Brevet FR3038983A1 — publié le 20170120

COMPOSES INHIBITEURS DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA La présente invention porte sur des composés identifiés par criblage, en particulier en test ELISA, démontrant une efficacité in vitro en tant qu'inhibiteur de la machinerie responsable de la virulence chez Pseusomonas aeruginosa. C'est l'assemblage de l'injectisome de la sécrétion de type III de ces bactéries à Gram négatif qui est ciblé par les molécules de l'invention, notamment l'interaction protéine-protéine de PscE et PscG. Les molécules selon l'invention peuvent être obtenues facilement en peu d'étapes et permettent un accès simple à une grande variété d'analogues. L'invention vise aussi une méthode d'identification de composés capable d'inhiber la machinerie de virulence de Pseudomonas aeruginosa, un dispositif permettant la mise en oeuvre de cette méthode d'identification. Le champ d'application concerne le traitement préventif et curatif des pathologies à Pseudomonas aeruginosa, en particulier les pathologies nosocomiales et ouvre la porte vers une nouvelle antibiothérapie mettant à disposition des composés rendant les bactéries inoffensives sans les détruire, évitant de ce fait toute pression de sélection induisant l'apparition de forme de résistance. Pseudomonas aeruginosa appartient à une famille de pathogènes bactériens appelés « ESCAPE » (E. faecium, S. aureus, Clostridium difficile, A. baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae), ayant la capacité d'« échapper » aux traitements antibiotiques actuels (L. R. Peterson. Bad bugs, no drugs: no ESCAPE revisited. Clin. Infect. Dis. 2009, 49, 992-993). Il est omniprésent dans la nature et sa capacité à s'adapter à différents milieux en disposant d'une panoplie d'effecteur de sécrétion en fait un pathogène humain 3038983 2 opportuniste efficace. L'infection due à Pseudomonas aeruginosa peut être soit chronique, soit aigue, dépendant de la pathologie sous-jacente ou de l'état immunitaire de l'individu. Lié à l'accroissement de formes de résistance 5 multiple aux antibiotiques classiques, le traitement des infections liées à Pseudomonas aeruginosa, notamment dans le milieu hospitalier, représente aujourd'hui un grave problème de santé publique (F. Barbier, M. Wolff. Multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa: towards a therapeutic dead end? Med. 10 Sci. (Paris) 2010, 26, 960-968). Dans l'optique d'une nouvelle thérapie antibactérienne, de nouvelles cibles spécifiques aux bactéries sont à l'étude, portant notamment sur le mécanisme de virulence pour développer un traitement alternatif aux infections bactériennes (F. Barbier, M. Wolff. Multi-drug 15 resistant Pseudomonas aeruginosa: towards a therapeutic dead end? Med. Sci. (Paris) 2010, 26, 960-968). Lors de la phase d'infection aigue, Pseudomonas aeruginosa utilise une nanomachine de sécrétion de type III (T3S) hautement conservée. Quatre cytotoxines, ExoS, ExoT, ExoY et 20 ExoU sont ainsi injectées, via l'aiguille de sécrétion, dans le cytoplasme de la cellule eucaryote fragilisant ainsi l'hôte ce qui permet l'invasion et l'instauration de l'infection (. R. Hauser. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 25 7, 654-665). La machinerie T3S est une cible de choix comme l'atteste des travaux actuellement en cours et qui ciblent un de ces composants, PcrV, avec une approche thérapeutique basée sur les anticorps. En particulier, des fragments d'anticorps de haute affinité dirigés contre PcrV sont en développement 30 par la société pharmaceutique KaloBios pour le traitement des infections liées à Pseudomonas aeruginosa. Pour leur virulence, et aux premiers stades de l'infection, ces bactéries synthétisent au niveau de leur membrane 3038983 3 bactérienne la nanomachine de virulence de type T3S, ou encore appelée injectisome de sécrétion de type III, qui permet d'injecter dans des cellules cibles des toxines, molécules destinées à perturber le fonctionnement de la cellule infectée 5 et visant in fine à la détruire. La nanomachine de virulence T3S, ou machinerie de virulence T3S, ou encore désignée T3S, est composée de protéines fonctionnellement conservées exportant des composants d'assemblage macromoléculaire à travers les deux membranes 10 bactériennes (G. R. Cornelis. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 2006, 4, 811-825). Dans Pseudomonas aeruginosa, comme chez d'autres bactéries, T3S peut être divisé en trois sous-ensembles : la base, l'aiguille et le translocon, chacun composé de plusieurs macromolécules 15 interagissant entre elles. Le translocon est la partie la plus éloignée de l'appareil T3S. Il est composé de deux protéines hydrophobes PopB et PopD qui s'associent à et avec la membrane de la cellule hôte. Cet assemblage permet le passage des toxines à travers le plasma membranaire. Dans la proximité du 20 translocon et en interaction avec l'aiguille de sécrétion, PcrV crée le lien entre les deux entités. PscF est le principal constituant de l'aiguille sécrétrice de 80 nM de long. L'inactivation génétique de gènes codant pour PscE et PscG conduit à des souches non-cytotoxiques sur 25 cellules eucaryotes, due à l'absence d'activité T3S (M. Quinaud, J. Chabert, E. Faudry, E. Neumann, D. Lemaire, A. Pastor, S. Elsen, A. Dessen, I. Attree. The PscE-PscF-PscG complex controls type III secretion needle biogenesis in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol. Chem. 2005, 280, 36293- 30 36300)* La résolution de structure cristalline du complexe PscE-PscF-PscG a contribué grandement à la compréhension de leurs fonctions (M. Quinaud, S. Ple, V. Job, C. Contreras-Martel, J. P. Simorre, I. Attree, A. Dessen. Structure of the 3038983 4 heterotrimeric complex that regulates type III secretion needle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007, 104, 7803-7808). PscG est une protéine qui interagit directement avec la partie hydrophobe de l'hélice C-terminale de PscF, 5 lui-même nécessaire à la polymérisation de la protéine en aiguille. Il est intéressant de noter que PscG interagit avec PscE par une interaction hydrophobe sur une surface de 1300 A2. Des études biochimiques in vitro réalisées en parallèle avec des expériences in vivo sur Pseudomonas aeruginosa ont 10 montré que PscE est une co-chaperone de PscG, et que l'absence de PscE mène à la déstabilisation de l'interaction PscG-PscF (S. Ple, V. Job, A. Dessen, I. Attree. Cochaperone interactions in export of the type III needle component PscF of Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 2010, 192, 3801- 15 3808). Des mutations simples et doubles points introduites dans la zone d'interaction entre PscE et PscG ont abouti à une souche de Pseudomonas aeruginosa présentant un phénotype non-cytotoxique. Sur l'ensemble des études réalisées sur les systèmes de 20 sécrétion de type III, dont celles conduites avec d'autres bactéries pathogènes, il ressort que de petites molécules de synthèse, ainsi que des produits d'origine naturelle ont été capables d'inhiber le pouvoir de virulence en tests cellulaires (L. K. Tsou, P. D. Dossa, H. C. Hang. Small 25 molecules aimed at type III secretion systems to inhibit bacterial virulence. Med. Chem. Commun. 2013, 4, 68-79). Les salicylidènes acylhydrazides ont été parmi les premiers à montrer une efficacité sur le système T3S (WO 2006/132583). Leur mode d'action reste à être élucidé, bien que les effets 30 liés à leur propriété chélatante du fer, des effets inhibiteurs putatifs de l'expression de TS3 ou des effets entraînant une diminution de la taille des aiguilles sécrétrices ont été avancées. Les salicylanilides ont été décrits comme étant une autre famille de composés efficaces 3038983 5 sur T3S (M. K. Dahlgren, A. M. Kauppi, I.-M. Olsson, A. Linusson, M. Elofsson. Design, Synthesis, and Multivariate Quantitative Structure-Activity Relationship of Salicylanilides-Potent Inhibitors of Type III Secretion in 5 Yersinia. J. Med. Chem. 2007, 50, 6177-6188). D'autres chélatants ont été identifiés par criblage, tels que la pyridine. D'autres familles de composés ont été découverts plus récemment, telles que les phenoxyacetamides (WO 2010/118046 Al), les 7-méthyl amine quinolines (WO 10 2008/115118) et les thiazolidinones (WO 2009/137133). Par ailleurs, des produits naturels, souvent complexes, ont aussi montré des propriétés spécifiques sur l'inhibition de T3S (K. Kimura, M. Iwatsuki, T. Nagai, A. Matsumoto, Y. Takahashi, K. Shiomi, S. Omura, A. Abe. A small-molecule inhibitor of the 15 bacterial type III secretion system protects against in vivo infection with Citrobacter rodentium. J. Antibiot. 2011, 64, 197-203). La présence d'un T3S fonctionnel est souvent associée au décès chez des patients présentant des infections respiratoires et 20 systémiques provoquées par Pseudomonas aeruginosa. T3S semble contribuer au développement de pneumonie grave en empêchant la capacité de l'hôte à contenir l'infection bactérienne au niveau des poumons. Ceci permet non seulement à Pseudomonas aeruginosa de persister dans le poumon, mais il facilite 25 également une surinfection par d'autres espèces de bactéries. Bien que plusieurs agents antibactériens soient efficaces contre Pseudomonas aeruginosa, les forts taux de mortalité associés aux infections à Pseudomonas aeruginosa, même chez les patients hospitalisés recevant des antibiotiques reflètent 30 le besoin de nouveaux agents thérapeutiques. Les antibiotiques bactériostatiques et bactéricides conventionnels semblent en outre insuffisants pour combattre ces infections, et les nouvelles approches de traitement telles que des inhibiteurs 3038983 6 des machineries de virulence de Pseudomonas aeruginosa peuvent s'avérer utile en tant que thérapies adjunctives. C'est dans ce contexte que les inventeurs ont eu l'idée de 5 développer un test ELISA permettant de cribler des petites molécules capables d'inhiber les interactions entre les deux protéines chaperones PscE et PscG. Pour cela, les protéines individuelles PscE et PscG ont été purifiées à partir d'E. coll. Un test d'ELISA a été développé 10 en fixant une de deux protéines au niveau de la surface d'un support solide, telle qu'une boite de microtitration à 96 puits. Suite au lavage, la deuxième protéine est ajoutée et l'interaction est révélée par les anticorps spécifiques et une réaction colorimétrique, grâce à un anticorps secondaire 15 couplé à un substrat chromogénique ou fluorescent. C'est ainsi la première fois qu'un criblage de type chemogénomique inverse est effectué sur le système de T3S, à savoir que des inhibiteurs puissent être identifiés d'abord au niveau du complexe de protéines (chaperone PscE-PscG) pour ensuite 20 rechercher l'effet phénotypique sur la cellule (inhibition de l'injectisome sur cellule). Plusieurs chimiothèques, ont été criblées afin d'identifier les composés capables d'inhiber l'interaction PscE-PscG et donc d'inhiber la machinerie de virulence de Pseudomonas aeruginosa et in fine de pouvoir 25 prévenir ou traiter une infection pathogène causée par Pseudomonas aeruginosa. C'est ainsi que la présente invention a pour objet un procédé d'identification de molécules inhibitrice de la machinerie de virulence de Pseudomonas aeruginosa, un dispositif pour 30 l'identification d'une molécule inhibitrice de la machinerie de virulence de Pseudomonas aeruginosa, des composés nouveaux inhibiteurs de la machinerie de virulence de Pseudomonas 3038983 7 aruginosa, des composés pour leur utilisation pour prévenir et/ou traiter une infection pathogène causée par Pseudomonas aeruginosa ainsi que des compositions pharmaceutiques pour prévenir et/ou traiter une infection pathogène causée par 5 Pseudomonas aeruginosa. Ainsi dans une premier mode de réalisation, la présente invention vise un composé de formule (A) : (A) Dans lequel : 10 X est un halogène ; Y est un halogène ; Z est un groupement hydroxy, amine, ou un groupement -0R1 dans lequel R1 est un alkyle en C1-C4 ou un acyle en Ci-C4 ; p est un nombre entier et 13 > p 2 ; et 15 q est un nombre entier et 13 > q 2, avec préférentiellement p+q m > 2 ; et 10 n est un nombre entier et 13 > n 2, préférentiellement 23 > m+n. L'expression halogène définit un atome choisi dans le groupe constitué par le Chlore, le Fluor, le Brome et l'Iode. De manière avantageuse, X est un Chlore. 15 D'autres sels pharmaceutiquement acceptables sont aussi possibles et X peut représenter un hydrogensulfate (HSO4-), un acide Trifluoroacetique (TFA-), ou un acide acétique par exemple. Dans un mode de réalisation particulier, le composé de formule 20 (D) selon l'invention caractérisé en ce que : - X est Cl ; - m et n sont des nombres pairs ; et/ou - préférentiellement m+n > 6 3038983 12 C'est aussi un objet de la présente invention que de fournir un composé de formule (D) selon un mode de réalisation tel qu'illustré précédemment caractérisé en ce que : - m =4 et n =6 ou 8, préférentiellement 6 ; 5 - m =6 et n =8 ou 10, préférentiellement 10 ; - m =8 et n =4, 6, 8, ou 10, préférentiellement 6 ou 10, - m =10 et n= 4 ou 10, préférentiellement 10. Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) 10 est caractérisé en ce que X est un chlore, m=4 et n= 2. Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) est caractérisé en ce que X est un chlore, m=4 et n= 6. Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) est caractérisé en ce que X est un chlore, m=6 et n= 4. 15 Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) est caractérisé en ce que X est un chlore, m=10 et n= 2. Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) est caractérisé en ce que X est un chlore, m=4 et n= 8. Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) 20 est caractérisé en ce que X est un chlore, m=6 et n= 8. Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) est caractérisé en ce que X est un chlore, m=8 et n= 8. Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) est caractérisé en ce que X est un chlore, m=10 et n= 6. 25 Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) est caractérisé en ce que X est un chlore, m=10 et n= 8. 3038983 13 Dans un mode de réalisation particulier, le composé (D) est caractérisé en ce que X est un chlore, m=10 et n= 10. C'est aussi un autre objet de la présente invention que de 5 fournir des composés de formule (A) et/ou (D) en tant que médicament. Plus particulièrement la présente invention concerne les composés de formule (A) et/ou (D) pour leur utilisation pour prévenir et/ou traiter une infection pathogène causée par 10 Pseudomonas aeruginosa. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de réalisation de l'invention, l'infection pathogène traitée ou prévenue par le composés (A) et/ou (D) selon l'invention est une infection nosocomiale, préférentiellement choisie parmi 15 les infections des yeux, des plaies, en particulier suite à une brûlure et/ou une opératoire, des urines, en particulier de la vessie ou de l'urètre par exemple après sondage, du système gastro-intestinale, d'un poumon en particulier après bronchoscopie, des méningites en particulier d'inoculation, 20 des septicémies. Ces composés selon l'invention ont démontré une efficacité en tant qu'inhibiteur de la machinerie responsable de la virulence chez Pseudomonas aeruginosa. Ces molécules ciblent 25 l'assemblage de l'injectisome de la sécrétion de type III de ces bactéries et plus particulièrement l'interaction protéine-protéine PscE-PscG telle que démontré ici dans le test de criblage aussi objet de la présente invention. C'est la première fois que des composés de synthèse ont été identifiés 30 comme inhibiteurs de ce mécanisme d'action empêchant la formation de l'injectisome. Ces molécules sont nouvelles et 3038983 14 sont obtenues facilement en peu d'étapes (4 à 5 étapes), avec un accès simple à une grande variété d'analogues. Le champ d'application concerne une nouvelle antibiothérapie qui rendrait les bactéries inoffensives sans induire d'effet 5 bactéricide, évitant de ce fait toute pression de sélection induisant l'apparition de forme de résistance. La présente invention vise aussi une méthode permettant de cribler des molécules capables d'inhiber les interactions 10 entre les deux chaperones PscE et PscG et par là même d'inhiber la machinerie responsable de la virulence chez Pseudomonas aeruginosa. Pour cela, tout d'abord les protéines individuelles PscE et PscG ont été purifiées à partir d'E. coll. Un test d'ELISA a été développé afin d'évaluer 15 l'interaction protéine-protéine et l'inhibition de celle-ci par le composés testés. La réalisation de ce test débute en fixant une de deux protéines sur un support, tel que le matériau d'une boite à 96 puits. Suite au lavage, la deuxième protéine est ajoutée et l'interaction peut être révélée. 20 La mise en évidence de l'intéraction PscE-PscG ainsi que de l'inhibition de cette interaction peut être réalisée par divers moyens biochimiques à disposition d'un homme du métier pour la caractérisation des interactions protéine-protéine. Dans un mode particulier, l'interaction protéine-protéine est 25 évaluée par des anticorps spécifiques et par une réaction colorimétrique, grâce à un anticorps secondaire couplé. Plusieurs chimiothèques et une vingtaine de produits naturels commerciaux peuvent être criblé manuellement ou de façon automatique afin de déterminer les composés possédant 30 l'activité désirée. En plaçant la limite vers 50% d'inhibition à une concentration de 50 pM de la molécule testée, les résultats de ce premier criblage ont révélé 17 composés 3038983 15 (Tableau 2) présentant une capacité d'inhibition permettant de conclure positivement quant à leur capacité à inhiber Pseudomonas aeruginosa. Cette valeur de % d'inhibition peut être bien sûr placée à un niveau inférieur et ne sert ici que 5 de valeur guide informative. Ainsi un composé testé pourra être retenu comme inhibiteur de la machinerie de virulence de Pseudomonas aeruginosa à partir d'un pourcentage d'inhibition de l'interaction PscE/PscG d'au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, 10 particulièrement au moins 60%, plus particulièrement au moins 70%, et plus particulièrement encore au moins 80%, voire plus particulièrement au moins 90% ou au moins 95%. Les composés identifiés par cette méthode selon l'invention 15 sont l'acide pentétique, le clioquinol, le myricétine, le bensérazide, le gossypol, un sel de 3-alkylpyridium 6 (3-APS), et l'héderagénine. Dans la perspective de développer des composés structuralement originaux, différents de ceux déjà décrits, les efforts des 20 inventeurs se sont portés sur deux familles de composés criblés et identifiés comme inhibiteurs de l'interaction PscEPscG. Il s'agit des chélateurs de cations de type quinoline tel que le clioquinol et les sels de pyridinium tel que le sel de 3-alkyl pyridinium (3-APS). Le clioquinol fait partie des 25 meilleurs inhibiteurs de l'interaction PscE-PscG lors du criblage primaire Quant aux 3-APS, ce sont des fragments élémentaires constitutifs de structures polymériques naturelles d'origine marine possédant de nombreuses propriétés biologiques 30 C'est aussi un objet de la présente invention que de fournir un procédé d'identification d'une molécule inhibitrice de la machinerie de virulence de Pseudomonas aeruginosa comprenant 3038983 16 une étape d'évaluation de la capacité de ladite molécule à inhiber l'interaction PscE/PscG. Le procédé d'identification selon la présente invention prévoit la mise en contact d'une molécule à tester avec les 5 protéines PscE et PscG et à évaluer la capacité de ladite molécule à inhiber l'interaction entre ces deux protéines. Comme indiqué plus avant, toute méthode d'étude et d'évaluation de l'interaction protéine-protéine est applicable dans le cadre de la présente invention à partir du moment ou 10 elle permet de déterminer un pourcentage d'inhibition de l'interaction PscE-PscG. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'évaluation de la capacité de ladite molécule à 15 inhiber l'interaction PscE/PscG est réalisée par une technique ELISA. Ainsi un procédé d'identification selon la présente invention comprend les étapes suivantes : a) Fournir un support sur lequel est fixée une des deux 20 molécules PscE ou PscG, b) Mettre en contact le support avec une solution contenant la molécule PscE ou PscG, la molécule en solution correspondant à celle non fixée au support, c) Ajouter une solution contenant la molécule à tester 25 d) Laver le support e) Ajouter un anticorps primaire dirigé contre la molécule non fixée au support, Laver le support f) Ajouter un anticorps secondaire dirigé contre le premier anticorps et couplé à une enzyme, 30 g) Laver le support h) Ajouter un substrat de l'enzyme générant lors de son hydrolyse par l'enzyme un signal, i) Quantifier le signal 3038983 17 j) Evaluer la capacité d'inhibition de la molécule à tester par comparaison avec une gamme étalon. C'est aussi un objet de la présente invention que de fournir 5 un dispositif pour l'identification d'une molécule inhibitrice de la machinerie de virulence de Pseudomonas aeruginosa comprenant un support solide sur la surface duquel est fixée une des deux molécules PscE ou PscG. Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif selon 10 la présente invention est caractérisé en ce que le support solide est une plaque de microtitration munie d'au moins un puit, la molécule étant fixée au support au niveau dudit puit. La fixation de la molécule, PscE ou PscG, peut être réalisée par liaison covalente ou préférentiellement par liaison de 15 faible énergie, en particulier liaison hydrophobe, liaison hydrogène ou liaison de type Van der Walls, c'est-à-dire encore par adsorption. Ainsi le dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que la fixation de la molécule au support est réalisée par 20 liaison faible. Dans un mode de réalisation particulier du dispositif selon la présente invention la surface du support solide est hydrophobe afin d'assurer la liaison, de préférence par adsorption, de la molécule audit support. 25 La présente invention vise aussi un procédé de fabrication d'un dispositif selon la présente invention caractérisé en ce que : al. un support solide est mis en contact avec une solution de PscE ou de PscG afin d'assurer la fixation de PscE 30 ou PscG sur la surface dudit support, bl. la solution de l'étape al est éliminée du support, cl. le support est optionnellement lavé et/ou séché, et dl. le dispositif de criblage est récupéré. 3038983 18 Dans un mode de réalisation particulier, la fabrication d'un dispositif selon l'invention est caractérisée en ce que la fixation de PscE ou PscG sur la surface du support est obtenue via liaisons faibles de type hydrophobe, hydrogène ou de Van 5 der Walls. Dans un mode particulier, le procédé de fabrication selon la présente invention est caractérisé en ce que la surface du support solide présente un traitement de surface hydrophobe. Enfin dans un mode de réalisation particulier, le procédé de 10 fabrication d'un dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que le support solide est une plaque de microtitration comprenant au moins un puit. A titre particulier, une plaque de microtitration de type NUNC 15 est particulièrement adaptée. C'est aussi un autre objet de la présente invention que de fournir l'utilisation d'un dispositif selon la présente invention pour l'identification de molécules aptes à inhiber 20 la machine de virulence de Pseudomonas aeruginosa. Enfin, la présente invention vise l'utilisation d'un dispositif selon la présente invention pour l'identification de molécules aptes à prévenir et/ou traiter une infection 25 pathogène causée par Pseudomonas aeruginosa. La présente invention vise enfin au moins l'un des composés choisi parmi : l'acide pentétique, le clioquinol, le myricétine, le bensérazide, le gossypol, un sel de 3- 30 alkylpyridium 6 (3-APS), et l'héderagénine pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter une infection pathogène causée par Pseudomonas aeruginosa. 3038983 19 De manière préférentielle le composé selon l'invention pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter une infection pathogène causée par Pseudomonas aeruginosa est caractérisé en ce que l'infection est une infection nosocomiale. 5 Dans un mode de réalisation particulier, l'infection pathogène est une infection choisie parmi les infections des yeux, les infections des plaies, en particulier suite à une brûlure et/ou une opération chirurgicale, les infections des voies 10 urinaires, en particulier de la vessie ou de l'urètre par exemple après sondage, les infections du système gastro-intestinal, les infections d'un poumon en particulier après bronchoscopie, les méningites, en particulier d'inoculation, et les septicémies. 15 3038983 20 Exemple 1 : Réalisation du test ELISA 50 pL de protéine PscG à 1 pM (pour le criblage de librairies) ou 2.2 pM (pour le criblage de molécules nouvellement synthétisées) est incubé dans une plaque NUNC 96 puits pendant 5 8 h à 4°C. Les puits sont lavés trois fois avec 200 pL de 1X PBS/0.1% Tween20®. Les puits sont traités toute une nuit à 4°C avec 200 pL d'une solution de lait à 5% dans 1X PBS/0.1% Tween20®. La solution est ensuite jetée et la plaque séchée par égouttage. 10 Le test est réalisé comme suit : - Contrôle négatif (plus faible niveau de signal): 100 pL de tampon (25 mM Tris-HC1, 250 mM NaC1, pH 8.0); - Contrôle positif (plus fort niveau de signal): 50 pL de tampon et 50 pL d'une solution à tester à 25 pM (criblage de 15 librairie) ou 3 pM (criblage de molécules analogues) de la protéine PscE; - Test des inhibiteurs: 40 pL tampon, 50 pL d'une solution à 25 pM (criblage de librairie) ou 3 pM (criblage de molécules analogues) de protéine PscE et 10 pL de la solution contenant 20 l'inhibiteur à tester. Les solutions sont laissées pendant 4h à température ambiante. Les puits sont lavés trois fois avec 200 pL de 1X PBS/0.1% Tween20®. L'anticorps anti-PscE dilué à 1:2,000 dans 1X PBS/0.1% Tween20®, 50 pL, est ajouté et le tout est laisse 2 h 25 à température ambiante. Les puits sont laves trois fois avec 200 pL de 1X PBS/0.1% Tween20®. L'anticorps anti souris conjugué avec HRP est dilué à 1:5,000 dans 1X PBS/0.1% Tween20® et 50 pL sont ajoutés et laissés pendant 2h à température ambiante. Les puits sont lavés trois fois avec 200 30 pL of 1X PBS/0.1% Tween20®. La révélation du test ELISA est réalisée par ajout de 50 pL de réactif TMB suivi par une incubation de 15 minutes à température ambiante dans l'obscurité. L'arrêt de la réaction 3038983 21 est réalisé par ajout de 50 pL of 2N HC1. La plaque est lue à t 450 nm. Résultats d'inhibition Tableau 1. Molécules identifiées dans le criblage primaire PscE-PscG à 50 pM Molécules Nom Propriétés connues % inhibition PscE-PscG à 50 pM o Acide 94% OH Pentétique H0201^121-1 H020) (D021-1 CI Clioquinol Antifongique Antiprotozoa ire AntiAlzheime r 93.7% (IC50= 5 pM) . 1 N OH OH Myricétine Anti-oxidant 80.5% HO 011 HO le O OH 1 HO O OH HO Bensérazide Inhibiteur de décarboxylas e 86.3% (IC50= 11 pM) el kli, o HO OH N NH2 OH H o o Gossypol 73.9% HO / OH HO OH HO 41. ®. OH I0 Sels de 3- 56% - 2 O N 12 N N °gI O N 0 N=N N=N (r./,0,\M 6 N=N 6 N=N o a O - N 12 NN Cl 44 3038983 26 19 19.8% 20 pas d'inhibition 22 88.8% 24 38.6% 26 44.2% 27 39.6% 28 37.8% 29 24% 30 52.8% 31 82.9% 33 54.2% 34 30.6% 3- 35 29.8% APS/clioquinol 36 54.2% 37 92.5% 38 27.3% 39 97.3% 40 87.2% 41 69.1% 42 pas d'inhibition 43 29.5% 44 33.4% 3038983 27 45 71.6% 46 pas d'inhibition 47 pas d'inhibition 48 72.3% 49 69.8% 50 18.9% 51 28.9% 52 3.4% EXAMPLE 3 : Préparation des molécules 5 Pour 1-azido-4-butane lla: Coutrot, F., and Busseron, E., Controlling the Chair Conformation of a Mannopyranose in a Large-Amplitude [2]Rotaxane Molecular Machine, Chem.-Eur. J. 2009, 15, 5186-5190 Pour 1-azido-6-hexane 11 b et 1-azido-8-octane llc: Agnew, H. 10 D., Rohde, R. D., Millward, S. W., Nag, A., Yeo, W.-S., Hein, J. E., Pitram, S. M., Tariq, A. A., Burns, V. M., Krom, R. J., Fokin, V. V., Sharpless, K. B., and Heath, J. R., Iterative In Situ Click Chemistry Creates Antibody-like Protein-Capture Agents, Angew. Chem., Int. Ed. 2009, 48, 4944-4948. 15 Procédure générale: synthèse de 1-azido-10-bromodecane (11d) Une solution de 1,10-dibromodecane (9.23 g, 30.7 mmol) et NaN3 20 (2 g, 30,7 mmol) dans le DMF (35 mL) est agitée à température ambiante pendant 48 h. De l'éther est ajouté (150 mL) et la phase organique est lavée à l'eau (3x150 mL). La phase 3038983 28 organique est séchée et évaporée (MgSO4). Le produit est purifié par flash chromatographie (2% CH2C12/cyclohexane, gel de silice) pour donner lld sous la forme d'une huile incolore (4.27 g, 53%). 5 10 Rf = 0.38 (cyclohexane/EtOAc 98:2); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.30-1.40 (m, 10H), 1.40-1.44 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.85 (m, 10 2H), 3.25 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.9 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.8 (CH2), 28.3 (CH2), 28.8 (CH2), 28.9 (CH2), 29.2 (CH2), 29.4 (CH2), 29.5 (CH2), 32.9 (CH2), 34.1 (CH2), 51.6 (CH2). 15 1-azido-12-bromododecane (11e) 12 A partir de 1,12-dibromododecane (5.05 g, 15.4 mmol), le 20 produit lle (2.2 g, 49%) est obtenu par flash chromatographie (silica gel, 2% CH2C12/cyclohexane) sous la forme d'une huile incolore; Rf = 0.5 (2% CH2C12/cyclohexane); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1,25-1.33 (m, 12H), 1.59 (m, 1H), 1.85 (m, 1H), 3.25 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 3.40 (t, J = 6.9 Hz, 1H); 13C NMR (100 25 MHz, CDC13) 6 26.9 (CH2), 28.3 (CH2), 28.9 (CH2), 29.0 (CH2), 29.3 (CH2), 29.5 (CH2), 29.6 (3xCH2), 33.0 (CH2), 34.2 (CH2), 51.6 (CH2). 30 Procédure générale de synthèse de 3-(3-(4- azidobutoxy)propyl)pyridine (12a) 3038983 29 A un mélange de 1-azido-4-bromobutane (1.29 g, 7.2 mmol) et de 3-(3-hydroxypropyl)-pyridine (1.04 g, 7.6 mmol) est ajouté du KOH (730 mg, 13.0 mmol) et du tétrabutylammonium hydrogène sulphate (123 mg, 0,36 mmol). Après mélange sous argon pendant 5 48 h, du CH2C12 est ajouté et le mélange est filtré. Le solvant est ôté sous vide et le produit purifié par flash chromatographie (30% EtOAc/cyclohexane, gel de silice) pour donner 12a sous la forme d'une huile jaune (682 mg, 40%). 4 Dei N3 10 C 12 H18N4 0 M=234,15g/mol Rf = 0.13 (20% EtOAc/cyclohexane); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 15 1.57-1.75 (m, 4H), 1.89 (m, 2H), 2.70 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.31 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.42 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.44 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 7.20 (dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.43-8.45 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.0 (CH2), 27.0 (CH2), 29.6 (CH2), 31.1 (CH2), 51.4 (CH2), 69.7 20 (CH2), 70.3 (CH2), 123.4 (CH), 136.0 (CH), 137.3 (C), 147.4 (CH), 150.0 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 357 (70) W+Nar; 235 (100) [Mr+H]+. 25 3-(3-(6-azidohexyloxy)propyl)pyridine (12b) 6 0\/\/\/N3 C 14H22N4 0 M=262,18 g/mol 30 3038983 30 A partir 1-azido-6-bromohexane (2.8 g, 13.4 mmol), le produit 12b (2.56 g, 72%) est obtenu sous la forme d'une huile jaune. Rf = 0.14 (20% EtOAc/cyclohexane); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 5 1.39-1.42 (m, 4H), 1.60-1.63 (m, 4H), 1.86-1.98 (m, 2H), 2.70 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3.27 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.35-3.43 (m, 4H), 7.21 (dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 7.7, 1.6 Hz, 1H), 8,44-8,47 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 25.9 (CH2), 26.7 (CH2), 28.9 (CH2), 29.6 (CH2), 29.7 (CH2), 31.1 10 (CH2), 51.5 (CH2), 69.6 (CH2), 70.9 (CH2), 123.4 (CH), 136.0 (CH), 137.3 (C), 147.4 (CH), 150.1 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 285 (30) W+Nar; 263 (100) [Mr+H]+. 15 3-(3-(8-azidooctyloxy)propyl)pyridine (12c) 8 N FW = 290,21g/mol C 1 6112 6N4 0 20 A partir de 1-azido-8-bromo-octane (2.68 g, 11.4 mmol), le produit 12c (2.54 g, 76.5%) est obtenu sous la forme d'une huile jaune. 25 Rf = 0.18 (20% EtOAc/cyclohexane); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.34-1.41 (m, 8H), 1.54-1.63 (m, 4H), 1.89 (m, 2H), 2.70 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 3.25 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 7.21 (dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8,44 (dd, J = 4.8, 1.6 Hz, 1H), 8.46 30 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.2 (CH2), 26.8 (CH2), 28.9 (CH2), 29.2 (CH2), 29.4 (CH2), 29.6 (CH2), 29.8 (CH2), 31.1 (CH2), 51.6 (CH2), 69.6 (CH2), 71.1 (CH2), 123.4 3038983 31 (CH), 136.0 (CH), 137.3 (C), 147.4 (CH), 150.1 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 313 (72) [NI+Na]+; 291 (100) [M+H]+ 5 3-(3-(10-azidodecyloxy)propyl)pyridine (12d) 10 C a H3 oN40 10 M=318,24 g/mol A partir de 1-azido-10-bromo-decane (3.52 g, 13.4 mmol), le produit 12d (3.42 g, 80%) est obtenu sous la forme d'une huile jaune. 15 Rf = 0.21 (20% Et0Ac/cyclohexane); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.23-1.34 (m, 12H), 1.54-1.64 (m, 4H), 1.89 (m, 2H), 2.70 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3.25 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.38-3.43 (m, 4H), 7.20 (dd, J = 7.5, 4.8 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8,44 20 (dd, J = 4.8, 1.6 Hz, 1H), 8.46 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.4 (CH2), 26.8 (CH2), 29.0 (CH2), (CH2), 29.5 (CH2), 29.6 (CH2), 29.6 (CH2), 29.7 (CH2), (CH2), 31.2 (CH2), 51.6 (CH2), 69.6 (CH2), 71.2 (CH2), (CH), 136.0 (CH), 137.4 (C), 147.5 (CH), 150.2 (CH); 29.3 29.9 123.4 LRMS 25 (ESI+) m/z (%): 341 (55) [M+Na]+; 319 (100) [M+H]+. 3-(3-(12-azidododecyloxy)propyl)pyridine (12e) 12 30 3038983 32 C2 OH3 4N4 0 MM = 346 A partir de 1-azido-12-bromo-dodecane (3.71 g, 12.8 mmol), le produit 12e (3.34 g, 75%) est obtenu sous la forme d'une huile 5 jaune. Rf = 0.21 (20% EtOAc/cyclohexane); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.23-1.40 (m, 14H), 1.54-1.63 (m, 4H), 1.89 (m, 2H), 2.71 (m, 2H), 3.25 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.41 10 (f, J = 6.2 Hz, 2H), 7.21 (dd, J = 7.8, 4.8 Hz, 1H), 7.51 (dt, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 8,44 (dd, J = 4.8, 1.7 Hz, 1H), 8.46 (d, J = 1.7 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.0 (CH2), 26.5 (CH2), 28.9 (CH2), 29.2 (5xCH2), 29.3 (2xCH2), 29.6 (CH2), 30.8 (CH2), 51.2 (CH2), 69.1 (CH2), 70.8 (CH2), 123.0 (CH), 135.6 15 (CH), 137.0 (C), 147.0 (CH), 149.8 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 347 (100) [Mr+H]+, 319 (5). Procédure générale de synthèse de 3-(3-(4- 20 azidobutoxy)propyl)pyridine (13a) 4 C 12112 ON2 0 M=208,16g/mol 25 A une solution d'azide 12a (390 mg, 1.67 mmol) dans la pyridine (12 mL) est ajoutée une portion de PPh3 (828 mg, 3.2 mmol) à 0°C. Après 30 min à cette température, le mélange est agité toute la nuit à température ambiante. Après 30 refroidissement à 0°C, une solution concentrée d'ammoniac aqueuse est ajoutée (0.91 mL) et le mélange est agité pendant une nuit à température ambiante. La pyridine est ôtée et une 3038983 33 solution de HC1 1N (19 mL) est ajoutée. La solution est lavée à l'éther. Du Na2CO3 solide (2.4 g) est ajouté par portion et le produit est extrait avec CH2C12. Le solvant organique est séché (MgSO4) et évaporé sous vide. Le produit est purifié par 5 flash chromatographie (10 to 15% Me0H/CH2C12 et 15% Me0H/1%Et3N/CH2C12) pour obtenir le produit 13a (212 mg, 58%) sous la forme d'une huile. Rf = 0.05 (10% Me0H/CH2C12); ); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.43 10 (m, 2H), 1.52 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 2.58-2.67 (m, 4H), 3.303.35 (m, 4H), 7.12 (dd, J = 7.8, 4.8 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8,35 (dd, J = 4.8, 1.6 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.0 (CH2), 29.4 (CH2), 30.3 (CH2), 30.9 (CH2), 41.9 (CH2), 69.3 (CH2), 70.7 (CH2), 123.2 15 (CH), 135.8 (CH), 137.1 (C), 147.2 (CH), 149.9 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 231 (4) W+Nar ; 209 (100) [Mr+H]+. 10-(3-(pyridin-3-yl)propoxy)hexan-l-amine (13b) 20 6 C 1 4 H2 4N2 0 M=236,19g/mol 25 Rf = 0.08 (15% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.30-1.41 (m, 4H), 1.46 (m, 2H), 1.91 (m, 2H), 2.68-2.72 (m, 4H), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.41 (t, J 6.3 Hz, 2H), 7.21 (dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8,44 (dd, J = 4.8, 1.5 Hz, 1H), 8.46 (d, J = 1.5 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 30 6 26.3 (CH2), 26.9 (CH2), 29.7 (CH2), 29.9 (CH2), 31.2 (CH2), 33.9 (CH2), 42.2 (CH2), 69.5 (CH2), 71.0 (CH2), 123.3 (CH), 3038983 34 135.9 (CH), 137.2 (C), 147.4 (CH), 150.1 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%) : 259 (12) [M+Na]+ ; 237 (100) [M+H]+. 5 8-(3-(pyridin-3-yl)propoxy)octan-l-amine (13c) 8 C 1 6112 8N2 0 M=264,22g/mol 10 A partir de 12c (2.0 g, 6.89 mmol), le produit 13c (1.32 g, 73%) est obtenu sous la forme d'une huile incolore. Rf = 0.05 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.30-1.43 15 (m, 8H), 1.46 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.90 (m, 2H), 2.69-2.72 (m, 4H), 3.38-3.43 (m, 4H), 7.21 (dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.44 (dd, J = 4.8, 1.5 Hz, 1H), 8.46 (d, J = 1.5 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.3 (CH2), 27.0 (CH2), 29.6 (CH2), 29.7 (CH2), 29.9 (CH2), 31.2 (CH2), 33.7 20 (CH2), 42.3 (CH2), 69.6 (CH2), 71.3 (CH2), 123.5 (CH), 136.1 (CH), 137.4 (C), 147.5 (CH), 150.2 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 287 (7) W+Nar ; 265 (100) [Mr+H]+. 25 10-(3-(pyridin-3-yl)propoxy)decan-l-amine (13d) 10 NH2 C18H32N20 30 M=292,25g/mol 3038983 A partir de 12d (2.0 g, 6.29 mmol), le produit 13d (1.58 g, 95%) est obtenu sous la forme d'une huile incolore. 5 Rf = 0.10 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.26-1.39 (m, 12H), 1.47 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.89 (m, 2H), 2.67-2.72 (m, 4H), 3.38-3.43 (m, 4H), 7.21 (dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.44 (dd, J = 4.8, 1.5 Hz, 1H), 8.46 (d, J = 1.5 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.4 (CH2), 10 27.0 (CH2), 29.6 (CH2), 29.7 (CH2), 29.7 (CH2), 29.7 (CH2), 29.7 (CH2 ) 29.7 (CH2), 29.9 (CH2), 31.2 (CH2), 33.4 (CH2), 42.2 (CH2 ) 69.6 (CH2), 71.3 (CH2), 123.5 (CH), 136.1 (CH), 137.4 (C), 147.5 (CH), 150.2 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 315 (4) [M+Na]+; 293 (100) [M+H]+. 15 12-(3-(pyridin-3-yl)propoxy)dodecan-l-amine (13e) 12 NI-12 20 C20H36N20 MM = 320 A partir de 12e (707 mg, 2.04 mmol), le produit 13e (370 mg, 47%) est obtenu sous la forme d'une huile incolore. 25 Rf = 0.13 (20% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.15-1.28 (m, 16H), 1.35 (m, 2H), 1.48 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 2.55-2.65 (m, 4H), 3.28-3.35 (m, 4H), 7.11 (dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.34 (dd, J = 4.8, 1.5 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 1.5 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.1 (CH2), 30 26.7 (CH2), 29.3 (5xCH2), 29.4 (3xCH2), 29.6 (CH2), 30.9 (CH2), 41.9 (CH2), 69.2 (CH2), 70.9 (CH2), 123.1 (CH), 135.7 (CH), 3038983 36 137.1 (C), 147.1 (CH), 149.8 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 343 (3) [M+Na]+ ; 321 (100) [M+H]+. 5 Procédure générale de synthèse de 3-(3-(4-azidobutoxy)propy1)- 1-(2,4-dinitrophenyl)pyridinium chloride (14a) Le produit 12a (521 mg, 2.2 mmol) et le 1-chloro-2,4- dinitrobenzene (897 mg, 4.4 mmol) dans l'ethanol (13 mL) est 10 chauffé à 135°C sous agitation pendant 48 h. L'éthanol est enlevé sous vide et le produit purifié par flash chromatographie (10% to 15% methanol/CH2C12, gel de silice) pour donner 14a (920 mg, 86%) sous la forme d'une huile brune. 4 Obi N3 et--Ni NO2 15 NO2 C18H21C1N605 MM = 436.5 Rf = 0.08 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.60-1.68 20 (m, 4H), 2.09 (m, 2H), 3.12 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.33 (m, 2H), 3.49 (m, 2H), 3.55 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 8.34 (d, J = 8.2, 6.3 Hz, 1H), 8.38 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.88 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.93 (dd, J = 8.7, 2.5 Hz, 1H), 9.23 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 9.25 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 9.33 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 25 26.9 (CH2), 28.0 (CH2), 30.7 (CH2), 31.2 (CH2), 52.4 (CH2), 70.3 (CH2), 71.4 (CH2), 123.3 (CH), 129.1 (CH), 131.4 (CH), 132.9 (CH), 140.2 (C), 144.6 (C), 144.8 (CH), 145.5 (C), 146.5 (CH), 150.2 (CH), 151.1 (C); LRMS (ESI+) m/z (%) : 401 (100) [m]+. 3038983 37 3-(3-(6-azidohexyloxy)propy1)-1-(2,4-dinitrophenyl)pyridinium chloride (14b) 6 O N3 CP NO2 NO2 5 C2 0112 5C 1N6 05 M=464.5 g/mol A partir de 12b (1.8 g, 6.89 mmol), le produit 14b (2.99 g, 10 93.5%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.09 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.35-1.45 (m, 4H), 1.53-1.62 (m, 4H), 2.07 (m, 2H), 3.10 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.29 (J = 6.8 Hz, 2H), 3.45 (J = 6.5 Hz, 2H), 3.53 (t, J 15 = 6.0 Hz, 2H), 8.33 (d, J = 8.0, 6.3 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.92 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 9.22 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 9.25 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 9.32 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.9 (CH2), 27.7 (CH2), 29.8 (CH2), 30.7 (2xCH2), 31.3 (CH2), 52.5 (CH2), 70.3 (CH2), 72.0 20 (CH2), 123.3 (CH), 129.1 (CH), 131.3 (CH), 132.9 (CH), 140.2 (C), 144.6 (C), 144.8 (C), 145.5 (C), 146.6 (CH), 150.2 (CH), 151.1 (C); LRMS (ESI+) m/z (%): 429 (100) [m]+. 25 3-(3-(8-azidooctyloxy)propy1)-1-(2,4-dinitrophenyl)pyridinium chloride (14c) 3038983 8 CP 38 NO2 NO2 C2 2 H2 9C 1N6 05 M=492,2g/mol 5 A partir de 12c (1.9 g, 6.89 mmol), le produit 14c (2.88 g, 89%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.09 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.35-1.45 (m, 8H), 1.53-1.63 (m, 4H), 2.09 (m, 2H), 3.12 (t, J = 7.6 Hz, 10 2H), 3.30 (J = 6.8 Hz, 2H), 3.46 (J = 6.6 Hz, 2H), 3.54 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 8.35 (d, J = 7.9, 6.3 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.88 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.93 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 9.19 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 9.26 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.3 (CH2), 27.9 (CH2), 30.0 (CH2), 30.3 (CH2), 30.6 15 (CH2), 30.8 (CH2), 30.9 (CH2), 31.3 (CH2), 52.6 (CH2), 70.3 (CH2), 72.2 (CH2), 123.3 (CH), 129.1 (CH), 131.3 (CH), 132.8 (CH), 140.3 (C), 144.7 (C), 144.8 (CH), 145.6 (C), 146.6 (CH), 150.3 (CH), 151.3 (C); LRMS (ESI+) m/z (%) : 457 (100) [m]+. 20 3-(3-(10-azidodecyloxy)propy1)-1-(2,4-dinitrophenyl)pyridinium chloride (14d) 10 Cl- NO2 NO2 25 C24H33C1N605 3038983 39 M = 520.5 g/mol A partir de 12d (2.42 g, 7.6 mmol), le produit 14d (3.5 g, 88.5%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. 5 Rf = 0.15 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.30-1.40 (m, 12H), 1.52-1.62 (m, 4H), 2.07 (m, 2H), 3.09 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.27 (J = 6.9 Hz, 2H), 3.44 (J = 6.6 Hz, 2H), 3.52 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 8.31 (d, J = 8.0, 6.3 Hz, 1H), 8.36 (d, J 10 = 8.7 Hz, 1H), 8.83 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.91 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 9.21 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 9.24 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 9.31 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.4 (CH2), 27.9 (CH2), 30.0 (CH2), 30.3 (CH2), 30.7 (4xCH2), 30.9 (CH2), 31.3 (CH2), 52.5 (CH2), 70.3 (CH2), 72.2 (CH2), 123.2 (CH), 129.1 15 (CH), 131.3 (CH), 132.9 (CH), 140.2 (C), 144.6 (C), 144.8 (CH), 145.5 (C), 146.5 (CH), 150.2 (CH), 151.1 (C); LRMS (ESI+) m/z (%): 485 (100) [m]+ 20 3-(3-(12-azidododecyloxy)propy1)-1-(2,4- dinitrophenyl)pyridinium chloride (14e) 12 N NO2 NO2 25 C26H37C1N605 MM = 548.5 A partir de 12e (1.95 g, 5.64 mmol), le produit 14e (2.85 g, 91%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. 3038983 Rf = 0.17 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.28-1.40 (m, 16H), 1.51-1.62 (m, 4H), 2.06 (m, 2H), 3.09 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.28 (J = 6.8 Hz, 2H), 3.43 (J = 6.8 Hz, 2H), 3.51 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 8.31 (d, J = 8.1, 6.3 Hz, 1H), 8.35 (d, J 5 = 8.7 Hz, 1H), 8.84 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.91 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 9.19 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 9.25 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 9.29 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.4 (CH2), 27.9 (CH2), 30.0 (CH2), 30.4 (CH2), 30.7 (4xCH2), 30.8 (2xCH2), 30.9 (CH2), 31.3 (CH2), 52.6 (CH2), 70.3 (CH2), 72.2 (CH2), 123.2 10 (CH), 129.1 (CH), 131.3 (CH), 132.9 (CH), 140.3 (C), 144.7 (C), 144.8 (CH), 145.6 (C), 146.6 (CH), 150.2 (CH), 151.2 (C); LRMS (ESI+) m/z (%) : 513 (100) [m]+. 15 Procédure générale de synthèse de 3-(3-(4-azidobutoxy)propy1)- 1-(4-(3-(pyridin-3-yl)propoxy)butyl)pyridinium chloride (17) 4 Obi N3 -CI 1" O 4 C2 4E13 6 C 1N5 02 20 MM = 461.5 Au sel de Zincke 14a (112 mg, 0.26 mmol) dans le n-butanol est ajoutée l'amine 13a (70 mg, 3.1 mmol). Le mélange est mis au reflux pendant 18 h. Après évaporation, le produit est purifié 25 par flash chromatographie (7% to 10% méthanol/CH2C12, gel de silice) pour donner 17 (91 mg, 77%) sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.10 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.58-1.7 (m, 6H), 1.89 (m, 2H), 1.99 (m, 2H), 2.09 (m, 2H), 2.73 (m, 30 2H), 2.97 (m, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.41-3.51 (m, 8H), 4.66 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.37 (dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 3038983 41 7.7 Hz, 1H), 8.03 (dd, J = 7.9, 6.2 Hz, 1H), 8.37 (m, 2H), 8.47 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.87 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.96 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.0 (CH2), 27.5 (CH2), 28.1 (CH2), 30.0 (CH2), 30.5 (CH2), 30.8 (CH2), 31.4 (CH2), 32.2 5 (CH2), 52.4 (CH2), 62.9 (CH2), 70.6 (CH2), 70.9 (CH2), 71.1 (CH2), 71.4 (CH2), 125.4 (CH), 129.1 (CH), 138.6 (CH), 139.8 (C), 143.6 (CH), 145.5 (C, CH), 146.9 (CH), 147.7 (CH), 150.2 (CH) ; LRMS (ESI+) m/z (%) : 426 (100) [e]; 398 (30). 10 3-(3-(4-azidobutoxy)propy1)-1-(6-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)hexyl)pyridinium chloride (18) 4 0 N3 -Cl" O 6 15 C26H40C1N502 MM = 489.5 A partir de 14a (165 mg, 0.38 mmol) et de l'amine 13b (115 mg, 0.49 mmol), le produit 18 (138 mg, 74%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. 20 Rf = 0.17 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.38-1.49 (m, 6H), 1.54-1.74 (m, 4H), 1.86 (m, 2H), 1.95-2.09 (m, 4H), 2.67 (m, 2H), 2.93 (m, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.38-3.45 (m, 6H), 4.67 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.37 (dd, J = 7.7, 5.0 Hz, 1H), 7.71 25 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 7.8, 6.2 Hz, 1H), 8.34-8.41 (m, 2H), 8.49 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.93 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 9.02 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.9 (CH2), 27.0 (CH2), 27.1 (CH2), 28.1 (CH2), 30.4 (CH2), 30.6 (CH2), 30.7 (CH2), 31.4 (CH2), 32.2 (CH2), 32.6 (CH2), 52.4 (CH2), 62.9 (CH2), 70.6 30 (2xCH2), 71.3 (CH2), 71.7 (CH2), 125.3 (CH), 129.0 (CH), 138.5 (CH), 139.7 (C), 143.5 (CH), 145.4 (CH), 145.5 (C), 146.8 3038983 42 (CH), 147.6 (CH), 150.2 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 454 (100) U41, 426 (45). 5 3-(3-(6-azidohexyloxy)propy1)-1-(4-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)butyl)pyridinium chloride (19) 6 4 C26H40C1N502 MM = 489.5 10 A partir de 13b (163 mg, 0.35 mmol) et de l'amine 12a (92 mg, 0.42 mmol), le produit 19 (118 mg, 69%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.12 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.30-1.43 15 (m, 4H), 1.49-1.61 (m, 4H), 1.66 (m, 2H), 1.89 (m, 2H), 2.00 J = (m, 2H), 2.12 (m, 2H), 2.73 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.98 (t, 4.70 7.5 Hz, 2H), 3.27 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.37-3.53 (m, 8H), (m, 2H), 7.39 (m, 1H), 7.72 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 7.8, 6.2 Hz, 1H), 8.33-8.41 (m, 2H), 8.49 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.92 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 9.01 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, 20 CDC13) 6 27.0 (CH2), 27.4 (CH2), 27.7 (CH2), 30.0 (2xCH2), 30.5 (CH2), 30.7 (CH2), 30.8 (CH2), 31.4 (CH2), 32.2 (CH2), 52.5 (CH2), 62.9 (CH2), 70.6 (CH2), 70.9 (CH2), 71.1 (CH2), 71.9 (CH2), 125.4 (CH), 129.1 (CH), 138.4 (CH), 139.8 (C), 143.5 (CH), 145.4 (CH), 145.5 (C), 146.9 (CH), 147.6 (CH), 150.1 25 (CH) ; LRMS (ESI+) m/z (%) : 454 (100) [MI, 426 (35). 3-(3-(4-azidobutoxy)propy1)-1-(8-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)octyl)pyridinium chloride (20) 3038983 43 4 CI " 8 C28H44C1N502 MM= 517,5 A partir de 13a (105 mg, 0.24 mmol) et de l'amine 14c (79.5 5 mg, 0.3 mmol), le produit 20 (120 mg, 96%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.13 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.30-1.46 (m, 8H), 1.51-1.71 (m, 4H), 1.87 (m, 2H), 1.95-2.06 (m, 4H), 2.73 (m, 2H), 2.97 (m, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.37-3.46 (m, 6H), 10 3.49 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.63 (m, 2H), 7.36 (dd, J = 7.7, 5.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.02 (dd, J = 7.8, 6.2 Hz, 1H), 8.34-8.39 (m, 2H), 8.47 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.88 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.97 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.0 (CH2), 27.3 (CH2), 27.6 (CH2), 28.1 (CH2), 28.7 (CH2), 30.2 15 (CH2), 30.3 (CH2), 30.5 (2xCH2), 30.8 (CH2), 30.9 (CH2), 32.2 (CH2), 52.5 (CH2), 63.1 (CH2), 70.6 (2xCH2), 71.5 (CH2), 72.1 (CH2), 125.4 (CH), 129.1 (CH), 138.6 (CH), 139.9 (C), 143.5 (CH), 145.5 (CH, C), 146.9 (CH), 147.6 (CH), 150.2 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%) : 482 (100) [MI, 454 (42). 20 3-(3-(6-azidohexyloxy)propy1)-1-(6-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)hexyl)pyridinium chloride (21) 6 N3 -Cl' 25 6 C28H44C1N502 MM = 517,5 3038983 44 A partir de 14b (169 mg, 0.36 mmol) et de l'amine 13b (103 mg, 0.44 mmol), le produit 21 (156 mg, 83%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.22 (15% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.30- 5 1.48 (m, 8H), 1.49-1.72 (m, 6H), 1.86 (m, 2H), 1.94-2.07 (m, 4H), 2.72 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.27 (m, 2H), 3.37-3.44 (m, 6H), 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.63 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.37 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.02 (m, 1H), 8.32-8.39 (m, 2H), 8.47 (d, J = 8.0 10 Hz, 1H), 8.88 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.97 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.9 (CH2), 27.0 (CH2), 27.1 (CH2), 27.8 (CH2), 30.0 (CH2), 30.5 (CH2), 30.6 (CH2), 30.7 (CH2), 30.8 (CH2), 31.4 (CH2), 32.2 (CH2), 32.7 (CH2), 52.5 (CH2), 63.0 (CH2), 70.6 (CH2), 70.7 (CH2), 71.8 (CH2), 71.9 (CH2), 125.3 (CH), 129.1 15 (CH), 138.5 (CH), 139.8 (C), 143.5 (CH), 145.5 (CH, C), 146.9 (CH), 147.7 (CH), 150.3 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 482 (100) [MI, 454 (60). 20 3-(3-(6-azidohexyloxy)propy1)-1-(8-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)octyl)pyridinium chloride (22) 6 O N3 CI e 8 C30H48C1N502 25 MM = 545.5 A partir de 14b (145 mg, 0.31 mmol) et de l'amine 13c (99 mg, 0.38 mmol), le produit 22 (112 mg, 66%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.11 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.3130 1.45 (m, 12H), 1.51-1.62 (m, 6H), 1.87 (m, 2H), 1.94-2.06 (m, 4H), 2.73 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.28 3038983 (m, 2H), 3.38-3.44 (m, 6H), 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.60 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.01 (dd, J = 7.6, 6.0 Hz, 1H), 8.33-8.40 (m, 2H), 8.46 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.84 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.93 5 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.0 (CH2), 27.2 (CH2), 27.3 ( CH2) 27.8 (CH2), 30.0 (CH2), 30.2 (CH2), 30.4 (CH2), 30.5 (CH2), 30.7 (2xCH2), 30.8 (CH2), 31.4 (CH2), 32.2 (CH2), 32.7 (CH2), 52.5 (CH2), 63.0 (CH2), 70.6 (2xCH2), 71.8 (CH2), 71.9 (CH2), 125.3 (CH), 129.1 (CH), 138.5 (CH), 139.8 (C), 143.5 10 (CH), 145.4 (CH, C), 146.8 (CH), 147.7 (CH), 150.2 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 510 (100) U41; 482 (30); HRMS (ESI+): calcd for C30H48N502 [141: 510.3802, found: 510.3802. 15 3-(3-(8-azidooctyloxy)propy1)-1-(6-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)hexyl)pyridinium chloride (23) 8 \/0/..N3 -ci 6 C30H48C1N502 20 MM = 545.5 A partir de 14c (150 mg, 0.3 mmol) et de l'amine 13b (86 mg, 0.36 mmol), le produit 23 (105 mg, 63%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.13 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.29-1.48 25 (m, 12H), 1.50-1.63 (m, 6H), 1.87 (m, 2H), 1.93-2.07 (m, 4H), 2.72 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.26 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.38-3.45 (m, 6H), 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.61 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.01 (dd, J = 7.8, 6.0 Hz, 1H), 8.34-8.39 30 (m, 2H), 8.46 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.86 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3038983 46 8.94 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.9 (CH2), 27.2 (CH2), 27.3 (CH2), 27.9 (CH2), 30.0 (CH2), 30.4 (CH2), 30.5 (CH2), 30.6 (CH2), (CH2), 5 (CH2) (CH), (CH), (30). 30.7 (CH2), 30.8 (CH2), 30.9 (CH2), 31.4 (CH2), 32.2 32.7 (CH2), 52.6 (CH2), 63.0 (CH2), 70.6 (CH2), 70.7 71.8 (CH2), 72.1 (CH2), 125.3 (CH), 129.1 (CH), 138.5 139.8 (C), 143.5 (CH), 145.6 (CH, C), 146.9 (CH), 147.7 150.3 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 510 (100) [e]; 482 10 3-(3-(10-azidodecyloxy)propy1)-1-(6-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)hexyl)pyridinium chloride (24) 10 -ci N 6 C32H52C1N502 15 MM = 573.4 A partir de 14d (169 mg, 0.32 mmol) et de l'amine 13b (92 mg, 0.39 mmol), le produit 24 (123 mg, 66%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. 20 Rf = 0.16 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.27-1.47 (m, 16H), 1.48-1.62 (m, 6H), 1.86 (m, 2H), 1.95-2.08 (m, 4H), 2.72 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.26 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.37-3.45 (m, 6H), 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.65 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.37 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.71 25 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.03 (dd, J = 7.8, 6.0 Hz, 1H), 8.33-8.41 (m, 2H), 8.47 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.90 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.99 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 26.9 (CH2), 27.1 (CH2), 27.4 (CH2), 27.9 (CH2), 30.0 (CH2), 30.3 (CH2), 30.5 (CH2), 30.6 (CH2), 30.7 (4xCH2), 30.9 (CH2), 31.4 (CH2), 32.2 (CH2), 32.6 30 (CH2), 52.5 (CH2), 63.0 (CH2), 70.5 (CH2), 70.6 (CH2), 71.7 3038983 5 47 139.7 (CH2), 72.1 (CH2), 125.3 (CH), 129.0 (CH), 138.4 (CH), (C), 143.5 (CH), 145.4 (CH, C), 146.8 (CH), 147.7 (CH), (CH) ; HRMS (ESI+) m/z (%) : calcd for C32H52N502 [MI: 538 found: 538.4114. 150.2 4115, 3-(3-(8-azidooctyloxy)propy1)-1-(8-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)octyl)pyridinium chloride (25) 8 e 8 10 C32H52C1N502 MM = 573.5 A partir de 14c (247 mg, 0.5 mmol) et de l'amine 13c 0.63 mmol), produit 25 (262 mg, 91%) est obtenu sous d'une huile brune. 15 Rf = 0.19 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.25-1.43 (m, 16H), 1.48-1.61 (m, 6H), 1.87 (m, 2H), 1.92-2.06 (m, 4H), 2.73 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.26 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.37-3.44 (m, 6H), 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.60 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.71 20 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.01 (dd, J = 7.8, 6.0 Hz, 1H), 8.34-8.40 (m, 2H), 8.46 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.85 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 27.9 147.7 (CH), 150.3 (CH) ; LRMS (ESI+) m/z (%) : 538 (100) U41; 510 (18). (165 mg, la forme 8.94 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.3 (3xCH2), (CH2), (CH2), 25 (CH2) (CH2), (CH2), (CH2), (CH2), (CH2), 30.2 (CH2), 30.8 (CH2), 52.6 (CH2), 125.3 (CH), 30.0 30.5 30.6 32.2 32.7 72.0 72.1 138.6 (CH), 139.8 30.3 (CH2), 30.9 (2xCH2) 63.1 (CH2), 129.1 (CH), , 31.4 (CH2), 70.6 (2xCH2), 30.4 (CH2), (C), 143.5 (CH), 145.5 (CH, C), 146.9 (CH), 30 3038983 48 3-(3-(12-azidododecyloxy)propy1)-1-(4-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)butyl)pyridinium chloride (26) 12 -Cl" 1\1 4 C32H52C1N502 5 MM = 573.5 A partir de 14e (278 mg, 0.51 mmol) et de l'amine 13a (133 mg, 0.61 mmol), le produit 26 (197 mg, 68%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. 10 Rf = 0.22 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.24- 1.40 (m, 16H), 1.47-1.60 (m, 4H), 1.66 (m, 2H), 1.89 (m, 2H), 2.00 (m, 2H), 2.12 (m, 2H), 2.74 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.26 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.43-3.53 (m, 6H), 4.71 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.40 15 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.06 (dd, J = 7.8, 6.0 Hz, 1H), 8.34-8.44 (m, 2H), 8.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.94 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 9.03 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.4 (3xCH2), 27.9 (CH2), 29.9 (CH2), 30.0 (CH2), 30.4 (CH2), 30.5 (CH2), 30.7 (3xCH2), 30.8 (2xCH2), 30.9 (CH2), 31.4 20 (CH2), 32.2 (CH2), 52.5 (CH2), 62.8 (CH2), 70.5 (CH2), 70.8 (CH2), 71.0 (CH2), 72.1 (CH2), 125.4 (CH), 129.1 (CH), 138.8 (CH), 139.9 (C), 143.5 (CH), 145.4 (CH), 145.5 (C), 146.9 (CH), 147.4 (CH), 149.9 (CH); HRMS (ESI+) m/z (%): calcd for C32H52N502 [MI: 538.4115, found: 538.4113. 25 3-(3-(6-azidohexyloxy)propy1)-1-(10-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)decyl)pyridinium chloride (27) 3038983 49 6 -Cl" 10 C32H52C1N502 MM = 573.5 A partir de 14b (117.6 mg, 0.25 mmol) et de l'amine 13d (89 5 mg, 0.3 mmol), le produit 27 (212 mg, 64%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.20 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 1.26-1.43 (m, 16H), 1.50-1.62 (m, 6H), 1.87 (m, 2H), 1.96-2.07 (m, 4H), 2.73 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.28 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.37-3.44 (m, 6H), 10 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.65 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 7.8, 6.0 Hz, 1H), 8.33-8.41 (m, 2H), 8.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.92 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 9.01 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.0 (CH2) , 27.3 (CH2) , 27.4 (CH2), 27.8 (CH2), 30.0 15 ( CH2) 30.2 (CH2), 30.5 (CH2), 30.6 (CH2), 30.7 (2xCH2), 30.8 (2xCH2), 30.9 (CH2) , 31.4 (CH2) , 32.2 (CH2), 32.7 (CH2), 52.5 (CH2), 63.0 (CH2), 70.5 (CH2), 70.6 (CH2), 71.8 (CH2), 72.0 (CH2), 125.2 (CH), 129.0 (CH), 138.3 (CH), 139.7 (C), 143.5 (CH), 145.4 (CH), 145.5 (C), 146.8 (CH), 147.7 (CH), 150.3 20 (CH); HRMS (ESI+) m/z (%) : calcd for C32H52N502 [e]: 538.4115, found: 538.4114. 3-(3-(6-azidohexyloxy)propy1)-1-(12-(3-(pyridin-3- 25 yl)propoxy)dodecyl)pyridinium chloride (28) 6 0\/\/\/N3 +% -CI" m 12 C34H56C1N502 3038983 MM = 601.5 A partir de 14b (95 mg, 0.2 mmol) et de l'amine 13e (82 mg, 0.25 mmol), le produit 28 (104 mg, 84%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.19 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR 5 (400 MHz, CDC13) 6 1.29-1.42 (m, 20H), 1.50-1.63 (m, 6H), 1.88 (m, 2H), 1.94-2.05 (m, 4H), 2.73 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.28 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.38-3.44 (m, 6H), 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.58 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.00 (dd, J = 10 7.8, 6.0 Hz, 1H), 8.33-8.41 (m, 2H), 8.46 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.83 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.91 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.0 (CH2), 27.3 (CH2), 27.5 (CH2), 27.8 (CH2), 30.0 (CH2), 30.3 (CH2), 30.5 (CH2), 30.6 (CH2), 30.7 (3xCH2), 30.8 (3xCH2), 30.9 (CH2), 31.4 (CH2), 32.2 (CH2), 32.7 (CH2), 52.5 15 (CH2), 63.1 (CH2), 70.6 (CH2), 70.7 (CH2), 72.0 (CH2), 72.1 (CH2), 125.3 (CH), 129.1 (CH), 138.5 (CH), 139.8 (C), 143.4 (CH), 145.5 (C), 145.6 (CH), 146.9 (CH), 147.7 (CH), 150.3 (CH) ; HRMS (ESI+) m/z (%) : calcd for C34H56N502 [MI: 566.4428, found: 566.4425. 20 3-(3-(8-azidooctyloxy)propy1)-1-(10-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)decyl)pyridinium chloride (29) 8 -ci 25 10 C34H56C1N502 MM = 601.5 A partir de 14c (217 mg, 0.44 mmol) et de l'amine 13d (155 mg, 0.53 mmol), le produit 29 (172 mg, 65%) est obtenu sous la 30 forme d'une huile brune. Rf = 0.20 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR 3038983 51 (400 MHz, CDC13) 6 1.25-1.41 (m, 20H), 1.49-1.61 (m, 6H), 1.88 (m, 2H), 1.95-2.05 (m, 4H), 2.73 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.27 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.37-3.45 (m, 6H), 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.62 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (dd, 5 J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.02 (dd, J = 7.8, 6.0 Hz, 1H), 8.32-8.40 (m, 2H), 8.47 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.87 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.96 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.3 (2xCH2), 27.5 (CH2), 27.9 (CH2), 30.0 (CH2), 30.3 (CH2), 30.4 (CH2), 30.5 (CH2), 30.6 (2xCH2), 30.7 (2xCH2), 30.8 10 (CH2), 30.9 (2xCH2), 31.4 (CH2), 32.3 (CH2), 32.7 (CH2), 52.6 (CH2), 63.1 (CH2), 70.6 (2xCH2), 72.1 (2xCH2), 125.3 (CH), 129.1 (CH), 138.5 (CH), 139.8 (C), 143.5 (CH), 145.5 (CH, C), 146.9 (CH), 147.7 (CH), 150.3 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%): 566 (100) [M]; 538 (24). 15 3-(3-(10-azidodecyloxy)propy1)-1-(10-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)decyl)pyridinium chloride (30) 10 N3 O 10 20 C36H60C1N502 MM = 629.5 A partir de 14d (284 mg, 0.55 mmol) et de l'amine 13d (208 mg, 0.71 mmol), le produit 30 (199 mg, 91%) est obtenu sous la forme d'une huile brune. Rf = 0.12 (10% Me0H/CH2C12); 1H NMR 25 (400 MHz, CDC13) 6 1.26-1.41 (m, 24H), 1.48-1.62 (m, 6H), 1.87 (m, 2H), 1.95-2.06 (m, 4H), 2.73 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.26 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.37-3.44 (m, 6H), 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.63 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.03 (dd, J = 30 7.8, 6.0 Hz, 1H), 8.34-8.39 (m, 2H), 8.47 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3038983 52 8.89 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.97 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 6 27.3 (CH2), 27.4 (CH2), 27.5 (CH2), 27.9 (CH2), 30.0 (CH2), 30.3 (CH2), 30.4 (CH2), 30.5 (CH2), 30.6 (CH2), 30.7 (5xCH2), 30.8 (CH2), 30.9 (2xCH2), 31.4 (CH2), 32.3 (CH2), 32.7 5 (CH2), 52.6 (CH2), 63.0 (CH2), 70.6 (2xCH2), 72.1 (2xCH2), 125.3 (CH), 129.0 (CH), 138.4 (CH), 139.7 (C), 143.5 (CH), 145.4 (CH), 145.5 (C), 146.8 (CH), 147.7 (CH), 150.3 (CH); LRMS (ESI+) m/z (%) : 594 (100) [M]+, 566 (6). HRMS (ESI+) m/z (%): calcd for C36H60N502 [1\11: 594.4741, found: 594.4737. 10 3-(3-(12-azidododecyloxy)propy1)-1-(8-(3-(pyridin-3- yl)propoxy)octyl)pyridinium chloride (31) 12 REVENDICATIONS1. Procédé d'identification d'une molécule inhibitrice de la machinerie de virulence de Pseudomonas aeruginosa comprenant une étape d'évaluation de la capacité de ladite molécule à inhiber l'interaction PscE/PscG. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'évaluation de la capacité de ladite molécule à inhiber l'interaction PscE/PscG est réalisée par une technique ELISA. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 comprenant les étapes suivantes : a) Fournir un support sur lequel est fixée une des deux molécules PscE ou PscG, b) Mettre en contact le support avec une solution contenant la molécule PscE ou PscG, la molécule en solution correspondant à celle non fixée au support, c) Ajouter une solution contenant la molécule à tester d) Laver le support e) Ajouter un anticorps primaire dirigé contre la molécule non fixée au support, Laver le support f) Ajouter un anticorps secondaire dirigé contre le premier anticorps et couplé à une enzyme, g) Laver le support h) Ajouter un substrat de l'enzyme générant lors de son hydrolyse par l'enzyme un signal, i) Quantification du signal j) Evaluation de la capacité d'inhibition de la molécule à tester par comparaison avec une gamme étalon. 4. Au moins l'un des composés choisi parmi : l'acide pentétique, le clioquinol, le myricétine, le bensérazide, le gossypol, un sel de 3-alkylpyridium 6 (3-APS), et l'héderagénine pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter une infection pathogène causée par Pseudomonas aeruginosa, 5. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'infection est une infection nosocomiale. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que caractérisé en ce que l'infection pathogène est une infection choisie parmi les infections des yeux, les infections des plaies, en particulier suite à une brûlure et/ou une opération chirurgicale, les infections des voies 3038983 urinaires, en particulier de la vessie ou de l'urètre par exemple après sondage, les infections du système gastro-intestinal, les infections d'un poumon en particulier après bronchoscopie, les méningites, en particulier d'inoculation, et les septicémies. 7. Composé de formule (A) (A) caractérisé en ce que X est un halogène ; Y est un halogène ; Z est un groupement hydroxy, amine, ou un groupement-0R1 dans lequel R1 est un alkyle en Ci-C4 ou un acyle en Cr-C4; p est un nombre entier et 13 > p k 2 ; et q est un nombre entier et 13 > q k 2, préférentiellement p+q 6 . 8 Composé de formule (A) selon la revendication 7 caractérisé en ce que Z est -OH ou OAc - Y est CI -Xe tCI;et - p et q sont des nombres pairs avec préférentiellement 8 p 2 et 10 k q 2. 9 Composé de formule (A) selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que p =2 et q =2, 4 ou 10, préférentiellement 4 ; - p =4 et q =2, 4 ou 6, préférentiellement 4 ; 3038983 - p =6 et q =2, 4, 6 ou 10, préférentiellement 4 ; ou - p =8 et q =4 ou 8, préférentiellement 4. 10. Procédé de fabrication de composé de formule (A) caractérisé en ce que le composé de formule B : (B) dans lequel X, p et q sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 7 à 9, est mis en réaction en présence d'un catalyseur, préférentiellement du cuivre, avec le composé de formule C (C) dans lequel Y et Z sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 7 à 9, et E est un groupement partant choisi dans le groupe constituté par le triméthylesilyle, le triisopropyl silyle (TIPS) et dimethyl alcool. 11. Composé de formule (D) : (D) caractérisé en ce que : X est un halogène ; m est un nombre entier et 13 > m > 2 ; et 3038983 n est un nombre entier et 13 > n 2, préférentiellement 23 > m+n, et les sels pharmaceutiquement acceptables. 12. Composé de formule (D) selon la revendication 11 caractérisé en ce que : -X est Cl; - m et n sont des nombres pairs ; et/ou - préférentiellement m+n > 6 13. Composé de formule (D) selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en ce que : - m =4 et n =6 ou 8, préférentiellement 6,; - m =6 et n =8 ou 10, préférentiellement 10 ; ou - m =8 et n =4, 6, 8, ou 10, préférentiellement 6 ou 10, - m =10 et n= 4 ou 10, préférentiellement 10. 14. Composés de formule (A) selon l'une des revendications 7 à 9 et/ou (D) selon l'une des revendications 11 ou 12 en tant que médicament. 15. Composés de formule (A) selon l'une des revendications 7 à 9 et/ou (D) selon l'une des revendications 11 ou 12 pour leur utilisation pour prévenir et/ou traiter une infection pathogène causée par Pseudomonas aeruginosa. 16. Composés de formule (A) selon l'une des revendications 7 à 9 et/ou (D) ) selon l'une des revendications 11 ou 12 pour leur utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que l'infection pathogène est une infection nosocomiale, préférentiellement choisie parmi les infections des yeux, des plaies, en particulier suite à une brûlure et/ou une opératoire, des urines, en particulier de la vessie ou de l'urètre par exemple après sondage, du système gastro-intestinale, d'un poumon en particulier après bronchoscopie, des méningites en particulier d'inoculation, des septicémies.