Brevet FR3044876A1 — publié le 20170616

PROCÉDÉ D'OBTENTION DE COMPOSITIONS TENSIOACTIVES À BASE DE L-GULURONAMIDES D'ALKYLE DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un nouveau procédé direct d'obtention de compositions tensioactives comprenant des L-guluronamides d'alkyle poly(oligo)guluronates ou de mélanges de L-guluronamides et de D- mannuronamides d'alkyle à partir de matières premières biosourcées (alginates, oligoalginates, poly(oligo)guluronates, algues brunes) ou biocompatibles/biodégradables. La présente invention trouve par exemple des applications dans les tensioactifs, notamment pour la cosmétologie, le domaine phytosanitaire, agroalimentaire et la détergence (industrielle). Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. État de la technique Les tensioactifs à base de carbohydrates représentent une classe importante de composés amphiphiles dont l'intérêt croissant peut s'expliquer par des facteurs d'ordre fonctionnel, économique et environnemental (Hill et Lehen-Ferrenbach, 2009) [1]. Les dérives amides de sucres caractérisés par la présence d'une fonction amide reliant la tête sucre hydrophile à la chaîne lipophile présentent l'avantage d'être résistants vis-à-vis de l'hydrolyse en milieux neutre et alcalin, notamment comparativement aux dérivés esters (Laurent et al., 2011) [2]. Si des travaux ont déjà montré la possibilité d'accéder à des dérivés amides à partir d'acides uroniques comme l'acide glucuronique et l'acide galacturonique issus de l'hydrolyse d'hémicelluloses ou de pectines (Laurent et al., 2011, précité) [2], il existe peu de travaux permettant de 3044876 2 valoriser des polysaccharides d'origine algale. Un seul exemple de tensioactif amide est issu de la transformation d'oligomères de l'acide Dmannuronique provenant de la dépolymérisation d'alginates. Par contre, la préparation de compositions tensioactives sous forme amide à base d'acide 5 L-guluronique ou de mélanges d'acide L-guluronique et d'acide Dmannuronique et permettant de valoriser la totalité des saccharides présents dans le biopolymère n'a pas été développée à ce jour. Il existe trois classes distinctes de tensioactifs à base de saccharides : les esters (esters de sorbitan, sucroesters), les acétals (alkylpolyglucosides) 10 et les amides (alkyl glucamides). Industriellement, les alkyl sucroamides sont produits en deux étapes : amination réductrice d'un carbohydrate avec une alkylamine, suivie de l'acylation du N-glycoside résultant (Demande internationale WO 9206984 ; Demande internationale WO 9303004 ; Brevet US 7,655,611 ; Brevet US 5,872,111) [3-6]. De façon similaire, les 15 gluconamides sont obtenus en deux étapes : l'oxydation d'un carbohydrate conduisant à une lactone ou un acide aldonique suivie d'une réaction avec des alkyl amines pour former des gluconamides (Brevet US 2,670,345) [7]. Des dérivés comportant une liaison amide entre les parties hydrophile et lipophile via une liaison N-glycoside ont été plus récemment développés 20 (Brevet US 7,655,611, précité) [5]. Une autre stratégie a reposé sur la formation de tensioactifs N-alkylamides à partir d'acides uroniques comme l'acide glucuronique et l'acide galacturonique issus de l'hydrolyse d'hémicelluloses ou de pectines (Laurent et al., 2011, précité) [2]. Tous ces procédés de synthèse des tensioactifs utilisent des monosaccharides 25 comme matières premières et les conditions de synthèse sont généralement peu respectueuses de l'environnement (réactifs toxiques et non biodégradables). Des tensioactifs mannuronamides ont été produits à partir d'oligomères de l'acide D-mannuronique (Benvegnu et Sassi, Topics in 30 Current Chemistry, 294: 143-164, 2010 ; Demande internationale WO 03/104248) [8, 9]. Le procédé repose sur la production 3044876 3 d'oligomannuronates saturés (dépolymérisation acide) qui sont ensuite transformés en intermédiaire monosaccharide comportant deux chaînes butyle. Ce synthon est ensuite soumis à une réaction d'aminolyse à l'aide d'una amine grasse dans un solvant tel que le méthanol ou le l'isopropanol 5 en présence ou non d'une base organique. Le dérivé N-acylé ainsi obtenu présente des propriétés émulsionnantes. Toutefois l'utilisation des poly(oligo)mères à base d'acide L-guluronique provenant de la dépolymérisation d'alginates (Demande internationale WO 03/099870) [10] ou encore de l'alginate entier n'a pas été valorisée à ce jour. 10 Il existe donc un réel besoin d'un nouveau procédé de synthèse de composés et compositions palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant de maîtriser l'obtention à l'échelle industrielle, de réduire les coûts et d'améliorer les propriétés attendues des composés et compositions notamment dans le 15 domaine des tensioactifs, et répondant au principe de la « chimie bleue ». Description de l'invention Les Inventeurs ont mis au point un nouveau procédé, sans solvant, utilisant des réactifs biocompatibles / biodégradables, pour accéder 20 simplement à des compositions tensioactives à base de L-guluronamide ou de mélanges de L-guluronamides et de D-mannuronamides directement (procédé « one-pot ») à partir de poly(oligo)guluronates, d'alginates bactériens, d'alginates raffinés et semi-raffinés (mélange d'alginate, de cellulose, d'hémicellulose et de fucane) ou d'algues brunes, évitant ainsi 25 une étape de dépolymérisation préalable. Les poly(oligo)guluronates proviennent de la dépolymérisation d'alginates, par exemple selon le procédé décrit dans la Demande internationale WO 03/099870 [10]. Les alginates (semi-raffinés, raffinés) et les oligoalginates sont obtenus par des traitements simples en milieux aqueux acide, à partir d'algues fraiches ou 30 sèches (WO 03/099870 [10]). Les alginates bactériens sont obtenus par 3044876 4 exemple à partir de culture de bactéries mucoïdes (e.g. cf. Demande internationale WO 2009/134368) [11]. La présente invention a donc pour objet un procédé d'obtention d'une composition comprenant : 5 (i) des L-guluronamides d'alkyle de formules (la) et (lb) : Ycc ORi CON HR2 ? H OH OH 1 C C 1 i H H (la) ou (ii) un mélange de L-guluronamides d'alkyle de formules (la) et (lb) et de Dmannuronam ides d'alkyle de formules (lia) et (11b) : où 10 R1 est une chaîne alkyle de 2 à 22, de préférence de 2 à 8, préférentiellement de 2 à 4, atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée ; R2 est un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle de 2 à 22, de préférence de 8 à 18, préférentiellement de 12 à 18, atomes de carbone, 15 linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée pouvant comporter une fonction amine terminale ; et caractérisé en ce que ledit procédé comprend : a) une étape de réaction de butanolyse et de glycosylation de Fischer à partir de poly(oligo)guluronates, d'alginates, d'oligoalginates, et/ou d'algues 2 0 brunes ; CONH R2 HO- C -H 0 OR OH / 1 / H 1 H (l lb) CON H R2 H C / 1 C H 0 IH OH O C- 1 1 H H (Ha) OR H 3044 876 5 b) une étape de réaction d'aminolyse sur le milieu réactionnel issu de l'étape a), en présence d'une amine de formule R'NH2 où R' est composé de 5 à 22, de préférence de 8 à 18, préférentiellement de 12 à 18, atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée. 5 Par « poly(oligo)guluronates » au sens de la présente invention, on entend les produits issus de la dépolymérisation d'alginates, par exemple selon le procédé de la Demande Internationale WO 03/099870 [10]. Par « oligoalginates » au sens de la présente invention, on entend les produits issus d'un traitement par voie enzymatique et/ou acide d'alginate, 10 par exemple selon le procédé de la Demande Internationale WO 03/099870 [10]. Par « alginates » au sens de la présente invention, on entend des alginates raffinés et/ou semi-raffinés, obtenus par exemple selon le procédé de la Demande Internationale WO 03/099870 [10]. On entend également 15 des alginates bactériens, obtenus par exemple à partir de culture de bactéries mucoïdes (e.g. cf. Demande internationale WO 2009/134368) [11]. Par « algues brunes » au sens de la présente invention, on entend les algues nommées Phaeophyceae ou Phéophycées dont il existe 1500 20 espèces (e.g. Ascophyllum nodosum, Fucus serratus, Laminaria hyperborea, Laminaria digitata, Ecklonia maxima, Macrocystis pyrifera, etc...), et dont les parois sont essentiellement composées de fucanes sulfatés et d'alginate. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, ledit 25 procédé comprend, avant l'étape a), les étapes de préparation des alginates (sem i-)raffinés, oligoalginates et poly(oligo)guluronates. Les poly(oligo)guluronates proviennent de la dépolymérisation d'alginates. Les alginates semi-raffinés proviennent de la lixiviation acide d'algues brunes suivie d'une solubilisation des alginates de sodium par augmentation du pH 30 puis d'une séparation solide/liquide afin d'éliminer les résidus algaux. Les alginates raffinés proviennent d'une étape supplémentaire de 3044876 6 dépigmentation par le formol et d'une étape de purification. Les oligoalginates proviennent du traitement par voie enzymatique et/ou acide de solution d'alginate. Les alginates bactériens sont obtenus par exemple à partir de culture de bactéries mucoïdes (e.g. cf. Demande internationale 5 WO 2009/134368) [11]. Selon un mode de réalisation particulier de la présente inventon, ledit procédé peut comprendre en outre une étape a') de neutralisation du milieu réactionnel issu de l'étape a), et réalisée avant l'étape b), conduisant à une composition finale incluant une quantité variable de sel d'amine grasse 10 résiduelle. Par exemple, l'étape de neutralisation est réalisée en présence de soude 1M, jusqu'à un pH de 7. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l'étape de butanolyse et de glycosylation de Fisher a) est réalisée en présence (i) d'eau et/ou d'un solvant ionique et/ou d'un solvant eutectique, 15 (ii) d'un alcool ROH, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, ayant de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence du n-butanol, et (iii) d'un catalyseur acide tel que par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, un acide alkyl sulfurique tel que l'acide décyl ou lauryl sulfurique, un acide sulfonique tel que l'acide benzènesulfonique, l'acide paratoluène sulfonique, l'acide 20 camphosulfonique, un acide alkylsulfonique tel que l'acide méthylsulfonique, l'acide décylsulfonique, l'acide laurylsulfonique, l'acide sulfosuccinique ou un sulfosuccinate d'alkyl tel le sulfosuccinate de décyle ou sulfosuccinate de lauryle, les acides perhalohydriques, tel que l'acide perchlorique, des métaux tels que le fer, leurs oxydes ou leurs sels, comme leurs 25 halogénures. De préférence, il s'agit d'acide alkylsulfonique ou d'acide m éthanesulfon igue Par « solvant ionique » au sens de la présente invention, on entend par exemple le chlorure de 1-butyl-3-méthylimidazolium [BMIM]Cl, le bromure de 1-butyl-3-méthylimidazolium [BMIM]Br, le méthylsulfate de tris- 30 (2-hydroxyéthyl)m éthylam m on ium (HEMA) et l'acétate de 1-éthyl-3- 3044 876 7 méthylimidazolium [EMIM]Ac0 ; ledit solvant ionique comprenant typiquement jusqu'à 10% d'eau. Par « solvant eutectique » au sens de la présente invention, on entend des systèmes formés d'un mélange eutectique de bases ou d'acides de 5 Lewis ou Brônsted qui peuvent contenir une variété d'espèces anioniques et/ou d'espèces cationiques. Les solvants eutectiques de première génération ont été basés sur des mélanges de sels d'ammonium quaternaire avec des donneurs de liaison d'hydrogène tels que les amines et les acides carboxyliques (e.g. sel d'ammonium quaternaire et (hydrate 10 de) chlorure de métal. Cette étape a) est réalisée, par exemple, en mettant en présence un équivalent de poly(oligo)guluronates de degré de polymérisation compris entre 2 et 100, de préférence environ 35, issus de la dépolymérisation acide (Demande internatinale WO 03/099870) [10] d'alginates extraits des 15 espèces Ascophyllum, Durvillaea, Ecklonia, Laminaria, Lessonia, Macrocystis, Sargassum and Turbinaria, et de préférence des alginates riches en acide L-guluronique ; de 10 à 1000 équivalents molaires d'eau ; de 2 à 300 équivalents molaires d'alcool, tel que le n-butanol, sont introduits, et de préférence 150 équivalents molaires ; de 10-3 à 10 équivalents molaires 20 d'un catalyseur acide, tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, un acide alkyl sulfurique tel que l'acide décyl ou lauryl sulfurique, un acide sulfonique tel que l'acide benzènesulfonique, l'acide paratoluène sulfonique, l'acide camphosulfonique, un acide alkylsulfonique tel que l'acide méthylsulfonique, l'acide décylsulfonique, l'acide laurylsulfonique, l'acide 25 sulfosuccinique ou un sulfosuccinate d'alkyl tel le sulfosuccinate de décyle ou sulfosuccinate de lauryle, les acides perhalohydriques, tel que l'acide perchlorique, des métaux tels que le fer, leurs oxydes ou leurs sels, comme leurs halogénures, et de préférence de 1,1 à 10 équivalents molaires d'acide alkylsulfonique, et de préférence 2,1 équivalents molaires d'acide 30 méthylsulfonique. 3044876 8 La réaction est alors conduite au reflux de l'azéotrope à pression atmosphérique (montage Dean Stark), entre 130 et 135°C dans le cas du butanol, de préférence sur 12 heures. La composition ainsi formée est constituée majoritairement de composés à deux chaînes provenant de 5 l'alcool (de préférence du butanol) dérivés de l'acide L-guluronique. La préparation des L-guluronamides d'alkyle où la chaîne alkyle est dérivée d'une amine grasse, se poursuit par l'étape b) d'aminolyse, après abaissement de la température (de préférence jusqu'à 60°C), en ajoutant de 1 à 25 équivalents molaires d'une amine de formule R'NH2, linéaire ou 10 ramifiée, saturée ou insaturée où R' est composé de 5 à 22 atomes de carbone, et de préférence de 3 équivalents molaires sont ajoutés. La réaction est conduite à une température de préférence de 65-70 °C et sous pression réduite pour le recyclage de l'alcool précédemment cité. La composition ainsi formée constitue un produit d'usage dérivé de 15 l'acide L-guluronique comme émulsifiants. Les sels et les sucres n'ayant pas réagi peuvent être éliminés de cette composition par reprise dans un solvant organique, de préférence l'éther diéthylique, puis filtrés et rincés plusieurs fois avec le solvant organique. Le filtrat contenant les L-guluronam ides d'alkyle est concentré pour donner une 20 composition enrichie en produits d'intérêt qui constitue également un produit d'usage tel qu'un agent émulsifiant présentant des propriétés antibactériennes et antifongiques aux concentrations utilisées pour la formation des émulsions. L'étape a) du procédé de l'invention est réalisée, par exemple, en 25 mettant en présence d'un équivalent d'alginate, telles que les alginates extraits des espèces Ascophyllum, Durvillaea, Ecklonia, Laminaria, Lessonia, Macrocystis, Sargassum and Turbinaria, les oligoalginates issus d'une dépolymérisation, et de préférence des alginates riches en acide Lguluronique ; de 10 à 1000 équivalents molaires d'eau ; de 2 à 300 30 équivalents molaires d'alcool tel que le n-butanol sont introduits et de préférence 150 équivalents molaires ; de 10-3 à 10 équivalents molaires 3044876 9 d'un catalyseur acide, tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, un acide alkyl sulfurique tel que l'acide décyl ou lauryl sulfurique, un acide sulfonique tel que l'acide benzènesulfonique, l'acide paratoluène sulfonique, l'acide camphosulfonique, un acide alkylsulfonique tel que l'acide 5 méthylsulfonique (ou méthanesulfonique), l'acide décylsulfonique, l'acide laurylsulfonique, l'acide sulfosuccinique ou un sulfosuccinate d'alkyl tel le sulfosuccinate de décyle ou sulfosuccinate de lauryle, les acides perhalohydriques, tel que l'acide perchlorique, des métaux tels que le fer, leurs oxydes ou leurs sels, comme leurs halogénures, et de préférence de 10 1,1 à 10 équivalents molaires d'acide alkylsulfonique, et de préférence 2,5 équivalents molaires d'acide méthylsulfonique. La réaction est alors conduite au reflux de l'azéotrope à pression atmosphérique (montage Dean Stark), entre 130 et 135°C dans le cas du butanol, de préférence sur 24 heures. 15 La composition ainsi formée est constituée majoritairement de composés à deux chaînes provenant de l'alcool (de préférence du butanol) dérivés de l'acide L-guluronique et de l'acide D-mannuronique. La préparation des L-guluronamides d'alkyle et des Dmannuronamides d'alkyle où la chaîne alkyle est dérivée d'une amine 20 grasse, se poursuit par l'étape b) d'aminolyse, après abaissement de la température (de préférence jusqu'à 60°C) selon deux protocoles possibles : 1) La réaction d'aminolyse se fait sans neutralisation préalable du milieu : en présence de 1 à 25 équivalents molaires d'une amine de formule R'NH2, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée où R' est composé de 5 à 25 22 atomes de carbone, et de préférence de 3 équivalents molaires. Par exemple, l'amine grasse est choisi dans le groupe constitué de la dodécylamine et de l'amine oléique. La réaction est conduite à une température de préférence de 65-70 °C et sous pression réduite pour le recyclage de l'alcool précédemment cité. La composition ainsi formée 30 constitue un produit d'usage dérivé de l'acide L-guluronique et de l'acide D- mannuronique comme émulsifiants. Les sels et les sucres n'ayant pas réagi 3044876 10 peuvent être éliminés de cette composition par reprise dans un solvant organique, de préférence l'éther diéthylique, puis filtrés et rincés plusieurs fois avec le solvant organique. Le filtrat contenant les L-guluronamides d'alkyle et les D-mannuronamides d'alkyle est concentré pour donner une 5 composition enrichie en produits d'intérêt qui constitue également un produit d'usage tel qu'un agent émulsifiant présentant des propriétés antibactériennes et antifongiques aux concentrations utilisées pour la formation des émulsions. 2) La réaction d'aminolyse se fait après neutralisation préalable 10 du milieu : par ajout d'une solution de NaOH 1N jusqu'à un pH proche de 7. Le milieu est ensuite concentré 6 fois sous pression réduite sans aller à sec. Puis de 1 à 10 équivalents molaires d'une amine de formule R'NH2, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée où R' est composé de 5 à 22 atomes de carbone, et de préférence de 1 équivalent molaire, sont ajoutés. Par 15 exemple, l'amine grasse est choisi dans le groupe constitué de la dodécylamine et de l'amine oléique. La réaction est conduite à une température de préférence de 65-70°C et sous pression réduite pour le recyclage de l'alcool précédemment cité. Par la suite, de 100 à 1000 équivalents molaires d'eau, de préférence 500 équivalents sont ajoutés au 20 milieu. Le mélange est agité environ 15 minutes à 65-70°C. Après arrêt de l'agitation, le milieu est laissé pendant environ 10 mn à cette même température de manière à ce que les produits organiques floculent. Après abaissement de la température à l'ambiante, la phase organique se solidifie et il est alors facile d'éliminer l'eau chargée des sels. 25 Les compositions ainsi formées par le procédé de l'invention constituent des produits d'usage dérivés de l'acide L-guluronique et de l'acide D-mannuronique tel que des agents émulsifiants présentant des propriétés antibactériennes et antifongiques aux concentrations utilisées pour la formation des émulsions. 30 La présente invention a également pour objet une composition obtenue par le procédé selon l'invention. Les compositions de l'invention 3044876 11 sont constituées de dérivés d'acide L-guluronique ou des deux acides uroniques (acide L-guluronique et acide D-mannuronique) issu du même polysaccharide. En outre, les dérivés de l'acide L-guluronique et de l'acide D-mannuronique qui constituent les compositions de l'invention sont sous 5 forme à la fois de pyranosides (cycle à 6 chaînons) et de furanosides (cycles à 5 chaînons). En fonction de la longueur de la chaîne et de la nature des chaînes d'alkyle, les compositions de l'invention seront considérées comme des agents émulsionnants pour des émulsions eau dans huile (E/H) ou huile dans eau (H/E). De plus, elles pourront présenter 10 des propriétés antibactériennes et antifongiques. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'une composition selon l'invention comme agent tensioactif. De préférence, ledit agent tensioactif est choisi dans le groupe constitué des agents solubilisants, hydrotropes, mouillants, moussants, émulsionnants, 15 émulsifiants et/ou détergents. La présente invention a également pour objet une composition selon l'invention pour une utilisation comme agent antibactérien et/ou antifongique. La présente invention a également pour objet un tensioactif 20 comprenant une composition selon l'invention. Ledit tensioactif peut présenter les propriétés suivantes : Nombre d'atomes de Tensioactif à deux chaînes lipophiles : D-mannuronamides carbone de la chaîne d'alkyl et/ou L-guluronamides d'alkyle lipophile (alkyle R2) : Entre 1 et 6 Agents hydrotropes et/ou solubilisants Entre 6 et 14 Agents émulsifiants huile dans eau (H/E) et/ou eau dans huile (E/H) Entre 16 et 22 Agents émulsifiants eau dans huile (E/H) La présente invention a également pour objet un antifongique et/ou antibactérien comprenant une composition selon l'invention. Le procédé de l'invention conduit à des compositions tensioactives 25 originales en utilisant exclusivement des matières premières biosourcées 3044876 12 (poly(oligo)guluronates, alginates, oligoalginates, algues brunes) ou biocompatibles / biodégradables : - en mettant en oeuvre une méthodologie qui permet de transformer l'acide L-guluronique provenat de poly(oligo)guluronates ou à la fois 5 l'acide L-guluronique et l'acide D-mannuronique, i.e. les deux sucres uroniques constitutifs des alginates, pour conduire à des compositions tensioactives constituées exclusivement de l'acide Lguluronique ou des deux saccharides (l'acide L-guluronique et l'acide D-mannuronique) ; 10 - en utilisant des conditions qui peuvent permettre de s'affranchir de l'étape préalable de dépolymérisation de l'alginate et donc de l'utiliser directement ; - en proposant des conditions qui répondent aux principes de la chimie bleue, réactions sans solvants organiques autres que les 15 alcools/amines réactifs, ne produisant pas de déchets (recyclage des alcools à chaînes courtes (n-butanol, etc... )) et utilisant des réactifs biodégradables (acide méthane sulfonique et analogues) ; - en réalisant l'ensemble des réactions selon un procédé « one pot » sans isolement, ni purification des intermédiaires réactionnels ; 20 - en contrôlant la quantité d'amine grasse utilisée lors de l'étape d'aminolyse et les conditions de neutralisation de l'acide utilisé lors de première phase du procédé, il est possible d'aboutir à des compositions tensioactives comprenant des proportions variables de sels d'alkyl ammonium ; 25 - en utilisant des conditions simples de purification partielle des bruts réactionnels et d'isolement des compositions tensioactives qui permettent d'aboutir aux composés dérivés et aux compositions à des prix plus compétitifs par rapport au marché actuel. Le procédé de l'invention permet de produire des compositions 30 dérivées de l'acide L-guluronique ou dérivées à la fois de l'acide L- guluronique et de l'acide D-mannuronique sous forme d'amide qui 3044876 13 présentent l'avantage de former des émulsions eau dans huile (E/H) et huile dans eau (H/E) très stables en comparaison avec des émulsifiants commerciaux, et de posséder des propriétés antibactériennes et antifongiques aux concentrations utilisées pour la formation des émulsions. 5 Ainsi le procédé de l'invention permet à la fois de réduire les coûts de production des compositions tensioactives et de proposer de nouvelles compositions dans un objectif d'amélioration des performances (propriétés émulsionnantes notamment). D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à 10 la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures - La figure 1 représente la mesure des tensions interfaciales des 15 compositions GN12, GN18, AIgN12, AIgN18 et Algn12brut. - La figure 2 représente la mesure du pouvoir émulsionnant des compositions GN12, GN18, AIgN12, AIgN18 et Algn12brut en comparaison de références commerciales Xylance® et Montanov®. 20 EXEMPLES Exemple 1: PROCÉDÉ D'OBTENTION DE L-GULURONAMIDES D'ALKYLE À PARTIR DE POLY(OLIGO)GULURONATES 3044876 14 /NH-(CH2)9-CH3 HC-OH O OH 1) C4I19011 au reflux AMS, 24 heures 2)H3C-(CH2).-NH2 HN-\ (CH2)n-CH3 Pour n = 17, Rdt = 36-39% ,C eee OH 0 HO OH Pour n = 11, Rdt = 38-40% O-(C112)3C113 OH vs.r0-(CH2)3-CH3 L-Polyguluronate Ratio M/G = 0.25 OH 1) Réaction de butanolyse et de glycosylation de Fischer 1 g de L-poly(oligo)guluronate de sodium (7500 g/mol, Degré de 5 polymérisation = 44) dont le ratio M/G est 0,25 (5,71 mmol, 1 éq) a été mélangé avec 2 mL d'eau distillée. 80 mL (150 éq) de butanol ont été ajoutés à la solution d'alginate sous agitation avec 778 pl d'acide méthane sulfonique (12 mmol, 2,1 éq). Le milieu a été agité à la température de reflux du butanol (130-135°C) pendant 12 heures. Les eaux présentes dans 10 le milieu et celles formées au cours de la réaction ont été éliminées dans un Dean Stark rempli de butanol, par une distillation azéotropique eau-butanol. Etant plus dense que le butanol, l'eau se déplace vers le fond du Dean Stark et quelques ml de butanol passent dans le ballon pour conserver le volume initial. Après 12 heures, une chromatographie sur couche mince 15 (CH2C12/CH3OH 95/5 v/v) a été réalisée pour le milieu réactionnel pour s'assurer que le produit attendu a bien été synthétisé. 2) Réaction d'aminolyse La température du milieu a été abaissée jusqu'à 60°C avant d'ajouter 20 3 équivalents molaires (17,14 mmol) d'amine grasse (Pour n = 11, 3,18 grammes et pour n = 17, 4,62 grammes) nécessaire pour augmenter le pH à 8,5. Après 30 minutes d'agitation à 65°C et sous pression réduite de 150 mbar, le butanol a été évaporé en diminuant la pression de 150 mbar à 6 mbar sous une période de 1 heure. Le milieu a été laissé sous pression 3044876 15 réduite de 6 mbar pendant 1 heure et demi pour s'assurer de l'évaporation des traces de butanol qui se formaient. Le résidu obtenu a été repris dans l'éther diéthylique puis filtré sur fritté et rincé plusieurs fois avec l'éther diéthylique pour éliminer les sels et le 5 sucre de départ non réagi. Le filtrat (contenant nos guluronamides d'alkyle) a été concentré sous vide pour éliminer l'éther diéthylique. Une huile brune a ainsi été obtenue. Pour n = 11, après chromatographie éventuelle de l'huile obtenue sur 10 colonne de gel de silice (80 grammes, en utilisant l'éluant CH2C12/CH3OH 95/5 v/v), a été déterminée la présence de 0,95 g (2,27 mmol, 40% de rendement) d'un mélange de 4 formes d'isomères de N-(12-dodécyl)-n-butyl p-L-gulurofuranosiduronamide (37%), N-(12-dodécyI)-n-butyl a-L- gulurofuranosiduronam ide (21%), N-(12-dodécyI)-n-butyl a-L- 15 guluropyranosiduronamide (28%), et N-(12-dodécyl)-n-butyl p-Lguluropyranosiduronamide (14%). Le ratio pyranose/furanose est de 0,74. Cette composition tensioactive a été nommée GN12. Pour n = 17, après chromatographie éventuelle de l'huile obtenue sur 20 colonne de gel de silice (80 grammes, en utilisant l'éluant CH2C12/CH3OH 95/5 v/v), a été déterminée la présence de 1,08 g (2,16 mmol, 38% de rendement) d'un mélange de 4 formes d'isomères de N-(18-octadécyl)-nbutyl p-L-gulurofuranosiduronam ide (36%), N-(18-octadécyI)-n-butyl a-L- gulurofuranosiduronam ide (23%), N-(18-octadécyI)-n-butyl a-L- 25 guluropyranosiduronamide (25%), et N-(18-octadécyl)-n-butyl p-Lguluropyranosiduronamide (16%). Le ratio pyranose/furanose est de 0,69. Cette composition tensioactive a été nommée GN18. Exemple 2 : PROCÉDÉ D'OBTENTION DE L-GULURONAMIDES ET D30 MANNURONAMIDES D'ALKYLE À PARTIR D'ALGINATES 3044876 16 -00C OH cH 1) C4H9OH au reflux -00C -0 AMS, 24 heures --or"--900C OH 1 OH G G 2)113c-(cH2).-N112 Pour u= 11, Rdt = 38-40% Pour n= 17, Rdt = 36-39% Alginate de sodium Ratio M/G = 0.6 0-(CH2)3-CH3 HN-(CH2)n-CH3 \ OH _Fi e ...« C ..0 i. vv-0-(CH2)3-CH3 0OH OH NH-(CH2)n-CH3 HC-OH NH-(CH2)n-CH3 HO-CH NHICH2)n-CH3 OH 0 HO HO 0-(CH2)3-CH3 A) sans neutralisation préalable du milieur réactionnel avant la réaction d'aminolyse 5 1) Réaction de butanolyse et de glycosylation de Fischer 1 g d'alginate de sodium (110 200 g/mol, Degré de polymérisation = 630, extrait de Sargassum vulgare) dont le ratio M/G est 0,71 (5,71 mmol, 1 éq) a été mélangé avec 3 mL d'eau distillée. 80 mL (150 éq) de butanol 10 ont été ajoutés à la solution d'alginate sous agitation avec 927 pl d'acide méthane sulfonique (14,27 mmol, 2,5 éq). Le milieu a été agité à la température de reflux du butanol (130-135°C) pendant 24 heures. Les eaux présentes dans le milieu et celles formées au cours de la réaction ont été éliminées dans un Dean Stark rempli de butanol, par une distillation 15 azéotropique eau-butanol. Etant plus dense que le butanol, l'eau se déplace vers le fond du Dean Stark et quelques ml de butanol passent dans le ballon pour conserver le volume initial. Après 24 heures, une chromatographie sur couche mince (CH2C12/CH3OH 95/5 v/v) a été réalisée pour le milieu réactionnel pour s'assurer que le produit attendu a bien été 20 synthétisé. 2) Réaction d'aminolyse 3044876 17 La température du milieu a été abaissée jusqu'à 60°C avant d'ajouter 3 équivalents molaires (17,14 mmol) d'amine grasse (Pour n = 11, 3,18 grammes et pour n = 17, 4,62 grammes) nécessaire pour augmenter le pH à 8,5. Après 30 minutes d'agitation à 65°C et sous pression réduite de 5 150 mbar, le butanol a été évaporé en diminuant la pression de 150 mbar à 6 mbar sous une période de 1 heure. Le milieu a été laissé sous pression réduite de 6 mbar pendant 1 heure et demi pour s'assurer de l'évaporation des traces de butanol qui se formaient. Le résidu obtenu a été repris dans l'éther diéthylique puis filtré sur fritté 10 et rincé plusieurs fois avec l'éther diéthylique pour éliminer les sels et le sucre de départ non réagi. Le filtrat (contenant les guluronamides et mannuronamides d'alkyle) a été concentré sous vide pour éliminer l'éther diéthylique. Nous obtenons ainsi une huile brune foncée. Pour n = 11, après chromatographie éventuelle de l'huile obtenue sur 15 colonne de gel de silice (80 grammes, en utilisant l'éluant CH2C12/CH3OH 95/5 v/v), a été déterminée la présence de 0,91 g (2,18 mmol, 39% de rendement) d'un mélange de 6 formes d'isomères (C22H43N06, masse molaire = 417,59 g/mol) de N-(12-dodécyl)-n-butyl p-L- gulurofuranosiduronam ide (26%), N-(12-dodécyI)-n-butyl a-L- 2 0 gulurofuranosiduronam ide (15%), N-(12-dodécyI)-n-butyl a-L- guluropyranosiduronam ide (16%), N-(12-dodécyI)-n-butyl p-L- guluropyranosiduronam ide (12%), N-(12-dodécyI)-n-butyl a-D- mannofuranosiduronam ide (18%) et N-(12-dodécyI)-n-butyl a-D- mannopyranosiduronamide (14%). Cette composition tensioactive a été 25 nommée AlgN12. D'après l'analyse des spectres RMN 1D et 2D du brut réactionnel (avant purification), ont pu être calculés : le ratio pyranose/furanose des formes guluronamides (0,72), le ratio pyranose/furanose des formes 30 mannuronamides (0,81) et le ratio mannuronamide/guluronamide (0,47). 3044876 18 En outre, la quantité des sels de mésylates de dodécylammonium formés au cours de la réaction d'aminolyse a pu être quantifiée. En partant de 1 g d'alginate (1 éq.), cette quantité formée a été de 1,8 équivalents molaires (0,010 moles, 2,89 grammes). 5 Caractérisation du sel d'amine associé: mésylate de dodécylammonium O CH3S03 H3N C13F131NO3S M = 281.46 g/mol 10 Pour n = 17, après chromatographie éventuelle de l'huile obtenuesur colonne de gel de silice (80 grammes, en utilisant l'éluant CH2C12/CH3OH 95/5 v/v), a été déterminée la présence del ,03 g (2,05 mmol, 36% de rendement) d'un mélange de 6 formes d'isomères (C28H55N06, masse 15 molaire = 501,75 gulurofuranosiduronam ide gulurofuranosiduronam ide guluropyranosiduronam ide guluropyranosiduronam ide 20 mannofuranosiduronam ide mannopyranosiduronamide (14%). Cette composition tensioactive a été nommée AlgN18. D'après l'analyse des spectres RMN 1D et 2D du brut réactionnel 25 (avant purification), ont pu être calculés : le ratio pyranose/furanose des formes guluronamides (0,71), le ratio pyranose/furanose des formes mannuronamides (0,84) et le ratio mannuronamide/guluronamide (0,46). De même, la présence des sels de mésylates d'octadécylammonium formés lors de la réaction d'aminolyse a pu être quantifiée. En partant de 1 g g/mol) de N-(18-octadécyl)-n-butyl p-L- (25%), N-(18-octadécyI)-n-butyl a-L- (15%), N-(18-octadécyI)-n-butyl a-L- (16%), N-(18-octadécyI)-n-butyl 13-1, (12%), N-(18-octadécyI)-n-butyl a-D- (18%) et N-(18-octadécyl)-n-butyl a-D- 3044876 19 d'alginate (1 éq.), cette quantité formée a été de 2 équivalents molaires (0,011 moles, 4,16 grammes). Caractérisation du sel d'amine associé: mésylate d'octadécylammonium. O cH3so3 H3N H43NO3S M = 365.62 g/mol B) avec neutralisation préalable du milieu réactionnel avant la réaction d'aminolyse 15 Dans le but de développer un procédé sans étape de purification derrière, plus simple à mettre en oeuvre à l'échelle pilote, tout en utilisant une quantité faible en amine et en évitant l'utilisation de solvants organiques (hormis le butanol), il a été procédé selon le protocole décrit ci-dessous : 20 1) Réaction de butanolyse et de glycosylation de Fischer 1 g d'alginate de sodium (110 200 g/mol, Degré de polymérisation = 630, extrait de Sargassum vulgare) dont le ratio M/G est 0,71 (5,71 mmol, 1 éq) a été mélangé avec 3 mL d'eau distillée. 80 mL (150 éq) de butanol ont été ajoutés à la solution d'alginate sous agitation avec 927 pl d'acide 25 méthane sulfonique (14,27 mmol, 2,5 éq). Le milieu a été agité à la température de reflux du butanol (130-135°C) pendant 24 heures. Les eaux présentes dans le milieu et celles formées au cours de la réaction ont été éliminées dans un Dean Stark rempli de butanol, par une distillation azéotropique eau-butanol. Etant plus dense que le butanol, l'eau se déplace 30 vers le fond du Dean Stark et quelques ml de butanol passe dans le ballon 5 C19 10 3044876 20 pour conserver le volume initial. Après 24 heures, une chromatographie sur couche mince (CH2C12/CH3OH 95/5 v/v) a été réalisée pour le milieu réactionnel pour s'assurer que le produit attendu est bien synthétisé. 5 2) Neutralisation du milieu réactionnel Afin de diminuer la quantité d'amines à ajouter lors de la seconde étape du procédé, le milieu réactionnel a été neutralisé, après refroidissement, avec de la soude 1 M (8 mL) jusqu'à un pH de 7. Ensuite, l'eau a été évaporée à l'évaporateur rotatif. 10 3) Réaction d'aminolyse 1 équivalent molaire de dodécylamine (5,71 mmol, 1,06 grammes) a été ajouté au milieu réactionnel. Après 30 minutes d'agitation à 65°C et sous pression réduite de 150 mbar, le butanol a été évaporé en diminuant la 15 pression de 150 mbar à 6 mbar sous une période de 1 heure. Le milieu a été laissé sous pression réduite de 6 mbar pendant 1 heure et demi pour s'assurer de l'évaporation des traces de butanol qui se formaient. Une étape pour éliminer les sels a consisté à ajouter 500 équivalents molaires de l'eau (60 mL) et l'ensemble a été agité à 70°C pendant 15 20 minutes.Après arrêt de l'agitation, les produits organiques amides floculaient à la surface de l'eau. En laissant le milieu refroidir à température ambiante, la phase organique s'est solidifiée, il a alors été facile d'éliminer l'eau chargé de sels, et les floculats solides ont été récupérés. Ces floculats, de coloration brune extrêmement intense, sont formés du brut de 25 L-guluronamide et D-mannuronamide d'alkyle et des sels de mésylates de dodécylammonium. La masse finale obtenue en brut a été de 1,21 grammes (2,9 mmol). Cette composition tensioactive a été nommée AlgN12brut. D'après l'analyse des spectres RMN 1D et 2D du brut réactionnel 30 (sans purification), a été déterminée la présence d'un mélange de 6 formes 3044876 21 d'isomères (C22H43N06, masse molaire = 417,59 g/mol) de N-(12-dodécyI)- n-butyl p-L-gulurofuranosiduronam ide (24%), N-(12-dodécyI)-n-butyl a-L- gulurofuranosiduronam ide (14%), N-(12-dodécyI)-n-butyl a-L- guluropyranosiduronam ide (18%), N-(12-dodécyI)-n-butyl 5 guluropyranosiduronam ide (10%), N-(12-dodécyI)-n-butyl a-D- mannofuranosiduronam ide (19%) et N-(12-dodécyI)-n-butyl a-D- mannopyranosiduronam ide (15%). Ces données ont permis de calculer le ratio pyranose/furanose des formes guluronamides (0,73), le ratio pyranose/furanose des formes 10 mannuronamides (0,79) ainsi que le ratio mannuronamide/guluronamide (0,51). De plus, la présence des sels de mésylates de dodécylammonium formés lors de la réaction d'aminolyse a pu être quantifiée. En partant de 1 g d'alginate (1 éq.), cette quantité formée a été de 0,4 équivalents 15 molaires (0,0023 moles, 0,64 grammes). Exemple 3: MESURES DES TENSIONS INTERFACIALES (CAS DU SYSTÈME HUILE TOURNESOL-EAU) DES COMPOSITIONS GN12, GN18, AlgN12, Algn18 et Algn12brut 20 Les propriétés interfaciales des compositions tensioactives GN12, GN18, AIgN12, AIgN18 et Algn12brut ont été évaluées via la mesure des tensions interfaciales huile-eau. Les tensioactifs ont été solubilisés dans l'huile de tournesol à des concentrations variant de 0,12 à 2,28 g/L. Afin de favoriser la solubilité des tensioactifs dans l'huile, les solutions ont été 25 laissées dans un bain aux ultrasons pendant 10 minutes à 50°C. Les mesures des tensions à l'interface entre l'huile et l'eau ont été effectuées à 25°C avec un tensiomètre à anneau (Krüss, modèle K 100C). L'anneau utilisé était en platine iridié calibré. La tension interfaciale entre l'huile de tournesol (marque Carrefour) et 30 l'eau à 25°C a varié entre 24,71 et 25,04 mN/m. 3044876 22 Pour chaque composition tensioactive, l'appareil a mesuré initialement la tension de surface de l'huile de tournesol contenant le tensioactif (liquide de faible densité), puis la tension de surface de l'eau (liquide de haute densité). Enfin, l'huile a été ajoutée délicatement sur l'eau, tout en évitant la 5 formation de bulles, l'appareil a commencé à mesurer la tension interfaciale entre l'huile de tournesol et l'eau (moyenne de 10 mesures). Tensions interfaciales des compositions tensioactives (mN/m) GN12 AIgN12 AIgN12 brut GN18 AIgN18 0,12 g/L 18,91 18,45 17,25 0,25 g/L 13,79 15,21 14,08 17,49 17,56 0,46 g/L 12,45 11,75 11,29 14,315 14,37 0,61 g/L 9,15 10,39 9,87 13,02 1,11 g/L 7,24 6,94 10,9 9,63 1,64 g/L 5,97 8,475 2,28 g/L 6,75 6,22 2,97 g/L 5,83 3,49 g/L 5,346 Les cases grisées correspondent à des cas où la tension interfaciale n'a pas été mesurée La figure 1 montre que les compositions tensioactives ont été capables 10 de diminuer de façon similaire les tensions interfaciales eau/huile à des valeurs suffisamment faibles pour conférer aux compositions des pouvoirs émulsionnants. Il a été constaté que la composition AIgN12 brut obtenue par le procédé direct d'obtention des L-guluronamides et Dmannuronam ides d'alkyle à partir de l'alginate, avec neutralisation préalable 15 du milieu avant la réaction d'aminolyse était plus efficace que la composition tensioactive AlgN12 correspondant au mélange de tensioactifs L-guluronamides et D-mannuronamides d'alkyle purifiés par chromatographie (procédé direct d'obtention des L-guluronamides et Dmannuronamides d'alkyle à partir de l'alginate, sans neutralisation préalable 20 du milieu avant la réaction d'aminolyse). Ces résultats ont montré la possibilité d'utiliser un brut de réaction sans nécessiter de purification supplémentaire. De même, les compositions dérivées de la dodécylamine 3044876 23 (GN12, AIgN12, AlgN12brut) ont été plus efficaces que celles dérivées de l'octadécylamine (GN18, AIgN18). Exemple 4: MESURE DU POUVOIR ÉMULSIFIANT DES 5 COMPOSITIONS GN12, GN18, AIgN12, Algn18 et Algn12brut La stabilité des émulsions huile dans eau (H/E) et eau dans huile (E/H) formées à partir des compositions tensioactives GN12, GN18, AIgN12, AIgN18 et Algn12 brut a été étudiée en comparaison avec celle d'alkylpolyglycosides commerciaux : Montanov 82® de Seppic et Xyliance® 10 de Soliance/ARD. La stabilité des deux types émulsions H/E et E/H a été évaluée en considérant les deux ratios eau/huile 75/25 et 25/75 respectivement dans des tubes gradués à fond rond, 0,5% du produit tensioactif est introduit (20 mg). L'huile de tournesol a été introduite (1 ou 3 mL), puis les tensioactifs 15 ont été solubilisés dans un bain aux ultrasons pendant 10 minutes à 50°C. Après la solubilisation de l'émulsifiant, l'eau ultrapure a été ajoutée (1 ou 3 mL). Les deux phases ont ensuite été émulsionnées à l'aide d'un homogénéiseur Ultraturraxlka T18 basic° pendant 10 minutes à 11000 20 tours/min. L'emulsion a été placée dans un bain thermostaté à 20°C. L'évolution de l'émulsion et sa démixtion progressive a été observée pendant quelques heures à plusieurs semaines. La figure 2 montre les résultats d'analyse du pouvoir émulsionnant des compositions de l'invention. 25 Les compositions tensioactives dérivées de la dodécylamine (GN12, AIgN12 et AlgN12brut) ont formé des émulsions H/E très stables, y compris dans le cas de la composition tensioactive brute (AIgN12 brut) ainsi que des émulsions E/H stables (GN12 et AIgN12). Les compositions tensioactives dérivées de l'octadécylamine (GN18 et AIgN18) ont formé des émulsions 30 E/H très stables, les autres émulsions H/E ont subi une démixtion totale au bout de 5 h. 3044876 24 Pour les 2 types d'émulsions (E/H et H/E), les nouvelles compositions (GN12, AIgN12 et AlgN12brut) ont formé des émulsions plus stables que les références commerciales (Xyliance® et Montanov®). 5 Exemple 5: ACTIVITÉ ANTIBACTÉRIENNE DE DIFFÉRENTES FRACTIONS DE PRODUITS MODIFIÉS Deux protocoles ont été utilisés. Le premier (protocole A) a été appliqué à des fractions enrichies en isomères du N-(12-dodécyl)-n-butyl a- 10 L-guluronam ide par chromatographie sur gel de silice. Le second (Protocole B) a été suivi pour tester l'activité des compositions tensioactives dérivées de la dodécylamine (GN12, AIgN12 et AlgN12brut) et de la composition tensioactive dérivée de l'octadécylamine (AIgN18) 15 Protocole A 1) Préparation du milieu de culture : Le milieu de culture utilisé a été un mélange de 21 g/L Muller Hinton Broth et de 10 g/L d'agar dans l'eau. Ce mélange a été agité puis laissé 20 bouillir. Ensuite, une étape d'autoclavage de ce mélange, pendant 30 minutes, a été nécessaire afin de le stériliser avant toute manipulation. Ce milieu de culture a été versé, à chaud, dans des boîtes de Petri, puis laissé refroidir. 25 2) Préparation des produits modifiés à tester : 5 mg de chaque sucre modifié ont été dissous dans 1 mL de DMSO. Une série de dilution à 1/2, par le DMSO, a ensuite été réalisée à partir de la solution mère, afin d'obtenir les concentrations 2,5 g/L, 1,25 g/L, 0,625 g/L et 0,3125 g/L. 30 3044876 25 3) Préparation des suspensions bactériennes et fongiques : Les souches bactériennes utilisées ont été Pseudomonas aeruginosa, Escherichia Coli, Enterococcus faecium et Staphylococcus aureus, en plus de la souche fongique Candida albicans. 106 bactéries ont été prélevées 5 puis transférées dans une solution de NaCI 0,9%. Chaque boite de Petri, contenant le milieu Muller Hinton, a été inondée par une suspension bactérienne différente. 4) Protocole : 10 Après avoir laissé sécher les suspensions bactériennes sur la gélose, 10 pL de chaque solution à tester, et à différentes concentrations, ont été déposés sur la surface de la gélose inondée par la suspension bactérienne. Dans chaque boîte de Petri, 10 pL de DMSO ont été déposés comme contrôle négatif. 15 Les contrôles positifs utilisés ont été des disques imbibés d'ampicilline pour Escherichia cou/ et Enterococcus faecium, des disques de ceftazidime pour Pseudomonas aeruginosa et des disques de vancomycine pour Staphylococcus aureus. Après séchage, les boîtes de Petri ont finalement été incubées à 20 37°C dans l'étuve, pendant 24 heures. L'activité antibactérienne a été évaluée par la mesure de la zone de clarification en mm tout autour du lieu de dépôt des différentes solutions à tester. A titre d'exemple, l'activité des fractions I, II et III enrichies en isomères du N-(12-dodécyI)-n-butyl a-L-guluronamide (forme p-L- 25 furanoside = Fraction I ; forme a-L-pyranoside = Fraction II ; 13-1, pyranoside = Fraction III) : Fractions Concentration P. E. cou E. faecium C albicans enrichies aeruginosa S. aureus en N-(12- 5 0 0 9 mm 4,5 mm 10,5 mm dodécyl)-n- btlity1-13-L- 2,5 9 mm 4 mm 5 mm 3044876 26 gulurofuran osiduronam ide (75%) Fraction I 1,25 7 mm 4 mm 5 mm 0,625 0 4 mm 0 0,3125 0 0 0 N-(12- dodécyI)-n- btlityl-a-Lguluropyran osiduronam ide (74%) Fraction II 5 0 0 20 mm 5 mm 18,5 mm 2,5 20 mm 3 mm 17 mm 1,25 11 mm 3 mm 5 mm 0,625 8 mm 0 0 0,3125 8 mm 0 0 N-(12- dodécyI)-n- btlity1-13-1, guluropyran osiduronam ide (94%) Fraction III 5 0 0 0 9 mm 20,5 mm 2,5 7 mm 18 mm 1,25 5 mm 0 0,625 0 0 0,3125 0 0 Contrôle Ceftazidime 28 mm Ampicilline Ampicilline Vancomycine positif 22 mm 26 mm 19 mm C) / NH-(CH2)11-CH3 C) / NH-(CH2)11- CH3 C C 1 1 HC-OH HC-OH 00 0-(CH2)3-CH3 OH HO OH HO O-(CH2)3-CH3 N-(12-dodécyI)-n-butyl-a-L- gulurofuranosiduronamide HN (CH 1 CH -.- - -2,11- - - -3 \ OH 0-(CH2)3-CH3 C OH OH N-(12-dodécy1)-n-buty1-13-Lgulurofuranosiduronamide HN -.- - -2, \ (CH111-CH3 OH C OH OH 0-(C H2)3-CH3 N-(12-dodécyI)-n-butyl-a-L N-(12-dodécy1)-n-buty1-13-L- guluropyranosiduronamide guluropyranosiduronamide Fractions Concentration P. E. cou E. faecium C S. aureus enrichies 3044876 27 en aeruginosa albicans 5 6mm Ni-(18- octadécyI)- 2,5 6 mm n-liutyl-a-L- 1,25 0 0 6 mm 0 0 gulurofuran osiduronam 0,625 4 mm ide (47%) 0,3125 0 5 4,5 mm 10 mm Ni-(18- octadécyI)- 2,5 4 mm 0 n-kkityl-I3-L- 1,25 0 0 4 mm 0 0 gulurofuran osiduronam 0,625 3 mm 0 ide (63%) 0,3125 0 0 5 6mm Ni-(18- octadécyI)- 2,5 4 mm n-liutyl-I3-L- 1,25 0 0 0 0 0 guluropyran osiduronam 0,625 0 ide (86%) 0,3125 0 Contrôle Ceftazidime Ampicilline Ampicilline Vancomycine positif 28 mm 22 mm 26 mm 19 mm N H-(C H 2)17- C H3 0% / C HC-OH 0 0 -(CH2)3-CH3 NH-(CH2)17- CH3 0% / C HC-OH O 0 -(CH2)3-CH3 N-(18-octadécy1)-n-buty1-13-L- N-(18-octadécyI)-n-butyl-a-Lgulurofuranosiduronamide gulurofuranosiduronamide H N -(CH2)17 -CH3 \ OH C 0 H N -(CH2)17 -CH3 \ OH C 0 0-(C H2)3 -C H3 OH OH 0-(C H2)3 -C H3 OH OH N-(18-octadécy1)-n-butyl-a-L N-(18-octadécy1)-n-buty1-13-L- guluropyranosiduronamide guluropyranosiduronamide N-(18-octadécyI)-n-butyl-a-o-mannopyranosiduronamide 3044876 28 NH-(CH2)17-CH3 O-(CH2)3-CH3 Pour les études des activités antibactériennes et antifongiques, les fractions issues de la purification du brut N-(12-dodécyl)-n-butyl- Lguluronamide ont été testées. Chaque fraction est plus enrichie en un 5 isomère que les autres. Contre les bactéries gram positif Enterococcus faecium et Staphylococcus aureus, les N-(12 dodécyl)-n-butyl L-guluronamide (fraction enrichie en forme pyranose a) ont montré une capacité importante à inhiber la croissance de ces deux bactéries de l'ordre de 20 mm et 18,5 mm, 10 respectivement. Cette activité inhibitrice a diminué en diminuant la concentration. Il semble que les formes pyranoses, présentes majoritairement (94%), n'aient montré aucun effet inhibiteur contre Enterococcus faecium, mais aient montré un effet plus important sur la croissance de la levure Candida albicans (9 mm à 5 g/L), en plus de l'effet 15 inhibiteur le plus fort contre Staphylococcus aureus (20,5 mm à 5 g/L). Par contre, les N-(18 octadécyl)-n-butyl L-guluronamide n'ont montré aucun effet inhibiteur ni sur la bactérie gram positif Staphylococcus aureus, ni sur la levure Candida albicans. Contre les bactéries gram négatif Pseudomonas aeruginosa et 20 Escherichia coui, ni les N-(12 dodécyl)-n-butyl L-guluronamide et ni les N-(18 octadécyl)-n-butyl L-guluronamide (que ce soit sous forme furanose ou pyranose) n'ont montré une activité inhibitrice de la croissance de ces deux bactéries. OH 25 Protocole B 3044876 29 Les résultats intéressants de l'activité antibactérienne et antifongique, obtenus pour les fractions enrichies en isomères du N-(12-dodécyl)-n-butyl a-L-guluronamide, ont encouragé les inventeurs à tester l'activité antibactérienne et antifongique des mélanges des produits tensioactifs 5 obtenus à partir des guluronates (GN12) et à partir des alginates (AIgN12, AIgN12 brut et AIgN18). Pour ces produits mélanges de tensioactifs, une nouvelle méthode à été testée basée sur l'étude de la capacité des tensioactifs de l'invention à tuer les bactéries et puis le comptage du nombre de bactéries vivantes sur la gélose de Muller-Hinton. 10 1) Préparation de l'inoculum bactérien et fongique : L'inoculum a été préparé à une turbidité équivalente à 0,5 MacFarland (Biomérieux France), puis dilué à 1/100 (106 UFC/ml). De cet inoculum, une série des dilutions 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6 a été effectuée. 100 pl de 15 chaque dilution ont été étalés (méthode de numération) à la surface d'une gélose de Muller-Hinton (détermination de nombre des bactéries en UFC/ml dans l'inoculum 2) Préparation des produits modifiés à tester : 20 Des solutions mères ont été préparées pour chaque tensioactif GN12 (430 mg/ml), AIgN12 (310 mg/ml), AIgN12 brut (216 mg/ml) et AIgN18 (219 mg/ml). Une série de dilutions à raison 1/2, par le DMSO a étéréalisée pour chaque produit dans un bouillon de Muller-Hinton, la dilution finale était 1/128. 25 3) Protocole : Dans chaque tube des dilutions de tensioactif, 1 ml de l'inoculum bactérien a été ajouté. 3044876 30 Après incubation de 24h à 36°C, 100 pl de chaque tube clair ont été étalés à la surface d'une gélose Muller-Hinton suivi par une incubation 24h à 37°C. Le nombre des bactéries vivantes a été déterminé : N0=nx10 UFC/ml 5 (n=nombre des colonies). Le pourcentage des bactéries vivantes a été calculé : N0/N x100 : Nom de la Nom du Concentration Résultats bactérie produit préparée (mg/mi) Escherichia AIgN12 310 mg/mi 155 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries cou 77,5 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 38,75 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 19,375 mg/mi => Inhibition de 99,99% des bactéries AlgN12 216 mg/mi 108 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 54 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 27 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 13,5 mg/mi => Inhibition de 99,99% des bactéries (Brut) AlgN18 219 mg/mi 109,5 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 54,75 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 27,375 mg/mi => Inhibition de 99,99% des bactéries GN12 430 mg/mi 215 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 107,5 mg/mi => Inhibition de 99,99% des bactéries Pseudomonas AlgN12 310 mg/mi 155 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries aeruginosa 77,5 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 38,75 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 19,375 mg/mi => Inhibition de 99,9% des bactéries AlgN12 216 mg/mi 108 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries (Brut) 54 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 27 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 13,5 mg/mi => Inhibition de 99,9% des bactéries AlgN18 219 mg/mi 109,5 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 54,75 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 27,375 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries GN12 430 mg/mi 215 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 107,5 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 3044876 31 53,75 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries Enterococcus AlgN12 310 mg/mi 2,42 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries faecium AIgN12 216 mg/mi 1,7 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries (Brut) AlgN18 219 mg/mi 109,5 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 54,75 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 27,375 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries G N12 430 mg/mi 3,36 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries Candidas AlgN12 310 mg/mi 2,42 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries albicans AIgN12 216 mg/mi 1,7 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries (Brut) AlgN18 219 mg/mi 109,5 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 54,75 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries 27,375 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries G N12 430 mg/mi 3,36 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries Staphylococcus aureus AlgN18 219 mg/mi 109,5 mg/mi => Inhibition de 100% des bactéries Contre la bactérie gram positif Enterococcus faecium, le mélange d'AIgN12 brut (avec une neutralisation préalable à la réaction d'aminolyse) paraît plus efficace que le mélange AIgN12 (procédé sans neutralisation préalable à la réaction d'aminolyse) car une concentration de 1,7 mg/ml de 5 AIgN12 (brut) suffira d'inhiber 100% d'Enterococcus faecium alors que cette concentration est plus élevée dans le cas d'AIgN12 (2,42 mg/ml). De plus, le mélange de tensioactifs issus de la modification chimique de l'alginate (mélange de mannuronamide et guluronamide) présente un pouvoir plus fort contre Enterococcus faecium que les tensioactifs à base de 10 guluronamides seulement (concentration plus élevée en GN12 de l'ordre de 3,36 mg/ml pour inhiber 100% d'Enterococcus faecium). Cette observation est la même pour l'inhibition de Candida albicans. Contre les bactéries gram négatif Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coui, des concentrations très élevées en tensioactifs sont 15 nécessaires pour inhiber à 100% ces deux bactéries ; montrant que AIgN12 3044876 32 (38,75 mg/ml), AIgN12 brut (13,5 mg/ml) et GN12 (53,75 mg/ml) ont un faible pouvoir antibactérien contre ces deux types de bactéries. En comparant les AIgN12 et les AIgN18, le produit tensioactif amide d'alginate ayant une chaîne octadécyle présente un pouvoir antibactérien 5 plus faible contre les bactéries gram positif et gram négatif testées. Une concentration élevée en AIgN18 est nécessaire pour inhiber 100% de bactéries Enterococcus faecium (27,375 mg/mil), Pseudomonas aeruginosa (27,375 mg/mi), Escherichia cou/ (54,75 mg/mi) et Candida albicans (27,375 mg/mi). 10 3044 876 33 Listes des références 1- Hill et Lehen-Ferrenbach, "In Sugar-based surfactants fundamentals and Applications", C.C. Ruiz (Ed.), 1-20, CRC Press, ISBN 978-1-4200- 5 5166-7, 2009 2- Laurent et al., J. Surfact. Deterg., 14 : 51-63, 2011 3- Demande internationale WO 9206984 4- Demande internationale WO 9303004 5- Brevet US 7,655,611 10 6- Brevet US 5,872,111 7- Brevet US 2,670,345 8- Benvegnu et Sassi, Topics in Current Chemistry, 294: 143-164, 2010 9- Demande internationale WO 03/104248 10- Demande internationale WO 03/099870 15 11- Demande internationale WO 2009/134368 REVENDICATIONS1) Procédé de préparation d'une composition comprenant : des L-guluronam ides d'alkyle de formules (la) et (lb) : ou (ii) un mélange de L-guluronamides d'alkyle de formules (la) et (lb) et de D-mannuronamides d'alkyle de formule (lia) et (11b) : où - R1 est une chaîne alkyle de 2 à 22 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée ; - R2 est un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle de 2 à 22 atomes de carbone linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée pouvant comporter une fonction amine terminale ; et caractérisé en ce que ledit procédé comprend : a) une étape de réaction de butanolyse et de glycosylation de Fischer à partir de poly(oligo)guluronates, d'oligoalginates, d'alginates et/ou d'algues brunes ; b) une étape de réaction d'aminolyse sur le milieu réactionnel issu de l'étape a), en présence d'une amine de formule R'NH2, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée où R' est composé de 5 à 22 atomes de carbone. H C H ORi OH H c cl I H H (Tb) CONHR2 H c 0 OR1 1 CONHR2 ? H OH OH 1 C C 1 1 H H (la) H OR1 H CONHR2 OH OHc H 1 H (11b) CONHR2 H C I/III C H I OH OH OH I 1-1 11-1 (Ila) 3044876 35 2) Procédé selon la revendication 1, où ledit procédé comprend une étape a') de neutralisation du milieu réactionnel issu de l'étape a) avant l'étape b). 5 3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, où l'étape a) est réalisée en présence (i) d'eau et/ou d'un solvant ionique et/ou d'un solvant eutectique, (ii) d'un alcool de formule ROH, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, ayant de 1 à 4 atomes de carbone, et (iii) d'un catalyseur acide. 10 4) Procédé selon la revendication 3, où le catalyseur acide est choisi dans le groupe constitué de : l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, un acide alkyl sulfurique, un acide sulfonique, un acide alkylsulfonique ou un sulfosuccinate d'alkyl, les acides perhalohydriques, des métaux, leurs oxydes ou leurs sels comme leurs halogénures. 15 5) Procédé selon la revendication 4, où le catalyseur acide est l'acide méthanesulfonique. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où l'alcool 2 0 ROH est le n-butanol. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, où l'étape b) est réalisée en présence d'une amine grasse choisie dans le groupe constitué de dodécylamine et de l'amine oléïque. 8) Composition obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9) Composition selon la revendication 8, où ladite composition est une 3 0 émulsion huile dans eau ou eau dans huile. 3044876 36 10) Utilisation d'une composition selon la revendication 7 ou 8 comme agent tensioactif. 11) Utilisation d'une composition selon la revendication 10, où l'agent 5 tensioactif est choisi dans le groupe constitué des agents solubilisants, hydrotropes, mouillants, moussants, émulsionnants, émulsifiants et/ou détergents. 12) Composition selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8 pour 10 une utilisation comme agent antibactérien et/ou antifongique. 13) Tensioactif comprenant une composition selon la revendication 7 ou 8. 15 14) Antibactérien et/ou antifongique comprenant une composition selon la revendication 7 ou 8.