Brevet FR3033409A1 — publié le 20160909

ELECTRODOT : PROCÉDÉ D'ANALYSE D'ÉCHANTILLONS BIOLOGIQUES EN MATRICE DE SPOTS FIXÉS PAR L'ACTION D'UN COURANT ELECTRIQUE CONJUGUÉE À UNE DIFFÉRENCE DE PRESSION. UGOLIN NICOLAS, TUPINIER ARNAUD, FEDOR YOANN, JUKIC IVANA, CHEVILLARD SYLVIE, JULIE BENSIMON, BEI l'ENCOURT CAROLINE, EL BAROUDI JAAFAR Introduction Les méthodes de filtration en matrice ou « dot blot » sont des méthodes classiques d'analyse d'une pluralité d'échantillons biologiques, tels que : - extrait cellulaire, - cellules en suspension, - plasma sanguin, - protéine et ou acide nucléique en suspension, - molécule biologique en solution ou en suspension et - plus généralement un matériel biologique etc... Ces techniques sont utilisées pour réaliser sur un support tel que membrane de nitro cellulose, de polyfluorure de vinyldene (PVDF), membrane micro ou nano structurée, membrane de polymère filtre etc..., une matrice de dépôts d'échantillons où chaque échantillon forme un spot, tel que chaque spot représente la capture de tout ou partie dudit échantillon. La mise en oeuvre de la filtration dot blot, fait intervenir généralement des dispositifs comprenant une plaque percée de puits transversaux, tel qu'un échantillon biologique en solution ou suspension soit disposé dans chaque puits de la plaque, ladite plaque étant disposée de manière jointive sur une membrane de filtration. Une différence de pression AP, appliquée de part et d'autre de la membrane, permet la filtration de l'échantillon biologique au travers de ladite membrane de manière à retenir sur cette dernière des cibles d'intérêt des échantillons en même que d'autres éléments des l'échantillons, chaque échantillon formant un spot d'une matrice de spots de géométrie miroir à celle de la plaque à puits. Les cibles d'intérêt de chaque spot seront alors analysées, par différentes méthodes d'analyse utilisées en biologie, tel que : - Des méthodes d'imagerie de fluorescence, de chimioluminescence, colorimétrie, lorsque les cibles d'intérêt sont marquées avant, durant ou après la filtration par un marqueur fluorescent, chimioluminescent ou colorimétrique, tel que par exemple un marqueur intégré à la structure de la cible ou interagissant avec la structure de la cible, notamment par l'utilisation d'anticorps directement marqués ou marqués grâce à un anticorps secondaire. - Des méthodes de spectroscopie tel que LIBS (spectroscopie sur plasma induit par laser), spectrométrie de masse , spectroscopie infrarouge ... ou toute autre méthode permettant de quantifier ou d'identifier la ou les cibles d'intérêts. L'utilisation des technologies de dot blots par filtration est largement limitée par les méthodes de préparation de l'échantillon. En effet, l'ajout d'agents chaotropiques tel que l'urée ou de détergents tels que le sodium dodécyl sulfate (SDS), le triton etc..., dans l'échantillon pour extraire les cibles d'intérêts, pénalise fortement la capture par les membranes de filtration de nombreuses cibles acides nucléiques ou protéiques. Ces limitations sont particulièrement observées dans l'analyse de protéines nucléaires notamment pour l'analyse par dot blot de certaines histones de certains types cellulaires. Par exemple, certains protocoles d'extraction d'histones quantitative de follicules pileux, telles que les histones yH2AX , H2AX,ou H3 nécessitent l'utilisation de SDS, alors que le SDS est incompatible avec l'adsorption quantitative par filtration desdites histones sur des 3033409 2 membranes de nitrocellulose ou de PVDF. Nous pouvons également citer comme limitation dans l'utilisation des techniques de dot blot par filtration : 5 - La géométrie des dispositifs classiquement utilisés pour la mise en oeuvre de la filtration par exemple : - Pour permettre une meilleure sensibilité de détection, les puits des plaques de filtration doivent disposer d'un certain volume minimal permettant la détection 10 des cibles en fonction de la sensibilité de détection, ce qui entraîne une dispersion et/ou un écartement des spots sur la membrane de filtration directement proportionnelle à la taille des puits de la plaque à puits. De ce fait la surface des membranes est importante par rapport au nombre de spots, et nécessite alors pour l'analyse des volumes importants de solutions de saturation 15 et de révélation comportant des composés couteux tels que anticorps primaires marqués ou non-marqués et anticorps secondaires marqués etc. La filtration n'est pas puits-indépendant, de ce fait lorsque les échantillons possèdent des viscosités différentes d'un puits à l'autre, la vitesse de filtration varie d'un puits à l'autre. Les conditions et la vitesse de filtration ne sont plus 20 contrôlées dès qu'un puits de filtration est vidé, puisque AP appliqué à la membrane chute dès que le premier puits de la plaque est vide. - Le manque d'ergonomie dans la mise en oeuvre des procédés, d'une part pour la manipulation des dispositifs de filtration existants, concernant notamment les 25 méthodes de montage et de fixation utilisées (vis), - la durée de mise en oeuvre liée à la préparation des membranes de filtration notamment pour les méthodes utilisant un marquage par anticorps fluorescent ou chimioluminescent après l'étape de filtration. 30 - Les problèmes d'affinités croisées qui peuvent survenir pour les marquages par anticorps, par exemple dirigés contre certaines formes de phosphorylation de protéine. En effet, sur un spot de la membrane il peut coexister plusieurs types de protéines phosphorylées. Or la plupart des anticorps dirigés spécifiquement contre 35 la forme phosphorylé d'une protéine, présenteront une affinité non négligeable pour le groupement phosphate d'autres protéines. Lorsqu'une protéine d'intérêt est en faible quantité sur un spot comportant d'autres protéines phosphorylées en plus grande quantité, l'anticorps spécifique de la protéine d'intérêt donnera un fort signal non spécifique en reconnaissant les autres fonctions phosphate présentes sur le spot. 40 Pour contourner ces problématiques limitantes, nous proposons un procédé et un dispositif de mise en oeuvre faisant intervenir un champ électrique perpendiculaire au plan de la membrane et une filtration simultanée ou consécutive à l'application du champ électrique, afin de réaliser une matrice de dépôts d'échantillons, ou spots, en présence 45 d'agents chaotropiques ou de détergent, tout en augmentant l'ergonomie de mise en oeuvre, diminuant le temps de marquage et augmentant la spécificité de marquage pour certaines protéines phosphorylées. On entend par échantillon : 50 - un extrait cellulaire, - des cellules en suspension, - plasma sanguin, - des protéines et/ou acides nucléiques en suspension, - des molécules biologiques en solution ou en suspension et 55 toute combinaison de ces éléments et plus généralement tout produit biologique. On entend par membrane fixation, tout membrane ou substrat tels que : 3033409 3 - les membranes de nitrocellulose - les membranes de PVDF, - les membranes micro ou nano structurées, - les membranes de polymère 5 - les filtres plus généralement tout substrat de fixation d'échantillon biologique. 1) Procédé de fixation sur une membrane de fixation, en matrice de spots, de tout ou partie d'une pluralité d'échantillons biologiques tel que chaque échantillon est disposé dans un 10 puits Fig1.1 d'une plaque à puits transversaux et débouchant F1.2, et tel que soit positionné sous ladite plaque à puits la membrane de fixation F1.3, de manière à soumettre chaque échantillon à l'action simultanée ou séquentielle, d'un champ électrique Figl.4 et d'une pression Fig1.5 telle que le champ électrique présente une direction perpendiculaire à la membrane de fixation, et un différentiel de potentiel entre les deux faces de la membrane 15 de fixation comprise entre 1 milliVolt et 1 kiloVolt, et tel que la pression présente un différentiel de pression AP entre les deux faces de la membrane de fixation comprise entre 0,1 millibar et 100 bar. Dans ce mode de réalisation, la fixation des molécules d'intérêt sur la membrane de fixation se fait par la double action du champ électrique et de la filtration. L'action du champ électrique permettant une meilleure fixation des cibles d'intérêts sur la 20 membrane même en présence d'un détergent dans le milieu tel que le SDS, le triton ou d'autres agents chaotropiques, ou de toute combinaison de ces agents et détergents... 2) Dans certains modes de réalisation, le champ électrique est obtenu grâce à deux électrodes en matériaux conducteurs, tel que polymère conducteur, composite conducteur, 25 métal, or, platine, tantal, etc., disposées au-dessus Fig1.6 et en dessous Fig1.7 de la plaque à puits, la membrane de fixation étant intercalée entre la face inférieure de la plaque à puits Fig2.14 et l'électrode inférieure Fig1.7. 2.1) Dans un mode de réalisation encore plus particulier, au moins une des électrodes sera 30 une feuille d'un conducteur d'électricité tel que or, platine, cuivre, tantale, etc., éventuellement déposé sur un polymère tel que kapton, silicone, PMMA, PLA 2.2) Dans d'autres modes de réalisation la feuille de métal électrode comportera au moins une surface structurée collante, obtenue par exemple grâce à une colle de 35 repositionnement, ou au moins une surface structurée jointive Fig1.9, par exemple en caoutchouc, silicone, ou tout autre polymère, telle que la surface jointive ou collante, laisse libres des surfaces de l'électrode en forme de spot Fig1.10 en vis-à-vis des puits de la plaque à puits, de manière à avoir une matrice d'électrodes métalliques apparentes. Les spots de l'électrode laissés libres par la surface jointive ou collante comporteront au moins 40 pour l'électrode inférieure des pores permettant de laisser passer un liquide. 2.3) Dans certains modes de réalisation au moins une des faces de la membrane de fixation Fig1.3 comportera une surface structurée jointive ou collante 9 laissant libre une matrice de 45 spots sur la membrane de fixation Fig1.11 en vis-à-vis de la matrice de puits. 2.4) Dans certains modes de réalisation un papier poreux, formant un tampon Fig1.8, par exemple de 0,1 à 5 mm d'épaisseur tel que papier whatman, papier de dessin vergé etc., est disposé contre au moins une des électrodes, de manière à faire un tampon entre l'électrode et la membrane, ou l'électrode et la plaque à puits. Dans certains modes de réalisation, au 50 moins une face du papier sera structurée Fig1.9 par une colle ou un polymère jointif de manière à laisser libre une matrice de spots de papier Fig1.12 en vis-à-vis de la matrice de puits de la plaque à puits. 3) Dans certains modes de réalisation, la plaque à puits est réalisée telle que, la face 55 inférieure Fig2.14 de plaque à puits ainsi que le diamètre inférieur des puits (face de la plaque à puits recevant la membrane de fixation) sont réduits par exemple par une homothétie d'un facteur K et/ou k' par rapport à la taille de la face supérieure Fig1.13 de la plaque à puits et du diamètre supérieur des puits. Cette réduction d'un facteur K et/ou k' 3033409 4 permet de réduire la taille des spots d'un facteur de combinaison K et k' mais aussi, la distance entre les spots du même facteur de combinaison K+k' et permet de réaliser des membranes de fixation réduites du facteur K par rapport à la surface supérieure de la plaque à puits. Ceci permet de réduire le volume réactionnel pour les étapes de révélation 5 par anticorps, ainsi que de réduire les surfaces à analyser pour les méthodes d'imagerie ou de spectroscopie. 4) Dans certains modes de réalisation, la plaque à puits possède une électrode ionique liquide, gel ou éponge imbibée, reliant la face supérieure à la face inférieure de la plaque à 10 puits. Cette électrode permet d'imposer une différence de potentiel entre les deux faces de la membrane quelquesoit le niveau d'échantillon dans les puits de la matrice. 5) Dans certains modes de réalisation, l'électrode supérieure comprendra Fig1.6, la face supérieure de la plaque à puits, et une partie de la surface des puits. 15 5.1) Dans certains modes de réalisation, une structure Fig2.15 formant une électrode telle que croix ou tout autre forme connectée à l'électrode supérieure, sera disposée dans un plan transversal des puits de la plaque à puits. 20 6) Dans certains modes de réalisation la différence de pression AP est obtenue par aspiration en dessous de la membrane de fixation au travers de l'électrode inférieure. L'empilement de tout ou partie des éléments décrits ci-dessus par exemple est disposé sur une grille d'aspiration Fig3.16 en dessous de laquelle est appliquée une dépression. 25 6.1) Dans un mode de réalisation encore plus préférentiel la grille Fig3.16 est structurée par une colle ou un matériau jointif, de manière à délimiter des spots étanches entre eux où ladite grille apparaît libre pour former une matrice de spots de grille en vis-à-vis des puits de la plaque à puits. 30 7) Dans certains modes de réalisation, la grille d'aspiration Fig3.16 et l'électrode inférieure sont confondues, la grille comprend alors au moins un élément conducteur électrique, permettant d'appliquer un champ électrique, dans chaque puits de la plaque à puits, au travers de la membrane de fixation. L'élément conducteur électrique pourra être un plaquage ou un dépôt métallique tel que Or, Cuivre, Tantal, Platine ... 35 8) Dans un mode de réalisation particulier, la différence de pression AP est obtenue par une pression appliqué au-dessus de la membrane au travers des puits de la plaque à puits et de l'électrode supérieure. 40 9) Dans certains modes de réalisation, les échantillons biologiques sont introduits dans les puits 1 de la plaque à puits grâce à une plaque de loges Fig3 .18 formant une matrice de loges disposées de manière homologue au puits de la matrice de puits. Les échantillons sont introduits dans la plaque de loges maintenue horizontale, tel que par exemple un échantillon par loge. Puis la plaque à puits comprenant une combinaison quelconque des 45 empilements décrits est clipsée Fig3.19 sur la plaque de loges restée horizontale, la face supérieure de la plaque à puits étant rapprochée des ouvertures de la plaque de loges. 9.1) Dans certains modes de réalisation, les deux plaques de loges et plaques à puits peuvent êtres guidées et maintenues l'une contre l'autre par des systèmes d'aimant et de 50 platines magnétiques ou ferreuses, introduits par exemple aux quatre coins des plaques. 10) Dans un mode de réalisation particulier, la plaque à loges comporte dans chaque loge un piston mobile Fig3.20, par exemple en polymère souple tel que silicone, caoutchouc ect. Derrière chaque piston est disposé dans la plaque de loges, un pore Fig3.21 permettant, par 55 le déplacement du piston, de compenser la pression ou d'appliquer la pression, selon que le dispositif soit utilisé en surpression ou en dépression. Le piston mobile garantit une application homogène de la pression ou de la dépression, durant le processus dès qu'un puits est vidé il est obstrué par son piston ce qui prévient la chute de AP 3033409 5 11) Dans un mode de réalisation particulier les différentes électrodes et membranes utilisées dans le dispositif, comporterons des languettes Fig3.22 permettant une récupération rapide de la membrane de fixation et les différentes surfaces des plaques à 5 puits, plaque de loges, électrode, tampon papier etc. sont structurés Fig3.9 par un matériau collant, jointif pour définir une matrice de spots à l'image de la matrice de puits telle que chaque spot soit isolé des autres spots par ledit matériau. 12) Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif comportera un kit de révélation 10 rapide. Le kit comprendra pour chaque membrane de fixation, un sac de complexation en matière plastique de taille suffisante pour recevoir la membrane, le sac sera muni d'un dispositif de fermeture rapide telle que glissière de fermeture ou curseur de fermeture. L'une des faces du sac comportera un dispositif de fixation rapide à un support, par exemple la partie velours d'une fixation ou bande auto-agrippante, la partie crochet de 15 ladite bande étant disposée sur le support recevant le sac par exemple dans un four d'incubation. Le sac sera préférentiellement opaque protégeant de la lumière, par exemple de couleur noir et opaque aux ultra-violets, de manière à ce que la lumière ne puisse altérer les propriétés des réactifs et du matériel biologique disposé dans ledit sac. Le sac sera pré-rempli par une solution ou par une poudre permettant de réaliser une solution de saturation 20 de la membrane. Par exemple le sac contiendra de 0,1 à 10g de lait en poudre lyophilisé. Le kit comprendra égalisant pour chaque membrane de fixation une capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide, en aluminium, matière plastique etc., contenant les réactifs lyophilisées de marquage tel que des anticorps lyophilisés et des éléments de saturation comme du lait lyophilisé. Le contenu de la capsule sera préférentiellement 25 compressé de manière à obtenir un corps agrégé. Le kit comprendra également un four à agitation thermostaté entre 4°C et 50°C préférentiellement 37°C, le four comportera des éléments pour fixer le sac de révélation et permettre son agitation. Le kit pourra être formé par une combinaison de toute ou partie des éléments précités. 30 12.1) Dans un mode de réalisation particulier, le système d'agitation du four pourra par exemple comprendre un axe tournant d'un diamètre compris entre 0,5 cm et 60 cm, ledit axe disposant de moyens pour fixer le sac de révélation, par exemple la partie crochet d'un bande auto-agrippante. 35 12.2) Dans un mode de réalisation particulier, la capsule hermétiquement fermée a ouverture rapide comportera, au moins un anticorps dirigé contre une cible d'intérêt, ledit anticorps étant marqué par au moins un fluorophore, chromophore, un agent bioluminescent ou chimioluminescent, tel que chaque anticorps dirigé contre une cible donnée soit marqué par un fluorophore, un chromophore, un agent bioluminescent ou 40 chimioluminescent donné. 12.3) Dans un mode de réalisation particulier, la capsule hermétiquement fermée a ouverture rapide comportera, au moins un anticorps primaire dirigé contre une cible d'intérêt et un anticorps secondaire dirigé contre au moins un anticorps primaire tel que l' 45 anticorps secondaire soit marqué par au moins un fluorophore, un chromophore, un agent bioluminescent ou chimioluminescent. 12.4) Dans un mode de réalisation particulier, la capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide comportera, au moins un anticorps de saturation non marqué, ni 50 directement, ni par un anticorps secondaire, permettant de concurrencer les liaisons aspécifiques parasites d'un anticorps primaire donné pour d'autres cibles que sa cible d'intérêt. Par exemple la capsule comportera des anticorps primaires marqués, directement ou par un anticorps secondaire, dirigés contre des protéines d'intérêt phosphorylées telles que histone yH2AX, Phospho KU 70, phospho ATM ect., et au moins un des anticorps de 55 saturation non marqué dirigé contre les phospho-serines, phospho-tréonines, phosphotyrosines etc., telle que la fixation aspécifique des anticorps primaires sur des cibles phosphorylées différentes de leur cible d'intérêt soit concurrencée par la fixation des anticorps de saturation. 3033409 6 12.5) la mise en oeuvre du kit comprendra 6 étapes principales : - Solubilisation de l'agent de saturation contenu dans le sac de complexation par 5 l'ajout d'une dose de tampon par exemple du 50 ml de TBS pour 2,5g de lait. - Introduction de la membrane de fixation dans le sac de complexation et fermeture du sac. - Incubation du sac de complexation entre 4°C et 40°C dans le four à agitation thermostaté par accrochage sur l'axe tournant du four grâce aux bandes auto- 10 agrippantes. - Récupération du sac du four et ajout du contenu d'une capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide dans le sac de complexation dilué à la concentration attendue par un tampon, par exemple par du TBS. - Incubation du sac entre 4 et 40°C dans le four à agitation thermostaté. 15 - récupération du sac du four, rinçage de la membrane et lecture de la membrane. Exemples : Fig4.23 Exemple d'extraction du matériel biologique, pour des cellules HEK, par différents 20 tampons d'extraction 25, 26, 27, 28, en dot-blot filtration puis marquage par un anticorps primaire anti-histone yH2AX et un anticorps secondaire chimio-luminescent dirigé contre l'anticorps primaire. Fig4.24 Exemple d'extraction du matériel biologique, pour des follicules pileux, par 25 différents tampons d'extraction 25, 26, 27, 28, en dot-blot filtration puis marquage par un anticorps primaire anti-histone yH2AX et un anticorps secondaire chimioluminescent dirigé contre l'anticorps primaire. Fig4.29 Exemple d'extraction du matériel biologique, pour des cellules HEK, par un 30 tampon d'extraction SDS 5%, en électrodot, puis marquage simultané par un anticorps primaire anti-histone yH2AX et un anticorps secondaire chimio-luminescent dirigé contre l'anticorps primaire, les produits de marquage étant lyophilisés dans un capsule aluminium. Fig4.30 Exemple d'extraction du matériel biologique, pour des follicules pileux, par un 35 tampon d'extraction SDS 5%, en électrodot, puis marquage simultané par un anticorps primaire anti-histone yH2AX et un anticorps secondaire chimio-luminescent dirigé contre l'anticorps primaire, les produits de marquage étant lyophilisés dans un capsule aluminium du lait écrémé lyophilisé 40 Fig4 .31 Exemple d'extraction du matériel biologique pour des cellule HEK, par un tampon d'extraction SDS 5%, en électrodot, puis marquage simultané par un anticorps primaire anti-histone yH2AX marqué par un fluorophore à 667 nm et un anticorps primaire antihistone H2AX marqué par un fluorophore à 488 nm, les produits de marquage étant 45 lyophilisés dans un capsule aluminium contenant du lait écrémé lyophilisé. 3033409 7 LEGENDES DE L'ENSEMBLE DES FIGURES 5 1) puits 2) plaque à puits transversaux et débouchants 3) membrane de fixation 10 4) champ électrique 5) gradient de pression 6) électrode supérieure 7) électrode inférieure 8) papier poreux, formant un tampon 15 9) surface structurée jointive ou collante 10) électrode en forme de spot 11) spot membrane fixation 12) spot papier tampon 13) face supérieure plaque à puits 20 14) face inférieure plaque à puits 15) électrode dans un plan transversal des puits 16) grille d'aspiration 17) Aspiration 18) plaque de loges 25 19) clips 20) piston mobile 21) pore 22) languettes 23) Cellule HEK dot blot 30 24) follicule pileux dot blot 25) extraction tampon de lyse basique 26) extraction SDS 10% 27) extraction SDS 1% 28) extraction tampon RIPA 35 29) Cellule HEK electrodot 30) follicule pileux electrodot 31) Cellule HEK électrodot extraction SDS 5% REVENDICATIONS1) Procédé de fixation sur une membrane de fixation, en matrice de spots, de tout ou partie d'une pluralité d'échantillons biologiques tel que chaque échantillon est disposé dans un puits (1) d'une plaque à puits (2) transversaux et débouchant, et tel que soit positionné sous ladite plaque à puits la membrane de fixation (3), caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre chaque échantillon à l'action simultanée, séquentielle, d'un champ électrique (4) et d'une pression (5) tels que le champ électrique présente une direction perpendiculaire à la membrane de fixation, et un différentiel de potentiel entre les deux faces de la membrane de fixation comprise entre lmilliVolt et 1 kiloVolt, et tel que la pression présente une différentielle de pression iP entre les deux faces de la membrane de fixation comprise entre 1 millibar et 100 bar. 2) Dispositif pour mettre en oeuvre le procédé selon la revendication 1 comprenant la plaque à puits (2) transversaux et débouchants ainsi que la membrane de fixation, caractérisé en ce qu'il comprend deux électrodes fournissant le champ électrique, lesdites électrodes étant composées de matériaux conducteurs, polymère conducteur, composé conducteur, Or, platine, Tantale, disposé au dessus (6) et en dessous (7) de la plaque à puits (2), la membrane de fixation étant intercalée entre la face inférieure de la plaque à puits et l'électrode inférieure. 3) Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que au moins une des électrodes est une feuille d'un conducteur d'électricité, comportera au moins une surface structurée collante (9), jointive, la surface structurée laissant libre des surfaces de l'électrode en forme de spot (10) en vis-à-vis des puits de la plaque de puits, de manière à avoir une matrice d'électrodes métalliques apparentes, les spots (10) de l'électrode laissés libres par la surface jointive ou collante comportant au moins pour l'électrode inférieure des pores permettant de laisser passer un liquide. 4) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 et 3 caractérisé en ce que un papier poreux formant un tampon (8) de 0,1 à 3 mm d'épaisseur tel que papier wattman, papier de dessin vergé, est disposé contre au moins une des électrodes et que au moins une face du papier est structurée (9) par une colle ou un polymère jointif de manière à laisser libre une matrice de spot de papier (12) en vis-à-vis de la matrice de puits de la plaque à puits. 5) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la face inférieure (14) de la plaque à puits ainsi que le diamètre inférieur des puits, définis comme la face de la plaque à puits recevant la membrane de fixation, sont de taille réduite par une homothétie, tel que homothétie de facteur K, d'une combinaison de facteur K et k' par rapport à la taille de la face supérieure (13) de la plaque à puits et du diamètre supérieur des puits, ladite réduction permettant de réduire d'autant la taille des spots et la distance entre les spots sur la membrane de fixation. 6) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que, la plaque à puits possède une électrode ionique liquide, gel ou éponge imbibée, reliant la façe supérieure à la face inférieure de la plaque à puits. 7) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que, 50 l'électrode supérieure comprendra, la face supérieure de la plaque à puits, une partie de la surface des puits, et éventuellement une structure (15) disposée dans un plan transversal des puits de la plaque à puits. 8) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que, une 55 grille d'aspiration (16) et l'électrode inférieure (7) sont confondues, telle que ladite grille comprend au moins un élément conducteur électrique, permettant d'appliquer un champ électrique, dans chaque puits de la plaque à puits, au travers de la membrane de fixation. 3033409 9 9) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 8 caractérisé en ce que la différence de pression AP est obtenue par aspiration (17) en dessous de la membrane de fixation au travers de l'électrode inférieure la grille d'aspiration en dessous de laquelle est appliquée une dépression. 5 10) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que la différence de pression AP est obtenue par une pression appliquée au-dessus de la membrane au travers des puits de la plaque à puits et de l'électrode supérieure. 10 11) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que, une plaque de loges (18) formant une matrice de loges disposées de manière homologue aux puits de la matrice à puits, soit utilisée pour introduire les échantillons biologiques dans les puits de la plaque à puits, et comporte dans chaque loge un piston mobile (20) de préférence en polymère souple tel que silicone caoutchouc, de manière que derrière 15 chaque piston est disposé dans la plaque de loges, un pore (21) permettant de compenser une pression par le déplacement du piston. 12) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisé en ce que, les électrodes, membranes, papiers-tampons utilisés du dispositif, comporteront des languettes 20 (22) permettant une récupération rapide de la membrane de fixation et que les différentes surfaces des plaques à puits, plaques de loges, électrodes, papiers-tampons sont structurés par un matériau collant, jointif pour définissant une matrice de spots à l'image de la matrice de puits telles que chaque spot soit isolé des autres spots par ledit matériau. 25 13) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 12, caractérisé en ce que, un kit de révélation rapide comprend pour chaque membrane de fixation, un sac de complexation en matière plastique de taille suffisante pour recevoir la membrane, ledit sac est muni d'un dispositif de fermeture rapide telle que glissière, curseur, l'une des faces du sac comporte un dispositif de fixation rapide à un support, tel que la partie velours d'une 30 bande auto-agrippante, ledit sac est préférentiellement opaque protégeant de la lumière et est pré-rempli d'une poudre permettant de réaliser une solution de saturation de la membrane de fixation tel que 0.1 à 10g de lait en poudre lyophilisé, le kit comprendra également pour chaque membrane de fixation une capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide, en aluminium, matière plastique, qui contient des réactifs lyophilisé de 35 marquage et de saturation tel que des anticorps , éléments de saturation de la membrane de fixation, fluorophore, chromophore, agent bioluminescent chimioluminescent, le contenu de la capsule étant préférentiellement compressé de manière à obtenir un corps agrégé. 14) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que, un 40 système d'agitation d'un four de complexation comprend un axe tournant d'un diamètre compris entre 0.5 cm et 60 cm, ledit axe disposant de moyens pour fixer le sac de révélation, tel que des crochets d'un bande auto-agrippante. 45 15) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 14, caractérisé en ce que, la capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide comporte, au moins un anticorps primaire dirigé contre une cible d'intérêt et au moins un anticorps secondaire dirigé contre le au moins un anticorps primaire tel que ledit anticorps secondaire soit marqué par au moins un fluorophore, un chromophore, un agent bioluminescent ou chimioluminescent. 16) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 15, caractérisé en ce que la capsule hermétiquement fermée à ouverture rapide comporte, au moins un anticorps de saturation, permettant de concurrencer les liaisons aspécifiques parasites d'un anticorps primaire pour d'autres cibles que sa cible d'intérêt.55