Brevet FR3031113A1 — publié le 20160701

La présente invention concerne un procédé de production d'au moins un produit d'intérêt à partir d'insectes. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de production de chitine et/ou de chitosan par hydrolyse enzymatique de cuticules d'insectes. Selon l'invention, par « chitine », on entend tout type de dérivé chitinique, c'est- à-dire de dérivé de polysaccharides comportant des unités N-acétyl-glucosamine et des unités D-glucosamines, en particulier les copolymères chitine-polypeptides (parfois désignés sous l'appellation « composite chitine-polypeptides »). La chitine serait le deuxième polymère le plus synthétisé dans le monde vivant après la cellulose. En effet, la chitine est synthétisée par de nombreuses espèces du monde vivant: elle constitue en partie l'exosquelette des crustacés et des insectes et la paroi latérale qui entoure et protège les champignons. Plus particulièrement, chez les insectes, la chitine constitue ainsi 3 à 60% de leur exosquelette. Par « chitosan », on entend selon la présente invention les produits de désacétylation de la chitine. La limite usuelle entre le chitosan et la chitine est déterminée par le degré d'acétylation : un composé ayant un degré d'acétylation inférieur à 50% est nommé chitosan, au-delà, un composé ayant un degré d'acétylation supérieur à 50% est nommé chitine. Les applications de la chitine et/ou du chitosan sont nombreuses: cosmétique (composition cosmétique), médicale et pharmaceutique (composition pharmaceutique, traitement des brûlures, biomatériaux, pansements cornéens, fils chirurgicaux), diététique et alimentaire, technique (agent filtrant, texturant, floculant ou adsorbant notamment pour la filtration et dépollution de l'eau), etc. En effet, la chitine et /ou le chitosan sont des matériaux biocompatibles, biodégradables et non toxiques. L'extraction traditionnelle de la chitine s'effectue par voie chimique à partir de crustacés, de céphalopodes, mais aussi, de manière plus exceptionnelle, de champignons. Cette voie emploie de grandes quantités de réactifs (tel que l'acide chlorhydrique, l'hydroxyde de sodium et des agents de blanchiment) qui ont pour effet de dénaturer la structure de la chitine telle qu'elle existe à l'état naturel, par exemple telle que présente dans la carapace des crustacés. En outre, la plupart des réactifs chimiques sont nocifs pour l'homme et l'environnement et génèrent d'importants 3031113 2 volumes d'effluents à traiter. Enfin, la chitine et/ou le chitosan issu(s) de crustacés peuvent générer des réactions allergiques chez les personnes sensibles. Une autre voie d'extraction de la chitine est la voie enzymatique. Cette voie est considérée comme plus douce, permettant ainsi de mieux préserver la chitine et/ou 5 le chitosan. Toutefois, la chitine obtenue par cette voie est d'une couleur brunâtre, nécessitant des étapes de purification afin d'obtenir une poudre valorisable, c'est-à-dire de couleur blanche. Les procédés existants comportent donc généralement une ou plusieurs étape(s) visant à débarrasser la chitine de ses impuretés, telle qu'une étape de déminéralisation à l'acide réalisée préalablement à l'hydrolyse enzymatique et/ou 10 une étape de blanchiment de la chitine avec un agent oxydant, réalisée de manière subséquente à l'hydrolyse enzymatique. Ces deux étapes de purification de la chitine ont malheureusement pour effet d'altérer la structure chimique de la chitine. Le travail des inventeurs a permis de mettre en évidence qu'il était possible d'obtenir une chitine à la fois plus pure et de structure plus proche de la structure 15 originelle de la chitine en effectuant une étape de traitement mécanique préalable à l'hydrolyse, à savoir une étape de pressage des cuticules d'insectes. L'invention concerne donc un procédé de production d'au moins un produit d'intérêt à partir d'insectes, comportant les étapes suivantes : (i) le pressage des cuticules d'insectes, puis, 20 (ii) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolytique. Par « produit d'intérêt », on entend plus particulièrement la chitine et/ou le chitosan et/ou un hydrolysat. Par « hydrolysat », on désigne un produit qui comporte des protéines, des protéines hydrolysées, des peptides, des acides aminés et/ou d'autres composés 25 dérivés d'une protéine, susceptibles d'être obtenus par hydrolyse enzymatique de protéines. Le ou les produit(s) d'intérêt sont obtenus à partir d'insectes. Par « insectes », on entend des insectes à n'importe quel stade de développement, tel qu'un stade adulte, larvaire ou un stade de nymphe. De préférence, les insectes mis en oeuvre 30 dans le procédé selon l'invention sont comestibles. Plus particulièrement, les insectes peuvent être choisis parmi le groupe constitué par les coléoptères, les diptères, les lépidoptères, les isoptères, les orthoptères, les hyménoptères, les blattoptères, les hémyptères, les hétéroptères, les éphéméroptères et les mécoptères, de préférence, parmi les coléoptères, 35 les diptères, les orthoptères et les lépidoptères. 3031113 3 Préférentiellement, les insectes sont choisis parmi le groupe constitué par Tenebrio molitor, Hermetia illucens, Galleria mellonella, Alphitobius diaperinus, Zophobas morio, Blattera fusca, Musca domestica, Chrysomya megacephala, Locusta migratoria, Schistocerca gregaria, Acheta domestica et Samia ricini, et plus 5 préférentiellement encore, T molitor. Une ou plusieurs espèces d'insectes peuvent être utilisées dans le procédé selon l'invention, de préférence une seule espèce d'insecte. Si plusieurs espèces sont utilisées, on choisira avantageusement deux espèces proches telles que par exemple, Hermetia illucens et Musca domestica. 10 Les insectes sont de préférence élevés et non prélevés dans la nature. Par exemple, les insectes sont élevés dans une ferme d'insectes. L'élevage des insectes dans une ferme spécifique permet non seulement de contrôler et d'éliminer les risques associés aux maladies véhiculées par des insectes, mais également de limiter les risques associés à la toxicité des produits alimentaires dérivés des 15 insectes due par exemple à la présence d'insecticides. En outre, l'élevage permet de contrôler la qualité de l'approvisionnement en insectes et de limiter les coûts d'approvisionnement. Par « cuticules d'insectes », on vise non seulement les cuticules une fois celles- ci séparées des insectes, mais également les cuticules incluant tout ou partie des 20 autres constituants de l'insecte, y compris l'insecte dans son intégralité. En effet, il est possible d'appliquer le procédé selon l'invention à l'insecte complet, tels que des insectes broyés, ou bien à seulement une partie des insectes comportant les cuticules, par exemple les exuvies et/ou les mues d'insectes, séparées naturellement et collectées par un procédé adéquat. 25 La cuticule est la couche externe (ou exosquelette) sécrétée par l'épiderme des insectes. Elle est en général formée de trois couches : l'épicuticule, qui est la couche la plus fine et la plus externe de la cuticule (inférieure à 4 lm) ; cette couche est imperméable à l'eau et comporte une couche de cire imperméabilisante, ainsi que des protéines et de la chitine, en 30 quantité moindre ; l'exocuticule, qui est la couche intermédiaire de la cuticule ; elle est composée essentiellement de protéines durcies, les tannées, qui sont responsables de la rigidité de la cuticule, de chitine et éventuellement de mélanine ; et l'endocuticule, qui est une couche fine, flexible, constituée d'un mélange 35 de protéines et de chitine. 3031113 4 Le pressage des cuticules d'insectes a pour objectif principal d'éliminer un jus de presse riche en matière grasse et/ou d'enrichir le gâteau de presse en substrat pour l'hydrolyse. Dans le procédé selon l'invention, le pressage des cuticules d'insectes permet 5 d'obtenir un gâteau de presse comportant une teneur en huile inférieure ou égale à 20%, préférentiellement, inférieure ou égale à 15%, plus préférentiellement, inférieure ou égale à 12%, encore plus préférentiellement, inférieure ou égale à 10%. Dans la présente demande, les gammes de valeurs s'entendent bornes incluses. De même, lorsqu' « environ » ou « de l'ordre de » précède un nombre, cela 10 équivaut à plus ou moins 10% de la valeur de ce nombre. Par ailleurs, afin d'enrichir le gâteau de presse en substrat pour l'hydrolyse, le pressage des cuticules d'insectes permet d'obtenir un gâteau de presse présentant une teneur en matière sèche comprise entre 30% et 60%, préférentiellement, comprise entre 40% et 55%, et plus préférentiellement comprise entre 45% et 50%. 15 Tout système de presse peut être utilisé pour réaliser le pressage des cuticules d'insectes, tel que par exemple, une presse mono-vis ou bi-vis (presse bi-vis de type Angel), un filtre-presse (filtre-presse de type Choquenet), une presse à plateaux, etc. Ces systèmes sont bien connus de l'homme du métier qui est à même de déterminer les conditions de pressage afin d'obtenir les teneurs en huile et/ou en eau mentionnées 20 ci-avant. Dans le procédé selon l'invention, le pressage des cuticules d'insectes est suivi d'une hydrolyse enzymatique. De préférence, l'hydrolyse enzymatique est effectuée par au moins une enzyme protéolytique, de préférence une protéase. Dans la présente demande, les noms ou 25 suffixes « peptidase » et « protéase » sont utilisés indifféremment pour désigner une enzyme lysant une liaison peptidique des protéines. Avantageusement, celle-ci est effectuée pendant une durée de 4 à 8h, préférentiellement, pendant 4 à 5h, à une température de 40 à 60°C, préférentiellement, 45 à 55°C et à un pH compris entre 6 et 8, préférentiellement entre 6,5 et 7,5. 30 L'hydrolyse enzymatique peut être réalisée avec une seule protéase ou alternativement avec un mélange d'enzymes contenant au moins une protéase, plus préférentiellement un mélange d'enzymes contenant plusieurs protéases, tel qu'un mélange contenant une endoprotéase et une exoprotéase, ou une protéase et une polysaccharase. 35 De préférence, la protéase est choisie parmi le groupe constitué par les 3031113 5 aminopepdidases, les métallocarboxypeptidases, les endopeptidases sérine, les endopeptidases cystéine, les endopeptidases aspartiques, les métalloendopeptidases. Avantageusement, les enzymes peuvent être choisies parmi les suivantes : Enzyme(s) Classe Numéro Fournisseur Ville Pays EC Flavourzyme Amino- EC Novozyme Bagsvaerd Danemark peptidases 3.4.11.1 Fungal protease EC Bio-Cat Troy Etats-Unis 500 3.4.11.1 Kojizyme EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.11.1 Protex P Endo- EC 3.4.21 Genencor Leiden Pays-Bas peptidases International sérine B.V. Chymotrypsine EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.21.1 Protamex EC 3.4.21 Novozyme Bagsvaerd Danemark Elastase EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.21.14 Trypsine EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.21.36 Alcalase EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.21.4 Papaïne Endo- EC Bio-Cat Troy Etats-Unis peptidases 3.4.22.2 cystéine Bromelaine EC Bio-Cat Troy Etats-Unis (ananase) 3.4.22.32 Prolyve NP Endo- EC 3.4.23 Lyven Colombelles France peptidases aspartique Pepsine EC Sigma Aldrich Saint- France 3.4.23.1 Quentin- Fallavier Neutral protéase Métallo- EC Bio-Cat Troy Etats-Unis endo- 3.4.24.28 peptidase Protex 50FP Endo- EC 3.4.21 Genencor Leiden Pays-Bas peptidase International B.V. Pancrealyve Exo & endo n.a.* Lyven Colombelles France 3031113 6 Enzyme(s) Classe Numéro Fournisseur Ville Pays EC peptidase (cocktail protéases + amylases) Izyme BA Protéase EC 3.4.23 Novozyme Bagsvaerd Danemark aspartique Sumizyme Cocktail n.a.* Takabio - Shin Aichi Japon enzymatique Nihon *n.a. : non applicable L'enzyme ou le mélange d'enzymes est introduit(e) à une quantité allant de 0,2 à 10 % en poids de matière sèche estimé, préférentiellement de 0,4 à 8% en poids et plus préférentiellement de 0,5 à 2%. Par « poids de matière sèche estimé », on vise 5 plus particulièrement le poids de matière sèche d'insectes ou de partie(s) d'insectes, tel qu'on peut l'estimer lors de l'entrée en étape d'hydrolyse enzymatique. Avantageusement, l'étape d'hydrolyse enzymatique s'effectue en présence d'eau, telle que de l'eau douce. La quantité d'eau mise en oeuvre lors de l'hydrolyse enzymatique est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d'eau en mL 10 sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. On notera que ce ratio correspond également au ratio du poids d'eau sur le poids d'insecte, la masse volumique de l'eau étant de 1,0 g/mL dans les conditions normales de température et de pression. 15 Le procédé selon l'invention permet l'obtention d'une chitine ayant un degré de pureté compris entre 50 et 90%, préférentiellement compris entre 60 et 85%, plus préférentiellement de l'ordre de 80% (voir l'Exemple 2 et la Figure 2). De plus, le procédé selon l'invention permet l'obtention d'un hydrolysat présentant un certain nombre de propriétés avantageuses, en particulier en terme de 20 digestibilité, de teneur en lipides et/ou protéines, de taille de protéine ou de composition en acides aminés. De préférence, le procédé selon l'invention comporte une étape de broyage préalable à l'étape de pressage. Cette étape de broyage a pour objectif de réduire les cuticules et/ou les 25 insectes en particules afin de faciliter l'accès des enzymes au substrat lors de 3031113 7 l'hydrolyse enzymatique. Cette étape permet également, lorsqu'elle est suivie d'une étape de pressage, de faciliter l'élimination du jus de presse et l'isolation de la matière solide. Le broyage peut avantageusement être effectué avec un broyeur mixeur, 5 tel qu'un broyeur mixeur à couteaux. De préférence, à l'issue du broyage, la taille des particules d'insectes est inférieure à 1 cm (plus grande taille de particule observable à l'aide d'un microscope), de préférence inférieure à 0,5 cm, plus préférentiellement encore, une taille comprise entre 500 lm et 0,5 cm. 10 Afin de faciliter le broyage, une quantité d'eau peut être ajoutée. Cette quantité d'eau est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. 15 Avantageusement, le procédé selon l'invention comporte également une étape d'abattage des insectes préalable à l'étape de pressage et/ou de broyage. Cette étape d'abattage peut s'effectuer par des méthodes classiques d'élevage d'animaux à sang froid et/ou de petite taille (crustacés, poissons, escargots, etc.), tels que le froid (congélation), le chaud (ébouillantage), la privation d'oxygène, etc. 20 Avantageusement, l'étape d'abattage des insectes est effectuée par ébouillantage. L'ébouillantage permet non seulement d'abattre les insectes, mais également d'abaisser la charge microbienne (réduction du risque d'altération et sanitaire) et d'inactiver les enzymes internes des insectes pouvant déclencher une autolyse, et ainsi un brunissement rapide de ceux-ci. Cet ébouillantage est réalisé de manière à 25 provoquer la mort le plus rapidement possible, dans le respect du bien-être animal, et selon les préconisations scientifiques. Avantageusement, les insectes sont abattus, par exemple par ébouillantage, puis broyés avant d'être pressés. De préférence, l'étape d'ébouillantage est réalisée dans l'eau, telle que de l'eau 30 douce, à une température de 95 à 105°C, préférentiellement de l'ordre de 100°C et pendant une durée de 2 à 20 min, préférentiellement, 5 à 15 min. La quantité d'eau introduite à cette étape d'ébouillantage est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore 35 plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. 3031113 8 Le procédé selon l'invention peut comporter, en outre, une étape de traitement des cuticules des insectes par un agent oxydant préalablement à l'hydrolyse enzymatique. De préférence, dans le procédé selon l'invention, l'agent oxydant mis en oeuvre 5 lors du traitement des cuticules est choisi parmi le groupe constitué par le peroxyde d'hydrogène, le permanganate de potassium, l'ozone et l'hypochlorite de sodium, plus préférentiellement encore, le peroxyde d'hydrogène. Avantageusement, lorsque l'agent oxydant est le peroxyde d'hydrogène, la quantité introduite de cet agent pour le traitement des cuticules d'insectes est telle 10 que la teneur en peroxyde d'hydrogène est comprise entre 1 et 33% en poids sur le poids total d'insectes, préférentiellement, entre 2 et 12% en poids sur le poids total d'insectes, préférentiellement de l'ordre de 6% en poids. Préférentiellement, le traitement de cuticules d'insectes par l'agent oxydant s'effectue en présence d'eau, telle que de l'eau douce. Avantageusement, la quantité 15 d'eau mise en oeuvre lors du traitement des cuticules est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. Le traitement des cuticules d'insectes avec l'agent oxydant peut être effectué 20 pendant l'une ou plusieurs des étapes ci-après : - concomitamment avec l'ébouillantage et/ou après l'étape d'ébouillantage, plus préférentiellement concomitamment avec l'ébouillantage. Plus particulièrement, lorsque le traitement des cuticules d'insectes est effectué pendant l'ébouillantage, l'agent oxydant peut être avantageusement ajouté à l'eau utilisée pour ébouillanter les 25 insectes. - avant, concomitamment et/ou après le broyage. Plus particulièrement, lorsque le traitement des cuticules d'insectes est effectué pendant le broyage, l'agent oxydant peut être avantageusement ajouté à l'eau utilisée pour le broyage. - avant et/ou concomitamment avec le pressage. 30 - lors d'une étape spécifique de traitement des cuticules d'insectes. Avantageusement, l'hydrolyse enzymatique peut être suivie d'une étape d'inactivation thermique visant à inactiver l'enzyme ou le mélange d'enzymes mis en oeuvre lors de l'hydrolyse enzymatique. A l'issue d'un procédé selon l'invention, la chitine peut être récupérée par 35 pressage ou centrifugation du milieu de réaction de l'hydrolyse enzymatique. 3031113 9 A ce stade, un co-produit de la chitine est également récupéré, à savoir un hydrolysat. Un mode de réalisation préférentiel d'un procédé selon l'invention est plus détaillé ci-après. En particulier, ce mode de réalisation préférentiel décrit diverses étapes 5 avantageuses pour un procédé selon l'invention, telles que des étapes de purification douce de la chitine : un second pressage, des lavages, filtration et séchage éventuels. Enfin, la chitine étant généralement commercialisée sous forme de poudre, un second broyage peut également être réalisé. Celui-ci peut également être effectué afin de favoriser la réaction de désacétylation, qui permet de préparer du chitosan 10 à partir de chitine. Les conditions de la réaction de désacétylation sont plus amplement décrites à l'étape 10 du mode de réalisation préférentiel détaillé ci-après. Un procédé particulièrement avantageux de production de chitine à partir de cuticules d'insectes, comporte les étapes suivantes : a) l'abattage des insectes, 15 b) le broyage des insectes, c) le pressage des insectes, d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolitique, e) la récupération de la chitine, 20 les cuticules d'insectes pouvant optionnellement être traitées avec un agent oxydant avant l'étape d). Les modes de réalisation préférés des diverses étapes a) à e) ainsi que le traitement avec l'agent oxydant sont tels qu'indiqués ci-avant ou dans l'étape correspondante dans le mode de réalisation préférentiel ci-après. 25 L'invention concerne également une chitine susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention. Grâce aux conditions douces employées dans le procédé selon l'invention, cette chitine possède une structure proche de la chitine telle que présente à l'état naturel dans la cuticule de l'insecte tout en ayant un haut degré de pureté, tel qu'un degré de pureté compris entre 50 et 90%, préférentiellement compris 30 entre 60 et 85%, plus préférentiellement de l'ordre de 80%. Un procédé particulièrement avantageux de production d'un hydrolysat à partir d'insectes, comportant les étapes suivantes : a) l'abattage des insectes, b) le broyage des insectes, 35 c) le pressage des insectes, 3031113 10 d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolitique, e) la récupération de l'hydrolysat, les cuticules d'insectes pouvant optionnellement être traitées avec un agent 5 oxydant avant l'étape d). Les modes de réalisation préférés des diverses étapes a) à e) ainsi que le traitement avec l'agent oxydant sont tels qu'indiqués ci-avant ou dans l'étape correspondante dans le mode de réalisation préférentiel ci-après. L'invention concerne également un hydrolysat susceptible d'être obtenu par un 10 procédé selon l'invention. L'hydrolysat selon l'invention présente au moins l'une quelconque des propriétés avantageuses suivantes : - une excellente digestibilité, en particulier une digestibilité pepsique, supérieure à 95%, préférentiellement supérieure ou égale à 98% et plus préférentiellement 15 supérieure ou égale à 99%, la digestibilité pepsique ayant été mesurée selon une méthode conforme à la directive 72/188/EEC ; - une teneur en protéines/peptides supérieure ou égale à 70%, préférentiellement supérieure ou égale à 75%, et plus préférentiellement supérieure ou égale à 80% ; 20 - une teneur en lipides inférieure à 10%, préférentiellement inférieure ou égale à 5%, plus préférentiellement inférieure ou égale à 2%, et encore plus préférentiellement inférieure ou égale à 1% ; et/ou - une composition dans laquelle les acides aminés les plus abondants sont la proline, l'alanine, la leucine, la glutamine et/ou la valine. Par « plus abondant », 25 on entend une quantité relative de l'acide aminé dans la composition supérieure à 5%, préférentiellement supérieure à 7% en poids sur le poids total d'acides aminés. La forte teneur en proline s'avère particulièrement intéressante. Dans la présente demande, toute référence à un règlement ou à une directive concerne ledit règlement ou ladite directive tel qu'en vigueur à la date de dépôt de la 30 présente demande. L'hydrolysat peut avantageusement être complété avec des additifs pour équilibrer son profil nutritionnel afin d'être adapté à différents types d'animaux. L'hydrolysat peut avantageusement être concentré puis séché pour obtenir un hydrolysat séché. Alternativement, l'hydrolysat peut être sous forme liquide. Ces 35 hydrolysats peuvent être utilisés comme un aliment ou un ingrédient alimentaire 3031113 11 en particulier pour des animaux, ou, alternativement, ils peuvent être traités, par exemple, pour isoler des acides aminés. Un procédé particulièrement avantageux de production de chitosan à partir de cuticules d'insectes, comporte les étapes suivantes : 5 a) l'abattage des insectes, b) le broyage des insectes, c) le pressage des insectes, d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une protéase, e) la récupération de la chitine, 10 f) la désacétylation de la chitine récupérée, g) la récupération du chitosan, les cuticules d'insectes pouvant optionnellement être traitées avec un agent oxydant avant l'étape d). Les modes de réalisation préférés des diverses étapes a) à g) ainsi que le 15 traitement avec l'agent oxydant sont tels qu'indiqués ci-avant ou dans l'étape correspondante dans le mode de réalisation préférentiel ci-après. L'invention concerne également un chitosan susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention. La chitine et/ou le chitosan susceptible(s) d'être obtenu(s) par un procédé selon 20 l'invention peu(ven)t avantageusement être utilisé(s) dans diverses applications : - dans des compositions cosmétiques, pharmaceutiques, nutraceutiques ou diététiques, comme biomatériaux pour traiter des brûlures en tant que seconde peau, pour réaliser des pansements cornéens ou des fils chirurgicaux, 25 comme agent filtrant, texturant, floculant et/ou adsorbant notamment pour la filtration et dépollution de l'eau. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, le procédé comporte les étapes suivantes, décrites schématiquement en Figure 1. On notera que certaines étapes sont indiquées comme facultatives dans ce mode de réalisation préférentiel. 30 - Etape 1 : ébouillantage des insectes Cette étape 1 d'ébouillantage permet d'abattre les insectes tout en abaissant la charge microbienne (réduction du risque d'altération et sanitaire) et en inactivant les enzymes internes des insectes pouvant déclencher une autolyse, et ainsi un brunissement rapide de ceux-ci. Les insectes, de préférence des larves, sont ainsi 35 ébouillantés à l'eau pendant 2 à 20 min, préférentiellement, 5 à 15 min. De préférence, 3031113 12 l'eau est à température comprise entre 95 à 105 °C, préférentiellement 100°C. La quantité d'eau introduite à cette étape 1 d'ébouillantage est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus 5 préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. Lors de cette étape, il est également possible de traiter les cuticules d'insectes en utilisant une eau d'ébouillantage comportant l'agent oxydant selon les modalités indiquées dans l'étape intermédiaire ci-après. - Etape intermédiaire (facultative) : traitement des cuticules par 10 l'adent oxydant Il est possible d'introduire dans le procédé une étape spécifique de traitement des cuticules par l'agent oxydant. Avantageusement, cette étape intermédiaire de traitement des cuticules s'effectue entre l'étape 1 d'ébouillantage et l'étape 2 de broyage. 15 Cette étape intermédiaire s'effectue de préférence avec un agent oxydant choisi parmi le groupe constitué par le peroxyde d'hydrogène (H202), le permanganate de potassium (KMnO4), l'ozone (03) et l'hypochlorite de sodium (NaCIO), plus préférentiellement, le peroxyde d'hydrogène. Selon un premier mode de réalisation, à l'issue de l'étape 1 d'ébouillantage, on 20 introduit directement dans la cuve d'ébouillantage l'agent oxydant, après éventuel refroidissement de l'eau d'ébouillantage à une température de l'ordre de 40 à 60°C, préférentiellement de l'ordre de 50°C. Le peroxyde d'hydrogène tel que commercialisé est usuellement sous la forme d'une solution aqueuse, par exemple une solution à 30% en poids sur le poids total 25 d'eau. La quantité introduite de peroxyde d'hydrogène pour le traitement est telle que la teneur en peroxyde d'hydrogène est comprise entre 1 à 33% en poids sur le poids total d'insectes, préférentiellement, 2 à 12% en poids sur le poids total d'insectes, préférentiellement de l'ordre de 6% en poids. 30 Selon un second mode de réalisation, les insectes sont retirés de la cuve d'ébouillantage, tamisés et réintroduits dans une cuve. Le peroxyde d'hydrogène est alors introduit dans la cuve sous la forme d'une solution aqueuse diluée, la teneur en peroxyde d'hydrogène étant alors comprise entre 1 et 33% en poids sur le poids d'eau, préférentiellement, 2 à 12% en poids sur le poids 35 d'eau, préférentiellement de l'ordre de 6% en poids. 3031113 13 - Etape 2 : broyage Les insectes sont retirés de la cuve d'ébouillantage ou de traitement, ils sont ensuite tamisés, et placés dans un broyeur, tel qu'un broyeur mixeur à couteaux, permettant de réduire les insectes en particules. 5 Afin de faciliter le broyage, une quantité d'eau peut être ajoutée. Cette quantité d'eau est similaire à celle introduite lors de l'étape 1 d'ébouillantage : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. Il est également possible de garder l'eau 10 d'ébouillantage et/ou l'eau de l'étape intermédiaire pour effectuer cette étape. Cette eau est susceptible de contenir l'oxydant. Dans ce cas, le traitement des cuticules peut avoir lieu durant l'étape 1 d'ébouillantage et l'étape 2 de broyage ou pendant l'étape intermédiaire de traitement des cuticules et pendant l'étape de broyage. De préférence, à l'issue du broyage, la taille des particules d'insectes est 15 inférieure à 1 cm (plus grande taille de particule observable à l'aide d'un microscope), de préférence inférieure à 0,5 cm. Il n'est pas nécessaire de réduire excessivement la taille des particules, par exemple à une taille inférieure à 250 Cette étape 2 de broyage favorise l'accès des enzymes à leur substrat. Lors de cette étape, il est possible d'introduire dans le broyeur l'agent oxydant 20 afin de traiter les cuticules selon les modalités indiquées dans l'étape intermédiaire ci- avant. Lorsque le traitement des cuticules n'est pas effectué de manière concomitante avec le broyage, il est possible d'ajouter lors de cette étape, des additifs antioxydants communément employés pour la conservation et la stabilité du produit. 25 - Etape 3 : pressage des cuticules d'insectes La pâte humide issue de l'étape 2 de broyage est ensuite placée dans une presse selon un mode opératoire qui permet de presser et séparer un jus comportant à la fois une fraction huileuse et une fraction protéique. De préférence, l'étape de pressage permet d'obtenir un gâteau de presse 30 comportant une teneur en huile inférieure ou égale à 20%, préférentiellement, inférieure ou égale à 15%, plus préférentiellement, inférieure ou égale à 12%, encore plus préférentiellement, inférieure ou égale à 10%. De même, l'étape de pressage permet d'obtenir un gâteau de presse présentant une teneur en matière sèche comprise entre 30% et 60%, 35 préférentiellement, comprise entre 40% et 55%, et plus préférentiellement comprise 3031113 14 entre 45% et 50%. Tout système de presse peut être utilisé pour réaliser l'étape de pressage, tel que par exemple, une presse mono-vis ou bi-vis (presse bi-vis de type Angel), un filtre-presse (filtre-presse de type Choquenet), une presse à plateaux, etc. 5 Ces systèmes sont bien connus de l'homme du métier qui est à même de déterminer les conditions de pressage afin d'obtenir les teneurs en huile et/ou en eau mentionnées ci-avant. Si la pâte humide issue de l'étape 2 de broyage a été obtenue avec une eau comportant l'oxydant, il peut être avantageux d'éliminer au moins une partie de cet 10 oxydant avant l'étape 3 de pressage. Cette étape 3 de pressage peut éventuellement être réalisée avant l'étape 2 de broyage à partir des insectes ébouillantés. Toutefois, il est avantageux d'effectuer l'étape 3 de pressage après l'étape 2 de broyage. Cette étape 3 de pressage permet donc l'obtention d'un jus de presse et d'un 15 gâteau de presse. - Etape 4 : hydrolyse enzymatique La pâte humide issue de l'étape 2 de broyage ou le gâteau de presse issu de l'étape 3 de pressage est placé dans une cuve d'hydrolyse avec de l'eau. Optionnellement, et comme cela sera décrit ci-après, la fraction protéique issue 20 de l'étape 12 de séparation, peut être réintroduite dans cette étape 4 d'hydrolyse enzymatique, en la mélangeant au gâteau de presse. De manière optionnelle et dans le cas où l'eau de l'ébouillantage ne contient pas d'oxydant, l'eau de l'ébouillantage peut être récupérée et réintroduite lors de l'étape d'hydrolyse. En effet, cette eau contient des fractions d'insectes solubilisées de 25 par l'action de cet ébouillantage et l'utilisation de celle-ci lors de l'hydrolyse permet de réduire les pertes. Optionnellement, cette eau issue de l'ébouillantage peut être dégraissée, certaines cires pouvant s'être dissoutes dans l'eau. La quantité d'eau introduite à cette étape 4 d'hydrolyse enzymatique est similaire à celle introduite lors de l'étape 1 d'ébouillantage : le ratio du volume d'eau 30 en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. L'hydrolyse enzymatique est réalisée avec une protéase, telle qu'une protéase commerciale pendant 4 à 8h, plus particulièrement pendant 4 à 5h, à un pH de 6 à 8, 35 plus particulièrement de 6,5 à 7,5, à une température de 40 à 60°C, 3031113 15 plus particulièrement de 45 à 55°C. La quantité d'enzymes introduite lors de l'étape d'hydrolyse est inférieure à 10 % en poids sur le poids total de matière sèche estimé entrant en hydrolyse, préférentiellement inférieure à 6%, plus préférentiellement de l'ordre de 2 %. 5 L'hydrolyse protéolytique engendre la production d'une phase soluble contenant les peptides, glucosamines et oligochitines et d'un résidu solide formé de chitine, principalement de copolymère chitine-polypeptides. - Etape 5 : inactivation thermique Afin de stopper l'activité des enzymes de la réaction et de stabiliser la phase 10 soluble de l'hydrolyse, on réalise une inactivation thermique en chauffant ce jus entre 80 et 105° pendant 10 à 25 min, préférentiellement, 15 à 20 minutes. Selon un mode opératoire, cette étape 5 d'inactivation thermique est réalisée selon les techniques habituelles de stérilisation de l'industrie agroalimentaire. Selon un autre mode opératoire, l'inactivation enzymatique est réalisée par chauffage sous rayonnement IR 15 ou UV, ou micro-ondes. - Etape 6 : pressage Le résidu solide, majoritairement composé de chitine, est récupéré puis pressé par un pressoir afin d'essorer au maximum ce résidu pour réinjecter dans la phase soluble ce pressât. Le résidu pressé ainsi formé est composé essentiellement de 20 chitine, principalement sous la forme de copolymère chitine-polypeptides. - Etapes (facultatives) 7 et 8 : lavage et séchage Le résidu solide est ensuite lavé, filtré, à nouveau lavé puis séché par les technologies classiques connues par l'homme de métier. Avantageusement, le système de séchage est étudié pour protéger la structure 25 du copolymère de chitine-polypeptides : l'hydrométrie, la ventilation et la composition de l'air sont contrôlés. Avantageusement, le séchage peut s'effectuer dans une étuve ventilée à une température de 60 à 80°C, préférentiellement de l'ordre de 70°C. Optionnellement, ces étapes peuvent comporter une étape de délipidation terminale : le résidu solide est traité avec du HCI afin d'enlever les derniers résidus 30 lipidiques, notamment les cires cuticulaires. Les étapes 9 à 11 qui suivent, visent à transformer la chitine en chitosan et ne sont donc mises en oeuvre que lorsque le produit souhaité est le chitosan. - Etape 9 (facultative) : broyage Le résidu solide séché, comportant majoritairement de la chitine, est ensuite 35 broyé, par exemple dans un broyeur à couteaux. 3031113 16 La production de chitosan à partir de chitine, par la réaction de désacétylation, dépend en grande partie de la taille des particules de chitine. Ainsi un broyage très fin du résidu solide séché avant désacétylation permet d'augmenter significativement les rendements et la vitesse de la réaction de désacétylation, comme cela est illustré 5 dans le Tableau 1 ci-après : Broyage 30 s Broyage 45 s Broyage 60 s Broyage 120 s 50% des C25). La montée en température au-dessus du point de fusion de ces huiles (environ 38°C) lors de la centrifugation permet de solubiliser cette crème et de faciliter la séparation de la fraction huileuse du reste du jus. 20 Le centrifugat passe ensuite en décantation selon un mode opératoire (type décanteur ou tricanteur), afin de séparer au mieux les huiles et les protéines. Ces étapes permettent ainsi l'obtention d'une fraction huileuse. La fraction protéique, une fois séparée de la fraction huileuse, peut être mélangée au gâteau de presse issu de l'étape 3 de pressage juste avant l'étape 4 25 d'hydrolyse. En effet, souvent plus de 20% des protéines sont perdues dans le jus lors de l'étape 3 de pressage, d'où l'intérêt de récupérer cette fraction et de la soumettre à l'étape d'hydrolyse. - Etape 13 (facultative) : concentration Selon un mode opératoire, la concentration est réalisée par évaporation sous 30 vide de la partie aqueuse. Le concentrât présente un extrait sec supérieur à 10%, de préférence supérieur à 20%. Cette opération facilite le séchage et des additifs communément employés pour la conservation et la stabilité du produit peuvent être ajoutés à cette étape. - Etape 14 (facultative) : séchage 35 Le concentrât est enfin séché par des technologies connues de l'homme du 3031113 18 métier, telles que par exemple, par pulvérisation / atomisation (« spray-drying »), qui permet d'obtenir un extrait, c'est-à-dire une poudre sèche de concentrât riche en peptides et glucosamines, les glucosamines étant en particulier issues de l'hydrolyse partielle de la chitine par H202 (essentiellement). 5 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, avec référence aux figures, qui représentent respectivement : La Figure 1 est un schéma d'un mode de réalisation préférentiel du procédé selon l'invention, 10 La Figure 2 un diagramme comparant le degré de pureté de la chitine obtenue par un procédé enzymatique comportant une ou plusieurs étapes préalables de broyage(s) et pressage, La Figure 3 est un diagramme comparant le taux de lipides mesuré dans différentes fractions du produit intermédiaire dont la chitine a été extraite, 15 La Figure 4 illustre la répartition des lipides dans le jus et le gâteau de presse obtenus par un procédé enzymatique comportant des étapes préalables de broyage et de pressage ou une étape préalable de pressage, La Figure 5 est un diagramme illustrant la répartition des protéines/peptides selon leurs masses molaires (en %) dans un hydrolysat selon l'invention et 20 dans le jus de presse, La Figure 6 est un diagramme illustrant la répartition relative des acides aminés constitutifs d'un l'hydrolysat selon l'invention, et La Figure 7 est un diagramme illustrant l'abondance relative des acides aminés dans la chitine. 25 Exemple 1 : Exemple de procédé selon l'invention 600 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 600 mL d'eau, préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis 30 mixées avec un volume d'eau de 600 mL. Le liquide ainsi obtenu est pressé avec une presse bi-vis de type Angel dans les conditions suivantes : Vitesse = 82 tr/min; W (énergie) = 3 HP (chevaux vapeur) soit 2,68 x 106 J; Porosité (approximative) = 0,5 mm dans la première partie et 0,2 mm dans la 3031113 19 dernière partie. On obtient ainsi un jus de presse et un gâteau de presse de 136,49 ± 4,48 g en poids humide, dont 100,22 ± 0,22 g sont utilisés dans les étapes suivantes. Tout autre type de presse aurait toutefois pu être utilisé, dans la mesure où celle-ci permet 5 l'extraction l'obtention d'un gâteau de presse sensiblement similaire en termes de teneur en eau et/ou de teneur en lipides. A titre d'exemple, d'autres essais ont été réalisés avec le filtre presse de type Choquenet présentant les caractéristiques suivantes : Surface de filtration de la cellule = 50 cm2 ; 10 Pression = 2 à 8 bars ; Température = 20 à 80 °C, Porosité = 25 à 80 µm ; Débit en fin de filtration = 100 à 250 mL/h. Le gâteau de presse est transféré dans un Erlen Meyer contenant 600 mL 15 d'une solution de protéase (Prolyve NP conc) à 1% (par rapport au poids humide du gâteau de presse), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 lm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 20 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 16,99 ± 1,77 g de chitine par ce procédé. L'hydrolysat (filtrat obtenu après hydrolyse) représente dans ces conditions 609,98 ± 10,9 g avec une teneur en matière sèche de 5,05%, ce qui, après lyophilisation, donne 30,8 ± 0,55 g de l'hydrolysat sec. 25 Exemple 2: Influence des étapes mécaniques préalables à l'hydrolyse enzymatique sur le degré de pureté de la chitine obtenue Différents types de prétraitement mécanique ont été testés, le broyage (« broyage 1 ») seul, le broyage suivi du pressage, le broyage suivi du pressage et d'un second broyage (« broyage 2 »), ainsi que le pressage seul. 30 Pour le pressage, la presse de type Angel décrite à l'exemple 1 a été utilisée. 1. Matériel et méthodes Production de chitine avec un broyage 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un 35 bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. 3031113 20 Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis mixées avec un volume d'eau de 200 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré dans un Erlen Meyer contenant 2 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen 5 Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 lm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 8,13 ± 0,27 g de chitine par ce procédé. Production de chitine avec un broyage suivi d'un pressage 10 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis mixées avec un volume d'eau de 200 mL. Le liquide ainsi obtenu est passé dans une presse de type bi-vis. 30 g du gâteau de presse ainsi obtenu sont transférés dans un 15 Erlen Meyer contenant 150 mL d'eau et 0,3 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 lm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 4,71 ± 20 0,11 g de chitine par ce procédé. Production de chitine avec un premier broyage (« broyage 1 ») suivi d'un pressage et d'un second broyage (« broyage 2 ») 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. 25 Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis mixées avec un volume d'eau de 200 mL. Le liquide ainsi obtenu est passé dans une presse de type bi-vis. Le gâteau de presse ainsi obtenu est séché 24 heures dans une étuve à 70 °C, puis broyé à 250 iim. 10 g de la poudre ainsi obtenue sont transférés dans un Erlen Meyer contenant 50 mL d'eau et 0,1 g de protéase (Prolyve), l'ensemble 30 est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 lm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 4,93 ± 0,12 g de chitine par ce procédé. 35 Production de chitine avec pressage uniquement 3031113 21 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis passées dans une presse de type bi-vis. 90 g de gâteau de presse ainsi obtenu sont 5 transférés dans un Erlen Meyer contenant 450 mL d'eau et 0,9 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,450,5 lm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. 10 On obtient ainsi 6,48 ± 0,28 g de chitine par ce procédé. Production de chitine par voie chimique 50 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain- marie à 100 °C et contenant 50 mL d'eau, préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis mixées 15 avec un volume d'eau de 60 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré dans un récipient de 1 L et 500 mL d'une solution d'HCI 1M sont ajoutés. L'ensemble est placé à 90 °C sous agitation pendant 1 heure. Le contenu est ensuite filtré et le résidu solide est transféré dans un flacon de 1 L contenant 500 mL d'une solution de NaOH 1M, l'ensemble est placé à 90 °C sous agitation pendant 24 heures. Le résidu est ensuite 20 filtré et placé en étuve ventilée à 70 °C pendant 24 heures. On obtient ainsi 0,944 ± 0,005 g de chitine purifiée par voie chimique. Calcul du degré de pureté Le degré de pureté de la chitine est déterminé en comparaison de la masse en résidu sec obtenue par rapport à celle résultant d'une extraction chimique, 5 % environ 25 de la matière sèche initiale. Mesure du taux de lipides On place 2 g d'échantillon dans un bécher, on y ajoute 0,2 g de Na2SO4 et 15 mL de CHC13/Me0H (2/1 v/v). L'ensemble est placé sous agitation magnétique pendant 20 minutes, ensuite la solution est filtrée, le résidu est placé de nouveau dans 30 le bécher avec 10 mL de CHC13/Me0H (2/1 v/v). L'ensemble est placé sous agitation magnétique pendant 15 minutes, ensuite la solution est filtrée, les phases solvants sont réunies et évaporées à poids constant. La teneur en lipides est déterminée comme pourcentage de masse après extraction-évaporation par rapport à la masse initiale de l'échantillon (2 g). 35 3031113 22 2. Résultats Comme cela peut être constaté sur la Figure 2, le procédé a une influence sur la pureté de la chitine obtenue, les meilleurs résultats étant obtenus avec un pressage a minima. Le meilleur résultat est obtenu avec le broyage suivi du pressage, à savoir 5 une chitine présentant un degré de pureté de 78% et le moins bon avec le broyage seul, à savoir une chitine présentant un degré de pureté de 48%. Une analyse plus fine du produit intermédiaire dont la chitine a été extraite, permet de constater qu'un bas taux de lipides est favorable à une plus grande pureté de la chitine obtenue (Figure 3). Par « produit intermédiaire », on vise le produit entrant 10 en hydrolyse enzymatique, c'est-à-dire issu de la dernière étape avant hydrolyse, à savoir, selon les procédés de production ci-avant, l'étape de broyage 1 ou 2 ou l'étape de pressage. L'analyse du taux des lipides dans la chitine et le jus d'hydrolyse permet en effet de relever qu'en fonction du taux de lipides initiaux présents dans le produit 15 intermédiaire, le taux des lipides dans la chitine est relativement stable, de 7 à 15%, tandis que le taux des lipides dans l'hydrolysat varie, quant à lui, de 11 à 47% (Figure 3). Plus particulièrement, si le produit intermédiaire a une teneur en lipides de 35%, alors : 20 - la chitine qui résultera de l'hydrolyse ne sera pure qu'à 50% et comportera 10% lipides, et - la teneur en lipides de l'hydrolysat avoisinera quant à elle les 40%. En revanche, si la teneur en lipides du produit intermédiaire est de 7%, alors : - la chitine obtenue après hydrolyse aura une pureté de 80% et aura une teneur 25 en lipides de 8% et l'hydrolysat présentera également une faible teneur en lipides, de l'ordre de 10%. Cela indique que lorsque le taux des lipides initiaux est élevé, supérieur à 12%, l'enzyme responsable d'hydrolyse est amenée à hydrolyser non seulement les protéines, mais également les lipides par promiscuité catalytique. C'est ainsi qu'un taux 30 de lipides dans la chitine similaire est obtenu, à savoir 8,6 et 7,9% dans les cas où les lipides initiaux étaient de 35 et 7% respectivement. En revanche, la pureté de la chitine passe dans ce cas de 48 à 84% respectivement. Ainsi, sur les 52% d'impuretés d'une part et 16% de l'autre, 8% en moyenne sont dus aux lipides, la quantité de protéines restées accrochées à la chitine est donc de 38 points supérieure dans le cas où 35 davantage de lipides étaient présents dans le produit intermédiaire soumis à 3031113 23 l'hydrolyse. Finalement, l'importance du broyage en amont du pressage peut également être étudiée (Figure 4). Il apparait ainsi clairement que la répartition des lipides entre le gâteau et le jus de presse est bien plus efficace, 12,9 versus 87,1 contre 42,7 versus 5 57,3, lorsqu' un broyage préalable a été réalisé. Exemple 3 : Analyse de l'hydrolysat Une analyse détaillée de l'hydrolysat obtenu à l'exemple 1 a été effectuée. 1. Teneur en glucosamines 10 La teneur de l'hydrolysat en glucosamines et certains autres sucres a été analysée par chromatographie gazeuse après méthanolyse et sillilation. Mode opératoire : 10 mg de l'échantillon et 50 pg d'étalon interne sont placés dans 500 !IL d'un mélange méthanol/acide chlorhydrique 3 N pendant 4 heures à 110 °C (ou 24 heures à 15 130 °C). Le mélange est ensuite neutralisé avec le Ag2CO3. 50 !IL d'anhydride acétique sont ajoutés afin de ré-acétyler les osamines éventuellement présentes. Après une nuit à l'obscurité et à température ambiante, les échantillons sont centrifugés (15 min, 3000 rpm) et le surnageant est évaporé. Les composés sont ensuite dissous dans 100 1.1L de pyridine et incubés une nuit à température ambiante 20 avec 100 !IL de BSTFA (Supelco). Les réactifs sont ensuite évaporés et le résidu repris dans 700 !IL de CH2Cl2 et injecté en CPG. Programme de température : 1 minute à 120 °C, rampe de 1.5 °C/minute jusqu'à 180 °C, puis 2 °C/minute jusqu'à 200 °C. Détection : FID 25 Colonne : HP-5MS (30 m, 0.25 mm diamètre interne) Etalon interne : myo-inositol Les différentes teneurs ont été mesurées et calculées de deux façons différentes (Tableau 2). Il en ressort que le glucosamine est contenu dans l'hydrolysat à hauteur de 0,1-0,15 % en masse et avec un ratio de 0,04-0,05 par rapport au 30 glucose. 3031113 24 Méthanolyse à 110 °C Méthanolyse à 130 °C (3/0 massique Ratio molaire % massique Ratio molaire Glucose 1,6 ± 0,3 1 2 ± 0,4 1 Mannose 0,3 ± 0,05 0,15 ± 0,005 0,4 ± 0,08 0,15 ± 0,007 Glucosamine 0,1 ± 0,02 0,04 ± 0,007 0,15 ± 0,04 0,05 ± 0,003 Tableau 2 : Répartition du glucosamine, mannose et glucose dans l'hydrolysat 2. Taille des protéines 5 La taille des protéines/peptides de l'hydrolysat a été évaluée par HPLC, appareil Shimadzu 20A, à température ambiante, sur colonne Superdex Peptide 10/300 GL, dans le tampon acétonitrile (ACN) 30%, acide trifluoroacétique (TFA) 0,1%, avec un débit de 0,4 mL/min. La détection a été réalisée à 205 nm et le volume d'échantillon injecté était de 20 pl_ 10 De même, la taille des protéines/ peptides du jus de presse préparé à l'Exemple 1, a également été évaluée dans des conditions identiques à des fins de comparaison. La comparaison de la taille des protéines entre le jus de presse et l'hydrolysat (Figure 5) montre clairement que l'essentiel, 76%, des peptides présents dans 15 l'hydrolysat ont une masse molaire comprise entre 130 et 900 Da. En revanche, la partie des protéines peu digestes (de masse molaire supérieure à 1300 Da) est réduite de 31% à 2%. De même, la proportion de peptides présentant un caractère d'amertume (de masse molaire inférieure à 130 Da) passe de 38% à 15%. Les critères de digestibilité et palatabilité se trouvent donc ainsi améliorés par le traitement 20 enzymatique proposé. 3. Digestibilité Le taux de digestibilité pepsique de l'hydrolysat est estimé à 99,6 % des protéines totales. Il a été mesuré par un laboratoire externe, la méthode utilisée est conforme à la directive 72/199/EEC et a été pratiquée sans dégraissage. 25 4. Teneur en protéines Le taux de protéines de l'hydrolysat est estimé à 84,8 %. Il a été mesuré par un laboratoire externe, selon la méthode Kjeldahl avec le coefficient de correction de 6,25. La méthode utilisée est conforme au règlement CE 152/2009. 5. Teneur en lipides 30 Le taux de lipides de l'hydrolysat est estimé à 0,7 ± 0,5 %. Il a été mesuré par 3031113 25 un laboratoire externe selon la méthode dite de « l'hydrolyse » adaptée du règlement CE 152/2009 (procédé B). 6. Composition en acides aminés L'hydrolysat obtenu après traitement par les différentes enzymes a été analysé 5 quant à sa composition en acides aminés (Figure 6). On y observe la prépondérance de la proline, conjointement avec la présence de l'hydroxy proline (HYP) - métabolite de la proline et acide aminé absent chez certains organismes, par exemple les crustacés. Or, la proline et son métabolite, l'hydroxy proline, jouent un rôle essentiel dans le métabolisme, notamment en permettant la synthèse d'autres acides aminés 10 tels que l'arginine et le glutamate. Si la plupart des mammifères sont capables de synthétiser la proline, la production de cet acide aminé par les nouveau-nés, les oiseaux et les poissons est insuffisante, c'est pourquoi une supplémentation en proline et hydroxy proline est parfois mise en place afin d'accroitre la croissance de certains animaux. Par ailleurs, la proline est le premier acide aminé contenu dans le lait des 15 mammifères, elle y est présente à hauteur de 12%, en revanche son contenu dans les protéines des plantes est bien moindre, seulement 2,9% dans le soja et 0,8% dans le maïs. On retrouve donc dans cet hydrolysat une teneur en proline aussi élevée que dans le lait et bien supérieure à celle trouvée dans les protéines végétales. Les autres acides aminés présents en quantité importante sont l'alanine, la 20 leucine et le glutamate (avec la glutamine). Leurs quantités relatives sont supérieures à 9%. En revanche, les acides aminés soufrés tels que la cystéine et la méthionine sont en faible quantité, de l'ordre de 0,5%. La méthode utilisée pour la détermination de ces résultats (hydrolyse acide) n'a pas permis la mise en évidence des acides aminés tels que le tryptophane et l'arginine. 25 Par ailleurs, l'asparagine a été entièrement transformée en acide aspartique et la glutamine en acide glutamique et ce qui est observé sous les pics ASP et GLU est en fait respectivement la somme de l'acide aspartique et de l'asparagine d'une part et de l'acide glutamique et de la glutamine d'autre part, initialement présents dans l'hydrolysat. 30 Exemple 4 : Analyse de la chitine Une analyse détaillée en acides aminés de la chitine obtenue à l'exemple 1 a été effectuée. La teneur totale en acides aminés est de 32,3 g pour 100 g de copolymère 35 (déterminée comme somme des acides aminés). Les acides aminés majoritairement 3031113 26 présents sont la valine, la glycine, l'alanine et la tyrosine (Figure 7). Les analyses ont été sous-traitées et les résultats obtenus selon la méthode NF EN ISO 13904 pour le tryptophane et NF EN ISO 13903 pour les autres acides aminés. REVENDICATIONS1. Procédé de production d'au moins un produit d'intérêt à partir d'insectes, comportant les étapes suivantes : (i) le pressage des cuticules d'insectes, puis, (ii) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolytique. 2. Procédé selon la revendication 1, comportant une étape de broyage préalable à l'étape de pressage. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comportant une étape d'abattage des insectes préalable à l'étape de pressage et/ou de broyage. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comportant en outre une étape de traitement des cuticules des insectes par un agent oxydant préalablement à l'hydrolyse enzymatique. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le ou les insecte(s) est/sont choisi(s) parmi le groupe constitué par les coléoptères, les lépidoptères, les orthoptères et les diptères. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la protéase est choisie parmi le groupe constitué par les aminopepdidases, les métallocarboxypeptidases, les endopeptidases sérine, les endopeptidases cystéine, les endopeptidases aspartiques, les métalloendopeptidases. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le produit d'intérêt est la chitine et/ou le chitosan. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le produit d'intérêt est un hydrolysat. 9. Procédé de production de chitine à partir de cuticules d'insectes, comportant les étapes suivantes : a) l'abattage des insectes, b) le broyage des insectes, c) le pressage des insectes, d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolitique, e) la récupération de la chitine, les cuticules d'insectes pouvant optionnellement être traitées avec un agent oxydant avant l'étape d). 3031113 28 10. Chitine susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 9. 11. Procédé de production d'un hydrolysat à partir d'insectes, comportant les étapes suivantes : 5 a) l'abattage des insectes, b) le broyage des insectes, c) le pressage des insectes, d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolitique, 10 e) la récupération de l'hydrolysat, les cuticules d'insectes pouvant optionnellement être traitées avec un agent oxydant avant l'étape d). 12. Hydrolysat susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 8, 11. 15 13. Procédé de production de chitosan à partir de cuticules d'insectes, comportant les étapes suivantes : a) l'abattage des insectes, b) le broyage des insectes, c) le pressage des insectes, 20 d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une protéase, e) la récupération de la chitine, f) la désacétylation de la chitine récupérée, g) la récupération du chitosan, les cuticules d'insectes pouvant optionnellement être traitées avec un agent 25 oxydant avant l'étape d).