Brevet FR3025428A1 — publié le 20160311

Composition pharmaceutique stable comprenant du PDGF [0001] La cicatrisation de certaines plaies, comme les ulcères de pied diabétique, les ulcères veineux et les ulcères de pression, reste à ce jour un problème majeur de santé publique malgré les avancées dans le domaine des bonnes pratiques de soin. [0002] On sait aujourd'hui que cette cicatrisation, des ulcères de pied diabétique, lente et incomplète est due à un processus de cicatrisation qui ne se déroule pas normalement (R. Lobmann et al. J. of Diabetes and its complication, 2006, 20, 329- 335). [0003] Un traitement à base du facteur de croissance PDGF-BB est commercialisé aux Etats-Unis sous la dénomination commerciale Regranex° dans l'indication du traitement de l'ulcère de pied diabétique. Il se présente sous forme de gel pour application topique et permet de promouvoir la cicatrisation des ulcères par la favorisation de la prolifération cellulaire et donc la formation de nouveaux tissus. [0004] Cependant ce traitement est coûteux, en raison du coût du PDGF-BB et de la dose utilisée, soit 6,25 pg/crn2/j (calculé à partir de http://www.rxlist.com/regranex-drug/indications-dosage.html). En plus la formulation sous forme de gel comprenant une carboxyméthylcelluiose sodique (CMC) implique dans le processus de traitement de laver la plaie entre chaque application journalière de Regranex® pour éliminer les résidus de CMC restants. Cette élimination nécessaire des résidus de la CMC induit un ralentissement de la cicatrisation car chaque intervention sur la plaie crée un traumatisme sur celle-ci. [0005] La formulation de PDGF-BB utilisée dans Regranex® n'est donc pas optimale, notamment du fait qu'une partie importante du PDGF-BB n'est pas effectivement utilisée du fait de sa dégradation rapide et/ou de son élimination journalière lors des phases de lavage du traitement. [0006] On connait au nom de la demanderesse un brevet européen EP1940448 qui décrit notamment une composition pharmaceutique comprenant un complexe PDGF/polysaccharide destinée à favoriser la cicatrisation. Ces compositions ont été testées, les résultats finaux sur 195 patients démontrent la «non infériorité» de ladite ° composition vis-à-vis de Regranexet ce, pour l'ensemble des doses utilisées. 3025428 2 [0007] Afin de pouvoir offrir un produit plus efficace, plus confortable dans l'utilisation et apportant des doses réduites de facteur de croissance pour des raisons de prix et d'effets secondaires potentiels et sous forme d'une formulation aqueuse stable, des recherches complémentaires ont été menées. 5 [0008] De façon surprenante, la stabilité, et donc l'efficacité, ont pu être améliorées et une composition sous forme de solution aqueuse stable à température ambiante, c'est-à-dire 25°C, pendant trois mois a pu être mise au point. [0009] Dans un mode de réalisation, la stabilité a été démontrée à 30°C. 10 [00010] La présente invention consiste ainsi en une composition, sous forme de solution aqueuse stable à 25°C pendant au moins 3 mois, comprenant au moins un polysaccharide fonctionnalisé et un PDGF-BB, caractérisée en ce que ledit polysaccharide fonctionnalisé comprend un taux d'anhydrides mixtes résiduels 15 inférieur à 2 0/0 et est choisi parmi les polysaccharides fonctionnalisés de formule I ci- après : Formule I - les polysaccharides ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 20 1 kg/mol et 500 kg/mol, étant choisis dans le groupe constitué des dextranes et des hydroxyéthyl amidons (HES) - R, bras de liaison, étant un radical comprenant entre 1 et 10 atomes de carbone, éventuellement branché ou substitué, éventuellement insaturé et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s) et/ou un ou plusieurs 25 hétéroatome(s) choisi parmi 0, N et S G étant une fonction amide résultant du couplage entre une fonction acide carboxylique du précurseur du bras de liaison R et la fonction amine d'un tryptophane, 3025428 3 - F étant une fonction résultant du couplage entre le précurseur du bras de liaison R et une fonction alcool du polysaccharide, F étant choisie parmi les fonctions éther, ester ou carbamate, - Trp étant un reste de tryptophane, L et/ou D, produit dudit couplage entre la 5 fonction amine du tryptophane et une fonction acide carboxylique portée par le précurseur du radical R, - R1 étant un radical comprenant entre 1 et 10 atomes de carbone, éventuellement branché ou substitué, éventuellement insaturé et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s) et/ou un ou plusieurs 10 hétéroatome(s) choisi parmi O, N et S, - F1 étant une fonction résultante du couplage entre le précurseur du radical R1 et une fonction alcool du polysaccharide, F1 étant choisie parmi les fonctions éther, ester ou carbamate, j, compris entre 0,2 et 0,8, représentant le degré de substitution en -F-R-G-Trp 15 par unité saccharidique, - i, compris entre 0,1 et 1,8, représentant le degré de substitution en -F1-R1- COOX par unité saccharidique, i+j étant compris entre 0,5 et 2, - X représentant un cation, et 20 la fonction acide carboxylique du tryptophane étant sous forme de carboxylate de X. [00011] Dans un mode de réalisation, X représente des cations alcalins. [00012] Dans un mode de réalisation, les cations alcalins sont choisis dans le 25 groupe constitué par Na+ et K+. [00013] Brève description des figures : [00014] La figure 1 illustre un dispositif de conditionnement et de pulvérisation (1). [00015] La Figure 2 illustre un dispositif (1) comprenant des moyens de 30 positionnement (4). [00016] La Figure 3 illustre un dispositif amovible (6) comprenant des moyens de positionnement (4). [00017] Les figures 4 et 5 présentent les stabilités de formulations selon l'invention et de formulations comparatives. Les abscisses représentent le temps en mois et les 35 ordonnées l'activité résiduelle du PDGF-BB par rapport au temps t=0 en 'Vo. Les courbes en pointillés correspondent à la formulation selon l'invention et les courbes pleines correspondent à la formulation comparative. 3025428 4 [00018] Selon un mode de réalisation, ladite composition est stable à 30°C, et en particulier à 40°C, pendant au moins 3 mois. [00019] Par « composition ou formulation stable à Y°C pendant x mois» on entend que la composition ou la formulation conservée x mois à Y°C présente un ED50 5 supérieur ou égal à 50 0/0, notamment supérieur ou égal à 60 0/0, de l'ED50 de la composition à tO. Ces mesures étant effectuées selon le protocole décrit en exemple 6. [00020] L'ED50 est la concentration de PDGF-BB nécessaire pour obtenir 50% de l'activité mitogène maximale. 10 [00021] Par «degré de substitution en Z », on entend au sens de la présente invention le nombre moyen de motif Z par unité saccharidique. [00022] La teneur en anhydrides mixtes résiduels des polysaccharides fonctionnalisés étant determinée selon le protocole décrit en exemple 3, à savoir par 15 dosage en chromatographie en phase gazeuse par détection par ionisation de flamme (GC-FID) de l'éthanol formé suite au traitement en milieu basique desdits polysaccharides. [00023] Dans un mode de réalisation, i est compris entre 0,2 et 1,2. [00024] Dans un mode de réalisation, i est compris entre 0,4 et 1,0. 20 [00025] Dans un mode de réalisation, j est compris entre 0,3 et 0,7. [00026] Dans un mode de réalisation, j est compris entre 0,35 et 0,6. [00027] Dans un mode de réalisation, i+j est compris entre 0,6 et 1,7. [00028] Dans un mode de réalisation, i+j est compris entre 0,8 et 1,4. [00029] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides, dextranes et 25 hydroxyéthyl amidons (HES), sont, avant substitution par les substituants -F1-R1- COOX et -F-R-G-Trp, à l'état natif, c'est-à-dire qu'après substitution ils ne comportent pas de substituant autre que -F1-R1-COOX et -F-R-G-Trp. [00030] Ils peuvent être synthétisés selon des techniques connues de l'Homme de l'Art ou achetés auprès de fournisseurs, par exemple Pharnnacosnnos, Serumwerk, 30 Fresenius,Sigma-Aldrich, NOF Corp. ou CarboMer Inc. [00031] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide avant substitution par les substituants -F1-R1-COOX et -F-R-G-Trp, est choisi dans le groupe constitué des polysaccharides de masse molaire moyenne en poids comprise entre 5 kg/mol et 250 35 kg/mol. [00032] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide avant substitution par les substituants -F1-R1-COOX et -F-R-G-Trp, est choisi dans le groupe constitué des 3025428 5 polysaccharides de masse molaire moyenne en poids comprise entre 10 kg/mol et 100 kg/mol. [00033] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide avant substitution par les substituants -F1-R1-COOX et -F-R-G-Trp est choisi dans le groupe constitué des 5 polysaccharides de masse molaire moyenne en poids comprise entre 20 kg/mol et 90 kg/mol. [00034] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide avant substitution par les substituants -F1-R1-COOX et -F-R-G-Trp est choisi dans le groupe constitué des polysaccharides de masse molaire moyenne en poids comprise entre 1,5 kg/mol et 10 750 kg/mol. [00035] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide avant substitution par les substituants -F1-R1-COOX et -F-R-G-Trp fonctionnalisé est choisi dans le groupe constitué des polysaccharides de masse molaire moyenne en poids comprise entre 7,5 15 kg/mol et 375 kg/mol. [00036] Dans un mode de réalisation, le le polysaccharide avant substitution par les substituants -F1-R1-COOX et -F-R-G-Trp est choisi dans le groupe constitué des polysaccharides de masse molaire moyenne en poids comprise entre 15 kg/mol et 150 kg/mol. 20 [00037] Dans un mode de réalisation, le le polysaccharide avant substitution par les substituants -F1-R1-COOX et -F-R-G-Trp est choisi dans le groupe constitué des polysaccharides de masse molaire moyenne en poids comprise entre 30 kg/rnol et 135 kg/rnol. [00038] Dans un mode de réalisation, le le polysaccharide avant substitution par les 25 substituants -Fl-R1-COOX et -F-R-G-Trp est choisi dans le groupe des dextranes. [00039] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide fonctionnalisé est choisi dans le groupe constitué des dextranes fonctionnalisés illustrés, de manière arbitraire, par la formule II, ci-après : 30 Formule II dans laquelle : 3025428 6 chaque groupe L représente indépendamment -OH, -F-R-G-Trp, ou -F1-R1-COOX, avec F, R, G, Trp, F1, R1, et X, ayant les définitions données pour la Formule I, les degrés de substitution en -F1-R1-COOX et en -F-R-G-Trp, respectivement appelés i et j, ayant les valeurs données pour la Formule I, et 5 les dextranes présentent une masse molaire moyenne en poids comprise entre 1 kg/mol et 500 kg/mol. [00040] Dans un mode de réalisation, les dextranes sont choisis dans le groupe des dextranes de masse molaire moyenne en poids comprise entre 5 kg/mol et 10 250 kg/mol. [00041] Dans un mode de réalisation, les dextranes sont choisis dans le groupe des dextranes de masse molaire moyenne en poids comprise entre 10 kg/mol et 100 kg/mol. [00042] Dans un mode de réalisation, les dextranes sont choisis dans le groupe des 15 dextranes de masse molaire moyenne en poids comprise entre 20 kg/mol et 90 kg/mol. [00043] Dans une mode de réalisation, le dextrane a une masse molaire moyenne en poids d'environ 40 kg/mol. 20 [00044] Dans un mode de réalisation, le polysacharide fonctionnalisé est un hydroxyéthyl amidon (HES) fonctionnalisé. [00045] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide fonctionnalisé est choisi dans le groupe constitué des hydroxyéthyl amidons (HES) fonctionnalisés, illustrés, de manière arbitraire, par la formule III, ci-après : 25 Formule III dans laquelle : 3025428 7 chaque groupe L représente indépendamment -OH, -F-R-G-Trp, ou -F1-R1-COOX, avec F, R, G, Trp, F1, R1, et X, ayant les définitions données pour la Formule I, les degrés de substitution en -F1-R1-COOX et en -F-R-G-Trp, respectivement appelés i et j, ayant les valeurs données pour la Formule I, 5 - les HES présentent un degré de substitution en radical hydroxyéthyl allant de 0,1 à 1,4 par unité saccharidique, - les HES présentent une masse molaire moyenne en poids comprise entre 5 kg/mol et 250 kg/mol. 10 [00046] Dans un mode de réalisation les HES sont choisis dans le groupe des HES de masse molaire moyenne en poids comprise entre 5 kg/mol et 250 kg/mol. [00047] Dans un mode de réalisation, les HES sont choisis dans le groupe des HES de masse molaire moyenne en poids comprise entre 10 kg/mol et 100 kg/mol. [00048] Dans un mode de réalisation, les HES sont choisis dans le groupe des HES 15 de masse molaire moyenne en poids comprise entre 20 kg/mol et 90 kg/mol [00049] Selon un mode de réalisation, les HES présentent un degré de substitution en radical hydroxyéthyl allant de 0,2 à 1,0 par unité saccharidique. [00050] Selon un mode de réalisation, les HES présentent un degré de substitution en radical hydroxyéthyl allant de 0,3 à 0,8 par unité saccharidique. 20 [00051] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide fonctionnalisé comprend un taux d'anhydrides mixtes résiduels inférieur à 1,5 0/0. [00052] Dans un mode de réalisation, le radical R comprend entre 1 et 10 atomes 25 de carbone, et est une chaine, éventuellement branchée ou substituée, éventuellement insaturée et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s). [00053] Dans un mode de réalisation, le radical R comprend entre 1 et 3 atomes de carbone, et est une chaine, éventuellement branchée ou substituée. [00054] Dans un mode de réalisation, le radical R comprend 3 atomes de carbone, 30 et est une chaine. [00055] Dans un mode de réalisation, le radical R1comprend entre 1 et 10 atomes de carbone, et est une chaine, éventuellement branchée ou substituée, éventuellement insaturée et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s). [00056] Dans un mode de réalisation, le radical R1 comprend entre 1 et 3 atomes de 35 carbone, et est une chaîne, éventuellement branchée ou substituée. [00057] Dans un mode de réalisation, le radical R comprend 3 atomes de carbone, et est une chaine. 3025428 8 [00058] Dans un mode de réalisation, le radical R et le radical R1, identiques ou différents, sont choisis parmi les radicaux de formule IV suivante : R.; p R4 Formule IV 5 dans laquelle : - p est un entier supérieur ou égal à 1 et inférieur ou égal à 9, et, El R3 et R4 identiques ou différents sont choisis dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un alkyle saturé ou insaturé, linéaire, ramifié ou cyclique en Ci à C6, 10 un benzyle, un alkyle-aryle en C7 à C10 et comportant éventuellement des hétéroatomes choisis dans le groupe constitué par 0, N et/ou S, ou des fonctions choisies dans le groupe constitué par les fonctions acide carboxylique, amine, alcool ou thiol. 15 [00059] Dans un mode de réalisation, le précurseur du radical R, avant rattachement au radical Trp, est choisi parmi les groupes suivants, dans lesquels * représente le site de rattachement à F: 20 ou leurs sels de cations alcalins choisis dans le groupe constitué de Na÷ ou e. [00060] Dans un mode de réalisation, le motif R1-COOX est choisi parmi les groupes suivants, dans lesquels * représente le site de rattachement à F1 : 25 OX OX OX ox ox 3025428 9 avec X représentant un cation, notamment un cation alcalin, en particulier choisi dans le groupe constitué par Na+ et K+. [00061] Dans un mode de réalisation, les radicaux R et R1 sont identiques. 5 [00062] Dans un mode de réalisation, les radicaux R et R1 sont des radicaux -CH2-, [00063] Dans un autre mode de réalisation, les radicaux R et R1 sont différents. [00064] [00065] 10 [00066] [00067] [00068] [00069] [00070] 15 [00071] éthers. [00072] Dans un mode de réalisation, la fonction F est une fonction éther. Dans un mode de réalisation, la fonction F est une fonction carbamate. Dans un mode de réalisation, la fonction F est une fonction ester. Dans un mode de réalisation, la fonction F1 est une fonction éther. Dans un mode de réalisation, la fonction F1 est une fonction carbarnate. Dans un mode de réalisation, la fonction F1 est une fonction ester. Dans un mode de réalisation, la fonction F est identique à la fonction F1. Dans un mode de réalisation, les fonctions F et F1 sont des fonctions Dans un mode de réalisation, les fonctions F et F1 sont des fonctions carbamates. [00073] 20 esters. Dans un mode de réalisation, les fonctions F et F1 sont des fonctions [00074] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide fonctionnalisé répond à la Formule I dans laquelle le poysaccharide est un dextrane, les fonctions F et F1 sont identiques, et les radicaux R et R1 sont identiques. 25 [00075] Dans un mode de réalisation particulier, le polysaccharide fonctionnalisé répond à la Formule I dans laquelle le polysaccharide est un dextrane, F et Flsont des fonctions éther, et R et R1 sont des radicaux -CH2-- [00076] Dans un mode de réalisation particulier, le polysaccharide fonctionnalisé 30 répond à la Formule I dans laquelle : - le polysaccharide est un dextrane, - F et F1 sont des fonctions éther, - R et R1 sont des radicaux -CH2-, i est compris entre 0,4 et 1,0, 35 - j est compris entre 0,35 et 0,6, i+j est compris entre 0,8 et 1,4 et le taux d'anhydrides mixtes résiduels est inférieur à 1,5 0/0. 3025428 10 [00077] Dans un mode de réalisation particulier, le polysaccharide fonctionnalisé répond à la Formule I dans laquelle : le polysaccharide est un dextrane de masse molaire moyenne en poids d'environ 40 kg/mol, 5 F et F1 sont des fonctions éther, - R et R1 sont des radicaux -CH2-, est compris entre 0,4 et 1,0, j est compris entre 0,35 et 0,6, - i+j est compris entre 0,8 et 1,4 et 10 le taux d'anhydrides mixtes résiduels est inférieur à 1,5 %. [00078] Dans un mode de réalisation, le PDGF-BB est choisi dans le groupe constitué paries PDGFs recombinants humains comportant deux chaînes B (rhPDGFBB). La chaine B est notamment décrite dans la base de données Uniprot sous le 15 n°P01127. [00079] Selon un mode de réalisation, le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme de dimères de polypeptides, chaque polypeptide comprenant les deux séquences suivantes: 20 - une séquence ayant une homologie d'au moins 80 0/0 avec SEQ ID NO : 1, et - une séquence ayant une homologie d'au moins 80 9/0 avec SEQ ID NO : 2. [00080] Selon un mode de réalisation, le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme de dimères de polypeptides, chaque polypeptide comprenant les deux séquences suivantes: 25 - une séquence ayant une homologie d'au moins 90 °/0 avec SEQ ID NO : 1, et - une séquence ayant une homologie d'au moins 90 0/0 avec SEQ ID NO : 2. [00081] Selon un mode de réalisation, le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme de dimères de polypeptides, chaque polypeptide comprenant les deux séquences suivantes: 30 - une séquence ayant une homologie d'au moins 95 % avec SEQ ID NO : 1, et - une séquence ayant une homologie d'au moins 95 0/0 avec SEQ ID NO : 2. [00082] Selon un mode de réalisation, le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme dimère de polypeptides, chaque polypeptide comprenant une séquence SEQ ID NO : 1 et une séquence SEQ ID NO : 2 ayant une ou plusieurs substitutions des acides 35 aminés cystéine correspondant aux résidus 10, 16, 19 et 20 de SEQ ID NO : NO : 2. [00083] Les pourcentages d'homologie auxquels il est fait référence dans l'exposé de la présente invention se comprennent en termes de similarité ou d'identité de 3025428 11 séquences et désignent l'étendue selon laquelle les séquences sont identiques ou fonctionnellement ou structuralement similaires sur une base de nucléotide par nucléotide ou sur une base d'aminoacide par aminoacide sur une fenêtre de comparaison. La comparaison entre deux séquences est traditionnellement réalisée 5 en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison pouvant être réalisée par segment ou par «fenêtre de comparaison ». Les pourcentages d'homologie selon l'invention sont déterminés sur la base d'un alignement global des séquences à comparer, c'est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité, en utilisant par exemple l'algorithme de 10 Needleman et Wunsch O. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970). En particulier, cette comparaison de séquences peut être effectuée à l'aide du logiciel needle notamment disponible sur le site internet de « European Bioinfornnatics Institute » (ebi.ac.uk). [00084] Selon un mode de réalisation, le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme de dimères de polypeptides, chaque polypeptide comprenant les deux 15 séquences suivantes: - une séquence SEQ ID NO : 1, et - une séquence SEQ ID NO : 2. [00085] La SEQ ID NO : 1 (ici nommée zone 1 de PDGF-B) étant : 20 CKTRTEVFEISRRLI. [00086] La SEQ ID NO : 2 (ici nommée zone 2 de PDGF-B) étant : NANFLVW PPCVEVQRCS GCCNNRNVQC RPTQVQLRPV QVRKIEIVRK KPIFKKATVT LED H LACKCE. [00087] Les séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 ou les séquences qui présentent au moins 80 °h, 90 9/0 ou 95 °h d'homologie avec celles-ci consistent 25 chacune en une partie séparée et non chevauchante de la séquence d'acides aminés du polypeptide. [00088] Selon un mode de réalisation le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme de dimères de polypeptides dans lesquels les séquences SEQ ID NO : 1 et 30 SEQ ID NO : 2 ou les séquences qui présentent au moins 80 0/0, 90 9/0 ou 95 % d'homologie avec SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 sont distantes de 1 à 10 acides aminés, notamment de 1 à 5, et en particulier de 3 acides aminés. [00089] Selon un mode de réalisation le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous 35 forme de dimères de polypeptides ayant une ou plusieurs des modifications suivantes de SEQ ID NO : 3 a) une ou plusieurs substitutions des acides aminés cystéine correspondant aux résidus 43, 49, 52 et 53 de SEQ ID NO : 3, 3025428 12 b) la délétion d'1 à 14 des acides aminés aux positions 1-14 de SEQ ID NO : 3, et c) la délétion de 1 à 9 acides aminés aux positions 101-109 de SEQ ID NO : 3. [00090] Selon un mode de réalisation le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous 5 forme de dimères de polypeptides comprenant une séquence ayant une homologie d'au moins 80 9/0 avec SEQ ID NO : 3. [00091] Selon un mode de réalisation le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme de dimères de polypeptides comprenant une séquence ayant une homologie d'au moins 90 % avec SEQ ID NO : 3. 10 [00092] Selon un mode de réalisation le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme de dimères de polypeptides comprenant une séquence ayant une homologie d'au moins 95 % avec SEQ ID NO : 3. [00093] Selon un mode de réalisation le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme de dimères d'une protéine comprenant la séquence SEQ ID NO : 3. 15 [00094] La SEQ ID NO : 3 (ici nommé zone 3 de PDGF-B)étant : SLGSLTIAEP AMIAECKTRT EVFEISRRLI DRTNANFLVW PPCVEVQRCS GCCNNRNVQC RPTQVQLRPV QVRKIEIVRK KPIFKKATVT LEDHLACKCE TVAAARPVT En particulier, le PDGF-BB est choisi parmi les protéines sous forme de dimères de 20 polypeptide comprenant une séquence codé par le cDNA de séquence SEQ ID NO : 4 suivante : AGCCTGGGTTCCCTGACCATTGCTGAGCCGGCCATGATCGCCGAGTGCAAGACGCGCACCGA GGTGTTCGAGATCTCCCGGCGCCTCATAGACCGCACCAACGCCAACTTCCTGGTGTGGCCGC CCTGTGTGGAGGTGCAGCGCTGCTCCGGCTGCTGCAACAACCGCAACGTGCAGTGCCGCCCC 25 ACCCAGGTGCAGCTGCGACCTGTCCAGGTGAGAAAGATCGAGATTGTGCGGAAGAAGCCAAT CTI-TAAGAAGGCCACGGTGACGCTGGAAGACCACCTGGCATGCAAGTGTGAGACAGTGGCAG CTGCACGGCCTGTGACCT. [00095] Dans un mode de réalisation, le PDGF-BB est le rhPDGF-BB (recombinant 30 human PDGF-BB), dont la DCI est bécaplermine. [00096] Le PDGF-BB peut être produit par divers procédé de génie génétique. [00097] En particulier le PDGF-BB peut être obtenu par expression recombinante dans une bactérie, comme le procédé décrit dans l'exemple 1.1., ou encore selon un 35 procédé basé sur les données publiées par Karumuri N.N. et al. (Biotechnol. Lett, 2007, pp 1333-1339), par exemple tel que décrit dans l'exemple 1.2. [00098] Le PDGF-BB peut encore être produit par expression recombinante dans une levure, notamment via Saccharomyces cerevisiae, tel que décrit par P.A. 3025428 13 d'Hemecourt et al. dans « WOUNDS : A comprendium of Clinical Research and Practice », 1998, pp69-75, et dans le mennorandum du 9 décembre 1997 déposée à la FDA dans le cadre du dossier REGRANEX (becaplermin), sous la référence BLA-96- 1408. Un PDGF-BB obtenu par par expression recombinante dans une levure est 5 encore décrit dans le brevet US4845075 de Zymogenetics. [00099] Les PDGF-BB peuvent ainsi être choisis parmi les PDGF-BB recombinants humains, obtenus selon les techniques connues de l'Homme de l'Art ou achetés auprès de fournisseurs comme par exemple auprès des sociétés Gentaur (USA) ou Research Diagnostic Inc. (USA). 10 [000100] Dans un mode de réalisation, la concentration en PDGF-BB est comprise entre 0,01 et 10 mg/ml. [000101] Dans un mode de réalisation, la concentration en PDGF-BB est comprise entre 0,05 et 2 mg/ml. 15 [000102] Dans un mode de réalisation, la concentration en PDGF-BB est comprise entre 0,1 et 0,5 mg/ml. [000103] Dans un mode de réalisation, la concentration en PDGF-BB est d'environ 0,25 mg/ml. [000104] Dans un mode de réalisation, la concentration en polysaccharide 20 fonctionnalisé est comprise entre 0,1 et 150 mg/ml. [000105] Dans un mode de réalisation, la concentration en polysaccharide fonctionnalisé est comprise entre 1 et 100 mg/ml. [000106] Dans un mode de réalisation, la concentration en polysaccharide fonctionnalisé est comprise entre 3 et 37,5 mg/ml. 25 [000107] Dans un mode de réalisation, la concentration en polysaccharide fonctionnalisé est d'environ 12,5 mg/ml. [000108] Dans un mode de réalisation, le ratio pondéral polysaccharide fonctionnalisé/ PDGF-BB est compris entre 10 et 200. 30 [000109] Dans un mode de réalisation, le ratio pondéral polysaccharide fonctionnalisé/ PDGF-BB est compris entre 20 et 100. [000110] Dans un mode de réalisation, le ratio pondéral polysaccharide fonctionnalisé/ PDGF-BB est compris entre 30 et 75. [000111] Dans un mode de réalisation, le ratio pondéral polysaccharide/PDGF-BB est 35 d'environ 50. 3025428 14 [000112] Selon un autre mode de réalisation, la composition est sous forme de poudre, par exemple obtenue par lyophilisation de la composition sous forme de solution acqueuse ci-dessus décrite. [00011]] L'invention concerne également une formulation pharmaceutique 5 comprenant au titre d'ingrédient actif une composition selon l'invention telle que décrite ci-dessus. [000114] L'invention concerne également une formulation pharmaceutique comprenant au titre d'ingrédient actif une composition selon l'invention telle que ci-dessus décrite pour une utilisation comme médicament destiné à favoriser la 10 cicatrisation de plaies. [000115] Dans un mode de réalisation elle concerne également une formulation pharmaceutique comprenant au titre d'ingrédient actif une composition selon l'invention telle que ci-dessus décrite pour une utilisation comme médicament destiné à favoriser la cicatrisation de plaies chroniques. 15 [000116] L'invention concerne également une formulation pharmaceutique une formulation pharmaceutique comprenant au titre d'ingrédient actif une composition selon l'invention telle que ci-dessus décrite, pour son utilisation comme médicament destiné à favoriser la cicatrisation de plaies. [000117] Dans un mode de réalisation la formulation pharmaceutique pour son 20 utilisation comme médicament destiné à favoriser la cicatrisation de plaies est utilisée selon une posologie comprise entre 1 et 25 pg/cm2, tous les 2 jours, pendant une durée au maximum de 20 semaines. [000118] Dans un mode de réalisation la posologie est d'une durée de au plus seize semaines, ou encore au plus douze semaines. 25 [000119] Dans un mode de réalisation la posologie est comprise entre 2 et 20 pg/cnn2 tous les deux jours. [000120] Selon un mode de réalisation, la dose est comprise entre 2,5 et 15 pg/cm2 tous les deux jours. [000121] Selon un mode de réalisation, la dose est de 4,2 pg/cm2, tous les deux 30 jours. [000122] La durée des applications peut correspondre au temps nécessaire pour que la plaie soit refermée. [000123] Selon un mode de réalisation et en fonction de la nature des plaies, la formulation pharmaceutique est appliquée au minimum pendant une semaine. 35 [000124] Les plaies peuvent être des atteintes entrainant une perte de tissu cutané, comme les brûlures, des destructions des tissus, comme des abrasion ou des plaies résultants de l'intégration de greffe de peau. 3025428 15 [000125] Les plaies chroniques peuvent être des ulcères, comme l'ulcère du pied diabétique, l'ulcère veineux de la jambe, et les escarres, [000126] Selon un mode de réalisation, les plaies chroniques sont des ulcères de pied diabétique. 5 [000127] La formulation pharmaceutique selon l'invention est de préférence une formulation à application locale et/ou topique pouvant se présenter sous la forme d'une solution éventuellement administrée via des moyens de pulvérisation. 10 [000128] La présente invention concerne encore un ensemble comprenant un dispositif de conditionnement et de distribution (1) et une formulation pharmaceutique selon l'invention (7), ledit dispositif de conditionnement et de distribution (1) comprenant un récipient (2) comprenant la formulation (7), 15 - des moyens de distribution (3) de type pompe montés sur le récipient (2), lesdits moyens de distribution (3) comprenant des moyens de pulvérisation (8) et des moyens anti-retours permettant d'éviter le reflux de la formulation dans le récipient, - des moyens d'étanchéité permettant d'éviter le passage de flux de l'extérieur 20 vers l'intérieur du dispositif, hormi via des moyens d'entrée d'air permettant d'équilibrer la pression interne du dispositif avec la pression externe après chaque pulvérisation, via un flux d'air provenant de l'extérieur, et - des moyens de protection de la formulation contre la contamination microbienne. [000129] Les moyens de protection de la formulation vis-à-vis de la contamination 25 bactérienne peuvent être des moyens de filtration de l'air entrant dans le récipient, permettant audit air entrant d'être dépourvu de contamination microbienne. [000130] Lesdits moyens de filtration peuvent être une membrane présentant une porosité d'au plus 200 nm. [000131] Les moyens de protection de la formulation vis-à-vis de la contamination 30 bactérienne peuvent être une enveloppe souple solidarisée avec les moyens de distribution (3) de manière étanche, ladite enveloppe souple comprenant la formulation. [000132] Avantageusement, le dispositif (1) comprend également des moyens de positionnement (4), permettant de positionner les moyens de pulvérisation (8) à la 35 distance souhaitée (d). [000133] Ces moyens de positionnement (4) comprennent au moins une partie (5) destinée à être en contact avec une surface de peau saine. En particulier, les moyens de positionnement comprennent deux parties (5). Ces parties (5) peuvent être planes, 3025428 16 c'est-à-dire présenter une largeur au moins égale à la moitié du diamètre extérieur du récipient (2). [000134] Ces moyens de positionnement (4) peuvent être disposés sur un dispositif amovible (6) apte à être fixé sur le dispositif de conditionnement et de distribution 5 (1), en particulier sur une partie distale par rapport aux moyens de pulvérisation (8). [000135] Un tel dispositif (1) permet la délivrance d'une quantité précise de composition par pulvérisation. La présence des moyens de positionnement (4) permettant le contrôle de la distance de pulvérisation (d), cela permet ainsi la délivrance d'une dose précise de PDGF-BB par cm2 par pulvérisation. 10 [000136] Un ensemble tel que défini ci-dessus peut permettre le maintien de la stérilité de la formulation pendant au moins 30 mois avant la première ouverture du dispositif la contenant et/ou pendant au moins 6 semaines en conditions d'usage, c'est-à-dire pulvérisation tous les 2 jours. Par « stérilité » on entend la définition telle 15 que fournie par la Pharmacopée Européenne 6.0, point 2.6.1. [000137] Dans un mode de réalisation, la formulation pharmaceutique comprend en outre des excipients pharmaceutiques. [000138] La nature des excipients susceptibles d'être formulés avec la composition selon l'invention est choisie en fonction de sa forme de présentation selon les 20 connaissances générales du galéniste. [000139] Ces excipients peuvent être utilisés dans cette invention afin d'ajuster les paramètres de la formulation pharmaceutique comme un tampon pour ajuster le pH, un agent permettant d'ajuster l'isotonicité, des conservateurs antimicrobiens ou encore un agent anti-oxydant comme le chlorhydrate de L-lysine. 25 [000140] Selon un mode de réalisation la formulation pharmaceutique est dépourvue de conservateurs antimicrobiens. [000141] En particulier la formulation pharmaceutique est dépourvue des conservateurs antimicrobiens suivants : parabens, notamment parahydroxybenzoate 30 de benzyle, parahydroxybenzoate de butyle, parahydroxybenzoate de propyle, parahydroxybenzoate d'éthyle, et parahydroxybenzoate de méthyle, m-crésol et phénol. [000142] Par « formulation pharmaceutique dépourvue de conservateurs antimicrobiens » on entend que la composition ne comprend pas de composé(s) en 35 teneur(s) telle(s) qu'il(s) permet(tent) à ladite composition de répondre aux critères d'efficacité de la conservation antimicrobienne tels que définis dans la Pharmacopée Européenne 6.0 point 5.1.3. 3025428 17 [000143] Dans un mode de réalisation, la formulation pharmaceutique est caractérisée en ce que la concentration en PDGF-BB est comprise entre 10 pg et 10 ring/ml. [000144] Dans un autre mode de réalisation, la formulation pharmaceutique est 5 caractérisée en ce que la concentration en PDGF-BB est comprise entre 100 et 1000 pg/ml. [000145] Selon un mode de réalisation, la formulation pharmaceutique est appliquée à une dose comprise entre 1 et 25 pg/cm2 tous les deux jours. Ces applications 10 peuvent être effectuées pendant au plus vingt semaines, voire au plus seize semaines, ou encore au plus douze semaines. [000146] Selon un mode de réalisation, la formulation pharmaceutique est appliquée à une dose comprise entre 2 et 20 pgicrn2 tous les deux jours. Ces applications peuvent être effectuées pendant au plus vingt semaines, voire au plus seize semaines, 15 ou encore au plus douze semaines. [000147] Selon un mode de réalisation, la formulation pharmaceutique est appliquée à une dose comprise entre 2,5 et 15 pg/cm2 tous les deux jours. Ces applications peuvent être effectuées pendant au plus vingt semaines, voire au plus seize semaines, ou encore au plus douze semaines. 20 [000148] Selon un mode de réalisation, la formulation pharmaceutique est appliquée à une dose de 4,2 pg/cm2, tous les deux jours. Ces applications peuvent être effectuées pendant au plus vingt semaines voire au plus seize semaines, ou encore au plus douze semaines. [000149] La durée des applications peut correspondre au temps nécessaire pour que 25 la plaie soit refermée. [000150] Selon un mode de réalisation et en fonction de la nature des plaies, la formulation pharmaceutique est appliquée au minimum pendant une semaine. [000151] L'invention concerne également le protocole d'application suivant. 30 [000152] La plaie doit être séchée avec une gaze stérile avant application de la composition. [000153] Le dispositif comprenant la formulation doit être tenu dans une position verticale permettant la pulvérisation de la formulation. Avant la première utilisation, le dispositif de pulvérisation doit être activé plusieurs fois, afin d'amorcer correctement 35 la pulvérisation. [000154] L'administration de la quantité souhaitée par unité de surface est effectuée via une seule pulvérisation de la formulation à une distance spécifique. Cette distance peut être fixée par les moyens de positionnemnt ci-dessus décrits. Plusieurs 3025428 18 pulvérisations pouvant être effectuées afin de couvrir la totalité de la surface de la plaie, si celle-ci le nécessite, de manière à limiter la zone couverte par 2 pulvérisations. [000155] La formulation présente sur la peau saine à la limite de la plaie doit être 5 soigneusement essuyée, en revanche la formulation présente sur la plaie, y compris les bords de la plaie, doit être laissée telle que déposée et ne doit pas être essuyée ni tamponnée. [000156] Ensuite un pansement, en particulier un pansement semi-perméable, est placé de manière à recouvrir la plaie. 10 [000157] Ces étapes sont répétées tous les deux jours jusqu'à fermeture de la plaie ou pendant au plus 20 semaines, selon le délai le plus court, à l'exception de l'amorçage du dispositif qui ne doit être réalisé que lors de la première utilisation. [000158] L'invention concerne également un procédé ou une méthode de stabilisation d'une formulation comprenant un polysaccharide et un PDGF-BB 15 caractérisé en ce que le taux d'anhydrides mixtes résiduels est abaissé en dessous de 2 0/0. [000159] Dans un mode de réalisation, il est abaissé en dessous de 1,5 °/0. [000160] Selon encore un autre de ses aspects, l'invention concerne un procédé de 20 préparation de polysaccharides fonctionnalisés de Formule I ci-après : Polysaccharide - Formule I les polysaccharides ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 1 kg/mol et 500 kg/mol, et étant choisis dans le groupe constitué des 25 dextranes et des hydroxyéthyl amidons (HES) - R, bras de liaison, étant un radical comprenant entre 1 et 10 atomes de carbone, éventuellement branché ou substitué, éventuellement insaturé et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s) et/ou un ou plusieurs hétéroatonne(s) choisi parmi O, N et S F1 [TrpG 3025428 19 - G étant une fonction amide résultant du couplage entre une fonction acide carboxylique du précurseur du bras de liaison R et la fonction amine d'un tryptophane, - F étant une fonction résultante du couplage entre le précurseur du bras de 5 liaison R et une fonction alcool du polysaccharide, F étant choisie parmi les fonctions éther, ester ou carbamate, - Trp étant un reste de tryptophane, L et/ou D, produit dudit couplage entre la fonction amine du tryptophane et une fonction acide carboxylique portée par le précurseur du radical R, 10 - R1 étant un radical comprenant entre 1 et 10 atomes de carbone, éventuellement branché ou substitué, éventuellement insaturé et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s) et/ou un ou plusieurs hétéroatome(s) choisi parmi O, N et S, - F1 étant une fonction résultante du couplage entre le précurseur du radical R1 15 et une fonction alcool du polysaccharide, F1 étant choisie parmi les fonctions éther, ester ou carbamate, - j, compris entre 0,2 et 0,8, représentant le degré de substitution en -F-R-G-Trp par unité saccharidique, - i, compris entre 0,1 et 1,8, représentant le degré de substitution en 20 COOX par unité saccharidique, - i+j étant compris entre 0,5 et 2, - X représentant un cation, et - la fonction acide carboxylique du tryptophane étant sous forme de carboxylate de X, 25 comprenant les étapes suivantes : - amidification d'au moins une partie des fonctions acides carboxyliques d'un polysaccharide choisi parmi les dextranes et les HES fonctionnalisés par un radical porteur d'une fonction acide carboxylique libre activée par formation d'un anhydride mixte, 30 - diminution du taux d'anhydrides mixtes résiduels à moins de 2 %, et - récupération du polysaccharide fonctionalisé de Formule I. [000161] Lorsque les fonctions acides carboxyliques sont portées par des radicaux R1 et R différents, les méthodes de protection et déprotection utilisées en synthèse sont 35 appliquées pour amidifier sélectivement les fonctions acides carboxyliques portées par le radical -F-R-COOH. [000162] Selon un mode de réalisation l'étape de diminution du taux d'anhydrides mixtes résiduels à moins de 2 % est réalisée dans des conditions de saponification 3025428 20 douces, notamment par passage durant l'étape de purification par diafiltration de volumes de soude 0,01N à température ambiante. [000163] Un tel procédé présente l'avantage d'être simple, notamment via 5 l'utilisation du tryptophane sous forme acide aminé, et de conduire à des compositions comprenant ledit polysaccharide fonctionnalisé et du POGF-BBayant une stabilité améliorée. EXEMPLES 10 Exemple 1 : Mode de préparation du PDGF-BB Exemple 1.1 : Préparation de PDGF-BB par voie bactérienne 15 a. Transformation de la souche Bactérienne [000164] Le PDGF-B, SEQ ID NO : 4 de l'ADNc utilisé, est cloné dans un vecteur pET24b entre les sites Ndel et Hind3. [000165] Pour transformer la souche bactérienne, un tube de E. coli BL21(DE3) compétentes est décongelé sur glace. Dans un tube pré-refroidi, on dépose 1 pl de 20 plasmide pET24b/PDGF-B et 20 pl de bactéries compétentes. Après 5 minutes d'incubation sur glace, un choc thermique est réalisé par incubation à 42°C pendant 30 secondes. Le tube est immédiatement refroidi sur glace pendant 2 minutes avant ajout de milieu de culture contenant 97% (v/v) de milieu YES (30 g/L de Yeast Extract and 5g/L de NaCI), 2% (v/v) de glucose et 1% (v/v) de MgCl2. Les bactéries sont 25 incubées 1h à 37°C avec agitation à 270 tours par minute puis déposées sur une boite de Pétri contenant du milieu YES Agar et 100 mg/mi de Kanamycine. La boite est incubée pendant 16h à 37°C. Une colonie est alors isolée. b. Fabrication d'une pré-Master Cell Bank 30 [000166] Une colonie de E.coli BL21(DE3) transformée par du pET24b / PDGF-B isolée sur boite de pétri de l'exemple 1.1.a est inoculée dans 250 mL de milieu YES contenant 50 pg/ml de kanamycine. L'opération est répétée une seconde fois. Les deux flacons sont alors incubées à 37°C sous agitation (270 tours par minute) et la densité optique à 600 nm est suivie jusqu'à obtenir une densité optique supérieure à 35 1 [000167] Une des cultures est sélectionnée et centrifugée 30 minutes à 5020g à 4°C. Le culot est resuspendu dans 100 mL de milieu YES contenant 15% de glycérol. La 3025428 21 banque ainsi obtenue est aliquotée par 1 ml dans des tubes pour cryocongélation et conservée à 4°C pour analyse et utilisation ultérieure. [000168] Les analyses permettant de caractériser cette banque sont les suivantes : 5 Comptage de colonies sur boite [000169] Des dilutions successives de la pré-Master Cell Bank sont réalisées après décongélation d'un tube. Ces dilutions sont analysées sur boite de Petri sans antibiotique. Un millilitre de la banque est d'abord dilué dans 9 ml de NaCI 0,9% stérile. La suspension cellulaire est diluée successivement en répétant la même 10 opération jusqu'à obtenir des facteurs de dilution supérieurs à 10-7. 100 pL de ces dilutions sont alors déposées sur boite de Pétri contenant du milieu YES Agar afin d'obtenir des boites contenant 10 à 300 colonies. Après incubation sur la nuit à 37°C, le nombre de colonies (CFU) correspondant à une dilution définie est évalué dans chaque boite contenant entre 10 et 300 colonies. Le titre microbien (CFU/ml) est alors 15 calculé en multipliant le nombre de colonies sur la boite par le facteur de dilution. Dans le cas de la pre-Master Cell Bank de l'exemple, le titre est de 3,89 108 CFU/mL. Coloration Gram [000170] La membrane cellulaire des bactéries est colorée en violet par de l'oxalate 20 de cristal violet. Après fixation et décoloration par l'alcool-acétone, les bactéries de la banque cellulaire E.coli BL21(DE3) / pET24b PDGF-B deviennent roses confirmant que ces bactéries sont bien gram négatives. Observation microscopique 25 [000171] Les bactéries de E.coli I BL21(DE3) pET24b / PDGF-B colonies apparaissent sous la forme de bâtonnets de petite taille avec parfois des bâtonnets plus long, formes compatibles avec des bactéries de souche E.coli [000172] Les colonies sont de forme circulaires, de couleur crème, brillantes, convexes et sans hétérogénéité, comme attendu pour ce type de bactéries. 30 Stabilité plasmidique [000173] La stabilité plasmidique est déterminée par des cultures successives en flasque dans du milieu YES et sans antibiotique sur environ 100 générations. A chaque transfert, un échantillon est dilué et mis sur boite afin d'obtenir des colonies 35 individuelles. 100 colonies sont alors transférées sur des boites avec et sans kanamycine (100 mg/mi). Le ratio entre le nombre de colonies poussant sur boite contenant l'antibiotique et celle ne contenant pas l'antibiotique donne le pourcentage de stabilité plasmidique. 3025428 22 Tableau 1 : stabilité plasmidique en fonction du nombre de générations pour la pré- Master Cell Bank E.coli I BL21(DE3) pET24b / PDGF-BB 5 Séquençage double brin [000174] La séquence du gène codant pour le PDGF-B insérée dans le plasmide pET24b est contrôlée en utilisant des « primers » dirigés contre les séquences promotrices et terminatrices du T7 situées sur le plasmide pET24b. 10 Primers utilisé: T7 prom: 5' - TAA-TAC-GAC-TCA-CTA-TAG-GG - 3' (SEQ ID NO : 5) T7 term: 5' - CTA-GTT-ATT-GCT-CAG-CGG-T - 3' (SEQ ID NO : 6) [000175] Les résultats obtenus démontrent que la séquence des deux brins obtenue correspond bien à celle de l'ADNc du PDGF-B décrite dans la SEQ ID NO : 4. 15 c. Production du PDGF-BB par fermentation sous contrôle d'IPTG [000176] A partir de cette pré-Master Cell bank, une Master Cell Bank et une Working Cell Bank sont obtenues et caractérisées selon le même type de critères. [000177] La fermentation décrite ci-dessous peut-être adaptées à différentes 20 échelles en fonction des quantités nécessaires de protéine. Dans cet exemple, la fermentation est réalisée sur un réacteur de 50L. Deux vials de la Working Cell Bank de E.coli BL21(DE3) pET24b / PDGF-BB sont décongelés et inoculés chacun dans 500 mL de milieu YEGP sans antibiotique dans des flasques de 2L. Après incubation environ 6h à 37°C sous agitation (270 tours par minute), un densité optique à 600 nm 25 comprise entre 1 et 3 est obtenue. [000178] L'une des cultures est choisie pour ensemencer un fermenteur de 50L contenant 42 L de milieu PPM. La croissance des bactéries est réalisée sous contrôle Fed batch de glucose jusqu'à une densité optique comprise entre 45 et 55. L'induction de la production de PDGF-B est alors réalisée par ajout de 1 mM IPTG pendant 5h. Le 30 PDGF-B surexprimé se retrouve dans les corps d'inclusion des bactéries et ces bactéries sont alors récoltées et centrifugées. 3025428 23 d. Purification du PDGF-BB [000179] Les bactéries contenant du PDGF-B sont alors récoltées et centrifugées. Après resuspension, elles sont homogénéisées et centrifugées afin d'éliminer les débris cellulaires et de récolter les corps d'inclusion contenant le PDGF-BB. Ces derniers sont 5 lavés puis centrifugés et congelés pour purification ultérieure. [000180] Une méthode de purification consiste à resuspendre le PDGF-B dans un tampon contenant du l'urée, du chlorhydrate de guanidium ou du thiocyanate de guanidinium afin de dénaturer ces corps d'inclusion. Après filtration, le PDGF-B dénaturé peut être purifié par chromatographie en phase inverse par chargement sur 10 une résine de type Source 30 RPC et élution dans une phase mobile contenant de l'acétonitrile. [000181] Le PDGF-B ainsi purifié peut être renaturé par dilution dans un milieu de renaturation contenant des agents favorables à la renaturation comme un tampon de type Tris, un sel d'Arginine, et un mélange d'agent oxydant et réducteur comme du 15 glutathion réduit et oxydé. Après dilution, le PDGF-B se replie et se dimérise en PDGF- BB pour adopter une structure tridimensionnelle dimérique lui permettant d'être actif. Trois ponts disulfure intra chaîne et deux ponts inter chaîne sont aussi formés. LE PDGF-BB replié est alors être purifié notamment par chromatographie d'échange ce cations avant d'être diafiltré contre son tampon de stockage et conservé congelé. 20 Exemple 1.2 : Préparation de PDGF-BB par voie bactérienne [000182] Du PDGF-BB est obtenu par un procédé « voie bactérienne » de la manière suivante : 25 1. clonage du PDGF-BB, dans un plasmide sous contrôle du promoteur T7 et contenant le gène de résistance à l'Ampicilline, 2. transformation de bactéries similaires aux BL21 DE(3) et constitution de banques cellulaires, 3. fermentation puis induction par ajout d'isopropyl 8-D-1-thiogalactopyranoside, 30 ou IPTG en abrégé, avant la récolte des cellules, 4. lyse cellulaire et purification des corps d'inclusion, 5. dénaturation des corps d'inclusion et purification du PDGF-B dénaturé par chromatographie en phase inverse puis repliement et dinnérisation par dilution dans un tampon Tris-EDTA, et enfin 35 6. diafiltration finale contre le tampon de stockage de la protéine. 3025428 24 Exemple 2 : Synthèse de polysaccharides fonctionnalisés Exemple 2.1 : Synthèse du dextraneméthylcarboxylate de sodium substitué par le L-tryptophane selon le procédé 1 (Polysaccharide fonctionnalisé 1) 5 [000183] Un dextraneméthylcarboxylate de sodium issu d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids d'environ 40 kg/mol (Pharmacosmos) et avec un degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates de sodium de 1,16 par unité saccharidique est synthétisé selon les procédés décrits dans les demandes de brevets W01999/29734, W02010/041119 ou FR12/60808. 10 [000184] La solution de dextraneméthylcarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anion(que) pour obtenir le dextraneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures. [000185] 150 g de dextraneméthylcarboxylique acide (0,76 mol fonction méthylcarboxylique acide) sont solubilisés dans le DMF puis refroidis à 0°C. Une fois la 15 solution de polymère à 0°C, 84,5 g (0,83 mol) de N-méthylmorpholine (NMM) et 90,6 g (0,83 mol) d'ethyl chloroformate (EtOCOCI) sont ensuite ajoutés. Après 10 minutes de réaction, 66,8 g (0,33 mol) de L-tryptophane (Roth) sont ajoutés. Le milieu est ensuite maintenu à 10°C durant 30 minutes. Le milieu est ensuite chauffé à 30°C. A 20°C, une solution aqueuse d'imidazole (103,4 g, 1,52 mol) est ajoutée. La 20 solution est purifiée par diafiltration sur membrane PES 10 kD contre NaCI (0,9%), NaOH (0,01N), et de l'eau. La concentration de la solution de polysaccharide est déterminée par extrait sec. D'après l'extrait sec : [Polysaccharide fonctionnalisé 1] = 41,3 mg/g [000186] D'après l'analyse UV : le degré de substitution en acides 25 nnéthylcarboxyliques modifiés par le L-tryptophane par unité saccharidique est de 0,45. Exemple 2.2 : Synthèse du 2-hydroxyéthyl éther d'amidon méthylcarboxylate de sodium substitué par le L-tryptophane selon le procédé 1 (Polysaccharide 30 fonctionnalisé 3) [000187] Un 2-hydroxyéthyl éther d'amidon méthylcarboxylate de sodium issu d'un 2-hydroxyéthyl éther d'amidon (CAS 9005-27-0, masse molaire moyenne en poids d'environ 70 kg/mol, degré de substitution en hydroxyéthyl de 0,4, Serumwerk) avec un degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions 35 nnéthylcarboxylates de sodium de 1,14 par unité saccharidique est synthétisé selon les procédés décrits dans les demandes de brevets W01999/29734, W02010/041119 ou FR12/60808. 3025428 25 [000188] Par un procédé similaire à celui décrit pour la préparation du Polysaccharide fonctionnalisé 1, un 2-hydroxyéthyl éther d'amidon méthylcarboxylate de sodium substitué par le L-tryptophane est obtenu. [000189] D'après l'extrait sec : [Polysaccharide fonctionnalisé 3] = 21,3 mg/g 5 [000190] D'après l'analyse UV : le degré de substitution en acides nnéthylcarboxyliques modifiés par le L-tryptophane par unité saccharidique est de 0,40. Exemple comparatif 2.3 : Synthèse du dextraneméthylcarboxylate de sodium 10 substitué par le L-tryptophane selon le procédé 2 (Polysaccharide fonctionnalisé 2) [000191] Un dextraneméthylcarboxylate de sodium issu d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids d'environ 40 kg/mol (Pharmacosmos) et avec un degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates de sodium 15 de 1,03 par unité saccharidique est synthétisé selon les procédés décrits dans les demandes de brevets W01999/29734, W02010/041119 ou FR12/60808. [000192] La solution de dextraneméthylcarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le dextraneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures. 20 [000193] 135,1 g de dextraneméthylcarboxylique acide (0,675 mol fonction méthylcarboxylique acide) sont solubilisés dans le DMF puis refroidis à 0°C. Une fois la solution de polymère à 0°C, 68,3 g (0,675 mol) de NMM et 73,2 g (0,675 mol) de EtOCOCI sont ajoutés. Après 10 minutes, 62 g (0,30 mol) de L-tryptophane (Roth) sont ajoutés. Le milieu est ensuite maintenu à 10°C durant 30 minutes. Le milieu est 25 ensuite chauffé à 30°C. A 20°C, une solution aqueuse d'imidazole (91,9 g, 1,35 mol) est ajoutée au milieu. La solution est purifiée par diafiltration sur membrane PES 10 kD contre NaCI (0,9%) puis de l'eau. La concentration de la solution de polysaccharide est déterminée par extrait sec. [000194] D'après l'extrait sec : [Polysaccharide fonctionnalisé 2] = 39,4 mg/g 30 [000195] D'après l'analyse UV : le degré de substitution en acides méthylcarboxyliques modifiés par le L-tryptophane par unité saccharidique est de 0,41. [000196] Le degré de substitution en radicaux -F-R-G-Trp, ou j est déterminé par analyse UV à 280 nm selon la méthode suivante. 35 [000197]La concentration massique de la solution mère à analyser est déterminée par perte à la dessication. La solution est ensuite diluée à une concentration de 0,1 mg/g et l'absorbance de la solution diluée est mesurée par spectrométrie UV à 280 nm. La quantité molaire (mmol) de -Trp par g de polysaccharide fonctionnalisé (tr,p) 3025428 26 est alors déterminé en appliquant la loi de Beer-Lambert en utilisant le coefficient d'extinction molaire de l'acétyle tryptophane. Le degré de substitution en radicaux -FR-G-Trp, j est alors obtenu par la formule suivante : tTrp x ( 162 + DScarboxylate X 80) 1000(1 - (tTrp ) (1000 x 186) 5 avec t-rrp étant la quantité molaire (mmol) de Trp par g de polysaccharide fonctionnalisé et DScarboxylate le degré de substitution en carboxylate avant greffage du tryptophane. Exemple 3 Quantification des anhydrides mixtes résiduels présents sur les 10 polysaccharides fonctionnalisés [000198] Un polysaccharide fonctionnalisé 1 préparé selon l'Exemple 2.1 et un polysaccharide fonctionnalisé 2 préparé selon l'Exemple 2.3 sont analysés pour doser la quantité d'anhydrides mixtes résiduels présents sur le polysaccharide. La quantité d'anhydrides mixtes résiduels présents sur le polysaccharide a été déterminée par 15 dosage de l'éthanol formé suite à l'hydrolyse en milieu basique de ces derniers. L'éthanol formé est dosé en chromatographie gazeuse avec une détection par ionisation de flamme (GC-FID). [000199] L'éthanol libre résultant de la réaction de greffage et restant sous forme de trace dans la solution de polysaccharide est d'abord dosé. 20 [000200] Les anhydrides mixtes présents sur chaque polysaccharide sont ensuite hydrolysés par ajout d'hydroxyde de sodium 10 N (10 pL dans 500 pL de solution de polysaccharide) ce qui conduit à la formation d'éthanol qui est dosé par GC-FID. [000201] Pour doser la quantité d'éthanol avant et après traitement par ajout d'hydroxyde de sodium à la solution de polysaccharide, le protocole suivant est utilisé. 25 [000202] A partir de chaque solution de polysaccharide avant et après traitement par ajout d'hydroxyde de sodium, cinq solutions sont préparées. Ces solutions contiennent une même concentration de polysaccharide, une concentration d'étalon interne (isopropanol) de 20 pg par g de solution, et une concentration en éthanol ajouté de 5, 10, 20, 40 et 80 pg par g de solution. 30 [000203] Ces solutions sont ensuite filtrées à l'aide d'un filtre à centrifuger (seuil de coupure de 10 kD) pendant 45 minutes à 5000 G pour éliminer le polysaccharide. [000204] L'éthanol récupéré dans le filtrat est dosé par GC-FID avec injection directe en utilisant un gradient de température commençant à 40°C pendant 1 minute, puis une augmentation de 20°C par minute jusqu'à 260°C. 35 [000205] La concentration en éthanol est calculée par la méthode des ajouts dosés avec étalon interne. 3025428 27 [000206] Résultats : 34 pg d'éthanol par g de polysaccharide fonctionnalisé 1 et 357 pg d'éthanol par g de polysaccharide fonctionnalisé 2 ont été mesurés dans les solutions de polysaccharide fonctionnalisé 1 et polysaccharide fonctionnalisé 2, respectivement. 5 [000207] Après ajout d'hydroxyde de sodium à la solution de chacun des polysaccharides, 1774 pg d'éthanol par g de polysaccharide fonctionnalisé 1 et 4823 pg d'éthanol par g de polysaccharide fonctionnalisé 2 ont été mesurés. [000208] Par différence, on en déduit que les anhydrides résiduels présents sur le polysaccharide ont conduit par ajout de d'hydroxyde de sodium à la formation de 1740 10 pg d'éthanol par g de polysaccharide fonctionnalisé 1 et 4466 pg d'éthanol par g de polysaccharide fonctionnalisé 2. [000209] Sachant que la masse molaire moyenne du motif des polysaccharides utilisés dans ce dosage est respectivement de 339 g/mol pour le polysaccharide fonctionnalisé 1 et de 302 g/mol pour le polysaccharide fonctionnalisé 2, les résultats 15 exprimés en pourcentage molaire d'anhydrides mixtes résiduels présents sur les polysaccharides sont rassemblés dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Résultats de la quantification des anhydrides mixtes résiduels présents sur les polysaccharides. 20 Exemple 4 : Préparation d'une formulation rhPDGF-BB/polvsaccharide Exemple 4.1 : Préparation d'une formulation comprenant 0,25 mg/mL de 25 rhPDGF-BB et 12,5 mg/mL de polysaccharide fonctionnalisé 1 (Formulation 1) [000210] La Formulation 1 (dont la composition finale est spécifiée dans le Tableau 3 ci-dessous) est préparée par mélange de 1 L d'une solution de polysaccharide fonctionnalisé 1 à 25 mg/mL, sodium phosphate 20 mM, 300 mOsrn/kg, pH 7,2 et de 30 1 L d'une solution de rhPDGF-BB à 0,5 mg/mL, 300 mOsm/kg telles que préparées ci- après. Polysaccharide Polysaccharide fonctionnalisé 1 fonctionnalisé 2 Pourcentage molaire d'anhydrides mixtes résiduels présents sur le polysaccharide 1,3 90 2,9 9/0 3025428 28 [000211] La solution de polysaccharide fonctionnalisé 1 à 25 mg/mL est préparée à partir de polysaccharide fonctionnalisé 1 (synthétisé selon l'Exemple 1) lyophilisé. Pour cela, 28 g de lyophilisat de polysaccharide fonctionnalisé 1 sont remis en solution par 750 g de solution de tampon sodium phosphate 20 mM, pH 7. Le pH de la solution de 5 polysaccharide fonctionnalisé 1 est ensuite ajusté à 7,2 par 1,5 g de solution d'hydroxyde de sodium 1 N. L'osmolalité est ajustée à 300 mOsm/kg par ajout de 20 g d'une solution de chlorure de sodium à 30 9/0 (w/v). Enfin, la solution de polysaccharide fonctionnalisé 1 est diluée à 25 mg/mL par ajout de 216,8 g d'une solution de sodium phosphate 20 mM, 300 mOsm/kg, à pH 7. 1 L d'une solution de 10 polysaccharide fonctionnalisé 1 à 25 mg/mL, sodium phosphate 20 mM, 300 mOsm/kg, pH 7,2 est ainsi obtenu. [000212] De façon alternative, la solution de polysaccharide fonctionnalisé 1 à 25 mg/mL peut être directement préparée à partir d'une solution suffisament concentrée de polysaccharide fonctionnalisé 1, de tampon sodium phosphate 200 mM pH 7 et 15 d'une solution de chlorure de sodium à 30 °h (w/v). [000213] La solution de rhPDGF-BB à 0,5 mg/mL est préparée à partir de 198,5 g d'une solution filtrée de rhPDGF-BB obtenu selon l'exemple 2 à 2,56 mg/mL par addition de 829,5 g de chlorure de sodium 0,9 9/0 (w/v). 1L d'une solution de rhPDGF- 20 BB à 0,5 mg/n1L, 300 nnOsnn/kg est ainsi obtenu. Formulation 1 rhPDGF-BB (0,25 mg/mL) Polysaccharide 1 (12,5 mg mL) Tampon sodium phosphate (10 mM) Chlorure de sodium (0,8% w/v) Hydroxyde de sodium (0,5 mM) Eau Tableau 3 : Formulation 1 25 Exemple 4.2 : Préparation de variantes de la Formulation 1 [000214] La formulation rhPDGF-BB/polysaccharide fonctionnalisé 1 peut également être préparée à des concentrations en rhPDGF-BB et en polysaccharide fonctionnalisé 1 qui sont différentes de celles selon l'Exemple 4.1. Une formulation rhPDGF-BB (1 rrig/mL) / polysaccharide fonctionnalisé 1 (50 mg/mL) est par exemple préparée par 30 mélange de 1 L d'une solution de polysaccharide fonctionnalisé 1 à 100 mg/mL, 3025428 29 sodium phosphate 20 mM, 300 mOsm/kg, pH 7,2 et de 1 L d'une solution de rhPDGFBB à 2 mg/mL, 300 mOsm/kg. [000215] La Formulation 1 (préparée selon l'Exemple 4.1) peut également être préparée en remplaçant le tampon sodium phosphate par un tampon de sel 5 hydrochlorhydrate de Tris(hydroxylméthyl)aminométhane (Tris), ou par un tampon de phosphate de potassium. [000216] La Formulation 1 (préparée selon l'Exemple 4.1) peut également être préparée en remplaçant le chlorure de sodium par un ou plusieurs autres agents de tonicité e.g. chlorure de potassium, mannitol, sorbitol, glycérine, 10 dextrose, sucrose, tréhalose et/ou maltose. [000217] La Formulation 1 (préparée selon l'Exemple 4.1) peut également être préparée en remplaçant l'hydroxyde de sodium par un autre agent d'ajustement de pH e.g. citrate de sodium, diéthanolamine, sulfate de sodium, sulfate d'ammonium, hydroxyde de potassium ou borate de sodium. 15 Le Tableau 4 ci-dessous présente quelques exemples de variantes de la Formulation 1. Formulation 2 Formulation 3 Formulation 4 Formulation 5 rhPDGF-BB (1 mg/mL) rhPDGF-BB (0,25 -mg/mL) rhPDGF-BB (1 mg/mL) rhPDGF-BB (0,75 ma/mL) Polysaccharide fonctionnalisé 1 (50 Polysaccharide fonctionnalisé 1 Polysaccharide fonctionnalisé 1 Polysaccharide fonctionnalisé 1 mg/mL) (12,5 mg/mL) (50 ring/mL) (37,5 mg/mL) Tampon sodium phosphate (10 mM) Tampon potassium phosphate (10 mfrP Tampon potassium phosphate (10 mM) Tampon potassium phosphate (10 mM) Chlorure de sodium (0,45% w/v) Chlorure de sodium , (0,8% w/v) Chlorure de sodium (0,45% w/v) Hydroxyde de sodium (1,7 mM) Chlorure de sodium (0,56% w/v) Hydroxyde de sodium (1,4 mM) Hydroxyde de sodium (1,7 nnM) Hydroxyde de sodium (0,5 mM) Eau Eau Eau Eau 20 Tableau 4 : Variantes de la Formulation 1 3025428 30 Exemple comparatif 5 Préparation d'une formulation rhPDGF- BB/polvsaccharide fonctionnalisé Une formulation comprenant 0,25 nng/mL de rhPDGF-BB et 12,5 mg/nnL de polysaccharide fonctionnalisé 2 (Formulation A), voir tableau 5, est préparée selon le 5 même protocole que celui décrit à l'exemple 4.1. Tableau 5 : Formulation A 10 Exerr71:- 6 : Mise en évidence de la stabilité des formulations rhP GF- BB/polvsaccharide fonctionnalisé [000218] La stabilité des formulations rhPDGF-BB/polysaccharide est déterminée par mesure de l'ED50, i.e. concentrations de rhPDGF-BB nécessaire pour obtenir 50% de l'activité mitogène maximale, comparativement à l'activité de la formulation à t=0 15 conservée à -80°C. [000219] La stabilité des formulations a été testée à 30°C et 40°C sur une durée s'étendant jusqu'à 3 mois ou 6 mois avec plusieures mesures intermédiaires. [000220] Des cellules HDFa (Human Dermal Fibroblasts adult ; Life Technologies) sont cultivées en flasque de 75 cnn2 (Dutscher) en milieu de culture MEM 20 alpha (Minimum Essential Medium Eagle alpha ; Life Technologies) additionné de 10 % de SVF (Sérum de Veau Foetal ; Sigma) jusqu'à ce qu'elles soient entre les passages 2 et 8. [000221] A il, le milieu de culture est éliminé et les cellules lavées avec du PBS (Phosphate Buffered Saline ; Life Technologies) à raison de 10mL de PBS par flasque. 25 Les cellules sont décollées à la trypsine (Life Technologies) à raison de 1nnL de trypsine par flasque, pendant 3 minutes à température ambiante. Le décollement des cellules est vérifié au microscope. L'action de la trypsine est stoppée par ajout de 9mL de milieu de culture MEM alpha additionné de 10 96 de SVF. Les cellules sont Formulation A rhPDGF-BB (0,25 mg/mL) Polysaccharide fonctionnalisé 2 (12,5 nne/mL Tampon sodium phosphate (10 mM) Chlorure de sodium (0,8% w/v) drox de de sodium 0 5 mM Eau 3025428 31 comptées sur cellule de Malassez. Le nombre de cellules par flasque doit être compris entre 2 et 4 millions. [000222] Les cellules sont centrifugées à 365 g pendant 5 minutes à température ambiante. Le surnageant est éliminé et le culot cellulaire est repris avec du milieu de 5 culture MEM alpha additionné de 0,5 % de SVF à raison de 100000 cellules par mL. 100 pL du culot cellulaire repris sont alors distribués par puit d'une plaque de culture cellulaire 96 puits (Dutscher). [000223] A J2, les cellules HDFa sont activées avec les différentes formulations rhPDGF-BB/polysaccharide. Pour chaque formulation, température et temps de 10 cinétique à analyser, on dépose sur la même plaque une gamme préparée à partir de la formulation incubée à la température et au temps désiré ainsi qu'une gamme de la même formulation conservée à -80°C depuis le temps t=0.Les gammes sont réalisées selon la procédure suivante : [000224] Une gamme de dilution de deux en deux (concentrations de rhPDGF-BB 15 allant de 250 ng/mL à 0,5 ng/mL) de chaque formulation de rhPDGFBB/polysaccharide (Formulation 1 et Formulation A) est réalisée dans du milieu MEM alpha contenant 0,5% de SVF. 25pL de chaque dilution sont alors ajoutés dans les puits de la plaque de culture préparée à J1 en duplicats. [000225] Des contrôles ne comportant pas de rhPDGF-BB sont également déposés 20 sur les plaques (i.e. contrôle négatif : milieu de culture MEM alpha 0.5% SVF final ; contrôle positif : MEM alpha 10% SVF final). Les plaques sont ensuite incubées pendant 2 heures à 37°C sous atmosphère contenant 5% de CO'. 12,5 pL de solution BrdU (Bromodéoxyuridine ; fournie dans le Kit Cell proliferation ELISA BrdU, Roche Applied Science) diluée au 1/100 en milieu MEM alpha additionné de 0,5% de SVF sont 25 alors ajoutés par puits. Les plaques sont ensuite incubées pendant 22h à 37°C sous atmosphère contenant 5% de CO2. [000226] A J3, l'incorporation de BrdU est révélée: La solution BrdU diluée en milieu de culture est éliminée. 200pL de solution Fix Denat (fournie dans le Kit ELISA) sont déposés par puits. Après incubation pendant 30 minutes à température ambiante, la 30 solution Fix Denat est éliminée. La solution stock anti-BrdU-POD (fournie dans le Kit ELISA et préparée en reconstituant le lyophilisat anti BrdU POD dans 1,1 mL d'eau doublement distillée pendant 10 min sous agitation) est extemporanément diluée au 1/100 dans 10mL d'Antibody Dilution Solution (fournie dans le kit ELISA). 100pL de solution anti-BrdU-POD diluée sont déposés par puits. Après incubation pendant 1 35 heure et 30 minutes à température ambiante, la solution anti-BrdU-POD est éliminée. Quatre lavages successifs sont ensuite effectués en distribuant puis éliminant 250pL de PBS-Tween 0,06% par puits. Le Substrate Connponent B (fourni dans le Kit ELISA) est alors extemporanément dilué au 1/100 avec le Substrat Component A (fourni dans 3025428 32 le Kit ELISA). 100pL de la solution de substrat obtenue sont déposés par puits. Un film opaque est disposé sur le fond de la plaque. Dans les 15 minutes qui suivent l'ajout de la solution de substrat, la luminescence est mesurée avec un lecteur de plaque EnVision (Perkin Elmer) et une durée d'intégration de 900ms. 5 [000227] Les ED50 sont calculées pour chaque formulation rhPDGF-BB/polysaccharide et chaque temps et température après une régression non linéaire à 4 paramètres par la méthode des moindres carrés résiduels en utilisant le logiciel Excel (Microsoft). [000228] Le pourcentage d'activité au temps t par rapport à l'activité à t=0 est 10 calculée par le rapport de l'ED50 du temps t=0 divisé par l'ED50 au temps t multiplié par 100. [000229] Les résultats de stabilité concernant la Formulation 1 préparée avec le polysaccharide fonctionnalisé 1 en comparaison avec la Formulation A préparée avec le polysaccharide fonctionnalisé 2 sont présentés en Figure 4 (stabilité à 30°C) et 15 Figure 5 (stabilité à 40°C). [000230] Dans les Figures 4 et 5 les abscisses représentent le temps en mois et les ordonnées l'activité résiduelle du PDGF-BB par rapport au temps t=0 en 9/0. Les courbes en pointillés correspondent à la formulation 1 et les courbes pleines correspondent à la formulation A. 20 [000231] Il est clairement mis en évidence que la stabilité de la formulation 1 comprenant un polysaccharide fonctionnalisé dont le taux d'anhydrides mixtes résiduels est inférieur à 2 0/0 est améliorée par rapport à la formulation A selon l'art antérieur. 25 Exemple 7 : Utilisation d'une formulation l'invention dans le traitement de plaies chroniaues [000232] La composition est une formulation topique comprenant du PDGF-BB recombinant sous forme de solution à appliquer sur la plaie, au moyen d'un dispositif comprenant un récipient équipé de moyens de distribution de type pompe. 30 [000233] L'administration est effectuée en positionnant la buse du pulvérisateur à environ 1,8 cm de la plaie. [000234] Cette distance est sensiblement respectée grâce à un dispositif démontable qui se fixe sur le flacon et qui permet d'être à la distance adéquate entre le pulvérisateur et la plaie. Ce dispositif, démontable, est en polypropylène. 35 [000235] La composition est la Formulation 1 décrite dans l'exemple 4.1, c'est une, solution stérile, claire et incolore qui contient 0,25 mg/mi de rh PDGF-BB et 12,5 mg/rinl de polysaccharide fonctionnalisé 1. [000236] Le récipient portant un pulvérisateur est rempli avec 2,2 ml de solution. 3025428 33 [000237] Le schéma d'administration et d'application est le suivant : [000238] La plaie est séchée avec une gaze stérile avant l'application de la composition selon l'invention. Le flacon est tenu verticalement de manière à permetre la vaporisation. Avant la première utilisation, le dispositif de pulvérisation doit être 5 activé plusieurs fois, afin d'amorcer correctement la pulvérisation. [000239] L'administration de la quantité souhaitée par unité de surface est effectuée via une (1) pulvérisation de la composition à environ 1,8 cm de la plaie avec une quantité de composition par pulvérissation de 53 pl. Plusieurs vaporisations sont effectuées lorsque cela est nécessaire pour couvrir la totalité de la surface de la plaie. 10 [000240] La composition présente sur la peau saine est soigneusement essuyée, en revanche la composition qui a été vaporisée sur la plaie, n'est ni essuyée ni tamponnée. Le récipient est utilisé jusqu'à plus de six semaines après la première utilisation. [000241] Ensuite un pansement, en particulier un pansement semi-perméable, est 15 placé de manière à recouvrir la plaie. [000242] Ces étapes (à l'exception de l'amorçage du dispositif qui ne doit être réalisé que lors de la première utilisation) sont répétés tous les deux jours jusqu'à fermeture de la plaie ou pendant au plus 20 semaines. [000243] Ce protocole permet l'application de la posologie suivante : délivrance 20 d'une dose de 4,2 pg/cm2 de rhPDGF-BB chaque deux jours après un débridement de la plaie ou un nettoyage de celle-ci. REVENDICATIONS1. Composition, sous forme de solution aqueuse stable à 25°C pendant au moins 3 mois, comprenant au moins un polysaccharide fonctionnalisé et un PDGF-BB, caractérisée en ce que ledit polysaccharide fonctionnalisé comprend un taux d'anhydrides mixtes résiduels inférieur à 2 %, et est choisi parmi les polysaccharides fonctionnalisés de formule I ci-après : Polysaccharide R1 COOX Formule I - les polysaccharides ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 1 kg/mol et 500 kg/mol, étant choisis dans le groupe constitué des dextranes et des hydroxyéthyl amidons (HES) - R, bras de liaison, étant un radical comprenant entre 1 et 10 atomes de carbone, éventuellement branché ou substitué, éventuellement insaturé et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s) et/ou un ou plusieurs hétéroatome(s) choisi parmi O, N et S - G étant une fonction amide résultant du couplage entre une fonction acide 20 carboxylique du précurseur du bras de liaison R et la fonction amine d'un tryptophane, - F étant une fonction résultant du couplage entre le précurseur du bras de liaison R et une fonction alcool du polysaccharide, F étant choisie parmi les fonctions éther, ester ou carbamate, 25 - Trp étant un reste de tryptophane, L et/ou D, produit dudit couplage entre la fonction amine du tryptophane et une fonction acide carboxylique portée par le précurseur du radical R, - Ri étant un radical comprenant entre 1 et 10 atomes de carbone, éventuellement branché ou substitué, éventuellement insaturé et/ou comportant éventuellement I [ F i R I G Trp 3025428 35 un ou plusieurs cycle(s) et/ou un ou plusieurs hétéroatome(s) choisi parmi O, N et S, - Fi étant une fonction résultante du couplage entre le précurseur du radical Ri et une fonction alcool du polysaccharide, Fi étant choisie parmi les fonctions éther, 5 ester ou carbamate, - j, compris entre 0,2 et 0,8, représentant le degré de substitution en -F-R-G-Trp par unité saccharidique, - i, compris entre 0,1 et 1,8, représentant le degré de substitution en -Fi-Ri-COOX par unité saccharidique, 10 - i+j étant compris entre 0,5 et 2, - X représentant un cation, et - la fonction acide carboxylique du tryptophane étant sous forme de carboxylate de X. 15 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polysaccharide avant substitution par les substituants -Fi-Ri-COOX et -F-R-G-Trp est choisi dans le groupe des dextranes. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le polysaccharide fonctionnalisé est choisi dans le groupe constitué des dextranes fonctionnalisés, illustrés de manière arbitraire, par la formule II, ci-après : Formule II dans laquelle : - chaque groupe L représente indépendamment -OH, -F-R-G-Trp, ou -Fi-Ri- COOX, avec F, R, G, Trp, Fi, Ri, et X, ayant les définitions données pour la Formule I, les degrés de substitution en -F-R-G-Trp, et en -Fi-Ri-COOX, respectivement appelés i et j, ayant les valeurs données pour la Formule I, et les dextranes présentent une masse molaire moyenne en poids comprise entre 1 kg/mol et 500 kg/mol. 3025428 36 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que i est compris entre 0,2 et 1,2. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée 5 en ce que j est compris entre 0,3 et 0,7. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que i+j est compris entre 0,6 et 1,7. 10 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le radical R comprend entre 1 et 10 atomes de carbone, et est une chaine, éventuellement branchée ou substituée, éventuellement insaturée et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s). 15 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le radical Ri comprend entre 1 et 10 atomes de carbone, et est une chaine, éventuellement branchée ou substituée, éventuellement insaturée et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s). 20 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les radicaux R et Ri sont identiques. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la fonction F est une fonction éther. 25 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la fonction Fi est une fonction éther. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 11, caractérisée 30 en ce que le polysaccharide fonctionnalisé est choisi parmi les polysaccharides fonctionnalisés de Formule I dans laquelle : - F et Fi sont des fonctions éther, - R et Ri sont des radicaux -CH2-. 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 12, caractérisée en ce que, le polysaccharide fonctionnalisé est choisi parmi les 3025428 37 polysaccharides fonctionnalisés de Formules I ou II, dans laquelle le polysaccharide est un dextrane, F et Fi sont des fonctions éther, et R et Ri sont des radicaux -CH2-. 14. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 13, 5 caractérisée en ce que le polysaccharide fonctionnalisé est choisi parmi les polysaccharides fonctionnalisés de Formule I ou II, dans laquelle : le polysaccharide est un dextrane, - F et Fi sont des fonctions éther, R et Ri sont des radicaux -CH2-, 10 i est compris entre 0,4 et 1,0, j est compris entre 0,35 et 0,6 i+j est compris entre 0,8 et 1,4 et - le taux d'anhydrides mixtes résiduels est inférieur à 1,5 %. 15 15. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que la concentration en PDGF-BB est comprise entre 0,01 et 10 mg/ml. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que la concentration en polysaccharide est comprise entre 0,1 et 150 mg/ml. 20 17. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que le ratio polysaccharide/PDGF-BB est compris entre 10 et 200. 18. Formulation pharmaceutique comprenant au titre d'ingrédient actif une 25 composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 17. 19. Formulation pharmaceutique selon la revendication 18, pour son utilisation comme médicament destiné à favoriser la cicatrisation de plaies. 30 20. Ensemble comprenant un dispositif de conditionnement et de distribution (1) et une formulation pharmaceutique selon l'une quelconque de revendications 18 à 19 (7), ledit dispositif de conditionnement et de distribution (1) comprenant un récipient (2) comprenant la formulation pharmaceutique (7), des moyens de distribution (3) de type pompe montés sur le récipient (2), lesdits 35 moyens de distribution (3) comprenant des moyens de pulvérisation (8) et des moyens anti-retours permettant d'éviter le reflux de la formulation dans le récipient, 3025428 38 - des moyens d'étanchéité permettant d'éviter le passage de flux de l'extérieur vers l'intérieur du dispositif, hormi via des moyens d'entrée d'air permettant d'équilibrer la pression interne du dispositif avec a pression externe après chaque pulvérisation, via un flux d'air provenant de l'extérieur, et 5 des moyens de protection de la formulation contre la contamination microbienne. 21. Procédé de préparation de polysaccharides fonctionnalisés de Formule I ci- après : Polysaccharide 10 - - 15 - 20 - - 25 - 30 Formule I les polysaccharides ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 1 kg/mol et 500 kg/mol, étant choisis dans le groupe constitué des dextranes et des hydroxyéthyl amidons (HES) R, bras de liaison, étant un radical comprenant entre 1 et 10 atomes de carbone, éventuellement branché ou substitué, éventuellement insaturé et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s) et/ou un ou plusieurs hétéroatome(s) choisi parmi O, N et S G étant une fonction amide résultant du couplage entre une fonction acide carboxylique du précurseur du bras de liaison R et la fonction amine d'un tryptophane, F étant une fonction résultante du couplage entre le précurseur du bras de liaison R et une fonction alcool du polysaccharide, F étant choisie parmi les fonctions éther, ester ou carbamate, Trp étant un reste de tryptophane, L et/ou D, produit dudit couplage entre la fonction amine du tryptophane et une fonction acide carboxylique portée par le précurseur du radical R, Ri étant un radical comprenant entre 1 et 10 atomes de carbone, éventuellement branché ou substitué, éventuellement insaturé et/ou comportant éventuellement un ou plusieurs cycle(s) et/ou un ou plusieurs hétéroatome(s) choisi parmi 0, N et S, R1 COOX 3025428 39 - Fi étant une fonction résultante du couplage entre le précurseur du radical Ri et une fonction alcool du polysaccharide, Fi étant choisie parmi les fonctions éther, ester ou carbamate, - j, compris entre 0,2 et 0,8, représentant le degré de substitution en -F-R-G-Trp 5 par unité saccharidique, - i, compris entre 0,1 et 1,8, représentant le degré de substitution en -Fi-Ri-COOX par unité saccharidique, - i+j étant compris entre 0,5 et 2, - X représentant un cation, et 10 - la fonction acide carboxylique du tryptophane étant sous forme de carboxylate de X comprenant les étapes suivantes : amidification d'au moins une partie des fonctions acides carboxyliques d'un polysaccharide choisi parmi les dextranes et les HES fonctionnalisés par un radical 15 porteur d'une fonction acide carboxylique libre activée par formation d'un anhydride mixte, diminution du taux d'anhydrides mixtes résiduels à moins de 2 %, et - récupération du polysaccharide fonctionalisé de Formule I.