Brevet FR3038837A1 — publié le 20170120

Chitosane pour mélange avec un fluide coagulable La présente invention concerne le domaine des compositions implantables pour réparer un défaut tissulaire et un défaut articulaire, et en particulier du cartilage. Par exemple, les compositions peuvent implantées ou injectées sur une lésion du cartilage ayant été débridée et ayant subi une procédure de microfractures qui consiste à percer des microtunnels-pbue-stimuler la moelle osseuse. Le chitosane est un polysaccharide bien connu de l'art antérieur. Il s'agit d'un copolymère composé d'unités glucosamine, désacétyréeS, et--trunités .1\1-acétyleglucosamine (acétylées). Les propriétés du chitosane varient notamment selon la structure du polymère, et en particulier de sa masse moléculaire, reflété par sa viscosité dynamique par exemple. Le chitosane présente des difficultés de formulation car il est soluble à pH acide, inférieur à 6, mais insoluble à pH supérieur à cette valeur. Il est connu que l'ajout de sel organique comme le glycérophosphate permet de solubiliser le chitosane à pH plus élevée en évitant sa précipitation. Les solutions de glycérol-phosphate en mélange avec un chitosane de haute masse moléculaire (>200kDa) présente une transition sol-gel dépendante de la température et peuvent gélifier lors du passage d'une température d'environ 4 °C à une température d'environ 40 °C. Il est connu de la demande de brevet WO 2011/060545 de préparer un mélange chitosane/sang présentant une concentration de chitosane décrite comme allant de 1 à 10 % en masse et dans lequel le ratio volumique sang/chitosane va de 4/1 à 1/1 de manière à former un caillot sous la forme d'une pâte par un mécanisme de coagulation du sang en présence de chitosane. Cette demande de brevet évoque l'utilisation de différents sels organiques ou inorganiques, et se focalise (exemples et modes de réalisation) sur l'utilisation de sels inorganiques. Cette demande préconise l'utilisation d'un chitosane présentant une masse moléculaire supérieur à 200kDa, et plus spécifiquement de 232kDa. Les concentrations de chitosane utilisées sont d'environ 2% en masse. Les temps de coagulation sont au mieux de 5 minutes avec le sang humain (voir exemple 2, et figure 5). On peut relever en comparant les tableaux 3 et 6 que le temps de coagulation sur le sang humain peut être très différent de celui obtenu sur le sang animal, en l'occurrence ici le temps de coagulation avec le sang humain est nettement supérieur- au temps de coagulation avec le sang de lapin (du simple au quintuple). Ce document ne décrit pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane et de sang présentant un temps de coagulation rapide. Ce document ne décrit pas comment préparer 3038837 2 un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur la surface d'un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. Ce document évoque que les caillots se fragmentent en au moins en deux fragments (tableaux 3 et 7). Par ailleurs, ce document évoque (tableau 8) que les caillots présentant une concentration de 2% de chitosane 5 n'étaient pas homogènes. Il n'est donc pas aisé d'obtenir à la fois une coagulation rapide du caillot de sang et que ce caillot soit intègre, non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression et la déformation. La demande de brevet WO 2011/060544, du même déposant que la demande WO 2011/060545 (Corporation de l'Ecole Polytechnique de Montréal), décrit la préparation de 10 compositions à base de chitosane pour leur utilisation pour la réparation tissulaire, et se focalise sur une comparaison de formulations avec ou sans glycérophosphate (en abrégé « GP », remplacé dans ce cas par un sel de chlorure de sodium tout en ajustant la formulation au pH de 6,6 - voir exemples). Il est étudié notamment l'influence du poids moléculaire qui varie dans une large gamme (2,7 à 298 kDa). La masse moléculaire du 15 chitosane ne semble pas avoir d'effet en présence de NaCI mais il semble que la masse moléculaire du chitosane influence le temps de coagulation en présence de GP, les meilleurs résultats étant obtenus pour une masse moléculaire élevée, soit une masse moléculaire de 232kDa et 298kDa (voir exemple 2, tableaux 9, 11, 13 et 15). Pour une masse moléculaire du chitosane inférieure à 232kDa, le temps de coagulation avec du 20 sang de lapin est supérieur à 12 minutes en présence d'un sel organique, d'après les figures 3 et 5. Ceci justifierait la valeur de masse moléculaire du chitosane préconisée par la demande WO 2011/060545 (232kDa d'après les exemples). Les concentrations de chitosane utilisées dans WO 2011/060544 sont inférieures à 2% (tableaux, exemples). Dans tous les exemples de cette demande, les caillots sont évalués avec du sang 25 fraîchement prélevé chez le lapin, ce qui ne permet pas de conclure sur le temps de coagulation ou les propriétés mécaniques d'un mélange chitosane/sang humain. Ce document ne décrit pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation rapide, ni comment améliorer le temps de coagulation en particulier d'un fluide humain coagulable. Ce document ne décrit pas 30 comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. Ce document évoque que les caillots se fragmentent en au moins en deux fragments (tableaux 10, 12, 14 et 16). Par ailleurs, ce document évoque que l'homogénéité des mélanges chitosane/sang est variable. Il n'est donc pas aisé d'obtenir à la fois une coagulation rapide du caillot de sang qui soit intègre, 35 non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression et la déformation. 3038837 3 La demande de brevet WO 2011/060554, du même déposant que la demande WO 2011/060545 (Corporation de l'Ecole Polytechnique de Montréal), décrit la préparation de compositions à base de chitosane et de sang pré-solidifiés pour leur utilisation pour la réparation tissulaire. Les concentrations de chitosane utilisées dans WO 2011/060554 5 sont inférieures à 2% (tableaux, exemples). Les temps de coagulation décrit en présence d'une composition comprenant du chitosane et un sel organique sont supérieurs, largement, à 20 minutes. Un tel temps de coagulation n'est pas souhaité par un praticien clinique, en général le chirurgien lorsqu'il doit injecter une telle composition dans un tissu d'un patient. Il convient donc de limiter le temps de coagulation d'une formulation de 10 chitosane en mélange avec du sang humain. Ce document ne décrit pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation rapide, ni comment améliorer le temps de coagulation. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. Ce document vise à fournir des compositions à 15 pH physiologique (pH 7). Ce document n'indique pas comment éviter qu'un caillot se fragmente et ne décrit pas non plus comment obtenir un caillot qui ne soit pas pré-solidifié, notamment pour permettre l'injection du mélange sang-chitosane à travers une aiguille dans le cas d'une procédure d'implantation par arthroscopie. La demande de brevet WO 2011/060553 décrit un enseignement proche des 20 demandes de brevet précitées (WO 2011/060545, WO 2011/060544, et WO 2011/060554), mais concerne des compositions en 2 parties, l'une comprenant le chitosane, l'autre le sel organique (glycérol-phosphate). Elle décrit des compositions comprenant jusqu'à 2,5 % de chitosane (en page 8). Les études de faisabilité portent sur des compositions en 2 parties comprenant un chitosane de masse moléculaire supérieure 25 à 300kDa (tableau 3) et des concentrations de 1,5% de chitosane en solution (tableau 6). Les concentrations de chitosane utilisées en mélange avec du sang humain sont inférieures à 2% en masse par rapport à la masse de la solution de chitosane. Ce document ne décrit pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation rapide, ni comment améliorer le temps de 30 coagulation. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. Ce document n'indique pas si les caillots se fragmentent et n'adresse pas le problème spécifique de fournir à la fois des mélanges homogènes préalablement à la coagulation et des caillots présentant à la fois une coagulation rapide et qui soit intègre, non rétracté, 35 non fragmenté, résistant à la compression et la déformation. 3038837 4 La demande de brevet WO 02/00272 décrit une composition et une méthode pour réparer et régénérer le cartilage ou d'autres tissus. Cette demande enseigne pages 15/16 qu'il est connu de mélanger un chitosane avec un glycérol-phosphate, le chitosane présentant une concentration de 0,5 à 3% et une haute masse moléculaire (plusieurs 5 centaines de kDa) notamment pour éviter la précipitation du chitosane à pH supérieur à 6,2. Ce document enseigne également (page 16) que le chitosane peut rester à l'état soluble à pH physiologique mais que cela nécessite de réduire la concentration ou la masse moléculaire et le degré de désacétylation du chitosane (0,1%, 350 kDa, 50%). Les exemples supportent une concentration en chitosane de 1,5% pour ses applications en 10 mélange avec le sang (exemple 4). Les concentrations de chitosane des solutions utilisées en mélange avec du sang humain sont donc inférieures à 2%. Ce document ne suggère pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation rapide, ni comment améliorer le temps de coagulation. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son 15 application sur un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. La demande de brevet WO 99/07416 décrit une composition thermo-gélifiable à base de chitosane. Ce document ne suggère pas comment diminuer le temps de coagulation d'un mélange d'une telle composition avec du sang. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur un tissu 20 qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. Il est connu que les solutions de chitosane et de GP sont en général conservées de manière séparées et reconstituées en salle d'opération avant mélange avec le sang, en raison de leur caractère thermosensible, comme décrit par exemple par la demande WO 2011/060553. 25 D'une manière générale, on recherche des procédures thérapeutiques ou chirurgicales les plus courtes possibles, en particulier pour minimiser les coûts de personnel, pouvoir réaliser plus d'interventions quotidiennes, éviter les risques d'infection liés à l'exposition prolongée à l'environnement extérieur, etc. Les procédures de miniarthrotomie et d'arthroscopie telles que décrite dans l'art antérieur, par exemple par 30 Stanish et al. (Oper Tech Orthop 16:271, 2006) semblent relativement longues. Ainsi, il serait avantageux de la raccourcir, notamment en accélérant la formation du caillot qui prend actuellement de 15 à 25 minutes selon Tey et al. (Arthroscopy Techniques 4, 29, 2015) et Stanish et al (2006). Il y a aujourd'hui une tendance générale à pratiquer les procédures chirurgicales 35 sous endoscopie, pour minimiser le caractère invasif, les risques d'infection et favoriser la 3038837 5 réparation des tissus. Par exemple, Stanish et al. (Oper Tech Orthop 16, 271, 2006 ; J Bone Joint Surg Am. 95,1640, 2013) indiquent que l'implantation d'un caillot et sang et de chitosane peut être réalisée par arthroscopie, si la lésion est visible entièrement dans le champ de vision. Steinwachs et al. (Arthroscopy Techniques 3, 399, 2014) et Tey et al. 5 l'ont décrite dans le cas du genou et de la hanche respectivement. Dans ce cas, il est préconisé que le mélange soit injecté avant formation du caillot sur la lésion comprenant les microtunnels, et d'attendre que le caillot se forme avant de retirer les instruments. Tey et al. ont utilisé une aiguille de 18 Gauge pour injecter le caillot (diamètre intérieur de 800 à 880p m). 10 Tey et al (Arthroscopy Techniques 4, 29, 2015) ont également montré récemment que le caillot formé par le mélange du sang et d'une solution de chitosane de ultra-haute masse moléculaire pourrait être utilisé sur d'autres articulations que le genou, malgré l'effet de la gravité car la hanche, par exemple, est en position verticale lors de l'opération du patient. Jusqu'à présent, il était conseillé de maintenir le patient dans une position qui 15 met le site à traiter en position horizontale, comme décrit par exemple par Stanish et al (2013). et Steinwachs et al (2014), ce qui n'est possible facilement qu'avec le genou. Le besoin de réparation du cartilage de la hanche et de l'épaule est important. Cette approche a été proposée par Tey et al. pour pouvoir utiliser le caillot sang/chitosane même en position verticale, par une procédure d'arthroscopie en deux temps, notamment 20 parce qu'il a été remarqué que le caillot était relativement adhérent sur la surface. Cependant, il est nécessaire d'améliorer le produit pour pouvoir généraliser son usage facile pour des positions non horizontales, en jouant notamment sur son adhérence à la lésion et en facilitant son administration par arthroscopie. L'art antérieur ne suggère pas comment améliorer cette technologie de réparation 25 du cartilage. Ainsi, il ressort des précédentes demandes que, si certaines pistes techniques ont été envisagées pour préparer des compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation faible en mélange avec du sang humain, la solution proposée par la présente invention n'était pas suggérée. Au contraire il ressort que l'homme du métier 30 s'était focalisé sur une concentration de chitosane inférieure ou égale à 2% pour ses applications en mélange avec le sang, et plus précisément focalisé sur les chitosanes présentant une masse moléculaire supérieure à 200kDa. Des compositions présentant une concentration de chitosane élevée présente le désavantage technique, .en présence d'un sel organique de sucre ou de polyol, de gélifier à température ambiante. Cela pose 35 donc un problème de stabilité de la formulation -de chitosane en présence d'un tel sel 3038837 6 organique dans le temps, à température ambiante. L'homme du métier était donc encouragé à utiliser une concentration de chitosane inférieure à 2%. Dans le cas de l'utilisation de telle composition pour la régénération de cartilage, par exemple, le patient doit être opéré pour que la composition soit implantée au niveau 5 du cartilage défectueux. Lors de cette opération, le praticien clinique doit attendre que la composition à base de chitosane mélangée avec le sang du patient coagule, comme décrit par exemple par Stanish et al. (Oper Tech Orthop 16:271, 2006) et Tey et al. (Arthroscopy Techniques 4, 29, 2015), de 15 à 25 minutes. Plus le temps est long, plus le patient est immobilisé dans la salle d'opération. Or, d'une manière générale, on recherche 10 des procédures chirurgicales les plus courtes possibles, en particulier pour minimiser les coûts de personnel, pouvoir réaliser plus d'interventions quotidiennes, éviter les risques d'infection liés à l'exposition prolongée à l'environnement extérieur, etc. Ainsi, il serait avantageux de les raccourcir, notamment en accélérant la formation du caillot. Par ailleurs lorsque l'opération porte sur des articulations autres que le genou, par exemple l'épaule, 15 ou toute autre articulation qui ne se présente pas selon un plan horizontal lorsque le patient est allongé sur la table d'opération, la composition peut présenter une texture, et en particulier une viscosité qui n'est pas adaptée. Dans un tel cas, la composition, lorsqu'elle est mise en contact du cartilage peut ne pas rester en position, voire s'écouler. Il existe donc le besoin de fournir des compositions présentant une bonne intégrité, une 20 bonne homogénéité des constituants, de bonnes propriétés mécaniques, une bonne adhérence à la surface du tissu pour permettre une implantation optimale sur un tissu qui n'est pas disposé dans le plan horizontal lorsque le patient est allongé sur une table d'opération. La présente invention a pour but de résoudre un ou de préférence plusieurs des 25 problèmes techniques exposés ci-dessus. La présente invention a notamment pour but de résoudre le problème technique de fournir une composition à base de chitosane et d'un fluide coagulable, utilisable pour une régénération tissulaire et présentant un faible temps de coagulation en présence d'un fluide coagulable, et en particulier du sang complet. 30 La présente invention a également pour but de fournir une composition à base de chitosane qui soit homogène en présence d'un fluide coagulable, et en particulier du sang. La présente invention a encore pour but d'améliorer les propriétés mécaniques du mélange coagulé chitosane/fluide coagulable, et en particulier du mélange 33 chitosane/sang. 3038837 7 Plus spécifiquement la présente invention a pour but de fournir une composition présentant à la fois un temps de coagulation rapide, une bonne homogénéité, et des bonnes propriétés mécaniques, en particulier pour faciliter une implantation sur un plan non-horizontal. 5 La présente invention a également pour but de fournir de telle composition pour qu'elle soit facilement injectable, notamment au travers d'une aiguille, et plus précisément encore au travers d'une aiguille prévue pour une procédure d'arthroscopie. Pour que la procédure par arthroscopie se généralise, il est souhaitable que le mélange entre le sang et la solution de chitosane soit bien homogène, car sinon cela 10 compromettrait le succès de la réparation sur l'entièreté de la lésion et entraînerait un néocartilage non homogène ; Le mélange à injecter doit également être peu visqueux, pour pouvoir passer au travers d'une aiguille facilement. Il doit enfin être coagulé rapidement pour qu'il ne coule pas au délà de la lésion à traiter. La présente invention a également pour but de fournir de une composition à base 15 de chitosane répondant au maximum de critères techniques pour fournir un caillot intègre, non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression et la déformation. La présente invention a également pour but de fournir des compositions stables dans le temps. La présente invention a également pour but de fournir des système de stockage et 20 d'administration des compositions adéquats pour leur fabrication et conservation, et facile d'usage pour le chirurgien. La présente invention a pour but notamment de résoudre ces problèmes techniques de manière fiable, industrielle et peu coûteuse. La coagulation du sang est un phénomène complexe (hémostase primaire et 25 secondaire). Différents paramètres peuvent affecter positivement ou négativement le procédé de coagulation lors de la formation de caillots, et tout particulièrement lors de la formation d'un caillot de sang. Il a été découvert de manière surprenante par les présents inventeurs qu'il est possible de résoudre un ou plusieurs des problèmes techniques précités en préparant 30 une composition comprenant un mélange d'une formulation de chitosane et d'un fluide coagulable, dans laquelle la formulation de chitosane présente une concentration d'au moins 2,5 % de chitosane en masse par rapport à la masse totale de formulation de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60 mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1% (v/v), ladite composition comprenant au 35 moins un sel inorganique. 3038837 8 La vitesse de coagulation est particulièrement optimisée lorsque la concentration de chitosane est supérieure ou égale à 3 % en masse, par rapport à la masse de la formulation de chitosane. La composition selon l'invention couvre lorsqu'elle se réfère au mélange de 5 chitosane et de fluide coagulable à la fois à la composition fluide préalablement à la coagulation du fluide coagulable en présence du chitosane, et le mélange coagulé. Selon une variante de la composition de l'invention concerne le mélange fluide. Selon une autre variante, la composition de l'invention concerne le mélange coagulé. On entend par « formulation de chitosane » la solution comprenant le chitosane, le 10 sel inorganique et les éventuels autres ingrédients de la formulation, juste avant son mélange avec le fluide coagulable. Il ne s'agit pas de la « solution de chitosane » qui s'entend de la solution de chitosane avant sa mise en contact avec le sel inorganique. Toute autre signification est précisée spécifiquement, le cas échéant ou le contexte rend cette précision inutile. 15 On entend par « fluide coagulable », un fluide corporel (ou biologique) d'un mammifère, de préférence un être humain, qui peut être isolé du corps, par exemple au moyen d'une seringue de prélèvements, et qui coagule, c'est-à-dire qu'il forme in fine un caillot, en d'autres termes un thrombus. Parmi les fluides coagulables on peut citer en particulier : un sang, un plasma, un lysat plaquettaire, un plasma riche en plaquettes, un 20 plasma riche en plaquettes sans érythrocytes, et leur mélanges. Le sang se réfère à la fois au sang complet et au sang processé (c'est-à-dire ayant subi une opération technique), au sang veineux, au sang artériel, au sang des os, au sang de la moelle épinière, au sang de cordon ombilical, au sang du placenta. Le fluide coagulable peut être enrichi par amplification de la présence de l'un ou 25 plusieurs de ses composants. Un composant du fluide peut par exemple être les érythrocytes, les leucocytes, les lymphocytes, les cellules polymorphonucléaires, les monocytes, les plaquettes, les fibrinogènes, les cellules souches à l'exception des cellules souches embryonnaires humaines, la thrombine l'hémoglobine, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, un facteur de coagulation. 30 Le fluide coagulable peut être additionné d'un agent exogène, par exemple un ou plusieurs facteurs de coagulation, pour obtenir une durée de coagulation optimale, et/ou des propriétés mécaniques désirées, lorsque le fluide coagulable est coagulé, par exemple un sel de calcium. Le fluide coagulable peut être également additionné d'agents thérapeutiques. Parmi les substances thérapeutiques on peut citer les polysaccharides, 35 les polypeptides, les liposomes, les ADN, les anticorps, les ARN, les protéines, les 3038837 9 peptides, les fragments matriciels extracellulaires, les facteurs de croissance, les facteurs chémotactique, les cytokines, les facteurs angiogéniques, les cellules vivantes, par exemple les chondrocytes, les ostéoblastes, les cellules souches à l'exception des cellules souches embryonnaires humaines. 5 Il a été découvert de manière surprenante que l'augmentation de la concentration de chitosane dans la formulation de chitosane diminue le temps de coagulation du fluide coagulable lorsque l'on mélange cette formulation de chitosane avec un fluide coagulable, et en particulier le sang. Une telle formulation de chitosane permet de coaguler le fluide coagulable, en particulier le sang, rapidement. Une telle formulation de chitosane permet 10 de former une structure tridimensionnelle avec le fluide coagulable, en formant un réseau interpénétré avec les composants du fluide et le chitosane en solution. La formulation de chitosane selon l'invention permet d'obtenir des résultats satisfaisants en termes de rétractations du caillot de fluide coagulable, en particulier des 15 caillots de sang. La formulation de chitosane selon l'invention permet d'obtenir des propriétés mécaniques satisfaisantes, notamment en terme d'étalement et d'adhésion sur le tissu à réparer, en particulier lorsqu'il n'est pas disposé selon un plan horizontal. Les inventeurs ont notamment découvert que lorsque la concentration de 20 chitosane est supérieure à 2%, la coagulation n'est pas satisfaisante si la viscosité dynamique de la solution de chitosane n'est pas conforme à la présente invention. Il a également été identifié par les présents inventeurs que des compositions selon l'art antérieur, comprenant un mélange de chitosane de masse moléculaire supérieure à 200kDa, en présence d'un sel inorganique ne présentaient pas une viscosité optimale et 25 pouvaient mener à des problèmes de manipulation de la composition prélable à la coagulation et du caillot de sang. En effet, il est difficile de préparer facilement un mélange sang/solution de chitosane préalable à la coagulation qui soit homogène, c'est-à-dire pour laquelle les deux parties de la composition sont mélangées intimement et forment un réseau interpénétré. Or, il est important que la composition préalable à la 30 coagulation soit homogène, car toute la surface de la lésion ainsi que les microtunnels qui sont formés dans la lésion du cartilage doivent être traités avec la même quantité de chitosane et de sang, pour favoriser la formation d'un nouveau cartilage de bonne qualité réparti sur tout le volume nouvellement formé. 3038837 10 Les compositions de l'invention présentent une viscosité dynamique permettant un bon étalement de la composition de chitosane en mélange avec un fluide coagulable, lorsqu'elle est coagulée. Les compositions de l'invention, coagulées, présentent également une bonne 5 adhésion au niveau du site d'application, par exemple sur un cartilage, et plus généralement sur un tissu osseux ou un autre tissu. Un tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine, regroupées en ensemble fonctionnel, c'est-à-dire concourant à une même fonction. Le chitosane est par exemple référencé sous le numéro CAS 9012-76-4. 10 Le chitosane utilisé pour l'invention est avantageusement d'origine fongique, et de préférence issu du mycélium d'un champignon du type Ascomycète, et en particulier d'Aspergillus piger, et/ou d'un champignon Basidiomycète, et en particulier Lentinula edodes (shiitake) et/ou Agaricus bisporus (champignon de Paris). De préférence, le chitosane est issu d'Agaricus bisporus. Le chitosane est de préférence très pur, c'est-à- 15 dire contenant peu d'impuretés issues de son origine fongique, et d'une qualité microbiologique compatible avec son utilisation comme implant ou composition pharmaceutique. Une méthode de préparation du chitosane est celle décrite par exemple dans les brevets de la famille de WO 03/068824 (EP 1483299 ; US 7 556 946, etc). La masse moléculaire moyenne du chitosane peut être estimée par la valeur de 20 viscosité dynamique de la solution à 1% (m/m) de chitosane dans l'acide acétique 1% (v/v). La « solution à 1% (m/m) de chitosane » s'entend d'une solution d'eau distillée comprenant 1% en masse de chitosane par rapport à la masse totale de la solution de chitosane dans l'eau distillée. A cette solution à 1% (m/m) de chitosane est ajouté de l'acide acétique pour obtenir une solution à 1% (m/m) de chitosane et 1% (v/v) d'acide 25 acétique. On peut aussi ajouter la poudre de chitosane dans une solution d'acide acétique pour arriver à 1%. L'acide acétique à 1% (v/v) s'entend d'une concentration de 1% en volume d'acide acétique par rapport au volume de la solution d'eau distillée finale. La viscosité apparente dynamique est mesurée à l'aide d'un viscosimètre à mobile tournant, par exemple un viscosimètre à mobile tournant de la marque Brookfield, par 30 exemple muni d'une aiguille (« spindle ») de type S34 à une vitesse ajustée en fonction de la viscosité par l'homme de l'art de 0,3 à 100tr/min selon les préconisations liée au viscosimètre, et par exemple de 5 tour/min, et à une température de 25°C. Avantageusement, le chitosane utilisé selon l'invention présente, selon la méthode de mesure précitée, une viscosité dynamique comprise entre 5 et 60mPa.s, par exemple 3038837 11 de 5 à 55mPa.s, lorsqu'il se trouve en solution à la concentration de 1% (m/m) dans l'acide acétique 1% (v/v). Selon une variante, le chitosane utilisé selon l'invention présente une viscosité dynamique comprise entre 5 et 25mPa.s, par exemple de 8 à 20mPa.s, lorsqu'il se trouve 5 en solution à la concentration de 1% (m/m) dans l'acide acétique 1% (v/v). Selon une variante, le chitosane utilisé selon l'invention présente une viscosité dynamique comprise entre 26 et 50mPa.s, par exemple de 30 à 45mPa.s, lorsqu'il se trouve en solution à la concentration de 1% (m/m) dans l'acide acétique 1% (v/v). Le chitosane peut être de différentes masses moléculaires, dans la gamme de 10 masses moléculaires selon la présente invention. En particulier, l'invention concerne un chitosane présentant un poids moléculaire Mv allant de 20 000 (20k) à 145 000 (145k). Selon une variante, la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv) du chitosane est comprise entre 20 000 (20k) et 120 000 (120k). 15 Selon une variante, la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv) du chitosane est comprise entre 20 000 (20k) et 60 000 (60k). Selon une autre variante, la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv) du chitosane est comprise entre 60 000 (60k) et 100 000 (100k). Il est possible d'hydrolyser le chitosane afin de diminuer sa masse moléculaire. 20 De préférence ici, la masse moléculaire moyenne est la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv), calculée à partir de la viscosité intrinsèque selon l'équation de Mark-Houwink. La viscosité intrinsèque est mesurée par viscosimètrie capillaire, avec un viscosimètre capillaire de type Ubbelohde, selon la méthode de la monographie de la Pharmacopée Européenne EP2.2.9. On mesure le temps d'écoulement de la solution à 25 travers un tube capillaire adapté (Lauda, par exemple le tube capilaire Ubbelohde 510 01 de diamètre 0.53mm) à l'aide d'un viscosimètre automatique Lauda Visc, d'abord à la concentration initiale en chitosane, puis pour plusieurs dilutions, par exemple selon les recommandations de la méthode EP2.2.9. On en déduit la viscosité intrinsèque réduite pour chacune des concentrations. On porte la viscosité réduite en fonction de la 30 température, et on extrapole la valeur à la concentration 0 pour en déduire la viscosité intrinsèque. Il faut par exemple porter la viscosité réduite (flréd en ml/g) des i dilutions en fonction de la concentration C des i dilutions (g/ml) selon la formule 2. Formule 2. [11réd] = t0) - (1 - C). Pour calculer la masse viscosimétrique moyenne, on applique l'équation de Mark- 35 Houwink avec les constantes k et alpha recommandées par Rinaudo et al. (Int. J. Biol. 3038837 12 Macromol, 1993, 15, 281-285), selon le degré d'acétylation (DA) du chitosane, selon l'une des trois formules suivantes. Formule 3. Mv = ([ri]/0,082)(1e76), pour un DA de 2% ; Formule 4. Mv = ([ril/0,076)(1/13'76), pour un DA de 10% (par exemple 11.5%) ; 5 Formule 5. Mv = ([00,074)(").76), pour un DA de 20% (par exemple 21%). Pour les valeurs de DA intermédiaires, on réalise une interpolation linéraire pour calculer la masse viscosimétrique moyenne (Mv). Avantageusement, le chitosane présente un degré d'acétylation compris entre 5 et 50%. Le degré d'acétylation est exprimé en nombre de moles d'unités N-acétyl-D- 10 glucosamine par rapport au nombre de moles d'unités totales N-acétyl-D-glucosamine et D-g lucosam ine présentes. Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 25 et 40%. Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 20 et 30%. Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 15 et 25%. 15 Selon une variante préférée, le degré d'acétylation est compris entre 5 et 20%. Selon une variante préférée, le degré d'acétylation est va de 5 à 20%, et encore de préférence de 5 à 15 %. Le degré d'acétylation est déterminé par titrage potentiométrie. Le chitosane est dissout dans une solution d'acide chlorhydrique. L'excès d'acide chlorhydrique n'ayant 20 pas réagi avec les fonctions amines du chitosane est dosé par une solution titrée d'hydroxyde de sodium. On en déduit ainsi le nombre de mole d'unité D-glucosamine présentes dans le chitosane et donc par soustraction le degré d'acétylation. Le chitosane présente avantageusement un degré d'acétylation contrôlé. Par les termes « chitosane ayant un degré d'acétylation contrôlé » on entend un produit dont le 25 degré d'acétylation, c'est-à-dire la proportion des unités N-acétyl-glucosamine, peut être ajustée de manière contrôlée. Selon une variante spécifique, l'invention met en oeuvre un chitosane présentant un degré d'acétylation est compris entre 5 et 20%, une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1% (m/m) de chitosane dans l'acide 30 acétique 1% (v/v)) de 5 et 60mPa.s, par exemple de 5 à 55mPa.s. Selon une variante très avantageuse, l'invention met en oeuvre un chitosane présentant un degré d'acétylation est compris entre 5 et 20%, et une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1% (m/m) de chitosane dans l'acide acétique 1% (v/v)) de 5 et 25mPa.s, par exemple de 8 à 20mPa.s. 3038837 13 Selon une variante très avantageuse, l'invention met en oeuvre un chitosane présentant un degré d'acétylation est allant de 5 à 15%, et une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1% (m/m) de chitosane dans l'acide acétique 1% (v/v)) de 5 et 25mPa.s, par exemple de 7 à 20mPa.s. 5 Le chitosane est avantageusement purifié et ensuite de préférence séché. Après purification, le procédé de l'invention peut comprendre une étape de séchage du chitosane substitué, puis éventuellement de broyage de celui-ci pour obtenir une poudre. On peut sécher le chitosane par exemple par évaporation de l'eau, par exemple par un procédé de spray-drying (atomisation), de lit fluidisé, ou par séchage sous vide ou à 10 pression atmosphérique, ou encore par lyophilisation. Le chitosane peut être solubilisé dans une solution aqueuse, et par exemple dans une eau de qualité pharmaceutique acceptable pour une injection ou implantation dans un corps, et en particulier un corps humain. Avantageusement, la dissolution du chitosane dans une solution aqueuse est 15 effectuée par ajustement du pH à un pH suffisamment acide par l'ajout d'un acide. On peut utiliser avantageusement l'acide chlorhydrique, et de préférence un acide organique, et encore de préférence l'acide acétique. Avantageusement, on vise un pH compris entre 4,5 et 8,5, et de préférence entre 5,5 et 6,5. Ainsi selon une variante, la solution ou formulation de chitosane comprend un 20 acide. L'acide peut être présent à une concentration de 0,001 à 0,1N, par exemple environ 0,01N. Une composition selon l'invention présentant une concentration de chitosane plus importante que les compositions de l'art antérieur est intéressante du fait des propriétés intrinsèques du chitosane qui sont bénéfiques pour la réparation du cartilage, comme 25 décrit par Hoemann et al. (Osteoarthritis & Cartilage 15, 78, 2007), Chen et al. (Cartilage 2, 173, 2011), ou encore Stanish et al. (J Bone Joint Surg 95, 1640, 2013) en combinaison avec une procédure de stimulation de la moelle osseuse par microfracture, ou comme décrit par Oprenyeszk et al. (Osteoarthritis Cart 21, 1099, 2013 ; Plos One 10, 2015). 30 On peut faire notamment référence à la demande WO 2011/060553 pour les différentes voies d'activation du complément. Selon une variante, la formulation de chitosane présente une concentration de chitosane supérieure à 2,5 % et inférieure à 10 % en masse par rapport à la masse de formulation finale. 3038837 14 Avantageusement, la concentration de chitosane est supérieure ou égale à 2,8%, par exemple supérieure ou égale à 3%, ou encore par exemple supérieure ou égale à 3,2%, en masse par rapport à la masse totale de la formulation de chitosane (m/m). Selon une variante spécifique, la concentration de chitosane va de 2,9 à 3.5% 5 (m/m), exprimée en masse par rapport la masse totale de la formulation de chitosane. Selon une variante spécifique, la concentration de chitosane est supérieure à 3.5% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse totale de la formulation de chitosane. Selon une variante spécifique, la concentration de chitosane est inférieure à 6% 10 (m/m), exprimée en masse par rapport la masse totale de la formulation de chitosane. Selon une variante spécifique, la concentration de chitosane va de 3,6 à 4.5% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse totale de la formulation de chitosane. Selon une variante spécifique, la concentration de chitosane va de 4,6 à 5.5% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse totale de la formulation de chitosane. 15 Selon une variante particulière, la concentration de chitosane est environ de 3,0% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la formulation de chitosane. Selon une variante particulière, la concentration de chitosane est environ de 4,0% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la formulation de chitosane. Selon une variante particulière, la concentration de chitosane est environ de 5,0% 20 (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la formulation de chitosane. Selon une variante très avantageuse, l'invention concerne une formulation de chitosane et une solution de chitosane pour préparer cette formulation de chitosane, ledit chitosane, présentant un degré d'acétylation est compris entre 5 et 20%, et une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1% (m/m) du 25 chitosane dans l'acide acétique 1% (v/v)) de 5 et 25mPa.s, par exemple de 8 à 20mPa.s, ladite formulation de chitosane présentant une concentration de chitosane supérieure ou égale à 3%, ou encore par exemple supérieure ou égale à 3,2% en masse par rapport à la masse totale de la formulation de chitosane (m/m). Selon une variante très avantageuse, l'invention met en oeuvre une formulation de 30 chitosane et une solution de chitosane pour préparer cette formulation de chitosane, ledit chitosane présentant un degré d'acétylation est allant de 5 à 15% et une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1% (m/m) de chitosane dans l'acide acétique 1% (v/v)) de 5 et 25mPa.s, par exemple de 7 à 20mPa.s., ladite formulation de chitosane présentant une concentration de chitosane supérieure ou 35 égale à 2,8%, par exemple supérieure ou égale à 3%, ou encore par exemple'supérieure 3038837 15 ou égale à 3,2% en masse par rapport à la masse totale de la formulation de chitosane (m/m). L'invention permet avantageusement d'éviter les problématiques techniques liées à la présence d'une transition sol-gel à température ambiante et sont particulièrement 5 stables à température ambiante ou réfrigérée. Le pH de la solution de chitosane peut être ajusté par l'ajout -d'un acide, de préférence un acide organique faible, de préférence l'acide acétique. ce qui présente l'avantage de fournir une composition dont le pH est modulable très facilement et précisément. 10 Avantageusement, le pH de la solution de chitosane est supérieur au pKa des groupes amine du chitosane en solution aqueuse et inférieur à 6,5. Avantageusement, le pH de la solution de chitosane est supérieur à 5,5. Selon une variante spécifique, le pH de la solution de chitosane est d'environ 6,0. Selon une variante, le pH va de 5,0 à 6,5, et de préférence de 5,5 à 6,5, et de 15 préférence encore de 5,8 à 6,2. Selon une variante préférée, le pH est inférieur à 7,0. Selon une variante spécifique, le pH de la formulation de chitosane est de 6,2 +/- 0,2. Selon une autre variante spécifique, le pH est de 6,1 +/- 0,2. 20 Selon une autre variante spécifique, le pH est de 6,0 +/- 0,2. Selon une autre variante spécifique, le pH est de 5,9 +/- 0,2. Le pH est mesuré sur la formulation de chitosane. Le pH est déterminé en suivant la méthode décrite dans la pharmacopée européenne (EP 2.2.3). Le pH-mètre utilisé est un pH-mètre de la gamme Sartorius muni d'une électrode combiné en verre (PY-P11). 25 Les mesures de pH sont réalisées entre 20 et 25 °C. Selon un mode de réalisation, la formulation de chitosane présente une osmolalité de 100 à 700mosm/kg, de préférence de 200 à 500mosm/kg. Avantageusement, l'osmolalité de la formulation de chitosane est comprise entre 250 et 400 mosm/kg , et de préférence de 275 à 325 mosm/kg. 30 Selon une variante, la formulation de chitosane présente une osmolalité compatible avec une articulation. Il est préférable que l'osmolalité de la formulation de chitosane soit comprise entre 250 et 400, et plus spécifiquement entre 250 et 380mosm/kg. La détermination de l'osmolalité des solutions est effectuée avec un micro- 35 osmomètre automatique (Osmometer Type 15M de la marque Lifiser Messtechnik). 3038837 16 L'équipement est préalablement calibré avec une solution de 300mosm/kg. L'échantillon est placé dans un récipient prévu à cet effet, et est mis à la température standard de la mesure. Avantageusement, le sel inorganique est un agent ajustant l'osmolarité de la 5 solution de chitosane. Selon une variante, la composition comprend un tampon, par exemple un tampon acétate. Des agents tampon sont connus de l'homme du métier. On peut utiliser au moins un polyol et en particulier un sucre réducteur dans la 10 composition de l'invention. De tels polyols peuvent être par exemple choisis parmi le groupe consistant en : isopropanol, sorbitol, mannitol, alkylène glycol comme le propylène glycol, poly(alkyl glycol), par exemple un poly(éthylène glycol), fructose, galactose, ribose, glucose, xylose, rhamnulose, sorbose, erythrulose, deoxy-ribose, ketose, mannose, arabinose, fuculose, fructopyranose, ketoglucose, sedoheptulose, trehalose, tagatose, 15 sucrose, allose, threose, xylulose, hexose, methylthio-ribose, methylthio-deoxy-ribulose, et l'un quelconque de leurs mélanges. De préférence, la composition comprend au moins un sucre réducteur, par exemple le mannitol. Selon une variante, la formulation de chitosane peut comprendre également un ou 20 plusieurs autres sels inorganiques. Parmi les sels inorganiques (sel principal ou sel supplémentaire, désigné comme autre sel inorganique), on peut citer par exemple un sel de sodium, un sel de chlorure, de potassium, de calcium, de magnésium, de phosphate, de sulfate, ou sel l'un quelconque de leurs mélanges. Selon une variante particulière, le sel inorganique peut-être le chlorure 25 de potassium, le chlorure de sodium, chlorure de césium, le chlorure de calcium, le fluorure de césium, le perchlorate de potassium, le nitrate de sodium, le sulfate de calcium, ou l'un quelconque de leurs mélanges. Selon une variante avantageuse, la formulation de chitosane comprend un sel de chlorure ou un sel de sodium. 30 Selon une variante spécifique, la formulation de chitosane comprend un sel de chlorure de sodium. Selon une variante, la formulation de chitosane comprend un sel de calcium à titre d'autre,sel inorganique (sel inorganique secondaire ou supplémentaire). Selon une variante, la présente invention concerne une formulation de chitosane 35 comprenant au moins 2% en masse de chitosane, et de préférence de 1 à 10% en masse 3038837 17 de sel inorganique, par exemple de chlorure de sodium, et éventuellement de 0,1 à 20% de sucre réducteur. Avantageusement, la formulation de chitosane comprend de 2,8 à 6,5% en masse de chitosane substitué et de 0,1 et 5%, de préférence environ 1%, en masse de sel inorganique, par exemple de chlorure de sodium, et éventuellement de 0,1 5 à 15% en masse de sucre réducteur, par rapport à la masse totale de la composition. La formulation et la solution de chitosane de l'invention ne comprennent pas de sel organique qui rendrait le mélange résultant gélifiable (présence d'une transition sol-gel, en particulier dans les conditions d'utilisation). En d'autres termes, la formulation de chitosane selon l'invention ne comprend avantageusement pas d'agent qui entraînerait la 10 gélation ou le caractère thermo-gélifiable de la solution de chitosane. Avantageusement, la formulation de chitosane n'est pas gélifiable, c'est-à-dire ne subit pas de transition sol-gel à une température supérieure à 10°C et de préférence à comprise entre 10 et 50°C. Ainsi l'invention concerne avantageusement une formulation de chitosane non-thermogélifiable, et de préférence non-gélifiable. 15 La formulation et la solution de chitosane de l'invention ne comprennent en particulier pas de sel de glycérol-phosphate. D'une manière générale, d'un point de vue de la sécurité, il est préféré de limiter le nombre et la dose des composants de toute composition à usage thérapeutique ou médicale, en particulier de limiter la composition aux composés qui sont nécessaires à 20 son effet clinique et/ou à son mode d'action, notamment dans le cas d'une composition implantable ou injectable devant être au contact du cartilage et de l'os de manière prolongée. Les compositions sans agent thermogélifiable ou sans sel organique de polyol ou de sucre sont donc avantageuses. Un autre avantage est que la formulation de chitosane peut être conditionnée et stockée dans un seul conditionnement, sans besoin 25 de reconstitution de la formulation avant mélange avec le sang. Un autre avantage est qu'elle est stable dans le temps car elle ne risque pas de gélifier. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition ou d'une formulation selon l'invention. Ce procédé comprend typiquement : 30 - la dissolution d'un chitosane dans une solution aqueuse, d'un acide dilué, de préférence de l'eau et un acide dilué, de préférence un acide faible, de préférence un acide organique, éventuellement une solution tamponnée d'un acide et d'une base faibles' de préférence à pH compris entre 4,5 et 8,5, et de préférence entre 4,5 et 7,0, de préférence encore entre 5,5 à 6,5 ; 35 - l'ajustement éventuel du pH par exemple au pH de 6.0 ; 3038837 18 - le mélange avec une solution-de sel inorganique, comme par exemple un sel de chlorure de sodium - l'ajustement éventuel de l'osmolalité de la solution ; - l'ajustement éventuel de la viscosité de la solution. Les formulations de chitosane sous forme de solution avec au moins un sel inorganique peuvent être préparées de la manière suivante : - la dispersion du chitosane dans d'une solution aqueuse, comme par exemple de l'eau, - l'ajout d'une solution acide, de préférence un acide faible organique, de 10 préférence l'acide acétique pour solubiliser le chitosane et ajuster le pH, par exemple à pH compris entre 4,5 et 6,9, et de préférence entre 5,0 et 6,9, et par exemple à pH 6,0 de préférence pour solubiliser le chitosane sous forme de solution, - l'ajout d'au moins un sel inorganique et éventuellement d'excipients de formulation, 15 - la stérilisation, de préférence par autoclave à la vapeur, - éventuellement le conditionnement pour la conservation de la solution. Les formulations de chitosane sous forme de solution avec au moins un sel inorganique peuvent être aussi préparées de la manière suivante : 20 - la dispersion du chitosane dans d'une solution aqueuse, comme par exemple de l'eau, - l'ajout d'une solution acide pour ajuster le pH, par exemple à pH compris entre 4,5 et 7, et de préférence entre 5 et 6,9, et par exemple à pH 6, de préférence pour solubiliser le chitosane sous forme de solution, 25 - la stérilisation, de préférence par autoclave à la vapeur, - éventuellement le conditionnement pour la conservation de la solution de chitosane, par exemple un flacon ou une seringue. - éventuellement le séchage ou la lyophilisation de la solution de chitosane dans le conditionnement, 30 - la mise en contact du chitosane avec au moins un sel inorganique et éventuellement d'excipients, de préférence sous la forme d'une solution de sel inorganique, de préférence stérilisée, de préférence par filtration ou par autoclave, - éventuellement la stérilisation, de préférence à la vapeur, - éventuellement le conditionnement pour la conservation de la solution. 35 3038837 19 Les formulations de chitosane sous forme de solution avec au moins un sel inorganique peuvent être encore préparées de la manière suivante - la fourniture d'un chitosane sous forme sèche ou lyophilisée, - éventuellement la dispersion du chitosane dans d'une solution aqueuse, comme 5 par exemple de l'eau, - la stérilisation, de préférence à la vapeur, - éventuellement le séchage ou la lyophilisation de la solution de chitosane, - éventuellement le conditionnement pour la conservation du chitosane, éventuellement sous forme sèche ou lyophilisée. 10 - La mise en contact du chitosane avec au moins un sel inorganique, un acide pour ajuster le pH, de préférence à pH de 5,5 à 6,5, et par exemple à pH 6, de préférence pour solubiliser le chitosane sous forme de solution en présence du sel inorganique, et éventuellement d'excipients, de préférence pour fournir une solution acide de chitosane et de sel inorganique, 15 - éventuellement la stérilisation, de préférence à la vapeur, - éventuellement le conditionnement pour la conservation de la solution. Le ou les sels inorganiques peuvent être mis en contact avec la solution de chitosane sous forme d'une ou plusieurs solutions d'un ou plusieurs sels inorganiques. Des solutions de sel inorganiques sont disponibles commercialement. 20 Le sel inorganique peut être ajouté à la solution de chitosane après stérilisation de celle-ci, par exemple. Selon une variante, la dissolution du chitosane s'effectue dans de l'eau comprenant un sucre réducteur, comme par exemple le mannitol. Selon une variante, l'agent tamponnant est un tampon acétate. 25 Avantageusement, le procédé comprend également une étape ultérieure de remplissage d'un dispositif d'injection, comme par exemple une seringue, avec la formulation de chitosane ou la solution de chitosane. Avantageusement, le dispositif d'injection, comme par exemple une seringue peut ensuite subir une stérilisation à la vapeur. Ce dispositif, par exemple une seringue, peut ensuite être emballé, de préférence 30 de manière stérile. Il est avantageux d'utiliser un chitosane présentant un degré de pureté suffisant pour l'application envisagée. L'invention couvre encore un chitosane ou une formulation de chitosane sous une forme sèche, notamment sous une forme lyophilisée. 3038837 20 On peut notamment (re)disperser, et de préférence solubiliser, le produit lyophilisé avant usage. Selon une variante, le chitosane peut être sous forme sèche, notamment sous une forme lyophilisée, avant sa mise en contact avec le sel inorganique, qui peut se présenter 5 sous forme d'une solution aqueuse. Ainsi, l'invention concerne un chitosane sous forme sèche, en particulier sous forme de poudre, par exemple sous forme lyophilisée, apte et destiné à être mis en solution avec une solution comprenant au moins un sel inorganique, comme ceux précités, la formulation résultante étant apte et destinée à être mise en contact avec un 10 fluide coagulable. Selon une variante préférée, l'invention concerne donc un dispositif médical comprenant une chambre contenant un chitosane sous une forme sèche, notamment sous une forme lyophilisée, et une chambre contenant une solution d'au moins un sel inorganique. 15 Selon une autre variante, le chitosane peut être formulé avec au moins un sel inorganique, puis séché, et notamment lyophilisé. La formulation résultante, lyophilisée, peut être dispersée, et de préférence solubilisée sous forme d'une solution aqueuse, avant mélange avec le fluide coagulable. Ainsi l'invention concerne un dispositif médical comprenant ou consistant en une 20 formulation de chitosane à une concentration d'au moins 2,5 % de chitosane en masse par rapport au volume de formulation de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1% (v/v), destinée à être mélangée avec un fluide coagulable, et au moins un sel inorganique. Avantageusement, le dispositif médical comprend au moins un, et de préférence 25 un seul, récipient renfermant une formulation de chitosane et d'au moins un sel inorganique sous forme d'une solution, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1% (v/v), ladite formulation présentant une concentration supérieure ou égale à 2,5% de chitosane en masse par rapport à la masse de formulation de chitosane. 30 L'invention concerne encore un dispositif médical comprenant plusieurs récipients, lesdits récipients étant éventuellement physiquement indépendants (« kit-of-part »), caractérisé en ce que le dispositif médical comprend au moins (i) un récipient renfermant un chitosane sous forme sèche ou en solution, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1% (v/v), et 35 (ii) un récipient renfermant une solution d'au moins un sel inorganique, dispositif dans 3038837 21 lequel le chitosane et la solution d'au moins un sel inorganique présentent une concentration apte à être supérieure ou égale à 2,5 % de chitosane en masse par rapport à la masse de formulation de chitosane, la formulation de chitosane étant formée par la mise en contact du chitosane, sous forme sèche ou en solution, et ladite solution d'au 5 moins un sel inorganique. À titre d'exemple, on peut citer les dispositifs du type seringues double-chambre en série ou en parallèle, par exemple décrits dans le brevet EP 0511402, EP 0728492, US 3749084, US 4538920, US 5971953, US 20120265171, ou encore les différentes seringues double-chambre commercialisées par les sociétés Vetter-Pharrna (Vetter Lyo- 10 Ject® dual-chamber syringe), Unilife (EZMix GenesisTM), Tyfill (double chamber syringe), VDW (2Seal easymiX®). L'invention concerne encore un dispositif médical comprenant une composition, une solution ou une forme sèche (poudre par exemple) de chitosane selon l'invention. Avantageusement, la formulation de chitosane comprenant au moins un sel 15 inorganique peut être donc disposée dans une chambre d'un dispositif médical comprenant une chambre unique comprenant la formulation de chitosane comprenant au moins un sel inorganique. .Selon une variante préférée, l'invention concerne donc un dispositif médical comprenant une chambre, et par exemple une chambre unique, contenant une formulation de chitosane en mélange avec au moins un sel inorganique. 20 L'invention concerne donc en particulier un ou plusieurs des articles ou packaging, de préférence stériles, comprenant un ou plusieurs dispositifs médicaux d'injection pré-remplis, lesdits dispositifs médicaux étant tels que définis dans l'invention. Il s'agit typiquement de seringues ou de flacons à usage biologique pré-remplis par une formulation de chitosane, une solution de chitosane ou une poudre de chitosane. 25 Des telles formulations de chitosane (comprenant ou non le sel inorganique en mélange avec le chitosane) ou de tels dispositifs médicaux peuvent être par exemple conservées à température ambiante (20°C), ce qui est très avantageux. Avantageusement, ces solutions de chitosane sont stables pendant plusieurs mois à une température ambiante ou réfrigérée (en général 4°C à 8°C), et en particulier à 4°C. 30 Pour le mélange avec le fluide coagulable, la formulation de chitosane ou la solution de chitosane est mise en contact avec le fluide coagulable, puis l'ensemble est mélangé. Selon une variante, la solution de chitosane initiale est mise en contact avec le sel inorganique, puis la formulation de chitosane résultante est mélangée avec le fluide 35 coagulable, et en particulier le sang. 3038837 22 Selon une variante, la solution de chitosane initiale est mélangée avec le fluide coagulable, et en particulier le sang, puis la solution de sel inorganique est ajoutée au mélange. Le mélange avec le fluide coagulable peut se réaliser dans le dispositif médical 5 contenant la formulation ou solution de chitosane (avec ou sans sel inorganique) via un système conçu pour réaliser ce mélange, ou dans un dispositif séparé. Selon une variante qui concerne une procédure par implantation, le praticien clinique prélève le fluide coagulable par une seringue puis injecte ce fluide dans un flacon contenant la formulation ou la solution de chitosane, puis agite ce flacon. Le mélange est laissé à reposer ou agité 10 jusqu'à obtenir une coagulation satisfaisante. Ensuite, le praticien clinique prélève le mélange coagulé avec une spatule pour disposer ou implanter le caillot à l'endroit désiré. Selon une autre variante qui concerne par exemple une procédure par arthroscopie, le praticien clinique prélève le fluide coagulable par une seringue puis injecte ce fluide dans un flacon contenant la formulation ou la solution de chitosane, puis agite ce flacon. Le 15 mélange est injecté au travers d'une aiguille sous endoscopie avant La présente invention concerne une composition comprenant ou consistant à un mélange de chitosane et de fluide coagulable selon un rapport volumique fluide coagulable/chitosane allant de 1 :1 à 4 :1, et par exemple de 2 :1 à 3 :1, ce rapport étant exprimé en volume fluide coagulable par rapport au volume de formulation de chitosane (v/v). 20 Selon une variante, le rapport volumique fluide coagulable/chitosane est de 3 :1. On ne souhaite en effet pas diminuer la proportion de sang dans le mélange, par exemple dans le but de favoriser l'homogénéité du mélange ou bien de promouvoir une formation du caillot plus rapide, car il est désiré de maintenir une concentration en composants actifs du sang élevée, ces composants étant bénéfiques à la réparation du cartilage. Il a 25 été montré que ce rapport volumique 3:1 était favorable pour la réparation du cartilage (Stanish et al. 2006). La présente invention concerne plus particulièrement une composition injectable ou implantable comprenant ou consistant en une composition selon l'invention. Selon une variante, la composition selon l'invention est utilisée comme 30 composition pharmaceutique ou dispositif médical injectable ou implantable. La présente invention permet la stérilisation, en particulier la stérilisation par autoclave à la vapeur des solutions ou formulations de chitosane. Avantageusement, la solution ou formulation de chitosane selon la présente invention est stérile. Très avantageusement, la formulation et/ou solution de chitosane 3038837 23 selon la présente invention sont stérilisées par montée en température, de préférence sous autoclave. Selon une variante, la formulation ou solution de chitosane est stérilisée à la vapeur, par exemple par une élévation de la température à une température supérieure à 5 100°C, et de préférence supérieure à 120°C, par exemple entre 121 et 138°C, sous autoclave, pendant une durée suffisante à la stérilisation, par exemple en général de 15 à 25 minutes. Selon une variante, les formulations de chitosane de l'invention sont transparentes ou translucides. 10 Par « translucide » on entend que l'on peut distinguer un objet lorsqu'on place la formulation de chitosane entre l'ceil de l'observateur et l'objet. Par « transparente » on entend que l'on peut distinguer des caractères alphanumériques lorsqu'on place la formulation de chitosane entre l'ceil de l'observateur et les caractères observés. En général on réalise cette évaluation avec une épaisseur d'environ 1cm. 15 Selon une variante, la formulation de chitosane de l'invention est incolore, c'est-à- dire en particulier qu'un observateur à l'ceil nu n'attribue pas de couleur spécifique à la formulation de chitosane. En particulier, la présente invention concerne une composition, formulation, solution ou poudre de chitosane selon l'invention, éventuellement comprise dans un 20 dispositif médical, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique. L'invention concerne une composition, formulation, solution ou poudre de chitosane selon l'invention, éventuellement comprise dans un dispositif médical, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique d'une maladie articulaire. La présente invention concerne plus particulièrement une composition ou un 25 dispositif médical selon l'invention pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique, par exemple comprenant l'injection ou implantation par voie sous-cutanée, intradermique, intraoculaire, intra-osseuse ou intra-articulaire, de ladite composition, par exemple pour la réparation ou le comblement d'au moins un tissu corporel nécessitant une réparation ou un comblement. 30 Selon une variante, le tissu corporel est choisi parmi les tissus appartenant aux cordes vocales, muscles, ligaments, tendons, cartilages, organes sexuels, os, articulations, yeux (cornée), peau (derme), un tissu périodontal, un tissu maxillo-faciale, un tissu temporomandibulaire, un abcès, une tumeur reséquée, un ulcère, ou l'une quelconque de leurs combinaisons, et plus particulièrement aux joints articulaires. 35 L'invention permet notamment le traitement d'un ménisque. 3038837 24 La présente invention concerne plus particulièrement une composition selon l'invention pour son utilisation dans une méthode de traitement d'une arthrose, ou la réparation d'un défaut de cartilage, par exemple par injection ou après mélange avec le fluide coagulable et implantation dans le cartilage. 5 La présente invention concerne plus particulièrement un dispositif médical, par exemple implant médical, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une composition selon l'invention et éventuellement d'un système de mélange des composants de la composition et d'un système d'administration de la composition. La présente invention peut également comprendre un ou plusieurs additifs ou 10 excipients permettant de moduler ses propriétés. Selon une variante spécifique la composition de l'invention comprend une suspension de particules, par exemple des particules solides ou de gel. La présente invention concerne également une composition selon l'invention pour son utilisation comme vecteur cellulaire, d'un ou plusieurs type cellulaire, et/ou un ou 15 plusieurs d'agents actifs. Il peut s'agir d'agents actifs d'un point de vue pharmaceutique ou biologique. La composition de l'invention peut en effet être compatible avec la présence de cellules, de préférence de cellules vivantes. Parmi les cellules vivantes d'intérêt, on peut citer par exemple : chondrocytes (cartilage articulaire), fibrochondrocytes (ménisque), fibroblastes de ligament (ligament), fibroblastes de peau 20 (peau), ténocytes (tendons), myofibroblastes (muscle), les cellules souches mésenchymales à l'exception des cellules souches embryonnaires humaines, les globules rouges (sang) et kératinocytes (peau). La composition de l'invention peut également être utilisée comme vecteur thérapeutique pour la délivrance ciblée et/ou à libération contrôlée d'au moins un agent thérapeutique. 25 Selon l'invention la formulation de chitosane est particulièrement destinée à être mélanger avec du sang ou du plasma, ou un lysat plaquettaire, ou du plasma riche en plaquettes, ou tout fluide coagulable en présence de la formulation de l'invention permettant par exemple d'augmenter les performances du produit. La présente invention concerne ainsi une méthode de traitement thérapeutique 30 mettant en oeuvre l'injection ou l'implantation d'une composition selon la présente invention. Les méthodes de traitement thérapeutique couvrent toute utilisation de la composition telles que par exemple celles précitées. La présente invention, couvre en particulier une méthode de traitement in situ et la préparation de la composition de chitosane in situ. Ainsi le mélange avec un fluide 3038837 25 coagulable peut être réalisé au niveau du site d'implantation ou d'injection, le fluide coagulable étant disponible au niveau de ce site. L'invention concerne encore l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour un traitement thérapeutique. 5 Comme énoncé précédemment, l'invention concerne en particulier une méthode de traitement thérapeutique d'une articulation, comme par exemple le ménisque . Selon une variante, la formulation de chitosane est appliquée directement au niveau du site d'injection ou d'implantation pour sa coagulation avec un fluide coagulable disponible au niveau du site d'injection ou d'implantation. 10 Les méthodes de traitement selon l'invention peuvent être mises en oeuvre selon les méthodes connues de l'homme du métier. On entend par « composition selon l'invention », « formulation de chitosane selon l'invention », « solution de chitosane selon l'invention », ou des termes équivalents, une composition, une formulation de chitosane, ou une solution de chitosane, respectivement, 15 telle que définie dans la présente invention, y compris selon l'une quelconques des variantes, modes de réalisation particuliers, spécifiques ou avantageux, indépendamment ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons, y compris selon les caractéristiques préférées. Par « compris entre » une valeur numérique et une autre valeur numérique, on 20 entend une plage numérique incluant les bornes. Ces bornes peuvent toutefois être exclues. La présente invention couvre également une méthode de soin esthétique, en d'autres termes non-thérapeutique, comprenant l'injection ou l'implantation d'une composition selon l'invention. Il s'agit par exemple du comblement de rides ou du 25 comblement d'une ou plusieurs zones de tissu visible endommagées, par exemple suite à un accident ou une intervention chirurgicale, dans un but esthétique. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune 30 façon limiter la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité. 35 Ainsi, chaque exemple a une portée générale. 3038837 26 D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en masse, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. 5 Exemples Exemple 1 - Caractéristiques de chitosanes de différentes masses moléculaires Des chitosanes de différentes masses moléculaires sont préparés de la manière suivante : la chitine est mise en suspension aqueuse en présence d'hydroxyde de 10 sodium, puis le milieu est porté à haute température pendant une durée variable selon la masse moléculaire désirée. Le chitosane est ensuite purifié par solubilisation en milieu acide et précipité en milieu alcalin, lavé et séché. On détermine la viscosité dynamique de solutions de différents chitosanes d'origine 15 fongique et crustacé de concentration 1% (m/m) dans l'acide acétique 1% (v/v) à l'aide d'un viscosimètre à mobile tournant Brookfield équipé d'un Spindle de type S34. On détermine également la masse moléculaire moyenne viscosimétrique (Mv) par viscosimétrie capillaire, et le degré d'acétylation par titration potentiométrique. Tableau 1- Caractéristiques de chitosanes d'origine et masse moléculaire variable Ref Gamme Origine Viscosité Mv DDA (mol%) dynamique à 1% (mPa.$) CS1 Ultralow (UL) A.bisporus 10 55000 86 CS2 Ultralow (UL) A.bisporus 15 75000 85 CS3 Low (L) A.bisporus 33 100000 81 CS4 Low (L) A.bisporus 40 115000 78 CS5 Medium (MY A.bisporus 50 130000 75 CS6 High (H) A.bisporus 154 220000 72 CS7 Ultra- Crustacé 489 ND 83 high (UH) 3038837 27 CS8 Ultralow (UL) A.bisporus 12 ND 87 CS9 Low (L) A.bisporus 32 100300 81 CS10 MMedium) ( A.bisporus 63 150400 77 CS11 MM)eium ( A.bisporus 78 ND 75 CS12 High (H) A.bisporus 101 190500 73 ND - Non déterminé On voit que la masse moléculaire moyenne des chitosanes, déterminée par viscosimétrie capillaire, et la viscosité dynamique de leurs solutions à la concentration de 1% (m/m) 5 dans l'acide acétique à 1% (v/v) sont corrélées. On classe les chitosanes par gamme de masse moléculaire, de 'ultra-low' (très faible) à 'ultra-high' (très élevée). On peut ainsi estimer la masse moléculaire moyenne viscosimétrique d'un chitosane au départ de la viscosité dynamique de la solution à 1% (m/m) dans l'acide acétique à 1% 10 (v/v). Par exemple, le chitosane de référence CS7 d'origine crustacée a une masse moléculaire moyenne viscosimétrique estimée supérieure à 400,000, au vu de sa viscosité en solution de 489mPa.s. Ainsi, la valeur de viscosité dynamique à 1% peut être utilisée pour estimer la masse moléculaire d'un chitosane. 15 3038837 28 Exemple 2 - Viscosité dynamique de solutions de chitosane dans l'acide acétique 1% (v/v) en fonction de la concentration en chitosane (%, m/m) 5 Les chitosanes de différentes masses moléculaire préparés selon l'exemple 1 sont mises en solution dans l'acide acétique 1% (v/v) à des concentrations de 0.5% à 5%. La viscosité dynamique est mesurée à l'aide d'un viscosimètre à mobile tournant Brookfield, équipé d'un spindle de type S34. Tableau 2 - Viscosité dynamique (mPa.$) en fonction de la concentration en chitosane Concentration (%, m/m) 0,5% 1,0% 1,5% 2,0% 2,5% 3,0% 4,0% 5,0% Gamme Référence chitosane Viscosité dynamique (mPa.$) UL CS1 10 39 UL CS2 15 360 L CS3 33 130 M CS5 50 250 H CS6 154 700 UH CS7 489 1540 UL CS8 12 22 38 64 105 244 L CS9 32 79 162 319 594 1905 5712 M CS10 62 171 451 996 2060 7700 38000 M CS11 78 237 579 1194 2790 11900 H CS12 27 101 307 828 2105 4210 24940 10 On comprend de ce tableau 2 que la viscosité des solutions de chitosane augmente avec la concentration en chitosane, et ce d'autant plus que la masse moléculaire est élevée. La relation entre le logarithme de la viscosité et la concentration en chitosane est linéaire. La pente de la courbe du log de la viscosité en fonction de la concentration est d'autant plus 15 élevée que la masse moléculaire du chitosane est élevée. Les inventeurs ont mis en avant de manière surprenante que les chitosanes de l'invention sont particulièrement bien adaptés pour préparer des caillots de sang de manière aisée et qui soient homogènes, car pour les chitosanes de masses moléculaires élevées, les chaînes sont de longueur trop importante et susceptibles d'avoir une mobilité réduite et faire résulter en dès 20 mélanges non homogènes du chitosane avec le sang avant quê-le caillot ne se forme. 3038837 29 Les chitosane de masse moléculaire plus faible, par exemple dans la gamme 'low' et `ultra-low', permettent d'augmenter la concentration sans compromettre l'homogénéité du mélange avec le sang. 5 3038837 30 Exemple 3 - rapidité de la formation d'un caillot avec des solutions de chitosane à pH et compositions variables Dans cet exemple, on forme des mélanges entre des solutions de chitosane de masse moléculaire (exprimée en terme de viscosité à 1%) et de sang fraîchement prélevé sur 5 des adultes humains volontaires, dans le but d'obtenir le plus rapidement possible, en moins de 15 minutes, un caillot qui satisfasse le mieux les propriétés suivantes de préférence simultanément : homogène, ferme, non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression manuelle et à une déformation telle que le passage dans un trocart. L'objectif clinique est que ce caillot puisse être manipulé facilement par un chirurgien, afin 10 de l'apposer sur une surface ostéo-chondrale, par exemple une lésion du cartilage ayant été préalablement percé par des microfractures - sous la forme de microtunnels. La procédure peut se faire par implantation, ou encore par athéroscopie, c'est-à-dire à travers une aiguille de faible diamètre, sous endoscopie, comme décrit pas Stanish et al. (J Bone Joint Surg Am. 95,1640, 2013) et Steinwachs et al. (Arthroscopy Techniques 3, 15 399, 2014). Dans ce cas, il est avantageux que le caillot soit souple, non fragmenté et résistant, pour pouvoir être injecté au travers l'aiguille et être positionné de manière homogène durable à l'entrée des microtunnels, en vue de les combler et de stimuler la régénération du cartilage de manière équivalente sur l'ensemble de la lésion. On recherche à ce que le mélange du sang frais du patient et de la solution de chitosane 20 soit homogène avant la formation du caillot ; en effet la réparation doit se faire de manière homogène sur toute la surface de la lésion, c'est-à-dire qu'on vise à ce que le comblement des microtunnels soit équivalent d'un microtunnel à un autre et que la quantité de de la composition (de chitosane en mélange avec le sang) en contact avec la surface ostéo-chondrale soit être répartie de manière homogène. En outre, le caillot ne 25 doit pas fragmenter et doit être déformable pour pouvoir s'étaler correctement sur la surface du cartilage et ne pas être décroché au cours de l'intervention. Simultanément à l'homogénéité du mélange sang/chitosane avant formation du caillot, on recherche une durée de formation du caillot significativement plus rapide que celle des compositions chitosane/sang décrites dans la littérature ou commercialisés. Par exemplé, 30 on recherche une formation plus rapide du caillot, selon notre méthode de détermination de la durée de formation du caillot, que celle de la solution du chitosane CS7 à 2.05% utilisée comme contrôle dans cet exemple, ou que celles de solution de chitosane et de beta-glycérol-phosphate à pH 7 connue de l'art antérieur. En particulier, on cherche une durée de formation du caillot de moins de 10 minutes, 35 idéalement de moins de 5 minutes, tout en ayant un caillot en une partie (sans fragment, 3038837 31 conservant son intégrité), qui ne se rétracte pas et qui résiste à une compression manuelle. Dans cet exemple, on ne caractérise donc que les caillots dont la durée de formation est inférieure à 15 min, c'est-à-dire inférieure ou égale à 10 minutes. Dans cet exemple, le rapport volumique sang sur solution de chitosane du mélange est 5 fixé à 3/1 (v/v). Un chitosane de masse moléculaire faible est utilisé, ce qui permet de garantir une bonne homogénéité du mélange sang/solution de chitosane avant formation du caillot, et une formation du caillot rapide. On prépare des solutions de chitosane de concentration de 2%, 3% et 4% à pH 7.0 ou à 10 pH 6.0. Préparation des solutions de chitosane à pH 7.0 Une solution de beta-glycérophosphate (GP) est préparée par dissolution de betaglycérol-phosphate de sodium, d'eau de qualité pharmaceutique pour injection et d'acide chlorydrique 1N. Cette solution est ensuite filtrée sur 0.2pm. Le chitosane est dispersé 15 dans cette solution, puis on ajoute un volume d'acide acétique glacial variable en fonction de la concentration en chitosane pour atteindre un pH de 7,0 ± 0,2. Cette solution est ensuite stérilisée par autoclave. La concentration en GP finale est de 2% (m/m), le pH est de 7,0 ± 0,2 et l'osmolalité est de 300 ± 25 mOsmol/kg. 20 Préparation des solutions de chitosane à pH 6,0 ± 0,2 Le chitosane est dispersé dans de l'eau de qualité pharmaceutique pour injection, puis on ajoute un volume d"acide acétique glacial afin d'obtenir un pH de 6,0 ± 0,2. On ajoute le chlorure de sodium en poudre pour atteindre une osmolarité de 275 à 325mOsm/kg. Cette solution est ensuite stérilisée par autoclave. La concentration en chlorure de sodium finale 25 est de 1% (m/m) dans la formulation finale, le pH est de 6,0 ± 0,2 et l'osmolalité est de 300 ± 25 mOsmol/kg. Prélèvement sanguin et préparation du mélange sang/solution de chitosane : Les prélèvements de sang complet sont réalisés par un personnel qualifié auprès 30 d'adultes humains volontaires. Chaque échantillon de sang est analysé afin de détecter des anomalies éventuelles au niveau de la coagulation. Si une anomalie est détectée, le test n'est pas poursuivi pour cet échantillon. Le sang complet fraîchement prélevé, c'est-à-dire moins de 5 minutes avant usage, est mélangé à la solution de chitosane/beta-glycérophosphate (GP) à un ratio volumique de 3038837 32 3 :1, en mélangeant 1,5 ml de solution de chitosane/GP et 4.5 ml de sang. Le mélange sang/chitosane est ensuite légèrement agité manuellement pendant 10 secondes. 5 Les caillots sont formés de la manière suivante : - 0,3 ml du mélange chitosane/sang sont versés dans un tube en verre ; - Le tube est ensuite placé dans un bain thermostaté à 37°C, sans agitation. Après 5, 10 et 15 minutes, l'aspect dés caillots est vérifié en faisant basculer doucement le tube. On détermine visuellement si le caillot est formé au centre (caillot complet), ou si 10 seuls les bords du caillot sont solidifiés, ou si le sang coule toujours. On note la durée nécessaire à la formation du caillot complet. A titre de comparaison, on réalise le caillot avec du sang frais sans ajout de la formulation de chitosane/GP. 15 Taux de rétraction du caillot : Les caillots sont laissés à incuber durant 1 heure dans un bain thermostatisé à 37°C, sans agitation. Après 1 heure d'incubation, le caillot s'est plus ou moins rétracté, ce qui provoque une expulsion d'un certain volume de sang. Pour déterminer le taux de rétraction, le tube et le caillot sont pesés ensemble à la sortie du bain. Le liquide expulsé 20 du caillot est ensuite retiré à l'aide d'une seringue en verre munie d'une aiguille. Le tube et le caillot sont à nouveau pesés ensemble. Le taux de rétraction est déterminé selon le calcul suivant : %rétraction ni (tube + caillot sortie du bain) - ni (tube + caillot après retrait excédant liquide) * 100 in (tube + caillot sortie du bain) A titre de comparaison, le caillot avec du sang frais se rétracte d'environ 40%. 25 Test de compression : Une fois le test de rétraction réalisé, les caillots sont déposés dans une boîte de pétri. Une force de compression est appliquée manuellement sur le caillot afin de déterminer sa résistance, caractérisée par l'observation visuelle de l'effet de la compression: libération 30 de sang après compression et/ou fragmentation du caillot. Le test est toujours réalisé par la même personne avec une force de compression sensiblement identique. 3038837 33 Test de déformation : Ensuite, on évalue visuellement si le caillot est apte à être déformé sans se désintégrer, par exemple à passer à travers une grosse aiguille de type 18 Gauge de diamètre interne 800 à 880pm sous forme de grosses gouttes. 5 Test d'étalement/adhésion : Ensuite, on évalue la capacité du caillot à être s'étendre sur une surface à traiter sans glisser trop facilement, en inclinant la surface à la verticale avec un angle d'environ 60° par rapport à l'axe horizontal. 10 Caractère homogène du mélange Le caractère homogène du mélange sang/chitosane préalablement à la coagulation est simulé et évalué visuellement : on prépare la solution de chitosane à pH 7,0 ou pH 6,0, et on y ajoute un tampon phosphate pour mimer l'ajout de sang, dans un rapport volumique 15 de 1/3 et dans un tube en verre. On agite manuellement pendant 10 secondes, et on observe le mélange. Si la formulation de chitosane est distribuée de manière uniforme, on considère que le mélange est homogène. Si on observe que le mélange forme quelques zones opaques et de consistance 'gélatineuse', on considère que le mélange est peu homogène. Si on observe que le mélange forme beaucoup de zones opaques de 20 consistance gélatineuse, on considère que le mélange est non homogène. 3038837 34 Tableau 3 - Formation de caillot de sang frais en présence d'une solution du chitosane CS2 (de viscosité à 1% de 15mPa.$) à pH 7 et pH 6 +1- 0.2 et osmolalité entre 275 et 325mOsm/kg . Concentration Homogénéité Durée de formation du caillot complet Rétraction du Aspect du Maintien du caillot sur la surface et en chitosane du mélange caillot caillot et capacité de %(rnim) avant formation du caillot (%) résistance comblement de cavité à la compression Sang fraîchement prélevé Non >15 min 40% Se fragmente NS homogène Solution de chitosane CS2 à pH 6.0 2 0% Très 15 min 0.2% Se fragmente NS homogène 3.0% Très 5 min 0.2% Intègre, non Très bonne homogène fragmenté adhérence et Résistant à la compression, déformable bon étalement sur la surface 4.0% Très 5 min 0.2% Intègre, non Très bonne homogène fragmenté adhérence et Résistant à la compression, déformable bon étalement sur la surface Solution de chitosane CS2 à pH 7.0 2 0% Très 15 min 0.1% NS NS homogène 3.0% Très 15 min 0.2% NS NS homogène 4.0% Très 10 min 0.2% Intègre, non Bonne homogène fragmenté adhérence et Résistant à la compression, déformable bon étalement sur la surface Contrôle (solution de chitosane CS7 à 2.0% et pH 7.0) 2.0% Non 15 min 0.2% NS NS homogène NS : Caillot non satisfaisant pour le critère évalué 5 Il ressort de ces résultats de manière surprenante que les seules solutions de chitosane qui permettent de fournir un mélange homogène avec le sang frais sont celles réalisées 3038837 35 avec les chitosanes conformes à l'invention dont la viscosité à 1% dans l'acide acétique est inférieure à 60mPa.s. Il ressort encore de cet exemple que l'on peut obtenir de manière surprenante une formation d'un caillot intègre, non rétracté et non fragmenté de manière significativement 5 plus rapide avec la solution de chitosane à pH 6.0 et en l'absence de beta glycérophosphate de sodium que la solution contrôle du chitosane CS7 à 2.0%, tout en conservant de bonnes propriétés, telles que l'homogénéité du mélange sang/chitosane avant formation du caillot, une rétraction du caillot très faible, une bonne résistance à la compression , le caillot restant déformable, une bonne capacité à s'étaler. 10 De plus, on constate que pour le même chitosane de faible masse moléculaire (CS2), de manière très surprenante, on peut former bien plus rapidement un caillot adéquat à une concentration en chitosane plus faible avec une formulation de chitosane à pH 6.0 en présence d'un sel inorganique (sans sel organique de sucre ou de polyol, et en particulier sans glycérophosphate de sodium), qu'à pH 7.0 avec une formulation de chitosane en 15 présence d'un sel organique de sucre ou de polyol, et en particulier de glycérophosphate de sodium. De plus, on mesure que la viscosité de la solution du chitosane est faible à la concentration de 4% (environ 360mPa.$), et que l'on forme un mélange homogène avec le caillot. Le fait de maintenir une viscosité de la solution de chitosane faible permet une 20 fabrication industrielle aisée, ce qui n'est pas le cas pour des chitosanes de masse moléculaire plus élevée, comme décrit à l'exemple 2. Enfin, les caillots formés avec les solutions de concentration 3% et 4% à pH 6 ont une capacité d'adhérence plus importante que le caillot formé avec la solution de concentration 4% à pH 7, lorsqu'on les positionne sur une surface mimant la position 25 verticale, par exemple à un angle de 60°. Exemple 4 - Rapidité de formation d'un caillot de sang frais en présence de solution de chitosane de différentes masses moléculaires 30 Dans cet exemple, on forme des mélanges entre des solutions de chitosane de masse moléculaire (exprimée en terme de viscosité à 1%) et de sang fraîchement prélevé sur des adultes humains volontaires, dans le but d'obtenir un mélange homogène et un caillot ferme, souple, non rétracté et non fragmenté. L'objectif clinique est que ce caillot puisse être manipulé facilement par un chirurgien, afin de l'apposer sur une surface ostéo- 3038837 36 chondrale, par exemple une lésion du cartilage ayant été préalablement percé par des microfractures - sous la forme de microtunnels. Les caillots et mélanges sont formés et évalués selon la procédure de l'exemple 3. Tableau 4 - Formation de caillot de sang frais en présence d'une solution de chitosane (pH 7 +1- 0.2 ; osmolalité entre 275 et 325mOsm/kg) Homogénéité du mélange PBS / chitosane Ref Durée de formation du caillot complet Rétraction Aspect du Maintien du caillot sur la surface et capacité de comblement chitosane du caillot et de cavité et gamme caillot résistance (viscosité à 1%, (%).* à la mPa.$) compression Sang fraîchement prélevé > 15 min 40% NS NS Concentration en chitosane 2.0% (m/m)* Homogène CS1 UL (10) 15 min 0.2% NS NS Homogène CS5 M (50) 15 min 0.5% NS NS Peu homogène CS10 M (63) 15 min 0,2% NS NS Peu homogène CS6 H (154) 15 min 0,2% NS NS Peu homogène Contrôle 15 min 0.2% Intègre OK Du sang est libéré sous compression, peu déformable CS7 UH (489) Concentration en chitosane 3.0% (m/m)* Homogène CS1 UL (10) 15 min 0.2% NS NS Homogène CS2 UL (15) 15 min 0.2% NS NS Homogène CS5 M (50) 15 min 0.1% NS NS Peu homogène CS10 M (63) 15nnin 0,2% NS NS Non homogène CS6 H (154) 15nnin 0,2% NS NS Non homogène CS7 UH (489) 15min 0,2% NS NS Concentration en chitosane 4.0% (m/m)* Homogène CS1 UL (10) 5 min 0.5% Non fragmenté OK Résistant, déformable Homogène CS2 UL (15) 10 min 0.2% Non fragmenté OK Résistant, déformable Homogène CS4 L (40) 10 min 0.2% Légèrement fragmenté OK Résistant, déformable Homogène CS5 M (50) 10 min 0.2% Légèrement fragmenté OK Résistant, déformable 3038837 37 Peu homogène CS10 M (63) 15min 0,2% NS NS Non homogène CS6 H (154) 15min 0,2% NS NS Non homogène CS7 UH (489) 15min 0,2% NS NS *Concentration en chitosane dans la solution chitosane/glycérophosphate avant mélange avec le sang ; **Après 1 heure à 37°C. NS : Caillot non satisfaisant pour le critère évalué 5 Il ressort de ces résultats que les seules solutions de chitosane qui permettent de fournir un mélange homogène avec le sang frais sont celles réalisées avec les chitosanes de référence CS1, CS2, CS4 et CS5 dont la viscosité à 1% est de 10 à 50mPa.s. A partir de la viscosité à 1% de 63mPa.s (CS10), le mélange est peu homogène, ce qui favorise la fragmentation du caillot formé. 10 Il ressort encore de ces résultats que l'augmentation de la concentration en chitosane permet de manière surprenant d'accélérer la formation du caillot de manière significative par rapport à la solution contrôle du chitosane CS7 à 2.0%. En dessous d'une concentration de 4% en chitosane, la durée de formation du caillot est d'au moins 15 minutes pour tous les chitosanes testés, ce qui n'est pas optimal. 15 On obtient une durée de formation du caillot significativement plus faible, c'est-à-dire inférieure ou égale à 10 minutes, pour les solutions de chitosane à 4% dont la masse moléculaire est faible (références CS1, CS2, CS4 et CS5, de viscosité à 1% de 10 à 50mPa.$). Il ressort également de cet exemple qu'avec une solution de chitosane de concentration 20 4% pour un chitosane de viscosité à 1% de 10mPa.s (référence CS1), il est possible à la fois de fournir un mélange homogène entre le sang et une solution de chitosane et de glycérophosphate à pH 7, et de former un caillot en moins de 5 minutes, ce caillot étant très satisfaisant et répondant à tous les critères techniques recherchés (intègre, non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression et la déformation). 25 3038837 38 Exemple 5 - Influence de la présence d'un sel de calcium sur la formation du caillot avec une formulation de chitosane de faible masse moléculaire Dans cet exemple, on a étudié l'influence de la présence du chlorure de calcium (CaCl2) 5 en concentration variable sur la formation du caillot préparé avec des solutions de chitosane de faible masse moléculaire (référence CS2, viscosité à 1% de 15mPa.$) de concentrations 3 et 4%. Le sel de calcium, sous forme de chlorure (Calcium chloride dehydrate, Merck (réf:1.02465.1000)), est ajouté dans la solution de chitosane pour obtenir la concentration 10 désirée, puis le glycérophosphate est ajouté. Cette formulation est ensuite mélangée avec du sang frais le protocole décrit précédemment. Tableau 5 - Formation de caillot de sang frais en présence d'une solution du chitosane CS2 (viscosité à 1% de 15mPa.$), beta-glycérophosphate de sodium et chlorure de calcium (pH 7 +/0.2) Concentration en CaCl2 Durée de Rétraction du Aspect du Maintien (mg/1) formation caillot caillot et du caillot sur la du caillot (%)** résistance surface et complet à la compression capacité de comblement de cavité Concentration en chitosane 3% (m/m) 0 15 min 0.2% Intègre, résistant à la NS compression, déformable 25 15 min 0.2% Intègre, très résistant à la compression, déformable NS 50 15 min 0.1% Intègre, résistant à la NS compression, déformable 100 15 min 0.2% Intègre, résistant à la NS compression, déformable Concentration en chitosane 4% (m/m) 0 5 min 0.2% Intègre, résistant à la Bonne adhésion compression, déformable et bon étalement 25 5 min 0.2% Intègre, résistant à la Bonne adhésion compression, déformable et bon étalement 50 5 min 0.2% Intègre, très résistant à la compression, déformable Très bonne adhésion et bon étalement 100 5 min 0.2% Intègre, très résistant à la compression, déformable Très bonne adhésion et bon étalement 3038837 39 Il ressort de cet exemple que la présence de chlorure de calcium dans la solution de chitosane, à pH et osmolarité égaux, n'accélère pas la formation du caillot. Par contre, la présence de chlorure de calcium améliore sa cohésion, sa capacité à rester intègre sous compression et déformation et à ne pas laisser une partie du sang se libérer sous 5 compression, et son caractère adhérent. Ceci est avantageux pour la mise en place du caillot sur la surface à traiter, notamment par arthroscopie. Il est également avantageux d'avoir ces propriétés de cohésion et d'adhésion renforcées pour pouvoir positionner le caillot de manière durable sur l'articulation à traiter, même si 10 elle est en position non horizontale, sans que le caillot ne glisse sous l'effet de la gravité. REVENDICATIONS1.- Composition comprenant un mélange d'une formulation de chitosane et d'un fluide coagulable, dans laquelle la formulation de chitosane présente une concentration d'au moins 2,5 % de chitosane en masse par rapport à la masse totale de formulation de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1% (v/v), ladite composition comprenant au moins un sel inorganique. 2.- Composition, selon la revendication 1, caractérisée en ce que le chitosane présente un poids moléculaire Mv allant de 20 000 à 145 000. 3.-Composition, selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la formulation de chitosane présente une concentration de chitosane supérieure à 2,5 % et inférieure à 10 % en masse par rapport à la masse de formulation finale. 4--Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le chitosane est un chitosane d'origine fongique. 5.-Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le sel inorganique est un agent ajustant l'osmolarité de la solution de chitosane. 6.-Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le sel inorganique est choisi parmi un sel de sodium, un sel de chlorure, de potassium, de calcium, de magnésium, de phosphate, de sulfate, ou sel l'un quelconque de leurs mélanges, et plus particulièrement parmi le chlorure de potassium, le chlorure de sodium, chlorure de césium, le chlorure de calcium, le fluorure de césium, le perchlorate de potassium, le nitrate de sodium, le sulfate de calcium, ou l'un quelconque de leurs mélanges. 7.-Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le rapport volumique (v/v) entre le fluide coagulable et le chitosane est de 1/1 à 4/1. 3038837 41 8.- Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'osmolalité de la formulation de chitosane est comprise entre 250 et 400 mosm/kg , et de préférence de 275 à 325 mosm/kg. 5 9.- Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la formulation de chitosane comprend un ou plusieurs autres sels inorganiques, et de préférence un sel de calcium. 10.-Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en 10 ce que le pH va de 5,0 à 6,5, et de préférence de 5,5 à 6,5, et de préférence encore de 5,8 à 6,2. 11.- Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la composition comprend des cellules vivantes, par exemple des ostéoblastes, 15 à l'exception des cellules souches embryonnaires humaines. 12.- Dispositif médical comprenant ou consistant en une formulation de chitosane à une concentration d'au moins 2,5 % de chitosane en masse par rapport au volume de formulation de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou 20 égale à 60 mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1% (v/v), destinée à être mélangée avec un fluide coagulable, et au moins un sel inorganique. 13.- Dispositif médical selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un, et de préférence un seul, récipient renfermant une formulation de chitosane 25 et d'au moins un sel inorganique sous forme d'une solution, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1% (v/v), ladite formulation présentant une concentration supérieure ou égale à 2,5% de chitosane en masse par rapport à la masse de formulation de chitosane. 30 14.- Dispositif médical comprenant plusieurs récipients, lesdits récipients étant éventuellement physiquement indépendants (« kit-of-part »), caractérisé en ce que le dispositif médical comprend au moins (i) un récipient renfermant un chitosane sous forme sèche ou en solution, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à .60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1% (v/v), et (ii) un récipient renfermant une solution d'au moins un sel inorganique, dispositif dans lequel le chitosane et la 3038837 42 solution d'au moins un sel inorganique présentent une concentration apte à être supérieure ou égale à 2,5 % de chitosane en masse par rapport à la masse de formulation de chitosane, la formulation de chitosane étant formée par la mise en contact du chitosane, sous forme sèche ou en solution, et ladite solution d'au moins un sel 5 inorganique. 15.- Dispositif médical comprenant une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 10 16.- Composition telle que définie à l'une des revendications 1 à 11, éventuellement comprise dans un dispositif médical, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique. 17.- Composition telle que définie à l'une des revendications 1 à 11, 15 éventuellement comprise dans un dispositif médical, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique d'une maladie articulaire.