Brevet FR3029936A1 — publié le 20160617

PROCEDE ET DISPOSITIF DE CARACTERISATION DU POUVOIR INHIBITEUR D'UNE MOLECULE SUR UN MICROORGANISME DOMAINE DE L'INVENTION L'invention a trait au domaine de l'analyse du pouvoir inhibiteur d'une molécule sur la croissance d'un microorganisme, et notamment le pouvoir inhibiteur d'un antibiotique sur la croissance d'une bactérie et le pouvoir inhibiteur d'un antifongique sur la croissance d'une levure ou d'une moisissure. ETAT DE LA TECHNIQUE L'activité d'un antibiotique sur une bactérie est caractérisée notamment par la « concentration minimale inhibitrice », ou CMI, qui se définit comme la concentration 15 minimale de l'antibiotique à mélanger à une population de la bactérie pour inhiber en totalité sa multiplication. Une première technique employée pour mesurer la CMI consiste, pour un technicien de laboratoire, à préparer plusieurs tubes à paroi transparente comprenant une concentration 20 initiale de la bactérie, concentration qui est identique pour tous les tubes, un milieu nutritif pour la bactérie, et une concentration initiale d'antibiotique qui est croissante en fonction de l'ordre des tubes disposés dans un rack. Une fois les tubes préparés avec le gradient de concentration d'antibiotique, le technicien met en alors en incubation les tubes. Si la concentration d'un antibiotique dans un tube est trop faible pour inhiber la 25 croissance des bactéries, un trouble apparait dans le tube, ce trouble étant de plus en plus présent à mesure que la population bactérienne croît. Après une durée d'incubation donnée, le technicien de laboratoire inspecte donc visuellement les tubes et identifie la CMI comme étant égale à la concentration d'antibiotique la plus faible parmi les tubes qui ne montrent aucun trouble. On conçoit aisément l'imprécision d'une telle méthode. 30 Non seulement le nombre de tubes préparés est très réduits, usuellement à moins de 10, ce qui ne permet pas d'obtenir une précision élevée sur la CMI, mais en outre l'identification de celle-ci dépend du jugement d'un technicien concernant la présence ou non d'un trouble dans un tube. 35 Des dispositifs et procédés ont donc été mis au point pour augmenter à la fois la précision sur la concentration d'antibiotique dans un échantillon et la robustesse de la détection d'une croissance bactérienne dans un échantillon. Plus particulièrement, des dispositifs sont aujourd'hui capables de préparer une grande quantité d'échantillons bactériens, 10 3029936 2 pouvant chacun comprendre leur propre concentration d'antibiotique, et capables de mesurer automatiquement et avec précision une grandeur qui dépend de la taille de la population bactérienne dans un échantillon, par exemple une fluorescence ou une densité optique. Notamment, le dispositif décrit dans l'article « Millifluidic droplet analyser for 5 microbiology » de L. Baraban et al, Lab on Chip, 2011, 11, 4057, produit un train de gouttelettes de volume inférieur au microlitre et dont la composition en bactéries, milieu nutritif et antibiotique peut être ajustée avec précision. Un tel dispositif permet notamment de produire un train de plusieurs centaines à plusieurs milliers de gouttelettes de volume constant et comprenant chacune un nombre initial fixe de bactéries, et une concentration initiale d'antibiotique qui est décroissante en fonction de la position des gouttelettes dans le train. En se référant à la vue schématique de la figure 1, ce dispositif 10 comporte pour la production du train de gouttelettes : - trois seringues 12, 14, 16, dont le débit est pilotable et contenant respectivement une solution aqueuse de bactéries, une solution aqueuse de nutriments et une solution aqueuse d'antibiotique. Les seringues 12, 14, 16 injectent de manière contrôlée leurs contenus dans une jonction 18 où ils sont mélangés pour former une solution aqueuse ; et - deux seringues 20, 22 dont le débit est pilotable et contenant respectivement une première et une seconde huiles, non miscibles avec la solution aqueuse, et non miscibles entre elles. Le contenu de ces seringues est injecté au niveau d'une jonction 24. Cette jonction reçoit par ailleurs la solution aqueuse en provenance de la jonction 18 et débouche sur un tube principal transparent 26. La première huile, par exemple du type hydrofluoroéther, notamment du HFE-7500®, sert de milieu continu dans lequel des gouttelettes de solution aqueuse en provenance de la jonction 18 sont déposées. La seconde huile, minérale, est utilisée pour former des éléments d'espacement des gouttelettes. Notamment, après chaque gouttelette de solution aqueuse formée dans la première huile, une gouttelette de la seconde huile est déposée dans la première huile. En se référant à la figure 2, les seringues 12, 14, 16, 20, 22 sont donc pilotées par ordinateur afin d'obtenir un train uniforme, tant en volume qu'en espacement, de gouttelettes de solution bactérienne dans le tube 26. Sur la figure 2 sont illustrées trois gouttelettes de solution bactérienne Gk_i, Gk et Gk-pi formées successivement dans la première huile 28 et séparées les unes des autres par des gouttelettes d'espacement Sk-1, Sk, Sk-pi constituées de la seconde huile. On note notamment que les gouttelettes Gk-1, Gk et Gk-pi sont naturellement référencées par leur position dans le train de gouttelettes, ou de 3029936 3 manière équivalente par un numéro, ou index, entier k. L'entier « 1 » correspond ainsi à la gouttelette formée en premier dans le train objet de l'étude par l'analyseur. Le contenu des trois premières seringues 12, 14, 16 et leur commande par ordinateur permet d'obtenir des gouttelettes comprenant : 5 - une même concentration initiale de bactéries [bact]ini(k) = constante, telle qu'illustré par la courbe 30, ou un nombre initial No constant de bactéries ; - et une concentration initiale d'antibiotique [AT/3] ini(k) qui décroit en fonction de la position k de la gouttelette dans le train de gouttelette, comme cela est illustré par la courbe 32. 10 Pour la partie détection de la population de bactérie dans les gouttelettes, le dispositif 10 comporte : - un tube secondaire 28 en parallèle du tube principal 26, une vanne pilotable 30 permettant d'injecter l'huile de la seringue 20 soit dans le tube 26 soit dans le tube 15 secondaire 28, et deux vannes 32, 34, disposées respectivement en début et en fin du tube principal 26 et pilotables entre une position ouverte et une position fermée. Les vannes 30, 32, 34, pilotées par ordinateur, permettent ainsi de définir deux écoulements « A » et « B » de sens opposés dans le tube principal 26, et donc un mouvement de va-et-vient 36 des gouttelettes dans le tube transparent 26 ; et 20 - un système de détection 38, disposé en face du tube 26, pour mesurer la fluorescence des gouttelettes à une longueur d'onde particulière. Notamment, les bactéries contenues dans les gouttelettes comprennent une molécule fluorescente, soit naturellement, soit artificiellement (par exemple par incorporation dans 25 le génome de la bactérie d'un gène codant une protéine fluorescente). En variante, le milieu nutritif des gouttelettes comprend un élément métabolisable par les bactéries sous la forme d'une molécule fluorescente. La fluorescence d'une gouttelette dépend donc directement du nombre de bactéries contenues dans celle-ci. Le système de détection 38 comporte un ensemble d'éléments et circuits pour former un spot lumineux sur le tube 30 principal 26 de manière à exciter la longueur d'onde de fluorescence des molécules fluorescentes, et mesurer la fluorescence induite par cette excitation. Ainsi, en se référant à la figure 3A, qui illustre un mouvement vers la gauche des gouttelettes Gk-1, Gk et Gk+1, chacune d'entre elles passent dans le spot de détection 35 du système 38. Le signal de mesure induit par le passage des gouttelettes Gk-1, Gk et Gk-Pi devant le système 28 produit 35 un signal tel qu'illustré à la figure 3B, à savoir un train d'impulsions sensiblement sous la forme de créneaux /k+1 (tpk+1), lic(tpk), 3029936 4 Le dispositif 10 permet un passage rapide de l'ensemble des gouttelettes dans le spot 35. Le passage de toutes les gouttelettes dans le spot 35 peut prendre en effet moins d'une minute. La fréquence des passages devant le spot 35 et/ou la fréquence des mesures peut quant à elle être réglée indépendamment de la vitesse du mouvement de va-et-vient. Pour 5 des bactéries par exemple, la fluorescence des gouttelettes est mesurée environs 8 fois par heure ou toutes les 7 à 8 minutes durant 2h à 16h environ. En fonctionnement, le dispositif 10 produit donc un train de N gouttelettes dans le tube principal 26, puis la seringue 20 et les vannes 30, 32, sont pilotées afin de produire un 10 mouvement de va-et-vient des gouttelettes dans le tube 26 afin que chacune des gouttelettes passe à intervalle régulier devant le système de détecteur 28 qui mesure sa fluorescence. Un cycle de mesure est ainsi constitué du passage de l'ensemble des gouttelettes dans le spot 35 pour leur mesure. Lors d'un cycle de mesure «p », les gouttelettes sont mesurées à des instants différents, l'instant de mesure d'une 15 gouttelette « k» étant égal à tpk. L'instant tp est quant à lui l'instant de mesure de la dernière gouttelette lors du plème cycle, c'est-à-dire l'instant de mesure t' ou tp en fonction du sens du va-et-vient lors du plème cyle de mesure. Le signal de mesure est ensuite traité par ordinateur pour réduire chaque impulsion 20 mesurée /k(tpk) à une valeur xk(tpk), par exemple la moyenne du plateau de chaque impulsion, et les valeurs xk(tpk) ainsi produites sont mémorisées dans l'ordinateur avec leur instant d'acquisition tpk. Les valeurs xk(tpk) sont donc représentatives de la quantité de bactéries contenues dans les gouttelettes. Pour chaque gouttelette k, il est donc produit /c un ensemble de mesures {x (dicd ), x (), , xk(tpk), , xk(c)} correspondant à 25 l'ensemble d'instants de mesures {d, tz, ..., tpk, ..., te} jusqu'à l'instant te = tp. Notamment, chaque instant d'acquisition tpk correspond à une durée particulière d'incubation des gouttelettes. Les figures 4A et 4B illustrent par exemple les valeurs xk(tpk) en fonction du numéro k 30 des gouttelettes k E [1; N], respectivement pour le premier cycle de mesure et pour un cycle de mesure correspondant à tp = 400 minutes. Ces figures correspondent à la production de 1300 gouttelettes comprenant initialement chacune 1000 bactéries E. coli avec une concentration d'antibiotique « cefotaxime » (ou CTX) variant régulièrement de 0,0015pg.mL-1 à 0.031.1.g.mL-1, soit une précision sur la concentration inférieure à 10-4 35 lag.mL-1. On constate sur ces figures qu'une partie des gouttelettes voient leurs mesures xk(tpk) croitre par rapport à leurs instants initiaux respectifs d, ce qui signifie donc une croissance de la population des bactéries qu'elles contiennent, et corolairement que la concentration initiale d'antibiotique qu'elles contiennent était insuffisante pour 3029936 5 totalement inhiber cette croissance. La figure 5 illustre le même phénomène en fonction de l'ensemble des instants de mesure compris entre 0 et 1400 minutes. La détermination de la concentration minimale inhibitrice CMI est alors réalisée en 5 incubant les gouttelettes pendant une durée jugée satisfaisante, puis en partageant les gouttelettes du dernier cycle de mesure p en deux ensembles, à savoir entre celles dont le signal de mesure xic(te) reste sensiblement identique à leur signal initial xic(d) et celles dont le signal de mesure xic(te) est supérieur à leur signal initial .e(d). Il est ainsi déterminé le numéro kin, divisant les gouttelettes en ces deux ensembles. Le gradient de 10 concentration étant défini en fonction du numéro k des gouttelettes, la concentration CMI est alors égale à la concentration initiale d'antibiotique de la gouttelette de numéro kin,. Les inventeurs ont mené des essais de détermination de concentrations CMI à l'aide du dispositif venant d'être décrit, ces essais étant illustrés aux figures 6A-6C. Ces dernières 15 illustrent des essais menés sur 5 répliquats d'une souche de E. Coli (« répliquat 1 » à « répliquat 5 ») en présence de gentamycine (figure 6A), de chloramphénicol (figure 6B) ou d'acide nalidixique (figure 6C). Sur ces figures, les abscisses représentent le temps d'incubation des gouttelettes (en minutes) et les ordonnées la concentration MIC (en 1.1.g.mL-1) déterminée par « découpage » de l'ensemble des gouttelettes tel que décrit ci- 20 dessus. Un point d'une courbe, de coordonnées (MICA, tp), représente donc la détermination de la concentration CMI en fonction des valeurs xic(tpk) des gouttelettes acquises pour le cycle de mesure p. La souche d'E. Coli utilisée pour les tests est une souche connue, de référence ATCC 25922, dont une CMI est connue pour les trois antibiotiques considéré. Le trait en pointillés de ces figures représente la 25 concentration CMI reconnue par l'administration française, ou CMI « réglementaire » (0,5 1.1.g.mL-1 pour le gentamycine, 4 1.1.g.mL-1 pour le chloramphénicol et 2 1.1.g.mL-1 pour l'acide nalidixique) et la bande grisée autour de la CMI réglementaire correspond à l'intervalle de tolérance pour lequel une mesure de la CMI par un technique quelconque est jugée réglementairement conforme. La concentration CMI réglementaire est 30 déterminée selon la technique manuelle décrite ci-dessus pour une durée d'incubation fixée réglementairement de 18 à 24h, et l'intervalle de tolérance correspond une dilution +1/-1 autour de cette concentration. A la vue de ces résultats, on remarque notamment qu'il n'y a pas de convergence de la 35 concentration CMI déterminée selon la méthode de « découpage », celle-ci continuant d'augmenter sur une longue période. Ce comportement de la concentration CMI pourrait s'expliquer en partie par le type de détection par fluorescence utilisée. En effet, dans le cadre d'un antibiotique bactériostatique, lorsque la fluorescence mesurée est celle de 3029936 6 molécules rejetées par les bactéries suite à la digestion du milieu nutritif, la quantité de ces molécules peut augmenter alors que le nombre de bactérie reste sable. Toutefois, ceci n'expliquerait que très partiellement le comportement de la concentration MIC. Sans être lié à la théorie, les inventeurs pensent que les dispositifs tel que celui décrit 5 précédemment mettent à jour des phénomènes qui étaient masqués par la technique de référence de détermination de la concentration CMI. Une détermination précise et robuste de la concentration minimale inhibitrice « réelle » (par opposition à la CMI « réglementaire ») en fonction des données produites par un dispositif aussi précis que celui décrit dans l'article « Millifluidic droplet analyser for microbiology », ou de tout 10 autre dispositif analogue capable de produire un grand nombre de « incubateurs » en contrôlant avec précision leurs contenus initiaux, soulève donc de nouveau problème, et est donc en pratique difficile. Ce même constat se pose également pour toute grandeur utilisée pour caractériser le 15 pouvoir inhibiteur d'une molécule sur des microorganismes (bactéries, levure, moisissure, etc), comme par exemple le taux de croissance des bactéries, la phase de latence de la croissance, le nombre maximum de bactéries par volume, des intervalles de concentration d'antibiotiques partiellement inhibitrices, etc. 20 EXPOSE DE L'INVENTION Le but de la présente invention est de résoudre le problème susmentionné en proposant une détermination plus robuste et plus précise du pouvoir inhibiteur d'une molécule sur un microorganisme, par exemple la concentration MIC réelle. 25 A cet effet, l'invention a pour objet un procédé d'estimation d'une grandeur G inhib quantifiant le pouvoir inhibiteur d'une molécule sur un microorganisme d'un type prédéterminé, comprenant : - la réalisation d'une pluralité d'échantillons, comprenant chacun au moins un 30 microorganisme dudit type, un milieu nutritif pour le microorganisme et une quantité initiale de la molécule par microorganisme dudit type présent dans l'échantillon, ladite quantité initiale étant croissante dans un intervalle ro L, min Qmax] en fonction d'un classement prédéterminé des échantillons ; - l'incubation des échantillons ; 35 - pour chaque échantillon, la mesure de la croissance des microorganismes dans l'échantillon en fonction du temps pendant une durée d'incubation prédéterminée ; et - la détermination de la grandeur Ginhib en fonction des mesures de la croissance des microorganismes dans les échantillons, 3029936 7 Selon l'invention, la détermination de la grandeur G inhib comprend : pour chaque échantillon, le calcul d'une valeur reflétant la croissance du microorganisme dudit type en fonction de la mesure de croissance des 5 microorganismes dans l'échantillon; le classement des valeurs calculées pour les échantillons en fonction du classement des échantillons ; et la détermination de la grandeur Ginhib en fonction de l'évolution des valeurs classées. 10 En d'autres termes, la détermination de la grandeur G inhib n'est pas réalisée sur les valeurs xk(te), ou toutes autres grandeurs qui y seraient directement liées, comme par exemple la taille de la population bactérienne calculée en fonction de ces valeurs pour un temps tp ou un cycle P donné. Une information sur la dynamique de croissance des 15 bactéries est tout d'abord déterminée en fonction des valeurs txk(d),x.k(02c), ...,xic(tpk), ..., k k 1 X- (t p) j et c' est cette information qui est traitée ensuite pour déterminer la grandeur G inhib - Cette information est recherchée avantageusement en se fondant sur une connaissance a 20 priori du comportement des bactéries, notamment à l'aide d'un modèle de croissance dont on identifie au moins l'un des paramètres contenant une information sur la dynamique de croissance. Comme cela sera détaillé ci-après, la détermination de la grandeur G inhib se fait alors rapidement, de manière plus précise et reproductible. En outre, l'ensemble du procédé est automatisé et donc moins dépendant de l'interprétation des opérateurs. 25 Selon un mode de réalisation : - la croissance du microorganisme est modélisée par un modèle de croissance en fonction du temps comprenant : - une première phase de latence de durée X ; 30 - suivie d'une seconde phase de croissance exponentielle de pente maximale p dans l'espace logarithmique ; et - suivie d'une troisième phase stationnaire de valeur maximale A ; et la valeur reflétant la croissance du microorganisme dudit type en fonction du temps est une estimation de la pente maximale p. et/ou une estimation de la durée de 35 la phase de latence X. 3029936 8 En d'autres termes, le profil de croissance correspond à celui proposé par Rosso L. dans sa thèse « Modélisation et microbiologie prévisionnelle : élaboration d'un nouvel outil pour l'agroalimentaire. » Thèse de doctorat, Université Claude Bernard Lyon 1, 1995. La pente p. et la phase de latence X sont en effet chacune directement liée à la dynamique de 5 croissance des bactéries. Selon un mode de réalisation : [Qinmrinc ninmrci - la grandeur Ginhib comprend un intervalle ax I pour lequel la croissance des microorganismes dans les échantillons est au moins partiellement inhibée ; 10 - la quantité initiale de la molécule en fonction du classement des échantillons comprend : - une première partie constante sur plusieurs échantillons et égale à Qmin , la borne inférieure Qmin de l'intervalle [Qmin Qmax] étant choisie de sorte qu'il n'y a aucune inhibition de la croissance des microorganismes dans les 15 échantillons ; - suivie d'une seconde partie strictement croissante de Qmin à Qmax ; - suivie d'une troisième partie constante sur plusieurs échantillons et égale à Qmax, la borne supérieure Qmax de l'intervalle [0 Qmax] étant choisie de sorte qu'il y a une inhibition totale de la croissance des microorganismes dans 20 les échantillons ; rnivirc nmici - et la détermination de l'intervalle comprend : L'emin Ymax] - l'identification d'une zone de transition dans l'évolution des valeurs classées entre deux zones extrêmes sensiblement stationnaires de ladite évolution; et veinc Qinmracxi - la détermination de l'intervalle comme étant l'intervalle 25 correspondant aux échantillons de la zone de transition identifiée. En d'autres termes, grâce à la construction particulière des échantillons, il est possible Qinyn d'identifier de manière plus aisée l'intervalle veinc acxidans lequel. Cet intervalle, qui est la zone de transition de l'effet inhibiteur de la molécule, entre aucun effet 30 inhibiteur et un effet inhibiteur complet, est en soi une grandeur utile Ginhib et comporte en outre d'autres types d'informations utiles, comme par exemple la concentration MIC. Notamment, l'identification de la zone de transition comprend la détermination de deux points d'inflexion de l'évolution des valeurs classées, la zone de transition étant bornée 35 par les deux points d'inflexion déterminés. Notamment, l'indentification de la zone de transition comprend la modélisation de l'évolution des valeurs classées par une fonction continue linéaire par morceau comprenant uniquement deux segments de droite extrêmes 3029936 9 et un segment de droite intermédiaire compris entre les deux segments de droite extrême, le segment de droite intermédiaire étant la zone de transition. Selon une variante avantageuse, la grandeur G inhib comprend une quantité initiale 5 minimale de molécules Qmic qui est totalement inhibitrice de la croissance des microorganismes, et ladite quantité initiale minimale inhibitrice Qmic étant choisie égale à la borne supérieure Qinm/acx de l'intervalle [Qinmrinc Qinmracx]. Selon un mode de réalisation, la borne inférieure Qnun de l'intervalle [Qmin Qmax] est 10 une quantité nulle de la molécule, par exemple un antibiotique. Selon un mode de réalisation : - les mesures de la croissance des bactéries dans les échantillons et la détermination de la grandeur G inhib en fonction desdites mesures sont mises en oeuvre pour des durées 15 d'incubation croissantes de manière à obtenir une séquence de grandeur G inhib en fonction de la durée d'incubation des échantillons ; - le procédé comprend l'analyse de la stabilité de ladite séquence en fonction de la durée d'incubation; et - la grandeur G inhib est la valeur de la séquence une fois la séquence stabilisée. 20 En d'autres termes, l'invention permet de déterminer une séquence correspondant à la grandeur G inhib qui est convergente, ce qui permet de mettre en oeuvre un test de stabilité, et donc un test permettant la détection et l'arrêt automatique de l'incubation et/ou du traitement des données. Notamment, la précision de l'estimation augmente avec la 25 longueur de la séquence. Selon un mode de réalisation, les échantillons comprennent chacun initialement au moins 100 microorganismes, et de préférence au moins 500 microorganismes. En d'autres termes, prévoir un nombre initial minimal de bactéries évite d'exacerber la 30 particularité d'une bactérie particulière. Bien entendu, grâce à l'invention, il est également possible d'étudier une population plus réduite, voir même un microorganisme si l'on souhaite connaître l'effet de la molécule sur ce microorganisme en particulier, comme pour l'étude des phénomènes d'hétéro-résistance d'une bactérie par exemple. 35 Selon un mode de réalisation, les échantillons comprennent chacun une quantité initiale d'une deuxième molécule différente apte à inhiber la croissance des microorganismes, notamment une quantité initiale identique pour tous les échantillons. En d'autres termes, 3029936 10 l'invention permet d'étudier les effets de synergie entre des agents inhibiteurs, par exemple des antibiotiques. Selon un mode de réalisation, la quantité minimale de la molécule par microorganisme 5 dudit type est une concentration de la molécule dans les échantillons, la concentration initiale de microorganisme dudit type dans les échantillons étant constante en fonction du classement des échantillons. Selon un mode de réalisation, le microorganisme est une bactérie, et la molécule est un 10 antibiotique. En variante, le microorganisme est une levure ou une moisissure, et la molécule est un antifongique. Selon un mode de réalisation, le milieu nutritif comporte un élément métabolisable par le microorganisme sous la forme de molécule fluorescente, et la mesure de la croissance des 15 microorganismes dans les échantillons est une mesure de la fluorescence des échantillons. En variante, l'absorbance des échantillons est variable en fonction de la quantité de microorganismes présents dans ceux-ci, et en ce que la mesure de la croissance des microorganismes dans les échantillons est une mesure de densité optique. 20 Selon un mode de réalisation, la réalisation de la pluralité d'échantillon comporte la réalisation d'un train de gouttes formant échantillons dans de l'huile. L'invention a également pour objet un dispositif d'estimation d'une grandeur G inhib quantifiant le pouvoir inhibiteur d'une molécule sur un microorganisme d'un type 25 prédéterminé, comprenant : des moyens pour la réalisation d'une pluralité d'échantillons, comprenant chacun au moins un microorganisme dudit type, un milieu nutritif pour le microorganisme et une quantité initiale de la molécule par microorganisme dudit type présent dans l'échantillon, ladite quantité initiale étant croissante dans un intervalle ro L, min Qmax] 30 en fonction d'un classement prédéterminé des échantillons ; des moyens pour l'incubation des échantillons ; des moyens pour la mesure de la croissance des microorganismes dans chaque échantillon en fonction du temps pendant une durée d'incubation prédéterminée ; et des moyens de calcul pour la détermination de la grandeur Ginhib en fonction des 35 mesures de la croissance des microorganismes dans les échantillons, 3029936 11 Selon l'invention, les moyens de calcul sont aptes à mettre en oeuvre : pour chaque échantillon, le calcul d'une valeur d'un paramètre d'un modèle paramétrique de croissance du microorganisme dudit type en fonction de la mesure de croissance des microorganismes dans l'échantillon; 5 le classement des valeurs calculées pour les échantillons en fonction du classement des échantillons ; et la détermination de la grandeur Ginhib en fonction de l'évolution des valeurs classées. 10 Notamment, le dispositif est apte à mettre en oeuvre un procédé du type précité. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, à l'appui des 15 figures annexées, dans lesquelles : la figure 1 est une vue schématique simplifiée de l'analyseur décrit dans l'article «Millifluidic droplet analyser for microbiology » ; la figure 2 est un exemple de gouttelettes produites par l'analyseur de la figure 1 ; la figure 3 est un schéma décrivant la production de signaux de fluorescence par 20 l'analyseur de la figure 1 ; les figures 4A et 4B sont des tracés de mesures de fluorescence en fonction du numéro des gouttelettes produites, respectivement à 0 minute et 400 minutes ; la figure 5 est un tracé de mesures de fluorescence en fonction du numéro des gouttelettes produites et du temps ; 25 les figures 6A à 6C sont des tracés illustrant la détermination de la concentration minimale inhibitrice selon une méthode de découpage de l'état de la technique, pour des essais réalisés sur l'E. Coli avec trois antibiotiques différents ; la figure 7 est un organigramme d'un mode de réalisation du procédé selon l'invention ; 30 la figure 8 est un tracé illustrant un profil de concentration initiale d'antibiotique dans les gouttelettes généré lors du procédé selon l'invention ; la figure 9 est un tracé illustrant des consignes de débit des seringues de l'analyseur de la figure 1, généré en fonction du profil de la figure 8 ; la figure 10 est un tracé des mesures de fluorescence des gouttelettes produites par 35 les consignes de la figure 9 en fonction du temps ; la figure 11 est un tracé illustrant des mesures de fluorescences en fonction du numéro des gouttelettes pour différents instants de mesure ; 3029936 12 - les figures 12A et 12B sont des tracés illustrant l'estimation de la concentration initiale réelle d'antibiotique dans les gouttelettes pour deux essais différents ; - la figure 13 est un tracé illustrant la croissance de bactérie en présence de nutriments et en fonction du temps ; 5 - la figure 14 est un tracé illustrant la transformation des mesures de fluorescence en séquence de taux maximum de croissance des bactéries en fonction du numéro des gouttelettes ; - la figure 15 est un tracé illustrant la transformation des mesures de fluorescence en séquences de durées de phase de latence de la croissance des bactéries en fonction du 10 numéro des gouttelettes ; - les figures 16A et 16B sont des tracés illustrant respectivement une phase de transition dans une séquence de taux maximum de croissance et l'approximation de la séquence de taux maximum de croissance par une fonction linéaire par morceaux ; - les figures 17 et 18 sont des tracés illustrant des zones de transition obtenues 15 respectivement sur une séquence de taux maximum de croissance et une séquence de durées de phase de latence ; et - les figures 19A à 19C sont des tracés illustrant la détermination de la concentration minimale inhibitrice selon l'invention, pour les essais réalisés sur l'E. Coli avec trois antibiotiques différents des figures 6A à 6C. 20 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION EXEMPLE DE REALISATION 25 Il va à présent être décrit en relation avec l'organigramme de la figure 7 un mode de réalisation du procédé selon l'invention, des étapes de ce procédé étant illustrées par les figures 8 à 19. Le procédé est appliqué à la détermination d'une concentration minimale inhibitrice MIC de la croissance de bactéries, à l'aide du dispositif 10 décrit dans l'article «Millifluidic droplet analyser for microbiology» et sommairement décrit ci-dessus en 30 relation avec la figure 1. La commande des organes de ce dispositif et le traitement des mesures sont réalisés à l'aide d'une unité de traitement d'information classique, par exemple un ordinateur. Le procédé comporte la production, en 50, de données expérimentales sur la croissance 35 de bactéries en présence d'un gradient d'antibiotique, et l'analyse, en 52, des données produites pour déterminer la concentration MIC. 3029936 13 L'étape de production 50 comporte une première étape 54 de détermination de paramètres pour la production des données. L'étape 54 comprend notamment la définition d'un intervalle de concentration [Cmin; Cmax] dans lequel la concentration CMI est supposément comprise, à savoir Cmin Nmin de la gouttelette dont la mesure lissée eflnin est supérieure de X% à la valeur Z N min , par exemple de 1%. De manière analogue, la valeur maximale Z = 20 max{e, e, ...,,N} des mesures lissées est identifiée et la fin du gradient est identifiée comme le plus grand numéro Ngmax Nem De manière analogue, la courbe M(tp) est sensiblement nulle sur un intervalle [Nc.mI(4); Ar] avec Nc.m/(tp) REVENDICATIONS1. Procédé d'estimation d'une grandeur G inhib quantifiant le pouvoir inhibiteur d'une molécule sur un microorganisme d'un type prédéterminé, comprenant : - la réalisation (50) d'une pluralité d'échantillons, comprenant chacun au moins un microorganisme dudit type, un milieu nutritif pour le microorganisme et une quantité initiale de la molécule par microorganisme dudit type présent dans l'échantillon, ladite quantité initiale étant croissante dans un intervalle [Qmin Qmax] en fonction d'un classement prédéterminé des échantillons ; - l'incubation des échantillons; - pour chaque échantillon, la mesure (50) de la croissance des microorganismes dans l'échantillon en fonction du temps pendant une durée d'incubation prédéterminée ; et - la détermination (52) de la grandeur Ginhib en fonction des mesures de la croissance des microorganismes dans les échantillons, caractérisé en ce que la détermination (52) de la grandeur G inhib comprend : - pour chaque échantillon, le calcul (66) d'une valeur reflétant la croissance du microorganisme dudit type à partir de mesures de croissance des microorganismes dans l'échantillon; - le classement (68) des valeurs calculées pour les échantillons en fonction du classement des échantillons ; et - la détermination (70) de la grandeur Ginhib en fonction de l'évolution des valeurs classées. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé : - en ce que la croissance du microorganisme est modélisée par un modèle de croissance en fonction du temps comprenant : ^ une première phase de latence de durée X ; ^ suivie d'une seconde phase de croissance exponentielle de pente maximale p. dans l'espace logarithmique ; et ^ suivie d'une troisième phase stationnaire de valeur maximale A ; - et en ce que la valeur reflétant la croissance du microorganisme dudit type en fonction du temps est une estimation de la pente maximale p. et/ou une estimation de la durée de la phase de latente X. 3029936 25 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé - en ce que la grandeur Ginhib comprend un intervalle , Qinmiacxipour lequel la croissance des microorganismes dans les échantillons est au moins partiellement inhibée ; 5 - en ce que la quantité initiale de la molécule en fonction du classement des échantillons comprend : - une première partie constante sur plusieurs échantillons et égale à Qmin , la borne inférieure Qmin de l'intervalle ro Qmax] étant choisie de sorte qu'il n'y a aucune inhibition de la croissance des microorganismes dans 10 les échantillons ; - suivie d'une seconde partie strictement croissante de Qmin à Qmax ; - suivie d'une troisième partie constante sur plusieurs échantillons et égale à Qmax, la borne supérieure Qmax de l'intervalle [0 Qmax] étant choisie de sorte qu'il y a une inhibition totale de la croissance des 15 microorganismes dans les échantillons ; [Qmin- et en ce que la détermination de l'intervalle [Q Qinmracx]comprend : - l'identification d'une zone de transition dans l'évolution des valeurs classées entre deux zones extrêmes sensiblement stationnaires de ladite évolution; et rninmrc nmrci 20 - la détermination de l'intervalle re comme étant l'intervalle in Yntaxl comm correspondant aux échantillons de la zone de transition identifiée. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'identification de la zone de transition comprend la détermination deux points d'inflexion de l'évolution des 25 valeurs classées, la zone de transition étant bornée par les deux points d'inflexion déterminés. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que l'indentification de la zone de transition comprend la modélisation de l'évolution des valeurs classées par 30 une fonction continue linéaire par morceau comprenant uniquement deux segments de droite extrêmes et un segment de droite intermédiaire compris entre les deux segments de droite extrême, le segment de droite intermédiaire étant la zone de transition. 35 6. Procédé selon la revendication 3, 4 ou 5, caractérisé en ce que la grandeur G mhib comprend une quantité initiale minimale de molécules Qmic qui est totalement inhibitrice de la croissance des microorganismes, et en ce que ladite quantité initiale 3029936 26 Qmax mx de minimale inhibitrice QMIC étant choisie égale à la borne supérieure l'intervalle [Amin nmac 1 - 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce 5 que la borne inférieure Qmin de l'intervalle [Q min Qmax] est une quantité nulle de l'antibiotique. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé : - en ce que les mesures de la croissance des bactéries dans les échantillons et la 10 détermination de la grandeur G inhib en fonction desdites mesures sont mises en oeuvre pour des durées d'incubation croissantes de manière à obtenir une séquence de grandeur Ginhib en fonction de la durée d'incubation des échantillons ; - en ce que le procédé comprend l'analyse de la stabilité de ladite séquence en 15 fonction de la durée d'incubation; et - en ce que la grandeur Ginhib est la valeur de la séquence une fois la séquence stabilisée. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce 20 que les échantillons comprennent chacun initialement au moins 100 microorganismes, et de préférence au moins 500 microorganismes. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les échantillons comprennent chacun une quantité initiale d'une deuxième 25 molécule différente apte à inhiber la croissance des microorganismes, notamment une quantité initiale identique pour tous les échantillons. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la quantité minimale de la molécule par microorganisme dudit type est une 30 concentration de la molécule dans les échantillons, la concentration initiale de microorganisme dudit type dans les échantillons étant constante en fonction du classement des échantillons. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce 35 que le microorganisme est une bactérie, et en ce que la molécule est un antibiotique. 3029936 27 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le microorganisme est une levure ou une moisissure, et en ce que la molécule est un antifongique. 5 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu nutritif comporte un élément métabolisable par le microorganisme sous la forme de molécule fluorescente, et en ce que la mesure de la croissance des microorganismes dans les échantillons est une mesure de la fluorescence des échantillons. 10 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'absorbance des échantillons est variable en fonction de la quantité de microorganismes présents dans ceux-ci, et en ce que la mesure de la croissance des microorganismes dans les échantillons est une mesure de densité optique. 15 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la réalisation de la pluralité d'échantillon comporte la réalisation d'un train de gouttes formant échantillons dans de l'huile. 20 17. Dispositif d'estimation d'une grandeur G inhib quantifiant le pouvoir inhibiteur d'une molécule sur un microorganisme d'un type prédéterminé, comprenant : - des moyens pour la réalisation d'une pluralité d'échantillons, comprenant chacun au moins un microorganisme dudit type, un milieu nutritif pour le microorganisme et une quantité initiale de la molécule par microorganisme 25 dudit type présent dans l'échantillon, ladite quantité initiale étant croissante dans un intervalle [Amin min Qmax] en fonction d'un classement prédéterminé des échantillons ; - des moyens pour l'incubation des échantillons ; - des moyens pour la mesure de la croissance des microorganismes dans chaque 30 échantillon en fonction du temps pendant une durée d'incubation prédéterminée ; et - des moyens de calcul pour la détermination de la grandeur Ginhib en fonction des mesures de la croissance des microorganismes dans les échantillons, caractérisé en ce que les moyens de calcul sont aptes à mettre en oeuvre : 35 - pour chaque échantillon, le calcul d'une valeur reflétant la croissance du microorganisme dudit type en fonction de la mesure de croissance des microorganismes dans l'échantillon; 3029936 28 - le classement des valeurs calculées pour les échantillons en fonction du classement des échantillons ; et - la détermination de la grandeur Ginhib en fonction de l'évolution des valeurs classées. 18. Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est apte à mettre en oeuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 16.