Brevet FR3031112A1 — publié le 20160701

CONSTRUCTION D'ADN POUR LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES OCULAIRES La présente invention propose une méthode de traitement des pathologies oculaires par thérapie génique non virale. La méthode selon l'invention concerne plus particulièrement une construction d'ADN permettant la production ciblée intraoculaire de protéines thérapeutiques durant une période pouvant aller jusqu'à plusieurs mois. L'utilisation de ladite construction d'ADN pour le traitement de pathologies oculaires par thérapie génique non virale est également décrite. La construction d'ADN et son utilisation selon l'invention sont plus particulièrement adaptées au traitement des pathologies de la rétine par le biais d'une injection de la construction d'ADN dans le muscle ciliaire suivie d'un électrotransfert pour la production durable et intraoculaire d'une protéine thérapeutique d'intérêt. La cécité liée aux maladies métaboliques, inflammatoires ou à l'âge est en forte croissance et pose un problème de société de plus en plus significatif en Europe et dans le monde en terme de santé publique. Les causes principales de cécité sont liées à des pathologies de la rétine parmi lesquelles la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), les rétinopathies diabétiques (RD) et l'uvéite. La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) entrainant une cécité a une prévalence de l'ordre de 8,7%, affecte près de 26% de la population de 50 ans et plus. La DMLA devient un problème majeur de santé publique et social en raison de l'accroissement de l'âge de la population. L'augmentation constante et majeure de l'incidence du diabète est la cause majeure des rétinopathies diabétiques (RD) qui deviennent à leur tour une priorité de santé publique et de recherche scientifique. Les statistiques montrent que le diabète de type II touchera d'ici 2030 plus de 4,5% de la population dont près de 30% souffrira de rétinopathie diabétique. Enfin, l'uvéite représente un groupe de maladies inflammatoires oculaires dont la prévalence est estimée à 1/1000 et l'incidence à 0,5/1000. L'uvéite est responsable de 10% des cas de cécité et a donc, bien que plus rare que les maladies précédentes, un impact social et économique majeur chez de jeunes patients en âge de travailler. Pour traiter ces pathologies, des injections intraoculaires d'agents thérapeutiques ont été développées. En 2006, les premières protéines thérapeutiques de type anti-VEGF (pour Vascular Endothelial Growth Factor ou facteur de croissance de l'endothélium vasculaire) ont été administrées par voie intraoculaire pour le traitement des néovascularisations choroïdiennes de la DMLA. On citera notamment en tant qu'exemple de protéine de type anti-VEGF le Lucentis® (ranibizumab) qui a obtenu une autorisation de mise sur le marché 3031112 2 pour le traitement des néovascularisations choroïdiennes de la DMLA et de l'oedème diabétique maculaire. Les injections intraoculaires de protéines thérapeutiques, et notamment de protéines recombinantes, sont devenues depuis communes pour le traitement des oedèmes maculaires de la DMLA, de la rétinopathie diabétique et des occlusions veineuses. 5 Afin d'assurer un effet continu sur les pathologies oculaires, les anti-VEGF décrits ci-dessus sont administrés une fois par mois ou au mieux une fois tous les deux mois selon les patients. Il y a donc une nécessité de suivi de chaque patient afin de déterminer la fréquence d'administration des anti-VEGF pour que le traitement soit pleinement efficace. Par ailleurs, cette méthode de traitement induit des variations du taux de protéine thérapeutique dans la 10 sphère oculaire du patient, à savoir une concentration importante lors de l'injection (un pic) et une concentration qui s'amenuise petit à petit pour tendre vers zéro jusqu'à l'injection suivante. La concentration en protéine thérapeutique n'est donc pas régulière et de nombreux effets secondaires sont reportés avec ce mode d'administration. Parmi les pathologies oculaires, l'uvéite est définie comme un processus inflammatoire qui 15 affecte l'iris, le corps ciliaire ou la choroïde de l'oeil du patient, ces trois éléments formant l'uvée. C'est un terme générique qui couvre plusieurs pathologies différentes dont les causes demeurent inconnues mais sont généralement de deux types : les uvéites infectieuses et les uvéites non infectieuses. On distingue l'uvéite antérieure qui touche l'iris ou le corps ciliaire et est la plus commune des uvéites dans les pays de l'ouest, de l'uvéite intermédiaire qui 20 touche le vitré antérieur, et l'uvéite postérieure qui touche la choroïde et la rétine. L'uvéite non infectieuse a souvent une composante autoimmune. L'uvéite antérieure aigue associée à l'antigène HLA-B27 représente la première cause d'uvéite (Rothova et a 1., Br Jr Ophthalmol. 1992; 76:137-41). Par ailleurs on retrouve des uvéites antérieures associées à de nombreuses maladies rhumatologiques telles la sarcoïdose. L'uvéite postérieure de cause non infectieuse 25 est le plus souvent associée à la maladie de Behçet, à la maladie de Vogt Koyanagi Harada, à la chorio-rétinopathie de Birdshot, etc. Le traitement avec des corticoïdes par voie orale et/ou topique est largement utilisé dans le traitement des uvéites postérieures non infectieuses. De plus, pour les pathologies les plus réfractaires, des immunosuppresseurs peuvent être ajoutés au traitement pour augmenter les 30 effets anti-inflammatoires des corticostéroïdes. Ceci concerne notamment mais pas exclusivement la cyclosporine, le methotrexate, l'azathioprine, le mycophénolate mofétil, le tacrolimus et le chlorambucil. Depuis une dizaine d'années des traitements utilisant des anticorps anti-TNF alpha peuvent également été utilisés hors prescription AMM (hors label). 3031112 3 Des essais cliniques portant sur l'utilisation des composés thérapeutiques suivants : cyclosporine A, rapamycine, tacrolimus, et anti-TNF alpha, ont été menés pour évaluer l'efficacité et la sureté de ces composés et ainsi pouvoir traiter des pathologies oculaires autoimmunes comme la maladie de Behçet. Il a cependant été montré que l'administration 5 systémique de ces composés thérapeutiques conduit à long terme à de nombreux effets secondaires et que pour certains d'entre eux, leur administration locale présente peu d'efficacité ou une mauvaise tolérance par le patient. Les méthodes de traitement décrites ci-dessus présentent donc plusieurs inconvénients. Les composés thérapeutiques administrés par voie systémique et topique entrainent de très 10 nombreux effets secondaires. Les protéines recombinantes administrées par injections intra vitréennes doivent être administrées fréquemment avec des fluctuations importantes des concentrations entre chaque administration. La répétition de ces injections qui restent extremement stressantes pour les patients engendrent également des effets secondaires importants (décollement du vitré, hémmorragies, déchirure rétinienne, etc). Ainsi au final de 15 nombreux patients renoncent à leur traitement. La présente invention propose une construction d'ADN et son utilisation pour le traitement de pathologies oculaires. La présente invention permet de diminuer le nombre et/ou la fréquence des interventions du chirurgien et donc de réduire l'aspect invasif des injections intra oculaires tout en assurant une production stable et constante de protéines thérapeutiques 20 pendant une durée de plusieurs mois. Ainsi l'invention décrit une construction d'ADN destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d'un patient, qui comprend une origine de réplication, un promoteur permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, et un polynucléotide codant pour 25 une protéine thérapeutique sélectionnée pour son activité dans le traitement des pathologies oculaires, ladite construction étant amenée dans la sphère oculaire par injection directe dans le muscle ciliaire suivie d'un électrotransfert. La construction d'ADN selon l'invention est de forme linéaire ou circulaire, préférentiellement de forme circulaire. Dans un mode de réalisation particulier, la 30 construction d'ADN selon l'invention est un plasmide circulaire. Dans un mode de réalisation particulier la construction d'ADN est une construction d'ADN nu. 3031112 4 La construction d'ADN selon l'invention est injectée dans un muscle oculaire où elle est soumise à un électrotransfert. La technique connue de thérapie génique non virale utilisée dans la présente invention est l'injection de la construction d'ADN dans un muscle oculaire puis l'électrotransfert pour induire une perméabilisation transitoire des cellules du muscle 5 ciliaire et une migration de l'ADN pour optimiser la transfection de la construction d'ADN. Cette technique d'électrotransfert d'ADN (appelée aussi électroporation ou électroperméabilisation) est la plus simple et sûre des méthodes de thérapie génique car elle est facile à mettre en oeuvre, fiable et sûre pour le patient. On lui préfère souvent d'autres méthodes car le taux de transfection de l'ADN est faible par rapport au taux d'expression des 10 vecteurs viraux par exemple. L'un des inconvénients de l'utilisation de vecteurs viraux est l'induction de réponses immunitaires auxdits vecteurs viraux ce qui diminue leur efficacité ultérieure. De plus, les études menées sur les lentivirus et les rétrovirus montrent que ces derniers sont susceptibles d'induire des mutations d'insertion durant leur intégration dans le génome hôte. Les constructions d'ADN ne présentent pas ce type d'inconvénients, sont 15 faciles à produire et à manipuler et n'induisent pas de réponse immunitaires les rendant ainsi parfaitement adaptés à la thérapie génique de patients humains. Selon la présente invention, l'injection de la construction d'ADN se fait dans le muscle ciliaire car ce dernier est capable de produire les protéines de façon homogène et constante et du fait de sa position, favorise la diffusion de ces protéines dans l'ensemble de la sphère 20 oculaire (Bloquel et al. "Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis", FASEB 1 2006 Feb;20(2):389-91; Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins", J Gene Med. 2010 Nov;12(11):904-19). Les cellules musculaires lisses ont un taux de renouvellement faible et 25 sont bien réparties de part et d'autre du cristallin. La quantité de protéine à produire est proportionnelle à la surface du muscle transfecté (Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins", J Gene Med. 2010 Nov;12(11):904-19). Ainsi, la production de protéines thérapeutiques sera homogène et constante dans l'ensemble de la sphère oculaire et 30 sera limitée à cette sphère oculaire. On citera à titre d'exemple la méthode d'électrotransfert décrite dans la demande de brevet EP2266656 qui traite d'une méthode d'injection d'une composition pouvant contenir de l'ADN au niveau des tissus du corps ciliaire et/ou des tissus musculaires extraoculaires. Dans un mode de réalisation préféré, l'électrotransfert selon la présente invention se fait à l'aide d'un dispositif oculaire (tel que décrit dans le brevet 3031112 5 EP2266656) et d'un générateur électrique délivrant une séquence de 8 pulses électriques de 10ms et de 200V/cm à 700V/cm ou 1 pulse de 100ns à 10ms et de 200V/cm à 700V/cm suivi de 1 à 5 pulses de 50 à 200V/cm et de 10ms. Le muscle ciliaire fait partie du corps ciliaire, proche du limbe et juste derrière la sclère. 5 L'injection de la construction d'ADN dans celui-ci est donc très faiblement invasive contrairement aux injections sous-rétiniennes et constitue donc le lieu préféré d'injection de la construction d'ADN selon l'invention. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'invention porte sur une construction d'ADN nu destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules du muscle ciliaire d'un patient, qui comprend une origine de réplication, un 10 promoteur permettant son expression dans les cellules du muscle ciliaire du patient, et/ou une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans le muscle ciliaire du patient, et un polynucléotide codant pour une protéine thérapeutique sélectionnée pour son activité dans le traitement des pathologies oculaires, ladite construction étant amenée dans le muscle ciliaire par injection directe suivie d'un électrotransfert. 15 La protéine thérapeutique encodée par la construction d'ADN selon l'invention est une protéine connue pour son effet sur les pathologies oculaires et notamment les uvéites en combinaison ou non avec des corticostéroïdes et/ou des immunosuppresseurs. La protéine thérapeutique est sélectionnée pour son effet particulier sur les pathologies oculaires humaines. 20 Comme évoqué ci-dessus, les pathologies oculaires peuvent être de type inflammatoire et la cytokine TNF-alpha (Tumor Nectosis Factor ou facteur de nécrose tumorale, de type alpha) joue un rôle important dans le développement de ces pathologies inflammatoires. La stratégie connue de l'art antérieur consistant à utiliser des anti-corps anti-TNF-alpha et des récepteurs solubles au TNF-alpha semble efficace pour diminuer 25 voir enrayer le développement de l'inflammation liée au TNF-alpha (Greiner et al. IOVS, 2004, 45:170-176 and Hale et al. Cytokine 33(2006):231-237). Ainsi, la protéine thérapeutique encodée par la construction d'ADN selon l'invention est de type anti TNFalpha. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine thérapeutique est une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé 30 via une charnière au fragment constant de l'immunoglobuline humaine IgG1 (Peppel et al., J Exp Med, 174 :1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophtalmol, 22 :845-851). La SEQ ID NO 1 détaille la séquence protéique du domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF-a, ou récepteur soluble de type I du TNF-a, qui est compris dans la 3031112 6 construction d'ADN selon l'invention, cette séquence est nommée hTNFR-Is dans la présente invention. La SEQ ID NO 2 détaille la séquence protéique du fragment constant de l'immunoglobuline humaine de type G1 (IgG1) qui est compris dans la construction d'ADN selon l'invention, cette séquence est nommée hIgG1 dasns la présente invention. 5 La présente invention décrit une nouvelle construction d'ADN destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d'un patient pour le traitement de pathologies oculaires caractérisée en ce qu'elle est constituée de : - une origine de réplication de type mammifère, - un promoteur permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, et 10 - une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, - un polynucléotide codant pour une protéine de fusion comprenant les versions humaines du récepteur soluble de type I du TNF-a (hTNFR-Is) et de la chaîne lourde l'immunoglobuline G1 (hIgG1) ainsi qu'un site de clivage à la thrombine, 15 ladite construction étant amenée dans la sphère oculaire par injection directe dans le muscle ciliaire suivie d'un électrotransfert. Dans la présente invention, la construction d'ADN comprend un polynucléotide codant pour une protéine de fusion comprenant les versions humaines du récepteur soluble de type I du TNF-a (hTNFR-Is) et de la chaîne lourde l'immunoglobuline G1 (hIgG1) ainsi qu'un site de 20 clivage à la thrombine. Comme évoqué ci-dessus, il est connu de l'art antérieur d'utiliser la thérapie génique non virale pour le traitement de l'uvéite (Touchard et al., Effects of ciliary muscle plasmid electrotransfer of TNF-alpha soluble receptor variants in experimental uveitis, Gene Ther. 2009 Jul;16(7):862-73). Il est également connu d'utiliser des compositions thérapeutiques 25 contenant des corticoïdes, seuls ou en combinaison avec des immunomodulateurs, dans le traitement de certaines uvéites non infectieuses. Dans un mode de réalisation préféré la protéine de fusion présente une séquence dans laquelle la version humaine du récepteur soluble de type I du TNF-a (hTNFR-Is) est lié à la chaine lourde de l'immunoglobuline G1 humaine (hIgG1) par un site de clivage à la thrombine. Le 30 site de clivage à la thrombine correspond typiquement à la SEQ ID NO 3. Dans un mode de réalisation plus préféré la protéine de fusion correspond à la SEQ ID NO 4. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention décrit une construction d'ADN dans laquelle le polynucléotide code pour une protéine de fusion de type hTNFR-Is/hIgG1 3031112 7 présentant au moins 90% de similarité avec la SEQ ID NO 4. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention décrit une construction d'ADN dans laquelle le polynucléotide code pour une protéine de fusion de type hTNFR-Is/hIgG1 qui présente 91% de similarité avec la SEQ ID NO 4, préférentiellement 92%, préférentiellement 93%, 5 préférentiellement 94%, préférentiellement 95%, préférentiellement 96%, préférentiellement 97%, plus préférentiellement 98%, et encore plus préférentiellement 99% de similarité avec la SEQ ID NO 4. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention décrit une construction d'ADN dans laquelle la protéine de fusion, ou protéine thérapeutique, correspond à la séquence protéique décrite 10 dans la SEQ ID NO 4 (voir Liste des Séquences) correspondant à la protéine dénommée hTNFR-Is/hIgG1 dans la présente invention. Dans un mode de réalisation particulier la construction d'ADN selon l'invention est de forme circulaire. Dans un autre mode de réalisation de l'invention la construction d'ADN est une construction 15 d'ADN nu dans laquelle la protéine de fusion, ou protéine thérapeutique, correspond à la séquence protéique décrite dans la SEQ ID NO 4 (voir Liste des Séquences) correspondant à la protéine dénommée hTNFR-Is/hIgG1 dans la présente invention. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la construction d'ADN comprend une origine de réplication de type pUC, un promoteur de type CMV permettant son expression 20 dans la sphère oculaire du patient, et une ou plusieurs séquences activatrices favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, et un polynucléotide codant la protéine de fusion de SEQ ID NO 4. Le plasmide est de façon préférée un vecteur de type pEVO6 correspondant au plasmide NTC8685-EGFP (Nature Technology Corporation®), dont on élimine la séquence codant pour la EGFP (« Enhanced Green Fluorescent Protein » ou 25 protéine fluorescente de couleur verte), comprenant une origine de réplication pUC, des séquences promotrices de type CMV et des séquences activatrices de type CMV et SV40, et la séquence codant pour la protéine d'intérêt est clonée dans la cassette prévue à cet effet en position 2938-2944 de pEVO6 (voir Fig. 1). Cette construction est utilisée dans la partie exemples ci-dessous. 30 Dans un mode de réalisation particulier, la construction d'ADN selon la présente invention présente au moins 90% de similarité avec la SEQ ID NO 5, préférentiellement 91% de similarité avec la SEQ ID NO 5, préférentiellement 92%, préférentiellement 93%, 3031112 8 préférentiellement 94%, préférentiellement 95%, préférentiellement 96%, préférentiellement 97%, plus préférentiellement 98%, et encore plus préférentiellement 99% de similarité avec la SEQ ID NO 5. Dans un mode de réalisation préféré, la construction d'ADN selon l'invention correspond à la 5 séquence n°5 u SEQ ID NO 5. Cette construction d'ADN correspond à la représentation schématique de la Fig. 2. La présente invention décrit également l'utilisation d'une construction d'ADN selon l'invention, destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules du muscle ciliaire d'un patient pour le traitement de pathologies oculaires par injection dans le muscle 10 ciliaire suivi d'un électrotransfert. Les pathologies oculaires ciblées sont les uvéites non infectieuses et particulièrement les uvéites antérieures, intermédiaires et postérieures et plus particulièrement les uvéites chroniques. L'invention porte plus particulièrement sur l'utilisation d'une construction d'ADN destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules musculaires ciliaires de la sphère 15 oculaire d'un patient, qui comprend - une origine de réplication de type mammifère, - un promoteur permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, et - une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, 20 - un polynucléotide codant pour une protéine de fusion comprenant les versions humaines du récepteur soluble de type I du TNF-ct (hTNFR-Is) et de la chaîne lourde l'immunoglobuline G1 (hIgG1) ainsi qu'un site de clivage à la thrombine, ladite construction étant amenée dans la sphère oculaire par injection directe dans le muscle ciliaire suivie d'un électrotransfert. 25 Dans un mode de réalisation préféré, l'invention décrit l'utilisation d'une construction d'ADN qui comprend une origine de réplication de type pUC, un promoteur de type CMV permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, et un polynucléotide codant pour la protéine de fusion de SEQ ID NO 4. Le plasmide pEVO6 semble particulièrement bien adapté 30 à la réalisation d'une construction d'ADN selon l'invention et à son utilisation pour le traitement des pathologies oculaires par injection puis électrotransfert. 3031112 9 Une fois la séquence codant pour la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgG1 insérée dans la cassette de clonage du plasmide pEV06, on obtient la séquence ADN décrite dans la liste des séquences sous SEQ ID NO 5. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention décrit également l'utilisation d'une 5 construction d'ADN selon la présente invention qui présente au moins 90% de similarité avec la SEQ ID NO 5, préférentiellement 91% de similarité avec la SEQ ID NO 5, préférentiellement 92%, préférentiellement 93%, préférentiellement 94%, préférentiellement 95%, préférentiellement 96%, préférentiellement 97%, plus préférentiellement 98%, et encore plus préférentiellement 99% de similarité avec la SEQ ID NO 5. 10 Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention décrit l'utilisation d'une construction d'ADN selon l'invention qui correspond à la SEQ ID NO 5. Cette construction d'ADN correspond à la représentation schématique de la Fig. 2. L'utilisation de la construction d'ADN selon l'invention a pour objectif de traiter les uvéites, et particulièrement les uvéites infectieuses. Dans un mode de réalisation préféré la 15 construction d'ADN selon l'invention est utilisée pour le traitement d'une uvéite, préférentiellement une uvéite non infectieuse. EXEMPLE 20 A. Le choix du squelette de la construction d'ADN a été fait suite à différents tests qui ont amené à la sélection de pEV06. Dans un premier temps on a mis en évidence l'expression de la Luciférase encodée dans 4 plasmides différents et dépourvus d'un gène de sélection aux antibiotiques (pEV02, pEV05, pEVO6 et pEV06-NP). Ces 4 plasmides, commercialement disponibles, ont été évalués en 25 parallèle. Les résultats détaillés en Fig. 7 montrent l'expression de la Luciférase dans le vitré de l'oeil de lapins 31 jours après électroporation du muscle ciliaire selon la méthode décrite dans EP2266656. Il en résulte que le plasmide pEVO6 (cf Fig. 1) permet d'obtenir la meilleure expression du transgène dans l'oeil de lapin. 30 Parmi les 4 plasmides testés, pEVO6 a été sélectionné pour évaluer la durée de l'expression d'un transgène dans un modèle murin. 3031112 10 La Fig. 8 montre les résultats obtenus chez le rat sur une durée de 150 jours. Il en résulte que l'expression du transgène encodé dans le plasmide pEVO6 perdure au delà de 150 jours. L'ensemble de ces résultats a conduit à la sélection du plasmide pEVO6 pour la mise en oeuvre d'un développement préclinique et clinique du plasmide pEVO6 encodant une protéine de 5 fusion ou protéine thérapeutique, selon la présente invention. B. Une construction d'ADN sous la forme d'un plasmide selon la présente invention est testée dans un modèle d'uvéite induite par une endotoxine (EIU pour endotoxin induced uveitis) chez le rat. Sont également testés un plasmide encodant une protéine de fusion chimérique 10 hTNFR-Is/mIgG1 (version humaine pour TNFR-Is et version murine pour IgG1) et une protéine monomérique hTNFR-Is. Les conditions expérimentales sont les mêmes pour les trois types de plasmides. Cette expérience permet de vérifier s'il y a une différence d'efficacité entre l'injection et l'électrotransfert d'une protéine de fusion dimérique sous forme humaine hTNFR-Is/hIgGl, sous forme chimérique hTNFR-Is/mIgGl, ou d'une 15 protéine monomérique hTNFR-Is dans ce modèle d'uvéite. Plasmides Les constructions d'ADN sont réalisées à partir du plasmide pEVO6 contenant une origine de réplication de type pUC, un marqueur de sélection, des séquences promotrices de type CMV 20 et favorisant l'expression de type CMV et SV40 et la séquence codant pour la protéine d'intérêt est clonée dans la cassette prévue à cet effet en position 2938-2944 (voir Fig. 1 pour la représentation schématique de pEV06). Les plasmides pEV06-hTNFR-Is/mIgGl, pEV06- hTNFR-Is/hIgG1 et pEV06-hTNFR-Is encodent respectivement pour la protéine de fusion hTNFR-Is/mIgGl, la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgGl et la forme monomérique hTNFR- 25 Is. Animaux Des rats Lewis femelle âgées de 6 à 8 semaines et pesant 130 à 170 g sont utilisés conformément aux dispositions du protocole ARVO (for Association for Research in Vision 30 and Ophtalmology). Les rats sont anesthésiés par injection d'une dose de kétamine (75 mg/kg) et de Largactil (0,5 mg/kg) avant injection des plasmides et électrotransfert. À la fin de l'expérience, les rats sont anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital (30 3031112 11 mg/kg) avant prélèvement de sang par ponction intracardiaque, puis les rats sont euthanasiés par administration d'une dose létale de pentobarbital. Électrotransfert au niveau du muscle ciliaire du rat 5 L'électrotransfert est réalisé comme décrit dans Bloquel et al. « Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis » (FASEB J2006; 20: 389-391) en modifiant la voie d'injection par une approche transsclérale (Touchard "The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins", J Gene Med. 2010 10 Nov;12(11):904-19). Le plasmide est injecté à raison de 15 lag dans 10 [1,1 de solution saline, dans le muscle ciliaire des animaux à l'aide d'une seringue adaptée. Les impulsions électriques sont administrées à l'aide d'une électrode spécifique iridium/platine de 250 iam de diamètre. Cette électrode interne est introduite dans le tunnel transscléral existant. L'électrode externe est une feuille de platine courbée pour épouser la 15 forme de l'oeil et placée au niveau du limbe face à l'électrode interne. L'électrotransfert est réalisé à raison de 8 impulsions électriques carrées unipolaires (200V/cm, 10 ms, 5 Hz) générées par un électroporateur (Genetronics) comme décrit dans Touchard et al (J Gene Med. 2010 Nov;12(11):904-19). Lesdites conditions ayant été prédéterminées spécifiquement pour transfecter de façon optimale de l'ADN plasmidique dans le muscle ciliaire de rat. 20 Induction et évaluation du score clinique sur une uvéite induite par endotoxine (EIU) L'uvéite induite par endotoxine est provoquée par injection dans le coussinet plantaire de 0,1 ml d'une solution saline stérile et apyrogène contenant 200 lag de lipopolysaccharide (LPS) de type Salmonella typhimurium. Les yeux des animaux sont examinés par biomicroscopie à la 25 lampe à fente durant la période de sévérité maximale de l'uvéite induite dans ce modèle, soit 24h après l'injection. L'intensité de l'inflammation oculaire est évaluée pour chaque oeil selon trois critères (estimé en « unités arbitraires » ou UA) : i) la rougeur de l'oeil est évaluée de 0 à 3 : (0) indique une vasodilatation normale au niveau de l'iris et de la conjonctive, (1) 30 indique la présence d'une dilatation minimale des vaisseaux de l'iris et de la conjonctive, (2) indique la présence d'une dilatation modérée des vaisseaux de l'iris et de la conjonctive, et (3) indique la présence d'une dilatation intense des vaisseaux de l'iris et de la conjonctive. ii) la présence de cellules dans la chambre antérieure est évaluée de 0 à 2 : 3031112 12 (0) indique l'absence de cellules dans la chambre antérieure de l'oeil, (1) indique la présence de cellules dans la chambre antérieure et (2) indique la présence de cellules dans la chambre antérieure avec formation d'un hypopion. iii) la présence de fibrine est évaluée de 0 à 2 : 5 (0) indique l'absence de fibrine dans la chambre antérieure, (1) indique la formation de fibrine dans la chambre antérieure et (2) indique la formation de fibrine dans la chambre antérieure avec isolement total de la pupille (bouchon de fibrine). Cette évaluation clinique est réalisée en aveugle par un ophtalmologiste. Pour chaque paramètre, le score clinique est donné en unités arbitraires (UA). L'intensité de 10 l'inflammation oculaire (ou score global de l'uvéite) est évaluée sur une échelle de 0 à 7 pour chaque oeil et est obtenue en additionnant les scores cliniques mesurés sur chacun des trois paramètres et exprimés en UA. Analyse des résultats 15 Les expériences sont menées avec une construction dont le plasmide non codant est pEV06.00, correspondant au plasmide pEVO6 circularisé. Les séquences codant pour des protéines de fusion dimériques hTNFR-Is/mIgG1 et hTNFR-Is/hIgG1 ou la forme monomérique de hTNFR-Is sont insérées dans la cassette de clonage du plasmide pEVO6 selon le protocole indiqué ci-dessus. Les résultats sont résumés dans le tableau 1 : 20 Rougeur Cellules CA Fibrine Score global Témoin 2,7 1,5 1,6 5,8 hTNFR-Is/mIgG1 2,3 1,0 1,5 4,8 hTNFR-Is 2,2 0,8 1,8 4,8 hTNFR-Is/hIgG1 1,6 0,6 1,0 3,2 Tableau 1 : scores cliniques Ces résultats exprimés en unités arbitraires (UA) sont présentés dans les Fig. 3 à 6. 25 La Fig. 3 montre les résultats du score clinique global de l'uvéite induite par une endotoxine (LPS) dans notre modèle. La colonne de gauche est un contrôle correspondant à l'injection puis l'électrotransfert du plasmide vide. La deuxième colonne montre le score obtenu en utilisant un plasmide codant pour la protéine chimère hTNFR-Is/mIgGl. La troisième colonne montre le score obtenu en administrant un plasmide encodant le hTNFR-Is seul et la dernière 3031112 13 colonne correspondant à l'administration d'un plasmide selon l'invention encodant la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgGl. On obtient un effet thérapeutique potentiel bien supérieur en utilisant une construction d'ADN selon l'invention par comparaison avec la forme monomérique de hTNFR-Is ou la 5 protéine de fusion hTNFR-Is/mIgGl. Les Fig. 4 à 6 montrent les composantes du score clinique illustré par la Fig. 3 à savoir, la rougeur (Fig. 4), la présence de cellules dans a chambre antérieure (Fig. 5) et la présence de fibrine (Fig. 6). Pour les trois critères observés, les constructions injectées sont les mêmes que celles décrites ci-dessus. Pour le caractère rougeur, la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgGl 10 montre une meilleure activité que la forme monomérique de hTNFR-Is ou la protéine de fusion hTNFR-Is/mIgG1 (voir Fig. 4). De même pour la présence de cellules dans la chambre antérieure (voir Fig. 5) et la présence de fibrine (voir Fig. 6). Par ailleurs la protéine de fusion secrétée par le muscle ciliaire est dosée dans l'oeil mais n'est pas retrouvée dans le sérum (données non illustrées). 15 Ces résultats montrent le potentiel thérapeutique de la protéine de fusion hTNFR-Is/hIgG1 par rapport aux autres constructions testées dans le traitement de l'uvéite. D'autre part, en raison de l'absence de cette protéine de fusion dans le sérum, aucun effet secondaire indésirable n'est attendu contrairement à ce qui a pu être constaté dans le cas de traitement aux anticorps anti-TNF alpha administrés par voie intraveineuse ou sous-cutanée. 20 Ainsi la construction selon la présente invention et son mode d'administration constituent une voie de traitement des pathologies oculaires par thérapie génique non virale et notamment de l'uvéite. REVENDICATIONS1. Construction d'ADN destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules 5 musculaires de la sphère oculaire d'un patient pour son utilisation dans le traitement de pathologies oculaires caractérisée en ce qu'elle est constituée de : - une origine de réplication de type mammifère, - un promoteur permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, et - une ou plusieurs séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire 10 du patient, - un polynucléotide codant pour une protéine de fusion comprenant les versions humaines du récepteur soluble de type I du TNF-a (hTNFR-Is) et de la chaîne lourde l'immunoglobuline G1 (hIgG1) ainsi qu'un site de clivage à la thrombine, ladite construction étant amenée dans la sphère oculaire par injection directe dans le muscle 15 ciliaire suivie d'un électrotransfert. 2. Construction d'ADN pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine de fusion présente une séquence dans laquelle la version humaine du récepteur soluble de type I du TNF-a (hTNFR-Is) est liée à la chaîne lourde de l'immunoglobuline G1 20 humaine par un site de clivage à la thrombine. 3. Construction d'ADN pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est de forme circulaire. 25 4. Construction d'ADN pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à, 3, caractérisée en ce que ladite construction est de l'ADN nu. 5. Construction d'ADN pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le polynucléotide code pour une protéine de fusion présentant au moins 30 90% de similarité avec la SEQ ID NO 4. 6. Construction d'ADN pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le polynucléotide code pour une protéine de fusion présentant au moins 95% de similarité avec la SEQ ID NO 4, préférentiellement 96%, plus préférentiellement 97%, plus 3031112 2 préférentiellement 98%, et encore plus préférentiellement 99% de similarité avec la SEQ ID N04. 7. Construction d'ADN pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le 5 polynucléotide code pour une protéine de fusion correspondant à la SEQ ID NO 4. 8. Construction d'ADN pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend une origine de réplication de type pUC, un promoteur de type CMV permettant son expression dans la sphère oculaire du patient, et une ou plusieurs 10 séquences favorisant l'expression de l'ADN dans la sphère oculaire du patient, et un polynucléotide codant la protéine de fusion de SEQ ID NO 4. 9. Construction d'ADN pour son utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle présente au moins 90% de similarité avec la SEQ ID NO 5, préférentiellement 91%, 15 préférentiellement 92%, préférentiellement 93%, préférentiellement 94%, préférentiellement 95%, préférentiellement 96%, préférentiellement 97%, plus préférentiellement 98%, et encore plus préférentiellement 99% de similarité avec la SEQ ID NO 5. 10. Construction d'ADN pour son utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce 20 qu'elle correspond à la SEQ ID NO 5. 11. Construction d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la pathologie oculaire est une uvéite, préférentiellement une uvéite non infectieuse.