Brevet FR3047081A1 — publié le 20170728

PROCÉDÉ DE DIAGNOSTIC DE LA CIVD DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique et à un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique. La présente invention se rapporte également à un procédé de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique. La présente invention trouve une application notamment dans le domaine médical et vétérinaire. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentées à la fin du texte. Etat de la technique Le choc septique est un syndrome caractérisé par une réaction inflammatoire de l'hôte en réponse à un agent pathogène responsable d'une hypotension résistante à l'expansion volémique et nécessitant l'introduction de vasopresseurs (noradrénaline) et s'accompagnant de défaillances viscérales. La coagulation est activée de manière constante au cours du choc septique et participe à la défense de l'hôte. Toutefois, cette activation peut être « dérégulée » avec une thrombopénie, une stimulation leucocytaire et endothéliale ainsi qu'une consommation des facteurs de la coagulation et de ses inhibiteurs, se traduisant par des microthromboses et responsable d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). L'association entre CIVD, gravité et défaillance multiviscérale est connue de longue date, rationnel de l'utilisation de traitements anticoagulants au 3047081 2 cours du choc septique en plus des traitements étiologiques et de défaillances d'organes. Toutefois, les études cliniques portant sur des traitements ayant un impact sur la coagulation - qui n'ont jamais ciblé spécifiquement les patients présentant une CIVD - se sont révélées 5 décevantes car ne permettant pas d'améliorer le pronostic des patients. À l'échelle de la France, 80000 cas de sepsis sont observés chaque année, défini comme une réponse inflammatoire systémique que l'organisme développe en réponse à l'invasion par un micro-organisme pathogène, et qui se traduit par une hypoperfusion des organes et une 10 dette en oxygène, pouvant évoluer vers un tableau de défaillance multiviscérale. L'hypotension artérielle y est persistante malgré un remplissage vasculaire adapté et nécessite le recours à des vasopresseurs (noradrénaline, adrénaline). Il s'agit donc d'une maladie grave et assez fréquente. 15 Cet état est lié à une activation cellulaire intense via l'induction de cytokines pro-inflammatoires et des modifications phénotypiques de l'endothélium vasculaire, qui prend alors un caractère pro-adhésif, pro-inflammatoire et pro-thrombotique. Il a été montré dans l'état de la technique, qu'après invasion par 20 un agent pathogène, la réponse de l'hôte se fait par la mise en jeu des systèmes d'immunité innée et d'immunité adaptative. L'immunité innée constitue la première ligne de défense, en libérant un grand nombre de chimiokines et cytokines (Aziz et al., 2013). Les polynucléaires neutrophiles (PNN) sont des cellules de 25 l'immunité innée. Ces cellules ont longtemps été considérées comme des cellules ayant pour seule fonction la phagocytose des pathogènes extracellulaires. Au cours des dernières années, l'évolution des connaissances sur la physiologie et la place des PNN a progressé dans un schéma plus complexe associant immunité innée, immunité adaptative, et 30 hémostase (Môcsai, 2013). Si les PNN ont un rôle majeur dans la défense antibactérienne par l'intermédiaire de la phagocytose. Il a été démontré depuis le début des années 2000 qu'ils jouent également un rôle dans la 3047081 3 protection vis-à-vis des germes intracellulaires (virus, mycobactéries) et dans la régulation de la réponse immunitaire adaptative, en particulier par l'interaction avec les lymphocytes B de la zone marginale au sein de la rate. Ainsi, les PNN sont capables de relarguer le contenu de leur noyau, 5 ADN et histones, formant un maillage qui supporte des enzymes comme la myéloperoxidase (MPO) ou l'élastase. Ces structures, décrites pour la première fois en 2004, sont appelées NETs (Neutrophil Extracellular Traps) et sont capables de capturer des pathogènes dans leur réseau macromoléculaire (Brinkmann et al., 2004). Deux mécanismes de NETose 10 sont décrits : l'un aboutit au suicide cellulaire et dure quelques heures, l'autre, la NETose "vitale", plus rapide permet la survie du PNN sous forme anucléée capable de phagocytose, fonction qui ne dépend pas de la synthèse de nouvelles protéines donc de la présence d'un noyau (Fuchs et al., 2007). 15 Les deux mécanismes s'accompagnent de modifications morphologiques des PNN décrites en microscopie électronique après induction de NETose in-vitro par du PMA ou phorbol-myristate-acetate (Brinkmann and Zychlinsky, 2012). D'abord, la chromatine se décondense, le noyau perd ses lobulations, le cytoplasme se dégranule et les NETs sont 20 expulsés par la cellule. La voie de la NETose vitale semble impliquée au cours des infections par bactéries à Gram-positif. Les NETs sont relargués à partir des vésicules contenant la chromatine décondensée et les protéines anti-bactériennes. Les NETs exercent une fonction antimicrobienne en piégeant 25 bactéries et mycètes, mais pourraient également avoir un rôle dans la thrombino-formation. Ainsi, les NETs pourraient être un acteur majeur d'un nouveau concept appelé immunothrombose (Kessenbrock K, et al., 2015 ; Engelmann et Massberg, PMID 2013). A ce jour, la rapidité du processus de NETose, sa focalisation 30 au site de l'infection et la dégradation de l'ADN par les nucléases circulantes sont des obstacles à la détection directe in vivo dans le sang circulant. Toutefois, il existe des marqueurs indirects de NETose, 3047081 4 notamment l'association de taux élevés de nucléosomes, d'histones citrullinées et de MPO circulants (Abrams et al., 2013),(Kessenbrock et al., 2009). La NETose a pu être associée par l'intermédiaire de ces marqueurs à différentes pathologies notamment thrombotiques, infectieuses, 5 cancéreuses ou auto-immunes (Kessenbrock et al., 2009)'(Demers et al., 2012). Les NETs jouent donc non seulement un rôle dans les mécanismes de défense de l'hôte, mais participent aussi à l'interaction entre inflammation et coagulation durant les processus infectieux (Branzk 10 and Papayannopoulos, 2013). Il existe des procédés de détection des leucocytes et neutrophiles à l'aide de la cytométrie en flux, tels que décrits dans la demande de brevet américaine publiée sous le numéro US 2013/0101996, afin de déterminer, par exemple si l'organisme est dans un processus de 15 défense de l'hôte. Deux scores biologiques combinant les paramètres sanguins accessibles dans l'état de l'art actuel ont été proposés pour le diagnostic de CIVD. Une des difficultés de l'élaboration de scores réside dans le fait qu'il n'existe pas à ce jour de « définition biologique » consensuelle de la 20 CIVD. Le premier test de détection décrit en 2001 émane de l'International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH), le second de la Japanese Association for Acute Medicine (JAAM) en 2005 et revu en 2006. Le score de l'ISTH est basé sur la présence d'une thrombopénie sévère, d'une diminution du taux de prothrombine (allongement du temps 25 de Quick), d'une consommation du fibrinogène et d'une élévation des D- dimères, marqueurs de la fibrinolyse. Il permet de diagnostiquer les CIVD survenant au cours des pathologies néoplasiques, des traumatismes, de la pathologie obstétricale, mais apparait déficient au cours du choc septique en raison de l'importance du syndrome inflammatoire avec une 30 thrombocytose, une élévation du fibrinogène et la présence de D-dimères. Il semble donc peu adapté à une détection de CIVD lors d'un choc septique. 3047081 5 Le score JAAM a été développé afin de diagnostiquer la CIVD lors de choc septique, et ne retient pas le fibrinogène comme critère diagnostic tout en utilisant des valeurs seuil plus « cohérentes » dans le cadre d'un sepsis pour les D-dimères et les plaquettes. Ces différences ont 5 conduit à des discussions au niveau du comité CIVD de l'ISTH pour redéfinir l'entité CIVD en séparant coagulopathies obstétricales, traumatiques, septiques ou oncologiques. Toutefois, ces scores ne peuvent être calculés, mis en oeuvre qu'à partir d'échantillons particuliers et nécessitent un temps important 10 pour l'obtention des résultats, générant ainsi un coût et un délai important dans la prise en charge. En outre, il n'existe pas actuellement de procédé permettant de détecter de manière sure et systématique une CIVD. Il n'existe pas non plus de procédé et/ou de moyen permettant de prédire la survenue, par 15 exemple à partir d'un échantillon biologique, d'une coagulation intravasculaire disséminée. Il n'existe pas dans l'état de la technique de procédé permettant de déterminer chez un individu présentant un choc septique si celui-ci va déclencher/présenter dans un futur proche une coagulation intravasculaire 20 disséminée. En revanche, il existe un procédé capable d'établir une prédiction d'un diagnostic négatif de CIVD chez un individu présentant un choc septique. Il s'agit notamment d'un score combinant 3 paramètres : La concentration de microparticules circulantes membranaires exposant la phosphatidylsérine et l'antigène CD105, la numération plaquettaire et le 25 taux de prothrombine avec une spécificité de 71,2%, sensibilité de 71,0%, et une valeur prédictive négative de 93,1%. Ce procédé, même efficace, n'est pas technologiquement d'une mise en oeuvre facile et rapide. Il existe donc un réel besoin de trouver un procédé et/ou un moyen palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en 30 particulier un procédé simple, rapide et efficace permettant de détecter la CIVD, afin d'améliorer le pronostic vital des individus et de réduire ainsi les coûts de sa prise en charge. 3047081 6 Description de l'invention La présente invention a pour but de surmonter les inconvénients de l'art antérieur en fournissant un procédé de prédiction et/ou de détection 5 de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant une étape de détection et/ou de mesure de la concentration et/ou du taux d'au moins un marqueur biologique. Dans la présente, par « marqueur biologique », on entend au moins un marqueur biologique choisi dans le groupe comprenant les 10 neutrophiles, les plaquettes, les microparticules sanguines exposant la phosphatidylsérine. Selon l'invention la détection dudit au moins un marqueur biologique choisi peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. 15 Selon l'invention la mesure du taux dudit au moins un marqueur biologique choisi peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Selon l'invention la mesure de la concentration dudit au moins un marqueur biologique choisi peut être réalisée par tout procédé adapté 2 0 connu de l'homme du métier. Dans la présente par « neutrophiles » on entend les granulocytes neutrophiles ou polynucléaires neutrophiles (PNN) qui sont des cellules sanguines appartenant à la lignée blanche (leucocytes), qui ont donc un rôle dans le système immunitaire. 25 Dans la présente, la mesure de la fluorescence de neutrophiles peut être effectuée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé utilisant un marqueur des neutrophiles, par exemple un marqueur fluorescent. La mesure de la fluorescence peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Il peut 30 s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basé sur la reconnaissance de sondes fluorescentes et/ou de fluorochrome. Il peut s'agir par exemple d'un procédé comprenant un marquage des 3047081 7 neutrophiles comprenant l'utilisation d'un fluorochrome. Il peut s'agit par exemple d'un procédé comprenant l'application d'un fluorochrome à un échantillon, par exemple sanguin après une étape de lyse des globules rouges par un premier réactif qui peut agir également sur la membrane des 5 leucocytes en la perméabilisant permettant ainsi la fixation dudit fluorochrome. Dans la présente, par « fluorochrome » on entend un agent sans perméation membranaire à base ou non de polyméthine qui se lie aux acides nucléiques. Il peut s'agir avantageusement d'un fluorochrome 10 qui ne diffuse dans le cytoplasme qu'au travers de la membrane, par exemple leucocytaire, perméabilisée et fixée. Les sondes fluorescentes peuvent être par exemple des intercalants s'insérant entre les bases de l'ADN ou des sondes spécifiques d'histones citrullinées par exemple des anticorps, ou des sondes spécifiques d'une conformation ou d'une 15 modification post-traductionnelle des histones, des nucléosomes ou toute protéine de structure de l'ADN ou se fixant sur l'ADN en lien avec la décompaction de l'ADN ou par la NETose, ou d'une séquence nucléaire spécifiquement accessible au marquage au cours de la NETose, ou de sonde ciblant les cassures de l'ADN ou de sonde mesurant les phases 20 précoces de l'apoptose comme les modifications membranaires plasmiques ou mitochondriales. Il peut s'agir par exemple de molécules choisies dans le groupe comprenant des intercalants de l'ADN, des sondes de décompaction ou de marqueurs d'une activité enzymatique associée à l'ADN lors de la NETose, 25 insolubilisés ou non sur tous types de support combinés ou non. Il peut s'agir par exemple d'iodure de propidium, d'anticorps, par exemple anti-histone citrullinée, d'anticorps anti-ADN, de substrats fluorescents de l'activité de protéines liées à l'ADN décompacté comme l'élastase leucocytaire, la PR3, la myéloperoxidase, de mesure de 30 modification de l'ADN par effet TUNEL, par cytométrie en flux, de mesure de l'Annexine V extra-membranaire, d'incorporation de DIOC6 (3,3'- di hexyloxacarbocyan ine iodide). 3047081 8 Le fluorochrome et/ou sonde fluorescente peut être tout fluorochorme et/ou sonde fluorescente adapté(s) connu de l'homme du métier. Il peut s'agir, par exemple de fluorochrome et/ou sonde fluorescente disponible dans le commerce, par exemple commercialisés 5 par la société Thermofisher sous les références commerciales Syto40, DIOC6(3) et Thiazol orange. L'homme du métier, de part ces connaissances générales saura choisir le fluorochrome et/ou la sonde adapté pour le marquage de neutrophiles. En outre, l'homme du métier, de part ces connaissances 10 générales, connait les différentes populations leucocytaires et saura les identifier, par exemple lors d'une cytométrie en flux, en fonction de leur granulométrie ou de leur taille. Lorsque le procédé de mesure de la fluorescence de polynucléaires neutrophiles est un procédé utilisant un fluorochrome 15 intercalant, par exemple un procédé de cytométrie en flux, il peut s'agir par exemple de Syto40, iodure de propidium et le cytomètre de flux Gallios (Beckman-Coulter) ou FACS-Canto (Becton-Dickinson) et/ou tout autre cytomètre en flux équipé par exemple de 3 lasers dont un violet (405 nm) et un bleu (488 nm) avec un réglage en gain logarithmique, avec par 20 exemple la fluorescence du SYTO 40 mesurée sur un détecteur couplé avec le laser, violet (405 nm) et associé à un filtre passe-bande centré vers 450-460 nm, les autres lasers étant utilisés pour l'identification des leucocytes et des neutrophiles par exemple à l'aide d'anticorps anti CD45- FITC et CD49d. 25 Selon l'invention par « intensité de fluorescence » on entend tout signal mesuré à la longueur d'onde de réémission du fluorophore après excitation par exemple à 630 nm. L'intensité de fluorescence est proportionnelle à l'état de décompaction de l'ADN. Dans la présente, la mesure de la fluorescense des neutrophiles 30 peut être réalisée par tout dispositif connu de l'homme du métier adapté à la présente invention. Il peut s'agir par exemple d'un dispositif 3047081 9 commercialisé par la société Sysmex, par la société Socimed, par la société Alere. Il peut s'agir par exemple de l'automate Sysmex XN. Les inventeurs de la présente invention ont démontré que la mesure de la fluorescence des neutrophiles à partir d'un échantillon 5 biologique, par exemple un échantillon sanguin, permet de déterminer la présence d'une CIVD chez un individu présentant un choc septique et/ou d'identifier un individu susceptible de développer une CIVD. La présente invention a pour objet un procédé in-vitro de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée 10 (CIVD) à partir d'un premier échantillon biologique comprenant une étape de mesure de la fluorescence des neutrophiles. En outre, la présente invention a pour objet un procédé in-vitro de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) comprenant une mesure à partir d'un premier échantillon biologique de la 15 fluorescence des neutrophiles. Dans la présente, par « échantillon biologique », on entend tout échantillon obtenu à partir de mammifères, par exemple un mammifère choisi dans le groupe comprenant l'ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, 20 Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea. Il peut s'agir par 25 exemple d'un humain ou d'un animal. Il peut s'agir par exemple d'un animal d'élevage, d'un animal de compagnie, d'un animal en voie de disparition ou de tout autre animal. Selon l'invention, l'échantillon biologique peut être un échantillon de sang. 30 Selon l'invention, l'échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique ou un risque de choc septique. 304 70 81 10 Selon l'invention, le procédé de détection peut comprendre en outre une étape de comparaison de l'intensité de la fluorescence mesurée avec une valeur de référence de fluorescence. Selon l'invention l'intensité de fluorescence de référence peut 5 être l'intensité de fluorescence des neutrophiles mesurée chez un sujet ou la moyenne de la valeur de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence. Dans la présente par « sujet sain de référence », on entend un mammifère, par exemple un être humain, n'ayant pas subi d'infection, de 10 choc, d'hémorragie, de choc septique et/ou toute autre atteinte corporelle susceptible d'entrainer une coagulation intravasculaire disséminée telle que définie ci-dessus. Selon l'invention par « groupe de sujets de référence » on entend un groupe permettant de définir une valeur de référence fiable. Il 15 peut s'agir par exemple d'un groupe comprenant au moins 2 sujets de référence tel que définis ci-dessus, par exemple au moins 10, au moins 40, au moins 60, au moins 100 sujets de référence. Il peut s'agir par exemple d'un groupe comprenant de 30 à 500 sujets, de 40 à 200, de 45 à 110 sujets de référence. 20 Selon l'invention, la valeur de référence de fluorescence des neutrophiles R Neut SFL ou Rneutfl peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC obtenue, à partir d'analyse statique de valeurs obtenues à partir d'un sujet de référence et/ou groupe de sujets de référence. La valeur de référence peut être déterminée, par exemple 25 obtenue via une courbe ROC tel que décrit dans Stiel et al. « Neutrophil Fluorescence: A New Indicator of Cell Activation During Septic ShockInduced Disseminated Intravascular Coagulation. » Crit Care Med. 2016;44(11):e1132-e1136. Selon l'invention, lorsque la fluorescence des neutrophiles est 30 mesurée avec un dispositif commercialisé par la société Sysmex, par exemple de l'automate Sysmex XN, la valeur de référence de fluorescence des neutrophiles R Neut SFL ou Rneutfl obtenue via une courbe ROC tel que 3047081 11 décrit dans Stiel et al. « Neutrophil Fluorescence: A New Indicator of Cell Activation During Septic Shock-Induced Disseminated Intravascular Coagulation. » Crit Care Med. 2016;44(11):e1132-e1136, peut être une fluorescence supérieure à 57 unités arbitraires. 5 Avantageusement, les inventeurs ont démontré que lorsque la valeur de fluorescence mesurée est supérieure à la valeur de référence, le procédé selon l'invention permet de détecter et/ou prédire une coagulation intravasculaire disséminée. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont 10 également démontré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination/mesure de la fluorescence des neutrophiles permet une détection de la CIVD avec une sensibilité supérieure ou égale à 91 % et une spécificité supérieure ou égale à 81 %. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de 15 la coagulation intravasculaire disséminée peut comprendre en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration ROcD1O5 de microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation 105 (CD105) et exposant la phosphatidylsérine. Dans la présente par « microparticules sanguines exposant la 20 phosphatidylsérine » on entend des microparticules de la membrane plasmique exposant la phosphatidylsérine. Il peut s'agir par exemple de microparticules membranaires libérées, par exemple dans l'espace vasculaire à partir de cellules, par exemple des cellules endothéliales, des plaquettes, des monocytes, des granulocytes ou polynucléaires 25 (neutrophiles, éosinophiles ou basophiles) ou de leurs précurseurs circulants, des cellules érythrocytaires, des lymphocytes ou d'origine non vasculaire exposant la phosphatidylsérine. Par exemple, les microparticules membranaires peuvent avoir une taille, c'est-à-dire un diamètre individuel, compris entre 50 nm et 1 um et exposant la 30 phosphatidylsérine. Par exemple, les microparticules membranaires peuvent porter une activité facteur tissulaire ou une activité fibrinolytique. 3047081 12 La mesure de la concentration de microparticules membranaires porteuses de Cluster de Différenciation peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basée sur la reconnaissance de sondes 5 fluorescentes, par exemple des anticorps marqués, des sondes protéiques ou lipidiques, fixées ou non sur des billes, voire des sondes reconnaissant le matériel génétique inclus dans les microparticules comme les miRNA. Les sondes peuvent aussi être spécifiques de la PhosphatidylSérine (PhtdSer) par exemple l'annexine 5 ou tout autre dérivé d'annexine obtenu 10 par génie moléculaire, par exemple les diannexines. Les sondes peuvent également, par exemple, reconnaitre des lipides de la membrane et leurs degrés de compaction, par exemple des sondes lipidiques à chaînes carbonées plus ou moins longues. Les sondes protéiques peuvent être par exemple des anticorps détectant les clusters de différentiation à la surface 15 des microparticules ou détectant toute autre protéine ou enzyme hébergée à la surface des microparticules ou dans la microparticule comme l'actine, les métalloprotéinases, les récepteurs de protéines à activités enzymatiques, par exemple le facteur tissulaire ou uPAR les cytokines et interleukines. La mesure de la concentration des microparticules peut 20 également être réalisée par dosage quantitatif des lipides totaux ou des protéines totales ou à l'aide de la technique Tunable Resistive Pulse Sensing. La mesure de la concentration de microparticules membranaire peut être également réalisée, par exemple, via un test prothrombinase tel que décrit dans Hugel B, Zobairi F, Freyssinet JM. Measuring circulating 25 cell-derived microparticles. J Thromb Haemost. 2004 Oct;2(10):1846-7 [12]. Brièvement, dans ce procédé, les facteurs de coagulation du sang et la concentration de calcium sont déterminés en sorte que PhtdSer est le paramètre limitant dans la génération de thrombine soluble à partir de prothrombine exogène ajoutée dans le milieu réactionnel. Les résultats 30 sont exprimés en nanomolaire d'équivalent PhtdSer (nM éq. PhtdSer) par référence à une courbe étalon établie avec des liposomes de composition connue et concentration tel que décrit dans Hugel B, Zobairi F, Freyssinet 3047081 13 JM. « Measuring circulating cell-derived microparticles » J Thromb Haemost. 2004 Oct;2(10):1846-7 [12]. La mesure de la concentration des microparticules peut également être réalisée, par exemple, par mesure de l'activité facteur tissulaire. Brièvement le procédé utilise des facteurs de la 5 coagulation spécifiques du complexe dit Tenase et de dose la formation de facteur Xa à partir de facteur X ajouté dans le milieu réactionnel tel que décrit dans Aupeix K, et al. « The significance of shed membrane particles during programmed cell death in vitro, and in vivo, in HIV-1 infection. » J Clin Invest 1997; 99(7): 1546-54. [13]. L'activité portée par les MP-FT+ est 10 rapportée à une courbe étalon de concentration connue en facteur tissulaire. La concentration obtenue est exprimée en pmoles par litre d'activité facteur tissulaire. La mesure de la concentration de microparticules membranaires peut être également réalisée par exemple par une méthode chronométrique basée sur des billes recouvertes par un 15 moyen de capture, par exemple un anticorps, permettant l'identification (phénotype) des microparticules et la mesure d'un temps de coagulation après ajout d'un plasma dépourvu de phospholipides. Dans cette méthode, le temps de coagulation est dépendant de la quantité de phospholipides anioniques (PhtdSer) apportés par les MPs spécifiquement captées au 20 préalable par les billes. Une calibration du test chronométrique à partir d'une solution de liposomes de concentration connue afin peut être éventuellement effectuée et permet de convertir le résultat chronométrique (secondes) en activité procoagulante (nM eq. Phtd Ser). Il peut être réalisé par exemple à l'aide d'automates de la gamme STAR de l'entreprise 25 Stago. Selon l'invention, le second échantillon biologique est un échantillon biologique tel que défini ci-dessus. Selon l'invention, le second échantillon biologique peut être identique ou différent du premier échantillon biologique. 3 0 Selon l'invention, le premier et second échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. 3047081 14 Selon l'invention, le premier et/ou le second échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison de la 5 concentration ROcD105 mesurée avec une valeur de référence RCD105. Selon l'invention la valeur de référence RCD105 peut être la valeur de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD105 mesurée chez un sujet ou la moyenne de la valeur de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence. 10 Selon l'invention, le sujet sain de référence ou groupe de sujets sains de référence est tel que défini ci-dessus. Selon l'invention, la valeur de référence RCD105 peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC. Selon l'invention, la valeur de référence RCD105 peut être une 15 concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation supérieure à 0,65 nM équivalent PhtdSer ou PS. Avantageusement, les inventeurs ont démontré qu'une concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD105 mesurée supérieure à la valeur de référence selon le procédé de 20 l'invention permet de détecter et/ou prédire une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont démontré que le procédé de détection de la CIVD comprenant en outre la détermination de la concentration ROcD105 permet une détection avec une 25 sensibilité supérieure ou égale à 69% et une spécificité supérieure ou égale à 48 %. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure à partir d'un troisième échantillon biologique de 30 la concentration plaquettaire ROPIt. 3047081 15 Dans la présente par « plaquettes » on entend des thrombocytes ou plaquettes sanguines formés par fragmentation des mégacaryocytes. Selon l'invention, le troisième échantillon biologique est un 5 échantillon biologique tel que défini ci-dessus. Selon l'invention, le troisième échantillon biologique peut être identique ou différent du premier et/ou du second échantillon biologique. Selon l'invention, le premier et troisième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. 10 Selon l'invention, le second et troisième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, le premier, second et troisième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, la mesure de la concentration plaquettaire 15 dans un échantillon peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple des procédés décrits par McNair et al, JECT. 2015 ;47 :113-118 et/ou d'un procédé par exemple automatisé grâce à un compteur de type Coulter utilisant l'impédance électrique pour en dériver une concentration plaquettaire. En effet le passage de cellules 20 en suspension dans un électrolyte modifiant la résistance électrique entre deux électrodes génère une variation d'impédance enregistrée sous forme d'impulsion corrélée au passage des cellules dont on cherche à établir la concentration (principe Coulter) Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de 25 la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison de la concentration ROPIt mesurée avec une valeur de référence RPIt. Selon l'invention la valeur de référence RPIt peut être la valeur de la concentration plaquettaire mesurée chez un sujet sain de référence ou la moyenne des valeurs de concentrations mesurées chez un groupe 30 de sujets sains de référence. Selon l'invention, le sujet sains de référence ou groupe de sujets sains de référence est tel que défini ci-dessus. 3047081 16 Selon l'invention, la valeur de référence RPIt peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC. Selon l'invention la valeur de référence RPIt peut être un taux de plaquettes par exemple égale à 127 G/L 5 Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont démontré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration RPIt permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 68% et une spécificité supérieure ou égale à 90 %. 10 Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure du taux de prothrombine RoTP. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en 15 outre une étape de mesure à partir d'un quatrième échantillon biologique du taux de prothrombine ROTP. Selon l'invention, le quatrième échantillon biologique est un échantillon biologique tel que défini ci-dessus. Selon l'invention, le quatrième échantillon biologique peut être 20 identique ou différent du premier, du second échantillon et/ou du troisième échantillon biologique. Selon l'invention, le premier et quatrième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, le second et quatrième échantillons 25 biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, le troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, le premier, second et quatrième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. 3 0 Selon l'invention, le premier, troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. 3047081 17 Selon l'invention, le second, troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, le premier, second, troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. 5 Selon l'invention, la mesure du taux de prothrombine dans un échantillon peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans Delabranche et al., CCMED 2016 et/ou du procédé comprenant par exemple un dosage du facteur II par colorimétrie et/ou via l'utilisation d'un automate du type 10 STAGO STA-R Evolution utilisant des réactifs commerciaux adaptés disponibles en routine. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison du taux de prothrombine ROTP mesurée avec une valeur de référence RTP. 15 Selon l'invention la valeur de référence RTP peut être la valeur du taux de prothrombine ROTP mesurée chez un sujet sain de référence ou la moyenne des valeurs de concentrations mesurées chez un groupe de sujets sains de référence. Selon l'invention, le sujet sain de référence ou groupe de sujets 20 sains de référence est tel que défini ci-dessus. Selon l'invention, la valeur de référence ROTP peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC. Selon l'invention la valeur de référence RTP peut être un taux de prothrombine inférieur à 58%. 25 Avantageusement, les inventeurs ont démontré que lorsque la valeur du taux de prothrombine mesurée est inférieure à la valeur de référence, le procédé selon l'invention permet de détecter et/ou prédire une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont 30 également démontré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration ROTP permet une détection avec une 3047081 18 sensibilité supérieure ou égale à 73 et une spécificité supérieure ou égale à 60%. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont également démontré que le procédé de détection de la CIVD comprenant 5 la détermination de la combinaison de la fluorescence et du CD105, des plaquettes et du taux de prothrombine permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 76% et une spécificité supérieure à 86%. En d'autres termes, le procédé selon l'invention comprenant, à partir d'au moins un échantillon biologique, la mesure de la fluorescence 10 des neutrophiles, par exemple en utilisant des automates Sysmex XN, la mesure de la concentration plaquettaire, du taux de prothrombine et de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 76% et une spécificité supérieure ou égale à 86%. 15 Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont également démontré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la combinaison de la fluorescence des neutrophiles, de la numération plaquettaire et du taux de prothrombine permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 66 et une spécificité 20 supérieure ou égale à 85% Dans la présente la valeur de fluorescence des neutrophiles mesurée RONeut SFL est indépendamment désignée ROneutfl, la valeur Vneutfl peut être également désignée Vneutsfl et la valeur de référence RNeut SFL est indépendamment désignée RNeutfl. 25 La présente invention a également pour objet un procédé in-vitro de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : 3 0 a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutfl b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl 3047081 19 c. mesure de la concentration ROCD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), d. comparaison de la valeur mesurée ROCD105 avec une valeur 5 de référence RCD105 e. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt f. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt g. mesure du taux de prothrombine RoTP 10 h. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP i. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutfl égale à 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur Rneutfl ou d'une valeur Vneutfl égale à 0 si ROneutfl est 15 inférieure à la valeur Rneutfl j. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si ROCD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si ROCD105 est inférieur à la valeur RCD105 k. affectation d'une valeur VPIq égale à 1 si RoPlt est inférieure 20 à la valeur RPIt ou d'une valeur VPIq égale à 0 si RoPlt est supérieure à la valeur RPIt I. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est supérieure à la valeur RTP 25 m. calcul du score S1 selon la formule suivante : S1 = c + Vneutfl x a + VCD105 x 3 + Vplaquettes X 0+ VTP X 0 dans laquelle c est compris de -0,708 à 2,280, par exemple égal à 0,786, a est compris de 0,152 à 1,928, par exemple égal à 1,040, 13 est compris entre 0,154 à 1,549, par exemple égal à 0,851, Q est compris entre -0,016 3 0 à -0,005, par exemple égal à -0,010, 0 est compris entre -0,036 à 0,001, par exemple égal à -0,017. 3047081 20 En outre, les inventeurs ont montré que lorsque la valeur de S1 est supérieure à -0,47 le procédé permet avantageusement une prédiction avec une sensibilité supérieure ou égale à 76% et une spécificité supérieure ou égale à 86%. 5 En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés avec le devenir du mammifère dont l'échantillon biologique provient. Selon l'invention le procédé peut comprendre alternativement et/ou additionnellement au calcul du score S1, une étape n. de calcul du score S2 comme suit : 10 n. Calcul du score S2 selon la formule suivante : S2 = c + Vneutfl x a + Vplaquettes X 0+ VTP X 0 dans laquelle c est compris de 0,381 à 3,070, par exemple égale à 1,726, a est compris de 0,209 à 1,910, par exemple égale à 1,060, 0 est compris entre -0,015 à -0,005, par exemple égale à -0,10, et 0 est compris entre - 15 0,040 à -0,004, par exemple égale à -0,022 En outre, les inventeurs ont démontré que lorsque la valeur de S2 est supérieure à 0,16 le procédé permet avantageusement une prédiction d'une CIVD avec une sensibilité supérieure ou égale à 66% et une spécificité supérieure ou égale à 95% 20 En d'autres termes, les inventeurs ont clairement démontré que les scores obtenus peuvent être corrélés avec le devenir du mammifère dont l'échantillon biologique provient et permettent avantageusement de détecter une CIVD. La présente invention a également pour objet un procédé de 25 détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration ROCD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 30 (CD105), b. comparaison de la valeur mesurée ROCD105 avec une valeur de référence RCD105 3047081 21 c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt e. mesure du taux de prothrombine RoTP 5 f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP g. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si ROCD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur VCD105 égale à 0 si ROCD105 est inférieur à la valeur RCD105 10 h. affectation d'une valeur VPIq égale à 1 si RoPlt est inférieure à la valeur RPIt ou d'une valeur VPIq égale à 0 si RoPlt est supérieure à la valeur RPIt i. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est 15 supérieure à la valeur RTP j. calcul du score S3 selon la formule suivante : S3 = E+ a X VCD105 ± p X \big ± y X VTP dans laquelle E est compris entre 0,686 et 2,830, par exemple égale à 1,758, a est compris entre 0,180 et 0,785, par exemple égale à 0,483, p 20 est compris entre -0,018 et -0,009, par exemple égale à -0,014, et y compris entre -0,027 et 0,001, par exemple égale à -0,013. Les inventeurs ont démontré que lorsque la valeur de S3 est supérieure à 0,03 le procédé permet avantageusement une prédiction de 25 CIVD avec une sensibilité supérieure ou égale à 67% et une spécificité supérieure ou égale à 94%. En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés avec le devenir du dont l'échantillon biologique provient En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés 3 0 avec le devenir du dont l'échantillon biologique provient La présente invention a également pour objet un examen de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon 3047081 22 l'invention comprenant des moyens de mesure de la Fluorescence des neutrophiles et de la concentration de neutrophiles. Les moyens de mesure de la fluorescence et/ou de la concentration de neutrophiles sont tel que définis ci-dessus. 5 L'invention a également pour objet un procédé in-vitro de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) comprenant une étape d'analyse morphologique des neutrophiles sur un frottis sanguin. En d'autres termes, le procédé peut comprendre en outre une étape d'analyse morphologique des neutrophiles, par exemple sur un 10 frottis sanguin. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison de la morphologie des neutrophiles, par exemple sur un frottis sanguin, avec la morphologie de neutrophiles observée, par exemple à partir d'un frottis 15 sanguin, d'un sujet ou d'un groupe de sujets sains de référence. Selon l'invention, le sujet sain de référence ou groupe de sujets sains de référence est tel que défini ci-dessus. Selon l'invention, l'analyse morphologique peut être réalisée à partir d'un frottis sanguin. Selon l'invention, un frottis sanguin peut être 20 obtenu par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans Stiel et al « Neutrophil Fluorescence: A New Indicator of Cell Activation During Septic Shock-Induced Disseminated Intravascular Coagulation. » Crit Care Med. 2016;Nov;44(11):e1132-e1136 permettant notamment une analyse par 25 observation visuelle, grâce à un microscope optique suite à une coloration May-Grünwald-Giemsa ou Wright réalisée sur lame. Selon l'invention, l'étape d'analyse ou de comparaison de la morphologie des neutrophiles peut comprendre l'observation d'au moins un paramètre choisi dans le groupe comprenant la condensation 30 chromatienne des neutrophiles, les granules des neutrophiles et les vacuoles des neutrophiles. 3047081 23 Selon l'invention, l'étape d'analyse ou de comparaison de la morphologie des neutrophiles peut comprendre l'observation d'au moins deux paramètres choisis dans le groupe comprenant la condensation chromatienne des neutrophiles, les granules des neutrophiles et/ou les 5 vacuoles des neutrophiles. Selon l'invention, l'étape d'analyse ou de comparaison de la morphologie des neutrophiles peut comprendre l'observation de la condensation chromatinienne des neutrophiles, des granules des neutrophiles et des vacuoles des neutrophiles. 10 Selon l'invention, la chromatine des neutrophiles peut être condensée ou décondensée. L'homme du métier de part ces connaissances générales sait déterminer la condensation ou la décondensation de la chromatine de neutrophiles. Selon l'invention, l'observation des granules des neutrophiles 15 peut comprendre la détermination du nombre et/ou de la densité desdites granules des neutrophiles. L'homme du métier par ces connaissances générales connait l'aspect morphologique et ladensité normales des granules des neutrophiles. Selon l'invention, l'observation des vacuoles peut comprendre la 20 détermination de la présence ou l'absence de vésicules de neutrophiles sur ledit frottis. L'homme du métier de part ces connaissances générales sait déterminer la présence ou l'absence de vacuoles sur des neutrophiles. Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape de comparaison entre la morphologie, par exemple anormale, des 25 neutrophiles issus d'un échantillon biologique et la morphologie normale des neutrophiles chez un sujet sain et l'établissement d'un score cytologique d'anormalité. Selon l'invention, l'analyse morphologique peut être réalisée par exemple par échantillon biologique sur 1 à 1000 neutrophiles, par exemple 30 sur 1 à 100 neutrophiles. Par exemple, lorsque l'analyse morphologique est effectuée sur un frottis sanguin, elle peut être réalisée sur 1 à 100 neutrophiles. 3047081 24 La présente invention a également pour objet un procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant en outre les étapes suivantes : 5 - observation de la condensation chromatinienne des neutrophiles, - observation du nombre et/ou de la densité des granules des neutrophiles, - observation des vacuoles des neutrophiles, 10 D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. 15 Brève description des figures La Figure 1 représente une fluorescence des polynucléaires neutrophiles (PNN) (NEUT-FL) plus élevée et significativement associée à la CIVD. Les résultats sont représentés par des boîtes à moustaches rouges (CIVD) ou bleue (absence de CIVD). La ligne horizontale dans la 20 boîte correspond à la médiane. Les limites, supérieure et inférieure, de la boîte correspondent respectivement aux 25ème et 75ème percentiles et les barres supérieure et inférieure aux 10ème et 90ème percentiles. Les lignes pointillées correspondent à des valeurs de référence. Les analyses statistiques représentent les différences entre les mesures répétées entre 25 les patients avec ou sans CIVD. A. NEUT-FL chez 100 patients en choc septique. B. Courbe ROC (Receiver-operating characteristic) de NEUT-FL au cours du choc septique. C. Microparticules neutrophiliques rapportées au taux de neutrophiles chez 100 patients en choc septique. La figure 2 représente un diagramme en bâton de la concentration 30 moyenne des microparticules membranaires plasmatiques en phosphatidylSérine équivalent (ordonnée) en fonction du temps lors d'une CIVD (en gris) ou non (blanc). Les lignes en pointillées représentent les 3047081 25 valeurs normales. Les analyses statistiques représentent les différences des mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps. Figure 2A représente un diagramme en bâton de la concentration 5 moyenne des microparticules membranaires en phosphatidylsérine équivalent (ordonnée) lors d'un choc septique (en gris) ou non (blanc). Les résultats représentés sont la concentration totale de microparticules membranaires (PhtdSer-microparticules). Figure 2B représente les concentrations des microparticules membranaires dérivées des leucocytes 10 (CD11a-microparticules) rapportées aux leucocytes circulants et Figure 2C des microparticules membranaires dérivées des cellules endothéliales CD105-microparticules et Figure 2D des microparticules membranaires dérivées des cellules endothéliales CD31-microparticules. Figure 3 représente des diagrammes en bâton des résultats obtenus 15 en fonction de la présence d'une CIVD (gris) ou pas de CIVD (blanc). Les lignes en pointillés représentent les valeurs normales. L'ordonné représente la concentration des leucocytes en G/L, des plaquettes en G/L, le rapport microparticules membranaires portant le CD11 a sur le nombre de leucocytes en nM/G, le taux de prothrombine en %, le taux 20 d'antithrombine en %, la concentration en D-Dimères en mg/L, les taux circulants de microparticules CD-105 et microparticules CD-31. L'abscisse représente la condition et le jour de mesure : 1 er (D1), 3ème (D3). Les analyses statistiques représentent les différences des mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps. 25 Figure 4 représente en A. les courbes ROC de CD-105 - microparticules, le taux de prothrombine, numération plaquettaire et le score prédictif de CIVD, en B, l'arbre décisionnel des patients en option de traitement. N+ renvoie au nombre de patients avec CIVD, N- est le nombre de patients sans CIVD. 30 La figure 5 : complète la figure 4, avec en A la représentation des fenêtres enregistrées par le cytomètre automatique et utilisées pour l'analyse du paramètre NEUT-FL. En C les variations des 304 70 81 26 « scattergrammes » chez les sujets contrôles, ou en sepsis sans ou avec DIC. En D. Les modifications morphologiques observées sur des frottis sanguins après coloration MGG 5 EXEMPLE Exemple 1. Utilisation d'un score combinant CD105+-MPs, le taux de prothrombine et la numération plaquettaire Résumé : 10 Objectifs: la stratification des patients en choc septique est insuffisante et peut entraîner une allocation inappropriée de traitement dans les essais cliniques randomisés (ECR), en particulier en ce qui concerne les traitements anticoagulants. Nous montrons que les microparticules dérivées de l'endothélium CD-105 sont les biomarqueurs 15 pertinents de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans le choc septique. Étude prospective observationnelle chez les patients en choc septique hospitalisés dans quatre unités de réanimation. Patients et méthodes: 265 patients atteints de choc septique consécutivement hospitalisés, la CIVD a été diagnostiquée selon JAAM 2 0 score 2006. Principaux résultats: 259 patients ont été analysés. 61 avaient une CIVD à l'admission (CIVD-J1) et 32 une CIVD développée durant les 24 premières heures après l'admission (CIVD-J2). Plusieurs modèles de régression logistique ont confirmé que les MP dérivées des cellules 25 endothéliales ont été associées à la CIVD: CD105+-MPs (OR 2,13) et CD31+-MPs (OR 0,65) (p 0,60 nM éq. PhtdSer, OR 1,67, p 38°C [0] 90/min [1] 3 * fréquence respiratoire > 20/min ou PaCO2 12000/mm3, 10% des cellules Plaquettes (G/L) [0] > 120 [1] 80-119 ou 30% [3] 64 [1] 15,0 Diagnostic de CIVD Score 4/8 Dosage des microparticules : 10 L'activité pro-coagulante des MPs a été dosée par test 3047081 31 fonctionnel prothrombinase sur plaque multi-puits streptavidinée (Roche®, France) par capture sur Annexine V ou grâce à des anticorps spécifiques de l'origine cellulaire pour le phénotypage microparticulaire. Ceci a été réalisé aux différents temps de prélèvement. 5 La méthode de dosage fonctionnel des MPs mise au point par l'équipe utilise un test enzymatique prothrombinase effectué dans une plaque multi-puits. Le dosage est réalisé après capture des MPs sur de l'Annexine V biotinylée insolubilisée au fond des puits recouverts de streptavidine. Le test utilise, d'une part, la haute affinité de l'Annexine V 10 (AV) pour la Phosphatidylsérine (PhtdSer) exprimée à la surface des MPs, et d'autre part celle de la biotine pour la streptavidine. La streptavidine est fixée de manière covalente au fond des puits et l'AV biotinylée se fixe à la streptavidine. Pour le phénotypage des MPs, l'AV est remplacée par différents anticorps (Ac) monoclonaux biotinylés spécifiques de différentes 15 cibles spécifiques de l'origine cellulaire des MPS. Nous utilisons ainsi un Ac anti-CD105 (endogline) - (R&D Systems, Mineapolis, USA) pour caractériser les MPs d'origine endothéliale, un Ac anti-CD11a (Leinco Technologies, St Louis, USA) pour caractériser les MPs d'origine leucocytaire, et un Ac anti-CD66b -CEACAM8- (BD Pharmingen, Franklin 20 Lakes, USA) pour caractériser spécifiquement les MPs d'origine neutrophilique. Les normes chez des volontaires sains ont été établies au cours de travaux préalables (Stiel et al « Neutrophil Fluorescence: A New Indicator of Cell Activation During Septic Shock-Induced Disseminated Intravascular Coagulation. » Crit Care Med. 2016;44(11):e1132-e1136). 25 Les échantillons de plasma (100 pL/puits) contenant les microparticules ont été ensuite déposés en double dans les puits et incubés pendant 30 minutes à 37°C. Après capture des MPs au fond des puits et lavage extensif, la réaction enzymatique prothrombinase a été réalisée. Les quantités de calcium et des facteurs de coagulation II, Va et 30 Xa ajoutées ont été déterminées afin que la phosphatidylserine fixée sur les MPs soit le facteur limitant de la transformation de la thrombine en prothrombine. La quantité de thrombine générée a été révélée par son 3047081 32 action lytique sur un substrat chromogénique (pNAPEP0216, 1,52mM, Cryopep, Montpellier, France). L'absorbance a été mesurée grâce à un spectrophotomètre (VersaMax Molecular Devices, Sunnylavale, Calfornie, USA) à la longueur d'onde de 405 nm. L'absorbance mesurée est 5 proportionnelle à la quantité de PhtdSer exposée par les MPs. Les résultats sont exprimés en nanomolaires équivalents phosphatidylserine (nMeq. PhtdSer) par référence à une courbe de calibration réalisée avec des vésicules synthétiques aux quantités connues de PhtdSer. 10 Statistique. Les variables ont été décrites comme des fréquences, et la comparaison a été faite par un test de x2 ou un test exact de Fisher. Les données quantitatives ont été données en moyennes et déviations standards et analysées avec le test de Kruskall-Wallis. Les mesures 15 répétées ont été analysées par ANOVA pour mesures répétées ou avec un modèle linéaire mixte. Les analyses post-hoc ont été réalisées en utilisant le test t avec correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples. Avant de procéder à cette analyse, les variables ont été évaluées pour leur normalité et les variables dont la distribution n'est pas normale ont été 20 transformées en utilisant soit une transformation logarithmique, racine carrée, inverse ou exponentielle. Plusieurs modèles de régression logistique ont été effectués pour expliquer la survenue d'une CIVD. Toutes les statistiques ont été réalisées avec le logiciel R version 3.1.3 software (R Core Team (2012). R: A language and environment for statistical 25 computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. http://www.Rproject.org/). Une valeur de p 0,60 nM éq. PhtdSer, OR 1,67, p 3 166 (100,0) 32 (100,0) 61 (100,0) SOFA 10,2±2,9*# 12,3±2,4* 13,5±2,8# SAPS II 53,3±18,0*# 62,4±19,9* 63,5±17,1# Mortalité à J28 - 48 (28,3)*# 13 (41,9)* 29 (46,8) # N (%) a" CIVD-J2": patients présentant les critères de CIVD à J2 et pas à J1; b "CIVDJ1": Patients présentant les critères de CIVD à J1 *p 0,6 71,70 48,19 nM eqPS Numération 0,99 [0,98- 0,99] 0,25) Exemple 2 Exemple d'un score combinant la fluorescence des neutrophiles, le taux de prothrombine, la numération plaquettaire et les microparticules CD105-MP 5 10 15 3047081 37 Patients 150 patients consécutifs d'âge adulte, remplissant tous les critères de choc septique à l'admission aux soins intensifs, ont été inclus dans l'étude. Les patients atteints de maladies chroniques à un stade 5 terminal ainsi que les patients souffrant de neutropénie ont été exclus de l'étude Selon le score JAAM, 35% des patients présentent une CIVD. Les patients présentant une CIVD précoce induite par le choc septique étaient plus gravement malades avec des scores de gravité SOFA (Sequential Organ Failure Assesment Score) et SAPS2 (Simplified Acute Physiology 10 Score) ainsi qu'une mortalité plus élevée statistiquement dans le groupe CIVD (tableau 5). Les numérations des leucocytes et des neutrophiles étaient significativement inférieures chez les patients atteints de CIVD tandis la quantification de l'hémoglobine et du sodium n'est pas altérée, excluant de fait un effet de dilution du plasma. 15 Prélèvements sanguins : En sus des prélèvements présentés dans l'exemple 1, des tubes ont été prélevés pour les analyses nécessaires aux soins des patients, dont un tube EDTA (VacutainerTM, Becton Dickinson, Le Pont de Claix, 20 France) et utilisés pour la détection de la fluorescence liée à la décompaction de l'ADN. Au cours du processus de validation, nous avons analysé, depuis des échantillons prélevés sur des volontaires sains, l'activation ex- vivo des neutrophiles stimulés par une concentration de 4 pM d'ionomycine (Calbiochem, Merck Biodeveloppement, Martillac, 25 France) Numérations et formules sanguines L'intensité du marquage par l'intercalant de l'ADN qui témoigne de l'accessibilité du double brin (cellule immature, activation cellulaire...), a 30 été identifiée comme NEUT-FL. La norme du paramètre NEUT-FL a été établie à partir de 1300 bilans, soit à partir de l'ensemble des patients majeurs ayant eu un bilan biologique pendant une période de 24 heures au 3047081 38 CHU de STRASBOURG sur les deux sites hospitaliers regroupant l'ensemble des spécialités médicales et chirurgicales adultes. Analyse de la morphologie des cellules 5 Des frottis sanguins ont été effectués sur les patients et échantillonnés en sur tube EDTA (7,2mg/4mL) / citrate (0,129M) puis soumis à une coloration de May-Grünwald-Giemsa. L'échantillonnage des volontaires sains a quant à lui été effectué depuis un prélèvement sanguin veineux périphérique. 10 Statistique : Les variables catégorielles (ou qualitatives) ont été analyses par le test exact de Fisher et les variables continues par le test des rangs signés de Wilcoxon. La normalité de la distribution a été analysée par le test de Shapiro-Wilk. La méthode de Bonferroni-Holm a été utilisée pour 15 obtenir les « p-values » ajustées pour les comparaisons multiples. L'analyse des aires sous les courbes ROC (Receiver-operating characteristic) a été réalisée et le coefficient de corrélation de Spearman déterminé. On considère statistiquement significatif une « p-value » inférieure à 0,05. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à 20 l'aide du logiciel R version 3.1.3 software (R Core Team (2012). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. http://www.Rproject.org/). Les variables asymétriques sont présentés sous la forme de valeurs médianes avec interquartiles grâce au logiciel GraphPad Prism® version 6 (La Jolla, 25 CA, USA). Résultats : Numérations leucocytaires Les numérations leucocytaires et des 30 neutrophiles étaient significativement plus basses chez les patients présentant une CIVD. La fluorescence des neutrophiles était augmentée chez l'ensemble des patients en choc septique (p 57 UA CD105 ±-MPs > 0,65 nM éq. PS 2,343 1,289 à 5,236 0,017 Numération des 0,990 0,983 à 0,995 REVENDICATIONS1. Procédé in-vitro de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un premier échantillon biologique comprenant une mesure de la fluorescence de neutrophiles. 2. Procédé de détection selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de comparaison de la valeur mesurée avec une valeur de référence. 3. Procédé de de détection selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'échantillon biologique est choisi dans le groupe comprenant un échantillon de sang. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration RMCD105 de microparticules membranaires porteuses du le cluster de différenciation 105 (CD105). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques sont un seul et même échantillon. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques proviennent d'un patient présentant un choc septique. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la valeur de référence fluorescence de neutrophiles est supérieure à 30 57 UA. 3047081 49 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, dans lequel la valeur de référence RCD105est supérieure à 0,65 nM eq PS. 9. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une 5 coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutfi b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl 10 c. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), d. comparaison de la valeur mesurée ROCD105 avec une valeur de référence RCD105 15 e. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt f. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt g. mesure du taux de prothrombine RoTP h. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur 20 de référence RTP i. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutfl égale à 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur Rneutfl ou d'une valeur Vneutfl égale à 0 si ROneutfl est inférieure à la valeur Rneutfl 25 j affectation d'une valeur Vcolo5 égale à 1 si ROCD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 Si ROCD105 est inférieur à la valeur RCD105 k. affectation d'une valeur VPIq égale à 1 si RoPlt est inférieure à la valeur RPIt ou d'une valeur VPIq égale à 0 si RoPlt est supérieure à la valeur RPIt 3047081 50 I. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est supérieure à la valeur RTP m. calcul du score S1 selon la formule suivante : 5 Si = E + Vneutfl X Ci + VCD105 X r3 + VPIq X 0+ VTP X e dans laquelle c est compris de -0,708 à 2,280, a est compris de 0,152 à 1,928, r3 est compris entre 0,154 à 1,549, S2 est compris entre -0,016 à 0,005, et El est compris entre -0,036 à 0,001, OU 10 S1=0,786 + 1,040 x Vneutfl + 0,851 x VCD105 + (-0,010 X VPIq) + (-0,017 x VTP) 10. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : 15 a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutfl b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur 20 de référence RPIt e. mesure du taux de prothrombine RoTP f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP g. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles 25 Vneutfl égale à 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur Rneutfl ou d'une valeur Vneutfl égale à 0 si ROneutfl est inférieure à la valeur Rneutsfl h. affectation d'une valeur VPIq égale à 1 si RoPlt est inférieure à la valeur RPIt ou d'une valeur VPIq égale à 0 si RoPlt est 30 supérieure à la valeur RPIt 3047081 51 L affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est inférieure à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est supérieure à la valeur RTP j. calcul du score S2 selon la formule suivante : 5 S2 = E + Vneutfl X a + Vplaquettes X + VTP X dans laquelle c est compris de 0,381 à 3,070, a est compris de 0,209 à 1,910, 0 est compris entre -0,015 à -0,005, e est compris entre -0,040 à 0,004 OU 10 S2 = 1,726 + 1,060*Vneutfi + (-0,010*Vpie) (-0,022*V-rp), 11.Procédé de détection etiou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : 15 a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutfi b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles ROneutfl avec une valeur de référence RNeutfl c. mesure de la concentration ROCD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 20 (CD105), d. comparaison de la valeur mesurée ROCD105 avec une valeur de référence RCD105 e. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt f. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur 25 de référence RPIt g. mesure du taux de prothrombine RoTP h. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP i. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles 30 Vneutfl égale à 1 si ROneutfl est supérieure à la valeur Rneutsfl ou d'une valeur Vneutfl égale à 0 si ROneutfl est inférieure à la valeur Rneutn 3047081 52 j. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si ROCD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si ROCD105est inférieur à la valeur RCD105 k. affectation d'une valeur VPIq égale à 1 si RoPIt est supérieur 5 à la valeur RPIt ou d'une valeur VPIq égale à 0 si RoPlt est inférieur à la valeur RPIt I. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est supérieur à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est inférieur à la valeur RTP 10 n. calcul du score S1 et/ou S2 selon la formule suivante : Si = E + Vneutfl X a + VCD105 X13 + Vpiq x n+ VTP X e dans laquelle E est compris de -0,708 à 2,280, a est compris de 0,152 à 1,928, 13 est compris entre 0,154 à 1,549, CI est compris entre -0,016 à - 15 0,005, et 8 est compris entre -0,036 à 0,001, S2 = E + Vneuttl x a + VPIq X 0 + VTP X A dans laquelle E est compris de 0,381 à 3,070, a est compris de 0,209 à 1,910, 0 est compris entre -0,015 à -0,005, 8 est compris entre -0,040 à - 20 0,004.