Brevet FR3023925A1 — publié le 20160122

« Système de trajectographie automatique pour microscope optique basé sur une caméra rapide intelligente» La présente invention se situe dans le domaine des systèmes de trajectographie 3D pour microscope optique. Plus particulièrement, mais de manière non limitative, la présente invention se rapporte au domaine des microscopes à fluorescence. Ce type de microscope utilise une source excitatrice dont le spectre est adapté au type de fluorescence recherché et au type d'échantillon. Cette source est généralement une lampe à arc, une Diode Electro Luminescente (LED) ou un Laser. La source excitatrice éclaire tout ou partie de l'échantillon à imager qui absorbe les photons correspondants et émet à son tour des photons à une longueur d'onde différente. Cette fluorescence est ensuite collectée par le microscope et détectée par un capteur photosensible. Les microscopes à fluorescence sont généralement également équipés d'une seconde source, souvent de type lumière blanche, permettant d'observer pour le même échantillon une image par contraste de transmission. Il existe de nombreuses sources de dérive dans un microscope : thermiques, mécaniques, optiques, électroniques... Elles sont dues à l'instrument lui-même mais aussi à son fonctionnement et au type d'échantillon imagé. Ces dérives sont à l'origine d'une perte de résolution, de focus et/ou de positionnement de l'échantillon sous le microscope optique. Ces effets sont d'autant plus importants que la durée d'acquisition est grande. Or, dans le domaine de l'imagerie du vivant - et notamment en microscopie par fluorescence - les durées d'imagerie peuvent atteindre plusieurs heures lorsqu'on souhaite mettre en évidence l'évolution d'un phénomène biologique par exemple. Par ailleurs, il est nécessaire d'acquérir une succession d'images à différentes profondeurs Z pour réaliser une acquisition 3D des objets. Comme très souvent dans le domaine biologique, pour avoir une information d'intérêt (co-localisation, interaction de protéines...), les cellules sont marquées à différentes couleurs afin de mettre en évidence plusieurs phénomènes simultanément. Il est alors nécessaire d'acquérir autant d'images que de marqueurs pour chaque FBN P14 PHO CRI - 2 profondeur, ce qui rallonge encore le temps total d'imagerie et donc l'impact des phénomènes perturbants sur la mesure. Un système de maintien de focus est nécessaire dans tout type de microscope automatisé afin de compenser ces effets de dérives dans le temps. Ce système permet ainsi de bénéficier d'une mise au point parfaite sur l'échantillon quels que soient les changements mécaniques ou thermiques qui se produisent au niveau de la colonne optique du microscope. Il existe aujourd'hui deux approches pour réaliser ce maintien de focus : une, logicielle, basée sur le traitement de piles d'images de fluorescence acquises à différents plans et une, matérielle, basée sur un dispositif de contrôle de la position de la lamelle couvre-objet. Les méthodes logicielles de traitement de piles d'images recherchent l'image de la pile offrant le meilleur contraste sur une zone d'intérêt. Ces méthodes présentent deux grandes limitations : plusieurs images étant nécessaires à la détermination du plan focal, elles sont très lentes et ralentissent considérablement le taux de rafraichissement du microscope. Par ailleurs, le plan focal ainsi déterminé est celui qui offre le meilleur contraste sur l'image et ne correspond pas nécessairement au plan dans lequel se situe le phénomène de fluorescence que l'on souhaite imager. Les méthodes matérielles sont basées sur des dispositifs de contrôle de la position de la lamelle couvre-objet via la mesure d'un signal optique réfléchi. Un premier dispositif consiste à faire réfléchir un demi-cercle de lumière infrarouge provenant d'une LED à 870 nm sur la lamelle observée et projeter cette réflexion sur un capteur CCD linéaire afin de déterminer la position de la lamelle. Le signal ainsi généré au niveau du capteur CCD est ensuite utilisé pour asservir l'axe Z du microscope. La précision obtenue sur la position du plan focal est inférieure au tiers de la profondeur focale de l'objectif. La bande passante d'un tel dispositif est de l'ordre de 200Hz. Un second dispositif consiste à projeter une grille sur la lamelle observée, ladite lamelle agissant comme une surface réfléchissante. L'image réfléchie de cette grille est ensuite interceptée par une caméra qui est orientée en FBN P14 PHO CRI -3 biais par rapport audit faisceau réfléchi. De cette manière, seulement une petite portion de la grille réfléchie est nette sur la caméra. En cas de dérive thermique au niveau de la colonne optique du microscope, la position relative de la réflexion de la grille sur la caméra change. Un système d'asservissement compense alors cette dérive suivant l'axe Z du microscope jusqu'à ce que ladite réflexion de la grille soit à nouveau nette. Les systèmes connus de mise au point automatique dynamiques basés sur le traitement temps réel d'un signal de réflexion d'un spot LED sur la lamelle couvre-objet présentent deux grandes limitations : C'est seulement la position de la lamelle couvre-objet qui est mesurée et contrôlée, et non pas la zone d'intérêt à imager de l'échantillon. Ces dispositifs sont ainsi tout à fait adaptés pour compenser des dérives thermiques inhérentes à la mécanique du microscope. En revanche, ils sont aveugles à tout phénomène de dérive à l'intérieur même de l'échantillon, ce qui est fort fréquent dans le cas d'échantillons biologiques. Plus précisément, ces dispositifs ne permettent pas de corriger les dérives ou mouvements parasites qui se produisent entre la lamelle couvre-objet et l'échantillon (mouvement naturel à l'intérieur d'une cellule vivante, échauffement local induit par la fluorescence...) et il est donc tout à fait possible de perdre le plan focal au bout de plusieurs minutes d'acquisitions sans que ce type de système de mise au point dynamique ne s'en rende compte. Par essence, l'algorithme de correction temps réel utilisé est généralement très simple et n'intègre pas d'historique d'état dans la correction apportée : le signal de correction envoyé au système d'asservissement du plan focal ne dépend que de la mesure actuelle sans intégrer les valeurs précédentes. Il n'est pas non plus prédictif. Par ailleurs, les systèmes connus actuels ne permettent pas de contrôler la position de l'échantillon dans le plan XY. Une dérive latérale de la colonne optique du microscope ou un mouvement parasite de l'échantillon dans l'une des directions X ou Y n'est ni mesuré ni compensé. Ainsi, dans le domaine de la micromanipulation et notamment pas voie optique, les systèmes actuels ne réalisent que des tâches de maintien de l'objet dans FBN P14 PHO CRI -4 une position prédéterminée grâce à une pince optique. La position de la pince peut éventuellement être modifiée en fonction de l'observation de l'objet par le microscope. Mais si l'objet se déplace ou dérive à une vitesse trop élevée par rapport au taux de rafraîchissement du système de mise au point automatique dynamique (200 Hz) alors ledit objet ne pourra pas être « rattrapé » par la pince optique. La présente invention a pour objet de répondre au moins en grande partie au problème précédent et de conduire en outre à d'autres avantages. Un but de l'invention est de proposer un système de mise au point 10 dynamique capable de détecter des pertes de focus plus soudaines de l'échantillon. Un autre but de l'invention est de proposer un système d'asservissement latéral de l'échantillon. Un autre but de l'invention est d'augmenter la bande passante du système 15 d'asservissement en focus et/ou en position. On obtient au moins l'un des objectifs précités avec un système de trajectographie pour microscope optique comprenant une caméra rapide placée au niveau du plan image dudit système optique et apte à détecter une zone d'intérêt dudit échantillon, une source de lumière apte à éclairer 20 au moins une partie de l'échantillon et au moins une unité de contrôle programmée pour calculer des informations spatiales de ladite zone d'intérêt de l'échantillon. On dispose ainsi d'un dispositif capable d'imager des phénomènes physiques et/ou biologiques plus rapides qui ne sont pas correctement 25 enregistrables aux cadences vidéo traditionnelles, de l'ordre de 25 images par seconde. Ces enregistrements à haute fréquence peuvent notamment être réalisés via un contraste en transmission, permettant des temps d'intégration plus courts que le contraste de fluorescence. Selon un autre aspect de l'invention, l'unité de contrôle peut asservir au 30 moins la mise au point dudit système optique et/ou la position de la zone d'intérêt de l'échantillon à l'aide de la caméra rapide et desdites informations spatiales calculées. Il est ainsi possible de contourner les défaillances des systèmes connus jusqu'alors. Elle peut permettre FBN P14 PHO CRI -5 d'enregistrer des images d'une zone d'intérêt de l'échantillon - et non pas une face réfléchissante de la lamelle couvre-objet - à une fréquence d'échantillonnage et avec un niveau de contraste suffisants pour asservir le microscope en focus et/ou en position. La caméra rapide peut permettre d'acquérir entre 2 et 20 fois plus d'images qu'une caméra traditionnelle et de les exploiter pour asservir le microscope en focus et/ou en position. Ainsi la présente invention propose un dispositif apte à acquérir des images suffisamment détaillées et suffisamment rapidement pour être exploitées dans une boucle d'asservissement de la platine de translation qui supporte l'échantillon. De cette manière, l'asservissement est réalisé sur la zone d'intérêt imagée, et non pas sur un capteur situé dans ladite platine comme c'était le cas auparavant. D'un point de vue métrologique, la présente invention répond de manière plus juste à la problématique de contrôle et de et garantit la stabilité de l'image enregistrée (en focus et en bougé). Selon un autre aspect de l'invention, la fréquence d'échantillonnage de ladite caméra rapide peut être d'au moins 100 Hz. Selon un autre aspect de l'invention, ladite caméra rapide peut imager ledit échantillon en transmission. Selon un autre aspect de l'invention, l'unité de contrôle peut être intégrée à la caméra rapide pour asservir la mise au point et/ou la position de ladite zone d'intérêt de l'échantillon et afin de minimiser le temps de traitement des informations enregistrées par ladite caméra et - in fine - d'augmenter la bande passante du système d'asservissement. Selon un autre aspect de l'invention, ladite au moins une unité de contrôle programmée pour asservir la mise au point et/ou la position de ladite zone d'intérêt de l'échantillon peut être un réseau programmable, un microprocesseur, une carte graphique ou un ASIC afin d'augmenter la bande passante du système d'asservissement et la fiabilité dudit système d'imagerie automatique. Selon un autre aspect de l'invention, l'unité de contrôle et/ou la caméra rapide peuvent fonctionner en temps réel. De cette manière, le temps nécessaire au traitement des informations nécessaires pour FBN P14 PHO CRI -6 l'asservissement en position et/ou en focus est déterministe et l'asservissement dudit microscope est plus robuste et plus performant. Selon un autre aspect, l'invention peut comprendre en outre au moins un système optique apte à réaliser la mise au point sur un échantillon afin d'automatiser ces opérations. Selon un autre aspect de l'invention, la source de lumière peut être une source LED pulsée apte à illuminer au moins une partie de l'échantillon et afin d'augmenter le contraste sur cette zone. Selon un autre aspect de l'invention, la source de lumière peut être synchronisée avec ladite caméra rapide pour améliorer les conditions d'éclairement de l'échantillon et le contraste de l'image utilisée pour l'asservissement, sans perturber un éventuel autre mode d'imagerie du microscope optique utilisé. Selon un autre aspect de l'invention, ladite caméra rapide peut acquérir de façon séquentielle une série d'images utilisées pour réaliser ledit asservissement avec un premier temps d'intégration d'une part, et au moins une image scientifique avec un second temps d'intégration d'autre part. Selon un autre aspect de l'invention, la mise au point et la position de l'échantillon peuvent être ajustées durant l'acquisition de ladite au moins une première série d'images afin de parfaire la mise au point et/ou la position de la zone d'intérêt de l'échantillon sous le microscope entre deux acquisitions d'images scientifiques et d'améliorer la résolution desdites images scientifiques. Selon un autre aspect de l'invention, le système d'imagerie automatique pour de la microscopie optique peut comprendre en outre un capteur optique, notamment apte à imager les phénomènes de fluorescence. L'utilisation d'un second capteur optique, en plus de la caméra rapide, peut permettre de dissocier l'acquisition - rapide - des images utilisées pour asservir le microscope, de celles acquises à des fins scientifiques et pour lesquels le temps d'intégration est plus long - ne permettant pas de réaliser un tel asservissement en focus et/ou en position. Selon un autre aspect de l'invention, ladite caméra rapide et ledit capteur optique peuvent fonctionner en parallèle : l'acquisition de la caméra rapide FBN P14 PHO CRI -7 se superpose de manière autonome et indépendante de l'acquisition scientifique afin d'implémenter facilement et à moindre coûts la présente invention sur des dispositifs existants. Par ailleurs, la bande passante du système d'asservissement est - dans ce cas - accrue. Selon un autre aspect de l'invention, la fréquence d'échantillonnage de ladite caméra rapide peut être au moins dix fois supérieure à celle dudit capteur optique afin d'obtenir les fréquences d'échantillonnage nécessaires pour un asservissement de qualité (fiable et robuste). Selon un autre aspect de l'invention, les informations spatiales utilisées pour l'asservissement en focus et/ou en position dudit échantillon peuvent être du type détection du maximum de corrélation avec une image de référence par ladite caméra rapide. Ce premier critère de ressemblance est facilement calculable et exploitable à haute fréquence pour être ensuite utilisé dans la boucle d'asservissement pour rétroagir sur la platine de translation et/ou sur le système optique. Selon un autre aspect de l'invention, les informations spatiales utilisées pour l'asservissement en focus et/ou en position dudit échantillon peuvent être du type détection du maximum de contraste par ladite caméra rapide. Ce second critère de ressemblance est facilement calculable et exploitable à haute fréquence pour être ensuite utilisé dans la boucle d'asservissement pour rétroagir sur la platine de translation et/ou sur le système optique. Selon un autre aspect de l'invention, le système de trajectographie pour microscope optique peut comprendre en outre une source de lumière excitatrice apte à faire fluorescer ledit échantillon afin de mettre en 25 évidence notamment certains phénomènes physiques et/ou biologiques. Selon un autre aspect de l'invention, le système d'imagerie automatique pour de la microscopie optique peut comprendre en outre au moins une pince optique apte à manipuler ledit échantillon. Selon un autre aspect de l'invention, le système d'imagerie automatique 30 pour de la microscopie optique peut comprendre en outre au moins un procédé selon lequel le focus est corrigé durant l'acquisition de l'au moins une série d'image enregistrées à hautes fréquence par la caméra rapide et FBN P14 PHO CRI _g sur la base desquelles l'unité de contrôle détermine une information spatiale utilisée pour l'asservissement dudit focus. Selon d'autre aspect avantageux, l'invention comprend un procédé d'acquisition vidéo d'images scientifiques stabilisées comprenant les étapes itératives (i) d'enregistrement d'une image première scientifique avec un premier temps d'intégration, (ii) enregistrement d'une série d'images à haute fréquence, (iii) détermination d'un critère de ressemblance à partir de la série d'images, (iv) calcul des paramètres correctifs en position et/ou focus, (y) correction du focus et/ou de la position par ledit système optique et/ou une platine de translation, (vi) enregistrement de l'image scientifique suivante. Selon d'autres caractéristiques avantageuses, l'invention peut concerner en outre l'utilisation d'un dispositif de trajectographie pour microscope optique afin de réaliser de la reconstruction 3D d'objets mesurés par ledit microscope. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront encore au travers de la description qui suit d'une part, et de plusieurs exemples de réalisation donnés à titre indicatif et non limitatif en référence aux dessins schématiques annexés d'autre part, sur lesquels : - La figure 1 illustre de manière schématique un microscope suivant la présente invention, dans une configuration à un seul capteur photosensible ; - La figure 2 illustre de manière schématique un microscope suivant la présente invention, dans une configuration à deux capteurs photosensibles ; - La figure 3 illustre de manière schématique le système d'asservissement de suivant la présente invention ; - La figure 4 illustre un chronogramme selon un premier mode de réalisation de la présente invention ; - La figure 5 illustre un chronogramme selon un seconde mode de réalisation de la présente invention ; - La figure 6 illustre un mode de réalisation de la présente invention pour un asservissement du focus. FBN P14 PHO CRI -9 Ces modes de réalisation étant nullement limitatifs, on pourra notamment considérer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites par la suite de manière isolées (même si cette sélection est isolée au sein d'une phrase comprenant d'autres caractéristiques), si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure. Cette sélection comprend au moins une caractéristique de préférence fonctionnelle sans détails structurels, et/ou avec seulement une partie des détails structurels si cette partie uniquement est suffisante pour conférer un avantage technique ou à différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure. La figure 1 schématise un microscope 1 selon l'invention. Il s'agit d'une vue schématique non limitative dans laquelle l'image d'un échantillon 9 posé entre une lame de microscope 6 et une lamelle couvre-objet 7 est amplifiée par un jeu d'objectifs 8. L'échantillon est porté par une platine de translation 17 à au moins un axe et qui peut être motorisée. L'image ainsi obtenue est formée sur un capteur optique 12 qui peut être une caméra ou n'importe quel autre type de capteur photosensible sans restreindre la protection revendiquée. Selon un premier mode de réalisation, le capteur photosensible 12 est une caméra rapide. Une caméra rapide est une caméra qui est capable d'acquérir des images à des cadences supérieures aux flux vidéo classiques (environ 30 images par secondes). Typiquement, on parle de caméra rapide pour des fréquences au moins supérieures à 100 images par secondes. En tant que tel, la caméra rapide est bien connue de l'homme du métier et ne constitue pas, en tant que tel, l'objet de la présente invention. Dans le cas particulier de la microscopie de fluorescence, une source de lumière excitatrice 3 complète le dispositif. Il s'agit généralement d'une source laser à large bande ou à bande étroite, dont les longueurs d'ondes peuvent se situer dans les ultra-violets ou dans les gammes de longueur d'onde correspondant au spectre visible, soit entre 200 et 600 nm. D'une manière générale, la source excitatrice 3 peut prendre n'importe quelle forme et produire un rayonnement de n'importe quel type. La source excitatrice est apte à exciter ledit échantillon et à le faire fluorescer en FBN P14 PHO CRI - 10 - réponse à ce stimulus. Pour ce faire, le faisceau incident 14 est focalisé sur l'échantillon 9 à l'aide par exemple dudit jeu d'objectifs 8. La zone d'interaction 10 absorbe l'énergie lumineuse incidente et fluoresce à une longueur d'onde généralement différente. Cette lumière 15 émise par l'échantillon 9 en réponse à l'excitation est captée par le jeu d'objectifs 8 et renvoyée vers le capteur optique 14 par le biais par exemple d'un jeu d'optiques semi-réfléchissantes 4, 5 et/ou de miroir(s) réfléchissant(s) 16. Les images ainsi renvoyées par ce dispositif, en réponse à une excitation lumineuse, sont représentatives d'un phénomène physique et/ou biologique d'intérêt et sont appelées « images scientifiques » par la suite. Eventuellement, le dispositif 1 peut être complété par une source d'éclairage secondaire 2 qui illumine tout ou partie de l'échantillon 9. Cette source de lumière secondaire 2 peut éclairer l'échantillon 9 en transmission comme représenté sur la figure 1 ou suivant tout autre mode alternatif - notamment en réflexion - sans porter atteinte à la protection recherchée. La source de lumière secondaire peut être de n'importe quel type et produire un spectre de lumière de tout type, aussi bien large bande que selon une bande dite étroite. De manière préférentielle, mais non exclusive et non limitative de la protection revendiquée, la source de lumière secondaire peut être une source laser pulsée, à l'aide d'une Diode Electro Luminescente par exemple, et à une longueur d'onde supérieure à 800 nm afin de ne pas parasiter les phénomènes de fluorescence et/ou d'interaction lumineuse générés au niveau de l'échantillon. La lumière secondaire ainsi générée est captée de la même façon que la lumière excitatrice 14 par le jeu d'objectifs 8 et - au travers des optiques semi-réfléchissantes 4 atteint le capteur photosensible 12. Dans le cas d'une configuration à deux caméras, comme illustré sur la figure 2, le capteur photosensible 12 est constitué d'une caméra rapide tandis que le détecteur photosensible 11 est une caméra sensible aux phénomènes d'interaction lumineux générés au niveau de l'échantillon et dont les fréquences d'échantillonnage sont généralement moindres. Par la suite, on appellera cette caméra la « caméra scientifique ». Une combinaison d'optiques semi-réfléchissantes 4, 5 permet d'orienter une partie du flux lumineux 13 vers la caméra rapide 12 et une autre partie du FBN P14 PHO CRI - 11 - flux lumineux 15 vers la caméra scientifique 11. Généralement, mais non limitativement, la caméra scientifique 11 n'est pas une caméra rapide car sa sensibilité aux longueurs d'ondes émises par l'échantillon 9 excité par la source de lumière excitatrice 3 est insuffisante ; a contrario, il s'agit généralement d'une caméra sensible aux longueurs d'ondes visibles et inférieures à 780 nm et dont la sensibilité est supérieure à celle des caméras rapides. Cette configuration à deux caméras est avantageuse car elle permet de bénéficier des avantages de la présente invention sur des microscopes à fluorescence pré-existant, en complétant ces dispositifs par l'ajout d'une caméra rapide et des dispositions suivantes relatives à l'asservissement de l'échantillon et/ou de la mise au point. En effet, la présente invention concerne aussi un dispositif d'asservissement du plan focal sur une zone d'intérêt 10 de l'échantillon 9 et de la position dudit échantillon, comme illustré sur la figure 2. En référence à la figure 3, les systèmes précédemment décrits peuvent avantageusement être complétés par une unité de contrôle2l programmée pour contrôler la position relative de l'échantillon 9 par rapport au jeu d'objectifs 8 et/ou la mise au point. Ladite unité de contrôle peut avantageusement être un réseau logique programmable (FPGA...) ou tout autre dispositif apte à être programmé 21 pour réaliser un automatisme (carte graphique, processeur, DSP...). Tous ces dispositifs 21 sont - en tant que tels - bien connus de l'homme du métier. Le contrôle s'entend ici comme toute forme d'asservissement - régulation ou asservissement - et par n'importe quelle forme d'algorithme (proportionnel, proportionnel- intégrateur, proportionnel-intégrateur-dérivateur...). La régulation s'entend comme un asservissement à consigne fixée et constante au cours du temps, le système compensant les effets de perturbation. En l'espèce, il peut s'agir de la régulation du système de mise au point : consigne étant donnée de placer le focus à un certain plan focal correspondant à une zone d'intérêt de l'échantillon 9, l'automate compense tous les phénomènes perturbants (dérives thermiques, mouvements parasites...) qui éloignent le plan focal de cette position prédéterminée. L'asservissement quant à lui s'entend d'un système dit suiveur, pour lequel la consigne varie en temps réel en fonction des données capteurs mises à jour régulièrement. En l'espèce, les données FBN P14 PHO CRI - 12 - acquises par la caméra rapide 12 sont exploitée en ce sens par l'unité de contrôle 21 afin de compenser les phénomènes perturbants en rétroagissant sur la platine de translation motorisée 17 pour corriger la position de la zone d'intérêt 10 sous le microscope 1 et/ou sur le jeu d'objectifs8 pour en corriger le focus. A la différence de la régulation, ce système mesure et compense les phénomènes perturbants alors qu'un déplacement peut être imposé pour suivre une particule mobile dans les trois directions de l'espace par exemple. Avantageusement, l'utilisation d'un réseau programmable pour réaliser ledit asservissement permet une transcription matérielle des fonctions logiques. Par conséquent, l'automate est temps réel et procure une meilleure fiabilité audit dispositif. En effet, un automate temps réel est déterministe : il répond aux évolutions et aux sollicitations de l'environnement avec lequel il est en relation en un temps déterminé et constant. Les données scientifiques mesurées par la caméra scientifique 11 sont transmises vers un ordinateur 20 ou tout terminal disposant d'une interface graphique. Elles peuvent aussi être stockées sur une mémoire interne à la caméra et transférée ensuite sur un support mobile, type clef usb, dvd... Les figures 4, 5 et 6 décrivent de manière schématique les deux principaux modes de fonctionnement de la présente invention. La figure 4 décrit un chronogramme simplifié qui illustre un mode de réalisation avec deux caméras fonctionnant en parallèle comme décrit dans la figure 2. La première caméra est la caméra scientifique 11 apte à réaliser de l'imagerie de fluorescence sur des échantillons 9 naturellement fluorescents ou marqués par des fluophores. L'excitation des échantillons 9 se fait par le biais d'une source d'éclairage principal non représentée dont la longueur d'onde se situe dans l'UV ou le visible entre 200 nm et 600 nm. La lumière fluorescée par l'échantillon se situe, quant à elle, dans une gamme de longueur d'onde comprise par exemple entre 400 et 780 nm. La sensibilité de la caméra scientifique 12 est optimale pour cette gamme de longueur d'onde. La seconde caméra est la caméra rapide 12 intégrant par exemple un capteur CMOS ou sCMOS qui a une sensibilité accrue. Elle est apte à FBN P14 PHO CRI - 13 - détecter une image en transmission de l'échantillon 9, éclairé par une source lumineuse secondaire 2 dont la longueur d'onde n'interfère pas avec les gammes de longueur d'ondes exploitées par la caméra scientifique 11. Par exemple, la caméra rapide acquiert des images en transmission avec une lumière intense décalée dans le rouge afin d'obtenir un contraste suffisant. Typiquement, mais de manière non limitative, la source d'éclairage secondaire 2 est une Diode Electro Luminescente qui émet à 800 nm. Elle peut en outre intégrer un réseau logique programmable 21 qui permet de traiter les images en temps réel et de délivrer à haute fréquence des données pour la boucle d'asservissement de la platine de translation 17 et/ou le microscope 1. Selon ce premier mode de réalisation avec deux caméras, la caméra scientifique 11 réalise des enregistrements vidéo à une fréquence typiquement proche de 25 images par secondes. Afin de détecter des phénomènes de fluorescences très peu lumineux, les temps d'intégration de la caméra scientifique 11 sont nécessairement allongés, de l'ordre de 30 ms par exemple. Les blocs 30a, 30b, 30c du chronogramme représentent ces périodes d'enregistrement d'une image par la caméra scientifique 11 durant le flux vidéo. L'intervalle 33a, 33b, 33c entre deux images est donc de l'ordre de 10 ms. La caméra rapide 12, quant à elle, enregistre des images à plus haute fréquence, typiquement à environ 500 images par secondes. Le temps d'intégration de ces caméra doit être suffisant pour obtenir un niveau de détail et de contraste sur l'image suffisant pour calculer un critère de ressemblance qui est utilisé dans un algorithme d'asservissement (par détection du maximum de contraste ou du maximum de corrélation par exemple). Il n'est pas nécessaire d'obtenir la même résolution et le même niveau de détail que sur la caméra scientifique 11. C'est la raison pour laquelle le temps d'intégration de la caméra rapide 12 est inférieur, typiquement de l'ordre de 1 ms afin de pouvoir enregistrer au moins dix images pour chaque image enregistrée par la caméra scientifique 11. Ces images sont ensuite traitées par l'unité de contrôle 21 pour déterminer le paramètre qui servira de rétro-contrôle sur les différents axes de la platine de translation 17 et/ou du microscope 1 qui sont ainsi asservis. Cet asservissement est réalisé durant la période inter-image 33a, 33b, 33c au FBN P14 PHO CRI - 14 - cours de laquelle les commandes spécifiques sont envoyées aux actionneurs afin de corriger les positions dans l'espace de l'échantillon 9 et/ou le focus. La figure 5 illustre un chronogramme pour un autre mode de réalisation de la présente invention avec une seule caméra, préférentiellement la caméra rapide 12 comme illustré dans la figure 1. Il s'agit d'un mode d'imagerie séquentielle pour lequel l'imagerie rapide et l'imagerie scientifique sont assurées par la même caméra. Le chronogramme illustre une séquence d'enregistrement hybride au cours de laquelle des séquences d'enregistrement rapides se succèdent à d'autres plus lentes. En effet, il est nécessaire d'adapter le temps d'intégration de la caméra 12 en fonction de la destination des images enregistrées. S'il s'agit d'images scientifiques30a, 30b, 30c, alors il est nécessaire d'obtenir suffisamment de détails pour qu'elles soient exploitables. Dans ce cas, le temps d'intégration de la caméra rapide 12 est allongé, par exemple à 30 ms. Durant l'intervalle entre deux images scientifiques, une série d'images 34a, 34b, 34c est enregistrée en rafale et à plus haute fréquence. Ces images sont utilisées par l'unité de contrôle 21 pour asservir en position et/ou en focus l'échantillon 9 sous le microscope 1. Afin d'obtenir suffisamment d'images pour cet asservissement, il est nécessaire d'augmenter la fréquence d'échantillonnage, au détriment du temps d'intégration et du niveau de détails enregistrés. L'important n'est pas, là encore, d'enregistrer des images suffisamment détaillées pour qu'elles soient exploitables d'un point de vue scientifique, mais uniquement le niveau de détail suffisant pour obtenir suffisamment de contraste et/ou de détails pour calculer un critère de ressemblance et faire fonctionner un algorithme basé par exemple sur la détection du maximum de contraste ou de corrélation. A titre d'exemple, mais de manière non limitative, le temps d'intégration des images 34a, 34b, 34c est de l'ordre de 1 ms. Enfin, lorsque suffisamment d'images rapides ont été enregistrées, l'unité de contrôle 21 peut piloter la platine de translation 17 et/ou le jeu d'objectifs 8 afin d'ajuster la position et/ou le focus de l'échantillon 9 par rapport au microscope 1 afin de compenser les éventuelles dérives et mouvements parasites qui auraient ainsi été détectés. FBN P14 PHO CRI - 15 - Ainsi, le mode de réalisation d'imagerie séquentielle à une seule caméra offre des fréquences d'échantillonnage d'imagerie scientifique légèrement moins hautes que dans le cas du premier mode de réalisation à deux caméras en parallèle. Typiquement, cette fréquence d'échantillonnage d'imagerie scientifique est de l'ordre de 20 images par secondes. Il offre cependant l'avantage de n'utiliser qu'une seule caméra rapide, les coûts sont donc réduits et l'intégration optique sur le microscope est facilitée. Alternativement, afin d'augmenter les niveaux de contrastes et de détails, il peut être nécessaire de compléter le dispositif précédent par des éclairages pulsés et synchronisés : durant les périodes 40 d'acquisition d'images scientifiques, la source d'éclairage 3 illumine l'échantillon 9 afin de le faire fluorescer ; et la source d'éclairage secondaire 2 est éteinte. Durant l'intervalle suivant où les images enregistrées servent à corriger la position et/ou le focus de l'échantillon 9, la source excitatrice 3 est éteinte et la source secondaire 2 illumine l'échantillon afin d'augmenter le contraste de la zone d'intérêt 10 sur laquelle l'unité de contrôle 21 réalise l'asservissement. La figure 6 illustre un autre chronogramme pour un mode de réalisation particulier de l'invention et qui concerne le maintien de focus durant l'imagerie d'une zone d'intérêt 10 sur un échantillon 9. L'objectif résolu par la présente invention est ici de garder dans le plan focal une zone particulière d'intérêt 10 repérée en début d'observation durant toute la durée de l'observation. Entre deux images scientifiques 30a et 30b enregistrées au cours d'un flux vidéo, une série d'images rapides 34 sont enregistrées à plus haute fréquence, comme décrit précédemment. Durant cette phase d'imagerie rapide, la position verticale de l'échantillon 9 est modifiée autour de la position d'origine afin de réaliser des images à plusieurs altitudes et de déterminer ainsi le meilleur plan focal réajusté. La détermination du meilleur plan focal parmi la série d'images rapides ainsi enregistrées est réalisée durant l'intervalle 35 en maximisant une fonction (un critère de ressemblance) - par exemple de contraste ou de corrélation par rapport à la première image réalisée en début d'observation. La nouvelle position verticale, correspondant au meilleur plan focal, est ainsi calculée en temps réel entre deux images scientifiques 30a et 30b. Puis la mise au point est FBN P14 PHO CRI - 16 - ajustée en déplaçant le jeu d'objectifs 8 ou la platine de translation 17 vers la nouvelle position ainsi calculée. La réduction des temps d'intégration durant l'imagerie rapide qui sert à l'asservissement est compensée par un éclairage secondaire plus puissant. De cette façon, le système corrige les erreurs de dérive du plan focal durant l'observation microscopique et le flou de bougé est ainsi minimisé. Par rapport à l'état de l'art connu, et notamment les approches logicielles d'autofocus, la présente invention est beaucoup plus rapide car elle repose sur l'utilisation nouvelle d'une caméra rapide. Par ailleurs, elle permet de réaliser la mise au point sur l'objet d'intérêt 10 qui est réellement imagé plutôt que sur une zone de référence décorrélée de ladite zone d'intérêt. D'un point de vue métrologique, la présente invention est plus juste et plus fiable Alternativement, le dispositif peut être complété par un moyen de manipulation micrométrique de l'échantillon dans le champ optique du microscope. Ce moyen peut être, par exemple, composé de pinces optiques - bien connues de l'homme du métier - afin de manipuler au moins une partie de l'échantillon 9 de manière non invasive et sans contact. L'invention concerne aussi le domaine de la reconstruction 3D d'objet par microscopie optique pour laquelle une succession d'images d'un même objet sont réalisées à différentes plans focaux afin de les recombiner et d'obtenir une image nette de l'objet ainsi imagé sur toute sa hauteur. La présente invention peut ainsi permettre de réaliser de telles acquisitions avec une meilleure précision et à plus grande vitesse. La présente invention peut inclure certaines techniques de co-localisation pour lesquelles des mesures de plusieurs grandeurs physiques sont réalisées à l'aide d'un instrument sur un même objet. Par exemple, dans le domaine de la microscopie optique, il peut être intéressant de conjuguer des mesures de fluorescences avec de certains marqueurs avec une image optique « classique » afin de mettre en évidence l'étendue spatiale d'un phénomène donné. La présente invention permet ainsi de réaliser cette colocalisation dans de meilleures conditions puisqu'elle garantit que le focus et/ou la position de l'objet mesuré soit stable dans le champs du microscope. FBN P14 PHO CRI - 17 - Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui ont été décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS1. Système de trajectographie pour microscope optique (1) caractérisé en ce qu'il comprend une caméra rapide (12) placée au niveau du plan image d'un système optique (8) et apte à détecter une zone d'intérêt (10) d'un échantillon (9), une source de lumière (2) apte à éclairer au moins une partie de l'échantillon (9) et au moins une unité de contrôle (21) programmée pour calculer des informations spatiales de ladite zone d'intérêt (10) de l'échantillon (9). 2. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon la 10 revendication précédente, caractérisé en ce que l'unité de contrôle (21) réalise en outre l'asservissement d'au moins la mise au point dudit système optique (8) sur la zone d'intérêt (10) de l'échantillon (9) à l'aide de la caméra rapide (12) et desdites informations spatiales calculées. 3. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une 15 quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'unité de contrôle (21) est programmée en outre pour asservir la position de la zone d'intérêt (10) de l'échantillon (9) à l'aide de la caméra rapide (12) et desdites informations spatiales calculées. 4. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une 20 quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'au moins une unité de contrôle (21) est intégrée à la caméra rapide (12). 5. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ladite au moins une unité de contrôle (21) est un réseau programmable, un 25 FPGA, un processeur, une carte graphique ou un ASIC. 6. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'unité de contrôle (21) et/ou la caméra rapide (12) fonctionnent en temps réel. 7. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une 30 quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il- 19 - comprend en outre au moins un système optique (8) apte à réaliser la mise au point sur un échantillon (9). 8. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source de lumière (2) est une source LED pulsée. 9. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source de lumière (2) est synchronisée avec la caméra rapide (12). 10. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite caméra rapide (12) intègre de façon séquentielle : - au moins une première série d'images (34) avec un premier temps d'intégration, lesdites images étant utilisées pour réaliser ledit asservissement en focus et/ou position, - au moins une image scientifique (30) avec un second temps d'intégration. 11. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la mise au point et/ou la position de l'échantillon (9) sont ajustées de manière synchrone avec l'acquisition de ladite au moins une première série d'images (34). 12. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un capteur optique (11). 13. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ladite caméra rapide (12) et ledit capteur optique (11) fonctionnent en parallèle. 14. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites informations spatiales utilisées pour l'asservissement en focus- 20 - et/ou en position dudit échantillon (9) sont du type détection du maximum de corrélation avec une image de référence par ladite caméra rapide. 15. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications là 13, caractérisé en ce que lesdites informations spatiales utilisées pour l'asservissement en focus et/ou en position dudit échantillon (9) sont du type détection du maximum de contraste par ladite caméra rapide. 16. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une source de lumière excitatrice (3) apte à faire fluorescer ledit échantillon (9). 17. Système de trajectographie pour microscope optique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une pince optique apte à manipuler ledit échantillon (9). 18. Procédé de trajectographie pour microscope optique (1) mettant en oeuvre le système de trajectographie selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le focus est corrigé durant l'acquisition de ladite au moins une série d'image (34). 19. Procédé d'acquisition vidéo d'images scientifiques stabilisées à l'aide d'un système de trajectographie selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes itératives suivantes : - enregistrement d'une image scientifique (30) avec un premier temps d'intégration, - enregistrement d'une série d'images (34) à haute fréquence, - détermination d'un critère de ressemblance à partir de la série d'images (34), - calcul des paramètres correctifs en position et/ou focus,- 21 - - correction du focus et/ou de la position par ledit système optique (8) et/ou une platine de translation (17), - enregistrement de l'image scientifique (30) suivante. 20. Utilisation du système de trajectographie selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour la reconstruction 3D d'un objet par microscopie optique.