Brevet FR3024451A1 — publié le 20160205

La présente invention a pour objet de nouveaux sels de strombine et l'utilisation de ces sels pour des applications cosmétiques. La peau est un organe composé de plusieurs couches de tissus qui constitue est la 5 première barrière de protection de l'organisme chez l'homme. Localement, la peau salie, érodée ou blessée peut être sujette à l'apparition de rougeurs cutanées ou favoriser le développement d'organismes pathogènes conduisant à des infections bactériennes ou microbiennes. 10 Pour lutter contre ces infections, la peau produit naturellement plusieurs types de peptides antimicrobiens : les cathélicidines, les défensines et l'élafine (ou SKALP). Cathélicidines 15 Les cathélicidines sont des polypeptides produits par les macrophages, les lymphocytes polynucléaires neutrophiles et de nombreux autres types cellulaires dont les cellules épithéliales du tissu cutané, les kératinocytes. Ces composés sont impliqués dans l'immunité innée et participent à la défense de l'organisme face aux infections bactériennes. Ils agissent notamment en détruisant la membrane cellulaire 20 des microbes une fois que ces derniers ont été phagocytés par les macrophages. Leur spectre d'action est très large et comprend de nombreux types de bactéries, virus et autres champignons. Défensines 25 Les défensines sont de petits peptides cationiques (3,5 à 6 kDa) qui, comme les cathélicidines, sont impliquées dans l'immunité innée. Il en existe 3 types : a, p et 0, mais seules les a- et 0-défensines sont présentes chez l'homme. Les défensines humaines exercent une activité antimicrobienne dans un spectre d'activité très large comprenant les bactéries, les champignons, les virus et les protozoaires. Leur 30 mécanisme d'action est encore mal connu mais il est actuellement admis que les défensines s'insèrent dans la membrane des microorganismes en formant un pore multimérique, ce qui conduit à la lyse de la cellule cible. Élafine 35 L'élafine, aussi connue sous le nom de Skin-derived AntiLeukoProtease (SKALP), est un inhibiteur spécifique de l'élastase. Elle est naturellement rencontrée dans la peau humaine et participe à la protection des fibres élastiques du tissu cutané. Cette protéine présente aussi des fonctions anti-inflammatoire et antimicrobienne particulièrement importantes lors du développement de nombreuses pathologies du tissu cutané telles que le psoriasis. Dans le cadre du traitement cosmétique des infections bactériennes de la peau, il est donc utile d'identifier des composés capables d'induire et/ou d'augmenter la production d'au moins un de ces peptides antimicrobiens dans le tissu cutané. Interleukine-1 L'interleukine-1 (IL-1) est une cytokine qui est produit par les cellules du système immunitaire ou par d'autres cellules, telle que les cellules épithéliales, en particulier les kératinocytes. Une fois produite et libérée dans le milieu extracellulaire, cette cytokine se fixe et interagit avec des récepteurs rencontrés à la surface des cellules cibles pour produire ses effets. Elle constitue le primum moyens de l'inflammation. En réalité, IL-1 désigne une famille de molécules comprenant onze membres, parmi lesquels les deux formes les plus étudiée : l'IL-la et l'IL-1(3. Dans le cadre du traitement cosmétique des rougeurs cutanées, il est donc utile d'identifier des composés capables de réduire la production d'IL-1, notamment d'IL-1a 20 et d'IL-1(3, lorsque celle-ci est induite par un « stress » tel que l'exposition aux UV-B ou les agressions chimiques. La strombine, également appelée acide de methylimidodiacetic ou N-(D-1carboxyethyl)-glycine, est un acide aminé de formule chimique : H 0NO H O O 25 La strombine a été découverte pour la première fois dans l'huître Crassotrea gigas en 1980. Il s'agit d'un produit de condensation de la glycine et de l'alanine avec le pyruvate. 30 La strombine existe sous la forme de deux isomères optiques : la (L)-strombine et la (D)-strombine. La synthèse de la (L)-strombine a été largement décrite dans la littérature, comme par exemple dans la demande de brevet internationale WO-A-2010/100589. Certains sels de la (L)-strombine ont également été décrits. Ainsi, le brevet US 4,666,906 décrit le sel de sodium de la (L)-strombine et son utilisation comme intermédiaire de synthèse, sans pour autant suggérer une éventuelle activité 5 cosmétique de ce sel. Or, il a maintenant été trouvé de nouveaux sels de (L)-strombine qui, de façon tout à fait surprenante, sont efficaces dans le cadre du traitement cosmétique des infections bactériennes et des rougeurs cutanées. 10 La présente invention a donc pour objet un composé de formule générale (I) Mir, NH (I) dans laquelle : - n est un entier égal à 1, 2 ou 3 ; 15 - m est un entier égal à 1, 2 ou 3 ; et - M est choisi parmi les métaux alcalins à l'exclusion du sodium, les métaux alcalino-terreux, les métaux de transition, les métaux terreux et le groupe NH4. Les composés selon la présente invention n'ont jamais été décrits auparavant. Ces 20 composés sont capables d'induire et/ou d'augmenter la production des cathélicidines, des a- et 13-défensines et/ou de l'élafine permettant ainsi leur utilisation dans le cadre du traitement cosmétique des infections bactériennes de la peau. Les composés selon la présente invention sont également capables de réduire la production d'IL-1, notamment d'IL-1a et d'IL-1(3 permettant ainsi leur utilisation dans le cadre du 25 traitement cosmétique des rougeurs cutanées. Dans le cadre de la présente invention : - on entend par « métal alcalin » tout métal appartenant à la première colonne du tableau périodique des éléments (groupe IA), c'est-à-dire le lithium, le sodium, le potassium, le rubidium, le césium et le francium ; - on entend par « métal alcalino-terreux » tout métal appartenant à la seconde colonne du tableau périodique des éléments (groupe Ila), c'est-à-dire le béryllium, le magnésium, le calcium, le strontium, le baryum et le radyum ; - on entend par « métal de transition » tout métal du bloc d du tableau périodique qui n'est ni un lanthanide ni un actinide, c'est-à-dire l'un des 38 éléments des périodes 4 à 7 et des groupes 3 à 12 hormis le lutécium (qui est un lanthanide) et le lawrencium (qui est un actinide) ; à savoir le scandium, le titane, le vanadium, le chrome, le manganèse, le fer, le cobalt, le nickel, le cuivre, le zinc, l'yttrium, le zirconium, le niobium, le molybdène, le technétium, le ruthénium, le rhodium, le palladium, l'argent, le cadmium, l'hafnium, le tantale, le tungstène, le rhénium, l'osmium, l'iridium, le platine, l'or, le mercure, le rutherfordium, le dubnium, le seaborgium, le bohrium, l'hafnium, le meitnerium, le darmstadtium, le roentgenium et le copernicium ; - on entend par « métal terreux » tout métal appartenant de la treizième colonne du tableau périodique des éléments (groupe Illa), c'est-à-dire le bore, l'aluminium, le gallium, l'indium et le thallium ; - on entend par « infection bactérienne de la peau » toute infection ayant pour origine Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Candida albicans ou Malassezia furfur et se manifestant notamment sous la forme de problèmes de peau particulièrement inesthétiques tels que les boutons ou des états pelliculaires ; et - on entend par « rougeur cutanée » toute rougeur apparaissant sur des peaux sensibles ou réactives, notamment les rougeurs apparaissant à la suite de changements de température, d'irradiations solaires, d'agressions chimiques (produits irritants) ou physiques (grattage, frottement, etc). De préférence, la présente invention a pour objet un composé de formule générale (I) tel que défini précédemment dans lequel les caractéristiques suivantes sont choisies seules ou en combinaison : - n est un entier égal à 1 et m est un entier égal 2 ; 35 - n est un entier égal à 2 et m est un entier égal à 1; - M est un métal alcalin. De préférence M est choisi comme étant le lithium ou le potassium ; - M est un métal alcalino-terreux. De préférence M est choisi comme étant le magnésium, le calcium ou le baryum ; - M est un métal de transition. De préférence M est choisi comme étant le cobalt, l'argent, le zinc ou le manganèse ; et/ou 5 - M est le groupe NH4. Les composés de formule (I) peuvent être préparés par tout procédé connu et classiquement utilisé par l'homme du métier, notamment par analogie avec les procédés décrits dans Organishe Moletül Verbindungen par Paul Pfeiffer (1927, 13610 142). A titre d'exemple, les composés de formule (I) selon la présente invention dans lesquels M est un métal alcalin ou un métal alcalino-terreux peuvent être obtenus selon le schéma réactionnel suivant : OH C H3 0 0 N H OH Mm n = 1, m = 2 n = 2, m = 1 15 Les composés de formule (I) selon la présente invention dans lesquels M est un métal de transition ou un métal terreux peuvent être obtenus à partir des métaux de transition ou des terreux sont généralement synthétisés à partir du sel disodique de la 20 (L)-strombine et d'un sel du métal correspondant selon le schéma réactionnel suivant : 0...,,.........,,,,,,,.... NaOH NH ONa sel métallique M OS? n, OH H2O ONa Les composés de formule (I) selon la présente invention sont donc capables d'induire 25 et/ou d'augmenter la production des cathélicidines, des a- et 13-défensines et/ou de l'élafine permettant ainsi leur utilisation dans le cadre du traitement cosmétique des infections bactériennes de la peau. Ils sont également capables de réduire la production d'IL-1, notamment d'IL-1a et d'IL-1(3 permettant ainsi leur utilisation dans le cadre du traitement cosmétique des rougeurs cutanées. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation cosmétique d'un ou plusieurs composés de formule (I) tels que définis précédemment contre les infections bactériennes de la peau et/ou contre les rougeurs cutanées. La présente invention a également pour objet une composition cosmétique comprenant (à titre de principe actif) un ou plusieurs composés de formule (I) tels que définis précédemment, ainsi que son utilisation pour le traitement cosmétique traitement cosmétique des infections bactériennes de la peau et/ou des rougeurs cutanées. Les compositions cosmétiques selon la présente invention peuvent être formulées sous toute forme galénique appropriée à leur administration. Les compositions selon la présente invention peuvent ainsi être formulées sous forme de crème, gel, lotion, lait, émulsion huile dans eau ou eau dans huile, solution, onguent, pulvérisateur, huile corporelle, lotion après-rasage, savon, bâton protecteur des lèvres, bâton et crayon pour maquillage. Les compositions cosmétiques selon la présente invention contiennent un ou plusieurs composés de formule (I) selon la présente invention dans des teneurs allant de 0,005% à 75% en poids total de la composition, préférentiellement de 0,01% à 25% en poids total de la composition, préférentiellement encore de 0,05% à 5% en poids total de la composition. Pour la préparation de ces compositions cosmétiques, un ou plusieurs composés de 30 formule (I) selon la présente invention ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont mélangés aux excipients classiquement utilisés dans le domaine cosmétique. Les compositions cosmétiques selon la présente invention peuvent prendre la forme 35 d'une crème dans laquelle un ou plusieurs composés de formule (I) selon la présente invention ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont associés aux excipients couramment utilisés en cosmétologie. Les compositions cosmétiques selon la présente invention peuvent prendre la forme de gels dans les excipients appropriés tels que les esters de cellulose ou d'autres agents gélifiants, tels que le carbopol, le sepinov (polyacrylate), la gomme guar, etc. Les compositions cosmétiques selon la présente invention peuvent aussi prendre la forme d'une lotion ou d'une solution dans lesquelles un ou plusieurs composés de formule (I) selon la présente invention ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont sous forme encapsulée. Les microsphères suivant l'invention peuvent par exemple être constituées de corps gras, d'agar et d'eau. Un ou plusieurs composés de formule (I) selon la présente invention ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être incorporés dans des vecteurs de type liposomes, glycosphères, cyclodextrines, dans des chylomicrons, des macro-, micro-, nano-particules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules et aussi être absorbés sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux. Ces émulsions jouissent d'une bonne stabilité et peuvent être conservées pendant le temps nécessaire pour l'utilisation à des températures comprises entre 0 et 50°C sans qu'il y ait sédimentation des constituants ou séparation des phases. Les compositions cosmétiques selon la présente invention peuvent aussi contenir des additifs ou des adjuvants usuels en cosmétologies, comme par exemple des agents antimicrobiens ou des parfums mais aussi des lipides d'extraction ou de synthèse, des polymères gélifiants et viscosifiants, des tensio-actifs et des émulsifiants, des principes actifs hydro- ou liposolubles, des extraits de plantes, des extraits tissulaires, des extraits marins, des actifs de synthèse. Les compositions cosmétiques selon la présente invention peuvent aussi comprendre d'autres principes actifs complémentaires choisis pour leur action. Lorsque les compositions selon la présente invention contiennent des principes actifs complémentaires, ceux-ci sont généralement présents dans la composition à une concentration suffisamment élevée pour qu'ils puissent exercer leur activité. Les compositions cosmétiques selon la présente invention sont de préférence utilisées quotidiennement et appliquées une ou plusieurs fois par jour. La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples 35 suivants. Exemple 1 : Composés selon l'invention NH 0 0 Mir, Composé M n m Aspect Teneur Dosage P.f. (°C) en eau(1) 1 NH4 1 2 Poudre 0,2% 103,8%(2) 227 beige 2 Li 1 2 Poudre 6,5% 95,4%(3) 104 beige 3 K 1 2 Poudre 4,7% 100,7%(3) >260 blanche 4 Mg 1 1 Poudre 21,5% 95,0%(3) 191 blanche Ca 1 1 Poudre 5,2% 95,8%(3) 105 blanche 6 Ba 1 1 Poudre 0,3% 98,3%(3) >260 blanche 7 Mn 1 1 Poudre 19,0% 94,5(3) 151 beige 8 Co 1 1 Poudre 21,5% 98,0%(3) 173 beige 9 Ag 1 2 Poudre 2,7% 97,0%(3) 147 grise Zn 1 1 Poudre 8,3 98,0%(3) >260 blanche 5 (1) : par Karl Fisher (2) : dosage par HCI 0,1N sur estimé sec (3) : dosage par HC104 0,1N sur estimé sec Exemple 2 : Préparation du sel d'ammonium de la (L)-strombine (composé 1) c H3 H ONH4 ONH4 Dans un ballon verre monocol de 250m1, on introduit dans l'ordre 14,7g (0.1 mol) de (L)-strombine, 50g d'eau déminéralisée et 40g d'ammoniaque à 20%. Le mélange est agité pendant deux heures à température ambiante puis concentré sous vide à 60-65°C. Après deux évaporations sous vide avec deux fois 60 ml d'éthanol, le résidu est séché 10 sous vide à 40°C en présence d'anhydride phosphorique. Après broyage, 12,3g de poudre beige est isolé (teneur en eau = 0.2%, titre par HCIO4 0.1N = 103.8 % sur exprimé sec). Exemple 3 : Préparation du sel de lithium de la (L)-strombine (composé 2) H3 O .x H20 OLi OLi Dans un ballon verre monocol de 250m1, on introduit dans l'ordre 14,7 g (0.1 mol) de (L)-strombine, 60g d'eau déminéralisée et 8,4g (0.2 mol) de lithine,H20. Le mélange est agité pendant une heure à température ambiante puis concentré sous vide à 60°C. Après deux évaporations sous vide avec deux fois 50 ml d'éthanol, le résidu est séché 25 sous vide à 60°C en présence d'anhydride phosphorique. Après broyage, 16,8g de solide est isolé (teneur en eau = 6.5%, titre par HCI 0.1N = 95.4% sur exprimé sec). 15 20 30 Exemple 4 : Préparation du sel de magnésium de la (L)-strombine (composé 4) CH3 H 0 0 ... .Mg '' Dans un ballon verre monocol de 250m1, on introduit dans l'ordre 14,7g (0.1 mol) de (L)-strombine, 100g d'eau déminéralisée et 6g (0.1 mol) d'hydroxyde de magnésium. Le mélange est agité et chauffé à reflux pendant une heure puis refroidi à 20°C, filtré sous vide et rincé avec 50 ml d'eau déminéralisée. Le solide obtenu est séché dans une étuve ventilée à 90°C pendant 24 heures. Après broyage, 17,6g de poudre blanche est isolé (teneur en eau = 21.5%, titre par HCI 0.1N = 95% sur exprimé sec, dosage du métal par EDTA 0.1N = 95.5%). Exemple 5 : Préparation du sel de calcium de la (L)-strombine (composé 5) CH3 H 0 0 ,-. Ca Dans un ballon verre monocol de 250m1, on introduit dans l'ordre 14,7g (0.1 mol) de (L)-strombine, 100g d'eau déminéralisée et 8g (0.11 mol) d'hydroxyde de calcium. Le mélange est agité et chauffé à reflux pendant une heure, puis refroidi à 20°C et filtré. Le filtrat obtenu est concentré sous vide à sec. Après deux évaporations sous vide avec deux fois 50 ml d'éthanol, puis concentration sous vide à 60°C, le solide obtenu est séché dans une étuve ventilée à 105°C pendant 24 heures. Après broyage, 16g de poudre blanche est isolé (teneur en eau = 5.2%, titre par HCI 0.1N = 95.8% sur exprimé sec). .x H20 .x H20 Exemple 6 : Préparation du sel de manganèse de la (L)-strombine (composé 7) c H3 H 0 0 - M n Dans un ballon verre monocol de 500 ml, on ajoute dans l'ordre 14,7g (0.1 mol) de (L)- strombine, 150g d'eau déminéralisée et 27g (0.2 mol) de soude à 30%. On ajoute en 1 heure 20g (0.1 mol) de chlorure de manganèse au mélange sous agitation à température ambiante. Un précipité blanc se forme rapidement. L'agitation est maintenu durant 12 heures, puis le mélange obtenu est filtré sous vide et rincé avec 50m1 d'eau déminéralisée. Le solide obtenu est séché dans une étuve ventilée à 60°C pendant 24 heures, puis, 15 après broyage, on obtient 18,6 g de poudre blanche (teneur en eau = 19%, titre par HCI 0.1N = 94.5% sur exprimé sec). Exemple 7 : Préparation du sel d'argent de la (L)-strombine (composé 9) .x H20 10 .x H20 20 Dans un ballon verre monocol de 500 ml, on introduit dans l'ordre 14,7g (0.1 mol) de (L)-strombine, 150g d'eau déminéralisée et 27 g (0.2 mol) de soude à 30%. On ajoute en 1 heure 34g (0.2 mol) de nitrate d'argent au mélange sous agitation à température ambiante. 25 Un précipité noir argenté se forme rapidement. Le mélange est maintenu sous agitation durant 20 heures puis est filtré sous vide et rincé avec deux fois 100 ml d'eau déminéralisée. 30 Le solide obtenu est séché dans une étuve ventilée à 60°C pendant 48 heures puis, après broyage, on obtient 27,5 g de poudre grise argentée sont isolés (teneur en eau = 2.7%, titre par HCI 0.1N = 97% sur exprimé sec). Exemple 8 - Activité des composés de l'invention sur la production de SKALP/Elafine et de la cathélicidine LL-37 L'évaluation de l'effet des actifs 9 et 10 sur la production de SKALP/Elafine et de LL-37 a été étudiée dans un modèle de kératinocytes humains normaux cultivés en 10 monocouches. Ces kératinocytes humains normaux ont été obtenus à partir d'une plastie abdominale réalisée chez une femme de 41 ans. Pour la réalisation des essais, ces cellules ont été cultivées jusqu'à l'obtention de monocouches confluentes. 15 L'activateur de référence utilisé dans ces études était le sérum de veau foetal (SVF) à 5% (v/v) pour la SKALP/Elafine et la dexaméthasone à 10 uM pour la LL-37. Les cellules ont été incubées pendant 48 heures en absence (témoin) ou en présence 20 du produit de référence ou de concentrations croissantes des actifs à l'essai (0,05u.g/m1; 0,5µg/ml et 5µg/ml) pour se faire les composés 9 et 10 ont été solubilisés directement dans le milieu d'incubation des cellules. A la fin de la période d'incubation, d'une part, la SKALP/Elafine ou le LL-37 contenu 25 dans les milieux de culture a été quantifié à l'aide d'un kit E.L.I.S.A. sensible et spécifique et d'autre part, les protéines contenues dans les lysats cellulaires ont été quantifiées par une méthode spectrocolorimétrique (méthode de Bradford - Bradford M. (1976) Anal. Biochem., 72, 248-254). 30 Les résultats sont donnés sous la forme de pg de SKALP/Elafine ou de LL-37 par lig de protéine (moyennes +/- la déviation standard, S.D.). La significativité statistique des différences observées entre les conditions «Contrôle» et « produit de référence » a été évaluée par un test de Student (Student t test). La 35 significativité statistique des différences observées entre les conditions «Témoin» et « produits à l'essai », a été évaluée, produit par produit, par une analyse de la variance à un facteur (One Way ANOVA), suivie d'un test de Holm-Sidak (* : p Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux ci-dessous. Taux de SKALP/Elafine Contrôle Composé 9 (1.1g/m1) Composé 10 (1.1g/m1) 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5 SKALP (pg/ug 129,9 141,6 105,9 272,2 176,5 160,2 329,7 de protéines) 140,5 139,8 118,6 242,7 175,6 140,3 328,8 121,1 118,1 110,3 269,1 173,0 162,3 326,1 Moyenne 130,5 133,2 111,6 261,3* 175,0* 154,3* 328,2* S.D. 9,7 13,1 6,4 16,2 1,8 12,2 1,9 % véhicule 100,0 102,0 85,5 200,2 134,1 118,2 251,5 Tableau 1 * : Moyenne significativement différente de celle du groupe « Véhicule » (p Taux de LL-37 Contrôle Composé 9 (1.1g/m1) Composé 10 (1.1g/m1) 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5 LL-37 (pg/ug de 284,9 389,0 381,6 310,9 329,6 339,8 353,2 protéines) 314,3 345,3 397,7 308,9 332,4 358,7 374,6 278,2 349,2 394,3 339,1 3901,5 332,7 328,3 Moyenne 292,5 361,2* 391,2* 319,6 350,8* 343,7* 352,1* S.D. 19,2 24,2 8,5 16,9 34,4 13,4 23,2 % véhicule 100,0 123,5 133,8 109,3 120,0 117,5 120,4 Tableau 2 * : Moyenne significativement différente de celle du groupe « Véhicule » (p Exemple 9 - Activité des composés de l'invention sur la production d'IL-la (en présence ou non d'UVB) L'évaluation de l'effet des actifs 9 et 10 sur la production d'IL-1a a été étudiée dans un 5 modèle de kératinocytes humains normaux cultivés en monocouches. Ces kératinocytes humains normaux ont été obtenus à partir d'une plastie abdominale réalisée chez une femme de 41 ans. Pour la réalisation des essais, ces cellules ont été cultivées jusqu'à l'obtention de monocouches confluentes. 10 L'inhibiteur de référence utilisé dans cette étude était la dexaméthasone à 10 uM. Les cellules ont été incubées : - pendant 24 heures en absence (témoin) ou en présence du produit de référence ou 15 de concentrations croissantes des actifs à l'essai pour les conditions « basales » - pré-incubées une heure en absence (témoin) ou en présence du produit de référence ou de concentrations croissantes des actifs 9 et 10 pour les conditions « basales », exposées à 0,08 J/cm2 d'UVB, puis incubées à nouveau 24 heures en absence (témoin) ou en présence du produit de référence ou de concentrations croissantes des actifs 9 20 et 10 pour les conditions « avec UVB ». Les concentrations utilisées étaient 0,05ug/m1; 0,5µg/ml et 5µg/ml, pour se faire les composés 9 et 10 ont été solubilisés directement dans le milieu d'incubation des cellules. 25 A la fin de la période d'incubation, d'une part, l'IL-1a contenue dans les milieux de culture a été quantifiée à l'aide d'un kit E.L.I.S.A. sensible et spécifique et d'autre part, les protéines contenues dans les lysats cellulaires ont été quantifiées par une méthode spectrocolorimétrique (méthode de Bradford - Bradford M. (1976) Anal. Biochem., 72, 248-254). 30 Les résultats sont donnés sous la forme de pg l'IL-1a par lig de protéine (moyennes +/la déviation standard, S.D.). La significativité statistique des différences observées entre les conditions «Contrôle» 35 et « produit de référence » a été évaluée par un test de Student (Student t test). La significativité statistique des différences observées entre les conditions «Témoin» et « produits à l'essai », a été évaluée, produit par produit, par une analyse de la variance à un facteur (One Way ANOVA), suivie d'un test de Holm-Sidak (* : p Taux d'IL-la dans les conditions « basales » Contrôle Composé 9 (1.1g/mL) Composé 10 (1.1g/mL) 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5 IL-la (pg/pg 8,3 9,9 14,0 10,1 7,8 10,3 8,9 de protéines) 8,3 7,6 9,1 6,4 12,8 9,6 8,9 8,4 9,1 12,1 9,2 12,1 10,1 10,9 Moyenne 8,3 8,9 11,7 8,5 10,9 10,0 9,6 S.D. 0,1 1,1 2,4 1,9 2,7 0,3 1,2 % véhicule 100 106,1 140,4 102,4 130,6 119,7 114,9 Tableau 3 * : Moyenne significativement différente de celle du groupe « Véhicule » (p Pour ce faire, la technique en milieu liquide a été retenue car elle permet, en fonction des germes testés, de détecter parallèlement deux types d'activité antimicrobienne : - une activité bactériostatique ou fongistatique sur la croissance, - une activité bactéricide ou fongicide par abattement des germes initialement inoculés. La notion de microbiostasie (bactériostatique ou fongistatique) se définit comme l'arrêt du développement des microorganismes par inhibition partielle ou totale de 10 leur multiplication. Elle se traduit par un ralentissement de la croissance des microorganismes par rapport à celles notées sur le témoin. La notion de microbiocidie (bactéricide ou fongicide) se définit comme l'arrêt du développement des microorganismes par mort des cellules. Selon les référentiels 15 utilisés, un produit n'est bactéricide que si un abattement de 4 log (CMB : Concentration Minimale Bactéricide) ou de 5 log (normes AFNOR Antiseptiques et désinfectants chimiques) est obtenu. Et il n'est levuricide/fongicide que si un abattement de 3 log (CMF : Concentration Minimale Fongicide) ou de 4 log (normes AFNOR) n'est obtenu. 20 Les souches microbiennes testées sont les suivantes : Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027, Staphylococcus aureus - ATCC 6538, Escherichia coli - ATCC 8739, Staphylococcus epidermidis - ATCC 12228, Propionibacterium acnes - ATCC 6919, Candida albicans - ATCC 10231 et Malassezia furfur - ATCC 14521. 25 Les microorganismes testés sont sortis de congélation (-80°C) et repiqués deux fois sur milieu approprié. Ces milieux sont incubés de 32 à 36°C de 18 à 6j, selon les microorganismes. Les cultures sont menées en conditions aérobies sauf pour P. acnes qui nécessitent des conditions anaérobies ; les cultures sont alors réalisées en jarre 30 anaérobie en présence d'anaerocult (Merck) durant 6 jours. Les suspensions à tester sont préparées extemporanément en eau physiologique stérile à partir des cultures sur milieux géloses. Les densités des suspensions ainsi obtenues sont ajustées par mesure de la D.O. à 620 nm ; elles doivent se situer aux 35 environs de 108 cellules/ml. Les microorganismes à tester sont placés extemporanément dans un milieu liquide favorable à leur croissance, puis immédiatement inoculés dans le produit à une densité finale d'environ 106 UFC/ ml pour les bactéries et d'environ 105 UFC/ ml pour les levures. Plus précisément, le contact entre les préparations microbiennes et le 5 produit à tester (9 et 10 sont solubilisés dans une solution aqueuse contenant 8% en DMSO) se fait par addition volume à volume dans un flacon stérile en verre. Ces flacons sont mis en incubation sous agitation rotative thermostatée (150 rotations/min) pour une durée de 24h (pour P. aeruginosa, S. aureus, E. coli et S. epidermidis), 48h (pour C. albicans) ou 72h (pour M. furfur). Les incubations 10 anaérobies de P. acnes sont conduites en enceinte thermostatée durant 6j. A l'issue des périodes d'incubation, des dénombrements sont réalisés en milieux géloses appropriés (tableau 1), après dilution-neutralisation en LT100 sur des gammes de dilutions adaptées. Les incubations des boîtes ensemencées sont menées durant 15 48h à 10 jours, selon les microorganismes. L'activité bactéricide ou levuricide des produits est appréciée en comparant les densités obtenues au temps final (Tf) à celles notées au temps initial (T0). Le potentiel bactéricide ou levuricide s'estime à partir de l'abattement obtenu. 20 L'activité bactériostatique ou levurostatique des produits est appréciée par l'éventuelle diminution de la croissance des germes microbiens entre témoin (Téf) et produit testé (Tf), en fin de suivi. 25 Les tableaux suivants présentent pour chaque produit testé et pour chacune des souches testées les densités obtenues aux : > temps initial (T0), les densités étant les mêmes pour les témoins et produits testés , > temps finaux pour les témoins (Témoin Téf) et produits testés (Test Tf) 30 Les résultats obtenus sont exprimés en UFC/ml et sont rapportés dans le tableau suivant. To Témoin Composé 9 à 0,165% Test Tf Composé 10 à 0,165% Test Tf Téf P. aeruginosa 1,1.106 1,3.109 5 logno) S. aureus 1,3.106 3,0.109 5 logno) E. coli 1,6.106 1,5.109 5 logno) S. epidermidis 2,5.106 2,5.109 5 logno) bactériostatique (z1 log/Téf) C. albicans 8,0.10 1,0.108 4 logno) levurostatique (z2 log/ Téf) P. acnes 8,5.105 2,7.108 5 logno) (z3 log/Téf) M. furfur 1,5.105 1,5.108 4 logno) Tableau 5 Le composé 9 présente une activité batéricide/levuricide nette. Le composé 10 présente une activité levurostatique. En revanche, son activité bactériostatique n'est pas effective sur l'ensemble des germes testés. REVENDICATIONS1. Composé de formule générale (I) 7 0 0 - H3C NH Mir, (I) dans laquelle : - n est un entier égal à 1, 2 ou 3 ; - m est un entier égal à 1, 2 ou 3 ; et - M est choisi parmi les métaux alcalins à l'exclusion du sodium, les métaux alcalino- 10 terreux, les métaux de transition, les métaux terreux et le groupe NH4. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est égal à 1 et m est égal à 2. 15 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est égal à 2 et m est égal à 1. 4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que M est un métal alcalin choisi comme étant le lithium ou le potassium. 20 5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que M est un métal alcalino-terreux choisi comme étant le magnésium, le calcium ou le baryum. 25 6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que M est un métal de transition choisi comme étant le cobalt, l'argent, le zinc ou le manganèse. 7. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que M est le groupe NH4. 8. Composition cosmétique comprenant un composé selon l'une des revendications 1 à 7.