Brevet FR3042505A1 — publié le 20170421

La présente invention se rapporte au domaine de la valorisation de la biomasse algale, plus précisément la présente invention concerne un procédé d'extraction de lipides issus de micro-algues. Les micro-algues sont des organismes eucaryotes, la plupart du temps unicellulaires, délimitées par une membrane plasmique et une paroi. La composition et la structure de cette paroi peuvent être variables selon la microalgue considérée. Ainsi, chez certaines microalgues vertes telles que Chlorella, elle est constituée de cellulose et possède une forte rigidité entraînant une résistance élevée de l'algue vis-à-vis des contraintes mécaniques. Pour les micro-algues appartenant à la classe des diatomées, la paroi, aussi appelée frustule, est constituée de silice cristallisée. Cette dernière est plus cassante que celle de Chlorella. Enfin, d'autres espèces mettent en place autour de leur cellule, une gangue polysaccharidique pour se protéger des agressions environnementales. L'épaisseur de cette gangue varie au cours du temps, elle est assez fine lors de la croissance exponentielle de la micro-algue puis plus épaisse en phase stationnaire. L'intérêt pour la valorisation des microalgues est croissant, ainsi les microalgues trouvent de nombreuses applications en particulier dans les aliments, les produits cosmétiques, les produits pharmaceutiques.. en outre de nombreuses recherches sont menées sur la biomasse algale dans la perspective de l'utiliser comme biocarburant. Dans le but de valoriser la totalité de la biomasse micro-algale, dans un objectif de bioraffinage, il est nécessaire de fractionner, cFisoler les différents métabolites de ladite micro-algue. Les principaux métabolites des microalgues, à savoir les polysaccharides, les protéines et les pigments, sont généralement solubles dans le milieu de culture. De plus les microalgues peuvent, dans certaines conditions, accumuler cFimportantes quantités de lipides sous la forme de globules de triglycérides dits « TAG» (pour triglycérides d'acides gras). En outre elles produisent également des acides gras polyinsaturés dites « AGPI », sous la forme de phospholipides et de glycolipides possédant une forte valeur ajoutée. Le but de la présente invention est précisément la récupération des lipides de la biomasse algale et plus précisément des triglycérides d'acides gras et des acides gras polyinsaturés. 3042505 2 La récupération de ces deux fractions se fait classiquement via une extraction par solvant organique sur une biomasse préalablement séchée, puis par un fractionnement des différentes classes de lipides via des opérations unitaires variées (extraction sélective, précipitation sélective, distillation ). Les lipides sont ainsi recueillis dans la phase organique 5 et les protéines dans la fraction qui est insoluble dans ledit solvant organique. Cette technologie est notamment décrite dans : "Lipid extracted algae as a source for protein and reduced sugar: a step Gloser to the biorefinery." Ansari, F. A., A. Shriwastav, S. K. Gupta, I. Rawat, A. Guldhe and F. Bux (2015) Bioresour Technol 179: 559-564. Cette méthode implique une forte consommation d'énergie liée au séchage de la 10 biomasse qui entraine également une dégradation de certains composés thermosensibles comme les vitamines, les pigments ou certaines protéines. La série d'opérations ainsi que les importantes quantités de solvants mises en jeu complexifient le procédé et augmentent les coûts de production. Un des principaux avantages du procédé selon l'invention est qu'il peut être mis 15 en oeuvre sur une biomasse sans que celle-ci soit préalablement séchée. Le procédé selon l'invention permet ainsi d'éviter la mise en oeuvre d'une étape de séchage, longue et coûteuse, tant en énergie que financièrement. US2013/0338384 divulgue un procédé de récupération de lipides à partir d'une biomasse microalgale comprenant le chauffage de ladite biomasse à une température allant 20 de 80 °C à 150 °C à une pression allant de 1 à 5 bar. Des méthodes de désintégration de cellules de Chlorella vulgaris en vue de récupérer les lipides aptes à la production de biodiesel sont également décrites notamment dans la publication « Disruption of Chlorella vulgaris Cells for the Release of BiodieselProducing Lipids : A Comparison of Grinding, Ultrasonication, Bead Milling, Enzymatic 25 Lysis, and Microwaves » Hongli Zheng et al., Appl. Biochem Biotechnol (2011) 164 :1215-1224. Cette publication ne décrit pas les conditions du procédé selon l'invention qui met en oeuvre un broyeur à billes et qui permet l'obtention d'une composition qui peut être ensuite facilement valorisée par simple centrifugation. 30 Le problème technique posé à l'origine de la présente demande était de disposer cFun procédé de fractionnement des lipides contenus dans une biomasse micro-algale qui ne nécessite pas de sécher ladite biomasse, qui permet de s'affranchir de l'utilisation de 3042505 3 solvants et qui conduit à l'obtention dune composition dont les différents constituants peuvent être ensuite facilement séparés. En effet dans l'optique de bioraffinage de la biomasse, une extraction sélective de chacun des constituants est recherchée. 5 Le procédé selon l'invention répond à ces exigences. Un premier objet de la présente invention vise un procédé de traitement dune biomasse micro-algale comprenant les étapes suivantes : - disposer dune biomasse micro-algale comprenant au moins 15 % en poids de lipides par rapport à la masse totale de ladite biomasse et présentant une concentration en matière 10 sèche comprise entre lg/1 et 200 g/1, - broyer ladite biomasse au moyen d'un broyeur à billes mis en oeuvre dans les conditions suivantes : - le diamètre moyen des billes (dGM) varie de 0,2 à 2,5.10-3m, de préférence de 0,4 à 1,0. 10-3m et de manière préférée est denviron 0,6 10-3 m, 15 - la vitesse d'agitation en bout de pale(u) varie de 4 à 50 m.s-1, de préférence de 5 à 20 m. s_1 et de manière préférée est denviron 8 m. sec-1 ; - récupérer la composition obtenue. Les conditions de mise en oeuvre du broyage selon l'invention permettent dassurer le relargage de la quasi totalité des gouttelettes de triglycérides, tout en assurant 20 une déconstruction partielle des structures cellulaires entrainant la libération de certains voire de tous les phospholipides et glycolipides. En outre les conditions de mise en oeuvre du broyage selon l'invention permettent déviter une homogénéisation trop poussée du milieu, et par conséquent déviter la formation démulsion. 25 La composition obtenue à l'issue du broyage présente l'avantage dêtre ensuite facilement valori sable. Un deuxième objet de l'invention vise la composition susceptible d'être par le procédé selon l'invention. L'étape mettant en oeuvre un broyeur à billes selon l'invention est 30 avantageusement suivie des étapes suivantes, dans cet ordre : - une étape de centrifugation à une accélération centrifuge comprise entre 3500g et 20 000g, pendant une durée comprise entre 2 et 40 minutes, à une température 3042505 4 comprise entre 5 et 40 °C de la composition obtenue, ladite étape de centrifugation conduisant à l'obtention dau moins 3 phases ; - une étape de récupération des phases permettant disoler une première phase dite « superculot », une deuxième phase dite « surnageant » plus dense que la première 5 phase et dune troisième phase dite « culot » plus dense que la deuxième phase. Avantageusement, l'étape de centrifugation est effectuée directement sur la composition obtenue à l'issue de l'étape mettant en oeuvre un broyeur à billes, c'est-à-dire que l'étape de centrifugation est mise en oeuvre après l'étape mettant en oeuvre un broyeur à billes sans étape(s) intermédiaire(s) hormis l'étape visant à récupérer ladite composition 10 obtenue. Le procédé selon l'invention permet donc de fractionner les lipides et les protéines contenus dans des microalgues sans sécher la biomasse (extraction en voie humide) ni utiliser de solvants, évitant ainsi la dénaturation des composés tout en limitant les volumes à traiter. 15 Un autre avantage du procédé selon l'invention est qu'il peut être mis en oeuvre directement sur le milieu de culture, en particulier sur une suspension de micro-algues en sortie de production, ce qui contribue à réduire les volumes d'eau utilisés pour mettre en oeuvre ledit procédé. Ainsi le procédé selon l'invention permet de travailler sur une biomasse 20 concentrée directement récoltée après culture. Avantageusement en mettant en oeuvre seulement deux étapes : une étape de broyage et une étape de séparation de phases, il est possible d'obtenir directement trois phases sélectivement enrichies en différents composés : une première phase dite « superculot » riche en lipides, une deuxième phase dite « surnageant » riche en protéines 25 et une troisième phase dite « culot » riche en composés insolubles. Le superculot et le culot peuvent ainsi être directement valorisables, le surnageant peut être soumis à une opération de filtration membranaire permettant soit la séparation des protéines et des sucres solubilisés des TAG soit la concentration des protéines et des TAG pour arriver à deux fractions purifiées. 30 Aucune altération de molécules liée au séchage de la biomasse et à l'utilisation de solvant n'est dans ce cas là observée. 3042505 5 Biomasse micro-algale Le procédé selon la présente invention est mis en oeuvre à partir d'une biomasse micro-algale suffisamment riche en lipides et suffisamment concentrée, ainsi la biomasse micro-algale comprend au moins 15 %, de préférence environ 17,5 % en poids de lipides 5 par rapport à la masse totale de la biomasse, en outre la biomasse micro-algale présente une concentration en matière sèche comprise entre 1g/1 et 200 g/1, de préférence entre 5g/1 et 150g/1 et de façon encore préférée entre 35g/1 et 100g/1, c'est-à-dire par rapport au volume de la biomasse micro-algale à traiter. De préférence la biomasse microalgale comprend au moins une microalgue 10 choisie parmi Nannochloropsis sp., Nannochloropsis oceanica, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis suecica, Porphyridium cruentum, Parachlorella kessleri, Dunaliella satina, Chlorella vulgaris, Neochloris oleoabundans, Haematococcus pluvialis et de préférence parmi les souches suivantes Nannochloropis oceanica, Parachlorella kessleri, Tetraselmis suecica. 15 Procédé mettant en oeuvre un broyeur à billes Le procédé selon l'invention comprend une étape lors de laquelle est utilisé un broyeur à billes. Les broyeurs à billes sont classiquement utilisés pour l'homogénisation des 20 produits visqueux tels que les peintures et aussi pour broyer les minéraux. Les broyeurs à billes comprennent une enceinte, par exemple un bol fermé par un couvercle, destinée à recevoir la composition à traiter, ladite enceinte étant alimentée via une pompe en composition à traiter. Classiquement le taux de remplissage en billes du broyeur, correspondant au 25 pourcentage du volume du bol occupé par les billes, va de 50 % à 80 %, de préférence de 70 % à 80 % volume/volume et avantageusement cFenviron 75 % volume/volume. Le contenu de l'enceinte, hors billes, comprend essentiellement la biomasse microalgale. Le taux de remplissage pourra être adapté notamment en fonction de la nature 30 des billes utilisées. En effet dans certains cas, une agglomération des billes entre les pâles de l'agitateur a pu être observée. 3042505 6 Il relève des compétences de l'homme du métier de sélectionner le taux de remplissage adapté au milieu à traiter. Le débit d'alimentation de la composition dans le broyeur va généralement de 150 ml/min à 200 ml/min. Il relève également des compétences de l'homme du métier de 5 sélectionner le débit dalimentation adapté au milieu à traiter. De préférence, le traitement dans un broyeur à billes est réalisé pendant une durée (temps de séjour) variant de 1 à 30 minutes, de préférence de 2 à 20 minutes, de manière encore préférée de 4 à 10 minutes et avantageusement cFenviron 6 minutes. Le traitement au broyeur à billes est généralement effectué à une température, 10 généralement régulée, allant de 18 °C à 40 °C, de préférence allant de 18 à 25 °C. Comme déjà mentionné, le procédé de traitement mécanique selon l'invention met en oeuvre un broyeur à billes, de préférence en verre, dans les conditions suivantes : - le diamètre moyen des billes (dGM) varie de 0,2 à 2,5.10-3m, de préférence de 0,4 à 1,0. 10-3m et de manière préférée est cFenviron 0,6 10-3 m, 15 - la vitesse d'agitation en bout de pale(u) varie de 4 à 50 m.s-1, de préférence de 5 à 20 m. s_1 et de manière préférée est cFenviron 8 m. sec-1 ; A l'issue de l'étape de broyage à billes, la composition obtenue est avantageusement récupérée. Selon une mise en oeuvre du procédé, une seule étape de broyage à billes est 20 effectuée. Selon une mise en oeuvre préférée du procédé, le traitement dans un broyeur à billes est répété au moins deux fois, de préférence entre deux et dix fois et avantageusement entre trois et quatre fois. De préférence, ce procédé est mis en oeuvre en « batch » afin de pouvoir traiter 25 un volume de biomasse de manière simple. Etape de centrifugation Comme déjà mentionné, les conditions opératoires permettant une centrifugation conduisant aux 3 phases annoncée sont 30 - une accélération centrifuge comprise entre 3500g et 20 000g, de préférence entre 6000g et 15 000g et de façon encore préférée environ de 12 000g, 3042505 7 - pendant une durée comprise entre 2 et 40 minutes, de préférence entre 5 et 30 minutes et de façon encore préférée entre 10 et 20 minutes, - à une température comprise entre 5 et 40°C, de préférence entre 10 et 30°C et de façon encore préférée entre 20 et 25°C de la composition obtenue; 5 Comme déjà mentionné, à l'issue de l'étape de centrifugation trois phases sont essentiellement obtenues, ces trois phases étant sélectivement enrichies en différents composés. La première phase, le superculot, comprend généralement plus de 30 %, de préférence plus de 60 % de lipides, elle comprend également des protéines en une quantité 10 limitée comprise entre 10 et 30 % permettant une valorisation directe du superculot. Néanmoins, en fonction des utilisations visées, une opération de séparation des protéines présentes dans le superculot peut être effectuée. Il relève des compétences de l'homme du métier de choisir la méthode de séparation à mettre en oeuvre. 15 En outre, les opérations de purification du superculot sont facilitées à cause de la proportion réduite des protéines. La première phase comprend essentiellement un mélange de triglycérides (TAG) et d'acides gras polyinsaturés dites « AGPI », sous la forme de phospholipides et de glycolipides. 20 La deuxième phase, le surnageant, comprend généralement plus de 20 %, de préférence plus de 40 % de protéines et également une quantité importante de lipides. Par conséquent le surnageant peut être soumis à une ou plusieurs opération(s) de séparation des protéines et des lipides notamment des TAG pour obtenir deux fractions purifiées, avantageusement cette /ces opération(s) de séparation peuvent être effectuée(s) 25 au moyen d'une membrane. Avantageusement au moins une étape de séparation des lipides est effectuée sur la deuxième phase. Les lipides notamment des TAG isolés à l'issue de la ou des opération(s) de séparation et le superculot voire les lipides isolés du superculot sont avantageusement 30 rassemblés. La troisième phase, le culot, est riche en composés insolubles. Le culot peut être directement valorisable. 3042505 8 Les opérations de purification des composants sont facilitées notamment dû au fait que les trois phases sont sélectivement enrichies en différents composés. Le procédé selon l'invention doit être considéré comme permettant une récupération ciblée et quasi-totale des lipides. 5 Propriétés des lipides Les lipides sont utilisés dans des compositions chimiques, cosmétiques ou pharmaceutiques, en nutraceutique, en alimentation notamment animale. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans en limiter la portée. 10 Exemples Pour tous ces exemples, on utilise une biomasse de Nannochloropis oceanica. Cette biomasse a été cultivée en photobioréacteur tubulaire de 10 L. La biomasse a été traitée au moyen d'un broyeur à billes (DynoMill Mutlilab, 15 WAB, Suisse) en verre dans les conditions précisée dans chaque exemple. Le dosage des lipides est réalisé par la méthode de Folch. Les protéines sont mesurées par absorbance à 280 nm, mesure éventuellement complétée d'un dosage des protéines réalisé selon le protocole BCA afin de vérifier la justesse des mesures spectro-photométriques. 20 Exemple 1 (conforme à l'invention) Etape de Broyage - Biomasse de Nannochloropis oceanica contenant 17,5 % de lipides, - Concentration en matière sèche de l'alimentation 75g/L, 25 - Billes en verre de 0,6 mm de diamètre, - Vitesse d'agitation de 8m.s-1, - cp : Taux de remplissage du broyeur : 75 %, - Q : débit cFalimentation en ml/min : 200, - Température régulée à 20 °C, 30 - Temps de séjour moyen de 6 minutes. Etape de centrifugation : - Centrifugation en pots de 500mL pendant 10 minutes à 20 °C et 17000g. 3042505 9 % en masse par % en masse par rapport à la masse de rapport à la masse de protéines initiales TAG initiaux Superculot 11 42 Surnageant 48 28 Culot 40 24 Total 99 94 Dans cet exemple on récupère bien les trois fractions précédemment citées. Exemple 2 (comparatif) 5 Biomasse de Nannochloropis oceanica contenant 12,5 % de lipides, Concentration en matière sèche de l'alimentation 75g/L, Billes en verre de 0,6 mm de diamètre, Vitesse d'agitation de 8m.s-1, cp : Taux de remplissage du broyeur : 75 %, 10 Q : débit cFalimentation en ml/min 200, Température régulée à 20 °C, Temps de séjour moyen de 6 minutes. Dans cet exemple, avec une biomasse moins riche en lipides, seulement deux phases sont obtenues après la centrifugation. 15 Il est donc possible, via l'invention décrite et en seulement deux opérations, cFaboutir à une extraction de près de 70 % des lipides totaux sans solvant sur une biomasse humide ainsi qu'à un fractionnement des TAG et des lipides polaires riches en AGPI. Le superculot et le culot peuvent ainsi être directement valorisables, le surnageant peut être soumis à une opération de séparation des protéines et des TAG 20 (membranes) conduisant à deux fractions purifiées. REVENDICATIONS1. Procédé de traitement dune biomasse micro-algale caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - disposer dune biomasse micro-algale comprenant au moins 15 %, en poids de lipides par rapport à la masse totale de ladite biomasse et présentant une concentration en matière sèche comprise entre lg/1 et 200 g/1, - broyer ladite biomasse au moyen d'un broyeur à billes mis en oeuvre dans les conditions suivantes : - le diamètre moyen des billes (dGM) varie de 0,2 à 2,5.10-3m, de préférence de 0,4 à 1,0 10-3m et de manière préférée est denviron 0,6 10-3 m, - la vitesse d'agitation en bout de pale(u) varie de 4 à 50 m.s-1, de préférence de 5 à 20 m. s_1 et de manière préférée est denviron 8 m. sec-1 ; - récupérer la composition obtenue. 2. Procédé selon la revendication 1, le traitement dans un broyeur à billes étant réalisé pendant une durée variant de 1 à 30 minutes, de préférence de 2 à 20 minutes, de manière encore préférée de 4 à 10 minutes et avantageusement denviron 6 minutes. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, le taux de remplissage en billes du broyeur variant de 50 % à 80 %, de préférence de 70 % à 80 % volume/volume et 20 avantageusement denviron 75 % volume/volume. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel l'étape de traitement dans un broyeur à billes est suivie des étapes suivantes, dans cet ordre : -une étape de centrifugation à une accélération centrifuge comprise entre 3500g et 20 000g, pendant une durée comprise entre 2 et 40 minutes, à une température comprise 25 entre 5 et 40 °C de la composition obtenue, ladite étape de centrifugation conduisant à l'obtention dau moins 3 phases ; -une étape de récupération des phases permettant disoler une première phase dite « superculot », une deuxième phase dite « surnageant » plus dense que la première phase et dune troisième phase dite « culot » plus dense que la deuxième phase. 30 5. Procédé selon la revendication précédente dans lequel au moins une étape de séparation des lipides est effectuée sur la deuxième phase. 3042505 11 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la biomasse microalgale comprend au moins une microalgue choisie parmi Nannochloropsis sp., Nannochloropsis oceanica, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis suecica, Porphyridium cruentum, Parachlorella kessleri, Dunaliella satina, Chlorella vulgaris, Neochloris 5 oleoabundans, Haematococcus pluvialis et de préférence parmi les souches suivantes Nannochloropis oceanica, Parachlorella kessleri, Tetraselmis suecica.. 7. Composition susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3.