Brevet FR3045047A1 — publié le 20170616

STÉRÉO-ISOMÈRE DE CONFIGURATION DE LA BROMADIOLONE, COMPOSITION ET APPÂT RODONTICIDE LE COMPRENANT ET PROCÉDÉ DE LUTTE CONTRE DES RONGEURS CIBLES NUISIBLES L'invention concerne un stéréo-isomère de configuration de 5 la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. L'invention concerne donc le domaine technique de la lutte contre des populations de rongeurs cibles nuisibles. Il est connu d'utiliser des poisons sous forme d'appâts 10 rodonticides contre des rongeurs cibles nuisibles. On sait de EP 2 090 164 que la bromadiolone est un anticoagulant de deuxième génération agissant à simple dose. On connait aussi un appât comprenant de la bromadiolone, la proportion de la bromadiolone dans l'appât étant de 50 ppm. Un tel appât est susceptible d'être consommé par des 15 animaux autres que des rongeurs cibles nuisibles lorsqu'il est mis à la disposition de rongeurs cibles nuisibles. Il peut être consommé directement (consommation primaire) par des animaux domestiques ou des animaux de compagnie. Il peut aussi être consommé accidentellement par des humains. Une telle consommation peut produire chez ces animaux domestiques, chez ces animaux de compagnie ou 20 chez des humains un empoisonnement qui peut être létal. En outre, une fraction de la bromadiolone de ces appâts rodonticides peut être ingérée (consommation secondaire) par des animaux -notamment par des oiseaux- prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé un tel appât rodonticide ou par des animaux charognards de 25 rongeurs nuisibles morts d'avoir consommé un tel appât rodonticide. Cette consommation secondaire est susceptible d'entrainer à terme la mort de ces animaux prédateurs ou charognards qui peuvent être des animaux -notamment des oiseaux- appartenant à des espèces protégées. L'invention vise donc à pallier ces inconvénients en 30 proposant un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de 3045047 2 configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont en même temps efficaces pour contrôler les populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement d'animaux non-cibles -notamment des animaux domestiques, des animaux de compagnie ou des humains- consommant accidentellement un tel appât rodonticide. L'invention vise à pallier ces inconvénients en proposant un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont en même temps efficaces pour contrôler les populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement secondaire d'animaux domestiques (animaux de compagnie ou d'élevage) ou sauvages -par exemple des renards ou des oiseaux- prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé de l'appât rodonticide ou charognards de rongeurs cibles nuisibles morts empoisonnés. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dont la mise en oeuvre est en accord avec les règles de bon usage -notamment vis à vis de la protection des oiseaux, et en particulier des rapaces-. L'invention vise aussi un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont respectueux de l'environnement, de la santé humaine et des animaux non cibles -notamment des oiseaux, et en particulier des rapaces-. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de 30 configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un 3045047 3 procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont susceptibles de pouvoir être utilisés pour lutter contre des rongeurs cibles nuisibles résistants à des appâts connus de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. L'invention vise donc à proposer une alternative à des 5 appâts rodonticides connus. Pour ce faire, l'invention concerne un stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E3, de la bromadiolone présentant par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des 10 conditions décrites ci-après, un temps de rétention t3 de valeur telle que t1 250,1 et m/z 525,1 -> 181 correspondant à la bromadiolone. Un exemple de chromatogramme est présenté en figure 1. 25 Les valeurs des temps de rétention de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone sont de : - pour l'énantiomère El dudit diastéréoisomère D1,2, t1 = 4,3 min ; - pour l'énantiomère E2 dudit diastéréoisomère D1,2, t2 = 5,0 min ; - pour l'énantiomère E3 dudit diastéréoisomère D3,4, t3 = 6,3 min, et ; 30 - pour l'énantiomère E4 dudit diastéréoisomère D3,4, t4 = 8,8 min. 3045047 27 Les valeurs de temps de rétention t1, t2, t3 et t4 sont susceptibles de varier selon les conditions chromatographiques. Cependant, en tout état de cause, dans ces conditions (choix de ces phases stationnaire et mobile), l'ordre d'élution des stéréo-isomères de configuration de la 5 bromadiolone reste inchangé. À titre indicatif, les valeurs des temps de rétention de chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone peuvent varier avec une variation de quelques degrés Celsius de la température de la colonne de chromatographie. Pour ledit énantiomère E1, le temps de rétention (t1) peut varier entre 4,1 min et 4,4 min. Pour ledit énantiomère E2, le temps de rétention (t2) 10 peut varier entre 4,8 min et 5,2 min, Pour ledit énantiomère E3, le temps de rétention (t3) peut varier entre 6,0 min et 6,6 min. Pour ledit énantiomère E4, le temps de rétention (t4) peut varier entre 8,3 min et 9,0 min. Extraction de la bromadiolone de foies de rats traités à la bromadiolone en vue de l'analyse des stéréo-isomères de configuration de la 15 bromadiolone Homogénéisation de l'échantillon de foie On pèse avec précision de l'ordre de 0,525 g (±0,025 g) de foie de rat que l'on place dans un tube en polypropylène de 50 mL On ajoute 10 mL d'acétone et on soumet la suspension à une homogénéisation au moyen 20 d'un homogénéisateur/disperseur Ultra-Turrax® pendant une durée de l'ordre de 30 sec. On rince la tige de l'homogénéisateur/disperseur à l'eau chaude puis 2 fois avec 20 mL d'acétone dans un tube en polypropylène. On centrifuge l'homogénat pendant 5 min à une vitesse de centrifugation de 3000 rpm (rotation par minute). On collecte et on transvase le surnageant dans un tube à essai. On 25 soumet l'échantillon à une évaporation sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C de façon à former un extrait sec. Élimination des lipides Dans le tube contenant l'extrait sec, on ajoute 1 mL d'acétonitrile de façon à solubiliser l'extrait sec. On lave la solution 30 d'acétonitrile 2 fois successivement avec 1 mL d'hexane. L'extrait débarrassé des lipides est séché sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C, puis 3045047 28 repris avec 0,5 mL de méthanol et solubilisé par agitation sous vortex. On ajoute ensuite 0,5 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q). L'échantillon est homogénéisé sous vortex. Extraction de la bromadiolone sur phase solide (« SPE, 5 Solid Phase Extraction ») On fait passer 1 mL de dichlorométhane (CH2Ct2), puis 1 mL de méthanol (CH3OH), puis 1 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q) sur une cartouche Oasis HLB 1cc (WAT094225, Waters). On dépose ensuite l'extrait de foie débarrassé des lipides (1mL Me0H/H20 Milli-Q) et contenant la 10 bromadiolone en tête de la cartouche préalablement. L'extrait de foie pénètre dans la cartouche par gravité au contact de la phase solide de la cartouche. On dépose en tête de cartouche 1 mL de solution de lavage formée de méthanol (CH3OH) et d'eau ultra-pure (H2O) en proportion volumique de 90/10. On sèche la cartouche par aspiration sous vide connectée en partie basse de la cartouche. 15 On dépose ensuite en tête de cartouche 1 mL de solution d'élution formée de dichlorométhane (CH2Ct2) et de méthanol (CH3OH) en proportion volumique de 90/10 et on collecte en bas de cartouche un éluat comprenant la bromadiolone. On évapore le solvant de l'éluat sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C. On reprend l'échantillon dans 0,5 mL d'acétonitrile (NC-CH3) et on filtre 20 la solution d'acétonitrile contenant la bromadiolone sur filtre 0,2 ium. Rémanence hépatique des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone chez le rat On administre par gavage ("per os") à des rats SD « Sprague Dawley » mâles et femelles, âgés de 8 semaines et pesant de l'ordre de 25 200 g, un mélange de diastéréoisomères (diastéréoisomère D1,2 et diastéréoisomère D3,4) de la bromadiolone en solution dans un mélange d'huile végétale et de DMSO à 5 %. La proportion molaire dudit diastéréoisomère D1,2 est de 56% et la proportion molaire dudit diastéréoisomère D3,4 est de 44%. On administre (à JO) de la solution de gavage de façon que 30 la quantité de bromadiolone ingérée par chaque rat soit de l'ordre de 13 mg par kilogramme de rat. Pour éviter l'hémorragie, les rats gavés sont traités 3045047 29 quotidiennement par administration par voie sous cutanée d'une dose de vitamine K1 (à titre d'antidote vis-à-vis de l'hémorragie) à raison de 0,1U pour 200g de poids de rat vif. À J1 (J+1), J3 (J+3) et J7 (J+7) après le gavage, on 5 euthanasie 4 rats préalablement anesthésiés à l'isoflurane, on prélève le foie des rats euthanasiés puis on extrait la bromadiolone du foie et on dose la quantité de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone par analyse par chromatographie liquide haute pression sur une colonne chirale comme décrit ci-dessus. On mesure l'aire sous les pics du chromatogramme obtenu et on 10 quantifie chaque diastéréoisomère de la bromadiolone par comparaison avec une courbe d'étalonnage. Les résultats sont représentés en figure 2. Ledit diastéréoisomère D1,2 (colonne à hachures verticales) présente une rémanence dans le foie des rats plus élevée que la rémanence dudit diastéréoisomère D3,4 15 (colonne noire). Rémanence des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone dans le foie de rats mâles et femelles consommant un appât rodonticide comprenant de la bromadiolone On met à disposition de rats mâles et femelles, une quantité 20 d'appât rodonticide comprenant 15 ppm de bromadiolone, dont 4% dudit diastéréoisomère D1,2 et 96% dudit diastéréoisomère D3,4. À la mort des rats, on extrait, on analyse et on dose chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone présent dans le foie de chaque rat mâle ou femelle. Les résultats sont représentés en figure 3 dans laquelle les colonnes noires représentent le 25 pourcentage des stéréo-isomères de configuration E1, E2, E3 et E4 de la bromadiolone chez les rats mâles, et les colonnes à hachures horizontales représentent le pourcentage des stéréo-isomères de configuration E1, E2, E3 et E4 de la bromadiolone chez les rats femelles. L'énantiomère E3 selon l'invention est plus rémanent dans 30 le foie des rats femelles qu'il ne l'est dans le foie des rats mâles. Un appât 3045047 30 rodonticide selon l'invention permet de cibler majoritairement les femelles d'une population de rongeurs cibles nuisibles. Il va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et applications. En particulier, une composition, un appât 5 rodonticide et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles sont sujets à des infinités de variantes tant dans la formulation de l'appât rodonticide que dans les modes de mise en oeuvre du procédé. REVENDICATIONS1/ - Stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E3, de la bromadiolone présentant par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention t3 de valeur telle que ti