Brevet FR3032719A1 — publié le 20160819

DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION La présente invention vise un dispositif de diagnostic par amplification isotherme d'ADN. Elle s'applique, notamment, au diagnostic du virus Ebola à partir de gouttes de sang, d'urine ou de salive. ETAT DE LA TECHNIQUE Dans le domaine du diagnostic médical, il existe, entre autres, deux familles de tests biologiques : D'une part, la famille des tests par immunoessais, dont font partie les tests « immuno-enzymatiques » et abréviés ELISA (pour « enzyme-linked immunosorbent assay », traduit par « dosage d'immunoadsorption par enzyme liée »). Ces tests ont pour objectif de détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon. La formation et la localisation spatiale du complexe anticorps-antigène est détectable par plusieurs techniques : greffage d'espèces colorées ou fluorescentes, nanoparticules, enzymes... Le signal caractérisant la présence de l'espèce recherchée peut être détecté à l'oeil ou par spectroscopie. On compte, dans cette famille, les tests de type bandelette, dipstick (traduit par « jaugeur ») ou lateral flow test (traduit par « test par flux latéral »). Ces tests de type Point-of-Care (traduit par « au chevet du patient ») sont très adaptés à des situations de terrain avec peu de matériel à disposition. Mais le diagnostic par immunoessais se restreint à détecter des espèces impliquées dans des complexes anticorps-antigène. Par exemple, dans le cas d'un virus, la détection est indirecte : les immunoessais permettent de sonder la présence de protéines caractéristiques ou d'anticorps émis lors de la présence du virus. D'autre part, la famille des tests par amplification d'ADN qui permettent de reconnaître et de multiplier une séquence spécifique d'ADN ou ARN. Dans le cas d'un virus, c'est donc un test beaucoup plus direct : on reconnaît le matériel génétique de l'espèce recherchée. Mais ces tests nécessitent du matériel coûteux et un savoir faire particulier pour être mis en oeuvre. Ces tests ne permettent pas de 3032719 2 réaliser des essais au chevet du patient, et ce particulièrement dans les zones géographiques éloignées des laboratoires. Pour l'ensemble de ces raisons, ces tests par isotherme d'ADN ne permettent pas de réaliser rapidement et à bas coût des diagnostics hors de laboratoires. 5 OBJET DE L'INVENTION La présente invention vise à remédier à tout ou partie de ces inconvénients. A cet effet, la présente invention vise un dispositif de diagnostic par amplification isotherme d'ADN, qui comporte : 10 - un substrat poreux comportant : - une zone comportant au moins un composé réactif réagissant avec un composé cible d'un échantillon, dite « zone de diagnostic », - une zone de dépôt de fluide transporté, par capillarité, dans la zone de dépôt d'échantillon et dans la zone de diagnostic, 15 - la zone de dépôt d'échantillon positionnée entre la zone de dépôt de fluide et la zone de diagnostic, et - deux canaux, positionnés dans l'épaisseur du substrat poreux, respectivement entre, d'une part, la zone de dépôt de fluide et la zone de dépôt d'échantillon, d'autre part, la zone de dépôt d'échantillon et la 20 zone de diagnostic ; et - un moyen d'échauffement isotherme local de la zone de diagnostic. Grâce à ces dispositions, un échantillon de sang, d'urine ou de salive est placé sur la zone de dépôt d'échantillon et cet échantillon est transporté par le fluide déposé dans la zone de dépôt de fluide jusqu'à la zone de diagnostic. Ce transport 25 est réalisé par capillarité à travers le substrat poreux. La zone de diagnostic est échauffée pour séparer les doubles-brins d'ADN, activer des enzymes présentes, favoriser le mélange par agitation thermique. Les enzymes ont pour fonction de répliquer les brins d'ADN complémentaires des amorces, c'est à dire des brins d'ADN courts, présentent dans le mélange de composés réactifs. Le choix des amorces définit la cible du test de diagnostic. Dans le cas où l'échantillon contient des brins d'ARN, une première enzyme réalise l'étape de transcription, c'est à dire la recopie de l'ARN en ADN, avant de permettre la réplication de l'ADN. Une même enzyme peut réaliser les deux étapes de transcription et de réplication. 3032719 3 L'échauffement local de la zone de diagnostic permet notamment un gain d'énergie dans le cas d'un dispositif autonome. Dans des modes de réalisation : la zone de dépôt d'échantillon et la zone de diagnostic et 5 les deux canaux sont respectivement confondus. Ces modes de réalisation permettent de limiter les risques de pertes d'échantillon dans les zones et canaux ne comportant pas de composé réactif. Dans des modes de réalisation, au moins un composé réactif est présent dans 10 la zone de diagnostic sous forme séchée. Ces modes de réalisation permettent un transport facilité du dispositif depuis un site de production à un site d'utilisation. Dans des modes de réalisation, le dispositif objet de la présente invention comporte, dans la zone de dépôt d'un échantillon, un composé de préparation de 15 l'échantillon par lyse chimique des cellules. L'avantage de ces modes de réalisation est qu'ils permettent de rendre l'ADN ou ARN dans l'échantillon plus accessible en plus de décontaminer l'échantillon. Dans des modes de réalisation, le dispositif objet de la présente invention comporte un moyen d'échauffement isotherme local de la zone de dépôt zo d'échantillon. L'avantage de ces modes de réalisation est qu'ils permettent de rendre l'ADN ou ARN dans l'échantillon plus accessible en plus de décontaminer l'échantillon. Dans des modes de réalisation, le substrat poreux est une feuille de papier. Ces modes de réalisation permettent une fabrication facile et à bas coût du 25 dispositif. Dans des modes de réalisation, le moyen d'échauffement isotherme local est un circuit électrique conducteur mis en regard du substrat poreux. L'avantage de ces modes de réalisation est qu'ils permettent de réaliser un échauffement par utilisation d'une batterie, ce qui permet au dispositif d'être mobile 30 et réalisé à bas coût. Dans des modes de réalisation, le dispositif objet de la présente invention comporte : - une surface de support du circuit électrique conducteur et 3032719 4 une surface étanche, la surface étanche étant positionnée de manière intercalaire entre le substrat poreux et la surface de support. Ces modes de réalisation permettent de contenir l'échantillon dans le substrat poreux tout en permettant au moyen d'échauffement isotherme local d'assurer un 5 rendement optimal du fait de la proximité avec le substrat. Dans des modes de réalisation, le circuit électrique conducteur est supporté par une feuille de papier. L'avantage de ces modes de réalisation est qu'ils permettent une réalisation à bas coût du moyen d'échauffement, ce moyen d'échauffement occupant de plus un 10 espace limité. Dans des modes de réalisation, au moins un canal est formé par dépôt de cire fondue pénétrant dans l'épaisseur du substrat puis solidifiée. Ces modes de réalisation ont l'avantage de présenter une grande simplicité de fabrication. 15 Dans des modes de réalisation, au moins un canal est formé par un contraste hydrophile-hydrophobe dans l'épaisseur du substrat. L'avantage de ces modes de réalisation est qu'ils permettent une réalisation optimale du canal. Dans des modes de réalisation, au moins un canal est formé par 20 photolithographie dans l'épaisseur du substrat. Ces modes de réalisation ont l'avantage de permettre une réalisation optimale du canal. Dans des modes de réalisation, le dispositif objet de la présente invention comporte une zone supplémentaire comportant au moins un composé réactif de la 25 zone de diagnostic reliée par un canal à la zone de dépôt d'un fluide. L'avantage de ces modes de réalisation est qu'ils permettent de vérifier que le fluide n'est pas contaminé. Dans des modes de réalisation, le dispositif objet de la présente invention comporte une zone supplémentaire comportant le composé réactif de la zone de 30 diagnostic, et au moins un composé cible, reliée par un canal à la zone de dépôt d'un fluide. 3032719 5 Ces modes de réalisation permettent de vérifier que le réactif du dispositif réagit avec le composé cible de manière à fiabiliser le diagnostic de la zone de diagnostic. Dans des modes de réalisation, le moyen d'échauffement isotherme local est 5 configuré pour échauffer les zones de dépôt d'échantillon et de diagnostic à une température comprise entre 20°C et 120°C. Ces modes de réalisation permettent d'échauffer les zones de dépôt d'échantillon et de diagnostic à une température à laquelle le mélange de réactifs fonctionne. 10 Dans des modes de réalisation, au moins un composé réactif change de couleur au contact du composé cible. L'avantage de ces modes de réalisation est qu'ils permettent de détecter facilement la réaction entre le mélange de composés réactifs et le composé cible. Dans des modes de réalisation, au moins au moins un composé réactif émet 15 un signal de fluorescence au contact du composé cible. L'avantage de ces modes de réalisation est qu'ils permettent de détecter facilement la réaction entre le mélange de composés réactifs et le composé cible. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES 20 D'autres avantages, buts et caractéristiques particulières de l'invention ressortiront de la description non limitative qui suit d'au moins un mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, en regard des dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 représente, schématiquement et en perspective, un premier mode 25 de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, la figure 2 représente, schématiquement et en perspective, un mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, la figure 3 représente, schématiquement et en perspective, un mode de réalisation particulier du système assemblé objet de la présente invention, 30 la figure 4 représente, schématiquement, un logigramme d'étapes particulier du procédé objet de la présente invention, la figure 5 représente, schématiquement et en perspective, un deuxième mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, 3032719 6 - la figure 6 représente, schématiquement et en perspective, un troisième mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, - la figure 7 représente, schématiquement et en perspective, un quatrième mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention et 5 - la figure 8 représente, schématiquement et en perspective, un cinquième mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention. DESCRIPTION D'EXEMPLES DE REALISATION DE L'INVENTION La présente description est donnée à titre non limitatif, chaque caractéristique 10 d'un mode de réalisation pouvant être combinée à toute autre caractéristique de tout autre mode de réalisation de manière avantageuse. Par ailleurs, chaque paramètre d'un exemple de réalisation peut être mis en oeuvre indépendamment d'autres paramètres dudit exemple de réalisation. On note que le terme « un » est utilisé au sens « au moins un ». 15 On note dès à présent que les figures ne sont pas à l'échelle. On observe, sur les figures 1 à 3, une vue en coupe d'un mode de réalisation du dispositif 10 objet de la présente invention. Ce dispositif 10 de diagnostic par amplification isotherme d'ADN comporte : - un substrat 105 poreux comportant : 20 - une zone 110 comportant au moins un composé 115 réactif réagissant avec un composé 120 cible d'un échantillon, dite « zone de diagnostic », - une zone 125 de dépôt de fluide transporté, par capillarité, dans une zone 130 de dépôt d'échantillon et dans la zone 110 de diagnostic, 25 - la zone 130 de dépôt d'échantillon, positionnée entre la zone 125 de dépôt de fluide et la zone 110 de diagnostic, qui comporte un composé 145 de préparation de l'échantillon par lyse chimique des cellules, - deux canaux, 135 et 140, positionnés dans l'épaisseur du substrat poreux, respectivement entre, d'une part, la zone 125 de dépôt de 30 fluide et la zone 130 de dépôt d'échantillon, d'autre part, la zone 130 de dépôt d'échantillon et la zone 110 de diagnostic, 3032719 7 - une zone 155 supplémentaire comportant au moins un composé 115 réactif de la zone 110 de diagnostic reliée par un canal 160 à la zone de dépôt 125 d'un fluide, et - une zone 165 supplémentaire comportant au moins un composé 115 5 réactif de la zone 110 de diagnostic, et au moins un composé 120 cible, reliée par un canal 170 à la zone 125 de dépôt d'un fluide ; - un moyen 205 d'échauffement isotherme local de la zone de diagnostic 110 et des zones 155 supplémentaire et 165 supplémentaire de contrôle ; - un moyen 150 d'échauffement isotherme local de la zone 130 de dépôt 10 d'échantillon ; - une surface 210 de support du circuit électrique conducteur ; et - une surface 215 étanche, la surface 215 étanche étant positionnée de manière intercalaire entre le substrat 105 poreux et la surface 210 de support. En particulier, on observe, sur la figure 1, le substrat poreux 105 mis en oeuvre 15 par le dispositif 10. Ce substrat poreux 105 est, par exemple, une feuille de papier, en fibres en cellulose, en membranes de nitrocellulose, en papier filtre constituant un milieu poreux susceptible de permettre le passage d'un fluide. Au contact du substrat poreux 105, une goutte d'eau ou une goutte de sang se diffuse en surface et dans l'épaisseur du substrat poreux 105 autour du point de contact entre la goutte et le 20 substrat poreux 105. Afin de canaliser l'écoulement des gouttes dans ce substrat poreux 105, un ensemble de zones et de canaux sont définis dans le substrat poreux 105. Ces zones et canaux sont délimités par des barrières traversant le substrat poreux 105 en épaisseur. Ces barrières sont formées, par exemple : - par dépôt de cire fondue pénétrant dans l'épaisseur du substrat poreux 105 25 puis solidifiée, - par un contraste hydrophile-hydrophobe dans l'épaisseur du substrat poreux 105 - par découpe au laser, - par réticulation de polymères et/ou 30 - par photolithographie dans l'épaisseur du substrat poreux 105. On appelle « zone » un volume fermé du substrat poreux 105 comportant au moins une ouverture et « canal » un conduit reliant au moins deux ouvertures de zones. 3032719 8 Le dispositif 10 met en oeuvre plusieurs zones dans le substrat poreux 105 : Une première zone, appelée zone de diagnostic 110, comporte au moins un composé réactif 115 réagissant avec un composé cible 120. Par exemple, un mélange de composés réactifs 115 est formé d'une enzyme, un mélange des quatre 5 désoxyribonucléotides et une sélection d'amorces permettant la réalisation d'une technique d'amplification isotherme d'ADN parmi : PCR (« Polymerase Chain Reaction », traduit en français par « Réaction en chaîne par polymérase »), RT-PCR (« Reverse Transcriptase - PCR », traduit en français par « PCR après transcription inverse ») et ses dérivés, i.o LAMP (« Loop-mediated isothermal amplification », traduit en français par « Amplification isotherme par des structures en boucle ») et RT-LAMP (« Reverse transcription - LAMP », traduit en français par « LAMP après transcription inverse »), RPA (« Recombinase polymerase amplification », traduit en français par 15 « Amplification par polymérase, assistée de recombinases ») et RT-RPA (« Reverse transcription - RPA », traduit en français par « RPA après transcription inverse »), SDA (« Strand displacement amplification », traduit en français par « amplification par déplacement de brin ») et RT-SDA (« Reverse transcription 20 - SDA », traduit en français par « SDA après transcription inverse »), HDA (« Helicase dependant amplification », traduit en français par « amplification assistée par hélicases ») et RT-HDA (« Reverse transcription HDA », traduit en français par « HDA après transcription inverse ») et - NEAR (« Nicking enzyme amplification reaction », traduit en français par « 25 Réaction d'amplification par enzymes de coupure ») et RT-NEAR (« Reverse transcription - NEAR », traduit en français par « NEAR après transcription inverse ») Au moins un composé réactif est présent sous forme séchée dans la zone de diagnostic 110. Dans des variantes, au moins un composé réactif est présent sous 30 forme d'un hydrogel. Dans d'autres variantes, au moins un composé réactif est présent sous format humide. Dans ces variantes, la zone de diagnostic 110 est isolée de l'environnement extérieur par des feuilles de plastique, par exemple. 3032719 9 Lorsqu'au moins un composé réactif est sous forme séchée, chaque dit composé réactif est réhydraté par le fluide déposé dans la zone de dépôt de fluide 125. Lorsqu'au moins un composé réactif entre en contact avec le composé cible 120, sous réserve des conditions thermiques adéquates, les amorces s'hybrident au 5 morceau d'ADN qui leur est complémentaire, l'enzyme peut alors se fixer aux amorces et répliquer le brin d'ADN (utiliser les désoxyribonucléotides disponibles pour créer le complémentaire du brin d'ADN). Lors de cette réplication, un intercalant colorimétrique ou fluorescent est généralement intégré et est à l'origine du signal de détection. 10 Au moins un composé réactif 115 change de couleur au contact du composé cible 120, ce qui permet de détecter la présence du composé cible. Si un composé cible est détecté, un utilisateur du dispositif 10 peut en déduire un diagnostic médical tel l'infection d'un individu par un virus dont l'ADN est le composé cible 120 du composé réactif 115 du dispositif 10. 15 Dans des variantes, au moins au moins un composé réactif 115 émet un signal de fluorescence au contact du composé 120 cible. Cette zone de diagnostic 110 est reliée à la zone de dépôt d'échantillon 130 par un canal 135 rectiligne. La zone de dépôt d'échantillon 130 comporte un composé 145 de préparation de l'échantillon par lyse chimique des cellules présent 20 sous forme séchée dans l'épaisseur du substrat poreux 105. Ce composé 145 est, par exemple, un agent détergent détruisant de la membrane plasmique des cellules présentes dans l'échantillon, ce qui permet d'extraire le matériel génétique des cellules. La zone de dépôt d'un échantillon 130 est reliée à la zone de dépôt d'un fluide 25 125 par un canal 140. La zone de dépôt d'un fluide 125 est configurée pour recevoir de l'eau, par exemple. Cette zone de dépôt de fluide 125 est reliée par un canal 160, différent du canal 140, à une zone 155 supplémentaire comportant au moins un composé réactif 115. Cette zone 155 supplémentaire a pour fonction de vérifier que le fluide déposé dans la zone de dépôt de fluide 125 ne présente pas le composé 30 cible 120, ce qui induirait un diagnostic erroné par rapport à l'échantillon déposé dans la zone de dépôt d'échantillon 130. La zone de dépôt d'un fluide 125 est également reliée, par un canal 170 différent du canal 140 et du canal 160, à une zone 165 supplémentaire comportant le 3032719 10 composé réactif 115 et au moins un composé cible 120 sous formes séchées. Lorsque le fluide hydrate la zone 165 supplémentaire, le composé réactif 115 réagit avec le composé cible 120. Cette zone 165 supplémentaire a pour fonction de vérifier le fonctionnement du dispositif 10. 5 Dans des variantes, la zone de dépôt d'un fluide 125 présente une aire sensiblement supérieure aux aires des autres zones du dispositif 10. Ainsi, comme on le comprend, le dépôt d'un échantillon dans la zone de dépôt d'un échantillon 130 puis le dépôt d'eau dans la zone de dépôt d'un fluide 125 entraine, par un mécanisme de pompe capillaire, un déplacement de l'eau dans les 10 zones de vérification, 155 supplémentaire et 165 supplémentaire, et dans la zone de dépôt d'un échantillon 130. L'eau transporte ainsi l'échantillon dans la zone de dépôt d'échantillon 130 et dans la zone de diagnostic 110. Les zones et canaux du substrat poreux 105 agissent comme système microfluidique. Le substrat poreux 105 est, par exemple, enveloppé dans un feuillet en 15 plastique recouvrant l'intégralité des surfaces du substrat poreux 105 à l'exception des zones de dépôt, 125 et 130. De cette manière, le substrat poreux 105 est protégé et chaque composé réactif 115 est isolé afin d'éviter les contaminations. On observe, sur la figure 2, un mode de réalisation particulier du moyen d'échauffement 205 isotherme local et de la surface 210 de support. 20 La surface de support 210 est, par exemple, une feuille de papier ou de fibres de cellulose similaire au matériau utilisé pour réaliser le substrat poreux 105. Cette surface de support 210 présente des dimensions préférentiellement identiques à celles du substrat poreux 105. Un circuit électrique conducteur 205 est positionné sur cette surface de 25 support 210 de manière à ce que, lorsqu'un courant traverse le circuit, ce circuit échauffe localement le substrat poreux 105 par effet Joule. Le positionnement du circuit électrique conducteur 205 est réalisé de manière à ce que, lorsque la surface de support 210 et le substrat poreux 105 sont mis en contact, le moyen d'échauffement 205 isotherme local soit mis en regard des zones de diagnostic 110 30 et des zones, 155 supplémentaire et 165 supplémentaire. Le moyen d'échauffement 205 isotherme local est configuré pour échauffer la zone de diagnostic 110 et les zones de contrôle 155 supplémentaire et 165 supplémentaire à une température 3032719 11 comprise entre 20°C et 120°C. Préférentiellement, ette température est comprise entre 45°C et 65°C. Un circuit électrique conducteur 150 secondaire est positionné de manière à être en regard de la zone de dépôt d'échantillon 130 du substrat poreux 105 afin 5 d'agir comme moyen 150 de préparation de l'échantillon par dénaturation thermique de l'échantillon. Ces circuits électroniques, 205 et 150, sont alimentés par une batterie 220 par exemple. Cette batterie 220 présente, par exemple, une tension de 9 volts, ce qui permet au système substrat 105, surface 205 et batterie 220 d'être portable. 10 Dans des variantes, le moyen d'échauffement 205 isotherme local est configuré pour réaliser un ensemble de cycles thermiques afin de réaliser une réaction de PCR. Dans ces variantes, au moins un composé réactif 115 est adapté à réaliser cette réaction. On observe, sur la figure 3, le dispositif 10 assemblé pour réaliser un 15 diagnostic. Dans ce mode de réalisation, une surface 215 étanche est positionnée de manière intercalaire entre le substrat 105 poreux et la surface 210 de support. Le moyen d'échauffement 205 isotherme local est positionné sous les zones de diagnostic 110 et les zones, 155 supplémentaire et 165 supplémentaire tandis que le moyen de préparation 150 thermique est positionné sous la zone de dépôt zo d'échantillon 130. De cette manière, l'échantillon transporté dans la zone de dépôt d'échantillon 130 et dans la zone de diagnostic 110 est échauffé, ce qui permet aux enzymes de fonctionner et à la fonction d'amplification isotherme d'ADN d'avoir lieu. D'autre part, l'échauffement isotherme local de la zone 165 supplémentaire permet de vérifier le 25 fonctionnement de chaque composé réactif 115. Le moyen de préparation 150 thermique permet de purifier et de désinfecter l'échantillon déposé dans la zone de dépôt d'échantillon 130. On comprend, à la lecture de la description des figures 1 à 3, que le dispositif 10 peut être fabriqué de manière contrôlée, standardisée en laboratoire ou par des 30 procédés industriels. Après fabrication, le dispositif 10 est stocké dans une pochette en plastique hermétique et doit être stocké à l'abri de la chaleur, de la lumière et de l'humidité pour permettre la conservation des dispositifs 10. 3032719 12 On observe, sur la figure 4, un logigramme d'étapes du procédé objet de la présente invention. Ce procédé comporte : - une étape de prélèvement 305 d'un échantillon, - une étape de dépôt 310 de l'échantillon dans une zone de dépôt d'échantillon 5 du dispositif 10 tel que décrit en regard des figures 1 à 3, - une étape de préparation 315 de l'échantillon, - une étape de transport 320 de l'échantillon préparé, - une étape d'amplification isotherme 325 de l'échantillon et - une étape de détection 330 de la présence d'un composé cible dans 10 l'échantillon. L'étape de prélèvement 305 est réalisée, par exemple, par une seringue ou par une aiguille piquant un individu au bout du doigt pour extraire une goutte de sang. Dans des variantes, une goutte d'urine ou de salive est prélevée. Dans des variantes préférentielles, une goutte de sang tirée d'une prise de sang est utilisée. A 15 des fins de simplicité d'utilisation, une goutte de sang prise au bout du doigt de l'individu est souvent utilisée. L'étape de dépôt 310 est réalisée, par exemple, par la mise en contact de l'échantillon avec la zone de dépôt d'échantillon du dispositif tel que décrit en regard des figures 1 à 3. 20 L'étape de préparation 315 est réalisée par lyse chimique des cellules de l'échantillon et/ou par dénaturation thermique de l'échantillon. La lyse chimique est réalisée par un agent détergent, par exemple, tandis que la dénaturation thermique est réalisée par échauffement isotherme local de la zone de dépôt d'échantillon par un circuit électrique conducteur positionné en regard de ladite zone. Cette étape de 25 préparation 315 a pour objectifs d'extraire le matériel ADN ou ARN des cellules de l'échantillon et de décontaminer l'échantillon en désactivant le virus par exemple. L'étape de transport 320 est réalisée, par exemple, par dépôt d'une quantité standardisée d'eau stérile sur la zone de dépôt d'un fluide du dispositif 10. Cette eau, par un mécanisme de pompe capillaire, transporte l'échantillon dans la zone de 30 dépôt d'échantillon et dans la zone de diagnostic du dispositif 10. La quantité d'eau déposée est, par exemple, trente fois supérieure à la quantité d'échantillon déposé. 3032719 13 L'étape d'amplification isotherme 325 est réalisée, par exemple, par échauffement du milieu réactif, comportant l'échantillon préparé et chaque composé réactif, dans la zone de diagnostic. Cet échauffement permet aux enzymes, initialement présentes sous forme séchée, réhydratées d'amplifier l'ADN du composé 5 cible. L'amplification isotherme 325 est moins contraignante que les méthodes de PCR (pour « Polymerase Chain Reaction », traduit en français par « Réaction en chaine par polymérase ») et les cycles thermiques associés à ces méthodes. Le moyen d'échauffement isotherme local est supporté par une surface qui, 10 associée au substrat poreux du dispositif 10 forme une puce à trois épaisseurs : une épaisseur de substrat poreux comportant le système microfluidique de canaux et de zones, - une surface étanche adhésive fixée au substrat poreux et - une surface supportant le circuit électrique d'échauffement. 15 L'étape de détection 330 est réalisée, par exemple, par détection de la couleur ou de la fluorescence du substrat poreux au niveau de la zone de diagnostic. Cette spectrométrie est réalisée directement par l'utilisateur ou, par exemple, par un terminal portable communicant, tel un téléphone portable comportant un capteur d'image par exemple. Un logiciel de traitement d'image embarqué dans ledit terminal 20 ou dans un serveur informatique distant détermine la couleur du substrat poreux et en déduit une information de diagnostic. Dans des variantes, le procédé comporte une étape de vérification de la pureté de l'eau par détection de la couleur dans une zone du substrat poreux en lien avec la zone de dépôt d'un fluide. Si cette zone, pourvue uniquement de chaque 25 composé réactif, présente une couleur ou une fluorescence caractéristique de la présence du composé cible dans ladite zone, l'eau utilisée est infectieuse et le diagnostic établi par le dispositif 10 ne peut être exact. Dans des variantes, le procédé comporte une étape de vérification du fonctionnement du dispositif 10 par détection de la couleur ou de la fluorescence 30 dans une zone du substrat comportant, sous formes séchées, chaque composé réactif et le composé cible. Lorsque l'eau déposée hydrate cette zone, les composés sont mis en contact et la couleur de ladite zone devient représentative de la détection 3032 719 14 du composé cible. Si cette zone ne prend pas cette couleur, alors le diagnostic réalisé ne peut être considéré comme correct. Une fois le diagnostic établi, la puce peut être brûlée pour éviter de générer des déchets infectieux. Le système d'échauffement peut être extrait pour être 5 réutilisé en liaison avec un autre substrat poreux. On observe, sur la figure 5, un mode de réalisation particulier du dispositif 40 objet de la présente invention. Ce dispositif 40 diffère du dispositif 10 tel que décrit en regard de la figure 1 en ce que : - la zone 410 de dépôt d'échantillon et la zone 455 de diagnostic sont 10 confondus et - les deux canaux sont confondus en un seul canal 430. Ainsi, ce dispositif 40 comporte un substrat poreux 405 similaire au substrat poreux 105 décrit en regard de la figure 1, un ensemble de canaux, 430, 440 et 450, et de zones, 410, 425, 435, 445 et 455, étant délimités sur et dans ce substrat 15 poreux 405. La zone 410 correspond à une zone de dépôt d'échantillon. Cette zone de dépôt 410 d'échantillon est reliée à une zone de dépôt 425 de fluide similaire à la zone de dépôt 125 de fluide décrite en regard de la figure 1. Dans ce mode de réalisation, le fluide sert principalement à hydrater la zone de dépôt d'échantillon 410 20 et de diagnostic 455 pour éviter un séchage des composés avant qu'un diagnostic ne soit réalisé. Les zones supplémentaires, 435 et 445, correspondent respectivement aux zones, 155 et 165, décrites en regard de la figure 1 et assurent des fonctions similaires. 25 Dans des variantes, les zones de dépôt 410 d'échantillon et de diagnostic 455 comportent un composé de préparation de l'échantillon similaire au composé 165 de préparation de l'échantillon décrit en regard de la figure 1. On observe, sur la figure 6, un mode de réalisation particulier du dispositif 50 objet de la présente invention. Ce dispositif 50 comporte : 30 - un substrat poreux 505, - une zone 525 de dépôt de fluide reliée à un canal 530 transportant le fluide par capillarité jusqu'à une zone 560 comportant au moins un composé réactif 515, 3032719 15 trois canaux, 535, 545 et 555, pour transporter le fluide et chaque composé réactif 515 par capillarité respectivement depuis la zone 560 jusqu'à : - une zone 510 de dépôt d'un échantillon agissant comme zone de diagnostic lors du contact entre l'échantillon et de chaque composé 5 réactif 515 sous l'action d'un moyen d'échauffement isotherme local (non représenté), - une zone 540 supplémentaire ne comportant ni composé réactif 515, ni composé cible 520, permettant de vérifier que le fluide ne comporte pas de composé cible 520 et 10 - une zone 550 supplémentaire comportant le composé cible 520 pour vérifier la capacité de fonctionnement du dispositif 50. On observe, sur la figure 7, un mode de réalisation particulier du dispositif 60 objet de la présente invention. Dans cette figure 7, on distingue trois composants des composés réactifs décrits ci-dessus. Ces composés réactifs sont formés : 15 d'amorces, c'est à dire de petits brins d'ADN qui reconnaissent spécifiquement une séquence recherchée dans un échantillon, cette séquence étant surnommée « composé cible » dans les figures ci-dessus, de bases désoxyribonucléiques, c'est à dire les briques élémentaires qui forment l'ADN et 20 d'enzymes capables d'assembler les bases désoxyribonucléiques pour former le brin d'ADN complémentaire de la cible que le cherche. L'enzyme ne fonctionne que si l'amorce a trouvé une séquence complémentaire. Ce dispositif 60 comporte un substrat poreux 605 comportant une zone 610 de dépôt de fluide relié à trois canaux, 615, 620 et 625, pour transporter le fluide par 25 capillarité. Par le canal 615, ce fluide est transporté vers une zone 685 comportant un type d'amorce 665, des bases désoxyribonucléiques et des enzymes 645, sous formes séchées par exemple, pour vérifier que le fluide ne comporte pas le composé cible 630. Si le composé cible 630 est présent, les amorces 665 et enzymes 645 30 réagissent et indiquent à un utilisateur, par le biais d'une fluorescence par exemple, que le composé cible 630 est présent dans le fluide. Par le canal 625, le fluide est transporté vers une zone 680 comportant un type d'amorce 665, des bases désoxyribonucléiques, des enzymes 645 et le 3032719 16 composé cible 630 sous formes séchées, par exemple. Au contact du fluide, les amorces 665 et enzymes 645 réagissent et provoquent une fluorescence indiquant à un utilisateur que le dispositif 60 fonctionne convenablement en présence du composé cible 630. 5 Par le canal 620, le fluide est transporté vers une zone 625 de dépôt d'échantillon, cet échantillon comportant ici le composé cible 630. Cette zone 625 de dépôt d'échantillon est reliée, par un canal 635, à une zone 640 de stockage d'enzymes 645 sous forme séchés. Le fluide transporte l'échantillon et les enzymes stockés 645 dans trois zones 10 distinctes, 650, 660 et 670, reliées chacune à la zone 640 de stockage par un canal distinct. Dans chaque zone, 650, 660 et 670, une amorce, 655, 665 et 675, différente est placée. Chaque amorce, 655, 665 et 675, correspond à un diagnostic différent, chaque amorce, 655, 665 et 675, réagissant avec un composé cible 630 différent ou avec une partie différente d'un composé cible 630. 15 On observe, sur la figure 8, un mode de réalisation particulier du dispositif 70 objet de la présente invention. Dans cette figure 8, on distingue trois composants des composés réactifs décrits ci-dessus. Ces composés réactifs sont formés : - d'amorces, c'est à dire de petits brins d'ADN qui reconnaissent spécifiquement une séquence recherchée dans un échantillon, cette séquence étant 20 surnommée « composé cible » dans les figures ci-dessus, - de bases désoxyribonucléiques, c'est à dire les briques élémentaires qui forment l'ADN et d'enzymes capables d'assembler les bases désoxyribonucléiques pour former le brin d'ADN complémentaire de la cible que le cherche. L'enzyme ne 25 fonctionne que si l'amorce a trouvé une séquence complémentaire. Ce dispositif 70 comporte un substrat poreux 705 comportant une zone 710 de dépôt de fluide relié à un canal 720 pour transporter le fluide par capillarité. Par le canal 720, le fluide est transporté vers une zone 725 de stockage d'enzymes 745 sous forme séchée. Cette zone 725 de stockage est reliée à trois 30 canaux, 715, 725 et 735. Par le canal 715, le fluide comportant des enzymes 745 est transporté vers une zone 785 comportant un type d'amorce 765 et des bases désoxyribonucléiques, sous formes séchées par exemple, pour vérifier que le fluide ne comporte pas le 3032719 17 composé cible 730. Si le composé cible 730 est présent, les amorces 765 et enzymes 745 réagissent et indiquent à un utilisateur, par le biais d'une fluorescence par exemple, que le composé cible 730 est présent dans le fluide. Par le canal 725, le fluide comportant des enzymes 745 est transporté vers 5 une zone 780 comportant un type d'amorce 765, des bases désoxyribonucléiques et le composé cible 730 sous formes séchées, par exemple. Au contact du fluide, les amorces 765 et enzymes 745 réagissent et provoquent une fluorescence indiquant à un utilisateur que le dispositif 70 fonctionne convenablement en présence du composé cible 730. 10 Par le canal 735, le fluide comportant des enzymes 745 est transporté vers une zone 740 de dépôt d'échantillon, cet échantillon comportant ici le composé cible 730. Le fluide transporte l'échantillon et les enzymes stockés 745 dans trois zones distinctes, 750, 760 et 770, reliées chacune à la zone 740 de stockage par un canal 15 distinct. Dans chaque zone, 750, 760 et 770, une amorce, 755, 765 et 775, différente est placée. Chaque amorce, 755, 765 et 775, correspond à un diagnostic différent, chaque amorce, 755, 765 et 775, réagissant avec un composé cible 730 différent ou avec une partie différente d'un composé cible 730. REVENDICATIONS1. Dispositif (10, 40) de diagnostic par amplification isotherme d'ADN, caractérisé en ce qu'il comporte : - un substrat (105, 405) poreux comportant : - une zone (110, 410) comportant au moins un composé (115, 415) réactif réagissant avec un composé (120, 420) cible d'un échantillon, dite « zone de diagnostic », - une zone (125, 425) de dépôt de fluide transporté, par capillarité, dans la zone de dépôt d'échantillon et dans la zone de diagnostic, - la zone (130, 410) de dépôt d'échantillon positionnée entre la zone de dépôt de fluide et la zone de diagnostic, et - deux canaux (135, 140, 430), positionnés dans l'épaisseur du substrat poreux, respectivement entre, d'une part, la zone de dépôt de fluide et la zone de dépôt d'échantillon, d'autre part, la zone de dépôt d'échantillon et la zone de diagnostic ; et - un moyen (205) d'échauffement isotherme local la zone de diagnostic. 2. Dispositif (10) selon la revendication 1, qui comporte une zone (155) supplémentaire comportant au moins un composé (115) réactif de la zone (110) de diagnostic reliée par un canal (160) à la zone de dépôt (125) d'un fluide. 3. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 ou 2, qui comporte une zone (165) supplémentaire comportant au moins un composé (115) réactif de la zone (110) de diagnostic, et au moins un composé (120) cible, reliée par un canal (170) à la zone (125) de dépôt d'un fluide. 4. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel au moins un composé (115) réactif est présent dans la zone (110) de diagnostic sous forme séchée. 25 3032719 19 5. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 4, qui comporte, dans la zone (130) de dépôt d'un échantillon, un composé (145) de préparation de l'échantillon par lyse chimique des cellules. 5 6. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 5, qui comporte un moyen (150) d'échauffement isotherme local de la zone de dépôt d'échantillon. 7. Dispositif (40) selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel : - la zone (410) de dépôt d'échantillon et la zone (455) de diagnostic et 10 - les deux canaux (430) sont respectivement confondus. 8. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le substrat (105) poreux est une feuille de papier. 15 9. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel le moyen (205) d'échauffement isotherme local est un circuit électrique conducteur mis en regard du substrat (105) poreux. 20 10. Dispositif (10) selon la revendication 9, qui comporte : une surface (210) de support du circuit électrique conducteur et une surface (215) étanche, la surface étanche étant positionnée de manière intercalaire entre le substrat (105) poreux et la surface de support. 11. Dispositif (10) selon l'une des revendications 9 ou 10, dans lequel le circuit électrique conducteur est supporté par une feuille de papier. 12. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel au moins un canal (135, 140) est formé par dépôt de cire fondue pénétrant dans l'épaisseur du substrat (105) puis solidifiée. 3032719 20 13. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel au moins un canal (135, 140) est formé par un contraste hydrophile-hydrophobe dans l'épaisseur du substrat (105). 5 14. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel au moins un canal (135, 140) est formé par photolithographie dans l'épaisseur du substrat (105). 15. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel le moyen (205) d'échauffement isotherme local est configuré pour échauffer les zones de dépôt i.o (130) et de diagnostic (110) à une température comprise entre 20°C et 120°C. 16. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 15, dans lequel au moins un composé (115) réactif change de couleur au contact du composé (120) cible. 15 17. Dispositif (10) selon l'une des revendications 1 à 16, dans lequel au moins au moins un composé (115) réactif émet un signal de fluorescence au contact du composé (120) cible.