Brevet FR3036405A1 — publié le 20161125

PROCEDE DE MESURE RAPIDE DE LA DEMANDE BIOCHIMIQUE EN OXYGENE La présente invention a pour objet une méthode de calibration permettant la quantification de la DB05, son utilisation dans un procédé de mesure rapide de la demande biochimique en oxygène dans un milieu liquide aqueux contenant des matières organiques biodégradables et un kit pour la mise en oeuvre de ce procédé. L'invention s'applique au domaine de l'analyse de la biodégradabilité de matières organiques de types variés, tels que, par exemple, celles des eaux et boues de station d'épuration, des effluents agro-industriels ou d'élevage, des déchets industriels, agroindustriels et agricoles ou du compost. Les substrats organiques sont utilisables par les micro- organismes en tant que substrats desquels ils retirent de l'énergie et la capacité de croître. De nombreuses applications industrielles utilisent ces réactions biochimiques de dégradation, en conditions aérobies ou anaérobies, notamment : épuration des eaux usées, production de composés à haute valeur ajoutée, production d'énergie, et production agro-alimentaire. Les sources de substrats organiques disponibles sont très variées : cultures et résidus de culture, production et résidus agro-alimentaires, déchets ménagers et urbains, biomasse notamment algale. Il existe différentes méthodes pour mesurer la biodégradabilité des substrats organiques, c'est-à-dire pour mesurer l'étendue avec laquelle des micro-organismes vont pouvoir utiliser ces substrats pour les transformer. Chaque domaine d'application utilise sa propre méthode très généralement basée sur la mesure du produit formé au cours de la réaction, parfois sur la mesure du substrat dégradé. Ces méthodes sont longues, complexes à mettre en place et requièrent un appareillage lourd, encombrant et coûteux. 3036405 -2 Un des paramètres industriels les plus couramment utilisés pour mesurer la biodégradabilité des substrats organiques est la demande biochimique (ou biologique) en oxygène (DBO). La DBO représente la quantité de dioxygène nécessaire aux micro-organismes aérobies de 5 l'eau pour oxyder les matières organiques, dissoutes ou en suspension dans l'eau. La mesure la plus couramment réalisée est celle de la DBO5. La DBO5 correspond à la demande biochimique ou (biologique) en oxygène après 5 jours d'incubation de l'échantillon à une température de 20°C. Son protocole de mesure standard est 10 décrit dans la norme NF EN 1899-1 de mai 1998. Ce protocole de mesure est long et les résultats peuvent varier principalement en raison des fluctuations de la diversité microbienne de l'inoculum utilisé. De nombreux travaux effectués au cours des deux dernières 15 décennies ont conduit au développement de différentes technologies plus rapides et plus fiables (Jouanneau S. et al., Water Research, (2014), 49, 62-82). Parmi ces méthodes on peut citer également les méthodes à base de médiateurs rédox comme celle décrite par Dudal Y. et al. 20 (Anal. Bioanal. Chem., (2006), 384, 175-179) qui reprend le contenu de la demande internationale WO 2006/079733 et décrit un test de fluorescence sur microplaque pour la mesure de l'activité catabolique induite par les matières organiques dissoutes (dissolved organic matter ou DOM). Cette technique permet, à partir de courbes de 25 calibration de glucose, de calculer la quantité minéralisable d'un DOM et de classifier les DOM en fonction de leur capacité à réagir avec des bactéries. Plus récemment les inventeurs ont mis au point une mesure de la biodégradabilité des substrats organiques par la détection 30 fluorescente et/ou colorimétrique de l'activité microbienne générée 3036405 -3 par l'ajout de substrats organiques dans un mélange de microorganismes permettant d'en déduire par étalonnage la valeur attendue pour chaque domaine d'applications et de quantifier la matière organique présente. Cette méthode, décrite dans la demande 5 EP2597461, est réalisée sur un format permettant la multiplicité des mesures avec un traitement des données automatisé. Elle est basée sur le fait que lors de l'incubation, la matière organique biodégradable va être assimilée par les bactéries directement ou après hydrolyse des polymères de plus hauts poids moléculaires (polysaccharides, 10 polypeptides, ...). Les différentes voies cataboliques aboutissent à la production de pyruvate et/ou acétyl-CoA qui, en condition aérobie, sont oxydées au sein du cycle de Krebs. Lors de cette oxydation, des cofacteurs sont réduits (NAD+, FAD, ...) et ces cofacteurs réduits sont par la suite ré-oxydés au niveau de la chaîne respiratoire 15 induisant la production d'énergie sous forme d'ATP via l'ATP synthase et le processus de phosphorylation oxydative. En condition aérobie, l'accepteur final d'électron au niveau de la chaîne respiratoire est le dioxygène de l'air qui subit une réduction conduisant à la production d'eau. La sonde moléculaire utilisée va se substituer à une petite 20 fraction du dioxygène en tant qu'accepteur final d'électron et être réduite en une forme chimique très fluorescente. De cette manière, l'activité métabolique mise en jeu lors de la dégradation de la matière organique va pouvoir être mesurée par fluorescence et cette mesure est directement proportionnelle à la consommation d'oxygène par les 25 bactéries. Cette consommation d'oxygène est précisément ce qui définit la demande biologique en oxygène ; lorsque celle-ci est mesurée sur 5 jours, on la désigne sous le terme de DBO5. Néanmoins il reste encore à mettre à disposition des laboratoires d'analyses impliqués dans le suivi de ce paramètre une 3036405 - 4 - méthode permettant de concilier leurs besoins croissants de rentabilité et de réactivité. Or les inventeurs ont découvert qu'ils pouvaient utiliser la dérivée de l'intensité de fluorescence pour mesurer la dégradation de la matière 5 organique. La dérivée de l'intensité de fluorescence illustrée dans la figure 1 représente la vitesse de consommation de 02. Les molécules organiques les plus facilement assimilables sont dégradées rapidement ( 24h). Aussi les inventeurs ont développé, sur la base de ces différences d'assimilation, un standard complexe spécifique des eaux résiduaires urbaines pour réaliser les courbes étalons. L'invention a donc pour objet une méthode de calibration pour 15 la mesure par fluorescence de la DBO5 d'échantillons à partir d'échantillons de concentrations croissantes dits échantillons de référence ou solutions standards (Stdl à Std8), lesdits échantillons de référence étant préparés à partir d'une même solution mère comprenant : 20 i) de 30 à 60 mg/L d'une peptone Pl, ii) de 20 à 50 mg/L d'un polypeptide P2 d'environ 30 à 50 kDa comprenant au maximum 400 acides aminés iii) de 20 à 50 mg/L d'un polypeptide P3 d'environ 50 à 70 kDa comprenant au maximum 600 acides aminés 25 iv) de 5 à 25 mg/L d'un mélange d'oligosaccharides G1 comprenant entre 15 et 25 unités de glucose, avantageusement 15 unités de glucose. v) de 5 à 25 mg/L d'un polysaccharide G2 à chaînes ramifiées comprenant plusieurs centaines à plusieurs 30 dizaines de milliers d'unités de glucose 3036405 -5 vi) de 130 à 170 d'un polysaccharide G3 à chaînes linéaires organisées en fibres comprenant plusieurs dizaine de milliers à plusieurs millions d'unités de glucose, le total des protéines représentant 35 à 45 % en poids de la 5 matière organique totale présente dans la solution, avantageusement 40 % en poids et le total des glucides représentant 55 à 65 % en poids de de la matière organique totale présente dans la solution, avantageusement 60 %. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les ratios 10 exprimés en % par rapport à la masse totale de matières organiques) sont : P1 = 15% P2 et P3 = 12,5% chacun G1 et G2 = 5% chacun 15 G3 = 50% Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la peptone P1 est une peptone de caséine, faiblement hydrolysée, comprenant de 20 à 30% en poids d'acides aminés libres et 70 à 80% d'oligopeptides et polypeptides de faible poids moléculaire, 20 inférieur à 25 kDa, comprenant au maximum 200 acides aminés. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le polypeptide P2 est de l'albumine de blanc d'oeuf de poule. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le polypeptide P3 est de l'albumine de sérum bovin. 25 Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le glucide G1 est une maltodextrine faiblement hydrolysée (dextrose équivalent = env. 4-7%) aboutissant à un mélange d'oligosaccharides présentant en moyenne une quinzaine d'unités glucose. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le 30 glucide G2 est de l'amidon de pomme de terre. 3036405 -6 Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le glucide G3 est de la cellulose de fibre de coton. La solution mère qui permet de produire la gamme étalon est préparée en solubilisant les différents constituants du standard (G1 à 5 G3 et P1 à P3) dans une solution saline. La solution saline correspond à une dilution au 1/50 dans de l'eau distillée du tampon EnverdiDBO® (réactif B). Le tampon Enverdi-DBO® est fortement inspiré du tampon utilisé dans la norme DBO5 française (NF EN 1899-1 de mai 1998) et comprend : 10 KH2PO4 = 8,5 g/L K2HPO4 = 21,75 g/L Na2HPO4, 12H20 = 33,4 g/L NH4CI = 1,7 g/L MgSO4, 7H20 = 4,5 mg/L 15 FeCI3, 6H20 = 0,25 mg/L CaCl2 = 5,5 mg/L Conformément à l'invention, la solution mère présente en outre les caractéristiques suivantes : 20 demande chimique en oxygène déterminée au moyen de la méthode en tube fermé (ST-DCO) est comprise entre 340-360 mg 02/L (mesurée selon la norme ISO 15705 de 2002), DBO5 comprise entre 120-160 mg 02/L (mesurée 25 selon la norme NF EN 1899-1 de mai 1998) concentration totale en protéines comprise entre 100 et 130 mg/L, avantageusement 115 mg/L, concentration totale en glucides comprise entre 160 et 200 mg/L, avantageusement 180 mg/L 3036405 - 7 - - pH = 7-7,5 (mesurée selon la norme NF T90-008 de 2001), - conductivité = 1,1 à 1,4 mS/cm (mesurée selon la norme NF EN 27888 de 1994). 5 L'homme du métier saura choisir, à la lumière de ses connaissances générales, les quantités de P1 à P3 et G1 à G3 de manière à ce que la solution mère présente ces caractéristiques. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les solutions standards sont les suivantes : 10 Standard 8 (Std 8) ou solution mère (SM) : DBO5 utile (sans G3) = env. 110 mgO2/L Standard 7 (Std 7) ou SM diluée au 2/3 : DBO5 utile (sans G3) = env. 73 mgO2/L Standard 6 (Std 6) ou SM diluée au 1/3 : DBO5 utile (sans 15 G3) = env. 37 mgO2/L Standard 5 (Std 5) ou SM diluée au 1/10 : DBO5 utile (sans G3) = env. 11 mgO2/L Standard 4 (Std 4) ou SM diluée au 1/15 : DBO5 utile (sans G3) = env. 7,5 mgO2/L 20 Standard 3 (Std 3) ou SM diluée au 1/30 : DBO5 utile (sans G3) = env. 3,5 mgO2/L Standard 2 (Std 2) ou SM diluée au 1/75 : DBO5 utile (sans G3) = env. 1,5 mgO2/L Standard 1 (Std 1) ou solution saline : DBO5 25 = 0 mgO2/L Au sens de la présente invention, on entend par « DBO5 utile », la DBO5 mesurée à partir des solutions standards telles que définies précédemment et correspondant à la matière métabolisable en 48 heures. Elle est donc basée sur les peptides P1 à P3 et les 3036405 -8 polysaccharides G1 et G2, G3 n'étant pas métabolisé au bout de 48 heures. Selon leur complexité, les molécules P1 à P3 et G1 à G3, constituant les solutions standards se dégradent plus ou moins 5 rapidement au cours de l'incubation. De même, l'intensité de fluorescence qui résulte de leur dégradation varie en fonction de la quantité d'oxygène requise pour leur minéralisation. Ainsi, le profil de dégradation est divisé en 2 zones : la zone 1 (Z1) de 0 à 24h et la zone 2 (Z2) de 24 à 48h. Le glucide G1 et la protéine P1 sont 10 dégradés en Z1, les protéines P1 et P2, ainsi que le glucide G2 sont dégradés en Z2 (voir figure 2). Le glucide G3 n'est pas significativement dégradé en 48h. Le temps d'incubation correspondant à la limite entre la zone 1 et 2 est indicatif et peut varier selon l'inoculum considéré. 15 Les zones Z1 et Z2 sont calibrées de manière indépendante car la relation qui relie la fluorescence à l'oxygène consommé diffère de par la nature même des molécules qui les constituent et des conditions physico-chimiques du milieu au temps d'incubation considéré. La part de la DBO5 du standard dégradée en Z1 et celle 20 dégradée en Z2 sont calculées à partir des données issues de la production du standard et de mesures DB05 normée effectuées sur le standard et les molécules le constituant en utilisant le même inoculum que celui utilisé avec Enverdi-DBO®, à savoir soit une entrée de Station d'Epuration des eaux usées (STEP) urbaine, soit 25 une préparation commerciale en utilisant les formules suivantes : 3036405 -9 %DBO Z1 = ([G1].DBO5m-G1 + [P1].DBO5m-P1) /I [X].DBO5m-X %DBO Z2 = ([P2].DBO5m-P2 + [P3].DBO5m-P3 + [G2].DBO5m-G2) / E 5 [X].DBO5m-X DBO Z1 = DB05 Stdi x %DBO Z1 DBO Z2 = DB05 Stdi x %DBO Z2 avec : X = Gl, G2, G3, Pl, P2 ou P3 10 [X] = la concentration de la molécule X calculée à partir de la pesée effectuée pour la préparation de la solution mère - en mg/L DBO5m-X = la DBO5 spécifique de la molécule X obtenue par mesure selon la méthode DBO5 de référence avec le même inoculum que celui utilisé dans la méthode Enverdi-DBO® - en mgO2/mg de X 15 E [X].DBO5m-X = la somme des DBO5 apportées par chacune des molécules constituant la solution mère - en mgO2/L DBO5 Stdi = la DBO5 des solutions standards Stdl à Std8 calculée à partir de la mesure effectuée sur la solution mère selon la méthode DBO5 de référence avec le même inoculum que celui utilisé 20 dans la méthode Enverdi-DBO® - en mgO2/L Au final, quatre courbes de calibration sont obtenues : - une courbe de calibration Z1 gamme haute (GH) obtenue à partir des solutions standards Stdl, Std5, Std6, Std7 et Std8 ; - une courbe de calibration Z2 GH obtenue à partir des 25 mêmes solutions standards, Stdl, Std5, Std6, Std7 et Std8 ; - une courbe de calibration Z1 gamme basse (GB) obtenue à partir des solutions standards Stdl, Std2, Std3, Std4 et Std5 et - une courbe de calibration Z2 GB obtenue à partir des mêmes solutions standards Stdl, Std2, Std3, Std4 et Std5. 3036405 - 10 - La valeur reportée sur l'axe des ordonnées des droites de calibration est l'aire sous la courbe des dérivées de fluorescence (AUC), respectivement, en Z1 et en Z2 pour les courbes de calibration de la zone 1 et de la zone 2. Mathématiquement, cela 5 revient à prendre la différence entre les intensités de fluorescence obtenue à 24h et Oh pour Z1 et celles obtenues entre 48 et 24h pour Z2. Les concentrations des différentes solutions standard donc leurs valeurs de DBO5 varient selon l'inoculum considéré et l'homme du 10 métier saura les adapter en conséquence. Pour établir les courbes de calibration, le point Std1 correspond au blanc de mesure (solution tamponnée exempte de matière organique), le point Std2 correspond à une valeur DBO5 d'environ 1,5 mg 02/L, le point Std5 correspond à une valeur DBO5 d'environ 11 mgO2/L et le point Std8 correspond à 15 une valeur DBO5 d'environ 110 mgO2/L. Par ailleurs, pour un inoculum donné, la calibration de la méthode Enverdi-DBO® vis-à-vis de la DBO5 normée peut-être vérifié à l'aide de la solution mère utilisée pour préparer la gamme et, si besoin, réajustée. En conclusion, l'AUC est proportionnelle à la quantité de sonde 20 moléculaire réduite au cours du métabolisme bactérien mis en jeu pour la dégradation de la matière organique et donc à la quantité de dioxygène requise pour cela. L'équivalence avec la DBO5 est obtenue par l'intermédiaire d'un standard complexe représentatif des eaux résiduaires urbaines et dont la DBO5 selon la méthode normée a été 25 mesurée. Pour la quantification des échantillons, les AUC en Z1 et Z2 sont calculées à partir des mesures de fluorescence effectuées au cours de l'incubation et la valeur DBO5 est déterminée grâce aux courbes de calibration établies en sommant la valeur obtenue en Z1 et celle 30 obtenue en Z2. Les échantillons fortement concentrés (entrée de 3036405 station d'épuration) sont quantifiés avec les courbes de calibration GH et ceux faiblement concentrés (sortie de station d'épuration) avec les courbes de calibration GB. Le choix de la gamme adaptée à quantification d'un échantillon est effectué automatiquement en 5 fonction de la valeur de l'AUC obtenue pour l'échantillon en comparaison avec celles obtenues pour les solutions standards et ce de manière indépendante entre Z1 et Z2. Ainsi, par exemple, la quantification d'un échantillon qui présenterait beaucoup de DBO5 en Z1 et peu en Z2, utiliserait la gamme GH en Z1 et la gamme GB en 10 zone 2, ceci afin de garantir un résultat le plus juste possible. L'invention a également pour objet un procédé de mesure rapide de la demande biochimique en oxygène dans des échantillons contenant des matières organiques biodégradables, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : 15 a) incubation avec un bioréactif fluorescent et un inoculum de micro-organismes susceptibles de dégrader l'échantillon à tester, au sein d'une microplaque à plusieurs cupules : - d'une part d'au moins un échantillon contenant des matières organiques biodégradables, et 20 - d'autre part de 8 échantillons de concentrations croissantes appelés échantillons de référence ou solutions standards (Stdl à Std8), préparés à partir d'une même solution mère comprenant : i) de 30 à 60 mg/L d'une peptone Pl, 25 ii) de 20 à 50 mg/L d'un polypeptide P2 d'environ 30 à 50 kDa comprenant au maximum 400 acides aminés, iii) de 20 à 50 mg/L d'un polypeptide P3 d'environ 50 à 70 kDa comprenant au maximum 600 acides aminés, 3036405 - 12 - iv) de 5 à 25 mg/L d'un mélange d'oligosaccharides G1 comprenant entre 15 et 25 unités de glucose, avantageusement 15 unités de glucose, v) de 5 à 25 mg/L d'un polysaccharide G2 à chaînes 5 ramifiées comprenant plusieurs centaines à plusieurs dizaines de milliers d'unités de glucose, vi) de 130 à 170 d'un polysaccharide G3 à chaînes linéaires organisées en fibres comprenant plusieurs dizaine de milliers à plusieurs millions d'unités de glucose, 10 le total des protéines représentant 35 à 45 % en poids de la matière organique totale présente dans la solution, avantageusement 40 % en poids et le total des glucides représentant 55 à 65 % en poids de de la matière organique totale présente dans la solution, avantageusement 60 %. 15 - G1 et P1 étant dégradés entre 0 et 24 heures d'incubation (zone 1 ou Z1), G2, P2 et P3 étant dégradés entre 24 et 48 heures d'incubation (zone 2 ou Z2) et G3 n'étant pas dégradé en 48 heures, lesdits échantillons de référence ou solutions standard permettant de construire quatre 20 courbes de calibration suivant la zone de dégradation Z1 ou Z2 et fonction des concentrations des échantillons de référence; b) analyse de la fluorescence émise par lesdits échantillons au cours du temps, ladite analyse de fluorescence comprenant 25 trois étapes : - mesure d'une intensité de fluorescence émise suite à la dégradation de l'échantillon à tester et des échantillons de référence sous l'effet de l'inoculum de micro-organismes, pendant 45-55 heures, avantageusement 48 heures, 3036405 - 13 - - utilisation de ladite intensité de la fluorescence mesurée pour l'échantillon à tester pour calculer une concentration de matière organique de référence, par comparaison avec l'intensité de la fluorescence mesurée pour les échantillons 5 de référence, et - conversion de cette concentration de matière organique en valeurs nng02.L-1 équivalentes à la norme DBO5 (demande biologique en oxygène sur 5 jours), par application d'un modèle de correspondance obtenu 10 préalablement par comparaison entre des mesures de l'intensité de fluorescence réalisées selon le même procédé sur les échantillons de référence et des mesures réalisées selon la norme DBO5 pour lesdits échantillons de référence. 15 En pratique, les étapes d'utilisation de l'intensité de la fluorescence et de conversion de la concentration de matière organique peuvent être réalisées simultanément puisqu'on passe directement de la fluorescence à une valeur en mgO2/L grâce aux courbes de calibration et à la caractérisation préalable de ce standard 20 selon la méthode normée. La méthode selon l'invention peut être utilisée en routine pour la quantification de la DBO5 d'eaux résiduaires urbaines (brutes, eu cours ou après traitement). Outre l'analyse d'eaux résiduaires urbaines, ladite méthode peut être utilisée pour tout échantillon 25 d'eaux résiduaires industrielles qui présenterait des caractéristiques proches des eaux résiduaires urbaines, c'est-à-dire dont la matière organique biodégradable est majoritairement constituée de molécules biochimiques. La méthode s'est ainsi révélée valable pour les eaux usées des industries agro-alimentaires et papetières. La méthode 30 peut également être utilisée pour les eaux de surfaces et les eaux 3036405 - 14 - naturelles pour peu que la limite de quantification soit de 0,5 mgO2/L tel que l'impose la norme DBO5 pour ce type d'échantillon (NF EN 1899-2) ; quel que soit le type d'eau analysé, le pH des échantillons doit-être compris entre 6 et 8 ; si ce n'est pas le cas, le pH doit être 5 ajusté au préalable. Conformément à l'invention, les échantillons contenant des matières organiques peuvent être prélevés à n'importe quel endroit d'une installation de traitement des eaux usées ou en sortie d'usine ou d'un site d'activité générant des déchets. 10 Comme pour la méthode normée, la dilution des échantillons avant analyse se base sur leur valeur totale en matière organique mesurée par la DCO et exprimée également en mgO2/L. Si la DBO5 estimée à partir de la DCO est inférieur à la DBO5 du std8 alors 15 l'échantillon peut être analysé brut, sinon, l'échantillon doit être dilué de manière adéquate dans de l'eau saline (réactif B dilué au 1/50ème dans de l'eau déminéralisée). Le programme de traitement automatisé des données fourni par Envolure permet également de déterminer le taux de dilution adéquate des échantillons à partir de la 20 DCO mesurée ainsi que de définir, avant analyse, le plan de plaque, c'est-à-dire la position sur la microplaque des différentes solutions standards (gamme étalon) et des échantillons. L'analyse des échantillons et de la gamme étalon doit-être effectuée en duplicats ou triplicats ; une microplaque 96 puits permet ainsi d'analyser 25 simultanément 40 échantillons en duplicats ou 24 échantillons en triplicats. L'ajustement éventuel du pH des échantillons, la détermination de la dilution des échantillons à partir de leur DCO et la définition du plan de plaque constituent ainsi les premières étapes de l'analyse. Le lecteur/incubateur de microplaque doit également être 3036405 - 15 - mis à préchauffer à 30°C afin d'être à la bonne température le moment venu. Une fois ces premières étapes effectuées et après avoir procédé à la dilution des échantillons, ceux-ci doivent être prétraités. Le 5 prétraitement des échantillons consiste en une stérilisation partielle afin d'inhiber l'activité des bactéries naturellement présentes au sein de ces derniers. De cette manière, les échantillons et les standards (qui ne contiennent pas initialement de bactéries) sont analysés dans les mêmes conditions d'inoculation ce qui permet d'aboutir à des 10 résultats comparables. Pour ce faire, les échantillons préalablement dilués sont transférés dans la microplaque en polypropylène à l'aide d'une micropipette en respectant le plan de plaque défini en amont. Le volume transféré est de 200 pL. La microplaque est recouverte d'un film en aluminium afin d'empêcher l'évaporation et placée dans 15 une étuve à 120°C pendant 10 minutes. A la fin de ce temps, la plaque est placée à 4°C dans un réfrigérateur pendant 10 min afin de revenir à température ambiante et de condenser les vapeurs éventuelles. Pendant le prétraitement des échantillons, l'inoculum peut être 20 préparé. Pour cela, l'eau usée utilisée à cette fin (entrée de Station d'Epuration des eaux usées ou STEP) est soit filtrée à 1,2 pm à l'aide de la seringue et filtres seringues fournis dans le kit, soit centrifugée à 5000 g pendant 30 s. Le filtrat ou le surnageant de centrifugation est récupéré et dilué dans de l'eau saline (réactif B dilué au 1/50ème 25 dans de l'eau déminéralisée). Une fois les échantillons prétraités et l'inoculum préparé, la microplaque en polystyrène peut-être remplie en vue de l'incubation des échantillons en présence de l'inoculum avec suivi de la fluorescence au cours du temps. Pour cela, chaque puits de la 3036405 - 16 - microplaque qui sera utilisé pour l'analyse doit-être rempli, en respectant l'ordre suivant, avec : 20 pL de réactif A 60 pL de réactif B 170 pL d'échantillon ou de solution standard (selon plan de plaque défini) 20 pL d'inoculum A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B C D E F G H Std1 Std1 Ech1 Ech1 Ech9 Ech9 Ech17 Ech17 Ech25 Ech25 Ech33 Ech33 Std2 Std2 Ech2 Ech2 Ech10 Ech10 Ech18 Ech18 Ech26 Ech26 Ech34 Ech34 Std3 Std3 Ech3 Ech3 Ech11 Ech11 Ech19 Ech19 Ech27 Ech27 Ech35 Ech35 Std4 Std4 Ech4 Ech4 Ech12 Ech12 Ech20 Ech20 Ech28 Ech28 Ech36 Ech36 Std5 Std5 Ech5 Ech5 Ech13 Ech13 Ech21 Ech21 Ech29 Ech29 Ech37 Ech37 Std6 Std6 Ech6 Ech6 Ech14 Ech14 Ech22 Ech22 Ech30 Ech30 Ech38 Ech38 Std7 Std7 Ech7 Ech7 Ech15 Ech15 Ech23 Ech23 Ech31 Ech31 Ech39 Ech39 Std8 Std8 Ech8 Ech8 Ech16 Ech16 Ech24 Ech24 Ech32 Ech32 Ech40 Ech40 Std1 à Std8 correspondent à Std1 à Std8 définis précédemment 5 Ech = échantillon testé Ces volumes doivent être introduits avec des micropipettes ou avec une pipette distributrice. La microplaque remplie, le film perméable aux gaz est positionné sur celle-ci. En plus de permettre les échanges 10 gazeux afin d'assurer l'aérobiose, ce film permet également de limiter l'évaporation du contenu des puits. La microplaque peut ensuite être introduite dans le lecteur/incubateur préchauffé à 30°C et la séquence d'analyse est démarrée. La séquence d'analyse dure 48h avec une mesure de fluorescence (Xex/Xem = 540/600 nm) toutes les 15 30 min. Chaque mesure de fluorescence est précédée d'une agitation linéaire de la microplaque. Lorsque la séquence d'analyse est terminée, les données brutes peuvent être traitées de manière automatisée par un programme informatique fourni par Envolure. La DBO5 des échantillons est alors calculée tel que décrit 20 précédemment. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention le bioréactif fluorescent est un dérivé de la Résazurine (n° CAS : 550- 3036405 - 17 - 82-3) commercialisé par la société Invitrogen - Life Technologies sous le nom de Prestoblue®. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la température d'incubation est comprise entre 25 et 35 °C, 5 avantageusement 30 à 35 °C, encore plus avantageusement égale à 30 °C. A ces températures, l'accélération des cinétiques permet d'aboutir à un équivalent DBO5 après 48h seulement au lieu de 5 jours dans les conditions de la méthode normée (incubation à 20°C). Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, 10 l'incubation est réalisée dans un milieu tampon à pH 7,2 apte à fournir les nutriments essentiels aux bactéries : phosphore, azote et oligo-éléments, avantageusement dans un tampon phosphate à pH 7,2. Conformément à l'invention, le procédé peut être appliqué à un 15 effluent de station d'épuration choisi parmi les eaux brutes, les eaux décantées, les eaux traitées biologiquement et les rejets, une eau de surface ou une eau souterraine, un effluent ou un déchet de production artisanale ou industrielle. L'invention a également pour objet un kit utile pour la mise en 20 oeuvre du procédé selon l'invention et comprenant : le bioréactif fluorescent, les échantillons de référence et la solution tampon. Les exemples 1 et 2 et les figures 1 à 3 qui suivent illustrent l'invention. La figure 1 illustre la dérivée de l'intensité de fluorescence en 25 fonction du temps pour les solutions standards Std1 à Std 8; les molécules organiques les plus facilement assimilables sont dégradées rapidement ( 24h). 3036405 - 18 - La figure 2 montre la corrélation entre les valeurs de DB05 de substitution et de référence pour les trois sites de prélèvements (O Lab du Syndicat Interdépartemental pour l'Assainissement de l'Agglomération Parisienne (SIAAP) ; - Lab du Milwaukee 5 Metropolitan Sewerage District (MMSD) et © Lab no 3). Les lignes Inc. sup. et Inc. inf. représentent respectivement les limites supérieures et inférieures de l'incertitude absolue généralement admises pour les valeurs de DB05 fournies par la méthode standard. La figure 3 illustre le profil de dégradation de Pl, P2, G1 et G2 ; 10 ce profil est divisé en 2 zones : la zone 1 (Z1) de 0 à 24h et la zone 2 (Z2) de 24 à 48h. Le glucide G1 et la protéine P1 sont dégradés en Z1, les protéines P1 et P2, ainsi que le glucide G2 sont dégradés en Z2. 15 Exemple 1 : Protocole de calibration La valeur DB05 d'un échantillon selon la méthode normée pouvant varier selon l'inoculum utilisé, il est nécessaire avant toute utilisation en routine de la méthode Enverdi-DBO® de calibrer celle-ci en fonction de l'inoculum utilisé en comparaison de la méthode DB05 20 normée. Cette étape permet également, selon les caractéristiques de l'inoculum, de préciser son protocole de préparation et en particulier le facteur de dilution qui devra être appliqué avant de l'utiliser pour l'analyse. Enfin, pour chaque inoculum on détermine le temps d'incubation qui délimite exactement les deux zones de calibration 25 (Z1 et Z2). Pour chaque méthode, on utilise les solutions indiquées dans le tableau ci-dessous : 30 3036405 - 19 - Méthode normée (NF EN 1899-1 de mai 1998) Enverdi-DBO® Std8 Std1 à Std 8 G1 à 100 mg/L G1 à 100 mg/L G2 à 100 mg/L G2 à 100 mg/L G3 à 100 mg/L G3 à 100 mg/L P1 à 100 mg/L P1 à 100 mg/L P2 à 100 mg/L P2 à 100 mg/L P3 à 100 mg/L P3 à 100 mg/L Selon la méthode normée, les valeurs DBO5 pour StdO à Std7 sont déterminées par calcul à partir de la valeur de Std8 ; on détermine la valeur DBO5 des solutions standards Std1 à Std8 pour 5 l'inoculum considéré (DBO5-Stdi) et on détermine la fraction de DBO5 dégradée en Z1 et celle dégradée en Z2 soit %DBO Z1 et %DBO Z2 ; ces valeurs peuvent être intégrées dans un programme de traitement automatisé des résultats. Selon la méthode Enverdi-DBO®, on détermine le temps 10 d'incubation délimitant Z1 et Z2 (Z1 doit contenir les pics de dégradation de G1 et P1 ; Z2 doit contenir les pics de dégradation de P2, P3 et G2) puis on détermine le facteur de dilution de l'inoculum : la fluorescence obtenue pour le Std1 doit être la plus faible possible et l'analyse du Std8 ne doit pas conduire à une limitation par la sonde 15 de la fluorescence produite (saturation). Dans le même temps, l'inoculum doit-être en mesure de dégrader P2, P3 en moins de 48h. La dilution optimale de l'inoculum correspond donc au meilleur compromis conduisant à la vérification de ces deux critères. Après calibration de la méthode Enverdi-DBO® vis-à-vis de la 20 DBO5 normée pour un inoculum donné et détermination du facteur de 3036405 - 20 - dilution optimal de l'inoculunn, il convient de valider cette calibration et cette dilution d'inoculunn en comparant les résultats obtenus via les deux méthodes sur un panel varié d'échantillons très faiblement à fortement concentrés en DBO5, ainsi que sur le contrôle recommandé 5 dans la norme DBO5. Si nécessaire, la calibration ou la dilution de l'inoculum peuvent être ajustées à cette étape afin d'aboutir à des résultats statistiquement comparables sur les deux méthodes pour les mêmes échantillons et le même inoculum. On utilise pour cette calibration 20 échantillons de DBO5 faibles à très faibles ( 20 mgO2/L). Un témoin acide glutamique-glucose (AGG) à 210 mgO2/L est utilisé comme témoin de la norme DBO5. La calibration peut être également réalisée en utilisant des solutions standards mixtes : Std Z1 (mélange d'une solution de G1 et 15 d'une solution de P1 à respectivement, 15 et 45 mg/L), Std Z2 (mélange d'une solution de P2, d'une solution de P3 et d'une solution de G2 à des concentrations respectives de 35, 35 et 15 mg/L) et Std8 correspondant à la solution standard elle-même qui contient G1, Pl, P2, P3, G2 et G3 à des concentrations respectives de 15, 45, 35, 35, 20 15 et 150 mg/L). Exemple 2 : Comparaison des résultats obtenus avec la méthode selon l'invention et des méthodes standards (Norme US et norme UE) 25 1. Mode opératoire Un total de 109 échantillons moyennés 24 h d'eaux usées brutes et traitées a été recueilli sur une période de 20 jours à partir des diverses stations d'épuration des deux MMSD (Milwaukee, USA) et le SIAAP (Paris, France). Ces échantillons ont été stockés à 4 °C et 30 analysés dans les 48 h. Juste avant l'analyse, 25 ml des échantillons 3036405 - 21 - ont été partiellement stérilisés pendant 3-7 min en utilisant un four à micro-ondes réglé à une puissance minimale ( REVENDICATIONS1. Méthode de calibration pour la mesure par fluorescence de la DBO5 d'échantillons à partir d'échantillons de concentrations croissantes dits échantillons de référence ou solutions standards (Std1 à Std8), lesdits échantillons de référence étant préparés à partir d'une même solution mère comprenant : i) de 30 à 60 mg/L d'une peptone P1 qui est une peptone de caséine, faiblement hydrolysée, comprenant de 20 à 30% en poids d'acides aminés libres et 70 à 80% d'oligopeptides et polypeptides de faible poids moléculaire, inférieur à 25 kDa, comprenant au maximum 200 acides aminés, ii) de 20 à 50 mg/L d'un polypeptide P2 qui est de l'albumine de blanc d'oeuf de poule, d'environ 30 à 50 kDa comprenant au maximum 400 acides aminés, iii) de 20 à 50 mg/L d'un polypeptide P3 qui est de l'albumine de sérum bovin d'environ 50 à 70 kDa comprenant au maximum 600 acides aminés iv) de 5 à 25 mg/L d'un mélange d'oligosaccharides G1 comprenant entre 15 et 25 unités de glucose, avantageusement 15 unités de glucose, v) de 5 à 25 mg/L d'un polysaccharide G2 à chaînes ramifiées comprenant plusieurs centaines à plusieurs dizaines de milliers d'unités de glucose qui est de l'amidon de pomme de terre, vi) de 130 à 170 mg d'un polysaccharide G3 à chaînes linéaires organisées en fibres comprenant plusieurs dizaine de milliers à plusieurs millions d'unités de glucose qui est de de la cellulose de fibre de coton. 3036405 - 24 - le total des protéines représentant 35 à 45 % en poids de la matière organique totale présente dans la solution, avantageusement 40 % en poids et le total des glucides représentant 55 à 65 % en poids de de la matière organique 5 totale présente dans la solution, avantageusement 60 °h. 2. Procédé de mesure rapide de la demande biochimique en oxygène dans des échantillons contenant des matières organiques biodégradables, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : 10 a) incubation, avec un bioréactif fluorescent et un inoculum de micro-organismes susceptibles de dégrader l'échantillon à tester, au sein d'une microplaque à plusieurs cupules : d'une part d'au moins un échantillon contenant des matières organiques, et 15 - d'autre part de 8 échantillons de concentrations croissantes appelés échantillons de référence (Stdl à Std8), préparés à partir d'une même solution mère comprenant : i) de 30 à 60 mg/L d'une peptone P1 qui est une peptone 20 de caséine, faiblement hydrolysée, comprenant de 20 à 30% en poids d'acides aminés libres et 70 à 80% d'oligopeptides et polypeptides de faible poids moléculaire, inférieur à 25 kDa, comprenant au maximum 200 acides aminés' 25 ii) de 20 à 50 mg/L d'un polypeptide P2 qui est de l'albumine de blanc d'oeuf de poule, d'environ 30 à 50 kDa comprenant au maximum 400 acides aminés, iii) de 20 à 50 mg/L d'un polypeptide P3 qui est de l'albumine de sérum bovin d'environ 50 à 70 kDa comprenant au 30 maximum 600 acides aminés, 3036405 - 25 - iv) de 5 à 25 mg/L d'un mélange d'oligosaccharides G1 comprenant entre 15 et 25 unités de glucose, avantageusement 15 unités de glucose, de 5 à 25 mg/L d'un polysaccharide G2 à chaînes 5 ramifiées comprenant plusieurs centaines à plusieurs dizaines de milliers d'unités de glucose qui est de l'amidon de pomme de terre, vi) de 130 à 170 mg d'un polysaccharide G3 à chaînes linéaires organisées en fibres comprenant plusieurs 10 dizaine de milliers à plusieurs millions d'unités de glucose qui est de de la cellulose de fibre de coton, le total des protéines représentant 35 à 45 % en poids de la matière organique totale présente dans la solution, avantageusement 40 °h en poids et le total des glucides 15 représentant 55 à 65 % en poids de de la matière organique totale présente dans la solution, avantageusement 60 %. - G1 et P1 étant dégradés entre 0 et 24 heures d'incubation (zone 1 ou Z1), G2, P2 et P3 étant dégradés entre 24 et 48 heures d'incubation (zone 2 ou Z2) et G3 n'étant pas 20 dégradé en 48 heures, lesdits échantillons de référence ou solutions standard permettant de construire quatre courbes de calibration suivant la zone de dégradation Z1 ou Z2 et fonction des concentrations des échantillons de référence; 25 b) analyse de la fluorescence émise par lesdits échantillons au cours du temps, ladite analyse de fluorescence comprenant trois étapes : mesure d'une intensité de fluorescence émise suite à la dégradation de l'échantillon à tester et des échantillons 30 de référence sous l'effet de l'inoculum de micro- 3036405 - 26 - organismes, pendant 45 à 50 heures, avantageusement 48 heures, - utilisation de ladite intensité de la fluorescence mesurée pour l'échantillon à tester pour calculer une concentration 5 de matière organique de référence, par comparaison avec l'intensité de la fluorescence mesurée pour les échantillons de référence, et - conversion de cette concentration de matière organique en valeurs mg02.L-1 équivalentes à la norme 10 DBO5 (demande biologique en oxygène sur 5 jours), par application d'un modèle de correspondance obtenu préalablement par comparaison entre des mesures de l'intensité de fluorescence réalisées selon le même procédé sur les échantillons de référence et des mesures 15 réalisées selon la norme DBO5 pour lesdits échantillons de référence. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que la concentration en matière organique biodégradable des échantillons de 20 référence Std1 à Std8 correspond à une valeur de DBO comprise entre 0 et environ 110 mg02.L-1. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que l'incubation est réalisée dans un milieu tampon 25 phosphate à pH 7,2 à une température comprise entre 25 et 35°C. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 caractérisé en ce que l'échantillon organique est un effluent de station d'épuration choisi parmi les eaux brutes, les eaux décantées, les eaux 30 traitées biologiquement et les rejets, une eau de surface ou une eau 3036405 - 27 - souterraine, un effluent ou un déchet de production artisanale ou industriel. 6. Kit utile pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 5 2 caractérisé en ce qu'il comprend : le réactif biofluorescent, les échantillons de référence et la solution tampon.