Brevet FR3028863A1 — publié le 20160527

L'invention concerne un procédé pour mettre en oeuvre un système de culture de cellules afin de réaliser une succession d'opérations sur lesdites cellules. L'invention s'applique typiquement à la culture cellulaire, notamment dans le cadre d'une thérapie cellulaire, c'est-à-dire lorsque les cellules sont destinées à être injectées à un patient dans le but de le traiter. La culture cellulaire désigne un ensemble de techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un but thérapeutique, d'expérimentation scientifique ou de production biotechnologique. Parmi ces techniques, une première opération consiste en l'ensemencement des cellules. L'ensemencement comprend la mise en culture de cellules dans un récipient de culture. Cet ensemencement est réalisé en introduisant dans le récipient de culture, des cellules mises en suspension dans un milieu de culture. L'opération de renourrissage consiste en un changement ou renouvellement du milieu de culture. Dans ce cas, le milieu de culture est prélevé du récipient de culture et remplacé par un milieu de culture frais. Cette opération est utilisée pour apporter aux cellules en culture les éléments nécessaires à leur maintien, prolifération, expansion et/ou différentiation. A la fin de la culture, les cellules sont repiquées, c'est-à-dire qu'elles sont concentrées et retirées du récipient de culture pour être récupérées ou réensemencées dans d'autres récipients de culture. En variante, à la fin de la culture, le surnageant sans cellules pouvant contenir des produits d'intérêt est récupéré. Ces différentes opérations doivent être réalisées dans des conditions aseptiques afin d'éviter toute contamination bactérienne. 3028863 2 Or, ces différentes opérations nécessitent l'utilisation de récipients variés tels que des seringues, des flacons, des flasques et des poches. De plus, ces récipients sont soit vides soit remplis de solutions variées, telles que des 5 milieux de culture, des compléments de milieu de culture ou des réactifs. Du fait de la diversité des opérations à effectuer sur les cellules, de la diversité des récipients à utiliser et de la diversité des solutions à utiliser, il n'est pas possible de travailler avec des systèmes fermés, c'est-à-dire des systèmes 10 dans lesquels les différents composants seraient tous pré-connectés de fabrication. En pratique, ces opérations sont par conséquent réalisées en système ouvert, généralement sous hotte à flux laminaire, afin de réduire le risque de contamination des cellules. 15 Ces opérations réalisées sous hotte constituent cependant toujours un risque de contamination du fait des erreurs de manipulations possibles. D'autre part, certains récipients de culture étant relativement encombrants, les manipulations sous hotte ne sont pas toujours aisées. 20 Des solutions ont déjà été proposées afin de sécuriser les opérations de culture cellulaire. Par exemple, le document EP 1 903 101 Al propose un système de tubulures, désigné système de transfert, permettant de réaliser l'étape de changement de 25 milieu en système fermé, une fois la connexion réalisée entre d'une part la poche de milieu de culture frais et le système de transfert et d'autre part entre le récipient de culture et le système de transfert. Cependant, ces deux connexions sont aujourd'hui réalisées sous hotte à flux laminaire. D'autre part, ce système ne permet de sécuriser qu'une seule des opérations de culture. 30 Le document US 2011/0281358 Al propose un système fermé pour isoler et collecter des cellules, telles que des cellules progénitrices de la moelle osseuse, puis les ensemencer sur une matrice tridimensionnelle biocompatible 3028863 3 ou sur un greffon de tissue. Cependant, si ce système est adapté pour réaliser l'opération d'ensemencement, les autres opérations ultérieures à réaliser nécessitent l'ouverture du système. 5 On connaît également du document WO 87/06952 un système pour réaliser l'introduction d'un milieu de culture dans un récipient de culture sous forme d'une poche souple comprenant les cellules à cultiver. Les différents éléments de ce système peuvent notamment être reliés entre eux par des connecteurs stériles. Mais, ce système nécessite d'adapter tous les récipients utiles à la 10 culture de cellules en les équipant de connecteurs stériles spécifiques. D'autre part, le nombre de connexion à réaliser pour certaines opérations peut être important, rendant complexe l'utilisation d'un tel système. L'invention propose de sécuriser l'ensemble des opérations de culture cellulaire 15 en fournissant un système fermé pouvant être manipulé en dehors d'une hotte à flux laminaire, facilitant ainsi les manipulations nécessaires auxdites opérations. L'invention propose également de simplifier lesdites opérations en fournissant un dispositif unique pouvant être utilisé quelle que soit l'opération à réaliser et quel que soit le protocole particulier suivi par l'utilisateur. 20 A cet effet, l'invention concerne un procédé pour mettre en oeuvre un système de culture de cellules afin de réaliser une succession d'opérations sur lesdites cellules, ledit système de culture comprenant un assortiment de dispositifs fermés et stériles, ledit assortiment de dispositifs comportant : 25 - un dispositif de culture comprenant un récipient de culture adapté à la culture de cellules, - plus d'un dispositif de transfert destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture ou à partir dudit dispositif de culture, ledit dispositif de transfert comprenant au moins une poche vide en 30 communication fluidique avec une tubulure primaire de transfert sur laquelle est branchée une ou plus tubulures secondaires de transfert, et un dispositif de raccord multiple pour raccorder le dispositif de culture à plus d'un dispositif de transfert, ledit dispositif de raccord multiple 3028863 4 comprenant une pluralité de tubulures de raccordement, plus d'une desdites tubulures de raccordement étant destinée à être connectée stérilement à l'une des tubulures de transfert desdits dispositifs de transfert, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : 5 (a) connecter stérilement l'une des tubulures de raccordement du dispositif de raccord multiple à l'une des tubulures de transfert d'un desdits dispositifs de transfert, (b) réaliser en système fermé une opération sur les cellules à cultiver, (c) une fois l'opération réalisée, déconnecter ledit dispositif de transfert dudit 10 dispositif de raccord multiple, et (d) répéter les étapes (a) à (c) avec un autre dispositif de transfert pour réaliser une autre opération sur les cellules. D'autres objets et avantages apparaîtront au cours de la description qui suit. 15 La figure 1 représente de façon schématique un récipient de culture équipé d'un élément de fermeture pourvu d'une tubulure primaire de raccordement. La figure 2 représente de façon schématique l'élément de fermeture de la figure 20 1, pourvu d'une tubulure primaire de raccordement. Les figures 3 et 4 représentent de façon schématique chacune une réalisation d'un ensemble de tubulures de raccordement. 25 La figure 5 représente de façon schématique une réalisation particulière d'un dispositif de raccord multiple. Les figures 6 à 8 représentent chacune une réalisation d'un dispositif de transfert. 30 La figure 9 représente de façon schématique un récipient nécessaire à la réalisation d'une opération de culture pouvant être connecté stérilement à un dispositif de transfert. 3028863 5 L'invention fournit un procédé pour mettre en oeuvre un système de culture sécurisé afin de réaliser certaines opérations de culture cellulaire en système fermé telles que l'ensemencement, le changement de milieu et le repiquage des 5 cellules. Une autre opération est l'échantillonnage du milieu de culture ou de la suspension cellulaire contenu dans un récipient de culture. Les cellules sont par exemple des cellules animales, notamment humaines destinées à être injectées à un patient dans un but thérapeutique. Les cellules 10 sont en particulier des cellules du type adhérentes telles que les cellules souches mésenchymateuses. Les cellules humaines sont notamment des cellules non embryonnaires. Les opérations de culture nécessitent généralement l'utilisation d'un milieu de 15 culture qui est un milieu biologique notamment adapté à l'expansion ou le maintien des cellules. Le milieu de culture est par exemple un milieu nutritif. En particulier, le milieu nutritif est un milieu de base synthétique disponible dans le commerce, tel que Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), CMRL, EMEM, RPMI1640, DMEM/F-10, DMEM/F12. 20 Ce milieu de base peut être supplémenté avec divers additifs couramment utilisés par l'homme du métier. Parmi les additifs, on peut citer du sérum ou un substitut de sérum comme du 25 lysat plaquettaire, des acides aminés non essentiels, la L-glutamine, des vitamines, des antibiotiques, le béta-mercaptoéthanol, des facteurs de croissance, des cytokines, etc. En variante, le milieu biologique est un milieu de différentiation permettant, par 30 exemple, la différentiation de cellules souches en cellules spécifiques. En relation avec les figures, le système de culture sécurisé comprend un dispositif de culture 1 destiné à la culture de cellules, plus d'un dispositif de 3028863 6 transfert 2 destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture ou à partir du dispositif de culture et un dispositif de raccord multiple 3 pour raccorder ledit dispositif de culture 1 et un desdits dispositifs de transfert 2 de sorte à mettre en communication fluidique ledit dispositif de culture 1 et ledit 5 dispositif de transfert 2. Selon la figure 1, le dispositif de culture comprend un récipient de culture 4 adapté à la culture de cellules. 10 Le récipient de culture 4 est un récipient souple tel qu'une poche ou un récipient rigide tel qu'un flacon, un flacon à plusieurs étages, par exemple le CellStackTM de Corning ou le Cell FactoryTM de Thermo Fisher Scientific, ou encore des bouteilles tournantes. 15 En relation avec la figure 1, le récipient de culture 4 comprend au moins un orifice primaire pour permettre l'introduction de fluide dans ledit récipient 4 de culture ou le retrait de fluide dudit récipient 4. Dans un exemple particulier, le récipient de culture 4 est un récipient rigide et 20 transparent, réalisé par exemple en un matériau polymère biocompatible tel que le polystyrène. Le matériau polymère peut être traité chimiquement et/ou physiquement pour permettre l'adhésion des cellules. D'autres matériaux biocompatibles pour réaliser le récipient de culture 4 sont le 25 polypropylène, l'éthylène-acétate de vinyl, le Teflon®, le polycarbonate, le polyéthylène téréphtalate, le polyéthylène téréphtalate glycolisé (PETg) ou le polyéthylène haute densité (HDPE). Sur la figure 1, le récipient de culture 4 est muni d'un moins un autre orifice 30 secondaire 5 formant un évent et comprenant une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz. La membrane possède avantageusement une porosité de 0,22 pm de sorte à former un évent stérile et à garder la stérilité du 3028863 7 dispositif de culture. Cet évent permet notamment de fournir aux cellules cultivées, l'oxygène nécessaire à leur survie. Au moins une partie d'un dispositif de raccord multiple 3 est arrangé au niveau 5 de l'orifice primaire dudit récipient de culture 4. En relation avec la figure 5, le dispositif de raccord multiple 3 permet de raccorder le dispositif de culture 4 à plus d'un dispositif de transfert 2 et comprend une pluralité de tubulures de raccordement 7. Ces tubulures de 10 raccordement sont fermées et aptes à être connectées de façon stérile à d'autres tubulures. Selon une première réalisation (non représentée), le dispositif de raccord multiple comprend un élément de fermeture du récipient de culture, tel qu'un 15 bouchon, à partir duquel s'étend une pluralité de tubulures de raccordement aptes à être connectées de façon stérile à d'autres tubulures. Un exemple de bouchon intégrant une pluralité de tubulures est décrit dans le document US 2014/0103077. 20 Selon une deuxième réalisation et en relation avec les figures 1 à 5, le dispositif de raccord multiple 3 comprend d'une part une tubulure primaire 6 de raccordement en communication fluidique avec le récipient de culture 4 et d'autre part un ensemble de tubulures comprenant une pluralité de tubulures secondaires de raccordement 7, l'une au moins étant connectée (figure 5) ou 25 destinée à être connectée (figures 1 à 4) à ladite tubulure primaire 6 de raccordement. En particulier, et comme représenté sur la figure 5, le dispositif de raccord multiple 3 comprend un élément de fermeture 8 du récipient de culture 4, tel 30 qu'un bouchon, à partir duquel s'étend la tubulure primaire 6 de raccordement. Avantageusement, le dispositif de culture 1 et la tubulure primaire 6 de raccordement du raccord multiple sont pré connectés de fabrication, l'utilisateur 3028863 8 devant ensuite connecter stérilement la tubulure primaire 6 de raccordement à l'une des tubulures secondaires 7 de raccordement de l'ensemble de tubulures pour former un sous-système fermé constitué du dispositif de culture 1 et du dispositif de raccord multiple 3. Encore plus avantageusement, le dispositif de culture 1 et le dispositif de raccord multiple 3 sont pré connectés de fabrication de sorte à former ledit sous-système fermé constitué du dispositif de culture et du dispositif de raccord multiple. Sur la figure 1, le récipient de culture 4 comprend un col définissant ledit orifice primaire arrangé pour recevoir l'élément de fermeture 8. Par exemple, le col du récipient 4 comprend un filet sur sa surface extérieure et l'élément de fermeture 8 est un bouchon pouvant être vissé sur ledit col du récipient 4. Pour plus de sécurité et assurer la stérilité du système, l'élément de fermeture 8 est placé de façon définitive sur l'orifice primaire du récipient de culture 4, de sorte qu'un utilisateur ne puisse pas le retirer dans des conditions normales d'utilisation. Selon une variante de réalisation, un orifice formant évent comprenant une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz est prévu sur l'élément de fermeture dudit récipient. Avantageusement, la membrane possède une porosité d 0,22 pm de sorte à obtenir un évent stérile. 25 Dans une autre variante représentée sur les figures 1 et 2, une tubulure d'aération 9 s'étend à partir dudit élément de fermeture 8, ladite tubulure d'aération 9 comprenant à son extrémité un évent 10 comprenant une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz. Avantageusement, 30 la membrane possède une porosité de 0,22 pm pour préserver la stérilité du dispositif de culture. 5 10 15 20 3028863 9 Cet évent 10 permet non seulement d'introduire l'oxygène nécessaire à la survie des cellules cultivées dans le récipient de culture 4, mais aussi et en particulier dans le cas d'un récipient de culture rigide, de faciliter les mouvements fluidiques vers le récipient de culture 4 ou à partir du récipient de 5 culture 4. La tubulure d'aération 9 est pourvue d'un élément sélectif d'ouverture et de fermeture 11 de la communication fluidique dans ladite tubulure tel qu'un clamp. Ce clamp, en position fermée, est notamment utile lors de l'ajout ou du retrait 10 de fluide du récipient de culture 4 afin d'éviter de mouiller ladite membrane de l'évent 10, ce qui conduirait à empêcher ultérieurement l'entrée d'oxygène dans ledit récipient de culture 4. En relation avec les figures 3 à 5, l'ensemble de tubulures comprend une 15 pluralité de tubulures 7 de raccordement, plus d'une desdites tubulures de raccordement étant destinées à être connectée de façon stérile à une tubulure d'un des dispositifs de transfert comme décrit ci-après. En particulier, l'ensemble de tubulures comprend une première tubulure sur 20 laquelle est branché au moins un connecteur 12 à voies multiples, d'autres tubulures étant branchées sur chacune des autres branches du connecteur 12 à voies multiples, de sorte à obtenir un ensemble comportant une pluralité de tubulures 7 de raccordement destinées à être connectées stérilement à d'autres tubulures. 25 Notamment, l'ensemble de tubulures comporte au moins trois, notamment entre trois et huit tubulures 7 pouvant être connectées stérilement. Par exemple, sur les figures 3 et 4, les connecteurs 12 à voies multiples sont 30 des connecteurs à quatre voies. En variante, chaque connecteur peut comprendre entre cinq et huit branches. 3028863 10 Chacune des tubulures 6, 7 du dispositif de raccord multiple 3 est équipée d'un élément sélectif d'ouverture et de fermeture 13 de la communication fluidique dans ladite tubulure, tel qu'un clamp. 5 Chacune des tubulures 6, 7 du dispositif de raccord multiple 3 destinées à être connectées stérilement à une autre tubulure est fermée à son extrémité libre, c'est-à-dire l'extrémité qui n'est reliée à aucun autre élément. Par exemple, chacune des tubulures 6,7 est fermée par un bouchon ou toute autre petite pièce conique ou cylindrique qui s'encastre par pression dans ladite extrémité 10 de la tubulure et qui garantit la fermeture et donc la stérilité (après stérilisation) du dispositif de raccord multiple. Un autre dispositif stérile du système de culture est le dispositif de transfert 2 destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture 1 ou à 15 partir dudit dispositif de culture 1. Le fluide est notamment sous forme d'un liquide tel qu'un milieu de culture, une suspension cellulaire, des compléments ou additifs pour milieu de culture, des réactifs nécessaires à la culture de cellules, des solutions de rinçage, etc. 20 Notamment, ledit dispositif de transfert 2 est destiné, via le dispositif de raccord multiple 3, à introduire des solutions comme du milieu de culture frais dans le récipient de culture 4, à supplémenter du milieu de culture frais avec des compléments ou additifs pour milieu de culture, à introduire des réactifs comme 25 par exemple un réactif de dissociation, dans ledit récipient de culture 4, ou à recueillir le milieu de culture usagé provenant du récipient de culture 4. En relation avec les figures 6 à 8, le dispositif de transfert 2 comprend au moins une poche vide 14 en communication fluidique avec une tubulure primaire 15 30 de transfert sur laquelle est branchée plus d'une tubulure secondaire 16 de transfert. 3028863 11 Selon une réalisation particulière, la tubulure primaire 15 de transfert comprend au moins un connecteur 17 à voies multiples sur lequel est branché plus d'une tubulure secondaire 16 de transfert, notamment entre deux et huit tubulures secondaires de transfert. Ainsi, le dispositif de transfert 2 comprend une pluralité de tubulures 15, 16 aptes à être connectées stérilement à d'autres tubulures. Chacune des tubulures 15, 16 de transfert destinées à être connectées 10 stérilement à d'autres tubulures est fermée à son extrémité libre, c'est-à-dire l'extrémité qui n'est reliée à aucun autre élément. Par exemple, chacune desdites tubulures est fermée par un bouchon ou toute autre petite pièce conique ou cylindrique qui s'encastre par pression dans ladite extrémité de la tubulure, garantissant ainsi la stérilité du dispositif (après stérilisation). 15 En variante représentée sur la figure 7, l'une des tubulures de transfert 18 est pourvue à son extrémité d'un filtre 19 comprenant une membrane stérilisante. La membrane possède une porosité de 0,22 dam. Ledit filtre 19 comprend un connecteur 20, notamment de type Luer, apte à connecter un récipient, tel 20 qu'une seringue, équipé d'un connecteur compatible approprié. Cette tubulure 18 équipée d'un filtre stérilisant 19 pourra être utilisée par exemple pour connecter une seringue remplie d'une solution de dissociation telle que de la trypsine ou de toute autre solution additive telle que l'héparine. 25 En particulier, chacune des tubulures 15, 16, 18 du dispositif de transfert est équipée d'un élément sélectif d'ouverture et de fermeture 21 de la communication fluidique dans ladite tubulure tel qu'un clamp. 30 Le dispositif de transfert 2 présente l'avantage de pouvoir être utilisé pour réaliser de façon sécurisé, c'est-à-dire en réduisant le risque de contamination pathogène, plusieurs opérations de culture et également d'être adapté aux différents protocoles de culture de l'utilisateur final. 3028863 12 En effet, grâce à la pluralité de tubulures disponibles pour réaliser des connexions stériles, l'utilisateur va pouvoir connecter stérilement les différents récipients nécessaires à l'exécution d'une opération de culture de cellules, tel 5 qu'un récipient vide pour recueillir les cellules cultivées, un récipient contenant du milieu de culture frais ou toute autre solution. Un tel récipient est représenté sur la figure 9. Le récipient se présente sous forme d'une poche 22 à partir d'un orifice duquel s'étend une tubulure 23. Cette 10 tubulure est fermée à son autre extrémité notamment par un bouchon ou toute autre petite pièce conique ou cylindrique qui s'encastre par pression dans ladite extrémité de la tubulure, garantissant ainsi la stérilité du dispositif (après stérilisation). 15 En particulier, le récipient 22 comprend du milieu de culture frais, des compléments de milieu de culture tel qu'un lysat plaquettaire, de la trypsine, etc. La tubulure 23 est destinée à être connectée de façon stérile à l'une des 20 tubulures 15, 16 du dispositif de transfert. An variante, de tels récipients 22 sont pré connectés ou intégrés de fabrication au dispositif de transfert. 25 Dans le cas où les solutions nécessaires à une opération de culture de cellules ne sont pas fournies dans des récipients munis d'une tubulure apte à être connectée à une tubulure du dispositif de transfert, celles-ci devront être reconditionnées dans des récipients équipés d'une tubulure. 30 La connexion stérile entre les différentes tubulures du système de culture sécurisé est notamment réalisée à l'aide d'un appareil de connexion stérile tube à tube tel que l'appareil TSCDTM (Terumo Medical Corp.), le TCDTM (Genesis BPL) ou le BiowelderTM (Sartorius Stedim). 3028863 13 Les tubulures destinées à être connectées stérilement sont réalisées dans un matériau soudable et stérilisable. Notamment, ces tubulures sont réalisées en polychlorure de vinyle ou tout autre élastomère thermoplastique 5 thermosoudable comme le C-FlexTM de Saint-Gobain. Les dispositifs du système de culture ou parties de ceux-ci sont fermés et stériles, c'est-à-dire qu'ils ont été stérilisés par une méthode de stérilisation classique comme la stérilisation vapeur ou la stérilisation par irradiation gamma 10 ou par oxyde d'éthylène. On décrit maintenant un procédé selon l'invention pour mettre en oeuvre un système de culture de cellules tel qu'il vient d'être décrit afin de réaliser une succession d'opérations sur lesdites cellules, ledit système de culture 15 comprenant un assortiment de dispositifs fermés et stériles, ledit assortiment de dispositifs comportant : - un dispositif de culture 1 comprenant un récipient de culture 4 adapté à la culture de cellules, - plus d'un dispositif de transfert 2 destiné à permettre le mouvement de fluide 20 vers le dispositif de culture 1 ou à partir dudit dispositif de culture, ledit dispositif de transfert 2 comprenant au moins une poche vide 14 en communication fluidique avec une tubulure primaire 15 de transfert sur laquelle est branchée une ou plus tubulures secondaires 16 de transfert, et - un dispositif de raccord multiple 3 pour raccorder le dispositif de culture 1 à 25 plus d'un dispositif de transfert 2, ledit dispositif de raccord multiple 2 comprenant une pluralité de tubulures 7 de raccordement, plus d'une desdites tubulures de raccordement étant destinée à être connectée stérilement à l'une des tubulure 16 de transfert desdits dispositifs de transfert 2. 30 Selon l'invention, le procédé comprend les étapes consistant à : (a) connecter stérilement l'une des tubulures 7 de raccordement du dispositif de raccord multiple 3 à l'une des tubulures de transfert 16 d'un desdits dispositifs de transfert 2, 3028863 14 (b) réaliser en système fermé une opération sur les cellules à cultiver, (c) une fois l'opération réalisée, déconnecter ledit dispositif de transfert 2 dudit dispositif de raccord multiple 3, et (d) répéter les étapes (a) à (c) avec un autre dispositif de transfert 2 pour 5 réaliser une autre opération sur les cellules. Chaque opération à réaliser sur les cellules est choisie notamment dans le groupe constitué par l'ensemencement, le changement de milieu ou le repiquage. 10 A l'étape (d), l'autre opération à réaliser sur les cellules peut être du même type ou non. Par exemple, si la première opération est une opération de changement de milieu, l'opération suivante est une autre opération de changement de milieu ou une opération de repiquage. 15 En particulier, le procédé comprend, préalablement à l'étape (b), l'étape consistant à connecter stérilement à au moins une des tubulures 16 de transfert dudit dispositif de transfert 2, au moins une tubulure 23 équipant un récipient 22 nécessaire pour réaliser l'opération à réaliser sur les cellules, par exemple un 20 récipient comprenant un liquide tel qu'un milieu de culture, un complément ou additif pour milieu de culture, une solution tampon ou un réactif de dissociation. Après la réalisation de l'opération, la déconnexion du dispositif de transfert 2 dudit dispositif de raccord multiple 3 est réalisée en soudant et coupant la 25 tubulure de raccordement 7 du dispositif de raccord multiple 3 qui a été connectée à la tubulure 16 du dispositif de transfert 2 à l'étape (a). Avantageusement et afin de réduire le risque de contamination en cas de connexion défectueuse, la déconnexion est réalisée en soudant coupant la 30 tubulure de raccordement 7 au plus près du connecteur 12 à voies multiples, empêchant ainsi la ré-utilisation de la portion de tubulure restante. 3028863 15 On décrit maintenant des exemples particuliers de mise en oeuvre du système de culture sécurisé tel que représenté sur les figures comprenant un dispositif de culture 1, un dispositif de raccord multiple 3 et un dispositif de transfert 2. 5 Le procédé comprend l'étape préliminaire consistant à : le cas échéant, connecter stérilement la tubulure primaire 6 de raccordement du dispositif de raccord multiple 3 à l'une des tubulures secondaires 7 de raccordement de l'ensemble de tubulures de sorte à former le dispositif de raccord multiple 3. 10 connecter stérilement l'une des tubulures 7 de raccordement de l'ensemble de tubulures à l'une des tubulures 16 d'un dispositif de transfert 2. Ces étapes préliminaires peuvent être réalisées en dehors de la hotte à flux 15 laminaire puisque les connexions sont des connexions stériles. On décrit maintenant un procédé de mise en oeuvre du système pour réaliser une opération d'ensemencement. 20 Pour réaliser l'ensemencement, on a besoin, en plus des dispositifs de culture 1, de raccord multiple 3 et de transfert 3, d'une poche de milieu de culture frais, d'un récipient contenant une suspension cellulaire et éventuellement d'un récipient contenant des compléments de milieu de culture. La poche et chacun des récipients sont équipés d'une tubulure en communication fluidique avec le 25 volume intérieur dudit récipient ou de ladite poche. Le procédé comporte les étapes préliminaires suivantes : connecter stérilement la poche de milieu de culture frais à l'une des tubulures de transfert 16 du dispositif de transfert, 30 connecter stérilement le récipient contenant la suspension cellulaire à ensemencer à l'une des tubulures 16 du dispositif de transfert, 3028863 16 le cas échéant, connecter stérilement un ou plus autres récipients contenant des compléments pour milieu de culture à une ou plus autres tubulures 16 du dispositif de transfert. 5 L'opération d'ensemencement comprend les étapes consistant à : - transférer la suspension cellulaire et, le cas échéant, des compléments de milieu de culture dans la poche de milieu de culture frais, - transférer le milieu de culture frais contenant les cellules et éventuellement complémenté dans le récipient de culture 4 du dispositif 10 de culture 1, déconnecter le dispositif de transfert 2 en soudant et coupant avantageusement la tubulure de raccordement 7 connectée à la tubulure de transfert 16 au plus près du connecteur à voies multiples 12 auquel la tubulure de raccordement est branchée, afin d'empêcher sa réutilisation. 15 Après cet opération d'ensemencement, le système de culture comprenant le dispositif de culture 1 et le dispositif de raccord multiple 3 est prêt à être utilisé pour réaliser une autre opération. 20 Le procédé de mise en oeuvre du système pour réaliser l'opération de changement de milieu est décrit ci-dessous. Pour réaliser le changement de milieu, on a besoin, en plus des dispositifs de culture 1, de raccord multiple 3 et de transfert 2, d'une poche de milieu de 25 culture frais et d'un ou plusieurs récipients contenant un complément de milieu de culture. La poche et chacun des récipients sont pourvus d'une tubulure en communication fluidique avec le volume intérieur dudit récipient ou de ladite poche. 30 Les étapes suivantes peuvent être réalisées en dehors de la hotte. Le procédé comprend les étapes préliminaires consistant à : 3028863 17 connecter stérilement la poche de milieu de culture frais à l'une des tubulures de transfert 16 du dispositif de transfert 2, le cas échéant, connecter stérilement un ou plus autres récipients contenant des compléments pour milieu de culture à une ou plus autres 5 tubulures 16 du dispositif de transfert 2. L'opération de changement de milieu comprend les étapes consistant à : transférer le milieu usagé dans la poche vide 14 de dispositif de transfert 2, 10 le cas échéant, transférer les compléments de culture dans la poche de milieu de culture frais, transférer le milieu de culture frais éventuellement complémenté dans le récipient de culture 4, déconnecter le dispositif de transfert 2 en soudant et coupant la tubulure 15 de raccordement 7 connectée à la tubulure de transfert 16. Après cet opération de changement de milieu, le système de culture comprenant le dispositif de culture 1 et le dispositif de raccord multiple 3 est prêt à être utilisé pour réaliser une autre opération. 20 On décrit enfin un procédé de mise en oeuvre du système pour réaliser une opération de repiquage. Pour réaliser le repiquage, c'est-à-dire la récupération et la concentration de 25 cellules, on a besoin, en plus des dispositifs de culture 1, de raccord multiple 3 et de transfert 2, d'une solution de dissociation de cellules de type trypsine, d'une solution tampon de type PBS, d'une seringue vide munie d'une tubulure et d'une poche vide de recueil des cellules. Les poches et les récipients sont équipés d'une tubulure en communication fluidique avec le volume intérieur 30 desdits récipients ou desdites poches et d'une balance Le procédé comprend les étapes préliminaires suivantes : 3028863 18 connecter de façon stérile la poche de solution tampon, la poche de recueil des cellules, la seringue et la trypsine à l'une des tubulures 16 de transfert du dispositif de transfert 2, de sorte à former un système fermé. 5 L'opération de repiquage consiste à : transférer le milieu de culture usagé dans la poche vide 14 du dispositif de transfert 2, prélever un certain volume de milieu de culture dans la seringue vide, rincer le récipient de culture 4 avec une solution tampon, 10 ajouter une solution de dissociation dans le récipient de culture 4 afin de détacher les cellules du récipient, transférer un volume déterminé de milieu de culture pour neutraliser la solution de dissociation en disposant le récipient de culture sur la balance, 15 transférer les cellules détachées dans la poche de recueil des cellules, et déconnecter le dispositif de transfert 2 en soudant et coupant la tubulure de raccordement 7 connectée à la tubulure de transfert 16. Pour chacune de ces étapes, il est avantageux d'utiliser une tubulure de 20 raccordement 7 qui n'a pas déjà été utilisée afin d'éviter tout risque de contamination. Si la seringue n'est pas équipée d'une tubulure, on peut alors utiliser un système de transfert tel que représenté sur la figure 7 qui comprend une 25 tubulure 18 pourvue à son extrémité d'un filtre 19 comprenant une membrane stérilisante. La seringue est alors connectée au filtre stérilisant pour réaliser de façon sécurisée l'opération de repiquage. Lors de chacune de ces opérations, le clamp 11 sur la tubulure d'aération est 30 en position fermée. Entre chaque opération, le dispositif de culture assemblé avec le dispositif de raccord multiple est disposé dans un incubateur à 37°C, le clamp 11 sur la tubulure d'aération 9 étant en position ouverte. REVENDICATIONS1. Procédé pour mettre en oeuvre un système de culture de cellules afin de réaliser une succession d'opérations sur lesdites cellules, ledit système de culture comprenant un assortiment de dispositifs fermés et stériles, ledit assortiment de dispositifs comportant : un dispositif de culture (1) comprenant un récipient de culture (4) adapté à la culture de cellules, plus d'un dispositif de transfert (2) destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture (1) ou à partir dudit dispositif de culture (1), ledit dispositif de transfert (2) comprenant au moins une poche vide (14) en communication fluidique avec une tubulure primaire (15) de transfert sur laquelle est branchée une ou plus tubulures secondaires (16) de transfert, et un dispositif de raccord multiple (3) pour raccorder le dispositif de culture (1) à plus d'un dispositif de transfert (2), ledit dispositif de raccord multiple (3) comprenant une pluralité de tubulures (7) de raccordement, plus d'une desdites tubulures de raccordement étant destinée à être connectée stérilement à l'une des tubulures de transfert (16) desdits dispositifs de transfert (2), ledit procédé comprenant les étapes consistant à : (a) connecter stérilement l'une des tubulures de raccordement (7) du dispositif de raccord multiple (3) à l'une des tubulures de transfert (16) d'un desdits dispositifs de transfert (2), (b) réaliser en système fermé une opération sur les cellules à cultiver, (c) une fois l'opération réalisée, déconnecter ledit dispositif de transfert (2) dudit dispositif de raccord multiple (3), et (d) répéter les étapes (a) à (c) avec un autre dispositif de transfert (2) pour réaliser une nouvelle opération sur les cellules. 30 2. Procédé selon la revendication 1 comprenant, préalablement à l'étape (b), l'étape consistant à connecter stérilement à au moins une des tubulures de 3028863 20 transfert (16) dudit dispositif de transfert, au moins une tubulure (23) équipant un récipient (22) nécessaire pour réaliser l'opération à réaliser sur les cellules. 3. Procédé selon la revendication 2 selon lequel le récipient nécessaire pour 5 réaliser l'opération à réaliser sur les cellules comprend un liquide tel qu'un milieu de culture, un complément ou additif pour milieu de culture, une solution tampon ou un réactif de dissociation. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 selon lequel 10 l'opération de l'étape (b) est choisie dans le groupe constitué par l'ensemencement, le changement de milieu ou le repiquage. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 selon lequel la déconnexion du dispositif de transfert (2) dudit dispositif de culture (4) est 15 réalisée en soudant et coupant la tubulure de raccordement (7) du dispositif de raccord multiple (3) qui a été connectée à la tubulure (16) du dispositif de transfert (2) à l'étape (a). 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 selon lequel le 20 récipient de culture (4) est rigide. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 selon lequel le dispositif de raccord multiple (3) comprend un élément de fermeture (8) dudit récipient de culture (4) à partir duquel s'étend une pluralité de tubulures de 25 raccordement (7). 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 selon lequel le dispositif de raccord multiple (3) comprend d'une part une tubulure primaire (6) de raccordement en communication fluidique avec le récipient de culture (4) et d'autre part un ensemble de tubulures comprenant une pluralité de tubulures secondaires (7) de raccordement, l'une au moins étant connectée ou destinée à être connectée à ladite tubulure primaire (6) de raccordement. 3028863 21 9. Procédé selon la revendication 8 comprenant le cas échéant l'étape préliminaire de connecter stérilement la tubulure primaire (6) de raccordement du dispositif de raccord multiple à l'une des tubulures secondaires (7) de raccordement de l'ensemble de tubulures. 5 10. Procédé selon la revendication 8, selon lequel le dispositif de raccord multiple (3) comprend un élément de fermeture (8) dudit récipient (4) à partir duquel s'étend ladite tubulure primaire (6) de raccordement. 10 11. Procédé selon l'une des revendications 8 ou 10, selon lequel une tubulure d'aération (9) s'étend à partir dudit élément de fermeture (8), ladite tubulure d'aération (9) comprenant à son extrémité un évent (10) comprenant une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz. 15 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 selon lequel chacune des tubulures (7, 16) desdits dispositifs de raccord multiple (3) et dispositif de transfert (2) destinées à être connectées stérilement est fermée à son extrémité libre. 20 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 selon lequel l'une au moins des tubulures de transfert (18) est pourvue à son extrémité d'un filtre (19) comprenant une membrane stérilisante. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 selon lequel 25 chacune des tubulures (7, 16) desdits dispositifs de raccord multiple (3) et dispositif de transfert (2) sont équipées d'un élément sélectif d'ouverture et de fermeture (13,21) de la communication fluidique dans ladite tubulure. 30