Brevet FR3034103A1 — publié le 20160930

Procédé de mesure de la concentration de microorganismes dans un liquide La présente invention concerne un procédé de contrôle de procédés fermentaires tel que la production d'alcool, ainsi qu'un appareil spécialement conçu pour mettre en oeuvre ce procédé. L'une des plus importantes étapes dans la production du vin est la fermentation alcoolique. Dans cette étape, on utilise des levures de type saccharomyces qui transforment le sucre en éthanol et produisent d'autres composants qui apportent au vin ses diverses caractéristiques organoleptiques. La bioconversion du glucose en éthanol avec un dégagement de gaz carbonique CO2 est régie par l'équation suivante : C6H1206 2(CH3CH2OH) + 2CO2 La fermentation alcoolique est un phénomène spontané. Toutefois, divers incidents peuvent se produire causant la mort des levures et l'arrêt de ladite fermentation. Des populations bactériennes peuvent alors se multiplier et provoquer diverses maladies comme les piqûres acétiques et lactiques. De façon classique, le suivi de la fermentation est réalisé en mesurant la densité du vin à l'aide d'un densimètre. En effet, s'il y a un problème de fermentation dû à l'affaiblissement de l'activité de levures, on aura un ralentissement de l'évolution de la densité. Toutefois si on attend d'observer ce ralentissement, le phénomène est déjà bien avancé, et on aura une perte de temps et/ou de production significative. Afin de prévenir ce problème, un comptage de levures et l'estimation du pourcentage de viabilité sont effectués. Il existe trois techniques classiques de comptage. La première est le comptage sur boite de Petri. Cette technique consiste à placer 0,1 mL de liquide par boite de Petri. Après, vient la phase d'incubation qui dure de 2 à 7 jours. A la fin de cette phase on compte le nombre de colonies qui sont apparues. En effet, la multiplication d'un germe crée une colonie. Par conséquent, le nombre de colonies correspond au nombre de levures. Un 3034103 2 inconvénient majeur de cette technique est qu'il faut plusieurs jours avant d'obtenir un résultat. La deuxième technique est le comptage par épifluorescence. Cette méthode consiste à filtrer un échantillon de liquide sur membrane. Celle-ci est mise en 5 contact avec un fluorochrome. Suite à cette étape, les levures vivantes deviennent fluorescentes et le comptage peut être effectué à l'aide d'un microscope adapté. La troisième technique consiste à faire le comptage avec un microscope. Actuellement, la numération cellulaire qui est la détermination de la concentration 10 des cellules par unité de volume, est réalisée manuellement en utilisant une lame de comptage spéciale qui contient une chambre de volume et de surface bien déterminés (cellule de numération) comme la cellule de Thoma ou Malassez. Il existe d'autres techniques telles que le cytomètre de flux ou les compteurs coulter qui s'utilisent sans microscope. 15 Un microscope est un système optique composé de plusieurs lentilles et qui peut fournir une image agrandie d'un objet de taille microscopique. Il est composé généralement d'un objectif 3, un oculaire 5 et un éclairage. Le modèle le plus classique d'un éclairage se compose d'une lampe halogène et un condenseur afin de fournir un éclairage homogène de l'échantillon. Dans un premier temps, 20 une image de l'échantillon 2, réelle inversée et agrandie, est obtenue à travers l'objectif et se forme quelque part dans le tube du microscope. Cette image intermédiaire est agrandie par l'oculaire qui la projette sur la rétine de l'oail 4 de l'observateur. La fig. 1 présente le modèle optique d'un microscope. 25 Un inconvénient majeur de ces dernières techniques est qu'elles sont longues, fatigantes et demandent un savoir faire particulier. Les systèmes optique et mécanique utilisés dans la fabrication des microscopes classiques sont assez complexes. Ces microscopes sont difficiles à embarquer. Les modèles actuels ne sont pas adaptés pour des applications sur le terrain. 30 En plus de ses composants, un microscope peut avoir d'autres accessoires, par exemple les filtres de couleur qui diminuent la dominante rouge et permettent d'avoir des images en lumière proche de la lumière naturelle. Certains 3034103 3 microscopes peuvent être équipés d'un polariseur qui permet d'avoir une lumière polarisée et favorise la propagation de la lumière dans un plan plutôt qu'un autre, donnant une information supplémentaire sur la nature de l'échantillon. Pour faire de la photomicrographie, on peut par exemple équiper le microscope d'une tête 5 trioculaire et le coupler à un capteur d'image, par exemple sous la forme d'un écran, afin de pouvoir acquérir des images tout en permettant d'observer l'échantillon à travers l'oculaire pour faire le cadrage et la mise au point. Néanmoins ces techniques présentent d'importants inconvénients. Elles nécessitent un équipement compliqué et/ou beaucoup de temps pour donner un 10 résultat pertinent. Un objet de la présente invention est de proposer un procédé et un dispositif qui permettent de contrôler la population levurienne dans un liquide en peu de temps, et avec un matériel simple, robuste, et peu sensible aux éléments externes. 15 Un autre objet de la présente invention est de proposer un procédé de contrôle de la fabrication d'une boisson fermentée qui puisse être mis en oeuvre dans un environnement difficile, non protégé tel qu'une cave viticole, ou une installation industrielle. Un autre objet de la présente invention est de proposer un procédé de contrôle 20 de fermentation qui soit facile à mettre en oeuvre, et notamment qui puisse être mis en oeuvre par un utilisateur non spécialisé, et sans formation longue. A cet effet la présente invention propose un dispositif de mesure de la concentration de microorganismes dans un liquide comportant une source de lumière, un support d'échantillon, un capteur d'images, un dispositif optique situé 25 entre ledit support d'échantillon et ledit capteur d'images, un microprocesseur et un programme de comptage. Ledit dispositif est particulier en ce que ledit dispositif optique est constitué d'une seule lentille transparente. Grâce à ces dispositions, on obtient un dispositif simple et robuste, utilisable dans un environnement de terrain, et en même temps très performant d'un point 30 de vue optique. Selon d'autres caractéristiques 3034103 4 ladite lentille peut être une bille, permettant un mode de réalisation particulièrement aisé, ledit support d'échantillon peut être disposé sur un rail, de façon mobile et réglable le long dudit rail, et ledit dispositif optique être fixe par rapport audit 5 capteur d'images ; une telle disposition permet un réglage optique facile et accessible à un personnel non spécialisé, par réglage de la position d'un seul objet, en l'occurrence le support d'échantillon, ledit dispositif peut comprendre une lentille de collimation disposée entre ladite source de lumière et ledit support d'échantillon, de sorte à collimater 10 la lumière de ladite source de lumière vers ledit échantillon ; une telle disposition permet d'obtenir des images avec une répartition de lumière plus homogène et un contraste plus élevé, ledit dispositif optique peut comprendre un filtre polarisant, permettant de rejeter les rayons réfléchis, 15 - ledit microprocesseur peut comporter un afficheur, permettant ainsi une lecture immédiate du résultat par l'opérateur. La présente invention concerne également un procédé de mesure de la concentration de microorganismes dans un liquide, tel que par exemple du vin. Ce procédé est particulier en ce qu'il comporte les étapes suivantes : 20 - prélèvement d'un échantillon dudit liquide, - introduction dudit échantillon dans un dispositif selon l'invention, - détection d'une image dudit échantillon par ledit capteur d'images, - détermination de la concentration de microorganismes contenus dans ledit par comptage de microorganismes sur ladite image, par le moyen 25 dudit programme. Grâce à ces dispositions, on obtient avec un dispositif très simple et robuste, un résultat rapide, permettant une réaction précoce et adaptée sur la production en cours. Selon d'autres caractéristiques : 30 - on peut ajouter à ladite quantité de liquide un additif, apte à différencier visuellement des microorganismes vivants de microorganismes morts, et le 3034103 5 comptage peut être un comptage des microorganismes vivants, permettant ainsi d'apporter une information encore plus pertinente au producteur, le comptage peut utiliser la méthode de reconnaissance de formes, permettant un comptage plus fiable, même avec des images de basse qualité et 5 de faible contraste, ou avec des images bruitées. L'avantage apporté par la présente invention réside principalement en ce qu'il permet d'effectuer une analyse sur le terrain, avec un matériel simple et robuste, et en produisant des résultats de mesures quasi immédiats. En plus ce système offre par exemple aux vignerons la possibilité de suivre 10 l'évolution de la fermentation en cave et leur permet de mieux s'équiper afin de mieux contrôler leur production. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit faite en référence aux figures annexées dans lesquelles La figure 1 est un schéma optique du fonctionnement d'un microscope 15 La figure 2 est un schéma optique du fonctionnement d'un appareil selon l'invention. - La figure 3 est une vue schématique de réalisation d'un appareil selon l'invention Le dispositif selon l'invention comporte une source de lumière 11 sur un support 20 16, un échantillon 12 sur un support d'échantillon 17, une lentille 13, qui peut être sphérique et ainsi former une bille, sur un support de lentille 18, et une caméra 14 sur un support de caméra 19. Pour supprimer les réflexions de lumière sur la surface de l'échantillon 12, on peut placer un filtre polarisant (non représenté) devant la source de lumière 11. En effet, le phénomène de réflexion induit un 25 changement de polarisation de la lumière. Ainsi, en utilisant un filtre (par exemple une feuille de plastique composée de cristaux parallèles les uns aux autres), il est possible de rejeter les rayons réfléchis. Un condenseur de lumière (non représenté) peut également être monté en plaçant une lentille de collimation, par exemple sphérique, entre la source de 30 lumière 11 et l'échantillon 12. Cette lentille de collimation permet de collimater la lumière, la condenser et la diriger vers l'échantillon 12. Les images obtenues présentent une répartition de lumière plus homogène et un contraste plus élevé. 3034103 6 L'ajout de cette lentille de collimation ne change rien au fait que le dispositif optique 13, situé entre l'échantillon 12 et le capteur d'images 14, est constitué d'une seule lentille 13. La lentille de collimation est à considérer comme un accessoire de la source de lumière 11, et sa fonction est d'adapter la source de 5 lumière 11 pour la rendre plus efficace. La source de lumière 11 peut être par exemple une LED. Le support d'échantillon permet de supporter une lame sur laquelle on peut disposer l'échantillon de vin ou d'un autre liquide à analyser. Typiquement on peut disposer de l'ordre d'un millimètre cube sur une lame, représentant une 10 goutte, puis poser une lamelle sur l'échantillon, qui maintient l'échantillon sur la lame, par capillarité. On peut aussi y ajouter un additif permettant de différencier les microorganismes vivants et morts, par exemple par leur couleur. On peut alors soit obtenir la concentration totale en microorganismes, soit la concentration en microorganismes vivants. D'autres types de différenciations 15 peuvent être envisagés. La lame peut alors être disposée verticalement, l'échantillon reste bien maintenu à la lame. On peut aussi prévoir que le dispositif est disposé de sorte que la lame soit disposée horizontalement, ce qui présente l'avantage d'éviter une concentration de microorganismes vers le bas. 20 Le support d'échantillon est disposé mobile en translation le long de l'axe optique du dispositif. On peut ainsi régler la netteté de l'image en réglant la position de l'échantillon le long de l'axe optique. Un dispositif optique 13 à une seule lentille présente l'avantage que le réglage de l'image peut se faire par ce seul mouvement, sans nécessité d'adaptation des positions des autres éléments. La 25 distance entre la lentille 13 et le capteur d'images 14 peut être fixe. Cela facilite nettement à la fois la conception du dispositif, et le réglage du dispositif, qui est ainsi à la portée de tous, et ne nécessite pas la présence d'un opérateur spécialisé. On peut ajouter sur le support d'échantillon une cellule de Thoma ou de 30 Malassez, permettant de faciliter le comptage. De telles cellules disposent des carrés de plusieurs dimensions, généralement trois dimensions différentes, pour donner un repère dimensionnel par rapport au comptage. Les plus petits carrés contiennent de l'ordre d'un millionième de millilitre, et les plus grands de l'ordre 3034103 7 d'un millième de millilitre. On peut alors compter les microorganismes présents dans un carré, et déduire du nombre obtenu un nombre de microorganismes par millilitre. On peut aussi effectuer le comptage sur plusieurs carrés, et retenir une valeur moyenne. Les microorganismes se trouvant sur une frontière d'un carré 5 sont pris en compte par exemple seulement s'ils sont sur la ligne supérieure ou à droite, afin d'éviter les doublons. En oenologie, et avec le dispositif selon l'invention, on obtient des valeurs comprises entre plusieurs centaines de milliers et plusieurs dizaines de millions de microorganismes par millilitre. Selon le cas, on choisit la cellule de comptage 10 à disposer sur l'échantillon pour qu'il y ait une dizaine de microorganismes par carré, permettant un comptage fiable sur une dizaine de carrés, pour en retenir une valeur moyenne. Par exemple en regardant un carré de 2,5 x 10-7 mL, si on y voit une dizaine de microorganismes, la taille des carrés est adaptée, et la mesure peut être faite de cette manière. Cela donne environ 40 millions de 15 microorganismes par millilitre. Si au contraire ces petits carrés contiennent tantôt un microorganisme, tantôt aucun, on avise alors des carrés plus grands, par exemple de 4 x 10-6 mL, ou même 1 x 10-4 mL. Si on trouve entre 10 et 20 microorganismes par carré de 1 x 10-4 mL, ce sont ces carrés qu'il faut considérer pour la mesure, et cela donne une concentration comprise entre cent 20 mille et deux cent mille microorganismes par millilitre. Le programme est configuré pour effectuer automatiquement un tel choix, et en déduire l'information de la concentration. Le dispositif optique 13, sous la forme d'une lentille unique, est disposé sur un support de lentille 18 configuré dans ce but. 25 Le capteur d'images 14, qui peut être une caméra, est disposé sur un support de caméra 19. La caméra 14 peut comporter un module du type de celui connu sous le nom de Raspberry Pi (marque déposée), ou une autre carte électronique adaptée et optimisée, muni d'un capteur de technologie CMOS, (Complementary Metal 30 Oxide Semiconductor) par exemple de taille 3673 x 2738 micromètres comme celui connu sous la dénomination OV5647 de chez Omnivision. 3034103 8 Les divers supports peuvent être fixés sur un rail 15 d'une manière qu'on puisse régler leurs distances respectives. On peut aussi prévoir que ces distances peuvent être réglées de façon automatique. Selon un mode préféré de réalisation, seul le support d'échantillon 17 est 5 réglable le long du rail 15, la distance entre le dispositif optique 13 et le capteur d'images 14 étant fixe. Ceci permet un réglage facile et à la portée de tous, de la netteté de l'image. Le dispositif selon l'invention est portable, facile à utiliser, léger, permettant un grandissent entre 100x et 1000x et dont le coût est faible. 10 Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, on peut ajouter un moniteur pour l'affichage et alimenter le système avec une batterie pour plus d'autonomie. Une carte SIM, un port USB ou un port infrarouge peuvent être intégrés permettant ainsi de connecter le microscope, et d'envoyer des informations vers un système distant. 15 Le dispositif selon l'invention comporte un microprocesseur, configuré pour compter automatiquement le nombre de levures dans un échantillon. Il peut pour cela utiliser la méthode d'extraction des contours. Afin d'avoir une bonne efficacité de l'algorithme de comptage, il est préférable de réaliser un certain nombre de prétraitements qui ont pour but d'éliminer les imperfections 20 liées à l'acquisition de l'image. Au début, l'image rouge vert bleu obtenue est convertie en une image à niveaux de gris où chaque pixel de l'image est représenté par la valeur de son intensité qui est comprise entre 0 et 255. La valeur 0 correspond au noir et la valeur 255 au blanc. Le but est d'isoler les couches qui correspondent aux levures, de 25 réduire la taille de l'image et par conséquent, de rendre plus facile la manipulation de la mémoire et plus court le temps d'exécution du programme. L'utilisation d'une led entraîne une distribution non uniforme de la luminosité dans l'image. Pour avoir une répartition plus équilibrée des niveaux de luminosité, une égalisation d'histogramme peut être appliquée. Cette opération 30 permet d'avoir une répartition du nombre de pixels par niveau de gris qui offre une image plus facile à étudier. 3034103 9 Il est aussi préférable d'appliquer différentes égalisations pour chaque région de l'image où il y a une grande variation de luminosité. Ainsi, l'image sera divisée en plusieurs parties de tailles MxM chacune, où M et une dimension de l'ordre de 20 pixels, puis l'égalisation est appliquée sur chaque partie de l'image 5 individuellement. L'utilisation d'un capteur nu augmente la possibilité d'avoir des images bruitées à cause des grains de poussière qui peuvent être déposés sur le capteur, générant ainsi des pixels noirs repartis aléatoirement sur l'image. L'utilisation d'un filtre médian permet d'éliminer la poussière de l'image. Ce filtre classe le voisinage 10 d'un pixel par ordre croissant, puis remplace le pixel par la médiane de ses voisins. Le filtre gaussien permet de réduire le bruit s'il est utilisé avec un écart type inférieur à 1. En augmentant la valeur de l'écart type, on obtient une image de plus en plus floue. En effet, ce filtre crée un noyau qui se déplace sur chaque 15 pixel de l'image et calcule le produit de convolution en affectant pour chaque pixel de voisinage un poids proportionnel à sa distance du pixel central. En utilisant la courbe de la fonction gaussienne, une moyenne pondérée est calculée où les pixels les plus proches ont un poids plus grand que celui des pixels les plus lointains. 20 L'image obtenue est une image lisse et convoluée car ce filtre atténue les composantes à haute fréquence. Il est équivalant à un filtre passe bas. L'étape de seuillage et d'extraction du fond consiste à isoler les levures et les séparer du fond de l'image. Pour cela, une binarisation est appliquée. Elle permet de classer les pixels de l'image en deux classes distinctes. La première 25 classe contient les levures et la deuxième le reste de l'image. Le problème dans ce cas est de trouver un seuil qui sépare ces deux classes. La méthode de seuillage global est utilisée dans le cas où le fond de l'image est uniforme. Dans le cas général, un seuillage local est plus performant car la répartition des niveaux de gris est non uniforme et le choix d'un seuil ne permet 30 pas de séparer efficacement les levures du fond de l'image. En effet, le seuillage local consiste à répartir l'image en plusieurs régions où le seuil est déterminé automatiquement pour chaque sous image. 3034103 10 Afin de mettre en valeur les cellules qui correspondent aux pics d'intensité, le filtre morphologique chapeau haut de forme peut être appliqué. Cette transformation extrait les pics les plus étroits de l'élément structurant choisi. Enfin, pour éliminer les pixels isolés qui appartiennent aux seuils sélectionnés 5 mais ne présentent pas des levures et pour obtenir des contours fermés, on applique les opérations de morphologie mathématique. Une érosion permet d'éliminer les points blancs isolés tandis que la dilatation élimine les points noirs isolés. Ces deux opérations consistent à parcourir l'image avec un élément structurant de taille NxN, où N est un nombre de l'ordre de 3 ou 5 pixels. Le 10 centre de l'élément structurant est placé sur chaque pixel de l'image et une opération logique est appliquée sur les pixels de voisinage. Pour une érosion, on applique un ET logique et pour une dilatation un OU est appliqué. La combinaison entre ces deux opérations donne une ouverture qui correspond à une érosion puis une dilatation. D'un autre côté, la fermeture correspond à une 15 dilatation puis une érosion. L'application de l'une de ces fonction sur l'image binaire permet de supprimer les pixels isolés qui ne représentent pas des levures puis renforce la densité des pixels et ferme les contours. Une fois les paramètres de binarisation, qui isolent les levures du fond de l'image, trouvés, on procède à la détection du contour et au comptage des 20 levures présentes dans un échantillon. Dans cette étape on peut utiliser par exemple la fonction findcontours qui est implémentée dans la bibliothèque OpenCV, une bibliothèque graphique libre, adaptée pour être utilisée dans le cadre de la présente invention. Les résultats obtenus suite à l'application de cette fonction sont filtrés de façon à éliminer toute fausse identification qui peut 25 se produire en se basant sur la taille des levures. En utilisant cette méthode, on peut détecter la majorité des cellules. Une deuxième méthode peut être utilisée, la méthode de la reconnaissance de formes. La méthode de la reconnaissance de formes consiste à comparer chaque région 30 de l'image avec un motif qui correspond à une levure. Cette fonction fait glisser le motif sur l'image en utilisant l'une des méthodes possibles de comparaison et permet de localiser toutes les occurrences possibles. 3034103 11 Une première méthode de comparaison consiste à calculer la différence au carré entre le motif et l'image. Une parfaite correspondance sera égale à 0 tandis qu'une fausse correspondance aura une valeur plus grande. Une deuxième méthode est la correspondance par corrélation. Elle consiste à 5 multiplier l'image et le motif. Les meilleures correspondances sont obtenues pour les valeurs les plus grandes et les fausses correspondances pour les valeurs les plus faibles et notamment celles qui sont égales à O. Une troisième méthode est la correspondance par coefficient de corrélation. Selon cette méthode, une comparaison entre la moyenne du motif et de l'image 10 est faite. Une correspondance parfaite correspond à un résultat égal à 1. Un décalage correspond à un résultat égal à -1. Si on obtient 0 comme résultat cela signifie qu'il n'y a pas de corrélation Il existe pour chacune de ces trois méthodes une version normalisée. Ces versions sont très utiles dans le cas où il y'a une différence de luminosité entre le 15 motif utilisé et l'image, ou dans le cas où la luminosité n'est pas uniforme. Cette méthode de comptage a plusieurs avantages. Elle permet de détecter les levures et de les dénombrer même dans des images de basse qualité et de faible contraste. De plus, cette méthode est fiable même si les zones de l'image qui correspondent aux levures sont bruitées. Grâce à cette fonction, on a un 20 temps d'exécution beaucoup moins important que le modèle de comptage par extraction de contours. Un essai sur 5 images et une centaine de levures présentes par image a montré une erreur moyenne inférieure à 10% pour ces deux méthodes. De tels niveaux d'erreurs sont acceptables pour les besoins du contrôle de fermentation du vin, 25 ou d'autres liquides fermentés. Le dispositif selon l'invention ouvre de nouvelles perspectives dans le contrôle des fermentations. Ce système peut également être utilisé dans plusieurs applications industrielles où le dénombrement des microorganismes est un outil important de maîtrise de procédés de fabrication de leurs produits (brasseries, 30 pharmaceutique, amidonneries, oenologie, fabrication d'éthanol-carburant, production de levures,...). REVENDICATIONS1. Dispositif de mesure de la concentration de microorganismes dans un échantillon (12) de liquide, comportant une source de lumière (11), un support d'échantillon (17), un capteur d'images (14), un dispositif optique (13) situé entre ledit support d'échantillon (17) et ledit capteur d'images (14), un microprocesseur et un programme de comptage, caractérisé en ce que ledit dispositif optique (13) est constitué d'une seule lentille transparente.2. 3. 4. 5. 6. 7. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel ladite lentille (13) est sphérique. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel ledit support d'échantillon (17) est disposé sur un rail (15), de façon mobile et réglable le long dudit rail (15), et ledit dispositif optique (13) est fixe par rapport audit capteur d'images (14). Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel ladite source de lumière (11) comprend une lentille de collimation disposée entre ladite source de lumière (11) et ledit support d'échantillon (17), de sorte à collimater la lumière de ladite source de lumière (11) vers ledit échantillon (12). Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite source de lumière (11) comporte un filtre polarisant. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit microprocesseur comporte un afficheur. Procédé de contrôle du développement de microorganismes dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : prélèvement d'un échantillon (12) dudit liquide, introduction dudit échantillon (12) dans un dispositif selon l'une des revendications précédentes, détection d'une image dudit échantillon (12) par ledit capteur d'images (14), 3034103 13 détermination de la concentration de microorganismes contenus dans ledit échantillon par comptage de microorganismes sur ladite image, par le moyen dudit programme. 8. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel on ajoute audit 5 échantillon (12) un additif, apte à différencier visuellement des microorganismes vivants de microorganismes morts, et ledit comptage est un comptage de microorganismes vivants. 9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 7, dans lequel le comptage utilise la méthode de reconnaissance de formes. 10