Brevet FR3037338A1 — publié le 20161216

La présente invention se situe dans le domaine médical, et plus particulièrement dans le domaine de la cardiologie. La présente invention a en effet pour objet un procédé de greffe sur la membrane 5 chorioallantoïde vascularisée d'un oeuf fécondé d'au moins une cellule cardiaque ou d'au moins une cellule capable de se différencier en une cellule cardiaque. La présente invention a notamment pour objet un procédé de greffe d'un fragment de tissu cardiaque sur la membrane chorioallantoïde vascularisée d'un oeuf fécondé. La présente invention a également pour objet un procédé de caractérisation de l'activité d'un composé vis-à-vis d'un tissu cardiaque mettant en oeuvre un oeuf 10 fécondé sur la membrane chorioallantoïde duquel a été greffé au moins une cellule cardiaque ou d'au moins une cellule capable de se différencier en une cellule cardiaque, ou un fragment de tissu cardiaque. La présente invention a également pour objet un kit comprenant un oeuf fécondé sur lequel a été greffé au moins une cellule cardiaque, ou une cellule capable de se différencier en une cellule cardiaque, ou un fragment de tissu cardiaque. 15 La cardiologie à ce jour est démunie de modèles expérimentaux intermédiaires entre l'expérimentation in vitro (cellules isolées, culture de cardiomyocytes, greffe organotypique) et l'expérimentation in-vivo (greffe de coeur sur mammifères, y compris l'homme). Il existe donc un besoin réel de disposer de nouveaux modèles d'expérimentation in vivo. Les inventeurs ont maintenant développé un procédé de greffe d'au moins une cellule 20 cardiaque, ou une cellule capable de se différencier en une cellule cardiaque ou un fragment de tissu cardiaque sur une membrane chorioallantoïde vascularisée d'un oeuf fécondé, ledit procédé comprenant la réalisation, sur ledit oeuf fécondé, d'une microlésion en surface de la membrane chorioallantoïde (MCA) de l'oeuf, la mise en contact de ladite cellule isolée ou ledit fragment de tissu et de ladite MCA, au niveau de ladite microlésion, et l'incubation de l'oeuf ainsi traité pendant 25 au moins 48h dans une enceinte thermostatée et dans des conditions adaptées, de manière à permettre la greffe de ladite cellule isolée ou dudit fragment de tissu cardiaque sur la MCA et la vascularisation du fragment de tissu cardiaque. La greffe de cellules sur des membranes chorioallantoïdes d'oeufs fertilisés, en conditions in-ovo (dans la coquille), date de 1912 (Murphy J., Rous P., 1912). Beaucoup plus récemment, 30 certaines cellules tumorales ont été greffées in ovo (Deryugina, E. I and Quigley P., 2008). Ce n'est que plus récemment que la culture hors de l'oeuf (ex-ovo) a été utilisée (Dunn B E and Boone M.A., 1976). La membrane chorioallantoïde est également largement utilisée pour l'étude d'activité anti angiogéniques de molécules (Ribatti D., 2008). Les oeufs sont également utilisés pour la production 35 de vaccin pour l'homme (Goodpasture, Woodruff and Buddingh, 1931). Cependant, depuis plus de 3037338 2 cent ans, date de la première publication de greffe in ovo, aucune équipe n'a eu l'idée de greffer des fragments de coeur sur des MCA. Un procédé selon l'invention de greffe d'au moins une cellule cardiaque ou au moins une cellule capable de se différencier en une cellule cardiaque, ou un fragment de tissu cardiaque sur la membrane chorioallantoïde d'un oeuf fécondé, se situe à mi-chemin entre les deux techniques citées précédemment, fournissant de par la vascularisation du greffon une alternative fiable pour tester de nouvelles voies thérapeutiques en toute sécurité avant passage au stade clinique. Un procédé selon l'invention permet notamment de greffer des fragments myocardiques sur la membrane chorioallantoïde (MCA) d'un oeuf fécondé : une fois implantés, ces greffons se vascularisent spontanément et retrouvent leur fonction pulsatile au bout de 2 à 5 jours. Un procédé selon l'invention permet également de greffer des cellules cardiaques isolées néonatales et adultes, ou des cellules capables de se différentier en cellules cardiaques, sur la membrane chorioallantoïde (MCA) d'un oeuf fécondé. Après la greffe, les cellules cardiaques isolées peuvent former un tissu cardiaque. De même, après la greffe, les cellules isolées capables de se différencier en cellules cardiaques se différencient et peuvent former un tissu cardiaque. Le tissu cardiaque ainsi formé se vascularise et acquiert une fonction pulsatile. Il est alors possible de tester, par analyse morphologique ou biologique, les effets de différents traitements sur ces tissus cardiaques implantés. Ce modèle évite le recours aux animaux de laboratoire et permet une observation visuelle directe des implants, créant ainsi une alternative aux techniques de greffe in vivo couramment utilisées. Ce modèle est utilisable pour des cellules ou tissus humains, d'où son grand intérêt, en effet les inventeurs ont montré qu'il n'existe pas de barrière d'espèce s'opposant la greffe de tissus de mammifères. Il représente donc un modèle alternatif fiable entre le tube à essai (culture de cellules cardiaques ou greffe organotypique) et la greffe d'organes entiers sur porcs ou grands primates, tout en s'exonérant des contraintes légales liées à l'expérimentation animale. Les inventeurs ont amélioré la technique de culture hors de l'oeuf pour obtenir des viabilités comparables à celles des cultures in-ovo. Contrairement aux cellules tumorales, qui sont très prolifératives, les cellules cardiaques sont des cellules hautement différenciées et spécialisées avec, au stade adulte et en l'état des connaissances, une capacité proliférative quasiment inexistante. La membrane chorioallantoïde permet de greffer des fragments de tissus cardiaques capables de se revasculariser après implantation et de retrouver spontanément une fonction pulsatile. La culture ex ovo permet une grande accessibilité à la MCA, favorisant l'observation dynamique directe des greffons et des études morphologiques quantitatives (écho DOPPLER) et biologiques qu'aucun autre modèle existant ne propose. L'injection de produits à visée thérapeutique dans la veine omphalo- mésentérique de neuf permet d'en étudier à la fois les propriétés pharmacologiques, la stabilité et l'innocuité. 3037338 3 De plus, les autres modèles existants présentent l'inconvénient majeur de produire des cellules cardiaques aux propriétés (électro)physiologiques modifiées, rendant délicate l'interprétation des données obtenues sur des cultures à long terme. Un procédé selon l'invention permet également de résoudre différentes difficultés techniques rencontrées lors de la culture de 5 cellules, telles que les précurseurs de cellules cardiaques, notamment concernant le phénotype cellulaire, la pleine fonctionnalité de ces cellules et l'organisation en tissu cardiaque fonctionnel. L'utilisation diceufs fertilisés, autorisée par la Food and Drug Administration (FDA, guideline HFD-240, HFM- 40, HFZ-200, June 2006. Guidance for Industry), n'entre pas dans la législation des animaux de laboratoire Article R214-90 du Code Rural et de la Pêche Maritime) et 10 se trouve donc exonérée des lourdes contraintes liées à l'expérimentation animale. L'invention, peu coûteuse à mettre en oeuvre (1.50 euros/ceuf de poule/ expérience), autorise l'implantation de deux greffons au moins par oeuf, Les principaux avantages d'un procédé selon l'invention sont : juridiquement la MCA n'est pas considérée comme un modèle animal, le modèle est non-immun pendant les 18 premiers jours 15 du développement, le micro-environnement est antiseptique, des observations directes et dynamiques sont possibles, en effet l'organisation des cellules isolées en un tissu fonctionnel, battant et/ou contractile est rapide. Ce modèle permet des études à relativement long terme, pour observer notamment des substances dont le passage et/ou l'accumulation dans un organisme vivant est lent, mais également à court terme, pour des phénomènes aigus, tels que par exemple observer 20 l'effet de drogues, ou étudier des mécanismes et des voies de signalisation biologiques. De plus, la MCA est assez résistante pour recevoir des cellules isolées ou des fragments de tissus, même après retrait de la membrane ectodermique. Il est important de procéder au bon moment du développement de l'oeuf à une lésion suffisante pour favoriser l'implantation du greffon sans toutefois que cette lésion ne devienne 25 rédhibitoire, ce qui ferait échouer la greffe. En particulier, dans un aspect particulier d'un procédé selon l'invention de greffe d'au moins une cellule cardiaque, ladite cellule faisant partie d'un tissu cardiaque, il est important de procéder à ladite microlésion à un stade de développement de l'oeuf d'au moins 9 jours, afin que la vascularisation de la MCA soit suffisante pour permettre au tissu cardiaque greffé de devenir pulsatile et/ou contractile. 30 Par ailleurs, si la taille de l'oeuf de poule ne permet que l'implantation que de petits fragments, la taille des implants est cependant suffisante pour y mener des études physiologiques. Toutefois, pour mener à bien des tests de laboratoire, tels la faculté de thérapies nouvelles consistant à réparer ou régénérer le muscle cardiaque après un infarctus, ou encore l'innocuité de nouvelles molécules, l'invention constitue une avancée notoire dans un domaine aujourd'hui démuni 35 de techniques alternatives. Il apparaîtra aisément à l'homme du métier que le procédé de greffe de cellules isolées ou d'un fragment de tissu cardiaque sur la membrane chorioallantoïde d'un oeuf 3037338 4 fécondé selon l'invention peut être mis en oeuvre sur un oeuf de taille plus importante qu'un oeuf de poule, et notamment sur un oeuf d'autruche. L'invention sera maintenant décrite de manière détaillée à l'aide d'exemples destinés à l'illustrer sans la limiter, diverses modifications pouvant y être apportées sans sortir du cadre 5 général de l'invention. La présente invention a pour objet un procédé de greffe d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différentier en cellules cardiaque, sur la membrane chorioallantoïde vascularisée d'un oeuf fécondé, ledit procédé comprenant la mise en oeuvre des 10 étapes suivantes : - la culture en conditions ex ovo de rceuf fécondé jusqu'à un stade de développement d'au moins 8 jours, - la réalisation d'une microlésion en surface de la membrane chorioallantoïde (MCA) de l'ceuf fécondé, 15 - la mise en contact d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différentier en cellules cardiaque, et de ladite MCA au niveau de ladite microlésion, et - l'incubation de rceuf fécondé ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée, à une température comprise entre 36°C et 39°C et avec un degré d'hygrométrie compris entre 80% et 90%. 20 Dans un procédé selon l'invention, la greffe d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différentier en cellules cardiaque, désigne l'implantation de ladite cellule, ou greffon, sur la membrane chorioallantoïde vascularisée d'un oeuf fécondé. L'expression « oeuf fécondé » désigne également un oeuf fertilisé. L'expression « membrane chorioallantoïde » est un terme anatomique qui désigne la 25 membrane extra-embryonnaire qui résulte de la fusion de la membrane de la vésicule allantoïde et de la membrane séreuse de Von Baer (chorion). La membrane chorioallantoïde comprend trois couches, ou feuillets : l'ectoderme, attaché à la membrane de la coquille, le mésoderme, enrichi en vaisseaux sanguins et l'endoderme, en contact avec la cavité allantoïde. Par « conditions ex ovo », on entend un oeuf fécondé, cultivé complétement hors de sa 30 coquille après transfert de rceuf 48h après le début de l'incubation dans un récipient concave, de préférence des coupelles de pesées en polystyrène. Selon un mode de réalisation particulier, ledit récipient concave dont le couvercle est fabriqué en mettant face à face 2 coupelles reliées par du ruban adhésif, un peu comme une moule. Selon un aspect particulier d'un procédé de greffe d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au 35 moins une cellule capable de se différencier en cellule cardiaque sur la membrane chorioallantoïde vascularisée d'un oeuf fécondé, ladite cellule cardiaque est une cellule cardiaque isolée. Selon un 3037338 5 aspect plus particulier d'un procédé selon l'invention, ladite cellule cardiaque isolée est un cardiomyocyte. Selon un aspect particulier d'un procédé de greffe d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différencier en cellule cardiaque sur la MCA vascularisée d'un oeuf 5 fécondé, ladite cellule capable de se différencier en cellule cardiaque est une cellule isolée. Par « cellule capable de se différencier en une cellule cardiaque », on désigne une cellule indifférenciée, une cellule totipotente, une cellule multipotente, une cellule souche, une cellule dite « iPS » (Induced Plunpotent Cells, telle qu'obtenue selon un procédé décrit dans EP 1 970 446), une cellule précurseur d'une cellule cardiaque ou une cellule progénitrice d'une cellule cardiaque. L'homme du 10 métier spécialiste du domaine technique de la cardiologie et des cellules cardiaques déterminera aisément les critères phénotypiques et/ou génotypiques permettant de sélectionner une cellule isolée capable de se différencier en une cellule cardiaque, appréciée notamment par l'expression de marqueurs protéiques spécifiques ou encore de la fonction contractile caractéristique de la cellule cardiaque. L'homme du métier spécialiste du domaine technique de la cardiologie et des cellules 15 cardiaques déterminera également les conditions de culture et l'addition de facteurs de différentiation, permettant de conduire à la différentiation de ladite cellule en une cellule cardiaque. Les critères phénotypiques et/ou génotypiques permettant de sélectionner une cellule isolée capable de se différencier en une cellule cardiaque, appréciée notamment par l'expression de marqueurs protéiques spécifiques ou encore de la fonction contractile caractéristique de la cellule cardiaque. 20 Selon un aspect plus particulier, l'invention a donc pour objet un procédé caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la culture, en conditions ex ovo, de l'oeuf fécondé jusqu'à un stade de développement de l'oeuf d'au moins 8 jours, 25 - la réalisation d'une microlésion en surface de membrane chorioallantoïde (MCA) de l'ouf, - la mise en contact d'au moins une cellule cardiaque isolée et de ladite MCA, au niveau de ladite microlésion, et - l'incubation de l'oeuf ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée à une température comprise entre 36°C et 39°C, de préférence entre 36,5°C et 38,5°C, de 30 préférence entre 37°C et 38°C et plus préférentiellement à 37,8°C et avec un degré d'hygrométrie compris entre 80% et 90% et plus préférentiellement de 84%. Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a donc pour objet un procédé caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la culture, en conditions ex ovo, de l'oeuf fécondé jusqu'à un stade de développement de 35 l'oeuf d'au moins 8 jours, 3037338 6 - la réalisation d'une microlésion en surface de membrane chorioallantoïde (MCA) de rceut - la mise en contact d'au moins une cellule isolée capable de se différentier en cellule cardiaque et de ladite MCA, au niveau de ladite microlésion, et 5 - l'incubation de l'oeuf ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée à une température comprise entre 36°C et 39°C, de préférence entre 36,5°C et 38,5°C, de préférence entre 37°C et 38°C et plus préférentiellement à 37,8°C et avec un degré d'hygrométrie compris entre 80% et 90% et plus préférentiellement de 84%. 10 Selon un autre aspect particulier d'un procédé de greffe d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différencier en une cellule cardiaque sur la MCA vascularisée d'un oeuf fécondé, ladite cellule cardiaque est une cellule cardiaque d'un fragment de tissu cardiaque. Selon cet aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé caractérisé en ce qu'il 15 comprend les étapes suivantes : - la culture en conditions ex ovo de l'oeuf fécondé jusqu'à un stade de développement de l'oeuf d'au moins 9 jours, - la réalisation d'une microlésion en surface de la MCA de l'oeuf fécondé, - la mise en contact d'un fragment de tissu cardiaque et de ladite MCA au niveau de ladite 20 microlésion, et - l'incubation de l'oeuf fécondé ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée, à une température comprise entre 36°C et 39°C et avec un degré d'hygrométrie compris entre 80% et 90%. L'expression « un stade de développement de l'oeuf d'au moins 8 jours » désigne un oeuf 25 ayant été cultivé pendant au moins huit jours après la fécondation. Cette expression inclut un oeuf ayant atteint un stade de développement de huit jours (J8), neuf jours (J9), dix jours (J10), onze jours (J11), douze jours (J12), treize jours (J13), quatorze jours (J14), quinze jours (J15), seize jours (J16), dix-sept jours (J17) ou dix-huit jours (J18). L'expression « un stade de développement de l'oeuf d'au moins 9 jours » désigne un oeuf ayant été cultivé pendant au moins neuf jours après la 30 fécondation. Cette expression inclut un oeuf ayant atteint un stade de développement de neuf jours (J9), dix jours (J10), onze jours (J11), douze jours (J12), treize jours (J13), quatorze jours (J14), quinze jours (J15), seize jours (J16), dix-sept jours (J17) ou dix-huit jours (J18). Selon un aspect particulier, dans un procédé de greffe sur la MCA d'un oeuf fécondé selon l'invention, l'oeuf fécondé est cultivé en conditions ex ovo jusqu'à un stade de développement d'au 35 moins 10 jours et d'au plus 12 jours, soit J10, J11 ou J12. La densité des vaisseaux et la pression 3037338 7 vasculaire aux stades J10 à J12 est favorable à la revascularisation du greffon, dans le cas d'un tissu cardiaque. Selon un aspect plus particulier, la présente invention a pour objet un procédé de greffe d'un fragment de tissu cardiaque sur la MCA vascularisée d'un oeuf fécondé, ledit fragment de tissu 5 cardiaque consistant en une biopsie de tissu cardiaque, et selon un aspect plus particulier, un fragment de tissu cardiaque comprenant aussi du tissu péricardique Dans un procédé de greffe sur la MCA vascularisée d'un oeuf fécondé, selon l'invention, la culture, en conditions ex ovo, de l'oeuf fécondé est réalisée dans des conditions standard, à savoir : - la température est de préférence comprise entre 36°C et 39°C, de préférence entre 10 36,5°C et 38,5°C, de préférence entre 37°C et 38°C et plus préférentiellement à 37,7°C. - le degré d'hygrométrie est de préférence compris entre 30% et 90%, de préférence entre 80% et 85%, et plus préférentiellement de 84%. Dans un procédé de greffe d'au moins une cellule sur la MCA vascularisée d'un oeuf fécondé, selon l'invention, l'incubation de l'oeuf après réalisation de la microlésion pendant au 15 moins 48h dans une enceinte thermostatée et dans des conditions adaptées permet la greffe dudit fragment de tissu cardiaque sur la MCA et la vascularisation dudit fragment. Le procédé de greffe sur la MCA d'un oeuf fécondé selon l'invention comprend l'application d'une microlésion dans la zone d'implantation choisie, ladite microlésion correspondant à une lésion superficielle capable d'entraîner une micro-hémorragie et/ou à une 20 lésion peu étendue. Dans un procédé de greffe d'un fragment de tissu cardiaque sur la MCA d'un oeuf fécondé, selon l'invention, la taille de ladite microlésion est légèrement supérieure à la taille du greffon, soit de préférence la taille du greffon + 1 mm. La taille de la microlésion est choisie de telle sorte que la microlésion ne provoque pas de mort par hémorragie de l'oeuf embryonné, et dépend de l'oeuf et de 25 la densité de vascularisation de la MCA. La surface de la microlésion appliquée est comprise entre 0,5 cm2 et 16 cm2.De préférence, l'application est suivie et/ou est concomitante de l'absorption du sang qui s'écoule du fait de la lésion des micro-capillaires. Selon un aspect particulier d'un procédé de greffe sur la MCA d'un oeuf fécondé, selon l'invention, ladite microlésion est réalisée par le retrait du feuillet ectodermique de l'oeuf fécondé 30 dans la zone d'implantation choisie. Selon un aspect plus particulier d'un procédé de greffe sur la MCA d'un oeuf fécondé, selon l'invention, la microlésion est réalisée par le retrait du feuillet ectodermique de l'oeuf fécondé, selon l'une des méthodes suivantes : - le feuillet ectodermique est retiré en utilisant un papier souple : ledit papier souple est 35 capable d'épouser les irrégularités de la surface de la MCA. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, le feuillet ectodermique est retiré en appliquant sur la MCA un papier 3037338 8 absorbant de type « papier buvard », l'application de papier souple présente l'avantage d'absorber le sang qui s'écoule lors de la micro-hémorragie créée, - le feuillet ectodermique est retiré en utilisant un objet abrasif : ledit objet abrasif est capable de créer l'abrasion du feuillet ectodermique par grattage. Selon un aspect particulier d'un 5 procédé selon l'invention, le feuillet ectodermique est retiré en mettant en contact la MCA avec un objet abrasif, et en grattant, ledit objet abrasif est choisi de préférence parmi : une pointe d'aiguille métallique pour seringue et une pointe de cône pour pipette, - le feuillet ectodermique est retiré en utilisant une substance absorbante, capable de coller à la surface de la MCA, le feuillet ectodermique est ensuite retiré par roulage. Selon un aspect 10 particulier d'un procédé selon l'invention, le feuillet ectodermique est retiré avec une substance absorbante, et de préférence une pointe de coton tige. Selon un aspect particulier d'un procédé de greffe sur la MCA d'un oeuf fécondé, selon l'invention, ladite microlésion est réalisée par le retrait du feuillet ectodermique de l'oeuf fécondé, dans la zone d'implantation choisie, concomitante ou immédiatement suivie d'une étape permettant 15 l'absorption du sang écoulé qui résulte de la microhémorragie induite par le retrait du feuillet ectodermique. De préférence, l'absorption du sang est réalisée par l'application d'une substance absorbante, de préférence en utilisant du papier buvard, ou en utilisant une pipette monocanal, sans toucher à la MCA. Selon un autre aspect particulier d'un procédé de greffe sur la MCA d'un oeuf fécondé, 20 selon l'invention, dans lequel un fragment de tissu cardiaque est greffé, ledit tissu cardiaque est appliqué sur la MCA de manière à ce que le tissu cardiaque proprement dit soit en contact avec la MCA et que le péricarde ne soit pas en contact avec la MCA. Une telle disposition a pour effet technique de favoriser la vascularisation du greffon. Dans un procédé selon l'invention, l'oeuf est maintenu à une température constante grâce à 25 une incubation dans une enceinte thermostatée, dans laquelle la température intérieure est comprise de préférence entre 36°C et 39°C, de préférence entre 36,5°C et 38,5°C, de préférence entre 37°C et 38°C et préférentiellement de 37,7°C. Dans un procédé selon l'invention de greffe d'un fragment de tissu cardiaque sur une MCA vascularisée d'un oeuf fécondé, l'oeuf est incubé dans une enceinte thermostatée, dans laquelle le 30 degré d'hygrométrie est compris de préférence entre 80% et 90%, plus préférentiellement de 84%. Selon un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet un procédé de greffe sur la MCA d'un oeuf fécondé, caractérisé en ce que lors de toutes les manipulations réalisées hors de l'enceinte thermostatée l'oeuf est posé sur un support chauffant. Les inventeurs ont en effet montré qu'il est important que la température de l'oeuf soit 35 maintenue constante, non seulement lors des périodes d'incubation mais également lors des manipulations ayant lieu à l'extérieur de l'enceinte thermostatée. L'homme du métier souhaitant 3037338 9 maintenir constante la température de l'oeuf lors des manipulations pourra choisir un support chauffant permettant de maintenir la température de l'oeuf à une valeur optimale. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, lors des manipulations l'oeuf est posé sur une couverture chauffante 5 Selon un aspect particulier, dans un procédé de greffe d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différentier en cellule cardiaque sur la MCA d'un oeuf fécondé, selon l'invention, ledit oeuf fécondé est un oeuf d'oiseau, ledit oeuf d'oiseau est choisi de préférence parmi : un oeuf de poule et un oeuf d'autruche. Selon un autre aspect particulier, dans un procédé de greffe d'au moins une cellule 10 cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différentier en cellule cardiaque sur la MCA d'un oeuf fécondé, selon l'invention, la cellule cardiaque, la cellule capable de se différentier en cellule cardiaque ou le fragment de tissu cardiaque provient d'un animal vertébré, de préférence ledit animal vertébré est choisi parmi : 1) les oiseaux, de préférence les poules, et 2) les mammifères, de préférence les singes, les porcs, les souris, les rats et l'Homme. 15 Selon un autre aspect particulier, dans un procédé de greffe d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différentier en cellule cardiaque sur la MCA d'un oeuf fécondé, selon l'invention, ladite cellule cardiaque, ladite cellule capable de se différentier en cellule cardiaque ou ledit fragment de tissu cardiaque est sain, soit exempt de pathologie connue. Selon un autre aspect particulier, dans un procédé de greffe d'au moins une cellule cardiaque, ou 20 d'au moins une cellule capable de se différentier en cellule cardiaque sur la MCA d'un oeuf fécondé, selon l'invention, ladite cellule cardiaque, ladite cellule capable de se différentier en cellule cardiaque ou ledit fragment de tissu cardiaque est atteint d'une pathologie, de préférence une pathologie cardiaque. 25 Selon un autre aspect particulier, la présente invention a également pour objet un procédé de caractérisation de l'activité d'un composé vis-à-vis du tissu cardiaque, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - l'obtention d'un oeuf fécondé greffé avec au moins une cellule cardiaque, ou au moins une cellule capable de se différentier en tissu cardiaque, sur la MCA d'un oeuf fécondé, 30 ledit procédé comprenant la mise en oeuvre des étapes suivantes : la culture en conditions ex ovo de l'oeuf fécondé jusqu'à un stade de développement d'au moins 8 jours, la réalisation d'une microlésion en surface de la MCA de l'oeuf fécondé, la mise en contact d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différentier en cellules cardiaque, et de ladite MCA au niveau de ladite microlésion, et 35 l'incubation de l'oeuf fécondé ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée, jusqu'à formation du tissu cardiaque, 3037338 10 - l'injection du composé dans ledit oeuf fécondé greffé, de préférence par une injection intraveineuse, - l'observation dudit tissu cardiaque, - la caractérisation de l'activité dudit composé. 5 Selon un autre aspect particulier, la présente invention a également pour objet un procédé de caractérisation de l'activité d'un composé vis-à-vis du tissu cardiaque, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - l'obtention d'un oeuf fécondé greffé avec un fragment de tissu cardiaque sur la MCA d'un oeuf fécondé, ledit procédé comprenant la mise en oeuvre des étapes suivantes : la 10 culture en conditions ex ovo de l'oeuf fécondé jusqu'à un stade de développement d'au moins 9 jours, la réalisation d'une microlésion en surface de la MCA de l'oeuf fécondé, la mise en contact d'un fragment de tissu cardiaque et de ladite MCA au niveau de ladite microlésion, et l'incubation de l'oeuf fécondé ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée, 15 - l'injection du composé dans ledit oeuf fécondé greffé, de préférence par une injection intraveineuse, - l'observation dudit tissu cardiaque, - la caractérisation de l'activité dudit composé. Les inventeurs ont en effet montré qu'un composé pouvait être injecté dans un oeuf fécondé 20 sur lequel a été greffé du tissu cardiaque, obtenu notamment par un procédé selon l'invention, et qu'il était possible d'observer l'activité dudit composé vis-à-vis dudit fragment, et à partir de cette observation de caractériser l'activité dudit composé vis-à-vis du tissu cardiaque. L'activité cardiaque peut notamment être caractérisée selon les paramètres suivants : - présence ou absence de marqueurs biochimiques, tels que des protéines spécifiquement 25 exprimées par les cellules cardiaques, - présence ou absence de marqueurs biologiques ou fonctionnels, notamment de l'activité contractile, de l'activité automatique, de l'activité électrique globale ou de l'activité électrique cellulaire, telle que la présence d'un potentiel d'action notamment, cartographie de l'activité électrique cellulaire au niveau du tissu formé, analyse de 30 l'activité biologique par des indicateurs fluorescents (calcium, potentiel, stress oxydant par exemple). Selon un aspect plus particulier, la présente invention a également pour objet un procédé de caractérisation de l'activité d'un composé vis-à-vis du tissu cardiaque, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : 3037338 11 a) l'obtention d'un oeuf fécondé greffé avec une cellule cardiaque, une cellule capable de se différentier en cellule cardiaque, du tissu cardiaque, obtenu par un procédé de greffe d'au moins une cellule ou d'un fragment de tissu cardiaque, notamment selon l'invention, b) l'injection du composé dans ledit oeuf fécondé greffé, de préférence par une injection 5 intraveineuse, c) l'observation dudit tissu cardiaque, d) la comparaison des résultats de l'observation de l'étape c) avec les résultats de l'observation de tissu cardiaque d'un oeuf fécondé greffé avec du tissu cardiaque n'ayant pas reçu ledit composé, et 10 e) la caractérisation de l'activité dudit composé. En effet, la comparaison de l'activité du tissu cardiaque ayant été greffé sur un oeuf auquel le composé a été administré avec l'activité du tissu cardiaque greffé sur un oeuf n'ayant pas reçu le composé, ou tissu cardiaque de référence, permet de caractériser les propriétés dudit composé. Selon un aspect plus particulier, la présente invention a également pour objet un procédé de 15 caractérisation de l'activité d'un composé vis-à-vis du tissu cardiaque, dans lequel le tissu cardiaque est observé par une méthode intra-vitale, choisie de préférence parmi : une échographie Doppler et/ou une observation microscopique, des méthodes d'imagerie avec utilisation de sondes fluorescentes ou autre procédé permettant de mesurer la contraction et le rythme. Dans un procédé selon l'invention, l'échographie Doppler est réalisée de préférence avec une sonde haute fréquence, 20 l'utilisation d'une échographie doppler avec une sonde de 33 MHz n'avait jamais été utilisée pour des objets aussi petits que les greffons tels qu'utilisés dans la présente invention. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'observation microscopique est réalisée de préférence au moyen d'un microscope optique à fluorescence. L'homme du métier comprendra aisément l'intérêt de l'utilisation d'une méthode intra-vitale et choisira parmi les méthodes existantes celle qui lui 25 paraîtra la plus appropriée selon la nature de la caractérisation souhaitée. Selon un autre aspect plus particulier, la présente invention a également pour objet un procédé de caractérisation de l'activité d'un composé vis-à-vis du tissu cardiaque, dans lequel le tissu cardiaque est observé par une méthode analytique invasive, de préférence choisie parmi une analyse histologique et/ou une analyse biochimique. Dans ce cas, l'homme du métier choisira parmi 30 les méthodes existantes celle qui lui paraîtra la plus appropriée selon la nature de la caractérisation souhaitée. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un oeuf fécondé greffé, obtenu par un procédé selon l'invention, pour caractériser la toxicité cardiaque d'un composé. 35 L'invention a également pour objet l'utilisation d'un oeuf fécondé greffé, obtenu par un procédé selon l'invention, pour caractériser l'activité un composé vis-à-vis du tissu cardiaque. 3037338 12 L'invention a également pour objet un kit comprenant un oeuf fécondé greffé obtenu, ou susceptible d'être obtenu, par un procédé comprenant les étapes suivantes : - l'obtention d'un oeuf fécondé en conditions ex ovo, et l'incubation de l'oeuf fécondé pendant au moins 9 jours, 5 - la réalisation d'une microlésion en surface de membrane chorioallantoïde (MCA) de l'oeuf, - la mise en contact dudit fragment de tissu et de ladite MCA, au niveau de ladite microlésion, et - l'incubation de l'oeuf ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée à 10 une température comprise entre 36°C et 39°C, de préférence entre 36,5°C et 38,5°C, de préférence entre 37°C et 38°C et plus préférentiellement à 37,8°C et avec un degré d'hygrométrie compris entre 80% et 90%, de préférence de 84%. L'invention a également pour objet un kit comprenant un oeuf fécondé greffé, obtenu par un procédé selon l'invention. 15 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et figures suivants. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1: photographies du système ex ovo. 20 Figures 2A et 2B: photographies du greffon entièrement revascularisé dans les états de diastole et de systole. Figure 2A : systole, figure 2B : diastole. Figure 3 : Vascularisation très tardive du greffon partiellement infarci. La partie revascularisée devient pulsatile. Figure 4: photographie d'une injection de la nanoémulsion dans les veines de l'oeuf fécondé. 25 EXEMPLES Exemple 1 : Les oeufs fécondés sont incubés dans des conditions standard de température (37,5°C) et d'humidité (60%) pendant deux jours puis transférés hors de leur coquille dans des coupelles de 30 pesée stériles en polystyrène (culture ex-ovo). Après un total de douze jours d'incubation à 37°C et 84% d'humidité, les greffes peuvent être réalisées comme suit : Donneurs : Après ouverture de la cage thoracique de souris ou de rat adultes, les coeurs sont clampés, prélevés et transférés dans un milieu de culture DEM-glucose maintenu à 30°C. Les oreillettes sont retirées et les ventricules coupés soit frontalement, soit sagittalement ou soit 35 transversalement, en fonction des expérimentations envisagées. 3037338 13 Receveurs : Les oeufs fécondés âgés de 12 jours sont maintenus à l'extérieur de l'incubateur à température constante de 38°C grâce à des couvertures chauffantes, ceci afin d'éviter la mort de l'embryon par hypothermie. La membrane chorioallantoïde est délicatement lésée au papier Whatman sans cendre pour créer des micro-hémorragies qui faciliteront la re-vascularisation du 5 fragment cardiaque. Les greffons sont alors déposés sur ces zones lésées, face péricardique à l'extérieur, et le site d'implantation choisi de telle sorte que l'implant, qui se déplacera au cours de la croissance de l'embryon de poulet, reste visible à la fin de l'expérience. Après la greffe, l'oeuf est replacé en incubation pendant 48 heures, sans manipulation, afin de favoriser la néo-vascularisation du greffon. 10 A l'issue de cette période, les oeufs sont observés tous les jours à la loupe binoculaire. Les greffons qui se sont correctement implantés sur la MCA ont un rythme autonome d'environ 60 pulsations/min. Ceux dont les pulsations ne sont pas apparentes ne sont pas éliminés car une vascularisation tardive est possible avec ce modèle. Au terme des quatre premières expérimentations indépendantes, 12 implants sur 18 étaient 15 revascularisés et 8 d'entre eux ont retrouvé leur fonction pulsatile au plus tard 5 jours après implantation. Il faut noter que, dans les conditions expérimentales testées, l'une des expériences avec 3 implants a été réalisée à J8 et n'a donné aucun résultat positif Exemple 2: 20 Les oeufs fécondés de White Leghorn poulet ont été reçues de Haas écloserie (Produits avicoles Hass, Kaltenhouse - France), et immédiatement nettoyés avec de l'eau froide distillée, imbibée sur une feuille de sopalin pliée en 4 (1 face par oeuf nettoyé) puis désinfectés avec une solution de chlorhexidine aqueuse à 0,2 % (Gilbert, France) imbibées sur une feuille de sopalin pliée en 4, avant d'être stocké à 12-13 ° C jusqu'à utilisation, dans un réfrigérateur ventilé dont le 25 flux d'air arrive directement sur un récipient remplit d'eau et non directement sur les oeufs stockés. L'incubation commence quand les oeufs ont été placées dans une couveuse d'oeufs (Fiem MG140 -200, Guanzate - Italie) à 37,5 ° C et 60% d'humidité, équipée avec des portoirs basculants automatiques et un humidificateur froid à ultrasons automatique (Necchi N7600, Bremed - Italie, ou équivalent compatible avec l'automatisme de la couveuse). 30 Après 42 heures d'incubation (Hamburger - stade Hamilton 11) les oeufs ont été transférés dans des coupelles de pesées (89 x 89 x 25) mm stérilisées à l'alcool (Dominique Dutcher SAS, Brumath - France) dont le couvercle a été fait avec une coupelle inversée, maintenue avec un ruban adhésif transparent sur un bord, et placée dans un incubateur à 37,5°C et 80% d'humidité, sans circulation d'air mécanique. L'humidité est assurée par la présence sur le plancher chauffant de 35 l'incubateur d'un récipient (170 x 260 x 25) mm rempli d'eau. Les oeufs fraîchement ouverts ne sont pas du tout manipulés pendant 48h dès leur mise en incubation dans l'incubateur. 3037338 14 La survie, dans ces conditions varie de 53 à 75% au jour 14 après incubation (elle est au maximum de 90%) selon la qualité initiale des oeufs. 1. Implantation sur la MCA: Les implants de fragments tissulaires ne peuvent être réalisés qu'à partir du moment où la 5 MCA est richement vascularisée et où la pression vasculaire est suffisante pour irriguer l'implant qui sera posé dessus, c'est-à-dire pas avant J10-J11. Contrairement aux implants de suspensions cellulaires qui peuvent être réalisés dès le 7' jour de développement de rceuf. La date d'implantation de fragments est un compromis entre « n'être pas trop tardif » pour bénéficier d'une plus longue période possible de greffe (jusqu'à J18) « mais pas trop précoce » pour 10 permettre la vascularisation des implants de se réaliser. Le jour de l'implantation, l'implant est d'abord préparé avant d'être implanté sur la MCA au dernier moment. Le coeur de rat au stade néonatal (1-2 jours après la naissance), ou d'embryon de poulet, est extrait puis incubé dans un milieu DMEM (ou équivalent) + héparine (20 U/ml) à 37°C si 15 implantation immédiate ou 4°C si transport sur le lieu de l'implantation. Sans héparine dans le DMEM, le pourcentage de greffon revascularisé est plus faible. Le coeur peut être aussi massé entre les doigts pour retirer les globules rouges et les éléments figurés du sang qui s'y trouve et qui peuvent conduire à un thrombus défavorable à la revascularisation du greffon. Les oreillettes sont retirées à l'aide de pince fine, et les ventricules coupés en petits dés 20 d'environ 1.5 mm de côté au scalpel (lame n° 24). Les fragments seront implantés surfaces sectionnées vers la MCA. La zone d'implantation de la MCA est choisie en fonction de sa riche vascularisation. Le feuillet ectodermique est retiré : 1/ soit à l'aide d'un papier « buvard », assez souple pour épouser les irrégularités de la surface de la 25 MCA, et suffisamment épais pour pouvoir absorber la micro-hémorragie qui va résulter du retrait du feuillet ectodermique, 2/ soit à l'aide d'un coton tige qui sera roulé sur la zone à implanter jusqu'à obtenir des micro-hémorragie de la MCA. L'implant est délicatement posé sur la zone hémorragique, surfaces sectionnées vers la 30 MCA. Cependant, l'intensité de l'hémorragie n'est pas mesurable, mais elle est un des paramètres liés à la réussite de la vascularisation de l'implant. Une fois implanté, rceuf est remis dans l'incubateur le plus délicatement possible (pour ne pas déplacer le fragment nouvellement implanté) et rceuf laissé sans être déplacé, ni même ouvert pendant 48h suivantes. 35 Afin de minimiser la mortalité des oeufs fécondés pendant de longues périodes d'observation ou de manipulations, des coupelles de pesées ont été placées sur les couvertures 3037338 15 chauffantes pour maquettes de voitures télécommandées (GTTW AC740, GT -Power Tech Co., Ltd; . Shenzhen, Chine) réglées à 40°C. 2. Observation du greffon : Les oeufs de poule greffés avec des fragments de tissu cardiaque greffés sur la MCA ont été 5 maintenus en culture pendant 8 jours. Des analyses par échographie Doppler ont montré une vascularisation fonctionnelle dans le tissu greffé, même non pulsatile, qui présentait des vaisseaux intra-tissulaires. La fonctionnalité des allogreffes et des xénogreffes a été enregistrée sur vidéo. Au terme de neuf expérimentations indépendantes, le pourcentage de fragments cardiaques 10 vascularisés est de 80% et le pourcentage de fragments pulsatiles est voisin de 50%. Conclusion : La xénogreffe de tissu cardiaque sur la MCA apparaît être un modèle prometteur pour tester l'effet d'agents actifs injectés par voie générale sur un greffon sain (effet toxique) mais aussi sur des greffons pathologiques (effet thérapeutique), mais aussi comme modèle d'ischémie-reperfusion et de revascularisation, mais encore comme modèle de réparation ou de 15 régénération du tissu cardiaque, enfin comme modèle pour la mise au point d'un pacemaker biologique. L'autre avantage de la xénogreffe de tissu cardiaque sur la CAM, notamment par rapport aux dispositifs in vitro existants des cellules est de présenter un modèle où le tissu cardiaque se vascularise se rapprochant ainsi d'une situation physiologique qui est très différente d'une culture in vitro classique. Il faut remarquer que, depuis plus de 100 ans que la MCA d'ceufs fertilisés de poule 20 est utilisée, il n'y a jamais eu, à la connaissance des inventeurs, de travaux publiés relatifs à des xénogreffes de coeur. Exemple 3: Les oeufs fécondés sont incubés dans des conditions standard de température (37,5°C) et 25 d'humidité (60%) pendant deux jours puis transférés hors de leur coquille dans des coupelles de pesée stériles en polystyrène (culture ex-ovo). Les oeufs fécondés âgés de 8 jours ou de 15 jours sont maintenus à l'extérieur de l'incubateur à température constante de 38°C grâce à des couvertures chauffantes, ceci afin d'éviter la mort de l'embryon par hypothermie. La membrane chorioallantoïde est délicatement lésée. 30 Des cardiomyocytes isolés de rat ou de souris, obtenus par isolement enzymatique, sont alors délicatement déposés sur ces zones lésées, et le site d'implantation choisi de telle sorte que l'implant, qui se déplacera au cours de la croissance de l'embryon de poulet, reste visible à la fin de l'expérience. Après la greffe, les oeufs sont replacés en incubation pendant 48 heures, sans manipulation. 3037338 16 A l'issue de cette période, les oeufs sont observés tous les jours à la loupe binoculaire. Les pulsations sont apparentes, démontrant l'organisation des cardiomyocytes en véritable tissu cardiaque. Les pulsations des cellules peuvent être synchrones ou asynchrones 5 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Murphy. J.B. and Rous P. (1912) "The Behavior of Chicken Sarcoma Implanted in the Developing 10 Embryo." J. Exp. Med. 15(2); 119-132. Deryugina, E. I. and Quigley J.P. (2008) "Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis " Histochemistry and Cell Biology 130(6), 1119-1. Dunn, B.E. and Boone M.A. (1976). "Growth of the Chick Embryo In vitro Poultry" Science. 55 15 1067-1071. Ribatti D. (2008). "Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis" Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 270: 191- 224. Goodpasture E.W.A.M., Woodruff and Buddingh G. J. (1931) "The Cultivation of Vaccine and Other Viruses in the Chorioallantoic Membrane of Chick Embryos" Science 74: 371-372. 20 REVENDICATIONS1. Procédé de greffe d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différentier en cellule cardiaque, ladite cellule étant choisie parmi : une cellule indifférenciée, une cellule totipotente, une cellule multipotente, une cellule souche, une cellule dite iPS, une cellule précurseur d'une cellule cardiaque et une cellule progénitrice d'une cellule cardiaque, à l'exception d'une cellule souche embryonnaire d'origine humaine, sur la membrane chorioallantoïde vascularisée d'un oeuf d'oiseau fécondé, ledit procédé comprenant la mise en oeuvre des étapes suivantes : - la culture en conditions ex ovo de l'oeuf fécondé, jusqu'à un stade de développement de l'oeuf d'au moins 8 jours, - la réalisation d'une microlésion en surface de la membrane chorioallantoïde (MCA) de l'oeuf fécondé, - la mise en contact d'au moins une cellule cardiaque, ou d'au moins une cellule capable de se différentier en cellules cardiaque, et de ladite MCA, au niveau de ladite microlésion, et - l'incubation de l'oeuf fécondé ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée, à une température comprise entre 36°C et 39°C et un degré d'hygrométrie compris entre 80% et 90%. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite cellule cardiaque est une cellule cardiaque isolée ou une cellule cardiaque d'un fragment de tissu cardiaque. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la culture en conditions ex ovo de l'oeuf fécondé jusqu'à un stade de développement de l'oeuf d'au moins 9 jours, - la réalisation d'une microlésion en surface de la MCA de l'oeuf fécondé, - la mise en contact d'un fragment de tissu cardiaque et de ladite MCA au niveau de ladite microlésion, et - l'incubation de l'oeuf fécondé ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée, à une température comprise entre 36°C et 39°C et un degré d'hygrométrie compris entre 80% et 90%. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la microlésion est réalisée par le retrait du feuillet ectodermique de l'oeuf fécondé, dans la zone d'implantation choisie. 3037338 18 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le feuillet ectodermique est retiré selon l'un des procédés suivants : - retrait à l'aide d'un papier souple capable d'épouser les irrégularités de la surface de la MCA, de préférence du papier buvard, 5 - retrait à l'aide d'un objet abrasif, de préférence capable de créer l'abrasion du feuillet ectodermique par grattage, ledit objet abrasif étant choisi de préférence parmi : une pointe d'aiguille métallique pour seringue et une pointe de cône pour pipette, - retrait à l'aide d'une substance absorbante, capable de coller à la surface de la MCA et de retirer par roulage le feuillet ectodermique, de préférence une pointe de coton tige. 10 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite cellule cardiaque ou ladite cellule capable de se différentier en cellule cardiaque provient d'un animal vertébré choisi parmi : les oiseaux, de préférence les poules, et les mammifères, de préférence les singes, les porcs, les souris, les rats et l'Homme 15 7. Procédé de caractérisation de l'activité d'un composé vis-à-vis du tissu cardiaque, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) l'obtention d'un oeuf fécondé greffé avec du tissu cardiaque, obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, 20 b) l'injection du composé dans ledit oeuf fécondé greffé, de préférence par une injection intraveineuse, c) l'observation dudit tissu cardiaque, d) la comparaison des résultats de l'observation de l'étape c) avec les résultats de l'observation de tissu cardiaque d'un oeuf fécondé greffé avec du tissu cardiaque et n'ayant 25 pas reçu ledit composé, et e) la caractérisation de l'activité dudit composé. 8. Procédé selon la revendication 7, dans laquelle le tissu cardiaque est observé par une méthode d'observation choisie parmi : une méthode intra-vitale, de préférence écho Doppler et/ou 30 microscopie, des méthodes d'imagerie avec utilisation de sondes fluorescentes ou autre procédé permettant de mesurer la contraction et le rythme, et une méthode analytique invasive, de préférence une analyse histologique et/ou une analyse biochimique. 9. Utilisation d'un oeuf fécondé greffé, obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, pour caractériser la toxicité cardiaque d'un composé ou pour caractériser l'activité un composé vis-à-vis du tissu cardiaque. 3037338 19 10. Kit comprenant un oeuf fécondé greffé, obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à6.