Brevet FR3033499A1 — publié le 20160916

Composition pour le traitement des tumeurs neuroendocrines pancréatiques La présente invention concerne une composition pour le traitement des tumeurs neuroendocrines, notamment tumeurs neuroendocrines pancréatiques et plus particulièrement une combinaison d'au moins deux principes actifs pour le traitement de ces tumeurs. Les tumeurs neuroendocrines pancréatiques (TNEPs) (ou tumeurs endocrines du pancréas ou tumeurs des îlots pancréatiques) sont des tumeurs rares et hétérogènes dans leur présentation anatomopathologique et clinique. Cela rend le diagnostic, le pronostic et la prise en charge thérapeutique relativement compliqués. En outre, il a été démontré que ces tumeurs, dont la prolifération est faible et dont la réponse à l'apoptose serait dérégulée, sont chimiorésistantes. Les options thérapeutiques sont donc limitées et les premiers résultats des traitements par thérapies ciblées montrent des réponses encourageantes mais partielles. Les molécules de chimiothérapie classiques (taxol, cisplatin) sont généralement inefficaces pour cette pathologie. Cette résistance innée s'explique sans doute par leur faible taux de prolifération ainsi que l'expression accrue de certains facteurs pouvant conférer une résistance aux chimiothérapies. Les traitements cytotoxiques actuels entraînent des stabilisations mais peu de fontes tumorales. En outre, l'évolution parfois lente de la maladie (taux de survie relative de 40% à 10 ans) implique une prise en charge thérapeutique à long terme avec des traitements successifs à forte toxicité et l'apparition de résistances acquises. La streptozotocin est notamment connue dans le traitement de TNEPs, cependant il a été montré l'apparition d'une résistance à cette molécule. La voie PI3K/AKT/mTOR est une voie de signalisation intracellulaire régulant la croissance cellulaire, la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et l'angiogenèse. Cette voie de signalisation est largement étudiée dans le cadre de l'oncogenèse puisque la plupart des protéines la constituant sont codées par des gènes suppresseurs de tumeurs ou des proto-oncogènes dont la mutation peut favoriser le développement d'un processus tumoral. Cette voie de signalisation est notamment décrite par Dreyer et al (Cancéro dig., 2009, vol.1, N°3, 187-190). Parmi les protéines impliquées dans la voie PI3K/AKT/mTOR on peut citer les trois protéines PI3K, AKT et mTOR. PI3K est un hétérodimère à activité kinase constitué de deux protéines (une sous-unité régulatrice p85 et une sous-unité catalytique p110). AKT est une protéine kinase. mTOR (mammalian Target Of Rapamycin), également connu 3033499 2 sous le nom de FRAP, RAF1 ou RAPT1 est une sérine/thréonine kinase de 289 kDa de la famille des PIKKs (phosphoinositide 3-kinase-like kinases). mTOR s'associe à plusieurs autres protéines pour former deux complexes distincts appelés mTOR complex 1 (mTORC1) et mTOR complex 2 (mTORC2). mTOR est un régulateur central de la 5 croissance et de la prolifération cellulaire. Plus particulièrement mTOR régule la prolifération cellulaire, la croissance cellulaire, la mobilité cellulaire, la survie cellulaire, la synthèse protéique et la transcription. mTOR est activé par l'axe PI3K/Akt et à son tour phosphoryle les effecteurs en aval de la voie de signalisation PI3K/Akt. La voie de signalisation mTOR est notamment décrite dans Zoncu et al (Nature Rev Mol Cell Biol, 10 2011, 12, 21-35). Il a été décrit l'utilisation d'inhibiteur de la voie de signalisation mTOR pour le traitement des TNEPs. Cependant, les résultats obtenus montrent que la fonte tumorale reste limitée (réponse objective inférieure à 10%) et montrent également l'apparition de résistance. 15 Il existe donc un intérêt à développer de nouveaux axes thérapeutiques pour le traitement des TNEPs permettant de s'affranchir des résistances acquises. Un objectif de la présente invention est par conséquent de fournir de nouveaux 20 axes thérapeutiques pour le traitement des tumeurs neuro-endocrines, notamment TNEPs permettant de s'affranchir des résistances acquises. Un autre objectif de la présente invention est également de fournir de nouveaux axes thérapeutiques permettant l'amélioration du traitement des tumeurs ch imiorésistantes. 25 Un autre objectif encore de la présente invention est de fournir de nouveaux axes thérapeutiques permettant d'obtenir de meilleurs résultats en termes d'apoptose et de fonte tumorale (réduction de la surface tumorale). D'autres objectifs apparaîtront à la lecture de la description de l'invention qui suit. 30 La présente invention a par conséquent pour objet une composition comprenant de la streptozotocin ou un de ses dérivés et au moins un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR, et leurs sels, formes ou dérivés pharmaceutiquement acceptables. De préférence, la présente invention a pour objet une composition comprenant de 35 la streptozotocin et au moins un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR, et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. 3033499 3 De préférence, la présente invention a pour objet une composition comprenant de la streptozotocin et au moins un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR. La streptozotocin (STZ) correspond au composé 2-deoxy-2- 5 ({[methyl(nitrosoamino]carbonyl}amino)-6-D-glucopyranose (N° CAS: 18883-66-4). Ce composé et des procédés de synthèse sont notamment décrits dans U53027300 et FR2034735. Ce composé est notamment commercialisé sous le nom Zanosare par la société Keocyt. Parmi les dérivés de la streptozotocin on peut notamment citer le composé de formule OH décrit dans FR2092093 incorporé ici par référence. 10 0 -0Me HO NH 0 N-CH3 ON HO Dans le cadre de la présente invention, on entend par inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR, tous composés capables de bloquer cette voie de signalisation. La voie de signalisation PI3K/AKT/mTOR est connue de l'Homme du métier et notamment décrite 15 par Dreyer et al (Cancéro dig., 2009, vol.1, N°3, 187-190). Plus particulièrement, dans le cadre de la présente invention, on entend par inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR tous composés capables d'inhiber l'un des complexes mTORC1 et/ou mTORC2 et/ou l'une des enzymes PI3K et/ou Akt intervenant en amont de la voie mTOR. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inhibiteurs susmentionnés inhibent l'action des protéines 20 visées. De préférence, dans le cadre de la présente invention, les inhibiteurs de la voie PI3K/AKT/mTOR sont choisis parmi : Les inhibiteurs de mTORC1 ; 25 Les inhibiteurs de mTORC2; Les inhibiteurs de P 13K; Les inhibiteurs de Akt ; ou Les inhibiteurs de PI3K, mTORC1 et mTORC2, 3033499 4 seuls ou en mélange. De façon particulièrement préférée, les inhibiteurs de la voie PI3K/AKT/mTOR sont choisis parmi : 5 - Les inhibiteurs de PI3K, mTORC1 et mTORC2 ; ou - Les inhibiteurs de mTORC1, seuls ou en mélange. De tels inhibiteurs sont notamment décrits dans les documents W02006/065601, 10 W02007/090913, W02008/0318947, W02008/144463, W02009/071888, W02009/032651, W02009/032652, W02009/032653, US5310903, W095/16691, W02008/070041, W02006122806, incorporés ici par référence, seuls ou en mélange. De préférence, les inhibiteurs de la voie PI3K/AKT/mTOR sont choisis parmi 15 BEZ235, BKM120, Everolimus (ou RAD), MK-2206 dichlorate, Pictilisib, LY294002, CAL- 101, PI-3065, HS-173, PI-103, NU7441, TGX-221, I0-87114, Wortmannin, XL147, ZSTK474, BYL719, AS-605240, PIK-75, 3-methyladenine, A66, 5AR245409, PIK-93, GSK2126458, PIK-90, PF-04691502, AZD6482, Apitolisib, GSK1059615, Duvelisib, Gedatolisib, TG100-115, AS-252424, BGT226, CUDC-907, PIK-294, AS-604850, 20 G5K2636771, BAY80-6946, YM201636, CH5132799, CAY10505, PIK-293, PKI-402, TG100713, VS-5584, 0Z024832, Quercetin, Rapamycin, AZD8055, Temsirolimus, KU0063794, Zotarolimus, Torkinib, Tacrolimus, Ridaforolimus, INK 128, IPI-145, 5AR245409, Torin1, USI-027, WIE-354, AZD2014, brin 2, WYE-125132, BET226, Palomid 529, PP121, PP242 WYE-687, CH5132799, WAY-600, Chrysophanic, ETP- 25 46464, GDC-0349, GDC-0941, GDC-0068 XL388, Perifosine, G5K690693, lpatasertib, AZD5363, AT13148, PF-04691502, AT7867, Triciribine, 001128930, A-674563, PHT427, Miltefosine, Honokiol, 1I010, seuls ou en mélange. De façon préférée, les inhibiteurs de la voie PI3K/AKT/mTOR sont notamment 30 choisis parmi les composés définis dans les documents W02008/070041, US5310903, W095/16691, W02006122806 et BKM120, incorporés ici par référence, seuls en mélange. De préférence, les inhibiteurs de la voie PI3K/AKT/mTOR sont choisis parmi 35 BEZ235, BKM120, Everolimus (ou RAD), MK-2206 dichlorate, de préférence BEZ235 ou RAD, seuls ou en mélange. 3033499 5 BEZ235 est le composé de formule H2N N composé de formule BKM120 est le composé de formule Everolimus (ou RAD) est le 5 MK-2206 dichlorate est le composé de formule Les sels pharmaceutiquement acceptables peuvent notamment être des sels d'addition avec des bases, ils sont par exemple des sels pharmaceutiquement 10 acceptables tels que les sels de sodium, les sels de potassium, les sels de calcium, lesquels sont obtenus en utilisant des hydroxydes de métaux alcalins et alcalino-terreux 3033499 6 correspondants comme bases. Comme autre type de sels d'addition avec des bases pharmaceutiquement acceptables, on peut citer les sels avec des amines et notamment la glucamine, le N-méthylglucamine, le N,N-diméthylglucamine, l'éthanolamine, la morpholine, la N-méthylmorpholine ou la lysine. Les sels peuvent également être obtenus 5 avec des acides minéraux ou organiques et de préférence des acides pharmaceutiquement acceptables tels que les acides chlorhydrique, phosphorique, fumarique, citrique, oxalique, sulfurique, ascorbique, tartrique, maléique, mandélique, méthanesulfonique, lactobionique, gluconique, glucarique, succinique, sulfonique ou hydroxypropanesulfon igue. 10 On entend par formes ou dérivés pharmaceutiquement acceptables, des formes modifiées ou dérivées des composés ci-dessus leur permettant d'être assimilés par l'organisme. De préférence, dans les compositions de la présente invention, le ratio en poids de 15 streptozotocin par rapport à l'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR est compris entre 100 et 500, de préférence entre 100 et 300. Les compositions de la présente invention, sont de préférence des compositions pharmaceutiques et peuvent en outre comprendre au moins un excipient 20 pharmaceutiquement acceptable. Lesdits excipients pharmaceutiquement acceptables sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels connus de l'Homme du métier. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être présentées sous 25 des formes destinées à l'administration par voie parentérale, intraveineuse, orale, rectale, permuqueuse ou percutanée. Elles seront donc présentées sous forme de solutés ou de suspensions injectables ou flacons multi-doses, sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules, de pilules, de cachets, de poudres, de suppositoires ou de capsules 30 rectales, de solutions ou de suspensions, pour l'usage percutané dans un solvant polaire, pour l'usage permuqueux. Les excipients qui conviennent pour de telles administrations sont notamment les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristalline, les carbonates alcalino-terreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les 35 formes solides. 3033499 7 Pour l'usage rectal, le beurre de cacao ou les stéarates de polyéthylèneglycol sont les excipients préférés. Pour l'usage parentéral, l'eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques sont les véhicules les plus commodément utilisés. 5 La présente invention concerne également un kit comprenant d'une part de la streptozotocin, un de ses dérivés ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables et d'autre part au moins un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR ou un de leurs sels, formes ou dérivés pharmaceutiquement acceptables tels que définis plus haut. De préférence, le 10 kit comprend d'une part de la streptozotocin et d'autre part au moins un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR. Dans ce kit, la streptozotocin et les inhibiteurs de la voie PI3K/AKT/mTOR peuvent être conditionnés dans des préparations séparées chacun avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, éventuellement aptes à être mélangés notamment extemporanément. 15 L'invention concerne également l'utilisation d'une composition ou d'un kit selon l'invention pour la préparation d'un médicament. L'invention concerne également la composition ou le kit selon l'invention pour son utilisation en tant que médicament. 20 L'invention concerne également l'utilisation d'une composition ou d'un kit selon l'invention pour la prévention ou le traitement de tumeurs neuro-endrocrines (également appelées tumeurs endocrines), notamment les tumeurs neuro-endocrines du pancréas (TNEPs). 25 L'invention concerne également les compositions ou le kit de l'invention destinés à une utilisation pour la prévention ou le traitement de tumeurs neuro-endrocrines (également appelées tumeurs endocrines), notamment des tumeurs neuro-endocrines du pancréas (TNEPs). 30 De façon tout à fait surprenante et avantageuse, les inventeurs ont montré que l'association de STZ et d'au moins un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR selon l'invention avait une activité synergique sur le traitement des tumeurs neuro-endocrines, notamment les TNEPs. De façon surprenant, les inventeurs ont montré une action synergique de l'association de ces composés sur l'apoptose et la fonte tumorale (ou 35 réduction de la surface tumorale). 3033499 8 La présente invention concerne en particulier les compositions, notamment, pharmaceutiques, ou le kit de l'invention pour leur utilisation pour la prévention ou le traitement des tumeurs neuro-endocrines, notamment tumeurs neuro-endocrines du pancréas. 5 La présente invention concerne en particulier une méthode de prévention ou de traitement des tumeurs neuro-endocrines, notamment tumeurs neuro-endocrines du pancréas, comprenant l'administration d'une quantité efficace d'une composition ou kit selon l'invention à un patient qui en a besoin. 10 La présente invention concerne en particulier les compositions ou kit de l'invention pour la préparation de médicaments pour le traitement des tumeurs neuro-endocrines, notamment tumeurs neuro-endocrines du pancréas. La présente invention concerne enfin une composition selon l'invention ou kit 15 comprenant de la STZ et au moins un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR tel que défini ci-dessus, ou un de leurs sels, formes ou dérivés pharmaceutiquement acceptables, pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle à un patient qui en a besoin. Pour une administration simultanée, la STZ et l'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR peuvent être en mélange dans la même préparation les contenant avec un véhicule ou excipient 20 pharmaceutiquement acceptable. Ils peuvent aussi être conditionnés dans des préparations séparées chacun avec un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable, aptes à être mélangés notamment extemporanément. En cas d'administration séparée ou séquentielle, chacun des principes actifs est conditionné dans une préparation propre contenant un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. 25 La posologie peut varier dans des limites importantes en fonction de l'indication thérapeutique, et de la voie d'administration, ainsi que de l'âge et du poids du sujet. L'identification du patient qui a besoin du traitement ci-dessus indiqué est définie par l'Homme du métier. On entend par patient un être humain ou un animal. Un médecin 30 ou un vétérinaire peut identifier, par l'intermédiaire de tests cliniques, d'examen physique, de tests ou diagnostics biologiques et par l'historique familial et/ou médical, les sujets qui ont besoin d'un tel traitement. On entend par quantité suffisante, une quantité de composition selon l'invention ou de l'association de STZ et d'au moins un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR du kit 35 selon la présente invention efficace pour prévenir ou traiter des conditions pathologiques, notamment pour la prévention ou le traitement des tumeurs endocrines ou neuro- 3033499 9 endocrines, notamment les tumeurs neuro-endocrines du pancréas. La quantité suffisante peut être déterminée par l'Homme du métier, par l'intermédiaire de technique conventionnelle et par l'observation des résultats obtenus dans des circonstances analogues. Pour déterminer la quantité suffisante différents facteurs doivent être pris en 5 compte par l'homme du métier, notamment et sans y être limité : le sujet, sa taille, son âge, son état de santé général, la maladie impliquée et son degré de sévérité ; la réponse du sujet, le type de composé, le mode d'administration, la biodisponibilité de la composition administrée, le dosage, l'utilisation concomitante d'autres concomitante d'autres médicaments, etc. De préférence, dans la composition ou le kit de l'invention, le 10 ratio streptozotocin/inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR est tel que la streptozotocin est administrée dans une quantité de 500 mg/jour à 1500 mg/jour, de préférence de 750 mg/jour à 1000 mg/jour et l'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR est administré de 1 mg/jour à 15 mg/jour, de préférence de 2,5 mg/jour à 10 mg/jour, de préférence de 5mg tous les 2 jours à 10mg/jour. 15 La présente invention va maintenant être détaillée à l'aide d'exemples non limitatifs. La figure 1 représente les effets de combinaison STZ+ inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR sur l'activation de la voie mTOR et l'apoptose (clivage de la caspase-3). 20 Les figures 2 à 4 représentent la surface tumorale intrahépatique après traitement par la Streptozotocin, les inhibiteurs de la voie PI3K/AKT/mTOR (Everolimus, BEZ-235, BKM-120) ou la combinaison Streptozotocin et inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR (ND= Non déterminé). 25 Test d'additivité : Les cellules MIN6 sont ensemencées en plaques 384 puits à une densité de 5000 cellules par puits dans 251..11 de milieu (DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 5mM glucose, 15% SVF (Sérum de Veau Foetal), 1% de Penicilline/Streptomycine (100 Ul/ml de penicilline et 100 pg/m1 de streptomycine), 0,1% de [3-mercaptoethanol) dans un 30 incubateur à 37°C sous 5% de CO2. 72h plus tard le milieu est changé pour du milieu contenant ou non de la Streptozotocin associée ou non à un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR (everolimus, BKM-120, MK-2206, BEZ-235, tableau 1), les cellules sont mises à incuber dans le milieu décrit ci-dessus additivé ou non de streptozotocin et/ou d'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR. 24h après incubation dans ce milieu, les plaques 35 sont équilibrées pendant 30 minutes à température ambiante. 25111 de réactif cell titer glo reagent (Promega) est ajouté selon les instructions du constructeur. Après 2 minutes 3033499 10 d'agitation, les plaques sont laissées à incuber 10 minutes à température ambiante et la luminométrie est lue sur un luminomètre (Luminoskan Ascent 2.5, Thermo Scientific) pendant 1 seconde. Un puits sans cellule est traité de manière similaire, le résultat obtenu pour ce contrôle négatif est retranché aux résultats obtenus pour les échantillons. Les 5 résultats des tests sont présentés aux tableaux 2 à 5 ci-dessous. Le delta Bliss correspond à la différence entre la valeur théorique obtenue par le calcul suivant A+B-AxB où A est la réponse pour la streptozotocin seule, B est la réponse pour l'inhibiteur seul, et la valeur obtenue. Le Bliss sum est ensuite calculé par addition, pour chacun des couples streptozotocin/inhibiteur l'ensemble des delta Bliss obtenu. Si le Bliss sum est inférieur à 0 10 la réponse est considérée comme antagoniste, si le Bliss sum est égal à 0 la réponse est considérée comme additive et si le Bliss sum est supérieur à 0 la réponse est considérée comme synergique (Borisy et al., Proc Natl Acad Sci U SA., 2003;100(13):7977-82. Concentration Concentration Concentration Concentration Concentration 1 2 3 4 5 Streptozotocin 0.5mM 1mM 2mM 4mM 8mM Everolimus 0,05pM 0,1pM 0,5pM 1 pM 5pM BKM-120 0,01pM 0,1pM 1pM lOpM 100pM MK-2206 0,05pM 0,5pM 5pM 25pM 50pM BEZ-235 0,005pM 0,001pM 0,05pM 0.1pM 0,5pM Tableau 1 : concentrations utilisées pour les tests d'additivité 15 Delta Bliss (0/0) STZ (concentration en mM) Bliss sum 0 0,5 1 2 4 8 78 Everolimus 0 0 0 0 0 0 0 (concentration en pM) 0,05 0 5 5 9 4 1 0,1 0 4 2 4 2 1 0,5 0 7 5 7 1 1 1 0 4 -1 4 2 1 5 0 8 1 -1 0 0 Tableau 2 20 3033499 11 Delta Bliss (0/0) STZ (concentration en mM) Bliss sum 0 0,5 1 2 4 8 38 MK-2206 0 0 0 0 0 0 0 (concentration en uM) 0,05 0 1 4 12 5 3 0,5 0 -1 3 8 5 2 5 0 0 0 6 -5 0 25 0 0 0 0 -1 -1 50 0 0 0 0 -1 -1 Tableau 3 Delta Bliss (0/0) STZ (concentration en mM) Bliss sum 0 0,5 1 2 4 8 188 BKM-120 0 0 0 0 0 0 0 (concentration en uM) 0,01 0 9 13 13 13 18 0,1 0 4 6 11 10 15 1 0 7 16 16 12 16 10 0 2 7 5 -3 7 100 0 5 6 -3 -7 -10 Tableau 4 Delta Bliss (0/0) STZ (concentration en mM) Bliss sum 0 0,5 1 2 4 8 96 BKM-120 0 0 0 0 0 0 0 (concentration en uM) 0,005 0 3 8 16 13 27 0,001 0 2 2 12 8 21 0,05 0 18 4 24 9 28 0,1 0 14 -24 -7 -20 -9 0,5 0 -4 -3 -18 -4 -23 5 Tableau 5 Les résultats des essais montrent donc une synergie de l'association STZ et inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR. 3033499 12 Evaluation de l'activation de la voie mTOR et de la caspase-3 en western-blot: Les cellules INS-13 sont ensemencées en plaques 6 puits à une densité de 800 000 cellules par puits dans 2m1 de milieu (RPMI (Roswell Park Memorial lnstitute medium) 5mM glucose, 10% SVF, 1% Hepes, 1% sodium Pyruvate, 1% Penicilline/Streptomycine 5 Streptomycine (100 Ul/ml de penicilline et 100 pg/m1 de streptomycine), 0,1% de [3- mercaptoethanol) dans un incubateur à 37°C sous 5%de 002. 72h plus tard le milieu est changé pour du milieu contenant ou non de la Streptozotocin associée ou non à un inhibiteurs de la voie PI3K/AKT/mTOR (voir tableau 3 pour les concentrations utilisées), les cellules sont mises à incuber dans les conditions 10 précédentes en présence des traitements pendant 4 à 6 heures. Concentration Streptozotocin 2mM Everolimus 0,011.1M BKM-120 11..IM MK-2206 11..1M BEZ-235 0,11.1M Tableau 6 : concentrations utilisées pour l'activation de la voie PI3K/AKT/mTOR et de la caspase-3 en western-blot 15 Les cellules sont ensuite récoltées et les protéines extraites avec le tampon de lyse RIPA (Santa Cruz Technology) : après 30 minutes de lyse sous agitation, les solutions sont centrifugées 15 minutes à 13000rpm à 4°C. Le surnaant contenant les protéines est récupéré. 204 de protéines dans du XT Sample Buffer 4X (BioRad) sont dénaturés à 95°C pendant 20 5 minutes puis déposés sur un gel d'acrylamide Criterion XT Bis-Tris Gel, 12%, (BioRad). Les protéines migrent dans du tampon MOPS (BioRad) à 80Volts pendant 30 minutes puis à 160Volts pendant 1h30. Elles sont ensuite transférées sur une membrane PVDF (polyvinylidene difluoride) (immobilon, Millipore) dans du tampon de transfert Tris-Glycine Méthanol (Tris-base 20mM, Glycine 150mM, méthanol 20%) à 100Volts pendant 1h. Les 25 membranes sont ensuite bloquées (TBS (tris-buffered saline)-Tween0,01% - 5% Lait) puis incubées avec l'anticorps primaire reconnaissant la protéine d'intérêt pendant une nuit à 4°C (voir tableau 7 anticorps utilisés). Après pluàeurs lavages en TBS-Tween 0,01%, la membrane est incubée pendant 1heure en présence d'un anticorps secondaire dirigé contre l'anticorps primaire. Après plusieurs lavages en TBS-Tween 0,01%, les complexes 30 anticorps-antigènes sont révélés en luminescence grâce au réactif Luminata Crescendo 3033499 13 (Millipore) sur des films autoradiographiques. La tubuline est utilisée comme témoin de charge des protéines. Protéine d'intérêt Anticorps utilisé concentration AKT (Phospho-Thr308) 13038 Cell signaling 1/1000 dans TBS -Tween technology 0,01% - 5% Lait AKT (Phospho-Ser473) 9271 Cell signaling 1/1000 dans TBS -Tween technology 0,01% - 5% BSA p70S6K (Phospho-Thr389) 9234 Cell signaling 1/1000 dans TBS -Tween (protéine normalement technology 0,01% - 5% BSA activée par mTOR) 4E-BP1 (Phospho-T45) 2334-1 Epitomics 1/1000 dans TBS -Tween (protéine normalement 0,01% - 5% BSA activée par mTOR) Caspase-3 clivée (Asp175) 9664 Cell signaling 1/1000 dans TBS -Tween technology 0,01% - 5% Lait Tubulin Sigma 1/1000 dans TBS -Tween 0,01% - 5% Lait Tableau 7 : Anticorps utilisés pour l'analyse en western-blot 5 Les résultats sont représentés à la figure 1. Ces résultats montrent, selon les inhibiteurs une inhibition de PI3K, mTOR et/ou AKT. Le BKM-120, quant à lui, entraîne une inhibition totale de la voie PI3K/AKT/mTOR. Concernant l'activation de l'apoptose par clivage de la caspase-3, les résultats montrent 10 une augmentation du clivage de la caspase-3 et donc de l'apoptose par rapport aux résultats obtenus pour la STZ seule. Evaluation des combinaisons in vivo Des souris xenogreffes avec cellule d'insulinome INS-1 âgées de 5 semaines sont 15 anesthésiées à l'isoflurane. Une mini laparotomie gauche est pratiquée pour sortir la rate de la cavité abdominale. La suspension cellulaire (2,5 millions de cellules d'insulinome dans 501.11 de PBS phosphate-buffered saline (stérile) est injectée dans la rate. La paroi abdominale et la peau sont recousues en deux plans à l'aide de fil chirurgical résorbable. Ils sont pesés deux fois par semaine. Le traitement débute 7 jours après la greffe et dure 20 3 à 5 semaines (comme indiqués dans le tableau 8). 3033499 14 La solution de STZ est préparée extemporanément dans une solution citrate préparée extemporanément (stabilité environ 20 minutes). Les solutions d'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR (MK-2206 et BKM-120) sont préparées dans du DMSO puis diluées extemporanément à la bonne concentration dans du NaCI ou de l'eau respectivement. Le 5 BEZ-235 est dilué dans du méthylcellulose 5% extemporanément. Combinaison testée Traitement par STZ Traitement par inhibiteur de la voie P I3K/AKT/mTOR STZ + Everolimus Injection IP 5jours/7 : 10mg/kg Injection IP 5jours/7 : 1.5mg/kg STZ + BEZ-235 Injection IP 5jours/7 : 10mg/kg Gavage 5jours/7 : 45mg/kg STZ + BKM-120 Injection IP 5jours/7 : 10mg/kg Gavage 5jours/7 : 60mg/kg IP= intrapéritonéale Tableau 8 : protocole de traitement pour le modèle de xénogreffes. Les souris sont traitées avec l'un ou l'autre des composés, ou les deux en combinaison. Les souris 10 contrôles sont injectées avec du NaCI et gavées avec du NaCI ou du méthylcellulose. L'eau de boisson est supplémentée avec du sucrose 10%. Chacun des essais est réalisé sur 10 animaux 15 Après 3 à 5 semaines de traitement, les souris sont mises à mort, le foie, la rate et le pancréas sont prélevés et fixés dans du formol tamponné. Après au minimum 24h, les organes sont inclus en paraffine, coupés et marqués en immunohistochimie. Un marquage des foies pour la chromogranin A permet d'identifier les cellules tumorales. La 20 surface tumorale est analysée en morphométrie avec le logiciel HISTOLAB (Alphelys) et les données analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism (GraphPad Version 5.03). Les résultats sont présentés aux figures 2 à 4 (*p REVENDICATIONS1.- Composition comprenant de la streptozotocin ou un de ses dérivés et au moins un inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR, et leurs sels, formes ou dérivés 5 pharmaceutiquement acceptables. 2.- Composition selon la revendication 1, dans laquelle l'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR est choisi parmi les composés capables d'inhiber l'un des complexes mTORC1 et/ou mTORC2 et/ou l'une des enzymes PI3K et/ou Akt. 10 3.- Composition selon la revendication 1, dans laquelle l'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR est choisi parmi : les inhibiteurs de mTORC1 ; les inhibiteurs de mTORC2; 15 les inhibiteurs de PI3K ; les inhibiteurs de Akt ; ou les inhibiteurs de PI3K, mTORC1 et mTORC2. 4.- Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle 20 l'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR est choisi parmi BEZ235, BKM120, Everolimus (ou RAD), MK-2206 dichlorate, Pictilisib, LY294002, CAL-101, PI-3065, HS-173, PI-103, NU7441, TGX-221, IC-87114, Wortmannin, XL147, ZSTK474, BYL719, AS-605240, PIK-75, 3-methyladenine, A66, SAR245409, PIK-93, GSK2126458, PIK-90, PF-04691502, AZD6482, Apitolisib, GSK1059615, Duvelisib, 25 Gedatolisib, TG100-115, AS-252424, BGT226, CUDC-907, PIK-294, AS-604850, GSK2636771, BAY80-6946, YM201636, CH5132799, CAY10505, PIK-293, PKI-402, TG100713, VS-5584, CZC24832, Quercetin, Rapamycin, AZD8055, Temsirolimus, KU0063794, Zotarolimus, Torkinib, Tacrolimus, Ridaforolimus, INK 128, IPI-145, SAR245409, Torin1, USI-027, WIE-354, AZD2014, Torin 2, VVYE-125132, BET226, Palomid 529, PP121, 30 PP242 VVYE-687, CH5132799, WAY-600, Chrysophanic, ETP-46464, GDC-0349, GDC0941, GDC-0068 XL388, Perifosine, GSK690693, Ipatasertib, AZ05363, ATI 3148, PF04691502, AT7867, Triciribine, CCT128930, A-674563, PHT-427, "Miltefosine, Honokiol, TIC10, seuls ou en mélange. 35 5.- Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR est choisi parmi BEZ235, BKM120, Everolimus (ou RAD), MK-2206 dichlorate, de préférence BEZ235 ou RAD, seuls ou en mélange. 3033499 16 6.- Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le ratio en poids de streptozotocin par rapport à l'inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR est compris entre 100 et 500 de préférence entre 100 et 300. 7.- Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, colertrenant en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 8.- Kit comprenant de la streptozotocin ou un de ses dérivés et au moins un 10 inhibiteur de la voie PI3K/AKT/mTOR, et leurs sels, formes ou dérivés pharmaceutiquement acceptables tels que définis aux revendications 1 à 5. 9.- Composition ou kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour son utilisation en tant que médicament. 15 10.- Composition ou kit selon la revendication 9, pour son utilisation pour la prévention ou le traitement de tumeurs neuro-endrocrines. 11.- Composition ou kit selon la revendication 10, pour son utilisation pour la 20 prévention ou le traitement de tumeurs neuro-endocrines du pancréas.