Brevet FR3024738A1 — publié le 20160212

DISPOSTIF ET PROCEDE DE SELECTION DE CELLULES EUCARYOTES DANS UN CANAL DE TRANSPORT PAR ALTERATION DES CELLULES EUCARYOTES AU MOYEN D'UN RAYONNEMEMENT ELECTROMAGNETIQUE Domaine technique La présente invention concerne le domaine de la sélection in vitro de cellules eucaryotes, et en particulier, mais on exclusivement de spermatozoïdes, 10 notamment de spermatozoïdes d'animaux, au moyen d'un rayonnement électromagnétique. Art antérieur Un spermatozoïde est une cellule eucaryote de type haploïde, qui ne contient généralement qu'un seul exemplaire de chaque chromosome, par 15 exemple un chromosome X ou Y, et dont la motilité est assurée par un flagelle. Dans le domaine de la reproduction animale, on a développé à ce jour différentes solutions de sexage, qui permettent de sélectionner et trier automatiquement des spermatozoïdes en fonction de leur chromosome X ou Y, et qui sont basées sur la cytométrie de flux. 20 D'une manière générale, toutes ces solutions techniques de sexage par cytométrie de flux reposent sur le fait que les spermatozoïdes X contiennent environ 4% d'ADN de plus que les spermatozoïdes Y. Ainsi, dans ces solutions techniques de sexage : (a) on marque les spermatozoïdes avec un intercalant d'ADN fluorescent, 25 généralement désigné fluorochrome ; les spermatozoïdes X, qui sont présumés contenir une plus grande quantité d'ADN absorbent une quantité plus importante de fluorochrome que les spermatozoïdes Y ; (b) on injecte une solution contenant les spermatozoïdes marqués dans un canal de transport, et le cas échéant on les soumet à une focalisation 30 hydrodynamique de manière à les aligner et les faire circuler dans ce canal de transport, 3024738 2 (c) on excite les spermatozoïdes marqués avec un rayonnement approprié, afin qu'ils émettent un rayonnement lumineux par fluorescence, (d) on détecte l'intensité du rayonnement lumineux émis par fluorescence (intensité de fluorescence), et 5 (e) on sélectionne automatiquement chaque spermatozoïde X ou Y en fonction de cette intensité de fluorescence détectée. Une première méthode de tri connue (étape (e) susvisée) consiste à soumettre la solution contenant les spermatozoïdes marqués à des vibrations au moyen d'un transducteur piézoélectrique, de manière à former des microgouttelettes, qui dans la mesure du possible ne contiennent chacune qu'un seul spermatozoïde, puis à charger électriquement chaque gouttelette en fonction de l'intensité de fluorescente détectée, et enfin à faire passer successivement les microgouttelettes chargées électriquement dans un champ électrique permettant de séparer les gouttelettes chargées contenant un spermatozoïde X des gouttelettes chargées contenant un spermatozoïde Y. Cette méthode de tri est décrite par exemple dans les demandes de brevet internationales suivantes : W02004/104178, W02004/017041, W02009/014643, W02009/151624. Cette méthode de tri par formation de microgouttelettes présente plusieurs 2 0 inconvénients. L'étape de formation des microgouttelettes est délicate, et il est difficile de s'assurer qu'une microgouttelette ne contient qu'un seul spermatozoïde. La formation de microgouttelettes est un facteur limitatif pour la cadence de tri. Dans cette méthode, les spermatozoïdes sont soumis à un stress mécanique important qui est susceptible de les endommager de manière irréversible et non 25 contrôlée. On a proposé dans la demande de brevet internationale W02010/001254 une autre solution dans laquelle la sélection des spermatozoïdes est effectuée au moyen d'un rayonnement électromagnétique, de type faisceau laser, choisi de manière à altérer de manière sélective, en fonction de l'intensité de fluorescente 30 détectée, les spermatozoïdes marqués et transportés en file indienne dans un canal de transport. Cette solution permet avantageusement d'éviter les 3024738 3 inconvénients inhérents à la formation de microgouttelettes. Néanmoins cette solution de sélection au moyen d'un laser présente d'autres inconvénients. L'énergie du rayonnement électromagnétique utilisé pour altérer de manière sélective les spermatozoïdes est absorbée de manière prépondérante par le fluide 5 de transport des spermatozoïdes et également par la paroi du canal de transport traversée par le rayonnement électromagnétique, ce qui normalement conduit à devoir utiliser des lasers de forte puissance pour altérer les spermatozoïdes. Or l'utilisation de lasers de forte puissance est un facteur limitatif pour la cadence de sélection, car les temps de commutation d'un laser augmentent avec la puissance 10 du laser. De plus, l'alignement du laser et de son optique de focalisation par rapport au canal de transport est délicat et très sensible, et le moindre désalignement optique peut nuire de manière importante à l'efficacité du laser. A la connaissance de la demanderesse, cette solution technique n'est pas exploitée commercialement à ce jour. 15 On a par ailleurs proposé des solutions de tri mettant en oeuvre des rayonnements électromagnétiques qui permettent de dévier sélectivement, en fonction de l'intensité de fluorescente détectée, la trajectoire des spermatozoïdes marqués et alignés dans un canal de transport, ce qui permet d'aiguiller automatiquement les spermatozoïdes en fonction de leur chromosome X ou Y, sans altérer les spermatozoïdes et sans devoir former des microgouttelettes. Ce type de solution nécessite de mettre en oeuvre des rayonnements électromagnétiques de forte puissance pour modifier de manière sélective la trajectoire des spermatozoïdes, et peut être mise en oeuvre uniquement avec une très faible vitesse de transport des spermatozoïdes et avec une très faible cadence de tri. A la connaissance de la demanderesse, cette solution technique n'est pas exploitée commercialement à ce jour et la faisabilité technique de ce type de solution reste à démontrer. Les solutions techniques susvisées peuvent également être utilisées pour sélectionner in vitro tout autre type connu de cellules eucaryotes. Il existe donc a à ce jour un besoin de trouver une solution technique de sélection de cellules eucaryotes, et en particulier de spermatozoïdes de 3024738 4 mammifères, notamment de spermatozoïdes d'animaux, qui soit efficace, et qui pallie les inconvénients susvisés des solutions de l'art antérieur. Objectif de l'invention La présente invention a pour objectif de proposer une nouvelle solution 5 technique de sélection de cellules eucaryotes qui pallie notamment les inconvénients susvisés des solutions de l'art antérieur. Résumé de l'invention L'invention a ainsi pour premier objet un dispositif permettant de sélectionner cellules eucaryotes, et notamment des spermatozoïdes, lequel dispositif comporte 10 un canal de transport, dans lequel peut circuler une solution contenant lesdites cellules eucaryotes, un premier passage traversant débouchant dans ledit canal de transport, une source de rayonnement électromagnétique, qui est couplée à une première extrémité d'une première fibre optique, l'autre extrémité d'émission de la première fibre optique étant insérée dans ledit premier passage traversant, sans être 15 en saillie dans le canal de transport. Le dispositif comporte en outre des moyens électroniques de commande, qui permettent de commander automatiquement ladite source de rayonnement électromagnétique, de manière à altérer de manière sélective les cellules eucaryotes circulant dans le canal de transport, au moyen du rayonnement électromagnétique d'altération émis par la source de rayonnement 20 électromagnétique. Le terme « altérer » ou « altération » signifie dans le présent texte que la cellule eucaryote est modifiée directement ou indirectement par le rayonnement électromagnétique d'altération, de sorte que sa viabilité ou motilité est détériorée de manière suffisante pour que la cellule eucaryote ne soit plus viable ou fertile, 25 indépendamment du phénomène physique et/ou biologique et/ou chimique occasionnant cette détérioration. Dans le cadre général de l'invention, cette altération par le rayonnement électromagnétique peut par exemple découler d'une lésion ou altération photochimique de la cellule eucaryote et/ou d'un effet de stress thermique subi par la cellule eucaryote. 30 De préférence, le canal de transport est un canal microfluidique dont au moins une dimension en section transversale (section perpendiculaire à la direction de 3024738 5 déplacement des spermatozoïdes dans le canal) est inférieure à 1mm, et plus particulièrement inférieure à 100pm. Grâce à la combinaison d'un canal de transport, de préférence microfluidique, et d'une fibre optique intégrée, le rayonnement électromagnétique 5 d'altération peut être délivré dans le canal de transport au plus près de la cellule eucaryote, ce qui permet avantageusement d'améliorer l'interaction du rayonnement électromagnétique avec les cellules eucaryotes, et de ce fait permet avantageusement de mettre en oeuvre une source de rayonnement électromagnétique de plus faible puissance, pouvant être plus rapidement 10 commutée ou modulée. En outre, dans l'invention, l'extrémité d'émission de la fibre optique étant insérée dans ledit passage traversant, sans être en saillie dans le canal de transport, le flux des cellules eucaryotes n'est pas perturbé, ce qui permet de maintenir une localisation précise des cellules eucaryotes dans le canal de transport. Enfin, l'extrémité d'émission de la fibre optique étant insérée dans 15 ledit passage traversant, le dispositif peut être manipulé sans risque de désalignement optique, et est ainsi robuste. Le dispositif de l'invention peut être utilisé pour sélectionner in vitro des cellules eucaryote, et notamment des spermatozoïdes, et plus particulièrement peut être utilisé dans le domaine de la reproduction animale pour sélectionner in 20 vitro tout type de spermatozoïdes d'animaux, et de manière non limitative et non exhaustive, des spermatozoïdes de bovins, de porcins, d'ovins, d'équidés, de caprins, de lapins, d'oiseaux. L'invention n'est pas limitée à la sélection de spermatozoïdes de type X ou de type Y, mais peut être utilisée pour sélectionner tout autre type de spermatozoïdes. 25 Plus particulièrement, le dispositif de l'invention peut comporter les caractéristiques additionnelles et facultatives ci-après, prises isolément ou en combinaison les unes avec les autres : le canal de transport est un canal microfluidique dont au moins une dimension en section transversale est inférieure à 1mm, et plus 30 particulièrement inférieure à 100pm. 3024738 6 - le dispositif comporte des moyens optiques de focalisation, qui sont fixés ou intégrés à l'extrémité d'émission de la première fibre optique, et qui permettent de focaliser dans ledit canal de transport le rayonnement électromagnétique émis en sortie de la première fibre optique. 5 - lesdits moyens optiques de focalisation sont formés par l'extrémité d'émission de la première fibre optique, qui est profilée de manière à focaliser dans ledit canal de transport le rayonnement électromagnétique (R) émis en sortie de la fibre optique. - l'extrémité d'émission de la première fibre optique est de forme conique. 10 - l'extrémité d'émission de la fibre première optique (61) est de type «wedge». - l'extrémité d'émission de la première fibre optique affleure le canal de transport sans être en saillie dans le canal de transport. - la partie distale d'émission de de la première fibre optique est insérée dans 15 ledit premier passage traversant, en butée contre un épaulement. - le canal de transport a une section transversale rectangulaire. - la largeur du canal de transport rectangulaire est inférieure à 1mm, et de préférence inférieure à 100pm. - le premier passage traversant est réalisé à travers l'une des parois 20 longitudinales de plus grande dimension du canal de transport à section rectangulaire. - le dispositif comporte une deuxième source de rayonnement électromagnétique apte à émettre rayonnement électromagnétique d'excitation, qui permet d'exciter l'émission par fluorescence des cellules 25 eucaryotes circulant dans ledit canal de transport (100), et au moins un photo-détecteur permettant de détecter la fluorescence émise par lesdites cellules eucaryotes. - les moyens électroniques de commande sont aptes traiter un signal électrique de détection délivré par ledit photo-détecteur, et à commander 30 la première source de rayonnement électromagnétique, pour l'altération sélective des cellules eucaryotes, en fonction de ce signal de détection. 3024738 7 - le dispositif comporte un passage traversant pour l'excitation de fluorescence, qui débouche dans ledit canal de transport, en amont du premier passage traversant ; la deuxième source de rayonnement électromagnétique est couplée à une première extrémité d'une fibre optique 5 d'excitation de fluorescence, l'autre extrémité d'émission de cette fibre optique d'excitation de fluorescence étant insérée dans ledit passage traversant pour l'excitation de fluorescence, sans être en saillie dans le canal de transport. - la partie distale d'émission de la fibre optique d'excitation de fluorescence 10 est insérée dans ledit passage traversant pour l'excitation de fluorescence, en butée contre un épaulement. - le dispositif comporte un passage traversant pour la détection de fluorescence, qui débouche dans ledit canal de transport en amont du premier passage traversant ; une extrémité d'une fibre optique de détection 15 de fluorescence est insérée dans ce passage traversant, sans être en saillie dans le canal de transport, et l'autre extrémité d'émission de ladite fibre optique de détection de fluorescence étant associée au photo-détecteur. - la fibre optique de détection de fluorescence est une fibre optique large coeur. 20 - une partie distale de la fibre optique de détection de fluorescence est insérée dans ledit passage traversant pour la détection de fluorescence, en butée contre un épaulement. - le canal de transport étant délimité au moins par une paroi de fond et par deux parois longitudinales en vis-à-vis qui sont transversales, et de 25 préférence perpendiculaires, à la paroi de fond, le passage traversant pour l'excitation de fluorescence est réalisé à travers la paroi de fond du canal de transport, et le passage traversant pour la détection de fluorescence est réalisé à travers l'une des parois longitudinales du canal de transport. - le canal de transport étant délimité au moins par une paroi de fond et par 30 deux parois longitudinales en vis-à-vis qui sont transversales, et de préférence perpendiculaires, à la paroi de fond, le passage traversant pour 3024738 8 la détection de fluorescence est réalisé à travers la paroi de fond du canal de transport, et le passage traversant pour l'excitation de fluorescence est réalisé à travers l'une des parois longitudinales du canal de transport. - le canal de transport étant délimité au moins par une paroi de fond et par 5 deux parois longitudinales en vis-à-vis qui sont transversales, et de préférence perpendiculaires, à la paroi de fond, le passage traversant pour l'excitation de fluorescence est réalisé à travers l'une des parois longitudinales du canal de transport, et le passage traversant pour la détection de fluorescence est réalisé à travers l'autre paroi longitudinale du 10 canal de transport. - la distance entre la sortie dans le canal de transport) du passage traversant pour l'excitation de fluorescence et la paroi opposée du canal de transport est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm. - la distance entre la sortie dans le canal de transport du passage traversant 15 pour la détection de fluorescence et la paroi opposée du canal de transport est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm. - la distance entre la sortie dans le canal de transport du premier passage traversant et la paroi opposée du canal de transport est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement 20 encore inférieure à 50pm. - le dispositif comporte des moyens permettant d'injecter dans ledit canal de transport une solution contenant des cellules eucaryotes, et de préférence des cellules eucaryotes marquées au moyen d'au moins un fluorochrome. - Le dispositif comporte des moyens de focalisation hydrodynamique 25 permettant d'injecter dans le canal de transport un liquide de manière à entraîner les cellules eucaryotes dans le canal de transport, en les positionnant sensiblement dans un plan de focalisation hydrodynamique ou sensiblement le long d'un axe de focalisation hydrodynamique et en les espaçant les unes derrière les autres. 30 - lesdits moyens optiques de focalisation permettent de focaliser le rayonnement électromagnétique d'altération sensiblement dans ledit plan 3024738 9 de focalisation hydrodynamique des cellules eucaryotes ou sensiblement sur l'axe de focalisation hydrodynamique des cellules eucaryotes. - le canal de transport est délimité en partie par une rainure gravée dans l'une des faces d'un substrat dur, et plus particulièrement dans un substrat en 5 silicium. - le premier passage traversant, et le cas échéant le passage traversant pour l'excitation de fluorescence, et/ou le passage traversant pour la détection de fluorescence, sont délimités chacun en, partie par une rainure gravée dans la même face du substrat que le canal de transport. 10 - la puissance moyenne de la source du rayonnement électromagnétique d'altération des cellules eucaryotes est inférieure à 10W, et de préférence inférieure à 1W. L'invention a pour autre objet un procédé de sélection in vitro de cellules eucaryotes pouvant avoir des types différents permettant de les répertorier en au 15 moins deux catégories distinctes. Plus particulièrement, mis non exclusivement les cellules eucaryotes peuvent par exemple se différencier grâce l'ADN de leur noyau. Pour la mise en oeuvre de ce procédé, on utilise le dispositif de sélection susvisé, et on injecte, dans le canal de transport du dispositif de sélection, une solution contenant les cellules eucaryotes à sélectionner, on fait circuler dans le canal de 20 transport lesdites cellules eucaryotes les unes derrière les autres, on détecte automatiquement le type de chaque cellule eucaryote circulant dans le canal de transport, et on irradie de manière sélective, avec le rayonnement électromagnétique d'altération, les cellules eucaryotes qui ont été détectés comme étant d'un même type prédéfini, de manière à les altérer suffisamment pour les rendre non viables, les 25 autres cellules eucaryotes n'étant pas altérées au moyen du rayonnement électromagnétique d'altération. Préalablement à la mise en oeuvre du procédé de sélection, les cellules eucaryotes peuvent avoir subi pour leur conservation un traitement de congélation ou de refroidissement. Egalement, les cellules eucaryotes peuvent indifféremment 30 avoir été purifiées ou non. 3024738 10 Plus particulièrement, le procédé de l'invention peut comporter les caractéristiques additionnelles et facultatives ci-après, prises isolément ou en combinaison les unes avec les autres : - on focalise de manière hydrodynamique les cellules eucaryotes dans le 5 canal de transport de manière à les aligner les unes derrière les autres sensiblement dans un plan de focalisation hydrodynamique ou sensiblement le long d'un axe de focalisation hydrodynamique, et la distance entre la sortie dans le canal de transport du premier passage traversant et le plan de focalisation hydrodynamique ou l'axe de focalisation 10 hydrodynamique des cellules eucaryotes dans le canal de transport, est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. - on focalise de manière hydrodynamique les cellules eucaryotes dans le canal de transport de manière à les aligner les unes derrière les autres 15 sensiblement dans un plan de focalisation hydrodynamique ou sensiblement le long d'un axe de focalisation hydrodynamique, et la distance, entre la sortie dans le canal de transport du passage traversant pour l'excitation de fluorescence et ledit plan de focalisation hydrodynamique ou ledit axe de focalisation hydrodynamique des cellules 20 eucaryotes dans le canal de transport, est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. - on focalise de manière hydrodynamique les cellules eucaryotes dans le canal de transport de manière à les aligner les uns derrière les autres 25 sensiblement dans un plan de focalisation hydrodynamique ou sensiblement le long d'un axe de focalisation hydrodynamique, et la distance entre la sortie dans le canal de transport du passage traversant pour la détection de fluorescence et le plan de focalisation hydrodynamique ou l'axe de focalisation hydrodynamique des cellules eucaryotes dans le 30 canal de transport, est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. 3024738 11 - les cellules eucaryotes sont des spermatozoïdes (SP), notamment des spermatozoïdes d'animaux, pouvant avoir des chromosomes différents Brève description des figures Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus 5 clairement à la lecture de la description détaillée ci-après de plusieurs variantes de réalisation de l'invention, laquelle description est donnée à titre d'exemple non limitatif et non exhaustif de l'invention, et en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 est représentation schématique d'une première variante de 10 réalisation d'un dispositif de sélection de l'invention, la puce microfluidique de ce dispositif de sélection étant représentée en vue de dessus ; - la figure 2 est une vue en coupe transversale de la puce microfluidique de ce dispositif de sélection, dans le plan de coupe II-II de la figure 1 ; 15 - la figure 3 est une vue en coupe transversale de ce dispositif de tri, dans le plan de coupe de la figure 1 ; - la figure 4 est une vue en coupe transversale de ce dispositif de tri, dans le plan de coupe IV-IV de la figure 3 ; - la figure 5 est une vue en coupe transversale de ce dispositif de tri, dans 20 le plan de coupe V-Vde la figure 1 ; - la figure 6 est une vue en coupe transversale de ce dispositif de tri, dans le plan de coupe VI-VI de la figure 1 ; - la figure 7 est une vue en coupe transversale de ce dispositif de tri, dans le plan de coupe VII-VII de la figure 6 ; 25 - la figure 8 est une vue en coupe transversale d'une deuxième variante d'un dispositif de sélection avec fibre optique de type « wedge », dans le même plan de coupe que la figure 7 ; - la figure 9 représente la partie distale d'une fibre optique de type « wedge », 3024738 12 - la figure 10 est une vue en coupe transversale d'une troisième variante d'un dispositif de sélection avec fibre optique de type « tapered», dans le même plan de coupe que la figure 7 ; - la figure 11 est une représentation schématique d'une quatrième 5 variante de réalisation d'un dispositif de tri de l'invention, la puce microfluidique de ce dispositif de sélection étant représentée en vue de dessus ; - la figure 12 est une vue en coupe transversale de la puce microfluidique d'une cinquième variante d'un dispositif de sélection. 10 Description détaillée On a représenté sur la figure 1, une première variante de réalisation d'un dispositif permettant la sélection de spermatozoïdes en fonction de leur chromosome, et par exemple de leur chromosome X ou Y. La description détaillée ci-après est axée sur la sélection de 15 spermatozoïdes se différenciant par leur type de chromosomes. L'invention n'est toutefois pas limitée à la section de spermatozoïdes, mais peut s'appliquer plus généralement à la sélection de cellules eucaryotes pouvant avoir des types différents permettant de les répertorier en au moins deux catégories distinctes. Plus particulièrement, mis non exclusivement les cellules eucaryotes peuvent par 20 exemple se différencier grâce l'ADN de leur noyau. Le dispositif de la figue 1 comporte : - une puce microfluidique 1 comportant un canal de transport microfluidique 100 principal, - des moyens d'injection 2 permettant d'injecter, dans le canal de 25 transport microfluidique 100 principal, une solution S contenant un échantillon de spermatozoïdes SP à sélectionner, - des moyens (3, 101) de focalisation hydrodynamique permettant d'injecter, dans le canal de transport microfluidique 100 principal, un liquide L de manière à obtenir une focalisation hydrodynamique des 30 spermatozoïdes dans le canal de transport microfluidique 100 principal, 3024738 13 - des moyens 4 d'excitation de la fluorescence des spermatozoïdes SP circulant dans le canal microfluidique 100 principal, - des moyens 5 de détection de la fluorescence émise par les spermatozoïdes circulant dans le canal de transport microfluidique 100 5 principal, - des moyens de sélection 6, comportant une source de rayonnement électromagnétique 60, et permettant d'altérer de manière sélective les spermatozoïdes circulant dans le canal de transport microfluidique principal 100, au moyen du rayonnement électromagnétique émis par la 10 source 60, - des moyens électroniques de commande 7, qui permettent de commander automatiquement ladite source de rayonnement électromagnétique 60, à partir de la détection de fluorescence réalisée par les moyens de détection 5, 15 - des moyens de collecte 8 permettant de collecter tous les spermatozoïdes en sortie du canal de transport microfluidique principal 100. Puce microfluidique 1- Canal de transport microfluidique principal 100 En référence à la figure 2, la puce microfluidique 1 comprend un substrat 20 rigide 10, ayant une face avant 10a et une face arrière 10b, et une plaque 11 fixée contre la face avant 10a du substrat 10. En référence à la figure 1, dans cette variante particulière de réalisation, le canal de transport microfluidique principal 100 est rectiligne et s'étend suivant la direction longitudinale Y correspondant à la direction de déplacement des 25 spermatozoïdes dans le canal microfluidique 100. Ce canal microfluidique 100 traverse de part en part le substrat 10 et comporte une ouverture d'admission 100a et une ouverture d'évacuation 100b. Dans une autre variante, tout ou partie de ce canal microfluidique principal 100 pourrait ne pas être rectiligne. 30 Plus particulièrement, en référence à la figure 2, la section transversale (dans un plan (X,Z)) du canal de transport microfluidique principal 100 est 3024738 14 rectangulaire, de hauteur H mesurée dans la direction Z perpendiculaire à la face supérieure 10a plane du substrat 10, et de largeur E mesurée dans la direction transversale X, parallèle à la face supérieure 10a plane du substrat 10 et perpendiculaire à la direction longitudinale Y du canal microfluidique. La hauteur 5 H du canal 100 est supérieure à la largeur E du canal microfluidique100. De préférence, la largeur E du canal est inférieure à 1mm, et plus préférentielle encore inférieure à 100pm. La hauteur H du canal peut également être inférieure à 1mm. La structure et la technique de fabrication de la puce microfluidique 1 10 comportant ledit canal de transport microfluidique 100 sont sans importance et ne sont pas limitatives de l'invention. A titre d'exemple uniquement, dans la variante de réalisation de la figure 2, le canal microfluidique principal 100 est délimité par une rainure ayant une forme en U en section transversale et réalisée dans la face supérieure 10a du substrat 15 10, et par la face arrière 11 b de la plaque 11. La paroi de fond 100c de la rainure forme la paroi de fond du canal microfluidique 100 ; les deux parois 100d de la rainure qui sont parallèles, et qui sont transversales, et plus particulièrement perpendiculaires à la paroi de fond 100c, forment les deux parois longitudinales 100d du canal microfluidique 100 ; la partie de la face inférieure 11 b de la plaque 20 11, située au droit de la rainure en U, forme la paroi supérieure 100e du canal microfluidique 100. Cette section transversale rectangulaire du canal microfluidique 100 permet, de manière connue en soi, de faciliter l'orientation spatiale des spermatozoïdes dans le canal 100 lors de l'étape de focalisation hydrodynamique. 25 En particulier, les spermatozoïdes ayant une forme non sphérique et aplatie, la mise en oeuvre d'un canal microfluidique 100 à section transversale rectangulaire contribue à une orientation spatiale des spermatozoïdes avec leur face aplatie de plus grande surface orientée sensiblement parallèlement au plan (Y, Z), c'est-à-dire sensiblement parallèle au plan des deux parois longitudinales 100d du canal 30 microfluidique 100. Il revient à l'homme de l'art de sélectionner judicieusement et 3024 73 8 15 de manière connue en soi les dimensions du canal microfluidique 100, et notamment le ratio H/E. Il convient toutefois de souligner que l'invention n'est pas limitée à la mise en oeuvre d'un canal de transport 100 ayant une section transversale 5 rectangulaire, ledit canal de transport 100 pouvant plus généralement avoir une géométrie différente en section transversale, et pouvant par exemple et de manière non limitative et non exhaustive, avoir une forme circulaire, ovale, polygonale. Le substrat 10 est réalisé dans un matériau, qui est chimiquement inerte. 10 Par exemple, mais non nécessairement, le matériau du substrat 10 est choisi de manière à pouvoir subir une gravure physique ou chimique, par exemple une gravure par plasma. Plus particulièrement, mais de manière non limitative de l'invention, le substrat est par exemple en silicium ou en arséniure de gallium. Dans ce cas, la rainure (100c,100d) de hauteur H et de largeur E est avantageusement 15 réalisée par une gravure anisotrope de la face supérieure 10a du substrat 10. Le substrat avec la rainure (100c,100d) peut également être produit par impression 3D. La plaque 11 est dans un matériau qui est chimiquement inerte, et peut être opaque ou transparente. La plaque 11 est par exemple en verre ou en plastique. 2 0 Elle est fixée au substrat 10 par tout moyen, et par exemple par collage anodique ou thermocompression. Moyens d'injection 2 des spermatozoïdes dans le canal microfluidique Les moyens d'injection 2 ont pour fonction d'injecter, dans le canal microfluidique 100 principal, une solution S contenant un échantillon de 25 spermatozoïdes à sélectionner. Plus particulièrement, dans la variante de la figure 1, ces moyens d'injection 2 comportent une seringue 20, qui est remplie avec une solution S contenant l'échantillon de spermatozoïdes SP à sélectionner, et qui est associée à un système d'injection automatique 21, qui peut par exemple être de type pousse- 30 seringue ou de type pompe péristaltique. La sortie de la seringue 20 est couplée à un tube capillaire 22, dont la partie distale 22a a été insérée dans le canal 3024738 16 microfluidique 100 par l'ouverture d'admission 100a de ce canal 100. Le tube capillaire 22 est un tube souple, dont la section transversale est de préférence adaptée à la section du canal microfluidique 100. Plus particulièrement, le tube capillaire 22 est de préférence fixé au substrat 5 10, par tout moyen, et notamment par collage. Les spermatozoïdes SP contenus dans la seringue 20 sont dilués dans la solution tampon S, qui est compatible biologiquement avec les spermatozoïdes, et par exemple dans une solution aqueuse comportant 30g/L de TRIS (trishydroxyméthylaminométhane), 17,25 g/L d'acide citrique monohydraté et 12,5 10 g/L de fructose dans de l'eau à un pH d'environ 7. De nombreuses autres solutions tampon S connues de l'homme du métier peuvent être utilisées. On pourra sur ce point se référer par exemple à l'enseignement de la demande de brevet internationale W02004/088283. Plus particulièrement, l'ADN des spermatozoïdes SP contenus dans la 15 solution tampon S a été marqué, de manière connue en soi, au moyen d'au moins un fluorochrome, qui peut fluorescer lorsqu'il est associé à l'ADN. Parmi les fluorochromes couramment utilisés pour marquer les spermatozoïdes, on peut citer à titre d'exemples non limitatifs et non exhaustifs : les fluorochromes de type bisbenzimide, et notamment les fluorochromes Hoechst (Hoechst 33342, Hoechst 20 33258, ... ), le bromure d'éthidium, les fluorochromes SYBR tel que le SYBR-14 . De nombreux autres fluorochromes connus de l'homme du métier peuvent être utilisés. En particulier, pour de plus amples détails sur la réalisation d'une solution tampon S comportant des spermatozoïdes marqués au moyen de fluorochromes, on pourra se référer par exemple à l'enseignement de la demande 25 de brevet internationale W02004/088283. En fonctionnement, le système d'injection 21 pousse la solution tampon S contenant les spermatozoïdes SP, de manière à la faire sortir par l'ouverture distale 22b du capillaire 22, et à l'injecter dans le canal microfluidique 100 avec un débit contrôlé automatiquement, et de préférence constant. On a pu vérifier que 30 cette injection de la solution tampon S contenant les spermatozoïdes SP dans le 3024738 17 canal microfluidique 100 n'affectait pas la fertilité, et notamment la motilité des spermatozoïdes. Moyens (3, 101) de focalisation hydrodynamique des spermatozoïdes Afin de permettre la mise en oeuvre d'une focalisation hydrodynamique des 5 spermatozoïdes SP dans le canal microfluidique 100, la puce microfluidique 1 comporte deux canaux microfluidiques secondaires 101, qui de manière usuelle sont formés de part et d'autre du canal de transport microfluidique 100 (Figure 1). Chaque canal microfluidique secondaire 101 comporte une ouverture d'admission 101a et débouche, à l'opposé de l'ouverture d'admission 101a, latéralement dans 10 le canal microfluidique principal 100. La sortie du tube capillaire 22 est positionnée en amont de la zone de jonction entre les canaux microfluidiques secondaires 101 et le canal de transport microfluidique 100, la partie distale 22a du tube capillaire 22 pouvant être insérée plus ou moins profondément dans le canal de transport 100. 15 Plus particulièrement, et de manière similaire à ce qui a été décrit précédemment pour le canal microfluidique principal 100, chaque canal microfluidique secondaire 101 est délimité d'une part par une rainure en U gravée dans la face supérieure du substrat 10, et d'autre part par la face inférieure 11 b de la plaque 11. 20 Les moyens de focalisation hydrodynamique comportent pour chaque canal secondaire 101, des moyens d'injection 3 sous la forme d'une seringue 30, qui est remplie avec une solution L, et qui est associée à un système d'injection 31 automatique, par exemple de type pousse-seringue ou de type pompe péristaltique. La sortie de la seringue 30 est couplée à un tube capillaire 32, dont 25 la partie distale 32a a été insérée dans le canal microfluidique 100 par l'ouverture d'admission 101a d'un canal secondaire 101. Chaque tube capillaire 32 est un tube souple, dont la section transversale est de préférence adaptée à la section du canal secondaire 101. Plus particulièrement, chaque tube capillaire 32 est de préférence fixé au substrat 10, par tout moyen, et notamment par collage. 3024 73 8 18 Le liquide utilisé pour les solutions L est de préférence, mais non nécessairement, identique à celui utilisé pour la solution tampon S contenant les spermatozoïdes SP. En fonctionnement, chaque système d'injection 31 pousse chaque solution 5 L de manière à l'injecter dans le canal microfluidique secondaire 101 correspondant avec un débit contrôlé automatiquement, et de préférence constant. De manière connue en soi, les débits de chaque solution L et de la solution tampon S contenant les spermatozoïdes SP sont contrôlés automatiquement, de manière à créer dans le canal microfluidique 100a, deux flux laminaires FL à 10 vitesse élevée formés par chaque solution L, de part et d'autre du flux central plus lent formé par la solution S contenant les spermatozoïdes SP. Ces flux laminaires FL permettent, de manière connue, d'entraîner les spermatozoïdes SP dans le canal microfluidique principal 100 en leur faisant subir une focalisation hydrodynamique, de type 2D, qui aboutit sensiblement à aligner les 15 spermatozoïdes SP les uns derrière les autres, avec un espacement sensiblement constant entre deux spermatozoïdes voisins, et avec un alignement des spermatozoïdes SP sensiblement dans un plan P longitudinal parallèle au plan (Y,Z). La position de ce plan de focalisation hydrodynamique P des 20 spermatozoïdes entre les deux parois longitudinales 100d du canal 100 dépend notamment de la différence de vitesse entre les deux flux laminaires FL de liquide L. Lorsque ces vitesses sont égales, le plan de focalisation hydrodynamique P des spermatozoïdes est sensiblement centré entre les deux parois longitudinales 100d du canal 100 (Figure2). Dans le cadre de l'invention, le plan de focalisation 25 hydrodynamique P des spermatozoïdes peut être décentré par rapport aux deux parois longitudinales 100d du canal 100. L'invention n'est pas limitée à une focalisation hydrodynamique 2D des spermatozoïdes SP dans le canal microfluidique principal 100. Il est également possible dans le cadre de l'invention de mettre en oeuvre une focalisation 30 hydrodynamique 3D, tel que décrit par exemple dans la demande de brevet internationale W02011/005776, de manière à aligner les spermatozoïdes 3024738 19 sensiblement le long d'un axe de focalisation hydrodynamique longitudinal parallèle à l'axe Y du canal microfluidique 100. Moyens 4 d'excitation de la fluorescence Les moyens 4 d'excitation de la fluorescence comportent une source 40 de 5 rayonnement électromagnétique, de type source laser, dont la longueur d'onde est adaptée au marqueur (fluorochrome) des spermatozoïdes. Par exemple, et de manière non limitative de l'invention, on met en oeuvre un rayonnement électromagnétique d'excitation de longueur d'onde comprise entre 300nm et 400nm, et par exemple plus particulièrement aux alentours de 375 nm lorsque 10 les spermatozoïdes SP ont été marqués avec du Hoechst. La puce microfluidique 1 comporte un premier passage traversant 102, qui débouche dans le canal microfluidique principal 100 (figures 1 et 3) dans une partie du canal microfluidique principal 100 située en aval de la zone de focalisation hydrodynamique (zone de de jonction entre les canaux 100 et 101). 15 Dans la variante particulière de la figure 1, ce passage traversant 102 est réalisé à travers l'une des parois longitudinales 100d du canal microfluidique 100. Dans la variante illustrée sur les figures 1 et 4, la distance entre la sortie 102b dans le canal de transport 100 du passage traversant 102 et la paroi opposée 100d du canal de transport 100 correspond à la largeur E du canal de transport 20 100, et est de préférence inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm. Ce passage traversant 102 est délimité par une rainure en U gravée dans la face supérieure 10a du substrat 10 et par la face inférieure 11 b de la plaque 11. Dans une autre variante, le passage traversant 101 pourrait être percé à 2 5 travers le substrat 10. La sortie de la source de rayonnement électromagnétique 40 est couplée à une fibre optique 41 dont la partie distale 41a est insérée dans ce premier passage traversant 102, de telle sorte que l'extrémité d'émission 41b (figure 4) de la fibre optique 41 ne soit pas en saillie dans le canal microfluidique 30 100, afin de ne pas perturber les écoulements de fluides dans le canal microfluidique 100, et de ce fait de ne pas perturber le positionnement et 3024 73 8 20 l'orientation spatiale des spermatozoïdes SP circulant dans le canal microfluidique 100. De préférence, l'extrémité d'émission 41b de la fibre optique 41 est positionnée au plus près de ce canal microfluidique 100, et de préférence affleure le canal microfluidique 100. 5 Sur cette figure 4, la gaine mécanique de la fibre optique est référencée 412, la gaine optique de la fibre optique est référencée 410, et le coeur de la fibre optique est référencée 411. Dans cette variante, l'extrémité distale de la gaine optique 410 et du coeur 411de la fibre optique, par laquelle est émis le rayonnement électromagnétique d'excitation, est dénudée. Dans une autre 10 variante, l'extrémité distale de la gaine optique 410 et du coeur 411 de la fibre optique pourrait ne pas être dénudée et être entourée par la gaine mécanique 412 de la fibre optique 41. Plus particulièrement, dans la variante de la figure 4, le passage traversant 102 est profilé de manière à comporter un épaulement 102a formant une butée de 15 positionnement 102a pour l'extrémité distale 412a de la gaine mécanique 412 de la fibre optique. Il suffit ainsi d'insérer la fibre optique jusqu'à ce que l'extrémité distale 412a de la gaine mécanique 412 soit bloquée par la butée de positionnement 102a, ce qui permet avantageusement un positionnement simple et précis de l'extrémité distale d'émission de la fibre optique 41 par rapport au 20 canal microfluidique 100. En fonctionnement, lorsque l'extrémité d'émission de la fibre optique 41 affleure le canal de transport 100, le rayonnement électromagnétique d'excitation est émis par la fibre optique 41 directement dans le canal de transport 100. Lorsque l'extrémité d'émission de la fibre optique 41 est positionnée légèrement 25 en retrait dans le passage traversant 102, le rayonnement électromagnétique d'excitation est émis dans ce passage traversant 102 puis pénètre dans le canal de transport 100. Cette insertion de la fibre optique 41 dans la puce microfluidique 1, à proximité du canal microfluidique 100, permet avantageusement d'amener le 30 rayonnement électromagnétique d'excitation au plus près des spermatozoïdes SP 3024738 21 circulant dans le canal microfluidique, ce qui contribue à améliorer les performances de l'excitation de la fluorescence. Afin également d'améliorer les performances de l'excitation de la fluorescence, la distance Di (figure 4), entre la sortie 102b dans le canal de 5 transport 100 du premier passage traversant 102 et le plan de focalisation hydrodynamique P (focalisation hydrodynamique 2D) ou l'axe de focalisation hydrodynamique (focalisation hydrodynamique 3D) des spermatozoïdes SP dans le canal de transport 100, est de préférence très faible. On réduit ainsi avantageusement la longueur du trajet du rayonnement électromagnétique 10 d'excitation jusqu'aux spermatozoïdes SP, à travers le liquide transportant les spermatozoïdes dans le canal de transport 100. De préférence, mais non nécessairement cette distance Di est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. L'insertion de la fibre optique 41 dans la puce microfluidique 1 permet 15 également d'éviter les risques de désalignement du rayonnement électromagnétique d'excitation par rapport au canal microfluidique 100 lorsque l'on manipule la puce microfluidique 1. Moyens 5 de détection de la fluorescence Les moyens 5 de détection de la fluorescence comportent une fibre optique 20 51 et un photo-détecteur 50, de type photomultiplicateur (PM) qui est adapté pour détecter la longueur d'onde de fluorescence des spermatozoïdes, à savoir par exemple une longueur d'onde comprise entre 400nm et 500nm, et par exemple aux alentours de 460nm lorsque les spermatozoïdes ont été marqués avec un fluorochrome de type Hoechst. 25 La puce microfluidique 1 comporte un deuxième passage traversant 103, qui débouche dans le canal microfluidique principal 100 (figures 1 et 5) en vis à vis du premier passage traversant 103. Dans la variante particulière de la figure 1, ce passage traversant 103 est réalisé à travers l'autre paroi longitudinale 100d du canal microfluidique 100. 30 La distance entre la sortie 103b dans le canal de transport 100 du passage traversant 103 et la paroi opposée 100d du canal de transport 100 correspond à 3024738 22 la largeur E du canal de transport 100, et est de préférence inférieure à 1 mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm. Sur cette figure 5, la gaine mécanique de la fibre optique est référencée 512, la gaine optique de la fibre optique est référencée 510, et le coeur de la fibre 5 optique est référencée 511. De manière identique à ce qui a été précédemment décrit pour la fibre optique 41, la partie distale 51a de la fibre optique de détection 51 est insérée dans ce deuxième passage traversant 103de telle sorte que l'extrémité distale de la fibre optique 51 ne soit pas en saillie dans le canal microfluidique 100, et est de 10 préférence positionnée au plus près de ce canal microfluidique 100. L'extrémité d'émission 51b de la fibre de détection 51 est positionnée en vis à vis du photo-détecteur 50, de telle sorte que la lumière (fluorescence) qui est émise dans le canal microfluidique 100, et qui est captée par la fibre 51, est détectée par le détecteur de lumière 50. Le détecteur de lumière 50 délivre un 15 signal électrique 50a caractéristique de l'intensité lumineuse de la fluorescence qui est détectée. Cette insertion de la fibre optique de détection 51 dans la puce microfluidique 1, à proximité du canal microfluidique 100, permet avantageusement d'améliorer la détection de fluorescence et contribue à une 20 meilleure discrimination entre un spermatozoïde X et un spermatozoïde Y. Afin également d'améliorer les performances de la détection de fluorescence, la distance entre la sortie 103b dans le canal de transport 100 du deuxième passage traversant 103 (figure 1- ouverture 103b de ce passage 103 débouchant dans le canal de transport 100) et le plan de focalisation 25 hydrodynamique P (focalisation hydrodynamique 2D) ou l'axe de focalisation hydrodynamique (focalisation hydrodynamique 3D) des spermatozoïdes dans le canal de transport 100 est de préférence très faible. On réduit ainsi avantageusement la longueur du trajet du rayonnement de fluorescence, à travers le liquide transportant les spermatozoïdes dans le canal de transport 100. De 30 préférence, mais non nécessairement cette distance est inférieure à 1mm, plus 3024738 23 préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. Plus particulièrement, afin de collecter un maximum de lumière, la fibre optique de détection 51 peut par exemple être une fibre optique large coeur 511 5 (figure 5) contrairement à la fibre optique d'excitation 41, dont le coeur 411 (figure 4) est de plus faible diamètre de manière à concentrer spatialement le rayonnement électromagnétique. Moyen de sélection 6 Les moyens de sélection 6 comportent une source 60 de rayonnement 10 électromagnétique, de type source laser (pulsé ou continu) et une fibre optique 61. La sortie de cette source de rayonnement électromagnétique 61 est couplée à la fibre optique 61. La puce microfluidique 1 comporte un troisième passage traversant 104, qui débouche dans le canal microfluidique principal 100 (figures 1 et 6) dans une 15 partie du canal microfluidique principal 100 située en aval de la zone de détection de fluorescence. Dans la variante particulière de la figure 1, ce passage traversant 104 est réalisé à travers l'une des parois longitudinales 100d du canal microfluidique 100. La distance entre la sortie 104b dans le canal de transport 100 du passage 20 traversant 104 et la paroi opposée 100d du canal de transport 100 correspond à la largeur E du canal de transport 100, et est de préférence inférieure à 1 mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm. Sur la figure 6, la gaine mécanique de la fibre optique est référencée 612, la gaine optique de la fibre optique est référencée 610, et le coeur de la fibre 25 optique est référencé 611. De manière identique à ce qui a été précédemment décrit pour la fibre optique 41, la partie distale 61a de la fibre optique 61 est insérée dans ce troisième passage traversant 104, de telle sorte que l'extrémité distale d'émission 61b (figure 7) de la fibre optique 61 ne soit pas en saillie dans le canal microfluidique 30 100, et est de préférence positionnée au plus près de ce canal microfluidique 100. 3024738 24 Lorsqu'elle activée, la source 60 émet dans le canal microfluidique 100 un rayonnement électromagnétique d'altération R, qui a pour fonction d'altérer directement ou indirectement un spermatozoïde SP circulant dans le canal microfluidique principal 100 et passant à travers ce rayonnement 5 électromagnétique d'altération, de manière à ce que ce spermatozoïde ne soit plus fertile. Le spermatozoïde SP traversant le rayonnement électromagnétique d'altération est modifié, de sorte que sa viabilité ou motilité est détériorée de manière suffisante pour que le spermatozoïde ne soit plus fertile, indépendamment du phénomène physique et/ou biologique et/ou chimique occasionnant cette 10 détérioration. Dans le cadre général de l'invention, cette altération par le rayonnement électromagnétique peut par exemple découler d'une lésion ou altération photochimique du spermatozoïde et/ou d'un effet de stress thermique subi par le spermatozoïde. Pour obtenir cette altération, on peut pratiquer une longueur d'onde pour le 15 rayonnement électromagnétique d'altération qui est sélectionnée dans une large gamme spectrale. Plus particulièrement, mais non exclusivement, la longueur d'onde du rayonnement électromagnétique d'altération sera typiquement sélectionnée dans une gamme de longueur d'ondes allant de l'UV à l'Infrarouge. L'insertion de la fibre optique 61 dans la puce microfluidique 1, à proximité 20 du canal microfluidique 100, permet avantageusement d'amener le rayonnement électromagnétique d'altération des spermatozoïdes au plus près des spermatozoïdes SP circulant dans le canal microfluidique. En fonctionnement, lorsque l'extrémité d'émission de la fibre optique 61 affleure le canal de transport 100, le rayonnement électromagnétique d'altération 25 est émis par la fibre optique 61 directement dans le canal de transport 100. Lorsque l'extrémité d'émission de la fibre optique 61 est positionnée légèrement en retrait dans le passage traversant 104, le rayonnement électromagnétique d'altération est émis dans ce passage traversant 102 puis pénètre dans le canal de transport 100. 30 Afin également d'améliorer les effets du rayonnement électromagnétique d'altération, la distance D3 (figure 7), entre la sortie 104b dans le canal de transport 3024738 25 100 du troisième passage traversant 104 et le plan de focalisation hydrodynamique P (focalisation hydrodynamique 2D) ou l'axe de focalisation hydrodynamique (focalisation hydrodynamique 3D) des spermatozoïdes SP dans le canal de transport 100, est de préférence très faible. On réduit ainsi 5 avantageusement la longueur du trajet du rayonnement électromagnétique d'altération jusqu'aux spermatozoïdes SP, à travers le liquide transportant les spermatozoïdes dans le canal de transport 100. De préférence, mais non nécessairement cette distance D3 est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. 10 Il en résulte notamment qu'on réduit fortement les phénomènes d'absorption du rayonnement électromagnétique d'altération par le liquide circulant dans le canal microfluidique 100, et on élimine les phénomènes d'absorption du rayonnement électromagnétique d'altération par le substrat 10 de la puce microfluidique, comparativement à une solution dans laquelle le rayonnement 15 électromagnétique d'altération devrait passer à travers ledit substrat. Il devient ainsi possible d'altérer les spermatozoïdes en les irradiant avec un rayonnement électromagnétique de faible puissance, par exemple ayant une puissance moyenne inférieure à 10W, et de préférence inférieur à 1W. L'invention n'est toutefois pas limitée à ces valeurs de puissance. 20 Grâce à l'intégration de la partie distale 61a de la fibre optique 61 dans la puce microfluidique, on évite également les risques de désalignement du rayonnement électromagnétique d'altération par rapport au canal microfluidique 100, notamment lorsque l'on manipule la puce microfluidique 1. Focalisation - fibre « wedge » ou fibre « tapered » 25 De préférence, la fibre optique 61 est une fibre optique microlentillée dont l'extrémité d'émission 61b est profilée de manière à former une lentille permettant de focaliser le rayonnement électromagnétique d'altération R dans le canal microfluidique 100 par rapport au trajet des spermatozoïdes SP, c'est-à-dire dans le cas des figures annexées dans le plan d'alignement P des spermatozoïdes SP. 30 Plus particulièrement, en référence aux figures 8 et 9, dans une variante de réalisation la fibre optique 61 est une fibre optique dite « wedge », c'est-à-dire 3024738 26 dont l'extrémité distale d'émission forme une lentille biseautée sur les deux faces suivant une direction. Plus particulièrement, en référence à la figure 10 dans une variante de réalisation la fibre optique 61 est une fibre optique dite « tapered », c'est-à-dire 5 dont l'extrémité distale d'émission forme une lentille conique. La position de l'extrémité d'émission 61b de la fibre optique 61 par rapport au plan de focalisation hydrodynamique P des spermatozoïdes SP est choisie de manière à optimiser l'interaction entre le rayonnement électromagnétique d'altération F par rapport au plan de focalisation hydrodynamique P des 10 spermatozoïdes SP, en sorte de délivrer le maximum d'énergie sensiblement dans ce plan d'alignement P des spermatozoïdes. Plus particulièrement, en référence à la figure 8, la fibre optique « wedge » 61 permet une focalisation du rayonnement électromagnétique d'altération R le long sensiblement d'une ligne de focalisation O dans le plan de focalisation 15 hydrodynamique P des spermatozoïdes SP et parallèle à l'axe Z. La fibre optique « tapered » permet une focalisation du rayonnement électromagnétique d'altération R en un point de focalisation O sensiblement dans le plan de focalisation hydrodynamique P des spermatozoïdes SP. On optimise ainsi l'utilisation de la puissance du rayonnement 20 électromagnétique d'altération R pour obtenir l'altération des spermatozoïdes SP, ce qui permet de réduire la puissance de la source rayonnement électromagnétique 60. Moyens électroniques de commande 7 Les moyens électroniques de commande 7 reçoivent en entrée le signal 25 50a de détection de fluorescence délivré par le photo-détecteur 50, et délivre en sorte un signal de commande 7a permettant de commander automatiquement ladite source de rayonnement électromagnétique 60, à partir de la détection de fluorescence. Plus particulièrement, les moyens électroniques de commande 7 sont par 30 exemple conçus pour comparer le signal 50a de détection de fluorescence avec un seuil prédéfini, qui de manière connue permet une discrimination entre un 3024 73 8 27 spermatozoïde X et un spermatozoïde Y, et de commander automatiquement ladite source de rayonnement électromagnétique 60 : - de manière à ce que le rayonnement électromagnétique d'altération R soit émis dans le canal microfluidique 100, si on souhaite altérer le 5 spermatozoïde SP qui a été détecté lorsque celui-ci traverse ledit rayonnement électromagnétique d'altération R ou - de manière à ce que le rayonnement électromagnétique d'altération R ne soit pas émis dans le canal microfluidique 100, si on souhaite 10 conserver intact le spermatozoïde SP qui a été détecté. Dans l'échantillon collecté par les moyens de collecte 8, les spermatozoïdes d'un type donné (par exemple Y) sont ainsi intacts et fertiles et les spermatozoïdes de l'autre type (par exemple X) sont altérés de manière suffisante pour ne plus être fertiles. 15 L'invention permettant notamment de réduire la puissance de la source de rayonnement électromagnétique, la modulation du rayonnement électromagnétique d'altération R en fonction de la détection de fluorescence peut être très rapide, ce qui permet d'atteindre des cadences de sélection élevées. A titre d'exemple uniquement, et de manière non limitative, il est par 20 exemple possible de mettre oeuvre l'invention avec une source laser de puissance 60 de l'ordre de quelques centaines de mW, émettant dans une gamme de longueur d'ondes entre 1 pm et 3pm, et avec une fibre optique « tapered » 60, et de sélectionner des spermatozoïdes avec une cadence d'un spermatozoïde toutes les 100ps. 25 Autres variantes L'invention n'est pas limitée aux variantes de réalisation susvisées. De manière non limitative et non exhaustive de l'invention, d'autres variantes de réalisation brièvement décrites ci-après peuvent par exemple être également envisagées. 30 En référence à la variante de la figure 11, les passages traversants 102 et 103 respectivement pour la fibre optique d'excitation 41 et pour la fibre optique de 3024738 28 détection de fluorescence 51 ne sont pas nécessairement orientés perpendiculairement à l'axe longitudinal Y du canal microfluidique principal 100, mais peuvent former avec cet axe longitudinal Y un angle Q inférieur à 90°. En référence à la variante figure 12, la fibre optique 51 de détection de la 5 fluorescence peut être intégrée à la puce microfluidique 1 en ayant sa partie distale insérée dans un passage traversant 103 réalisé dans la paroi de fond 100c du canal microfluidique 100. Les fibres optiques 41 et 51 sont ainsi avantageusement orientées à angle droit l'une par rapport à l'autre, ce qui permet d'éviter les risques de détection d'une fluorescence parasite qui pourrait notamment être émise par la 10 fibre optique 41 des moyens 4 d'excitation de fluorescence. A l'inverse, dans une autre variante, ce peut être la fibre optique 41 d'excitation de la fluorescence qui peut être intégrée à la puce microfluidique 1 en ayant sa partie distale insérée dans un passage traversant 103 réalisé dans la paroi de fond 100c du canal microfluidique 100. 15 Dans une autre variante de réalisation (non représentée), les moyens 4 d'excitation de fluorescence peuvent être complétement externes à la puce microfluidique 1 et ne pas comporter de fibre optique intégrée à la puce microfluidique 1. De la même manière, les moyens 5 de détection de fluorescence peuvent 20 être complétement externes à la puce microfluidique 1 et ne pas comporter de fibre optique intégrée à la puce microfluidique 1. REVENDICATIONS1. Dispositif permettant de sélectionner des cellules eucaryotes (SP), lequel dispositif comporte un canal de transport (100), dans lequel peut circuler une solution contenant lesdites cellules eucaryotes (SP), un premier passage traversant (104) débouchant dans ledit canal de transport (100), une source de rayonnement électromagnétique (60), qui est couplée à une première extrémité d'une première fibre optique (61), l'autre extrémité d'émission (61b) de la première fibre optique étant insérée dans ledit premier passage traversant (104), sans être en saillie dans le canal de transport (100), ledit dispositif comportant en outre des moyens électroniques de commande (7), qui permettent de commander automatiquement ladite source de rayonnement électromagnétique (60), de manière à altérer de manière sélective les cellules eucaryotes (SP) circulant dans le canal de transport (100), au moyen du rayonnement électromagnétique d'altération (R) émis par la source de rayonnement électromagnétique (60). 2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le canal de transport (100) est un canal microfluidique dont au moins une dimension en section transversale est inférieure à 1mm, et plus particulièrement inférieure à 100pm. 3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant des moyens optiques de focalisation, qui sont fixés ou intégrés à l'extrémité d'émission (61b) de la première fibre optique, et qui permettent de focaliser dans ledit canal de transport (100) le rayonnement électromagnétique (R) émis en sortie de la première fibre optique (61). 4. Dispositif selon la revendication 3, dans lequel lesdits moyens optiques de focalisation sont formés par l'extrémité d'émission (61b) de la première fibre optique (61), qui est profilée de manière à focaliser dans ledit canal de transport (100) le rayonnement électromagnétique (R) émis en sortie de la fibre optique (61). 5. Dispositif selon la revendication 4, dans lequel l'extrémité d'émission (61b) de la première fibre optique (61) est de forme conique. 6. Dispositif selon la revendication 4, dans lequel l'extrémité d'émission (61b) de la fibre première optique (61) est de type « wedge ». 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'extrémité d'émission (61b) de la première fibre optique affleure le canal de transport (100) sans être en saillie dans le canal de transport. 8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la partie distale (61a) d'émission de de la première fibre optique (61) est insérée dans ledit premier passage traversant (104), en butée contre un épaulement (104a). 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le canal de transport (10) a une section transversale rectangulaire. 10. Dispositif selon la revendication 9, dans lequel la largeur (E) du canal de transport (100) rectangulaire est inférieure à 1 mm, et de préférence inférieure à 100pm. 11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, dans lequel le premier passage traversant (104) est réalisé à travers l'une des parois longitudinales (100d) de plus grande dimension (H) du canal de transport (100) à section rectangulaire. 12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une deuxième source de rayonnement électromagnétique (40) apte à émettre rayonnement électromagnétique d'excitation, qui permet d'exciter l'émission par fluorescence des cellules eucaryotes (SP) circulant dans ledit canal de transport (100), et au moins un photo-détecteur (50) 3024738 31 permettant de détecter la fluorescence émise par lesdites cellules eucaryotes (SP). 13. Dispositif selon la revendication 12, dans lequel les moyens électroniques de commande (7) sont aptes traiter un signal électrique de détection (50a) délivré par ledit photo-détecteur (50), et à commander la première source de rayonnement électromagnétique (60), pour l'altération sélective des cellules eucaryotes (SP), en fonction de ce signal de détection (50a). 14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, comportant un passage traversant (102) pour l'excitation de fluorescence, qui débouche dans ledit canal de transport (100), en amont du premier passage traversant (104), et dans lequel la deuxième source de rayonnement électromagnétique (40) est couplée à une première extrémité d'une fibre optique (41) d'excitation de fluorescence, l'autre extrémité d'émission (41b) de cette fibre optique (41) d'excitation de fluorescence étant insérée dans ledit passage traversant (102) pour l'excitation de fluorescence, sans être en saillie dans le canal de transport (100). 15. Dispositif selon la revendication 14, dans lequel la partie distale (41a) d'émission de la fibre optique (41) d'excitation de fluorescence est insérée dans ledit passage traversant (102) pour l'excitation de fluorescence, en butée contre un épaulement (102a). 16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, comportant un passage traversant (103) pour la détection de fluorescence, qui débouche dans ledit canal de transport (100) en amont du premier passage traversant (104), et dans lequel une extrémité (41b) d'une fibre optique (51) de détection de fluorescence est insérée dans ce passage traversant (103), sans être en saillie dans le canal de transport (100), et l'autre extrémité (51b) d'émission de ladite fibre optique (51) de détection de fluorescence étant associée au 3024738 32 photo-détecteur (50). 17. Dispositif selon la revendication 16, dans lequel la fibre optique (51) de détection de fluorescence est une fibre optique large coeur. 5 18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17, dans lequel une partie distale de la fibre optique (51) de détection de fluorescence est insérée dans ledit passage traversant (103) pour la détection de fluorescence, en butée contre un épaulement (103a). 10 19. Dispositif selon la revendication 14 et l'une quelconque des revendications 16 à 18, dans lequel le canal de transport étant délimité au moins par une paroi de fond (100c) et par deux parois longitudinales(100d) en vis-à-vis qui sont transversales, et de préférence perpendiculaires, à la paroi de fond (100c), le 15 passage traversant (102) pour l'excitation de fluorescence est réalisé à travers la paroi de fond (100c) du canal de transport (100), et le passage traversant (103) pour la détection de fluorescence est réalisé à travers l'une des parois longitudinales (100d) du canal de transport (100). 20 20. Dispositif selon la revendication 14 et l'une quelconque des revendications 16 à 18, dans lequel le canal de transport étant délimité au moins par une paroi de fond (100c) et par deux parois longitudinales(100d) en vis-à-vis qui sont transversales, et de préférence perpendiculaires, à la paroi de fond (100c), le passage traversant (103) pour la détection de fluorescence est réalisé à 25 travers la paroi de fond (100c) du canal de transport (100), et le passage traversant (102) pour l'excitation de fluorescence est réalisé à travers l'une des parois longitudinales (100d) du canal de transport (100). 21. Dispositif selon la revendication 14 et l'une quelconque des revendications 16 30 à 18, dans lequel le canal de transport étant délimité au moins par une paroi de fond (100c) et par deux parois longitudinales(100d) en vis-à-vis qui sont transversales, et de préférence perpendiculaires, à la paroi de fond (100c), le passage traversant (102) pour l'excitation de fluorescence est réalisé à travers 3024738 33 l'une des parois longitudinales (100d) du canal de transport (100), et le passage traversant (103) pour la détection de fluorescence est réalisé à travers l'autre paroi longitudinale (100d) du canal de transport (100). 5 22. Dispositif selon l'une quelconque des revendication 16 à 21, dans lequel la distance (E) entre la sortie (102b) dans le canal de transport (100) du passage traversant (102) pour l'excitation de fluorescence et la paroi opposée du canal de transport (100) est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm. 10 23. Dispositif selon l'une quelconque des revendication 16 à 22, dans lequel la distance (E) entre la sortie (103b) dans le canal de transport (100) du passage traversant (103) pour la détection de fluorescence et la paroi opposée du canal de transport (100) est inférieure à 1mm, plus préférentiellement 15 inférieure à 100pm. 24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la distance (E) entre la sortie (104b) dans le canal de transport (100) 20 du premier passage traversant (104) et la paroi opposée du canal de transport (100) est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. 25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, 25 comportant des moyens (2) permettant d'injecter dans ledit canal de transport (100) une solution (S) contenant des cellules eucaryotes (SP), et de préférence des cellules eucaryotes (SP) marquées au moyen d'au moins un fluorochrome. 30 26. Dispositif selon la revendication 25, comportant des moyens de focalisation hydrodynamique (3 ; 101) permettant d'injecter dans le canal de transport (100) un liquide (L) de manière à entraîner les cellules eucaryotes (SP) dans le canal de transport (100), en les positionnant sensiblement dans un plan de 3024738 34 focalisation hydrodynamique (P) ou sensiblement le long d'un axe de focalisation hydrodynamique et en les espaçant les unes derrière les autres. 5 27. Dispositif selon la revendication 26 et l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel lesdits moyens optiques de focalisation permettent de focaliser le rayonnement électromagnétique d'altération (R) sensiblement dans ledit plan (P) de focalisation hydrodynamique des cellules eucaryotes (SP) ou sensiblement sur l'axe de focalisation hydrodynamique des cellules 10 eucaryotes (SP). 28. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le canal de transport (100) est délimité en partie par une rainure gravée dans l'une (10a) des faces d'un substrat dur (10), et plus particulièrement 15 dans un substrat en silicium. 29. Dispositif selon la revendication 28, dans lequel le premier passage traversant (104), et le cas échéant le passage traversant (102) pour l'excitation de fluorescence, et/ou le passage traversant (103) pour la détection de 20 fluorescence, sont délimités chacun en, partie par une rainure gravée dans la même face (10a) du substrat (10) que le canal de transport (100). 30. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la puissance moyenne de la source (60) du rayonnement 25 électromagnétique d'altération des cellules eucaryotes (SP) est inférieure à 10W, et de préférence inférieure à 1W. 31. Utilisation du dispositif visé à l'une quelconque des revendications précédentes pour sélectionner automatiquement in vitro des cellules 30 eucaryotes, plus particulièrement des spermatozoïdes, et plus particulièrement encore des spermatozoïdes d'animaux. 32. Procédé de sélection in vitro de cellules eucaryotes (SP) pouvant avoir des 3024738 types différents permettant de les répertorier en au moins deux catégories distinctes, au moyen d'un dispositif de sélection visé à l'une quelconque des revendications 1 à 30, au cours duquel on injecte, dans le canal de transport (100) du dispositif de tri, une solution (S) contenant les cellules eucaryotes 5 (SP) à trier, on fait circuler dans le canal de transport 100) lesdites cellules eucaryotes (SP) les unes derrière les autres, on détecte automatiquement le type de chaque cellule eucaryote circulant dans le canal de transport (100), et on irradie de manière sélective, avec le rayonnement électromagnétique d'altération (R), les cellules eucaryotes (SP) qui ont été détectées comme 10 étant d'un même type prédéfini, de manière à les altérer suffisamment pour les rendre non viables, les autres cellules eucaryotes n'étant pas altérées au moyen du rayonnement électromagnétique d'altération (R). 33. Procédé selon la revendication 32, au cours duquel on focalise de manière 15 hydrodynamique les cellules eucaryotes dans le canal de transport de manière à les aligner les unes derrière les autres sensiblement dans un plan de focalisation hydrodynamique (P) ou sensiblement le long d'un axe de focalisation hydrodynamique, et dans lequel la distance (D3) entre la sortie (104b) dans le canal de transport (100) du premier passage traversant (104) 20 et le plan de focalisation hydrodynamique (P) ou l'axe de focalisation hydrodynamique des cellules eucaryotes (SP) dans le canal de transport (100), est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. 25 34. Procédé selon l'une quelconque des revendications 32 ou 33, mis en oeuvre au moyen d'un dispositif de sélection visé à la revendication 14 ou 15, au cours duquel on focalise de manière hydrodynamique les cellules eucaryotes dans le canal de transport de manière à les aligner les unes derrière les autres sensiblement dans un plan de focalisation hydrodynamique (P) ou 30 sensiblement le long d'un axe de focalisation hydrodynamique, et dans lequel la distance (Di), entre la sortie (102b) dans le canal de transport (100) du passage traversant (102) pour l'excitation de fluorescence et ledit plan de 3024738 36 focalisation hydrodynamique (P) ou ledit axe de focalisation hydrodynamique des cellules eucaryotes (SP) dans le canal de transport (100), est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. 5 35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 32 à 34, mis en oeuvre au moyen d'un dispositif de sélection visé à l'une quelconque des revendications 16 à 18, au cours duquel on focalise de manière 10 hydrodynamique les cellules eucaryotes dans le canal de transport de manière à les aligner les uns derrière les autres sensiblement dans un plan de focalisation hydrodynamique (P) ou sensiblement le long d'un axe de focalisation hydrodynamique, et dans lequel la distance entre la sortie (103b) dans le canal de transport (100) du passage traversant (103) pour la détection 15 de fluorescence et le plan de focalisation hydrodynamique (P) ou l'axe de focalisation hydrodynamique des cellules eucaryotes (SP) dans le canal de transport (100), est inférieure à 1mm, plus préférentiellement inférieure à 100pm, et plus préférentiellement encore inférieure à 50pm. 20 36. Procédé selon l'une quelconque des revendications 32 à 35, dans lequel les cellules eucaryotes sont des spermatozoïdes (SP), notamment des spermatozoïdes d'animaux, pouvant avoir des chromosomes différents