Brevet FR3024547A1 — publié le 20160205

L'invention concerne le domolno. technii. la détection de cibies bio ues, Pais précisément, l' uention a iur un objet un nouveau p- 'dé de n--7'--:ction de phases de captura pour la rtction d'une c )iologique dans un échantillor procédés de détectIon c.t. 2 détection correspandard_rs. Dans le domaine. des tests de détection il est toujours recherché d'ane lu r la se :1 et i- ,citl,ité de dét,.7.(.7.tiCa. De telles am tions peuveï en jouant sur c.: rents facteurs, comn !es condtions: ceiuu ion, la phase de capture ou de détection e, L 1ntes SOluliOnsd ,-:.:.:soudre de telles problématiques ont été proposée s clans art antérieur. A titre d'exemNe de on peut se aux -ente, clernanr1 ) d t un proc d'un matérie' L ut Dntelic échantillon On , ';';pose r'Y - )ture, on niet en contact n avec au nic); la phase de capture, cornpkIxephuSE2 cnapuireematériel biologique cible, pro cédé est caractené n:r falit: que H phase de est sa:micuD Jar CLJB -n ou lineeiro constt ir T ain u prerr,er ".) avec - aractère apparent nyrprr des premiers groLiperneab rior coordination à un premer prerner .nd bic Matér d'optir ,,:tilrrtinal lui-Mêrrie arl T-Oe de recormaîtr uertlent ,ase de capture prOpOS, afin ladite S Lis ce [yl C L.) Ur e tele , sur e-ci, tc.0 diminuare' foire action s-rodaife J'adsorpton dudlt rra de cap IrL,. Eu oarticum docurnPn,.r'.-',,,arion d'un. pol'irpère partinlilaire ou linéaire nol3mrnerr. un polymère fonctionn d'acrviam de meule :enu par polymérisation d'un monomère, ro3oluble, d'au\ de méthacrilarlide 0;..1 d'un dérivé rra:::11fl7 un agent de reiculnlion et d'au Trolnpun 302 4 54 7 iImic, leN-rt., - N-isopropyla !e N-méthyiNN-a- prorqieee,,iienide, le monomère étant de .ence le N- 2 monomère fonctionnel. Le rnianomèrparmi le N- isoproF. °lubie est, de thylméthacrylFm prop -cr/la le N-n-pr ropyli.rnéthi L N-cyclo ;-,3crylzim e, le niNie (NIPANI e e monomère fonctionnel est, de prererence, chu rmï ues, -uellereent -7' Z acides eeri-e,,7,e, Pacir itaconique, les dérivés acr ni-F.; et k-,Is dérivés nié 10 manière prek, D ropylacrylam vés de, rateicie itecor LrIyltrier est utuisé, peticulaire du type corriorenant des roupes ccwnei ou de l'an de 15 capture et/ou de déte_uori qui comprenU e. molécule ()ryal ayant au moins une fonction réactive et moins un matérie :éique susceptihle de receni eitre ou de se cifiquement .,lir,,,i,reerrecït indirettem t. L Lique matérie possèdant snec'" sor D cova.lence à 20 e de la moiecuie )'inique, qui tu au moins compreftrri. au moins giA résidus yshe, ou dériv lysine, cont phase Ge capture est, de mareavï.::'.inta't-je,'.ir immo bi :;ur un suc ert solide !Der adsorption passive ou iialscr valente., La molécule. organique t notammen un p, u irie,eire, Les 25 homopolyn tels eitie c1:0p0 tels que Trières d'ann,-,, rràà, CO lyrrëres de N- vinyl-pyrrolidone, et notamment copolyrnér,-; N- stbdo maléique/méthyl-vinyl-éther, cou fN acryloxysuccinimide'. les polysaccharides cGrorne le poly, urtNin ii ...cose, 30 natui-efs ou syn , , les polynuc, ek:i P q .7,:t.D ' 'mè res ,:lla, comme es enzymes, sont c en tent es de poh Dans les e):7- - les polymères suivants sont uuiisés : 55 - LE leman 98/5929' ylvl, l ler ,., rcirk:-.!,, 'i e , le P7u 86 (étr , ielanhy ide i le ,-)' 49 ,,.. anh plidonela! lie malique.) malique) et le N',/Pitte, - La demande WO i 044533 pror.)ose un ,,:océdé ttitention d'une phase de rptre d'un matériel biologique cible, compaenant une téine d' capable de, se lier 52, directementindirectemené. audit ratérid irim-tno51 7b.17 une phar i Sa ti fl ompc upements dans ieque q_encestidi r i différentes, 10 comq7enent rJence p tkPri,e de la protéine !'une comprenant ne niccession ins six rt.sidiJ N-termnale extrém C-terrri7,nale'. 'r r' rttomprenot j CCe o n d'au moirrs six résidus histibile P.50P e rtirmidt3le e une succession d'au et L' e succession: d'au moins six itetsitsiLis 15 r six réti;,isi,Lis immobilisées sur la phase 'l r' C-terminale, sort chacune flat' ieeNeleritt: entre sn xtr les itpoppetinei'-int nmin,, ni:Cr e des ee let,rétpit, Jpements sirirn cttene, séquence per) cipuie sacernent IiI 20 d'inibilisation e ,aoisie en tant que phatie de ccittpi-ture. La resporid à un polymère, I rft,")L':,é sur un d e Dans s - nette demande de r -,:erranhyd utilisé 'r:: les e>z-nples, Le polymère 25 cle !ie dissoudre dans clL U\19,7 ç:, ment' ction de coup,:: 95q/c; !a protéine partenaire de la cible hledc à détecter. ccirifiltre décrit dans la demande WO ...D51, bien que ces CHP -tts copolymères permettent une ait-nai:ion de la sensibilité dam: DO es tittists ctiDgnostiou s i"s résentent un certain nombre d'in' y 'rie.nts tC l'a bord, le cdpolyii-nera est adsorbé le support so , en plusieurs points, répartis le : squelette, ce a pour cons..:',:-.'iL.P7,17,e el\ est il est yls en milheL que la dis de 5 jrr" réagir avec le T,711..r biologique Cl7sie copolymère-r hioic- par exemple Er-out N. et - - 5. dans certains cas, les ccrjiés itent une struuure agrégée (voir -;rtjugate Cherni 7 (5), 568-575, ou DelaH T et al., PolyrnE.:rs for Advanced Tuchn,. 'es, 9,34P- nomène d'aç, réscIL tcyberne[ 9910/ / s des molecu s db' s'en trouve senabliite, affenle. 10 _o. con VVO n1197361. propose nouveau pour la frmial: n btologiques qu (3.99 uthodes rr-MSe5 en oeuvre dans la :drar. :es tests de t d. dr uV PPpUU r [:....3olide fa,vern-is ..Lles cibles e molécuks ,seerp:a,'ras bi avec 15 ligands biolc toty ligands et do -v.: a''e r la tusts ues. détediun est essentiel ennDl'n,re conservent 20 h 1 iPcrauer, r.31 .L que c,.7 p 7 le bk" les cas ,mrnent tecter e errilet la phase de .1pC rte une ur Tracrojrsation ,Jes prntéinu r la 25 r: 5-e de nealisée urnoirr.; en ç rie en solvant ---,nique, C mme c.seLit le. cas dans demanc J 0:1/".;,2361, peut El'..,:,1-enicir'or des -;:nortiènes de-`,-fiIaturc.-àion, entr Haat au rT.r une de sensilDilité du prozL " deteCiton. Dans ce contexL l'inveffiion se propose de modifier les .. 2FeS de 30 c pb'Ire .1 procédé de prép t u, d'aulirrie.71ter - notamment sensibilité de n. Pour cela, il est proposé un procédé dans lequel le couplage '7;3 d biologique au poiym réalisé dans une solution essenUellement 7»..queuse. Llaventirin concerne un procédé e préparation d'une p`7771 de ton ,.t/ou la ni.. -ntion d'une entité biolo ue capture pour cible, Uciite Iture l'entité un o0l',;.17-ere. arnohiohile cuDctérisé en CE Li 3nt un e étant obi 1)e2. nri biologiqL 7,Dur ce façon rry,/a1e - sur un 7,appo sur bolide, par mise en cota: du suppor1,: solide a\ie une chspersion de 10 rtitefles forméE-. d'une pbralité de chaînes amphinhile, lesc1a aF.:rnicelle -2.s en s t'alité de mole les du ligaryd1joloqinue, Dans e 7KIre V17-h,/erton partie yurOP ri 0 rL hile r-,.-:13ente unKe !)iologic art 15 a\raleseisr:,, sur -,"3 C; e geuse dus le cadre on, Ukhetion est. Aisée dans u r solvant ou mélange de aos:Ikrarts mons masse e[ence a r,l3.1 m Oins 91:,:ah e 20 masse; s4: ersess,rer.ritusqhe . à au moins 99":/:,, e n rin 75.a -.,, dreaj , U n e t e 1 (,'.;; snsnç)::athsation en 'ase aqueuse permet» > 'UratiOr d a n d birrd , pue par rapport aux nre'cée de l'art nn:7;Ye-rli phase aqueu,eirphase organicp,..le, avec Li LIE.' forte pçopn 25 organique. Une concentration en [L 'mère amp oble ce 50 à 500 p-.: era, par exempte, tilisée lors de la mise en contact des micelles avec le support. De manière avantageuse,. après l'immobil:stifm, le polymère reste 30 au moins er . e a forme de micelles, sorte que des m : formées d'une de chaînes amphipnile, le micelles rteuses en surface d'une de molécules du antéri qui ut Iseat ligand biologique liées do façon covale au polymère a mpbiIe, soient immobilisées a itrace du support. Pour cela, notamment, la concentration en pely, &a r r bile iors de la mise en contact avec le support doit être sL, setrr ,. concentration micelone critiqu 1C) du polymère, de mr3 à maintenir l'étet micellaire. moins 10 fois su teu-i:-e : des mic[ r rSU ppc pour -vatKin" de age est Le procédé selon l'inverton comprendre couplage covalent entre le jîc Lriiqueet le p: rea ue netvnlère 5E. trouve sous la form e rolcelies' de manière durer les m :J r: rtrses en surface d'une plun7.S'te de moléciies du lq,ttlitid Ltans ce cas, cou de façon ava use ,:far sok,ant, ou mél solvar)ts constitué à au io-,Diris 90%. r-nese, de _ à au moins- fe.' masse, et encore plus -rceitieernen'u. r0itloT3.tl.J r1155SE Là encore, un tel couplage en pnase urn".-Ior ne manière avadtagei. concentrai-loin e.-1 celle uts: ors de la mise er fa',,,es)r[ser efFlca rniceltaire lers de csE. De r mettre une orie tation, de re couc vers p a rtle Ir uronne n ri ophile Jne teik? concentntion 2enyiet roriser la conseniaticrn forme de lors du courge,.e et ensuite r r e mmol.-L 3tic m par exemple, une concentranon en icfles avec r pantio ydrenle' ,,,irière orientée verF,; la 30 la forme de micelles, de scde LI e des micelles formées cl 'L tran. cit'à chaînes du polymère r n o h lphi let sont immobilisées à s du support, lesdites micelles étant porteuses en surface d'une plu., alite de. lors de l'étape de couple, cuva entre Le couplage du H bi gigue es nanie,re obtenir (les fricene.5'. to de rnaH cova:ente au ligand biolo .zn, le polr. LO, au moins en parfie. sous 302 4 54 7 7 rreM,::ules du ligand L e liées de façon covalente au Lire p hi phile. Par exemple, pour favoriser l'immobllSation du poly, "us la forme de mice s en surface, une ét...-3p de couplage.' ue précéfiernme sera mise en ceuwe avec une rrIrnentreti()n en poly correspondant: u s50fois,depré7'. EYU moins 200 :Lis coneasitrat -tcellaire cr du polymère. Dans le cElu r:/T amphiphile est de lyrrE né bloc cco- mtant au moins un bL: bloc hydrophobe, ebioc rirnphile étant L ds r celles, e é ?odeur par slows n élût, rtie manière avantageuse, e p era n oeuvre avec ti'Liirie o itredes caractéristiques 5 tes 15 dsca ra cté su ivD rttes, vuire tuutes les carat.i.en suivantes - danc la .çiiçppndr Jl rinsité moyenne de Hioc- par ch de polyn notamment à 100 ; densit 20 mol J. u, polymère à pi r 11.1 's impl clans lE> micelles présente unr de de rminé par diffusion dynanieltie de la luriaK 25 le polyrriiii 7-3n esiente une maiiiitatiii s 'tire -tiePeryuEnt. s ,.1,,:::,érieure ; le biologique eie un antigène., ur une petéir - ari-;pn comporte, voire est exclusiveritiefit constb:r ie, ur premier bloc riéaire cor 5tptiaot en un horlopo'' -ère phobe résu, C la polyr -; ior d'un monomère A hy rop ' e ; un deuxième bloc - - e consistant ,ence, Li 10 h, cirophile et a band en un e h résubnt de la copolyr&is:., d'un m ono rn e rd, 3 portant i.ne fonction réactive ,X et un rn.73flonièrE? C hydrophild 71 de fonctior r ctive, deuxlème bloc ét premierpemierF c: de marà[:i-e cova!ente ; dans ce cas monomère A est: :fylate, a C les lactides, , parmi préférentiel' -Prit es cL rid ses y M de, tert:obu 10 acry ate,, le lacticP i'dctadécyl acrylarnide, Iactid:. coude ou le styrène ; et/ou 0 le mononl.:,:e ...oisi !parmi les onctiori d'acrylate, méthacrylate, rn d e oucrylamiH les forKtionn yren,Lp...y,b t 5 15 préférentie e ri tent le méth loxy succi e 2-1-pvc, éth méth.crv acr 3te, le - rn I é thyl mry are ou le ,4-11-0-isoprcl ,clen 20 n ; o le monomère u na fonction ré-3 .X. choisie parmi o n -N C.CH, les 'ouperr ester, I ace rbon,' sulfhydrile, c fur :lydrazine, zone, 25 isocyanat . isothiocydnate, alcoxyarnï a hyde, époxy, rue, ma mid. t oalrrur, parmi les fonctionsacbraU.:.7.s par un agent a- civant comme les carbodiimides, et notamment un acide carte inclue activé sous 30 d'ester de N- de encore parmi les cornpc,sés homo- ou Lo- t ctliennels ; 0 le rc_c_r:crière C est choisi narmi les nide, la N- pyrro zeicrence, ie monomère C est la N- vinylpyrrcliciorle ou la r:L morpholine ; o le preri-er bDC V-P :nasse molaire comprise entre I me Tite masse no'1 000 10 mole e'.n préférence, supérieur- à' 2 duu le deuxii..Ssi - bloc est un copolymère stits 'nt la composltion e; ?. par le ranpoil, les quai de noméres mc citialtité monorn C sur quantitéden:reL L,cre, à la 15 gamme allant: c:k. le 1,5 à 4. 'invention a éda objet une pha5: capture isintité bioV immobilisc, 20 p ursillté de. porti. ns r l'entité '1. 1)1 ky.D liées de amphiphile. 25 De rna, avant présentera combinaison cible, actéribée en ce qn lle isceripsinte des micelles ' 51,J p port inice les étant foi U ne. oiyiile, lesdite5 miecitle tclr. M kk: S HS Un st.sisicque. cies caracri JT ssulvan des É- ':-Ect(.::::ristiques bas, une la phas3 de capture selon nu» lesdites rrt écules du and .nte aux chi;nes du po voire toutes les caractéristiques bjvantlf.: - les micelles scat imuI es par adsorption sur le support 30 solide ; - au mcfns une partie des rlceUes sont immobilisées par adsc sur le support solide par Hrtermédiaire d'une inten7:chon tigand, biologique/support solide, une isafrtiErf des micelles potiv.arffr. éventuellemnt être immobilisées par tireisi:Drption sur le support soiide par l'intermédiaire d'une .,eracti,. /- .J.pDoz-t solide, les interactions mises en jeu pouvant: notamment être c,'2,s, i,-nisons électrostatiques ou ioniques, ou des interactions e pol' re amphiphile vers le coeur des micees et une. ode rophobe orientée à la surface des rite tJ nt .. part --- étant :couple de manière :r ente sur la 10 hydrnnhc:b:E.L r. nydrop, :rte ffiirar liaison co biokri 15 - le polyrnèn2 (177 'mère am ni hifr_,. ti'St. un pc!yri à Uni,: , af..i moins un bffec P Dosftionr es micef f es, incfne une molécule d iti17,577:e molanfe supérieure à 000 g/mole, préférentiellement: emret )le ; nolymère amnhLphile comporte ,fre es, exclu crnstitu r nphem :fer bfoc rfrriéeffre c:onsist_ [ . . °Life hyd nabe ré;uitant ùr r rolymériffrfation dJ srfonorne A 20 ; ui leu me Lf-rhoc )nssufeff en un corLrrfeh ahhife rést.- i' de la ho of fyafffiéri!: d'un Trf)nomèr Diddriant i..] ef (onction ctive X et: d'an iTiOnOrr hvdrohile dive, ledit: deuxième bloc r covabente ; les MC ':eit A anctionfi 25 et les briocs sent, de préférence, ter cf Lie, définis Dr (-:»::::» msnent dans le cadre do pro, ligand ue est un antigène, , ou une proteme. Jorif de détect Jou Un n usiur oDjet un ce quantiricdUah cl'' crtL fo;oif igue cible comprenant une pha 30 cadiedffe selon. Invention et au moins traceur pour la détection. Lfrp,fredifddh a également pour , .,171 dispositif de détection et/ou de quantification d'ure. entité r:i!fa Pif-, cible, comprenant une phase de capture en:- orocédé de l'invention et au moins un traceur pour la détecton' L'inven a éga!etnent cr objet une trousse de détection OU de cifttlfttation r e.té I: n4 cr e comprenant : un support le se de micelles formées de une suspenson chaînes d'ul oc! de rnolécule' rn porteuses en surface d'une biolod Vent]rible, rsdites moi r le ligand :'oiorr 10 fttnt-tie aux chaînes du polymère arnDlt ; et au rrioizin tracez Ir pour L'invention a égal,=.:, ,,u3ntification 15 ont la phrt3.,tte. bol. n et/ou Thilon n dis r une ft échantillon itivrt.: détecte et. Du on quaritifi.r ladite phase de C,73 ptare, nror'. 20 Hcluantihuition in vitro d'une entité b ort tisocse r itia:trt2.; se lr- le procédé selon l'inven.Lir que avec au moins IF Contact ledit i>3 insi obtenue, t on t/ou on quantifie ladite citité e cible fixée sur la phase 25 de capture. L'inventjon a également pour objet un procédé de détection et/ou de ctut ltificatior /r7 VitrOire entit' clztni,5 un échantU : on prépi:-,-e 3 5 e G ptu re sélon prr,r crie de ''invenuni, on m'.', en contat échantillon bif.)logique 30 u moins la cary:lireasi pr Lt on détecte t'ou on quantifie ladite entité ble. cible fixée de capture. De tels procédés dt, de quantificaJon pourront être un procédé direct, dar:7 b.'id .ciantillon, Jsce;:a:L Je contenir l'entité bico est naï.'SJ en contact .-.-vec la phase de capture et la réaction entre ligand biolog-que immc à sur le support: et: Ver, Ur.,!,),Igure cible est mise en évkience à la présen,:.te d'un traceur. Dans ,ae cas, le traceur es ment un ligand biolog na de biologique cible couplé à kin -Irclueur. Les irnimunod.c) également nornmE_.,s imr s. sont les ont les plus classique.:ment De vIdÉS un procédé indirect dans 1,72:quel i a usc Lible de cote l'entité Ucu cble est en contact avec la p,.a.ie de capture, présence d'an L lue de ï.,clogique d'oie et la réaction entre ligar q'J, mobilisë support et L'(:-51:itc:i biob: cible est: mis t: n éviaence la hdft'e,:r.f:Tn nt: ion d( --lion entre ks 'n-nrrob', et l'analoç4,,,,i, ..,ntité niCji njbk,En 1...)ans sec.eur notarn ent l'a naio l'entité pétition, sont formats ° les plus class ament utj Dans les n?OE,.,jr, ut ce soit dans un rocédé direct ou indim,''..' le marqueur axera arm '1 les ,7yrrieS, chrr m es, mol: rescentes e S (Daiztvesi sels électro,chrniluminescents. ,-,Ho-ation de la Sens nstatée en cadre de améloration de la sensibilité sensibiit THer de de la non d: e and .faits en ieu lit d'une meilleure en!:ation du c),cigique, ansuite sa réaction avecLeu biologique cL, de la combi :n de ces différents (grets. qantifi-.-Ion pourrontre la phase de capture l'invention. difrrenters biolog ,couplage et s,:-cn immobilisation pouyun,.. s: Les définitions deso plus détaillées cîrr.s permettent de mieux comprendre12._ Par « micelle formée d'une'té de chA Po Yrli amp,n1hile », on entend un asserols sous une for; de polymère amphiphi!e, dont une partie forme la olutHcn aqueuse dans micelles se. forme le comme illustré reedent sur la F mère arnphiphile va s'auto- mbH cette forme, lors, qu'il se trouve en solution aqueuse, ChbkiES court trouve 10 à ure (7, Cr-i centration supérieu, rnee concerts cell micelles sont. -,ttadon carat:d:éristique dudit Dard le cadre de eur diamètre 15 'd'pam,--e derrder est L. radar) denam a rrd.7.,..ddt a eltfuskdo - trtdedre , Le rayon nyoroc!ryr -Jr-1,7r c,,,,,..°.,.. ::..-f,,../cr,n d' UP:7,-; .. ."? orique E' due la particue rsidérée. ad-si-dent un de préférence de O à 150 auralit le même coeffic ^ l'ir-^^ ler à ' a nL «drogue dee, celles peut ê rne9, dans c) de duldrnens, dobtion -1,;;;ututdise rapport de l'écu' su,-e diamètre hyd ddernique usterrniné, par le même ns largete' de distribution en taille CSt. typiquement rerieur à 0,2 et le plus présentatif la sou lnférieur à 0,1, caractaérl de la ,rjudtdri ", étroite de te Par « », on entend Un ,)1..) rn' e 1l 0 ondund de 25°C. L'Indice NaCI par exedd:, (Ma 'r Ufle (d&i COM la fois ur _ 30 Le caractère ohne et au-dessus .ne :.ïphile et une partie ou bloc hydropl-iobe. dpre se c.d.actérise, en solLdjon aqueuse Itratjon a ppeiàe concentra .1 micellaire critique (CMC), par so _ d3tion sous forme de micelles, ce processus 10 extren permet de. c-ittninuer nerge iibe cr ce de l'invention, les c:rîne de polymères seront, rvorse ur assembt - -")us la forme de micelles. U- phile utIlt,-bé dans I- cadre de l'invention est un co.t., constlt MtiiilS deux blocs au {Tains un Ir' lent .gioh,tlerhent hy un bloc ies deux monon-ylc-es ,r)c,:ecirant ledit monorn mon,: linéaires et non ramiUt7t oc ne:T-ment hyclrc-),. e et au moins I loc chaque monomère à rié à dE-qt/ autres . Une des de manière covalente à une des Le terme 4'i rtre tés du bloc globaleneni= hydrophile. tt.m .1 moins n'ert spécifie autrerneni- cornrrieJfl ol-'y'rct: par au nr.)1n5 rnc,norrière: tern ccottti, aussi bien 3 15 copol mères statistiq kxi.: at.ttr"flËtt:t. polymè nphiphile peut compoitee- nrernier hyd sc",'17.h foi-rne d'un hmopolyrrr Iyd nn) h C:c±St-à-drii"e -int un seil monomère A -pid, 'Dpriobe. Un tel rg îl compr r Ieuxième 20 app.D.rtant cory'oDosante r:'L-ri polyrt,:tt sous lit) foîr. d'un copcqyrrire constittit,. AX, monomères : prerrdEd- manorrd:.:TE:.! C -ohiiant de l'hydro favart.t,t:tq- ur (>.tepokEttslent° max:Ïrria; erne bloc en ;:tl'It.:tc r utre monomère B ap.p. une foriction réactive X, réaliser le coupbge covalent: 25 biceogique. De préft: deuxième b Etatisbruue et présentera a\r,.anta;easement un E,,1Unbre de ctions réactives roches d xtrémité citi bloc hyc nctn 'iée au hydre :)be. lu r' à ITGEL l'extr': J r cvers la solution,, pour 2!7-S! rer présent Vaccess!bilité Tite du 30 ligand uty'.nli dans Li soluttion, pour une _ é de :reconnaissar.ccb. accrue. Dans un cas extrême, le deuxième bloc peut être aussi constitué d'un seul monomère non fonctionnel, clOnt mon- m situé e bout cle chaîne (sur l'extrémité unn Hée au bloc h ,_e) sera ranftionansé. C'est le cas, par d'un bloc polyéth PEG (unité monomère non fonc-tbni-K?;11,,: ) dr., e bout de chaîne hyr-Jr-oxyle peut être expie H. pour la corJuyon à des lige lère ayE -e, au moins 1 fc pi -eLnce, de 1 à 1C ictions rt-t-Â-cti\A--;:s X, sont présents de polymè.- _ phïphiie. Le dn ,,lère ampîhiie sera, d Lr:e, un 10 c: sbtist, ,7:> monomères et C Tt drtu7 statistiquement aa ne madromoléctUa, ::,_) ou un do re a tea-ia(uans leque ,,Is ''tariaraeres B et C se; succè(Jent, , ...a IHÎ:retnent selon une structure ,,lérli , e EC), t'enta aqualle n est un rIbre entier). 15 Crdifférents cce peuvent être (:,btenus par r O, Ondensation, nr pdymérisation en chaîne par voie raditab ionique, ou par transfert t groupe, osiantageusement ation a nte COM la pOlyMét-SatiO r nrÉ .r.Jsori ; :1.00: par les nitrotaytt- Nfi polymérsatjcDF---[ , fert fï.:.,-rnarne ATRP), et de préférence polyménsation par tran reversibaa fahaîne i: )n-frac ation, apoP ft.A.FT ne r sa- par exerr dar S e Pckimerization, Ameilcan Chemical Sode ntf.) DC. 25 1997 G. 0.dian, .;ples Pol\m-rerizat: - Intersck,?.nOE. Pui-Aceo,-L 1991 Ldernarfit t la ation de tek )niles et cr pour de détails. Par « monomère hydrophobe », on entend un monomère dort 30 l'bc,--nop,olymère présente er hase aqueuse une strLirt e de pet,::eta compacte,. correspondant à un coefficient de Mar, Hou',,,,iink-Sakuratia (facteur de forme) inférieur à 0,8. Par « monorn fonctionnel », on entend un monomère porteur d'une fonction réatye X. Par « monomère hydroht », on cntend un mono dont Vhomopolymère phase aqueu,:,,e une structure c correspondant à un coefficient de Mark-i-loimink Sakurada sL r à 0,8. La technique de mesure de masse iTIC;12''' d'un polymère, qui est eu primée dans la pr n-,,,,,enleon par le M. rio[aire en ole d'excluson seeirio nombre en g/mole) Erir In cenerna.,L ré relEitiVE à un étaleTage (stancee paç. exeiiiple), Pi ne en phase organique, :oro-"P ne. col donne des masses melolres dites eri hic, gigue », on ereend une or SUS( - - rKnr'rnirru ou d- ne herr n 'en 15 e: un paire in liais, noue biolocuque cible. A titre d'exemple de tels ni us citer notamment, un matériel protéin!._!e ruu olycop pue qu'un antigène, un L eetene, un anticorps' une protéine' ',FIE: na rlofitine, un pL_ une enzyme, un sucre rients de ee une .e.,,sene. ; reeds e unol un matériel nucléique col puun acide n U(1: éique (AL.*=f eu Ap,N fragment d'acide nijcJoic r,JO, une sonde anmrcï,, L'invention errt -rtic- ment a ,J,D ' pnrrni les tigènes, pr o Je cible entend un 25 . A titre c r maté dol. .0 tir o cci ci '.1,,,s ci ntt rtt, on citer les anticoi,_:, s Ls.rnhènoc ole antigonou, les pro é peptides, Iee enzymes, les sucres, Les anticccm jeunot: -rôle do ligand b ol. a pour LeniAn hckrrrique cible sont des nticorns ycIraux ou mei 30 Les anticores inc rtclnnaux dr .ent. -Te obtenus pTi eTnunleaecn d'i'.in animal avec, comme immunogène, l'entité biologique Lin Lpent de ce dernier ou encore un éq uiva ent proche sur le plan str'.pctural suMe de la récu anticc ps recherchés sous forme par unent du animal, et séparation desa.t.s .anticorF I eo u7rOs du sérum, notamment par chrorrolpograph h d'E:1:finite une colonne, sur e .,-3st fixé un antigène s, fiquement reconnu par les aritico, notamment l'immunogen,- Les anticorp5. monoclonaux .neuvent être ohtf.?ro.ic par la technique des hybridomes, taro Mt 0 OC ona U p:-72: i2Pi[P- t 10 o bte nus par l'h.omrre également r' que, par des tEotom n. Les antlooroo, ps recorns,..nantrs nooso de l'hcrnme c (7.'Y de f a e'r7r.r. "-N'y , A tt h Fabn leS « iht- dJ 17. (c11 e-o'Orzro 15 raqn:en Ces uï-ents fonctionnels peuvent notons par génie gén&i nanoiline :nom commercial) ,oro etites protéine ui, nyckaprpo, ont Ut. [Ololc ç r, c. la capturer, ou tpc,L simplo- 20 cilM, Seir 0 Li! rl L terre des composesr immun( es e premouvolrre rémoM imrroloOan t C 0 S ' Mais )e.s rocoori.LIEO3 par Lms WnmunisaLion d'animaux dans r!es 25 conc101oos connue5' en partlmJ par immunisation avec un conjuç.. -1...itène-prc. Ces composés ont c,'rp,àralement une ma moléculaire inférieure à AD r i, et le plos »nt infériew ec peu être, par exem des :peptide des ,,,Itiarnh..;" des hc7-nories, des pr iides, des toxines ou ui'ers 30 rno TronS, les n les et nL" clos. e terme « tine » dés:g des protéines iLii se tient spéùfiquement et de façon réversible à certains sucres. Elk.-s )ajeur dans l'imn.-'r reconnaissant les g.luddes ies de .certains agents infectieLD,:. Un exemple de lect.. est la Concaiviiivalirn,744 (hérniili,7, ne) qui est responsable entre autres de l'héni,an,utination. Les ligands biologiques utilisés peu nt être c ou non de )logique cible. Ils sont dits s[. ,-4e façon exciu1ve Ju quasi 'cusivc, bic cible. Ilc; dits non Lies lorsque la ecti\nre à able est et sont ,7-7:k..)r:3 capables cle 7E:: lier à 10 d'autres entités que: Lee 1,sis ou,e, riro, Lr D'une manWiese ryr, or' nt comrr:, un spéc biologique ciple for»»: Dier, entend U, d bick., e li pour l'entité bioli'. cible , souhaite déit .-.,,iologique cible un antigène qui reconnaît lecilt - Si » b Ncible est ,:que cibie est un rcepteu ,,i isiic est une prc.:,' se lie ,,3u1it nà:,.!pteur, . référence':.:. uernE::ot ; nmitité biologique cibie est un n> - un anticorps ciu une protéine qui reconnaît ledit spécifiqupnent. 25 Llnvaltion est p, rticu aux cas où re IHjatUantigE prot.Ine. « fonction d'une pa le porr Cfr.,.' part, sur , ,ique, or une fonction de former un lien iiivaleint: p ction avec une c ionction réactive 30 soit les fonctiols colduisent à une cnon réactive après achvation. -ctvonsves X sont choisies, à titre d'exemple, r» ni les. --p[De:: .5 ester ,OCUbc: sulfhydn disulfure, 15 20 ur, anticorps... biolo pissiliterercei spécif7.3e-':1-ner: est. 19 amira , acide carbox COH) isocyanclte, :sothciariate, maléimide, h :érle,o1, proxy; et les fonctions aCtjVa 'es par ageri i activant C.:-mme les carbodilmides or des composés homo- ou éru-'ii nctionne!s. On pourra notamment utilSe7 un cde cari sous H e d'ester de N- 302 4 54 7 .17zine, hydrazone ide, époxy, n_ le, 's-C=CH-), maléimide -oxysucicTr-iii-n '7'chlordphényle, de ti.hchlorophényle, de p- ne_ hényle, carbuiry La ou le fonctior. 10 permettant d- former une HaL7,0r1 enur e ; and biologi, et cova!e., >-,ec entre !e erlère, des m;cielles '.:-ïr;c1 type proté uoe une °polo portn. la chaîne Fater ni , 15 anmoins,,1 breux e "introduit-es" préala stand 7:- Peuvent F.--',:xister laLurellerre: sur le Par exemple, ,,,ers le L..1(.7ilog!_.ue de P;- suffie:Ji ite, les arrjnes utLis, pour le r,rerFon s un cies technicp,', s hien connues de rhomme Un tag e. défini corrirriedHquenTe cl'accies nés est-à- d à l5 structure ïnH CIFIL '17».-)téine titis tant que 20 H ologiq.'uî est introdUte ssrl pour lui en particulier' '''7. de sa xu011 COVaeruerur h re.. ai- cas où le ligand bi y,.2.: est un matériel ar c possible d'i if- comprenant six résu nu, ou cl,. 25 lysine, ou irfflement, d'autres abdes ,seri'nés. De t. ,,..vent se trou-ver à un endroit queicongue Ju a H rnu. De , dans le cas où le ligand [H.'. Hque et une :irotelne, le tag ey -rémité N-ou C-terrninale. De norrbleusPq méthodes pour Htrodulre des fonctions réactives 30 sur Lir)ip1( i- 's : pour les protéines, antigènes,. anticorps u pol.i' ;ides, voir par exemple "Chemistry of protein conjugati and S. S., CRC press, iR,at:in, 1991 302 4 54 7 20 ou "Bi --',-Le techniques", Herrna.nscn G. T., emic Press, San Diego, 1995. Pour les acides nudâcp.ies, on .1.' , par un potyrucle e par méthode chimique sur suphosit solide ayant une fonction réactive à un endroit CtJ e conq ue de h chaîne ,7omme, par exerripie, l'extre é 5' eu l'extrémité 3' ou sur une base r un phosphate internuv'.'. nu sur ia position 2' du sucre ,vo - :ocoF for OlgonuclEni-'cliEs and Analops, Synt e=ici and Properties édité par S. Agrawal, HL ss, otowa, Des Liodes r lerl: dans Kohen L. dans Sterairi rrirnitinoi=iiissay ch 7 m enes sont :r- "r' K. C"., Avili 1.9 4, END Carne )r - - 'Iole, l'introductJc d'une fonction hémisuccinatr en tien 6, 11, ou 21, d' ,'..hloroformiate: 11 ou d'une fonction carboxymetrr q.Dsition 6, Je la La fonctior rhictive présente >,rhare polymère art ce.11d. 'ente sur biologique d',::::p,'Fire part seront choisies de manière à rune avec l'autre et forritrar une iihisar. c..-ovalente établissant Url Ii anent entre les chai 1olymere (r1 J ne rricee: et: es ..,0;:rlues. Par exemple., p:ut coupler r e forictica Brnin sur notamrient. par le sucdnimic OU Sli LH-1 Hyde urp:": fon alccx.\,,,amine avec. une ou un aldéhyde; n efonctiun un aldéhy ; ou t .1 encore une fonistein htiloi sur ,ogénoi,,iiihi/leu r 'ade. E manière connue, dans H n i.A.1plage entra uni .TrÉne et un aaÉr j. il est pr l'imine forr soit sWriu17.3 par l'action de NE 13 dans une étape , par action de NaBI-14 ou NeB93C14. De In anièni.: EDiant:ageuse, en moyenne, de 0,1 à 10( rnolécuîes de ligand biologe seron-t-.. fixées par C!TaÎnri".:.'re et les seront« porteuses, en moyenn:, Je 100 à 50000. 71olécules de ligand biologique suive nt: leur masse ruclairl et leur nature. A titre d'exemple, sur les micei fes de copolymère polylactide-lpi poly(N-vinv acryl isucchnr (PLA-b- -cO 5r} utilisées dans les exern suivre (dont une c comporte en rnoye ne 80 fonctions réactives de type esters de N.- roxy succinimide), il a pu être couplé. (en: PP37 i;)H 7,4) environ 7r,(i>oir p24 par ri17,ce., masse rnolare, : 2400o ofol soit en\.eiron 'eine par che. Ce nombre de ge des fonctions amine résid rë- ion dc.:2i L Je dosage 10 à Ljntrobercr.nte su fd1iq rfl,L,Gresdami et peut seront être c: par ut couplage 0 1E7 h Anes rs mo 15 une cidd ophorè9::: b D S- PAGE - le cas du é anL d ,:Àue le plus .souvent plusitwfs foncti biologiri pourrontJonc 10,p:ont ainsi le nombre de moléc..nes .: de COLed (mesure directe sur les mil r7..-x c.. à 1 et 10 pg.m11 en p24) 'OU e ("0 nihn rd.ilsbH aISA par a ors gairi signific7t'e est 30 302 4 54 7 c!Tan.utrie [p24] c t.J.pa, e (gunL-1) hydroc..i,,m rnicy PI Cr I ii - 10 105 0,13 C...e., ...w 1 loo 0,2. Dliué 10 2.F..)(1 0,5 Dilué 1 ,:.A..., 0,5 Conclusn : tu des montrent que 1 TTI ,_,nificat''' 3 en ELISA, il est indispensable de reaiiseir le dnuplaçe . la iéin sur le carymère orga se sous la form de mciLeHes, AiT'3i ,.,. e-,t, - de taira u p24 sur les m ces, dre ,..ini milieu aqueuxdeconcentration en :sud , -aère nettement. supérier,iiire à la CMC, ;rifla és,ia er Mue . rnicellaire ET r!7)E STABILITE ) de r4 rt r 4°C pte à g/mL, 'al 4 ,..vent eur supériorité en 10 n? u- conservëe rncis. rc au termes Jeii :;tilité 15 U cVFC:AS LA DETEr.7170N Le r cerielym -co-NVv) que été utin Lou,»,:). de la TnI (ITC) en _ la détection d'ar'-'n_Jcps sur un 7utomate r'IC)ssai VIDAS® I Société b C 20 Lzh .1 a irles micelles de PLA-b-P(NIS-co- en PBS à une cc- aratilon 0,137 mg/mL en Tri. mg/mL micelleis (0,15 mg d Trirl par mg de coi L couplage a été Ï.;. par gel SDS-PAGE qui met en eliiviciende di'ire couplage sur les nircalles semble presque total, pitrieci TnI libré n'est 25 pas détectée. La TnI ainsi couplée sur les micelles a été testée sur VI 2),,g7SLMbioMérieux) et comparée à la TnI seule, aux micelles seules sur la .pL:...,5e solide. Le test automatisé VIDAS est composé de 2 éléments : 1- la cartouche est une ban-,Ette plastique cryiteurnt t O puits scellés avec -in film a h.rn--àlium duu uqcels sont réparties ies différentes le cône, appelé SPR (Solid Phase Peceptacle), fait office de ,e de - e*: de r pire, puis, - par 10 de la TnI (ITC) à 0,03 solde. Chucue réactif de la cartouche ur les -ue sont immobilisées soft solt " seules a rr C,O3 0,19C CL ; dans un volume de 300 un, A ilissue de l'étape O'irr mobUcatt ambicnte sur 12 heures, les cônes scct vi: 15 tem passivi:dion (tampon d tior ftype protéique ou p,..ptkl rouis 6 int nsu te conser,,é(E., +4°C jusqu'à utii un, s un deuxièrT)e temps, les 3 pl- - de cap re ru L CLHtELLL ont mp e.p les fa;sunt mcr avec ,,aceur qu mcvange 20 ux anticorps monoclonaux unti Ï ni (clones 16,A1.1. 700 c:.: HYTEST, Ounric, Pour des raisons anticorps est directeur rnE.?. pu ru: 0.71.: a 1(,?' r 4 n 7 OM ré a CtiOr fT"' mur et diminuer a durée (prouDcoie DEX2 du VIDA.5( lurent- totale 25 environ 40 min). La concentration d'utilisation de ce traceur est de dans un volume de 400 pL. LA génération du nnal se fait par t lu sub I 4-Méthylombellifer 'eq:sphate ; l'c du cccv cst3lyse ,Jrolyse de ce siityttiTot en 4Fv1éth; i;mbuli01crone dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm. 30 s 77.:Vd p ,sume les résultats obtenus en VIDAS® sur les TnI ère sous la forme de micelles et non couplées. Le sur bruit est sq TnI est c:-:-Du au polymè.-e. :.ésultats VIDAS de la TnI couplée par rapport d ufl T u non couplée. SPR contrôle 'T I :rapport s / bruit micelles seules 0,190 pg/ml en Conclusion Le m'in ege eirl° le sur 1e ropolvmrP organisé sous forme rapport siynal / brui CODON/1' 0,1_90 g/ ml en cor tmlen TnI 1156 de micelLes der ,et 10 ,Jde, montrer qJflQporb.'.:Juses mnr 0 ibilité les la t cette et est la protéine S103[3, 15 cervei':'1'.' L-r=ovrr', Le polyn est: le PLA-b-P(NteS-co-NVP) comme dans les exemples précéd,''in-ts' 1 .'3e soit S n,; forme mice0aire- chspersbn en tam p n dissous da ns du D, e , pour couph aVe C. l'antigène S1006 en rniheu 20 [1";1'.'.7,,0- 950/e tbrrporl aqu(- deux protocoles menés en sorit réalisés pour ' ience des conditions de couplage dire COU -ge en milieu 7Ulpeu:',-,: avec micelles versus r en 302 4 54 7 39 semi-organique DM.(70,' J avec ri,pi::)Iymère initialement ssous en DMSO, sur le gain de sensibilité ccL protéine/copolymèr( ?.n clas5ice.Jament reportée dans f,a Chem. 2001, 12, 972-979...). Le: CcAplages polymère -0CflE est ELISA. La ce.-ibition de _impon aqueux est et al., Bioconjugate ',ansés n.eri solution en tube Fr ,J:lorf, soit sur microplogue après immisation de la micelle ou du copolymère. iSATION DES couv...A,OE-s 10 A. Préparation de conjugués L 100B Les mis cie copolymère PLA-P(NAS-co-F\IVP .nt été, ° urées comme pr°,-,'-'1,--ivient. repr)rté « Etude ELISA eur d'anticorp5 ai u:24 Elles .5yDnt. h---,,b:enent à urr-,-2,, :-,:oirlee,..,ritri-tr,-;yri de 5,21 md/rnL. une de 5 Tp=fl1. 15 Le sa''rioi.- 100B a ét la concentration de mg/mL en F133 1X.. Le protocole de couplage ue à celui , é7lisé pour celui de la e p24 est décrit dans E I ci-a.p 20 Tableau 4 vol PBS vol en pL 51.00 à 0,6 g/L 150 vol en pL micelles 150 [S1001 copo] (mg/n. Img/mL) 0,3 2, -S100 0 micelles seules ref 150 o 150 2,605 Incubation 18 heures à température ambiante. B.Préparpti- nolymère-S100B en DMSO Le protocole cic! c i' rit dans le Tableau 5 ci-après. 25 Tableau 5 40 vol en Si C r 150 150 o vol en uL 0 0 15 o vol en pL so: copo 15 o 15 [5100] mg/mL) ,)] g/mL) 2,605 0 2,605 vol PBS 5100 5100 ref ,copo ref 285 135 135 Incubation 18 heures à température ambiante. CARACTERISATION DES COUPLAGES Dosage des fonctions amine résiduelles restant sur la protéine après couplage (% modification des amines) Le dosage est réalisé comme précédemment -apporté pour la protéine p24. Suite au couplage, le % d'arr ées est d'environ 100%. 10 ELT_SA,..510 condi 'éntes, présentées schématiquement o évaluées : 1- La référence s:. ()B immobilisée ,:::H...ectement sur la plaque de microtitriqbn (5100 15 2- Les copolymères sous form de seules immobCisées sur la plaque uie première unicebes seules ) puis le couplage en plaque, sur micelles r-1..'..nobilisées, de la Jr S100B (micelles pi S100), 3- Les copc.,, 20 mrrrbilisés su le couplage en DMSO 5% seuls, non micellaires, dans une première étape (copo ref)' r copc . e immobilisé, de la protéine S100B (copolymere puis S100), des conjugués micelle-S100B JJsés en tut [dorf (micelles-F.5100) et REVENDICATIONS1. L'im cF or conjugués pDlymère DMSO 5% + S17,3B rC.2 - en fi -nclorf (copc[ a l' Dans oplaqua, (Nunc Maxisorp F96) sont disi:n bués 100 ts de M , SeUH ccr-v.ifficr 2) ou de copolymère seul (1è" étape r au à ciImL La microplaque estin,---,.:, 12h, à ,mpérature , - -bian 50US 2,1"h d'd .en i .. ;orption, puy puL r,à,,:f7r, les cc, concr b o7 dans la mit :rrrre Cui ec 1 pL/puits d't ,sc,RAtion de S1.00E, à 5 ML, dans L préalablemen, flf-»r ver les rni.71.e.;s seule: ,DU le copolymère Pr ailleurs, dans les es, el distrdme 100 pL/puits de 510C - (condition 1,':',111K1) du conjugué micelles-S100B 74 pg/rni_ de mice : t 5 pg/mL de S1.0)B ,1), ou encore conjugué copolyT::r re-5100 pr de copolymi - - non micellaire p.fml,_ de S10 (ce, ut. 5). rnicroplaque est incubée 5upplémentaires, à température ..'jrirïb r sous agitation, afin l'adsorption (conditions 1, 4_ 5) couplage (conditions 2. dque est vidée ; tlois lavages TBS (Tris buffered sa T 0, sont effecti puits sont :LH-és en ajoL 3uu pLipuits 'Larnpon rr r. r ii (tampon iii: r"A 5,2) contc:inFant u - sawratjan .,de type protéique r. La micrc, 'lue est r r penc:;,-mli-. 1 h à 37°C, suivi de 3 lava-.;e. TBS. Un r wps anti-S100E (dot sot -; ,-- de Fab' et H la phoWlatase alcane es-- 4 ,100 pl ' :oncentrat:C;'n rii:3 C,pendant 1 h à 37°C, suiv! 3 lavage5 ABS.. FL rit, 100 : r ru substrat p- 103phate sont ajoutés. La lecture du s;(nal colorimétrique est réaliisée à 405 nm sur lecteur de micro 30 La résultats ELISA pou types d'ImmobliSation [sation d'un conjuç.:i.conne plus de signal que la protéine S100B immobilisée seule, sans Fiugrnentation du bruit de fond. Le rapport signal sur bruit est donc am .s:.5tlon des plcelles pour Dt-,:,ili5ation de la protéine OOB L mmobliSation du llymère+.5.100B issu du couplage r nii DiviSû/eau nincl,..' quant à eile, qu'une scuiLqté très rapert à la 1OOE Le. Enfin, le fait de CCLP la p n second temps, '7,ie i-nicelles (tampon 100% aqueux) ou le cop mère ;0/tampon aqueux) préalablemc- la phas( l'apporte pas d'amélioratioi_ sensibilité par rapt a SIC Conclusion Le couplage de !t?:ne sur le copolymère sous forme de perr-let: de f-::,ar rapport i SIUCB ib U u même i. ;Lar le connlyrni.,..: forrre: concltic.ms 17)MS(,.:" initiàlerref.r: dissous en DK' p'ar raoport coup: ?' à poster de antigène sur une oh7.17,E: sohde modifie par les micelles ou le même copolymère non mIcellalre,201- Jon d'une phase de capture pour la détection 43 - et/ou la duantfication d'une Entjt,.., 5101: de capture comportant un igenrl hvd ncnrr lend biologique étant lié de ct.,-,,Nalente à -un poymère amprphlle et étant ri.->,mobilisé sur un support sotde, caractérisé en ce que brocnique est immobilisé su Le support solide, mise en contant du support 5C 7J'2. avec une, dde er ni de micelles fru rrréen d'une pluralde que vers 1-rd emphiphre,' Fric:odes étant porteus( en -m'écu eq du lkunind biolophire ion selon a. revendication '; caractdrind en ce présente une partie der; Fr,Lelles et une partie hydrorM rcr Lologiq étant couplé de rni,,r chas ni rfaci ente S'A P. - Procédé selon la r(1.:n.,'-efl,.11C.:2bOn1 ou 2 co u-3 Ismcr-loCib,',ncf-I, le 7,o,yrneu,-,, rer, de sorte que dan micch formées d'une arriphiphe étant rrrtu plurutte de molécules du ligand biolori ip ne tu de - nous la torrlle de chaîner utace .e - cave enta u. TOin sé surface du snuo- prëparaton .5er-.:,n; la revend icetior 1, 2 ou 3, caré. trirré ce que l' rnrinDirsation est réahséi.: dans; un solvant ou ange de solvants consol COflStLuCa au munis en masse' de prttérence au moins 95% en masse, et encore plus &érenti ,,ment à au moins ra en masse d'eau. - prénaratier selon l'une des re,,,q,râcei,Dos 1 à 4, ccrcictharié en ce qu'il carrpand une tteae de couplac:e ccvrckrnt, entre biolocit nie et le tuni rnèrc arnphirDhile, r67iisée s que le pCyrrère se trouva sous la forme de micelles, de srulare ru mer les miceHes porteuses en surface d'une .uralité de .Ç>yelécules ligand 6 - V'océdé de prépa la re\ dication 5, C377 e.n ce que le couplage est - un so nt ou mt constitué à au n-K-3Tn1; cY. P^Se, de preférence à au moins en masse, et encore ::ritifa,:lienient à au MO r'S, 99% en masse d'eau. ' - Procéc ... pré :on 4 ou 5, caract sé en ce que le couplage avec une concentration en My-ne, csp au moins de préféreni 20 rOiS concentrabc,i) micellaireen que...! du pcet/ou avec une 10 ccncentration en polymère 1.,1 7U mu 10 fois supérieure à 1'..Allisée lors de la -pues. le support. reven1icFions es le est un L au m(...7h,5 15 bloc h op ï e Ploc nydr positionn, au nivei surface es micelles, et ét. r îaison ccva ente, une du ligand biol 9 - Procédé de préparaticn -.,;elben rune qconque des rf.:..-',,..n.1(tcathDri,7, 1 à carartérisé en ce que d;:7.Hi, suspension de mirpue...,:, )gique par chai.- de 0,1.. à 1_00, et nota ri de il. à 100. de pré- selon quelconque des - icai.,k.ns 1 à 9, caracte'î en ce que I pension micelles par diffusion 8 Prccécié 25 d Y n que de la lumk,J Pro7.édé de prépi selon l'une L '.7.orique rier'3 ,- 1.1 e IOfl lue le 20 moyenne de molécules un indice de n(,-,iyclispersité de 0 à 0,2 que le - heure mo e, revencik:e,:bns 1 à 10, caracu3ri3e en préFrenre masse préférer teernent supérieure )1.0 12 - Proi:édé de préparabm selç.igl l'une rp 3:onque du., revendications 1 à 11, carac..L en co que le r ar4 comporte, voire est exclusive- constitué de, un premier bloc linéairecon§starit en un horncup, h,'innère. hydrunobe résultant de la ation d'un monomère A hydn 'lobe ; un deu-;ttérne bloc linéaire consistant en un co n d'un monomère Itp nittle résultant de la CO 1301',,,,M o nt. une ironcton réactive X et d'un moncntà hydrontlUe, n nattant pas de onction réactive, 47-iit deuxième bloc étant lié ne ex. premier LOC de maniè - 13 - Prou «e prépweon selon la revenc, iUCl 12, caractérisé en ce que iemr A eff c» parmi obes de meth»cJOEIL. acre annt métn mide, nt:1i des, ou 10 ascyréne eL préférence monomère A est le n- but :plate, le tertio' Ttiobutyl acrylami»» ctadécyl ac'nrit' tttle,. le lactide, lactijet ott' 7, ou le styrène, Priant- Ie de préparatici,n selon la revend. atK:in 12 ou cara: que le rnorrom ;eH ni les 15 fonctionnels d'acry c é rivés fonct 5 ar.-lox'( 9 Incinirn a rn acrylatc 20 r -lactopy nose. de y rnicie, les -nce le minitonnare B est le N- droxyétliv ,4-d. :. opylidne-6 de n selon l'une revendit.:.,:t'tinitt caracr.,_ ce que le mon»n diJ e fonciann réactiye dittnsu.., f wrri les '5.7nchons -1 "CH ectur, halogénocatburty 25 disulf az 'le, nerattone, azide, :anate, isc,d1Ocyanate 6,,Jicox--\,/arrine, , nitrile, emide, h des porteur ' lfh a, mai les forictices activables par t comme les 7. atodirn'i7!es, et notamment,: E'Iii acide carbo. «Je Ep::::"r.»é sous forme N-hydroxysuccin.rde, de atachàDi'ophényle, de 30 tr t, de -nitrophir carboxyph )u encore parmi les cu.npcsds homo- ou héL-ro-bifur.c-Jonnels.16 - Procédé de prépi :ion selon l'une quelcorg,,,e, des revendications 12 à 15, car: c en ce que le monomère C '7.st choisi demi derivés d'ad de mé'crylarn.e, la N- py de preence, rrt)nomère C: est la N-sviriylpyiruidone o il morphoilhe. 17 - Procédé de pr.1Deraion selon l'une !que des revendications 12 à 16, cerecterisé en ce que . oc a une masse molaire comprise erEtre 10CP:D et 27(-300 g/mole. 18 - Procédé de rior lune quelconque des 10 reverdications 12 à 17, cara ue le Cieuxière nrntr;qare ',';upérieure à 1 OL, de érence, 2 19 - P .-J,')ration selon l'une des dérisé en ce que e !st un 15 cc.g.Jts*,11i,,:.:..re ster; , ccr,rnposition exprimée par le rapport de monomère.:-. de monomère C nère P pparti nce, gamme allant de 1 u !ntiellement ant de 1,5 à 4. - Procéde se on l'une quel revendcatic:)e, à 19 20 c ris n ce que le ue est un ou u.ine. ii-r edecarreduneentii.:,e u e for..,-;-,-s une pluralité chaînes d'un 25 amphis iitE eUe. de r,,,Dins - cible, ies ,scules au i covalente a,,'rx. ampUi 22 - de capture selon revcotcon 21, caractérisée 'ari ce 30 que _-s micelles sc s par ad pt.ion sur le support - Phase de ,17.,,;:,--1:DturE?: rever ss:-31=SK)h 22, caractÉ _ ce - ur _ de7iicelles sont irnmobi es par adsorptrn cible caractéri, en ce trnrU.:. des celles mmobilisées support sok' k'sdites èrP -:euses en surface pour étant liées de façonhntE,Trnédiaire d'une in'z,er2cdc pouvant, nOir:oirnm,-r ioniques' clEfs hteractions 24 - P capture sek... ra ,:En ce que le c con nt au moins un b d'une interaction VPEN:1 partie des micelles po 77 ,7717orption suu- '7:! support onde par /support r, es !rt.7.7ctions . re des liaisons électrostatiques. ou alconque des revencÉ:nc.i 21 un biologiq par solidE, éventuellemerlt etre rn 10 b rop bob e bloc he hile étant posii.brine en surface des .et étac0: porteur r son. covalente, d'au moins urE-: du liga;.Z: bich 25 - Pha ca "une qu Fi srevJ(: 21 à 24, caractÉ :mè p présente c 15 molaire supérieure à 5 000 -wement supéure à 10 000 g/mole. 26 - Phase de capture selon l'une quelconque de r 21 5, caractérLE3ée en ce quepc),ymère ampr;. mporte, voire est vemen 1: constitué de, un premier bloc in: ia consistant en un 20 r..Y..nopcf,,,,rmère hydrophobe . )oiymérisa-h-.-...-,n d'un re.-..,:,riomère A hydrophol ; un de. .-;,: bloc ire'[.7.,:prijstant en un copolymère .roph, résultant de ;a copolyr monomère B port une fonctim p!'active X et d'un morionëre., C hydroph portant pas de ft onct,:y) réactive, ledit deuxiérr une 25 extrémité: r 'e rnanière covalente. 27 - captu.-e 5,Jan la revendication 26, c irisée en ce que le pc revu lica Here amphiphile est tel que défini - , 57.7.P.1 conque des 13 à 19. ie de capture selon l'une quelconque des revendications 21 30 à '7, car ..t sée en e, protéine. tique est un antigène, un29 - Dispositif de détection e-:/ou de qu:riUHCF:on d'une entité biologique cïDie comprenant. phase de c:apture selon l'une quelconque cies r vendcztions 2i à 28 et au moins un traceur pour la détection. 30 - DisosL.. c détection etlou de qu7-,:nbft ;Jon d'une entité biologique cible comenan Lre .3se de cz=tpture cbter- - le pi-cp___:,'J de l'une ci;...°eIcipnqu. des revendications 1 à 't au r ns un traceur pyDLyq" 31 - et./CUJ .de quEntnation d'une entité 10 biologique cihle : ur -ort solide ; une su5 :"r'ëon er ition aqueuse de n poly L)lécules d'au moins 15 biolu'ict.,.ie cible, lesdites molécule L ligand r" liées O.,' -t-çon covalente aux ch du i /mère am phinhiie aL-crac,Ar pour la déteci.7ion. 32 - Procédé de détection et/ou de cir3nH Jior in vitro d'une en' 20 t ogique çlhie un écl'unUllon bioloyitlu, selon leg cfispose C le phai;3,i.i de capture seer 'une quelconqw. reverdkraf.srry, 1 à 28, on met e;'- cc,nt.nrt. ledit wtiPor, de ('(.7pi'Lrr:.,, et qt,rarltri"Li:'! fixée syL )hase _ _ 25 E.K.-..tion et/bu quanil. cation ,,,Itro cru entité que cible di s L b selor- cy capture cbter ue seic uz !unie queiLL, que à 20' met en contact échantillon biologio: aVP n10« -:?ij phase de capture are cbten. et on on fie lad ?ntite Dgique cibe car)T:iLire, - Procl détectt:.r eti de ation bioloylque cible dans un échantillon r selon pJç.im on prépareune phase de cr sse'l,.:73n le procédé de l'une quelc: des revendications 1 à 20, met en contact ledit échantillon bi avec au moins la phase de ca,ntu- , ainsi préparée, et on détecte on quantifie ladite entité bic fixée sur la phase de cap -re. - Procédé de i"une des revendications 32 à 34 ca?,dtei- 3é en c'' jble est cOEntac pha car. - 'and ,é sur le support et entité ' e.--q mise evinen à la 10 présence d'iin traceur. 36 - P :édé selon 35 cs ctérisé en ce ,:ue le traceur e dn ligand vs 'té bio, ligue cible cou un mar.:pJeur, - Procédé de détection l'une des re,b,?,r cations 32 à 34 15 c7r,7. sé en ce du'll - procétP: inclrect susceptità-2 cc,).nt.c.1-Yr l'entité .L..:iok)gique cible es 1 contact as Je capture, en présence J'un analogue ble réacti biologique immobilisé sur le support E Ver évidence gr i la 20 présence t r, indic par détection de la réaction entre le ligand biov,',) 'mobilisé birJogique 38- Pr(DCé la re r, ori 3 c::'ris. en ce que le traceur est fan,'2,kyrgue de l'entité ;:llé à .-irtarqueur.. 25 la revendic71:.on .35 ou 3 re que le mar._ eur edt. choisi parmi les i7.,nzymes, chromor', molécules radioactive. , fluorescentes et les sels support et l'aneogue de l'entité 30