Brevet FR3029422A1 — publié le 20160610

Microbille d'hydrogel La présente invention concerne des microbilles d'hydrogel, leur procédé de fabrication et leurs utilisations, en particulier dans des compositions pharmaceutiques ou des dispositifs médicaux, plus particulièrement pour le traitement d'une pathologie d'une articulation. Le chitosane est un polymère d'origine naturelle présentant un intérêt connu depuis de nombreuses années. Ce polysaccharide peut être obtenu à partir de sources animales comme à partir de carapace de crustacés, mais également à partir de sources fongiques à partir de parois cellulaires de champignons. Le chitosane est par exemple utilisé sous la forme de matrice pour encapsuler des principes actifs. Il sert alors en général de véhicule pharmaceutique. Ces véhicules peuvent se présenter sous forme solide, en particulier lorsqu'ils sont séchés ou lyophilisés. De nombreux brevets concernent cette technologie. En parallèle de cette technologie, se sont développées des particules à base de chitosane sous forme d'hydrogel, de différentes dimensions. Ces compositions présentent un taux particulièrement élevé d'eau les rendant très différentes des matrices précitées. En général l'eau représente plus de 85%, voire plus de 90% en masse de la composition. De telles particules d'hydrogels présentent une composition et des propriétés très différentes des matrices de chitosane évoquées ci-dessus. De telles particules d'hydrogel sont notamment utilisées en ingéniérie tissulaire ou également comme vecteur de composés actifs. Cependant tout hydrogel ne convient pas pour former des billes pouvant être facilement injectables dans le corps humain ou animal. La demande de brevet WO 2007/135114 décrit des billes pour l'ingénierie tissulaire comprenant un mélange d'alginate avec un dérivé de chitosane. Cette demande enseigne d'utiliser un dérivé de chitosane afin de le rendre soluble en milieu aqueux, en particulier dans un tampon à pH 7.4, pour éviter la formation de coacervats insolubles dans le mélange avec l'alginate. Cette demande préconise en particulier de greffer des unités d'oligosaccharide, en particulier à base de lactose, pour modifier le chitosane. Il est préparé une solution aqueuse de dérivé de chitosane à pH 7,4 et une solution aqueuse d'alginate au même pH. La solution aqueuse de dérivé de chitosane en mélange avec l'alginate présente un pH d'environ 7,4 et peut ensuite servir à former des gouttelettes, qui sont alors gélifiées au contact d'un agent de gélation de l'alginate, formant ainsi des billes d'hydrogel. La demande enseigne plus particulièrement la formation de gouttelettes de la solution d'alginate et de dérivé de chitosane à un ratio massique de 3:1, par passage via 3029422 2 une seringue de type 23Ga ou par l'utilisation d'un générateur de type électrostatique, avec une buse de 0.7mm. Les capsules obtenues après gélation dans un bain contenant un ion calcium et après lavage sont de taille millimétrique, de diamètre d'environ 3 à 4mm. Elle contiennent en majeure partie de l'alginate (75% du total des polymères) et en 5 mineure partie un dérivé de chitosane (25% du total des polymères). Cette proportion élevée d'alginate peut être expliquée par la difficulté à préparer une solution gélifiable homogène et pouvant facilement former des microcapsules lorsque la proportion d'alginate diminue. Il est connu de par le brevet EP 2538987 B1 (US 20120321678) des billes 10 d'hydrogel à base de chitosane et d'alginate, en particulier pour leurs utilisations en supplémentation intra-articulaire. Il s'agit dans ce brevet d'améliorer les effets d'un hydrogel en le combinant avec des billes d'hydrogel, utilisable au moins dans cette application spécifique. Il convient notamment que ces billes présentent une durée de vie après injection au niveau intra-articulaire élevée ainsi que des propriétés mécaniques 15 intéressantes où l'injection est réalisée. De telles billes sont particulièrement intéressantes de par leurs propriétés, en particulier leurs propriétés élastiques, apportées lors de l'injection intra-articulaire. Les billes d'hydrogel selon ce brevet présentent toutefois des trabécules. Les trabécules sont des espèces fibrillaires ou filamenteuses présentes à l'intérieur de l'hydrogel. 20 L'article d'Oprenyeszk et al., 2013 (Protective effect of a new biomaterial against the development of experimental osteoarthritis lesions in rabbit: a plot study evaluating the intra-articular injection of alginate-chitosan beads dispersed in an hydrogel Osteoarthritis Cartilage, 2013 Aug. 21(8):1099-107. dol : 10.1016/j.joca.2013.04.017) décrit une étude de l'injection chez des lapins des microbilles d'hydrogel d'un mélange de 25 chitosane et d'alginate préparées selon l'enseignement du brevet EP 2538987 B1. Ces microbilles présentent une gamme de diamètre de 600 à 900pm. Bien que ces microbilles soient formées d'un réseau alginate/chitosane répartis de manière homogène, elles présentent également des trabécules. Cette étude pilote fournit des résultats supportant l'intérêt des microbilles pour le traitement de l'ostéoarthrite et des lésions du cartilage 30 associées, par voie intra-articulaire. Cette technologie nécessite encore d'être améliorée car les microbilles présentent un diamètre qu'il est difficile de diminuer, notamment de par la présence dans la solution du mélange alginate/chitosane des trabécules limitant l'injection via une buse de diamètre très fin. Les présents inventeurs considèrent qu'il aurait pu être utilisé un cisaillement plus important, mais un tel cisaillement aurait 35 probablement altéré la masse moléculaire des polymères en jeu et la structure du réseau qu'ils forment entre eux, et ainsi fait perdre la cohésion des microbilles obtenues, par 3029422 3 exemple telle qu'estimée par une manipulation entre les doigts. Cette perte de cohésion est indésirable pour les applications envisagées dans la présente invention. La demande WO 2009/150651 décrit encore un hydrogel à base de la combinaison de deux solutions de chitosanes de caractéristiques différentes, au départ 5 d'une solution acide portée progressivement à pH neutre. Le premier chitosane est hautement acétyle avec un degré d'acétylation compris entre 40% et 60%. Le second chitosane est hautement déacétylé avec un degré d'acétylation d'au plus 20%. De tels hydrogels sont sensibles à la température ce qui leur permet de gélifier in situ, après injection dans le corps humain ou animal. La demande n'enseigne pas comment former 10 des particules d'hydrogel. La présente invention a pour but de fournir des particules d'hydrogel. En particulier, la présente demande a pour but de fournir des billes d'hydrogel ne présentant pas de particules solides, comme des trabécules. La présente invention a également pour but de fournir des billes d'hydrogel dont la 15 composition comprend du chitosane, éventuellement en mélange avec d'autres composés. Cette composition est avantageusement homogène. La composition est considérée « homogène » au sens où la composition est sous la forme d'une solution aqueuse et ne forme pas de coacervats polymériques, des filaments solides ou des trabécules. 20 La présente invention a également pour but de fournir des billes d'hydrogel, au départ d'une solution dont la viscosité est adéquate pour pouvoir être mise en oeuvre sous forme de gouttelettes selon une ou plusieurs des techniques disponibles industriellement, et avantageusement en adaptant le diamètre des gouttelettes pour la préparation de microbilles d'hydrogel injectables au travers d'aiguilles fines. 25 Il ressort de l'état de la technique que la préparation de telles billes d'hydrogel n'est pas aisée puisque le brevet EP 2538987 B1 décrit que le mélange chitosanealginate est très visqueux, et forme des microbilles comprenant des trabécules, et la demande WO 2007/13514 préconise l'utilisation d'un dérivé de chitosane soluble pour surmonter le problème technique de la formation de particules solides dans les billes 30 d'hydrogel. La présente invention a encore pour but de fournir des billes d'hydrogel dont le procédé de fabrication soit industrialisable, de préférence en limitant les coûts de fabrication et en assurant une bonne reproductibilité des microbilles ainsi fabriquées. Avantageusement, l'invention a pour but de fournir des microbilles présentant de 35 bonnes propriétés, par exemple de bonnes propriétés mécaniques pour les applications envisagées, et plus spécifiquement pour des injections intra-articulaires, par exemple de 3029422 4 bonnes propriétés élastiques et d'absorption des chocs, une bonne résistance à l'écrasement, et une bonne adhésion sur les tissus. À cet égard, les billes d'hydrogel selon le procédé antérieur décrit dans le brevet EP 2538987 B1 ont un diamètre élevé. L'article d'Oprenyeszk et al. 2013, montre que de 5 telles particules présentent un diamètre de 600 à 900 micromètres (lm). Les billes d'hydrogel ne sont donc pas convenables pour des injections intra-articulaires qui nécessitent des aiguilles fines de faible diamètre, notamment dans le cadre de maladies articulaires traitée par viscosupplémentation intra-articlaire et de maladies articulaires chroniques. De telles maladies sont typiquement les pathologies du cartilage, qui 10 entraînent des lésions et des défauts du cartilage et une douleur articulaire, comme l'arthrose, par exemple due soit au vieillissement soit à un accident. Pour assurer la facilité d'injection par le praticien, augmenter le confort du patient, limiter les risques d'injection mal placée et éviter les risques d'infection, en particulier lors d'injections répétées, il convient d'utiliser des aiguilles fines. 15 La présente invention a donc encore pour but de fournir une composition injectable par voie intra-articulaire qui facilite des injections répétées, notamment au travers d'aiguilles fines tel que par exemple des aiguilles de type 18 à 22 Gauge comme recommandé pour la plupart des produits de viscosupplémentation actuellement commercialisé, en particulier au-dessus de 21 Gauge, ou éventuellement encore plus 20 fines, par exemple de 23 Gauge. Il est donc désiré de mettre au point des microbilles dont les propriétés et la distribution de diamètre peuvent être ajustés pour pouvoir être facilement injectées au travers d'aiguilles fines, en particulier des microbilles dont le diamètre moyen en nombre est inférieur à 900pm, de préférence inférieur à 800pm, de préférence inférieur à 700pm, et encore de préférence dont le D(0.9) est inférieur à 25 900pm, de préférence inférieur à 800pm, de préférence inférieur à 700pm. Il a été découvert que les problèmes techniques évoqués ci-dessus peuvent être résolus par la présente invention. En particulier, l'invention met en oeuvre un procédé de fabrication spécifique des microbilles d'hydrogel à base de chitosane, lequel ne comprend pas la formation de trabécules solides dans les microbilles, évitant ainsi les inconvénients 30 mentionnés dans l'art antérieur, de manière surprenante. Il est apparent à la lecture de l'art antérieur discuté ci-dessus que la solution apportée par la présente invention n'était pas évidente pour l'homme du métier. L'invention concerne plus spécifiquement une particule ou une bille d'hydrogel, et plus particulièrement une microbille d'hydrogel. 35 Ainsi, la présente invention concerne une microbille d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane et de l'alginate, l'eau étant présente à une concentration 3029422 5 d'au moins 90% en masse, le chitosane étant présent une concentration de 0,3 à 10 % en masse et l'alginate étant présent à une concentration de 0,5 à 10% en masse, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel, ladite bille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 ladite bille 5 ne présentant pas de trabécules solides. Les pourcentages en masse exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel sont exprimés par rapport aux constituants de l'hydrogel. Les pourcentages en masse exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel s'entendent de préférence de la microbille d'hydrogel sans agent actif, par exemple des cellules, des 10 polypeptides, des protéines, des polynucléosides ou polynucléotides, qui ont une vertu thérapeutique et qui ne sont pas directement nécessaires à la préparation de l'hydrogel. On entend en particulier par « billes » une particule de forme sensiblement sphérique. Une telle forme peut être appréciée par microscope. Une telle bille peut présenter des imperfections inhérentes au procédé de fabrication. On entend par 15 « microbille » une bille présentant une taille inférieure à 1000 micromètres. Les billes selon l'invention présentent avantageusement un diamètre moyen en nombre compris entre 200 et 800 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 700 micromètres. Selon une variante, les billes selon l'invention présentent un diamètre moyen en 20 nombre de préférence compris entre 100 et 500 micromètres, et de préférence entre 200 et 500 micromètres.La mesure du diamètre moyen en nombre des billes selon l'invention est réalisée de préférence par microscopie optique, selon la méthode suivante : Le diamètre moyen en nombre, l'écart-type et le coefficient de variation d'une population de microbilles sont mesurées à l'aide d'un microscope optique inversé, par 25 exemple de la marque OLYMPUS, modèle CKX41 et muni d'une caméra et d'un objectif 20X. Une fraction de la population de microbilles est placée dans une cupule d'observation elle-même placée sous l'objectif. Une photo numérique est prise après ajustement de l'image. Le programme « LABSENSE » de la marque OLYMPUS et accompagnant le microscope permet un traçage de lignes droites calibrées selon l'objectif 30 utilisé. Un minimum de 20 billes est sélectionné sur l'image et une diagonale est tracée par le programme sur chacune d'elle. Le programme permet une visualisation directe de la mesure. Ces mesures sont reportées sur un tableur, par exemple EXCEL de la marque MICROSOFT et les variables suivantes sont calculées. La moyenne est calculée à l'aide de la formule : 3029422 6 s =- L'écart-type est calculé à l'aide de la formule : Le coefficient de variation C, est calculé à l'aide de la formule (écart-type divisé par la moyenne) : X « n » représente le nombre de billes de l'échantillons dont le diamètre est mesuré, 5 « x, » représente le diamètre mesuré pour une bille, « i » étant un nombre entier allant de 1 à n. La distribution du diamètre des microbilles peut également être mesurée par une méthode de diffraction laser, par exemple à l'aide d'un équipement Mastersizer de Malvern, par exemple un Mastersizer 2000, en utilisant un protocole de mesure de 10 préférence suivant la norme IS013320:2009 ou suivant la monographie de la Pharmacopée Européenne EP2.9.31, mettant en oeuvre la théorie de Mi. Avantageusement, la distribution des billes est étroite, c'est-à-dire avec une faible dispersion du diamètre des billes par rapport au diamètre moyen, c'est à dire par exemple un indice de dispersité de moins de 2 mesuré par diffraction laser, par exemple comme 15 précité. Avantageusement, les microbilles présentent un D(0,1) compris entre 100 et 600 micromètres, et avantageusement compris entre 200 et 400 micromètres. Selon une variante, les microbilles présentent un D(0,5) compris selon une variante entre 100 et 800 micromètres, et de préférence entre 300 et 700 micromètres. 20 De préférence, les microbilles présentent un D(0,5) compris selon une variante entre 300 et 600 micromètres. Avantageusement, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 100 et 1000 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 950 micromètres. Selon une variante spécifique, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 25 100 et 950 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 900 micromètres, en encore avantageusement entre 300 et 800 micromètres. Selon une variante spécifique, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 200 et 700 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 650 micromètres. L'invention concerne notamment des billes d'hydrogels stérilisées ou non dont le 30 diamètre D(0.9) est : inférieur à 700pm (pouvant être injectées via une aiguille de 19 Gauge), inférieur à 650pm (pouvant être injectées via une aiguille de 20 Gauge), inférieur à 500pm (pouvant être injectées via une aiguille de 21 Gauge). Le D(0,1), D(0,5) et le D(0,9) sont mesurés par diffraction laser comme précité. - - - 3029422 7 Avantageusement, les microbilles d'hydrogel comprennent au moins 95% d'eau en masse. Selon une variante spécifique, les microbilles hydrogel comprennent au moins 97% en masse d'eau. Selon une variante, le chitosane est présent dans l'hydrogel à une concentration 5 comprise entre 0,3 et 5 %, et de préférence de 0,5 et 3 % en masse de chitosane. Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 0,5 et 0.7 % en masse de chitosane. Le chitosane est référencé sous le N °CAS 9012-76-4. Le chitosane de l'invention est un polysaccharide de préférence préparé à partir d'une source fongique. Il est de 10 préférence extrait et purifié à partir de sources fongiques alimentaires ou biotechnologique sûres et abondantes tels que Agaricus bisporus ou Aspergillus piger. Le chitosane est obtenu par hydrolyse d'un extrait riche en chitine. La chitine est un polysaccharide composé de plusieurs unités N-acétyl-D-glucosamine reliées entre elles par une liaison de type B (1,4). Le chitosane est constitué des unités D-glucosamine 15 (unités désacétylées) et d'unités N-acétyl-D-glucosamine (unités acétylées) reliées entre elles par des liaisons de type B (1,4) et constitue un polymère du type poly(N-acétyl-Dg lucosam ine)-poly(D-g lucosam ine). Le chitosane de l'invention est donc avantageusement d'origine fongique, et de préférence issus du mycélium d'un champignon du type Ascomycète, et en particulier 20 d'Aspergillus piger, et/ou d'un champignon Basidiomycète, et en particulier Lentinula edodes (shiitake) et/ou Agaricus bisporus. De préférence le champignon est Agaricus bisporus. Toute origine et méthode de préparation de chitosane peuvent être utilisées. Une méthode de préparation du chitosane est celle décrite dans les brevets issus de la demande W003068824 (EP1483299 ; US 7,556,946). 25 Le chitosane est avantageusement un chitosane non modifié chimiquement par une réaction de couplage par liaison covalente avec une ou plusieurs autres espèces chimiques. Le chitosane est avantageux pour sa capacité à former des particules de structure tridimensionnelle de type hydrogel mécaniquement résistante, sa biocompatibilité et sa 30 biodégradabilité après administration ou implantation. De plus, la présence de chitosane dans de telles particules d'hydrogel est désirée pour ses propriétés intrinsèques, physico-chimiques et/ou biologiques, par exemple pour sa capacité à adhérer aux surfaces biologiques ou sa capacité à stimuler la cicatrisation de tissus. Avantageusement, la masse moléculaire moyenne du chitosane est inférieure ou 35 égale à 80,000. Selon une variante, la masse moléculaire du chitosane est comprise entre 15,000 et 70,000, et de préférence entre 35,000 et 60,000. 3029422 8 De préférence ici, la masse moléculaire moyenne est la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv), calculée à partir de la viscosité intrinsèque selon l'équation de Mark-Houwink. La viscosité intrinsèque est mesurée par viscosimètrie capillaire, avec un viscosimètre capillaire de type Ubbelohde, selon la méthode de la monographie de la 5 Pharmacopée Européenne EP2.2.9. On mesure le temps d'écoulement de la solution à travers un tube capillaire adapté (Lauda, par exemple le tube capilaire Ubbelohde 510 01 de diamètre 0.53mm) à l'aide d'un viscosimètre automatique Lauda Visc, d'abord à la concentration initiale en chitosane, puis pour plusieurs dilutions, par exemple selon les recommandations de la méthode EP2.2.9. On en déduit la viscosité intrinsèque réduite 10 pour chacune des concentrations. On porte la viscosité réduite en fonction de la température, et on extrapole la valeur à la concentration 0 pour en déduire la viscosité intrinsèque. Il faut par exemple porter la viscosité réduite (llréd en ml/g) des i dilutions en fonction de la concentration C des i dilutions (g/ml) selon la formule 5. Formule 2. [rIréal = (t1 - t0) - (1 - C). 15 Pour calculer la masse viscosimétrique moyenne, on applique l'équation de Mark- Houwink avec les constantes k et alpha recommandées par Rinaudo et al. (Int. J. Biol. Macromol, 1993, 15, 281-285), selon le DA du chitosane, selon l'une des trois formules suivantes. Formule 3. Mv = (W0,082)(110'76), pour un DA de 2% ; 20 Formule 4. Mv = (W0,076)(110'76), pour un DA de 10% (par exemple 11.5%) ; Formule 5. Mv = (W0,074)(110'76), pour un DA de 20% (par exemple 21%). Pour les valeurs de DA intermédiaires, on réalise une interpolation linéraire pour calculer la masse viscosimétrique moyenne (Mv). 25 À titre d'exemple, le chitosane peut présenter un degré d'acétylation compris entre 10 et 40 %, et de préférence entre 10 et 25 `Vo. Le degré d'acétylation est déterminé par potentiométrie. Le chitosane est dissout dans une solution d'acide chlorhydrique. L'excès d'acide chlorhydrique n'ayant pas réagi avec les fonctions amines du chitosane est dosé par une solution titrée d'hydroxyde de 30 sodium. On en déduit ainsi le nombre de mole d'unité D-glucosamine présentes dans le chitosane et donc par soustraction le degré d'acétylation. Avantageusement, le chitosane de la présente invention peut présenter une viscosité dynamique comprise entre 5 et 50mPa.s en solution à 1% (m/v) dans l'acide acétique à 1% (v/v). 35 La viscosité dynamique de la solution de chitosane à 1% est de préférence comprise entre 5 et 25mPa.s. La viscosité est mesurée typiquement sur dispositif 3029422 9 Brookfield DV2T à une vitesse de 50 à 100 tr/min (par exemple 100tr/min) avec une aiguille « Spindle S18 » à 25°C. La solution de chtosane se comporte comme un fluide newtonien : la viscosité est indépendante de la vitesse de rotation. La valeur de viscosité est donc la même quelle que soit la vitesse de rotation choisie. La vitesse sélectionnée 5 est compatible avec la torsion maximale du ressort du dispositif de mesure. Les alginates, sels de l'acide alginique, sont des polysaccharides aux applications multiples, couramment utilisés notamment dans les domaines pharmaceutique, cosmétique et alimentaire. Leur capacité à former des gels est une de leurs propriétés les plus exploitées. Les alginates de métaux alcalins (sodium, potassium, magnésium...) sont 10 solubles dans l'eau tandis que les alginates d'ions divalents ou trivalents comme le calcium, l'aluminium ou le fer y sont pratiquement insolubles. Ainsi, par exemple la mise en présence d'un alginate de sodium avec un agent de gélification, comme par exemple un sel de calcium, en solution aqueuse permet la gélification de l'alginate, par exemple sous forme d'alginate de calcium. 15 L'alginate est un polymère formé de deux monomères liés ensemble : le mannuronate ou acide mannuronique dont certains sont acétyles et le guluronate ou acide guluronique. Un alginate préféré est un de grade pharmaceutique ou médical, en particulier un alginate de sodium adapté à son injection ou son implantation dans le corps humain ou animal. Il s'agit en particulier d'un alginate de faible masse moléculaire, par 20 exemple caractérisée par sa viscosité en solution à 1%. Avantageusement, l'alginate est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 1 à 10%, et de préférence de 1 à 5 %, en masse. Selon une variante spécifique, la microbille comprend de 1 et 1,4% en masse d'alginate. 25 Plus particulièrement, la microbille comprend de 0,5 à 0,7% en masse de chitosane et moins de 1,3% en masse d'alginate. Selon une variante, la microbille comprend moins de 1,2% en masse d'alginate. L'alginate peut présenter avantageusement une viscosité dynamique en solution à 1% comprise entre 20 et 300mPa.s, et de préférence entre 20 et 180mPa.s, et par 30 exemple de 70 à 150 mPa.s. La mesure de cette viscosité est effectuée selon la même méthode et appareillage que pour les solutions de chitosane, avec une vitesse de rotation allant de 5 à 20 tr/min (par exemple 10tr/min). La solution d'alginate se comporte aussi comme un fluide newtonien. Un exemple spécifique de composition de la microbille comprend 0,5% de 35 chitosane et 1,0% d'alginate en masse par rapport à la masse de la composition totale de la microbille. 3029422 10 Outre le chitosane et l'alginate, la microbille de la présente invention peut comprendre différents excipients et/ou différents principes actifs. Parmi les excipients, on peut citer les agents favorisant la gélification de la bille, les agents de modification de la viscosité, les agents de modification de la rhéologie, 5 La composition des microbilles est avantageusement non-thermogélifiable. En effet, pour assurer une bonne stabilité des billes avant et après injection, typiquement par voie intra-articulaire, la gélation ou la transition sol-gel ne doit pas intervenir après ou au moment de l'injection. Avantageusement, les microbilles de l'invention sont sous forme d'hydrogel avant leur application, en particulier par injection dans le corps d'un sujet en 10 ayant besoin, notamment au niveau intra-articulaire. En particulier, les microbilles ne sont pas sensibles aux variations de température entre 8 et 40°C, c'est-à-dire qu'elles ne subissent pas de transition sol-gel ou ne sont pas dégradées dans cette gamme de température. À cet égard, les microbilles peuvent être suspendues dans une solution visqueuse 15 ou un hydrogel, qui lui, avantageusement, peut-être thermogélifiable. Il s'agit typiquement d'hydrogel d'un ou plusieurs polysaccharides gélifiables. La présente invention concerne encore une solution visqueuse ou un hydrogel, thermogélifiable ou non, comprenant une pluralité de microbilles de l'invention. La composition de la microbille selon l'invention peut également comprendre des 20 composés d'intérêt, tout particulièrement au niveau pharmaceutique (principe actif pharmaceutique) et encore plus spécifiquement pour une action intra-articulaire, plus particulièrement sur le cartilage. Il s'agit encore plus spécifiquement d'agents bénéfiques dans des compositions à usage intra-articulaire, par exemple pour diminuer la douleur ou diminuer l'inflammation. 25 Parmi de tels agents, on peut citer les médicaments anti-inflammatoires, plus particulièrement les médicaments non-stéroïdiens, les agents anesthésiques, les agents analgésiques, en particulier du type opioïdes, les corticostéroïdes, les anti-néoplastiques, les anticorps monoclonaux, les vitamines, les minéraux, les agents de contrastes, etc. On peut notamment citer parmi les médicaments non-stéroïdiens (NSAIDS) par 30 exemple : DiclofenacTM, IbuprofenTM, PiroxicamTM; les anesthésiques, par exemple : LidocaineTM , BupivacaineTM; les analgésiques opioïdes par exemple : codéine, morphine; corticostéroides, par exemple : dexamethasone, prednisone; les agents antinéoplastiques, par exemple : MethotrexateTM; les agents antiviraux, par exemple : AcyclovirTM , VidarabineTM; les anticorps monoclonaux, par exemple : HumiraTM 35 InfliximabTM 3029422 11 Les microbilles de l'invention, en particulier utilisables comme suppléments injectables par voie intra-articulaire peuvent aussi contenir des composés comme des cellules, des protéines, de polynucléotides (ARN, ADN), des minéraux comme par exemple : sélénium, strontium, des vitamines comme par exemple : tocophérol, ou 5 d'autres agents actifs comme par exemple le curcumin. Parmi les cellules, il est particulièrement intéressant d'utiliser des chondrocytes, des cellules souches, ou des cellules ayant la capacité de produire des substances actives. Les microbilles d'hydrogel selon la présente invention présentent une structure 10 d'hydrogel homogène. Les microbilles d'hydrogel selon la présente invention ne présentent pas de trabécules, ni de particules solides inhérentes à la préparation de l'hydrogel. Il n'est pas exclu que des agents actifs soient sous forme solide ou colloïdale, par exemple sous forme nanoparticulaire. Avantageusement, les microbilles de l'invention sont cohésives. La cohésion des 15 billes n'est pas perdue lors de la friction entre les mains. De plus le les billes présentent avantageusement une bonne résistance à la compression, en particulier lors de la manipulation entre les doigts. Une telle résistance peut être par exemple évaluée par la mesure de résistance à la compression de sur un banc d'essai (par exemple Instron Bluehill). On peut aussi utiliser une technique de 20 nanoindentation (par exemple avec la gamme d'équipements de marque PI Series Picoindenter commercialisé par la société Hysitron ou le Mach 1 commercialisé par la société Biomomentum) ou encore une technique de tribologie adaptée (par exemple avec la gamme d'équipements de marque Tl Series Triboindenteur commercialisé par Hysitron). 25 Encore avantageusement, les billes sont déformables et peuvent être injectées par une aiguille dans le diamètre intérieur est plus faible que le diamètre maximum des billes. Ceci présente un grand avantage pour l'injection dans un tissu car à diamètre intérieur égal, on peut utiliser une aiguille de diamètre extérieur plus faible, formant ainsi un trou de diamètre moins important. 30 Les microbilles peuvent être fabriquées avantageusement selon le procédé de l'invention. Le procédé de l'invention comprend : (i) le mélange d'une solution aqueuse comprenant un chitosane à pH inférieur à 7 auquel le chitosane est soluble, et d'une solution aqueuse comprenant un alginate à pH 35 supérieur à 7 auquel l'alginate est soluble, ledit mélange comprenant au moins un mélange par cisaillement, ledit mélange étant dénommé « prémix », et 3029422 12 (ii) la gélification du prémix sous forme de microbilles par précipitation de gouttes de prémix dans une solution comprenant au moins un agent de gélification du prémix. Le pH est déterminé en suivant la méthode décrite dans la pharmacopée européenne (EP 2.2.3). Le pH-mètre utilisé est un pH-mètre de la gamme Sartorius muni 5 d'une électrode combiné en verre (PY-P11). Les mesures de pH sont réalisées entre 20 et 25 °C. Le chitosane est de préférence dissout dans une solution aqueuse à pH inférieur à 7. Une telle solution comprend typiquement un acide, de préférence faible, comme par exemple un acide organique. On peut avantageusement utiliser l'acide acétique. La 10 solution comprend typiquement 0,5 à 3% d'acide acétique exprimé en volume par rapport au volume total de la solution de chitosane Le pH de la solution de chitosane est typiquement compris entre 2 et 6,5, et de de préférence compris entre 3,5 et 6,0. La viscosité dynamique de la solution de chitosane est de préférence comprise 15 entre 5 et 50mPa.s, et encore de préférence entre 10 et 30mPa.s. La viscosité dynamique est mesurée typiquement à l'aide d'un dispositif Brookfield DV2T à 20 tr/min avec une aiguille « Spindle S18 ». Avantageusement, l'osmolarité de la solution de chitosane va de 100 à 300mOsm/kg. 20 La détermination de l'osmolarité des solutions est effectuée avec un micro- osmomètre automatique (Osmometer Type 15M de la marque Leiser Messtechnik). L'équipement est préalablement calibré avec une solution de 300mosm/kg. L'échantillon est placé dans un récipient prévu à cet effet, et est mis à la température standard de la mesure. 25 La solution d'alginate de sodium présente un pH supérieur à 10, et de préférence compris entre 12 et 14, et encore de préférence d'environ 13. On peut utiliser une base pour ajuster le pH. Parmi les bases, on peut citer l'hydroxyde de sodium, le carbonate de sodium, l'hydroxyde de potassium, etc. La solution d'alginate présente avantageusement une viscosité dynamique 30 comprise entre 50 et 300mPa.s, et de préférence comprise entre 50 et 150mPa.s. Une telle viscosité dynamique peut être mesurée sur un dispositif à mobille tournant, par exemple le dispositif Brookfield DV2T à 5 tr/min avec une aiguille « Spindle S18 ». Avantageusement, la solution d'alginate de sodium ne comprend pas d'agent tampon. 35 La solution de chitosane et d'alginate sont mélangées dans une proportion volumique par exemple allant de 1:10 à 10:1, de préférence 1/5 à 5/1, et typiquement 3029422 13 allant de 1:3 à 1:1 (v/v). Avantageusement, la proportion volumique de la solution d'alginate est supérieure à celle de la solution de chitosane. Pour l'homogénéisation des solutions de chitosane et d'alginate pour la préparation du prémix, on peut utiliser par exemple un dispositif du type comprenant un 5 rotor et un stator assurant un mouvement axial et un mouvement radial de la solution pour son homogénéisation. De tels dispositifs sont notamment commercialisés sous la référence commerciale Ultra-Turrax®. Avantageusement, la rotation est réalisée dans un premier temps à faible vitesse puis à vitesse élevée. Une vitesse lente est typiquement de quelques tours par minute (1 à 10tr/m). 10 Avantageusement, une vitesse lente est mise en oeuvre lorsque l'on ajoute les solutions de chitosane et d'alginate l'une à l'autre. Une vitesse élevée est typiquement de plusieurs milliers de tours par minute, de préférence supérieure à 3000 tr/min, et encore de préférence supérieure à 10000 tr/m. La vitesse élevée reste en générale inférieure à 20000 tr/min. Avantageusement, une vitesse 15 élevée est mise en oeuvre lorsque l'ajout d'un solution à l'autre est terminé. En général, l'agitation à vitesse élevée est arrêtée lorsque la solution est homogène. Un procédé particulièrement préféré comprend le mélange entre la solution de chitosane et d'alginate avec une agitation, de préférence par cisaillement, avec une rotation faible. Après ajout complet de la solution de chitosane, le mélange est agité par 20 cisaillement à une vitesse élevée. La solution homogène obtenue ne présente pas de trabécules ni de fibres solides. Avantageusement, le pH du prémix est supérieur à 10, voire supérieur à 11, et de préférence compris entre 12 et 13. En-dessous du pH avantageux précité, il se produit une précipitation induisant la formation de particules solides indésirables. 25 Avantageusement, on n'utilise pas de solution tampon pour réaliser le prémix. Le prémix est également un objet de l'invention. Plus précisément, l'invention concerne encore une solution comprenant de l'eau, du chitosane et de l'alginate, dénommée « prémix », présentant un pH supérieur à 12 et apte à former des microbilles selon l'invention. Avantageusement, le prémix présente une viscosité dynamique 30 comprise entre 100 et 500 mPa.s. La viscosité dynamique du prémix est de préférence comprise entre 100 et 500mPa.s, et encore de préférence comprise entre 180 et 300 mPa.s. La viscosité apparente dynamique du prémix est mesurée à l'aide d'un viscosimètre à mobile tournant, par exemple un viscosimètre à mobile tournant de la 35 marque Brookfield, par exemple muni d'une aiguille (« spindle ») de type S18 à une vitesse de 5 tr/min et à une température de 25°C. 3029422 14 L'osmolarité du prémix est avantageusement comprise entre 100 et 300 mOsm/kg, et typiquement comprise entre 100 et 200mOsm/kg. La gélification des microbilles intervient dans des conditions aptes à la gélification du prémix. 5 Plus précisément, on utilise un ou plusieurs agents de gélification aptes à la formation d'un hydrogel de chitosane et d'alginate à partir du prémix. Selon une variante, la gélification de la solution intervient par la mise en présence du prémix avec au moins un agent de gélification de l'alginate. L'alginate présent dans le prémix est de préférence sous une forme apte à gélifier. Par exemple on peut utiliser un 10 alginate de sodium. Comme agents de gélification, on peut citer à titre d'exemple les ions calcium et strontium, qui conviennent spécifiquement pour la gélification d'un alginate de sodium. Un agent de gélification est donc de préférence choisi parmi le chlorure de calcium, le chlorure de strontium, et leurs mélanges. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention le chlorure de calcium. 15 La gélification est réalisée en mettant le prémix en contact goutte-à-goutte avec une solution comprenant un agent de gélification. La concentration d'agent de gélification est déterminée par l'homme du métier. On peut utiliser typiquement une concentration de 50 à 200 mM de chlorure de calcium. Le dispositif pour la formation des gouttes et leur gélification peut être du type 20 « prilling », c'est-à-dire un procédé de grelonage. On utilise de préférence un dispositif comprenant une buse de production de gouttes présentant un diamètre interne supérieur ou égal à 100 on peut par exemple utiliser un diamètre de 100 ou 150pm. Pour la formation des microbilles, on peut utiliser un procédé discontinu, par exemple en faisant passer la solution à travers une aiguille à l'aide d'une pompe 25 péristaltique. On peut aussi utiliser un procédé continu, industriellement approprié. A titre d'exemple de procédé continu on peut citer par exemple un procédé électromagnétique à jet laminaire appelé aussi prilling, comme avec l'équipement en continu VAR-D commercialisé par Nisco) ou d'autres procédaient comme par exemple un procédé de formation de gouttes électrostatique, ou à flux d'air coaxial, ou à flux d'air dynamique, ou 30 par gravité, ou par nébulisation (ou « spray drying »), ou encore par extrusion en continu avec le jet sortant coupé à l'aide d'un outil rotatif (appelé Jetcutter, comme avec l'équipement Genialab). Lorsque les gouttes de prémix tombent dans la solution comprenant l'agent de gélification, une agitation peut être réalisée, par exemple à l'aide d'un barreau magnétique, par exemple une vitesse comprise entre 50 et 500tr/min. 35 Avantageusement, le procédé comprend le lavage des microbilles, de préférence avec une solution aqueuse, et encore de préférence de l'eau. 3029422 15 Le procédé de l'invention comprend par exemple la récupération des microbilles par gravité. Lorsque l'agitation est arrêtée, les billes sédimentent au fond du récipient contenant la solution, typiquement le récipient du bain de lavage. On peut retirer par exemple la solution par un dispositif d'aspiration, comme à travers une aiguille dont les 5 caractéristiques (typiquement le diamètre) ne permettent pas le passage des microbilles. Après retrait de la solution, il ne reste que les microbilles dans le récipient, qui peuvent être manipulées pour des opérations ultérieures. La présente invention concerne également des microbilles stériles. Avantageusement les microbilles sont stérilisées à la chaleur humide, typiquement en 10 utilisant un autoclave. Typiquement, les conditions d'autoclave sont une température d'environ 121°C, pendant une durée d'au moins 15 mhutes. Ainsi, la présente invention concerne encore une méthode de stérilisation des microbilles décrites dans l'invention. La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou un dispositif 15 médical comprenant une pluralité des microbilles selon l'invention ou obtenues selon le procédé de l'invention. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique injectable comprenant les microbilles de l'invention. La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou 20 médical consistant en un fluide synovial artificiel. Selon une variante, la composition pharmaceutique ou le dispositif utile dans le traitement d'une pathologie d'une articulation. Selon une variante, la composition pharmaceutique ou le dispositif utile dans le traitement de la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une 25 articulation ou pour ralentir la progression d'une pathologie d'une articulation. La présente invention concerne encore un dispositif médical, éventuellement sous forme d'un ou plusieurs kits d'emballages, éventuellement séparés physiquement, comprenant une seringue, une aiguille et une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'invention, ladite seringue comprenant un réservoir éventuellement pré- 30 rempli de la composition pharmaceutique ou dispositif médical précité. La présente invention concerne un tel dispositif médical pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie articulaire comprenant l'injection d'une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'invention par voie intra-articulaire. La présente invention concerne également des microbilles d'hydrogel selon 35 l'invention, ou obtenues selon l'invention pour son utilisation dans le traitement d'une un dispositif médical est médical est 3029422 16 pathologie, par injection dans le corps humain ou animal, éventuellement présence d'une solution ou hydrogel injectable. Par exemple, l'aiguille utilisée est une aiguille choisie parmi les aiguilles de 18 à 22 gauge, de préférence encore de 22 gauge et plus. Par exemple, l'aiguille utilisée présente 5 des parois normales, fines ou extra-fines. La présente invention concerne encore une méthode de supplément du fluide synovial, en particulier lors d'une pathologie affectant une articulation, comme par exemple l'arthrose (ostéoarthrite ou osteoarthritis) ou des lésions du cartilage, etc. La présente invention concerne encore une méthode de lutte contre la douleur ou 10 l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation. La présente invention concerne encore une méthode de lutte contre une inflammation d'une articulation. Plus spécifiquement, de telles pathologies sont par exemple : l'ostéoarthrite (osteoarthritis) (primaire (idiopathique) ou secondaire), l'arthrite rhumatoïde (rheumatoid 15 arthritis), blessure d'une articulation (par exemple traumatique ou une blessure iée à la mobilité articulaire répétée), une pathologie du cartilage (par exemple. chondrocalcinose ou chondromalacie), arthrite septique. La présente invention concerne encore une méthode de réduction ou de lutte contre la douleur associée avec une maladie, par exemple comme celles précitées, ou 20 encore en ralentir la progression. La présente invention concerne encore une méthode pour améliorer la réparation osseuse, en particulier du cartilage. De telles méthodes comprennent typiquement l'injection intra-articulaire d'une composition comprenant des microbilles selon l'invention. Selon une variante, la méthode 25 selon l'invention comprend une pluralité d'injections. Selon une variante, on peut réaliser une injection une ou deux fois par mois pendant plusieurs mois. Selon une autre variante, on réalise deux injections espacées d'un temps variable. Selon une autre variante, on réalise une seule injection. Les méthodes de l'invention sont utiles à un sujet en ayant besoin, tel que par 30 exemple un sujet nécessitant le traitement d'une pathologie articulaire. Le ou les sites d'injection sont typiquement choisis parmi : un genou, une épaule, une hanche, une articulation temporo- mandibulaire, une articulation carpométacarpienne, un coude, une cheville, un poignet, une articulation de la main, un disque intervertébral, ou une autre articulation. Selon une variante, l'injection est réalisée dans 35 une cavité articulaire, au contact du cartilage. 3029422 17 Plus généralement les microbilles de l'invention sont utilisées en ingénierie tissulaire ou comme vecteurs de composés actifs, en particulier comme vecteurs de composés pharmaceutiquement actifs. Les expressions du type « comprend de... à ... » « compris entre... et... » « allant 5 de... à... » ou leurs équivalents incluent les bornes cités, sauf indication contraire. Selon une variante, les bornes de l'intervalle sont exclues. On couvre par «selon l'invention » ou des termes équivalents, une composition, méthode ou procédé défini tel que dans la présente invention, y compris selon l'une quelconques des variantes, modes de réalisation particuliers ou spécifiques, 10 indépendamment ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons, y compris selon les caractéristiques préférées. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune 15 façon limiter la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité. 20 Ainsi, chaque exemple a une portée générale. D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en masse, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. 3029422 18 Exemples Tableau 1 - Références pour les tailles des aiguilles en vue de l'injection des microbilles selon la norme ISO 9626 (1991 : Amd 1 :2001) Source Gauge Diamètre Diamètre interne (ID) externe (OD) (min - max) (pm) ID parois ID parois ID parois normales/regular Fines/fine extra- (11m) (pm) fines/ultrafine (11m) 1 29 324 - 351 133 190 27 400 - 420 184 241 26 440 - 470 232 292 25 500 - 530 232 292 22 698 - 730 390 440 522 20 860 - 920 560 635 687 19 1030 -1100 648 750 850 18 1200 -1300 790 910 1041 2 23 -620 -325 21 -820 -500 1- "The Gauge system for the medical use" in Anesthesia & Analgesia, 2002 ; les 5 valeurs sont extraites de la norme IS09626:1991/Amd 1:2001. 2- "Does needle size matter ?", in J Diab Sci Technol 1, 725, 2007. Le diamètre externe (OD) (min - max) dénote la tolérance selon la norme précitée. Sauf indication contraire, le diamètre des aiguilles mentionné est celui ID parois 10 normales/regular. Exemple 1 - Préparation d'un prémix de chitosane et d'alginate Le chitosane ultrapur provient de Synolyne Pharma (Belgique). Il est d'origine fongique (champignons de Paris, Agaricus bisporus), et présente les caractéristiques 15 suivantes : degré d'acétylation 14mol% et masse moléculaire viscosimétrique moyenne (Mv) 54000. On solubilise le chitosane à une concentration de 1,5% (m/m) dans une solution d'acide acétique à 1% (v/v). La viscosité dynamique de la solution ainsi obtenue est comprise entre 15 et 25mPa.s (selon la méthode de mesure décrite dans la description). Le pH de la solution est d'environ 4.4. 3029422 19 L'alginate de sodium ultrapur (Pronova UP LVM) provient de Novamatrix (Norvège). Il présente une viscosité dynamique en solution à 1% (mesurée selon la description) de environ 110mPa.s. 5 L'alginate de sodium est solubilisé à la concentration de 1,5% (m/m) dans une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 0,5% (v/v). La viscosité dynamique de la solution ainsi obtenue est comprise entre 110 et 120 mPa.s (selon la méthode de mesure décrite dans la description). Le pH de la solution est d'environ 13. Il n'y a pas eu d'ajout d'agent tampon. 10 Les solutions de chitosane et d'alginate sont mélangées à raison de 66,7m1 de solution de chitosane et 133,3m1 de solution d'alginate, puis elles sont homogénéisées durant 3 minutes à vitesse élevée à l'aide d'un homogénéisateur IKAT18 (IKA, Allemagne). Le résultat est une solution qui ne présente pas de trabécule ou de fibres. Cette solution homogène forme le prémix. Le prémix présente les caractéristiques 15 suivantes : -pH : environ 12,2 ; -Viscosité dynamique : environ 190mPa.s ; -Osmolarité : environ 180mOsm/kg ; Les concentrations finales de chitosane et d'alginate dans le prémix sont de 0,5% (m/m), 20 et 1,0% (m/m), respectivement. Exemple 2 - Préparation des microbilles à l'échelle 200m1 à partir du prémix de chitosane et d'alginate Les gouttes de prémix selon l'exemple 1 sont formées par un procédé 25 électromagnétique de jet laminaire aussi appelé "prilling" avec un équipement "Encapsulator VAR-D (Gen. 2) (Nisco, Zürich, Suisse), connecté à une pompe péristaltique Watson Marlow (Willmington, MA, USA) modèle 520S; équipé d'une buse de diamètre approprié. Dans cet exemple, on utilise une buse de diamètre 100pm, et un débit entre 1 et 3tr/min et une fréquence de 500 à 2500Hz. 30 Les gouttes de prémix selon l'exemple 1 tombent dans une solution de chlorure de calcium de concentration 102mM (15g/1) et sont agitées entre 15min et une heure (plus particulièrement une heure) à l'aide d'un barreau magnétique, à une vitesse de 250tr/min. Les billes sont ensuite lavées à l'eau pour injection (environ un litre à chaque lavage) 6 à 7x. Le bulk est agité environ une minute entre chaque lavage à 250tr/min, à 35 l'aide d'un barreau magnétique. 3029422 20 Les billes sont récupérées par gravité. L'agitation est arrêtée et les billes sédimentent au fond du bain de lavage. Le liquide est enlevé. Lorsque le récipient de récupération est exempt d'eau, les billes sont pesées et la masse nette des billes est ajustée à une masse nette égale à celle du prémix avant production. 5 On obtient en fin de production un récipient contenant une masse connue de billes, ainsi qu'une masse connue d'eau pour injection. Les microbilles présentent un diamètre compris entre 100 et 700um par microscopie optique, et la distribution de diamètre suivante, mesurée par diffractométrie laser selon la méthode de la description: D(0.1) de 250pm, D(0,5) de 430um et D(0.9) de 690um (mesurés). 10 Les billes sont stérilisées à la chaleur humide (autoclave - modèle SYSTEC DX- 23, Wettenberg, Allemagne), à 121°C, pendant 15 mhutes. Les microbilles stérilisées présentent un diamètre mesuré par microscopie optique compris entre 100 et 700um (mesuré selon la méthode de la description). La distribution de diamètre des billes stérilisées est la suivante, mesurée par diffractométrie laser selon 15 la méthode de la description : D(0.1) = 210um D(0,5) = 345um D(0,9) = 550pm. 20 Exemple 3 - Reproductibilité de la préparation de microbilles La préparation de trois lots de prémix est réalisée selon l'exemple 1, au départ de 3 lots de chitosane (dont la viscosité dynamique en solution à 1% est d'environ 15mPa.$), et un lot d'alginate. La viscosité dynamique de la solution de chitosane est d'environ 25mPa.s, et son osmolarité est d'environ 150mOsm/kg. Les trois lots de prémix ont les 25 caractéristiques suivantes : -Viscosité dynamique : entre 160 et 250mPa.s -Osmolarité : environ 175mOsm/kg -pH : environ 12.3 30 On réalise trois lots de microbilles préparées selon l'exemple 2, avec soit une buse de diamètre 150pm, soit avec une buse de diamètre 100pm, en utilisant 50m1 de prémix. Au total, 6 lots de microbilles ont été produits. Les microbilles avant stérilisation présentent la distribution de diamètre rapportées dans le Tableau 2 (selon les méthodes de la description). 35 3029422 21 Tableau 2 - Distribution de taille des microbilles en fonction du diamètre de la buse (valeur minimum et valeur maximum des 3 lots de microbilles) Diamètre de la Distribution de taille buse par diffractométrie laser (min - max de 3 lots) D(0.1) D(0.5) D(0.9) 100pm 140 à 170pm 300 à 320pm 585 à 630pm 150pm 325 à 340pm 475 à 515pm 660 à 750pm On déduit de cet exemple que le procédé de production des billes est robuste, conduisant à des distributions de taille reproductibles. On conclut également que le diamètre de la buse permet de moduler la distribution de taille des microbilles d'hydrogel. 5 On peut, par exemple, obtenir un diamètre D(0,9) de moins de 650pm en utilisant une buse de diamètre 100pm. On vérifie que les microbilles sont facilement injectables au travers d'aiguilles de diamètre variable, par exemple une aiguille adaptée à l'injection intra-articulaire. Les billes récoltées après injection conservent sensiblement la même distribution de taille. 10 Exemple 4 - Préparation de microbilles à l'échelle 500m1 à partir du prémix de chitosane et d'alginate La préparation de prémix est réalisée selon l'exemple 1, avec 1 lot de chitosane dont la viscosité dynamique en solution à 1% est de 12mPa.s. La viscosité 15 dynamique de la solution de chitosane est de 25mPa.s et son osmolarité est de 150mOsm/kg. Une fois le prémix chitosane-alginate réalisé, ses caractéristiques sont les suivantes : -Viscosité dynamique : 210mPa.s -Osmolarité : 175mOsm/kg 20 -pH : 12.3 Les microbilles sont préparées selon l'exemple 2 avec une buse de diamètre 150pm, au départ de 500m1 de prémix. Les microbilles avant stérilisation présentent un diamètre compris entre 100 et 700 lm mesuré par microscopie optique, et la distribution 25 de diamètre mesurée par diffractométrie laser suivante : - D(0,1) = 373pm ; - D(0,5) = 584pm ; - D(0,9) = 892pm. 3029422 22 Les billes sont stérilisées selon la procédure de l'exemple 2, et après stérilisation présentent un diamètre compris entre 100 et 700 lm mesuré par microscopie optique, et la distribution de diamètre mesurée par diffractométrie laser suivante : - D(0,1) = 269um ; 5 - D(0,5) = 401um ; - D(0,9) = 595pm. Les microbilles préparées selon les exemples 2, 3 et 4 présentent une composition homogène, sans trabécules ni des particules solides. 10 La résistance mécanique à la pression manuelle des microbilles préparées selon les exemples 2 à 4 est bonne, et les microbilles sont avantageusement déformables. Les microbilles sont aptes à être injectées par une aiguille fine adaptée à une injection intra-articulaire. Les microbilles conservent leur élasticité et leur distribution de taille après injection 15 à travers une aiguille fine adapté à une injection intra-articulaire, et après stockage pendant 6 mois en milieu aqueux. Exemple 5 - Caractéristiques physico-chimiques des microbilles de l'invention Des billes d'hydrogel à base de chitosane et d'alginate sont préparées selon les 20 méthodes de l'invention (voir exemples 1 et 2) par un procédé de formation des billes électromagnétique à jet laminaire avec une buse de diamètre 100um (procédé 1). Les billes sont également préparées selon la méthode de l'art antérieur décrite selon l'exemple 1 du brevet EP 2538987 B1 (procédé 2). Les paramètres des procédés et la composition des billes obtenues sont résumés dans le Tableau 3, et les caractéristiques 25 physico-chimiques des billes sont données dans le Tableau 4. 3029422 23 Tableau 3- Paramètres des procédés de fabrication de billes d'hydrogel de l'invention (procédé 1) et selon le brevet EP 2538987 B1 (procédé 2) Procédé de préparation Procédé 1 Procédé 2 Composition Chitosane-alginate Chitosane-alginate selon EP 2538987 B1 (exemple selon les 1) exemples 1 et 2 Concentration en chitosane dans les billes finales (exprimé en % m/m dans les billes finales) 0,5% 0.6% Concentration en alginate (exprimé en % m/m dans les billes finales) 1,0% 1,2% Procédé d'homogénéisation du prémix Par cisaillement Par agitation vigoureuse pendant 3 minutes pendant plusieurs minutes Homogénéité du prémix Oui Non (le chitosane forme des trabécules-filaments) Viscosité dynamique du prémix 200-300mPa.s >500mPa.s Technologie de production des gouttes Continue Discontinue (par jet à flux (avec une seringue laminaire)) équipée d'une aiguille 25Ga) Plus petite taille possible pour la formation des gouttelettes d'hydrogel (avant gélation) 100pm (diamètre de environ 250pm (diamètre interne de l'aiguille) la buse) 3029422 24 Tableau 4- Caractéristiques physico-chimiques des billes d'hydrogel Procédé de préparation des billes Procédé 1 Procédé 3 Composition Chitosane-alginate Chitosane-alginate selon selon l'exemple 1 brevet EP 2538987 B1 Diamètre moyen des billes après gélation et avant stérilisation (mesuré par microscopie selon la méthode de la description) 300 ± 5011m 2600 ± 200pm Facilité d'injection intra-articulaire au travers d'une aiguille adaptée Oui Non, les billes ont un diamètre trop élevé Résistance mécanique à la pression manuelle* Bonne Faible (les billes sont (les billes sont déformables) friables) Stabilité - intégrité des billes** Bonne Faible **Evaluation manuelle ***Evaluation manuelle 5 Par ailleurs, afin de déterminer les propriétés élastiques et d'absorption des microbilles d'hydrogel, on réalise des mesures de rhéologie en oscillation à l'aide d'un rhéomètre rotatif avec cisaillement de plateaux, (ARES G2, TA Instrument). Pour pouvoir réaliser les mesures, on ajoute les microbilles à une solution visqueuse d'un biopolymère, à 37°C. On met ainsi en évidence que le module élastique (G, appelé aussi module de 10 stockage) de la solution visqueuse avec les microbilles est significativement supérieur au module G' de la solution du biopolymère sans les microbilles. Cette différence est indicative de l'élasticité des billes et de leur capacité à absorber les chocs en milieu physiologique. En parallèle, on mesure la viscosité de la solution visqueuse avec et sans les microbilles, à 37°C, à l'aide du rhéomètre sous rotation continue, à vitesse croissante, 15 sur une plage de cisaillement déterminée. On observe ainsi que la viscosité n'est pas modifiée par l'ajout des billes. Exemple 6- Stabilité des billes au stockage Les microbilles d'hydrogel sont conservées à 4°C dais une solution aqueuse. 20 Après une durée de stockage de 3 et 6 mois, leur aspect, leur diamètre moyen en nombre et leur distribution de taille, mesurées selon les méthodes de la description, sont inchangés. Les billes sont injectables sans difficulté à travers une aiguille fine, et conservent sensiblement leurs caractéristiques de taille après injection. REVENDICATIONS1.- Microbille d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane et de l'alginate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 90% en masse, le chitosane étant présent une concentration de 0,3 à 10 % en masse et l'alginate étant présent à une concentration de 0,5 à 10% en masse, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel, ladite bille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 pm, ladite bille ne présentant pas de trabécules solides. 2.- Microbille d'hydrogel, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente un D(0,9) compris entre 100 et 950 micromètres. 3.- Microbille d'hydrogel, selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en te que le chitosane est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 0,3 et 5 %, et de préférence de 0,5 et 3 % en masse de chitosane. 4.- Microbille d'hydrogel, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'alginate est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 1 à 10%, et de préférence de 1 à 5 %, en masse. 5.- Microbille d'hydrogel, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est stérile. 25 6.- Procédé pour la préparation de microbilles d'.,layclrogel selon la revendication 1, ledit procédé comprenant (i) le mélange d'une solution aqueuse comprenant un chitosane à pH inférieur à 7 auquel le chitosane est soluble, et d'une solution aqueuse comprenant un alginate à pH supérieur à 7 auquel l'alginate est soluble, ledit mélange comprenant au 30 moins un mélange par cisaillement, ledit mélange étant dénommé « prémix », et (ii) la gélification du prémix sous forme de microbilles par précipitation de gouttes de prémix dans une solution comprenant au moins un agent de gélification du prémix, lesdites microbilles comprenant au moins de l'eau, du chitosane et de l'alginate, -l'eau étant présente à une concentration d'au moins 90% en masse, le chitosane étant présent une 35 concentration de 0,3 à 10 % en masse et l'alginate étant présent à une concentration de 0,5 à 10% en masse, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse 3029422 26 de la microbille d'hydrogel, ladite bille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 pm, ladite microbille ne présentant pas de trabécules solides. 7.- Solution comprenant de l'eau, du chitosane et de l'alginate, dénommée 5 « prémix », caractérisée en ce qu'elle présente un pH supérieur à 12 et apte à former des microbilles telles que définies telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 8.- Solution selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle présente une 10 viscosité dynamique comprise entre 100 et 500 mPa.s. 9.- Composition pharmaceutique ou dispositif médical comprenant une pluralité des microbilles telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou obtenues selon la revendication 6. 15 10.- Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste en un fluide synovial artificiel. 11.- Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9 ou 20 10, pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie d'une articulation. 12.- Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9 ou 10, pour son utilisation dans le traitement de la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation ou pour ralentir la progression d'une pathologie d'une articulation. 13.- Dispositif médical, éventuellement sous forme d'un ou plusieurs kits d'emballages, éventuellement séparés physiquement, comprenant une seringue, une aiguille et une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, ladite seringue comprenant un réservoir éventuellement pré- rempli de la composition pharmaceutique ou dispositif médical précité. 14.- Dispositif médical selon la revendication 13 pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie articulaire comprenant l'injection d'une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 par voie intra-articulaire. 3029422 27 15.- Microbilles d'hydrogel telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou obtenues selon la revendication 6 pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie, par injection dans le corps humain ou animal, éventuellement présence d'une solution ou hydrogel injectable.