Brevet FR3026644A1 — publié le 20160408

Colle biologique et son utilisation comme médicament La présente invention se rapporte à une colle biologique à base de fibrinogène, de facteur VII activé et d'une source d'ions calcium. On entend par « colle biologique » un composant capable de réunir des éléments tissulaires (peau, os, organes divers) et en même temps d'assurer une hémostase des tissus lésés, pouvant ainsi renforcer, compléter ou remplacer une réunion de ces tissus par une ou des sutures. Un tel composant permet également de favoriser la réparation/cicatrisation en offrant notamment la possibilité d'une diffusion lente de composés actifs. La coagulation sanguine est réalisée selon des étapes en cascade impliquant différentes proenzymes et procofacteurs présents dans le sang qui sont converties, par l'intermédiaire d'enzymes protéolytiques, en leur forme activée. Cette succession d'étapes ou cascade de la coagulation est effectuée selon deux systèmes de la coagulation, appelés voie extrinsèque de la coagulation et voie intrinsèque de la coagulation, conduisant à la transformation de la prothrombine en thrombine. La voie extrinsèque implique l'intervention du Facteur VII présent dans le sang. Toutefois, celui-ci requiert une activation résultant en facteur VII activé ou facteur Vila pour initier cette cascade de coagulation. Le facteur Vila présente une faible activité enzymatique jusqu'à ce qu'il se complexe au facteur tissulaire de nature phospholipidique libéré après une lésion tissulaire. Le facteur Vila ainsi complexé transforme le facteur X (FX) en facteur Xa (FXa) en présence d'ions calcium. Le facteur Xa à son tour transforme la prothrombine en thrombine, laquelle active le facteur V (Facteur Va). La thrombine active également le facteur XIII en facteur X111a. La thrombine, en présence de calcium, agit sur le fibrinogène en le transformant en fibrine. La présence de facteur XIlla permet la formation d'un caillot de fibrine à réseau maillé solide et adhérent qui est progressivement et lentement résorbé avec l'installation du tissu cicatriciel de consolidation, à laquelle le réseau sert de trame. La voie intrinsèque de la coagulation comprend une cascade de réactions aboutissant à l'activation de la thrombine par l'intermédiaire du facteur XII (FXII). Celui-ci active le facteur XI (Facteur Xla - FXIa) qui active le facteur IX (facteur IXa - FIXa) en présence de facteurs tissulaires phospholipidiques (FT). Le facteur IXa participe à l'activation du facteur X en facteur Xa en présence de facteur Villa, de facteur tissulaire et d'ions calcium. Ceci conduit ensuite à la transformation de la prothrombine en thrombine. Il convient de noter que la présence de facteur Xa ou de thrombine permet aussi l'activation du facteur VII (facteur Vila). Il apparait donc que le facteur Vila joue un rôle prépondérant dans les mécanismes de la coagulation intrinsèque, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Il est utilisé dans le traitement des hémophiles A ayant un inhibiteur circulant, c'est-à-dire un anticorps spécifique qui limite ou empêche l'activation du facteur VIII (FVIII). Le facteur Vila présente l'intérêt de pouvoir agir localement en présence de facteur tissulaire libéré après lésion de tissus engendrant des hémorragies, même en l'absence de Facteur VIII ou IX. Cependant, dans le cas de lésions tissulaires hémorragiques engendrées par les plaies, blessures ou interventions chirurgicales externes, la réparation tissulaire par suture est une nécessité pour notamment favoriser l'arrêt de l'hémorragie par formation du caillot de fibrine, selon les mécanismes explicités précédemment. Il peut s'avérer nécessaire de favoriser, notamment dans le cas de chirurgies lourdes, l'hémostase de tissus lésés. Hormis l'hémostase de tissus lésés, il convient également d'accélérer, renforcer, voire compléter le processus naturel de cicatrisation tissulaire, suture ou non, liée à la réunion des tissus pour éviter leur déhiscence. Ceci est notamment possible par l'application locale de colle biologique. Les colles biologiques sont constituées d'un mélange de facteurs circulants de la coagulation sanguine, notamment de protéines fibrinogène et facteur XIII. Elles requièrent en outre un apport de thrombine exogène, enzyme nécessaire pour transformer le fibrinogène en fibrine insoluble, réticulable par le facteur XIII. Des composants additionnels sont nécessaires pour effectuer la coagulation du fibrinogène, notamment l'ion calcium, et éventuellement de l'aprotinine, ajoutée pour ses propriétés anti-fibrinolytiques. Les colles biologiques peuvent également servir à fixer des biomatériaux de nature diverse (collagène, alginates et acide polylactique) à des tissus biologiques pour renforcer leurs propriétés mécaniques en attendant une consolidation par la repousse naturelle des cellules de l'organisme, par exemple dans le cas des peaux artificielles. Les colles biologiques peuvent également servir de réservoir pour distribuer dans le temps, lors de leur résorption, différents composés actifs tels que des antibiotiques, facteurs de croissance ou de stimulation cellulaire. Les colles biologiques disponibles dans le commerce se présentent en réalité sous forme de kits comprenant au moins les quatre composants cités ci-dessus sous forme sèche dans lequel les protéines activables par la thrombine, le fibrinogène et le facteur XIII, doivent être isolées de la thrombine, car leur association engendre une prise en fibrine en un temps très bref, de l'ordre de quelques secondes après reconstitution dans un liquide et mélange. C'est la raison pour laquelle les kits de colle biologique sont au moins bi-composants, c'est-à-dire comprenant, d'une part, un lot à base de fibrinogène et de facteur XIII et, d'autre part, un lot à base de thrombine. La colle biologique remplit ses fonctions indiquées ci-dessus par reconstitution et mélange des deux lots, par exemple avec des seringues et aiguilles, puis application sur le tissu à suturer ou bien par vaporisation sur la plaie. Cependant, de telles reconstitutions et mélanges sont relativement complexes et source d'erreurs possibles, notamment en cas d'urgence, étant donné que dès la mise en contact du fibrinogène et de la thrombine sous forme liquide, en présence des autres composants, la fibrine est formée presque instantanément. Le mélange fibrinogène-thrombine ne peut donc se faire que juste avant l'application sur la plaie ou zone opératoire ou directement sur la plaie. De plus, lorsqu'un dispositif unique de distribution de colle biologique est utilisé, il existe un risque réel d'une prise en fibrine dans le dispositif même, ce qui peut conduire à un colmatage du système de distribution et d'application. Par ailleurs le produit n'étant pas stable, il peut être difficile de prévoir le volume requis avant le début de l'intervention. La reconstitution en urgence de produit lyophilisé s'accompagne d'un temps d'attente de stabilisation du produit qui peut être handicapant pour le bon déroulement d'une opération chirurgicale. Les inconvénients cités ci-dessus posent donc des problèmes en particulier dans le cadre d'interventions chirurgicales et/ou de situations d'urgence, où souvent la rapidité du geste opératoire est une nécessité. Il est observé que de tels inconvénients sont susceptibles d'engendrer une réunion inhomogène des tissus par formation d'amas de fibrine avant adhésion tissulaire, pouvant en outre être accentués par la rétraction du caillot, conduisant au final à une cicatrice irrégulière, propice à une déhiscence à des saignements secondaires post-opératoires. Pour remédier à ces inconvénients, la Demanderesse a précédemment mis au point une colle biologique répondant à plusieurs objectifs conjoints. Le premier objectif était de fournir une colle biologique comprenant des facteurs de la coagulation, exempte de thrombine, sans risque d'une formation de fibrine avant l'application sur un tissu biologique et capable d'être stockée sous la forme d'un soluté homogène. Le deuxième objectif était de fournir une colle présentant également des capacités accrues, d'une part, d'hémostase de tissus lésés et, d'autre part, de réunion de tissus conduisant à une cicatrisation améliorée. La demande W02007080276 a ainsi décrit une colle biologique monocomposée liquide à usage thérapeutique, exempte de thrombine, et comprenant du fibrinogène, du facteur Vila, et une source d'ions calcium. Cependant, l'efficacité de cette colle biologique peut se trouver limitée en cas de saignements importants, le flux sanguin tendant alors à disperser la colle biologique et à l'évacuer en dehors du site de la plaie ou du tissu lésé. La Demanderesse a développé une formulation améliorée de la colle biologique décrite en optimisant la concentration des composants de cette dernière. La nouvelle formulation est plus efficace pour l'hémostase de tissus lésés et permet une cicatrisation améliorée, tout en ayant un coût de production plus faible. La Demanderesse a également étudié cette formulation en incluant dans la composition au moins un agent gélifiant, ce qui permet de réduire ou éliminer les risques de dispersion de la colle biologique en dehors du site de la plaie en cas de saignements importants. La Demanderesse a également montré que la présence de gélifiant augmente la stabilité de la colle biologique à température ambiante, par rapport à la formulation dépourvue d'agent gélifiant. Enfin, la Demanderesse a montré qu'une concentration réduite en fibrinogène, en particulier inférieure à 60 mg/mi pour des concentrations en FVIla de 0,34 à 34 Ul/ml, est avantageuse pour que la colle biologique présente un pouvoir collant et des propriétés d'hémostase améliorés. Il existe ainsi un ratio optimal de concentration de fibrinogène sur la concentration de FVIla (les concentrations étant exprimées en poids par volume) dans la colle biologique, ce ratio étant de 60000 :1 à 1000 :1. Colle biologique L'invention concerne donc une colle biologique liquide, à usage thérapeutique, exempte de thrombine, comprenant du fibrinogène, du facteur Vila et une source d'ions calcium dans laquelle le ratio de la concentration de fibrinogène sur la concentration de FVI la (les concentrations étant exprimées en poids par volume) est de 60000 :1 à 1000:1. Le colle biologique se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique, c'est-à-dire une formulation « monocomposée » dans laquelle les au moins trois composants d'intérêt constitutifs de la colle forment une composition unique liquide ou lyophilisée à reconstituer, par opposition aux colles bi-composants de l'art antérieur. Dans le cadre de l'invention, tout fibrinogène (Fbg) et facteur VII activé (FV11a) de l'art antérieur, de préférence recombinant, conviennent pour réaliser la colle, à condition toutefois qu'ils soient compatibles avec les ions calcium de la colle sous forme liquide ainsi obtenue, c'est-à-dire que leur mise en contact n'engendre pas la transformation du fibrinogène en fibrine, notamment pendant au moins 24 heures avant utilisation. Les deux ingrédients actifs, le fibrinogène et le FVIIa, doivent donc être dépourvus de thrombine (Fila) résiduelle mais aussi de facteurs de la coagulation tels que, en présence d'ions calcium, la cascade de la coagulation intrinsèque ou extrinsèque soit déclenchée. De tels facteurs de la coagulation sont le facteur II (FII) et le facteur X (FX), et, de préférence, les facteurs prothrombiniques (facteurs II, IX et X) et notamment sous leur forme activée. A titre d'exemple, une teneur maximale acceptable en Fl I et FX dans le fibrinogène est d'environ 0,1 Ul/g de fibrinogène, pour chacun. De préférence, le fibrinogène et le FVIla de la colle ne proviennent pas d'un plasma préactivé. Le fibrinogène, de préférence viralement sécurisé, peut être préparé par toute technique partielle ou complète de fractionnement plasmatique connue dans l'art antérieur. Il peut s'agir du procédé décrit dans EP 0 305 243 ou encore celui mis au point par la Demanderesse dans la demande de brevet FR 05 06640 selon lequel on peut obtenir un concentré de fibrinogène. On peut également mettre en oeuvre du fibrinogène transgénique (recombinant) produit en lignée cellulaire ou par le biais d'animaux transgénique, notamment dans leur lait. Il peut s'agir du fibrinogène transgénique produit et purifié selon le procédé décrit dans la demande de brevet W095/23868, W000/17234, W000/17239 ou W02009/134130. La préparation du facteur Vila, notamment sous la forme d'un concentré, de préférence viralement sécurisé, est également connue. On peut à titre d'exemple citer le brevet EP 346 241. On peut également utiliser du facteur Vila recombinant ou transgénique, en particulier décrit dans le document FR 0604872. Selon un mode de réalisation, la colle de l'invention comprend en outre du facteur XIII. Un apport exogène de facteur XIII favorise la réticulation du réseau de fibrine et, par conséquent, son pouvoir coagulant et cicatrisant. De préférence, la colle biologique comprend du FXIII lorsque le fibrinogène est recombinant. La Demanderesse a en effet observé que la colle biologique incluant du fibrinogène recombinant conduit à une réduction de la vitesse de coagulation, de l'amplitude et de la fermeté des caillots formés, et que cette réduction peut être en partie ou totalement contrebalancée par l'ajout de FXIII dans la colle biologique. Le facteur XIII, de préférence viralement sécurisé, peut être isolé à partir du plasma par toute méthode développée dans l'art antérieur et il pourra avantageusement constituer la protéine accompagnante du fibrinogène lors du fractionnement du plasma. On préfère, dans ce cas, mettre en oeuvre le procédé décrit dans la demande de brevet FR 05 06640. On peut également mettre en oeuvre du facteur XIII recombinant produit en lignée cellulaire de mammifère ou de levure, ou transgénique, produit dans le lait d'animaux transgéniques. Ce principe actif doit toutefois répondre aux mêmes critères de pureté, énoncés plus haut, notamment relatifs à la présence de certains autres facteurs plasmatiques, si le facteur XIII est d'origine plasmatique. Selon un autre mode de réalisation, la colle biologique ne contient pas d'autre facteur de coagulation que le fibrinogène et le FVI la. Une telle colle présente l'avantage de ne nécessiter que deux facteurs de coagulation, ce qui limite notamment les coûts de préparation à l'échelle industrielle de la colle grâce à la présence d'un nombre minimal mais efficace de composants actifs. Les sources d'ions calcium représentent des composants hydrosolubles, compatibles avec un usage clinique. De préférence, ces composants sont des sels inorganiques, tels que le chlorure de calcium (CaCl2) ou le gluconate de calcium. Les composants constitutifs de la colle sont présents en des quantités efficaces permettant à la colle de répondre aux objectifs thérapeutiques recherchés. Ainsi, la colle biologique comprend avantageusement une teneur en fibrinogène de 0,1 mg à 60 mg par ml de colle biologique, en particulier de 0,1 à 40 mg/ml, et de façon plus préférée de 0,2 à 60 mg/ml, de 0,3 à 40 mg/ml, de 0,5 à 30 mg/ml, de 1 à 20 mg/ml, ou encore de 1 à 10 mg/ml. La colle biologique comprend une teneur en FVIla de 0,1 pg à 10 pg par ml de colle biologique, de façon plus préférée de 1 à 5 pg/m1 de facteur Vila (soit de 3,4 à 16,7 Ul/ml), et de préférence de 2 à 4 pg/m1 (soit de 6,8 à 13,6 Ul/ml). Le cas échéant, le facteur XIII est présent à raison de 2 Ul/ml à 700 Ul/ml, de préférence de 2 Ul/ml à 10 Ul/ml. La colle biologique comprend de 2 !moles à 30 !moles de la source d'ions calcium par ml de colle biologique, de façon plus préférée de 3 à 6 pmole/m1 de la source d'ions calcium. La Demanderesse a toutefois observé que les meilleurs résultats en termes des effets recherchés mentionnés ci-dessus peuvent être obtenus lorsque les teneurs des deux facteurs de coagulation fibrinogène et FVIIa, et notamment leur ratios, sont spécifiquement choisis. Ainsi, dans la colle biologique selon l'invention, le ratio de la concentration de fibrinogène sur la concentration de FVI la (les concentrations étant exprimées en poids par volume) est de 60000 : 1 à 1000 : 1, de façon plus préférée de 20000 : 1 à 1000 : 1 et de préférence de 10000 : 1 à 1000 : 1. Selon un mode de réalisation, la viscosité de la colle selon l'invention est supérieure à 1 mPa.s à 37 oc La viscosité de la colle biologique selon l'invention est augmentée et correspond à la viscosité obtenue par la présence d'au moins un agent gélifiant, dont la teneur est de 0,01% à 10 (3/0 (en poids/volume, soit 0,01 à 10 gramme(s)/100 ml de solution) de façon plus préférée de 0,1% à 5%, ou encore de 0,5 à 20/0. Dans ce cas, l'agent gélifiant est un gélifiant pharmaceutiquement acceptable. Dans le cadre de la présente invention, un agent gélifiant fait référence à un agent gélifiant et/ou épaississant. De préférence il s'agit d'un dérivé d'un composé d'origine naturel, comme la cellulose, de façon préférée ledit gélifiant est l'hydroxypropylcellulose. L'agent gélifiant est de préférence une hydroxypropylcellulose de poids moléculaire supérieur à 60 kDa avantageusement de 500 à 2000 kDa, plus avantageusement de 500 à 1000 kDa. A titre d'exemple, le gélifiant utilisé peut être le Klucel MF (Ashland) de grade pharmaceutique. Outre les dérivés cellulosiques, l'agent gélifiant peut également être choisi parmi un polymère d'acide acrylique, le chitosan, la gélatine, les alginates, les carraghénanes, et leurs dérivés respectivement, cette liste n'étant pas limitative. Selon un mode de réalisation de l'invention, un mélange de plusieurs gélifiants peut être utilisé. Les concentrations et activités sont par millilitre de solution liquide finale de colle biologique. Une telle solution peut notamment être obtenue par reconstitution des composants lyophilisés. Comme indiqué ci-dessus, ces facteurs présents de préférence à de telles concentrations assurent les fonctionnalités recherchées pour la présente colle biologique. 20 La colle biologique liquide selon l'invention est stable car ses composants peuvent être en présence en milieu liquide en vue d'une utilisation fonctionnelle de celle-ci, et ce même au moins pendant 24 heures précédant cette utilisation, sans risque d'un déclenchement prématuré du processus de la coagulation. Cette stabilité de la colle est 25 vérifiée, dans la mesure où on n'observe pas de fibrinoformation pendant 24 heures d'incubation à température ambiante. La colle biologique de l'invention remplit sa fonction réparatrice de tissus une fois appliquée au niveau de la plaie ou du tissu cruenté, car la thrombine est formée in situ par contact de la colle biologique sur la plaie ou sur le tissu cruenté. 30 En effet, cette formation de thrombine in situ est assurée par le facteur Vila qui est donc mis en contact avec tous les composants plasmatiques autorisant le déclenchement et le déroulement de la voie extrinsèque ou intrinsèque de la coagulation. Comme explicité précédemment, son activité biologique est dépendante de l'interaction avec le facteur tissulaire de nature phospholipidique endogènes. Le complexe facteur VII 35 activé/facteur tissulaire en présence d'ions calcium transforme le facteur X présent dans le plasma en facteur X activé, lequel transforme la prothrombine en thrombine, enzyme responsable de la formation du caillot en générant la fibrine en présence de fibrinogène. Il se produit alors une fibrinoformation et, par conséquent, le pouvoir adhésif de la colle biologique obtenue s'en trouve renforcé, car la fibrine se forme alors directement au niveau de la plaie ou du tissu à réparer par chirurgie, où les composants cellulaires phospholipidiques sont exposés. Bien que le fibrinogène et les ions calcium soient déjà présents naturellement dans le sang, leur apport permet de renforcer et d'accélérer davantage encore le processus de réunion tissulaire et d'hémostase par la colle biologique de l'invention et ce même par rapport aux colles de l'art antérieur. Ceci constitue un avantage décisif de la présente colle. L'ajout de gélifiant permet de favoriser le contact de la colle à la plaie. Cet ajout permet également de limiter la dispersion de la colle au niveau des plaies à saignements importants. Les inventeurs ont par ailleurs remarqué que l'ajout de gélifiant permet d'augmenter la stabilité de la colle et d'améliorer l'effet coagulant. La colle biologique de l'invention présente de nombreux autres avantages. Sa mise à disposition évite les inconvénients de manipulation et préparation des colles biologiques de l'art antérieur, notamment dans le cas de situations d'urgences, ce qui améliore ses aptitudes de collage tissulaire, en termes de déhiscence et d'absence de saignements secondaires au niveau de la cicatrice en formation. A titre d'exemple, la colle de l'invention évite la formation de « paquets » ou amas de fibrine visible au niveau d'une plaie qui s'expliquerait par une prise inhomogène et autonome de la colle, probablement à cause de la fibrine formée avant adhésion, sans contact avec la plaie. La cicatrice formée présente en outre un trait net, par rapport à un collage à durée égale obtenu en utilisant, par exemple, une colle biologique bi-composant à base d'une part, d'un mélange de fibrinogène et contenant du facteur XIII, et, d'autre part, d'un mélange de thrombine calcique, pour lequel on n'observe pas les effets ci-dessus. Elle est simple à préparer et est d'une stabilité accrue dans le temps, dans la mesure où l'on n'observe pas de fibrinoformation pendant 24 heures à température ambiante. A titre d'exemple, elle est stable sous forme liquide pendant au moins 24 heures à température ambiante, en particulier pendant au moins 2, 4 ou 6 jours. Comme indiqué ci-dessus, la colle biologique de l'invention est prête à l'emploi et comprend un mélange homogène de tous les composants sous forme liquide. Elle peut également se présenter sous la forme congelée, ce qui la rend apte à un stockage prolongé sous cette forme au moins pendant 2 ans sans risque d'une fibrinoformation, qui serait observée, le cas échéant, après décongélation. Il suffit d'une simple remise à température ambiante pour que la colle puisse être utilisée. L'invention concerne également une colle biologique à usage thérapeutique, exempte de thrombine, à base de fibrinogène, comprenant du facteur Vila et une source d'ions calcium tels que définis précédemment, se présentant sous la forme lyophilisée, apte à un stockage prolongé. Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre de techniques de lyophilisation connues de la colle sous forme liquide. La mise à disposition d'une telle présentation de la colle présente l'avantage décisif de ne nécessiter qu'une simple reconstitution du lyophilisat comprenant les facteurs de coagulations et la source d'ions calcium dans un solvant ou milieu aqueux biologiquement compatible pour obtenir la colle liquide stable, cette préparation étant effectuée à l'avance en prévision de l'utilisation. Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne également une colle biologique à usage thérapeutique, exempte de thrombine, à base de fibrinogène, comprenant du facteur Vila, une source d'ions calcium et au moins un gélifiant tels que définis précédemment, se présentant sous la forme lyophilisée, apte à un stockage prolongé. Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre de techniques de lyophilisation connues de la colle sous forme liquide. La mise à disposition d'une telle présentation de la colle présente l'avantage décisif de ne nécessiter qu'une simple reconstitution du lyophilisat comprenant les facteurs de coagulations, la source d'ions calcium et le(s) gélifiant(s) dans un solvant ou milieu aqueux biologiquement compatible pour obtenir la colle liquide stable, cette préparation étant effectuée à l'avance en prévision de l'utilisation. De plus, de telles colles lyophilisées sont très facilement stockables à température ambiante pendant au moins 2 ans sans risque d'une fibrinoformation, qui serait observée, le cas échéant, après reconstitution. Elles sont aisément transportables jusqu'à un site où un patient requiert un usage de ces colles. Kit L'invention concerne également un kit pour la préparation de la colle biologique selon l'invention comprenant des moyens de conditionnement comprenant un lot de fibrinogène lyophilisé, un lot de facteur FVIla lyophilisé, un lot de source d'ions calcium sous la forme de poudre et un solvant aqueux. Un tel kit comprenant notamment trois lots différents, individuels, sous forme sèche, chacun comprenant l'un, particulier, des composants constitutifs de la colle de l'invention, constitue en fait un produit intermédiaire dont il sera ensuite facile de réunir et de dissoudre les lots dans un solvant ou milieu aqueux biologiquement compatible, tel que l'eau purifiée pour injection (PPI), pour l'obtention de la colle biologique liquide stable de l'invention, concentrée au besoin, qui peut ensuite être congelée. L'avantage de mettre à disposition un tel kit est la possibilité d'un stockage prolongé des trois lots de composants différents au moins pendant 2 ans à température ambiante, sans l'observation d'une fibrinoformation après reconstitution, et l'obtention de la colle biologique liquide et stable par simple dissolution. Selon un mode de réalisation de l'invention, le dit kit comprend en outre un lot d'au moins un gélifiant sous forme sèche. Les moyens de conditionnement constituent en fait des moyens permettant de stocker en particulier les composants de la colle, de préparer et de distribuer la colle avant utilisation. Ils comprennent en outre avantageusement au moins un récipient pour au moins trois des composants différents de la colle, dont, de préférence, au moins un pour chaque composant. Chaque récipient est destiné à recevoir l'un des composants qui est ensuite dissous dans le solvant aqueux. Les récipients peuvent être des flacons en divers matériaux de type verre et polymères biologiquement compatibles. De préférence, les moyens de conditionnement peuvent être avantageusement un récipient unique contenant au moins les trois ou quatre composants si le kit comprend du gélifiant. Un tel conditionnement présente l'avantage qu'une simple dissolution de l'ensemble fournit directement la colle liquide prête à l'emploi. Avantageusement, le kit comprend également un dispositif de distribution de la colle liquide une fois préparée par dissolution des lots ci-dessus avec le solvant aqueux. Un tel dispositif représente par exemple une seringue de volume approprié en fonction de la dose de colle à délivrer, comportant une aiguille fine, typiquement de diamètre inférieur à 2 mm, en particulier inférieur à 1 mm, ou bien un cathéter classique ou bien un pinceau qui permet d'étaler précisément la colle reconstituée à la surface de la plaie, ou bien un tissu biocompatible et/ou biodégradable qui permet de maintenir la colle sur la plaie. Le tissu pourra avoir été imbibé extemporanément avec la colle reconstituée ou bien avoir été fabriqué en présence de la colle. Dans cette dernière option, le tissu intégrant les composés de la colle biologique est alors prêt à l'emploi et déposé directement sur la plaie. De préférence, le kit ci-dessus comporte un lot multi-composant de mélange des lots desdits facteurs lyophilisés et un lot de source d'ions calcium sous la forme de poudre. Ce kit comprend donc, d'une part, un lot de mélange lyophilisé des facteurs de coagulation de l'invention, et, d'autre part, un lot de la source d'ions calcium sous forme de poudre, susceptible d'être également sous la forme d'un lyophilisat, qu'il suffira simplement de réunir et de mélanger avec un milieu aqueux, tel que l'eau PPI, avant utilisation. En variante, le kit peut comprendre un lot de mélange lyophilisé des facteurs de coagulation, et, d'autre part, un lot de la source d'ions calcium sous forme de solution aqueuse. Avantageusement, ce kit comprend également au moins un gélifiant sous forme sèche ou sous forme de solution aqueuse, formant un lot bi-composant par mélange avec la source d'ions calcium ou formant un lot à part. De préférence, le kit de l'invention est caractérisé par le fait que chaque lot de facteur fibrinogène ou FVI la lyophilisé, ou le lot bi-composant du mélange desdits lots des facteurs lyophilisés comprend des constituants d'une formulation stabilisante de lyophilisation pharmaceutiquement acceptable. Il en est de même de la colle biologique lyophilisée. En effet, les différents lyophilisats des facteurs de coagulation sont obtenus par lyophilisation des concentrés ou solutions liquides des facteurs ou de chacun de ces facteurs, selon des techniques classiquement mises en oeuvre, comprenant avantageusement, à cet effet, une formulation stabilisante de lyophilisation. La formulation stabilisante peut, en tant que de besoin, comprendre des adjuvants stabilisants connus dans la technique. Par conséquent, l'invention concerne également l'utilisation du kit selon l'invention pour la préparation d'une colle biologique liquide, par reconstitution des lots dudit kit dans un solvant aqueux biologiquement compatible suivie, le cas échéant, d'une congélation. Applications thérapeutiques L'invention concerne également une colle biologique telle que décrite plus haut pour utilisation comme médicament. Dans le cas où la colle est stockée sous la forme congelée, il suffira, préalablement à l'utilisation, de dégeler celle-ci. Dans le cas d'une colle lyophilisée seule ou au contact d'un tissu, la reconstitution dans un solvant aqueux biologiquement compatible permet de l'utiliser pour les effets recherchés. Dans le cas d'une formulation liquide ou d'un tissu imbibé, la colle sera prête à l'emploi. La colle biologique de l'invention est donc utilisée pour stimuler le retour de l'hémostase et/ou la cicatrisation de tissus biologiques lésés, tels que la peau ou tout organe susceptible d'interventions chirurgicales (rate, foie, poumons, intestins, vaisseaux etc.), qui, comme explicité précédemment, peuvent représenter les tissus cruentés ou les plaies hémorragiques, dont le saignement peut même être très faible dans la mesure où tous les facteurs nécessaires à la cascade de la coagulation sont présents. La colle peut être utilisée, en présence de plasma, pour la préparation d'un médicament, ce dernier étant avantageusement destiné à traiter les tissus lésés, par exemple réunir ces tissus, choisis dans le groupe constitué par le cartilage, le collagène, l'os et la poudre d'os. De plus, en présence de plasma, elle est également utilisée pour la préparation d'un médicament destiné à réunir les biomatériaux choisis dans le groupe constitué par les alginates ou l'acide polylactique. La présence du plasma est par conséquent nécessaire dans certains cas pour l'apport exogène des facteurs plasmatiques afin d'initier la cascade de la coagulation, et, de préférence, est du plasma compatible ou autologue. Cet apport pourra notamment être effectué dans le cadre d'interventions chirurgicales classiques, en stomatologie ou odontologie. Le tissu biologique peut également provenir de cellules-souches mises en culture et différenciées. Bien que la colle de l'invention soit un médicament, en particulier un pansement a application locale, c'est-à-dire à usage externe sur une plaie ou autre comme décrit plus haut, il n'est pas exclu que le médicament puisse également être une gélule adaptée, gastrorésistante ou non, dans laquelle la colle biologique est sous forme sèche, et ingérée pour le traitement d'un saignement digestif. La stabilité d'au moins 24 heures de la colle de l'invention lui permet de rester fluide et donc de pouvoir être utilisée pour la préparation d'un médicament destiné à emboliser les vaisseaux sanguins nourriciers d'une cible tumorale. Ceci peut être avantageusement effectué par voie d'injection utilisant un cathéter classique jusqu'à ces cibles tumorales pour ainsi « assécher » la tumeur. La colle permet d'apporter une hémostase à travers un système endoscopique utilisé en microchirurgie (prélèvements, biopsies, excision de polypes etc.). La fluidité de la présente colle, liée notamment à sa stabilité, rend possible son utilisation à travers d'une aiguille fine, typiquement de diamètre inférieur à 1 mm, en particulier inférieur à 0,5 mm, pour une application en chirurgie sous microscope, par exemple ophtalmique. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.35 FIGURES La Figure 1 montre l'influence du gélifiant, de sa concentration et de la concentration en fibrinogène (Fbg) sur le temps de formation total (CT+CFT) du caillot formé. La Figure 2 montre l'influence du gélifiant, de sa concentration et de la concentration en fibrinogène sur la fermeté du caillot formé. La Figure 3 montre l'influence du gélifiant, de sa concentration et de la concentration en fibrinogène sur l'efficacité du caillot formé (ratio de la résistance du caillot sur la vitesse de formation du caillot). La figure 4 montre les études de stabilité des colles par rapport au temps de formation total du caillot (CT+CFT), sans gélifiant à différentes concentrations de fibrinogène. La figure 5 montre les études de stabilité des colles par rapport à la fermeté du caillot sans gélifiant à différentes concentrations de fibrinogène. La figure 6 montre les études de stabilité des colles par rapport au temps de formation total du caillot (CT + CFT) en présence de 1% de Klucell MF à différentes concentrations de fibrinogène. La figure 7 montre les études de stabilité des colles par rapport à la fermeté du caillot en présence de 1% de Klucell MF à différentes concentrations de fibrinogène. La figure 8 montre le pouvoir collant à 15 minutes au niveau carotidien de 5 compositions de colle. La figure 9 montre le pouvoir collant à 15 minutes au niveau hépatique de 5 compositions de colle. La figure 10 montre le pouvoir collant à 15 minutes au niveau splénique de 5 compositions de colle. La figure 11 montre le saignement hépatique en gramme à 15 minutes après incisions et application d'une des 5 compositions de colles testées. La figure 12 montre le saignement splénique en gramme à 15 minutes après incisions et application d'une des 5 compositions de colles testées. La figure 13 montre le saignement rénal en gramme à 15 minutes après incisions et application d'une des 5 compositions de colles testées.35 EXEMPLES Exemple 1 : Etude du type de gélifiant Quatre composées sont testés selon leur capacité à gélifier la colle : le Klucel HF (PM : 1 150 kDa), le Klucel MF (PM : 850 kDa), le PlasdoneC30 (PM : 58kDa) et le PlasdoneC17 (PM : 10kDa). De fortes concentrations des gélifiants PlasdoneC30 et PlasdoneC17 (concentrations supérieures à 30% en g/mL de solution) sont nécessaires pour obtenir une viscosité satisfaisante contrairement aux Klucel HF et Klucel MF pour lesquels des concentrations de 0,01 à 10% épaississent de manière importante la préparation de colle. En conséquence, les propriétés de la colle gélifiée ont été étudiées en présence de Klucel HF et Klucel MF. Exemple 2: Influence du gélifiant et de la concentration en fibrinogène sur le temps de formation total du caillot La gélification de la colle biologique est mesurée en ROTEM. Le ROTEM est une mesure de thromboélastométrie qui fournit de manière systématique plusieurs paramètres : les temps de coagulation (CT) et le temps de formation du caillot (CFT), deux paramètres cinétiques qui caractérisent la rapidité de coagulation de la solution. Pour plus de simplicité, la valeur correspondant à la somme de ces deux paramètres (CT+CFT) est présentée, correspondant au temps total de formation du caillot. Le système fourni aussi une valeur qui reflète la solidité du caillot formé (MCF en mm). Brièvement, une solution de gélifiant a été préparée par reconstitution du gélifiant en poudre dans un tampon HEPES 25 mM, NaCI 175 mM pH 7,4 durant 16h à température ambiante. Une solution 2X concentrée en gélifiant a ainsi été préparée (1 ou 2 g/100 ml). Le lendemain, un volume de cette solution gélifiante (ou de tampon pour le contrôle négatif) a été ajouté à un volume de solution de fibrinogène concentrée 2X et préalablement dialysée contre le même tampon HEPES (solution de fibrinogène de 6 à 90 mg/mi avant dilution). Le FVIla a ensuite été ajouté en concentration désirée (2-5 pg/ml) dans un volume minimum ( La somme du temps de formation du caillot et du temps de coagulation a été mesurée dans chacune des conditions (Figure 1). Sans gélifiant, l'augmentation de la concentration en fibrinogène conduit à une diminution régulière du temps d'apparition du caillot de 1164 à 300 s. En présence de 0,5% de Klucell HF, les temps à 10 mg/mi de fibrinogène restent supérieurs à ceux obtenus en absence de gélifiant, sans que ce ne soit significatif. En présence de 0,5% ou de 1% de Klucell MF, les temps de formation du caillot sont similaires à ceux obtenus sans gélifiant, voire même plus faible à 20 mg/mi fibrinogène et 0,5% Klucell MF. En conséquence la présence de Klucell MF ou de Klucell HF entre 0,5 et 1% ne modifie significativement pas le temps de formation du caillot. Exemple 3: Influence de la concentration de gélifiant et de la concentration en fibrinogène sur la résistance du caillot. La fermeté du caillot (MCF en mm) a été mesurée en ROTEM comme décrit dans l'exemple 2 (figure 2). Sans gélifiant, la fermeté du caillot augmente régulièrement avec la concentration en fibrinogène passant de 27 mm pour 3 mg/mi de fibrinogène à 93 mm pour 20 mg/mi de fibrinogène. La présence de 0,5 (3/0 de Klucell MF ou de Klucell HF ne modifie pas de manière significative la fermeté notamment à partir de 10 mg/mi de fibrinogène. Exemple 4: Influence de la concentration de gélifiant et de la concentration en fibrinogène sur l'efficacité de formation du caillot Le rapport de la fermeté du caillot (en mm) sur la vitesse de formation (en s) permet d'évaluer la qualité globale de la formation du caillot en un paramètre unique. Ce rapport a été calculé et est présenté en fonction des différents paramètres de l'étude (figure 3). Sans gélifiant, le ratio augmente régulièrement en fonction de la concentration en fibrinogène devenant maximal à 20 mg/mi (ratio=0,31). En présence de 0,5% de Klucell HF, ce ratio est diminué pour 10 mg/mi de fibrinogène. En présence de 1% Klucell MF, le ratio est meilleur dans les faibles concentrations en fibrinogène (3 et 5 mg/mi) qu'en son absence. En présence de 0,5% de Klucell MF, les ratios sont globalement conservés par rapport à une solution sans gélifiant. On note un optimum vers 20 mg/mi de fibrinogène. Ces données montrent que la présence de l'épaississant Klucell MF dans la solution de colle biologique n'affecte pas la formation du caillot de fibrine tout en augmentant la viscosité de la solution. Exemple 5: Etude de stabilité de différentes colles quant au maximum de fermeté du caillot et au temps de coagulation (CT) et de formation du caillot (CFT). La stabilité de plusieurs formulations de colle a été évaluée par une analyse au ROTEM. Dans un premier temps, des formulations de colles biologiques ne contenant pas de gélifiant ont été préparées et analysées. Il s'agit de mélanges de 10 ou 20 mg/mi de fibrinogène incubés en présence de FVIla pendant 0 à 10 jours ou dans lesquels le FVIla a été ajouté extemporanément. La prise de la colle a ensuite été démarrée par adjonction d'un mélange d'inducteur (facteur tissulaire 0,5 pM, phospholipides 2 pM, calcium 3 mM) en présence de 5 (3/0 de plasma humain. L'incubation des solutions jusqu'à 7 jours n'affecte pas la vitesse d'apparition du caillot (CT+CFT) et ce, que le FVI la ait été incubé en présence de fibrinogène (Fbg-FVI la) ou ajouté au moment de la mesure (Fbg) (Figure 4). Après 7 jours, le temps de formation du caillot augmente régulièrement pour toutes les conditions étudiées. La fermeté du caillot est optimale à 20 mg/mi de fibrinogène, que le FVI la ait été incubé en présence du fibrinogène ou non (Figure 5, - et x). Il n'y a pas de variation de la fermeté pendant les 7 premiers jours puis celle-ci-diminue régulièrement au cours du temps pour toutes les conditions étudiées. Les caillots réalisés à partir des mélanges contenant 20 mg/mi de fibrinogène restent plus résistants que ceux réalisés à partir des solutions à 10 mg/ml. Une expérience similaire a été répétée en ajoutant 1% (1g/100 mL de solution) de gélifiant Klucell MF au fibrinogène et en les incubant ensemble pendant des temps différents (Figure 6 et 7). La présence de gélifiant ne modifie pas de manière importante la qualité des caillots formés. Elle a même tendance à limiter la perte d'efficacité entre les jours 7 et 10. Comme précédemment, les mélanges réalisés à partir de 20 mg/mi de fibrinogène sont plus rapidement formés et plus résistants. En conclusion, la préparation de colle biologique peut être incubée jusqu'à 7 jours à 25°C sans perdre ni diminuer sa fonction de coagulation. L'ajout de Klucell MF à 1% améliore même les performances de la solution aux temps plus longs. Exemple 6: Etude in vivo de cinq formulations de colles biologiques Dans cette étude, plusieurs formulations de colle ont été testées dans un modèle de saignement d'organes chez le lapin. Les cinq formulations testées ont été dénommées : Colle A, Colle B, Colle C (correspondant à 3 formulations de colle avec différentes concentrations de fibrinogène) et Solution 1, Solution 2 (formulation de colle avec ajout d'un gélifiant), toutes ces solutions ont été comparées à un placebo (solution tampon).35 Colle A : 3 mg/mi de Fibrinogène + 2 pg/m1 FVI la Colle B : 20 mg/mi de Fibrinogène + 2 pg/m1 FVIla Colle C : 80 mg/mi de Fibrinogène + 2 pg/m1 FVI la Solution 1 : 3 mg/mi de Fibrinogène + 2 pg/m1 FVI la + 1% (p/v) de Klucell MF Solution 2 : 20 mg/mi de Fibrinogène + 2 pg/m1 FVI la + 1% (p/v) de Klucell MF Le critère principal de jugement est le saignement d'organes, évalué par la quantité de sang épanché après les lésions d'organes. Le critère de jugement secondaire est le pouvoir collant observé d'une part au niveau des vaisseaux carotidiens (sans plaie induite), et d'autre part au niveau des berges des lésions d'organes, gradé de 0 à 2 (0= pas de pouvoir collant, 1= adhérence faible, 2=adhérence forte). Cette étude a inclus au total trente-trois lapins femelles de 3kg environ, avec 6 groupes de 5 animaux (auxquels s'ajoutent 3 animaux pilotes) : groupe Placebo, groupe Colle A, groupe Colle B, groupe Colle C, groupe Solution 1, groupe Solution 2. Un modèle de saignement d'organes a été appliqué pour évaluer la capacité hémostatique (capacité à limiter le saignement) et le pouvoir collant chez des lapins ayant subi des plaies chirurgicales d'organes. Toute l'expérience s'est déroulée sous anesthésie générale. L'ordre des traitements (colles ou placebo) a été administré selon tirage au sort. Après induction de l'anesthésie, les lapins ont été trachéotomisés et ventilés mécaniquement. On a procédé dans un premier temps à l'étude du pouvoir collant au niveau carotidien (sans saignement induit). On a procédé ensuite à l'étude des saignements d'organes après laparotomie médiane xyphopubienne et lésions hépatiques, spléniques, puis rénales, avec recueil du saignement pendant 15 minutes pour chaque organe. Le sang perdu et recueilli a été pesé. A la fin de l'expérimentation, les animaux ont été sacrifiés. 35 Tableau 1: Etude du pouvoir collant de différentes formulations Placebo Colle A Colle B Colle C Solution 1 Solution 2 Carotide 0 0 10 3 8 10 score 5min/20* médiane 5min 0 (0-0) 0 (0-0) 1 (0-2) 0 (0-2) 1 (0-2) 1 (0-2) score 15min/20* 0 9 11 6 15 15 médiane 15min 0(0-0) 1(0-2) 1(0-2) 0(0-2) 2(0-2) 1.5 (1-2) p score vs placebo 0,005 Le saignement hépatique dans le groupe colle A est statistiquement plus faible que dans le groupe placebo. Du fait d'une valeur extrême dans le groupe Solution 1, il n'y a pas de différence significative entre la Solution 1 et le groupe placebo (figure 11). D'autre part, il n'y a pas de différence significative entre les différents groupes quant au saignement splénique du fait d'une grande dispersion des valeurs (figure 12). Cependant on observe une tendance non significative à une réduction du saignement splénique dans les groupes Solutions 1 et 2. Il semble que les Solutions 1 et 2 permettent de diminuer le saignement rénal bien que pour la Solution 1 cet effet ne soit pas significatif (figure 13). De manière générale l'utilisation de concentrations en fibrinogène inférieures à 60 mg/mi semble préférable pour limiter les saignements. L'utilisation de gélifiant dans la formulation de la colle peut également permettre une réduction des saignements notamment au niveau rénal. REVENDICATIONS1.- Colle biologique liquide, à usage thérapeutique, exempte de thrombine, comprenant du fibrinogène, du facteur Vila et une source d'ions calcium dans laquelle le ratio de la concentration de fibrinogène sur la concentration de FVIla (les concentrations étant exprimées en poids par volume) est de 20000 :1 à 1000 :1 et la concentration en fibrinogène est inférieure à 60 mg/ml. 2.- Colle biologique selon la revendication 1, comprenant une teneur en fibrinogène de 0,1 mg à 40 mg par ml de colle biologique. 3.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 2, comprenant une teneur en FVI la de 0,1 pg à 10 pg par ml de colle biologique. 4.- Colle biologique selon la revendication 3, dans laquelle le facteur Vila et/ou le fibrinogène sont recombinants. 5.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 4, comprenant de 2 !moles à 30 !moles de la source d'ions calcium par ml de colle biologique. 6.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant en outre au moins un agent gélifiant. 7.- Colle biologique selon la revendication 6, dans laquelle ledit au moins un agent gélifiant est un dérivé de cellulose. 8.- Colle biologique selon l'une des revendications 6 à 7, dans laquelle ledit au moins un agent gélifiant dérivé de la cellulose est l'hydroxypropyl cellulose. 9.- Colle biologique selon la revendication 6, dans laquelle ledit au moins un agent gélifiant est présent à raison de 0,01 à 10% en poids/volume, soit 0,01 à 10 gramme(s)/100 ml de solution). 10.- Colle biologique selon la revendication 6, dans laquelle ledit au moins un agent gélifiant est de poids moléculaire supérieur à 60 kDa. 11.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant en outre du facteur XIII. 12.- Colle biologique selon la revendication 11 dans laquelle le facteur XIII est présent à raison de 2 Ul à 700 Ul par millilitre de solution finale de colle biologique. 13.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 10, ne contenant pas d'autres facteurs de coagulation que le fibrinogène et le FV11a. 14.-Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 13 se présentant sous forme congelée. 15.- Colle biologique, l'une des revendications 1 à 13, se présentant sous forme lyophilisée. 16.-Kit pour la préparation de la colle biologique selon l'une des revendications 1 à 13, comprenant des moyens de conditionnement comprenant un lot de facteur fibrinogène lyophilisé, un lot de facteur FVIla lyophilisé, un lot de source d'ions calcium sous la forme de poudre, un solvant aqueux et éventuellement un lot de gélifiant(s) sous la forme de poudre. 17.- Kit selon la revendication 16, comprenant également un dispositif de distribution de la colle une fois préparée par dissolution desdits lots avec le solvant aqueux. 18.- Kit selon l'une des revendications 16 à 17, pour son utilisation à la préparation d'une colle biologique telle que définie selon l'une des revendications 1 à 15 par reconstitution des lots dudit kit dans un solvant aqueux biologiquement compatible suivie, le cas échéant d'une congélation. 19.- Colle biologique telle que définie selon l'une des revendications 1 à 15 pour son utilisation comme médicament. 20.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 15, pour son utilisation 35 pour stimuler le retour à l'hémostase et/ou la cicatrisation de tissus biologique lésés. 30 21.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 15, au contact d'un tissu ou d'une membrane (biocompatible et/ou biodégradable) pour son utilisation pour stimuler le retour à l'hémostase et/ou la cicatrisation de tissus biologique lésés.