Brevet FR3025028A1 — publié le 20160226

La présente invention se rapporte au cancer du pancréas, et plus particulièrement au pronostic de survie d'un patient atteint d'un cancer du pancréas. L'invention vise aussi à déterminer la capacité dudit patient à recevoir un traitement du cancer du pancréas, particulièrement un traitement à la gemcitabine. Avec 43920 nouveaux cas annuels aux États-Unis, et 37390 décès, la mortalité liée au cancer du pancréas est de plus de 85%, ce qui place le cancer du pancréas au quatrième rang en termes de mortalités des cancers aux États-Unis tant chez les hommes que chez les femmes. L'incidence du cancer du pancréas a nettement augmenté au cours des 15 dernières décennies. Chaque année, environ 60000 personnes en Europe, et plus de 230000 dans le monde entier, sont diagnostiqués avec cette maladie. Les patients atteints d'un cancer du pancréas présentent souvent un moins bon pronostic par rapport à d'autres tumeurs malignes et types de cancer, en partie parce que la détection précoce est difficile. 20 Au moment du diagnostic, la plupart des patients atteints d'un adénocarcinome canalaire pancréatique présente une maladie localement avancé ou métastatique, et seulement 10 à 20% des cas sont des candidats à une chirurgie curative. La médiane de survie à partir du diagnostic est d'environ 3 à 6 mois; la survie 25 à 5 ans est très inférieure à 5% et une rémission complète est extrêmement rare. Les thérapies actuelles approuvées ou utilisées en pratique clinique chez les patients atteints de cancer du pancréas sont des traitements à base de gemcitabine, folfirinox ou encore d'erlotinib. La gemcitabine est un analogue de nucléoside, administré par voie 30 intraveineuse à une dose d'environ 1000 mg/m2. Un traitement à la gemcitabine fait usuellement partie des traitements de première intention recommandés pour le cancer du pancréas résécable (phase l-Il), le cancer du pancréas localement 3025028 2 avancé non résécable (stade III) et du cancer du pancréas métastatique avancé (stade IV). Avec la gemcitabine, la médiane de survie globale varie entre 4,9 mois et 8,3 mois. 5 Le succès limité des traitements et le taux de mortalité qui reste élevé pour une partie des patients soulignent la nécessité en moyens pour améliorer le ciblage thérapeutique des patients qui pourraient s'avérer de bons répondeurs à la gemcitabine et qui toléreraient bien la gemcitabine dans cette indication. Le traitement du cancer du pancréas par différents composés peut avoir 10 différents degrés d'efficacité en fonction du patient. Cependant, jusqu'à aujourd'hui, il n'existe aucun moyen de prédire le bénéfice clinique des différents traitements disponibles sur un patient donné. Il existe ainsi toujours un besoin en tests permettant de sélectionner pour chaque patient le bon traitement, de manière à leur donner les meilleures chances de survie. Il pourrait être souhaitable que ledit test soit un test que l'on puisse réaliser régulièrement. Un avantage supplémentaire serait que ledit test soit non invasif. Le travail des inventeurs a permis d'identifier un ensemble de gènes dont l'étude du niveau d'expression permet d'évaluer le temps de survie d'un patient atteint d'un cancer du pancréas. Avantageusement cette prédiction permet également de prédire les chances de réussite d'un traitement à la gemcitabine et de sélectionner les patients susceptibles de répondre favorablement à un traitement à la gemcitabine. Ainsi l'étude du niveau d'expression desdits gènes permet d'apporter un enseignement quant à l'opportunité d'administrer un traitement à la gemcitabine à un patient atteint d'un cancer du pancréas. Un des avantages de l'invention réside dans le fait que le niveau d'expression desdits gènes peut être évalué directement à partir d'un échantillon de sang, avantageusement de sang total du patient, préalablement prélevé. Ceci est particulièrement avantageux dans le cas du cancer du pancréas car il est très difficile d'accéder aux cellules tumorales. 3025028 3 En outre, l'échantillonnage du sang (collecte, stabilisation et transport) peut être standardisé. Enfin l'utilisation de sang total est plus sûre que l'utilisation d'une fraction de sang comme par exemple des cellules mononucléées du sang périphérique 5 (PBMC), car elle permet d'éviter les erreurs de manipulation liées à la préparation desdites fractions. Par "sang total", on entend le sang avec tous ses constituants, (plasma, globules rouges, globules blancs, plaquettes, ...) par opposition à "fraction de sang", qui correspond à un produit obtenu par séparation des composants particuliers du sang. Les cellules mononucléaires du sang 10 périphérique constituent un exemple d'une fraction de sang. L'invention a donc pour objet un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie chez un patient atteint d'un cancer du pancréas comprenant les étapes suivantes : a) mesurer le niveau d'expression d'au moins un gène marqueur choisi 15 parmi le groupe constitué des gènes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C et RPLP1 ou des gènes homologues, dans un échantillon de sang dudit patient préalablement prélevé ; b) comparer le niveau d'expression mesuré du ou des gènes marqueur(s) choisi(s) à l'étape a) chez ledit patient avec un seuil de référence ; 20 c) évaluer le temps de survie chez ledit patient. Le terme «homologue» est défini dans le présent texte comme une séquence de polynucléotides présentant un degré d'identité d'au moins 80%, de préférence 85%, plus préférablement 90%, et encore plus préférentiellement de 99% avec la séquence du gène (de longueur totale) sauvage. Le degré d'identité fait référence 25 à une identité de séquence entre deux séquences. L'identité peut être déterminée en comparant une position dans chaque séquence qui peut être alignée à des fins de comparaison. Quand une position équivalente dans les séquences comparées est occupée par la même base, alors les molécules sont identiques à cette position. Divers algorithmes et / ou programmes d'alignement peuvent être utilisés 30 pour la détermination de l'homologie de deux séquences, dont FASTA et BLAST. Le procédé selon l'invention permet d'établir un pronostic de survie chez un patient atteint d'un cancer du pancréas. 3025028 4 Selon l'invention, les étapes a) à c) du procédé ci-avant peuvent être mises en oeuvre sur un patient atteint d'un cancer du pancréas ayant reçu un traitement, et particulièrement un traitement à base de gemcitabine, pour prévoir ou évaluer l'efficacité et/ou le bénéfice d'un traitement du cancer du pancréas chez un patient 5 atteint de ladite pathologie, en particulier, en termes d'espérance de vie. Ainsi l'invention a aussi pour objet un procédé in vitro pour prévoir ou évaluer l'efficacité et/ou le bénéfice d'un traitement du cancer du pancréas chez un patient atteint de ladite pathologie comprenant les étapes suivantes : a) mesurer le niveau d'expression d'au moins un gène marqueur choisi 10 parmi le groupe constitué des gènes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C et RPLP1 ou des gènes homologues, dans un échantillon de sang dudit patient préalablement prélevé ; b) comparer le niveau d'expression mesuré du ou des gènes marqueur(s) choisi(s) à l'étape a) chez ledit patient avec un seuil de référence; 15 c) évaluer le temps de survie chez ledit patient. Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour prévoir ou évaluer l'efficacité et/ou le bénéfice d'un traitement du cancer du pancréas à la gemcitabine. Dans les procédés selon l'invention, le seuil de référence utilisé à l'étape c) 20 pour effectuer la comparaison est préalablement déterminé pour chaque gène ou chaque combinaison de gènes. Le principe de l'invention repose sur le fait que la Demanderesse a pu établir que l'étude du niveau d'expression d'au moins l'un des 5 gènes (NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C et RPLP1), avantageusement d'une combinaison de 2 à 5 de ces 25 gènes, encore plus avantageusement d'une combinaison des 5 gènes, permet d'établir un pronostic de survie du patient. Plus particulièrement, La Demanderesse a établi qu'en comparant des données de niveau d'expression d'au moins l'un des 5 gènes (NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C et RPLP1) ou leur combinaison, obtenues à partir d'un échantillon de sang dudit patient testé avec 30 des données qu'elle a elle-même établies pour les 5 gènes considérés ou leur combinaison sur une population référence de malades atteints d'un cancer du 3025028 5 pancréas, avant ou pendant le traitement, permettait d'établir un pronostic de survie du patient et un suivi dans le traitement de celui-ci. Le procédé selon l'invention peut être réalisé sur un échantillon de sang d'un patient, de préférence sur un échantillon de sang périphérique dudit patient, ledit 5 échantillon de sang étant prélevé préalablement à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Le sang périphérique est le sang qui circule à travers le coeur, les artères, les capillaires et les veines. Selon l'invention, l'étape a) du procédé peut être réalisée en mesurant le niveau d'expression de 1 des 5 gènes (ou gènes homologues) du groupe défini ci- 10 avant, avantageusement de 2 des 5 gènes, plus avantageusement de 3 des 5 gènes, encore plus avantageusement de 4 des 5 gènes, et préférentiellement des 5 gènes (ou gènes homologues) du groupe défini ci-avant. Ainsi selon l'invention l'étape a) du procédé peut être réalisée en mesurant le niveau d'expression d'au moins un gène (ou gène homologue) choisi parmi les 15 gènes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C et RPLP1, avantageusement d'au moins une des combinaisons suivantes : NME4 et ITPR3 ; NME4 et SESN3 ; NME4 et ARL4C ; NME4 et RPLP1 ; ITPR3 et SESN3 ; ITPR3 et ARL4C ; ITPR3 et RPLP1; SESN3 et ARL4C ; SESN3 et RPLP1 ; ARL4C et RPLP1 ; plus avantageusement le niveau d'expression des gènes de l'une des combinaisons 20 suivantes : NME4 et ITPR3 et SESN3 ; NME4 et ITPR3 et ARL4C ; NME4 et ITPR3 et RPLP1 ; NME4 et SESN3 et ARL4C ; NME4 et SESN3 et RPLP1 ; NME4 et ARL4C et RPLP1 ; ITPR3 et ARL4C et RPLP1 ; ITPR3 et SESN3 et RPLP1 ; ITPR3 et SESN3 et ARL4C ; SESN3 et ARL4C et RPLP1 ; encore plus avantageusement le niveau d'expression des gènes de l'une des combinaisons 25 suivantes NME4 et ITPR3 et SESN3 et ARL4C ; NME4 et ITPR3 et ARL4C et RPLP1 ; NME4 et ITPR3 et SESN3 et RPLP1 ; ITPR3 et SESN3 et ARL4C et RPLP1, et préférentiellement la combinaison suivante NME4 et ITPR3 et SESN3 et ARL4C et RPLP1. Préférentiellement, selon l'invention, l'étape a) du procédé est réalisée en 30 mesurant le niveau d'expression d'au moins un gène (ou gène homologue) choisi parmi les gènes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C et RPLP1, ou le niveau 3025028 6 d'expression des gènes de la combinaison suivante NME4 et ITPR3 et SESN3 et ARL4C et RPLP1. Dans un premier mode de réalisation du procédé selon l'invention, le niveau d'expression du ou des gène(s) choisi dans le groupe consistant en NME4, ITPR3, 5 SESN3, ARL4C et RPLP1 est mesuré par la mesure de la quantité de la protéine codée par ledit gène dans l'échantillon de sang dudit patient à tester. Dans ce cas, le taux de protéines est de préférence mesuré en utilisant des méthodes de détection à base d'anticorps tels que l'immunochimie ou l'analyse western-blot. Dans un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, le niveau 10 d'expression du ou des gène(s) est mesuré par la mesure du taux de transcription dudit gène. Ce taux peut être mesuré par la mesure de la quantité de l'ARN ou de l'ADNc dudit gène. Dans ce cas, le niveau d'ARN transcrit ou l'ADNc peut être mesuré en utilisant des méthodes de détection d'acides nucléiques comme la PCR quantitative, les puces à ADN, l'hybridation avec des sondes marquées, ou 15 les immuno-essais en écoulement latéral, en particulier à l'aide de bandelettes d'écoulement latéral. De préférence, dans les procédés selon l'invention, le niveau d'expression du gène ou de la combinaison de gènes, est mesuré par PCR quantitative en temps réel (real time quantitative polymerase chain réaction ou qPCR) réalisée sur les 20 transcrits ARN dudit gène ou sur leur ADN complémentaire (cDNA). Une qPCR est une PCR dans laquelle l'ADN amplifié est détecté en temps réel alors que la réaction de polymérisation progresse. Cette détection se fait par l'accumulation d'un signal fluorescent. Cette technique utilise des amorces (sens et anti-sens) et un marqueur, de 25 préférence, un intercalant fluorescent de l'ADN formé au cours des cycles de PCR. Avantageusement, lesdites amorces sont spécifiques des régions flanquantes du gène considéré. Dans le cas du gène NME4, les régions flanquantes sont situées sur l'exon sur le chromosome 16 entre les nucléotides 399665 et 399728 (Assembly Dec. 30 2013, GRch38/hg38 source UCSC). 3025028 7 Dans le cas du gène ITPR3, les régions flanquantes sont situées sur l'exon sur le chromosome 6 entre les nucléotides 33696404 et 33696485 (Assembly Dec. 2013, GRch38/hg38 décembre 2013, source UCSC). Dans le cas du gène SESN3, les régions flanquantes sont situées sur l'exon 5 sur le chromosome 11 entre les nucléotides 95166241 et 95166313 (Assembly Dec. 2013, GRch38/hg38, source UCSC). Dans le cas du gène ARL4C, les régions flanquantes sont situées sur l'exon sur le chromosome 4 entre les nucléotides 234 493 401 et 234 493 502 (Assembly Dec. 2013, GRch38/hg38 décembre 2013, source UCSC). 10 Dans le cas du gène de la RPLP1, les régions flanquantes sont situées sur l'exon sur le chromosome 15 entre les nucléotides 69455485 et 69455598 (Assembly Dec. 2013, GRch38/hg38 décembre 2013, source UCSC). Dans un mode de réalisation avantageux, les amorces suivantes peuvent être utilisées pour réaliser la qPCR : 15 - ARNs issus du gène NME4 o amorce sens: CATGATTGGACACACCGACTC (SEQ ID NO. 1) o amorce anti-sens: GACGCTGAAGTCACCCCTTAT (SEQ ID NO. 2) ARNs issus du gène ITPR3 o amorce sens: TCCTGGGGAAGAGTTGTACG (SEQ ID NO. 3) 20 o amorce anti-sens: AGGAGAAAAACAAGCGGTCA (SEQ ID NO. 4) ARNs issus du gène SESN3 o amorce sens: TTGCCTTTGTAGTCCTGTGC (SEQ ID NO. 5) o amorce anti-sens: CATTAGTCCAGTCACGTGCTTC (SEQ ID NO. 6) ARNs issus du gène ARLC4 25 o amorce sens: AAAGCCCTGTGGTGTATCAA (SEQ ID NO. 7) o amorce anti-sens: GCTTCCTCTGTTGGGTCAGA (SEQ ID NO. 8) ARNs issus du gène RPLP1 o amorce sens: TGGGCTTTGGTCTTTTTGAC (SEQ ID NO. 9) o amorce anti-sens: CAGACCATTTTTGCAGAGCA (SEQ ID NO. 10) 30 La qPCR permet de déterminer la valeur du nombre de cycle (Ct) d'un gène chez le patient à tester. Le Ct (« cycle threshold ») est défini comme le nombre de 3025028 8 cycles de PCR nécessaires pour que le signal fluorescent franchisse le bruit de fond. La valeur de Ct obtenue peut être ensuite normalisée par rapport au niveau d'expression d'au moins un gène ubiquitaire exprimé en nombre de cycle dans le 5 même échantillon de sang du même patient. Lesdits gènes ubiquitaires sont des gènes qui sont exprimés dans toutes les cellules d'un organisme dans des conditions normales et physiopathologiques. Ces gènes sont généralement exprimés à des niveaux relativement constants. De préférence, dans les procédés selon l'invention, à l'étape a), outre le 10 niveau d'expression d'un gène (Ctgène) marqueur ou de chaque gène d'une combinaison d'au moins 2 gènes marqueurs, on mesure le niveau d'expression d'au moins un gène ubiquitaire, lesdits niveaux d'expression étant mesurés en nombre de cycle(s) (Ct, « cycle threshold ») par PCR quantitative en temps réel (qPCR), puis on normalise le niveau d'expression du ou des gène(s) marqueur(s) 15 par rapport au niveau d'expression du au moins un gène ubiquitaire selon ACtgène = Ctgène - R moyenne des) Ct (gène(s) ubiquitaire(s))] afin d'obtenir un niveau d'expression normalisé ACtgène pour chaque gène marqueur dont on a mesuré le niveau d'expression. De préférence, dans les procédés selon l'invention, la normalisation est 20 effectuée par rapport au niveau d'expression de deux gènes ubiquitaires, en particulier, par rapport au niveau d'expression des gènes GAPDH et B2M. Dans ce cas, le niveau d'expression normalisé ACtgène d'un gène marqueur est calculé par : ACtgène = Ctgène - (CtB2M + CtGAPDH) / 2 25 Dans le cas du gène B2M, les régions flanquantes sont situées sur l'exon sur le chromosome 15 entre les nucléotides 44718721 et 44718792 (Assembly Dec. 2013, GRch38/hg38, source UCSC). Dans le cas du gène de la GAPDH, les régions flanquantes sont situées sur les exons sur le chromosome 12 entre les nucléotides et les nucléotides 6534833 30 6536572 (Assembly Dec. 2013, GRch38/hg38, source UCSC). Des amorces particulièrement appropriées pour les gènes de B2M et GAPDH peuvent être: 3025028 9 - ARNs issus du gène B2M o amorce sens: GCTCAGTAAAGACACAACCATCC (SEQ ID NO. 11) o amorce anti-sens: CATCTGTGGATTCAGCAAACC (SEQ ID NO. 12) - ARNs issus du gène GAPDH 5 o amorce sens: ATGGGGAAGGTGAAGGTCG (SEQ ID NO. 13) o amorce anti-sens: GGGGTCATTGATGGCAACAATA (SEQ ID NO. 14) Avantageusement, pour réaliser la qPCR, les amorces, leur taille (de préférence compris entre 80 et 150 nucléotides), leur température de fusion ( Tm, de préférence de 60°C ± 1°C), leur pourcentage en nucléotides G et C (GC%, de 10 préférence -60% en 3'), leur auto-complémentarité 3' et 5' et leur stabilité (de préférence inférieure à 4 nucléotides), les gammes de dimensions du produit et les paramètres thermodynamiques (évolution de la structure secondaire selon le Tm des amorces et la concentration en sel de sodium ) sont choisis pour permettre une détection simultanée. 15 Selon un premier mode de réalisation, lors de l'étape a), le niveau d'expression d'un seul gène marqueur est mesuré. Dans ce mode de réalisation, lors des étapes b) et c), les seuils de référence (Sref) d'un gène donné sont définis dans le tableau 1 ci-après : Tableau 1 Gène Sref NME4 3,1864 ITPR3 6,4014 SESN3 3,6262 ARL4C 2,6286 RPLP1 6,3748 20 - un niveau d'expression normalisé ACt de NME4 supérieur à 3,1864, et/ou un niveau d'expression normalisé ACt de ITPR3, SESN3, ARM4C et/ou RPLP1 inférieur respectivement à 6,4015 ; 3,6262 ; 2,6286 et 6,3748, 25 indiquant un pronostic de survie à long terme, tandis que un niveau d'expression normalisé ACt de NME4 inférieur à 3,1864, et/ou un niveau d'expression normalisé ACt de ITPR3, SESN3, ARM4C et/ou RPLP1 supérieur respectivement à 6,4015 ; 3,6262 ; 2,6286 et 6,3748, 3025028 10 indiquant un pronostic de survie à court terme Par "survie à long terme", il est entendu la survie de plus de 10 mois, de préférence plus de 12 mois, encore plus préférablement plus de 15 mois. Par "survie à court terme", on entend une survie de moins de 6 mois, moins 5 de 5 mois, soit moins de 3 mois. De plus, lorsqu'un patient est supposé avoir une survie à long terme, cela signifie également qu'il peut être considéré éligible pour un traitement à base de gemcitabine. A contrario, une survie à court terme du patient indique qu'un traitement à base de gemcitabine ne présentera pas ou peu de bénéfice au 10 patient. Un autre traitement devrait alors être envisagé. Les travaux de la Demanderesse (voir exemple 1) sur une population de référence l'ont conduite en effet à identifier 5 gènes pouvant être utilisés comme marqueurs pour un pronostic de survie d'un patient atteint d'un cancer du pancréas, mais également à déterminer pour ces 5 gènes, des valeurs pour des 15 seuils de Seuil référence (Sref) permettant d'effectuer une comparaison. Toutefois, une plus grande précision dans le pronostic peut être apportée grâce à la mesure d'une combinaison d'au moins deux gènes. Par conséquent, selon un second mode de réalisation, lors de l'étape a), on mesure de niveau d'expression d'une combinaison d'au moins deux gènes marqueurs et, lors des 20 étapes b), pour chaque gène marqueur dont on a mesuré l'expression : i) on détermine une valeur INDEXgène dépendante du niveau d'expression normalisé du gène, définie par : - INDEXgène = +1*coefficient [3 du gène, si ACtgène > seuil de référence du gène, et 25 - INDEXgène = -1*coefficient [3 du gène, si ACtgène seuil de référence du gène, et - INDEXgène = -1*coefficient f3 du gène, si ACtgène 1,5), 20 Le taux de faux positifs (FDR ) est une valeur-p ("pvalue") ajustée (ici FDR REVENDICATIONS1. Procédé in vitro pour établir un pronostic de survie chez un patient atteint d'un cancer du pancréas comprenant les étapes suivantes : a) mesurer le niveau d'expression d'au moins un gène marqueur choisi parmi le groupe constitué des gènes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C et RPLP1 ou des gènes homologues, dans un échantillon de sang dudit patient préalablement prélevé ; b) comparer le niveau d'expression mesuré du ou des gènes marqueur(s) choisi(s) à l'étape a) chez ledit patient avec un seuil de référence; c) évaluer le temps de survie chez ledit patient. 2. Procédé in vitro pour prévoir ou évaluer l'efficacité et/ou le bénéfice d'un traitement du cancer du pancréas chez un patient atteint de ladite pathologie comprenant les étapes suivantes : a) mesurer le niveau d'expression d'au moins un gène marqueur choisi parmi le groupe constitué des gènes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C et RPLP1 ou des gènes homologues, dans un échantillon de sang dudit patient préalablement prélevé ; b) comparer le niveau d'expression mesuré du ou des gènes marqueur(s) choisi(s) à l'étape a) chez ledit patient avec un seuil de référence ; c) évaluer le temps de survie chez ledit patient. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit traitement est un traitement à la gemcitabine. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on mesure à l'étape a) le niveau d'expression d'au moins deux gènes, avantageusement de 3, plus avantageusement de 4, et préférentiellement de 5 gènes. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit échantillon de sang est un échantillon de sang total périphérique. 3025028 6. 5 7. 8. 10 15 9. 20 10. 25 29 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le niveau d'expression du ou des gène(s) est mesuré par la mesure de la quantité de la (ou des) protéine(s) codée(s) par ledit gène présente(s) dans l'échantillon de sang. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le niveau d'expression du ou des gène(s) est mesuré par le niveau de la transcription de l'ARN ou de l'ADNc dudit gène. Procédé selon la revendication 7, dans lequel l'étape a), outre le niveau d'expression d'un gène (Ctgène) marqueur ou de chaque gène d'une combinaison d'au moins 2 gènes marqueurs, on mesure le niveau d'expression d'au moins un gène ubiquitaire, lesdits niveaux d'expression étant mesurés en nombre de cycle(s) (Ct, « cycle threshold ») par PCR quantitative en temps réel (qPCR), puis on normalise le niveau d'expression du ou des gène(s) marqueur(s) par rapport au niveau d'expression du au moins un gène ubiquitaire selon ACtgène = Ctgène - [(moyenne des) Ct (gène(s) ubiquitaire(s))] afin d'obtenir un niveau d'expression normalisé ACtgène pour chaque gène marqueur dont on a mesuré le niveau d'expression. Procédé selon la revendication 8, dans lequel, le niveau d'expression normalisé ACt d'un gène marqueur ou de chaque gène d'une combinaison d'au moins deux gènes marqueurs est normalisé par rapport à deux gènes ubiquitaires B2M et GAPDH. Procédé selon la revendication 9, dans lequel, lors de l'étape a), le niveau d'expression d'un seul gène marqueur est mesuré et lors des étapes b) et c), les seuils de référence (Sref) d'un gène donné sont : Gène Sref NME4 3,1864 ITPR3 6,4014 SESN3 3,6262 ARL4C 2,6286 RPLPI 6,3748 un niveau d'expression normalisé ACt de NME4 supérieur à 3,1864 et/ou 3 0 2 5 0 2 8 30 un niveau d'expression normalisé ACt de ITPR3, SESN3, ARL4C et/ou RPLP1 inférieur respectivement à 6,4015 ; 3,6262 ; 2,6286 et 6,3748 indiquant un pronostic de survie à long terme. 5 11. Procédé selon la revendication 9, dans lequel, lors de l'étape a), on mesure le niveau d'expression d'une combinaison d'au moins deux gènes marqueurs et, lors des étapes b), pour chaque gène dont on a mesuré l'expression i) on détermine une valeur INDEXgène dépendante du niveau 10 d'expression normalisé du gène, définie par : INDEXgène = +1*coefficient 13 du gène, si ACtgène > seuil de référence du gène, et INDEXgène = -1*coefficient 13 du gène, si ACtgène