Brevet FR3013049A1 — publié le 20150515

ANALOGUE DE L'INSULINE GLARGINE La présente invention concerne un nouvel analogue de l'insuline glargine basale permettant de traiter le diabète, sa préparation et son utilisation. La prévalence du diabète constitue un problème de santé majeur dans le monde, et on s'attend à une augmentation importante du nombre de cas dans le futur. Des analogues de l'insuline ont été conçus dans le but d'améliorer le traitement. Des insulines à action rapide, à action intermédiaire et à action prolongée (basale) ont été développées et autorisées pour une utilisation chez l'homme. La finalité du traitement est de mimer l'insuline prandiale et/ou basale. L'effet secondaire le plus courant d'une insulinothérapie est l'hypoglycémie quand une quantité trop importante d'insuline est présente, qui résulte de l'injection d'une quantité trop importante d'insuline ou d'un pic de concentration dû à la variabilité de la vitesse d'absorption à partir d'un tissu sous-cutané. Ce dernier cas est particulièrement vrai pour les insulines à action intermédiaire ou prolongée qui forment un dépôt ou se trouvent sous une forme cristalline au niveau du site d'injection. L'insuline est l'une des protéines les plus étudiées en termes de propriétés structurelles et de modifications chimiques, et d'implications sur les propriétés physiologiques. L'insuline humaine est composée de deux chaînes de 21 (chaîne A) et de 30 (chaîne B) acides aminés, liées par l'intermédiaire de deux ponts disulfure inter-chaînes et un pont disulfure intra-chaîne. L'insuline humaine possède un poids moléculaire de 5807 et un point isoélectrique d'environ 5,3. En solution à pH neutre, l'insuline présente une capacité d'auto-assemblage dépendant de la concentration en dimères et en hexamères : voir Brange dans Galenics of Insulin Springer Verlag 1987. La forme hexamère est la forme la plus stable, mais c'est le monomère qui est biologiquement actif. Les produits insuliniques les plus efficaces actuellement utilisés sont des analogues de l'insuline (voir, Oiknine et al. Drugs 2005, 65, 325-340 pour une vue d'ensemble). Les insulines à action rapide sont des insulines basées sur des analogues avec lesquels la formation des structures dimères et/ou hexamères n'est pas favorisée, de sorte que la forme monomère est rapidement disponible après l'administration. Celles-ci sont commercialisées sous les noms commerciaux d'Humalog® (insuline lispro), de Novolog® (insuline aspart) et d'ApieraC) (insuline glulisine) ; le nom commun de l'analogue d'insuline est donné entre parenthèses. Parmi les insulines basales à action prolongée, on trouve le Lantus® (insuline glargine) qui possède un point isoélectrique d'environ 7 et qui précipite sur le site d'injection, ce qui permet la libération lente des monomères à partir du site d'injection, et le Levemir® (detemir) qui contient un acide gras greffé sur la chaîne B qui lui confère une action prolongée due à son adsorption sur l'albumine en circulation. Ces deux insulines à action prolongée ne procurent pas une couverture complète pendant 24 heures chez tous les patients. En outre, dans le cas du detemir, l'activité thérapeutique de l'insuline a été réduite d'un facteur quatre à cause de la modification chimique, ce qui nécessite davantage de protéines pour le même effet : voir Kurtzhals et al. Diabetes, 2000, 49, 999-1005. L'obtention de meilleures insulines à action prolongée, c'est-à-dire à profil plat (sans pic), pour réduire les évènements hypoglycémiques nocturnes est encore hautement souhaitable pour améliorer le contrôle de la glycémie et ce domaine de recherche est très actif. Récemment, le Tresiba® (insuline degludec) a été autorisé en Europe et au Japon. Cette insuline contient un acide hexadécanedioïque greffé sur la Lys B29 par l'intermédiaire d'un espaceur gamma-L-glutamyle. Cette modification entraîne la formation de multi-hexamères dans les tissus sous-cutanés, ce qui permet à l'insuline de se libérer lentement au cours du temps et d'avoir une forte affinité de liaison vis- à-vis de l'albumine. Globalement, la durée d'action est supérieure à 24 heures. La synthèse et la description de cette molécule sont données dans le brevet US 7 615 532 et dans Jonassen et al. Pharm. Res. 2012, 29, 2104-2114. L'insuline glargine (protéine active du Lantus®) est particulièrement importante pour la présente invention, l'insuline glargine étant décrite dans le brevet US 5 656 772. Dans la molécule de l'insuline glargine, l'asparagine A21 est remplacée par une glycine et deux arginines ont été ajoutées à la position B30 terminale. La molécule est appelée GlyA2I-ArgB31-ArgB32-insuline humaines ou, plus couramment, insuline glargine. Elle est formulée à pH 4 et précipite à pH neutre, son point isoélectrique étant d'environ 7,0. La protéine est préparée par mutagenèse dirigée dans E. Coli. D'autres approches visant à obtenir des insulines à action prolongée ont été décrites dans la littérature, mais aucune n'a permis jusqu'à présent d'obtenir des produits commerciaux. En effet, les conditions requises pour obtenir le profil pharmacocinétique d'une véritable insuline basale qui répond aux besoins des patients sont très strictes. Certains exemples basés sur des modifications de l'insuline sont donnés ci-dessous. Le brevet US 6 221 837 décrit des analogues de l'insuline contenant 1 à 5 histidines en position B30. Ces produits sont capables de se lier à davantage de zinc et présentent un profil à libération modifiée après injection sous-cutanée. La prolongation de la durée jusqu'à 14 heures chez les chiens nécessite un excès de zinc (généralement 80 mg/mi pour une formulation d'insuline de 40 UT/mi). La durée d'une formulation sans zinc des mêmes composés est similaire à celle de l'insuline humaine et est d'environ 6 à 8 heures. D'une manière similaire, le brevet US 6 686 177 décrit des analogues de l'insuline contenant 1 à 5 histidines en position BO pour augmenter la liaison au zinc, et la durée est prolongée jusqu'à 16 heures chez le chien. Philipps et al. J. Biological Chemistry 2010, 285, 11755-11759 décrivent des analogues de l'insuline dans lesquels deux histidines sont présentes aux positions A4 et A8. L'objectif est ici de créer des hexamères fixée au zinc et donc d'améliorer le profil de durée d'action. Dans une étude effectuée sur le rat, il a été trouvé que la durée était similaire à celle du Lantus®. Dans une autre publication de Kohn et al. Peptides 2007, 28, 935-048, les auteurs décrivent une stratégie pour prolonger la durée en augmentant le point isoélectrique de l'insuline par l'ajout de lysines et/ou d'arginines positivement chargées. Des résultats satisfaisants sont obtenus quand une arginine est ajoutée à l'extrémité N-terminale de la chaîne A et que deux arginines sont ajoutées à l'extrémité C-terminale de la chaîne B. Le point isoélectrique mesuré est de 7,3 par rapport à 7,0 pour l'insuline glargine. Cependant, leurs activités biologiques sont bien inférieures à celle de l'insuline glargine. La molécule est également décrite dans la demande de brevet US 2006/0 217 290. Le brevet US 2005/0 014 679 décrit l'ajout d'acides aminés basiques, tels que l'arginine ou la lysine, à l'insuline afin d'obtenir des formulations à action prolongée. Les produits décrits, par exemple ArgA0GlyA21Lys-(1\e-Arg)B29, présentent un profil de durée d'action similaire à celui du Lantus®. Dans ce contexte, la modification de l'insuline par diverses manières (principalement, par le greffage d'acides gras et la modification des séquences de la chaîne A et/ou de la chaîne B pour augmenter le point isoélectrique) peut permettre d'obtenir de meilleures propriétés, comme une liaison à l'albumine ou une précipitation induite par le pH, mais parfois au détriment de l'activité thérapeutique et/ou en induisant des modifications de propriétés pharmacologiques qui excluent un usage clinique à vie. L'obtention d'une insuline basale véritable sujette à de très faibles fluctuations de concentration avec une ou moins d'une injection par jour pour améliorer le traitement des patients reste un défi. Les inventeurs ont découvert que les propriétés pharmacocinétiques de l'insuline glargine (protéine active du Lantus®) peuvent être significativement améliorées par le greffage d'une seule histidine sur le résidu de N-epsilon lysine en position B29 de l'insuline glargine par l'intermédiaire d'une liaison amide, appelée LysB29 (-.. TE_ His) insuline glargine ou LysB29(NE-His)GlyA2lArgB31ArgB32-insuline humaine dans la suite du présent document. Sur le plan de la structure, cette nouvelle molécule est différente des molécules de l'art antérieur décrites ci-dessus, dans lesquelles une ou plusieurs histidines sont insérées dans la chaîne A ou B principale ou dans les chaînes teiminales. Avec ce nouvel analogue de l'insuline, des formulations à action prolongées ont été obtenues sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un excès de zinc ou d'effectuer une conversion pour obtenir des suspensions cristallines. L'ajout d'une histidine, comme décrit dans le présent document, n'a aucun impact sur les caractéristiques structurelles et le point isoélectrique du précurseur de l'insuline glargine. L'amélioration envisagée est un profil de libération plus long et plus plat par rapport à celui du Lantus , pour ainsi réduire le nombre d'événements hypoglycémiques et hyperglycémiques avec seulement une injection par jour ou moins. Par conséquent, un premier aspect de l'invention concerne un analogue de l'insuline glargine qui est la Lys B29His)GlyA2lArgB3lArgB32-insuline humaine. Dans un second aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un analogue de l'insuline glargine qui est la LysB29(1\eHis)GlyA2 I ArgB31Arg832- insuline humaine. La présente invention concerne également un analogue de l'insuline glargine ou une composition pharmaceutique selon l'invention utilisable dans un traitement thérapeutique d'un humain ou d'animaux. En particulier, la présente invention concerne l'analogue de l'insuline glargine ou la composition pharmaceutique, tels que décrits ci-dessus, pour une utilisation dans le traitement du diabète et/ou de l'hyperglycémie. La présente invention concerne également un procédé de préparation de l'analogue de l'insuline glargine selon l'invention, comprenant l'étape de greffage d'une histidine protégée sur l'insuline glargine à un pH de 10 et 11, puis une étape de déprotection. Telle qu'utilisée dans le présent document et sauf indication contraire, l'expression « acide aminé » fait référence aux acides aminés naturels ou non 10 naturels, sous forme de stéréoisomères D et L pour les acides aminés chiraux. Il est entendu qu'elle fait référence à la fois aux acides aminés et aux résidus d'acides aminés correspondants, comme ceux que l'on trouve, par exemple, dans une structure peptidyle. Les acides aminés naturels et non naturels sont bien connus dans l'art. Les acides aminés naturels communs comprennent, mais sans s'y limiter, 15 l'alanine (Ala), l'arginine (Arg), l'asparagine (Asn), l'acide aspartique (Asp), la cystéine (Cys), la glutamine (Gin), l'acide glutamique (Glu), la glycine (Gly), l'histidine (His), l'isoleucine (Ile), la leucine (Leu), la lysine (Lys), la méthionine (Met), la phénylalanine (Phe), la proline (Pro), la sérine (Ser), la thréonine (Thr), le tryptophane (Trp), la tyrosine (Tyr) et la valine (Val). Dans les protéines d'origine 20 naturelle, des acides aminés sont tous des stéréoisomères L. La présente invention concerne un analogue de l'insuline glargine qui est la LysB29(-. His)GlyA2lArgB31Arg1332_insuline humaine. La LysB29(1\r His)GlyA21_ ArgB3lArgB32_insuline humaine est également appelée ci-après dans le présent document LysB29(NE-His) insuline glargine. 25 L'expression « analogue de l'insuline glargine » fait référence à un analogue de l'insuline glargine ou, plus précisément, dans le contexte de l'invention, à une insuline glargine chimiquement modifiée. Comme mentionné ci-dessus, l' insuline glargine est un composé bien connu qui est décrit dans le brevet US 5 656 772 et commercialisé sous le nom de Lantus®. 30 Dans la molécule d'insuline glargine, l'asparagine A21 est remplacée par une glycine et deux arginines ont été ajoutées à la position B30 terminale par rapport à l'insuline humaine native. La molécule est appelée GIyA21ArgB31_Args32_instiline humaine, ou plus couramment insuline glargine. LysB29(. His) signifie qu'un acide aminé histidine est greffé sur le groupe amine N-epsilon du résidu de lysine en position B29 de l'insuline glargine (ou Gly`21ArgB31ArgB32-insuline humaine) par l'intermédiaire d'une liaison amide. En particulier, l'analogue de l'insuline glargine de l'invention ne comprend aucune arginine ou aucun résidu d'acide aminé équivalent en position A0. Dans un mode de réalisation, l'histidine de (NE-His), c'est-à-dire l'acide aminé histidine qui est greffé sur le groupe amine N-epsilon du résidu de lysine en position B29 de l'insuline glargine, est choisie dans le groupe constitué de la L-histidine, de la D-histidine et de la D,L-histidine. De préférence, l'histidine de (N8-His) est la L-histidine. Dans un second aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant l'analogue de l'insuline glargine décrit ci-dessus. L'analogue de l'insuline glargine est formulé de façon à obtenir une composition pharmaceutique qui est acceptable cliniquement pour être administrée à 15 un humain ou à un animal. Par conséquent, la composition pharmaceutique comprend l'analogue de l'insuline glargine et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Des véhicules ou excipients pharmaceutiques sont connus de l'homme du métier. Ceux-ci seront le plus souvent des véhicules ou excipients classiques 20 permettant d'administrer des compositions aux humains, notamment des solutions telles que l'eau stérile, une solution physiologique et les solutions tamponnées au pH physiologique. Les compositions peuvent également être administrées par voie orale, intramusculaire ou sous-cutanée, ou sous la forme d'un aérosol. Les compositions peuvent être administrées selon les procédures standards utilisées par l'homme du 25 métier. Les excipients pharmaceutiques peuvent être des épaississants, des diluants, des tampons, des conservateurs, des agents tensioactifs et équivalents, en plus de la molécule de choix. Des descriptions de certains de ces excipients ou véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être trouvées dans The Handbook of Pharmaceutical Excipients, publié par l'American Pharmaceutical Association et la 30 Pharmaceutkal Society of Great Britain. Remington : the Science and Practice of Pharmacy 20ème édition (2000), décrit des compositions et des formulations appropriées pour l'administration pharmaceutique des analogues de l'insuline glargine de l'invention, sous la forme de solutions aqueuses, de formulations lyophilisées ou d'autres formulations sèches. En plus des supports biologiquement neutres, les compositions pharmaceutiques à administrer peuvent contenir des quantités minimes de substances auxiliaires non toxiques, tels que des agents mouillants ou émulsifiants, des conservateurs et des agents tampons de pH et équivalents. Les compositions phaimaceutiques peuvent également comprendre un ou plusieurs principes actifs supplémentaires. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique est une solution aqueuse. Traditionnellement, l'excipient pharmaceutiquement acceptable est l'eau. Dans un mode de réalisation préféré, la concentration de l'analogue de l'insuline glargine est de 1 mg/ml à 20 mg/ml. On suppose que l'activité thérapeutique du composé est similaire à l'activité thérapeutique du Lantus®. Dans ce cas, 100 UI seront équivalents à 600 nmol ou 3,7 mg. Il est envisagé que les formulations pharmaceutiques puissent contenir 40 à 500 Ul/ml, ce qui est équivalent à 1,49 à 18,6 mg de protéine, respectivement. De préférence, la formulation contient 40 à 300 UI/ml ou, par exemple, entre 3,5 mg/ml et 4 mg/ml. La composition pharmaceutique peut comprendre traditionnellement un sel divalent, une base, un acide, un agent d'isotonicité, des conservateurs et/ou de l'eau stérile. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique 20 comprend des ions de métal divalent choisis dans le groupe constitué des ions de zinc, de magnésium, de cuivre et de calcium. De préférence, les ions de métal divalent sont des ions de zinc. Les sels de zinc sont de préférence le chlorure de zinc, le sulfate de zinc, l'oxyde de zinc ou l'acétate de zinc. La concentration en ions de zinc est de préférence de 0,3 à 3 équivalents par mole de l'analogue de l'insuline glargine, 25 et de manière davantage préférée de 0,5 à 1,5 équivalent par mole de l'analogue de l'insuline glargine. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique possède un pH de 3,5 à 4,5. Formulée à un pH de 3,5 à 4,5, la formulation est un liquide limpide qui est injectable grâce à de petites aiguilles de 30 à 32 G. De préférence, le 30 pH est environ de 4. Les acides et les bases utilisées pour ajuster le pH peuvent être, par exemple, l'hydroxyde de sodium et l'acide chlorhydrique, et pour assurer les propriétés tampons, un phosphate, un acétate ou un citrate peut être utilisé. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un conservateur. Le conservateur qui est nécessaire pour des fioles ou cartouches à multi-usage peut être choisi dans le groupe constitué des dérivés du phénol, comme le phénol, le m-crésol, le chlorocrésol, l'alcool benzylique et leur mélange. De préférence, le conservateur peut être choisi dans le groupe constitué du phénol, du m-crésol et d'un mélange de ceux-ci. Un mélange de phénol et de m-crésol ou le m-crésol seul est préféré. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un agent d'isotonicité. Par exemple, l'agent d'isotonicité peut être le glycérol (glycérine), le chlorure de sodium, le tréhalose, le mannitol ou le dextrose. Pour une injection sous- cutanée, l'osmolalité est habituellement ajustée à environ 290 à 330 mOsm/kg. La quantité va d'environ 1,6 % à 2,6 % en poids/poids. L'agent d'isotonicité est de préférence le glycérol ou le chlorure de sodium, et de manière davantage préférée le glycérol. En outre, un tensioactif servant à réduire ou à empêcher une adsorption en surface peut être ajouté, comme décrit dans l'art antérieur : Development and manufacture of protein pharmaceuticals Eds. Nail et al. Chapitre 2, 2002, Kulwer Academic/plenum publishers, NY. Dans un mode de réalisation spécifique, la composition pharmaceutique comprend : - un analogue de l'insuline glargine à une concentration située entre 3,5 mg/m1 et 4,0 mg,/ml, de préférence à une concentration de 3,7 mg/ml, - des ions de zinc à une concentration de 20 pg/m1 à 50 pg/ml, - du m-crésol à une concentration de 25 mmo1/1 à 30 mmo1/1, - du glycérol à un taux d'environ 1,6 % à 2,5 % en poids/poids, et son pH est d'environ 4. Un autre objet de l'invention concerne l'analogue de l'insuline glargine ou la composition pharmaceutique, tel que décrit ci-dessus, pour une utilisation dans un traitement thérapeutique chez les humains ou les animaux. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de traitement comprenant 30 l'administration à un sujet en ayant besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace de l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition pharmaceutique, tel que décrit ci-dessus. Un autre objet de l'invention concerne une utilisation de l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition phamiaceutique, tel que décrit ci-dessus, dans la préparation d'un médicament. En particulier, la présente invention concerne l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition pharmaceutique, tel que décrit ci-dessus, pour une utilisation dans le traitement du diabète et/ou de l'hyperglycémie. En particulier, la présente invention concerne un procédé de traitement du diabète et/ou de l'hyperglycémie, comprenant l'administration à un sujet en ayant besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace de l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition pharmaceutique, tel que décrit ci-dessus. En particulier, la présente invention concerne une utilisation de l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition pharmaceutique dans la préparation d'un médicament destiné au traitement du diabète et/ou de l'hyperglycémie. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation de l'analogue de l'insuline glargine, tel que décrit ci-dessus, comprenant l'étape de greffage d'une histidine protégée sur l'insuline glargine à un pH de 10 à 11, puis une étape de déprotection. L'analogue de l'insuline glargine de l'invention est préparé de manière commode par le greffage d'un dérivé d'histidine protégée sur l'insuline glargine, qui est suivi d'une déprotection. Les techniques pouvant être utilisées sont similaires à celles utilisées pour l'acylation de l'insuline ou des analogues de l'insuline et sont connues de l'homme du métier. Par exemple, le brevet US 5 646 242 décrit une acylation, de préférence en position B29 (position de l'epsilon-lysine) à un pH supérieur à 10. L'histidine utilisée pour mettre en oeuvre cette réaction a sa fonction carboxylate activée par un N-hydroxysuccinimide (ester activé par NHS) et les azotes actifs protégés par des fonctions t-butyloxycarbonyle (Boc). Après la réaction d'acylation, les Boc sont éliminés avec de l'acide trifluoroacétique. L'ester de BocHis(Boc)-N-hydroxysuccinimide ou des composés similaires peuvent être préparés facilement selon des procédures décrites, par exemple, dans Greene's Protecting Groups in Organic Synthesis, Wuts et al. John Wiley and Sons ene Ed. 2007. L'histidine peut être la L-histidine, la D-histidine ou un mélange racémique. L'insuline glargine utilisée peut être produite par des techniques recombinantes classiques, par exemple dans E. Coli, Saccharomyses cerevisae ou Pichia pastoris. La synthèse de l'insuline glargine est décrite, par exemple, dans le brevet US 5 656 772 et les demandes de brevet US 2011/0 236 925 et 2012/0 214 965. L'invention va être davantage illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, les exemples et les figures ne doivent pas être interprétés d'une quelconque manière que ce soit comme une limite à la portée de la présente invention. FIGURES 10 Figurel. La figure 1 représente un gel après électrofocalisation pour déterminer le PI de l'insuline (puits 1), de la LysB29(1\r-His) insuline glargine (puits 2), de l'insuline glargine (puits 3) et de l'insuline glargine Lantus® (puits 4). M : marqueur de PI. 15 Figure 2. Les figures 2A et 2B représentent des thermogrammes de formulations de l'insuline glargine et de la LysB29(1\1E-His) insuline glargine. La figure 2A représente un thenuogramme d'une composition dans laquelle l'insuline glargine est à 3,6 mg/m1 et le pH est de 4. La figure 2B représente un thermogramme d'une composition dans laquelle la LysB29(1\e-His) insuline glargine est à 3,6 mg/m1 20 et le pH est de 4. Figure 3. Les figures 3A et 3B représentent des spectres en UV proche de formulations de l'insuline glargine et de la LysB29(1\r-His) insuline glargine. La figure 3A représente un spectre en UV proche d'une composition dans laquelle l'insuline glargine est à 3,6 mg/ml et le pH est de 4. La figure 3B représente un 25 spectre en UV proche d'une composition dans laquelle la LysB29(1\1E-His) insuline glargine est à 3,6 mg/ml et le pH est de 4. Figure 4. La figure 4 représente des profils moyens de pharmacocinétique après une seule administration SC de la formulation FT-2, décrite dans l'exemple 4 ci-dessous, et de Lantus®. 30 Exemples : Exemple 1 : synthèse de la LySB29(NE-His) insuline glargine Environ 600 mg d'insuline glargine (Biocon) ont été dissous dans un tampon au carbonate de sodium (50 mM, pH 10,2) pour obtenir une concentration en protéines de 20 g/l. L'ester de Boc-L-His(Boc)-N-hydroxysuccinimide (1 équivalent) a été dissous dans de l'acétonitrile (30 ml), puis ajouté à la solution de protéines. La solution a été laissée sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante, et la réaction a été soumise à un traitement final par l'ajout d'éthanolamine (12 équivalents, 6,1 ml, ajusté à pH 9,0 avec du HC1 0,1 N) et 120 ml d'eau. La conversion en protéine mono-acylée souhaitée a été estimée à environ 67 % par CLHP en phase inversée. Le mélange réactionnel a ensuite été lyophilisé et dissout dans de l'acide trifluoroacétique pur (12 ml) pour effectuer la déprotection des fragments BOC. Après 1 heure à température ambiante, de l'eau (108 ml) a été ajoutée lentement et le milieu a été lyophilisé, dissous à nouveau dans du HC1 0,01 N (100 ml) et lyophilisé une nouvelle fois. Ensuite, le produit a été dissous à 50 mg/m1 dans du HCl 0,01 N et purifié par CLHP préparative en phase inversée sur une colonne Chromolith® Prep RP-18e (100 x 25 mm, 3 itm, 120 À). La phase mobile était constituée de 0,1 % de TFA v/v dans de l'eau distillée (éluant A) et d'acétonitrile contenant 0,1 % de TFA v/v (éluant B). La phase mobile a été passée avec un gradient linéaire allant de 25 % à 28 % de l'éluant B pendant 6 minutes, puis avec 28 % d' éluant B pendant 6 minutes à un débit de 20 ml/minute, et l'absorbante UV a été suivie à 215 nm et 280 nm. Les fractions contenant le produit souhaité ont été regroupées et lyophilisées. Finalement, l'analogue de l'insuline glargine a été dessalé par dialyse contre du HC1 0,01 N et lyophilisé. La pureté du composé par CLHP en phase inversée était de 95 % avec un rendement de 33 %. Exemple 2 : analyse structurelle et propriétés Spectrométrie de masse. La masse moléculaire de la LysB29(1\r-His) insuline glargine a été déteiminée par LC/ESI-MS TOF en mode positive (spectromètre de masse, LC/MSD TOF disponible chez Agilent, équipé d'une source d'ionisation par électropulvérisation et d'un analyseur à temps de vol, relié à un système CLHP HP1100 disponible chez Agilent). Un pic principal à 6200,0 Da a été mesuré (la valeur théorique est de 6200,1). Cartographie peptidique. Une cartographie peptidique de la LysB29(W-His) insuline glargine a été réalisée en utilisant une protéas xprovenant de la souche V8 (Glu-C) de Staphylococcus aureus. Quatre fragments sont attendus de cette digestion par la protéase qui clive sélectivement les liaisons peptidiques du côté carboxyle des résidus d'acide aspartique et d'acide glutamique. Une analyse par LC/ESI-MS TOF du produit de digestion a confirmé que le fragment III (B22-B32) avait été greffé avec une histidine, tandis que les autres fragments étaient identiques à ceux d'un produit de digestion de l'insuline glargine. La masse moléculaire mesurée du fragment III contenant l'histidine greffée est de 1565,8 Da (la valeur théorique est de 1565,9 Da). Les résultats de spectrométrie de masse obtenus avec le composé 1 et ses produits de digestion ont confirmé la position du greffage et la structure chimique. Teneur en zinc. La détermination du zinc dans la poudre lyophilisée finale de la LysB29(1\r-His) insuline glargine a été réalisée par le procédé spectrophotométrique conçu par Sâbel et al. Anal. Biochem. 2010, 397, 218-226. Ce procédé permet la détermination d'un faible taux d'ion de zinc en solution aqueuse au moyen du réactif colorimétrique Zincon (2-carboxy-2'-hydroxy-5'-sulfoformazylbenzène). Le complexe Zn2+-zincon formé est stable et présente une forte absorbante à 620 mn. La poudre de LysB29(NE-His) insuline glargine, obtenue après les étapes de synthèse de purification, contient une quantité négligeable de zinc ( Une liaison maximale d'environ 1,5 zinc par monomère de LysB29(1\r-His) insuline glargine et une liaison maximale d'environ 0,75 zinc par molécules de monomère d'insuline glargine sont mesurées. Point isoélectrique. Une électrofocalisation (IEF) a été mise en oeuvre afin d'évaluer le point isoélectrique (PI) de la LysB29(M-His) insuline glargine par rapport à l'insuline humaine recombinante et à l'insuline glargine (précurseur de matière première et Lantus®). Le PI a été déterminé au moyen d'un gel Novex IEF de pH 3- 10 (Invitrogen, #EC6655) et par comparaison avec les PI de marqueurs connus allant de 4,45 à 9,6. Après une électrophorèse, les protéines ont été visualisées par l'incubation du gel dans une solution de coloration (bleu de Coomassie à 0,04 % et crocéine rouge à 0,05 % dans l'acide acétique à 10 % et l'isopropanol à 27 %). Le point isoélectrique de la LysB29(NE-His) insuline glargine a été mesuré à 7,0 et à 7,1 pour l'insuline glargine. Le point isoélectrique de l'insuline humaine a été mesuré à 6,0. Les résultats montrent que l'ajout du fragment histidine à l'insuline glargine ne modifie pas de manière significative son point isoélectrique. Les résultats sont présentés sur la figure 1. Microcalorimétrie. Les températures de fusion des protéines insuline glargine et LysB29(1\r-His) insuline glargine, en solution à pH 4, ont été mesurées par microcalorimétrie (microcalorimètre à balayage différentiel VP-DSC disponible chez Microcal, LLC). Les solutions ont été préparées à une concentration de 3,6 mg,/m1 par la mise en suspension de la poudre dans de l'eau et en portant le pH des solutions à 4 avec du HC1/NaOH 1 N. Du glycérol (2,3 %) et du m-crésol (25 mM) ont également été ajoutés. La quantité de Zn2+/monomère était de 0,75. La vitesse de balayage était de 1 °C/minute et une pression en excès de 28 psi a été appliquée. Les deux produits présentaient une transition de fusion monomodale à 73-74 °C. Cette température suggère que les deux protéines sont sous forme de dimère, comme l'insuline humaine dans les mêmes conditions (Huus, K. ; et al. Biochemistry. 2005, 44, 11171-11177). En outre, il a été trouvé que cette température de fusion n'était pas dépendante de la quantité de zinc dans la plage de 0 à 1,1 pour la LysB29(K-His) insuline glargine en solution, ce qui suggère également qu'il n'existe aucune liaison au zinc à pH 4,0. Les résultats sont présentés sur la figure 2. Dichroïsme circulaire. Une analyse dans l'UV proche (spectres enregistrés de 250 nm à 310 nm) a été réalisée dans une cuvette en quartz ayant une longueur de trajet de 1 cm, à 20 °C et à une vitesse de 50 nm/minute, en prenant un temps de réponse de 2 secondes et une largeur de bande de 1 nm. Chaque spectre était le résultat de la moyenne de 3 balayages répétés, corrigés par rapport au bruit de fond avec le spectre du tampon correspondant. Les signaux de CD ont ensuite été convertis en ellipticité molaire. Les formes spectrales identiques et les ellipticités molaires identiques de l'insuline glargine et de la LysB29(1\r-His) insuline glargine, formulées à pH 4 et à une concentration de 3,64 mg/ml avec une quantité de 5 0,75 Zn2+/monomère, impliquent que les structures tridimensionnelles des deux composés sont identiques. Les résultats sont présentés sur la figure 3. Exemple 3 : test de solubilité in vitro Un test in vitro a été développé afin d'évaluer la capacité de l'analogue de 10 l'invention à précipiter à pH neutre (étape A), et à se dissocier pour donner une forme soluble lors d'une dilution (étape B). Les formulations ont été préparées à pH 4 et à une concentration de 3,5 mg/ml, et contenaient également 30 pg,/m1 de Zn2+ (qui correspond à 0,75 Zn2+/monomère), 2,3 % de glycérol et 25 mM de m-crésol. Cette formulation a été comparée à une insuline glargine préparée dans les mêmes 15 conditions et qui possède la même composition que le Lantus® commercial. Les formulations ont ensuite été ajoutées à un milieu tamponné avec du Tris-HC1 25 mM, pH 7,4 (150 pl dans 350 pl, respectivement) et laissées au repos pendant une heure à température ambiante. Ensuite, chaque suspension a été centrifugée et le pourcentage de protéines solubilisées dans le surnageant a été mesuré par CLHP en phase 20 inversée. Afin d'évaluer la capacité de dissociation, les suspensions ont été diluées 50 fois dans le même tampon et traitées comme précédemment (centrifugation et dosage par CLHP) après une heure de repos à température ambiante. Les résultats comparant la LysB29(i\r-His) insuline glargine et l'insuline glargine sont présentés dans le tableau ci-dessous. 25 Composé % de protéines solubles : % de protéines solubles : étape A étape B Lys1329(l\e-His) insuline Les données de concentration/réponse ont été ajustées par une régression de Marquadt à 4 paramètres (logiciel Magellan®). L'activité mitogénique relative (rapport des CE50) a été déteiminée en comparant la LysB29(1\e-His) insuline glargine à l'insuline humaine recombinante dans chaque expérience et la moyenne des activités relatives obtenues dans différentes expériences a été calculée. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous. CE50 (nm) Activité mitogénique relative (rapport des CE50) Insuline (n = 12) 72 ± 48 1 Insuline glargine (n = 3) 14 ± 6 4,6 ± 2,6 Lys1329(1\1E-His) insuline glargine (n = 5) 25 ± 9 3,9 ± 1,8 IGF-1 (n = 4) 1 ± 0 47 ± 26 Les résultats montrent que la LysB29(NE-His) insuline glargine et l'insuline glargine présentent des activités mitogéniques équivalentes. Exemple 5 : préparation de formulations pour réaliser une étude animale Des formulations de LysB29(1\f-His) insuline glargine ont été préparées en mélangeant des solutions mères de tous les ingrédients pour atteindre les quantités souhaitées. Toutes les formulations contenaient environ 600 nmol de protéines par ml, 25 mM de m-crésol, 2,3 % de glycérol et du zinc ajouté sous la forme de chlorure de zinc. Le pH a été ajusté avec des solutions d'acide chlorhydrique et d'hydroxyde de sodium. Le pH, l'osmolalité et la teneur en zinc sont présentés dqus le tableau ci- dessous. Ces formulations ont été préparées de façon à être très similaires à la préparation Lantus® selon des données publiques. Seule la teneur en zinc est modifiée ; pour effectuer une comparaison, la formulation FT-2 contenait environ la même quantité de zinc par protéine que le Lantus®. Toutes les formulations ont été stérilisées par filtration et étaient limpides et incolores. La teneur en protéines dans toutes les formulations n'a pas changé après un stockage d'un mois à la fois à 25 °C et à 5 °C. Nom Teneur en API (mg/mi) Teneur en Zn pH Osmolarité (g g/m1)[2] (mOsm/kg) Lantus® [1] 3,64 30 (0,77) environ 4 - FT-1 3,70 13 (0,33) 4,2 306 FT-2 3,69 29 (0,75) 4,2 305 FT-3 3,71 42 (1,08) 4,2 311 [1] Composition donnée dans les informations de prescription du Lantus®. [2] Le chiffre entre parenthèses indique la quantité de zinc par monomère (rapport en mol/mol). Exemple 6 : étude pharmacocinétique chez le rat Les trois prototypes ont été utilisés dans une étude pharmacocinétique par échantillonnage limité parallèle sur des rats mâles atteints par un diabète induit par la streptozitocine. 40 animaux au total (10 rats par groupe, divisés en 2 sous-groupes de 5 rats) ont reçu un des trois prototypes ou le Lantus® en une seule injection sous-cutanée de 30 UI/kg. A tO, tous les rats utilisés dans l'étude présentaient une glycémie supérieure 20 ou égale à 300 mg/dl. L'induction du diabète chez les animaux a été réalisée par l'administration d'une solution de streptozotocine (STZ) à 40 mg/kg par voie intraveineuse, 3 jours avant le début de l'étude. Du sang a été collecté à partir de la veine jugulaire aux moments temporels suivants : 0 (pré-dose), 4 h, 12 h, 24 h, 36 h, 72 h post-dose pour un sous-groupe, 0 25 (pré-dose), 1 h, 8 h, 18 h, 30 h, 48 h, 96 h post-dose pour l'autre sous-groupe. Les échantillons de plasma ont été analysés par un essai ELISA développé pour la déteçmination des analogues de l'insuline sur la base du kit ELISA pour l'iso- insuline Mercodia #10-1128-01. Il a été vérifié que l'insuline glargine et la LysB29(1\e-His) insuline glargine possède la même réactivité avec le kit ELISA pour l'iso-insuline. Les paramètres phainiacocinétiques ont été déterminés en utilisant une analyse non compartimentée (sur un système Phoenix WinNonlin 6.3) et sont présentés dans le tableau ci-dessous. Les paramètres pharmacocinétiques moyens et entre parenthèses pour les concentrations : % de CV et le nombre de moments temporels utilisés pour le calcul. Quand cela n'est pas spécifié, n = 5. Groupe Cmax AUCo-36h C 1 h C8h C18h C24h C36h (mUI/1) (h*mUI/1) (mUI/1) (mUI/1) (mUI/1) (mUI/1) (mUI/1) 2190 2190 574 200 137 (46, 85 FT-1 14 728 (21) (47) (28) (15) n = 4) (n = 1) 532 532 395 319 220 111 (23, FT-2 11 055 (24) (54) (47) (66) (37) n = 3) 741 377 315 387 211 132 (26, FT-3 11 969 (41) (79) (33) (39) (38) n = 4) 1783 1783 563 370 95 98 Lantus® 16 561 (36) (80) (47) (69) (n = 1) (n = 1) Pour n inférieur à 5, les valeurs sont toutes inférieures à 80 mUI/1 (LLOQ) et ne sont pas prises en compte. Les formulations FT-2 et FT-3 ont donné des valeurs de Cmax plus basses et des profils pharmacocinétiques moyens plus longs que le Lantus®. Les concentrations en insuline 18 heures après l'administration étaient très proches, mais étaient plus élevées 24 heures et 36 heures après l'administration. Sur la figure 3, les courbes de pharmacocinétique pour F1'-2 et le Lantus® sont présentées à titre comparatif. FT-1 dont la teneur en zinc est inférieure à celle du Lantus® présente un profil similaire à ce dernier. Il est donc clair qu'une durée d'exposition plus longue chez l'homme peut être attendue avec le nouvel analogue. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention. Références Tout au long de la présente demande, différentes références décrivent l'état de la technique à laquelle la présente invention se rapporte. Les descriptions de ces références sont incorporées à titre de référence à la présente description. Oiknine R, Bernbaum M, Mooradian AD. A critical appraisal of the role of insulin analogues in the management of diabetes mellitus. Drugs. 2005 ; 65(3) : 32540. Kurtzhals P, Schâffer L, Sørensen A, Kristensen C, Jonassen I, Schmid C, 10 Triib T. Correlations of receptor binding and metabolic and mitogenic potencies of insulin analogs designed for clinical use. Diabetes. Juin 2000 ; 49(6) : 999-1005. Jonassen I, Havelund S, Hoeg-Jensen T, Steensgaard DB, Wahlund PO, Ribel U. Design of the novel protraction mechanism of insulin degludec, an ultra-longacting basal insulin. Pharm. Res. Aout 2012 ; 29(8) : 2104-14. Epub 7 avril 2012. 15 Phillips NB, Wan ZL, Whittaker L, Hu SQ, Huang K, Hua QX, Whittaker J, Ismail-Beigi F, Weiss MA. Supramolecular protein engineering : design of zincstapled insulin hexamers as a long acting depot. J Biol Chem. 16 avril 2010 ; 285(16) : 11755-9. Epub 24 février 2010. Kohn WD, Micanovic R, Myers SL, Vick AM, Kahl SD, 71-rang L, Strifler 20 BA, Li S, Shang J, Beals JM, Mayer JP, DiMarchi RD. pI-shifted insulin analogs with extended in vivo time action and favorable receptor selectivity. Peptides. Avril 2007 ; 28(4) : 935-48. Epub 25 janvier 2007. Development and manufacture of protein pharmaceuticals Eds. Nail et al. Chapitre 2, 2002, Kulwer Academic/plenum publishers, NY 25 Green's Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons 4ème Ed. 2007 Sâbel CE, Neureuther JM, Siemarm S A spectrophotometric method for the determination of zinc, copper, and cobalt ions in metalloproteins using Zincon. Anal Biochem. Février 2010 15 ; 397(2) : 218-26. Epub 2 octobre 2009 30 Huus K, Havelund S, Olsen HB, van de Weert M, Frokjaer S. Biochemistry. Thermal dissociation and unfolding of insulin. 23 aout 2005 ; 44(33) : 11171-7. REVENDICATIONS1. Analogue de l'insuline glargine qui est la LysB29(1\r-Flis)GiyA21ArgB31ArgB32_ insuline humaine. 2. Composition phan iaceutique comprenant l'analogue de l'insuline glargine selon la revendication 1 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 3. Composition pharmaceutique selon la revendication 2, comprenant des ions de métal divalent choisis dans le groupe constitué des ions de zinc, de magnésium, de cuivre et de calcium. 4. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, dans laquelle - lesdits ions de métal divalent sont des ions de zinc, et - la concentration en ions de zinc est de 0,3 à 3 équivalents par mole de l'analogue de l'insuline glargine. 5. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, possédant un pH de 3,5 à 4,5. 6. Composition phaiiiiaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, 20 dans laquelle la concentration dudit analogue de l'insuline glargine est de 1 mg/ml à 20 mg/ml. 7. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, comprenant en outre un conservateur choisi dans le groupe constitué du phénol, du 25 m-crésol et d'un mélange de ceux-ci. 8. Composition phaimaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, comprenant en outre un agent d'isotonicité qui est le glycérol ou le chlorure de sodium. 30 9. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, comprenant : a. ledit analogue de l'insuline glargine à une concentration comprise entre 3,5 mg/ml et 4,0 mg/ml, par exemple à une concentration de 3,7 mg/ml b. des ions de zinc à une concentration comprise entre 20 ggiml et 50 pg/m1 c. du m-crésol à une concentration comprise entre 25 mmo1/1 et 30 mmo1/1 d. du glycérol à un taux de 1,6 % à 2,5 % en poids/poids, par exemple de 2,3 % en poids/poids e. et son pH est d'environ 4. 10 10. Analogue de l'insuline glargine selon la revendication 1 ou composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, pour une utilisation dans un traitement thérapeutique d'un humain ou d'animaux. 15 11. Analogue de l'insuline glargine selon la revendication 1 ou composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, pour une utilisation dans le traitement du diabète et/ou de l'hyperglycémie. 12. Procédé de préparation de l'analogue de l'insuline glargine selon la revendication 20 1, comprenant l'étape de greffage d'une histidine protégée sur l'insuline glargine à un pH compris entre 10 et 11, puis une étape de déprotection.