Brevet FR3036800A1 — publié le 20161202

Procédé d'observation d'un échantillon Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est lié à l'observation d'un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par imagerie sans lentille, en mettant en oeuvre un algorithme de reconstruction holographique aux performances améliorées. ART ANTERIEUR L'observation d'échantillons, et en particulier des échantillons biologiques, par imagerie sans lentille connaît un développement important depuis ces dix dernières années. Cette technique permet d'observer un échantillon en le disposant entre une source de lumière et un photodétecteur matriciel, sans disposer de lentille de grossissement optique entre l'échantillon et le photodétecteur. Ainsi, le photodétecteur collecte une image de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon. Cette image est formée de figures d'interférence entre l'onde lumineuse émise par la source et transmise par l'échantillon, et des ondes de diffraction, résultant de la diffraction par l'échantillon de l'onde lumineuse émise par la source. Ces figures d'interférences sont parfois dénommées figures de diffraction, ou désignées par le terme anglais « diffraction pattern ». Le document W02008090330 décrit un dispositif permettant l'observation d'échantillons biologiques, en l'occurrence des cellules, par imagerie sans lentille. Le dispositif permet d'associer, à chaque cellule, une figure d'interférence dont la morphologie permet d'identifier le type de cellule. L'imagerie sans lentille apparaît alors comme une alternative simple, et peu onéreuse, à un microscope classique. De plus, son champ d'observation est nettement plus important que ne peut l'être celui d'un microscope. On comprend alors que les perspectives d'application liées à cette technologie sont importantes. Ce document mentionne également la possibilité d'illuminer l'échantillon à l'aide de sources de lumière de différentes longueurs d'onde. Le document US2012/0218379, postérieur au document précédent, reprend l'essentiel des enseignements de W02008090330, tout en mentionnant la possibilité d'utiliser un 3036800 2 photodétecteur matriciel couleur, mais l'information couleur est ensuite traitée pour former une image monochrome. D'une façon générale, l'image formée sur le photodétecteur matriciel, comportant des figures d'interférence, peut être traitée par un algorithme de propagation numérique, de manière à 5 estimer des propriétés optiques de l'échantillon. De tels algorithmes sont bien connus dans le domaine de la reconstruction holographique. Pour cela, la distance entre l'échantillon et le photodétecteur étant connue, on applique un algorithme de propagation, prenant en compte cette distance, ainsi que la longueur d'onde. On peut alors reconstituer une image d'une propriété optique de l'échantillon. Un algorithme de reconstruction numérique est par exemple 10 décrit dans US2012/0218379. Il est également connu que de tels algorithmes peuvent générer une image affectée d'un bruit de fond important, qualifié par le terme anglais « Twin Image », signifiant « image jumelle ». Un tel bruit est dû au fait que l'image de départ, formée par le photodétecteur, ne contient qu'une information partielle quant à l'onde lumineuse collectée par le photodétecteur. En effet, une 15 image ne donne qu'une information relative à la partie réelle de l'onde lumineuse, obtenue par l'intensité mesurée. Mais une telle image ne comporte pas d'information relative à la partie imaginaire de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le détecteur, en particulier sa phase. L'algorithme de reconstruction utilise donc une information incomplète, ce qui se traduit par l'apparition de bruit sur l'image reconstruite. 20 Un tel bruit de fond peut compliquer l'interprétation des images reconstruites par propagation numérique ; il est important d'en diminuer l'influence par des algorithmes appropriés. Pour ce faire, la publication « Lensless phase contrast microscopy based on multiwavelenght Fresnel diffraction », Optics Letters Vol. 39, N°2, 15 janvier 2014, décrit un algorithme permettant d'améliorer la qualité des images reconstruites. Cette publication décrit un dispositif 25 d'imagerie sans lentille basé sur l'utilisation de trois sources de lumières de longueurs d'onde différentes (respectivement 685 nm, 785 nm, 940 nm). L'échantillon est illuminé successivement par ces trois sources de lumières. Le photodétecteur acquiert alors autant d'images que de sources de lumières, ces images étant formées dans un plan, dit plan du détecteur, selon lequel s'étend le capteur. A chaque image correspond une longueur d'onde. 30 Une première image, d'une première longueur d'onde, est rétro-propagée, selon ladite première longueur d'onde, dans un plan selon lequel s'étend l'objet, dit plan de l'objet, de façon à obtenir, dans ce plan objet, un premier champ complexe. La phase de ce premier champ 3036800 3 complexe, dans le plan objet, est multipliée par un ratio entre la première longueur d'onde et une deuxième longueur d'onde. Ce champ complexe est alors propagé, selon ladite deuxième longueur d'onde, du plan objet vers le plan du détecteur, suite à quoi son module est remplacé par le module de l'image acquise à ladite deuxième longueur d'onde. Il est alors rétro-propagé 5 dans le plan de l'objet, pour une deuxième itération. Le procédé itératif se poursuit jusqu'à une l'atteinte d'un critère de convergence. Le document W02014035238, dont certains inventeurs sont les auteurs de la publication évoquée ci-dessus, comporte les mêmes enseignements. Les inventeurs proposent une méthode alternative à celle proposée dans la publication 10 précédente. EXPOSE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention est un procédé d'observation d'un échantillon, comportant les étapes suivantes : i) illumination dudit échantillon à l'aide d'une source de lumière, apte à produire une onde 15 lumineuse se propageant selon un axe de propagation. ii) acquisition, à l'aide d'un photodétecteur, d'une pluralité d'images de l'échantillon, formées dans un plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le photodétecteur, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse, transmise par l'échantillon, sous l'effet de ladite illumination, chaque image 20 étant acquise selon une bande spectrale différente l'une de l'autre, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : iii) détermination, à partir de chaque image acquise selon chaque bande spectrale, d'une amplitude complexe initiale de l'onde lumineuse transmise, selon ladite bande spectrale, dans ledit plan de détection, 25 à partir de chaque amplitude complexe établie dans ledit plan de détection, selon une bande spectrale, détermination d'une amplitude complexe de l'onde transmise, selon chaque bande spectrale, dans un plan selon lequel s'étend l'échantillon, v) combinaison d'une pluralité d'amplitudes complexes déterminées lors de l'étape iv), à différentes bandes spectrales, pour calculer une fonction de pondération dans le plan 30 de l'échantillon, 3036800 4 vi) projection de ladite fonction de pondération dans le plan de détection, de façon à obtenir, pour chaque bande spectrale, une fonction de pondération dans ledit plan de détection, vii) mise à jour de chaque amplitude complexe de l'onde lumineuse transmise, selon 5 chaque bande spectrale, dans le plan de détection, à l'aide de ladite fonction de pondération déterminée, dans ladite bande spectrale, au cours de l'étape vi), viii) répétition des étapes iv à vii jusqu'à l'atteinte d'un critère d'arrêt. Ainsi, de façon alternative à la méthode exposée dans l'art antérieur, chaque itération comprend une propagation, dite rétro-propagation, du plan du détecteur vers le plan de l'échantillon, 10 d'une pluralité de d'amplitudes complexes, dans différentes bandes spectrales. Ces différentes amplitudes complexes sont combinées, dans le plan de l'échantillon, pour former une fonction de pondération. Cette combinaison, dans le plan de l'échantillon, d'une pluralité d'amplitudes complexes, correspondant à différentes plages spectrales, a pour effet de lisser le bruit affectant chacune d'entre elle, ce bruit étant la conséquence de la rétro-propagation. 15 La fonction de pondération est ensuite propagée du plan de l'échantillon vers le plan de détection, où elle est utilisée pour former une nouvelle estimation de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse à laquelle est exposé l'échantillon, et cela dans chaque bande spectrale considérée. Selon un mode de réalisation, la fonction de pondération, dans ledit plan de échantillon, est 20 calculée en calculant une somme pondérée de différentes amplitudes complexes, ou de leur logarithme, dans le plan de l'échantillon, de l'onde lumineuse transmise, les dites amplitudes complexes étant respectivement associées à différentes bandes spectrales. Selon un mode de réalisation, la fonction de pondération, dans ledit plan de échantillon, est déterminée en calculant une somme pondérée du module et/ou de l'argument de différentes 25 amplitudes complexes, dans le plan de l'échantillon, de l'onde lumineuse transmise, les dites amplitudes complexes étant respectivement associées à différentes bandes spectrales. Le procédé peut comprendre l'une quelconque des caractéristiques suivantes, prises isolément ou selon les combinaisons techniquement réalisables : 3036800 5 lors de l'étape iii), le module de l'amplitude complexe de l'onde transmise dans une bande spectrale est déterminé en normalisant l'intensité de l'image mesurée par le photodétecteur 16, dans ladite bande spectrale, par une intensité de référence mesurée par ledit photodétecteur en l'absence d'échantillon. 5 lors de l'étape iv), la détermination de l'amplitude complexe dans un plan de l'échantillon, dans une bande spectrale, est obtenue en appliquant un opérateur de propagation, selon un axe de propagation, à ladite amplitude complexe, définie dans la même bande spectrale, dans le plan de détection. lors de l'étape vi), ladite fonction de pondération, dans le plan de détection, est obtenue 10 en en appliquant un opérateur de propagation, selon l'axe de propagation, à la fonction de pondération, déterminée, dans le plan de l'échantillon, au cours de l'étape v). lors de l'étape vii), le module de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse transmise, selon une bande spectrale, dans le plan de détection, est calculé en fonction du module de ladite amplitude complexe initiale, dans ladite bande spectrale. 15 lors de l'étape vii), l'argument de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse transmise, selon une bande spectrale, dans le plan de détection, est calculé en fonction de l'argument de la fonction de pondération déterminée, dans ledit plan de détection et à ladite bande spectrale, au cours de l'étape vi). Lors de l'étape v), ladite fonction de pondération peut être commune à l'ensemble des bandes 20 spectrales. Alternativement, cette étape v) peut comprendre la détermination d'une pluralité de fonctions de pondérations, chaque fonction de pondération étant associée à une bande spectrale. Le procédé peut comporter, suite à l'étape viii), l'étape ix) : formation d'une image représentative du module ou de l'argument de l'amplitude complexe de l'onde, transmise par 25 l'échantillon, dans le plan de l'échantillon ou dans le plan de détection, selon au moins une bande spectrale (X,). Un autre objet de l'invention est un dispositif d'observation d'un échantillon comportant : une source de lumière, apte à illuminer ledit échantillon, 3036800 6 un photodétecteur, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le photodétecteur, le photodétecteur étant apte à former une pluralité d'images, dans un plan de détection, d'une onde lumineuse transmise par l'échantillon sous l'effet de l'illumination par ladite 5 source de lumière, chaque image étant obtenue selon une bande spectrale différente l'une de l'autre, un processeur, apte à traiter ladite pluralité d'images en exécutant des instructions, programmées dans une mémoire, mettant en oeuvre un procédé tel que précédemment décrit. 10 FIGURES La figure 1 représente un premier exemple de dispositif pour la mise en oeuvre de l'invention, l'échantillon analysé étant une lame d'anatomo-pathologie. La figure 2 représente un premier exemple de dispositif pour la mise en oeuvre de l'invention, l'échantillon analysé étant un liquide corporel comportant des particules. 15 La figure 3 représente le plan de détection, sur lequel une image est formée, ainsi que le plan de l'échantillon. Cette figure illustre également les liens entre les principales grandeurs mises en oeuvre dans les différents modes de réalisation exposés. La figure 4 représente un logigramme décrivant l'enchaînement des principales étapes d'un procédé itératif de reconstruction. 20 La figure 5 représente un deuxième exemple de dispositif pour la mise en oeuvre de l'invention, l'échantillon analysé étant une lame d'anatomo-pathologie. Les figures 6A, 6B et 6C représentent des images reconstruites, dans un plan de l'échantillon, dans une première bande spectrale, selon un algorithme de reconstruction itératif, ces images étant respectivement obtenues suite à un nombre d'itérations respectivement égal à 1, 3 et 10. 25 Les figures 7A, 7B et 7C représentent des images reconstruites, dans un plan de l'échantillon, dans une deuxième bande spectrale, selon un algorithme de reconstruction itératif, ces images étant respectivement obtenues suite à un nombre d'itérations respectivement égal à 1, 3 et 10. 3036800 7 Les figures 8A, 8B et 8C représentent des images reconstruites, dans un plan de l'échantillon, dans une troisième bande spectrale, selon un algorithme de reconstruction itératif, ces images étant respectivement obtenues suite à un nombre d'itérations respectivement égal à 1, 3 et 10. Les figures 9A, 9B et 9C représentent des images composites, obtenues par combinaison des 5 images reconstruites dans la première, la deuxième et la troisième bande spectrales, ces images correspondant respectivement à 1, 3 et 10 itérations. Ces images sont des images couleurs, représentées ici en noir et blanc. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS 10 La figure 1 représente un exemple de dispositif objet de l'invention. Une source de lumière 11 est apte à produire une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'échantillon 10 peut être un échantillon biologique que l'on souhaite caractériser. Il peut par 15 exemple s'agir d'une lame de tissu, ou lame d'anatomo-pathologie, comportant une fine épaisseur de tissu déposée sur une lame transparente 15. Par fine épaisseur, on entend une épaisseur de préférence inférieure à 100 um, et de préférence inférieure à 10 um, typiquement quelques micromètres. Un tel échantillon est représenté sur la figure 1. On observe que l'échantillon s'étend selon un plan Po, dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de 20 propagation Z. L'échantillon 10 peut également comporter un milieu 14, solide ou liquide, comportant des particules 1, 2, 3, 4, 5 à caractériser, un tel cas de figure étant représenté sur la figure 2. Il peut par exemple s'agir de particules biologiques dans un milieu de culture, ou dans un liquide corporel. Par particule biologique, on entend une cellule, une bactérie ou autre microorganisme, 25 un champignon, une spore...Le terme particules peut également désigner des microbilles, par exemple des microbilles métalliques, des microbilles de verre ou des microbilles organiques, couramment mises en oeuvre dans des protocoles biologiques. Il peut également s'agir de gouttelettes insolubles baignant dans un milieu liquide, par exemples des gouttelettes lipidiques dans une émulsion de type huile dans eau. Ainsi, le terme particule désigne à la fois des 30 particules endogènes, initialement présentes dans l'échantillon examiné, et des particules exogènes, ajoutées à cet échantillon avant l'analyse. 3036800 8 D'une façon générale, une particule a une taille avantageusement inférieure à 1 mm, voire inférieure à 500 um, et de préférence une taille comprise entre 0.5 um et 500 um. La distance entre la source de lumière et l'échantillon est de préférence supérieure à 1 cm. 5 Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. De préférence, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieure au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. Ainsi, de préférence, la lumière parvient à l'échantillon sous la forme d'ondes planes, ou pouvant être considérées comme telles. 10 La source de lumière 11 est apte à produire une pluralité d'ondes lumineuses incidentes 121 12,, chaque Me onde lumineuse 12, s'étendant selon une Me bande spectrale X. Les bandes spectrales 121...12, sont différentes les unes des autres, et, de préférence, ne se recouvrent pas. Dans l'exemple de dispositif représenté sur les figures 1 et 2, la source de lumière comporte 15 trois sources de lumières élémentaires de type diodes électroluminescentes (LED, acronyme du terme anglais Light Emitting Diode), 111, 112 et 113 émettant respectivement dans les bandes spectrales Xi = 450nm -465 nm ; X2 = 520nm - 535 nm ; X3 = 620nm -630 nm. De préférence, il n'y a pas de recouvrement entre les différentes bandes spectrales ; un recouvrement négligeable, par exemple concernant moins de 25%, mieux moins de 10% de l'intensité 20 lumineuse émise, est toutefois envisageable. Dans ces exemple, la source de lumière 11 comporte une diode LED multiple de marque Cree (marque déposée) et de référence XLamp (marque déposée) MC-E. Cette diode comporte quatre diodes électroluminescentes élémentaires adressables individuellement, dont trois seulement sont mises en oeuvre dans le cadre de cette invention, la quatrième étant une LED blanche. 25 D'autres configurations de sources lumineuses 11 sont possibles et décrites par la suite. Ces sources de lumières élémentaires peuvent être des sources temporellement cohérentes, comme des diodes Laser. La source de lumière 11 est de préférence ponctuelle. Elle peut notamment comprendre un diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 30 um et 1mm, de préférence entre 50 um et 500 um, par exemple 150 um. 3036800 9 Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à une source de lumière élémentaire 111, 112 ou 113, et dont une deuxième extrémité est placée face à l'échantillon. La source de lumière 11 comporte de préférence un diffuseur 17, disposé entre chaque source 5 de lumière élémentaire 111, 112 et 113 et le diaphragme 18. Les inventeurs ont constaté que l'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de chaque source élémentaire par rapport à l'ouverture du diaphragme. Autrement dit, l'utilisation d'un tel diffuseur permet d'utiliser une source de lumière élémentaire 11,, avec 1 i 3, légèrement décentrée par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. Dans cet exemple, le diaphragme est 10 fourni par Thorlabs sous la référence P150S. De préférence, chaque source de lumière élémentaire 11, est de faible largeur spectrale, par exemple inférieure à 100 nm, voire 20 nm. Le terme largeur spectrale désigne la largeur à mi-hauteur de la bande d'émission de la source de lumière considérée. Dans cet exemple, le diffuseur mis en oeuvre est un diffuseur 40° (Référence Light Shaping 15 Diffuser 40°, fabriqué par Luminit). La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11,, selon un cône d'angle a, a étant égal à 40° dans le cas présent. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 60°. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et un photodétecteur matriciel 16. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement à la lame 20 transparente 15 supportant l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 10° étant admise. Le photodétecteur 16 est un imageur, apte à former une image selon un plan de détection P. 25 Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un photodétecteur matriciel comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Les CMOS sont les photodétecteurs préférés car la taille des pixels est plus faible, ce qui permet d'acquérir des images dont la résolution spatiale est plus favorable. Dans cet exemple, le détecteur est un capteur CMOS commercialisé par Omnivision sous la référence 0V5647. Il s'agit d'un capteur CMOS RGB, comprenant 2592 x 1944 pixels, avec 30 un pas inter-pixels est de 1.4 um. La surface utile du photodétecteur est de 3.6 x 2.7 mm2. 3036800 10 Le plan de détection P s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. De préférence, le photodétecteur comprend une matrice de pixels, au-dessus de laquelle est disposée une fenêtre de protection transparente. La distance entre la matrice de pixels et la 5 fenêtre de protection est généralement comprise entre quelques dizaines de um à 150 ou 200 um. Les photodétecteurs dont le pas inter pixel est inférieur à 3 um sont préférés, afin d'améliorer la résolution spatiale de l'image. Le photodétecteur peut comprendre un système de renvoi d'image de type miroir vers une 10 matrice de pixels, auquel cas le plan de détection correspond au plan selon lequel s'étend le système de renvoi d'image. D'une façon générale, le plan de détection P correspond au plan dans lequel une image est formée. La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du photodétecteur 16 est, dans cet exemple, égale à 300 um. 15 D'une manière générale, et cela quel que soit le mode de réalisation, la distance d entre l'échantillon et les pixels du photodétecteur est préférentiellement comprise entre 50 um et 2 cm, de préférence comprise entre 100 um et 2 mm. On remarque l'absence d'optique de grossissement entre le photodétecteur 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de 20 chaque pixel du photodétecteur 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image. La figure 3 représente un échantillon 10, comportant des objets diffractants 32 disposés autour de zones non diffractantes ou peu diffractantes 31, qualifiées par la suite de zones pauvres. L'échantillon peut être solide, par exemple dans le cas d'un tissu déposé sur une lame 25 d'anatomo-pathologie. Il peut également être liquide, par exemple dans le cas d'un liquide corporel ou d'un milieu de culture cellulaire. Le photodétecteur 16 est apte à réaliser une image I, d'une onde lumineuse 22, transmise par l'échantillon 10 lorsque ce dernier est éclairé par une onde incidente 12,, dans la i'me bande spectrale X. La bande spectrale de l'onde lumineuse transmise 22, comporte tout ou partie de 3036800 11 la bande spectrale de l'onde incidente 12,. L'onde lumineuse 22, transmise par l'échantillon dans la bande spectrale X, résulte de l'interaction de l'échantillon 10 avec l'onde lumineuse incidente 12,, produite par la source de lumière élémentaire H,. Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12,, l'échantillon 10 peut engendrer une onde 5 diffractée, susceptible de produire, au niveau du plan de détection P, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12, transmise par l'échantillon. Ces interférences donnent lieu, sur l'image acquise par le photodétecteur, à une pluralité de figures de diffraction élémentaires, chaque figure de diffraction élémentaire comportant une zone centrale et plusieurs anneaux de diffraction concentriques. Chaque figure de diffraction 10 élémentaire est due à un objet diffractant 32 dans l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12,. Ainsi, l'onde lumineuse 22, dans une bande spectrale X, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel 16, peut comprendre : une composante résultant de la diffraction, précédemment décrite, cette composante 15 de diffraction pouvant notamment se traduire par la présence de figures de diffraction élémentaires sur le photodétecteur 16, chaque figure de diffraction élémentaire pouvant être associée à un élément diffractant 32 de l'échantillon. Un tel élément diffractant peut être une cellule, ou une particule ou tout autre objet diffractant 32 présent dans l'échantillon 10. 20 une composante résultant de l'absorption de l'onde lumineuse incidente 12, dans l'échantillon. Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image générée par le photodétecteur matriciel 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à 25 une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. On décrit ci-après les étapes d'un procédé itératif d'obtention d'une image de l'échantillon 10, en lien avec les figures 3 et 4. Pre étape : initialisation 30 Lors d'une première étape 100 d'acquisition d'images, chaque source de lumière élémentaire 11, de la source de lumière 11 est successivement activée, chaque source de lumière produisant 3036800 12 une onde lumineuse incidente (121, .. 12N), dans une bande spectrale (X1,...XN), selon un axe de propagation Z, en direction de l'échantillon 10. A chaque acquisition, le photodétecteur matriciel recueille une image 1, correspondant à une bande spectrale X, l'indice i, relatif à la bande spectrale, étant compris entre 1 et N, N étant le 5 nombre de bandes spectrales considérées. Dans l'exemple représenté sur les figures 1 et 2, la source de lumière 11 comporte trois sources de lumière élémentaires 111, 112 et 113, le photodétecteur recueille trois images li, 12, 13, correspondant respectivement aux bandes spectrales Xi, X2 et X3. L'échantillon est placé à une coordonnée axiale z = 0, selon l'axe de propagation Z. On désigne 10 par r une coordonnée radiale, c'est-à-dire une coordonnée dans un plan perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Le plan z = d correspond au plan de détection, tandis que le plan z = 0 correspond à un plan passant par l'échantillon, dit plan de l'échantillon et noté Po. Si Id(r)=I(r) désigne la valeur de l'intensité collectée, dans la bande spectrale X, par le pixel du détecteur de coordonnée radiale r dans le plan de détection, il est possible d'établir, à 15 l'aide de l'image l, une amplitude complexe ard (r) = a" I (r) de l'onde 22, au niveau dudit pixel de coordonnée r, dont le module peut être exprimé selon l'expression : la>>1 = \ii>) L'exposant d exprime le fait que l'amplitude complexe est déterminée selon le plan P de l'échantillon, d'équation z = d. L'amplitude complexe a" I (r) comporte un module et un 20 argument, de telle sorte que : d (r) = (r)e (r) où : (r) désigne le module de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse détectée par le photodétecteur, dans la Me bande spectrale X,, à une coordonnée radiale r dans le plan 25 de détection ; d (pi (r) désigne la phase de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse détectée par le photodétecteur, dans la Me bande spectrale X, et à ladite coordonnée radiale r dans plan de détection. 3036800 13 Or, le photodétecteur matriciel ne fournit aucune information relative à la phase de l'onde lumineuse. Aussi, lors de l'étape 100, on considère que emcil(r) est égal à une valeur initiale arbitraire, par exemple égale à 1. L'amplitude complexe a( r) peut être exprimée de façon normalisée, selon l'expression : 5 (r) Act (r) = 'line an où : Irne an désigne l'intensité moyenne de la lumière émise par la source de lumière 11 dans la Me bande spectale X ; cette intensité moyenne peut être déterminée expérimentalement, en disposant le photodétecteur 16 face à la source de lumière 11, 10 sans échantillon interposé entre l'un et l'autre, et en calculant la moyenne des pixels de l'image acquise par le photodétecteur 16. - Act (r) désigne l'amplitude complexe normalisée de l'onde lumineuse 22, détectée par le photodétecteur matriciel 16 dans la Me bande spectrale X. La normalisation peut également être réalisée en divisant l'amplitude complexe a" I (r) par 15 irne an ) ce terme représentant l'intensité lumineuse, à la coordonnée radiale r, mesurée en l'absence d'échantillon. L'amplitude complexe normalisée Act (r) comporte un module et un argument, de telle sorte que : A( r) = (r)e (r) 20 où : m( r) désigne le module de l'amplitude complexe normalisée Aq (r) - 1 1 d (f) (r) désigne la phase de l'amplitude complexe normalisée, qui est également la phase de l'amplitude complexe a" I (r). La première étape 100 permet d'attribuer à chaque amplitude complexe a" I (r) ou à chaque 25 amplitude complexe normalisée Act (r) une valeur initiale à partir de l'image I, détectée par le photodétecteur dans la Me bande spectrale X, de telle sorte que : d = (r) = \il>) 3036800 d I (r) A = 1 (r) = mi (r) = imean L'indice p correspond le rang de l'itération du procédé itératif décrit par la suite. L'étape 100 étant une étape d'initialisation, on attribue la valeur 1 à cet indice. 5 En adressant tout ou partie des pixels r du photodétecteur 16, on obtient une image complexe, ou champ complexe, de l'onde lumineuse 22, au niveau du plan du détecteur, cette image rassemblant les amplitudes complexes afi (r) ou les amplitudes complexes normalisées Act (r). Dans la suite de la description, on ne considère que l'amplitude complexe normalisée Act I (r) , sachant que le raisonnement s'applique également à l'amplitude complexe a( r). 10 Cette première étape est répétée pour chaque bande spectrale (Xi...XN) détectée par le photodétecteur. 2ime étape : rétro-propagation dans le plan Po de l'échantillon Durant une deuxième étape 200, on estime l'amplitude complexe normalisée 11?,p(r) de l'onde 15 22, à laquelle est exposé le détecteur, dans le plan de l'échantillon Po. Cette estimation est réalisée par rétro-propagation de l'amplitude complexe normalisée Ac p(r) , déterminée dans le plan de détection P, du plan de détection P vers le plan de l'échantillon Po. L'indice p désigne le rang de l'itération. Lors de la première itération (p = 1), on utilise l'amplitude complexe normalisée Acilp=i(r) = Act I (r) obtenue suite à la première étape 100. Lors des 20 itérations suivantes (p > 1), on utilise l'amplitude complexe résultant de l'itération précédente, comme cela sera détaillé par la suite. Selon les principes bien connus de la reconstruction holographique numérique, en effectuant un produit de convolution entre l'amplitude complexe de l'onde lumineuse 22,, relative à la bande spectrale X, déterminée dans le plan de détection z = d, et un opérateur de propagation 25 h(r,z), il est possible de reconstruire une amplitude complexe de cette même onde lumineuse en tout point de coordonnées (r,z) de l'espace, et en particulier dans le plan Po de l'échantillon. Autrement dit, l'amplitude complexe normalisée Aî p(r) de l'onde lumineuse 22, peut s'obtenir, à un point de coordonnées (r,z), à partir de Aîp=d(r), selon l'opération : 14 OU 3036800 15 A(r) = (r) * hAi(r, z - d), Où ha, désigne l'opérateur de propagation dans la bande spectrale X. Lorsque la reconstruction s'effectue selon le sens la propagation de la lumière, par exemple de l'échantillon vers le photodétecteur, on parle de propagation. Lorsque la reconstruction 5 s'effectue selon le sens inverse de la propagation de la lumière, par exemple du photodétecteur vers l'échantillon, on parle de rétro-propagation. L'opérateur de propagation peut notamment reposer sur le modèle de diffraction de Fresnel. Dans cet exemple, l'opérateur de propagation est la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : , z h(r,z) = 7.1z eJ`77,exp(jn- Az 10 où X désigne la longueur d'onde. Ainsi, ilî p=° (r) = 119,3)(r) = Ad (r) * hAi(r, -d) 1 if d (r - r')2 = - id - e Ai,p(r ) exp (i n- )dr' p où 15 r' désigne les coordonnées radiales dans le plan du photodétecteur (z = d), r désigne les coordonnées radiales dans le plan de reconstruction (z = 0), - X, désigne la longueur d'onde centrale de la bande spectrale considérée. A(r) est donc obtenu par rétro-propagation de Acil,p (r) selon la distance d séparant le plan de détection P du plan de l'échantillon Po. 20 Cette deuxième étape est répétée pour chaque bande spectrale (Xi...XN) émise par la source de lumière 11 ou, de façon plus générale, pour chaque bande spectrale (Xi...XN) respectivement associée à chaque image (11...IN) détectée par le photodétecteur 16. Il est possible, à ce stade, d'établir une image du module ou de la phase de l'amplitude A(r) complexe de chaque onde lumineuse 22, dans le plan de l'échantillon Po, l'amplitude 25 complexe étant normalisée ou non, en calculant la valeur de A(r) aux différentes coordonnées r dans le plan de l'échantillon. Chaque image du module de l'amplitude complexe A(r) est représentative de l'intensité de l'onde lumineuse au niveau de l'échantillon, tandis que chaque image de l'argument de 3036800 16 l'amplitude complexe A(r) est repréntative de la phase de l'intensité de l'onde lumineuse au niveau de d'échantillon. Lorsque, comme dans le cas présent, on met en oeuvre trois bandes spectrales centrées respectivement sur des longueurs d'onde dans le bleu, le vert et le rouge, l'information 5 contenue dans les trois images permet d'obtenir une image en couleur de l'échantillon. On note que l'amplitude complexe normalisée 11?p(r) est équivalente à une fonction de transmission de l'onde incidente 12, par l'échantillon 10 à la coordonnée radiale r. eme étape : détermination de la fonction de pondération Au cours de l'étape 300, on constitue, dans le plan de l'échantillon, une fonction de pondération, 10 notée Fpc)(r), de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon dans les différentes bandes spectrales X, considérées. Selon cet exemple, la fonction de pondération Fpc)(r), dans le plan de l'échantillon, peut être commune à chaque bande spectrale. Elle est obtenue en combinant les amplitudes complexes normalisées 11?,p(r) de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon, dans le plan Po de 15 l'échantillon et dans les différentes bandes spectrales X, Selon un exemple, la fonction de pondération est obtenue par une somme pondérée de chaque amplitude complexe déterminée lors de l'étape 200, dans le plan Po de l'échantillon, selon l'expression 1 Fp° (r) = 20 où 1 Fp (r) = K A3>p Où K est une matrice de pondération, de dimension 2N x2N, chaque terme k,,, de la matrice de 10 pondération représentant le poids associé soit à l'argument, soit à la phase, de l'amplitude complexe A ij3, p(r ) associée à la bande spectrale 4. Selon ce mode de réalisation, chaque coordonnée du vecteur Ai°, représente soit le module, soit l'argument, d'une amplitude complexe, A(r) dans une bande spectrale j. 15 De même que dans l'exemple, la fonction de pondération est de préférence normalisée, de telle sorte que chaque terme ep s'exprime sous la forme : 3 1 (r)1 = 3 ki'i 1AJ°'p(r)1 j=1 et 6 Arg (Fio,p (r)) = z,=14 arg(Aci,P (r)) 20 Quelle que soit le cas de figure, les coefficients d'une matrice de pondération peuvent être préalablement déterminés, soit de façon arbitraire, soit en se basant sur des essais expérimentaux. Par exemple, il est possible d'établir un coefficient de régression linéaire au entre deux 25 composantes i et j du vecteur A( r), en considérant une pluralité de positions axiales (r) dans 3036800 24 le plan de l'échantillon, de façon à obtenir une statistique suffisante. Le coefficient ku de la matrice de pondération est alors être déterminé en fonction de ce coefficient de régression linéaire au, éventuellement affecté d'un terme tenant compte de la dispersion autour du modèle de régression linéaire. Dans un tel cas de figure, la diagonale de la matrice de pondération peut 5 être constituée de coefficients k' égaux à 1. Cela permet d'établir une fonction de pondération ep , associé à la longueur d'onde X, prenant en compte la corrélation entre les différents termes du vecteur A( r). 10 Variantes concernant la source de lumière ou le photodétecteur. Dans les exemples donnés en lien avec les figures 1 et 2, la source de lumière 11, apte à émettre une onde lumineuse 12 dans différentes bandes spectrales, comporte trois sources de lumières élémentaires 111, 112, 113, prenant la forme de diodes électroluminescentes, émettant respectivement dans une première bande spectrale Xi, une deuxième bande spectrale X2 et une 15 troisième bande spectrale X3, les bandes spectrales étant différentes les unes des autres, et, de préférence, ne se recouvrent pas. La source de lumière 11 peut également comporter une source de lumière blanche 11,' placée en amont d'un dispositif de filtrage 19, par exemple une roue à filtres, apte à interposer un filtre de bande passante X, entre la source de lumière blanche et l'échantillon, comme représenté sur 20 la figure 5, de telle sorte que l'image I, formée par le photodétecteur 16 soit représentative de ladite bande passante X. Plusieurs filtres, présentant des bandes passantes différentes les unes des autres, sont alors successivement interposés entre la source de lumière 11,, et l'échantillon 10. Selon une variante, le dispositif de filtrage 19 peut également être un filtre tribande, définissant 25 une pluralité de bandes spectrales. Un exemple de filtre convenant à l'application est le filtre Tri-Band 458, 530 & 628 nm - Edmund Optics, définissant des bandes spectrales respectivement centrées sur les longueurs d'onde 457 nm, 530 nm et 628 nm. Cela permet une illumination de l'échantillon simultanément à l'aide de 3 longueurs d'onde. L'utilisation d'un diffuseur 17, tel que précédemment décrit, entre la source de lumière et le 30 diaphgrame 18 est préférable, et cela quel que soit le mode de réalisation. 3036800 25 Le photodétecteur 16 peut, comme précédemment décrit, être un photodétecteur matriciel RGB, ce qui permet d'acquérir successivement ou simultanément différentes des images différentes bandes spectrales Dans ce cas, la source de lumière peut être une source de lumière blanche 11'', auquel cas les différentes images peuvent être acquises simultanément. 5 Il peut également s'agir d'un photodétecteur 16 monochrome, auquel cas la source de lumière 11 est apte à générer, successivement, une onde lumineuse dans différentes bandes spectrales Dans une telle configuration, la source lumineuse comporte soit plusieurs sources de lumières élémentaires 111, 112, 113, soit un dispositif de filtrage 19, comme précédemment 10 décrit. Dans un tel cas de figure, l'échantillon est successivement exposé à des ondes lumineuses incidente 121.12,...12N, N étant le nombre de bandes spectrales considérées. Une image I, fflN), représentative de l'onde lumineuse 22, transmise par l'échantillon est alors acquise à chaque exposition. 15 Essais réalisés. Des essais ont été réalisés selon la configuration représentée sur la figure 1 et décrite ci-dessus. L'échantillon est une lame d'anatomo-pathologie, comportant une coupe de colon coloré par Hematoxyline Eosine Safran. La source de lumière est disposée à une distance égale à 5 cm de l'échantillon, cette distance 20 séparant le diaphragme 18 de l'échantillon 10. Les figures 6A, 6B et 6C représentent une image du module lep(r)1 de l'amplitude complexe A°1(r) de l'onde 221 transmise par l'échantillon, dans le plan Po de l'échantillon, dans la première bande spectrale X s'étendant entre 450 et 465 nm, ces images étant obtenues après un nombre d'itérations p respectivement égal à 1, 3 et 10. 25 Les figures 7A, 7B et 7C représentent une image du module 111?,p(r)1 de l'amplitude complexe de l'onde 222 transmise par l'échantillon, dans le plan Po de l'échantillon, dans la première bande spectrale X2 s'étendant entre 520 et 535 nm, ces images étant obtenues après un nombre d'itérations p respectivement égal à 1, 3 et 10. 30 Les figures 8A, 8B et 8C représentent une image du module Inp(r)1 de l'amplitude complexe np(r) de l'onde 223 transmise par l'échantillon, dans le plan Po de l'échantillon, dans la première bande spectrale X3 s'étendant entre 620 et 630 nm, ces images étant obtenues après 3036800 26 un nombre d'itérations p respectivement égal à 1, 3 et 10. On remarque que le niveau de gris moyen de ces images est plus important que le niveau de gris des images des figures 6A, 6B, 6C, 7A, 7B et 7C. Cela est dû au fait que l'échantillon à la coloration rouge-violet de l'échantillon. 5 Les figures 9A, 9B et 9C représentent respectivement la combinaison des images 6A-7A-8A, 6B- 7B-8B; 6C-7C-8C. Ces figures permettent d'avoir une représentation en couleur de l'échantillon, en prenant en compte simultanément les trois bandes spectrales Xi, X2 et X3 Sur chaque série d'images, on observe une augmentation du contraste en fonction du nombre 10 d'itérations. On peut également constater la formation d'images dont la résolution spatiale est satisfaisante lorsque le nombre d'itérations est inférieur ou égal à 10, ce qui limite le temps de calcul à quelques secondes. Le procédé est donc apte l'observation d'échantillons, sur champ large, et à cadences élevées. 15 II permet d'obtenir des images selon une ou plusieurs bandes spectrales, le rendant compatible avec les procédés de coloration couramment pratiqués dans le domaine de l'anatomocytopathologie. 20 REVENDICATIONS1. Procédé d'observation d'un échantillon (10), comportant les étapes suivantes : i) illumination dudit échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), apte à produire une onde lumineuse (12) se propageant selon un axe de propagation (Z), acquisition, à l'aide d'un photodétecteur (16), d'une pluralité d'images (11...IN) de l'échantillon, formées dans un plan de détection (P), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le photodétecteur (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (22i) transmise par l'échantillon sous l'effet de ladite illumination, chaque image (I,) étant acquise selon une bande spectrale (X,) différente l'une de l'autre, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : iii) détermination, à partir de chaque image acquise (I,) selon une bande spectrale (XI d'une amplitude complexe initiale (111(r)) de l'onde lumineuse transmise (22,), selon ladite bande spectrale, dans ledit plan de détection (P), iv) à partir de chaque amplitude complexe ( Agp=i(r),4(r)) établie dans ledit plan de détection (P), selon une bande spectrale (XI détermination d'une amplitude complexe (11?p(r)) de l'onde transmise (22i), selon chaque bande spectrale, dans un plan Po selon lequel s'étend l'échantillon, v) combinaison d'une pluralité d'amplitudes complexes (11?p(r)) déterminées lors de l'étape iv), à différentes bandes spectrales, pour calculer une fonction de pondération (Fp° (r), Fp° (r)),dans le plan de l'échantillon (Po), vi) projection de ladite fonction de pondération (Fp° (r), F° (r)), dans le plan de détection (P), de façon à obtenir, pour chaque bande spectrale (XI une fonction de pondération (F1 (r)) dans ledit plan de détection (P) , vii) mise à jour de chaque amplitude complexe (11(r)) de l'onde lumineuse (22,) transmise, selon chaque bande spectrale (XI dans le plan de détection (P), à l'aide de de ladite fonction de pondération (Fidp(r)) obtenue, dans ladite bande spectrale (XI au cours de l'étape vi), viii) répétition des étapes iv à vii jusqu'à l'atteinte d'un critère d'arrêt. 3036800 28 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la fonction de pondération, dans ledit plan de échantillon (Fpc)(r),Fpc)(r)) est calculée en calculant une somme pondérée de différentes amplitudes complexes (11?,p(r)), ou de leur logarithme, dans le plan de l'échantillon (P0), de l'onde lumineuse transmise (22i), les dites amplitudes complexes A(r) étant respectivement 5 associées à différentes bandes spectrales (X,). 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la fonction de pondération, dans ledit plan de échantillon (Fpc)(r),Fi?p(r)) est déterminée en calculant une somme pondérée du module (111?,p(r)l) et/ou de l'argument (arg(11?,p(r)) de différentes amplitudes complexes (11?,p(r)), 10 dans le plan de l'échantillon (P0), de l'onde lumineuse transmise (22i), les dites amplitudes complexes 11?,p(r) étant respectivement associées à différentes bandes spectrales (X,). 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape iii), le module (rnp(r)) de l'amplitude complexe (4(r)) de l'onde transmise (22,) dans une bande spectrale (X,) est déterminé en normalisant l'intensité (I,(r)) de l'image (I,) mesurée par le 15 photodétecteur 16, dans ladite bande spectrale, par une intensité de référence (I0(r)) mesurée par ledit photodétecteur 16 en l'absence d'échantillon. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape (iv), la détermination de l'amplitude complexe (A? p(r)) dans un plan de l'échantillon (P0), dans 20 une bande spectrale (XI est obtenue en appliquant un opérateur de propagation (h), selon un axe de propagation (Z), à ladite amplitude complexe (11(r)), définie dans la même bande spectrale (XI dans le plan de détection (P). 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape 25 vi), ladite fonction de pondération (Fpdi(r)), dans le plan de détection (P), est obtenue en en appliquant un opérateur de propagation (h), selon l'axe de propagation Z, à la fonction de pondération (Fpc)(r), Fpc)(r)), déterminée, dans le plan de l'échantillon (P0), au cours de l'étape v). 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape (vii), le module ( 111gp(r)1 )de l'amplitude complexe (11(r)) de l'onde lumineuse transmise 3036800 29 (22,), selon une bande spectrale (XI dans le plan de détection (P), est calculé en fonction du module (1111(r)l) de ladite amplitude complexe initiale ( il'ilp=i(r)), dans ladite bande spectrale (X,). 5 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape (vii), l'argument de l'amplitude complexe (11(r)) de l'onde lumineuse transmise (22,), selon une bande spectrale (XI dans le plan de détection (P), est calculé en fonction de l'argument de la fonction de pondération (Fidp(r)) déterminée, dans ledit plan de détection et à ladite bande spectrale (XI au cours de l'étape vi). 10 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape v), ladite fonction de pondération (Fpc)(r)) est commune à l'ensemble des bandes spectrales. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'étape v) comprend 15 la détermination d'une pluralité de fonctions de pondérations (Fpdi(r)), chaque fonction de pondération étant associée à une bande spectrale (X,). 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant, suite à l'étape viii), l'étape 20 ix) : formation d'une image représentative du module ou de l'argument de l'amplitude complexe (11(r),111?,p(r)1 ) de l'onde (22,), transmise par l'échantillon (10), dans le plan de l'échantillon (Po) ou dans le plan de détection (P), selon au moins une bande spectrale (X,). 25 12. Dispositif d'observation d'un échantillon (10) comportant : une source de lumière (11), apte à illuminer ledit échantillon, un photodétecteur (16), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le photodétecteur (16), le photodétecteur étant apte à former une pluralité d'images (11..1,...IN), dans un plan de 30 détection (P), d'une onde lumineuse (22,) transmise par l'échantillon sous l'effet de 3036800 30 l'illumination par ladite source de lumière, chaque image étant obtenue selon une bande spectrale (X,) différente l'une de l'autre, un processeur (20), apte à traiter ladite pluralité d'images en exécutant des instructions, programmées dans une mémoire (22), mettant en oeuvre un procédé selon l'une des 5 revendications 1 à 11. 10