Brevet FR3017714A1 — publié le 20150821

La présente invention a pour objet un procédé pour le pronostic précoce d'une dengue sévère ou dengue hémorragique utilisant des marqueurs protéiques. Ces 30 dernières années, la dengue, une maladie virale transmise par les moustiques hématophages urbains du genre Aedes, s'est répandue à travers le monde de manière inquiétante. C'est actuellement un véritable problème de santé publique pour plus d'une centaine de pays situés dans la zone subtropicale, particulièrement dans les zones pacifique-ouest, Amérique du sud et Asie du sud-est. L'émergence de la maladie est due en grande partie à l'explosion démographique et à l'urbanisation anarchique. Les anomalies climatiques ont également un rôle non négligeable. A ce titre, la dengue pourrait émerger dans les régions occidentales du globe jusqu'alors épargnées par le virus. Ainsi, Aedes albopictus, un des vecteurs de la maladie, a récemment été trouvé dans le nord de l'Italie et dans le sud de la France. Dernièrement, des cas de dengue autochtones ont été signalés dans le sud de la France. On estime que près de 3 milliards de personnes sont exposés aux risques de dengue. Près d'un million d'hospitalisations sont recensées annuellement et les décès se comptent par milliers. Les enfants sont les principales victimes de la maladie. Le virus de la dengue est un virus enveloppé à ARN monocaténaire de polarité positive de la famille des Flaviviridae. Le génome du virus (11 000 nucléotides) code pour une polyprotéine d'environ 3400 acides aminés qui subit un clivage co- et post-traductionnel qui résulte en des protéines structurales (C, prM, E) et des protéines non-structurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Il existe 4 sérotypes viraux (DV1 à DV4), qui peuvent coexister en zones d'endémie. Il y a environ 70% d'homologie de séquences entre les différents sérotypes. L'infection par un sérotype donné confère une immunité sur le long terme pour ce sérotype. La protection croisée ne dure que quelques mois : la réinfection est donc possible avec un sérotype différent. La manifestation clinique la plus commune (fièvre de dengue « classique » ou Dengue Fever : DF) est un état fébrile de quelques jours accompagné notamment de céphalées sévères, de lombalgies, de douleurs musculaires et articulaires, qui régressent spontanément sans traitement spécifique au bout de quelques jours. Cependant, on assiste parfois à des complications conduisant à une dengue hémorragique (Dengue Hemorrhagic Fever : DHF). Dans ce cas, on note une augmentation transitoire de la perméabilité vasculaire et une fuite du plasma responsable d'une thrombopénie et d'une coagulopathie. Dans les cas les plus sévères, la fuite de plasma peut entraîner un choc 5 hypovolumique mortel (Dengue Shock Syndrome : DSS) si le patient n'est pas pris en charge rapidement. Des atteintes hépatiques et neurologiques, rares mais mortelles, sont également associées à la sévérité de la maladie. Variable selon les épidémies, le taux de mortalité peut atteindre 5% des cas déclarés de DHF. Ce taux peut 10 augmenter jusqu'à 20% sans une prise en charge hospitalière ou des traitements adaptés. Par simplification, ces cas sévères seront dénommés dans la suite de la description, par opposition aux dengues classiques DF, dengues sévères DS. 15 90% des cas de dengues sévères ont lieu lors d'une infection secondaire par un sérotype hétérologue et 10% lors d'une infection primaire, habituellement chez des nourrissons âgés de 6 mois à 1 an. Il existe plusieurs facteurs qui influent sur la sévérité de l'infection, tels que les facteurs de l'hôte, le sérotype et le 20 génotype du virus, l'ordre et l'intervalle de succession des virus infectants, la qualité et la quantité d'anticorps à réactions croisées et la réponse CD4/CD8. Des études ont montré une corrélation entre la charge virale et la sévérité de la maladie. Cependant, les causes exactes de l'apparition d'une dengue sévère ne sont toujours pas 25 connues. Jusqu'à présent, aucun déterminant spécifique de la virulence n'a été mis en évidence. De plus, comme il n'existe pas de vaccins contre le virus de la dengue, les seuls traitements disponibles sont des traitements symptomatiques. C'est pourquoi, il est important de pouvoir surveiller les épidémies et de pronostiquer les cas sévères 30 pour une prise en charge hospitalière adaptée. Les méthodes actuellement utilisées pour le diagnostic de la dengue ne permettent pas de pronostiquer une évolution vers une dengue sévère. Tout au plus, les méthodes sérologiques permettent de discriminer infections primaires et secondaires et les méthodes 35 moléculaires permettent de détecter le virus et d'effectuer le sérotypage[1, 2, 3, 4]. La présente invention répond aux problématiques présentées ci-dessus par un procédé qui permet à la fois une détection précoce et spécifique de protéines dans un échantillon sanguin permettant de pronostiquer les cas de dengues sévères. En effet, les inventeurs ont trouvé de manière surprenante que des protéines de l'hôte étaient exprimées de manière plus ou moins abondante (surexprimées/sous5 exprimées) dans les cas de dengues sévères en comparaison avec leur quantité ou expression dans des cas de dengues classiques dans des échantillons sanguins constitués par le plasma. Tout particulièrement, ils ont montré pour la première fois et de manière totalement inattendue que le facteur plaquettaire 4(ou platelet factor 4 ou PF4) 10 est sous exprimé dans le cas des dengues sévères et constitue donc un marqueur pronostique de la dengue sévère. Aussi la présente invention a pour objet un procédé pour pronostiquer, in vitro, dans un échantillon sanguin, la probabilité pour un patient d'évoluer vers une dengue sévère, dans lequel : 15 a)on détermine la quantité d'au moins un marqueur qui est le platelet factor 4 dans ledit échantillon sanguin, b)on compare la quantité de platelet factor 4 déterminée dans l'étape a) avec une quantité de référence dudit marqueur obtenu à partir d'un groupe d'individus qui ont été diagnostiqués comme étant 20 atteints d'une dengue non sévère, dans lequel si la quantité de platelet factor 4 déterminée dans l'étape a) est inférieure à la quantité de référence établie dans l'étape b), on pronostique que le patient va évoluer vers une dengue sévère. Selon le procédé de l'invention on peut aussi déterminer dans l'étape 25 a) la quantité d'au moins un autre marqueur choisi parmi l'olfactomédine 4 (OLFM4) et l'a2-macroglobuline (A2M) ou la quantité respective des deux marqueurs dans l'échantillon sanguin et dans l'étape b) on compare la quantité du marqueur ou des deux marqueurs de l'étape a) avec une quantité de référence obtenue à partir d'un groupe 30 d'individus qui ont été diagnostiqués comme étant atteints d'une dengue non sévère et si la quantité du marqueur ou des deux marqueurs déterminée dans l'étape a) est supérieure pour l'olfactomlédine-4 et/ou inférieure pour l'a2-macroglobuline à la quantité de référence établie dans l'étape b), on détermine que le patient va évoluer vers 35 une dengue sévère. L'invention concerne également un kit pour le pronostic in vitro d'une dengue sévère comprenant : - un partenaire de liaison du platelet factor 4, - un partenaire de liaison de la protéine NS1 du virus de la dengue. Le kit peut de plus comprendre un partenaire de liaison de OLFM4 et/ou un partenaire de liaison de l'A2M. Définitions Par échantillon sanguin on entend le sang total, le sérum et le plasma. Par partenaire de liaison on entend par exemple les récepteurs, 10 les anticorps, les fragments d'anticorps, les analogues d'anticorps et tout autre ligand capable de se lier à une protéine. Les anticorps partenaires de liaison sont par exemple soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux. Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un 15 animal avec l'immunogène approprié, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les 20 anticorps. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-dessous. Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris avec l'immunogène approprié, dont les lymphocytes B sont alors 25 capables de produire des anticorps contre cet antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules 30 capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de la protéine pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert (Western blot) en 35 une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité décrite ci-dessus. Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier. Par « analogues d'anticorps » on entend des composés biologiques 5 et/ou chimiques qui possèdent les mêmes capacités de liaison que les anticorps ou fragments d'anticorps ou des capacités de liaison similaires. En particulier, les analogues d'anticorps incluent de anticorps sont capables de se lier à petites protéines qui comme les une cible biologique permettant ainsi de la 10 ou tout simplement de la cibler au sein échantillon biologique. Les champs d'anticorps sont pratiquement aussi titre d'exemple, on peut citer les détecter, de la capturer d'un organisme ou d'un d'applications de ces analogues vastes que ceux des anticorps. A NanofitinesTM , petites protéines commercialisées par la société AFFILOGIC. 15 Les partenaires de liaison spécifiques de la protéine recherchée peuvent être utilisés comme réactif de capture, comme réactif de détection ou comme réactifs de capture et de détection. La visualisation des réactions immunologiques, c'est-à-dire de la liaison protéine/partenaire de liaison, peut être effectuée par tout 20 moyen de détection par l'intermédiaire d'un marquage, du partenaire de liaison. Par marquage, on entend la fixation d'un réactif marqueur capable de générer un signal détectable, c'est à dire un composé, une substance ou une particule qui peut être détecté par des moyens visuels, 25 fluorescents, instrumentaux. Une liste non limitative de ces réactifs marqueurs consiste en : les particules métalliques ou d'alliages, telles que les particules d'or colloïdal, les particules de polymère, telles que les particules de 30 latex colorés, les particules magnétiques, les molécules fluorescentes, les molécules chimioluminescentes. A titre d'exemple de tests immunologiques tels que définis ci-dessus, 35 on peut citer les méthodes « sandwich » et de « compétition ». Figures : La majorité des figures illustre la validation des résultats par un test ELISA quantitatif effectué sur des échantillons individuels de patients prélevés durant la phase aigüe de la maladie (patients dengue classique, notés DF et patients dengues sévères, notés DS), avant défervescence. Dans tous les cas la lecture est effectuée à une densité optique (DO) de 450nm. Les résultats ont été obtenus sur des échantillons d'origine géographique différente : la Colombie et le Cambodge. Sur les graphes obtenus(Logiciel GraphPad Prism V4.03), la médiane calculée est représentée par un trait horizontal. La boîte illustre les valeurs englobant 50% des individus. Les valeurs maximum et minimum sont également illustrées. Les valeurs prises en compte correspondent à la moyenne de deux essais indépendants effectués en duplicate. La figure 1 illustre la présence de virus dans les fractions purifiées 15 à partir du plasma de patients mais pas dans le contrôle (C), mis en évidence avec un western-blot utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine virale E. La figure 2 illustre les résultats obtenus pour le dosage quantitatif par test ELISA du marqueur PF4 sur des échantillons de plasma 20 provenant de patients colombiens. La figure 3 illustre les résultats obtenus pour le dosage quantitatif par test ELISA du marqueur PF4 sur des échantillons de plasma provenant de patients cambodgiens. La figure 4 illustre les résultats obtenus pour le dosage quantitatif 25 par test ELISA du marqueur OLFM4 sur des échantillons de plasma provenant de patients colombiens. La figure 5 illustre les résultats obtenus pour le dosage quantitatif par test ELISA du marqueur OLFM4 sur des échantillons de plasma provenant de patients cambodgiens. 30 La figure 6 illustre les résultats obtenus pour le dosage quantitatif par test ELISA du marqueur A2M sur des échantillons de plasma provenant de patients cambodgiens. Exemple 1 : Caractérisation des échantillons 35 15 échantillons de plasma colombiens ont été sélectionnés parmi lesquels 8 ayant développé une dengue classique (DF) et 7 ayant développé une dengue sévère qui ont été regroupés constituant un pool de plasma DF et un pool de plasma dengue sévère. Tous les plasmas ont été prélevés durant la phase aiguë de la maladie, avant la phase critique, sur des malades ayant une infection secondaire. Les sérotypes concernés étaient les sérotypes 1, 2 et 3. Tous les patients ayant développé une dengue sévère étaient hospitalisés et présentaient des signes d'hémorragies. Aucune comorbidité n'a été rapportée [5]. Tous les plasmas ont été contrôlés comme étant NS1-positifs (Kit Platelia Dengue Biorad) et la charge virale a également été vérifiée en Q-RTPCR par un kit commercial (PrimerDesign) suivant les instructions du fournisseur : le nombre moyen de copies d'ARN viral a été estimé à 4.106 et 4.1 107 pour les pools dengue classique (DF) et dengue sévère, respectivement. Les pools constitués correspondent à un volume d'environ 2mL de plasma. Avant purification, les mélanges de plasma ont été centrifugés de 5 min. à 1000g et à 4°C, afin d'enlever les impuretés présentes dans l'échantillon et d'obtenir des échantillons clarifiés. Les critères de sélection des plasmas sont décrits dans le tableau 1 qui suit. Les prélèvements ont été effectués après apparition des symptômes. Tableau 1 Plasma colombiens POOL DF POOL DS General Nombre 8 7 Age (Moyenne) 26.8 33.7 M/F ratio 6/2 3/4 Jour 3.3 2.7 Infection secondaire Oui Oui NS1 Positif Positif Serotype DV1 1 0 DV2 1 3 DV3 6 4 Ces pools d'échantillons de plasma ont ensuite été purifiés pour obtenir des fractions enrichies en virus comme décrit ci-dessous. Exemple 2 : Purification des échantillons Toutes les étapes sont effectuées à 4°C. Les échantillons clarifiés sont complétés par 8mL de PBS pH8 froid (PBS8), puis sont centrifugés 2h à 41 000 g dans une ultracentrifugeuse OptimaL90 (Beckman). Le rotor utilisé est le rotor SW41 (Beckman). Après centrifugation, le surnageant est enlevé et le culot viral obtenu est resuspendu dans 200 microlitres de PBS8 puis chargé sur un gradient discontinu constitué de 5 mL de saccharose 60% (p/p) en PBS8 et 5 mL de saccharose 20% (p/p) en PBS8. Après une nouvelle centrifugation de 2h à 41 000 g, un anneau enrichi en virions, localisé à l'interface entre les deux solutions de saccharose, est prélevé à la pipette, dilué 10 fois par du PBS8 et finalement centrifugé une dernière fois 2h à 41 000 g. Le culot obtenu est re-suspendu dans 200 microlitres de PBS8. Cette re-suspension est ensuite purifiée par utilisation d'un polyelectrolyte insoluble, le Viraffinity (BioSupportGroup, USA). Pour cela, 200 microlitres d'un tampon MN (60mM MES pH6.5, 150 mM NaCl)sont ajoutés à la suspension virale ainsi que 100 microlitres de Viraffinity. Le mélange est incubé 5 min. à température ambiante puis centrifugé 10 min. à 1000g , selon les instructions du fournisseur. Le surnageant est enlevé et le culot de polymère est rincé 3 fois avec 200 microlitres de tampon MN. Les protéines virales sont récupérées par chauffage du polymère 5 min./70°C en présence de 50 microlitres d'un tampon contenant du SDS (Novez InVitrogen) puis d'une centrifugation de 5 min. à 1000 g. La présence du virus dans les échantillons finaux a été vérifiée par immunoblot avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine d'enveloppe du virus de la dengue (protéine E). Comme illustré sur la figure 1 de forts signaux à 60 KDa et 120 KDa, correspondant respectivement aux formes monomériques et dimériques de la protéine d'enveloppe, sont spécifiquement détectés par l'anticorps monoclonal dans les pools de plasma . En revanche, la protéine d'enveloppe n'a pas été détecté sur un contrôle correspondant à un pool de plasma sains (non dengue) purifié de la même façon que ce qui a été décrit ci-dessus. Exemple 3 : Identification des protéines spécifiques de chaque pool de plasma DF et dengue sévère par spectrométrie de masse (MS) Méthode : Les préparations virales et l'échantillon contrôle obtenus selon l'Exemple 2 sont déposées sur un gel de polyacrylamide non dénaturant, et mises à migrer jusqu'à ce que les protéines entrent à l'intérieur du gel, ceci afin de dessaler l'échantillon. La bande contenant les protéines est excisée manuellement puis lavée 3 fois dans un tampon contenant 50% d'acétonitrile pour finalement être séchée dans 100% d'acétonitrile. Le gel est ensuite réhydraté dans une solution à 7% d'H202 avant d'être lavé de nouveau. Une solution de trypsine diluée dans 25mM NH4HCO3 est ensuite ajoutée pour une hydrolyse à 37°C sur la nuit. Les peptides ainsi obtenus sont extraits par des extractions séquentielles de 15 minutes avec 30 microlitres d'acétonitrile 50%, 30 microlitres d'acide formique 5% et 30 microlitres d'acétonitrile 100%. Ces extractions séquentielles sont mélangées, séchées sous vide et resuspendues dans une solution contenant 5% d'acétonitrile et 0.1% d'acide trifluoroacétique. Après quantification des échantillons, une quantité définie de peptides est analysée par chromatographie nanoliquide couplée en tandem à de la spectrométrie de masse(Ultimate 3000, Dionex et LTQ-Orbitrap VelosPro, Thermo Fisher Scientific). Les résultats sont acquis grâce au logiciel Xcalibur (ThermoFisher) et transformés automatiquement par le logiciel Mascot Daemon V2.2 (Matrix Science). La recherche se fait ensuite sur les bases de données Swissprot et Trembl via Mascot2.2. Chaque expérience a été menée deux fois, de façon indépendante. L'identification des protéines a été réalisée par le laboratoire EDYP Service (CEA Grenoble, France). Résultats : La protéine virale d'enveloppe E a été identifiée de façon répétée 25 dans les échantillons contenant du virus. La séquence du peptide majoritairement identifié est GWGNGCGLLFKG. Ce résultat confirme la présence du virus dans la fraction purifiée. Pour les protéines d'origine cellulaire, identifiées par protéomique sur les pools de plasmas purifiés, les résultats obtenus sont résumés 30 dans les tableaux 2a et 2b. Dans ces tableaux, seules les protéines ayant une variance inférieure à 25% pour le nombre de peptides trouvés d'une expérience à l'autre ont été considérées. De même, pour l'échantillon dengue sévère, un nombre de peptide supérieur à 2 a été requis. Suivant ces critères, 189 protéines ont finalement été 35 sélectionnées. Ces protéines sont décrites dans le tableau 2a et 2b qui suit. Un rapport « nombre de peptides échantillon dengue sévère (DS) »/ « nombre de peptides échantillon dengue classique (DF) » (DS/DF) a pu être calculé pour une majorité de ces protéines (cf. tableau 2a). Certaines protéines ont été identifiées uniquement dans l'échantillon DS (cf. tableau 2b), dans ce cas le rapport DS/DF n'était pas calculable. Tableau 2a Numero Nom protéine Nombre moyen de peptides DF Nombre moyen de peptides DS Ratio peptides D d'accession DS/DF P09871 Complement Cls subcomponent (C1 3,5 14,5 4,14 esterase) P07225 Vitamin K-dependent protein S 1 4 4,00 P01008 Antithrombin-III (ATIII) (Serpin Cl) 3 9,5 3,17 Q16610 Extracellular matrix protein 1 1 3 3,00 (Secretory component p85) P27918 Properdin (Complement factor P) 1,5 4 2,67 B4E1B2 Serotransferrin 11 29 2,64 Q53H26 Transferrin variant (Fragment) 11 29 2,64 B4DPQ0 Complement Clr subcomponent 5 13 2,60 P01019 Angiotensinogen (Serpin A8) 1 2,5 2,50 B4DDU2 Tubulin alpha-ubiquitous chain 2,5 6 2,40 P01779 Ig heavy chain V-III region TUR 2,5 6 2,40 P68366 Tubulin alpha-4A chain (Alpha- 3 6,5 2,17 tubulin 1) P00734 Prothrombin (Coagulation factor II) 2 4 2,00 P21333 Filamin-A (Actin-binding protein 14,5 28,5 1,97 280) P00450 Ceruloplasmin (EC 1.16.3.1) 8,5 16,5 1,94 (Ferroxidase) E7EX29 14-3-3 protein zeta/delta (Fragment) 4,5 8,5 1,89 P63104 14-3-3 protein zeta/delta (KCIP-1) 4,5 8,5 1,89 B4E1D8 cDNA FLJ51597, highly similar to 10,5 19 1,81 C4b-binding protein P18206 Vinculin (Metavinculin) 5 9 1,80 P12814 Alpha-actinin-1 (Alpha-actinin 6,5 11,5 1,77 cytoskeletal isoform) 043707 Alpha-actinin-4 (F-actin cross- 6,5 11,5 1,77 linking protein) P06396 Gelsolin (AGEL) (Actin- 3,5 6 1,71 depolymerizing factor) P05106 Integrin beta-3 (Platelet membrane 5,5 9 1,64 glycoprotein IIIa) (GPIIIa) P08514 Integrin alpha-IIb (GPIIb) 12,5 20 1,60 (Platelet membrane glycoprotein IIb) P01833 Polymeric immunoglobulin receptor 2,5 4 1,60 (PIgR) Q9Y490 Talin-1 28,5 43 1,51 A2J1N9 Rheumatoid factor RF-ET12 (Fragment) 3 4,5 1,50 Q5NV90 V2-17 protein (Fragment) 3 4,5 1,50 P01023 Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M) 56,5 83 1,47 A2KBC6 Anti-FactorVIII scFv (Fragment) 6,5 9,5 1,46 P01011 Alpha-l-antichymotrypsin (ACT) 3,5 5 1,43 (Serpin A3) P00738 Haptoglobin 13,5 19 1,41 P02743 Serum amyloid P-component (SAP) 2,5 3,5 1,40 P01024 C3 and PZP-like alpha-2- 60,5 84,5 1,40 macroglobulin domain-containing protein 1 A8K008 cDNA FLJ78387 17,5 24 1,37 A2IP15 HRV Fab 026-VL (Fragment) 3 4 1,33 Q6UX06 Olfactomedin-4 (OLM4) (Antiapoptotic 4,5 6 1,33 protein GW112) P03952 Plasma kallikrein (EC 3.4.21.34) 1,5 2 1,33 (Fletcher factor) P08567 Pleckstrin (Platelet 47 kDa protein) 1,5 2 1,33 (p47) P07996 Thrombospondin-1 19,5 26 1,33 P07437 Tubulin beta chain (Tubulin beta-5 4,5 6 1,33 chain) A2MYD4 V2-7 protein (Fragment) 3 4 1,33 P00488 Coagulation factor XIII A chain (EC 3,5 4,5 1,29 2.3.2.13) Q71U36 Tubulin alpha-1A chain (Alpha- 3,5 4,5 1,29 tubulin 3) P68363 Tubulin alpha-1B chain (Alpha- 3,5 4,5 1,29 tubulin ubiquitous) Q9BQE3 Tubulin alpha-1C chain (Alpha- 3,5 4,5 1,29 tubulin 6) Q9H4B7 Tubulin beta-1 chain 3,5 4,5 1,29 Q96K68 cDNA FLJ14473 fis, clone 12 15 1,25 MAMMA1001080 P08107 Heat shock 70 kDa protein 1A/1B 2 2,5 1,25 P34931 Heat shock 70 kDa protein 1-like 2 2,5 1,25 P11142 Heat shock cognate 71 kDa protein 2 2,5 1,25 Q6N089 Putative uncharacterized protein 15 18,5 1,23 DKFZp686P15220 P02675 Fibrinogen beta chain 11 13,5 1,23 P00739 Haptoglobin-related protein 12 14,5 1,21 Q86UX7 Fermitin family homolog 3 (Kindlin- 5 6 1,20 3) P02751 Fibronectin (FN) 61,5 72,5 1,18 B7ZLE5 FN1 protein 61,5 72,5 1,18 Q6MZM7 Putative uncharacterized protein 61,5 72,5 1,18 DKFZp686O12165 Q68CX6 Putative uncharacterized protein 61,5 72,5 1,18 DKFZp686O13149 P68032 Actin, alpha cardiac muscle 1 8,5 10 1,18 (Alpha-cardiac actin) Q562R1 Beta-actin-like protein 2 (Kappa- 8,5 10 1,18 actin) POCOL4 Complement C4-A (Acidic complement 52 61 1,17 C4) POCOLS Complement C4-B (Basic complement 52 61 1,17 C4) BOUZ85 Complement component 4B (Childo 53 62 1,17 blood group) Q6MZQ6 Putative uncharacterized protein 15 17,5 1,17 DKFZp686G11190 P07477 Trypsin-1 (EC 3.4.21.4) (Serine 3 3,5 1,17 protease 1) Q4TZM4 Hemoglobin beta chain (Fragment) 6,5 7,5 1,15 P04004 Vitronectin (VN) (S-protein) (V75) 6,5 7,5 1,15 B2RUT6 Complement component 4A (Rodgers 53,5 61,5 1,15 blood group) P01031 Complement C5 3,5 4 1,14 Q9UL78 Myosin-reactive immunoglobulin light chain variable region 3,5 4 1,14 Q5NV62 V3-4 protein (Fragment) 6 7 1,17 A6H8M8 C4A protein (Complement C4 gamma 53,5 61 1,14 chain) P02768 Serum albumin 51,5 58,5 1,14 Q7Z351 Putative uncharacterized protein 15 17 1,13 DKFZp686N02209 P02649 Apolipoprotein E (Apo-E) 4 4,5 1,13 P01009 Alpha-l-antitrypsin (Alpha-1 8,5 9,5 1,12 protease inhibitor) (Serpin Al) Q08380 Galectin-3-binding protein (Basement 12 13 1,08 membrane autoantigen p105) Q6N092 Putative uncharacterized protein 12 13 1,08 DKFZp686K18196 (Fragment) P63261 Actin, cytoplasmic 2 (Gamma-actin) 20 21,5 1,08 P02671 Fibrinogen alpha chain 9,5 10 1,05 P60709 Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin) 19,5 20,5 1,05 A2MYE1 A30 (Fragment) 4 4 1,00 Q96SA9 Anti-streptococcal/anti-myosin immunoglobulin kappa light chain 3,5 3,5 1,00 P06576 ATP synthase subunit beta, 2 2 1,00 mitochondrial (EC 3.6.3.14) 043866 CD5 antigen-like (CT-2) (IgM- 15 15 1,00 associated peptide) P12259 Coagulation factor V (Activated 1,5 1,5 1,00 protein C cofactor) P02747 Complement Clq subcomponent subunit 5,5 5,5 1,00 C P04196 Histidine-rich glycoprotein (HPRG) 1,5 1,5 1,00 P01892 HLA class I , A-2 alpha chain (MHC 3 3 1,00 class I antigen A*2) P30447 HLA class I histocompatibility 3 3 1,00 antigen, A-23 alpha chain F6IQP2 MHC class I antigen (Fragment) 3 3 1,00 F6IR35 MHC class I antigen (Fragment) 3 3 1,00 A2NKM7 NANUC-2 heavy chain (Fragment) 3 3 1,00 P26022 Pentraxin-related protein PTX3 2 2 1,00 (Pentaxin-related protein PTX3) P02760 Protein AMBP 2,5 2,5 1,00 A2J1M8 Rheumatoid factor RF-IP12 3 3 1,00 (Rheumatoid factor RF-IP13) A2J1NO Rheumatoid factor RF-IP14 (Fragment) 6 6 1,00 Q9HCC1 Single chain Fv (Fragment) 7,5 7,5 1,00 HOYLA9 Uncharacterized protein 2 2 1,00 P02774 Vitamin D-binding protein (DBP) 2 2 1,00 (VDB) P02647 Apolipoprotein A-I (ApoA-I) 11 10,5 0,95 (Apolipoprotein Al) P68871 Hemoglobin subunit beta (Beta- 8,5 8 0,94 globin) A2NYQ9 Anti-folate binding protein 7 6,5 0,93 (Fragment) A2JA14 Anti-mucinl heavy chain variable 6,5 6 0,92 region (Fragment) B6EDE2 Epididymis luminal protein 180 6,5 6 0,92 (Fragment) Q14477 Hbbm fused globin protein (Fragment) 6,5 6 0,92 Q670S4 Hemoglobin Lepore-Baltimore 6,5 6 0,92 (Fragment) P02042 Hemoglobin subunit delta (Delta- 6,5 6 0,92 globin) Q9UL90 Myosin-reactive immunoglobulin heavy chain variable region 6,5 6 0,92 A2NZ55 Variable immnoglobulin anti- 6,5 6 0,92 estradiol heavy chain Q15485 Ficolin-2 (37 kDa elastin-binding 5,5 5 0,91 protein) Q9UL88 Myosin-reactive immunoglobulin heavy chain variable region 5 4,5 0,90 Q6ZVX0 cDNA FLJ41981 fis, clone 9,5 8,5 0,89 SMINT2011888 Q7Z374 Putative uncharacterized protein 9,5 8,5 0,89 DKFZp686CO2218 Q6MZX9 Putative uncharacterized protein 9,5 8,5 0,89 DKFZp686M08189 P02679 Fibrinogen gamma chain 12,5 11 0,88 Q6P5S8 antioxidant activity; very-low- 16 14 0,88 density lipoprotein particle remodeling P27105 Erythrocyte band 7 integral membrane 4 3,5 0,88 protein (Stomatin) P69905 Hemoglobin subunit alpha (Alpha- 4 3,5 0,88 globin) Q6GMX0 Putative uncharacterized protein 16 14 0,88 P02792 Ferritin light chain (Ferritin L 3,5 3 0,86 subunit) Q9UL71 Myosin-reactive immunoglobulin heavy chain variable region 7 6 0,86 Q07954 Prolow-density lipoprotein receptor- 7 6 0,86 related protein 1 (LRP-1) A1A508 PRSS3 protein 3,5 3 0,86 Q6P5S3 Putative uncharacterized protein 7 6 0,86 Q65ZC9 Single-chain Fv (Fragment) 7 6 0,86 Q5CZ94 Putative uncharacterized protein 6,5 5,5 0,85 DKFZp781M0386 P19823 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy 9,5 8 0,84 chain H2 (ITI-HC2) Q16195 Keratin (Fragment) 9,5 8 0,84 P30464 HLA class I , B-15 alpha chain (MHC 3 2,5 0,83 class I antigen B*15) P03989 HLA class I , B-27 alpha chain (MHC 3 2,5 0,83 class I antigen B*27) Q9UL83 Myosin-reactive immunoglobulin light chain variable region 3 2,5 0,83 P35579 Myosin-9 (Myosin heavy chain 9) 8,5 7 0,82 A0A5E4 Putative uncharacterized protein 8,5 7 0,82 P10909 Clusterin (Apolipoprotein J) (Apo-J) 5,5 4,5 0,82 Q5EFE6 Anti-RhD monoclonal T125 kappa light chain 16 13 0,81 Q86TT1 Full-length cDNA clone CSODD006YLO2 28 22,5 0,80 of Neuroblastoma 014791 Apolipoprotein Ll (ApoL-I) 2,5 2 0,80 A2NB45 Cold agglutinin FS-1 L-chain 2,5 2 0,80 (Fragment) A2NB44 Cold agglutinin FS-2 H-chain 2,5 2 0,80 (Fragment) B1N7B8 Cryocrystalglobulin CC1 kappa light 2,5 2 0,80 chain variable region Q86SX2 Full-length cDNA clone CSODLOO4YM19 2,5 2 0,80 of B cells Q7Z3Y6 Rearranged VH4-34 V gene segment 2,5 2 0,80 (Fragment) AON5G5 Rheumatoid factor D5 light chain 2,5 2 0,80 (Fragment) HOYK52 Uncharacterized protein 2,5 2 0,80 Q14624 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy 16 12,5 0,78 chain H4 (ITI-HC4) P31946 14-3-3 protein beta/alpha (KCIP-1) 4,5 3,5 0,78 P62258 14-3-3 protein epsilon (14-3-3E) 4,5 3,5 0,78 Q04917 14-3-3 protein eta (Protein AS1) 4,5 3,5 0,78 P61981 14-3-3 protein gamma (KCIP-1) 4,5 3,5 0,78 P27348 14-3-3 protein theta (Protein HS1) 4,5 3,5 0,78 A2NUT2 Lambda-chain (AA -20 to 215) 9 7 0,78 P02776 Platelet factor 4 (PF-4) 4 3 0,75 P10720 Platelet factor 4 variant (CXCL4L1) 4 3 0,75 P02746 Complement Clq subcomponent subunit 9,5 7 0,74 B P48740 Mannan-binding lectin serine 7,5 5,5 0,73 protease 1 (EC 3.4.21.-) Q96JDO Amyloid lambda 6 light chain 9 6,5 0,72 variable region SAR (Fragment) Q6GMV8 Putative uncharacterized protein 9 6,5 0,72 Q8NEJ1 Putative uncharacterized protein 9 6,5 0,72 AON5G3 Rheumatoid factor G9 light chain 9 6,5 0,72 (Fragment) P02745 Complement Clq subcomponent subunit 3,5 2,5 0,71 A P60660 Myosin light polypeptide 6 (MLC-3) 3,5 2,5 0,71 Q6MZU6 Putative uncharacterized protein 17,5 12,5 0,71 DKFZp686C15213 Q6N093 Putative uncharacterized protein 17,5 12,5 0,71 DKFZp686I04196 (Fragment) P61224 Ras-related protein Rap-lb (GTP- 3 2 0,67 binding protein smg p21B) P19105 Myosin regulatory light chain 12A 4 2,5 0,63 (MLC-2B) P05387 60S acidic ribosomal protein P2 2,5 1,5 0,60 (Renal carcinoma antigen NY-REN-44) P19338 Nucleolin (Protein C23) 10 6 0,60 075636 Ficolin-3 (Collagen/fibrinogen 3,5 2 0,57 domain-containing lectin 3 p35) F8VWA4 Uncharacterized protein 3,5 2 0,57 B7Z539 cDNA FLJ56954 8 4,5 0,56 Q96CX2 BTB/POZ domain-containing protein 4,5 2,5 0,56 KCTD12 (Pfetin) P02730 Band 3 anion transport protein(AE 1) 17,5 9,5 0,54 P23528 Cofilin-1 (p18) 3 1,5 0,50 P06748 Nucleophosmin (NPM) 3 1,5 0,50 Q6N091 Putative uncharacterized protein 7 3,5 0,50 DKFZp686CO2220 Q6N041 Putative uncharacterized protein 7 3,5 0,50 DKFZp686016217 (Fragment) P11166 Solute carrier family 2, facilitated 2 1 0,50 glucose transporter member 1 P04275 von Willebrand antigen 2 61,5 28,5 0,46 P62805 Histone H4 2,5 1 0,40 Q13201 Multimerin-1 (EMILIN-4) 11 4 0,36 B7Z1F8 cDNA FLJ53025, highly similar to 52 16 0,31 Complement C4-B P04114 Apolipoprotein B-100 (Apo B-100) 25 7,5 0,30 Q8TCG3 TPMsk3 (Fragment) 5 1,5 0,30 P16452 Erythrocyte membrane protein band 5,5 1 0,18 4.2 (P4.2) P11277 Spectrin beta chain, erythrocyte 23 3 0,13 (Beta-I spectrin) P02549 Spectrin alpha chain, erythrocyte 33 1,5 0,05 (Erythroid alpha-spectrin) Tableau 2b Numero Nom protéine Nombre moyen de peptides DS d'accession P00751 Complement factor B (C3/C5 4.5 convertase) P00752 Complement component C8 alpha chain 2 P00753 Peroxiredoxin-1 (Natural killer 2 cell-enhancing factor A) P00754 Moesin (Membrane-organizing 2 extension spike protein) P00755 Chloride intracellular channel 2 protein 1 P00756 Ferritin heavy chain (Ferritin H 2 subunit) Exemple 4 : ELISA de confirmation Méthode : Afin de confirmer les résultats de spectrométrie de masse, des ELISA quantitatifs spécifiques ont été effectués en duplicate sur des plasmas individuels. Les protéines sélectionnées et testées, parmi celles identifiées dans les tableaux 2a/2b, sont celles qui présentaient un rapport dengue sévère (DS)/dengue classique (DF) supérieur ou égal à 1,33 et inférieur ou égal à 0,75 avec un nombre moyen de peptides supérieur à 1 pour chaque échantillon et un lien potentiel avec la pathogénie de la dengue. Ce premier criblage a permis de ne tester que les protéines présentant le plus d'intérêt. Suivant ces critères, les protéines suivantes ont été sélectionnées : la céruloplasmine, la protéine S, le complément facteur properdine, 1'antithrombine III, le composant sécrétoire p85, la protéine du complément Clr, la protéine du complément Cls, l'angiotensine, le facteur II, le CFB, l'anti-Facteur VIII, le sérum amyloide P-composant, l'olfactomedine 4 (OLFM4), la trombospondine, le facteur plaquettaire 4 (PF4), la protéine du complément Clq, la moésine, et la protéine du complément C8. La multimerine-1, l'apolipoproteine B-100 et le facteur von Willebrand ont également été testées. Il convient de noter que ces protéines sont majoritairement des éléments de la voie de coagulation ou de la cascade du complément. Ces ELISA ont été effectués grâce à des kits commerciaux (USCN, China), en suivant les instructions des fournisseurs. Les analyses statistiques (Test de Man-Whitney et courbe de ROC/AUC) ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism V4.03. Chaque marqueur-candidat a été testé sur des échantillons de plasma individuels. Ces échantillons sont des échantillons de plasma provenant de patients ayant développé soit une dengue classique DF, soit une dengue sévère DS prélevés durant la phase aigüe de la maladie (phase virémique). Tous les patients avaient une dengue secondaire. Seuls les sérotypes 1, 2 et 3 étaient représentés (pas de sérotype 4). Ces prélèvements étaient originaire de 1'Universidad Industrial de Santander (Bucaramanga, Colombie) [5] ou de l'Institut Pasteur du Cambodge (Phnom-Penh). Ces derniers faisaient partie d'une étude prospective menée en accord avec le comité éthique local. Les caractéristiques des deux sources de prélèvements sont détaillées dans les tableaux 3 et 4 qui suivent. Les échantillons ont été collectés après apparition des symptômes. Tableau 3 DF(n=15) DS (n=15) Valeur de p Age moyen +-SD (an) 29.3+-0.52 28.3+-0.5 ns % male 60% 53% ns Prélèvement (jour) 3.06 2.37 ns Poids moyen+-SD (Kg) 60.2 +-8.6 50.3+-15.6 ns Cholestérol total (g/L) 1.44+-5.4 1.29+-10.1 0.03 AST (U/L) 90.2+-9.75 142.7+-29.8 0.001 ALT (U/L) 69.7+-11.4 90.8+-24.5 ns Test tourniquet positif 8/15 (60%) 10/15 (66%) ns Charge virale 4.05 106+-3.5 4.1 107+-5.22 0.006 (copie/mL) Serotype DV2-DV3 DV2-DV3 Dengue secondaire oui oui Comorbidité non non Tableau 4 DF (n=23) DS (n=26) Valeur de p Age moyen+-SD age (an) 8.6+-0.38 7.3+-0.45 ns % male 56% 35.6% ns Prélèvement (jour) 2.6 3.2 ns Poids moyen+-SD (Kg) 20.48+-0.93 18.86+-0.98 ns Cholestérol total 3.32+-0.14 2.37+-0.12 0.1). Par contre, pour deux marqueurs les résultats permettent de distinguer clairement une DF d'une DS. Le premier marqueur est PF4 (Platelet 10 factor 4 ou facteur plaquettaire 4) Pour les échantillons colombiens une différence de concentration plasmatique en faveur des échantillons DF est observée (p Tableau 8 Protéines Numéro Rapport DS/DF 95% IC sur des d'accession moyenne ratios Alpha 2 A2MG HUMAN 0.33 0.25-0.44 macroglobuline Complément C3f CO3 HUMAN 0.89 0.68-1.17 Héparine cofacteur 2 HEP2 HUMAN 2.25 1.71-2.95 30 Exemple 7 : ELISA de confirmation Méthode : Afin de confirmer les résultats de spectrométrie de masse, des ELISA quantitatifs spécifiques ont été effectués en duplicate sur des plasmas individuels. Les protéines testées sont celles identifiées dans l'exemple 6 : l'alpha-2 Macroglobuline (A2M), La protéine C3 du complément, l'héparine co-facteur 2. Ces ELISA ont été effectués grâce à des kits commerciaux (USCN, China), en suivant les instructions du fournisseur. Les analyses statistiques (Test de Man-Whitney et courbe de ROC/AUC) ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism V4.03. Chaque marqueur-candidat a été testé sur des échantillons individuels. Ces échantillons étaient des plasmas de patients ayant développés soit une dengue classique DF, soit une dengue sévère DS et prélevés durant 15 la phase aigüe de la maladie (phase virémique). Tous les patients avaient une dengue secondaire. Seul le sérotype 1 était représenté. Ces prélèvements étaient originaire de l'Institut Pasteur du Cambodge (Phnom-Penh) et faisaient partie d'une étude prospective menée en accord avec le comité éthique local. Les caractéristiques de la source 20 de prélèvements sont détaillées dans le tableau 9. Tableau 9 DF (n=23) DS (n=26) Valeur de p Age moyen+-SD age (an) 8.6+-0.38 7.3+-0.45 ns % male 56% 35.6% ns Prélèvement (jour) 2.6 3.2 ns Poids moyen+-SD (Kg) 20.48+-0.93 18.86+-0.98 ns Cholestérol total (mmol/L) 3.32+-0.14 2.37+-0.12 0.1). Cependant, pour les échantillons cambodgiens testés en ELISA pour A2M, 10 la différence de concentration était significative (p REVENDICATIONS1. Procédé pour déterminer, in vitro, dans un échantillon sanguin, la probabilité pour un patient d'évoluer vers une dengue sévère, dans 5 lequel : a)on détermine la quantité d'au moins un marqueur qui est le facteur plaquettaire 4 dans ledit écharitillon sanguin, b)on compare la quantité du facteur plaquettaire 4 déterminée dans. l'étape a) avec une quantité de référence dudit marqueur obtenue à 10 partir d'un groupe d'individus qui ont été diagnostiqués comme étant atteints d'une dengue non sévère, dans lequel, si la quantité du facteur plaquettaire 4 déterminée dans l'étape a) est inférieure à la quantité de référence établie dans l'étape b), on détermine que le patient va évoluer vers une dengue 15 sévère. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel dans l'étape a) on détermine la quantité d'au moins un autre marqueur choisi parmi l'olfactomedine-4 et l'a2-macroglobuline dans l'échantillon sanguin, 20 et dans l'étape b) on compare la quantité dudit autre marqueur de l'étape a) avec une quantité de référence dudit autre marqueur obtenue à partir d'un groupe d'individus qui ont été diagnostiqués comme étant atteints d'une dengue non sévère, et si la quantité dudit au moins autre marqueur déterminée dans l'étape a) est supérieure pour 25 l'olfactomedine 4 ou inférieure pour l'a2-macroglobuline à la quantité de référence établie dans l'étape b), on détermine que le patient va évoluer vers une dengue sévère. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel dans l'étape a) on 30 détermine la quantité d'au moins deux autres marqueurs choisis parmi l'olfactomedine 4 et l'a2-macroglobuline dans l'échantillon sanguin et dans l'étape b) on compare la quantité de chacun des deux autres marqueurs de l'étape a) avec une quantité de référence pour chacun desdits autres marqueurs obtenue à partir d'un groupe d'individus qui 35 ont été diagnostiqués comme étant atteints d'une dengue non sévère, et si la quantité de chacun des autres marqueurs déterminée dans l'étape a) est supérieure pour l'olfactomedine 4 et inférieure pour l'a2-macroglobuline à la quantité de référence de chacun des marqueurs établie dans l'étape b), on détermine que le patient va évoluer vers une dengue sévère. 4. Utilisation du facteur plaquettaire 4 comme marqueur pour déterminer, in vitro, dans un échantillon'sanguin, la probabilité pour un patient d'évoluer vers une dengue sévère. 5. Utilisation selon la revendication 4, de l'olfactomédine 4 comme 10 marqueur pour déterminer, in vitro, dans un échantillon sanguin, la probabilité pour un patient d'évoluer vers une dengue sévère. 6. Utilisation selon la revendication 4, de l'a2-macroglobuline comme marqueur pour déterminer, in vitro, dans un échantillon sanguin, la 15 probabilité pour un patient d'évoluer vers une dengue sévère. 7. Utilisation selon la revendication 4 de l'olfactomédine 4 et de l'a2-macroglobuline comme marqueurs pour déterminer, in vitro, la probabilité pour un patient d'évoluer vers une dengue sévère. 20 8. Kit pour déterminer, in vitro, la probabilité pour un patient d'évoluer vers une dengue sévère comprenant un récepteur, un anticorps, un fragment d'anticorps, un analogue d'anticorps ou tout autre ligand capable de se lier au facteur plaquettaire 4. 25 9. Kit selon la revendication 8 comprenant également un récepteur, un anticorps, un fragment d'anticorps, un analogue d'anticorps ou tout autre ligand capable dè se lier à l'olfactomédine 4. 30 10. Kit selon la revendication 8 ou 9, comprenant également un récepteur, un 'anticorps, un fragment d'anticorps, un analogue d'anticorps ou tout autre ligand capable de se lier à l'a2- macroglobuline.