Brevet FR3020378A1 — publié le 20151030

Utilisation d'acide urique pour la culture de bactéries sensibles à la tension en oxygène La présente invention concerne la culture en milieu acellulaire de bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène, 5 notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air voire des bactéries anaérobies strictes pour lesquelles l'oxygène est toxique 10 et qui doivent être cultivées en absence totale d'oxygène ou ne tolérant que de faibles concentrations d'oxygène. On distingue donc parmi les bactéries sensibles à l'oxygène : -les bactéries microaérophiles c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver sous une atmosphère comprenant la concentration 15 d'oxygène ambiante qui est de environ 21%, notamment entre 1% et 20%, le plus communément à environ 2-2,5%, et -les bactéries anaérobies strictes c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver en présence d'oxygène ou dans des concentrations inférieures aux concentrations de microaérophilie, notamment 20 strictement inférieure à 1%, le plus communément inférieure à 0.1%, idéalement 0%. Pour cultiver les bactéries anaérobies strictes, il faut soit les cultiver dans des étuves ne comportant pas d'oxygène, soit dans des tubes qui ont été désoxygénés et elles ne poussent alors qu'au fond du tube. 25 Parmi les bactéries anaérobies strictes, on cite plus particulièrement les bactéries extracellulaires, c'est à dire des bactéries qui ne peuvent vivre qu'à l'extérieur de cellules. Plus particulièrement, la présente invention concerne la culture de bactéries anaérobies et la culture de bactéries microaérophiles en atmosphère aérobie. Dans WO 2014/064359, on propose d'améliorer et faciliter les conditions de croissance en culture acellulaire des bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène et notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant choisies parmi les bactéries suivantes : - les bactéries anaérobies, y compris les bactéries anaérobies strictes, et - les bactéries microaérophiles du type citées ci-dessus. On entend ici par «atmosphère microaérophile», de l'air appauvri en oxygène avec une proportion molaire en oxygène inférieure à 10%, de préférence 5%, de préférence encore inférieure à 2,5%. Pour les bactéries anaérobies strictes, la teneur en oxygène doit être proche de 0%, notamment inférieure à 0.1%, comme mentionné ci-dessus, la tolérance à de très faibles quantités d'oxygène étant variable selon les espèces de bactéries anaérobies. Dans WO 2014/064359, on propose d'ajouter certains composés antioxydants à savoir l'acide ascorbique, le glutathion et hydrogne sulfure dans un milieu de culture acellulaire pouvait permettre de: - améliorer la croissance des dites bactéries en obtenant plus rapidement des bactéries en concentration suffisante pour être détectables après multiplication et/ou en augmentant la concentration en bactéries après un délai donné de culture, c'est-à-dire par unité de temps, et - cultiver avec au moins un même niveau de croissance voire à un niveau plus élevé, des bactéries anaérobies strictes en présence de quantité plus élevées d'oxygène qu'en l'absence de composé antioxydant, c'est-à-dire en atmosphère microaérophile, notamment avec des teneurs en oxygène de 2 à 5%, mais aussi des teneurs en oxygène supérieures à 5%, voire en aérobie, c'est-à-dire en présence d'un taux d'oxygène équivalent à la tension en oxygène proche de l'air ambiant soit environ 21%, et - cultiver avec au moins un même niveau de croissance, dans une atmosphère contenant des tensions d'oxygène plus élevées, desdites bactéries intracellulaires microaérophiles, cultivables en l'absence de composé antioxydant, en atmosphère microaérophile, voire avec un niveau de croissance plus élevé comme c'est le cas pour la bactérie Coxiella burnetii; et - cultiver avec un niveau de croissance plus élevé, en atmosphère microaérophile, des bactéries cultivables, en l'absence de composé antioxydant, dans une atmosphère contenant une tension d'oxygène plus élevée, mais inférieure à la teneur en oxygène de l'air, comme c'est le cas pour la bactérie intracellulaire facultative Mycobacteriurn tuberculosis. Dans WO 2014/ 064359, on fournit donc un procédé de culture in vitro de bactéries en milieu de culture acellulaire, de bactéries dont la croissance est sensible à la teneur en oxygène, la croissance optimale desdites bactéries exigeant une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite, voire nulle, par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant choisies parmi les bactéries anaérobies et les bactéries microaérophiles intracellulaires, caractérisé en ce que l'on ajoute dans le dit milieu de culture acellulaire un composé antioxydant choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion et l'hydrosulfure de sodium, et l'on cultive la dite bactérie dans ledit milieu de culture en présence d'oxygène. Dans WO 2014/ 064359, l'acide ascorbique et le glutathion sont préférés car ils sont capables à des doses précises de permettre la culture à un niveau d'oxygène plus élevé. Dans WO 2014/064359, plus particulièrement encore, lesdits composés antioxydants, sont mis en oeuvre à une concentration de 0,1 g/L à 2 g/L, ou concentration molaire de 10-6 M à 10-2 M. D'autres composés antioxydants tels que l'hydrosulfure de sodium (NaHS) ou la cystéine sont moins efficaces et requièrent des concentrations plus élevées. L'ajout d'un composé antioxydant permet de tolérer une croissance en présence de teneur en oxygène relativement plus élevée, voire en atmosphère d'air ambiant notamment pour les bactéries microaérophiles intracellulaires telles que Coxiella burnetii ou Helicobacter cinaedi et les bactéries anaérobies strictes telles que Bacteroides. Et, cet ajout permet aussi pour certaines bactéries telles que Mycobacteriurn tuberculosis cultivables à des tensions d'oxygènes plus élevées en l'absence de composé antioxydant, d'améliorer leur croissance à des tensions en oxygène diminuées en présence de composé antioxydant. Dans certaines conditions l'acide ascorbique apparait toxique et/ou trop acide vis à vis de certaines bactéries et/ou pour certain milieux de culture à fortes doses. Ceci a été mis en évidence notamment pour Mycobacteriurn tuberculosis (4) D'autre part, le glutathion est très onéreux. Selon la présente invention, les inventeurs ont découvert de façon fortuite qu'un effet équivalent sur la croissance des dites bactéries anaérobies ou sensibles à l'oxygène pouvait également être obtenu en ajoutant dans le dit milieu de culture de l'acide urique (7,9- dihydro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione ou 2,6,8-trioxypurine) à la place des composés antioxydants décrits dans WO 2014/064259, l'acide urique étant mis en oeuvre dans des concentrations similaires ou inférieure à celles de l'acide ascorbique et du glutathion tel que décrit dans WO 2014/064359. L'acide urique, bien qu'ayant dans certaines conditions des 5 propriétés antioxydantes, n'est pas classiquement utilisé en microbiologie à titre de composé antioxydant car dans certaines conditions il présente au contraire des propriétés oxydantes (5). Les inventeurs dans le cadre de travaux sur la maladie de Kwashiorkor, une forme de malnutrition infantile, ont découvert 10 l'importance de l'acide urique pour la croissance des bactéries anaérobies. Ils ont observé chez ces enfants une flore microbienne du tube digestif très particulière en ce qu'elle comporte très peu de bactéries anaérobies d'une part et une carence en acide urique d'autre part. Cette carence en acide urique provient d'une alimentation ne 15 comportant pas de viande et peu de légume alors que l'acide urique provient de la dégradation des purines que l'on trouve en quantité importante dans les aliments carnés. Pour expliquer la spécificité de la flore de ces patients, ils ont voulu vérifier si l'acide urique suffirait à permettre la culture en aérobiose des bactéries théoriquement 20 anaérobies ce qui les a conduit à découvrir que des doses faibles d'acide urique présent normalement dans le tube digestif permet effectivement de rétablir la croissance des bactéries anaérobioses absentes chez ces patients déficients en acide urique. Cette découverte est particulièrement importante et avantageuse 25 car l'acide urique est moins acide et moins toxique que l'acide ascorbique et beaucoup moins onéreux que le glutathion à savoir environ 1 Euros /g pour l'acide urique, au lieu de 100 Euros /g pour le glutathion. Plus particulièrement, l'acide urique est mis en oeuvre à une 30 concentration d'au moins 0,1g/L, de préférence au moins 0,2 g/L, notamment de 0.2 à 0.5g/L, pour obtenir un effet équivalent voire supérieur sur la croissance des dites bactéries sensibles à l'oxygène, en atmosphère aérobie et à des concentrations inférieures ou égales à celles de l'acide ascorbique et du glutathion seuls ou en mélange permettant un effet semblable sur la croissance des dites bactéries dans les mêmes atmosphères ambiantes aérobies. L'acide urique peut être mis en oeuvre en mélange avec l'acide ascorbique et/ou le glutathion mais l'acide urique peut être mis en oeuvre sans composé antioxydant additionnel dans le dit milieu de culture. Plus particulièrement, ledit milieu de culture comprend les composants que l'on retrouve dans les milieux de base de culture aptes à cultiver une bactérie anaérobie, comprenant au moins: - plusieurs sources de carbone, - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate, - une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium, - au moins un sel de métaux choisi parmi K, Mg, Na, Ca, de préférence NaCI. Plus particulièrement, ledit milieu culture est un milieu acellulaire est choisi parmi un milieu axénique constitué de substances chimiques ou biologiques défini qualitativement et quantitativement, et un milieu acellulaire comprenant un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire. De préférence, ledit milieu comprend une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 7,5. Plus particulièrement, ledit milieu de culture est un milieu acellulaire conventionnel de bactérie microaérophile ou anaérobie, de préférence un milieu comprenant des composant choisis parmi un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire, un digestat enzymatique, notamment un digestat enzymatique de caséine, soja et/ou de tissu animal, une peptone, un extrait de levure, un sucre tel que dextrose ou glucose, un sel NaCI et/ou Na2PO4. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture est un filtrat de dit broyat ou lysat, notamment de tissu sanguin ou tissu de coeur et/ou poumon, lorsque ladite bactérie est une bactérie extracellulaire tel que les milieux dits bouillon de type coeur-cervelle, milieux Columbia à 5% de sang de mouton ou milieu Schaedler tels que décrits ci-après. D'autres milieux conventionnels appropriés sont les milieux Brucella ou Wilkins-Chagren. De tels milieux de culture acellulaires sont bien connus de l'homme de l'art. Ces milieux sont utilisables avec agar (solide ou semi-solide) ou sans agar (liquide). On peut utiliser en particulier des milieux de culture polyvalents pour microorganismes anaérobies, notamment le milieu de Schaedler. De tels milieux de culture acellulaires qu'ils soient liquides, solides ou biphasiques sont bien connus de l'homme de l'art. Plus particulièrement, le dit milieu de culture de bactéries anaérobies peut se trouver sous forme liquide ou solide ou semi-solide, notamment gélose ou semi gélose, gélose ou semi gélose. Plus particulièrement, on cultive la dite bactérie dans une dite atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène supérieure à la tension maximale tolérée en l'absence d'acide urique ou de composé antioxydant pour un même niveau de croissance dans une même durée de culture. En pratique, plus particulièrement encore, on cultive la dite 25 bactérie dans une dite atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure ou égale à 20% Plus particulièrement encore, on cultive lesdites bactéries selon la présente invention dans une atmosphère comprenant une teneur en oxygène supérieure à 5%, notamment dans de l'air contenant 5% de CO2 (soit une teneur en oxygène inférieure à 16%), voire dans une atmosphère aérobie d'air ambiant. Plus particulièrement encore, dans certains cas, comme explicité ci-après, on cultive la dite bactérie microaérophile intracellulaire dans une dite atmosphère d'incubation microaérophile comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure à 5%, de préférence de 2 à 5%, de préférence encore 2,5%. Plus particulièrement, l'acide urique est mis en oeuvre avec un composé antioxydant est choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion (y-L-Glutamyl-L-cysteinylglycine) et l'hydrosulfure de sodium. L'acide ascorbique et le glutathion sont préférés car ils sont capables à des doses précises de permettre la culture à un niveau d'oxygène plus élevé. Plus particulièrement encore, le dit composé antioxydant est mis en oeuvre à une concentration de 1 pg/ml à 2 mg/ml, de préférence au moins 100 pg/ml. De préférence, le dit composé antioxydant est l'acide ascorbique et/ou le glutathion, de préférence à une concentration d'au moins 100 pg/ml. Plus particulièrement, la dite bactérie est une bactérie cultivable dans un dit milieu de culture en l'absence d'acide urique ou de dit composé oxydant sous une atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure à la proportion molaire d'oxygène dans l'air, de préférence inférieure à 20%, et on cultive la dite bactérie en présence de dit acide urique dans le dit milieu de culture sous une atmosphère d'incubation comprenant une teneur en oxygène inférieure ou égale à la proportion d'oxygène dans l'air, de préférence inférieure à 20%, de préférence encore supérieure à 5%. Selon un premier mode de réalisation, la dite bactérie est une bactérie anaérobie extracellulaire cultivable en atmosphère anaérobie en l'absence de dit acide urique ou de dit composé antioxydant, et l'on obtient une croissance de la dite bactérie en présence d'oxygène avec une proportion molaire inférieure ou égale à la proportion d'oxygène dans l'air. Parmi les bactéries extracellulaires anaérobies, on cite plus particulièrement les bactéries appartenant aux genres Peptostreptococcus, Finegoldia, Anaerococcus, Peptoniphilus, Veillonella, Propionibacteriurn, Lactobacillus, Actinornyces, Clostridiurn, Bacteroides, Porphyrornonas, Prevotella, Firrnicutes, Solobacteriurn, Atopobiurn, Rurninococcus et Fusobacteriurn, plus particulièrement les espèces choisies parmi Finegoldia magna, Bacteroides rnassiliensis, 10 Fusobacteriurn necrophorurn, Finegoldia magna, Prevotella nigrescens, Solobacteriurn rnorei, Atopobiurn vaginae et Rurninococcus gna vus. Selon ce premier mode de réalisation plus particulier, on cultive une bactérie extracellulaire anaérobie notamment une bactérie du tube digestif chez l'homme ou l'animal dans un dit milieu acellulaire en 15 présence d'une proportion molaire d'oxygène inférieure ou égale à celle de l'air et en présence de dit acide urique, de préférence en atmosphère d'air ambiant. Ce premier mode de réalisation est illustré dans l'exemple ci- après par la culture aérobie de Bacteroides thetaiotaornicron en 20 présence d'acide urique. Il s'agit de bactéries anaérobies strictes du tube digestif, qui normalement ne se cultivent que dans des conditions strictement anaérobies. Ceci se traduit quand on inocule une dite bactérie dans un tube désoxygéné par le fait qu'un voile de culture n'apparait que dans 25 la partie basse du tube, tandis que la partie haute reste vierge de culture. Si on ajoute, de l'acide urique selon la présente invention à 200pg/ml, la culture se fait pratiquement jusqu'à la surface, voire complètement jusqu'à la surface à la concentration de 500pg/m1 et encore mieux à 1 mg/I avec l'acide urique comme avec un mélange 30 d'acide ascorbique à 500pg/m1 et de gluthation à 500pg/ml. La bactérie produit en 24h des colonies après ensemencement en gélose. Dans un autre mode de réalisation, la dite bactérie est une bactérie microaérophile intracellulaire apte à être cultivée dans un dit milieu de culture acellulaire, sous atmosphère d'incubation microaérophile avec une proportion molaire en oxygène de pas plus de 5%, de préférence pas plus de 2,5% dans l'atmosphère d'incubation, en l'absence d'acide urique ou de composé antioxydant, et on cultive la dite bactérie en présence d'acide urique dans un dit milieu de culture sous une atmosphère d'incubation microaérophile comprenant une proportion molaire en oxygène entre 2,5% et 20%, de préférence entre 5% et 16%, notamment de l'air éventuellement enrichi à 5% de CO2. La présente invention s'applique plus particulièrement aux bactéries microaérophiles du fait, entre autres, de l'ajout dedit acide urique. Ce mode de réalisation est illustré par la culture aérobie de la bactérie Helicobacter cinaedi (DSMZ 5359) cultivé à l'air ambiant. D'autre caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront à la lumière de la description détaillée des exemples de réalisations suivants. Exemple 1 : Culture de Bacteroides thetaiotaornicron avec un zo milieu Schaedler. Une souche de bactérie anaérobie Bacteroides thetaiotaornicron a été obtenue au travers de l'étude "culturomics" des inventeurs (2) aussi accessible dans divers collections de dépôt (CSUR P766 aussi déposée selon le Traité de Budapest à la collection de dépôt de micro- 25 organismes DSMZ (Allemagne) le 19 mai 2014 sous le numéro DSM 28808, d'autres souches sont aussi accessibles dans divers collections de dépôt telles que les souches DSM 2079, ATCC 29148 et NCTC 10582). Pour leur production en quantité suffisante, B. thetaiotaornicron a été cultivée en atmosphère anaérobie à 37 °C dans un milieu de 30 culture polyvalent. On a testé le milieu de Schaedler (Reference 42098 ; BioMérieux, La Balmes-les-Grottes, France) approprié aussi pour la culture de bactéries anaérobies. Le milieu Schaedler (commercialisé par Biomerieux, Marcy l'étoile, France) présentait la composition suivante pour 1 litre : - Digestat enzymatique de caséine 5.6 g - Digestat enzymatique de tourteau de soja 1 g - Digestat enzymatique de tissus animal 5 g - Extrait de levure 5 g - NaCI 1.7 g - Phosphate de potassium 0.82 g - Dextrose 5.82 g - Tris (hydroxymethyl) Aminomethane 3 g - Hemine 0.01 g - L-cysteine 0.4g Ce milieu Schaedler a été complémenté par l'ajout des composés hydrocarbonés à savoir de 1 g/L d'amidon de riz et de 1 g/L de glucose (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) et l'ajout d'acide urique et composés anti-oxydants à savoir complémenté par l'ajout de - soit 0.1 g/L d'acide ascorbique (VWR International, Louvain, Belgique), 0,1 g/L d'acide urique et 0,1 g/L de glutathion (Sigma- Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France), -soit.0.1; 0.2 ou 0.3 g/L d'acide urique seul comme composé antioxydant. L'ajout de composés hydrocarbonés amidon et glucose visait ici à pour produite H2 pour contrôler la croissance de la bactérie. La résazurine est mise en oeuvre comme un indicateur d'oxydoréduction à une concentration de 0,1mg/mL pour contrôler la présence d'oxygène (la résazurine oxydée a une couleur rose, et devient transparente en l'absence d'oxygène). La culture aérobie en air ambiant B. thetaiotaornicron a été effectuée par l'inoculation de 105 organismes/mL dans un récipient incubé à 37°C contenant le milieu de culture complémenté par l'ajout de composés anti-oxydants et composés source de carbone. Le pH a été ajusté à 7,5 par ajout de KOH 10M. La souche a été cultivée parallèlement en condition aérobie et par l'inoculation de 105 organismes/mL avec le milieu de culture complémenté selon la présente invention et avec le milieu Schaedler complémenté par les composés hydrocarbonés mentionnés ci-dessus mais en revanche sans composés anti-oxydants. Le milieu de culture supplémenté en ajoutant 1 g/L d'amidon de riz et de 1 g/L de glucose inoculé en anaérobie par 108 cellules/L de B. thetaiotaornicron a été introduit comme témoin positif et pour vérifier la production de H2 par B. thetaiotaornicron en culture anaérobie. Ces contrôles ont été effectués en parallèle en atmosphère ambiante (aérobie). Le milieu de culture non-inoculé a été introduit comme contrôle négatif. La croissance de B. thetaiotaornicron a été évaluée quotidiennement par la production d'hydrogène. La mesure d'hydrogène a été réalisée l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse GC-8A (Shimadzu, Champs-sur-Marne, France) équipé d'un détecteur de conductivité thermique et une Chromosorb WAW 80/100 mailles colonne SP100 (Alltech, Carquefou, France). L'azote N2 à une pression de 100 kPa a été utilisé comme gaz porteur. Le détecteur et les températures de l'injecteur étaient de 200°C et la température de la colonne était de 150°C. Les contrôles négatifs sont restés négatifs sans croissance survenant après une semaine d'incubation indiquant que les résultats rapportés ici ne sont pas simplement le résultat d'une contamination par d'autres microorganismes. Les contrôles positifs étaient positifs une production d'hydrogène observée dans la culture anaérobie B. thetaiotaornicron. La culture de B. thetaiotaornicron inoculée en aérobie sans composés antioxydants est restée négative et l'hydrogène n'a pas été produit. Après une incubation de 24 heures à 37°C en air ambiant (dans des conditions aérobies), un milieu de culture sans composés antioxydants a conservé sa couleur rose indiquant la présence d'oxygène et la culture est restée négative pour la souche testée. Le milieu de culture aérobie avec l'acide urique ou les dits composés anti-oxydants est devenu transparent indiquant l'absence d'oxygène. Les cultures de B. thetaiotaornicron réalisées dans des conditions aérobies avec l'acide urique ou les dits composés anti-oxydants donnaient toutes une culture positive pour B. thetaiotaornicron avec production d'hydrogène après une incubation de 24 heures. Les résultats de croissance avec de l'acide urique sans dit composé antioxydant étaient équivalents à ceux obtenus avec un mélange d'acide urique avec d'acide ascorbique et de glutathion lorsque la concentration en acide urique seul était d'au moins 0.2 g/L et supérieur avec 0.3g/L d'acide urique seul. Ces résultats indiquent qu'il est possible de cultiver à l'air ambiant (condition aérobie) des bactéries réputées strictement anaérobies, dans un milieu approprié contenant un mélange approprié d'antioxydants et en particulier avec de l'acide urique seul sans antioxydant. La procédure de culture est réalisée sur des tubes de milieu de culture du type Schaedler avec 0,2% d'agar (Biomerieux, Marcy l'étoile, France). Le milieu Schaedler présentait la composition suivante pour 1 litre: -Digestat enzymatique de caséine 5.6 g -Digestat enzymatique de tourteau de soja 1 g -Digestat enzymatique de tissus animal 5 g -Extrait de levure 5 g -NaCI 1.7 g -Phosphate de potassium 0.82 g -Dextrose 5.82 g -Tris (hydroxymethyl) Aminomethane 3 g -Hemine 0.01 g -L-cysteine 0.4g -Agar (i milieu semi-solide) 0.2% Pour chaque bactérie on inocule 2 tubes, un tube régénéré sans acide urique et un tube régénéré dans lequel on ajoute 500pg/m1 ou 1mg/m1 d'acide urique. Pour régénérer le tube, on le place au bain marie à 100°C jusqu'à ce que toutes les bulles de gaz visibles dans le milieu aient disparu. Ensuite, pour le tube avec acide urique, on attend le refroidissement du tube à 50°C (schématiquement jusqu'à pouvoir le tenir dans la main sans se brûler) et on ajoute la suspension d'acide urique. On homogénéise ensuite par retournement (3-4 pour assurer un bon mélange). Pour chaque bactérie un inoculum de 107 bactéries /ml a été inoculé sur toute la hauteur des tubes Schaedler 0,2%, un normal et un complémenté en acide urique. Les tubes ont été incubés à 37°C dans une étuve anaérobie stricte durant 24-48 heures. Dans ces conditions, il a été observé une croissance habituelle des bactéries depuis le fond du tube jusqu'à 1,5 cm en dessous de la surface du milieu en absence d'acide urique témoignant du caractère anaérobie de cette bactérie, et une croissance jusqu'à la surface en présence de 500 pg/ml (28 X 10-4 M) d'acide urique indiquant une croissance en présence d'une tension d'oxygène plus grande qu'en l'absence d'acide urique. Des tests en tous points identiques ont été réalisés soit avec du gluthation ou de l'acide ascorbique à 500pg/I. Avec l'acide urique seul, la croissance est identique à ce qui est observé avec l'acide ascorbique. Enfin, afin de valider définitivement la capacité de ce composé acide urique à autoriser la croissance de bactéries anaérobies strictes en présence d'oxygène, on a préparé des milieux solides constitués de milieu Columbia avec 5% de sang de sang de mouton dans lesquels ont été ajouté de l'acide urique à 500pg/I ou 1mg/L, ou un mélange gluthation à 500pg/I + acide ascorbique à 500pg/I ou de l'acide ascorbique à 1mg/I. Ces géloses inoculées de bactéries anaérobies ont été incubées soit en air ambiant soit en air ambiant enrichi de 5% de CO2. La meilleure pousse ayant été obtenue avec de l'acide urique ou l'acide ascorbique à 1mg/I indifféremment. Ces tests ont été réalisés avec un milieu Columbia 5% de sang de mouton présentant la composition suivante pour 1 litre: -Digestat enzymatique de caséine 5g -Digestat enzymatique de tissus animal 8g -Peptone enrichie de levure 10 g -Amidon de maïs 1g -NaCI 5g -Agar (si milieu gélose) 14 g -Sang de mouton 5% Exemple 2 : Effet de l'acide urique sur la culture Helicobacter cinaedi (DSMZ 5359). On a utilisé une souche DSMZ 5359 cultivée dans le même milieu de culture Schaedler que décrit à l'exemple 1 et dans les mêmes conditions opératoires d'aérobiose aux mêmes concentrations d'acide urique excepté que l'on n'a pas complémenté le milieu de culture par l'ajout de composés hydrocarbonés amidon et glucose. La bactérie a été établie en culture en 24h et confirmée par spectrométrie de masse de type Maldi tof.10 Références bibliographiques [1] La Scola B, Fournier PE, Raoult D. Burden of emerging anaerobes in the MALDI-TOF and 165 rRNA gene sequencing era. 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Procédé de culture in vitro en milieu de culture acellulaire, de bactérie dont la croissance est sensible à la teneur en oxygène, la croissance optimale de la dite bactérie exigeant une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air, ladite bactérie étant choisie parmi les bactéries anaérobies et les bactéries microaérophiles intracellulaires, dans lequel on cultive la dite bactérie dans ledit milieu de culture en présence d'oxygène, caractérisé en ce que l'on ajoute dans le dit milieu de culture de l'acide urique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide urique est mis en oeuvre à une concentration d'au moins 0,1g/L, de préférence au moins 0,2 g/L, de préférence encore de 0,2 à 2 g/L. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'acide urique est mis en oeuvre sans composé antioxydant additionnel dans le dit milieu de culture. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le dit milieu acellulaire est choisi parmi : - un milieu axénique constitué de substances chimiques ou biologiques défini qualitativement et quantitativement, et - un milieu comprenant un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on cultive la dite bactérie dans une dite atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène supérieure à la tension maximale tolérée en l'absence d'acide urique ou de composé antioxydant pour un même niveau de croissance dans une même durée de culture. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la dite bactérie est une bactérie cultivable dans un dit milieu de culture en l'absence d'acide urique ou de composé antioxydant sous une atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure à la proportion molaire d'oxygène dans l'air, de préférence inférieure à 20%, et on cultive la dite bactérie en présence de dit acide urique oxydant dans le dit milieu de culture sous une atmosphère d'incubation comprenant une teneur en oxygène inférieure ou égale à la proportion d'oxygène dans l'air, de préférence inférieure à 20%, de préférence encore supérieure à 5%. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la dite bactérie est une bactérie anaérobie extracellulaire cultivable en atmosphère anaérobie en l'absence d'acide urique ou de composé antioxydant, et l'on obtient une croissance de la dite bactérie avec un milieu de culture comprenant de l'acide urique en présence d'acide d'oxygène avec une proportion molaire inférieure ou égale à la proportion d'oxygène dans l'air, de préférence en présence d'une atmosphère d'air ambiant. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7 , caractérisé en ce que l'on cultive une bactérie extracellulaire anaérobie dans un dit milieu acellulaire, ledit milieu de culture est un milieu acellulaire conventionnel de bactérie anaérobie, de préférence un milieu comprenant des composant choisis parmi un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire, un digestat enzymatique, notamment un digestat enzymatique de caséine, soja et/ou de tissu animal, une peptone, un extrait de levure, un sucre tel que dextrose ou glucose, un sel NaCI et/ou Na2PO4. 9. Procédé de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la dite bactérie est une dite bactérie microaérophile intracellulaire apte à être cultivée dans un dit milieu de culture acellulaire, sous atmosphère d'incubation microaérophile avec une proportion molaire en oxygène de pas plus de 5%, de préférencepas plus de 2.5% dans l'atmosphère d'incubation, en l'absence de dit composé antioxydant, et on cultive la dite bactérie en présence de dit composé oxydant dans un dit milieu de culture sous une atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène entre 2,5% et 20%, de préférence entre 5% et 16%. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 9, caractérisé en ce que la dite bactérie est choisie parmi Bacteroides thetaiotaornicron et Helicobacter cinaedi.