Brevet FR3035589A1 — publié le 20161104

Domaine de l'invention La présente invention vise le domaine des traitements des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Plus particulièrement, la présente invention vise l'utilisation d'une composition pour la protection des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), notamment pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) ou encore de la maladie de Stargardt et la rétinite pigmentaire chez les mammifères. L'invention a pour but d'améliorer la vision des individus atteint de ces maladies ou au moins de stabiliser l'évolution de la maladie. Etat de la technique La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une cause de cécité irréversible chez les populations de personnes âgées, en particulier en Europe et en Amérique du Nord. La DMLA affecte la partie centrale de la rétine, appelée macula, entraînant une grave déficience visuelle et la perte irréversible de la vision centrale. La fonction maculaire est à l'origine de la vision centrale et de l'acuité visuelle dont la haute résolution est liée à sa forte concentration en photorécepteurs à cônes. Le stade précoce de la DMLA est marqué par des dépôts appelés Drüsen, qui n'affectent la vision que de façon marginale. Les phases ultérieures comprennent deux formes de DMLA, l'atrophie géographique (forme sèche) ou exsudative (forme zo humide ou néovasculaire), la première étant beaucoup plus fréquente que la seconde. Les dernières étapes de ces deux formes conduisent à la destruction de la rétine neurosensorielle maculaire, mais l'évolution de la DMLA sèche est généralement lente, alors que la DMLA humide peut conduire à la cécité complète en quelques semaines. 25 Le vieillissement est l'accumulation progressive avec le temps de changements qui sont associés à (ou responsables de) une susceptibilité croissante de la maladie. Dans la rétine, un certain nombre de maladies dégénératives, y compris le glaucome, la rétinite pigmentaire et la DMLA, peuvent survenir à la suite du vieillissement. La rétinite pigmentaire regroupe un ensemble hétérogène de 30 dégénérescences rétiniennes génétiques, impliquant les photorécepteurs et l'EPR, et conduisant à une perte de vision nocturne, puis tardivement de la vision centrale. Bien que les mécanismes spécifiques impliqués dans l'initiation de différents types 3035589 2 de maladies liées au vieillissement rétinien diffèrent, on pense que le stress oxydatif et l'inflammation qui en résultent sont des éléments importants qui contribuent à la pathogenèse. Les théories de l'étiologie de la DMLA incluent des modifications 5 hydrodynamiques dans la membrane de Bruch causées par une accumulation progressive de matériel extracellulaire contenant des lipides, et la sénescence de l'EPR, dont l'activité est indispensable à la survie des photorécepteurs. Les cellules de l'EPR ont plusieurs fonctions différentes dans les yeux: elles établissent la barrière hémato-rétinienne par leurs jonctions serrées, et sont ainsi responsables du Io statut immuno-privilégié de la partie intérieure de l'ampoule de l'oeil ; elles maintiennent en vie les photorécepteurs en leur apportant des nutriments et participent au cycle visuel. La compréhension actuelle est qu'une déficience de la fonction des cellules de l'EPR est à l'origine du développement de la DMLA. Le vieillissement provoque un dysfonctionnement des cellules de l'EPR et une 15 insuffisance de leur métabolisme, ainsi que de leur activité phagocytaire. Une digestion incomplète des segments externes des photorécepteurs peut conduire à la formation de Drüsen en réduisant la diffusion à travers la membrane de Bruch, ce qui provoque dans un premier temps une déformation de la rétine et des images perçues. Avec l'âge, l'EPR stocke une quantité croissante de lipofuscines. Celles-ci sont composées de lipides et de protéines, qui proviennent des phagolysosomes, des lysosomes et des photorécepteurs. Les lipofuscines contiennent également de la N-rétinyl-N-rétinylidène éthanolamine (A2E), qui est formée par la condensation de deux molécules de rétinaldéhyde avec de l'éthanolamine. Le vieillissement s'accompagne d'une accumulation accrue d'A2E dans la rétine (Bhosale et al., 2009). Sous l'action de la lumière bleue et en présence d'oxygène, l'A2E génère des espèces réactives qui provoquent des dommages aux protéines, aux lipides et à l'ADN, et donc un stress oxydatif important dans les cellules vieillissantes de l'EPR (Sparrow & Cai, 2001). Ces dommages perturbent l'activité lysosomiale des cellules de l'EPR et provoquent une accumulation de déchets, ce qui finit par engendrer, de place en place, la mort des cellules de l'EPR qui est suivie par celle des photorécepteurs auxquels elles étaient associées. Aucun médicament n'existe sur le marché pour le traitement de la DMLA sèche, alors que des médicaments par injection intravitréenne d'anticorps anti-VEGF 303 5 5 8 9 3 (Vascular Endothelial Growth Factor) sont commercialisés permettant de bloquer partiellement la formation de néovaisseaux et offrant ainsi une alternative de traitement de la DMLA humide. Des compléments alimentaires ont été formulés avec des composés antioxydants génériques, à savoir des minéraux et des vitamines aux 5 propriétés antioxydantes, par exemple le zinc, les vitamines A, C, E, avec une efficacité thérapeutique réelle mais limitée. La formule AREDS nutraceutique 1 (en anglais « Age-Related Eye Disease Study », AREDS 2001) est considérée comme la norme de soins aux États-Unis pour le traitement de la DMLA sèche, réduisant le risque de DMLA avancée de 25 % et la perte de vision de 19 % sur cinq ans. 10 De nombreux produits proposent une base de formulation commune : Zinc et vitamines C et E, à laquelle sont ajoutés divers ingrédients : lutéine, resvératrol, acides gras Oméga 3, sans toutefois disposer de données d'efficacité convaincantes sur ces ingrédients additionnels, ni sur les catégories de patients susceptibles de répondre favorablement à ces différentes molécules (Elliot & Williams, 2012). 15 Les caroténoïdes (des molécules exclusivement apportées par l'alimentation), ont été plus particulièrement étudiés, car certains d'entre eux (lutéine, zéaxanthine = des xanthophylles) sont naturellement présents dans la macula (Subczynski et al., 2010), et l'on sait que ces composés possèdent un fort pouvoir antioxydant. C'est donc logiquement que ces composés ont été testés (seuls ou en combinaison) dans 20 la formule AREDS, mais les résultats obtenus ont été limités, la supplémentation ne s'avérant efficace que pour un sous-ensemble de patients carencés en ces composés (Pinazo-Duràn et al., 2014). Ces molécules sont efficaces in vitro pour protéger des cellules de l'EPR (Human D407) contre les effets toxiques du peroxyde d'hydrogène (Pintea et al., 2011). 25 D'autres xanthophylles ont également fait l'objet d'études par supplémentation orale, seules ou en combinaison avec la lutéine et/ou la zéaxanthine (ex. astaxanthine - Parisi et al., 2008). Récemment, des diapocaroténoïdes (= caroténoïdes tronqués aux deux extrémités - IUPAC chemical nomenclature) ont été testés in vitro et in vivo, en particulier la crocétine (= 8,8'-diapocarotene-8,8'-dioate) 30 et ses glycosides (les crocines). Les crocines présentent un effet photoprotecteur in vitro sur des cultures primaires de photorécepteurs de bovins ou de primates (Laabich et al., 2006), et la crocétine protège les cellules neuroganglionnaires contre un stress oxydatif (Yamauchi et al., 2011). Le safran (une épice riche en crocines/crocétine) administré per os s'est avéré actif in vivo sur la qualité de la 3035589 4 rétine (Maccarone et al., 2008; Falsini et al., 2010; Boisti et al., 2014). Toutefois, le safran contenant d'autres molécules susceptibles d'être actives sur la rétine, comme d'autres caroténoïdes ainsi que du safranal (Verma&Middha, 2010 ; FernàndezSànchez et al., 2012), il est difficile de conclure quant à l'effet de la seule crocétine. 5 Des expérimentations ont également été réalisées avec un autre apocaroténoïde, la bixine (= methylhydrogen 6,6'-diapocarotene-6,6'-dioate) ou certains de ses dérivés, in vitro sur des cellules neuroganglionnaires et in vivo par injections intravitréennes pour contrecarrer les effets d'un stress du réticulum endoplasmique (Tsuruma et al., 2012). Les tests ainsi réalisés évaluent le plus 10 souvent une activité antioxydante et donc protectrice des composés vis-à-vis de divers types cellulaires de la rétine soumis à la présence d'un agent oxydant (ex. le peroxyde d'hydrogène), et ils ne se situent donc pas directement dans le contexte de la DMLA. Un extrait de graines d'Urucum (Bixaorellana) précédemment développé 15 (Bixilia®) a montré un effet photoprotecteur sur la peau humaine exposée aux UV (Veillet et al., 2009) et sur des cellules d'EPR soumises à un stress photooxydant (Fontaine et al., 2011). L'extrait Bixilia® est un extrait naturel d'Urucum qui a été enrichi en Bixine. Bixilia® contient d'autres composés photoprotecteurs de nature phénolique, dont la présence pourrait expliquer l'activité photoprotectrice supérieure 20 de l'extrait brut par rapport à la Bixine seule. Dans le brevet FR 11 54172 (Fontaine et al., 2011), l'effet protecteur des cellules d'EPR de certains des composés de l'extrait Bixilia® est analysé. Les résultats des tests utilisant la Bixine ou Norbixine aux concentrations 0,1 micromolaire (pM), 1 i_iM et 10 i_iM n'ont pas d'activité photoprotectrice et laissent même penser que plus la concentration en Bixine ou 25 Norbixine est grande, moins les cellules d'EPR survivent et donc moins l'effet photoprotecteur est grand. On remarque, entre autres, que des substances telles que la cyanidine et l'acide ellagique à des concentrations de 10 i_iM et 20 i_iM ont un effet photoprotecteur avantageux sur les cellules d'EPR. Une étude approfondie a conduit à identifier les molécules actives présentes 30 dans l'extrait Bixilia® et à préciser leur mécanisme d'action, puis à démontrer leur efficacité in vivo chez la souris et le rat. Cette étude a donné naissance à la présente invention. L'invention prévoit ainsi de trouver un traitement alternatif à ceux déjà existants pour la protection des cellules d'EPR. 3035 589 5 Objet de l'invention Les inventeurs ont découvert que la Norbixine, en particulier sa forme 9'-cis, permettait de diminuer fortement la mort cellulaire provoquée par une illumination avec des rayonnements bleus des cellules de l'EPR prétraitées avec de la N-rétinyl- 5 N-rétinylidène éthanolamine (A2E). Selon un premier aspect, la présente invention vise une composition contenant de la norbixine obtenue par purification à partir d'un extrait de graines de Bixa orellana, pour son utilisation pour la photoprotection des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez le mammifère. 10 Dans le cadre de l'invention, on entend par « extrait de graines de Bixa orellana » un extrait préparé à partir de la partie externe des graines, c'est-à-dire de la substance cireuse recouvrant les graines de Bixa orellana. Cette substance cireuse est connue pour être riche en bixine et en d'autres caroténoïdes mineurs, ainsi que pour son utilisation comme colorant alimentaire. 15 La Norbixine, biodisponible chez les mammifères après administration orale, est bien mieux absorbée que la Bixine et se retrouve dans en particulier dans la rétine. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la composition comporte plus de 90 % en poids de Norbixine. 20 Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la composition comporte plus de 90 % en poids de Norbixine sous sa forme 9'-cis de formule (I) : CH3 CH3 (I) Dans des modes de réalisation particuliers, la composition comporte au moins un élément choisi parmi le zinc, la vitamine C et la vitamine E. 25 Dans des modes de réalisation particuliers, la composition peut être utilisée sous forme d'un complément alimentaire ou d'un médicament. Par complément alimentaire on entend produit renfermant ladite composition ayant pour objet de compléter l'alimentation en apportant des nutriments bénéfiques pour la santé selon la définition donnée par la directive européenne 2002/46/EC. Par 303 5 5 8 9 6 exemple, un complément alimentaire peut être une gélule ou comprimé à avaler ou une poudre ou petite ampoule à mélanger à un aliment et présentant des effets bénéfiques sur les cellules d'EPR. Par médicament on entend produit contenant une dose précise dudit composé 5 ou dudit extrait selon la définition donnée par la directive européenne 65/65/CE à savoir toute substance ou composition présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales. Par exemple, le médicament contenant le composé aux doses thérapeutiques peut-être administré par voie orale sous forme de gélule ou comprimé ou injecté par voie intra-vitréenne 10 ou tout autre voie permettant de conférer des effets bénéfiques sur la rétine. Dans des modes de réalisation particuliers, la composition comprend un support acceptable pour être ingéré, injecté dans l'oeil, injecté par voie systémique ou injecté dans le sang. Dans des modes de réalisation, la composition est administrée au mammifère, 15 par jour, en quantité comprise entre 0,48 mg/kg de poids corporel et 48 mg/kg de poids corporel, de préférence comprise entre 0,6 mg/kg de poids corporel et 20 mg/kg de poids corporel. Selon d'autres modes de réalisation particuliers de l'invention, la composition est destinée à prévenir les dommages à la rétine susceptibles d'être causés par zo l'exposition aux rayonnements bleus. Par rayonnement bleus, on entend les rayonnements correspondant à la bande bleue du spectre de la lumière visible, de longueur d'onde comprise entre 435 nm et 490 nm. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la composition est destinée au traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) chez le 25 mammifère. Dans d'autres modes de réalisation particuliers, la composition est destinée à traiter la maladie de Stargardt et/ou la rétinite pigmentaire chez le mammifère. La maladie de Stargardt, ou syndrome de Stargardt, est une pathologie héréditaire, associant une baisse d'acuité visuelle bilatérale à une atrophie de la macula, qui 30 reproduit, à un âge précoce, les symptômes de la forme sèche de la DMLA. Brève description des figures 3035589 7 La Figure 1 illustre le pourcentage de cellules d'EPR survivantes en présence de N-rétinyl-N-rétinylidène éthanolamine (A2E) et de l'extrait Bixilia® ou de Bixine (20 i_iM) ou de Norbixine (20 i_iM) après avoir été soumises à une illumination. La Figure 2 illustre l'activité photoprotectrice des extraits successifs des 5 graines d'Urucum (C = cyclohexane; D = dichlorométhane; M = méthanol) sur les cellules de l'EPR mises en présence d'A2E et soumises à une illumination. La Figure 3a illustre les concentrations plasmatiques après ingestion de Bixine (à gauche) ou de Norbixine (à droite) chez la souris C57BI/6. La Figure 3b illustre l'analyse pharmacocinétique de la Norbixine chez la 10 souris C57BI/6. La Figure 4 illustre l'analyse par HPLC-MS/MS de la Norbixine dans les yeux de souris double KO (ABCA4-/-, RDH8-/-) après injection intrapéritonéale (10 mg/kg). (3 : la Norbixine injectée, 1 et 2 : mono-glucuronides de ce composé). La Figure 5 illustre la cinétique de l'accumulation de l'A2E dans l'oeil de souris 15 double KO (ABCA4-/-, RDH8-/-) en fonction de l'âge, en comparaison avec des souris normales. La Figure 6 illustre les électrorétinogrammes (Ondes A à gauche et Ondes B à droite) de souris double KO (ABCA4-/-, RDH8-/-) ayant reçu des injections intravitréennes unilatérales de Norbixine (afin d'obtenir une concentration finale dans 20 le vitré de 130 pM), placées pendant 24 h à l'obscurité puis exposées à la lumière bleue (4000 lux, 1 h). Les électrorétinogrammes sont réalisés 7 jours après l'illumination. La Figure 7 illustre le nombre de couches de noyaux de photorécepteurs en fonction de la distance à partir du nerf optique dans les yeux de souris traitées 25 comme dans la figure 6. La Figure 8A illustre le protocole expérimental de la création du modèle « rat blue light ». La Figure 8B illustre les résultats des électrorétinogrammes des rats auxquels il a été injecté de la norbixine (100 mg/kg, 4 injections par rat d'une solution à 50 mM 3035589 8 dans du NaCI 9 %., 4 rats/série) en utilisant le PBN (phényl-N-tert-butylnitrone, 50 mg/kg, solution à 20 mg/mL dans du NaCI 9 %.) comme témoin positif. Les électrorétinogrammes sont réalisés 7 jours après le traitement. La Figure 9A illustre le nombre de couches de noyaux de photorécepteurs en 5 fonction de la distance à partir du nerf optique dans les yeux de rats après injections intrapéritonéales d'alpha-phényl-N-tert-butylnitrone (PBN) ou de Norbixine et illumination avec une lumière bleue. Les analyses histologiques sont réalisées 7 jours après le traitement. La Figure 9B illustre l'aire sous chaque courbe de la Figure 9A. 10 La Figure 10 illustre la quantité d'A2E accumulée dans l'oeil de souris double KO (ABCA4-/-, RDH8-/-) ayant ingéré ou non de la nourriture complémentée en norbixine pendant 3 mois. La Figure 11 illustre les électrorétinogrammes de souris double KO (ABCA4-/-, RDH8-/-) ayant été nourries ou non avec de la nourriture contenant 0,3 mg/g de 15 norbixine pure pendant 3 mois. La Figure 12 illustre la relation entre l'amplitude de l'électrorétinogramme (onde A) et la quantité d'A2E accumulée dans les yeux des souris double KO (ABCA4-/-, RDH8-/-). La Figure 13 illustre les résultats de l'analyse par HPLC en phase inverse de 20 la norbixine purifiée à partir de l'extrait de Bixa orellana (l'identification des isomères a été réalisée selon Scotter et al., 1998 et Polar-Cabrera et al., 2010). Description détaillée d'exemples de réalisation de l'invention A la différence de la plupart des études précédemment publiées, les modèles utilisés dans la présente invention (à la fois in vitro et in vivo) mettent en avant le rôle 25 de la N-rétinyl-N-rétinylidène éthanolamine (A2E) et de sa phototoxicité, et sont à ce titre, plus proches de la pathologie humaine. Les tests utilisés in vitro s'apparentent dans leur principe à ceux utilisés avec d'autres substances naturelles sur une lignée de cellules d'EPR humain (cellules ARPE-19 - Young et al., 2005). Protocoles et Résultats 3035589 9 1- Préparation de la Bixine et de la Norbixine La Bixine pure à 95% en poids est préparée à partir d'un produit commercial (Annatto B) provenant d'une extraction organique des graines d'Urucum et d'une concentration en Bixine supérieure à 85% en poids. La purification est réalisée par 5 recristallisations successives. La Norbixine pure à 95% en poids est obtenue après hydrolyse alcaline de la Bixine purifiée (5% KOH, 60°C, 3 heures). La solutbn obtenue est acidifiée par de l'acide chlorhydrique concentré et la Norbixine est récupérée par centrifugation. Le culot est lavé deux fois par de l'eau pour éliminer les sels, et le culot final est 10 lyophilisé. La pureté des composés est appréciée par spectrophotométrie UV-Vis et HPLC en phase inverse : les composés contiennent essentiellement les isomères 9'- cis (concentration supérieure à 90% en poids, figure 13). 2- Tests in vitro 15 Un test in vitro destiné à étudier l'effet photoprotecteur de diverses substances naturelles sur les cellules de l'EPR mises en présence d'A2E a été utilisé. L'effet photoprotecteur des molécules est évalué dans un modèle cellulaire de phototoxicité induite par traitement par A2E suivi d'une illumination en lumière bleue. Par rayonnements bleus on entend les rayonnements correspondant à la bande bleue du 20 spectre de la lumière visible, soit de longueur d'onde comprise entre 435 et 490 nm. Ce modèle utilise des cultures primaires d'EPR de porc adulte. La survie cellulaire est quantifiée grâce à un test de viabilité cellulaire. On ajoute à -48h les composés à tester (en solution 5 mM dans le DMSO) pour obtenir des concentrations finales de 1 à 20 i_iM) puis à -19h de l'A2E (concentration finale 30 25 i_iM) et on irradie les cellules (temps Oh). On mesure 24h après la survie des cellules. L'acquisition des images ainsi que leur traitement sont réalisés à l'aide d'un microscope à fluorescence piloté par le logiciel Metamorph et d'un programme de quantification dédié. Les expériences sont réalisées sur des microplaques de 96 puits en quadruplicate et l'expérience est reproduite au minimum quatre fois. Les 30 résultats sont exprimés sous forme d'un ratio représentant le nombre de cellules vivantes dans les puits traités par les molécules à tester, divisé par le nombre de cellules vivantes dans les puits contrôles (traités par le milieu de dilution sans A2E). 3035589 10 Ce test a permis précédemment de mettre en évidence la très bonne activité photoprotectrice d'un extrait éthanolique de graines d'Annatto (Bixilia® - voir Fontaine et al., 2011). Dans le travail précédent, si l'activité de l'extrait d'Annatto avait été démontrée, la nature de la (ou des) substance(s) photoprotectrice(s) n'avait 5 pas été identifiée, et le composant principal de cet extrait (la bixine) s'était avéré inefficace aux concentrations de 0,1 11M, 1 i_iM et 1011M. Un travail complémentaire a donc été entrepris afin d'identifier le (ou les) composé(s) actif(s). a. La Bixine est responsable d'une grande partie de l'activité 10 photoprotectrice de Bixilia® La Figure 1 montre que la Bixine et la Norbixine (20 i_iM) protègent efficacement les cellules de l'EPR contre la phototoxicité induite en présence d'A2E par rapport au contrôle avec A2E. Un extrait brut de graines d'Urucum dilué pour apporter 20 i_iM de bixine possède une activité photoprotectrice élevée. L'utilisation 15 de bixine très pure et à la concentration de 20 i_iM a permis de montrer que ce composant possédait en fait une activité photoprotectrice importante (Figure 1) et que celle-ci expliquait une part importante de l'activité de l'extrait Bixilia® dilué de façon à apporter la même quantité de bixine. Une activité comparable a également été trouvée pour la Norbixine, qui représente le métabolite circulant majeur de la 20 Bixine (Lévy et al., 1997). Ces résultats sont en accord avec l'activité photoprotectrice de ces mêmes composés, précédemment démontrée pour la photoprotection de la peau humaine (Veillet et al., 2009). b. Bixilie contient d'autres composés photoprotecteurs 25 Bixilia® contient d'autres composés photoprotecteurs de nature phénolique, dont la présence pourrait expliquer l'activité supérieure de l'extrait brut par rapport à la bixine seule (pour une même concentration en bixine). Une extraction séquentielle de l'enveloppe des graines d'Urucum a été réalisée avec successivement du cyclohexane, du dichlorométhane et du méthanol (1 L de chaque / 100 g de graines). 30 Après extraction au cyclohexane on obtient une fraction avec une concentration en Bixine de 0,65 11M, après extraction au dichlorométhane on obtient une fraction qui possède une concentration en Bixine de 1485 11M, et après extraction au méthanol une fraction qui possède une concentration en Bixine de 4511M. 3 0 3 5 5 8 9 11 On reproduit alors le test in vitro précédent. Selon la Figure 2 la fraction dichlorométhane, qui contient 97 % de la Bixine, est très active, mais on note également que l'extrait méthanolique riche en composés phénoliques possède une activité significative (C = cyclohexane; D = 5 dichlorométhane; M = méthanol). 3- Biodisponibilité de la Bixine et de la Norbixine Des études de la biodisponibilité de la Bixine et de la Norbixine ont été réalisées chez des souris C57BI/6. Les composés ont été administrés par voie orale 10 (50 mg/kg). Des prélèvements sanguins ont été effectués après 0,25, 0,5, 1, 3, 6, 8 et 24 h et analysés par HPLC-DAD (UV 460 nm)-MS/MS. Le tableau 1 et la Figure 3a dévoilent que la Bixine ingérée est rapidement transformée en Norbixine et que les deux composés circulent à des concentrations comparables, on ne les détecte plus après 8 heures. On note par ailleurs que la Norbixine ingérée est nettement plus 15 biodisponible que la Bixine. Tableau 1 : Ingestion de bixine (50 mg/kg) Ingestion de norbixine (50 mg/kg) Tmax (h) Cmax AUC 0-24h Tmax (h) Cmax AUC (ng/m L) (ng.h/mL) (ng/m L) (ng.h/mL) Bixine 0,5 833 1666 Norbixine 0,5 12400 41609 Norbixine 0,5 649 1343 La comparaison des analyses plasmatiques (figure 3b) après injection 20 intrapéritonéale (5 mg/kg) et administration orale (50 mg/kg) montre que la biodisponibilité de la Norbixine est de 55%. La présence de Norbixine dans les yeux a été recherchée chez des souris double KO (ABCA4-/-, RDH8-/-) 3 heures après injection intrapéritonéale de Norbixine (10 mg/kg). Les yeux de 6 animaux ont été disséqués et les échantillons ont été 25 extraits avec de l'acétonitrile, poolés puis analysés par HPLC-MS/MS (Figure 4), ce qui a permis de détecter spécifiquement la présence de la Norbixine dans l'EPR et la rétine (Tableau 2). 303 5 5 8 9 12 Tableau 2 : Echantillon Norbixine (ng/organe) EPR 5,15 Rétine 2,40 Cristallin REVENDICATIONS1. Composition contenant de la norbixine obtenue par purification à partir d'un extrait de graines de Bixa orellana, pour son utilisation pour la photoprotection des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez le mammifère. 2. Composition selon la revendication 1, comportant plus de 90% en poids de Norbixine. 3. Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, comportant plus de 90% en poids de Norbixine sous sa forme 9'-cis de formule (I) 0 OH CH3 HO CH3 CH3 CH3 (I) 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, comportant au moins un élément choisi parmi le zinc, la vitamine C et la vitamine E. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, se présentant sous la forme d'un complément alimentaire ou d'un médicament. 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant un support acceptable pour être ingéré, injecté dans l'oeil, injecté par voie systémique ou injecté dans le sang. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, pour son utilisation pour la protection des cellules de I'EPR par administration au mammifère, par jour, en quantité comprise entre 0,48 mg/kg de poids corporel et 48 mg/kg de poids corporel, de préférence comprise entre 0,6 mg/kg de poids corporel et 20 mg/kg de poids corporel. 3035589 19 8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, pour son application dans la prévention des dommages à la rétine causés par l'exposition aux rayonnements bleus correspondant à la bande bleue du spectre de la lumière 5 visible, de longueur d'onde comprise entre 435 nm et 490 nm. 9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, pour son application dans le traitement de la dégénérescence oraculaire liée à l'âge (DMLA) chez les mammifères. 10 10. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, pour son application dans le traitement de la maladie de Stargardt et/ou la rétinite pigmentaire chez les mammifères.