Brevet FR3044927A1 — publié le 20170616

ÉMULSIONS MAGNÉTIQUES RÉACTIVES La présente invention concerne des émulsions magnétiques réactives. ÉTAT DE LA TECHNIQUE Les colloïdes magnétiques sont très utilisés dans le domaine des biotechnologies, en particulier pour la capture en solution des molécules d'ADN ou d' ARN, de protéines ou de cellules. L'article de Jérôme Bibette, « Monodisperse ferrofluid emulsions », Journal of Magnetism and Magnetic Materials, Vol. 122, 1993, pp 37-41 décrit des émulsions monodisperses comprenant des gouttes de ferrofluide. Toutefois, ces émulsions précédemment décrites ne sont pas fonctionnalisées. La demande de brevet FR3001154 divulgue une composition de nanoémulsion huile dans eau pour IRM, comprenant une phase aqueuse, une phase lipidique sous forme de nanogouttelettes comprenant une huile et des nanoparticules magnétiques à base d'un composé du fer et recouvertes par un ou plusieurs acides gras en C8-C22, et un mélange de tensioactifs à l'interface entre les phases aqueuse et lipidique, le mélange de tensioactifs comprenant au moins un lipide amphiphile et au moins un ligand de ciblage amphiphile. Les gouttelettes des nanoémulsions divulguée dans FR3001154 ont une taille suffisamment petite pour circuler dans les milieux biologiques sans dégradation du produit, jusqu'à la cible du ligand de ciblage amphiphile inséré dans les gouttelettes grâce à son groupe lipophile. La taille des gouttelettes est typiquement de 30 à 300 nm. La figure 1 représente une gouttelette de la nanoémulsion selon l'art antérieur. Le numéro 1 désigne une nanoparticule magnétique à base d'un composé à base de fer et recouverte par un ou plusieurs acides gras en C8-C22, le numéro 2 désigne la phase lipidique comprenant l'huile selon l'invention, le numéro 3 désigne un lipide amphiphile, le numéro 4 désigne un lipide pégylé, et le numéro 5 désigne un ligand de 3044927 2 ciblage amphiphile (ou « biovecteur » amphiphile). En outre, les numéros 3, 4 et 5 désignent également les composés utilisés en tant que surfactant dans la nanoémulsion. Toutefois, la structure des gouttelettes des nanoémulsions décrites dans FR3001154, du fait de leurs petites tailles, sont instables à des tailles supérieures au micromètre. 5 En effet, à de telles tailles, de l'ordre du micromètre, se produit un phénomène bien connu : la coalescence. La coalescence est un phénomène par lequel deux substances identiques, mais dispersées, ont tendance à se réunir. Le phénomène principal qui entre en jeu est que le matériau optimise sa surface sous l'action de la tension superficielle, de manière à atteindre un minimum d'énergie. Ainsi, la structure des microgouttelettes 10 selon l'art antérieur engendre la fusion des microgoutelettes entre elles du fait d'une instabilité de l'interface huile-eau. En outre, il est connu de l'homme du métier que les grains d'oxyde de fer des émulsions magnétiques migrent à l'interface eau/huile. Celle-ci n'est plus liquide et perd en réactivité car l'interface devient constituée de nanoparticules solides. Ainsi, les 15 gouttelettes peuvent présenter une réactivité limitée, car les ligands sont fixés à l'interface. Il faut donc en greffer beaucoup par gouttelette pour s'assurer qu'il y aura au moins un ligand au point de contact lors de la rencontre entre la gouttelette et l'objet à capturer. Par ailleurs, les gouttelettes à interface liquide, plus réactives que les gouttelettes 20 présentant une interface solide ont pour défaut de présenter le risque d'une solubilisation du surfactant de ciblage. En effet, du fait de la mobilité du surfactant de ciblage, il y a un risque de solubilisation de celui-ci dans la phase aqueuse ce qui entraîne une menace sur la stabilité de la gouttelette de l'émulsion. Il existe donc un besoin relatif à l'obtention d'émulsions stables. 25 La présente invention propose une émulsion qui permet d'empêcher la coalescence des nanogouttelettes et d'en accroître la réactivité grâce à sa structure plus stable. 3044927 3 RÉSUMÉ L'invention concerne une émulsion huile dans eau comprenant : une phase huileuse dispersée comprenant au moins une nanoparticule magnétique hydrophobe, 5 une phase aqueuse, lesdites phases huileuse et aqueuse formant une interface sur laquelle se répartissent, au moins un surfactant de ciblage, - au moins deux surfactants, 10 au moins un des au moins deux surfactants n'étant pas un lipide amphiphile. Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un surfactant non ionique. Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un poloxamère. 15 Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est sélectionné parmi les poloxamères suivants : poloxamère 234, poloxamère 335, poloxamère 188, poloxamère 407, et poloxamère 338. Selon un mode de réalisation, au moins une nanoparticule magnétique présente au moins l'une des propriétés suivantes: diamagnétisme, ferromagnétisme, 20 ferrimagnétisme, paramagnétisme, superparamagnétisme, antiferromagnétisme. Selon un mode de réalisation, la phase huileuse comprend un surfactant choisi parmi, mais sans y être limitée : lecithine de soja, 1,2-di-(9Z-octadecenoy1)-sn-glycero-3- phosphocholine, 1-p almito y1-2-oleo yl- sn-glycero-3 -pho spho choline, L-a- phosphatidylcholine. 25 Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un surfactant zwitterionique. 3044927 4 Selon un mode de réalisation, ledit ligand de ciblage dudit surfactant de ciblage est de la biotine. L'invention concerne également une particule liquide au sein d'une phase aqueuse comprenant une phase huileuse, ladite particule liquide comprenant : 5 au moins une nanoparticule magnétique hydrophobe, au moins un surfactant de ciblage, au moins deux surfactants, dont au moins un des au moins deux surfactants n'est pas un lipide amphiphile, lesdits surfactants se répartissant à l'interface liquide entre la phase huileuse et la phase 10 aqueuse. Selon un mode de réalisation, ladite particule liquide a un diamètre compris dans un intervalle allant de 1 !am à 10 !am. L'invention concerne également l'utilisation de l'émulsion pour la capture d'objet en solution. 15 DÉFINITIONS Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante : « Nanoparticules » : assemblage d'atomes dont au moins une des dimensions se situe à l'échelle nanométrique. La norme ISO TS/27687 défini comme 20 nanoparticule, un objet dont les trois dimensions sont à l'échelle nanométrique, c'est- à-dire une particule dont le diamètre nominal est inférieur à 100 nm environ. « Particule liquide » : volume fermé d'un composé en phase liquide limité par une interface liquide en contact avec une autre phase liquide constituée par au moins un autre composé différent. La notion de gouttelette correspond à la notion de particule 25 liquide. « Émulsion » : mélange intime de deux substances liquides qui en situation normale sont non miscibles, comme l'eau et l'huile, mais qui vont par des opérations spécifiques réussir à avoir un aspect macroscopiquement homogène, mais 3044927 5 microscopiquement hétérogène. L'une des substances sera dispersée dans la seconde substance sous forme de gouttelettes ou de particules liquides. Une nanoémulsion est une émulsion qui comprend des goutelettes ou des particules liquides d'une taille comprise dans un intervalle allant de 100 nm à 600 nm. Une microémulsion 5 comprend des goutelettes d'une taille comprise dans un intervalle allant de 1 !lm à 100 !lm. « Surfactant » : molécules amphiphiles présentant deux parties de polarité différente, l'une lipophile (qui retient les matières grasses) et apolaire, l'autre hydrophile (miscible dans l'eau) et polaire. Ils permettent ainsi de solubiliser deux 10 phases non miscibles, en interagissant avec l'une apolaire (c'est-à-dire lipophile donc hydrophobe), par sa partie hydrophobe ; tandis qu'avec l'autre phase qui est polaire, il interagira par sa partie hydrophile. Les surfactants peuvent aussi être appelés tensioactif. « Surfactant de ciblage » : structure à deux blocs possédant un premier bloc 15 soluble dans une phase huileuse et un second bloc soluble dans la phase aqueuse. Le second bloc comporte une partie comprenant un ligand de ciblage afin d'interagir dans la phase aqueuse. Dans certaines applications, cette structure se comporte d'un premier élément amphiphile possédant des propriétés zwitterioniques comme un lipide, un élément central hydrophile comme un PEG, les deux premiers éléments 20 formant un lipide pégylé, et un troisième élément hydrophile, comportant un ligand de ciblage c'est-à-dire la partie permettant le ciblage. Dans d'autres applications, la structure est un polymère. « Ligand de ciblage » : atome, ion ou molécule portant des fonctions chimiques lui permettant de se lier à un ou plusieurs atomes ou ions centraux. En biologie, un 25 ligand (du latin ligandum, liant) est une molécule qui se lie de manière réversible sur une macromolécule ciblée, protéine ou acide nucléique, jouant en général un rôle fonctionnel : stabilisation structurale, catalyse, modulation d'une activité enzymatique, transmission d'un signal. Le ligand de ciblage est la partie terminale d'un surfactant de ciblage. 3044927 6 « Lipide » : concerne une chaine carbonée linéaire ou ramifiée, saturée, insaturée ou polyinsaturée. Ce motif peut être accroché à la structure d'un amphiphile par un groupement fonctionnel. « Poloxamère » : copolymères non-ioniques à trois blocs, possédant typiquement un 5 bloc central hydrophobe et deux blocs externes hydrophiles. Ces copolymères de type poly(oxyde d'éthylène-b-oxyde de propylène-b-oxyde d'éthylène) ont pour formule générale H(OCH2CH2),,(OCH(CH3)CH2)y(OCH2CH2),,OH ou pour simplifier (E0),(PO)y(E0), avec x compris dans un intervalle allant de 2 à 130 et y compris dans un intervalle allant de 15 à 67. Sous le terme générique de 10 poloxamère », ces copolymères sont communément identifiés avec la lettre « P » (pour poloxamère) suivie par 3 chiffres. Les deux premiers chiffres x 100 donnent la masse molaire approximative du bloc central, et le dernier chiffre x 10 donne le taux massique de motifs oxyde d'éthylène dans la molécule [ex. : poloxamère 407 (P407, nom commercial Pluronic F127) avec une masse molaire du bloc central de 4 000 15 g-mol-1 et un taux de motifs oxyde d'éthylène de 70 %]. « Ferrite » : oxydes de fer de formule générale [x Fe203, y MOI], où M désigne un métal magnétisable sous l'effet d'un champ magnétique tel que Fe, Co, Ru, Mg, Mn, le métal magnétisable pouvant être éventuellement radioactif. « Ferrofluide » : solutions colloïdales de nanoparticules ferromagnétiques dans un 20 solvant ou de l'eau. DESCRIPTION DÉTAILLÉE L'invention concerne une émulsion huile dans eau comprenant : une phase huileuse dispersée comprenant au moins une nanoparticule 25 magnétique hydrophobe, une phase aqueuse, les dites phases huileuse et aqueuse formant une interface liquide sur laquelle se répartissent, au moins un surfactant de ciblage, au moins deux surfactants, 3044927 7 de sorte que au moins un des au moins deux surfactants n'est pas un lipide amphiphile. Selon un mode de réalisation, l'émulsion est une microémulsion. L'invention concerne également une particule liquide au sein d'une phase aqueuse 5 comprenant une phase huileuse, ladite particule liquide comprenant au moins une nanoparticule magnétique hydrophobe, au moins un surfactant de ciblage, au moins deux surfactants, dont au moins un des au moins deux surfactants n'est pas un lipide amphiphile, lesdits surfactants se répartissant à l'interface liquide entre la phase huileuse et la phase aqueuse. 10 Selon un mode de réalisation, la particule liquide a un diamètre inférieur à 50 [tm. Selon un mode de réalisation, la particule liquide a un diamètre inférieur à 20 [tm. Selon un mode de réalisation,-la particule a un diamètre compris dans un intervalle allant de 0.5 [tm à 50 [tm. Selon un mode de réalisation,-la particule a un diamètre compris dans un intervalle 15 allant de 0.5 [tm à 20 [tm. Selon un mode de réalisation,-la particule a un diamètre compris dans un intervalle allant de 1 [tm à 10 [tm. Selon un mode de réalisation,-la particule a un diamètre compris dans un intervalle allant de 5 [tm à 10 [tm. 20 Selon un mode de réalisation,-la particule a un diamètre compris dans un intervalle allant de 4 [tm à 6 [tm. Selon un mode de réalisation,-la particule a un diamètre de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 [tm. Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un 25 surfactant zwitterionique. 3044927 8 Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un lipide amphiphile. Le lipide amphiphile inclus mais sans y être limité : les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glycolipides, les stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules 5 composées d'un acide gras couplé à un groupement lipophile par une fonction éther ou ester, tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan ; les lipides polymérisés; les esters de sucre tels que les mono-et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits lipides amphiphiles pouvant être utilisés seuls ou en mélanges. 10 Selon un mode de réalisation, le lipide amphiphile est un phospholipide. Les phospholipides incluent mais sans y être limité :phosphatidylcholine (appelée aussi lécithine), dioléoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distéaroylphosphatidylcholine, phosphatidyléthanolamine, sphingomyéline, pho sphatidyls érine, phosphatidylinositol. 15 Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants n'est pas un lipide amphiphile. Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un surfactant non ionique. Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un 20 surfactant non ionique diblocs. Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un surfactant non ionique triblocs. Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un poloxamère. 25 Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est sélectionné parmi les poloxamères suivants mais sans y être limité : poloxamère 403, poloxamère 234, poloxamère 335, poloxamère 188, poloxamère 407, et poloxamère 338. 3044927 9 Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est sélectionné parmi les poloxamères suivants mais sans y être limité : poloxamère 234, poloxamère 335, poloxamère 188, poloxamère 407, et poloxamère 338. Selon un mode de réalisation, au moins un des au moins deux surfactants est un 5 surfactant zwitterionique et le second surfactant est un surfactant non ionique. Selon un mode de réalisation, ladite au moins une nanoparticule magnétique présente au moins l'une des propriétés suivantes: ferromagnétisme, paramagnétisme, superparamagnétisme, diamagnétisme, ferrimagnétisme, antiferromagnétisme. Selon un mode de réalisation, ladite au moins une nanoparticule magnétique présente au 10 moins l'une des propriétés suivantes: ferromagnétisme, ferrimagnétisme, antiferromagnétisme. Les nanoparticules magnétiques ont des tailles micrométrique ou sous-micrométrique, c'est-à-dire non inférieure à 100-200 nm, par exemple des particules de ferrites, dont notamment de magnétite (Fe304), de maghémite (y-Fe2O3) et autres composés minéraux magnétiques d'éléments de transition qui se comportent 15 comme des aimants permanents. Les nanoparticules superparamagnétiques comprennent de la ferrite, dont notamment de la magnétite (Fe304), de la maghémite (y-Fe2O3) et autres composés minéraux magnétiques d'éléments de transition, de taille inférieure à environ 100-150 nm. Contrairement aux nanoparticules ferromagnétiques, les nanoparticules 20 superparamagnétiques ne se comportent plus comme de petits aimants autonomes du fait que leur taille est inférieure à une valeur critique, c'est-à-dire qu'elles s'alignent dans une direction préférentielle uniquement lorsqu'elles sont soumises à un champ magnétique externe. Selon un mode de réalisation, ladite au moins une nanoparticule magnétique comprend 25 en tout ou partie, de l'hydroxyde de fer ; de l'oxyde de fer hydraté ; des ferrites ; de l'oxydes de fer mixtes tels que des oxydes de fer mixtes de cobalt, de nickel, de manganèse, de béryllium, de magnésium, de calcium, de baryum, de strontium, de cuivre, de zinc ou de platine ; ou un mélange de ceux-ci. 3044927 10 Selon un mode de réalisation, ladite au moins une nanoparticule magnétique, comprend une ferrite, notamment la maghémite (y-Fe2O3) ou la magnétite (Fe304), ou encore les ferrites mixtes de cobalt (Fe2CoO4) ou de manganèse (Fe2MnO4). Selon un mode de réalisation, la phase huileuse comprend une huile choisie parmi, mais 5 sans y être limitée :, huile minérale, huile végétale, huile de soja, une huile silicone, polysiloxane, une solution de sulfure de carbone CS2, de l'hexane, du pentane, alkane C10-16, octane, decane, dodecane, tetradecane, hexadecane, isononyl nonanoate, isopropyl palmitate, isopropyl myristrate, ethyl oleate. Selon un mode de réalisation, la phase huileuse comprend en outre un surfactant choisi 10 parmi, mais sans y être limité : lécithine de soja, 1,2-di-(9Z-octadecenoy1)-sn-glycero-3- phosphocholine, 1-palmitoy1-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, L-a- phosphatidylcholine. Selon un mode de réalisation, la phase huileuse comprend en outre une huile choisie parmi, mais sans y être limité : lécithine de soja, 1,2-di-(9Z-octadecenoy1)-sn-glycero-3- 15 phosphocholine, 1-palmitoy1-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, L-a- phosphatidylcholine. Selon un mode de réalisation, la phase huileuse comprend en outre des lipides insaturés choisi parmi, mais sans y être limité : lécithine de soja, 1,2-di-(9Z-octadecenoy1)-snglycero-3 -pho spho choline, 1-p almito y1-2-oleo yl- sn-glyc ero -3 -pho sphocholine, L- a20 phosphatidylcholine. Selon un mode de réalisation, les particules liquides composant l'émulsion comprennent un nombre de surfactant de ciblage compris dans un intervalle allant de 1 à 108, 100 à 107, 103 à 106. Selon un mode de réalisation, les particules liquides composant l'émulsion comprennent 25 un nombre de surfactant de ciblage inférieur à 80 000 000. Selon un mode de réalisation, les particules liquides composant l'émulsion comprennent un nombre de surfactant de ciblage inférieur à 13 000 000. 3044927 11 Selon un mode de réalisation, les particules liquides composant l'émulsion comprennent un nombre de surfactant de ciblage compris dans un intervalle allant de 1 à 80 000 000. Selon un mode de réalisation, les particules liquides composant l'émulsion comprennent un nombre de surfactant de ciblage compris dans un intervalle allant de 1 à 13 000 000. 5 Selon un mode de réalisation, les particules liquides composant l'émulsion comprennent un nombre de surfactant de ciblage compris dans un intervalle allant de 300 à 4 000 000. Selon un mode de réalisation, les particules liquides composant l'émulsion comprennent un nombre de surfactant de ciblage compris dans un intervalle allant de 7000 à 10 4 000 000. Selon un mode de réalisation, les particules liquides composant l'émulsion comprennent un nombre de surfactant de ciblage compris dans un intervalle allant de 5000 à 1 500 000. Selon un mode de réalisation les surfactants de ciblage représentent avantageusement de 15 0,01 à 10% par rapport au lipide insaturé. Selon un mode de réalisation, le surfactant de ciblage comporte un premier bloc qui est un lipide amphiphile. Le lipide amphiphile inclus mais sans y être limité : les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glycolipides, les stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; 20 les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement lipophile par une fonction éther ou ester, tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan ; les lipides polymérisés; les esters de sucre tels que les mono-et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits lipides amphiphiles pouvant être utilisés seuls ou en mélanges. 25 Selon un mode de réalisation, le lipide amphiphile est un phospholipide. Les phospholipides incluent mais sans y être limité : phosphatidylcholine (appelée aussi lécithine), dioléoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, 3044927 12 dipalmitoylphosphatidylcholine, distéaroylphosphatidylcholine, phosphatidyléthanolamine, sphingomyéline, phosphatidylsérine, phosphatidylinositol. Selon un mode de réalisation, le surfactant de ciblage comporte un bloc central qui est un spacer. 5 Selon un mode de réalisation, le surfactant de ciblage comporte un bloc central qui est un polyéthylèneglycol (PEG). Selon un mode de réalisation, le surfactant de ciblage comporte un bloc central qui est un polyéthylèneglycol (PEG) choisi parmi mais sans y être limité : PEG600, PEG1000, PEG2000, PEG5000, PEG10000. 10 Selon un mode de réalisation, est utilisé comme ligand de ciblage de la biotine. Selon un mode de réalisation, est utilisé comme surfactant de ciblage l'un composé suivants mais sans y être limité : 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N[biotinyl(polyethylene glycol)-600] , 1,2-distearoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N-[biotinyl(polyethylene glycol)- 1000] , 1,2-distearoyl- sn-glyc ero-3 - 15 phosphoethanolamine-N- [biotinyl(polyethylene glycol)-2000] , 1,2-dis tearo yl- sn- glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-5000] , 1,2-distearoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-10000] . Selon un mode de réalisation, est utilisé comme ligand de ciblage l'un des composés cationiques suivants mais sans y être limité : KF8004 Amodimethicone, 1,2-dioleoy1-3- 20 trimethylammonium-propane, oleylamine. Selon un mode de réalisation, est utilisé comme ligand de ciblage l'un des composés anioniques suivants mais sans y être limité: 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)-2000], acide oléique. Selon un mode de réalisation de l'invention, on utilise comme ligand de ciblage, un 25 ligand de ciblage choisi parmi mais sans y être limité : les peptides (avantageusement de moins de 20 acides aminés, plus avantageusement de 5 à 10 acides aminés), les pseudopeptides, les peptidomimétiques, les acides aminés, les agents de ciblage 3044927 13 d'intégrines (peptides et pseudopeptides, peptidomimétiques notamment), les glycoprotéines, les lectines, les dérivés ptéroïques ou aminoptéroïques, les dérivés de l'acide folique et antifolique, les anticorps ou fragments d'anticorps, les stéroïdes, les oligonucléotides, les séquences d'acide ribonucléique, les séquences d'acide 5 désoxyribonucléique, les hormones, les protéines éventuellement recombinantes ou mutées, les mono- ou polysaccharides, les composés à squelette benzothiazole, benzofurane, styrylbenzoxazole/thiazole/imidazole/quinoline, styrylpiridine et composés dérivés, et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation, le ligand de ciblage du surfactant de ciblage est un ligand 10 biologique permettant de cibler spécifiquement certaines cellules : les peptides, par exemple le peptide RGD (linéaire ou cyclisé), leurs dérivés et leurs analogues (ex : le peptide octéotrate, analogue de la somatostatine, un analogue de la bombésine, de la neurotensine, l'EGF, le VIP...) ; des protéines, des anticorps, leurs dérivés ou leurs analogues ; des monosaccharides tels que le glucose, des oligosaccharides, des 15 polysaccharides, leurs dérivés et leurs analogues ; des oligonucléotides, ADN, leurs dérivés et leurs analogues ; des molécules organiques telle que le folate, le pamidronate biphosphonaté et des complexes organométalliques dont l'activité de ciblage est due à la reconnaissance moléculaire de ces ligands par des récepteurs sur-exprimés à la surface des cellules de la zone d'intérêt. 20 Selon un mode de réalisation, le ligand de ciblage (c'est-à-dire la partie permettant le ciblage) du surfactant de ciblage est un ligand biologique marqueur d'une activité biologique donnée, par exemple d'une activité enzymatique. A titre d'exemple de tels ligands, on peut par exemple mentionner les peptides clivables par une protéase donnée, à l'extrémité desquels sera greffé un inhibiteur de la fluorescence du label. Ce type de 25 ligands permet d'imager spécifiquement l'activité enzymatique de la protéase. Un autre exemple est constitué par les ligands biologiques comportant un pont disulfure séparant le label d'un inhibiteur de sa fluorescence. Selon des modes de réalisations, le ligand de ciblage du surfactant de ciblage est choisi parmi la liste suivante mais sans y être limité (les documents et références entre 30 parenthèses sont des exemples et non une liste limitative) : 3044927 14 les ligands de ciblage ciblant des récepteurs VEGF et angiopoiétine (décrits dans WO 01/97850), les polymères tels que polyhystidine (US 6,372,194), les polypeptides ciblant la fibrine (WO 01/09188), les peptides de ciblage d'intégrines (WO 01/77145, WO 02/26776 pour alphaV-beta3 (WO 02/081497) par exemple 5 RGDWXE), lespseudopeptides et peptides de ciblage de métalloprotéases MMP (WO 03/062198, WO 01/60416), les peptides ciblant par exemple le récepteur KDR/Flk-I dont R-X-K-X-H et RX-K-X-H, ou les récepteurs Tie-1 et 2 (WO 99/40947 par exemple), les glycosides de sialyl Lewis (WO 02/062810 et « Müller et al, Eur. J. Org . Chem, 2002, 3966-3973), les antioxydants tels que l'acide 10 ascorbique (WO 02/40060), les ligands de ciblage de la tuftsine (par exemple US 6,524,554), de ciblage de récepteurs à protéine G GPCR en particulier la cholécystokinine (WO 02/094873), les associations entre antagoniste d'intégrine et mime de la guanidine (US 6,489,333), les quinolones ciblant alphav beta3 ou 5 (US 6,511,648), les benzodiazépines et analogues ciblant des intégrines 15 (US 10 2002/0106325, WO 01/97861), les imidazoles et analogues (WO 01/98294), les peptides RGD (WO 01/10450), les anticorps ou fragments d'anticorps (FGF, TGFb, GV39, GV97, ELAM, VCAM, inductible par TNF ou IL (US 6,261,535), les molécule de ciblage modifiées par interaction avec la cible (US 5,707,605), les agents de ciblage de dépôts amyloïdes (WO 02/28441 par exemple), les peptides 20 clivés cathepsines (WO 02/056670), les mitoxantrone ou quinone (US 6,410,695), les polypeptides ciblant des cellules épithéliales (US 6,391,280), les inhibiteurs de cystéines protéases (WO 99/54317), les ligands de ciblage décrits dans : US 6,491,893 (GCSF), US 2002/0128553, WO 02/054088, WO 02/32292, WO 02/38546, WO 03/006059, US 6,534,038, WO 01/77102, EP 1 121 377, 25 Pharmacological Reviews (52, n°2, 179 ; facteurs de croissance PDGF, 20 EGF, FGF...), Topics in Current Chemistry (222, W.Krause, Springer), Bioorganic & Medicinal Chemistry (11, 2003, 1319-1341 ; dérivés tétrahydrobenzazépinones ciblant alphaV-beta3) ; les inhibiteurs d'angiogenèse, notamment ceux testés en essais cliniques ou déjà 30 commercialisés, notamment : les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des récepteurs FGFR ou VEGFR tels que SU101, SU5416, SU6668, ZD4190, PTK787, ZK225846, des composés azacycles (WO 02/44156, WO 02/059110) ; les 3044927 15 inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des MMP tels que le BB25-16 (marimastat), le AG3340 (prinomastat), le solimastat, le BAY12-9566, le BMS275291, le metastat, le neovastat ; les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des intégrines tels que le SM256, le SG545, des molécules d'adhésion bloquant le EC-ECM (tels que le EMD 5 121-974, ou la vitaxine) ; des médicaments à mécanisme d'action anti-angiogénique plus indirect tels que le carboxiamidotriazole, le TNP470, la squalamine, le ZD0101 ; les inhibiteurs décrits dans le document WO 99/40947, les anticorps monoclonaux très sélectifs pour la liaison au récepteur KDR, les analogues de la somatostatine 10 (WO 94/00489), les peptides de liaison à la sélectine (WO 94/05269), des facteurs de croissance (VEGF, EGF, PDGF, TNF, MCSF, interleukines); des ligands de ciblage de ciblage de VEGF décrits dans Nuclear Medicine Communications, 1999, 20 ; - les peptides inhibiteurs du document WO 02/066512 ; 15 - des ligands de ciblage capables de cibler des récepteurs : CD36, EPAS-1, ARNT, NHE3, Tie-1, 1/KDR, Flt-1, Tek, neuropiline-1, endogline, pléientropine, endosialine, Axl., alPi, a2ssl, a4P1, a5p1, eph B4 (éphrine), récepteur laminine A, récepteur neutrophiline 65, récepteur leptine OB-RP, récepteur chimiokine CXCR-4 (et autres récepteurs cités dans le document W099/40947), LHRH, bombésine/GRP, 20 récepteurs gastrine, VIP, CCK ; - des ligands de ciblage de type inhibiteurs de tyrosine kinase ; - les inhibiteurs du récepteur GPIlb/Illa connus choisis parmi : (1) le fragment fab d'un anticorps monoclonal du récepteur GPIlb/111a, Abciximab, (2) les petites molécules peptidiques et peptidomimétiques injectées en intraveineuse telles que 25 l'eptifibatide et le tirofiban ; des peptides antagonistes de récepteurs au fibrinogène (EP 0 425 212), des peptides ligands de récepteurs 1 lb/111a, des ligands du fibrinogène, des ligands de la thrombine, des peptides capables de cibler la plaque d'athérome, les plaquettes, la fibrine, des peptides à base d'hirudine, des dérivés à base de guanine ciblant le 30 récepteur 1 lb/111a ; 3044927 16 d'autres ligands de ciblage ou fragments biologiquement actifs de ligands de ciblage connus de l'homme du métier comme médicaments, à action anti-thrombotique, anti agrégation plaquettaire, antiathérosclérotique, antiresténotique, anticoagulante ; d'autres ligands de ciblage ou fragments biologiquement actifs de ligands de ciblage 5 ciblant alpha V beta3, décrits en association avec des DOTA dans le brevet US 6,537,520, choisis parmi les suivants : mitomycine, tretinoine, ribomustine, gemcitabine, vincristine, etoposide, cladribine, mitobronitol, methotrexate, doxorubicine, carboquone, pentostatine, nitracrine, zinostatine, cetrorelix, letrozole, raltitrexed, daunorubicine, fadrozole, fotemustine, thymalfasin, sobuzoxane, 10 nedaplatin, cytarabine, bicalutamide, vinorelbine, vesnarinone, aminoglutethimide, amsacrine, proglumide, elliptinium acetate, ketanserin, doxifluridine, etretinate, isotretinoine, streptozocine, nimustine, vindesine, flutamide, drogenil, butocin, carmofur, razoxane, sizofilan, carboplatine, mitolactol, tegafur, ifosfamide, prednimustine, picibanil, levamisole, teniposide, improsulfan, enocitabine, lisuride, 15 oxymetholone, tamoxifen, progesterone, mepitiostane, epitiostanol, formestane, interferon-alpha, interferon-2 alpha, interferon-beta, interferon-gamma, colony stimulating factor-1, colony stimulating factor-2, denileukin diftitox, interleukin-2, leutinizing hormone releasing factor ; certains ligands de ciblage ciblant des types particuliers de cancers, par exemple des 20 peptides ciblant le récepteur ST associé au cancer colorectal, ou le récepteur tachykinine ; des ligands de ciblage utilisant des composés de type phosphines ; des ligands de ciblage de ciblage de P-sélectine, E-sélectine ; par exemple, le peptide de 8 acides aminés décrit par Morikawa et al, 1996, 951, ainsi que différents 25 sucres ; - l'annexine V ou des ligands de ciblage ciblant les processus apoptotiques ; - tout peptide obtenu par des technologies de ciblage telles que le phage display, modifié éventuellement par des acides aminés non naturels ; des ligands de ciblage peptidiques connus de ciblage de plaques d'athérome, cités 30 notamment dans le document WO 2003/014145 et notamment VCAM ; des vitamines ; des ligands de récepteurs hormonaux dont les hormones et les stéroïdes ; 3044927 17 des ligands de ciblage ciblant des récepteurs opioïdes ; des ligands de ciblage ciblant des récepteurs TKI ; des antagonistes LB4 et VnR ; des composés nitriimidazoles et benzylguanidines ; 5 des ligands de ciblage rappelés dans Topics in Current Chemistry, vol. 222, 260- 274, Fundamentals of Receptor-based Diagnostic Metallopharmaceuticals, notamment : des ligands de ciblage de ciblage de récepteurs peptidiques surexprimés dans les tumeurs (récepteurs LHRH, bombésine/GRP, récepteurs VIP, récepteurs CCK, récepteurs tachykinine par exemple), notamment les analogues de 10 somatostatine ou de bombésine, des peptides dérivés octréotide éventuellement glycosylés, les peptides VIP, les alpha-MSH, les peptides CCK-B ; des peptides choisis parmi : des peptides cycliques RGD, fibrine-chaîne alpha, CSVTCR, tuftsine, fMLF, YIGSR (récepteur : laminine) ; - des oligosaccharides, des polysaccharides et des dérivés d'oses, des dérivés ciblant 15 les récepteurs Glut (récepteurs d'oses) ; - des ligands de ciblage utilisés pour des produits de type smart ; - des marqueurs de la viabilité myocardique (tétrofosmine et hexakis2méthoxy- 2méthylpropylisonitrile) ; - des traceurs du métabolisme des sucres et des graisses ; 20 des ligands de récepteurs de neurotransmetteurs (récepteurs D, 5HT, Ach, GABA, NA) ; des oligonucléotides ; des ligands de ciblage décrits dans WO 03/20701, en particulier le PK11195 ligand du récepteur périphérique aux benzodiazépines ; 25 des peptides liant la fibrine, notamment les séquences peptidiques décrites dans WO 03/11115 ; des inhibiteurs d'agrégation de plaques amyloïdes (décrits par exemple dans WO 02/085903) ; des pharmacophores composés de ciblage de la maladie d'Alzheimer, en particulier 30 les composés comprenant les squelettes de type benzothiazole, benzofuranes, styrylbenzoxazoles/thiazoles/imidazoles/quinoline, styrylpiridines ; 3044927 18 des pharmacophores composés de ciblage obtenus à partir de squelettes chimiques à activité pharmacologique décrits dans US2007098631, notamment les formules des pages 4 à 10 et pages 13-14 (incorporé par référence), notamment les composés du tableau page 4 dans la colonne intitulée « scaffolds and derivatives » : biphenyl; 5 arylpiperidine; arylpiperazine; 1,4 dihydropyridine dihydropyrimidone; 1,4 benzodiazepine-2-one; 1,5 benzodiazepine-2-one; 1,4-benzodiazepine-2,5 diones; pyrrolo2,1-c 1,4 benzodiazepines 5,11 diones; 1,4 benzothiazepine-5-ones; 5,11- dihydrobenzopyrido 3,2b 1,4 diazepine-6-ones benzopyrane; chromone; benzopyranone; coumarine, pyranocoumarine; benzopiperazinones; quinazolinone; 10 quinazolindione; quinoxalinone; imidazoquinoxaline; indole; benzimidazole, benzofurane, benzothiophene ; des ligands de ciblage d'intégrines, notamment des composés non peptidiques mimétiques de peptides RGD, et en particulier des composés tetrahydro naphtyridine décrits par exemple dans : J Med. Chem., 2003, 46, 4790-4798, 15 Bioorg. Med. Chem. Letters, 2004, 14, 4515-4518, Bioorg. Med. Chem. Letters, 2005, 15, 1647-1650 ; des ligands de ciblage de MUC5AC, notamment des fragments d'anticorps, des peptides et des composés non peptidiques mimétiques de peptides ; des ligands d'une cible associée à l'angiogenèse, notamment d'une cible choisie 20 parmi 4N1 K, AGF ("angiopoietin-related growth factor" en anglais), Angiogénine (ANG), Angiopoïetine-1, Angiopoïetine -2, Angiostatine, ARP4 ("angiopoietinrelated protein 4" en anglais), bFGF ("basic fibroblast growth factor" en anglais), CD31 (PECAM-1), CD34, CD97, CD146 (MUC18), CECs ("circulating endothelial cells" en anglais), CEPs ("circulating endothelial precursor cells" en anglais), 25 Collagénase-1 (C1), COX-2 (Cyclooxygénase-2), E7820, EG-1 ("endothelial- derived gene-l" en anglais), Extra-Domaine B (ED-B) de la Fibronectine, Endogline (CD105), ESAF ("Endothelial cell stimulating angiogenesis factor" en anglais), Facteur VIII (facteur anti-hémophilique A), Flt-1 ("Fms-like tyrosine kinase 1" en anglais), Intégrine al a2, Intégrine a2131, Intégrine a3131, Intégrine a5131, 30 Intégrine av [33, Intégrine a6134, Intégrine a9131, Intégrine-61, KDR, N-Cadhérine, Nestine, NG2 protéoglycane, PSMA ("prostate-specific membrane antigen" en anglais), PV-1 ("Plasmalemmal vesicle as sociated protein- 1" en anglais), S100A13, 3044927 19 Syndécane-1, T-Cadhérine, TEM-5 ("Tumor endothelial marker 5" en anglais), TEM-8 ("Tumour endothelial marker-8" en anglais), Thrombospondine-1 (TSP1), Thrombospondine-2 (TSP2), Thy-1, Tie-1, Tie-2, Tn-C (Ténascine-C), TP (Thymidine phosphorylase), VCAM-1 ("vascular cell adhesion molecule-1" en 5 anglais), VE-cadhérine, VEGF, VWF ("von Willebrand Factor" en anglais) et les inhibiteurs d'angiogenèse rappelés au paragraphe 2) ci-dessus. En particulier, pour les composés tetrahydro naphtyridine, tout composé de naphtyridine connu de l'art antérieur peut être utilisé (notamment ceux de WO 2009/114776), l'utilisation des composés naphtyridine comme ligand de ciblage pour imagerie 10 médicale étant décrite dans WO 2007/042506. Selon un mode de réalisation, le surfactant de ciblage comporte un bloc qui est un fluorophore. Selon un mode de réalisation, le fluorophore peut être fonctionnalisé pour créer des styrene ou des groupements acrylate, autorisant ainsi leurs incorporations dans du 15 polystyrene, du polyacrylate ou d'autres polymères tels que polyimide, polyacrylamide, polyethylene, polyvinyl, polydiacetylene, polyphenylene-vinylene, polypeptide, polysaccharide, polysulfone, polypyrrole, polyimidazole, polythiophene, polyether, epoxies, silica glass, silica gel, siloxane, polyphosphate, hydrogel, agarose, cellulose. L'invention concerne également un procédé de fabrication de l'émulsion précédemment 20 décrite qui consiste à, dans un premier temps, mettre en suspension le ferrofluide dans un volume d'huile, puis, simultanément, à solubiliser des phospholipides saturés et des phospholipides possédant un agent de ciblage dans la phase huileuse et des poloxamères dans la phase aqueuse, puis, dans une dernière étape, fabriquer l'émulsion en mélangeant des solutions huileuse et aqueuse précédemment fabriquées selon un 25 procédé classique connu de l'homme du métier. L'invention concerne également l'utilisation des particules ou de l'émulsion selon l'invention pour la capture d'objet en solution. 3044927 20 Les objets en solution peuvent être, mais sans y être limité : des molécules d'ADN ou d'ARN, des protéines, des cellules, des peptides, des micro-organismes, des cellules. L'invention concerne également l'utilisation des particules ou de l'émulsion selon l'invention pour le contrôle, la calibration et/ou la réalisation de mesures physiques, 5 notamment optiques, dans un dispositif de cytométrie en flux destiné à l'analyse biologique. Selon un mode réalisation, l'utilisation des particules ou de l'émulsion selon l'invention est destinée à l'analyse de cellules biologiques. Selon un mode de réalisation, les particules ou l'émulsion selon l'invention permettent 10 la détection de cibles dans un échantillon biologique, notamment par exemple via une détection du FSC (Forward SCatter - évaluation de la taille des particules) / SSC (Side SCatter - évaluation de la granularité des particules) d'agrégats formés par les particules de l'invention et leur cible en cytométrie de flux. 15 BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : représentation schématique d'une nanogouttelette d'une émulsion selon l'art antérieur. Figure 2 : représentation schématique d'une particule liquide d'une émulsion selon l'invention. 20 Figure 3 : démonstration de l'influence du poloxamère. Figure 4 : démonstration de l'influence de la longueur de la chaîne pégylé. EXEMPLES La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui 25 illustrent non-limitativement l'invention. 3044927 21 Exemple 1 : Méthode de fabrication d'une émulsion magnétique selon l'invention Matériel et méthodes Matériel ferrofluide comprenant des nanoparticules recouvertes d'acide oléique dans un ratio 5 poids/volume (p/v) de 70%, suspendues dans un mélange d'octane et d'acide oléique dans un ratio p/v de 15%, phase huileuse contenant 1,3mM de lipides insaturés, phase aqueuse, poloxamère de type poloxamère 234, poloxamère 335, poloxamère 188, poloxamère 10 407, et poloxamère 338. L'efficacité des différents poloxamères est mise en évidence dans la figure 3. Méthodes Dans un premier temps, le ferrofluide est mis en suspension dans un volume d'huile. Simultanément, des phospholipides saturés et des phospholipides possédant un agent de 15 ciblage sont solubilisés dans la phase huileuse et des poloxamères sont solubilisés dans la phase aqueuse. Enfin dans une dernière étape, l'émulsion est fabriquée par le mélange des solutions huileuse et aqueuse précédemment fabriquées selon un procédé classique connu de l'homme du métier. 20 Exemple 2 : Émulsion biotinylée selon l'invention La phase huileuse est préparée par dilution du ferrofluide dans l'huile décane à une concentration de 3% en poids. Les phospholipides sont préparés par évaporation d'un solvant de chloroforme sous azote, typiquement 50 pl de DOPC (10 mg / ml) et 100 pl de DSPE-PEG1000-biotine lipide (0,1 mg / ml). 25 Le film lipidique séché est ensuite mélangé avec 0,5 ml du mélange ferrofluide-huile en utilisant une combinaison de mélange, sonification et chauffage pour donner une phase 3044927 22 huileuse contenant 1,3 mM de lipides. La phase aqueuse est préparée par dissolution du surfactant poloxamère 234 et PVP émulsifiant dans l'eau désionisée à 1% en poids et 15% en poids respectivement. Dans une dernière étape, l'émulsion est préparée à la main avec un mortier et un pilon, 5 de sorte que 0,5 ml de la phase huileuse est ajoutée goutte à goutte à 0,5 ml de la phase aqueuse avec un cisaillement appliquée de façon intermittente jusqu'à ce que la phase huileuse soit complètement ajoutée et que le mélange homogène est atteint. Exemple 3 : Émulsion greffée selon l'invention La phase huileuse est préparée par dilution du ferrofluide dans l'huile minérale à une 10 concentration de 3% en poids. Les phospholipides sont préparés par évaporation d'un solvant de chloroforme sous azote, typiquement 50 pl de lécithine de soja (10 mg / ml) et de lipide 3501..IL DSPE-PEG2000-carboxylique (1 mg / ml). La figure 4 montre l'influence de la longueur de la chaîne pégylé. Le film lipidique séché est ensuite mélangé avec 0,5 ml du mélange ferrofluide-huile en 15 utilisant une combinaison de mélange, sonication et chauffage pour donner une phase huileuse contenant 1,3 mM de lipides. La phase aqueuse est préparée par dissolution du surfactant poloxamère 407 et PVP émulsifiant dans l'eau désionisée à 1% en poids et 15% en poids respectivement. Dans une dernière étape, l'émulsion est préparée à la main avec un mortier et un pilon, 20 de sorte que 0,5 ml de la phase huileuse est ajoutée goutte à goutte à 0,5 ml de la phase aqueuse avec un cisaillement appliqué de façon intermittente jusqu'à ce que la phase huileuse soit complètement ajoutée et que le mélange homogène est atteint. Les protéines sont ensuite greffées sur les gouttes d'émulsion en utilisant des techniques classiques (voir par exemple : Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 25 3 édition (2 septembre 2013)). REVENDICATIONS1. Émulsion huile dans eau comprenant : - une phase huileuse dispersée comprenant au moins une nanoparticule magnétique hydrophobe, - une phase aqueuse, lesdites phases huileuse et aqueuse formant une interface sur laquelle se répartis sent, - au moins un surfactant de ciblage, et - au moins deux surfactants, au moins un des au moins deux surfactants n'étant pas un lipide amphiphile. 2. Émulsion selon la revendication 1 caractérisée en ce que au moins un des au moins deux surfactants est un surfactant non ionique. 3. Émulsion selon la revendication 1 ou la revendication 2 caractérisée en ce que au moins un des au moins deux surfactants est un poloxamère. 4. Émulsion selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que au moins un des au moins deux surfactants est sélectionné parmi les poloxamères suivants : poloxamère 234, poloxamère 335, poloxamère 188, poloxamère 407 et poloxamère 338. 5. Émulsion selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que ladite au moins une nanoparticule magnétique présente au moins l'une des propriétés suivantes : diamagnétisme, ferromagnétisme, ferrimagnétisme, paramagnétisme, superparamagnétisme, antiferromagnétisme. 6. Émulsion selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la phase huileuse comprend un surfactant choisi parmi, mais sans y être limitée : lécithine de soja, 1,2-di-(9Z-octadecenoy1)-sn-glycero-3-phosphocholine, 1- palmitoy1-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, L-a-phosphatidylcholine. 3044927 24 7. Émulsion selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que au moins un des au moins deux surfactants est un surfactant zwitterionique. 8. Émulsion selon l'une des revendications précédentes caractérisée en que ledit ligand de ciblage dudit surfactant de ciblage est de la biotine. 5 9. Particule liquide au sein d'une phase aqueuse comprenant une phase huileuse, ladite particule liquide comprenant : - au moins une nanoparticule magnétique hydrophobe, - au moins un surfactant de ciblage, - au moins deux surfactants, dont au moins un des au moins deux 10 surfactants n'est pas un lipide amphiphile, lesdits surfactants se répartissant à l'interface liquide entre la phase huileuse et la phase aqueuse. 10. Particule liquide selon la revendication 9 caractérisée en ce que ladite particule liquide a un diamètre compris dans un intervalle allant de 1 [tm à 10 [tm. 15 11. Utilisation de l'émulsion selon l'une des revendications précédentes pour la capture d'objet en solution.