Brevet FR3026486A1 — publié le 20160401

METHODE DE DETERMINATION DU POTENTIEL ALLERGENE DE POLLENS FLORAUX BUTINES PAR L'ABEILLE. La présente invention concerne une méthode de détermination du potentiel allergène des pollens floraux allergènes de produits en contenant, notamment de produit de la ruche. Le pollen est la semence mâle des fleurs qui constitue la seule source de certains macronutriments récoltés par l'abeille, notamment les abeilles mellifères ou abeiiles de type mélipones ou du type Apis. Collectés sur les anthères florales à l'extrémité des étamines, les grains de pollens floraux sont associés aux sécrétions de l'abeille et sont assemblés par l'abeille en pelotes placées dans les corbeilles des pattes arrières de l'insecte. Chaque pelote d'un poids de 5 à 10 mg (Mauricio A, Beihefte zur Schweizerischen Bienen-Zeitung 1953; 2:486-556) comporte plusieurs centaines de milliers de grains d'une seule espèce florale pour chaque pelote et nécessite la visite d'au moins 80 fleurs d'un même type de plante. Les pelotes de pollen floral ainsi pétries constituent ce que l'on dénomme « pollen d'abeille » encore abrégé en « P- apis» lequel est constitué de différents types de pelotes dont les pollens qu'elles contiennent proviennent d'espèces florales respectivement différentes. Le pollen d'abeille est transporté jusqu'à la ruche où il est stocké dans les cellules de cire. Il constitue alors le pain d'abeille. Au sein de la ruche, lorsque les avettes transportent et s'échangent le fruit de leur travail, les grains de pollens floraux récoltés se répandent aussi à d'autres produits de la ruche (PR) comme le miel, la gelée royale, la propolis et plus faiblement la cire. Ainsi, le pollen floral est un composant commun des produits de la ruche. Selon la présente invention, on entend donc par produit de la ruche : les produits fabriqués par les abeilles à base de pollen floraux comprenant le pollen d'abeille, le pain d'abeille, le miel, la gelée royale, la propolis et accessoirement la cire. Mais, on met en oeuvre la méthode de la présente invention principalement pour des produits de la ruche qui sont les plus utilisés pour l'alimentation, la pharmacie et/ou la cosmétique à savoir : le pollen d'abeille, le miel, la gelée royale et la propolis. Les végétaux dont les fleurs sont visitées par les abeilles sont très nombreux. Par exemple, plus de 268 espèces et variétés de plantes sont décrites en Angleterre (Kirk W, IBRA, seconde édition, 2006). Pour l'Europe, deux auteurs, Ricciardelli D'Albore G et Intoppa F, listent l'ensemble des familles de végétaux visités par l'abeille dans leur ouvrage Fiori et Api (Ricciardelli D'Albore G, Intoppa F, 2000; Fiori e Api; La fora visitata dalle api e dagli altri apoidei in Europa; Calderini Edagricole, Bologna, Italy). Certains pollens floraux des produits de la ruche sont responsables d'allergie. Les accidents anaphylactiques liés à la consommation des PR augmentent. Une riche littérature scientifique corrobore ce constat (Dutau G et al, Revue française d'allergologie, 2009 49:16-22. Tuncel et al, Allergol Immunopathol (Madr), 2011 Mar- Apr;39(2):112-3. Pecquet C, Eur J dermatol., 2013 Nov-Dec;23(6):767-73.). Chez la personne prédisposée (atopique), les accidents allergiques sont liés à l'ingestion ou au contact d'allergènes de pollens allergisants présents dans les produits de la ruche . Si les mêmes symptômes surviennent lorsqu'une personne est sensible à un allergène particulier et réagit à un autre allergène dont la structure est proche du premier, on parle alors d'allergie croisée. Par exemple, les pollens floraux d'armoise et de pissenlit, deux genres appartenant à la famille des astéracées, ont des allergènes croisants. Or, le pollen floral d'armoise et plus généralement de la famille des astéracées sont mis en avant dans la genèse de ces accidents (Helbling A et al, Allergy 1992 Feb; 47(1): 41-9). A côté de ceux-ci, les produits de la ruche comportent des pollens allergènes des familles graminées et oléacées (Dimou M et Thrasyvoulou A, Grana, 2007; 46: 292-299) ou encore bétulacées. Les quatre principaux types distinctifs de pollens allergènes à savoir : les pollens de plantes astéracées, graminées, oléacées et bétulacées sont à l'origine de la grande majorité des allergies polliniques en France et en Europe. Une faible proportion de ces pollens floraux dans les produits de la ruche (quelques pour cent seulement) suffit à engendrer des symptômes. Les allergènes des pollens floraux sont classiquement des protéines ou des glycoprotéines aptes à engendrer chez l'individu atopique, la synthèse d'immunoglobulines de type E spécifiques (IgEs). Selon le type de pollen floral, ils se situent sur l'exine autour des sillons et des pores, plus rarement dans l'intine et le cytoplasme cellulaire. Les protéines allergènes des pollens floraux appartiennent à un petit nombre de familles de protéines : 29 familles sur les 7868 actuellement connues (Radauer C, Breiteneder H, J Allergy Clin Immunol. 2006 Jan;117(1):141-7) Ces allergènes protéiques sont qualifiés de majeurs lorsqu'ils entrainent l'apparition d'IgEs chez plus de 50% de la population prédisposée, sinon ils sont dits mineurs. Dans la plupart des familles ou des espèces taxonomiques florales, les allergènes majeurs partagent une très forte homologie de structure, d'actions biologiques et une aptitude allergène commune. Ce sont alors des panallergènes. C'est le cas en particulier pour les pollens allergènes des plantes astéracées, bétulacées, oléacées et graminées qui sont parmi les principaux pollens les plus allergènes. Par exemple, des protéines isoformes allergènes de type pectase lyase sont communes aux différents genres végétaux de la famille des cupressacées (cyprès de Florence, thuya, genévrier...). Ainsi, Cup al, l'allergène majeur du cyprès d'Arizona, « chef de file » des cupressacées est une pectase lyase. Pour les oléacées (olivier, frêne, troène...), c'est une trypsin inhibitor comme Ole el de l'olivier. Pour les graminées (petites poacées, céréales...), les béta-expansines comme Phl pl et les G25 comme Phl p5b sont deux allergènes majeurs de la phléole, chef de file des poacées. Pour les bétulacées (bouleau, aulne, charme...), c'est une protéine de défense du type PR10 comme Bet vl du bouleau. Pour les astéracées, il existe plusieurs protéines candidates comme les profilines, les protéines de transport lipidique. La famille des astéracées comprend principalement les genres : Taraxacurn (pissenlit), Artemisia (armoise), Circium (cirse), Cichoriurn (chicorée), Achillea (achillées), Carduus (chardons), Arnbrosia (ambroisie), Solidago (solidage). La famille des graminées comprend principalement : les céréales, les petites poacées. La famille des oléacées comprend principalement: Olea (olivier), Fraxinus (frêne), Ligustrurn (troène). La famille des bétulacées-comprend principalement : Betula (bouleau), Ainus (aulne), Carpinus (charme), Caylus (noisetier). D'autres pollens allergènes moins fréquents ou moins allergènes proviennent de plantes suivantes : plantaginacées, chénopodiacées, salicacées, cupressacées, urticacées, rosacées et fagacées. Les différents types de pollens se distinguent par leurs caractéristiques d'aspect visuel. L'enveloppe extérieure présente une morphologie très variée et des spicules, pores et sillons par leur nombre et leur taille et leur disposition permettent de distinguer les pollens selon les familles ou genres voire les espèces et en particulier une caractéristique distinctive principale est leur diamètre d'enveloppe externe ou plus grand diamètre. Donc définir la famille ou le genre botanique du pollen floral est une étape importante pour établir sa nature allergène. Les protéines allergènes des pollens floraux conservent leur propriétés allergènes dans les produits de la ruche depuis leur entrée dans la ruche jusqu'à leur récolte par l'apiculteur et leur utilisation par le consommateur final comme le montre les revues d'accidents allergiques aux différents PR (Dutau G et al, Revue française d'allergologie, 2009 49:16-22.). Les produits de la ruche sont des aliments d'origine animale et répondent ainsi habituellement à la réglementation des aliments. Une information du type « ce produit est contre-indiqué aux personnes allergiques aux produits de la ruche » est parfois présente. Ces informations ont pour but d'attirer l'attention du consommateur « allergique » (soit environ 20 °h des consommateurs potentiels) mais elles ne sont pas satisfaisantes car elles signalent un danger mais ne sont pas précises. Par exemple, l'expression « allergiques aux produits de la ruche » peut induire en erreur par défaut. Cette formulation ne permet pas au consommateur souffrant d'un rhume des foins au pollen de bouleau de prendre conscience d'emblée et clairement du danger qui lie les PR et le pollen floral auquel il est allergique. A l'inverse, l'attention des allergiques au métal Nickel (10% des consommatrices potentielles) peut être attirée par excès à un risque qui n'existe pas. Dès lors, une information définissant la nature et l'importance du risque allergique s'avère utile. Dans les domaines de l'alimentation, de la cosmétique, il existe des kits de détection d'allergènes alimentaires. Leur fonctionnement repose habituellement sur une technologie immuno-biochimique permettant d'établir la présence ou l'absence d'allergènes alimentaires à identifier. Le résultat fourni est seulement binaire : oui ou non sans estimation du potentiel allergène. Plusieurs méthodes d'immunocytochimie ont aussi été développées et sont utilisées dans le cadre de la recherche appliquée, afin de déterminer si une substance suspecte d'être allergène l'est réellement. Ces techniques complexes de laboratoire établissent pour cette substance un potentiel allergène à usage « interne » (pour le laboratoire), car si le produit est allergène il peut être exclu d'une composition pharmaceutique ou cosmétique. Dans les laboratoires pharmaceutiques producteurs d'allergènes, notamment polliniques, la réactivité cutanée permet de mesurer le potentiel allergène des protéines allergènes. Chaque laboratoire élabore des solutions de protéines allergènes à partir de pollen floral récolté mécaniquement et conditionné selon des qualités pharmaceutiques imposées par la standardisation et les règles de bonnes pratiques industrielles. Schématiquement, le pollen floral est délipidé, puis il est mélangé à une solution de diluant aqueux afin de réaliser un choc osmotique. Puis une centrifugation et une filtration séparent le culot de pollen floral du surnageant qui comporte des protéines allergènes hydrosolubles. C'est avec les protéines du surnageant que les laboratoires pharmaceutiques élaborent leurs médicaments allergènes qu'ils caractérisent avec des unités de puissance allergène. Deux méthodes sont actuellement utilisées dans la standardisation de ces extraits allergènes : la qualification du spectre allergène de l'extrait et des essais fonctionnels biologiques. La première méthode définit ce spectre allergène avec des techniques de laboratoire complexes pour déterminer qualitativement et quantitativement chaque protéine allergène spécifique (ex: les allergènes majeurs vus plus haut) par l'emploi d'anticorps monoclonaux. Cette méthode indique la présence d'une protéine allergène spécifique, mais ne confère pas d'information sur la puissance de son action biologique dans l'extrait. La seconde méthode, fonctionnelle tels que les tests cutanés aux allergènes, fournit des informations sur la puissance biologique de l'extrait, mais pas sur sa composition spécifique (Cox L, Expert Rev Clin Immunol. 2005 Nov; 1(4): 579-588). Chaque laboratoire producteur d'allergènes dispose de son propre référentiel interne, ce sont les « in house reference (IHR) ». L'IHR est obtenu le plus souvent avec des extraits de protéines allergènes, dilués de 10 en 10 puis testés par tests de piqûre dénommés « prick tests » par comparaison à l'histamine ou à un histamino-libérateur, le phosphate de codéine, sur un groupe de patients « tout venant » allergiques à l'extrait. Les tests de piqûre « prick-tests » sont effectués à l'aide d'une pointe à travers une goutte de solution contenant les protéines allergènes déposées sur la peau. La lecture du test est effectuée 20 minutes après. Elle comporte la mesure du diamètre maximal ou de la surface de la papule observée. En fonction du laboratoire, l'extrait de protéines allergènes de référence (IHR) retenu est celui qui induit soit une papule d'un diamètre ou d'une surface prédéfinis, soit d'une papule équivalente à celle induite par une solution d'histamine à 1 mg/mi ou à 10 mg/mi (Aas K et al, Allergy, 1978 Jun; 33(3): 130-137) La réactivité cutanée est toujours prise pour témoin du potentiel allergène d'un « cocktail » de protéines allergènes extraites d'une matière première allergène comme le pollen floral. Ceci est lié à l'existence d'une relation mathématique de type: p = b (Concentration protéines-allergènes ) A entre la concentration des protéines allergènes des solutions extraites d'un pollen floral « Concentration protéines-allergènes » et la réactivité cutanée estimée par « p » la mesure du diamètre ou de la surface de la papule induite par le test de piqûre « prick test », où A et b sont deux constantes dépendantes du pollen floral, des conditions expérimentales comme, par exemple, la méthode de mesure du poids des protéines (méthodes de Bradford, de Kiejdal, de Lowry...), la méthode d'extraction des protéines allergènes du pollen floral. De la corrélation ci-dessus, on déduit la formule : Logio p = A (Logic) (Masse protéines-allergènes )) B Cette courbe dose-réponse établie expérimentalement a été démontrée depuis de nombreuses décennies (Dreborg A et al, Clinical Allergy, 1987; 17: 537-550). Cette relation a permis à de nombreux laboratoires d'allergènes d'élaborer leurs référentiels internes avec des critères propres à chacun (ex pour un oléacé: Hrabina M et al, Int Arch Allergy Immuno1,2007; 142: 11-18). Elle permet de titrer les préparations pharmaceutiques allergènes non pas en masse de principe actif (masse de protéines allergènes) mais en unités IHR, qu'elles soient sèches (comprimé) ou dissoutes (solutions).Actuellement le même type de courbe dose-réponse est démontré entre les protéines allergènes majeurs d'un pollen floral et la réactivité cutanée. Si les produits de la ruche sont réputés allergènes et présentent un intérêt potentiel dans la prise en charge des allergies (Münstedt K et Kalder M, J ApiP and ApiM Sci 2010;2 (a): 145-148. Saarinen K et ail, Int Arch Allergy Immunol. 2011;155(2):160-6.), il n'existe pas actuellement de procédé pour qualifier et quantifier de façon satisfaisante le potentiel allergène des produits de la ruche pouvant contenir différents types de protéines de pollens allergènes. Cette absence constitue un désavantage pour le consommateur final des produits de la ruche et pour l'industriel pour la formulation d'un complexe comportant des produits de la ruche, ou pour la définition d'une posologie thérapeutique sans risque allergique d'une composition à base de produit de la ruche pour la réalisation d'études cliniques... Cependant, les produits de la ruche sont des produits animaux de composition complexe de laquelle il est difficile d'extraire les molécules allergènes provenant des pollens floraux allergènes qu'ils contiennent. Dès lors, l'étude d'une relation entre la masse des protéines allergènes d'un produit contenant des pollens allergènes, notamment un produit de la ruche, et le potentiel allergène de ces protéines, mesuré par la réactivité cutanée, est difficile à mettre en oeuvre. Le but de la présente invention est donc de mettre à disposition un procédé d'estimation du potentiel allergène des produits de la ruche ou de la fraction de produit de la ruche d'une composition en contenant, qui définit la nature du risque allergène et le degré de ce risque de façon plus simple. Selon la présente invention, on a pu établir et caractériser expérimentalement une relation entre la masse d'un pollen floral allergène contenu dans une dose donnée de produit de la ruche ou composition en contenant et le potentiel allergène de ce pollen mesuré par réactivité cutanée, et ce sans avoir à extraire les protéines allergènes contenues dans le pollen. Selon la présente invention on a défini un indice de potentiel allergène dénommé « indice APIS» (pour « Allergen Potency 8i Immun Safety ») qui permet d'évaluer le potentiel allergène d'un pollen allergène provenant de pollen d'abeille et plus généralement d'un produit de la ruche ou composition en contenant. Selon la présente invention, l'indice APIS définit la nature allergène et le potentiel allergène des pollens floraux allergènes à partir du poids des différents pollens allergènes contenus dans un produit, notamment un produit de la ruche, inclus dans une dose donnée correspondant à une unité de consommation donnée. L'inventeur formule l'hypothèse - sans être lié par cette théorie- que ceci a été rendu possible du fait que les contenus protéiques des pollens sont constants au cours des saisons d'une part et d'autre part les abeilles ne récoltent que des pollens à maturité donc avec des compositions protéiques sensiblement constantes et un poids de protéines allergènes optimales pour chaque type de pollen. Ainsi, la présente invention permet de formuler pour chaque pollen floral allergène du spectre pollinique d'un produit de la ruche ou de la fraction de produit de la ruche d'un complexe ou composition en contenant, un indice APIS qui rend compte: - de la nature allergène définie par le nom du genre ou de la famille botanique du pollen floral, - du potentiel allergène APIS de ce pollen floral allergène mesuré en fonction de sa masse et d'une loi de définition du potentiel allergène de ce pollen allergène établie 30 expérimentalement. Les inventeurs ont établi qu'une relation Log10 (di) = Ai Log10 (Mi) + Bi dans laquelle Mi est la masse du pollen floral allergène pi, peut être définie expérimentalement en mesurant la valeurs de di correspondant au diamètre maximal en mm de la papule apparaissant en réactivité cutanée suite à des tests de piqûres du 35 type « prick tests » réalisés avec différentes solutions de concentrations connues différentes de dit pollen allergène pi provenant de pollen d'abeilles contenant le dit pollen floral allergène pi comme seul pollen allergène. Plus précisément, la présente invention fournit une méthode de détermination du potentiel allergène des pollens floraux allergènes butinés par l'abeille mellifère 40 inclus dans une dose donnée d'un produit contenant desdits pollens floraux allergènes, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes suivantes dans lesquelles: a) on isole l'ensemble des différents types de pollens floraux contenus dans la dite dose de dit produit, et b) on identifie et détermine le poids de chaque type de dit pollen floral allergène, et c) on attribue pour chacun des n types de pollens floraux allergènes pi, de préférence différents genres et/ou familles de pollens floraux allergènes, avec i=1 à n un indice de potentiel allergène APIS pi comme étant APIS pi = 10 x di avec Log10 (di) = Ai Log10 (Mi) + Bi avec i = 1 à n dans laquelle : - Mi est la masse du dit type de pollen floral allergène pi, - Ai et Bi sont des constantes spécifiques selon les dits types de pollens allergènes pi, Ai et Bi étant déterminées expérimentalement à partir des courbes de valeurs de di correspondant à la surface moyenne ou au diamètre maximal moyen de la papule apparaissant en réactivité cutanée sur plusieurs sujets allergiques, de préférence au moins 10 sujets, suite à des tests de piqûres, de préférence du type du type « prick tests », réalisés avec plusieurs solutions de différentes concentrations connues différentes de dit type de pollen allergène pi provenant de pollen d'abeilles contenant le dit type de pollen floral allergène pi provenant de pollen d'abeilles comme seul pollen allergène. Les différents types de pollens floraux correspondant à des pollens de plantes de différentes espèces ou différents genres ou différentes familles, notamment des familles de pollens allergènes similaires du type pan allergène. Ainsi, si le produit comporte comme pollen allergène de plante graminées ou astéracées un seul genre voire une seule espèce, il peut être intéressant d'indiquer l'indice APIS de potentiel allergène du pollen dudit genre ou de la dite espèce. C'est le cas notamment dans les exemples qui suivent pour les pollens de zea mays ou d'armoise. Zéa mays comporte les béta-expansines comme Phl p1 mais pas les G25 comme Phl p5b et le pollen d'abeille de zéa mays souvent monofloral. L'armoise rassemble en elle les différentes protéines candidates panallergènes des astéracées, ce qui se traduit de facto par une forte incidence des accidents allergiques sévères même en présence d'une faible quantité de pollen d'armoise. En revanche, si le produit à analyser comporte des pollens allergènes similaires du type panallergène comme discuté ci-dessus, de plantes de plusieurs genres d'une même famille comme illustré dans les exemples qui suivent, il sera plus approprié de mentionner l'indice APIS de la famille. Plus particulièrement, Ai et Bi sont déterminées expérimentalement à partir des courbes de valeurs de di correspondant au diamètre maximal moyen de la papule apparaissant en réactivité cutanée suite à des tests de piqûres du type prick test avec des dites solutions de concentrations de 100 ou 10 ou 1 mg/mi de pollen d'abeille ne comportant qu'un seul genre ou famille de pollen allergène, un pollen d'abeille ne comportant aucun genre ou famille de pollen allergène étant en outre mis en oeuvre à titre de témoin négatif, notamment pour éliminer une sensibilisation cutanée aux allergènes propres au corps de l'abeille. Plus particulièrement, selon la présente invention il a été établi qu'il est possible de déterminer pour chacun des n types de pollens floraux allergènes pi avec i=1 à n un risque allergène comme étant : - nul si APIS pi Au sens de la présente invention, on entend par « pollen floral » la semence mâle des végétaux appartenant à une famille ou à un genre au sens de la classification phylogénétique des êtres vivants. Dans le cadre de la présente invention, est qualifié d'allergène tout pollen floral disposant de substances de types protéines ou autres, reconnues comme immunologiquement néfastes pour un individu donné. Ce pollen peut être originaire de diverses variétés végétales et n'est pas limité à une fleur particulière. Plus particulièrement, le dit pollen allergène est compris dans familles végétales telles que graminées, bétulacées, plantaginacées, oléacées, chénopodiacées, salicacées, cupressacées, urticacées, rosacées, fagacées et astéracées. De préférence encore, les dits pollens allergènes sont choisis parmi les pollens des genres ou familles de plantes suivantes : armoise, zéa mays, astéracées, bétulacées, graminées et oléacées. Plus particulièrement encore, pour déterminer l'indice APIS pi= 10xdi des 6 pollens allergènes suivants, on se réfère aux équations suivantes : - pour le pollen d'armoise (i=1) : Logi° (di) = 0,2964 (Logio (M1)) + 0,5201, - pour le pollen d'astéracées (i=2) : Logi° (d2) = 0,25 (Logio (M2)) + 0,4333 - pour le pollen de bétulacées (i=3) : Logi° (d3) = 0,3165 (Logio (M3)) + 0,3546 - pour le pollen de graminées (i=4): Logi° (d4) = 0,24 (Logio (M4)) + 0,3315 - pour le pollen de zéa mays (i=5) : Logi° (d5) = 0,2311 (Logio (M5)) + 0,1437 - pour le pollen d'oléacées (i=6) : Logi° (d 6) = 0,2139 (Logi() (M6)) + 0,3933. Plus particulièrement encore, on détermine pour chacun des n pollens floraux allergènes pi avec i=1 à n un risque allergène comme étant : - nul si APIS pi 9 - négligeable si 10 APIS pi 19 - très faible si 20 APIS pi 29 - faible à modéré si 30 APIS pi 39 - important si 40 APIS pi Plus particulièrement encore, on détermine le dit indice APIS des différents pollens allergènes contenus dans un dit produit alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique pour - l'information du consommateur final du dit produit, - la définition d'une posologie, d'une dose unitaire ou journalière admissible au regard du risque d'allergie. Plus particulièrement encore, l'on détermine le dit indice APIS des différents pollens allergènes contenus dans un dit produit alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique pour - pour l'information du consommateur final de produits de la ruche, - pour la formulation d'un complexe comportant un produit de la ruche de type alimentaire, complément alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique, - pour la définition d'une posologie d'une dose unitaire ou journalière ou thérapeutique d'un complexe à base de produits de la ruche, - pour la réalisation d'études cliniques avec des produits de la ruche ou un complexe à base de produits de la ruche. L'indice APIS selon la présente invention est défini pour une dose donnée de produit de la ruche ou composition en contenant, notamment pour unité de consommation de produit de la ruche ou composition comportant une fraction de produit de la ruche. Une unité de consommation correspond ici à : - une unité de vente au consommateur, c'est à dire la quantité physique élémentaire qui sert de référence à la mesure de la composition vendue, notamment une composition alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique, lorsqu'il existe un conditionnement destiné à recevoir la quantité de produit nécessaire à une seule utilisation. Par exemple: le pot de miel de 30 g, le sachet de 6 g de pollen d'abeille, la friandise au miel de 5 g, la gélule de 400 mg de complément alimentaire contenant 125 mg de gelée royale, la capsule de 2 g de propolis lyophylisée, la portion individuelle de 5 g d'un aliment conditionné par un industriel de l'agroalimentaire tel que une boisson composée de différents ingrédients dont divers produits de la ruche et présentée en dosette de 10 ml. - la dose conseillée par le vendeur lorsque le produit est vendu en « vrac » (c'est à dire sans conditionnement destiné à recevoir la quantité de produit nécessaire à une seule utilisation). Par exemple, du pollen d'abeille ou du miel ou une pâte à tartiner composée de différents ingrédients dont divers produits de la ruche, conditionnés en barquette ou en pot, avec une mention du type « dose conseillée : une cuillère à soupe le matin au petit-déjeuner ». La loi de définition du potentiel allergène d'un pollen allergène est une courbe dose-réponse entre la masse du dit pollen allergène et la réactivité cutanée de sujets allergiques à ce pollen. Elle est établie expérimentalement avec un pollen d'abeille Papis contenant le dit pollen allergène car : - comme indiqué plus haut, les protéines allergènes des pollens floraux conservent leurs propriétés allergènes dans les produits de la ruche jusqu'à leur utilisation par le consommateur final. - l'indice APIS doit être en mesure de définir avec pertinence ce potentiel allergène à l'endroit où la masse de pollen allergène est la plus importante, c'est à dire dans le pollen d'abeille P-apis. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faite de manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - les figures 1A à 7A représentent les courbes du type : ( dp ) = b (Concentration p-allergènes) A de mesures de la réactivité cutanée (dp=diamètre maximal moyen de papule) chez 10 sujets allergiques au dit pollen allergène en fonction de la concentration en dit pollen allergène(Concentration p.allergène) respectivement pour les pollens allergènes des plantes suivantes dans un pollen d'abeille: armoise(figure 1A), astéracées (figure 2A), bétulacées (figure 3A), graminées (figure 4A), zéa mays (figure 5A), oléacées (figure 6A) et pour un pollen non allergène à titre de témoin négatif à savoir pollen de lierre (hedera helix (figure 7A) ; et - les figures 1B à 7B représentent les courbes linéaires du type Log10 (dp) = A (Log10 ( Masse p-allergène )) + B correspondant respectivement aux courbes des figures 1A à 7A. Les figures 1A à 7A et 1B à 7B illustrent les exemples 1-1 à 1-7 et respectivement 2-1 à 2-7 ci-après et y sont davantage commentées. 1) L'analyse palynologique des produits de la ruche, au sens de l'invention, définit le spectre et la proportion de chaque pollen floral par genres ou familles botaniques au sein de ce spectre, et détermine la masse totale des pollens floraux: Masse pollens par unité de masse de produit de la ruche. 1.1) Pour le miel, la détermination de la quantité totale du sédiment pollinique par unité de masse peut être effectuée par la méthode suivante: 10 g de miel sont dissous dans 20 ml d'eau à 40° C puis centrifugé pendant 10 minutes. Le liquide surnageant est soigneusement aspiré laissant seulement 1-2 ml qui sont ensuite agités et décantés dans un tube à centrifuger gradué de la bonne taille, afin de récupérer tous les sédiments. A la suite d'une nouvelle centrifugation de 10 minutes, le volume de sédiment est lu sur le tube gradué. La masse du culot est définie par le produit du volume lu par la masse volumique du sédiment pollinique. Celle-ci est de 1,3 g.cm-3 (1,3 g.m1-1) (Chauvin R, Traité de biologie de la ruche, Les produits de la ruche, Vol 3, Masson, 1968). Un miel contient environ 2 à 10 pl de sédiments par 10 g, soit entre 0,26 et 1,3 mg de pollens par gramme de miel. Après la pesée du culot pour déterminer Masse pollens par gramme de miel, l'examen au microscope détermine le spectre pollinique et la proportion de chaque pollen floral selon des procédures codifiées comme par exemple la technique de Louveaux (3. Louveaux J. et al, Methods of melissopalynology, Bee World. 1970; 51(3): 125-138). Pour adopter cette méthode, on doit disposer d'un équipement de filtrage Millipore et de filtres Millipore à 1 p d'un diamètre de 25 mm, de lames et de lamelles de microscope assez grandes pour contenir les filtres. Une quantité donnée de miel est choisie sur la base de la quantité de sédiments (généralement 10 g). Le miel est pesé, dissous dans 20 ml d'eau distillée, puis centrifugé une première fois pour éliminer le surnageant. Après une seconde centrifugation, le culot est ensuite dissous dans 10 ml d'eau distillée et placé dans le dispositif de filtration relié à une pompe à air. Le tube de centrifugation est rincé à fond avec une petite quantité d'eau distillée puis cette eau est ensuite versée dans la machine de filtrage. Après filtration de la totalité du liquide, le filtre est retiré et on laisse sécher. Quelques gouttes d'huile d'immersion sont placées sur une lame de microscope et le filtre est ensuite placé sur le chariot du microscope où il devient translucide. L'ensemble est recouvert d'une lamelle puis le comptage et l'identification des grains polliniques de 100 champs sont effectués au grossissement x 800. L'examen balaye le centre et la périphérie du filtre. Une autre méthode, la méthode de Maurizio (Maurizio A, Ann. Abeille, 1964; 7 : 289-299) est effectuée avec deux échantillons de miel homogénéisé de 50 g chacun. Chaque échantillon est pesé et 100 ml d'eau distillée sont ajoutés. Le mélange est dissous dans un bain-marie à 40 ° C. La préparation est centrifugée pendant 5 minutes pour décanter les sédiments. 90 ml de surnageant sont aspirés. Les 10 ml restant comportant le sédiment sont ensuite agités et décantés à nouveau dans un tube de centrifugeuse gradué de 10 ml. La préparation est centrifugée une seconde fois pendant 5 minutes et le liquide surnageant est soigneusement aspiré. Quelques gouttes d'eau distillée sont ajoutées au sédiment de manière à porter l'ensemble à volume fixe (habituellement 0,5 ml). A l'aide d'une micro-pipette 10 pl de la suspension sont prélevés et étalés en frottis sur une surface de 1 cm2 d'une lame. Deux échantillons sont prélevés pour chaque échantillon de miel et il y a donc quatre frottis au total. Les frottis sont séchés à 40 ° C puis le comptage et l'identification des grains polliniques sont effectués sous le microscope (grossissement 300) en utilisant un oculaire muni d'un réticule. Pour chaque frottis, 100 champs sont comptés à partir d'un bord du frottis en allant vers le centre et en oblique pour passer vers le côté opposé. Après avoir calculé la valeur moyenne des 400 domaines considérés, la valeur obtenue est rapportée à 10 grammes de miel. 1.2) Pour le pollen d'abeille P-apis, celui-ci subit un nettoyage rigoureux car il est destiné à la consommation humaine. Le tri et le nettoyage du pollen sont effectués à l'aide une machine proche d'un tarare agricole pour séparer les pelotes de pollen des poussières, des fragments de corps d'abeille, de cire ou de propolis. Au laboratoire, dans le cas du P-apis, la masse des pollens floraux Masse pollens est assimilée à la masse du P-apis car il est admis que les pelotes de pollen d'abeille ne comportent que des grains de pollens floraux pétris. Le comptage et l'identification des grains polliniques floraux sont effectués par l'examen sous le microscope de frottis d'un culot de sédiment là aussi obtenu après dissolution dans de l'eau distillée. La qualité de l'échantillon de P-apis analysé est variable en fonction de la 35 méthode employée. Par exemple, Pitsios et al choisissent 5 pelotes de couleurs différentes dans l'échantillon puis pèsent 50 pg de chaque pelote qu'ils dissolvent dans 0,05 ml de solution. La solution est mise entre lame et lamelle puis est examinée au microscope pour l'identification et le comptage des grains de pollen floraux. Ils calculent ensuite 40 pour 1 gramme de P-apis le nombre total de grains et celui de chaque pollen floral (Pitsios C et al, Ann Allergy Asthma Immunol. 2006 Nov; 97(5):703-6). Mais les questions de l'homogénéité et de la représentativité de l'extrait de cette technique sont discutées. Des techniques dérivées des méthodes de Louveaux (Louveaux J. et al, Bee World, 1978; 59: 139-157) ou d'Erdtman (Erdtman G., Sv. Bot. Tidskr., 1960; 54: 561- 564) et d'analyses de Vergeron (Vergeron P., Ann. Abeille, 1964; 7: 349-364) sont actuellement les plus utilisées en 2014 comme par exemple par Saavedra-Cahuatocto DM et al : Dix grammes de P-apis bien homogénéisés sont placés dans 5 ml d'eau distillée pendant deux heures puis centrifugés pendant 10 min à 2 500 tours par minute. L'échantillon de pollen est alors déshydraté avec de l'acide acétique (10 ml) pendant 60 min puis centrifugé de nouveau. Le sédiment est alors acétolysé puis rehydraté dans une solution aqueuse de glycérine puis re-concentré par centrifugation avant de constituer 5 frottis d'analyse montés entre lame et lamelle. Chaque frottis est ensuite étudié sous microscope pour l'identification de 300 grains de pollens floraux. Au total des 5 frottis, 1500 grains déterminent les pourcentages de chaque type de pollen floral. Accessoirement les pollens floraux sont classés en pollen dominant 45%), en pollen d'accompagnement (15-45%), en pollen isolé (1-15%) et en pollen présent (p: Après une nouvelle centrifugation, le sédiment est à niveau dissous dans 10 ml d'alcool éthylique pur. Après une dernière centrifugation, le sédiment obtenu est alors exploité comme expliqué plus haut (D'albore RG, Adipologie, 1979, 10(3), 241-267). 2) L'analyse pollinique des produits de la ruche (PR) est habituellement effectuée par un laboratoire spécialisé en termes d'analyses sur les matrices apicoles et les produits de la ruche. Une liste exhaustive de ces laboratoires peut être consultée, par exemple, sur le site internet de l'Institut technique et scientifique de l'apiculture et de la pollinisation - Institut de l'abeille (ITSAP-institut de l'abeille). Dans la présente invention, la masse d'un pollen floral allergène « Masse p- allergène » inclus dans un produit de la ruche PR, dont l'ensemble des pollens floraux du spectre pollinique a pour Masse totale Masse pollens/ est établi de la manière suivante: 2.1) calculs des volumes Vpn de chacun des 1 à n types de pollens floraux présents dans le spectre pollinique à partir du rayon r du grain de pollen floral et de la formule Vpn = 4/3 n r3 s'il est sphérique, ou à partir des demi axes équatoriaux e et longitudinaux I et de la formule Vpn = 4/3 n e2 I si le pollen floral est de forme ellipsoïde. Les valeurs de r, e et I sont extraites de la littérature à partir d'observations établies sur les pollens contenus dans les PR, notamment dans le P-apis (KIRK William - IBRA - seconde édition - 2006). Cette précaution est fondamentale pour prendre en compte les modifications de volume des pollens floraux liées aux qualités orthodoxes ou récalcitrantes des dits pollens au contact des sécrétions aqueuses de l'abeille. 2.2) calcul de la proportion rtion P p-allergène de volume occupé par un pollen floral allergène « p-allergène »: Pp-allergène = (Vp-allergène - %p-allergène) ep-allergène - %p-allergène) + (Vp2 - %p2) + (Vpn (Y0pn )) où (Yopn est le pourcentage de pollen floral pn observé dans le spectre pollinique établi par l'analyse palynologique. 2.3) calcul de la masse de pollen floral allergène « Masse p-allergène >>: Masse p-allergène = Pp-allergène - Masse pollens Il est admis que la masse volumique du culot de pollens est homogène de 1,3 g.cm-3 (1,3 g.m1-1) (Chauvin R, Traité de biologie de la ruche, Les produits de la ruche, Vol 3, Masson, 1968). A titre illustratif, on décrit ci-après des exemples 1-1 à 1-7 de calcules avec les types de matériels et les fournisseurs de matériels indiqués dans l'exemple 1. 3) Pour définir l'équation de détermination de l'indice APIS de potentiel allergène d'un pollen floral allergène particulier il est nécessaire au préalable de : - disposer d'un pollen d'abeille P-apis dont le dit pollen allergène est l'unique pollen allergène des pollens floraux du spectre pollinique, - calculer la masse de pollen floral allergène inclus dans le P-apis comme indiqué plus haut, - disposer d'un P-apis dont le spectre pollinique ne comporte aucun genre ou famille de pollen floral allergène; celui-ci étant utilisé comme « témoin P-apis négatif » pour permettre d'éliminer une sensibilisation cutanée aux allergènes propres au corps de l'abeille. 3.1) La préparation des extraits de P-apis est effectuée comme suit avec les deux types de P-apis définis ci-dessus : - Peser 5 g de pollen d'abeille P-apis frais ou décongelé avec une balance de précision puis broyer les pelotes et homogénéiser l'ensemble sur une plaque de verre; - Peser et diluer 450 mg de pollen P-apis homogénéisé dans 4,5 ml diluant (dilution poids/volume - 100 mg de P-apis /ml de diluant) puis homogénéiser la solution avec un agitateur à vitesse maximale pendant 1 minute. La solution est conservée à température ambiante pendant 24 heures. - Homogénéiser la solution de P-apis avec l'agitateur avant de prélever puis diluer 0,5 ml de la solution à 100 mg/mi dans 4,5 ml de diluant pour obtenir une solution à 10 mg/mi; Répéter ces opérations avec la solution à 10 mg/mi pour avoir au moins 3 solutions de P-apis à 100 mg/ml, 10 mg/mi et 1 mg/mi; A l'aide de la masse du pollen floral allergène inclus dans le P-apis, on déduit la masse du pollen floral allergène (en mg) contenue dans 1 ml de chaque solution de Papis. Les solutions de P-apis sont conservées à 8 °C et sont idéalement utilisées dans les 5 jours. 3.2) La mesure de la réactivité cutanée d'un pollen floral allergène contenu dans le P-apis est évaluée par la mesure du plus grand diamètre des papules (exprimé en millimètre) observées 20 minutes après le test de piqûre « prick-test » effectué à l'aide d'une pointe à travers une goutte de solution contenant le dit type de pollen allergène déposée sur la peau (Konstantinou GN et ail, Int Arch Allergy Immunol. 2010; 151(4):343-5). - Les tests cutanés sont réalisés sur la face antérieure de l'avant-bras de dix sujets allergiques au pollen allergène en cause. - Chaque sujet allergique est caractérisé par : - un diagnostic de maladie allergique et un dosage d'IgE sériques spécifiques au pollen allergène supérieur à 0,35 kUI/1, - un test de piqûre « prick test » positif avec l'extrait commercial du pollen allergène (papule supérieure à 3 mm de diamètre), - un test de piqûre « prick test » positif avec le témoin positif commercial d'histamine concentré à 10 mg/mi qui démontre la réactivité cutanée des sujets (papule supérieure à 3 mm de diamètre), - un test de piqûre « prick test » négatif avec le témoin négatif commercial (papule inférieure à 1 mm de diamètre), - l'absence de traitement anti-histaminique depuis 8 jours au moins. - Les tests cutanés comportent des tests de piqûres « prick tests » avec les extraits suivants: - les témoins positifs et négatifs commerciaux, - les 3 solutions de témoin P-apis négatif, - l'extrait commercial de pollen floral allergène, - les 3 solutions préparées avec le P-apis contenant le pollen floral allergène. - Chaque test cutané effectué avec les dits extraits est effectué en double et donne lieu à deux mesures de diamètre maximal de papule. Le diamètre maximal moyen de la papule est calculé par la moyenne géométrique des deux valeurs mesurées. La moyenne géométrique de n nombres xi (i variant de 1 à n) se définit comme la racine n ième du produit des xi , soit (x1.x2...xn) lin. Ici c'est la racine carrée du produit des deux mesures. - La distribution des mesures observées est validée par le contrôle au risque statistique alpha Comme défini plus haut, l'indice APIS se formule pour chaque pollen floral allergène du spectre pollinique d'un PR ou de la fraction de PR d'un complexe constituant une unité de consommation, par : le nom du genre ou de la famille botanique du pollen floral, le potentiel allergène de ce pollen exprimé en unité d'indice APIS L'unité d'indice APIS est définie pour mesurer le potentiel allergène d'un pollen allergène inclus dans une unité de consommation. Une unité de consommation titre X APIS pour le dit pollen lorsque, d'après la loi de définition du potentiel allergène associée au dit pollen, la masse du dit pollen incluse dans la dite unité de consommation provoque une papule d'un diamètre de x millimètres et avec X=10x. APIS est formulé de la manière suivante : APIS nom botanique du pollen allergène = X En fonction de la valeur de l'indice APIS, il peut être défini un risque allergène, c'est à dire un risque d'engendrer chez un sujet allergique pollinique à un pollen floral allergène une réaction allergique liée à l'utilisation d'une unité de consommation qui comporte le dit pollen allergène. Le tableau 2 ci-dessous présente ce risque allergène en fonction de la valeur de APIS déterminé en fonction des multiples essais réalisés. Tableau 2 : APIS APIS Exemple 1-1 : Calcul de Masse armoise dans un pollen d'abeille P-apis comportant pour unique pollen floral allergène l'armoise et dont le spectre pollinique se compose de : Armoise 43,1 °h; Mercurialis 25,7 °h, Lythrum salicaria 16,0 °h Brassicacées 14,7 %,(indéterminé Exemple 2-1 : Mesure de la réactivité cutanée du pollen floral « armoise » dans un pollen d'abeille P-apis comportant pour unique pollen floral allergène armoise. Les diamètres maximaux moyens de papule (dp en mm) pour 10 sujets 51 à 510 sont donnés au tableau 1 ci-après Tableau 2-1 : Rangs des Sujets armoise 24,6 mg/m1 armoise 2,46 mg/m1 armoise 0,25 mg/m1 51 22,97 11 8,94 S2 4,90 2,83 1,73 S3 6,93 3,87 1 S4 11,96 9 4,90 S5 17,97 6 1,41 S6 6,93 1,73 1 S7 8 5,92 3,87 S8 8,94 6 2,83 59 6,93 3,87 1,73 S10 3 2,83 1 dp 8,39 4,61 2,14 Ces valeurs dp sont rapportées sur : - la courbe de la figure 1A qui représente une courbe y1= 3,328 (x1) 0,2977 dans laquelle yi=dp armoise, Xi= concentration armoise/ b=3,328 et A= 0,2977, et - la courbe linéaire de la figure 1B yz= 0,2964 x2+ 0,5201 dans laquelle y2= Log10(dp armoise) et X2= LOg 10(M armoise) Exemple 2-2 : Mesure de la réactivité cutanée du pollen floral « astéracées » dans un pollen d'abeille P-apis comportant pour unique pollen floral allergène astéracées. Tableau 2-2 : Rangs des Sujets asteracées 57,8 mg/m1 asteracées 5,78 mg/m1 asteracées 0,58 mg/m1 51 17,89 9 4,90 S2 5,92 3,46 2 S3 5,47 3,46 1,41 S4 9,48 6,48 3,87 S5 13,41 5,47 1 S6 6 4 3,46 S7 6,48 4,90 3 S8 6 3,46 2 59 6,48 3,87 2 S10 3,46 3 1,73 dp 7,22 4,44 2,28 Ces valeurs dp sont rapportées sur : - la courbe de la figure 2A qui représente une courbe yi= 2,6935 (X1) 0,2535 dans laquelle yi=dp asteracées, Xi= concentration asteracées, et - la courbe linéaire de la figure 2B y2= 0,25 x2+ 0,4333 dans laquelle yz= Log10(dp asteracées) et x2= Log 10(M asteraceés) Exemple 2-3 : Mesure de la réactivité cutanée du pollen floral « bétulacées » dans un pollen d'abeille P-apis comportant pour unique pollen floral allergène 10 bétulacées. Tableau 2-3 : Rangs des Sujets bétulacées 13,9 mg/m1 bétulacées 1,39 mg/m1 bétulacées 0,14 mg/m1 51 4 1,73 1 S2 6,48 3,87 1 S3 3,87 2 1 S4 5 4 1,41 S5 6 1,41 1 S6 4,90 3 1,41 S7 3 1,73 1 S8 4 3,87 1 S9 6,48 3 1 S10 9,48 4,90 2,45 dp 5,05 2,72 1,17 Ces valeurs dp sont rapportées sur : - la courbe de la figure 3A qui représente une courbe yi= 2,2709 (x1) 0,318 dans laquelle yi=dP bétulacées, x1= concentration bétulacées, et - la courbe linéaire de la figure 3B y2= 0,3165 x2+ 0,3546 dans laquelle y2= Log10(dp bétulacées) et x2= Log10(M bétulacées) Exemple 2-4 : Mesure de la réactivité cutanée du pollen « graminées » dans un pollen d'abeille P-apis comportant pour unique pollen allergène graminées. Tableau 2-4 : Rangs des Sujets graminées 16,8 mg/m1 graminée graminées 0,17 mg/m1 s 1,68 mg/m1 51 3,87 2 1 S2 2 1,41 1 S3 4,47 3 1,41 S4 7,48 4,47 2,83 S5 6,48 3 1,73 S6 2,45 1 1 S7 4,90 3 1,41 S8 4,47 3,87 2,45 59 5,92 2,83 1,41 S10 4 1,73 1 dp 4,29 2,40 1,42 Ces valeurs dp sont rapportées sur : - la courbe de la figure 4A qui représente une courbe yi= 2,1561 (x1) 3,2407 dans laquelle yi=dp graminés, X1 = concentration graminés, et - la courbe linéaire de la figure 4B y2= 0,24 x2+ 0,3315 dans laquelle y2= Log10(dp graminés) et x2= Log 10(M graminés) Exemple 2-5 : Mesure de la réactivité cutanée du pollen floral zéa mays (maïs) dans un pollen d'abeille P-apis comportant pour unique pollen floral allergène le zéa mays. Tableau 2-5 : Rangs des Sujets maïs 98,3 mg/m1 maïs 9,83 mg/m1 maïs 0,98 mg/m1 51 2,45 1,41 1 S2 4 3,46 1,73 S3 3,87 1,73 1 S4 8,49 6 3 S5 3,46 2 1 S6 2,45 1,73 1 S7 5 2,83 1,73 S8 5 4 2 S9 3,87 2 1,41 S10 4 1,73 1 dp 4,00 2,42 1,38 Ces valeurs dp sont rapportées sur : - la courbe de la figure 5A qui représente une courbe yi= 1,4 (X1)°2309 dans laquelle yi=dp zéa mays Xi= concentration zéa mays, et - la courbe linéaire de la figure 5B yz= 0,2311 x2+ 0,1437 dans laquelle y2= Log10(dpzéa mays) et - x2= Log10(M zea mays) Exemple 2-6 : Mesure de la réactivité cutanée du pollen floral « oléacées » dans un pollen d'abeille P-apis comportant pour unique pollen floral allergène les oléacées et définition de la relation ( dp oléacées ) = b (Concentration oléacées ) A Tableau 2-6 : Rangs des Sujets oléacées 27,3 mg/m1 oléacées 2,73 mg/m1 oléacées 0,27 mg/m1 51 5 4 3,97 S2 4,90 2,45 2 S3 4,47 4 1,73 S4 3,87 2,45 1,73 S5 3,87 1,73 1 S6 4,90 3 1,73 S7 4,90 1,73 1 S8 5 2 1,73 59 9,49 6,92 5,91 S10 6,92 3,87 1,41 dp 5,14 2,93 1,89 Ces valeurs dp sont rapportées sur : - la courbe de la figure 6A qui représente une courbe yi= 2.458 (x03.2167 dans laquelle yi=dp oleacéesi x1= concentration oieacées, et - la courbe linéaire de la figure 6B yz= 0,2139 x2+ 0,3933 dans laquelle y2= Log10(dp oléacées) et X2= Log 10(M oléacées) Exemple 2-7 : Mesure de la réactivité cutanée du pollen floral « hédéra hélix » dans un pollen d'abeille P-apis ne comportant pas de pollen floral allergène Tableau 2-7 : Rangs des Sujets pollen pollen pollen témoin négatif témoin négatif témoin négatif 1 100 mg/m1 10 mg/m1 mg/m1 51 0 0 0 S2 0,5 0 0 S3 0,5 0,5 0 S4 0 0 0,5 S5 0 1 1 S6 0,5 0 1 S7 1 0 0,5 58 0 0 0 59 0 0 0 510 0,5 0 0,5 dp 0,3 0,15 0,35 Ces valeurs dp sont rapportées sur : - la courbe de la figure 7A qui représente une courbe yi= 0.2707(x1)3.°335 dans laquelle yi=dp hedera helixs, Xi= concentration hedera helix - la courbe linéaire de la figure 7B y2= 0,03 x2+ 0,57 On constate l'absence de relation significative ( dp hedera helix) = b (Concentration hédéra hélix ) EXEMPLE 3 : Calcul des indices APIS d'une unité de consommation composée d'un ou plusieurs produits de la ruche et détermination des risques allergènes. Exemple 3-1 : Portion individuelle d'un aliment composé de miel et de pollen d'abeille Une portion individuelle d'un aliment comporte du miel et du pollen d'abeille et totalise une masse de 2,4 mg de pollen floral d'oléacées. Elle constitue une unité de consommation définie par un industriel de l'agroalimentaire. Il désire connaitre le risque allergène de son produit alimentaire. Le pollen floral d'oléacées est un pollen allergène. On déduit de la masse de pollens oléacées et de la loi de définition du potentiel allergène des oléacées la mesure de la papule p : Logi° (p) = 0,2139 (Logio ( Masse oléacées )) ± 0,3933 Logi° (p) = 0,2139 (Logio (2,4)) + 0,3933 Logi° (p) = 0,2139 (0,38) + 0,3933 Logio (p) = 0,4746 p = 3 mm Cette unité de consommation est donc caractérisée par un potentiel allergène de 3 . 10 = 30 unités APIS pour les oléacées. Pour cette portion individuelle d'aliment, cette qualité est notée : APIS oléacées = 30. Le risque allergène de cette portion individuelle est faible à modéré pour oléacées. Exemple 3-2 : Portion individuelle journalière de pollen d'abeille Un professionnel de l'agroalimentaire commercialise du pollen d'abeille frais en barquette de 220 grammes pour une cure de 3 semaines. La portion individuelle journalière de pollen d'abeille est de 10 grammes à prendre le matin au petit-déjeuner. Il dispose d'un stock de pollen frais d'été « toutes fleurs » et il désire connaitre s'il peut le commercialiser sans danger auprès des consommateurs allergiques aux pollens floraux. Le spectre pollinique de son stock de pollen d'abeille comporte: Mercuriale 34,9 °h; Graminées 17,2 °h; Matricaire 15,9 °h; Pissenlit 12,1%; Trèfle blanc 6,3%; Armoise 4,3 °h; Millepertuis 3,6 °h; Epervière 2,9 °h et Mélilot 2,1 °h (indéterminés Exemple 3-3 : Portion individuelle de miel pour petit déjeuner. Un professionnel de l'agroalimentaire commercialise du miel en petits pots de verre de 30 et de 50 grammes auprès des professionnels de l'hôtellerie et de la restauration. Il dispose d'un stock de « miel de fleurs » bio et désire connaitre s'il peut le commercialiser sans danger auprès des consommateurs allergiques aux pollens floraux. L'analyse de ce miel montre un miel très riche avec 5810000 grains de pollens par 10 grammes. Ce miel contient 8,9 pl de sédiments par 10 g, soit 1,157 mg de pollens par gramme de miel. La masse de pollens s'élève à : 1,157 mg . 30 = 34,71 mg par portion individuelle de 30 g 1,157 mg . 50 = 57,85 mg par portion individuelle de 50 g Le spectre pollinique de ce miel comporte les pollens de : Lotier 60,0 °/0., Thym 14,9 °/0., Achillea 7,8 °/0., Clématis 6,2 °/(:), Carduus 3,0 °/0., Panicaut 2,8 °/0., Astéacées liguliflores 2,8 °/0., Olea europa 2,3% (indéterminés A partir des diamètres de chaque pollen (respectivement en micromètres : 18, 33, 29, 22, 43, 30, 36 et 21), on obtient les indices suivants pour les portions individuelles suivantes : - portion de 30 g de miel, pour les oléacées une Masse oléacées de 0,46 mg et pour les astéracées une Masse astéracées de 12,10 mg. D'après les lois de définition du potentiel allergène des oléacées et des astéracées, on obtient par portion journalière de miel d'abeille : APIS oléacées = 21 APIS astéracées = 50 Le risque allergène de cette portion individuelle de 30 g est très faible pour oléacées et important pour astéracées. - portion de 50 g de miel, pour les oléacées une Masse oléacées de 0,77 mg et pour les astéracées une Masse astéracées de 20,13 mg. D'après les lois de définition du potentiel allergène des oléacées et des astéracées, on obtient par portion journalière de miel d'abeille : APIS oléacées = 23 APIS astéracées = 57 Le risque allergène de cette portion individuelle de 50 g est très faible pour oléacées et important pour astéracées. A la connaissance de ces résultats, le professionnel de l'agroalimentaire demande quel est l'impact sur les APIS si les portions individuelles sont conditionnées en pots de 10 ou de 15 grammes de miel. Les réponses sont les suivantes pour les portions : - portion de 10 g de miel, pour les oléacées une Masse oléacées de 0,15 mg et pour les astéracées une Masse astéracées de 4,3 mg. D'après les lois de définition du potentiel allergène des oléacées et des astéracées, on obtient les indices suivants par portions journalières de miel d'abeille suivantes : APIS oléacées = 16 APIS astéracées = 38 Le risque allergène de cette portion individuelle de 10 g est négligeable pour oléacées et faible à modéré pour astéracées. - portion de 15 g de miel, pour les oléacées une Masse oléacées de 0,23 mg et pour les astéracées une Masse astéracées de 6,04 mg. D'après les lois de définition du potentiel allergène des oléacées et des astéracées, on obtient par portion journalière de miel d'abeille : APIS oléacées = 18 APIS astéracées = 42 Le risque allergène de cette portion individuelle de 15 g est négligeable pour oléacées et important pour astéracées. 35 REVENDICATIONS1. Méthode de détermination du potentiel allergène des pollens floraux allergènes butinés par l'abeille mellifère inclus dans une dose donnée d'un produit contenant desdits pollens floraux allergènes, Caractérisée en ce qu'on réalise les étapes suivantes dans lesquelles: a) on isole l'ensemble des différents types de pollens floraux contenus dans la dite dose de dit produit, et b) on identifie et détermine le poids de chaque type de dit pollen floral allergène, et c) on attribue pour chacun des n types de pollens floraux allergènes pi, de préférence différents genres et/ou familles de pollens floraux allergènes, avec i=1 à n un indice de potentiel allergène APIS pi comme étant APIS pi = 10 x di avec Log10 (di) = Ai Log10 (Mi) + Bi avec i = 1 à n dans laquelle : - Mi est la masse du dit type de pollen floral allergène pi, - Ai et Bi sont des constantes spécifiques selon les dits types de pollens allergènes pi, Ai et Bi étant déterminées expérimentalement à partir des courbes de valeurs de di correspondant à la surface moyenne ou au diamètre maximal moyen de la papule apparaissant en réactivité cutanée sur plusieurs sujets allergiques, de préférence au moins 10 sujets, suite à des tests de piqûres réalisés avec plusieurs solutions de différentes concentrations connues différentes de dit type de pollen allergène pi provenant de pollen d'abeilles contenant le dit type de pollen floral allergène pi provenant de pollen d'abeilles comme seul pollen allergène. 2. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que dans une étape suivante : d) on détermine pour chacun des n types de pollens floraux allergènes pi avec i=1 à n un risque allergène comme étant : - nul si APIS pi 3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'à l'étape b), on réalise les étapes suivantes dans lesquelles : b.1) on identifie les différents types de pollens floraux, de préférence différents genres et/ou familles de pollens floraux, en fonction de leurs caractéristiques d'aspect visuel, de préférence leurs diamètres, et on détermine le pourcentage de chacun des mtypes de pollens floraux Vpj avec j=1 à m par comptage visuel, et b.2) on détermine en fonction de la forme sphérique ou ellipsoïde de chaque type de pollen floral, le volume de chaque grain de chaque type de pollen floral, et b.3) on déduit la masse de chaque dit type de pollen pi par le produit de la masse totale des pollens floraux et la proportion volumique du dit type pollen pi, la proportion volumique Ppi de chaque pollen floral allergène pi étant déterminée par le quotient : (Vpi . % pi) / (Vpj . % pj) avec j = 1 à m dans laquelle : - Vpi est le volume du grain de pollen floral allergène pi - %pi est le pourcentage du dit pollen floral allergène pi - Vpj est le volume du grain de pollen floral appartenant l'ensemble des différents types de pollens floraux isolés - °/opj est le pourcentage du dit pollen floral pj. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'à l'étape b.3) on détermine la masse totale des pollens floraux par le produit du volume total des pollens floraux et de la masse volumique du pollen. 5. Méthode selon la revendication 3 ou 4 caractérisée en ce que : - à l'étape a), on isole lesdits pollens floraux par centrifugation, - à l'étape b.), on sépare les différents pollens floraux par dissolution du culot de sédiment pollinique, de préférence dans une solution aqueuse et/ou alcoolique, et - de préférence, à l'étape b3), on détermine la masse totale des pollens floraux par le produit du volume total du culot de centrifugation de sédiment pollinique et de la masse volumique du culot de centrifugation de sédiment. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que Ai et Bi sont déterminées expérimentalement à partir des courbes de valeurs de di correspondant au diamètre maximal moyen de la papule apparaissant en réactivité cutanée suite à des tests de piqûres avec des dites solutions de concentrations de 100 ou 10 ou 1 mg/mi de pollen d'abeille ne comportant qu'un seul genre ou famille de pollen allergène, un pollen d'abeille ne comportant aucun genre ou famille de pollen allergène étant en outre mis en oeuvre à titre de témoin négatif ». 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'on détermine le potentiel allergène des pollens floraux allergènes de produit(s) de la ruche inclus dans une dose donnée de dit produit de la ruche ou d'un produit complexe comportant au moins un produit de la ruche. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que le produit de la ruche est choisi parmi le pollen d'abeille, le miel, la gelée royale et la propolis. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le ditpollen allergène est compris dans les familles végétales telles que graminées, bétulacées, plantaginacées, oléacées, chénopodiacées, salicacées, cupressacées, urticacées, rosacées, fagacées et astéracées. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les dits types de pollens allergènes sont choisis parmi les pollens des genres et familles de plantes suivantes : armoise, zéa mays (maïs), astéracées, bétulacées, graminées et oléacées. 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que pour déterminer l'indice APIS pi= 10xdi des 6 pollens allergènes suivants on se réfère aux équations suivantes : - pour le pollen d'armoise (i=1) : Logio (d1 ) = 0,2964 (Logio ( M1)) + 0,5201, - pour le pollen d'astéracées (i=2) : Logi° (d2 ) = 0,25 (Logio ( M2 )) + 0,4333 - pour le pollen de bétulacées (i=3) : Logio (d3 ) = 0,3165 (Logio ( M3)) + 0,3546 - pour le pollen de graminées (i=4): Logic) (d4 ) = 0,24 (Logio ( M4)) + 0,3315 - pour le pollen de: zéa mays (i=5) : Logio (d5 ) = 0,2311 (Logio ( M5)) + 0,1437 - pour le pollen d'oléacées (i=6) : Logio (d 6) = 0,2139 (Logio ( M6)) + 0,3933. 12. Méthode selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'on détermine pour chacun des n pollens floraux allergènes pi avec i=1 à n un risque allergène comme étant : - nul si APIS pi 9 - négligeable si 10 APIS pi 19 - très faible si 20 APIS pi 29 - faible à modéré si 30 APIS pi 39 - important si 40 APIS pi 13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que l'on détermine le dit indice APIS des différents pollens allergènes contenus dans un dit produit alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique pour - l'information du consommateur final du dit produit, - la définition d'une posologie, d'une dose unitaire ou journalière admissible au regard du risque d'allergie.