Brevet FR3041505A1 — publié le 20170331

La présente invention concerne une composition acide, particulièrement une composition alimentaire acide, comprenant au moins une phycocyanine stable à pH acide. Les phycocyanines sont des colorants alimentaires qui confèrent aux produits auxquels elles sont incorporées une couleur bleue. La phycocyanine extraite de spiruline est aujourd'hui le seul pigment bleu naturel approuvé par l'US-FDA (FR Doc No: 2013-19550). Elle est vendue sous forme liquide, ou sous forme de poudre pour être utilisée comme pigment bleu dans l'alimentaire. Cette phycocyanine extraite de spiruline présente toutefois l'inconvénient d'être instable à pH acide, inférieur à 5, entrainant une perte de coloration et une précipitation qui limitent son utilisation. Dans le meilleur des cas, la perte de stabilité interviendra autour d'un pH de 4 (cf. spécifications techniques de la phycocyanine extraite de spiruline Linablue® ; http://www.lt-spl.cojp/busônessien/spirulina/linablue.tml). Or, de nombreuses compositions alimentaires acides existent, notamment des boissons gazeuses ou non gazeuses, pour lesquels la phycocyanine extraite de spiruline ne peut être employée, tant comme colorant alimentaire que pour ses propriétés antioxydantes. Il existe un besoin d'identifier de nouvelles phycocyanines stables à pH acide, particulièrement stable à pH acide inférieur à 4. La résistance ou la stabilité au pH sont mesurées ici comme une perte de coloration inférieure à 10%, après un minimum de 10 minutes d'exposition au pH acide. La stabilité au pH peut être mesurée par des autres méthodes telles que la caractérisation physique des phycocyanines au sein des compositions acides en fonction de temps. Ainsi, la présente invention concerne une composition acide, particulièrement une composition alimentaire acide, pouvant comprendre au moins une phycocyanine résistante aux pH acides. Avantageusement, ladite phycocyanine peut être une phycobiliprotéine dont l'apoprotéine peut comprendre au moins la protéine de SEQ ID NO 1 ou la SEQ ID 2 ou un variant de celles-ci. Selon l'invention, la phycocyanine pourra être en particulier une phycocyanine extraite d'une Galdieriaceae, plus particulièrement extraite de Galdieria. La composition acide selon l'invention, particulièrement la composition alimentaire acide pourra être soit solide ou pâteuse, soit liquide, en particulier une boisson gazeuse ou non. Par composition acide, particulièrement par composition alimentaire acide, on entend selon l'invention, une composition de pH inférieur ou égal à 4, 3041505 2 avantageusement de pH allant de 2 à 4, plus avantageusement allant d'environ 2,5 à 3,5. Les phycocyanines et allophycocyanines sont des phycobilliprotéines comprenant des sous-unités alpha et beta composés d'une apoprotéine lié de façon 5 covalente à un chromophore. Les différentes phycocyanines se distinguent essentiellement par la séquence de leurs apoprotéines des sous-unités alpha et beta. Selon l'invention la composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, peut comprendre une phycocyanine résistante aux pH acides dont l'apoprotéine de la sous-unité a peut comprendre la SEQ ID NO 1 (numéro 10 d'accession YP_009051179.1) et l'apoprotéine de la sous-unité [3 peut comprendre la SEQ ID 2 (numéro d'accession YP_009051180.1) ou des variants de celles-ci. Selon un mode préféré de l'invention, la composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, peut comprendre une phycocyanine résistante aux pH acides dont l'apoprotéine de la sous-unité a peut être constituée de la SEQ ID NO 1 15 (numéro d'accession YP_009051179.1) et l'apoprotéine de la sous-unité [3 peut être constituée de la SEQ ID 2 (numéro d'accession YP_009051180.1) ou des variants de celles-ci. Selon une autre forme de l'invention, la composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, peut comprendre en outre une allophycocyanine 20 associée à la phycocyanine. De manière avantageuse, l'apoprotéine de la sous-unité alpha de ladite allophycocyanine pourra comprendre la SEQ ID NO 3 (numéro d'accession YP_009051103.1) et l'apoprotéine de la sous-unité [3 pouvant comprendre la SEQ ID NO 4 (YP_009051104.1) ou des variants de celles-ci. 25 Selon un autre mode préféré de l'invention, l'apoprotéine de la sous-unité alpha de ladite allophycocyanine pourra être constituée de la SEQ ID NO 3 (numéro d'accession YP_009051103.1) et l'apoprotéine de la sous-unité [3 pourra être constituée de la SEQ ID NO 4 (YP_009051104.1) ou des variants de celles-ci. La composition en acides aminés d'une protéine peut conférer à ladite protéine 30 des propriétés différentes selon ladite composition en acides aminés. Les caractéristiques d'une protéine dépendent entre autres de sa composition en acides aminés et de la valeur de son point isoélectrique (pl). Le point isoélectrique est la valeur de pH de la solution à partir de laquelle la charge net de la protéine est nulle ou, autrement dit, le pH pour lequel la molécule est électriquement neutre et les protéines 35 tendent à s'attirer, s'agréger et précipiter. A un pH supérieur à leur point isoélectrique les protéines ont tendance à être chargée négativement et à se repousser. 3041505 3 L'étude comparative des points isoélectriques des différentes protéines via la méthode de calcul décrite par Patrickios et Yamasaki (Polypeptide Amino-AcidComposition and IsoelectricPoint .11. Comparison between Experiment and Theory. Analytical Biochemistry. 231, 1, 1995: 82-91.1995) montre une certaine corrélation 5 entre les calculs théoriques et la résistance pH acide observée de manière expérimentale. Il ressort des études de la Demanderesse que la résistance au pH acide de la phycocyanine pourrait être liée à la séquence en acides aminés de la sous unité a de ladite phycocyanine. On note d'ailleurs qu'à l'intérieur de la séquence en acides 10 aminés de la sous unité a de la phycocyanine, l'identité des 26 premiers acides aminés semblent particulièrement importante. C'est particulièrement le cas de la phycocyanine obtenue par culture de souches de microalgues des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, très particulièrement des souches Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium et Cyanidioschyzon merolae. 15 Ainsi avantageusement la composition selon l'invention peut comprendre au moins une phycocyanine dont au moins une apoprotéine, particulièrement celle la sous-unité a, peut présenter un point isoélectrique bas permettant une meilleure stabilité à pH acide. Par point isoélectrique bas on entend un point isoélectrique d'une valeur 20 inférieure ou égale à 3, préférentiellement inférieure ou égale à 2.5, plus préférentiellement inférieure ou égale à 2.2. Ainsi encore plus avantageusement la composition selon l'invention peut comprendre au moins une phycocyanine dont au moins une apoprotéine, particulièrement celle de la sous-unité a, peut présenter un point isoélectrique inférieur 25 ou égal à 3, préférentiellement inférieur ou égal à 2.5, plus préférentiellement inférieur ou égal à 2.2. Ainsi selon un mode particulier de l'invention la composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, peut comprendre au moins une phycocyanine dont l'apoprotéine de la sous-unité a peut présenter un point 30 isoélectrique bas, très particulièrement au moins une phycocyanine dont l'apoprotéine de la sous-unité a peut comprendre la SEQ ID NO 1, ou à un variant. Ainsi selon un autre mode particulier de l'invention la composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, peut comprendre au moins une phycocyanine dont l'apoprotéine de la sous-unité a peut présenter un point 35 isoélectrique bas, très particulièrement au moins une phycocyanine dont l'apoprotéine de la sous-unité a peut être constituée de la SEQ ID NO 1, ou à un variant. 3041505 4 Par variant, on entend selon l'invention une séquence protéique correspondant à une séquence de référence, en l'espèce la protéine représentée par la SEQ ID NO 1 ou la SEQ ID NO 2, ou la SEQ NO3, ou la SEQ N04, modifiée par une ou plusieurs substitutions, insertions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés de la séquence 5 de référence et qui présente les mêmes propriétés fonctionnelles que ladite séquence de référence. Les variants selon l'invention peuvent présenter une identité de séquence d'au moins 83 % pour les sous-unités a de la phycocyanine, et d'au moins 82% pour les sous-unités beta de la phycocyanine. 10 De même selon l'invention pour les allophycocyanines, les variants peuvent présenter une identité de séquence d'au moins 89 % pour les sous-unités a de l'allophycocyanine, et d'au moins 90% pour les sous-unités [3 de l'allophycocyanine. L'homme du métier sait comment mesurer une identité de séquences protéiques selon les méthodes usuelles à sa disposition, notamment le programme BLASTP 15 (http://blast ncb.nlm.nih.ciov/Blast.cciD. De même, l'homme du métier sait comment identifier des variants desdites séquences et vérifier qu'ils conservent les mêmes propriétés structurelles par simple essai de stabilité en pH acide, par exemple en pratiquant un essai comme l'essai présenté à l'exemple 3. 20 Il est connu de l'homme du métier qu'un polypeptide peut être modifié par substitution, insertion et/ou délétion d'au moins un acide aminé sans modifier de manière substantielle sa fonction. Par exemple, la substitution d'un acide aminé à une position donnée par un autre acide aminé chimiquement équivalent est un exemple connu de variation de séquence 25 qui n'affecte pas de manière substantielle les propriétés de la protéine. Ces substitutions "conservatrices" peuvent être définies comme des échanges à l'intérieur des groupes d'acides aminés suivants - Ala, Ser, Thr, Pro, Gly - Asp, Asn, Glu, Gln 30 - His, Arg, Lys - Met, Leu, Ile, Val, Cys et - Phe, Tyr, Trp Ainsi selon l'invention, pour les variants des apoprotéines des phycocyanines et/ou des allophycocyanines utilisables dans les compositions acides, issus de 35 substitutions, d'insertions ou de délétions, ils peuvent comprendre de 1 à 30 acides aminés de différence en nombre par rapport à la séquence dite de référence correspondante, particulièrement pour ce qui concerne les sous unités a et/ou [3 de la 3041505 5 phycocyanine, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les pourcentages d'homologie/identité énoncés ci-dessus. Plus précisément selon l'invention, - pour les variants des apoprotéines de la sous-unité a des phycocyanines 5 utilisables dans les compositions acides selon l'invention, issus de substitutions, d'insertions et/ou de délétions, ils peuvent comprendre de 1 à 27 acides aminés de différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les pourcentages d'identité énoncés ci-dessus ; 10 - pour les variants des apoprotéines de la sous-unité [3 des phycocyanines utilisables dans les compositions acides selon l'invention, issus de substitutions, d'insertions et/ou de délétions, ils peuvent comprendre de 1 à 30 acides aminés de différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les 15 pourcentages d'identité énoncés ci-dessus ; - pour les variants des apoprotéines de la sous-unité a des allophycocyanines utilisables dans les compositions acides selon l'invention, issus de substitutions, d'insertions ou de délétions, ils peuvent comprendre de 1 à 24 acides aminés de différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure 20 où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les pourcentages d'identité énoncés ci-dessus ; - pour les variants des apoprotéines de la sous-unité [3 des allophycocyanines utilisables dans les compositions acides selon l'invention, issus de substitutions, d'insertions et/ou de délétions, ils peuvent comprendre de 1 à 20 acides aminés de 25 différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les pourcentages d'identité énoncés ci-dessus. Très particulièrement selon l'invention, et quelle que soit la séquence de référence considérée (sous-unité a et/ou [3 de la phycocyanine et/ou sous-unité a 30 et/ou [3 de l'allophycocyanine) les variants desdites sous-unités peuvent comprendre avantageusement de 1 à 15 acides aminés de différence, de préférence de 1 à 10 acides aminés de différence, en particulier fou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 acides aminés de différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la 35 protéine de référence et les pourcentages d'identité énoncés ci-dessus. Selon l'invention, la phycocyanine ou ses variants, utilisables, seuls ou en mélange avec une allophycocyanine ou ses variants, dans des compositions acides, 3041505 6 particulièrement dans des compositions acides alimentaires, peut être obtenue par culture d'un organisme naturel exprimant naturellement la phycocyanine ou son variant recherché ou par culture d'un organisme transformé génétiquement pour exprimer la phycocyanine ou son variant recherché sélectionné sur sa capacité à produire ladite 5 phycocyanine ou ses variants. A titre d'organismes naturels exprimant naturellement une phycocyanine utilisable dans les compositions selon l'invention ou son variant recherché on citera les algues (ou microalgues) des ordres des Cyanidiales. L'ordre des Cyanidiales, englobe les familles des Cyanidiaceae ou des 10 Galdieriaceae, elles-mêmes subdivisées en les genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, auxquelles appartiennent entre autres les espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria. On citera 15 en particulier la souche Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919. Ainsi selon l'invention, la composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, peut comprendre une phycocyanine résistante aux pH acides pouvant provenir d'organismes naturels comme les algues ou microalgues relevant de 20 l'ordre des Cyanidiales, Particulièrement selon l'invention, la composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, peut comprendre une phycocyanine résistante aux pH acides pouvant provenir d'organismes naturels comme les algues ou microalgues pouvant appartenir aux familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, 25 Très particulièrement selon l'invention, la composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, peut comprendre une phycocyanine résistante aux pH acides pouvant provenir d'organismes naturels comme les algues ou microalgues pouvant appartenir aux genres Cyanidioschyzon, Cyanidium, Galdieria, Encore plus particulièrement selon l'invention, la composition acide, 30 particulièrement la composition alimentaire acide, peut comprendre une phycocyanine résistante aux pH acides pouvant provenir d'organismes naturels comme les algues ou microalgues pouvant appartenir aux espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, 35 Galdieria maxima, Galdieria partita, Galdieria sulphuraria. La forme préférée de la composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, selon l'invention peut comprendre une phycocyanine résistante aux 3041505 7 pH acides pouvant provenir d'une microalgue naturelle telle que Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium ou Cyanidioschyzon merolae. A titre d'organisme transformé pour exprimer la phycocyanine ou son variant recherché sélectionné sur sa capacité à produire ladite phycocyanine ou ses variants 5 peut citer un microorganisme transformé de manière à exprimer l'apoprotéine de SEQ ID NO 1 et/ou de SEQ ID NO 2 et/ou de SEQ ID NO 3 et/ou de SEQ ID NO 4, ledit microorganisme comprenant également les voies de biosynthèse nécessaires à la production du chromophore et à sa liaison à l'apoprotéine. On citera en particulier les levures comme microorganismes susceptibles d'être modifiés pour produire la 10 phycocyanine et/ou l'allophycocyanine utilisées dans les compositions alimentaires selon l'invention. L'homme du métier n'aura aucune difficulté à trouver dans l'art antérieur la description des procédés de culture des organismes naturels et/ou modifiés pouvant produire une phycocyanine utilisable dans les compositions selon l'invention. 15 Par exemple, la culture des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, appartenant à l'ordre des Cyanidiales, bien connue de l'homme du métier peut avantageusement être réalisée en mode mixotrophe, la lumière étant généralement nécessaire à la biosynthèse des pigments. Une telle culture industrielle peut être avantageusement réalisée en fermenteurs 20 de grands volumes de type 1 000 litres, 10 000 litres, 20 000 litres, 100 000 Litres. La culture peut être réalisée selon les conditions connues de l'homme du métier. Elle peut être réalisée en mode discontinu dit "batch", en mode semi-continu dit "fed batch" ou en mode continu. La phycocyanine utilisable dans les compositions selon l'invention peut être plus 25 particulièrement extraite d'une biomasse obtenue par culture d'une algue de l'ordre des Cyanidiales telle que définie précédemment cultivée en mixotrophie avec une lumière de longueur d'onde comprise entre 400 nm et 550 nm, avantageusement entre 420 nm et 500 nm, préférentiellement entre 430 et 480 nm, plus préférentiellement d'environ 455 nm. Il peut s'agir d'une lumière dite "blanche", de large spectre comprenant la 30 lumière de ladite longueur d'onde. Il peut aussi s'agir avantageusement d'une lumière dite de spectre étroit consistant en ladite longueur d'onde. Un tel procédé de préparation industrielle de biomasse de Cyanidiales en mixotrophie, et la biomasse ainsi obtenue, sont en particulier décrits dans la demande de brevet FR 15 59072 déposée le 25 septembre 2015. 3041505 8 Avantageusement selon l'invention par composition acide selon l'invention on entend toute composition imaginable qui présenterait un pH acide (inférieur à 4) et demandant à ce qu'une phycocyanine résistante au pH acide lui soit incorporée. Par composition alimentaire acide selon l'invention on entend toute composition 5 destinée à être ingérée par l'homme ou les animaux qui entre dans la définition précédente. Les compositions acides neutraceutiques doivent être considérées comme entrant dans la définition des compositions alimentaires acides au sens de l'invention. Les compositions alimentaires acides selon l'invention sont bien connues de l'homme du métier. Elles peuvent comprendre un véhicule pouvant comprendre des 10 constituants structurels associé à des composés actifs identifiés au regard de leurs apports nutritifs ou encore pour leurs propriétés bénéfiques à la santé de l'homme ou de l'animal. La composition alimentaire acide selon l'invention peut également comprendre des additifs alimentaires comme des agents de texture, des agents de saveur, des agents conservateurs, tous constituants bien connus de l'homme du 15 métier. Le véhicule peut comprendre de l'eau et/ou des protéines et/ou des matières grasses et/ou des fibres et/ou des sucres. Les constituants du véhicule peuvent avoir uniquement des propriétés structurelles mais ils sont généralement connus pour leurs apports nutritifs. Concernant les compositions acides autres qu'alimentaires selon l'invention elles 20 peuvent être entre autres pharmaceutiques, vétérinaires ou cosmétiques et comprendre en outre tout additifs et/ou actifs connus et utilisés dans ce genre de composition. La composition acide, particulièrement la composition alimentaire acide, selon l'invention peut être une composition solide ou pâteuse, ou une composition liquide. 25 Elle peut être prête à l'emploi ou bien sous forme d'un additif alimentaire que l'on ajoute à une préparation solide, pâteuse ou liquide pour préparer l'aliment qui pourra être ingéré. Dans une composition acide solide, liquide ou pâteuse selon l'invention, la phycocyanine peut être incorporée par exemple sous forme de poudre. Ladite 30 composition acide, particulièrement ladite composition alimentaire acide pourra alors se présenter sous toute forme usuelle connue telle que des crèmes, gels, mousses, pates, etc.. Particulièrement pour une composition alimentaire solide on peut citer notamment les gâteaux ou biscuits, les aliments secs à cuire, les poudres à diluer, les compositions gélatineuses solides ou "jelly", des mousses etc 35 Selon l'invention, ladite composition acide liquide pourra être une composition aqueuse dans laquelle la phycocyanine est dissoute. Elle peut se présenter sous la forme d'une composition prête à l'emploi ou comme un concentré liquide à diluer pour 3041505 9 son ingestion ou à ajouter à un aliment solide soit pour sa préparation, soit pour son ingestion, par exemple une composition liquide concentrée d'enrobage ou "topping" qui sera déposée sur un gâteau pour lui apporter sa couleur. Parmi ces compositions concentrées, on peut citer les sirops, alcoolisés ou non. 5 La composition acide liquide selon l'invention peut être de viscosité variable et comprendre ou non des additifs tels que des agents de viscosité, des gélifiants, et autres additifs structurants connus de l'homme du métier et usuels pour la préparation de compositions alimentaires liquides. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la composition alimentaire 10 liquide peut être une boisson acide, gazeuse ou non. On citera en particulier les sodas, les jus, les boissons pour sportifs, boissons d'effort, boissons de récupération, etc. Selon l'invention la teneur en phycocyanine dans les compositions selon l'invention pourra être conforme aux usages de l'homme du métier. Par exemple lorsque la phycocyanine sera utilisée pour colorer la composition 15 acide alors la teneur en phycocyanine dans ladite composition pourra être conforme aux usages de l'homme du métier en matière de coloration. Dans une composition acide liquide au sens de l'invention la teneur en phycocyanine peut être comprise entre 2,5 mg/L et 2500 mg/L, préférentiellement entre 25 mg/L et 300 mg/L. 20 Dans une composition liquide de type boisson prête à l'emploi, la teneur en phycocyanine peut être généralement comprise entre 25 mg/I et 300 mg/L, préférentiellement entre 50 mg/L et 100 mg/L. Dans une composition liquide concentrée à diluer pour son usage, comme un sirop, la teneur en phycocyanine peut être généralement comprise entre 250 mg/I et 25 2500 mg/I, préférentiellement entre 500 mg/L et 1000 mg/L. Dans une composition solide, la teneur en phycocyanine peut être généralement comprise entre 0,01 mg/g et 10 mg/g, préférentiellement entre 0,1 mg/g et 5,0 mg/g, très préférentiellement entre 0,25 mg/g et 2,5 mg/g. Un des avantages de l'invention réside comme on peut le voir dans les exemples 30 suivants dans le fait que la coloration apportée par les phycocyanines résistantes aux pHs acides présentent une meilleure tenue dans le temps. D'autres aspects et caractéristiques de l'invention pourront apparaitre à la lecture des exemples et des figures. La Figure 1 décrit les séquences en acides aminés des apoprotéines de la 35 phycocyanine et de l'allophycocyanine de Galdieria sulphuraria avec : SEQ ID NO 1 : YP_009051179.1 : Sous-unité a de la Phycocyanine ; SEQ ID NO 2 : YP_009051180.1 : Sous-unité [3 de la Phycocyanine ; 3041505 10 SEQ ID NO 3 : YP_009051103.1 : Sous-unité a de l'Allophycocyanine ; SEQ ID NO 4 : YP_009051104.1 : Sous-unité [3 de l'Allophycocyanine ; La Figure 2 présente la courbe de stabilité en fonction du pH des phycocyanines extraite de Galderia sulphuraria (UTEX2919) et de Cyanidioschyzon merolae (ACUF 5 199) dont la séquence de l'apoprotéine consiste en la SEQ ID NO 1 ou un variant, sur laquelle est rapportée la courbe de stabilité de la phycocyanine extraite de spiruline Linablue®. (-^-) : Phycocyanine de Galdieria sulphuraria (UTEX#2919) (---X---) : Phycocyanine de Cyanidioschyzon merolae (ACUF 199) 10 (--o*--) : Lina Blue® : Phycocyanine de Spirulina platensis (Arthrospira platensis) (données obtenues sur le site http://www.dltspl.colp/businessien/spirulina/linablue.html), avec indication des pH auxquels une précipitation de la Phycocyanine apparait. La Figure 3 représente l'évolution de la couleur d'une boisson acide comprenant 15 de la phycocyanine au cours du temps. SO, S2, S4 et S6 : semaine 0, 2, 4, et 6 EXEMPLES Exemple 1 : Production et extraction de la phycocyanine de Galdieria sulphuraria UTEX#2919 20 Matériel et méthodes Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919 Milieu de culture Mixotrophie : 30 g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2504, 1g/L KH2PO4, 716mg/L Mg504, 44mg/L CaCl2, 3 mL/L de solution stock Fe-EDTA (Fe504 à 6,9g/L et d'EDTA-Na2 à 25 9,3g/L) et 4 ml/L de solution de trace métal (3,09g/L EDTA-Na2 ; 0,080g/L Cu504,5H20 ; 2,860g/L H3B03 ; 0,040g/L NaVO3, 4H20 ; 1,820g/L MnC12 ; 0,040g/L CoC12,6H20 ; 0,220g/L Zn504,7H20 ; 0,017g/L Na2Se03 ; 0,030g/L (NH4)6Mo7024, 4H20). Conditions de culture : 30 Les cultures sont réalisées dans des réacteurs de 1 à 2 L de volume utile avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le pH de la culture est régulé via l'ajout de base (solution d'ammoniaque 14% (wNH3/w) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique 4N). La température de culture est fixée à 37°C. La culture est illuminée par des contres pâles équipée d'un système de LED blanche ou de LED 35 bleue (455 nm) de façon similaire à ce qui est décrit dans le brevet PCT/FR2014/050891. Le suivi de la croissance des cellules est effectué à différent 3041505 11 temps par mesure d'absorbance à 800 nm. Et une estimation de la masse sèche est réalisée par filtration. - Résultats Les performances de la culture en fin de croissance sont résumées dans le 5 tableau 1 suivant Mixotrophie Temps (h) 160 biomasse sèche (g/L) 20 Teneur en phycocyanine (mg/g biomasse sèche) 40 Tableau 1 L'estimation de la teneur intracellulaire en phycocyanine par gramme de matière sèche a été réalisée grâce à la méthode d'extraction et de dosage décrite par Moon et collaborateur [Moon et al., Korean J. Chem. Eng., 2014, 1-6] en remplaçant le tampon phosphate par de l'eau. 10 Exemple 2 : Extraction des phycocyanines Les souches Galdieria sulphuraria (UTEX#2919) et/ou Cyanidioschizon merolae (ACUF199) ont été cultivées dans les conditions de l'exemple 1. La phycocyanine est alors extraite selon une modification du protocole décrit par Moon et al., 2014 (op.citus). Cette modification consiste à remplacer le tampon 15 phosphate utilisé pour solubiliser la phycocyanine par de l'eau déminéralisée. On obtient alors un extrait (par ailleurs appelé "extrait de phycocyanines" ou "extrait brut") qui comprend, outre la phycocyanine recherchée, d'autres protéines hydrosolubles. Il existe plusieurs qualités d'extrait de phycocyanine possible selon les modes d'extraction et/ou de purification utilisés. Par exemple un extrait brut contiendra 20 une quantité de protéines hydrosoluble, autre que la phycocyanine, supérieure à celle trouvée dans un extrait purifié. Par extrait purifié on comprend un extrait brut dont une partie des protéines hydrosoluble aura été retirée grâce des méthodes d'ultra-filtration, filtration par fibres creuses, ou de chromatographie à échange d'ions connues de l'homme du métier, tout en conservant la phycocyanine. 25 L'indice de pureté est classiquement exprimé en faisant le rapport d'absorbance de la solution à 618 nm (absorbance spécifique de la phycocyanine) sur celui de la valeur d'absorbance à 280 nm spécifique des acides aminés aromatiques donnant une idée du taux de protéines globales. Plus ce rapport est bas, plus il y a de protéines autres que la phycocyanine en solution. 30 L'extrait brut a été purifié en utilisant le système de filtration à flux tangentiel KrosFle de chez Spectrue Labs. 3041505 12 Indice de Pureté Abs 618 nm/ Abs 280 nm Extrait brut de phycocyanine 0,54 Extrait purifié 2,12 Tableau 2. Mesure d'un indice de pureté d'un extrait de phycocyanine avant et apres purification. Exemple 3 : Etude de la stabilité de la phycocyanine extraite des souches Galdieria suiphuraria (UTEX#2919) et Cyanidioschizon merolae (ACUF199) et 5 Spirulina (Arthrospira) platensis en fonction du pH Les souches Galdieria suiphuraria (UTEX#2919) et Cyanidioschizon merolae (ACUF199) ont été cultivées dans les conditions de l'exemple 1. Les tests sont réalisés en prenant comme référence les données du produit commercial LinaBlue® (http://www.dlt-spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.html) de 10 la société DIC Lifetec Co, Ltd. (Tokyo, Japon) qui est une phycocyanine extraite de Spirulina (Arthrospira) platensis. Ces essais ont été réalisés avec les phycocyanines préparées à l'exemple 2 et présentant un indice de pureté de 2,12. La mesure de couleur bleue se fait par mesure d'absorbance à 618 nm grâce à un spectrophotomètre ultraspec 2100 pro 15 (Amersham). La perte de couleur exprimée en pourcentage se calcule de façon relative à la mesure de l'absorbance de l'échantillon dans les conditions de référence (pH 6). Pour le test de résistance en condition acide, le pH est abaissé de façon graduelle par ajout d'une solution d'acide citrique à 5% (Sigma 251275) à la préparation de 20 phycocyanine. Pour chaque valeur de pH un échantillon de la solution de phycocyanine est prélevé et son absorbance mesurée à 618 nm, 10 minutes après la baisse du pH à la valeur voulue. Les résultats de ces tests sont présentés à la Figure 2 : La phycocyanine extraite de Galdieria suiphuraria (UTEX#2919) [(- ^ -)] 25 présente une très bonne résistance au pH comparativement à celle de la Spiruline, avec moins de 10 % de perte de pigmentation jusqu'à pH 2.75 (98,25 % de sa coloration à pH 3, 92,4% à pH 2.75), la perte devenant plus importante à partir de pH 2,5 (79% à pH 2,5 ; 75% à pH 2,25 ; 46% à pH 2). La phycocyanine extraite de la souche Cyanidioschizon merolae (ACUF 199) 30 [(---X---)] présente une bonne résistance au pH comparativement à celle de la Spiruline, avec encore plus de 90 % de sa coloration à pH 3, 70 % à pH 2.75 ; 40 % à pH 2,5 ; 23 % à pH 2,25 ; 20 % à pH 2. 3041505 13 La phycocyanine extraite de la souche Spirulina platensis [(--o*--)] ne présente plus que 90 % de sa coloration à pH 4, 80 % à pH 3,8 ; 60 % à pH 3,6 ; 38 % à pH 3,4. La phycocyanine extraite de Spirulina platensis commence à précipiter à partir de pH 3,8. 5 En conclusion : Les phycocyanines de Galdieria sulphuraria ou de Cyanidioschyzon merolae sont plus résistantes au pH acide que celle extraite de la Spiruline. Exemple 4 - Analyse comparative des séquences des apoprotéines de phycocyanine et allophycocyanine de différentes microalgues et mesure de leurs 10 points isoélectriques Afin d'identifier une cause possible pour l'augmentation de la résistance au pH acide, la comparaison des séquences des sous-unités a et [3 des phycocyanines et allophycocyanines produites par différents microorganismes, particulièrement des microalgues a été réalisée à l'aide du programme BLASTP dont l'utilisation est bien 15 connue de l'homme du métier, sur la base des séquences publiées accessibles (voir N° d'accession) dans les bases de données. La comparaison est faite par rapport à la séquence de l'apoprotéine de la sous-unité correspondante de la souche Galdieria sulphuraria. Dans le même temps la valeur du point isoélectrique des apoprotéines des sous-unités 20 a et [3 des phycocyanines et allophycocyanines dont la comparaison des séquences a été réalisée a été déterminée par la méthode de calcul décrite par Patrickios et Yamasaki (1995). La phycocyanine et l'allophycocyanine produites par la souche Galdieria sulphuraria servent de référence dans ces études. 25 Résultats Les résultats de comparaisons de séquence et du calcul des pls sont présentés dans les tableaux 3 et 4 suivants : Sous-unité a de la Phycocyanine de (# accession) aa/aa (%Identité) pl Galdieria sulphuraria (YP_009051179.1) 162/162 (100%) 2.115 Cyanidium caldarium (P00306.3) 159/162 (98%) 2.1 Cyanidioschyzon merolae (NP_848986.1) 135/162 (83%) 2.129 Arthrospira maxima CS328 (EDZ96896.1) 119/162 (73%) 3.657 Spirulina Platensis (P72509.2) 119/162 (73%) 3.657 Arthrospira jenneri fz (AEV40872.1) 118/162 (73%) 3.657 Cyanobacterium stanieri PCC 7202 (AFZ46322.1) 123/162 (76%) 3.327 Halothece sp. PCC 7418 (WP_015227201.1) 130/162 (80%) 3.786 3041505 14 Geitlerinema sp. PCC 7407 (VVP_015173541.1) 120/162 (74%) 3.936 Nostoc sp. PCC 7120 (WP_010994705.1) 130/162 (80%) 3.978 Sous-unité p de la Phycocyanine de (# accession) aa/aa (%Identité) pl Galdieria sulphuraria (YP_009051180.1) 171/171 (100%) 4.112 Cyanidium caldarium (AAB34027.2) 169/171 (99%) 4.112 Cyanidioschyzon merolae (NP 848987.1) 141/171 (82%) 4.112 Arthrospira maxima CS328 (EDZ96897.1) 130/171 (76%) 3.966 Spirulina plantensis (1HA7 B) 130/170 (76%) 3.966 Arthrospira jenneri fz (AEV40871.1) 130/171 (76%) 4.062 Cyanobacterium stanieri PCC 7202 (AFZ46321.1) 135/171 (79%) 3.966 Halothece sp. PCC 7418 (WP 015227202.1) 133/171 (78%) 4.074 Geitlerinema sp. PCC 7407 (VVP 015173542.1) 138/171 (81%) 4.12 Nostoc sp. PCC 7120 (BAB72486.1) 141/170 (83%) 4.159 Tableau 3. Comparaisons des séquences des apoprotéines alpha et beta de la phycocyanine de différents organismes. Résultat de Blast indiquant le pourcentage d'identité entre la séquence protéique de Galdieria sulphuraria et les séquences des autres souches pour la chaine alpha (A) et la chaine beta (B). Le point isoélectrique de 5 chaque protéine est indiqué (Patrickios et Yamasaki, 1995) Sous-unité a de l'Allophycocyanine de (# accession) aa/aa (%Identité) pl Galdieria sulphuraria (YP_009051103.1) 161/161 (100%) 3.9 Cyanidium caldarium (AAA20110. 1) 158/161 (98%) 3.932 Cyanidioschyzon merolae (NP_849064.1) 144/161 (89%) 3.989 Arthrospira jenneri (AEV40869.1) 131/161 (81%) 4.008 Arthrospira platensis (CAA65141.1) 131/161 (81%) 4.054 Cyanobacterium stanieri PCC 7202 (AFZ46138.1) 125/161 (78%) 3.997 Halothece sp. PCC 7418 (WP_015226049.1) 133/161 (83%) 3.724 Geitlerinema sp. PCC 7407 (VVP_015172402. 1) 137/161 (85%) 4.054 Nostoc sp. PCC 7120 (WP_010994198.1) 130/161 (81%) 4.041 Sous-unité p de l'Allophycocyanine de (# accession) aa/aa (%Identité) pl Galdieria sulphuraria (YP_009051104.1) 161/161 (100%) 3.502 Cyanidium caldarium (AAB01577.1) 158/161 (98%) 3.657 Cyanidioschyzon merolae (NP_849065.1) 145/161 (90%) 3.298 Arthrospira jenneri (AEV40870.1) 138/161 (86%) 3.502 Arthrospira platensis (BAA19986.1) 141/161 (88%) 3.532 Cyanobacterium stanieri PCC 7202 (AFZ46566.1) 141/161 (88%) 3.532 Halothece sp. PCC 7418 (WP_015226048.1) 138/161 (86%) 3.502 3041505 15 Geitlerinema sp. PCC 7407 (VVP_015172403.1) 140/161 (87%) 3.502 Nostoc sp. PCC 7120 (WP_010994199.1) 138/160 (86%) 3.657 Tableau 4. Comparaisons des séquences des apoprotéines alpha et beta de l'allophycocyanine de différents organismes. (A) Résultat de Blast indiquant le pourcentage d'identité entre les séquences protéiques de Galdieria sulphuraria et les séquences des autres souches pour la chaine alpha (A) et la chaine beta (B). Le point 5 isoélectrique de chaque protéine est indiqué (Patrickios et Yamasaki, 1995). L'analyse des pourcentages d'identité entre la séquence l'apoprotéine de la sous-unité alpha de référence de Galdieria sulphuraria et les séquences d'apoprotéines des autres organismes analysés permet de constater que lesdites apoprotéines de la sous-unité alpha de Cyanidium caldarium (P00306.3) et de Cyanidioschyzon merolae 10 (NP_848986.1), outre celle de Galdieria sulphuraria (YP_009051103.1) entrent dans les critères retenues par l'invention pour être utilisées dans les compositions acides selon l'invention. En conclusion : Il est clair que les phycocyanines résistantes aux pHs acides (point isoélectrique 15 d'une valeur inférieure à 3) ont un pourcentage plus élevé d'identité de leurs sous- unités a par rapport à la séquence de Galdieria sulphuraria. Exemple 5 : Stabilité dans le temps dans une boisson Le test de stabilité de la phycocyanine, extraite de la souche UTEX#2919, en milieu acide dans le temps a été réalisé en ajoutant la phycocyanine dans une boisson de 20 type limonade (telle que décrite dans l'exemple 6 : boisson 1) de pH 2,95. Après ajout de 0,025 %o de phycocyanine dont la séquence de l'apoprotéine consiste en un variant de la SEQ ID NO 1, la boisson a été exposée à un cycle jour/nuit (16/8 en heure) avec une lumière artificielle pendant 6 semaines, à température ambiante. Des prélèvements réguliers sont réalisés au cours du temps afin de mesurer 25 l'absorbance à 618 nm. Une aliquote est prélevée aux semaines 0 (SO), 2 (S2), 4 (S4), et 6 (S6) et l'absorbance à 618 nm mesurée au spectrophotomètre ultraspec 2100 pro (Amersham) afin de définir le point 100% de la couleur. La couleur résiduelle est exprimée en pourcentage de la valeur initiale de référence. La Figure 3 montre les résultats de cette expérience. On constate une perte de couleur 30 régulière au cours du temps lors d'une exposition durable à la lumière. Toutefois après 6 semaines d'exposition il reste encore plus de 60% de la couleur. Exemple 6 : Exemples de boissons acides sous forme liquide comprenant de la phycocyanine Les boissons contenant de la phycocyanine pourront avoir la composition suivante : 35 Boisson 1 - Boisson de type Soda : - Eau gazeuse qsp 1L - Sucres 70 g 3041505 16 1,5 g - Acide citrique 4 à8 g - Arome naturel biologique qsp 100 mg de - Extrait de Phycocyanine obtenu à l'exemple 2 Phycocyanine 5 Le pH de cette boisson est de 2,95 Boisson 2 - Boisson diététique pour Sportifs : - Eau de source qsp 1L - Glucose 20 g - Fructose 10 g 10 - Acide Citrique 2,7 g - Citrate de Sodium 1,87 g - Citrate de Potassium 0,327 g - Chlorure de Magnésium 2,5 mg - Chlorure de Calcium 3 mg 15 - Arome naturel biologique 4 g - Extrait de Phycocyanine obtenu à l'exemple 2 qsp 150 mg de Phycocyanine Le pH de cette boisson est de pH 3,5 Exemple 6 : Boisson acide sous forme de poudre à dissoudre comprenant 20 de la phycocyanine - Sucres 70 à 100 g - Acide citrique 1 à 1,5 g - Arome naturel biologique 4 à 8 g - Extrait de Phycocyanine obtenu à l'exemple 2 qsp 250 mg de 25 Phycocyanine La poudre (75 à 110g) ainsi préparée peut être dissoute dans 1L d'eau pour obtenir une boisson acide colorée en bleu. Exemple 7 : Composition acide solide comprenant de la phycocyanine : confiserie acide : 30 - Eau : qsp 1 kg - Sucres : 800 g - Acide citrique : 1 à 2 g - Extrait de Phycocyanine obtenu à l'exemple 2 qsp 2500 mg de Phycocyanine 35 REVENDICATIONS1 Composition acide, particulièrement une composition alimentaire acide, comprenant au moins une phycocyanine résistante aux pH acides que ladite phycocyanine étant une phycocyanine dont au moins une apoprotéine, particulièrement celle la sous-unité a, présente un point isoélectrique inférieur à 3. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite phycocyanine est une phycobiliprotéine dont l'apoprotéine comprend au moins la protéine de SEQ ID NO 1 ou la SEQ ID 2 ou un variant de celles-ci. 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'apoprotéine de la sous-unité a de ladite phycocyanine comprend la SEQ ID NO 1 (numéro d'accession YP_009051179.1) et l'apoprotéine de la sous-unité p de ladite phycocyanine comprend la SEQ ID 2 (numéro d'accession YP_009051180.1) ou des variants de celles-ci. 4. Composition selon la revendications 3, caractérisée en ce que ladite apoprotéine de la sous-unité a est constituée de la SEQ ID NO 1 (numéro d'accession YP_009051179.1) et l'apoprotéine de la sous-unité E3 est constituée de la SEQ ID 2 (numéro d'accession YP_009051180.1) ou des variants de celles-ci. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une allophycocyanine associée à la phycocyanine. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'apoprotéine de la sous-unité a de ladite allophycocyanine comprend la SEQ ID NO 3 (numéro d'accession YP_009051103.1) ou des variants de celles-ci et l'apoprotéine de la sous-unité 13 de ladite allophycocyanine comprend la SEQ ID NO 4 (YP_009051104.1) ou des variants de celles-ci. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'apoprotéine de la sous-unité a de l'allophycocyanine est constituée de la SEQ ID NO 3 (numéro d'accession YP_009051103.1) ou des variants de celles-ci et l'apoprotéine de la sous-unité p est constituée de la SEQ ID NO 4 (YP_009051104.1) ou des variants de celles-ci. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la phycocyanine est une phycocyanine extraite d'une algue (ou microalgue) relevant de l'ordre des Cyanidiales. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la phycocyanine est une phycocyanine extraite d'une algue (ou microalgue) appartenant à la famille des Cyanidiaceae ou à la famille des Galdieriaceae. 3041505 18 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la phycocyanine est une phycocyanine extraite d'une algue (ou microalgue) appartenant aux genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria. 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la phycocyanine est une phycocyanine extraite d'une algue (ou microalgue) appartenant aux espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita, Galdieria sulphuraria, préférentiellement des espèces Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium, et Cyanidioschyzon merolae. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est solide, pâteuse ou liquide. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle a un pH inférieur ou égal à 4, avantageusement de pH allant de 2 à 4, plus avantageusement allant d'environ 2,5 à 3,5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que la teneur en phycocyanine est comprise entre 2,5 mg/L et 2500 mg/L dans le cas d'une composition liquide, ou comprise entre 0,25 mg/g et 2,5 mg/g dans le cas d'une composition solide. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que ladite phycocyanine est une phycocyanine dont au moins une apoprotéine, particulièrement celle la sous-unité a, présente un point isoélectrique inférieur à 2.5, plus préférentiellement inférieur à 2.2. 5 1012. 13. 15 14. 20 15.