Brevet FR3035512A1 — publié le 20161028

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un système et un procédé d'analyse d'interaction entre un acide nucléique et une protéine. ETAT DE LA TECHNIQUE L'analyse de l'interaction entre un acide nucléique et une protéine fournit des informations concernant l'activité de la protéine. On connaît déjà des dispositifs permettant de mesurer des propriétés mécaniques d'une molécule. Le document US 7,052,650 décrit par exemple un dispositif pour manipuler et tester des molécules, telles que des molécules d'ADN, au moyen d'un piège magnétique. Dans ce dispositif, une molécule linéaire est attachée en plusieurs points à l'une de ses extrémités à un support et est attachée en plusieurs points à l'autre de ses extrémités à une bille magnétique. Le dispositif comprend des aimants propres à exercer une force magnétique sur la bille de manière à créer une force de traction contrôlée agissant sur la molécule selon une direction perpendiculaire au support. Le dispositif comprend une source d'éclairage employant une lumière collimatée, un objectif de microscope, et une caméra permettant de visualiser un motif de diffraction créé par la bille, ce qui permet d'en déduire une position de la bille par rapport au plan focal de l'objectif de microscope, et donc une extension de la molécule. De plus, l'analyse du mouvement Brownien de la bille en combinaison avec l'extension de la molécule permet de déterminer la force magnétique appliquée sur la bille. Un tel dispositif permet de déterminer une courbe force - extension de la molécule. Ce document indique que le dispositif proposé permet d'étudier des interactions d'une molécule d'ADN avec des protéines, telles des topoisomérases. Le document - Single-molecule analysis of DNA uncoiling by a type II topoisomerase », par Terence R.; Strick, Vincent Croquette et David Bensimon, Nature, vol. 404, 20 avril 2000, décrit par exemple l'utilisation d'un tel dispositif pour mesurer en temps réel une variation d'extension d'une molécule d'ADN sous l'action d'une enzyme topoisomérase de type II en présence d'adénosine triphosphate (ATP). Le document - The helicase-like domains of type III restriction enzymes trigger long-range diffusion along DNA », par Friedrich W. Schwartz et al, Science, vol. 340, 19 avril 2013, décrit par ailleurs un piège magnétique comprenant un support, une bille magnétique 3035512 2 et au moins un aimant générant un champ magnétique. Une molécule linéaire comportant deux extrémités est piégée en attachant l'une des extrémités de la molécule au support et l'autre des extrémités de la molécule à la bille magnétique. Sous l'effet du champ magnétique généré par l'aimant, la bille magnétique est soumise à une force magnétique 5 tendant à étirer la molécule suivant une direction parallèle au support. En parallèle, un signal fluorescent émis par une enzyme est mesuré. Un tel dispositif permet d'observer une diffusion d'une enzyme de restriction EcoP151 de type III le long de la molécule d'ADN. On connait également du document - Scanning Evanescent Fields Using a pointlike Light Source and a Nanomechanical DNA Gear », par Hergen Brutzer et al, Nano Letters, 10 American Chemical Society, 2011, p.473-478, un procédé de caractérisation d'un champ évanescent au moyen d'un piège magnétique. Ce procédé de caractérisation comprend des étapes selon lesquelles une source d'illumination émet un champ évanescent que l'on cherche à caractériser. Un piège magnétique est appliqué à une molécule d'ADN spécifique à quatre branches, à laquelle est 15 attachée un fluorophore. Le fluorophore est excité par le champ évanescent et émet ainsi un signal de fluorescence mesuré par un capteur approprié. Le piège magnétique est par ailleurs mis en oeuvre pour modifier la taille de la stucture à quatre branches ce qui permet de déplacer le fluorophore à travers le champ évanescent. En rapprochant le fluorophore de la surface, il est possible d'enregistrer une variation de l'intensité du rayonnement 20 fluorescent généré par le fluorophore en fonction de la position du fluorophore par rapport à la surface du substrat. Les procédés décrits dans ces documents ne permettent cependant pas d'analyser une interaction mécanique entre une molécule d'ADN et une protéine fluorescente, propre à générer une déformation de la molécule d'ADN. 25 RESUME DE L'INVENTION Un but de l'invention est d'analyser de manière précise l'interaction entre un acide nucléique et une protéine. Ce but est atteint dans le cadre de la présente invention grâce à un système d'analyse 30 d'interaction entre un acide nucléique et une protéine fluorescente, le système comprenant : - un support présentant une surface d'accrochage pour accrocher une première extrémité de l'acide nucléique, 3035512 3 - des moyens de génération d'un champ évanescent dans une zone s'étendant le long de la surface d'accrochage et dans laquelle la première extrémité de l'acide nucléique est localisée, le champ évanescent étant adapté pour exciter la protéine fluorescente pour que la protéine fluorescente émette un signal fluorescent lorsque 5 la protéine est située dans la zone, - une bille magnétique adaptée pour être accrochée à une deuxième extrémité de l'acide nucléique, - au moins un aimant propre à exercer sur la bille une force magnétique tendant à éloigner la bille du support selon une direction perpendiculaire à la surface 10 d'accrochage, - un premier capteur pour mesurer un premier signal optique caractéristique d'une position de la bille magnétique par rapport à la surface d'accrochage, le premier capteur étant agencé pour être conjugué avec un premier plan focal, - un deuxième capteur pour mesurer simultanément un deuxième signal optique, le 15 deuxième signal optique étant le signal fluorescent émis par la protéine fluorescente, le deuxième capteur étant agencé pour être conjugué avec un deuxième plan focal localisé sur la surface d'accrochage, dans lequel le premier capteur est déplaçable en translation de manière à modifier la position du premier plan focal par rapport au deuxième plan focal. 20 Le déplacement du premier capteur permet de régler de manière précise la position du premier plan focal de manière à obtenir une mesure précise de la position de la bille magnétique. Le système proposé permet ainsi d'obtenir simultanément deux types d'informations : d'une part, la position de la bille magnétique, via l'analyse du premier 25 signal optique fourni par le premier capteur, et d'autre part, l'état de fluorescence de la protéine, via l'analyse du deuxième signal optique fourni par le deuxième capteur. Comme l'acide nucléique est accroché par sa première extrémité au support, et par sa deuxième extrémité à la bille magnétique, dont on connaît la position, il est possible de déduire l'extension de l'acide nucléique ainsi que certaines informations relatives à sa 30 conformation (par exemple la courbure et la torsion imposées à l'acide nucléique),Il est alors possible de croiser l'information relative à l'extension de l'acide nucléique et l'information relative à l'état de fluorescence de la protéine pour mettre en relation la 3035512 4 conformation de l'acide nucléique piégé et l'interaction de la protéine avec l'acide nucléique. L'interaction de la protéine avec l'acide nucléique a pour effet de modifier les propriétés mécaniques de l'acide nucléique, qui peut affecter l'extension de l'acide 5 nucléique. De plus, grâce au signal fluorescent, il est possible de localiser la protéine dans le champ évanescent, et donc de déterminer une position de la protéine par rapport à l'acide nucléique. Par ailleurs, le champ évanescent fournit un éclairage localisé qui permet d'exciter 10 une protéine spécifique parmi plusieurs protéines. La combinaison du champ évanescent avec les moyens d'extension de la molécule (la bille et les aimants) permet ainsi d'éviter que le signal de fluorescence émis par la protéine dont on cherche à analyser l'interaction avec l'acide nucléique ne soit parasité par d'autres signaux tels qu'un signal de fluorescence émis par une protéine qui ne réagit pas avec l'acide nucléique, ou un signal 15 de fluorescence émis par la bille magnétique elle-même. Par ailleurs, le champ évanescent peut être calibré en employant l'autofluorescence de la bille magnétique accrochée à la molécule d'ADN dont on contrôle simplement la torsion via le piège magnétique. L'invention se rapporte également à un procédé d'analyse d'interaction entre un 20 acide nucléique et une protéine fluorescente, le procédé comprenant des étapes de : - accrocher une première extrémité de l'acide nucléique à une surface d'accrochage d'un support, - générer un champ évanescent dans une zone s'étendant le long de la surface d'accrochage et dans laquelle la première extrémité de l'acide nucléique est 25 localisée, le champ évanescent étant adapté pour exciter la protéine fluorescente pour que le la protéine fluorescente émette un signal fluorescent lorsque la protéine est située dans la zone, - accrocher une deuxième extrémité de l'acide nucléique à une bille magnétique, - exercer sur la bille une force magnétique tendant à éloigner la bille magnétique du 30 support selon une direction perpendiculaire à la surface d'accrochage, - mesurer un signal optique caractéristique d'une position de la bille magnétique par rapport à la surface d'accrochage au moyen d'un premier capteur, le premier capteur étant agencé pour être conjugué avec un premier plan focal, 3035512 5 - mesurer simultanément un deuxième signal optique au moyen d'un deuxième capteur, le deuxième signal optique étant le signal fluorescent émis par la protéine fluorescente, le deuxième capteur étant agencé pour être conjugué avec un deuxième plan focal localisé sur la surface d'accrochage, 5 dans lequel le premier capteur est déplaçable en translation de manière à modifier la position du premier plan focal par rapport au deuxième plan focal. PRESENTATION DES DESSINS D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention ressortiront de la 10 description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels : - La figure 1 représente de façon schématique, en vue de côté, une partie d'un système d'analyse conforme à un mode de réalisation possible de l'invention. - La figure 2 représente le système d'analyse de la figure 1, en vue de dessus. 15 - La figure 3 est un diagramme représentant un signal fluorescent émis par la bille en fonction de l'extension de l'ADN au cours d'une étape préalable de calibrage du système d'analyse. - Chacune des figures 4a, 4b et 4c montre deux courbes temporelles de données acquises simultanément au moyen du système d'analyse : une première courbe 20 représentant l'extension d'une molécule d'ADN mesurée au cours du temps et une deuxième courbe représentant le signal de fluorescence émis par une protéine qui fluoresce et qui se co-localise à la molécule d'ADN en fonction du temps. Les deux courbes sont obtenues simultanément. - La figure 5 est un diagramme représentant l'extension de l'ADN en fonction du 25 temps en correspondance avec des images montrant la présence d'une composante spécifique d'un complexe de réparation de l'ADN au cours d'un processus de réparation. Sur l'ensemble des figures, les éléments similaires portent des références identiques. 30 DEFINITIONS Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un 3035512 6 enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. Il doit être aussi compris ici que la présente invention ne 5 concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner ici les acides nucléiques isolés obtenus par recombinaison 10 génétique au moyen par exemple de cellules hôtes ou obtenus par synthèse chimique. L'extension de l'acide nucléique est définie comme la distance entre les deux extrémités de l'acide nucléique, c'est-à-dire entre la première extrémité accrochée à la surface d'accrochage et la deuxième extrémité accrochée à la bille. En pratique, l'extension de l'acide nucléique est assimilée à la distance entre la bille et la surface 15 d'accrochage. Une protéine ou un polypeptide au sens de l'invention est un enchainement d'au moins 3 acides aminés. On entend par - acide aminé » tous les résidus des acides a-aminés naturels (par exemple Alanine (Ala), Arginine (Arg), Asparagine (Asn), Acide aspartique (Asp), Cystéine (Cys), Glutamine (Gln), Acide glutamique (Glu), Glycine (Gly), Histidine 20 (His), Isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Méthionine (Met), Phénylalanine (Phe), Proline (Pro), Sérine (Ser), Thréonine (Thr), Tryptophane (Trp), Tyrosine (Tyr) et Valine (Val)) sous la forme D ou L, ainsi que les acides aminés non naturels. Dans le cadre de la présente invention, des protéines d'intérêt peuvent comprendre des protéines catalytiques, telles que de l'ADN, de l'ARN polymérase, de l'ADN translocase, 25 de l'ARN translocase, de l'ADN hélicase, de l'ARN hélicase, de l'ADN topoisomérase, de l'ARN topoisomérase, de l'ADN recombinase et de l'ARN recombinase, ou des protéines structurelles, telles que des histones et variantes ou des SMC (structural maintenance of chromosomes). Un fluorophore au sens de l'invention est une molécule chimique qui émet des 30 photons lorsqu'elle est stimulée par de la lumière dans une gamme de longueurs d'onde appropriée, et comprend également les protéines intrinsèquement fluorescentes (par exemple GFP, pour - Green Fluorescent Protein » en anglais), les cristaux semi-conducteurs (Qdots, Qrods), où tout autre composé ou molécule ou structure de taille nanométrique 3035512 7 pouvant émettre des photons sous l'action d'une stimulation optique dans une gamme de longueurs d'onde appropriée. Une protéine fluorescente peut être obtenue de diverses manières, par exemple par greffage ou couplage d'un fluorophore à la protéine dont on souhaite étudier l'interaction 5 avec l'acide nucléique. Des fluorophores préférés pour la mise en oeuvre de l'invention sont des protéines fluorescentes de type GFP (- Green fluorescent protein » en anglais), YFP (- Yellow fluorescent protein » en anglais), YPet (YFP optimisée pour FRET avec CPet), Tandem Tomato, ou des fluorophores organiques tels la série des Cyanures (par exemple Cy3, Cy5), 10 Alexa (par exemple Alexa Fluor 488, 546), des Dyomics (par exemple Dyomics DY-549), ou des cristaux semi-conducteurs fluorescents (QDots). Un champ évanescent est un champ électromagnétique dont l'intensité décroît exponentiellement selon une direction donnée. Dans le cadre de la présente invention, l'intensité du champ évanescent décroît à mesure que l'on s'éloigne de la surface 15 d'accrochage. DESCRIPTION DETAILLEE D'UN MODE DE REALISATION Système d'analyse 20 En référence à la figure 1, le système d'analyse représenté comprend un support 1, une bille magnétique B et une paire d'aimants AI, A2. Le support 1 est constitué d'un matériau translucide, par exemple du verre. Le support 1 peut être constitué d'un tube capillaire permettant l'introduction d'une solution dans laquelle l'acide nucléique est immergé. 25 Le support 1 comprend une surface externe 12 et une surface interne 10 opposée à la surface inférieure 12. La surface interne 10 constitue une surface d'accrochage pour accrocher un acide nucléique, telle qu'une molécule d'ADN par exemple. La surface d'accrochage est sensiblement plane, et s'étend perpendiculairement à une direction Z, qui peut être verticale par exemple. 30 Les aimants Al, A2 sont agencés en regard de la surface d'accrochage 10, de part et d'autre de la molécule d'ADN. Les aimants AI, A2 sont par ailleurs agencés pour générer un champ magnétique s'étendant dans une zone localisée entre la surface d'accrochage 10 et les aimants Al, A2, 3035512 8 ce champ magnétique étant ajustable via des moyens appropriés (non-illustrés), tels que par exemple un système permettant de déplacer les aimants par rapport au support 1 selon la direction Z. Dans la suite, on appellera - zone d'interaction » l'espace libre entre la surface 5 d'accrochage 10 et les deux aimants Al, A2. La bille magnétique B est adaptée pour être soumise à une force magnétique tendant à déplacer la bille B suivant une direction perpendiculaire au plan de la surface d'accrochage 10 (donc parallèlement à l'axe Z) lorsque que la bille B se trouve à portée du champ magnétique généré par la paire d'aimants AI, A2. 10 Le système d'analyse comprend par ailleurs une première source lumineuse SI. La première source lumineuse S1 est placée entre les deux aimants AI, A2. La première source lumineuse S1 est orientée de sorte à émettre un signal optique vers la surface d'accrochage 10. La première source lumineuse S1 est par exemple une diode électroluminescente 15 (LED). La première source lumineuse S1 est de préférence configurée pour émettre un signal optique rouge, voire infrarouge. La première source lumineuse S1 est configurée par exemple pour produire une lumière dont la longueur d'onde est centrée sur 650 nanomètres +/- 10 nanomètres ou 880 +/- 100 nm. 20 Le système d'analyse comprend par ailleurs des moyens de génération d'un champ évanescent le long de la surface d'accrochage. Les moyens de génération sont configurés pour que l'intensité du champ évanescent décroisse exponentiellement suivant l'axe Z perpendiculaire à la surface d'accrochage. Plus précisément, les moyens d'émission sont configurés pour que l'intensité du champ 25 évanescent soit maximale au niveau de la surface d'accrochage 10, et relativement faible, voire nulle, à hauteur des aimants AI, A2. En référence à la figure 2, les moyens de génération du champ évanescent comprennent une deuxième source lumineuse S2. La deuxième source lumineuse S2 est adaptée pour émettre une lumière dont la 30 longueur d'onde est par exemple 488 nm, ou 532 nm, ou 642 nm, et différente de la gamme de longueurs d'onde 70 de la lumière émise par la première source lumineuse SI. La deuxième source lumineuse S2 est une source de lumière cohérente. 3035512 9 La deuxième source lumineuse S2 est par exemple un laser fonctionnant dans une gramme de longueurs d'ondes centrée en 514 nanomètres (la lumière émise est alors de couleur verte). La deuxième source lumineuse S2 est configurée pour émettre un signal lumineux 5 propre à exciter une protéine fluorescente. Les moyens d'émission du champ évanescent comprennent par ailleurs une chaîne d'éléments optiques pour produire le champ évanescent à partir de la lumière générée par la deuxième source lumineuse S2. La chaîne d'éléments optique comprend les éléments suivants, agencés sur un même 10 chemin optique : - une lame demi-onde WP agencée en aval de la deuxième source lumineuse, - un séparateur de polarisation PBS (ou - polarization beam splitter » en anglais) agencé en aval de la lame demi-onde WP, - une lentille divergente T1 adaptée pour augmenter le diamètre d'un rayon incident 15 à environ 8 millimètres, - une lentille convergente T2 en aval de la lentille T1 divergente, adaptée pour collimater un rayon reçu de la lentille divergente T1, - un doublet achromatique L1, agencé en aval de la lentille T2, - un premier filtre dichroïque D1, agencé en aval du doublet achromatique L1, et 20 - un objectif O. Le doublet achromatique L1 est adapté pour focaliser un rayon incident dans le plan focal arrière de l'objectif O. Le filtre dichroïque D1 est positionné de sorte à réorienter vers l'objectif 0 un rayon incident en provenance du doublet L1. 25 Le filtre dichroïque D1 et l'objectif 0 sont agencés en dessous du support I. L'objectif 0 est localisé entre le filtre dichroïque D1 et le support I. L'objectif 0 est agencé pour émettre le champ évanescent vers la surface inférieure du support, à partir d'un rayon que l'objectif reçoit du filtre dichroïque D1. Dans un mode de réalisation, l'objectif 0 est maintenu et positionné en dessous de la 30 surface d'accrochage 10 par un élément mobile permettant de le déplacer selon son axe optique de façon controlée et réversible. Dans un mode de réalisation ceci est accompli à l'aide d'un élément piezoéléctrique controlé par l'unité de traitement U. 3035512 10 La chaîne d'éléments optiques des moyens de génération du champ évanescent comprend également: - deux miroirs de redirection MI, M2 agencés pour rediriger un rayon en provenance de la lame demi-onde vers la lentille divergente TI, 5 - deux miroirs de redirection M3, M4 agencés pour rediriger un rayon en provenance de la lentille convergente T2 vers le double achromatique Ll , - deux miroirs M5 et M6 agencés pour rediriger un rayon en provenance du double achromatique Ll vers le filtre dichroïque DI. En particulier, le miroir M6 est monté sur une platine de translation, le rendant 10 pilotable de sorte à déplacer le rayon reçu par l'objectif 0 entre l'axe optique de l'objectif 0 et la périphérie de l'objectif. Les miroirs M5 et M6 permettent de régler les rayons provenant de la source S2 de telle sorte à ce que l'incidence du rayon central provenant de la source dans le plan focal arrière de l'objectif soit normale à ce plan. 15 Le doublet achromatique Ll est par ailleurs monté sur une platine de translation, le rendant pilotable de sorte à optimiser la focalisation du rayon collimaté provenant de la lentille T2 et dirigé vers le filtre dichroique DI. Le système d'analyse comprend par ailleurs deux caméras Cl et C2 : une première caméra Cl positionnée pour acquérir le signal optique généré par la première source 20 lumineuse SI, et une deuxième caméra C2 agencée pour recevoir un signal de fluorescence d'un fluorophore excité par le champ évanescent dans la zone d'interaction. La première caméra Cl est du type CCD (- Charge Coupled Device » en anglais). La deuxième caméra C2 est du type EMCCD (- Electron Multiplying Charge Coupled Device » en anglais). 25 Il serait également possible d'utiliser d'autres types de caméras, telles que des caméras CMOS (- Complementarity metal-oxide-semiconductor » en anglais) pour les caméras Cl et C2. Le système d'analyse comprend par ailleurs des éléments optiques de réception pour rediriger le signal optique et le signal fluorescent vers la première caméra Cl et la 30 deuxième caméra C2. Les éléments optiques de réception comprennent: - l'objectif 0, qui est configure pour collecter le signal optique et le signal fluorescent, 3035512 11 - un deuxième filtre dichroïque D2 agencé pour séparer les signaux collectés par l'objectif. Le deuxième filtre dichroïque D2 est adapté pour mettre en oeuvre une séparation de signaux optiques incidents en fonction de leurs longueurs d'onde. 5 Le filtre dichroïque D2 est plus précisément adapté pour rediriger un signal optique selon la première gamme de longueurs d'ondes 70 sur un premier chemin optique menant à la première caméra C1, et un signal optique selon la deuxième longueur d'ondes 7^2 sur un deuxième chemin optique menant à la deuxième caméra C2. Ainsi, un signal optique issu de la première source lumineuse S1, et un signal 10 fluorescent émis par une protéine fluorescente excitée par le champ évanescent lui-même issu de la deuxième source lumineuse S2 peuvent être séparés par le deuxième filtre dichroïque D2. Le système comprend en outre un miroir de redirection M7 positionné entre l'objectif et le deuxième filtre dichroïque D2. 15 Dans le mode de réalisation représenté sur les figures 1 et 2, le miroir M7 est positionné à 45 degrés par rapport à l'axe Z, de sorte à pouvoir réorienter les rayons verticaux du signal fluorescent et du signal optique reçus de l'objectif dans un plan horizontal parallèle à la surface d'accrochage 10 (ce plan horizontal étant parallèle à la figure 2 et perpendiculaire à la figure 1). 20 Le système comprend par ailleurs un filtre en émission F2 et une lentille L2 agencés sur le chemin optique entre le filtre dichroïque D2 et la caméra C2. Un miroir M8 est en outre agencé entre le filtre dichroïque D2 et le filtre en émission F2. Dans une autre réalisation un deuxième miroir identique peut être rajouté dans le chemin optique entre le dicrhoïque D2 et le filtre en émission F2. 25 La lentille L2 est adaptée pour focaliser un rayon en provenance du filtre F2 sur une puce réceptrice de la caméra C2. Les éléments de la chaîne optique de réception sont agencés de telle sorte à ce que le plan focal de la puce réceptrice de la caméra C2 est conjugué avec le plan focal P2 avant de l'objectif 0 par le biais des autres éléments de la chaîne optique de réception. 30 Le fait que le plan focal de la puce réceptrice de la caméra C2 et le plan focal P2 soient conjugués signifie qu'un point donné du plan focal P2 a pour image un point du plan focal de la puce réceptrice de la caméra C1. 3035512 12 Par ailleurs, le plan focal P2 avec lequel la puce réceptrice de la caméra C2 est conjugué est différent du plan focal P1 avec lequel la puce réceptrice de la caméra Cl est conjugué. Dans un mode de réalisation, le système de maintien et de positionnement de 5 l'objectif 0 permet de déplacer simultanément et de la même façon les plans P1 et P2, tout en maintenant le plan P1 conjugué avec la puce réceptrice de la caméra Cl et tout en maintenant le plan P2 conjugué avec la puce réceptrice de la caméra C2. Le système comprend un filtre en émission F3 et une lentille L3 agencés sur le chemin optique entre le filtre dichroïque D2 et la caméra Cl. Une paire de miroirs M9, M10 10 sont en outre agencés entre le filtre dichroïque D2 et le filtre en émission F2. La lentille L3 est adaptée pour focaliser un rayon en provenance du filtre F3 sur une puce réceptrice de la caméra Cl. La première caméra Cl est montée mobile en translation par rapport à la lentille L3. L'axe de translation de la première caméra Cl est parallèle à son axe optique. De la 15 sorte, la première caméra Cl est conjuguée avec un plan focal parallèle à la surface d'accrochage 10 et localisé dans la zone d'interaction, et dont la position le long de l'axe Z est variable. Le système comprend par ailleurs une unité de traitement U de données délivrées par les caméras Cl et C2. L'unité de traitement U comprend un ou plusieurs processeurs. 20 Le système comprend également une mémoire MEM à laquelle l'unité de traitement U a accès en écriture voire en lecture. Plusieurs sources lumineuses S2 peuvent être combinées et introduites dans le système simultanément ou en séquence afin de générer plusieurs champs évanescents, chaque champ évanescent étant propre à exciter par exemple une protéine fluorescente 25 particulière ou une région fluorescente particulière de la même protéine. De façon analogue, plusieurs caméras de type C2 peuvent être présentes dans le système simultanément. L'addition d'éléments S2 et C2 additionnels se fait par l'emploi de lames dichroïques, miroirs, lentilles et filtres additionnels selon le schéma général du montage. La fluorescence émise par les ces composantes fluorescentes peut être collectée via une ou 30 plusieurs caméras C2. Plusieures billes magnétiques B peuvent être traitées simultanément par les deux caméras Cl et C2 et l'unité de traitement U. 3035512 13 Procédé d'analyse Le procédé d'analyse de l'interaction entre une protéine et un acide nucléique, par exemple une molécule d'ADN, est mis en oeuvre par les étapes suivantes. 5 A titre préliminaire, une première extrémité de la molécule d'ADN est fixée à la surface d'accrochage 10 du support 1. Une deuxième extrémité de la molécule d'ADN, opposée à la première extrémité, est fixée à la bille magnétique B, qui est laissée libre. Avant la mise en oeuvre du procédé, un calibrage in situ du champ évanescent est 10 réalisé. Ce calibrage ne nécessite aucun matériel additionnel ni de modifications particulières de la molécule d'ADN dans ce but. Au cours du calibrage, les propriétés mécaniques de l'ADN sont modifiées de façon incrémentale par le biais de la force et la torsion imposées à l'ADN dans le piège magnétique. A chaque incrément de force ou de torsion, l'extension de l'ADN est mesurée 15 par le biais de l'analyse basée sur le premier signal généré via la source S1 et enregistré par la caméra Cl. A chaque incrément de force ou de torsion, la fluorescence intrinsèque de la bille magnétique sous l'effet de la stimulation générée par la source S2 est mesurée et enregistrée sur la caméra C2. Les deux mesures peuvent être réalisées simultanément, mais peuvent aussi être réalisée de façon découplée afin d'optimiser indépendamment le 20 niveau de confiance en la mesure de la position de la bille ou de la fluorescence de la bille.Au cours du calibrage, les étapes suivantes sont mises en oeuvre. Selon une première étape, les aimants sont déplacés pour faire varier la force (ou la torsion) appliquée à la molécule d'ADN Selon une deuxième étape, la position de la bille magnétique par rapport à la surface 25 d'accrochage est mesurée par le biais de la caméra CI. Selon une troisième étape, un signal fluorescent généré par la bille magnétique est mesuré par le biais de la caméra C2. Selon une quatrième étape, une courbe représentant la position de la bille magnétique par rapport à la surface d'accrochage en fonction de la contrainte (force ou 30 torsion) incrémentalement modifiée est établie. Selon une cinquième étape, une courbe représentant l'intensité du signal fluorescent émis par la bille magnétique en fonction de la contrainte (force ou torsion) incrémentalement modifiée est établie. 3035512 14 Selon une sixième étape, les deux courbes obtenues à la quatrième étape et à la cinquième étape sont combinées afin de construire une courbe représentant l'intensité du signal fluorescent généré par la bille magnétique en fonction de la position de la bille magnétique par rapport à la surface d'accrochage. 5 La figure 3 est une courbe représentant l'intensité d'un signal fluorescent émis par la bille en fonction de l'extension de l'ADN, obtenue au cours lors du calibrage préalable du système d'analyse. La même molécule d'ADN est utilisée lors du procédé d'analyse d'interaction entre la molécule d'ADN et la protéine fluorescente. 10 Le procédé d'analyse d'interaction entre la molécule d'ADN et la protéine fluorescente est mis en oeuvre de la manière suivante. La première source lumineuse S1 est activée. La première source lumineuse S1 émet alors des rayons lumineux infrarouges dans la zone d'interaction, en direction de la surface d'accrochage 10. Ces rayons infrarouges sont diffractés par la bille magnétique B, et captés 15 par l'objectif O. L'objectif 0 transmet les rayons lumineux au filtre dichroïque D2 après réflexion sur le miroir M7. Le filtre dichroïque D2 redirige le rayon sur le chemin optique menant à la première caméra CI. La première caméra Cl produit à partir de la lumière infrarouge qu'elle reçoit à un 20 instant de référence une image représentant un motif de diffraction de la bille B. Ce motif de diffraction comprend une pluralité d'anneaux concentriques caractéristiques de la position de la bille magnétique par rapport au plan focal conjugué à Cl. La position de ce plan focal conjugué à Cl par rapport à la surface d'accrochage est connue, par exemple par mesure différentielle avec une bille magnétique collée à la 25 surface d'accrochage. Ainsi l'analyse de l'image obtenue par la première caméra Cl permet de connaître la position de la bille au-dessus de la surface, et donc l'extension de l'ADN. L'image captée par la première caméra Cl est donc qualifiée dans la suite d'image de position. L'unité de traitement U reçoit l'image de position captée par la première caméra Cl 30 et détermine une valeur de position de la bille magnétique B par rapport à la surface d'accrochage 10, par une analyse des anneaux de diffractions représentés dans l'image. Cette valeur de position correspond par exemple à la distance qui sépare la surface d'accrochage 10 et la bille magnétique B parallèlement à la direction de l'axe Z. 3035512 15 La valeur de position est mémorisée dans la mémoire MEM. L'étape de détermination de position est répétée par l'unité de traitement U pour une succession d'images de position captées par la caméra Cl au cours du temps, de sorte à produire une courbe de position de la bille magnétique en fonction du temps. 5 Simultanément, la deuxième source lumineuse S2 est activée. La deuxième source lumineuse S2 émet une lumière cohérente dont la gamme de longueurs d'ondes est différente de la gamme de longueurs d'ondes de la lumière infrarouge émise par la première source lumineuse SI. Les rayons lumineux cohérents émis par la source S2 sont successivement traités par 10 les éléments optiques suivants : la lame WP, le séparateur PBS, le miroir Ml, le miroir M2, la lentille T1, la lentille T2, le miroir M3, le miroir M4, le doublet achromatique Ll, le miroir M5, le miroir M6, le filtre dichroïque D1 et l'objectif O. En particulier, l'objectif 0 projette la lumière cohérente qu'il reçoit vers la surface externe 12 du support 1, qui traverse l'épaisseur du support 1 translucide et atteint la zone 15 d'interaction ou se trouve la bille B et la molécule d'ADN. Un champ évanescent E est alors produit dans la zone d'interaction dans laquelle la molécule d'ADN est localisée, le long de la surface de support 10. Le champ évanescent E est confiné dans une partie basse de la zone d'interaction, c'est-à-dire une partie connexe à la surface d'accrochage 10. La partie basse dans laquelle 20 le champ évanescent est confiné est d'une hauteur H de l'ordre de la centaine de nanomètres depuis la surface supérieure d'accrochage 10. Pour la mise en oeuvre du procédé, on produit une protéine fluorescente selon une méthode conventionnelle. La protéine fluorescente peut être obtenue de diverses manières : par exemple par 25 greffage ou couplage d'un fluorophore à la protéine d'intérêt. La protéine fluorescente est introduite dans la zone d'interaction de sorte que la protéine interagisse avec la molécule d'ADN. La protéine fluorescente, localisée dans la zone d'interaction, est excitée par le champ évanescent E généré. La protéine fluorescente, excitée par le champ évanescent E, 30 émet un rayon fluorescent qui est capté par l'objectif 0 après avoir traversé le support translucide I. 3035512 16 L'objectif 0 transmet le rayon fluorescent au filtre dichroïque D2 après réflexion sur le miroir M7. Le filtre dichroïque D2 redirige le rayon fluorescent sur le chemin optique menant à la deuxième caméra C2. La deuxième caméra C2 produit, à partir du rayon fluorescent, une image dite 5 - image de fluorescence » dont la couleur est représentative d'une intensité de fluorescence du rayon fluorescent. L'unité de traitement U détermine, à partir de l'image de fluorescence, une valeur d'intensité de fluorescence de la protéine fluorescente. La valeur d'intensité est mémorisée dans la mémoire MEM. 10 L'étape de détermination d'intensité de fluorescence par l'unité de traitement U est mise en oeuvre pour une pluralité d'images de fluorescence acquises successivement au cours du temps, de sorte à produire une courbe de fluorescence de la protéine en fonction du temps. Pendant que les deux sources lumineuses S1 et S2 sont simultanément actives, les 15 aimants Al, A2 génèrent un champ magnétique qui applique à la bille B une force magnétique qui tend à éloigner la bille de la surface d'accrochage parallèlement à l'axe Z (donc la deuxième extrémité de la molécule d'ADN qui y est accrochée), tandis que la première extrémité de la molécule d'ADN reste accrochée à la surface d'accrochage. Sous l'effet de cette force magnétique, la molécule d'ADN est soumise à une 20 contrainte de traction parallèlement à l'axe Z. Au cours d'un intervalle de temps donné, la valeur de la position de la bille magnétique B déterminée par l'unité de traitement U varie en conséquence de l'interaction de la protéine avec la molécule d'ADN. La caméra Cl est positionnée de sorte que son plan focal conjugué P1 soit 25 constamment décalé au-dessus de la position de la bille magnétique B, au cours du déplacement de la bille B. Le décalage est de préférence de l'ordre de quelques microns. La bille (B) magnétique est éloignée à au moins 400 nanomètres de la surface d'accrochage (10). D'autre part, comme le champ évanescent E généré par les moyens de génération est 30 d'intensité décroissante suivant l'axe Z, l'intensité du rayon de fluorescence émis par la protéine fluorescente dépend de la position de la protéine le long de l'axe Z. 3035512 17 L'intensité de fluorescence atteint une valeur sensiblement nulle si la protéine fluorescente quitte la partie basse de la zone d'interaction, le champ évanescent E étant en effet confiné à cette partie basse de la zone d'interaction. En conséquence, la valeur d'intensité de fluorescence déterminée par l'unité de 5 traitement U peut également varier au cours du même intervalle de temps si la protéine se déplace selon l'axe Z dans la zone d'interaction. Le système proposé permet de déterminer deux grandeurs physiques différentes : d'une part la position de la bille B, et d'autre part l'intensité de fluorescence de la protéine. 10 Il peut être déduit de la position de la bille magnétique B des informations relatives à la conformation de la molécule d'ADN attachée à la bille B. De plus, la conformation de la molécule d'ADN donne des informations sur l'activité de la protéine. Il est par exemple possible de déduire un angle de courbure et/ou un angle de torsion imposé par la protéine à la molécule d'ADN au cours de son interaction avec la 15 protéine. Par ailleurs, la courbe d'intensité de fluorescence peut être utilisée pour déterminer un instant d'arrivée de la protéine au voisinage de la molécule d'ADN (il s'agit d'un instant à partir duquel une fluorescence non nulle de la protéine apparaît sur la courbe de fluorescence), et/ou un instant de départ de la protéine (instant à partir duquel la courbe 20 de fluorescence redescend à la valeur zéro). En combinant les informations captées par les caméras Cl et C2, il est possible de caractériser de façon précise l'interaction de la protéine avec la molécule d'ADN. En particulier, on peut déduire la composition et l'état catalytique d'un complexe comprenant la protéine et agissant sur la molécule d'ADN par des traitements mis en oeuvre par l'unité 25 de traitement U. La figure 4a représente de manière schématique un premier exemple d'interaction entre une protéine P1 et une molécule d'ADN analysable par ce système et ce procédé. - la courbe supérieure de la figure 4a est une courbe représentant une variation de l'extension de la molécule d'ADN au cours du temps (cette extension étant déduite 30 de la distance séparant la bille B de la surface d'accrochage 10, mesurée par le capteur Cl). - La courbe inférieure de la figure 4a est une courbe représentant une variation de l'intensité du signal fluorescent émis par la protéine, mesurée par le capteur C2 : 3035512 18 cette courbe permet de détecter un instant d'arrivée tO de la protéine et un instant de départ tl de la protéine. Dans ce premier exemple, une protéine fluorescente P1 se lie à l'ADN puis au bout d'un certain temps le déforme mécaniquement ; au bout d'un certain temps elle cesse de 5 déformer mécaniquement l'ADN, puis au bout d'un certain temps elle s'en dissocie. Ce phénomène est illustré par l'évolution du signal enregistré par le capteur Cl. Ainsi, on observe dans le signal enregistré via la caméra Cl en un instant tO une réduction de l'extension de l'ADN (depuis un niveau de repos référencé - Baseline » au niveau référencé 1), cette réduction étant représentative de la déformation d'ADN 10 provoquée par la protéine Pl. On observe également dans le signal enregistré par la caméra Cl une augmentation de l'extension de l'ADN depuis le niveau 1 à un niveau de repos référencé - Baseline », cette augmentation étant représentative du moment où la protéine P1 cesse de déformer la molécule d'ADN. 15 Simultanément, on observe dans le signal enregistré via la caméra C2 que la protéine fluorescente peut être détectée sur l'ADN à partir d'un instant ta antérieur à l'instant tO de déformation de l'ADN, et ce jusqu'à un instant td postérieur à l'instant tl auquel la déformation de l'ADN par la protéine P1 cesse. Les figures 4b et 4c représentent de manière schématique un deuxième exemple 20 d'interaction entre deux protéines Pl, P2 et une molécule d'ADN. Dans ce deuxième exemple, la première protéine P1 est affectée dans son interaction avec l'ADN par la seconde protéine P2. Initialement, le signal mesuré par la caméra Cl est à un niveau de reposé référencé - Baseline » comme sur la figure 4a, indiquant qu'aucune protéine n'est activement en 25 train de modifier les propriétés mécaniques de l'ADN. Simultanément, aucun signal de fluorescence n'est détecté par la caméra C2 à l'endroit de l'échantillon ou est localisé la molécule d'intérêt. Similairement à l'exemple représenté en figure 4a, on observe à l'instant tO une modification du signal de position de la bille magnétique via la caméra Cl et du signal de 30 fluorescence dans la caméra C2. Ceci illustre que la protéine P1 est présente sur l'ADN et y agit mécaniquement. On observe ensuite à un instant t2 une modification du signal de position de la bille magnétique B à un niveau 2 localisé entre le niveau 1 et le niveau - Baseline » de repos, 3035512 19 mais aucune modification du signal de fluorescence dans la caméra C2. Ceci illustre que la protéine initiale P1 est toujours présente, mais qu'elle a modifié ses interactions mécaniques avec l'ADN. On observe ensuite à l'instant tl postérieur à t2 une modification du signal de 5 position de la bille magnétique B à son niveau de repos - Baseline », représentant une cessation de la déformation de la molécule d'ADN, comme dans l'exemple représenté en figure 4a. Simultanément, deux signaux de fluorescence sont captés par la caméra C2 (ou plusieurs caméras C2) : un premier signal de fluorescence de la protéine PI, et un 10 deuxième signal de fluorescence de la protéine P2. Le premier signal de fluorescence est visible sur la figure 4b : on y observe, comme dans le cas précédemment décrit en regard de la figure 4a, l'apparition d'une fluorescence par la protéine P1 avant le début de la déformation de l'ADN en l'instant tO, et la disparition de la fluorescence de la protéine P1 en l'instant tl ou postérieurement à tl . 15 Le deuxième signal de fluorescence est visible sur la figure 4b. On y observe une apparition de la protéine P2 sensiblement à l'instant ou le signal capté par la caméra Cl passe du niveau 1 au niveau 2. On en déduit alors que la protéine P2 a modulé l'interaction préexistante entre la protéine P1 et la molécule d'ADN. L'unité de traitement U peut en outre déterminer une position de la protéine par 20 rapport à la surface d'accrochage en fonction de l'intensité du signal fluorescent captée par la caméra C2. La longueur de la molécule d'ADN influe significativement sur la qualité des données captées par les caméras Cl et C2. Si la longueur de la molécule d'ADN est trop grande, le bruit de mesure de position de 25 la bille captée par la caméra Cl est trop élevé. Par ailleurs, si la longueur de la molécule d'ADN est choisie trop petite, alors la bille magnétique se trouve être trop éclairée par le champ évanescent E à tel point que la bille magnétique génère alors un signal fluorescent qui parasite excessivement le signal de fluorescence généré par la protéine. 30 De préférence la longueur de la molécule d'ADN est par conséquent choisie entre 1000 et 5000 bases, par exemple 3000 bases, cette gamme offrant un bon compromis de qualité entre les images captées par la caméra Cl et les images captées par la caméra C2. 3035512 20 La figure 5 est un diagramme représentant l'extension de l'ADN en fonction du temps en correspondance avec des images montrant la présence d'une composante spécifique d'un complexe de réparation de l'ADN au cours d'un processus de réparation. 5 REVENDICATIONS1. Système d'analyse d'interaction entre un acide nucléique et une protéine fluorescente, le système comprenant : - un support (1) présentant une surface d'accrochage (10) pour accrocher une première extrémité de l'acide nucléique, - des moyens de génération (S2, 0) d'un champ évanescent (E) dans une zone s'étendant le long de la surface d'accrochage (10) et dans laquelle la première extrémité de l'acide nucléique est localisée, le champ évanescent (E) étant adapté pour exciter la protéine fluorescente pour que la protéine fluorescente émette un signal fluorescent lorsque la protéine est située dans la zone, - une bille (B) magnétique adaptée pour être accrochée à une deuxième extrémité de l'acide nucléique, - au moins un aimant propre à exercer sur la bille (B) une force magnétique tendant à éloigner la bille (B) du support (1) selon une direction perpendiculaire à la surface d'accrochage (10), - un premier capteur pour mesurer un premier signal optique caractéristique d'une position de la bille (B) magnétique par rapport à la surface d'accrochage (10), le premier capteur étant agencé pour être conjugué avec un premier plan focal (P1), - un deuxième capteur pour mesurer simultanément un deuxième signal optique, le deuxième signal optique étant le signal fluorescent émis par la protéine fluorescente, le deuxième capteur étant agencé pour être conjugué avec un deuxième plan focal (P2) localisé sur la surface d'accrochage, dans lequel le premier capteur est déplaçable en translation de manière à modifier la position du premier plan focal par rapport au deuxième plan focal. 2. Système selon la revendication précédente, comprenant en outre une première source lumineuse (S1) pour éclairer la bille (B) magnétique dans une première gamme de longueurs d'ondes, le premier signal optique mesuré par le premier capteur étant produit par l'éclairage de la bille (B) magnétique par la première source lumineuse, et dans lequel les moyens de génération du champ évanescent (E) comprennent une deuxième source lumineuse (S2) configurée pour exciter la protéine de manière à produire le deuxième 3035512 22 signal optique dans une deuxième gamme de longueurs d'onde, différente de la première gamme de longueurs d'onde. 3. Système selon la revendication précédente, dans lequel la deuxième source lumineuse 5 (S2) est une source de lumière cohérente. 4. Système selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le premier capteur (C1) et le deuxième capteur (C2) sont agencés de sorte que le plan conjugué P1 dont le capteur Cl forme une image est différent du plan conjugué P2 dont le capteur C2 forme une image. 10 5. Système selon la revendication précédente, dans lequel soit une lentille (L3), soit le premier capteur (Cl), est mobile de sorte à pouvoir faire varier la position du plan focal P1 dont le capteur Cl forme une image. 15 6. Système selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le premier signal optique contient des données d'image représentant un motif de diffraction caractéristique de la position de la bille (B) magnétique par rapport à la surface d'accrochage (10). 7. Système selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre un objectif 20 (0) pour collecter le premier signal optique et le deuxième signal, et un élément dichroïque pour séparer les signaux collectés par l'objectif. 8. Système selon la revendication précédente, dans lequel l'objectif (0) est également configure pour générer le champ évanescent (E). 25 9. Système selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre des moyens de traitement (U) configurés pour déterminer une position de la protéine par rapport à la surface d'accrochage (10) en fonction de l'intensité du deuxième signal optique. 30 10. Système selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre des moyens de traitements (U) configurés pour déterminer un temps de départ et/ou un temps d'arrivée de la protéine en fonction du deuxième signal optique mesuré. 3035512 23 11. Procédé d'analyse d'interaction entre un acide nucléique et une protéine fluorescente, le procédé comprenant des étapes de : - accrocher une première extrémité de l'acide nucléique à une surface d'accrochage (10) d'un support (1), 5 - générer un champ évanescent (E) dans une zone s'étendant le long de la surface d'accrochage (10) et dans laquelle la première extrémité de l'acide nucléique est localisée, le champ évanescent (E) étant adapté pour exciter la protéine fluorescente pour que le la protéine fluorescente émette un signal fluorescent lorsque la protéine est située dans la zone, 10 - accrocher une deuxième extrémité de l'acide nucléique à une bille (B) magnétique, - exercer sur la bille (B) une force magnétique tendant à éloigner la bille (B) magnétique du support (1) selon une direction perpendiculaire à la surface d'accrochage (10), - mesurer un premier signal optique caractéristique d'une position de la bille (B) 15 magnétique par rapport à la surface d'accrochage (10) au moyen d'un premier capteur, le premier capteur étant agencé pour être conjugué avec un premier plan focal (P1), - mesurer simultanément un deuxième signal optique au moyen d'un deuxième capteur, le deuxième signal optique étant le signal fluorescent émis par la protéine 20 fluorescente, le deuxième capteur étant agencé pour être conjugué avec un deuxième plan focal (P2) localisé sur la surface d'accrochage, dans lequel le premier capteur ou une lentille (L3) est déplaçable en translation de manière à modifier la position du premier plan focal conjugué P1 par rapport au deuxième plan focal conjugué P1. 25 12. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la bille (B) magnétique est éloignée à au moins 400 nanomètres de la surface d'accrochage (10). 13. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'acide nucléique (ADN) est 30 d'une longueur comprise entre 1000 et 5000 bases, de préférence 3000 bases. 14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, dans lequel le premier plan focal conjugué P1 est différent du deuxième plan focal conjugué P2. 3035512 24 15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 14, dans lequel le premier plan focal conjugué P1 est positionné de sorte que la bille magnétique soit localisée entre le premier plan focal conjugué P1 et le deuxième plan focal conjugué P2 pendant la mise en oeuvre du 5 procédé d'analyse.