Brevet FR3032620A1 — publié le 20160819

La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de Ruscus (Liliaceae) et en particulier de Ruscus aculeatus L. dans le traitement de l'insuffisance veineuse et notamment des varices, chez des patients dont les veines pathologiques présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à l'acétylcholine ou au carbachol, altérée. L'insuffisance veineuse chronique des membres inférieurs est un problème de santé publique important. Sa prévalence globale est estimée entre 11 et 24% dans les pays industrialisés avec une nette prépondérance féminine (sex-ratio = 1/3). L'insuffisance veineuse chronique englobe toutes les manifestations en rapport avec une anomalie fonctionnelle ou physique du système veineux causée par une incontinence valvulaire avec ou sans obstruction veineuse associée. Ce dysfonctionnement veineux peut être congénital ou acquis. Il existe deux réseaux veineux du membre inférieur, le réseau veineux profond qui draine 90% du sang veineux et le réseau veineux superficiel constitué par les veines saphènes qui prennent en charge les 10% restants. Ces deux réseaux sont reliés par des veines perforantes. Le système veineux est assuré par trois systèmes successifs : la semelle plantaire de Lejars qui dépend de la statique plantaire et du déroulement du pas, la pompe musculaire du mollet, essentielle et le système abdomino-diaphragmatique. Les veines des membres inférieurs sont pourvues de valvules qui empêchent le reflux. Trois mécanismes essentiels contribuent à la défaillance du retour veineux, la maladie variqueuse, le syndrome post-thrombotique et l'insuffisance veineuse fonctionnelle. - La maladie variqueuse : Les varices se définissent comme des veines dont la paroi est pathologique et qui deviennent dilatées et tortueuses avec incontinence valvulaire. Il existe deux types de varices, les varices systématisées, elles sont développées aux dépens des réseaux grande et petite saphènes et les varices non systématisées OU diffuses, dites encore non-saphènes. Les varices peuvent être soit primaires, soit secondaires à une maladie post-phlébitique. Une 3032620 2 varice est dite primaire lorsqu'elle survient d'elle-même, sans facteur mécanique causal. Elle est dite secondaire lorsqu'elle survient suite à un autre problème sous-jacent tel une obstruction sur des vaisseaux profonds, servant alors de voie de circulation 5 alternative, un reflux veineux profond suite par exemple à une absence congénitale de valvules veineuses ou à une destruction postthrombotique, ou plus rarement lors de shunt artério-veineux. L'incontinence des perforantes de cheville joue un rôle fondamental dans l'apparition d'une insuffisance veineuse chronique. Les varices 10 peuvent être fonctionnellement muettes et s'exprimer par un préjudice esthétique ou bien provoquer des signes d'insuffisance veineuse chronique. L'explication véritable est mal appréhendée. Une prédisposition génétique est indiscutable. Les facteurs déclenchant identifiés sont la stase veineuse provoquée entre autres par la 15 grossesse, l'obésité, la constipation, la striction vestimentaire, la sédentarité, la station debout prolongée. Les facteurs alimentaires aggravent la déficience liée au terrain, l'évolution des habitudes alimentaires introduit un déséquilibre qui favorise la peroxydation nocive des membranes cellulaires veineuses. 20 - Le syndrome post-thrombotique : La thrombose veineuse peut générer une maladie postthrombotique, surtout si elle est mal ou insuffisamment traitée. Le mécanisme essentiel en est la destruction valvulaire, source de reflux, avec ou sans obstruction résiduelle. Le risque est 25 particulièrement important en cas de thrombose suro-poplitée. L'obstruction chronique de la veine fémorale commune est également très péjorative. - l'insuffisance veineuse fonctionnelle : Ce terme est réservé au retour veineux défaillant avec des 30 veines morphologiquement normales. Cette situation peut être liée à une diminution de la marche, une ankylose tibio-tarsienne, à une perte du volume musculaire, ou encore à une altération de la dynamique cardio-respiratoire. Elle est fréquemment rencontrée chez le sujet âgé. 35 Il existe d'autres causes d'insuffisances veineuses, mais elles ne représentent qu'une partie infime des causes d'insuffisance veineuse, il s'agit de malformations veineuses ou artério-veineuses, 3032620 3 les compressions veineuses extrinsèques chroniques et les dysgénésies valvulaires. Les signes fonctionnels de l'insuffisance veineuse chronique sont nombreux, fréquents, variés et peu spécifiques comme les jambes 5 lourdes, les crampes, les démangeaisons. Ils sont classiquement aggravés au cours de la journée, après station debout ou assise prolongée, par la chaleur et sont améliorés par le froid, la surélévation des membres inférieurs, l'exercice physique, ou la contention-compression veineuse. 10 Il existe des signes physiques, ils sont recherchés chez un malade en position debout. - les signes de stase : l'oedème du pied et les varicosités bleutées de la cheville et de l'arche plantaire ; - les signes du retentissement tissulaire avec des lésions 15 uniquement cutanées, les dermites purpuriques et pigmentées, l'atrophie blanche de Milian, l'eczéma et avec des lésions cutanées et sous-cutanées, la dermo-hypodermite de stase, la stase lymphatique et enfin des ulcères. L'évolution de l'insuffisance veineuse chronique aboutit à l'ulcère veineux 20 dont les principales caractéristiques sont le caractère indolore, non creusant, le fond humide et le siège péri-malléolaire. Les complications propres aux varices sont de deux ordres, les 25 complications thrombotiques et hémorragiques. Les complications thrombotiques peuvent être la thrombose veineuse superficielle ou profonde. La thrombose veineuse superficielle survient sur une veine dont la paroi est altérée et se traduit par un cordon rouge induré inflammatoire sur le trajet d'une varice. On doit distinguer les 30 thromboses veineuses superficielles segmentaires dont le potentiel évolutif est banal des thromboses saphènes extensives vers les crosses ou par les veines perforantes avec un risque de thrombose veineuse profonde et d'embolie pulmonaire. Ces thromboses veineuses superficielles sur varices sont à différencier des thromboses 35 veineuses superficielles sur veines saines. La stase veineuse liée aux altérations valvulaires est propice à la survenue de thromboses veineuses profondes. Pour les complications hémorragiques, la 3032620 4 rupture d'une ampoule variqueuse est une complication hémorragique classique mais rare des varices. Il convient de la juguler rapidement par une compression locale et une surélévation du membre. Le diagnostic positif d'insuffisance veineuse chronique est 5 essentiellement clinique. Le diagnostic étiologique et l'importance des lésions en cause sont précisées par des examens complémentaires, en premier lieu l'examen doppler et l'échographie. L'évaluation clinique commence par un interrogatoire. L'examen clinique se fait en position debout, il permet de préciser le caractère systématisé 10 ou non des varices, les complications trophiques, de sélectionner les patients qui nécessitent des explorations complémentaires qui préciseront les indications thérapeutiques. L'examen au Doppler continu est la prolongation de l'examen clinique et permet de mettre en évidence un reflux veineux pathologique (par insuffisance 15 valvulaire ostiale ou tronculaire), une incontinence de veine perforante. L'échographie permet de visualiser des séquelles de thrombose veineuse (reflux ou obstruction), ou encore une compression veineuse. L'échographie doppler permet donc l'examen complet et détaillé, à la fois morphologique et dynamique, de la 20 circulation veineuse. Il existe d'autres techniques mais elles sont d'indication plus rare, comme la pléthysmographie, la mesure de la pression veineuse ambulatoire, la phlébographie. La prise en charge thérapeutique de l'insuffisance veineuse est axée dans un premier temps sur le traitement médical puis le 25 traitement chirurgical. La première mesure est de chercher à corriger les facteurs favorisant l'insuffisance veineuse, avoir une activité physique régulière (marche), éviter la station debout prolongée, réduire un surpoids, éviter les expositions à la chaleur, surélever les pieds du lit (drainage postural lors du sommeil). La 30 mesure suivante est la contention/compression, il s'agit d'un acte médical. Il consiste en l'application sur un segment de membre d'une pression par un matériel élastique (bandes ou chaussettes, bas, collants). La compression élastique classique prescrite à l'heure actuelle dans le traitement de l'insuffisance veineuse chronique 35 modérée, importante et sévère, répond au principe de dégressivité : la pression est maximale en cheville puis diminue en remontant vers le mollet et la cuisse, ce principe est utilisé quel que soit le 3032620 5 stade de l'insuffisance veineuse. La compression réduit la dilatation des veines et augmente la vitesse d'écoulement du sang veineux. Elle diminue le volume du membre avec un effet anti-oedème et elle améliore l'efficacité de la pompe musculaire du mollet lors 5 de la marche. Il existe des traitements opératoires, visant à agir directement sur les varices. La sclérothérapie consiste à injecter un produit sclérosant dans une varice. Elle est habituellement réservée à des varices non systématisées ou en complément de la 10 chirurgie d'éveinage. L'éveinage ou le stripping est l'opération traditionnelle pour l'élimination des varices importantes. Les phlébectomies ambulatoires consistent à extraire les varices résiduelles. Et enfin la cryochirurgie qui consiste à la congélation de la veine à l'azote. 15 Les traitements médicamenteux consistent en deux classes, les traitements anticoagulants qui sont réservés à titre curatif aux thromboses veineuses profondes et aux thromboses veineuses superficielles extensives et à titre préventif lors de circonstances à risque. La seconde classe rassemble les veinotoniques ou 20 phlébotropes, appelés encore veinotropes. La plupart des études montrent que les veinotoniques ont plusieurs grandes activités. La première est une amélioration de la tonicité des parois de la veine. La seconde activité, c'est une diminution de la perméabilité capillaire qui favorise les oedèmes, un troisième effet connu est une 25 activité rhéologique c'est-à-dire que cela améliore la viscosité des globules rouges et donc cela permet une meilleure perfusion, enfin il est souvent rapporté un effet anti-inflammatoire. Les phlébotropes peuvent être utilisés : 30 - dès le stade précoce, soit de façon isolée, pour soulager lourdeurs, douleurs, crampes, sensations de gonflement. Soit en association avec la compression. L'hygiène de vie garde bien entendu toute sa place. - Au stade des varices, avec ou sans altération de la peau et des 35 tissus, ils pourront être utilisés de façon adjuvantes aux traitements opératoires des varices, si les symptômes sont présents ou persistent. 3032620 6 Au stade d'ulcère veineux, par leur action anti-inflammatoire, ils pourraient accélérer la cicatrisation, associés aux traitements locaux, à la compression, et aux traitements opératoires le cas échéant. 5 Les substances naturelles à activité veinotonique sont issues des classes chimiques suivantes : les flavonoïdes, les antocyanes et proanthocynidines, les saponines et les coumarines. Les actions pharmacologiques des flavonoïdes sont multiples, un 10 effet anti-oedémateux, une diminution de la perméabilité capillaire, un effet antiphlogistique, une augmentation de la résistance capillaire et une diminution de l'agrégation érythrocytaire. On peut citer comme flavonoïdes à activité phlébotrope, l'hespéridine, la diosmine, la rutine et la toxérutine. Les anthocyanes et 15 proanthocyanidines agissent uniquement par une diminution de la perméabilité capillaire. Les coumarines agissent par diverses actions pharmacologiques, un effet anti-oedémateux, une augmentation de l'activité des macrophages et une augmentation du flux lymphatique, les principales coumarines ayant une activité 20 phlébotrope sont l'aesculétine, l'aesculine ainsi que les coumarines du mélilot et de l'aspérale odorante. Enfin les saponines, leurs actions pharmacologiques sont un effet anti-oedémateux, une diminution de la perméabilité capillaire et un effet veinotonique. On peut citer comme saponines l'aescine et la ruscine. 25 La ruscine est isolée à partir du petit houx, Ruscus aculeatus L. de la famille des Liliaceae, appelé aussi fragon, buis piquant, myrte épineux, épine de rat ou houx frelon. Il s'agit d'un sous-arbrisseau ligneux, persistant. Ses fruits sont des baies rouges aux vertus ornementales. La partie de la plante utilisée en usage 30 médical est le rhizome. Les principaux constituants sont des saponosides stéroïdiques, la néoruscine conduisant à la néoruscogénine, le néoruscoside, le ruscoside, la ruscine conduisant à la ruscogénine, les aculéosides A et B. Il existe également d'autres constituants, des stérols, des acides gras, des oses, des 35 huiles essentielles, des dérivés benzofuraniques, des flavonoïdes... Le mode d'action connu des saponosides passe par une stimulation des récepteurs alpha-adrénergiques post-jonctionnels de la cellule lisse 3032620 7 de la paroi vasculaire. Il est bien connu que les substances stéroliques du Ruscus aculeatus, c'est-à-dire les Ruscogénines et les saponines correspondantes, sont douées de propriétés veinotoniques, et 5 constituent d'ailleurs les principes actifs de diverses spécialités pharmaceutiques. Actuellement un médicament non soumis à prescription à base de Ruscus, d'hespéridine méthylchalcone et d'acide ascorbique est commercialisé. 10 Le traitement médical par cet extrait de Ruscus se caractérise par une grande variabilité interindividuelle. De façon surprenante, les inventeurs ont montré qu'un extrait de Ruscus se liait aux récepteurs muscariniques de sous-type M1 et M3 entraînant une réponse fonctionnelle sur la perméabilité. Ainsi en sélectionnant 15 les patients présentant des récepteurs muscariniques, notamment de sous-type M1 et M3, les réponses à l'extrait de Ruscus seront forcément accrues et surtout la variabilité interindividuelle sera largement diminuée. Malgré la chirurgie relativement efficace, le taux de récidive 20 des ulcères veineux reste élevé. Ceci peut être expliqué au moins en partie par une dysfonction endothéliale au niveau micro-vasculaire qui persiste après la chirurgie. La fonction endothéliale de micro-vaisseaux cutanés a été 25 étudié chez des patients atteints d'insuffisance veineuse par l'évaluation des débits sanguins par la technique du Doppler (Klonizakis et al., Microvascular Res. 77, 158-162, 2009). Une courbe dose-réponse à l'acétylcholine est comparée chez des volontaires sains en position debout et allongée, et chez des 30 patients ayant subi une chirurgie suite à des varices. En position allongée, les réponses à l'acétylcholine ne sont pas différentes entre les patients et les sujets sains. En revanche, en position debout, la réponse vasodilatatrice à l'acétylcholine est significativement atténuée chez les patients, révélant une fonction 35 endothéliale altérée. Des résultats équivalents ont été retrouvés dans l'étude publiée par Carrasco et al., (Angiology, 60(6), 763771, 2009). 3032620 8 Les inventeurs concluent donc que l'extrait de Ruscus agissant comme agonistes sur les récepteurs muscariniques de type Ml, M3 et/ou M5 permettrait de restaurer cette fonction endothéliale altérée. Lors de l'examen clinique relativement habituel chez des 5 patients présentant une insuffisance veineuse, une évaluation par Doppler des réponses vasodilatatrices à l'acétylcholine permettrait de sélectionner les patients qui présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à l'acétylcholine altérée et donc de leur proposer un traitement adapté à leur besoin. Il est à noter que 10 ce challenge à l'acétylcholine pourrait être remplacé par le carbachol, agoniste des récepteurs muscariniques, l'acétylcholine ayant l'inconvénient d'impacter d'autres familles de récepteurs, nicotiniques en particulier. Cette évaluation de la réponse fonctionnelle à l'acétylcholine ou au 15 carbachol peut se faire en routine, comme un élément de diagnostic peu invasif et décisionnel pour le traitement avec un extrait de Ruscus. Dans la présente invention, on entend par réponse fonctionnelle vasodilatatrice à l'acétylcholine altérée, une réponse 20 vasodilatatrice, évaluée en particulier par Doppler, diminuée de plus de 20% par rapport aux conditions standards observées sur une veine saine similaire, c'est-à-dire de même calibre et même positionnement. Préférentiellement, la réponse fonctionnelle vasodilatatrice à l'acétylcholine est diminuée de plus de 30% par 25 rapport aux conditions contrôles. De façon encore préférée, la réponse fonctionnelle vasodilatatrice à l'acétylcholine est diminuée de plus de 50% par rapport aux conditions contrôles. La présente invention a pour objet l'utilisation d'un extrait de Ruscus pour son utilisation comme médicament destiné au 30 traitement de l'insuffisance veineuse chez des patients dont les veines atteintes présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à l'acétylcholine altérée. La présente invention concerne en outre une composition pharmaceutique comprenant un extrait de Ruscus comme principe actif 35 et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. L'extrait de Ruscus selon la présente invention peut être avantageusement préparé selon le brevet européen EP0112770. 3032620 9 Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent être formulées pour l'administration à l'être humain. Les compositions selon l'invention peuvent être administrées par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, 5 transdermique, locale ou rectale ou bien encore intra-nasale. Dans ce cas le principe actif peut être administré sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux êtres humains. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les 10 comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les formes d'administration sous-cutanée ou transdermique, topique, intramusculaire, intraveineuse, intra-nasale ou intraoculaires, les formes d'administration rectale. 15 Lorsque l'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange le ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique, la silice ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose ou d'autres 20 matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif. On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des 25 gélules molles ou dures. Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. 30 Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillant, ou des agents de mise en suspension, de même qu'avec des correcteurs du goût ou des édulcorants. Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires 35 qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylènes glycols. Pour une administration parentérale (intraveineuse, 3032620 10 intramusculaire, intradermique, sous-cutanée), intra-nasale ou intraoculaire, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants 5 pharmacologiquement compatibles. Le principe actif peut également être formulé sous forme de microcapsules, éventuellement avec un ou plusieurs supports additifs. Avantageusement, la composition pharmaceutique selon la 10 présente invention est destinée à une administration par voie orale. 3032620 11 Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemple 1 : Mesure d'affinité pour les récepteurs muscariniques 5 Protocole : Des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant de façon stable deux sous-types de récepteurs muscariniques humains (hMl et hM3) sont achetées (Perkin Elmer). Ces différentes membranes sont incubées deux heures dans 20 mM de tampon HEPES (pH 7,4) en présence 10 de 0,2 nM du ligand [3H]N-méthyl-scopolamine en compétition avec l'extrait de Ruscus. La liaison non-spécifique est déterminée en présence de 10 pM d'atropine (antagoniste non sélectif des récepteurs muscariniques). L'extrait de Ruscus testé est préparé selon le brevet EP 0112770. 15 Résultats L'extrait de Ruscus se lie aux récepteurs muscariniques de sous-type M1 et M3 avec des affinités respectives de 61,9 pg/ml et 96,1 pg/ml. Exemple 2 : couplage fonctionnel des récepteurs muscariniques à la 20 réponse calcique Protocole : Les cellules de l'exemple 1 sont transfectées transitoirement par électroporation (250 mV, 250 pF) avec 10 pg de plasmides contenant les différents sous-types de récepteurs muscariniques humains (hMl, 25 hM3 et hM5). Ce sont les trois sous-types qui sont couplés à une protéine Gq, M2 et M4 étant couplés à une protéine Gi. Les cellules sont ensemencées dans des plaques 96 puits. Quarante-huit heures après la transfection, le milieu de culture cellulaire est remplacé par 200 pl par puits d'un milieu contenant un indicateur de 30 fluorescence, le Fluo-4. Après deux heures d'incubation dans une enceinte à 37°C, 5% CO2, les plaques 96 puits sont transférées dans un lecteur à fluorescence (pcell, Hamamatsu). L'appareil transfère 20 pl de la microplaque contenant les composés à tester sur les cellules et la lecture de la fluorescence s'effectue chaque seconde 35 durant 3 minutes. La valeur maximale du pic de fluorescence pour chaque concentration testée est utilisée pour déterminer la puissance et l'efficacité du composé. Chaque valeur représente la 3032620 12 moyenne de 3 puits, la fluorescence est exprimée en unité arbitraire (Figure 1). Produits testés : - Le carbachol, c'est un agoniste des récepteurs muscariniques, 5 avec une affinité semblable à l'acétylcholine ; - Un extrait de Ruscus (identique à celui de l'exemple 1) ; - La Diosmine, un veinotonique, de la famille de flavonoïdes. - L'atropine, un antagoniste non-sélectif des récepteurs muscariniques. 10 Résultats Une forte augmentation de la réponse calcique est mesurée après la distribution du carbachol sur les cellules CHO-K1 exprimant transitoirement soit le récepteur humain muscarinique hMl, hM3 ou hM5 (Figure 1). Cette réponse est concentration-dépendante. En 15 revanche, la distribution de la diosmine n'induit pas d'augmentation calcique et ce, quelle que soit la concentration testée. La distribution de l'extrait de Ruscus induit une augmentation de la réponse calcique en fonction de la concentration distribuée (Figure 1). Cette augmentation calcique est retrouvée et mesurée pour les 20 trois sous-types de récepteurs considérés avec des valeurs d'EC50 de 12,5 ± 1,0 pg/ml pour le sous-type hMl, 31,3 ± 2,1 pg/ml pour le sous-type hM3 et 67,8 ± 15,7 pg/ml pour le sous-type hM5. Cette augmentation de la réponse calcique est antagonisée par la pré-incubation de 1 pM d'atropine, quel que soit le sous-type de 25 récepteur muscarinique considérée (Figure 1). Exemple 3 : couplage fonctionnel des récepteurs muscariniques à la réponse du gène rapporteur AP-1 Protocole : 30 Les cellules de l'exemple 1 sont transfectées transitoirement avec la Lipofectamine Plus selon les recommandations du fournisseur avec 3 pg de plasmides contenant les différents sous-types de récepteurs muscariniques humains (hMl, hM3 et hM5) et 10 pg de plasmides contenant le gène rapporteur AP-1 luciferase. Vingt-quatre heures 35 après la transfection les cellules sont réensemencées dans des plaques 96 puits opaques à la densité, de 20000 cellules par puits. Vingt-quatre heures après, le milieu de culture cellulaire est 3032620 13 remplacé par de l'Opti-MEM 1 sans rouge de phénol et mis en présence des composés à tester pour huit heures à 37°C dans un volume final de 50 pl. L'activité luciférase est évaluée avec le kit BriteLite Luciferase selon les instructions du fournisseur. Cinquante pl du 5 réactif reconstitué BriteLite sont ajoutés par puits, après cinq minutes d'incubation dans le noir la luminescence est mesurée à l'aide d'un compteur du type TopCount. Produits testés : Identiques à ceux de l'exemple 2. 10 Résultats : Une forte augmentation de l'activité luciférase est mesurée après la distribution d'un agoniste muscarinique, le carbachol sur les cellules CHO-K1 exprimant transitoirement le gène rapporteur AP1 et soit le récepteur humain muscarinique hMl, hM3 ou hM5 (Figure 2). 15 Cette réponse est concentration-dépendante. En revanche, la distribution de la diosmine n'induit pas d'augmentation de l'activité luciférase quelle que soit la concentration testée. La distribution de l'extrait de Ruscus induit une augmentation de l'activité luciférase en fonction de la concentration distribuée 20 (Figure 2). Cette augmentation est mesurée pour les deux-sous types de récepteurs considérés avec des valeurs d'EC50 de 64,8 ± 15,2 pg/ml pour le sous-type hMl et 149,5 ± 14,7 pg/ml pour le sous-type hM3. Cette augmentation de la réponse calcique est antagonisée par la pré-distribution de 1 pM d'atropine, antagoniste non-sélectif des 25 récepteurs muscariniques, quel que soit le sous-type de récepteur muscarinique considéré (Figure 2). Une légère augmentation de l'activité luciférase est mesurée pour le sous-type de récepteur muscarinique hM5, mais elle n'est pas concentration-dépendante. 30 Exemple 4 : mesure de la perméabilité veineuse sur deux modèles de hamster Protocole : Ces études sont effectuées sur la poche de joue de hamsters mâles (Mesocricetus auratus) âgés de 7 à 10 semaines (Bouskela et al., J. 35 cardiovasc. Pharmacol. 24, 281-285, 1994). Les animaux sont traités par voie orale deux fois par jour durant deux semaines avec différentes doses de l'extrait de Ruscus, de diosmine ou de leur 3032620 14 placebo (18 animaux par condition). Le jour de l'expérience, les animaux sont anesthésiés par une injection intra-péritonéale de 0,10,2 ml de pentobarbital sodique et maintenus avec de l'a-chloralose (100 mg/kg) administré par la voie fémorale. Pour les expériences, 5 les poches de joue sont disséquées selon la méthode de Duling (Duling, Microvascular Res. 5, 423-429, 1973) modifiée par Svensjo (Svensjo et al., Uppsala J. Med. Sci. 83, 71-79, 1978). Brièvement, la poche de la joue est retournée et disposée sur une platine de microscope. Une zone d'approximativement 1 cm2 est préparée pour la 10 microscopie de la perméabilité des macromolécules. La poche de la joue est continuellement superfusée avec 5 ml/min avec un tampon HEPES/HCO2 . Le pH est maintenu à 7,4 en bullant la solution avec 5% de CO2 et 95% de N2. Trente minutes après cette préparation, une solution de FITC-dextran dans du glucose, marqueur macromoléculaire, 15 est injectée par voie intraveineuse à la dose de 25 mg/100 g. La perméabilité microvasculaire aux macromolécules est quantifiée en comptant le nombre de sites d'extravasation, c'est-à-dire de fuite, du plasma fluorescent, visualisé par le traceur fluorescent dans les veinules post-capillaires. Les observations sont effectuées à l'aide 20 d'un microscope Leitz Ortholux avec un objectif 3.5x et un filtre d'excitation de longueur d'onde 490 nm. - modèle de perméabilité macromoléculaire à l'histamine La mesure du nombre de sites de « fuite » est effectuée en scannant la zone d'observation avec différents intervalles standardisés, 5 25 minutes après la dernière application topique d'histamine (2 applications séparées par un intervalle de 35 minutes et une concentration finale de 2 x 10-6 M). Les sites de « fuite » sont considérés si leur diamètre est supérieur à 100 pM. Le nombre de sites de « fuite » est rapporté par centimètre carré. Dans le cas du 30 blocage de l'effet du Ruscus, l'atropine à 0,1 ou 1 pM est appliquée au préalable à l'histamine. - modèle de perméabilité macromoléculaire à l'ischémie Une ischémie locale de la poche de joue est produite pendant 30 minutes au moyen d'un ballonnet gonflable autour du cou de la poche 35 retournée. Lors de la reperfusion, la perméabilité macromoléculaire est augmentée (Bouskela et al., Br. J. Pharmacol. 122, 1611-1616, 3032620 15 1997). Résultats : - modèle de perméabilité macromoléculaire induite par l'histamine L'extrait de Ruscus donné par voie orale induit une diminution dose-5 dépendante de la perméabilité au niveau de la joue de hamster induite par l'histamine en application topique (Figure 3a). Cette perméabilité est mesurée en fuites/cm2 avec 6 animaux par groupe. Cette diminution est complètement abolie en présence d'atropine, quelle que soit la dose d'extrait de Ruscus considérée (Figure 3b). 10 - modèle de perméabilité macromoléculaire induite par une ischémie. Dans ce modèle d'ischémie, la perméabilité est également mesurée en fuites par cm2 avec 6 animaux par groupe. L'extrait de Ruscus donné 15 par voie orale induit également une baisse de la perméabilité au niveau de la joue de hamster, même si le nombre de « fuites » par cm2 est moins important que dans le modèle de perméabilité induite par histamine. Cette diminution est également dose-dépendante (Figure 4a). La baisse de perméabilité est également reversée en 20 présence d'atropine, de façon dose-dépendante (Figure 4b). Il convient de noter que cette réversion est plus difficile à obtenir en présence de fortes doses d'extrait de Ruscus. REVENDICATIONS1. Extrait de Ruscus aculeatus L. pour son utilisation comme médicament dans le traitement de l'insuffisance veineuse chez des patients dont la ou les veines atteintes présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à l'acétylcholine ou au carbachol, altérée. Extrait de Ruscus aculeatus L. pour son utilisation comme médicament dans le traitement de l'insuffisance veineuse, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une insuffisance veineuse chronique des membres inférieures.2. 3. 20 4. 25 Extrait de Ruscus aculeatus L. pour son utilisation comme médicament dans le traitement de l'insuffisance veineuse, selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'insuffisance veineuse chronique des membres inférieures provient de maladies variqueuses. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif un extrait de Ruscus aculeatus L. et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament dans le traitement de l'insuffisance veineuse chez des patients dont la ou les veines atteintes présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à l'acétylcholine ou au carbachol, altérée.