Brevet FR3033800A1 — publié le 20160923

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la glycosylation par voie enzymatique de synthons hydroxyles afin d'obtenir des monomères glycosylés. La présente invention se rapporte également à de nouvelles voies de synthèse chimio-enzymatiques de glyco(co)polymères fondées sur la polymérisation chimique ou sur une réaction de couplage chimique des monomères glycosylés obtenus par voie enzymatique. ART ANTERIEUR Les glyco(co)polymères suscitent un intérêt croissant ces dernières années de par leur large potentiel dans de nombreux secteurs biotechnologiques et industriels. L'introduction d'unités glucidiques dans des macromolécules synthétiques peut conférer aux polymères de nouvelles propriétés physico-chimiques, par exemple accroître leurs solubilités, modifier leurs caractères hydrophobes, et ouvrir ainsi la voie à de nouvelles applications industrielles. Dans les secteurs biomédicaux, ces glyco(co)polymères suscitent un vif intérêt pour la fabrication de biomatériaux destinés à la réparation de lésions, à l'ingénierie tissulaire (Cho et al., Biomaterials. 2006 Feb;27(4):576-85. Epub 2005 Aug 8), à la vectorisation de principes actifs (Ahmes et Narain, Biomaterials. 2011 Aug;32(22):5279-90), ou encore pour modifier et rendre biocompatible une surface hydrophobe. De même, les glyco(co)polymères sont particulièrement intéressants dans le domaine du diagnostic biologique (Abraham et al., Biomaterials. 2005 Aug;26(23):4767- 78), comme support pour le couplage covalent de biomolécules, ou comme architectures multivalentes favorisant les processus de reconnaissance avec certaines protéines (Spain et al., Polym. Chem., 2011,2, 60-68 ; Vasquez-Dorbatt et al., Chembiochem. 2012 Nov 26;13(17):2478-87). Au vu du large panel d'utilisation de cette classe de macromolécules, le développement de voies de synthèse efficaces permettant d'accéder à des glyco(co)polymères de structures et fonctionnalités contrôlées ainsi qu'à des architectures macromoléculaires complexes et inédites est un enjeu majeur. Ces dernières années, des efforts notables ont été consacrés au développement de voies chimiques de synthèse de plus en plus sophistiquées permettant de mieux contrôler la glycosylation des polymères synthétiques. 3033800 2 En effet, un intérêt croissant est exprimé pour des glycopolymères hybrides, différant des polysaccharides naturels, et formés d'une partie synthétique, de type (méth)acrylate, (méth)acrylamide, styrène, norbornényle, acétate de vinyle, peptide,... et d'une partie glucidique. 5 Différentes méthodes de synthèse de glyco(co)polymères comprenant un squelette synthétique décoré par des groupements glucidiques ont été explorées par le passé (Ladmiral et al., Eur Polym J, 2004, 40, 431-449 ; Spain et al., J. Polym. Sci. Part. A-Polym. Chem, 2007,45, 2059-2072) qui consistent en: 10 - la glycosylation chimique de polymères synthétiques. Toutefois, cette méthode présente l'inconvénient de conduire souvent à de faibles degrés de fonctionnalisation liés à des problèmes d'encombrement stérique. Pour contourner ce problème, les fonctions réactives portées par le polymère doivent être éloignées du squelette du polymère afin d'augmenter la réactivité tout en 15 diminuant l'encombrement stérique généré par le greffage des séquences saccharidiques pendantes. Là encore, cela nécessite la production de synthons réactifs et la polymérisation de monomères non conventionnels (Slavin et al., Eur Polym J, 2011, 47, 435-446). 20 - la polymérisation (anionique, radicalaire ou par ouverture de cycles) de monomères glycosylés, obtenus principalement par voie chimique, après plusieurs étapes et en particulier des étapes de protection/déprotection sélectives des fonctions hydroxyle des sucres. La glycosylation des synthons est aujourd'hui principalement effectuée par voie 25 chimique, requérant donc des procédés multi-étapes fastidieux et difficilement contrôlables. Cette voie d'obtention est la plus répandue. De façon générale, la synthèse des glycomonomères se révèle souvent très pénible, nécessitant des étapes de protection et déprotection coûteuses en temps ainsi que l'emploi de catalyseurs métalliques ou solvants toxiques. De plus, la diversité des structures 30 saccharidiques accessibles par ces voies reste encore limitée. Enfin, dans certains cas, des mélanges de structures indésirables sont obtenus et rendent difficile le contrôle de la réaction de polymérisation et par la suite de la structure et des propriétés des polymères. 3033800 3 Par exemple, la synthèse du 2-(hydroxy)ethyl methacrylate (HEMA) glucosylé, le 2-methacryloyloxyethyl-a-D-glucopyranoside (MEG1c), concerné par la présente invention, n'a jusqu'à présent été réalisée que par voie chimique. En particulier, Kitazawa (Kitazawa et al., Chem Lett, 1990, 19, No. 9, 1733- 5 1736) ont proposé une synthèse basée sur l'utilisation de donneur de glucose comme le méthylglucoside, de l'acide phosphomolybdique comme catalyseur et du 2,4- dinitrochlorobenzène comme inhibiteur. Cependant, la stéréosélectivité de cette méthode est faible. De même, Nakaya (Nakaya et al., Makromol. Chem., Rapid. Commun., 1993, 10 14, 77-83) ont, en 1993, synthétisé un autre glucopolymère en faisant réagir le HEMA avec du bromure de 2,3,4,6-tetra-0-acetyl-a-D-glucopyranose en présence d'oxyde d'argent ou de cyanure de mercure, selon la méthode de Helferich (Helferich et Weis, Chem. Ber., 1956, 89, 314-321). Afin d'améliorer les rendements et d'éviter l'utilisation des sels de mercure, 15 toxiques, une autre voie chimique a été proposée par Ambrosi en 2002 (Ambrosi et al. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2002, 45-52). La glucosylation était alors faite en couplant le donneur de glucose, le bromure de 2,3,4,6-tetra-0-acetyl-a-D-glucopyranose à l'accepteur, le HEMA, dans du dichlorométhane anhydre, en utilisant du trifluorométhanesulfonate d'argent comme catalyseur. La réaction dure toutefois 6 jours et le rendement est de 80 °A. 20 Le polymère est ensuite obtenu par polymérisation radicalaire. Face aux divers problèmes précédemment énoncés, les procédés enzymatiques se positionnent très favorablement en raison de la spécificité et sélectivité d'action des enzymes pour contourner les difficultés de la synthèse chimique et proposer une alternative « éco-compatible », diminuant non seulement l'utilisation de produits nocifs (catalyseurs 25 métalliques, solvants organiques) mais également les coûts et les temps de production des monomères glycosylés. Un grand nombre d'enzymes responsables de la synthèse, la dégradation et la modification des glucides sont aujourd'hui répertoriées dans la nature. De surcroît, cette diversité peut être étendue de façon considérable à l'aide de techniques d'ingénierie 30 enzymatique permettant de concevoir à façon ou d'améliorer les biocatalyseurs. Pourtant, malgré un fort potentiel d'innovation, les voies de production enzymatique de synthons glycosylés n'ont été que peu explorées à ce jour. 3033800 4 Dans les années 90, Kobayashi a décrit l'utilisation d'une P-galactosidase avec comme substrats le 4-nitrophenyl N-acetyl-P-Dglucosaminide et du lactose pour conduire à la p-Nitrophenyl N-acetyl-P-lactosaminide (Kobayashi et al., J Carbohydr Chem, 1994, 13, 753-766). Cette étape enzymatique est suivie d'une réduction de la fonction nitro en fonction 5 amine pour ensuite accrocher une fonction acrylate. Dans les années 2000, des lipases ont été utilisées pour l'estérification de différents sucres avec des (méth)acrylates, avec toutefois des rendements et des sélectivités limitées (Albertin et al., Macromolecules, 2004, 37 (20), pp 7530-7537 ; Miura et al., J Polym Sci Part A-Polym Chem, 2004, 42, 4598-4606; Park et al., J Biomed Mater Res A. 10 2004 Dec 1;71(3):497-507 ; Kulshrestha et al., ACS Symp Ser, 2005, vol. 900, pp. 327-342; Tsukamoto et al., J Chem Technol Biotechnol, 2008, 83, 1486-1492). Très récemment, il a été proposé des voies de production enzymatique de glycosides insaturés de type vinyle à l'aide de glycoside-hydrolases utilisées en synthèse soit en réaction d'hydrolyse inverse par contrôle thermodynamique, soit en réaction de 15 transglycosylation par contrôle cinétique (Kloosterman et al., Green Chem., 2014,16, 203- 210; Kloosterman et al., Green Chem., 2014,16, 1837-1846; Kloosterman et al., Macromol Biosci, 2014, 14(9), 1268-1279; US2012/0028308 ; US2012/0028307 ; Mazzocchetti et al., Macromol Biosci. 2014 Feb;14(2):186-94). Toutefois, l'ensemble de ces procédés présentent un rendement, une vitesse de 20 réaction ainsi qu'une sélectivité insuffisants. La diversité ainsi que la taille des sucres pouvant être obtenus à l'issus de ces procédés sont également limitées. Il existe en conséquence un besoin, dans l'état de la technique, pour un procédé enzymatique permettant la glycosylation de synthons hydroxylés structurellement très 25 variables. Il existe un besoin pour un procédé de glycosylation de synthons hydroxylés qui permette d'économiser du temps et des coûts dans la production de synthons glycosylés, ou monomères. Il existe également un besoin pour un procédé permettant de mieux contrôler les 30 degrés de glycosylation des synthons et les structures ainsi que leur distribution. 3033800 5 Il existe ainsi en outre un besoin pour des enzymes aptes à glycosyler des synthons hydroxylés de différentes natures, permettant ainsi d'aboutir à une grande diversité de synthons glycosylés, ou monomères, polymérisables ou pouvant être couplés par réaction de couplage. 5 Il existe de plus un besoin pour un procédé de synthèse de glyco(co)polymères, permettant avantageusement d'accéder à une plus grande diversité d'architectures macromoléculaires pour différents domaines d'applications (biomatériaux, matériel d'implant, ingénierie tissulaire, diagnostic biologique, délivrance de principes actifs, ...). Il existe un besoin pour un procédé de synthèse de glyco(co)polymères qui 10 permette d'économiser du temps et des coûts dans la production de glyco(co)polymères. Il existe en outre un besoin pour des procédés limitant l'utilisation de produits jugés toxiques. La présente invention permet avantageusement de répondre à l'ensemble de ces 15 besoins. RESUIVIE DE L'INVENTION Ainsi, la présente invention fournit un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins 20 une glycane-saccharase avec au moins un synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel : (A) ledit synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué : (i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) : 25 dans laquelle : R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en Ci-C3 ; R2 représente un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et 3033800 6 X1 représente -(0)-, -(S)- ou -(NR'2(OH))-, de préférence -(0)-, - (NH)-, OU -(NR'2(OH))-, avec R'2 représentant un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement avec m étant un entier compris entre 1 et 10; (ii) des synthons styréniques de formule (II) : HO (II) dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10; (iii) des synthons N-Carboxyanhydride (NCA) de formule (III) : 0 H R7 H (m) dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10; (iv) des synthons lactones/lactames/thiolactones de formule (IV) OH 2 Oc I (IV) dans laquelle : R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un 20 groupement (C2H40)'' avec m étant un entier compris entre 1 et 10; n représente un entier compris entre 1 et 20 ; X2 représente -(0)-, -(N1-1)- ou -(S)- ; et 5 10 15 3033800 7 R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en Ci-C20 (y) des synthons de formule (V) : H S' 7 OH (v) 5 dans laquelle R7 représente un groupement alkylène en C1-C20 ; et (vi) des synthons de formule (VI) : (VI) dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20 10 Selon un mode de réalisation préféré, la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNp WT), 15 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S vardelA4N - S512C); 20 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha- 1,2 BrS) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN-123- GBD-CD2) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 25 (ASDg) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; 30 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR- C-del-bis) ; et 3033800 8 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis). Plus particulièrement, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ 5 ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 pouvant être choisie parmi : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP R226X3), ladite séquence ayant un acide aminé Xi représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y. 10 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé 15 choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; 20 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 25 SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé 30 choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé 3033800 9 choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans 5 le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y. En particulier, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 peut être choisie parmi : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 10 (ASNP R226X3), ladite séquence ayant un acide aminé Xi représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y; 15 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 20 SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V et W et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un 25 acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un 30 acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A; 3033800 10 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, F, G, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W; 5 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans 10 le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M. Selon un mode de réalisation de l'invention, le synthon hydroxylé mis en oeuvre est plus particulièrement choisi dans le groupe constitué du HEMA, du NHAM, du HEAA, du VP, du VBA, du HMNCA, du AHMCL, du MVL, du BME, de l'alcool allylique et du NNHEA. 15 Selon ce mode de réalisation, il est de préférence choisi parmi le HEMA, le NHAM, le HEAA, l'alcool allylique, le NNHEA et le BME, en particulier le HEMA et le NHAM. Selon un mode de réalisation, un synthon hydroxylé selon l'invention mis en oeuvre dans un procédé de glycosylation enzymatique de l'invention est glucosylé ou 20 fructosylé à l'issu de ce procédé, de préférence glucosylé. L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère comprenant la polymérisation d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention. 25 Selon un mode de réalisation, le procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère selon l'invention comprend, dans l'ordre, les étapes suivantes : a) la polymérisation de deux monomères obtenus, indépendamment l'un de l'autre, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention, permettant d'aboutir à une chaîne de 2 monomères ; 30 b) la polymérisation de la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention ; puis 3033800 11 c) une ou plusieurs étapes successives, et indépendantes, consistant polymériser la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention. Le procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère selon ce mode de réalisation 5 peut en outre également comprendre, indépendamment : - au moins une étape a') entre les étapes a) et b) ; - au moins une étape b') entre les étapes b) et c) ; et/ou - au moins une étape c') après l'une quelconque des étapes c), dans lesquelles la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente 10 est polymérisée avec au moins un synthon non-glycosylé. L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère, de préférence à blocs, comprenant le couplage d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon 15 l'invention, de préférence de monomères obtenus à partir des synthons de formule (V) et/ou (VI) selon l'invention. Dans le cadre de la présente invention, et sauf mention différente dans le texte, on entend par : 20 - alkyle : un groupe aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 20, notamment de 1 à 10, de préférence de 1 à 6 atomes de carbone ; et - alkylène : un groupe alkylène divalent, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 20, notamment de 1 à 10, de préférence de 1 à 6, atomes de carbone ; Les motifs glycoside sont connus de l'homme du métier. 25 Dans la mesure où le saccharose est mis en oeuvre dans les procédés de glycosylation selon l'invention, un motif glycoside selon l'invention est choisi parmi un ou plusieurs glucose(s), un ou plusieurs fructose(s) ou un mélange de glucose(s) et de fructose(s). 30 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les inventeurs ont mis au point un procédé enzymatique de glycosylation de synthons hydroxyles mettant en oeuvre des glycane-saccharases spécifiques identifiées par le 3033800 12 demandeur, aptes à effectuer une telle glycosylation, en particulier glucosylation ou fructosylation. Ces enzymes spécifiques ne nécessitent pour cela que la présence de saccharose, une agro-ressource renouvelable et bon marché. A ce titre, un procédé selon l'invention est 5 avantageusement peu couteux. Ces synthons glycosylés, ou monomères, sont avantageusement mis en oeuvre dans un procédé chimique de préparation de glyco(co)polymères de structures et fonctionnalités contrôlées. Ainsi, les inventeurs ont mis au point un procédé de synthèse chimio- 10 enzymatique de glyco(co)polymères fondé sur la polymérisation chimique ou une réaction de couplage des monomères glycosylés obtenus par voie enzymatique. Les procédés selon la présente invention permettent avantageusement de mieux contrôler les degrés de glycosylation des synthons et les structures ainsi que leur distribution. 15 Ils permettent en outre de contourner les difficultés liées à la chimie des sucres et de limiter l'utilisation de produits toxiques. Ils s'avèrent également avantageux en termes de diminution des coûts et temps de production des synthons glycosylés. Enfin, ces procédés permettent avantageusement d'accéder à une plus grande 20 diversité d'architectures macromoléculaires pour différents domaines d'applications, tels que les biomatériaux, le matériel d'implant, l'ingénierie tissulaire, le diagnostic biologique et la délivrance de principes actifs. Glycane-saccharases de l'invention 25 La présente invention concerne en premier lieu un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase de l'invention avec au moins un synthon hydroxylé selon l'invention et au moins un saccharose. Comme indiqué précédemment, les enzymes de l'invention sont 30 avantageusement aptes à glycosyler des synthons au niveau de leur fonction hydroxyle. En particulier, les enzymes selon l'invention sont aptes à glucosyler ou à fructosyler les synthons de l'invention. 3033800 13 Ainsi, certaines de ces enzymes consistent plus particulièrement en des glycoside-hydrolases appartenant aux familles 13 et 70 des glycoside-hydrolases (GH13 et GH70). Les glycoside-hydrolases appartenant à la famille 13 sont des amylosaccharases 5 naturellement produites par les bactéries des genres Deinococcus, Neisseria ou Alteromonas. Les glycoside-hydrolases appartenant à la famille 70 sont quant à elles des glucane-saccharases naturellement produites par des bactéries lactiques des genres Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus ou Weissela sp En outre, la fructosyltransférase de Bacillus subtilis est également mise en oeuvre 10 dans un procédé de glycosylation selon l'invention. Les enzymes de l'invention sont toutes capables de transférer le glucose ou le fructose provenant du saccharose sur les synthons hydroxyles de l'invention. L'ensemble des enzymes sauvages ou mutées décrites dans la présente demande, connues de l'homme du métier, n'avait à ce jour jamais été mises en oeuvre afin de 15 glucosyler des synthons hydroxyles de l'invention. La séquence nucléotidique de la forme sauvage de l'enzyme ASNp (AmyloSaccharase de Neisseria polysaccharea) (famille GH13) a pour référence GenBank AJ011781.1 tandis que sa séquence polypeptidique a pour référence Uniprot Q9ZEU2 (SEQ ID NO : 1). 20 La séquence nucléotidique de la forme sauvage de l'enzyme DSR-S (issue de la souche Leuconostoc mesenteroides B-512F) a pour référence GenBank 109598. La séquence nucléotidique de la forme sauvage de l'enzyme DSR-E (issue de la souche Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299) a pour référence GenBank AJ430204.1 et la référence Uniprot Q8G9Q2. 25 L'enzyme GBD-CD2 (séquence SEQ ID NO: 13) est une forme tronquée de l'enzyme DSR-E susmentionnée, comme décrit dans Brison et al., J. Biol. Chem., 2012, 287, 7915-24. Des références bibliographiques décrivant les enzymes sauvages et mutées selon la présente invention sont indiquées dans le Tableau 1. En outre, la méthode d'obtention des 30 enzymes mutées est décrite dans les demandes de brevet européen EP 2 100 966 et EP 2 100 965. 3033800 14 Les séquences peptides des différentes enzymes sauvages ou mutées selon l'invention sont indiquées dans la présente demande. Ainsi, une enzyme selon l'invention peut être synthétisée par des méthodes classiques de chimie de synthèse, soit des synthèses chimiques homogènes en solution ou en 5 phase solide. A titre illustratif, l'homme de l'art peut utiliser les techniques de synthèse de polypeptide en solution décrite par HOUBEN WEIL (1974, In methode der Organischen Chemie, E. Wunsh ed., volume 154 et 15-II, Thieme, Stuttgart.). Une enzyme selon l'invention peut être également synthétisée chimiquement en phase liquide ou solide par des couplages successifs des différents résidus d'acides aminés (de l'extrémité N-terminale vers 10 l'extrémité C-terminale en phase liquide, ou de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N- terminale en phase solide). L'homme de l'art peut notamment utiliser la technique de synthèse peptidique en phase solide décrite par Merrifield (MERRIFIELD RB, (1965a), Nature, vol.207 (996): 522-523; MERRIFIELD RB, (1965b), Science, vol.150 (693):178- 185 .) 15 Selon un autre aspect, une enzyme selon l'invention peut être synthétisée par recombinaison génétique, par exemple selon un procédé de production comprenant les étapes suivantes : (a) préparer un vecteur d'expression dans lequel a été inséré un acide nucléique codant la séquence peptidique d'une enzyme de l'invention, ledit vecteur comprenant 20 également les séquences régulatrices nécessaires à l'expression dudit acide nucléique dans une cellule hôte choisie ; (b) transfecter une cellule hôte avec le vecteur recombinant obtenu à l'étape (a) ; (c) cultiver la cellule hôte transfectée à l'étape b) dans un milieu de culture approprié; 25 (d) récupérer le surnageant de culture des cellules transfectées ou le lysat cellulaire desdites cellules, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; et (e) séparer ou purifier, à partir dudit milieu de culture, ou à partir du culot de lysat cellulaire, l'enzyme de l'invention ainsi obtenue. Pour purifier une enzyme selon l'invention qui a été produite par des cellules 30 hôtes transfectées ou infectées par un vecteur recombinant codant ladite enzyme, l'homme de l'art peut avantageusement mettre en oeuvre des techniques de purification décrites par 3033800 15 Molinier-Frenkel (2002, J. Viral. 76, 127-135), par Karayan et al. (1994, Virology 782-795) ou par Novelli et al. (1991, Virology 185, 365-376). Ainsi, les glycane-saccharase utilisables dans un procédé de l'invention sont 5 choisies dans un groupe comprenant : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, 10 D394 et R446 ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S vardelA4N - S512C); - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; 15 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN-123- GBD-CD2) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 20 (DSR-S-OK) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASRC-del-bis) ; et 25 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis). Selon un mode de réalisation particulier, la mutation d'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 en position R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 ou R446 est une mutation par substitution. 30 Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position R226, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 2 (ASNP 3033800 16 R226X4), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y. Selon ce mode de réalisation, X1 représente de préférence un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V. 5 Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position 1228, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y. 10 Selon ce mode de réalisation, X2 représente de préférence un acide aminé choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y. Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position F229, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP 15 F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y. Selon ce mode de réalisation, X3 représente de préférence un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y. 20 Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position A289, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y. 25 Selon ce mode de réalisation, X4 représente de préférence un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N P, Q, S, T, V et W, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T. Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position F290, elle est choisie 30 parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y. 3033800 17 Selon ce mode de réalisation, X5 représente de préférence un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W. 5 Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position 1330, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y. 10 Selon ce mode de réalisation, X6 représente de préférence un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A. Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position V331, elle est choisie 15 parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y. Selon ce mode de réalisation, X7 représente de préférence un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus 20 préférentiellement de C, D, E, F, G, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W; Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position D394, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans 25 le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y. Selon ce mode de réalisation, X8 représente de préférence un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E. Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position R446, elle est choisie 30 parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y. 3033800 18 Selon ce mode de réalisation, X9 représente de préférence un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M. Selon un mode de réalisation, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, 5 A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 2 à 10 définies ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulier, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi : 10 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP R226X4), ladite séquence ayant un acide aminé Xi représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y. - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi 15 dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 20 SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un 25 acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, 30 T, V, W et Y ; 3033800 19 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 5 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé 10 choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y. Selon un mode de réalisation particulier, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi : 15 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP R226X3), ladite séquence ayant un acide aminé Xi représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi 20 dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y; 25 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N P, Q, S, T, V et W, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 30 SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et 3033800 20 W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un 5 acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus 10 préférentiellement de C, D, E, G, F, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 15 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M. Comme montré dans les exemples, toutes les enzymes possédant l'une de ces séquences peptidiques présentent une capacité statistiquement supérieure, voire très supérieure, à celle de l'enzyme sauvage à glucosyler les synthons hydroxyles de l'invention. 20 En outre, il peut être avantageux d'utiliser certaines des enzymes sauvages et/ou mutantes selon l'invention selon la nature du synthon hydroxyle mis en oeuvre dans un procédé de l'invention. Ainsi, dans le cas où le synthon hydroxyle mis en oeuvre dans un procédé de 25 l'invention est le HEMA, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des HEMA mono-glucosylés, telles que par exemple une enzyme de séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2). De plus, dans le cas où le synthon hydroxyle mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que 30 des HEMA mono-glucosylés et des HEMA di-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe : 3033800 21 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant W; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant A; 5 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant E; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant A; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 10 (ASDg) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS). 15 Enfin, dans le cas où le synthon hydroxyle mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, certaines enzymes permettent avantageusement d'obtenir un mélange de HEMA mono-glucosylés, di-glucosylés et tri-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP 20 WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, I, K, L, M et V; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP 25 R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant G; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASRC-del-bis) En particulier, les enzymes choisies dans le groupe : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 30 SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant A; et 3033800 22 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASRC-del-bis) ; permettent avantageusement d'obtenir une proportion très proche de HEMA mono-glucosylés et de HEMA tri-glucosylés. 5 De même, dans le cas où le synthon hydroxyle mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NHAM, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des NHAM mono-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 10 (ASDg) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S vardelA4N - S512C); et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK). 15 De plus, dans le cas où le synthon hydroxyle mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NHAM, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des NHAM mono-glucosylés et des NHAM di-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe : 20 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant N; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 25 SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de N, P et Q; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant N; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP 30 V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant T; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant E; 3033800 23 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASRC-del-bis) , - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN-323- GBD-CD2) ; et 5 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha- 1,3 BrS). Enfin, dans le cas où le synthon hydroxyle mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NHAM, certaines enzymes permettent avantageusement d'obtenir un 10 mélange de NHAM mono-glucosylés, di-glucosylés et tri-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant M; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP 15 V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D et E; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS). 20 En outre, dans le cas où le synthon hydroxyle mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NNHEA, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des NNHEA mono-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASRC-del-bis) ; et 25 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha- 1,3 BrS). Il doit être compris de ces formulations que les acides aminés définis comme étant respectivement X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 et X9 sont présents et tels que définis ci- 30 dessus dans les glucane-saccharases de l'invention ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1. 3033800 24 La présente invention englobe également les séquences dont la séquence d'acides aminés a au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en acides aminés avec l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à 18 telles que définies 5 précédemment et une activité biologique de même nature. Par activité biologique de même nature en ce qui concerne les séquences peptidiques 1 à 18, on entend une même capacité à glycosyler les synthons hydroxyles de l'invention. Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques ou 10 d'acides aminés, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à 15 obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique (ou un acide aminé identique) est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques (ou entre les deux acides aminés) par le nombre total de 20 positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides (ou en acides aminés) des deux séquences entre elles. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus. 25 De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » ; (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH = 30 « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ; (15) GAP 3033800 25 EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ». Plus particulièrement, la présente invention concerne également les séquences dont la séquence d'acides aminés a 100 % d'identité en acides aminés avec les acides 5 aminés 225 à 450 des séquences SEQ ID NO: 2 à 10 et au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en acides aminés avec le reste des séquences SEQ ID NO : 2 à 10 telles que définies précédemment, et une activité biologique de même nature. Les enzymes selon l'invention permettent d'aboutir à des synthons glycosylés, 10 ou monomères, pouvant être mono- ou poly-glycosylés. Ainsi, comme illustré dans les exemples de la présente demande, les spécificités des différentes enzymes de l'invention permettent avantageusement d'aboutir à façon à des monomères de structure donnée. A titre d'exemple, et comme illustré dans les exemples, et en particulier dans le 15 Tableau 3, lorsque le HEMA est glucosylé à l'aide de l'enzyme GBD-CD2, la totalité des monomères obtenus sont mono-glucosylés. Au contraire, la mise en oeuvre de l'enzyme ASR en présence de HEMA permet d'aboutir à une répartition homogène de HEMA mono-, di- et tri-glucosylés. 20 Synthons hydroxylés et mises en oeuvre a) Synthons hydroxylés mis en oeuvre dans un procédé enzymatique de glycosylation de l'invention Les synthons hydroxyles spécifiquement mis en oeuvre dans un procédé enzymatique de fabrication de monomères de l'invention sont choisis parmi les composés de 25 formules (I) à (VI). Ainsi, selon un premier aspect, les synthons hydroxyles de l'invention peuvent être des composés de formule (I) : (i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) : 3033800 26 dans laquelle : R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en Ci-C3 ; R2 représente un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)0, 5 avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et Xi représente -(0)-, -(S)- ou -(NR'2(OH))-, de préférence -(0)-, - (N1-1)-, ou -(NR'2(OH))-, avec R'2 représentant un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement -(C2H40)-, avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ; Selon un mode de réalisation, Ri représente un atome d'hydrogène. 10 Selon un autre mode de réalisation, Ri représente un alkyle en C1-C3, de préférence un méthyle. Selon un mode de réalisation, R2 représente un groupement alkylène en C1-C20, en particulier en C1-C10, notamment de Ci à C5. Plus particulièrement, R2 peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un 15 pentylène, et représente de préférence un méthylène ou un éthylène. Selon un mode de réalisation, Xi représente -(0)-, -(N1-1)- ou -(NR'2(OH))-, de préférence -(0)- ou -(N1-1)-. Selon un mode de réalisation, R'2 représente un groupement alkylène en C1-C20, en particulier en C1-C10, notamment de Ci à C5. Plus particulièrement, R'2 peut être choisi 20 dans le groupe constitué d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un pentylène, et représente de préférence un méthylène ou un éthylène. Selon un mode de réalisation particulier, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que : Ri représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3, de préférence un 25 hydrogène ou un méthyle ; R2 représente un groupement alkyle en C1-C20, de préférence un alkylène en C1-C10, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène ; et Xi représente -(0)-, -(N1-1)- ou -(NR'2(OH))-, de préférence -(0)- ou -(N1-1)-. 3033800 27 Selon un mode de réalisation préféré, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que : Xi représente -(0)- ; Ri représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en Ci-C3, de préférence un 5 alkyle en Ci-C3, en particulier un méthyle ; et R2 représente un groupement alkyle en Ci-C20, de préférence un alkylène en C1- Cio, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène, préférentiellement un éthylène. Un tel synthon de formule (I) peut en particulier être un 2-(hydroxy)ethyl 10 methacrylate (HEMA) : )-r()--OH 0 Selon un autre mode de réalisation préféré, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que : Xi représente -(NET)- ; 15 Ri représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en Ci-C3, de préférence un hydrogène ou un méthyl ; et R2 représente un groupement alkyle en Ci-C20, de préférence un alkylène en CiCio, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène. Un tel synthon de formule (I) peut en particulier être un N-(hydroxy)methyl 20 acrylamide (NHAM) ou un N-(hydroxy)ethyl acrylamide (HEAA) : 0 o H (NHAM) (HEAA) Selon un autre mode de réalisation préféré, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que : X1 représente -(NR'2(OH))-, dans lequel R'2 représente un groupement alkylène 25 en en particulier en C1-C10, notamment de Ci à C5, plus particulièrement un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène ou un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus préférentiellement un éthylène ; R1 représente un atome d'hydrogène ; et 3033800 28 R2 représente un groupement alkyle en C1-C20, de préférence un alkylène en Ci- Ci0, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène, notamment un éthylène. Un tel synthon de formule (I) peut en particulier être un N,N-bis(2- 5 hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA) : HO HO 10 Selon un mode de réalisation particulier, un synthon de l'invention de formule (I) est choisi parmi le 2-(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), le N(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), le N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA) et le N,Nbis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA), de préférence parmi le HEMA, LE NHAM et le HEAA. 15 Selon un autre aspect, les synthons hydroxyles de l'invention peuvent être des composés de formule (II) : HO (II) dans laquelle R3 représente une liaison covalente; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)0, avec n étant un entier compris entre 1 et 10 20 De préférence, R3 représente une liaison covalente ou un groupement alkylène en C1-C20. Un tel groupement alkylène peut en particulier être en Ci-C10, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R3 peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un pentylène, et est de préférence un méthylène ou un 25 éthylène. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, R3 représente une liaison covalente, un méthylène ou un éthylène. 3033800 29 Un synthon de formule (II) peut en particulier être un 4-vinylphenol (VP) ou un 4-vinyl benzylalcool (VBA) : (VP) (VBA) 5 Selon un autre aspect, les synthons hydroxyles de l'invention peuvent être des composés de formule (III) : RI3F1 (III) dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10. 10 De préférence, R4 représente un groupement alkylène en Ci-C20, en particulier en C1-C10, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R4 peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un pentylène, et est de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un méthylène. Un synthon de formule (III) peut en particulier être un 4-(hydroxy)methyl 15 oxazolidine-2,5-dione (HMNCA) : H Selon un autre aspect, les synthons hydroxyles de l'invention peuvent être des composés de formule (IV) : (IV) 20 3033800 30 dans laquelle : R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement (C2H40)'' avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ; n représente un entier compris entre 1 et 20 ; 5 X2 représente -(0)-, ou -(S)- ; et R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C20. Selon un mode de réalisation préféré, X2 représente -(0)-. Selon un mode de réalisation, n est compris entre 1 et 10, notamment entre 1 et 5. n est en particulier choisi parmi 1, 2, 3, 4 et 5, et représente de préférence la valeur 1 ou 2. 10 De préférence, R5 représente une liaison covalente ou un groupement alkylène en C1-C10, notamment en C1-05. Plus particulièrement, le groupement alkylène peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, d'un éthylène, d'un propylène, d'un butylène et d'un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un méthylène. 15 Ainsi, de façon particulièrement préférée, R5 représente une liaison covalente ou un méthylène. Selon un mode de réalisation, R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en Ci-Cio, notamment en Ci-Cs. Plus particulièrement, le groupement alkyle peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthyle, d'un éthyle, d'un propyle, d'un butyle et d'un 20 pentyle, de préférence un méthyle ou un éthyle, plus particulièrement un méthyle. Ainsi, de façon particulièrement préférée, R6 représente un hydrogène ou un méthyle. Selon un mode de réalisation particulier, un composé de formule (IV) est tel 25 que : R5 représente un groupement alkylène en Ci-Cio, notamment en C1-05, et est en particulier un méthylène ; n représente un entier compris entre 1 et 5 ; et représente de préférence la valeur 1 ou 2, en particulier la valeur 2; 30 X2 représente -(0)- ; et R6 représente un hydrogène. 3033800 31 Un tel synthon de formule (IV) peut en particulier être un a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL) : HO Selon un autre mode de réalisation particulier, un composé de formule (IV) est 5 tel que : R5 représente une liaison covalente ; n représente un entier compris entre 1 et 5 ; et représente de préférence la valeur 1 ou 2, en particulier la valeur 1 ; X2 représente -(0)- ; et 10 R6 représente un groupement alkyle en C1-C10, notamment en C1-05 et est en particulier un méthyle. Un tel synthon de formule (IV) peut en particulier être un (±)- mevalonolactone (MVL) : HO CH3 15 Selon un mode de réalisation particulier, un synthon de l'invention de formule (IV) est choisi parmi l'a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL) et le (±)- mevalonolactone (MVL). Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des 20 composés de formule (V) : HSOH (v) dans laquelle R7 représente un groupement alkylène en C1-C20. De préférence, R7 représente un groupement alkylène en Ci-Cio, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R7 peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, 3033800 32 d'un éthylène, d'un propylène, d'un butylène et d'un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un éthylène. Un tel synthon de formule (V) peut en particulier être un 2-mercaptoéthanol (BME) : HS OH 5 Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (VI) : RSOH (VI) dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20. 10 De préférence, R8 représente un groupement alkylène en Ci-Cio, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R8 peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, d'un éthylène, d'un propylène, d'un butylène et d'un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un méthylène. Un tel synthon de formule (VI) peut en particulier être un 15 2-propène-1-ol (alcool allylique) : Selon un mode de réalisation, un synthon de l'invention peut être choisi dans le groupe constitué du 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinylphenol (VP), du 20 4-vinyl benzylalcool (VBA), du 4-(hydroxy)methyl oxazolidine-2,5-dione (HMNCA), du cc(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL), du (±)- mevalonolactone (MVL), du 2-mercaptoéthanol (BME), du 2 propène-l-ol (alcool allylique) et du N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA). Un synthon selon l'invention est en particulier choisi dans le groupe constitué du 25 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinyl benzylalcool (VBA), du 2 propène-l-ol (alcool allylique) et du 2-mercaptoéthanol (BME). 3033800 33 b) Synthons glycosylés ou monomères La glycosylation enzymatique des synthons hydroxylés, et en particulier monohydroxylés, de l'invention se fait en présence de saccharose. Dans la présente demande, les termes « synthons glycosylés » et « monomères 5 sont utilisés de manière interchangeable pour désigner les synthons glycosylés obtenus à l'issu du procédé enzymatique selon l'invention de glycosylation des synthons hydroxylés. Ainsi, les synthons de l'invention sont plus particulièrement glucosylés ou fructosylés durant le procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention. Le procédé selon l'invention de fabrication d'un synthon glycosylé, ou 10 monomère, de l'invention peut notamment être mis en oeuvre dans les conditions énoncées à l'exemple 1, point 1.3 ci-après. Les monomères de l'invention peuvent être mono- ou pluri-glycosylés, comme illustré dans les exemples de la présente demande. 15 Modes de réalisation préférés Dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, la glycane-saccharase mise en oeuvre peut avantageusement être choisie dans le groupe comprenant : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP 20 WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP R226,(1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, N, P, S et T, de préférence C ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 25 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de P, T et V, de préférence T ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant W; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 30 SEQ ID NO: 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant H, I, K, L, M et W, de préférence H et L; 3033800 34 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, I, K, L, M, N, P, Q, R, V et W, de préférence A, C, I, K, L, M, P et V, en particulier A, C, I, K, L, M et V, et notamment A, C, 5 I, L, V et A ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant A, C, E, F, G, H, K, L, M et N, de préférence A; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP 10 V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, en particulier C, D, E, G, H, et notamment E; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant A, C, E, G, H, I, L, M et N, 15 en particulier A ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M et N, de préférence C, G, K, L et N, notamment N; 20 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha- 1,2 BrS) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN-123- GBD-CD2) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 25 (ASDg) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASRC-del-bis) ; et 30 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis). 3033800 En outre, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre est le NHAM, la glycane-saccharase mise en oeuvre dans un procédé de l'invention peut être choisie dans le groupe comprenant : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP 5 WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP R226X3), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 10 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, E, L, M, N, P, Q, R, T, V et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, N, P, Q, V, W et Y, de préférence M; 15 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T et V, de préférence N, P, Q, S, et V, notamment N, P et Q ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 20 SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, G, L, M, N, P, Q, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, M, N et V, de préférence N; 25 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T et Y, de préférence C, D, E, N, et T, notamment E; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP 30 D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, E, G et N, de préférence E ; 3033800 36 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S 5 vardelA4N - S512C); - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN-123- GBD-CD2) ; 10 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha- 15 1,3 BrS) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASRC-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis). 20 Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du 2-mercaptoéthanol (BME) à titre de synthon hydroxyle et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le 25 groupe comprenant : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP WT) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi 30 dans le groupe constitué de A, E, F, H, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence L, V, W et Y; 3033800 37 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, P, Q, R, V, W et Y, de préférence C, M, P, Q, V, W et Y, en particulier C, M, P, V et Y, notamment Y; 5 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V et W, de préférence C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V et W, et notamment F, M, N, P, Q, S et T; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 10 SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, D, E, G, I, M, P, Q, S, T, V et W, en particulier D, Q, S, T et W, et notamment S, T et W; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 15 SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, N, Q, S, T, V et W, de préférence Q et V; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, de 20 préférence A, C, D, E, F, G, H, I, N, Q, R, S, T, W et Y, en particulier C, D, E, F, N, R, S, T, W et Y, et notamment E, T, et W; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, E et S, de préférence E ; 25 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, Q, S et T, de préférence S ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 12 (alpha-1,2 BrS) ; 30 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 13 (AN123-GBD-CD2) ; 3033800 (ASDg) ; et 38 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS). 5 Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du propèn- 1 -ol (alcool allylique) à titre de synthon hydroxyle et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le 10 groupe comprenant : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé Xi représentant un acide aminé 15 choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de D, E, F, G, H, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence H; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 20 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence D, E, G, H, I, K et M, en particulier D, E, G, I, K et M; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un 25 acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, M W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, 30 W et Y, de préférence C, D, E, G, H, I, K, L, M et W, en particulier C et H; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un 3033800 39 acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, K, L, M, S et Y, en particulier C; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé 5 choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, N et W; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de 10 préférence E, F, G, H, I, K et L, en particulier E; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, Q, S, T, V, W et Y, de préférence M; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 12 15 (alpha-1,2 BrS) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 13 (AN123-GBD-CD2) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ; 20 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis). 25 Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du VBA à titre de synthon hydroxyle et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP 30 WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP R226,(1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé choisi dans 3033800 le groupe constitué de H, K, M, N, Q, S, T, V et Y, en particulier H, K, M, N, Q, S, T et V, de préférence H, K, M, N, Q, T et V; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le 5 groupe constitué de V; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de M, N, P, Q, S, T et V, de préférence M, N, P, Q, S et T, et notamment P, Q et S; 10 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de V et W; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans 15 le groupe constitué de C, D, G, S, T et Y, de préférence C, G, S, T et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant l'acide aminé A; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 12 (alpha-1,2 BrS) ; et 20 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR- C-del-bis) Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une 25 glycane-saccharase avec au moins du NNHEA à titre de synthon hydroxyle et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 30 (ASNP R226,(1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, D, E, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y; 3033800 41 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, H, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y, de préférence V; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 5 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, I, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence M; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, 10 V et W, de préférence C, G, M, N, Q, S, T et V, en particulier Q; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, G, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier C, L, V et W; 15 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, K, M, Q, T, V et Y, de préférence V; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé 20 choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, W et Y, de préférence D, E, G, H, N, S, T et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de E, G, R et S ; 25 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et 30 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR- C-del-bis). 3033800 42 c) Mise en oeuvre des monomères de l'invention Les monomères de l'invention sont polymérisables et/ou peuvent être couplés par réaction de couplage, et peuvent être mis en oeuvre dans un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère selon l'invention, comprenant la polymérisation et/ou une réaction de 5 couplage d'au moins deux de ces monomères. Un procédé chimio-enzymatique selon l'invention est avantageux au regard de nombreux aspects, tel notamment le temps de réaction très court permettant, en l'espace de quelques heures, notamment en l'espace de 24 heures, de passer des synthons hydroxyles au glyco(co)polymères d'intérêt. 10 En outre, la détermination par les inventeurs (i) de synthons de structures variables aptes à être glycosylé dans un procédé selon l'invention et (ii) d'enzymes de spécificités différentes, permet la production « à façon » de glyco(co)polymères d'une grande variabilité. La polymérisation et la réaction de couplage selon l'invention permettent en 15 outre d'accéder à des architectures moléculaires originales, telles que des (co)polymères en peigne ou à bloc, qui pourront être évalués pour le développement de nouveaux matériaux de balance hydrophile/hydrophobe modulable. Un tel procédé peut notamment être mis en oeuvre dans les conditions énoncées à l'exemple 6 ci-après. 20 Selon un mode de réalisation, un procédé de fabrication par polymérisation d'un glyco(co)polymère selon l'invention comprend dans l'ordre, les étapes suivantes : a) la polymérisation de deux monomères de l'invention, permettant d'aboutir à une chaîne de 2 monomères ; b) la polymérisation de la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape 25 précédente avec un monomère de l'invention ; puis c) une ou plusieurs étapes successives, et indépendantes, consistant polymériser la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère de l'invention. Selon un mode de réalisation, un tel procédé de polymérisation peut en outre 30 comprendre, indépendamment : - au moins une étape a') entre les étapes a) et b) ; - au moins une étape b') entre les étapes b) et c) ; et/ou 3033800 43 au moins une étape c') après l'une quelconque des étapes c), dans lesquelles la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente est polymérisée avec au moins un synthon non-glycosylé. 5 EXEMPLES Exemple 1 : Production et mise en oeuvre de glucane-saccharases pour la glucosvlation du 2-(hydroxv)ethyl methacrylate (HEMA) et du N-(hydroxv)methyl acrylamide (NHAM) 10 Une librairie comprenant 8 enzymes sauvages (appartenant aux familles GH70 et 13 des glycoside-hydrolases) et 171 mutants simples (positions 226, 228, 229, 289, 290, 330, 331, 394 et 446) construits à partir de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp) (famille GH13) ont été testés pour leur aptitude à glucosyler l'HEMA et le NHAM. 15 Les glucane-saccharases sélectionnées pour l'étude, ainsi que leur origine, sont indiquées dans le Tableau 1. Le Tableau 1 illustre en effet un certain nombre des glucane-saccharases testées dans les exemples du présent texte et précise : colonne 1 : l'organisme dont l'enzyme est 20 originaire ; colonne 2 : les différentes enzymes sauvages testées ainsi que les positions mutées du site actif de ces enzymes sauvages dans les glucane-saccharases mutées également testées ; colonne 3 : les références bibliographiques dans lesquelles ces enzymes, aussi bien sous formes sauvages que mutées, ont été décrites dans l'état de la technique. Ces enzymes ont été utilisées sous forme recombinante et sont exprimées chez 25 Escherichia cou. 1.1. Production des enzymes en microplaques L'ensemble des souches d'Escherichia cou, surexprimant les glucane- saccharases hétérologues des familles GH13 et GH70, sauvages ou leurs mutants 30 (Tableau 1), sont stockées au format microplaque 96 puits afin de faciliter les futures étapes de criblage de glucosylation des synthons hydroxyles. 3033800 44 A partir des microplaques sources, une pré-culture de ces souches d'E. cou i est menée pendant 22 h à 30°C, 700 rpm dans des microplaques 96 puits, dans 200 [iL de milieu de culture Luria-Bertani supplémenté avec 100 [tg/mL d'ampicilline. Ces précultures sont utilisées à leur tour pour ensemencer les microplaques 5 « deep-wel » dont chaque puits contient 1 mL par puits de milieu auto-inductible ZYM5052 contenant 35 notamment 0,2 % (p/v) d' ci-lactose, 0,05 % (p/v) de D-glucose, 0,5 % (p/v) de glycérol et 0,05 % (p/v) de L-arabinose (Studier et al., Protein Expr Purif. 2005 May;41(1): 207-34.). Après 22 h de culture à 30°C et à 700 rpm, la suspension cellulaire est 10 centrifugée pendant 20 min à 3 000 g à 4°C. Les culots cellulaires sont re-suspendus dans les microplaques deep-well 96 puits, avec 300 [iL de tampon phosphate salin (24 mM phosphate de sodium/potassium et 274 mM NaC1) contenant 0,5 g/L de lysozyme et 5 mg/L de RNAse pancréatique bovine. S'en suit une incubation de 30 min à 30°C sous agitation, ces microplaques sont 15 ensuite stockées une nuit à -80°C. Après décongélation, les microplaques sont vigoureusement agitées puis centrifugées pendant 20 min à 3 000 g à 4°C. Les surnageants centrifugés contenant les enzymes recombinantes sont transférés dans des microplaques 96 puits deep-well propres pour réaliser la mise en oeuvre des réactions d'accepteur. 20 1.2. Test d'activité enzymatique sur saccharose Avant de réaliser les réactions de criblage enzymatique de glucosylation, 50 [iL des surnageants sont utilisés pour réaliser un test d'activité enzymatique sur saccharose. L'activité enzymatique est évaluée au format microplaque en point final après 25 30 minutes d'incubation de 146 mM final de saccharose par dosage des sucres réducteurs par l'acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS). Après dilution au demi dans de l'eau, l'absorbance est lue à 540 nm. 1.3. Conditions de mise en oeuvre des tests d'activité enzymatique sur les 30 accepteurs Pour le criblage de la banque de mutants de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, les réactions d'accepteur sont réalisées en microplaques deep-well dans un 3033800 volume de 300 pL, en présence de 73 mM de saccharose, de 73 mM d'accepteur (HEMA, NHAM, ou autre ...) en concentrations finales et de 150 pL de lysat cellulaire centrifugé. Les microplaques sont incubées à 30°C et à 700 rpm. Après 24h de réaction, les enzymes sont dénaturées à 95°C pendant 10 minutes. 5 Ces microplaques sont stockées à -20°C en vue d'une analyse rapide de la glucosylation par HPLC/MS. Pour le criblage des enzymes sauvages, les réactions d'accepteur sont réalisées en tube dans un volume de 1 mL, en présence de 146 mM de saccharose, de 438 mM d'accepteur (HEMA ou NHAM) en concentrations finales de 1U/mL d'activité 10 enzymatique. Les tubes sont incubés à 30°C et agité à 500 rpm. Après 24h de réaction, les enzymes sont dénaturées à 95°C pendant 10 minutes, les milieux réactionnels sont centrifugés, filtrés, dilués et analysées par LC/MS. 15 1.4. Méthodes analytiques LC et LC/MS des produits de réaction d'accepteurs L'analyse des réactions d'accepteurs est réalisée en deux temps. Une première analyse HPLC courte sur colonne hypercarb (6 minutes) est réalisée pour identifier la présence ou non de produits de glucosylation. La deuxième analyse HPLC sur colonne Hypercarb ou Amino (30 minutes) 20 permet une séparation et une identification de tous les constituants du mélange réactionnel. Dans le cas d'une analyse LC-MS, le système HPLC Dionex est couplé à un spectromètre de masse, simple quadrupole MSQP1us, ThermoScientific. Les conditions utilisées sont résumées dans le Tableau 2. La quantité des produits de glycosylation (en g/L) a été estimée sur la base du 25 coefficient de réponse de l'accepteur en détection UV. Exemple 2 : Détermination des efficacités de glucosylation du HEMA et du NHAM par les enzymes de l'Exemple 1 30 Les réactions en présence d'accepteur ont été mises en oeuvre en appliquant les conditions décrites dans l'exemple 1. 3033800 46 Dans un premier temps, ces réactions d'accepteurs ont été mises en oeuvre avec un panel de 7 Glycane-saccharases sauvages de spécificités distinctes, ces enzymes étant indiquées dans le Tableau 1, à savoir : ASDg, ASR, GBD-CD2, DSR-S-MN, DSR-OK, cc-1,2-BrS et cc-1,3-BrS. 5 Après 24h de réaction, le milieu réactionnel est analysé par HPLC-MS sur colonne Hypercarb (30 min) pour identifier les produits de glucosylation. Les Tableaux 3 et 4 présentent le taux de conversion du saccharose et les trois principaux produits de glucosylation obtenus en présence, respectivement, du HEMA et du 10 NHAM en g/L, caractérisés par MS et correspondant respectivement à l'accepteur monoglucosylé (Accepteur-G1c1), di-glucosylé (Accepteur-G1c2) et tri-glucosylé (AccepteurG1c3). Des produits en plus faibles quantités sont également détectés, correspondant à des formes tetra-, penta-, hexa- et heptaglucosylées. Etant donnée la présence d'un seul groupe hydroxyle réactif sur la molécule, un 15 seul type de mono-glycosylation de la molécule est attendu, et donc le même produit mono- glucosylé quelle que soit l'enzyme. En revanche, la structure des produits di- et tri-glucosylés peut différer en fonction de la spécificité de l'enzyme et la structure des produits ne pourra être déterminée sans ambiguïté que par analyse RMN. 20 Résultats de glucosylation A l'exception de DSR-S-MN et DSR-OK, qui ne reconnaissent pas le HEMA, toutes les glycane-saccharases sauvages testées glucosylent les accepteurs HEMA et NHAM avec des efficacités variables et des tailles de produits de glucosylation variables. 25 Résultats de glucosylation du HEMA Les réactions réalisées en présence des enzymes ASR et ASDg ont conduit à des taux de conversion du saccharose particulièrement élevés (95 %) accompagnés de production de produits d'accepteurs glucosylés variant de 2,7 à 20,9 g/L. 3033800 47 Parmi ces enzymes, l'ASR synthétise un taux significativement plus élevé de HEMA glucosylé (20,9 g/L). Avec l'ASR, les produits formés se répartissent dans des proportions équivalentes entre les formes mono-, di- et tri-glucosylées du HEMA. Il est en outre observé que l'utilisation de l'enzyme GBD-CD2 ne conduit qu'à 5 des HEMA mono-glucosylés. Ainsi, l'utilisation de cette enzyme permet avantageusement de n'obtenir que des HEMA mono-glucosylés. En ce sens, on observe que l'utilisation des enzymes cc-1,2-BrS et cc-1,3-BrS, démontrent un taux de conversion du saccharose également très élevé (respectivement 93 % et 84 °A) conduit majoritairement à la production de HEMA mono-glucosylés. 10 Résultats de glucosylation du NHAM Toutes les glycane-saccharases s'avèrent capables de reconnaitre le NHAM et de le glucosyler, mais dans des proportions 2,5 à 5 fois inférieures aux taux observés pour le HEMA. 15 Les enzymes GBD-CD2, cc-1,2-BrS et cc-1,3-BrS sont les plus productrices de NHAM glucosylé avec des taux de l'ordre de 2 g/L. La forme mono-glucosylée du NHAM demeure le produit observé en plus large quantité. 20 Exemple 3 : Détermination des efficacités de glucosylation du HEMA et du NHAM par l'amylosaccharase de N polysaccharea (ASNp) et par ses mutants Le HEMA et le NHAM ont ensuite été testés en réaction d'accepteur à l'aide de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNP) et de sa banque de mono-mutants 25 identifiés dans le Tableau 1. Les réactions de glucosylation mises en oeuvre en présence d'accepteur ont été analysées dans un premier temps en utilisant une méthode HPLC courte (6 min) dans l'objectif d'identifier rapidement les enzymes efficaces en glucosylation de l'accepteur. 3033800 48 Les résultats obtenus pour le HEMA et le NHAM sont résumés respectivement dans les Tableaux 5 et 6. Les valeurs données dans les tableaux représentent les productions en g/L calculées à partir des aires relatives issues de la détection par DEDL des produits de 5 glucosylation du HEMA et du NHAM par rapport à l'enzyme sauvage (dont l'aire relative est de 1). Résultats de glucosylation du HEMA L'enzyme sauvage ASNp ainsi que 69 enzymes mono-mutées se sont avérés 10 aptes à glucosyler le HEMA, comme représenté dans le Tableau 5. Plus particulièrement, 25 mutants sont apparus glucosyler le HEMA plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir R226C, I228T, F229W, A289H, A289L, F290A, F290C, F290I, F290K, F290L, F290M, F290P, F290V, 1330A, V331C, V331D, V331E, V331G, V331H, D394A, R446C, R446G, R446K, R446L et R446N, et 15 notamment les mutants F290A, F290C, F290I, F290K, F290L, F290M, F290V, 1330A, V331E, D394A et R446N, en particulier F290A, F290C, F290I, F290L, F290V et 1330A. Parmi ces mutants, ceux ciblant la position 290 se sont avérés être les plus performants en termes de glucosylation du HEMA. 20 Résultats de glucosylation du NHAM L'enzyme sauvage ASNp ainsi que 103 enzymes mono-mutées se sont avérées aptes à glucosyler le NHAM, comme représenté dans le Tableau 6. Plus particulièrement, 13 mutants sont apparus glucosyler le NHAM au moins aussi efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir F229M, A289N, A289P, 25 A289Q, A289S, A289V, 1330N, V331C, V331D, V331E, V331N, V331T et D394E. En particulier, 11 d'entre eux sont apparus glucosyler le NHAM plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir F229M, A289N, A289P, A289Q, 1330N, V331C, V331D, V331E, V331N, V331T et D394E, et notamment les mutants F229M, V331E et D394E. 3033800 49 Exemple 4: Etude des produits de glucosylation du HEMA et du NHAM obtenus à l'Exemple 3 A la suite du criblage, un certain nombre de mutants testés à l'Exemple 3 ont été analysés plus finement par LC-MS (détection UV210 pour le HEMA, détection UV215 pour le 5 NHAM), selon le protocole indiqué à l'exemple 1 afin d'analyser les produits de glucosylation obtenus. Ainsi, le HEMA a été glucosylé par les enzymes décrites dans le Tableau 7, résultant du criblage présenté à l'exemple 3. Le NHAM a quant à lui été glucosylé par les enzymes décrites dans le 10 Tableau 8, résultant du criblage présenté à l'exemple 3. Exemple 5 : Production à l'échelle du gramme de produits de glucosylation du HEMA et du NHA1VI à l'aide des enzymes sélectionnées 15 1. Production à l'échelle du gramme A partir des glycane-saccharases les plus efficaces identifiées, l'ASR et l'a-1,3-BrS, ainsi que les mono-mutants F290C et D394E de l'ASNp, des lots de HEMAglucosylé et de NHAM-glucosylé ont été produits à l'échelle du gramme afin de réaliser les tests de polymérisation. 20 Les réactions sont réalisées dans un volume final de 500 mL, en présence de 143 mM de saccharose, de 438 mM d'accepteurs et d' 1 U/mL d'enzyme. Après consommation totale du saccharose, l'enzyme est désactivée à 95°C et le milieu réactionnel est concentré par lyophilisation pour une étape de purification ultérieure. Les niveaux de production estimés sont donnés en Tableau 9. 25 2. Purification des produits de glucosylation La purification a pour objectif d'éliminer les sucres résiduels. La purification est réalisée par flash chromatographie, sur une colonne C18 Reveleris de 80g à 120g (Alltech, Epernon, France). La purification est réalisée en utilisant 30 un gradient eau/acétonitrile. 3033800 Exemple 6 : Mise en oeuvre des réactions de polymérisation à partir des HEMA et NHAM glucosylés Des mélanges de monomères glycosylés ont été polymérisés. Typiquement, la polymérisation radicalaire d'un mélange molaire HEMA-G1c/HEMA-(G1c)2/HEMA-(G1c)3 5 61/18/21 a été réalisée. Les techniques de polymérisation radicalaire contrôlée de type ATRP (Atom Transfer Radical Polymerization) et RAFT (Reversible Addition Fragmentation Transfer) ont été privilégiées. Une polymérisation typique par ATRP se déroule comme suit. 10 L'acide 4-(bromométhyl) benzoïque (amorceur de la polymérisation, 10,7 mg, 50 [tmol., 1 éq.) est versée dans 10 mL d'eau (milliQ) et une solution de NaOH aqueuse (0,5 mL, 0,1 M) est ajoutée. L'ensemble est agité jusqu'à dissolution complète. La solution est ensuite dégazée par bullage d'argon et la bipyridine (ligand, 15,7 mg, 100 !mol., 2 éq.) et Cuffir (catalyseur, 7,1 mg, 50 !mol., 1 éq.) sont ajoutés dans 15 cet ordre. 20 mL d'une solution dégazée du mélange de monomères glucosylés-HEMA sont ajoutés (0.78 g, 2.0 mmol., 40 éq.). La polymérisation se déroule alors pendant 8h à température ambiante. La réaction est arrêtée par oxydation à l'air du Cul en CuII (la solution passe de marron à bleu). La solution est ensuite passée sur une colonne de silice pour se débarrasser 20 du CuII. Le milieu réactionnel est alors lyophilisé pour récupérer le polymère sous la forme d'une poudre blanche. Le rendement de polymérisation est généralement supérieur à 90 °A. 25 Exemple 7 : Mise en oeuvre de la méthode de glucosylation sur le 2-propènol (alcool allylique) et sur le 2-mercaptoéthanol (BME) Glucosylation de l'alcool allylique et du BME Le procédé décrit dans les exemples précédents a été utilisé afin de glucosyler d'autres synthons hydroxyles convenant à l'invention en vue de réaliser des réactions de 30 couplage. 3033800 51 Ainsi, le 2-propènol (alcool allylique) et le 2-mercaptoéthanol (BME), ont été testés en suivant le même protocole décrit ci-avant à l'aide des glycane-saccharases sauvages et mutées précédemment mises en oeuvre avec le HEMA et le NHAM. 5 Résultats Les résultats relatifs à l'alcool allylique sont présentés dans les Tableaux 10 et 12. Les résultats relatifs au BME sont présentés dans les Tableaux 11 et 13. Les résultats indiquent que 4 des enzymes sauvages testées sont capables de glucosyler les molécules acceptrices, à savoir l'ASDg, la GBD-CD2, l'a-1,2-BrS et 10 l'a-1,3-BrS. A l'instar de ce qui a été observé pour le HEMA et le NHAM, nous observons que les cc-1,2-BrS et cc-1,3-BrS sont les enzymes les plus efficaces pour réaliser la glucosylation de ces deux accepteurs. En outre, l'ASNp sauvage ainsi que la très grande majorité des mutants testés 15 s'avèrent aptes à glucosyler le 2-propènol, comme illustré dans le Tableau 12. Plus particulièrement, 60 mutants sont apparus glucosyler l'alcool allylique au moins aussi efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir I228H, F229D, F229E, F229G, F229H, F229I, F229K, F229M, A289C, A289D, A289E, A289F, A289G, A289H, A289I, A289K, A289L, A289M, A289W, A289Y, F290C, F290D, F290E, F290G, F290H, 20 F2901, F290K, F290L, F290M, F290W, 1330C, 1330D, 1330E, 1330F, 1330G, 1330H, 1330K, 1330L, 1330M, 1330S, 1330Y, V331C, V331D, V331E, V331F, V331G, V331H, V331I, V331K, V331L, V331N, V331W, D394E, D394F, D394G, D394H, D394I, D394K, D394L et R446M. En particulier, à l'exception de F229H, tous ces mono-mutants sont apparus 25 glucosyler l'alcool allylique plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, et notamment F290C, F290H, 1330C, D394E et R446M. L'ASNp sauvage ainsi que 89 mono-mutants s'avèrent également apte à glucosyler le BME, comme illustré dans le Tableau 13. 30 Plus particulièrement, 59 mutants sont apparus glucosyler le BME au moins aussi efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir : 3033800 52 I228L, I228V, I228W, I228Y, F229C, F229M, F229P, F229Q, F229V, F229Y, A289C, A289D, A289E, A289F, A289G, A289H, A289I, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289R, A289S, A289T, A289V, A289W, F290A, F290C, F290D, F290E, F290G, F290I, F290K, F290M, F290P, F290Q, F290S, F290T, F290V, F290W, I330Q, 1330V, V331A, 5 V331C, V331D, V331E, V331F, V331G, V331H, V331I, V331N, V331Q, V331R, V331S, V331T, V331W, V331Y, D394E et R446S. En particulier, 57 d'entre eux sont apparus glucosyler le BME plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir : I228L, 1228 V, I228W, I228Y, F229C, F229M, F229P, F229V, F229Y, A289C, 10 A289D, A289E, A289F, A289G, A289H, A289I, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289R, A289S, A289T, A289V, A289W, F290A, F290C, F290D, F290E, F290G, F290I, F290M, F290P, F290Q, F290S, F290T, F290V, F290W, I330Q, 1330V, V331A, V331C, V331D, V331E, V331F, V331G, V331H, V331I, V331N, V331Q, V331R, V331S, V331T, V331W, V331Y, D394E et R446S, et en particulier F229Y, A289C, A289D, A289E, A289F, 15 A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, A289V, A289W, F290D, F290Q, F290S, F290T, F290W, V331C, V331D, V331E, V331F, V331N, V331R, V331S, V331T, V331W et V331Y, et notamment A289F, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, F290S, F290T, F290W, V331E, V331T et V331W. 20 Exemple 8 : Détermination des efficacités de glucosylation du 4-yinyl benzylalcool (VBA) par l'amylosaccharase de N polysaccharea (ASNp), par ses mutants et par certaines enzymes de l'exemple 1 Le VBA a été testé en réaction d'accepteur à l'aide de l'amylosaccharase de 25 Neisseria polysaccharea (ASNp), de sa banque de mono-mutants identifiés dans le Tableau 1, comme décrit dans l'exemple 3, et également à l'aide de l'a-1,2-BrS et de l'ASR. Les résultats obtenus pour le VBA avec les enzymes cc-1,2-BrS et ASR sont représentés dans le Tableau 14, tandis que les résultats obtenus pour le VBA avec l'ASNP et ses mono-mutants sont résumés dans le Tableau 15. 30 3033800 53 Résultats de glucosylation du VBA Tout d'abord, il est observé que les enzymes cc-1,2-BrS et ASR peuvent glucosyler le VBA. En outre, le VBA peut être glucosylé par l'ASNp sauvage, ainsi que par 26 de 5 ses mono-mutants testés, à savoir : R226H, R226K, R226M, R226N, R226Q, R226S, R226T, R226V, R226Y, 1228 V, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, A289V, F290V, F290W, V331C, V331D, V331G, V331S, V331T, V331Y et R446A. En particulier, tous ces mono-mutants à l'exception du R226S, sont apparus glucosyler le VBA plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, et notamment 10 A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, V331C, V331G, V331S, V331T, V331Y et R446A, en particulier A289P, A289Q, A289S et R446A. Exemple 9 : Détermination des efficacités de glucosylation du N,N-bis(2- 15 hydroxyethyDacrylamide (NNHEA) par l'amylosaccharase de N polysaccharea (ASNp), par ses mutants et par certaines enzymes de l'exemple 1 Le NNHEA a été testé en réaction d'accepteur à l'aide de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp), de sa banque de mono-mutants identifiés dans le Tableau 20 1, comme décrit dans l'exemple 3, et également à l'aide de l'a-1,3-BrS et de l'ASR. Les résultats obtenus pour le NNHEA avec les enzymes cc-1,3-BrS et ASR sont représentés dans le Tableau 16, tandis que les résultats obtenus pour le NNHEA avec l'ASNp et ses mono-mutants sont résumés dans le Tableau 17. 25 Résultats de glucosylation du NNHEA Tout d'abord, il est observé que les enzymes cc-1,3-BrS et ASR peuvent glucosyler le NNHEA et conduisent uniquement à la production de NNHEA ono-glucosylés. En outre, le NNHEA peut être glucosylé par l'ASNp sauvage, ainsi que par 113 30 de ses mono-mutants testés, comme illustré dans le Tableau 17. 3033800 54 En particulier, 31 d'entre eux sont apparus glucosyler le NNHEA plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir : 1228V, F229M, A289C, A289G, A289M, A289N, A289Q, A289S, A289T, A289V, F290A, F290C, F290G, F2901, F290K, F290L, F290M, F290Q, F290S, F290T, 5 F290V, F290W, 1330V, V331D, V331E, V331G, V331H, V331N, V331S, V331T et V331Y. Exemple 10 : Glycosylation d'accepteurs catalysée par une 10 fructosyltransférase Afin de varier la nature du sucre transféré sur les accepteurs, le potentiel d'une fructosyltransferase commercial a été évalué sur le HEMA, le NHAM et le HEAA (N(hydro)ethyl acrylamide), dans des conditions similaires à celles mises en oeuvre précédemment avec les glucane-saccharases. 15 Ces accepteurs ont ainsi été fructosylés par la fructosyltransférase de Bacillus subtilis (voir Tableau 1). Résultats Les chromatogrammes obtenus sur colonne Hypercarb et amino, comme décrit 20 précédemment, après réaction de fructosylation à partir de la fructosyltransférase de B. subtilis, ont permis d'observer une fructosylation de l'ensemble des accepteurs testés. Plus particulièrement, la fructosylation totale observée pour le HEMA est de 32,5 mg/L, pour le HEAA de 84,8 mg/L et pour le NHAM de 21,1 mg/L. Plus particulièrement, tandis que seuls des HEMA et NHAM mono-fructosylés 25 ont été obtenus, le HEAA a été fructosylés, 1, 4, 5, 6 et même 7 fois. Dans la mesure où ces accepteurs ne possèdent qu'un seul groupe hydroxyle réactif, un seul type de chaque niveau de fructosylation de ces molécules est obtenu. En outre, la consommation de saccharose de la fructosyltransférase mise en oeuvre et les taux de production (en g/L) des accepteurs testés fructosylés ont été mesurés. 30 On observe que dans tous les cas, plus de 98 % du saccharose a été consommé par l'enzyme. En outre, on observe une production de HEAA fructosylés 3 à 4 fois supérieure à celle observée avec le NHAM et le HEMA. 3033800 Organisme Glycane-saccharase Références Neisseria polysaccharea ASNp WT et 171 mutants Potocki de Montalk et al., J. (EC 2.4.1.4) simples du site actif of Bacteriology. 1999, 181, (Positions 226, 228, 229, 289, 375-381 290, 330, 331, 394, 446) Champion E., 2008. Thèse de Glucane-saccharases doctorat, INSA, Toulouse Champion C. et al., J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 7379- 7389 Cambon E. et al., Biotechnol Bioeng. 2014 Sep;111(9):1719-28 Deinococcus geothermalis ASDg WT Emond et al., FEMS Microbiol Lett. 2008 Aug;285(1):25-32 Glucane-saccharase Leuconostoc mesesnteroides Alternane-saccharase Joucla. G., 2003. Thèse de NRRL B-1355 tronquée (ASR-C-del-bis ou doctorat, INSA, Toulouse ASR) Joucla et al., FEBS Lett. 2006 Glucane-saccharase Feb 6;580(3):763-8 Leuconostoc mesesnteroides Dextrane-saccharase tronquée o, M ulis C., 2006. Thèse de B-512F DSR-S vardel MN (DSR-S- doctorat, INSA, Toulouse 44N) Moulis C. et al., FEMS Glucane-saccharase Microbiol. Lett., 2006 261 203-210 Leuconostoc mesesnteroides Dextrane-sucrase tronquée W0/2002/074943 NRRL B-1299 DSR-E (GBD-CD2) Brison et al., J. Biol. Chem., Glucane-saccharase 2012, 287, 7915-24 Oenococcus kitaharae Dextrane-saccharase FR1301402 DSM17330 (DSR-S-OK) Glucane-saccharase Leuconostoc citreum a-1,3 BrS FR1301402 NRRL B-742 Glucane-saccharase Leuconostoc citreum oc-1,2 BrS FR1301402 NRRL B-1299 Glucane-saccharase W0/2002/074943 Bacillus subtilis Fructosyltransferase Cheetham et al. Enzyme NCIMB11871 Microb. Technol. 1989, 11, 212-219; Baciu et al. Journal of Biotechnology, Volume 116, Issue 4, 6 April 2005, Pages 347-357 Tableau 1 3033800 56 HPLC Dionex Hypercarb (6 min.) Hypercarb Amino (30 min) C18 U3000 (30 min.) (Thermo scientific) Colonne Hypercarb 5um Hypercarb 5um Sperisorb Amino, C18 SB ZORBAX, Eluent (100x2,1mm) - (100x2.1mm) - 5um 5um Débit / Thermo Thermo (250x4.0mm) - (250x4.6mm) - Température ACN 10 %/ H20 Gradient H20- Bischoff Agilent 90% ACN ACN 80%! H20 20% Gradient H20- 0,5 ml/min ; 8°C 0,5 ml/min ; 8°C 1 ml/min; 30°C ACN 1 ml/min; 30°C Détection LC DEDL (Détecteur Evaporatif à Diffusion de Lumière) UV210/215 nm + DEDL UV204nm + DEDL Détection LC-MS - Ionisation Electrospray positif (ESI+) ; source à 450°C. Tension capillaire : 3kV ; Tension cône : 50 V Tableau 2 3033800 57 Ratio : saccharose 143 mM / Glucosylation du HEMA (g/L) HEMA 438 mM Enzymes Conversion du Glucosylation HEMA-G1c1 HEMA-G1c2 HEMA-G1c3 saccharose (%) totale ASDg 95,0 2,709 1,306 1,403 0 ASR 95,0 21,030 6,745 7,046 7,240 GBD-CD2 23,7 2,168 2,168 0 0 DSR-S-44N 39,0 0 0 0 0 DSR-OK 29,0 0 0 0 0 a-1,2-BrS 93,2 10,635 10,421 0,215 0 a-1,3-BrS 84,4 13,486 12,628 0,858 0 Tableau 3 3033800 58 Ratio : saccharose 143 mM / Glucosylation du NHAM (g/L) NHAM 438 mM Enzymes Conversion du Glucosylation NHAM-G1c1 NHAM-G1c2 NHAM-G1c3 saccharose (%) totale ASDg 12 0,136 0,136 0 0 ASR >95 0,340 0,135 0,205 0 GBD-CD2 42 2,201 1,517 0,684 0 DSR-S-44N 60 0,062 0,062 0 0 DSR-OK >95 0,149 0,149 0 0 a-1,2-BrS >95 1,886 1,781 0,054 0,050 a-1,3-BrS >95 2,078 1,918 0,160 0 Tableau 4 :::::-:-:-:::::::::-:- = C.C79 Mutants positifs HEMA A C D E F G H I K L LI N P Q R S T V IN Y Positions mutées R226 0,076 0,101 fi 3 0 9 0 0 0 0 0 0,008 0,006 0 0,009 0,006 0 ., , ... 1228 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,041 0 0 0 0,099 0,014 0 F22 O O O O O 0 O O O O O 0 O O 0 0 0 0,121 A289 0 O O 0 0 0,127 0,039 0,045 0,139 0,007 0 0 0 0 0 0 0 0,015 F290 4,532 8966 0 0 0 0,013 3,134 ,. 0,795 2,152 0,793 0,014 0,139 0,075 0 0 0 938 0,004 1330 0,287 0 022 0 0,014 0,042 0 040 0,011 0,008 0,008 0,033 0,052 O O O O O 0 ........., V331 0,010 0,103 0.234 0,444 0,026 0,098 0,108 O 0,046 0,023 0,023 .-..-.-.-.-.-.-.-. ,. D394 0,236 0,049 0,012 0 0,065 0,019 0,024 0 0,030 0,030 0,038 R446 0,019 0,157 0,007 0,019 0,021 0,136 0,013 0,029 0,089 0.118 0,039 0.257 Tableau 5 Lel Mutants posrtifs :- 0.083 0 003 0.004 0.004 .' 0 . 03 0 003 000' 0,004 0,003 0,002 0,=. 0.002 0 003 0.003 ,.. 0,003 _ 0 005 0 8,8 . 0.019 0020 0814 0,0,02 0,009 1 0 0 0 CIE 0 0 002 C 01C - 080? 0.120 0,0E1 0,002 0,003 0,012 0,002 0.011 I 0 003 ,. 0 0 002 8,806 0 009 3802 0,003 0.007 P216 0 015 1 .1.801 0 0,033 ,..., 1-11A 1 _ o 0 0.057 0,091 0,02r 0 014 0005 - - - --. ,,7_ 0,Q0! - 0 001 I . 9.001 0.01:: 0 007 0 001 .. 0.013 0,0e 0,012 0,007 0,001 0.002 0 013 T Tableau 6 (.> o 00 o o 3033800 61 Ratio : saccharose 73 mM / HEMA Glucosylation du HEMA (g/L) 73 mM Enzymes Conversion du Glucosylation HEMA-G1c1 HEMA-G1c2 HEMA-G1c3 saccharose (%) totale ASNp sauvage 87 0,141 0,079 0,062 Traces F229W 92,5 0,121 0,069 0,052 0 F290A 73,5 4,532 1,961 0,486 2,084 F290C 83 8,966 6,064 1,734 1,167 F2901 69 3,134 2,377 0,420 0,337 F290K 57 0,795 0,616 0,179 Traces F290L 92 2,197 1,531 0,621 0,045 F290M 92 0,793 0,544 0,249 Traces F290V 40 5,938 4,535 0,704 0,699 1330A 4 0,287 0,188 0,099 0 V331E 88 0,444 0,299 0,145 0 D394A 23 0,236 0,149 0,087 0 R446G 14,5 0,191 0,094 0,041 0,055 Tableau 7 3033800 62 Ratio : saccharose 73 mM / NHAM Glucosylation du NHAM (g/L) 73 mM Enzymes Conversion du Glucosylation NHAM-G1c1 NHAM-G1c2 NHAM-G1c3 saccharose (%) totale ASNp sauvage 76,5 0,101 0,025 0,076 0 F229M 73,7 0,169 0,130 0,033 0,007 F229N 2,5 0,100 0,051 0,049 0 A289N 90,8 0,211 0,126 0,084 0 A289P 81,0 0,127 0,032 0,096 0 A289Q 52,1 0,083 0,037 0,045 0 1330N 0,6 0,096 0,033 0,063 0 V331C 75,0 0,065 0,031 0,029 0,004 V331D 17,7 0,077 0,039 0,032 0,007 V331E 64,2 0,145 0,097 0,038 0,010 V331T 86,9 0,100 0,031 0,069 0 D394E 86,6 0,187 0,137 0,050 0 Tableau 8 3033800 63 Accepteur Enzyme Volume Lyophilisé g/L Production estimée (g) HEMA F290C 500 oui 38,8 19,4 ASR 500 oui 29,7 14,8 ct-1,3-BrS 500 oui 15,1 7,5 NHAM D394E 500 oui 1 0,5 ASR 500 non 1 0,5 ct-1,3-BrS 500 oui 2,5 1,25 Tableau 9 3033800 64 Ratio : saccharose 143 mM / Glucosylation de l'alcool allylique 2-propèn-ol 438 mM (g/L) Enzymes Conversion du Glucosylation saccharose (%) totale ASDg 82,6 0,166 ASR 91,5 0 GBD-CD2 46,3 1,225 DSR-S-44N 76,1 0 DSR-OK 97,4 0 a-1,2-BrS 88,8 1,908 a-1,3-BrS 76,6 1,207 Tableau 10 3033800 65 Ratio : saccharose 143 mM / Glucosylation du BME (g/L) BME 438 mM Enzymes Conversion du Glucosylation saccharose (%) totale ASDg 80,4 1,849 ASR 91,3 0 GBD-CD2 3,0 1,674 DSR-S-44N 5,5 0 DSR-OK 97,2 0 a-1,2-BrS 89,1 2,848 a-1,3-BrS 81,9 2,736 Tableau 11 6 i9 Mutants positifs QdL Alcool AII\:IiCLI A C D E F G H I K L 1V1 N P Q R S T V Vil Y _ in a., R226 0,313 0,252 0,127 0207, 0,184 0,065 0.061 0,356 0,154 013 0,042 0,16 019 0.15 0,092 0,197 0,117 0 0,177 "5 E vi c o ._ o 1228 D D 0,35 0,352 0,279 0,57 0,888 0 0 D 0 0,274 D,366 0,421 0,383 0,277 0,312 0,404 0 53 F229 0 0,408 0,649 0966 0,684 0,619 0,851 0799 0,6 0.626 0 0,338 0,413 045 0,412 0,511 0,571 0,524 0,545 A2S9 0,852 0,697 0,816 0,783 0,785 0,881 0,77 0,763 0831 0,803 0 0,517 0,499 054 0,432 0,591 0,409 0.654 0,648 F2,90 0,538 1,052 0,825 0,89 0,8E2 1,105 0,7 _ 0,82 0,787 0 999 0 0.37 0,442 0,525 0,437 0,5 0 573 0,649 0,572 13 .30 0,56.8 1,004 0,929 0,792 0,852 0994 0,858 0,707 0,73 0,734 0,495 0,326 0,509 0,5-98 0.799 0 463 0.593 0,4E7 0,701 V331 0,413 0,707 0,778 0,728 0,772 0,703 0849 0,778 0,737 0,705 0,578 0347 0.26E- 0.385 0467 0,59-8 0,519 0,626 0,486 D394 0.302 0,455 1,018 0.707 0,806 0,686 0,756 0,777 0,659 0,497 0 0,155 0,327 0,402 0 el 0,417 0,277 0,478 0,411 R446 037 036 0,394 0,477 0,47 0,548 0,451 0,508 0,371 0,394 1,112 0 0 0,477 0,205 0 32_- 0292 0,315 0,318 Tableau 12 [7777777777-- 1.-22L. 0 004 F 0.011 0.009 0.027 C,D1E 0,004 0 0,012 0.045 0.020 _ 0.0,D9 OC- - 0.014 c,oso o 0,024 0,021 0,00,5 C.134 I F;:':.-1'" 0,1 01 - ,217 0.0di O L6l 0.376 0 :?.-4.., C 40 0 000 0,012 OC. 004 0.030 0.021 0,014 .:: :12 0.000 0.2 .. .110 0,420 0,472 J32 0012 C 0 0 0 0 0,058 0.012 0.020 LL;1_ .'......-1 0399 O7 L,:1 0 367 0.2E5 0 072 0 010 0.01 - 0,142 0 0,042 127 02i8 0,3ef 025E .... D791 --- c n 8 0.005 0 -7.012 0 0 - 1 770 0.005 Tableau 13 3033800 68 Ratio : saccharose 73 mM / Glucosylation du VBA VBA 73 mM Enzymes Conversion du Glucosylation saccharose (%) totale (g/L) a-1,2-BrS 63,1 7,9 ASR 95,3 2,5 Tableau 14 1...,..:,1......:.:.5:.:....:,...,.....:.....,.:1L5:,...1.:.i).:.7:...:... Mutants positifs I VBA A C D E F G H I K L M N P Q R S Positions mutées R226 D D O O 0 0 1,2 0 0,6 0 0,7 1,9 0 0,7 0,5 0,9 06 0 0,3 1228 O O 0 0 0 c o o D O O 0 0 0 2,1 F22 o o o o o o o o o 0 o o o o 0 0 A289 .-:-:-:-:-. o o O O O O O D 0 3,3 5,7 10,5 , 14,2 62 1,5 F:290 O O O O O O D 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2,2 1,1 1330 0 c 0 0 0 c 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O c 1/331 0 6 1 0 0 4,1 O 0 0 0 0 0 O O 0 4,3 5,3 C 3,3 D394 o c o o o o D o O O D D O 0 0 0 0 0 0 R446 14,6 Tableau 15 3033800 70 Ratio : saccharose 73 mM / NNHEA 73 mM Glucosylation du NNHEA (g/L) Enzymes Conversion du Glucosylation NNHEA-G1c1 NNHEA-G1c2 NNHEA-G1c3 saccharose (%) totale ASR >98 0,86 0,86 0 0 a-1,3-BrS >98 1,47 1,47 0 0 Tableau 16 Mutants positifs r-IN H EA. A C D E F G H I K. L NPQR S T VWY Positions mutées R226 0,6 0 0,07 0,89 0 0 0 0,81 0,59 0,62 0,65 0,78 0 0,29 0,73 0,77 0,66 0,49 0,56 1228 0,49 0,75 0 0,05 0,07 0 0,96 0 0,71 1,02 0,31 0,61 0,63 0 0,07 0,61 1,99 0,08 0,6 F229 0 0,3 0 0 -.. : . - . : 0 0,51 0 0,52 1,66 0,2 0 0,02 0,04 0 0 0,51 0,67 1,5 , .A289 2,31 1,2 0,66 0,13 1,77 0,34 1,46 0,09 0,25 2,88 2,61 0,85 5,11 0,18 2,59 2,49 2,06 1,19 F290 2,03 7,17 0,41 1,46 _ 2,41 0,4 2,73 1,91 6,58 2,85 0 0,84 1,81 1,54 2,34 2,55 8,99 5,28 0,62 1330 0 0,08 0 0 0 0 0 - - : - 0,05 0 1,1 0 0 0,12 0 0 0.07 1,66 0 0.04 ...-.....- V331 0 0,4 2,05 2,33 0,46 1,88 1,44 0,74 0,06 0,88 0,66 1,93 0 0 0,14 2,15 2,37 0,38 2,04 D394 0 0 . - . : . - 0.31 00,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0,02 0,16 0 0 0 0 FLF 0 059 0 0 01 0,31 0 0 0,4 0,13 0,28 0,37 0 0,36 025 0,49 0 0 0,24 Tableau 17 3033800 72 SEQUENCES : Série SEQ ID NO : 1 : (Protéine = séquence de la glucane-saccharase ASNp sauvage (Amylosucrase Neisseria polysaccharea)) 5 SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYSQRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV DLFAGDLKGLKDKIPYFQELGLTYLHLMPLFKCPEGKSDGGYAVS SYRD VNP AL GT IGDLREVIAALHEAGISAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRIVIP D Q YDRTLREIFPD QHP GGF SQLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM 10 LFL ANL GVDILRIVIDAVAF IWK QMGT S CENLPQAHAL IRAFNAVM RIAAP AVFFK SE AIVHPDQVVQYIGQDECQIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT AWVNYVRSHDDIGW TF ADEDAAYL GISGYDHRQFLNRFFVNRFDGSFARGVPF QY NP S TGDCRVS GT AAALVGL AQDDPHAVDRIKLLYSIAL STGGLPLIYLGDEVGTLND DDWSQD SNKSDD SRWAHRPRYNEALYAQRNDPSTAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP 15 RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIGG KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA Série SEQ ID NO : 2: (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) R226X1) 20 SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYSQRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV DLFAGDLKGLKDKIPYFQELGLTYLHLMPLFKCPEGKSDGGYAVS SYRD VNP AL GT IGDLREVIAALHEAGISAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRIVIP D Q YDRTLX1EIFPD QHP GGF SQLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM 25 LFL ANL GVDILRIVIDAVAF IWK QMGT S CENLPQAHAL IRAFNAVM RIAAP AVFFK SE AIVHPDQVVQYIGQDECQIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT AWVNYVRSHDDIGW TF ADEDAAYL GISGYDHRQFLNRFFVNRFDGSFARGVPF QY NP STGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLND DDWSQD SNKSDD SRWAHRPRYNEALYAQRNDPSTAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP 30 RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIGG KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA 3033800 73 Série SEQ ID NO : 3 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea)1228X2) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV YGNNEALLPMLEMLLAQAWQSYSQRNSSLKDIDIARENNPDWILSNKQVGGVCYV 5 DLFAGDLKGLKDKIPYFQELGLTYLHLMPLFKCPEGKSDGGYAVSSYRDVNPALGT IGDLREVIAALHEAGISAVVDFIFNHTSNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRIVIP D Q YDRTLREX2F PD QHP GGF SQLEDGRWVWTTFNSF QWDLNY SNPWVF RAMAGE MLFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGTSCENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKS EAIVHPDQVVQYIGQDECQIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH 10 TAWVNYVRSHDDIGW TF ADED AAYL GI S GYDHRQF LNRFF VNRFDGSF ARGVPF Q YNPSTGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN DDDW SQD SNK SDD SRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNFSEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIG GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA 15 Série SEQ ID NO : 4: (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) F229X3) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV YGNNEALLPMLEMLLAQAWQSYSQRNSSLKDIDIARENNPDWILSNKQVGGVCYV 20 DLFAGDLKGLKDKIPYFQELGLTYLHLMPLFKCPEGKSDGGYAVSSYRDVNPALGT IGDLREVIAALHEAGISAVVDFIFNHTSNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRIVIP DQYDRTLREIX3PDQHPGGFSQLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGE MLFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGTSCENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKS EAIVHPDQVVQYIGQDECQIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH 25 TAWVNYVRSHDDIGWTFADEDAAYLGISGYDHRQFLNRFFVNRFDGSFARGVPFQ YNPSTGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN DDDW SQD SNK SD D SRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNFSEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIG GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA 30 3033800 74 SEQ ID NO: 5 : (Protéine = séquence mutée de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) A289X4) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYSQRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV 5 DLFAGDLKGLKDKIPYFQELGLTYLHLMPLFKCPEGKSDGGYAVS SYRD VNP AL GT IGDLREVIAALHEAGISAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRIVIP D Q YDRTLREIFPD QHP GGF SQLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM LFLANLGVDILRMDAVX4FIWKQMGTSCENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKS EAIVHPDQVVQYIGQDECQIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH 10 TAWVNYVRSHDDIGW TF ADEDAAYL GIS GYDHRQFLNRFF VNRFDGSF ARGVPF Q YNP STGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN DDDWSQD SNKSDD SRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIG GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA 15 Série SEQ ID NO : 6: (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) F290X5) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYSQRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV 20 DLFAGDLKGLKDKIPYFQELGLTYLHLMPLFKCPEGKSDGGYAVS SYRD VNP AL GT IGDLREVIAALHEAGISAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRIVIP D Q YDRTLREIFPD QHP GGF SQLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM LFLANLGVDILRMDAVAX5IWKQMGTSCENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKS EAIVHPDQVVQYIGQDECQIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH 25 TAWVNYVRSHDDIGW TF ADEDAAYL GIS GYDHRQFLNRFF VNRFDGSF ARGVPF Q YNP STGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN DDDWSQD SNKSDD SRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIG GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA 30 3033800 75 Série SEQ ID NO : 7 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) 1330X6) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ S Y S QRNS SLKD ID IARENNPDWIL SNKQVGGVCYV 5 DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKCPEGK 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STTADGLAYYDTDENAPVAYTDA NGDLIF TNE S IYGVQNP QV S GYLAVWVPVGAQ QD QDARTA SD T TTNT SDKVFH SN AALDSQVIYEGF SNFQAFATDS SEYTNVVIAQNADQFKQWGVT SFQLAPQYRSSTD T SFLD SIIQNGYAF TDRYDL GYGTP TKYGTAD QLRD AIKALHA S GIQ AIADW VPD QI YNLPEQELATVTRTNSFGDDDTDSDIDNALYVVQ SRGGGQ YQEMYGGAFLEELQ A 20 LYP SLFKVNQISTGVPIDGSVKITEWAAKYFNGSNIQGKGAGYVLKDMGSNKYFKV V SNTED GDYLPKQLTNDL SETGF THDDKGIIYYTL S GYRAQNAF IQDDDNNYYYFD KT GHLVT GL QKINNHTYFFLPNGIELVK SFL QNED GTIVYFDKKGHQVFD QYITD QN GNAYYFDDAGVMLK S GLATID GHQ QYFD QNGVQVKDKF VIGTD GYKYYFEP GS G NLAILRYVQNSKNQWFYFDGNGHAVTGFQTINGKKQYFYNDGHQ SKGEF IDAD GD 25 TF YT SATDGRLVTGVQKINGITYAFDNTGNLITNQYYQLADGKYMLLDDSGRAKT GFVLQDGVLRYFDQNGEQVKDAIIVDPDTNL S Série SEQ ID NO: 12: (Protéine = séquence de la glucane-saccharase a-1,2 BrS (a-1,2 BrS de Leuconostoc citreum NRRL B-1299)) 30 MRQKETITRKKLYK S GK SWVAAAT AF AVMGV SAVTTVSADTQTP VGT TQ SQ QDLTGQRGQDKPT TKEVIDKKEPVPQV SAQNAGDL SADAK TTKADDK QDTQ PTNAQLPDQGNKQTNSNSDKGVKESTTAPVKTTDVP SKSVTPETNT SINGGQYVEK 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AFDFLLANDVDNSNPVVQAENLNWLHYLMNFGTITAGQDDANFD SIRIDAVDFIHN D TIQRTYDYLRDAYQ VQ Q SEAKANQHISLVEAGLDAGT STIHNDALIESNLREAATL SLTNEPGKNKPLTNMLQDVDGGTLITDHTQNSTENQATPNYSIIHAHDKGVQEKVG 15 AAITDATGADWTNF TDEQLKAGLELFYKDQRATNKKYNSYNIP SIYALMLTNKDT VPRMYYGDMYQDD GQ YMANK S IYYDALV SLMT ARK S YV S GGQ TM S VDNHGLLK S VRF GKDAMTANDL GT SATRTEGLGVIIGNDPKLQLND SDKVTLDMGAAHKNQKY RAVIL TTRD GL ATFNSDQAP TAW TNDQGTL TF SNQEINGQDNTQIRGVANPQVS GY L AVWVP VGA SDNQDARTAAT T TENHD GKVLH SNAALD SNLIYEGF SNF QPK AT TH 20 DEL TNVVIAKNADVFNNW GIT SFEMAPQYRS SGDHTFLD STIDNGYAF TDRYDLGF NTPTKYGTD GDLRATIQALHHANMQVMADVVDNQVYNLP GKEVV S ATRAGVYG NDDAT GF GTQLYVTN S VGGGQYQEKYAGQYLEALKAKYPDLFEGKAYDYWYKN YANDGSNPYYTL SHGDRESIPADVAIKQWSAKYMNGTNVLGNGMGYVLKDWHN GQYFKLDGDKSTLPKGGRADPAFLYKVVSAWSHPQFEK 25 Série SEQ ID NO: 14: (Protéine = séquence de la glucane-saccharase ASDg (Amylosaccharase de Deinococcus geothermalis)) MLKDVLTSELAAQVRDAFDDDRDAETFLLRLERYGEDLWESLRAVYGD QVRALP GRLLEVMLHAYHARPAELRRLDEARLLRPDWL 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VLYF DK T T GAL ANTN 15 VS SIKEGLTAQNDDFTAHNAVYSTKSESF TNIDGYLTAEAWYRPADILENGTDWRA SRADEF RP IL T TWWPDK Q TEVNYLNYM K T Q GF ITND QDFKL SDD QLLLNHAAQ SV QGEIEKKISQQGSTDWLKTLLQ TFINQQP SWNGESEDPGSDHL QGGAL TF VNSPLTP D SN SNFRLLNRTP TNQ T GTP QYD TDA SLGGFELLLANDVDN SNPVVQAEQLNWLY YLLNFGSITADDPNANFDGIRIDAVDNVDADLLQIAAAYFKDAFKSGSNDQTTNQH 20 L SILEDW SHNDPEYM KAQ GYP QL TMDD YMHT QL IW SL TKPDNIRGTMQRFMD YY LVNRAND STNNEAVANYSFVRAHD SEVQ T VIA Q II SDLYPN S GS GL IP T TD QL Q AAF EVYNADMKSDVKKYTQYNIP S AYAMLL TNKD TVPRVYYGDMYTDD GD YMANK S PYFDAISTLLKARVKYAAGGQ SMAVDKNDILT SVRFGQNAMLASD SGDNQTRQEG IGVIVSNNSHLKLAENDQVVLHMGAAHKNQAFRALLLTIESGLENFDTDLQAPVKY 25 TDANGDLIF TAAEL AGYLNPEV S GYL S AWVP VGAADNQD ART AAD SAT STDGNVF H SNAALD SNVIFEGF SNFQ S IP T AEQHDDF TNVKIAENAGLFKDWGIT SF QLAP Q YR S STD S TF LD S IIQNGYAF TDRYDL GF D TP TKYGD VDDLRAAIKALHANNIQ VMADWV PD Q IYNL QNPEIITVNRTD SYGQPIAGSDLQNDLYLAYTNGGGQYQTKFGGAFLEKL QQLYPDLF TKTQISTGQ TIDP SQKITEW SAKYFNGSNIQGRGAYYVLRD SGTDQYFK 30 VI SNDENEAFLPK QL TNQP GET GF SQDDQGIIFF S T S GYQ AKNAF VQ GDD GNYYYF D NT GHMVT GP Q TINGRHYLFFPNGVEAQNVF VQNDRGETYYYD QRGRQVANQ YVT D TNGN SFRF DENGIML ANQL AQ VD GHW QFFK S S GVQ AKD AF IL GSD GKLRYFE S G CENS ÀÔDUNCVIIIIIÀÔDNNMIUNIAÀDIAIDMITIMSGNFUNV S MUNINI S CEINÔGNIS CUITID dVINS CUIÀUDDÀ)IVÔÀ C1999A S NAAIIAIÔ IMUMGAKINI CID MINAHÔVSAAUNGVHIDÀIÔKVAKEVINASIAIDVÔHMHIVNUICEÔCEIDÀNIcumo o£ ICEÀXCESIDADMÔAIS CUIDIGLICEND CES SXÀÔdVIUKEII-DMSNTICEII\INIIAAI\IVÀÔ 1\19XIdIAINÔJI\IS numAr-Dis CUIVVNLIMANDOELI\INÔMIIADIVIUÔMCKV9AdAM AVIADVAUcINFIXONAVI CES ÔGNIIINÔMIAFICIDHCKIMVIdVNI\ICEÔCW\IAIDNCEM rITAFIVXÀVÔI\DITIVIDINI-MIS CESI\INIUID S SMSAIA919ÔNXSUVIDÔDÔVOEINICEN DIA S flAUDSNNLIDCDINIDCKNINIAVINIÔDDVAÀNMIVNININÔMVI\IÀÀISNIV ÇZ IAIÀÔDDCFICECIDÀGÔÀINCIDÀJAXdAICENNLITTIVÀVS dill\IÀÔNÀNNAS ÔHÔCEUÀJV N'191\IÔIÔÔINIKESINSII\MNNNAININIIIIAICEÔICENCITIVHAISÀ1\1c1IIS S (IDRIS S ÙSI I\IKICKIVAINUISMIVclacICUINCUILVI\INSIS )1MICEXMI\IS UKIV S NUAIIdi UD Nd VUAISIH ÔNVAVUNCLE 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(Protéine = séquence de la glucane-saccharase ASR- C-del-bis (Alternane-saccharase tronquée de Leuconostoc mesenteroides NRRL B- 15 1355)) MEQQETVTRKKLYKSGKVWVAAATAFAVLGVSTVTTVHADTNSNVAV KQINNTGTND SGEKKVPVP STNND SLKQGTDGFWYD SDGNRVDQKTNQILLTAEQ LKKNNEKNL S VI SDD T SKKDDENI SKQ TKIANQ Q TVD TAKGLT T SNL SDPITGGHYE NHNGYFVYIDASGKQVTGLQNIDGNLQYFDDNGYQVKGSFRDVNGKHIYFD S VT G 20 KAS SNVDIVNGKAQGYDAQGNQLKKSYVAD S SGQTYYFDGNGQPLIGLQTIDGNL QYFNQ Q GVQ IKGGF QD VNNKRIYF APNTGNAVANTEIINGKLQ GRDANGNQVKNA F SKDVAGNTFYFDANGVML TGL Q TI S GKTYYLDEQ GHLRKNYAGTFNNQFMYFDA DTGAGKTAIEYQFDQGLVSQ SNENTPHNAAKSYDKS SFENVDGYLTADTWYRPTDI LKNGDTWTASTETDMRPLLMTWWPDKQTQANYLNFMS SKGLGITTTYTAATSQK 25 TLNDAAF VIQ TAIEQ QI SLKK S TEWLRDAID SFVKTQANWNKQTEDEAFDGLQWLQ GGFLAYQDD SHRTPNTD S GNNRKL GRQP INID GSKD T TD GK GSEF LLANDIDN SNP I VQAEQLNWLHYLMNFGSITGNNDNANFDGIRVDAVDNVDADLLKIAGDYFKALY GTDKSDANANKHL SILEDWNGKDPQYVNQQGNAQLTMDYTVT SQFGNSLTHGAN NRSNMWYFLD T GYYLNGDLNKKIVDKNRPN S GTLVNRIAN S GD TKVIPNY SF VRA 30 HDYDAQDPIRKAMIDHGIIKNMQD TF TFDQLAQGMEFYYKDQENP SGFKKYNDYN LPSAYAMLLTNKDTVPRVYYGDMYLEGGQYMEKGTIYNPVISALLKARIKYVSGG QTMATD S SGKDLKDGETDLLTSVRFGKGIMT SDQTTTQDNSQDYKNQGIGVIVGN 3033800 83 NPDLKLNNDKTITLHMGKAHKNQLYRALVL SND SGIDVYD SDDKAPTLRTNDNGD L IF HK TNTF VKQDGTIINYEMKGSLNALI S GYL GVWVP VGA SD S QD ART VATES S S S NDGSVFHSNAALD SNVIYEGF SNFQAMPT SPEQ STNVVIATKANLFKELGITSFELAP Q YRS S GD TNYGGM SFLD SFLNNGYAF TDRYDLGFNKADGNPNPTKYGTDQDLRNA 5 IEALHKNGMQAIADWVPDQIYALPGKEVVTATRVDERGNQLKDTDFVNLLYVANT KS SGVDYQAKYGGEFLDKLREEYP SLFK QNQVS TGQP IDA S TKIK QW SAKYMNGT NILHRGAYYVLKDWATNQYFNIAKTNEVFLPLQLQNKDAQTGFISDASGVKYYSIS GYQ AKD TF IED GNGNW YYFDKD GYMVRSQ Q GENP IRT VET SVNTRNGNYYFMPN GVELRKGFGTDNSGNVYYFDDQGKMVRDKYINDDANNFYHLNVDGTMSRG 10 Série SEQ ID NO: 18 : (Protéine = séquence de la fructosyltransferase de Bacillus subtilis NCIMB 11871) MNIKKFAKQATVLTFTTALLAGGATQAFAKETNQKPYKETYGISHITRH DML Q IPE Q QKNEKYQ VPEF D S STIKNIS SAKGLDVWD SWPLQNADGTVANYHGYHI 15 VF ALA GDPKNADD T S IYMF YQKVGE T S ID SWKNAGRVFKD SDKF D AND SILKDQT QEWSGSATFT SDGKIRLFYTDF S GKHYGK Q TL T TA Q VNV S A SD S SLNINGVED YK S I F D GD GK T YQNVQ QF IDEGNY S SGDNHTLRDPHYVEDKGHKYLVFEANTGTEDGYQ GEESLFNKAYYGKSTSFFRQESQKLLQ SDKKRTAELANGALGMIELNDDYTLKKV MKPLIASNTVTDEIERANVFKMNGKWYLFTD SRGSKM TID GIT SNDIYML GYV SN S 20 LTGPYKPLNKTGLVLKMDLDPNDVTFTYSHFAVPQAKGNNVVITSYMTNRGFYAD KQ S TF AP SFLLNIKGKKTSVVKD SILEQGQLTVNK REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins un synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel : (A) ledit synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué : (i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) : dans laquelle : R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en Ci-C3 ; R2 représente un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et X1 représente -(0)-, -(S)- ou -(NR'2(OH))-, de préférence -(0)-, -(NET)- ou -(NR'2(0E1))-, avec R'2 représentant un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement -(C2H40)-, avec m étant un entier compris entre 1 et 10; (ii) des synthons styréniques de formule (II) : dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10; 3033800 85 (iii) des synthons N-Carboxyanhydride (NCA) de formule (III) : 0 0 H RCIFI (III) dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10; 5 (iv) des synthons lactones/lactames/thiolactones de formule (IV) : J; OH (IV) dans laquelle : R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un 10 groupement (C2H40)'' avec m étant un entier compris entre 1 et 10; n représente un entier compris entre 1 et 20 ; X2 représente -(0)-, -(NET)- ou -(S)- ; et R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en Ci-C20; 15 (v) des synthons de formule (V) : FI S -1 (V) dans laquelle R7 représente un groupement alkylène en C1-C20 ; et (vi) des synthons de formule (VI) : 20 (VI) dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la glycane saccharase est choisie dans le groupe comprenant : 3033800 86 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, 5 D394 et R446 ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S vardelA4N - S512C); - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; 10 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN-123- GBD-CD2) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 15 (DSR-S-OK) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASRC-del-bis) ; et 20 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis). 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y. - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; 3033800 87 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence 5 SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un 10 acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, 15 T,V,WetY; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP 20 D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y. 25 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel la séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi : - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP 30 R226X3), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V; 3033800 88 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP 1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP 5 F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un 10 acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V et W, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et 15 W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W ; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, 20 en particulier de A et C, plus préférentiellement de A; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, F, G, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W; 25 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E; - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé choisi dans 30 le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M. 3033800 89 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué du 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinylphenol (VP), du 4-vinylbenzyl alcohol 5 (VBA), du 4-(hydroxy)methyl oxazolidine-2,5-dione (HMNCA), du a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL), du (±)- mevalonolactone (MVL), du 2-mercaptoéthanol (BME), du 2 propène-l-ol (alcool allylique) et du N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA). 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel 10 le synthons hydroxylé est choisi dans le groupe constitué du 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinyl benzylalcool (VBA), du 2 propène-l-ol (alcool allylique) et du 2-mercaptoéthanol (BME) et du N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA). 15 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le synthon hydroxylé est glucosylé ou fructosylé à l'issu du procédé. 8. Procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère comprenant la 20 polymérisation d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Procédé selon la revendication 8, comprenant, dans l'ordre, les étapes suivantes : 25 a) la polymérisation de deux monomères obtenus, indépendamment l'un de l'autre, à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 8, permettant d'aboutir à une chaîne de 2 monomères ; b) la polymérisation de la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une 30 quelconque des revendications 1 à 7 ; puis c) une ou plusieurs étapes successives, et indépendantes, consistant polymériser la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un 3033800 90 monomère obtenu à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10. Procédé selon la revendication 9, comprenant, indépendamment : 5 au moins une étape a') entre les étapes a) et b) ; au moins une étape b') entre les étapes b) et c) ; et/ou au moins une étape c') après l'une quelconque des étapes c), dans lesquelles la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente est polymérisée avec au moins un synthon non-glycosylé. 10 11. Procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère, de préférence à blocs, comprenant le couplage d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, de préférence de monomères obtenus à partir des synthons de formule (V) et/ou (VI) tels que définies en 15 revendication 1.