Brevet FR3038984A1 — publié le 20170120

ANALYSE PROTÉOMIQUE DE COMPARTIMENTS SUBCELLULAIRES DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un nouveau procédé d'analyse protéomique de compartiments subcellulaires combinant une microdissection laser suivie d'une analyse par spectrométrie de masse. La présente invention trouve notamment une application dans le domaine de la recherche, mais également dans le domaine du diagnostic médical. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique L'analyse par spectrométrie de masse permet d'identifier et de quantifier les protéines d'un échantillon biologique. Cette analyse peut être réalisée à partir de tissus entiers ou d'extraits cellulaires et après séparation biochimique de compartiments cellulaires dans le cadre d'une analyse protéomique subcellulaire. Cependant, la spécificité et la reproductibilité des méthodes de fractionnement subcellulaire sont largement discutées du fait des biais induits par la lyse cellulaire qui entraîne une déstabilisation des compartiments cellulaires et des complexes moléculaires qui les composent [1, 2]. Aujourd'hui, l'imagerie MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/lonization Imaging Mass Spectrometry ou MALDI-IMS) apporte une nouvelle dimension aux analyses histologiques car elle combine sensibilité et sélectivité et permet de visualiser directement l'arrangement des biomolécules dans un tissu. Toutefois cette nouvelle technologie présente pour le moment deux limites importantes (i) une résolution latérale dans le meilleur des cas de 20 pm incompatible avec l'analyse des 3038984 2 compartiments subcellulaires [3] et (ii) contrairement à l'approche bottomup basée sur la digestion des protéines, l'imagerie MALDI nécessite une approche top-down qui repose sur l'analyse de protéines entières et qui en est encore aujourd'hui à ses balbutiements [4-6]. Gregorich et al. ([4]) 5 soulignent bien les obstacles à la mise en oeuvre de cette technologie en termes de solubilité des protéines, séparation et détection des protéines de grande taille, associés à une baisse de rendement et une absence d'automatisation. Dans le cadre de leurs travaux utilisant le couplage imagerie MALDI et l'identification Top Down en spectrométrie de masse, 10 Ye et al. ([5]) pointent les limites de cette technique d'imagerie, qui nécessite de travailler sur coupes congelées et ne permet pas le travail sur coupes fixées, et dont la résolution limitée ne permet pas une analyse subcellulaire. Enfin, Ait-Belkacem et al. ([6]), qui utilisent le couplage imagerie MALDI et l'identification Top Down en spectrométrie de masse 15 pour caractériser les structures moléculaires des glioblastomes, n'obtiennent dans ce cas qu'une résolution spatiale de 30pm, ce qui ne permet pas d'analyse à l'échelle subcellulaire. Le document EP1601450 ([9]), qui décrit une méthode de détection d'analytes dans un lysat, ne permet pas non plus une analyse à une 20 échelle subcellulaire. Il existe donc un réel besoin d'une approche alternative palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant d'obtenir une meilleure résolution, mais également 25 d'améliorer la spécificité et la reproductibilité des analyses. Description de l'invention Pour ce faire les Inventeurs ont mis au point une nouvelle approche qui représente une alternative à plusieurs méthodologies comme la 30 compartimentation cellulaire par centrifugation et dans certains cas l'immunoprécipitation. De plus, compte-tenu des avancées actuelles et des 3038984 3 limitations spatiales et d'identification, cette nouvelle approche propose une alternative à l'imagerie MALDI. Cette nouvelle approche applicable aussi bien sur des cultures cellulaires que sur des coupes tissulaires, et ce sans avoir forcément 5 besoin de recourir à un marquage isotopique métabolique des protéines de l'échantillon, combine la microdissection laser qui permet une découpe sélective des éléments subcellulaires (à une résolution de 0,6 pm) et l'analyse par spectrométrie de masse. Cette nouvelle approche permet ainsi de se placer dans une résolution spatiale compatible avec la 10 séparation de compartiments subcellulaires tels que le noyau, la membrane cytoplasmique, la membrane nucléaire, les vésicules, la mitochondrie, le lysosome, le centriole, le protéasome, les adhésions focales, le lamellipode, les filopodes, la rosette d'invadosomes, le réticulum endoplasmique, l'appareil de golgi. Il est également possible de découper 15 des compartiments extracellulaires présents entre deux cellules, comme les jonctions cellules-cellules (e.g. les synapses). En outre cette nouvelle combinaison originale permet d'améliorer la spécificité et la reproductibilité des analyses par rapport aux méthodes actuellement pratiquées de fractionnement subcellulaire suivi d'une analyse par spectrométrie de 2 0 masse. Cette nouvelle approche intéresse en premier lieu les laboratoires de recherche, qui pour beaucoup recherchent de nouvelles méthodes pour identifier de nouveaux partenaires au sein des organelles ou structures subcellulaires. En outre, cette nouvelle approche permet de comparer la 25 composition protéique d'un compartiment subcellulaire entre différents échantillons cellulaires, par exemple celle d'un compartiment subcellulaire issu d'une cellule normale et celle d'un compartiment subcellulaire issu d'une cellule tumorale. Cette nouvelle approche permet également d'identifier des protéines surexprimées dans le cadre de différentes 30 pathologies. Enfin le fait de pouvoir cibler un compartiment subcellulaire permet d'identifier et d'analyser des protéines qui avec une approche non 3038984 4 ciblée seraient minoritaires et non détectables dans une gamme protéique beaucoup plus complexe. La présente invention a donc pour objet un procédé d'analyse protéomique subcellulaire d'un échantillon biologique test comprenant une 5 étape de microdissection laser d'un compartiment subcellulaire dudit échantillon suivie d'une étape d'analyse par spectrométrie de masse des éléments constitutifs dudit compartiment subcellulaire. On entend par « échantillon biologique test », par exemple un échantillon de cellules ou un échantillon issu d'une coupe de tissu d'un 10 sujet dont on veut connaitre la composition qualitative et/ou quantitative en protéine(s) d'au moins un compartiment subcellulaire. On entend par « éléments constitutifs du compartiment subcellulaire », toute protéine présente au sein d'un compartiment microdisséqué. A titre d'exemple, l'actine filamenteuse est un élément 15 constitutif des rosettes d'invadosomes, l'ADN est un élément constitutif du noyau, etc.... Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé d'analyse protéomique peut comprendre en outre, préalablement à l'étape de microdissection, une étape de marquage isotopique 2 0 métabolique des protéines de l'échantillon cellulaire test, une étape de fixation des cellules (e.g. afin de limiter les contaminants en Z sur des expériences sur cellules entières, il est possible au préalable de fixer, et inclure les cellules en paraffine et réaliser des coupes de 3 pm) dudit échantillon et/ou une étape de marquage du compartiment subcellulaire 2 5 test. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, ledit procédé d'analyse protéomique peut comprendre en outre, postérieurement à l'étape de microdissection laser et préalablement à l'étape d'analyse par spectrométrie de masse, une étape d'extraction des 30 protéines d'intérêt du compartiment subcellulaire, de réversion de la fixation et/ou de protéolyse. 3038984 5 Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé d'analyse protéomique subcellulaire comprend ou consiste en les étapes suivantes : a) Fixation dudit échantillon ; 5 b) Marquage du compartiment subcellulaire test ; c) Microdissection laser dudit compartiment subcellulaire ; d) Extraction des protéines dudit compartiment subcellulaire, réversion de la fixation et protéolyse ; e) Analyse des peptides issus de l'étape d) par spectrométrie de 10 masse ; f) Identification des peptides analysés. Selon un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé d'analyse protéomique subcellulaire comprend ou consiste en les étapes suivantes : 15 a) Marquage isotopique métabolique des protéines d'un échantillon biologique test ; b) Fixation dudit échantillon ; c) Marquage du compartiment subcellulaire test ; d) Microdissection laser dudit compartiment subcellulaire ; 20 e) Extraction des protéines dudit compartiment subcellulaire, réversion de la fixation et protéolyse ; f) Analyse des peptides issus de l'étape e) par spectrométrie de masse ; g) Identification des peptides analysés. 2 5 L'étape a) de marquage isotopique peut être réalisée par toute technique de marquage connue de l'homme du métier. Il est à noter que le marquage isotopique métabolique, du style SILAC, n'est pas réalisé lorsque l'échantillon biologique test est une coupe tissulaire. Dans ce cas, le procédé de l'invention, et notamment l'étape de microdissection laser, 3 0 peut être automatisée. 3038984 6 La mise en oeuvre d'au moins une partie des étapes du procédé peut être avantageusement automatisée. Il peut s'agir notamment de l'étape de microdissection laser. En particulier, dans le cas où le procédé ne comprend pas l'étape de marquage isotopique, cette automatisation 5 concerne l'étape de microdissection laser. Cette automatisation permet avantageusement d'obtenir une quantité suffisante de matériel pour l'analyse en spectrométrie de masse et l'identification des peptides. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l'étape de fixation est réalisée avec un agent réticulant, par exemple le 10 paraformaldéhyde, la formaline, le glutaraldéhyde. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le compartiment subcellulaire est choisi dans le groupe constitué par le noyau, la membrane cytoplasmique, la membrane nucléaire, les vésicules, la mitochondrie, le lysosome, le centriole, le protéasome, les adhésions 15 focales, le lamellipode, les filopodes, la rosette d'invadosomes, le réticulum endoplasmique, l'appareil de golgi, les jonctions cellule-cellule (e.g. synapses). L'étape c) de marquage donc de repérage du compartiment subcellulaire d'intérêt peut être réalisée par différents peptides ou drogues. 20 Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l'étape de marquage du compartiment subcellulaire est réalisée avec un marqueur fluorescent. Ce marquage peut être réalisé après l'étape de fixation, ou avant par expression constitutive dans le compartiment subcellulaire de l'échantillon test d'un marqueur, typiquement fluorescent. Par exemple, il 25 s'agit du peptide Lifeact ou de la phalloïdine pour l'actine filamenteuse des rosettes d'invadosomes, mais aussi du DAPI comme intercalant de l'ADN qui permet de visualiser les noyaux, de l'ER tracker pour le réticulum endoplasmique, etc.... De manière alternative ou complémentaire, ce marqueur peut être exprimé par les cellules dans lesquelles la 30 microdissection laser d'un compartiment subcellulaire est effectuée. 3038984 7 L'étape e) d'extraction des protéines dudit compartiment subcellulaire test, de réversion de la fixation et/ou de protéolyse peuvent être réalisées par toutes techniques connues de l'homme du métier. La présente invention a également pour objet, un procédé 5 d'identification in vitro d'élément constitutif d'un échantillon biologique d'un sujet comprenant une étape de microdissection laser d'un compartiment subcellulaire dudit échantillon suivie d'une étape d'analyse par spectrométrie de masse des éléments constitutifs dudit compartiment subcellulaire, et de comparaison qualitative et/ou quantitative des éléments 10 constitutifs analysés par rapport à un échantillon de référence. L'élément constitutif peut par exemple être une protéine, notamment une protéine présente dans le complexe d'invasion, dit invadosome. Les invadosomes qui comprennent, les podosomes des cellules normales et les invadopodes des cellules tumorales, forment des complexes protéiques 15 riches en actine spécialisés dans la dégradation protéolytique de la matrice extracellulaire. Cette activité protéolytique confère aux cellules tumorales la capacité de traverser des barrières anatomiques et de migrer à travers les tissus. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, ledit 20 procédé d'identification in vitro comprend en outre préalablement à l'étape de microdissection, au moins une étape choisie parmi le groupe constitué de : marquage isotopique métabolique des protéines de l'échantillon biologique test, fixation dudit échantillon, marquage du compartiment subcellulaire test. 25 Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, ledit procédé d'identification in vitro comprend en outre postérieurement à l'étape de microdissection laser et préalablement à l'étape d'analyse par spectrométrie de masse, au moins une étape choisie parmi le groupe constitué de : extraction des protéines d'intérêt du compartiment 30 subcellulaire, réversion de la fixation, protéolyse. 3038984 8 Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé d'identification in vitro comprend ou consiste en les étapes suivantes : a) Fixation dudit échantillon ; 5 b) Marquage dudit compartiment subcellulaire test ; c) Microdissection laser dudit compartiment subcellulaire ; d) Extraction des protéines dudit compartiment subcellulaire, réversion de la fixation et protéolyse ; e) Analyse des peptides issus de l'étape d) par spectrométrie de 10 masse ; f) Identification des peptides analysés ; g) Comparaison qualitative et/ou quantitative des peptides issus de l'étape f) par rapport aux peptides présents dans un échantillon de référence ou à une valeur de référence. 15 Selon un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé d'identification in vitro comprend ou consiste en les étapes suivantes : a) Marquage isotopique métabolique des protéines d'un échantillon biologique d'un sujet atteint d'une tumeur ; 20 b) Fixation dudit échantillon ; c) Marquage dudit compartiment subcellulaire test ; d) Microdissection laser dudit compartiment subcellulaire ; e) Extraction des protéines dudit compartiment subcellulaire, réversion de la fixation et protéolyse ; 25 f) Analyse des peptides issus de l'étape e) par spectrométrie de masse ; g) Identification des peptides analysés ; h) Comparaison qualitative et/ou quantitative des peptides issus de l'étape g) par rapport aux peptides présents dans un échantillon 30 de référence ou à une valeur de référence. 3038984 9 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le compartiment subcellulaire consiste en les rosettes d'invadosomes. L'étape a) de marquage isotopique peut être réalisée par toute technique de marquage connue de l'homme du métier. Il est à noter que le 5 marquage isotopique métabolique, du style SILAC, n'est plus réalisé lorsque l'échantillon biologique test est une coupe tissulaire. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l'étape de fixation est réalisée avec un agent réticulant, par exemple le paraformaldéhyde, la formaline, le glutaraldéhyde. 10 Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le compartiment subcellulaire est choisi dans le groupe constitué par le noyau, la membrane cytoplasmique, la membrane nucléaire, les vésicules, la mitochondrie, le lysosome, le centriole, le protéasome, les adhésions focales, le lamellipode, les filopodes, la rosette d'invadosomes, le réticulum 15 endoplasmique, l'appareil de golgi, les jonctions cellule-cellule (e.g. synapses). L'étape c) de marquage donc de repérage du compartiment subcellulaire d'intérêt peut être réalisée par différents moyens de marquage du compartiment subcellulaire tels que des peptides ou 20 drogues. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l'étape de marquage du compartiment subcellulaire est réalisée avec un marqueur fluorescent. Ce marquage peut être réalisé après l'étape de fixation, ou avant par expression constitutive dans le compartiment subcellulaire de l'échantillon test d'un marqueur, typiquement fluorescent. 25 Par exemple, il s'agit du peptide Lifeact ou de la phalloïdine pour l'actine filamenteuse des rosettes d'invadosomes, mais aussi du DAPI comme intercalant de l'ADN qui permet de visualiser les noyaux, de l'ER tracker pour le réticulum endoplasmique, etc.... L'étape e) d'extraction des protéines dudit compartiment 30 subcellulaire test, de réversion de la fixation et/ou de protéolyse peuvent être réalisées par toutes techniques connues de l'homme du métier. 3038984 10 On entend par échantillon de référence de l'étape h), tout échantillon dont la concentration en peptides après comparaison avec la concentration en peptides dudit échantillon cellulaire test offre une indication de la capacité invasive d'une tumeur chez ledit sujet dont 5 provient ledit échantillon cellulaire test. À titre d'exemples d'échantillons de référence de l'étape h), on peut citer des échantillons cellulaires provenant d'un individu sain ou provenant d'un individu atteint d'une tumeur, ou encore une solution protéique à une concentration déterminée. 10 On entend par individu sain, un individu qui ne présente pas de pathologies, en particulier un individu qui ne présente pas de tumeur. Un autre objet de l'invention se rapporte à un kit pour l'analyse protéomique subcellulaire d'un échantillon biologique test, notamment pour la mise en oeuvre du procédé d'analyse protéomique subcellulaire de 15 l'invention, comprenant : - au moins un moyen de marquage du compartiment subcellulaire test tel que défini ci-avant, - au moins un moyen de réversion de la fixation et un moyen de réalisation de la protéolyse, et, 20 - au moins une solution protéique de référence à une concentration déterminée. Le kit selon l'invention comprend en outre de façon préférée au moins un des moyens suivants, de préférence tous les moyens suivants : - un moyen de marquage isotopique des protéines de l'échantillon 25 test, - un moyen de fixation des cellules dudit échantillon, et - un moyen d'extraction des protéines dudit compartiment subcellulaire. Le kit de l'invention peut comprendre en outre tous les moyens 30 nécessaires à la mise en oeuvre du procédé d'analyse protéomique subcellulaire de l'invention. 3038984 11 D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. 5 Brève description des figures - La figure 1 représente (A-C) une image de microscopie à fluorescence de cellules NIH-3T3-Src marquées par le Dapi et la phalloïdine afin de révéler respectivement l'ADN du noyau et l'actine 10 filamenteuse (les rosettes d'invadosomes sont indiquées par les flèches). (D-E) Ces images de microscopie montrent le même type cellulaire exprimant de manière stable le peptide Lifeact-RFP, les éléments microdisséqués sont entourés par des pointillés. (F) Ce schéma montre une rosette entourée manuellement par l'expérimentateur et découpée par 15 un premier laser. (G-H) Ce schéma représente le processus de récupération des éléments microdisséqués par un second laser qui catapulte la rosette découpée au niveau du bouchon collecteur. (I) Cette image de microscopie montre la fluorescence des éléments microdisséqués au niveau du bouchon collecteur, le schéma associé 20 représente ce même bouchon collecteur avec les éléments microdisséqués et récupérés. EXEMPLES OU MODES DE REALISATION 25 Exemple 1 : Analyse protéomique des rosettes d'invadosomes Bien que le protocole qui suit soit adaptable à d'autres compartiments subcellulaires, le compartiment subcellulaire associé à la capacité des cellules à dégrader les éléments de la matrice extracellulaire a été choisi comme modèle pour la présente étude, à savoir la rosette d'invadosomes. 30 Ce type de structure se forme dans des cellules exprimant de manière constitutive la forme active de l'oncogène c-Src et participe à la capacité 3038984 12 d'invasion cellulaire. Il est crucial de connaître la composition protéique exacte et détaillée de ces structures afin de mettre en évidence des cibles thérapeutiques pour tenter d'inhiber l'invasion des cellules tumorales. L'actine filamenteuse est le composant majeur et structural de ces 5 rosettes, et par conséquent l'élément qui a été choisi pour repérer ces rosettes au moment de la microdissection laser. Les expérimentations ont été menées sur une lignée cellulaire générée à partir de cellules fibroblastiques NIH-3T3 qui expriment de manière constitutive l'oncogène c-Src et qui forment des rosettes 10 d'invadosomes [7]. De plus, ces cellules expriment de manière constitutive le peptide de levure Lifeact [8] couplé à un fluorophore, à savoir le m-cherry (figure 1D). Ce peptide a la capacité de se lier spécifiquement à l'actine mais uniquement sous sa forme filamenteuse. L'analyse par spectrométrie de masse d'une très faible quantité de 15 matériel fait appel aux limites de sensibilité des spectromètres. Dans ce contexte une majorité des protéines identifiées sont en fait issues de contaminations provenant de la manipulation et de l'air ambiant. Pour discriminer les protéines des rosettes microdisséquées des éléments contaminants extérieurs (air ambiant, solutions, etc..), un marquage 20 isotopique métabolique des protéines d'intérêt (C13Arginine (Arg6) et C13Lysine (Lys6)) a d'abord été réalisé selon la méthode SILAC (Stable Isotopic Labeling by Amino acids in Cell culture). Cette méthode consiste à utiliser un milieu de culture dépourvu en arginine et lysine dans lequel on ajoute de l'arginine et de la lysine marquées avec du carbone C13 et de la 25 proline non marquée pour éviter la métabolisation de l'arginine marquée en proline marquée, et incorporer ce marquage pendant au moins 6 cycles de doublement cellulaire. Les cellules exprimant le peptide lifeact couplé au fluorophore m-cherry (figure 1D) et marquées avec les isotopes lysine et arginine ont été 30 cultivées sur un anneau membranaire en silicone (qu'on recouvre avec de 3038984 13 gélatine afin de favoriser l'adhésion des cellules) placé dans une boite lumox dish 50 (Zeiss). Après adhésion et rinçage avec du PBS, les cellules ont été fixées avec un agent réticulant, le paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans une 5 solution de PBS pendant 20 minutes. Après deux rinçages, les cellules ont été maintenues dans une solution de PBS à 4°C. Ensuite ces cellules ont été marquées par le DAPI qui est un intercalant de l'ADN fluorescent qui permet de visualiser les noyaux O. Les cellules ont ensuite été placées sur un microdissecteur laser 10 équipé d'un objectif X63 sec (Zeiss), et les cellules sont maintenues dans une fine pellicule de PBS. Les rosettes à découper ont été entourées par l'intermédiaire d'un stylet, sur une tablette graphique (cercles pointillé) avant microdissection (figure 1E). Pour la découpe laser, un microscope Zeiss (PALM 15 MicroBeam) a été utilisé. Les rosettes ont ensuite été récoltées sur le bouchon d'un support (tube collecteur) en silicone (figure 1H). Le support a ensuite été lavé avec une solution 50mM Tris-HCI pH 6,8, SDS 7,5%, glycérol 20%, bêta-mercaptoéthanol 5%, bleu de 20 bromophénol 0,1% pendant 2 heures à 95°C, ce qui a permis d'extraire les protéines et de réverser leur fixation. Cet extrait a ensuite été chargé dans un puits de gel SDS-PAGE 10% et mis sous une tension de 100 Volts jusqu'à migration du bleu de bromophénol jusqu'à la limite entre le gel de tassement et le gel de 25 séparation en se servant d'un marqueur de masse moléculaire comme témoin visuel dans un autre puits. Un carré de gel a ensuite été découpé entre la limite supérieure du puits et le front de migration a été traité pour réduction/alkylation des protéines puis protéolyse par la trypsine et extraction des peptides issus de 30 cette digestion. 3038984 14 Les peptides ont ensuite été analysés par LC-MS/MS avec un gradient chromatographique C18 de 2 heures et une analyse sur un spectromètre de masse de type Q-Exactive (Thermo). L'interrogation des banques de données a été réalisée avec deux 5 algorithmes différents (Mascot et Sequest) en utilisant le logiciel Proteome Discoverer en incluant le marquage1Cm 3. _ C13rg et - -Lys comme modifications variables. Seuls les peptides de hauts scores, marqués et/ou identifiés avec l'un et/ou l'autre des deux algorithmes ont été conservés. Le tableau 1 représente le bilan du nombre de protéines 10 identifiées lors des différentes expériences. L'augmentation du nombre de pièces microdisséquées a d'abord permis d'augmenter le nombre de protéines identifiées pour atteindre 101 protéines identifiées après la découpe de 10 000 rosettes. Tableau Nombre de Nombre de Pourcentage de 1 Expérience pièces micro- protéines protéines strictement disséquées identifiées identiques par rapport à l'expérience précédente 1 350 9 2 3000 55 44% 3 10000 101 60% + 20% (protéines très proches) = 80% 15 Il est également observé qu'en augmentant la quantité de matériel, plus de peptides sont identifiés, correspondant aux protéines identifiées lors de l'expérience précédente réalisée avec moins de matériel. Ainsi, entre l'expérience 2 et l'expérience 3, est confirmée l'identification de 60% 20 des protéines et sont identifiées en plus 20% de protéines très similaires (isoformes, sous-unités différentes d'une même protéine) listées dans le tableau 2 suivant. Ces éléments démontrent la robustesse et la reproductibilité de cette technique. 3038984 15 Tableau 2 protéines de la lère expérience retrouvées dans les expériences 2 et 3 Vimentin OS=Mus musculus GN=Vim Actin, cytoplasmic 1 (Fragment) OS=Mus musculus GN=Actb Histone H4 OS=Mus musculus GN=Histl h4a Tubulin alpha-1C chain OS=Mus musculus GN=Tubalc protéines communes entre les expériences 2 et 3 Peroxiredoxin-1 (Fragment) OS=Mus musculus GN=Prdx1 40S ribosomal protein S3 OS=Mus musculus GN=Rps3 ATP synthase subunit alpha OS=Mus musculus GN=Atp5a1 Histone H3 (Fragment) OS=Mus musculus GN=H3f3a Protein Ahnak OS=Mus musculus GN=Ahnak Histone H2A OS=Mus musculus GN=Histl h2a1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H OS=Mus musculus GN=Hnrnph1 Fructose-bisphosphate aldolase A OS=Mus musculus GN=Aldoa Tubulin alpha-1B chain OS=Mus musculus GN=Tubalb Elongation factor 1-alpha 1 OS=Mus musculus GN=Eeflal Histone H2B type 1-F/J/L OS=Mus musculus GN=Histl h2bf Heat shock protein HSP 90-beta OS=Mus musculus GN=Hsp90abl 40S ribosomal protein SA OS=Mus musculus GN=Rpsa Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase OS=Mus musculus GN=Gapdh Vimentin OS=Mus musculus GN=Vim Stress-70 protein, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Hspa9 Isoform C of Prelamin-A/C OS=Mus musculus GN=Lmna Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Al OS=Mus musculus GN=Hnrnpal Pyruvate kinase PKM OS=Mus musculus GN=Pkm ATP synthase subunit beta, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Atp5b Elongation factor 2 OS=Mus musculus GN=Eef2 Poly(rC)-binding protein 1 OS=Mus musculus GN=Pcbp1 Actin, cytoplasmic 1 OS=Mus musculus GN=Actb Histone H4 OS=Mus musculus GN=Histl h4a lsoform 2 of 60 kDa heat shock protein, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Hspd1 Tubulin alpha-1A chain OS=Mus musculus GN=Tubal a Heat shock cognate 71 kDa protein OS=Mus musculus GN=Hspa8 Polyubiquitin-B (Fragment) OS=Mus musculus GN=Ubb Histone H2B type 2-E OS=Mus musculus GN=Hist2h2be Cytoskeleton-associated protein 4 OS=Mus musculus GN=Ckap4 Myosin-9 OS=Mus musculus GN=Myh9 Nucleophosmin OS=Mus musculus GN=Npml Phosphoglycerate kinase OS=Mus musculus GN=Pgkl 3038984 16 protéines de l'expérience 2 qui ressemblent beaucoup aux protéines détectées lors de l'expérience 3 60S ribosomal protein L31 OS=Mus musculus GN=RpI31 Elongation factor 1-delta (Fragment) OS=Mus musculus GN=Eef1d T-complex protein 1 subunit gamma OS=Mus musculus GN=Cct3 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U, isoform CRA_b OS=Mus musculus GN=Gm28062 Annexin A2 OS=Mus musculus GN=Anxa2 60S ribosomal protein L13 OS=Mus musculus GN=Rp113 Alpha-actinin-4 OS=Mus musculus GN=Actn4 40S ribosomal protein S8 OS=Mus musculus GN=Rps8 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX5 OS=Mus musculus GN=Ddx5 Elongation factor 1-gamma OS=Mus musculus GN=Eef1g 60S acidic ribosomal protein PO (Fragment) OS=Mus musculus GN=RplpO 3038984 17 Listes des références 1. 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Abram, C.L., et al., The adaptor protein fish associates with members of the ADAMs family and localizes to podosomes of Srctransformed cells. J Biol Chem, 2003.278(19): p. 16844-51. 8. Riedl, J., et al., Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods, 2008. 5(7): p. 605-7. 25 9. EP1601450. REVENDICATIONS1. Procédé d'analyse protéomique subcellulaire d'un échantillon biologique test comprenant une étape de microdissection laser d'un s compartiment subcellulaire dudit échantillon suivie d'une étape d'analyse par spectrométrie de masse des protéines dudit compartiment subcellulaire. 2. Procédé selon la revendication 1, ledit procédé comprenant en outre 10 préalablement à l'étape de microdissection, au moins une étape choisie parmi le groupe constitué de : marquage isotopique métabolique des protéines de l'échantillon biologique test, fixation dudit échantillon, marquage du compartiment subcellulaire test. 15 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, ledit procédé comprenant en outre postérieurement à l'étape de microdissection laser et préalablement à l'étape d'analyse par spectrométrie de masse, au moins une étape choisie parmi le groupe constitué de : extraction des protéines d'intérêt du compartiment subcellulaire, réversion de la fixation, protéolyse. 20 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant les étapes suivantes : a) Marquage isotopique métabolique des protéines d'un échantillon biologique test ; 25 b) Fixation dudit échantillon ; c) Marquage du compartiment subcellulaire test ; d) Microdissection laser dudit compartiment subcellulaire ; e) Extraction des protéines dudit compartiment subcellulaire,. réversion de la fixation et protéolyse ; 30 f) Analyse des peptides issus de l'étape e) par spectrométrie de masse ; 3038984 19 g) Identification des peptides analysés. 5. Procédé selon la revendication 4, où l'étape de fixation est réalisée avec un agent réticulant. 6. Procédé selon la revendication 5, où l'agent réticulant est le paraformaldéhyde. 7. Procédé selon la revendication 4, où l'étape de marquage du 10 compartiment subcellulaire est réalisée avec un marqueur fluorescent. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le compartiment subcellulaire est choisi dans le groupe constitué par le noyau, la membrane cytoplasmique, la membrane nucléaire, les 15 vésicules, la mitochondrie, le lysosome, le centriole, le protéasome, les adhésions focales, le lamellipode, les filopodes, la rosette d'invadosomes, le réticulum endoplasmique, l'appareil de golgi, les jonctions cellule-cellule. 9. Procédé d'identification in vitro d'une protéine d'un échantillon 20 biologique d'un sujet comprenant une étape de microdissection laser d'un compartiment subcellulaire dudit échantillon suivie d'une étape d'analyse par spectrométrie de masse d'au moins une protéine dudit compartiment subcellulaire, et de comparaison qualitative et/ou quantitative de ladite protéine analysée par rapport à un échantillon de référence ou une valeur 25 de référence. 10. Procédé selon la revendication 9, ledit procédé comprenant en outre préalablement à l'étape de microdissection, au moins une étape choisie parmi le groupe constitué de : marquage isotopique métabolique des 30 protéines de l'échantillon biologique test, fixation dudit échantillon, marquage du compartiment subcellulaire test. 303 89 84 20 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, ledit procédé comprenant en outre postérieurement à l'étape de microdissection laser et préalablement à l'étape d'analyse par spectrométrie de masse, au moins une étape choisie parmi le groupe constitué de : extraction des protéines d'intérêt du compartiment subcellulaire, réversion de la fixation, protéolyse. 12. Procédé selon la revendication 11 comprenant les étapes suivantes : a) Marquage isotopique métabolique des protéines d'un échantillon 10 biologique d'un sujet ; b) Fixation dudit échantillon ; c) Marquage dudit compartiment subcellulaire test ; d) Microdissection laser dudit compartiment subcellulaire ; e) Extraction des protéines dudit compartiment subcellulaire, réversion 15 de la fixation et protéolyse ; f) Analyse des peptides issus de l'étape e) par spectrométrie de masse ; g) Identification des peptides analysés ; h) Comparaison qualitative et/ou quantitative des peptides issus de 20 l'étape g) par rapport aux peptides présents dans un échantillon de référence ou à une valeur de référence. 13. Procédé selon la revendication 12, où ledit compartiment subcellulaire est la rosette d'invadosome. 25 14. Kit pour l'analyse protéomique subcellulaire d'un échantillon biologique test selon un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3-8 et 10-13, comprenant : - au moins un moyen de marquage du compartiment subcellulaire 30 test, 3038984 21. - au moins un moyen de réversion de la fixation et un moyen de réalisation de la protéolyse, et, - au moins une solution protéique de référence à une concentration déterminée. 15. Kit selon la revendication 14, comprenant en outre au moins un moyen choisi parmi : - un moyen de marquage isotopique des protéines de l'échantillon test, io - un moyen de fixation des cellules dudit échantillon, et - un moyen d'extraction des protéines dudit compartiment subcellulaire.