immunodéprimés. 15 a) Préparation d'une protéine recombinante VGLE du virus zona-varicelle Le gène ORF68 codant pour la glycoprotéine gE du virus zona-varicelle (N° accession UniProtKB P09259), appelée aussi VGLE a été utilisé pour la construction. Le domaine extramembranaire (acides aminés 31-538 correspondant à la SEQ ID N°1) de la protéine native (623 acides aminés au total) a été fusionné à 6 histidines du côté N-Terminal pour permettre 20 une purification par chromatographie d'affinité métal-chélate. La séquence ainsi choisie a été obtenue sous forme de gène synthétique, cloné dans un vecteur d'expression, puis le plasmide introduit dans des bactéries E. coli. Après culture, les bactériens ont été récupérés, lysés et la protéine recombinante d'intérêt purifiée sur résine Ni-NTA (Qiagen). Après un cycle de lavage, la protéine est éluée en présence d'un gradient imidazole puis dialysée et 25 quantifiée. SEQ ID N°1 SVLRYDDFHT FLENAHEHHG QRQYGDVFKG DE DKLDTNS V VYNQGRGI ras DLNPKPQGQR LKHTTCFQDV I E PGVLKVLR FHMWNYHSHV NAPQCLSHMN TTLKFVDTPE KPKEITPVNP YEPYYHS DHA GE RLMQPTQM L I EVSVEENH VVDVDCAENT TEKQYLGVY FS VG DT ES LA SGCT FTS PHL SLSGLYVFVV GTS PLLRY ESSWVNRGES SAQED LG DDT PFTLRAPIQP KE DQLAE I S Y WNMRGS DGTS MHLQYKIHEA AQRVASTVYQ Y FNGHV LAVA S P.KAYDHNS P GI HVI FTLNG I YGVRYTETW REQGKKEADQ TYAT FLVTWK P FDLLLEWL Y NC EHADN YT A YTVVSTVDHF YIWPRNDYDG DDRHKIVNVD S FLPSLTCTG PW I VVI\TS TL GDEKT RN PT P VP I DPTCQPM YCLGI SHMEP VNAIEERGFP 30 DAAPAIQHIC FDELELDPPE AVTPQPRGAE RLYSTCLYHP S FGL I LH DGG 35 PTAGQPPATT 3046847 21 b) Mode opératoire de l'immunoessai VIDAS pour détecter les IgG anti-VZV Le cône à usage unique sert à la fois de phase solide pour la réaction et de système de pipetage. La cartouche est composée de 10 puits (X0 à X9) recouverts d'une feuille d'aluminium scellée et étiquetée. Le premier puits (X0) comporte une partie prédécoupée 5 pour faciliter l'introduction de l'échantillon. Le dernier puits (X9) est une cuvette optique dans laquelle la fluorescence du substrat est mesurée. Les différents réactifs nécessaires à l'analyse sont contenus dans les puits intermédiaires (X1 à X8). Toutes les étapes du test sont réalisées automatiquement par l'instrument. Elles sont constituées d'une succession de cycles d'aspiration/refoulement du milieu réactionnel. 10 Les cônes ont été sensibilisés avec 300pL d'une solution de la protéine recombinante VGLE décrite en a) et diluée à 3 pg/mL dans un tampon carbonate 77 mM, pH 9,2. Après environ 20h d'incubation à +18/25°C avec la solution de sensibilisation, les cônes sont vidés. Ensuite, 300 pL d'une solution tampon Tris 200 mM contenant 5 g/L de d'albumine sérique bovine (BSA) sont ajoutés. La passivation de la phase se poursuit à +18/25°C sur la nuit. Les 15 cônes sont vidés, séchés, puis conservés à +4°C jusqu'à utilisation, à l'abri de l'humidité. L'automate VIDAS® mélange 11,4 pL de l'échantillon de sérum ou de plasma à tester dans 400 pL de diluant échantillon contenant un tampon phosphate pH 7,4 contenant 154 mM de NaCI et 5 g/L de BSA. Dès que le cône VIDAS® est en contact avec l'échantillon, la première étape de la réaction immunologique commence. Cette étape permet la liaison 20 spécifique des IgG anti-VGLE présents ou non dans l'échantillon de sérum ou de plasma, à la protéine virale VGLE adsorbée sur le cône. Après 210 secondes d'incubation à 37°C, les composants non liés sont éliminés par lavage avec un tampon Tris 200 mM pH 7,8, NaCI 300 mM et Tween 20 0,05%. Lors de la seconde étape, le cône est incubé avec une solution de conjugué contenant environ 20 ng/mL d'une IgG de souris anti-IgG humain (bioMérieux), 25 couplé à la phosphatase alcaline, dans un tampon phosphate 10 mM, NaCI 154 mM, lait en poudre 5 g/L. Le puits X5 contient 400 pL de cette solution que le cône aspire/refoule pendant 4 minutes, toujours à 37°C. La seconde étape entraîne la formation d'un complexe entre les IgG anti-VGLE retenues sur la phase solide et le conjugué anti-IgG couplé à la phosphatase alcaline. Cette étape est suivie de 2 lavages successifs, afin d'éliminer les 30 composés non fixés. Lors de l'étape finale de révélation, le substrat 4-méthylombelliferyl phosphate est aspiré, puis refoulé dans le cône ; l'enzyme du conjugué catalyse la réaction d'hydrolyse de ce substrat en 4-méthylombelliferone dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm. La valeur du signal de fluorescence (RFV=relative fluorescence value) est proportionnelle à la 35 concentration des IgG anti VZV présents dans l'échantillon. 3046847 22 c) Résultats Dans les conditions d'utilisation de référence, le volume d'échantillon biologique utilisé est de 11,4 pL. Dans ces conditions, le signal de référence permettant de discriminer les échantillons positifs (présence d'une réponse humorale) des échantillons négatifs (absence 5 d'une réponse humorale) est de 70 RFV. Afin de gagner en sensibilité diagnostique et de mieux détecter les IgG anti-VZV chez les immunodéprimés, nous avons augmenté le volume d'échantillon de 11,4 pL à 38,3 pL, sans modifier le volume de diluant maintenu à 400 pL ce qui correspond à une augmentation d'un facteur 3,1 du rapport de dilution (volume échantillon)/(volume échantillon + volume 10 diluant). Pour des échantillons faiblement positifs collectés chez des sujets non immunodéprimés, cette augmentation du volume d'échantillon permet d'augmenter le signal obtenu de 215 RFV en moyenne (+93 à + 324 RFV) comme illustré dans le Tableau 1. De plus, l'augmentation du signal non spécifique n'est que de +21 RFV en moyenne (+4 à + 57 RFV). Comme le signal spécifique augmente bien plus que le signal non spécifique, la 15 modification du signal de référence a été envisagée. Tableau 1. Comparaison des signaux obtenus en augmentant le volume d'échantillon pour des sujets non immunodéprimés. Code échantillon Signal VIDAS (RFV) volume échantillon 11,4 pl 147 72 152 97 132 154 81 volume échantillon 38,3 385 205 476 280 371 425 263 Signal VIDAS (RFV) "bruit de fond" volume l volume échantillon échantillon 11,4 pi 38,3 pi 20 77 9 Î 23 15i 56 4 8 20 49 28 66 6 16 9 17 18 29 19 33 223 59 13 18 [ se48-H3 se48-H8 se48-1-128 se48-H32 se48-F5 se48-FIL se48-F16 se48-F18 se48-F31 se48-F32 se48-F36 se48-F40 177 497 133 367 155 425 117 253 100 281 20 Ainsi, 47 échantillons obtenus chez des sujets immunodéprimés (patients transplantés, immunodéprimés suite au traitement immunosuppresseur administré pour éviter le rejet du greffon) ont été dosés, afin de déterminer un nouveau signal de référence adaptée à volume d'échantillon de 38,3 pL et une population d'immunodéprimés : le nouveau signal de 3046847 23 référence a été fixé à 150 RFV. Ensuite, les deux couples volume d'échantillon/ signal de référence ont été comparés sur un nouveau panel d'échantillons de sujets immunodéprimés. Encore une fois, il s'agit d'un panel d'échantillons faiblement positifs ; la démonstration de la positivité de ces échantillons a été réalisée avec la technique microplaque Enzygnost anti- 5 VZV/IgG à incubation longue. Les résultats sont récapitulés dans le Tableau 2. Parmi ces 32 échantillons faiblement positifs, 6 ne sont pas détectés par le test VIDAS dans les conditions de référence (volume d'échantillon 11,4 pL). Il s'agit donc de faux-négatifs. Dans les conditions de dosage améliorées (volume d'échantillon 38,3 pL), le nombre de faux-négatifs n'est plus que de 4. Ce résultat correspond bien à une amélioration 10 de la sensibilité diagnostique de 81% à 87%. Il est, cependant, important de noter que cette estimation de sensibilité sous-estime la sensibilité réelle du test. En effet, le panel utilisé n'est pas un panel de diagnostic, il est enrichi en échantillons difficiles à détecter. En conclusion, l'augmentation du volume de prise d'essai et le choix d'un second signal de référence ont permis d'améliorer la sensibilité diagnostique d'un coffret de diagnostic 15 sérologique pour les populations immunodéprimées, sans changer ni les réactifs du coffret, ni leurs concentrations. 3046847 24 Tableau 2. Comparaison des immunoessais avec volume d'échantillon standard et volume d'échantillon augmenté chez des patients immunodéprimés. VIDAS volume d'échantillon -7- VIDAS volume d'échantillon 11,4111 30,3pl Code Signal RFV Interprétation Pos: RFV>70 Signal RFV Interprétation Pos : RFV>150 échanti on 121850 185 Pos 489 Pas 121G65 245 Pas 820 Pas 21852 218 Pas 524 Pas 121860 173 | Pos 491 Pos 121981 78 Pas 201 Pas 121979 137 Pas 373 Pas 121986 181 Pas 430 Pas 121990 181 Pas 515 Pas 121991 61 Neg 1 127 Neg 121993 L 231 ----- 714 Pos Pos - i---- 121994 132 Pas 297 Pas 122001 283 Pos 871 Pos 122011 80 Pas 205 Pas 122015 185 Pas 444 Pas ; 121606 132 Pas 378 Pas 27333 62 Neg 211 i Pas 1 121642 65 Neg 105 1 Neg 122021 34 Neg 51 Neg 122022 59 Neg 170 Pas 122025 5 Pos 456 Pas 122033 127 Pas 294 Pos 122038 28 Neg 109 Neg 127107 147 Pas 375 Pos 127091 123 Pos 308 Pos 121666 255 Pos 854 Pas 43290 169 Pas 330 Pas 43255 252 Pos 649 Pas [143258 266 Pas 579 Pos 43266 278 Pas 638 Pas 43290 233 Pos 498 Pas 43314. 261 Pos 608 Pas . 43318 255 Pas 510 Pos REVENDICATIONS1. Procédé de détermination d'une réponse humorale due à la présence d'un agent infectieux cible chez un sujet immunodéprimé, par détection dans un échantillon biologique El dudit sujet, d'au moins un anticorps cible susceptible d'être produit par ledit sujet lorsque ce dernier est infecté ou a été infecté par ledit agent infectieux cible, comprenant les étapes suivantes a) disposer d'un volume V1 de l'échantillon El, b) diluer le volume V1, avec un volume Dl de diluant, selon le rapport de dilution Ri qui est égal à Vi/(Vi+D1), le rapport de dilution Ri étant supérieur au rapport de dilution R2 utilisé dans le cas d'un sujet non immunodéprimé, R2 étant égal à V2/(V2+D2) avec V2 et D2 qui sont respectivement le volume d'échantillon E2 et le volume de diluant utilisés dans le cas d'un sujet non immunodéprimé, de manière à obtenir un échantillon dilué, c) réaliser la détection dudit au moins anticorps cible sur l'échantillon dilué obtenu, de manière à conclure quant à la présence éventuelle de la réponse humorale. 2. Procédé de détermination selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente les caractéristiques suivantes : disposer d'une trousse ou d'un dispositif de détection d'anticorps dirigés contre ledit agent infectieux, capable donc de déterminer la réponse humorale due à la présence dudit agent infectieux cible chez un sujet, - disposer d'un diluant pour diluer les échantillons à tester, ledit diluant pouvant faire partie de la trousse ou du dispositif de détection, - disposer d'un rapport de dilution R2 qui est égal à V2/(V2+D2) adapté à une population de sujets non immunodéprimés, - disposer d'un rapport de dilution Ri qui est égal à V1/(V1+D1) adapté à une population de sujets immunodéprimés, avec Ri > R2, choisir le rapport de dilution Ri, compte tenu du caractère immunodéprimé du sujet dont est issu l'échantillon à analyser. 3. Procédé de détermination d'une réponse humorale due à la présence d'un agent infectieux cible chez un sujet immunodéprimé ou non immunodéprimé, par détection dans un échantillon biologique dudit sujet, d'au moins un anticorps cible susceptible d'être produit 3046847 26 par ledit sujet lorsque ce dernier est infecté ou a été infecté par ledit agent infectieux cible, caractérisé en ce qu'il présente les caractéristiques suivantes : - disposer d'une trousse ou d'un dispositif de détection d'anticorps dirigés contre un agent infectieux, capable donc de déterminer la réponse humorale due à la présence 5 dudit agent infectieux cible chez un sujet, disposer d'un diluant pour diluer les échantillons à tester, ledit diluant pouvant faire partie de la trousse ou du dispositif de détection, disposer d'un rapport de dilution R2 qui est égal à V2/(V2+D2) adapté à une population de sujets non immunodéprimés, Io disposer d'un rapport de dilution Ri qui est égal à Vi/(V1+D1) adapté à une population de sujets immunodéprimés, avec Ri > R2, - choisir le rapport de dilution utilisé en fonction du caractère immunodéprimé ou non du sujet dont est issu l'échantillon à analyser : Ri est utilisé si le sujet est immunodéprimé et R2 est utilisé si le sujet est non immunodéprimé. 15 4. Procédé de détermination selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le rapport de dilution Ri est défini comme suit : 1,5R2 5. Procédé de détermination selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que 20 l'augmentation du rapport de dilution Ri par rapport au rapport de dilution R2 est obtenue par augmentation du volume V1 d'échantillon El, par rapport au volume V2 d'échantillon E2 utilisé dans le cas d'un sujet non immunodéprimé. 6. Procédé de détermination selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que 25 l'augmentation du rapport de dilution Ri par rapport au rapport de dilution R2 est obtenue par diminution du volume Di de diluant, par rapport au volume D2 de diluant utilisé dans le cas d'un sujet non immunodéprimé. 7. Procédé de détermination selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'à 30 l'étape c), un signal est obtenu et la conclusion quant à l'éventuelle présence de la réponse humorale est positive si le signal obtenu est supérieur à un signal de référence Si, ledit signal de référence Si étant supérieur ou égal au signal de référence S2 utilisé dans le cas d'un échantillon issu d'un sujet non immunodéprimé. 3046847 27 8. Procédé de détermination selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la détection dudit au moins anticorps est réalisée à l'étape c) dans les mêmes conditions que dans le cas d'une détection réalisée à partir d'un échantillon biologique E2 d'un sujet non immunodéprimé. 5 9. Procédé de détermination selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la détection dudit au moins anticorps cible est réalisée à l'étape c) par un immunoessai, notamment un test ELISA ou ELFA, direct ou indirect. 10 10. Procédé de détermination selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la durée entre le début de la dilution de l'étape b) et l'obtention de la conclusion de l'étape c) est inférieure ou égale à 2 heures, de préférence inférieure ou égale à une heure et 30 minutes, et encore, préférentiellement, inférieure ou égale à une heure. 15 11. Procédé de détermination selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'agent infectieux est une bactérie, un virus, un champignon ou un parasite.