Brevet FR3025202A1 — publié le 20160304

PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRECIPITE STABLE ENRICHI EN PHYCOBILIPROTEINES La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un précipité stable et enrichi en phycobiliprotéines, comprenant au moins une étape de précipitation consistant en l'ajout d'acide salicylique à un extrait aqueux de phycobiliprotéines, ledit précipité ayant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 50% de la quantité initialement contenue dans ledit extrait aqueux, et présentant une clarté au moins égale à 70%. Les phycobiliprotéines, dont on en distingue les phycocyanines, les phycoérythrines, les allophycocyanines et leurs protéines associées, sont des protéines pigmentaires photosynthétiques présentes chez certaines algues (algues rouges et cryptophycées) et chez toutes les cyanobactéries. Ces pigments protéiques ont une capacité colorante allant du rouge au bleu. Actuellement, ces pigments connaissent un regain d'intérêt. Il existe en effet à l'heure actuelle une forte tendance de substituer les composants synthétiques par des produits naturels. Cette tendance s'explique d'une part, par l'augmentation de la demande du consommateur pour des produits naturels pour des impératifs sanitaires, écologiques et de protection de l'environnement et d'autre part, par l'évolution de la législation qui vise à favoriser les produits naturels par rapport à ceux de synthèse. Cet état de fait explique l'accroissement considérable de la demande du marché en colorant naturels. La revue de la liste des colorants naturels disponibles sur le marché fait apparaître un manque considérable de colorants bleus. Les seuls indiqués sont la Chamazulène (extraite des fleurs de la camomille) et l'Indigo (issu de la fermentation des feuilles de l'indigotier). La disponibilité de ces deux colorants reste cependant en deçà des besoins du marché, en raison des faibles rendements d'extraction qui ne dépassent pas pour les deux cas 0.1% du poids sec. Parmi les phycobiliprotéines, la phycocyanine détient un monopole de fait en raison de sa couleur bleue unique. La phycocyanine est une protéine colorée trouvée exclusivement chez les algues bleues. Elle n'est pas synthétisable par voie chimique. Les résultats de diverses études portant sur la phycocyanine font état de l'éventualité de son pouvoir antioxydant, anti-inflammatoire et anti-tumoral. La phycocyanine est largement indiquée pour colorer en bleu certains produits alimentaires (glacés ou sucrés du genre boissons glacés, crèmes glacées, pâtes, gâteaux et biscuits, etc...). Elle peut-être, introduite comme composant dans des crèmes de soin de la peau, des masques 3025202 2 de beauté et des produits solaires. Elle remplace avantageusement des pigments de synthèse considérés comme suspects. A l'heure actuelle, les applications connues de la phycocyanine à échelle industrielle se limitent à quelques produits alimentaires (les massepains; les jus sucrés ; les glaces, sorbets et 5 accessoirement des chocolats) ou à quelques formulations cosmétiques (crèmes et gels). Les seules ventes de la phycocyanine sur le marché sont monopolisés par quelques compagnies (essentiellement japonaises) et n'arrivent à couvrir que 2% au maximum du marché américain de colorants naturels alimentaires. De plus, la phycocyanine peut être extraite en quantités élevées (jusqu'à 20 % du poids sec) à 10 partir de la cyanobactérie spiruline (Arthrospira platensis). Cette microalgue bleue considérée par l'OMS comme SAFE, est produite à échelle industrielle. Son exploitation est largement répandue dans plusieurs pays du monde. Une fois les phycobiliprotéines extraites de la biomasse, il est nécessaire de procéder à une étape de concentration qui se traduit le plus souvent par une précipitation. 15 Il existe plusieurs procédés de concentration des phycobiliprotéines. Certains sont longs utilisant des équipements lourds tel que la centrifugation, la lyophilisation ou encore la dialyse. L'extrapolation de tels procédés à échelle industrielle génère des couts d'investissement élevés. D'autres, plus simples, utilisent la précipitation par les sels et particulièrement le sulfate d'ammonium qui permet en plus de conserver les phycobiliprotéines contre les bactéries et les 20 champignons. Dans le cadre d'une précipitation au sulfate d'ammonium des quantités élevées de ce sel (supérieure à 60% du poids de l'extrait) sont nécessaires. De plus le sulfate d'ammonium est connu pour ses effets aigus d'irritation de la peau et des yeux et de congestions pulmonaires et difficultés respiratoires en cas d'ingestion ou d'inhalation. On exclut de ce cadre les autres méthodes utilisées communément pour la précipitation des 25 protéines emploient des acides, solvants organiques, polymères non ioniques ou même des agents floculant qui sont non alimentaires, et causent souvent la dénaturation des phycobiliprotéines. Les inventeurs ont mis en évidence que l'ajout d'acide salicylique à un extrait aqueux de phycobiliprotéines permettait de précipiter les phycobiliprotéines. L'acide salicylique est un 30 acide naturel, de qualité alimentaire et très communément utilisé comme conservateur alimentaire. Les exigences principales du marché des phycobiliprotéines, couvrent trois aspects essentiels : la nécessité de répondre aux diverses législations relatives aux produits alimentaires ou 3025202 3 cosmétiques, une bonne stabilité de la couleur et un prix compétitif. Le caractère naturel des phycobiliprotéines en général, et le fait que leur extraction soit réalisée en solution aqueuse, en l'absence de tout solvant organique, est un avantage certain au niveau de la législation. Le problème technique que cherche à résoudre l'invention, est l'obtention d'un précipité riche en 5 phycobiliprotéines tout en étant stable. Les phycobiliprotéines sont de nature protéique, solubles dans des solvants aqueux, ce qui favorise le développement des bactéries et des champignons et affecte sérieusement leur durée de conservation. Les phycobiliprotéines sont par ailleurs, fortement photosensibles ce qui engendre une mauvaise stabilité de la couleur, limitant une utilisation massive de ces 10 phycobiliprotéines en industrie. En effet Les phycobiliprotéines sont sujets à une photodégradation leur faisant rapidement perdre leur capacité colorante même sous faible éclairement. Ce processus photochimique conduit à la dénaturation partielle ou totale de la molécule chromophore. Certains procédés utilisent des piégeurs d'oxygène et de radicaux libres, telle que la bioptérine-glucoside. Les phycobiliprotéines sont conjuguées à ces piégeurs 15 par voie chimique. De tels stabilisateurs ne donnent pas, jusqu'à présent, entière satisfaction du fait qu'il n'existe aucune certitude sur leur non toxicité. Par ailleurs, leur coût est trop élevé pour envisager une utilisation à grande échelle quel que soit l'utilisation finale des phycobiliprotéines. Enfin, les phycobiliprotéines stabilisées jusqu'à présent ne le sont que sur un temps court 20 (quelques heures), incompatible avec une application cosmétique, nutraceutique ou agro-alimentaire de ces pigments. Le brevet US5643585propose d'utiliser un matériel dérivé d'algues rouges, sous forme non soluble, plus stable ; ledit matériel étant obtenu par un procédé utilisant un solvant organique Cette forme non soluble limite l'utilisation de ces pigments à des composés en poudre. 25 Le brevet W02005065697 décrit un procédé de photo-stabilisation de phycobiliprotéines par l'ajout d'un excipient contenant de l'acide ascorbique dans l'extrait aqueux. Ce procédé ne décrit aucune étape de concentration de l'extrait qui est indispensable pour des préparations exigeant une faible teneur en eau, Le brevet W02014045177 décrit un procédé d'extraction et de stabilisation de la 30 phycocyanine par macération directe de la biomasse dans du glycérol ou dans un mélange eau/glycérol suivie d'une filtration. Le temps de macération nécessaire est assez long allant jusqu'à 15 jours. De même le rendement d'extraction est assez faible, ne dépassant pas 1% de la biomasse utilisée. 3025202 4 Les inventeurs ont de façon surprenante mis en évidence que l'ajout d'acide salicylique à un extrait aqueux de phycobiliprotéines permettait de résoudre le problème technique posé. L'invention a donc pour principal objet un procédé d'obtention d'un précipité stable enrichi en phycobiliprotéines, comprenant au moins une étape précipitation consistant en l'ajout d'acide 5 salicylique à un extrait aqueux de phycobiliprotéines, ledit précipité ayant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 50% de la quantité initialement contenue dans ledit extrait aqueux et présentant une clarté au moins égale à 70%. On entend par phycobiliprotéines, les protéines pigmentaires hydrosolubles de la photosynthèse telles que l'allophycocyanine (APC), la famille des phycocyanines (C-PC et R10 PC), la famille des phycoérythrines (R-PE et C-PE) et la phycoérythrocyanine (PEC), isolées de certaines microalgues ou de cyanobactéries. On entend par extrait aqueux, le produit obtenu par l'étape d'extraction et de dissolution des phycobiliprotéines en utilisant un solvant aqueux comme l'eau, l'eau de mer ou toute solution aqueuse contenant un sel de CaC12, NaC1 ou tout autre sel de phosphate ou de 15 potassium. On entend par précipité, ce qui résulte de l'étape de précipitation, à savoir la quantité de phycobiliprotéines concentrée par précipitation, à partir d'un extrait aqueux. Dans le cadre de l'invention on utilise l'acide salicylique pour précipiter les phycobiliprotéines. Une biomasse de microalgues contient au maximum, selon les conditions de culture, 20% de 20 phycobiliprotéines. En conséquence, on entend par « précipité ayant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 50% de la quantité initialement contenue dans l'extrait aqueux », le fait que 50% des 20% que compte l'extrait aqueux en phycobiliprotéines sont précipités par le procédé selon l'invention. Les phycobiliprotéines objet de la présente invention peuvent être extraites à partir de 25 cyanobactéries ou de microalgues. Lorsque l'extraction est faite sur Arthrospira platensis (spiruline), elle est réalisée selon le procédé décrit par Rebeller M. et col. 1979. Ce procédé d'extraction est réalisé dans une solution de CaC12 à 10 g/1 pendant deux heures, qui est suivie d'une filtration sur toile de 10 itm. Elle peut être réalisée également dans de l'eau de mer ce qui permet d'enrichir l'extrait phycobiliprotéines en oligoéléments et de réduire le cout 30 d'extraction en évitant l'utilisation des sels de commerce. La quantité des différents phycobiliprotéines en solution est déterminée par la méthode spectrophotométrique établie par Bryant et col. 1976. 3025202 5 Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir un précipité de phycobiliprotéines comprenant au moins 50% de la quantité de phycobiliprotéines contenues dans l'extrait aqueux initial, de préférence, 75% et de manière encore plus préférée 80%. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit précipité de phycobiliprotéines 5 comprend au moins 85% de la quantité de phycobiliprotéines contenues dans l'extrait aqueux initial, ou au moins 90%, 95% et jusqu'à ce que la précipitation soit totale, c'est-à-dire que ledit précipité comprend 100% des phycobiliprotéines contenues dans l'extrait aqueux. L'extraction des phycobiliprotéines à partir d'une biomasse sèche ou fi-aiche entraîne une lyse 10 cellulaire. On entend par lyse cellulaire la rupture des membranes plasmiques de cellules ou de bactéries par tout moyen et notamment des moyens physiques/mécaniques (par sonication, cycles congélation/décongélation) ou des moyens chimiques (solutions de CaCl2, (NH4)2SO4) ou encore des moyens biologiques (enzymes). La lyse cellulaire engendre des fragments et des 15 complexes membranaires non solubles, qui subsistent en suspension dans l'extrait récupéré. L'élimination de ces résidus d'extraction est appelée clarification. Les inventeurs ont de façon surprenante mis en évidence que l'ajout d'acide salicylique à un extrait aqueux de phycobiliprotéines permet à la fois de précipiter les phycobiliprotéines contenues dans l'extrait et d'éliminer les résidus d'extraction. 20 On peut parler de précipitation sélective séparant les phycobiliprotéines des résidus d'extraction. Il est en effet possible de précipiter l'un ou l'autre de ces deux composés en variant la concentration en acide salicylique. On entend par clarté la proportion de phycobiliprotéines dans le précipité total obtenu selon le procédé de l'invention. La clarté est de 100% lorsque le précipité ne contient pas de fragments 25 membranaires résidus de la lyse cellulaire. La teneur en fragments est évaluée par la mesure de la densité optique à 680nm et selon une courbe de corrélation établie liant la D0680 à la biomasse sèche de microalgues (Costa et al., 2002). 30 Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir un précipité ayant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 50% de la quantité initialement contenue dans ledit extrait aqueux et présentant une clarté au moins égale à 80%, de préférence 90%, ou égale à 100%. 3025202 6 Le procédé selon la présente invention, permet d'obtenir un précipité de phycobiliprotéines comprenant de 50% à 80% de la quantité de phycobiliprotéines contenues dans ledit extrait aqueux et présente une clarté au moins égale à 70%. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, la clarté dudit précipité enrichi en 5 phycobiliprotéines est égale à 75%, 80%, 85%, 90% 95% ou encore 100%. En d'autres termes, la teneur en fragments ou complexe membranaires est comprise entre 0% (la clarification est alors totale) et 30% et peut être égale à 5%, 10%, 15% ou 25% de la quantité de précipité. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le procédé permet l'obtention d'un 10 précipité ayant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 70% de la quantité initialement contenue dans ledit extrait aqueux et étant dépourvu de fragments membranaires. On entend par « dépourvu de fragments membranaires », le fait que le précipité présente une clarté de 100%. Dans un mode particulier de l'invention, le procédé selon la présente invention utilise un 15 extrait aqueux de phycobiliprotéines contenant au moins 1.5g/1 desdites phycobiliprotéines. L'extrait aqueux de phycobiliprotéines utilisée pour la précipitation à l'aide de l'acide salicylique doit donc contenir une quantité égale à supérieure à 1.5g/1 de phycobiliprotéines. L'acide salicylique utilisé dans le procédé selon la présente invention est ajouté à l'extrait aqueux de manière à obtenir une concentration en acide salicylique sensiblement égale ou 20 supérieure à 4g/1 et sensiblement égale ou inférieure à 20g/l. Dans un mode particulier de l'invention, l'acide salicylique est ajouté à l'extrait aqueux de phycobiliprotéines de manière à obtenir une concentration en acide salicylique sensiblement égale ou supérieure à 4 et sensiblement égale ou inférieure à 13g/l. Dans ce mode de 25 réalisation, le précipité de phycobiliprotéines présente une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 50% de la quantité initiale contenue dans l'extrait aqueux et une clarté de 100%. En d'autres termes, le précipité ne présente plus de fragments membranaires ou résidus issus de l'étape d'extraction permettant l'obtention de l'extrait aqueux. La clarification est alors totale. Les fragments et complexes membranaires restent alors dans 30 le surnageant. Plus particulièrement, il a été démontré que la qualité de la clarification (clarification totale ou partielle) est dépendante des teneurs respectives en phycobiliprotéines et en fragments membranaires. En effet, plus la solution est concentrée en phycobiliprotéines et moins elle contient de fragments, et meilleure sera la clarification. Plus précisément, la solution en 3025202 7 phycobiliprotéines présentant une teneur en phycobiliprotéines supérieure à 1.5 g/1, de préférence une teneur en phycobiliprotéines comprise entre 1.5g/1 et 1.8g/1, et une teneur en fragments comprise entre 0.7g/1 et 0.9W1 permettra une bonne clarification. Dans ces conditions la clarification peut être totale pour une concentration en acide salicylique 5 comprise entre une valeur sensiblement égale ou supérieure à 4g/let une valeur sensiblement égale ou inférieur à 13g/1. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'acide salicylique est ajouté à l'extrait aqueux de phycobiliprotéines de manière à obtenir une concentration en acide salicylique sensiblement égale ou supérieure à 13g/1 et sensiblement égale ou inférieure à 14g/l. Dans ce 10 mode de réalisation, le précipité de phycobiliprotéines présente une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 70% de la quantité initiale contenue dans l'extrait aqueux et une clarté au moins égale à 70%. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé peut comprendre une étape de clarification préalable à l'étape de précipitation par l'acide salicylique. 15 La clarification peut se faire par une simple décantation qui élimine une grande partie des résidus mais dans ces conditions une proportion plus au moins élevée de fragments et de complexes membranaires non solubles, produits de lyse cellulaire, subsistent en suspension dans l'extrait récupéré. Une clarification totale nécessite le recours à des procédures plus drastiques tell que la 20 centrifugation à plus de 8000t/mn, la dialyse ou l'ultrafiltration tangentielle avec des boyaux ou de membranes qui coupent à moins de 100 Kdaltons ou la chromatographie utilisant des polymères qui permettent de retenir les fragments lors du passage de l'extrait. L'extrapolation à échelle industrielle de tels procédés, drastiques, de clarification génère souvent des couts d'investissement élevés. 25 La clarification peut donc être réalisée au moyen seul de l'ajout d'acide salicylique ou par deux moyens additionnels que sont la décantation et l'ajout d'acide salicylique dans l'extrait aqueux. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé peut comprendre une étape de solubilisation du précipité, après la précipitation sélective des phycobiliprotéines à l'aide 30 d'acide salicylique. Cette étape de solubilisation est notamment réalisée à l'aide d'un polyol naturel, de qualité alimentaire. La glycérine ou le glycérol en sont des exemples. La glycérine est un excellent conservateur naturel. Elle stabilise les protéines et empêche la croissance bactérienne et 3025202 8 fongique. La glycérine a l'avantage de permettre une meilleure conservation des phycobiliprotéines. Le glycérol ou tout dérivé ou toute forme du polyol propan-1,2,3-triol (ou 1,2,3-propanetriol) peuvent aussi être utilisée dans le cadre de l'invention. 5 Dans le cadre de la présente invention, il a été déterminé que 1.2 1 de glycérine permet de solubiliser 27 g de phycobiliprotéines précipitées et/ou clarifiées. La solution phycobiliprotéines-glycérine peut être, conservée plus de trois mois à des conditions ambiantes de température et luminosité et plusieurs années à froid et à l'obscurité. La présente invention protège également un précipité stable de phycobiliprotéines tel 10 qu'obtenu par le procédé des revendications 1 à 9, sous forme de poudre ou en suspension. Les phycobiliprotéines clarifiées et stabilisées selon l'invention sont en effet utilisables pour toute forme d'application (poudre, liquide ou semi-liquide) tant dans le domaine de la cosmétique, que dans le cadre de préparations nutraceutiques, agroalimentaires, ou pharmaceutiques. 15 Les phycobiliprotéines précipitées à l'acide salicylique qu'elles soient clarifiées ou non par le procédé de l'invention peuvent être séchées à l'étuve à 40°C ou lyophilisées, ce qui améliore la stabilité et augmente la durée de conservation. Elles peuvent être incorporées directement dans tout produit en poudre pour toute application agroalimentaire, thérapeutique, cosmétique ou pharmaceutique. 20 Le précipité solubilisé et stabilisé par la glycérine selon le procédé de l'invention peut être conditionné directement dans des ampoules par exemple ou incorporé dans toute application, liquide ou visqueuse, comme additif, colorant et principe actif pour des formulations alimentaires, cosmétiques ou pharmaceutiques. Les deux formes des phycobiliprotéines en poudre ou en solution dans la glycérine 25 contiennent en plus, des protéines associées, des résidus du sel CaCl2 ayant servi à l'extraction initiale et des résidus de l'acide salicylique utilisé pour la précipitation. Ces éléments sont tous des produits alimentaires qui ne gênent en rien l'utilisation du produit dans toute application alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. Dans une variante, on peut réduire la teneur en sel et en acide salicylique par un lavage du 30 précipité avec de l'eau distillée avant sa solubilisation dans la glycérine. Ce lavage est préférable pour des applications ne tolérant pas la présence excessive d'acide salicylique. L'invention vise également en tant que nouveaux produits la solution surnageant obtenue à l'issue de l'étape de précipitation et/ou de clarification. Cette solution contient la fraction non précipitée de phycobiliprotéines et de fragments. Elle est de plus riche en protéines 3025202 9 hydrosolubles, en oligoéléments et en une quantité d'acide salicylique solubilisé. Elle forme une composition riche en principes actifs qui peut servir pour toute forme liquide de produits alimentaire et/ou cosmétique. La présente invention couvre également toute composition cosmétique, dermatologique ou 5 nutraceutique, contenant un précipité selon les revendications 11 ou12, susceptibles d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 que ce soit des compositions en forme de poudre, comprimés ou gélules ou encore sou forme liquide ou visqueuse tell que les crèmes, gels ou pâtes. 10 DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 représente la courbe d'iso- demi-vie des phycobiliprotéines solubilisées en fonction de la variation de la température (Temp en °C) et de l'intensité lumineuse (Lum en µmoles photon/m2/s). La figure 2 représente la variation du taux de précipitation des phycobiliprotéines (phy) et des 15 fragments (frag) en fonction de la concentration en acide salicylique (g/1). La figure 3 représente la variation de la clarté du précipité en fonction de la concentration de fragments (g/1) et des concentrations initiales en phycobiliprotéines. La teneur en acide salicylique est de 13 g/l. 20 EXEMPLES Exemple 1 : La précipitation à l'acide salicylique Le procédé de la présente invention est subdivisé en deux étapes essentielles : 1) L'extrait de phycobiliprotéines est additionné d'acide salicylique en poudre de qualité 25 commerciale. La solution (acide salicylique + extrait) est mise sous agitation pendant 15 minutes. Cette étape permet d'homogénéiser la solution et de favoriser la mise en contact de l'acide avec les molécules de phycobiliprotéines en solution. La solution est mise dans une ampoule à décanter. La quasi-totalité des phycobiliprotéines, plus de 90%, précipite au bout d'une heure au maximum. La quantité d'acide salicylique 30 nécessaire à la précipitation de la quasi-totalité des phycobiliprotéines au bout d'une heure dépend de la quantité de ces derniers dans l'extrait initial. La présente invention établit l'équation suivante qui permet de déterminer la quantité minimale d'acide salicylique à utiliser pour n'importe qu'elle quantité de phycobiliprotéines solubles dans l'extrait initial. Acide salicylique (g) = 0.007 * Phycobiliprotéines (mg) / 0.52. 3025202 10 Pour des utilisations exigeant une plus grande pureté des phycobiliprotéines, l'invention montre qu'on peut clarifier l'extrait de phycobiliprotéines par précipitation sélective en utilisant l'acide salicylique. La clarification est utilisée après une étape de décantation permettant d'éliminer les résidus décantables de l'extrait. Elle vise par conséquent à séparer 5 les phycobiliprotéines, des fines particules membranaires qui restent en suspension après décantation. Les phycobiliprotéines précipités, clarifiés ou non, sont récupérés par filtration grossière sur toile ou papier filtre ou simplement en déversant le surnageant par le haut de l'ampoule à décanter. 10 2) Les phycobiliprotéines précipités, clarifiés ou non, sont solubilisés dans la glycérine. L'invention détermine que 1.2 I de glycérine sont suffisants pour solubiliser 27 g de phycobiliprotéines précipitées. Le rendement de solubilisation est entre 95 % à 99 %. Il est à signaler que la fraction non solubilisée dans la glycérine peut être récupérée dans de l'alcool absolu. 15 Exemple 2 : La demi-vie des phycobiliprotéines précipités par l'acide salycylique et resolubilisées dans le glycérol selon le procédé de la présente invention, est étudiée, en fonction de la température et de l'intensité lumineuse. On désigne par demi-vie (Y) le nombre de jours aboutissant à la dégradation de la moitié des 20 phycobiliprotéines. La température est étudiée dans un intervalle de 20 à 60°C, l'intensité lumineuse est étudiée dans un intervalle de 50 à 150 !mol photon/m2/s. Onze expériences ont été réalisé dont huit représentent la combinaison entres les trois niveaux correspondant aux deux facteurs. Les trois autres représentent des points centraux et 25 permettent d'évaluer l'erreur expérimentale. Le modèle mathématique proposé est LogioY= 4 - 0.08Temp - 0.013*Lum + 0.0005*Temp2 + 0.0002*temp*Lum. Ce modèle est valide à 94%, avec un coefficient de corrélation R2 = 98% et il est prédictible (Q) à 95%. 30 La variation de la demi-vie des phycobiliprotéines (en jours) selon les conditions de température et de lumière est donnée par la courbe d'iso demi-vie (figurel) La demi-vie des phycobiliprotéines précipités par l'acide salicylique et re-solubilisés dans le glycérol peut dépasser 110 jours, pour une température inférieure à 20°C et une intensité lumineuse inférieure à 50 pmol photon/m2/s. 3 0 2 5 2 0 2 11 Par prédiction en dehors de l'intervalle d'étude on peut estimer la demi-vie des phycobiliprotéines stabilisées, à 11 ans lorsque les conditions de stockage sont de 4 °C et dans l'obscurité totale Dans les mêmes conditions de température (20°C) et de luminosité (50 mol photon/m2/s). les 5 essais de stabilité montrent que pour les extraits aqueux non traités, c'est-à-dire n'ayant pas été soumis au procédé de l'invention basé sur l'ajout d'acide salicylique et/ou de la glycérine, la totalité des phycobiliprotéines est dégradée au bout de 12 heures, Pour les phycobiliprotéines en poudre, précipités et stabilisés par l'acide salicylique sans resolubilisation dans le glycérine, la dégradation ne dépasse pas 10% après plus de 2 mois 10 d' incubation. Pour les extraits aqueux solubilisés dans de la glycérine mais non précipité par l'acide salicylique selon le procédé de la présente invention, la dégradation est de 50%, après un mois d'incubation. Les extraits aqueux précipités par l'acide salicylique et solubilisés dans la glycérine montrent 15 une meilleure stabilité. Exemple 3 On cherche à clarifier les phycobiliprotéines extraits par précipitation sélective à l'acide salicylique. L'extraction peut se faire à partir de la biomasse sèche ou fraiche de la spiruline. 20 On utilise 13 g de spiruline sèche (ou 130g de spiruline fraiche) suspendue dans 0.2 1 d'eau de mer stérile, bien homogénéiser. L'ensemble est Congelé à -4 °c pendant une nuit. Il est décongelé dans 0.4 1 d'eau de mer stérile et soumis à une agitation pendant deux heures à froid. Une deuxième congélation-décongélation suivie d'une décongélation dans 0.4 1 d'eau de mer stérile sous agitation et à 25 froid pendant deux heures est effectuée. La suspension obtenue est transvasée dans un récipient à décanter pendant une nuit à froid afin de séparer la phase aqueuse de l'extrait, de la biomasse décantable. Le rendement de l'extraction des phycobiliprotéines est estimé à 12 - 15 % du poids sec de la spiruline. 30 La teneur en phycobiliprotéines est estimée en se basant sur la densité optique à 620nm et 650nm et par l'application des formules de Bryant et col (1976). La teneur en fragments est évaluée par la mesure de la densité optique à 680nm selon une courbe de corrélation établie liant la D0680 à la biomasse sèche de spirulines. 3025202 12 La concentration en phycobiliprotéines de l'extrait, ainsi évaluée, est de 1.5 g/1 d'eau de mer. La teneur en fragments et en éléments membranaires est évaluée à 1.9 g/l. On ajoute par intermittence 1 à 2 g d'acide salicylique en poudre sous agitation continue. A chaque ajout, la solution est mise au repos pendant deux heures, au bout desquelles les 5 phycobiliprotéines précipitent. On évalue alors la quantité de phycobiliprotéines et de fragments en solution pour déterminer les taux de précipitation. Les résultats des taux de précipitation sont présentés sur la figure 2. On montre qu'on peut obtenir un précipité à 100% clarifié pour une concentration inférieure à 12-13 g/1 d'acide salicylique. 10 Le rendement maximal de phycobiliprotéines précipitées et totalement clarifiées, ainsi obtenu est de 70% pour un ajout de 13g/1 d'acide salicylique. La totalité des fragments et des complexes membranaires restent dans le surnageant et ne sont précipités qu'à des concentrations élevés en acide salicylique. 15 Exemple 4 : Variation du taux de clarté des phycobiliprotéines précipités On étudie la variation du taux de clarté des phycobiliprotéines précipitées pour différentes concentrations initiales de l'extrait en phycobiliprotéines et en fragments (obtenus par différents dilution et centrifugation) et pour différentes concentrations d'acide salicylique. L'étude est réalisée selon la méthodologie des plans d'expérience, moyennant un plan 20 factoriel complet à trois niveaux avec interaction. Les facteurs sont : la concentration initiale de l'extrait en phycobiliprotéines, variant de 0.3 à 1.52 g/1, la concentration en fragments variant de 0.7 à 1.9 g/1 et la concentration en acide salicylique dans un intervalle de 10 à 20 g/l. La matrice expérimentale donnée par le modèle est composée de quinze expériences 25 représentent la combinaison entres les trois niveaux (minimum, maximum et centre) correspondant aux trois facteurs. Trois répétitions de la même combinaison permettent d'évaluer l'erreur expérimentale. Après ajout de l'acide salicylique la quantité de phycobiliprotéines et de fragments non précipitées sont déterminées séparément pour chaque expérience par spectrophotométrie. On 30 en déduit les teneurs en phycobiliprotéines et en fragments précipitées. On calcule la clarté. On désigne par clarté = 100 * quantité de phycobiliprotéines précipitées/quantité de phycobiliprotéines +fragments précipités Le modèle permet de tracer les courbes d'iso-clarté qui sont présentées dans la figure 3. 3025202 13 On montre qu'on ne peut obtenir un taux de clarification totale de 100% que pour une concentration en phycobiliprotéines supérieure à 1.5 g/1 et une teneur en fragments inférieure à 0.9 g/l. La teneur en acide salicylique nécessaire à la clarification totale dans ces conditions est inférieure à 13g/1. 5 3 02 5 2 02 14 REFERENCES Arad et Ai., 1997. Coloring material. US patent. US/ 5.643. 585 Bryant D.A., Glazer, A.N. et Eiserling F.A., 1976. Characterisation and Structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Arch. Microbiol, 110,61-75. 5 Costa JAV, Colla LM, Duarte Filho PF, Kabke K, Weber A., 2002. Modelling of Spirulina platensis growth in freshwater using response surface methodology. World J Microbiol Biotechnol 18:603-607 Minard. F., 2005. Method for the photostabilisation of phycobiliproteins in an aqueous extract, compositions containing stabilised phycobiliproteins and use of stabilised 10 phycobiliproteins. Brevet n° W02005065697 Al. Rebeller M. Yout P et Lonchamp D., 1979. Procédé d'extraction selective des colorants contenus dans les algues cyanophycées. (Brevet déposé par l'institut français du pétrole inscrit sous la classification. C 09 B 61/00). Frédéric Pottecher, 2014. Procedé d'extraction et de stabilisation dephycocyanine et ses 15 application. WO 2014045177 Al. Brevet déposé par Ecosystem. REVENDICATIONS1. Procédé d'obtention d'un précipité stable et enrichi en phycobiliprotéines, comprenant au moins une étape de précipitation consistant en l'ajout d'acide salicylique à un extrait aqueux de phycobiliprotéines, ledit précipité ayant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 50% de la quantité initialement contenue dans ledit extrait aqueux, et présentant une clarté au moins égale à 70%. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit précipité a une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 50% de la quantité initialement contenue dans ledit extrait aqueux et présente une clarté au moins égale à 80%, de préférence 90%, ou égale à 100%. 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit précipité a une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 70% de la quantité initialement contenue dans ledit extrait aqueux et est dépourvu de fragments membranaires.4. 5. 6. 7. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit extrait aqueux de phycobiliprotéines contient au moins 1.5g/1 desdites phycobiliprotéines. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'acide salicylique est ajouté à l'extrait aqueux de phycobiliprotéines, à raison de 4 à 20g/l. Procédé selon la revendication 1 ou 3, dans lequel l'acide salicylique est ajouté à l'extrait aqueux de phycobiliprotéines dans un intervalle de au moins 4 g/1 à 13g/1. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel l'acide salicylique est jouté à un extrait aqueux de phycobiliprotéines dans un intervalle de 13 à 14g/l. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel une étape de clarification préalable à l'étape de précipitation par l'acide salicylique, est ajoutée. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel une étape de solubilisation du précipité est ajoutée. 3025202 16 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le précipité est solubilisé dans un polyol naturel choisi parmi la glycérine, le glycérol, ou tout dérivé ou toute forme du polyol propan-1,2,3-triol (ou 1,2,3-propanetriol). 5 11. Précipité stable de phycobiliprotéines tel qu'obtenu par le procédé des revendications 1 à 10, sous forme de poudre ou en suspension. 12. Précipité selon la revendication 11, totalement dépourvu de fragments membranaires. 10 13. Utilisation d'un précipité selon l'une des revendications 11 ou 12 dans la préparation de compositions cosmétiques, thérapeutiques ou nutraceutiques. 14. Composition cosmétique ou dermatologique contenant un précipité selon les revendications 11 oul2, susceptibles d'être obtenu par le procédé selon l'une 15 quelconque des revendications 1 à 10, et comprenant un excipient pharmaceutique acceptable. 15. Composition nutraceutique comprenant un précipité selon la revendication 11 ou 12, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 10. 25