Brevet FR3030752A1 — publié le 20160624

PROCEDE ET DISPOSITIF OPTIQUE DE SUIVI D'OBJETS EN TEMPS REEL DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé et un dispositif optique de suivi d'objets en temps réel. Lesdits objets sont typiquement des molécules d'origine biologique comme : l'ADN, des enzymes, des protéines, ou d'origine chimique comme les macromolécules (notamment les polymères), les nanoparticules fonctionnalisées ou non. ARRIERE PLAN DE L'INVENTION La structure et la dynamique d'objets tels que des macromolécules en solution est d'une importance essentielle dans un grand nombre de domaines d'études, de la physique et la chimie à la biologie. Notamment, les processus biologiques dépendent d'interactions moléculaires qui peuvent être représentées comme l'interaction entre deux objets de même nature ou de différente nature. Ces interactions sont au coeur d'investigations intensives dans les laboratoires biopharmaceutiques, cosmétiques, agroalimentaires, etc. qui cherchent à suivre et à caractériser l'interaction, par exemple en termes d'ancrage de molécules à leur cible à des fins de traitement thérapeutique, de changement de conformation, de polymérisation, etc. Différentes techniques expérimentales ont été proposées pour ces études comme les méthodes de spectroscopie (absorption infra-rouge ou Raman, fluorescence) ou de diffusion de rayonnements (rayons X, neutrons). Combinées à des simulations, notamment par dynamique moléculaire, ces méthodes se sont révélées bien adaptées bien qu'elles présentent toutes des défauts, conceptuels ou de mise en oeuvre. Généralement, les méthodes optiques sont mal adaptées dès lors que les échelles de longueur recherchées deviennent bien inférieures à la longueur d'onde de la lumière incidente, qui est de l'ordre du demi-micromètre dans le domaine visible. C'est dans ce contexte que les méthodes optiques non linéaires quadratiques présentent une alternative remarquable. En effet, les processus non linéaires d'ordre pair sont interdits dans les milieux possédant un centre d'inversion comme les fluides, gaz ou liquides dans l'approximation dipolaire électrique. Ainsi, toute déviation de la symétrie du milieu étudié à cette centrosymétrie est un milieu source pour un processus non linéaire d'ordre pair, en particulier pour le premier d'entre eux, l'ordre deux. Plusieurs processus optiques non linéaires peuvent être utilisés pour la caractérisation de la matière à partir d'un même faisceau d'excitation. Les processus les plus régulièrement utilisés sont : (1) la génération de seconde harmonique (ou SHG, acronyme du terme anglo-saxon Second Harmonic Generation) ; (2) la fluorescence à deux photons (ou TPEF, acronyme du terme anglo-saxon TwoPhoton Excited Fluorescence) ; (3) la diffusion hyper Raman (H R). Ces processus se distinguent cependant par leurs propriétés : - le processus (1) peut être cohérent, appelé encore SHG cohérent, et dans ce cas dépendant de N2 où N est le nombre d'objets participant au processus, ou incohérent, et dans ce cas dépendant de N seulement. Ce dernier processus est usuellement appelé diffusion hyper Rayleigh (ou HRS, acronyme anglo-saxon pour Hyper Rayleigh Scattering). Ces deux processus SHG et HRS sont très sensibles à la symétrie de l'organisation spatiale et temporelle des N objets. En particulier, le processus HRS est très sensible aux effets de corrélation à courte distance (ici entendu comme bien inférieure à la longueur d'onde) entre les N objets, - les processus (3) et (4) sont des processus incohérents peu sensibles aux effets de cohérence et plutôt utilisés pour déterminer la densité locale d'objets (notamment pour la TPEF) ou obtenir des informations internes sur les objets (le plus souvent vibrationnelles pour des molécules). Dans le processus HRS, deux photons de même fréquence sont convertis en un seul photon de fréquence double. Ce processus provient, dans un liquide isotrope, des fluctuations d'orientation instantanées qui s'y produisent. Qu'elles soient d'origine naturelle (liée à l'agitation thermique par exemple), ou provoquée par une action extérieure comme des interactions moléculaires, ces fluctuations conduisent à un signal mesurable. La diffusion hyper Rayleigh étant un processus incohérent dans l'approximation dipolaire électrique, l'intensité varie linéairement avec le nombre d'éléments diffusants (i.e. les molécules pour un liquide), et le processus de diffusion possède un diagramme de rayonnement angulaire non nul dans tout l'espace des 41-r radians. A cet effet, on excite un échantillon au moyen d'un faisceau lumineux à la fréquence fondamentale et l'on collecte vers un détecteur les photons résultant de cette excitation. Il est usuel d'utiliser un faisceau d'excitation incident à angle droit de la direction de collection de la lumière diffusée afin de diminuer la pollution lumineuse sur le détecteur par le faisceau incident. Cette configuration permet aussi d'introduire à dessein une approche au-delà de l'approximation dipolaire électrique, notamment à l'ordre suivant appelé l'ordre quadripolaire électrique, pour obtenir des informations supplémentaires sur l'organisation à courte échelle, bien inférieure à la longueur d'onde, des macromolécules ou du liquide. Le nombre maximal de paramètres est de six, appelés les six invariants, mais dans une configuration à angle droit ce nombre est limité et réduit à quatre : ces paramètres correspondent aux intensités lvv, IvH, 145v et IFIFI où V et H indiquent la polarisation verticale (V), à 45° ou horizontale (H), la première lettre désignant le faisceau incident et la seconde la lumière harmonique diffusée, étant rappelé que l'on se place dans le repère du laboratoire. La géométrie usuelle à angle droit d'un montage de diffusion hyper Rayleigh est illustrée de manière schématique sur la figure 1. Le faisceau fondamental incident à la fréquence w est de préférence issu d'un laser femtoseconde pour conserver une puissance crête élevée tout en réduisant les effets thermiques en utilisant une énergie faible. La direction de propagation est orientée selon l'axe Z et la polarisation du laser est réalisée dans le plan (X, Y) avec un angle y. On utilisera ici uniquement la polarisation linéaire mais le passage à une polarisation circulaire, azimutale ou radiale - ou, plus généralement, elliptique - selon le système étudié permet d'étendre le nombre d'invariants déterminés. La direction de collection est réalisée à angle droit de la direction Z, selon la direction Y. Un monochromateur est placé à la suite d'un filtre pour supprimer les photons incidents linéairement diffusés et un détecteur de type photomultiplicateur permet la détection des photons hyper Rayleigh. Le signal est généralement faible et peut nécessiter un régime de comptage de photons le cas échéant. Le document VVO 2009/125148 décrit un procédé et un dispositif pour mesurer la forme d'une particule ou la configuration spatiale d'une molécule dans une macro- molécule qui met en oeuvre deux faisceaux d'excitation présentant des directions d'incidence différentes, de préférence perpendiculaires. La collection de la lumière se fait dans une direction qui est la même que la direction d'incidence de l'un des faisceaux et qui est perpendiculaire à la direction d'incidence de l'autre faisceau. En d'autres termes, le montage met en oeuvre une collection de la lumière à 90° et à 180° par rapport aux faisceaux incidents. L'utilisation de ces deux angles permet d'enrichir l'analyse et de caractériser plus précisément la forme des particules ou la conformation spatiale de molécules au sein de macro-molécules. Cependant, ce montage implique la mise en oeuvre de deux chemins optiques incidents et est donc relativement complexe à réaliser. Un tel montage se prête donc difficilement à une mise en oeuvre industrielle. BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION Un but de l'invention est de concevoir un dispositif et un procédé optique de suivi en temps réel d'objets qui soit aisé et peu onéreux à mettre en oeuvre, tout en permettant un suivi précis des objets ou d'interactions entre objets. Conformément à l'invention, il est proposé un procédé optique de suivi en temps réel d'objets, comprenant : - la dispersion desdits objets dans une matrice centrosymétrique, - l'excitation d'au moins un desdits objets par un unique faisceau lumineux d'excitation polarisé, ledit faisceau pénétrant dans la matrice selon une unique direction d'incidence, - la détection en optique non linéaire des photons de lumière diffusés par au moins un des objets dispersés dans la matrice, dans la même direction que celle du faisceau incident mais dans le sens opposé audit faisceau, - la détermination de l'intensité de diffusion Hyper Rayleigh résolue en polarisation desdits photons détectés, - la détermination en temps réel, à partir de ladite intensité de diffusion, d'au moins une information sur la structure des objets et/ou sur une interaction entre objets. Par « information en temps réel sur la structure des objets », on entend toute information relative à la concentration, à la taille, à la conformation spatiale d'un objet et/ou à une interaction d'un objet avec un autre objet (identique ou différent), quelle que soit la cause d'une éventuelle évolution de celles-ci ; par exemple interaction molécule- molécule, polymérisation, cinétique chimique, etc. Selon un mode de réalisation, on place un objectif sur le trajet du faisceau d'excitation incident et du faisceau diffusé de telle sorte que le point focal dudit objectif soit situé dans la matrice. De manière optionnelle, on déplace le point focal de l'objectif dans la matrice et on détermine l'intensité de diffusion hyper Rayleigh pour chaque position dudit point focal. Selon une forme d'exécution du procédé, on obtient une pluralité d'échantillons formés chacun d'une matrice et d'objets dispersés dans ladite matrice et on excite simultanément les objets de chaque échantillon avec le faisceau lumineux incident. Selon une variante, on obtient une pluralité d'échantillons formés chacun d'une matrice et d'objets dispersés dans ladite matrice et on excite successivement les échantillons en déplaçant le faisceau lumineux incident. De manière avantageuse, le volume de la matrice est compris entre 0,1 pl et 100 pl. De manière avantageuse, la taille des objets est inférieure à 200 nm. Selon une application de l'invention, lesdits objets comprennent des protéines, des liposomes et/ou des nanoparticules fonctionnalisées et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur les interactions entre lesdits objets. Selon une application de l'invention, lesdits objets sont des protéines et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur la conformation desdites protéines. Selon une application de l'invention, lesdits objets sont des protéines et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur la polymérisation desdites protéines. De manière avantageuse, on analyse la signature optique des photons détectés en mettant en oeuvre une approximation dipolaire électrique ou une approximation d'ordre supérieur et l'on en déduit une information sur la taille et/ou la conformation des objets. Un autre objet concerne un dispositif de suivi en temps réel d'objets comprenant : - un dispositif d'émission d'un faisceau de lumière cohérente, - un dispositif de polarisation dudit faisceau de lumière cohérente, - un support apte à supporter ou contenir au moins un volume d'une matrice centrosymétrique dans laquelle lesdits objets à suivre sont dispersés, - un dispositif de détection de photons de lumière diffusés par au moins un objet présent dans ladite matrice, ledit dispositif de détection étant agencé sur un trajet optique de photons diffusés par ledit objet dans la même direction que celle du faisceau incident mais dans le sens opposé audit faisceau, - un objectif agencé sur le trajet du faisceau incident et sur le trajet des photons diffusés dans le sens opposé audit faisceau, - un dispositif de calcul configuré pour déterminer l'intensité de diffusion HyperRayleigh des photons détectés par le dispositif de détection et pour déterminer en temps réel, à partir de ladite intensité de diffusion, au moins une information relative à la structure des objets et/ou à une interaction entre objets. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 est une vue schématique d'un montage hyper Rayleigh conventionnel, dans lequel la direction d'excitation et la direction de collecte sont à angle droit, - la figure 2 est une vue schématique d'un montage de diffusion hyper Rayleigh mis en oeuvre dans l'invention, dans lequel la direction du faisceau d'excitation est identique à la direction du faisceau diffusé mais de sens opposé (rétro-réflexion), - la figure 3 est une vue schématique d'un dispositif de suivi selon un mode de réalisation de l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention met en oeuvre un processus de doublage de fréquence qui consiste à convertir deux photons à la fréquence de la source laser utilisée (w) en un photon à la fréquence harmonique (2w). La technique de diffusion hyper Rayleigh (HRS) utilisée permet de générer une signature optique rayonnée dans l'espace de l'objet en solution et de suivre l'évolution de l'objet et/ou l'évolution de son environnement, incluant les interactions entre objets identiques ou différents. L'invention permet de sonder les objets à l'échelle nanométrique dispersés dans une matrice, sans qu'un marquage desdits objets ne soit nécessaire. Contrairement au montage connu dans lequel l'excitation et la collection sont à angle droit, l'invention met en oeuvre une excitation et une collection dans la même direction mais dans des sens opposés (rétro-réflexion). Dans un premier temps, on rappelle la théorie pour une géométrie à angle droit, puis on expose la théorie relative à la rétro-réflexion. Théorie pour la géométrie à angle droit Dans la description qui suit, on considère la caractérisation de macromolécules dispersées dans un liquide. L'intensité hyper Rayleigh diffusée dans tout l'espace est donnée par : IHRS = GN(P2)12 (1) où IFIRs est l'intensité fondamentale, N le nombre de macromolécules diffusantes, 13 l'hyperpolarisabilité de ces macromolécules et G une constante définie par : G = (87r)2 cconL (2) 2A.4 où c est la vitesse de la lumière, Co est la permittivité du vide, À est la longueur d'onde fondamentale et n2,,, est l'indice optique de la phase liquide à la fréquence harmonique. Dans (1) les crochets tiennent compte de la procédure de moyennage sur toutes les orientations de macromolécules dans le liquide compte tenu de l'isotropie de ce dernier. Pour des mesures de diffusion hyper Rayleigh résolues en polarisation, les éléments du tenseur de la première hyperpolarisabilité des macromolécules doivent être introduits. Ces éléments sont décrits dans le repère (0, X, Y, Z) du laboratoire. On a: IFy,HRSF 4 = a cos y + br cos2 y sin2y+ c- - 4 stn y où r désigne la polarisation H ou la polarisation V. Les six paramètres différents de l'intensité introduite en (3) sont : av = GN/2(axx) (4a) bv = GN/2(4axy + 2fixxxfixyy) (4b) cv = GNI2(ayy) (4c) aH = GNI2(i3jxx) (4d) bH = GNI2(4pLy + 2fizxxfizyy) (4e) cH = GNI2(igjyy) (4f) Pour une réponse purement locale, c'est-à-dire pour des macromolécules non centrosymétriques et sans mode collectif, les relations suivantes peuvent être obtenues par raison de symétrie : (3) bV = aV eV (5a) bH = aH eH (5b) bH = 2aH = 2cH aH = eH (5c) (5d) Toute déviation de ces égalités indiquera ainsi la nécessité de discuter des résultats au-delà de l'approximation dipolaire électrique et donc dans l'approximation quadripolaire électrique pour introduire des effets retardés à travers des effets collectifs par exemple. Avec les relations (5a)-(5d), on obtient : Aly,HRS = aV COS2 y CV sin2 y (6a) pour la polarisation V des photons harmoniques diffusés, et IFly,HRS = CV (6b) pour la polarisation H de ces photons harmoniques. Ainsi, seuls deux paramètres sont accessibles et, en ne considérant pas une mesure absolue de l'intensité, difficile par ailleurs à mettre en oeuvre, on obtient un coefficient de dépolarisation caractérisant les macromolécules : D = cv = (ig,(x) (7) ai/ (flt)(x) Géométrie en rétro-réflexion La figure 2 illustre un montage de diffusion hyper Rayleigh selon l'invention et dans lequel, contrairement au montage de la figure 1 où les directions du faisceau incident et du faisceau diffusé sont à angle droit, la direction du faisceau incident est identique à la direction du faisceau diffusé mais de sens opposé. Le faisceau est incident selon la direction Z et est polarisé linéairement dans le plan (X, Y). Les photons diffusés sont collectés selon la même direction. Pour cela ils sont séparés des photons incidents à l'aide d'un miroir dichroïque avant d'être collectés et détectés selon le même principe que le montage précédent. Au lieu d'une polarisation linéaire, on peut choisir une polarisation elliptique du faisceau incident, incluant notamment une polarisation circulaire, azimutale ou radiale et de manière générale elliptique selon le système étudié afin d'étendre le nombre d'invariants déterminés. Théorie pour la géométrie en rétro-réflexion Dans ce cas, et en utilisant les expressions ci-dessus, on peut montrer que l'on obtient : Aly,HRS = aV COS2 y CV sin2 y (8a) IFly,HRS = CV COS2 y av sin2 y (8b) c'est-à-dire deux graphes dipolaires tournés de rr/2 l'un par rapport à l'autre. Le même coefficient de dépolarisation est obtenu qu'en (7), ce qui confère à cette géométrie les mêmes avantages que la géométrie à angle droit pour une analyse dans l'approximation dipolaire électrique. On notera que l'obtention de ce résultat n'était pas prévisible. En effet, comme indiqué à la page 25 de la thèse de Julien Duboisset, la configuration à 900 permet d'obtenir plus d'information qu'a 00 ou 180°. On aurait donc pu s'attendre qu'une configuration uniquement à 0° ne donne pas suffisamment d'information pour qu'un suivi des objets puisse être mis en oeuvre. On peut donc mettre en oeuvre, dans la mesure en rétro-réflexion (0°) selon l'invention, une analyse de la signature optique des photons détectés utilisant une approximation dipolaire électrique ou une approximation d'ordre supérieur (quadripolaire par exemple). On peut ainsi obtenir, en plus d'une information qualitative sur la structure des objets et/ou sur les interactions entre objets, une information sur la taille et/ou sur la conformation des objets, c'est-à-dire une information quantitative ou semi-quantitative. Suivi des objets Objets Les objets à suivre peuvent être des molécules d'origine biologique comme l'ADN, des enzymes, des protéines, ou d'origine chimique comme les macromolécules (notamment les polymères), les nanoparticules fonctionnalisées ou non. La taille desdits objets est typiquement inférieure à 200 nm, bien qu'une taille plus grande soit accessible si on ne se limite pas à l'approximation quadripolaire mais qu'on met en oeuvre un traitement, multipolaire par exemple, plus complet. Il n'existe a priori pas de limite inférieure pour les objets. En particulier, une molécule d'eau peut être caractérisée au moyen du procédé selon l'invention, l'eau étant considérée comme le solvant des molécules d'eau. D'une manière générale, on peut considérer que la taille des objets est comprise entre 0,1 et 200 nm. Le procédé ne nécessite pas de marquage des objets. Matrice Pour mettre en oeuvre le procédé, on disperse les objets dans une matrice centrosymétrique. La matrice est en outre au moins partiellement transparente aux fréquences (fondamentale et harmoniques) des faisceaux lumineux incident et diffusé. Ladite matrice peut être un liquide, un gel, un solide centrosymétrique, voire un gaz. Par exemple, la matrice peut être choisie parmi : les solvants aqueux ou organiques (parmi lesquels : alcool, chloroforme, isopropanol, etc.) ; les gels (gélatine, polyacrylamide, etc.), le verre. Dispositif de suivi La figure 3 est une vue schématique d'un dispositif de suivi d'objets mettant en oeuvre un montage de diffusion hyper-Rayleigh par rétro-réflexion. Le dispositif 1 comprend une source lumineuse cohérente d'excitation, par exemple une source laser femtoseconde 10. Les propriétés de ladite source pourront être par exemple une fréquence de l'ordre de 80 MHz, une puissance de l'ordre de 100 mVV et une durée des impulsions de l'ordre de 140 fs. Un miroir 20 défléchit le faisceau provenant de la source 10 à 900 vers un objectif 30 d'un microscope. Les caractéristiques (grossissement, ouverture) de l'objectif sont choisies arbitrairement. On pourra notamment choisir un objectif réflectif (type Cassegrain) pour collecter une onde harmonique de longueur d'onde inférieure à 400 nm (proche UV). Entre la source 10 et le miroir 20 sur le trajet du faisceau incident sont agencés successivement une lame À/2 et un filtre bloquant la fréquence harmonique. Dans la géométrie à angle droit, l'ouverture numérique pour l'excitation et la collection n'obéit pas à des contraintes particulières ; dans ce contexte, il est préférable de limiter l'ouverture numérique en excitation avec un objectif à faible ouverture, et de limiter de même la collection à une faible ouverture. En effet, cette configuration permet une meilleure définition sans recours à des corrections pour tenir compte des angles solides finis. En revanche, dans la géométrie en rétro-réflexion mise en oeuvre dans l'invention, il est préférable de choisir une grande ouverture numérique, par exemple avec un objectif de microscope à forte ouverture, afin de favoriser l'observation des effets retardés, y compris pour les objets les plus faibles si cela s'avère nécessaire. L'ouverture numérique a en effet aussi un effet amplificateur permettant de collecter davantage de photons diffusés. L'échantillon 2 contenant les objets à caractériser est mis en place sur un support 3. Dans la configuration illustrée sur la figure 3, l'objectif 30 est situé sous le support 3, ce qui impose au support 3 d'être transparent à la longueur d'onde du faisceau incident et du faisceau rétro-diffusé. Cependant, dans d'autres configurations, l'objectif peut être au-dessus de l'échantillon ou sur le côté de celui-ci, le support pouvant être alors transparent ou non à la longueur d'onde d'excitation. L'échantillon se présente de préférence sous la forme d'un micro-volume ou nano- volume, c'est-à-dire qu'il présente un volume typiquement compris entre 0,1 pl et 100 pl. Ceci permet de concentrer des échantillons contenant un très faible nombre d'objets (de l'ordre de 1 picomole). Dans l'exemple illustré à la figure 3, l'échantillon 2 se présente sous la forme d'une gouttelette déposée à la surface d'une plaque de verre formant le support 3. De manière alternative, l'échantillon peut se trouver dans un ou plusieurs puits réalisés dans une plaque (par exemple, une plaque à 96 puits telle qu'utilisée conventionnellement dans les méthodes d'analyses biologiques). De manière alternative, l'échantillon peut se trouver dans un circuit micro-fluidique. Ces différents supports de l'échantillon sont bien connus dans le domaine des analyses biologiques. Le dispositif de suivi présente l'avantage, grâce à son unique bras de mesure (excitation et collecte) d'être peu encombrant et notamment d'accéder aisément aux supports connus décrits ci-dessus. En particulier, le bras de mesure peut être positionné le plus près possible de l'échantillon, ce qui permet de collecter une intensité plus importante. Un dispositif à deux bras à angle droit ne peut en général être placé aussi près de l'échantillon de manière commode. L'objectif 30 est positionné de tel sorte que le point focal soit localisé dans le volume de l'échantillon 3. Avantageusement, l'objectif et le support sont mobiles l'un par rapport à l'autre, ce qui permet de balayer avec le faisceau incident une pluralité d'échantillons. De manière alternative, l'objectif peut être configuré pour exciter simultanément l'ensemble des échantillons. Avantageusement, l'objectif peut être contrôlé de sorte à déplacer le point focal dans le volume de l'échantillon, ce qui permet de balayer ledit volume et de faire plusieurs mesures dans un même volume. Entre le miroir 20 et l'objectif 30 sur le trajet du faisceau incident, un miroir dichroïque 40 est agencé de sorte à laisser passer le faisceau incident et à dévier le faisceau rétro-diffusé vers un détecteur 50. Entre le miroir dichroïque 40 et le détecteur 50 sont agencés successivement un filtre 41 bloquant la longueur d'onde fondamentale et un monochromateur ou photomultiplicateur 42. Le détecteur permet de déterminer l'intensité de diffusion hyper Rayleigh. Un processeur permet, à partir de ladite intensité, de déterminer au moins une information sur la structure des objets. L'information structurale (non seulement à l'échelle de l'objet dans sa globalité mais aussi au niveau d'une partie de l'objet), appelée hyperpolarisabilité des objets, est proportionnelle aux coefficients a, b, c dans les formules ci-dessus pour les différentes polarisations (l'hyperpolarisabilité est un tenseur dont la configuration en polarisation entrée et sortie permet d'en déduire les éléments, comment le montrent les formules présentées plus haut). Comme mentionné plus haut, la collecte du signal étant réalisée en continu, cette information structurale peut être fournie en temps réel, c'est-à-dire qu'elle rend compte de l'évolution d'une population d'objets au cours du temps. On peut ainsi suivre des cinétiques chimiques pendant une durée typiquement, mais pas seulement, comprise entre 1 minute et quelques minutes. En conclusion, un montage de diffusion hyper Rayleigh assemblé selon une géométrie en rétro-réflexion peut être utilisé pour le suivi de macromolécules. Une telle géométrie permet en effet d'atteindre les mêmes paramètres physiques des macromolécules étudiées. Elle possède cependant une grande facilité de mise en oeuvre, l'échantillon pouvant être irradié selon les six axes perpendiculaires aux parois d'une cellule à faces parallèles. Une incidence quelconque est cependant possible selon la géométrie du support. Applications Les applications qui découlent de l'invention concernent notamment les molécules biologiques et chimiques qui constituent le matériel de la recherche pharmaceutique, pour identifier et sélectionner les molécules pour des tests cliniques. On peut citer parmi celles-ci les molécules d'origine biologique telles que les protéines, les peptides, l'ARN, l'ADN, les macromolécules complexes mais également les molécules chimiques telles que les polymères, les nanoparticules, les colloïdes, les gels, etc... Ces tests biochimiques sont généralement effectués en grandes quantités afin de tester des interactions dans des volumes très faibles de l'ordre de 1 à 100p1. Suivi d'interactions moléculaires Une application de l'invention vise le suivi d'interactions moléculaires. Dans ce cas, les objets sont des molécules ou biomolécules comme des protéines, des liposomes et/ou des nanoparticules fonctionnalisées. Le procédé permet de suivre en temps réel la cinétique des interactions entre lesdits objets, et notamment de déterminer la constante cinétique et l'affinité. Par exemple, les liposomes sont des vecteurs thérapeutiques qui permettent d'encapsuler des molécules ou des protéines. L'interaction entre la molécule ou la protéine et la surface du liposome, ainsi que le maintien de la fonction et de l'activité de la molécule ou de la protéine sont des facteurs critiques à surveiller. Stabilité d'un produit pharmaceutique L'utilisation croissante des anticorps monoclonaux pose des problèmes de stabilité du produit, notamment dus aux fortes concentrations desdits anticorps. Durant le développement du produit, les conditions d'optimisation du solvant sont clés pour assurer la stabilité de la structure des protéines. Le procédé selon l'invention permet de réaliser des mesures non destructives de la stabilité structurale et de l'agrégation des protéines. Suivi de polymérisation Le suivi de la polymérisation de monomères dans différentes conditions est au coeur du développement de certains traitements du cancer. Le procédé permet un suivi de polymérisation en suivant l'évolution de la taille et de la conformation sans marquage. Lien entre la conformation et l'activité d'une protéine Le changement de conformation d'une protéine est un paramètre critique mais qui est difficile à suivre de manière directe. L'invention permet de suivre la conformation d'une protéine sans marquage de celle-ci. Analyse et détermination de la taille d'un objet L'invention permet également le suivi de l'évolution de la taille et de la forme d'un objet au cours du temps. REFERENCES VVO 2009/125148 Julien Duboisset, Génération de second harmonique de biomolécules : des acides aminés aux protéines, Chapitre 1, Thèse soutenue le 2 octobre 2009 REVENDICATIONS1. Procédé optique de suivi en temps réel d'objets, comprenant : - la dispersion desdits objets dans une matrice centrosymétrique, - l'excitation d'au moins un desdits objets par un unique faisceau lumineux d'excitation polarisé, ledit faisceau pénétrant dans la matrice selon une unique direction d'incidence, - la détection en optique non linéaire des photons de lumière diffusés par au moins un des objets dispersés dans la matrice, dans la même direction que celle du faisceau incident mais dans le sens opposé audit faisceau, - la détermination de l'intensité de diffusion Hyper Rayleigh résolue en polarisation desdits photons détectés, - la détermination en temps réel, à partir de ladite intensité de diffusion, d'au moins une information sur la structure des objets et/ou sur une interaction entre objets. 15 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on place un objectif sur le trajet du faisceau d'excitation incident et du faisceau diffusé de telle sorte que le point focal dudit objectif soit situé dans la matrice. 20 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel on déplace le point focal de l'objectif dans la matrice et on détermine l'intensité de diffusion hyper Rayleigh pour chaque position dudit point focal. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel on obtient une 25 pluralité d'échantillons formés chacun d'une matrice et d'objets dispersés dans ladite matrice et on excite simultanément les objets de chaque échantillon avec le faisceau lumineux incident. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel on obtient une 30 pluralité d'échantillons formés chacun d'une matrice et d'objets dispersés dans ladite matrice et on excite successivement les échantillons en déplaçant le faisceau lumineux incident. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel le volume de la 35 matrice est compris entre 0,1 pl et 100 pl. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel la taille des objets est inférieure à 200 nm. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel lesdits objets comprennent des protéines, des liposomes et/ou des nanoparticules fonctionnalisées et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur les interactions entre lesdits objets. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel lesdits objets sont des protéines et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur la conformation desdites protéines. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel lesdits objets sont des protéines et l'information déterminée à partir de l'intensité de diffusion hyper Rayleigh comprend une information sur la polymérisation desdites protéines. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel on analyse la signature optique des photons détectés en mettant en oeuvre une approximation dipolaire électrique ou une approximation d'ordre supérieur et l'on en déduit une information sur la taille et/ou la conformation des objets. 12. Dispositif (1) de suivi en temps réel d'objets comprenant : - un dispositif (10) d'émission d'un faisceau de lumière cohérente, - un dispositif (20) de polarisation dudit faisceau de lumière cohérente, - un support (3) apte à supporter ou contenir au moins un volume d'une matrice (2) centrosymétrique dans laquelle lesdits objets à suivre sont dispersés, - un dispositif de détection de photons de lumière diffusés par au moins un objet présent dans ladite matrice, ledit dispositif de détection étant agencé sur un trajet optique de photons diffusés par ledit objet dans la même direction que celle du faisceau incident mais dans le sens opposé audit faisceau, - un objectif agencé sur le trajet du faisceau incident et sur le trajet des photons diffusés dans le sens opposé audit faisceau, - un dispositif de calcul configuré pour déterminer l'intensité de diffusion Hyper-Rayleigh des photons détectés par le dispositif de détection et pour déterminer en temps réel, à partir de ladite intensité de diffusion, au moins une information relative à la structure des objets et/ou à une interaction entre objets.