Brevet FR3027804A1 — publié le 20160506

UTILISATION D'UN INHIBITEUR DE TRANSCRIPTASE INVERSE DANS LA PREVENTION ET LE TRAITEMENT DES MALADIES DEGENERATIVES La présente invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de transcriptase inverse dans la prévention et le traitement des maladies dégénératives. Une caractéristique de la plupart des maladies dégénératives, en particulier neurodégénératives, est qu'elles se manifestent tard dans la vie. Cela est vrai de leurs formes sporadiques mais aussi génétiques, comme cela est illustré par la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et même la maladie monogénique de Huntington. Cela suggère que le vieillissement rend les cellules plus sensibles, même si on ne peut exclure que les mutations elles-mêmes accélèrent ce vieillissement. Le stress oxydatif qui mime un vieillissement accéléré génère des dérivés réactifs de l'oxygène (ROS pour Reactive Oxygen Species) qui sont toxiques, en particulier au niveau du génome où les protéines de la chromatine et les bases de l'ADN sont soumises à une oxydation (Vijg, J., and Suh, Y., 2013). Les dérivés réactifs de l'oxygène peuvent induire des cassures simple-brin et double-brin (DSB pour Double-Strand Break) de l'ADN, activant ainsi les systèmes de réponse aux dommages faits à l'ADN (O'Sullivan and Karlseder, 2012; Marteijn et al., 2014). Par exemple, un article récent montre que chez la souris l'activité neuronale et donc la synthèse d'ATP et de dérivés actifs de l'oxygène sont accompagnées de façon physiologique par la formation de cassures double-brin de l'ADN qui sont rapidement réparées chez les souris de type sauvage, contrairement aux souris J20, modèle de la maladie d'Alzheimer (Suberbielle et al., 2013). Les longs éléments nucléaires intercalés LINEs (LINE pour Long Interspersed Nuclear Elements) font partie des séquences répétées dispersées au sein de l'ADN. Les séquences LINE actives sont des éléments transposables sans longue séquence terminale répétée (LTR pour Long Terminal Repeat) capables de réplication autonome, ce qui leur permet de se dupliquer et de s'insérer à d'autres sites dans le génome. Les LINE codent pour un ARN polycistronique avec 2 phases ouvertes de lecture, ORF1 et ORF2. ORF2 encode une transcriptase inverse (RT pour Reverse Transcriptase) qui copie l'ARN du LINE en ADN et une endonucléase qui peimet l'insertion de cet ADN dans le génome à travers la formation d'une cassure double-brin, et qui -au passage- introduit une mutation dans le génome qui peut s'avérer délétère. Les inventeurs ont montré que le stress oxydatif qui mime un vieillissement accéléré, induit la foimation de cassures double-brin (DSB) de l'ADN, une déstructuration de l'hétérochromatine et l'expression des gènes d'éléments transposables (LINE). Ils ont proposé que l'expression des LINE induite par le stress oxydatif est à l'origine, au moins en partie, de la formation des DSB et démontré que la formation de ces DSB est diminuée en présence d'un inhibiteur de transcriptase inverse (ou reverse transcriptase). Sur la base de ces observations, les inventeurs proposent d'utiliser les inhibiteurs de transcriptase inverse dans la prévention et le traitement des maladies dégénératives. En conséquence, la présente invention a pour objet un inhibiteur de transcriptase inverse pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une maladie dégénérative. Conformément à l'invention, la maladie dégénérative est une maladie d'origine génétique et/ou acquise, liée notamment à l'âge (vieillissement) et/ou au stress, notamment au stress oxydatif. Du fait qu'il réduit la formation de DSB, l'inhibiteur de transcriptase inverse a un effet thérapeutique dans les dégénérescences liées à l'âge et/ou au stress, ou bien encore à des conditions qui augmentent les effets délétères du stress (une mutation, 20 par exemple). Il est utile, notamment dans la prévention et le traitement des maladies neurodégénératives, en particulier à déclenchement tardif, du vieillissement neuronal et des effets du stress oxydatif dans les cellules nerveuses ou d'autres types de cellules. Parmi les maladies dégénératives on peut citer de façon non-limitative 25 les maladies neurodégénératives telles que par exemple, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie d'Huntington, la sclérose latérale amyotrophique (SLA), les maladies dégénératives affectant la vue ou l'audition, notamment le glaucome. L'inhibiteur de transcriptase inverse est nucléosidique ou non- 30 nucléosidique. Parmi les inhibiteurs utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer notamment ceux actuellement disponibles comme médicament dans le traitement de l'infection par le Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH), à savoir, les inhibiteurs nucléosidiques tels que : azidothymidine (AZT ou Zidovudine ou), 2'-3'- dideoxycytidine (ddC ou Zalcitabine), R1R)-442-amino-6-(cyclopropylamino)purin-9- y1]-1-cyclopent-2-enyl]methanol (ABC ou Abacavir), 2'-3 ' -didehydro-2' -3 '- dideoxythymidine (d4T ou Stavudine), 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine (3TC ou Lamivudine), dd I (2'-3'-dideoxyinosine), 4-amino-5-fluoro-1- [2-(hydroxymethyl)- 1,3-oxathiolan-5-y1]- pyrimidin-2-one (FTC), 2-(6-aminopurin-9-yl)ethoxymethylphosphonic acid (bis-POM PMPA), Adefovir, Didanosine, Emtricitabine et Ténofovir ; les inibiteurs non-nucléosidiques tels que : Efavirenz (EFV), Névirapine (NVP), Delavirdine (DLV), Etravirine et Rilvipirine. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit inhibiteur est un inhibiteur nucléosidique, de préférence la Stavudine. L'inhibiteur est administré par une voie adaptée à la pathologie à traiter (orale, parentérale, locale) et à des doses suffisantes pour obtenir l'effet 15 thérapeutique désiré, qui peuvent être déterminées aisément par l'Homme du métier. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention. Exemple 1: Le stress oxydatif induit la formation de cassures double-brin (DSB), 20 une déstructuration de l'hétérochromatine et l'expression des gènes d'éléments transposables (LINEs) 1. Matériels et méthodes Animaux Les souris ont été traitées conformément aux directives pour le 25 maintien et l'utilisation des animaux de laboratoire du National Institute of Health (États-Unis) et de la Directive Européenne 86/609 du Conseil CEE pour la protection des animaux utilisés à des fins de recherche expérimentale et autres utilisations scientifiques. Les souris Swiss OF1 de souche sauvage (Janvier) ou mutante hétérozygote En] +/- (Hanks et al., 1995) ont été maintenues dans des animaleries 30 conventionnelles. Les groupes expérimentaux sont constitués de souris âgées de 6 à 9 semaines. Traitement 6-0HDA Pour les injections de 6-0HDA (6-hydroxydopamine), des souris anesthésiées ont été placées sur un dispositif stéréotaxique et un trou de trépan a été percé dans le crâne à 3.3 mm en caudale et 1 mm en latéral du bregma. L'aiguille de la seringue a été alignée sur le trou et descendue à 4 mm de la surface du crâne et l'injection de 6-0HDA (2 itl; 0.8 1..tg/p1 Sigma) ou du contrôle dans la SNpc a été réalisée pendant plus de 4 min. Pour l'analyse immunohistologique, les souris ont été sacrifiées 6h, 24h ou 7 jours après l'injection de 6-0HDA. Pour les analyses qRT-PCR, des tissus de la SNpc 6h après l'injection 6-0HDA ont été obtenus en réalisant des carottes de 1 mm dans des couronnes de tissu congelé de 2 mm d'épaisseur, à l'aide d'un appareil stéréotaxique. qRT-PCR L'ARN total RNA de tissue de la SNpc a été extrait à l'aide du Kit RNeasy® Lipid Tissue kit (Qiagen) suivi d'une digestion à la DNase I (Thermo), puis une transcription inverse a été réalisée sur 200 ng d'ARN en utilisant le kit Sensiscripte (Qiagen). Des réactions de qRT-PCR on été effectuées avec des paires d'amorces spécifiques des séquences à amplifier, à l'aide du kit SYBR-Green (Invitrogen) et les valeurs ont été normalisées par rapport aux taux d'ARNm de GAPDH ou HPRT. Les résultats ont été analysés à l'aide de la méthode ddCt (Livak and Schmittgen, 2001). Immunomarquage Les souris ont été anesthésiées puis une perfusion transcardiaque a été effectuée avec du PBS puis du PBS contenant 4% de paraformaldéhyde. Les cerveaux ont été post-fixés pendant une 1h et cryoprotégés avec une solution de sucrose 15%. Les tissus ont été inclus dans l'OCT, congelés dans l'isopentane refroidi, puis conservés à -80°C avant d'être coupés. Des coupes de 18 lm d'épaisseur du cerveau au niveau de la SNpc ont été réalisées. Pour l'immunofluorescence, les lames ont été séchées à l'air, peunéabilisées pendant 20 min dans du PBS contenant 1% Triton X-100 et incubées à 100°C pendant 20 min dans du tampon citrate (10 mM acide citrique, 0,05% Tween 20, pH 6,0) pour démasquer l'antigène. Après 1h de blocage (10% sérum normal de chèvre , 0,05% Triton X-100 dans PBS), les tissus ont été incubés toute la nuit à 4°C avec des anticorps primaires dilués dans la solution de blocage (anti-y-H2AX de souris 1:200, Millipore; anti-TH de poulet, 1:500, Abcam; anti-caspase3 activée de lapin, 1:200, Abcam; anti-nucléoline de lapin, 1:200, Sigma; anti-fibrillarine de lapin, 1:200, Gentex; anti-H3k27me3 de lapin, 1:200, Millipore; antiH3k9me3 de lapin, 1:200, from Edith Heard; anti-Mecp2 de lapin, 1:300, Abcam; antiPCNA de lapin, 1:200, Cell Signaling; anti-cycline A de lapin, 1:200, Santa Cruz; anti- phospho-H3 de souris, 1:100, Cell Signaling ; anti-Lamin de lapin, Santa Cruz). Les coupes ont été incubées avec les anticorps secondaires appropriés (488 anti-poulet, 647 anti-poulet, 488 anti-souris, 546 anti-souris and 546 anti-lapin Alexa Fluor, Life technologies) pendant 1h à température ambiante. Les coupes de cerveau marquées ont été visualisées à l'aide d'un microscope confocal à fluorescence (5P5, Leica). Pour l'immunohistochimie TH, les lames ont été perméabilisées dans une solution de 1% Triton X-100 et incubées toute la nuit à 4°C avec du PBS, 10% sérum normal de chèvre contenant un anticorps polyclonal anti-TH (1:1000; Pel-Freez Biologicals). Les coupes ont été traitées avec un anticorps secondaire biotinylé puis incubées avec un complexe avidine-peroxydase de raifort (horseradish peroxidase ou HRP) biotinylée (ABC system, Vectastain). La peroxydase a été révélée à l'aide du kit de substrat de peroxydase (HRP) basé sur la diaminobenzidine (DAB) (Vectastain) puis visualisée avec un microscope Eclipe i90 (Nikon). Quantification des images Les images de microscopie ont été analysées à l'aide du logiciel ImageJ. Pour l'immunofluorescence, toutes les quantifications ont été effectuées à l'aide d'un grossissement 60X et des plans focaux successifs de 0,7 larn d'épaisseur. Le marquage au DAPI a été utilisé pour localiser les noyaux des cellules immunomarquées avec la TH. 100 à 300 cellules individuelles TH positives ont été quantifiées pour chaque condition. Pour le comptage des foyers y-H2AX, le nombre de points y-H2AX dans le noyau de chaque cellule a été déterminé ; du fait d'un marquage endogène, un seuil de 2 foyers par cellules a été établi. Pour l'analyse des motifs H3K27me3 et Nucléoline, un graphique en deux dimensions de l'intensité des pixels le long d'une ligne positionnée au travers du noyau a été créée. Les motifs spécifiques identifiés ont été utilisés pour déterminer la présence de H3K27me3. Pour l'analyse des marquages H3K9me3 et Mecp2, la même procédure a été utilisée avec les chromocentres DAPIdenses. Le rapport des fluorescences H3k27me3 périnucleaire et nucléaire a été déterminé en mesurant la densité de pixel le long de l'enveloppe nucléaire et du nucléoplasme marqué au DAPI. 2. Résultats Un stress oxydatif mimant un vieillissement accéléré a été induit spécifiquement dans les neurones mésencéphaliques dopaminergiques (mDA) de la substance noire pars compacta (SNpc) en injectant localement une drogue oxydante, la 6-0HDA (6-hydroxydopamine), capturée via les transporteurs à la dopamine (DA) exprimés spécifiquement par les neurones mDA de la SNpc. Des sections de mésencéphale de souris injectés avec la 6-0HDA et 10 de souris contrôle ont été marquées avec des anticorps spécifiques de y-H2AX, H3K27me3 et Tyrosine hydroxylase (TH; un marqueur des neurones dopaminergiques) et analysées en microscopie confocale en fluorescence. Six heures après l'injection de 6-0HDA dans la substance noire pars compacta (SNpc) des souris, on observe une diminution du marquage H3K27m3 15 périnucléolaire et périnucléaire dans les neurones TH+ par rapport aux souris contrôles (Figure 1A). Le triple immunomarquage des sections de mésencéphale par y-H2AX, H3K27me3 et TH montre que la colocalisation de H3K27me3 avec le DAPI observé dans les neurones TH+ des souris contrôle disparaît dans les souris injectées 20 avec la 6-0HDA (Figure 1B). De même, la colocalisation de MeCP2 avec le DAPI observé dans les neurones TH+ des souris contrôle disparaît dans les souris injectées avec la 6-0HDA (Figure 1B). Le pourcentage de neurones TH+ avec un marquage H3K27me3 25 périnucléolaire ou H3K9me3 visible est diminué de façon significative dans les souris injectées avec la 6-0HDA (n = 3, *** p Des sections de mésencéphale de souris En1 + /- âgées de 9 semaines ont été analysées pour le marquage H3K27. La quantification a montré une diminution du pourcentage de neurones TH+ avec un marquage H3K27 périnucléolaire dense par rapport aux souris sauvages (wt) (Figure lE n = 3, * p Nat Neurosci 16, 613-621. 6. Vijg, J., and Suh, Y. (2013). Genome instability and aging. Armu Rev Physiol 75, 645-668. REVENDICATIONS1. Inhibiteur de transcriptase inverse pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une maladie dégénérative. 2. Inhibiteur pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un inhibiteur nucléosidique. 3. Inhibiteur pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite maladie dégénérative est liée au vieillissement ou au stress oxydatif. 4. Inhibiteur pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite maladie dégénérative est une maladie neurodégénérative. 5. Inhibiteur pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la dite maladie dégénérative est sélectionnée dans le groupe constitué par la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie d'Huntington, la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les maladies dégénératives affectant la vue ou l'audition. 6. Inhibiteur pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite maladie affectant la vue est le glaucome.20