Brevet FR3024453A1 — publié le 20160205

La présente invention concerne un procédé d'augmentation de la sialylation d'un fragment Fc, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Les anticorps monoclonaux sont utilisés aujourd'hui en tant qu'agents thérapeutiques pour traiter une variété de pathologies, y compris les cancers, les maladies auto-immunes, les maladies inflammatoires chroniques, le rejet de greffe, les maladies infectieuses et les maladies cardio-vasculaires. Ils constituent donc un enjeu thérapeutique majeur. Nombre d'entre eux est déjà commercialisé, et une proportion toujours croissante est en cours de développement ou d'essais cliniques. Cependant, il existe un besoin important pour optimiser les propriétés structurales et fonctionnelles des anticorps, afin d'en maîtriser les effets secondaires. Une des questions critiques dans l'utilisation d'anticorps monoclonaux en thérapie est leur persistance dans la circulation sanguine. La clairance de l'anticorps affecte directement l'efficacité du traitement, et par conséquent, la fréquence et la quantité de l'administration du médicament, qui peut entraîner des effets indésirables chez le patient. Les immunoglobulines d'isotype G (IgG) constituent la classe d'immunoglobulines la plus fréquente chez l'homme et aussi la plus utilisée en thérapie. Différentes expériences de mutagenèse spécifique dans la région constante (Fc) des IgG de souris ont permis d'identifier certains résidus d'acides aminés critiques impliqués, pour certains, dans l'interaction entre les IgG et le FcRn (Kim et al., 1994, Eur J Immunol.; 24:2429-34; Kim et al., 1994, Eur J Immunol.; 24: 542-8; Medesan et al., 1996, Eur J Immunol. ; 26:2533-6; Medesan et al, 1997, J Immunol; 158:2211-7). Des études ont plus récemment été menées chez l'homme (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. ; 276 : 65916604).30 11 existe cependant toujours un besoin de trouver des anticorps, ou des fragments d'anticorps, ayant une demi-vie améliorée, et présentant des propriétés biologiques intéressantes. La présente invention fournit des moyens pour obtenir un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc ayant une sialylation optimisée. Cette sialylation optimisée, i.e. améliorée, confère notamment au variant une demi-vie augmentée, ainsi que des propriétés anti-inflammatoires optimisées par rapport à un polypeptide parent. Le terme « demi-vie » se réfère à une demi-vie biologique d'un polypeptide d'intérêt dans la circulation d'un animal donné, et est représenté par le temps nécessaire à la moitié de la quantité présente dans la circulation de l'animal à être éliminée de la circulation et/ou d'autres tissus de l'animal. En effet, de façon surprenante, les inventeurs ont découvert qu'un fragment Fc muté sur une position spécifique, proche du site de N-glycosylation, présente une sialylation fortement augmentée par rapport au fragment Fc non muté. Cela permet ainsi d'augmenter les propriétés d'intérêt du fragment Fc, et notamment sa demi-vie. Cela peut permettre en outre d'augmenter son activité anti-inflammatoire. La présente invention a donc pour objet un procédé d'augmentation de la sialylation 20 d'un fragment Fc, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. La présente invention a également pour objet un procédé de production d'un variant 25 d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une sialylation améliorée dudit fragment Fc par rapport au polypeptide parent, qui comprend une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 30 Par « augmentation de la sialylation » ou « sialylation améliorée », on entend que la sialylation de la protéine obtenue est augmentée d'au moins 10%, de préférence au moins 15%, de préférence au moins 20%, de préférence au moins 25%, de préférence au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de préférence au moins 55%, de préférence au moins 60%, de préférence au moins 65%, de préférence au moins 70%, de préférence au moins 75%, de préférence au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 95%, par rapport à la protéine avant l'étape de mutation. La sialylation d'une protéine est un mécanisme de glycosylation bien connu (voir notamment Essentials of Glycobiology, 2nd edition, Varki et al, 2009). Elle correspond à un ajout, par liaison covalente, d'au moins un acide sialique (i.e. acide N- acétylneuraminique et ses dérivés, comme l'acide N-glycosylneuraminique, l'acide Nacétylglycoylneuraminique) dans la chaîne glycosylée de la protéine. Tel qu'ils sont utilisés ici, les termes «protéine» et «polypeptide» sont utilisés ici de manière interchangeable et se réfèrent à une séquence d'au moins deux acides aminés liés de façon covalente, incluant les protéines, polypeptides, oligopeptides et peptides. Les termes « protéine » et « polypeptide » incluent notamment les anticorps ou immunoglobulines, notamment entiers, monoclonaux, multi-spécifiques, bi- spécifiques, dual-spécifiques, synthétiques, chimériques, humanisés, humains, les protéines de fusion avec des immunoglobulines, les anticorps conjugués, et leurs fragments. Les termes « protéine » et « polypeptide » incluent également les polypeptides Fc définis par un polypeptide comprenant tout ou partie d'une région Fc, notamment les fragments Fc isolés, Fc conjugués, Fc multimériques et les protéines de fusion avec un fragment Fc. Par « fragment Fc » ou « région Fc », on entend la région constante d'une immunoglobuline de longueur totale à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (i.e. CH1-CL). Ainsi le fragment Fc fait référence à un homodimère, chaque monomère comprenant les deux derniers domaines constants des IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 et CH3), ou les trois derniers domaines constants des IgE et IgM (i.e. CH2, CH3 et CH4), et la région charnière flexible N-terminale de ces domaines. Le fragment Fc, lorsqu'il est issu d'IgA ou d'IgM, peut comprendre la chaîne J. De préférence, on utilise dans la présente invention un fragment Fc d'une IgGl, qui se compose de la charnière flexible N-terminale et des domaines CH2-CH3, c'est-à-dire la portion à partir de l'acide aminé C226 jusqu'à l'extrémité C-terminale, la numérotation étant indiquée selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, on utilise un fragment Fc d'une IgG1 humaine (i.e. acides aminés 226 à 447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat). Dans ce cas, la charnière inférieure se réfère aux positions 226 à 230, le domaine CH2 fait référence aux positions 231 à 340 et le domaine CH3 se réfère aux positions 341-447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. Le fragment Fc utilisé selon l'invention peut comprendre en outre une partie de la région charnière supérieure, en amont de la position 226. Dans ce cas, de préférence, on utilise un fragment Fc d'une IgG1 humaine comprenant une partie de la région située entre les positions 216 à 226 (selon l'indice EU). Dans ce cas, le fragment Fc d'une IgG1 humaine fait référence à la portion à partir de l'acide aminé 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224 ou 225 jusqu'à l'extrémité C-terminale. La définition de « fragment Fc » inclut un fragment scFc pour « single chain Fc ». Par « fragment scFc », on entend un fragment Fc simple chaîne, obtenu par fusion génétique de deux monomères Fc reliés par un linker polypeptidique. Le scFc se replie naturellement en une région Fc dimérique fonctionnelle. De préférence, le fragment Fc utilisé dans le cadre de l'invention est choisi parmi le fragment Fc d'une IgG1 ou IgG2. De préférence encore, le fragment Fc utilisé est le fragment Fc d'une IgGl. Dans la présente demande, la numérotation des résidus du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Par « mutation d'acide aminé », on entend ici un changement dans la séquence d'acides aminés d'un polypeptide. Une mutation est choisie notamment parmi une substitution, une insertion et une délétion. Par «substitution», on entend le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent, par le même nombre d'autres acides aminés. De préférence, la substitution est ponctuelle, i.e. elle ne concerne qu'un seul acide aminé. Par exemple, la substitution N434S se réfère à un variant d'un polypeptide parent, dans lequel l'asparagine en position 434 du fragment Fc selon l'index EU ou équivalent dans Kabat est remplacé par la sérine. Par « insertion », on entend l'addition d'au moins un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, l'insertion G>235-236 désigne une insertion de glycine entre les positions 235 et 236. Par « délétion », on entend l'élimination d'au moins un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, E294de1 désigne la suppression de l'acide glutamique en position 294 ; une telle délétion est appelée De1294. Par «polypeptide parent», on entend un polypeptide non modifié qui est ensuite modifié pour générer un variant. Ledit polypeptide parent peut être un polypeptide d'origine naturelle, un variant d'un polypeptide d'origine naturelle, une version modifiée d'un polypeptide naturel ou un polypeptide synthétique. De préférence, le polypeptide parent comprend un fragment Fc choisi parmi les fragments Fc de type sauvage, leurs fragments et leurs mutants. Par conséquent, le polypeptide parent peut éventuellement comprendre des modifications pré-existantes d'acides aminés dans le fragment Fc par rapport aux fragments Fc de type sauvage. Ainsi de préférence, le fragment Fc du polypeptide parent comprend déjà au moins une mutation additionnelle (i.e. modification pré-existante), de préférence choisie parmi P230S, T256N, V259I, N315D, A330V, N361D, A378V, S383N, M428L, N434Y. De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent comprend au moins une combinaison de mutations additionnelles choisie parmi P230S/N315D/M428L/N434Y, T256N/A378V/S383N/N434Y, V259I/N315D/N434Y et N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y. De préférence, selon une première alternative, le polypeptide parent consiste en un fragment Fc, et de préférence un fragment Fc entier. De préférence, selon une seconde alternative, le polypeptide parent consiste en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C-terminal à un fragment Fc. Dans ce cas, avantageusement, le polypeptide parent est un anticorps, un polypeptide de fusion Fc ou 30 un conjugué Fc. De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5. De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent a pour séquence SEQ ID NO : 1. Les séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 sont exemptes de région charnière en N-terminal. Les séquences représentées en SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10 correspondent respectivement aux séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 avec leurs régions charnières en N-terminal. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le fragment Fc du polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10. De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent a une séquence correspondant aux positions 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 ou 11232 de la séquence SEQ ID NO : 6. Alternativement, le polypeptide parent consiste en une immunoglobuline, un anticorps ou encore en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C-terminal à un anticorps ou une immunoglobuline. Par «variant», on entend une séquence polypeptidique qui est différente de la séquence 20 du polypeptide parent par au moins une modification d'acide aminé. De préférence, la séquence du variant a au moins 80% d'identité avec la séquence du polypeptide parent, et plus préférentiellement au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% d'identité. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un 25 pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons 30 de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, J. Mol Evol., 18:38-46), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Dans des modes de réalisation préférés, le polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps, de préférence une IgG, et le variant selon l'invention est alors choisi parmi les variants d'IgG. Plus préférentiellement, le variant selon l'invention est choisi parmi les variants d'IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4 humaines. De préférence, le procédé de production du variant ou le procédé d'augmentation de la sialylation selon l'invention comprend une mutation effectuée sur au moins un acide aminé du fragment Fc situé en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, la mutation est effectuée sur l'acide aminé du fragment Fc situé en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305. Plus préférentiellement, la mutation est effectuée sur l'acide aminé du fragment Fc situé en position 293 ou 294, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.25 Les séquences décrites dans la présente demande peuvent être résumées comme suit: SEQ ID NO : Protéine 1 Fragment Fc d'IgG1 humaine Glm1,17 (résidus 226-447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat) sans région charnière N-terminal. 2 Fragment Fc d'IgG2 humaine sans région charnière N-terminal. 3 Fragment Fc d'IgG3 humaine sans région charnière N-terminal. 4 Fragment Fc d'IgG4 humaine sans région charnière N-terminal. Fragment Fc d'IgG1 humaine G1m3 sans région charnière N-terminal. 6 Fragment Fc d'IgG1 humaine Glm1,17 (résidus 226-447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat) avec région charnière N-terminal. 7 Fragment Fc d'IgG2 humaine avec région charnière N-terminal. 8 Fragment Fc d'IgG3 humaine avec région charnière N-terminal. 9 Fragment Fc d'IgG4 humaine avec région charnière N-terminal. Fragment Fc d'IgG1 humaine Glm3 avec région charnière N-terminal. Plus préférentiellement, l'étape de mutation du procédé de préparation du variant selon 5 l'invention est obtenue comme suit : i) on fournit une séquence nucléique codant pour le polypeptide parent comprenant le fragment Fc ; ii) on modifie la séquence nucléique fournie en i) pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant ; et iii) on exprime la séquence nucléique obtenue en ii) dans une cellule hôte, et on récupère le variant. Une telle étape de mutation est donc effectuée en utilisant une séquence nucléique (polynucléotide ou séquence nucléotidique) codant pour ledit polypeptide parent (étape i)). La séquence nucléique codant pour le polypeptide parent peut être synthétisée par voie chimique (Young L and Dong Q., 2004,-Nucleic Acids Res., Apr 1 5;32(7), Hoover, D.M. and Lubkowski, J. 2002, Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et al., 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6;7:285). La séquence nucléotidique codant pour le polypeptide parent peut être également amplifiée par PCR en utilisant des amorces adaptées. La séquence nucléotidique codant pour le polypeptide parent peut également être clonée dans un vecteur d'expression. L'ADN codant pour un tel polypeptide parent est inséré dans un plasmide d'expression et inséré dans une lignée cellulaire ad hoc pour sa production (par exemple la lignée HEK-293 FreeStyle, la lignée YB2/O, ou la lignée CHO), la protéine ainsi produite étant ensuite purifiée par chromatographie. Ces techniques sont décrites en détails dans les manuels de référence : Molecular cloning : a laboratory manual, 3iemeédition-Sambrook and Russel eds. (2001) et Current Protocols in Molecular Biology - Ausubel et al. eds (2007). La séquence nucléique fournie en i) (polynucléotide), qui code pour le polypeptide parent, est ensuite modifiée pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant. C'est l'étape ii). Cette étape est l'étape de mutation à proprement parler. Elle peut être effectuée par toute méthode connue de l'art antérieur, notamment par mutagénèse dirigée ou par mutagénèse aléatoire. De préférence, la mutagénèse aléatoire telle que décrite dans la demande W002/038756 est utilisée : il s'agit de la technique Mutagen. Cette technique utilise une ADN mutase humaine, notamment choisie parmi les ADN polymérases (3, ri et t. Une étape de sélection des mutants ayant conservé la liaison au FcRn est nécessaire pour retenir les mutants d'intérêt. Alternativement, les substitutions d'acides aminés sont de préférence réalisées par mutagénèse dirigée, par la technique de PCR d'assemblage utilisant des oligonucléotides dégénérés (voir, par exemple, Zoller et Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488). Enfin, dans l'étape iii), on exprime la séquence nucléique obtenue en ii) dans une cellule hôte, et on récupère le variant ainsi obtenu. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes. Les cellules hôtes préférées sont la lignée de rat YB2/0, la lignée de hamster CHO, en particulier les lignées CHO dhfr- et CHO Lec13, PER.C6TM (Crucell), HEK293, T1080, EB66, K562, NSO, SP2/0, BHK ou COS. De préférence encore, on utilise la lignée de rat YB2/0. Alternativement, les cellules hôtes peuvent être des cellules d'animaux transgéniques modifiés pour produire le polypeptide dans le lait. Dans ce cas, l'expression d'une séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention est contrôlée par un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, ledit promoteur ne contrôlant pas naturellement la transcription dudit gène, et la séquence d'ADN contenant en outre une séquence de sécrétion de la protéine. La séquence de sécrétion comprend un signal de sécrétion interposé entre la séquence codante et le promoteur. L'animal peut ainsi être choisi parmi le mouton, la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache. Le polynucléotide codant pour le variant obtenu à l'étape ii) peut également comprendre des codons optimisés, notamment pour son expression dans certaines cellules (étape iii)). Par exemple, lesdites cellules comprennent les cellules COS, les cellules CHO, les cellules HEK, les cellules BHK, les cellules PER.C6, les cellules HeLa, les cellules NIH/3T3, 293 (ATCC # CRL1573), des cellules T2, les cellules dendritiques ou les monocytes. L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés a pour avantage majeur d'accroître la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). L'optimisation de codons joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourraient ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de codons a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel de traduction (Chechetkin, J. of Theoretical Biology 242, 2006 922-934). L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence. De préférence, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules HEK, telles que des cellules HEK293, les cellules CHO, ou les cellules YB2/0. Plus préférentiellement, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules YB2/0. Alternativement, de préférence, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules d'animaux transgéniques, de préférence la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache. Le variant obtenu selon l'invention peut être combiné avec des excipients pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération prolongée, comme des polymères biodégradables, pour former une composition thérapeutique. La composition pharmaceutique peut être administrée par voie orale, sublinguale, sous- cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrathécale, intra-oculaire, intra-cérébrale, transdermique, pulmonaire, locale ou rectale. Le principe actif, seul ou en association avec un autre principe actif, peut alors être administré sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques. Des formes unitaires d'administration comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les aérosols, les implants sous- cutanés, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intrathécale, les formes d'administration par voie intranasale et les formes d'administration rectale. De préférence, la composition pharmaceutique contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. 11 peut s'agir en particulier de formules isotoniques, stériles, de solutions salines (avec phosphate monosodique ou disodique, chlorure de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium et analogues, ou des mélanges de tels sels), ou de compositions lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables. Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, y compris l'huile de sésame, l'huile d'arachide, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de micro-organismes, comme les bactéries et les champignons. Les dispersions selon l'invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un conservateur pour empêcher la croissance des micro-organismes. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion contenant, par exemple, l'eau, l'éthanol, un polyol (par exemple, la glycérine, le propylène glycol, le polyéthylène glycol, et analogues), des mélanges appropriés de ceux-ci, et/ou les huiles végétales. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par l'utilisation d'un tensioactif, tel que la lécithine. La prévention de l'action de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques, par exemple, des parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l'acide sorbique ou encore le thimérosal. Dans de nombreux cas, il sera préférable d'inclure des agents isotoniques, par exemple, des sucres ou du chlorure de sodium. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption, par exemple, le monostéarate d'aluminium ou la gélatine. Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. À cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art. Par exemple, une dose peut être dissoute dans 1 ml de solution de NaC1 isotonique puis ajoutée à 1000 ml de liquide approprié, ou injectée sur le site proposé de la perfusion. Certaines variations de posologie devront nécessairement se produire en fonction de l'état du sujet traité. La composition pharmaceutique de l'invention peut être formulée dans un mélange thérapeutique comprenant environ 0.0001 à 1.0 milligrammes, soit environ 0.001 à 0.1 milligrammes, soit environ de 0.1 à 1.0 milligrammes, voire environ 10 milligrammes par dose ou plus. Des doses multiples peuvent également être administrées. Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle. FIGURES Figure 1 : alignements de séquences d'IgG1 humaine natif se référant aux positions 216 à 447 selon l'indice UE La figure 1 montre des alignements de séquences d'IgG1 humaine natif se référant aux positions 216 à 447 (selon l'indice UE) avec les séquences correspondantes d'IgG2 humaine (SEQ ID NO: 2 et 7), IgG3 humaine (SEQ ID NO: 3 et 8) et IgG4 humaine (SEQ ID NO: 4 et 9). Les séquences d'IgG1 se réfèrent à l'allotype Glm1,17 (SEQ ID NO: 1 et 6) et à l'allotype G1m3 (SEQ ID NO: 5 et 10). Le domaine "charnière inférieure CH2-CH3" de IgG1 commence à la position 226 (voir flèche). Le domaine CH2 est surligné en gris et le domaine CH3 est en italique. Figure 2 : Demi-vie d'anticorps anti-CD20 et anti-Rhesus D produits en YB2/0 : La persistance des immunoglobulines dans le sérum de souris transgéniques pour le FcRn humain a été évaluée. Deux spécificités antigéniques ont été testées ; les IgG antiCD20 et les IgG anti-RhD délétées en position 294 ont été testées en comparaison avec 20 les IgG WT correspondantes. A) Représente l'évolution dans le temps de la concentration des IgG plasmatiques B) Représente la demi-vie observée pour les deux IgG délétées en position 294 et des IgG WT. 25 EXEMPLES Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention. Exemple 1 : Production des variants délétés en position 294 30 Les inventeurs ont analysé la sialylation de plusieurs variants conformes à l'invention, notamment délétés en position 294 (indice EU ou équivalent dans Kabat). Parmi les variants De1294 analysés, plusieurs variants comprennent une combinaison de mutations additionnelles parmi les combinaisons décrites pour conférer une liaison optimisée au FcRn dans la demande de brevet EP 0 233 500. L'identification et l'obtention de tels variants « optimisés FcRn » peut se faire selon les méthodes décrites dans l'art antérieur, en particulier la demande de brevet européen EP 0 233 500, qui décrit l'obtention de tels mutants selon la technique dite Technique MutaGenTM. Typiquement, cette méthode comprend les étapes suivantes : A/ Construction d'une banque de Fc Le gène humain Fc codant pour les résidus 226 à 447 (selon l'index EU de Kabat et représenté en figure 1) dérivé de la chaine lourde d'une IgG1 humaine est cloné dans un vecteur approprié, tel que le vecteur phagemide pMG58 selon les protocoles standards 15 bien connus de l'homme du métier. B/ Mutagenèse Plusieurs banques sont ensuite générées, suivant la procédure décrite dans WO 02/038756, qui utilise des ADN polymérases humaines de faible fidélité dans le but 20 d'introduire des mutations aléatoires de façon homogène sur la séquence cible entière. Plus précisément, trois mutases distinctes (pol (3, ri et t) ont été utilisées dans des conditions différentes pour créer des profils de mutations complémentaires. C/ Expression des banques de Fc par Phage-display et sélection des variants 25 présentant une liaison améliorée au récepteur néonatal FcRn Les banques de Fc sont exprimées en utilisant la technique du Phage-display selon des protocoles standards, pour servir à la sélection des fragments Fc. La sélection peut se faire conformément au protocole détaillé dans la demande brevet européenne EP 2 233 500, notamment par sélection sur FcRn en phase solide ou liquide, puis 30 détermination des caractéristiques de liaisons des fragments au FcRn par ELISA. D/ Production des variants sous forme d'Ig entière et délétion en position 294 Plusieurs combinaisons de mutations « optimisées FcRn » ont été sélectionnées pour servir de base à la production de mutants délétés en position 294. Les combinaisons suivantes ont été sélectionnées : N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y (T5A-74) T256N/A378V/S383N/N434Y (C6A-78) V259I/N315D/N434Y (C6A-74) 1- Production des variants IgG dans les cellules HEK La séquence de fragment Fc SEQ ID NO : 1 a été clonée dans un vecteur d'expression eucaryote générique dérivé de pCEP4 (Invitrogen) et contenant la chaîne lourde d'un anticorps chimérique anti-CD20 selon des protocoles de PCR standard. La chaîne légère de cet anticorps a été insérée dans un vecteur dérivé de pCEP4 semblable. Toutes les mutations d'intérêt dans le fragment Fc ont été insérées dans le vecteur d'expression contenant la chaine lourde anti-CD20 par PCR de chevauchement. Par exemple, le variant 294Del a été obtenu en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la délétion en position 294 sur la chaine lourde contenue dans le vecteur d'expression. Les fragments ainsi obtenus par PCR ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR a été purifié sur gels d'agarose 1% (w/ v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné dans le vecteur d'expression de la chaine lourde anti-CD20. Les cellules HEK 293 ont été cotransfectées avec les vecteurs d'expression de la chaine légère et de la chaine lourde de l'IgG anti-CD20 en des quantités équimolaires selon des protocoles standard (Invitrogen). Les cellules ont été cultivées de manière à produire les anticorps de manière transitoire. Les anticorps produits ont pu être isolés et purifiés selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation.30 2- Production des variants IgG dans les cellules YB2/0 Les variants Fc ont été préparés dans un format IgG entière dans la lignée cellulaire YB2/O (ATCC, CRL-1662) avec la spécificité anti-CD20 et anti-RhD. Pour cela, la chaine lourde et légère des IgG ont été clonées dans un vecteur bicistronique HKCD20 optimisé pour la production dans YB2/0. La production a été réalisée dans des pools stables de cellules YB2/0. Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps ont été réalisées selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation. Les inventeurs ont vérifié que la délétion en position 294 n'avait pas d'impact significatif sur la liaison au FcRn. Les variants délétés en position 294 conservent leur liaison au FcRn par rapport à l' IgG parent (IgG WT ou IgG comprenant des mutations « optimisées FcRn »). Exemple 2 : Analyse de la sialylation de différentes protéines Mode opératoire : préparation de l'échantillon 1 Dessalage et N-déglycosylation Dans un premier temps, l'échantillon à analyser a été dessalé selon des protocoles standards de façon à éliminer tous les glucides réducteurs libres potentiellement présents ainsi que les substances susceptibles d'interférer durant les étapes ultérieures (sels et excipients). Après dessalage, l'échantillon a été séché puis les glycannes ont été libérés par l'action enzymatique de la N-Glycannase en conditions dénaturante et réductrice, afin de maximiser le rendement de N-déglycosylation. Pour la N- déglycosylation des Ig, l'échantillon sec a été repris par 45 !IL de la solution de digestion PNGase F diluée au 1/5. 1,5 !IL d'une solution de 13-mercaptoéthanol 10 % (v/v) dans l'eau ultra-pure a été ajouté avant agitation et incubation 15 minutes à température ambiante. Ensuite, 1 !IL de la solution de PNGase F (2.5 mUffiL) a été ajoutée avant agitation et incubation au bain-marie à 37° C durant 12 à 18 heures. Puis les glycannes ont été séparés des protéines déglycosylées par précipitation à l'EtOH froid. L'extrait glycannique obtenu a alors été reparti en 4 fractions avant d'être traité par des exoglycosidases. 2 Quantification des taux de fucosylation et de GlcNAc intercalaire, et de l'indice 5 de galactosylation des N-glycannes Chaque N sous-fraction alcoolique séchée, renfermant l'équivalent de 100 1..tg de glycoprotéine, a été respectivement digérée (1) par les a-sialidase, 13-galactosidase et Nacéty1-13-hexosaminidase, afin de déterminer le taux de fucosylation ; (2) par les asialidase, 13-galactosidase et a-fucosidase, pour le calcul du taux de GlcNAc 10 intercalaire; et (3) par les u-sialidase et a-fucosidase, pour déterminer l'indice de galactosylation. Ces déglycosylations ont été effectuées à 37°C pendant 12 à 18 heures. L'isolement des produits de dégradations exoglycosidasiques a été réalisé par extraction 15 alcoolique à froid par ajout de 60 !IL (3 volumes) d'éthanol absolu équilibré à - 20°C, avant agitation puis incubation à - 20°C durant 15 minutes. Une centrifugation à 10000 rpm a été réalisée pendant 10 minutes à + 4°C, et le surnageant a été immédiatement transféré dans un microtube de 0.5 mL avant d'être séché sous vide. Les oligosaccharides obtenus ont ensuite été marqués par un fluorochrome, l'APTS, 20 puis séparés et quantifiés en HPCE-LIF. 3 Exploitation des résultats L'identification des pics de N-glycannes est réalisée à l'aide d'un étalon glycoprotéinique de référence dont la N-glycosylation est parfaitement connue, par 25 comparaison des temps de migration de ses N-glycannes avec ceux des espèces observées sur les profils électrophorétiques des échantillons à analyser. De plus, les temps de migration des oligosaccharides étalons sont convertis en unités de glucose (GUs) après analyse d'un mélange hétérogène d'un homopolymère de glucose (Glc ladder). Ces valeurs de GUs seront ensuite comparées à celles de quelques 30 oligosaccharides standards de GUs connues, et permettront d'augmenter l'indice de confiance des identifications. Résultats A-Variants produits dans YB2/0 Les polypeptides suivants ont été analysés : Nom Mutations Anti-CD20 De1294 De1294 Anti-CD2O-C6A 78-De1294 T256N/A378V/S383N/N434Y/De1294 Anti-CD2O-C6A 74-De1294 V2591/N315D/N434Y/De1294 Anti-RhD Anti-RhD De1294 De1294 Anti-RhD -C6A 78 T256N/A378V/S383N/N434Y Anti-RhD -C6A 78-De1294 T256N/A378V/S383N/N434Y/De1294 Anti-CD20 De1294 : Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées. 87.98% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 48.24%. 42 11.9 A2F 19.8 Al 5.5 AlF 1..6 C.:.:- 0.S4 0.5" G:: i_. I. F 0.19 2.44 GI_:1 : 0.14 G - + .1,3)F 2.C5 G212. 0.51 G2F12. 3,S4 Structures sialylees non identifiées 49.18 - - -:: f,ic._., 1-_,--..-..: Anti-CD2O-C6A 78-De1294 : Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées. 88.69% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 51.87%. A ") A 2 F !Jh Al 7.2 AlF j..12 C:_:. 1.17 `._. ' 31, - GI:1:'3F 0 _ r - G2 + C-1. 1.:: ; c :-._.212. 6 G2FU 1 S 1:Lves sia ',I 44 5 - a - .'..1c..Dsy.:.e. Anti-CD2O-C6A 74-De1294 : Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées. 93.48% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 51.24%. Al _- _._ 2 : 1 r, 77 . 1.92 G='! -.--: G'-{'. ' - 3 1. L -a:1 0,43 ( :L3:, GC:,3,F 0.1Q : 2 G=1.6:,' 0.11 + G i : 1.2: : 2.05 G2L. 0,15 G2F i G2FB c S-J-Jcnves sia , I = L9 Q. ÿ3.4Q - a f ..Dsv .7. 1 51.24 Anti-RhD : Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées constituées majoritairement de structures courtes agalactosylées non-fucosylées (GO : 52.06%). Les structures fucosylées sont minoritaires. On observe quelques structures possédant une GlcNac en position bissectrice (GOB, GOFB). La structure oligosaccharidique prédominante est : GO (52.06%). Le taux de fucosylation calculé est de 17.05%, le taux de fucosylation obtenu avec le mn DSial + DGal + DhexNAc (*) est de 13.07%. Le taux de formes possédant une GlcNac bissectrice est de 2.87%. Le taux de galactosylation calculé est de 40.5%. Struct re ,, HPCE-LIF Sia'ylated 0,00 --- 2 %, :--a.d ::; n Bissecing 2.87 17 sylated* 13,D7 F..;cosylated 1. .5 A2 0.00 A2F 0.00 VI3N2 0,00 M3N2F 0:CO AL 0.00 . H 0.00 G2F6 0,00 0,47 G2F G28 0.00 G2 456 G1FB MO G1F 5,65 - _.3. :2 GiB 0.00 G1 24,59 -I D .:: GDFB :1.24 9,59 F n g 1,63 . , 52.06 7.,IAN-5 0.00 deni9és).5-0 Anti-RhD De1294 : Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées et quelques structures triantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées. 92.25% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 37.08%. ,-. F :3:,1 r_. _ - _ -2- 1 .:;'b 2X72 (.22_. 0 -.._ --' _.1. I. ..rlées',.'' 4 2_ ':-=1"..Zge E J r. E n .: 37 -:' Anti-RhD -C6A 78: La structure oligosaccharidique prédominante est : GO (55.20%). Le taux de fucosylation calculé est de 12.37%, le taux de fucosylation obtenu avec le mn DSial + DGal + DhexNAc (*) est de 10.63%. Le taux de formes possédant une GlcNac bissectrice est de 2.27%. Le taux de galactosylation calculé est de 39.13%. St-uctre :'::-0 HPCE-L1F Si ylatec 0.00 Bissec.inR 2.27 F..:cosylated* 11-2. ,,-.1.3 F, cosvlated 1,: AZ 0.00 A.2F 0.00 M3N2 0.00 5113N2F 0.00 AI' 0.00 A.F 0.00 G2FB 0.00 G2F 0.00 GZB 0.00 G2 4.00 G1FB 0.00 G1F 4.20 ^ - - _ G1B 0.83 G1 26.10 GDFB 0.66 G CiF 7.51 1.50 . 55.20 MAN-5 0.00 Identifiés ... _ Anti-RhD -C6A 78-De1294 : Les électrophorégrammes obtenus montrent des structures glycanniques biantennées et quelques structures triantennées. Ces structures sont majoritairement sialylées. 91.83% des structures semblent sialylées. Le taux de fucosylation calculé est de 57.81%. ..«. ' 3 .3.. 1 13 C1: (f11 - , 1- i - 1 C2 _ (2 a C2: a j -, n.83 ..1 ""-1 : 37S1 B- Variants produits dans des lignées HEK Les polypeptides suivants ont été analysés (Anti-CD20 IgG variants) : Nom Mutations T5A-74 N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y T5A-74H V264E/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y T5A-74De1294 E294de1/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y WT / Le variant T5A-74H diffère du variant parent T5A-74 par la mutation V264E. Le mutant T5A-74De1294 diffère du variant parent T5A-74 par la délétion de l'acide aminé en position 294. Ils ont par la suite analysé le profil de glycosylation de ces variants. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-après (en pourcentage) : Exemple 3 : Analyse de la demi-vie des IgG délétées en position 294 La persistance des Immunoglobulines dans le sérum de souris transgéniques pour le FcRn humain a été évaluée. Deux spécificités antigéniques ont été testées ; les IgG anti- CD20 et les IgG anti-RhD délétées en position 294 ont été testées en comparaison avec les IgG WT correspondantes. Des expériences de pharmacocinétique ont ainsi été effectuées chez la souris hFcRn qui sont homozygotes pour un allèle KO du FcRn murin et hétérozygote pour un transgène 10 de FcRn humain (mFcRn-/- hFcRnTg). Pour ces études pharmacocinétiques, chaque animal a reçu une seule injection intraveineuse d' IgG à 5 mg / kg au niveau du sinus rétro-orbital, dans un protocole similaire à celui décrit précédemment (Petkova SB, et al. Enhanced half-life of genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: 15 potential application in humorally mediated autoimmune disease. Int Immunol 2006). Des échantillons de sang ont été prélevés à partir du sinus rétro-orbital à de multiples points de temps et les IgGs titrées par ELISA. Résultats : T5A- 74De1294 T5A-74H T5A-74 27 0 Non 2,13 GI( GOF 81,44 G1 60FB 1 G1( .6 0,51 10,08 5,64 9,18 19,56 3,34 1,7/ 10,27 28,76 79,47 1,21 o o 4,92 0,88 0,71 9,23 0 3,68 0 2 5,94 0,91 1,57 0 >51,11 15,44 >34,38 >67,64 94,17 Al AlF_ G G1(1.3)F G1(1.6)F8 G28 Gatactasyta , SiatyfatiQn 2 G FB Fucosylatior 1,8 6,41 0,84 5,57 0 1,65 16,27-+- >58,36 0 >37,8 97,36 740,88 6,72 29,28 2,37 0,65 Dans cet essai, les deux IgG délétées en position 294 ont montré une augmentation de la demi-vie avec un ratio (demi-vie variant/WT) de 1,7 (Figure 2). Les paramètres analysés sont regroupés dans le tableau ci-dessous : Molécules CO AUCO-t ._!:::11nf e Vd CI Uh Anti-CD20 WT 29.2 4.07 0.097 Anti-CD20 De1294 48.8 2. 0.037 Anti-RhD WT O 7491 80 0 65.7 2 0.017 Anti-RhD De1294 141 11142 13354 111 1.66 0.010 Les paramètres analysés sont définis ci-dessous : CO : Concentration maximale extrapolée à TO AUCO-t : Aire sous la courbe temps/concentration plasmatique (du temps TO au dernier temps t où l'anticorps est encore quantifiable) AUCinf : Aire sous la courbe temps/concentration plasmatique de TO à l'infini (= AUCO-t + extrapolation jusqu'à l'infini) T1/2 : Demi-vie Vd : Volume de distribution Cl : Clairance REVENDICATIONS1. Procédé d'augmentation de la sialylation d'un fragment Fc, comprenant une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 2. Procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une sialylation améliorée dudit fragment Fc par rapport au polypeptide parent, qui comprend une étape de mutation d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240 à 243, 258 à 267 et 290 à 305 dudit fragment Fc, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la sialylation dudit fragment Fc ou dudit variant obtenu est augmentée d'au moins 10%, de préférence au moins 15%, de préférence au moins 20%, de préférence au moins 25%, de préférence au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de préférence au moins 55%, de préférence au moins 60%, de préférence au moins 65%, de préférence au moins 70%, de préférence au moins 75%, de préférence au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 95%, par rapport audit fragment Fc ou audit variant avant l'étape de mutation. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la mutation est choisie parmi une insertion, une substitution, de préférence ponctuelle, et une délétion. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le 30 polypeptide parent consiste en un fragment Fc. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le polypeptide parent consiste en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C-terminal à un fragment Fc. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que ledit polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 ou selon la revendication 7, caractérisé en ce que le polypeptide parent consiste en une séquence d'acides aminés 10 fusionnée en N- ou C-terminal à un anticorps ou une immunoglobuline. 9. Procédé selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que le fragment Fc du polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5, de préférence correspond à la séquence SEQ ID NO : 1. 15 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mutation est effectuée sur au moins un acide aminé situé en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305, la numérotation étant celle de l'index 20 EU ou équivalent dans Kabat. 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mutation est effectuée sur au moins un acide aminé situé en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 263, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 25 300, 301, 302, 303, 304 ou 305, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mutation est effectuée sur l'acide aminé situé en position 293 ou 294, la numérotation 30 étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 13. Procédé selon l'une des revendications 2 à 12, caractérisé en ce que le fragment Fc du polypeptide parent comprend déjà au moins une mutation additionnelle, de préférence choisie parmi P230S, T256N, V2591, N315D, A330V, N361D, A378V, S383N, M428L, N434Y, de préférence une combinaison de mutations additionnelles choisie parmi P230S/N315D/M428L/N434Y, T256N/A378V/S383N/N434Y, V2591/N315D/N434Y et N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y. 14. Procédé selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que l'étape de mutation est obtenue comme suit : i) on fournit une séquence nucléique codant pour le polypeptide parent comprenant le fragment Fc ; ii) on modifie la séquence nucléique fournie en i) pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant ; et iii) on exprime la séquence nucléique obtenue en ii) dans une cellule hôte, et on récupère le variant.