Brevet FR3033575A1 — publié le 20160916

Milieu et procédé de culture des mycobactéries comprenant du sérum d'agneau. La présente invention concerne un nouveau milieu de culture des mycobactéries, en particulier des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, permettant de réduire de façon significative les délais d'isolement par culture et donc le délai de diagnostic des mycobactérioses, en particulier de la tuberculose. Les mycobactéries sont des bactéries classées dans le phylum des Actinobacteria par le séquençage du gène 165 ARNr et par les analyses dites "multilocus phylogeny" [Mignard S, Flandrois JP. A seven-gene, multilocus, genus-wide approach to the phylogeny of mycobacteria using supertrees. Int 3 Syst Evol Microbiol. 2008;58:1432-41] et caractérisées par la présence d'acides mycoliques dans leur paroi, ce qui leur confère une affinité tinctoriale particulière mise en évidence notamment par la coloration de Ziehl-Neelsen, et par un chromosome à haut G + C % > 60 % [Pfyffer GE. Mycobacterium : general characteristics, laboratory detection, in staning procedures. In : Murray Pr, Baron E3, Jorgensen 31-1, Landry ML, Pfaller MA. Manual of Clinical Microbiology 9ème Eds. Amercian Society for Microbiology, Washington DC; 2007, pp. 543-572]. Le genre bactérien Mycobacterium comporte plus de cent espèces, dont des espèces environnementales isolées d'environnements inertes (sol, eau), des espèces associées aux animaux et une espèce essentiellement associée à l'homme, Mycobacterium leprae, agent de la lèpre [Cole S et al. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature 2001;409:1007-11]. Certaines espèces environnementales sont responsables d'infections opportunistes chez l'homme (les espèces du complexe Mycobacterium aviurn et du complexe Mycobacterium abscessus par exemple) et certaines espèces sont responsables de zoonoses, en particulier certaines espèces de complexe Mycobacterium tuberculosis, responsables de la tuberculose [Ghodbane R, Drancourt M. Non-human sources of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 2013 Nov;93(6): 589-95]. Le diagnostic des mycobactérioses repose sur l'isolement et la culture de l'une des espèces du genre Mycobacterium à partir d'un prélèvement clinique réalisé chez l'homme ou chez l'animal. De ce point de vue, le genre Mycobacterium comporte une espèce non-cultivable en milieu axénique (Mycobacterium leprae), des espèces de croissance rapide (Mycobacterium fortuiturn, Mycobacterium abscessus) donnant des colonies visibles en moins de sept jours de culture et des espèces à croissance lente donnant des colonies visibles en plus de sept jours de culture, soit en pratique de routine, entre 3 et 8 semaines de culture, notamment avec des milieux Middlebrook. En médecine humaine, les espèces du complexe Mycobacterium aviurn sont détectables après 10-20 jours de culture et les espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis requièrent 10-100 organismes viables par ml de 3033575 2 prélèvement et 6-8 semaines de culture pour obtenir 100% de prélèvements positifs [Colebunders R, Bastian I. A review of the diagnosis and treatment of smear-negative pulmonary tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2000;4:97-107]. Etant donné l'importance numérique et la gravité des cas de tuberculose humaine, c'est sur le diagnostic de la 5 tuberculose que les améliorations des techniques de laboratoire sont particulièrement sensibles. En effet, la tuberculose est une maladie infectieuse de l'homme et des animaux due à l'une des neuf espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis(et les souches BCG qui en sont dérivées), Mycobacterium africanurn, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium rnicroti, 10 Mycobacteriurn pinnipedll[Dye C. et al. Prospects for worlwide tuberculosis control under the WHO DOTS strategy. Lancet 1998; 352:1886-91; Bos KI, Harkins KM, Herbig A, Coscolla M, Weber N, Comas I, Forrest SA, Bryant JM, Harris SR, Schuenemann VJ, Campbell TJ, Majander K, Wilbur AK, Guichon RA, Wolfe Steadman DL, Cook DC, Niemann S, Behr MA, Zumarraga M, Bastida R, Huson D, Nieselt K, Young D, Parkhill J, Buikstra JE, Gagneux S, 15 Stone AC, Krause J. Pre-Columbian mycobacterial genomes reveal seals as a source of New World human tuberculosis. Nature 2014;514:494-7], Mycobacterium rnungi [Alexander KA, Laver PN, Michel AL, Williams M, van Helden PD, Warren RM, Gey van Pittius NC. Novel Mycobacterium tuberculosis complex pathogen, M. mungi. Emerg Infect Dis. 2010;16:12969] et Mycobacterium suricattae [Parsons SD, Drewe JA, Gey van Pittius NC, Warren RM, van 20 Helden PD. Novel cause of tuberculosis in meerkats, South Africa. Emerg Infect Dis. 2013;19:2004-7]. L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a estimé que la tuberculose a été responsable de 9 millions de nouveaux cas et de 1,5 millions de décès en 2013 [World Health Organization. 2014. Global tuberculosis report 2014: Geneva : World Health Organization]. Ces chiffres soulignent l'importance qu'il y a à optimiser le diagnostic 25 microbiologique de la tuberculose afin d'améliorer la prise en charge médicale des patients et de leur entourage. L'isolement et la culture des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis sont réalisées à partir de prélèvements cliniques obtenus chez un patient présentant des signes et des symptômes évocateurs de la tuberculose. La forme clinique la plus fréquente, 30 qui est aussi la seule forme clinique contagieuse, est la tuberculose pulmonaire qui est diagnostiquée par l'isolement et la culture d'une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis à partir d'un prélèvement respiratoire tel que l'expectoration, l'aspiration bronchique, le liquide de lavage broncho-alvéolaire obtenu sur bronchoscopie, voire la biopsie pulmonaire. Chez les patients ne produisant pas d'expectoration, les selles peuvent 35 être utilisées comme une alternative pour l'isolement et la culture des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis en cas de tuberculose pulmonaire [El Khéchine A, Henry M, Raoult D, Drancourt M. Detection of Mycobacterium tuberculosis complex 3033575 3 organisms in the stools of patients with pulmonary tuberculosis. Microbiology 2009;155:2384-9]. Il existe d'autres formes cliniques de tuberculose, en particulier la tuberculose ganglionnaire, mais également les tuberculoses osseuses (Mal de Pott) ainsi que les tuberculoses digestives. En fonction de la forme clinique, différents prélèvements 5 cliniques peuvent être adressés au laboratoire pour isoler et cultiver les mycobactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis et diagnostiquer les formes extrapulmonaires. Pour l'isolement et la culture des mycobactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis, on dispose de milieux solides, de milieux liquides, et de milieux biphasiques comportant une phase liquide et une phase solide. Les milieux solides sont fabriqués à base 10 de gélose ou d'agar. Les milieux contenant de l'oeuf entier sont l'utilisation très courante et le milieu le plus utilisé est le milieu de Lôwenstein Jensen. Ce milieu, comme les autres milieux contenant de l'oeuf, contient du vert malachite qui participe à inhiber la croissance des microorganismes contaminants. Plusieurs formulations contenant des concentrations variables de vert malachite ont été proposées avec comme résultat constant qu'une 15 diminution de la concentration de vert malachite augmente le ratio de contamination du milieu et une augmentation de la concentration de vert malachite tend à diminuer l'isolement et la culture des mycobactéries du groupe tuberculeux. Une deuxième catégorie de milieux solides sont les milieux à l'agar en particulier le milieu Middlebrook 7H10 et le milieu 7H11 (milieu 7H10 plus 0,1% de caséine hydrolysée). Le milieu de Middlebrook contient 2% de 20 glycérol, qui facilite la culture des mycobactéries du complexe Mycobacteriurn aviurn. Les milieux liquides correspondent essentiellement au milieu Middlebrook 7H9. Cependant, l'isolement des mycobactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis est lent puisque la totalité des souches des différentes espèces du complexe Mycobacteriurn tuberculosis est isolée dans un délai compris entre 6 et 8 semaines. Tout gain de temps sur 25 ce délai représente donc une amélioration significative du diagnostic de laboratoire de la tuberculose et les autres infections à mycobactérie. Dans le brevet EP 2 364 357, on a décrit une formulation de milieux de culture permettant l'isolement plus rapide des mycobactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis et des autres mycobactéries, notamment permettant une détection et 30 identification détectable visuellement à l'oeil nu en moins de 15 jours, voire même en 10 jours, à partir d'échantillons de prélèvement cliniques. Cette formulation de EP 2 364 357 permet l'isolement des mycobactéries avec la capacité de détecter visuellement à l'oeil nu les mycobactéries en croissance, aussi bien en milieu liquide adapté aux automates de détection qu'en milieu solide pour une détection manuelle, (notamment les compositions des exemples 35 1B (milieu liquide) et 2B (milieu solide) cette dernière étant ci-après dénommée MOD4). Ces 3033575 4 formulations du fait de la présence de lécithine, sont, de surcroît, compatibles avec une décontamination à la chlorhexidine dans le cas de prélèvements cliniques pouvant comprendre des bactéries de la flore commensale risquant d'inhiber la croissance des mycobactéries [Ghodbane R, Raoult D, Drancourt M. Dramatic reduction of culture time of 5 Mycobacterium tuberculosis. Sci Rep. 2014;4:4236]. Le délai diagnostique basé sur la culture dépend non seulement des qualités propres du milieu de culture -ici la présence de sérum d'agneau dans le milieu de culture selon l'invention, mais également, de la capacité à détecter les mycobactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis en croissance. Plus particulièrement lors de l'utilisation des 10 milieux solides, il s'agit de la capacité à détecter le plus rapidement possible l'apparition des colonies de Mycobacteriurn tuberculosis. En routine, les colonies sont détectées par l'observation macroscopique du milieu de culture à l'oeil nu correspondant à la détection de colonies de Mycobacteriurn tuberculosis de quelques millimètres ce qui requiert la présence d'un contraste entre la couleur des colonies et celle du milieu de culture. 15 Plus précisément, dans EP 2 364 357, les milieux de culture de mycobactéries, comprennent des facteurs de croissance de mycobactéries et, de préférence, des antibiotiques sans activité à l'égard des mycobactéries, caractérisés en ce qu'ils comprennent les composants additionnels suivants : - de la lécithine, et 20 - du sang défibriné, et - du sérum de veau foetal décomplémenté. Cependant, la mise en oeuvre de sang, rend ces formulations difficiles à manipuler lors de sa fabrication industrielle et limite le délai de péremption dudit milieu car le sang doit être mis en oeuvre dans un délai inférieur à 24h et conservé à 4°C pour rester frais. En 25 outre, le sang doit être prélevé en présence d'anticoagulants pour éviter sa coagulation ces anticoagulants pouvant avoir un effet négatif sur la croissance des mycobactéries. C'est pourquoi, il existe un intérêt à mettre au point un milieu conservant les caractéristiques et performances des milieux décrit ci-dessus, mais ne comportant pas de sang selon le but de la présente invention. 30 Les inventeurs ont découvert qu'en remplaçant le sérum de veau foetal par du sérum d'agneau combiné à un colorant synthétique sans activité contre les mycobactéries, on obtient, en l'absence de sang, des résultats de croissance détectable à l'oeil nu, au moins 3033575 5 identique voire amélioré permettant l'isolement rapide des mycobactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis et des autres mycobactéries, notamment permettant une détection et identification détectable visuellement à l'oeil nu en moins de 15 jours, voire même en 10 jours, à partir d'échantillons de prélèvement cliniques. Cette combinaison sérum 5 d'agneau combiné à un colorant synthétique compense les propriétés du sang en termes d'élément nutritif pour la croissance des mycobactéries et d'agent contrastant pour la capacité de détection visuelle à l'oeil nu. Cet agent contrastant permet de repérer les colonies à l'oeil nu pour ensuite les isoler et analyser le cas échéant par coloration de Ziehl-Neelsen ou de Kinyoun ou par spectrométrie de masse de type maldi tof comme décrit ci-après. 10 Plus précisément, la présente invention fournit un milieu de culture de mycobactéries, comprenant de la lécithine, des facteurs de croissance de mycobactéries et, de préférence, au moins un composé antibiotique sans activité à l'égard des mycobactéries, et au moins un colorant sans activité antimycobactérienne, qui comprend en outre au moins les composants additionnels suivants : 15 - du sérum d'agneau, de préférence décomplémenté, et - au moins un colorant sans activité contre les mycobactéries, permettant de contraster la couleur du milieu de culture par rapport aux colonies de mycobactéries. Le sérum d'agneau n'est pas un ingrédient connu pour l'isolement des bactéries extracellulaires. 20 De préférence, le sérum d'agneau est compris dans une proportion en volume de 2,5 à 25%, de préférence d'au moins 15%. Le sérum d'agneau est de préférence décomplémenté, c'est-à-dire qu'on lui a retiré, de façon connue, l'ensemble des protéines appelées "complément sérique" par chauffage, notamment à 56°C pendant une heure, ce complément sérique pouvant avoir une activité 25 antibactérienne. Dans le milieu selon l'invention, en l'absence d'agent contrastant on différentie très difficilement la couleur crème des colonies par rapport à la couleur jaune clair du milieu de par la présence de lécithine et autres. En l'absence d'agent contrastant, il est nécessaire d'utiliser un instrument de type microscope inversé à faible grossissement permettant 30 d'observer des colonies d'une taille d'environ un millimètre. Avantageusement encore, la détection des colonies peut se faire par autofluorescence des mycobactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis éclairées sous une lumière ultraviolette et d'une longueur appropriée, permet de détecter des colonies d'une taille comprise entre 0,25 et 1 mm. 3033575 6 De préférence, le colorant est un colorant de couleur rouge de préférence à une concentration de 10 à 100mg/L. De préférence, le colorant de couleur rouge est choisi parmi l'azorubine et le rouge de Ponceau 4R de préférence encore à une concentration de 30 à 50mg/L. Comme montré 5 plus loin dans les exemples, ces colorants n'affectent pas la croissance des mycobactéries et présentent une grande stabilité dans le temps, notamment d'au moins 5 semaines. De préférence encore, le colorant est un mélange d'azurobine et de rouge de Ponceau 4R de préférence encore dans une proportion en concentrations de 50/30. De préférence encore, le colorant est un mélange d'azorubine à 50mg/L et rouge 10 Ponceau 4R à 30mg/L. Plus particulièrement, le milieu de culture de mycobactéries selon l'invention est constitué d'un milieu de culture de base, connu pour la culture des mycobactéries, comprenant notamment des sels minéraux, sucres, acides aminés, protéines et vitamines, ledit milieu de culture de base étant supplémenté par lesdits composants additionnels 15 mentionnés ci-dessus. De préférence, le milieu de culture de mycobactéries selon l'invention contient au moins un composé antioxydant, de préférence l'acide ascorbique de préférence à une concentration d'au moins 0.1g/L. Ce composé antioxydant permet de s'affranchir du contrôle de la tension en oxygène inférieure à 5% et de réaliser une culture en atmosphère de 20 5%CO2 voire à l'air libre et atmosphère ambiante à la même température de 37°C. Plus particulièrement, la lécithine est comprise dans une proportion pondérale de 0,1 à 5%, de préférence 0,5 à 1%. Plus particulièrement encore, la lécithine est de la lécithine de jaune d'oeuf. Plus particulièrement, un milieu de culture de mycobactéries selon l'invention 25 comprend un milieu de culture de mycobactéries de base comprenant, outre de l'eau distillée, les composants suivants : sulfate d'ammonium, sulfate de magnésium, sulfate de cuivre, sulfate de zinc, citrate de sodium, citrate d'ammonium ferrique, chlorure de sodium, chlorure de calcium, phosphate monopotassique, phosphate disodique, acide L-glutamique, biotine et pyridoxine. Ces composants sont, notamment, les composants contenus dans les 30 milieux de culture de mycobactéries dénommés milieux Middlebrook. 3033575 7 En pratique, ce milieu de culture se présente initialement sous forme d'un lyophilisat desdits composants listés ci-dessus, destiné à être dilué dans de l'eau distillée pour former le milieu de culture selon l'invention. Plus particulièrement encore, le composé antibiotique sans activité 5 antimycobactérienne est pris dans le groupe consistué par les polymyxines, l'acide nalidixique, le triméthoprime, l'azlocilline et la vancomycine. Avantageusement, le milieu de culture comporte, en outre, un antifongique qui est de préférence l'amphotéricine B. L'ensemble constitué des antibiotiques et antifungiques cités ci-dessus, à l'exception de la vancomycine, constitue l'ensemble dénommé, connu de l'homme de l'art sous 10 l'appellation PANTA. Ledit milieu de culture est avantageusement un milieu de culture solide contenant un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%. De manière préférentielle, il s'agit d'un milieu solide de type Middlebrook de référence 15 7H10, additionné avec ledit produit gélifiant et des facteurs de croissance de mycobactéries additionnels suivants : acide oléique, albumine bovine, de préférence la fraction V de l'albumine bovine, dextrose, catalase et glycérol. Le vert de malachite, contenu dans le milieu 7H10, est un inhibiteur de croissance des bactéries autres que mycobactéries. Les facteurs de croissance de mycobactéries additionnels ci-dessus, autres que le glycérol, sont 20 connus sous la dénomination facteurs OADC. La présente invention fournit également un procédé de détection par culture d'une mycobactérie à l'aide d'un milieu de culture de mycobactéries selon l'invention consistant à incuber un échantillon pouvant contenir une mycobactérie, dans ledit milieu de culture de mycobactéries, à une température de 30 à 37°C, appropriée pour la culture de l'espèce de 25 mycobactérie contenue dans l'échantillon. La présente invention fournit par ailleurs un procédé de détermination de la viabilité d'une mycobactérie préalablement détectée dans un échantillon par un procédé approprié tel que, de façon non exhaustive, un procédé d'observation microscopique, un procédé de détection d'une séquence d'ADN, ou un procédé de détection antigénique. La présente invention fournit enfin un procédé de détermination 30 de la sensibilité et de la résistance d'une mycobactérie à des antibiotiques ou de façon plus générale, toute substance pouvant être mise en contact avec la mycobactérie en culture dans le milieu selon l'invention. 3033575 8 La plupart des mycobactéries est cultivée à 37°C. Toutefois, certaines mycobactéries, telles que Mycobacteriurn rnarinurn, Mycobacterlurn haernophilurn, Mycobacterlurn ulcerans, sont cultivées à une température de 28°C à 30°C. Mycobacteriurn szulgai peut être cultivée entre 25°C et 37°C, Mycobacteriurn consplcuurn est cultivée entre 22°C et 31°C. La 5 température optimale de croissance de Mycobacteriurn xenopi et de Mycobacteriurn shirnoidei est de 45°C. Les bactéries Mycobacteriurn genavense, Mycobacteriurn kansae Mycobacteriurn fortuiturn, les bactéries du complexe Mycobacteriurn avlurn, à savoir Mycobacteriurn avlurn, Mycobacterrirrn Intracellulare, Mycobacteriurn chirnaera et Mycobacteriurn colornblense sont cultivées à 37°C. 10 Plus particulièrement, dans un procédé de culture d'une mycobactérie selon l'invention, on cultive un échantillon contenant une bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosis à une température de 37°C dans un dit milieu de culture de mycobactéries. Un procédé de culture de mycobactéries selon l'invention peut également concerner des mycobactéries hors complexe Mycobacteriurn tuberculosis, telles que celles citées ci- 15 dessus, notamment Mycobacterrirrn rnarinurn, les espèces du complexe Mycobacterrirrn aviurn, Mycobacteriurn haernophilurn, Mycobacteriurn xenopi, les espèces du complexe Mycobacteriurn abscessus, Mycobacterrirrn genavense, Mycobacterrirrn kansasli, Mycobacteriurn ulcerans et Mycobacteriurn fortulturn. On entend ici par "bactéries du complexe Mycobacterrirrn tuberculosis", les bactéries 20 des espèces Mycobactericirn tuberculosis, Mycobactericirn bovis et ses clones ou sous- espèces BCG, Mycobacteriurn africanurn, Mycobacterrirrn canettli, Mycobacteriurn caprae, Mycobacteriurn rnicroti, Mycobacteriurn Mycobacterrirrn rnungi et Mycobacteriurn suricattae. Avantageusement, dans un procédé de culture d'une mycobactérie selon l'invention, 25 on réalise les quatre étapes suivantes: - on effectue la culture d'un échantillon de prélèvement biologique pouvant contenir des mycobactéries jusqu'à ce qu'une croissance de bactéries soit détectable, et - on identifie que la bactérie détectée est une bactérie du genre mycobactérie par un test de coloration, de préférence un test de coloration de Ziehl-Neelsen ou de Kinyoun, et 30 - le cas échéant, on identifie l'espèce de ladite mycobactérie par des moyens d'analyse moléculaire, de préférence par analyse de la masse moléculaire des protéines bactériennes par spectrométrie de masse. 3033575 9 Les moyens d'analyse moléculaire peuvent être des moyens d'analyse des protéines bactériennes, notamment par détermination de leur masse moléculaire par spectrométrie de masse. Toutefois, alternativement, on pourra avoir recours aux méthodes classiques d'identification moléculaire du génome (ADN ou ARN) avec des sondes et/ou amorces 5 d'amplification spécifiques des différentes espèces de mycobactéries, notamment telles que décrites dans la demande WO 2008/050064. En particulier, pour la détection de mycobactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis, on peut avoir recours à un système appelé multi spacer sequence typing (abrégé ci-après en MST) constitué d'une série de fragments d'acides nucléiques de zones intergéniques non codantes du génome des 10 bactéries du complexe Mycobacteriurn tuberculosis, lesdits fragments constituant des marqueurs génétiques permettant l'identification des différentes espèces du complexe Mycobacteriurn tuberculosis et le génotypage des isolats d'une même espèce du complexe Mycobacteriurn tuberculosis et, notamment de l'espèce Mycobacteriurn tuberculosis, par l'analyse des séquences desdits fragments de zones appelés MST. 15 Avantageusement, on détecte une croissance de bactérie du complexe Mycobacteriurn tuberculosisen moins de 15 jours, de préférence en 10 jours au plus. Les milieux de culture selon l'invention permettent en outre la détection de 50% de l'ensemble des différentes principales espèces de mycobactéries en moins d'une semaine, à savoir Mycobacteriurn marin uni, Mycobacteriurn aviurn, les bactéries des espèces 20 Mycobacteriurn tuberculosis, Mycobacteriurn bovis et ses clones ou sous-espèces BCG, Mycobacteriurn africanurn, Mycobacteriurn canee Mycobacteriurn caprae, Mycobacteriurn rnicroti, Mycobacteriurn pinnipeck" Mycobacteriurn rnungiet Mycobacteriurn suricattae. Dans un mode préféré de réalisation dans lequel on réalise une culture d'un échantillon de prélèvement biologique pouvant contenir une mycobactérie et des bactéries 25 contaminantes dont la croissance peut inhiber la croissance des mycobactéries, le procédé est caractérisé en ce que : 1/ on réalise une étape préalable de décontamination initiale dudit échantillon dans ledit milieu de culture avec de la chlorhexidine pendant une période limitée, afin de limiter l'action de la chlorhexidine à une activité contre les bactéries autres que mycobactéries, de 30 préférence environ 15 minutes de traitement dans une solution de chlorhexidine à 1% sous agitation, et 2/ on élimine la chlorhexidine en lavant l'échantillon ainsi traité de l'étape 1/ avec un tampon neutre, et on centrifuge et récupère le culot bactérien contenant les bactéries 3033575 10 contaminantes ainsi inactivées et les mycobactéries non inactivées, que l'on inocule sur un dit milieu de culture de mycobactéries. L'utilisation de chlorhexidine comme décontaminant était limitée, précédemment, à la décontamination d'échantillons dans des milieux de culture solides, car la chlorhexidine 5 entraîne une précipitation des milieux de culture liquides. En outre, la chlorhexidine est, en principe, connue pour être toxique sur les mycobactéries. Toutefois, on avait découvert précédemment que la présence de lécithine d'oeuf (mais pas la lécithine de soja) dans le milieu de culture permettait d'éviter ou de différer la précipitation du milieu de culture liquide, d'une part, et, d'autre part, l'action limitée dans le temps de la chlorhexidine, par la 10 mise en oeuvre de ladite étape de lavage 2/, permet d'inhiber l'activité postérieure de la chlorhexidine à l'égard des mycobactéries. La chlorhexidine conserve toutefois son activité première contre les bactéries de la flore commensale dont la croissance peut inhiber la croissance des mycobactéries, appelées ci-dessus bactéries contaminantes. On procède, en particulier, à cette étape de décontamination préalable pour les 15 prélèvements biologiques connus pour être porteurs d'une flore commensale, tels que des prélèvements d'expectoration, de biopsie cutanée ou de selles, lesquels représentent 95% des prélèvements biologiques disponibles pour une analyse de mycobactéries. En revanche, pour des prélèvements biologiques tels que provenant d'hémoculture ou de biopsie ganglionnaire ou de biopsie pulmonaire ou de biopsie osseuse, une telle décontamination 20 n'est pas requise. Le procédé ci-dessus est aussi particulièrement avantageux lorsque ledit prélèvement biologique est effectué à partir de selles. Ledit milieu de culture est un milieu de culture solide et on détecte une croissance de dites mycobactéries à l'oeil nu lorsque l'on peut apercevoir la formation d'une colonie de 25 bactéries sur ledit milieu de culture solide. En général, l'observation de la formation d'une colonie bactérienne correspondant à une concentration en bactéries de 106 bactéries/ml. Dans un mode préféré de réalisation d'un procédé selon l'invention, l'on identifie l'espèce de bactéries du genre mycobactérie par des moyens d'analyse moléculaire 30 consistant dans une analyse du profil protéique obtenu par spectrométrie de masse, en le comparant à une série de spectres de profil protéique obtenus avec des échantillons de souche de mycobactéries de référence de différentes espèces cultivées dans les mêmes conditions de culture. 3033575 11 On entend ici par "mêmes conditions de culture" que l'on a recours au même milieu de culture, même température de culture pour une même espèce de mycobactérie. Un milieu de culture solide selon la présente invention permet de réduire le délai de croissance des colonies de M. tuberculosis en présence d'antibiotique et donc obtenir 5 rapidement des résultats d'antibiogramme. Par ailleurs, on a découvert selon la présente invention qu'il était possible d'utiliser avantageusement le procédé E-test pour la réalisation des antibiogrammes de M. tuberculosis. Le E-test (AB Biodisk, Solna, Suède ; bioMérieux, Marcy-l'Etoile, France) consiste en une bande de papier imprégné d'un gradient de concentration d'un antibiotique étudié, permettant une lecture directe de la concentration 10 provoquant l'inhibition de croissance de la bactérie (Concentration Minimale Inhibitrice, CMI). Le E-test a été validé pour M. tuberculosis sur des milieux de référence différents de celui selon l'invention [Esteban J. et al. Eur 3 Clin Microbiol Infect Dis 2005 ; 24: 856-857] et les caractéristiques du milieu de culture solide selon l'invention ne permettaient pas prévoir s'il serait approprié à la réalisation des E-tests. 15 On a démontré selon la présente invention que le milieu de culture solide selon l'invention permet également une réalisation plus rapide et une lecture plus facile d'un test phénotypique de sensibilité et résistance aux antibiotiques du complexe Mycobacteriurn tuberculosis que les milieux standards. La présente invention permet donc de mettre à profit l'invention d'un milieu 20 permettant l'isolement et la croissance rapide du complexe Mycobacteriurn tuberculosis, pour la réalisation rapide de tests phénotypiques de sensibilité du complexe Mycobacteriurn tuberculosis aux antibiotiques antituberculeux comme illustré dans l'exemple. Plus précisément, la présente invention fournit un procédé de culture permettant la détermination phénotypique rapide de la sensibilité d'une mycobactérie aux antibiotiques, 25 selon laquelle on réalise les étapes dans lesquelles : i/- on réalise une culture d'une dite mycobactérie, de préférence du complexe Mycobacteriurn tuberculosis, sur dit un milieu de culture solide en présence d'au moins un antibiotique donné, à différentes concentrations connues, et ii/- on détermine la plus petite concentration d'antibiotique, de préférence choisi 30 parmi la rifampicine, isoniazide, éthambutol, pyrazinamide et la streptomycine, qui inhibe toute croissance visible de ladite bactérie (CMI : concentration minimale inhibitrice). Ainsi, de façon connue, pour chaque couple de mycobactérie-antibiotique, on peut déterminer une concentration minimale inhibitrice ou CMI et la comparer aux concentrations 3033575 12 critiques d'antibiotiques qu'un malade peut recevoir sans danger et qui bloque la croissance de la souche bactérienne en cause. On détermine alors la sensibilité ou la résistance de la bactérie à l'antibiotique comme suit : - si la CMI est inférieure à la concentration critique inférieure, la bactérie est sensible 5 à l'antibiotique, et - si la CMI est supérieure à la concentration critique supérieure, la bactérie est résistante à l'antibiotique en cause. Dans un mode préféré de réalisation selon l'invention, à l'étape i/-, on dépose, sur ledit milieu de culture solide, au moins une bandelette de papier imprégné d'un dit 10 antibiotique, à différentes concentrations selon un gradient de concentration le long de ladite bandelette. Plus particulièrement, on ensemence une boite de Pétri comprenant ledit milieu de culture solide selon l'invention à une concentration d'au moins 104 colonies/ml, de préférence 106 colonies/ml, puis on dépose une dite bandelette sur ledit milieu de culture solide, 15 notamment une bandelette de type E-test qui comprend un gradient continu en concentrations croissantes d'antibiotique d'une extrémité à l'autre de ladite bandelette, lesdites concentrations d'antibiotique étant écrites directement sur la bandelette, et on met en incubation la boite sur laquelle repose la bandelette et on lit la CMI à l'intersection du disque d'inhibition de la croissance bactérienne avec la bandelette. 20 Selon d'autres modes de réalisation connus, on peut remplacer la bandelette par un disque de papier buvard imprégné de la concentration critique d'antibiotique, afin de vérifier l'existence d'une zone d'inhibition autour du disque pour établir que la souche est sensible à l'antibiotique. Selon une autre variante de réalisation connue, on peut incorporer l'antibiotique 25 directement dans la masse dudit milieu de culture solide à ladite concentration critique et comparer la croissance de la souche sur ledit milieu de culture solide imprégné dudit antibiotique, avec la croissance d'une même souche sur un même milieu de culture solide ne contenant pas d'antibiotique, pour vérifier la présence ou l'absence d'une croissance bactérienne dans le milieu de culture avec et, respectivement, sans antibiotique et en 30 déduire que la souche est sensible à l'antibiotique si l'on observe une croissance moindre de la souche dans le milieu de culture solide contenant ledit antibiotique. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture des exemples non limitatifs qui suivent en lien avec les dessins dans lesquelles : 3033575 13 La figure 1 est une représentation graphique du délai de détection t (en heures) de Mycobacteriurn tuberculosis sur le milieu selon l'invention par comparaison avec le milieu Colestos, en utilisant des inocula de différentes concentrations inoculées de 102, 103, 104 cfu/ml. 5 La figure 2 est une représentation graphique du délai de détection t (en heures) de Mycobacteriurn tuberculosis sur le milieu selon l'invention par comparaison avec le milieu Lôwenstein-Jensen (« L-3 »), en utilisant des inocula de différentes concentrations inoculées de 102, 103, 104 cfu/ml. EXEMPLE 1: DETERMINATION DE LA COMPOSITION DU MILIEU SELON 10 L'INVENTION 1) Dans le but d'éliminer le sang présent dans le milieu solide MOD-5% similaire à celui de de l'exemple 2C de EP 2 364 357, les inventeurs - après de nombreuses tentatives infructueuses- ont substitué avec succès au sang du mouton une concentration équivalente (5%) de sérum d'agneau pour définir un milieu MOD-L5 (MOD-Lamb Serum). Les 15 performances de ce milieu MOD-L5 ont été comparées à celles du milieu MOD et d'un milieu MOD sans sang de mouton MOD4-WB (MOD-without blood). La composition dudit milieu MOD-5% est donnée ci-dessous pour 1000 mL: Eau distillée stérile: 841.3 mL 1- Milieu de Middlebrook 7H10 : 20 Sulfate d'ammonium : 0,50 g Phosphate monopotassique :1,50 g Phosphate disodique :1,50 g Citrate de sodium : 0,4 g Sulfate de magnésium : 0,05 g 25 Chlorure de calcium : 0,00050 g Sulfate de zinc : 0,0010 g Sulfate de cuivre : 0,0010 g Acide L-glutamique : 0,50 g Citrate d'ammonium ferrique : 0,04 g 30 Chlorhydrate de pyridoxine : 0,0010 g Biotine : 0,00050 g Vert malachite : 0,000250 g Gélose (Agar): 13.5 g 2- Facteurs de croissance additionnels: 35 Albumine bovine : 7.5 g 3033575 14 Dextrose : 3 g Catalase : 0.0045 g Acide oléique : 0.09 g Bovine serum albumin : 1.65 g 5 Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) : 0.022 g Vinylpyrrolidine Copolymer : 1.67 mL Acide citrique : 0.0842 g Hemin 330 pg 0.00033 g Tween 80: 2 mL 10 Extrait de levure : 1g Pancreatic digest of casein: 1g Glucose: 2g Glycérol: 5 mL 3- Antibiotiques sans activité antimycobactérienne et antifungique : 15 Polymyxine : 20.000 unités Amphothéricine B : 0.002 g Acide nalidixique : 0.008 g Triméthoprime : 0.002 g Azlocilline : 0.002 g 20 Vancomycine : 0.005 g 4- Elements additionnels: Sérum de veau foetal: 50 ml Sang de mouton défibriné : 50 ml Lécithine : 5 g 25 Pour MOD-LS-5%, la composition est identique pour les composants des points 1 à 3 et présente les dits éléments additionnels suivants: 4- Elements additionnels: Sérum d'agneau: 50 ml 30 Lécithine : 5 g. Pour MOD-WS-5%, la composition est identique pour les composants des points 1 à 3 et présente les dits éléments additionnels suivants: 4- Elements additionnels: Sérum de veau foetal: 50 ml 35 Lécithine : 5 g Cinq souches de Mycobacteriurn tuberculosis ont été utilisées, la souche de référence Mycobacteriurn tuberculosisH37Ry et quatre souches cliniques dont une souche de la famille 3033575 15 Beijing. Des suspensions de concentration égale à 105 CFU/mL ont été préparées à partir de ces souches et 100 pL de chaque suspension ont été inoculés en triplicate sur les trois milieux. Les milieux ont été incubés en parallèle à 37°C sous une atmosphère contenant 5% 5 de CO2 et sous micro aérophile (tension oxygène entre 2,5% et 5%). Le délai moyen d'apparition des premières colonies était 4 ± 0,3 jour sur MOD, 3.8 ± 0,4 jours sur MOD-LS et 5.1 ± 0,6 jours sur MOD-WS. Il y avait pas de différence significative quant au délai d'apparition des colonies sur milieu MOD comparé au milieu MOD-LS (P = 0.1413). En revanche, en comparant le milieu MOD-WS au milieu MOD et au 10 milieu MOD-LS, la différence était plus significative (P 1 pg/ml) comme déterminé par la 5 méthode de référence en milieu solide [Woods GL, Warren NG, Inderlind CB. Susceptibility test methods : Mycobacteria, Nocardia, and over actinomycetes in: Manual of Clinical Microbiology, 9ème édition (Nurray PR, Baren EJ, Jorgensen JH, Bry NL, Pfaller MA. American Society for Microbiology, 2007, page 1223-1247). Ces souches ont été mises en suspension dans du tampon phosphate stérile à la concentration de 106 colonies/ml. 10 Cette suspension a servi à inonder en parallèle une boite de Pétri stérile contenant le milieu standard de référence : Middlebrook 7H10 complémenté par un mélange d'acide oléique, albumine, dextrose, et catalase (OADC), une boîte de Pétri stérile contenant le milieu MOD-15%HIBS et une boîte de Pétri stérile contenant le milieu solide MOD9 selon l'invention de l'exemple 1 ci-dessus. 15 Les inventeurs ont utilisé le système appelé E-test® (Biomérieux, France) pour déterminer la sensibilité des souches aux différents antibiotiques. Ce système est composé d'une bandelette en papier imprégnée d'antibiotique (isoniazide ou éthambutol) selon un gradient de concentration continu au long de la bandelette. Ce dispositif permet une lecture à l'oeil nu de la concentration à partir de laquelle il n'est plus observé de croissance de 20 Mycobacteriurn tuberculosis définissant ainsi de la concentration minimum inhibitrice de l'antibiotique (isoniazide ou éthambutol) vis-à-vis de la souche de Mycobacteriurn tuberculosis qui est testée. Les boîtes de Pétri ont été incubées à 37°C sous une atmosphère contenant 5% de CO2 pendant deux semaines avec une observation quotidienne à partir du sixième jour d'incubation. Les colonies ont été confirmées comme étant Mycobacteriurn 25 tuberculosis sur la base de leur aspect et après coloration de Ziehl montrant des cordons de bacilles alcoolo-acido-résistants. Il se forme un disque d'inhibition de la croissance bactérienne autour de la bandelette dans les zones contenant une concentration d'antibiotique supérieure à la concentration minimum inhibitrice, étant entendu que celle-ci est déterminée par l'intersection du disque d'inhibition avec la bandelette. 30 b/- Résultats : Les inventeurs ont observé que : 3033575 28 - (1) les colonies de Mycobacteriurn tuberculosis apparaissaient après 7 jours d'incubation sur le milieu MOD9 selon l'invention comme sur le milieu comparatif MOD15%HIBS. - (2) la lecture du E-test est possible dans ces conditions après 7 jours d'incubation 5 sur le milieu selon l'invention car il y a un nombre suffisant de colonies permettant la lecture et un très bon contraste entre les colonies qui apparaissent grises sur le fond rouge du milieu MOD 9 selon l'invention; comme sur le milieu MOD-15% HIBS et meilleur que sur le milieu de référence, du fait de la croissance incomplète des colonies sur le milieu de référence et d'un mauvais contraste entre la couleur de la colonie (translucide) et le milieu 10 de référence, - (3) les résultats des E-tests isoniazide et éthambutol obtenus sur le milieu MOD9 selon l'invention sont similaires à ceux obtenus au préalable avec MOD-15%HIBS-et sont plus précis que ceux des tests de référence, permettant la détermination d'une véritable concentration minimale inhibitrice. 15 Cette expérience démontre que, par utilisation d'un milieu solide selon l'invention, la réalisation de tests phénotypiques de sensibilité de Mycobacteriurn tuberculosis aux antituberculeux selon la méthode E-test, est aussi rapide et plus facile que la réalisation de E-test sur un milieu solide de référence. Une boîte de Pétri contenant le milieu de référence et le milieu selon l'invention 20 incubée après inoculation d'une même souche de l'espèce Mycobacteriurn tuberculosis, montre la présence de colonies de Mycobacteriurn tuberculosis facilement visibles après 7 jours sur le milieu selon l'invention et difficilement visibles sur le milieu de référence après 11 jours, permettant une lecture facile de la concentration inhibitrice de isoniazide (IZ) sur une première bandelette et éthambutol (ET) sur une deuxième bandelette. 25 On voit, autour des bandelettes, des zones d'inhibition de la croissance bactérienne en forme de disque ovoïde autour des parties de la bandelette contenant une concentration inhibitrice d'antibiotique, de sorte que l'intersection de la limite inférieure desdites zones inhibitrices avec les bandelettes permet de lire sur la bandelette graduée la concentration inhibitrice minimale de l'antibiotique. 30 REVENDICATIONS1. Milieu de culture de mycobactéries, comprenant de la lécithine, des facteurs de croissance de mycobactéries et, de préférence, des antibiotiques sans activité à l'égard des mycobactéries, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins les composants additionnels suivants : - du sérum d'agneau, de préférence du sérum d'agneau décomplémenté, et - au moins un colorant sans activité contre les mycobactéries, permettant de contraster la couleur du milieu de culture par rapport aux colonies de mycobactéries. 2. Milieu de culture de mycobactéries selon la revendication 1, caractérisé en ce que 10 le sérum d'agneau est compris dans une proportion en volume de 2,5 à 25%, de préférence d'au moins 15%. 3. Milieu de culture de mycobactéries selon la revendication 2, caractérisé en ce que le colorant est un colorant rouge, de préférence dans une concentration de 10 à 100mg/L. 4. Milieu de culture de mycobactéries selon la revendication 3, caractérisé en ce que 15 le colorant est choisi parmi l'azurobine et le rouge de Ponceau 4R de préférence dans une concentration de 30 à 50mg/L chacun. 5. Milieu de culture de mycobactéries selon la revendication 4, caractérisé en ce que le coTorant est un mélange d'azurobine et de rouge de Ponceau 4R de préférence dans une proportion en concentrations de 50/30. 20 6. Milieu de culture de mycobactéries selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il contient au moins un composé antioxydant, de préférence l'acide ascorbique, de préférence à une concentration d'au moins 0.1g/L. 7. Milieu de culture de mycobactéries selon l'une des revendications 1 à 6 dans lequel la lécithine est comprise dans une proportion pondérale de 0,1 à 5%, de préférence 0,5 à 25 1%, de préférence la lécithine étant de la lécithine de jaune d'ceuf. 8. Milieu de culture de mycobactéries selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend un milieu de culture de mycobactéries de base comprenant, outre de l'eau distillée, les composants suivants : sulfate d'ammonium, sulfate de magnésium, sulfate de cuivre, sulfate de zinc, citrate de sodium, citrate d'ammonium ferrique, chlorure de 30 sodium, chlorure de calcium, phosphate monopotassique, phosphate disodique, acide L-glutamique, biotine et pyridoxine. 3033575 30 9. Milieu de culture de mycobactéries selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que lesdits antibiotiques sans activité antimycobactérienne sont la polymyxine, amphotéricine B, acide nalidixique, triméthoprime, azlocilline et vancomycine, et le milieu de culture comporte, en outre, un antifongique, de préférence l'amphotéricine B. 5 10. Milieu de culture de mycobactéries selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit milieu de culture est un milieu de culture solide contenant un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0.5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%. 11. Milieu de culture de mycobactéries selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un milieu solide de type Middlebrook de référence 7H10, additionné de dit produit gélifiant et des facteurs de croissance de mycobactéries additionnels suivants : acide oléique, albumine bovine, de préférence la fraction V de l'albumine bovine, dextrose, catalase et glycérol. 12. Procédé de culture d'une mycobactérie à l'aide d'un milieu de culture de mycobactéries selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on chauffe un échantillon contenant une dite mycobactérie, dans un dit milieu de culture de mycobactéries, à une température de 30°C à 37°C, appropriée pour la culture de l'espèce de mycobactérie contenue dans l'échantillon. 13. Procédé de culture d'une mycobactérie selon la revendication 12, caractérisé en 20 ce que l'on cultive un échantillon contenant une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculost:s à une température de 37°C dans un dit milieu de culture de mycobactéries. 14. Procédé de culture d'une mycobactérie selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes: - on effectue la culture d'un échantillon de prélèvement biologique pouvant contenir 25 des mycobactéries jusqu'à ce qu'une croissance de bactéries soit détectable, et - on identifie que la bactérie détectée est une bactérie du genre mycobactérie par un test de coloration, et - le cas échéant, on identifie l'espèce de ladite mycobactérie par des moyens d'analyse moléculaire, de préférence par spectrométrie de masse. 30 15. Procédé de culture d'une mycobactérie selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel on réalise une culture d'un échantillon de prélèvement biologique pouvant 3033575 31 contenir une mycobactérie et des bactéries contaminantes dont la croissance peut inhiber la croissance des mycobactéries, caractérisé en ce que : 1/ on réalise une étape préalable de décontamination initiale dudit échantillon dans ledit milieu de culture avec de la chlorhexidine pendant une péwlode limitée, afin de limiter 5 l'action de la chlorhexidine à une activité contre les bactéries autres que mycobactéries, de préférence environ 15 minutes de traitement dans une solution de chlorhexidine à 1% sous agitation, et 2/ on élimine la chlorhexidine en lavant l'échantillon ainsi traité de l'étape 1/ avec un tampon neutre, et on centrifuge et récupère le culot bactérien contenant les bactéries 10 contaminantes ainsi inactivées et les mycobactéries non inactivées, que l'on inocule sur un dit milieu de culture de mycobactéries. 16. Procédé de culture d'une mycobactérie selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que l'on réalise une culture d'un échantillon de prélèvement biologique, ledit prélèvement biologique étant effectué à partir de selles. 15 17. Procédé de culture d'une mycobactérie selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que ledit milieu de culture est un milieu de culture solide et on détecte une croissance de dites mycobactéries à l'ceil nu lorsque l'on peut apercevoir la formation d'une colonie de bactéries sur ledit milieu de culture solide. 18. Procédé de culture d'une mycobactérie selon la revendication 17, dans laquelle on met en oeuvre un milieu de culture solide, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes dans lesquelles : i/- on réalise une culture d'une dite mycobactérie, de préférence du complexe Mycobacterklm tuberculosis, sur un dit milieu de culture solide en présence d'au moins un antibiotique donné, à différentes concentrations connues, et ii/- on détermine la plus petite concentration d'antibiotique, de préférence choisi parmi la rifampicine, isoniazide, éthambutol, pyrazinamide et la streptomycine, qui inhibe toute croissance visible de ladite bactérie. 19. Procédé de culture d'une mycobactérie selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'à l'étape if-, on dépose, sur ledit milieu de culture solide, au moins une bandelette de papier imprégné d'un dit antibiotique à différentes concentrations selon un gradient de concentration le long de ladite bandelette. 3033575 32 20. Procédé de détection de la croissance d'une bactérie du complexe Mycrobactérium Tuberculosis en moins de 15 jours, de préférence pas plus de 10 jours permettant la détection de 50%des mycobactéries en moins d'une semaine caractérisé en ce qu'on met en oeuvre un procédé de culture selon l'une des revendications 12 à 19.