Brevet FR3024546A1 — publié le 20160205

La présente invention entre dans le domaine médical, pour le diagnostic et le suivi de l'évolution de la fibrose tissulaire. A cet effet, l'invention concerne particulièrement un 5 système de détection et de quantification de la fibrose tissulaire. La fibrose tissulaire désigne l'accumulation de matrice extracellulaire au sein du tissu conjonctif. La fibrose intervient suite à une inflammation ou à une lésion dudit 10 tissu. Ce dernier ne va pas se régénérer naturellement et correctement. La fibrose est un processus d'accumulation de collagène qui est synthétisé par des cellules dans le tissu conjonctif. Le collagène est une famille de protéine physiologiquement 15 présente dans l'organisme pour notamment conférer au tissu ses propriétés de résistance mécanique à l'étirement. Cependant, au sein du parenchyme d'un organe, l'accumulation excessive de collagène, donc de tissu conjonctif résultant de la fibrose, entraine une perte progressive, souvent inéluctable, de la 20 fonction de l'organe. De ce fait, il existe plusieurs types de fibroses altérant la fonction des organes et entrainant diverses pathologies. On parle de fibrose pulmonaire pour désigner une altération du tissu conjonctif pulmonaire, dont les alvéoles se 25 retrouvent alors enserrées et étouffées par des fibres de collagène. On parle de fibrose hépatique pour un tissu conjonctif fibreux se développant là où les cellules hépatiques ont été détruites. Quand la fibrose hépatique s'étend, elle peut 30 aboutir au développement d'une cirrhose. On parle également de fibrose rénale qui correspond à une accumulation excessive de matrice extracellulaire dans le parenchyme rénal. En d'autres termes, il existe une corrélation étroite 35 entre le degré de fibrose d'un organe et sa fonction. De manière générale, plus l'accumulation de collagène est excessive dans les tissus conjonctifs, plus la perte de fonction de l'organe est importante. En conséquence, quantifier spécifiquement la fibrose tissulaire est nécessaire afin de définir un pronostic vital ou 5 fonctionnel et pour suivre l'évolution d'une fibrose existante. De manière connue, on réalise la quantification de la fibrose d'un tissu sur lames colorées. Un anatomopathologiste va établir un score en fonction de la surface relative occupée par la fibrose au sein de la biopsie. 10 On entend par « biopsie » le fait de prélever une toute petite partie d'un organe ou d'un tissu afin d'effectuer des examens médicaux. Cette technique d'analyse sur lames colorées a pour désavantage d'être subjective car elle est réalisée par l'oeil humain. Ce moyen de quantification de la fibrose présente 15 donc une mauvaise reproductibilité intra-utilisateur et inter-utilisateurs, et par conséquent cette quantification est peu représentative et manque de fiabilité. Pour pallier cette limitation de la quantification subjective sur lames colorées, il est également connu de faire 20 une quantification colorimétrique semi automatisée. Cette technique consiste en une analyse semi automatisée et informatisée basée sur une segmentation automatique des couleurs présentes sur les lames colorées au trichrome de Masson. La technique consiste à fixer les biopsies tissulaires, 25 les déshydrater, puis à les inclure dans de la paraffine. Des coupes de paraffine de quatre à dix micromètres (pm) sont étalées sur des supports de type lames, notamment compatibles avec la spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier (« IRTF ») puis colorée au Trichrome de Masson. Le Trichrome de 30 Masson colore en vert les fibres de collagène. Après coloration au Trichrome de Masson, les lames sont scannées puis, à partir des images obtenues, un opérateur sélectionne les zones de confusion apparaissant en vert, c'est-à-dire les zones où le collagène est physiologiquement présent. 35 L'image après sélection subit ensuite un traitement informatique basé sur un algorithme fondé sur la segmentation de couleurs, identifiant sur trois canaux les couleurs rouge, vert et bleu. Le vert correspondant au tissu conjonctif avec un excès de collagène et donc à la fibrose. Cependant, cette quantification colorimétrique semi 5 automatisée présente comme inconvénient de nécessiter une étape manuelle pour éliminer les zones de confusion, introduisant une part de subjectivité et un temps de traitement supplémentaire. En outre, à ce jour, cette technique n'a été validée qu'au niveau du tissu rénal. Par ailleurs, cette technique surévalue 10 systématiquement la fibrose rénale. En effet, les membranes basales tubulaires rénales sont constituées de collagène, donc colorées en vert et considérées comme de la fibrose. Ce défaut est d'autant plus important que les tubes sont jointifs et donc que la fibrose interstitielle est minime. Ainsi, sur une 15 biopsie exempte de fibrose, une quantification 15 à 20 % de fibrose est obtenue, témoignant d'une surestimation de ladite quantification. La quantification colorimétrique semi-automatique ne permet pas de différencier les différents types de collagènes 20 au sein d'un même tissu, car elle est basée sur une coloration par le vert colorant tous les collagènes. Bien que reproductible pour la fibrose tissulaire rénale, la quantification colorimétrique semi automatisée manque donc de représentativité. 25 Une technique équivalente utilise la spectroscopie Raman. Il est également connu pour quantifier la fibrose, notamment au niveau hépatique, la technique de Génération de Seconde Harmonique (SHG pour « Second-Harmonic Generation ») qui permet de réaliser une quantification semi automatisée du collagène de 30 type I présent dans les tissus. La technique SHG se base sur l'émission spécifique du collagène de type I après excitation par un microscope bi-photonique. Après fixation des biopsies tissulaires, déshydratation et inclusion dans de la paraffine, des coupes de 4 à 6 pin sont réalisée puis étalées sur supports 35 compatibles avec la FTIR, sans aucune coloration. Les biopsies tissulaires présentes sur les lames sont segmentées en plusieurs fragments et sont ensuite concaténées par le système. Après excitation, le collagène de type I va émettre un signal SHG. Sur chaque coupe, le signal SHG est détecté. Le signal SHG tissulaire est quantifié via un traitement numérique semi automatisé. Un opérateur devra définir pour chaque image ou groupe d'image les valeurs seuils de bruit et de positivité du signal SHG. Un algorithme de quantification traite ainsi chaque image. L'algorithme va calculer comme résultat la surface relative occupée par le signal SHG, spécifique du collagène de type I, pour chaque biopsie selon les seuils définis par l'opérateur. Il en résulte que cette technique présente comme inconvénient une intervention de l'utilisateur qui doit déterminer subjectivement un seuil de positivité du signal SHG. De plus, l'imagerie SHG a été décrite uniquement pour la 15 fibrose hépatique et pulmonaire. En outre, la technique SHG présente comme autre désavantage de ne pas distinguer la fibrose des structures histologiques comportant du collagène de type physiologiquement comme les tissus conjonctifs normaux. Cette 20 technique SHG permet alors la détection de l'ensemble du collagène de type I présent dans le tissu. La présente invention a pour but de pallier les inconvénients des méthodes précédemment mentionnées, en proposant un système de détection de la fibrose qui soit 25 capable de quantifier et de suivre l'évolution d'une fibrose tissulaire de façon reproductible, automatique, et objective en s'affranchissant de l'intervention de l'opérateur. Ce système permet de distinguer les différentes structures histologiques collagèniques c'est à dire le tissu conjonctif impliqué dans la 30 fibrose tissulaire pathologique du tissu conjonctif présent physiologiquement. Un tel système comporte tout d'abord un procédé de détection et de quantification de la fibrose dans lequel au moins : 35 - on positionne sur un support un échantillon tissulaire fixé non coloré ; - on effectue une acquisition infrarouge par balayage de points dudit échantillon ; - on convertit le spectre infrarouge rendu par chaque point acquis en au moins une image spectrale ; - on effectue un traitement numérique de ladite image spectrale par discrimination entre au moins le collagène physiologique et le collagène pathologique issu de la fibrose en attribuant à chaque point une classe spectrale définie par un algorithme classant les spectres selon leur similitudes spectrale ; - puis on attribue à chaque classe un état par comparaison statistique avec un modèle numérique de spectres ; - on quantifie la surface relative occupée par les points les points de chaque état et on enregistre le résultat. Selon d'autres caractéristiques additionnelles, non limitatives: - ladite acquisition infrarouge s'effectue par spectroscopie infrarouge à transformation de Fourrier. - ledit traitement comprend une étape préalable de prétraitement, consistant en l'élimination spectrale des bruits de fond provenant du support et du détecteur et en la neutralisation des interférences de la paraffine. - lesdites classes sont au nombre de quatre, dont les états sont nommés : normal, fibrose, collagène non fibreux, inflammation. - ladite discrimination s'effectue par comparaison de la valeur du spectre de chaque point avec des plages de valeurs de spectres dudit modèle, - on quantifie statistiquement les points d'une même classe sous la forme d'un pourcentage surfacique de la surface totale dudit échantillon. - on combine ledit résultat audit modèle avant de réitérer ledit procédé avec un autre échantillon. De plus, ledit système comprend aussi un dispositif de détection et de quantification de la fibrose, permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Un tel dispositif comprend au moins : - des moyens de réception d'un support d'un échantillon tissulaire ; - des moyens d'acquisition par spectroscopie infrarouge à transformation de Fournier positionnés en vis-à-vis desdits moyens de réception, lesdits moyens d'acquisition convertissant le spectre infrarouge rendu par chaque point acquis en au moins une image spectrale ; - des moyens de traitement numérique de ladite image spectrale par discrimination entre au moins le collagène physiologique et le collagène pathologique en attribuant à chaque point une classe spectrale par comparaison statistique avec un modèle numérique de spectres dont est pourvu lesdits moyens de traitement, lesdits moyens de traitement quantifiant les points possédant une classe spectrale similaire ; - des moyens d'enregistrement numérique du résultat 20 desdits moyens de traitement. Selon d'autres caractéristiques additionnelles, non limitatives: - lesdits moyens de réception sont motorisés et que ledit dispositif comprend des moyens de contrôle des déplacements 25 desdits moyens de réception, de manière à effectuer un balayage relatif dudit support par lesdits moyens d'acquisition infrarouge. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre des 30 modes de réalisation non limitatifs de l'invention, en référence à la figure annexée, représentant schématiquement l'architecture du système de détection et de quantification de la fibrose d'un échantillon. La présente invention concerne un système de détection et 35 de quantification de la fibrose au sein d'un échantillon, illustré sur la figure 1. Ledit échantillon 1 consiste en un échantillon tissulaire. Tout d'abord, l'échantillon 1 est fixé pour qu'il conserve un état le plus proche possible de l'état in vivo. La fixation de l'échantillon peut être chimique, par exemple avec du formol, 5 de l'AFA, ou du Liquide de Bouin, ou peut être physique, par exemple par congélation ou lyophilisation. L'échantillon 1 fixé est ensuite déshydraté. La déshydratation est effectuée par des moyens connus de l'homme du métier, par exemple à l'aide d'un automate ou par exemple dans des bains d'alcool croissant et en 10 utilisant des solvants organiques intermédiaires tel que le xylène et le toluène. Ledit échantillon 1 est inclut dans de la paraffine ou de la résine afin d'obtenir un bloc dur. L'inclusion consiste en une imprégnation de l'échantillon dans de la paraffine en 15 surfusion, puis il y a une polymérisation à froid. Après inclusion de l'échantillon, une coupe de l'échantillon inclut est réalisée à l'aide des techniques de microtomie connue. Une telle coupe de l'échantillon peut présenter différentes épaisseurs, en particulier une épaisseur de plusieurs dizaines 20 de micromètres (pm), notamment de 10 à 20 pm. Cette coupe comprenant l'échantillon 1 est positionnée sur un support 2, de préférence ce dernier consiste en une lame transparente aux rayonnements moyens infrarouges du spectre électromagnétique. La coupe comprenant l'échantillon 1 est 25 étalée sur ledit support 2. Aucune autre préparation supplémentaire n'est nécessaire. A ce titre, ledit échantillon 1 est non coloré. En dehors de cette opération de préparation, ledit système permet d'automatiser la détection de la fibrose tissulaire sur 30 un échantillon 1 et la quantification de la fibrose tissulaire par rapport aux autres tissus dudit échantillon 1, s'affranchissant de toute intervention humaine, offrant ainsi une reproductibilité accrue et des résultats objectifs. Pour ce faire, le système selon l'invention fait 35 intervenir une acquisition infrarouge de l'échantillon 1, puis un traitement informatique spécifique des informations spectrales issues de ladite acquisition. Concernant l'acquisition infrarouge, elle s'effectue par balayage de points dudit échantillon 1. Pour ce faire, le support 2 est placé au niveau de moyens 5 de réception 3 tels qu'une platine motorisée. Ces derniers permettent de maintenir en place ledit support 2 au cours de l'opération d'acquisition. Cette acquisition est réalisée par des moyens d'acquisition 4 par spectroscopie infrarouge positionnés en 10 vis-à-vis desdits moyens de réception 3. Préférentiellement, l'invention fait intervenir une spectroscopie infrarouge à transformation de Fournier. Elle associe une excitation polychromatique à un micro-spectromètre infrarouge pour la détection de l'absorption moyen-infrarouge 15 par l'échantillon 1. De façon subsidiaire, une réfrigération continue du détecteur peut être envisagée, afin de limiter le bruit de mesure. On notera alors que ledit support 2 est adapté à la spectroscopie par infrarouge, en particulier à transformation 20 de Fournier. En d'autres termes, le support 2 est constitué d'un matériau exempt de signal parasite en infra-rouge, ce matériau est par exemple du Fluorure de Calcium ou ZnSe pour une acquisition en transmission. Des lames de verre métallisées par argentation peuvent également être utilisées pour une 25 acquisition en mode réflexion. Cette acquisition s'effectue par balayage de points dudit échantillon 1. Un tel balayage peut provenir du déplacement des moyens d'acquisition 4 par rapport aux moyens de réception 3. Préférentiellement, ce sont lesdits moyens de réception 3 qui 30 sont prévus mobiles, tandis que les moyens d'acquisition 4 sont fixes. En d'autres termes, il s'agit d'un balayage relatif dudit support 2 par lesdits moyens d'acquisition 4 infrarouge. Pour ce faire, l'invention intègre des moyens 5 de contrôle des déplacements desdits moyens de réception 3. 35 En outre, ces moyens de contrôle 5 permet aussi de gérer automatiquement les paramètres d'acquisition des moyens 4. Ainsi, les moyens de contrôle 5 permettent d'automatiser et de rendre autonome l'étape d'acquisition de l'intégralité de l'échantillon 1. Lors de l'étape d'acquisition, chaque point rend un 5 spectre infrarouge. Dès lors, on convertit le spectre infrarouge rendu par chaque point acquis en au moins une image spectrale 6. Ce sont lesdits moyens d'acquisition 4 qui convertissent le spectre infrarouge rendu par chaque point acquis en ladite 10 image spectrale 6. A ce titre, ladite image spectrale est une représentation numérique de tous les points acquis. Les points sont repérés par leurs coordonnées dans l'espace selon deux dimensions. Chaque point constitue un pixel de ladite image 6. 15 Afin de quantifier la fibrose, on effectue un traitement numérique de ladite image spectrale 6. Ce traitement s'effectue par des moyens de traitement 8 adaptés. Le traitement consiste en une discrimination entre au moins le collagène physiologique et le collagène pathologique en attribuant à chaque point une 20 classe spectrale par comparaison avec un modèle numérique de spectres 7. Un tel modèle consiste en l'acquisition d'un large panel dit « d'entrainement » de biopsies rénales avec différents degrés de fibrose, pour lesquels l'attribution de chaque classe 25 a été réalisée par un anatomopathologiste expert en pathologie rénale, puis ce panel a subit une validation interne sur un second panel de biopsies. Un contrôle des résultats du modèle a été effectué puis une validation externe sur un troisième panel de biopsies analysées en aveugle afin de renforcer la 30 robustesse de ce modèle. Ainsi, à partir des valeurs des spectres mesurés des points de l'échantillon, il est possible de différencier les tissus présentant une fibrose des autres tissus. En particulier, lesdites classes peuvent être au nombre 35 d'au moins deux, mais préférentiellement quatre : collagène physiologique, collagène issue de la fibrose, inflammation et parenchyme « normal » (non collagènique, non fibreux et non inflammatoire). D'autres classes peuvent éventuellement être ajoutées. Préalablement, le traitement comprend une étape 5 automatisée de prétraitement des spectres, consistant en l'élimination des bruits de fond provenant du support 2 et du détecteur et en la neutralisation des interférences spectrale de la paraffine. Ce prétraitement consiste donc à améliorer la qualité de l'image 6, en éliminant également les spectres de 10 rapport signal/bruit insuffisant. Ledit prétraitement est effectué automatiquement, par un algorithme dédié. Ensuite, on quantifie statistiquement les points possédant une classe spectrale similaire et on enregistre le résultat 10. Ce sont les moyens de traitement 8 qui assurent automatiquement 15 ces regroupements statistiquement multivariés par classe. Des moyens 9 d'enregistrement numérique assurent ensuite la sauvegarde du résultat 10 issu desdits moyens de traitement 8. On entend par « similaire » des points ayant reçu en attribution une classe identique ou bien des classes 20 équivalentes. Dans ce dernier cas, plusieurs classes peuvent être regroupées en une seule et même classe globale, de taille plus importante. En particulier, on quantifie statistiquement les points d'une même classe sous la forme d'un pourcentage surfacique 11 25 de la surface totale dudit échantillon 1. En d'autres termes, on calcule le rapport en pourcentage du nombre de points de chaque classe par rapport au nombre total de points, correspondant à la surface totale de l'échantillon 1. Ainsi, il est possible d'obtenir automatiquement la 30 proportion de tissus possédant une fibrose pathologique par rapport aux autres tissus sains. Dès lors, il n'est plus nécessaire à un opérateur spécialisé d'interpréter les résultats, qui sont directement disponibles sous forme d'une valeur représentative de l'avancement de la fibrose. 35 De façon subsidiaire, l'invention prévoit d'améliorer la pertinence du résultat 10 issu du traitement automatique, en combinant tous les résultats au sein d'une base de données. Dès lors, le résultat obtenu vient se coupler aux résultats établis précédemment lors de l'analyse antérieure d'autres échantillons. Pour ce faire, on combine ledit résultat 10 audit modèle 7 avant de réitérer ledit procédé avec un autre échantillon. Cette évolutivité du modèle permet en particulier d'affiner les classes spectrales afin d'inclure ou d'exclure des pixels dans une classe donnée et par là même améliorer la robustesse du modèle Comme évoqué précédemment, l'invention a pour objet un procédé de détection et de quantification de la fibrose, dans lequel au moins : - on positionne sur un support 2 un échantillon tissulaire 1 fixé non coloré ; - on effectue une acquisition infrarouge par balayage de points dudit échantillon 1 ; - on convertit le spectre infrarouge rendu par chaque point acquis en au moins une image spectrale 6 ; - on effectue un traitement numérique de ladite image spectrale 6 par discrimination entre au moins le collagène physiologique et le collagène pathologique issue de la fibrose en attribuant à chaque point une classe spectrale par comparaison statistique avec un modèle numérique de spectres ; - on quantifie les points possédant une classe spectrale 25 similaire et on enregistre le résultat. L'invention concerne aussi un dispositif de détection et de quantification de la fibrose, comprenant au moins : - des moyens de réception 3 d'un support 2 d'un échantillon tissulaire 1 ; 30 - des moyens d'acquisition 4 par spectroscopie infrarouge à transformation de Fournier positionnés en vis-à-vis desdits moyens de réception 3, lesdits moyens d'acquisition 4 convertissant le spectre infrarouge rendu par chaque point acquis en au moins une image spectrale 6 ; 35 - des moyens de traitement numérique de ladite image spectrale 6 par discrimination entre au moins le collagène physiologique et le collagène pathologique en attribuant à chaque point une classe spectrale par comparaison statistique avec un modèle numérique de spectres dont est pourvu lesdits moyens de traitement, lesdits moyens de traitement quantifiant les points possédant une classe spectrale similaire ; - des moyens d'enregistrement numérique du résultat desdits moyens de traitement. De façon subsidiaire, tous les éléments, les aspects et les moyens numériques et informatiques, en particulier les algorithmes et les modèles numériques, sont exécutés au travers des terminaux numériques et informatiques dédiés, notamment connectés entre eux par l'intermédiaire de réseaux et de moyens de communication adaptés. REVENDICATIONS1. Procédé de détection et de quantification de la fibrose, dans lequel au moins : - on positionne sur un support un échantillon tissulaire fixé non coloré ; - on effectue une acquisition infrarouge par balayage de points dudit échantillon ; - on convertit le spectre infrarouge rendu par chaque 10 point acquis en au moins une image spectrale ; - on effectue un traitement numérique de ladite image spectrale par discrimination entre au moins le collagène physiologique et le collagène pathologique issu de la fibrose en attribuant à chaque point une classe spectrale définie par 15 un algorithme classant les spectres selon leur similitudes spectrale ; - puis on attribue à chaque classe un état par comparaison statistique avec un modèle numérique de spectres ; - on quantifie la surface relative occupée par les points 20 les points de chaque état et on enregistre le résultat. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ladite acquisition infrarouge s'effectue par spectroscopie infrarouge à transformation de Fourrier. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 précédentes, caractérisé en ce que ledit traitement comprend une étape préalable de prétraitement, consistant en l'élimination spectrale des bruits de fond provenant du support et du détecteur et en la neutralisation des interférences de la paraffine. 30 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites classes sont au nombre de quatre, dont les états sont nommés : normal, fibrose, collagène non fibreux, inflammation. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 35 précédentes, caractérisé en ce que ladite discriminations'effectue par comparaison de la valeur du spectre de chaque point avec des plages de valeurs de spectres dudit modèle, 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on quantifie statistiquement 5 les points d'une même classe sous la forme d'un pourcentage surfacique de la surface totale dudit échantillon. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on combine ledit résultat audit modèle avant de réitérer ledit procédé avec un autre 10 échantillon. 8. Dispositif de détection et de quantification de la fibrose, comprenant au moins : - des moyens de réception d'un support d'un échantillon tissulaire ; 15 - des moyens d'acquisition par spectroscopie infrarouge à transformation de Fournier positionnés en vis-à-vis desdits moyens de réception, lesdits moyens d'acquisition convertissant le spectre infrarouge rendu par chaque point acquis en au moins une image spectrale ; 20 - des moyens de traitement numérique de ladite image spectrale par discrimination entre au moins le collagène physiologique et le collagène pathologique en attribuant à chaque point une classe spectrale par comparaison statistique avec un modèle numérique de spectres dont est pourvu lesdits 25 moyens de traitement, lesdits moyens de traitement quantifiant les points possédant une classe spectrale similaire ; des moyens d'enregistrement numérique du résultat desdits moyens de traitement. 9. Dispositif selon la revendication précédente, 30 caractérisé par le fait que lesdits moyens de réception sont motorisés et que ledit dispositif comprend des moyens de contrôle des déplacements desdits moyens de réception, de manière à effectuer un balayage relatif dudit support par lesdits moyens d'acquisition infrarouge. 35