Brevet FR3025401A1 — publié le 20160311

L'invention se rapporte au domaine de la lutte contre les agents pathogènes des plantes, par utilisation de combinaisons d'organismes biologiques, tels que les insectes, les bactéries, les champignons, pour se débarrasser des ravageurs de cultures, insectes ou mauvaises herbes, afin de remplacer ou entrer en synergie avec les pesticides ou herbicides de synthèse. On distingue 4 principaux types d'agents de bio-contrôle. Les macro-organismes auxiliaires (ou l'agresseur agressé) sont des invertébrés, insectes, acariens ou nématodes utilisés de façon raisonnée pour protéger les cultures contre les attaques des bio-agresseurs. Les micro-organismes (ou l'agresseur maîtrisé) sont des champignons, bactéries et virus utilisés pour protéger les cultures contre les ravageurs et les 15 maladies ou stimuler la vitalité des plantes. Les médiateurs chimiques comprennent les phéromones d'insectes et les kairomones. Ils permettent le suivi des vols des insectes ravageurs et le contrôle des populations d'insectes par la méthode de confusion sexuelle et le piégeage. Les substances naturelles utilisées comme produits de bio-contrôle sont 20 composées de substances présentes dans le milieu naturel et peuvent être d'origine végétale, animale ou minérale. Botrytis cinerea est un champignon phytopathogène haploïde de la famille des Sclerotiniaceae, de la division des Ascomycota. Il est responsable de la 25 pourriture grise, une maladie cryptogamique qui sévit sur plusieurs cultures d'intérêt agronomique majeur comme la vigne, le tournesol, la tomate, la fraise. Botrytis cinerea attaque un nombre très important (au moins 270 espèces) de plantes sauvages, notamment des Rosacées, mais aussi nombre de plantes cultivées (Vitaceae, Solanaceae, Cucurbitaceae, Rosaceae et Fabaceae). La 30 viticulture, le maraîchage, l'arboriculture et la floriculture sont concernés par la pourriture grise. Ainsi on peut citer les cultures de tomate, framboise, fraise, haricot, concombre, ou la salade (essentiellement des plantes dicotylédones). Parmi les monocotylédones, les graminées sont considérées comme peu sensibles à la différence des bulbes (comme les oignons). La culture du cannabis et des 35 fleurs est aussi touchée, puisque les roses, gerberas, pivoines, oeillets, lis et chrysanthèmes sont vulnérables au botrytis. Bien que la pourriture grise s'attaque 3025401 2 préférentiellement aux fruits, tous les organes de la plante y sont potentiellement sensibles, et les symptômes sont variés : flétrissement des fleurs, taches foliaires, pourriture des racines, des tiges, ou des fruits. 5 D'autres espèces de champignon du genre Botrytis sont également pathogènes de plantes (notamment Botrytis squamosa, Botrytis allii sur l'oignon). Il existe un certain nombre de traitements fongicides anti-botrytis On peut ainsi utiliser des fongicides polyvalents, tels que les phtalimides, 10 ou des fongicides spécifiques à actions préventive et curative (en particulier les imides cycliques) ou à seule action préventive (notamment les pyriméthanil, fludioxonil, fluazinam, ou mépanipyrim). On peut aussi citer en tant que fongicide de synthèse, les krésoxim-méthyl (méthyl (aE)-a-(méthoxyimino)-2-[(2- methylphenoxy)méthyl]benzeneacétate), Iprodione (3-(3,5-dichlorophényI)-N- isopropyl-2,4-dioxoimidazolidine-1-carboxamide), fenhexamide (N-(2,3-dichloro-4- hydroxyphény1)-1-méthyl cyclohexanecarboxamide), ou boscalid (3- pyridinecarboxam ide, 2-chloro-N-(4'chloro[1,1'biphény1]-2-y1)). Il existe par ailleurs un certain nombre d'agents biologiques antagonistes 20 des pathogènes du genre Botrytis, et pouvant être utilisés dans la lutte contre Botrytis cinerea. - les champignons Fusarium spp. et Penicillium claviforme empêchent l'installation de B. cinerea sur des feuilles de laitue - les spores de de Cladosporium herbarum et Penicillium sp. ont permis 25 le contrôle de B. cinerea sur tomates sous serres par pulvérisation d'une suspension des spores - Inoculé sur les débris de fleurs attachés au fruit, C. herbarum contrôle efficacement B. cinerea sur la fraise, en protégeant les fleurs dans les conditions de plein champ 30 - Sur la base d'une observation d'un effet antagoniste de bactéries vis-à- vis de B. cinerea sur les feuilles de chrysanthèmes et de betteraves, les antibiotiques produits par ces bactéries ont été étudiés pour leur effet inhibiteur sur la germination des spores de B. cinerea sur feuilles de betterave. 3025401 3 - Différentes espèces de Trichoderma spp. ont été étudiées pour le contrôle de B. cinerea sur haricot, vigne, fraise et diverses cultures sous abris. * - Les champignons Ulocladium atrum et Gliocladium roseum ont été 5 utilisés pour inhiber la germination des conidies et le développement de B. cinerea sur le cyclamen - La demanderesse a développé, en vue d'une mise sur le marché, le champignon Microdochium dimerum souche L13, qui présente une bonne efficacité pour protéger les plaies d'effeuillage et les feuilles de 10 plants de tomates contre les attaques de B. cirenea en cultures sous abris. - L'isolat 1-112 de la bactérie Pseudomonas chlororaphis et l'isolat IC1270 de la bactérie Enterobacter agglomerans (renommée Serratia plymuthica), tous deux producteurs de pyrrolnitrine sont également des 15 antagonistes de B. cinerea. - Un certain nombre de levures (dont Pichia et Rhodotorula) et de bactéries (dont Bacillus et Pseudomonas) ont également été signalées pour leur efficacité dans le contrôle de B. cinerea en traitement post-récolte. On peut citer notamment la souche de Bacillus subtilis QST 713, commercialisée par Bayer Crop Science sous le nom de Serenade® Max. Ces microorganismes sont des exemples de microorganismes antagonistes de Botrytis cinerea. Par « agent antagoniste d'un agent pathogène », on entend désigner un agent non délétère (en particulier non pathogène lorsque cet agent est un microorganisme) pour une plante, capable de limiter le développement dudit agent pathogène nuisible au développement de la plante. On peut déterminer aisément et rapidement si un agent est antagoniste 30 d'un agent pathogène en effectuant certaines expériences simples et rapides : - Antagonisme in vitro en mettant en présence ledit agent et ledit pathogène - Antagonisme in vivo, en appliquant ledit agent sur la plante cible du pathogène seul (pour vérifier qu'il n'est pas lui-même délétère pour la 35 plante) et en présence du pathogène (pour évaluer la capacité de contrôle de celui-ci). 3025401 4 Ces expériences sont parfaitement connues et maîtrisées par l'homme du métier et ne demandent pas d'effort particulier pour être mises en oeuvre. Les modes d'actions des agents biologiques antagonistes du Botrytis sont 5 très variés (d'après Ajouz, 2009, Thèse de doctorat, Estimation du potentiel de résistance de Botrytis cinerea à des biofongicides.). Antibiose, c'est-à-dire la production de métabolites secondaires toxiques pour l'agent pathogène cible ; qui peuvent inhiber la germination, la croissance mycélienne et/ou la sporulation des agents 10 pathogènes. On a pu caractériser de telles substances responsables de l'antibiose chez des souches appartenant à diverses espèces d'agents de lutte biologique (notamment Bacillus subtilis, Serratia plymuthica, Pseudomonas fluorescens). Les espèces de Pseudomonas par exemple produisent de nombreuses substances antifongiques: 15 pyoverdine, pyoluteorine, pheazine, pyrrolnitrine, 2,4- diacetylphloroglucinol. L'antibiotique gramicidine S secrété par l'agent de protection biologique Brevibacillus brevis inhibe par exemple la germination et la croissance mycélienne de B. cinerea. La pyrrolnitrine (3-chloro-4-(2'-nitro-3'-chlorophenyI)-pyrrole) est un antibiotique à large 20 spectre d'action isolé pour la première fois dans les années soixante à partir de Pseudomonas pyrrocinia qui inhibe la croissance des champignons en bloquant le système respiratoire, et s'avère efficace pour lutter contre B. cinerea. 25 Hyperparasitisme : dans le cas de l'hyperparasitisme, l'antagoniste est un parasite qui reconnaît spécifiquement sa cible, pénètre dans ces cellules et entraîne sa destruction via la colonisation de ses organes. L'observation en microscopie de l'interaction entre Gliocladium roseum et B. cinerea sur tiges de framboisiers a montré que la protection résultait de la colonisation des conidies et des hyphes de l'agent pathogène par l'antagoniste. Ce mode d'action a aussi été décrit chez Gliocladium catenulatum. Enfin, Pythium periplocum s'est révélé être un mycoparasite de B. cinerea. - Compétition nutritive : B. cinerea est très sensible à l'absence de nutriments: il a, par exemple, besoin de nutriments d'origine extérieure 3025401 5 pour assurer la germination de ses spores. Certains microorganismes (bactéries, levures, champignons filamenteux) peuvent ainsi inhiber la germination des conidies de cet agent pathogène via la compétition pour des éléments nutritifs comme l'azote, le carbone, ou des macro- 5 ou microéléments présents dans le milieu. La réduction de la concentration en nutriments dans le milieu conduit généralement à un taux réduit de spores germées de l'agent pathogène et un ralentissement de la croissance mycélienne, réduisant ainsi le nombre d'infections et l'expansion des lésions. La compétition pour les 10 nutriments ou l'espace a été établie pour différentes levures appliquées sur pommes en traitements postrécoltes, comme par exemple Candida spp., Cryptococcus laurentii, Sporobolomyces roseus et Candida oleophila. Le champignon antagoniste Trichoderma harzianum souche T39 inhibe aussi la germination des conidies de B. cinerea en rentrant 15 en compétition pour les nutriments à des stades précoces de l'interaction. De même, plusieurs souches bactériennes et fongiques réduisent la germination des conidies de B. cinerea ce qui réduit la gravité des symptômes de la pourriture sur des feuilles détachées de tomate et de haricot. La bactérie Pseudomonas sp. peut, par exemple, 20 utiliser les acides aminés plus vite que les conidies de B. cinerea, empêchant ces dernières de germer. Interférence avec le pouvoir pathogène : les agents de protection biologique peuvent interférer avec les facteurs du pouvoir pathogène de 25 champignons en inhibant ou dégradant certaines enzymes hydrolytiques (cutinases, pectinases, etc.), ainsi qu'il a été observé chez T. harzianum T39. De même, la bactérie Bacillus circulans, réduit in vitro l'activité pectinolytique de B. cinerea et en conséquence son infection sur vigne. Certains microorganismes (comme Bacillus pumilus 30 et P. fluorescens) peuvent avoir un effet indirect sur la mise en place de la pathogénèse en modifiant par exemple le pH du milieu. Certains microorganismes dégradant l'acide oxalique, produit par B. cinerea lors de son interaction avec la plante, peuvent protéger le concombre, la tomate, la vigne et Arabidopsis thaliana contre des attaques de B. 35 cinerea. 3025401 6 - Modification des propriétés de surface des feuilles de la plante : certaines bactéries possèdent la capacité de changer les caractéristiques de surface des feuilles des plantes. Ceci a pour conséquence de gêner le processus d'attachement et de croissance 5 des agents pathogènes sur les feuilles. - Stimulation des défenses de la plante : La résistance induite chez la plante est un mode d'action de certains agents de protection biologique. La résistance peut être induite localement ou elle peut être systémique. 10 L'induction de résistance systémique chez la plante est décrite chez certains Trichoderma, chez Pythium oligandrum et chez des bactéries. Chez le haricot, Pseudomonas aeruginosa induit une résistance systémique contre B. cinerea. Trichoderma harzianum induit une résistance contre B. cinerea chez la tomate, la laitue, le poivron, le 15 haricot et le tabac. Différentes souches bactériennes ont aussi été caractérisées comme agents de la protection efficace contre B. cinerea dans des conditions in vitro (Acinetobacter lwoffii PTA-113 et PTA-152, Bacillus subtilis PTA-271, Pantoea aggiomerans PTA-AF1 et PTAAF2 et Pseudomonas fluorescens PTA-268 et PTA-CT2). Des cellules 20 mortes de certains antagonistes bactériens ou fongiques (T. harzianum par exemple), sont capables d'induire une résistance locale et la réduction de la pourriture grise sur le haricot vert, la tomate, le poivron et le tabac. 25 - Combinaison de mécanismes d'action : dans certains cas, on peut penser que le contrôle biologique est la résultante de plusieurs modes d'action combinés. Le cas le plus étudié concerne le champignon Trichoderma pour lequel différents modes d'action ont été mis en évidence pour une même souche antagoniste associant par exemple 30 hyperparasitisme et antibiose. Trichoderma harzianum T39 combine à la fois la compétition nutritive, l'interférence avec le pouvoir pathogène de B. cinerea et l'induction de résistance de la plante. Le mode d'action de la levure Candida saitoana impliquée dans la protection post-récolte de fruits combine à la fois compétition nutritive et pour l'espace, 35 hyperparasitisme et induction de résistance. Brevibacillus brevis utilise à la fois un antibiotique, la gramicidine S et un biosurfactant comme 3025401 7 mode d'action contre B. cinerea. Dans le cas de la combinaison de modes d'action chez un agent de lutte biologique, le rôle et l'importance précis de chacun des modes d'action dans le contrôle de la maladie n'est souvent pas connu. 5 Tous les micro-organismes mentionnés ci-dessus sont donc des agents antagonistes d'un pathogène de genre Botrytis, utilisables dans le cadre des méthode et composition décrites ci-après. 10 Un nombre élevé d'agents de protection biologique a ainsi été identifié en laboratoire, mais peu de ces agents ont été mis sur le marché. En France, Serenade®, contenant la souche QST 713 de Bacillus subtilis, est homologué pour utilisation contre B. cinerea sur la vigne (catalogue ACTA, 2008; http://e-phy.agriculture.gouv.fr), ainsi que BOTECTOR®, commercialisé par 15 De Sangosse, (Aureobasidium pullulans souche DSM 14940 et Aureobasidium pullulans souche DSM 14941) qui agit par compétition pour espace et compétition pour les nutriments (http://e-phy.agriculture.gouv.fr/spe/2120082-10024466.htm). D'autres produits sont en cours d'homologation, notamment la souche L13 de Microdochium dimerum (CNCM 1-3141) développée par la société Agrauxine 20 sous la dénomination AntiBot®. Cette souche a notamment été décrite par Nicot et al (Potential for including Microdochium dimerum, a biocontrol agent against Botrytis cinerea, into an integrated protection scheme of greenhouse tomatoes. In: Tomate sous abri. Protection intégrée. Agriculture biologique (p. 19-23). Presented at Colloque 25 International, Avignon, FRA (2003-09-17 - 2003-09-19). Paris, FRA : CTIFL), Bardin et al, (Compatibility between biopesticides used to control grey mould, powdery mildew and whitefly on tomato. Biological Control. 2008, 46 (3) : 476-483), Decognet et Nicot (1999. Effects of fungicides on a Fusarium sp. biological control agent of Botrytis cinerea stem infections in the perspective of an integrated 30 management of fungal diseases in greenhouse tomatoes. 1999; In: J.C. Van Lenteren (Editeur), IOBC, International Organisation for Biological and Integrated Control - West Palearctic Regional Section, Dijon (FRA), Integrated control in glasshouses (p. 49-52). Bulletin OILB SROP, 22 (1). Dijon, FRA : OILB/SROP), Nicot et al (Combined effectif microclimate and dose of application on the efficacy 35 of biocontrol agents for the protection of pruning wounds on tomatoes against Botrytis cinerea. In: Influence of A-biotic and biotic factors on biocontrol agents (p. 3025401 8 73-76). Bulletin OILB SROP, 25 (10). Presented at 7. IOBC Working Group Meeting, Kusadasi, TUR (2002-05-22 - 2002-05-25)). Elle a également été citée dans WO 2013/110591. 5 L'invention est basée sur la mise en évidence, par la Demanderesse, d'un effet de synergie lorsque l'on utilise, en combinaison, deux agents antagonistes d'un pathogène de genre Botrytis, l'un de ces deux agents étant un Microdochium, en particulier un Microdochium dimerum, et notamment la souche L13. Cet effet est notamment observé lorsque l'on utilise l'un et/ou l'autre agent à une quantité 10 inférieure à la quantité optimale d'utilisation (ou dose d'efficacité maximale) ou la quantité recommandée dans les homologations et autorisations de mise sur le marché. On dit ainsi que les agents sont utilisés à une dose sub-optimale. L'efficacité maximale d'un agent anti Botrytis est obtenue lorsque l'on n'observe pas une amélioration d'efficacité suite à une augmentation de la dose 15 du produit appliqué. La dose d'efficacité maximale est ainsi définie comme étant la dose minimale permettant d'observer l'efficacité maximale. Lorsque l'on observe une diminution de 80% des symptômes de la maladie, on dit que l'agent présente une efficacité de 80%. Ainsi, un agent présentant une efficacité de 100 % est tel que l'on n'observe pas de symptômes, alors qu'il n'y a 20 pas de différence entre les symptômes observés sur les plantes témoins et les plantes traitées par l'agent lorsque l'efficacité de celui-ci est de 0 %. L'efficacité, sur plants entiers de tomate, peut être évaluée en suivant une grille qualitative et quantitative quant à la présence de symptômes du botrytis. La grille de notation qualitative est composé de 2 niveaux : plants atteints (tige 25 principale nécrosée) et plants non atteints par le pathogène (tige principale indemne). La grille de notation quantitative permet de mesurer la longueur totale des nécroses sur la tige principale provoqués par le pathogène. Un suivi de la progression de développement du pathogène sur plusieurs jours permet de réaliser une analyse du type AUDPC (area under the disease progress curve) qui 30 est également couramment utilisée pour les évaluations d'efficacité des agents fongicides. Les données issues de ces notations sont ensuite analysées à l'aide d'un test statistique adapté afin de déterminer si les modalités de traitement ont une influence sur la présence, absence ou la cinétique de progression des symptômes comparées à la modalité témoin. 35 Une telle méthode de mesure de l'efficacité et des symptômes liés au botrytis est décrite notamment dans Bardin, Fargues, et Nicot (2008. Compatibility 3025401 9 between biopesticides used to control grey mould, powdery mildew and whitefly on tomato. Biological Control 46: 476-483). Des méthodes équivalentes peuvent aisément être mises en oeuvre pour déterminer l'efficacité d'un agent anti-botrytis sur d'autres plantes. 5 Une dose sub-optimale d'un agent anti botrytis est une dose pour laquelle on observe une efficacité inférieure à l'efficacité maximale, de façon plus préférée inférieure à 65%, de façon plus préférée, inférieure à 55 % de façon plus préférée inférieure à 50 % de façon plus préférée inférieure à 45 % de façon plus préférée 10 inférieure à 50 % de l'efficacité maximale. Cette dose sub-optimale est donc inférieure à la dose d'efficacité maximale. Ainsi, et comme décrit dans les exemples, la Demanderesse a démontré que l'utilisation, conjointe des deux composants, et notamment à des doses sub- 15 optimales, peut permettre d'obtenir un effet de synergie. En conséquence, il est préféré que les quantités relatives de ces deux composants soient telles qu'elles permettent l'obtention d'un effet supérieur à l'effet additif, en particulier mesuré par la méthode de Colby. 20 La méthode décrite dans la présente demande est donc une méthode de lutte contre ou de prévention contre l'infection par un agent pathogène du genre Botrytis chez une plante, comprenant une étape d'administration, à ladite plante, d'au moins un premier composant constitué d'un microorganisme antagoniste dudit pathogène, ledit microorganisme étant un champignon filamenteux du genre 25 Microdochium, et d'un second composant actif (antagoniste) contre ledit pathogène du genre Botrytis. Le premier composant est évidemment différent du second composant. Les deux composants sont appliqués en combinaison à une dose « efficace », c'est-à-dire à une dose pour laquelle on observe une efficacité 30 maximale de la combinaison. Dans un mode de réalisation préféré, le premier composant (microorganisme du genre Microdochium) est utilisé, dans ladite méthode, à une dose sub-optimale. Dans un mode de réalisation préféré, le second composant actif contre le 35 pathogène de genre Botrytis est appliqué à une dose sub-optimale. 3025401 10 Dans un mode de réalisation préféré, les deux composants sont appliqués à une dose sub-optimale. Dans ces modes de réalisation, il est clair que la dose sub-optimale pour chaque agent doit être déterminée par rapport à la dose efficace pour cet agent 5 utilisé seul. Dans un mode de réalisation particulier, aucun autre composant ayant un effet contre l'agent pathogène du genre Botrytis n'est apporté à la plante dans la mise en oeuvre de la méthode. 10 Dans un mode de réalisation particulier, ladite méthode est une « méthode biologique ». Par « méthode biologique », on entend désigner une méthode dans laquelle des éléments naturels (en particulier des substances naturelles ou microorganismes) sont appliqués sur des cultures, sans que des produits chimiques ou de synthèse (notamment des petites molécules organiques) ne 15 soient appliquées. Par produits chimiques ou de synthèse, on entend notamment désigner tout agent antibiotique ou fongicide, produit par synthèse chimique ou par purification à partir d'un microorganisme, purifié, et formulé pour application sur la plante. Dans ce mode de réalisation, il apparaît donc que le second composant n'est donc pas un antifongique de synthèse antagoniste du pathogène du genre 20 Botrytis et est alors préférentiellement un autre microorganisme antagoniste du pathogène du genre Botrytis. La méthode selon l'invention est particulièrement adaptée lorsque ledit pathogène est Botrytis cinerea, mais peut aussi être mise en oeuvre contre d'autres 25 pathogènes du genre Botrytis, tels que mentionnés ci-dessus. Ledit second composant peut être notamment choisi parmi les microorganismes antagonistes du Botrytis du genre Aureobasidium, Ulocladium, Gliocladium, Saccharomyces, Trichoderma (notamment T. harzanium T39) Bacillus 30 ou Candida. Ainsi, dans un mode de réalisation, le second composant est un champignon filamenteux. Dans un mode de réalisation, ledit second composant est un Aureobasidium pullulans. 35 Dans un mode de réalisation, ledit second composant est un Gliocladium catenulatum. 3025401 11 Dans un mode de réalisation, ledit second composant est un Ulocladium atrum. Dans un autre mode de réalisation, ledit second composant est une levure. 5 Dans un autre mode de réalisation, ledit second composant est une bactérie, préférentiellement du type Bacillus subtilis, et notamment la souche QST 713. Dans un autre mode de réalisation, ledit second composant n'est pas la souche QST 713 de Bacillus subtilis. Dans un autre mode de réalisation, ledit second composant est un 10 antifongique de synthèse. Dans un mode de réalisation particulier, cet antifongique de synthèse est le kresoxim-méthyl. Dans un mode de réalisation particulier, cet antifongique de synthèse est l'iprodione. 15 Dans un mode de réalisation particulier, cet antifongique de synthèse est le boscalid. Dans un mode de réalisation particulier, cet antifongique de synthèse est la fenhexam ide. Dans un mode de réalisation particulier, cet antifongique de synthèse est la 20 trifloxystrobine Dans un mode de réalisation préféré, ledit premier composant est un Microdochium dimerum, et notamment la souche L13 dont le développement réglementaire et la commercialisation sont effectués par la Demanderesse. 25 Ainsi que vu plus haut, et ainsi que démontré dans les exemples, la Demanderesse a démontré que l'utilisation, conjointe des deux composants peut permettre d'obtenir un effet de synergie. En conséquence, il est préféré que les quantités relatives de ces deux composants soient telles qu'elles permettant 30 l'obtention d'un effet supérieur à l'effet additif. Selon un mode de réalisation de la présente invention, l'effet obtenu est supérieur ou égal à 10 %, de préférence à 12, plus préférentiellement de supérieure ou égale à 15 % par rapport à l'effet additif attendu pour chacun des 35 deux composants, utilisé seul, ainsi que calculé selon la méthode décrite dans les exemples. Ceci signifie que le facteur de synergie est supérieur ou égale à 1,1, de 3025401 12 préférence supérieur ou égale à 1,12, de façon plus préféré supérieur ou égale à 1,15. Les exemples montrent que l'on peut observer des facteurs de synergie supérieurs ou égaux à 1,5, 2, 5 ou plus. 5 Il est aisé de déterminer ces quantités relatives, par des méthodes aisément utilisables et mises en oeuvre par l'homme du métier. Ainsi, il est possible de préparer quelques préparations de chacun des deux composants (par exemple, quatre ou cinq préparations en faisant varier la quantité de 1 à 10 (la valeur 10 10 étant la valeur usuelle pour laquelle l'efficacité est observée, par exemple la dose du produit homologué, en utilisant le composant sous sa forme matière active pure ou dans sa formulation commerciale), et de tester indépendamment chacune des préparations pour son efficacité contre Botrytis. On peut ensuite tester les mélanges des composants en faisant varier les 15 concentrations, et déterminer l'effet observé. On peut ainsi détecter l'effet de synergie, notamment en se basant sur les méthodes décrites dans les exemples. Ainsi, dans un mode de réalisation usuel, les deux composants sont appliqués chacun à une dose inférieure (en particulier comprise entre 1/10 et 1/1) 20 à la dose du produit homologuée ou généralement décrite comme présentant la meilleure efficacité (c'est-à-dire pour laquelle on n'observe pas d'amélioration de l'efficacité si l'on augmente la dose), sous sa forme matière active pure ou sa formulation commerciale. Ainsi, pour les produits suivants, les doses efficaces ou homologuées sont 25 les suivantes : - Cantus®WG commercialisé par BASF : Boscalid (500 g/kg) (2-chloro-N(4'-chlorobiphényl-2-yl)nicotinamide), de la famille des carboxamides sous groupe de nicotinamid ; dose homologuée : 1,2 kg/ha. - Rovral Aqua flo® SC, commercialisé par BASF : Iprodione (500 g/1) (3- 30 (3,5-dichlorophény1)-Nisopropy1-2,4-dioxoimidazolidine-1-Carboxamide) de la famille chimique des dicarboximides, groupe des hydantdines ; dose homologuée : 2 1/ha - Teldor® WG, commercialisé par Bayer CropScience : Fenhexamid (50%) (2',3'-dichloro-4'-hydroxy-1-méthylcyclohexanecarboxanilide) de 35 la famille chimique des hydroxi-anilides ; dose homologuée : 1,5 kg/ha. 3025401 13 - Stroby® DF, commercialisé par BASF: krésoxim-méthyl (50%) (méthyl(E)-2-méthoxyimino-242-(o-tolyloxyméthyl)phényl]acétate) de la famille des Strobilurines ; dose homologuée 0,2 kg/ha. - Natchez® WG, commercialisé par Bayer CropScience : Trifloxystrobine 5 (50%) (méthyl(E)-méthoxyimino-{(E)-a41-(a,a,a-trifluoro-m- toly1)éthylidène-aminooxy]-o-tolyl}acétate) de la famille des oximinoacétates (strobilurines) ; dose homologuée : 0,125 kg/ha - Serenade® Max, commercialisé par Bayer CropScience : Bacillus subtils QST 713 (156.7 g/kg) ; dose homologuée 2 kg/ha 10 - Botector®, commercialisé par DE SANGOSSE : Aureobasidium pullulans (250 g/kg) ; dose homologuée 0,4 kg/ha Pour d'autres microorganismes, tels que les levures, la dose théorique serait de l'ordre de 2,5 kg/ha. Il s'agit notamment de la dose efficace pour une souche propriétaire de levure (S. cerevisiae) efficace sur la vigne. 15 Dans le cadre de la méthode ou de la composition décrites ici, on utilise préférentiellement des doses sub-optimales de chacun des composants. Ainsi, on utilise préférentiellement une dose de Microdochium dimerum inférieure ou égale à 50 % (soit 1/2) de la dose d'efficacité maximale (DEM) (qui est, 20 pour la souche L13, 2x1012 spores /ha ; soit 2,5 kg/ha d'une formulation contenant 8x1011 spores/kg), de préférence inférieure ou égale à 40 % (soit de la dose d'efficacité maximale, de préférence inférieure ou égale à 30 % (soit environ 1/3) de la dose d'efficacité maximale, de façon plus préférée inférieure ou égale à 20 % (soit 1/5) de la dose d'efficacité maximale, de façon encore plus préférée inférieure 25 ou égale à 10 % (soit 1/10) de la dose d'efficacité maximale voire inférieure ou égale à 1/12 de la dose d'efficacité maximale. Les exemples montrent ainsi que l'on peut utiliser le premier composant à une dose égale à 1/15 de la dose d'efficacité maximale, soit de l'ordre de 167 g/ha pour une formulation contenant 8x1011 spores/kg. 30 Pour le second composant (antagoniste du Botrytis), la dose sub-optimale que l'on peut utiliser dépend bien entendu de la nature de ce second composant. Ainsi, on peut utiliser les doses suivantes : 3025401 14 - Boscalid (500 g/kg) : inférieure ou égale à 1/10, de préférence 1/50, de préférence 1/100, de préférence 1/200, de préférence 1/500, voire 1/1000 de la dose homologuée (1,2 kg/ha). - Iprodione (500 g/1) : inférieure ou égale à 1/10, de préférence 1/50, de 5 préférence 1/100, de préférence 1/200, de préférence 1/500, voire 1/1000 de la dose homologuée (2 1/ha). - Fenhexamid (50%) : inférieure ou égale à 1/10, de préférence 1/50, de préférence 1/100, de préférence 1/200, de préférence 1/500, voire 1/1000 de la dose homologuée (1,5 kg/ha). 10 - Trifloxystrobine (50%) : inférieure ou égale à 1/2, de préférence 1/5, de préférence 1/10, de préférence 1/20, de préférence 1/50, voire 1/100 de la dose homologuée (0,125 kg/ha). - Krésoxim-méthyl (50%) : inférieure ou égale à 1/10, de préférence 1/50, de préférence 1/100, de préférence 1/200, de préférence 1/500, voire 15 1/1000 de la dose homologuée (0,2 kg/ha). - Bacillus subtilis QST 713 (156.7 g/kg) : on peut utiliser la dose homologuée (2kg/ha) ou une dose inférieure ou égale à 1/2, voir inférieure ou égale à 1/5 de la dose homologuée. - Saccharomyces cerevisiae (souche propriétaire, nommée 1202, 20 présentant une efficacité sur les atteintes de botrytis sur la vigne) (100%) : on peut utiliser la dose envisagée (2,5 kg/ha) ou une dose inférieure ou égale à 1/10, de préférence 1/50, de préférence 1/100, de préférence 1/200, de préférence 1/500, voire 1/1000 de la dose homologuée. 25 Dans un mode de réalisation, les deux composants sont appliqués simultanément, au sein de la même bouillie de traitement. Ainsi, l'opérateur préparera une composition destinée au traitement de la plante, en incorporant simultanément ou successivement au moins un microorganisme Microdochium et 30 un autre agent antagoniste d'un agent pathogène du type Botrytis avec un ou plusieurs excipients. Ces excipients sont connus dans l'art, et sont, en particulier, des poudres ou granules mouillables. Dans un autre mode de réalisation, les deux composants ne sont pas 35 appliqués simultanément, mais sont appliqués séparément (l'un après l'autre). Ces deux applications distinctes doivent toutefois être réalisées à bref délai, c'est-à-dire 3025401 15 dans un intervalle inférieur à 48 heures, de préférence, inférieur à 26 heures, de préférence inférieur à 24 heures, de préférence inférieur à 16h, de façon plus préférée inférieure à 12 heures. En effectuant ces applications distinctes, on peut permettre au premier composant appliqué de commencer son effet avant l'autre 5 composant. Bien entendu, le premier composant à être ajouté peut être le microorganisme Microdochium, et le second composant à être ajouté peut être le second composant listé ci-dessus (l'autre agent antagoniste du pathogène de type Botrytis). Dans un autre mode de réalisation, le premier composant à être ajouté est le second composant listé ci-dessus (l'autre angent antagoniste du pathogène 10 de type Botrytis) et le second composant à être ajouté est le microorganisme de type Microdochium. Dans un mode de réalisation préféré, les deux composants sont appliqués sur ladite plante pendant une période de risque de développement de Botrytis (que 15 ça soit une période de risque de contamination des plantes ou de risque de développement des symptômes après contamination). La période de risque peut être ainsi déterminée pour la vigne. Les contaminations par Botrytis ont lieu à trois périodes clés du 20 développement de la vigne, Fin floraison (stade A) : les spores ne peuvent pas pénétrer dans la baie, mais la contamination peut se faire par les plaies liées à la chute des capuchons floraux. Fermeture de la grappe (stade B) : les spores ne peuvent toujours pas 25 pénétrer dans les baies, mais elles peuvent être enfermées entre les grains de raisin et sur les rafles. Elles constituent un inoculum qui attend des conditions favorables pour se développer. Véraison (stade C) : A partir de la véraison, la réceptivité des baies à cette maladie est forte, la pellicule de la baie se fragilise et des sucres son synthétisés. 30 Les spores du botrytis qui germent pénètrent à l'intérieur de la baie provoquant des réactions de défense enzymatiques et la libération de laccases par le champignon. Une fois que les baies sont réceptives, elles peuvent être contaminées de deux façons : la première, par le mycélium déjà installé sur des débris végétaux, coincés entre deux baies ou enfermés à l'intérieur de la grappe. La seconde voie de 35 contamination des baies passe par les spores produites par le champignon, qui sont ensuite transportées dans la parcelle par la pluie et le vent. La production de 3025401 16 spores, et donc la contamination par cette seconde voie, s'effectue à une température optimale de 15 à 20 °C, en présence d'eau libre ou d'une humidité relative supérieure à 90 % pendant au moins 15 heures. La période de risque de développement de symptômes de botrytis commence donc à partir de la véraison. 5 La période de risque pour les cultures maraîchères et ornementales est déterminée par les conditions suivantes : Le botrytis apprécie les températures modérées, et présente un développement optimal entre 18 et 20°C, et notamment en présence d'humidité, pendant des périodes pluvieuses, dans une ambiance 10 humide sous serre ou sous châssis. Une mauvaise aération est également un facteur favorisant, par exemple, au sein de cultures en milieu confiné ou en cas de végétation dense. Dans un mode de réalisation préféré, les composants sont appliqués par 15 pulvérisation sur les parties aériennes des plantes. La bouillie de traitement peut être préparée de la façon suivante : Les deux composants, présentés sous forme de granulés dispersibles, des poudres mouillables ou des formulations liquides, sont versées directement, dans la cuve d'un pulvérisateur à demi remplie d'eau, le système d'agitation étant en 20 marche pour obtenir une bonne mise en suspension. Ensuite on complète par ajout d'eau dans la cuve en ajoutant ce qui est nécessaire à l'application, tout en maintenant l'agitation. La bouillie peut s'utiliser aux volumes/ha habituellement appliqués sur les cultures (100 à 1000 1/ha). 25 La méthode peut être mise en oeuvre sur toute plante susceptible d'être infectée par un Botrytis, et notamment Botrytis cinerea. Ainsi que vu plus haut, cet agent pathogène a un large spectre d'hôtes. La méthode est particulièrement adaptée pour les plantes cultivées, et notamment lorsque lesdites plantes sont 30 choisies dans le groupe constitué des tomate, laitue, fraise, melon, vigne (produisant raisin de table ou raisin de vinification), et arbres fruitiers produisant des fruits à noyau (cerises, pêches abricots, brugnons et nectarines, prunes). Elle peut aussi être appliquée en horticulture. 35 L'invention se rapporte également à une composition phytopharmaceutique contenant, en tant qu'agents actifs, un premier composant constitué d'un 3025401 17 microorganisme antagoniste d'un pathogène du genre Botrytis, ledit microorganisme étant un champignon filamenteux du genre Microdochium, et un second composant actif contre ledit pathogène, les deux agents actifs étant différents. 5 Dans un mode de réalisation préféré, le premier composant, le second composant ou les deux composants sont présents, dans cette composition, à une dose ou concentration sub-optimale. De préférence cette composition ne contient que ces deux composants en tant qu'agents actifs, c'est-à-dire qu'il n'y a pas d'autres agents actifs contre 10 Botrytis dans la composition. Dans un autre mode de réalisation, cette composition peut contenir d'autres agents actifs contre Botrytis. Dans un mode de réalisation particulier toutefois, cette composition ne contient aucune molécule de synthèse (c'est-à-dire synthétisée per se en 15 laboratoire, ou isolée en laboratoire à partir d'un agent microbien). La composition est alors dite « biologique » ou « de biocontrôle ». Elle peut ainsi contenir un ou plusieurs autres agents de biocontrôle tels que décrits plus haut, et notamment un ou plusieurs autres microorganismes (levure, champignon filamenteux, ou bactérie). 20 Cette composition peut toutefois contenir des adjuvants ou excipients (en particulier des poudres ou granules mouillables). Cette composition est destinée à la mise en oeuvre de la méthode décrite ci-dessus. Elle est donc préférentiellement adaptée à l'administration par pulvérisation sur les parties aériennes des plantes. 25 Par ailleurs, les quantités du premier composant (microorganisme antagoniste d'un pathogène du genre Botrytis, ledit microorganisme étant un champignon filamenteux du genre Microdochium, en particulier un Microdochium dimerum), et du second composant actif contre ledit pathogène sont choisies pour permettre un effet supérieur à l'effet additif. Les quantités relatives de chaque 30 agent permettent ainsi d'obtenir une synergie d'efficacité. On a vu plus haut comment déterminer ces quantités relatives, ainsi que les quantités à utiliser, dans cette composition. Elles sont également choisies de telle sorte que l'une ou l'autre ou les deux sont inférieures aux quantités que l'on utiliserait pour les agents seuls. On a listé plus haut différents agents antagonistes d'un pathogène du genre 35 Botrytis utilisables dans cette composition, même si l'on préfère qu'il soit un antifongique de synthèse, une bactérie (notamment Bacillus subtilis) ou une levure. 3025401 18 Dans cette composition, ledit Microdochium et ledit second agent peuvent être mélangés dans un même container ou placés dans deux containers séparés, le mélange étant effectué lors de l'administration (pulvérisation conjointe des deux composants). 5 On a également décrit plus haut le procédé de fabrication d'une telle composition, qui comprend l'incorporation simultanée ou successive d'au moins un Microdochium et d'un autre agent antagoniste d'un agent pathogène du type Botrytis avec un ou plusieurs excipients. 10 Les exemples montrent donc bien que l'on peut utiliser un microorganisme du genre Microdochium, antagoniste d'un pathogène du genre Botrytis, et en particulier un Microdochium dimerum pour restreindre les doses d'un autre agent antagoniste de ce pathogène, et/ou préparer une composition destinée à la lutte contre, ou au traitement du Botrytis, et/ou à potentialiser l'effet de cet autre agent 15 antagoniste de ce pathogène, notamment en cas d'utilisation à des doses suboptimale. Cette utilisation peut être effectuée dans le cadre d'une méthode de traitement d'une plante par ledit autre agent (ajout de Microdochium dimerum et diminution de la dose de cet autre agent, en maintenant l'activité observée avec la dose de cet autre agent lorsqu'il est utilisé seul), ou dans le cadre d'une 20 préparation d'une composition phytopharmaceutique (diminution de la quantité de cet autre agent dans la composition, dans le but de traiter le même nombre de plantes ou la même surface). On envisage donc l'utilisation d'un microorganisme du genre Microdochium en combinaison avec un autre composé antagoniste d'un agent pathogène du 25 genre Botrytis pour augmenter l'efficacité de lutte ou de traitement contre ledit agent pathogène du genre Botrytis. DESCRIPTION DES FIGURES 30 Figure 1 : La Figure 1 montre des exemples de synergie entre Microdochium dimerum L13 et autres pesticides pour le contrôle de Botrytis cinerea. Colonne 1 : produit antagoniste utilisé ; colonne 2 : Matière active ; colonne 3 : Dose homologuée (dose d'efficacité maximale) ; colonne 4 : Efficacité mesurée du pesticide (dose sub optimale appliquée) ; colonne 5 : Efficacité mesurée de 35 Microdochium dimerum L13 (dose sub-optimale appliquée) ; colonne 6 : Efficacité attendue du mélange aux doses sub-optimales (formule de Colby) ; colonne 7 : 3025401 19 Efficacité mesurée du mélange aux doses sub-optimales ; colonne 8 : Facteur de synergie (SF) Figure 2 : La Figure 2 exemplifie l'effet de synergie observé. A. Témoin de contrôle non traité ; B. M. dimerum L13 (1/15 DEM) ; C. Cantus® (Boscalid) (1/1000 DEM) ; 5 D. M. dimerum L13 (1/15 DEM) et Cantus® (1/1000 DEM). Figure 3 : La Figure 3 exemplifie l'effet de synergie observé. A. Témoin de contrôle non traité ; B. M. dimerum L13 (1/15 DEM) ; C. Rovral Aqua flo® (Iprodione) (1/1000 DEM) ; D. M. dimerum L13 (1/15 DEM) et Rovral Aqua flo® (1/1000 DEM). 10 Figure 4 : La Figure 4 exemplifie l'effet de synergie observé. A. Témoin de contrôle non traité ; B. M. dimerum L13 (1/15 DEM) ; C. Stroby® (krésoxim-méthyl) (1/1000 DEM) ; D. M. dimerum L13 (1/15 DEM) et Stroby® (1/1000 DEM). Figure 5 : La Figure 5 exemplifie l'effet de synergie observé. A. Témoin de contrôle non traité ; B. M. dimerum L13 (1/15 DEM) ; C. Teldor® (Fenhexamid) (1/1000 15 DEM) ; D. M. dimerum L13 (1/15 DEM) et Teldor® (1/1000 DEM). Figure 6 : La Figure 6 exemplifie l'effet de synergie observé. A. Témoin de contrôle non traité ; B. M. dimerum L13 (1/15 DEM) ; C. S. cerevisiae (souche propriétaire 12012) (2,5 kg/ha) ; D. M. dimerum L13 (1/15 DEM) et S. cerevisiae (2,5 kg/ha). 20 EXEMPLES Modes opératoires et principes Définition Synergie : Efficacité inattendue, d'une association de substances actives, supérieure à la somme des activités des substances actives appliquées 25 séparément, et ceci clairement différencié d'un effet d'additivité qui est défini comme le niveau attendu d'efficacité de l'association des substances actives. Méthode de démonstration de l'existence d'une synergie entre deux substances actives ou produits. 30 La méthode mathématique retenue pour identifier les synergies d'efficacité de deux produits phytopharmaceutiques utilisés ensemble est dérivée de la formule de Colby (Gowing, 1960 (Comments on tests of herbicide mixtures, Weeds 8:379-391); Colby, 1967 (Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide combinations. Weeds 15 (1967), pp. 20-22) ; Soller et Wedemeir, 2012 35 (Prediction of synergistic multi-compound mixtures - A generalized Colby approach, Crop Protection, Vol 42, 2012, 180-185). 3025401 20 Selon cette méthode, les efficacités de produits phytopharmaceutiques appliqués séparément sont utilisées pour calculer l'efficacité attendue des produits utilisés en combinaison. 5 L'efficacité attendue d'une combinaison de deux produits est calculée de la façon suivante : P1 et P2 sont les efficacités observées de deux produits à une certaine dose d'application (en %), l'efficacité étant la réduction de symptômes provoqués par un pathogène par rapport à un témoin non traité, l'efficacité attendue E de la 10 combinaison des deux produits, en absence d'interaction entre eux, est donnée par la formule Eattendue = P1 + P2 Où P1 correspond au niveau d'efficacité de protection du produit 1 évalué individuellement et P2 correspond au niveau d'efficacité de protection du produit 2 15 évalué individuellement. Selon cette méthode, l'efficacité attendue d'une combinaison de deux produits ne correspond pas à la simple somme des efficacités individuelles, mais à une valeur inférieure. Le calcul de Colby repose sur la notion qu'une simple addition néglige la possibilité qu'une certaine proportion du pathogène soit 20 contrôlée de façon simultanée par les deux produits du mélange. Ce problème est résolu par la soustraction P1P2/100. Eattendue Où SF est le Facteur de Synergie ; Emesurée est l'efficacité mesurée de l'association de substances actives et Eattendue est l'efficacité attendue de l'association. 30 Le Facteur de Synergie SF est interprété de la façon suivante : Un ratio SF supérieur ou inférieur à 1 indique une déviation de l'hypothèse d'action indépendante des produits, ce qui démontre que biologiquement les deux produits agissent ensemble. Si SF>1 l'interaction est synergique, si SF 1 : Présence de Synergie 5 SF=1 : Présence d'Additivité SF REVENDICATIONS1. Méthode de lutte contre ou de prévention contre l'infection par un agent pathogène du genre Botrytis chez une plante, comprenant une étape d'administration, à ladite plante, d'au moins un premier composant constitué d'un microorganisme antagoniste dudit pathogène, ledit microorganisme étant un champignon filamenteux du genre Microdochium, et d'un second composant actif contre ledit pathogène du genre Botrytis, caractérisée en ce qu'au moins l'un des deux composants est appliqué à une dose suboptimale. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit pathogène est Botrytis cinerea. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit second composant est choisi dans le groupe constitué des levures, antifongiques de synthèse, bactéries, et des autres microorganismes de biocontrôle antagonistes dudit pathogène du genre Botrytis. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit second composant est une levure, notamment de type Candida albicans ou Saccharomyces cerevisiae. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit second composant est une bactérie de type Bacillus subtilis. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit second composant est un antifongique de synthèse, choisi dans le groupe constitué des kresoxim-méthyl, iprodione, boscalid, fenhexamide et trifloxystrobine. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en qu'il s'agit d'une méthode biologique, dans laquelle aucun autre agent actif de synthèse contre Botrytis n'est apporté à la plante. 10 2. 15 3. 204. 5. 25 6. 30 7. 35 3025401 24 8. 5 9. 10. 11. 12. 13. 14. 30 15. 35 Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les deux composants sont appliqués en quantités relatives permettant l'obtention d'un effet supérieur à l'effet additif. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les deux composants sont appliqués chacun à une dose sub-optimale . Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les deux composants sont appliqués simultanément, au sein de la même bouillie de traitement. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les deux composants sont appliqués l'un après l'autre, dans un intervalle inférieur à 48 heures. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que les deux composants sont appliqués sur ladite plante pendant une période de risque de développement de Botrytis. Méthode selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que les composants sont appliqués par pulvérisation sur les parties aériennes des plantes. Méthode selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites plantes sont choisies dans le groupe constitué des tomate, laitue, fraise, melon, vigne (produisant raisin de table ou raisin de vinification), et arbres fruitiers produisant des fruits à noyau (cerises, pêches abricots, brugnons et nectarines, prunes). Composition phytopharmaceutique contenant, en tant qu'agents actifs, un premier composant constitué d'un microorganisme antagoniste dudit pathogène, ledit microorganisme étant un champignon filamenteux du genre Microdochium, et un second composant actif contre ledit pathogène du genre Botrytis, dans laquelle les quantités des deux composants sont choisies pour permettre un effet supérieur à l'effet additif. 16. Compositions selon la revendication 15 , caractérisée en ce que ledit second composant est choisi dans le groupe constitué des levures, antifongiques de 3025401 25 synthèse, bactéries, et des autres microorganismes de biocontrôle antagonistes dudit pathogène du genre Botrytis. 17. Composition selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que ledit 5 premier composant et ledit second composant sont mélangés dans un même container ou placés dans deux containers séparés. 18. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisée en ce qu'elle contient également des excipients tels que des 10 poudres ou granules mouillables. 19. Procédé de fabrication d'une composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 18 comprenant l'incorporation simultanément ou successivement d'au moins un premier composant constitué d'un 15 microorganisme antagoniste dudit pathogène, ledit microorganisme étant un champignon filamenteux du genre Microdochium, et d'un second composant actif contre ledit pathogène du genre Botrytis. 20. Utilisation d'un microorganisme du genre Microdochium pour diminuer la 20 dose d'un composé antagoniste d'un agent pathogène du genre Botrytis. 21. Utilisation d'un microorganisme du genre Microdochium en combinaison avec un autre composé antagoniste d'un agent pathogène du genre Botrytis pour augmenter l'efficacité de lutte ou de traitement contre ledit agent 25 pathogène du genre Botrytis.