Brevet FR3032528A1 — publié le 20160812

Procédé de correction d'un signal rétrodiffusé par un échantillon et dispositif associé Domaine technique L'invention se situe dans le domaine de la caractérisation des échantillons, et notamment des échantillons biologiques, et plus particulièrement la peau. Description de l'art antérieur Les mesures optiques permettant de caractériser des échantillons sont répandues. Il s'agit en particulier de caractériser les propriétés optiques, ou la nature des matériaux qui composent un échantillon. On peut notamment citer les mesures basées sur la détection d'un signal rétrodiffusé par un échantillon illuminé par un faisceau lumineux. Il s'agit en particulier de la spectrométrie Raman, l'imagerie de fluorescence ou la spectrométrie de réflectance diffuse. La spectroscopie Raman fait partie des méthodes couramment utilisées. Elle est basée sur la diffusion inélastique des photons dans un milieu, suite à l'illumination du milieu par un faisceau de lumière monochromatique. Les photons résultant de ces interactions inélastiques sont détectés puis traités par un dispositif de spectroscopie, permettant de former un spectre Raman. Un tel spectre comprend généralement une pluralité de pics centrés sur des nombres d'ondes, ces derniers constituant une signature des espèces chimiques présentes dans un échantillon. Appliquée à la peau, et en configuration confocale, la spectrométrie Raman peut en particulier être adaptée à la classification entre un tissu sain et un tissu malade, ou le suivi de la migration d'un produit au sein des différentes couches constituant la peau. Cependant, la peau est un milieu diffusant et au-delà d'une certaine profondeur, les spectres Raman sont fortement dégradés par les perturbations liées à la diffusion de la lumière dans l'échantillon, qu'il s'agisse de la lumière du faisceau d'excitation, que de la lumière ré-émise à l'issue de la diffusion inélastique. Une autre méthode optique permettant la caractérisation d'un échantillon est la mesure de la fluorescence, qu'il s'agisse de fluorescence endogène ou exogène. Le principe est d'illuminer un échantillon, généralement à l'aide d'un faisceau dont la largeur spectrale est étroite et centrée sur une longueur d'onde d'excitation d'un fluorophore, puis de mesurer le signal de fluorescence 3032528 2 émis par le fluorophore en réponse au faisceau d'illumination. L'objectif est alors de localiser la position des fluorophores dans le milieu. Dans ce cas également, les mesures peuvent être perturbées par la diffusion de la lumière dans le milieu, qu'il s'agisse de la lumière d'excitation incidente ou de la lumière de fluorescence, ré- 5 émise suite à l'excitation du fluorophore. L'invention se propose de répondre à ces inconvénients, et d'améliorer la qualité de signaux optiques émis par un échantillon diffusant en réponse à une illumination Description de l'invention Un objet de l'invention est un procédé de correction d'un signal optique produit par un 10 échantillon comportant les étapes suivantes : illumination d'une surface de l'échantillon par un premier faisceau lumineux, produit par une première source lumineuse, ladite première source de lumière étant couplée à un premier système optique, apte à focaliser ledit premier faisceau lumineux dans un plan focal objet dudit premier système optique, ledit plan focal objet étant situé, dans 15 l'échantillon, à une profondeur z de la surface de l'échantillon, mesure, à l'aide d'un premier photodétecteur, d'un premier signal optique rétrodiffusé par l'échantillon en réponse audit premier faisceau lumineux, le photodétecteur produisant un premier signal mesuré, représentatif dudit premier signal optique, un filtre spatial étant interposé entre ledit premier système optique et le photodétecteur, 20 ledit filtre spatial comportant une fenêtre apte à transmettre ledit premier signal optique vers ledit photodétecteur, - ladite fenêtre étant disposée dans un plan focal conjugué dudit plan focal objet dudit premier système optique, caractérisé en ce que le procédé comporte également les étapes suivantes : 25 - détermination d'une propriété optique de diffusion ou d'absorption dudit échantillon, application d'une fonction de correction audit signal mesuré de façon à générer un premier signal optique corrigé, ladite fonction prenant en compte ladite propriété optique de diffusion ou d'atténuation 3032528 3 Le procédé peut comprendre la détermination de ladite profondeur entre ledit premier plan focal objet dudit premier système optique et ladite surface de l'échantillon, ladite fonction de correction prenant en compte ladite profondeur. La première source lumineuse peut être une source laser, le photodétecteur étant un 5 spectrophotomètre Raman, de telle sorte que ledit premier signal mesuré est un spectre Raman. Le procédé peut alors comprendre les étapes suivantes : mesure, à l'aide dudit spectrophotomètre Raman d'un spectre Raman de profondeur, représentatif du premier signal optique rétrodiffusé par l'échantillon en réponse audit premier faisceau lumineux, lorsque ledit premier plan focal objet est situé, dans 10 l'échantillon, à une profondeur Zdeph de la surface, ladite profondeur Zdeph étant supérieure à une profondeur seuil préalablement déterminée, - détermination d'un terme de correction en fonction de ladite propriété optique mesurée, - ladite fonction de correction prenant en compte ledit spectre de Raman de profondeur 15 et ledit terme de correction. La fonction de correction peut comprendre une fonction exponentielle croissante, l'exposant de l'exponentielle dépendant dudit terme de correction 13 et de ladite profondeur z. Cette fonction de correction peut comprendre un produit dudit spectre Raman par ladite exponentielle croissante. 20 Cette fonction de correction peut comprendre une addition dudit spectre Raman en profondeur (SPdepth) audit produit dudit spectre Raman (SPz) par ladite exponentielle croissante. Ledit premier rayonnement optique de rétrodiffusion peut également être un signal de fluorescence. Selon un mode de réalisation, ladite propriété optique est un coefficient décrivant la diffusion 25 de la lumière dans ledit échantillon, en particulier un coefficient de diffusion réduit, un coefficient de diffusion ou un facteur d'anisotropie de ladite diffusion. La détermination de ladite propriété optique peut comprendre les étapes de : 3032528 4 deuxième illumination d'une surface de l'échantillon à l'aide d'un deuxième faisceau lumineux, de façon à former, à la surface dudit échantillon, une zone élémentaire d'illumination, correspondant à la partie de ladite surface éclairée par ledit échantillon par ledit deuxième faisceau lumineux, 5 détection de N deuxièmes signaux optiques, rétrodiffusés par l'échantillon, chaque deuxième signal optique émanant de la surface de l'échantillon à une distance, dite distance de rétrodiffusion, de ladite zone élémentaire d'illumination, N étant un entier supérieur ou égal à 1, de manière à former autant de deuxièmes signaux détectés, - détermination d'au moins une propriété optique de l'échantillon, par comparaison 10 entre : ^ une fonction de chaque deuxième signal ainsi détecté, ^ et une pluralité d'estimations de ladite fonction chaque estimation étant réalisée en considérant une valeur prédéterminée de ladite propriété optique. La propriété optique à déterminer peut être un facteur d'anisotropie, représentant un angle 15 moyen de diffusion, un coefficient de diffusion réduit, un coefficient de diffusion ou un coefficient d'absorption. Au moins une distance de rétrodiffusion peut être inférieure à 200 um. Le procédé peut alors comprendre : - la détection d'au moins deux signaux optiques rétrodiffusés émanant de la surface de 20 l'échantillon, ^ un signal optique rétrodiffusé proche, émis à une distance de rétrodiffusion inférieure à 200 um ^ un signal optique rétrodiffusé éloigné, émis à une distance de rétrodiffusion supérieure celle correspondant audit signal rétrodiffusé proche, et par exemple 25 supérieure à 200 um - la détermination d'une première propriété optique à partir du signal proche, - la détermination d'une deuxième propriété optique, différente de la première propriété optique, à partir du signal éloigné. 3032528 5 Le procédé peut également comprendre la détection d'au moins deux signaux optiques rétrodiffusés proches, à deux distances de rétrodiffusion différentes, les deux distances étant inférieures à 200 um, L'échantillon examiné peut être la peau d'un humain ou d'un animal. 5 L'intensité du signal optique rétrodiffusé peut être mesurée à une pluralité de longueurs d'ondes Un autre objet de l'invention est un dispositif de caractérisation d'un échantillon, comprenant : une première source de lumière, apte à émettre un premier faisceau lumineux vers la surface dudit échantillon, 10 - un premier système optique, apte à focaliser ledit premier faisceau lumineux dans un plan focal objet, un premier photodétecteur, un filtre spatial, interposé entre ledit premier système optique et ledit photodétecteur, ledit filtre spatial comportant une fenêtre apte à transmettre un premier signal optique, 15 rétrodiffusé par ledit échantillon lorsqu'il est exposé audit premier faisceau lumineux vers ledit photodétecteur, ladite fenêtre étant disposée dans le plan focal conjugué dudit plan focal objet, caractérisé en ce que le dispositif comporte : un microprocesseur, apte à corriger ledit premier signal optique, en mettant en oeuvre 20 le procédé précédemment décrit. Le dispositif peut comporter une deuxième source de lumière, apte à émettre un deuxième faisceau lumineux vers une surface dudit échantillon, de façon à former, sur ladite surface, une zone élémentaire d'illumination, 25 au moins une fibre optique de détection, s'étendant entre une extrémité proximale, apte à être couplée à un deuxième photodétecteur et une extrémité distale, apte à collecter un signal optique rétrodiffusé par l'échantillon lorsqu'il est exposé audit deuxième faisceau lumineux, 3032528 6 un deuxième système optique comportant tout ou partie du premier système optique, ledit deuxième système optique présentant un facteur de grandissement et un axe optique, ledit deuxième système optique étant apte à conjuguer l'extrémité distale de chaque 5 fibre optique de détection à une zone élémentaire de détection située sur la surface de l'échantillon, de telle sorte que la distance entre la zone élémentaire d'illumination et chaque zone élémentaire de détection, perpendiculairement audit axe optique, est fonction dudit facteur de grandissement. 10 Dans un mode de réalisation, ledit deuxième système optique est également apte à conjuguer ladite deuxième source de lumière à une zone élémentaire d'illumination, située à la surface de l'échantillon, Le dispositif peut comporter un élément de renvoi, apte à diriger : - ledit premier faisceau lumineux vers l'échantillon, 15 - ou ledit premier signal optique rétrodiffusé par l'échantillon vers ledit premier photodétecteur, - ou ledit deuxième faisceau lumineux vers l'échantillon, - ou ledit deuxième signal optique vers ledit deuxième photodétecteur. Le dispositif peut également comporter 20 une première fibre optique de détection, dont l'extrémité distale est située à une première distance dudit deuxième faisceau lumineux, une deuxième fibre optique de détection, dont l'extrémité distale est située à une deuxième distance dudit deuxième faisceau lumineux, ladite deuxième distance étant supérieure à ladite première distance. 25 La deuxième source de lumière peut comporter une fibre optique d'illumination, s'étendant entre une extrémité proximale, notamment apte à recevoir de la lumière, 3032528 7 - et une extrémité distale, apte à émettre ledit deuxième faisceau lumineux en direction de la surface de l'échantillon. Lesdits premier système et deuxième système optiques peuvent être confondus et former alors un système optique commun. 5 Une fibre optique de détection peut être disposée dans ledit plan focal conjugué dudit plan focal objet dudit système optique commun, ladite fibre optique de détection étant apte à transmettre ledit premier signal otique vers le premier photodétecteur ou vers le deuxième photodétecteur. Le premier photodétecteur (4) et le deuxième photodétecteur peuvent former un même photodétecteur. 10 La première source de lumière et la deuxième source de lumière peuvent former une même source de lumière. Description des figures. La figure 1 représente un dispositif de spectrométrie Raman confocale, La figure 2 représente les étapes d'un procédé d'établissement d'une fonction de correction 15 d'un spectre Raman, La figure 3 représente l'évolution de l'intensité d'un signal Raman dans la bande spectrale 2870 cm-1- 3000 cm-1 dans un milieu diffusant, en fonction de la profondeur, La figure 4 représente la profondeur réelle du plan focal objet du système optique du dispositif en fonction de la profondeur apparente, 20 Les figures 5A à 5D représentent des exemples de correction de spectres Raman acquis à différentes profondeurs dans un milieu diffusant connu, Les figures 6A à 6D représentent des exemples de correction de spectres Raman acquis à différentes profondeurs dans un milieu diffusant connu, Les figures 7A et 7B représentent un premier exemple de dispositif bimodal, permettant de 25 combiner une mesure par spectrométrie Raman et une mesure de réflectance diffuse. La figure 8 représente une vue en coupe du dispositif similaire à celui représenté sur les figures 7A et 7B. 3032528 8 La figure 9 représente le parcours de la lumière dans un échantillon diffusant en fonction de la distance de rétrodiffusion. La figure 10 représente les étapes d'un procédé de détermination des propriétés optiques d'un échantillon, pouvant être mises en oeuvre à l'aide d'un dispositif selon l'invention. 5 La figure 11 est un exemple de table de calibration pouvant être utilisée dans le procédé de détermination des propriétés optiques d'un échantillon. Les figure 12 et 13 sont un deuxième et un troisième exemple de dispositif de spectrométrie Raman confocal bimodal. Description détaillée 10 La figure 1 représente un exemple de dispositif de spectrométrie Raman confocale. Il comporte une première source de lumière monochromatique 1, typiquement une source Laser, par exemple centrée sur une longueur d'onde de 532 nm, apte à produire un premier faisceau laser 2 monochromatique vers la surface d'un échantillon analysé 50. Le dispositif comporte également un premier système optique 3, apte à focaliser ledit faisceau 15 laser 2 dans un plan focal objet 5.1, en particulier à l'intérieur de l'échantillon 50. Le premier système optique 3 présente un axe optique Z, s'étendant de préférence perpendiculairement à la surface de l'échantillon (50). Le faisceau Laser est dirigé vers l'échantillon 50 par une réflexion sur une lame semiréfléchissante 7. 20 Le dispositif comporte également un filtre spatial, sous la forme d'un diaphragme 6, de type sténopé, dont l'ouverture 6.1 est disposée dans le plan focal image 5.2, conjugué dudit plan focal objet 5.1, ainsi qu'un premier photodétecteur, qui est ici un spectrophotomètre Raman 4, disposé en aval du diaphragme 6. Le terme aval s'entend dans le sens de propagation de la lumière. L'ouverture du sténopé est typiquement de quelques dizaines de um, et de préférence 25 inférieure à 500 um. Elle est par exemple de 50 um. Sous l'effet de l'illumination par le faisceau laser 2, l'échantillon est apte à émettre un premier signal optique 8, ce dernier étant transmis, par la lame semi-réfléchissante 7, vers le spectrophotomètre 4. Le spectrophotomètre Raman 4 est apte à établir un premier signal mesuré SP, qui est, dans le cas présent, un spectre du premier signal optique 8 rétrodiffusé par l'échantillon, dans une plage fréquentielle généralement comprise entre quelques dizaines de 3032528 9 cm-let quelques milliers de cm-1. Le spectre Raman a pour objectif d'identifier les fréquences de radiations issues de transitions énergétiques de molécules constituant l'échantillon suite à des diffusions inélastiques avec les photons constituant le faisceau incident. Le dispositif comporte un microprocesseur 9, couplé au spectrophotomètre 4, et dont il reçoit 5 des données d'entrée sous forme de spectres Raman. Le microprocesseur comporte une mémoire programmable, apte à stocker un algorithme de correction d'un spectre Raman décrit ci-après. Du fait de la présence du sténopé 6 situé dans le plan focal 5.2, conjugué du plan focal objet 5.1, et disposé entre le premier système optique 3 et le spectrophotomètre 4, seuls les photons 10 rétrodiffusés, provenant du plan focal objet, passent le sténopé et sont détectés par le spectromètre Raman, selon une configuration dite de détection confocale. Les photons rétrodiffusés, provenant de plans adjacents au plan focal objet 5.1, plus proches ou plus éloignés de la surface de l'échantillon, sont arrêtés et ne contribuent pas au spectre Raman formé par le spectrophotomètre. 15 Selon la résolution axiale du dispositif, les photons provenant du voisinage immédiat du plan focal objet 5.1, peuvent également être détectés. Le terme voisinage immédiat désigne une distance de quelques um, de préférence inférieure à 5 um, du plan focal objet 5.1. En déplaçant le plan focal objet 5.1 dans l'échantillon, il est possible d'obtenir des spectres représentatifs d'une succession de « coupes optiques », correspondant au plan focal objet. 20 Ainsi, cette configuration, dite de spectroscopie Raman confocale, permet d'obtenir une information sur la nature des matériaux constituant l'échantillon dans des plans successifs, parallèles à la surface de l'échantillon, et s'étendant selon une profondeur pouvant atteindre 100 um à 200 um, selon les propriétés d'absorption ou de diffusion de la lumière dans l'échantillon. Au-delà d'une profondeur de 100 um à 200 um, le signal rétrodiffusé 8, porteur 25 d'information, subit une extinction trop importante, du fait de l'absorption ou d'une diffusion réduisant trop fortement le signal traversant le sténopé. Cette perte en retour dépend de la position du plan focal objet 5.1 dans l'échantillon et l'information extraite du signal présente un biais. Le système optique 3 est dans cet exemple un objectif 100X d'ouverture numérique 0,9, et de 30 focale 1.7 mm. 3032528 10 Une lentille 1' peut être couplée à la source Laser, de façon à ajuster le diamètre du faisceau en amont du système optique 3. Cette lentille est optionnelle. Cependant, le signal Raman rétrodiffusé par l'échantillon est d'intensité faible. De plus, il est atténué par la diffusion et l'absorption des photons dans la profondeur z de l'échantillon 5 traversée, entre le plan focal objet 5.1 et la surface de l'échantillon. La figure 2 représente les étapes d'un procédé pour déterminer une fonction de correction, notée F.' apte à corriger l'influence de la diffusion des photons dans cette profondeur z. Notons que le spectrophotomètre Raman étant placé dans une configuration confocale, la position de la partie analysée de l'échantillon est maîtrisée, puisqu'il s'agit de l'intersection du 10 faisceau laser avec le plan focal objet 5.1. De ce fait, on connaît la distance traversée par la lumière dans l'échantillon avant et après l'échantillon, puisqu'il s'agit, dans les deux cas, de la profondeur z. Pour déterminer cette fonction de correction, on a constitué des fantômes de calibration formé à partir d'un matériau diffusant, présentant des propriétés optiques, en particulier un coefficient 15 de diffusion réduit et un indice de réfraction, proche de celui d'un tissu biologique. Ces fantômes ont été réalisés sur la base d'un matériau de type PDMS (Polydiméthylsiloxane), en ajoutant des particules de TiO2, de façon à augmenter le coefficient de diffusion. Quatre fantômes ont été constitués, présentant un coefficient de diffusion réduit µs'compris entre 21,2 cm-1 et 55,6 cm-1. D'une façon générale, le procédé d'établissement de la fonction de correction consiste à : 20 établir une pluralité de spectres, dits spectres de calibration SP - calib-z en effectuant un balayage du plan focal objet 5.1 du système optique dans un fantôme, ou dans une pluralité de fantômes, dont les propriétés optiques sont proches de l'échantillon à analyser, entre la surface du fantôme (z = 0) et un plan situé à une profondeur z d'environ 200 um, 25 puis modéliser une fonction représentative de la décroissance de l'intensité du signal Raman, dans une ou plusieurs bandes spectrales prédéterminées, dites bandes spectrales d'intérêt. Les bandes spectrales d'intérêt sont des bandes spectrales présentant des raies caractéristiques du matériau constituant les fantômes, en l'occurrence le PDMS, en particulier les bandes 30 spectrales [680 cm-1- 720 cm-1], [1380 cm-1- 1440 cm-1] , [2870 cm-1- 3000 cm-1]. 3032528 11 La première étape 80 consiste à obtenir les spectres de calibration SPcahb_z sur les fantômes précédemment décrits chaque spectre étant associé à une profondeur z donnée. L'expérience montre qu'au-delà d'une certaine profondeur seuil zt, l'intensité dans lesdites bandes spectrales d'intérêt n'évolue pratiquement plus et tend vers une valeur asymptotique. 5 Cette profondeur seuil zt varie en fonction des propriétés d'absorption et de diffusion du matériau examiné et en fonction de la longueur d'onde du faisceau laser. Les inventeurs ont constaté que sur les fantômes utilisés, cette valeur asymptotique est obtenue au-delà d'une profondeur seuil zt = 150 um. Au-delà de cette profondeur seuil, le spectre Raman n'évolue plus et tend vers un spectre Raman dit spectre Raman de profondeur, noté SP - depth et tel que SP - depth = 10 SPcalib-z, avec z > zt. La figure 3 représente l'évolution de l'intensité dans la bande spectrale [2870 cm-1- 3000 cm-1] en fonction de la profondeur z pour différents fantômes, dont le coefficient de diffusion varie de 21.2 cm-1 à 55.6 cm-1. Une particularité de la configuration confocale précédemment décrite est qu'on déplace le plan 15 focal objet 5.1 du système optique (3) à l'intérieur d'un milieu diffusant, dont l'indice de réfraction est différent de celui de l'air. Si l'échantillon était constitué d'air, la détermination de la profondeur zain du plan focal dans l'échantillon, dite profondeur apparente, serait aisément obtenu connaissant les paramètres du système optique (3). Cependant, du fait de l'indice de réfraction de l'échantillon, la profondeur réelle z du plan focal objet 5.1 est décalée par rapport 20 à la profondeur apparente, dans l'air, zair. Afin de tenir compte de ce décalage, une fonction de recalage fz(z) est déterminée, ce qui fait l'objet de l'étape 82. Cette étape 82 vise à déterminer la profondeur apparente zain lorsque la profondeur réelle z du plan focal objet 5.1 dans l'échantillon est connue. Elle peut être réalisée par modélisation ou de façon expérimentale. Une méthode expérimentale est d'utiliser des fantômes composites 25 comportant : une couche supérieure, dont l'indice de réfraction est représentatif de l'échantillon à examiner, cette couche étant par exemple formée par du PDMS. Selon les fantômes, l'épaisseur de la couche supérieure est comprise entre 20 um et 100 um. 3032528 12 une couche inférieure, formé par un matériau de référence dont la signature Raman est connue. Dans cet exemple, la couche inférieure est formée par une lame de Silicium d'épaisseur 500 um, le Silicium présentant une raie Raman caractéristique à 521 cm-1. Chaque fantôme composite fait l'objet d'un balayage progressif, en déplaçant le plan focal objet 5 5.1 du système optique 3 de la couche supérieure vers la couche inférieure. Lorsque le plan focal atteint la couche inférieure, l'intensité de la raie 521 cm-1 passe par un maximum. La profondeur réelle du plan focal, par rapport à la surface de la couche supérieure, est alors connue puisqu'elle correspond à l'épaisseur de la couche supérieure, tandis que la profondeur apparente zair est connue car elle dépend des paramètres optiques du système optique 3. On effectue alors une 10 correspondance entre la profondeur apparente zair et la profondeur réelle z du plan focal objet 5.1 dans l'échantillon. En utilisant des fantômes composites dont l'épaisseur de la couche supérieure varie entre 20 um et 100 um, on établit la fonction de recalage fz, permettant d'effectuer un recalage entre la profondeur apparente zair et la profondeur réelle z. 15 La figure 4 montre les résultats d'une courbe de calibration expérimentale, la profondeur réelle z étant représentée en fonction de la profondeur apparente zair, sur la base de laquelle on peut établir une fonction de recalage en profondeur f' telle que z= fz(zair) 1,48 x zair L'étape 84 consiste à déterminer un terme de correction 13 prenant en compte une ou plusieurs 20 propriétés optiques de l'échantillon. Les inventeurs ont considéré que la décroissance de l'intensité mesurée en fonction de la profondeur z prenait la forme d'une fonction exponentielle décroissante de type e-flz , le terme 13 étant un terme de correction dépendant du coefficient de diffusion réduit d'un échantillon. Dans cet exemple, on ne considère que le coefficient de diffusion réduit us à la longueur d'onde du faisceau Laser, soit X = 532 nm-1. En effet, les 25 inventeurs ont considéré que les longueurs d'onde du faisceau rétrodiffusé ne s'écartaient pas suffisamment de cette longueur d'onde laser pour justifier la prise en compte de la valeur du coefficient de diffusion réduit à d'autres longueurs d'onde. Sur la base des acquisitions réalisées lors de l'étape 80, il s'agit de modéliser la décroissance de l'intensité sur plusieurs bandes spectrales d'intérêt du spectre. 3032528 13 Les inventeurs ont établi que, dans les trois bandes spectrales d'intérêt précédemment définies, l'évolution de l'intensité, en fonction de la profondeur z, suit la loi : 1(Z)= (Isurface I face - -depth) e p x z+ Idepth (I.) où 1(z), 'surface et 'deo désignent respectivement les intensités mesurées, sur une bande spectrale 5 d'intérêt, à partir des spectres SP - calib-z SPsurface, (ou SPcalib-z=0), SPdepth (ou SPcalib-z>zt)- Par intensité dans une bande spectrale, on entend une valeur représentative de l'intégrale dans ladite bande spectrale. L'utilisation de fantômes de calibration, dont le coefficient de diffusion réduit us varie entre 21.2 cm-1 et 55.6 cm-1 permet de compléter cette loi empirique par la relation suivante, 10 exprimant la dépendance entre le terme de correction 13 et le coefficient de diffusion réduit us à 532 nm : fi (1-1's)= 0,0034 + 8,12 10-4x ps ' (2) Ainsi, en première approximation, le terme de correction peut être approximé par /3 (p's) 1.10-3 x ps'(2') 15 La combinaison des expressions (1) et (2) (ou (2')) permet établir un modèle décrivant l'évolution de l'intensité des bandes spectrales d'intérêt en fonction de la profondeur z examinée et de la diffusion de la lumière dans l'échantillon. C'est l'objet de l'étape 86. En généralisant ce modèle à l'ensemble des bandes spectrales du spectre, les inventeurs ont déterminé une fonction de correction Fcorr d'un spectre Raman SPz acquis à une profondeur z, 20 de façon à obtenir un spectre Raman corrigé SPcorr-z tel que SP corr-z = Fcorr(SPz) = [S Pz - SPaepthiefl(i2s)xz + SPdepth (3) - SPz désigne un spectre mesuré à la profondeur z (c'est-à-dire à une distance z sous la surface de l'échantillon) SPdepth désigne un spectre mesuré à une profondeur supérieure à une profondeur seuil zt sous la surface de l'échantillon. où : 25 3032528 14 - /3( ps) désigne la valeur du terme de correction (3 en fonction du coefficient de diffusion réduit ps', à la longueur d'onde du faisceau laser incident, de l'échantillon examiné, la valeur de /3(ps') étant déterminée selon l'expression (2) ou (2'). La profondeur seuil zt est de préférence déterminée expérimentalement, sur l'échantillon 5 analysé, en effectuant une pluralité de mesures de spectres à différentes profondeurs z, et en identifiant une profondeur zt à partir de laquelle le spectre mesuré n'évolue plus de façon significative, dans une ou plusieurs bandes d'intérêt prédéterminées. En effet, cette profondeur seuil varie en fonction de la longueur d'onde et des propriétés optique (absorption, diffusion) de l'échantillon. 10 Alternativement, la profondeur seuil zt peut être déterminée sur des fantômes de calibration mimant les propriétés optiques de l'échantillon à caractériser. Naturellement, l'expression (3) s'applique à l'intensité lz de toute bande spectrale d'un spectre SPI, cette intensité pouvant être corrigée selon l'expression 1 corr-z = Fcorr (I) = [Iz - Idepthiefl(14)xz + Idepth (5), 15 où lz désigne l'intensité d'une bande spectrale d'un spectre mesuré à la profondeur z (c'est-à-dire à une distance z sous la surface de l'échantillon) Idepth désigne l'intensité de ladite bande spectrale d'un spectre mesuré à une profondeur supérieure à une profondeur seuil zt sous la surface de l'échantillon. 20 /3( ps) désigne la valeur du terme de correction (3 en fonction du coefficient de diffusion réduit ps' ' à la longueur d'onde du faisceau laser incident, de l'échantillon examiné, /3( ps) étant déterminée selon l'expression (2) ou (2'). La figure 5A représente un spectre Raman mesuré sur un fantôme diffusant de PDMS, d'épaisseur 100 um, et dont le coefficient de diffusion réduit, à 532 nm, est égal à 26,8 cm-1, 25 pour une profondeur de 6µm. La figure 5B représente un spectre Raman corrigé en appliquant la fonction de correction explicitée ci-dessus. On voit que les pics sont corrigés de façon efficace. Les figures 5C et 5D représentent un zoom de spectres respectivement non corrigés et corrigés sur une bande spectrale s'étendant entre 2800 et 3050 cm-1. En partant du pic le plus intense vers le pic le moins intense, les profondeurs considérées sont respectivement 6 um, 20 um, 35 3032528 15 um, 50 um et 65 um. La comparaison entre les figures 5C et 5D atteste de la qualité de la correction. La figure 6A représente un spectre Raman mesuré sur un fantôme diffusant de PDMS, d'épaisseur 100 um, et dont le coefficient de diffusion réduit, à 532 nm, est égal à 55,6 cm-1, 5 pour une profondeur de 6 um. La figure 6B représente un spectre Raman corrigé en appliquant la fonction de correction explicitée ci-dessus. On voit que les pics sont corrigés de façon efficace. Les figures 6C et 6D représentent un zoom de spectres respectivement non corrigés et corrigés sur une bande spectrale s'étendant entre 2800 et 3050 cm-1. En partant du pic le plus intense vers le pic le moins intense, les profondeurs considérées sont respectivement 6 um, 20 um, 35 10 um, 50 um et 65 um. La comparaison entre les figures 6C et 6D atteste de la qualité de la correction. Un des éléments importants de la correction est la connaissance des propriétés optiques de diffusion dans le milieu, en particulier un coefficient décrivant la diffusion de la lumière dans le milieu, tel que le coefficient de diffusion réduit us, le coefficient de diffusion us ou le facteur 15 d'anisotropie de la diffusion g. En lien avec la figure 9, de telles propriétés optiques peuvent être déterminées en dirigeant un deuxième faisceau de lumière 20 collimaté à la surface de l'échantillon, de manière à former, à la surface de l'échantillon, une zone élémentaire d'illumination 18, formée par l'intersection dudit deuxième faisceau lumineux avec la surface de l'échantillon. En analysant un signal 20 optique rétrodiffusé (S1, Sz, S3, S4), émanant de la surface de l'échantillon à une ou plusieurs distances, (D1, D2, D3, D4) dites distances de rétrodiffusion, de la zone élémentaire d'illumination 18, on peut déterminer les propriétés optiques de l'échantillon. Les inventeurs ont conçu un dispositif bimodal, combinant deux modalités d'analyse : Une première modalité, visant à réaliser une première analyse de l'échantillon, à partir 25 d'un premier signal optique 8 rétrodiffusé par l'échantillon, à l'aide d'un premier photodétecteur placé en configuration confocale. Ce premier signal optique 8 peut être un signal portant une information de type Raman ou un signal de fluorescence, l'objectif étant alors d'établir une information quant à la constitution de l'échantillon : détermination de la nature chimique de constituants (spectrométrie Raman) ou 30 présence d'un fluorophore (mesure de fluorescence). 3032528 16 Une deuxième modalité, visant à déterminer les propriétés optiques de l'échantillon, par mesure d'un deuxième signal optique 52 rétrodiffusé, selon les principes rappelés dans le paragraphe précédent. Les résultats obtenus à l'aide de la deuxième modalité peuvent avantageusement être utilisés 5 pour corriger le signal acquis au cours de la première modalité, de façon à accroître la précision de l'analyse. Selon un mode de réalisation, représenté sur la figure 7A, le dispositif bimodal, comporte une voie de mesure par spectrométrie Raman (le" modalité) , présentant les caractéristiques décrites en lien avec la figure 1, et comportant également une voie de mesure permettant la 10 détermination des propriétés optique de l'échantillon (2'eme modalité). On retrouve les mêmes éléments que ceux décrits en lien avec la figure 1, à savoir une source de rayonnement laser 1, couplée à un système optique 3, apte à focaliser un premier faisceau optique 2, en l'occurrence un faisceau laser, produit par la source 1 dans le plan focal objet 5.1 du système optique 3, ledit plan focal objet 5.1 étant situé à une profondeur z en dessous de la 15 surface de l'échantillon 50. Le faisceau laser 2 est transmis par une première lame semi-réfléchissante 7.1, puis est réfléchi en direction de l'échantillon par une deuxième lame semi-réfléchissante 7.2. Le système optique comporte ici d'un objectif de microscope 3.1, couplé à une lentille 3.2. En réponse à ce faisceau, la partie de l'échantillon se trouvant au voisinage de l'intersection du 20 faisceau 2 avec le plan focal objet 5.1 émet un premier signal optique 8, apte à être collecté par le spectromètre Raman placé selon une configuration confocale, du fait de la présence du diaphragme 6, dont l'ouverture 6.1, formant un sténopé, est disposée dans le plan focal image 5.2 conjugué du plan focal objet 5.1. A noter que le diaphragme 6 peut être remplacé par une fibre optique, dont une extrémité distale, apte à collecter le signal optique 8, est placée dans le 25 plan focal image 5.2, l'extrémité proximale de ladite fibre assurant alors le transfert du signal optique vers le spectromètre Raman 4. Dans ce cas, l'extrémité distale de la fibre optique se comporte de façon équivalente au diaphragme 6 et forme un filtre spatial comportant une fenêtre, en l'occurrence l'extrémité distale de la fibre, apte à transmettre le signal optique 8 vers le photodétecteur 4. 3032528 17 Le microprocesseur 9, couplé au spectromètre Raman 4, assure le traitement des spectres Raman SPz mesurés lorsque le plan focal objet 5.1 est placé à une profondeur z sous la surface de l'échantillon et en particulier leur correction selon le procédé précédemment décrit. Par ailleurs, le dispositif représenté sur la figure 7A comporte une voie de mesure apte à 5 caractériser les propriétés optiques de l'échantillon. Ainsi, le dispositif comporte une deuxième source de lumière 10, qui est comprend dans cet exemple une source de lumière blanche 10'. La deuxième source de lumière 10 comprend, dans ce mode de réalisation, une fibre optique d'illumination 12, s'étendant entre une extrémité proximale 14 et une extrémité distale 16. La 10 fibre optique d'illumination 12 est apte à collecter la lumière, par une extrémité proximale 14 et à émettre un faisceau lumineux 20 par une extrémité distale 16, ledit faisceau lumineux étant alors dirigé vers la surface d'un échantillon 50. Dans une telle configuration, la source de lumière 10 est dite fibrée. Le diamètre de la fibre optique d'émission 12 est compris entre 100 un et 1 mm, et est par 15 exemple égal à 400 um. Par source ponctuelle, on entend une source dont l'aire est inférieure à 1 cm2, et de préférence inférieure à 5 mm2, et encore de préférence inférieure à 1 mm2. Le dispositif comporte également une pluralité de fibres optiques de détection 221, 222, 223...22n, l'indice n étant compris entre 1 et N, N désignant le nombre de fibres optiques de 20 détection dans le dispositif. N est un entier naturel compris généralement compris entre 1 et 100, et préférentiellement compris entre 5 et 50. Chaque fibre de détection 221, 222, 223...22n s'étend entre une extrémité proximale 241, 242, 243...24n et une extrémité distale 261, 262, 263...26n. Sur les figures 7A et 7B, les références 22, 24 et 26 désignent respectivement l'ensemble des 25 fibres de détection, l'ensemble des extrémités proximales des fibres de détection et l'ensemble des extrémités distales des fibres de détection. Le diamètre de chaque fibre optique de détection 22 est compris entre 50 um et 1 mm, et est par exemple égal à 300 um. 3032528 18 L'extrémité proximale 24 de chaque fibre optique de détection 22 est apte à être optiquement couplée à un deuxième photodétecteur 40. La figure 7.B représente le fonctionnement du dispositif selon la modalité de détermination des propriétés optiques de l'échantillon. 5 L'extrémité distale 261, 262, 263...26,, de chaque fibre optique de détection 22 est apte à collecter respectivement un deuxième signal optique 521, 522, 523...52,, rétrodiffusé par l'échantillon 50, lorsque ce dernier est exposé au faisceau lumineux 20, ledit signal optique étant transmis par la lame semi-réfléchissante 7.1. Le photodétecteur 40 est apte à détecter chaque deuxième signal optique 521, 522, 523...52,, de 10 façon à former un signal S1,S2, S3, ...Sn , dit deuxième signal mesuré, respectivement représentatif de chaque deuxième signal optique détecté. Il peut s'agir d'un spectrophotomètre, apte à établir le spectre en longueur d'onde du signal optique collecté par la fibre optique de détection 22 auquel il est couplé. Les fibres optiques de détection 22 s'étendent parallèlement à un axe longitudinal Z', autour de 15 la fibre optique d'émission 12. Elles sont maintenues fixes les unes par rapport aux autres par un élément de maintien 42. Leurs extrémités distales 26 sont coplanaires, et définissent un plan de détection 44. Une fibre optique 13, dite fibre de retour d'excitation, relie la deuxième source de lumière 10 au deuxième photodétecteur 4. Cette fibre optique est utile pour réaliser une mesure de 20 calibration détaillée ultérieurement. Cette fibre optique de retour d'excitation n'est pas représentée sur les figures suivantes, mais peut être présente sur l'ensemble des modes de réalisation. La figure 8 représente une vue en coupe du dispositif, dans le plan de détection 44, formé par l'ensemble des extrémités distales 26 des N fibres de détection. Dans cet exemple, N est égal à 25 36. Comme on peut le voir, les fibres optiques de détection sont réparties selon : un premier groupe Gi de six fibres optiques de détection 221...226, disposées régulièrement le long d'un cercle centré sur la fibre optique d'émission 12, de telle sorte que l'extrémité distale 261...266 de chaque fibre de ce groupe soit distante de 3032528 19 l'extrémité distale 16 de la fibre optique d'émission 12 d'une première distance d1 égale à 300 um. un deuxième groupe G2 de six fibres optiques de détection 227...2212, disposées régulièrement le long d'un cercle centré sur la fibre optique d'émission 12, de telle 5 sorte que l'extrémité distale 267...2612 de chaque fibre de ce groupe soit distante de l'extrémité distale 16 de la fibre optique d'émission 12 d'une deuxième distance d2 égale à 700 um. un troisième groupe G3 de six fibres optiques de détection 2213...2218, disposées régulièrement le long d'un cercle centré sur la fibre optique d'émission 12, de telle 10 sorte que l'extrémité distale 2613...2618 de chaque fibre de ce groupe soit distante de l'extrémité distale 16 de la fibre optique d'émission 12 d'une troisième distance d3 égale à 1,1 mm. un quatrième groupe G4 de six fibres optiques de détection 2219...2224, disposées régulièrement le long d'un cercle centré sur la fibre optique d'émission 12, de telle 15 sorte que l'extrémité distale 2619...2624 de chaque fibre de ce groupe soit distante de l'extrémité distale 16 de la fibre optique d'émission 12 d'une quatrième distance d4 égale à 1,5 mm. un cinquième groupe G5 de six fibres optiques de détection 2225...2230, disposées régulièrement le long d'un cercle centré sur la fibre optique d'émission 12, de telle 20 sorte que l'extrémité distale 2625...2630 de chaque fibre de ce groupe soit distante de l'extrémité distale 16 de la fibre optique d'émission 12 d'une cinquième distance cls égale à 2 mm. un sixième groupe G6 de six fibres optiques de détection 2231...2236, disposées régulièrement le long d'un cercle centré sur la fibre optique d'émission 12, de telle 25 sorte que l'extrémité distale 2631...2636 de chaque fibre de ce groupe soit distante de l'extrémité distale 16 de la fibre optique d'émission 12 d'une sixième distance d6 égale à 2,5 um. Lorsqu'on évoque une distance entre deux fibres, ou entre une fibre ou un faisceau lumineux, on entend une distance centre à centre. 30 Ainsi, chaque extrémité distale 26n d'une fibre optique de détection 22n est placée, dans un plan perpendiculaire à l'axe longitudinal Z' selon lequel s'étendent ces fibres, à une distance dr, 3032528 20 de la deuxième source de lumière 10 (c'est-à-dire de l'extrémité distale 16 de la fibre d'émission 12), et, par conséquent, à une distance dr, du faisceau lumineux 20 dirigé vers l'échantillon 50. Le dispositif peut comporter un deuxième photodétecteur 40, apte à être couplé à l'extrémité proximale 24n de chaque fibre optique de détection 22n. Dans cet exemple, le deuxième 5 photodétecteur est un spectrophotomètre, apte à déterminer le spectre d'un deuxième signal optique 521...52,-, rétrodiffusé par l'échantillon lorsque ce dernier est exposé au deuxième faisceau lumineux 20. Pour cela, les extrémités proximales 24 de chaque groupe de fibres optiques de détection, décrits ci-dessus, sont regroupées et sont, groupe par groupe, successivement couplées au deuxième photodétecteur 40 au moyen d'un commutateur optique 10 41. Ainsi, le deuxième photodétecteur permet de mesurer deuxième du rayonnement rétrodiffusé 52 par l'échantillon, sous l'effet d'une illumination par le deuxième faisceau lumineux 20. Le deuxième photodétecteur 40 est apte à être connecté à un deuxième microprocesseur 48, ce dernier étant configuré pour mettre en oeuvre le procédé pour déterminer une propriété 15 optique de l'échantillon. Alternativement, le dispositif ne comporte qu'un seul microprocesseur 9, apte à être couplé au premier photodétecteur 4 et au deuxième photodétecteur 40. Dans ce cas, le microprocesseur 9 effectue les opérations de correction du spectre Raman et de détermination des propriétés optiques. Le système optique 3 présente un facteur de grandissement G et un axe optique Z. Dans cet 20 exemple, l'axe optique Z est confondu avec l'axe longitudinal Z' selon lequel s'étendent les fibres optiques de détection, ce qui constitue une configuration préférée. Dans cet exemple, le système optique 3 comporte: un objectif de microscope 3.1, placé en configuration foyer infini, apte à produire une image à l'infini de la surface de l'échantillon observé, lorsque ce dernier est placé au 25 foyer de cet objectif. Dans cet exemple, il s'agit d'un objectif 100X, de distance focale fi. = 1.7 mm, un doublet achromat 3.2, de distance focale f2 = 50 mm, apte à projeter l'image fournie par ce dernier dans le plan de détection 44, ce plan étant placé à la distance focale du doublet. 3032528 21 Le système optique 3 décrit ci-dessus présente un facteur de grandissement G égal au rapport des distances focales, soit G ,,k,' 30. De préférence, le système optique 3 est amovible et interchangeable, ce qui permet, en utilisant le même dispositif, l'utilisation de systèmes optiques présentant des facteurs de grandissements 5 différents. Dans la première modalité, visant à établir un spectre Raman, le plan focal objet 5.1 du système optique 3 est situé dans l'échantillon, à une profondeur z de la surface de l'échantillon. Dans cette deuxième modalité, visant à établir les propriétés optiques de l'échantillon, le plan focal objet 5.1 du système optique est confondu avec la surface de l'échantillon. Il permet alors 10 de former une image de la surface de l'échantillon 50 sur le plan de détection 44 formé par les extrémités distales 26 de chaque fibre optique de détection 22, avec un facteur de grandissement G donné. Ainsi, chaque extrémité distale 261, 262...26n est respectivement conjuguée à une zone élémentaire de détection 281, 282...28n de la surface de l'échantillon. De cette façon, chaque fibre optique de détection 221, 222,...22n est apte à collecter respectivement 15 un deuxième signal optique élémentaire 521, 522,...52nrétrodiffusé par l'échantillon, chaque signal optique élémentaire 521, 522,...52némanant respectivement de la zone élémentaire de détection 281, 282...28n. De même, l'extrémité distale 16 de la fibre d'émission 12 est conjuguée à une zone élémentaire d'illumination 18 à la surface de l'échantillon, cette zone élémentaire d'illumination constituant 20 le point d'impact du faisceau lumineux 20 à la surface de l'échantillon 50. Ainsi, quel que soit le mode de réalisation, chacune desdites extrémités distales 261, 262...26n peut être située dans un plan focal image du système optique 3, et conjuguée à une zone élémentaire de détection 281, 282...28n située dans le plan focal objet dudit système optique, à la surface de l'échantillon. 25 De même, l'extrémité distale 16 de la fibre d'émission 12 est conjuguée à une zone élémentaire d'illumination 18 à la surface de l'échantillon, cette zone élémentaire d'illumination constituant le point d'impact du deuxième faisceau lumineux 20 à la surface de l'échantillon 50. 3032528 22 D'une façon générale, et quelle que soit le mode de réalisation, le terme zone élémentaire désigne une partie de la surface de l'échantillon dont les dimensions sont suffisamment faibles pour considérer qu'elle est traversée par un rayonnement lumineux homogène. Autrement dit, une zone élémentaire est une zone de forme délimitée, de préférence ponctuelle, c'est-à-dire 5 dont le diamètre ou la diagonale est inférieure à 5 mm, et de préférence inférieure à 1 mm, voire inférieure à 500 um. Une zone élémentaire d'illumination 18 est traversée par le faisceau lumineux 20, se propageant en direction de l'échantillon 50, tandis qu'une zone élémentaire de détection 28n est traversée par un rayonnement rétrodiffusé 52n, ce rayonnement étant produit par la rétrodiffusion, dans 10 l'échantillon, du faisceau lumineux 20. Le couplage optique, réalisé par le système optique 3, permet à chaque fibre de détection 22n de collecter le rayonnement rétrodiffusé élémentaire 52n, ce dernier correspondant au rayonnement rétrodiffusé traversant la zone élémentaire 28n. L'élément de maintien 42 peut assurer une liaison rigide entre les fibres optiques de détection 22 et le système optique 3, de façon à maintenir le plan de détection 44, formé par les extrémités 15 distales 26 des fibres optiques de détection à une distance fixe du système optique 3. Si dr, représente la distance entre l'extrémité distale 26n d'une fibre de détection 22n et l'extrémité distale 16 de la fibre d'émission 12, distance calculée dans un plan perpendiculaire à l'axe optique Z, la distance Dr, entre la zone élémentaire de détection 28n, conjuguée de ladite extrémité distale 26n, et la zone élémentaire d'illumination 18, conjuguée de ladite extrémité 20 distale 16, est telle que : dn Dn = 7 La distance Dr, est appelée distance de rétrodiffusion, car elle correspond à la distance, dans un plan perpendiculaire à l'axe optique Z, entre la zone élémentaire d'illumination 18 et une zone élémentaire de détection 28n de laquelle émanent le signal rétrodiffusé Sn. 25 Si la distance entre le faisceau lumineux et l'extrémité distale d'une fibre optique de détection est, en amont du système optique, égale à une première distance, la distance de rétrodiffusion est, à la surface de l'échantillon, égale à ladite première distance pondérée par l'inverse du facteur de grandissement. 3032528 23 Lorsque son facteur de grandissement est supérieur à 1, le système optique 3 tend à rapprocher significativement les zones élémentaires de détection 28n de la zone élémentaire d'illumination 18. Le terme « en amont » se comprend en considérant la direction de propagation de la lumière. 5 Lorsque le facteur de grandissement G est inférieur à 1, le système optique tend au contraire à éloigner significativement les zones élémentaires de détection 28n de la zone élémentaire d'illumination 18 par rapport à la configuration de l'art antérieur. Ainsi, selon la valeur du facteur de grandissement, les zones élémentaires de détection 28n sont : 10 soit rapprochées les unes des autres, et rapprochées de la zone élémentaire d'illumination, leur surface étant également diminuée du carré du facteur de grandissement, par rapport à la surface de l'extrémité distale à laquelle elles sont respectivement associées. Cela permet d'effectuer une caractérisation de l'échantillon avec une résolution spatiale élevée, sur une profondeur plus faible que selon l'art 15 antérieur. soit éloignées les unes des autres, et éloignées de la zone élémentaire d'illumination, leur surface étant augmentée du carré du facteur de grandissement, par rapport à la surface de l'extrémité distale à laquelle elles sont respectivement associées. Cela permet d'effectuer une caractérisation de l'échantillon avec une résolution spatiale 20 plus faible. La figure 9 résume cet effet technique, chaque flèche Fi, F2, F3 et F4 représentant le trajet, dans l'échantillon 50, des photons contribuant aux signaux rétrodiffusés respectifs 521, 522, 523, 524 respectivement associés aux zones élémentaires de détection 281, 282, 283, 284. Plus l'écartement entre les zones élémentaires de détection 281, 282, 283, 284 et la zone élémentaire 25 d'illumination 18 est élevée, plus la profondeur examinée zi, z2, z3, z4 de l'échantillon est importante. Inversement, plus l'écartement entre les zones élémentaires de détection et la zone élémentaire d'illumination est faible plus la profondeur examinée de l'échantillon est faible. Dans le cas présent, le dispositif est mis en oeuvre pour déterminer les propriétés optiques de l'échantillon, en particulier dans une couche superficielle, s'étendant entre la surface de 30 l'échantillon et une profondeur maximale d'environ 100 p.m à 150 p.m, de façon à utiliser lesdites propriétés optiques pour effectuer une correction d'un spectre Raman confocal. 3032528 24 Aussi, on utilise de préférence un système optique 3, dont le facteur de grandissement est supérieur à 1, et de préférence supérieur à 5 ou 10, pour pouvoir déterminer une propriété optique représentative de cette couche superficielle. Lorsque le deuxième photodétecteur est un spectromètre, le dispositif permet d'effectuer des 5 mesures du spectre rétrodiffusé selon des distances de rétrodiffusion de quelques dizaines à environ 200 um. On parle de spectroscopie de microreflectance diffuse. On décrit à présent un procédé susceptible d'être mis en oeuvre par le dispositif précédemment décrit, afin d'estimer une ou plusieurs propriétés optiques de l'échantillon examiné, et plus particulièrement d'une couche superficielle de cet échantillon, cette couche s'étendant en 10 particulier entre la surface et une profondeur généralement inférieure à 150 um. Le terme propriété optique désigne notamment un facteur gouvernant l'absorption et la diffusion des photons dans le milieu diffusant, en particulier un coefficient d'absorption, un coefficient de diffusion, un coefficient de diffusion réduit, un coefficient d'anisotropie de la diffusion, 15 En lien avec la figure 10, on décrit les principales étapes d'un procédé permettant l'estimation des propriétés optiques de diffusion, en particulier le coefficient d'absorption lia et le coefficient de diffusion réduit u's. Dans cet exemple, le facteur de grandissement G s'élève à 30. Comme représenté sur la figure 8, le dispositif comporte 36 fibres de détection, divisées en 6 groupes de 6 fibres, en fonction de la distance dr, séparant chaque fibre de détection 22n du faisceau 20 d'illumination 50. Ces distances dr, s'élèvent respectivement à 300 um ; 700 um ; 1.1 mm ; 1.5 mm ; 2 mm ; 2.5 mm Grâce au système optique 3, chaque fibre de détection 22n est conjuguée à une zone élémentaire de détection 28n. Les zones élémentaires de détection sont alors elles-mêmes divisées en 7 groupes, en fonction de la distance de rétrodiffusion Dr, séparant chaque zone 25 élémentaire de détection 28n à la zone élémentaire d'illumination 18. Compte tenu du facteur de grandissement, du système optique 3, les distances Dr, s'élèvent respectivement à environ 10 um ; 23 um ; 37 um ; 50 um ; 67 um ; 83 um. On procède alors selon les étapes suivantes : 3032528 25 1ère étape 110: application du dispositif préalablement décrit, en regard de l'échantillon 50, de telle sorte que la surface examinée soit placée dans la plan focal objet 5.1 du système optique 3. 2ième étape 120 : illumination de l'échantillon en dirigeant un faisceau lumineux 20 contre la 5 surface de l'échantillon, la partie de la surface illuminée constituant la zone élémentaire illuminée 18. 3ierne étape 130 : collection d'un deuxième signal optique 521, 522, 523, 524... 52', respectivement rétrodiffusé par l'échantillon, au niveau de chaque zone élémentaire de détection 281, 282, 283, 284... 28', , par la fibre optique 221, 222, 223, 224... 22,, de détection dont l'extrémité distale 261, 10 262, 263, 264... 26', est conjuguée à ladite zone élémentaire 281, 282, 283, 284... 28', . 4ieme étape 140: mesure, à l'aide d'un deuxième photodétecteur 40, du signal Sr, représentatif de chaque signal optique rétrodiffusé 52,, à chaque distance Dr, de la zone élémentaire d'illumination. Le signal Sn peut être notamment établi en cumulant les signaux optiques collectés par les fibres optiques de détection d'un même groupe. 15 5ième étape 150 : A l'aide de chaque signal Sr, correspondant à une distance de rétrodiffusion D,,, détermination d'une fonction 8,, appelée réflectance du signal, cette réflectance étant obtenue en fonction du signal Sr, et de paramètres de calibration. Ainsi, 8,, = fcalib(Sn), ou tain, désigne une fonction de calibration, dépendant de l'instrumentation mise en oeuvre, par exemple l'efficacité de collection par les fibres, la fonction de réponse du détecteur et l'intensité du faisceau 20 lumineux incident. La fonction de calibration f -calib peut être obtenue au cours d'une phase de calibration, préalablement ou postérieurement à la mesure sur l'échantillon. Par exemple, la réflectance 8,, peut être obtenue, à partir de Sn, selon l'expression : Rn = fcalib(Sn) Ssource ou selon l'expression Sn Sref Rstd-n Rn = fcalib(Sn) = X Ssource Sstd-n Sn - Sref 25 où : 3032528 26 Sr, est le signal détecté correspondant à la distance Dr, de la zone élémentaire d'illumination , Sref est un signal de calibration, traduisant les réflexions parasites du système optique, obtenu en activant la source de lumière, mais sans présence de l'échantillon, ce dernier 5 étant remplacé par un élément absorbant, tel un écran noir Ssource est le signal produit par la source de lumière. Sstd-n est un signal de rétrodiffusion mesuré, en considérant une distance de rétrodiffusion Dr,, sur un fantôme, dont les propriétés optiques (absorption, diffusion) sont connues, en utilisant le même dispositif que celui mis en oeuvre pour acquérir le 10 signal Sn. Rstd-n est une estimation de la réflectance produite, par ledit fantôme, à la distance de rétrodiffusion D. D'une façon générale, la réflectance représente l'intensité du signal rétrodiffusé. Elle est normalisée par l'intensité du faisceau incident au détecteur, auquel cas elle représente une 15 fraction du faisceau incident rétrodiffusée à la distance de rétrodiffusion considérée. 6Ierne étape 160 : pour au moins une longueur d'onde X, et en considérant au moins deux distances Dr, de rétrodiffusion, détermination du couple (u.a(X), u.'s(X)) présentant le moindre écart entre la réflectance mesurée ftr,(X), à la longueur d'onde X, et une réflectance modélisée RnA ja,p.s,model(X) pour différentes valeurs de µa(X) et de u.'s(X), à une distance de rétrodiffusion D. 20 Cette détermination peut être réalisée par la minimisation d'un écart quadratique, et par exemple selon l'expression : N (X), µsG )) = argminGia(up, sw)(1(Rge,e4,(À) - Rn (À)) n=1 où : N désigne le nombre de distances prises en compte 25 Rnmeoades, est une fonction de réflectance modélisée, établie pour la distance de rétrodiffusion Dr,, et pour un couple de valeurs lia et us. Les différentes valeurs de réflectance modélisée Rnmec'atis, sont obtenues, pour une pluralité de couples de valeurs lia, us au cours d'une phase de calibration, par simulation numérique, ou expérimentalement, sur des échantillons étalons dont les propriétés optiques sont connues. 3032528 27 Pour une distance de rétrodiffusion Dr, donnée, on peut représenter une pluralité de réflectances RZ'ades, modélisées en fonction de p.a et de us'. La figure 11 donne un exemple de représentation de telles réflectances modélisées à une distance de rétrodiffusion de 185 um, sous la forme d'une table de calibration, ou LUT, acronyme de Look Up Table. Chaque point de 5 la nappe représentée sur la figure 11 correspond à une estimation de la réflectance, à ladite distance de rétrodiffusion, en fonction du coefficient d'absorption p.a et la valeur du coefficient de diffusion réduit us. D'une façon générale, la notation R,277°,del, désigne une réflectance modélisée à la distance de rétrodiffusion Dr,, en prenant en compte des valeurs prédéterminées d'au moins un paramètre 10 optique p. Le paramètre p peut correspondre à une propriété optique, par exemple ps', ou un ensemble de propriétés optiques, par exemple (p.a, us') Les propriétés optiques déterminées, et en particulier us', peuvent être alors utilisées pour déterminer la fonction de correction d'un spectre Raman, par l'intermédiaire du facteur de correction 13, selon l'expression (2). 15 Les étapes 150 et 160 sont mises en oeuvre par le microprocesseur 48 (ou par le microprocesseur 9 le cas échéant), préalablement programmé à cet effet, et dont les données d'entrée sont les mesures réalisées par le deuxième photodétecteur 40. Lorsque le deuxième photodétecteur 40 est pourvu d'une fonction spectrométrique, les procédés précédemment décrits peuvent être mises en oeuvre pour une pluralité de longueurs 20 d'onde ou de bandes spectrales différentes. Dans ce cas, on obtient les différentes propriétés optiques en fonction de la longueur d'onde ou de la bande spectrale considérée. Dans l'application visée, l'utilisation d'un détecteur spectrométrique n'est pas rendue nécessaire, dans la mesure où une détermination des propriétés optiques à une longueur d'onde est suffisante, en l'occurrence la longueur d'onde de la source laser 1, en l'occurrence 532 nm. 25 Selon un autre mode de réalisation, représenté sur la figure 12, la deuxième source de lumière 10 est disposée face à la lame semi-réfléchissante 7.2. Le deuxième faisceau lumineux est réfléchi par la deuxième lame semi-réfléchissante 7.2, puis par la première lame semiréfléchissante 7.1 en direction de l'échantillon. L'intérêt de cette configuration est qu'elle permet de collecter un signal optique retrodiffusé 30 sous un angle de 180°, c'est-à-dire rétrodiffusé parallèlement au faisceau lumineux 20, transmis 3032528 28 par la lame semi-réfléchissante 19 vers une fibre optique de détection 22o, coaxiale dudit faisceau lumineux 20, cette fibre optique étant conjuguée à la zone élémentaire d'illumination 18 formée par la trace du faisceau d'illumination 20 sur la surface de l'échantillon. Cette fibre de détection 22o peut également être couplée, par son extrémité proximale 24o, au 5 spectromètre Raman 4. Le plan focal 44 constitue le plan focal image 5.2 du système optique 3. Ainsi, l'extrémité distale 260de cette fibre de détection 22o fait office de filtre spatial 6, et, de façon équivalente à un sténopé, place le spectromètre Raman 4 dans une configuration confocale. La fenêtre 6.1 du filtre spatial 6 correspond alors au coeur de ladite fibre, collectant le premier signal optique 10 Un autre avantage de ce mode de réalisation est qu'il permet de remplacer, de façon optionnelle, le premier photodétecteur 4 et le deuxième photodétecteur 40 en un seul et même photodétecteur commun. Selon un autre mode de réalisation, représenté sur la figure 13, la source laser 1 est utilisée comme source de lumière pour les deux modalités, à savoir l'acquisition du spectre Raman et la 15 détermination des propriétés optiques de l'échantillon. En effet, comme précédemment évoqué, les inventeurs ont considéré que la connaissance des propriétés optiques, en particulier le coefficient de diffusion us', à la longueur d'onde du faisceau laser seulement, permettait d'effectuer une correction du spectre Raman de façon efficace. Ainsi, le dispositif bimodal peut ne comporter qu'une seule source de lumière, ce qui permet 20 une simplification du dispositif. REVENDICATIONS1. Procédé de correction d'un signal optique produit par un échantillon (50) comportant les étapes suivantes : illumination d'une surface de l'échantillon (50) par un premier faisceau lumineux (2), produit par une première source lumineuse (1), ladite première source de lumière (1) étant couplée à un premier système optique (3), apte à focaliser ledit premier faisceau lumineux dans un plan focal objet (5.1) dudit premier système optique, ledit plan focal objet étant situé, dans l'échantillon, à une profondeur z de la surface de l'échantillon, mesure, à l'aide d'un premier photodétecteur (4), d'un premier signal optique (8) rétrodiffusé par l'échantillon (50) en réponse audit premier faisceau lumineux (2), le photodétecteur (4) produisant un premier signal mesuré (SP, SPz) représentatif dudit premier signal optique (8), un filtre spatial (6) étant interposé entre ledit premier système optique (3) et le photodétecteur (4), ledit filtre spatial comportant une fenêtre (6.1) apte à transmettre ledit premier signal optique vers ledit photodétecteur (4), ladite fenêtre (6.1) étant disposée dans un plan focal conjugué (5.2) dudit plan focal objet (5.1) dudit premier système optique, caractérisé en ce que le procédé comporte également les étapes suivantes : - détermination d'une propriété optique de diffusion ou d'absorption (lia, us',u.s, g) dudit échantillon, application d'une fonction de correction (Fcorr) audit signal mesuré (SP, SPz) de façon à générer un premier signal optique corrigé (SPcorr-z ), ladite fonction prenant en compte ladite propriété optique de diffusion ou d'atténuation 2. Procédé de correction selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend également la détermination de ladite profondeur (z) entre ledit premier plan focal objet (5.1) dudit premier système optique et ladite surface de l'échantillon, ladite fonction de correction (Fcorr) prenant en compte ladite profondeur (z). 3. Procédé de correction selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel la première source lumineuse est une source laser, le photodétecteur (4) étant un spectrophotomètre Raman, de 3032528 telle sorte que ledit premier signal mesuré (SPz) est un spectre Raman, le procédé comprenant les étapes suivantes : mesure, à l'aide dudit spectrophotomètre Raman (4) d'un spectre Raman de profondeur (SPdepth), représentatif du premier signal optique rétrodiffusé par l'échantillon (50) en 5 réponse audit premier faisceau lumineux (2), lorsque ledit premier plan focal objet (5.1) est situé, dans l'échantillon, à une profondeur (zdeph) de la surface, ladite profondeur (Zdeph) étant supérieure à une profondeur seuil (zt) préalablement déterminée, détermination d'un terme de correction ((3), en fonction de ladite propriété optique mesurée, 10 ladite fonction de correction (Fcorr) prenant en compte ledit spectre de Raman de profondeur (SPdepth) et ledit terme de correction ((3). - , 4. Procédé de correction selon la revendication 3, dans lequel la fonction de correction comprend une fonction exponentielle croissante, l'exposant de l'exponentielle dépendant dudit terme de correction (3 et de ladite profondeur z. 15 5. Procédé de correction selon la revendication 4, dans lequel la fonction de correction comprend un produit dudit spectre Raman (SPz) par ladite exponentielle croissante. 6. Procédé de correction selon la revendication 5, dans lequel la fonction de correction comprend une addition dudit spectre Raman en profondeur (SPdepth) audit produit dudit spectre - Raman (SPz) par ladite exponentielle croissante. 20 7. Procédé de correction selon la revendication 1, dans lequel ledit premier rayonnement optique de rétrodiffusion est un signal de fluorescence. 8. Procédé de correction selon la revendication 1 à 7, dans lequel ladite propriété optique est un coefficient décrivant la diffusion de la lumière dans ledit échantillon, en particulier un coefficient de diffusion réduit, un coefficient de diffusion ou un facteur d'anisotropie de ladite 25 diffusion. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la détermination de ladite propriété optique comprend les étapes de : deuxième illumination d'une surface de l'échantillon à l'aide d'un deuxième faisceau lumineux (20), de façon à former, à la surface dudit échantillon, une zone élémentaire 3032528 31 d'illumination (18), correspondant à la partie de ladite surface éclairée par ledit échantillon par ledit deuxième faisceau lumineux, détection de N deuxièmes signaux optiques (521, 522, 523, 524, 52,,), rétrodiffusés par l'échantillon, chaque deuxième signal optique émanant de la surface de l'échantillon à 5 une distance, (D1, D2, D3, D4, Dr,), dite distance de rétrodiffusion, de ladite zone élémentaire d'illumination, N étant un entier supérieur ou égal à 1, de manière à former autant de deuxièmes signaux détectés (Si, S2, S3, S4, Sn), détermination d'au moins une propriété optique (p) de l'échantillon, par comparaison entre : 10 - une fonction (Ri, R2, R3, R4, Rn) de chaque deuxième signal ainsi détecté (Si, S2, S3, S4, Sn), ^ et une pluralité d'estimations de ladite fonction (R1,pmodel, R2,pmodel, R3,pmodel, R4,pmodel , Rrumodel ) chaque estimation étant réalisée en considérant une valeur prédéterminée de ladite propriété optique (p), 15 10. Procédé selon la revendication 10, dans lequel au moins une distance de rétrodiffusion (D1, D2, D3, D4, Dri) est inférieure à 200 um. 11. Dispositif de caractérisation d'un échantillon (50), comprenant : une première source de lumière (1), apte à émettre un premier faisceau lumineux (2) vers la surface dudit échantillon (50), 20 un premier système optique (3), apte à focaliser ledit premier faisceau lumineux (2) dans un plan focal objet (5.1), un premier photodétecteur (4), un filtre spatial (6), interposé entre ledit premier système optique (3) et ledit photodétecteur (4), ledit filtre spatial comportant une fenêtre (6.1) apte à transmettre 25 un premier signal optique, rétrodiffusé par ledit échantillon lorsqu'il est exposé audit premier faisceau lumineux (2) vers ledit photodétecteur (4), ladite fenêtre étant disposée dans le plan focal (5.2) conjugué dudit plan focal objet (5.1), caractérisé en ce que le dispositif comporte : 3032528 32 un microprocesseur (9), apte à corriger ledit premier signal optique, en mettant en oeuvre le procédé objet d'une des revendications 1 à 10 12. Dispositif de caractérisation d'un échantillon selon la revendication 11, comportant également : 5 une deuxième source de lumière (10), apte à émettre un deuxième faisceau lumineux (20) vers une surface dudit échantillon, de façon à former, sur ladite surface, une zone élémentaire d'illumination (18), au moins une fibre optique de détection (22), s'étendant entre une extrémité proximale (24), apte à être couplée à un deuxième photodétecteur (40) et une extrémité distale 10 (26), apte à collecter un signal optique (52) rétrodiffusé par l'échantillon lorsqu'il est exposé audit deuxième faisceau lumineux, un deuxième système optique comportant tout ou partie du premier système optique (3), ledit deuxième système optique présentant un facteur de grandissement et un axe optique, 15 ledit deuxième système optique (3) étant apte à conjuguer l'extrémité distale de chaque fibre optique de détection (26) à une zone élémentaire de détection (28, 28n) située sur la surface de l'échantillon, de telle sorte que la distance (Dri) entre la zone élémentaire d'illumination et chaque zone élémentaire de détection, perpendiculairement audit axe optique, est fonction dudit facteur de 20 grandissement. 13. Dispositif selon la revendication précédente, dans ledit deuxième système optique est également apte à conjuguer ladite deuxième source de lumière (10) à une zone élémentaire d'illumination (18), située à la surface de l'échantillon, 14. Dispositif de caractérisation d'un échantillon selon la revendication 12 ou la revendication 25 13, comportant également un élément de renvoi (7, 7.1, 7.2), apte à diriger : - ledit premier faisceau lumineux (2) vers l'échantillon (50), - ou ledit premier signal optique (SPz) rétrodiffusé par l'échantillon (50) vers ledit premier photodétecteur (4), - ou ledit deuxième faisceau lumineux (20) vers l'échantillon (50), 3032528 33 - ou ledit deuxième signal optique (Si, S2, S3, S4, Sn) vers ledit deuxième photodétecteur (40). 15. Dispositif de caractérisation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, comportant 5 une première fibre optique de détection (221), dont l'extrémité distale est située à une première distance (d1) dudit deuxième faisceau lumineux (20), une deuxième fibre optique de détection (222), dont l'extrémité distale est située à une deuxième distance (d2) dudit deuxième faisceau lumineux (20), ladite deuxième distance étant supérieure à ladite première distance. 10 16. Dispositif de caractérisation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, dans lequel la deuxième source de lumière (10) comporte une fibre optique d'illumination (12), s'étendant entre une extrémité proximale (14), apte à recevoir une lumière, et une extrémité distale (16), apte à émettre ledit deuxième faisceau lumineux en 15 direction de la surface de l'échantillon (50). 17. Dispositif de caractérisation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, dans lequel lesdits premier système et deuxième système optiques sont confondus et forment un système optique commun (3). 18. Dispositif selon l'une des revendications 17, dans lequel une fibre optique de détection (22o) 20 est disposée dans ledit plan focal conjugué (5.2) dudit plan focal objet (5.1) dudit système optique commun, ladite fibre optique de détection étant apte à transmettre ledit premier signal optique vers le premier photodétecteur (4) ou vers le deuxième photodétecteur (40). 19. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel le premier photodétecteur (4) et le deuxième photodétecteur (40) forment un même photodétecteur. 25 20. Dispositif selon l'une des revendications 18 ou 19, dans lequel la première source de lumière et la deuxième source de lumière forment une même source de lumière.