Brevet FR3033564A1 — publié le 20160916

Composition de collagène de peaux de poissons La présente invention concerne un collagène isolé de son milieu naturel à partir de peaux d'animaux, et concerne plus particulièrement du collagène de peaux de poisson. Le collagène à l'état natif est constitué de trois chaînes polypeptidiques d'environs 1050 acides aminés associées en triple hélice. Le collagène comporte trois chaînes alpha (al, a2 et/ou a3) associées en triple hélice, laquelle triple hélice de collagène est qualifiée de chaîne gamma (y). S'il existe différents types de collagènes, le collagène de type I reste le plus abondant dans les organismes des vertébrés. Ce collagène de type I consiste en l'association en triple hélice de deux chaînes al à une chaîne a2. De nombreuses utilisations sont connues des collagènes obtenus à partir de peaux d'animaux. Diverses industries, par exemple l'industrie des cosmétiques et celle des produits alimentaires, tirent profit des propriétés intéressantes des dérivés du collagène, comme c'est le cas de la gélatine. La gélatine de collagène est bien connue en tant qu'ingrédient essentiel pour la fabrication des confiseries. Le collagène marin est extrait principalement de peaux, d'arêtes ou d'écailles d'animaux marin, voire il peut être extrait à partir de cnidaires. Des procédés d'extractions connus requièrent l'utilisation d'acide pour l'extraction, laquelle extraction est suivie d'une précipitation par des sels. Les collagènes ou dérivés obtenus sont composés majoritairement de chaînes alpha (al ou a2) et béta ([3) (la chaîne béta étant composée de deux chaînes alpha), et ne peuvent donc pas être considérés comme du collagène natif. La demande de brevet US2014147400 décrit un procédé d'obtention d'un collagène à partir de peaux d'un poisson, le tilapia (aussi dénommé « red tilapia » ou « Oreochromis nilotica »). Le collagène est extrait en ayant recours à l'utilisation de la papaïne et de chlorure de sodium. Le dérivé de collagène 1 3033564 2 obtenu est utilisé comme agent de clarification des bières, du vin ou des jus de fruit. Tous ces dérivés de collagène de l'art antérieur obtenus à partir de 5 source de collagène sont dénaturés au cours des étapes de purification, soit par l'utilisation d'acides ou de bases, soit par l'utilisation de sels, soit encore par l'utilisation d'enzymes. Il ne s'agit donc pas de collagène natif à proprement parler. 10 Pour pallier tout ou partie des inconvénients de l'état de la technique, la présente invention a pour objet un collagène natif de peau de poisson comprenant des chaînes a, [3 et y. Les inventeurs ont découvert de manière inattendue qu'un traitement à l'eau, avec un léger chauffage, de peaux de poisson convenablement prétraités mécaniquement permettait d'isoler un 15 collagène natif comportant des chaînes polypeptidiques de type gamma (y) sans le dénaturer. Les chaînes y sont des chaînes libres, ou associées entre elles, avec un poids moléculaire de chaque chaîne gamma d'au moins 300 kDa. Les teneurs en chaînes a du collagène selon l'invention sont avantageusement de 2 à 15% du poids total en extrait sec de collagène, voire de 6 à 12%. Les teneurs 20 en chaînes [3 du collagène selon l'invention sont avantageusement de 1 à 10 (3/0 du poids total en extrait sec de collagène, voire de 3 à 7%. Le collagène natif selon l'invention comporte avantageusement une teneur pondérale en chaînes y (de haut poids moléculaires) libres et/ou 25 associées entre elles - aussi qualifiée de teneur totale en chaîne y - d'au moins 60% par rapport à la masse totale de l'extrait sec de collagène obtenu. Une telle teneur en chaîne y garantie la qualité du collagène natif extrait de la peau des poissons. La teneur totale en chaînes y est de préférence d'au moins 65%, elle est de manière d'avantage préférée d'au moins 70%, voire d'au moins 75%. 30 La teneur en chaînes y libres - c'est-à-dire non associées entre elles - du collagène selon l'invention est avantageusement de 5 à 20 (3/0 du poids total en extrait sec de collagène, voire de 10 à 15%. 2 3033564 3 La teneur en chaînes y associées entre-elles, c'est-à-dire d'un poids moléculaire supérieur ou égal à 600 kDa, est avantageusement de 60 à 80 `Vo. Toutes les combinaisons des plages des valeurs des différentes 5 molécules du collagène, présentées précédemment dans le cadre de l'invention, sont également possibles. Le collagène natif selon l'invention est avantageusement extrait à partir de peaux de poisson fraîches. Une peau de poisson fraîche au sens de la présente 10 invention correspond à une peau utilisée dans les dix jours qui suivent la pêche, et conservée sur lit de glace dans l'attente de sa transformation. La peau conserve ainsi toute sa qualité structurale. Le collagène obtenu à partir de peaux de poisson frais est isolé en condition non dénaturante. 15 Le collagène natif selon l'invention est avantageusement extrait à partir de peaux de saumon. La peau du saumon ne requiert qu'un prétraitement mécanique sommaire et il est possible d'en extraire le collagène natif avec un rendement élevé. Le collagène obtenu à partir de peaux de saumon a une structure identique au collagène natif présent au sein de la peau du saumon. 20 Le collagène natif selon l'invention est avantageusement extrait à partir de peaux de saumon d'élevage. Le saumon d'élevage est une source de choix étant donné que sa traçabilité est parfaitement connue, la présence de métaux lourds est par exemple évitée. Le collagène obtenu à partir de peaux de saumon 25 d'élevage a une structure et une qualité constante qui n'est pas susceptible d'évoluer, comme c'est le cas du saumon sauvage dont la nature de la source est dépendante des périodes de pêche et des zones de prélèvement. La présente invention concerne aussi un procédé d'obtention de 30 collagène natif tel que décrit précédemment dans le cadre de l'invention, à partir de poisson, comprenant les étapes : a) fileter des saumons d'élevage pour en récupérer les peaux ; b) découper les peaux en morceaux de 2 à 4 cm2 ; 3 3033564 4 C) traiter les morceaux dans une séparatrice mécanique pour en éliminer la chair et les déshydrater ; d) plonger les morceaux dépulpés et déshydratés dans une enceinte comportant quatre volumes d'eau portée à une température de 40 5 à 5000; e) extraire le collagène en effectuant une agitation douce pendant 60 à 120 minutes ; f) collecter le jus de collagène par tamisage ou filtration (clarifiante) ; et 10 g) congeler le jus de collagène. L'étape c) met avantageusement en oeuvre l'utilisation d'une séparatrice mécanique (séparatrice mécanique à haute pression comprenant au moins un tamis à fentes) pour tamiser sous pression en éliminant les résidus liquides et 15 semi-liquides, lesquels passent par les fentes des tamis. Seul le rétentat, c'est-à- dire la fraction retenue dans les filtres, est gardé en vu des étapes de traitement ultérieures du procédé. Le procédé comporte avantageusement une étape de désinfection par 20 mise en contact des peaux fraîchement dépulpées avec une solution de soude à 0.5 - 1.5 mol/L pendant 5 à 15 mn, rinçage puis contact avec une solution d'acide formique à 2.5 à 7.5% pendant 5 à 15 mn. Les peaux comportant une flore microbiologique trop importante doivent être traitée ainsi, en vu d'éliminer les bactéries quelles contiennent. L'acide formique peut être remplacé par de 25 l'acide phosphorique ou de l'acide lactique. Le procédé comporte avantageusement une étape ultime de séchage en prenant soin d'éviter la dénaturation de la triple hélice. 30 Le procédé d'obtention du collagène comporte avantageusement une étape ultime de filtration (avant le séchage, lorsque celui-ci doit être effectué) en vue d'une désodorisation et/ou d'une décontamination. Le jus de collagène brut coloré, et/ou ayant une odeur forte, est transformé en un jus incolore et inodore. 4 3033564 5 La présente demande concerne aussi une utilisation du collagène natif telle que décrit précédemment dans le cadre de l'invention pour le soin cosmétique de la peau par hydratation. 5 Les exemples présentés dans la partie expérimentale sont uniquement donnés à titre illustratif et ne sauraient être interprétés comme limitatifs eu égard à la protection demandée. PARTIE EXPERIMENTALE 10 La correspondance entre l'unité Dalton (symbole « Da »), utilisée dans le cas d'espèce pour quantifier la masse des molécules du collagène, et l'unité de masse atomique unifiée (symbole « u ») du Système International (SI) est 15 rappelée : 1 Da = 1.00794 u. Le symbole kDa correspond au kilodalton très souvent utilisé en biochimie et en biologie. 1) Préparation : 20 Le collagène natif marin est isolé de la manière suivante : - la matière première consiste en des peaux de saumon fraiches (utilisée moins de 10 jours après la pêche du poisson, celui-ci étant conservé sur lit de glace dans l'attente de sa transformation). La peau conserve ainsi toute sa qualité. - après filetage du saumon, la peau est récupérée et découpée en morceau de 2 25 à 4 cm2. - les morceaux de peau sont ensuite traités mécaniquement pour en éliminer tous les résidus de chairs. Cette étape permet de ne conserver que strictement la peau et les écailles de saumon. Ce traitement mécanique se fait à l'aide d'une séparatrice mécanique de type SM 30 commercialisé par la société AM2C® sous la référence 5M820, dont le principe de séparation permet d'éviter l'échauffement de la peau de poisson. - la peau ainsi dépulpée est plongée dans 4 volumes d'eau et chaude (45°C+/-5°C) et lentement brassée pendant 90 minutes. Cette étape permet l'extraction du collagène. - le liquide formé est ensuite tamisé (mailles de diamètre interne de 0.8mm) pour récupérer le jus collagénique. - Ce jus est ensuite conditionné et congelé avant d'être séché. - le séchage du jus collagènique est réalisé à basse température, évitant ainsi la dénaturation de la triple hélice. Deux options sont possibles dans ce procédé : - en cas de flore microbiologique trop importante sur les peaux de saumons, une étape de débactérisation par contact avec de la soude (2 volume de NaOH 1N 5 3033564 6 pendant 10 minutes), rinçage puis contact avec de l'acide (acide formique 5% pendant 10 minutes) peut être mise en oeuvre avant l'extraction (sur la peau parfaitement dépulpée.) - en cas de jus collagènique trop coloré ou trop odorant, une étape de filtration - 5 sur plaque ou sur charbon - peut être mise en oeuvre. 2 Résultats : Caractérisation du collagène obtenu par différentes techniques 10 SDS-PAGE (électrophorèse sur gel polyacrylamide en conditions dénaturantes par le sodium dodécyl sulfate) : Une électrophorèse SDS-PAGE, permet de fractionner les chaines par leur taille. 15 Protocole : La technique SDS-PAGE a été mise en oeuvre selon la méthode décrite par Laemmli (1970). Le collagène lyophilisé est solubilisé dans de l'eau Milli-Q à la concentration de 1.5 mg/mL, puis dissout dans du tampon Laemmli au ratio 1:1. 20 15 !IL de cette solution échantillon et 10 !IL de marqueurs moléculaires sont chargés dans les puits du gel de polyacrylamide 4-20% pré-coulé (kit MiniPROTEAN® TGXTm, Laboratoires Bio-Rade). La migration est réalisée en tampon Tris-Gly-SDS (pH=8.3) contenant 25 mM de Tris, 192 mM de glycine et 0.1% (w/v) dans une cuve Mini Protean® Tétra System (Bio-Rade). Les gels 25 sont colorés avec 50 mL de bleu de Coomassie puis rincés à l'eau Milli-Q. Les bandes de protéines sont détectées avec l'analyseur d'image Gel D0cTM EZ Imager, puis les données sont analyses avec le logiciel Image Lab 4.0.1 (Biorade). 30 La présence de chaine y confirme la présence de collagène en triple hélice (voir la figure 1) et conforte que le collagène obtenu est du collagène natif. Chromatographie HPLC : 35 Une chromatographie liquide haute performance, permet de montrer la répartition des chaines de protéines collagéniques en fonction de leur poids. La figure 2 montre le chromatogramme obtenu selon le protocole suivant : 40 - Conditions d'analyses : Colonne : YarraTM 3pm SEC 4000 : 300 mm x 7.8 mm Débit : 1 mL/min Température : 20°C À : 220 nm 6 3033564 7 Phase mobile : tampon phosphate sodium 0.1 M ; pH=7 + 100 mM NaCI Injection : 20 pl_ Enregistrement : 15 minutes 5 - Témoins : Vérification de la gamme d'étalonnage entre 670 kDa et 17 kDa : - Solution témoin thyroglobuline : dissoudre 10.0 mg de thyroglobuline (commercialisé par la société Sigma-Aldrich® sous la référence: T9145) 10 dans 10.0 mL d'eau qualité HPLC. - Solution témoin apoferritine : prélever 100 pl_ de la solution d'apoferritine (commercialisé par la société Sigma-Aldrich® sous la référence: 3660- 1vI) et compléter avec 1.2 d'eau qualité HPLC. - Solution témoin 3-amylase : dissoudre 10.0 mg de 3-amylase 15 (commercialisé par la société Sigma-Aldrich® sous la référence : A8781) dans 10.0 mL d'eau qualité HPLC. - Solution témoin gammaglobuline : dissoudre 10.0 mg de gammaglobuline (commercialisé par la société Sigma-Aldrich® sous la référence : G7516) dans 5.0 mL d'eau qualité HPLC. 20 - Solution témoin alcool déshydrogénase : dissoudre 10.0 mg d'alcool déshydrogénase (commercialisé par la société Sigma-Aldrich® sous la référence: A8656) dans 5.0 mL d'eau qualité HPLC. - Solution témoin Bovine Sérum albumine (BSA) : dissoudre 10.0 mg de BSA (commercialisé par la société Sigma-Aldrich® sous la référence: 25 A2153) dans 10.0 mL d'eau qualité HPLC. - Solution témoin anhydrase carbonique : dissoudre 5.0 mg d'anhydrase carbonique (commercialisé par la société Sigma-Aldrich® sous la référence: 07025) dans 5.0 mL d'eau qualité HPLC. - Solution témoin myoglobine : dissoudre 10.0 mg de myoglobine 30 (commercialisé par la société Sigma-Aldrich® sous la référence : M5696) dans 10.0 mL d'eau qualité HPLC. - Volume d'exclusion : Le volume d'exclusion Vo est déterminé en injectant une solution de blue 35 dextran à la concentration de 5.0 mg/mL. - Echantillons : Echantillon solide : peser 50.0 mg de l'échantillon à analyser et le dissoudre dans 10.0 mL d'eau qualité HPLC. 40 Echantillon liquide : Prélever 3.0 mL et compléter à 10.0 mL avec de l'eau qualité HPLC. Une majorité de chaines de poids moléculaires supérieurs à 300 000 Da sont observées, ce qui atteste de la majorité de présence de triple hélice, voir du maintien de la structure fibrillaire du collagène extrait. 7 3033564 8 Microscopie électronique à balayage (MEB) : Les caractéristiques morphologiques du collagène ont été observées par 5 microscopie électronique à balayage (S-3200N; Hitachie). Les échantillons sont déposés sur des supports recouverts d'un alliage or/palladium et observés à différents grossissement. L'image obtenue conforte la présence des chaînes y mises en évidence par 10 l'électrophorèse et la chromatographie haute densité en phase liquide (voir la figure 3). Sur la figure 3 des fibres de l'ordre de 14 lm (cadre ovale) et de l'ordre de 90 lm sont observées (cadre rectangulaire avec grossissement). 15 Analyse Infrarouge (FTIR) : Le collagène obtenu a été soumis à une spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier en réflexion totale atténuée (ATR-FTIR). Un spectromètre FTIR (Bruker® Vertex 70 FT-IR avec un module AIR) a été utilisé. Le spectre, dans la 20 gamme 4000-400 cm-1 avec un gain de signal automatique, est collecté par 32 scans avec une résolution de 4 cm-1. Le spectre obtenu est analysé à l'aide du logiciel OPUS 8.0 (Brukere). La détermination est faite en triplicata. 25 Le spectre infrarouge obtenu conforte la présence des chaînes y en grande quantité (voir la figure 4). Tableau reportant les pics d'intérêt sur le spectre représenté en figure 4 : Amide I 1630 cm-, Amide II 1534 cm-, Amide III 1236 cm-, Amide A 3289 cm-, Amide B 2926 cm-, Absorbance amide III / bande à "::-- 1450 cm-1 0.08684 / 0.95 0.09096 = 30 Le collagène ainsi obtenu est utilisé à des fins cosmétiques comme agent hydratant. 8 î REVENDICATIONS1. Composition consistant en un jus de collagène ou un extrait sec de collagène isolé de peau de poisson comprenant des chaînes a, 13 et y. 2. Composition selon la revendication 1, dans lequel la teneur totale en chaînes y est d'au moins 60%. 3. Composition selon l'un des revendications 1 ou 2, dans lequel la teneur en chaînes y libres est de 5 à 20% et la teneur en chaînes y associées est de 60 à 80%. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le collagène est isolé à partir d'une peau de poisson fraîche. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le collagène est isolé à partir d'une peau de saumon. 6. Composition selon la revendication 5, dans lequel le saumon est du saumon d'élevage. 7. Procédé d'obtention d'une composition selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant les étapes : a. fileter des saumons d'élevage pour en récupérer les peaux ; b. découper les peaux en morceaux de 2 à 4 cm2; c. traiter les morceaux dans une séparatrice mécanique pour en éliminer la chair et les déshydrater ; d. plonger les morceaux dépulpés et déshydratés dans une enceinte comportant quatre volumes d'eau portée à une température de 40 à 50°C ; e. extraire le collagène en effectuant une agitation douce pendant 60 à 120 minutes ; f. collecter le jus de collagène par tamisage ou filtration ; et g. congeler le jus de collagène. 3033564 10 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le procédé comporte une étape de désinfection par mise en contact des peaux fraîchement dépulpées à la fin de l'étape c) avec une solution de soude à 0.5 - 1.5 mol/L pendant 5 à 15 mn, rinçage, puis contact avec une solution d'acide, 5 de préférence une solution d'acide formique, à 2.5 à 7.5% pendant 5 à 15 mn. 9. Procédé selon l'une des revendications 7 à 8, dans lequel le procédé comporte une étape ultime de filtration juste après l'étape f), en vue d'une 10 désodorisation et/ou d'une décontamination. 10. Utilisation de la composition selon l'une des revendications 1 à 6 pour le soin cosmétique de la peau par hydratation. 15