Brevet FR3025720A1 — publié le 20160318

ANTIMICROBIENS POTENTIALISES L'invention a pour objet les composés de formule (I), utilisés à une dose où ils ne présentent plus de propriétés antimicrobiennes, pour leur utilisation en tant qu'agent destinés à la potentialisation des actifs antimicrobiens avec lesquels ils sont co- administrés. En particulier, la combinaison « potentialisateur(s) + antimicrobien(s) » a pour but de prévenir et/ou traiter les infections bactériennes et fongiques chez l'homme ou l'animal. L'invention a également pour objet un procédé pour potentialiser des antimicrobiens dans lequel on co-administre avec ledit antimicrobien un composé (ou plusieurs) de formule (I). Dans ce procédé, on utilise le composé de formule (I) à une dose où il est inactif seul. OBJET DE L'INVENTION 15 Background L'invention a pour objet d'apporter des solutions aux problématiques liées à la baisse ou la perte d'activité des antimicrobiens durant leur période d'utilisation commerciale et médicale. L'invention est donc une solution qui s'applique aux antimicrobiens actuels et qui s'appliquera aux antimicrobiens futurs. 20 Après l'arrivée des antimicrobiens dans les années 1940 il est rapidement apparu que les microbes (bactéries et champignons) avaient la capacité de s'adapter aux antimicrobiens utilisés. L'efficacité de ceux-ci diminue au fil du temps et de leur utilisation. 2 stratégies existent pour lutter contre la résistance, la découverte de nouvelles molécules antimicrobiennes d'une part, et d'autre part l'association avec des 25 molécules destinées à bloquer sélectivement les mécanismes de résistance. Depuis une vingtaine d'années, il est observé une baisse du nombre de nouvelles molécules antimicrobiennes accédant au marché, ce qui a entrainé l'augmentation majeure de la prévalence mondiale de microbes résistants. Il s'ensuit alors une situation complexe pour les patients qui sont plus difficilement soignées de leurs infections 30 microbiennes. 3025720 2 Descriptif L'invention décrit l'utilisation de composés de formules (I) pour potentialiser des antimicrobiens. De façon inattendue, ces composés ont démontré leur capacité de potentialisation de l'effet des antimicrobiens à des doses faibles ( de 0,01 à 100 mg/1) 5 très éloignées de celles où ils peuvent, seuls, présenter des propriétés antimicrobiennes. En conséquence, les antimicrobiens avec lesquels les composés de formules (I) sont coadministrés présentent, du fait de la potentialisation, une activité supérieure à celle usuellement observée. L'invention vise à potentialiser les « antimicrobiens », utilisables chez l'homme 10 ou l'animal et non l'ensemble des composés qui présentent « des propriétés antimicrobiennes », qui eux ne sont souvent pas administrables à l'homme ou l'animal du fait d'une toxicité trop importante ou d'un seuil d'activité antimicrobienne trop élevé nécessitant des doses incompatibles avec la santé. Il est important de rappeler que toute molécule présente, dans l'absolu, des propriétés antimicrobiennes. Les propriétés antimicrobiennes d'une molécule doivent donc s'évaluer en regard de la concentration minimale qui inhibe la bactérie. L'invention se base sur la découverte surprenante que des composés, qui présentent des propriétés antimicrobiennes à des doses très élevées (niveau incompatible avec un usage en médecine pour cet effet) et dont les concentration minimale inhibitrice (CMI) supérieure à 5000 mg/L, avantageusement supérieure à 10 000 mg/L, présentent des effet de potentialisation à des doses faibles (0,01 à 100 mg/1). A ces doses, il devient envisageable d'utiliser les composés (I) chez l'homme ou l'animal. De façon encore aussi surprenante, il a été constaté que l'effet de potentialisation est meilleur à dose faible du composé (I), et que l'effet (pour les composés présentant des propriétés antimicrobiennes à dose très élevées) augmente lorsque l'on s'éloigne de la dose à laquelle le composé (I) présente seul des propriétés antimicrobiennes. Par exemple, il a été constaté de façon inattendue que le cinéole, qui présente des propriétés antimicrobiennes à une concentration de l'ordre du g/L (CMI de 25 000mg/1 à 50 000 mg/1 soit 2,5 à 5%, selon les souches), présente des effets de potentialisation des antibiotiques à ces concentrations proches de la CMI (1 à 3 dilutions). Lorsque l'on diminue sa concentration en dessous de la CMI, le cinéole ne potentialise plus les antibiotiques (voire exemples 2 et 6). Puis, de manière très 3025720 3 surprenante, on a constaté qu'en diminuant encore significativement la concentration en cinéole, de 10 à 50 fois moins que la CMI, le cinéole présente à nouveau des effets de potentialisation sur un très grand nombre d'antibiotiques sur un très grand nombre de souches, cette fois à des doses compatibles avec l'usage médical. 5 Un grand avantage est que les composés (I) utilisés à ces doses éloignées de leur seuil d'efficacité, sont le plus souvent utilisables chez l'homme ou l'animal sans contraintes de toxicité du fait de l'absence de toxicité ou à des niveaux acceptables de toxicité. Cela ne serait pas le cas si l'on souhaitait les utiliser aux doses élevées où ils présentent des propriétés antimicrobiennes voire aux doses proche de leur CMI ou ils 10 pourraient potentialiser les antimicrobiens. De façon tout aussi surprenante l'effet de potentialisation observé avec le composé selon l'invention n'est pas spécifique d'un mécanisme de résistance particulier mais s'observe sur diverses souches, qu'elles aient, ou n'aient pas, développé un ou plusieurs mécanismes de résistance distincts. 15 ART ANTERIEUR L'art antérieur décrit dans de nombreuses publications les propriétés antimicrobiennes de certains composés (I). Ces publications n'anticipent pas l'effet de potentialisation des composés (I) à des doses éloignées de leur seuil d'efficacité. L'art antérieur est conséquent sur les composés (I) car ils appartiennent à des 20 classes chimiques très étudiées dans de nombreux domaines. Les composés (I) dans le cadre de la présente invention présentent les caractéristiques suivantes qui permettent de les écarter de l'art antérieur et qui permettent d'envisager leur usage comme potentialisateur d'antimicrobiens administrés à l'homme et à l'animal: A/ Ils sont utilisés à des doses faibles (0,01 à 100 mg/1), doses éloignées de leur 25 seuil de propriétés antimicrobienne, leur effet de potentialisation n'est pas spécifique de mécanismes d'action ou de résistance particuliers B/ ils ont été validés par des méthodes de screening adaptée à leurs caractéristiques physico-chimiques C/ ils présentent, aux doses ou ils potentialisent, un ratio effet/toxicité qui 30 permet un usage sécurisé chez l'homme ou l'animal 3025720 4 D/ Ils constituent une (des) entité(s) chimique(s) isolée(s) dont les caractéristiques sont reproductibles de façon constante à l'infini car leur méthode d'obtention (synthèse, hémi-synthèse, extraction) le permet. E/ Ils ne possèdent pas de toxicité particulière qui interdirait leur usage même à 5 dose faible (génotoxicité, cardiotoxicité,...) A/ Concernant les niveaux d'activités mesurés dans l'art antérieur Dans l'art antérieur, la concentration utilisée pour observer une activité antimicrobienne n'est pas compatible avec une utilisation future chez l'homme ou l'animal, en particulier lors d'une application systémique. Dans la majeure partie des 10 publications scientifiques, l'usage médical est envisagé alors que les concentrations efficaces mesurées (de l'ordre de plusieurs mg/ml) sont incompatibles avec cet usage. Les effets antimicrobiens mesurés l'ont très souvent été pour des teneurs en huile essentielle, ou de son composé actif, de l'ordre de plusieurs mg/ml. Or, une telle concentration n'est pas adaptée pour une utilisation future chez l'homme ou l'animal, en 15 particulier par voie systémique. 1 mg/m1 correspond à 1 g/1 ou lg/kg ou encore 0,1%. Si la CMI était de 1 mg/ml, il faudrait, en fonction des paramètres de pharmacocinétique, administrer au moins 1 g/kg/j de poids vif. Par exemple, la dose effective pour une vache devrait être au moins 500 g/j et au moins 60 g/j pour l'homme (ceci correspond à la dose minimale car on suppose ici que le produit est totalement absorbé et distribué 20 dans l'organisme). Ces doses bien trop importantes ne sont pas envisageables pour une utilisation sécurisée en thérapeutique. Par exemple on peut citer deux publications qui citent l'effet antibactérien des terpénoïdes et leur éventuel capacité de potentialisation des antimicrobiens : - Biointerfacae Vol 2, Issue 1, 2012, 271-276: Marinas et al : Rosmarinus 25 officinalis essential oil as antibiotic potentiator against Staphylococcus aureus. Si cette publication semble proche de l'invention il est important de noter la dose envisagée (p274) d'eucalyptol qui, à 25 .iL/mL (soit 25 ml /L soit 25 g/1) se situe très loin de la dose administrable à l'homme ou l'animal. Le test de synergie envisagée est réalisé avec la solution de stockage (50% de cinéole) soit 50 g/L, 30 supérieure à la CMI du cinéole dans la publication, dosage incompatible pour une utilisation en médecine.. 3025720 5 - Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2009) 64, 1219-1225 : Hendry et al : Antimicrobial efficacy of eucalyptus oil and 1,8-cineole alone and in combination with chlorhexidine digluconate against microorganisms grown in planktonic and biofilm cultures. 5 Là encore il est envisagé la synergie avec un produit qui présente des propriétés antimicrobiennes. La concentration de cinéole envisagée est de 4 g/L, dose très proche de la CMI du cinéole dans la publication (8-64 g/L) mais trop importante pour être envisageable dans une administration humaine ou animale. Clairement l'invention se différencie de ces deux publications car dans celles-ci les 10 doses envisagées sont très élevées tandis que la concentration envisagée se situe à proximité de la CMI. B/ Concernant l'inadaptation des méthodes décrites dans l'art antérieur Les auteurs ayant travaillé selon des approches différentes (produits actifs seuls, produits naturels,...) sur les familles chimiques comprenant les composés (I) ont en 15 général utilisé les méthodes standard de mesure d'effet antibactérien sans les adapter à la nature hydrophobe et volatile des terpénoïdes et phénylpropanoïdes. Par exemple, WO 99/66796 (Wisconsin Alumni Research Foudation) décrit une méthode pour sensibiliser des cellules microbiennes vis-à-vis de composés antibactériens comprenant une étape de mise en contact avec un composé antibactérien 20 et un sesquiterpenoïde, pour améliorer l'effet du composé antibactérien. Dans cette demande, les CMI ont été déterminées avec la méthode de diffusion sur gélose, inadaptée à la nature volatile et hydrophobe des composés (I) et des familles apparentés. Cette méthode consiste à déposer des disques de papier imprégnés de quantités connues de composés à tester sur une gélose ensemencée avec la bactérie à 25 étudier. Il s'établit sur la gélose un gradient de concentration du composé autour de chaque disque ; après 18 heures on mesure le diamètre du halo d'inhibition. Cette méthode n'est toutefois pas fiable pour les composés hydrophobes qui, en raison de tensions de surface et d'angles de contacts très différents sur les surfaces hydrophiles, interfèrent avec la formation du gradient de concentration dans la gélose. Dans certaines 30 zones, la concentration en composés à tester est bien supérieure à la concentration théorique. Ainsi, les tests ne peuvent pas être quantitatifs, lorsqu'ils peuvent être qualitatifs. En outre, on note une dilution du composé hydrophobe à tester dans 3025720 6 l'éthanol, sans toutefois corriger le résultat alors que l'éthanol est un composé antibactérien et volatil. A noter que cette demande enseigne qu'aucun effet n'est obtenu avec des terpènes autres que les sesquiterpènes. 5 C/ Concernant la toxicité des composés de l'art antérieur A propos des composés et compositions naturelles, il y a une confusion entre l'origine naturelle et l'absence de toxicité. Les huiles essentielles (et leurs dérivés) sont habituellement décrites comme étant peu toxiques, ce qui est souvent vrai dans des applications alimentaires ou en parfumerie mais erroné dans le cadre d'une 10 administration thérapeutique. A propos des composés chimiques isolés, la confusion existe aussi et repose sur l'origine naturelle (extraction) des composés. Par exemple W02006/120567 (Advanced Scientific developments) décrit des compositions pharmaceutiques comprenant au moins une substance thérapeutique active 15 et décrite comme non toxique, choisie parmi carveol, thymol, eugenol, borneol, carvacrol, alpha-ionone, beta-ionone, et leurs isomères, dérivés et mélanges, et comprenant, à titre de deuxième substance thérapeutique active un antibiotique. Le carveol, thymol, eugenol, borneol, carvacrol, alpha-ionone, ou beta-ionone, utilisés seuls, présentent une activité antibactérienne et nombre d'entre eux posent cependant 20 également des problèmes de toxicité, ignorés dans cette demande. Par exemple, le carvacrol présente les données de toxicité suivantes: la DL 50 (souris, intraveineuse) est de 80 mg/kg tandis que la dose létale la plus faible en voie orale est de 100 mg/kg, chez deux espèces mammifères (chat et rat). Ces données sont à mettre en regard de la dose de 0,3 mg/m1 (soit 300 mg/kg), envisagés dans le document. 25 D/ Concernant la variabilité chimique des composés décrits dans l'art antérieur L'utilisation d'huile essentielle est problématique, à l'échelle industrielle, en termes de qualité et de reproductibilité étant donné que la composition d'une huile essentielle varie d'un lot à l'autre. Par exemple DE 196 31 037 (Boehringer) décrit l'utilisation de l'huile 30 essentielle d'arbre à thé pour potentialiser l'effet d'antibiotiques sur les souches Staphylococcus aureus. Le composant principal l'huile essentielle d'arbre à thé est le terpinen-l-ol. 3025720 7 Cette variabilité a notamment trois conséquences qui limitent industrialisation en vue d'une application chez l'homme ou l'animal: - il est difficile d'assurer la constance de l'effet thérapeutique - Il est difficile d'assurer la faible toxicité des produits 5 - le coût relatif à l'approvisionnement et au management de la qualité et de la reproductibilité des matières est important. Le tableau suivant récapitule l'enseignement de ces arts antérieurs : A/ Produits B/ Métlude de CI Toxicité D/ Problènr de Doseerivisagée tifs à dose envisagée suce-ling à la dose valiabfliËchimique incompatible avec la lubie damique des envisagée COMPOSéS Maiinasetal Oui Oui Oui Non 15 g/L soit 15 000 mg/1 Henchy etal Oui Non Oui Non 4 g/L soit 4 000 mg/1 WO 2009/043987 Ammatedinologies Oui Oui Oui Oui 0,1 à 0,4 % soit : 1 à 4 000 mg/L WO 2006/120567 Aclvanoed Oui Oui, (pas &gent Oui Non 0,3 mg/mi soit 3 000 mg/1 disposant) DE 19631037 &changer Oui Non (testcanslelait) Oui Oui 1 à 2 mg /ml soit 1000 à 2000 mg /1 WO 99/66796 Oui Oui Oui Non 1 mM soit 222 mg/L (pour le sesquiterpenoides) WiszonsinAlumni Piésente hwention Non Non Non Non 0,01 à 100 mg/L Tableau 1 Le travail portant sur des composés (I) à des doses faibles éloignées de celles 10 auxquelles ils présentent une activité antimicrobienne est nouveau et l'art antérieur n'a pas, à notre connaissance, envisagé cet usage. DEFINITIONS Par « micro-organisme », on entend tout organisme vivant, invisible à l'oeil nu en raison de ses faibles dimensions. 15 Par « organisme », on entend toute entité biologique (être vivant) animale ou végétale capable de naître, de se développer et normalement de se reproduire. 3025720 8 Dans ce brevet la définition de microbe reprend la définition de micro-organisme, limitée au champ médical auquel l'invention se réfère. Ainsi les « microbes » sont les microorganismes vivants potentiellement pathogènes (bactéries, champignons, levure et mycobactéries). Le terme exclue donc les pathogènes inertes comme les virus et les 5 prions. Par « antimicrobien » on entend tout composé destiné à être administré à l'homme ou l'animal capable de tuer ou d'inhiber la croissance de microbes. Les sels pharmaceutiquement acceptables de ces antimicrobiens sont également inclus dans cette définition. Cela inclut, par exemple, les sels de sodium, de potassium, de calcium, etc. et 10 les sels aminés de procaine, dibenzylamine, éthylendiamine, éthanolamine, méthylglucamine taurine, etc., de même que les sels d'addition acide tels que les hydrochlorures et les acides aminés basiques. Le terme regroupe ainsi les antibiotiques (leurs associations avec les inhibiteurs de mécanismes de résistance), les antifongiques destinés à un usage systémique ou local. 15 Par « propriétés antimicrobiennes » on entend les propriétés d'une quelconque substance capable de détruire ou d'inhiber la croissance des microbes. Les produits qui présentent des propriétés antimicrobiennes comprennent notamment les antimicrobiens et les biocides. Par opposition au terme « antimicrobien » qui regroupe les antibactériens, 20 antifongiques destinés à être administrés, le terme « biocide » regroupe les produits ayant des propriétés antimicrobiennes destinés à être appliqués à des systèmes inertes (virus et prions). Par « propriétés antibactériennes » et « propriétés antifongiques » on entend non seulement les propriétés bactéricides et fongicides caractérisées par la destruction des 25 bactéries et champignons (et levures, mycobactéries), mais également les propriétés bactériostatiques et fongistatiques, caractérisées par l'inhibition de la croissance desdites bactéries et champignons (et levures, mycobactéries). Les produits qui présentent des propriétés antibactériennes ou antifongiques comprennent notamment les antimicrobiens. 30 Par « bactérie résistante » aux antibiotiques on entend, au sens de la présente invention, une bactérie résistante à au moins un, notamment au moins deux, en 3025720 9 particulier au moins trois, voire au moins quatre, antibiotique(s) ou famille(s) d'antibiotique, classiquement utilisé(s). Par « bactérie multi-résistante » on entend, au sens de la présente invention une bactérie résistante à plusieurs antibiotiques, en particulier pour lesquels la souche 5 devrait être sensible, ou a priori sensible, tout particulièrement une bactérie qui présente au moins deux résistances non naturelles. On distingue les « résistances naturelles » des « résistances acquises ». Certains antibiotiques n'ont jamais été efficaces, à des doses non toxiques, contre certaines souches ou espèces bactériennes. Il s'agit d'une résistance naturelle. Lorsque des 10 antibiotiques normalement efficaces ne s'avèrent pas ou peu efficaces vis-à-vis d'une bactérie, cette bactérie a développé une résistance acquise. Une « infection microbienne » au sens de la présente invention désigne une infection provoquée par une ou plusieurs souches microbiennes et inclut les phases allant de la colonisation de l'hôte aux phases pathologiques. L'expression « infection 15 microbienne » englobe donc tout effet néfaste, signe clinique, symptôme ou toute maladie apparaissant chez l'homme ou l'animal suite à la colonisation par le microbe. Par "terpenoïde" on entend selon l'invention tout composé comprenant un squelette proche d'un terpène. Un « terpène » désigne un dérivé de l'isoprène qui est obtenu par voie biologique par la condensation d'unités en C5, conduisant par exemple 20 aux monoterpènes, sesquiterpenes. Par « proche » on entend que le squelette est similaire à un terpène ou différent en ce qu'au moins un substituant alkyle, normalement présent, peut être absent ou porté par un autre atome. Le squelette peut en outre être substitué par des radicaux variés tels que des radicaux aliphatiques, saturés ou insaturés, linéaires ou cycliques (alkyles, alcényles, alkylènes), oxy, des aldéhydes, des 25 esters, des alcools, des éthers et leurs équivalents soufrés ou azotés. Le terpénoïde peut avantageusement être d'origine naturelle. Par "phenylpropanoide" on entend selon l'invention tout composé comprenant un squelette proche d'un phénylpropane. Un « phenylpropane » désigne un dérivé obtenu par synthèse biologique à partir du phénylpropane et conduisant à des dérivés en 30 C6 (aromatique)-C3 (aliphatique) ou en C6 (aromatique)-C1 (aliphatique) et aux lactones correspondantes. Par « proche » on entend que le squelette est similaire à un phénylpropane, en particulier on retrouve le motif phényle, ou différent en ce qu'au 3025720 10 moins un substituant alkyle, normalement présent, peut être absent ou porté par un autre atome. Le squelette peut en outre être substitué par des radicaux variés tels que des radicaux aliphatiques, saturés ou insaturés, linéaires ou cycliques (alkyles, alcényles, alkylènes), oxy, des aldéhydes, des esters, des alcools, des éthers et leurs équivalents 5 soufrés ou azotés. Le phénylpropanoïde peut avantageusement être d'origine naturelle. Le terme « prophylaxie » ou « prévenir une infection » tel qu'utilisé dans la présente demande désigne tout degré de retardement dans le moment d'apparition de signes cliniques ou de symptômes de l'infection, ainsi que tout degré d'inhibition de la sévérité des signes cliniques ou symptômes de l'infection, y compris mais sans 10 limitation à, la prévention totale de ladite infection. Ceci nécessite que l'antimicrobien et le composé selon l'invention soient co-administrés à l'homme ou l'animal susceptible d'être colonisé par une souche microbienne à titre préventif, par exemple suite à un acte de chirurgie, d'implantation d'un dispositif médical, un acte médical intrusif. Cette administration prophylactique peut avoir lieu avant, pendant ou après l'acte susceptible 15 de provoquer une infection (en particulier une infection nosocomiale) dans le but d'empêcher, améliorer, et/ou réduire la sévérité de n'importe quelle infection subséquente. Le terme « traitement » au sens de la présente demande implique que l'antimicrobien et le composé selon l'invention soient co-administrées à un sujet 20 (humain ou animal) au moment de la colonisation ou après la contamination ou la suspicion de contamination par une souche microbienne susceptible de provoquer une infection telle qu'une infection nosocomiale. Le terme « traitement » ou « traiter une infection » inclut donc : tout effet curatif (inhibition de la croissance ou destruction du microbe) 25 obtenu grâce à la co-administration antimicrobien + composé selon l'invention ainsi que l'amélioration des signes cliniques ou des symptômes observés de même que l'amélioration de l'état du sujet. le ralentissement, l'interruption, ainsi que l'arrêt de la progression de l'infection. La co-administration antimicrobien-composé selon l'invention peut 30 en effet également permettre de ralentir la progression d'un microbe et/ou empêcher complètement ou partiellement une infection microbienne de s'étendre aux tissus environnants et au-delà. 3025720 11 - l'inhibition, l'atténuation ou la prévention des conséquences néfastes de l'infection telles que les dommages cellulaire ou physiologiques provoqués par les toxines produites par certains microbes au niveau des tissus infectés ou avoisinants. 5 Le terme « co-administrés » signifie que l'antimicrobien (ou le mélange antimicrobien) et le composé selon l'invention (ou le mélange de composés selon l'invention) sont administrés sous forme combinée ou juxtaposée au sujet (homme ou animal). La combinaison inclut toute association médicamenteuse, toute composition pharmaceutique, tout kit pharmaceutique, et tout médicament comprenant (i) au moins 10 un antimicrobien et (ii) au moins un composé selon l'invention. Les composés (i) et (ii) peuvent être présents sous la forme d'un mélange ou sous la forme de formulations ou compositions distinctes dans ladite combinaison. La combinaison peut également comprendre plusieurs antimicrobiens, par exemple 2, 3 ou 4 antimicrobiens ou plus, et/ou plusieurs composés selon l'invention, en particulier 2 ou 3 ou plus composés selon 15 l'invention. Ces constituants forment une unité fonctionnelle du fait d'une indication commune, qui est la mise en oeuvre d'un traitement antimicrobien. Cette thérapie combinée est plus spécifiquement destinée à la prophylaxie et/ou au traitement d'infections et de maladies d'origine microbienne, en particulier des infections nosocomiales. 20 La co-administration peut être simultanée ou étalée dans le temps. Le terme « simultané » signifie que l'antimicrobien (ou le mélange antimicrobien) et le composé selon l'invention (ou le mélange de composés selon l'invention) sont administrés en même temps, au même moment, à un sujet (homme ou animal). Ces composés peuvent être administrés sous la forme d'un mélange ou, 25 simultanément mais séparément, sous la forme de compositions distinctes. L'expression « administration séquentielle » signifie que l'antimicrobien (ou le mélange antimicrobien) et le composé selon l'invention (ou le mélange de composés selon l'invention) sont administrés non pas simultanément mais séparément dans le temps, l'un après l'autre. 30 L'expression « potentialiser » un antimicrobien signifie que l'utilisation d'un composé selon l'invention permet d'obtenir un effet prophylactique ou thérapeutique supérieur à l'effet prophylactique ou thérapeutique obtenu en utilisant le ou lesdits 3025720 12 antimicrobiens seuls. Ceci peut s'exprimer de différentes manières, alternatives ou cumulatives :augmentation de l'effet de l'antimicrobien, diminution de la dose d'antimicrobien à effet constant d'antimicrobien, réduction de la CMI. En outre, la potentialisation permet de réduire, voire annihiler, l'apparition de résistance. 5 L'expression augmenter l'effet d'un antimicrobiens signifie : l'élargissement du spectre microbien de l'activité de l'antimicrobien, l'augmentation de la vitesse d'action de l'antimicrobien, l'amélioration du succès clinique (cure rate) ou de la vitesse de l'obtention du succès clinique (time to cure) de l'antimicrobien, à dose constante d' antimicrobien. 10 L'expression « diminuer la quantité d'antimicrobien utilisée » signifie que l'utilisation de composé selon l'invention permet d'utiliser une quantité d'antimicrobien inférieure à la quantité d'antimicrobien normalement nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique ou prophylactique donné lorsque l'antimicrobien est administré seul. La diminution de la quantité d'antimicrobien utilisée peut être plus ou moins importante ; 15 elle est de préférence d'au moins 10%, et plus préférablement d'au moins 20 %, encore plus préférablement d'au moins 40%, voire 50% ou plus par rapport à la quantité normalement nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique ou prophylactique donné. « CMI » signifie « concentration minimale inhibitrice », qui est la plus faible concentration de substance à laquelle on n'observe plus de croissance microbienne 20 après 18 à 24h de contact dans des conditions favorables à la croissance microbienne La détermination de la CMI est réalisée en routine par la méthode "CLSI". Par « atome d'halogène », on entend, au sens de la présente invention, les atomes de fluor, de chlore, de brome et d'iode. Par « hétéroatome », on entend, au sens de la présente invention, N, O ou S, 25 avantageusement O. Par groupement « (Ci-C6)alkyle », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée monovalente saturée, linéaire ou ramifiée, comportant 1 à 6, de préférence 1 à 4, atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle 30 ou encore hexyle. Par groupement « (C2-C6)alcényle », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée monovalente, linéaire ou ramifiée, comportant au moins une 3025720 13 double liaison et comportant 2 à 6 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes éthényle ou allyle. Par « (Ci-C6)halogénoalkyle », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (Ci-C6)alkyle, tel que défini ci-dessus, pour lequel un ou plusieurs atomes 5 d'hydrogène ont été remplacés par un atome d'halogène tel que défini ci-dessus. Il peut s'agir en particulier d'un groupe CF3. Par groupement « (Ci-C6)alcoxy », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (Ci-C6)alkyle tel que défini ci-dessus, lié au reste de la molécule par l'intermédiaire d'un atome d'oxygène. A titre d'exemple, on peut citer les groupes 10 méthoxy, éthoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy ou encore tert-butoxy. Par groupement « (C2-C6)alcénoxy », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (C2-C6)alcényle, tel que défini ci-dessus, lié au reste de la molécule par l'intermédiaire d'un atome d'oxygène. A titre d'exemple, on peut citer le groupe -OCH2CH=CH2. 15 Par groupement « (Ci-C6)alkylène » ou « (Ci-C6)alcanediyle », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée divalente, linéaire ou ramifiée, comprenant 1 à 6 atomes de carbone, comme par exemple, un groupement methylène, éthylène, propylène, butylène, pentylène ou encore hexylène. Par groupement « (C2-C6)alcénylène » ou « (C2-C6)alcènediyle », on entend, au 20 sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée divalente, linéaire ou ramifiée, comprenant 2 à 6 atomes de carbone et au moins une double liaison, comme par exemple, un groupement vinylène (éthénylène) ou propénylène. DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention a pour objet un agent antimicrobien potentialisé par un composé de formule 25 I pour son utilisation dans le traitement d'une infection microbienne. Elle a ainsi pour objet une association d'un agent antimicrobien et d'un composé répondant à la formule I suivante : R1, R2, R3 (I) 3025720 14 dans laquelle R1, R2, R3 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, H, OH un groupe (Ci-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C1-C6)halogénoalkyle, (Ci-C6)alcoxy, (C2- C6)alcénoxy, (C -C6)halogénoalcoxy, -0-00-(C1-C6)alkyle ; A représente un hétéroatome ou un groupe R-(Het)-R' ou -(Het)-R où R, R', 5 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un groupe (Ci-C4)alcanediyle éventuellement substitué par des radicaux alkyles en C1-C4 et Het représente un hétéroatome en un ratio massique, composé de formule (I) : agent antimicrobien, variant de 8 :1 à 1 :10, et en ce que l'agent antimicrobien n'est pas un terpénoïde ou un 10 phenylpropanoide. L'agent antimicrobien est avantageusement un actif de la médecine conventionnelle occidentale, tel que cela sera décrit par la suite. En particulier, l'agent antimicrobien n'est pas un terpénoïde ou un phenylpropanoide, tel qu'un extrait d'huile 15 essentielle ou un composant d'huile essentielle. Le ratio massique composé de formule (I) : agent antimicrobien variant plus avantageusement de 4 :1 à 1 :10, plus avantageusement de 1 :1 à 1 :10, encore plus avantageusement de 1 :1 à 1 :5. Cela signifie que la dose administrée en composé de formule (I) est du même 20 ordre de grandeur, que celui de l'agent antimicrobien. Le ratio massique correspond au ratio des doses en mg/kg du composé et de l'agent antimicrobien à administrer à l'homme ou l'animal. D'une manière surprenante, il a été constaté que l'effet de potentialisation diminue lorsque la dose en composé selon l'invention (ou mélange de composés selon 25 l'invention) augmente. Cet effet de potentialisation peut réapparaître à la CMI du composé seul, mais cela n'est pas l'objet de l'invention. Dans le cadre de la présente invention, in vitro, la concentration en composé inactif, à laquelle on observe un effet de potentialisation, est très éloignée du seuil des propriétés antimicrobiennes (CMI), lorsque des propriétés antimicrobiennes sont 30 observées. Par très éloignée, on entend que la concentration in vitro est au moins 10 fois, avantageusement au moins 20 fois, plus avantageusement au moins 50 fois, encore plus avantageusement au moins 100 fois inférieure à la CMI. 3025720 15 En particulier, sur une souche A, la concentration en composé (I) répond avantageusement à l'équation suivante : [C] 2, 6 5 rrn ,--, oc 0,2 5 4 8 8 8 8 8 8 8 8 8 0,5 8 >2, 5 ,--, 0,2 5 4 4 8 8 8 8 8 8 8 8 8 0,5 8 >2, ,--, 5 oc ,r) 0.2 5 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 0.5 8 >2, 00 5 3025720 29 --, 4 8 8 8 16 8 8 8 8 8 8 8 0,5 8 >2, 5 oc Staphylococcus 0.2 16 4 8 8 8 8 8 8 8 8 8 0,5 8 >2, 5 oc --, oc Tableau 11 Le code couleur permettant d'interpréter les résultats est le suivant : aucune couleur si la CMI est équivalent avec et sans booster, gris si la valeur est inférieure avec booster. On constate que le cinéole est capable de potentialiser (phénomènes additifs) 5 l'amoxycilline à des concentrations très élevées (CMI 50 000mg/L). Lorsque la concentration en cinéole diminue, il n'y a plus de phénomènes potentialisation. D'une manière surprenante, cette potentialisation réapparait lorsque la dose en cinéole est très faible. Des essais ont également été réalisés avec l'augmentin® (amoxycilline/acide 10 clavulanique) où on observe les mêmes résultats. Un isobologramme établissant la courbe de la CMI d'amoxicilline observée en fonction de la concentration (dilution) de cinéole (souche : SA8238) est reporté sur la figure 1. On constate une synergie à des doses de cinéole importantes et faibles, avec un discontinuum inattendu. Exemple 3 : etest 15 Les tests correspondant sont effectués sur la base du test de CMI usuel : la bandelette etest® (Biomérieux) est déposée à la surface d'une gélose ensemencée dans laquelle le booster a été incorporé. Ce test permet de minimiser les risques d'effet solvant, à savoir une éventuelle interaction avec le solvant utilisé in vitro. On mesure la CMI de l'antibiotique seul, ou en association avec le cinéole à trois 20 concentrations différentes (lmg/L, 4mg/L, 16mg/L) dans différents solvants (Tween®80 ou DMSO) 25 3025720 30 Coli 8150 Coli 8138 MRSA 10178 (pénicillinase) CMI en mg/L (.7 = Pipera tazo Meropenen Cefoxitine Pipera tazo Cefoxitine = "t; a) "t; 0 >, a) = >, e E-, 5 .e 0 . e H temoin 0,125 0,75 0,047 3 6 6 0,125 0,094 1 temoin Tween eau 0,125 1 0,094 6 6 6 0,125 0,19 0,5 Témoin DMSO 0,19 1,5 0,094 8 16 6 0,25 0,064 1,5 Cineole lmg Tween/eau 0,125 1,5 0,064 3 , 4 0,125 0,064 0,5 Cineole lmg DMSO 0,19 1 0.064 8 6 4 0.19 0,094 0.-5 Cineole 4mg Tween/eau 0.094 0.-5 (or 3 6 3 0.094 0,064 0.38 Cineole 4mg DMSO 0.125 I 0.064 3 8 4 0,19 0,064 0,5 Cineole 16mg 0.1 0.1 0,1 1 2 1 0,094 0,047 0,125 Tween/eau Cineole 16mg DMSO 0.0(4 0.-5 6.064 3 6 4 0,125 0,047 0.19 Tableau 12 D'autres e-tests sont également réalisés en DMSO avec l'amoxycilline en présence ou non de cinéole. Les tests sont reportés dans le tableau suivant : témoin Cinéole 16 mg/L Cinéole 4 mg/L Amox Amox Amox ATCC25922 16 12 12 ô Liu 8141 8 0,1 8150 8 0.1 6 8156 12 Staphylococcus 8143 2 1.5 8146 0,5 0,19 0,38 8149 1 0_38 0,5 8240 24 16 12 8241 32 12 10168 Tableau 13 5 Une potentialisation est observée sur toutes les souches. D'autres e-tests sont également réalisés avec l'amoxycilline/acide clavulanique (Augmentin®) en présence ou non de cinéole (témoin : pas de cinéole, CIN16 : cinéole 3025720 31 à 16mg/L, CIN4 : cinéole à 4mg/L) DMSO. Les tests sont reportés dans le tableau suivant : témoin CIN16 CIN4 ATCC25922 12 6 E.coli 8141 6 0,1 z.J z.J o z.J 8146 0,38 019 0,25 z4 o ''' 8149 0,75 0,38 0,5 8238 1 0,75 0,38 8239 6 6 8240 4 8241 12 12 10168 0,75 0,5 0,38 Tableau 14 D'autres e-tests sont également réalisés sur des Pasteurelles. Les résultats sont rapportés 5 dans les tableaux suivants : 14012 Amox Augmentin ciprofloxacine meropenem cefoxitine Temoin ED 0,032 0,094 0,004 0,008 0,5 Temoin DMSO 0,094 0,094 0,006 0,008 0,5 Témoin TE 0,19 0,19 0,006 0,023 0,75 Cineole 5mg eau 0,094 0,094 0,003 0,006 0,5 Cineole 5mg DMSO 0,094 0,094 0,004 0,006 0,5 Cineole 5mg TE 0,094 0,094 0,004 0,008 0,5 Cineole 10 mg eau 0,094 0,125 0,004 0,008 0,5 Cineole 10 mg 0,125 0,125 0,004 0,006 0,38 DMSO Cineole 10 mg TE 0,094 0,125 0,006 0,008 0,5 Tableau 15 14013 Amox Augmentin ciprofloxacine Temoin ED 0,19 0,19 0,012 Temoin DMSO 0,19 0,25 0,012 Témoin TE 0,25 0,25 0,016 Cineole 5mg eau 0,25 0,25 0,012 Cineole 5mg DMSO 0,25 0,19 0,012 Cineole 5mg TE 0,25 0,25 0,012 Cineole 10 mg eau 0,19 0,19 0,016 Cineole 10 mg DMSO 0,25 0,19 0,012 Cineole 10 mg TE 0,125 0,19 0,012 Tableau 16 3025720 32 14014 Temoin ED Amox meropenem cefoxitine Temoin DMSO 0,125 0,016 0,38 Témoin TE 0,094 0,012 0,5 Cineole 5mg eau 0,19 0,016 0,5 Cineole 5mg DMSO 0,094 0,012 0,19 Cineole 5mg TE 0,094 0,016 0,38 Cineole 10 mg eau 0,125 0,016 0,38 Cineole 10 mg DMSO 0,125 0,016 0,5 Cineole 10 mg TE 0,094 0,012 0,38 Temoin ED 0,094 0,012 0,38 Tableau 17 Exemple 4 : test de croissance / test de bactéricidie 5 1 Test de croissance sur la souche 10168 Les tests de croissance sont faits en milieu liquide avec une dispersion du booster des antibiotiques préalable dans un solvant adapté. On mesure la cinétique de croissance des bactéries en présence d'Augmentin®, d'Augmentin® boosté cinéole ou de cinéole. 10 Les résultats sont reportés sur la figure 2 (souche 10168, genre Staphylococcus), dont la légende est : Carré : témoin (bactérie seule) Triangle : Augmentin® dilué dans un mélange Tween®80/eau à une concentration de 4 fois sa CMI 15 Croix (x) : Augmentin® et le cinéole, dilués dans un mélange Tween®80/eau, l'Augmentin® est à une concentration de 4 fois sa CMI, ratio massique Augmentin® / cinéole de 64/100 Etoile (*) : cinéole seul dilué dans un mélange Tween®80/eau. On constate que la présence de cinéole, à une très faible dose, permet d'accélérer la 20 vitesse de bactéricidie de l'Augmentin®. 2 Effet post antibiotique sur la souche 08150 (CMI de l'Augmentine= 4 mg/L) On compte le nombre de bactéries après 16h de contact en présence d'augmentin® (AC) et/ou de cinéole, puis plusieurs heures après la fin de mise en contact. L'Augmentin® est utilisé à sa CMI. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant : 3025720 33 temps de contact de l'augmentin®+cineole de 16h temps (h) témoin AC CMI AC CMI AC CMI Cinéole 16mg/L Cinéole 4mg/L Cinéole 16mg/L Cinéole 4mg/L 0 2,47E+07 2,53E+05 1,40E+04 1,00E+02 2,20E+07 2,17E+07 1 9,20E+06 3,40E+04 7,80E+03 9,00E+03 3,88E+07 4,92E+07 2 7,10E+07 1,60E+05 5,10E+04 3,00E+03 6,40E+07 5,50E+07 3 2,07E+08 1,84E+06 7,60E+05 3,60E+04 2,70E+08 3,90E+08 4 3,10E+08 9,90E+06 6,40E+06 3,40E+05 4,20E+08 3,50E+08 5 6,60E+08 3,70E+07 3,55E+07 2,37E+06 5,50E+08 5,90E+08 6 4,10E+08 2,10E+08 2,00E+08 1,27E+07 5,90E+08 6,00E+08 Tableau 18 On constate que l'ajout de cinéole permet de réduire significativement le nombre de bactéries, y compris après la mise en contact. 3 Effet post antibiotique sur la souche 08152 (CMI de l'Augmentine= 0,5mg/L) 5 On compte le nombre de bactéries après 16h de contact en présence d'augmentin® (AC) et/ou de cinéole, puis plusieurs heures après la fin de mise en contact. L'Augmentin® est utilisé à une concentration de 4 fois sa CMI. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant : Temps (h) témoin AC 4x AC 4xCMI AC4xCMI Cinéole 4mg/L Cineole 16mg/L Cineole 4mg/L CMI Cinéole 16mg/L 0 1,24E+07 5,50E+02 2,90E+02 1,50E+02 9,00E+06 8,00E+06 1 9,30E+06 1,18E+03 5,50E+02 3,00E+02 1,64E+07 1,50E+07 2 2,74E+07 1,19E+03 4,60E+02 101° UFC/ml) sont étalés sur une boîte de Mueller Hinton contenant une concentration d'huile égale à 4 fois la CMI du produit à tester. Après 48h d'incubation on observe la 5 présence ou non de colonies susceptibles d'être des mutants résistants. On a constaté que l'utilisation de cinéole permettait également de diminuer l'apparition de bactéries résistantes. Les résultats sont reportés dans les tableaux suivants : Témoin Témoin DMSO envahie envahie Ciprofloxacine DMSO Ciprofloxacine / cinéole 1 :1,5 DMSO envahie 0 Tableau 20 - Souche 10168 / MRSA 10 Alors que la ciprofloxacine seule sur le S. aureus résistant à la méthicilline (MRSA) entraine l'apparition d'innombrable mutants, l'ajout de cinéole à la ciprofloxacine n'entraîne plus l'apparition des mutants Témoin Témoin DMSO envahie envahie Ciprofloxacine DMSO Ciprofloxacine / cinéole 1 :1,5 DMSO Nombreux 26 Tableau 21 - Souche 9003 / BLSE Là encore la cinéole, entraine la diminution d'apparition de mutants sur une souche à 15 gram négatif résistante. Exemple 6 : Modèle de sepsis 200 !IL d'une solution bactérienne (IVIRSA) ajustée à 5.108 CFU/ml est injectée par voie intraveineuse (voie retro-orbitale) à des souris CD1. Le traitement est commencé 1 20 h après l'injection bactérienne par voie sous cutanée. A 24 h, les souris sont euthanasiées et un comptage bactérien est effectué dans le rein. Test Vivo 1 : injection d'amoxicilline :acide clavulanique (AMC) à dose variable (0,25 mg/kg, 2 mg/kg, 16 mg/kg et 128 mg/kg)+ cinéole (B) à dose constante (30 mg/kg), 3025720 injectés 2 fois par 24 (H+1 et H+4). Témoins : groupe non traité et groupe recevant 30 mg/kg de cinéole sans antibiotique. Nombre de bactéries 1og10 CFU/g rein Les résultats sont reportés sur la figure 3. Test vivo 2 Injection d'amoxicilline : clavulanique (AMC) à dose constante (8mg/kg) + 5 cineole (B) à dose variable (4 mg/kg, 64 mg/kg, 128 mg/kg, 256 mg/kg, 512 mg/kg) injectés 2 fois par jour. Témoins : groupe non traité, groupe recevant 32 mg/kg de cinéole sans antibiotique (CIN), groupe recevant 8 mg/kg d'antibiotique sans cinéole (AMC8). (*) p 24h Moyenne groupe 3 25 3,5 2,45 0,1505 0,5005 0,3 27,3235 24h Tableau 23 20 3025720 37 0,25 h 0,5 1 h 2h 4h 8h 24 h AUC 0-24h Temps h passé au dessus de la CMI Moyenne groupe 5 5,5 1,75 2,15 1,75 0,3 0,3 0,01 9,56125 24h Tableau 24 Le rapport de la concentration plasmatique rapporté à la CMI est obtenu par les dilutions successives du plasma. Bien que cette méthode soit semi quantitative, elle permet néanmoins de montrer que l'effet est plus intense quand le cinéole est présent 5 (AUC supérieure). De même et de façon univoque, l'ajout de cinéole permet d'allonger le temps passé au dessus de la CMI. Ce résultat est en ligne avec la courbe de la figure 2, réalisée in vitro. Liste des abréviations : 10 Amox amoxycilline Aug augmentin® Staph Staphylococcus Coli E. coli Pyo Pseudomonas aeruginosa 15 AUC aire sous la courbe REVENDICATIONS1. Association d'un agent antimicrobien et d'un composé de formule I pour son utilisation dans le traitement d'une infection microbienne, le composé répond à la formule I suivante : R1, R2, R3 (I) dans laquelle R1, R2, R3 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, H, OH un groupe (Ci-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C1-C6)halogénoalkyle, (Ci-C6)alcoxy, (C2- C6)alcénoxy, -C6)halogénoalcoxy, -0-CO(C1-C6)alkyle ; A représente un hétéroatome ou un groupe -(Het)-R' ou R-(Het)-R' où R, R', représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un groupe (Ci-C4)alcanediyle éventuellement substitué par des radicaux alkyles en Cl-C4 et Het représente un hétéroatome. en un ratio massique, composé de formule (I) : agent antimicrobien, variant de 8 :1 à 1 :10, et en ce que l'agent antimicrobien n'est pas un terpénoïde ou un phenylpropanoide. 2. Association pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que dans la formule (I) R2 et R3 représentent chacun H, R1 représente un groupe (Ci-C6)alkyle, et A représente l'hétéroatome O un groupe R-O-R' ou -O-R' où R, R', représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un groupe (Ci-C2)alcanediyle éventuellement substitué par des radicaux alkyles en C1-C4. 3. Association pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le composé de formule (I) est le cinéole. 4. Association pour son utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit antimicrobien est un antibiotique, en particulier un antibiotique choisi parmi : les antibiotiques inhibant la synthèse du peptidoglycane, les 3025720 39 antibiotiques inhibant la synthèse des acides nucléiques, les antibiotiques inhibant la synthèse des folates, les antibiotiques inhibant la synthèse des acides mycoliques, l'un quelconque de leurs sel pharmaceutiquement acceptables, et l'une quelconque de leurs combinaisons. 5 5. Association pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'antimicrobien est un antifongique, en particulier un antifongique choisi parmi : les polyènes, les azolés, les allylamines, les thiocarbamates, les echinocandines, la griseofulvine, et la fluorocytosine. 10 6. Association pour son utilisation selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le ratio massique composé de formule (I) : agent antimicrobien varie de 4 :1 à 1 :10, avantageusement de 1 :1 à 1 :10, plus avantageusement de 1 :1 à 1 :5. 15 7. Association pour son utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'infection microbienne est induite par un pathogène choisi parmi les genres potentiellement pathogènes suivants: Acetobacter, Acetobacterium, Acinetobacter, Citrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Serratia , Staphylococcus, 20 Streptococcus, Actinobacillus, Neisseria, Mannheima, Pasteurella, Candida, Aspergillus, Cryptococcus Trichosporon, Malassezia, et Mycobacterium. 8. Association pour son utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'antimicrobien est l'amoxicilline. 25 9. Association pour son utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce l'antimicrobien est un mélange amoxicilline/ acide clavulanique. 10. Association pour son utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce l'antimicrobien est le sertaconazole. 3025720 40 11. Association pour son utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé de formule (I) est adapté pour une administration par voie systémique.