Brevet FR3024731A1 — publié le 20160212

ANTICORPS ANTI-CK8 POUR UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DES CANCERS DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine des anticorps pouvant être utilisés à des fins thérapeutiques. En particulier, la présente invention concerne un anticorps anti cytokératine 8. Ces anticorps s'avèrent être utiles dans le traitement des cancers exprimant la cytokératine 8 (CK8), en particulier des cancers colorectaux. ARRIERE PLAN DE L'INVENTION La cytokératine 8 (CK8) est une protéine qui constitue les filaments intermédiaires du cytosquelette des cellules épithéliales. Différentes études ont montré que la protéine CK8 serait présente à la membrane de différentes cellules cancéreuses. Ainsi, Godfroid et al. (Journal of Cell Science, 99 : 595-607, 1991) ont décrit la présence des protéines CK8 à la surface de cellules de carcinome du sein mis en culture. Hembrough et al. (Journal of Cell Science, 108 :1071-1082, 1995) ont décrit la présence de CK8 ou d'une protéine « CK8 like » à la surface des hépatocytes, des cellules HepG2 et des cellules de carcinomes du sein. La protéine CK8 a également été détectée à la surface de carcinomes d'autres cancers comme le cancer du tractus digestif supérieur (Gires et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 328 :1154-1162, 2005). Il a également été montré que la protéine CK8 est exposée à la surface des cellules tumorales invasives ou non invasives dans les cancers colorectaux (W02010/136536). Plus particulièrement, il a été montré que dans les cancers colorectaux, l'apparition de cellules invasives et/ou métastatiques s'accompagne d'un clivage de la protéine CK8 humaine exposée à la surface de ces cellules. La partie N-terminale de la protéine CK8 reste exposée à la surface des cellules d'adénocarcinome colique alors que la partie C-terminale de la protéine disparaît partiellement ou totalement de la surface de ces cellules. Le cancer colorectal est un cancer particulièrement invasif. Bien que des améliorations significatives ont été obtenues dans le traitement des patients atteints de cancer colorectal métastatique (CRC), ce type de cancer demeure un important problème de santé publique dans 3024731 2 le monde entier (Weitz et al Lancet 2005; 365: 153-65). Le CRC est le troisième cancer le plus diagnostiqué chez les deux sexes avec 940 000 cas estimés / an et la deuxième cause de décès par cancer avec environ 500 000 cas / an (Weitz et al Lancet 2005; 365: 153-65). En France, 37 000 nouveaux patients sont diagnostiqués avec un CRC chaque année, dont environ 5 la moitié décèdera de la maladie métastatique. Cependant, environ 50% des 36 000 nouveaux patients présentent déjà des métastases au moment du diagnostic ou développeront des métastases (Weitz et al Lancet 2005; 365: 153-65 ; Cunningham et al Lancet 2010 ; Chevreul Eur J Health Econ 2010). La mise sur le marché de médicaments plus efficaces (Irinotecan, Oxaliplatin) a permis 10 d'améliorer significativement le traitement des patients atteints de CRC. La dernière décennie a également vu l'émergence de thérapies à base de molécules, les anticorps monoclonaux, dirigées contre des cibles spécifiques surexprimées (récepteur à l'EGF ou VEGF) dans les cellules tumorales par rapport aux cellules saines. Ces molécules améliorent significativement les traitements. 15 Différents anticorps monoclonaux se |iantà la protéine CK8 humaine ont été décrits. En particulier, Erlandsson et al. (J. of Molecular Recognition, 16 :157-163, 2003 ; Johansson et al Cancer Res 1999, 59, 48-51) ont décrit l'anticorps monoclonal TS1 dirigé contre la protéine CK8 humaine et son anti-idiotype aTS1 ainsi que leur utilisation en immunothérapie pour le traitement des carcinomes. Doljak et al. (Cancer Letters, 267 :75-84, 2008) ont décrit 20 un anticorps monoclonal se liant au motif \JKIAl~EVEIATY conservé parmi différentes cytokératines. Cet anticorps monoclonal se lie notamment aux protéines CK2, CK8, CK10 et CK18 dans des cellules MCF-7 de cancer du sein. Cet anticorps inhibe in vitro l'activation du plasminogène sur des cellules MCF-7. L'anticorps monoclonal M20 commercialisé par Sigma® a été décrit par Van Muijen, G. et al. (Lab. Invest., 57 : 359, 1987 ; Waseem et al 25 Biochemistry 2004, 43, 1283-1295). Il a été montré que cet anticorps, liant spécifiquement la protéine CK8, inhibe la croissance et la capacité invasive des cellules tumorales de cancer co|nrectu|dans des tests réalisés in vitro et in vivo (W02010/136536). En particulier, dans la demande internationale de brevet W02010/136536, il a été montré que cet anticorps se lie spécifiquement à la partie non clivée de la protéine CK8 humaine présente à la surface des 30 cellules tumorales d'adénocarcinome colique. 3024731 3 Même si des progrès ont été réalisés dans l'identification des antigènes à la surface des cellules tumorales et dans la compréhension des mécanismes associés au développement des cancers et que ces progrès ont permis le développement d'anticorps monoclonaux pouvant améliorer significativement les traitements, leur efficacité et leur spécificité peuvent encore 5 être améliorées. Ainsi, des besoins demeurent pour la mise au point de moyens thérapeutiques pour traiter les tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier pour traiter les cancers colorectaux. BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION 10 La présente invention porte sur un anticorps, ou fragment d'anticorps, liant spécifiquement le peptide ayant la séquence selon SEQ ID No. 29 ou un peptide présentant au moins 60% d'homologie avec le peptide ayant la séquence selon SEQ ID No. 29. La présente invention porte également sur un anticorps, ou fragment d'anticorps pour son utilisation dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8, en 15 particulier le peptide de séquence selon SEQ ID No.29, à leur surface. La présente invention porte également sur un peptide antigénique de la CK8 humaine ayant la séquence selon SEQ ID No. 29. Enfin, la présente invention porte sur une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon la présente invention et un véhicule pharmaceutique approprié, en particulier 20 pour son utilisation dans le traitement dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8, en particulier le peptide de séquence selon SEQ ID No. 29, à leur surface. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS 25 Les figures lA et 1B illustrent la mise en évidence par western-blot des isoformes de la CK8 à l'aide des anticorps anti-CK8 dont l'anticorps monoclonal murin D-A10. La figure 2 illustre la compétition ou non via les peptides 1 (SEQ ID N°1) et 2 (SEQ ID N°2) sur le marquage cellulaire des Ac anti CK8 analysée par cytométrie en flux. La figure 3 illustre l'effet des peptides 1 (SEQ ID N°1) et 2 (SEQ ID N°2) sur la mise en 30 évidence des isoformes de la protéine CK8 par western-blot à l'aide de l'anticorps M20 et de l'anticorps monoclonal murin D-Al 0. 3024731 4 La figure 4 illustre l'effet des anticorps anti-CK8 (50 ug/mL) dont l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 sur l'invasion des cellules Isreco-1 induite par 10% de FBS. La figure 5 illustre l'effet des anticorps anti-CK8 sur la prolifération cellulaire Isreco-1. La figure 6 illustre l'effet des anticorps anti-CK8 dont l'anticorps monoclonal murin D-A10 5 sur la croissance tumorale (Isreco-1) chez la souris. La figure 7 illustre l'effet dose-dépendant de la concentration en anticorps monoclonal murin D-Al 0 sur la croissance tumorale (Isreco-1) chez la souris. La figure 8 illustre l'effet des anticorps anti-CK8 dont l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 sur la croissance tumorale (HCT116) chez la souris. 10 La figure 9 illustre l'effet dose-dépendant de la concentration en anticorps monoclonal murin D-Al 0 sur la croissance tumorale (HCT116) chez la souris. La figure 10 illustre le positionnement des peptides 1 (SEQ ID N°1), 2 (SEQ ID N°2), 3 (SEQ ID N°3) et 4 (SEQ ID N°4) dans la séquence de la cytokératine 8 humaine (ref UniProtKB P05787). 15 La figure 11 illustre la réactivité de l'anticorps M20 et de l'anticorps monoclonal murin D- Al 0 pour les différents peptides 1 (SEQ ID N°1), 2 (SEQ ID N°2), 3 (SEQ ID N°3) et 4 (SEQ ID N°4) par test ELISA. La figure 12 illustre la réactivité de l'anticorps monoclonal murin D-A10 pour les différents peptides 5 à 16 et de 18 à 28 (SEQ ID N°5 à SEQ ID N°16) et (SEQ ID N°18 à SEQ ID N°28) 20 par test ELISA. La figure 13A illustre l'effet des peptides 5 et 10 à 16 (SEQ ID N°5 et SEQ ID N°10 à SEQ ID N°16) sur la reconnaissance du peptide 1 (SEQ ID N°1) par l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 en ELISA et la figure 13B l'effet des peptides 18 à 24 (SEQ ID N°18 à SEQ ID N°24) sur la reconnaissance du peptide 17 (SEQ ID N°17) par l'anticorps monoclonal murin D-A10 25 en ELISA. La figure 14 illustre les séquences en acides aminés et en acides nucléiques de la région variable de la chaine légère (VL) de l'Ac Mo murin D-Al 0 (chaîne légère murine variable de l'anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d'après IMGT®). 30 La figure 15 illustre les séquences en acides aminés et en acides nucléiques de la région variable de la chaine lourde (VH) de l'Ac Mo murin D-Al 0 (chaîne lourde murine variable de 3024731 5 l'anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d'après IMGT®). DEFINITIONS 5 Le terme « anticorps » tel qu'utilisé dans la description de la présente invention désigne des anticorps monoclonaux (Ac Mo) ou polyclonaux. Les anticorps peuvent être des anticorps chimériques, humanisés ou conjugués. L'expression « anticorps monoclonal » telle qu'utilisée dans la description de la présente invention désigne un anticorps issu d'une population d'anticorps sensiblement homogènes. 10 Plus particulièrement, les anticorps individuels d'une population sont identiques à l'exception de quelques mutations éventuelles pouvant se produire naturellement qui peuvent se retrouver en proportions minimes. En d'autres termes, un anticorps monoclonal consiste en un anticorps homogène résultant de la prolifération d'un seule clone cellulaire (par exemple un hybridome, une cellule hôte eucaryote transfectée avec une molécule d'ADN codant pour l'anticorps 15 homogène, une cellule hôte procaryote transfectée avec une molécule d'ADN codant pour l'anticorps homogène, etc.) et qui est généralement caractérisé par des chaînes lourdes d'une seule et même classe et sous-classe, et des chaînes légères d'un seul type. Les anticorps monoclonaux sont fortement spécifiques et sont dirigés contre un seul antigène. En outre, contrairement aux préparations d'anticorps polyclonaux qui comprennent classiquement 20 différents anticorps dirigés contre différents déterminants, ou épitopes, chaque anticorps monoclonal est dirigé contre un seul épitope de l'antigène. L'expression « anticorps chimérique(s) » telle qu'utilisée dans la description de la présente invention désigne des anticorps comprenant les parties constantes des chaînes lourdes et légères d'un anticorps d'une espèce donnée, par exemple d'un anticorps humain, sur 25 lesquelles sont greffées les parties variables des chaînes lourdes et légères d'un anticorps d'une espèce hétérologue, par exemple d'un anticorps murin. L'expression « anticorps humanisé(s) » telle qu'utilisée dans la description de la présente invention désigne des anticorps humains dans lesquels les régions hypervariables (CDR) sont remplacées par les régions hypervariables (CDR) d'un anticorps d'origine hétérogène, par 30 exemple d'origine murine, qui constituent le site de liaison de l'antigène. Certains acides aminés situés dans les régions adjacentes aux régions CDR (régions FR) jouant un rôle dans la 3024731 6 structure du site de liaison de l'antigène, les anticorps humains peuvent en outre être modifiés (CDR) de manière à comprendre les acides aminés de la région FR de l'anticorps d'origine hétérogène. L'expression « anticorps conjugués » telle qu'utilisée dans la description de la présente 5 invention désigne des molécules mixtes artificielles dans lesquelles des composants sont associés à un anticorps capable de reconnaître sélectivement un antigène. Ces composants peuvent être drogues cytotoxiques, des agents anticancéreux, des toxines, des fragments et/ou des radioéléments. L'expression « fragment(s) d'anticorps » telle qu'utilisée dans la description de la 10 présente invention désigne des portions d'anticorps (par opposition à des anticorps entiers) qui sont fonctionnelles, c'est-à-dire des portions d'anticorps capables de lier un antigène. Des exemples de fragments d'anticorps incluent les fragments Fv (constitués des régions variables des chaînes lourdes et légères d'un anticorps), ScFv (fragment variable simple chaîne divalent), Fab (constitués de la chaîne légère en entier et d'une partie de la chaîne lourde), 15 F(ab')2 (constitués de deux fragments Fab reliés par la région charnière) ou tout fragment dont la durée de demi-vie aurait été augmentée par modification chimique. Le terme « cancer » tel qu'utilisé dans la description de la présente invention désigne toutes les formations néoplasiques malignes, quelle qu'en soit la nature histologique. Il existe deux grandes catégories de tumeurs malignes : les carcinomes, d'origine épithéliale, et les 20 sarcomes, d'origine conjonctive. Les tumeurs malignes sont formées de cellules atypiques, envahissantes ou avec une capacité de dissémination, caractérisées généralement par un pouvoir d'accroissement autonome, une délimitation imprécise, une capacité d'envahissement des tissus et vaisseaux voisins et une tendance à disséminer par la production de métastases. Le terme « polynucléotide » tel qu'utilisé dans la description de la présente invention 25 désigne une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaîne nucléotidique double brin pouvant être de type ADNc (complémentaire) ou génomique. Le terme « épitope » tel qu'utilisé dans la description de la présente invention désigne une molécule qui peut être reconnue par un paratope (partie variable d'un anticorps ou d'un 30 récepteur membranaire des lymphocytes T : TCR) pour déterminer si elle appartient au domaine du soi ou au domaine du non-soi. 3024731 7 Le terme « homologie » tel qu'utilisé dans la présente description désigne la ressemblance entre séquences peptidiques. Les séquences peptidiques peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport au polypeptide de référence. Le pourcentage d'homologie est basé sur le pourcentage d'identité 5 des séquences. LISTE DES SEQUENCES La SEQ ID N°1 désigne le peptide suivant : AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD- C 10 La SEQ ID N°2 désigne le peptide suivant : AEQRGELAIKDANAKLSELE-C La SEQ ID N°3 désigne le peptide suivant : AALQRAKQD-C La SEQ ID N°4 désigne le peptide suivant : SELEAALQRAKQD-C La SEQ ID N°5 désigne le peptide suivant : AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD La SEQ ID N°6 désigne le peptide suivant : AALQRAKQD 15 La SEQ ID N°7 désigne le peptide suivant : EAALQRAKQD La SEQ ID N°8 désigne le peptide suivant : LEAALQRAKQD La SEQ ID N°9 désigne le peptide suivant : ELEAALQRAKQD La SEQ ID N° 10 désigne le peptide suivant : SELEAALQRAKQD La SEQ ID N° 11 désigne le peptide suivant : LSELEAALQRAKQD 20 La SEQ ID N° 12 désigne le peptide suivant : KLSELEAALQRAKQD La SEQ ID N° 13 désigne le peptide suivant : AKLSELEAALQRAKQD La SEQ ID N° 14 désigne le peptide suivant : NAKLSELEAALQRAKQD La SEQ ID N° 15 désigne le peptide suivant : ANAKLSELEAALQRAKQD La SEQ ID N° 16 désigne le peptide suivant : DANAKLSELEAALQRAKQD 25 La SEQ ID N° 17 désigne le peptide suivant : C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD La SEQ ID N° 18 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQRAKQ La SEQ ID N° 19 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQRAK La SEQ ID N° 20 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQRA La SEQ ID N° 21 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQR 30 La SEQ ID N° 22 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQ La SEQ ID N° 23 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAAL 3024731 8 La SEQ ID N°24 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAA La SEQ ID N°25 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEA La SEQ ID N°26 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELE La SEQ ID N°27 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSEL 5 La SEQ ID N°28 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSE La SEQ ID N°29 désigne le peptide suivant : LSELEAAL La SEQ ID N°30 désigne la séquence nucléotidique suivante : AAC ATT GTTATGACC CAGGCC GCAC CC TC TGTAC CT GTCACTCC TGGAGAGTCAGT ATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTTCTGTATAGTAATGGCAACACTTATT 10 T GTATTGGTTC CT GCAGAGGC CAGGCCAGTCTCC TCAGC GCC TGATATATTATAT G TCCAACCTTGCC TCAGGAGTCC CAGAC AGGTTCAGTGGCAGAGGGTCAGGAACT G ATTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTG TATGCAAAGTCTAGAATATCCTTTCACG La SEQ ID N°31 désigne le peptide suivant : 15 NIVIVIT QAAP SVPVTPGE SVSIS CRS SKSLLYSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSN LAS GVPDRF S GRGS GTDF TLRISRVEAEDVGVYYCMQ SLEYPF TF GGGTKLEIK La SEQ ID N°32 désigne la séquence nucléotidique suivante : GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCGGGGGGGTCACGG GGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTTACTTTTAGTGGCTTCTGGATGAGCTGGGT 20 TCGACAGACACC TGGGAAGAC CC TGGAGTGGATTGGAGACATTAATTC TGATGGC AGTGCAAT AAAATACGCACC AT CCATAAAGGAT C GATTCACT AT CTTCAGAGACA AT GACAAGAGCACC CTGTAC CTGCAGAT GAGC AATGTGCGATCT GAGGACACAGC CACGTATTTCTGTATCGCCCATTACTCCGGTGGGGGGTTTGCTTACTGGGGTCAAG GAACCTCGGTCACCGTCTCCTCA 25 La SEQ ID N°33 désigne le peptide suivant : EVQLLETGGGLVQPGGS RGL S CEGS GF TF S GFWMSWVRQ TPGKTLEWIGDINSD GS AI KYAP S IKDRF TIFRDNDKS TLYLQMSNVRSED TATYF CIAHYS GGGFAYWGQ GT SVT VS S La SEQ ID N°34 désigne le peptide suivant : KSLLYSNGNTY 30 La SEQ ID N°35 désigne le peptide suivant : YMS La SEQ ID N°36 désigne le peptide suivant : MQSLEYPFT 3024731 9 La SEQ ID N°37 désigne le peptide suivant : GFTFSGFW La SEQ ID N°38 désigne le peptide suivant : INSDGSAI La SEQ ID N°39 désigne le peptide suivant : IAHYSGGGFAY 5 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Anticorps et fragments d'anticorps Les inventeurs ont développés des anticorps, ou fragments d'anticorps, qui lient spécifiquement le peptide ayant la séquence des acides aminés de la position 353 à la position 360 de la protéine CK8 humaine (ref Uni-ProtKB P05787) ou le peptide ayant au moins 60%, 10 ou au moins 70% voire au moins 85%, d'homologie avec ladite séquence. La séquence d'acides aminés de la position 353 à la position 360 de la protéine CK8 humaine est présentée dans la SEQ ID N°29. Par « spécifiquement », il est entendu que les anticorps, ou fragments d'anticorps, lient uniquement le peptide de la CK8 humaine ayant ladite séquence ou présentant au moins 60%, ou au moins 70% voire au moins 85%, d'homologie avec ladite 15 séquence. Il est entendu que les anticorps, ou fragments d'anticorps, peuvent liés tout fragment protéique/peptidique comprenant ladite séquence. La présente invention porte donc sur des anticorps, ou fragments d'anticorps, liant spécifiquement le peptide selon la séquence SEQ ID N°29 ou un peptide présentant au moins 60%, ou au moins 70% voire au moins 85%, d'homologie avec le peptide ayant la séquence 20 selon SEQ ID No. 29. Ces anticorps ou fragments d'anticorps sont désignés dans la description de la présente invention par l'expression « anticorps ou fragments d'anticorps de la présente invention ». Les anticorps, ou fragments d'anticorps, de la présente invention (anticorps anti-CK8, 25 ou fragments d'anticorps anti-CK8) s'avèrent inhiber de manière efficace les capacités invasives des cellules tumorales in vitro et inhiber efficacement la croissance tumorale in vivo. Les anticorps de la présente invention sont de préférence des anticorps monoclonaux. Ces anticorps monoclonaux peuvent être des anticorps d'origine murine, chimériques ou humanisés. Ils peuvent être obtenus selon les méthodes standards bien connues de l'homme du 30 métier. 3024731 10 Les anticorps monoclonaux, notamment d'origine murine, peuvent être préparés selon les techniques décrites dans le manuel Antibodies (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) ou préparés ou à partir d'hybridomes. De telles techniques sont bien connues de l'homme du 5 métier. En particulier, les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent être obtenus par exemple à partir de cellules d'un animal immunisé avec un fragment de la protéine CK8 humaine comprenant le peptide ayant la SEQ ID N°29. Les fragments de la protéine CK8 10 humaine pourront être produits selon les modes opératoires usuels par expression dans un organisme hôte recombinant ou par synthèse peptidique par exemple. Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisé un fragment de la CK8 humaine comprenant le peptide de la SEQ ID N°29. D'autres techniques de purification bien connues de l'homme du 15 métier pourront être utilisées simultanément ou successivement. Les anticorps chimériques peuvent être préparés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps chimérique peut être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable 20 d'un anticorps monoclonal non humain, notamment murin, et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Les méthodes de préparation d'anticorps 25 chimériques sont largement décrites dans la littérature. Les anticorps humanisés peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme du métier. 30 Les fragments d'anticorps de la présente invention peuvent être obtenus à partir des anticorps tels que décrits précédemment par digestion enzymatique, par exemple au moyen de 3024731 11 pepsine ou de papaïne, et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. De manière alternative, les fragments d'anticorps de la présente invention peuvent être obtenus par des techniques de recombinaisons génétiques ou par synthèse peptidique. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier. 5 Les anticorps, ou fragments d'anticorps, de la présente invention sont de préférence des anticorps, ou fragments d'anticorps choisis parmi les anticorps murins, chimériques, et humanisés, présentant de préférence une séquence optimisée. L'expression «séquence optimisée» indique notamment que les codons codant pour les 10 acides aminés constitutifs de la protéine d'intérêt (par exemple, les domaines variables d'anticorps) peuvent être optimisés pour une meilleure reconnaissance par la machinerie de traduction dans un type de cellule dédiée. A cet égard, la séquence d'acides aminés de la protéine codée par la séquence optimisée est identique à la séquence non optimisée, mais la séquence de nucléotides est différente. 15 Les anticorps, ou fragments d'anticorps, de la présente invention sont de préférence des anticorps, ou fragments d'anticorps, humanisés. Les anticorps, ou fragments d'anticorps, de la présente invention peuvent comprendre au moins l'une des séquences suivantes : SEQ ID N°31 ou SEQ ID N°33 et leurs dérivés Les anticorps, ou fragments d'anticorps, de la présente invention peuvent comprendre 20 des régions variables codées par des polynucléotides ayant la séquence nucléotidique de la chaîne légère murine variable (SEQ ID No. 30) et/ou la séquence nucléotidique de la chaîne lourde murine variable (SEQ ID No.32). La SEQ ID N°30 désigne la séquence nucléotidique de la chaîne légère murine variable d'un anticorps selon la présente invention (anticorps anti-CK8 D-A10 avec 25 description des FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d'après IMGT® présentée en figure 14). La SEQ ID N°31 désigne la séquence d'acides aminés de la chaîne légère murine variable d'un anticorps selon la présente invention (anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d'après IMGT® présentée en figure 30 14). 3024731 12 La SEQ ID N°32 désigne la séquence nucléotidique de la chaîne lourde murine variable d'un anticorps selon la présente invention (anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d'après IMGT® présentée en figure 15). 5 La SEQ ID N°33 désigne la séquence d'acides aminés de la chaîne lourde murine variable d'un anticorps selon la présente invention (anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d'après IMGT® présentée en figure 15). 10 Les séquences des régions CDR sont définies conformément à IMGT ®, Kabat © ou le système de numérotation commun qui conserve les séquences communes entre IMGT Kabat © (voir section exemples). Les régions CDR de l'anticorps monoclonal murin anti-CK8 D-Al 0 (mD-Al 0) selon la présente invention sont présentées au tableau 1. SEQ ID No: Séquence IMGT® SEQ ID No: Séquence Kabat® SEQ ID No: Séquence (Common numbering system) VL mD-A10 CDR1 34 KSLLYSNG NTY 34K RSSKSLLYSNGN TYLY 34C KSLLYSNGNTY CDR2 35 YMS 35K YMSNLAS 35C YMS CDR3 36 MQSLEYPFT 36K MQSLEYPFT 36C MQSLEYPFT VH mD-A10 CDR1 37 GF TF S GFW 37K GFWMS 37C GFW CDR2 38 INSDGSAI 38K DINSDGSAIKYAP SIKD 38C INSDGSAI CDR3 39 IAHYSGGG FAY 39K HYSGGGFAY 39C HYSGGGFAY Tableau 1: Numérotation des séquences CDR. 3024731 13 Par définition, ces régions CDR, comprennent des régions CDR variantes, par délétion, substitution ou addition d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s), lequel variant maintient la spécificité de la CDR d'origine. Le système de numérotation commune prévoit une définition 5 CDR ayant les séquences courtes d'acides aminés ou de la définition du CDR minimal. Ce polypeptide comprend un ou deux domaines de liaison comprenant une paire de chaînes VII et \TL dans laquelle la chaîne VL contient une région CDR1 de séquence SEQ ID N° 34, CDR2 de séquence SEQ ID N° 35, CDR3 de séquence SEQ ID N° 36; et la chaîne VII 10 comprenant une région CDR1 de séquence SEQ ID N° 37, CDR2 de séquence SEQ ID N° 38 et une région CDR3 de séquence SEQ ID N° 39. Ce polypeptide se lie spécifiquement à l'épitope de CK8 (SEQ ID NO : 29). Dans cet exemple, ce polypeptide comprend ces deux domaines de liaison. 15 L'anticorps ou fragment d'anticorps selon la présente invention peut être un fragment F(ab')2, Fab, Fv, ScFv ou un anticorps monoclonal ou tout fragment d'anticorps. Les anticorps, ou fragments d'anticorps, de la présent invention s'avèrent inhiber de manière efficace les capacités invasives des cellules tumorales in vitro et inhiber efficacement 20 la croissance tumorale in vivo. En particulier, les inventeurs ont montré selon la présente invention que l'anticorps monoclonal murin D-A10 (désigné indifféremment « DA-10 » ou « mD-Al 0 »), inhibe efficacement les capacités invasives des cellules Isreco-1 in vitro (figure 4) et inhibe efficacement la croissance tumorale des cellules Isreco 1 et HCT116 chez les souris (figures 6 à 9). En particulier, les inventeurs ont montré que l'anticorps D-Al 0 inhibe in 25 vitro les capacités invasives des cellules Isreco-1, tandis que l'anticorps D-D6 n'exerce aucun effet. Cette activité antagoniste est également observée avec l'anticorps M20 (figure 4). In vivo, seuls les anticorps D-Al 0 et M20 contrôlent également le développement des tumeurs. Si les anticorps D-A10 et M20 reconnaissent tous deux la protéine CK8 humaine et 30 présentent des propriétés antagonistes, il a été montré que les anticorps D-Al 0 et M20 ne reconnaissent pas le même épitope (figure 2, figure 3, figure 11). En effet, l'anticorps M20 3024731 14 reconnait spécifiquement le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 366 de la CK8 humaine (SEQ ID N°1), mais ne détecte pas les peptides ayant soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 357 de la protéine CK8 humaine (SEQ ID N°2), soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 358 à 5 366 de la protéine CK8 humaine (SEQ ID N°3),ou soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 354 à 366 de la protéine CK8 humaine (SEQ ID N°4). Alors que l'anticorps monoclonal murin D-A10 reconnait à la fois le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 366 de la CK8 humaine (SEQ ID N°1) et le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 354 à 366 de la 10 CK8 humaine (SEQ ID N°4), et ne détecte pas les peptides ayant soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 357 de la CK8 humaine (SEQ ID N°2), soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 358 à 366 de la CK8 humaine (SEQ ID N°3), (figurell). 15 De plus, la détection soit en cytométrie de flux (figure 2) ou par western blot (figure 3) des isoformes de la protéine CK8 humaine par l'anticorps M20 n'est inhibée ni par le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 366 de la CK8 humaine (SEQ ID N°1), ni par le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 357 de la CK8 humaine (SEQ ID N°2) alors que la détection des 20 isoformes de la CK8 humaine par l'anticorps monoclonal murin (Mab)D-A10 est fortement inhibée par le peptide ayant la séquence selon SEQ ID N°1 mais pas par le peptide ayant la séquence selon SEQ ID N°2 et celle du MAb D-D6 est inhibée à la fois par les deux peptides ayant la séquence selon SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2. 25 Le positionnement des peptides 1 (SEQ ID N°1), 2 (SEQ ID N°2), 3 (SEQ ID N°3) et 4 (SEQ ID N°4) sur la séquence de la cytokératine 8 humaine (ref Uni-ProtKB P05787) est présenté à la figure 10. La figure 12 décrit la réactivité de l'anticorps monoclonal murin D-A10 pour des 30 peptides anti-CK8 délimités en N et C terminal (peptide 5 à 16 et 18 à 28, SEQ ID N°5 à SEQ ID N°16 et SEQ ID N°18 à SEQ ID N°28). L'anticorps D-Al 0 se fixe sur les peptides 5, 11 à 3024731 15 16 et sur les peptides 18, 19 à 23. La leucine en position 353 du peptide 11 est essentielle à la reconnaissance par l'anticorps. En effet, l'anticorps D-Al 0 ne se fixe pas sur le peptide 10. La leucine en position 360 du peptide 23 est essentielle à la reconnaissance par l'anticorps. En effet, l'anticorps D-Al 0 ne se fixe pas sur le peptide 24. La présence essentielle des leucines 5 en position 353 et 360 de la séquence de l'épitope est confirmée par la non compétition des peptides 10 (SEQ ID N°10) et 24 (SEQ ID N°24) pour la reconnaissance par l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 en ELISA (figure 13A et 13B) lorsque cette compétition est réalisée avec le peptide 1 et peptide 17 respectivement. L'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal murin D-A10 anti-cytokératine 8 est donc la séquence de 8 acides aminés « LSELEAAL » 10 correspondant aux acides aminés de la position 353 à la position 360 (SEQ ID N°29). L'ensemble des séquences en acides aminés ainsi que la reconnaissance ou pas par l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 des peptides 1, 5 à 28 (SEQ ID N°1, SEQ ID N°5 à SEQ ID N°28) sont présentés dans le tableau 5. 15 Dans certains modes de réalisation, l'anticorps de la présente invention est l'anticorps monoclonal murin D-A10. La présente invention porte également sur un anticorps, ou fragments d'anticorps, se liant spécifiquement au peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la 20 position 353 à la position 360 de la protéine CK8 humaine, c'est-à-dire se liant spécifiquement au peptide ayant la séquence telle que montrée dans la SEQ ID N°29 pour utilisation dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier dont les cellules expriment le peptide de séquence selon SEQ ID N°29 à leur surface. 25 Tout particulièrement, l'anticorps, ou fragments d'anticorps, de la présente invention peuvent être utilisés pour traiter les cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou. Les cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du 30 pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou se caractérisent par la présence de cellules tumorales exprimant la protéine CK8 à leur surface. 3024731 16 En particulier, les anticorps, ou fragments d'anticorps, de la présente invention peuvent être utilisés pour traiter les cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou invasifs et/ou métastatiques. 5 De préférence, les anticorps, ou fragments d'anticorps, utilisés en thérapie sont des anticorps humanisés. Peptides 10 L'invention porte également sur un peptide antigénique de la CK8 humaine ayant la séquence selon SEQ ID N°29. Un tel peptide peut être utilisé en vaccination. Polynucléotides 15 L'invention a aussi pour objet des polynucléotides codant pour le peptide dérivé de la CK8 humaine ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 353 à la position 360 de la protéine CK8 humaine (SEQ ID N°29). De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les polynucléotides modifiés. 20 Les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse chimique. 25 L'invention a aussi pour objet des polynucléotides codant pour les régions variables de l'anticorps D-A10 ayant la séquence nucléotidique de la chaîne légère murine variable (SEQ ID No. 30) et la séquence nucléotidique de la chaîne lourde murine variable (SEQ ID No.32). Ainsi, la présente invention porte également sur des polynucléotides pouvant 30 comprendre l'une des séquences suivantes : SEQ ID No. 30 ou SEQ ID N°32. 3024731 17 Les séquences en acides aminés et acides nucléiques des régions variables de la chaine lourde et de la chaine légère de l'anticorps D-A10 sont représentées dans le tableau 2. Séquence en acide nucléique VL Séquence en acide nucléique VH D-A10 SEQ ID No: 30 SEQ ID No: 32 Séquence en acide aminé VL Séquence en acide aminé VH D-A10 SEQ ID No: 31 SEQ ID No: 33 5 Tableau 2: Numérotation des séquences VL ou VH en acides aminés et acides nucléiques. Compositions pharmaceutiques L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un anticorps, ou fragments d'anticorps, de la présente invention. 10 Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre un anticorps ou fragment d'anticorps et un véhicule pharmaceutique approprié. Des exemples de véhicule pharmaceutique approprié incluent les solvants, la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. Les compositions peuvent en outre 15 comprendre des agents de dispersion, des agents mouillants, des agents de mise en suspension, des agents de solubilisation, des stabilisants, des conservateurs, des correcteurs du goût et/ou des édulcorants. Les compositions peuvent être formulées pour l'administration aux mammifères, en 20 particulier à l'homme. Elles peuvent être destinées à être administrées par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale. Les compositions se présentent alors sous toutes formes appropriées selon les modes d'administration souhaités. Elles peuvent donc être sous la forme d'une solution ou d'une suspension liquide orale ou injectable, ou sous la forme solide ou semi-solide, de poudres, de 3024731 18 comprimés, de capsules, de granules, de dragées, de gélules, de sprays, de cachets, de pilules, de tablettes, ou de pâtes. La posologie varie selon le traitement et selon l'affection en cause. L'invention concerne aussi des compositions vaccinales comprenant un peptide selon 5 la présente invention et un adjuvant approprié. En vaccination, les adjuvants sont classiquement définis comme des substances capables de potentialiser ou de moduler la réponse immunitaire contre un ou plusieurs antigènes co-administrés. Les vaccins sont habituellement inoculés par injection, mais ils peuvent l'être par voie orale ou par spray nasal. 10 L'invention se rapporte à des compositions pharmaceutiques ou vaccinales pour la prévention et/ou le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier des cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou. 15 L'invention concerne aussi des méthodes de traitement thérapeutique des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier des cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou, comprenant l'administration à un individu d'une quantité efficace d'un anticorps, ou fragment d'anticorps, selon la présente 20 invention. L'invention concerne enfin l'utilisation des anticorps, ou fragment d'anticorps, selon la présente invention pour la fabrication de médicaments pour le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier des cancers colorectaux, des 25 ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou. EXEMPLES L'anticorps M20 auquel il est fait référence ci-dessous est l'anticorps disponible 30 commercialement sous la référence C5301 (Sigma) et l'anticorps 1 E8 est l'anticorps commercialement disponible sous la référence ab28050 (abcam). 3024731 19 Préparation des anticorps anti-CK8 Les anticorps anti-CK8, sont générés en utilisant des techniques d'obtention hybridomes (Zola et al., Aust." Exp Biol Med Sei. 1981 ; 59 : 303-6). Différents peptides 5 composés de 5, 7, 10, 15, 20 acides aminés reconnus par l'anticorps M20 ont été synthétisés. Ces fragments peptidiques comprennent au moins un épitope correspondant aux positions 338 à 367 de la CK8 humaine. L'immunisation a été réalisée par des peptides M20-like, c'est-à-dire des peptides contenant en quasi-totalité (peptide 1) ou en partie (peptide 2) la séquence reconnue par l'anticorps M20. Leurs séquences sont les suivantes : 10 Peptide 1 : AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C (SEQ ID N°1) Peptide 2 : AEQRGELAIKDANAKLSELE-C (SEQ ID N°2) L'immunisation a été réalisée sur 3 souris OF1 avec un mélange des 2 peptides couplés à la KLH. Les rates de souris dont le sérum était détecté positif par tests ELISA 15 pour les peptides CK8 et la protéine CK8 issue de fraction cellulaire enrichie en CK8 ont été sélectionnés. Les splénocytes ont été fusionnés avec la lignée de myélome de souris X63- Ag8.653. Après clonage de l'hybridome, deux Ac Mo murins ont été obtenus D-Al 0 et D-D6. Le clone D-A10 ou le clone D-D6 a été injecté dans le péritoine d'une souris Nude. Le liquide d'ascite murin a été purifié par colonne de chromatographie d'affinité sur protéine A 20 (la protéine A à une affinité pour la partie Fc des IgG murines). Les IgG ont été éluées à pH acide, puis transférées dans du PBS. Après concentration, la solution de PBS contenant les IgG a été filtrée et le dosage a été réalisé à 280 nm. Culture cellulaire 25 Les cellules de cancer du côlon (CC) humaines établies Isreco-1, Isreco-2, Isreco-3, HCT116+1+, HCT116 -/- et HT29 sont cultivées dans un milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (Sigma, St Quentin Fallavier, France) complété avec 10 % de sérum foetal bovin (SFB) inactivé par la chaleur (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 4 mM de L-glutamine (Sigma, St Quentin Fallavier, France) et 50 U/m1,50 µg/ml de pénicilline - streptomycine (Sigma, St 30 Quentin Fallavier, France). 3024731 20 Les cellules de l'adénocarcinome du sein humain établies MCF-7 (disponibles auprès de l'ECACC) sont cultivées dans du Minimum Essential Medium Eagle (Sigma, St Quentin Fallavier, France) complété avec 10 % de sérum foetal bovin (SFB) inactivé par la chaleur (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 2 mM de L-glutamine (Sigma, St Quentin Fallavier, 5 France), 100 U/mL, 100 p.g/mL de pénicilline - streptomycine (Sigma, St Quentin Fallavier, France) et 1% Non Essential Amino Acids (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Les cellules de leucémie des cellules B-précurseurs humaines établies Nalm-6 (disponibles auprès de DSMZ), les cellules du lymphome humain de Burkitt établies Raji (disponibles auprès de l'ECACC), les cellules du lymphome humain non Hodgkin établies RL 10 (disponibles auprès de DSMZ), les cellules du lymphome humain histiocytic établies U937 (disponibles auprès de l'ECACC), les cellules de leucémie lymphoblastique aigüe humaine établies Cem (disponibles auprès de DSMZ), les cellules de leucémie lymphoblastique aigüe humaine établies Molt4 (disponibles auprès de DSMZ), les cellules de plasma humain établies Fravel (disponibles auprès de l'ECACC) sont cultivées dans du RPMI-1640 (Sigma, St 15 Quentin Fallavier, France) sont cultivées dans du RPMI-1640 (Sigma, St Quentin Fallavier, France) complété avec 10 % de sérum foetal bovin (SFB) inactivé par la chaleur (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 2 mM de L-glutamine (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 100 U/mL, 100 p.g/mL de pénicilline - streptomycine (Sigma, St Quentin Fallavier, France). 20 Etude de l'expression cellulaire de CK8 par cytométrie en flux Cet exemple décrit des méthodes d'investigation de l'expression cellulaire de CK8 à la surface des cellules et de détermination des épitopes suite à une compétition d'anticorps ou de peptides analysée par cytométrie en flux. 2.105 cellules pour 96 puits sont incubées avec une dilution d'un anticorps monoclonal anti- 25 CK8 non conjugué à 10 µg/ml, puis diluées à 1/10. Les anticorps non liés sont retirés par lavage avec du PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, France) complété par 1 % d'albumine bovine (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Ensuite, les cellules sont centrifugées (5 min à 400 g) et l'anticorps lié est détecté avec un Ac polyclonal de chèvre anti Ig de souris (Fab')2 conjugué à de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (MP Biomedical, Illkirch, France) à 30 4 °C pendant 30 minutes. Après lavage, les cellules sont centrifugées (5 min à 400 g) et remises en suspension dans 300 gl de PBS. L'anticorps de détection lié est quantifié sur un 3024731 21 appareil FACSCAN (BD Biosciences, Rungis, France), (canal FL1, 2000 événements par acquisition). Pendant l'expérience, les contrôles des isotypes respectifs sont inclus afin d'exclure les événements de liaison non spécifique. L'expression de CK8 est déterminée suite à l'analyse du marquage via les anticorps anti-CK8 5 (1E8, M20, D-D6 ou D-A10) de façon comparative au marquage cellulaire observé avec les anticorps irrelevants de même isotype. Les résultats des expériences (pourcentage et intensité de marquage) sont illustrés dans le tableau ci-dessous avec une concentration en AcM ou à 5 µg/ml. Diverses lignées de cellules cancéreuses telles que cancer du côlon ou du sein expriment les antigènes CK8. Aucune 10 expression n'est observée sur des cellules de lymphomes ou de leucémies. Cell line Cell line type 1E8 M20 D D6 D-A10 Name 0/ IFM % IFM % IFM % IFM ISRECO-1 1-1Lrrn colon carcinorna 45f ; 2 144 - i. r °' 421 ' " 4 ° ° ISRECO-2 1 ;11.n colon carcromP, '23+ ;; I 424' I : ' , 473 ... ISRECO-3 I i;;ina" colo arclrà,nici 414 i.:: 1 402 4; , 341 , 47f .3 -., .., 4 .; HCT116+/+ - .- co:on c.:::irc.Jr,, 1 ; 4-? _ - ' 1274 , - 1 ), 334 ' HCT116-1- Fluman (;;-0n (::.:r cuirima , 11 :;".3,, ' "".'!.1 ' 31f. , ") 3851 - '; -2 411. ' HT29 Huinanc...;1;.... ar.I.:n.Dcart.;:!),-jrr..; 49/: 284 , , , _ , :361, MCF-7 B .tdenocarcinom 77 - 412 1 4 17 4/64 51+1-23 388, -', 50+/-23 :197 Nalm6 I fur;H; -1 precursor leu k -, 0+/0 J 0+10 - 0+/-0 Raji 1nn Bu!;,::..;, P.Inpholla 0+/0 - RL , ',H. ,r;.)homan F3rf, 0+/0 - u+: 0+/0 - 0+/-0 0+/-0 ..rnphoma 0+/-0 - 0+/-0 ^____ 0c.a s,r. ..: Molt4 ' innn .-(.:irte 4 )hcbase:r.- ieukaemia (.. - ) Fravel Flu m an ria 0 : I I ..:.4 04 u 0; PBMNC Hnpnoc,i.4.,...,i, 0+ -0 .. 0 : . ; 04;;-.0 , I 3024731 23 Compétition Anticorps et peptides analysée par cytométrie en flux. Brièvement, 2.105 cellules Isreco-1 pour 96 puits sont incubées en présence d'un anticorps anti-CK8 avec ou sans peptides apparentés à CK8 (peptide 1 ou peptide 2 tel que décrit ci-dessus) testés à différentes concentrations et incubées à 4 °C pendant 30 minutes. Seules les 5 données avec 1.25 µg/mL d'un anticorps anti-CK8 sont illustrées. Les anticorps non liés sont retirés par lavage avec du PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, France) complété par 1 % d'albumine bovine (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Ensuite, les cellules sont centrifugées (5 min à 400 g) et l'anticorps lié est détecté st détecté avec un Ac polyclonal de chèvre anti Ig de souris (Fab')2 conjugué à de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (MP 10 Biomedical, Illkirch, France) à 4 °C pendant 30 minutes. Après lavage, les cellules sont centrifugées (5 min à 400 g) et remises en suspension dans 300 gl de PBS. L'anticorps de détection lié est quantifié sur un appareil FACSCAN (BD Biosciences, Rungis, France), (canal FL1, 2000 événements par acquisition). Pendant l'expérience, les contrôles des isotypes respectifs sont inclus afin d'exclure les événements de liaison non spécifique. 15 Les résultats des expériences sont présentés à la Figure 2. Le marquage cellulaire Isreco-1 (2.105 cellules / mL) par l'anticorps 1E8, M20, D-D6 ou D-A10 est réalisé en présence ou non du peptide 1 ou peptide 2. Le pourcentage d'inhibition de l'intensité de marquage de l'Anticorps testé à 12.5 µg/mL en présence de différentes concentrations de peptides est reporté. 20 Détection des isoformes de la protéine CK8 par western-blot après mise en compétition ou non des anticorps anti-CK8 avec des peptides CK8 Lors des expériences de western-blot (WB), cinq microgrammes de protéines issues d'un lysat de cellules colorectales cancéreuses Isreco-1 sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE et 25 transférées sur membrane de nitrocellulose. La membrane est saturée avec une solution de de TBS-T (Tris-HCL 20 mM ph 7 ; NaCL 130 mM ; 0,1Tween 20) contenant 5 % de lait, puis incubée avec différents anticorps anti-CK8 dilués dans une solution de TBS-T contenant 2,5 % de lait. L'anticorps M20 (50 µg/mL) ou les anticorps monoclonaux murins tels que 1 E8 (1/500 eme), D-A10 (1 ug/mL) ouD-D6 (1 ug/mL) sont incubés pendant 1h avec la membrane. 30 Les anticorps primaires sont révélés avec des anticorps secondaires anti-souris couplés à la péroxydase (HRP). Les résultats sont présentés figure 1. 3024731 24 Les isoformes de la protéine CK8 sont différemment détectées selon les anticorps anti-CK8 testés. La forme entière de la protéine CK8 (CK8-E) est révélée par tous les anticorps. La forme tronquée en C terminale de la protéine CK8 (CK8-C) révélée par les anticorps M20 et D-A10, tandis que l'anticorps 1E8 dirigé contre l'extrémité C terminale de CK8 ne la 5 reconnait pas. Les différentes isoformes, ainsi que leur masse moléculaire estimée et leur séquence correspondante en acides aminés sont indiquées dans le tableau 3. Lors des expériences de compétition en WB, les anticorps M20 (11.tg/mL) ou les anticorps monoclonaux murins tels que D-Al 0 (11.tg/mL) ouD-D6 (11.tg/mL) sont préalablement incubés 2 heures à température ambiante avec le peptide 1 ou le peptide 2 avec un ratio moléculaire de 10 1/100 (1 molécule d'anticorps pour 100 molécules de peptide) dans une solution de TBS-T. Le mélange anticorps-peptides est ensuite mis en contact des membranes dans une solution de TBS-T avec 2,5% de lait pendant 1h pour une révélation par anticorps secondaire anti-souris couplés HRP. Les résultats sont présentés à la figure 3. E : Forme entière de CK8 I : Isoforme de CK8 indéterminée C : Isoforme de CK8 tronquée en 15 C terminal Les isoformes de la CK8 sont présentées dans le tableau 3 ci-dessous. Isoforme protéique de CK8 MM estimée Séquence correspondante (kDa) (AA) E' ( forme longue extension N 57 1-511 tem) E - orrne entère) 54 1-483 I (forme indéterminée) 51,49,48, 47, 46 2 C (forme clivée en C tem)) 43 Est mée 1-393 Tableau 3 : isoformes de la protéine CK8 20 3024731 25 Effet de l'anticorps monoclonal murin D-A10 sur les capacités invasives des cellules colorectales cancéreuses Isreco-1 in cellulo : Analyse de l'invasion des cellules cancéreuses par mesure en temps réel de l'impédance des cellules ( système xCELLi2ence-ACEA BiosciencesTM) 5 Le système de mesure en temps réel, xCELLigence (ACEA BiosciencesTM), est basé sur la mesure de l'impédance des cellules générée par la fixation des cellules sur des microélectrodes. Le système utilisé pour tester l'invasion des cellules cancéreuses est le système RTCA DP. Ce système utilise des plaques CIM composée de 16 puits. Les puits sont constitués d'une chambre inférieure et d'une chambre supérieure. La chambre supérieure est 10 perforée par des pores de 81.tM de diamètre eux-mêmes placés au-dessus des microélectrodes. Lors de la mesure de la capacité invasive des cellules Isreco-1, la chambre inférieure est remplie de milieu de culture avec 10 % de sérum de veau foetal (SVF). Lescellules Isreco-1 (20 000 cellules) en présence de milieu sans SVF sont placées dans la chambre supérieure préalablement recouverte d'une couche de matrigel (matrigelTM, BD biosciences) avec ou non 15 1"anticorps anti-CK8 (M20, D-A10 ou D-D6 à 50 ug/ml). Lors de l'invasion, les cellules, attirées par le gradient de SVF établi entre la chambre inférieure et la chambre supérieure, digèrent le matrigel avant de migrer au travers des pores et de contacter les micro-électrodes. La mesure de l'impédance générée après invasion est réalisée toutes les 15 minutes pendant 70 heures et enregistrée par un ordinateur relié à l'appareil RTCA DP. Les résultats des mesures 20 de la capacité invasive des cellules sont présentés à la figure 4. Le pourcentage d'inhibition de la capacité invasive des cellules Isreco-1 est reporté avec un écart-type pour 3 expériences indépendantes. Analyse de la viabilité des cellules suite à la détermination du taux d'ATP. 25 La viabilité des cellules est déterminée d'après la quantification de l'ATP, un indicateur de cellules métaboliquement actives. La détection est basée sur l'utilisation du kit CellTiterGloe (Promega, Charbonnières-les Bains, France). En quelques minutes, après une perte de l'intégrité de la membrane, les cellules perdent la capacité à synthétiser de l'ATP et les ATPases endogènes détruisent tout l'ATP restant, entraînant ainsi une chute abrupte des taux 30 d'ATP. Les cellules Isreco-1 (5.104 cellules/mL) sont incubées seules pendant 72 heures ou en présence d'un anticorps anti-CK8 ou d'un anticorps isotype contrôle (B-Z1 IGgl, B-E4 3024731 26 IgG2a). Le réactif CellTiter-Glo® est ajouté directement aux cellules en culture selon un rapport de 50 gl de réactif pour 200 gl de milieu de culture. Les plaques de dosage sont incubées à température ambiante pendant 10 minutes et le signal bioluminescent est enregistré en utilisant un fluorimètre multipuits standard Mithras LB940, (Berthold, Thoiry, France). Les 5 résultats des expériences pour déterminer l'activité des anticorps anti-CK8 sont présentés à la figure 5. Les cellules Isreco-1 (2.104 cellules / mL) sont cultivées durant 72 heures en présence ou non d'Ac anti-CK8 (M20, 1E8, D-D6 ou D-A10) ou en présence d'Ac murin irrelevant de même isotype (B-Z1, B-E4). La viabilité cellulaire est déterminée par quantification d'ATP. Le pourcentage d'inhibition de la prolifération cellulaire des cellules 10 Isreco-1 est reporté, avec un écart-type pour 2 expériences indépendantes. Seul l'anticorps 1E8 est capable de neutraliser la prolifération cellulaire Isreco-1. Détermination des régions CDR et FR de l'anticorps monoclonal murin D-A10 De l'ADNc correspondant à la région variable de l'hybridome est obtenu en utilisant deux 15 approches. La première approche consiste à utiliser dans la PCR un jeu d'amorces dégénérées associées à des acides aminés N-terminaux générées depuis le séquençage N-terminal et la seconde approche consiste à utiliser dans la PCR un jeu d'amorces dégénérées générées par la base de données d'amorces IMGT® et les amorces spécifiques décrites précédemment (Essono et al., J Immunol Methods. 2003 ; 203 : 279 : 25-66, Wang et al., Mol Immunol. 1991 ; 28 : 20 1387-97). La séquence de la région variable N-terminale est déterminée par dégradation d'Edman. L'extraction de l'ARN total est effectuée en utilisant le kit Tri Reagent selon le protocole décrit par le fournisseur Sigma. Les fragments VL et VH amplifiés sont clonés dans le vecteur de clonage TOPO-TA (Invitrogen) pour les analyses de séquences par la méthode de la 25 didésoxyterminaison (Sanger et al., Nature. 1977 ; 265 : 687-95). Ensuite, les constructions d'anticorps sont amplifiées par PCR et clonées dans le vecteur d'expression. Les régions CDR et FR des anticorps sont déterminées selon les différentes approches de numérotation tels que le système de numérotation IMGT (ImMunoGeneTics Information System® http://imgt.cines.fr), de Kabat ou le système de numérotation commun. Toutefois, les 30 régions CDR déterminées par IMGT pour un anticorps donné ne sont pas nécessairement identiques aux CDR définies par les autres systèmes de numérotation. Les CDR du domaine 3024731 27 variable et les régions de cadre ont été identifiées par l'inventeur, grâce aux systèmes de numérotation IMGT. Les positions sont numérotées selon IMGT® et l'index de Kabat® (séquences d'acides aminés de la région V et segments de séquences identiques dans les anticorps de spécificités 5 différentes). Les contributions relatives des gènes VH et VL, des minigènes et des régions déterminant la complémentarité se liant aux sites de combinaison d'anticorps sont analysées (Kabat et al., NIH Publ. 1991 ; No. 91-3242, Vol. 1, 647-669). Effet de l'anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale des cellules 10 colorectales cancéreuses Isreco-1 implantées en sous cutanée chez la souris. Les cellules Isreco-1 (10x106) et leur milieu de culture complet (10% sérum de veau foetal et 1 % pénicilline-streptomycine) ont été injectés en sous cutané à 12 souris SCID CB17. Au bout de 15 jours, la tumeur formée a atteint un volume entre 100 et 150 mm3. A ce temps, les souris ont été séparées en 4 groupes de 3 souris. Chaque groupe a reçu ou non un traitement 15 spécifique par injection intrapéritonéale à l'opposé de la tumeur. Une fois par semaine pendant 4 semaines (jours 15, 22, 29 et 36-flêches noires sur le graphique), les souris ont reçu une injection de 30 mg/kg de l'anticorps de référence M20, du MAb D-A10, D-D6 ou n'ont pas reçu d'injection (groupe contrôle). Pour chaque souris, le volume de la tumeur a été mesuré deux fois par semaine tout au long de l'expérience. Le volume moyen de chaque groupe de 20 souris est représenté sur le graphique avec un écart-type correspondant à 3 souris par groupe. Les résultats sont présentés à la figure 6. Effet dose-dépendant de la concentration de l'anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale des cellules colorectales cancéreuses Isreco-1 implantées en sous- 25 cutané chez la souris. Des fragments de tumeurs formées à partir de cellules colorectale cancéreuses Isreco-1 ont été implantés en sous cutané à 18 souris SCID CB17. Au bout de 15 jours, la tumeur a atteint un volume entre 100 et 150 mm3. A ce temps, les souris ont été séparées en 6 groupes de 3 souris. Chaque groupe a reçu ou non un traitement spécifique par injection intrapéritonéale à l'opposé 30 de la tumeur. Une fois par semaine pendant 4 semaines (jours 15, 22, 29 et 36-flêches noires sur le graphique), les souris ont reçu une injection de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 3024731 28 ou 60 mg/kg du l'anticorps monoclonal murin (MAb) D-Al 0 ou n'ont pas reçu d'injection (groupe contrôle). Pour chaque souris, le volume de la tumeur a été mesuré deux fois par semaine tout au long de l'expérience. Le volume moyen de chaque groupe de souris est représenté sur le graphique avec un écart-type correspondant à 3 souris par groupe. 5 Les résultats sont présentés à la figure 7. Effet de l'anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale des cellules colorectales cancéreuses HCT116 implantées en sous-cutanée chez la souris. 10x106 cellules HCT116 et leur milieu de culture complet (10% sérum de veau foetal et 1 % 10 pénicilline-streptomycine) ont été injectés en sous cutané à 12 souris SCID CB17. Au bout de 6 jours, la tumeur formée a atteint un volume entre 100 et 150 mm3. A ce temps, les souris ont été séparées en 4 groupes de 3 souris. Chaque groupe a reçu ou non un traitement spécifique par injection intrapéritonéale à l'opposé de la tumeur. Une fois par semaine pendant 3 semaines (jours 6, 13 et 20-flêches noires sur le graphique), les souris ont reçu une injection de 15 30 mg/kg de l'anticorps de référence M20, du MAb D-A10, MAb D-D6 ou n'ont pas reçu d'injection (groupe contrôle). Pour chaque souris, le volume de la tumeur a été mesuré deux fois par semaine tout au long de l'expérience. Le volume moyen de chaque groupe de souris est représenté sur le graphique avec un écart-type correspondant à 3 souris par groupe. Les résultats sont présentés à la figure 8. 20 Effet dose-dependant de la concentration de l'anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale des cellules colorectales cancéreuses HCT116 implantées en sous-cutané chez la souris. 10x106 cellules HCT116 et leur milieu de culture complet (10% sérum de veau foetal et 1 % 25 pénicilline-streptomycine) ont été injectés en sous cutané à 18 souris SCID CB17. Au bout de 10 jours, la tumeur formée a atteint un volume entre 100 et 150 mm3. A ce temps, les souris ont été séparées en 6 groupes de 3 souris. Chaque groupe a reçu ou non un traitement spécifique par injection intrapéritonéale à l'opposé de la tumeur. Une fois par semaine pendant 3 semaines (jours 10, 17, et 24-flêches noires sur le graphique), les souris ont reçu une 30 injection de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg ou 60 mg/kg de l'anticorps monoclonal murin (MAb) D-A10 ou n'ont pas reçu d'injection (groupe contrôle). Pour chaque souris, le 3024731 29 volume de la tumeur a été mesuré deux fois par semaine tout au long de l'expérience. Le volume moyen de chaque groupe de souris est représenté sur le graphique avec un écart-type correspondant à 3 souris par groupe. Les résultats sont présentés à la figure 9. 5 Détermination de la spécificité des Ac anti-CK8 par ELISA Principe général Les peptides CK8, couplés ou non à l'albumine de sérum bovin (BSA) au niveau du groupement SH de la cystéine C terminale, sont immobilisés au fond des puits d'une plaque 96 10 puits pendant une nuit. Les puits sont ensuite saturés avec une solution de tampon phosphate salin (PBS) contenant 2, 5% de lait et incubés avec des dilutions des anticorps anti-CK8 avec une solution de PBS-Tween contenant 0,5% de BSA pendant 2 heures. Les anticorps antiCK8 sont ensuite révélés par des anticorps secondaires anti IgG murines couplés à la péroxydase ( HRP). L'absorbance est lue à 450 nm. 15 Les conditions spécifiques pour les différentes expériences réalisées sont détaillées ci-dessous. Réactivité de l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 ou de l'anticorps M20 pour les différents peptides 1 (SE() ID N°1), 2 (SE() ID N°2), 3 (SE() ID N°3) et 4 (SEQ ID N°4) de la CK8 humaine. 20 Les peptides 1, 2, 3 et 4 de la CK8 humaine ont été couplés à la BSA au niveau du groupement SH de la cystéine C terminale et immobilisés au fond de puits de plaque 96 puits. La séquence protéique complète de la cytokératine 8 humaine (ref Uni-ProtKB P05787), 483 acides aminés (aa), est présentée à la figure 10. Les positions des séquences des peptides 1, 2, 3 et 4 sont indiquées par des flèches grises et noires sur la séquence de la CK8 humaine : 25 Peptide 1 (SEQ ID N°1) : AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C (aa 338- aa 366) Peptide 2 (SEQ ID N°2): AEQRGELAIKDANAKLSELE-C (aa 338- aa 357) Peptide 3 (SEQ ID N°3): AALQRAKQD-C (aa 358- aa 366) Peptide 4 (SEQ ID N°4): SELEAALQRAKQD-C (aa 354- aa 366) 30 Différentes concentrations (10, 1 et 0,1 lag/mL) de l'anticorps M20 ou de l'anticorps monoclonal murin D-A10 ont été incubés pendant 2h à température ambiante avec soit le 3024731 30 peptide 1, soit le peptide 2, soit le peptide 3 ou encore le peptide 4 et utilisé pour une détection en ELISA. Les valeurs de densité optique (DO) lues à 450 nm sont présentées sur le graphique. Les résultats sont présentés à la figure 11 et présentés dans le tableau 4 ci-dessous. La reconnaissance ou non par l'anticorps M20 ou le l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 des 5 peptides 1 à 4 est respectivement indiquée par un signe + ou -. Peptide (M17') Séquence CK8 ( ) Réactivité de l'anticorps Peptide 1 Peptide 2 Peptide 3 Peptide 4 M20 D-A10 333-AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C-356 338-AEQRGELAIKDANAKLSELE-C-357 358-AALQRAKQD-C-356 354-SELEAALQRAKQD-C-356 Tableau 4 : codification et séquence en acides aminés des peptides 1, 2, 3 et 4 de la CK8 humaine, ainsi que leur reconnaissance ou non par l'anticorps M20 ou le l'anticorps 10 monoclonal murin D-Al 0 (signe + ou - respectivement). Réactivité de l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 pour les différents peptides 5 à 16 et 18 à 28 (SEQ ID N°5 à SEQ ID N°16 et SEQ ID N°18 à SEQ ID N°28) de la CK8 humaine. Les peptides 5 à 16 et 18 à 28 de la CK8 humaine ont été immobilisés au fond de puits de 15 plaque 96 puits. Différentes concentrations (10 ; 1 ; 0,1 ; 0,01 ; 0,001 et 0,0001 lag/mL) de l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 ont été incubés pendant 2h à température ambiante avec les différents peptides et utilisé pour une détection en ELISA. Les valeurs de densité optique (DO) lues à 450 nm sont présentées sur le graphique. Les résultats sont présentés à la figure 12. La codification, la séquence et leur reconnaissance l'anticorps monoclonal murin D-A10 20 sont présentées au tableau 5. Effet des peptides 5, 10 à 16 et 18 à 24 (SEQ ID N°5 et SEQ ID N°10 à SEQ ID N°16 et SEQ ID N°18 à SEQ ID N°24 ) sur la reconnaissance des peptides CK8 1 et 17 (SEQ ID N°1 et SEQ ID N°17) par l'anticorps monoclonal murin D-A10. 25 Lors de la mise en compétition de l'anticorps monoclonal murin D-A10 avec différents peptides CK8, le mélange anticorps-peptides est incubé pendant 30 minutes avant d'être mis 3024731 31 en présence du peptide à détecter et immobilisé au fond des puits. L'anticorps monoclonal murin D-Al 0 est soit mis en présence des peptides 5 et 10 à 16 (SEQ ID N°5 et SEQ ID N°10 à SEQ ID N°16) pour la reconnaissance du peptide 1 (SEQ ID N°1) ou soit mis en présence des peptides 18 à 24 (SEQ ID N°18 à SEQ ID N°24) pour la reconnaissance du peptide 17. 5 Le peptide 1 de la CK8 humaine a été couplé à la BSA au niveau du groupement SH de la cystéine C terminale et a été immobilisé au fond de puits de plaque 96 puits. L'anticorps monoclonal murin D-Al 0 à la concentration de 0,03 lag/mL a été incubé pendant 30 minutes en présence des peptides 5 et 10 à 16 à différentes concentrations (10 ; 1 ; 0,1 ; 0,01 ; 0,001 et 10 0,0001 lag/mL). Le mélange peptide-anticorps ou l'anticorps seul a ensuite été mis en présence pendant 2h à température ambiante avec le peptide 1 et utilisé pour une détection en ELISA. Les valeurs de densité optique (DO) lues à 450 nm sont présentées sur le graphique. Les résultats sont présentés à la figure 13A. La codification, la séquence et leur reconnaissance par l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 sont présentées au tableau 5. 15 Le peptide 17 de la CK8 humaine a été couplé à la BSA au niveau du groupement SH de la cystéine N terminale et a été immobilisé au fond de puits de plaque 96 puits. L'anticorps monoclonal murin D-Al 0 à la concentration de 0,01 lag/mL a été incubé pendant 30 minutes en présence des peptides 18 à 24 à différentes concentrations (10 ; 1 ; 0,1 ; 0,01 ; 0,001 et 20 0,0001 lag/mL). Le mélange peptide-anticorps ou l'anticorps seul a ensuite été mis en présence pendant 2h à température ambiante avec le peptide 17 et utilisé pour une détection en ELISA. Les valeurs de densité optique (DO) lues à 450 nm sont présentées sur le graphique. Les résultats sont présentés à la figure 13B et dans le tableau 5 ci-dessous. La reconnaissance ou non par l'anticorps monoclonal murin D-A10 des peptides 1 et 5 à 28 est respectivement 25 indiquée par un signe + ou -. 3024731 32 Peptide (N°) Séquence CK8 (aa) Réactivité de l'anticorps D-A10 Peptide 1 333-AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKO,D-C-366 Peptide 5 338-AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-366 Peptide 6 358-AALQRAKQD-366 Peptide 7 357-E )n,,I,QRAKCID-356 Peptide 8 555-LEAALORAKC,D-365 Peptide 9 355-ELEAALORAKOD-366 Peptide 10 354-SELEAALORAKOD-366 Peptide 11 353-LSELEMLQRAKQD-366 Peptide 12 352-KLSELEAALQRAKQD-366 Peptide 13 351-AKLSE LEAALQRAKQD-366 Peptide 14 350-NAKLSELEAALQRAKQD-365 Peptide 15 349-ANAKLSELEAALQRAKQD-366 Peptide 16 348 -DANAKLSELEAALQRAKQD-3E E Peptide 17 345- C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD-365 Peptide 18 345-AIKDANAKLSELEAALQRAK0,-355 Peptide 19 345-AIKDANIAKLSELEAALO,RAK-364 Peptide 20 345-AKDANAKLSELEAALQRA-363 Peptide 21 345-AIKDANAKLSELEAALQR-362 Peptide 22 345-AIKDANAKLSELEAALQ-361 Peptide 23 345-4KDANAIKLSELEAAL-360 Peptide 24 345-AIKDANAKLSELEAA-35 Peptide 25 345-AIKDANAKLSELEA-358 Peptide 26 345-AIKDANAKLSELE-357 Peptide 27 345-AIKDANAK _SEL-356 Peptide 28 345-4 KDANAKLSE-355 Tableau 5 : codification et séquence en acides aminés des peptides 1 et 5 à 28 de la CK8 humaine, leur reconnaissance ou non par l'anticorps monoclonal murin D-Al 0 (signe + ou respectivement). 5 REVENDICATIONS1. Anticorps, ou fragment d'anticorps, liant spécifiquement le peptide ayant la séquence selon SEQ ID No. 29 ou un peptide présentant au moins 60% d'homologie avec le peptide ayant la 5 séquence selon SEQ ID No. 29. 2. Anticorps, ou fragment d'anticorps, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps monoclonal. 10 3. Anticorps, ou fragment d'anticorps, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps humanisé. 4. Anticorps, ou fragment d'anticorps, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'une des séquences suivantes : SEQ ID No 31 ou SEQ ID No 33. 5. Anticorps, ou fragment d'anticorps, selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend des régions variables codées par des polynucléotides ayant la séquence nucléotidique de la chaîne légère murine variable (SEQ ID No. 30) et/ou la séquence nucléotidique de la chaîne lourde murine variable (SEQ ID No.32). 6. Anticorps, ou fragment d'anticorps, selon l'une des revendications 1 à 5, pour son utilisation dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8, en particulier le peptide de séquence selon SEQ ID No.29, à leur surface. 25 7. Anticorps, ou fragment d'anticorps, selon l'une des revendications 1 à 6 pour son utilisation dans le traitement des cancers colorectaux, des ovaires, du sein, des testicules, du poumon, du rein, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du pancréas, de la tête et du cou. 8. Anticorps, ou fragment d'anticorps, selon la revendication 7, pour son utilisation dans le 30 traitement des cancers invasifs. 15 20 3024731 34 9. Anticorps, ou fragment d'anticorps, selon l'une des revendications 1 à 7, pour son utilisation dans le traitement des cancers colorectaux, de préférence des cancers colorectaux invasifs. 10. Peptide antigénique de la CK8 humaine ayant la séquence selon SEQ ID No. 29. 11. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps selon l'une des revendications 1 à 5 et un véhicule pharmaceutique approprié. 12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 pour utilisation dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8, en particulier le peptide de séquence selon SEQ ID No. 29, à leur surface. 13. Composition pharmaceutique selon les revendications 11 ou 12 pour utilisation dans le traitement des cancers colorectaux.