Brevet FR3025516A1 — publié le 20160311

LIGAND POTENTIALISANT DE LA BIOACTIVITE DE LA FSH DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à des anticorps dirigés contre l'hormone folliculo-stimulante (FSH) capables de potentialiser la bioactivité de la FSH mais pas celle de l'hormone lutéinisante (LH). La présente invention trouve ses applications principalement en médecine vétérinaire, pour induire l'ovulation chez un mammifère femelle. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Les gonadotrophines (ou gonadotropines) sont des hormones glycoprotéiques complexes jouant un rôle central dans la régulation de la reproduction chez les vertébrés en agissant sur les fonctions des gonades (ovaires et testicules). Deux de ces hormones sont sécrétées chez tous les vertébrés : l'hormone lutéinisante (LH) et l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Chez deux groupes de mammifères, équidés et primates, il existe en outre une gonadotrophine chorionique (CG) sécrétée par le placenta : la choriogonadotropine humaine (hCG) et la choriogonadotropine équine (eCG) qui agissent toutes deux via des récepteurs LH. L'hormone lutéinisante (LH) est produite par les cellules gonadotropes du lobe antérieur de l'hypophyse sous stimulation de la GnRH, elle-même produite par l'hypothalamus. La LH stimule la production de testostérone chez les mâles, tandis qu'elle intervient dans les modifications du cycle ovarien chez les femelles où elle est responsable de la croissance folliculaire terminale et de l'ovulation puis de la transformation du follicule ovulatoire rompu en corps jaune. Pendant la phase lutéale du cycle menstruel, la LH stimule la sécrétion de progestérone par le corps jaune, indispensable au développement précoce et à l'implantation de l'embryon. La LH est constituée d'une sous-unité a commune à toutes les hormones glycoprotéiques d'une même espèce (comme la FSH, la CG et 3025516 2 l'hormone thyréostimulante, la TSH) et d'une sous-unité [3 responsable de la spécificité d'activité de l'hormone ; activité qui n'existe que si les deux sous-unités sont associées de manière non covalente sous-forme d'un dimère. L'hormone folliculo-stimulante (ou FSH) est produite par l'anté-hypophyse 5 sous stimulation de la GnRH produite par l'hypothalamus. Chez les mâles, elle stimule les cellules de Sertoli indispensables à la spermatogénèse. Chez les femelles, elle est responsable du recrutement des follicules primordiaux, immatures, de leur croissance et de leur différentiation en follicules pré-ovulatoires en stimulant les récepteurs FSH des cellules de la granulosa. La FSH 10 est constituée de deux sous-unités a et [3, et a une structure semblable à celle de la LH. Seul le dimère est capable de stimuler les récepteurs FSH. Chez les femelles, les taux de LH et de FSH sont cycliques : très faibles en période de repos sexuel ou en dehors de la période ovulatoire, avec un pic de sécrétion en période préovulatoire. 15 Les gonadotrophines sont utilisées en médecine vétérinaire et humaine, pour induire l'ovulation chez les mammifères femelles. Bien qu'efficaces, ces traitements présentent un risque sanitaire du fait de l'utilisation d'hormones extraites à partir de fluides biologiques (sang, urine) ou de tissus (hypophyses), particulièrement dans le domaine vétérinaire. C'est le cas de la chorionic 20 gonadotropine équine (eCG) extraite à partir de sang de juments gravides, et de la LH et FSH porcines extraites à partir d'hypophyses de porc. Dans le domaine vétérinaire, on utilise également une hCG extraite à partir d'urine de femmes enceintes, le Chorulon® (Laboratoire MSD). Dans le domaine de la clinique humaine, et particulièrement de la 25 Procréation Médicalement Assistée (ou PMA), on utilise des hormones extraites à partir d'urine de femmes ménopausées telles que Fostimon® (Laboratoire Genévrier) qui est une FSH purifiée et Menopur® (Laboratoire Ferring Pharmaceuticals) qui est une hMG (human menoposal gonadotropin), mélange de FSH et de LH et la Gonadotropine Chorionique Endo5000® qui est une hCG 30 purifiée (Laboratoire Schering-Plough). On utilise également des FSH humaines recombinantes, telles que Gonal-F® (Laboratoire Merck Serono) et Puregon® (Laboratoire Merck Shering-Plough); des hCG et LH recombinantes telle que Ovidrel® et Luveris® (Laboratoire Merck Serono). 3025516 3 En outre l'usage répété de ces hormones induit le plus souvent une réaction immunitaire qui vient neutraliser l'effet des hormones conduisant ainsi à une baisse d'efficacité thérapeutique. Cependant, il a également été mis en évidence dans quelques cas que la réaction immunitaire pouvait produire des anticorps 5 capables de potentialiser l'activité de l'hormone lorsqu'elle était co-administrée (Brevet EP 1518863) [1]. Depuis, il a également été mis en évidence trois anticorps monoclonaux anti-LH capables de potentialiser son action ainsi que celle de la FSH pour deux d'entre eux (Demande Internationale WO 2012/066519) [2]. 10 Description de l'invention Les Inventeurs ont maintenant obtenu un anticorps monoclonal produit contre la FSH ovine (oFSH). Cet anticorps est capable de potentialiser son action ainsi que celle de la FSH humaine recombinante Gonal-F®, de la 15 choriogonadotropine équine (eCG) et humaine (hCG) Chorulon® et Endo 5000®. Cet anticorps monoclonal est dénommé A8. L'hybridome qui a produit l'anticorps A8 a été déposé conformément au Traité de Budapest, le 6/12/2013 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 2 0 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM 1-4828. Les séquences nucléotidiques des régions variables des chaines lourdes et légères de l'anticorps A8 ont été déterminées, les séquences peptidiques correspondantes déduites, et sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Anticorps monoclonal A8 Chaîne lourde (VH) Séquence GAGGTCCAACTGCAGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCT GGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTT TCAGTGACTTTGGAACGCACTGGATTCGTCAGGCTCCAGAGAA GGGACTGGAGTGGGTCGCATATATTAGTAGTGGCAGTAGTACC AGGTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCA GAGACGATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCT AAGGTCTGAAGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGATCTTATG ATGGTTACCACGTTCCCTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGAC TCTGGTCACTGTCTCTGCAG nucléotidique (SEQ ID NO : 1) Séquence EVQLQESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDFGTHWIRQAPEKG LEVVVAYISSGSSTRYYADTVKGRFTISRDDPKNTLFLQMTSLRSED TAMYYCARSYDGYHVPSFAYWGQGTLVTVSA peptidique 3025516 4 (SEQ ID NO : 2) Chaîne légère (VL) Séquence GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGTCTGTCAGTCT TGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTG TACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAA CCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAGTTTCCAACC GATTTTCTGGGATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTTCATCAGG GACAGACTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGAT CTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCAC ATTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA nucléotidique (SEQ ID NO : 3) Séquence DVLMTQTPLSLSVSLGDQASISCRSSQN IVHSNGNTYLEWYLQKP GQSPKLLIYRVSNRFSGIPDRFSGSSSGTDFTLKISRVEAEDLGVY YCFQGSHVPLTFGAGTKLELK peptidique (SEQ ID NO : 4) Les séquences codant pour les CDRs (régions déterminant la complémentarité) ont été déterminées à partir des séquences des régions variables des chaînes lourdes (VH-CDR) et légères (VL-CDR) des anticorps A8 ci-dessus. Les séquences peptidiques correspondantes ont été déduites, et sont 5 présentées respectivement dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Anticorps monoclonal A8 VH-CDR1 (SEQ ID NO : 5) GFTFSDFG VH-CDR2 (SEQ ID NO : 6) ISSGSSTR VH-CDR3 (SEQ ID NO : 7) ARSYDGYHVPSFAY VL-CDR1 (SEQ ID NO : 8) QNIVHSNGNTY VL-CDR2 RVS VL-CDR3 (SEQ ID NO : 9) FQGSHVPLT La présente invention a pour objet un ligand de l'hormone folliculostimulante (FSH) potentialisant la bioactivité de la FSH et de la gonadotropine chorionique (CG) mais pas celle de l'hormone lutéinisante (LH), caractérisé en ce 10 que : le domaine variable de la chaine lourde contient les CDRs suivants : - VH-CDR1, défini par la séquence GFTFSDFG (SEQ ID NO : 5) ; - VH-CDR2, défini par la séquence ISSGSSTR (SEQ ID NO : 6) ; - VH-CDR3, défini par la séquence ARSYDGYHVPSFAY (SEQ ID NO : 7) ; et 15 le domaine variable de la chaine légère contient les CDRs suivants : - VL-CDR1, défini par la séquence QNIVHSNGNTY (SEQ ID NO : 8) ; - VL-CDR2, défini par la séquence RVS ; - VL-CDR3, défini par la séquence FQGSHVPLT (SEQ ID NO : 9). 3025516 5 On entend par « CDR » au sens de la présente invention, les trois régions hypervariables des régions variables des chaînes lourdes et légères d'un anticorps qui constituent les éléments du paratope et permettent de déterminer la complémentarité de l'anticorps avec l'épitope de l'antigène. Ces trois régions 5 hypervariables sont encadrées par quatre régions constantes qui constituent la « charpente » (FR ou framework regions) et donne une configuration stable au domaine variable. Un ligand selon la présente invention est par exemple : - l'anticorps monoclonal A8 produit par l'hybridome CNCM 1-4828 10 - un fragment Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv ou scFv, un nanobody de l'anticorps ci-dessus. De préférence, il s'agit d'un fragment scFv ; - une forme bi-, tri- ou tétravalente (diabodies, triabodies, tétrabodies) de deux, trois ou quatre fragments de scFv, respectivement ; - un anticorps recombinant comprenant le paratope de l'anticorps ci-dessus et 15 dont les régions constantes ont été modifiées de sorte à minimiser l'immunogénicité vis-à-vis de l'animal ou de l'homme auquel il est destiné. Par exemple, il s'agit d'un anticorps chimérique (humanisé, ovinisé, caprinisé, bovinisé, porcinisé etc...) ou entièrement humanisé, ovinisé, caprinisé, bovinisé, porcinisé. 2 0 A titre d'exemple non limitatif, la séquence nucléotidique du scFv dérivé de l'anticorps A8 a été déterminée, la séquence peptidique correspondante déduite, et sont présentées dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 scFv A8 CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGTGGCGGTCTGGTACAACCG GGTGGCAGCCGTAAACTGAGCTGCGCGGCATCAGGCTTTACCT TTTCAGACTTTGGCACTCATTGGATTCGTCAGGCCCCGGAAAAG GGCCTGGAATGGGTAGCGTACATTAGCAGCGGCTCAAGCACTC GCTATTATGCCGATACGGTCAAAGGCCGCTTTACGATTTCGCGT GATGATCCGAAAAACACCCTGTTCCTGCAAATGACGTCGCTGC Séquence GTAGCGAAGATACTGCCATGTATTACTGTGCGCGTTCATATGAT nucléotidique GGTTACCATGTCCCGTCGTTCGCGTATTGGGGCCAGGGCACCC TGGTGACTGTGAGCGCAGGTGGTGGCGGTTCAGGTGGTGGTG (SEQ ID NO : 10) GCTCAGGTGGCGGTGGTAGCGATATTCAGATGACCCAGACCCC GCTGTCGCTGAGCGTTTCACTGGGTGACCAGGCAAGCATCTCA TGTCGCAGCAGCCAGAACATCGTGCACTCGAATGGTAATACCT ACCTGGAATGGTACCTGCAAAAGCCGGGCCAAAGCCCTAAACT GCTGATCTATCGTGTGTCGAACCGCTTTTCGGGCATTCCTGATC GCTTCAGCGGCAGCTCGTCAGGCACCGACTTCACCCTGAAAAT TTCGCGCGTTGAGGCCGAAGACCTGGGTGTATATTACTGCTTC 3025516 6 CAGGGTTCGCACGTTCCGCTGACGTTTGGCGCGGGCACGAAA CTCGAGCTGAAACACCATCACCATCACCATTAACTCGAGCTGAA GTAA QVQLQQSGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDFGTHWIRQAPEKG Séquence LEVVVAYISSGSSTRYYADTVKGRFTISRDDPKNTLFLQMTSLRSED peptidique TAMYYCARSYDGYHVPSFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSG GGGSDIQMTQTPLSLSVSLGDQASISCRSSQN IVHSNGNTYLEWY (SEQ ID NO 11) LQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGIPDRFSGSSSGTDFTLKISRVEAEDL GVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKHHHHHH La présente invention a également pour objet une séquence nucléotidique codant pour un ligand selon l'invention. La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant, en particulier un vecteur d'expression, comprenant une séquence nucléotidique 5 selon l'invention. La présente invention a également pour objet une cellule hôte comprenant une séquence nucléotidique selon l'invention ou un vecteur recombinant selon l'invention. Par exemple, il s'agit de l'hybridome CNCM 1-4828 ou d'une cellule transformée par une séquence nucléotidique ou un vecteur recombinant selon 10 l'invention. La présente invention a également pour objet un procédé de production d'un ligand selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture dans un milieu approprié de cellules hôte selon l'invention, et la récupération dudit ligand à partir de ladite culture. 15 Les Inventeurs ont mis en évidence que l'anticorps A8 potentialise la FSH ovine, la FSH humaine recombinante Gonal-F®, la eCG et les hCG Chorulon0 et Endo 5000®. En outre, les Inventeurs ont mis en évidence que le scFv dérivé de l'anticorps A8 possède les mêmes propriétés de liaison et de potentialisation que l'anticorps dont il dérive. 2 0 La présente invention a également pour objet un ligand selon l'invention pour une utilisation comme médicament, en particulier pour potentialiser la bioactivité de la FSH, et de la gonadotropine chorionique (CG) pour induire l'ovulation chez un mammifère femelle et pour réduire les problèmes d'infertilité ou d'hypofertilité hormono dépendants chez un mammifère mâle ou femelle. 2 5 La présente invention a également pour objet un complexe formé d'un ligand et d'une gonadotrophine, ou d'un peptide actif de celle-ci, capable de se lier audit ligand et dont l'activité est potentialisée par ledit ligand. Par exemple, il s'agit du complexe d'un ligand avec l'hormone gonadotropine chorionique (CG) 3025516 7 ou avec la FSH, extraites de tissus ou fluides biologiques ou recombinantes, ou un peptide actif de celles-ci capable de se lier audit ligand et dont l'activité est potentialisée par ledit ligand. La présente invention a également pour objet un ligand ou complexe selon 5 l'invention pour une utilisation comme médicament, en particulier pour induire une (mono)ovulation voire une polyovulation chez un mammifère femelle ou pour réduire les problèmes d'infertilité ou d'hypofertilité hormono dépendants chez un mammifère mâle ou femelle. Ledit médicament permet également d'augmenter le taux de progestérone endogène circulant sécrété par un ou plusieurs corps 10 jaunes chez un mammifère femelle, favorisant ainsi le développement embryonnaire précoce et diminuant le risque d'avortement. La présente invention a également pour objet un procédé de production carnée, où ledit procédé comprend l'administration de ligand et/ou de complexe de l'invention à un mammifère femelle animal non humain. 15 La présente invention a également pour objet un ligand et/ou complexe de l'invention pour une utilisation dans le traitement de l'infertilité ou de l'hypofertilité hormono dépendante chez un mammifère. Dans le cas d'un mammifère femelle souffrant d'infertilité ou d'hypofertilité, l'administration du ligand ou complexe de l'invention va permettre de stimuler une procréation naturelle, médicalement 20 assistée ou artificielle. Il est à noter que l'administration du ligand ou complexe de l'invention à un mammifère femelle sain va également permettre de déclencher l'ovulation dans le cadre d'une procréation naturelle ou artificielle. On entend par « infertilité/hypofertilité hormono dépendante » au sens de la présente invention, une infertilité/hypofertilité due à une insuffisance hormonale 25 par exemple de faibles concentrations circulantes de FSH ou une absence de cette hormone résultant par exemple d'une cause externe (par exemple les pesticides) ou interne (par exemple, insuffisance hypophysaire ou hypothalamique ou d'un problème de réceptivité des gonades à la FSH due à une anomalie des récepteurs ou des gonadotropines FSH, CG par exemple une 30 mutation ou un polymorphisme des récepteurs). Les ligands et complexes de l'invention peuvent être utilisés chez l'homme ou l'animal, en particulier les ovins, bovins, caprins, équins, porcins, murins, canins, camelins etc... Les ligands, les hormones ou les complexes selon l'invention peuvent être administrés soit séparément, soit séquentiellement, soit conjointement, par 3025516 8 injection, par exemple intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, transcutanée, intradermique, intraorbitaire, intraoculaire, ophtalmique, ou par voie transoculaire, sans altérer leur effet potentialisant. La présente invention a également pour objet une composition 5 pharmaceutique comprenant un ligand ou complexe de l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ladite composition pharmaceutique peut comprendre en outre de la FSH et/ou de l'hormone gonadotropine chorionique (CG). D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la 10 lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures - La figure 1 représente les sensorgrammes d'interaction de l'anticorps 15 A8 avec la FSH ovine (A) et la FSH humaine gonal F (B). Les 6 sensorgrammes représentés dans les figures A et B sont ceux obtenus pour les différentes concentrations de oFSH et hFSH. La répétition de chaque injection est représentée pour chaque concentration. - La figure 2 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps 20 monoclonal A8 sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH) sur des cellules de granulosa bovines (A) et sur une lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain (B). Elle illustre également l'effet potentialisant de l'anticorps A8 sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) Gonal F® sur la lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur 25 FSH humain (C). La figure 3 représente représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal A8 (A) et du scFv A8 (B) sur la bioactivité de la FSH ovine en utilisant une lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur Glosensor®, et l'effet de l'anticorps A8 sur la 30 FSH humaine (hFSH) Gonal F® (C). - La figure 4 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps monoclonal A8 sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH) (A) et sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) Gonal F® (B) chez le rat femelle. 3025516 9 - La figure 5 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps monoclonal A8 et du scFv A8 sur la bioactivité de la FSH humaine Gonal FO (hFSH) selon une administration par voie intra-péritonéale chez le rat femelle. - La figure 6 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps 5 monoclonal A8 sur la bioactivité des choriogonadotropines humaines (hCG) Chorulon® et Endo 5000® chez le rat mâle. - La figure 7 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps monoclonal A8 sur la bioactivité de la choriogonadotropine équine (eCG) Chronogest® chez le rat femelle. 10 - La figure 8 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps monoclonal A8 injecté seul sur la bioactivité des gonadotropines endogènes chez la brebis en début de saison sexuelle. - La figure 9 représente l'effet potentialisant in vivo du complexe FSH porcine (pFSH)/A8 et celui obtenu avec l'anticorps monoclonal A8 injecté seul 15 chez la brebis en période de saison sexuelle. EXEMPLES EXEMPLE 1 : OBTENTION DES LIGANDS DE L'INVENTION, ET LEUR 20 CARACTERISATION Stratégie d'immunisation des souris Cinq souris Balb/C ont été immunisées contre la FSH ovine (oFSH). Les injections ont été réalisées par voie intra-péritonéale et par voie intra-dermique 25 selon la stratégie d'immunisation suivante : - JO : une première injection par voie intra-dermique (JO) a été réalisée avec 50pg de FSH ovine (purifiée avec adjuvant de Freund complet ; - J23 : injection par voie intra-péritonéale par voie intra-péritonéale de 30pg de oFSH purifiée avec adjuvant de Freund Incomplet ; 30 - J44 : injection par voie intra-dermique de 30pg de FSH ovine purifiée avec adjuvant de Freund incomplet ; - J65 : injection par voie intra-péritonéale de 30pg de sous-unité béta ([3) de oFSH avec adjuvant de Freund incomplet ; 3025516 10 - J82 : injection par voie intra-péritonéale de 30pg de sous-unité [3 de FSH ovine sans adjuvant ; - J86: fusion. 5 !son/page L'isotypage de l'anticorps A8 a été réalisé avec le kit d'isotypage FastElysa commercialisé par RD Biotech (référence RDB 3255) en suivant les recommandations du fabriquant. L'anticorps A8 est une immunoglobine de classe IgG1 et d'isotype Kappa. 10 Les valeurs des densités optiques (DO) obtenues ont été 0,288 et 0,185 respectivement. Séquençage Les séquences nucléotidiques de la partie variable de la chaîne lourde 15 (VH) et légère (VL) de l'anticorps A8 sécrété par l'hybridome CNCM 1-4828 ont été déterminées à partir de leur ARN messager (ARNm) selon le protocole ci-après. Les ARNs ont été extraits des cellules à l'aide du kit RNeasy® Mini Kit (Ref 74104, Qiagen, Pays-Bas) en suivant les recommandations du fabriquant. Les concentrations en ARN purifiés ont été estimées par mesure de l'absorbance (A) 20 à 260 nm et leur qualité par le rapport A260nm/280nm et visuellement après migration électrophorétique sur gel d'agarose. Les ADN complémentaires des ARNm ont alors été synthétisés à l'aide d'un oligo-dT18 comme amorce par réaction de rétrotranscription avec l'enzyme M-MLV (Ref M1701, Promega, USA) en suivant les recommandations du 25 fabriquant. La synthèse du second brin d'ADN a été réalisée par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) selon le protocole suivant : à 4 pI de la réaction de rétrotranscription sont ajoutés dans un volume final de 50 pI ; le tampon de réaction (1X final), 200 pM de chaque dNTPs, 300 nM d'amorces sens et 30 antisens, 1,25 U de GoTaq polymérase (Ref M3175, Promega, USA). Pour l'amplification de la partie variable de la chaîne légère, 2 couples d'amorces différents ont été utilisés (MKRev1+ MKC5For et MKRev 7 + MKC5For) et 3 couples différents pour celle de la chaîne lourde (VHRev1 + VHFor1, VHRev1 + VH For2 et VH Rev2 + VH For3). 3025516 11 Tableau 4: Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour séquencer les chaînes lourdes (VH) et légères(VL) de l'anticorps A8 Anticorps A8 Chaîne lourde (VH) Nom Séquence 5'-3' SEQ ID NO VHRev1 CGGGATCCTCTAGAGGTCCAACTGCAGGAGTC AGG SEQ ID NO : 12 VHRev2 AGATCTAGAAAGCTTAGGTCAAGCTGCAGCAGT CAGG SEQ ID NO : 13 VHFor1 CAGGGGCCAGTGGATAGAC SEQ ID NO :14 VHFor2 CGGGATCCTCTAGACAGTGGATARACMGATGG SEQ ID NO : 15 VHFor3 AGATCTAGAGAATTCTGAGGAGACGGTGACCG TGGTCCCTTGGCCCCAG SEQ ID NO : 16 Chaîne légère (VL) MKRev1 GATGTTTTGATGACCCAAACT SEQ ID NO : 17 MKRev7 GATATCCAGATGACACAGACT SEQ ID NO : 18 MKC5For GGATACAGTTGGTGCAGCATC SEQ ID NO : 19 Le programme de PCR qui a été utilisé est composé d'une dénaturation 5 initiale de 2 min à 95°C suivie de 30 cycles de dénaturation 30 sec à 95°C, hybridation 30 sec à 47°C et amplification 1 min à 72°C et enfin d'une amplification finale de 5 min à 72°C. Les produits de PCR obtenus ont été dessalés avec le kit QlAquick®Gel extraction kit (Ref 28704, Qiagen GmbH, Allemagne) puis ligaturés avec le plasmide pGEMT easy vector (ref A1360, 10 Promega, USA) pour être transformés en bactéries. L'ADN plasmidique extrait de différents clones bactériens a été envoyé pour analyse par séquençage (Macrogen Europe, Pays-Bas). La séquence nucléotidique 5' terminale de la chaîne légère de l'anticorps a été déterminée grâce à la conception d'amorces spécifiques ancrées dans la 15 séquence leader de l'ADNc (amorce Fw). Trois amorces ont été conçues suite à l'identification d'homologie par alignement entre la séquence VL obtenue précédemment et la base de données ENSEMBL (release 64 ; http://uswest.ensembl.org/index.html, dans le domaine public). L'amorces antisens (Rev) a été conçue dans la séquence VL précédemment déterminée. Le 20 protocole utilisé pour obtenir la partie 5' est le même que celui décrit au paragraphe précédent. Tableau 5 Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour séquencer la partie 5'de la chaîne légère (VL) de l'anticorps A8 Anticorps A8 Nom Séquence 5'-3' SEQ ID NO Chaîne légère (VL) A8_VL4 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG SEQ ID NO :20 A8-VL5 GCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGT SEQ ID NO :21 3025516 12 A8-VL6 ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTG SEQ ID NO :22 A8-VLrev TGTGAGCGGAACATGTGAACCTTGAAA SEQ ID NO :23 Les séquences nucléotidiques consensus ont été déduites de l'alignement des séquences en utilisant le logiciel MultAlin (Corpet, Nucl. Acids Res., 16(22) :10881-10890, 1988) [3]. La transcription en séquences polypeptidiques et l'annotation des CDRs ont été réalisées à l'aide de logiciel IMGT/V-QUEST. Les 5 résultats sont présentés dans les tableaux 6 et 7 . Tableau 6 : Séquences nucléotidiques et peptidiques des parties variables lourdes (VH) et lé ères VL de l'anticorps A8 Anticorps monoclonal A8 Chaîne lourde (VH) Séquence GAGGTCCAACTGCAGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCT GGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTT TCAGTGACTTTGGAACGCACTGGATTCGTCAGGCTCCAGAGAA GGGACTGGAGTGGGTCGCATATATTAGTAGTGGCAGTAGTACC AGGTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCA GAGACGATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCT AAGGTCTGAAGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGATCTTATG ATGGTTACCACGTTCCCTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGAC TCTGGTCACTGTCTCTGCAG nucléotidique (SEQ ID NO - 1) . Séquence EVQLQESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDFGTHWIRQAPEKG LEVVVAYISSGSSTRYYADTVKGRFTISRDDPKNTLFLQMTSLRSED TAMYYCARSYDGYHVPSFAYWGQGTLVTVSA peptidique (SEQ ID NO : 2) Chaîne légère (VL) Séquence GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGTCTGTCAGTCT TGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTG TACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAA CCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAGTTTCCAACC GATTTTCTGGGATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTTCATCAGG GACAGACTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGAT CTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCAC ATTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA nucléotidique (SEQ ID NO : 3) Séquence DVLMTQTPLSLSVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEVVYLQKP GQSPKLLIYRVSNRFSGIPDRFSGSSSGTDFTLKISRVEAEDLGVY YCFQGSHVPLTFGAGTKLELK peptidique (SEQ ID NO : 4) Tableau 7: CDR des parties variables lourdes (VH) et légères (VL) de l'anticorps A8 Anticorps monoclonal A8 VH-CDR1 (SEQ ID NO : 5) GFTFSDFG VH-CDR2 (SEQ ID NO : 6) ISSGSSTR VH-CDR3 (SEQ ID NO : 7) ARSYDGYHVPSFAY VL-CDR1 (SEQ ID NO : 8) QNIVHSNGNTY VL-CDR2 RVS VL-CDR3 (SEQ ID NO : 9) FQGSHVPLT 10 4/ Construction, production et caractérisation du scFv A8 a/ Construction du fragment d'anticorps scFv A8 3025516 13 Le gène de synthèse du fragment variable simple chaîne (scFv) dérivé de l'anticorps A8 a été synthétisé par ATG:Biosynthetics GmbH (Allemagne). La séquence est conçue de la fusion des parties variables lourde et légère (SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO : 3) liées par une séquence codant pour le peptide 5 (Gly4Ser)3 assurant la fonctionnalité de la protéine et terminés par une séquence codant le peptide His6 (peptide HIS-tag) qui autorisera la purification du scFv. Afin de permettre l'insertion dans le plasmide d'expression, la séquence est flanquée par les sites enzymatiques de restriction Pstl et Sall. Une séquence additionnelle est ajoutée entre l'extrémité 3' du VL et le site Sall autorisant la suppression du 10 peptide His6 si désiré. Les codons ont été optimisés pour l'expression en E. coll. Une représentation schématique de la construction du gène de synthèse est détaillée ci-dessous : VH Lieur VL LQ (G4S)3 ........................... LEIKH6LEIK VD 15 Pstl Xhol Xhol Sall Le fragment d'anticorps a été inséré entre les sites enzymatiques Pstl et Xhol du plasmide d'expression pSVV1(ATG:Biosynthetics GmbH (Allemagne) selon E. S. Ward et collaborateurs (Ward et al., Nature, 341: 544-546, 1989) [4] qui contient sous le contrôle d'un promoteur inductible LacZ, une séquence signal 20 PeIB qui fusionnée en phase de lecture avec le gène du fragment d'anticorps recombinant, permet l'adressage de la protéine synthétisée vers le périplasme bactérien. Dans le périplasme, cette séquence signal est éliminée par une peptidase. Après contrôle par séquençage de la qualité de la construction, le 25 plasmide pSVV1-scFv A8 a été transformé par choc thermique en bactéries HB2151 (T53040, Interchim, France) rendues chimiquement compétentes (Li et al., Afr. J. Biotechnol., 9(50) : 8549-8554, 2010) [5]. Tableau 8 : Séquences nucléotidiques et peptidiques du scFv A8 scFv A8 CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGTGGCGGTCTGGTACAACCG Séquence GGTGGCAGCCGTAAACTGAGCTGCGCGGCATCAGGCTTTACCT TTTCAGACTTTGGCACTCATTGGATTCGTCAGGCCCCGGAAAAG nucléotidique GGCCTGGAATGGGTAGCGTACATTAGCAGCGGCTCAAGCACTC (SEQ ID NO : 10) GCTATTATGCCGATACGGTCAAAGGCCGCTTTACGATTTCGCGT GATGATCCGAAAAACACCCTGTTCCTGCAAATGACGTCGCTGC GTAGCGAAGATACTGCCATGTATTACTGTGCGCGTTCATATGAT 3025516 14 GGTTACCATGTCCCGTCGTTCGCGTATTGGGGCCAGGGCACCC TGGTGACTGTGAGCGCAGGTGGTGGCGGTTCAGGTGGTGGTG GCTCAGGTGGCGGTGGTAGCGATATTCAGATGACCCAGACCCC GCTGTCGCTGAGCGTTTCACTGGGTGACCAGGCAAGCATCTCA TGTCGCAGCAGCCAGAACATCGTGCACTCGAATGGTAATACCT ACCTGGAATGGTACCTGCAAAAGCCGGGCCAAAGCCCTAAACT GCTGATCTATCGTGTGTCGAACCGCTTTTCGGGCATTCCTGATC GCTTCAGCGGCAGCTCGTCAGGCACCGACTTCACCCTGAAAAT TTCGCGCGTTGAGGCCGAAGACCTGGGTGTATATTACTGCTTC CAGGGTTCGCACGTTCCGCTGACGTTTGGCGCGGGCACGAAA CTCGAGCTGAAACACCATCACCATCACCATTAACTCGAGCTGAA GTAA QVQLQQSGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDFGTHWIRQAPEKG Séquence LEVVVAYISSGSSTRYYADTVKGRFTISRDDPKNTLFLQMTSLRSED peptidique TAMYYCARSYDGYHVPSFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSG GGGSDIQMTQTPLSLSVSLGDQASISCRSSQN IVHSNGNTYLEWY (SEQ ID NO : 11) LQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGIPDRFSGSSSGTDFTLKISRVEAEDL GVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKHHHHHH b/ Production du fragment d'anticorps recombinant -Culture bactérienne 5 Une préculture est réalisée dans 5m1 de milieu 2xYT contenant 50pg/m1 d'ampicilline toute la nuit à 37°C. Le lendemain, 500p1 de cette préculture est ensemencée dans 500m1 du même milieu et mis à croître à 37°C à 15ORPM jusqu'à obtenir une D0600n, de 1,4. La synthèse du scFv est induite par l'ajout de 0,1mM d'IPTG 16h à 16°C à 15 RPM. 10 -Extraction Le milieu de culture est centrifugé 30min à 4500g à 4°C. La suite de la préparation se réalise à 4°C. Pour extraire le périplasme bactérien, le culot est remis en suspension et incubé dans 10m1 de TES (Tris 0, M pH8, EDTA 0,5M, 15 saccharose 0,5M) pendant 30min auxquels sont alors ajoutés 15m1 de TES dilué au 1/4 pour être de nouveau incubé 30min. L'extrait bactérien est centrifugé 30min à 10 000g. Le surnageant est mis à dialyser contre du PBS pendant une nuit. Le surnageant dialysé est traité immédiatement pour purifier le scFv ou conservé à -20°C jusqu'à utilisation. 2 0 La production du scFv dans le périplasme est analysée par Western blot avec anti His-Tag HRP (Réf. R93125 Life technologies, France). -Purification 3025516 15 Le périplasme est centrifugé pendant 20min à 5 000g à 4°C. Le surnageant est incubé avec HIS-Select® Nickel Affinity Gel (Ref P6611, Sigma-Aldrich, MO, USA) sous agitation pendant 1h à 4°C. Le gel est lavé avec un tampon phosphate de sodium 0,05M, NaCI 0,3M pH8 puis le même tampon 5 additionné de 20mM d'imidazole jusqu'à obtenir une D028onm proche de 0. Le scFv est alors élue avec un tampon tampon phosphate de sodium 0,05M, NaCI 0,3M, 250mM imidazole pH8. L'éluat est dialysé contre du PBS toute la nuit. Il est conservé à -20°C. 10 -Contrôle qualité Le scFv purifié est analysé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15% après coloration au bleu de coomassie et par chromatographie d'exclusion sur colonne SephadexTM 75 10 /300 GL (Réf. 17-5174-01 GEHealthcare, Allemagne). 15 5/ Spécificité La spécificité de l'anticorps A8 a été étudiée par différentes techniques : Western Blot, ELISA et résonance plasmonique de surface (SPR). La spécificité du scFv A8 a été étudiée par ELISA. 20 Pour l'analyse conduite par Western Blot, 5pg de chaque hormone ou sous- unité ont été déposés sur gel de polyacrilamide 15% en conditions non-dénaturantes et en conditions dénaturantes. Après transfert sur nitrocellulose, l'anticorps A8 a été incubé à la concentration 5pg/m1 et révélé avec un anticorps secondaire anti-IgG1 couplé à la peroxydase (HRP) (Réf. 115-035-205, Jackson 25 ImmunoResearch Laboratories Inc) et un substrat cheluminescent, le West pico® (THERMO scientific, France). Pour l'analyse de la spécificité conduite par ELISA, l'hormone étudiée a été préparée à la concentration de 10pg/m1 dans du tampon carbonate de sodium 0,1M pH9,6 et distribuée à raison de 100p1 par puits sur une plaque ELISA. Le 30 temps d'adsorption a été de 18 heures à +4°C. Après cinq lavages, les puits sont traités avec 100p1 de PBS additionné de Tween 0,1% et de BSA 1% pendant 45 min à 37°C, puis chaque anticorps ou scFv a été distribué à raison de 100pl/puits et incubés 1 heure à 37°C. Sur chaque hormone évaluée, les anticorps et les scFv ont été distribués à différentes concentrations selon une gamme de 10 à 3025516 16 250pg/ml pour les anticorps et de 10 à 150 ou 200pg/ml pour les scFv. Après cinq lavages, un anticorps secondaire anti-IgG1 couplé à la peroxydase (HRP) (Ref 115-035-205, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc) a été distribué à raison de 100pl/puits et incubé 1 heure à 37°C. Pour les scFv un anti-His Tag HRP (Ref 5 R93125 Life technologies, France) a été utilisé. Après cinq lavages, l'activité enzymatique a été révélée avec du TMB distribué à raison de 100pl/puits. Le temps de révélation a été de 5 à 30 min à température ambiante selon la vitesse de la réaction. Après arrêt de la réaction avec H2SO4 1M (50p1/puits) l'intensité de la réaction colorée (Densité Optique) est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre 10 pour plaques ELISA. Le pourcentage de réaction croisée a été calculé par rapport aux valeurs obtenues avec la FSH ovine (oFSH) considérée comme la valeur 100% de référence. Le pourcentage de réaction croisée a été calculé de façon classique en comparant les courbes dose-réponse obtenues avec la gamme de concentration 15 de l'anticorps ou du scFv. A partir de la courbe obtenue avec l'hormone référence - soit A la concentration donnant 50% de la densité optique maximale (ED 50). A partir de la courbe obtenue avec une autre hormone, - soit B la concentration correspondante à la même valeur de densité optique que celle utilisée pour définir A . 20 Le pourcentage de réaction croisée est égal à A divisé par B et multiplié par 100 [(A/B) X 100]. Les analyses conduites par SPR ont été conduites sur un BiacoreT100 (GE Healthcare, France) et réalisées sur un anticorps de capture, anticorps anti-Fc d'IgG de souris, (Jackson laboratories, USA) préalablement immobilisé sur un 25 sensorchip CM5 (GE Healthcare, France). L'anticorps A8 (20pg/m1) a été injecté pendant 45 secondes au débit de 10p1/min suivie d'une injection de l'hormone pendant 180 secondes au débit de 30 pl/min. après chaque séquence d'injections la surface est régénérée avec H3PO4 100mM pendant 1 min. Le signal est ensuite soustrait des signaux non-spécifiques enregistré sur les pistes contrôles puis 30 analysé par le logiciel BiaEval (version 2.03, GE Healthcare) du Biacore T100. Chaque concentration est injectée deux fois de façon aléatoire pour contrôler la répétabiité des résultats : la courbe de chaque réplicat est représentée sur les figures. Les calculs des constantes cinétiques sont réalisés sur l'ensemble des données. 3025516 17 a/ Spécificité de A8 vis-à-vis des FSH et LH ovines et leurs sous-unités La reconnaissance de A8 sur la oFSH dimérique, les sous-unités a et [3 oFSH, la oLH dimérique et la sous-unité [3 oLH a été d'abord étudiée par Western 5 Blot. Seule la oFSH dimérique et la [3 oFSH ont été fortement reconnues à la fois en conditions non-dénaturantes et dénaturantes et ont donné un signal très important. Un très faible signal a été observé sur la oLH après un temps de révélation maximal. Aucun signal n'a été observé sur la [3 oLH dans les deux conditions. L'anticorps A8 reconnaît donc un épitope non-conformationnel situé 10 sur [3oFSH. Par technique ELISA, la spécificité de l'anticorps A8 vis-à-vis de oFSH et de [3 oFSH a été confirmée. Le tableau 9 illustre les pourcentages de réactions croisées de l'anticorps A8 avec les sous-unités (s.u.) a et [3 de la oFSH et la sous-unité [3 de la oLH 15 Tableau 9 A8 oFSH s.u. a ovine s.u. p, oFSH oLH s.u. p, oLH Réaction croisée 100% 0% 100% 10% 2% L'anticorps A8 ne reconnaît pas la sous-unité a ovine mais fortement la sous-unité [3 de la FSH ovine (100%) ; il croise très peu avec la oLH et [3 oLH. Sa spécificité est anti-sous unité [3 oFSH. L'affinité de A8 pour la oFSH a été analysée par SPR sur un appareil 20 Biacore T100® (GE Healthcare, France). La constante de dissociation, Kd, mesurée pour la oFSH est de 6,3.10-9M. La figure 1A illustre les profils d'interaction de la oFSH à différentes concentrations (1,56 à 50nM) sur l'anticorps A8 immobilisé. L'intensité d'interaction présente un Rmax de 34,1 unités de résonance (RU). Les constantes cinétiques sont de 1,3.105±1,4.102 M-1.s-1 pour la 25 vitesse d'association et de 8,2.10-4±8,4.10-7 s-1 pour la vitesse de dissociation. La comparaison d'un profil d'interaction de la oFSH et de la oLH injectée à 100nM sur l'anticorps A8, donne un niveau de liaison spécifique de 23 RU et 4 RU respectivement, vingt secondes après la fin de l'injection, ce qui représente une réaction croisée de 15% de oLH par rapport à oFSH. 30 b/ Spécificité de A8 vis-à-vis des FSH porcine et humaine Le tableau 10 illustre les pourcentages de réactions croisées de A8 et du scFv A8 avec la FSH porcine (pFSH) et différentes FSH humaines : Tableau 10 3025516 18 oFSH pFSH hFSH hFSH hFSH (Fostimon) hMG (Gonal F) (Puregon) (Menopur) A8 100% 30) issus de la compilation de plusieurs bioassays, un test paramétrique (test t de Student non apparié) suivi d'une correction de Bonferroni a été appliqué. 15 Effet potentialisant des anticorps sur la bioactivité de la FSH chez la Ratte L'effet potentialisant de l'anticorps A8 et de son scFv a été étudié sur la FSH ovine et sur une FSH humaine utilisée en reproduction humaine dans le cadre des traitements de procréation médicalement assistée, la Gonal-F, FSH recombinante commercialisée par Merck Serono. 20 Comme décrit dans le protocole de Steelman et Pohley, des rattes immatures de 21 jours ont reçu pendant trois jours consécutifs 2 injections matin et soir, de 100p1 d'un mélange de hCG et FSH comportant une quantité constante de hCG (3,5U1) additionnée d'une quantité variable de FSH allant de 0,5 à 1,5 UI pour la FSH humaine Gonal F ou de 0,5 à 2 pg pour la FSH ovine. Les injections 25 ont été réalisées par voie sous-cutanée au niveau de la nuque. Chaque expérience comprenait au minimum 4 lots : un lot traité avec du sérum physiologique (sérum cl)), un lot traité avec l'anticorps ou le scFv seul, un lot traité avec le mélange hCG+FSH, un lot traité avec le mélange hCG/FSH additionné de 2pg d'anticorps ou de scFv purifié. 30 Dans le cas d'un traitement avec le complexe hormone/anticorps ou scFv, avant l'injection, le mélange FSH + anticorps a été préalablement incubé 20min à 37°C ou à température ambiante indifféremment, puis ajouté à la hCG. La hCG peut indifféremment être mélangée à la FSH pendant l'incubation du complexe. 3025516 25 Le quatrième jour, les rattes ont été pesées, et leurs ovaires ont été prélevés, disséqués puis pesés. Les résultats sont exprimés en milligramme d'ovaire/100 grammes de poids corporel. L'augmentation du poids des ovaires est proportionnelle à la quantité de FSH bioactive injectée. Ceci permet de quantifier 5 et de comparer la bioactivité d'une même quantité d'hormone injectée seule ou en complexe avec l'anticorps A8. La comparaison des deux réponses a ainsi permis de quantifier l'effet potentialisant de l'anticorps A8 ou de son scFv. La figure 4A illustre un exemple représentatif de l'effet de l'anticorps A8 sur 10 la bioactivité FSH ovine. Chaque lot comportait 5 femelles. Le lot traité avec l'anticorps A8 injecté seul a présenté le même poids moyen des ovaires que les femelles du lot contrôle ayant reçu du sérum physiologique (28,6 mg et 31mg respectivement). Le lot ayant reçu le traitement hormonal classique (hCG 3,5U1 +oFSH 0,5pg) a donné un poids moyen des ovaires de 90,5 ± 6mg. Le lot traité 15 avec la FSH ovine préalablement complexée à l'anticorps A8 a présenté un poids moyen de 136 ± 8 mg soit une augmentation significative de la bioactivité FSH de 150% par rapport au lot ayant reçu le traitement hormonal classique (p REVENDICATIONS1. Ligand de l'hormone folliculo-stimulante (FSH) potentialisant la bioactivité de la FSH et de la CG, caractérisé en ce que ledit ligand est un anticorps ou un fragment de celui-ci et en ce que : le domaine variable de la chaine lourde contient les CDRs suivants : - VH-CDR1, défini par la séquence GFTFSDFG (SEQ ID NO : 5) ; - VH-CDR2, défini par la séquence ISSGSSTR (SEQ ID NO : 6) ; - VH-CDR3, défini par la séquence ARSYDGYHVPSFAY (SEQ ID NO : 7) ; et le domaine variable de la chaine légère contient les CDRs suivants : - VL-CDR1, défini par la séquence QNIVHSNGNTY (SEQ ID NO : 8) ; - VL-CDR2, défini par la séquence RVS ; - VL-CDR3, défini par la séquence FQGSHVPLT (SEQ ID NO : 9). 2. Ligand selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ligand est choisi dans le groupe constitué de Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, diabodies, triabodies, tétrabodies et nanobodies. 3. Ligand selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ligand est l'anticorps monoclonal A8 produit par l'hybridome CNCM 1-4828. 4. Ligand selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence peptidique du scFv est la séquence SEQ ID NO : 11. 5. Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour une utilisation comme médicament. 6. Complexe ligand-gonadotrophine choisi parmi : un complexe d'un ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 avec la FSH ou un peptide actif de celle-ci ; un complexe d'un ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 avec l'hormone gonadotropine chorionique (CG) ou un peptide actif de celle-ci. 3025516 7. Complexe selon la revendication 6, pour une utilisation comme médicament. 8. Ligand selon la revendication 5 ou complexe selon la revendication 7, 5 où ledit médicament est destiné à induire une ovulation ou une polyovulation chez un mammifère femelle. 9. Ligand selon la revendication 5 ou complexe selon la revendication 7, où ledit médicament est destiné à augmenter le taux de progestérone endogène 10 circulant chez un mammifère femelle. 10. Composition pharmaceutique destinée à être utilisée pour l'induction de l'ovulation chez un mammifère femelle, caractérisée en ce qu'elle comprend un ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et/ou un complexe selon 15 la revendication 6 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 11. Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une FSH et/ou une CG. 20 12. Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou complexe selon la revendication 6, pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention de l'infertilité ou de l'hypofertilité chez un mammifère.