Brevet FR3038616A1 — publié le 20170113

Procédé de purification et de concentration d'acides nucléiques La présente invention concerne un procédé pour purifier et concentrer des acides nucléiques susceptibles d'être présents dans un échantillon et des matériaux pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. L'invention comprend également des kits de diagnostic permettant de mettre en oeuvre un tel procédé. Le risque bactérien d'origine hydrique a été historiquement le plus grave et le plus fréquent. En Europe, au 19ème siècle, plusieurs épidémies mortelles ont été transmises par l'eau (typhoïde, choléra). L'eau est un milieu favorable au développement des bactéries et des parasites. Les déjections animales ou les rejets des matières fécales d'origine humaine ont été les principales sources de contamination bactérienne de l'eau. Ce risque a été considérablement réduit par la mise en place de procédés de désinfection des eaux et des installations de traitement des eaux usées, mais il n'a pas disparu. L'eau reste aujourd'hui à l'origine de la mort de 3 à 10 millions de personnes par an dans le monde, contaminées par des bactéries. Le contrôle de la qualité microbiologique de l'eau repose sur la recherche d'indicateurs de contamination fécale, qui est la contamination bactérienne la plus répandue. Elle peut être aisément suivie par la présence d'une bactérie témoin : Escherichia cou ou E. co/i, germe habituel de la flore intestinale des animaux et des hommes, qui se retrouve dans les matières fécales. La présence d'E. co/i dans l'eau révèle une contamination fécale. Les contaminations de ce type se traduisent par des diarrhées, ou des gastro- entérites (diarrhées + vomissements + fièvre) plus ou moins graves, mais susceptibles d'engager le pronostic vital pour les personnes les plus fragiles. Selon une estimation de l'Institut de veille sanitaire, des eaux non conformes à la réglementation pourraient être la cause de 10 à 30 % du total de gastro- entérites aiguës observées dans les secteurs desservis par ces eaux. Le cas le plus fréquent de contamination est celui d'une mise en contact accidentelle d'eaux usées et de l'eau destinée à la distribution. Une autre 3038616 2 situation classique consiste à relier, par erreur, les installations de distribution d'eau et les installations de traitement d'eaux usées ou les réseaux d'eau non potables. Une autre situation à risque est liée aux remises en service de canalisations, après arrêt de plusieurs semaines, les eaux stagnantes 5 constituant un milieu favorable au développement de films bactériens propices aux contaminations. Parmi les critères de qualité de l'eau distribuée, le paramètre bactériologique mérite la plus grande vigilance car il reflète le risque immédiat pour la santé du consommateur. La réglementation impose la recherche d'indicateurs de 10 contamination et les contrôles sont réalisés par les DDASS ou les ARS. L'identification de bactéries dans l'environnement est indispensable pour la santé publique. Par exemple, parmi les autres bactéries responsables de nombreuses pathologies, on trouve les bactéries de genre Legionella, qui peuvent être trouvées dans des sites hydriques naturels et artificiels et plus 15 particulièrement dans les réseaux d'eau chaude sanitaire, responsables notamment de la légionellose et de la fièvre de Pontiac. Il existe plusieurs espèces de Legionella, mais l'espèce L. pneumophila semble avoir une virulence plus importante que les autres espèces puisqu'elle est en cause dans plus de 90% des cas de légionellose. Elle est à l'origine de pneumonies sévères 20 entraînant une insuffisance respiratoire et/ou un état de choc et une insuffisance polyviscérale pouvant entraîner le décès. L'infection est due à l'inhalation de microgouttelettes contenant la bactérie. En outre la présence de Legionella pneumophila dans un réseau d'eau peut avoir des conséquences importantes pour l'exploitation allant jusqu'à l'arrêt du circuit 25 en passant par des opérations longues et coûteuses de nettoyage et désinfection pour la remise en état des circuits. On peut également citer à titre d'exemples des bactéries que l'on trouve dans l'eau destinée à la consommation humaine et qui sont responsables de problèmes sanitaires, Cryptosporidium sp., les cyanobactéries et de leurs toxines, Pseudomonas aeruginosa et Bacillus sp. 30 L'identification de bactéries dans l'environnement est donc indispensable pour la santé publique. Pour évaluer la présence et le nombre de cellules bactériennes telles que les 3038616 3 légionnelles plusieurs approches sont possibles. Une première approche, sur laquelle s'appuie par exemple la méthode normalisée AFNOR T 90-431 (dernière révision de novembre 2014), repose sur la mise en culture des germes et le dénombrement des unités formant colonie. 5 Toutefois, cette méthode basée sur la culture des germes nécessite plusieurs jours pour établir un diagnostic. Une deuxième approche consiste à marquer la bactérie notamment L. pneumophila ou E. coli par un anticorps fluorescent spécifique et à quantifier la bactérie par cytométrie (Philippe Lebaron; Applied And Environnemental 10 Microbiology (2004), p 1651-1657 ; Paul E. Johnson et al. International Society for Analytical Cytology Cytometry Part A 69A:1212-1221 (2007)). Cette méthode présente l'avantage de permettre de dénombrer les bactéries en quelques heures et d'apprécier la viabilité des cellules dénombrées mais elle présente de nombreux inconvénients notamment 15 le risque plus ou moins élevé de réactions croisées avec d'autres cellules bactériennes et l'absence de normalisation. Enfin une troisième approche permet des réponses plus spécifiques. L'utilisation de sondes nucléiques marquées permet une détection très spécifique après hybridation avec leurs cibles. L'inconvénient réside dans le faible nombre de 20 cibles par cellules qui rend cette technique peu sensible et mal adaptée à la détection de micro-organismes peu concentrés. Depuis quelques années, cet inconvénient a été surmonté par l'utilisation des techniques d'amplification génique en temps réel, par exemple par réaction en chaîne par polymérisation (PCR) ou par amplification d'acides nucléiques par séquence (NASBA, nucleic 25 acid sequence-based amplification) [Stolhaug A. & Bergh K. (2006) ; Appl. Environ. Microbiol., Vol. 72(9) ; 6394-6398]. Toutefois la plupart des techniques nécessitent d'abord une préparation de l'échantillon lourde par filtration, centrifugation ou par précipitation. Or, les filtres ou culots générés sont respectivement souvent saturés ou compacts et contiennent de nombreuses 30 molécules et particules qui interfèrent fortement avec les procédés biologiques d'analyses notamment les amplifications géniques. Il est donc souvent nécessaire de diluer très fortement les échantillons pour éviter les inhibitions 3038616 4 des réactions d'amplification, et éviter des faux résultats négatifs. Dans les trois méthodes, le seuil de sensibilité de la détection des cellules bactériennes dans les eaux n'est pas inférieur à quelques dizaines de cellules par litre. Or, dans le cas des pathogènes susceptibles de coloniser les circuits 5 d'eaux, les eaux industrielles ou environnementales ou l'air ceux-ci sont présents à de très faibles concentrations. Il est donc important de disposer d'un test à la fois sensible et rapide permettant de détecter des contaminations, notamment bactériennes, à de faibles concentrations. Des dispositifs miniaturisés de détection de microorganismes ont été mis au 10 point. Liu et al. décrivent une biopuce pour la détection de bactéries au sein de laquelle sont effectuées les étapes suivantes : la capture immunomagnétique des bactéries cibles ; la pré-concentration des bactéries et leur purification ; la lyse des bactéries ; l'amplification par PCR des acides nucléiques obtenus et la détection basée sur des puces à ADN électrochimiques [Liu et al. Anal. Chem. 15 (2004) 76, 1824-1831]. De par la capture immunomagnétique des bactéries cibles, ce dispositif ne permet qu'une détection spécifique, visant une bactérie particulière. La demande internationale W02008/097342 décrit un procédé de liaison et 20 d'isolement d'une molécule biologique, notamment d'un acide nucléique, comprenant la mise en contact d'un mélange susceptible de contenir ladite molécule avec un milieu de séparation ayant un polyion, notamment un polycation, lié de manière non covalente à sa surface, lequel polyion est destiné se lier à ladite molécule biologique. Le procédé nécessite une première solution 25 de lavage pour éliminer les impuretés du milieu de séparation, une seconde solution de lavage pour éliminer le polyion et une solution d'élution pour éluer la molécule biologique. Il a été également montré que certains polymères échangeurs d'ions, comme la 30 polyéthylèneimine (PEI), permettent la capture de molécules chimiques (Ziebarth J. et Wang Y., Biophys J. 2009;97(7):1971-83). Toutefois, le besoin persiste de disposer d'un procédé qui présente les 3038616 5 avantages suivants : - être techniquement simple et rapidement réalisable, - avoir une forte capacité de purification et de concentration pour permettre l'analyse de tout échantillon et permettre la détection de traces d'acides 5 nucléiques qui proviennent notamment d'ADN génomique ou d'ARN humain, bactérien ou viral, - avoir un fort rendement de récupération, - permettre une élimination des contaminants et inhibiteurs de PCR qui peuvent être présent dans l'eau analysée, 10 - avoir un faible coût, - être automatisable, - ne pas mettre en oeuvre de composés chimiques dangereux pour l'environnement et la santé humaine. 15 Au cours de leurs travaux, les inventeurs ont mis au point un procédé de capture de fragments d'acides nucléiques à partir d'un échantillon à analyser, qui permet de satisfaire toutes ces exigences en un minimum d'étapes mettant en oeuvre des techniques facilement automatisables. 20 Au sens de la présente invention, les termes «capture» et «complexation» sont équivalents. En effet, conformément à l'invention, les fragments d'acides nucléiques (AN) contenus dans l'échantillon à analyser sont capturés ou complexés par fixation sur des polycations formant un complexe AN-polycations stable dans l'eau. 25 Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé pour fixer et purifier des fragments d'ADN simple brin ou double brin. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape de récupération des fragments d'ADN élués. Les fragments d'ADN élués sont identifiées et/ou quantifiés par 30 toute technique connue de l'homme du métier, telle que, de façon non limitative : la réaction en chaîne par polymérisation (PCR), l'amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (qPCR), le transfert d'ADN 3038616 6 (southern blotting), le séquençage, le pyroséquençage, les analyses de polymorphisme d'un seul nucléotide (SNP, single-nucleotide polymorphism), les empreintes génétiques (fingerprinting) et les digestions avec des enzymes de restriction. 5 Selon un second aspect, l'invention concerne un procédé pour capturer et purifier des fragments d'ARN à partir d'un échantillon. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape de récupération des fragments d'ARN élués. Les fragments d'ARN élués sont utilisables pour des applications prévues en aval telles que, de façon non limitative : de la 10 transcription inverse, de la RT-PCR, du séquençage, du transfert d'ARN (northern blotting). Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation du procédé de l'invention pour la détection de bactéries, de virus, de parasites et d'acides nucléiques 15 eucaryotes. Selon encore un dernier aspect, l'invention concerne un kit pour purifier et concentrer au moins un fragment d'acides nucléiques à partir d'un échantillon susceptible d'en contenir en utilisant le procédé selon l'invention. 20 Description détaillée La présente invention porte sur un procédé pour purifier et concentrer au moins un fragment d'acides nucléiques d'une taille supérieure à 20 pb susceptible d'être présent dans un échantillon, le procédé comprenant les étapes 25 suivantes : a) mise en contact d'au moins un desdits fragments d'acides nucléiques avec une solution d'un polymère polycationique en vue de former un complexe entre ledit au moins un fragment d'acides nucléiques et le polymère polycationique, 30 b) fixation du complexe obtenu à l'étape a) sur une résine échangeuse de cations par agitation lente ou douce et 3038616 7 c) élution dudit au moins un fragment d'acides nucléiques de la résine échangeuse de cations par application d'une force d'agitation, ledit procédé étant caractérisé en ce que les étapes a) à c) du procédé sont réalisées à un pH compris entre environ 6,0 et 10,0, avantageusement entre 5 environ 7,5 et 9,5, et de manière particulièrement avantageuse entre environ 8 et 9, le pH de chacune de ces étapes pouvant être identique ou différent l'un de l'autre. Ainsi selon l'invention, les étapes a) à c) peuvent soit, être réalisées toutes les 3 au même pH, soit deux des étapes être réalisées au même pH et la troisième à 10 un pH différent, soit chaque étape être mise en oeuvre à un pH différent. Selon l'invention on entend par fragment d'acides nucléiques un fragment d'ADN simple brin, un fragment d'ADN double brin, de l'ADN génomique ou de l'ARN. Conformément à l'invention, on entend par échantillon, par exemple, un 15 prélèvement d'eau industrielle, d'eau environnementale ou d'eau potable, destinée à la consommation humaine ou animale, ou encore un prélèvement d'un liquide biologique dans lequel on souhaite déterminer la présence d'un microorganisme ou détecter la présence d'une séquence spécifique d'ADN ou d'ARN d'eucaryote. Comme liquide biologique, on peut citer un prélèvement de 20 sang, d'urine, de salive ou de plasma. Un échantillon peut également être obtenu par dissolution ou mise en suspension d'un échantillon solide, par exemple un prélèvement tissulaire ou un échantillon de plante. L'extraction des fragments d'acides nucléiques à partir des échantillons est 25 réalisée par toute technique connue de l'homme du métier permettant de libérer et d'extraire les acides nucléiques contenus dans lesdits échantillons. Conformément à la présente invention, le polymère polycationique est utilisé sous forme d'une solution, c'est à dire en phase homogène ; le polymère 30 polycationique peut être sélectionné dans le groupe constitué par la polylysine linéaire, les dendrimères greffés de lysine (DGL), la polyéthylènimine (PEI), la 3038616 8 polyamidoamine (PAMAM) (Tang et al., Bioconjug. Chemistry, (1996), 7, 703714 ; Plank et al., Hum. Gene Ther. 1999, 10, 319-332), le chitosane, la polyarginine, la polyornithine, le sulfate de protamine et le polybrène. De manière préférée, le polymère polycationique est choisi dans le groupe 5 comprenant la poly-L-lysine (PLL), des dendrimères greffés de lysine (DGL), le polyéthylènimine (PEI) ou la polyamidoamine (PAMAM). Selon un mode particulier de la présente invention, le polymère polycationique est une polyéthylènimine (PEI). De préférence, la PEI présente un poids 10 moléculaire moyen compris entre 1 et 1000 kDa. De manière encore plus préférée, la PEI utilisée est une PEI de 750 kDa comme par exemple le produit commercialisé sous le nom LUPASOL® P, BASF. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, le polymère 15 polycationique est une poly-L-lysine (PLL) d'un poids moléculaire moyen se situant entre 1 kDa et 1000 kDa, avantageusement entre 10 et 30 kDa, encore plus avantageusement égal à 20 kDa. De manière particulièrement préférée, la poly-L-lysine est utilisée à une quantité comprise entre 0,1 et 10 mg, de préférence à une quantité d'environ 1mg par échantillon. 20 Selon un autre mode de réalisation, le polymère polycationique est un dendrimère greffé de polylysine (DGL). Au sens de la présente invention, on entend par «dendrimères greffés de polylysine» des polymères à base de D- ou de L-lysine tels que ceux décrits dans la demande internationale 25 W02006/114528. Ces dendrimères sont soit constitués uniquement de lysine, on parle dans ce cas d'homopolylysines, soit constitués de plus de 30% en mole de lysine et contenant également des unités d'autres aminoacides, on parle dans ce cas d'hétéropolylysines. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, on utilise des 30 dendrimères greffés de polylysine de générations 1 à 5. Les DGL de générations supérieures à 5 ont tendance à former des agrégats qui rendent difficile leur utilisation. 3038616 9 La quantité de polymère polycationique ajoutée est telle que le rapport de charge [+] / [-] (parfois représenté par le rapport N/P en mol/mol) entre le polymère polycationique et l'acide nucléique soit supérieur à 2, 5 avantageusement supérieur à 10. L'ensemble de ces polymères est disponible dans le commerce ou peut-être préparé par toute technique connue de l'homme du métier. 10 Le complexe acides nucléiques/polymère polycationique obtenu à l'étape a) est ensuite fixé sur une résine échangeuse de cations. On entend par résines échangeuses de cations des résines cationiques chargées négativement ; on peut citer à titre d'exemple les résines fortes porteuses de groupements issus d'acides forts comme les acides phénylsulfonique et méthylsulfonique et les 15 résines faibles porteuses par exemple de groupements carboxyliques ou carboxyméthyles. Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, la résine échangeuse de cations est une résine cationique échangeuse faible. Les résines échangeuse de cations utilisées dans la présente invention ont de préférence une capacité d'échange d'ions au moins égale à 2 mEq/g, de 20 préférence au moins égale à 10 mEq/g et en particulier comprise entre 10 et 30 mEq/g. Toutes résines connues de l'homme du métier et présentant ces caractéristiques peuvent être utilisées. On peut citer à titre d'exemples de résines échangeuses de cations faibles, les copolymères d'acide méthacrylique et de divinylbenzène, commercialisées par exemple sous la dénomination 25 AMBERLITE IRP88 de la société Rôhm et Haas, sous la dénomination Indion 234 de Indion Resins et sous la dénomination Oasis WCX de la société Waters. Conformément à l'invention, la fixation du complexe acide nucléique/polymère polycationique sur la résine échangeuse de cations se fait par simple mise en 30 contact de ces deux composants dans un milieu aqueux par agitation lente ou douce. De préférence, le complexe acide nucléique/polymère polycationique est retenu sur la résine échangeuse de cations mise en suspension par des 3038616 10 retournements successifs du tube contenant la dite résine (procédé en batch) ou par percolation sur une cartouche ou colonne de chromatographie contenant ladite résine. De manière avantageuse, dans le procédé en batch, on procède à 3 à 5 retournements manuels des tubes. 5 Conformément à l'invention, l'étape d'élution est effectuée par application d'une force d'agitation énergique à une température élevée. Selon l'invention, la force d'agitation est une agitation mécanique choisie parmi : une agitation par agitateur orbital, notamment de type vortex, par agitateur linéaire, par 10 thermomixer, par ultrasons ou par micro-ondes. De manière avantageuse, l'agitation mécanique est réalisée à l'aide d'un agitateur vortex à une vitesse d'agitation supérieure à 1000 tours par minute, avantageusement supérieure à 1500 tours par minute et de manière particulièrement avantageuse à une vitesse de 2500 tours par minute. 15 Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'élution du au moins un fragment d'acides nucléiques est réalisée par exposition à un champ d'ultrasons en utilisant un bain à ultrasons. Les échantillons contenant le complexe polycations/acides nucléiques fixé sur le support solide sont soumis à un champ ultrasonore, en général constant, pendant une durée d'environ 1 minute. Les 20 molécules présentes dans les échantillons sont alors soumises à une forte agitation entraînant le décrochage des acides nucléiques du support solide et la mise en solution de ces derniers dans le tampon (ce décrochage constitue l'étape d'élution des acides nucléiques). Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, l'élution du au moins 25 un fragment d'acides nucléiques est réalisée par exposition à des micro-ondes d'une fréquence comprise entre 2400 et 2500MHz. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'étape d'agitation mécanique est réalisée par un agitateur orbital de type Vortex couplée à une 30 étape de chauffage. Selon un mode avantageux de l'invention, pour tous les modes d'agitation 3038616 11 mécanique utilisées, la température doit être portée à entre environ 30°C et 100°C, avantageusement à une température comprise entre environ 60°C et 80°C et de manière particulièrement avantageuse à une température d'environ 75°C. 5 Dans un mode particulièrement avantageux de l'invention, l'étape d'agitation mécanique est réalisée par un agitateur orbital de type Vortex à une température comprise entre environ 30°C et 100°C, avantageusement à une température comprise entre environ 60°C et 80°C et de manière 10 particulièrement avantageuse à une température d'environ 75°C. Conformément à l'invention, tout type de tampon connu de l'homme du métier habituellement utilisé pour l'élution des acides nucléiques peut convenir. On peut citer, à titre d'exemple, un tampon TE (Tris EDTA) (10 mM Tris pH 8,5, 1 15 mM EDTA). Le pH de la solution de tampon TE est compris entre environ 6,0 et 10,0, avantageusement entre environ 7,5 et 9,5 et de manière particulièrement avantageuse entre environ 8,0 et 9,0. L'un des avantages du procédé selon l'invention est qu'il permet un décrochage 20 des acides nucléiques de la phase solide sans récupérer les polymères polycationiques qui restent fixés sur le support solide, permettant ainsi d'obtenir des acides nucléiques purs qui peuvent être directement utilisés pour des analyses par des méthodes de biologie moléculaire. L'élution des fragments d'acides nucléiques ne nécessite aucun changement de tampon et peut être 25 réalisée dans le même tampon et dans les mêmes conditions de pH et de force ionique que les étapes de complexation et de fixation au support solide par simple force d'agitation en quelques minutes. Les différents éléments indésirables peuvent être retenus soit par le polycation, soit par la phase solide ou encore être éliminés lors de la première étape de capture du polyplexe. De 30 ce fait, l'efficacité de nettoyage est plus importante qu'avec les technologies existantes. 3038616 12 Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, après l'étape d'élution des fragments d'acides nucléiques, le procédé peut comprendre au moins une des étapes sélectionnées parmi une étape de récupération des fragments d'acides nucléiques et une étape de quantification des fragments d'acides 5 nucléiques. L'étape de quantification des fragments d'acides nucléiques peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par réaction en chaîne par polymérisation (PCR ou polymerase chain reaction), par RT-PCR, par 10 pyroséqunçage, par amplification, par transcription (TMA ou Transcription Mediated Amplification), par réaction en chaîne de ligase (LCR ou ligase chain reaction), par amplification d'acides nucléiques isothermique et initiée par des amorceurs chimériques (ICAN ou isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid), par amplification isothermique d'ADN médiée par 15 des boucles (LAMP ou Loop-mediated isothermal amplification of DNA). La présente invention concerne également l'utilisation du procédé selon l'une des revendications précédentes pour la détection de bactéries, la détection de virus, la détection de parasites et l'identification de séquences eucaryotes. 20 Ainsi le procédé selon l'invention peut être utilisé non seulement dans l'ingénierie sanitaire et la surveillance microbiologique des eaux et des surfaces mais également en biologie et en médecine. Selon encore un autre aspect, l'invention concerne également une méthode pour 25 la détection de bactéries, de virus et de parasites ou la détection d'acides nucléiques eucaryotes dans un échantillon susceptible d'en contenir par purification d'un fragment d'acides nucléiques d'une taille supérieure à 20 pb, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact d'au moins un desdits fragments avec une solution d'un 30 polymère polycationique en vue de former un complexe entre ledit au moins un fragment d'acides nucléiques et le polymère polycationique, 3038616 13 b) fixation du complexe obtenu à l'étape a) sur une résine échangeuse de cations par agitation lente ou douce et c) élution dudit au moins un fragment d'acides nucléiques de la résine échangeuse de cations par application d'une force d'agitation, 5 ledit procédé étant caractérisé en ce que les étapes a) à c) du procédé sont réalisées à un pH compris entre environ 6,0 et 10,0, avantageusement entre environ 7,5 et 9,5, et de manière particulièrement avantageuse entre environ 8 et 9, le pH de chacune de ces étapes pouvant être identique ou différent l'un de l'autre. 10 De manière avantageuse, les étapes a) à c) sont suivies d'une étape d'analyse du au moins un fragment d'acides nucléiques ainsi purifié. L'invention concerne enfin un kit pour purifier et concentrer au moins un fragment d'acides nucléiques à partir d'un échantillon susceptible d'en contenir 15 en utilisant le procédé selon l'invention. Un tel kit comprend un polymère polycationique soluble en phase homogène, une résine échangeuse de cations et une solution tampon à un pH compris entre 6,0 et 10,0. Les exemples 1 à 10 et les figures 1 et 2 qui suivent illustrent l'invention. 20 La Figure 1 illustre l'effet de la puissance de la force mécanique (en rpm) sur les rendements d'extraction conformément à l'exemple 4 soit sous forme d'une courbe (A) soit sous forme de valeurs numériques (B). La Figure 2 illustre la comparaison de la capacité à éliminer les inhibiteurs de PCR présent dans des échantillons d'eaux industrielles entre la méthode selon 25 l'invention et une méthode classique de purification d'ADN par ultra-filtration. EXEMPLE 1 : METHODE DE PURIFICATION D'ADN GENOMIQUE 1.1 Matériels et méthodes 30 Différentes solutions d'ADN génomique de Legionella pneumophila, contenant respectivement 2 000, 36 000 et 328 000 UG (unités génome) par échantillon sont mises en présence de 100 pL d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 3038616 14 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une 5 densité de charges de 10 mEq/g) mise en suspension (procédé en batcht) par dix retournements successifs du microtube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 200 pL d'un tampon d'élution, le TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA 1mM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex 10 pendant 10 minutes. Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. 5 pL du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Biorad, kit iQ-CheckTM legionella pneumophila). 15 1.2 Résultats Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous. UG initiaux Rendements moyens par d'ADNg retrouvés après échantillon purification selon le procédé de l'invention (en %) 2 000 119,45 ± 21,71 36 000 70,9 ± 5,66 328 000 74,6 ± 14,57 Tableau 1 : Purification d'ADN génomique Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir des rendements de récupération d'ADN génomique très satisfaisants, d'environ 64 et 134 %, conformément aux exigences des normes NF T 90-471 et ISO TS 12869. 20 25 3038616 15 EXEMPLE 2 : METHODE DE PURIFICATION D'UN ACIDE NUCLEIQUE DE 150 PB 2.1 Matériels et méthodes 5 Différentes solutions d'un acide nucléique de 150 pb, respectivement titrées à 1469, 4898 et 48989 unités par échantillon sont mises en présence de 100 pL d'une solution de polylysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le 10 polyplexe est ensuite retenu sur une résine échangeuse de cations mise en suspension (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 200 pL d'un tampon d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA 1mM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite 15 maintenus à 75°C pendant 10 minutes au bain-marie avant d'être agités au vortex pendant 10 minutes. Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. 5 pL du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) avec les amorces (R1 5'- CCA Ar- GAG CGC 20 CAC TCA TAG - 3' / F1 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' - FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 90-431. 2.2 Résultats 25 Les résultats sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous Unités initiales Moyenne des rendements (en %) de récupération par échantillon 48989 34 ±14,4 4898 28 ± 1,4 Tableau 2 : Purification d'un acide nucléique de 150 pb. 3038616 16 Le procédé selon la présente invention permet de récupérer entre environ 28 et 34 % d'un acide nucléique de 150 pb. 5 EXEMPLE 3: IMPACT DE LA NATURE DU POLYCATION SUR LE RENDEMENT D'ELUTION 3.1 Matériels et méthodes Différentes solutions d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrées à 10 86000, 64000 et 4130000 UG par échantillon, sont respectivement mises en contact dans des microtubes avec 100 pL d'une solution à 10 mg/mL soit de polyéthylène-imine (PEI) de différents types sous les dénominations Lupasol® WF, Lupasol® PS, Lupasol® HF, et Lupasol® G100, soit d'une solution à 10 mg/mL de Polybrène, soit d'une solution à 10 mg/mL de dendrimères greffés de 15 lysine (DGL) (soit de générations 2, 3, 4 ou 5) et soit d'une solution à 10 mg/mL de polylysine linéaire. Le polyplexe ADNg/polymère polycationique est formé sous agitation douce par trois retournements successifs desdits microtubes. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) 20 par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 200 pL d'un tampon d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA 1mM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex pendant 10 minutes. Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de 25 prélever le surnageant. 5 pL du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Biorad, kit iQ-CheckTM legionella pneumophila). 3.2 Résultats Les résultats sont donnés dans le tableau 3 ci-dessous. 30 3038616 17 Type de Polycations Rendement en % d'ADN g retrouvé après purification par le procédé selon l'invention DGL G1 44 DGL G2 45 DGL G3 35 DGL G4 62 Polybrène 11 Lupasol® WF, 25 000 g.mo1-1, 10 viscosité > 200 000 mPa.s Lupasol® PS, 750 000 g.mo1-1, 38 viscosité de 1 700 mPa.s Lupasol® HF, 25 000 g.mo1-1, 25 viscosité de 11 000 mPa.s Lupasol® P, 750 000 g.mo1-1, 56 viscosité de 25 000 mPa.s Lupasol® G100, 5 000 g.mo1-1, 21 viscosité de 1 100 mPa.s PLL 99 Tableau 3 : Purification d'ADN génomique avec différents types de polycations Une grande diversité de polycations solubles permettent d'obtenir des rendements satisfaisants, à savoir supérieurs à 25 %, en référence aux normes NF T 90-471 et ISO TS 12869 de décembre 2012. EXEMPLE 4 : EFFET DE LA PUISSANCE DE LA FORCE MÉCANIQUE 4.1 Matériels et méthodes 15 Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrée à 19 013 UG par échantillon, est mise en présence de 100 pL d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL dans un microtube. Le polyplexe ADNg-PLL se forme sous agitation douce par trois retournements 20 successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix 5 10 3038616 18 retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 200 pL d'une solution tampon d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA 1mM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C 5 pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex (Pulsing vortex mixer : 120 V / 50-60 Hz / 150 W / 500 - 2 500 rpm) pendant 10 minutes à différentes puissances (en rpm), soit de 0, 500, 1 000, 1 500, 2 000 ou 2 500. Les tubes sont centrifugés (x10 000 g pendant 5 secondes) afin de prélever le surnageant. 10 5 pL du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Biorad, kit iQCheckTM legionella pneumophila). 4.2 Résultats : 15 Ils sont donnés dans les figure 1A et 1B. Les rendements optimums sont atteints à partir d'une agitation supérieure à 1500 rpm. 20 EXEMPLE 5: IMPACT DE LA MISE EN OEUVRE DE L'ETAPE D'AGITATION LORS DE L'ELUTION 5.1 Matériels et méthodes Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrée à 404 000 UG par 25 échantillon, est mise en présence de 100 pL d'une solution de polylysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. Le polyplexe ADNg-PLL se forme sous agitation douce par trois retournements successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs 30 du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 200 pL d'une solution tampon d'élution TE est ajouté sur la résine. L'élution est réalisée selon différentes méthodes : - Vortex pendant 10 minutes à 75°C, - Ultrasons pendant 30 secondes (45 kHz) à 75°C, ou 3038616 19 - Application de micro-ondes pendant 30 secondes (800 watts) + 10 minutes à 180 watts (2450 MHz). Les tubes sont ensuite centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes pour pouvoir prélever le surnageant. 5 pL du surnageant sont alors utilisés pour titrer l'élution 5 par qPCR (Biorad, kit iQ-CheckTM legionella pneumophila). 5.2 Résultats : Les résultats sont donnés dans le tableau 4 ci-dessous. Méthode d'élution Rendement en % d'ADN g retrouvé après le procédé Vortex 66 Micro-ondes 26,2 Ultrasons 41 10 Tableau 4 : Purification d'ADN génomique en utilisant différentes méthodes physiques d'élution 15 Ces résultats montrent que dans la présente invention, différentes méthodes d'élution mécanique peuvent être utilisées, tels que l'agitation orbitale, les micro-ondes et les ultrasons. Ces différentes méthodes permettent d'obtenir de bons rendements de purification. 20 EXEMPLE 6 : EFFET DU PH DE LA SOLUTION D'ELUTION ET DE LA METHODE D'ELUTION SUR LES RENDEMENTS DE RECUPERATION D'ADN GENOMIQUE. 3038616 20 6.1 Matériels et méthodes Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila titrée à 45 501 UG par échantillon, est mise en présence de 100 pL d'une solution de poly-lysine 5 linéaire (PLL) à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements 10 successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. 200 pL d'une solution à différents pH, de 8,5 à 12, sont ajoutés sur la résine. Les tubes sont ensuite traités selon deux méthodes : - agitation au vortex pendant 10 minutes à 75°C (méthode A), - agitation douce en effectuant 10 retournements du tube (méthode B). 15 Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes pour pouvoir prélever le surnageant. 2 pL du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) avec les amorces (R1 5'- CCA Ar- GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / F1 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' - FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 20 90-431. 6.2 Résultats : Les résultats sont donnés dans le tableau 5 ci-dessous. Rendement d'extraction d'ADNg selon le procédé de la présente invention (en °/0) pH de capture pH d'élution Méthode d'élution A 8,5 8,5 110 8,5 9 100 8,5 10 111 8,5 11 118 8,5 12 100 Tableau 5 : Effet de la variation du pH sur le rendement d'élution 25 3038616 21 Les valeurs hautes de pH de la solution d'élution ne permettent pas d'obtenir de bons rendements. En revanche l'agitation mécanique forte (2 500 rpm) permet d'obtenir de bons rendements quel que soit le pH de la solution d'élution. De plus ces bons rendements sont obtenus que le pH de capture soit identique ou non au pH 5 d'élution. EXEMPLE 7 : EFFET DE LA FORCE IONIQUE LORS DE L'ETAPE DE CAPTURE DE L'ADN PAR LE POLYCATION 10 7.1 Matériels et méthodes Plusieurs solutions d'ADN génomique de Legionella pneumophila, contenant 2 544 ng par échantillon sont mises en présence de 100 pL d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois 15 retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est récupéré dans un nouveau microtube. 20 Un volume de 2 pL est dosé au nanodrop (Lq à 5 ng/pl) dans le but d'évaluer le rendement de capture. 7.2 Résultats Ils sont donnés dans le tableau 6 ci-dessous Force ionique rendement de capture d'ADN génomique en % (concentration en NaCI) en mM 0 > à 81 17 > à 82,5 86 > à 76,2 172 > à 64,3 344 > à 71,4 1000 66,2 25 Tableau 6 : Effet de la variation de la force ionique sur le rendement d'élution 3038616 22 Selon le procédé de la présente invention, la force ionique n'influe pas sur les rendements de capture. 5 EXEMPLE 8 : EFFET DE LA FORCE IONIQUE DE LA SOLUTION D'ELUTION SUR LES RENDEMENTS DE RECUPERATION D'ADN GENOMIQUE. 8.1 Matériels et méthodes Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrée à 58 025 UG par 10 échantillon, est mise en présence de 100 pL d'une solution de poly-lysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 15 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. 200 pl d'une solution tampon d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA 1mM) à des concentrations en NaCI variables, de 20 à 340 mM, sont ajoutés sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex pendant 10 minutes. 20 Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. 2 pL du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Perfecta toughmix, Quanta) avec les amorces (R1 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / F1 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT 25 CCG-BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 90-431. 8.2 Résultats : Les résultats sont donnés dans le tableau 7 ci-dessous. Force ionique (Concentration en Rendement en % d'ADN génomique NaCI) en mM retrouvé après le procédé 0 80 20 65,5 90 44 170 35 3038616 23 250 43,5 340 29,5 Tableau 7 : Effet de la variation de la force ionique sur le rendement d'élution 5 Le procédé selon la présente invention, permet d'obtenir de bons rendements, à savoir supérieurs à 25 % en référence aux normes NF T 90-471 et ISO TS 12869, quelle que soit la force ionique de la solution d'élution. EXEMPLE 9 : IMPACT DE LA MISE EN OEUVRE DU PROCEDE 10 9.1 Matériels et méthodes Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrée à 293 782 UG par échantillon, est mise en présence de 100 pL d'une solution de polylysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique 15 est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu sur une cartouche contenant une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par percolation. 20 Un volume de 100 pL d'une solution d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA 1mM) est alors mis en contact avec la résine. L'élution est réalisée selon différentes méthodes : - Vortex pendant 10 minutes à 75°C, - Ultrasons pendant 30 secondes (45 kHz) à 75°C, ou 25 - Application de micro-ondes pendant 30 secondes (800 watts) + 10 minutes à 180 watts (2450 MHz). 2 pL de l'éluât sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Perfecta toughmix, Quanta) avec les amorces (R1 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / F1 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT 30 CCG-BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 90-431. 3038616 24 9.2 Résultats Ils sont donnés dans le tableau 8 ci-dessous Méthode Rendements moyens (en %) d'élution d'ADN g retrouvé après le procédé en cartouche Vortex 44 ± 0,9 Micro- 54,5 ± 5,3 ondes Ultrasons 46,5 ± 7,4 5 Tableau 8 : Effet de la mise en oeuvre en cartouche du procédé Le procédé avec une mise en oeuvre en cartouche selon la présente invention, permet d'obtenir de bons rendements d'extraction avec les différentes méthodes d'élution. 10 EXEMPLE 10 : CAPACITE DU PROCEDE A ELIMINER LES INHIBITEURS DE PCR D'ECHANTILLONS REELS 10.1 Matériels et méthodes 15 La capacité du procédé à enlever les inhibiteurs d'un échantillon a été évaluée sur 24 échantillons d'eau provenant de différentes tours aéro-réfrigérantes. Ces échantillons sont connus pour être fortement chargés en inhibiteurs de PCR après une purification par ultrafiltration (méthode B). 20 L'extraction de l'ADN a été réalisée par la présente invention (méthode A). Méthode B Un même volume a été filtré (entre 10 et 100 ml selon les propriétés de chaque échantillon) sur une membrane en polycarbonate (0,45 dam). La membrane est ensuite déposée dans une solution de lyse et placée 15 minutes à 95°C. 25 Une fois la lyse terminée, les membranes sont retirées des tubes. 3038616 25 Méthode A Le surnageant est récupéré puis mis en présence de 100 pL d'une solution de polylysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique extrait est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois 5 retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 100 pL d'une solution d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA 1mM) est ajouté sur la 10 résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex pendant 10 minutes. Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. L'élution est récupérée dans un nouveau microtube. 15 Pour chaque extrait, 5pL sont déposés en qPCR (Biorad, kit iQ-CheckTM legionella pneumophila ou iQ-CheckTM legionella spp.), lorsqu'une inhibition est observée des dilutions successives de l'échantillon sont réalisées jusqu'à la levée de l'inhibition. 10.2 Résultats 20 Ils sont donnés dans la figure 2. 96% des échantillons connus pour être inhibés après une purification par ultrafiltration ne sont pas inhibés dans le cas d'une purification par ce procédé. Ainsi le procédé selon l'invention permet d'éliminer les inhibiteurs de PCR. 25 REVENDICATIONS1. Procédé pour purifier et concentrer au moins un fragment d'acides nucléiques d'une taille supérieure à 20 pb susceptible d'être présent dans un échantillon, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact d'au moins un desdits fragments avec une solution d'un polymère polycationique en vue de former un complexe entre ledit au moins un fragment d'acides nucléiques et le polymère polycationique, b) fixation du complexe obtenu à l'étape a) sur une résine échangeuse de cations par agitation lente ou douce et c) élution dudit au moins un fragment d'acides nucléiques de la résine échangeuse de cations par application d'une force d'agitation, ledit procédé étant caractérisé en ce que les étapes a) à c) du procédé sont réalisées à un pH compris entre environ 6,0 et 10,0, avantageusement entre environ 7,5 et 9,5, et de manière particulièrement avantageuse entre environ 8 et 9, le pH de chacune de ces étapes pouvant être identique ou différent l'un de l'autre. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit fragment d'acides nucléiques est un fragment d'ADN simple brin, un fragment d'ADN double brin, de l'ADN génomique ou de l'ARN. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la force d'agitation correspond à une agitation mécanique choisie parmi une agitation par agitateur orbital, par agitateur linéaire, par thermomixer, par ultrasons ou par micro-ondes. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agitation mécanique est réalisée à une température comprise entre environ 30°C et 100°C, avantageusement à une température comprise entre environ 60°C et 80°C et de manière particulièrement avantageuse à une température d'environ 75°C. 3038616 27 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agitation mécanique est réalisée par un agitateur orbital, à une température comprise entre environ 30°C et 100°C, avantageusement à une température comprise entre environ 60°C et 80°C et de manière particulièrement avantageuse à une température 5 d'environ 75°C. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la résine échangeuse de cations présente une capacité d'échange d'ions au moins égale à 2 mEq/g, de préférence au moins égale à 10 mEq/g et en particulier comprise entre 10 et 30 mEq/g. 10 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère polycationique est choisi dans le groupe comprenant la poly-L-lysine (PLL), des dendrimères greffés de lysine (DGL), le polyéthylènimine (PEI) ou la polyamidoamine (PAMAM). 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polymère 15 polycationique est la poly-L-lysine utilisée sous forme d'une solution à une quantité comprise entre 0,1 et 10 mg, de préférence à une quantité d'environ 1mg par échantillon. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de récupération après l'étape d'élution dudit au 20 moins un fragment d'acides nucléiques. 10. Utilisation du procédé selon l'une des revendications précédentes pour la détection de bactéries, la détection de virus et la détection de parasites et de séquences nucléiques eucaryotes. 11. Kit pour purifier et concentrer au moins un fragment d'acides nucléiques à partir 25 d'un échantillon susceptible d'en contenir en utilisant le procédé selon l'une des revendications 1 à 8, ledit kit comprenant un polymère polycationique soluble en phase homogène, une résine échangeuse de cations et une solution tampon à un pH compris entre 6,0 et 10,0.