Brevet FR3029790A1 — publié le 20160617

Microbille d'hydrogel de chitosane La présente invention concerne des microbilles d'hydrogel, leur procédé de fabrication et leurs utilisations, en particulier dans des compositions pharmaceutiques ou des dispositifs médicaux, plus particulièrement pour le traitement d'une pathologie d'une articulation. Le chitosane est un polymère d'origine naturelle présentant un intérêt connu depuis de nombreuses années. Ce polysaccharide peut être obtenu à partir de sources animales comme à partir de carapace de crustacés, mais également à partir de sources fongiques à partir de parois cellulaires de champignons. Le chitosane est par exemple utilisé sous la forme de matrice pour encapsuler des principes actifs. Il sert alors en général de véhicule pharmaceutique. Ces véhicules peuvent se présenter sous forme solide, en particulier lorsqu'ils sont séchés ou lyophilisés. De nombreux brevets concernent cette technologie. En parallèle de cette technologie, se sont développées des particules à base de chitosane sous forme d'hydrogel, de différentes dimensions. Ces compositions présentent un taux particulièrement élevé d'eau les rendant très différentes des matrices précitées. En général l'eau représente plus de 85%, voire plus de 90% en masse de la composition. De telles particules d'hydrogels présentent une composition et des propriétés très différentes des matrices de chitosane évoquées ci-dessus. De telles particules d'hydrogel sont notamment utilisées en ingénierie tissulaire ou également comme vecteurs de composés actifs. Cependant tout hydrogel ne convient pas pour former des billes pouvant être facilement injectables dans le corps humain ou animal. Il est connu de par le brevet EP 2538987 B1 (US 20120321678) des billes d'hydrogel à base de chitosane et d'alginate, en particulier pour leurs utilisations en supplémentation intra-articulaire. Il s'agit dans ce brevet d'améliorer les effets d'un hydrogel en le combinant avec des billes d'hydrogel, utilisable au moins dans cette application spécifique. Il convient notamment que ces billes présentent une durée de vie après injection au niveau intra-articulaire élevée ainsi que des propriétés mécaniques intéressantes où l'injection est réalisée. De telles billes sont particulièrement intéressantes de par leurs propriétés, en particulier leurs propriétés élastiques, apportées lors de l'injection intra-articulaire. Les billes d'hydrogel selon ce brevet présentent toutefois des trabécules. Les trabécules sont des espèces fibrillaires ou filamenteuses présentes à l'intérieur de l'hydrogel. 3029790 2 La demande WO 2009/150651 décrit encore un hydrogel à base de la combinaison de deux solutions de chitosanes de caractéristiques différentes, au départ d'une solution acide portée progressivement à pH neutre. Le premier chitosane est hautement acétyle avec un degré d'acétylation compris entre 40% et 60%. Le second 5 chitosane est hautement déacétylé avec un degré d'acétylation d'au plus 20%. De tels hydrogels sont sensibles à la température ce qui leur permet de gélifier in situ, après injection dans le corps humain ou animal. La demande n'enseigne pas comment former des particules d'hydrogel. La présente invention a pour but de de fournir des particules d'hydrogel à base de 10 chitosane. La présente invention a encore pour but de de fournir des particules d'hydrogel à base de chitosane dont la concentration est plus élevée que certaines billes d'hydrogel antérieures, présentant environ 0,5% en masse de chitosane par rapport à la masse de l'hydrogel, tout en conservant de bonnes propriétés mécaniques en particulier pour des 15 applications en injection intra-articulaire. La présente invention encore pour but d'améliorer la stabilité des billes de chitosane. En particulier, la présente demande a pour but de fournir des billes d'hydrogel ne présentant pas de particules solides, comme des trabécules. 20 La présente invention a également pour but de fournir des billes d'hydrogel dont la composition comprenant du chitosane, éventuellement en mélange avec d'autres composés. Cette composition est avantageusement homogène. Il ressort de l'état de la technique que la préparation de telles billes d'hydrogel n'est pas aisée puisque le brevet EP 2538987 B1 décrit la formation de trabécules et la 25 demande WO 2007/13514 préconise l'utilisation d'un dérivé de chitosane pour surmonter le problème technique de la formation de particules solides. La présente invention a encore pour but de fournir des billes d'hydrogel dont le procédé de fabrication soit industrialisable, de préférence en limitant les coûts de fabrication et en assurant une bonne reproductibilité des particules ainsi fabriquées. 30 En particulier, la présente invention a pour but de simplifier le procédé de fabrication, notamment en diminuant la variabilité du procédé, variabilité que l'on retrouve en particulier lorsque plusieurs biopolymères sont utilisés comme des chitosanes de nature différente ou des mélanges de chitosane et d'alginate, et notamment encore en diminuant le nombre d'étapes du procédé et le nombre de matières premières à mettre en 35 oeuvre. 3029790 3 En particulier, la présente invention a pour but d'éviter la préparation d'une solution préliminaire contenant de l'alginate, tout en conservant le caractère 'hydrogel' des microbilles, c'est à dire la capacité à rester stable tout en retenant une grande quantité d'eau, et à rester déformables et élastiques à la compression. 5 Avantageusement, l'invention a pour but de fournir des microbilles présentant de bonnes propriétés, par exemple de bonnes propriétés mécaniques pour les applications envisagées, et plus spécifiquement pour des injections intra-articulaires, par exemple de bonnes propriétés élastiques et d'absorption des chocs, une bonne résistance à l'écrasement, et une bonne adhésion sur les tissus. 10 À cet égard, les billes d'hydrogel selon le procédé antérieur décrit dans le brevet EP 2538987 B1 ont un diamètre élevé. L'article d'Oprenyeszk et al. 2013, montre que de telles particules présentent un diamètre de 600 à 900 micromètres (lm). Les billes d'hydrogel ne sont donc pas convenables pour des injections intra-articulaires qui nécessitent des aiguilles fines de faible diamètre, notamment dans le cadre de maladies 15 articulaires traitée par viscosupplémentation intra-articulaire et de maladies articulaires chroniques. De telles maladies sont typiquement les pathologies du cartilage, qui entraînent des lésions et des défauts du cartilage et une douleur articulaire, comme l'arthrose, par exemple due soit au vieillissement soit à un accident. Pour assurer la facilité d'injection par le praticien, augmenter le confort du patient, limiter les risques 20 d'injection mal placée et éviter les risques d'infection, en particulier lors d'injections répétées, il convient d'utiliser des aiguilles fines. La présente invention a donc encore pour but de fournir une composition injectable par voie intra-articulaire qui facilite des injections répétées, notamment au travers d'aiguilles fines tel que par exemple des aiguilles de type 18 à 22 Gauge comme 25 recommandé pour la plupart des produits de viscosupplémentation actuellement commercialisé, en particulier au-dessus de 21 Gauge, ou éventuellement encore plus fines, par exemple de 23 Gauge. Il est donc désiré de mettre au point des microbilles dont les propriétés et la distribution de diamètre peuvent être ajustés pour pouvoir être facilement injectées au travers d'aiguilles fines, en particulier des microbilles dont le 30 diamètre moyen en nombre est inférieur à 900pm, de préférence inférieur à 800pm, de préférence inférieur à 700pm, et encore de préférence dont le D(0.9) est inférieur à 900pm, de préférence inférieur à 800pm, de préférence inférieur à 700pm. Il a été découvert que les problèmes techniques évoqués ci-dessus peuvent être résolus par la présente invention. En particulier, l'invention met en oeuvre un procédé de 35 fabrication spécifique des microbilles d'hydrogel à base de chitosane, lequel ne comprend pas la formation de trabécules solides dans les microbilles, évitant ainsi les inconvénients 3029790 4 mentionnés dans l'art antérieur, de manière surprenante. Il est apparent à la lecture de l'art antérieur discuté ci-dessus que la solution apportée par la présente invention n'était pas évidente pour l'homme du métier. Par ailleurs, les microbilles de l'invention permettent d'augmenter la proportion de 5 chitosane. A cette fin, le principe de la gélification de l'alginate par un ion calcium n'est pas le principe qui est mis en oeuvre. En effet, l'invention utilise le principe de la réticulation du chitosane par des ions polyphosphates pour obtenir une composition d'hydrogel de chitosane. Il est déjà connu de former des solutions de chitosane en présence de beta-glycerophosphate de sodium, par exemple des solutions de chitosane 10 et de beta-glycerophosphate ayant la propriété de gélifier lorsque la température augmente, par exemple à la température du corps humain. Il est également connu de stabiliser des microsphères solides et sèches de chitosane en le combinant avec du tripolyphosphate de sodium. Il est encore connu de former des complexes à base de chitosane et d'acide phytique (inositol hexakisphosphate) en solution, ou encore des 15 capsules de taille millimétriques composées de chitosane et d'acide phytique. Cependant l'art antérieur ne présume pas de la possibilité de former des microbilles de chitosane qui soient sous forme d'hydrogel et possédant des propriétés convenables pour leur passage au travers d'une aiguille de diamètre adapté pour réaliser des injections intra-articulaires, par exemple dans le but de traiter une pathologie d'une articulation, comme par exemple 20 une lésion du cartilage, en particulier chez un être humain. La présente invention permet encore d'augmenter la stabilité du chitosane en jouant sur la réticulation non covalente du chitosane, et non pas sur la gélification de l'alginate en présence d'un ion calcium, via la chélation de l'ion calcium par l'alginate. Il n'était notamment pas évident pour l'homme du métier que l'association du 25 chitosane avec un composé polyphosphate aurait permis d'obtenir des billes d'hydrogel aux bonnes propriétés, en particulier mécaniques, pour une injection intra-articulaire, par viscosupplémentation, et injectable au travers d'une aiguille fine. L'invention concerne plus spécifiquement une particule ou une bille d'hydrogel, et plus particulièrement une microbille d'hydrogel. 30 Ainsi, la présente invention concerne une microbille d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane, au moins un composé polyphosphate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 85% en masse d'hydrogel, ladite bille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 lm On entend en particulier par « billes » une particule de forme sensiblement 35 sphérique. Une telle forme peut être appréciée par microscope. Une telle bille peut 3029790 5 présenter des imperfections inhérentes au procédé de fabrication. On entend par « microbille » une bille présentant une taille inférieure à 1000 micromètres. Les billes selon l'invention présentent avantageusement un diamètre moyen en nombre compris entre 200 et 800 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 5 700 micromètres. Selon une variante, les billes selon l'invention présentent un diamètre moyen en nombre de préférence compris entre 100 et 500 micromètres, et de préférence entre 200 et 500 micromètres.La mesure du diamètre moyen en nombre des billes selon l'invention est réalisée de préférence par microscopie optique, selon la méthode suivante : 10 Le diamètre moyen en nombre, l'écart-type et le coefficient de variation d'une population de microbilles sont mesurées à l'aide d'un microscope optique inversé, par exemple de la marque OLYMPUS, modèle CKX41 et muni d'une caméra et d'un objectif 20X. Une fraction de la population de microbilles est placée dans une cupule d'observation elle-même placée sous l'objectif. Une photo numérique est prise après 15 ajustement de l'image. Le programme « LABSENSE » de la marque OLYMPUS et accompagnant le microscope permet un traçage de lignes droites calibrées selon l'objectif utilisé. Un minimum de 20 billes est sélectionné sur l'image et une diagonale est tracée par le programme sur chacune d'elle. Le programme permet une visualisation directe de la mesure. Ces mesures sont reportées sur un tableur, par exemple EXCEL de la marque 20 MICROSOFT et les variables suivantes sont calculées. La moyenne est calculée à l'aide de la formule : s = - L'écart-type est calculé à l'aide de la formule : Le coefficient de variation C, est calculé à l'aide de la formule (écart-type divisé par la moyenne) : 25 « n » représente le nombre de billes de l'échantillons dont le diamètre est mesuré, « x, » représente le diamètre mesuré pour une bille, « i » étant un nombre entier allant de 1 à n. La distribution du diamètre des microbilles peut également être mesurée par une méthode de diffraction laser, par exemple à l'aide d'un équipement Mastersizer de 30 Malvern, par exemple un Mastersizer 2000, en utilisant un protocole de mesure de préférence suivant la norme IS013320:2009 ou suivant la monographie de la Pharmacopée Européenne EP2.9.31, mettant en oeuvre la théorie de Mi. 3029790 6 Avantageusement, la distribution des billes est étroite, c'est-à-dire avec une faible dispersion du diamètre des billes par rapport au diamètre moyen, c'est à dire par exemple un indice de dispersité de moins de 2 mesuré par diffraction laser, par exemple comme précité. 5 Avantageusement, les microbilles présentent un D(0,1) compris entre 100 et 600 micromètres, et avantageusement compris entre 200 et 400 micromètres. Selon une variante, les microbilles présentent un D(0,5) compris selon une variante entre 100 et 800 micromètres, et de préférence entre 300 et 700 micromètres. De préférence, les microbilles présentent un D(0,5) compris selon une variante 10 entre 300 et 600 micromètres. Avantageusement, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 100 et 1000 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 950 micromètres. Selon une variante spécifique, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 100 et 950 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 900 micromètres, en 15 encore avantageusement entre 300 et 800 micromètres. Selon une variante spécifique, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 200 et 700 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 650 micromètres. L'invention concerne notamment des billes d'hydrogels stérilisées ou non dont le diamètre D(0.9) est : 20 - inférieur à 700pm (pouvant être injectées via une aiguille de 19 Gauge), - inférieur à 650pm (pouvant être injectées via une aiguille de 20 Gauge), - inférieur à 500pm (pouvant être injectées via une aiguille de 21 Gauge). Le D(0,1), D(0,5) et le D(0,9) sont mesurés par diffraction laser comme précité. Avantageusement, les microbilles d'hydrogel comprennent au moins 95% d'eau en 25 masse. Selon une variante spécifique, les microbilles hydrogel comprennent au moins 97% en masse d'eau. Avantageusement, le chitosane est présent à une concentration de 0,3 à 10 % en masse, et le ou les composés polyphosphate étant présents en quantité suffisante pour former une microbille d'hydrogel, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à 30 la masse de la microbille. Selon un mode de réalisation, le chitosane est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 0,5 et 5 %, et de préférence entre 1,0 et 3 % en masse de chitosane, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille. 35 Les pourcentages en masse exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel sont exprimés par rapport aux constituants de l'hydrogel. Les pourcentages en 3029790 7 masse exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel s'entendent de préférence de la microbille d'hydrogel sans agent actif, par exemple des cellules, des polypeptides, des protéines, des polynucléosides ou polynucléotides, qui ont une vertu thérapeutique et qui ne sont pas directement nécessaires à la préparation de l'hydrogel. 5 Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 1,0 et 3,0%, et par exemple 1,5%, en masse de chitosane. Le chitosane est référencé sous le N °CAS 9012-76-4. Le chitosane de l'invention est un polysaccharide de préférence préparé à partir d'une source fongique. Il est de préférence extrait et purifié à partir de sources fongiques alimentaires ou 10 biotechnologique sûres et abondantes tels que Agaricus bisporus ou Aspergillus piger. Le chitosane est obtenu par hydrolyse d'un extrait riche en chitine. La chitine est un polysaccharide composé de plusieurs unités N-acétyl-D-glucosamine reliées entre elles par une liaison de type B (1,4). Le chitosane est constitué des unités D-glucosamine (unités désacétylées) et d'unités N-acétyl-D-glucosamine (unités acétylées) reliées entre 15 elles par des liaisons de type B (1,4) et constitue un polymère du type poly(N-acétyl-D- glucosamine)-poly(D-glucosamine). Le chitosane de l'invention est donc avantageusement d'origine fongique, et de préférence issus du mycélium d'un champignon du type Ascomycète, et en particulier d'Aspergillus piger, et/ou d'un champignon Basidiomycète, et en particulier Lentinula 20 edodes (shiitake) et/ou Agaricus bisporus. De préférence le champignon est Agaricus bisporus. Toute origine et méthode de préparation de chitosane peuvent être utilisées. Une méthode de préparation du chitosane est celle décrite dans les brevets issus de la demande W003068824 (EP1483299 ; US 7,556,946). Le chitosane est avantageusement un chitosane non modifié chimiquement par 25 une réaction de couplage par liaison covalente avec une ou plusieurs autres espèces chimiques. Le chitosane est avantageux pour sa capacité à former des particules de structure tridimensionnelle de type hydrogel mécaniquement résistante, sa biocompatibilité et sa biodégradabilité après administration ou implantation. De plus, la présence de chitosane 30 dans de telles particules d'hydrogel est désirée pour ses propriétés intrinsèques, physico- chimiques et/ou biologiques, par exemple pour sa capacité à adhérer aux surfaces biologiques ou sa capacité à stimuler la cicatrisation de tissus. Selon une variante, la masse moléculaire moyenne du chitosane est inférieure ou égale à 80000. Selon une variante, la masse moléculaire du chitosane est comprise entre 35 15000 et 70000, et de préférence entre 35000 et 60000. 3029790 8 Selon une autre variante, la masse moléculaire moyenne du chitosane est supérieure à 80000. En particulier, la masse moléculaire du chitosane est supérieure à 140000. La limite supérieure et en général imposé par la viscosité de la solution de chitosane. On préfère utiliser un chitosane dont la masse moléculaire moyenne est 5 inférieure à 1000000. De préférence ici, la masse moléculaire moyenne est la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv), calculée à partir de la viscosité intrinsèque selon l'équation de Mark-Houwink. La viscosité intrinsèque est mesurée par viscosimètrie capillaire, avec un viscosimètre capillaire de type Ubbelohde, selon la méthode de la monographie de la 10 Pharmacopée Européenne EP2.2.9. On mesure le temps d'écoulement de la solution à travers un tube capillaire adapté (Lauda, par exemple le tube capilaire Ubbelohde 510 01 de diamètre 0.53mm) à l'aide d'un viscosimètre automatique Lauda Visc, d'abord à la concentration initiale en chitosane, puis pour plusieurs dilutions, par exemple selon les recommandations de la méthode EP2.2.9. On en déduit la viscosité intrinsèque réduite 15 pour chacune des concentrations. On porte la viscosité réduite en fonction de la température, et on extrapole la valeur à la concentration 0 pour en déduire la viscosité intrinsèque. Il faut par exemple porter la viscosité réduite (hréd en ml/g) des i dilutions en fonction de la concentration C des i dilutions (g/ml) selon la formule 5. Formule 2. [hréa] = (t1 - t0) - (1 - C). 20 Pour calculer la masse viscosimétrique moyenne, on applique l'équation de Mark- Houwink avec les constantes k et alpha recommandées par Rinaudo et al. (Int. J. Biol. Macromol, 1993, 15, 281-285), selon le DA du chitosane, selon l'une des trois formules suivantes. Formule 3. Mv = ([h]/0,082)(1/0,76), pour un DA de 2% ; 25 Formule 4. Mv = ([h]/0,076)(1/°'76), pour un DA de 10% (par exemple 11.5%) ; Formule 5. Mv = ([h]/0,074)(1/°'76), pour un DA de 20% (par exemple 21%). Pour les valeurs de DA intermédiaires, on réalise une interpolation linéraire pour calculer la masse viscosimétrique moyenne (Mv). 30 À titre d'exemple, le chitosane peut présenter un degré d'acétylation compris entre 10 et 40 %, et de préférence entre 10 et 25 `Vo. Le degré d'acétylation est déterminé par potentiométrie. Le chitosane est dissout dans une solution d'acide chlorhydrique. L'excès d'acide chlorhydrique n'ayant pas réagi avec les fonctions amines du chitosane est dosé par une solution titrée d'hydroxyde de 35 sodium. On en déduit ainsi le nombre de mole d'unité D-glucosamine présentes dans le chitosane et donc par soustraction le degré d'acétylation. 3029790 9 Par exemple, la solution de chitosane à une concentration de 1,5% (m/v) dans l'acide acétique 1% (v/v) peut présenter une viscosité dynamique comprise entre 100 et 500mPa.s. Avantageusement, le chitosane de la présente invention peut présenter une viscosité dynamique comprise entre 50 et 400mPa.s en solution à 1,5%. 5 La viscosité dynamique de la solution de chitosane à 1,5% (m/v) est de préférence comprise entre 150 et 300mPa.s, et encore de préférence entre 200 et 280mPa.s. La viscosité est mesurée typiquement par viscosimétrie à mobile tournant, par exemple sur un dispositif Brookfield DV2T à une vitesse de rotation de 5tr/min avec une aiguille « Spindle SC4-18 » à 25°C. 10 Le composé polyphosphate est de préférence un sel d'un composé polyphosphate organique ou inorganique. Parmi les composés polyphosphates organiques on peut citer par exemple l'acide phytique, en particulier le inositol hexakisphosphate de sodium, ou un glycérophosphate, par exemple le beta-glycérophosphate de sodium . 15 Parmi les composés polyphosphates inorganiques on peut citer par exemple le tripolyphosphate, en particulier le tripolyphosphate de sodium. Avantageusement, le composé polyphosphate est choisi parmi l'acide phytique, comme par exemple sel de sodium d'acide phytique, un tripolyphosphate, comme par exemple le tripolyphosphate de sodium, un glycérophosphate comme par exemple un 20 beta-glycérophosphate de sodium, et l'un quelconque de leurs mélanges. L'acide phytique ou acide myo-inositol hexaphosphorique ou encore acide inositol hexakisphosphorique est une biomolécule de formule brute C61-118024P6. L'acide phytique est un composé de plantes ubiquitaires, présent à 1-5 % en masse de la plupart des céréales, noix, huile de graines, les spores, et pollens. Il représente typiquement une 25 proportion de 60 à 90% duotal du phosphore des graines. Il se retrouve sous forme de mélange de sels, typiquement de calcium/magnésium et potassium dans certaines parties des graines. Cette molécule est hautement chargée avec les six groupes phosphate s'étendant du centre du noyau myo-ionisol, chacun des groupes ayant son propre pKa. Les propriétés de l'acide phytique peuvent se retrouver par exemple dans l'article 30 deEvans et al. (Titration studies of phytic acid, JAOCS, 59, 4, 1982). Par exemple l'acide phytique est présent dans l'hydrogel des microbilles à une concentration de 0,5 à 10% en masse. Selon une variante spécifique, l'acide phytique est présent dans l'hydrogel à une concentration d'au moins 1%, et de préférence d'au moins 2% en masse d'acide phytique. 35 Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 2 à 10%, et plus particulièrement de 4 à 8% en masse d'acide phytique. 3029790 10 Avantageusement, la présente invention concerne une microbille comprenant de 1 à 2% de chitosane et au moins 3% en masse d'acide phytique. Un exemple de composition de la microbille comprend 1,5 % de chitosane et 4 à 8 (3/0 d'acide phytique en masse par rapport à la masse de la composition totale de la 5 microbille. Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 0.5 à 5%, et plus particulièrement de 1 à 5% en masse de tripolyphosphate, de préférence de tripolyphosphate de sodium. Avantageusement, la présente invention concerne une microbille comprenant de 1 10 à 1% de chitosane et au moins 0.5 % en masse de tripolyphosphate, de préférence de tripolyphosphate de sodium. Un exemple de composition de la microbille comprend 1,5 % de chitosane et 1 à 2% de tripolyphosphate, de préférence de tripolyphosphate de sodium, en masse par rapport à la masse de la composition totale de la microbille. 15 Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 2 à 10%, et plus particulièrement de 4 à 8% en masse de glycérophosphate, de préférence un betaglycérophosphate de sodium. Avantageusement, la présente invention concerne une microbille comprenant de 1 à 2% de chitosane et au moins 3 % en masse de glycérophosphate, de préférence un 20 beta-glycérolphosphate de sodium. Un exemple de composition de la microbille comprend 1,5% de chitosane et 4 à 8% de glycérophosphate, de préférence un beta-glycérophosphate de sodium en masse par rapport à la masse de la composition totale de la microbille. Avantageusement, la microbille comprend une quantité de base suffisante pour 25 élever le pH à une valeur permettant la formation de microbilles d'hydrogel de l'invention. Parmi les bases on peut citer les bases minérales comme par exemple l'hydroxide de sodium, le carbonate de sodium, l'hydroxyde de potassium, etc. Après lavage par des bains d'eau successifs, la microbille contient l'eau, le chitosane et le composé polyphosphate. 30 Outre l'eau, le chitosane, le composé polyphosphate, la microbille de la présente invention peut comprendre différents excipients et/ou différents principes actifs. Parmi les excipients, on peut citer les agents favorisant la gélification de la bille, les agents de modification de la viscosité, les agents de modification de la rhéologie, et des agents de modification de la cinétique de dégradation des microbilles in vivo, etc. 35 La composition des microbilles est avantageusement non-thermogélifiable. En effet, pour assurer une bonne stabilité des billes avant et après injection, typiquement par 3029790 11 voie intra-articulaire, la gélation ou la transition sol-gel ne doit pas intervenir après ou au moment de l'injection. Avantageusement, les microbilles de l'invention sont sous forme d'hydrogel avant leur application, en particulier par injection dans le corps d'un sujet en ayant besoin, notamment au niveau intra-articulaire. En particulier, les microbilles sont 5 sous forme hydrogel lors de leur stockage, par exemple à température ambiante ou au froid, et ne sont pas sensibles aux variations de température entre 8 et 40°C, c'est-à-dire qu'elles ne sont pas désintégrées ou dégradées dans cette gamme de température. À cet égard, les microbilles peuvent être suspendues dans une solution visqueuse ou un hydrogel, qui lui, avantageusement, peut-être thermogélifiable. Il s'agit typiquement 10 d'hydrogel d'un ou plusieurs polysaccharides gélifiables. La présente invention concerne encore une solution visqueuse ou un hydrogel, thermogélifiable ou non, comprenant une pluralité de microbilles de l'invention. La composition de la microbille selon l'invention peut également comprendre des composés d'intérêt, tout particulièrement au niveau pharmaceutique (principe actif 15 pharmaceutique) et encore plus spécifiquement pour une action intra-articulaire, plus particulièrement sur le cartilage. Il s'agit encore plus spécifiquement d'agents bénéfiques dans des compositions à usage intra-articulaire, par exemple pour diminuer la douleur ou diminuer l'inflammation. Parmi de tels agents, on peut citer les médicaments anti-inflammatoires, plus 20 particulièrement les médicaments non-stéroïdiens, les agents anesthésiques, les agents analgésiques, en particulier du type opioïdes, les corticostéroïdes, les anti-néoplastiques, les anticorps monoclonaux, les vitamines, les minéraux, les agents de contrastes, etc. On peut notamment citer parmi les médicaments non-stéroïdiens (NSAIDS) par exemple : DiclofenacTM, IbuprofenTM, PiroxicamTM; les anesthésiques, par exemple : 25 LidocaineTM , BupivacaineTM; les analgésiques opioïdes par exemple : codéine, morphine; corticostéroides, par exemple : dexamethasone, prednisone; les agents antinéoplastiques, par exemple : MethotrexateTM; les agents antiviraux, par exemple : AcyclovirTM , VidarabineTM; les anticorps monoclonaux, par exemple : HumiraTM InfliximabTM 30 Les microbilles de l'invention, en particulier utilisables comme suppléments injectables par voie intra-articulaire peuvent aussi contenir des composés comme des cellules, des protéines, de polynucléotides (ARN, ADN), des minéraux comme par exemple : sélénium, strontium, des vitamines comme par exemple : tocophérol, ou d'autres agents actifs comme par exemple le curcumin. 3029790 12 Parmi les cellules, il est particulièrement intéressant d'utiliser des chondrocytes, des cellules souches, ou des cellules ayant la capacité de produire des substances actives. Les microbilles d'hydrogel selon la présente invention présentent une structure 5 d'hydrogel homogène. Les microbilles d'hydrogel selon la présente invention ne présentent pas de trabécules, ni de particules solides inhérentes à la préparation de l'hydrogel. Il n'est pas exclu que des agents actifs soient sous forme solide ou colloïdale, par exemple sous forme nanoparticulaire. Avantageusement, les microbilles de l'invention sont cohésives. La cohésion des 10 billes n'est pas perdue lors de la friction entre les mains. De plus, les billes présentent avantageusement une bonne résistance à la compression, en particulier lors de la manipulation entre les doigts. Une telle résistance peut être par exemple évaluée par la mesure de résistance à la compression ur un banc de compression mécanique (par exemple un équipement Instron Bluehill). On peut aussi 15 utiliser une technique de nanoindentation (par exemple avec la gamme d'équipements de marque PI Series Picoindenter commercialisé par la société Hysitron ou le Mach 1 commercialisé par la société Biomomentum) ou encore une technique de tribologie adaptée (par exemple avec la gamme d'équipements de marque Tl Series Triboindenteur commercialisé par Hysitron). 20 Encore avantageusement, les billes sont déformables et peuvent être injectées par une aiguille dans le diamètre intérieur est plus faible que le diamètre maximum des billes. Ceci présente un grand avantage pour l'injection dans un tissu car à diamètre intérieur égal, on peut utiliser une aiguille de diamètre extérieur plus faible, formant ainsi un trou de diamètre moins important. 25 Les microbilles peuvent être fabriquées avantageusement selon le procédé de l'invention. L'invention concerne donc un procédé pour la préparation de microbilles d'hydrogel selon l'invention. Plus spécifiquement, le procédé de l'invention comprend l'ajout d'une solution de 30 chitosane à une solution de réticulation comprenant au moins un composé polyphosphate, puis la gélification du chitosane en présence de la solution de réticulation pour former les microbilles d'hydrogel. Le chitosane est de préférence dissout dans une solution aqueuse à pH inférieur à 7. Une telle solution comprend typiquement un acide, de préférence faible, comme par 35 exemple un acide organique. On peut avantageusement utiliser l'acide acétique. La 3029790 13 solution comprend typiquement 0,5 à 3% d'acide acétique exprimé en volume par rapport au volume total de la solution de chitosane Le pH de la solution de chitosane est typiquement compris entre 2 et 6,5, et de de préférence compris entre 3,5 et 6,0. 5 Avantageusement, l'osmolarité de la solution de chitosane à la concentration de 1,5% (m/v) va de 100 à 300 mOsm/kg, à la température de 25°C. La détermination de l'osmolarité des solutions est effectuée avec un micro- osmomètre automatique (Osmometer Type 15M de la marque Leiser Messtechnik). L'équipement est préalablement calibré avec une solution de 300mosm/kg. L'échantillon 10 est placé dans un récipient prévu à cet effet, et est mis à la température standard de la mesure. La gélification des gouttelettes de la solution de chitosane sous forme de microbilles intervient dans des conditions aptes à la gélification de la solution de chitosane et du composé polyphosphate. 15 Selon une variante, on peut ajouter un ou plusieurs composés polyphosphates à la solution de chitosane, avant de faire tomber goutte à goutte cette solution dans la solution de réticulation comprenant un ou plusieurs composés polyphosphate identiques ou différents de celui/ceux ajouté(s) à la solution de chitosane. On peut ainsi par exemple ajouter de 0,01 à 1% (m/m), et de préférence de 0,1 à 0,5% (m/m, signifiant 20 masse/masse), de composé polyphosphate dans la solution de chitosane. Selon une variante la solution de réticulation présente un pH compris entre 8 et 14, plus particulièrement entre 9,5 et 14, ajusté par ajout d'une solution diluée d'une base, par exemple d'hydroxyde de sodium. Selon une variante, la solution de réticulation est une solution d'acide phytique et 25 d'hydroxyde de sodium présentant un pH compris entre 5,5 et 7, par exemple d'environ 6. Selon une variante, la solution de réticulation est une solution d'acide phytique et d'hydroxyde de sodium présentant un pH compris entre 8 et 14. Selon une autre variante spécifique, la solution de réticulation est une solution d'acide phytique et d'hydroxyde de sodium présentant un pH compris entre 8 et 10, par 30 exemple d'environ 9. Selon une autre variante spécifique, la solution de réticulation est une solution d'acide phytique et d'hydroxyde de sodium présentant un pH compris entre 11 et 14, par exemple d'environ 13. Avantageusement, il est possible de faire varier les propriétés des microbilles 35 hydrogel selon le pH de la solution de réticulation utilisée. 3029790 14 La concentration de base dans la solution de réticulation est déterminée par l'homme du métier afin d'obtenir le pH est désiré. On peut typiquement utiliser une concentration de base allant de 0,01 à 1 M, et plus spécifiquement allant de 0,05 à 0,75M dans la solution de réticulation. 5 La gélification est réalisée en mettant la solution de chitosane en contact goutte à goutte avec une solution de réticulation comprenant au moins un composé polyphosphate, ou éventuellement un ou plusieurs autres agents de gélification. Le dispositif pour la formation des gouttes et leur gélification peut être du type « prilling », c'est-à-dire un procédé de grelonage. On utilise de préférence un dispositif 10 comprenant une buse de production de gouttes présentant un diamètre interne supérieur ou égal à 100 on peut par exemple utiliser un diamètre de 100 ou 150pm. Pour la formation des microbilles, on peut utiliser un procédé discontinu, par exemple en faisant passer la solution à travers une aiguille à l'aide d'une pompe péristaltique. On peut aussi utiliser un procédé continu, industriellement approprié. A titre 15 d'exemple de procédé continu on peut citer par exemple un procédé électromagnétique à jet laminaire appelé aussi prilling, comme avec l'équipement en continu VAR-D (commercialisé par Nisco) ou d'autres procédaient comme par exemple un procédé de formation de gouttes électrostatique, ou à flux d'air coaxial, ou à flux d'air dynamique, ou par gravité, ou par nébulisation (ou « spray drying »), ou encore par extrusion en continu 20 avec le jet sortant coupé à l'aide d'un outil rotatif (appelé Jetcutter, comme avec l'équipement Genialab). Lorsque les gouttes de solution de chitosane tombent dans la solution de réticulation comprenant le composé polyphosphate, une agitation peut être réalisée, par exemple à l'aide d'un barreau magnétique, par exemple une vitesse comprise entre 50 et 500tr/min. 25 Avantageusement, le procédé comprend le lavage des microbilles, de préférence avec une solution aqueuse, et encore de préférence de l'eau. On réalise de préférence un lavage intensif dans des conditions aptes à obtenir des microbilles d'hydrogel de diamètre constant d'un lavage à l'autre. Le procédé de l'invention comprend par exemple la récupération des microbilles 30 par gravité. Lorsque l'agitation est arrêtée, les billes sédimentent au fond du récipient contenant la solution, typiquement le récipient du bain de lavage. On peut retirer par exemple la solution par un dispositif d'aspiration, comme à travers une aiguille dont les caractéristiques (typiquement le diamètre) ne permettent pas le passage des microbilles. Après retrait de la solution, il ne reste que les microbilles dans le récipient, qui peuvent 35 être manipulées pour des opérations ultérieures. 3029790 15 La présente invention concerne également des microbilles stériles. Avantageusement les microbilles sont stérilisées à la chaleur humide, typiquement en utilisant un autoclave. Typiquement, les conditions d'autoclave sont une température d'environ 121°C, pendant une durée d'au moins 15 mhutes. 5 Ainsi, la présente invention concerne encore une méthode de stérilisation des microbilles décrites dans l'invention. La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou un dispositif médical comprenant une pluralité des microbilles selon l'invention ou obtenues selon le procédé de l'invention. 10 La présente invention concerne également une composition pharmaceutique injectable comprenant les microbilles de l'invention. La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou un dispositif médical consistant en un fluide synovial artificiel. Selon une variante, la composition pharmaceutique ou le dispositif médical est 15 utile dans le traitement d'une pathologie d'une articulation. Selon une variante, la composition pharmaceutique ou le dispositif médical est utile dans le traitement de la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation ou pour ralentir la progression d'une pathologie d'une articulation. La présente invention concerne encore un dispositif médical, éventuellement sous 20 forme d'un ou plusieurs kits d'emballages, éventuellement séparés physiquement, comprenant une seringue, une aiguille et une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'invention, ladite seringue comprenant un réservoir éventuellement pré-rempli de la composition pharmaceutique ou dispositif médical précité. La présente invention concerne un tel dispositif médical pour son utilisation dans le 25 traitement d'une pathologie articulaire comprenant l'injection d'une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'invention par voie intra-articulaire. La présente invention concerne également des microbilles d'hydrogel selon l'invention, ou obtenues selon l'invention pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie, par injection dans le corps humain ou animal, éventuellement présence d'une 30 solution ou hydrogel injectable. Par exemple, l'aiguille utilisée est une aiguille choisie parmi les aiguilles de 18 à 22 gauge, de préférence encore de 22 gauge et plus. Par exemple, l'aiguille utilisée présente des parois normales, fines ou extra-fines. La présente invention concerne encore une méthode de supplément du fluide 35 synovial, en particulier lors d'une pathologie affectant une articulation, comme par exemple l'arthrose (ostéoarthrite ou osteoarthritis) ou des lésions du cartilage, etc. 3029790 16 La présente invention concerne encore une méthode de lutte contre la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation. La présente invention concerne encore une méthode de lutte contre une inflammation d'une articulation. 5 Plus spécifiquement, de telles pathologies sont par exemple : l'ostéoarthrite (osteoarthritis) (primaire (idiopathique) ou secondaire), l'arthrite rhumatoïde (rheumatoid arthritis), blessure d'une articulation (par exemple traumatique ou une blessure iée à la mobilité articulaire répétée), une pathologie du cartilage (par exemple. chondrocalcinose ou chondromalacie), arthrite septique. 10 La présente invention concerne encore une méthode de réduction ou de lutte contre la douleur associée avec une maladie, par exemple comme celles précitées, ou encore en ralentir la progression. La présente invention concerne encore une méthode pour améliorer la réparation osseuse, en particulier du cartilage. 15 De telles méthodes comprennent typiquement l'injection intra-articulaire d'une composition comprenant des microbilles selon l'invention. Selon une variante, la méthode selon l'invention comprend une pluralité d'injections. Selon une variante, on peut réaliser une injection une ou deux fois par mois pendant plusieurs mois. Selon une autre variante, on réalise deux injections espacées d'un temps variable. Selon une autre variante, on 20 réalise une seule injection. Les méthodes de l'invention sont utiles à un sujet en ayant besoin, tel que par exemple un sujet nécessitant le traitement d'une pathologie articulaire. Le ou les sites d'injection sont typiquement choisis parmi : un genou, une épaule, une hanche, une articulation temporo- mandibulaire, une articulation carpo- 25 métacarpienne, un coude, une cheville, un poignet, une articulation de la main, un disque intervertébral, ou une autre articulation. Selon une variante, l'injection est réalisée dans une cavité articulaire, au contact du cartilage. Lorsqu'on ajoute les microbilles à un fluide, une solution visqueuse ou un hydrogel, par exemple à un viscosupplément, par exemple comprenant un acide 30 hyaluronique, on obtient une augmentation du module d'élasticité (G') mesuré par rhéologie. Ceci traduit la résistance au stress des microbilles d'hydrogel, et par conséquent une amélioration de la résistance au stress du fluide contenant les microbilles. Par extension, la capacité du fluide à absorber les chocs, par exemple quand il est injecté dans une articulation et plus spécifiquement l'articulation du genou, est 35 améliorée en présence des billes. La viscosité du fluide à température physiologique est inchangée de manière avantageuse, de sorte qu'il reste facile à injecter à travers une 3029790 17 aiguille de diamètre acceptable par un médecin, et qu'il garde une viscosité suffisante pour agir comme viscosupplément. Ainsi, la présente invention concerne encore, l'utilisation de microbilles selon l'invention, ou obtenues selon l'invention, pour modifier les propriétés, en particulier les 5 propriétés mécaniques, d'un viscosupplément par exemple injectable au niveau d'une articulation. Plus généralement les microbilles de l'invention sont utilisées en ingénierie tissulaire ou comme vecteurs de composés actifs, en particulier comme vecteurs de composés pharmaceutiquement actifs. 10 Les expressions du type « comprend de... à ... » « compris entre... et... » « allant de... à... » ou leurs équivalents incluent les bornes cités, sauf indication contraire. Selon une variante, les bornes de l'intervalle sont exclues. On couvre par «selon l'invention » ou des termes équivalents, une composition, méthode ou procédé défini tel que dans la présente invention, y compris selon l'une 15 quelconques des variantes, modes de réalisation particuliers ou spécifiques, indépendamment ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons, y compris selon les caractéristiques préférées. Sur les figures : La figure 1 représente une observation par microscope optique des microbilles 20 d'hydrogel formées en présence de la solution de réticulation contenant le beta- glycérophosphate de sodium à la concentration 5% et l'hydroxyde de sodium à la concentration 0,1M (N°7). La figure 2 représente une observation par microscope optique des microbilles d'hydrogel formées en présence de la solution de réticulation contenant le 25 tripolyphosphate de sodium à la concentration de 2%, le glycérophosphate de sodium à la concentration de 5% et l'hydroxyde de sodium à la concentration de 0,1M (N°8). D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des 30 exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait 35 partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale. 3029790 18 D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en masse, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. 5 Exemples Tableau 1 - Références pour les tailles des aiguilles en vue de l'injection des microbilles selon la norme ISO 9626 (1991 : Amd 1 :2001) Source Gauge Diamètre Diamètre interne (ID) externe (OD) (min - max) (pm) ID parois ID parois ID parois normales/regular Fines/fine extra- (11m) (pm) fines/ultrafine (11m) 1 29 324 - 351 133 190 27 400 - 420 184 241 26 440 - 470 232 292 25 500 - 530 232 292 22 698 - 730 390 440 522 20 860 - 920 560 635 687 19 1030 -1100 648 750 850 18 1200 -1300 790 910 1041 2 23 -620 -325 21 -820 -500 1- "The Gauge system for the medical use" in Anesthesia & Analgesia, 2002 ; les 10 valeurs sont extraites de la norme IS09626:1991/Amd 1:2001. 2- "Does needle size matter ?", in J Diab Sci Technol 1, 725, 2007. Le diamètre externe (OD) (min - max) dénote la tolérance selon la norme précitée. Sauf indication contraire, le diamètre interne des aiguilles mentionné est des 15 parois normales/regular. Exemple 1 - Préparation de la solution de chitosane Un chitosane ultrapur de source fongique (Synolyne Pharma, Belgique), de masse moléculaire viscosimétrique moyenne (Mv) de 180.000 (supérieure à 140.000) et de 3029790 19 degré d'acétylation (DA) de 27mo1°/0 (supérieur à 20mol°/0) est dispersé dans une solution contenant 1% (0,167M) d'acide acétique, à une concentration de 1,5% (comprise entre 1 et 2%) sous agitation magnétique ou mécanique. La solution est mélangée pendant une durée de 3 heures (1 à 12 heures). La solution est filtrée sur filtre avec un diamètre de 5 pore de 511m. A une concentration de 1.5%, le pH de la solution de chitosane est d'environ 4, son osmolarité à 25°Cest d'environ 150mOsm/kg, et sa viscosité dynamique est d'environ 220mPa.s (mesurée par viscosimétrie à mobile tournant avec un équipement Brookfield, à 5 tr/min avec le Spindle SC4-18). 10 On peut former des gouttelettes au départ de cette solution de chitosane avec des buses de faible diamètre jusqu'à la plus petite taille disponible pour l'équipement VAR-D (Nisco), c'est à dire avec la buse de diamètre 100pm. Exemple 2 - Préparation des solutions de réticulation à base de composés 15 polyphosphate Les solutions de réticulation sont des mélanges de composés polyphosphate seuls ou combinés, à différentes concentrations, dont le pH est ajusté en présence d'une base comme par exemple un hydroxyde de sodium, ou non. On utilise comme polyphosphate un composé choisi parmi : le tripolyphosphate de sodium (TPP, Sigma), le beta- 20 glycérophosphate de sodium (GP, Safic Alcan), ou l'acide phytique sous la forme de sel de sodium anhydride (ou inositol hexakisphosphate de sodium anhydre, PA, Sigma). Les concentrations des composés polyphosphates et la base (NaOH), ainsi que le pH des solutions de réticulation sont consignées dans le tableau 2. 5 3029790 20 Tableau 2 - Solutions de réticulation à base de composés polyphosphate N° Polyphosphate NaOH pH Faisabilité de la préparation de microbilles d'hydrogel stables (Exemples 3 et 4) 1 0 0,05M 12,8 Non 2 0 0,1 M 13,0 Non 3 0 0,5M 13,2 Non 4 TPP 5% 0 8,6 Non 5 GP 5`)/0 0 9,3 Non 6a TPP 5% 0,1M 12,9 Oui 6b TPP 2.5% 0,05M 12,4 Non 6c TPP 1.25% 0,075M 12,7 Oui 7 GP 5% 0,1M 13,0 Oui 8a* TPP 2% et GP 5% OM 8,8 Non 8b** TPP 2% et GP 5% 0,05M 12,5 Oui 8c TPP 2% et GP 5% 0,1M 12,9 Oui 9 PA 5`)/0 0 3,0 Non 10 PA 5`)/0 0,1M 6,0 Oui 11 PA 5`)/0 0,3M 9,0 Oui 12 PA 5`)/0 0,5M 13,0 Oui 13 PA 2`)/0 0,1 M 6,0 Non 14 PA 2% 0,3 M 9,0 Non 15 PA 2% 0,5 M 13,0 Non *8a : TPP 2% + GP 5% sans NaOH => les billes se forment mais sont instables : elles s'effritent après 5 à 10 minutes : les billes ne sont pas conformes aux microbilles de Î invention ; **8b : TPP 2% + GP 5% + NaOH 0.05M => les billes se forment et restent stables après une heure dans la solution de réticulation: les billes sont conformes à l'invention 10 3029790 21 Exemple 3 - Préparation de microbilles d'hydrogel de chitosane par réticulation avec le tripolyphosphate (TPP) seul ou en combinaison avec le glycerophosphate (GP) On forme des gouttelettes au départ de la solution de chitosane selon l'exemple 1 5 par un procédé électromagnétique avec un équipement "Encapsulator VarD (Gen 2) (Nisco, Zürich, Suisse), équipé d'une buse de diamètre 150pm. Les gouttelettes sont plongées dans un volume de 50m1 d'une des solutions de réticulation selon l'exemple 2 (N° 1 à 8c du Tableai 1), et sont agitées pendant une durée de 3 heures à l'aide d'un barreau magnétique, à une vitesse comprise entre 100 et 10 1000tr/m in. Lorsque des microbilles se forment, elles sont ensuite lavées à l'eau (environ un litre à chaque lavage) plusieurs fois de manière consécutive. On réalise une légère agitation avec un barreau magnétique durant environ une minute entre chaque lavage, à une vitesse comprise entre 100 et 1000tr/min. Les billes sont laissées à sédimenter entre 15 chaque lavage. Les billes sont finalement récupérées par gravité. On obtient un récipient contenant une masse connue de billes d'hydrogel, ainsi qu'une masse connue d'eau. Il ressort de cet exemple que des billes d'hydrogel stables peuvent être formées en présence des solutions de réticulation N° 6, 6c, 7 et 8c, c'est-à-dire seulement en présence de sels de polyphosphate TPP et/ou GP et d'une quantité suffisante de NaOH. 20 Les billes d'hydrogel stables ne peuvent pas être formées en présence de NaOH seul (N° 1 à 3), en l'absence de polyphosphate : bén qu'à ces pH le chitosane précipite, il ne se forme pas de bille d'hydrogel stable. En présence de polyphosphate TPP et/ou GP et en l'absence de NaOH, les billes formées ne sont pas suffisamment stables d'un point de vue mécanique, et ne résistent pas aux lavages successifs. 25 Les conditions de la solution de réticulation qui donnent les meilleurs résultats en terme de cohésion et de stabilité des microbilles d'hydrogel sont les conditions N° 6c, 7 et 8c. Les caractéristiques des billes d'hydrogels ainsi obtenues sont résumées dans le Tableau 3. 3029790 22 Tableau 3 - Caractéristiques des microbilles d'hydrogels formées en présence de GP et d'un mélange GP/TPP en présence de NaOH (buse de diamètre 150pm) Solution de Distribution de diamètre Aspect et tenue réticulation des billes d'hydrogel mécanique Par microscopie Par diffraction optique laser N °6c ND D(0.1) = 190pm Bonne tenue TPP 1,25% NaOH 0,075M pH = 12,7 D(0.5) = 490pm D(0.9) = 740pm N ° i diamètre moyen = 645pm diamètre min = 370pm diamètre max = 890pm ND Billes peu résistantes, GP 5`)/0 élastiques, NaOH 0,1M pH = 13,0 moyennement rondes (Figure 1) N ° 8c diamètre moyen = 560 lm diamètre min = 420pmdiamètre max = 700pm ND Billes plus résistantes, GP 5`)/0 TPP 2c)/0 NaOH 0,1M pH = 12,9 moins élastiques, plus rondes (Figure 2) ND : Non déterminé On observe sur les figures 1 et 2 la forme sensiblement sphérique des microbilles 5 d'hydrogel de l'invention. On conclut de cet exemple qu'il est nécessaire d'atteindre un pH suffisamment élevé pour obtenir des billes d'hydrogel de bonne stabilité et intégrité et bien élastiques avec les polyphosphates TPP et GP. On conclut également que les billes d'hydrogel formées par contact avec la 10 solution à base de TPP et de GP en combinaison sont plus stables et élastiques que les billes formées au départ de TPP ou de GP seul, à pH basique équivalent. On peut également produire des microbilles d'hydrogel stables de plus petite taille avec la buse de diamètre 100pm. Les microbilles de l'invention sont injectables au travers d'aiguilles fines. 15 3029790 23 Exemple 4 : Préparation des microbilles d'hydrogel de chitosane avec l'acide phytique On forme des gouttelettes au départ de la solution de chitosane selon l'exemple 1 5 par un procédé électromagnétique avec un équipement "Encapsulator VarD (Gen 2) (Nisco, Zürich, Suisse), équipé d'une buse de diamètre 100pm. Les gouttelettes sont plongées dans un volume de 50m1 d'une des solutions de réticulation à base d'acide phytique (PA) selon l'exemple 2 (N° 9 à 15 du Tableau 1), et sont agitées pendant une durée de 3 heures à l'aide d'un barreau magnétique, à une 10 vitesse comprise entre 100 et 1000tr/min. Lorsque des microbilles se forment, elles sont ensuite lavées à l'eau (environ un litre à chaque lavage) plusieurs fois de manière consécutive. On réalise une légère agitation avec un barreau magnétique durant environ une minute entre chaque lavage, à une vitesse comprise entre 100 et 1000tr/min. Les billes sont laissées à sédimenter entre 15 chaque lavage. Les billes sont finalement récupérées par gravité. On obtient un récipient contenant une masse connue de billes d'hydrogel, ainsi qu'une masse connue d'eau. Il ressort de cet exemple que des billes d'hydrogel stables peuvent être formées en présence des solutions de réticulation N° 10, 11 et 12, c'est-à-dire seulement en présence de polyphosphate PA et de NaOH simultanément, les deux composants devant 20 se trouver en quantité suffisante l'un et l'autre. Les caractéristiques des billes d'hydrogels ainsi obtenues sont résumées dans le Tableau 4. En présence d'acide phytique à une concentration de 5% et en l'absence de NaOH, les billes formées ne sont pas stables au cours du temps, et ne résistent pas aux lavages successifs à l'eau. Lorsqu'on ajoute NaOH, on forme des billes stables dès la 25 concentration en NaOH de 0,1M (pH 6,0), contrairement aux cas des polyphosphates TPP et GP de l'exemple 3 pour lesquels le pH doit être plus élevé (par exemple plus élevé que 12,5) pour que les billes soient stables. En présence d'acide phytique à une concentration plus faible de 2% quelle que soit la quantité de NaOH (de 0,1 à 0,5M), on forme des billes, mais elles ne sont pas 30 stables. 3029790 24 Tableau 4 - Caractéristiques des microbilles d'hydrogels formées en présence d'acide phytique et de NaOH Solution de Distribution de diamètre Aspect et tenue réticulation des billes d'hydrogel (avant stérilisation) mécanique des billes Par microscopie optique N°1C Diamètre moyen = 325um Opaque PA 5% Diamètre min = 260um Molles, déformables, NaOH 0,1 M pH = 6,0 Diamètre max = 360um élastiques et tendres N° 11 Diamètre moyen en nombre compris entre Transparentes avec un PA 5°/0 100 et 700 lm coeur opaque NaOH 0,3M pH = 9,0 Moyennement élastiques, moyennement dures N° 12 Diamètre moyen en nombre compris entre Très transparentes, PA 5°/0 100 et 700 lm avec un coeur très NaOH 0,5M pH = 13,0 dense et de faible diamètre Peu déformables et élastiques, dures Diamètre min/max : Plus petit/ grand diamètre mesuré parmi les 20 billes observées. On conclut qu'avec une quantité suffisante d'acide phytique (par exemple 5%) et 5 en présence de NaOH, on peut former des microbilles d'hydrogel quels que soient la concentration en NaOH et le pH (au-dessus de 6,0). Par contre, la proportion en NaOH influence fortement l'aspect et la tenue mécanique des billes d'hydrogel. On peut ainsi moduler les propriétés des microbilles. 10 Les billes sont stérilisées à la chaleur humide (autoclave - modèle SYSTEC DX- 23, Wettenberg, Allemagne). Les paramètres d'autoclavage sont les suivants : température de 121 °C, durée de 15 minutes. 3029790 25 Les microbilles ainsi stérilisées présentent un diamètre moyen en nombre compris entre 100 et 700 lm. Précisément, les billes préparées à l'aide de la solution de réticulation N°10 présentent un diamètre moyen en rombre de 200pm. 5 Elles sont injectables au travers d'aiguilles fines. 10 Exemple 5 - Propriétés rhéologiques Lorsqu'on ajoute les microbilles selon les exemples 3 et 4 à un fluide, une solution visqueuse ou un hydrogel, par exemple à un viscosupplément à base d'acide hyaluronique, on obtient une augmentation du module d'élasticité (G') mesuré par 15 rhéologie (détail de la méthode). Ceci traduit la résistance au stress des microbilles d'hydrogel, et par conséquent une amélioration de la résistance au stress du fluide contenant les microbilles. Par extension, la capacité du fluide à absorber les chocs, par exemple quand il est injecté dans une articulation et plus spécifiquement l'articulation du genou, est améliorée en présence des billes. La viscosité du fluide à température 20 physiologique est inchangée de manière avantageuse, de sorte qu'il reste facile à injecter à travers une aiguille de diamètre acceptable par un médecin, et qu'il garde une viscosité suffisante pour agir comme viscosupplément. Exemple 6 - Elasticité des microbilles 25 Afin de déterminer les propriétés élastiques et d'absorption des microbilles d'hydrogel, on ajoute les microbilles - préparées selon les exemples 3 et 4 avec les solutions de réticulation N°6a, 6c, 8b, 8c, 10, 11 et 12 de l'exemple 2 - à un fluide visqueux, par exemple une solution d'acide hyaluronique, à 37°C. 30 On mesure les propriétés rhéologiques en oscillation du fluide visqueux seul et du fluide visqueux avec les microbilles, à l'aide d'un rhéomètre rotatif avec cisaillement de plateaux, (ARES G2, TA Instrument). Cette analyse peut renseigner sur l'évolution des variables G', G" et Tan(15)) sur une plage de fréquences de cisaillement donnée, par exemple de 0,1Hz à 100 rad.s-1, et a une température donnée, par exemple 37°C. 35 L'amplitude est fixée en valeur constante, par exemple 1%. On met en évidence que le module élastique (G', appelé aussi module de stockage) de la solution visqueuse comprenant les microbilles est significativement supérieur au module G' de la solution de la solution visqueuse sans les microbilles, et ceci 3029790 26 quelle que soit la composition de la solution de réticulation. La différence de G' est indicative de l'élasticité des microbilles. La valeur du module G' du fluide est augmentée significativement en présence des microbilles, ce qui indique que les microbilles confèrent au fluide une meilleure capacité à résister au stress et à absorber les chocs. 5 En parallèle, on mesure la viscosité dynamique de la solution visqueuse avec et sans les microbilles, à 37°C, à l'aide du même équpement de rhéomètrie, sous rotation continue, à vitesse croissante, sur une plage de cisaillement déterminée. On observe que la viscosité dynamique du fluide visqueux n'est pas modifiée par l'ajout des microbilles. Il reste ainsi facilement injectable au travers d'une aiguille, et peut par exemple agir comme 10 viscosupplément pour soulager une articulation après injection dans l'articulation du genou. Par exemple, on prépare un mélange d'un viscosupplément (à base d'acide hyaluronique) disponible commercialement (SynVisc®, Sanofi) avec les microbilles préparées selon l'exemple 3 avec la solution de réticulation N°10 (acide phytique 5%, 15 Na0H0.1M, pH6). Les 2 solutions (avec et sans microbilles) contiennent la même concentration en acide hyaluronique. On mesure le module d'élasticité G' et la viscosité dynamique des 2 solutions à 37°C, selon les paramètres de mesure consignés dans les tableaux 5 et 6. Les résultats sont présentés dans les tableaux 5 et 6. Il ressort de cet exemple 20 que l'ajout des microbilles de chitosane et d'acide phytique entraîne une augmentation du module d'élasticité de la solution d'acide hyaluronique de 40%, sans modification de sa viscosité dynamique. Les microbilles sont injectables facilement à travers une aiguille de diamètre variable, et en particulier d'une aiguille adaptée à l'injection intra-articulaire. Les 25 microbilles de l'invention récoltées après injection conservent sensiblement la même distribution de taille. Par ailleurs, la même solution d'acide hyaluronique avec les microbilles (obtenues avec la solution N°10 du tableau 3) est injectable au travers d'aiguilles de diamètre variable, par exemple une aiguille adaptée à l'injection intra-articulaire. Les billes 30 récoltées après injection conservent sensiblement la même distribution de taille. 3029790 27 Tableau 5 - Module d'élasticité G' d'un acide hyaluronique commercial avec et sans microbilles (N°10), à 37°C Fréquence d'oscillation (Hz) G'HA Sans microbilles (Pa) G' HA+MB Avec microbilles (Pa) Différence G'HA+MB - G'HA (Pa) Différence (G'HA+MB-G'HA)/G'HAX100 (%) 1 25 35 10 +40% 10 66 93 27 +41% Tableau 6 - Viscosité dynamique d'un acide hyaluronique commercial avec et sans microbilles (N°10), à 37°C Taux de Viscosité dynamique HA sans Viscosité dynamique HA avec cisaillement (par seconde) microbilles (mPa.$) microbilles (mPa.$) 1 32 33 10 3,7 3,7 HA : Acide hyaluronique ; 5 MB : Microbille Exemple 6 - Stabilité des billes au stockage et injectabilité Les microbilles d'hydrogel préparées à l'aide des solutions de réticulation N°6a, 6c, 8b, 8c, 10, 11 et 12 de l'exemple 2 sont conservées à 4°C dans une solution aqueuse. 10 Après une durée de stockage de 3 et 6 mois, leur aspect, leur diamètre moyen en nombre et leur distribution de taille, mesurées selon les méthodes de la description, sont inchangés. Les microbilles sont injectables sans difficulté à travers une aiguille fine, et conservent sensiblement leurs caractéristiques de taille après injection. REVENDICATIONS1.- Microbille d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane, au moins un composé polyphosphate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 85% en masse, d'hydrogel, ladite microbille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 2.- Microbille d'hydrogel, selon la revendication 1, caractérisée en ce que le D(0,9) est compris entre 100 et 950 micromètres. 3.- Microbille d'hydrogel, selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le chitosane est présent à une concentration de 0,3 à 10 % en masse, et le ou les composés polyphosphate étant présents en quantité suffisante pour former une microbille d'hydrogel, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille. 4.- Microbille d'hydrogel, selon des revendications 1 à 3, micromètres caractérisée en ce que le chitosane est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 0,5 et 5%, et de préférence entre 1,0 et 3% en masse de chitosane, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille. 5.- Microbille d'hydrogel, selon des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le composé polyphosphate est choisi parmi l'acide phytique, comme par exemple sel de sodium d'acide phytique, un tripolyphosphate, comme par exemple le tripolyphosphate de sodium, un glycérophosphate comme par exemple un beta-glycérophosphate de sodium, et l'un quelconque de leurs mélanges. 6.- Microbille d'hydrogel, selon des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est stérilisée. 7.- Procédé pour la préparation de microbilles d'hydrogel tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8.- Procédé, selon la revendication 7, caractérise en ce qu'il comprend l'ajout d'une solution de chitosane à une solution de réticulation comprenant au moins un 3029790 29 composé polyphosphate, puis la gélification du chitosane en présence de la solution de réticulation pour former les microbilles d'hydrogel. 9.- Composition pharmaceutique ou dispositif médical comprenant une pluralité 5 des microbilles telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou obtenues selon l'une quelconque des revendications 7 à 8. 10.- Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste en un fluide synovial artificiel. 10 11.- Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9 ou 10, pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie d'une articulation. 12.- Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9 ou 15 10, pour son utilisation dans le traitement de la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation ou pour ralentir la progression d'une pathologie d'une articulation. 13.- Dispositif médical, éventuellement sous forme d'un ou plusieurs kits 20 d'emballages, éventuellement séparés physiquement, comprenant une seringue, une aiguille et une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, ladite seringue comprenant un réservoir éventuellement pré-rempli de la composition pharmaceutique ou dispositif médical précité. 25 14.- Dispositif médical selon la revendication 13 pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie articulaire comprenant l'injection d'une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 par voie intra-articulaire. 30 15.- Utilisation de microbilles telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou obtenues selon l'une quelconque des revendications 7 à 8 pour modifier les propriétés, en particulier les propriétés mécaniques, d'un viscosupplément par exemple injectable au niveau d'une articulation. 35