Brevet FR3026109A1 — publié le 20160325

- 1 - Domaine technique La présente invention concerne notamment une bactérie permettant l'expression à haut niveau d'une protéine 5 d'intérêt. La présente invention concerne également un procédé de production d'une protéine d'intérêt mettant en oeuvre une bactérie selon l'invention. Par ailleurs, la présente invention concerne également un ensemble de parties permettant d'obtenir une bactérie selon 10 l'invention. Technique antérieure La production de protéines recombinantes, comme les enzymes, les hormones et les anticorps, est nécessaire dans 15 de nombreux domaines comme la recherche en biologie, la médecine humaine ou vétérinaire et l'industrie alimentaire. Cette production est souvent faite en cellules procaryotes et plus particulièrement en Escherichia coli (E. coli). Le promoteur lac est le promoteur inductible le plus 20 utilisé pour l'expression de protéine chez E. coli. Il peut être notamment utilisé pour induire l'expression de la T7 polymérase. Dans ce système, le gène codant la T7 polymérase est inséré dans le chromosome bactérien sous le contrôle de l'opéron lac. L'ajout d'isopropyle-P-D 25 galactoside (IPTG) dans le milieu de culture permet d'induire efficacement la transcription de la T7 polymérase qui va ensuite pouvoir induire la transcription d'un gène, codant une protéine hétérologue, placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique de la T7 polymérase. 30 Toutefois, l'IPTG présente des limitations pour la production industrielle de protéines recombinantes. Ces limitations sont notamment liées au coût et à la toxicité UBGII1-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 2 - de l'IPTG. Par ailleurs, l'IPTG doit être introduit à un moment bien précis de la croissance bactérienne ce qui implique la nécessité de suivre précisément la densité cellulaire dans le milieu de culture. Afin de contourner les problèmes liés à l'IPTG, différentes stratégies ont été mises en oeuvre. Parmi celle-ci, on peut notamment citer l'utilisation de lactose ou du galactose comme inducteur de transcription. Mais ces derniers ne permettent pas d'atteindre des taux de production équivalents à l'IPTG et nécessitent toujours une surveillance précise de la croissance bactérienne. Des systèmes auto-inductibles mettant en oeuvre des milieux de culture spécifiques, comprenant des molécules métabolisées de telles sortes à induire automatiquement l'induction de la transcription à partir du promoteur lac, ont également été proposés. Ces derniers systèmes, bien qu'efficaces, peuvent mettre en oeuvre des molécules et des milieux qui ne sont pas encore approuvés par les autorités réglementaires. Il existe donc un besoin pour de nouvelles bactéries capables d'exprimer de façon auto-inductible une protéine hétérologue sous le contrôle d'un promoteur lac dans un milieu de culture ne comprenant pas de molécules toxiques. Résumé de l'invention Ainsi la présente invention concerne notamment une bactérie exprimant de façon temporaire ou continue une protéine Hsp caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une séquence d'acide nucléique, codant une protéine d'intérêt, sous le contrôle d'un promoteur lac. Il a été observé, de façon surprenante, que l'expression d'une protéine Hsp par la bactérie induisait UBGII1-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 3 - la transcription des séquences d'acides nucléiques sous le contrôle d'un promoteur lac. Dans le cadre de la présente invention, le terme « promoteur lac » se réfère à un promoteur de l'opéron lac, dont l'activité de transcription est réprimée par une protéine répresseur comme la protéine Lad I codée par le gène lad l mais levée par un inducteur, tel que le lactose ou des analogues de celui-ci (par exemple, l'isopropyle-P-D galactoside (IPTG)). L'inducteur se lie à la protéine répresseur et empêche la répression de la transcription génique. Dans le cadre de la présente invention, le terme « sous le contrôle » entend signifier que la transcription de la séquence d'acide nucléique, codant ladite protéine d'intérêt, est dépendante de l'association d'une polymérase sur ledit promoteur. Avantageusement, ledit promoteur lac est placé en amont de ladite séquence d'acide nucléique, codant ladite protéine d'intérêt. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, 20 ladite protéine d'intérêt n'est pas la P-galactosidase, la lactose perméase et/ou la thiogalactoside transacétylase. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention ladite protéine d'intérêt est une protéine hétérologue. Dans le cadre de la présente invention, le terme 25 « protéine hétérologue » entend signifier que ladite protéine n'est pas une protéine naturellement exprimée par ladite bactérie. La présente invention concerne également un ensemble de parties pour la production d'une protéine d'intérêt par 30 une bactérie comprenant : (i) une séquence d'acide nucléique codant ladite protéine d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur lac. UBGII1-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 4 - (ii) une séquence d'acide nucléique codant une protéine Hsp. Ledit ensemble de parties permet d'obtenir la bactérie selon l'invention. L'homme du métier peut notamment utiliser l'ensemble de parties selon l'invention pour transfecter une bactérie et obtenir une bactérie selon l'invention. Selon un mode de réalisation préféré, l'ensemble de parties selon l'invention comprend en outre une bactérie. Selon un mode de réalisation préféré, ledit acide nucléique codant une protéine d'intérêt est compris dans un premier plasmide. Dans le cadre de ce mode de réalisation, ledit plasmide comprend le promoteur lac. Selon un mode de réalisation préféré, ladite protéine 15 d'intérêt est une protéine recombinante. Selon un autre mode de réalisation préféré, ladite protéine d'intérêt est une polymérase. Selon un mode de réalisation encore plus préféré, ladite polymérase est une 17 polymérase. 20 Dans le cadre de ces deux derniers modes de réalisations, la bactérie ou l'ensemble de parties selon l'invention comprend en outre une deuxième séquence d'acide nucléique, codant une seconde protéine d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique de ladite polymérase. 25 Ainsi, dans ce mode de réalisation c'est l'induction de l'expression de la polymérase qui va permettre l'expression de la protéine d'intérêt. Selon un mode de réalisation préféré ladite deuxième séquence d'acides nucléiques est comprise dans ledit premier plasmide ou dans un second 30 plasmide. Selon un mode de réalisation encore plus préféré, ladite séquence codant pour la polymérase sous le contrôle d'un promoteur Lac est comprise dans le génome de ladite bactérie. UBGII1-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 5 - Selon un mode de réalisation préféré, ladite protéine Hsp est codée par une séquence d'acides nucléiques sous le contrôle d'un promoteur lac. Selon un mode de réalisation préféré, ladite bactérie est une E. coli. Selon un mode de réalisation préféré, ladite bactérie appartient à la souche BL21(DE3) star ou à la souche BL21(DE3). Dans le cadre de la présente invention, le terme 10 « protéine Hsp » fait référence aux « heat shock protein » c.à.d. aux protéines appartenant au groupe de protéines dont l'expression est naturellement induite par un choc thermique. Ces protéines sont bien connues de l'homme du métier. Elles sont notamment impliquées dans le pliage et 15 le dépliage des autres protéines. Leur expression est augmentée lorsque les cellules sont exposées à des températures élevées ou à d'autres stress. Les Hsp sont trouvées dans presque tous les organismes vivants, de la bactérie à l'homme. Les protéines de choc thermique sont 20 nommées en fonction de leur poids moléculaire. Par exemple, la Hsp60, Hsp70 et Hsp90 se réfèrent à des familles de protéines de choc thermique de l'ordre de 60, 70 et 90 kilodaltons par la taille, respectivement. Dans le cadre de la présente invention, le terme 25 « protéine Hsp » fait référence aux protéines Hsp produites naturellement par les cellules eucaryotes ou procaryotes. Le terme « protéine Hsp » fait également référence aux protéines présentant une séquence ayant une homologie supérieure à 90%, préférentiellement supérieure à 95% et 30 tout a fait préférentiellement supérieure à 99% aux protéines Hsp naturellement produites. Dans le cadre de la présente invention, est considérée comme une séquence protéique, homologue d'une autre séquence protéique, une UBGII1-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 6 - protéine qui présente, sur un nombre d'acides aminés au moins égal à 80 pourcent du nombre d'acides aminés de la séquence protéique de référence, de préférence sur la longueur totale de la séquence de référence, un pourcentage d'homologie correspondant aux valeurs indiquées précédemment. Le pourcentage d'homologie est calculé en comptant le nombre de positions pour lesquelles les séquences protéiques présentent des acides aminés identiques et en divisant ce nombre de positions identiques par la longueur de la séquence du polypeptide le plus long et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'homologie entre ces deux séquences. Selon un mode de réalisation préféré, la protéine Hsp est choisie dans le groupe comprenant les Hsp27 (P04792), Hsp40 (P25685), Hsp60 (P10809), Hsp70 (P08107), Hsp90 (P08238 and P07900) et Hsp110 (Q92598) (Uniprot reference number).Selon un mode de réalisation préféré, la protéine Hsp est la protéine Hsp70 humaine (Uniprot reference number : P08107). La présente invention concerne également un procédé pour l'expression d'une protéine d'intérêt par une bactérie caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une bactérie selon l'invention. Selon un mode de réalisation préféré, ladite bactérie 25 est cultivée dans un milieu ne contenant pas d'IPTG. Selon un mode de réalisation préféré, ladite bactérie est cultivée dans un milieu liquide. De façon surprenante, la demanderesse a observé que la concentration en glucose et/ou en lactose du milieu de 30 culture utilisé permet de moduler le moment où la protéine d'intérêt est exprimée par la bactérie selon l'invention. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de culture comprend du glucose. UBGII1-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 7 - Selon un mode de réalisation encore plus préféré ledit milieu de culture comprend entre 0.01% et 0.5% de glucose et selon un mode de réalisation tout à fait préféré entre 0.3% et 0.7% de glucose. Ainsi, selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de culture comprend du lactose. Selon un mode de réalisation encore plus préféré ledit milieu de culture comprend entre 0.01% et 0.5% de lactose et selon un mode de réalisation tout à fait préféré entre 0.3% et 0.7% de lactose. Description des modes de réalisation Expression de protéines hétérologues par une bactérie 15 exprimant l'Hsp70 humaine Matériels et méthodes Dans toutes les expériences suivantes une souche de bactérie E. coli BL21(DE3)star a été utilisée. Toutefois, 20 l'invention n'est pas limitée à ce type particulier de bactéries. La séquence codant l'Hsp70 humaine a été clonée dans le plasmide d'expression bactérien pET21d et placée sous le contrôle du promoteur T7lac. Ce plasmide contient par 25 ailleurs un gène de résistance à l'ampicilline. Le plasmide pET21d-Hsp70 a été utilisé pour transformer E. coli BL21(DE3)Star et obtenir une bactérie capable d'exprimer l'Hsp70. Un second plasmide pET comprenant un gène de 30 résistance à la kanamycine et la même origine de réplication que le plasmide pET21d a été utilisé pour cloner un gène codant pour une protéine hétérologue. Ce UBGII1-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO/GE -8 - second plasmide a été utilisé pour transformer la souche bactérienne codant Hsp70. La production de cinq protéines hétérologues différentes a été testée, ces protéines sont : _ La méthionine sulfoxyde réductase B (MsrB) de Xanthomonas compestris. - La thioredoxine 1 (Trx1) d'E. coli. - La purine nucléoside phosphorylase (PNP) d'E. coli. Le domaine N-Terminal du récepteur T1R3 d'Homo sapiens. La miraculine de Richardella dulcifica (MCL). Ces cinq protéines sont d'origines différentes (bactérie, plante ou homme) et de taille variant de 14kDa à 45kDa. Elles présentent par ailleurs différentes fonctions (enzyme, récepteur ou ligand) et localisation cellulaire (cytoplasme, plasma ou membrane). Les bactéries transformées ont été cultivées en milieu LB, dans des volumes différents (5m1, 20 ml, 1L) à 20 différentes températures (25°C, 30°c et 37°C) Les milieux de culture obtenus ont été analysés par électrophorèse PAGE-SDS. Résultats 25 Toutes les protéines testées sont exprimées à haut niveau à 37°C en l'absence d'inducteur. Ainsi on peut observer sur les électrophorèses PAGE-SDS que la protéine hétérologue est la protéine la plus fortement exprimée par la bactérie. 30 Une accumulation des protéines hétérologues est observée pendant au moins 20 heures. La production des protéines hétérologues n'est pas dépendante du volume de milieu de culture utilisé. UBGII1-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 9 - Ces résultats sont retrouvés à toutes les températures. Effets du glucose et du lactose sur l'expression des 5 protéines d'intérêts Matériels et méthodes Les bactéries transformées pour exprimer les protéines recombinantes citées précédemment ont été 10 cultivées en milieu LB supplémenté avec 0.05% de glucose ou 0.2% de lactose. La croissance bactérienne a été suivie en mesurant la densité optique à 600nm et la quantité de protéine recombinante produite a été mesurée par chromatographie 15 PAGE-SDS du surnageant de culture. Résultats En l'absence de glucose ou de lactose, l'expression des protéines d'intérêt apparait à une densité optique de 20 1. L'ajout de 0.05% de glucose dans le milieu retarde l'expression de la protéine d'intérêt à une densité optique à 600nm de 1.5. L'ajout de 0.02% de lactose permet d'accélérer la 25 production de la protéine d'intérêt à une densité optique de 0.7. UBGII1-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO/GE REVENDICATIONS1 - Bactérie exprimant de- façon temporaire ou continue une protéine Hsp caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une séquence d'acide nucléique, codant une protéine d'intérêt, sous le contrôle d'un promoteur lac. 2 - Bactérie selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que ledit acide nucléique codant une protéine d'intérêt est compris dans un premier 10 plasmide. 3 - Bactérie selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt est une protéine recombinante. 15 4 - Bactérie selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt est une polymérase. 20 5 - Bactérie selon la revendication précédente caractérisée en ce que ladite polymérase est une T7 polymérase. 6 - Bactérie selon l'une des revendications 4 à 25 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une deuxième séquence d'acide nucléique, codant une seconde protéine d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique de ladite polymérase. 30 7 - Bactérie selon la revendication précédente caractérisée en ce que ladite deuxième séquence d'acides UBGII1-FR-I_TEXTE SUITE NOTIF_SO/GEnucléiques est comprise dans ledit premier plasmide ou dans un second plasmide. 8 - Bactérie selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que ladite protéine Hsp est codée par une séquence d'acides nucléiques sous le contrôle d'un promoteur lac. 9 - Bactérie selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que ladite bactérie est une E. cou. 10 - Bactérie selon la revendication 9 caractérisée en ce que ladite bactérie appartient à la souche BL21(DE3) M ou BL21(DE3)star. 11 - Bactérie selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la protéine Hsp est choisie dans le groupe comprenant l'Hsp40, l'Hsp70, 20 l'Hsp80 et l'Hsp110. 12 - Bactérie selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la protéine Hsp est la protéine Hsp70 humaine. 25 13 - Procédé pour l'expression d'une protéine d'intérêt par une bactérie caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une bactérie selon l'une des revendications 1 30 à 12. UBGIII-FR-l_TEXTE SUITE-NOTIF_SO/GE- 12 - 14 - Procédé selon la revendication précédente caractérisé en ce que ladite bactérie est cultivée dans un milieu ne contenant pas d'IPTG. 15 - Procédé selon la revendication précédente caractérisé en ce que ladite bactérie est cultivée dans un milieu liquide. 16 - Ensemble de parties pour la production d'une 10 protéine d'intérêt par une bactérie comprenant (i) une séquence d'acide nucléique codant ladite protéine d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur lac. (ii) une séquence d'acide nucléique codant une protéine Hsp. 15 17 - Ensemble de parties selon la revendication précédente caractérisé en ce qu'il comprend en outre une bactérie. 20 18 - Ensemble de parties selon l'une des revendications 16 ou 17 caractérisé en ce que ledit acide nucléique codant une protéine d'intérêt est compris dans un premier plasmide. 25 19 - Ensemble de parties selon l'une des revendications 16 à 18 caractérisé en ce que ladite protéine d'intérêt est une protéine recombinante. 20 - Ensemble de parties selon l'une des 30 revendications 16 à 19 caractérisé en ce que ladite protéine d'intérêt est une polymérase. UOGII1-FR-1_TEXTE SUITE NOTIF_SO/GE- 13 - 21 - Ensemble de parties selon la revendication précédente caractérisé en ce que ladite polymérase est une T7 polymérase. 22 - Ensemble de parties selon l'une des revendications 20 à 21 caractérisé en ce qu'elle comprend en outre une deuxième séquence d'acide nucléique, codant une seconde protéine d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique de ladite polymérase. 23 - Ensemble de parties selon la revendication précédente caractérisé en ce que ladite deuxième séquence d'acides nucléiques est comprise dans ledit premier plasmide ou dans un second plasmide. 24 - Ensemble de parties selon l'une des revendications 16 à 23 caractérisé en ce que ladite protéine Hsp est codée par une séquence d'acides nucléiques sous le contrôle d'un promoteur lac. 25 Ensemble de parties selon l'une des revendications 16 à 24 caractérisé en ce que ladite bactérie est une E. coli. 25 26 - Ensemble de parties selon la revendication 25 caractérisé en ce que ladite bactérie appartient à la souche BL21(DE3) ou BL21(DE3)star. 27 - Ensemble de parties selon l'une des 30 revendications 16 à 26 caractérisé en ce que la protéine Hsp est choisie dans le groupe comprenant l'Hsp40, l'Hsp7°, l'Hsp80 et l'Hsp110. UBGII1-FR-1_TEXTE SUITE NOTIF_SO/GE 20- 14 - 28 Ensemble de parties selon l'une des revendications 16 à 27 caractérisé en ce que la protéine Hsp est la protéine Hsp70 humaine. UOGII1-FR-1_TEXTE SUITE NOTIF_SO/GE