Brevet FR3035409A1 — publié le 20161028

Méthode d'extraction d'ADN comprenant un traitement de dégradation enzymatique d'un échantillon biologique. La présente invention concerne une méthode d'extraction d'ADN à partir d'un échantillon biologique en contenant dans laquelle avant les étapes finales de séparation et purification de l'ADN on réalise un prétraitement de dégradation enzymatique des polysaccharides dudit échantillon biologique dans certaines conditions de mise en oeuvre. Les différentes étapes successives suivantes impliquées dans l'extraction d'ADN sont typiquement effectuées comme résumé ci-10 après. - La lyse des cellules ou tissus pour accéder à l'ADN, se fait par des méthodes physiques et/ou chimiques. La lyse cellulaire pour l'extraction d'ADN bactérien est souvent effectuée par des méthodes chimiques utilisant notamment le lysozyme, l'EDTA et/ou des 15 détergents. - L'élimination des débris cellulaires ou tissulaires se fait généralement à l'aide de détergents comme le sodium dodecyl sulfate et par centrifugation. - La dénaturation des protéines de l'extrait cellulaire ou 20 tissulaire, est effectuée à l'aide d'une protéase telle que la protéinase K. Les protéines sont éliminées à l'aide de solvants organiques tels que le phénol, ou un mélange 1:1 de phénol et de chloroforme, le précipité de protéines étant ensuite séparé par centrifugation. - L'élimination de l'ARN est effectuée par addition de RNase qui 25 dégrade rapidement l'ARN en ribonucléotides. - La séparation de l'ADN par précipitation/agrégation/élution de l'ADN. 3035409 2 Les étapes de séparation de l'ADN communément mises en oeuvre dans les kits d'extraction ou de purification de l'ADN sont rappelées ci-après. - L'extraction organique comprend la séparation et purification 5 de l'ADN généralement récupéré par précipitation à l'aide d'éthanol ou d'isopropanol en présence de cations monovalent tel que Na+, et à une température inférieure à 20°C. L'ADN précipité est généralement resuspendu dans un tampon TE ou de l'eau distillée. - la technologie utilisant la silice comprend l'absorption de l'ADN spécifiquement sur membrane/billes/particules de silice en présence de certains sels et à un pH particulier. Les contaminants cellulaires sont éliminés par différentes étapes de lavage. L'ADN est finalement élué dans un tampon faible en sel ou tampon d'élution. Des sels chaotropes sont inclus pour aider à la dénaturation de protéines et l'extraction d'ADN. Un exemple de kit de ce type est utilisé dans l'exemple 1, à savoir QIAamp DNA mini kit (Qiagen). - la séparation magnétique est basée sur la liaison réversible de l'ADN à une surface solide/billes/ particules magnétiques qui ont été recouvertes d'un anticorps liant l'ADN ou d'un groupe fonctionnel qui interagit spécifiquement avec l'ADN. Après liaison de l'ADN, les billes sont séparées des autres composants cellulaires contaminants, lavées et finalement l'ADN purifié est élué par extraction à l'éthanol. Un exemple de kit de ce type est utilisé dans l'exemple 2, à savoir EZ1 Advanced XL utilisant le kit EZ1 DNA Tissue (Qiagen, Courtaboeuf, France). Comme rapporté dans plusieurs études (1,2), que les méthodes d'extraction et purification d'ADN utilisées ont un impact sur l'abondance et la diversité de l'ADN extrait d'un échantillon contenant une population microbienne. Par exemple, dans les échantillons de selles, la co-purification de sels biliaires et de polysaccharides complexes contaminant l'extraction de l'ADN est fréquente (3, 4). 3035409 3 Comme la qualité et la pureté des acides nucléiques comptent parmi les facteurs les plus critiques pour l'analyse PCR, l'optimisation des méthodes d'extraction d'ADN est primordiale. Bien que les inhibiteurs de PCR sont courants dans les échantillons de selles, peu d'attention a 5 été portée sur les biais potentiels provoqués par ces inhibiteurs mal définis (3). Plusieurs études soulignent d'ailleurs la nécessité d'optimiser les méthodes d'extraction d'ADN afin obtenir des résultats précis (5). Le but de la présente invention est d'améliorer l'extraction et la 10 purification d'ADN d'un échantillon biologique, notamment un échantillon contenant des microorganismes et plus particulièrement des bactéries. La plupart des microorganismes s'accumule majoritairement dans un biofilm constitué d'une matrice polymérique extracellulaire riche en 15 polysaccharides pour constituer leur environnement immédiat. Ce biofilm ainsi que les polysaccharides des glycoprotéines et des glycolipides des membranes cellulaires constituent une barrière protectrice qui confère une extraordinaire résistance à une variété d'agression et d'agents antimicrobiens, correspondant à une stratégie 20 de survie partagée par les microorganismes. Ces biofilms bactériens contiennent des polysaccharides complexes (peptidoglycanes, cellulose...) associés à de nombreux composants constitués d'excrétas et de déchets métaboliques. Par exemple, les exopolysaccharides produits dans les biofilms bactérien présents dans les matières fécales 25 présentent des activités inhibitrices pour les enzymes de restriction, des enzymes de modification et des enzymes de polymérisation de l'ADN (6-9). Selon la présente invention, on a découvert que - sous certaines conditions de prétraitement de lyse mécanique et de dénaturation 30 protéique - la dégradation enzymatique des polysaccharides et notamment de la cellulose présentes dans les selles le cas échéant, préalablement à l'extraction et la purification de l'ADN, permettait 3035409 4 d'augmenter le rendement de l'extraction et la quantification subséquente par amplification par PCR de l'ADN. Les résultats comparatifs des expériences réalisées tant sur les bactéries issues d'un biofilm ou isolées et productrices de matrice polysaccharidiques que 5 sur les échantillons de selles ainsi que divers prélèvements cliniques ont permis de démonter l'accroissement du rendement d'extraction de l'ADN et de la détection d'espèces bactériennes diverses. Les résultats montrent une très nette amélioration de la technique d'extraction avec une capacité de détection et de quantification supérieure aux 10 techniques d'extraction sans ledit traitement enzymatique selon la présente invention. Ainsi, le seuil de détection des bactéries dans un échantillon donné se révèle jusqu'à 1000 fois supérieur après un prétraitement avant extraction de l'ADN selon la présente invention en comparaison au même échantillon sans le dit prétraitement. 15 Plus précisément, la présente invention fournit une méthode d'extraction d'ADN à partir d'un échantillon biologique y compris des microorganismes en contenant dans laquelle on réalise un pré-traitement de l'échantillon comprenant au moins les étapes suivantes de : 20 a) lyse mécanique de l'échantillon biologique, de préférence par broyage, et b) dénaturation protéique, de préférence sans protéinase, et c) mise en contact de l'échantillon avec au moins une enzyme glycosidase, de préférence une pluralité de différentes glycosidases de 25 préférence des endoglycosidases. A l'étape b), on évite la mise en oeuvre de protéinase pour éviter de dégrader les enzymes glycosidases de l'étape c). A l'étape c), les inventeurs considèrent que les dite glycosidases ont pour fonction d'opérer une lyse des liaisons glycosidiques des 30 polysaccharides associés ou non aux protéines ou aux lipides des 3035409 5 cellules et/ou microorganismes de l'échantillon, notamment des glycoprotéines membranaires et/ou exopolysaccharides de matrices extracellulaires de microorganismes notamment de bactéries. Plus particulièrement, le dit prétraitement est réalisé avant des 5 étapes finales de séparation et purification de l'ADN. Une glycosidase ou son terme générique de « sialidase » aussi dénommée glycoside hydrolase catalyse l'hydrolyse de liaisons glycosidiques et libère au moins un composé osidique. Les glycosides hydrolases peuvent aussi être classées en tant 10 que exo-glycosidase ou endo-glycosidase en fonction de leur spécificité à hydrolyser les sucres terminaux d'une chaîne (exo-glycosidases), ou au contraire, à libérer des oligosaccharides (endo-glycosidases) en attaquant une liaisons osidiques au sein d'une chaîne. Les glycosides hydrolases peuvent aussi être classées en fonction 15 du type de liaisons hydrolysées telles que des liaisons 0-glycosidique (o-glycosidase) ou N-glycosidique (N-glycosidase) ou S-glycosidique (Sglycosidase). Enfin, les glycosidases peuvent être définies en fonction du motif spécifique du monosaccharide ou sucre hydrolysé. 20 Une P-N-Acetylglucosaminidase est une glycosidase qui catalyse l'hydrolyse de résidus P-N-Acetylglucosamine des oligosaccharides. Une P-galactosidase est une exoglycosidase de type 0- glycosidase qui hydrolyse des P-galactosides en monosaccharides. Une neuraminidase ou sialidase, est une glycoside hydrolase qui 25 catalyse : - l'hydrolyse d'une liaison 0-osidique a-(2->3)-, a-(2->6)- ou a(2->8)- des résidus d'acide sialique d'oligosaccharides, notamment de glycoprotéines et de glycolipides, pour l'exoneuraminidase, 3035409 6 - l'endohydrolyse d'une liaison (2->8)-a-sialosyle d'acides oligoou polysialiques pour l'endoneuraminidase. On cite parmi les N-acétyl-glucosaminidases: - l'endoglycosidase H ou EndoH qui est une endo 3-N-acétyl- 5 glucosaminidase qui hydrolyse la liaison 0-osidique de l'anomère i3 de la N-acétyl-glucosamine entre deux motifs N-acétyl-glucosamine ; et - l'endoglycosidase F ou PNGase F qui est aussi une endo 13-Nacétyl-glucosaminidase, mais elle hydrolyse une liaison N-osidique entre la dernière N-acétyl-glucosamine d'un oligosaccharide et 10 l'asparagine de la chaîne peptidique. - Une cellulase est une enzyme 0-glycosidase (1,4-(1,3:1,4)-13-DGlucan 4-glucano-hydrolase) qui peut décomposer la cellulose. De préférence, à l'étape c), on met en oeuvre une pluralité d'enzymes glycosidases de différentes spécificités quant aux types de 15 motifs de sucres dont les liaisons sont hydrolysées et/ou quant aux types de liaisons hydrolysées parmi les liaisons 0- glycosidique (oglycosidase) ou N-glycosidique (N-glycosidase) ou S-glycosidique (Sglycosidase) et/ou quant aux modes d'action de l'hydrolyse du type endoglycosidase ou exoglycosidase. 20 Plus particulièrement, les dites glycosidases comprennent au moins une endoglycosidase et de préférence au moins une exoglycosidase. Plus particulièrement encore, les dites glycosidases comprennent au moins une pluralité d'endoglycosidases, de préférence au moins 3 25 endoglycosidases, de préférence encore au moins 5 endoglycosidases, de spécificités différentes en fonction du type de liaisons hydrolysées choisies parmi des liaisons 0-glycosidique, N-glycosidique et Sglycosidique, de préférence parmi les 0-glycosidases et N-glycosidases. 3035409 7 Plus particulièrement encore, les dites glycosidases comprennent au moins trois enzymes choisies parmi les enzymes a-(2->3,6,8,9)-Neuraminidase, 13-(1->4)-Galactosidase, endo-a-N- acetylgalactosaminidase, P-N-Acetylglucosaminidase et la cellulase. 5 On cite en particulier, les P-N-Acetylglucosaminidase de type 0- glycosidase telle que l'EndoH ou de type N-glycosidase telle que la PNGase F. Plus particulièrement encore, les dites glycosidases sont mises en oeuvre à une température de 37°C pendant au moins 3 heures de 10 préférence au moins 8 heures (une nuit) dans un tampon de lyse tel que un tampon comprenant 0.5% Sodium Dodecyl sulfate(SDS) ; 40 mM dithiothréitol (DTT); 50 mM Citrate ou actétate de Sodium, pH=6. On entend ici par «échantillon biologique», des échantillons contenant des tissus et/ou cellules humaines ou animales ou végétales 15 ou microbiennes, plus particulièrement des échantillons de prélèvements cliniques humain ou animal, des prélèvements environnementaux ou des prélèvements d'aliments ou encore des cultures de microorganismes. Plus particulièrement encore, le dit échantillon biologique est un 20 prélèvement clinique humain ou animal choisi parmi les échantillons de selles et échantillons de fluides tel que urine, sang, lavages bronchoalvéolaires, échantillons de sécrétion corporelles tel que salives, selles, sécrétions de muqueuses et sécrétions d'organes sexuels, échantillons de tissus tels que des sections de tissu ou biopsies duodénales, 25 biopsies des valves cardiaques, des végétations et des biopsies pulmonaires ou autres organes. Plus particulièrement encore, le dit échantillon biologique est un échantillon contenant ou susceptible de contenir des bactéries. 3035409 8 Plus particulièrement encore, le dit échantillon biologique est un échantillon de selles et de préférence les glycosidases comprennent au moins une cellulase. Plus particulièrement encore, le dit échantillon biologique 5 comprend des bactéries isolées. Plus particulièrement encore, à l'étape a) de lyse mécanique, on réalise un broyage comprenant le mélange et agitation d'une dudit échantillon avec des billes de verres ou un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide. 10 Plus particulièrement encore, à l'étape b) de dénaturation protéique, on réalise un chauffage, de préférence à 100°C, dans un milieu acide, notamment dans un tampon. 0.5% Sodium Dodecyl sulfate(SDS) ; 40 mM dithiothréitol (DTT)-15 min à 100°C. Plus particulièrement encore, avant l'étape c), on réalise une 15 étape de centrifugation, de préférence de 10000 à 20000g, et on récupère le culot contenant l'ADN, notamment l'ADN bactérien, que l'on met en contact de l'échantillon avec un tampon de lyse contenant au moins une dite enzyme glycosidase pour réaliser l'étape c). Plus particulièrement encore, après l'étape c), on sépare et 20 purifie l'ADN par fixation sur une colonne contenant du silicate ou des particules magnétiques, notamment des billes, puis lavage pour éluer ledit ADN en le séparant de la colonne ou des particules magnétiques par lavage et centrifugation pour récupérer lesdits fragments d'ADN. La présente invention fournit aussi une méthode de détection et 25 quantification d'ADN d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'on quantifie par PCR l'ADN extrait par une méthode d'extraction d'ADN selon l'invention. 3035409 9 La présente invention fournit aussi une trousse de mise en oeuvre d'une méthode d'extraction ou de détection et quantification d'ADN selon l'invention caractérisée en ce qu'elle comprend au moins : - des réactifs pour l'extraction d'ADN et/ou des réactifs pour 5 l'amplification d'ADN, et - des dites glycosidases. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de différents exemples de réalisation en référence aux figures 1 à 5 suivantes. 10 - La figure 1 représente la diversité des espèces représentées par le nombre d'UTO par échantillon en ordonnée par rapport aux nombres de séquences d'amplifiats par échantillon en abscisses obtenus par les méthodes d'extraction 1 à 10 (M1 à M10) de l'exemple 1. - La figure 2 est une représentation de l'analyse en coordonnées 15 principale pour les méthodes d'extractions 1 à 10 (M1 à M10) discutée à l'exemple 1. - La figure 3 représente la diversité des espèces représentées par le nombre d'UTOs par échantillon pour les méthodes d'extraction 1 à 10 de l'exemple 1. Les espèces communes aux 10 méthodes étant 20 regroupées au centre de la figure et reliées entre elles par un trait ; la spécificité et la diversité du nombre d'espèces pour chaque méthode de M1 à M10 étant regroupé autour de chaque noeud périphérique. - Les figures 4A et 4B représentent la quantification par RT-qPCR des séquences de T. whipplei des échantillons traités par un cocktail de 25 glycosidases de 5 biopsies duodénales qui avaient été précédemment analysées et présentaient une réactivité positive en immunohistochimie et négative pour l'amplification de la séquence whi2 de T. whipplei par PCR sans prétraitement de déglycosylation (DB1 à DB5), un échantillon IHC négatif et PCR négatif, ainsi qu'un témoin positif en IHC et en PCR 3035409 10 (Figure 4A) et de 13 lavages broncha-alvéolaires (Cl à C13 , Figure 4B) de l'exemple 2. - La figure 5 représente les effets du traitement enzymatique sur l'extraction d'ADN à l'exemple 3 mesuré par la quantification de l'ADN 5 par RT-qPCR des gènes whi2 de T. whipplei, et le gène de p-actine mammifère sur des échantillons traités et non traités (NT). Exemple 1 : Extraction d'ADN de la flore intestinale d'échantillons de 1 selle. A) Méthodes d'extraction. 10 On a comparé 10 méthodes extractions d'ADN différentes dont plusieurs disponibles dans le commerce, publiées dans la littérature ou précédemment utilisées dans le laboratoire des inventeurs. L'ADN est extrait en duplicata à partir du même échantillon de selles d'une femme obèse de 36 ans avec un indice de masse corporelle (IMC) de 15 30,4 pour toutes les méthodes. La quantité, la pureté de l'ADN et l'amplification par PCR ont été évaluées. Les extraits d'ADN ont été répartis en aliquotes de 10 à 20 pl et congelés à -20 °C pour éviter la répétition des cycles de congélation-décongélation avant l'analyse. 1) Méthode d'extraction comparative 1. 20 L'ADN fécal a été extrait à partir de 0,25 g de selles en utilisant le protocole selles de Qiagen modifié [selles QIAampC) DNA Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France)], comme décrit précédemment (10) et rappelé ci-dessus. 2) Méthode d'extraction comparative 2. 25 0,25 g de selles ont été lyophilisés en utilisant un appareil Lyovac GT2 (GEA Process Engineering, Maryland, USA). Les produits lyophilisés ont été dilués dans 500 pl de tampon de phosphate salin PBS (Phosphate Buffered Saline) et exposés à des ultrasons pendant 1 heure. Par la suite, 25 pl de trypsine (5%) ont été ajoutés aux produits 3035409 11 soniques et ces mélanges ont été incubés 15 minutes à 37°C. L'ADN de ces échantillons a ensuite été extrait en utilisant la méthode d'extraction 1. 3) Méthode d'extraction comparative 3. 5 0,25 g de selles ont été lyophilisés en utilisant un appareil lyophilisateur Lyovac GT2 (de Leybold-Heraeus GmbH,DE ) 220 V. 50 Hz. Max 2,2 kW. Les produits lyophilisés ont été dilués dans 12 ml de tampon PBS, récoltés et broyés en utilisant sous haute pression (30Kpsi) par un dispositif connu sous le nom de « French press » 10 pendant 20 minutes suivant les recommandations du fournisseur (Constant Systems Ltd). L'ADN de ces échantillons a ensuite été extrait en utilisant la méthode d'extraction 1. 4) Méthode d'extraction comparative 4. L'ADN fécal a été extrait à partir de 0,25 g de selles en utilisant 15 le kit d'extraction PowerBiofilmTM DNA Isolation Kit (Mobio, Carlsbad, États-Unis), suivant les recommandations du fabricant. Le principe repose sur la technologie de lyse cellulaire associée à la suppression d'inhibiteurs pour l'augmentation des rendements d'extraction de l'ADN et de l'ARN libre de tous les types de biofilms, y compris les tapis 20 microbiens. 5) Méthode d'extraction 5 selon l'invention. On a ajouté 500 pl de tampon PBS à 0,25 g de selles, qui ont ensuite été homogénéisés en utilisant un dispositif de rupture mécanique par broyage connu sous le nom FastPrepC) (Biomedicals, 25 Santa Ana, Californie, USA), (à 6.5m/s) comme décrit par le fabricant. 200 pl de ce mélange ont été centrifugés à 17.000 rpm (12000g) pendant 10 minutes. Le surnageant a été éliminé. Le culot a été dénaturé dans 200 pl de tampon de dénaturation (New England Biolabs, USA) 10 min à 100°C. On a ensuite ajouté 160 pl de H20, 40 30 pl de tampon de réaction G5 10X suivis de 5 pl d'enzyme EndoHf (New 3035409 12 England Biolabs, USA), 5 pl de cellulase (Sigma, France) et 5 pl de PNGase F (SIGMA). Le mélange a été incubé une nuit à 37°C puis l'ADN a été extrait en utilisant la méthode d'extraction 1). 6) Méthode d'extraction comparative 6. 5 On a ajouté 500 pl de tampon PBS à 0,25 g de selles et traité l'échantillon par ultrasons pendant 2 heures, avec des pulses de 15 secondes pendant 2 minutes avec un dispositif 800 R de Qsonica LLC (USA). On a ensuite ajouté 1 mmole d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) et 0,1 mmol de dodécylsulfate de sodium (SDS), 10 l'ADN a été extrait à partir de ce mélange en utilisant la méthode d'extraction 1. 7) Méthode d'extraction comparative 7. Un total de 0,25 g de selles a été lyophilisé en utilisant un Lyovac GT2. Les produits lyophilisés ont été dilués dans 1 ml de 15 tampon PBS contenant 10 pl de Tween (1%). Ce mélange a été placé dans de l'azote liquide pendant 30 minutes, puis concassé. 500 pl de PBS ont été ajouté et le mélange a été traité aux ultrasons pendant 1 heure. On a ensuite ajouté 25 pl de trypsine (5%), et incubé le mélange pendant 15 minutes à 37 °C. L'ADN a été extrait à partir de ce 20 mélange en utilisant la méthode d'extraction 1. 8) Méthode d'extraction comparative 8. A partir de 0,25 g de selles, ont été ajouté 500 pl de tampon PBS, 1 mmole d'EDTA et 0,1 mmol de SDS ainsi que les enzymes EndoHf (endoglycosidase recombinante de Sigma-Aldrich)(5 pl), la 25 cellulase (5 pl), la PNGase (endoglycosidase recombinante de Sigma- Aldrich (5 pl) et de la proteinase K (12 pl). Ce mélange a été incubé pendant 2 heures à 37°C, et l'ADN a ensuite été extrait en utilisant la méthode d'extraction 1. 3035409 13 Cette méthode 8 se distingue essentiellement de la méthode 5 en ce que le traitement de déglycosilation enzymatique n'est pas précédée d'une lyse mécanique et comprend une dénaturation des protéines par protéinase. 5 9) Méthode d'extraction comparative 9. On a ajouté 500 pl de tampon PBS à 0,25 g de selles, qui ont ensuite été homogénéisés en utilisant un appareil de par rupture mécanique FastPrepC) (Biomedicals, Santa Ana, Californie, USA), (à 6.5m/s) suivant les recommandations du fabricant. L'ADN a été extrait 10 en utilisant la méthode d'extraction 1. 10) Méthode d'extraction 10. Un aliquote (- 500 mg) congelé de chaque échantillon a été suspendu dans une solution contenant 500 pl de tampon d'extraction [Tris 200 mM (pH 8,0), NaCI 200 mM, EDTA 20 mM], 210 pl de SDS à 15 20%, 500 pl d'un mélange de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25: 24: 1, pH 7,9) et 500 pl d'une suspension épaisse de 0,1 mm de diamètre zircone/perles de silice (Biospec Products, Bartlesville). Les cellules microbiennes ont ensuite été lysées par rupture mécanique avec un appareil FastPrepC) à pendant 2 min à température ambiante 20 (à 6.5m/s), puis l'ADN a été extrait avec un mélange de phénol/chloroforme/alcool isoamylique et précipitation à l'isopropanol, comme décrit précédemment (11). B) Méthodes d'amplification d'ADN et de séquençage. Les PCR temps réel ont été réalisées en triplicata sur des 25 appareils CFX96 (Bio-Rad clinical Diagnostics, Marnes-la-Coquetter, France). La qualité de l'extraction a été quantifiée par PCR temps réel en ciblant de l'ADN humain à savoir la séquence codant pour le gène de la 13-globine. Un cycle seuil (Ct : cycle threshold) inférieur à 34 Ct était considéré comme positif. Une PCR universelle vis-à-vis des 30 bactéries ciblant la séquence codant pour l'ADNr 165 (13) a été 3035409 14 réalisée avec le Kit Takyon NoRox Probe MasterMix UNG (Eurogentec, Seraing, Belgique) sur tous les ADN extraits. Séquençage : Les échantillons positifs en PCR temps réel ciblant l'ADNr 165 ont été séquences par la méthode Sanger avec un 5 séquenceur ABI 3130x1 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Villebond Sur Yvette, France). Les séquences ont été assemblées avec le logiciel CodonCode Aligner et alignés contre la banque nucléotidique GenBank (nr/nt). C) Résultats. 10 1) Analyse d'une population microbienne par le pyroséquençage à haut débit de la région V6 de l'ADN ribosomique 165 (15). Les échantillons comprenaient des bactéries principalement des phyla actinobacteria, pro teobacteria, verrucornicrobia, bacteroidetes et firrnicutes. Au sein d'une même espèce, ou d'une communauté 15 bactérienne, il existe une diversité génétique (déterminée par la séquence nucléotidique de la région variable du gène 165). Une UTO (Unité Taxonomique Opérationnelle, OTU en anglais) est un regroupement d'individus d'une même espèce dont les séquences d'ADNr 165 présentent une similitude de plus de 97,5%. Sur la figure 1 20 est présentée les résultats des courbes de raréfaction des différentes méthodes d'extraction. Chaque point représente en ordonnée le nombre d'UTO différent correspondant à la diversité des échantillons en fonction de l'abondance des séquences en abscisse mesuré en log10. Le plus grand nombre d'UTO différentes est obtenu avec la méthode 25 d'extraction 5 qui se distingue largement des autres méthodes d'extraction. Toutes les autres méthodes réalisent un score moins élevé d'UTO, donc une faible représentation de la diversité de l'échantillon, alors que l'abondance de séquences est significativement plus élevée. La méthode d'extraction 8 donnant la plus faible diversité 30 d'espèces comme montré figure 1 et tableau 1 ci-après ce qui s'explique du fait de la présence de l'action de la protéinase qui 3035409 15 dégrade les enzymes glycosidases d'une part et d'autre part l'absence de lyse mécanique préalable. Tableau 1 Méthodes d'extraction Genres. détectes Sensibilité (0/0) Espèces détectés Sensibilité (0/0) Méthode 1 68 20 111 15 Méthode 2 62 18 100 13 Méthode 3 110 33 155 19 Méthode 4 98 29 181 24 Méthode 5 258 77 522 70 Méthode 6 107 32 175 23 Méthode 7 55 16 98 13 Méthode 8 78 23 109 15 Méthode 9 47 14 103 14 Méthode 10 70 21 159 21 TOTAL 336 746 5 2) On a utilisé la méthode dite d'analyse en coordonnées principales (en anglais, Principal Coordinate Analysis ou PCoA) qui a pour but de représenter graphiquement une matrice de ressemblance/différence entre les méthodes d'extraction. La comparaison révèle les différences de la composition apparente des 10 communautés microbiennes obtenues avec les différentes méthodes d'extraction d'ADN. On a constaté que la part des populations microbiennes communes aux méthodes d'extraction, représente une faible partie des populations séquencées. Les différents UTOs obtenus pour chaque méthode ne sont pas toujours les mêmes indiquant que 15 chaque méthode présente une efficacité différentielle préjudiciable à une analyse fine de la composition effective de la communauté bactérienne. La sensibilité de chaque méthode est la mesure du rapport du nombre de genre ou d'espèces détectées par chacune des méthodes sur le nombre total de genres et espèces détectées. La méthode 5, 3035409 16 avec une sensibilité de 77% des genres différents détectés et 70% d'espèces différentes détectées, est la plus représentative de la diversité de l'échantillon initial (tableau 1). 3) Diversité et abondance de l'ADN selon les différentes 5 méthodes d'extraction. La richesse est définie par le nombre de genres différents ou d'espèces différentes présents dans notre échantillon de selle étudié selon l'étude statistique décrite ci-après. 3.1) Etude statistique : 10 Les indices de la richesse et de la biodiversité des différents OTU ont été calculés en utilisant le logiciel mothur, avec la mise en oeuvre de l'indice de Chao1 et la formule non-paramétrique Shannon. La richesse est estimée par l'indice Chao1, alors que la diversité, dépendant de façon dont les séquences se répartissent de façon 15 uniforme sur les différents OTU, a été estimée en utilisant la formule de Shannon non paramétrique. Les courbes de raréfaction ont été calculées et tracées avec une combinaison de progiciels statistiques : mothur et R. A des analyses coordonnées principales (PCoA) au niveau du genre selon les dissemblances de Bray-Curtis a été réalisée en 20 utilisant les corrélations de QIIME. Les coefficients de Pearson entre les différentes méthodes d'extraction d'ADN ont été calculés au niveau du genre utilisant R. Ces matrices de corrélation ont ensuite été transformées dans des matrices de distance, où la distance = (1 - corrélation). Les essais ANOVA ont été utilisés pour identifier les 25 différences significatives entre les paramètres mesurés en fonction des différentes méthodes d'extraction de l'ADN. Pour comparer les méthodes d'extraction, les corrélations entre les différentes méthodes ont été calculées pour l'abondance relative aux niveaux phylum, de la famille et du genre en utilisant des méthodes statistiques non 30 paramétriques (test de Kruskal-Wallis). Enfin, nous avons calculé la sensibilité de chaque méthode d'extraction d'ADN au niveau des genres 3035409 17 et d'espèces par comparaison le nombre d'espèces détectées par chacune des méthodes d'extraction sur le nombre total de genres et espèces détectées. A titre de comparaison de données, nous avons utilisé le Logiciel Epi Info, version 6.0 (Centers for Disease Control and 5 Prevention, Atlanta, GA, USA 394). Une valeur de p 3,6,8,9)-Neuraminidase, 0.5 pl d'Oglycosidase, 0.5 pl de B-(1->4)-Galactosidase, 0.5 pl de B-NAcetylglucosaminidase et 9.5 pl 10X G5 Reaction Buffer issus du kit Enzymatic Protein Deglycosylation (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, USA) et 20 les mélanges ont été incubés sur la nuit à 37°C. Les ADN ont été extraits avec le protocole d'extraction de la méthode contrôle. Les enzymes ci-dessus étaient les suivantes : - EndoHf (Endo-N-Glycosidase recombinante) (New England Biolabs, catalog number= P07035) 25 - PNGase F (Endo-N-Glycosidase recombinante ) (Sigma= Catalog Number P2619) - 0-Glycosidase (endo-a-N-acetylgalactosaminidase de Streptococcus pneumonia) (Sigma= Catalog Number G1163) 3035409 20 -a-(2->3,6,8,9)-Neuraminidase (Sialidase A, exo-glycosidases de Arthrobacter ureafaciens recombinant, expressed in E. cou)) (Sigma= Catalog Number N8271) -13-(1->4)-Galactosidase (exo et endo activités from 5 Streptococcus pneumoniae expressed in E. cou i (Sigma= Catalog Number G0413) B-N-Acetylglucosaminidase (exo-glycosidases, Streptococcus pneumoniae recombinant expressed in E. cou) (Sigma= Catalog Number A6805) 10 3) PCR : Les PCR temps réel ont été réalisées en triplicata sur des appareils CFX96 (Bio-Rad clinical Diagnostics, Marnes-la-Coquetter, France). La qualité de l'extraction a été quantifiée par PCR temps réel en ciblant un ADN de référence, le gène humain de la 13-globine. Un 15 cycle seuil (Ct : cycle threshold) inférieur à 34 Ct était considéré comme acceptable. Les ADN extraits des patients présentant maladie de Whipple ont été testés pour la détection et la quantification de Tropheryrna whipplei (14) avec un système principal un système principal d'amplification du gène whi2 et un système secondaire de 20 confirmation du gène whi3 en cas de résultat positif (14). 4) Résultats La charge bactérienne totale des échantillons a été obtenue après une PCR quantitatvie en temps réel avec le système CFX96TM PCR en temps réel (Bio-Rad). On a utilisé un ensemble amorce-sonde 25 spécifique ciblant les gènes de T. whipplei, et d'un gène rapporteur de référence, la B-actine humaine. La sensibilité d'analyse de la PCR en temps réel ciblant ces gènes ont été déterminés dans des réactions en triplicata en utilisant des dilutions en série de raison 10 d'un titrage connu de T. whipplei produit en culture axénique. 3035409 21 On a travaillé sur des échantillons de patients atteints de la maladie de Whipple, préalablement analysés dans notre laboratoire et qui présentaient une réactivité positive en immunohistochimie (IHC) et une réactivité négative en PCR standard (DB1 à DB5) en parallèle d'un 5 échantillon contrôle positif (IHC+, PCR+) et d'un échantillon contrôle négatif (IHC -, PCR-). La détection et la quantification par RT-qPCR des séquences de T. whipplei dans 5 biopsies duodénales DB1 à DB5 (Figure 4A) et 13 lavages broncho-alvéolaires Cl à C13 (Figures 4B) des échantillons de patients effectuées après glycosidases ont été 10 comparées à celles des mêmes échantillons non traités (témoin négatif Tneg et témoin positif Tpos). Les résultats rapportés sur les figures 4A et 4B montrent que le traitement par glycosidases des échantillons cliniques favorise la détection de l'ADN de T. whipplei de manière très significative (p=0.0003). 15 Exemple 3 : Extraction d'ADN de T. whipplei cultivé à partir de culture axénique. On a utilisé un ensemble de T. whipplei cultivé à partir de culture axénique et une aliquot de l'ADN humain purifié pour servir de témoin externe et l'étalonnage de référence. De ce mélange, on a fait trois 20 aliquotes; la première a été traitée avec un cocktail de glycosidases selon la méthode de glycosylation 1, la seconde avec le lysozyme, le dernier n'a reçu aucun traitement. De chacune des trois aliquotes on a généré trois aliquotes supplémentaires, une de chaque pour l'amplification spécifique par PCR 25 quantitative en temps réel (qPCR) du gène whi2 gène de T. whipplei, une amplification pour le gène p-actine humain. Toutes les amplifications ont été réalisées en triple. La méthode de détermination de la concentration d'un échantillon d'ADN, ou AACt, est l'un des moyens les plus populaires pour déterminer les différences de 30 concentrations entre des échantillons et est basé sur la normalisation avec un gène de référence unique. Le AACt est la différence entre les valeurs de Ct (ACt ech) des échantillons traités ou non, normalisé avec 3035409 22 les valeurs du gène de référence unique le gène p-actine humain traité ou non (ACt actine). L'analyse statistique: Le niveau tout au long de l'étude de signification a été fixé à la valeur P 0.05). Pour chaque gène, on n'a observé aucune différence significative entre 25 chacune des trois réactions individuelles de qPCR (moins de 0,5 de cycles, p 200) (figure 5). 30 3035409 23 Références Bibliographiques 1. Henderson,G. et al. Effect of DNA extraction methods and sampling techniques on the apparent structure of cow and sheep rumen microbial communities. PLoS. One. 8, e74787 (2013). 5 2. McOrist,A.L., Jackson,M., & Bird,A.R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. J. Microbiol Methods 50, 131139 (2002). 3. Schrader,C., Schielke,A., Ellerbroek,L., & Johne,R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012). 10 4. Ariefdjohan,M.W., Savaiano,D.A., & Nakatsu,C.H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutr J. 9, 23 (2010). 5. Oikarinen,S. et al. PCR inhibition in stool samples in relation to age of infants. J. Clin. Virol. 44, 211-214 (2009). 15 6. Costerton,J.W., Stewart,P.S., & Greenberg,E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 284, 1318-1322 (1999). 7. Furukawa,K. & Bhavanandan,V.P. Influences of anionic polysaccharides on DNA synthesis in isolated nuclei and by DNA polymerase alpha: correlation of observed effects with properties of the polysaccharides. Biochim. 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Culturomics identified 11 new bacterial species from a single anorexia nervosa stool 10 sample. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2013 Nov;32(11):1471-81 14. Bousbia,S., Papazian,L., Auffray,JP., Fenollar,F., Martin,C., Li,W., Chiche,L., La Scola,B., Raoult,D. Tropheryma whipplei in patients with pneumonia. Emerg Infect Dis. 2010 Feb;16(2):258-63. 15. Lagier JC, Armougom F, Million M, Hugon P, Pagnier I, Robert C, Bittar F, 15 Fournous G, Gimenez G, Maraninchi M, Trape JF, Koonin EV, La Scola B, Raoult D.Clin Microbiol Infect. 2012 Dec; 18(12): 1185-93. 20 REVENDICATIONS1. Méthode d'extraction d'ADN à partir d'un échantillon biologique ou bactériologique en contenant dans laquelle on réalise un prétraitement comprenant au moins les étapes suivantes de : a) lyse mécanique de l'échantillon biologique, de préférence par broyage, et b) dénaturation protéique, de préférence sans protéinase et c) mise en contact de l'échantillon avec au moins une enzyme glycosidase, de préférence une pluralité de différentes glycosidases. 2. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en que le dit prétraitement est réalisé avant des étapes finales de séparation et purification de l'ADN. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'à l'étape c), on met en oeuvre une pluralité d'enzymes glycosidases de différentes spécificités quant aux types de motifs de sucres dont les liaisons sont hydrolysées et/ou quant aux types de liaisons hydrolysées parmi les liaisons 0-glycosidique ou N-glycosidique ou S-glycosidique et/ou quant aux modes d'action de l'hydrolyse du type endoglycosidase ou exoglycosidase. 4. Méthode selon la revendication 3 caractérisée en ce que les dites glycosidases comprennent au moins une endoglycosidase et de préférence au moins une exoglycosidase. 5. Méthode selon la revendication 4 caractérisée en ce que les dites glycosidases comprennent au moins une pluralité d'endoglycosidases de spécificités différentes en fonction du type de liaisons hydrolysées choisies parmi des liaisons 0-glycosidique et Nglycosidique et S-glycosidique, de préférence 0-glycosidique et N-g lycosid iq ue. 3035409 26 6. Méthode selon la revendication 3 caractérisée en ce que les dites glycosidases comprennent au moins trois enzymes choisies parmi les enzymes a-(2 ->3,6,8,9)-Neura mi nidase, 13-(1->4)-Galactosidase, 13-N-Acetylgl ucosam i nidase, endo-a-N-acetylgalactosaminidase et 5 cellulase. 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que les dites glycosidases sont mises en oeuvre à une température de 37°C pendant au moins 3 heures de préférence au moins 8 heures dans un tampon de lyse. 10 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que le dit échantillon biologique est un prélèvement clinique choisi parmi les échantillons de selles et échantillons de fluides corporels tel que urine, sang, lavages broncho-alvéolaires, échantillons de sécrétion corporelles tel que salives, selles, sécrétions de muqueuses et 15 sécrétions d'organes sexuels, échantillons de tissus tels que des sections de tissu ou biopsies duodénales, biopsies des valves cardiaques, des végétations et des biopsies pulmonaires, ou autres organes corporels. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en 20 ce que le dit échantillon biologique est un échantillon contenant ou susceptible de contenir des bactéries. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce que le dit échantillon biologique est un échantillon de selles et les glycosidases comprennent au moins une cellulase. 25 11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le dit échantillon biologique comprend des bactéries isolées. 12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisée en ce qu'à l'étape a) de lyse mécanique, on réalise un broyage comprenant le mélange et agitation d'une dudit échantillon avec des 3035409 27 billes de verres ou un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre, de préférence encore lavée à l'acide. 13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce qu'à l'étape b) de dénaturation protéique, on réalise un 5 chauffage, de préférence à 100°C, dans un milieu acide. 14. Méthode selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisée en ce qu'avant l'étape c), on réalise une étape de centrifugation, de préférence de 10000 à 20000g, et on récupère le culot contenant l'ADN, que l'on met en contact de l'échantillon avec un tampon de lyse 10 contenant au moins une dite enzyme glycosidase pour réaliser l'étape c). 15. Méthode de détection et quantification d'ADN d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'on quantifie par PCR l'ADN extrait par une méthode d'extraction d'ADN selon l'une des revendications 1 à 14. 15 16. Trousse de mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins : - des réactifs pour l'extraction d'ADN et/ou des réactifs pour l'amplification d'ADN, et - des dites glycosidases. 20