Brevet FR3035407A1 — publié le 20161028

La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de conservation à moyen et long termes de cellules, tissus ou organes. Ce procédé est plus particulièrement destiné à la conservation des greffons jusqu'à leur transplantation chez le receveur. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION A ce jour, la cryopréservation est la seule méthode disponible pour la conservation des greffons de cellules hématopoïétiques à moyen et long termes. En effet, sans congélation et à une température de 4°C, il a été observé que le nombre et la capacité fonctionnelle des cellules progénitrices contenues dans les greffons diminuaient drastiquement après seulement 3 jours de conservation (Hechler et al., 1996). La cryopréservation présente cependant des inconvénients notables, notamment la possibilité d'agglutination durant la décongélation ou le risque de réaction anaphylactique déclenchée par la présence de cryoprotecteurs. De plus, cette méthode n'est pas applicable à tous les types cellulaires. De précédentes études ont démontré que la conservation à court-terme à 4°C des cellules souches hématopoïétiques CD34+ était améliorée en modifiant les conditions atmosphériques des cultures, notamment en diminuant la concentration en oxygène et augmentant la concentration en dioxyde de carbone (Vlaski et al., 2014). Bien que notables, ces améliorations demeurent insuffisantes pour assurer la survie et le maintien des capacités fonctionnelles des cellules, et en particulier des cellules progénitrices, pour une conservation à long terme à 4°C. Un procédé optimal permettrait de conserver à long terme les greffons en conditions d'hypothermie, sans congélation, et simplifierait ainsi la logistique et les processus de greffe tout en améliorant les résultats obtenus chez le receveur. RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs ont démontré que la pré-incubation de cellules en hypothermie modérée et sous une atmosphère hypoxique et/ou hypercapnique avant d'être conservées en hypothermie sévère permettait d'améliorer considérablement la survie et la capacité de prolifération desdites cellules, notamment dans le cas de cellules souches. 3035407 2 Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo de conservation de cellules animales, de préférence de cellules humaines, en hypothermie sévère comprenant une étape consistant à maintenir lesdites cellules en hypothermie modérée et sous une atmosphère hypoxique et/ou hypercapnique durant 5 environ 12 à environ 72 heures, avant de les conserver en hypothermie sévère. Les cellules peuvent être conservées en hypothermie sévère à une température comprise entre environ 1°C et environ 12°C, de préférence environ 4°C. Les cellules peuvent être maintenues en hypothermie modérée à une température comprise entre environ 20°C et environ 35°C, de préférence environ 30°C. 10 Les cellules peuvent être maintenues en hypothermie modérée et sous une atmosphère hypoxique et/ou hypercapnique durant environ 24 à environ 48 heures, de préférence durant environ 48 heures. L'atmosphère hypoxique peut comprendre environ 0,5 à environ 10 % de dioxygène, de préférence environ 5 % de dioxygène. 15 L'atmosphère hypercapnique peut comprendre environ 5 à environ 20 % de dioxyde de carbone, de préférence environ 9 % de dioxyde de carbone. De préférence, les cellules sont maintenues en hypothermie modérée et sous une atmosphère hypoxique et hypercapnique. Les cellules conservées selon le procédé de l'invention peuvent être des cellules 20 de peau, de cartilage, des ostéocytes, des cellules endothéliales, des cellules musculaires, des cellules neurales, des cellules rétiniennes, des cellules pancréatiques, des cellules sanguines, ou des cellules souches ou progénitrices capables de se différencier en ces cellules. Ces cellules peuvent notamment être organisées en tissu, de préférence 25 sélectionné dans le groupe constitué de la peau, la cornée, un tendon, un tissu osseux, un vaisseau sanguin, un nerf, une valve cardiaque, une membrane amniotique, un tissu cartilagineux, un îlot de Langerhans et un tissu musculaire, ou organisées en organe complet ou partiel, de préférence sélectionné dans le groupe constitué du rein, foie, coeur, cordon ombilical, placenta, intestin, poumon et pancréas. De préférence, les cellules conservées sont des cellules souches hématopoïétiques, des cellules souches mésenchymateuses, ou une combinaison de celles-ci, de préférence des cellules souches hématopoïétiques. 3035407 3 Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une trousse comprenant un milieu de conservation cellulaire, un premier conteneur stérile destiné à recevoir des cellules, tissus ou organes et le milieu de conservation cellulaire, et un dispositif permettant de créer une atmosphère hypoxique et/ou hypercapnique dans le 5 premier conteneur comprenant les cellules, tissus ou organes, et optionnellement un second conteneur permettant d'assurer le maintien du premier conteneur et/ou des cellules, tissus ou organes à une température contrôlée. Alternativement, la trousse peut comprendre un conteneur stérile destiné à recevoir des cellules, tissus ou organes et le milieu de conservation cellulaire renfermant 10 une atmosphére hypoxique et/ou hypercapnique, ledit conteneur stérile étant optionnellement pré-rempli avec du milieu de conservation cellulaire. Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne également l'utilisation d'une trousse selon l'invention pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, c'est-à-dire pour conserver des cellules animales en hypothermie sévère. 15 BREVE DESCRIPTION DES DESSINS Figure 1 : Cellules CD34+ de sang placentaire. Rendement des cellules viables par rapport à t=0. Air : 21% 02, et 0.01% CO2 ; : 9% CO2 et 5% 02; Hypo : 5% 02 et 0.001 CO2 ; Hyper : 20% 02 et 20% CO2. * : p REVENDICATIONS1. Procédé in vitro ou ex vivo de conservation de cellules animales, de préférence de cellules humaines, en hypothermie sévère comprenant une étape consistant à maintenir lesdites cellules en hypothermie modérée et sous une atmosphère hypoxique et/ou hypercapnique durant environ 12 à environ 72 heures, avant de les conserver en hypothermie sévère. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les cellules sont conservées en hypothermie sévère à une température comprise entre environ 1°C et environ 12°C, de préférence environ 4°C. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les cellules sont maintenues en hypothermie modérée à une température comprise entre environ 20°C et environ 35°C, de préférence environ 30°C. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les cellules sont maintenues en hypothermie modérée et sous une atmosphère hypoxique et/ou hypercapnique durant environ 24 à environ 48 heures, de préférence durant environ 48 heures. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'atmosphère hypoxique comprend environ 0,5 à environ 10 % de dioxygène, de préférence environ 5 % de dioxygène. 25 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'atmosphère hypercapnique comprend environ 5 à environ 20 % de dioxyde de carbone, de préférence environ 9 % de dioxyde de carbone. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les cellules 30 sont maintenues en hypothermie modérée et sous une atmosphère hypoxique et hypercapnique. 20 3035407 17 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les cellules sont des cellules de peau, de cartilage, des ostéocytes, des cellules endothéliales, des cellules musculaires, des cellules neurales, des cellules rétiniennes, des cellules pancréatiques, des cellules sanguines, ou des cellules souches ou progénitrices capables 5 de se différencier en ces cellules. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les cellules sont organisées en tissu, de préférence sélectionné dans le groupe constitué de la peau, la cornée, un tendon, un tissu osseux, un vaisseau sanguin, un nerf, une valve cardiaque, une 10 membrane amniotique, un tissu cartilagineux, un îlot de Langerhans et un tissu musculaire, ou organisées en organe complet ou partiel, de préférence sélectionné dans le groupe constitué du rein, foie, coeur, cordon ombilical, placenta, intestin, poumon et pancréas. 15 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les cellules sont des cellules souches hématopoïétiques, des cellules souches mésenchymateuses, ou une combinaison de celles-ci, de préférence des cellules souches hématopoïétiques. 11. Trousse comprenant un milieu de conservation cellulaire, un premier conteneur stérile destiné à recevoir des cellules, tissus ou organes et le milieu de conservation cellulaire, et un dispositif permettant de créer une atmosphère hypoxique et/ou hypercapnique dans le premier conteneur comprenant les cellules, tissus ou organes, et optionnellement un second conteneur permettant d'assurer le maintien du premier conteneur et/ou des cellules, tissus ou organes à une température contrôlée. 12. Trousse comprenant un conteneur stérile destiné à recevoir des cellules, tissus ou organes et le milieu de conservation cellulaire renfermant une atmosphére hypoxique et/ou hypercapnique, ledit conteneur stérile étant optionnellement pré-rempli avec du milieu de conservation cellulaire. 13. Utilisation de la trousse selon la revendication 11 ou 12 pour conserver des cellules animales selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 10.