Brevet FR3020379A1 — publié le 20151030

PROCEDE DE PRODUCTION DE METHANE PAR CO-CULTURE AEROBIE DE MICROORGANISMES ANAEROBIES. La présente invention concerne un procédé de production de gaz méthane (CH4) par culture microbienne en conditions aérobie de microorganismes anaérobies. Le méthane produit biologiquement a été considéré jusqu'à un passé récent comme n'étant produit que de façon anaérobie, c'est-à-dire sans oxygène, et usuellement en présence d'hydrogène, par fermentation anaérobie d'un certain nombre de déchets organiques. Dans FR2537992, on produit du gaz CH4 par fermentation et dégradation anaérobie de déchets organiques. Pour ce faire, on injecte de l'hydrogène qui réagit avec le CO2 produit pour former du CH4 et ainsi diminuer le taux de CO2 en mélange avec CH4.il faut 10 à 5000 litres de gaz H2 par m3 de CH4 produit. Dans FR2601690, on utilise un méthanogène thermophile Methanococcus therrnolitotrophicus sous alimentation en H2/CO2, la culture se faisant dans un milieu contenant essentiellement une source d'azote et une source de sels assimilables à 110°C en anaérobie. Des travaux récents, depuis 2006 (1), ont montré que dans la mer il été possible de détecter du méthane dans un milieu aérobie, exclusivement après enrichissement par du methylphosphonate, par un ou plusieurs microorganismes fixant l'azote (Karl DM, Beversdorf L, Bjôrkman KM, Church MJ, Martinez A, DeLong EF. Aerobic production of methane in the sea. Nat Geosci 2008;1:473-8. Par ailleurs, le méthane naturel est produit dans l'intestin en conditions anaérobies sous l'activité de microorganismes méthanogènes. Dans le tube digestif le méthane est produit sous l'action de microorganismes Archae méthanogènes appelés, en particulier Methanobrevibacter srnithll ou Methanornassilicoccus lurninyensis, qui fabriquent du méthane à partir de molécules d'hydrogène (H2) produites par la fermentation des sucres par des bactéries anaérobies du tube digestif, en particulier par les Bacteroides, en particulier par Bacteroides thetaiotaornicron. Le but de la présente invention est de fournir un nouveau procédé biotechnologique de production de méthane en conditions aérobies. Les inventeurs ont découvert de façon surprenante qu'il était possible de permettre la culture de bactéries anaérobies en associant au milieu de culture, un composé anti-oxydant tout en maintenant la culture d'archaea méthanogène. Plus précisément, les inventeurs ont observé que l'addition de composés antioxydants dans un milieu de culture en atmosphère aérobie avec une bactérie anaérobie apte à produire de l'hydrogène, permettait aussi la culture d'une archaea méthanogène, du fait de la production d'hydrogène par ladite bactérie anaérobie. Ils ont pu mesurer la production d'hydrogène en présence de ladite bactérie anaérobie et la production de méthane par ladite archaea, faite de façon aérobie, par l'association des deux microorganismes anaérobies, notamment Methanobrevibacter srnithll ou Methanornassiliicoccus lurninyensis et Bacteroides thetaiotaornicron. Ainsi, la réalisation de chambres simples ou doubles de confection avec d'une part Bacteroides thetaiotaornicron, ou d'une autre bactérie anaérobie, et d'autre part Methanobrevibacter srnithll ou Methanornassiliicoccus lurninyensis, ou d'un autre organisme méthanogène permet de fournir une quantité significative de méthane. La présente invention consiste donc essentiellement dans la production biologique de méthane (Biogaz) par une association d'une bactérie méthanogène et une bactérie anaérobie cultivant en aérobie dans un milieu riche en composants antioxydants et contenant une source hydrocarbonée. Pour ce faire, la présente invention fournit un procédé de production de gaz méthane dans un réacteur par co-culture en atmosphère aérobie, de préférence air ambiant d'au moins : un premier microorganisme consistant une bactérie anaérobie apte à produire de l'hydrogène par fermentation en présence d'un substrat et /ou d'un milieu de culture comprenant ou complémenté en composé(s) hydrocarboné(s), notamment de l'amidon et/ou des sucres, et un deuxième microorganisme consistant en une Archaea méthanogène apte à produire du méthane à partir d'hydrogène et d'un substrat et /ou milieu de culture comprenant ou complémenté en composé(s) hydrocarboné(s), notamment de l'amidon et/ou des sucres, et un substrat organique et minéral comprenant des composants de milieux de culture aptes à permettre la culture des deux dits premier et deuxième microorganismes anaérobies, ledit milieu de culture comprenant ou étant complémenté en composé(s) hydrocarboné(s), notamment de l'amidon et/ou des sucres, et étant en outre supplémenté en composé(s) anti-oxydant(s). Plus particulièrement, les autres conditions de culture, notamment de température, sont les conditions appropriées pour la culture desdits microorganismes. En particulier, on doit augmenter la température pour incuber si nécessaire à une température favorisant la croissance desdits microorganismes, notamment à au moins 30°C voire 37°C. On comprend que le procédé selon la présente invention ne nécessite pas l'apport d'hydrogène externe et que le réacteur de coculture comprend des moyens de récupération du gaz méthane produit. De préférence, on réalise tout d'abord la culture dudit premier microorganisme dans ledit substrat et on introduit ledit deuxième microorganisme après que ledit premier microorganisme a déjà produit des produits de fermentation et de l'hydrogène. Plus particulièrement, ledit composé antioxydant est choisi de préférence parmi l'acide ascorbique, l'acide urique, le glutathion (y-L- Glutamyl-L-cysteinylglycine). L'acide ascorbique est préféré car il est capable à des doses précises de permettre la culture à un niveau d'oxygène plus élevé. Plus particulièrement encore, ledit composé antioxydant est mis en oeuvre à une concentration de 1 pg/ml à 2 mg/ml, ou concentration molaire de 10-6 M à 10-2 M, de préférence au moins 1g/I. D'autres composés antioxydants tels que l'hydrosulfure de sodium (NaHS) ou la cystéine sont moins efficaces et requièrent des concentrations plus élevées. De préférence, ledit milieu comprend une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 7,5. Plus particulièrement, ladite Archaea est une Archaea choisie parmi les Archae suivantes: Méthanobrevibacter, Methanosphaera, Methanornassiliicoccus, Methanobacteriurn, Methanococcus et Methanosaeta. Plus particulièrement, ladite Archaea est une Archaea choisie parmi les Archae suivantes : Methanobrevibacter srnithii, Methanobrevibacter oralis, Methanosphaera stadtrnanae, Methanornassiliicoccus lurninyensis, Methanobacteriurn beljingense et Methanosaeta con ciii. Plus particulièrement encore, ladite Archea est Méthanobrevibactera srnithll ou Methanornassiliicoccus lurninyensis. Les bactéries anaérobies strictes c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver en présence d'oxygène ou dans des concentrations inférieures à 1%, le plus communément inférieure à 0.1%, idéalement 0%. Parmi les bactéries anaérobies strictes, on cite plus particulièrement les bactéries extracellulaires, c'est à dire des bactéries qui qui ne peuvent vivre qu'à l'extérieur de cellules. Plus particulièrement, ladite bactérie anaérobie apte à produire de l'hydrogène est choisie parmi les bactéries des familles Actinobacteria et Bacteroidetes. De préférence, ladite bactérie anaérobie est du genre Bacteroides, Ces bactéries sont connues en particulier pour digérer l'amidon en produisant de l'hydrogène. Plus particulièrement, ladite bactérie anaérobie est Bacteroides thetaiotaornicron. On cite aussi comme Actinobacteria, la bactérie Lactococcus lactis. Plus particulièrement, ledit milieu de culture comprend les composants que l'on retrouve dans les milieux de base de culture aptes à cultiver une archaea ou une bactérie anaérobie, comprenant au moins : plusieurs sources de carbone, une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate, une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium, au moins un sel de métaux choisi parmi K, Mg, Na, Ca, de préférence NaCI. Plus particulièrement, ledit milieu culture est un milieu acellulaire est choisi parmi un milieu axénique constitué de substances chimiques ou biologiques défini qualitativement et quantitativement, et un milieu acellulaire comprenant un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire. Plus particulièrement, ledit milieu de culture est un milieu acellulaire conventionnel de bactérie anaérobie, de préférence un milieu comprenant des composant choisis parmi un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire, un digestat enzymatique, notamment un digestat enzymatique de caséine, soja et/ou de tissu animal, une peptone, un extrait de levure, un sucre tel que dextrose ou glucose, un sel NaCI et/ou Na2PO4. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture est un milieu conventionnel de culture de bactéries anaérobies tel que les milieux dits bouillon de type coeur-cervelle, milieux Columbia à 5% de sang de mouton ou milieu Schaedler tels que décrits ci-après. D'autres milieux conventionnels appropriés sont les milieux Brucella ou Wilkins-Chagren. De tels milieux de culture acellulaires sont bien connus de l'homme de l'art. On peut utiliser en particulier des milieux de culture polyvalents pour microorganismes anaérobies, notamment le milieu de Schaedler, ledit milieu étant complémenté en composés hydrocarbonés, de préférence de l'amidon et de(s) sucre(s), et en dit(s) composéantioxydant(s). Les inventeurs ont en effet testé différentes molécules présentant une activité antioxydante et ont découvert que certains composés antioxydants dans certaines concentrations présentent un effet supérieur sur la croissance des dites bactéries. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faite de manière illustrative et non limitative, d'un exemple de réalisation. Pour illustrer l'invention, les inventeurs ont cultivé des archaea méthanogènes réputées anaérobies strictes (réputées ne cultiver qu'en l'absence stricte d'oxygène), en atmosphère aérobie (c'est à dire à l'air libre, contenant environ 16% d'oxygène) et en présence de bactéries réputées anaérobie stricte, dans des milieux de culture de bactéries et d'archae réputées anaérobies, lesdits milieux de culture étant complémentés en composés anti-oxydants pour supporter la croissance en atmosphère d'air ambiant et complémentés en composés hydrocarbonés pour produite H2 et CH4. 1. Souches utilisées Une archaea méthanogène Methanobrevibacter srnithll souche ATCC 3561T DSMZ 861 a été obtenue auprès de la collection allemande de microorganismes et de cultures cellulaires (DSMZ, Braunschweig, Allemagne). Une archaea Methanornassiliicoccus lurninyensis déposée à la collection de dépôt de microorganismes DSMZ (Allemagne), conformément au Traité de Budapest, sous le numéro DSMZ 24529 a aussi été testée décrite dans FR124779 (publié sous le numéro 2 990954).Par ailleurs, une souche de bactérie anaérobie Bacteroides thetaiotaornicron a été obtenue au travers de l'étude "culturomics" des inventeurs (Lagier JC et al., Microbial culturomics: paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin Microbiol Infect. 2012;18:1185-93) aussi accessible dans divers collections de dépôt (CSUR P766, DSM ATCC 29148 et NCTC 10582). Une autre souche de bactérie anaérobie suivante a aussi été testée : Lactococcus lactis (Collection Nationale de cultures de microorganismes CNCM 1-2716). 2) Culture aérobie des microorganismes anaérobies à l'aide d'antioxydants. Pour leur production en quantité suffisante, les deux souches M. srnithll ou M. lurninyensis et B. thetaiotaornicron ont été cultivées en atmosphère anaérobie à 37 °C dans un milieu de culture polyvalent. On a testé le milieu de Schaedler (Reference 42098 ; BioMérieux, La Balmes-les-Grottes, France) ainsi que le milieu dénommé «milieu SAB » décrit dans FR 124779 (publié sous le numéro 2 990954) et WO 2013/0044933 habituellement utilisé pour cultiver les archaea méthanogènes humains et qui apparait approprié aussi pour la culture de bactéries anaérobies. Le milieu Schaedler (commercialisé par Biomerieux, Marcy l'étoile, France) présentait la composition suivante pour 1 litre : - Digestat enzymatique de caséine 5.6 g - Digestat enzymatique de tourteau de soja 1 g - Digestat enzymatique de tissus animal 5 g - Extrait de levure 5 g - NaCI 1.7 g - Phosphate de potassium 0.82 g - Dextrose 5.82 g - Tris (hydroxymethyl) Aminomethane 3 g - Hemine 0.01 g - L-cysteine 0.4g Le milieu SAB utilisé était dépourvu de Na25 et de L-cystéine et comprenait : NiCl2x6H20 (0,07mg/1), Na2Mo04 x 2H20 (0,02mg/1), Fe504 x 7H20 (0,2 mg/1), Mg504 x 7H20 (0,01 g/1), K2HPO4 (0,5 g/1), KH2PO4 (0,5 g/1), KCI (0,05 g/1), CaCl2 (0,05 g/1), NaCI (1,5 g/1), NH4CI (1 g/1), Na-Acétate (1 g/1), Extrait de levure (1 g/1), Biotrypticase (1 g/1), Solution d'oligoéléments de Widdel (2 m1/1), Solution d'oligoéléments de Balch (10 m1/1), Résazurine (1 mg/1), Na25e203.5H20 (0,015 mg/1), Na2W04.2H20 (0,02 mg/1), NiC12.6H20 (0,07 mg/1), NaHCO3 (4 g/1), Na-Formate (0,4 g/1), Methanol (40 mM), Solution de vitamines de milieu de Balch (10 m1/1), Acide valérique (0,6 g/1), Acide isovalérique (0,6 g/1), Acide 2-méthylbutyrique (0,6 g/1), Acide isobutyrique (0,6 g/1), Acide 2-méthylvalérique (0,6 g/1). Les oligoéléments de Balch comprennent NaCI, Fe504, Zn504, Mg504, Mn504, Co504, H3B03, NiCl2, Na2Mo04, CaCl2. Les oligoéléments de Widdel comprennent FeCl2, CoCl2, MnCl2, ZnCl2, H3B03, Na2Mo04, NiCl2 et CuC12. Les vitamines du milieu de Balch sont listées au tableau 6 ci-après et comprennent la biotine, acide folique, hydrochlorure de pyridoxine, hydrochlorure de thiamine, riboflavine, acide nicotinique, pantothénate de DL-calcium, vitamine B12, Acide p-aminobenzoïque, acide lipoique). Ce milieu Schaedler ainsi que ce milieu SAB ont été complémentés par l'ajout des composés hydrocarbonés à savoir de 1 g/L d'amidon de riz et de 1 g/L de glucose (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) et l'ajout de composés anti-oxydants à savoir complémenté par l'ajout de 1 g/L d'acide ascorbique (VWR International, Louvain, Belgique), 0,1 g/L d'acide urique et 0,1 g/L de glutathion (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France). La résazurine est mise en oeuvre comme un indicateur d'oxydo- réduction à une concentration de 0,1mg/mL pour contrôler la présence d'oxygène (la résazurine oxydée a une couleur rose, et devient transparente en l'absence d'oxygène). La culture aérobie en air ambiant de M. srnithll ou M. lurninyensis et B. thetaiotaornicron a été effectuée dans des récipients séparés et dans un même récipient incubés à 37°C contenant le milieu de culture complémenté par l'ajout de composés anti-oxydants et composés source de carbone. Le pH a été ajusté à 7,5 par ajout de KOH 10M. Les deux souches ont été cultivées séparément ainsi qu'en coculture, en condition aérobie et par l'inoculation de 105 organismes/mL de chaque souche avec le milieu de culture complémenté selon la présente invention et parallèlement avec le milieu Schaedler ou SAB complémenté par les composés hydrocarbonés mentionnés ci-dessus mais en revanche sans composés anti-oxydants. Les témoins positifs consistent en un tube contenant le milieu de culture complémenté ci-dessus, inoculé en conditions anaérobie par 108 microorganismes/L de M. srnithll ou M. lurninyensis en présence du mélange gazeux de 80% H2 + 20% de CO2 à la pression de deux atmosphères requise pour la croissance optimale des archaea méthanogènes. Le milieu de culture complémenté inoculé en anaérobie par 108 microorganismes/L de M. srnithll ou M. lurninyensis sans ce mélange de gaz a été introduit pour vérifier la croissance de cette archaea méthanogène sans H2. Le milieu de culture supplémenté en ajoutant 1 g/L d'amidon de riz et de 1 g/L de glucose inoculé en anaérobie par 108 cellules/L de B. thetaiotaornicron a été introduit comme témoin positif et pour vérifier la production de H2 par B. thetaiotaornicron en culture anaérobie. Ces contrôles ont été effectués en parallèle en atmosphère ambiante (aérobie). Le milieu de culture non-inoculé a été introduit comme contrôle négatif. 3) Détection de la croissance par chromatographie en phase gazeuse. La croissance de M. srnithll ou M. lurninyensis a été évaluée quotidiennement par la production de méthane et la croissance de B. thetaiotaornicron a été évaluée quotidiennement par la production d'hydrogène. La mesure de méthane et d'hydrogène a été réalisée l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse GC-8A (Shimadzu, Champs-sur-Marne, France) équipé d'un détecteur de conductivité thermique et une Chromosorb WAW 80/100 mailles colonne SP100 (Alltech, Carquefou, France). L'azote N2 à une pression de 100 kPa a été utilisé comme gaz porteur. Le détecteur et les températures de l'injecteur étaient de 200° C et la température de la colonne était de 150° C. 4) Résultats 4.1) Contrôles Les contrôles négatifs sont restés négatifs sans croissance survenant après une semaine d'incubation indiquant que les résultats rapportés ici ne sont pas simplement le résultat d'une contamination par d'autres microorganismes. Les contrôles positifs étaient positifs avec une production de méthane observée dans la culture anaérobie de M. strnithll ou M. lurninyensis et avec une production d'hydrogène observée dans la culture anaérobie B. thetaiotaornicron. Il n'y a eu aucune production de méthane décelable dans la culture de M. srnithll ou M. lurninyensis inoculée seul en anaérobie et en aérobie sans mélange de gaz. Egalement, la culture de B. thetaiotaornicron inoculée en aérobie sans composés antioxydants est restée négative et l'hydrogène n'a pas été produit. 4.2) Co-culture aérobie. Après une incubation de 24 heures à 37° C en air ambiant (dans des conditions aérobies), un milieu de culture sans composés antioxydants a conservé sa couleur rose indiquant la présence d'oxygène. Le milieu de culture aérobie avec les composés anti-oxydants est devenu transparent indiquant l'absence d'oxygène après sa réduction par les composés antioxydants. Le milieu de culture inoculé en aérobie par M. srnithll ou M. lurninyensis avec les composés anti-oxydants est devenu transparent, mais la culture est restée négative et le méthane n'a pas été produit. Le milieu de culture inoculé en aérobie par B. thetaiotaornicron en présence des antioxydants est devenu transparent et une croissance bactérienne a été observée avec production d'hydrogène. Les co-cultures de M. srnithll ou M. lurninyensis et B. thetaiotaornicron réalisées dans des conditions aérobies avec des composés anti-oxydants donnaient toutes une culture positive pour B. thetaiotaornicron avec production d'hydrogène après une incubation de 24 heures. En revanche, dans certaines expériences, aucune croissance n'était observée pour M. srnithll ou M. lurninyensis (bien que le milieu de culture soit devenu transparent). Les inventeurs ont émis l'hypothèse que M. srnithll ou M. lurninyensis est mort en raison de son exposition à l'oxygène avant que le milieu n'ait été réduit par les composés antioxyda nts. Des expériences ont été effectuées avec introduction de B. thetaiotaornicron à tO et M. srnithll ou M. lurninyensis ajoutée à t0+ 24 heures d'incubation. L'addition de M. srnithll ou M. lurninyensis après 24 heures d'incubation a permis dans tous les cas de rétablir sa croissance par la consommation de l'hydrogène préalablement produit par B. thetaiotaornicron en présence de composés antioxydants et en lui évitant une exposition mortelle à l'oxygène. Cette même expérience a été réalisée sans composé anti-oxydant et la culture est restée négative pour les deux souches testées. D'autre part, la bactérie anaérobie Lactococcus lactis (Collection Nationale de cultures de micro-organismes CNCM 1-2716) a aussi été testée avec succès combinée à ces deux archaea. 4.3) Interprétation. Ces résultats indiquent qu'il est possible de cultiver à l'air ambiant (condition aérobie) des bactéries réputées strictement anaérobies, dans un milieu approprié contenant un mélange approprié d'antioxydants. Dans ces conditions, les bactéries anaérobies produisent de l'hydrogène qui peut être alors utilisé dans un deuxième temps par les archaea méthanogènes pour la production de méthane. Il est démontré qu'il est possible de produire du méthane à l'air ambiant, dans des conditions appropriées de co-culture de bactéries et de méthanogènes anaérobies dans un milieu de culture complémenté en composés source de carbone et composés anti-oxydants. L'introduction des archaea méthanogènes dans un milieu contenant déjà des produits de fermentation et de l'hydrogène estpréférable. REVENDICATIONS1. Procédé de production de gaz méthane par co-culture dans un réacteur en atmosphère aérobie, de préférence air ambiant, d'au moins : un premier microorganisme consistant en une bactérie anaérobie apte à produire de l'hydrogène par fermentation en présence d'un substrat et /ou d'un milieu de culture comprenant ou complémenté en composé(s) hydrocarboné(s), et un deuxième microorganisme consistant en un Archaea méthanogène apte à produire du méthane à partir d'hydrogène et d'un substrat et /ou milieu de culture comprenant ou complémenté en composé(s) hydrocarboné(s), et un substrat organique et minéral comprenant des composants de milieux de culture aptes à permettre la culture des deux dits premier et deuxième microorganismes, ledit milieu de culture comprenant ou étant complémenté en composé(s) hydrocarboné(s), et étant en outre supplémenté en composé(s) anti-oxydant(s). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réalise tout d'abord la culture dudit premier microorganisme dans ledit substrat et on introduit ledit deuxième microorganisme après que ledit premier microorganisme a déjà produit des produits de fermentation et de l'hydrogène. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le(s) dit(s) composé(s) anti-oxydant (s) est (sont) choisi(s) parmi l'acide ascorbique, l'acide urique, le glutathion, de préférence l'acide ascorbique. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite Archaea est une Archaea choisie parmi les archaesuivantes: Méthanobrevibacter, Methanosphaera, Methanomassillicoccu5' Methanobacterium, Methanococcus et Methanosaeta. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite archaea est une archaea choisie parmi les archae suivantes: Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter oralis, Methanosphaera stadtmanae, Methanomassiliicoccus luminyensis, Methanobacterium beijingense et Methanosaeta concilli. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit archea est Méthanobrevibacter smithil ou Methanomassiliicoccus 10 luminyensis. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite bactérie anaérobie apte à produire de l'hydrogène est choisie parmi les bactéries des familles Bacteroidetes et Actinobacteria. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que 15 ladite bactérie anaérobie est du genre Bacteroides. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite bactérie anaérobie est Bacteroides thetaiotaomicron. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite bactérie anaérobie est lactococcus lactis. 20 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend au moins les composants suivants: - plusieurs sources de carbone, - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate, 25 - une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium,- au moins un sel de métaux choisi parmi K, Mg, Na, Ca, de préférence NaCI. 12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que ledit composé antioxydant est mis en oeuvre à une concentration de 1 mg/I à 2 g/I, de préférence au moins 1g/I. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit milieu comprend une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 7,5. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ledit milieu comprend les composants du milieu de Schaedler complémenté en composés hydrocarbonés, de préférence de l'amidon et de(s) sucre(s), et en dit(s) composé(s) antioxydant(s).