Brevet FR3036621A1 — publié le 20161202

TRACEUR FLUORESCENT CIBLANT MULTIVALENT DANS LE PROCHE INFRAROUGE POUR IMAGERIE OPTIQUE La présente invention concerne des composés tels que des sondes de fluorescence dans le domaine du proche infrarouge. Ces composés comprennent des molécules de ciblage de tissus ou organes cibles, un fluorophore et un support sur lequel sont fixés les molécules de ciblage et le fluorophore. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE L'imagerie de fluorescence est en plein essor dans de nombreuses applications chirurgicales. Plusieurs dispositifs médicaux sont sur le marché permettant la détection et la visualisation d'un des seuls fluorophores disposant d'une autorisation de mise sur le marché : le vert d'indocyanine. Toutefois, ce fluorophore est une molécule non spécifique de tissus ou d'organes cibles ce qui restreint son champ d'application. L'imagerie médicale est une technique prometteuse dans les interventions chirurgicales. Elle peut, par exemple, servir à guider le chirurgien lors de son intervention. Cette technique repose sur l'administration au patient d'un traceur fluorescent. En l'espèce, il s'agit d'un traceur fluorescent ciblant des tissus ou organes nécessitant l'intervention chirurgicale. Le principe repose sur un éclairement par une source lumineuse d'un traceur fluorescent, préalablement administré au patient, spécifique de tissus ou organes cibles. L'éclairement a pour effet d'exciter ledit traceur fluorescent qui émet alors à son tour un rayonnement à une longueur d'onde donnée. Les principales applications sont dans le domaine du proche infrarouge entre 700 nm et 1000 nm. En effet, cette fenêtre optique correspond au domaine de longueurs d'ondes dans lequel les tissus biologiques absorbent le moins. 3 03 662 1 L'intérêt des traceurs fluorescents est qu'ils permettent d'associer des propriétés d'au moins deux classes de molécules telles que des propriétés de fluorescence d'une part, et, des propriétés de ciblage de tissus ou organes spécifiques d'autre part. 5 Les demandes de brevet américaines US20140271482 de Low et n 20140275533 de Kularatne notamment présentent des molécules fluorescentes monovalentes ciblant des tissus spécifiques. Une molécule est dite monovalente lorsqu'elle ne fixe qu'un exemplaire de molécule de ciblage. En l'espèce, les sondes décrites ciblent des zones liées à des 10 maladies inflammatoires. Ces demandes ne divulguent pas de support multivalent permettant la fixation de plusieurs molécules de ciblage, par exemple. L'objet de la présente invention est de proposer une molécule ou traceur ciblant des tissus ou organes spécifiques. Plus précisément, l'objet de la 15 présente invention est de proposer un traceur fluorescent comprenant un support multivalent fluorescent présentant des points d'ancrage pour des molécules de ciblage. Dans cette optique, le brevet EP1539804 de P. Dumy décrit un procédé de synthèse d'un support peptidique ou châssis moléculaire. 20 La figure 1 représente un exemple de châssis moléculaire. Il s'agit d'un châssis moléculaire 1, plus connu sous le nom de châssis RAFT, acronyme de « Regioselectively Adressable Functionnalized Templates », en langue anglaise ou châssis fonctionnalisable régio-sélectivement. Il s'agit d'un décapeptide cyclique comprenant la séquence de résidus 25 d'acides aminés : [-Glycinea-Prolineb-LysinerAlanined-Lysinee-Glyciner Prolineg-Lysineh-Lysinei-Lysiner], les enchaînements des acides aminés [Glycine a ; f - Proline b; g-] formant des coudes 2 de sorte que la configuration du châssis moléculaire 1 présente un plan moyen Pm définissant une face dite supérieure F. comprenant quatre résidus Lysine K., Ka, Kb et Ki du 3036621 décapeptide cyclique et une face dite inférieure Fi, opposée à la face supérieure F. comprenant au moins une Lysine K. On entend par plan moyen Pm le plan pour lequel la somme des distances entre le plan moyen Pm et les résidus d'acides aminés est minimale. 5 La préparation du châssis moléculaire 1 comprend une première étape de synthèse du décapeptide linéaire, la méthode d'élongation mise en oeuvre afin d'obtenir le décapeptide linéaire à partir d'une glycine ancrée dans une résine étant décrite dans l'état de la technique «P. Dumy et al. Tetrahedron Lett 1995, 36, 1255-1258 », une deuxième étape de cyclisation 10 intramoléculaire du décapeptide linéaire de sorte à obtenir un châssis moléculaire cyclique et une troisième étape de fonctionnalisation du châssis moléculaire cyclique 1 selon les fonctionnalités souhaitées. Le décapeptide cyclique RAFT ainsi réalisé est multivalent, il peut être associé de manière contrôlée à deux domaines fonctionnels indépendants : 15 un domaine dédié au ciblage de zones d'intérêt, telles que des zones exprimant des intégrines, et un domaine pour la détection. On entend par « intégrines » des hétéro-dimères transmembranaires des récepteurs de surface cellulaire qui jouent un rôle dans les processus d'adhésion cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire. Les intégrines 20 jouent un rôle important dans le rattachement des cellules à leur environnement, et, en particulier, au réseau de protéines de la matrice extracellulaire. L'intégrine avi33 est une intégrine identifiée comme spécifique des zones d'angiogénèse. Il a été démontré que cette intégrine était surexprimée par les cellules endothéliales des vaisseaux néo-angiogéniques, 25 elle a également été mise en évidence sur de nombreuses lignées de cellules tumorales humaines. De nombreuses intégrines interagissent avec leurs substrats protéiques via la séquence de résidus d'acides aminés -RGD- acronyme de « Arginine- 3036621 Glycine-Acide Aspartique ». Cette séquence RGD est un motif commun présent sur la plupart des protéines de la matrice extracellulaire. La figure 2 présente la formule chimique d'une molécule de ciblage 3 comprenant un pentapeptide cyclique spécifique de l'intégrine a133 5 comprenant la séquence de résidus d'acides aminés R, G et D, acronyme de Arginine, Glycine, Acide aspartique [-RGDfK-]. Ces observations ont ainsi servi de base au développement de molécules de ciblage spécifique de l'intégrine 0v133. Une publication de Boturyn et al. "Template Assembled Cyclopeptides as 10 Multimeric System for Integrin Targeting and Endocytosis", J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 5730-5739, présente en outre des traceurs fluorescents spécifiques de l'intégrine av63. Le traceur de Boturyn comprend un châssis RAFT configuré de sorte à définir un plan moyen, tel que défini dans le brevet de P. Dumy cité précédemment, permettant d'une part du plan moyen 15 la fixation de molécules de ciblage, et, d'autre part du plan moyen la fixation du fluorophore directement sur un résidu Lysine de la face dite inférieure du châssis RAFT. En l'espèce, les molécules de ciblage comprennent quatre cyclopentapeptides comprenant la séquence peptidique RGD. Le fluorophore est la fluorescéine qui fluoresce dans le domaine de longueurs d'onde du 20 visible. Sur la base de ces développements, il a été proposé un traceur fluorescent dans le domaine du proche infrarouge spécifique de l'intégrine a63, représenté sur la figure 3. Le traceur fluorescent Tf comprend : 25 un châssis moléculaire 1, en l'espèce, le décapeptide cyclique RAFT comprenant la séquence de dix résidus d'acides aminés : [-Ga-Pb-KcAd-Ke-GrPg-Kh-Ki-Ki] décrite à la figure 1, un fluorophore 4 de la famille des cyanines fluoresçant dans le domaine de longueurs d'onde compris entre 700 et 900 nm, et 3036621 un ensemble de ciblage 3 de l'intégrine 433. En l'espèce, l'ensemble de ciblage 3 comprend quatre molécules de ciblage 3a comprenant le cyclo-pentapeptide comprenant la séquence de résidus d'acides aminés [-RGD-]. Les molécules cyclo-pentapeptides 3 sont couplés aux quatre résidus d'acides aminés Lysine Ke, Ke, Kh et Ki de la face dite supérieure Fs du châssis moléculaire 1 via des liaisons oximes. Le fluorophore 4 comprend notamment une chaîne carbonée 4a présentant des doubles liaisons covalentes et un groupement aromatique indol 4b aux 10 extrémités de la chaîne carbonée 4a disposés de sorte à permettre une délocalisation des électrons des doubles liaisons sur l'ensemble de la chaîne carbonée 4a et des groupements aromatiques indol 4b. Notons que le fluorophore 4 est ici l'IRDye800 (marque déposée) mais peut également être de la cyanine 5 (marque déposée), l'Alexa fluor 700 (marque 15 déposée)ou un fluorophore développé spécifiquement à 700 nm noté BM 105 (marque déposée). Le fluorophore 4 est relié à un résidu lysine Ki de la face dite inférieure Fi du châssis moléculaire 1 en formant une liaison amide via un groupement aliphatique d'un des groupements aromatiques indol 4b. 20 Le procédé de réalisation du traceur fluorescent Tf selon l'état de la technique comprend : - une première étape de synthèse du châssis RAFT 1 comprenant : o une sous-étape de synthèse d'un décapeptide linéaire sur résine [-K(boc)-K(Alloc)-K(Boc)- P-G-K(Boc)- A-K(Boc)-P-G], 25 o une sous-étape de cyclisation du décapeptide en solution, o une sous-étape de déprotection des K(Boc), o une sous-étape de greffage d'un précurseur d'oxyamine protégé, 3 0 3 66 2 1 6 o une sous-étape de déprotection de K(Alloc). - une deuxième étape de synthèse de la molécule de ciblage 3, ici, le pentapeptide cyclique [-D(tBu)-f-K(Alloc)-R(Pbf)-G-] 3a, - une troisième étape de couplage entre le châssis RAFT 1 et des molécules 5 de ciblage 3a comprenant : o une sous-étape de cyclisation du pentapeptide en solution, o une sous-étape de déprotection de K(Alloc), o une sous-étape de greffage de S protégé, o une sous-étape de déprotection de D, de S et de R, et 10 o une sous-étape d'oxydation de S, - une quatrième étape d'activation du fluorophore 4. En pratique, le fluorophore est commercialisé sous la forme activée ce qui le rend particulière instable et réactif vis-à-vis des amines. - une cinquième étape de couplage, ultérieure aux troisième et quatrième 15 étapes, entre le châssis RAFT comprenant la molécule de ciblage 3a RAFT[- RGD-] et le fluorophore 4. Les rendements de ce procédé sont relativement faibles et notamment le rendement de couplage entre le châssis RAFT 1 comprenant les molécules de ciblage et le fluorophore 4. 20 En effet, pour obtenir 15g de traceur fluorescent Tf tel que celui décrit figure 3, 410 g de molécule de ciblage 3a, 75g de châssis RAFT 1 et 7g de fluorophore 4 sont nécessaires. Les coûts globaux de réalisation d'un traceur fluorescent Tf selon l'art connu sont très élevés en raison d'une part du coût d'achat du fluorophore 4, et, 25 d'autre part du procédé de synthèse qui génère des pertes de matières premières importantes. 3036621 7 RESUME DE L'INVENTION Aussi, un but de l'invention est de proposer un traceur fluorescent ciblant ayant un coût très inférieur à celui d'un traceur fluorescent selon l'art connu. Selon un aspect de l'invention, il est proposé un traceur fluorescent pour s ciblage de tumeurs comprenant : - au moins un premier fluorophore comprenant une chaîne linéaire carbonée comprenant au moins un enchaînement d'au moins trois doubles liaisons covalentes carbone-carbone de sorte à permettre une délocalisation des électrons des doubles liaisons lorsque le 10 fluorophore est excité par un rayonnement lumineux, de manière à fluorescer dans un domaine de longueurs d'ondes compris entre 700 et 1000 nm, - un ensemble de ciblage comprenant au moins deux molécules de ciblage identiques, et 15 - un oligopeptide cyclique : o configuré de sorte à définir un plan moyen définissant une première face supérieure et une deuxième face inférieure, o comprenant au moins un premier résidu d'acide aminé Lysine sur la deuxième face inférieure, 20 o des molécules de ciblage étant fixées sur la première face supérieure du plan moyen, o le fluorophore étant fixé sur la deuxième face inférieure du plan moyen via un bras espaceur reliant un carbone de l'enchaînement des au moins trois doubles liaisons et le résidu 25 d'acide aminé lysine de l'oligopeptide. 303 6 62 1 Le traceur fluorescent selon l'invention permet notamment d'utiliser des fluorophores commerciaux moins onéreux que ceux utilisés dans le procédé de l'état de la technique. Avantageusement, l'oligopeptide est un décapeptide. Ainsi, le traceur s fluorescent est facilement éliminé ce qui limite sa toxicité pour l'organisme. Avantageusement, la première face et la deuxième face du décapeptide sont fonctionnalisables de manière chimio-sélective. Préférentiellement, le décapeptide comprend l'enchaînement de résidus d'acides aminés suivants : [--K-K-K-P-G-K-A-K-P-G-]. 10 Avantageusement, le bras espaceur comprend une chaîne carbonée linéaire comprenant un nombre de carbones supérieur ou égal à quatre permettant ainsi de limiter le problème d'espacement ou d'encombrement stérique lors du couplage entre le fluorophore et le châssis. Avantageusement, le bras espaceur est relié au fluorophore via une liaison 15 amide ou une liaison éther ou une liaison thioéther. Avantageusement, le bras espaceur est relié à l'oligopeptide via une liaison amide. Avantageusement, le fluorophore est de la famille des cyanines et préférentiellement, le fluorophore est choisi parmi les fluorophores suivants : 20 S0121, S0306, S0456, S2180, IR775 chloride, IR780 iodide, IR786, IR806, IR820. Avantageusement, l'oligopeptide comprend un deuxième résidu Lysine sur la face inférieure, un deuxième fluorophore est accroché audit résidu lysine via un bras espaceur ou non. Les deux fluorophores peuvent alors interagir de 25 sorte à permettre une fluorescence FRET acronyme de « Freister Resonance Energy Transfer », en langue anglaise ou transfert d'énergie entre molécules fluorescentes, en langue française. 3036621 Avantageusement, les molécules de ciblage comprennent un peptide ou pseudo-peptide. Et préférentiellement, les molécules de ciblage comprennent des pentapeptides cycliques, la séquence peptidique du pentapeptide ciblant une intégrine comprend les résidus d'acides aminés [-Arginine- Glycine - 5 Acide aspartique-] (RGD). Avantageusement, l'oligopeptide comprend des résidus Lysine sur la première face supérieure sur lesquels les molécules de ciblage sont fixées via une liaison oxime. Ce type de liaison confère au traceur fluorescent une bonne stabilité in vivo et in vitro. 10 Alternativement, les molécules de ciblage sont fixées via des liaisons amide. Alternativement, l'oligopeptide comprend au moins un résidu Cystéine sur la première face supérieure sur lequel une molécule de ciblage est fixée via une liaison thioéther permettant une fixation régio-sélective de molécules de ciblage différentes. 15 Selon un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé de synthèse d'un traceur fluorescent pour ciblage de tumeurs comprenant : - au moins un premier fluorophore comprenant une chaîne linéaire carbonée comprenant au moins un enchaînement d'au moins trois doubles liaisons covalentes carbone-carbone de sorte à permettre une 20 délocalisation des électrons des doubles liaisons lorsque le fluorophore est excité par un rayonnement lumineux de manière à fluorescer dans un domaine de longueurs d'ondes compris entre 700 et 1000 nm, - un ensemble de ciblage comprenant au moins deux molécules de 25 ciblage identiques, et - un oligopeptide cyclique : 3036621 10 o configuré de sorte à définir un plan moyen définissant une première face supérieure et une deuxième face inférieure, o comprenant au moins un résidu d'acide aminé Lysine sur la deuxième face inférieure, o des molécules de ciblage étant fixées sur la première face supérieure du plan moyen, o le fluorophore étant fixé sur la deuxième face inférieure du plan moyen via un bras espaceur reliant un carbone de l'enchaînement des au moins trois doubles liaisons et un résidu 10 d'acide aminé Lysine de l'oligopeptide, le procédé comprend une étape de fixation du fluorophore à l'oligopeptide cyclique via le bras espaceur préalablement à une étape de fixation des molécules de ciblage à l'oligopeptide. LISTE DES FIGURES 15 L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre donnée à titre non limitatif, et, grâce aux figures annexées parmi lesquelles : - la figure 1, déjà décrite, représente un châssis RAFT, - la figure 2, déjà décrite, illustre une molécule de ciblage 20 comprenant un pentapeptide [-RGDfK-] cyclique spécifique de l'intégrine avi33. - la figure 3, déjà décrite, représente un traceur fluorescent selon l'art connu, - la figure 4 illustre un représentant de la famille de traceurs 25 fluorescents selon l'invention, 3036621 les figures 5a, 5b, 5c représentent les formules générales de fluorophores utilisés dans un traceur selon l'invention, - les figures 6a, 6b, 6c, 6d, 6e, 6f, 6g, 6h représentent des exemples de formules chimiques de fluorophores commerciaux 5 potentiellement utilisables selon l'invention, - les figures 7a, 7b, 7c et 7d représentent des bras espaceurs utilisés dans un traceur selon l'invention, - la figure 8 représente un châssis RAFT permettant le greffage de deux fluorophores sur la face inférieure Fi. 10 - la figure 9 représente les réactions de couplage entre un bras espaceur et un fluorophore selon l'invention, - les figures 10a et 10b représentent les réactions de synthèse du châssis RAFT, et de couplage entre le fluorophore muni du bras espaceur et le châssis RAFT, selon l'invention, 15 - la figure 11 représente les réactions de synthèse de la molécule de ciblage, selon l'invention, - la figure 12 représente la réaction de couplage entre le châssis RAFT fluorescent et les molécules de ciblage via une liaison amide, selon l'invention. 20 DESCRIPTION DETAILLEE La figure 4 est une formule semi-développée d'un représentant de la famille de traceur fluorescent Tf selon l'invention. En l'espèce, le traceur fluorescent Tf comprend un châssis RAFT 1 comprenant, comme dans le document de Boturyn, un enchaînement de dix 25 résidus d'acides aminés [-K-K-K-P-G-K-A-K-P-G-J sous forme cyclique. Les 3036621 enchaînements des résidus d'acides aminés [-Glycine-Proline] constituent des coudes 2 de sorte à définir un plan moyen Pm de part et d'autre duquel un fluorophore 4 et un ensemble de ciblage 3 peuvent être fixés. En l'occurrence, l'ensemble de ciblage 3 comprend des molécules de 5 pentapeptide cyclique 3a comprenant une séquence spécifique de type RGD. Les pentapeptides cycliques 3a sont reliés au châssis RAFT 1 au niveau des résidus Lysine Kc, Ke, Kfb et Ki de la face supérieure Fs du châssis RAFT 1. En l'espèce, ils sont reliés via une liaison oxime permettant une bonne stabilité in vivo et in vitro. Toutefois, il est aussi possible de les 10 relier via une liaison amide. Alternativement, il est possible de relier au moins une molécule de ciblage 3a via une liaison thioéther à condition de remplacer un résidu Lysine par un résidu Cystéine auquel cas il est possible de greffer un type de molécules de ciblage sur les résidus Lysine et un autre type de molécule sur le résidu Cystéine permettant ainsi le greffage régio-sélectif de 15 molécules de ciblage. Le fluorophore 4 est fixé au châssis 1 via un bras espaceur 8. En l'espèce, le fluorophore 4 est le IR775 (marque déposée) ou 2-[(E)-2-{(3E)-2-chloro-3- [(2Z)-2-(1,3,3-trimethy1-1 ,3-dihydro-2H-indo1-2-ylidene)ethylidene]cyclohex-1 - en-1 -yl}ethenyI]-1 ,3,3-trimethy1-3H-indolium ch bride, selon la nomenclature. 20 Le bras espaceur 8 comprend un enchaînement de cinq carbones, une fonction phénolate à une extrémité 884 de la chaîne carbonée reliant le bras espaceur 8 au fluorophore 4 et une fonction carboxylique 881 reliant le bras espaceur 8 au châssis RAFT I. Plus précisément, les figures 5a, 5b et 5c représentent des formules 25 générales de fluorophores 4 potentiellement utilisables selon l'invention. Le fluorophore 4 selon l'invention doit posséder des propriétés d'absorption dans le domaine de longueurs d'ondes du proche infrarouge compris entre 750 nm et 1000 nm et un pic d'émission présentant un maximum compris 3036621 entre 770 nm et 870 nm. Aussi, le fluorophore 4 présente un chaîne carbonée linéaire ou non comprenant un enchaînement de doubles liaisons covalentes conjuguées, les électrons des doubles liaisons pouvant se délocaliser. De plus, le fluorophore 4 présente sur l'un des carbones de la 5 chaîne carbonée un groupement halogène X pouvant réagir avec un groupement. La figure 5a présente un fluorophore 4 comprenant une chaîne linéaire de carbone 4a présentant des doubles liaisons conjuguées, les électrons des doubles liaisons pouvant se délocaliser sur l'ensemble de la chaîne ic carbonée 4a. Les extrémités de la chaîne carbonée 4a présentent des groupements amine tertiaire et ammonium quaternaire. La figure 5b présente aussi un fluorophore 4 potentiellement utilisable pour la réalisation d'un traceur fluorescent selon l'invention. La figure 5b diffère de la figure 5a en ce que l'extrémité ammonium quaternaire présente un 15 groupement aromatique. La figure 5c présente à chacune des extrémités de la chaîne carbonée 4a un groupement aromatique. Eventuellement, le groupement aromatique tel que le pyrrole ou l'indol comprend un groupement aliphatique présentant un groupement fonctionnel pouvant modifier les caractéristiques physico-chimiques du traceur 20 fluorescent Tf. Par exemple, l'ajout d'un groupement sulfonate peut augmenter l'hydrophilie et ainsi augmenter la solubilité du traceur fluorescent Tf dans un solvant aqueux: Quelques exemples de fluorophores du commerce potentiellement utilisables sont représentés sur les figures 6 : 25 - IR786 (marque déposée), ou perchlorate de 2-(242-Chloro-3-([1,3-dihydro1,313-trimethy1-211-indo1-2-ylidene] ethylidene)-1-cyclohexen-1-ylletheny1)- 1,3,3-trimethylindolium (figure 6a), 3036621 14 - 1R806 (marque déposée) ou sel interne (sel sodique) hydroxyde de 24242- Chloro-31[1,3-dihydro-1,1-dimethy1-3-(4-sulfobuty1)-2H-benzo[e]indol-2- ylidenej-ethylidene]-1-cyclohexen-1-y13-etheny11-1,1-dimethyl-3- (4-sulfobuty1)- 1H-benzo[e]indolium(figure 6b), -1R820 (marque déposée) ou sel interne (sel sodique) hydroxyde de 24242- Chloro-34[1,3-d ihydro-1,1-d imethy1-3-(4-sulfobuty1)-2H-benzo[elindol-2- ylidene]-ethylidene]-1-cyclohexen-1-y11-ethenyl]-1,1 -d imethy1-3-(4-sulfobuty1)- 1H-benzo[e]indolium (figure 6c), - S0456 (marque déposée) ou sel interne (sel trisodique) hydroxyde de 3,3- 10 Dimethy1-2[242-chloro-3[241,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(4- sulfobuty1)-2H-indol-2-ylidenel-ethylidene]-1-cyclohexen-1-y11-ethenyl]-5- sulfo-1-(4-sulfobuty1)-3H-indolium (figure 6d), - S2180 (marque déposée) ou sel interne (sel trisodique) hydroxyde de 242- (2-Chloro-34211,1-dimethy1-7-sulfo-3-(4-sulfobuty1)-1,3-dihydro- 15 benzo[e]indo1-2-ylidenej-ethylidenei-cyclohex-1-eny1)-vinyl]-1, 1-dimethy1-7- sulfo-3-(4-sulfobutyl)-1H-benzo[e]indolium (figure 6e), - S0306 (marque déposée) ou sel interne (sel sodique) hydroxyde de 24242- Chloro-34[1,3-dihydro-1,1-dimethy1-3-(4-sulfobuty1)-21-1-benzo[e]indol-2- ylideneFethylidene1-1-cyclohexen-1-yll-ethenyl]-1,1-dimethyl-3- (4-sulfobuty1)- 20 1H-benzo[e]indolium (figure 6f), - S0121 (marque déposée) ou sel interne (sel sodique) hydroxyde de 24242- Chloro-34241,3-dihydro-3,3-dimethy1-1-(4-sulfobuty1)-2H-indol-2-ylidene]. ethylidene]-1-cyclohexen-l-yli-etheny1]-3,3-dimethy1-1-(4-sulfobuty1) -3Hindolium (figure 6g), 25 - IR780 iodide (marque déposée) ou iodure de 24242-Chloro-3-[(1,3-dihydro3,3-dimethy1-1-propy1-2H-indol-2-ylidene) ethylidene]-1-cyclohexen-1- yljetheny1]-3,3-dimethyl-1-propylindolium (figure 6h). 3036621 15 Ces fluorophores ont un coût bien plus faible que les fluorophores utilisés Pour la synthèse de traceurs fluorescents Tf selon l'art antérieur. La différence de coût peut s'expliquer d'une part par le fait que ces fluorophores sont structurellement plus simples que les fluorophores utilisés 5 auparavant de type IRDyeee800 et d'autre part par le fait qu'il n'est pas nécessaire de les activer. Par ailleurs, les figures 7a, 7b, 7c et 7d présentent des formules semidéveloppées de bras espaceur 8 potentiellement utilisables. De manière générale, le bras espaceur 8 selon l'invention comprend une 10 chaîne carbonée 8a, un premier groupement terminal 884 reliant le fluorophore 4 au bras espaceur 8 et un deuxième groupement terminal 881 reliant le bras espaceur 8 au châssis RAFT 1. Bien que l'état de la technique présente un bras espaceur constitué d'une tyrosine, il a été démontré qu'il n'est pas possible de greffer un fluorophore 4 15 sur un châssis RAFT 1 selon l'invention via un bras espaceur constitué d'un résidu tyrosine à cause notamment de problèmes d'encombrement stérique ou d'espacement. Préférentiellement, le nombre de carbones de la chaîne carbonée 8a est supérieur ou égal à 4 facilitant ainsi le greffage du fluorophore 4 et limitant 20 ainsi les problèmes liés à l'encombrement stérique. Le premier groupement terminal 884 peut être un groupement amine, un groupement éther, ou un groupement thioéther. La fixation du bras espaceur 8 via le premier groupement terminal 884 modifie sensiblement le maximum d'émission. En effet, un premier groupement terminal amine diminue la 25 longueur d'onde du pic maximum de fluorescence de 100 à 150 nm. Aussi, ce type de premier groupement terminal ne sera pas privilégié. Un premier groupement terminal éther (figure 7a et figure 7c) diminue la longueur d'onde 3036621 16 du maximum du pic d'émission de 10 à 15 nm. Un premier groupement terminal thioéther (figure 7b et figure 7d) augmente la longueur d'onde du maximum du pic d'émission de 10 à 15 nm. En outre, l'utilisation d'un premier groupement terminal de type phénol (figure 7a et figure 7c) 5 augmente la délocalisation des électrons de la chaîne carbonée 4a du fluorophore ce qui augmente le rendement quantique. Le deuxième groupement terminal 881 peut être un acide carboxylique (figure 7a et figure 7b) ou succinimide ester (figure 7c et figure 7d). Le bras espaceur 8 est fixé via le deuxième groupement terminal 881 sur un 10 résidu Lysine situé sur la face dite inférieure Fi du châssis RAFT 1. Selon une variante de l'invention représentée sur la figure 8, le résidu Alanine situé sur la face dite inférieure Fi du châssis RAFT 1 peut être substitué par un résidu Lysine, auquel cas un deuxième fluorophore peut accessoirement être fixé de sorte à permettre une fluorescence FRET, par 15 exemple. Selon un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé de réalisation du traceur Tf comprenant une étape de couplage du fluorophore 4 avec le châssis RAFT 1 de sorte à former un châssis RAFT fluorescent préalablement à l'étape de couplage des molécules de ciblage 3. 20 Ce procédé de réalisation diminue les pertes de matières premières, et plus particulièrement celles des molécules de ciblage, et permet d'éviter l'étape d'activation du fluorophore avant l'étape de couplage. Le procédé comprend : - une première étape, illustrée sur la figure 9, de préparation d'un 25 fluorophore modifié 4' dans laquelle le bras espaceur 8 est couplé au fluorophore 4, 3036621 17 - une deuxième étape, représentée sur la figure 10, dans laquelle le châssis RAFT 1 est synthétisé, une troisième étape, représentée sur la figure 10, dans laquelle le châssis RAFT 1 est couplé au fluorophore modifié 4' de sorte à 5 former un châssis fluorescent 10, une quatrième étape, illustrée sur la figure 10, dans laquelle un précurseur 11 de liaison oxime est greffé au châssis RAFT 1 sur les résidus Lysine de la face dite supérieure F's de sorte à former un châssis fluorescent modifié 10', 10 - une cinquième étape, représentée sur la figure 11, dans laquelle les molécules de ciblage 3a sont synthétisées, et - une sixième étape, illustrée sur la figure 12, de couplage entre les molécules de ciblage 3a et le châssis fluorescent modifié 10'. Plus précisément, la figure 9 présente les étapes de préparation du 15 fluorophore modifié 4', décrite notamment dans le document de Hyun, H. et al, « c-GMP-compatible preparative scale of near-infrared fluorophores. Contrast Media Mol. Imaging, 2012, 7: 516 ». Le bras espaceur 8, acide 5- (4-hydroxyphenyl) pentanoïque, comprend un premier groupement terminal 881 phénol. Le phénol est convertit en phénolate, plus réactif que le phénol, 20 dans une solution d'hydroxyde de sodium dans le méthanol pour former un bras espaceur modifié 8'. Le bras espaceur 8' obtenu est ensuite mélangé au fluorophore 4, ici le S0456 (ou sel interne (sel trisodique) hydroxyde de 3,3-Dimethy1-2[242-chloro-34241 ,3-dihydro-3,3-dimethy1-5-sulfo-1-(4- sulfobutyI)-2 H-indo1-2-ylidenel-ethylidene]-1-cyclohexen-1-y11-ethenyl]-5- 25 sulfo-1-(4-sulfobutyl)-3H-indolium) dans le DMSO (acronyme de DiMéthylSulfOxyde) pour obtenir le fluorophore modifié 4' constitué du fluorophore 4 sur lequel est greffé le bras espaceur 8'. 3036621 18 La figure 10a présente les deuxième, troisième et quatrième sous-étapes du procédé. Dans un premier temps, un décapeptide linaire comprenant la séquence de résidus d'acides aminés [-K(Boc)-K(Alloc)-K(Boc)-P-G-K(Boc)- A-K(Boc)-P-G-] est synthétisé sur résine, les groupements BOC et ALLOC 5 étant des groupements protecteurs de sorte à permettre, par la suite, une fonction nalisation régiosélective du châssis fluorescent. Après décrochage de la résine, le décapeptide est cyclisé et le résidu Lysine protégé par le groupement (Alloc) est déprotégé en présence de palladium (Pd°) et de phénylsilane de sorte à former un châssis RAFT 1 présentant un plan moyen 10 Pm. Le fluorophore modifié 4' est ensuite greffé sur le résidu Lysine déprotégé. Les groupements protecteurs BOC sur les résidus Lysine de la face dite supérieure Fs sont clivés en milieu acide puis un précurseur d'oxyamine protégé 11 est greffé sur les résidus Lysine via une liaison amide pour former le châssis RAFT fluorescent modifié 10'. Notons que la troisième 15 étape et la quatrième étape peuvent être interverties, comme illustré sur la figure 10b. En l'espèce, dans un premier temps, les groupements protecteurs BOC sur les résidus Lysine de la face dite supérieure Fs sont clivés en milieu acide puis des précurseurs d'oxyamine protégés 11 sont greffés sur les résidus Lysine via une liaison amide. Le résidu Lysine situé sur la face 20 inférieure Fi protégé par le groupement (Alloc) est déprotégé de sorte à permettre le greffage du fluorophore modifié 4' pour former un châssis fluorescent modifié 10'. Par ailleurs, il est intéressant de noter que la sous-étape d'activation du fluorophore 4 indispensable dans le procédé selon l'état de la technique 25 n'est pas nécessaire dans le procédé selon l'invention. La figure 11 présente les étapes de synthèse de la molécule de ciblage 3a. Dans un premier temps, le pentapeptide linéaire comprenant la séquence de résidus d'acides aminés RGD spécifique des intégrines est synthétisé sur une résine. En l'espèce, le pentapeptide comprend la séquence [-D(tBu)-f- K(Alloc)-R(Pbf) G-1. Après décrochage du peptide de la résine, celui-ci est 303 66 2 1 19 cyclisé puis le résidu Lysine protégé par le groupement /M'oc est ensuite déprotégé en présence de palladium (Pd°) et de phénylsilane. Un résidu sérine protégée est ensuite greffé sur le résidu Lysine avant déprotection totale du pentapeptide en milieu acide. La fonction alcool de la sérine est 5 ensuite oxydée avec du périodate de sodium dans l'eau pour obtenir un groupement aldéhyde. La figure 12 illustre l'étape de couplage entre le châssis fluorescent modifié 10' et les pentapeptides cycliques 3a. Dans le procédé revendiqué, le fluorophore commercial 4 intervient très tôt 10 dans le processus de synthèse du traceur fluorescent Tf par rapport au procédé de l'état de la technique. Or, les exigences de pureté et de qualité relatives aux matières premières incorporées dans des formulations destinées à l'administration humaine intervenant tôt dans le procédé de synthèse sont moindres que pour les 15 matières premières intervenant en fin de procédé comme cela est le cas dans le procédé de l'état de la technique. En l'espèce, le fluorophore 4 peut donc être de qualité et de pureté inférieures à celles requises lors de la synthèse selon le procédé de l'état de la technique, ce qui contribue de manière significative à la baisse du coût d'achat du fluorophore 4. 20 De plus, contrairement au procédé décrit dans l'état de la technique, l'étape d'activation du fluorophore préalable à l'étape de couplage entre le fluorophore modifié 10' et le châssis RAFT 1 n'est pas nécessaire ce qui permet de diminuer encore les coûts de fabrication du traceur fluorescent Tf selon l'invention. 25 Aussi, la synthèse de 15 g de traceur fluorescent Tf requiert 30g de RAFT, 105g de RGD et 13g de fluorophore. 3036621 20 La nouvelle famille de traceurs fluorescents proposée dans la présente invention permet de diminuer de manière importante les coûts d'une part en permettant l'utilisation de matériaux moins onéreux mais aussi en améliorant le procédé de fabrication permettant ainsi de supprimer des étapes 5 réactionnelles. REVENDICATIONS1. Traceur fluorescent (Tf) pour ciblage de tumeurs comprenant : - au moins un premier fluorophore (4) comprenant une chaîne linéaire carbonée (4a) comprenant au moins un enchaînement d'au moins trois doubles liaisons covalentes carbone-carbone de sorte à permettre une délocalisation des électrons des doubles liaisons lorsque le fluorophore (4) est excité par un rayonnement lumineux de manière à fluorescer dans un domaine de longueurs d'ondes compris 10 entre 700 et 1000 nm, - un ensemble de ciblage (3) comprenant au moins deux molécules de ciblage identiques (3a), et - un oligopeptide cyclique (1) : O configuré de sorte à définir un plan moyen (Pm) définissant une 15 première face supérieure (Fa) et une deuxième face inférieure (Fi), O comprenant au moins un premier résidu d'acide aminé Lysine (K) sur la deuxième face inférieure (Fi), o les molécules de ciblage (3a) étant fixées sur la première face 20 supérieure (Fa) du plan moyen (Pm), O le fluorophore (4) étant fixé sur la deuxième face inférieure (Fi) du plan moyen (Pm) via un bras espaceur (8) reliant un carbone de l'enchaînement des au moins trois doubles liaisons et le résidu d'acide aminé lysine (Ki) de l'oligopeptide (1). 25 2. Traceur fluorescent selon la revendication 1 dans lequel l'oligopeptide (1) est un décapeptide. 3036621 3. Traceur fluorescent selon la revendication 2 dans lequel la première face supérieure (Fs) et la deuxième face inférieure (Fi) du décapeptide (1) sont fonctionnalisables de manière chimio-sélective. 4. Traceur fluorescent selon la revendication 3 dans lequel le décapeptide comprend l'enchaînement de résidus d'acides aminés suivants : [-K-K-K-P-G-K-A-K-P-G-]. 5. Traceur fluorescent selon l'une des revendications précédentes dans lequel le bras espaceur (8) comprend une chaîne carbonée linéaire (8a) comprenant un nombre de carbone (n) supérieur ou égal 10 à quatre. 6. Traceur fluorescent selon l'une des revendications précédentes dans lequel le bras espaceur (8) est relié au fluorophore (4) via une liaison amide ou une liaison éther ou une liaison thioéther. 7. Traceur fluorescent selon l'une des revendications précédentes dans 15 lequel le bras espaceur (8) est relié à l'oligopeptide cyclique (1) via une liaison amide. 8. Traceur fluorescent selon l'une des revendications précédentes dans lequel le fluorophore (4) est de la famille des cyanines. 9. Traceur fluorescent selon la revendication 8 dans lequel le 20 fluorophore (4) est choisi parmi les fluorophores suivants : S0121, S0306, S0456, S2180, 1R775 chloride, IR780 iodide, IR786, IR806, 1R820. 10. Traceur fluorescent selon l'une des revendications précédentes dans lequel l'oligopeptide comprend un deuxième résidu Lysine sur la face 25 inférieure (F1) sur lequel un deuxième fluorophore (4) est accroché via un bras espaceur (8) ou non. 3036621 23 11. Traceur fluorescent selon la revendication 1 dans lequel les molécules de ciblage (3a) comprennent un peptide ou pseudo-peptide. 12.Traceur fluorescent selon la revendication 11 dans lequel les molécules de ciblage (3a) comprennent des pentapeptides cycliques, la séquence peptidique du pentapeptide ciblant une intégrine comprend les résidus d'acides aminés [-Arginine - Glycine - Acide aspartique-] (RGD). 13. Traceur fluorescent selon l'une des revendications précédentes dans lequel l'oligopeptide (1) comprend des résidus Lysine sur la première 10 face supérieure (Fs) sur lesquels les molécules de ciblage (3a) sont fixées via une liaison oxime ou amide. 14.Traceur fluorescent selon la revendication 13 dans lequel l'oligopeptide (1) comprend au moins un résidu Cystéine sur la première face supérieure (Fs) sur lequel est fixée une molécule de 15 ciblage (3a) via une liaison thioéther. 15. Procédé de synthèse d'un traceur fluorescent pour ciblage de tumeurs comprenant un traceur fluorescent (Tf) pour ciblage de tumeurs comprenant : - au moins un premier fluorophore (4) comprenant une chaîne linéaire 20 carbonée (4a) comprenant au moins un enchaînement d'au moins trois doubles liaisons covalentes carbone-carbone de sorte à permettre une délocalisation des électrons des doubles liaisons lorsque le fluorophore (4) est excité par un rayonnement lumineux de manière à fluorescer dans un domaine de longueurs d'ondes compris 25 entre 700 et 1000 nm, - un ensemble de ciblage (3) comprenant au moins deux molécules de ciblage identiques (3a), et - un oligopeptide cyclique (1) : 3036621 24 o configuré de sorte à définir un plan moyen (Pm) définissant une première face supérieure (F) et une deuxième face inférieure o comprenant au moins un premier résidu d'acide aminé Lysine sur la deuxième face inférieure (Fi), o des molécules de ciblage (3a) étant fixées sur la première face supérieure du plan moyen (Pm), o le fluorophore (4) étant fixé sur la deuxième face inférieure (F1) du plan moyen (Pm) via un bras espaceur (8) reliant un 10 carbone de l'enchaînement des au moins trois doubles liaisons et un résidu d'acide aminé lysine (1(1) de l'oligopeptide (1), le procédé comprend une étape de fixation du fluorophore (4) à l'oligopeptide (1) via le bras espaceur (8) préalablement à une étape de fixation des molécules de ciblage (3a). 15