Brevet FR3029650A1 — publié le 20160610

PROCEDE ET DISPOSITIF DE MESURE OPTIQUE INTRODUCTION La présente invention concerne un procédé et un dispositif de mesure optique. Elle trouve des applications dans tous les domaines de l'imagerie, en particulier mais non limitée au domaine de la Microscopie, incluant mais non limité aux domaines de la Biologie, de la Médecine, de la Pharmacie, des Semiconducteurs, de l'Etude des matériaux, de la Métrologie, du contrôle, de la mesure et de l'observation et à l'ensemble des processus d'acquisition de l'information à partir d'observations optiques, dans le domaine macroscopique ou microscopique. Microscopie Un Microscope optique est un instrument utilisé en général pour voir, analyser ou mesurer les objets trop petits pour être visualisés par l'oeil nu. Nous utiliserons le terme biologique pour décrire toute entité de la Science du vivant, quelle que soit sa provenance, humaine, animale ou végétale et la finalité de son observation, recherche, diagnostique ou thérapeutique. Ce terme inclut les utilisations médicales de la technique décrite. La Microscopie est utilisée dans le domaine de la Biologie, par exemple, pour observer, étudier et mesurer des entités (objets) biologiques et leur dynamique. Nous utiliserons, par extension, le terme de Vision artificielle pour décrire l'ensemble des applications de mesure, métrologie ou observation d'objets ou éléments produits ou construits ou réalisés par un être humain ou une machine, par exemple, pour observer, étudier et mesurer des Semiconducteurs ou pour caractériser les matériaux. Les définitions usuelles sont utilisées pour: limite de diffraction optique, critère de Rayleigh, disque d'Airy et ses rayon et diamètre. Nous utilisons dans le contexte de l'invention les termes de superrésolution, superrésolu, d'imagerie de superrésolution et de microscopie de superrésolution pour décrire l'acquisition de données optiques, en imagerie, en microscopie ou en Vision artificielle, à une résolution supérieure à la limite de diffraction optique. Les définitions usuelles sont utilisées pour la fluorescence et pour les fluorophores. On se réfère maintenant à la Figure. 1, qui représente une illustration du paradigme de la Microscopie, 100. La Microscopie optique consiste en l'illumination, par une source lumineuse, non représentée, à l'aide d'un Microscope, 10, d'un échantillon biologique ou non-biologique,11, et la mesure en fonction du temps, à l'aide d'une observation visuelle ou d'un module de détection, 12, de la lumière émise, réémise, diffusée ou réfléchie ou transmise par l'échantillon. En Biologie, l'échantillon consiste en une - ou une pluralité - d'entités objets biologiques différentes, 13 et 14, positionnées à différentes positions. Des exemples de tels objets, sont, entre autres, une cellule, un 3029650 2 virus, une protéine et un fragment d'ADN. En vision industrielle artificielle l'échantillon peut être, par exemple, un élément semi-conducteur La Microscopie est segmentée en différentes modalités ayant des caractéristiques et des finalités différentes. De nombreuses descriptions des différentes modalités, de leurs caractéristiques et de leurs avantages existent extensivement dans la littérature et se trouvent par exemple sur les web des sociétés Zeiss, Leica, Nikon, ou Olympus. On peut structurer les applications de Microscopie de nombreuses manières différentes: l'une d'entre elles est de distinguer les modalités de Microscopie dévolues à visualiser des minuscules sources ponctuelles de celles dévolues à mesurer des objets continus. Le cas des minuscules sources ponctuelles est a priori beaucoup plus simple. L'objet consiste en un petit nombre de points lumineux ; ceux-ci peuvent être décrits par un petit nombre de paramètres - les descripteurs définis par la suite - simplifiant de beaucoup le problème physique et la complexité algorithmique. Le cas d'un objet continu, décrit par une distribution spatiale - ou spatio-temporelle, si on prend en compte la dynamique continue, est différent et est décrit aussi dans cette demande de brevet. Microscopie de fluorescence La microscopie de fluorescence est une des modalités de la microscopie; elle a remplacé, dans de nombreuses applications, les autres techniques de microscopie. Un microscope à fluorescence est un microscope optique utilisé pour étudier les propriétés d'objets, ou de substances organiques ou inorganiques en utilisant les phénomènes de fluorescence au lieu de, ou en plus d'autres modalités telle que la réflexion et l'absorption. On se réfère de nouveau à la Figure. 1, décrivant, cette fois, un microscope de fluorescence utilisé soit en Biologie soit en Vision artificielle pour caractériser, par exemple, des matériaux; en microscopie de fluorescence on fixe des minuscules sources ponctuelles, 15 à 18, par exemple des fluorophores basées sur le phénomène physique de la fluorescence à un photon, à des positions spécifiques et prédéterminées des objets, 13 et 14; on observe la lumière émise par les sources ponctuelles en lieu et place d'observer la lumière émise par les objets, 13 et 14, eux-mêmes. L'échantillon est éclairé par une lumière de longueur d'onde, ou de longueurs d'onde spécifiques, qui est absorbée par les sources ponctuelles, induisant ainsi l'émission de lumière à des longueurs d'onde différentes et plus élevées. Lors de la collection de la lumière émise, en fluorescence, la lumière d'illumination est séparée de la fluorescence émise, qui est plus faible, par l'utilisation d'un filtre spectral d'émission. La microscopie de fluorescence étudie la lumière émise par de petites sources ponctuelles, les fluorophores. Toutefois, lorsque la densité des fluorophores est élevée, les fluorophores ne sont plus analysés individuellement mais traités comme un objet continu. Il est important de noter, dès ce stade, que le même système permet l'observation d'objets continus, et n'est pas limité à l'observation de sources ponctuelles. 3029650 3 Les fluorophores sont devenus un outil important de la visualisation d'objets biologiques. L'activité et l'information biologique comprenant des détails au-dessus de la limite de résolution de 200 - 250 nm sont systématiquement visualisés et mesurées en utilisant la microscopie de fluorescence. Cette limite de résolution est dérivée du critère de Rayleigh, qui, dans le meilleur des cas, atteint 200 - 250 nm dans des systèmes conçus spécialement. Pendant longtemps, jusqu'à l'émergence des techniques de superrésolution décrites ci-dessous, il était reconnu que les techniques optiques, y compris la microscopie de fluorescence, sont incapables de visualiser des détails plus petits que le critère de Rayleigh, de l'ordre de 200 - 250 nm. Cependant, d'autres activités biologiques fondamentales se produisent également à des échelles de taille inférieure à 200 nm dans des échantillons biologiques. A ce niveau de résolution spatiale, des phénomènes importants peuvent être observés : les processus biologiques à l'échelle intracellulaire, le transfert d'information cellulaire, le repliement et le dépliement des protéines et les modifications de l'ADN et l'ARN. Ainsi, par exemple, la mesure de ces informations intracellulaires ouvrira de nouvelles voies à la compréhension de l'activité biologique, et conduira à des progrès dans la connaissance et le suivi de la recherche et du diagnostic médical. Microscopie confocale Les principales implémentations de la microscopie de fluorescence, décrites en détails dans la littérature, sont le microscope confocal, souvent utilisé dans une configuration à balayage ou à disque rotatif et le microscope d'imagerie à grand champ. On se réfère maintenant à la figure 2, qui est une représentation simplifiée d'un microscope confocal à fluorescence de l'art antérieur 200. Un microscope confocal de fluorescence, Fig. 2, est un instrument optique. Ses principaux composants matériels sont représentés dans la figure. 2. Ils comprennent: - Une source de lumière, 20, - un cadre optomécanique non représenté, - un cube de filtres, 21, - un objectif de microscope 22, et, - un ensemble détecteur, 23, - une unité de traitement, non représentée. La source de lumière, 20, qui peut être une lampe à arc ou d'un laser, crée de l'énergie lumineuse nécessaire pour la fluorescence. Le cadre optomécanique, non représenté, est le support de tous les éléments optiques et comprend des optiques auxiliaires et les capacités d'alignement. Il comprend également, des éléments optiques, non représentés, capables de façonner le faisceau, pour permettre sa focalisation d'un point de taille minimale, au moyen de l'objectif du microscope. 3029650 4 Il peut comprendre également, dans un microscope confocal de fluorescence à balayage, un mécanisme de balayage, spatial ou angulaire, non représenté pour modifier la position de la source ponctuelle par rapport à l'objet à mesurer. Le mécanisme de balayage peut alternativement: translater mécaniquement l'objet, en utilisant par exemple une platine de translation, scanner optiquement le faisceau sur l'objet, en utilisant par exemple un ensemble de miroirs galvanométriques ou translateurs acousto-optiques, ou utiliser une combinaison quelconque de ces moyens de translation, mécaniques ou optiques. Dans un microscope confocal de fluorescence à balayage, l'information est recueillie point à point, en utilisant le mécanisme de balayage. Il peut comprendre également, dans un microscope confocal de fluorescence à disque rotatif, un disque rotatif, comportant une pluralité de trous microscopiques, permettant la projection simultanée d'une pluralité de points. Dans un microscope confocal de fluorescence à disque rotatif, un ensemble de points, correspondant aux trous microscopiques est acquis à chaque instant et la rotation du disque permet de balayer l'ensemble de la surface de l'échantillon pour une position longitudinale donnée. Le cube de filtres, 21, canalise les différents signaux optiques et évite la contamination du signal de fluorescence parla lumière d'excitation. Le cube de filtres se décompose en: filtre d'excitation, 210, miroir dichroïque, 211, et filtre d'émission, 212. Les filtres et le miroir dichroïque sont choisis en fonction de la longueur d'onde d'excitation et des caractéristiques spectrales d'émission du fluorophore. L'objectif de microscope, 22, focalise la lumière créée par la source dans le plan focal de l'objectif, 24, en une distribution lumineuse de taille réduite, la distribution lumineuse considérée comme optimale consistant en un disque d'Airy. L'objectif de microscope, 22, permet également de recueillir en retour la lumière fluorescente émise par les fluorophores. Pour un microscope confocal de fluorescence à balayage le système peut être déscanné, c'est- à-dire que la lumière en retour peut passer par le mécanisme de balayage pour compenser la translation due au balayage. Une lentille de détecteur, 25, crée, au plan image du détecteur 26, une image magnifiée du plan focal de l'objectif, 24. Un trou confocal, 27, est théoriquement placé dans le plan image du détecteur, 26. Dans la plupart des systèmes pratiques, le trou confocal, 27, est placé dans un plan d'imagerie intermédiaire non représenté et réimagé sur le plan image du détecteur, 26. 3029650 L'assemblage du détecteur, 23, détecte l'intensité fluorescente globale dans le volume éclairé, et la transforme en signal numérique. Pour un microscope confocal à balayage, l'assemblage du détecteur est constitué d'un détecteur d'un seul élément, comme un PMT ou SPAD. Pour un microscope confocal à disque rotatif, l'assemblage du détecteur est constitué d'une matrice d'éléments de détection, telle qu'un CCD, un EMCCD, un CMOS ou une matrice de SPAD. L'ensemble des composants montés à partir de la source lumineuse jusqu'au filtre dichroïque est la voie d'éclairage, 201. L'ensemble des composants montés à partir du filtre dichroïque jusqu'à l'assemblage du détecteur est la voie de détection, 202. Le processus optique élémentaire d'un microscope confocal standard peut être segmenté en six étapes: - Projection de la lumière sur le volume d'analyse - émission de lumière fluorescente par les fluorophores - Imagerie des fluorophores sur le plan focal - Limitation dans le plan focal de la lumière analysée par le trou confocal - Intégration de la lumière analysée par un détecteur photoélectrique - Visualisation de l'intensité mesurée sous forme d'une valeur de pixel dans une image Des microscopes à fluorescence sont disponibles auprès de plusieurs fabricants, comme par exemple, Nikon, Zeiss, Leica ou Olympus. Les microscopes à fluorescence peuvent être soit des microscopes standards adaptés à la fluorescence soit des microscopes spécifiques optimisés pour la fluorescence. Les microscopes modernes sont des instruments polyvalents capables de fonctionner dans de nombreuses modalités différentes, y compris, mais sans s'y limiter, les modalités de fluorescence, en utilisant la même plate-forme optomécanique et la plupart des composants. La plupart des microscopes à fluorescence sont développés en tant que plate-forme ouverte, capable d'effectuer plusieurs fonctionnalités additionnelles avec des modifications minimes. D'autres microscopes à fluorescence sont des instruments dédiés, personnalisés à une tâche spécifique, comme le diagnostic médical ou pharmaceutique. Toutefois, Les différentes méthodes de microscopie existantes et les microscopes existants, n'incorporant pas la superrésolution, permettent l'observation microscopique dans la limite de la diffraction optique. Ceci réduit leur champ d'utilisation à un ensemble d'applications limité. Superrésolution De nouvelles méthodes optiques, les méthodes de superrésolution, sont capables d'obtenir des images à une résolution supérieure à la limite de diffraction. Ces méthodes sont développées par plusieurs entreprises, laboratoires et chercheurs et certains des instruments utilisant ces méthodes, les microscopes de superrésolution, sont disponibles commercialement. Une synthèse des techniques de superrésolution a été publiée par l'Académie des Sciences de Suède, à l'occasion de la remise des Prix Nobel de Chimie 2014 [38]. Plusieurs analyses comparatives des méthodes de 3029650 6 superrésolution ont été publiées récemment dans la littérature, comme les articles de Schermelleh et al. [1]. Une bibliographie mise à jour sur la superrésolution se trouve sur le site web de la société Zeiss, et sur le site web de la société Nikon. Les nouvelles techniques de superrésolution permettent elles d'obtenir des informations au-delà de la limite de résolution. Le principal problème de l'ensemble des techniques existantes de superrésolution est que l'enveloppe des performances, exprimée en termes de résolution latérale, de résolution longitudinale, de vitesse, d'intensité lumineuse nécessaire, de photo-toxicité dans l'objet biologique, d'aptitude à mesurer des objets différents, est très limitée. De plus, la plupart des méthodes et instruments existants de superrésolution peuvent fournir soit une bonne résolution latérale, soit une bonne résolution longitudinale, mais rarement les deux. De plus, tous ces instruments sont complexes et nécessitent une haute technicité de l'opérateur. De plus, ces instruments ne peuvent observer généralement qu'une faible partie des spécimens biologiques, en raison de fortes limitations opérationnelles, telles que pour certains d'entre eux une faible profondeur de champ ou de très fortes intensités nocives pour les cellules. Un autre problème avec les méthodes et instruments existants de super résolution, est que la plupart d'entre eux sont en mesure de récupérer, dans le volume illuminé, les attributs d'un fluorophore unique, mais ne parviennent pas à reconnaître simultanément la présence de plusieurs fluorophores et de mesurer leurs attributs. Un problème supplémentaire avec certaines méthodes et instruments existants de superrésolution est que ces méthodes et instruments existants sont présentés aux utilisateurs et perçus par eux comme un outil général, apte à remplacer les microscopes standard ou confocal. Cependant, les méthodes et instruments existants de superrésolution manquent de la simplicité, de la robustesse, de la facilité d'utilisation et des prix compétitifs des microscopes standards ce qui freine leur utilisation comme outils de recherche générale ou comme outils de diagnostic. Un autre problème avec certaines méthodes et instruments existants de superrésolution est que la plupart de ces méthodes et instruments sont construits comme des instruments autonomes conçus pour remplacer les microscopes standards. Une telle approche nécessite le remplacement des instruments existants ainsi que le renouvellement de tous les systèmes périphériques et toutes les connaissances et savoir-faire, liés aux plateformes de microscopie et développées depuis de nombreuses années. Un autre problème avec la plupart des méthodes et instruments existants de microscopie de fluorescence et de superrésolution est que ces méthodes et instruments sont conçus sur un paradigme d'acquisition d'image, pour lequel l'entité de base de l'information est une - ou plusieurs images, ou une - ou plusieurs - régions ROI - Region Of Interest bi ou tridimensionnelles. Les méthodes algorithmiques, systémiques et de superrésolution décrites 3029650 7 ultérieurement dans le contexte de l'invention permettront, par leur inhérente flexibilité, le développement de stratégies nouvelles d'acquisition. Ces procédures d'acquisition, dynamiques et sélectives, seront définies par une gestion optimisée de la séquence d'acquisition et de traitement interactif et différé. Elles permettront une optimisation plus évoluée de l'information utile, définie par des critères basés sur la forme, la géométrie et la dynamique d'un ou plusieurs objets fluorescents, séparément ou l'un par rapport à l'autre. Un autre problème avec la plupart des méthodes et instruments existants de microscopie de fluorescence et de superrésolution est que ces méthodes et instruments sont conçus pour étudier des échantillons sur des lamelles de microscopes. Cependant, le microscope confocal est aujourd'hui utilisé dans de nombreux domaines médicaux comme instrument de diagnostics in-vivo pour des examens internes et externes au corps humain par le biais de fibres optiques utilisées pour illuminer et pour visualiser la fluorescence émise par les tissus à diagnostiquer. La superrésolution ne permet pas actuellement de pratiquer des tels diagnostics in-vivo. Les méthodes algorithmiques, systémiques et de superrésolution décrites ultérieurement dans le contexte de l'invention permettront le développement de nouvelles méthodes de diagnostics in-vivo qui réduiront les besoins de pratiquer des biopsies et raccourciront le temps d'attente du patient. Il y a donc toujours un besoin urgent de fournir des méthodes et instruments de superrésolution et des méthodes algorithmiques capable de mesurer avec une grande précision les attributs d'un fluorophore. Il est en outre nécessaire de fournir des méthodes et des instruments pour détecter et quantifier la présence de plusieurs fluorophores placés dans le même volume illuminé. 3029650 8 RESUME DE L'INVENTION Un premier aspect de l'invention concerne un procédé optique de mesure pour déterminer sur un échantillon comportant une distribution lumineuse, la distribution spatiale, la métrologie ou la structure géométrique de la dite distribution lumineuse dans lequel la distribution lumineuse émet au moins une longueur d'onde et la fluorescence ou la réémission de la dite distribution lumineuse peut être déplétée par l'action d'au moins une distribution lumineuse, dite un faisceau de déplétion, le procédé comportant : la création à l'aide d'une source lumineuse, d'une première distribution lumineuse compacte dit un faisceau de déplétion brut, la transformation du faisceau de déplétion brut, en deux distributions compactes de topologies différentes polarisées orthogonalement, ces deux distributions compactes ayant l'une des propriétés de déplétion créant un fort confinement latéral, l'autre des propriétés de déplétion créant un fort confinement longitudinal. Un deuxième aspect de l'invention concerne un procédé de mesure pour déterminer sur un échantillon comportant une distribution lumineuse fluorescente la distribution spatiale, la métrologie ou la structure géométrique de la dite distribution lumineuse dans lequel la distribution lumineuse émet au moins une longueur d'onde et la fluorescence ou la réémission de la dite distribution lumineuse peut être déplétée par l'action d'au moins une distribution lumineuse, dite un faisceau de déplétion, le procédé comportant : la création à l'aide d'une source lumineuse, d'une première distribution lumineuse compacte, dite un faisceau de déplétion brut, la séparation du faisceau de déplétion brut en deux faisceaux de polarisations orthogonales, la propagation des deux faisceaux à travers un sous-module de polarisation de façon à créer une différence de marche supérieure à la distance de cohérence de la source lumineuse ou de la source réémettrice la transformation de chacun des deux faisceaux, en deux distributions compactes de topologies différentes polarisées orthogonalement, ces deux distributions compactes ayant l'une des propriétés de déplétion créant un fort confinement latéral, l'autre des propriétés de déplétion créant un fort confinement longitudinal, et ces deux distributions étant créées pour chacun des deux faisceaux incidents. Un troisième aspect concerne un procédé optique de mesure pour déterminer sur un échantillon comportant une distribution lumineuse fluorescente ou réémettrice, ou une pluralité de sources fluorescentes ou réémettrices, la distribution spatiale, la métrologie ou la structure géométrique de la dite distribution lumineuse ou source(s) réémettrice(s), émettant à une, ou à une pluralité, de longueur d'onde(s),en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon à une, ou à une pluralité, de longueur d'onde(s), référencées conjointement comme la longueur d'onde d'excitation, et la fluorescence ou la 3029650 9 réémission de la dite distribution lumineuse ou source(s) réémettrice(s) pouvant être déplétée par l'action d'une ou d'une pluralité de distributions lumineuses, référencées conjointement, comme le faisceau de déplétion, le procédé comportant : la création à l'aide d'un ou deux laser(s) ou source lumineuse(s), d'une première distribution lumineuse compacte, le faisceau d'excitation brut, et d'une seconde distribution lumineuse compacte, le faisceau de déplétion brut la transformation conjointe des deux faisceaux par un module optique, le module optique ayant la fonctionnalité de ne pas modifier - ou de modifier légèrement - une onde incidente pour certaines longueurs d'ondes et de transformer une onde incidente compacte, polarisée, en une ou deux distributions compactes de topologies différentes polarisées orthogonalement pour d'autres longueur d'ondes, les ou la distributions compactes de déplétion, ayant soit des propriétés de déplétion créant un fort confinement latéral, soit des propriétés de déplétion créant un fort confinement longitudinal. La distribution lumineuse peut être fluorescente ou réémettrice. La distribution lumineuse peut comporter au moins une source fluorescente ou réémettrice. La source lumineuse peut être un laser. La transformation peut être effectuée par un module optique ayant la fonctionnalité optique de transformer une onde incidente compacte polarisée en deux distributions compactes de topologies différentes polarisées orthogonalement. La première distribution lumineuse compacte peut être crée à l'aide d'au moins une source lumineuse, par exemple un laser. Selon un mode de réalisation les faisceaux de déplétion coïncident et se propagent suivant le même chemin optique. Selon un mode de réalisation dans lequel le ou les faisceaux de déplétion et le ou les faisceaux d'excitation, coïncident et se propagent suivant le même chemin optique. Selon un mode le ou les faisceaux de déplétion et le ou les faisceaux d'excitation, sont issus d'une même fibre optique. Selon un mode le module optique comporte un cristal conique sinusoïdal ou moyen Selon un mode le module optique permet d'avoir le même effet à optique à deux ou plus, longueur d'ondes de déplétion Selon un mode la séparation du faisceau de déplétion brut en deux faisceaux de polarisations orthogonales est contrôlée extérieurement de façon à contrôler les rapports d'intensité entre les deux faisceaux de confinement latéral et longitudinal Selon un mode la polarisation est effectuée par un cristal uniaxe ou biaxe ou une fibre biréfringente. 3029650 Selon un mode le module optique est achromatique Un quatrième aspect de l'invention concerne un analyseur permettant de sélectionner conjointement la distribution compacte ayant des propriétés de déplétion créant un fort confinement latéral de l'un des faisceaux et la distribution compacte ayant des propriétés de déplétion créant un fort confinement longitudinal du second faisceau, les deux distributions compactes ayant la même polarisation. Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif optique de mesure pour déterminer sur un échantillon comportant une distribution lumineuse, la distribution spatiale, la métrologie ou la structure géométrique de la dite distribution lumineuse dans lequel la distribution lumineuse émet au moins une longueur d'onde et la fluorescence ou la réémission de la dite distribution lumineuse ou source(s) réémettrice(s) peut être déplétée par l'action d'au moins une distribution lumineuse, dite un faisceau de déplétion, le dispositif comportant : un module pour créer à l'aide d'une source lumineuse, une première distribution lumineuse compacte dit un faisceau de déplétion brut, un module de transformation pour transformer le faisceau de déplétion brut, en deux distributions compactes de topologies différentes polarisées orthogonalement, ces deux distributions compactes ayant l'une des propriétés de déplétion créant un fort confinement latéral, l'autre des propriétés de déplétion créant un fort confinement longitudinal. Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif optique de mesure pour déterminer sur un échantillon comportant une distribution lumineuse fluorescente la distribution spatiale, la métrologie ou la structure géométrique de la dite distribution lumineuse émettant à une, ou à une pluralité, de longueur d'onde(s), dans lequel la distribution émet au moins une longueur d'onde et la fluorescence ou la réémission de la dite distribution lumineuse peut être déplétée par l'action d'au moins une distribution lumineuse, dite un faisceau de déplétion, le dispositif comportant : un module pour créer à l'aide d'une source lumineuse, d'une première distribution lumineuse compacte, dite un faisceau de déplétion brut, une module de séparation pour séparer le faisceau de déplétion brut en deux faisceaux de polarisations orthogonales, 3029650 11 un module de polarisation de façon à créer une différence de marche supérieure à la distance de cohérence de la source lumineuse ou de la source réémettrice un module de transformation pour transformer chacun des deux faisceaux, en deux distributions compactes de topologies différentes polarisées orthogonalement,ces deux distributions compactes ayant l'une des propriétés de déplétion créant un fort confinement latéral, l'autre des propriétés de déplétion créant un fort confinement longitudinal, et ces deux distributions étant créées pour chacun des deux faisceaux incidents. Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif optique de mesure pour déterminer sur un échantillon comportant une distribution lumineuse fluorescente ou réémettrice, ou une pluralité de sources fluorescentes ou réémettrices, la distribution spatiale, la métrologie ou la structure géométrique de la dite distribution lumineuse ou source(s) réémettrice(s), émettant à une, ou à une pluralité, de longueur d'onde(s), en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon à une, ou à une pluralité, de longueur d'onde(s), référencées conjointement comme la longueur d'onde d'excitation, et la fluorescence ou la réémission de la dite distribution lumineuse ou source(s) réémettrice(s) pouvant être déplétée par l'action d'une ou d'une pluralité de distributions lumineuses, référencées conjointement, comme le faisceau de déplétion, le dispositif comportant : un module pour créer à l'aide d'un ou deux laser(s) ou source lumineuse(s), d'une première distribution lumineuse compacte, le faisceau d'excitation brut, et d'une seconde distribution lumineuse compacte, le faisceau de déplétion brut un module pour effectuer une transformation conjointe des deux faisceaux par un module optique, le module optique ayant la fonctionnalité de ne pas modifier - ou de modifier légèrement une onde incidente pour certaines longueurs d'ondes et de transformer une onde incidente compacte, polarisée, en une ou deux distributions compactes de topologies différentes polarisées orthogonalement pour d'autres longueur d'ondes,les ou la distributions compactes de déplétion, ayant soit des propriétés de déplétion créant un fort confinement latéral, soit des propriétés de déplétion créant un fort confinement longitudinal. Selon un mode de réalisation le module optique est achromatique Selon un mode de réalisation le module de polarisation comporte un cristal uniaxe ou biaxe ou une fibre biréfringente. Un autre aspect de cette invention est la réalisation d'un procédé optique de mesure pour déterminer sur un échantillon comportant une ou une pluralité de nanoémetteurs fluorescents ou réémetteurs, émettant à une, ou à une pluralité, de longueur d'onde(s), la position axiale des dits nanoémetteur(s), 3029650 12 le procédé comportant : la transformation de la fonction de transfert (PSF - « Point Spread Function ») de la lumière émise par chaque nanoémetteur par un module optique ayant la fonctionnalité optique de créer une fonction de transfert (PSF) à forte dépendance axiale la génération, d'au moins une image, à partir de la lumière détectée ; et, soit la détection directe de l'image soit l'analyse algorithmique, simplifiée ou non, de ou des images pour obtenir une information de localisation du ou des nanoémetteurs Selon un mode à la dépendance de la fonction de transfert (PSF) est soit hélicoïdale, soit comportant deux lobes ayant des intensités relatives dépendant fortement de la position axiale, Selon un mode le module optique comporte un cristal conique linéaire, sinusoïdal ou moyen, un cristal uniaxe ou un ensemble de cristaux coniques et/ou uniaxes Un autre aspect de cette invention est la réalisation d'un dispositif optique de mesure pour déterminer sur un échantillon comportant une ou une pluralité de nanoémetteurs fluorescents ou réémetteurs, émettant à une, ou à une pluralité, de longueur d'onde(s), la position axiale des dits nanoémetteur(s), le dispositif comportant : un module optique transformant la fonction de transfert (PSF) de la lumière émise par chaque nanoémetteur en une fonction de transfert (PSF) à forte dépendance axiale un module de détection pour générer au moins une image, à partir de la lumière détectée ; et, soit la détection directe de l'image, soit un module algorithmique capable d'analyser le ou les images pour obtenir une information de localisation du ou des nanoémetteurs BREVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention va maintenant être décrite en relation avec certains modes de réalisation en référence aux figures illustratives suivantes de sorte qu'elle puisse être mieux comprise. Avec une référence spécifique aux figures, il est souligné que les indications figurantes sont présentées à titre d'exemple, et à des fins d'illustration de la discussion des modes de réalisation de l'invention et ne sont présentés que dans le but de fournir ce qui puisse être considéré la description la plus utile et facile à comprendre des principes et des aspects conceptuels de l'invention. À cet égard, aucune tentative n'est faite pour montrer des détails de structure de l'invention plus en détail que ce qui est nécessaire pour une compréhension fondamentale de l'invention, la description prise avec les dessins faisant apparaître à l'homme de l'art comment les différentes formes de l'invention peuvent être réalisées dans la pratique. Dans les dessins: Fig. 1 est une représentation simplifiée d'un microscope à fluorescence confocal de l'art antérieur, utilisé aussi comme support de l'invention; 3029650 13 Fig. 2 est une représentation picturale simplifiée d'un système de superrésolution en microscopie de fluorescence, conformément à un mode de réalisation de la présente invention; Fig. 3 est une illustration schématique simplifiée d'un module de diffraction conique, conformément à un mode de réalisation de la présente invention; Fig. 4a à 4d sont des représentations picturales simplifiées des paradigmes de mesure et de confinement volumique selon des modes de réalisation de l'invention et de la microscopie confocale; Fig. 5 est une représentation picturale simplifiée d'un mode de réalisation particulier de la plateforme de microscopie SRCDP ; Fig. 6a est une illustration schématique simplifiée d'un module latéral de superrésolution, conformément à un mode de réalisation de la présente invention; Fig. 6b est une illustration schématique simplifiée d'une autre réalisation d'un module latéral de superrésolution, conformément à un mode de réalisation de la présente invention; Fig. 7a à 7c présente des tables de distributions lumineuses d'un module de diffraction conique en fonction de la polarisation des polariseurs d'entrée et de sortie pour plusieurs valeurs du paramètre de diffraction conique, po. Ces distributions lumineuses ont été calculées par simulation des équations développées par Berry, [2] ; la Figure 7d complète ces tables de distribution en présentant la variation des distributions dites demi-lunes décalées en fonction de la position axiale (axe z). Fig.8 est une illustration schématique simplifiée d'un des modes de réalisation du dark tracking ; Fig. 9 est une illustration schématique simplifiée d'une méthode d'algorithme de superrésolution de données de fluorophores, conformément à un mode de réalisation de la présente invention. Fig. 10 est une illustration schématique simplifiée du calcul des descripteurs ; Fig. 11 est une illustration schématique simplifiée du module de contrôle de la plateforme SRCDP. Dans toutes les figures, des chiffres de référence similaires identifient des pièces similaires. 3029650 14 Définitions et compléments techniques Les définitions usuelles sont utilisées dans la description pour: phase et polarisation, polarimétrie, vecteurs et matrices de Jones, paramètres de Stokes et techniques de mesure des paramètres de Jones et de Stokes. Nous utiliserons alternativement les termes longitudinal et axial pour décrire la dépendance de la lumière le long de l'axe de propagation, auquel nous nous referons comme l'axe z ou axe longitudinal. Nous utiliserons le terme latéral pour décrire la dépendance de la lumière dans les axes orthogonaux à l'axe optique du système, auquel nous nous referons comme les axes x et y. Les définitions usuelles sont utilisées dans la description pour le mode TEMoo d'une fibre et les termes anglais, « Photonic Crystal Fiber » - PCF -,« few modes fiber » - FMF , vortex Fiber et « dual core Photonic Crystal Fiber ». Nous nous référerons à un dispositif permettant de coupler plusieurs lasers à différentes longueurs d'onde ou à une même longueur d'onde, avec la même polarisation ou avec différentes polarisations, dans une ou plusieurs fibres optiques, en utilisant le terme de banc laser. La définition des superoscillations est celle de Yakir Aaronov et de Sir Michael Berry. Une superoscillation est un phénomène dans lequel un signal qui est globalement limité en bande peut contenir des segments locaux qui oscillent plus rapidement que ses composantes de Fourier les plus rapides. [26] Le centre ou centroïde d'une distribution de lumière est le centre de gravité de l'intensité. Le diamètre d'une distribution de lumière est le diamètre du premier zéro d'intensité, pour des ondes régulières et singulières, sans prendre en compte le zéro central de l'onde singulière. Deux distributions de lumière sont collocalisées si leurs centres coïncident ou sont séparés par une valeur spatiale faible par rapport à la dimension de la distribution de lumière. Dans cette demande de brevet, nous utiliserons la longueur d'onde d'émission, comme métrique de base du système. Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour les composants optiques suivants : lentille dont la définition est élargie, pour inclure l'ensemble des moyens optiques qui transmettent, réfractent ou réfléchissent la lumière, optique auxiliaire - sous-module optique visant à interfacer et à ajuster soit les paramètres géométriques soit les paramètres de phase et/ou de polarisation entre deux autres sous-modules ou modules optiques -, polariseur, analyseur, lame de retard, séparateur de faisceau « beamsplitter » en anglais, polarisant et non-polarisant, combineur de faisceau beam combiner en anglais, polarisant et non-polarisant. Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour les polariseurs azimutal et radial. Nous étendrons, implicitement ou explicitement, certains développements décrits ultérieurement pour les polariseurs azimutal et radial, à l'ensemble des éléments polarisants variables dans l'espace. 3029650 Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles, [3] et [38], sont utilisées pour les différentes techniques de superrésolution; ces techniques peuvent être regroupées en familles: - REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions(RESOLFT), regroupant les techniques : Stimulated Emission Depletion microscopy (STED), Ground state depletion (GSD), Saturated Structured Illumination Microscopy (SSIM) et SPEM (Saturated Pattern Excitation Microscopy), Localisation Microscopy, (microscopie de localisation, en anglais) regroupant les techniques Photoactivated localization microscopy (PALM), FPALM (3D Localization in Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy), Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), dSTORM (direct STORM), SPDM (Spectral Precision Distance Microscopy), « stochastic blinking », Ground state depletion (GSD), et techniques similaires (quel que soit l'acronyme utilisé) - Structured Image Microscopy (SIM) - FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), - TIRF (Total Internai Reflection Fluorescence Microscopy). Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour différentes techniques de Microscopie, de résolution standard ou de superrésolution, fluorescentes ou non, telles que les termes anglais« Computational Microscopy », « Correlative Microscopy », « Crossplatform-microscopy », FCS - Fluorescence Correlation Spectroscopy », FCCS -« Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy », ou PCH - Photon Counting Histogram, RICS « Raster Imaging Correlation Spectroscopy » ou FRAP - « Fluorescence Recovery after Photobleaching) analysis ». Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour la transformée de Hough, pour les algorithmes MAP - « Maximum A Posteriori estimation », LSE « Least Squares Estimation », ICE « Iterated Conditional Expectation ». Nous nous referons à l'algorithme E-LSE, « emitter-Least Square Error » un algorithme nouveau décrit dans cette demande de brevet. Nous nous référons à un polariseur partiel pour décrire un élément ou un module dont l'absorption est différente pour les deux polarisations linéaires - dichroïsme linéaire - ou pour les deux polarisations circulaires - dichroïsme circulaire. Nous nous référons à des éléments dynamiques de polarisation ou de phase, pour décrire les moyens optiques dont les propriétés de polarisation ou de phase varient en fonction du temps de façon contrôlée, de façon discrète ou continue. Ces éléments dynamiques de polarisation ou de phase comprennent, mais ne sont pas limités à: lames d'onde tournante sur leur axe, valves de lumière basées sur des technologies à cristaux liquides, dispositifs électro-optiques, connus aussi comme cellules de Pockels, cellules de Kerr, dispositifs électro-optiques résonnants, dispositifs magnéto-optiques, connus également en tant 3029650 16 que cellules de Faraday, dispositifs acousto- ou élasto- optiques ou toute combinaison de ces moyens. Nous nous référons à des éléments dispersifs de polarisation ou de phase pour décrire des éléments dont l'état de polarisation dépend de la longueur d'onde. Le plus simple des sous-modules dispersifs de polarisation est la lame d'onde multimode ou épaisse, Nous nous referons a l' « algorithme du centroïde » pour décrire la procédure usuelle de mesure du centroïde et éventuellement de la largeur (FWHM - acronyme en anglais pour « Full width Half Maximum ») d'une distribution lumineuse. Dans ce document, les définitions usuelles sont utilisées pour les composants optoélectroniques suivants : détecteur photoélectrique, CCD, EMCCD, CMOS, SPAD Single Photon Avalanche Diode et matrice de SPAD. Nous utiliserons les termes: o image optique, pour la distribution spatiale d'intensité lumineuse, o image électronique, pour décrire la distribution spatiale de charges pour un CCD, de courant pour un CMOS ou d'évènements pour un SPAD, créées par l'image optique, à un instant donné, dans un plan de détection, o image numérique, pour décrire une matrice de nombres créée par la numérisation de l'image électronique. Pour simplifier la lecture et la compréhension du texte nous utiliserons aussi le terme d'image pour la sortie d'un détecteur à pixel unique tel qu'un PMT ou SPAD, en la considérant comme une image consistant en un unique pixel. Lorsqu'aucune ambiguïté n'existe, ou que la distinction entre les trois types d'images n'est pas nécessaire, nous utiliserons le terme simplifié générique d'image. Pour les images, nous utilisons la terminologie utilisée pour les détecteurs matriciels, tels que les CCD, les EMCCD et les CMOS. Pour les SPAD et les matrices de SPAD, le résultat d'une mesure est une liste ordonnée dans le temps, d'impacts de photons détaillant, pour chaque photon, le temps d'impact et la position de l'impact. Pour simplifier la présentation de ce document, nous inclurons ce cas dans notre définition des images. Les images détaillées dans ce document, dans de nombreux cas, peuvent être qualifiées des microimages, des images de taille sensiblement égale à un petit nombre de diamètres du disque d'Airy, typiquement inférieur à 5 diamètres, et/ou à faible nombre de pixels, typiquement 4*4 à 32*32. Dans une image numérique Aj, les indices m et n représentent les indices des pixels ; l'origine des pixels sera choisie comme la projection du centre du volume d'analyse défini dans un paragraphe ultérieur. 3029650 17 Polarimétrie et vecteurs de Stokes La polarimétrie se réfère à la mesure de l'état de polarisation de la lumière incidente. L'état de polarisation de la lumière incidente peut être décrit par les paramètres de Stokes, un ensemble de valeurs, introduit par George Gabriel Stokes en 1852, et utilisé en Optique. Copropagation de deux faisceaux optiques De nombreux systèmes et dispositifs optiques utilisent deux faisceaux - ou plus - ayant des propriétés différentes. Les faisceaux peuvent interagir entre eux ou non, être projetés séquentiellement ou simultanément. Dans la majorité de ces systèmes et dispositifs, les deux chemins optiques sont séparés physiquement l'un de l'autre. Cette séparation physique créée, au niveau de l'ingénierie du système un ensemble de contraintes, qui bien que résolvables, alourdissent de façon importante la complexité du système et son coût. Nous nous référons à des systèmes à chemin commun « common path » en anglais, pour référencer un ensemble de dispositifs dans lesquels les deux faisceaux différenciés se propagent suivant le même chemin physique, à des variations mineures près. Dans cette invention, nous référencerons, par extension, des systèmes à quasi chemin commun, pour référencer un ensemble de dispositifs dans lesquels les deux faisceaux différenciés se propagent suivant le même chemin physique, mais se séparent et se recombinent dans un module optique, le chemin optique dans l'élément optique étant négligeable par rapport au chemin optique total. Cette définition permet d'introduire le cas d'un module optique, contenant un séparateur de polarisation suivi à une distance très faible par un élément combinant les deux polarisations, ou tout élément similaire. L'introduction d'un tel module ne modifie pas de façon significative la fonctionnalité et les avantages d'un système à chemin commun. Dans la suite de cette invention, pour simplifier la lecture, lorsque nous nous référerons à un système à chemin commun, nous inclurons le cas d'un système à quasi chemin commun. Champ électrique en coordonnées polaires et modes angulaires E(p, 0) = A(p ,0) Dexp [i yo(p,O)]u(p,O) (EQ. 1) Il est usuel en Optique de décomposer les composantes du champ, soit son amplitude, sa phase et sa polarisation, en modes orthogonaux, cartésiens ou polaires. De nombreuses décompositions en modes orthogonaux polaires, tels que les modes Gaussiens, Hermite-Gaussiens, et Laguerre-Gaussiens sont connus de l'Homme de l'Art. Nous utiliserons principalement dans ce document, la décomposition de l'amplitude du champ électrique en modes Hypergéométriques-Gaussiens HyGG de forme : A(p ,0) oc exp (--p2 + ie 0) (EQ. 2) Dans cette décomposition, p est le mode radial et f l'ordre azimutal. 3029650 18 Ondes singulières Une onde singulière comprend une intensité nulle en son centre et une variation de phase azimutale d'un multiple de 2n. Ce thème de recherche en Optique, initié par l'article majeur de J.F Nye et M. Berry, en 1974, [4], est maintenant connu comme l'« optique singulière ». Des exemples d'ondes régulières et singulières sont présentés dans la suite. Nous utilisons le terme anglais beam shaping pour décrire la transformation d'une onde de forme et de topologie donnée en une onde d'une autre forme ou topologie, et en particulier la transformation d'une onde régulière en singulière et vice versa. Topologie et distributions lumineuses compactes Une distribution lumineuse, ponctuelle, sera réputée compacte si elle remplit une des conditions de compacité définies ci-dessous, par deux conditions alternatives et non exclusives : - soit, plus de 75% de l'énergie est contenue dans un cercle de rayon inférieur à 1.75 fois le rayon d'Airy, - soit un domaine lumineux, contenant plus de 65% de l'énergie est délimité par une ligne d'intensité nulle comprise dans un cercle de rayon inférieur à deux fois le rayon d'Airy, Nous distinguons différentes familles de distributions lumineuses ponctuelles, de topologies différentes : Les distributions régulières, dans leur définition usuelle en Optique, Les distributions ou ondes singulières, dénommées aussi vortices optiques, de charge topologique (ordre azimutal) f, dans lesquelles la phase varie de 0 à 27( t,autour de la direction de propagation, E étant un entier. Les distributions d'amplitude à variation azimutale d'ordre f, dénommées aussi distribution de Laguerre-Gauss, Les distributions de polarisation et optionnellement de phase à variation azimutale d'ordre (dénommées aussi modes de Laguerre-Gausspolarisés radialement. Deux distributions lumineuses compactes, seront réputées de familles topologiques différentes si elles remplissent au moins une, et n'importe laquelle, des conditions suivantes : L'une est régulière et l'autre est singulière, L'une est ponctuelle et l'autre est annulaire, Les ordres azimutaux de l'amplitude des deux distributions lumineuses différent, Les ordres azimutaux de la polarisation ou de la phase des deux distributions lumineuses différent. Alternativement, deux distributions lumineuses projetées sur un volume donné seront réputées de topologies différentes si dans une partie conséquente de la surface illuminée conjointement, les gradients sont de direction inversées. 3029650 19 Nanoémetteurs lumineux Un nanoémetteur lumineux est un petit émetteur secondaire, attaché à un objet; il est de taille sensiblement inférieure à une fraction de longueur d'onde, typiquement mais non limité à une taille inférieure à un cinquième de la longueur d'onde ; un nanoémetteur lumineux absorbe l'énergie incidente et réémet de la lumière à la même longueur d'onde que la lumière incidente ou à des longueurs d'onde différentes ; la lumière émise par le nanoémetteur peut être cohérente, partiellement cohérente ou incohérente avec la lumière absorbée. Les principaux exemples de nanoémetteurs lumineux sont les fluorophores et les nanoparticules, mais ils incluent aussi un grand nombre d'autres éléments. La définition, dans le contexte de l'invention, des nanoémetteurs lumineux est, déterminée par les deux conditions suivantes: création d'un émetteur lumineux secondaire ponctuel, et positionnement prédéterminé de cet émetteur relativement à une entité artificielle, biologique ou organique. Les mécanismes physiques qui peuvent créer un nanoémetteur sont nombreux ; ils incluent mais ne sont pas limités à l'absorption, la diffusion ou la réflexion, la fluorescence, «émission-déplétion», [5], par exemple en utilisant les techniques RESOLFT, les phénomènes de photo activation et de photo déplétion, la fluorescence à deux ou plusieurs photons, la diffusion élastique ou non, la diffusion Raman, ou à d'autres mécanismes physiques connues de l'Homme de l'Art. Nous utiliserons le terme émission de lumière pour décrire l'émission d'ondes électromagnétiques par le nanoémetteur lumineux, que la lumière soit cohérente, incohérente ou partiellement cohérente. Nous étendrons notre définition des nanoémetteurs, en y incluant les particules diffusantes, absorbantes et réfléchissantes, attachées à une entité biologique ou organique ; l'action d'une particule diffusante, réfléchissante ou absorbante sur le champ électromagnétique peut en effet être décrite comme la création avec une phase inverse, suivant le principe de Babinet, pour une particule absorbante d'un champ secondaire auxiliaire, émergeant de la particule, superposé au champ électromagnétique incident. Nous nous référerons dans cette demande de brevet aux descripteurs d'un nanoémetteur pour dénoter l'ensemble d'information décrivant un nanoémetteur en tant que source ponctuelle, à un instant déterminé. Etant donné que le nanoémetteur est considéré comme une source ponctuelle, l'ensemble de l'information le représentant contient un nombre limité de paramètres, soit : sa position dans l'espace, son intensité, les caractéristiques spectrales, d'intensité, de cohérence, de phase et de polarisation de la lumière émise par le fluorophore, en fonction de la lumière incidente. 3029650 Nous nous référerons dans cette demande de brevet aux descripteurs d'un objet structuré. Par exemple, pour une ligne uniforme, l'ensemble de l'information le représentant contient un nombre limité de paramètres, soit : son orientation dans l'espace, son intensité, les caractéristiques spectrales, d'intensité, de cohérence, de phase et de polarisation de la lumière émise par le l'objet, en fonction de la lumière incidente. Pour une distribution continue, l'objet est représenté, comme habituel en traitement d'image, par une matrice d'intensités. Toutefois, dans la majorité des cas, et dans la description de l'invention, nous nous référons, sous la désignation de descripteurs, à un sous-ensemble des descripteurs d'un nanoémetteur ou d'un objet géométrique simple, comprenant sa position géométrique, son intensité, et le type du fluorophore, lorsque plusieurs populations de nanoémetteurs lumineux, différenciées par exemple par leur spectre d'émission, sont présentes dans un même échantillon. Cette simplification utilisée dans la description n'altère pas le domaine de l'invention qui inclura dans son champ d'application l'intégralité des descripteurs des nanoémetteurs lumineux. Pour simplifier la compréhension du contexte de l'invention, la suite de la description référence seulement le cas le plus simple, celui dans lequel le nanoémetteur est un fluorophore et l'interaction physique est la fluorescence à un photon. Pourtant, cette description doit être comprise comme une illustration simplifiée d'une description générale des méthodes et concepts applicables à l'ensemble des nanoémetteurs lumineux cités préalablement ou connus de l'Homme de l'Art, quel que soit le phénomène physique sous-jacent. Il est marquant que le nanoémetteur échantillonne le champ ou l'intensité incidente à une position tridimensionnelle précise, sans influence de l'ensemble de la distribution spatiale de l'intensité incidente. Nous référencerons cette propriété remarquable dans cette demande de brevet comme la capacité d'échantillonnage du nanoémetteur lumineux. Toutefois, le mode de réalisation de l'invention décrit permet aussi de mesurer des objets structurés et des distributions continues ne possédant pas la capacité d'échantillonnage du nanoémetteur lumineux. On se réfère de nouveau à la Figure. 1 ; qui représente un ensemble de nanoémetteurs ou d'objets structurés, positionnés sur un objet biologique donné, 15 et 16 d'une part et 17 et 18 d'autre part. Alternativement, la lumière émise peut consister en une distribution continue, non représentée sur la Figure 1, ou en toute combinaison de nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distribution continues. L'ensemble de nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distribution continues est référencé comme un ensemble «d'objets biologiques lumineux»; ils représentent une carte de l'objet biologique, dans le sens défini par Alfred Korzybski en sémantique générale. Il est toutefois de pratique courante pour simplifier la description, de référencer l'objet biologique lumineux comme l'objet biologique lui-même, lorsqu'aucune ambiguïté ne peut apparaître. L'objet biologique lumineux contient de nombreuses informations pertinentes liées à l'objet 3029650 21 biologique, principalement l'information spatiotemporelle, la position de l'objet et son orientation en fonction du temps, et l'information morphologique, par exemple dans le cas de la scission d'une cellule en deux. Le système de mesure selon au moins un mode de réalisation de l'invention permettra de calculer la carte mesurée, et effectuer une évaluation des descripteurs de toute combinaison de nanoémetteurs, d'objets structurés ou une évaluation de la distribution spatiale de distributions continues. Cette carte mesurée diffère de la carte originale, en raison du bruit, des conditions de mesure, des limites du système ou de l'incertitude de mesure. Cette information de la carte mesurée peut être élaborée ultérieurement en différents niveaux d'abstraction. Ce premier niveau d'abstraction, qui décrit les résultats directs de la mesure, ne contient, à priori, aucune information biologique mais les résultats d'une mesure physique décrite par des nanoémetteurs, par des objets structurés ou par des distributions continues, qui pourrait d'ailleurs représenter n'importe quelle entité marquée. Le second niveau, le niveau d'abstraction géométrique structure les nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distributions continues sous forme d'objets géométriques. Il consiste en une description d'objets lumineux et de leurs caractéristiques dynamiques, telles que leur position ou orientation, ou leur morphologie. A ce niveau, l'information est encore une information physique et géométrique décrivant un ensemble d'objets. L'information géométrique utilise la carte mesurée et une information auxiliaire, potentiellement extérieure au système, sur la relation entre les points lumineux et des objets. Le niveau d'abstraction biologique permet une certaine appréhension de la réalité biologique grâce à une relation constitutive entre les objets mesurés et des entités biologiques correspondantes. Il contient un ensemble d'informations sur l'objet biologique, principalement la position et sa dynamique, sa forme et sa morphologie. L'information biologique utilise la carte mesurée et l'information géométrique, et une information auxiliaire, potentiellement extérieure au système, sur la relation des points lumineux et des objets aux entités biologiques. Un certain nombre de conclusions sur la fonctionnalité biologique de l'échantillon peuvent être obtenues à ce niveau. Le niveau d'abstraction fonctionnel permet une appréhension de la réalité biologique. Il consiste en une information fonctionnelle, décorrélée des informations géométriques, et répondant à des interrogations en termes et jargon biologique, tel que : « le virus a-t-il pénétré la cellule ? ». Un niveau additionnel d'information peut être défini incluant le processus de contrôle et d'instrumentation ; en effet, un processus de contrôle et d'instrumentation plus évolué peut être défini, permettant de remonter à une information biologique plus structurée, à travers une automatisation du processus d'acquisition de données. Un exemple de tels processus est décrit par Steven Finkbeiner, sous la dénomination de « Robotic Microscopy systems ». 3029650 22 Cette description des niveaux d'abstraction, définis dans cette demande, a été rédigée, pour simplicité, pour la Biologie. Elle est applicable, mutatis mutandis, à tous les domaines de la Vision, biologique et médicale, artificielle et industrielle. Diffraction conique La diffraction ou réfraction conique, est un phénomène optique prédit par Hamilton, [6], en 1832, et confirmé expérimentalement deux mois après par Lloyd, [7]. La diffraction conique décrit la propagation d'un faisceau de lumière dans la direction de l'axe optique d'un cristal biaxe. En effet, dans un cristal biaxe, l'axe optique est positionne dans le plan créé par le axes cristallographiques x et z; l'angle par rapport à l'axe z est 00, dépendant des trois indices de in-2 - n2-2 réfraction suivant la loi, tan 00 = Hamilton a prédit que la lumière émerge sous la forme d'un cône creux de rayons. La réfraction conique est une étape importante de l'histoire des sciences et a joué un rôle dans la démonstration de la théorie des ondes électromagnétiques. Un regain d'intérêt pour la diffraction conique eu lieu dans les dernières années du XXe siècle; elle a abouti à une théorie complète par Berry et al.[2], validée expérimentalement en 2009, [8]. Nous suivons ici la théorie, la terminologie et les définitions de Berry, y compris le changement de dénomination de l'effet physique, à partir de ce point, utilisant le terme plus rigoureux de diffraction conique. Toutefois, il est important de noter, que le terme « diffraction conique » est aussi utilisé pour deux autres techniques n'ayant aucune relation avec la technique que nous décrivons : - la diffraction en incidence oblique est aussi appelée diffraction conique - Le terme anglais, « conical diffraction mounting » référence un montage de réseau de diffraction dans lequel le réseau est monté sur une surface courbe. La diffraction conique a suscité un intérêt considérable au niveau théorique et expérimental, mais, « aucune application pratique semble avoir été trouvée », [9]. Historiquement, la diffraction conique a été observée dans les cristaux biaxes. Nous nous référons à un cristal conique pour décrire un cristal biaxe inorganique ou organique, présentant le phénomène de diffraction conique. Quelques exemples non limitatifs de cristaux biaxes comprennent, l'Aragonite, KTP, KTA, KBiW, LBO, KNbO3, MDT, YCOB, BIBO, DAST, POM, NPP, LAP, LiInS2 et LiInSe2. D'autres effets existent, créant soit une diffraction conique intrinsèquement plus faible soit en créant une diffraction conique plus faible le long d'un trajet optique plus court. Toutefois, ces effets peuvent être utilisés dans le cadre des dispositifs décrits. Ces effets comprennent les polymères, les cristaux liquides et les effets de biréfringence induite par voie externe. Les polymères comprennent mais ne sont pas limités à: les feuilles de polymère étirées et à la ',,-2 -2 n2 - 3029650 23 polymérisation en cascade, [10]; les cristaux liquides comprennent mais ne sont pas limités à: la phase nématique biaxe thermotrope, [11]; les effets externes de biréfringence induite comprennent, mais ne sont pas limités à: l'application d'un champ électrique créant un effet électro-optique, sur un cristal cubique non-centrosymétrique, et le modulateur photo-élastique. La phase dans le vortex créé par diffraction conique est une phase géométrique et est donc intrinsèquement achromatique. Les effets chromatiques additionnels sont la dispersion de l'axe optique et la dépendance des différents paramètres présents dans les équations de la diffraction conique en fonction de la longueur d'onde. La dispersion chromatique de l'axe optique crée un angle de l'axe optique du cristal, dépendant de la longueur d'onde, par rapport à l'axe optique du système. Elle est due, dans la majorité des cas, à la dispersion des indices de réfraction. Les indices de réfraction dépendent de la longueur d'onde, suivant les équations de Sellmeier. L'angle de l'axe optique varie donc en fonction de longueur d'onde, il crée un angle d'inclinaison chromatique de l'axe optique dans le plan créé par le axes x et z cristallographiques. Il dépend fortement du type de cristal. Dans un cristal de MDT, le cristal le moins dispersif dans le visible, la direction de l'axe optique varie de moins de 0,1 degrés entre 540 nm et 700 nm. Dans un cristal de KTP, le cristal plus achromatique dans l'IR de télécommunication, l'angle varie de 0,05 degrés, entre 1,350 nm et 2,100 nm, et moins de 0,02 degrés sur la fenêtre de télécommunication - 1450 nm à 1650 nm. D'autre part, l'angle 00 peut varier fortement en fonction de la longueur d'onde dans certains cristaux organiques comme le DAST. La compensation de la dispersion chromatique de l'axe optique peut être effectuée en utilisant l'optique géométrique. La dispersion chromatique de la direction de l'axe optique peut être compensée en utilisant la dispersion naturelle de verre ou d'autres matériaux optiques, ou en utilisant des réseaux ou de prismes. La procédure d'achromatisation ne diffère pas, dans ce cas, de la procédure standard de correction de toute aberration chromatique en optique géométrique, Cette procédure peut être conçue et optimisée en utilisant l'un des logiciels optiques commerciaux disponibles en définissant des fonctions cibles adéquates. Un concept différent d'achromatisation, est basé sur l'utilisation de deux matériaux différents, ayant des effets de diffraction coniques inverses, à haute et basse dispersions chromatiques. La dépendance des différents paramètres présents dans les équations de la diffraction conique en fonction de la longueur d'onde, modifie les paramètres d'efficacité des effets de diffraction conique. Pour des cristaux coniques linéaires, définis ultérieurement, la fonction de transfert fondamentale est identique à l'unité et ainsi trivialement indépendante de longueur d'onde. Par contre, la fonction de transfert du vortex dépend de la longueur d'onde et peut être représentée par un facteur chromatique égal à r (X). 3029650 24 Pour des cristaux coniques sinusoïdaux, définis ultérieurement, le comportement est différent de celui de cristaux linéaires coniques: l'onde fondamentale dépend de la longueur d'onde et l'onde vortex est presque indépendante de celle-ci. Effet, les simulations montrent que la forme de l'onde vortex n'est que légèrement modifiée par une variation du paramètre, 00 de 0,5 à 0,75. Par contre, la forme de l'onde fondamentale dépend de longueur d'onde et cet effet doit être pris en compte dans la conception de systèmes utilisant les deux ondes, fondamentale et vortex. On se réfère maintenant à la figure 3, qui est une illustration schématique simplifiée d'une configuration d'un module de diffraction conique, 300, conformément à un mode de réalisation de la présente invention. La lumière incidente, 30, est supposée être collimatée, même si d'autres conditions peuvent être adaptées en utilisant des moyens optiques simples. Le setup lui-même comprend une première lentille, 31, un cristal conique, 32 et une lentille optionnelle 33. Les deux premières lentilles, 31 et 33, sont configurées de préférence sous forme d'un télescope Kepler 1:1. L'ouverture numérique de la première lentille, 31, dans l'espace image, représentée ci-dessous par Uo, détermine les paramètres de l'effet conique à travers le rayon conique, défini ci-dessous. Un plan d'imagerie conique, 35, est placé au plan focal de la première lentille 31; un polariseur, ou un polariseur partiel, 29, décrit ci-dessus, peut également être ajouté. Toutefois, dans certains systèmes optiques ou la lumière incidente est déjà polarisée, cet élément n'est pas nécessaire. Une lentille de focalisation, 36, détermine la taille finale de la tache lumineuse. Elle peut être un objectif de microscope externe, ou peut être fusionnée avec la seconde lentille 33, telle qu'implémentée dans un autre mode de réalisation de cette invention. La répartition de la lumière projetée sur l'échantillon est, en première approximation, en négligeant les effets vectoriels, une image réduite de la distribution de la lumière dans le plan image. L'influence des effets vectoriels sera discutée ci-dessous. Le rapport d'échelle ou le grossissement est déterminé par l'objectif de microscope. Soit la variable spatiale, R, au plan d'imagerie conique, et le vecteur d'onde, U, représentées en coordonnées cylindriques par R, OR et U, Ou. Soit X, la longueur d'onde de la lumière. Le comportement du champ électrique émergeant du cristal conique 32 est entièrement caractérisé par un seul paramètre, le rayon conique, RO; le rayon conique dépend du matériau et l'épaisseur du cristal. Nous introduisons des paramètres normalisés permettant à la description ci-dessous de la répartition de la lumière, d'être valide à la fois au plan d'imagerie conique et au foyer de l'objectif du microscope, dans les limites de la théorie scalaire de diffraction. Un exemple d'introduction des paramètres normalisés est décrit dans la référence [2] La position radiale normalisée, p, le vecteur d'onde normalisée, u, représentés en coordonnées cylindriques par p, OR et u, Ou, et le rayon normalisé conique, po, sont donnés par: 3029650 R U Ro p = z-UO, u -; po= 2-U0. U (EQ. 3) R U R p = 2 - U0, u -; pu= 2-U0. Uo (EQ. 4) Uo étant l'ouverture numérique du système. Pour po 1, à un cristal conique mince sinusoïdal et pour 1 REVENDICATIONS1. Un procédé optique pour déterminer sur un échantillon comportant une distribution lumineuse, la distribution spatiale, la métrologie ou la structure géométrique de la dite distribution lumineuse, émettant à au moins une longueur d'onde, en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon à au moins une longueur d'onde, dite la longueur d'onde d'excitation, et la fluorescence ou la réémission de la dite distribution lumineuse ou source(s) réémettrice(s) pouvant être déplétée par l'action d'au moins une distribution lumineuse, dite un faisceau de déplétion, le procédé comportant la création d'une première distribution lumineuse compacte, le faisceau d'excitation brut, et d'une seconde distribution lumineuse compacte, le faisceau de déplétion brut la transformation conjointe des deux faisceaux de façon de ne pas modifier ou de modifier légèrement - une onde incidente pour certaines longueurs d'ondes et de transformer une onde incidente compacte, polarisée, en une ou deux distributions compactes de topologies différentes polarisées orthogonalement pour d'autres longueur d'ondes, les ou la distributions compactes de déplétion, ayant soit des propriétés de déplétion créant un fort confinement latéral, soit des propriétés de déplétion créant un fort confinement longitudinal. Revendication 2. . Un procédé selon la revendication 1 dans lequel les faisceaux de déplétion coïncident et se propagent suivant le même chemin optique. Revendication 3. Un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le ou les faisceaux de déplétion et le ou les faisceaux d'excitation, coïncident et se propagent suivant le même chemin optique. Revendication 4. Un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le ou les faisceaux de déplétion et le ou les faisceaux d'excitation, sont issus d'une même fibre optique. Revendication 5. Un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le ou les faisceaux de déplétion et le ou les faisceaux d'excitation sont créés par un module optique comportant un cristal conique sinusoïdal ou moyen Revendication 6. Un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le ou les faisceaux de déplétion et le ou les faisceaux d'excitation sont créés par un module optique comportant un cristal conique sinusoïdal et le module optique permet d'avoir le même effet à deux ou plus, longueur d'ondes de déplétion Revendication 7. Un dispositif optique de mesure pour déterminer sur un échantillon comportant une distribution lumineuse, la distribution spatiale, la métrologie ou la structure géométrique de la dite distribution lumineuse, émettant à au moins une longueur d'onde, en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon à au moins une longueur d'onde, dite la longueur d'onde d'excitation, et la fluorescence ou la réémission de la dite distribution lumineuse) pouvant être déplétée par l'action d'au moins une distribution lumineuse, dite un faisceau de déplétion, 69 3029650 le dispositif comportant: un module pour créer à l'aide d'un ou deux laser(s) ou source lumineuse(s), d'une première distribution lumineuse compacte, le faisceau d'excitation brut, et d'une seconde distribution lumineuse compacte, le faisceau de déplétion brut un module pour effectuer une transformation conjointe des deux faisceaux par un module optique, le module optique ayant la fonctionnalité de ne pas modifier - ou de modifier légèrement - une onde incidente pour certaines longueurs d'ondes et de transformer une onde incidente compacte, polarisée, en une ou deux distributions compactes de topologies différentes polarisées orthogonalement pour d'autres longueur d'ondes, les ou la distributions compactes de déplétion, ayant soit des propriétés de déplétion créant un fort confinement latéral, soit des propriétés de déplétion créant un fort confinement longitudinal.