Brevet FR3033047A1 — publié le 20160826

La présente invention concerne un dispositif de collection innovant permettant l'analyse rapide directe et indirecte d'acides nucléiques à partir de matériels biologiques prélevés notamment dans le cadre d'investigations de police technique et scientifique aux fins d'analyses génétiques ou d'identification par empreintes génétiques, ou encore dans le cadre d'analyses médicales. A ce jour, les dispositifs de collection (appelés communément kits de prélèvement) de traces biologiques employés sur les scènes d'infractions sont constituées d'écouvillons standardisés. L'emploi de ces écouvillons nécessite une étape d'extraction ADN au laboratoire qui est non seulement chronophage mais qui nécessite également des personnels techniques spécialisés et des matériels dédiés. L'analyse exige quant à elle un environnement protégé des contaminations, ce qui exclu l'utilisation d'un analyseur standard hors du périmètre protégé d'un laboratoire conventionnel. La durée des analyses se situe généralement aux alentours d'une dizaine d'heures pour obtenir le résultat de plusieurs dizaines de prélèvements biologiques de traces prélevées sur des scènes d'infractions (scène de crime par exemple). Le dispositif selon l'invention est constitué d'une tige rectiligne de 5 à 10 cm environ présentant une extrémité de forme facilitant sa manipulation et une autre extrémité, sécable ou éjectable sur laquelle est fixée un support absorbant souple dénommé «pastille biologique» destiné à la collecte. Cette pastille est pré-traitée avec des agents dénaturants et surfactants lors de sa conception permettant ainsi la lyse in situ des cellules. Il n'est donc pas nécessaire d'appliquer sur la pastille biologique un tampon d'humidification spécifique pour la lyse des cellules en amont de la collecte. La « pastille biologique » peut-être constituée soit de fibres synthétiques floquées sur une tige souple soit de fibres synthétiques floquées sur une pastille dont la souplesse permet de s'adapter à l'état de surface du support objet du prélèvement, soit directement d'une pastille de cellulose. La superficie de la pastille biologique est de l'ordre de 1 à 3,14 mm2 à savoir : - 1 à 2 mm2 dans sa forme de fibres synthétiques floquées sur une tige ; - environ 1,13 mm2 dans sa forme d'une pastille de cellulose de 1,2 mm de diamètre ; - environ 1,13 mm2 dans sa forme de fibres synthétiques floquées sur une pastille de 1,2 mm de diamètre ; - environ 3,14 mm2 dans sa forme d'une pastille de cellulose de 2 mm de diamètre ; 3033047 2 - environ 3,14 mm2 dans sa forme de fibres synthétiques floquées sur une pastille de 2 mm de diamètre. Quelque soit sa forme et sa nature, la pastille biologique a la propriété de piéger puis de relarguer les acides nucléiques collectés ainsi rendus directement 5 disponibles, sans délai, pour des applications de biologie moléculaire sans qu'il soit nécessaire de procéder à une étape conventionnelle d'extraction en laboratoire. Le dispositif selon l'invention est également constitué d'un étui hermétique, comportant un identifiant unique, à l'intérieur duquel vient s'insérer la tige ou uniquement la pastille biologique. 10 Le dispositif selon l'invention permet de réduire l'altération de la trace biologique par une surface de prélèvement moindre, de diminuer considérablement le temps d'analyse au laboratoire, de réduire l'obstacle de la contamination par la suppression de l'étape d'extraction ADN entre le prélèvement et le passage en analyseur et par conséquent de permettre l'utilisation d'un analyseur en série d'acides 15 nucléiques hors du laboratoire conventionnel de génétique permettant ainsi de disposer d'une capacité d'analyse de masse au plus près de la scène de prélèvement. Les dessins annexés illustrent l'invention : La figure 1 représente en coupe, le dispositif de l'invention. La figure 2 représente en coupe, une variante de ce dispositif. 20 Le support solide sec absorbant, nommé « pastille biologique », utilisé pour valider le protocole de collecte et d'analyse rapide est une matrice de cellulose de type FTA (société GE) ou NucleiCard (société COPAN) d'une superficie de l'ordre de 1 à 3 mm2. A défaut de disposer d'un dispositif de collecte industriel, objet de la présente 25 invention, la pastille biologique est manipulée à l'aide d'une pince de type pince brucelles. La méthode de collecte expérimentale se décompose de la manière suivante : humidification de la pastille biologique à l'aide d'eau stérile et apyrogène puis collecte de la trace biologique par essuyage du support à l'aide de mouvements de balayages horizontaux, circulaires ou par simples tamponnages en fonction de la 30 nature de la surface à essuyer. Les tests on été effectués sur différents types de traces susceptibles de présenter de l'ADN en quantité et qualité variables mais principalement dégradé. A cet effet, les collectes ont été effectuées sur des traces dites « de contact » (essuyage de différents supports comme l'intérieur d'un véhicule ou objets du quotidien), des traces 3033047 3 de sang, des cellules buccales et des tissus biologiques divers (éléments de corps dans des états de dégradation avancés tel que la putréfaction ou la carbonisation). En utilisant le dispositif selon l'invention, lorsque la trace biologique est humide, la collecte est effectuée directement, et lorsque la trace biologique est séchée 5 sur le support, l'étape de collecte est effectuée après son humidification avec de l'eau stérile et apyrogène. Sans délai, à l'issue de la collecte, l'ADN piégé dans la pastille biologique est directement amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction), sans qu'il soit nécessaire d'ajouter un additif pour stabiliser la réaction d'amplification, aux fins de 10 détermination de profils génétiques humains. Cette réaction d'amplification est effectuée à l'aide de kits commerciaux d'amplification de fragments d'ADN de type STR (Short Tandem Repeat) tels que les kits Identifier plus et Globalfiler (Lifetechnologies) selon les recommandations préconisées par le fournisseur. Le génotypage des produits de PCR est effectué à l'aide de l'analyseur 3500 xl 15 (Lifetechnologies). L'analyse des résultats est réalisée à l'aide du logiciel GeneMapper ID-X version 1.2. Par cette méthode de collecte et d'analyse, le délai entre la collecte de la trace biologique et la détermination du profil génétique est de moins de trois heures pour les premières vingt et une traces biologiques collectées. Le système d'analyse permet 20 ensuite de générer vingt et un résultats supplémentaires toutes les vingt à vingt cinq minutes. Afin de valider l'efficacité du processus d'analyse rapide, les traces biologiques ont également été collectées à l'aide d'un dispositif conventionnel de type écouvillon (Floaq swab, société COPAN) puis analysées à l'aide des kits Identifiler 25 Plus, Identifiler Direct et GlobalFiler selon les recommandations du fournisseur sans quantification au préalable de l'ADN extrait de l'intégralité de l'extrémité de l'écouvillon. Les résultats obtenus à partir du processus d'analyse rapide, objet de la présente invention, sont équivalents voire meilleurs que ceux obtenus à l'aide du 30 processus d'analyse conventionnel. En effet, le système de collection et d'analyse rapide est principalement plus performant sur les traces biologiques de très petites superficies et volumes (microtraces de l'ordre de 1 mm2 et 1141) en raison de la miniaturisation de la surface de collection et l'absence de perte de matériel génétique prélevé (en raison de l'absence d'extraction d'ADN à partir du dispositif de collecte). 3033047 4 Selon une variante illustrée par le dessin 2, ce dispositif peut-être également couplé à un second dispositif de collection constitué d'une tige d'une longueur de 5 à 10 cm environ dont l'extrémité sécable ou éjectable présente un support solide absorbant permettant la collection du matériel biologique pour conservation et 5 extraction ultérieures des acides nucléiques aux fins d'analyses par les techniques de biologie moléculaire notamment par PCR. Dans cette configuration, les deux dispositifs sont associés mais insérés chacun dans un étui hermétique distinct, identifiable notamment par un code à barres. Le dispositif selon l'invention permet d'une part d'obtenir des résultats 10 beaucoup plus rapidement que dans le cadre d'une analyse classique au laboratoire et d'autre part permet l'utilisation d'un analyseur ADN hors du laboratoire de génétique soit au plus près d'une scène de crime, soit au sein d'un service de police judiciaire de proximité. Les délais d'obtention des résultats sont ainsi considérablement réduits tout en conservant les avantages d'une production d'analyses en série de plusieurs dizaines 15 de prélèvements. Par ailleurs, l'utilisation de cet outil de collection, objet de la présente invention permet de réduire le coût de la main d'oeuvre, des équipements et des consommables de laboratoire nécessaires pour l'analyse génétique. Dans tous les cas, l'utilisation du dispositif de collection et d'analyse rapide, 20 du fait de sa faible surface de contact et d'essuyage de la trace biologique, préserve au maximum le matériel génétique présent sur le support essuyé, qui peut ainsi faire l'objet soit d'un nouveau prélèvement, soit d'une exploitation d'une autre nature comme l'identification du dessin papillaire des traces digitales ou la détermination de la nature biologique de la trace par exemple. 25 De part sa superficie miniature de l'ordre de 1 à 3,14 mm2, la pastille biologique présente à nouveau un intérêt majeur sur le plan économique car cette caractéristique permet de réaliser l'amplification d'acides nucléiques dans un volume réactionnel réduit de 50% par rapport aux préconisations du fournisseur et donc de réduire considérablement le coût des analyses d'un nombre important de prélèvements. 30 En effet, les tests effectuées avec les kits d'amplification génique Identifier plus et Globalfiler ont permis de démontrer l'efficacité du dispositif pour un volume réactionnel de PCR de 25ial comme préconisé par le fournisseur, mais également dans un volume réactionnel réduit de moitié soit 12,50. 3033047 5 Il a ainsi été démontré qu'une telle petite surface de la pastille permet de collecter une quantité suffisante d'acides nucléiques pour l'obtention d'un profil génétique. Le traitement de l'outil de collection et de sa pastille biologique à l'issue de la 5 fabrication par tous types de systèmes de stérilisation à sec, notamment de type oxyde d'éthylène et plasma, est de nature à permettre à l'outil de collection, objet de la présente invention, de répondre aux recommandations internationales les plus exigeantes en matière de prévention de toute contamination par des acides nucléiques ne provenant pas de la trace biologique prélevée. 10 L'utilisation d'agents dénaturants et surfactants alternatifs peuvent être utilisés dans la pastille biologique afin de garantir son innocuité vis à vis de la santé humaine. Dans ces conditions, la pastille biologique pourra être directement appliquée dans la cavité buccale d'un individu afin d'en prélever des cellules à des fins d'analyses génétiques. 15 Le dispositif selon l'invention est particulièrement destiné à la conception et à l'industrialisation d'un dispositif universel de prélèvement de matériel biologique, très facile d'emploi, notamment par des praticiens de police technique et scientifique de premier niveau, susceptibles de l'utiliser pour la réalisation de prélèvements destinés à des laboratoires ou établissements privés ou publics, français ou étrangers. REVENDICATIONS1) Dispositif de collection de matériel biologique à partir d'une trace biologique présente sur un support biologique ou non biologique à des fins d'analyse d'acides nucléiques, sans étape d'extraction, caractérisé en ce qu'il comprend une tige rectiligne d'une longueur comprise entre 5 et 10 cm, présentant une extrémité de forme facilitant sa manipulation et une autre extrémité, sécable ou éjectable, sur laquelle est fixé un corps absorbant souple et sec, appelé pastille biologique, la surface de ladite pastille étant comprise entre 1 et 3,14mm2, ledit dispositif permettant ainsi le prélèvement sur le support d'une micro-surface de 1 mm2 ou d'un micro-volume de 1 111. 2) Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pastille biologique est constituée d'une pastille de cellulose. 3) Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pastille biologique est constituée de fibres synthétiques floquées soit sur une tige souple, soit sur une pastille souple. 4) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la surface de la pastille biologique est : - de 1 à 2 mm2 dans sa forme de fibres synthétiques floquées sur une tige ; - d'environ 1.13 mm2 dans sa forme d'une pastille de cellulose de 1.2 mm de diamètre ; - d'environ 1.13 mm2 dans sa forme de fibres synthétiques floquées sur une pastille de 1.2 mm de diamètre ; - d'environ 3.14 mm2 dans sa forme d'une pastille de cellulose de 2 mm de diamètre ; - d'environ 3.14 mm2 dans sa forme de fibres synthétiques floquées sur une pastille de 2 mm de diamètre. 5) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la pastille biologique a été pré-traitée par des agents surfactants et dénaturants. 6) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ledit dispositif pouvant être physiquement associé à un second dispositif de collection, constitué d'une tige de 5 à 10 cm, dont l'extrémité sécable ou éjectable présente un support solide absorbant permettant la collection et la conservation du matériel biologique pour une extraction ultérieure des acides nucléiques aux fins d'analyses par les techniques de biologie 3033047 7 moléculaire notamment par PCR. 7) Dispositif selon la revendication 6, dans lequel chaque dispositif de collection est inséré dans un étui hermétique distinct identifiable. 8) Procédé d'analyse d'acides nucléiques dans du matériel biologique à partir d'une 5 trace biologique présente sur un support biologique ou non, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre le dispositif de collection de matériel biologique selon l'une des quelconque revendications 1 à 7. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : - collecte du matériel biologique à partir de la trace biologique présente sur un support 10 biologique ou non biologique par essuyage du support sur la surface de la pastille biologique à l'aide de mouvements de balayage ou par tamponnage ; - amplification directe de l'ADN présent dans la pastille biologique par PCR ; - génotypage des produits de l'amplification. 10) Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que l'amplification est 15 mise en oeuvre dans un volume réactionnel total de 12.5111 ou de 250. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendication 8 à 10, caractérisé en ce que la trace biologique sur une support biologique ou non biologique consiste en une trace de contact, une trace de sang, des cellules buccales, un tissu biologique dégradé ou non. 20 12) Procédé selon l'une quelconque des revendication 8 à 11, caractérisé en ce que lorsque la trace biologique est humide, la collecte est effectuée directement, et lorsque la trace biologique est séchée sur le support, l'étape de collecte est effectuée après son humidification avec de l'eau stérile et apyrogène.