Brevet FR3025717A1 — publié le 20160318

L'invention concerne un inhibiteur de TrkA, et un inhibiteur de EphA2, en particulier pour une utilisation dans le traitement de cancer. La progression d'un cancer implique de nombreuses étapes, dépendant notamment de la taille de la tumeur primaire mais également de la capacité des cellules tumorales à métastaser dans des organes distants de la tumeur primaire. De multiples raisons peuvent permettre d'expliquer le nombre important d'échecs dans le traitement thérapeutique des cancers. Dans de nombreux cas, l'échec thérapeutique est associé à l'activation de signaux de transduction sous les récepteurs à activité tyrosine kinase (1). Les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), également appelés récepteurs des facteurs de croissance, constituent une sous-famille des protéines kinase, agissant spécifiquement sur les résidus tyrosine de protéines. Ces glycoprotéines transmembranaires sont composées d'un domaine extracellulaire très variable capable de fixer le ligand, d'un domaine transmembranaire permettant l'ancrage dans la membrane cellulaire et d'un domaine intracellulaire (cytoplasmique) qui renferme l'activité tyrosine kinase et permet la transduction du signal au sein de la cellule. Ces RTK peuvent être classés en plusieurs sous- classes selon les caractéristiques de la région extracellulaire des récepteurs tyrosine kinases. Ainsi, l'émergence des thérapies anti-tumorales ciblant les facteurs de croissance, leurs récepteurs (récepteurs à activité tyrosine kinase), ou les effecteurs de leur signalisation a permis le développement de médicaments anticancéreux. Dans ce contexte, de nombreuses études ont étudié le rôle du Nerve Growth Factor (NGF) dans différents types de cancer, notamment dans le cancer du sein. Le NGF est le membre prototypique de la famille des neurotrophines qui agit via les récepteurs TrkA (Tropomyosin receptor kinase A) et p75NTR (p75 Neurotrophin Receptor). Le NGF a été démontré comme jouant un rôle dans les cellules non-neuronales, en particulier dans plusieurs types de cellules cancéreuses. Par exemple, il a été mis en évidence que le NGF favoriserait le développement tumoral dans des modèles précliniques de souris (2). 3025717 2 Des études plus récentes ont permis de décrire que le précurseur du NGF, le proNGF, est également exprimé, de façon spécifique, dans différents types de cancer, en particulier le cancer du sein (voir par exemple la demande US 2009068200 Al), et que le récepteur TrkA n'est pas seulement activé par le NGF mais également par son précurseur, le proNGF. Il a en 5 outre été démontré que l'expression du proNGF dans les tumeurs mammaires est corrélée à l'envahissement ganglionnaire. De plus, le proNGF augmenterait les capacités migratoires et invasives des cellules cancéreuses de sein in vitro (3). Il a dernièrement été mis en évidence par des chercheurs que l'action pro-invasive du 10 proNGF dans les cellules tumorales mammaires est liée à sa fixation sur la sortiline, un récepteur transmembranaire à domaine Vps 10p, et à l'activation du récepteur TrkA. La phosphorylation de TrkA induirait les protéines Src et Akt, jouant un rôle dans le développement cancéreux (3). 15 Les recherches menées jusqu'à présent suggèrent donc que l'axe proNGF/TrkA intervient de manière importante dans la progression tumorale de cancers, notamment du cancer du sein. Toutefois, il a été mis en évidence que des traitements utilisant des inhibiteurs de 20 TrkA, comme par exemple le lestaurtinib et ses dérivés, n'ont qu'une efficacité limitée comme le montrent les études cliniques réalisées (4). Les traitements utilisant des inhibiteurs de TrkA ne sont donc utilisés que pour le traitement de deuxième ligne de certaines leucémies aigues myéloïdes. 25 Il existe donc toujours un besoin de nouveaux traitements de cancers, notamment du cancer du sein. Or, les inventeurs ont découvert, après de nombreuses recherches, que l'utilisation d'une part, d'un inhibiteur de TrkA, et d'autre part, d'un inhibiteur de EphA2, permettait de 30 traiter de manière efficace certaines formes de cancers, en particulier le cancer du sein. En effet, les inventeurs ont réussi à mettre en évidence, de manière très surprenante, une plateforme de signalisation dans les cellules cancéreuses du sein, à l'origine d'une résistance aux inhibiteurs de tyrosine kinase TrkA communément utilisés. 3025717 3 Ainsi, il a été démontré que, dans les cellules cancéreuses, notamment du sein, le récepteur TrkA s'associe directement au récepteur EphA2 sous l'effet de la fixation du proNGF sur la sortiline et que l'hétérodimère TrkA/EphA2 est à l'origine de l'activation 5 d'une signalisation, indépendante de la phosphorylation de TrkA jusqu'ici connue et traitée. L'invention concerne donc un inhibiteur de EphA2 pour son utilisation dans le traitement de cancer traité par un inhibiteur de TrkA. 10 L'invention concerne également un inhibiteur de TrkA pour son utilisation dans le traitement de cancer traité par un inhibiteur de EphA2. L'utilisation des deux inhibiteurs permet d'inhiber, de manière efficace et synergique, des voies de signalisation distinctes induites sous l'effet du proNGF. 15 L'inhibiteur de TrkA permet d'inhiber les voies de signalisation, dépendantes de la phosphorylation de TrkA, qui étaient connues jusqu'à présent. Comme précédemment mentionné, il a en effet déjà été démontré que le proNGF, en se fixant sur la sortiline, provoque l'activation du récepteur TrkA, induisant à son tour des voies de signalisations 20 dépendantes de sa phosphorylation. Il a ici été confirmé par les inventeurs que la phosphorylation de TrkA permet notamment l'activation de la protéine Akt, intervenant de manière importante dans l'invasion des cellules cancéreuses. Comme évoqué précédemment, TrkA fait partie des kinases Trk, sous-famille des 25 RTK. Les kinases Trk comprennent trois isoformes présentant une forte homologie : TrkA, TrkB et TrkC, et sont activées par des facteurs de croissance, les neurotrophines. TrkA est habituellement activé par le NGF, mais également par son précurseur, le proNGF. Selon l'invention, on entend par « inhibiteur de TrkA», un antagoniste de TrkA, un 30 inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. De préférence, un inhibiteur de TrkA se réfère à un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou un antagoniste de TrkA. 3025717 4 Selon un premier mode de réalisation particulier dans lequel l'inhibiteur de TrkA est un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA, ledit inhibiteur est une petite molécule organique à faible poids moléculaire (naturelle ou non). Le terme « petite molécule organique » se rapporte à une molécule (naturelle ou non) d'une taille comparable aux molécules organiques généralement utilisées dans le domaine pharmaceutique. Ce terme exclut les macromolécules biologiques (par exemple, les protéines, acides nucléiques etc.). De préférence, une petite molécule organique selon l'invention a une taille inférieure à environ 10000 Da, de préférence inférieure à 5000 Da, de préférence encore inférieure à 2000 Da et de préférence encore inférieure à environ 1000 Da. De tels inhibiteurs de TrkA sont bien connus de l'homme du métier (voir par exemple, Wang et al. (5), ou WO 2008/052062), ou peuvent facilement être générés par l'homme du métier. De manière préférentielle, l'inhibiteur de TrkA selon l'invention est choisi entre K252a (voir par exemple Lelkes et al. (6)) et CEP-701 (voir par exemple Ruggeri B et al. (7)). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé alcyne (voir par exemple Wang et al. (5), W02006044823, Cee VJ et al. (8)). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé de pyrazole (voir par exemple Wang et al. (5)), et notamment des dérivés pyrazolopyrimidine (voir par exemple W02005103010, W02006082392, W02006117560), ou est un dérivé de purine (voir par exemple W02006087530, W02006087538, Hudkins RL et al. (9)). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé de pyrazole urée (voir par exemple Wang et al. (5), W02007064872, W02007059202, W02005110994). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé aminothiazole (voir par exemple Wang et al. (5), Das J et al. (10); W0200250071; Kim SH et al. (11)) 3025717 5 Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé pyrrolotriazine (voir par exemple Wang et al. (5), W02007061882; Ghose AK et al. (12), W02008057994). 5 Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé indolocarbazole (voir par exemple Wang et al. (5)) comme le CEP-701 ou lestaurtinib (voir par exemple Ruggeri B et al. (7)) ou des analogues (3'S)-epi-K-252a (voir par exemple, Gingrich DE et al. (13)) ou des 7-oxo-indénopyrrolocarbazoles substitués en position 13 (voir par exemple Tripathy R et al. (14)) 10 Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé oxindole (voir par exemple Wang et al. (5), Wood ER et al. (15), US20050228025), comme le sunitinib (voir par exemple Faivre S et al. (16)). 15 Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé cyclique pyrazolyle condensé (voir par exemple Wang et al. (5), JP2003231687). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé tétrahydropyrrolopyrazole (voir par exemple Wang et al. (5)), comprenant notamment un 20 1,4,5,6-tetrahydropyrrolo[3,4-c]pyrazole bicyclique comme le PHA-739358 (voir par exemple, W0200505427 ; Fancelli D et al. (17)). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé imidazopyridazine (voir par exemple Wang et al. (5), W0200852734). 25 Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé isothiazole (voir par exemple Wang et al. (5), W02004011461 ; Lippa B et al. (18)). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé 30 pyrrolopyrimidine (voir par exemple Wang et al. (5)), comme le CE-245677 (voir par exemple, W02004056830, W02005116035). Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est un dérivé azaindole (voir par exemple Wang et al. (5), W02008080001, W02008063888). 3025717 6 Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est le GNF-5837 (voir par exemple Albaugh et al. (19)). 5 Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de TrkA est le (2E)-343,5- bis(1,1-diméthyléthyle)-4-hydroxyphényle]-2-cyano-2-propènethioamide, connu sous le nom AG 789. Selon un autre mode de réalisation, ledit inhibiteur selon l'invention est un antagoniste 10 de TrkA. Un antagoniste est typiquement toute substance, composé simple ou complexe, d'origine naturelle ou synthétique qui s'oppose à l'activation du récepteur TrkA et qui s'oppose notamment à l'induction de la réponse biologique que l'on obtient avec un ligand naturel de ce récepteur. En général, un tel antagoniste altère la signalisation ou le recrutement des partenaires de TrkA dans la cellule. 15 Selon un exemple, l'antagoniste de TrkA est un anticorps anti-TrkA qui neutralise TrkA ou un fragment anti-TrkA de celui-ci qui neutralise TrkA. Des anticorps anti-TrkA sont connus de l'homme du métier. On peut par exemple se 20 référer à la demande WO 2013183032 ou à la demande WO 2009098238A. Des anticorps dirigés contre TrkA peuvent être produits selon des méthodes connues de l'homme du métier, notamment en administrant un antigène ou un épitope à un animal hôte choisi, par exemple un porc, une vache, un cheval, un lapin, une chèvre, un mouton ou encore 25 une souris. Différents adjuvants connus dans l'état de la technique peuvent être utilisés pour améliorer la production de l'anticorps. Bien que l'anticorps selon l'invention puisse être un anticorps polyclonal, un anticorps monoclonal est préféré. Des anticorps monoclonaux contre TrkA peuvent être préparés et isolés selon n'importe quelle méthode appropriée, par exemple selon la technique de l'hybridome initialement décrite par Kohler et Milstein (1975) (20); la 30 technique de l'hybridome EBV (Cole et al. 1985) (21), etc. De manière alternative, des méthodes décrites pour la production d'anticorps à une seule chaîne (voir par exemple le brevet US 4, 946, 778) peuvent être adaptées pour produire des anticorps à une seule chaîne anti-TrkA. 3025717 7 Des antagonistes pouvant être utilisés selon l'invention incluent également les fragments d'anticorps, par exemple mais de manière non limitative, les fragments F(ab')2, pouvant être générés par digestion avec de la pepsine d'une immunoglobuline, les fragments Fab pouvant être générés par réduction des ponts disulfures des fragments F(ab')2, les 5 fragments scFv. De manière alternative, des banques d'expression Fab et/ou scFv peuvent être produites pour permettre une identification rapide des fragments ayant la spécificité souhaitée pour TrkA. Des anticorps anti-TrkA humanisés et des fragments d'anticorps peuvent également 10 être préparés selon des techniques connues de l'homme du métier. Un « anticorps humanisé » se rapporte à une immunoglobuline humaine (anticorps receveur) dans lequel les résidus d'une région hypervariable (CDRs) sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce non-humaine (anticorps donneur) comme une souris, un rat, un lapin etc, qui a la spécificité, l'affinité et la capacité désirée. Selon certains exemples, les résidus FR de 15 l'immunoglobuline humaine sont remplacés par les résidus non-humains correspondants. En outre, des anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus non trouvés dans les anticorps receveurs ou donneurs. Ces modifications sont faites pour améliorer les performances de l'anticorps. L'anticorps humanisé comprendra éventuellement au moins une portion d'une région constante d'une immunoglobuline (Fc), typiquement celle d'une immunoglobuline 20 humaine. Des méthodes pour produire des anticorps humanisés sont décrites par exemple par Winter (brevet US 5,225,539) et Boss (Celltech, brevet US 4,816,397). Pour cette invention, des anticorps neutralisants de TrkA sont sélectionnés. 25 Dans un autre mode de réalisation, l'antagoniste de TrkA est choisi parmi les aptamères. Les aptamères sont une classe de molécules qui représentent une alternative aux anticorps en terme de reconnaissance moléculaire. Les aptamères sont des oligonucléotides ou des séquences oligopeptidiques ayant la capacité de reconnaître virtuellement toute classe de molécules cibles avec une haute affinité et spécificité. De tels ligands peuvent être isolés par 30 exemple via un système SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) d'une bibliothèque de séquences randomisées, comme décrit par Tuerk C. and Gold L. (22). La bibliothèque de séquences randomisées peut être obtenue par synthèse chimique combinatoire d'ADN. Dans cette bibliothèque, chaque membre est un oligomère linéaire, éventuellement modifié chimiquement, de séquence unique. 3025717 8 Pour cette invention, des aptamères neutralisants de TrkA sont sélectionnés. Selon un autre exemple, l'antagoniste de TrkA est un ligand naturel de TrkA ayant été 5 modifié de manière à empêcher la fixation d'un ligand naturel de TrkA. Des ligands naturels de TrkA sont par exemple le Nerve Growth Factor (NGF), son précurseur (proNGF), et la neurotrophine 3 (NT3) (23). L'homme du métier sait comment modifier des ligands naturels dudit récepteur de manière à produire des molécules antagonistes. 10 Bien que le mode de réalisation selon lequel l'inhibiteur de TrkA est un antagoniste de TrkA soit préféré, un autre mode de réalisation selon l'invention se rapporte à un inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA (i.e. du gène du récepteur TrkA). De petits ARN interférents (siRNA pour « Small inhibitory RNA") peuvent être 15 utilisés selon l'invention comme inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur TrkA. L'expression du gène du récepteur TrkA peut être réduite en mettant en contact un sujet ou une cellule avec des petits fragments d'ARN à double brin (dsRNA), ou un vecteur ou une construction génétique induisant la production de petits fragments d'ARN à double brin, de telle façon que l'expression du gène du récepteur TrkA soit spécifiquement inhibée (i.e. 20 interférence par ARN ou RNAi). Des méthodes pour sélectionner un dsRNA ou un vecteur codant pour dsRNA sont connues dans l'état de la technique pour les gènes dont la séquence est connue (voir par exemple les demandes WO 01/36646, et WO 01/68836). Des ribozymes peuvent également être utilisés selon l'invention comme inhibiteurs de 25 l'expression du gène du récepteur TrkA. Les ribozymes sont des molécules d'ARN enzymatique capables de catalyser le clivage spécifique de l'ARN. Le mécanisme d'action des ribozymes implique l'hybridation de séquence spécifique de la molécule ribozyme à l'ARN cible complémentaire, suivie par un clivage endonucléolytique. Les ribozymes à motif en épingle ou en marteau qui catalysent spécifiquement et efficacement le clivage 30 endonucléolytique des séquences ARNm du récepteur TrkA peuvent donc être utilisés selon l'invention. Les sites spécifiques de clivage dans tout ARN cible peuvent être initialement identifiés en scannant la molécule cible pour les sites de clivage, qui comprennent généralement les séquences suivantes, GUA, GUU et GUC. Une fois identifiés, de courtes séquences d'ARN ayant entre 15 et 20 ribonucléotides correspondant à la région du gène cible 3025717 9 contenant le site de clivage peuvent être évaluées pour prédire les caractéristiques structurales, comme la structure secondaire, qui peuvent rendre la séquence oligonucléotidique non appropriée. Le caractère approprié de la cible peut être aussi évaluée en testant son accessibilité à l'hybridation avec des oligonucléotides complémentaires en utilisant, par 5 exemple, des techniques de protection ribonucléase. Les oligonucléotides anti-sens siRNA et les ribozymes pouvant être utilisés en tant qu'inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur TrkA peuvent être préparés selon des méthodes connues. Des méthodes de synthèse chimique peuvent être utilisées comme par 10 exemple, la synthèse chimique en phase solide phosphoramadite. De manière alternative, des molécules d'ARN anti-sens peuvent être générées par transcription in vitro ou in vivo des séquences ADN codant la molécule d'ARN. De telles séquences d'ADN peuvent être incorporées dans une large variété de vecteurs qui incorporent des promoteurs d'ARN polymérase appropriés comme les promoteurs polymérase T7 ou SP6. Des modifications 15 peuvent être introduites dans les oligonucléotides selon l'invention afin d'augmenter leur stabilité intracellulaire et leur demi-vie. Des modifications pouvant être effectuées incluent, mais ne sont pas limitées à, l'addition de régions flanquantes de ribonucléotides ou désoxyribonucléotide à l'extrémité 5' et/ou 3' de la molécule, ou l'utilisation de phosphorothiorate ou de 2'-0-méthyle plutôt que des liaisons phosphodiestérases dans le 20 squelette oligonucléotidique. Des siRNA et ribozymes de l'invention peuvent être délivrés in vivo seuls ou en association avec un vecteur. On entend par « vecteur » tout véhicule capable de faciliter le transfert du siRNA ou du ribozyme aux cellules, et de préférence les cellules exprimant le 25 récepteur TrkA. De préférence, le vecteur transporte l'acide nucléique aux cellules avec une dégradation réduite par rapport à la dégradation qui résulterait en absence du vecteur. En général, les vecteurs pouvant être utilisés selon l'invention incluent, mais ne sont pas limités à, les plasmides, phagémides, virus, et autres véhicules dérivés de sources virales ou bactériennes et ayant été manipulés par insertion ou incorporation du siRNA ou des séquences 30 d'acide nucléique du ribozyme. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier. Il est enfin possible d'utiliser comme inhibiteur de TrkA une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. Par « molécule adaptatrice de signalisation », on entend des molécules qui interagissent avec le récepteur TrkA par des 3025717 10 domaines d'interaction pour enclencher la signalisation intracellulaire. Des molécules adaptatrices de signalisation du récepteur TrkA sont par exemple les protéines shc, FRS2, PLCgammal, Grb2. Ces inhibiteurs peuvent par exemple être de nature peptidique, généralement obtenus par la synthèse de tout ou partie d'une molécule de signalisation qui 5 aurait un effet dominant négatif sur la liaison des adaptateurs cellulaires. Ces molécules peuvent aussi être des mimétiques organiques, i.e. analogues non peptidiques, dont la conformation permet de reconnaitre la séquence du récepteur TrkA pour s'y fixer et empêcher la fixation par compétition du partenaire de signalisation (56). Ces inhibiteurs peuvent aussi, par leur liaison, empêcher l'activation du récepteur TrkA en inhibant les changements de 10 conformation nécessaire à l'activation de TrkA (par exemple, par antagoniste allostérique comme le AR-786 développé par Array Biopharm). La synthèse et l'utilisation de tels peptides analogues et de leurs mimétiques organiques pour inhiber les signalisations intracellulaires sont connues par l'homme de métier (voir par exemple EP2060265 B1). 15 L'utilisation seule d'un inhibiteur de TrkA dans le traitement de cancer reste d'une efficacité limitée en ce que des voies de signalisation indépendantes de la phosphorylation de TrkA interviennent également dans l'invasion des cellules cancéreuses. L'utilisation supplémentaire d'un inhibiteur de EphA2 permet ainsi d'inhiber une voie de signalisation indépendante de la phosphorylation de TrkA. 20 Le récepteur 2 Ephrine de type A (EphA2) est un récepteur à activité tyrosine kinase de 135 kDa. Les éphrines du groupe A sont liées à la membrane de la cellule source par un glycosyl-phospatidylinositol, tandis que les éphrines du groupe B ont un domaine transmembranaire. 25 On entend par « inhibiteur de EphA2 », un antagoniste de EphA2, un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de EphA2 ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. De préférence, un inhibiteur de EphA2 se réfère à un antagoniste de EphA2 ou un inhibiteur de l'expression du 30 récepteur EphA2, de préférence encore un inhibiteur de EphA2 se réfère à un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2. 3025717 11 Selon un mode de réalisation particulier dans lequel l'inhibiteur de EphA2 est un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de EphA2, ledit inhibiteur est une petite molécule organique à faible poids moléculaire (naturelle ou non). Le terme « petite molécule organique » se rapporte, ici aussi, à une molécule (naturelle 5 ou non) d'une taille comparable aux molécules organiques généralement utilisées dans le domaine pharmaceutique. Ce terme exclut les macromolécules biologiques (par exemple, les protéines, acides nucléiques etc.). De préférence, une petite molécule organique selon l'invention a une taille inférieure à environ 10000 Da, de préférence inférieure à 5000 Da, de préférence encore inférieure à 2000 Da et de préférence encore inférieure à environ 1000 Da. 10 Selon un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de EphA2 est le dasatinib ou BMS-354825 (voir par exemple Charles J. Nock et al. (24)). Selon un autre mode de réalisation particulier, ledit inhibiteur selon l'invention est un 15 antagoniste de EphA2. Un antagoniste est typiquement toute substance, composé simple ou complexe, d'origine naturelle ou synthétique qui s'oppose à l'activation du récepteur EphA2. En général, un tel antagoniste altère la signalisation ou le recrutement des partenaires de EphA2 dans la cellule. 20 Par exemple, l'antagoniste de EphA2 est un anticorps anti-EphA2 qui neutralise EphA2 ou un fragment anti-EphA2 de celui-ci qui neutralise EphA2. Des anticorps anti-EphA2 sont connus de l'homme du métier. On peut par exemple se référer à la demande W02009028639, à la demande W02004014292, la demande 25 W00112840 ou à la demande W02008010101. Des anticorps dirigés contre EphA2 peuvent aussi être produits selon des méthodes connues de l'homme du métier. On peut ainsi se référer aux paragraphes précédents mentionnant de telles méthodes de production également applicables ici. 30 Bien que l'anticorps selon l'invention puisse être un anticorps polyclonal, un anticorps monoclonal est préféré. Des anticorps monoclonaux dirigés contre EphA2 peuvent être produits et isolés selon des méthodes connues de l'homme du métier. On peut ici aussi se 3025717 12 référer aux paragraphes précédents mentionnant de telles méthodes de production également applicables ici. Des antagonistes pouvant être utilisés selon l'invention incluent également les 5 fragments d'anticorps, par exemple mais de manière non limitative, les fragments Fab, F(ab')2, scFv. Des anticorps ou des fragments d'anticorps anti-EphA2 humanisés peuvent également être préparés selon des techniques connues de l'homme du métier. On peut ici aussi se référer 10 aux paragraphes précédents mentionnant de telles méthodes de production, également applicables ici. Pour cette invention, des anticorps neutralisants de EphA2 sont sélectionnés. 15 Selon un autre exemple, l'antagoniste de EphA2 est choisi parmi les aptamères. Des aptamères peuvent être produits selon des méthodes connues de l'homme du métier. On peut ainsi se référer aux paragraphes précédents mentionnant de telles méthodes. Pour cette invention, des aptamères neutralisants de EphA2 sont sélectionnés. 20 Selon un autre exemple, l'antagoniste de EphA2 est un ligand naturel de EphA2 ayant été modifié de manière à empêcher la fixation d'un ligand naturel de EphA2. Un ligand naturel de EphA2 est ainsi l'éphrine Al. D'autres ligands naturels sont, avec des affinités plus faibles, les membres de la famille des éphrines A. L'homme du métier sait comment modifier 25 des ligands naturels du récepteur de manière à produire des molécules antagonistes. Par exemple, il est possible d'utiliser un ligand naturel ou un fragment de ligand naturel, de préférence l'éphrin Al, couplé à la partie Fc d'un anticorps (aussi appelé éphrine Al-Fc) (55). Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit inhibiteur selon 30 l'invention est un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2 (i.e. du gène du récepteur EphA2). De petits ARN interférents (siRNA pour « Small inhibitory RNA") peuvent être utilisés selon l'invention comme inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur EphA2. 3025717 13 L'expression du gène du récepteur EphA2 peut être réduite en mettant en contact un sujet ou une cellule avec des petits fragments d'ARN à double brin (dsRNA), ou un vecteur ou une construction génétique induisant la production de petits fragments d'ARN à double brin, de telle façon que l'expression du gène du récepteur EphA2 soit spécifiquement inhibée (i.e. 5 interférence par ARN ou RNAi). Des méthodes pour sélectionner un dsRNA ou un vecteur codant pour dsRNA sont connues dans l'état de la technique. On peut se référer aux paragraphes précédents évoquant de telles méthodes. On peut également se référer à la publication Haifa Shen et al. (25). 10 Des ribozymes peuvent également être utilisés selon l'invention comme inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur EphA2. Les oligonucléotides anti-sens siRNA et les ribozymes pouvant être utilisés en tant qu'inhibiteurs de l'expression du gène du récepteur EphA2 peuvent être préparés et 15 sélectionnés selon des méthodes connues. On peut se référer aux paragraphes précédents qui mentionnent de telles méthodes, également applicables ici. Il est enfin possible d'utiliser comme inhibiteur de EphA2 une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. Par « molécule adaptatrice de 20 signalisation », on entend des molécules qui interagissent avec les récepteurs par des domaines d'interaction pour enclencher la signalisation intracellulaire. Des molécules adaptatrices de signalisation du récepteur EphA2 sont par exemple Shc, Fakl, ephexin 4. Par exemple, ces inhibiteurs peuvent être de nature peptidique, généralement obtenus par la synthèse de tout ou partie d'une molécule de signalisation qui aurait un effet dominant négatif 25 sur la liaison des adaptateurs cellulaires. Ces molécules peuvent aussi être des mimétiques organiques, i.e. analogues non peptidiques, dont la conformation permet de reconnaitre la séquence du récepteur EphA2 pour s'y fixer et empêcher la fixation par compétition du partenaire de la signalisation. Ces inhibiteurs peuvent aussi par leur liaison empêcher l'activation du récepteur EphA2 en inhibant les changements de conformation nécessaires à 30 l'activation de EphA2 (par exemple par antagoniste allostérique ALW-II-41-27 (26)). La synthèse et l'utilisation de tels peptides analogues et de leurs mimétiques organiques pour inhiber les signalisations intracellulaires sont connues par l'homme de métier (voir par exemple EP2060265 B1). 3025717 14 Il est généralement connu que, dans les cellules normales épithéliales du sein, EphA2 est exprimée à la surface cellulaire et se lie à son ligand, ephrin-A 1. L'interaction ligand/récepteur contribue à l'homéostasie tissulaire. La surexpression de EphA2 avait précédemment été reportée comme jouant un rôle déterminant dans les capacités invasives et 5 oncogéniques des cellules cancéreuses de sein (27). Le récepteur EphA2 a été associé avec un phénotype de type basal et un comportement agressif dans les cellules tumorales (27,28). Or, il a ici été mis en évidence par les inventeurs que le proNGF, en se fixant sur la sortiline, recrute TrkA mais également que TrkA s'associe directement avec EphA2. Le 10 proNGF provoque donc l'association directe du complexe sortiline/TrkA et de EphA2. Comme mentionné précédemment, les inventeurs ont découvert que le complexe associant la sortiline, TrkA et EphA2 formé induit des voies de signalisation indépendantes de la phosphorylation de TrkA, comme par exemple l'activation de la protéine Src, intervenant elle aussi dans l'invasion des cellules cancéreuses. 15 Contrairement à ce qui était précédemment imaginé, les inventeurs ont ainsi mis en évidence que Src n'est pas induite par la phosphorylation de TrkA mais par une signalisation indépendante de cette phosphorylation, nécessitant le recrutement de EphA2 sur le complexe sortiline/TrkA. L'inhibition de TrkA seul ne permettait donc pas d'inhiber efficacement cette 20 protéine Src. Src est d'ailleurs une oncoprotéine dont l'activation dans les cellules cancéreuses est souvent associée à une résistance aux thérapies. L'inhibition de l'activité tyrosine kinase d'EphA2 permet donc, par exemple, d'inhiber l'activation de la protéine Src, ainsi que toutes les signalisations pro-tumorales induites par 25 EphA2 comme par exemple les signalisations dépendantes de Ras et des MAP-kinases (29), de Vav2-RhoA (30), Stat 5 (31). Ainsi, un traitement basé sur l'utilisation d'un inhibiteur de TrkA et d'un inhibiteur de EphA2 permet d'agir, de manière synergique et efficace, contre le cancer en surmontant les 30 phénomènes de résistance qui se mettaient en place avec un traitement basé sur un inhibiteur de TrkA seul, par exemple un traitement à base de lestaurtinib. Par ailleurs, les récepteurs à activité tyrosine kinase sont ici activés sous l'effet du proNGF, c'est-à-dire un ligand des récepteurs à activité tyrosine kinase n'ayant pas subi de 3025717 15 maturation. Il a en effet été mis en évidence par les inventeurs que ces voies de signalisation sont spécifiquement activées par le proNGF, le NGF activant lui les protéines Akt et Src de manière dépendante à la phosphorylation de TrkA, sans nécessiter la sortiline ou EphA2. Le proNGF n'agit donc pas de manière similaire au NGF, et induit l'invasion des cellules 5 cancéreuses d'une manière bien spécifique. On entend par « traitement de cancer » tout traitement capable, par exemple, de supprimer une tumeur ou des métastases, réduire le risque de récidive, ralentir le développement d'une tumeur ou des métastases, et/ou traiter les symptômes de la maladie. 10 Les cancers visés par la présente invention sont notamment ceux dans lesquels sont exprimés les récepteurs TrkA et EphA2, et de préférence en outre l'association des récepteurs TrkA et EphA2. 15 La détection des cancers visés par la présente invention peut se faire selon des techniques connues de l'homme du métier. Typiquement, les récepteurs TrkA et EphA2 sont détectés. De préférence, l'association de complexes protéiques, notamment l'association des récepteurs TrkA et EphA2, et éventuellement des récepteurs TrkA et EphA2 et de la sortiline, est également détectée. Par la suite, on appelle « récepteur à détecter » le récepteur TrkA et/ou 20 EphA2. Par exemple, mais de manière non limitative, les récepteurs TrkA et EphA2 peuvent être détectés dans un échantillon biologique par détection des ARNm de TrkA/EphA2, par détection directe des protéines TrkA/EphA2 ou par mise en évidence de l'activation de 25 TrkA/EphA2. Un échantillon biologique utilisé pour la détection directe de TrkA / EphA2 peut être un fluide biologique ou un tissu provenant de la biopsie d'une tumeur ou des métastases du patient. 30 A titre de fluide biologique utilisable selon la présente invention, on peut citer le sang, la moelle osseuse, le lait, le liquide céphalo-rachidien, les urines et les épanchements. 3025717 16 Le fluide biologique peut nécessiter un traitement particulier, notamment si ce sont des cellules tumorales circulantes qui expriment le récepteur à détecter. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le fluide biologique peut être préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes ou des fragments de cellules circulantes (exosomes ou 5 microvésicules) contenues dans ledit fluide biologique. Par « isoler les cellules tumorales circulantes », on entend obtenir une fraction cellulaire enrichie en cellules tumorales circulantes. Le traitement du fluide pour isoler les cellules tumorales circulantes peut par exemple être effectué par tri cellulaire dans un cytomètre de flux, par enrichissement sur Ficoll, par enrichissement par billes magnétiques recouvertes d'anticorps spécifiques, ou par 10 toute autre méthode d'enrichissement spécifique connue de l'homme du métier. Les fragments de cellules circulantes peuvent être préparés à partir de méthodes préparatives comme l'ultracentrifugation ou toutes autres méthodes chromatographiques, de cytométrie en flux permettant de les isoler ou de les enrichir connues par l'homme de métier. 15 Dans le cas où l'échantillon biologique est du sang ou de la moelle osseuse, les cellules tumorales circulantes peuvent être isolées grâce à une technique de séparation cellulaire sur Ficoll associée à une déplétion des cellules sanguines utilisant des anticorps anti- CD45 couplés à des billes magnétiques (Dynal Biotech ASA, Norvège). La détection directe du récepteur peut alors être effectuée directement à partir de cellules tumorales 20 circulantes isolées du fluide biologique par tout moyen bien connu de l'homme du métier, par exemple par marquage immunocytochimique de ces cellules avec un anticorps ou par cytométrie de flux. Lorsque l'échantillon biologique est du tissu, provenant typiquement de la biopsie de 25 la tumeur ou des métastases du patient, la détection directe du récepteur peut être effectuée directement sur les coupes obtenues, sans traitement préalable dudit tissu. La détection directe du récepteur visé peut être mise en oeuvre par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par spectrométrie de masse ou par tests immunologiques. 30 Le test immunologique peut être tout test largement connu de l'homme du métier impliquant des réactions immunologiques, à savoir des réactions entre un récepteur et un partenaire de liaison spécifique du récepteur. 3025717 17 La spectrométrie de masse peut être utilisée pour la détection directe de TrkA dans l'échantillon biologique. Le principe et la mise en oeuvre de la spectrométrie de masse sont largement connus de l'homme du métier. 5 Par exemple, l'échantillon biologique, éventuellement traité au préalable (par exemple par passage sur un support d'immunocapture, comportant un des partenaires de liaison du récepteur, par exemple un anticorps), est passé dans un spectromètre de masse et le spectre obtenu est comparé avec celui du récepteur à détecter (par exemple, TrkA ou EphA2). La détection peut également se faire par marquage des protéines membranaires (par exemple à la 10 biotine) pour une capture par affinité streptavidine/biotine. Des tests immunologiques sont également bien connus de l'homme du métier et incluent des réactions immunologiques, à savoir des réactions entre le récepteur à détecter et un partenaire de liaison spécifique du récepteur à détecter. 15 Les partenaires de liaison spécifiques du récepteur à détecter sont tout partenaire susceptible de se lier au récepteur. A titre d'exemple, on peut citer les anticorps, les fractions d'anticorps, les récepteurs et toute autre protéine capable de se lier au récepteur à détecter. Les anticorps partenaires de liaison sont typiquement soit des anticorps polyclonaux, soit des 20 anticorps monoclonaux. Des techniques d'obtention de tels anticorps sont bien connues de l'homme du métier. Par ailleurs, des exemples d'anticorps anti-TrkA sont connus et sont disponibles notamment dans le catalogue de Cell signaling ou de Alomone. Des exemples d'anticorps anti-EphA2 sont également connus et disponibles notamment dans le catalogue de Cell Signaling ou Santa Cruz. 25 Un marquage des partenaires de liaison spécifiques du récepteur à détecter pourra être effectué pour la révélation de la liaison récepteur/partenaire de liaison. Par « marquage des partenaires de liaison », on entend la fixation d'un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs consiste en 30 des enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la a-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, des chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants ; des molécules fluorescentes telles que l'alexa ou les phycocyanines ; 3025717 18 des molécules radioactives contenant des isotopes radioactifs des éléments comme le P, le S ou le I etc. Des systèmes indirects de marquage peuvent également être utilisés, comme par 5 exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Des couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, par exemple biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. L'anti-ligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits précédemment ou peut être lui-même détectable par un ligand/anti-ligand. 10 A titre d'exemple de tests immunologiques tels que définis ci-dessus, on peut citer les méthodes « sandwich » telles qu'ELISA, IRMA et RIA, les méthodes dites de compétition et les méthodes d'immunodétection directe comme l'immunohistochimie, l'immunocytochimie, le Western-blot, le Dot-blot. 15 Un autre mode de détection de la présence du récepteur à détecter consiste en la culture, en présence de l'échantillon biologique, de cellules sensibles au récepteur à détecter, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention. 20 Un autre mode de réalisation particulier de détection de la présence du récepteur à détecter dans les échantillons biologiques consiste en la détection de l'ARNm dudit récepteur à détecter dans ledit échantillon. La détection d'ARNm, de préférence à partir de cellules circulantes ou de fragments de 25 cellules circulantes dans un fluide biologique comme défini précédemment, est largement connue de l'homme du métier. Elle peut par exemple être mise en oeuvre par des réactions d'hybridation entre l'ARNm cible et un acide nucléique capable de liaison avec l'ARNm cible. On entend par acide nucléique les oligonucléotides, les acides désoxyribonucléiques et les acides ribonucléiques, ainsi que leurs dérivés. Le terme « oligonucléotide » désigne un 30 enchaînement d'au moins 2 nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou les deux), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par « nucléotide modifié », on entend par exemple un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau 3025717 19 du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthy1-5- désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5- désoxyuridine. De manière uniquement illustrative, une liaison internucléotidique modifiée peut être les liaisons phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate et 5 alkylphosphodiester. Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A-2 607 507, les LNA tels que phosphorothioate-LNA and 2'-thio-LNA décrits dans Bioorganic & Médicinal Chemistry Letters (32), et les PNA (33), sont des exemples d'oligonucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié. La révélation des réactions d'hybridation peut être effectuée par marquage des acides nucléiques de liaison, comme 10 illustré précédemment. Avant hybridation avec l'acide nucléique de liaison, l'ARNm cible peut être extrait par des méthodes connues de l'homme du métier, puis éventuellement amplifié, comme par exemple par RT-PCR ou par NASBA (34). 15 La détection de l'association de complexes protéiques peut également être effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par des tests immunologiques. Typiquement, la méthode de proximity ligation assays (PLA) ou Duolink peut être utilisée. La détection des complexes protéiques pourra également mettre en oeuvre des réactifs bivalents. 20 D'une manière avantageuse, un cancer visé par la présente invention, exprimant typiquement les récepteurs EphA2 et TrkA, est choisi parmi le cancer du sein (35, 36), le cancer de la prostate (37,38), le cancer du colon (36,37), le cancer de la langue (36,39), le cancer de la sphère oro-pharyngée (39,39), le cancer de la thyroide (40,41), le cancer du 25 pancréas (36,42), le neuroblastome (36,43), le gliome (44), le cancer de la peau (mélanome) (36,45), la leucémie aigue myéloïde (46,47). De manière préférentielle, un cancer visé par la présente invention est le cancer du sein, de la prostate ou de la sphère oro-pharyngée (tumeurs de la langue, de la cavité buccale, du pharynx et du larynx). De préférence encore, un cancer visé par la présente invention est le cancer du sein. 30 Un objet de l'invention se rapporte à une méthode de traitement d'un cancer chez un patient traité par un inhibiteur TrkA tel que précédemment décrit, comprenant une étape d'administration audit patient d'une quantité thérapeutiquement active d'un inhibiteur d' EphA2 tel que précédemment décrit. 3025717 20 Un objet de l'invention concerne également une méthode de traitement d'un cancer chez un patient traité par un inhibiteur de EphA2 tel que précédemment décrit, comprenant une étape d'administration audit patient d'une quantité thérapeutiquement active d'un 5 inhibiteur de TrkA tel que précédemment décrit. Le terme « patient » est entendu comme un humain affecté, ou amené à être affecté, par un cancer visé par la présente invention, tel que précédemment défini. 10 Le terme « quantité thérapeutiquement active » d'un inhibiteur selon l'invention signifie une quantité d'inhibiteur suffisante pour traiter un tel cancer, ayant un rapport bénéfice/risque acceptable pour un traitement médicamenteux. La quantité d'inhibiteur(s) et de compositions selon la présente invention ainsi que la fréquence d'administration pourront être déterminées par des études cliniques, par le médecin ou par le pharmacien. La quantité 15 "thérapeutiquement active" spécifique à chacun des patients pourra dépendre d'un certain nombre de facteurs comme la nature et la sévérité du désordre à traiter, l'inhibiteur utilisé, la composition utilisée, l'âge, le poids, l'état de santé général, le sexe et le régime du patient, le mode d'administration, la durée du traitement (en monodose ou en plusieurs doses), les médicaments utilisés en combinaison et d'autres facteurs bien connus des spécialistes 20 médicaux. Typiquement, l'inhibiteur de TrkA selon l'invention et l'inhibiteur de EphA2 selon l'invention peuvent être administrés de manière simultanée ou séquentielle. 25 De manière avantageuse, l'inhibiteur de TrkA selon l'invention et l'inhibiteur de EphA2 selon l'invention peuvent être combinés dans une composition pharmaceutique ou peuvent être séparés, par exemple sous forme de produit de combinaison (kit). Un objet de l'invention se rapporte ainsi à une composition pharmaceutique 30 comprenant un inhibiteur de TrkA tel que précédemment décrit, un inhibiteur de EphA2 tel que précédemment décrit et au moins un support pharmaceutiquement acceptable. Un mode de réalisation particulier se rapporte à une telle composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement de cancer. 3025717 21 Dans la composition pharmaceutique selon l'invention, l'inhibiteur de TrkA et l'inhibiteur de EphA2, en quantités thérapeutiquement actives, sont combinés avec un ou plusieurs supports pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à 5 libération prolongée, comme des polymères biodégradables, afin de former des compositions thérapeutiques. On entend par « pharmaceutique » ou « pharmaceutiquement acceptable » toute entité moléculaire et composition qui ne produisent pas de réaction allergique, négative ou toute 10 autre réaction désirée lors de l'administration à un mammifère, notamment un humain. Un support ou excipient pharmaceutiquement acceptable se réfère ainsi à un solide, semi-solide, diluant, matériel encapsulant, ou autre quelconque formulation non toxique. Par exemple, des solutions salines tamponnées au phosphate et stériles sont pharmaceutiquement acceptables. Les supports pharmaceutiquement acceptables peuvent habituellement comprendre un ou 15 plusieurs composés, par exemple choisis parmi des excipients, conservateurs, solubilisants, agents tampon, albumine etc. Des excipients connus sont par exemple de l'amidon, gélatine, acide stéarique, stéarate de calcium ou de magnésium etc. La forme de la composition pharmaceutique, le mode d'administration, le dosage et la 20 posologie peuvent dépendre, entre autres, du cancer à traiter, de ses symptômes, de sa sévérité, de l'âge, du poids et/ou du sexe du patient. De façon non limitative, la composition pharmaceutique selon l'invention peut être formulée de façon à pouvoir être administrée par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, 25 intramusculaire, intratumorale, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra-auriculaire, les inhibiteurs selon l'invention pouvant être administrés, de manière individuelle ou en combinaison, sous forme unitaire d'administration. 30 Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales injectables, des timbres transdermiques (« patch »), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire, intratumorale ou intraveineuse, des 3025717 22 formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres. Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes habituelles des domaines 5 considérés. Un autre objet de l'invention se rapporte à un produit de combinaison comprenant : - un inhibiteur de TrkA tel que précédemment décrit, et - un inhibiteur de EphA2 tel que précédemment décrit. 10 Un mode de réalisation particulier se rapporte à un tel produit de combinaison pour son utilisation dans le traitement de cancer. Un tel produit de combinaison ou kit permet l'administration des inhibiteurs de TrkA 15 et de EphA2 conformes à l'invention de manière simultanée, i.e. au même moment, ou séparée dans le temps, i.e. successivement. FIGURES 20 Figure 1 : Etude des effets pro-invasifs du NGF et proNGF sur des cellules épithéliales cancéreuses. Les tests d'invasion ont été réalisés sur des cellules cancéreuses de la langue (CAL 27, CAL 33), du larynx (SQ20B), du pharynx (FaDu), de prostate (DU145, PC3) et de sein (MDA-MB-231), ensemencées en chambre de Boyden et traitées avec du NGF (16nM) ou du proNGF N.0 (0.5 nM) pendant 20h. Les cellules non traitées représentent 25 le contrôle et déterminent une invasion basale de 100 %. Figure 2 : Etude de l'expression des récepteurs dans des cellules épithéliales cancéreuses. Les niveaux d'expression protéique des récepteurs EphA2, sortiline, p75NTR, et TrkA ont été mesurés par western blot sur des cellules sensibles au proNGF (cellules CAL 33, 30 DU145, PC3, et MDA-MB-231). 50 p.g de protéines totales sont chargés. Figure 3 : Etude de l'implication d'EphA2 sur les effets pro-invasifs du proNGF. Le test d'invasion est réalisé sur des cellules MDA-MB-231 (A), DU145 (B) et PC3 (C) transfectées avec un siRNA dirigé contre EphA2 (siEphA2), TrkA (siTrkA) ou un siRNA 3025717 23 aléatoire (siCRTL). Les cellules transfectées-siCTRL non traitées servent de contrôle et déterminent une invasion basale de 100% (barre blanche). Pour les statistiques, les barres d'erreurs représentent l'écart type. * p Leu) (répertoriée dans Swiss Prot) avec une étiquette HA (Hemagglutinine : Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala) en position N terminale. 15 Test d'invalidation séquentielle Les séquences de siRNA utilisées contre EphA2 (siEphA2) à 100 pmol pour chaque transfection, et contre TrkA (pool de 3 siTrkA 1, 2 et 3) sont présentées dans le tableau 1. Les transfections des siRNA ont été réalisées au moyen de INTERFERinTm selon les instructions du fabricant (POL409-10, Polyplus transfection, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France). 20 Tableau 1 ARN interférent Séquence siEphA2 GCAAGGAAGUGGUACUGCUGGACUU (SEQ ID NO :1) siTrkAl GAACCUGACUGAGCUCUAC (SEQ ID NO :2) siTrkA2 UGGAGUCUCUCUCCUGGAA (SEQ ID NO :3) siTrkA3 GCUGCAGUGUCAUGGGCAA (SEQ ID NO :4) Western Blot Après traitement, les cellules ont été lysées (tampon de lyse : 40 mM HEPES pH 7,5 ; 25 1 mM EDTA pH 8,0 ; 120 mM NaC1 ; 10 mM NaPPi ; 50 mM NaF ; 1,5 mM Na3VO4 ; 1% Triton X 100 ; 0,1% SDS ; 1 mM PMSF ; 10% glycérol et 1/100ème de cocktail d'inhibiteurs de protéases (Sigma) (20 min ; 4°C)). Les lysats sont récupérés et clarifiés par centrifugation (12 000 g ; 10 min ; 4°C). Le surnageant est alors stocké à -80°C jusqu'à son utilisation. Les extraits protéiques sont dilués à 2 idgeL-1 dans un tampon Laemmli 1X (7 min ; 100°C) puis 3025717 27 déposés et séparés sur SDS-PAGE (gel de concentration 3,6% d'acrylamide et gel de séparation 7,5% à 10% d'acrylamide (épaisseur 1 mm) ; 180 V ; 10 min puis 200 V constants ; jusqu'à la sortie du front de migration). Les protéines séparées en SDS-PAGE sont transférées selon la méthode de transfert semi sec (tampon : 48 mM Tris base, 39 mM 5 glycine, 1,64 mM SDS, 20% méthanol (v/v) ; 14 V ; 15 min par gel) ou liquide (tampon : 25 mM Tris base et 192 mM glycine ; 15% méthanol (v/v) ; 100 V ; 30 min) sur membranes de nitrocellulose (0,45 !lm; Whatman; Allemagne) ou PVDF (0,45 !dm ; Immobilon P ; Millipore ; France). La membrane de PVDF est «activée» au préalable (méthanol ; 10 min ; 20°C). Les membranes sont ensuite saturées (TBS-T ; 5% SAB ; 1 h ; 20°C) puis incubées (16 h ; 4°C) 10 avec l'anticorps primaire choisi. Les membranes sont enfin lavées (TBS-T), incubées (1 h ; 20°C) avec un anticorps secondaire (dilué au 1/5 000ème (anti-lapin) ou au 1/10 000ème (anti-souris) dans 5% Sérum albumine bovine) couplé à la HRP (Horse Radish Peroxydase), puis révélées avec le kit Super Signal® West Pico (Pierce). Les membranes sont placées dans un analyseur d'image (LAS 4000 ; Fuji), relié à un ordinateur qui permet la génération 15 d'image (logiciel Image reader LAS 4000). L'anticorps dirigé contre EphA2 est le sc-924 (Santa Cruz), l'anticorps dirigé contre la sortiline est le BD Bioscience 612101, l'anticorps dirigé contre TrkA est sc 14024 (Santa Cruz), l'anticorps dirigé contre HA est MMS-101R (Covance), l'anticorps dirigé contre Akt est Cell signaling 4691, l'anticorps dirigé contre phospho-Akt (Ser 473) est Cell signaling 20 9271, l'anticorps dirigé contre Src est Cell signaling 2109 (WB), l'anticorps dirigé contr'e PhosphoSrc (Tyr416) est Cell signaling 2105, l'anticorps dirigé contre l'actine est Sigma A2066.. Immunoprécipitation 25 Les billes (Protéine G-agarose, Millipore) ont été lavées deux fois (12 000 g ; 1 min ; 4°C) et reprises dans du PBS 1X (à 50% (v/v)). Les échantillons protéiques (1 mg) ont été pré-clarifiés (1 h ; 4°C ; sur roue (10 rpm)) avec 100 pl de billes et 5 1..tg d'anticorps isotypique (IgG2b de souris), centrifugés (12 000 g ; 2 min ; 4°C), puis le surnageant a été incubé (2 h ; 4°C ; sur roue (10 rpm)) avec 51..tg d'anticorps ct-HA 12CA5 (Roche). Les billes 30 (100 µL à 50% dans PBS 1X) ont été ajoutées directement aux complexes anticorps/protéines puis incubées (2 h ; 4°C ; sur roue (10 rpm)). Les complexes anticorps/antigènes/billes ont ensuite été centrifugés (12 000 g ; 5 min ; 4°C), lavés trois fois (tampon de lyse ; 4°C), puis dissociés par addition de tampon Laemmli 2X (25 mM Tris-HC1, 0,8% SDS, 4% glycérol, 1% 3-mercaptoéthanol, pH 6,8) (7 min ; 100°C). Enfin, après centrifugation (12 000 g ; 10 min ; 3025717 28 4°C), le surnageant a été conservé à -20°C. L'anticorps dirigé contre EphA2 est le sc-924 (Santa Cruz), l'anticorps dirigé contre la sortiline est le BD Bioscience 612101, l'anticorps dirigé contre HA est Roche 11 666 606 001. 5 PLA In situ (Proximity Ligation Assay) dans les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA, MDA-MB-231, DU145, PC3 Les cellules (20 000 cellules par puits) ont été ensemencées dans des Labtek® qui ont été traitées préalablement à l'alcool/acide chlorhydrique (éthanol absolu + 2% d'HC1). Les cellules ont ensuite été sevrées (0,1% SVF ; 1 h ; 37°C) puis traitées ou non avec du proNGF 10 N.C. (0,5 nM) ou du NGF (16 nM) pendant 5 min. Après une étape de fixation (Paraformaldéhyde (PFA) 4% dans PBS 1X (Phosphate Buffered Saline : 2,7 mM KC1, 8 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaC1, pH 7,4 ; 30 min ; 20°C), les cellules ont été incubées avec une solution de blocage (TBS-T : 20 mM Tris base, 137 mM NaC1, 0,1% de Tween 20, pH 7,6, 4% de Sérum Albumine Bovine (SAB) ; 1 h; 20°C puis avec les anticorps 15 primaires anti-HA, anti-sortiline et anti-EphA2 dilués au 1/50ème (anti-sortiline et anti-HA) ou au 1/100ème (anti-EphA2) dans la solution de blocage. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois au PBS 1X pendant 5 min puis incubées pendant 2 h à 37°C avec les sondes PLA oligo marquées anti-souris ou anti-lapin « plus » et anti-lapin ou anti-chèvre « moins » (Olink Bioscience) diluées au 1/Sème dans une solution de 4% SAB. Le choix des sondes PLA 20 dépend des anticorps primaires utilisés. Après deux lavages de 5 min au TBS-T, le signal est détecté par le kit de détection 613 Duolink (Olink Bioscience) selon les instructions du fournisseur. Afin de visualiser les noyaux, les cellules ont également été incubées avec du Hoechst 33 258 (1 mM dans PBS 1X) puis les échantillons ont été montés sur lame avec le milieu de montage pour fluorescence (Dako). Les images du PLA (points fluorescents rouges) 25 sont obtenues grâce à un microscope à fluorescence (objectif à immersion 100X, Xexcitation : 562 nm, émission : 624 nm, microscope Eclipse Ti ; Nikon, France) puis analysées avec le logiciel NIS-Elements BR de Nikon. Un point fluorescent rouge reflète une interaction entre les deux protéines (distantes de moins de 40 nm ; méthode quantitative). L'anticorps dirigé contre EphA2 est le AF-3035 (R&D Systems), l'anticorps dirigé 30 contre la sortiline est le AF 3154 (R&D Systems), l'anticorps dirigé contre TrkA est Alomone labs ANT-018. Test d'invasion In vitro 3025717 29 Les chambres de Boyden (Transwell® ; BD Biosciences ; France) ont été recouvertes d'une matrice biologique (collagène de type I de rat dilué à 400 1..tg.mL-1 dans du milieu EMEM-0,1% SVF ; Millipore). Les cellules ont ensuite été ensemencées à raison de 100 000 cellules/puits sur les membranes en PET (polyethylene terephtalate ; 0 : 10,5 mm ; porosité : 5 8 !lm) des chambres de Boyden et maintenues dans un milieu EMEM-0,1 % SVF. Les cellules ont été traitées avec du K252a (10 nM) dans la partie supérieure du Transwell®, avec ou non du NGF (16 nM) ou du proNGF N.C. (0,5 nM) dans la partie inférieure. Après 20 h de culture, elles sont lavées deux fois avec du PBS 1X et fixées (méthanol glacé ; 15 min ; 20°C). Les cellules non invasives (face supérieure du Transwell®) ont été éliminées par 10 raclage. Le nombre de cellules invasives a été estimé après coloration au Hoechst 33 258 (1 mM ; 30 min ; 20°C) en comptant leurs noyaux par microscopie à fluorescence sur un total de 5 champs choisis de manière aléatoire (objectif 10X ; excitation : 345 nm ; émission : 478 nm ; Eclipse Ti) grâce au logiciel ImageJ. Chaque expérience a été réalisée en triplicata. L'analyse statistique des résultats a été réalisée par analyse de variance ANOVA (post-test 15 Bonferroni). Coloration des gels au bleu de Coomassie colloïdal Après migration, les gels ont été fixés (16 h, 20°C) (25% d'éthanol (v/v) et 2% d'H3PO4 à 85% (v/v)), lavés trois fois (2% d'H3PO4 à 85% (v/v) ; 20 min, 20°C) et pré- 20 trempés dans une solution 2% d'H3PO4 à 85% (v/v), 1,1 M de (NH4)2SO4, 17% d'éthanol (30 min, 20°C). Ils ont ensuite été colorés dans la même solution supplémentée avec 0,05 g de bleu de Coomassie G250 (48 h, 20°C, sous agitation). Décoloration des gels et digestion trypsique 25 Les spots d'intérêt sont excisés, rincés avec de l'eau ultra-pure et décolorés par bains successifs d'une solution d' acétonitrile (ACN)/NH4HCO3 à 50 mM (50/50, v/v, 20°C, sous agitation). Après décoloration totale, les spots sont déshydratés (ACN 100%, 3x 10 min, 20°C) puis réhydratés (NH4HCO3 100 mM, 10 min, 20°C). Ils sont ensuite réduits (45 min, 56°C avec 10 mM DTT dans 100 mM NH4HCO3) et alkylés (30 min, 20°C, à l'obscurité 30 avec 55 mM iodoacétamide dans 100 mM NH4HCO3). Après séchage au Speed-Vac (30 min, 20°C), les spots sont réhydratés et incubés avec la trypsine (NH4HCO3 25 mM, 12,5 µg/m1 de trypsine (Promega ; Charbonnières les bains, France), 1 h, 4°C). Cette solution est ensuite renouvelée, sans trypsine et les tubes incubés (12 h, 37°C). Après récupération du surnageant, les morceaux de gel sont lavés successivement dans une solution d'ACN/acide formique 3025717 30 (45/10, v/v) (deux lavages) puis dans une solution d'ACN/acide formique (95/5, v/v). Les surnageants sont collectés, regroupés avec le précédent et l'ensemble évaporé au Speed-Vac. Analyse par spectrométrie de masse MS/MS 5 Les analyses nanoLC-nanoESl-MS/MS sont effectuées sur une trappe ionique (LCQ Deca XP+, Thermo Electron ; Brebières, France) équipée avec une source nano-électrospray couplée à une nano-chromatographie liquide haute pression (LC Packings Dionex ; Voisins le Bretonneux, France). Les digestats trypsiques sont repris dans 4 pl d'une solution à 0,1% d'acide formique et 1,4 pl sont injectés en utilisant un passeur d'échantillon Famos (LC 10 Packings Dionex). Les échantillons sont, dans un premier temps, dessalés puis concentrés sur une pré-colonne en phase inverse C18 (d'une longueur de 5 mm et d'un 0 interne de 0,3 mm, LC Packings Dionex) par un solvant A (H20/ACN, 95/5, v/v ; 0,1% d'acide formique), délivré par le système de pompage Switchos® (LC Packings Dionex) à un débit de 100/min pendant 3 min. Les peptides sont séparés sur une colonne C18 Pepmap (15 cm x 75 !lm de 0 15 interne, LC Packings Dionex). Un débit constant est appliqué (200 nL/min). Les peptides sont élués en 45 min en utilisant un gradient linéaire de 5 à 70% d'un solvant B (H20/ACN, 20/80, v/v ; 0,08% d'acide formique). Une tension de 1,5 kV est appliquée au niveau de l'aiguille nano-électrospray (0 externe : 360 pm, 0 interne : 20 pm, 0 interne de la pointe de l'aiguille : 10 pm, recouverte d'un alliage conducteur, New Objective, Wil, Suisse). Les 20 analyses sont effectuées en mode positif. L'acquisition des données est réalisée en mode automatique de séquençage peptidique qui consiste en une alternance d'un spectre MS entre ri-1/z 500 - 2000 et un spectre MS/MS de l'ion le plus intense du spectre MS précédent. Les spectres MS/MS sont acquis avec une fenêtre d'isolation de l'ion parent de 2 uma et avec une énergie de collision de 35%. Les fichiers MS/MS.raw sont transformés en fichiers .dta à l'aide 25 du logiciel Bioworks 3.1 (Thermo Electron). Les fichiers .dta sont ensuite compilés en utilisant le logiciel merge.bat téléchargeable via le logiciel Mascot Daemon version 2.1.6 (www.matrixscience.com) pour l'interrogation des banques de données sur SwissProt 51.4 (252616 séquences). Les paramètres de recherche sont les suivants : Homo sapiens (taxonomie), un site autorisé « missed cleavage » par la trypsine, carbamidométhylation, 30 oxydation des méthionines et phosphorylation des résidus Ser, Thr et Tyr (modifications variables), 2 Da (tolérance de masse des peptides) et 0,8 Da (tolérance de masse des MS/MS). Analyse de l'expression des gènes dans les échantillons tumoraux de sein. 3025717 31 Les expressions de la sortiline (SORTI), EphA2 et TrkA (NTRK1) ont été analysées sur des échantillons tumoraux et sains. L'analyse est effectuée sur la base du recueil de données de 35 cohortes publiées sur le site du National Center for Biotechnology Information (NCBI)/Genbank GEO database, de l'European Bioinformatics Institute (EBI) ArrayExpress 5 database et de l'institut Paoli Calmettes (Marseille). 6183 cas de cancer du sein non invasif sont ainsi analysés pour l'expression de NTRK1 et corrélés avec les données clinicopathologiques. Un traitement pré-analytique des données est ensuite appliqué. Pour les sets de données issus des puces à ADN Agilent, une normalisation par les quantiles a été appliquée afin d'obtenir les données processées. Concernant les données générées par les puces à ADN 10 Affimetrix, la méthode de normalisation RMA (Robust Multichip Average) (48) a été utilisée avec l'algorithme de calcul non-paramétrique des quantiles. Afin de rendre l'ensemble des données comparables et pour exclure tout biais provenant de l'hétérogénéité des populations, les niveaux d'expression de NTRK1 ont été standardisés à l'intérieur de chaque set de données en prenant pour référence la population luminale A, le sous-type moléculaire des 15 tumeurs étant défini par le PAM50 « Predictor » (49). Lorsque plusieurs sondes sont étudiées avec NTRK1, celle avec la variance la plus élevée dans un ensemble de données particulier a été sélectionnée. La sur-régulation de NTRK1 est définie par l'augmentation d'expression au-dessus du niveau médian. Les corrélations entre l'expression de NRTK1 et les variables histocliniques incluant l'âge des patients au moment du diagnostic ( 50), l'état 20 pathologique du ganglion lymphatique axillaire (pN : négatif vs positif), la taille de la tumeur (pT : pT1 vs pT2-3), le stade (I vs 2-3), immunocytochimie (IHC) du récepteur aux oestrogènes alpha (ER), du récepteur à la progestérone (PR), du statut du récepteur ERBB2 (positif vs negatif) pour chaque patients, et la durée de vie sans métastase (MFS) pour les patients ne présentant pas de métastase au moment du diagnostic, ont été recherchées. La 25 survie sans métastase est calculée de la date du diagnostic à la date de la première métastase découverte. Le suivi des patients est mesuré à la date de diagnostique à la date de la première récidive (follow-up). La survie est calculée par la méthode de Kaplan Meier et les courbes sont analyses par un test lok rank. Les distributions sont analysées par test de Fisher. La significativité est considérée avec un seuil de 5%. Toutes les analyses sont effectuées en 30 suivant les "REcommendations for tumor MARKer prognostic studies » (REMARK criteria) (50). Résultats 3025717 32 Tests d'invasion cellulaire Après 24h de traitement, on observe que le NGF et le proNGF augmentent l'invasion cellulaire des lignées cancéreuses CAL33, DU145, PC3 et MDA-MB-231. En revanche, les cellules tumorales FaDu et CAL27 ne répondent à aucun des facteurs de croissance, tandis 5 que l'invasion cellulaire de SQ20B est uniquement induite lors du traitement avec le NGF (figure 1). Des analyses par Western Blot ont donc ensuite été réalisées pour évaluer les niveaux d'EphA2, sortiline et TrkA dans les cellules répondant au proNGF (CAL33, DU145, PC3 et 10 MDA-MB-231) (figure 2). Ces trois récepteurs sont exprimés dans chacune des lignées cellulaires testées mais CAL33 n'exprime que très faiblement EphA2. L'implication d'EphA2 sur les effets pro-invasifs du proNGF a été évaluée en utilisant une chambre de Boyden sur les cellules surexprimant EphA2 (DU145, PC3 et MDA-MB- 15 231). Comme montré dans la figure 3, les siEphA2 abolissent l'invasion induite par le proNGF dans les cellules DU145, PC3 et MDA-MB-231. Ces résultats indiquent qu'EphA2 est impliqué dans l'invasion induite par le proNGF des cellules surexprimant EphA2. Analyse de l'expression des gènes dans les échantillons tumoraux de sein 20 De plus, une analyse rétrospective réalisée sur une cohorte de 588 patients en micro- arrays permet de corréler l'expression des récepteurs sortiline, TrkA et EphA2 à un mauvais pronostic dans le cancer du sein (Figure 4). En effet, l'expression des trois récepteurs induit une diminution significative de la survie sans métastase chez les patients. 25 Tests d'immunoprécipitation La formation d'un complexe entre TrkA, EphA2 et la sortiline a été analysée par immunoprécipitation dans les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA ainsi que des essais de PLA (Proximity Ligation Assay). 30 L'association des 3 récepteurs dans le complexe a tout d'abord été mise en évidence en spectrométrie de masse, les protéines immunoprécipitées par un anticorps dirigé contre HA-TrkA ont été identifiées (figure 5). L'analyse en spectrométrie de masse permet de manière irréfutable de démontrer la présence, dans le complexe formé par l'action du proNGF, de TrkA, de la sortiline et d'EphA2. 3025717 33 Les tests d'immunoprécipitation ont été effectués en utilisant des anticorps dirigés contre HA, contre la sortiline et contre EphA2 dans les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA (Figure 6). 5 En l'absence de proNGF, aucun complexe n'a été observé entre ces trois récepteurs. En revanche, avec le traitement au proNGF, la sortiline et EphA2 sont co-immunoprécipités avec TrkA. 10 En comparaison, en présence de NGF, la liaison sortiline/TrkA n'a été détectée qu'après 30 min de traitement mais la liaison avec EphA2 n'a pas été observée, ni après 5 min de traitement ni après 30 min. Ces résultats ont été confirmés par immunoprécipitation inverse de la sortiline et EphA2. Ainsi, le traitement NGF semble induire une association tardive de TrkA et sortiline mais n'induit pas de liaison avec EphA2. Ces données confirment les 15 résultats trouvés dans la littérature, en ce qu'en présence de NGF, la sortiline agit comme un récepteur d'endocytose dans des modèles de cellules neuronales. Tests de PLA (Proximity Ligation Assay) Les essais de PLA effectués sur les cellules MDA-MB-231 ont été réalisés pour 20 confirmer l'interaction entre la sortiline et HA-TrkA et entre HA-TrkA et EphA2 dans les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA (résultats non montrés). En l'absence de proNGF, aucun signal PLA n'a été visualisé ce qui suggère que ces récepteurs ne forment pas un complexe préexistant. 25 En revanche, sous traitement au proNGF, les tests PLA montrent une interaction entre la sortiline et TrkA et entre EphA2 et TrkA ce qui indique que TrkA interagit directement avec la sortiline et EphA2, et ce à une distance inférieure à 40nm (résultats non montrés). 30 Aucun signal de PLA n'a été détecté dans les essais entre la sortiline et EphA2, ce qui suggère que le proNGF n'induit pas d'interaction directe entre ces deux récepteurs (résultats non montrés). 3025717 34 De plus, les essais PLA dans les cellules MDA-MB-231, DU145, PC3 natives confirment que TrkA et EphA2 sont engagés dans un complexe sous traitement proNGF de la même façon que dans les cellules MDA-MB-231 HA-TrkA (résultats non montrés). 5 En comparaison au proNGF, le NGF n'induit aucun signal de PLA dans les cellules MDA-MB-231, révélant l'absence de complexe récepteur (résultats non montrés). Tests d'invalidation séquentielle L'impact d'une invalidation séquentielle de chacun des récepteurs dans la formation 10 de ce complexe a ensuite été analysé. L'expression de TrkA a été inhibée par des ARN interférents (siTrkA) (Figure 7A). TrkA et EphA2 sont normalement co-immunoprécipités avec la sortiline après 5 min de traitement proNGF. En revanche, les cellules traitées avec un ARN interférent anti-TrkA 15 (siTrkA) ne montrent pas d'association entre EphA2 et TrkA avec la sortiline, ce qui indique que la sortiline ne forme pas de complexe avec EphA2 en l'absence de TrkA. De manière intéressante, dans les cellules exprimant de manière stable les kinase-dead TrkA et dans lesquelles la phosphorylation de TrkA a été abolie (Figure 7B), proNGF 20 continue d'induire l'association TrkA avec la sortiline et EphA2. Ces résultats indiquent que la phosphorylation de TrkA n'est pas nécessaire pour la formation du complexe TrkA/sortiline/EphA2. L'implication de la sortiline dans le complexe sortiline/TrkA/EphA2 a ensuite été 25 évaluée par l'utilisation de la neurotensine qui inhibe par compétition, la liaison du proNGF à la sortiline (figure 7C). En présence de neurotensine, TrkA ne précipite ni la sortiline ni EphA2. Ainsi, la liaison proNGF/sortiline apparaît comme indispensable pour la formation du complexe 30 TrkA/sortiline/EphA2. Enfin, l'implication d'EphA2 dans l'association du complexe de récepteurs a été étudiée en utilisant un ARN interférant anti-EphA2 (figure 7D). 3025717 L'inhibition transitoire d'EphA2 abolit complètement l'expression de cette protéine et par conséquence aucune liaison entre EphA2 et TrkA n'a été observée. Néanmoins, en l'absence d'EphA2, le proNGF induit toujours l'association entre TrkA 5 et la sortiline. Par conséquent, TrkA s'associe à la sortiline après traitement au proNGF de manière indépendante d'EphA2. Ces résultats démontrent donc les points suivants : 1. TrkA, sortiline et EphA2 ne forment pas un complexe préexistant ; 10 2. Le complexe TrkA/EphA2 a besoin, comme prérequis, de l'association proNGF/sortiline ; 3. TrkA est nécessaire à la formation de ce complexe de récepteurs, indépendamment de son état de phosphorylation ; 4. L'inhibition d'EphA2 n'altère pas le complexe TrkA/sortiline. 15 Ces résultats suggèrent que le proNGF induit l'association entre la sortiline et TrkA, provoquant ensuite le recrutement d'EphA2 sur le complexe sortiline/TrkA. Exemple 2 - TrkA et EphA2 sont impliqués différemment dans l'activation des 20 protéines Akt et Src induites par le proNGF. Sauf indication contraire, les produits, réactifs et cultures cellulaires, sont les mêmes que ceux de l'exemple 1. 25 Les protéines Akt et Src sont impliquées toutes les deux dans l'effet pro-invasif de proNGF. Afin d'identifier le rôle de TrkA et d'EphA2 dans l'activation des protéines Akt et Src, les cellules MDA-MB-231 ont été traitées respectivement avec un inhibiteur de TrkA (K252a), un siRNA anti-EphA2 (siEphA2) dont la séquence est présentée dans le tableau 1, un inhibiteur de PI3-K (LY294002) (l'activation d'Akt est en effet sous-jacente à celle de la 30 PI3-K) et un inhibiteur de Src (SKI-1). Les transfections des siRNA ont été réalisées au moyen de INTERFERinTm selon les instructions du fabricant (POL409-10, Polyplus transfection, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France). 3025717 36 Résultats Comme démontré dans la figure 8A, le proNGF active à la fois Akt et Src. L'inhibition de la phosphorylation de TrkA par l'utilisation de K252a abolit l'activation d'Akt mais pas celle de Src. Des résultats similaires ont été obtenus par l'utilisation d'un mutant Kinase-dead de TrkA (figure 8B). Ceci indique que l'activation d'Akt, et non celle de Src, est dépendante de la phosphorylation de TrkA. L'inhibition de l'activation d'Akt avec LY294002 ne modifie pas la phosphorylation de Src. De façon similaire, l'inhibition de Src avec SKI-1 n'affecte pas la phosphorylation d'Akt. Par conséquent, l'activation d'Akt et Src par le proNGF sont deux voies de signalisation différentes. L'implication d'EphA2 dans l'activation d'Akt et Src a été déterminée par transfection transitoire des cellules avec un ARN interférent anti-EphA2 (figure 8C). L'inhibition d'EphA2 diminue la phosphorylation de Src induite par le proNGF mais pas celle de Akt. 20 Il a donc été démontré que la protéine Akt est activée par le proNGF via la phosphorylation de TrkA tandis que la protéine Src est activée par EphA2 indépendamment de la phosphorylation de TrkA Pour comparaison, les effets du NGF ont été déterminés (figures 8D, E et F). 25 Le NGF augmente les phosphorylations d'Akt et Src tandis que l'inhibiteur de TrkA, K252a, inhibe cette activation (figure 8D). Ce résultat a été confirmé par l'utilisation d'un mutant Kinase-Dead de TrkA (figure 8E). Les activations de Src et Akt par le NGF ne sont pas interconnectées comme pour le proNGF (figure 8D). Contrairement au proNGF, les effets 30 du NGF sur Src et Akt sont indépendants de EphA2 (figure 8F). L'inhibition d'EphA2 réduit uniquement l'activation basale de phospho-Akt et phospho-Src mais pas la phosphorylation induite par le NGF. En effet, le NGF est capable d'augmenter la phosphorylation d'Akt et Src même dans les cellules où l'expression d'EphA2 est inhibée. Ces résultats montrent que l'activation d'Akt et Src sont en aval de TrkA en présence de NGF. 5 10 15 3025717 37 Ces résultats montrent que l'activation de Src induite par le proNGF requiert à la fois TrkA et EphA2 mais qu'elle est indépendante de la phosphorylation de TrkA. En revanche, l'activation d'Akt induite par le proNGF est dépendante de la phosphorylation de TrkA mais 5 pas d'EphA2. Contrairement au proNGF, la signalisation du NGF requiert uniquement TrkA pour activer Akt et Src sans aucune implication d'EphA2. Exemple 3 - Le complexe TrkA/EphA2 est impliqué dans le développement et l'agressivité des tumeurs in vivo 10 Sauf indication contraire, les produits, réactifs et cultures cellulaires, sont les mêmes que ceux de l'exemple 1. Des essais de xénogreffes de lignées tumorales sur des souris immunodéficientes ont 15 été réalisés en utilisant des cellules MDA-MB-231. Xénogreffes des lignées tumorales en souris immunodéficientes. Les souris utilisées sont des femelles SCID de six semaines. Les cellules MDA-MB231 HA-TrkA (3x 106) sont injectées en sous cutanée dans le flanc des souris. Les souris sont 20 alors réparties aléatoirement dans les groupes expérimentaux (7 souris dans le groupe témoin et 6 dans les autres). 14 jours après inoculation des cellules, les animaux sont traités à trois reprises avec un intervalle de 3 jours entre chaque injection. Le CEP-701 (Calbiochem) est dissous dans un mélange (40% polyethylene glycol 1000, 10% povidone C30 et 2% alcool benzylique dans l'eau distillée) et injecté en intra péritonéal (10 mg/kg). Les siRNA EphA2 25 (7.5 microg/souris) sont injectés à proximité de la masse tumorale en utilisant du in vivo jetPEI® (Polyplus transfection) selon les recommandations du fabricant. Le volume tumoral est mesuré selon la formule suivante n/6 x longueur x largeur x (largeur+longueur)/2. Les analyses statistiques sont réalisées en utilisant le test de Mann and Whitney et le logiciel GraphPad Prism 5.01. 30 Résultats 3025717 38 Il avait antérieurement été démontré que le K252a (inhibiteur de TrkA) diminue la croissance des tumeurs xénogreffées avec des cellules MDA-MB-231 surexprimant TrkA (34). 5 Ici, une dose inférieure d'analogue de K252a (CEP-701 à 10mg/kg) a été utilisée afin de garantir une diminution modérée de la croissance tumorale. Comme montré sur les figures 9 A et B, le volume tumoral est légèrement mais significativement réduit par le traitement au CEP-701 comparé au contrôle. Le ciblage 10 d'EphA2 diminue également fortement la croissance des tumeurs xénogreffées. De manière particulièrement intéressante, le traitement combiné CEP-701/siEphA2 induit une diminution significative de la charge tumorale en comparaison de CEP-701 seul ou de siEphA2 seul. Ces résultats indiquent que TrkA et EphA2 coopèrent in vivo pour 15 augmenter la croissance tumorale. Exemple 4 - Un traitement combinant un inhibiteur de TrkA (lestaurtinib) et un inhibiteur de EphA2 (EphrinAl-Fc) diminue l'invasion des cellules cancéreuse de sein 20 Sauf indication contraire, les produits, réactifs et cultures cellulaires, sont les mêmes que ceux de l'exemple 1. Le test d'invasion est réalisé sur des cellules MDA-MB-231. Les cellules non stimulées de proNGF servent de contrôle et déterminent une invasion basale de 100% (barre 25 blanche à la figure 10). Pour les traitements, les concentrations suivantes sont appliquées : 0.5 nM proNGF N.C., 10 nM lestaurtinib, Ephrine A 1 -Fc (1 microg/ml), DMSO 1/10001ème vol/vol pour les conditions non stimulées (Non stim). Pour les statistiques, les barres d'erreurs représentent l'écart type. * p REVENDICATIONS1. Inhibiteur de EphA2 pour son utilisation dans le traitement de cancer traité par un inhibiteur de TrkA, dans lequel ledit inhibiteur de TrkA est un antagoniste de TrkA, un inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation et dans lequel ledit inhibiteur de EphA2 est un antagoniste de EphA2, un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de EphA2 ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. 2. Inhibiteur de TrkA pour son utilisation dans le traitement de cancer traité par un inhibiteur de EphA2, dans lequel ledit inhibiteur de TrkA est un antagoniste de TrkA, un inhibiteur de l'expression du récepteur TrkA, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de TrkA ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation et dans lequel ledit inhibiteur de EphA2 est un antagoniste de EphA2, un inhibiteur de l'expression du récepteur EphA2, un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase de EphA2 ou une molécule empêchant la fixation des molécules adaptatrices de signalisation. 3. Composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de TrkA, un inhibiteur de EphA2 et au moins un support pharmaceutiquement acceptable. 4. Composition pharmaceutique selon la revendication 3 pour son utilisation dans le traitement de cancer. 5. Produit de combinaison comprenant : - un inhibiteur de TrkA, et - un inhibiteur de EphA2. 6. Produit de combinaison selon la revendication 5 pour son utilisation dans le traitement de cancer. 7. Inhibiteur de EphA2 pour son utilisation selon la revendication 1, inhibiteur de TrkA pour son utilisation selon la revendication 2, composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 3 ou 4, ou produit de combinaison pour son utilisation selon 3025717 la revendication 5 ou 6, dans lequel ledit inhibiteur de TrkA une petite molécule organique, de préférence choisi entre K252a et CEP-701. 8. Inhibiteur de EphA2 pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 7, inhibiteur de TrkA pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 ou 7, composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 3, 4 ou 7, ou produit de combinaison pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel ledit cancer est choisi parmi le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer du colon, le cancer de la langue, le cancer de la sphère oro-pharyngée, le cancer de la thyroide, le cancer du pancréas, le neuroblastome, le gliome, le cancer de la peau (mélanome), la leucémie aigue myéloïde, de préférence le cancer du sein, de la prostate ou de la sphère oro-pharyngée, de préférence encore, le cancer du sein.