Brevet FR3045045A1 — publié le 20170616

STÉRÉO-ISOMÈRE DE CONFIGURATION DE LA BROMADIOLONE, COMPOSITION ET APPÂT RODONTICIDE LE COMPRENANT ET PROCÉDÉ DE LUTTE CONTRE DES RONGEURS CIBLES NUISIBLES L'invention concerne un stéréo-isomère de configuration de 5 la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. L'invention concerne donc le domaine technique de la lutte contre le développement de populations de rongeurs cibles nuisibles. Il est connu d'utiliser des poisons sous forme d'appâts 10 rodonticides contre des rongeurs cibles nuisibles. On sait de EP 2 090 164 que la bromadiolone est un anticoagulant de deuxième génération agissant à simple dose. On connait aussi un appât comprenant de la bromadiolone, la proportion de la bromadiolone dans l'appât étant de 50 ppm. Un tel appât est susceptible d'être consommé par des 15 animaux autres que des rongeurs cibles nuisibles lorsqu'il est mis à la disposition de rongeurs cibles nuisibles. Il peut être consommé directement (consommation primaire) par des animaux domestiques ou des animaux de compagnie. Il peut aussi être consommé accidentellement par des humains. Une telle consommation peut produire chez ces animaux domestiques, chez ces animaux de compagnie ou 20 chez des humains un empoisonnement qui peut être létal. En outre, une fraction de la bromadiolone de ces appâts rodonticides peut être ingérée (consommation secondaire) par des animaux -notamment par des oiseaux- prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé un tel appât rodonticide ou par des animaux charognards de 25 rongeurs nuisibles morts d'avoir consommé un tel appât rodonticide. Cette consommation secondaire est susceptible d'entrainer à terme la mort de ces animaux prédateurs ou charognards qui peuvent être des animaux -notamment des oiseaux- appartenant à des espèces protégées. L'invention vise donc à pallier ces inconvénients en 30 proposant un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de 3045045 2 configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont efficaces pour contrôler des populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement d'animaux non-cibles -notamment des animaux domestiques, des animaux de compagnie ou des humains- consommant accidentellement un tel appât rodonticide. L'invention vise aussi à pallier ces inconvénients en proposant un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont efficaces pour contrôler des populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement secondaire d'animaux domestiques (animaux de compagnie ou d'élevage) ou sauvages -par exemple des renards ou des oiseaux- prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé de l'appât rodonticide ou charognards de rongeurs cibles nuisibles morts empoisonnés. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dont la mise en oeuvre est en accord avec les règles de bon usage -notamment vis à vis de la protection des oiseaux, et en particulier des rapaces-. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont respectueux de l'environnement, de la santé humaine et des animaux non cibles -notamment des oiseaux, et en particulier des rapaces-. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de 30 configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un 3045045 3 procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui permettent de n'utiliser pour contrôler une population de rongeur cibles nuisibles qu'une faible dose de bromadiolone. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de 5 configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont susceptibles de pouvoir être utilisés pour lutter contre des rongeurs cibles nuisibles résistants à des appâts connus de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. 10 L'invention vise donc à proposer une alternative à des appâts rodonticides connus. Pour ce faire, l'invention concerne un stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E1, de la bromadiolone présentant par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre 15 stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention t1 de valeur telle que t1 Ledit énantiomère El selon l'invention est donc obtenu sous une forme séparée des énantiomères dudit diastéréoisomère D3,4 et sous une 3045045 7 forme séparée dudit énantiomère E2 dudit diastéréoisomère D1,2. Il est possible de réaliser une telle séparation par chromatographie liquide à haute pression sur colonne chirale LUX® Cellulose-1 (00E-4458-B0, phenomenex®, Le Pecq, France). Le cas échéant, il est possible de réaliser successivement plusieurs 5 étapes de chromatographie liquide à haute pression sur colonne chirale aux fins d'obtenir la quantité dudit énantiomère El recherchée et le niveau de pureté souhaité. Il est aussi possible de réaliser une telle séparation par chromatographie liquide à haute pression sur colonne chirale préparative, c'est-à-dire sur une colonne de chromatographie de plus grandes dimensions -notamment de diamètre 10 intérieur supérieur à 2 mm- et dans laquelle la phase stationnaire présente une granulométrie supérieure à 3 ium. On obtient ledit énantiomère E1 purifié et isolé des autres stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone par élimination de la phase mobile de la fraction collectée et contenant ledit énantiomère E1. Il n'était pas connu antérieurement de pouvoir séparer les 15 stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone et les énantiomères dudit diastéréoisomère D1,2. Dans ces conditions expérimentales, les énantiomères (E1 et E2) dudit diastéréoisomère D1,2 sont séparés et purifiés par chromatographie liquide à haute pression. Dans ces conditions chromatographiques, on sépare aussi et 20 on purifie les énantiomères dudit diastéréoisomère D3,4. L'un des énantiomères, dit énantiomère E3, dudit diastéréoisomère D3,4 est élué, dans les conditions de chromatographie décrites ci-dessus, le troisième par rapport aux quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone. Dans les conditions décrites ci-dessus, ledit énantiomère E3 présente un temps de rétention (t3) d'une 25 valeur comprise entre 6,0 min et 6,4 min. L'autre énantiomère, dit énantiomère E4, dudit diastéréoisomère D3,4 est élué, dans les conditions de chromatographie décrites ci-dessus, le quatrième par rapport aux quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone. Dans les conditions décrites ci-dessus, ledit énantiomère E4 présente un temps de rétention (t4) d'une valeur comprise entre 30 8,3 min et 9,0 min de sorte que les énantiomères E3 et E4 dudit diastéréoisomère 3045045 8 D3,4 sont séparés et purifiés par chromatographie liquide à haute pression sur colonne chirale dans ces conditions. L'invention concerne donc aussi un procédé chromatographique de séparation des stéréo-isomères de configuration de la 5 bromadiolone -notamment des énantiomères E1 et E2 dudit diastéréoisomère D12 et des énantiomères E3 et E4 dudit diastéréoisomère D3,4- de la bromadiolone. L'invention concerne donc un tel procédé chromatographique d'obtention dudit énantiomère E1 selon l'invention, dans lequel : - on choisit une colonne de chromatographie liquide à haute pression 10 de dimensions 150 x 2 mm, et renfermant une phase stationnaire chirale constituée de particules de cellulose tris(3,5-diméthylphénylcarbamate), lesdites particules étant d'une taille moyenne de 3 ium et présentant une taille moyenne de pores de 1000 À ; - on choisit, à titre de phase mobile liquide, un mélange formé 15 d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant 0,1% en volume d'acide formique (B), avec un rapport volumique A/B de 80/20 ; - on réalise la séparation à température ambiante ; - on introduit en tête de la colonne de chromatographie une composition liquide contenant dudit énantiomère El en solution dans de 20 l'acétonitrile, puis , - on fait passer la phase mobile liquide avec un débit de 0,25 mL/min dans la colonne de chromatographie et à la suite de la composition liquide, et on collecte en sortie de colonne une fraction de la phase mobile comprenant ledit énantiomère El, séparément des stéréo-isomères de configuration de la 25 bromadiolone distincts dudit énantiomère E1, et avec un temps de rétention t1 de valeur telle que t1 250,1 et m/z 525,1 -> 181 correspondant au signal de la bromadiolone. Un exemple de chromatogramme est présenté en figure 1. Les valeurs des temps de rétention de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone sont de : 30 - pour l'énantiomère El dudit diastéréoisomère D1,2, t1 = 4,3 min ; - pour l'énantiomère E2 dudit diastéréoisomère D1,2, t2 = 5,0 min ; 3045045 27 - pour l'énantiomère E3 dudit diastéréoisomère D3,4, t3 = 6,3 min, et ; - pour l'énantiomère E4 dudit diastéréoisomère D3,4, t4 = 8,8 min. Les valeurs de temps de rétention t1, t2, t3 et t4 sont susceptibles de varier selon les conditions chromatographiques. Cependant, en 5 tout état de cause, dans ces conditions (choix de ces phases stationnaire et mobile), l'ordre d'élution des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone reste inchangé. À titre indicatif, les valeurs des temps de rétention de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone peuvent varier avec une variation de quelques degrés Celsius de la température de la 10 colonne de chromatographie. Pour ledit énantiomère El, le temps de rétention (t1) peut varier entre 4,1 min et 4,4 min. Pour ledit énantiomère E2, le temps de rétention (t2) peut varier entre 4,8 min et 5,2 min, Pour ledit énantiomère E3, le temps de rétention (t3) peut varier entre 6,0 min et 6,6 min. Pour ledit énantiomère E4, le temps de rétention (t4) peut varier entre 8,3 min et 9,0 min. 15 Extraction de la bromadiolone de foies de rats traités à la bromadiolone Homogénéisation de l'échantillon de foie On pèse avec précision de l'ordre de 0,525 g (±0,025 g) de foie de rat que l'on place dans un tube en polypropylène de 50 mL On ajoute 20 10 mL d'acétone et on soumet la suspension à une homogénéisation au moyen d'un homogénéisateur/disperseur Ultra-Turrax® pendant une durée de l'ordre de 30 sec. On rince la tige de l'homogénéisateur/disperseur à l'eau chaude puis 2 fois avec 20 mL d'acétone dans un tube en polypropylène. On centrifuge l'homogénat pendant 5 min à une vitesse de centrifugation de 3000 rpm (rotation 25 par minute). On collecte et on transvase le surnageant dans un tube à essai. On soumet l'échantillon à une évaporation sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C de façon à former un extrait sec. Élimination des lipides Dans le tube contenant l'extrait sec, on ajoute 1 mL 30 d' acétonitrile de façon à solubiliser l'extrait sec. On lave la solution d'acétonitrile 2 fois successivement avec 1 mL d'hexane. L'extrait débarrassé 3045045 28 des lipides est séché sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C, puis repris avec 0,5 mL de méthanol et solubilisé par agitation sous vortex. On ajoute ensuite 0,5 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q). L'échantillon est homogénéisé sous vortex. 5 Extraction de la bromadiolone sur phase solide (« SPE, Solid Phase Extraction ») On fait passer 1 mL de dichlorométhane (CH2Ct2), puis 1 mL de méthanol (CH3OH), puis 1 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q) sur une cartouche Oasis HLB 1cc (WAT094225, Waters). On dépose ensuite l'extrait de 10 foie débarrassé des lipides (1mL Me0H/H20 Milli-Q) et contenant la bromadiolone en tête de la cartouche préalablement conditionnée. L'extrait de foie pénètre dans la cartouche par gravité au contact de la phase solide de la cartouche. On dépose en tête de cartouche 1 mL de solution de lavage formée de méthanol (CH3OH) et d'eau ultra-pure (H2O) en proportion volumique de 90/10. 15 On sèche la cartouche par aspiration sous vide connectée en partie basse de la cartouche. On dépose ensuite en tête de cartouche 1 mL de solution d'élution formée de dichlorométhane (CH2C 12) et de méthanol (CH3OH) en proportion volumique de 90/10 et on collecte en bas de cartouche un éluat comprenant la bromadiolone. On évapore le solvant de l'éluat sous un flux d'azote (N2) à la 20 température de 40°C. On reprend l'échantillon dans avec 0,5 mL d'acétonitrile (NC-CH3) et on filtre la solution d'acétonitrile contenant la bromadiolone sur filtre 0,2 ium. Rémanence hépatique des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone chez le rat 25 On administre par gavage ("per os") à des rats SD « Sprague Dawley » mâles et femelles, âgés de 8 semaines et pesant de l'ordre de 200 g, un mélange de diastéréoisomères (diastéréoisomère D12 et diastéréoisomère D3,4) de la bromadiolone en solution dans un mélange d'huile végétale et de DMSO à 5 %. La proportion molaire dudit diastéréoisomère D1,2 30 est de 56% et la proportion molaire dudit diastéréoisomère D3,4 est de 44%. 304 504 5 29 On administre (à JO) de la solution de gavage de façon que la quantité de bromadiolone ingérée par chaque rat soit de l'ordre de 13 mg par kilogramme de rat. Pour éviter l'hémorragie, les rats gavés sont traités quotidiennement par administration par voie sous cutanée d'une dose de vitamine 5 K1 (à titre d'antidote vis-à-vis de l'hémorragie) à raison de 0,1U pour 200g de poids de rat vif. À J1 (J+1), J3 (J+3) et J7 (J+7) après le gavage, on euthanasie 4 rats préalablement anesthésiés à l'isoflurane, on prélève le foie des rats euthanasiés puis on extrait la bromadiolone du foie et on dose la quantité de 10 chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone par analyse par chromatographie liquide haute pression sur une colonne chirale comme décrit ci-dessus. On mesure l'aire sous les pics du chromatogramme obtenu et on quantifie chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone par comparaison avec une courbe d'étalonnage. 15 Les résultats sont représentés en figure 2. L'énantiomère El est représenté par des colonnes blanches, l'énantiomère E2 est représenté par des colonnes noires, l'énantiomère E3 est représenté par des colonnes à hachures obliques et l'énantiomère E4 est représenté par des colonnes à hachures horizontales. L'énantiomère El présente la rémanence dans le foie des rats la plus 20 élevée des quatre énantiomères E1, E2, E3 et E4. Cette propriété fait de l'énantiomère El le candidat préférentiel pour la réalisation d'un appât rodonticide faiblement dosé en agent rodonticide -en particulier pour son utilisation dans un procédé « multi-feeding »-. Pouvoir anticoagulant de chaque stéréo-isomère de 25 configuration de la bromadiolone On administre par gavage à JO à des rats de laboratoire (OFA, Sprague Dawley de 200 g) mâles, soit : - une composition comprenant de l'énantiomère El à raison de 1,5 mg dudit énantiomère El par kilogramme de rat, soit ; 30 - une composition comprenant de l'énantiomère E2 à raison de 1,5 mg dudit énantiomère E2 par kilogramme de rat, soit ; 3045045 30 - une composition comprenant de l'énantiomère E3 à raison de 1,5 mg dudit énantiomère E3 par kilogramme de rat, soit ; - une composition comprenant de l'énantiomère E4 à raison de 1,5 mg dudit énantiomère E4 par kilogramme de rat. 5 Sur ces rats, on prélève du sang à J1, J3, J7 et J14 et on réalise une mesure du temps de coagulation (temps de Quick, exprimé en secondes) du plasma au moyen du kit "Neoplastine CI Determination of Prothrombin Time" (Diagnostica Stago, Asnière, France) par mesure sur un appareil Thrombotimer option 2 plus (Behnk Electronik, Norderstedt, 10 Allemagne). Les résultats obtenus sont donnés en figure 3 dans laquelle : - les barres d'histogramme blanches correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère El selon l'invention ; 15 - les barres d'histogramme noires correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère E2 ; - les barres d'histogramme à hachures obliques correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère E3, et ; - les barres d'histogramme à hachures horizontales correspondent au 20 temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère E4. A titre indicatif, la valeur normale du temps de coagulation de rats non traités est de l'ordre de 10 à 20 secondes. L'ingestion d'une dose de 1,5 mg par kilogramme de rat dudit énantiomère El selon l'invention est suffisante pour maintenir un effet 25 anticoagulant jusqu'à J7. Rémanence hépatique de chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone On prélève le foie des rats traités ci-dessus aux fins d'analyse comparative du pouvoir anticoagulant des stéréo-isomères de 30 configuration de la bromadiolone puis on extrait la bromadiolone du foie et on dose la quantité de chacun des stéréo-isomères de configuration de la 3045045 31 bromadiolone par analyse par chromatographie liquide haute pression sur une colonne chirale comme décrit ci-dessus. On mesure l'aire sous les pics du chromatogramme obtenu et on quantifie chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone par comparaison avec une courbe d'étalonnage. On dose les 5 énantiomères E1, E2, E3 et E4 de la bromadiolone présents dans le foie des rats. On exprime la rémanence hépatique de chaque énantiomère en microgramme (iug) d'énantiomère par gramme (g) de foie de rat. Les résultats sont représentés en figure 4 dans laquelle : - la barre d'histogramme blanche correspond à la rémanence dudit 10 énantiomère El selon l'invention dans le foie de rats traités avec ledit énantiomère Ei ; - la barre d'histogramme noire correspond à la rémanence dudit énantiomère E2 dans le foie de rats traités avec ledit énantiomère E2 ; - la barre d'histogramme à hachures obliques correspond à la 15 rémanence de l'énantiomère E3 dudit diastéréoisomère D3,4 de la bromadiolone dans le foie de rats traités avec ledit énantiomère E3, et ; - la barre d'histogramme hachurée horizontalement correspond à la rémanence de l'énantiomère E4 dudit diastéréoisomère D3,4 de la bromadiolone dans le foie de rats traités avec ledit énantiomère E4. 20 Ledit énantiomère El selon l'invention présente la plus forte rémanence hépatique parmi les énantiomères de la bromadiolone. Cette propriété fait de l'énantiomère El le candidat préférentiel pour la réalisation d'un appât rodonticide comprenant une faible proportion de substance rodonticide -en particulier pour son utilisation dans un procédé « multi-feeding »-. 25 Il va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et applications. En particulier, une composition, un appât rodonticide et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles sont sujets à des infinités de variantes tant dans la formulation de l'appât que dans les modes de mise en oeuvre du procédé. 30 REVENDICATIONS1/ - Stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère El, de la bromadiolone présentant par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention t1 de valeur telle que t1