Brevet FR3035794A1 — publié le 20161111

La préçente invention concerne le domaine c!' purification de sangs et. sus du sang et, e arel 1)s présents. PI procédé de p,.', t,cab.-7 liquid,e 'lier, la purft'Ication d par écisémert,' nvention corce-rie un 'que Cf.77Spond7r- . à du sang total humain ou 3rtlreeel à un produit CiLl sang rn =I utilisant un support partirf.,ill,,- rr d'au moins un type d'oligosacchde, notamment déterminant de :7anguins' Le systin----J - est ur-.. _..isme de c2 e de Voroanisme protém in orgarismd les 10 lgère.e humorale produit icon:.)s nt chaque inurlyHu., Par contre, le iinmu.l , en ler les anticorps sécrétés - la répcnsc-r.,. humorae sont à me de risque rnieurs lors des transp',..tation anes u Je tissus animaux vers rhomn- lors de transferts Hterhumains de plasma ou 15 d'organe). De même, 7c,mbreuses r es auto-immunes sont dues à la perc.i.i::ption par nisme de déterminants protéiques, lipidiques. ou sacchrardques ne cet_ organisme même, commt r, ce qui génèr.. ine réponse immurü:,:re chron - même, orsqu. Von injecte à un ir 20 des préparaticoS oharmacE es contenant des icor indispensable l'antigène corre Hondant, n'est pas la c thérapeutiquE,, Jt pas r. le receve pour éviter le risque provoquer des exerr.r, ; de cette --.ponse étant nolys L-.s anticorps cc onants ar éniques des 25 groupe ,guins. Ur.c paratiun donc. être ...épourvue de ce type dco;7' i. Pour falre, purification des antico itéiquE, longtemps, mais celle rps ariti sa =::'::n-i:717* PiUS problématique, à cause de 30 des molécules complexe et d 'a faible constante affir _ :E'S anticorps 7,nd-sac.: fficuL le synthèse a sont 'nt synthece in rnultienzymatique) .ne. Cette s cd-iceji: mettre en prése1-1,ce un 3035794 2 large excès d'antigène par rapport aux anticorps q!..!e Von souheite du milieu (l'excès est d'un facteur très élevé soit 1, 1C 000 saccharidique pour une molécule d'anb ce ratio étant dd V)ligosa t fixé zur une phase multir ou polymérisé). Syrne l'affirÉté un antic rrrir)s multimère, présentant 10 .s de nti par rr:cH:' est F.,...u.)érieure à celle dei., Dans :P. cas des ToM.. on d'avidité, pou: : ffe ri bleS Eeli f ps 10 - elporta n L)ts cics 'supports mufti P--3,a-it les antigènes saccuiaiiuiqùe et de les à la purif:. s IgG tout autant que des IgM. La séparation des :2-nticorrç anti-sac(hiri digues, Crw"" comme indésirables, d'avec un liqur )gique conservant tow:eii ses propriétés, 15 est une avancée -ape n-u3jeure u3rmet e nombreuses )lications. Lors d'une transfusion sangu le plasma transfusé, pour être univers' ' doit être débarrassé des Itirorps connus ou supposés du donneur, transfusior. ; uides ues, tes Que le plasma, sont 20 des actes thérane 4ectif obLrift une régénération du système d'hémoste ou estaurer l'hémodynamique E'dent, n'ont que deui-. , 'rifler et qui viennent se lier F1» » n d'immund 10 clp m Ees d'oligosaccharide(s) greffées phase solid, particulier, stabilisation de la L,,bm e!igosaccharideiantice par la fixa,h_n, notamment pa valente, avec l'ur leursdes acide:;:minés suivants : asp arginine, glutamine, tryptophane, ou cystéine, present sur ledit anticorps, sur une fc:...,c,b.ieJ-n 15 aldéhyde libre p ;en i la phase solide. Aussi, de marr.p..,, ;,-,q-',:rcédé de pi_hication se;n HentHr dit au moins support r bisé assurer, par I' ntermédi dne part e des fonctions aldéhyde libres présentes sur la ph solide, i',.;tabilisation des anticorp,5, : en particulier des IgG, qui vienr 20 er à au moins certaines des cnes d'oliaosacc-HIrlde(s) greffées ladite pha-- sol' Dans les p :édés - selon l'invention, cr ilise u port comprenant une ur laedelle sent greffées, par 'toison covalente, ,s moléc au -Kins r» capable de se lier à 25 un ou nu rri s anticorps présets Jans ledk quide biologique que l'on ite phase1')n::*-7 étant porteuse de fonctions alcde De 3 ' o rts, appelés dans !a e»nte demande de brevet, par SUULI cation vont n(nl..7n, ;7 nt être décrits en détails. 30 3035794 ition k?s types d phases phase solkle! .-s type pole- Igue, pl les polyta ou encore phases polyuretha es, les le chitos ,lorganique comme silice ou ne. La phase solide a se piesenter 7.: !a forme es d'une matrice )reuse ou d'un pouvant ans le cadre de l'invention, différents ez,. En partcer, or phase ,7.:jueuse. A titrE. d'exer: de phi solides de nature oranq ue, notamment du Dans le cadre c vvention, phase solide a été sélectionnée pour 15 permettre de greffer olic rides aminés, plus iies à purifier. Dans l'art antérieur, ie greffa g alisé sur des phases solides porteuses de s époxy ou acicle, ique. Ces rieures par rapg rdre de l'invention centent des inconvè knts : le greffage épc,,:y an-qft:p, est 20 difficile à contrôler .,3cide carboxylique fait intL:.-venir des .BC et/ou Fiqui c nplexi -a réacft- le coupiage. le cadre de even 'a phase solide :euse de for aldéhyde libres ; ces ibi-ïctions correspondent, en pnWc, à d aldéhyde résiduelles restant sur la phase solide nnrJs greffcqe cc 25 d'agosaccharide(s), dont le greffage a été ré é dutres tcns aldéhyde présentes 2mei surface de la phase solide, Aussi, de m avi. .use, dans les supports utilisés sJnn l'invention, les mc.) haride(s) greffées sur une solicporteuse de iyde par réaction sur le 30 partie seulement d _s 'dores pré entes sur phase solide, d'un olipocîchccc i iction, une liaison c: . 3035794 9 greffage est de manière telle qu'au final, des fonctions lit .s subsistent sur la phase C,7,-/ existant entre .,e solide et les r écl35 d'oligo5p:.:,c7-aride(s) sur le support final corn,-77.7-v-,r,dT. T nce nésultant de la réaction d'une fonctior »,-y-.rine du type -NH2, 1 -0-NH2, éventuellement sous forme hyde -Ci- F:: .avar. réali1 t moiéc 10 la rail exemple, être L nt '»-ées lors de la polyrsation de la solide. Il est 4galement possible que la phase ufl- le un ou pe ctic clives qui vont permettre l'introc dor clé, 15 aidé lT\ es. culier, la phase solide peut con plusieurs -le fonctions reactives présentant un caractère éleurc arboxyliques et dérivés activés (par des cnJox^,/licries activés au f91-15), ! épox,-,!' isocyanater: les isotniocyanates. Ces font uor m:;'.1vées en par 20 réartion avec un réactif qui porte, d'une p 1 thiol, un alcnni une fi mas dépi Olt -0-N1-12, et d'autre pi le fonction létrycle La fonction aldéhyde pourri "ti-( i'plyse de , Plr exemple, on pourra grei l'arninoacétaldényde diméthyl acétai réaction 3 sa fonction amine sur 25 Lue phase solide nnr'rt des fonctior,s >3/. àhyde sera ensuite libéré dans Dr7! &terni la » :3 types de fonctions réactives présentant u- nucléophile, tes thiols, alcools, et les fonctions - _ -0-NH2. Une telle 30 réactive rrri.--J, être mise en réactHng. 't avec une i.1»ie ne pat t,. ne fonctic acide '.,-3,--tivera pou- ner utàson avec phase p une fonctio: ihyde l'oligosaccharide et d'une fonction solide. .Jr- la phase sol - - t_.t donc mgosaccharide et sera solide. s fonctions aldéhyde pcurro [ 3035794 10 soit avec une molécule avec deux fonctions -,Icléhyde ..ue le .i..Jtaraldéhyde ou le diméthoxyéthanai, ce clisl-ner devant. 7:k ;:"7 Une ét,,-74De de déorotection. De r alternaUv phas solice peut contenir des Dns hydroxyle..)ar une base mte et. rr:,?,n présence d'1 r pan:, un halogène dr_ et d'autreTus-j_p.Dn raasquÉ. comme un e + hInnénoac.r thylac une fc 3olide. Cette 10 Ce même r polymère hvc re i r (..2u bromure de cyanogênc. -lui pourra ent rrrhrie l'aminoacétaldéhyde dir .:hyl acétal. Cans le cas uhe phaeP lie nile la silice, CP. k.,1--e pourra être fonctionvihsée p trich, - silare, 15 outri.',Ihoxysilane iortant aussi une fonction réactive, aldéh , autre pouvait être Of par la s rs un 1yde, par exempte le (3. glycidyloxypropyl) trir - .J.Kysilane, lege que soit la iiature de la prrle soPcie (organique ou inorgar il nst lalement possible d'utiliser urv7 ---tHlse solide euranci-Dus », pcm ,-ltroduction adéhyde s. De telles ns réactives en « click cl t, par ex choisies pat-Ti) thiol, nialéirrùü allyle, 71,- rsquee une liaSon éther à pro .. qui pou-Toni; cnrrfondai '''3pté pour ii p 25 hyde libre. ,rnanièra une ré: nta actiol vec un réin.uf Chemistry » une .fcp., - elon l'invention com Pi7 particules hyOrophr prmet de concentrer les 7 YU'ifines du liquide ogique purif e aucfit i)port. 30 Dans le cadre de l'invention, phase solide en ce!"- sera, ce préCf- utilisée. La cellulose pri -ntag-e âtre u ase éconon c qui, de plus, du . pouvoir'. osorbant, permet: 3035794 11 concentrer les liquides hic) ues tels que les produit3 issus du sang et: en iier les plasmas, sE,ront purifiés avec le L. en retenant une 7,,r cor12,7,riL.H.E-.1 clans lesdit.5 En effet, une phase slde teP,, que !a c ose. présenter-.'y,,arr,':.age d'être facilement disperse - -is le Î-nWe à traiter (sang ou produit 3s1.1 du sa, croffft- !'Ine grande suilace spéL P(zivoir me bonne humain_ aseptiq. 10 concerr Jque et immunologique par rapport lx composant _ang nr fnrm Je parip:.1...es staties et Cr: Prc asmatqui.7,. Er er téinesmasmatiqu,..r effet favorabe !'echerché, De 1S cadre cle l'invention, on pourra notamment uti"--.77 une.7 ce!lulpr. micronisée ou .' cellulose microustalline, en tant que phi sch.le. La celluÉo... r''.-...rocristalline est obtenue pr 1intéç. îécrf,ue contrôlée et hydrolyse acide des extrémités à p- rr '- 15 obtenue elle-même par désintégration mécaniqu p:Er. pulpe . matière VE '>ibreuse cellulosicp.K:L Les extrémites fibreuses présenU..:::, 51,'ir ceâ.ilos crclisée sont éliminées sur la cellulose microcristalku., Ct. Dans le cas d'une phase solide choisie parmi [e,:s 20 dans la cellulose, les fonctio aldéh pourror-i- introdu'. Jr la phase soiicie par oxydance périodique, oxydation 2 (2,2,6 améthylpipéridine-1.-oxyl), oxydation de Swern, avec un aldéhyde masqué halogéné, dérivetion la cellulr7p (-0Ts) (sur lequel on -nadéhy 25 ou lin par substitutif) tivatior r svie de, l'am Idéhyck::, cas inte. édiairement sés pour col fonction aldéhyd....._ L'oxydatior us eitraîne lc d'une liieon C-C entre rhr' es Jeux 21cnols vic " d'une ccharidiquc,at !,-,a création nctionz, aldéhyde dans Ic cas de la deklx fonctions tyd L 3035794 12 Deux fonctions aldéhyde à proximité l'une de l'autre sont donc créées. La (Je fonctions aldéhyde anière régulière et toutes es K,p'res présentée st. are 1 est donnée ttru purement illustraur. La création de . '-e régulière ou aléatoire 5 et plus ou moins rapproc avantagew,,e' dans les support n nven, la nn solide e ct fonction n cfth y lit s résultent iLLJC;nie, ELLE; ri encore 7,un -::référée, uns les S Lp ports sEcn tnn, phase solide est de la cellub5(7ii qui comporte des unft,,és de formue 10 -CH(CH0)-r. ,H)-0-CH(CHO)e0-. En effet, certaines de ce5:., peuvent subsister danlri la phase solide porteuse des molécules d'oligosaeLli, greffé Les conditions d'introducUo. ^ei J Ictions uJdéhydes et, e `'oxydation nnodique, utilisées pourront être adaptées ,-,eLrune du 15 .rérier, en fonction de la densité de fonctions aldéhyde 9:Juhaite introduire sur lu 2hase solide. On pourru, notamment, se réf r à "An introductn:,r ro the chemi of carbohydrates", D D. Guthrie e. 1 n Honeyman, Oxfoi-U Un"ersity Pres 1968, page 108 J2, pou eordtions appliquer pour l'oxydation 20 périodirme rie la cellulose, ou plus généralement des poir_u_zharides. En Lins le cas de oxydation périodir..p'.J,,.?., un pé nJe tel que le métap te de sodium NnO, sera _a rnchon d'oxydation périodique sera ln souvent ée iolide mise en suspension dans un scir,,,siiirit. 25 .ar exem [nétapériodate de sodium dis- dans une phase ,,,queuse est mis en réantun sur une inuu solide du type polysaccharide telle que la celkl isu en rrlspensuin Dc iueDiL-e avantageuse, la réaction est menée sous açtsr. un cn pnférencecsns L,,ivec 7u sans chauffage, et de préférencE.,! à s'satun-i>. appartenant u Li jar 30 allant de 0 à 3CL.- en , éî.ence ou aclUe. Le x d'introduction libres sur lu phase solide d._ polysaccharide lue L irL dépenu, en particulier, de le 3035794 13 concentration en réactif u'cUisé, et en p.-J:q-licJii.er en agent c el que le NaI04. Les cn -15:,:rs seront s pour obtenir, de fonction = wde p A 4 mono -ières préfé-2-"cliellient une fonction aidé, pour 25 à 8 mollumetes 5 si ues. phases - dé prre s ci fonctions aidé ;yde mrre.nL: sous la forme de grog.; formyle sont éç. dans le commerce. On r.)-1 S phz - 7 soldes anVéE.5 ch s ma c ,,euses d'un y que 10 commer(Talisés par Tosoh ',1:31o.sciences, notun SOUS T- AF-Fonrtyl-U30 ou des els o garose portant ri-, x-ir.itiions aldéhyde. Un tefle phase solide pori.euse ce -onctions aldé es est alors prête pour pouvoir être for ont . par greffage .,ent de r cules d'oligosaccharide(s), sur une partie ces fonCb 15 Oligosaccharide et Greffage sur la phase solide est possible que soient greffées sur la pl ;e solide des d'un seul oligosaccharide ou des molécules de plusieiiini; iligosaccharides différents. Le o c-.1igosaccharides greffé(s) sur la phase solide est (sont) 20 ifié(s) d'an énique(s), de par leur capacité à reconnaltre un ou plus anbLo _ u un tetrasacchanue, utpei-ir_asaccharide Dans le cadre de l'invention, préférence, gre sur la 25 phase solide des molécules d'au de cape:: de se lier a anticorps an t A. B ou N des groupes sanguins. Les ps anti détc.I.rrir ont des anticorps réguliers prése nez les Lrc' ,,,Lu-nals de gi-cn.Jpe sarigu'n B ou ; les anticorps anti minare: sont ahticorp5i len:; ,i)resents chez les êtres hLr r gro 30 sanguin A ou O; las arcu.-ps anti déterminant H sont présEn-ts chez êtres humains de groupe sanguin C Les " 3 iur les supports selon l'invention, qui sonl bles , 3035794 de se lier aux anticnrnç anti déteriThrDnt. (tes groupes sannuins, peuvent etre de tout type -c aride 7 ,ç'.:1ue du déterminant A, oligosaccl antigénique c. minant B notamment, par exempie sous leur forme naturelle hexasaccharidique ou réduite en taille (tri tetra ou pentasaccharidique). Notamment, le ou les p:Dsacc pourrafont igosac arides -rminant ,±7.-nts chez les rprenante une affinit( 1 et lihexasaccharide de Lype que le tetras-EK.:charide 10 humain mais qu résent les anticorps humains, 11, Je se lier aux Tbc groupe sanauin pas présent c 2 qC partie du ré humair les oligosaccharides capables de s'7. aux anticorps aruu .ermin ..: A, présents chez les individus du groupe sanguin B ou 0, tels que le, b:.:!trasacH--..aride de type 5 qui n'est pas 15 présent dans le répertoire huma, is qui Aésente, de façon surprenante une excellente affinité pour les dalicorps humains, l'hexaose de type 1. e l'hexaose de type 2 qui font partie du répertoire humain. DL manière avantageuse, le support utilisé SE 'invention sera de molécules d'un oligosaccharide capable de se lier aux anticorps 20 anti déterminant B, présents chez H.,:=S individus du groupe sanguin A ou 0 et/ou de molécules d'un oligosacduel -able de se lier aux anticoru anti déte inant A, présents chez les u groupe sanguin B ou d'ex riç rl tels oligasacch,:,,H,.:.'P,- peut GaINAcal-3(Fucui.- 2)Gi., .-.' H... T,Fuccf.1-2'.1:g ''' ,,L 1-3(Fucct1-2)GalB1-4G1c, - ' 25 3(Fuu-u.1-2)Gal .. GaINAccd-:,. 2)GalB1-3G1cNAc(31-3Galp:.- ,. Galc(1-3(f - ''''''-3G1cNAcB1-77, 1-4G1c, GaINAca.1-3(l"r-uz.1- 2)Gall31-4 . 1-2,GalB1-4G1c, et -3' Fr: L j Cl C.,-. , ' -4G I c N Ac 13 1 - 3Ge: Fucc(1-2Gal(31-3GicNAc, FtiC7 1-4GIcNAc, Fuccd...-2.1(31- 4G1c, F,-,11-2Galf31-3GIcNAc31-3Gal, FLd -2Galf31-4GIcNAcr31-3GEW 30 2Gai01-3G'aINAcf31-3Gali Fuccd-2Ga Fuca.1- 2Ga gosac es GaINAca.1-3(Fuca1- 2)G et Galc(1-3(Fuz, ,,J1-1G1c ét.'r.t --,référés. 3035794 15 Il est possible qu_e. soient ffés sur la phase solide un autre type. à des présents dans des échantillons de sanq 01, d Dduft..1, us sar,,, autres que ceux capables de se lier aux ciéterrnîna . de o Josaccharides. (1;115 u - les ;. 71"1 deS groupes A titre n - croerç iyIdes pouvdr1 le différen-s types te, Xeno (nntamment com.'nercïal par la so, ELICITÏL, SOUS la re,crence - uca.1-4' le Xer !liment: 10 commercia' ,é par la écité ELICITYL, 3Gal[31 le Xeno commerciahsé par la société ELICFTYL, sous réf t 2 (notar 1-2) , 3rrti91_-4(.::k11r. et le Y'no antigentype 1 (notamme,,,... ')r,t-len:::1,31sé par la jété EL L, sous la référence GLY074-1) Gala1-3Gal131-3G1cNAc. 15 - les antigènes de Forssman' sous . Mle d'un nentaose (nntamment commercialisé par la sociéEH, '7'1_1(71 GLY132 3GaINAci31-3Gaia1-4Galr-qGic u ose (notamment cc- rci par a ELICITYL, sous a rérerence GLY133) GaINAcct1-3(;aii' 20 _ors de !,7 paration de utilisés dans le cadre de l'invention, les o osaccharides devront ê onnalisés pour permettre leur greff par haison covalente E.iur la phasc action J ne foncn aldéh' présente en la phase solide. Line telle fonctiorn---.:,-)ri est, par exemp a présence 25 mine du type 4^11-1.:, ou -0-M12. Aussi, ce manière avz ageu,,» , Dréparation 7upport dans le dic. l'invel on le gra -. ride(s) sur une phase sohd7:-: porte'...se fonctior -CHO réaction, sur une ?.ulemr- _ -ctions a c._ e 30 -CHO iibrc Hltes sur h phase soucie, (J'un -2e fonction 1-.17i apte L.i:yrrner une liaison . iec aldéhyde -CHO. La liaison covalente existant entre sa phase s,;;ide 3035794 16 molécules -'icsaccharides greffées sur le support final I r .7 donc de cette réaction SU L: de _ . .3 aldéhyde-CHU Ubres présentes.. De ra5ppare préférE d'oH,740 greffées sur la phase solide par réaction d'un oiigosacch fonction:la porteur d'une fonction amine du type -NH2, -N ou -O- évent i'Jellernent soirs fOr,ViC.' protégée, et d'une fonct.u.. aldéhyde -CHO ]ntgrpe,r la pr-,:ase Pour cela, on pourra 77:,hahie portant une fondUcn ,eirrin,- protégée fOrTne de trinuoro notami 10 01 .Ljrra ap--2:map: ehaurc. une tEr.q1t7-: fonction partant c port,.,71.-it.un tion e (par mise en oeuvre par exern,F,:u' ou d'un osaccharide ayant réag ^^^ une hydrazine ou un ses déri , xi d'un oligosaccl ide activé r « click chemiJ,ry On peut ég t nnaliser roligosacchri, e par 15 amination ma-f.'1:::::trice avec un réact,if fonction amine ou hydrazhe et éventLm':i,Ic:1-nE..nt une autre r)oul la être (,:q1-',./èe par la r lion de telles fondions par « click che,rnistry » pourra, exerap:a êtrE. réall.sée en itilisant de's olignuddes porteurs foncUun allyle M -1(,:;amment :ion -N(COCH3)-CH2-CH=C112 20 cart )sition 4 u()sition réductrice obten_ un procc1ec rnentation bTff nnratarpment WO 01/04341 .e se référer pour pus fonction peut éguiernent être ;.troduite sur l'ellgosaccnai-id, réaction amine, par axe propa. larnine, sur raid 25 Unlior..',s;ecehirLie stablSation par acétylation former C 13) L'intpa,',1H,K;tion d'une fonc rImine sur ourra se faire par réactiou avec un réac,- ,ortcr:ur d'une foncticla - le ext.ré !, d et à l'autre extr cation capable de sur la foncrior portée par l'oligoucchsnde. e telle fonction sera, par exemple, u.ne fonction thiol -SH, un diène c- -é (par réaction de. L::)is ià(Ider). Il est 3035794 17 également possible de réaliser sur la fr'nction .2. une ozonolyse suivie d'une amir e--nrncc. L'introduction une pourra être également réalisée par une réaction de .« crick-chems.tp menée p - 5 eligosaccharide, porteur d'une --CaCH, notarnmert Cette fonction iürS d a produuUon . roligosaccharide h-:J7Kie wo oii, fermeltatIon :7;Li',..'ant le procédé décrit dans la Cetirtion peu- ' rd r pour plus de détails. te sur l'oligosacchr- 10 réacH mir , prePi:Y-gylamine, sur l'oligosaccharide et stabilisaoui I int iaire par acétylation pour fumier u fonction -N(COCH3)-CH2-C ,ans ce une réaction ue « click-rhemistry » sera menée avec un réactif porteur 'Line part, d'une fonction azide -N3, thiol -SH par exemple, 15 et d'autre part, d'une fonction du type amine. La réaction entre une fonction T CH et -N3 c:onduit à la for g- triazoie. La réacticr 'r:ntre une fonction -C=-CH et un duit respectivement à la formation d'un thioétit- rents bras couplage 'pourront être présents dans ledit réactif 20 utih:- ',pur le de l'olinnsaccharide) ntre la fonction, -! à établir le .gosaccher (notamm SH, -N3) (notamment amine ci type -NH?' ultérieurement: ut-Àiisée pour &ab frage --valent oligosaccna sur la phase solide : notamment.i Plage polyéthyr 25 glycol ou encore 1 c'.:haî.nes ylène m qui Feut être 2, 3, 4 ou 5 notarnrumt. La quantiU ,....,31igosaccharide(s) fonctionnalisé(s) mise en réaction sur la phase soU 3tee, le r-rawL:,.re à obte;-tir n support avec le tat.J.>1: fage onctions aldéhyde en'tes sur la 30 solide ellaye c gosaccharide(s) ffées sur la a5e solide, Cid n7.; le_ Les sourai:tées. En particLi; une 3 0 3 5 794 18 suffisarnmerri 7.Àble sera pour ne pas saturer les fonctions aldéhyde présentes sur la phase sc Dc - ière avantar _, dans les supports utilisés selon l'inven ratio nombre de rno'lf.,7es d'oligosaccharide(s) greffées sur ia pre s(:Hcie / nombre de fonctious ::,:-;k1,..éhyde libres présentes sur la phase solidc. ÎI - à la gamme allant ge 1,100 à 1/1, de préférence à gamme 1,200 à 1/10 et/ou le support compce de 1 à 100 mg croligosec ,:olde(s) /g le support, préférerth,..=_1 ment entre 2 et 40 mg -`igosacc'reiie(s) support. 10 On pourra se référer aux eneT pour la méthode de dosage du ou oligosacù-ride(s) t1r et le calcul de la quantité u pgosaccharide(s) greffé par gr de support, ainsi que la méthode de dct:3ge des fonctions aldéhyde libres et le calcul du ratio nombre de molécules d'oligosaccharide(s) greffées sur la phase solide / nombre de 15 fonctions aldéhyde libres présentes sur la phase solide pouvant être Utjlisén, Lors de la préparation de prnrt utilisés dans le cadre de l'invention, le greffage d'oligosaccharide(s) fonctionrnalisé(s) sera le plus souvent réalisé sur la phase solide mise en suspension dans un solvant. Le greffage ect généralement réal- en suspension dans un solvant aqueux par amina 20 réductrice. , la phase solide porteuse de fonctions aldéhyde libres rn suspension da17, un tampon, notamment légèrement é - :par exemple de pH 6-7), en ...rtrésence de l'oligosaccharide fonctionnalisé avec une fonction amine du ta -NH-NH- oi et d'un réducteur qui ne réduit pas les fonctions iydn ne réagissant pas avec les 25 fonctions amine. La réaction er._.3 les fonction5 12 et une partie des léhyde libres forme un intermédiaire imine instable. Cet imine est réduit par e réducteur pour onner ur son covalente -CH2-NH-. En général, la réaction sera menée n unn t;:Ampérature de l'ordre de 20 à 30°C, sous agitation pendant 2 à 'titre d'exemple de réducteur sélectif 30 on peut citer le cyanobor dr_ dn nnJnm, Par réducteur sélectif, on eenJ un agent réducteur vct.:: stabiliser la fur ,t:tr, mine forn...n, s les fonctions aldéhyd idres n'ayant pas nd avec 3035794 19 amine. Par exemple, un réducteur puissant comme le Borohydrure sor.i'um () n'est pas approprié puisqu'il r.duira eus Si toutes les aL e libres résiduc.:es présentes su' phase elles 1, ;ions (..'2'e cci,',e,),,ge sont coren'::::3 les et pour 1t être appl Far analogie on pot.u7 -')ot...5y-runent. seérer à Immgy, 1971, 20' 1061. A Sir iviett---' fur Coupling Prs to r:' C. J. E D. V. WILSON pour greffage sur sulide J final, 5.ur le sui. - -)rt utilisé dans le u.7,1 10 covalente oli(r),accharidi- 'hase solide pourra ét.- hr-teri e de, de liaison incluant flot r" r- ne triazole CU U e c une chaîne 'Polyéthylène et..:./au une ou a kylène ic u -rentes du ...ype 42jrn- avec ni qui peut )tamment. rtic un bras défini ",a sens 15 )sa, rkase solide du t -CH2-CH2-CH2- P qL rre 2, 3, 4 cJ Lur, Ce bras peut être part, - cligosacchari{ rte ,-'q ion allyle, celui-ci prés t une de purificatig, et un bras relat à sy 20 part: , .;; invention, les mo , phase solide par l'interméd'-'.-e d'un br.as bson r r le sens phase solide oligosacch urrner'ii Notamment, le bras de liaison L corr un azole ou '.r-le liaison - et/ou une es r:,:^olyétt -_t/ou 25 une Gu m.usieurs chaînes a ,..rentes Ju type J12)- avec t qui :.ut être 2, r,, exemple. ,,:,:.-Dlwriment'. de liaison corresc _ à l'en,: -012-0-12-S-012-CH2-c, )CI-13)- le groupe _,,,7H3) étant air' em une unité sa 'dicr_le de l'olk :hade préféren su car"-..x.5ne, anomérique 30 .sacc On utili dans le cadre de 'In vent- , un support dont s est à la fc.._ __Ise de LnCtions a .es résiduelles et cues 3 0 3 5 794 20 d'oligosaccharide(s ....us. Les 2 et 3présentent une cellulose conforme. a F su' 'leu- ik-25 Je deux exemples loos,72;:charide c été greffée I :ore, l'alternance greffage sur une fonction aide, absence t ge et dr: sur l'autre fo- présentéo sur les 2 et 3 est cannée à ent illusisatif. Le g 1ourr7 ou -tee et U '3° cc:,ntre, dans les :5 selon ivention dont la 'soLiF une u:.:ructure. e telle que la cellulose ci.ans laquelle P:e 'PD n :D PS a':!é.1-1yde 0 nt 'D te 70.: es par oxydabor- 10 y aura de(s) greffées me saccharidiuue oxyciee et e -nction aldéhyde libie. greftlg::2 rie deux oligc de!' onctions aldéhyde libres d n'èrhe unité saccharldlq' 1-P de la Tase solide est rie'f^forable. Aussi, . ;..:1dùiyde vicinal diunt:--"'. que o rte 15 oligosao:l...,'-:hde est très majo ne tell, :on. - stabP:,:er ia ,,,Dh-gosacchande[y-'dic(iy- )elon un rw..),-1,;.-,: de réalisé iffion féré, dar.: les su pp utilisés dans le cadre de 1, la phase solide est de le )se comporte, avant greffage des cules d'oligosaccharide, des mule 20 -CH(CH0)-CH.:. Après greffage, phase solide est, fr,177 e cadre clE,':'. ',Invention la cellu lui compc.::rt.-., °es unités de 25 et/ou des 0H)-0-CH(CH2-NH-L- ' ;ormule -CH(CH2NH-L-oligo)-CH(C1-1 D-Ci- (010)-0- dans le-lueko.:7, L. est un bras de liaison ..go ,est oliL, capable. lier à un ou F.:7.77; 7...nucorps,d nrrence un oligosE ide capable de se lier ild, : déterminant B, il est DOS;''jble d'obi .)lasmas sanc.p.,..jr prép p asmat- -"ts univ7r -reser-tant aucun d'adnL ion à des ht'mnaH-;,.., soit upe sanguin A, B 25 La présence ri f.)!*)CUOFH3 aldéhyde libres sui- la ph2se solide d, cunnewt perm.et c ' cas des anticor,-., le cas de;' 'H par !a n3r Dspara,g 30 -inIne ou glutaniirie présr1 r ariticoîps I e à un oiigosaccriai-ide et vie Dn,:stion aldéhyde libre présente f-:.,,,ur la phase solide du support ck7.:crit dans le caUre de l'invention. De mêiT,..e, cette stabilisation peut être réalisée par 3035794 27 l'intermédiaire d'un acide aminé présentant un pKa alcalin, ..a me la le tryptophane, ou la cystéine, présit sut I antc,:::eps .1 une foricton adéhyde libre présente sur la phase s(7)kiej o )ort décrit dans le cadre cle l'invention. Coo o cas de l'as.Daraline, le micro-enviror000 créée par la fixation dE.,. sur I a:c:haride favorise la ï"1 non en.7.ymatique d'une fonctior alciehyde située sur le support à de Voligosaccharide greffée (et en r. ouuc..ilier l'aldéhyde vicinal dono le co . d'un support du type cellulose corn.:t..rtant des unités -CHP-1 CH(CiiOft-0,--C,1-1(CFt sut no asparagine de l'anticor 10 laticn irout également se faire par formation d'un conjud.'m.: base de Schiff, intervenant a',.,e7 on acide aminé d l'an» comprenant une fonction amine 1H o roi fc ta une .oison covalente ir type -C=N- qui pourra être ré&c jans le is liquide biolt:q.j, qui présenterait au sib de fixa don de l'anticorps u o réducteur, lo H721 15 formée serait er:ore plus stade. Les eoor *, d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun ca-a(.;-,, Apparc es et Conditions utilisés pour les Caractérisatic. 20 Mesure d'absorhance La lecture de t,bance est Hsée sur un spectrophotomètre UNICO Spectromphotometer 1200P. 1 Hclmrtillon est transféré dans une cuve spéc:' -1 PMMA. HPAEC-PAD 25 Le profil en monosaccharides déterminé par HPAEC sur une chaîne chromatographique ICS2500 . La séparation est réalisée sur une colonni_ lex CarboPac PAL LHlHion est réalisée avec un gradient soude, cracetate de sodium et d'eau la colonne est thermostatée à 17°C. Le.,.; conditions d'élution sont détaillées dans le Tableau 1 ci-après : 3035794 28 Tableau 1 Temps (mn) NaOH 200 eau NaOH 200 mM déionisée mM Acétate 1M 0 9,0% 91,0% 0,0% 20 9,0% 91,0% 0,0% 20,1 7,0% 91,0% 2,0% 50,0% 50,0% 35,1 50,0" 0,0% 50,1% 50 50,070 ^,r)^1- 50,0% 50,1 9,0% 0,0% 65 9,0% 91,0-io 0,0% La détection est assurée par ampérométrie pulsée sur une électrode Chaque monosaccharide est calibré par un étalonnage externe. 5 MALDI TOF Les spectres de masse sont obtenus sur un spectromètre de masse MaldiToF-ToF Speed (Bruker Daltonics). L'échantillon est préparé en s ition à 2.10-4 M dans l'eau. On dépose sur une plaque 0,5 pL de la solution d'échantillon préparée avec 0,5 pl de DHB (acide 2,5-dihydroxybenzoïque) à 10 50 mg/mL. On laisse sécher à température ambiante ou sous un flux d'air à température ambiante. Après séchage du dépôt, la mesure est réalisée avec le spectromètre de masse. 10 ensembles de 1000 tirs chacun sont réalisés à différents endroits du dépôt. L'ensemble des 10 000 acquisitions constitue le spectre final. L'échelle des masses est ajustée par le passage d'une solution de calibration « Brucker peptide calibration standard 2 ». RMN du proton L'acquisition des spectres RMN du proton est réalisée sur un spectromi e résonnance magnétique Avance III 400 MHz Bruker. L'échantillon, _mus forme lyophilisé, est préparé dans une solution de D20, à raison d'environ 20 exactement 5 à 1( ig dans 700 pL de D20 comportant un étalon interne, le succinate de sodium à 1,77 g L. ! cguisition est réalisée dans un tube RMN, à 80°C avec un temps de relaxai' de 20 secondes et avec 16 scans. Les données brutes d'acquisition sor traitées avec le logiciel Topspin NMR de Brucker. 3035794 "ethode de do..ge des molécules idsaccharide(s) greffées et cala 3 quantité d'oligosaccharide(s) qrefe par gramme de support taux de greffage en oligosaccharide( mesuré par analyse des monosaccharides constitutifs après hydrolyse, par exemple à l'acide trifluoroacétique (TFA), du support utilisé selon l'invention conduisant à l'hydrolyse totale ch. gosaccharide. Pour cela, on peut utiliser le protocole type suivant : 20 mg r* support selon l'invention sont hydrolysés avec 500 pL de TFA 2N pendant 4h à 99°C. LE E-_'3nge est ensuite neutralisé aver 53 pL de NaOH 19N et ajusté avec à lmL avec de l'eau déionisé-_ Un stE 10 de l'oligosaccharide dans sa forme mise en oeuvre pour le grtfage, préférence dans sa forme non fonctionnalisée, est traité dans des corme identiques. Après filtration et dilution au quart, le profil monosaccharidic est déterminé par HPAEC-PAD. La comparais s résultats obteris pour ie support selon l'invention et le standard, sur le dosage d'unités saccharidiques 15 spécifiques des oligosaccharides non présents dans la phase solide utilisée, notamment du fucose et du galactose dans le cas des oligosaccharides ;és dans les exemples qui sont non présents sur la cellulose utilisés dans cel Lains des exemples en tant que phase solide, conduit soit directement à la quantité greffée d'oligosaccharide dans le cas où le standard est 20 l'oligosaccharide dans sa forme réductrice non fonctionnalisée, soit à la quantité greffée d'oligosaccharide + bras de liaison dans le cas où le standard est l'oligosaccharide dans sa forme mise en oeuvre pour le greffage. Dans ce cas, la quantité d'oligosaccharide greffée peut directement être obtenue après déduction de la masse du bras de liaison. 25 Méthode de dosage des fonctions aldéhyde libres et calcul du ratio nombre de molécules d'oligosaccharide(s) greffées sur la phase solide / nombre de fonctions aldéhyde libres présentes sur la phase solide Le nombre de fonctions aldéhyde présentes sur la phase solide peut mesuré par dosage colorimétrique avec de l'acide 3,5-dinitrosalycili (DNS) qui va être réduit en acide 3-amino-5-nitrosalicylique (composé rouge) par les fonctions aldéhyde libres présentes, avec un ét onnage externe 3035794 30 réalisé par exemple avec du glucose. Un protocole type Est donné à l'exemple 1. obtient ainsi le taux de fonctions aldéhyde par quantité de masse de support, et plus particulièrement, pour la , ce taux peut êt exprimé par unité polymérique de glucose en considéru... ne masse _lire de 162 g/rnol par unité glucose dans le polymère de Les dosages des oligosaccharides greffés par unité de r-PassE:- ou par monomère de glucose de support pour la cellulose, au dosage des fonctions aldéhydes par unité de masse de suppod ou par monomère de glucose de support pour la cellulose, permettent de 10 déterminer le ratio nombre de molécules d'oligosaccharide(s) greffées sur la phase solide / nombre de fonction,: 7idéhyde libres présentes sur la phase Les oligosaccharides qui vont être greffés sont les suivants : La dénomination GrA signifie que l'oligosaccharide est capable de se lier 15 aux anticorps anti déterminant A, présents chez les individus du groupe sanguin B ou 0 et GrB signifie que l'oligosaccharide est capable de se lier aux anticorps anti déterminant B, présents chez les individus du groupe sanguin A ou 0. 6GrA1 : GaINAca.1-3 Fucct1-2 Gal(31-3G1cNAcf31-3Gali31-4GIc : 20 25 6GrB1 : GalGt1-3 Fucc(1-2 Gal[31-3G1cNAct31-3Galf31-4GIc 30 HO OH 3035794 31 4GrA : GaINAca1-3(Fucal-2)Gal[31-4GIc OH 0 HO 0 OH 1-10 Gal 3GrA GaINAcal 3 Fucal-2 OH 15 0 H HO OH 4GrB5 : Gala1-3 Fucal-2 Gall31-4GIc OH 10 OH 20 Les exemples, ci-après, permettent d'iHustri nu,mtion, mais n'ont aucun caractère limitatif. L PREPARATION DES SUPPORTS Exemple 1: Activation de cellulose micronisée et greffage de l'oligosaccharide 6GrAl-NAc Propargyl préalablement activé avec 25 une fonction amine De la cellulose micronisée, Vitacel 600-30 produite par Rettenmaier, est activée par la création de fonctions aldéhyde, obtenues par un traitement au métapériodate NaI04. Pour cela, on mélange 500 g de cellulose micronisée avec 100 g de NaI04 et 5L d'eau. Le mélange est maintenu à température 30 ambiante une nuit, sous agitation, puis, le support cellulosique obtenu est rincé à l'eau, puis à l'éthanol et séché à l'étuve à une température d'environ 50°C. 3035794 32 Le nombre de fonctions aldéhyde ainsi crééF.s sur le support cellulosique est mesuré par dosage colorimétrique des fonctions réductrices. Pour cela, 5 mg de la __Jose activée obtenue sont solubilisés dans 500 pL d'eau déionisée. On ajoute 500 pL de réactif au DNS à 10g/I (1,6 g de NaOH dans 15 mL d'eau délonisée, 1 g d'acide 3,5 dinitrosalicylique (DNS) dans 20mL d'eau déionisée, 30g de tartrate double de sodium et de potassium, ajusté à 100mL avec de l'eau déionisée). Après 5 minutes à 95°C, l'échantillon obtenu est refroidi rapidement sous l'eau froide. On ajoute alors 5mL d'eau déionisée. Après un repos de 20mn, on effectue une lecture de 10 l'absorbance à 546 nm. Le résultat obtenu est comparé à une courbe d'étalonnage externe réalisée dans les mêmes conditions avec clt. :ose (comportant un aldéhyde par molécule). On en déduit que la lose activée obtenue comporte 1 fonction aldéhyde pour 14 glucoses. En réalisant 0 fois le dosage, il apparaît que la précision de la mesure est de 3%. Le pourcentage de précision est estimé par le rapport de l'écart type sur la moyenne des mesures. L'écart type étant défini par la racine carrée de la somme des écarts à la moyenne au carré divisé par te nombre de mesures moins une, étape d'activation préalable de l'oligosaccharide 6GrA1-NAc- 20 PropaiI,: est nécessaire pour permettre son greffage sur la cellulose activée par des fonctions aldéhyde obtenue. La GlycoBrick 6GrA1-NAc-Propargyl fournie par Elicityl (OligoTech® Ref GLY037-1-NPR) est activée par ajout d'une molécule espaceur amine comportant une fonction réactive azide, une chaîne de 3 PEG et une fonction amine, le 11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1- 25 amine (TCI Chemical référence A2363). La GlycoBrick 6GrA1-NAc-Propargyl est mise en solution dans un mélange Méthanol/Eau (50/50) à 10 g/L en présence de 1,2 eq. d'ascorbate de sodium, 0,4 eq. de CuSO4 et 1 équivalent d'azido espaceur amine, le 11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine. Après environ 2 heures sous agitation, le produit de la réaction, 6AGrA1 aminé est 30 puriei lr passage sur une résine échangeuse de cations. Pour c-f 1, la solLI st mise en contact avec de la résine Dowex® 50. Après élirr ition de la .3olution initiale et rinçagE à l'eau, ta molécule est désorbée av.::: une 3035794 solution d'ammoniaque à 2%. Aprè év.oration ei lyophilisation, le 6GrAl aminé de formule : 0 F. OH est prêt pour le greffage. Le greffage du 6GrA1 aminé sur la cellulose activée obtenue précédemment est réalisé de la manière suivante : 15 g de cellulose activée, 6000 pL d'une solution de 6GrA1 aminé dans l'eau à 50 g/L, 2400 pL de tampon phosphate 0,5M pH3 et 36,600 mL d'eau sont mélangés pendant environ 16 heures à température ambiante. 15 mL d'une solution de 10 NaCNBH3 à 100g/L dans l'eau sont alors ajoutés. On laisse réagir 8 h sous agitation. Le support greffé est ensuite abondamment rincé à l'eau, puis à l'éthanol pur et est ensuite séché à une température de l'ordre de 50°C. Le taux de greffage de 6GrA1 aminé est évalué par analyse des monosaccharides constitutifs après hydrolyse totale de l'oligosaccharide. Pour 15 cela, 20 mg de la cellulose fonctionnalisée obtenue sont hydrolysées avec 500 pL de TFA 2N pendant 4h à 99°C. Le mélange est ensuite neutralisÉE avec 53 pL de NaOH 19N et ajusté avec 1mL avec de l'eau déionisée. standard de 6GrA1 aminé e t traité dans des conditions identiques. filtration et dilution au quart, le profil monosaccharidique est détermi, par 20 HPAEC-PAD. La comparaison des résultats sur le dosage du fucose du galactose spécifique des oligosaccharides, mais non présents sur la cellulose, n re I lose greffée et le standard, conduit à une quantité greffée de 6GrA1 ou ollé de 12,0 mg/g de support final, correspondant à une quantité de 6GrA1 (après soustraction de la masse correspondant au bras de liaison) greffé de 9,4 mg/g de support final. En réalisant 10 fois le dosage, il apparaît que la précision de la mesure est de 3,4%. Le pourcentage de précision est estimé par le rapport de l'écart type sur la moyenne des mesures. L'écart type étant dthi par la racine carrée de la somme des écarts à la moyenne 3035794 34 au carré divisé par le nombre de mesures moins une. Ceci correspond à 688 moles d'unités glucose de la cellulose pour 1 mole d'oligosaccharide greffé. Le taux d'aldéhydes résiduels après greffage est déterminé selon la méthode décrite à l'exemple 1, il est ici de 1 pour 18 (un aldéhyde pour 18 unités 5 glucose, monomère de la cellulose). Le ratio nombre de molécules d'oligos -:charide(s) greffées sur la phase solide / nombre de fonctions aldéhyde libres présentes sur la phase solide est égal à 1/38. Exemple 2: Greffage de l'oligosaccharide 6GrB1-NAc Propargyl 10 préalablement avec une fonction amine, sur de la cellulose micronisée préaabiement activée On utilise la ceildose micronisée préalablement activée, produite à pie 1, comprà-àrr: 1 fonction aldéhyde pour 14 glucoses. Une étape d'activation préalable de l'oligosaccharide 6GrB1-NAc- 15 Propargyl (GlycoBrick 6GrB1-NAc-Propargyl fournie par Elicityl, OligoTech® Ref GLY040-1-NPR) est réalisée dans les mêmes conditions que celles utilisées à l'exemple 1 pour l'oligosaccharide 6GrA1-NAc-Propargyl et conduit à l'oligosa àr'de 6GrB1 aminé de formule suivante 20 Le greffage du 6GrB1 aminé sur la cellulose activée est réalisé comme à l'exemple 1. Le taux de greffage de 6GrB1 aminé est évalué selon la méthode détaillée à l'exemple 1 et permet de déterminer une quantité grefe;-,. 6GrB1 aminé de 12,9 mg/g de support final, correspondant à une qi 6GrB1 (après soustraction de la masse correspondant au bras cl,. 1::;3on) greffé de 10,0 mg/g de support final. Ceci correspond à 620 moles c glucose de la cellulose pour 1 mole d'oligosaccharide greffé. Le taux Ne12 Fi 3035794 35 d'aldéhydes résiduels après greffage est déterminé selon la méthode décrite à l'exemple 1, il est ici de 1 pour 19 unités glucose. Le ratio nombre de molécules d'oligoçccharide(s) greffées sur la phase solide / nombre de fonctions aldéhyde libres présentes sur la phase solide est égal a 1/33. Exemple i-réparation de 4GrA5-S-(CH2)2-NH2 et son greffage, sur de la cellulose micronisée préalablement activée 1) Préparation du précurseur de fermentation Lactose-rqA Allyle 10 On fait réagir 25 g de lactose déshydraté (Meggle DuraLac® H) avec 50 mL d'allyle amine. Après 12 heures de réaction à 43°C sous agitation avec un barreau magnétique, le mélange est séché à l'évaporateur rotatif sous pression réduite à 40-4C On co-évapore ensuite à tv is reprises, avec à chaque fois 100mL de méthanol et 100 mL de toluène. On reprend 15 l'ensemble dans 250 mL de méthanol auxquels on ajoute 200 mL d'anhydride acétique. On laisse réagir sous agitation et à température ambiante pendant 12 heures. Le mélange est ensuite séché à l'évaporateur rotatif sous pression réduite à 40-45°C. Cm co-évapore ensuite à trois reprises avec à chaque fois 100mL de méthanol et 100 mL de toluène. Le mélan réactionnel est repris avec 200 mL d'eau déionisée, puis lyophilisé. Le iyophilisat est repris dans 350 mL d'éthanol. On ajuste pH à 9 avec du méthyla,,.::: de sodium. On laisse réagir trois heures envi, L'Dus agitation et à température ambiante. 25 On ajoute ensuite l'ensemble avec de 200 mL d'eau déionisée et on neutralise c .brhydrique. 3035794 HO OH La production de 4GrA5-Ally1 est réalisée en fournissant à une souche drE. Cali modifiée du lactose Ally1 préparé précédemment (procédé décrit - dans le brevet FR2796082). La souche productrice de 4GrA5 est référencée SD142 par Elicityl (Randriantsoa, m. (2008). Synthèse Microbiologique des antigènes glucidiques des groupes sanguins. Grenoble : thèse de l'université Joseph Fourrier). Un fermenteur contenant 3,7L de milieu de culture (glycérol (2,4 g/L), NH4H2PO4 (7 g/L), KH2PO4 (7 g/L), solution de traces 10 minérales (7,5 mL/L), acide citrique (0,6 g/L), K01-1 (2,5 g/L), NaOH (1 g/L), MgSO4 7H20 (1 g/L), Thiamine (4,5 mg/L)+ Glucose 7,5 g/L) est ensemencé par 80 mL d'une pré-culture de la journée (à une Densité Optique de 2). L'oxygène dissout est maintenu à 40%, le pH régulé à 6,8 par addition de NH3 et la température maintenue à 34°C. La culture comporte trois phases. 15 La première phase dure jusqu'à la consommation totale du glucose, puis du glycérol qui ont été mis au départ dans le milieu de culture. Au début de la seconde phase, les gènes codant pour les différentes nucléotides synthétases et glycosyltransféras induits par ajout d'IPTG (isopropyl thiogalactopyranoside), substrats sont rajoutés au milieu de cultur.?, l'alimentation à haut débit (40 mL/h) est lancée pour 5h. Durant la troisième phase, le débit de l'alimentation est réduft à 25 mL/h. La culture est arrêtée 48h après l'induction. 3) Pur ion du 4GrA5-Ally1 produit par fermentation 25 Le mili( - de culture obtenu précédemment est cr-' rifugé pendant 20 mn à Rom Imm. Le culot bactérien est récupéré, puis remis en suspensinn dans 2._ r I déionisée équivalent au volume de culture. Le culot ' 36 2) Production ou 4GrA5-Ally1 par fermentation 0" /OH 0 H3 HO 3035794 37 en suspension est porté à dant 70 mn pour perméabiliser les bactéries. Les débris cellulaires sont,inés par centrifugation pendant 1 mn à 8000 rpm I e surnageant e Jdifié à un pH 3 avec de chlorhydrique. L :'cipité est éliminé par centrifugation pendant 20 mn à 8030 rpm. On neutralise le surnageant à la soude. On ajoute de la résine Dowex® optipore SD2 et on laisse pendant 12 heures sous agitation. Après élimination de la résine, la solution est concentrée à environ 500 mL à l'évaporateur rotatif sous pression réduite. La solution est ensuite purifiée en chromatographie HPLC à polarité inverse de phase sur un support C18 10 lichrosphère 12pm de la société Merck. L'élution est réalisée avec un gradient d'éthanol entre 0 et 9% en volume. Le 4GrA5-Allyl est élué, concentré à l'évaporateur rotatif sous pression réduite et lyophilisée. On obtient par cette méthode de purification 6,8 g de 4GrA5-Allyl. L'identité et la structure de l'oligosaccharide sont validées en spectrométrie de masse MALDI TOF et 15 RMN du proton. La spectrométrie de masse MALDI TOF permet de déterminer la masse attendue de 772 g/mol, c'est-à-dire sous sa forme complexée au sodium 795 ginlni, Le profil 1H RMN était conforme à la structure. La 1H RMN quantitative avec étalonnage interne pernet d'estimer la pureté à 95% + 1,9%. 20 4) Activation du 4GrA5-Ally1 par introduction d'une fonction amine HO NH2 Le 4GrA5-Allyl obtenu précédemment est aminé par réaction de la 25 fonction allyle avec la fonction thiol de la cystéamine. Pour cela, on mélange 500 mg de 4GrA5-Allyl produit précédemment avec 656 mg de cystéamine et 16,3 mg de d'acide 4-cyanovalérique dans 5 mL d'eau déionisée. La solution 303 5 794 38 est maintenue deux heures sous agitation à ,),.. L'oligosaccharide obtenu, le 4GrA5-S-(CH2)2-NH2 est ensuite purifié par passage sur résine Dowex® 50WX4. L'élution est ILLIisée avec de l'ammoniaque à 2%. La fraction éluée est concentrée à l'évaporateur rotatif sous pression réduite à sec. Le produit est repris avec 5 mL de méthanol et précipité avec 100 mL de THF. Le précipité est récupéré par filtration. Le produit est re-solubilisé à nouveau dans 5 mL de méthanol et précipité avec 100 mL de THF. On récupère le précipité par filtration, on le reprend dans de l'eau déionisée et le concer::: à l'évaporateur rotatif et le lyophilise. On obtient par cette méthode 465 mg 10 de 4GrA5-S-(CH2-NH2. La spectrométrie de masse MALDI TOF permet de déterminer une masse attendue de 849 g/mol, c'est-à-dire sous sa forme complexée au sodium 872 g/mol. Le profil 1H RMN était cor à la ctr !dure. La 1H RMN quantitative avec étalonnage interne perrn ustimer r reté à 100% +/- 3,3%. 5) Couplage du 4GrA5-S-(CH2)2-NH2 sur la cellulose activée On utilise une cellulose micronisée préalablement activée comme Hi à l'exemple 1, caractérisée avec 1 fonction aldéhyde pour 12 glucoses. Le greffage du 4GrA5 aminé sur cette cellulose activée est réalisé de la 20 r.nnire suivante : 20 g de cellulose activée, 7,530 mL d'une solutign S-(CH2)2-NH2dans l'eau à 50 g/L, 4,8 mL de tampon phosphe pH3, 69,270 mL d'eau et 20 mL d'une solution de NaCNBH3 à 10g/L sont mélangés et agités environ 72h à température ambiante. La cellulose greffée obtenue est ensuite abondamment rincée à l'eau, puis à l'éthanol pur et enfin séchée sous pression réduite. On obtient 18,5g de cellulose greffée. Le taux de greffage de 4GrA5 aminé est évalué selon la méthode détaillée à l'exemple 1 et permet de déterminer une quantité greffée de 4GrA5 aminé de 16,4 mg/g de support final, correspondant à une quantité de 4GrA5 (après soustraction de la masse correspondant au bras de liaison) 30 greffée de 10,8 mg/g de support final. Ceci correspond à >11/1 -,oles d'unités glucose de la cellulose pour 1 mole d'oligosaccharide fé. Le taux 3035794 39 d'''-14f-kydes résiduels après greffage est déterminé selon la méthode décrite nple 1, il est ici de 1 pour 15 unités glucose. Le ratio nombre de molécules d'oligosaccharide(s) grefféPç SUr phase solide f nombre de fonctions aldéhyde libres présentes sur la phase solide est égal à 1/26. Exemple 4: Préparation de 4GrB5-S-(CH2)2-NH2 et son eireffage, sur de la cellulose micronisée préalablement activée 1) Production du 4GrB5-Ally1 par fermentation 10 La production du 4GrB5-Ally1 est réalisée en fournissant à une souche d'E. Coli modifiée du Lactose Allyle préparé précédemment (procédé décrit dans le brevet WO 2001004341 Al). La souche productrice de 4GrB5 est référencée SD107 a Elicityl (Randriantsoa, m. (2008). Synthèse 15 Microbiologique des antigènes glucidiques des groupes sang Thèse de l'Université Joseph Fourrier Grenoble). On procède comme déL, n: l'exemple 3-1). 2) Purification du 4GrB5-Ally1 produit par fermentation 20 La purification est réalisée comme clé( l'exemple 3-2). On obtient par cette méthode de 6,8 g ue 4GrB5-Allyl. L'idtt et la structure de l'oligosaccharide sont validées en spectrométrk masse MALDI TOF et ,,MN ri nrnton. La spectrométrie de masse MALDI TOF permet de déterminer sse attendue de 731 g/mol, c'est-à-dire sous sa 25 forme complexée au sodium 754 g/mol. Le profil 1H RMN était conforme à la structure. La 1H RMN quantitative avec étalonnage interne permet d'est:rner la pureté à 100% +/- 3,8%. 3035794 3 Activation du 4GrB5-Ally1 par introduction d'une fonction amine OH Le 4GrB5-Ally1 obtenu précédemment est aminé par réaction de la fonction allyl avec la fonction thiol de la cystéamine. Pour cela, on mélange 500 mg de 4GrB5-Ally1 produit précédemment avec 699 mg de cystéamine et 17,2 mg d'acide 4-cyanovalérique dans 5 mL d'eau déionisée. La solution est maintenue trois heures sous agitation à 80°C. Pour le reste, on procède comme décrit à l'exemple 3-3). On obtient par cette méthode 461 mg de 10 4GrA5-S-(CH2)2-NH2. L'identité et la structure de l'oligosaccharide sont validées en spectrométrie de masse MALDI TOF et RMN du proton. La spectrométrie de masse MALDI TOF laisse apparaître la masse attendue de 808, c'est-à-dire sous sa f ne complexée au sodium 831. "IMN était conforme à la structuT La RMN quantitative avec étal:, rne 15 permet d'estimer la pureté à 97% +/- 4,9%. 4) Couplage du 4GrB5-5-(CH2)2-NH2 sur la cellulose activée On utilise une cellulose mici 'e préalablement activée, comme décrit à l'exemple 1, caractérisée avec 1 fonction aldéhyde pour 12 glucoses. Le greffage du 4GrElr --miné sur cette cellulose activée est réalisé comme à l'exemple 3-4), er rusant 7,166 mL d'une solution de 4GrB5-S(C1-12)2-NH2 dans l'eau à 50 9/ L. On obtiert 18,9 g de cellulose greffée. Le taux de greffage de 4GrB5 aminé est évalué selon la méthode détaillée à l'exemple 1 et conduit à une quantité greffée de 4GrB5 aminé de 25 13,5 rrig/g de support final, correspondant à une quantité de 4GrB5 (après soustraction de la masse correspondant au bras de liaison) greffé de 9,3 mg/g de support final. Ceci correspond à 364 moles d'unités glucose de la 3035794 41 cellulose pour 1 mole d'oligosacchride greffé. Le taux d'aldéhyd, après greffage est déterminé s-1- a méthode décrite à l'exemple 1, il est ici de 1. pour 16 unités glucose. Le ratio nombre de molécules d'oligosaccharide(s) gre" la phase solide / nombre de fonctions aldéhyde libres présentes sur I, solide est égal à 1/27. Exemples ccmparatifs 1 et 2 - Réduction des fonctions aldéhyde résiduelles présentes sur les supports des exemples 1 et 2 10 On met en suspension 13g du support cellulosique greffé de 'exemple 1 ou 13g du support cellulosique greffé de l'exemple 2 avec 1CC d'eau déionisée et 300 mg de NaBH4 conduisant E: réduction des T ictions aldéhyde en fonctions alcool. On agite 2h à trrpérure ambiante. On rince ensuite 4 fois avec 100 mL d'eau déionisée, puis 3 fois avec 100 mL 15 d'éthanol. La poudre obtenue est séchée à l'étuve à 50°C pendant 24h. On obtient respectivement 12,4 g de l'exemple 1 réduit et 12,8 g de l'exemple 2 réduit. Le dosage des fonctions aldéhyde libres est réalisé suivant la mL d .iosage au DNS décrite à l'exemple 1. Le taux de greffage est déterminé 20 ant la méthode de dose des monosaccharides en HPAEC avec hydrolyse totale, décrite précédernmert 3035794 42 Tableau 2 * mg d'oligosaccharide aminé 6GrA1 aminé ou 6GrB1 aminé) /g de port ratio oligo de la phase 6GrA solide/nombre 1 Aminé* de fonctions aldéhyde libres sur la phase solide Echantillon Fonctions aldéhyde oligo de la phase solide / 6Gr81 nombre de Aminé* fonctions aldéhyde libres sur la phase solide Echantillon Fonctions aldéhyde 1/33 1/2 Exemple 2 Exemple 2 après réduction) 1 aldéhyde pour 19 12,9 glucoses mg/g 1 aldéhyde pour 391 11,8 (Tilucoses mg/g 1 aldéhyde pour 18 12,0 1/38 glucoses mg/g 1 aldéhyde pour 327 11,5 1/2 glucoses mg/g Exemple 1 Exemple 1 (après réduction) ratio 3035794 43 ..,cemples comparatifs 3 et 4 - Rtion des aldéhydes résiduels sur les supports décrits aux exemples 3 et 4 On met en suspension 1 g du support cellulosique greffé de l'exemple 3 ou du support cellulosique greffé de l'exemple 4 avec 5 mL de tampon phosphate 2M pH 7, 5 mL d'eau déionisée et 156 mg de NaBH4. On agite 30 mn à température ambiante. On rince ensuite 4 fois avec 100 mL d'eau déionisée, puis 3 fois avec 100 mL d'éthanol. La poudre obtenue est séchée sous pression réduite à température ambiante pendant 72h. On obtient 10 respectivement 870 mg d'exemple comparatif 3 (exemple 3 avec fonction aldéhyde résiduelle sous forme réduite) et 670 mg d'exemple comparatif 4 (exemple 4 avec fonction aldéhyde résiduelle sous forme réduite). Le dosage des fonctions aldéhyde libres est réalisé suivant la méthode du dosage au DNS décrite à l'exemple 1. Le taux de greffage est déterminé 15 suivant la méthode de dosage des monosaccharides en HPAEC avec hydrolyse totale, décrite précédemment 3035794 44 Tableau 3 *mg dioligosaccharide aminé 4GrA5 aminé ou 4GrB5 aminé) /g de 5 support 1/27 1/2 Exemple 4 Exemple comparatif 4 après réduction) 1 dl pour 16 11,7 mg/g glucoses 1 aldéhyde pour 284 11,6 mg/g glucoses ratio oligo de la phase solide /nombre de Echantillon Fonctions aldéhyde 4GrA5 Aminé* fonctions aldéhyde libres sur la phase solide Exemple 3 Exemple comparatif 3 (après réduction) 13,1 mg/g 1/26 glucoses 1 aldéhyde pour 322 13,2 mg/g gl 1/1 1 aldéhyde pour 15 ratio oligo de la phase solide / nombre de Echantillon Fonctions aldéhyde 4GrB5 Aminé* fonctions aldéhyde libres sur la phase solide 3035794 emple 5 - Activation de ta cellulose microcristalline et greffage de l'oligosaccharide 6GrA1-NAc Propargyl préalablement activé avec une fonction amine. la cellulose microcristalline, Vivapur® type 101 produite par naier, est activée par la création de fonctions aldéhyde, par traitement rriétapériodate, Nal; )ur cela, on mélange 30 g de cellulose microcristalline avec 6g de Nal°, 10mL d'eau. Le mélange est maintenu pendant 12 heures sous ag,T température ambiante. Le support cellulosique obtenu est rincé a l'eau, puis à l'éthanol et séché à l'étuve à 10 environ 50°C. Le nombre de forc.:ïis aldéhyde ainsi créées sur le suppor: suré par dosage colorimétrique des fonctions réductrices, confor à l'exemple 1 et donne 1 fonction aldéhyde pour 17 unités glucose. L'oligosaccharide 6GrA1-NAc-Propargyl activé par introduction d'une 15 fonction amine (nommé 6GrA1 aminé), tel que décrit à l'exemple 1 est utilisé pour le greffage. Le greffage du 6GrA1 ,né sur le support cellulosique activé précédemment est réalisé comme l'exemple 1. Le taux de greffage de 6GrA1 aminé est évalué selon la méthode 20 détaillée à l'exemple 1 et conduit à une quantité greffée de 6GrA1 aminé de 4 mg/g de support final, correspondant à une quantité de 6GrB1 (aprc soustraction de la masse correspondant au bras de liaison) greffée de 7,3 mg/g de support final. Ceci correspond à 880 moles d'unités glucose de la cellulose pour 1 mole d'oligosaccharide greffé. Le taux d'aldéhydes résiduels 25 après greffage est déterminé selon la méthode décrite à l'exemple 1 et est ici de 1 pour 18 unités glucose. Le ratio nombre de molécules d'oliaosaccharide(s) greffées sur la phase solide / nombre de fonctions aldéhyde U res présentes sur la phase solide est égal à 1/49. 3035794 46 Exemple 6- AcMvatIon de la cellulose microcristalline greffage de roligosaccharide 6 Propargyl préalablement activé avec une fonction amine. On utilise une cellulose microcristalline préalablement activée cdr1.-r,L décrit à l'exemple 5, caractérisée avec 1 fonction aldéhyde pour 17 glucosu, L'oligosaccharide EGrB1-NAc-Propargyl activé par Toduction dune '-,1 amine ( om, que décrit'Lxemple 2, _st pour le greffage. Le greffage du 6GrB1 aminé sur le support cellulosique activé comme à 10 l'exemple 1. taux de greffage de 6GrB1 aminé est évalué selon la méthode dé ta e à l'exemple 1 et conduit à une quantité greffée de 6GrB1 aminé de 10,3 mg/g de support final, correspondant à une quantité de (après soustraction de la masse c espondant au bras de liaison) greffé A de 8,0 a de support final. Cec. _orrespond à 779 moles d'unités glucose de la [sose pour 1 mole d'oligosaccharide greffé. Le taux d'aldéhydes résidue après greffage est déterminé selon la méthode décrite à l'exemple 1, il est ici de 1 pour 18 unités glÀcose. Le ratio nombre de molécules d'oligosaccharide(s) greffées sur la phase 20 solide / nombre de fonctions aldéhyde libres présentes sur la phase solide est égal à 1/43. Uxemples 7 et 8 - Production de supports greffés à différentes concentration de 6 GRA1 et GRB1 : On util cellulose micronisÉ ,.alablement activée, produite 25 l'exemple 1, comprenant 1 fonction aldéhyde pour 14 unités On utilise également les. oligosaccharides préalableim, activés, produits respectivement à l'exeru T pour le 6GrA1 aminé et à l'exemple 2 pour le 6GrB1 aminé. Le greffage du 6GrA1 aminé et du aminé sur la cee 30 :mnisée activée est réalisé respectivement c- -! aux exemples 1 et 2, a 3035794 47 l'exception de la quantité d'oligosaccharide amine a:.)liquée qui correspond à celle présentée dans le Tableau 4 ci-après : Tableau 4 Ex. 7A 6GrA1 Cellulose Ex. 8C Ex. 7B Ex. 7C Ex. 8A Ex. 8B Cellulose micronisée (g) 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 6GrA1 Aminé à 50mg/nnl(pL) 500 250 125 6GrB1 Aminé à 50mg/m1(pL) 500 250 125 Tampon Phosphate 0,5M p 2U0 200 200 200 200 200 (p L) 3050 3300 3425 3050 3300 3425 eau déionisée (pL) ir,:iDr! .U5 mpératur n'Y iante NaCNBH3 à 100g/L (pL) 1250 1250 1250 1250 1250 1250 8 h à température ambiante Le support greffé est ensuite abondamment rincé à l'eau, puis à l'éthanol pur et est ensuite séché à une température de l'ordre de 50°C. Le taux de greffage de 6GrA1 aminé et 6GrB1 aminé est évalué selon la méthode détaillée à l'exemple 1 et conduit aux quantités greffées de 6GrA1 aminé et 6GrB1 aminé suivantes : 3 0 3 5 794 48 Tableau 5 - Supports greffés Exemple mg ratio oligo de mg oligo aminé d'oligo/g la phase /g de support * de support solide/nombre de fonctions aldéhyde libres ** sur la phase solide Cellulose Ex.7A 9,1 7 1/57 micronisée Ex.7B 5,7 4,5 1/91 6GrA1 Ex.7C 3,3 2,6 1/158 Cellulose Ex.8A 8,6 6,7 1/58 micronisée Ex.88 5,6 4,3 1/90 6GrB1 Ex.8C 3,7 2,9 1/136 -`igosacchariCe ïné 1 aminé ou 6GrB1 aminé) /g de support final 6Gri:' soustraction de la masse ** mg d'oligo.addharide correspondant aa bras dd 'e 7,cct final _ 10 Productiar de supports greffés avec des des Tes groupc7 sanguins e cci B avec variation léhyde pe,:%entes avant grefF, et 2) du bras fage de ,igosaccharlde et 3) de la taille de ride ride de , tetrasaccharide de type 5 ou trisacchi:':rkiç. Les celluloses iïer7onisées activée: sont soit activées comme à l'exemple 1 (nommé cellulose haute J,,iiivation), soit comme à 15 l'exerrn 1 à l'excep u fait quc tapériodate en rLrcccci.. avec une p,dportion d- fois 710 n m port a t (10 g de métapériodate pour 500ç ce cas où PcIlulose est activée avec moins ce 3035794 49 9périodate une cellulose comportant 1 fonction aldéhyde pour 105 :s , cellulose basse activation) est obtenue. Différents oligosaccharides des groupes sanguins greffés 5 commercialisés par Elicityl sont utilisés : 6GrA1-NAc-Propargyi (OligoTech ref GLY037-1-NPR), 6GrB1-NAc-Propargyi (OligoTech ref GLY040-1-NPR), 4GrA5-NAc-Propargyl (OligoTech ref GLY035-3-NPR), 4GrB5-NAc-Propargyi (OligoTech ref GLY038-3-NPR) et 3GrA5-NAc-Propargyl (OligoTech ref GLY031-3-NPR). Chaque oligosaccharide est activé sous forme aminée en 10 respectant les équivalences et le mode opératoire décrit dans l'exemple 1_ Seul l'espaceur amine/azide utilisé pré--nte deux variantes : soit on utilise l'espaceur utilisé dans l'exemple 1 (1: zido-3,6,9-trioxaundécan-1-arE TCI Chemical référence A2363), soit le 0-(2-aminoéthyl)-,,' -(2- azidoéthyl)heptaéthylène glycol (Aldrich ref 76318). 15 On obtient alors, dans le cas où l'espaceur utilisé est le 11-azido- 3,6,9-trioxaundécan-1-amine: - Pour 6GrA1, l'oligosaccharide aminé suivant : pH OH HO NH2 Pour 6GrB1, l'oligosaccharide aminé suivant : NHz 3035794 - Pour 4GrA5, l'oligosaccharide aminé suivant : OH OH CH3 OH On obtient alors, dans le s où l'espaceur utilisé est le 0 2- aminoéthyl)-0'-(2-azidoéthypheptaéthylène glycol : 0 - Pour 6GrA1, l'oligosaccharide aminé suivant AeHN 'N=N' H H Ho OH - Pour 4GrB5, l'oligosaccharide aminé suivant : OH 0 HO NH2 H OH - Pour 3GrA, l'oligosaccharide aminé suivant : OH OH OH CH N=N -NH? OH O '--NH2 hO Nl-i2 3035794 - Pour 4GrA5, l'oligosaccharide aminé suivant : OH,,- - Pour 4GrB5, l'oligosaccharide aminé suivan OH OH HO NH2 51 - Pour 6GrB1, l'oligosaccharide aminé suivant : 0 NH3 NH, N H2 H OH - Pour 3GrA, l'oligosaccharide aminé suivant : OH OH O HO OH OH AcHN 3 N N OH OH 10 Les différents essais réalisés sont résumés dans le Tableau 6 ci-après 3035794 52 tbleau 6 3ligosaccharide aminé préparé Réactifs utilisés pour la click chemistry Ref de l'Oligo Espaceur 6GrA1-Spl-N1-12 6GrB1-Spl-N H2 6GrA1-Sp2-NI-12 6GrB1-Sp2-NH2 4GrA5-Sp1-N H2 4GrB5-Spi-NH2 4G rA5-5p2- N H2 4GrB5-Sp2-NH2 3GrA-Spi-N H2 3GrA-5p2-N H2 T u4u-1-NPR GLY037-1-NPR GLY040-1-NPR GLY035-3-NPR GLY038-3-NPR GLY035-3-NPR GLY038-3-NPR GLY031-3-NPR GLY031-3-NPR 11-azido-3,6,9-trioxaundécan-1-arni 11-azido-3,6,9-trioxaundécan-l-amine 0-(2-aminoéthyl)-0'-(2- azidoéthyl)heptaéthylène glycol 0-(2-aminoéthyl)-0'-(2- azidoéthyl)heptaéthylène glycol 11-azido-3,6,9-trioxaundécan-1-amine 11-azido-3,6,9-trioxaundécan-l-amine 0-(2-aminoéthyl)-0`-(2.- azidoéthyl)heptaéthylène glycol 0-(2-Aminoéthyl)-CY-(2- azidoéthypheptaéthylène glycol 11-azido-3,6,9-trioxaundécan-1-amine 0-(2-aminoéthyl)-0'-(2- azidoéthyl)heptaéthylène glycol Chaque 7charide greffé sur ,-1-as deux celluloses rée c -ite :édemment u e protoc: t à l'exemple 1 et suivant les Tablea 7 et 8 ci-après : 3035794 53 Ta.14--.. - Celluloses greffées avec ur c _ c-r:charide du groupe A Ex. Ex. 9B Ex. 9C Ex. 9D Ex. 9E Ex. 9F Ex. 9G 9A Cellulose micro. 1,25 0,8 0,8 0,8 0,8 haute activation (g) Cellulose micro. 0,8 basse activation (g) 6GrA1-Sp1-NH2 500 320 à 50mg/m1(p1) 6GrA1-Sp2-NH2 372 à 50mg/m1(p1) 4GrA5-Sp1-NH2 234 à 50mg/m1 (pl) 4GrA5-Sp2-NH2 263 à 50mg/ral (pl) 3GrA5-Spl-NH2 195 à 50mg/m1(p1) 3GrA5-Sp2-NH2 225 à 50mg ml (pl) Tampon Phosphate 200 128 128 128 128 128 128 0,5M pH3 (pl) eau déionisée (pl) 3050 1952 2038 2077 1900 2009 2047 Agitation environ 16 h à température ambiante NaCNBH3 à 100g/L 1250 800 800 800 800 800 800 (PI) Agitation environ 8 h à température ambiante Le support greffé est ensuite abondamment rincé à l'eau, puis à l'éthanol pur et est ensuite séché à une température de l'ordre de 50°C. 3035794 54 Tableau 8 - Cellulose s avec un oligosaccharide du groupe B Ex. Ex. Ex. Ex. 10A 106 10C 10D Cellulose micro. haute activation (g) 1,25 0,8 0,8 Cellulose micro. basse activation (g) 0,8 374 6GrB1-Spl-NH2 à 50mg/m1 (pl) 500 320 128 6GrB1-Sp2-NH2 à 50mg/m1 (pl) 231 1898 4GrB5-Sp1-N1-12 à 50mg/m1(p1) 200 128 128 Tampon Phosphate 0,5M pl-13 (pl) 3050 1952 2041 eau déionisée (pl) Agitation environ 16 h à température ambiante NaCNBH3 à 100g/L (pl) 1250 800 800 800 Agitation environ 8 Ii température ambiante Le support greffé est ensuite abondamment rincé à l'eau, puis à l'éthanol pur et est ensuite séché à une température de l'ordre de 50°C. Le taux de greffage d'oh détaillée à l'exemple 1 et :5,73ccs est évalué selon la méthode .'itités greffées d'oligosaccharides 5 suivantes : 3035794 Supports greffés Exemple mg oligo aminé /g mg oligo/ ratio oligo de la de support * g de support ** phase solide/nombre de fonctions aldéhyde libre sur la phase solide Ex. 9A 9,1 7,1 1/53 Ex. 9B 3,4 2,7 1/22 Cellulose greffée avec Ex. 9C 9,2 6,4 1/39 oligo du Ex. 9D 11,5 7,4 1/26 Ex. 9E 6,7 4,5 1/85 Groupe A Ex H H 9,0 5,6 1/44 Ex 8,1 4,5 1/42 Cellulose Ex. 10A 6,7 1/55 greffée avec Ex. 10B 3,4 1/16 oligo du Ex. 10C 6,5 1/38 Groupe B Ex. 100 6,2 4,1 1/89 gosaccharide amine concerné /g de support final ** mg d'oligosaccharide concerné (après soustraction de correspondant au bras de liaison) /g de support final Exemple 11 et exemple comparatif 11 - Billes Tosoh réduites et non réduites après couplage d'oligosaccharides 4GRA5 Le greffage de l'oligosaccharide 4GrA5 aminé sur le support activé 10 chrofflatographique macroporeux Tosoh Biosciences (650 AF Formyl - polymère méthacrylique) présentant des fonctions aldéhyde de surface est réalisé de la manière suivante 3 ml de support Tosoh Biosciences (650 AF Formyl), 18,9 mg de 4GrA5 aminé précédemment préparé à l'exemple 3 et repris dans 378 pL d'eau déionisée, 1,5 mL de tar Tnte 0,5M pH3 et 10 M de NaCNBI! r-÷ 303 5 794 56 h environ à 25°C. Le support est ensuite abondamment rincé à l'eau. 1,5 mL du gel sont conservés pour constituer la fraction non réduite (exemple 11). Par ailleurs, 1,5 ml du même gel greffé est réduit par NaBH4 à la concentration de 3mg/ mL pendant lh. L'opération est renouvelée une fois avec 3mg/mL de NaBH4 une Le gel est ensuite àoondement rincé à l'eau et 1,5 mL du gel sont COlibui"-, pour constituer la fraction réduite (exemple comparatif 11). Le taux de fonction aldéhyde est mesuré suivant la au DNS décrite dans l'exemple 1. Le dosage est calibration au glucose exprimée en pmol d'aldéhyde/ml, glucose comporte une fonction aldéhydique. Les tau suivants : méthode de dosage réalisé suivant une sachant que chaque x mesurés sont les Gel non réduit (Ex. 11) 13,5 pmol/ml 15 Gel réduit (Ex. comparatif 11) 1,4 pmol/ml Echantillon Fonctions aldéhyde 4GrA5 Aminé* ratio oligo de la phase solide nombre de fonctions aldéhyde libres sur la phase solide Exemple 11 13 5 pmol/ml 3,2 1/4 Exemple 11 1.4 pmol/ml pmol/ml 1/1 (après 3,1 réduction) pmol/ml * en mg d'oligosaccharide concerné /g de support final 3035794 57 II. EVALUATION DES SUPPORTS Les plasmas avant e après épuration sont testés selon nnx «thodes 1-La iglutirUic méthode de Simonin, .,ce -r,',J.glementaire, qui teste pouvoir agglutinant des des hématies humarn du groupd o7t77 (A ou 7).. nr-idtode est surtout sensibleux IgM (10 d'affinitë) par rapport aux IgG monomériqu. x foncti.ns 10 2-La , est Lapierre Y., Riged D, Adam 3., Josef D., Meyer F., euer S., t C. Transfusion. 1990 Feb; :109- ) qui Li..se une col de gel miniaturisée corb::e anticorps anti IgG, après 'se en conta- des hématis 15 plasma. Cette méthode permet une q arrAcation du titre en antico, de type IgG et IgM. Elle est panic :rement intéressante pour ie titrage des IgG. Les échantillons de plasma. avant ou après .ation sont dilués en tampon PBS, par dilution l'un facteur z 1/2 1/ 4096) et 20 mis en contact avec des hématies du groupe sanguin considérées n'Jh,'iées 1/10 dans le même tampon. Le titre rerd ond à la dernière dilution pos.J,,. A. Les st Lreffés avec les oligosaccharides UG.RA1 et 6GrB1 sont comparés, quant à leur efficacité pour l'épuration plasmatique : 25 3mL d'un plasma positif au 1132 en anticorps anti A et au 1/32 en anticor -ti B sont mis en 3d.. nec 1.00 mg if, des supports exemp et (cellulose pendant Hnutes sous agitation. de 50 mg ' p rt A et 50 ny,-.j de 30 1 et 2 m4!d ur la cellulose microcnft L'épuratior l'on pratiqt le test d'hémag( 6 (cellLike, microcristau Le test étant réaiisé avc- support B soit respeciver support micronisée et 5 c 6 po., cellulde pour l'ensernUe des suppods lorsque 3035794 58 Les résultats ijtrnt que les oligosaccharides se nés sont :es sur les différents supports cellulosiques sélectionnés pour ..;puration plasmatique. Lu même essai est reproduit avec mL du même plasma et 100 mg dc rts des exemples 1, 2, 5 et 6. Ducs a cas, seuls les supports des exe tipies 1 et 2 montrent une orpto totale du plasma B. Les supports cellulosiqmc-reffés de l'exemple 1: tons , résichielles sous forrne et de l'exemple comix'Jif aidé résidue u 3ous leur forme réduite), d'une part, et de 10 ctic:ic .-qdéhyde résiduelles sous for non réduite) et de - r ,nctions aldéhyde résiduelles sous leur forme Cr.a...j T7 part, sont comparés. Les tests sont réalisés avec un plasma titrant 1/128 en -ps anti A et 1/1 2 8 er -nticorps anti B, avec 50 mg de support greffé 25 15 mg de gel pour L ..'ture des anticorps anti-A et 25 mg de gel pour la .4)ture des aft: orps anti-B) pour 1 mL de plasma sous agitation pendant minutes. s des exemples et 2 (fonctions aldéhyde résiduelles SOL me réduite) permettl une absorption totale du plasma 20 (en anticorps anti A et en anticorps anti eve un titre résiduel non détectable par B gel test et par le test d'hémagglutinatlon. Il y a donc une bonne éliminaU.Dr: ues IgM ir les -deux suoports pour ce plasma. Les supports des exemples comparatifs 1 et 2 (fonctions aldéhyde résiduelles sous leur forme réduite), testés dans les nLreu conditions, 25 donnent chacun une épuration partielle pour les a.v.ec un titre iel de 1/32 en gel test. Il apparaît donc que les supports selon ,,,,ntion portant des aldéhydes libres sont plus efficaces pour l'épuration def;: ps, en particulier pour les IgG. C. Les supports cellulosiques grefl, tie l'exemple 30 aldéhydE.,-: ;:iles sous forme non réduit) et de l'exemple aiciehyde résidu 7 sous leuTfcrmo réduite) d'une part, et de 3035794 59 Vexe . 4 (foncor aldéhyde résid-e'les sous forme non réduite) et de compara» 4 (fonctic _ réduite) autre sont corri hyde résiduelles sous leur forme Les tesLs sont cL avec un plasma de titre 1/1024 en anticorps 5 anti A et 1/512 en anticorps anti B comme suit : 10 mg de 5.-.,upp supporl. ,Je l'exerrde ,_.,sique gr' le Vexer et 10 . part, et 1( -ig de support cellulosique - de l'exemple comparatif 3 et 1C nig de support de l'exemple comparatif 4, d'autre part, sont incubés pei 30 minutes à 22°C sous agitatri 10 permanente en tube ^Ivce. Les résultal-..,7 sont I en gel tes anti IgG et anti IgM détectés) : Titre résicJL.1 anticorps ; anticorps :anti A anti F. Il apparaît que là encore, la rédi . du support s'accompagne ricln(ire effic- . pour des anticorps, surtout pour les 15 E5 de type IgG. D. Résultats d'hémostase : Trois plasmas de groupes respectifs 0, A et B fraîchement é- par absorption sur des supports A et B correspondant aux exemples 1 Ci 2 sont contrôlés pour leurs qualités hémostatiques Les suivants sont 20 obtenus entre les p esmas rnntrAle (ctl) et les mêmes pàsmas épi !ré.s. avec les e t nvention (test) pour leurs antic, anti et B Les paramètres contrôlés sont les suivants : / 64 ,)po1 les exemples 3 et 4 , port réduit des exemples comparatifs 3 et 4 3035794 F1,YI ci : activfté, u!r! du facteur M, mesurée par un essai de coagu en une étape , bioMérieux-deficient FVIII (bioMérieux, M.arcy l'Etoile, FranL r l'in- ent MDAII de bioMérieux. FIXc%: c3agulante du facteur J mesurée par un P ai en 5 une étape avec le kit Biophen FactorIX p hen-BioMed , Neu,, Oise, France). vWF :AG% : antigène c -,,--teur von Willebrand. test effectué avec les réactifs vWF AG sur un appareil BCS coagulat:, .nalyser (Dade Behring, Marburg, Allemagne). 10 vWF:R Vo activ Facteur n Willebrand, tué avec les réactifs BC vWF sur un appaleil Dada i3,,,7,hring. FII% : taux du Facteur II plasmatique ou .-1rombine mesuré par un essai en tape avec un kit utilisant un a sma déficient (STA deficientII' 'Jca Stago, Asnières-sur-Seine, Fi ace). 15 FVII-FY°L1 : taux du facteur VTT-Lv avec un kit 7 nt un plasma défi r un test n une étape BioMed). taux du Facteur V, mesuré un test en une étape avec un kit utilisant un plasma déficient (Hemnrlot V reageant, Hyphen BioMed). Fibrinogène plasmatique : )gène, dont I concentration est mesurée par e Fibriquick kit (bioMérieu L',,,',asé sur I iode de Clauss. 303 5 794 61 VWF:C0°/0 FII% FVII+X% FV% Fibrinogène (g/1) 95,4 73 95 90 1,7 98,4 70 106 107 2,5 63,5 92 89 55 2,1 60,7 103 88 56 2,5 43,9 97 93 96 1,8 43 104 93 98 2,0 Plasma I FVIIIc% - AG% O test 1 80,1 99,4 0 ctl 1.90,1 125,4 A test 1. 46,6 100,9 A cti 1.50,5 104,1 B test I 36,8 78,1 B ctl 1.37,6 82,9 114,4 109,2 62,8 61,4 46,7 44,5 Ces résultats montrent une très bonne conservation des facteurs de coagulation après l'épuration. E. Influence du taux de greffage Des essais ont été réalisés avec les différents supports greffés de l'exemple 7 à différentes concentration de 6 GRAl. Les essais ont été réalisés sur deux plasmas 0 de titres élevés (1/1024 en anticorps anti A et 1/512 en anticorps anti A). Les incubations sont réalisées avec 50mg de support 7A, 7B ou 7C pour lml de plasma, 30mn à 22°C sur agitateur circulaire. 10 Les plasmas épurés sont ensuite testés en gel test (avec anti IgG pour déterminer le titre résiduel en IgG et Te après absorption : 3035794 support est un f ' terminarit da, a qualité de l'épurati:In, F. Essais com -1 oe ration en colonne et en Lia' Le ..r.)tocüe sé el batch e! sous un format de cdlonn Les supports ,r),-;,r nples 1, 2, 5 et 6 (cellulose micronisée, ceuVnn 10 :microcristalline) testés en batnh ct été également mis en oeuvre da.'s un forrrn colonne chromatogrhique supports cellulosiques (cellulose micronisée et celluLnn micryilistalline) ont montré des comportements chromatoc--)hiques s proc h F 15 Les essais ont étés réalisés avec des colonnes de 00 mg de gel pour 5m1 de plasma. le temps d'écoulement était de 14 +/- 2minutes l'ensemble des supports' ,7J',/ec une pression de 0,1 bar. Les résultats r-;.:1(:)n sont identic.'=,,K!S à ceux obtenus pour le test en 20 batch présentés au para -phe. A. 62 ilasma Ç ttre oanticorps 1/16 1.024 , asma 0 de titre _hal en anticorps anti A 1/512 La concentration rvoligosacc our une masse donnée de Concentrations 6GrAl 11tres obtenus a pres ±puration Conditions greffage Ex.7A Ex.7B 5,7 303 5 794 63 G. Le supports des exemples 3 et 4, porteurs respectivement cPs oligosacch 4GrA5 et 4GrB5 ont été testés dans différentes conditions d'incubation pour des temps et des concentrations différentes. Le protocole était le suivant Essais en poche de plasmaphérèse avec 10H de plasma (titre en anticorns anti A 1/1024 e en anticorps anti B 1/512) avec un mélange conter la même quantité de supports A et B greffés (50 mg, 100 mg ou 200 mg Les titres résiduels obtenus étaient les suivants Quantité d 50m 200 m chaque support utilisé re e Titre en Titre en Titre en Titre anticorp. anti A en anticorps anti A anticorps anti B anticorps anti A anticorps anti B ticorps anti B Temps 1/8 1/8 1/4 1/2 1/4 ,lncubation Omn emps 1/4 1/4 1/2 1/2 o 'incubation Temps 114 1/2 o d'incubation Ces résultats montrent qu'une incubation de 1h à une concentraLu.. 10 10 mg/ ml pour chaque support est suffisante pour une épuration anticorps anti A et anti B très en dessous du seuil à risque, les anticup: résiduels étant des IgG. H. Essais d'absorption en phase liquide Afin d'évaluer la performance des supports préparés, l'effet coopératif des oligosaccharides fixés sur le support et la stabilisation secondaire, nous avons incubé un plasma 0 de titre élevé (1/1024 en anticorps anti A et 1/512 en anticorps anti B) avec les mêmes oligosaccharides que ceux utilisés fixés sur les supports, mais directement en solution. Après une heure d'incubation d'un ml de plasma avec des concentration.. 20 croissantes d'oligosaccharides tetraoses (4GrA5 et 4GrB5) et hexaoses 3035794 64 (6GrA1 et 6GrB1) préalablement dilués en PBS à la concentration de 100 mg/mi (soit 0,1mg/p1), les quantités d'oligosaccharide nécessaires pour la ralisation complète des anticorps IgG et IgM anti A et B du plasma sont les suiv Oligosaccharides Volume de solution PBS utilisée 4GrA5 4GrB5 6GrAl 6GrB1 60p1 30p1 120p1 60p1 6 g 3 g 12mg 6 g tité osaccharide utilisée Pour des doses plus faibles, une incubation prolongée de permet pas une meilleure absorption des anticorps. A titre comparatif, 10 50mg du support cellulosique de l'exemple 7A portant 0,455 mg d'oligosaccharides 6GrA1 neutralise (c'est-à-dire permet l'obtention d'un titre 0 à la fois pour les anticorps anti-A et anti-B) lml du même plasma en 30 minutes soit avec 26 fois moins d'oligosaccharides par millilitre de plasma qu'avec l'utilisation du même oligosaccharide en 15 solution, 50mg du support cellulosique de l'exemple 8B portant 0,287 mg d'oligosaccharides 6GrB1 neutralise lml du même plasma en 30 minutes soit avec 21 fois moins d'oilgosaccharides par millilitre de plasma qu'avec l'utilisation du même oligosaccharide en solution, 20 200mg du support cellulosique de l'exemple 3 portant 3,28 mg d'oligosaccharides 4GrA5 neutralise 10m1 du même plasn - en 90 minutes soit avec 18 fois moins d'oligosaccharides par ...... itre de plasma qu'avec l'utilisation du même oligosaccharide en solution, 200mg du support cellulosique de l'E,.:xer portant 2,- 25 d'oligosaccharides 4GrB5 neutralise plasma en 3035794 minutes soit avec 12 fois moins d'oligosaccharides par rde plasma qu'avec l'utilisation I même o saccharide en r, 7r, Pour des durées ortantes, l'avantage des oligosaccharics fixés sur suppTi-`7. est encore plus évident. Pa a neutraF n phase liquide laisse subsist,Ï:7:r cians le plasma des complexes et une ^-ntité très importante d'oligosaccharide libres qui pourront avoir des 7fets secondaires néfastes ; natients transfusés. Essais comparatifs avec des tri, tétra et hexa _arides 10 CL: 'ais sont réalisés avec un plasma Utre 1/128 anti A et anti B. Les tests sont réalisés - est 3035794 Conclusions : Les résultes des tri-saccharides sont moins bons que ceux obtenus avec les autres ,-accharides pour les configurations testées. Il «y a pE3 ..Itérêt pour un bras PEG plus long : 8 versus éthylène glycr ° Les r sont très proches entre 4GR5 et 6GR1. Test réalisés av c el d de polymère 10 .-. _xemp e compara 11) et non rédi (e 0 pL et ; -! chacun ux gels obtenus aux exemples 11 et comparatif 11 sont incubés pendant une heure sous agitation rotative avec 1 mL de plasma de titrE 1 1/1024 en anticiiiviiis anti-A. 15 Les résultats sont cirii;oiu,i ciar gel test : Titre résidJ,'.':q cin anticorps absorp 66 Formule du produit testé Résultats des tests en gel test :icorps anti 6GrE31 basse activation Antit( 6Gnil -NH2 basse activation 4GrA5-Spl-NH2 3GrA5-Spl-NH2 6GrAl-5p2-NH2 -Sp2-NH2 3GrA5-.5,,2-NH2 ..:x9A Ex9B E. L>:.9 D Ex9E Ex9F 3035794 67 1- Essais 2,,eq- iOpL de gel / mL de plasma : Support non .., Support réd Ex. 11 Exemple compar: 1/4 2- Essais avec 2pL cle . L de plasma : rt réduit :omparatif 11 Support non réduit 1' Ex. 11 1/128 Le test d'hémagglutination est négatif pour l'essai avec 10pL de gi7iI nna 10 réduit/m1 de plasma et positif pour les trois autres essais (gel réduit et non réduit à 2pL de gel/n-q.i »e pasrra gel réduit à 10pL de gel/mL de plasma). Cornme dans le csal. d.bn pport du type cellulose, la présence ;"onctions de libres est -able à une meilleure rétell'sT(1-1 des antic;o sur le support y compri ; !s IgM comme l'atteste le rés - 15 lOpli' Lfe gel par mL de plasmE. L 'et est toutefois moins marqué que cellulose, du fait.: iS _ . grande :é du Toso!-1 rapport aux fibre. plus faible nornb7,.... aldéhydes libres sur la phase solide. 20 K. Exemple sur sL. 5 ml de sang prélevé sur antio -iulant ACD (Ac -itrate de ant 5,5 ml de plasma sont mis ( - contact avec 55 mg du supr. t de , ple 3 iuqLcharki 4GrA5, dans un tube de 7.1 _ et une a. tation de 1.00 rpm. Après une heure à 25 2£ C tube est centrifugé, Après centrifugation, le ..i..4)port cellulosique occupe le fond du tube il forme un alot blanc bien délimité surmonté oar le cuit ':maties par la couche leucoplaquettaire Eten'Npr ;ma. Le titre art] A du plasma non Laité conte - dans i'éch i e sang 30 est de 1/128 en test il présente une très forte agglutination en test .r-ragglutination. 3035794 68 traitement le titre du plasma en gel test est de 1/8, il est négatif en h C ' xerrp, uve qi IP linhsorption des anticorps anti déterminant des groupes sa n S ut êtn isée s r SE7. ng total comme sur le avec une de recueil des fractions sanguines équivalente à celle du sang nor Cette liso-ption peur i directement dans une poche de prélèvemeriL - peut être mi ':;ee oeuvre avant ou après déleucocytation. 10 REVENDICATIONS1. Procédé de purification d'un liquid -ique comprer ies anticorps correspondant à du sang total humain ou animal ou à issu de sang humain ou animal, par mise en contact du liquick, avec av moins un supp-E enmprenarf ..ine phase solide sur greffée: .)ar liaison c._ -- , des ules d'au moins un ulosaccha capable de se lier à un i plusieur___sdits anticorps présE:t in liquide biologique, de manière à obtenir la ire une r 10 desdits anticorps présents dans ledit liquide biologique pa, 1(s) ave(.. moins certaines des molécules d'oligosaccharide(s) greffées sui' ladite phase solide, caractérisé en ce que ladite phase solide est porteuse de foui: aldéhyde -CHO libres. 2 - Procédé de HRcation selop revendicU 1 caractérisé en ce que 15 ledit au îs un agosaccharide est capable de se lier aux anticorps anti déterminant A, B ou H des groupes sanguins. 3 - Procédé de purification selon la revendication 2 caractérisé en ce molécules d'un seul oligosaccharide capable de se Per aux anticorps anti déterminant A, B ou H des groupes sanguins sont gr fées sur lad: -73hase 20 solide. 4- Procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le ratio nombre de molécules d'oligosacch gr rhs sur la phase solide / nombre de fonctions aldéhyde libres présentes phase solide appartient à la gamme allant de 1/400 à 1/1 de 25 préférence à la gamme allant 1/200 à 1/10. - Procédé de purification selon l'une quelconque des revendicaticr 1 à 4 caractérisé en ce que le support comporte de 1 à 101) d'oligosaccharide(s) /g de supp )référentiellement entre 2 et 40 mg d'oligosaccharide(s) /g C3 suppoi 30 6 - Procédé de purification seiu' 1ne quelcr,eque des revendications 1 à :aractérisé en ce que les fonctions alinyde libres assurent e )ilisation des anticorps, consécutiveme1 à leur reconnal_s_ 3035794 70 imny!nr.) .gique par lesdites molécules d'oligosaccharide(s) greffées sur la 7 - de de cation selon la revendication 6 carac,,...bré bn ce que la stabsation de la liaison oligosaccharidefanticorps est obtenu par fixation" notamment par liaison covalente, '" une asparagine, lysirrr, ou glutamine préser ir l'anticorps sur une frn:ii libre prés ;ur la phase - Et . -cédé de purificatLn 'AcT! Lune quelconque des revendiceinns 1 à 7 caractérisé en ce que les molécules d'oligosaccharide(s) sout gre sur la phase solide par l'intermédiaire d'une liaison résultant de L:Jraction d'une l'one-bon rmine du type -NH2, -NH-NH2 ou -0-NH2 portée avant greffage 7- 1'oligosaccharide et d'une fent:1:1c,, 1(' 'hyde -CHO portée avant greffage la phase solide. 9 - Procédé de pu, hcation selon l'une -;que des revendicatiou 1 à 8 caractérisé en ce que la phase solide est ur.; ,l'isaccharide et les foru:".uc aldéhyde libres résultent d'une oxydation périodique. O - Procédé de purification selon l'une quelconque des revendicaU.ir à 9 cari cLrv5é en ce que la phase solide est de la cellulose. 11 - Procédé de purification selon l'une quelconque des revendicat 1 à 10 caractérisé en ce que la phase solide est de la cellulose microni- ou de lï crLilose microcristalline. 12 rocédé d , ific revertf 0 ou 11 caractérisé en ce que la cellulose comporte des unités d f,:emule -CH(C-10 :11.1(CH201- 13 - Procédé e Durit;c :;elon l'une quelconque des revendications 10 à 12 caractérisé en ce que la cellulose comporte des unités de formule: -CH(CHO)-CH(C )-0-CH(CH2-NH-L-oligo)-0- (les unités ai - -C ;C:H2OH)-0-CH(CH0)-0- d,ns lesquelles L est un bras de liaison et oligo est un "gosacch3 7pab e de se lier à un ou plusieurs anticorps, 3035794 71 oligosaccharide cpable de se lier aux anticorps anti déterminant A, B ou H des groupes sanç.-.. - 14- Procédé do dcnnn n Aine quelconque des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que ',7?.Tr nge des - 'Iligosaccharide sur la phase solide est réalisé par lInt »faire d liaison -NH-L- dans le sens phase sc.)iide oligosaccLhue. Procédé de purification selon la revendiubDri 13 ou 14 caractérisé en c_ le liaison L comporte un coJpe triazole ou une liaison -S- et/ou une chEe'e polyéthylèn n dycol et/ou une ou plusieurs chail 10 identique-7 ou dLddrentes d.; -(0-12)t- avec t qui peut notamment. 16 - Procédé de purification la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce que le bras de liaison L coud à l'enchaînement : -CH2-CH2-S-CH2-CH2-Ci-1,-N(COCH3)-, le groupe N(COCH3) étant directement 15 Hé à une unité saccharididue de l'oligosaccharide, de préférence sur le carbone anomérique de t'ite unité sacchariqique. 7 - Procédé de purification selon l'une quelconque des revendicaldn 1 à 16 caractérisé en ce que l'oligosaccharide est un trisaccharidà, un tetrasaccharide, un pentasaccharide ou un hexasaccharide. 20 18 - Procédé de purification l'une quelconque evendicatie,n, à 16 caractérisé en ce que Dsaccharide est capable de se li anticorps anti déterminant B )saccharide est capable de se lier anticorps anti déterminant A. 19 - Procédé de pur tion selon l'une quE : ue evendica ; 1 25 à 17 caractHÉ:,-::: en ce que _ ...Jccharide - choisi C......gAcy1- 3(Fucal-2)G Galc(1-3(Fucal-2)Gall31, Gal- 1-3(Fucct1-2)Gal31-4' Galx1-3(Fuo )3a1r31-4G c, GaINAcc(1-- ,Fucc£1-2)Gal[31-3G1cNAck_ I431-3Galp1-4G1c, GaiNAcal-Galc(1-3(Fucc(1-2)Galpl- 3Gali31-4G1c, Gala1-3(Fuccd ? 3 (Fuca.1-2)Ga1131-4G1cNA431-: 30 4G1cNAc[31-3Gall31-4G1c, Fucc£1-2Galp1-3G1cNAc, Fucal-2Galp1-4GIcNAc, Fuc 1-2Gal(31-4G1c, Fucc(1-2GalB1-3GIcNA131-3Gal, Fuoà=1-2Ga 4G1( Fuca1-2Gal[31-3GIcNAL 3035794 72 3Gal(31-4G1c, Fuca.1-2Galp1-4GleNA01-3Gal(31-4G1c, les oligosaccharides GaINAccx1-. H2)Ga1131-4G1c et Gal(11-3(Fuccx1-2)Ga1131-4GIc étant préférés. 20 - Procédé de purification selon l'une quelconque c.le.1 revendicatior à 18, caractérisé en ce qu'il comprend une phase solide SE'présentant sow.:; forme de particules hydrophiles, du type cellulose, permettant LI corw.entration des protéines du liquiOe logique purifié grâce audit suppue.... 21 - Proceoe de purificatio ::i1e quelconque des revendications 1 à 20 caractérise en ce que la mise en contact est réalisée en plaçant le.oe. 10 support dans le liquide bft.e.Dgique àns des conditions d'incubation Tnettant la liaison oligosaccharide orps. - Procédé de purification selon la revendication 21 HK:térisé en ce qu'après la mise en coritat, ledit supnort est séparé du liquide biologique, notamment par filtration ou :ifugat 15 23 - Procédé de purifiez quelconque des revendications 1 à 22 caractérisé en ce que le otoiogique est un plasma d'un individu de groupe sanguin A, B ou 0 n mélange de plasmas de différents individuc. 24 rocédé de purification selon le quelconque des revendicat1 1 20 à 23 c... uctérisé en ce que le liquida L Dgique contient des anticorps anti A et/ou des anticorps anti B et est mis en contact avec au moins un dit support sélectionné, de manière à obtenir la capture d'anticorps anti A et/ou d'anticorps anti B présents dans le liquide biologique par liaison avec au moins certaines des molécules d'oligosaccharide(s) greffées sur la phase 25 solide. 25 - Procéd: ification selu r le quelconque de mdications 1 à 24 caractÉ .iue : le liquide biologique est du sang total de -I' 0, - soit le liquide biologique est mis en cont . manière simultanée ou séquentielle, avec un dit support porteur de molécules d'oligosaccharide(s) capabH c?. se lier aux anticorps anti déterminant A et avec un dit support Leur de molécules d'oligosaccharide(s) 3035794 73 capables de se lier aux anticorps anti déterminant R oit avec un support porteur à la foï's molécules d'oligosau de(s) capabi de se lier aux anticorp6 anti déterminant A de molécu d'oligosaccharide(s) capables de se lier a7,7 7d-os anti déterrl B, de manière à capturer les anticorp: c,léterminant A anticorps art déterminant B, par liaison auxdits oligosaccharides. 26 - Procédé de purification selon l'un: conque des revendicatï7.g',c à 24 c 7ctérisé en ce que : uide biologique est du sang total de groupe A, 10 ,lide biologique est mis en contact avec un dit support port, d'oligosaccharicies capables de se lier aux anticorpi, and déterminant B, de manière à capturer les anticorps anti déterrant B, par liaison )dit(s) oligosaccharide(s). 27 - Procédé de purification selon Vu ne quelconque des revendications 1 15 à 4 caractérisé en ce que : le liquide biologique est du sang total de groupe B, ide biologique est mis en contact avec un dit support porteur de ' ,ules d'oligosaccharide(s) capables de se lier aux anticorps anti déterminant A, de manière à capturer les anticorps anti déterminant 20 B, par liaison au(x)dit(s) oligosaccharide(s). 28 - Procédé de purification selon Vme quelconque des revend', 1 à 27, caractérisé en ce qu'avant ou après l'élimination des anticorps anti déterminant A et/ou des anticorps anti déterminant B, biologique est déleucocyté pour constituer une préparation Jine 25 dépourvue d'anticorps anti déterminant A et B. 29 - Procédé de purification de sang f groupe 0, selon 'une quelconque des revendications 1 à 25, car .!n ce qu'avant ou après --n:nation des -ntiorps anti déterminani À ei./ou arts anti déterminant B, le sang est déleucocyté pou stit [ne pr .,Taration 30 sAnni line dépourvue à la fois de déterminants antigéniques A et B et orps anti déterminant A et B. 3035794 74 3 0 - Procédé de :ntion selon'une quelconque des rE ions 1 à 25 caractérisé en ce que le licit hclogique est mis en contact, de manière séquentiel,:' ou simultané Wir2,17 au moins deux dits supports : l'un porteur d-r7 molécules d'oligosacnl-Dride(s) capables de aux tti dét HrIal mais non p d'oligosaccharide CZ-; 7 de s. . ntiu....ps ana déterminant 13 . ....utre porteur de gosaccharide(s) capables de seI F.:01-K anticorps anti déterrrin, mais non ,71osaccharide capable de se lier aux aricc.,_ déterminant 10 31 Proc e pur re idication 1 caractérisé en ce 1-dit au 'Hui s un Lilusaccharide est capable de se lier aux anticorps no-antigène( de Forssman. 12 - Procédé d' i.JL.lfication selon l'une quelconque des revendications 1. 1 caractérisé en ce que ladite mise en contact est réalisée er ':ant 15 ledit au moins support en suspension dans e quide biologique à p er, de préférence agitation, notamment 50 à 500 rpm et/ou pendant un temps de contact de 3 minutes 3 heures, et de préférence égal 1 avec une masse diulDport de 1 à 50 g par litre L LicJ Dgique. 20 33 - Procédé de purification selon l'une quelcc evend 1 à 3: caractérisé en ce que ladite mise en contact est réalise,::: une -ature appartenant à la gamme allant de 0 à 45°C, de -- a une i.,.mpérati- le 22°C +/-5°C. 34 - Prot le purification seli, nque des revendications 1 25 à 3J actérisé en ce qa .adite mise .z.ontact est réalisée à un .p1-1 compris entre 6 et 8. - Procédé de purific selon l'une quelconque des revendications 1 à 34 caractérisé en ce que iùuce mise en contact est réalisée en présence d'un anticoagulant. 30 36 - Procédé de purification selon l'une ,77..7.pe des revendications 1. à 35 caractérisé en c ue ledit au moins support est utilisé pour assurer, par l'intermédiaire d'au v...Dhs une partie des fonctions aldéhyd bres présentes 3035794 75 sur la phase solide, _ne. stabilisation des anticorps, et en particul qui viennent se lier à au moins certaines des molécules d'oligosaccnaride( greffées sur ladite phase solide. 37 de purification scion l'une c ciir. des revendicztor à 20 ca en ce que ladite en cc ilisée en plaç:3----t: support cli.1;..3 une poche de prélèvement de s. catiorr, ça r: purification selon l'une quelconque des reve )iologique à tér ce cit mise en contact est réalisée au moins support. dan 3 (7T17'. et en faisant circuler le 10 sur ledit au moins !=