Brevet FR3032446A1 — publié le 20160812

PROCEDE D'IMPLANTATION D'AMAS CELLULAIRES DANS UN EXPLANT DE PEAU DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un explant de peau contenant au moins un amas cellulaire, son procédé d'obtention et un kit de mise en oeuvre de ce procédé, ainsi que ses utilisations pour l'identification de composés présentant un effet anti-cancéreux ou pour l'obtention d'échantillons pileux. ART ANTERIEUR Les cellules cultivées en monocouche (2D) acquièrent un phénotype fondamentalement différent de celui des mêmes cellules in vivo. Ce phénomène provient d'une altération d'au moins une des fonctions liées à la prolifération, à la différenciation, à la survie, à l'architecture cellulaire ou encore à la migration cellulaire. Ces modifications induisent chez des cellules cultivées en 2D une sensibilité aux composés thérapeutiques distincte de celle observée chez les mêmes cellules in vivo, rendant ainsi l'identification de nouvelles molécules thérapeutiques particulièrement complexe et incertaine. Pour pallier cet inconvénient, des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle (3D) ont été mis au point dans le but de se rapprocher au plus près des conditions physiologiques rencontrées par les cellules dans l'organisme. Les méthodes 3D actuellement utilisées dérivent principalement de la technique de la goutte suspendue (Foti R, 2011, A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroid, J Vis Exp, 51 : pii 2720), dans laquelle la gravité entraîne une agrégation spontanée des cellules sur le ménisque de la goutte de milieu de culture qui les contient. D'autres techniques bien connues de l'Homme du métier consistent soit à mélanger une suspension cellulaire avec une matrice extracellulaire capable de se solidifier, soit à ensemencer une matrice de polymère avec un mélange cellule/matrice extracellulaire (Lee et al, 2007, Three-dimensional culture model of normal and malignant breast epithelial cells, Nat Methods, 4: 359-365/Fischbach et al, 2007 3032446 2 Engineering tumors with 3D scaffolds, Nat Methods, 4: 855-860). En dépit d'une relative hétérogénéité cellulaire qui résulte de la formation aléatoire de sphéroïdes, ces modèles sont couramment utilisés en cancérologie pour l'identification de composés d'intérêt thérapeutique. Toutefois, de tels modèles ne tiennent pas compte 5 de l'environnement tissulaire existant, particulièrement pertinent dans le cadre de l'étude de cancers de la peau. En 2013, un modèle 3D de mélanome métastatique a été mis au point sur une peau artificielle. Des sphéroïdes de la lignée cancéreuse 451-Lu ont été ajoutés à une coculture de kératinocytes/fibroblastes insérés dans une matrice de collagène de type I. 10 Après 31 jours de culture, l'exposition de ce modèle de culture à des agents anti- cancéreux montre une réponse des cellules 451-Lu différentes de celle observée pour ces mêmes cellules dans un modèle de culture 2D. Néanmoins, l'auteur souligne l'absence des cellules du système immunitaire, des cellules endothéliales et d'autres types cellulaires normalement présentes dans le microenvironnement du mélanome in 15 vivo (Wirsmann et al, 2013, Development of a human 3D organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing, Cell Death and Disease, 4, e719). Il existe par conséquent un réel besoin de mettre au point un modèle plus proche de la peau naturelle. Toutefois, la manipulation des sphéroïdes s'avère délicate pour les raisons suivantes : 20 lors de l'injection d'une solution contenant un ou plusieurs sphéroïdes dans le derme de la peau à l'aide d'une seringue et d'une aiguille, ces derniers peuvent rester coincés dans l'aiguille sans être entraînés par la solution injectée. Une alternative à cela est d'utiliser des systèmes d'injection à déplacement positif où un piston pousse la solution lors de l'injection. La 25 limite de ce système réside toutefois dans le risque d'altérer la structure de ces sphéroïdes, altérant ainsi les cellules qui le composent, lors de l'injection de solution, le derme étant élastique, il gonfle sous la pression de la solution injectée avant de se rétracter et ainsi créer un reflux de la solution, lequel peut entraîner le/les sphéroïde(s) hors du derme, 3032446 3 lorsqu'on injecte une solution contenant un/des sphéroïdes dans le derme de la peau, il est difficile de contrôler, sous l'effet de la pression exercée par la seringue, la dispersion du/des sphéroïdes, lorsqu'on injecte une solution contenant des sphéroïdes dans le derme de 5 la peau, il est nécessaire de mettre en oeuvre un volume conséquent pour entraîner les sphéroïdes hors de l'aiguille. Ceci peut provoquer une dilatation excessive du derme pouvant entrainer une réponse inflammatoire ou bien la rupture de la structure de la peau, - dans le cas de l'injection de sphéroïdes en solution, il est relativement 10 difficile de les aspirer dans l'aiguille et de les y garder sans qu'ils sédimentent d'un côté ou de l'autre de l'aiguille, rendant leur dispersion incontrôlable. De manière surprenante, les inventeurs ont mis au point un procédé in vitro qui permet de pallier tous ces inconvénients. L'enrobage du sphéroïde dans une matrice 15 biologiquement dégradable permet tout à la fois : - de maintenir l'intégrité structurale du sphéroïde et de l'expiant de peau qui l'accueille, de réduire le volume à injecter dans le derme de la peau, - de contrôler le nombre de sphéroïdes injectés, 20 de contrôler la dispersion/répartition des sphéroïdes au sein du derme, - de visualiser précisément le site d'implantation du/des sphéroïdes. Un tel procédé procure un gain de temps en terme de culture, une bonne reproductibilité et offre un choix de matrices biologiquement dégradables propice à chaque type cellulaire. Enfin, le procédé selon l'invention n'induit aucune interférence 25 entre le sphéroïde et le tissu au sein duquel il est implanté, recréant ainsi un microenvironnement comparable à celui de la physiologie. 3032446 4 RESUME DE L'INVENTION La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention d'expiant de peau contenant au moins un amas cellulaire. Les explants de peau utilisés pour cette invention sont issus de peau saine. Les amas cellulaires peuvent contenir des cellules 5 cancéreuses/tumorales ou des cellules de follicules pileux, de glandes sébacées, de glandes sudoripares, de corpuscules sensoriels. Les explants de peaux contenant au moins un amas cellulaire obtenus par le procédé de l'invention constituent des modèles tridimensionnels particulièrement intéressants pour identifier de nouveaux composés à visée thérapeutique. 10 Ainsi, un premier objet de l'invention concerne un procédé in vitro pour implanter des amas cellulaires dans un expiant de peau, ledit procédé comprenant une étape d'implantation d'au moins un amas cellulaire au sein dudit expiant de peau. De préférence, ledit amas cellulaire est enrobé dans une matrice biologiquement dégradable. 15 Le procédé en question peut viser à modéliser une tumeur de la peau, le ou les amas cellulaires implantés sont alors constitués de cellules tumorales. Le procédé selon l'invention peut également viser à obtenir des échantillons pileux, le ou les amas cellulaires implantés sont alors constitués de cellules de follicules pileux. Un autre objet de la présente invention se rapporte à un expiant de peau contenant au 20 moins un amas cellulaire et susceptible d'être obtenu par le procédé décrit précédemment. Encore un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un expiant de peau contenant au moins un amas cellulaire constitué de cellules tumorales pour l'identification de composés présentant un effet anti-cancéreux. 25 Encore un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un expiant de peau contenant au moins un amas cellulaire constitué de cellules de follicules pileux pour l'obtention d'échantillon pileux. 3032446 5 Enfin, un autre objet de l'invention porte sur un kit permettant la mise en oeuvre du procédé de l'invention, ledit kit comprenant des cellules à même de former des amas cellulaires, une matrice biologiquement dégradable, un expiant de peau et éventuellement un dispositif d'implantation. 5 DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 illustre le procédé de marquage/coloration d'un sphéroïde. La figure 2 illustre le procédé d'inclusion d'un sphéroïde dans la matrice biologiquement dégradable. La figure 3 illustre le procédé d'implantation d'un sphéroïde dans l'expiant de peau. 10 La figure 4 montre l'implantation d'un sphéroïde dans un expiant de peau après 24h de culture. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention a pour but de proposer un procédé in vitro reproductible et maitrisé d'implantation d'amas cellulaires dans le derme d'un expiant de peau, lequel procédé 15 offre un nouvel outil de culture organotypique convenant à l'étude de la biologie cutanée. Un premier objet de l'invention concerne un procédé in vitro pour implanter des amas cellulaires, en particulier des sphéroïdes, dans un expiant de peau, ledit procédé comprenant une étape c) d'implantation, au sein dudit expiant de peau, d'au moins un 20 amas cellulaire, en particulier d'au moins un sphéroïde, enrobé de préférence dans une matrice biologiquement dégradable. Par « amas cellulaires », on désigne un ensemble de cellules dont la taille varie de 10 à plusieurs milliers de cellules. Les cellules qui forment cet amas peuvent avoir été préalablement dissociées ou non. Une telle dissociation est généralement obtenue par 25 voie enzymatique selon des méthodes bien connues de l'Homme du métier. Les 3032446 6 cellules qui composent l'amas cellulaire peuvent avoir des contacts et des interactions d'intensité variable qui conduisent à des organisations spatiales distinctes. Ainsi, un amas cellulaire résultant de la dissociation de cellules ne possède pas de structure spatiale organisée à TO, contrairement à un amas cellulaire constitué de cellules 5 préalablement non dissociées. Toutefois, cette structure peut évoluer sous réserve que cet amas cellulaire soit mis en culture pendant plusieurs jours. Le sphéroïde constitue une organisation spatiale particulière des amas cellulaires. Par « sphéroïde », on désigne un ensemble de cellules organisées en multicouches concentriques et possédant une structure géométrique en forme de sphère. Les 10 sphéroïdes se distinguent des agrégats de cellules qui constituent des structures cellulaires facilement dissociables (en raison de l'absence de liaisons cellules-cellules ou cellules-matrice). Par ailleurs, de tels agrégats sont dépourvus de structure sphérique. En lien avec la définition d'un sphéroïde, on pourra se reporter aux différentes revues sur le sujet (Kunz-Schuhghart et al, 1998, Multicellular spheroids : A 15 three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology, Int. J. Exp. Path. 79, 1-23 / Lin et al, 2008, Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research, Biotechnol. J. 3, 1172-1184 / Hirschhaeuser et al, 2010, Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again, Journal of Biotechnology 148, 3-15). 20 Le diamètre des sphéroïdes utilisés dans le procédé selon la présente invention varie de 100 à 1000 gm, en particulier de 300 à 600 gm, et plus particulièrement ont un diamètre d'au moins 500 gm. Par « implantation », on entend l'introduction d'un amas cellulaire, en particulier un sphéroïde, dans le derme d'un expiant de peau. Cette introduction se caractérise par 25 une insertion de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde, directement dans la structure du derme. L'introduction de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde, dans le derme s'effectue à l'aide d'un dispositif d'implantation, notamment une aiguille creuse, biseautée ou non, ou de tout autre dispositif mécanique équivalent connu de l'Homme du métier. Dans les heures qui suivent l'insertion de l'amas 3032446 7 cellulaire, en particulier du sphéroïde, dans le derme, ce site d'insertion devient un site d'ancrage pour l'amas cellulaire, en particulier le sphéroïde, dans le derme. Par « derme », on désigne le tissu sous-jacent de l'épiderme qui contient des réseaux vasculaires et nerveux denses ainsi que des annexes kératinisées prolongeant 5 l'épiderme, ce tissu inclut également les follicules pileux, les glandes sébacées et les glandes sudoripares. Le derme est subdivisé en deux parties qui diffèrent par la composition et l'organisation de leur matrice extracellulaire respective. Le derme papillaire se trouve directement sous l'épiderme. Il s'agit d'un tissu conjonctif lâche constitué de fines 10 fibrilles de collagène de type I et III et des fibres élastiques qui sont orientées perpendiculairement à l'épiderme formant ainsi des structures en forme de chandelles. Le derme réticulaire, placée sous le derme papillaire, est également un tissu conjonctif composé d'un entrecroisement de faisceaux de grosses fibres de collagène et de fibres élastiques qui présentent une orientation préférentiellement 15 parallèle à la surface de la peau. Le derme réticulaire contient moins de collagène de type III que le derme papillaire. Par « expiant de peau », on désigne un fragment ou une biopsie de peau qui comprend au moins l'épiderme, le derme et les annexes épidermiques. Ce fragment ou biopsie de peau pourra comprendre également une partie du tissu sous-cutané encore appelé 20 hypoderme. De préférence, ledit fragment ou biopsie de peau est prélevé chez un mammifère, en particulier chez l'humain ou chez le porc. Dans le but d'assurer sa survie in vitro, le prélèvement doit avoir été réalisé dans un délai de 1h à moins de 72h, de préférence de 1h à moins de 48h avant l'implantation de l'amas cellulaire, en particulier du 25 sphéroïde. Les techniques de prélèvement d'expiant de peau sont bien connues de l'Homme du métier. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé in vitro selon l'invention comprend, préalablement à l'étape c), une étape b) d'enrobage dudit au moins un 3032446 8 amas cellulaire, en particulier dudit au moins un sphéroïde dans une matrice biologiquement dégradable. Par « matrice biologiquement dégradable », on désigne un ensemble de molécules à même de former une enveloppe autour d'un amas cellulaire, en particulier d'un 5 sphéroïde, notamment par polymérisation, et naturellement dégradées par les constituants du derme. Cette dégradation intervient dans les heures qui suivent l'implantation de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde dans l'expiant de peau, permettant ainsi l'interaction directe de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde avec l'expiant de peau. La matrice biologiquement dégradable a pour but de permettre 10 l'implantation de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde, dans l'expiant de peau mais doit disparaitre rapidement pour ne pas interférer dans les interactions expiant de peau / cellules implantées. Parmi les matrices biologiquement dégradables envisageables, l'Homme du métier au regard de ses connaissances générales choisira celle la plus adaptée au type cellulaire formant l'amas cellulaire, en particulier le sphéroïde. 15 Selon un mode de réalisation particulier, la matrice biologiquement dégradable est choisie dans le groupe comprenant ou consistant en la gélatine, les collagènes (en particulier les collagènes de type I, III, IV ou V), les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes de la matrice extracellulaire, l'élastine, une matrice synthétique biocompatible ou leur mélange. 20 Par «enrobage », on désigne l'action qui consiste à inclure/introduire/insérer l'amas cellulaire, en particulier le sphéroïde, dans la matrice biologiquement dégradable, laquelle se trouve de préférence en légère surfusion. La température de la matrice biologiquement dégradable doit permettre le maintien en vie des cellules de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde et ainsi ne doit pas dépasser 37°C au moment de 25 l'enrobage. Par ailleurs, la matrice biologiquement dégradable doit posséder une température de solidification à température ambiante (i.e. de 15°C à 25°C). De préférence, la matrice biologiquement dégradable sera la gélatine. L'origine de cette gélatine est animale, en particulier de boeuf ou de porc. 3032446 9 Plus spécifiquement encore, on utilisera une gélatine sous la forme d'une solution aqueuse dont la concentration en gélatine varie de 120 à 300 mg/ml, en particulier 150 mg/ml. Il est préférable que la viscosité de la matrice biologiquement dégradable varie de 15 à 5 250 mPa.s à 35°C. Une telle viscosité est nécessaire pour permettre une solidification de la matrice à température ambiante sans altérer la structure de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde, tout en conférant une fermeté suffisante pour permettre son expulsion de l'aiguille. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend, en 10 préalable à l'étape c) et à l'étape b), une étape a) de coloration dudit au moins un amas cellulaire, en particulier dudit au moins un sphéroïde. Par « coloration », on désigne une étape de marquage de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde, qui vise à le rendre apparent en lumière visible ou invisible en utilisant une sonde. Le but de cette étape de coloration est de pouvoir visualiser le ou 15 les amas cellulaires, en particulier le ou les sphéroïdes à implanter. Ceci est notamment réalisable par inclusion de pigments provenant de colorants naturels ou artificiels (cas des sondes colorantes). Il est également envisageable de colorer l'amas cellulaire avec une sonde fluorescente, notamment un fluorophore ou un fluorochrome. Dans ce cas, la détection de l'amas cellulaire est opérée sous émission 20 de fluorescence. En particulier, l'étape de coloration utilise une sonde colorante choisie dans le groupe comprenant ou consistant en le bleu de méthylène, le vert méthyle, le vert malachite, l'amido black, le cristal violet, le rouge neutre ou le bleu de Coomasie. Encore plus particulièrement, l'étape de coloration utilise une sonde fluorescente 25 choisie dans le groupe comprenant ou consistant en les carbocyanines lipophiliques Dil (DiIC18(3)), DiO (DiOC18(3)), DiD (Di1C18(5)) et DiR (Di1C18(7)), le NUCLEAR-IDTM, le CELL-MASKTM ou le CELL-TRACKERTM, ou des nanoparticules (Quantum dots ou nanoparticules d'or). 3032446 10 Cette étape de coloration peut également être réalisée avec tout autre type de sonde, de préférence une sonde biocompatible, c'est-à-dire une sonde qui n'induise pas de mort cellulaire au sein de l'amas cellulaire. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend en 5 outre une étape d) de mise en culture de l'expiant de peau après implantation dudit au moins un amas cellulaire, en particulier dudit au moins un sphéroïde à l'issu de l'étape c), de préférence jusqu'à dégradation de la matrice biologiquement dégradable. Une telle étape de mise en culture peut être réalisée selon les techniques classiques de culture d'explants de peau bien connues de l'Homme du métier. A titre d'exemple, de 10 telles méthodes sont explicitées dans la demande internationale WO 2013/164436. Par « mise en culture », on désigne la maintenance de l'état physiologique et morphologique de l'expiant de peau et de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde, qui y est implanté, c'est-à-dire de l'intégralité des cellules qui les composent. La durée de mise en culture varie en fonction de la nature de la matrice 15 biologiquement dégradable, et en particulier de la vitesse à laquelle elle est dégradée par les enzymes situées dans le derme de l'expiant de peau. Par « dégradation de la matrice biologiquement dégradable », on désigne la digestion de tout ou partie de la matrice biologiquement dégradable par les enzymes présentes dans le derme de l'explant de peau. Ces enzymes sont notamment des collagénases 20 synthétisées par les fibroblastes du derme ou des protéases contenues dans les granules des mastocytes du derme. La digestion de la matrice biologiquement dégradable conduit à l'obtention de peptides ou d'acides aminés qui sont rapidement éliminés. De préférence, la dégradation de la matrice biologiquement dégradable permet un 25 contact de l'amas cellulaire, en particulier du sphéroïde, et de ses cellules avec le derme. Avantageusement, cette dégradation est totale. Selon un autre mode de réalisation, la dégradation de la matrice biologiquement dégradable peut être partielle en ce sens qu'il subsiste une fine couche de matrice 3032446 11 biologiquement dégradable entre l'amas cellulaire et les cellules du derme. Cette interface matricielle permet toutefois une diffusion correcte des métabolites et des composés entre le derme et l'amas cellulaire. La durée de mise en culture de l'expiant pourra également varier en fonction de la 5 nature des cellules de l'amas cellulaire. Ainsi, dans le cas d'amas cellulaires comprenant des cellules à forte capacité multiplicative, la durée de culture de l'expiant de peau ne devra pas excéder celle du grossissement de l'amas cellulaire qui pourrait altérer l'intégrité tissulaire de l'expiant. Inversement, dans le cas de cellules à croissance lente ou pour lesquelles une différenciation est nécessaire, la durée de 10 culture de l'expiant de peau pourra dépasser plusieurs jours. Dans le procédé selon l'invention, ledit expiant de peau est une biopsie de peau saine. La biopsie peut provenir d'une plastie de n'importe quelle partie du corps d'un mammifère, de préférence d'un humain, comme par exemple de l'abdomen, de la poitrine, des fesses, du dos, du cuir chevelu, etc. 15 De préférence, la biopsie de peau est de forme cylindrique. Toutefois, toute autre forme géométrique de biopsie de peau convient également au procédé selon l'invention, en particulier une forme carrée, rectangulaire, ovale, triangulaire, etc.... De préférence, la forme cylindrique possède un diamètre qui varie de 1 mm à 50 mm, 20 plus particulièrement de 5 mm à 20 mm, encore plus particulièrement de 7 mm à 17 mm, et une épaisseur qui varie de 1 mm à 20 mm, plus particulièrement de 2 mm à 15 mm, encore plus particulièrement de 2 mm à 10 mm, et encore plus particulièrement de 2 mm à 5 mm. 25 Selon un mode de réalisation particulier, ledit au moins un amas cellulaire utilisé dans le procédé selon l'invention est constitué de cellules tumorales et il vise à modéliser une tumeur de la peau. 3032446 12 Par « cellules tumorales », on désigne des cellules possédant un dysfonctionnement au niveau du cycle cellulaire qui entraine une hyperprolifération cellulaire. Ce dysfonctionnement est généralement dû à une altération génétique somatique d'un oncogène, d'un gène suppresseur de tumeur ou d'un gène impliqué dans la réparation 5 de l'ADN. Par « tumeur de la peau », on désigne une masse constituée de cellules cancéreuses, également et indifféremment appelées cellules tumorales. La gravité des tumeurs de la peau réside dans le fait que pour la plupart d'entre elles, les cellules qui les forment peuvent se propager vers d'autres parties du corps pour y former des métastases. Les 10 tumeurs malignes de la peau se répartissent en deux familles principales : les carcinomes et les mélanomes. Les carcinomes cutanés se développent en général sur les parties du corps souvent exposées au soleil comme le visage, le cou, les épaules, les avant-bras ou le dos des mains. Ils surviennent en général après 50 ans et évoluent lentement. Ils sont très 15 fréquents, mais facilement guérissables dans la majorité des cas. Les principaux types de carcinomes sont les carcinomes basocellulaires et les carcinomes épidermoïdes cutanés (également appelés carcinomes spinocellulaires). Le mélanome cutané représente une minorité des cancers de la peau mais constitue le plus grave d'entre eux. Il survient à tout âge chez les adultes et est très rare chez 20 l'enfant. Le mélanome apparaît sur n'importe quelle partie du corps, le plus souvent sur le tronc chez l'homme et sur les jambes chez la femme. Son apparition est également liée à l'exposition au soleil. Il peut évoluer rapidement et se propager. Le mélanome se manifeste soit par l'apparition d'une tâche pigmentée sur la peau saine qui ressemble à un naevus, soit par la modification de couleur et de forme d'un naevus 25 préexistant. Les principaux types de mélanomes de la peau sont : le mélanome superficiel extensif, le mélanome nodulaire, le mélanome de Dubreuilh et le mélanome acro-lentigineux. 3032446 13 Selon un mode de réalisation plus particulier, les cellules tumorales constituant l'amas cellulaire utilisé dans le procédé selon l'invention sont des cellules de mélanomes ou de carcinomes (e.g. baso- ou spinocellulaire). Selon un autre mode de réalisation, les cellules constitutives de l'amas cellulaire utilisé 5 dans le procédé de l'invention sont issues d'une pathologie cutanée autre qu'un cancer, en particulier ces cellules sont issues de pathologies inflammatoires de la peau telles qu'une plaque de psoriasis, une lésion d'eczéma, ou une dermatite atopique. En particulier, dans le cadre de pathologies inflammatoires cutanées, les cellules constitutives de l'amas cellulaire sont des cellules de types fibroblastiques, des 10 kératynocytes, des cellules endothéliales ou des cellules nerveuses. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention vise à identifier des composés présentant un effet anti-cancéreux et il comprend en outre les étapes de : e) Mise en contact d'au moins un composé avec un expiant de peau à l'issue de l'étape d), 15 f) Mise en culture du mélange issu de l'étape e), et g) Identification des composés présentant un effet anti-cancéreux à l'issue de l'étape f). Par « effet anti-cancéreux », on désigne la capacité d'un composé à interagir avec le cycle cellulaire des cellules tumorales de l'amas cellulaire. La mesure du taux de survie 20 ou du niveau de prolifération des cellules tumorales de l'amas cellulaire implanté dans l'explant de peau constitue un bon indicateur de l'effet anti-cancéreux d'un composé. L'effet anti-cancéreux peut être évalué relativement à un composé contrôle ou témoin mis en contact avec un expiant de peau tel qu'obtenu par le procédé in vitro selon l'invention et ne possédant pas d'effet anti-cancéreux, ou relativement à un expiant de 25 peau tel qu'obtenu par le procédé selon l'invention qui n'est mis au contact d'aucun composé. Les techniques de mesure d'apoptose, du taux de nécrose ou la détermination des différentes phases du cycle cellulaire sont bien connues de l'Homme du métier. 3032446 14 De préférence, à l'issue de l'étape f) du procédé selon l'invention, on procédera à la sélection des composés qui sont associés à un taux de cellules mortes ou ne proliférant plus au sein de l'amas cellulaire d'au moins 10%, particulièrement d'au moins 30%, plus particulièrement d'au moins 50%, encore plus particulièrement d'au moins 90%. 5 Avantageusement, les composés sélectionnés sont ceux n'induisant pas ou peu de mort cellulaire parmi les cellules de l'expiant de peau, autre que celles de l'amas cellulaire. Par « n'induisant pas de mort cellulaire », on entend un taux de mort cellulaire qui soit au maximum supérieur à 10% à celui observé en l'absence du composé, de préférence au maximum supérieur à 5% et, de manière particulièrement 10 préféré au maximum supérieur à 2%. Par « composé », on désigne des composés chimiques ou des vecteurs d'expression qui peuvent provenir de banques, notamment à visée de criblage, ou de composés nouvellement synthétisés. Des vecteurs d'expression contenant un acide nucléique d'intérêt pourront notamment être utilisés dans la perspective de modifier le niveau 15 d'expression d'un gène cible des cellules de l'amas cellulaire. Les composés identifiés par le procédé de l'invention peuvent, dans une étape ultérieure, être testés sur des modèles animaux de pathologies cutanées, ceci afin de vérifier leur efficacité in vivo. Un avantage des explants de l'invention est de pouvoir analyser simultanément l'effet 20 des composés sur les cellules de l'amas cellulaire et sur les cellules du derme et de l'épiderme de l'expiant de peau. Ceci permet de discriminer les composés possédant à la fois un effet anti-cancéreux sur les cellules tumorales de l'amas cellulaire et un effet toxique sur les cellules du derme et de l'épiderme, des composés possédant un effet anti-cancéreux sur les cellules tumorales de l'amas cellulaire et qui sont non toxiques 25 pour les cellules du derme et de l'épiderme. En d'autres termes, la mesure de l'efficacité des composés vis-à-vis des cellules tumorales (amas cellulaire) et la mesure de leur innocuité vis-à-vis des cellules saines (expiant de peau) peuvent être réalisées au cours d'une même expérience, de manière synchrone. Ainsi, l'identification des 3032446 15 composés anti-cancéreux et non toxiques est réalisée en un seul criblage, engendrant ainsi un gain de temps considérable et une réduction des coûts. Selon un autre mode de réalisation particulier, ledit au moins un amas cellulaire utilisé dans le procédé de l'invention est constitué de cellules de follicule pileux, de glandes 5 sébacées, de glandes sudoripares ou de corpuscules sensoriels et il vise à l'obtention d'échantillons pileux. Par « obtention d'échantillons pileux », on désigne l'organisation de cellules en plusieurs couches distinctes et identifiables de sorte à recréer une structure similaire à celle d'un follicule pileux naturel. Ainsi, les échantillons pileux obtenus selon le 10 procédé in vitro de l'invention possèdent une densité de follicules pileux pouvant varier de 1 à plusieurs dizaines par expiant de peau. Selon un autre mode de réalisation plus particulier, les cellules de follicules pileux constituant l'amas cellulaire utilisé sont choisies dans le groupe comprenant ou consistant en les cellules dermiques de la papille, les cellules progénitrices de la 15 matrice, les cellules souches du bulbe ou leur mélange. Ces différents types cellulaires sont à l'origine de la morphogénèse in vitro de nouveaux follicules pileux. Tout comme les follicules pileux naturels, leur structure comprend une papille dermique, une gaine épithéliale interne et externe, un muscle horripilateur, une glande sébacée et une tige pilaire. 20 Un autre objet de l'invention concerne un expiant de peau contenant au moins un amas cellulaire susceptible d'être obtenu par le procédé décrit précédemment. Plus particulièrement, ledit au moins un amas cellulaire implanté dans l'expiant de peau est constitué de cellules tumorales. Encore plus particulièrement, ledit au moins amas cellulaire implanté dans l'expiant de 25 peau est constitué de cellules de follicules pileux. 3032446 16 Encore un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un expiant de peau contenant au moins un amas cellulaire susceptible d'être obtenu par le procédé décrit précédemment pour l'identification des composés présentant un effet anti-cancéreux. Les composés identifiés selon cette utilisation de l'invention peuvent servir de base à 5 l'élaboration de traitements thérapeutiques pour un patient souffrant de cancer cutané. Une telle utilisation selon l'invention permet d'envisager une thérapie personnalisable d'un patient à l'autre en fonction de l'intensité de l'effet anticancéreux des différents composés testés sur les cellules des amas cellulaires. Selon un autre mode de réalisation, un expiant de peau contenant au moins un amas 10 cellulaire susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention pourra être utilisé pour l'obtention d'échantillons pileux. De tels échantillons pileux peuvent notamment être réimplantés sur le cuir chevelu de patients atteints d'alopécie ou qui ont subit un traitement radio-ou chimiothérapeutique. 15 Encore un autre objet de l'invention concerne un kit de mise en oeuvre du procédé in vitro selon l'invention, ledit kit comprenant des cellules à même de former un amas cellulaire, une matrice biologiquement dégradable, un expiant de peau, et, éventuellement, un dispositif d'implantation d'un amas cellulaire. Dans un kit selon l'invention, les cellules à même de former un amas cellulaire sont des 20 cellules tumorales ou des cellules issues de follicules pileux. Dans un kit selon l'invention, la matrice biologiquement dégradable est choisie dans le groupe comprenant ou consistant en la gélatine, le collagène de type I, III, IV ou V, les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes de la matrice extracellulaire, l'élastine, une matrice synthétique biocompatible ou leur mélange. 25 Dans un kit selon l'invention, un expiant de peau est une biopsie de peau saine. Dans un kit selon l'invention, le dispositif d'implantation est une aiguille de format 14G à 29G, en particulier de 17G à 25G, plus particulièrement de 16G à 23G, montée sur 3032446 17 une seringue un capillaire, une tige creuse, un trocart ou tout autre dispositif mécanique susceptible de remplir les mêmes fonction qu'une aiguille à savoir le passage d'une matrice biologiquement dégradable et d'un amas cellulaire, la polymérisation de ladite matrice biologiquement dégradable autour de l'amas 5 cellulaire puis leur éjection dans un expiant de peau. Le dispositif d'implantation pourra être pourvu ou non d'une extrémité biseautée dans le but de faciliter l'implantation du sphéroïde dans l'expiant de peau. Les exemples suivants sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de la présente invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. 10 EXEMPLES 1 - Préparation du sphéroïde 1.1 - Culture de sphéroïdes Les sphéroïdes de cellules adhérentes sont obtenus par culture sur un support 15 empêchant l'adhérence des cellules. Les interactions cellules-cellules étant ainsi favorisées, les cellules s'agrègent et forment une structure 3D solide. La technique de culture en plaque 96 puits est décrite ci-après. La surface des puits de plaques de culture 96 puits est traitée avec un hydrogel n'ayant pas d'affinités avec les cellules (ex : Poly-HEMA) au moins 24h à l'avance. Les cellules 20 d'une culture monocouche sont décollées de leur support à l'aide de trypsine afin d'obtenir une suspension cellulaire. Les cellules sont ensuite comptées pour déterminer la concentration cellulaire de la suspension. 100 gL de suspension cellulaire contenant de 500 à 5000 cellules sont ensemencées par puits de plaques 96 puits pré-traitées avec l'hydrogel précité. Les plaques 96 puits sont centrifugées 6 min 25 à 190 g. Le rassemblement des cellules au centre des puits est vérifié sous microscope optique et les plaques 96 puits contenant les cellules sont incubées à 37°C, en présence de 5% de CO2 sous atmosphère humide. 3032446 18 Les sphéroïdes se forment et sont manipulables après 24 à 48h selon les cellules testées. Leur milieu de culture est renouvelé tous les trois jours et leur diamètre est mesuré sous un microscope inversé jusqu'à ce qu'ils atteignent le diamètre souhaité. Par exemple, les sphéroïdes HCT116 ensemencés à 2000 cellules à jour JO atteignent 5 un diamètre d'environ 550 lm à J+3. Les sphéroïdes peuvent être produits à partir de lignées commerciales où à partir de cellules primaires issues de tissus normaux ou pathologiques issus d'exérèses : cancers cutanés (mélanome, cancers baso- ou spinocellulaires, autre type de cancers cutanés) plaques de psoriasis, lésion d'eczéma ou de dermatite atopique, ou tout autre type de 10 pathologie cutanée. 1.2 - Marquage / coloration du sphéroïde Le sphéroïde est récupéré de son puits de la plaque 96 puits et transféré dans un tube à fond conique de 1,5 ml de type EPPENDORF (figure 1). Puis le sphéroïde est marqué avec la sonde fluorescente biocompatible souhaitée selon le mode opératoire qui lui 15 est propre. Par exemple, dans le cas du NUCLEAR-IDTM, le sphéroïde est incubé pendant 24h à 37°C dans une solution de NUCLEAR-IDTM à 11..tM dans du milieu de culture. Le sphéroïde est coloré avec un colorant choisi dans le groupe comprenant ou consistant en le bleu de méthylène, le vert méthyle, le vert malachite, l'amido black, le cristal violet, le rouge neutre ou le bleu de Coomasie: 20 - le milieu de culture du sphéroïde est remplacé par la solution de colorant à la concentration préconisée et incubé le temps nécessaire à 37°C. Par exemple, dans le cas du vert malachite, le sphéroïde est incubé pendant 15 min à 37°C dans une solution de vert malachite à 10 mg/mL dans du PBS. - le colorant est éliminé et rincé par bains successifs de PBS autant de fois que 25 nécessaire pour éliminer tout le surplus de colorant. 1.3 - Inclusion dans la gélatine Une solution de gélatine à 150 mg/mL est préparée et chauffée pour la rendre liquide au moins 1h à l'avance, puis sa température est rééquilibrée à 37°C. 1 mL de la 3032446 19 solution de gélatine est prélevé et transféré dans un tube EPPENDORF. Le sphéroïde est pipeté dans un volume minimal de PBS et re-suspendu dans la solution de gélatine. Une aiguille de jauge 16 à 23, plus particulièrement de 16 à 20 et encore plus particulièrement de 18 est montée sur une seringue de 0,5 à 10 mL et plus 5 particulièrement de 0,5 à 5 mL, et encore plus particulièrement de 1 mL. A l'aide de la seringue, la gélatine, caractérisée par une viscosité à 35°C comprise entre 15 et 250 mPa.s est aspirée jusqu'à remplir la totalité du volume de l'aiguille (la gélatine doit commencer à remonter dans le volume mort situé entre l'aiguille et la seringue). Une fois l'aiguille remplie, aspirer le sphéroïde suspendu dans la gélatine afin que celui-ci 10 reste dans les derniers microlitres de l'aiguille. Poser le dispositif seringue / aiguille contenant le sphéroïde à l'horizontale sous le PSM (Poste de Sécurité Microbiologique) et laisser prendre en masse la gélatine à température ambiante pendant minimum 10 minutes (figure 2). 2 - Implantation du sphéroïde 15 L'aiguille est détachée de la seringue. A l'aide d'une pince, l'expiant de peau est maintenu à plat, derme sur le dessus. L'aiguille est introduite dans l'expiant par le côté du derme, jusqu'à ce que le biseau soit entièrement rentré dans le derme. Le biseau de l'aiguille est placé au plus près de l'épiderme. Tout en maintenant l'extrémité de l'aiguille dans l'expiant de peau à l'aide d'une pince, 20 un objet cylindrique stérilisé et dont le diamètre est inférieur au diamètre interne de l'aiguille est introduit dans l'aiguille. La gélatine contenant le sphéroïde est éjectée de l'aiguille en poussant l'objet cylindrique stérilisé à l'intérieur de l'aiguille jusqu'à la vider de tout son contenu. L'aiguille est retirée délicatement de l'expiant de peau (figure 3). 25 3 - Culture ex vivo L'expiant implanté de son sphéroïde est monté sur une matrice liquide coulée dans un insert de culture selon le même procédé que celui utilisé pour le modèle NATIVESKINTm, basé sur l'utilisation d'une matrice naturelle servant de support 3032446 20 physique et de couche nourricière à des expiants de peau ou d'épiderme humains cultivés in vitro. L'expiant est ensuite cultivé en plaque (culture en incubateur, renouvellement quotidien du milieu de culture). L'observation du sphéroïde enrobé a révélé que la gélatine utilisée lors de 5 l'implantation est naturellement et rapidement dégradée par les constituants du derme dans les heures suivant son injection, permettant de ce fait l'interaction directe du sphéroïde avec l'expiant de peau ce qui fait de celui-ci un modèle reproductible et appréciable. 4 - Analyse par histologie 10 4.1 - Coupe sur microtome L'analyse peut se faire sur des échantillons inclus en bloc de paraffine par coupes sériées au microtome. L'expiant de peau dans lequel au moins un sphéroïde est implanté est déhydraté par un bain d'alcool puis passage dans un bain de xylène. Un premier bain dans la 15 paraffine permet de remplacer l'eau prélablement contenue dans l'expiant de peau par la paraffine. Les échantillons imprégnés de paraffine sont sortis de leur bain et transférés dans un récipient dont le fond est tapissé de papier absorbant, afin d'être apportés à proximité de la station d'inclusion . 20 Les échantillons, enfermés dans des cassettes d'histologie, sont plongés dans la paraffine liquide à 56°C pour faire refondre la paraffine qui les imprègne. Pour chaque échantillon : la cassette d'histologie est ouverte, l'échantillon est éventuellement coupé en deux. Un moule d'inclusion est rempli de paraffine liquide, et l'échantillon (ou les 2 morceaux d'échantillon) est placé dans le moule et orienté 25 dans le sens désiré pour la coupe. Le moule est en même temps transféré sur un support réfrigéré afin de solidifier la paraffine du fond du moule et d'y maintenir l'échantillon. Le couvercle de la cassette d'histologie sur lequel figure la référence de 3032446 21 l'échantillon est placé par-dessus, de telle façon que la paraffine le traverse (possibilité d'ajouter de la paraffine si besoin), puis le tout est placé au froid (réfrigérateur, freezer, chambre froide...) plusieurs minutes (5-6), afin de solidifier la paraffine en bloc, emprisonnant l'échantillon dans la bonne orientation et le couvercle de la 5 cassette d'histologie qui deviendra le support du bloc. Une fois le bloc bien solide, celui-ci est démoulé. L'excès de paraffine est éventuellement gratté à l'aide d'une spatule sur les côtés du couvercle de la cassette d'inclusion. Des coupes sériées d'épaisseur variant de 4 à 5 pm sont alors réalisées sur toute la 10 longueur du bloc de paraffine contenant l'échantillon. La figure 4 illustre les résultats d'une telle coloration réalisée sur un expiant de peau implanté avec un sphéroïde après 1 jour de culture. L'analyse du modèle par histologie (ex : coloration Hématoxyline et Eosine) permet d'attester de la présence d'un sphéroïde dans le derme de la biopsie de peau, d'observer sa structure et de suivre 15 son évolution au cours de la culture. 4.2 - Cryosection L'analyse peut également se faire sur coupe congelée afin de ne pas altérer la fluorescence des cellules / du(es) sphéroïde(s) à la déshydratation. La culture de l'expiant de peau dans lequel au moins un sphéroïde est implanté est 20 arrêtée en fixant l'échantillon 24h dans 10 fois son volume de formaline 10%. L'expiant est ensuite rincé dans 10 fois son volume de PBS, épongé sur un papier absorbant et transféré dans un tube EPPENDORF. Le tube EPPENDORF est plongé dans l'azote liquide jusqu'à la congélation de l'expiant. Dans l'enceinte du cryostat, l'expiant congelé est inclus en OCT puis des tranches 25 d'épaisseur constante de 3 à 15 1..tm de la partie de l'expiant contenant le/le(s) sphéroïde(s) implanté(s) sont réalisées. Les tranches sont déposées sur lames qui sont séchées pendant quelques heures au minimum. 3032446 22 Une coloration classique à l'Hématoxyline et Eosine est réalisée. REVENDICATIONS1. Un procédé in vitro pour implanter des amas cellulaires dans un expiant de peau, ledit procédé comprenant une étape c) d'implantation, au sein dudit expiant de peau, d'au moins un amas cellulaire, en particulier d'au moins un sphéroïde, enrobé de préférence d'une matrice biologiquement dégradable. 2. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend préalablement à l'étape c), une étape b) d'enrobage dudit au moins un amas cellulaire dans une matrice biologiquement dégradable. 3. Le procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la matrice biologiquement dégradable est choisie dans le groupe comprenant ou consistant en la gélatine, les collagènes, les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes de la matrice extracellulaire, l'élastine, une matrice synthétique biocompatible ou leur mélange, de préférence la matrice biologiquement dégradable est la gélatine. 4. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend, en préalable à l'étape c), et éventuellement de l'étape b), une étape a) de coloration dudit au moins un amas cellulaire, laquelle étape de coloration utilise un colorant choisi dans le groupe comprenant ou consistant en une sonde colorante ou une sonde fluorescente. 5. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d) de mise en culture de l'expiant après implantation dudit au moins un amas cellulaire au terme de l'étape c), et ceci de préférence jusqu'à dégradation de la matrice biologiquement dégradable. 3032446 24 6. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit au moins un amas cellulaire est constitué de cellules tumorales et en ce qu'il vise à modéliser une tumeur de la peau. 7. Le procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il vise à identifier des composés présentant un effet anti-cancéreux et en ce qu'il comprend en outre les étapes de : e) Mise en contact d'au moins un composé avec un expiant à l'issue de l'étape d), f) Mise en culture du mélange issu de l'étape e), et g) Identification des composés présentant un effet anti-cancéreux à l'issu de l'étape f) . 8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit au moins amas cellulaire est constitué de cellules de follicules pileux, de glandes sébacées, de glandes sudoripares ou de corpuscules sensoriels et en ce qu'il vise à l'obtention d'échantillon pileux. 9. Un expiant contenant au moins un amas cellulaire susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10. L'expiant selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit au moins un amas cellulaire est constitué de cellules tumorales ou de cellules de follicule pileux de glandes sébacées, de glandes sudoripares ou de corpuscules sensoriels. 11. Utilisation de l'expiant selon la revendication 10 implanté d'au moins un amas cellulaire constitué de cellules tumorales ou de cellules de follicule pileux, de glandes sébacées, de glandes sudoripares ou de corpuscules sensoriels pour l'identification de composés présentant un effet anti-cancéreux ou pour l'obtention d'échantillon pileux respectivement. 3032446 25 12. Un kit de mise en oeuvre du procède selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 comprenant des cellules à même de former un amas cellulaire, une matrice biologiquement dégradable, un expiant de peau et, éventuellement, un dispositif d'implantation d'un amas cellulaire.