Brevet FR3037077A1 — publié le 20161209

-I SOUCHES MUTANTES DU GENRE CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII La présente invention concerne des bactéries du genre Clostridium beijerinckii améliorées par mutagénèse aléatoire ainsi qu'un procédé de production d'un mélange comprenant du 5 butanol et de l'isopropanol au moyen de ces bactéries. Etat de la technique De nombreuses molécules chimiques dites "plateformes" composées de 2 à 6 atomes carbones sont principalement produites à partir de ressources fossiles. Ces molécules de 10 base servent à la production de composés intermédiaires dont les utilisations sont variées, comme par exemple pour la synthèse de polymères, de molécules pharmaceutiques, dans les formulations de carburants ou encore dans l'industrie des parfums. Cependant pour certaines raisons environnementales, mais surtout pour répondre à la diminution inéluctable des ressources pétrolières, des procédés alternatifs sont développés 15 pour permettre la production de ces molécules "plateformes" à partir de matière première renouvelable. Le propylène (ou propène) est la seconde molécule la plus utilisée dans la pétrochimie. Elle est principalement issue du pétrole et est notamment obtenue par vapocraquage, par craquage catalytique ou par la déshydrogénation du propane. 20 Une des voies possibles pour produire du propylène autrement qu'à partir de pétrole est de réaliser la déshydratation de l'isopropanol obtenu par fermentation biologique de sucres extraits de la biomasse, fermentation connue sous le nom de fermentation IBE (Isopropanol, Butanol, Ethanol). Les fermentations dites « fermentation solvantogène » sont réalisées par des 25 microorganismes du genre Clostridium. Les Clostridia sont des bacilles de gram positif capables de former des endospores et appartenant au phylum des Firmicutes. Ces bactéries sont anaérobies strictes et ubiquitaires, elles peuvent être retrouvées dans les intestins des animaux, dans les sols etc. Elles peuvent dégrader différents sucres et produire des solvants à partir d'une large variété de substrats. A l'issue de cette fermentation "solvantogène", les 30 produits finaux peuvent varier selon qu'il s'agisse d'une fermentation de type ABE (production d'Acétone, de Butanol et d'Éthanol) ou IBE (production d'Isopropanol, de Butanol et d'Éthanol). La souche "ABE" la plus étudiée est Clostridium acetobutylicum ATCC 824, isolée du sol en 1924 dans le Connecticut (Weyer & Rettger, 1927, J. Bacteriol. 14, 399-424). Une autre 3037077 2 souche très étudiée est Clostridium beijerinckii DSMZ 6423 (NRRL B593), car capable de produire un mix de solvants lsopropanol/Butanol/Ethanol en réduisant l'acétone en isopropanol grâce à la présence dans son génome d'une alcool-déshydrogénase (adh) primaire/secondaire NADPH dépendante (Ismaiel et al., 1993, J. Bacteriol., 175(16), 5097- 105). La principale contrainte liée au développement de procédés industriels de production de solvants par des souches de Clostridium est le titre final en solvants, problème qui est mentionné dès les premières constructions d'unités industrielles (Jones, D.T., Woods, D.T., 1986, Microbiological. Reviews. 50(4), 484- 524). La principale cause du faible titre en solvants est la toxicité des produits finaux et particulièrement du butanol. Une concentration en butanol supérieure à 10-12 g/L dans le milieu de culture est connue pour limiter la croissance des souches de Clostridium (Zheng et al., 2009, J. Ind.Microb. & Biotechnol. 36:1127-1138) La majorité des travaux scientifiques effectués jusqu'à aujourd'hui, vise à améliorer la synthèse de butanol par les souches de Clostridium. Pour cela, plusieurs approches ont été appliquées pour améliorer la tolérance au butanol dont celle basée sur la mutagenèse et la sélection de souches de Clostridium capables de résister à des teneurs plus élevées en butanol (US 4,757,010). La technique de mutagenèse aléatoire permet de modifier le patrimoine génétique des souches pour les faire évoluer vers un caractère particulier en exerçant une pression de sélection environnementale. La technique optimise et accélère ainsi le phénomène de sélection naturelle. Une autre technique qui peut être employée est celle du "brassage génétique" ("genome shuffling" selon la terminologie anglo-saxonne) qui permet de combiner et recombiner l'ADN de génomes entiers de multiples organismes en imitant le processus reproductif mais à plus grande échelle. Le phénomène de recombinaison s'effectue par fusion de protoplastes de souches ayant été par exemple sélectionnées à la suite d'un traitement mutagène et étalement sur milieu sélectif. La combinaison des deux techniques peut favoriser l'obtention de souches présentant une production améliorée de métabolites, une meilleure assimilation du substrat, une plus grande tolérance aux produits formés. A l'heure actuelle, il existe encore un besoin pour de nouvelles souches bactériennes, qui, cultivées dans des conditions de fermentation adéquates, permettent d'obtenir des concentrations améliorées d'un mélange d'isopropanol et de butanol. 3037077 3 Résumé de l'invention La présente invention se rapporte à : 5 - une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-4985 - une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le 10 n° CNCM 1-4986 - une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-4987 - une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à 15 l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n ° CNCM 1-5027 - une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n ° CNCM 1-5028 20 - une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n ° CNCM 1-5029 Les bactéries mutantes CMCM 1-4985, CNCM 1-4986, CNCM 1-4987 ont été obtenues à 25 partir de la souche Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 après traitement de cette dernière avec un agent mutagène, le N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), et sélection dans un milieu contenant une quantité importante d'isopropanol, ou de méthyl bromobutyrate ou d'éthyl bromobutyrate afin de sélectionner les mutants potentiellement intéressants pour la production d'un mélange d'isopropanol et de butanol. Par comparaison avec la souche mère 30 Clostridium beijerinckii DSMZ-6423, les bactéries sélectionnées ont démontré un bénéfice en termes de titre final en solvants lsopropanol et Butanol après fermentation de sucres. 3037077 4 L'invention concerne également une bactérie mutante du genre Clostridium beijerinckii, déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-4988. La soucheCNCM 1-4988 est issue d'une étape de brassage génétique réalisée avec les souches CNCM 1-4986 et CNCM 1-4987 suivie 5 d'une étape de sélection reposant sur l'aptitude des mutants à tolérer une concentration importante d'isopropanol dans son environnement. La souche CNCM 1-4988 mise en oeuvre en fermentation a la capacité de produire un mélange de solvants dont la concentration en isopropanol et butanol est améliorée par rapport à la souche Clostridium beijerinckii DSMZ-6423. 10 L'invention concerne également un procédé de production d'un mélange d'isopropanol et de butanol, par fermentation anaérobie réalisée à une température comprise entre 25 et 37°C, dans un milieu de culture contenant des sucres au moyen d'une bactérie choisie parmi les bactéries CNCM 1-4985, CNCM 1-4986, CNCM 1-4987 et CNCM 1-4988. 15 Le procédé selon l'invention peut également mettre en oeuvre une bactérie choisie parmi les bactéries CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 et CNCM 1-5029. Les bactéries CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 et CNCM 1-5029 ont été obtenues par brassage génétique avec des souches mutées au moyen de l'agent mutagène NTG. 20 De préférence le milieu de culture contient comme sucre le glucose. Selon un mode de réalisation, le milieu de culture contient un substrat amylacé hydrolysé. Selon l'invention, le milieu de culture peut contenir de l'acide carboxylique. Par exemple, le 25 milieu de culture contient de l'acide acétique et/ou de l'acide butyrique. Description détaillée de l'invention Pour améliorer les performances de la souche naturellement productrice d'IBE Clostridium beijerinckii DSMZ-6423, les inventeurs ont procédé à un traitement par un agent mutagène, 30 le N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), de ladite souche afin de modifier son contenu génétique. La technique de mutagénèse utilisée consiste à effectuer en milieu liquide une mise en contact de l'agent mutagène avec la souche bactérienne, puis à étaler sur différents milieux de culture solide, par exemple dans des boites de Pétri, les souches issues du traitement par 3037077 5 le mutagène. Les milieux de culture comprennent des taux d'isopropanol, ou de méthyl bromobutyrate ou d'éthyl bromobutyrate qui sont toxiques pour la souche native de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423. La sélection des souches est fondée sur le principe de recherche de mutants résistant à 5 l'isopropanol dans l'hypothèse où ces derniers supporteraient une accumulation d'isopropanol lors des essais de fermentation IBE. L'utilisation du méthyl bromobutyrate ou de l'éthyl bromobutyrate comme produit de sélection se base sur l'article de Clark, S. W., Bennett, G. N., & Rudolph, F. B. ((1989). Isolation and Characterization of Mutants of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Deficient in 10 Acetoacetyl-Coenzyme A:Acetate/Butyrate:Coenzyme A-Transferase (EC 2.8.3.9) and in Other Solvent Pathway Enzymes. Appl. Environ. Microbiol., 55(4), 970-6) dans lequel il est décrit des mutants de Clostridium acetobutylicum ATCC824, sélectionnés pour leur résistance au 2-bromobutyrate, et qui présentent des activités butyraldéhyde et butanol déshydrogénases modifiées. Les inventeurs sont partis de l'hypothèse que des souches 15 ayant une activité butyraldéhyde modifiée sont susceptibles de produire de façon améliorée de l'isopropanol dans la mesure où les réactions métaboliques impliquées dans la fermentation ABE sont proches de celles d'une fermentation IBE. Les souches mutées récupérées après l'étape de culture ont vu ainsi leur génome modifié 20 pour acquérir une résistance aux produits toxiques et potentiellement de meilleures facultés fermentaires pour la production de solvants (plus particulièrement en isopropanol et butanol). Les souches résistantes ont alors été cultivées dans un milieu de croissance contenant du glucose ou un substrat amylacé hydrolysé afin de déterminer leur aptitude réelle à produire de l'isopropanol et du butanol. A l'issue de ces étapes de fermentation, trois souches 25 mutantes de Clostridium beijerinckii ont pu être sélectionnées et ont fait l'objet de dépôts selon le traité de Budapest, auprès de l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F75724 PARIS Cedex 15, France), le 27 mai 2015, et qui portent respectivement les références CNCM 1-4985, CNCM 1-4986 et CNCM 1-4987. 30 Selon l'invention, une souche mutante CNCM 1-4988 également déposée selon le traité de Budapest auprès de l'Institut Pasteur a été obtenue par brassage génétique (ou "genome shuffling" selon la terminologie anglo-saxonne) de souches mutantes. Pour initier l'étape de brassage, des fusions sont induites entre des mutants de Clostridium beijerinckii. Cet échange génétique entre différentes populations mime ainsi les 3037077 6 recombinaisons caractéristiques de la reproduction sexuée. Les cellules filles obtenues après brassage sont de nouveau sélectionnées par recherche d'une évolution de leurs profils de fermentation. Le processus de « shuffling » peut être répété sur plusieurs générations (ou tour de brassage) jusqu'à l'obtention d'une souche finale améliorée pour sa capacité à 5 produire des solvants, isopropanol et butanol en particulier, et à tolérer des concentrations importante d'isopropanol dans son environnement. Ainsi la souche mutante CNCM 1-4988 a été obtenue après un tour de brassage réalisé avec les souches mutantes CNCM 1-4986 et CNCM 1-4987 et avec une sélection de souches pour une tolérance améliorée à l'isopropanol (au-delà de 40 g/L d'isopropanol). 10 La méthode de mutagénèse employée pour obtenir les souches qui font l'objet de l'invention est décrite de manière détaillée ci-après. La souche départ, également désignée par le terme "wild-type" selon la terminologie anglo15 saxonne, est Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 déposée auprès de Leibniz-Institut DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. La souche a été mise en préculture dans un milieu dit GAPES dont la composition est détaillée dans le tableau 1. L'étape de préculture a été effectuée à une température de 3537°C pendant 24 heures. 20 Composé Concentration (g/L) Extrait de levure 2,5 KH2PO4 1 K2HPO4 0,6 MgSO4, 7H20 1 FeSO4, 7H20 0,0066 Acide p-aminobenzoïque 0,1 Acétate d'ammonium 2,9 Glucose 60 Tableau 1 : Composition du milieu GAPES Cette préculture est ensuite utilisée pour initier une culture en milieu CGM (Clostridium Growth Medium), dont la composition est donnée au tableau 2. 25 30 3037077 7 Composé Concentration [g/L] Extrait de levure 5 K2HPO4 0,75 KH2PO4 0,75 MgSO4,7H20 0,4 MnSO4,H20 0,01 FeSO4,7H20 0,01 NaCI 1 Asparagine 2 (NH4)2SO4 2 Cystéine 0,125 Glucose 12,5 Tableau 2 : Composition du milieu CGM 5 Une fois cultivée, la souche sauvage de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 a été soumise à différentes conditions de mutation par contact en milieu liquide CGM avec du N-méthyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidine (NTG ; Sigma-Aldrich) qui est connu pour ses propriétés mutagènes. Dans une première série de test, la souche sauvage de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 10 récupérée en phase de croissance exponentielle, c'est-à-dire après 3 à 4 heures de culture, est mise en contact à une température de 35-37°C dais un tube à essai avec du NTG ajouté dans le milieu CGM pour obtenir une concentration de 50 pg/mL de NTG. La mise en contact avec le NTG est de 1 heure. Les cellules sont lavées deux fois avec une solution tampon de phosphate de potassium (pH 15 = 6,6) avant de les reprendre en milieu CGM frais pour réaliser une étape de régénération de 1 à 3 h à 35°C. Pour l'opération de sélection, les cellules mutées sont étalées sur boîtes de sélection après l'étape de régénération. Le milieu de sélection est un milieu CGM contenant comme agent de sélection l'éthyl bromobutyrate à une concentration de 0,5 mL/L. L'incubation dans le milieu de sélection est effectuée à une température de 35-37°C et 20 pendant 24-48 heures. Au bout de 24 à 48 heures de culture, des mutants présentant une résistance à l'agent de sélection ont été sélectionnés. 3037077 8 Les performances des différents mutants ainsi sélectionnés sont ensuite testées dans des fioles en conditions anaérobies et à l'aide de deux milieux de fermentation différents, à savoir le milieu GAPES décrit dans le tableau 1 et en milieu GAPES auquel on a remplacé le glucose par un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) correspondant à une concentration de 5 70 g/L équivalent glucose dans ledit milieu. Les fermentations anaérobies sont conduites à une température de 37°C pendant 48 heures et sous agitation. Dans une seconde série de test, la souche sauvage de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 10 est mise en culture dans le milieu CGM et recueillie en phase exponentielle, c'est-à-dire après 3 à 4 heures de culture, puis est mise contact avec 75 pg/mL de NTG. Les mutants ont été ensuite sélectionnés dans les mêmes conditions que mentionnées plus haut mais en utilisant comme agent de sélection l'isopropanol à une concentration de 40 g/L. Les mutants ainsi sélectionnés qui ont acquis une résistance à l'isopropanol sont ensuite 15 testés en fermentation dans des conditions anaérobies en fioles dans le milieu décrit dans le tableau 1 et ainsi qu'en milieu GAPES auquel on a ajouté à la place du glucose un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) afin d'apporter 70 g/L équivalent glucose. Les fermentations anaérobies sont conduites à une température de 37°Cpendant 48 heures et sous agitation. 20 Dans une troisième série de test, la souche sauvage de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 est mise en culture dans le milieu CGM et recueillie en phase exponentielle, c'est-à-dire après 3 à 4 heures de culture, puis est mise contact avec 50 pg/mL de NTG. Les mutants sont sélectionnés au moyen d'une solution de culture CGM contenant en outre 40 g/L d'isopropanol. 25 Les mutants résistants à l'isopropanol sont ensuite testés en fermentation dans des conditions anaérobies en fioles dans le milieu décrit dans le tableau 1 et ainsi qu'en milieu GAPES contenant, à la place du glucose, le substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) apportant 70 g/L d'équivalent glucose. Les fermentations anaérobies sont conduites à une température de 37°C pendant 48 heures et sous agitation. 30 Le tableau 3 ci-dessous regroupe les résultats d'analyse des solvants produits après 48 heures de fermentation anaérobies en milieu GAPES. Les solvants sont dosés par une chromatographie en phase gazeuse (appareil Varian®), avec une colonne CP-PoraBOND Q et un détecteur à ionisation de flamme (FID : Flamme 3037077 9 Ionisation Detector selon la terminologie anglo-saxonne). Le propan-1-ol est utilisé comme étalon interne. Les paramètres de la chromatographie sont les suivants : Colonne : longueur 25 mètres ; Diamètre interne (ID) : 0,32 mm ; diamètre extérieur 5 (ED) : 0,45 mm ; épaisseur du film : 5 !IL Température de l'injecteur : de 90°C à 250°C, 150C/min Débit du gaz vecteur 1,6 mL/min (6,8 psi) Température de la colonne : de 50°C à 250°C, 50 °Chin Température du détecteur FID : 80°C 10 Volume d'injection : Ethanol Acétone Isopropanol Butanol [Solvant] en g/L 6423 0,1 0,1 2,4 7,3 C. beijerinckii DSMZ Concentration en NTG / Milieu de sélection N° Souche 50 gg/mL de NTG 6 0,1 0,1 2,8 7,2 / 7 0,2 0,1 2,5 7,1 Milieu de sélection 8 0,1 0 2,4 7 contenant de l'éthyl 9* 0,2 0 2,8 10,5 bromobutyrate à 0,5 10 0,1 0,1 2,4 7,2 mUL 1 0,2 0,1 2,8 8,3 3 0,2 0 0,3 6,6 NTG 75 gg/mL 5 0,1 0 1,9 5,3 / 6* 0,1 0,1 2,3 5,5 Milieu de sélection 7 0,1 0,1 1,9 7,8 contenant de l'isopropanol à 40g/L 8 0,1 0 0,6 0,7 9 0,1 0 2,3 6,5 10 0,1 0 2,2 6,2 1 0,1 0,1 2,5 7,1 2 0,1 0 2,3 6,6 NTG 50 gg/mL 3 0,1 0,1 2,7 6,4 / Milieu de sélection 4 0,4 0,1 2,4 7 contenant de 5 0,1 0 1,9 6,5 l'isopropanol à 40g/L 6 0,2 0 2,4 7,3 7* 0 0 3,9 9,3 3037077 10 Tableau 3 : Concentration en solvants après fermentation en sur milieu GAPES à partir de souches mutantes obtenues par mutagénèse aléatoire au moyen de NTG. 5 Les souches mutantes qui ont fait l'objet d'un dépôt selon le traité de Budapest sont indiquées dans le tableau 3 par un astérisque. La souche 9* correspond à la souche CNCM 1-4985 déposée le 27 mai 2015 auprès de l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France). La souche 6* correspond à la souche CNCM 1-4986 déposée le 27 mai 2015 auprès de 10 l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France). La souche 7* correspond à la souche CNCM 1-4987 déposée le 27 mai 2015 auprès de l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France). Le tableau 4 donne les concentrations en solvants produits au moyen des souches mutantes 15 de Clostridium beijerinckii CNCM 1-4985, CNCM 1-4986 et CNCM 1-4987 par fermentation en milieu GAPES auquel on a remplacé le glucose par un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) à 70 g/L équivalent glucose. Après fermentation anaérobie pendant 48 heures, les teneurs en glucose sont déterminées par HPLC (Varian®) avec une colonne Aminex0HPX-87P (Biorad, 300 mm de long et 7,8 20 mm de diamètre) à 80°C. L'éluant utilisé est de l'eau avec un débit de 0,4 mL/min. Le détecteur est un refractomètre (Varian® 350 RI). Le volume d'échantillon injecté est 351..11_. Les solvants sont analysés par chromatographie en phase gazeuse comme mentionné ci-dessus. Concentration (en g/L) Rendement Solvant / Glucose Glucose Acétate Butyrate Ethanol Acétone Isopropanol Butanol va consommé . Solvant consommé Souche 44,8 3,1 3,1 0,18 0,17 6 10,1 16,4 36,7% DSMZ 6423 Souche 47,9 4,4 1,7 0,23 0,21 7,1 10,4 18 37,5% CNCM I- 4985 Souche 48,1 4,5 1,7 0,21 0,16 7 10,3 17,7 36,9% CNCM I- 4986 Souche 47,3 4 1,9 0,2 0,2 6,3 10,6 17,3 36,6% CNCM I- 4987 3037077 11 Tableau 4 : Concentration en solvants après fermentation en milieu GAPES contenant un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) (70 g/L équivalent glucose) en remplacement du glucose 5 On constate que la fermentation conduites avec les souches CNCM 1-4985, CNCM 1-4986 et CNCM 1-4987 produisent un moût de fermentation ayant des concentrations plus élevées en isopropanol et en butanol que celui produit par la souche sauvage Clostridium beijerinckii DSMZ 6423. 10 Les souches mutantes obtenues après l'étape de mutagénèse aléatoire au NTG et sélection pour leur résistance à l'isopropanol à 40 g/L ou à l'éthyl bromobutyrate à 0,5 mL/L, ont été utilisées pour une étape de brassage génétique selon le protocole décrit par Gao, X., Zhao, H., Zhang, G., He, K. & Jin, Y. (2012). Genome shuffling of Clostridium acetobutylicum CICC 15 8012 for improved production of acetone-butanol-ethanol (ABE). Curr. Microbiol., 65(2), 12832. Les souches mutantes sont d'abord amenées séparément en phase exponentielle en milieu CGM et prélevées après 3 à 4 heures de culture. Les cultures sont ensuite centrifugées pendant 10 minutes à 4000 G et lavées deux fois avec une solution de maléate de sodium 20 monohydrate n °1 (SMM 1) à pH 6,5 contenant 0,5 M de sucrose, 20 mM de maléate de sodium monohydrate, et 20 mM de MgC12. Les cellules recueillies sont mises en contact, à 35°C pendant 1h, avec une solution de maléate de sodium monohydrate n °2 qui a la composilon suivante : 0,5 M de sucrose, 20 mM de maléate de sodium monohydrate, 20 mM de MgC12, 1 g/L de cystéine, 1 g/L de 25 glutathione à laquelle on a ajouté 15 mg/mL de lysozyme. A l'issue du traitement, les cellules sont recueillies, lavées avec la solution de maléate de sodium monohydrate n°1 et centrifugées à 4000 G pendant 5 min. Les différentes populations sont ensuite mélangées dans 10mL d'une solution de maléate de sodium monohydrate n°3 (0,5 M de sucrose, 20 mM de maléate de sodium monohydrate, 20 30 mM de MgC12, 1 g/L de cystéine, 1 g/L de glutathione, 50 mM CaCl2) additionnée de 30% w/v (30g pour 100mL) de PEG 4000 et incubées pendant 20 min à une température de 35-37°C afin d'induire une fusion entre protoplastes. Les cellules fusionnées sont mises en suspension en milieu CGM et régénérées sur CGM agar pendant 40 heures. 3037077 12 Plusieurs croisements par fusion de protoplastes ont été réalisés à partir de souches mutantes traitées au NTG. Les souches génétiquement brassées ont été ensuite sélectionnées pour une tolérance accrue à l'isopropanol en milieu CGM (de 45 à 50 g/L d'isopropanol). 5 Le tableau 5 compare les concentrations en solvants du moût de fermentation, après 48 heures de fermentation, obtenues avec la souche CNCM 1-4988, déposée le 27 mai 2015 auprès de l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) et la souche sauvage Clostridium beijerinckii DSMZ 6423. Les fermentations ont été effectuées en milieu GAPES contenant du substrat amylacé hydrolysé (GRITZ ; 70 g/L 10 équivalent glucose) en remplacement du glucose. La souche CNCM 1-4988 est issue d'un seul tour de brassage génétique avec les souches CNCM 1-4986 et CNCM 1-4987. Concentration (en g/L) Rendement Solvant / Glucose Glucose Acétate Butyrate Ethanol Acétone Isopropanol Butanol Solvant consommé , totaux consomme Souche 44,8 3,1 3,1 0,18 0,17 6 10,1 16,4 36,7% DSMZ 6423 Souche 45,9 3,5 0,8 0,21 0,21 6 10,7 17,2 37,4% CNCM I- 4988 Tableau 5 : Concentration en solvants après fermentation en milieu GAPES contenant un 15 substrat amylacé hydrolysé (GRITZ ; 70 g/L équivalent glucose) en remplacement du glucose On constate que la souche CNCM 1-4988 produit plus de butanol que la souche sauvage, tout en maintenant un niveau de production en isopropanol identique. Différentes souches mutantes ont été également obtenues après deux tours de brassage génétique, puis ont été ensuite testées en fermentation anaérobie dans un milieu GAPES additionné d'un substrat amylacé hydrolysé (70 g/L équivalent glucose) en remplacement du glucose. La souche CNCM 1-5027 a été isolée de la manière décrite ci-dessous. On a réalisé une étape de brassage génétique avec la souche CNCM 1-4985 et avec une souche issue d'une mutagenèse avec une solution de NTG à 75 pg/mL puis sélectionnée 20 25 3037077 13 pour sa résistance à un milieu CGM contenant 40 g/L d'isopropanol. Après le tour de brassage, des cellules mutées ont a été sélectionnées en utilisant un milieu de sélection CGM contenant 40 g/L d'isopropanol. L'incubation dans le milieu de sélection est effectuée à une température de 35-37°C et pendant 24 heures. Au bout de 24 heures de culture, des 5 mutants présentant une résistance ont été sélectionnés et ont de nouveau subi une incubation à une température de 35-37°C et pendant 24 heures dans une milieu CGM contenant 50 g/L d'isopropanol. La souche CNCM 1-5027 est le résultat de cette seconde étape de sélection. 10 Quant à la souche CNCM 1-5028, elle est le résultat d'une étape de brassage génétique réalisée avec la souche CNCM 1-4985 et avec deux autres souches qui ont subi une étape préalable de mutagenèse avec du NTG (75 pg/mL) sélectionnées dans un milieu de sélection CGM contenant 40 g/L d'isopropanol. Comme plus haute, la souche CNCM 1-5028 est issue de deux étapes de sélection mettant en oeuvre un milieu CGM contenant 40 g/L 15 d'isopropanol puis un milieu de sélection CGM contenant 50 g/L d'isopropanol. La souche CNCM 1-5029 a été isolée en appliquant le protocole décrit ci-dessus mais dans lequel l'étape de brassage génétique a été réalisée avec deux souches issues de la mutagénèse au NTG (75 um/mL) et sélectionnées pour leur résistance dans un milieu de 20 sélection CGM contenant 40 g/L d'isopropanol. Comme précédemment, l'isolement de la souche CNCM 1-5029 a été faite en deux étapes de sélection mettant en oeuvre un milieu CGM contenant 40 g/L d'isopropanol puis un milieu de sélection CGM contenant 50 g/L d'isopropanol. 25 Le tableau 6 donne les concentrations en solvants du moût de fermentation, après 48 heures de fermentation à 37°C, obtenues avec les souches CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 et CNCM 1-5029. Les fermentations ont été effectuées en milieu GAPES dont la composition est donnée Tableau 1. 30 3037077 14 Concentration (en g/L) Glucose Butyrate Ethanol Acétone Isopropanol Butanol Rendement , Solvant / consomme Glucose Souche 18 0.77 0.24 0.09 1.54 5.69 42% DSMZ 6423 CNC M 23 0.99 0.22 0.07 1.59 4.69 29% 1-5027 CNCM 21 0.60 0.19 0.06 1.9 5.75 38% 1-5028 CNCM 22 0.66 0.22 0.08 1.81 6.24 38% 1-5029 Tableau 6 : Concentration en solvants après fermentation à 37°C en milieu GAPES contenant un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ ; 70 g/L équivalent glucose) en remplacement du glucose On observe que les souches CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 et CNCM 1-5029 sont capables de produire plus d'isopropanol que la souche de référence DSM 6423. Par ailleurs CNCM I5028 et CNCM 1-5029 permettent de produire plus de butanol par rapport à la souche DSMZ 6423. 5 10 REVENDICATIONS1. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-4985. 2. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-4986. 3. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-4987. 4. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-4988. 5. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-5027. 6. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-5028. 7. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n ° CNCM 1-5029. 8. Procédé de production d'un mélange d'isopropanol et de butanol par fermentation anaérobie, à une température comprise entre 25 et 37°C, dans un milieu de culture 3037077 16 contenant des sucres au moyen d'une bactérie selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel les sucres du milieu de culture est le 5 glucose. 10. Procédé selon les revendications 8 ou 9, dans lequel le milieu de culture contient un substrat amylacé hydrolysé. 10 11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, dans lequel le milieu de culture contient de l'acide carboxylique. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel le milieu l'acide carboxylique est de l'acide acétique ou de l'acide butyrique 15