Brevet FR3038615A1 — publié le 20170113

FIXATION DE MOLECULES ORGANIQUES SUR UNE MATRICE DE SILICE POREUSE L'invention concerne un procédé de fixation de molécules organiques biologiquement actives au sein d'une matrice de silice en utilisant l'association de phospholipides et d'une amine, en particulier d'un acide aminé ou de la dicyanodiamide. La plupart des molécules biologiquement actives sont très sensibles aux conditions environnementales, telles que le pH, la température, la force ionique ou la présence d'inhibiteurs. Il est donc nécessaire de les immobiliser dans des supports solides organo-minéraux afin de préserver leur structure et leur activité, lorsqu'elles sont destinées à être exposées à un milieu naturel soumis à des fortes variations notamment d'ordre environnemental. Plusieurs moyens ont déjà été mis en oeuvre pour immobiliser des enzymes sur des substrats. La fixation d'une enzyme sur un support minéral peut se faire par liaison covalente à la surface du solide (encore appelée immobilisation par couplage). Elle peut également être effectuée par adsorption de la molécule à l'intérieur des pores du support (par exemple par imprégnation du support avec une solution d'enzyme sous agitation), par encapsulation dans des membranes semi-perméables ou encore par piégeage de la protéine dans une matrice poreuse fabriquée par un procédé sol-gel. L'avantage de la fixation des enzymes par un procédé sol-gel dans des matrices minérales ou organo-minérales réside dans la faible perte d'enzymes par lixiviation ; cependant les enzymes enfermées dans une telle matrice sont généralement peu accessibles et l'on peut rencontrer des problèmes de diffusion des molécules du substrat vers l'extérieur liés à la structure du matériau, à l'ouverture de son réseau poreux et au diamètre de ses pores. Les matrices de silice poreuses ou mésoporeuses sont généralement préparées par condensation de silice autour de composés organiques tensio- 3038615 2 actifs, qui sont ensuite éliminés totalement ou partiellement pour générer le volume poreux. Certains matériaux dits MTS (Mésoporeux aux Tensioactifs Structurants, ou Micelle-Templated Silica) sont obtenus par auto-assemblage de micelles de 5 molécules de tensioactif en solution dans l'eau, autour desquelles se condense la silice. Les phases organiques tensio-actives mises en oeuvre peuvent s'organiser, selon les cas, en structure lamellaire, hexagonale ou cubique. Au cours de la synthèse de la silice, les ions silicates polymérisent et 10 forment un réseau tridimensionnel autour des agrégats de molécules organiques. La porosité disponible après élimination du structurant peut être plus ou moins élevée et sa forme résulte directement de la structure des phases organiques qui ont été préparées. Parmi les structures de silice mésoporeuse les plus étudiées, on connaît 15 les structures dites « MCM-41 » (hexagonale), « MCM-48 » (cubique) (Mobil Composition of Matter No. 41 et Mobil Composition of Matter No. 48 du nom de la société qui les a fabriquées pour la première fois en 1992), et la structure cubique 3-D de symétrie Ia3d dite « KIT-6 ». On sait que la taille et la forme des pores obtenus dépendent 20 étroitement de la nature du tensio-actif et de sa quantité dans le milieu réactionnel. Cependant, en l'état actuel des connaissances, il est très difficile de prévoir le rôle que peut jouer l'agent tensio-actif comme agent structurant et quelle structure il peut générer, car des mécanismes très complexes d'interactions interviennent entre les micelles de tensioactifs et les espèces 25 inorganiques qui pilotent l'auto-assemblage coopératif. Plusieurs systèmes d'encapsulation ont été décrits dans l'art antérieur. Par exemple, dans la demande FR 2 879 186, un procédé de préparation utilise l'association de phospholipides et d'une amine grasse comportant une chaîne aliphatique en C8-C21. Les amines grasses sont généralement utilisées 30 pour catalyser la réaction d'hydrolyse et de polycondensation des précurseurs de silice. La réaction d'hydrolyse/condensation peut ainsi se faire dans des 3 03 86 15 3 conditions réactionnelles plus basiques. Il est enseigné dans ce document, que les amines grasses, lorsqu'elles sont utilisées seules pour préparer la phase organique structurée, permettent l'obtention de silices mésoporeuses hexagonales mais que l'activité des enzymes immobilisées est insuffisante. 5 Associées à des phospholipides, elles permettent d'obtenir une meilleure activité apparente de l'enzyme immobilisée Laveille et al. ont proposé la synthèse de matériaux encapsulant une enzyme (glucose oxydase) basée sur la condensation de silice amorphe à partir d'un précurseur alcoxyde, autour d'une phase ordonnée de phospholipides 10 (Laveille, et al, 2010). La source de phospholipides (PL) utilisée dans ce document est de la lécithine d'oeuf constituée d'au moins 50% de phosphatidylcholine (PC), et notamment de phosphatidylethanolamine (PE). La concentration en lécithine et la nature du milieu solvant sont des paramètres déterminants pour la structure du matériau final. Le solvant utilisé pour la 15 dilution de la lécithine et dans lequel sont réalisées les réactions sol-gel, est un mélange de tampon aqueux d'acétate de sodium (AcNa) et d'éthanol (EtOH) en proportions variables. Ces matériaux, nommés SMS pour "sponge mosoporous silica" (Galarneau et al. 2007) ou NPS pour "nanoporous silica capsules" (Laveille et al. 2010) ont 20 une structure de type éponge avec un réseau poreux 3-D isotrope. Il est à noter que la formation de la mésostructure de type éponge est attribuée à la présence de la dodécylamine, une amine à chaîne aliphatique réputée toxique. Il serait donc intéressant de pouvoir fabriquer des matériaux de structure 3-D sans utilisation de molécule toxique. 25 Il a été mis au point dans le cadre de la présente invention une nouvelle méthode de fixation d'enzymes au sein d'une matrice de silice selon un procédé sol-gel de polycondensation de tétraalcoxysilanes en milieu aqueux en utilisant l'association d'une amine de petite taille en présence de phospholipides. Les 30 enzymes immobilisées d'une matrice obtenue selon ce procédé présentent d'excellentes activités, une bonne résistance aux conditions réactionnelles, sont 3038615 4 faciles à récupérer par simple filtration ou par centrifugation et peuvent ainsi être réutilisées un grand nombre de fois. Les biocatalyseurs obtenus résistent en outre très bien à la désorption ou lixiviation des enzymes. De plus les matrices obtenues présentent une structure 3-D mieux définie que celle des SMS ou NPS, 5 probablement cubique, comme suggéré par les diffractogrammes des rayons X. Enfin, le procédé de formation de ces produits ne nécessite pas l'utilisation de dodécylamine ou autre molécule toxique. Pour des applications agricoles, le produit de l'invention présente en outre l'avantage d'être biodégradable et basé sur des molécules naturelles 10 respectueuses de l'environnement, non contaminantes pour l'écosystème et l'Homme. En effet, une fois l'enzyme apportée à la plante, la matrice de silice se dissout progressivement dans le sol au contact de l'eau. Au surplus, l'amine de petite taille utilisée dans le cadre de l'invention est une amine naturelle ou ayant reçu une autorisation pour une utilisation en agriculture, présentant donc 15 l'avantage par rapport aux amines de synthèse de ne présenter aucun caractère de toxicité pour l'homme ou son écosystème. Or dans l'art antérieur il n'a jamais été exemplifié d'utilisation des silices mésoporeuses pour encapsuler des enzymes utilisables en agricultures et directement dans les sols, en particulier comme engrais. 20 En effet, Hossain, K.-Z. et al. (2008) décrit l'adsorption d'uréase sur une silice mésoporeuse de type PE-MCM-41 et leur utilisation potentielle pour réduire l'hydrolyse de l'urée et donc contrôler la libération d'azote dans les sols. Toutefois ces uréases encapsulées n'ont jamais été testées pour vérifier leur activité, que ce soit en conditions contrôlées ou en en plein champ. En outre 25 l'encapsulation se fait après la formation de la silice mésoporeuse par imbibition dans la porosité libérée par le gabarit organique calciné. Gogos, A. et al. (2012) décrit l'utilisation de silice mésoporeuse, mais uniquement pour permettre la délivrance d'insecticide. Burns et al. (2013) évoquent l'intérêt de protéger l'activité enzymatique 30 des sols à des fins de bioremédiation ou de protection des enzymes avec la matière organique des sols. 3038615 5 La présente invention a par conséquent pour objet un procédé de fixation d'une molécule organique biologiquement active au sein d'une matrice de silice, ledit procédé comprenant les étapes suivantes consistant à : (1) préparer une solution aqueuse (A) contenant une amine choisie 5 parmi les acides aminés, les oligopeptides, les amines comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges, préparer une solution alcoolique (B) d'au moins un alcool en C1-C6 et d'au moins un phospholipide, et préparer une solution aqueuse (C) de la molécule biologiquement active, (2) incorporer la solution (B) dans la solution (A) sous agitation pour 10 obtenir la formation une mésophase lyotrope, (3) incorporer la solution (C) dans le mélange obtenu à l'issue de l'étape (2), (4) ajouter au mélange obtenu à l'issue de l'étape (3), au moins un tétra-alcoxysilane, puis laisser reposer pendant une durée suffisante pour obtenir 15 des particules solides poreuses à base de silice renfermant la molécule biologiquement active. L'invention a également pour objet les produits susceptibles d'être obtenus par un tel procédé. Ainsi la présente invention concerne une molécule 20 organique biologiquement active fixée au sein d'une matrice de silice susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. Cette molécule fixée au sein de la matrice de silice a donc avantageusement la forme d'une particule solide poreuse à base de silice, en particulier d'une particule de silice mésoporeuse, au sein de laquelle se trouve incorporée la molécule active comme décrit ci-après dans le 25 paragraphe sur l'étape (4). L'invention a également pour objet l'utilisation des produits selon l'invention dans différents domaines, notamment l'agriculture, en particulier pour la nutrition des végétaux. De tels produits, lorsqu'ils sont à base de phosphatases, pourront par 30 exemple être épandus sur les cultures afin de transformer in situ les sources de phosphore organique non assimilable par la plante, en ions orthophosphates. 3038615 6 D'autres enzymes capable de minéraliser la matière organique des sols peuvent être encapsulées et utilisées comme biocatalyseur supporté lorsqu'épandues sur les cultures et permettre ainsi un recyclage des éléments nutritifs azotés, potassiques voire des oligo-éléments. Par exemple, les amylases, 5 les uréases, les cellulases entrent dans la décomposition de matières organiques et permettent la libération de formes d'azotes assimilables par les végétaux. La matrice de silice obtenue selon le procédé de l'invention est une silice mésoporeuse. On entend par « silice mésoporeuse » au sens de la présente invention, une silice ayant des pores d'une taille moyenne comprise entre 2 et 50 10 nm (norme IUPAC). Etape (1) : préparation des solutions (A), (B) et (C) Solution aqueuse (A) Cette solution aqueuse comprend (avantageusement est constituée par) 15 de l'eau et une amine choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les amines comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges. L'amine est donc choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les amines comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges, plus avantageusement parmi les acides aminés et les amines comprenant un groupe 20 nitrile. Parmi les acides aminés, on préfère les acides aminés naturels et en particulier les acides aminés apolaires, tels que par exemple valine, isoleucine, leucine, méthionine, phénylalanine, glycine, alanine et proline, en particulier les isomères L de ces acides aminés car il s'agit d'acides aminés naturels. Dans un mode de mise en oeuvre de l'invention, on préfère l'alanine, en 25 particulier la DL-alanine qui est moins couteuse. Parmi les oligopeptides, on pourra citer les dipeptides comme par exemple la glycyl-glycine. Les amines comprenant un groupe nitrile sont des amines primaires, des amines secondaires ou des amines tertiaires, en particulier l'amine est un dérivé 30 de guanidine et/ou de cyanamide tel que la 2-cyanoguanidine (dicyanodiamide). 3038615 7 La dicyanodiamide est couramment utilisé en agriculture comme inhibiteur de l'activité des bactéries nitrifiantes. C'est une molécule aminée ne contenant pas de chaîne aliphatique. Ainsi avantageusement l'amine de la solution aqueuse (A) selon 5 l'invention est choisie parmi l'alanine et la 2-cyanoguanidine. Selon un mode de mise en oeuvre, la solution aqueuse (A) est dépourvue d'oligosaccharide tels que des mono- ou di-saccharides, par exemple le bêta-D-lactose ou le glucose ;de glycérol, de sorbitol, ou encore de polymères synthétiques polyhydroxylés tels que le poly(alcool vinylique) ou de polymères 10 d'acides carboxyliques insaturés. Le pH de la solution aqueuse (A) est avantageusement compris entre 4,5 et 6, en particulier entre 5 et 6, plus particulièrement il est de 5,5. En particulier la solution aqueuse A est tamponnée, par exemple à l'aide d'un tampon acétate de sodium. 15 Solution alcoolique (B) Cette solution comprend (avantageusement est constituée par) au moins un alcool en C1-C6 et au moins un phospholipide. Au sens de la présente invention on entend par « alcool en C1-C6 », tout groupe alkyle en C1-C6 linéaire ou ramifié substitué par un ou plusieurs groupes 20 -OH, avantageusement par un seul groupe -OH. Le terme « phospholipides » au sens de la présente invention englobe les diglycérides phosphatés comportant de préférence un groupe azoté cationique lié au groupe phosphate. On peut citer à titre d'exemple de tels phospholipides, la phosphatidylcholine, la phosphatidylsérine et la 25 phosphatidyléthanolamine. Ces phospholipides sont généralement utilisés sous forme de mélanges obtenus à partir de diverses sources naturelles telles que les lécithines, par exemple la lécithine extraite du jaune d'oeuf ou la lécithine extraite du soja. Selon un mode de réalisation, on utilise, à titre de phospholipide, une 30 lécithine contenant au moins 50% de 1-alpha-phosphatidylcholine. On peut 3038615 8 également utiliser une lécithine contenant au moins 95% en poids de phosphatidylcholine. La concentration du phospholipide dans la solution alcoolique (B) est de préférence comprise entre 20 et 100 mg/ml, de préférence comprise entre 30 et 5 80 mg/ml, en particulier comprise entre 34 et 77 mg/ml. L'alcool en C1-C6 pourra être par exemple du méthanol ou de l'éthanol, en particulier de l'éthanol, plus particulièrement de l'éthanol à au moins 96% et avantageusement de l'éthanol à 99%. La solution alcoolique (B) peut en outre comprendre une amine choisie 10 parmi les acides aminés, les oligopeptides, les amines comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges. Avantageusement, le rapport massique entre le phospholipide et l'amine dans la solution (B), lorsque la solution (B) comprend une amine, est compris entre 10/1 et 60/1, de préférence de l'ordre de 47/1. 15 En particulier, la solution alcoolique (B) et la solution aqueuse (A) peuvent contenir la même amine. La concentration totale de phospholipides dans le mélange final (A+B+C) doit être suffisante pour observer la formation de la phase tridimensionnelle. 20 Le ratio entre les phospholipides et l'amine a par ailleurs une influence sur la taille des micelles et, par conséquent, la taille des pores de la silice mésoporeuse. La Demanderesse a obtenu des porosités satisfaisantes lorsque le rapport massique entre le phospholipide et l'amine dans le mélange final (A + B + C) est compris entre 1/1 et 20/1, de préférence compris entre 2/1 et 10/1. 25 Par ailleurs, il peut être intéressant que le ratio massique entre l'alcool en C1-C6 et l'eau soit compris entre 57/48 et 55/45 dans le mélange final (A+B+C). 30 Solution (C) 3038615 9 Dans l'étape (1) du procédé selon l'invention, on prépare une solution aqueuse (C) : la molécule biologiquement active est dissoute dans une quantité appropriée d'eau. Selon un mode de mise en oeuvre, la solution aqueuse (C) est 5 dépourvue d'hydrate de carbone, en particulier d'oligosaccharide tels que des mono- ou di-saccharides, par exemple le bêta-D-lactose ou le glucose, de glycérol, de sorbitol, ou encore de polymères synthétiques polyhydroxylés tels que le poly(alcool vinylique) ou de polymères d'acides carboxyliques insaturés. Les quantités respectives des différents composants entrant dans la 10 composition de la solution réactionnelle des étapes du procédé de la présente invention peuvent être définies plus particulièrement par rapport à la quantité totale de précurseur de silice utilisée. Ainsi, pour une mole de tétra-alcoxysilane, on utilise de préférence de 14 à 112 moles de H20, de 10-7 à 10-3 moles d'au moins une molécule 15 biologiquement active, de 0,05 à 0, 20 moles d'au moins un phospholipide, de 0,04 à 0,16 moles d'au moins une amine et de 8,5 à 34 moles d'au moins un alcool en C1-C6. Le pH de la solution aqueuse (A) et le pH de la solution aqueuse (C) sont de préférence identiques et choisis de manière à stabiliser la molécule 20 biologiquement active si besoin, en particulier compris entre 4,5 et 6, plus particulièrement entre 5 et 6, encore plus particulièrement il est de 5,5. Etape (2) : formation de la mésophase lyotrope Au sens de la présente invention, on entend par « mésophase lyotrope » 25 la phase cristal-liquide dont la formation est liée à la concentration des molécules mésogènes. La caractérisation de ces phases est classiquement réalisée par microscopie optique en lumière polarisée et diffraction des rayons X aux petits angles. Pour obtenir cette mésophase, la solution (B) est ajoutée dans la 30 solution (A) sous agitation. Le sens de cet ajout est très important. En effet, si on 3038615 10 ajoutait la solution (A) dans la solution (B), on n'obtiendrait pas la formation de cette mésophase. Avantageusement, la solution (B) est ajoutée goutte à goutte dans la solution (A). 5 En particulier l'agitation est effectuée à l'aide d'un barreau aimanté à une vitesse de rotation comprise entre 300 et 1000 tours par minute pour une durée comprise entre 5 et 15 minutes. Le mélange (A+B) est avantageusement maintenu sous agitation, en particulier à 900 tours par minute, pendant 10 minutes, c'est-à-dire jusqu'à la 10 formation de la mésophase lyotrope. Etape (3) : Ajout de la solution (C) dans le mélange (A+B) La solution (C) est ajoutée dans la solution (A+B) sous agitation, avantageusement avec un barreau aimanté, en particulier à une vitesse de 15 rotation comprise entre 700 et 900 tours par minute, pour une durée comprise entre 10 et 20 minutes. Le sens de cet ajout est très important. En effet, si on ajoutait la solution (A+B) dans la solution (C), on n'obtiendrait pas le produit désiré. Avantageusement, la solution (C) est ajoutée goutte à goutte dans la 20 solution (A+B). La solution obtenue est le mélange (A+B+C), dont l'analyse par diffraction des rayons X donne un diagramme présentant une mésophase tridimensionnelle (Figure 2) c'est-à-dire un réseau de pores orientés dans les trois directions de l'espace. La caractérisation de ces phases est classiquement 25 réalisée par microscopie optique en lumière polarisée et diffraction des rayons X aux petits angles. La solution (A+B+C) est avantageusement maintenue sous vive agitation (par exemple 900 tours par minute) pendant 10 minutes supplémentaires. 30 3038615 11 Etape (4) : silice Le tétra-alcoxysilane, précurseur de la matrice silicique, peut être choisi parmi les tétra-alcoxysilanes de formule Si(O-R1)4, les tétra-alcoxysilanes de formule Si(R2),,(0-R2)4 et leurs mélanges, chaque R1 et R2 représentant 5 indépendamment un radical alkyle linéaire ou ramifié en C1-C4, de préférence en C1-C2, et n valant 1, 2 ou 3. Le tétra-éthoxysilane (TEOS) est le précurseur de silice particulièrement préféré. L'addition du précurseur de silice se fait de préférence sous agitation pour assurer une bonne homogénéisation des différents ingrédients. L'agitation 10 est généralement maintenue pendant quelques minutes, de préférence pendant 5 à 120 minutes, en particulier pendant 90 à 120 minutes. Au cours de l'ajout du précurseur de silice, en particulier du TEOS, on observe un virage de la coloration du mélange qui s'assombrit ainsi que de sa texture qui s'épaissit en même temps. On observe au cours du temps la précipitation de fines particules de silice 15 en suspension. Les quantités précurseur de silice, en particulier du TEOS (en particulier de qualité « réactif »), comprises entre 0,4 et 0,8 mL sont préférées pour effectuer les synthèses. On laisse ensuite la solution réactionnelle reposer pendant plusieurs heures, de préférence pendant 2 à 48 heures, en particulier pendant 4 à 30 20 heures, plus avantageusement pendant 20 à 30 heures, au cours desquelles se déroule la réaction de polycondensation des tétra-alcoxysilanes. Avantageusement cette maturation se fait à une température comprise entre 20 et 35°C, en particulier d'environ 33°C. La température ne doit pas être trop élevée pour éviter la dégradation de la molécule active. Les fines particules de 25 silice observées sédimentent et la turbidité du mélange diminue. A la fin de la maturation, deux phases sont présentent dans le mélange: l'une solide et l'autre composée d'un mélange aqueux jaunâtre. Ces particules peuvent être séparées du milieu réactionnel par simple filtration, par exemple sur du verre fritté, ou par centrifugation. Elles sont ensuite 30 de préférence lavées avec un solvant ou mélange de solvants permettant de préserver l'activité des molécules biologiques. On préfère en particulier le lavage 303 86 1 5 12 des particules avec une solution tampon en particulier acétate de sodium à un pH compris entre 4 et 6, en particulier de 5,5. Elles sont ensuite de préférence séchées sous vide ou lyophilisées pour faciliter l'utilisation ultérieure et protéger les molécules biologiques. On préfère 5 en particulier le séchage sous vide pour une durée comprise entre 24 et 48 heures. Les particules de silice selon l'invention, ainsi obtenues par le procédé selon l'invention, ont généralement une taille moyenne en volume, avantageusement un diamètre moyen en volume (D50), comprise entre 10 et 25 10 pm, en particulier entre 10 et 20 pm, mesuré par granulométrie laser avec le Mastersizer 2000 de Malvern Instruments dans un tampon acétate comme illustré à la figure 3 et une forme sphérique, comme illustré à la figure 4. Leur volume poreux obtenu après calcination à une température comprise entre 450°C et 650°C pendant 6-10 heures sous air est déterminé à 15 partir des isothermes d'adsorption d'azote à 77 K, et est généralement compris entre 0,09 et 0,11 ml/g, de préférence il est de 0,10 ml/g (comme par exemple illustré à la figure 5). La taille moyenne des pores, déterminée par la méthode DerjaguinBroekhoff-de Boer (DBdB) à partir des isothermes de désorption d'azote à 77 K, 20 est comprise entre 3,5 et 4,5 nm. La surface spécifique des particules de silice, mesurée par la méthode Brunauer, Emmett and Teller (BET) à partir des isothermes d'adsorption-désorption d'azote à 77 K, est généralement comprise entre 30 et 50 m2/g, de préférence il est de 40 m2/g. 25 En particulier, afin de ne pas risquer de polluer les sols avec des composés chimiques, le choix du phospholipide et de l'amine (aussi dénommés agent texturants) a porté sur des réactifs non toxiques, et le biocatalyseur enzymatique supporté obtenu a été baptisé du nom de TMC signifiant « Tridimentional Mesoporous Capsule ». L'ensemble des composants entrant dans 30 la synthèse du TMC sont : l'agent structurant servant de gabarit organique (phospholipide, en particulier lécithine avec 50% de l-a-phosphatidylcholine, 3038615 13 Sigma-Aldrich), un co-structurant (amine, en particulier acide aminé ou dicyanodiamide DCD 99,5%), de l'éthanol absolu, en particulier à 99%, pour dissoudre les phospholipides et former les bicouches, de l'eau, un sel (acétate de sodium) et un précurseur de silice (TEOS, Fluka). 5 Ratios molaires de la synthèse du TMC avec le DCD (1) ou l'acide aminé (2) : (1) : 1 TEOS/1,33 Acétate Na/146 H20/68 Ethanol/0,62 DCD/0,2 Lécithine (2) : 1 TEOS/1,33 Acétate Na/146 H20/68 Ethano1/0,15 Acide aminé/0,2 10 Lécithine Molécule organique biologiquement active Le procédé de la présente invention peut servir à immobiliser dans une matrice solide poreuse n'importe quelle molécule biologiquement active, c'est-à- 15 dire n'importe quelle molécule capable de réagir avec les organismes vivants et donc jouant un rôle spécifique dans le métabolisme. Ce type de molécule peut être d'origine naturelle ou synthétique, telle qu'une hormone, une enzyme ou la substance active d'un médicament ou d'un produit phytopharmaceutique. En particulier il s'agit d'une enzyme par exemple les amylases, les uréases, les 20 cellulases et les phosphatases telles que les phytases. Avantageusement cette molécule est soluble dans l'eau. La molécule biologiquement active est de préférence une protéine dont le diamètre moyen est compris entre 5 et 25 nm, de préférence compris entre 7 et 14 nm, selon la méthode de mesure divulguée dans Oakley AJ et al. (2010) 25 pour Aspergillus niger phytase phyA ou selon la Protein Data Bank http://www.rcsb.org. On peut citer à titre d'exemples de telles protéines les phosphatases, et en particulier une phytase. Enzymes naturelles, les phytases jouent un rôle essentiel dans le cycle 30 du phosphore en hydrolysant les phytates ou les acides phytiques contenus dans les végétaux. 3038615 14 On distingue quatre catégories distinctes de phytases: phosphatases acides histidine (HAP), beta-hélice phytases (BPP), des phosphatases acides pourpres (PAP) et la cystéine phosphatase (CP). La plupart des phytases montrent une large spécificité de substrat. Elles 5 ont la capacité d'hydrolyser de nombreux composés phosphorylés, comme I'ADP, l'ATP, le phényle phosphate, le fructose 1,6-biphosphate, le glucose-6-phosphate, le glycérophosphate et la 3-phosphoglycérate. Seuls quelques phytases sont spécifiques de l'acide phytique, notamment les BPP. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les phytases sont 10 choisies parmi les phosphatases acides capables d'effectuer l'hydrolyse de cinq des six groupements phosphates du phytate, notamment la 6-phytase appelée myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase (numéro de classification EC 3.1.3.26). On peut également utiliser la 4-phytase (EC 3.1.3.26), et la 5-phytase (EC 3.1.3.72). 15 En particulier, la phytase utilisée est une phytase recombinante (EC 3.1.3.26) à partir d'un extrait concentré de l'enzyme dont la concentration est de 80 mg/ml. L'extrait phytasique a été obtenu par surexpression du gène phyA de Aspergillus piger par la levure Pichia pastoris (Boze, H., et al., 2004). On pourra utiliser dans le cadre de la présente invention, toute molécule 20 biologiquement active dont le diamètre moyen en volume, mesurée par exemple par granulométrie laser en particulier avec un granulomètre Malvern, est compris entre 5 et 25 nm, de préférence compris entre 7 et 14 nm, et en particulier soluble dans l'eau. Les enzymes immobilisées à l'intérieur d'une matrice obtenue selon ce 25 procédé présentent d'excellentes activités spécifiques, une bonne résistance aux conditions réactionnelles, sont faciles à récupérer par simple filtration ou par centrifugation, peuvent ainsi être réutilisées un grand nombre de fois et sont peu coûteuses à produire. Les biocatalyseurs obtenus résistent en outre très bien à la désorption 30 ou lixiviation des enzymes ( 80% 80 Activité Apparente (%) Activité Spécifique (U/mg) 10% 8 11% 12 Stabilité Température pH Optimal Stable à 55°C 5,5 Stable à 45°C 5,5 Température Optimale 55°C 45°C Temps Production (jours) Temps Manipulation (heures) Coût (E/g) 7 jours 3 h 3 jours 0,8 h 0,0064 Très basse Energie 4,65 Très forte 5 Ces résultats montrent que le procédé de fixation d'enzyme selon l'invention permet d'obtenir des biocatalyseurs présentant une meilleure activité spécifique que la même enzyme fixée selon le procédé de l'art antérieur mettant en oeuvre une imprégnation de la phytase dans une silice mésoporeuse à structure tridimensionnelle ictM nommée KIT-6. 10 Exemple 3 : Comparaison à l'aide de résine échangeuses d'anions de la disponibilité en Pi issu de l'hydrolyse du phytate par la phytase fixée par imprégnation dans KIT-6 10X et par encapsulation dans TMC obtenu dans l'exemple lb 15 Une solution de sol contenant du phytate de sodium 0,49 mM dans un sol artificiel constitué de 99 g de sable fin (Sigma-Aldrich, 50-70 mesh, ref. 14808-60-7), 30 mg de goethite de synthèse (Corne)), R. M., et al., 2006.), de 617 mg de kaolinite (Clay Minerai Society, KGa2) et un volume total d'eau ajouté dans le sol de 33 ml à pH 5,5 sont mis à incuber pendant 3 jours avec une 20 quantité d'enzyme équivalente à 0,50 mg de phytase, ladite phytase se trouvant 303 861 5 22 soit sous une forme non immobilisée, soit sous une forme immobilisée selon le procédé de l'exemple lb (TMC), soit sous une forme immobilisée par imprégnation dans du KIT-6 selon le procédé décrit dans l'article de Trouillefou, et al., 2014. 5 Puis, des résines échangeuses d'anions (BDH 55164, VWR) sont mises en contact pendant 24 heures avec ce sol artificiel. Le Pi adsorbé par les résines échangeuses est désorbé à l'aide de bains successifs (Q Qian, P., et al. 2002.) avec une solution de KCI 0,02 M. Les quantités de Pi désorbées et présentes dans la solution de sol sont ensuite dosées au vert de Malachite (Figure 8). 10 Les résultats de la Figure 8a indiquent clairement que les quantités de Pi résine sont supérieures pour le TMC de l'exemple lb selon l'invention par rapport à KIT-6 10X après 24 heures d'exposition. De plus, la Figure 8b montre que les quantités de Pi disponibles dans la solution de sol sont identiques. 15 Exemple 4 : Activité du matériau dans un sol sableux pour la nutrition de la plante modèle Medicago truncatulata Les plantules croissent dans des boîtes de Pétri (12x12 cm) scellées pour conserver la stérilité du milieu de culture. Les plantules sont disposées aux 4 coins de la boîte et un trou sur le dessus de chaque boîte, bouché avec un 20 adhésif stérile, permet d'effectuer l'arrosage des plantes au fil de l'expérience. Toutes les boîtes sont remplies avec 99 g de sable stérilisé, 16,5 ml de tampon MES (acide 2-(N-morpholino)ethanesulfonique) à pH 5,5 et trois solutions nutritives décrites dans le Tableau 2. En plus de ce mélange de base dans les boîtes de Pétri, sont ajoutés 1 ml d'un extrait de TMC (matériau de l'exemple la 25 selon l'invention) 1 mg/ml et 5 ml d'une solution de phytate de sodium 15 mM. 30 3038615 23 Tableau 2 : composition des solutions nutritives utilisées pour la culture de M. truncatula. Solution Volume de Composition élémentaire de la solution nutritive Concentration Concentration Nutritive solution de la solution dans le sol de source source culture (m1) (mM) (mM) Sol. Nut. 1 8 KNO3 100 24,24 CaCl2 70 16,97 FeEDDHA 0,14 0,03 Sol. Nut. 2 1,6 MgSO4 1000 48,48 Sol. Nut. 3 2 H31303 45 2,73 (NH4)6M007024 0,3 0,02 ZnSO4 15 0,91 MnSO4 18 1,09 CuSO4 4 0,24 Après 30 jours de culture, les plants sont récoltés pour être minéralisés individuellement. Leurs parties aériennes (PA) et racinaires (PR) sont toutefois séparées pour effectuer l'analyse de phosphore absorbé. Leur minéralisation est 5 réalisée dans des tubes scellés en présence de 10 ml de HCI (6 N) à 110°C pendant 16 h (Ali M. A. et al., 2009). Le dosage du Pi dans le minéralisât est effectué au vert de Malachite. Le matériau fonctionnel TMC selon l'invention a permis d'observer une accumulation significative de P dans les plantes cultivées (Figure 9). La quantité 10 de phosphore accumulé par les plantes en présence de TMC représente 2,5 celle du témoin, et les différences sont significatives pour les parties aériennes et racinaires. Bibliographie 15 - FR 2 879 186 ; - Laveille, P., et al. (2010). "Oxidation reactions using air as oxidant thanks to silica nanoreactors containing GOx/peroxidases bienzymatic systems", Catalysis Today, 157, 94-100; - Galarneau et al (2007). "Understanding the stability in water of mesoporous 3038615 24 SBA-15 and MCM-41." Journal of Physical Chemistry C 111(23): 8268-8277; - Hossain, K.-Z., et al. (2008). "Adsorption of urease on PE-MCM-41 and its catalytic effect on hydrolysis of urea." Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 62(1): 42-50 ; 5 - Gogos, A., et al. (2012). "Nanomaterials in Plant Protection and Fertilization: Current State, Foreseen Applications, and Research Priorities." Journal of Agricultural and Food Chemistry 60(39): 9781-9792 ; - Burns et al , (2013). ; Soil Biology & Biochemistry 58 (2013) pp 216-234 ; - Oakley AJ et al. (2010). "The structure of Aspergillus niger phytase phyA in 10 complex with a phytate mimetic." Biochem Biophys Res Commun 397(4):745749 ; - Boze, H., Laborde, C. et al. (2004). "Overexpression of ovine leptin in Pichia pastoris: physiological yeast response to leptin production and characterization of the recombinant hormone" Yeast, 21(3): 249-263 ; 15 - Trouillefou, Christophe Marcel, Edith Le Cadre, Thomas Cacciaguerra, Frédérique Cunin, Claude Plassard, et Emmanuel Belamie. (2014). "Protected activity of a phytase immobilized in mesoporous silica benefits to plant phosphorus nutrition". Journal of Sol-Gel Science and Technology, 74(1) : 55-65; - Ohno, T., et L. M. Zibilske. (1991). "Determination of low concentrations of 20 phosphorus in soil extracts using Malachite green". Soil Science Society of America Journal 55 (juin): 892-95 ; - Cornell, R. M., et U. Schwertmann. (2006). "The Iron Oxides: Structure, Properties, Reactions, Occurrences and Uses". Wiley ; - Q Qian, P., et J. J. Schoenau. (2002). "Practical Applications of Ion Exchange 25 Resins in Agricultural and Environmental Soil Research". Can. J. Soil Sci. 82 (février): 9-21. ; - Ali, M. A., et al. (2009). "Pinus pinaster seedlings and their fungal symbionts show high plasticity in phosphorus acquisition in acidic salis", Tree Physiology, 29, 1587-1597. REVENDICATIONS1. Procédé de fixation d'une molécule organique biologiquement active au sein d'une matrice de silice, ledit procédé comprenant les étapes suivantes consistant à : (1) préparer une solution aqueuse (A) contenant une amine choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les amines comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges, préparer une solution alcoolique (B) d'au moins un alcool en C1-C6 et d'au moins un phospholipide, et préparer une solution aqueuse (C) de la molécule biologiquement active, (2) incorporer la solution (B) dans la solution (A) sous agitation pour obtenir la formation une mésophase lyotrope, (3) incorporer la solution (C) dans le mélange (A+B) obtenu à l'issue de l'étape (2), (4) ajouter au mélange obtenu à l'issue de l'étape (3), au moins un tétra-alcoxysilane, puis laisser reposer pendant une durée suffisante pour obtenir des particules solides poreuses à base de silice renfermant la molécule biologiquement active. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'amine est choisie parmi les acides aminés apolaires en particulier parmi la valine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la glycine, l'alanine, et la proline, en particulier il s'agit de l'alanine. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'amine est choisie parmi les oligopeptides, en particulier choisie parmi les dipeptides tel que la glycyl-glycine. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'amine est la 30 2-cyanoguanidine. 303 861 5 26 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la solution alcoolique (B) contient une amine choisie parmi les acides aminés, les oligopeptides, les amines comprenant un groupe nitrile, l'urée et leurs mélanges. 5 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la solution alcoolique (B) et la solution aqueuse (A) contiennent la même amine. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé 10 en ce que la solution alcoolique (B) est ajoutée goutte à goutte dans la solution aqueuse (A). 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on utilise, à titre de phospholipide, une lécithine contenant au moins 15 95% en poids de phosphatidylcholine. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le pH de la solution aqueuse (A) et le pH de la solution aqueuse (C) sont identiques et choisis de manière à stabiliser la molécule biologiquement 20 active si besoin, en particulier compris entre 4,5 et 6. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le ratio massique entre l'alcool en C1-C6 et l'eau est compris entre 57/48 et 55/45 dans le mélange final (A+B+C). 25 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que le rapport massique entre le phospholipide et l'amine dans la solution (B), est compris entre 10/1 et 60/1, de préférence de l'ordre de 47/1. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le tétra-alcoxysilane est choisi parmi les tétra-alcoxysilanes 3038615 27 de formule 51(0-R1)4, les tétra-alcoxysilanes de formule Si(R2)n(0-R2)4 et leurs mélanges, chaque R1 et R2 représentant indépendamment un radical alkyle linéaire ou ramifié en C1-C4, de préférence en C1-C2, et n valant 1, 2 ou 3. 5 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la molécule biologiquement active est une protéine dont le diamètre moyen est compris entre 5 et 25 nm, de préférence compris entre 7 et 14 nm. 10 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que la molécule biologiquement active est une enzyme, de préférence une phosphatase, notamment une phytase. 15. Molécule organique biologiquement active fixée au sein d'une 15 matrice de silice susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14. 16. Composition, en particulier d'engrais, comprenant la molécule fixée au sein d'une matrice de silice selon la revendication 15 et un excipient. 17. Utilisation d'une phosphatase fixée au sein d'une matrice de silice susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou d'une composition la comprenant pour la nutrition phosphatée des végétaux. 20 25