Brevet FR3027918A1 — publié le 20160506

PRÉTRAITEMENT DE BIOMASSES LIGNOCELLULOSIQUES AVEC DES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX POUR LA PRODUCTION DE BIOÉNERGIES La présente invention concerne l'utilisation d'un champignon appartenant à la classe des basidiomycètes pour le prétraitement fongique d'une biomasse lignocellulosique dans le cadre de la production de bioénergies telles que l'éthanol et le méthane. Afin d'anticiper l'épuisement des énergies fossiles à terme et de contribuer à un environnement durable, le développement d'énergies renouvelables (hydraulique, solaire, éolienne, issue de la biomasse lignocellulosique) s'avère nécessaire. Les végétaux ou biomasse lignocellulosique (BL) sont un substrat de choix pour la production énergétique car ils sont renouvelables, largement disponibles et riches en sucres (55-75% MS) (Wan & Li, 2012). En outre, la méthanisation de la biomasse lignocellulosique, provenant notamment de résidus agricoles, possède un intérêt croissant dans la mesure où elle engendre une compétition limitée vis-à-vis de l'utilisation des terres pour les cultures alimentaires. Or, cette compétition est de plus en plus prise en compte dans la stratégie de développement des énergies renouvelables. Les procédés de production de bioénergies comprennent les principales étapes suivantes : 1) le prétraitement de la biomasse lignocellulosique, tel que le prétraitement biologique (e.g., champignons ou enzymes fongiques), physique (e.g., broyage, thermolyse), physico-chimique (e.g., thermohydrolyse, explosion à la vapeur) ou chimique (e.g., préhydrolyse à l'acide diluée, prétraitement en condition alcaline, utilisation de solvants organiques), 2) l'hydrolyse de la biomasse prétraitée, telle que l'hydrolyse à l'acide ou enzymatique et 3) la fermentation de la biomasse hydrolysée, telle que la fermentation éthanolique ou méthanique. Dans les filières de valorisation énergétique des biomasses lignocellulosiques, le prétraitement est le préalable indispensable à toute étape d'hydrolyse ou de fermentation. En effet, il est l'une des étapes-clef où se détermine le rendement futur de l'hydrolyse de la cellulose et de la valorisation des coproduits des parois végétales. Il a pour objectif de déstructurer la lignocellulose récalcitrante à l'hydrolyse enzymatique. La biomasse lignocellulosique (BL) est constituée de cellulose, des hémicelluloses et de la lignine. L'hydrolyse de la lignine est difficile et celle-ci est faiblement biodégradable en anaérobiose. En outre, dans la BL, les liaisons et interactions entre la lignine et les autres polymères rendent les sucres (en particulier les polysaccharides) fermentescibles peu accessibles. Chandler et al. (1980) montrent qu'l% de lignine décroît la digestion des matières organiques d'environ 3% (Lesteur et al., 2010). C'est la raison pour laquelle, des prétraitements sont nécessaires pour faciliter l'accès aux sucres fermentescibles des BL (Monlau et al., 2013). Le prétraitement fongique vise plus particulièrement à dégrader sélectivement les lignines sous l'action d'enzymes de délignification produites par le champignon pendant sa croissance afin de déstructurer le réseau hémilignocellulosique. Cette déconstruction facilite les étapes ultérieures de saccharification ou de fermentation de la cellulose et des hémicelluloses en améliorant l'accessibilité des enzymes de dégradation. Un prétraitement fongique efficace engendre : - une délignification sélective en préservant l'holocellulose pour permettre sa conversion ultérieure en éthanol ou en biogaz et produisant des monomères aromatiques dont certains peuvent être convertis lors de la méthanisation ; - une perte de matière sèche faible pour assurer la rentabilité du procédé. Les prétraitements, notamment physiques (e.g., broyage) et thermo-chimiques (e.g., alcalin, acide) représentent parfois jusqu'à la moitié de l'énergie utilisée lors de la transformation du substrat. Les prétraitements enzymatiques, qui nécessitent des étapes de production et d'extraction d'enzymes, sont très couteux. L'étape de prétraitement est donc une étape coûteuse représentant un obstacle significatif pour la commercialisation des procédés de production de bioénergies et pouvant générer des quantités importantes de déchets. Les prétraitements biologiques mettant en jeu des champignons filamenteux constituent une alternative aux prétraitements physiques, thermo-chimiques et enzymatiques, dans la mesure où ils permettraient un gain économique par une faible utilisation d'énergie ou par un coût de mise en oeuvre moindre. Parmi les champignons filamenteux, les champignons de la pourriture blanche (essentiellement des basidiomycètes) sont les seuls capables de dégrader tous les composants du bois (cellulose, hémicellulose et lignine) (Cullen et al., 2004). La capacité de ces champignons filamenteux à dégrader la lignine permet d'envisager leur utilisation industrielle, notamment dans les procédés de production dits de 2ème génération (2G) de bioénergies, telles que le biométhane. On peut distinguer deux modes de dégradation selon les champignons : une dégradation plus ou moins simultanée de l'ensemble des polymères du bois, et une délignification sélective au cours de laquelle la lignine est dégradée de façon préférentielle (Kirk et al., 1998). Les champignons de la pourriture blanche capables de provoquer une délignification sélective du bois sont des microorganismes potentiellement intéressants pour leur utilisation dans les filières de valorisation énergétique des biomasses lignocellulosiques. Plusieurs travaux ont concerné l'utilisation de champignons filamenteux dans des procédés de fermentation en milieu solide (FMS) sur différents substrats lignocellulosiques et notamment des pailles de blé. Néanmoins, un inconvénient du prétraitement fongique est qu'il requiert plusieurs semaines pour l'établissement d'une population fongique suffisante pour altérer significativement la matière. L'efficacité du prétraitement fongique s'évalue non seulement par une délignification sélective du substrat lignocellulosique prétraité mais également par son hydrolyse enzymatique afin d'estimer son potentiel de saccharification. L'amélioration de la digestibilité des biomasses lignocellulosiques prétraitées est généralement attribuée à la délignification et aux modifications des propriétés physiques des substrats : augmentation de la porosité de la surface des fibres ; diminution de la cristallinité de la cellulose et altération de la structure de la lignine qui pourra prévenir d'une adsorption irréversible des cellulases. Dans les différentes études, l'impact du prétraitement biologique est analysé en termes de libération de sucres réducteurs et/ou de glucose au cours de l'étape d'hydrolyse du substrat lignocellulosique prétraité. Toutefois il est à noter, qu'il est difficile d'effectuer une analyse comparative des améliorations d'hydrolyse rapportées dans la littérature en raison de la disparité des méthodes mises en oeuvre et notamment des cocktails cellulosiques utilisés plus ou moins efficaces. Cette disparité méthodologique se situe non seulement au niveau des conditions opératoires de l'hydrolyse enzymatique des biomasses prétraitées mais également au niveau des éventuels prétraitements physicochimiques associés aux prétraitements fongiques. Il existe en outre un besoin de trouver des souches de champignon qui soient performantes pour le prétraitement fongique. Dans le cadre de leurs recherches, les Inventeurs ont mis en oeuvre 5 souches fongiques appartenant à la classe des basidiomycètes dans un procédé de fermentation en milieu solide (FMS) afin de réaliser un prétraitement biologique de la paille de blé. La paille de blé est un modèle expérimental de la biomasse lignocellulosique parce que sa composition en matière organique (MO) est représentative des biomasses herbacées (Vassilev et al., 2012). Le traitement par FMS a été réalisé à 28°C pendant 21 jours. L'étude de la composition chimique de la paille de blé prétraitée a permis de mettre en évidence une délignification efficace avec des pertes en lignine comprises entre 30 et 50% (m/m). De façon générale, cette délignification s'accompagne d'une dégradation limitée des polysaccharides pariétaux. La souche Polyporus brumalis_BRFM 985 s'avère être sélective avec une faible dégradation de la cellulose et des hémicelluloses. L'hydrolyse enzymatique des pailles de blé prétraitées, par des cocktails cellulosiques commerciaux, a permis d'obtenir des gains allant jusqu'à 85% des quantités de sucres réducteurs libérés à partir des polysaccharides pariétaux avec la souche Polyporus brumalis_BRFM 985 par comparaison à la paille témoin non ensemencée. Les tests de potentiel méthane ont montré qu'il pouvait être obtenu jusqu'à 26% de méthane supplémentaire avec la souche Polyporus brumalis_BRFM 985 par rapport à la paille témoin non ensemencée (NmL CH4/g de matière organique prétraitée). En outre, les résultats d'hydrolyse enzymatique et de méthanisation montrent l'efficacité du prétraitement fongique de la paille de blé pour sa bioconversion en produits énergétiques. L'utilisation de la souche lignolytique Polyporus brumalis_BRFM 985 durant la période de stockage de la biomasse lignocellulosique (« stockage actif ») permettrait donc de faciliter la transformation ultérieure de cette biomasse lignocellulosique prétraitée dans les procédés de production 2G de bioénergies. La souche Polyporus brumalis_BRFM 985 a été déposée selon le traité de Budapest le 16 octobre 2014 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 25 rue du Docteur Roux, Paris, sous le numéro CNCM 1-4900. La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'une souche de champignon basidiomycète appartenant à l'espèce Polyporus brumalis, de préférence de la souche Polyporus brumalis CNCM 1-4900, pour le prétraitement d'une biomasse lignocellulosique en milieu solide. Avantageusement, ledit champignon n'est pas génétiquement modifié. Le champignon basidiomycète peut se présenter sous la forme de granulé de miscanthus inoculé avec ledit champignon basidiomycète. On entend par « prétraitement » la déconstruction totale ou partielle de la lignocellulose (délignification) d'une biomasse lignocellulosique. La sélectivité et l'efficacité de la déstructuration de la lignocellulose peuvent être estimées en mesurant, respectivement, le recouvrement des différents substrats pariétaux et les quantités de glucose et de xylose (issu du xylane, hémicellulose majoritaire des lignocelluloses) libérées par ladite biomasse lignocellulosique au cours d'une étape d'hydrolyse enzymatique. La « biomasse lignocellulosique » est essentiellement composée de cellulose (25 à 55%), d'hémicellulose (20 à 50%) et de lignine (10 à 35%) (les pourcentages des différents polymères variant en fonction de la ressource végétale de biomasse lignocellulosique). La biomasse lignocellulosique utilisée conformément à la présente invention inclut : - les résidus agricoles (e.g., paille de blé ou de riz, tiges), - les résidus forestiers (e.g., écorces, feuilles, branches) provenant d'espèces arborescentes résineuses (e.g., pins, épicéas) ou feuillues (e.g., eucalyptus, peuplier, saule), - les sous-produits de la transformation du bois (e.g., sciures, rebuts), - les plantes ligneuses ou herbacées (e.g., miscanthus, triticale) issues de cultures dédiées, - les déchets verts municipaux, - les déchets de bois (e.g., palettes, cagettes, bois d'ameublement), - les fractions fermentescibles des ordures ménagères. La biomasse lignocellulosique peut être constituée de fragments de moins de 50 cm, de préférence compris entre 1 mm et 50 cm. Avantageusement, la biomasse lignocellulosique est de la paille de blé, qui peut se présenter sous la forme d'un andain. Le prétraitement peut être effectué lors du stockage de la biomasse lignocellulosique préalablement à son utilisation dans un procédé de production de bioénergies (e.g., éthanol, méthane). La présente invention a également pour objet une méthode de production de bioénergie comprennent les étapes suivantes i) le prétraitement de la biomasse lignocellulosique en milieu solide ii) l'hydrolyse de la biomasse prétraitée, telle que l'hydrolyse à l'acide ou enzymatique et iii) la fermentation de la biomasse hydrolysée, telle que la fermentation éthanolique ou méthanique, caractérisée en se que ladite étape de prétraitement comprend la mise en contact d'une souche de champignon basidiomycète appartenant à l'espèce Polyporus brumalis, de préférence de la souche Polyporus brumalis CNCM 1-4900, avec ladite biomasse lignocellulosique. Avantageusement, ledit champignon n'est pas génétiquement modifié. La biomasse lignocellulosique utilisée pour la mise en oeuvre de ladite méthode est telle que définie ci-dessus. Ladite étape de prétraitement comprenant la mise en contact d'un champignon basidiomycète avec la biomasse lignocellulosique est dénommée ci-après étape de prétraitement fongique. Le champignon basidiomycète peut se présenter sous la forme de granulé de miscanthus inoculé avec ledit champignon basidiomycète. La durée de l'étape de prétraitement fongique varie en fonction de la quantité de champignon basidiomycète mis en contact avec la biomasse lignocellulosique, de la composition de la biomasse lignocellulosique, de la quantité de biomasse lignocellulosique, des conditions d'humidité, de température et d'aération de la biomasse lignocellulosique, et du résultat du prétraitement souhaité par l'homme du métier. La durée de cette étape de prétraitement fongique peut être déterminée par l'homme du métier en mettant en oeuvre ses connaissances générales à l'aide de méthodes de routine. Avantageusement, la durée de l'étape de prétraitement est de 5 à 100 jours. Les conditions d'humidité, de température et d'aération de la biomasse lignocellulosique lors de l'étape de prétraitement fongique peuvent également être déterminées par l'homme du métier en mettant en oeuvre ses connaissances générales à l'aide de méthodes de routine. Avantageusement l'humidité est maintenue constante pendant toute la durée de l'étape de prétraitement fongique, de préférence à hauteur de 50% à 100%. Avantageusement encore, de l'air est insufflé dans la biomasse lignocellulosique, de préférence entre 0,1 et 3 vvm et/ou des retournements occasionnels de la biomasse lignocellulosique sont effectués. Avantageusement encore la température de la biomasse lignocellulosique est maintenue entre 25 et 35 °C pendant toute la durée de l'étape de prétraitement fongique. L'étape de prétraitement fongique peut être mise en oeuvre préalablement, 30 simultanément ou postérieurement à une étape de traitement chimique ou physicochimique de ladite biomasse lignocellulosique. L'étape de prétraitement fongique peut également être mise en oeuvre préalablement, simultanément ou postérieurement à une étape de prétraitement enzymatique de ladite biomasse lignocellulosique comprenant l'utilisation d'un cocktail enzymatique comprenant 35 des hémicellulases et/ou des enzymes auxiliaires de dégradation des polysaccharides pariétaux. De tels cocktails enzymatiques sont disponibles commercialement. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, et qui se réfère au prétraitement de biomasse lignocellulosique (paille de blé) avec des champignons filamenteux pour la production de bioénergies, ainsi que des figures annexées : Figure 1: Activités glycosides hydrolases sur substrats complexes sécrétées par les champignons filamenteux au cours du prétraitement. CMC : Carboxyméthyle cellulose ; Birch X: Xylane de bouleau ; Wheat X: Xylane de blé ; Wheat XI: Xylane Insoluble de blé ; Man : Mannane ; GalMan : GalactoMannane. Figure 2: Activités ligninolytiques sécrétées par les champignons filamenteux au cours du prétraitement. Lac : laccase ; Mnp : Manganèse peroxydase ; Mip : Peroxydase indépendante du manganèse. Figure 3: Impact des souches fongique utilisées en prétraitement de la paille de blé sur les quantités de sucres réducteurs (bâton de gauche) et de glucose (bâton de droite) libérées après 96 heures d'hydrolyse enzymatique. Figure 4: Cinétique de production de sucres réducteurs (A) et de glucose (B) au cours de l'hydrolyse enzymatique de paille de blé prétraitée avec la souche P. brumalis (BRFM 985). La paille de blé témoin (TEM_Paille) est la paille de blé non ensemencée ayant subi les mêmes conditions opératoires (FMS de 21 jours + post traitements). Figure 5: Digestibilité et rendements de conversion des polysaccharides pariétaux des pailles de blé prétraitées. Cellulose : bâton du bas ; Holocellulose : bâton du haut ;Hémicellulose : bâton du milieu. Figure 6: BMP (Biochemical Methane Potential) des pailles de blé en NmL de méthane par gramme de MV (matières volatiles) prétraitées. EXEMPLE 1: EFFET DES PRÉTRAITEMENTS FONGIQUES SUR LA COMPOSITION DE LA PAILLE DE BLÉ: DÉLIGNIFICATION EFFICACE DE LA BIOMASSE L'impact des prétraitements fongiques sur la biomasse lignocellulosique (paille de blé) réalisés dans le cadre de notre étude a été évalué grâce à la détermination des teneurs des principaux constituants pariétaux (cellulose, hémicelluloses et lignine) et des rendements massiques. 1.1. Méthodologies 1.1.1 Souches fongiques Cinq souches fongiques BRFM (Banque de ressources fongiques de Marseille) fournies par le CIRM (Centre International des Ressources Microbiennes, Marseille) ont été sélectionnées sur la base d'un crible pour leurs potentialités à être utilisées comme agent biologique de prétraitement (cultures FMS) de substrats lignocellulosiques (paille de blé et miscanthus) pour en améliorer leur hydrolyse enzymatique ultérieure : BRFM 957: Trametes ljubarskii BRFM 985 : Polyporus brumalis CNCM I-4900 BRFM 1048 : Leiotrametes sp BRFM 1369 : Trametes menziesii BRFM 1554: Trametes pavonia Ces souches appartiennent au groupe des champignons filamenteux lignignolytiques de la pourriture blanche du bois. Elles appartiennent à la classe des basidiomycètes, à l'ordre des Polyporales et à la famille des Polyporaceae. 1.1.2. Conditions de culture Les cultures en FMS sont réalisées dans des colonnes de verre de volume utile de 250 mL (20 cm de hauteur et de 4 cm de diamètre). Une colonne contient 20 g de matière sèche (MS) de paille de blé, 0,5 g de glucose et 50 mg de tartrate diammonium. L'ajout d'une source de carbone et d'azote en quantité minime a pour but d'assurer le début de croissance du champignon. Chaque colonne est ensemencée avec 120 mg de MS de broyat mycélien. Les colonnes sont immergées dans une cuve thennostatée à 28°C pendant 21 jours. La rétention d'eau initiale de la paille est de 90%. Un flux d'air ascendant saturé en humidité est contrôlé à 120 ml/min par un débitmètre à bille. Pour chacune des souches, les cultures FMS ont été triplées et les pailles de blé prétraitées obtenues mises en commun et homogénéisées pour fournir des lots de substrats en quantités suffisantes pour leurs analyses. De la paille de blé non ensemencée est traitée dans les mêmes conditions et constitue ainsi la paille de blé témoin. 1.1.3. Détermination des teneurs en matières sèches et des rendements massiques des pailles de blé prétraitées Les teneurs en matières sèches et des rendements massiques des pailles de blé prétraitées sont déterminés à partir des pailles de blé prétraitées avec ou sans lavage à l'eau. Les teneurs en matières sèches sont déterminées par gravimétrie en mesurant la perte de poids obtenue après séchage du solide dans une étuve à 105°C jusqu'à un poids constant (après 48 h). A partir des matières sèches, des rendements massiques (%) sont calculés selon l'expression suivante : Matière sèche après traitement Rendement massique (%) = x 100 Matière sèche avant traitement 1.1.4 Détermination de la composition en polysaccharides pariétaux et en lignine des pailles de blé prétraitées La détermination de la composition en polysaccharides pariétaux et en lignine de la biomasse est basée sur une hydrolyse acide en deux étapes selon le protocole opératoire décrit par le NREL (National Renewable Energy Laboratory). La première étape consiste en une hydrolyse à 30°C en présence d'acide sulfurique à 72% pendant 1 heure. L'acide est ensuite dilué à 4% et la deuxième étape d'hydrolyse acide est réalisée en autoclave à 120°C pendant 1 heure. L'hydrolysat est ensuite filtré et le surnageant est analysé par dosage enzymatique (kit RTU glucose, Biomérieux) et colorimétrique (méthode de l'acide dinitrosalicylique) afin de déterminer les teneurs en cellulose et hémicelluloses. La lignine est partiellement solubilisée au cours de l'hydrolyse (lignine acido-soluble). Le résidu solide obtenu après hydrolyse contient ainsi la lignine acido-insoluble et des cendres. 1.2 Résultats Les champignons filamenteux cultivés sur paille de blé puisent dans ce support de croissance les métabolites et l'énergie nécessaires à leur développement. De plus, le métabolisme fongique conduit à la libération de fractions saccharidiques (oligosaccharides et sucres monomères) et de fragments de lignine non assimilés et qui se retrouvent dans les eaux de lavage des pailles de blé prétraitées. Il en résulte des pertes de matières sèches dont les valeurs sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : Rendements massiques des pailles de blé prétraitées 1\1° BRFM 957 985 1048 1369 1554 Témoine Souche T. P. Leiotrametes sp T T - ljubarskii brumalis menziesii pavonia Sans lavage Rendement massique 68,7 a (%) 83,3 82,1 76,5 81,8 96,5 ±2,5 ±1,2 ±2,4 ±2,6 ±1,0 ±0,7 Rendement massique global b (%) 71,2 86,3 85,1 79,3 84,8 100,0 Rendement massique global b (%) 60,0 78,2 81,2 75,0 79,7 100,0 : La masse finale de paille de blé déterminée après FMS est rapportée à la masse initiale de paille de blé avant FMS. b : Il correspond au rendement massique ramené au témoin correspondant au 100%. : Paille de blé non ensemencée traitée en FMS. De façon générale, des rendements massiques d'environ 80% sont obtenus après 21 jours de FMS. La plus grande perte de matière a été causée par T ljubarskii (40%). La composition de la paille de blé après traitement fongique a été analysée (voir tableau 2 ci-dessous). Les dégradations spécifiques de chacun des principaux constituants pariétaux, exprimés en pourcentage de leur teneur initiale ont été déterminées (voir tableau 3 ci-dessous). Tableau 2 : Composition en cellulose, hémicellulose et lignine des différents échantillons en % (g du constituant/ 100 g Matière Sèche de paille de blé prétraitée) BRFM Cellulose % Hémicelluloses % Lignine % Somme % 957 38,5 ± 0,1 29,8 ± 0,3 18,1 ± 0,2 86.4 985 41,0 ± 0,2 29,2 ± 0,3 17,1 ± 0,1 87.3 1048 38,6 ± 0,4 31,4 ± 0,4 18,2 ± 1,1 88.2 1369 37,3 ± 0,5 30,5 ± 0,3 19,3 ± 0,2 87.1 1554 36,8± 0,4 31,0± 0,8 18,6± 0,4 86.4 Témoin' 37,5 ± 0,9 31,4 ± 0,3 21,9 ± 1,0 90.8 a paille de blé non ensemencée traitée en FMS Tableau 3 : Rendements en cellulose, hémicellulose et lignine des différents échantillons BRFM Rendement massique a Cellulose Hémicelluloses Lignine b % perte C % b % perte C % b % perte c 957 60,0 23,1 38,4 17,9 43,1 10,8 50,5 985 78,2 32,1 14,5 22,9 27,3 13,4 39,0 1048 81,2 31,4 16,3 25,5 18,9 14,8 32,5 1369 75,0 28,0 25,2 22,9 27,2 14,5 33,9 1554 79,7 29,3 21,8 24,7 21,5 14,8 32,4 Témoin d 100,0 37,5 - 31,4 0,0 21,9 - : Rendements massiques globaux (cf. Tableau 1). b: Composition exprimée en % (g de constituant/ 100 g Matière Sèche de paille de blé témoin, c'est-à-dire de la paille témoin non ensemencée). Elle tient compte du rendement massique du prétraitement fongique indiqué dans la colonne précédente. Pour la calculer : rdt massique x % constituanttableau 2 C : Les pourcentages de perte ont été déterminés par rapport à la composition de la paille témoin non ensemencée (les valeurs déterminées pour chaque constituant de la paille témoin constitue le 100%). d : Paille de blé non ensemencée Tous les champignons filamenteux étudiés délignifient efficacement la paille de blé. Parmi eux, P. brumalis_BRFM 985 et Leiotrametes sp_BRFM 1048 sont les souches les plus performantes pour une délignification sélective de la paille (33-39% de délignification) tout en préservant la cellulose (84-85% de préservation). Par ailleurs, il est intéressant de noter que T. menziesii_BRFM 1369, T. pavonia_BRFM 1554 et Leiotrametes sp_BRFM 1048 dégradent la cellulose et les hémicelluloses avec des taux de perte similaires (22-25% et 21- 27% respectivement, pour BRFM 1369 et BRFM 1554; 16% et 19% respectivement, pour BRFM 1048) tandis que P. brumalis_BRFM 985 utilise préférentiellement les hémicelluloses comme source de carbone préservant ainsi l'essentiel de la cellulose (27% de dégradation des hémicelluloses et 14% de dégradation de la cellulose). La souche T ljubarskii BRFM 957 semble dégrader simultanément la cellulose, les hémicelluloses et la lignine (38%, 43% et 50% respectivement). Ces données sur la composition des parois végétales associées aux rendements massiques des prétraitements fongiques fournissent des informations sur la quantité de glucose et de xylose (composé majoritaire des hémicelluloses de paille de blé) théoriquement libérables au cours de l'hydrolyse enzymatique. La durée du prétraitement fongique de la paille de blé fixée à 21 jours semble adaptée à la majorité des souches puisque les pertes en holocellulose et en matière sèche restent raisonnables et compatibles avec les procédés de production de bioénergies. Pour T. ljubarskii_BRFM 957, l'importante dégradation de la lignocellulose associée à une perte de matière sèche élevée laisse suggérer un temps de prétraitement probablement trop long dans les conditions de culture employées. Chaque paille de blé prétraitée a été soumise à une hydrolyse enzymatique et le rendement de conversion des polysaccharides en sucres feimentescibles (digestibilité) a été calculé. EXEMPLE 2: CARACTÉRISATION BIOLOGIQUE DU PRÉTRAITEMENT FONGIQUE : ENZYMES LIGNOCELLULOLYTIQUES SÉCRÉTÉES La déconstruction des lignocelluloses résulte de la sécrétion par les champignons filamenteux de systèmes enzymatiques lignocellulolytiques complexes incluant des activités hydrolytiques et oxydatives agissant en synergie sur les différents polymères pariétaux. 2.1. Méthodologies Les différentes activités enzymatiques ont été déterminées à partir des extraits aqueux (5% (m de paille de blé/v d'eau) de consistance ; lh ; 4°C ; sous agitation) des pailles de blé prétraitées en sortie de colonne FMS. Ces activités ont été exprimées en Unité enzymatique par gramme de matière sèche de paille de blé prétraitée. 2.1.1 Activités Glycosides Hydrolases (GH) Les activités enzymatiques sur carboxymethylcellulose (CMC), cellulose microcristalline (avicel PH-101), xylanes, pectines, mannane, galactomannane, arabinane et arabinogalactane ont été mesurées par la méthode de l'acide dinitrosalicylique en utilisant le glucose comme standard. Une unité d'activité enzymatique a été définie comme la quantité d'enzyme relarguant liamol de sucres réducteurs par minute. 2.1.2 Activités ligninolytiques Les activités ligninolytiques mesurées sont la laccase, les peroxydases et la cellobiose déshydrogénase. L'activité laccase est déterminée par le suivi de l'oxydation d'ABTS (Acide 2,2'-azino- bis (3 éthylbénzothiazoline-6-sulphonique)). L'activité peroxydase globale incluant la manganèse peroxydase (MnP) et l'activité peroxydase indépendante du manganèse (MiP) est déterminée par le suivi de l'oxydation d'une solution de DMP (2,6-diméthoxyphénol) en présence de MnSO4, H202 et de fluorure de sodium. A partir de cette activité, on peut distinguer : - l'activité peroxydase indépendante du manganèse (MiP) qui est déterminée par le suivi de l'oxydation d'une solution de DMP (2,6-diméthoxyphénol) en présence uniquement de 5 H202; - l'activité manganèse peroxydase (MnP) qui est déterminée par le suivi de l'oxydation d'une solution de DMP (2,6-diméthoxyphénol) en présence de MnSO4 et de H202. Cette activité est calculée en retranchant à l'activité peroxydase globale l'activité MiP. L'activité cellobiose deshydrogénase correspond à la vitesse de réduction du 10 2,6-dichlorophénol-indophénol (DCPIP) en présence de cellobiose et de fluorure de sodium. Les activités ligninolytiques sont exprimées en U/g MS où une unité d'activité enzymatique a été définie comme la quantité d'enzyme oxydant 1 p.mol de substrat par minute. 2.2. Résultats 15 Les champignons filamenteux étudiés produisent une diversité d'hydrolases (Figure 1) et d'enzymes ligninolytiques (Figure 2). Il est intéressant de noter qu'aucune des souches ne produit de la CDH (cellobiose déshydrogénase). Parmi les souches testées, P. brumalis_BRFM 985 est la souche qui produit les activités GH les plus faibles et les activités ligninolytiques les plus importantes. Ce profil enzymatique 20 corrobore une délignification sélective de la paille de blé par ce champignon. En revanche, T ljubarskii_BRFM 957 sécrète le plus d'activités GH. Ce résultat est cohérent avec la dégradation importante de l'holocellulose observée pour ce champignon. EXEMPLE 3: EFFET DES PRÉTRAITEMENTS FONGIQUES SUR L'HYDROLYSE ENZYMATIQUE: AMÉLIORATION DES CINÉTIQUES ET RENDEMENTS 25 D'HYDROLYSE DES PAILLES PRÉTRAITÉES L'objectif du prétraitement fongique est de déstructurer la lignocellulose pour rendre plus accessibles les polysaccharides pariétaux à l'hydrolyse et ainsi augmenter les rendements en sucres fermentescibles. L'efficacité du prétraitement fongique a été évaluée par la détermination des digestibilités et des rendements de conversion des polysaccharides 30 pariétaux des pailles de blé prétraitées. Ceux-ci ont été calculés à partir des mesures des quantités de sucres réducteurs et de glucose libérés lors de leur hydrolyse par des mélanges commerciaux de cellulases 0C220 de Trichoderma reesei et SP188 d'Aspergillus figer. 3.1 Méthodologies Les hydrolyses enzymatiques sont réalisées à partir des pailles de blé prétraitées et 35 traitées à la soude dans un réacteur TORNADO (TornadoTm Overhead Stirring System, Radleys Discovery Technologies, Royaume Uni). Il a été démontré que le traitement alcalin pratiqué en conditions douces améliore la digestibilité enzymatique du substrat prétraité. Il est suggéré que ce traitement peut aider à éliminer le mycélium de la surface des fibres qui pourrait avoir un effet négatif sur l'étape enzymatique ultérieure. L'absence de lavage de la biomasse lignocellulosique entre les étapes du traitement alcalin et de l'hydrolyse enzymatique permet de limiter les pertes et d'assurer la fiabilité des résultats. 3.1.1. Traitement alcalin doux Les conditions du traitement alcalin sont les suivantes : - Durée : 1 h - Température : 50°C - Consistance en paille de blé prétraitée : 6% (m/m) - Concentration en soude : 0,12% (m/v) équivalent 30 mM, 2% (m/m) -pH = 12 3.1.2. Tests d'hydrolyse Les pailles de blé prétraitées, lavées à l'eau et ayant subi le traitement à la soude sont hydrolysées par les cocktails commerciaux de cellulases de T reesei et d'A. figer. Les conditions d'hydrolyse sont les suivantes : - Durée : 96 h - Température : 50°C - Consistance : 3% (m/m) dans du tampon Citrate Phosphate 50 mM, pH 4,4 La diminution de consistance de la suspension de paille de blé, de 6% (traitement alcalin) à 3% par l'ajout de tampon permet d'atteindre et de maintenir le pH réactionnel à 4,8. - Cellulases GC220 : 12 U/ g MS - P-glucosidase SP188 : 60 U/g MS - Antibiotiques : 0,15 mi/mi tétracycline et 0,04 mg/m1 cycloheximide L'ajout d'antibiotiques permet de prévenir de toute contamination microbienne. - Agitation : 500 RPM. 3.1.3. Dosage des sucres libérés La mesure des quantités de glucose libéré au cours de l'hydrolyse a été réalisée par dosage enzymatique (kit RTU glucose, Biomérieux), en utilisant une courbe étalon glucose (2 à 10 mM). Les sucres réducteurs relargués ont été mesurés par la méthode de l'acide dinitrosalicylique en utilisant le glucose comme standard (2 à 10 mM). 3.1.4. Détermination des digestibilités et des rendements de conversion des 30 polysaccharides pariétaux des pailles prétraitées Les digestibilités de la cellulose et des hémicelluloses ont été déterminées selon l'expression suivante : g de glc ou xyl libéré/ g de paille prétraitée Digestibilité (%) = x 100 g de glc ou xyl libérable/ g de paille prétraitée Cette donnée traduit le rendement de l'étape de l'hydrolyse enzymatique. 35 Les rendements de conversion de la cellulose et des hémicelluloses permettent de tenir compte des pertes de matière sèche occasionnées par les prétraitements fongiques. Ils sont exprimés en pourcentage et sont calculés selon l'expression suivante : Rendement de conversion (%) (g de glc ou xyl libéré/ g de paille prétraitée) * rendement massique X 100 g de glc ou xyl libérable / g de paille témoin non ensemencée Cette donnée traduit le rendement du procédé (prétraitement + hydrolyse enzymatique). 3.2 Résultats Toutes les pailles de blé prétraitées hydrolysées par les cellulases de T reesei et d'A. figer ont permis d'obtenir des quantités de sucres réducteurs libérées supérieures à celle de la paille témoin avec des gains allant jusqu'à 85%. Des gains de 12% à 83% de la quantité de glucose libéré à partir de pailles de blé prétraitées ont été observés (Figure 3). Le prétraitement de la paille de blé avec la souche P. brumalis_BRFM 985 s'est avéré être le lus efficace pour l'amélioration de l'hydrolyse enzymatique engendrant des gains de 85% et de 83% de sucres réducteurs et de glucose libérés respectivement. Les cinétiques d'hydrolyse de la paille de blé prétraitée avec la souche la plus performante, P. brumalis_BRFM 985, sont présentées Figure 4. Les digestibilités et les rendements de conversion des différents polysaccharides pariétaux des pailles de blé prétraitées en sucres fermentescibles ont été déterminés. Les résultats sont représentés Figure 5. Pour la majorité des souches testées, les digestibilités enzymatiques des pailles de blé prétraitées en comparaison à celle de la paille témoin ont augmenté, en particulier avec Leotrametes_BRFM 1048, P. brumalis_BRFM 985 et T ljubarskii_BRFM 957 (Figure 5). Par ailleurs, deux de ces champignons, Leotrametes_BRFM 1048 et P. brumalis_BRFM 985 ont engendré des augmentations importantes des rendements de conversion des différents composés pariétaux. Le taux important de délignification de la paille de blé prétraitée avec T ljubarskii_BRFM 957 (environ 50%) est en corrélation avec l'amélioration de sa digestibilité. Toutefois, la perte importante en matière sèche occasionnée par ce prétraitement a un effet néfaste sur les rendements de conversion de la lignocellulose. Les meilleurs rendements de conversion obtenus à partir de la paille de blé prétraitée avec P. brumalis_BRFM 985 atteignent des valeurs de 46%, 43,7% et 45% de conversion de la cellulose, des hémicelluloses et de l'holocellulose respectivement. EXEMPLE 4 : EFFET DES PRÉTRAITEMENTS FONGI I UES SUR LA NIÉTHANISATION : AMÉLIORATION DES POTENTIELS MÉTHANOGÈNE DES 30 PAILLES PRÉTRAITÉES La réaction de méthanisation entraîne la conversion de la matière organique en biogaz constitué majoritairement de méthane et de dioxyde de carbone. L'utilisation de consortia microbiens complexes permet la conversion de la plupart des composés organiques (sucres, protéines, lipides) en biogaz à l'exception de la lignine. Sous certaines conditions, des 35 composés aromatiques issus de la dégradation de la lignine peuvent être convertis en biogaz. Dans le cas de la paille prétraitée, les holocelluloses accessibles aux microorganismes ainsi que la biomasse fongique sont converties en biogaz. Les échantillons prétraités ont été méthanisés sans lavage afin de ne pas perdre le biogaz issu des sucres labiles et de la biomasse fongique. 4.1 Méthodologies 4.1.1. Détermination des teneurs en matières volatiles (MV) Les teneurs en matières volatiles (représentant la matière organique) sont déterminées par gravimétrie (méthode standard APHA, 1998). Il s'agit de la perte de poids obtenue par combustion (4h à 550°C) sur un échantillon préalablement séché (passé 48h à 105°C). 4.1.2. Mesure du potentiel méthanogène ou BMP (Biochemical Methane Potential) Les tests BMP sont réalisés dans des conditions favorables à la méthanisation et indiquent la quantité maximale de méthane qui puisse être obtenue pour ces substrats. Ils ont été réalisés avec la paille témoin et les pailles prétraitées non lavées lyophilisées ainsi que sur une biomasse fongique (BRFM 1554) cultivée en milieu liquide, lavée à l'eau (pour éliminer les traces de milieu de culture) et lyophilisée. On note que deux échantillons prétraités avec la souche BRFM 985 ont été mesurés en BMP. Les fioles BMP de 600 mL ont un volume utile de 400 mL, celui-ci contient le substrat (1.3 g MS/fiole), un inoculum de méthaniseur (3 g MV/L), de l'eau, des macro- et micro-éléments ainsi qu'un tampon bicarbonate afin de s'assurer de conditions optimales de méthanisation. Les fioles sont placées à 36°C sous agitation et le suivi de la production de biogaz a été réalisé par mesure de pression (manomètre), jusqu'à la fin de production (phase plateau) et ce en en triplicats. La mesure de la composition du biogaz a été effectuée pour chaque relevé de pression avec une analyse par micro-chromatographie en phase gazeuse : Varian GC-CP4900 (injecteur à 100°C, colonnes capillaires à 30°C, gaz vecteur : hélium). Les volumes de gaz sont exprimés en Normomillilitres (NmL). Il s'agit des volumes obtenus dans les conditions normales de température et de pression (0°C, 1 atm). 4.2 Résultats Les échantillons prétraités ont un BMP supérieur à celui du témoin, cela reflète l'amélioration de l'accessibilité des sucres notamment grâce à la délignification (voir Figure 6 et tableau 4 ci-dessous). En particulier, les souches BRFM 957 et BRFM 985 ayant conduit aux taux de délignification les plus importants mènent également aux potentiels méthane les plus élevés (environ 230 NmL CH4/g MV prétraitée). Par ailleurs, il est intéressant de noter que les pourritures blanches sont facilement biodégradées : la souche BRFM 1554 présente un BMP de 256 ± 60 NmL CH4/g MV, qui est supérieur à celui de la paille témoin (192 ± 9 NmL CH4/g MV) Ainsi, même s'il y a des pertes de matières, une partie de la biomasse lignocellulosique est transformée en biomasse fongique. Autrement dit, la paille est transformée en biomasse plus facilement biodégradable. Tableau 4 : BMP et écart-type des différents échantillons BRFM BMP Ecart-type BMP Ecart-type (NmL CH4/g MV prétraitée) (NmL CH4/g MS initiale) 985a a 242 15 198 12 985b 220 2 181 1 957a 230 9 153 6 1048a 217 12 185 10 1369a 202 6 166 5 1554a 198 1 159 7 Témoin 192 9 184 9 : Résultats non définitifs (plateau de fin de production non atteint) L'amélioration de la production de méthane est à mettre en regard de la perte de matière occasionnée. Ainsi, les résultats ont été exprimés en NmL/g MS initiale (Tableau 4), c'est-à- dire par g MS avant FMS (déterminés grâce au rendement massique). En tenant compte des pertes de matières obtenues pour les conditions de cultures utilisées, seules quelques souches peuvent augmenter le BMP de la paille (BRFM 1048 et BRFM 985). La souche BRFM 957 permet d'obtenir un BMP important lorsque celui-ci est exprimé par rapport à la MV, cela reflète la forte délignification. En revanche celle-ci est la plus médiocre lorsque le résultat est exprimé par rapport à la MS initiale, cela reflète les pertes importantes de MS qui ont eu lieu durant la FMS. EXEMPLE 5: PRÉTRAITEMENT DE 2 TONNES DE PAILLE DE BLÉ AVEC LA SOUCHE POLYPORUS BRUMALIS CNCM 1-4900 Préparation des inocula Inoculum primaire (production de biomasse fongique en fermentation liquide) La souche P. brumalis CNCM 1-4900 est ensemencée sur du milieu gélosé à base de malt et incubée 5 à 10 jours à 25-35 °C. Une préculture est réalisée en fioles de Roux contenant 200 ml de milieu à base de malt. Chaque fiole est inoculée avec 5 disques de mycélium (5 mm de diamètre) prélevés sur gélose. Après 7-10 jours de croissance à 25- 35 °C et à l'obscurité, le mycélium est récolté et broyé à l'aide d'un broyeur (Ultra Turrax). Le broyat est utilisé pour ensemencer un bioréacteur de volume utile de 50 litres afin de produire l'inoculum primaire. Le taux d'ensemencement est compris entre 0,5 et 5% m/v. Le milieu liquide de production de biomasse en fermenteur est composé d'extrait de malt et d'extrait de levure. L'aération est comprise entre 0,1 et 3 vvm et l'agitation entre 50 et 200 rpm. La température de la culture est maintenue entre 25 et 35 °C. Au bout de 2 à 10 jours, une production maximale de biomasse est atteinte. Elle est récoltée puis utilisée comme inoculum primaire pour la production de granulés de miscanthus colonisés par le champignon P. brumalis CNCM 1-4900 constituant l'inoculum secondaire. Inoculum secondaire (production de granulés de miscanthus colonisés par FMS). Les granulés de miscanthus servent de support nutritif à la souche fongique P. brumalis CNCM 1-4900. Les granulés de miscanthus sont conditionnés dans des sacs ou bacs et humidifié à hauteur de 50 à 300%. Ces granulés sont inoculés entre 0,1% et 2% m/m d'inoculum primaire. L'aération de la culture fongique est favorisée par un conditionnement des granulés inoculés dans des contenants en dessous de leur capacité maximale de remplissage et par leur fermeture par un dispositif filtrant. Les sacs ou bacs sont périodiquement agités afin de favoriser l'homogénéité de la colonisation du substrat. L'incubation dure de 4 à 15 jours, de préférence entre 4 et 7 jours, à une température comprise entre 25 et 35°C. Les granulés de miscanthus peuvent être utilisés extemporanément, après une conservation entre 4°C et 15°C, après lyophilisation ou tout autre moyen de conservation. Si nécessaire cette étape est répétée avant l'ensemencement de la paille, pour augmenter la quantité d'inoculum disponible. Prétraitement fongique de la paille de blé La paille est ensemencée avec l'inoculum secondaire à un taux d'inoculation compris entre 5 et 50%, préférentiellement entre 20 et 40% et humidifiée à hauteur de 50 à 100%. La paille de blé ensemencée est stockée en casier muni d'un équipement d'aération forcée. Ce dispositif permet à l'air d'être insufflé entre 0,1 et 3 vvm. Des retournements occasionnels de la matière lignocellulosique favorisent l'aération de la culture et en conséquence la croissance du champignon. La température est maintenue entre 25 et 35 °C. L'humidité est maintenue constante pendant toute la durée du prétraitement. La durée du prétraitement est comprise entre 7 et 90 jours. RÉFÉRENCES Chandler, J. A., & Jewell, W. J. (1980). Predicting methane fermentation biodegradability (p. 234). Solar Energy Research Institute. Cullen D., Kersten P.J. (2004). Enzymology and molecular biology of lignin degradation. In: R. Brambl, G. A. Marzluf, The mycota iii : Biochemistry and molecular biology - deuxieme edition. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag. Kirk T.K., Cullen D. (1998). Enzymology and molecular genetics of wood degradation by white-rot fungi. In: R. A. Young, M. Alchtar, Environmentally friendly technologies for the pulp and paper industry (pp. 273-307). New York: John Wiley & Sons. Lesteur, M., et al. (2010). Process Biochemistry, 45(4), 431-440 (review). Monlau, F., et al. (2013). Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 43(3), 260-322. Vassilev, S.V, et al. (2012). Fuel, 94, 1-33. Wan, C., & Li, Y. (2012). Biotechnology Advances, 30(6), 1447-57.15 REVENDICATIONS1. Utilisation d'une souche de champignon basidiomycète appartenant à l'espèce Polyporus brumalis pour le prétraitement d'une biomasse lignocellulosique en milieu solide. 2. Méthode de production de bioénergie comprennent les étapes suivantes i) le prétraitement de la biomasse lignocellulosique en milieu solide ii) l'hydrolyse de la biomasse prétraitée et iii) la fermentation de la biomasse hydrolysée, caractérisée en ce que ladite étape de prétraitement comprend la mise en contact d'une souche de champignon basidiomycète appartenant à l'espèce Polyporus brumalis avec ladite biomasse lignocellulosique. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le champignon basidiomycète est la souche Polyporus brumalis CNCM 1-4900. 4. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la biomasse lignocellulosique est choisie parmi les résidus agricoles, les résidus forestiers, les sous-produits de la transformation du bois, les plantes ligneuses ou herbacées issues de cultures dédiées, les déchets verts municipaux, les déchets de bois et les fractions fermentescibles des ordures ménagères. 5. Utilisation ou méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que la biomasse lignocellulosique est de la paille de blé. 6. Utilisation ou méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le champignon basidiomycète se présente sous la forme de granulé de miscanthus inoculé avec ledit champignon basidiomycète. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisée en ce que la durée de l'étape de prétraitement est de 5 à 100 jours. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que l'humidité de la biomasse lignocellulosique est maintenue constante pendant toute la durée de l'étape de prétraitement. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que lors de l'étape de prétraitement, de l'air est insufflé dans la biomasse lignocellulosique et/ou des retournements occasionnels de la biomasse lignocellulosique sont effectués. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisée en ce que la température de la biomasse lignocellulosique est maintenue entre 25 et 35 °C pendant toute la durée de l'étape de prétraitement.