Brevet FR3027917A1 — publié le 20160506

SPHEROIDES MIXTES DE MELANOCYTES ET DE KERATINOCYTES La présente invention se rapporte à la mise au point d'un modèle d'évaluation d'actifs visant l'épiderme. Elle vise plus spécifiquement la préparation de sphéroïdes mixtes de mélanocytes et de kératinocytes reproduisant les interactions cellulaires existantes au sein de l'épiderme, les sphéroïdes en tant que tels et leurs utilisations. L'épiderme est la couche la plus superficielle de la peau. Il est majoritairement constitué de kératinocytes qui prolifèrent et se différencient jusqu'à donner des cellules mortes appelées coméocytes qui s'éliminent par desquamation. Les mélanocytes, cellules spécialisées responsables de la production du pigment mélanique, se situent dans l'épiderme au niveau de la lame basale. La mélanine produite par les mélanocytes s'accumule dans des vésicules appelées mélanosomes qui sont transférées aux kératinocytes par leurs nombreuses extensions dendritiques. La pigmentation de la peau est la résultante de ce processus, appelé mélanogénèse, conduisant à la production de mélanine. L'épiderme remplit plusieurs fonctions incluant notamment la pigmentation de la peau et la fonction barrière, principalement assurée par la couche cornée. Ces fonctions peuvent être modulées par des actifs. A titre d'exemple, des produits dépigmentants sont disponibles dans le commerce à des fins cosmétiques ou dermatologiques pour le traitement de troubles hyper-pigmentaires de type melasma ou lentigo solaire. Le plus connu d'entre eux, l'hydroquinone, présente de nombreux effets secondaires et est aujourd'hui interdit en cosmétique. La mise en évidence de nouveaux composés pouvant représenter des alternatives à l'hydroquinone nécessite l'utilisation de modèles biologiques permettant d'évaluer leur activité dépigmentante. A l'heure actuelle, les modèles de co-culture de kératinocytes et de mélanocytes sont les plus utilisés dans ce domaine. Ils permettent de suivre différents aspects de la biologie de l'épiderme mais ne rendent pas compte du microenvironnement tridimensionnel de l'épiderme. Il existe également des modèles de peaux reconstruites mimant de façon plus fidèle le comportement de ces deux types cellulaires au sein de l'épiderme. Cependant les peaux reconstruites sont des modèles très lourds à mettre en oeuvre et également trop onéreux pour être utilisés en routine pour du criblage de molécules. Il apparait donc nécessaire de mettre au point des modèles tridimensionnels d'épiderme rapides à préparer et faciles à manipuler pour l'évaluation de nouveaux actifs. C'est dans ce contexte que la Demanderesse a mis au point des 5 sphéroïdes comportant une population cellulaire mixte de kératinocytes et de mélanocytes. La présente invention se rapporte en premier lieu à un procédé de préparation de sphéroïdes mixtes de kératinocytes et de mélanocytes caractérisé en ce qu'il comprend : 10 (a) la mise en suspension de kératinocytes avec des mélanocytes dans un milieu de culture supplémenté d'une préparation de protéines de la matrice extra-cellulaire, de préférence, cette préparation est présente à une concentration comprise entre 1 à 95% en volume/volume (pourcentage exprimé en volume de préparation par rapport au volume total du milieu de culture), de préférence entre 10 et 75% en volume/volume, et d'une 15 quantité inférieure ou égale à 10 mM, de préférence comprise entre 0,1 et 1 mM, d'un sel choisi parmi le calcium, le manganèse ou le magnésium, de préférence, il s'agit du calcium ; (b) la formation des sphéroïdes à partir du mélange obtenu à l'étape (a) ; et (c) l'incubation des sphéroïdes obtenus à l'étape (b). 20 Les cellules, kératinocytes et mélanocytes, utilisables dans le procédé selon l'invention peuvent être saines ou malades selon l'utilisation souhaitée des sphéroïdes ; lorsqu'il s'agit de cellules saines, elles peuvent être des kératinocytes primaires sains du type NHEK (Normal Human Epidermal Keratinocyte) et des mélanocytes primaires sains du type NHEM (Normal Human Epidermal Melanocyte) 25 provenant de biopsie ou de source commerciale. Le procédé peut être conduit avec des mélanocytes de tout phototype compris entre 1 et 6; là encore, l'homme du métier choisira le phototype le plus approprié aux expérimentations envisagées. Le ratio de kératinocytes par rapport aux mélanocytes n'est pas critique pour la préparation des sphéroïdes selon l'invention ; on préférera toutefois 30 utiliser un ratio qui se rapproche autant que possible de celui de l'épiderme, c'est-à-dire compris entre 1 mélanocyte pour 1 kératinocyte et 1 mélanocyte pour 40 kératinocytes ; de préférence, ce ratio est compris entre 1 mélanocyte pour 2 kératinocytes et 1 mélanocyte pour 5 kératinocytes. La quantité totale de cellules ensemencées pour la préparation d'un sphéroïde n'est pas essentielle et est adaptée en fonction de l'origine des cellules ensemencées ; à titre d'exemple, afin d'obtenir des sphéroïdes d'une dimension optimisée à partir de cellules primaires saines, il est préférable d'ensemencer entre 100 et 5000 cellules, de préférence entre 2000 et 3000 cellules, pour un sphéroïde. Les cellules sont de préférence ensemencées dans des plaques 96 puits. La préparation de protéines de la matrice extracellulaire est de préférence une préparation d'extrait protéique issue d'un sarcome comme par exemple celle vendue par la société Coming Life Sciences sous le nom Matrige10. L'étape (b) est de préférence réalisée par centrifugation, par exemple, entre 50 et 2200g pendant entre 30 secondes et 15 minutes, de préférence 6 minutes. L'étape (c) d'incubation est conduite dans des conditions classiques ; c'est-à-dire à une température comprise entre 35 et 38°C et pendant une durée de lh avant l'ajout de milieu supplémenté en sel, notamment le calcium, pour hydrater la préparation de protéines de la matrice extra-cellulaire telle que le Matrige10. Selon une variante de l'invention, l'incubation des sphéroïdes est prolongée au-delà de 3 jours pour voir apparaitre une modification des kératinocytes (allongement des cellules, aplatissement des noyaux, accumulation de kératine) au centre des sphéroïdes (Figures 2 à 4). Cette caractéristique rend le modèle très intéressant puisqu'il reproduit le gradient de différenciation des kératinocytes. Le sphéroïde mixte mime ainsi une peau « à l'envers » (les cellules les plus différenciées étant au coeur du sphéroïde) avec une structure similaire aux différentes strates de la peau (Figure 4). A titre indicatif, l'incubation de l'étape (c) peut durer entre 1 et 10 25 jours, de préférence entre 2 et 5 jours, selon le degré de différenciation des kératinocytes souhaité. Un avantage du procédé selon l'invention est qu'il permet de produire rapidement un grand nombre de sphéroïdes ayant des caractéristiques de taille et de population cellulaire standardisées, ce qui permet la mise en oeuvre d'essais de criblage 30 en série et de comparer des résultats obtenus. Diverses tentatives de préparation de sphéroïdes présentées dans la partie expérimentale ont permis de mettre en évidence les caractéristiques essentielles du procédé. Ainsi, l'absence de sel et/ou de préparation de protéines de la matrice extracellulaire, contenant également en particulier des facteurs de croissance, ou encore la préparation de sphéroïde simple d'un seul des deux types cellulaires auquel serait ajouté une suspension de l'autre type cellulaire ne conduisent pas à la formation de sphéroïde. La présente invention se rapporte également à des sphéroïdes mixtes de kératinocytes et de mélanocytes comprenant une préparation de protéines de la matrice extracellulaire et un sel choisi parmi le calcium, le magnésium et le manganèse pouvant être préparés selon le procédé qui précède ; avantageusement, il s'agit de sphéroïdes ayant un diamètre apparent compris entre 100 um et 1000 um et une forme régulière. De préférence, les sphéroïdes comprennent un nombre de cellules compris entre 100 cellules et 5000 cellules, de préférence entre 2000 et 3000 cellules. La présente invention se rapporte encore à des sphéroïdes mixtes qui comportent une masse centrale correspondant à une différenciation centrale des kératinocytes. Les sphéroïdes mixtes selon l'invention reproduisent les interactions kératinocytes/kératinocytes, kératinocytes/mélanocytes avec la présence d'extensions dendritiques et la production de mélanine par les mélanocytes. Ils peuvent donc servir de modèles pour l'évaluation de l'activité de molécules actives notamment dermatologiques ou cosmétiques. A cette fin, il peut s'avérer utile mais n'est pas indispensable, au cours de leur préparation, de marquer un ou plusieurs constituants de ces sphéroïdes afin de pouvoir suivre son évolution au cours du temps ou lorsque le sphéroïde sera mis en contact avec des molécules à tester. Le marquage pourra être de plusieurs natures : un marquage des cellules vivantes par un colorant avant la formation du sphéroïde ou un marquage anticorps sur coupe de sphéroïde ou sphéroïdes dissociés après formation du sphéroïde. Le type de marquage conditionnera l'analyse qui sera effectuée. La présente invention se rapporte encore à l'utilisation des sphéroïdes selon l'invention pour l'évaluation d'actifs susceptibles d'agir au niveau de l'épiderme. De par la fonctionnalité de leurs mélanocytes, les sphéroïdes mixtes présentent un modèle de choix pour l'évaluation de l'activité de la pigmentation, que ce soit par inhibition ou stimulation par des molécules et/ou des mélanges de molécules formulées ou encapsulées ou des produits dermatologiques ou cosmétiques ; pour conduire cette évaluation, il est nécessaire de suivre et d'analyser la mélanogénèse. Ce suivi peut être notamment réalisé selon deux axes différents : d'une part un dosage de la quantité de mélanine produite et d'autre part la quantification du transfert de la mélanine produite vers les kératinocytes. Le dosage de la mélanine peut être réalisé par photométrie selon un protocole tel que celui présenté dans l'exemple 3. L'évaluation de l'activité éventuelle d'une molécule sur la pigmentation peut également ou alternativement être réalisée par l'analyse du transfert des mélanosomes vers les kératinocytes en temps réel. Ceci peut être réalisé par un marquage tel que décrit dans l'exemple 4, puis analyse des sphéroïdes par imagerie 3D en profondeur ; cette évaluation peut également être réalisée par d'autres techniques telles que la cytométrie en flux. L'utilisation de sphéroïdes mixtes selon l'invention comportant une masse centrale peut aussi concerner l'étude de la kératinisation et des maladies associées (par exemple, le psoriasis, la dermatite atopique...) et servir pour le criblage de molécules modulant la différenciation des kératinocytes par mesure de l'épaisseur de la masse centrale à cinétique donnée. De façon plus générale, les sphéroïdes mixtes selon l'invention peuvent être utilisés pour l'étude de désordres ou de pathologies résultant d'un dysfonctionnement de la kératogénèse, de la mélanogénèse et/ou du transfert de mélanine ainsi que pour le criblage de molécules susceptibles de corriger ces dysfonctionnements en vue de leur utilisation pour des applications cosmétique, dermatologique ou cancérologique. Ainsi, la présente invention vise en particulier un procédé de criblage de molécules susceptibles d'agir sur la production de mélanine et/ou sur le transfert de 25 mélanosomes comprenant : (i) la préparation de sphéroïdes éventuellement marqués selon l'invention ; (ii) la mise en contact des sphéroïdes préparés à l'étape (i) avec une ou plusieurs molécules à tester ; 30 (iii) la sélection des molécules modulant la quantité de mélanine et/ou le transfert des mélanosomes ; ou encore un procédé de criblage de molécules susceptibles d'agir sur la différenciation des kératinocytes comprenant : (i) la préparation de sphéroïdes selon l'invention, par exemple comportant une masse centrale et/ou marqués ; (ii) la mise en contact des sphéroïdes préparés à l'étape (i) avec une ou plusieurs molécules à tester ; (iii) la sélection des molécules modulant la différenciation des kératinocytes. Figures Figure 1: A. cliché illustrant un sphéroïde mixte kératinocytes- mélanocytes en lumière transmise avec un ratio cellulaire de 1 NHEM pour 4 NHEK. La barre d'échelle représente 10011m. B. Graphique montrant l'évolution du volume des sphéroïdes mixtes sur 10 jours. Figure 2 : Clichés représentant un sphéroïde selon l'invention à J3. A. Marquage cytokératine 5 permettant de mettre en évidence les kératinocytes. B. Marquage NKIbeteb (Pmell 7) peimettant de mettre en évidence les mélanocytes. 15 C. Marquage DAPI des noyaux cellulaires. D. Marquage EdU des noyaux des cellules en prolifération. On observe des cellules proliférantes à la périphérie du sphéroïde mixte. E. Superposition des différents marquages. La barre d'échelle représente 104tm. 20 Figure 3 : Clichés représentant un sphéroïde selon l'invention à J7. A. Marquage cytokératine 5 permettant de mettre en évidence les kératinocytes. On observe un gradient d'expression de la CK5 correspondant à un gradient de différenciation. On peut noter que la morphologie des kératinocytes se modifie en fonction du gradient de différenciation avec un allongement des cellules (flèche). 25 B. Marquage DAPI des noyaux cellulaires. On observe une modification de la morphologie des noyaux avec un allongement (flèche) et finalement une perte des noyaux avec le gradient de différenciation. C. Marquage EdU des noyaux des cellules en prolifération. On observe des cellules proliférantes à la périphérie du sphéroïde mixte. 30 D. Superposition des différents marquages. La barre d'échelle représente 100p.m. Figure 4 : Différenciation kératinocytaire. A. Schéma d'organisation de l'épiderme. B. Coupe de peau en coloration Fontana Masson. C. Détail d'une coupe de sphéroïdes mixtes à J7 avec marquage cytokératine 5 en gris et EdU (noyaux des cellules en prolifération) en blanc. Figure 5 : clichés de sphéroïdes selon l'invention préparés avec divers ratios mélanocyte/kératinocyte (1/20, 1/5 et 1/2). La barre d'échelle représente 104tm. Figures 6A à 6E: clichés représentant les objets obtenus par diverses tentatives de préparation de sphéroïdes telles que décrites dans l'exemple 2. Figure 7 : Visualisation du transfert de mélanine dans les sphéroïdes mixtes. A. Analyse d'une coupe de sphéroïdes mixtes avec marquage cytokératine 5 (gris foncé) et NKIbeteb (Pme117) (gris clair). On observe sur le détail à droite des cellules doublement marquées (flèche). La barre d'échelle représente 100Ftm. B. Analyse d'un sphéroïde entier par imagerie SPIM et reconstitution 3D par le logiciel IMARIS avec marquage CellMask des kératinocytes (gris foncé) et CFDA des mélanocytes (gris clair). On observe sur le détail à droite des cellules doublement marquées (flèche). C. Analyse de sphéroïdes dissociés par cytomètrie en flux avec un marquage cytokératine 5 (FL4) et CFDA des mélanocytes (FL1). On observe une population doublement marquée (population entourée en pointillée). Exemple 1 - préparation de sphéroïdes selon l'invention Méthode Les cellules sont décollées par trypsination et comptées afin de préparer une suspension mixte de mélanocytes et kératinocytes à 60 000 cellules/mL dans du milieu supplémenté avec 10% de Matrigele. Cette suspension est ensuite ensemencée en plaque 96 puits préalablement recouvert de polyHEMA et centrifugée 6 min à 190g à 4°C. La plaque est incubée lh à 37°C, 5%CO2 pour laisser figer le Matrigele et du milieu de culture est ajouté dans chaque puits pour hydrater le Matrige10. Exemple 2 - caractérisation des sphéroïdes selon l'invention Les sphéroïdes ainsi produits ont un diamètre d'environ 250 p.m après 3 jours de culture 30 et leur volume double en 10 jours (Figure 1). A J3, la méthode de marquage par le NucView (marquage de la caspase 3) montre qu'il ne se produit pas d'apoptose dans les sphéroïdes mixtes. Des marquages EdU ont permis d'établir que les cellules de la périphérie du sphéroïde sont en prolifération. Ces cellules sont également marquées à la cytokératine 5 et correspondent donc à des kératinocytes (Figure 2). Il faut noter qu'après plusieurs jours en culture, une masse centrale apparaît dans le sphéroïde et que la morphologie des cellules se modifie (Figure 3) ; cette masse centrale est le résultat de la différenciation des kératinocytes (Figure 4). Des sphéroïdes selon l'invention ont également été préparés à divers ratios cellulaires mélanocytes/kératinocytes (1/20, 1/5 et 1/2) ; tous présentent des caractéristiques satisfaisantes comme illustré à la Figure 5. Les conditions suivantes de préparation de sphéroïdes ont également été testées, elles n'ont toutefois pas permis l'obtention de sphéroïdes : - méthode de centrifugation d'une suspension mixte NHEM-NHEK en milieu NHEK sans Matrigel0 et sans calcium ; par cette méthode, les cellules se rassemblent mais ne forment pas de structures tridimensionnelles (Figure 6A) ; - méthode de centrifugation d'une suspension mixte NHEM-NHEK en milieu NHEK 15 supplémenté avec 1mM de CaCl2 ou en milieu F12+SVF sans Matrigele : par cette méthode, les cellules forment des structures tridimensionnelles mais restent ségrégées par type cellulaire. La structure n'est pas sphérique et pas assez reproductible pour du criblage (Figure 6B) ; - méthode de confrontation d'un sphéroïde simple de NHEK avec une suspension de 20 NHEM en milieu NHEK supplémenté avec 1mM CaC12 ou en milieu F12+SVF sans Matrigel0 ; les sphéroïdes simples de NHEK préalablement formés ont été réalisés par la méthode de centrifugation : par la méthode de confrontation d'un sphéroïde préexistant avec une suspension cellulaire en milieu avec calcium ou en milieu F12+SVF mais sans Matrigele, les cellules forment des structures tridimensionnelles mais restent 25 ségrégées par type cellulaire. La structure n'est pas sphérique et pas assez reproductible pour du criblage (Figure 6C) ; - méthode de confrontation d'un sphéroïde simple de NHEM avec une suspension de NHEK en milieu NHEK supplémenté avec 1mM CaC12 ou en milieu F12+SVF sans Matrigele ; les sphéroïdes simples de NHEM préalablement formés ont été réalisés par 30 la méthode de centrifugation : par la méthode de confrontation d'un sphéroïde pré- existant avec une suspension cellulaire en milieu avec calcium ou en milieu F12+SVF mais sans Matrige10, les cellules forment des structures tridimensionnelles mais restent ségrégées par type cellulaire. La structure n'est pas sphérique et pas assez reproductible pour du criblage (Figure 6D) ; - méthode de confrontation de sphéroïde simple (sphéroïdes de NHEM d'une part et sphéroïdes de NHEK d'autre part) en milieu NHEK supplémenté avec 1mM CaCl2 sans Matrigel®; les deux sphéroïdes simples préalablement formés ont été réalisés par la méthode de centrifugation : par la méthode de confrontation de deux sphéroïdes de chaque type cellulaire en milieu avec calcium mais sans Matrigel®, les cellules forment des structures tridimensionnelles mais restent ségrégées par type cellulaire. La structure n'est pas sphérique et pas assez reproductible pour du criblage (Figure 6E) ; - méthode de la goutte à partir d'une suspension mixte NHEM-NHEK en milieu NHEK sans calcium supplémenté ou non avec du Matrigel® (10 à 50%). Les conditions avec Matrigel® n'ont pas formées de structures 3D: par cette méthode, les cellules forment des structures tridimensionnelles mais la structure n'est pas sphérique et pas assez reproductible pour du criblage ; - méthode de centrifugation d'une suspension mixte NHEM-NHEK en milieu NHEK sans calcium avec un pourcentage de Matrigel® variant de 10 à 50% : par cette méthode, les cellules forment des structures tridimensionnelles mais restent ségrégées par type cellulaire. La structure n'est pas sphérique et pas assez reproductible pour du criblage. Exemple 3 - Protocole de dosage de la mélanine par photométrie Les cellules sont lysées dans une solution de NaOH 1M + 10% DMSO puis incubées 30min à 90°C. Une gamme standard est réalisée avec de la mélanine synthétique et la lecture est faite à une longueur d'onde de 405nm. Le dosage des protéines totales est effectué sur le lysat du dosage de mélanine avec le 25 kit microBCA selon les recommandations du fournisseur. Une gamme standard est réalisée avec de la BSA et la lecture est faite à une longueur d'onde de 605nm. Les résultats sont exprimés sous la forme d'un rapport entre le dosage de mélanine et des protéines totales. Exemple 4 - exemple de protocole de marquage des sphéroïdes mixtes selon 30 l'invention Les sphéroïdes mixtes sont préparés comme expliqué dans l'exemple 1 avec des mélanocytes préalablement marqués au CFDA (carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester). Les sphéroïdes mixtes ainsi formés sont marqués au CellMask. Ils sont ensuite lavés, fixés à la formaline, déshydratés puis transparisés dans un mélange de Benzyl-alcohol et benzyl-benzoate (BaBb). L'analyse est faite par la technique d'imagerie à feuille de lumière. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation de modèle de peau sous forme de sphéroïdes mixtes de kératinocytes et de mélanocytes caractérisé en ce qu'il comprend : (a) la mise en suspension de kératinocytes avec des mélanocytes dans un milieu de 5 culture supplémenté d'une préparation de protéines de la matrice extracellulaire à une concentration comprise entre 1 et 95% en volume/volume et d'une quantité inférieure ou égale à 10 mM d'un sel choisi parmi le calcium, le manganèse ou le magnésium ; (b) la formation des sphéroïdes à partir du mélange obtenu à l'étape (a) ; et (c) l'incubation des sphéroïdes obtenus à l'étape (b). 10 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite suspension de l'étape (a) est préparée avec de 1 mélanocyte pour 1 kératinocyte à 1 mélanocyte pour 40 kératinocytes. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que les kératinocytes et les mélanocytes sont des cellules primaires saines et sont 15 ensemencés en une quantité comprise entre 100 et 5000 cellules par sphéroïde. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications qui précèdent, caractérisé en ce que la préparation de protéines de la matrice extracellulaire est du Matrigel®. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications qui précèdent, 20 caractérisé en ce que le sel est le calcium. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications qui précèdent, caractérisé en ce que l'incubation de l'étape (c) dure entre 1 et 10 jours. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications qui précèdent caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape de marquage. 25 8. Modèle de peau sous forme de sphéroïde mixte de kératinocytes et de mélanocytes comprenant une préparation de protéines de la matrice extracellulaire et un sel choisi parmi le calcium, le magnésium et le manganèse, ledit sphéroïde mixte étant susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à7. 30 9. Modèle de peau sous forme de sphéroïde selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle a un diamètre apparent compris entre 100 et 1000 tm et une forme régulière. 10. Modèle de peau sous forme de sphéroïde selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comporte une masse centrale. 11. Modèle de peau sous forme de sphéroïde selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'au moins un de ses constituants est 5 marqué. 12. Utilisation d'un modèle de peau sous forme de sphéroïde selon l'une quelconque des revendications 8 à 11 pour évaluer l'activité de composés agissant au niveau de l'épiderme. 13. Utilisation d'un modèle de peau sous foune de sphéroïde selon 10 l'une quelconque des revendications 8 à 11 pour tester l'activité de composés sur la production de mélanine et/ou le transfert des mélanosomes. 14. Utilisation d'un modèle de peau sous forme de sphéroïde selon l'une quelconque des revendications 8 à 11 pour tester l'activité de composés sur la différenciation des kératinocytes. 15 15. Procédé de criblage de molécules susceptibles d'agir sur la production de mélanine et/ou sur le transfert de mélanosomes comprenant : (i) la préparation de modèle de peau sous forme de sphéroïdes selon l'une des revendications 8 à 11; (ii) la mise en contact des sphéroïdes préparés à l'étape (i) avec une ou 20 plusieurs molécules à tester ; (iii) la sélection des molécules modulant la production de mélanine et/ou sur le transfert de mélanosomes. 16. Procédé de criblage de molécules susceptibles d'agir sur la différenciation des kératinocytes comprenant : 25 (i) la préparation de sphéroïdes selon l'une des revendications 8 à 11; (ii) la mise en contact des sphéroïdes préparés à l'étape (i) avec une ou plusieurs molécules à tester ; (iii) la sélection des molécules modulant la différenciation des kératinocytes. 30