Brevet FR3032617A1 — publié le 20160819

La présente invention a pour objet : un nouveau procédé de préparation d'un hydrogel injectable contenant de l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, réticulé par l'utilisation du 1,4-butanedioldiglycidyléther (BODE) un hydrogel obtenu selon ledit procédé de préparation l'utilisation de l'hydrogel obtenu selon ledit procédé de préparation dans les domaines de l'esthétique et de la médecine L'acide hyaluronique est un polysaccharide formé par la répétition d'une unité disaccharidique composée d'acide D-glucuronique et de N-acétylglucosamine. Sa structure est linéaire et sans spécificité d'espèce. L'acide hyaluronique est largement distribué dans les organismes vivants humains et animaux, dans lesquels il joue de nombreuses fonctions biologiques comme par exemple le contrôle du taux d'hydratation ou le maintien de la viscoélasticité de fluides ou de tissus. On le retrouve notamment en concentration élevée dans le liquide synovial, le corps vitreux de l'oeil et dans le derme. Un être humain de 70 kg possède environ 15 g d'acide hyaluronique dont la moitié est contenue dans la peau et cette quantité diminue avec le vieillissement. Les hydrogels d'acide hyaluronique sont connus et utilisés dans de larges domaines de l'esthétique et de la médecine depuis de nombreuses années. Ces gels sont, notamment, couramment injectés : dans les yeux, au cours de chirurgies ophtalmologiques, afin de maintenir l'espace intra- oculaire et protéger les tissus de l'oeil dans les articulations, en cas d'arthrose, pour supplémenter le liquide synovial déficient et restaurer temporairement les propriétés chondroprotectrices dudit liquide biologique dans ou sous la peau, afin de combler des rides ou d'augmenter le volume de certaines zones du visage ou du corps L'acide hyaluronique possède une demi-vie faible dans les organismes vivants (moins de 1 semaine). Dans le cas de nombreuses applications en esthétique et en médecine, les hydrogels injectables administrés contiennent de l'acide hyaluronique stabilisé par réticulation, ce qui permet de considérablement augmenter la durée de vie (encore appelée rémanence) de ce polysaccharide in vivo et donc la durée d'efficacité du produit injecté. Ainsi, grâce à cette modification par réticulation, un hydrogel à base d'acide hyaluronique réticulé a par exemple la capacité de combler des rides sur une période de plusieurs mois. 3032617 2 La réticulation de l'acide hyaluronique est réalisée par réaction chimique d'un réticulant avec l'acide hyaluronique. Le réticulant a alors pour but de lier les chaînes d'acide hyaluronique les unes aux autres par des liaisons covalentes. De nombreux réticulants sont actuellement utilisés pour la réticulation de l'acide hyaluronique 5 (cas de la divinylsulfone, de la biscarbodiimine ou du diépoxyoctane) mais le 1,4- butanedioldiglycidyléther (BDDE) est le réticulant le plus couramment utilisé. On le retrouve par exemple dans les dispositifs médicaux injectables de la gamme JuvédermTM (Allergan) ou RestylaneTM (Galderma) utilisés pour le comblement des rides et/ou la restauration des volumes du visage ou encore dans le dispositif médical DurolaneTM (Galderma) utilisé en intra-articulaire 10 dans le cadre du traitement de l'arthrose. Le BDDE (voir figure 1- molécule B) est considéré comme un réticulant de choix car son niveau de toxicité est faible. Ainsi, les produits à base d'acide hyaluronique réticulé au BDDE actuellement commercialisés sur le marché de l'esthétique et de la médecine sont connus pour leur haut niveau de sécurité (Ballin A.C. et al, Long-term efficacy, safety and durability of JuvédermTM XC, Clin. 15 Cosmet. Investig. Dermatol., 2013, 6:183-189). Pour illustrer ce fait, on peut également préciser que les produits réticulés au BDDE sont utilisés intensivement par les médecins depuis plus de 15 ans sans que leur haut niveau de biocompatibilité et tolérance n'ait été remis en cause. La toxicité du BDDE existe néanmoins et pour cette raison la plupart des fabricants cherchent à purifier au maximum leurs produits à base d'acide hyaluronique réticulé, en fin de procédé de 20 fabrication, afin de retirer au maximum le BDDE n'ayant pas réagi au cours de la réaction de réticulation. Sur la base des études menées par la société Ciba-Geigy et l'autorité de santé américaine FDA, les produits injectables à base d'acide hyaluronique réticulé au BDDE commercialisés sur le marché américain ont ainsi un taux de BDDE résiduel total (BDDE libre n'ayant pas réagi au cours du procédé de réticulation et subsistant dans le produit fini) inférieur à 25 2 ppm, dose calculée permettant d'abaisser le risque potentiel de cancer lié au BDDE à un niveau minimal. Dans le but d'améliorer davantage le niveau de sécurité des produits injectables contenant de l'acide hyaluronique réticulé et/ou de différencier les produits sur le plan marketing, l'homme de l'art a proposé l'utilisation de nouveaux réticulants pour la réticulation de l'acide hyaluronique ; 30 nouveaux réticulants présentés comme possédant un meilleur profil de toxicité que celui du BDDE, ceci afin de substituer le BDDE par un nouveau réticulant. On peut par exemple citer les documents suivants : 3032617 3 - WO 2014/181147 décrit un nouvel hydrogel injectable contenant de l'acide hyaluronique réticulé ; l'acide hyaluronique étant réticulé avec le trimétaphosphate WO 2012/054752 décrit un nouvel hydrogel injectable contenant de l'acide hyaluronique réticulé ; l'acide hyaluronique étant réticulé avec un agent réticulant à base de 5 polyéthylène glycol - WO 2014/064632 décrit un nouvel hydrogel injectable contenant de l'acide hyaluronique réticulé ; l'acide hyaluronique étant réticulé avec une polyamine endogène Ces solutions ne sont malgré tout pas pleinement satisfaisantes car aucune d'entre elles n'a pu démontrer qu'elle était en mesure : 10 - d'assurer un haut niveau de sécurité, c'est-à-dire de biocompatibilité et de tolérance, sur le court terme (de quelques heures à quelques mois) mais également sur le long terme (de quelques mois à plusieurs années) et ce sur plusieurs millions de patients traités partout à travers le monde et pour des indications et zones anatomiques bien différentes (peau, oeil, articulation, ...). A ce jour, cette démonstration complexe n'a été effectuée 15 qu'avec les produits réticulés au BDDE. - de permettre d'obtenir des propriétés physico-chimiques, rhéologiques/biomécaniques, de rémanence (durée de vie au niveau de la zone injectée) et de stabilité au cours de la durée de péremption répondant aux attentes des médecins afin de traiter l'ensemble des indications visées, et ce sur une période de temps considérée comme satisfaisante. De 20 même que pour la sécurité, à ce jour et contrairement aux produits réticulés au BDDE, les nouveaux réticulants proposés dans les documents décrits ci-dessus n'ont pas démontré leur efficacité clinique. Dans ce contexte, la présente invention, elle, n'a pas pour objectif de proposer un nouveau réticulant pour la réticulation de l'acide hyaluronique afin de substituer le BDDE, mais de 25 divulguer un nouveau procédé de préparation d'un hydrogel injectable contenant de l'acide hyaluronique réticulé au BDDE, ceci dans le but de permettre notamment une amélioration significative du profil de sécurité de l'hydrogel. Cette amélioration est obtenue par la neutralisation des fonctions époxydes présentes dans l'hydrogel et issues du BDDE ; fonctions chimiques susceptibles d'avoir une action délétère vis-à-vis du milieu in vivo environnant (cellules, 30 tissus, ...) après injection et donc de créer des effets indésirables à court et/ou à long terme. 3032617 4 A cet effet, l'invention a pour objet un nouveau procédé de préparation d'un hydrogel injectable contenant de l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, réticulé par l'utilisation du BDDE, caractérisé en ce que : - Il comprend au moins les étapes consistant à : 5 a) réticuler l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, par réaction chimique entre l'acide hyaluronique et le BDDE, dans une solution aqueuse b) après réticulation, ajouter dans la solution aqueuse contenant l'acide hyaluronique réticulé un ou plusieurs agents nucléophiles capables de réagir avec les fonctions époxydes issues du BDDE afin de les transformer en fonctions alcools 10 c) purifier l'hydrogel ainsi obtenu d) stériliser l'hydrogel - L'étape b est réalisée en milieu aqueux basique ou acide à une température comprise entre 2 et 85°C en choisissant des conditions de réaction qui évitent la précipitation de l'acide hyaluronique 15 L'invention traite d'un procédé de préparation d'un hydrogel contenant de l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels, et en particulier ses sels acceptables d'un point de vue physiologique comme les sels de sodium, calcium, zinc, potassium, avantageusement le set de sodium. L'acide hyaluronique peut être d'origine animale ou obtenu par fermentation bactérienne. Il peut avoir une masse moléculaire de quelques daltons à plusieurs millions de daltons, avantageusement 20 d'environ 0.1 à 4 millions de daltons. Selon un aspect de l'invention, l'acide hyaluronique utilisé au cours du procédé de préparation peut être un dérivé de l'acide hyaluronique, c'est-à-dire une molécule obtenue en modifiant par voie chimique, ou par toute autre voie, la molécule d'acide hyaluronique. La réaction de réticulation est effectuée en solution aqueuse dans un milieu acide ou basique, 25 avantageusement en milieu basique possédant un pH compris de préférence entre 8 et 13. L'ajout du réticulant BDDE dans la solution aqueuse peut se faire avant, pendant ou après l'ajout de l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, dans la solution. 3032617 5 La température de réticulation est généralement comprise entre environ 15°C et 75°C, avantageusement entre 15°C et 60°C. La durée de réticulation est généralement de plusieurs heures, avantageusement de plus de 1h jusqu'à environ 12h. 5 Selon l'invention, l'étape de réticulation est suivie par une étape de substitution nucléophile afin de neutraliser les fonctions époxydes contenues dans le milieu aqueux. Comme décrit dans la figure 1, la réticulation de l'acide hyaluronique (molécule A) avec le BDDE (molécule B) dans un milieu basique génère les composés suivants: le composé C, issu du BDDE, lie 2 chaînes d'acide hyaluronique : les 2 fonctions époxydes 10 du BDDE se sont transformées en fonctions éthers en réagissant avec les fonctions alcools primaires de l'acide hyaluronique le composé D, issu du BDDE, est lié par une de ses extrémités avec une chaîne d'acide hyaluronique (par une fonction éther) et l'autre extrémité s'est transformée en fonctions alcools après hydrolyse (fonctions chimiques non nocives in vivo) 15 le composé E, issu du BDDE, est une molécule de BDDE à l'état libre qui s'est hydrolysée à ses 2 extrémités : les fonctions époxydes ont été transformées en fonctions alcools le composé F, issu du BDDE, est une molécule de BDDE à l'état libre qui s'est hydrolysée à une seule de ses extrémités le composé G est une molécule de BDDE à l'état libre 20 le composé H, issu du BDDE, est lié par une de ses extrémités avec une chaîne d'acide hyaluronique (par une fonction éther) et l'autre extrémité est toujours sous forme de fonction époxyde (fonction chimique nocive in vivo) La présente invention vise donc à neutraliser les fonctions époxydes des composés F, G et H en les transformant en fonctions alcools, après finalisation de l'étape de réticulation, en ouvrant les 25 fonctions époxydes par substitution nucléophile en milieu aqueux et en évitant la précipitation de l'acide hyaluronique. Le ou les nucléophiles utilisés au cours de la substitution nucléophile sont caractérisés par leur capacité à ouvrir des fonctions époxydes en milieu aqueux. De manière avantageuse, ils : - possèdent un bon profil de sécurité (toxicité) 30 - sont au moins partiellement solubles dans l'eau 3032617 6 - ne nécessitent pas de composés additionnels (catalyseurs) autres que les ions hydroxydes et/ou hydronium présents dans le milieu réactionnel pour permettre l'ouverture et la neutralisation des époxydes - ont une bonne capacité à être éliminés/retirés de la solution aqueuse après la réaction 5 nucléophile, lors de la purification de l'hydrogel - ont une faible masse moléculaire, de préférence inférieure à 10 000 g/mol, préférentiellement inférieure à 5000 g/mol, encore préférentiellement inférieure à 1000 g/mol, encore préférentiellement inférieure à 500 g/mol sont choisis préférentiellement dans la catégorie des alcools, des amines ou des thiols 10 sont choisis préférentiellement dans la catégorie des alcools primaires dans le cas des alcools - sont choisis par exemple parmi les molécules suivantes : éthanol, mannitol, sorbitol ou méthylamine Il est important de préciser que l'ajout du ou des nucléophiles dans le milieu réactionnel est 15 réalisé après la réaction de réticulation et avant l'étape de purification. Cet ajout peut se faire soit à l'état pur soit sous la forme d'une solution dans laquelle le ou les nucléophiles ont été préalablement introduits. Au cours de la réaction de substitution nucléophile, la température, le pH et/ou le volume du mélange réactionnel peuvent être constants ou variables. Préférentiellement, la température est 20 comprise entre 20 et 75°C, encore préférentiellement entre 40 et 65°C, au moins pendant une partie de la réaction de substitution nucléophile. La réaction de substitution nucléophile peut être réalisée en statique après avoir mélangé le ou les nucléophiles au sein de la solution aqueuse ou en dynamique, c'est-à-dire sous mélange en continu ou uniquement par intermittence. 25 La quantité de nucléophiles à ajouter dépend notamment de la molécule choisie et de la quantité de fonctions époxydes à neutraliser. L'homme de l'art sera en mesure d'identifier cette quantité ainsi que de sélectionner les conditions les plus optimales (température, pH, durée de la réaction, ....) pour réaliser sa réaction de substitution nucléophile, au regard des caractéristiques spécifiques de l'hydrogel qu'il est en train de préparer. 3032617 7 Selon un aspect de l'invention, la réaction de substitution nucléophile est stoppée totalement lors de la purification de l'hydrogel ; purification ayant notamment pour effet de retirer partiellement ou totalement le ou les nucléophiles présents dans le milieu. Selon l'invention, l'étape de neutralisation des fonctions époxydes par substitution nucléophile 5 est suivie par une étape de purification de l'hydrogel permettant de retirer les molécules indésirables contenues dans l'hydrogel et notamment le BDDE libre susceptible de ne pas avoir réagi au cours de la réticulation et/ou de la substitution nucléophile, et/ou les dérivés du BDDE à l'état libre, et/ou le ou les agents nucléophiles n'ayant pas réagi au cours de la substitution nucléophile ainsi que toutes impuretés provenant des matières premières utilisées tout au long 10 du procédé de préparation de l'hydrogel. Cette purification est effectuée selon des techniques bien connues par l'homme de l'art comme par exemple par bains de dialyse, par lavage par flux d'eau continu ou par précipitation. On choisit de préférence la purification par dialyse en utilisant une solution physiologique iso-osmolaire et possédant un pH adapté. Préalablement à l'étape de purification, il peut être avantageux de neutraliser le gel obtenu, selon les procédés standards 15 connus dans le domaine ; par exemple par ajout d'un acide lorsque la réaction de substitution nucléophile a été conduite en milieu basique, et par ajout d'une base lorsque la substitution nucléophile a été conduite en milieu acide. Selon l'invention, en fin de procédé de préparation, l'hydrogel est conditionné dans un contenant adapté, puis il est stérilisé selon tout moyen connu en soi, et préférentiellement par autoclavage. 20 Le procédé de préparation selon l'invention est différent de ceux décrits dans l'art antérieur. Aucun de ces procédés ne fait intervenir, après réticulation et avant purification, une étape supplémentaire du procédé de préparation ayant vocation à transformer les fonctions époxydes présentes dans le milieu en fonctions alcools, ceci par substitution nucléophile. On peut par exemple citer les demandes de brevet WO 97/04012 ou WO 2005/085329 de l'art 25 antérieur. L'ensemble de ces documents décrit des procédés de préparation d'un hydrogel injectable contenant de l'acide hyaluronique réticulé au BDDE, mais aucun de ces procédés ne fait intervenir une étape supplémentaire après réticulation afin de neutraliser les fonctions époxydes contenues dans le milieu. A cet égard, il est important de préciser qu'un procédé de préparation d'un hydrogel injectable à base d'acide hyaluronique réticulé au BDDE est un procédé long. 30 L'homme du métier n'a ainsi pas intérêt à ajouter une étape supplémentaire dans son procédé de préparation. De manière surprenante, la présente invention, qui, elle, compte une étape supplémentaire dans son procédé de préparation, présente l'avantage de pouvoir réduire la 3032617 8 durée du procédé (gain de temps mais également d'argent) en limitant la durée de purification de l'hydrogel ; étape connue pour être très longue et coûteuse dans les procédés de l'art antérieur car devant permettre de retirer le BDDE résiduel à l'état libre dans le produit. Le procédé de préparation selon l'invention permet d'obtenir les avantages suivants : 5 le profil de sécurité de l'hydrogel injectable obtenu selon l'invention est significativement amélioré par rapport aux produits réticulés au BDDE connus dans l'art antérieur ; produits déjà reconnus pour leur grand niveau de sécurité. La neutralisation des fonctions époxydes contenues dans l'hydrogel par transformation de celles-ci en fonctions alcools permet en effet de réduire fortement les potentielles 10 interactions délétères susceptibles d'avoir lieu entre les fonctions époxydes de l'hydrogel et le milieu environnant au niveau du site d'injection (cellules, tissus,...). L'intérêt de cette amélioration pour la santé du patient traité est alors évident car permettant de limiter au maximum les effets indésirables à court et/ou à long terme. - l'amélioration de la sécurité de l'hydrogel injectable selon l'invention permet alors 15 d'injecter de plus grandes quantités d'hydrogel dans l'organisme du patient traité. La possibilité d'injecter ;me plus grande quantité autorise alors de traiter des nouvelles indications esthétiques ou médicales (cas par exemple des injections à visées esthétiques pour mieux définir les contours du corps nécessitant des volumes d'hydrogel importants) ne pouvant pas être abordées jusque-là ou de mieux traiter 20 les indications actuelles - de manière surprenante, la présente invention donne la possibilité d'obtenir des caractéristiques physico-chimiques et mécaniques équivalentes ou similaires pour l'hydrogel selon l'invention et les produits actuellement utilisés (tout en ayant un profil de sécurité amélioré), ce qui permet de garantir la même efficacité clinique. 25 Ainsi, un hydrogel selon l'invention utilisé pour le comblement des rides pourra avoir des propriétés de viscoélasticité similaires à un hydrogel de l'art antérieur afin de viser la même capacité à s'intégrer de manière appropriée dans les tissus de la peau et à créer le volume souhaité - de manière surprenante, comme décrit préalablement, bien qu'ayant une étape 30 supplémentaire dans le procédé de préparation selon l'invention, ledit procédé permet de réduire la durée totale nécessaire pour la préparation du produit, ce qui permet alors de réduire les coûts relatifs à sa fabrication et donc d'être plus 3032617 9 compétitif sur le marché car offrant un produit avec la même efficacité clinique, un niveau de sécurité amélioré et un coût de production réduit De manière avantageuse, le procédé de préparation selon l'invention d'un hydrogel injectable à base d'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, réticulé au BDDE, est caractérisé en ce qu'il 5 comprend au moins les étapes successives suivantes : réticulation de l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, et éventuellement d'autres polymères biocompatibles, dans une solution aqueuse - après réticulation, réalisation d'une substitution nucléophile sur les fonctions époxydes afin de transformer ces fonctions chimiques en fonctions alcools 10 - purification du mélange à l'aide d'une solution iso-osmolaire et possédant un pH adapté - homogénéisation du mélange avec éventuellement l'ajout d'un ou plusieurs autres polymères biocompatibles et/ou d'une ou plusieurs substances susceptibles d'apporter un bénéfice à l'organisme comme des substances actives 15 - dégazage optionnel conditionnement en seringue ou en flacon ou tout autre contenant hermétique stérilisation De manière avantageuse, l'hydrogel injectable selon l'invention est conditionné en seringues, puis il est stérilisé par autoclavage, pour une utilisation directe et/ou commercialisation. 20 L'invention concerne également un hydrogel obtenu selon le procédé de préparation préalablement décrit. Cet hydrogel est constitué au moins d'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, réticulé au BDDE ; les fonctions époxydes issues du BDDE étant partiellement ou totalement neutralisées après réticulation de l'acide hyaluronique, par transformation de celles-ci en fonctions alcools. 25 L'hydrogel selon l'invention est avantageusement implanté par injection dans les tissus et/ou les fluides des organismes vivants humains ou animaux. Selon un aspect de l'invention, la concentration totale de l'hydrogel en acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, est comprise entre 0.01 et 50 mg/ml, de préférence entre 1 et 35 mg/ml, avantageusement entre 8 et 30 mg/ml. 3032617 10 Selon un aspect de l'invention, l'hydrogel selon l'invention contient une ou plusieurs substances actives d'origine naturelle ou synthétique à action pharmacologique ou non, comme par exemple les antioxydants, les anti-inflammatoires, les antiseptiques, les antibactériens, les antifongiques, les anticancéreux, les anesthésiques locaux, les protéines, les hormones, seules ou en 5 combinaison. Ces substances actives sont soit dispersées dans l'hydrogel, soit greffées à un ou plusieurs des polymères de l'hydrogel, soit contenues/encapsulées dans un autre matériau lui-même dispersé au sein de l'hydrogel. Dans ce dernier cas, à titre d'exemple, on pourra citer l'encapsulation d'une substance active, comme un anti-inflammatoire, dans des microsphères à base d'un polymère dérivé de l'acide polylactique ou du poly-e-caprolactone. 10 Selon un aspect de l'invention, l'hydrogel selon l'invention contient de la lidocaïne dispersée au sein de sa matrice réticulée. Selon un aspect de l'invention, l'hydrogel selon l'invention contient un ou plusieurs composés d'origine biologique comme des cellules, des plaquettes enrichies, des gènes, des fragments d'ADN ou des facteurs de croissance. Ces composés sont préférentiellement dispersés dans 15 l'hydrogel, mais ils peuvent également être greffés à un ou plusieurs des polymères de l'hydrogel ou contenus/encapsulés dans un autre matériau lui-même dispersé au sein de l'hydrogel. Selon un aspect de l'invention, l'hydrogel selon l'invention contient des polymères qui sont dispersés au sein de la matrice réticulée de l'hydrogel. On peut citer par exemple les polymères de la famille des polysaccharides, les polyesters, les polyanhydrides, les polyphosphazènes, les 20 poly-e-caprolactones, les acides polylactiques et leurs dérivés, les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, la N-vinyl-pyrrolidone et les polymères acryliques et dérivés biologiquement acceptables. Selon un aspect de l'invention, l'hydrogel selon l'invention contient des substances minérales qui sont dispersées au sein de la matrice réticulée de l'hydrogel. On peut citer par exemple 25 l'hydroxyapatite ou les phosphates tricalciques comme le [3 tricalcium phosphate. Selon un aspect de l'invention, l'hydrogel selon l'invention est mélangé avec une ou plusieurs autres substances, préférentiellement stériles, susceptibles d'apporter un bénéfice à l'organisme, juste avant son administration chez le patient. Le mélange est alors effectué par l'utilisateur final, c'est-à-dire par un praticien ou par du personnel habilité, selon une méthode appropriée utilisant 30 un ou plusieurs dispositifs de mélange permettant de réaliser un mélange satisfaisant et de conserver la stérilité si nécessaire. On peut par exemple citer le mélange par l'utilisateur final de 3032617 11 l'hydrogel selon l'invention et d'un ou plusieurs composés comme des substances actives, des biologiques ou des substances minérales : - en réalisant des allers-retours entre deux contenants (l'un rempli de l'hydrogel selon l'invention et l'autre rempli du composé à disperser dans l'hydrogel), ces contenants 5 pouvant être par exemple des seringues - en extrudant simultanément le contenu de deux contenants (l'un rempli de l'hydrogel selon l'invention et l'autre rempli du composé à disperser dans l'hydrogel) pour réunir les différents composés et/ou les mélanger dans un autre contenant avant administration chez le patient 10 L'invention concerne également l'utilisation de l'hydrogel obtenu selon le procédé de préparation préalablement décrit pour des applications esthétiques ou thérapeutiques. Les bénéfices apportés par la présente invention rendent possible l'utilisation de l'hydrogel obtenu selon le procédé de préparation préalablement décrit pour de nombreuses applications en esthétique et en médecine et notamment pour celles déjà intensivement décrites dans la 15 littérature pour l'acide hyaluronique (Volpi N et al, Role, metabolism, chemical modifications and applications of hyaluronan, Curr. Med. Chem., 2009: 16(14) :1718-45). L'hydrogel selon l'invention est donc utilisé pour des applications esthétiques ou thérapeutiques, chez l'Homme ou chez l'animal. Il est implanté par injection dans la zone souhaitée. L'hydrogel selon l'invention est notamment utilisé pour : 20 combler des volumes - générer des espaces au sein de certains tissus, favorisant ainsi leur fonctionnement optimal remplacer des liquides physiologiques ou des tissus déficients - stimuler ou favoriser la régénération des tissus 25 - hydrater et protéger des tissus délivrer des substances susceptibles d'apporter un bénéfice à l'organisme et notamment des substances actives et/ou des biologiques A titre d'exemple, on peut citer les utilisations de l'hydrogel dans les cas suivants : - la formulation d'une composition implantable en intradermique et/ou en sous-cutané 30 et/ou en intramusculaire pour l'amélioration de la qualité de la peau, ou le 3032617 12 comblement des rides ou la restauration des volumes du visage (pommettes, menton, lèvres, nez, ...) ou du corps (fesse, ...) - la formulation d'une composition implantable à usage dentaire par exemple pour combler des poches parodontales et/ou pour stimuler la régénération des tissus 5 autour de la dent la formulation d'une composition implantable en intra-oculaire, notamment pour des applications au cours de la chirurgie de la cataracte, du glaucome, de la presbytie ou du vitré - la formulation de compositions implantables en intra-articulaire pour des applications 10 en orthopédie ou en rhumatologie notamment dans le cadre de la viscosupplémentation du liquide synovial déficient pour le traitement de l'arthrose mais également de la reconstruction osseuse ou de la régénération du cartilage - la formulation d'une composition implantable en urologie pour des applications dans le traitement de l'incontinence urinaire ou fécale 15 la formulation d'une composition implantable utilisée en médecine ou chirurgie générale dans le cadre du traitement de la fibrose ou pour améliorer la cicatrisation des plaies - la formulation d'une composition pharmaceutique implantable permettant la libération retardée et/ou contrôlée de substances actives et/ou de biologiques pour 20 différentes applications médicales EXEMPLES L'invention va maintenant être illustrée, de manière non limitative, par les exemples suivants. Le hyaluronate de sodium et l'ensemble des autres composés utilisés dans les exemples 25 possèdent un haut niveau de pureté. Les propriétés rhéologiques (mesure du module élastique G') des gels sont mesurées à 25°C à l'aide d'un rhéomètre à contrainte imposée (TA AR2000) et d'une géométrie cône/pFan 4 cm-2°. La concentration en BDDE des gels est mesurée à l'aide d'une chromatographie gazeuse GC/MS (PerkinElmer - Clarus SQ 8 GC/MS). 30 3032617 13 Exemple 1: Préparation d'un gel G1 et d'un gel REF1 (comparatif) On pèse 1.74 g d'une poudre de hyaluronate de sodium (NaHA), de masse moléculaire environ égale à 1.5 MDa, avec un taux d'humidité de 8.2%, auxquels on ajoute 17 g d'une solution aqueuse de NaOH à 0.25 N. L'hydratation de la poudre dure 1h30, avec une homogénéisation 5 manuelle régulière à la spatule. 0.72 g d'une solution de 1,4-butanedioldiglycidyléther (BDDE) dilué au 1/Sème dans la soude 0.25 N sont ajoutés au milieu réactionnel, suivi d'une homogénéisation mécanique de 15 minutes avant immersion dans un bain thermostaté à 50°C pendant 2h30. Dans 50% de la masse de réticulat obtenue, on ajoute une solution de tampon phosphate 10 contenant du HCI afin d'obtenir un pH=7.3 et une concentration en acide hyaluronique égale à 20 mg/ml. On laisse le gel gonfler à température ambiante pendant 24h dans cette solution et, à la fin de ce temps, on homogénéise manuellement à la spatule pendant 10 minutes. Soit REF1 le gel ainsi obtenu. Dans les 50% de réticulat restants, on ajoute 1.05 g de méthylamine et on mélange manuellement 15 à la spatule pendant 10 minutes, puis on introduit le mélange dans un bain thermostaté à 60°C pendant 1 heure et à température ambiante (25°C) pendant 4 heures supplémentaires. On ajoute ensuite une solution de tampon phosphate contenant du HCI afin d'obtenir un pH=7.3 et une concentration en acide hyaluronique égale à 20 mg/ml. On laisse le gel gonfler pendant 19h à température ambiante dans cette solution et, à la fin de ce temps, on homogénéise 20 manuellement à la spatule pendant 10 minutes. Soit G1 le gel ainsi obtenu. La concentration en BDDE est mesurée dans G1 et REF1 - G1: Concentration en BDDE inférieure à 10 mg/mi - REF1 : Concentration en BDDE supérieure à 50 mg/ml La plus faible concentration en BDDE dans G1 par rapport à REF1 montre que l'ajout du 25 nucléophile méthylamine après réticulation a permis de neutraliser les fonctions époxydes contenues dans le gel. Exemple 2 : Préparation d'un gel G2 selon l'invention et des gels REF2A et REF2B (comparatif) 3032617 14 On pèse 5.34 g d'une poudre de hyaluronate de sodium (NaHA), de masse moléculaire environ égale à 1.5 MDa, avec un taux d'humidité de 8.2%, auxquels on ajoute 51 g d'une solution aqueuse de NaOH à 0.25 N. L'hydratation de la poudre dure 1h30, avec une homogénéisation manuelle régulière à la spatule. 2.58 g d'une solution de 1,4-butanedioldiglycidyléther (BDDE) 5 dilué au 1/Sème dans la soude 0.25 N sont ajoutés au milieu réactionnel, suivi d'une homogénéisation mécanique de 15 minutes avant immersion dans un bain thermostaté à 50°C pendant 2h30. Dans 30% de la masse de réticulat obtenue, on ajoute une solution de tampon phosphate contenant du HCI afin d'obtenir un pH=7.3 et une concentration en acide hyaluronique égale à 10 30 mg/ml. On laisse le gel gonfler pendant 24h à température ambiante dans cette solution et, à la fin de ce temps, on homogénéise manuellement à la spatule pendant 10 minutes. Soit REF2AA le gel ainsi obtenu. Dans 30% de la masse de réticulat obtenue, on ajoute de l'éthanol jusqu'à précipitation de celui-ci puis on introduit le mélange dans un bain thermostaté à 50°C pendant 2 heures. On récupère 15 ensuite le précipité et on le dissout dans une solution de tampon phosphate contenant du HCI afin d'obtenir un pH=7.3 et une concentration en acide hyaluronique égale à 30 mg/ml. On laisse le gel gonfler pendant 19h à température ambiante dans cette solution et, à la fin de ce temps, on homogénéise manuellement à la spatule pendant 10 minutes. Soit REF2BB le gel ainsi obtenu. Dans les 40% de réticulat restants, on ajoute 3.04 g d'éthanol et on mélange manuellement à la 20 spatule pendant 10 minutes, puis on introduit le mélange dans un bain thermostaté à 50°C pendant 2 heures en effectuant un mélange à la spatule de S minutes au bout de 1 heure dans le bain thermostaté. On ajoute ensuite une solution de tampon phosphate contenant du HCI afin d'obtenir un pH=7.3 et une concentration en acide hyaluronique égale à 30 mg/ml. On laisse le gel gonfler pendant 19h à température ambiante dans cette solution et, à la fin de ce temps, on 25 homogénéise manuellement à la spatule pendant 10 minutes. Soit G22 le gel ainsi obtenu. La concentration en BDDE est mesurée dans G22 et REF2AA: - G22 : Concentration en BDDE inférieure à 10 mg/ml - REF2AA : Concentration en BDDE supérieure à 50 mg/ml La plus faible concentration en BDDE dans G22 par rapport à REF2AA montre que l'ajout du 30 nucléophile éthanol après réticulation a permis de neutraliser les fonctions époxydes contenues dans le gel. 3032617 15 Le module élastique G' à 0.7 Hz est mesuré pour G22, REF2AA et REF2BB: - G22 : G'(0.7 Hz) = 448 Pa - REF2AA : G'(0.7 Hz) = 456 Pa - REF2BB : G'(0.7 Hz) = 673 Pa 5 G22 et REF2AA ont des modules élastiques similaires ce qui n'est pas le cas du gel REF2BB qui possède un caractère élastique beaucoup plus prononcé. Il est à noter que, visuellement, on constate que G22 et REF2AA ont des aspects similaires alors que le gel REF2BB possède un aspect beaucoup plus granuleux. La précipitation du réticulat avec l'agent nucléophile ne permet donc pas d'obtenir un gel avec des propriétés rhéologiques similaires à celles d'un produit n'ayant pas 10 été soumis à une substitution nucléophile (= gel de l'art antérieur) : une efficacité clinique similaire ne peut donc pas être attendue. Les gels G22 et REF2AA sont dialysés en utilisant des membranes de dialyse à base de cellulose (seuil de rétention =10 000 Da) dans une solution de tampon phosphate. Le gel G22 est dialysé pendant 7h et le gel REF2AA pendant 28h. Il est à noter qu'à t=0, le gel G22 15 a déjà une concentration en BDDE inférieure à 10 ppm alors qu'il faut attendre près de 24h de dialyse pour être inférieure à cette valeur dans le cas du gel REF2AA. Après purification par dialyse, les gels G22 et REF2AA sont conditionnés en seringue de 1 ml puis stérilisés à l'autoclave à 121°C pendant 20 minutes. Soit G2 (gel selon l'invention) et REF2A, les gels stérilisés issus de G22 et REF2AA. 20 Le module élastique G' à 0.7 Hz est mesuré pour G2 et REF2A à t = 0 et après t = 7 mois de stockage à température ambiante (25°C) : - G2 à t = 0 : 00.7 Hz) = 129 Pa - REF2A à t = 0 : G'(0.7 Hz) = 134 Pa - G2 à t = 7 mois : G1(0.7 Hz) =118 Pa 25 - REF2A à t = 7 mois : G'(0.7 Hz) = 120 Pa On constate que le gel G2 selon l'invention possède un profil rhéologique similaire au cours du temps à celui du gel REF2A de l'art antérieur : une efficacité clinique similaire (capacité à créer du volume dans les tissus par exemple) peut donc être attendue pour ces 2 gels. REVENDICATIONS1 - Procédé de préparation d'un hydrogel injectable contenant de l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, réticulé par l'utilisation du BDDE, caractérisé en ce que : - Il comprend au moins les étapes consistant à : a) réticuler l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, par réaction chimique entre l'acide hyaluronique et le BDDE, dans une solution aqueuse b) après réticulation, ajouter dans la solution aqueuse contenant l'acide hyaluronique réticulé un ou plusieurs agents nucléophiles capables de réagir avec les fonctions époxydes issues du BDDE afin de les transformer en fonctions alcools c) purifier l'hydrogel ainsi obtenu d) stériliser l'hydrogel - L'étape b est réalisée en milieu aqueux basique ou acide à une température comprise entre 2 et 85°C en choisissant des conditions de réaction qui évitent la précipitation de l'acide hyaluronique 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ou les agents nucléophiles ajoutés dans la solution aqueuse sont choisis dans la catégorie des alcools, amines ou thiols 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que le ou les agents nucléophiles ajoutés dans la solution aqueuse sont choisis parmi l'éthanol, le mannitol ou le 20 sorbitol 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le bu les agents nucléophiles ajoutés dans la solution aqueuse ont une masse moléculaire inférieure à 1000 g/mol 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le ou les agents nucléophiles sont ajoutés dans la solution aqueuse soient à l'état pur ou soient sous la forme 25 d'une solution dans laquelle le ou les agents nucléophiles ont été préalablement introduits 3032617 17 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la transformation des fonctions époxydes en fonctions alcools est réalisée en présence d'ions hydroxydes et/ou hydronium comme seul catalyseur de la réaction de substitution nucléophile 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la température du milieu 5 est comprise entre 40 et 65°C au cours d'au moins une partie de la réaction de substitution nucléophile 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la réaction de substitution nucléophile est effectuée en réalisant un mélange en continu ou uniquement par intermittence 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la réaction de substitution 10 nucléophile est stoppée totalement au cours de l'étape de purification de l'hydrogel 10 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la purification de l'hydrogel est réalisée par dialyse 11 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les sels de l'acide hyaluronique sont le sodium, le calcium, le zinc ou le potassium 15 12 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, a une masse moléculaire comprise entre 0.1 et 4 millions de daltons 13 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'acide hyaluronique peut être un dérivé de l'acide hyaluronique, c'est-à-dire une molécule obtenue en modifiant par voie chimique, ou par toute autre voie, la molécule d'acide hyaluronique 14 - Procédé de préparation d'un hydrogel injectable caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes successives suivantes : réticulation de l'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, et éventuellement d'autres polymères biocompatibles, dans une solution aqueuse après réticulation, réalisation d'une substitution nucléophile sur les fonctions époxydes afin de transformer ces fonctions chimiques en fonctions alcools purification du mélange à l'aide d'une solution iso-osmolaire et possédant un pH adapté homogénéisation du mélange avec éventuellement l'ajout d'un ou plusieurs autres polymères biocompatibles et/ou d'une ou plusieurs substances susceptibles d'apporter un bénéfice à l'organisme comme des substances actives 3032617 18 - dégazage optionnel - conditionnement en seringue ou en flacon ou tout autre contenant hermétique - stérilisation 15 - Hydrogel obtenu selon la revendication 14, constitué au moins d'acide hyaluronique, ou l'un 5 de ses sels, réticulé par l'utilisation du BDDE, caractérisé en ce que les fonctions époxydes issues du BDDE sont partiellement ou totalement neutralisées après réticulation de l'acide hyaluronique, par transformation de celles-ci en fonctions alcools dans le cadre d'une réaction de substitution nucléophile 16 - Hydrogel selon la revendication 15, caractérisé en ce que la concentration totale en acide 10 hyaluronique, ou l'un de ses sels, est comprise entre 0.01 et 50 mg/ml 17 - Hydrogel selon l'une des revendications 15 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs substances actives à action pharmacologique ou non, comme par exemple les antioxydants, les anti-inflammatoires, les antiseptiques, les antibactériens, les antifongiques, les anti-cancéreux, les protéines, les hormones, les anesthésiques locaux, les biologiques, seules ou 15 en combinaison 18 - Hydrogel selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il contient de la lidocaïne dispersée au sein de sa matrice réticulée 19 - Hydrogel selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il contient une ou plusieurs substances minérales dispersées au sein de sa matrice réticulée 20 20 - Kit comprenant un hydrogel selon l'une des revendications 15 à 19, conditionné en seringues stériles 21 - Utilisation de l'hydrogel selon l'une des revendications 15 à 19, pour la préparation d'une composition pour des applications esthétiques ou thérapeutiques 22 - Utilisation de l'hydrogel selon la revendication 21, pour la formulation d'une composition 25 implantable en intradermique et/ou en sous-cutané et/ou en intra-musculaire pour l'amélioration de la qualité de la peau ou le comblement des rides ou la restauration des volumes du visage ou du corps, pour la formulation d'une composition intra-oculaire pour des applications en ophtalmologie, pour la formulation d'une composition implantable pour des applications en dentaire, pour la formulation d'une composition intra-articulaire pour des applications en orthopédie ou en rhumatologie, pour la formulation d'une composition implantable en urologie 3032617 19 pour des applications dans le traitement de l'incontinence, pour la formulation d'une composition implantable utilisée en médecine ou chirurgie générale dans le cadre du traitement de la fibrose ou pour améliorer la cicatrisation des plaies, pour la formulation d'une composition pharmaceutique implantable permettant la libération retardée et/ou contrôlée de substances 5 actives pour différentes applications médicales