Brevet FR3028527A1 — publié le 20160520

Introduction Plusieurs technologies telles que la fermentation à grande échelle sont appliquées pour la production industrielle d'huile à partir de microorganismes en utilisant comme substrat des matières grasses ou du glycérol. Dans le cadre de ces projets, les microorganismes sont utilisés comme usine cellulaire en réorientant leur métabolisme cellulaire vers la production de composés d'intérêt industriel ou alimentaire. La plupart de ces technologies ciblent la production de lipides de réserve avec une structure et/ou une composition spécifique. Ceux-ci comprennent les huiles enrichies en acides gras polyinsaturés essentiels qui peuvent être potentiellement utilisés comme complément alimentaire, les lipides ayant des similitudes de composition au beurre de cacao et des huiles non spécifiques destinées à être utilisées dans la synthèse des biocarburants. De ce fait, on constate un intérêt grandissant pour l'amélioration de la composition et de la teneur en huile des microorganismes, particulièrement des levures. Les microorganismes oléagineux sont des organismes capables d'accumuler des réserves lipidiques pouvant dépasser 20 % de la matière sèche de la cellule. La levure Yarrowia lipolytica est, parmi ces microorganismes, l'un des plus étudiés et les plus utilisés, de par sa capacité à accumuler des lipides cellulaires jusqu'à 40 % de son poids sec. En outre, c'est la seule levure connue capable d'accumuler l'acide linoléique (C18 :2) dans des proportions dépassant les 50 % des lipides totaux. L'acide linoléique est le premier substrat pour la production des acides gras à longue chaîne et polyinsaturés, qui présentent un intérêt alimentaire et biotechnologique. Dans les levures, la synthèse des triglycérides suit la voie Kennedy. Les acides gras libres sont activés par le coenzyme A (CoA) et utilisés pour l'acylation du glycérol, pivot de la synthèse des triglycérides. L'acétyl-CoA provient de la bêta-oxydation des acides gras, de l'oxydation du pyruvate dans le cycle de Krebs et de la dégradation oxydative des acides aminés dits cétogènes. Dans la première étape d'assemblage de triglycérides, le glycérol-3-phosphate (G-3-P) est acylé par l'acyltransférase spécifique du glycérol-3-phosphate (glycerol-3-phosphate acyltransférase ou SCT1) pour donner de l'acide lysophospatidique, qui est ensuite acylé par l'acyltransférase spécifique de l'acide lysophosphatidique (Phosphatidic acid acyltransférase ou SLC1) 3028527 2 pour donner de l'acide phosphatidique (PA). Celui-ci est ensuite déphosphorylé par une phosphohydrolase spécifique de l'acide phosphatidique (phosphatidic acid phosphohydrolase (PAP)) pour libérer du diacylglycérol (DAG). Dans la dernière étape le diacylglycérol est acyle soit par une diacylglycérol acyltransférase soit par une 5 phospholipide diacylglycérol acyltransférase pour produire des triacylglycérols (TAG). Les levures oléagineuses, et notamment Y. lipolytica, commencent à accumuler des lipides quand les sources d'azote dans le milieu deviennent limitantes, tandis que les sources de carbone sont en excès. Plus précisément, les levures en carence de nutriments sont soumis à trois phases de croissance: (i) la prolifération cellulaire lors 10 de la phase exponentielle de croissance, (ii) une phase d'accumulation de lipides, où la croissance ralentit à cause d'une limitation en nutriment (par exemple de l'azote), mais où la synthèse des lipides est maximale et (iii) une phase tardive d'accumulation où les lipides continuent de s'accumuler, mais la voie de la B-oxydation (la voie du catabolisme des lipides) est activée afin de remobiliser le carbone stocké. Enfin, les 15 cellules deviennent incapables de produire des métabolites essentiels et la plupart de l'activité métabolique cesse. Ce processus dépend de facteurs environnementaux tels que la température et le pH. (Beopoulos et al., 2009). Son génome ayant été complètement séquence (Dujon et al., 2004) et plusieurs outils génétiques étant disponibles, Y. lipolytica a été largement utilisée comme 20 organisme modèle de la biosynthèse et de l'accumulation des lipides. Différentes souches de levures oléagineuses possédant des capacités d'accumulation de lipides améliorées ont été construites en manipulant plusieurs gènes impliqués dans la bioconversion, la synthèse et la mobilisation des lipides (Beopoulos et al., 2008 ; Dulermo et Nicaud, 2011 ; Beopoulos et al., 2012 ; Tai et Stephanopoulos, 2013 ; 25 Blazeck et al., 2014 ; U.S. 7,238,482 ; U.S. 7,465,564 ; U.S. 7,550,286 ; U.S. 7,588,931 ; U.S. 7,932,077 ; WO 2010/004141 ; WO 2012/001144 ; WO 2014/136028). Toutefois, en dépit la quantité toujours croissante d'informations disponibles sur la biosynthèse des triglycérides, les étapes limitantes dans le processus de production 30 de lipides ne sont toujours pas connues. En outre, l'utilité industrielle des souches recombinantes construites à ce jour reste inconnue. Les levures oléagineuses n'ont pas généralement un taux de croissance élevé, de sorte que la croissance durant la phase exponentielle peut 3028527 3 considérablement affecter la production de lipides par la cellule. Or la croissance de telles souches recombinantes peut être négativement affectée par le fardeau génétique causé par les approches d'ingénierie métabolique classiques. Il existe donc toujours un besoin pour de nouvelles souches de levure oléagineuse 5 capables d'accumuler des lipides. Description La présente invention a pour objet de nouvelles souches de levure oléagineuse, chez lesquelles l'expression de facteurs de transcription participant à la régulation de l'accumulation des lipides et des métabolites intermédiaires de leur synthèse est 10 altérée. Les présents inventeurs ont pour la première fois mis en évidence une fonction biologique liée aux polypeptides TF001, TF004, TF007, TF015, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF038, TF039, TF040, TF041, TF043, TF051, TF052, TF055, TF060, TF064, TF068, TF070, TF072, TF074, TF075, TF077, TF078, TF079, TF084, TF085, 15 TF086, TF087, TF089, TF109 et TF126. Ils ont ainsi montré que la surexpression des facteurs de transcription de l'invention résulte dans une augmentation de la transcription quand ils sont surexprimés dans une levure oléagineuse. Cette augmentation est notamment indépendante de la protéine reportrice utilisée dans le système expérimental, soulignant ainsi la spécificité de l'effet. 20 En outre, la surexpression des facteurs de transcription de l'invention altère spécifiquement l'accumulation des lipides et d'au moins certains métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci chez les levures oléagineuses. En effet, des souches de levures oléagineuses surexprimant les facteurs de transcription TF001, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF039, TF040, TF072, TF079, TF084, TF085, 25 TF086, TF087 et TF126 présentent une accumulation accrue de lipides par rapport à une souche témoin, tandis que des souches surexprimant les facteurs de transcription TF007, TF038, TF043, TF055, TF060, TF064, TF068, TF075, TF077-et TF109 ne sont pas capables d'accumuler autant de lipides que la souche témoin. Par ailleurs, des souches de levures oléagineuses surexprimant les facteurs de transcription TF004, 30 TF015, TF043, TF051, TF052, TF070, TF074, TF077et TF078 présentent une accumulation accrue de succinate par rapport à une souche témoin, tandis que des souches surexprimant les facteurs de transcription TF041 et TF109 ne sont pas 3028527 4 capables d'accumuler autant de succinate que la souche témoin. Enfin, les souches surexprimant les facteurs de transcription TF015, TF041, TF072, TF078, TF089, et TF109 accumulent des quantités de citrate plus importantes qu'une souche témoin ; en revanche, les souches surexprimant TF068 et TF099 produisent moins de citrate 5 qu'une souche témoin. Un - facteur de transcription » est une protéine qui se lie à des régions d'ADN, notamment des régions promotrices, et affecte l'expression de gènes spécifiques. Plus précisément, le facteur de transcription (seul ou en complexe avec d'autres protéines) affecte la transcription de l'ADN en ARNm, par exemple, à travers 10 l'activation ou la répression de l'initiation de la transcription. Un facteur de transcription - régule positivement » la biosynthèse des lipides si l'expression du facteur de transcription augmente la transcription d'un ou plusieurs gènes codant pour des enzymes de la biosynthèse des lipides et augmente la production de lipides. Un facteur de transcription - régule négativement » la biosynthèse des lipides si 15 l'expression du facteur de transcription diminue la transcription d'un ou plusieurs gènes codant pour des enzymes de la biosynthèse des lipides et diminue la production de lipides. Un facteur de transcription peut comprendre un ou plusieurs domaines de liaison à l'ADN qui se fixent à des séquences spécifiques d'ADN adjacentes aux gènes qu'ils régulent. Les facteurs de transcription sont classés en 20 fonction de la similitude de leurs domaines de liaison d'ADN. La présence d'un tel domaine de liaison à l'ADN permet ainsi d'identifier un facteur de transcription dans des protéines putatives, comme celles qui sont codées par des phases ouvertes de lecture identifiées dans le cadre du séquençage du génome de Y. lipolytica (voir, par exemple Gabdouline et al, 2012). 25 En particulier, les facteurs de transcription de l'invention sont les facteurs de transcription listés dans le tableau 1. Nom usuel Nom systématique SEQ ID NO. (protéine) SEQ ID NO. (gène) TF001 YALIOA10637g 1 35 TF004 YALIOB06853g 2 36 TF007 YALIOB12716g 3 37 TF015 YALI0007821g 4 38 TF019 YALIOC13178g 5 39 TF021 YALIOC16390g 6 40 3028527 5 TF024 YALI0D01353g 7 41 TF031 YALI0D10681g 8 42 TF033 YALI0D14520g 9 43 TF038 YALI0D23045g 10 44 TF039 YALI0D23749g 11 45 TF040 YALI0E03410g 12 46 TF041 YALI0E05555g 13 47 TF043 YALI0E10681g 14 48 TF051 YALI0E31383g 15 49 TF052 YALI0E31669g 16 50 TF055 YALIOF03157g 17 51 TF060 YALIOF09361g 18 52 TF064 YALIOF16599g 19 53 TF068 YALIOE13948g 20 54 TF070 YALIOE11693g 21 55 TF072 YALI0C22682g 22 56 TF074 YALIOD09757g 23 57 TF075 YALIOF05346g 24 58 TF077 YALIOB08206g 25 59 TF078 YALIOD05005g 26 60 TF079 YALIOD12628g 27 61 TF084 YALIOB08734g 28 62 TF085 YALIOC11858g 29 63 TF086 YALIOB04510g 30 64 TF087 YALIOE01606g 31 65 TF089 YALI0006842g 32 66 TF109 YALIOE16577g 33 67 TF126 YALIOD05041g 34 68 Tableau 1 : Liste des facteurs de transcription de l'invention L'homme du métier comprendra sans aucune difficulté que le facteur de transcription de l'invention peut aussi être un homologue de l'un des facteurs de 3028527 6 transcription listés ci-dessus, pour autant que ledit homologue conserve la propriété d'affecter l'accumulation des lipides dans une levure oléagineuse quand il est surexprinné. Par - homologue » d'un facteur de transcription de l'invention, on entend ici une 5 protéine dont la séquence en acides aminés présente un pourcentage d'identité après alignement optimal avec la séquence du facteur de transcription donné d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % et 99%, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences en acides aminés pouvant être réparties au hasard et sur toute leur longueur. 10 Par - pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et 15 sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par - fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences 20 pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Lipman et Pearson (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA 25 dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P). Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide 30 nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est 3028527 7 identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. 5 Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, - BLAST 2 séquences » (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. Lett. 174 : 247-250) disponible sur le site http://www.ncbi.nlnn.nih.gov/gorf/b12.htnnl, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres - open gap penaltie » : 5, et 10 - extension gap penaltie » : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 » proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. L'invention porte donc une souche de levure chez qui l'expression d'au moins un des facteurs de transcription de l'invention (TF001, TF004, TF007, TF015, TF019, TF021, 15 TF024, TF031, TF033, TF038, TF039, TF040, TF041, TF043, TF051, TF052, TF055, TF060, TF064, TF068, TF070, TF072, TF074, TF075, TF077, TF078, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087, TF089, TF109 et TF126) est altérée, ladite souche mutante présentant une accumulation altérée des lipides ou d'au moins un des métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, par 20 rapport à une souche témoin. Préférentiellement, ladite souche présente une accumulation accrue des lipides par rapport à ladite souche témoin. On entend au sens de la présente invention par le terme - levure » les souches de levure en général, c'est-à-dire que ce terme comprend, entre autres, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorphe, Schizzosaccharomyces 25 pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans. 30 Les levures préférées au sens de l'invention sont les levures oléagineuses (Ratledge, in : Ratlege C, Wilkinson SG editors, Microbial lipids, Vol 2. London : Academic press 1988). Le terme «oléagineux» désigne les organismes qui ont tendance à stocker leur source d'énergie sous la forme d'huile (Weete, In: Fungal Lipid Biochennistry, rd Ed., 3028527 8 Plenum, 1980). Plus précisément, une - levure oléagineuse » selon l'invention est une levure qui peut faire de l'huile. En général, la teneur en huile cellulaire des microorganismes oléagineux suit une courbe sigmoïde, où la concentration de lipides augmente jusqu'à atteindre un maximum en fin de phase logarithmique ou en début 5 de phase stationnaire, avant de diminuer graduellement durant la phase stationnaire tardive, voire pendant la mort cellulaire (Yongmanitchai et Ward, 1991). Il est fréquent que des microorganismes oléagineux accumulent plus d'environ 25% de leur poids cellulaire sec sous forme d'huile. Les levures oléagineuses les plus connues incluent les genres Candida, Cryptoccocus, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon, 10 Lypomyces, Yarrowia. Les levures particulièrement préférées au sens de l'invention comprennent Yarrowia lipolytica, Rhodotura glutinis et Rhodosporidium toruloides. Une levure préférée au sens de la présente invention est Yarrowia lipolytica. La présente invention concerne donc préférentiellement une souche de levure oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, chez qui l'expression d'au 15 moins un des facteurs de transcription de l'invention est altérée, ladite souche mutante étant capable d'accumuler des lipides. Selon la présente invention, l'expression d'un gène est - altérée » dans une souche de levure oléagineuse si elle est augmentée ou diminuée par rapport à celle dudit gène dans une souche de référence, telle que par exemple une souche de levure 20 oléagineuse sauvage. Le terme - expression », tel qu'utilisé ici, se réfère à la transcription et l'accumulation stable de sens (ARNm) ou de l'ARN antisens. L'expression comprend également la traduction de l'ARNm en un polypeptide. Le terme - augmenté », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une plus grande quantité, par exemple, une quantité légèrement supérieure 25 à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité en grand excès par rapport à la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, augmentation » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou 30 de l'activité accrue est comparé. Les termes - augmenté », - plus grand que », et - accru » sont utilisés ici de manière interchangeable. Selon un mode de réalisation préféré, le facteur de transcription de l'invention est surexprimé, c'est-à-dire que son niveau d'expression est augmenté. Les inventeurs 3028527 9 ont ainsi montré que la surexpression des facteurs de transcription TF001, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF039, TF040, TF072, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087 et TF126 dans une levure oléagineuse conduit à une accumulation accrue de lipides par rapport à une souche témoin. Plus préférablement, la souche de 5 l'invention est une souche de levure oléagineuse chez qui au moins un des facteurs de transcription TF001, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF039, TF040, TF072, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087 et TF126 est surexprimé, et qui est capable d'accumuler des lipides. Les inventeurs ont aussi montré que des souches de levure oléagineuse surexprimant les facteurs de transcription TF004, TF015, TF043, TF051, 10 TF052, TF070, TF074, TF077et TF078 produisent plus de succinate qu'une souche témoin. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'invention a donc pour objet une souche de levure oléagineuse chez qui au moins un des facteurs de transcription TF004, TF015, TF043, TF051, TF052, TF070, TF074, TF077et TF078 est surexprimé, et qui est capable d'accumuler du succinate. Enfin, les résultats obtenus par les 15 inventeurs montrent qu'une accumulation plus importante de citrate est obtenue dans des souches surexprimant les facteurs de transcription TF015, TF041, TF072, TF078, TF089, et TF109. Ainsi, selon un troisième mode de réalisation préféré, l'invention porte sur une souche de levure oléagineuse surexprimant un facteur de transcription choisi parmi le groupe constitué de TF015, TF041, TF072, TF078, TF089, 20 et TF109. Dans certains modes de réalisation, l'altération de l'expression d'au moins un facteur de transcription correspond à une diminution de l'expression dudit facteur de transcription par rapport à une souche sauvage. Le terme - diminution », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une plus petite quantité, par 25 exemple, une quantité légèrement inférieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité beaucoup plus petite que la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, - diminution » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% de moins que la quantité ou de 30 l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité diminuée est comparé. Les termes diminué », - plus petit que », et - décru » sont utilisés ici de manière interchangeable. Selon un mode de réalisation préféré, l'expression d'au moins un facteur de transcription est significativement réduite par rapport à une souche sauvage. Ainsi 3028527 10 les inventeurs ont montré que l'expression des facteurs de transcription TF007, TF038, TF043, TF055, TF060, TF064, TF068, TF075, TF077 et TF109 est inversement corrélée avec la capacité d'une levure oléagineuse à accumuler des lipides ou les métabolites intermédiaires de leur synthèse. De même, ils ont observé que la 5 surexpression des facteurs de transcription TF041 et TF109 entraine une diminution de la quantité de succinate que produit une souche de levure oléagineuse et que la surexpression du facteur de transcription TF068 conduit à une moindre accumulation de citrate. La réduction de l'expression de l'un au moins de ces facteurs de transcription peut être obtenue par tout moyen connu de l'homme du métier, tel 10 que, par exemple l'utilisation d'un promoteur régulable ou d'un antisens. Préférablement, cette réduction est causée par une inactivation du gène codant ledit facteur de transcription. Par inactivation ou invalidation d'un gène d'intérêt (les deux termes tels qu'utilisés dans la présente demande sont synonymes et ont donc la même signification), on 15 entend selon l'invention, toute méthode aboutissant à la non expression de la protéine native codée par ledit gène d'intérêt, par modification de l'enchaînement des nucléotides constituant ledit gène de telle sorte que quand bien même sa traduction serait effective, elle ne conduirait pas à l'expression de la protéine native codée par le gène d'intérêt sauvage. 20 L'altération de l'expression du facteur de transcription, soit par surexpression soit par inactivation, entraine une accumulation altérée de lipides ou d'au moins un métabolite intermédiaire de leur synthèse dans la souche de l'invention. Préférentiellement, ladite altération de l'expression du facteur de transcription entraine une augmentation de l'accumulation des lipides. 25 Selon la présente invention, l'accumulation des lipides ou d'un métabolite intermédiaire est - altérée » dans une souche de levure oléagineuse si elle est augmentée ou diminuée par rapport à celle desdits lipides ou métabolite intermédiaire dans une souche de référence, telle que par exemple une souche de levure oléagineuse sauvage. Le terme - augmenté », tel qu'il est utilisé ici dans 30 certains modes de réalisation, signifie une plus grande quantité, par exemple, une quantité légèrement supérieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité en grand excès par rapport à la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, - augmentation » peut faire référence à une quantité 3028527 11 ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité accrue est comparé. Les termes augmenté », - plus grand que », et - accru » sont utilisés ici de manière 5 interchangeable. Le terme - diminution », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une plus petite quantité, par exemple, une quantité légèrement inférieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité beaucoup plus petite que la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, - diminution » peut faire référence à une quantité ou une 10 activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% de moins que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité diminuée est comparé. Les termes - diminué », plus petit que », et - décru » sont utilisés ici de manière interchangeable. Par "lipides", on entend ici toute molécule naturelle liposoluble (c'est-à-dire 15 lipophile). Les lipides sont un groupe hétérogène de composés possédant de nombreuses fonctions biologiques essentielles, ces composés intervenant ainsi aussi bien en tant que composants structuraux des membranes cellulaires, que sources de stockage de l'énergie ou que molécules intermédiaires dans les voies de signalisation. Les lipides peuvent être définis comme des petites molécules hydrophobes ou 20 amphiphiles, qui proviennent entièrement ou en partie de groupes cétoacyl ou isoprènes. Pour un aperçu d'ensemble de toutes les classes de lipides, on se reportera avantageusement à - Lipid Metabolites and Pathways Strategy (LIPID MAPS) classification system » (National Institute of General Medical Sciences, Bethesda, MD). Le terme "huile" désigne une substance lipidique qui est liquide à 25°C et 25 généralement polyinsaturée. Dans les organismes oléagineux, l'huile constitue la majeure partie des lipides totaux et se compose principalement de triglycérides. En effet, les levures oléagineuses stockent leurs lipides essentiellement sous la forme de TAG (80 à 90% de la fraction lipidique neutre) et le reste sous la forme d'esters de stéroïde (SE). Tel qu'utilisé ici, le terme - triacylglycérols » (ou - triglycérides » ou 30 « triacylglycérides » ou encore - TAG ») se réfère à des glycérides dans lesquels les trois groupements hydroxyle du glycérol sont estérifiés par des acides gras. Les TAGs peuvent contenir des acides gras polyinsaturés à longue chaîne (PUFA) et des acides gras saturés, ainsi que des acides gras possédant des chaînes plus courtes saturées ou insaturées, ainsi que des acides gras inhabituels. 3028527 12 Un « métabolite intermédiaire de la synthèse des lipides - tel qu'on l'entend ici est un métabolite produit au cours d'une des réactions de biosynthèse des lipides. Ces réactions de biosynthèse au sens de la présente demande ne comprennent pas seulement les réactions du cycle de Kennedy, mais aussi toutes les réactions dont on 5 considère habituellement qu'elles sont nécessaires pour produire les acides gras et te glycérol. A cet égard, on pourra se reporter par exemple à Beopoulos et al. (2011) ou à Abghari et Chen (2014). La synthèse des TAGs chez les levures, et en particulier chez les levures oléagineuses comme Y. lipolytica, interagit ainsi avec d'autres voies métaboliques. En particulier, l'acétyl-CoA est formé lors du cycle de Krebs, au cours 10 duquel de nombreux métabolites intermédiaires sont formés, dont notamment le citrate et le succinate. Ainsi, il a par exemple été montré que la production d'acide citrique conduit à l'accumulation de lipides chez les levures oléagineuses (Beopoulos et al., 2009). Le citrate est clivé par l'ATP citrate lyase pour donner de l'oxaloacétate et l'acyl-CoA, 15 lequel est l'unité de base dans la synthèse des TAGs, comme expliqué ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'altération de l'expression du facteur de transcription de l'invention entraine une augmentation de la production d'acide citrique. Les inventeurs ont ainsi montré que la surexpression des facteurs de transcription TFO19 et TF072 conduit à une production accrue de citrate comme de 20 lipides, tandis que l'expression de TF068 est inversement corrélée avec la production de citrate et de lipides. Dans un mode de réalisation encore plus particulièrement avantageux, la souche de l'invention est une souche de levure oléagineuse dans laquelle les facteurs de transcription TF019 et TF072 sont surexprinnés, ladite souche étant capables d'accumuler plus de lipides tout en produisant plus de citrate, par 25 rapport à une souche témoin. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention a pour objet une souche de levure oléagineuse dans laquelle l'expression du facteur de transcription TF068 est diminuée, ladite souche étant capable d'accumuler plus de lipides tout en produisant plus de citrate, toujours en comparaison avec une souche témoin. 30 En revanche, l'accumulation de succinate dans la cellule est généralement inversement corrélée avec l'accumulation de lipides. En effet, le succinate accumulé, c'est-à-dire sorti du cycle de Krebs, diminuerait le carbone dans le cycle du Krebs, ce qui réduirait le carbone utilisable pour la production de lipides. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'altération de 3028527 13 l'expression du facteur de transcription de l'invention entraine une diminution de la production de succinate. A cet égard, la production de succinate augmente tandis que la quantité de lipides accumulés diminue dans les souches surexprimant les facteurs de transcription TF077 et TF043. En revanche, la surexpression du facteur 5 de transcription TF019 conduit à une diminution de la production de succinate et une augmentation de la quantité de lipides concomitantes. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la souche de l'invention est une souche de levure oléagineuse dans laquelle l'expression de l'un au moins des facteurs de transcription TF077 et TF043 est diminuée, ladite souche étant capable d'accumuler plus de 10 lipides et moins de succinate qu'une souche témoin. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention a pour objet une souche de levure oléagineuse dans laquelle le facteur de transcription TF019 est surexprinné, ladite souche étant capable d'accumuler plus de lipides, tout en produisant moins de succinate par rapport à une souche témoin. 15 Enfin, dans un mode de réalisation tout particulièrement avantageux, l'invention a pour objet une souche de levure oléagineuse dans laquelle le facteur de transcription TF019 est surexprimé, ladite souche étant capable d'accumuler plus de lipides, tout en produisant plus de citrate et moins de succinate, par rapport à une souche témoin. 20 L'homme du métier comprendra aisément qu'il peut être avantageux d'introduire dans la souche de l'invention des modifications supplémentaires conduisant à des changements de la nature ou de la quantité des lipides produits. Les présents inventeurs ont ainsi précédemment construits plusieurs souches qui produisent de très grandes quantités de lipides. 25 Par exemple, ils ont montré que l'inactivation du gène GUT2 entraine une accumulation accrue de lipides chez les levures, particulièrement chez Y. lipolytica (WO 2010/004141 ; Beopoulos et al., 2008). Le gène GUT2 code l'isoforme Gut2p de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase, laquelle catalyse la réaction d'oxydation du glycérol-3-phosphate en DHAP. Dans un mode de réalisation préféré, la souche de 30 levure oléagineuse de l'invention n'exprime pas Gut2p. D'autre part, les inventeurs ont montré qu'il est possible d'obtenir une accumulation de lipides par la surexpression du gène GPD1 dans des levures dans lesquelles la bêta-oxydation des acides gras est déficiente (WO 2012/001144). Le gène GPD1 code la 3028527 14 glycérol-3-phosphate déshydrogénase qui catalyse la réaction de synthèse de glycérol-3-phosphate à partir de DHAP. Ainsi, dans un autre mode de réalisation préféré, la souche de levure de l'invention surexprime GPD1 et est déficiente pour la bêta-oxydation des acides gras. 5 La bêta-oxydation est la voie de dégradation des acides gras. Elle fait intervenir 4 réactions successives au cours desquelles interviennent une acyl-CoA oxydase dont les 6 isoformes sont codée par les 6 gènes PDX (voir le Tableau 2), une enzyme multifonctionnelle codée par le gène MFE1 et une 3-oxoacyl-CoA thiolase codée par le gène POT1 . Comme indiqué plus haut, la bêta-oxydation chez les levures se 10 déroule exclusivement dans le peroxysome, un organite cytoplasmique dont la biogénèse est contrôlée par les gènes PEX (voir Tableau 3). Quand le peroxysome n'est pas correctement assemblé ou quand il n'est pas fonctionnel, les acides gras ne sont pas correctement dégradés (WO 2006/064131 ; Thevenieau et al., 2007). De façon générale, les mutations affectant la bêta-oxydation selon l'invention sont 15 des mutations de perte de fonction qui entrainent une très forte diminution, voire une absence totale, de la bêta oxydation. Les mutations de perte de fonction selon l'invention peuvent correspondre à des mutations ponctuelles, à des insertions, à des délétions totales ou partielles, à des remplacements de gènes ou à toute autre cause moléculaire qui aboutit à une diminution substantielle de la bêta-oxydation. 20 Les souches de levure chez lesquelles la bêta-oxydation des acides gras est déficiente comprennent, au sens de l'invention, toutes les souches portant au moins une mutation de perte de fonction dans au moins un gène codant une enzyme directement impliquée dans la bêta-oxydation, mais aussi toutes les souches qui portent au moins une mutation de perte de fonction qui n'affecte la bêta-oxydation 25 que de façon indirecte, notamment à travers la biogénèse ou la fonction des peroxysomes. Il est bien entendu que les souches selon l'invention comprennent aussi toutes les souches portant des combinaisons des mutations décrites plus haut. Par exemple, entrent aussi dans le cadre de la présente invention les souches qui portent au moins une mutation de perte de fonction affectant directement la bêta-oxydation 30 et au moins une mutation de perte de fonction n'affectant la bêta-oxydation que de façon indirecte. Les souches déficientes dans la bêta-oxydation des acides gras comprennent, selon un aspect préféré de l'invention, toute souche portant une mutation de perte de 3028527 15 fonction dans un des gènes PEX listés dans le Tableau 3. Selon un autre aspect préféré de l'invention, les souches déficientes dans la bêta-oxydation des acides gras comprennent les souches portant au moins une mutation de perte de fonction dans l'un des gènes suivants : PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5, PDX6, MFE1, POT1. Plus 5 préférentiellement, les souches selon l'invention comprennent au moins une mutation de perte de fonction dans l'un au moins des gènes PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6. De façon encore plus préférée, les souches selon l'invention comprennent des mutations dans chacun des gènes PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6. 10 Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a donc pour objet une nouvelle souche de levure oléagineuse, préférentiellement une souche de Y. lipolytica, mutante, dans laquelle l'expression d'au moins un des facteurs de transcription de l'invention est altérée, qui surexprime le gène GPD1 et qui comporte au moins une mutation de perte de fonction dans un des gènes responsable de la bêta-oxydation 15 des acides gras, ladite souche de levure présentant une accumulation altérée des lipides ou d'au moins un des métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, par rapport à une souche témoin. Préférentiellement, ladite souche présente une accumulation accrue des lipides par rapport à ladite souche témoin. Avantageusement, ladite souche de levure comporte 20 au moins une mutation de perte de fonction dans au moins un des gènes choisis parmi les gènes PEX, PDX, MFE1 et POT1. De manière plus particulièrement préférée, les gènes PDX sont partiellement (PDX2 à PDX5) ou totalement (PDX1 à PDX6) inactivés dans la souche mutante de l'invention, ladite souche mutante présentant une accumulation altérée des lipides ou d'au moins un des métabolites intermédiaires de 25 la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, par rapport à une souche témoin. Préférentiellement, ladite souche présente une accumulation accrue des lipides par rapport à ladite souche témoin. Outre les mutations de perte de fonction précitées, qui conduisent à une déficience de la bêta-oxydation, la souche de levure selon l'invention peut comporter une ou 30 plusieurs mutations additionnelles dans au moins un gène codant une enzyme impliquée dans le métabolisme des acides gras. Cette(ces) mutation(s) additionnelle(s) peut(vent) avoir pour effet d'augmenter encore la capacité de la souche à accumuler des lipides. Alternativement, elle(s) peut(vent) altérer le profil des acides gras stockés. 3028527 16 Par exemple, on mentionnera les gènes TGL3 et TGL4 codent des lipases impliquées dans la dégradation des acides gras (Kurat et al., 2006 ; W02012/001144). Les présents inventeurs ont montré que l'inactivation des gènes TGL3 et/ou TGL4 conduit à une accumulation de lipides plus importante (Dulermo et al., 2013). 5 L'invention a donc aussi pour objet une souche de levure oléagineuse, préférentiellement une souche de Y. lipolytica, mutante, qui surexprime le gène GPD1 et qui est déficiente pour la bêta-oxydation, dans laquelle les gènes TGL3 et TGL4 sont inactivés et l'expression d'au moins un facteur de transcription selon l'invention est altérée, ladite souche présentant une accumulation altérée des 10 lipides ou d'au moins un des métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, par rapport à une souche témoin. Préférentiellement, ladite souche présente une accumulation accrue des lipides par rapport à ladite souche témoin. Chez Y. lipolytica, l'activité acyl-CoA:diacylglycerol acyltransférase principale est 15 codée par le gène yIDGA2 (YALIOD07986g) (Beopoulos et al., 2012). Cette activité enzymatique catalyse l'acylation du sn-1,2-diacylglycérol a, une étape limitante dans la formation des TAGs. L'invention a donc aussi pour objet une souche de levure oléagineuse, préférentiellement une souche de Y. lipolytica, dans laquelle l'expression d'au moins un des facteurs de transcription selon l'invention est altérée, 20 qui présente une accumulation altérée des lipides ou d'au moins un des métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, par rapport à une souche témoin et qui, en outre, surexprinne le gène yIDGA2. Préférentiellement, ladite souche présente une accumulation accrue des lipides par rapport à ladite souche témoin. 25 Il a aussi été montré que l'inactivation du gène YALI0810153g, qui code une 012 désaturase d'acide gras, permet d'augmenter la proportion d'acides gras en C18 :1 (WO 2005/047485). C'est donc aussi un objet de la présente invention que de fournir une souche de levure, notamment de levure oléagineuse, préférentiellement de Y. lipolytica, mutante, dans laquelle l'expression d'au moins un des facteurs de 30 transcription selon l'invention est altérée, qui présente une accumulation altérée des lipides ou d'au moins un des métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, par rapport à une souche témoin et qui, en outre, comporte un gène YALI0810153g inactivé. Préférentiellement, ladite souche présente une accumulation accrue des lipides par rapport à ladite souche témoin. 3028527 17 Selon un autre mode de réalisation, la souche de levure de l'invention, préférentiellement oléagineuse, plus préférentiellement Y. lipolytica, mutante, déficiente pour la bêta-oxydation, qui surexprime le gène GPD1 et présente une accumulation altérée, préférentiellement une accumulation accrue, des lipides ou 5 d'au moins un des métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, contient en outre un gène dont l'expression permet de modifier le profil en acide gras de ladite souche. Il a en effet été rapporté que l'expression ectopique de gènes codant certaines désaturases permet de modifier le profil en acides gras polyinsaturés dans une souche de levure et en particulier chez 10 Y. lipolytica. Ainsi l'expression d'une 012 désaturase d'acide gras permet d'obtenir des acides gras en C18 :2 en plus grande quantité (WO 2005/047485). De la même façon, l'expression d'une ,M désaturase ou d'une 015 désaturase conduit à un changement du profil des acides gras chez Y. lipolytica (WO 2005/047480 ; WO 2006/012325). L'invention a donc aussi pour objet une souche de levure, notamment 15 de levure oléagineuse, préférentiellement de Y. lipolytica, mutante, dans laquelle l'expression d'au moins un des facteurs de transcription selon l'invention est altérée, qui présente une accumulation altérée des lipides ou d'au moins un des métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, par rapport à une souche témoin et qui, en outre, exprime un gène codant une enzyme 20 choisie parmi une ,M désaturase, une 012 désaturase et une 015 désaturase. De préférence, ladite enzyme est une 012 désaturase. Encore plus préférentiellement, le gène codant ladite 012 désaturase est le gène de Y. lipolytica dont le numéro d'accession est le YALIOB10153g. De façon toujours plus préférée, ladite souche présente une accumulation accrue des lipides par rapport à ladite souche témoin. 25 Il sera immédiatement évident pour l'homme de l'art que les mutations décrites ci- dessus peuvent être combinées afin de créer des souches dans laquelle l'altération de l'expression d'au moins un des facteurs de transcription de l'invention se traduira par une plus grande altération de l'accumulation de lipides et, notamment, par une accumulation de lipides encore plus importante. Par exemple, il peut être 30 avantageux de supprimer tous les six gènes PDX tout en surexprimant le gène yIDGA2. En variante, la délétion de PDX1-6 peut être combinée à l'inactivation des gènes TLG3 et/ou TLG4. Bien entendu, les gènes PDX1-6 peuvent être inactivés dans une souche contenant par ailleurs une inactivation des gènes TLG3 et/ou TLG4 et 3028527 18 surexprimant le gène yIDGA2. Avantageusement, ces souches surexpriment en outre le gène GPD1. Ainsi l'invention concerne plus généralement une souche de levure oléagineuse comprenant n'importe quelle combinaison de modifications décrites ci-dessus, dans 5 laquelle l'expression d'au moins un facteur de transcription choisi parmi TF001, TF004, TF007, TF015, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF038, TF039, TF040, TF041, TF043, TF051, TF052, TF055, TF060, TF064, TF068, TF070, TF072, TF074, TF075, TF077, TF078, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087, TF089, TF109 et TF126 est altérée, et qui présente une accumulation altérée des lipides ou d'au moins un 10 des métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, par rapport à une souche témoin. Préférentiellement, ladite souche présente une accumulation accrue des lipides par rapport à ladite souche témoin. L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'une souche de levure dans laquelle l'expression d'au moins un facteur de transcription choisi parmi TF001, 15 TF007, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF038, TF039, TF040, TF043, TF055, TF060, TF064, TF068, TF072, TF075, TF077, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087, TF109 et TF126 est altérée, ladite souche étant capable d'accumuler des lipides. Préférentiellement, ladite levure est une levure oléagineuse. Plus préférentiellement, cette levure est choisie entre R. glutinis, R. toluroides et Y. 20 lipolytica. Encore plus préférentiellement, il s'agit de Y. lipolytica. Le procédé de l'invention comporte ainsi une étape de transformation d'une souche de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica, par au moins un polynucléotide permettant d'altérer l'expression d'un facteur de transcription choisi parmi TF001, TF004, TF007, TF015, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF038, TF039, TF040, 25 TF041, TF043, TF051, TF052, TF055, TF060, TF064, TF068, TF070, TF072, TF074, TF075, TF077, TF078, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087, TF089, TF109 et TF126. Dans un premier mode de réalisation, le facteur de transcription de l'invention est surexprimé par n'importe quel moyen connu de l'homme de métier. Autrement dit, ledit polynucléotide permet d'augmenter l'expression dudit facteur de transcription. 30 Pour cela, chaque copie de la phase ouverte de lecture codant ledit facteur de transcription est placée sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées. Lesdites séquences régulatrices comprennent des séquences promotrices, placées en 3028527 19 amont (en 5') de ladite phase ouverte de lecture, et des séquences terminatrices, placées en aval (en 3') de ladite phase ouverte de lecture. De préférence, les séquences promotrices et terminatrices utilisées appartiennent à des gènes différents de manière à minimiser les risques de recombinaison non désirée 5 dans le génome de la souche de Yarrowia. De telles séquences promotrices sont bien connues de l'homme du métier et peuvent correspondre notamment à des promoteurs inductibles ou constitutifs. A titre d'exemple de promoteurs utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer notamment le promoteur d'un gène de Y. lipolytica qui est fortement réprimé par le 10 glucose et qui est inductible par les acides gras ou les triglycérides tel que le promoteur PDX2 du gène de l'acyl CoA oxydase 2 de Yarrowia lipolytica et le promoteur du gène LIP2 décrit dans la demande PCT WO 01/83773. On peut aussi utiliser le promoteur du gène FBA1 du gène de la fructose-bisphosphate aldolase (US 2005/0130280), le promoteur du gène de la phosphoglycerate mutase GPM (WO 15 2006/0019297), le promoteur du gène YAT1 du gène du transporteur de l'ammonium (US 2006/0094102 Al ), le promoteur du gène GPAT du gène de la glycérol-3phosphate 0-acyltransferase (US 2006/0057690 Al ), le promoteur du gène TEF (Müller et al., 1998 ; US 2001/6265185), le promoteur hybride hp4d (WO 96/41889), les promoteurs hybrides XPR2 décrits dans Mazdak et al. (2000) ou encore les 20 promoteurs hybride UAS1-TEF et UAStef-TEF décrits dans Blazeck et al. (20011, 2013). De telles séquences terminatrices sont également bien connues de l'homme du métier et on peut citer, à titre d'exemple de séquences terminatrices utilisables dans le procédé selon l'invention, la séquence terminatrice du gène PGK1, la 25 séquence terminatrice du gène LIP2 décrit dans la demande PCT WO 01/83773. La surexpression du facteur de transcription d'intérêt peut être obtenue en remplaçant les séquences contrôlant l'expression du gène codant ledit facteur de transcription par des séquences régulatrices permettant une expression plus forte, telles que celles décrites ci-dessus. La personne du métier peut ainsi remplacer la 30 copie du gène codant ledit facteur de transcription dans le génome, ainsi que ses séquences régulatrices propres, par transformation de la souche mutante de levure par un polynucléotide linéaire comprenant la phase ouverte de lecture en question sous le contrôle de séquences régulatrices telles que celles décrites plus haut. 3028527 20 Avantageusement, ledit polynucléotide est encadré par des séquences qui sont homologues de séquences situées de chaque côté du gène chromosomique. Dans la mesure où cet évènement de recombinaison est rare, des marqueurs de sélection sont insérés entre les séquences assurant la recombinaison afin de permettre, après 5 transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. Préférablement, le facteur de transcription dont l'expression est augmentée est choisi parmi TF001, TF004, TF015, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF039, TF040, TF041, TF043, TF051, TF052, TF070, TF072, TF074, TF077, TF078, TF079, 10 TF084, TF085, TF086, TF087 TF089, TF109 et TF126. Selon un mode de réalisation plus préféré, ledit facteur de transcription est choisi parmi TF001, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF039, TF040, TF072, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087 et TF126. Dans un autre mode de réalisation également préféré, redit facteur de transcription est choisi parmi TF004, TF015, TF043, TF051, TF052, TF070, TF074, 15 TF077et TF078 Enfin, selon encore un autre mode de réalisation tout autant préféré, le facteur de transcription est choisi parmi le groupe constitué de TF015, TF041, TF072, TF078, TF089, et TF109. Avantageusement, la surexpression du gène codant ledit facteur de transcription est obtenue par l'introduction dans la souche de levure de l'invention de copies 20 surnuméraires dudit gène sous le contrôle de séquences régulatrices telles que celles décrites plus haut. Lesdites copies supplémentaires dudit gène peuvent être portées par un vecteur épisomal, c'est-à-dire capable de se répliquer dans la levure. Préférentiellement, elles sont portées par un vecteur intégratif, c'est-à-dire s'intégrant à un endroit donné dans le génome de la levure (Madzak et al., 2004). 25 Dans ce cas, le polynucléotide comprenant le gène GPD1 sous le contrôle de régions régulatrices est intégré par intégration ciblée. L'intégration ciblée d'un gène dans le génome d'une levure est une technique de biologie moléculaire fréquemment utilisée. Dans cette technique, un fragment d'ADN est cloné dans un vecteur intégratif, introduit dans la cellule à transformer, lequel 30 fragment d'ADN s'intègre alors par recombinaison homologue dans une région ciblée du génome receveur (Orr-Weaver et al., 1981). De tels procédés de transformation sont bien connus de l'homme du métier et sont décrits, notamment, dans Ito et al. (1983), dans Klebe et al. (1983) et dans Gysler et al. (1990). Dans la mesure où cet 3028527 21 évènement de recombinaison est rare, des marqueurs de sélection sont insérés entre les séquences assurant la recombinaison afin de permettre, après transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. 5 Elles peuvent aussi être portées par des fragments de PCR dont les extrémités présentent de l'homologie avec un locus donné de la levure, permettant ainsi l'intégration desdites copies dans le génome de la levure par recombinaison homologue. Toute méthode de transfert connue de l'art antérieur peut être utilisée pour 10 introduire la cassette de surexpression du facteur de transcription de l'invention dans la souche de levure. Préférentiellement on pourra utiliser la méthode à l'acétate de lithium et au polyéthylène glycol (Gaillardin et al., 1987 ; Le Dalt et al., 1994). Selon l'invention, il est possible d'utiliser toute méthode de sélection connue de l'art 15 antérieur compatible avec le gène (ou les gènes) marqueur(s) utilisés, toute souche exprimant le gène marqueur choisi étant potentiellement une souche de levure défective en gène ADE2, URA3 ou LEU2. Les marqueurs de sélection permettant la complémentation d'une auxotrophie, également communément appelés marqueurs d'auxotrophie, sont bien connus de 20 l'homme du métier. Le marqueur de sélection URA3 est bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de Y. lipolytica dont le gène URA3 (ladite séquence est aussi accessible par le numéro d'accession YALIOE26719g à l'adresse http: / /www.genolevures.org/»), codant pour l'orotidine-5'-phosphate 25 décarboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en uracile. L'intégration du marqueur de sélection URA3 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu dépourvu d'uracile. Le marqueur de sélection LEU2 décrit notamment dans le brevet US 4,937,189 est 30 également bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de Y. lipolytica dont le gène LEU2 (YALIOE26719g), codant la 8-isopropylnnalate déshydrogénase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de 3028527 22 pousser sur un milieu non supplémenté en leucine. Comme précédemment. L'intégration du marqueur de sélection LEU2 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en leucine. 5 Le marqueur de sélection ADE2 est également bien connu de l'homme du métier dans le domaine de la transformation de la levure. Une souche de Yarrowia dont le gène ADE2 (YAL10823188g), codant pour la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en adénine. Là encore, l'intégration du marqueur de sélection ADE2 10 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en adénine. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de l'invention, l'expression dudit facteur de transcription est diminuée par rapport à une souche sauvage. Autrement dit, le polynucléotide introduit dans la souche de levure oléagineuse, notamment de 15 Y. lipolytica, conduit à une diminution de l'expression du facteur de transcription. Dans ce mode réalisation, le facteur de transcription sera avantageusement choisi parmi TF007, TF038, TF041, TF043, TF055, TF060, TF064, TF068, TF075, TF077, et TF109. Selon un mode de réalisation préféré, ledit facteur de transcription est choisi parmi TF007, TF038, TF043, TF055, TF060, TF064, TF068, TF075, TF077 et TF109. 20 Selon un autre mode de réalisation préféré, le facteur de transcription est TF041 ou TF109. Enfin, selon un troisième mode de réalisation également préféré, le facteur de transcription est TF068. La diminution de l'expression dudit facteur pourra être obtenue par n'importe quel moyen connu de l'homme du métier convenant à ce but. On citera par exemple 25 l'utilisation de promoteurs qui peuvent être réprimés ou celle d'antisens. Préférentiellement, la diminution de l'expression dudit facteur de transcription sera obtenue par inactivation du gène codant ledit facteur de transcription. Plusieurs méthodes pour inactiver un gène d'intérêt dans une levure, et en particulier dans une levure oléagineuse, sont ainsi connues dans l'art antérieur. 30 Par exemple, on citera la méthode appelée POP IN/ POP OUT qui a été utilisée chez les levures, particulièrement chez Y. lipolytica, pour la délétion des gènes LEU2, URA3 et XPR2 comme il est décrit dans la revue de Barth et al. (1996). Elle consiste à intégrer un vecteur comprenant un gène d'intérêt délété au locus considéré, puis à 3028527 23 sélectionner l'excision dudit vecteur et d'identifier un clone qui par recombinaison a éliminé le gène sauvage et conservé le gène muté. Préférentiellement selon l'invention on pourra utiliser une méthode conduisant à l'inactivation du gène d'intérêt. 5 Par inactivation ou invalidation d'un gène d'intérêt (les deux termes tels qu'utilisés dans la présente demande sont synonymes et ont donc la même signification), on entend selon l'invention, toute méthode aboutissant à la non expression de la protéine native codée par ledit gène d'intérêt, par modification de l'enchaînement des nucléotides constituant ledit gène de telle sorte que quand bien même sa 10 traduction serait effective, elle ne conduirait pas à l'expression de la protéine native codée par le gène d'intérêt sauvage. Préférentiellement selon l'invention, on utilise une méthode conduisant à une extinction totale de l'expression du gène d'intérêt. Cela peut être réalisé par une délétion totale du gène d'intérêt, par une délétion partielle du gène d'intérêt, par 15 l'insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans ledit gène d'intérêt, ladite méthode utilisée rendant le gène d'intérêt non fonctionnel (gène d'intérêt inactivé ou invalidé), à tout le moins codant une protéine ne possédant pas les propriétés de la dite protéine native. On obtient ainsi une souche de levure n'exprimant pas le gène d'intérêt que l'on 20 nommera par la suite dans le présent texte "souche défective en gène d'intérêt". On peut aussi utiliser la méthode SEP (Maftahi et al., 1996) qui a été adaptée chez Y. lipolytica pour la disruption successive des gènes PDX (Wang et al., 1999). Cette méthode est plus rapide, mais nécessite toujours l'utilisation d'un marqueur permettant une contre sélection. Avantageusement selon l'invention on utilisera la 25 méthode SEP/Cre développée par Fickers et al. (2003) et décrite dans la demande internationale W02006/064131. C'est une méthode rapide et qui ne nécessite pas l'utilisation d'un marqueur permettant une contre sélection. Cette méthode consiste à : 1) sélectionner le gène d'intérêt que l'on veut déléter, 30 2) construire une cassette de disruption par PCR (« Polymerase Chain Reaction) ou par clonage, 3028527 24 3) introduire un marqueur de sélection contenant de part et d'autre des séquences de recombinaison (avantageusement des séquences loxP et/ou loxR ou dérivées) permettant une recombinaison entre elles pour l'élimination du marqueur (avantageusement une séquence de type loxP qui permet la 5 recombinaison sous l'action de la recombinase Cre), 4) sélectionner les souches avec le gène d'intérêt délété (transformation et sélection des transformants) et de vérifier la délétion, 5) transformer avec un vecteur permettant l'expression de la recombinase (avantageusement la recombinase Cre qui permet la recombinaison des 10 séquences loxP/(oxR et l'élimination du marqueur) 6) isoler un clone présentant la délétion du gène d'intérêt et ayant perdu le plasmide d'expression de la recombinase. La cassette d'insertion de l'étape 2 comprend un gène codant un marqueur de sélection (gène de sélection), ledit gène étant préférentiellement encadré par les 15 régions promotrices et terminatrices du gène d'intérêt, de façon à permettre le remplacement complet du gène d'intérêt par recombinaison homologue. Selon un mode particulier de réalisation, le gène de sélection est en outre encadré par une ou des séquences de recombinaison, lesdites séquences de recombinaison permettant une recombinaison entre elles conduisant à l'élimination du gène codant le marqueur 20 de sélection. Avantageusement la ou les séquence(s) de recombinaison, est (ou sont) une (ou des) séquence(s) loxP ou une (ou des) séquence(s) loxR ou (une ou des) séquence(s) dérivée(s) de ces séquences de recombinaison, ladite (lesdites) séquence(s) dérivées(s) ayant conservée(s) l'activité des séquences de recombinaison d'origine. Préférentiellement à cette étape, le gène codant le marqueur de sélection 25 pourra être encadré par des séquences de type loxP qui, sous l'action de la recombinase Cre se recombinent entre elles permettant l'excision de la séquence du gène codant ledit marqueur de sélection. L'introduction de la cassette d'invalidation à l'étape 3 dans la souche de levure récipiendaire peut se faire par toute technique connue de la personne du métier. 30 Comme indiqué plus haut, on se réfèrera pour cela à G. Barth et al. (1996). Les transformants exprimant le marqueur de sélection sont sélectionnés à l'étape 4. La présence du marqueur peut être vérifiée par toute méthode usuelle connue de la personne du métier, comme par exemple la PCR ou l'hybridation par Southern blot. 3028527 25 Dans l'étape 5, on introduit dans un transformant sélectionné dans l'étape précédente un plasmide permettant l'expression d'une recombinase. Préférentiellement, le plasmide sera porteur du gène de la recombinase Cre (Sauer, 1987) qui permet la recombinaison des séquences loxP/IoxR et l'élimination du 5 marqueur. Cette technique est couramment utilisée par l'homme du métier cherchant à exciser une séquence intégrée spécifique (Hoess and Abremski, 1984). L'étape 6 est une étape standard de sélection d'un clone ayant excisé le gène de sélection et présentant donc un phénotype d'absence du marqueur de sélection. Chacun de ces modes de réalisation peut être répété autant de fois que nécessaire. 10 Selon un mode de réalisation encore plus préféré, la méthode de l'invention permet de construire des souches dans lesquelles l'expression de plusieurs facteurs de transcription de l'invention est altérée. Par exemple, on peut ainsi construire des souches dans lesquelles l'expression de plusieurs facteurs de transcription selon l'invention est surexprimée. De même, il est possible de construire des souches dans 15 lesquelles l'expression de plusieurs facteurs de transcription est diminuée, préférablement par inactivation des gènes codant lesdits facteurs de transcription. Enfin, il est possible de construire des souches dans lesquelles l'expression d'au moins un facteur de transcription est augmentée et l'expression d'au moins un autre facteur de transcription est diminuée. 20 Selon encore un autre mode de réalisation préféré, la méthode de l'invention peut comprendre des étapes supplémentaires visant à modifier l'expression d'au moins un autre gène impliqué dans l'accumulation des lipides. Avantageusement, la méthode de l'invention comprendra ainsi une étape dans laquelle au moins une construction permettant de surexprimer un gène choisi parmi 25 GPD1 et DGA2 est introduite dans la souche de l'invention. Préférablement, une construction permettant de surexprimer GDP1 et une construction permettant de surexprimer DGA2 sont introduites ensemble dans ladite souche de l'invention. Selon un autre mode de réalisation préféré, au moins un des gènes contrôlant la beta-oxydation est inactivé dans la souche de l'invention. Comme noté plus haut, ces 30 gènes sont les gènes MFE1, POT1 et les gènes PDX (Tableau2) et les gènes PEX (Tableau 3). 3028527 26 Table 2: Gènes participant au métabolisme des acides gras chez la levure, notamment Y. lipolytica. La séquence de chacun des gènes ou des protéines correspondantes est disponible à partir du nom du gène ou de son numéro d'accession sur le site Genolevures (http://www.genolevures.org/). Gene Name N ° EC Function GUT1 YALIOF00484g EC 2.7.1.30 Glycérol kinase GPD1 YALIOB02948g EC 1.1.1.18 Glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)) GUT2 YALIOB13970g EC 1.1.99.5 Glycerol-3-phosphate déshydrogénase SCT1 YALI0000209g EC 2.3.1.15 Glycerol-3-phosphate acyltransférase SLC1 YALIOE18964g EC 2.3.1.51 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransférase DGA1 YALIOE32769g EC 2.3.1.20 Diacylglycérol acyltransférase LRO1 YALIOE16797g EC 2.3.1.158 Phospholipide :diacylglycérol acyltransférase TGL3 YALIOD17534g EC 3.1.1.3 Triacylglycérol lipase TGL4 YALIOF10010g EC 3.1.1.3 Triacylglycérol lipase ARE1 YALIOF06578g EC 2.3.1.26 Acyl-CoA :stérol acyltransférase DGA2 YALIOD07986g EC 2.3.1.20 Diacylglycérol acyltransférase TGL1 YALIOE32035g EC 3.1.1.13 Cholestérol estérase PDX1 YALIOE32835g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxydase PDX2 YALIOF10857g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxydase PDX3 YALIOD24750g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxydase PDX4 YALIOE27654g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxydase 3028527 27 PDX5 YALIOC23859g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxydase PDX6 YALIOE06567g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxydase MFE1 YALIOE15378g EC 4.2.1.74 Protéine multifonctionnelle de la beta oxydation POT1 YALI018568g EC 2.3.1.16 Peroxisomal Oxoacyl Thiolase Table 3: Gènes participant au métabolisme du peroxisome chez la levure, notamment Y. lipolytica. La séquence de chacun des gènes ou des protéines correspondantes est disponible à partir du nom du gène ou de son numéro 5 d'accession sur le site Genolevures (http://www.genolevures.org/). Gène Numéro d'accessionS. ce revisiae Numéro d'accession Y . lipolytica Fonction PEX1 YKL197c YALIOC15356g AAA-peroxine PEX2 YJL210W YALIOF01012g Peroxine à RING-finger fonctionnant dans l'import des protéines dans la matrice péroxisomale PEX3 YDR329c YALIOF22539g Protéine de la membrane péroxisomale (PMP) PEX4 YGR133w YALIOE04620g Enzyme péroxisomale de conjugaison à l' ubiquiti ne PEX5 YDR244w YALIOF28457g Récepteur de la membrane péroxisomale PEX6 YNL329c YALIOC18689g AAA-peroxine PEX7 YDR142c YALIOF18480g Récepteur péroxisomal PEX8 YG R077c / Organisateur intrapéroxisomal de la machinerie de l'import péroxisomal 3028527 28 PEX9 / YALIOE14729g Protéine intégrale de la membrane péroxisomale PEX10 YDR265w YALI0001023g Ligase E3 à l'ubiquitine de la membrane péroxisomale PEX11 YOL147c YALI0004092g Protéine de la membrane péroxisomale PEX12 YMR026c YALIOD26642g Peroxine à RING-finger de type C3HC4 de la membrane péroxisomal PEX13 YLR191w YALI0005775g Protéine intégrale de la membrane péroxisomale PEX14 YGL153w YALIOE9405g Peroxine de la membrane péroxisomale PEX15 YOL044w / Protéine intégrale de type II de la membrane péroxisomale PEX16 / YALIOE16599g Peroxine périphérique membranaire Intrapéroxisonnale PEX17 YNL214w / Peroxine de la membrane péroxisomale PEX18 YHR160c / Peroxine PEX19 YDL065c YALI0822660g Récepteur chaperone de l'import PEX20 / YALIOE06831g Peroxine PEX21 YGR239c / Peroxine PEX22 YAL055w / Protéine putative de la membrane péroxisomale PEX23 PEX30 (YLR324w) YALIOD27302g Peroxine intégrale de la membrane PEX31 péroxisomale (YGROO4w) PEX32 3028527 29 (YBR168w) PEX25 YPL112c YALIOD05005g Protéine périphérique de la membrane péroxisomale PEX27 YOR193w / Protéine périphérique de la membrane péroxisomale PEX28 YHR150w YALIOD11858g Peroxine intégrale de la membrane YALIOF19580g péroxisomale PEX29 YDR479c YALIOF19580g Peroxine intégrale de la membrane péroxisomale PEX30 YLR324W YALIOD27302g Protéine intégrale de la membrane péroxisomale PEX3 / YGROO4W YALIOD27302g Protéine intégrale de la membrane péroxisomale PEX32 YBR168w YALIOD27302g Protéine intégrale de la membrane péroxisomale Dans ce mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention comprend en particulier une étape d'inactivation d'au moins un gène contrôlant la bêta-oxydation, caractérisé en ce que 5 dans une première étape, on construit une cassette d'invalidation comprenant les séquences promotrices et terminatrices dudit gène de levure, particulièrement de levure oléagineuse, plus particulièrement de Y. lipolytica, encadrant un gène codant un marqueur de sélection (gène de sélection), ledit gène de sélection étant lui-même encadré de part et d'autre 10 de sa séquence par une (ou des) séquence(s) de recombinaison, lesdites séquences de recombinaison permettant une recombinaison entre elles conduisant à l'élimination dudit gène codant le marqueur de sélection ; 3028527 30 dans une deuxième étape, on introduit ladite cassette d'invalidation obtenue en 1, dans une souche de levure, particulièrement une souche de levure oléagineuse, plus particulièrement Y. lipolytica ; dans une troisième étape, on sélectionne, parmi les souches de levure 5 transformées à l'étape 2, une souche de levure, particulièrement une souche de levure oléagineuse, plus particulièrement une souche de Y. lipolytica, défective pour le gène d'intérêt, souche ayant introduit par double recombinaison (double cross-over) le gène marqueur en lieu et place dudit gène d'intérêt, conduisant ainsi à un gène inactivé ; 10 dans une quatrième étape, on vérifie l'invalidation dudit gène dans ladite souche de levure sélectionnée à l'étape 3. Selon une variante de l'invention, le procédé peut en outre présenter 2 étapes supplémentaires à savoir : une cinquième étape au cours de laquelle on transforme ladite souche 15 sélectionnée à l'étape 4 avec un vecteur permettant l'expression d'une recombinase afin d'obtenir l'élimination du gène exprimant le marqueur de sélection ; une sixième étape, au cours de laquelle on isole une souche de levure défective pour le gène, et n'exprimant plus le gène marqueur. 20 Le procédé d'inactivation d'un gène de la bêta-oxydation peut ensuite être répété de façon à inactiver un autre gène, si cela est nécessaire. La personne du métier sera ainsi à même d'inactiver autant de gènes que nécessaire, par simple répétition du procédé SEP d'inactivation de gène. Ladite personne peut ainsi construire les souches de levure mutantes décrites plus haut, qui comportent plusieurs gènes inactivés. 25 Selon l'invention, on pourra avantageusement utiliser une souche de levure qui ne réalisera pas la bêta-oxydation des lipides, par exemple une souche qui n'exprimera pas les gènes responsables de la bêta-oxydation des lipides comme les gènes PDX, MFE1 ou POT1 , avantageusement une souche n'exprimant pas les gènes PDX, à tout le moins les gènes PDX2, PDX3, PDX4 et PDX5, préférentiellement les gènes PDX1 , 30 PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6, comme par exemple les souches décrites dans la demande internationale WO 2006/064131 publiée le 22 juin 2006, préférentiellement les souches : 3028527 31 - MTLY37 (Leu', Ura±; àpox5, àpox2, àpox3, àpox4 ::URA3), - MTLY40 (Leu', Ura-; àpox5-PT, àpox2-PT, àpox3-PT, àpox4::ura3-41), - MTLY64 (Leu-, Ura- ; Hyg+; àpox5, àpox2, àpox3, àpox4::ura3-41 , leu2 ::Hyg), 5 - MTLY66 (Leu-, Ura- ; àpox5, àpox2, àpox3, àpox4::ura3-41, àleu2), - MTLY82 (Leu-, Ura- ; Nye; àpox5, àpox2, àpox3, àpox4::ura3-41, àleu2, pox1 ::Hyg), - MTLY86 Leu-, Ura- ; àpox5; àpox2, àpox3, àpox4::ura3-41, àleu2, àpox1), - MTLY92 (Leu-, Ura- ; Hyg+; àpox5, àpox2, àpox3, àpox4 ::ura3-41, àleu2, 10 àpox1 , pox6::Hyg), - MTLY95a (Leu-, Ura- ; àpox5, àpox2, àpox3, àpox4::ura3-41, àleu2, àpox1, àpox6) Dans un autre aspect de l'invention, on pourra aussi utiliser une souche de levure telle que celles décrite dans la demande PCT WO 2010/004141, publiée le 14 janvier 15 2010. On pourra par exemple utiliser les souches : - JMY1351 (Leu-, Lira', àpox5, àpox2, àpox3, àpox4::ura3-41, àleu2, àpox1, àpox6, àgut2) - JMY1393 (Leu-, Lira', àpox5, àpox2, àpox3, àpox4::ura3-41, àpox1, àpox6, àgut2). 20 Dans encore un autre aspect de l'invention, on pourra utiliser les souches décrites dans les publications Béopoulos et al. (2008, 2012), Dulermo et al. (2013) et Wang et al (1999). L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une souche de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica, pour la synthèse de lipides, particulièrement des acides 25 gras libres et des triacylglycérols. Dans un aspect plus particulièrement préféré, l'invention a pour objet l'utilisation d'une souche de levure oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, chez qui l'expression d'au moins un des facteurs de transcription de l'invention est altérée, ainsi que décrit plus haut, pour la synthèse d'acides gras libres et de triacylglycérols. 30 La présente invention a aussi pour objet un procédé de synthèse de lipide dans lequel : 3028527 32 - dans une première étape, on cultive une souche de levure selon l'invention dans un milieu approprié et - dans une seconde étape on récolte les lipides produits par la culture de l'étape 1. 5 Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et Figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée. Légendes des Figures 10 Figure 1 : Schéma du vecteur JMP1490 pour la création d'une plateforme Zeta au locus URA3. Il contient les régions amont (Pura3_CDS) et aval (Tura3_CDS) du gène URA3, le marqueur de sélection LEU2 pour Y. lipolytica, les régions Zeta pour l'intégration de la cassette d'expression et le marqueur de fluorescence RedStar2 sous le contrôle du promoteur pTEF. Il contient l'origine de réplication ColE1 et le 15 marqueur de sélection pour la kanamycine (KanR) pour la sélection chez E. coli. Figure 2 : Schéma du vecteur accepteur JMP1529 permettant d'intégrer un gène d'intérêt. Il contient le marqueur de sélection URA3 pour Y. lipolytica, les régions Zeta pour l'intégration de la cassette d'expression, le promoteur pTEF pour l'expression constitutif du gène d'intérêt ainsi que le marqueur de sélection pour le 20 chlorannphenicol (CmR) et le gène de toxicité ccdB bordés par les séquences de recombinaison (attR). Il contient l'origine de réplication ColE1 et le marqueur de sélection pour l'ampicilline (AmpR) pour la sélection chez E. coli. Figure 3: Construction des vecteurs d'expression pour la construction de l'ORFeome de Y. lipolytica. Les vecteurs donneurs issus de la banque de cDNA 25 (Mekouar et al., 2010) ou de vecteurs spécifiques contenant un gène d'intérêt (gène X) bordé par des séquences de recombinaison attL qui permettent la recombinaison in vitro avec les séquences attR du vecteur accepteur JMP1529. Le vecteur d'expression obtenu contient le gène d'intérêt sous le contrôle du promoteur constitutif pTEF. Il contient les marqueurs de sélection AmpR pour E.coli et URA3 30 pour Y. lipolytica. Figure 4 : Schéma de la cassette d'expression et du locus ura3-1490. A. Schéma de la cassette d'expression des gènes d'intérêts digérée par les enzymes de 3028527 33 restriction Notl ou Iceul. Il contient les régions Zeta pour l'intégration de la cassette d'expression, le gène d'intérêt sous le contrôle du promoteur constitutif pTEF ainsi que le marqueur de sélection URA3 pour Y. lipolytica. B. Schéma du locus ura3-1490 dans la souche réceptrice JMY2566. Il contient la plateforme d'intégration zeta du 5 vecteur JMP1490 intégré par recombinaison au locus URA3. Il contient le marqueur de sélection LEU2 pour Y. lipolytica, les régions Zeta pour l'intégration de la cassette d'expression et le marqueur de fluorescence RedStar2 sous le contrôle du promoteur pTEF. C. Schéma du locus ura3 dans la souche réceptrice JMY2566 après intégration par recombinaison de la cassette d'expression d'un gène d'intérêt à la plateforme 10 Zeta. Les doubles flèches correspondent aux tailles des fragments amplifiés par PCR avec le couple amorces ATTR2zetaUP/Turadown dans le cas d'une intégration aléatoire (2680bp) ou d'une intégration au locus (> à 4000 bp et de 1052bp). Figure 5: Vérification de l'intégration de la cassette d'expression. Gel d'électrophorèse de produit PCR amplifié avec le couple d'amorces 15 ATTR2zetaUP/Turadown pour 5 transformants indépendants permettant de discriminer entre une intégration à la plateforme Zeta (fragment de 1052pb) et une intégration aléatoire (fragment de 2680pb). M : marqueur de poids moléculaire 1Kb DNA ladder. Figure 6: Expression de protéines fluorescentes. Phénotype des souches de 20 validation du système de surexpression. Images par microscopie à fluorescence de la souche JMY2812 surexprimant de manière constitutive les protéines RedStar2 et EYFP ; Cadre du haut : fluorescence rouge de la RedStar2 (filtre Texasred); cadre du milieu: fluorescence verte de la EYFP (filtre YFP); cadre du bas : image des cellules en lumière blanche avec contraste de phase (DIC). 25 Figure 7 : Expression de la protéase alcaline extracellulaire. Image de colonies montrant sous forme de halos, la dégradation des protéines de lait par la protéine AEP codée par le gène XPR2. Souche sauvage W29, souche JMY2810 délétée pour le gène XPR2 et la souche JMY2813 surexprimant le gène XPR2. Figure 8 : Expression de l'invertase SUC2 de S. cerevisiae. Courbe de croissance en 30 microplaque des souches JMY2810 (témoin) et JMY2815 (surexprimant l'invertase SUC2) sur milieu minimum sucrose YNBsuc 0.5%. 3028527 34 Figure 9 : Fréquence de transformation et type d'intégration. Représentation graphique du nombre de transformants en fonction du protocole de transformation utilisé (Protocole A et Protocole B), de la souche (JMY2033 et JMY2566) et du gène (1: gène de la RedStar2 ; 2 : gène SUC2). Le nombre de transformants avec une 5 intégration à la plateforme Zeta est représenté en noir. Le nombre de transformants avec une intégration aléatoire est représenté en gris. Figure 10: Distribution de l'activité protéase alcaline extracellulaire. Activité protéase mesurée avec la FTC-caséine pour 96 transformants. Distribution de l'activité Vmax et nombre de transformants par niveau d'activité. La caséine-FTC a 10 été utilisée pour mesurer l'activité protéase en microplaques à l'aide d'un lecteur de microplaques (Bioteck), avec une longueur d'onde d'excitation à 494 nm et une longueur d'onde d'émission à 517 nm toutes les minutes pendant 1 heure. La Vmax a été calculée avec une fenêtre glissante de 30 points. Le nombre de clones pour chaque gamme de Vmax est indiqué au dessus de chaque barre. 15 Figure 11 : Accumulation de lipide. Représentation graphique du pourcentage de variation du niveau d'accumulation de lipides totaux intracellulaire en fonction de la souche étudiée par rapport à la souche témoin JMY2810. Le graphique comprend 14 souches sur-accumulant des lipides (Barres noires, TF001, TF072, TF039, TF084, TF019, TF079, TF087, TF086, TF126, TF040, TF024, TF031, TF033, TF085 et TF021 20 par ordre décroissant) et 11 souches accumulant moins de lipides (barres blanches, TF060, TF007, TF043, TF038, TF055, TF075, TF077, TF109, TF064, TF068 et TF099 par ordre décroissant) Figure 12 : Effet des facteurs de transcription sur l'activité du promoteur TEF.A, Courbes de croissance de transformants exprimant différents facteurs de 25 transcription (D0600). B. Expression de la Fluorescence à 558/586nm. W29 (carré blanc) : souche sauvage ; JMY2810 (losange gris): JMY2566 transformé avec un vecteur sans facteur de transcription ; Mutants d'intérêt (triangle blanc, triangle noir, carré gris et rond gris) : JMY2566 transformé avec les facteurs de transcription (TFxx,). 30 Figure 13 : Profils type de l'activité du promoteur TEF dépendant des facteurs de transcription. A. Profils d'expression de la RedStar2 sous le contrôle du promoteur constitutif pTEF de type 1. Surexpression de la RedStar2 en phase exponentielle de croissance. Cinétique de fluorescence représentative des souches TF046, TF068 et 3028527 TF099 (triangles noirs), de la souche témoin JMY2810 (losanges gris) et de la souche sauvage W29 (carrés blancs). B. Profils d'expression de la RedStar2 sous le contrôle du promoteur constitutif pTEF de type 2. Surexpression de la RedStar2 en phase stationnaire de croissance. Cinétique de fluorescence représentative des souches 5 TF090, TF110 et TF126 (triangles blancs), de la souche témoin JMY2810 (losanges gris) et de la souche sauvage W29 (carrés blancs). C. Vitesse d'expression de la RedStar2 en fonction des différentes phases de croissance : phase exponentielle (phase 1) ; fin de phase exponentielle (phase2), phase stationnaire (phase 3). Figure 14 : Production de succinate. Représentation graphique du pourcentage de 10 variation du niveau de production de succinate en fonction de la souche étudiée par rapport à la souche témoin JMY2810. Le graphique comprend 9 souches surproduisant du succinate (Barres noires, TF078, TF077, TF070, TF051, TF052, TF015, TF074, TF043, et TF004 par ordre décroissant) et 3 souches sous-produisant du succinate (Barres blanches, TF041, TF099 et TF019 par ordre décroissant). 15 Exemples Matériels et méthodes Souches et milieux Les souches d'Escherichia coli TOP10 and DH5a (Invitrogen) ont été utilisées pour la 20 transformation et l'amplification de l'ADN plasmidique recombinant. Les cellules ont été cultivées sur milieu LB (Sambrook et al., 2001) à 37°C. En fonction du marqueur de résistance, la kanamycine (50 ug/nnL) ou l'ampicilline (100 ug/nnL) ont été utilisées pour la sélection des plasmides. Les souches mutantes de Y. lipolytica sont dérivées de la souche auxotrophique Po1d 25 (Nicaud et al., 2002), elle-même dérivée de la souche sauvage W29 (de génotype MatA ; ATCC20460) (Barth et Gaillardin, 1996). Les souches utilisées et produites dans la présente invention sont présentées dans les tableaux 4 et 5. Leur construction est décrite ci-dessous. 30 3028527 36 Tableau 4 : Souches de E. coli Souche E. Numéro de Génotype Références cou plasmide JME1226 JMP1226 KanR PTura3-LEU2ex-Zeta Lazar et al. 2013 JME1490 JMP1490 JMP1226 pTEF-RedStar2 Ce travail JME1521 JMP1521 JMP62 pTEF-URA3ex AmpR et ORI de Ce travail PBR322 JME1529 JMP1529 JMP1521-cassette ccdB Gateway Ce travail JME1488 pDONR207 Vecteur donneur Gateway Invitrogen® JME1592 JMP1592 pDONR207-XPR2 Ce travail JME1593 JMP1593 pDONR207-SUC2 Ce travail JME1594 JMP1594 pDONR207-eYFP Ce travail JME1595 JMP1595 pDONR207-RedStar2 Ce travail JME1598 JMP1598 JMP1529-SUC2 Ce travail JME1599 JMP1599 JMP1529-eYFP Ce travail JME1600 JMP1600 JMP1529-RedStar2 Ce travail JME1603 JMP1603 JMP1529-XPR2 Ce travail JME911 JMP911 JMP62 URA3ex pPDX eYFP c-ter ce travail JME1394 JMP1394 JMP62 LEU2ex pTEF-RedStar2 Kabran et al. 2012 JME1469 JMP1469 JMP62 URA3ex-pTEF-SUC2 Lazar et al. 2013 JME1030 PDEST14 Vecteur de destination Gateway Invitrogen® 5 3028527 37 Table 5 : Souches de Y. lipolytica Souche de Y. Génotype Références lipolytica JMY195 (Pol d) MATa ura3-302 leu2-270 xpr2-322 Barth and Gaillardin (pXPR2-SUC2 au locus URA3) (1996) JMY2566 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta Ce travail leu2-270 xpr2-322 JMY2810 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-ZetaURA3ex-pTEF leu2-270 xpr2-322 Ce travail JMY2811 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-ZetaURA3ex-pTEF-RedStar2 leu2-270 xpr2- Ce travail 322 JMY2812 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-ZetaURA3ex-pTEF-eYFP leu2-270 xpr2-322 Ce travail JMY2813 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-ZetaURA3ex-pTEF-XPR2 leu2-270 xpr2-322 Ce travail JMY2815 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-ZetaURA3ex-pTEF-SUC2 leu2-270 xpr2-322 Ce travail JMY2033 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex leu2- Lazar et al., 2013 270 xpr2-322 JMY2101 MATa ura3-302 xpr2-322+pXPR2-SUC2 Ce travail Les milieux et conditions de cultures ont été décrits par Barth et al. (1996). Le milieu minimum YNB est composé de 0.17% (p/v) de base azotée levure (sans sulfate 5 d'ammonium et d'acides aminés, YNByvvv ; Difco, Paris, France), 0.5% (p/v) de NH4Cl, 1% (p/v) et 50nnM de tampon phosphate (pH 6.8). Ce milieu est complémenté de 0,5% à 3% de glucose (p/v ; YNBgIu) ou de 0,5% à 3% de glycérol (v/v ; YNBgIy), ou de 0,5% de sucrose (p/v ; YNBsuc) ou de 0,5% à 3% d'acide oléique (v/v ; YNBao), ou de 1,.6% de lait écrémé (p/v ; YNBsm) et complémenté de 0,01% d'uracile (p/v) pour les 10 souches auxotrophes. Les cellules de levure ont été cultivées sur les milieux YPD (Barth et al., 1996) ou YNBCas (YNBD avec casamino acides 0,2%) pour la sélection 3028527 38 des transformants Ura+. Pour les cultures en milieu solide, les milieux sont complémenté par 1,5% (w/v) d'agar. Techniques générales de biologie moléculaire Les techniques classiques de biologie moléculaires ont été utilisées dans cette étude 5 (Sambrook et al., 2001). Les enzymes de restriction proviennent de chez OZYME (Saint-Quentin-en-Yvelynes, France). Les levures sont transformées par la méthode à l'acétate de lithium (Le Dalt et al., 1994). L'ADN génomique des transformant est préparé selon la méthode de Querol (Querol et al., 1992). Les PCR sont réalisées avec un thermocycleur Eppendorf 2700 avec la polymerase GoTaq (Promega), la 10 TaKaRa Ex Tag' ou la PyroBest (Takara). Les fragments de PCR sont purifiés soit à partir de la PCR avec le kit de purification QIAgen Purification Kit, soit à partir du gel d'agarose avec le kit QlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France). Extraction d'ADN génomique de Yarrowia lipolytica Les souches de Yarrowia lipolytica (souche sauvage W29 ou souches mutantes), sont 15 cultivées sur boite en milieu YPD 24h à 28°C. Pour chaque souche, une colonie est prélevée et transvasée en tube PCR 200 pL, dans 10 pL de solution NaOH 0,02N. Chaque tube est incubé en thermocycleur 5 minutes à 100°C. Les tubes sont ensuite immédiatement placés en glace, puis centrifugés brièvement afin de récupérer les gouttelettes d'évaporation. Pour chaque PCR, 2 pL de suspension cellulaire sont 20 prélevés. Techniques de clonage Gateway A partir de cDNA : Les gènes d'intérêts présents dans la banque de cDNA de Y. lipolytica (Mekouar et al., 2010) sont transférés dans le vecteur accepteur JMP1529 avec le kit LR clonage (Invitrogen). 25 A partir de fragment PCR : Les gènes d'intérêts sont amplifiés par PCR avec les amorces décrites dans la table 6. Les fragments de PCR sont introduits dans le vecteur pENTIr/D-TOPOO (Invitrogen). Les gènes clonés dans le vecteur pENTIr/D-TOPOO sont transférés dans le vecteur accepteur JMP1529 en utilisant le kit LR Clonase II Enzyme (Invitrogen). Les vecteurs 30 recombinants issus de la recombinaison par la LR Clonase sont transformés dans 3028527 39 DH5a. Chaque transformant est sélectionné sur milieu sélectif (ampicilline 100 pg/mL). Les amorces utilisées pour vérifier les différentes souches construites sont listées 5 dans le tableau 6 ci-dessous. Tableau 6: Tableau des amorces pour la construction et la vérification des vecteurs et des souches de E. coli et Y. lipolytica. Nom Sequence nucléotidique Description F_AGE1_tefred CGCACCGGTaatcgatagagaccgggttg Amorce sens pour l'amplification du fragment pTEF-RedStar2 pour le clonage dans JMP1226. Site de restriction Agel en majuscule. R_AGEl_tefred GGTGACCGGTcgatttgtcttagaggaacg Amorce antisens pour l'amplification du fragment pTEF-RedStar2 pour le clonage dans JMP1226. Site de restriction Agel en majuscule. 61TEFstart tccccgaattacctttcctc Amorce pour la vérification du sens d'insertion du fragment pTEF-Redstar2 dans JMP1226 For_in_Dsred acccagctgacattccagac Amorce pour la vérification du sens d'insertion du fragment pTEF-Redstar2 dans JMP1226 uraup_l 226 ggttggccgacaacaatatc Amorce pour la vérification du sens d'insertion du fragment pTEF-RedStar2 dans JMP1226 leudown_l 226 gccctccaagatgaatggta Amorce pour la vérification du sens d'insertion du fragment pTEF-RedStar2 dans JMP1226 Puraextver cctgcgcaaaacattgtatg Amorce pour la vérification intégration de la cassette LEU2 pTEF-RedStar2 Zeta 3028527 au locus ura (amont) RED2_no_skl tggtgcctaggctgcttacaagaacaagtggtgtct Amorce pour la vérification intégration acc de la cassette LEU2 pTEF-RedStar2 Zeta au locus ura (amont) VerZetasens cgagtaacactcgctctggagagttagtcatcc Amorce pour la vérification intégration de la cassette LEU2 pTEF-RedStar2 Zeta au locus ura (aval) Turaextver tgctggctttacgttgtcag Amorce pour la vérification intégration de la cassette LEU2 pTEF-RedStar2 Zeta au locus ura (aval) PBRup cgcGCGGCCGCCGTAACTATAACGGTCC Amorce sens pour l'amplification du TAAGGTAGCGAAcatcatcagtaacccgtatc fragment AmpR-ori de PBR322. Site de gtgagc restriction Notl et Iceul en majuscule, Notl souligné PBRdown cgcGCGGCCGCTTCGCTACCTTAGGACC Amorce antisens pour l'amplification du GTTATAGTTACGgtcaggtggcacttttcgggg fragment AmpR-ori de PBR322. Site de aaat restriction Notl et Iceul en majuscule, Notl souligné bgl2_gate_plus cgcAGATCTatcacaagtttgtacaaaaaa Amorce sens pour l'amplification de la cassette Gateway® à partir du pDEST14 (Invitrogen). Site de restriction Bel en majuscule. gate_avr2_plus ggtgCCTAGGatcaccactttgtacaagaaa Amorce antisens pour l'amplification de la cassette Gateway® à partir du pDEST14 (Invitrogen). Site de restriction Avril en majuscule. attb1_dsred GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC Tatgagtgcttcttctgaaga Amorce sens pour l'amplification du gène RedStar2 avec la séquence de recombinaison attbl (en majuscule) Dsred_attb2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG Amorce antisens pour l'amplification du GTCttacaagaacaagtggtgtc gène RedStar2 avec la séquence de 3028527 41 recombinaison attb2 (en majuscule) Attbi -eYFP GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC Tatggtgagcaagggcgagga Amorce sens pour l'amplification du gène eYFP avec la séquence de recombinaison attbl (en majuscule) Attb2-eYFP GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG Amorce antisens pour l'amplification du GTCttacttgtacagctcgtccatgcc gène eYFP avec la séquence de recombinaison attb2 (en majuscule) Attbi -SUC2 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC Tatgcttttgcaagctttcc Amorce sens pour l'amplification du gène SUC2 avec la séquence de recombinaison attbl (en majuscule) Attb2-SUC2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG Amorce antisens pour l'amplification du GTCctattttacttcccttacttgg gène SUC2 avec la séquence de recombinaison attb2 (en majuscule) Attbl -xpr2 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC Tatgaagctcgctaccgcctt Amorce sens pour l'amplification du gène XPR2 avec la séquence de recombinaison attbl (en majuscule) Attb2-xpr2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG Amorce antisens pour l'amplification du GTCctaaatgccaacaccgttgtag gène XPR2 avec la séquence de recombinaison attb2 (en majuscule) ATTR2zetaUP tgatcctagggtgtctgtgg Amorce pour la vérification de l'insertion au locus Zeta Turadown tcttctgcctccaggaagtc Amorce pour la vérification de l'insertion au locus Zeta Transformation à haut débit en microplaque 96 puits. Les méthodes de transformations dérivent des protocoles de transformation à l'acétate de lithium (Le Dall et al., 1994 ; Chen et al., 1997) adapté au format 5 microplaques. Protocole A. la transformation est réalisée avec le kit YLEX (YLEX Expression Kit, Yeastern Biotech) en présence de Un- (0,1 mol/L). Le mélange réactionnel, 3028527 42 comprenant 100 pL de cellules (environ 106 cellules), 3 pL d'ADN entraineur (0,5 à 1 pg ADN de saumon, Dualsystems Biotech AG), et 3 pL de cassette d'expression (50 ng), est incubé à 39°C, 60 min. Les cellules sont alors étalées sur milieu sélectif approprié. 5 Protocole B. Une anse de cellules resuspendue dans 600 pL d'une solution de lithium acetate (LiAC) 0,1 M pH6 est incubée 1 heure à 28°C. Les cellules sont centrifugées et resuspendues dans 60 pL de LiAC. Le mélange réactionnel, comprenant 10 pL de cellule compétentes, 3 pL d'ADN entraineur et 3 pL de cassette d'expression, est incubé 15 minutes à 28°C dans un tube PCR. 66 pL de tampon de réaction (PEG 40%, 10 LiAC 0.1M pH6) sont ensuite ajoutés et l'ensemble est homogénéisé en douceur. Les cellules sont incubées en présence de l'ADN pendant 1 heure à 28°C, suivi d'un choc thermique de 10 minutes à 39°C. Les cellules sont alors étalées sur milieu sélectif approprié. Croissance en plaque de 96 puits 15 Les précultures sont effectuées en microplaques de 96 puits en YPD pendant 48 h. Les cultures sont effectuées dans 200 pl de milieu YNBgIu, YNBgIy et YNBao à une concentration en source de carbone de 0.5%. Les puits sont inoculés à une densité optique à 600 nm d'environ 0,1. La densité optique de chaque puits est lue à 600 nm toute les 20 min pendant 48 heures à 28°C sous agitation à l'aide d'un lecteur de 20 microplaque Biotek Synergy MX (http://www.biotek.com). Test de l'activité protéase par mesure de fluorescence L'activité protéase est mesurée à l'aide du substrat Fluorescein thiocarbamoylCasein (FTC-casein Thermo-Scientific). 50 pl de surnageant de culture (dilué au 1/5) sont incubés avec 50 pl FTC-casein (5 µg/ml en tampon phosphate 50nnM pH 6,8). La 25 fluorescence et la densité cellulaire sont mesurées chaque 1 min pendant 1h en lecteur microplaque (Biotek) avec une longueur d'onde d'excitation à 494 nm et une longueur d'onde d'émission à 517 nm pour la fluorescence. La Vmax est exprimée en fluorescence relative par minute (RFU/min). Microscopie 30 Les images de microscopie sont réalisées avec un microscope Zeiss Imager.M2 équipé d'une lampe HXP 120 C et de filtres pour visualiser la fluorescence de la protéine 3028527 43 eYFP (filtre 46-YFP) et de la protéine Redstar2 (filtre 45-Texasred ; http://www.zeiss.conn). Détermination de la quantité de lipides Les cellules sont inoculées à DO 0,5 (600nm) dans 25 mL de milieu YNB Glycérol 3% 5 ou YNB Glucose 3 %, 72 h à 28°C sous agitation orbitale à 160 rpm, puis centrifugées afin de récupérer le culot cellulaire. Le culot est ensuite lavé 2 fois avec 5 mL d'eau déminéralisé, repris dans 1 mL d'eau puis congelé à -20°C avant d'être lyophilisé. Les lipides sont convertis en méthyle esters en utilisant la méthode de Browse et al. (1986) à partir de 10 à 20 mg du poids sec du culot cellulaire lyophilisé. Les esters 10 produits sont ensuite analysés par chromatographie en phase gazeuse (GC). L'analyse est réalisée sur un appareil Varian 4300 gaz chromatograph équipé d'un détecteur à ionisation de flamme et d'une colonne Varian FactorFour vf-23 ms pour lequel les caractéristiques de passage/diffusion s'effectuent à 260°C à 3 pA (30 m, 25 mm, 0,25 pm). Les acides gras sont identifiés par comparaison avec des profils d'acides 15 gras commercialisés (FAME32; Supelco) et quantifiés en utilisant un standard interne, impliquant l'addition de 50 pg de C17:0 (Sigma) lors de la conversion en méthyle ester des lipides. Détermination de la quantité de sucres et d'acides L'acide citrique, le lactate, le succinate, le glucose et le glycérol sont déterminés 20 par HPLC (Ultimate 3000, Dionex-Thermo Fisher Scientific, UK) utilisant une colonne Aminex HPX87H couplé aux UV (210 nm) et un détecteur RI (Lazar Z et al., 2011). La colonne est éluée avec du H2504 0,01 N à température ambiante avec un débit de 0,6 mL/min. Les différents sucres et les métabolites du cycle du citrate sont identifiés et quantifiés en utilisant des standards. Avant l'analyse par l'HPLC, le milieu de culture 25 est centrifugé (YNB glycérol 3%) puis le surnageant est filtré sur membrane 0,45 pm et dilué au 1/10. Résultats Construction des souches et des vecteurs Construction du vecteur de destination Gateway spécifique de Y. lipolytica 30 Nous avons utilisé le vecteur JMP62-URA3ex-pTEF, qui présente une structure similaire au JMP62 (JMP62-URA3d1-pPDXb) décrit par Nicaud et al. (2002), comme 3028527 44 structure de base pour la construction du vecteur de destination Gateway spécifique de Y. lipolytica. Ce vecteur contient le marqueur de résistance à la kanamycine (KanR), le marqueur de sélection URA3ex, les sites de restriction Baml-11-AvrIl en aval du promoteur constitutif pTEF (Muller et al. 1998) et les séquences Zeta pour 5 l'intégration dans le génome. Afin d'obtenir un vecteur exprimant la résistance à l'ampicilline, la partie d'E. cou du vecteur pBR322 comprenant le gène de résistance à l'ampicilline (AmpR) et l'origine de replication ORI a été amplifiée par PCR avec les amorces PBRup et PBRdown. Ces deux amorces contiennent les sites de restrictions Notl et lceul (Tableau 6). Ce fragment PCR, digéré par l'enzyme de restriction Notl 10 et déphosphorylé, a ensuite été ligaturé au fragment correspondant à la cassette d'expression du vecteur JMP62-URA3ex-pTEF digéré par l'enzyme de restriction Notl, générant le vecteur JMP1521. La cassette de clonage Gateway (attR1-ccdbchlorannphenicol-attR2) a été amplifié à partir du vecteur pDEST14 avec le couple d'amorces bgl2_gate_plus et gate_Avr2_plus (Tableau 6) qui contiennent les sites de 15 restrictions Bglll et Avril permettant le clonage de cette cassette entre les sites Baml-11 et Avril du plasmide JMP1521, générant le vecteur JMP1529 (Figure 2). Construction de la souche receveuse permettant l'intégration des cassettes d'expression au locus URA3 et exprimant de manière constitutive une protéine fluorescente reportrice. 20 Construction de la plateforme d'intégration au locus URA3. Construction du plasmide JMP1490. Le fragment permettant d'exprimer de façon constitutive la protéine RedStar2 (pTEF-RedStar2-terra) a été amplifié par PCR à partir du plasmide JMP1394 (Kabran et al. 2012) en utilisant le couple d'amorces F_AGE1_tefred et R_AGE1_tefred, contenant chacune le site de restriction Agel. 25 Après digestion par Agel, le fragment a été ligaturé dans le vecteur JMP1226 permettant l'intégration d'une plateforme Zeta au locus génomique URA3 (Lazar et al. 2013), préalablement digéré par Agel et déphosphorylé. Le sens d'insertion au site de restriction Agel a été vérifié avec les deux couples d'amorces 61TEFstart/leudown_1226 et uraup_1226/For_in_Dsred (Tableau 6). Le plasmide 30 JMP1490 obtenu (Figure 2) contient le marqueur de résistance à la kanamycine (KanR) et possède un fragment Notl contenant le gène RedStar2 sous le contrôle du promoteur constitutif pTEF, le marqueur LEU2 et la plateforme Zeta bordés par les séquences amont (Pura3_CDS) et aval (Tura3_CDS) du locus URA3. 3028527 Construction de la souche réceptrice JMY2566. Le plasmide JMP1490 a été préalablement digéré par Notl pour la transformation dans la souche Pold par la méthode de l'acétate de lithium (Gaillardin et al. 1985). Les transformants Leu' ont été sélectionnés sur milieu minimum complémenté 5 d'uracile. L'intégration au locus URA3 à été vérifiée phénotypiquement: incapacité de pousser sur sucrose (Suc-) et fluorescence rouge constitutive, et par PCR: amplification des bordures d'intégration par PCR sur ADN génomique avec les deux couples d'amorces Puraextver/Red2_no_SKL et VerZetasens/Turaextver (Tableau 6). La souche résultante JMY2566 possède l'allèle ura3-1490 (ura3::pTEF-RedStar2- 10 LEU2ex-Zeta) en replacement de l'allèle ura3-302 (pXPR2-SUC2). Elle exprime de manière constitutive la RedStar2, elle est auxotrophe pour l'uracile et prototrophe pour la leucine et possède une plateforme d'intégration Zeta. Construction des souches contrôles de surexpression Construction des vecteurs témoins de surexpression 15 Les ORFs des gènes eYFP, Redstar2, SUC2, et XPR2 ont été amplifiées par PCR à partir des vecteurs JMP911, JMP1394, JMP1462 et de l'ADN génomique de W29 respectivement, à l'aide des amorces décrites dans le Tableau 6 permettant d'introduire les séquences de recombinaison Gateway attb à chaque extrémité du produit de PCR. Les 4 fragments PCR ont ensuite été clonés dans le vecteur donneur 20 pDONR207 (Invitrogen) par recombinaison grâce à la BP ClonaseTM (Invitrogen) en suivant les instructions du fournisseur. Les vecteurs d'entrée obtenus, JMP1592 (XPR2), JMP1593 (SUC2), JMP1594 (eYFP) et JMP1595 (RedStar2) ont été vérifiés par séquençage. Pour la construction des vecteurs d'expression, chaque ORF a ensuite été transférée dans le vecteur accepteur JMP1529 par recombinaison grâce à la LR 25 ClonaseTM (Invitrogen) en suivant les instructions du fournisseur (Figure 3). Les vecteurs d'expression résultant JMP1599 (eYFP), JMP1600 (Redstar2), JMP1603 (XPR2) et JME1598 (SUC2) ont été vérifiés par PCR et par analyse des profils de restriction. Construction des souches témoins de surexpression des gènes. 30 Les 4 vecteurs contrôles de surexpression obtenus précédemment ont été digérés par Notl et transformés dans la souche réceptrice JMY2566 par la méthode de l'acétate de lithium. L'intégration de la cassette d'expression à la plateforme Zeta à été 3028527 46 vérifiée par PCR. Les 4 souches obtenues sont nommées JMY2811 (pTEF-RedStar2), JMY2812 (pTEF-eYFP), JMY2813 (pTEF-XPR2) et JMY2815 (pTEF-SUC2). Une souche témoin, JMY2810, a également été construite par transformation du vecteur JMP1046 digéré par Notl, contenant le promoteur pTEF et le terminateur Lip2 encadrant le 5 site de clonage Baml-11-AvrIl vide, dans la souche JMY2566. Vérification de l'insertion des cassettes d'expression. L'intégration à la plateforme zeta dans la souche réceptrice JMY2566 a été vérifiée par PCR en utilisant les amorces ATTR2zetaup et Turadown (Tableau 6), avec le programme suivant : 30s 98°C, 25 cycles (10s, 98°C ; 30s, 60°C ; 2min 45 72°C). En 10 cas d'intégration aléatoire, la plateforme d'intégration zeta n'est pas modifiée et on attend un produit de PCR de 2680 paires de bases (Figure 4B). En cas d'intégration de la cassette d'expression à la plateforme, on attend deux produits de PCR (Figure 4C). L'amorce ATTR2zetaup a 2 sites possibles d'hybridation, le premier site en amont du gène LEU2 qui permettrait d'amplifier un fragment de plus de 4000 paires de bases, 15 dont la taille exacte est fonction du gène cloné dans la plateforme Zeta, et un deuxième site qui permet d'amplifier un fragment de 1052 paires de bases, quelle que soit la taille de la cassette d'intégration. Dans la pratique, avec le programme de PCR ci-dessus, on observe un amplicon de 2680 pb en cas d'intégration aléatoire et de 1052 pb en cas d'intégration à la plateforme zeta (Figure 5), les fragments de 20 taille supérieure à 4000 paires de bases ne pouvant pas être amplifiés. Par exemple, l'analyse de l'intégration dans cinq transformants indépendants montre que les clones 1 et 5 présentent une intégration à la plateforme zeta (bande de 1053 pb) et trois transformants présentent une intégration aléatoire (bandes de 2680 pb) (Figure 5). 25 Expression de gènes témoins. La souche JMY2811 (pTEF-RedStar2) présente une fluorescence qui est supérieure de 40% à la souche témoin, démontrant que le promoteur pTEF en amont du site aatR1 est fonctionnel. Cette souche possède une copie de la RedStar2 sous le contrôle du promoteur pTEF et une copie additionnelle sous le contrôle du promoteur pTEF en 30 amont du site attR1. La souche JMY2812 (pTEF-eYFP) présente une florescence rouge pour la RedStar2 et une fluorescence verte pour eYFP (Figure 6). La souche JMY2813 (pTEF-XPR2) présente un halo d'hydrolyse de la caséine similaire à la souche sauvage W29, alors que la souche JMY2810 qui est délétée pour le gène XPR2 ne présente pas 3028527 47 de halo d'hydrolyse (Figure 7). La souche JMY2815 (pTEF-SUC2) est capable de croitre sur milieu minimum YNB sucrose contrairement à la souche contrôle JMY2810 (Figure 8). Toutes ces souches témoins démontrent que le système Gateway développé pour Yarrowia lipolytica est fonctionnel, que ce soit pour l'expression de 5 protéines de Yarrowia lipolytica ou pour la sécrétion de protéines fonctionnelles. Fréquence de transformation et type d'intégration. La création d'une banque de surexpression Gateway nécessite la mise au point d'une méthode de transformation dans Y. lipolytica à haut débit qui soit efficace au format 96 puits. Deux méthodes de transformation ont été développées et miniaturisées. La 10 première méthode, méthode A, dérive du protocole - one-step transformation » décrit par Chen et al., 1997 utilisé dans le kit d'expression YLOSTM commercialisé par Yeastern (Thaïlande). La deuxième méthode, méthode B, a été développée pour favoriser l'intégration à la plateforme zeta. Deux souches de Y. lipolytica possédant une plateforme ZETA (JMY2033 et JMY2566) ont été créées. L'efficacité de 15 transformation a été testée avec les cassettes d'expression RedStar2 et SUC2 (Figure 9). Avec le protocole A, 82,7% des transformants sont obtenus par intégration au hasard dans le génome (Figure 9A), alors qu'avec le protocole B, 82,5% des transformants résultent d'une intégration au locus zeta (Figure 9B). Le taux de transformation dépend de la souche réceptrice : environ deux fois plus de 20 transformants sont obtenus avec la souche JMY2033 qu'avec la souche JMY2566 (150- et 87- transformants contre 87- et 44- transformants pour les méthodes A et B, respectivement) correspondant à une fréquence de transformation de 103 transformants par a de DNA. Expression de la protéase alcaline extracellulaire chez les transformants 25 aléatoires. Afin d'évaluer la variabilité des niveaux d'activité des protéines des souches issues d'une transformation haut-débit, la souche JMY2566 a été transformée avec la cassette d'expression du vecteur JM1592 (pTEF-XPR2) en suivant la méthode A de transformation à haut-débit décrite ci-dessus. 96 transformants ont été isolés et leur 30 activité protéase a été évaluée en cinétique par mesure de fluorescence en utilisant la FTC-caséine comme substrat. La figure 10 présente la distribution du nombre de transformants en fonction de l'activité protéase produite classé en fonction de la Vmax. Parmi les clones obtenus, 3% ne présentent pas d'activité, 88% présentent une 3028527 48 activité compris entre 3,4 et 5,4 (Vmax moyen de 4,4 ± 1,0) et 2 % présentent une augmentation significative de l'activité protéase. Ces résultats montrent que la méthode de transformation suivant le protocole A, produisant des transformants par intégration aléatoire majoritairement, permet 5 d'obtenir une diversité de clones avec des niveaux d'activité variables. En particulier, on peut rapidement et facilement obtenir des transformants avec une activité supérieure à la moyenne des transformants. Cette méthode est particulièrement pertinente pour l'obtention de souches améliorées pour une activité enzymatique sans passer par des étapes de mutagenèse, la différence d'activité 10 étant due au site d'intégration et à son environnement génomique, ou bien au nombre d'intégrations dans le génome de la cassette d'expression. Identification de l'ensemble des facteurs de transcription potentiels chez Y. lipolytica L'ensemble des séquences protéiques de Y. lipolytica (http://gryc.inra.fr/) a été 15 criblé en recherchant la présence de domaines structurels spécifiques de facteurs de transcription connus à l'aide de l'outil en ligne PFAM (http://pfam.xfam.org/). En retenant toutes les séquences protéiques présentant au moins une homologie de séquences avec un domaine spécifique de facteur de transcription (paramètres par défaut et significance de 1), 131 protéines ont été identifiées correspondant à 127 20 ORFS (4 ORFs codent pour 2 protéines). Afin d'obtenir la liste la plus exhaustive possible de facteurs de transcription potentiels, l'ensemble de ces séquences protéiques a été comparé par homologie de séquence à l'ensemble du protéome de Y. lipolytica (BLASTP) afin d'identifier des candidats ayant une homologie de séquence avec les facteurs de transcription potentiels déjà identifiés. Cette 25 approche a permis d'ajouter 17 protéines supplémentaires à la liste. Construction de l'ensemble des souches de Y. lipolytica surexprimant des facteurs de transcription putatifs Les ORFs codant pour des facteurs de transcriptions potentiels ont été clonées dans le système Gateway et dans le vecteur de surexpression spécifique JMP1529, soit à 30 partir de cDNA provenant d'une collection de cDNA de Y. lipolytica clonés dans un vecteur donneur (Mekouar et al ), soit par amplification PCR sur ADN génomique et clonage dans un vecteur TOPO pENTER Directional (Invitrogen). Au total, sur les 148 3028527 49 ORFs identifiées comme codant des facteurs de transcription potentiels, 112 ont pu être clonées dans le vecteur de surexpression JMP1529. Sur ces 112 vecteurs obtenus, 97 ont permis d'obtenir des souches de Y. lipolytica JMY2566 transformées (méthode de transformation protocole B) avec 66 présentant une intégration au locus zeta, 5 vérifiée par la méthode PCR. Dans la majorité des cas, la fréquence de transformation et le type d'intégration pour les facteurs de transcriptions corrèlent avec les résultats de transformation de la méthode A et de la méthode B décrites ci-dessus. Cependant, pour une minorité, aucun transformant n'est obtenu, quelle que soit la méthode utilisée. Sur 112 10 cassettes d'intégration, ce résultat a pu être observé pour 9 facteurs de transcription (TF030, TF034, TF035, TF056, TF061, TF065, TF082, TF092 et TF114). Cette absence de transformants pourrait être causée par l'action d'un rôle déterminant du facteur de transcription sur la viabilité cellulaire. Criblage de la collection de souches de surexpression de Y. lipolytica 15 Croissance sur différentes sources de carbones La croissance sur glucose et glycérol des 97 souches de surexpression de facteurs de transcription obtenues a été évaluée en microplaque et en erlenmeyer par suivi de la DO (600 nm). Une altération de croissance est observée pour certaines souches. En particulier, les souches surexprimant les facteurs de transcription TF044, TF069, 20 TF089 ont une croissance ralentie en glucose et en glycérol. Les souches surexprimant les facteurs de transcription TF122 et TF126 ont une croissance ralentie en glucose uniquement. Evaluation de la quantité de lipides accumulés. Les 97 souches de surexpression de facteurs de transcription obtenues ont été 25 cultivées en erlenmeyer de 250 ml en YNBgIy 3%. La quantité de lipides totaux accumulés reporté au poids sec a été mesurée après 72h de croissance et comparée à la souche témoin JMY2810. Le taux d'augmentation ou de diminution par rapport à cette souche témoin a été calculé (quantité de lipide par gramme de cellules dans la souche surexprimant le facteur de transcription/ quantité de lipide par gramme de 30 cellules dans la souche témoin) et ceux dont l'altération est supérieure à 9% sont considérés comme significatifs. En particulier, les souches surexprimant les facteurs de transcription TF001, TF072, TF039, TF084, TF019, TF079, TF087, TF086, TF126, 3028527 TF040, TF024, TF031, TF033, TF085, TF021 présentent une augmentation de la quantité de lipides totaux allant jusqu'à 27,3%. En revanche, les souches surexprimant les facteurs de transcription TF060, TF007, TF043, TF038, TF055, TF075, TF077, TF109, TF064, TF068, TF099 présentent une diminution de la quantité 5 de lipides totaux allant jusqu'à 38,5%. Evaluation de la quantité de citrate produit. En parallèle, la quantité de citrate produit par les 97 souches de surexpression de facteurs de transcription obtenues et cultivées en YNBgIy 3% a été évaluée et comparée à la souche témoin JMY2810 après 72h. Le taux d'augmentation ou de 10 diminution par rapport à cette souche témoin a été calculé. Les taux supérieurs à 30% sont considérés comme significatifs. En particulier, les souches surexprimant les facteurs de transcription TF072, TF019, TF089, TF041, TF015, TF078, présentent une augmentation de la quantité de citrate produit allant de 45% à 183% par rapport à la souche témoin, tandis que les souches 15 surexprimant les facteurs de transcription TF068 et TF099 présentent une diminution de la quantité de citrate produit allant de 36 à 86% par rapport à la souche témoin. il est à noter que les souches surexprimant les facteurs de transcription TF072 et TF019 présentent une augmentation à la fois de la quantité de lipides totaux et de la production de citrate. En revanche, la quantité de lipides totaux et de la quantité de 20 citrate produit sont toutes deux diminuées dans des souches surexprimant les facteurs de transcription TF068 et TF099. Evaluation de la quantité de succinate produit. En parallèle, la quantité de succinate produit par les 97 souches de surexpression de facteurs de transcription obtenues et cultivées en YNBgIy 3% a été évaluée et 25 comparée à la souche témoin JMY2810 après 72h. Le taux d'augmentation ou de diminution par rapport à cette souche témoin a été calculé. Une variation supérieure à 50% est considérée comme significative. En particulier, les souches surexprimant les facteurs de transcription TF078, TF077, TF070, TF051, TF052, TF015, TF048, TF043, TF004, présentent une augmentation de la quantité de succinate produit 30 allant de 54% à 305% par rapport à la souche témoin (Fig. 14). Dans les souches surexprimant les facteurs de transcription TF0041, TF099 et TF019, une diminution 3028527 51 de la quantité de succinate produit est observée qui va de 69% à 94% par rapport à la souche témoin (Fig.14). Les souches surexprimant les facteurs de transcription TF078 et TF015 présentent une augmentation de la production de succinate et de la production de citrate liées. 5 Il est aussi à noter que la production de succinate augmente tandis que la quantité de lipides accumulés diminue dans les souches surexprimant les facteurs de transcription TF077 et TF043. En revanche, la surexpression du facteur de transcription TF019 conduit à une diminution de la production de succinate et une augmentation de la quantité de lipides concomitantes. 10 3028527 52 References: Abghari A Et ChenS. 2014 "Yarrowia lipolytica as an oleaginous cell factory platform for production of fatty acid-based biofuel and bioproducts" Front. Energy Res. doi: 10.3389/fenrg.2014.00021. 5 Barth G, Gaillardin C. 1996. Yarrowia lipolytica. In: Wolf K (ed.). Non conventional yeasts in biotechnology, a handbook. Springer. p. 313-388. Beopoulos A, Mrozova Z, Thevenieau F, Dall MT, Hapala I, Papanikolaou S, Chardot T, Nicaud JM. 2008. Control of lipid accumulation in the yeast Y. lipolytica. Applied Environnnental Microbiology. 74: 7779-7789. 10 Beopoulos A, Cescut J, Haddouche R, Uribelarrea JL, Molina-Jouve C, Nicaud JM. 2009. Y. lipolytica as a model for bio-oil production. Progress in Lipid Research. 48: 375-387. Beopoulos A, Haddouche R, Kabran P, Dulermo T, Chardot T, Nicaud JM. 2012. Identification and characterization of DGA2, an acyltransferase of the DGAT1 acyl- 15 CoA:diacylglycerol acyltransferase family in the oleaginous yeast Y. lipolytica. New insights into the storage lipid metabolism of oleaginous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 93(4): 1523-1537. Blazeck J, Liu L, Redden H, Alper H. 2011 Tuning gene expression in Yarrowia lipolytica by a hybrid promoter approach. Appt Environ Microbiol 77:7905-7914. 20 Blazeck J, Reed B, Rishi Garg R, Gerstner R, Pan A, Agarwala V, Alper H. 2013 Generalizing a hybrid synthetic promoter approach in Yarrowia lipolytica. Applied Microbiol Biotechnol 97 (7) 3037-3052. Blazeck J, Hill A, Liu L, Knight R, Miller J, Pan A, Otoupal P, Alper HS. 2014. Harnessing Y. lipolytica lipogenesis to create a platform for lipid and biofuel 25 production. Nature Communications. D01: 10.1038/nconnnns4131. Dujon B, Sherman D, Fischer G, Durrens P, Casaregola S, Lafontaine I, De Montigny J, Marck C, Neuveglise C, Talla E, Goffard N, Frangeul L, Aigle M, Anthouard V, Babour A, Barbe V, Barnay S, Blanchin S, Beckerich JM, Beyne E, Bleykasten C, Boisrame A, Boyer J, Cattolico L,Confanioleri F, De Daruvar A, Despons L, Fabre E, Fairhead C, 30 Ferry-Dumazet H, Groppi A, Hantraye F, Hennequin C, Jauniaux N, Joyet P, Kachouri 3028527 53 R, Kerrest A, Koszul R, Lemaire M, Lesur I, Ma L, Muller H, Nicaud JM, Nikolski M, Oztas S, Ozier-Kalogeropoulos 0, Pellenz S, Potier S, Richard GF, Straub ML, Suleau A, Swennen D, Tekaia F, Wesolowski-Louvel M, Westhof E, Wirth B, Zeniou-Meyer M, Zivanovic I, Bolotin-Fukuhara M, Thierry A, Bouchier C, Caudron B, Scarpelli C, 5 Gaillardin C, Weissenbach J, Wincker P, Souciet JL. 2004. Genome evolution in yeasts. Nature. 430(6995): 35-44. Dulermo T, Nicaud JM. 2011. Involvement of the G3P shunte and 13-oxidation pathway in the control of TAG synthesis and lipid accumulation in Y. lipolytica. Metabolic engineering. 13(5): 482-491. 10 Dulermo T, Tréton B, Beopoulos A, Kabran Gnankon AP, Haddouche R, Nicaud JM. 2013. Characterization of the two intracellular lipases of Y. lipolytica encoded by TGL3 and TGL4 genes: new insights into the rote of intracellular lipases and lipid body organisation. Biochimica and Biophysica Acta. 1831(9): 1486-1495. Fickers P, Le Dall MT, Gaillardin C, Thonart P, Nicaud JM. 2003. New disruption 15 cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Y. lipolytica. Journal of Microbiological Methods. 55: 727-737. Gabdoulline R, Eckweiler D, Kel A, Stegmaier P. 2012. 3DTF: a web server for predicting transcription factor PWMs using 3D structure-based energy calculations. Nucleic Acids Res. 40(Web Server issue): W180-5. doi: 10.1093/nar/gks551. 20 Gaillardin C, Ribet AM. 1987. LEU2 directed expression of 13-galactosidase activity and phleomycin resistance in Y. lipolytica. Current Genetics. 11: 369-375. Gysler C, Kneuss P, Niederberger P. 1990. Transformation of commercial baker's yeast strains by electroporation. Biotechnol Tech 4: 285-290. Hoess RH, Abremski K. 1985. Mechanism of strand cleavage and exchange in the Cre- 25 lox site-specific recombination system. J Mol Biol. 181(3): 351-362. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. 1983. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriololy. 153: 163-168. Kabran P, Rossignol T, Gaillardin C, Nicaud JM, Neuvéglise C. 2012. Alternative splicing regulates targeting of malate dehydrogenase in Yarrowia lipolytica. DNA Res. 30 19(3):231-44. 3028527 54 Klebe RJ, Harriss JV, Sharp ZD, Douglas MG. 1983. A general method for polyethylene-glycol-induced genetic transformation of bacteria and yeast. Gene. 25(2-3): 333-341. Kurat et al. 2006. Obese yeast: triglyceride lipolysis is functionally conserved from 5 mammals to yeast. Journal of Biological Chemistry 281: 491-500. Lazar Z, Rossignol T, Verbeke J, Crutz-Le Coq AM, Nicaud JM, Robak M. 2013. Optimized invertase expression and secretion cassette for improving Y. lipolytica growth on sucrose for industrial applications. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 40(11): 1273-1283. 10 Le Dalt MT, Nicaud JM, Gaillardin C. 1994. Multiple-copy integration in the yeast Yarrowia lipolytica. Curr Genet. 26(1): 38-44. Lipman, D. J. and W. R. Pearson. 1988. Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444-2448. Madzak C, Tréton B, Blanchin-Roland S. 2000 Strong hybrid promoters and integrative 15 expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2(2): 207216. Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM. 2004. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. Journal of 20 Biotechnology, 109(1-2): 63-81. Maftahi M, Gaillardin C, Nicaud JM. 1996 Sticky-end polymerase chain reaction method for systematic gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12(9): 859-868. Mekouar M, Blanc-Lenfle I, Ozanne C, Da Silva C, Cruaud C, Wincker P, Gaillardin C, 25 Neuvéglise C. 2010 Detection and analysis of alternative splicing in Yarrowia lipolytica reveal structural constraints facilitating nonsense-nnediated decay of intron-retaining transcripts. Genome Biol.;11(6):R65. doi: 10.1186/gb-2010-11-6-r65. Müller S, Sandal T, Kamp-Hansen P, Dalboge H. 1998. Comparison of expression systems in the yeasts S. cerevisiae, Hansenula polymorphe, Kluyveromyces lactis, 3028527 Schizosaccharomyces pombe and Y. lipolytica. Cloning of two novel promoters from Y. lipolytica. Yeast. 14 (14):1267-1283. Needleman, S. B. and C. D. Wunsch. 1970. A general method applicable to the search for similarities on the amino-acid sequences of two proteins. J. Molec. Biol. 48: 444- 5 453. Nicaud JM, Madzak C, van den Broek P, Gysler C, Duboc P, Niederberger P, Gaillardin C. 2002 Protein expression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica. FEMS Yeast Res. 2(3): 371-9. Orr-Weaver TL, Szostak JW, Rothstein RJ. 1981 Yeast transformation: a model system 10 for the study of recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 78(10): 6354-6358. Querol A, Barri° E, Huerta T, Ramon D. 1992. Molecular monitoring of wine fermentations conducted by active dry yeast strains. Applied and Environmental Microbiology, 58: 2948-2953. Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd ed, Cold 15 Spring Harbor Laboratory Press, New York. Sauer B. 1987. Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 7(6): 2087-2096. Smith, TF, and Waterman, MS. 1981. Identification of Common Molecular Subsequences. Journal of Molecular Biology 147: 195-197 20 Tai M, Stephanopoulos G. 2013. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Y. lipolytica for biofuel production. Metabolic engineering. 15: 1-9. Thevenieau F, Le Dalt MT, Nthangeni B, Mauersberger S, Marchai R, Nicaud JM. 2007. Characterization of Yarrowia lipolytica mutants affected in hydrophobic substrate utilization. Fungal Genet Biol. 44(6): 531-542. 25 Wang HJ, Le Dall MT, Wach Y, Laroche C, Belin JM, Gaillardin C, Nicaud JM. 1999. Evaluation of acyl coenzyme A oxidase (Aox) isozyme function in the n-alkaneassimilating yeast Yarrowia lipolytica. Journal of Bacteriology 181(17): 5140-5148. 3028527 56 Yongmanitchai W, Ward OP, Growth of and omega-3 fatty acid production by Phaeodactylum tricornutum under different culture conditions. Appt. Environ. Microbiol. 57: 419-425, 1991 REVENDICATIONS1. Souche de levure oléagineuse dans laquelle l'expression d'un facteur de transcription choisi parmi TF001 (YALIOA10637g), TF004 (YALIOB06853g), TF007 (YALIOB12716g), TF015 (YALI0007821g), TF019 (YALIOC13178g), TF021 (YALIOC16390g), TF024 (YALIOD01353g), TF031 (YALIOD10681g), TF033 (YALIOD14520g), TF038 (YALIOD23045g), TF039 (YALI0D23749g), TF040 (YALIOE03410g), TF041 (YALIOE05555g), TF043 (YALIOE10681g), TF051 (YALIOE31383g), TF052 (YALIOE31669g), TF055 (YALIOF03157g), TF060 (YALIOF09361g), TF064 (YALIOF16599g), TF068 (YALIOE13948g), TF070 (YALIOE11693g), TF072 (YALI0C22682g), TF074 (YALIOD09757g), TF075 (YALIOF05346g), TF077 (YALIOB08206g), TF078 (YALIOD05005g), TF079 (YALIOD12628g), TF084 (YALIOB08734g), TF085 (YALIOC11858g), TF086 (YALIOB04510g) TF087 (YALIOE01606g), TF089 (YALI0006842g), TF109 2. La souche de la revendication 1, caractérisée en ce que ladite levure oléagineuse est Yarrowia lipolytica. 20 3. La souche de l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit facteur de transcription est surexprimé. 4. La souche de la revendication 3, caractérisée en ce que ledit facteur de transcription est choisi parmi TF001, TF004, TF015, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF039, TF040, TF041, TF043, TF051, TF052, TF070, TF072, TF074,TF077, 25 TF078, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087 TF089, TF109 et TF126. 5. La souche de l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'expression de ledit facteurs de transcription est diminuée par rapport à une souche sauvage. 6. La souche de la revendication 5, caractérisée en ce que la diminution de 30 l'expression est causée par une inactivation du gène codant ledit facteur de transcription. 10 (YALIOE16577g ) et TF126 (YALIOD05041g) est altérée, ladite souche présentant 15 une accumulation altérée des lipides ou d'au moins un des métabolites intermédiaires de la synthèse de ceux-ci, notamment du succinate ou du citrate, par rapport à une souche témoin. 3028527 58 7. La souche de l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que ledit facteur de transcription est choisi parmi TF007, TF038, TF041, TF043, TF055, TF060, TF064, TF068, TF075, TF077, et TF109. 8. La souche de l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que 5 l'expression d'au moins un facteur de transcription choisi parmi TF019 et/ou TF072 est augmentée et/ou l'expression d'au moins un facteur de transcription choisi parmi TF068 est diminuée. 9. La souche de l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'expression du facteur de transcription TF019 est augmentée et/ou l'expression d'au moins un facteur de transcription choisi parmi TF077 et/ou TF043 est diminuée. 10. La souche de l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite souche surexprime en outre te gène GPD1 et est déficiente pour la bêta-oxydation des acides gras. 11. La souche de l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une mutation de perte de fonction dans au moins un gène choisi parmi les gènes PEX, les gènes PDX, le gène MFE1 et le gène POT1. 12. La souche de l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une mutation de perte de fonction dans au moins un des gènes PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6. 13. La souche de l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une mutation de perte de fonction dans chacun des gènes PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6. 14. La souche de l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre au moins une mutation additionnelle dans au moins un gène codant une enzyme impliquée dans le métabolisme des acides gras. 15. La souche de la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est déficiente dans un au moins des gènes GUT2, TGL3 et TGL4. 16. La souche de levure oléagineuse de la revendication 14, caractérisée en ce que qu'elle comporte un gène YALIOB10153g inactivé. 3028527 59 17. La souche de la revendication 16, caractérisée en ce que ladite souche surexprime en outre le gène yDGA2. 18. La souche de levure oléagineuse selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 caractérisée en ce qu'elle exprime un gène codant pour une enzyme choisie 5 parmi une A8 désaturase, une M2 désaturase et une M5 désaturase. 19. La souche de levure oléagineuse de la revendication 18, caractérisée en ce que ledit gène code pour une M2 désaturase. 20. La souche de levure oléagineuse de la revendication 19, caractérisée en ce que ledit gène est le gène YALIOB10153g de Yarrowia lipolytica. 10 21. Procédé d'obtention d'une souche de levure oléagineuse selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de transformation d'une souche de levure oléagineuse par au moins un polynucléotide permettant d'altérer l'expression d'un facteur de transcription choisi parmi TF001, TF004, TF007, TF015, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, 15 TF038, TF039, TF040, TF041, TF043, TF051, TF052, TF055, TF060, TF064, TF068, TF070, TF072, TF074, TF075, TF077, TF078, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087, TF089, TF109 et TF126. 22. Le procédé de la revendication 21, caractérisé en ce que ledit polynucléotide permet la surexpression d'un facteur de transcription choisi parmi TF001, TF004, 20 TF015, TF019, TF021, TF024, TF031, TF033, TF039, TF040, TF041, TF043, TF051, TF052, TF070, TF072, TF074,TF077, TF078, TF079, TF084, TF085, TF086, TF087 TF089, TF109 et TF126. 23. Le procédé de la revendication 22, caractérisé en ce que ledit polynucléotide comprend une séquence promotrice choisie parmi le promoteur PDX2, le 25 promoteur LIP2, le promoteur FBA, le promoteur GPM, le promoteur YAT/, le promoteur GPAT, le promoteur TEF, le promoteur hybride hp4d et des promoteurs hybrides XPR2. 24. Le procédé de l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que ledit polynucléotide permet d'inactiver un facteur de transcription choisi parmi 30 TF007, TF038, TF041, TF043, TF055, TF060, TF064, TF068, TF075, TF077, et TF109. Y 3028527 60 25. Le procédé de l'une quelconque des revendications 21 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire dans laquelle un polynucléotide permettant la surexpression d'un autre gène régulant la synthèse lipidique est introduit dans la souche. 5 26. Le procédé de la revendication 25, caractérisé en ce que ledit gène est GPD1 ou yDGA2. 27. Le procédé de l'une quelconque des revendications 21 à 26, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire dans laquelle une mutation additionnelle affectant la synthèse lipidique est introduite dans la souche. 10 28. Le procédé de la revendication 25, caractérisé en ce que ladite mutation affecte au moins un des gènes PEX, un des gènes PDX, le gène MFE1, le gène POT1, les gènes TLG3 et TLG4, GUT2 et YALI0810153g. 29. Utilisation d'une souche de levure oléagineuse selon l'une des revendications 1 à 20 pour la synthèse de lipides, particulièrement des acides gras libres et des 15 triacylglycérols. 30. Procédé de synthèse de lipide comportant des étapes: (1) de culture d'une souche de levure oléagineuse selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 dans un milieu approprié et (2) de récolte les lipides produits par la culture de l'étape 1. 20