Brevet FR3013452A1 — publié le 20150522

PROC-DE C DETECTION D'UNE ESPECE FLUORESCENTE REVERSIBLEMENT PHOTOCONVERTIBLE L'invention porte sur un procédé de détection d'une espèce fluorescente réversiblement photoconvertible. Un tel procédé présente de nombreuses applications, notamment en chimie, en biologie et dans le domaine des mesures environnementales. On entend par « espèce » une espèce chimique telle qu'une molécule ou un complexe, ou un objet physique tel qu'une nanoparticule. On entend par « espèce réversiblement photoconvertible » (« photoswitchable » dans la littérature en anglais) une espèce présentant au moins deux états distincts, ayant des propriétés de fluorescence différentes, et pouvant passer d'un état à l'autre de manière réversible par effet de la lumière. Des exemples d'espèces fluorescentes réversiblement photoconvertibles sont la protéine « Dronpa » et le complexe « Spinach DFHBI » (« Spinach » étant un aptamère d'ARN et DFHBI une sonde fluorogène). Ces espèces peuvent, en particulier, être utilisées comme sondes ou marqueurs. L'imagerie, et plus particulièrement la microscopie par fluorescence est devenue un outil indispensable en biologie, mais également dans d'autres disciplines telles que la science des matériaux. Ses applications, cependant, sont limitées par la capacité d'observer un signal d'intérêt dans un fond de fluorescence ou de bruit. Ce problème est particulièrement aigu dans les applications d'imagerie in vivo, dans lesquelles les marqueurs fluorescents à détecter sont dispersés dans un milieu complexe auto-fluorescent et/ou diffusant ; le signal utile se retrouve alors noyé dans un bruit de fond intense. Une autre limite des techniques de détection et imagerie par fluorescence conventionnelles réside dans le fait que de nombreux fluorophores présentent des bandes d'émission larges ; dès lors, il est difficile de détecter sélectivement plusieurs marqueurs fluorescents dans un même échantillon, car leurs spectres d'émission tendent à se superposer. Pour surmonter ces limites, il a été proposé d'utiliser des sondes fluorescentes réversiblement photoconvertibles, un éclairage d'excitation de la fluorescence modulé (variable dans le temps de façon prédéterminée) et une démodulation du signal de fluorescence détecté. Cela permet d'exploiter la dynamique temporelle d'une sonde réversiblement photoconvertible - qui lui est propre et est différente de celle de fluorophores interférents - pour extraire un signal utile du bruit de fond ; on parle alors de « contraste dynamique ». Une technique connue de l'art antérieur exploitant ce principe est connue sous le nom de OLID, acronyme de «Optical Lock-In Detection », c'est-à-dire « détection synchrone optique ». Elle est décrite dans l'article de G. Marriott et al. « Optical lock-in detection imaging microscopy for contrastenhanced imaging in living cell », PNAS, vol. 105, n°46, pages 17789-17794 (18 novembre 2008). Un inconvénient de cette technique est qu'elle nécessite l'utilisation d'une séquence d'excitation lumineuse à deux couleurs, complexe à mettre en oeuvre. Elle ne fournit par ailleurs pas d'information quantitative sur la concentration du fluorophore réversiblement photoconvertible. Une autre technique connue de l'art antérieur utilisant une sonde fluorescente photoconvertible et une excitation modulée est connue sous le nom de SAFIRe, acronyme de « Synchronously Amplified Fluorescence Image Recovery » c'est-à-dire « récupération d'image par fluorescence amplifiée synchroniquement ». Elle est décrite dans l'article de Ch. I. Richards et al. « Synchronously Amplified Fluorescence Image Recovery (SAFIRe) », J. Phys. Chem. B 2010, 114, 660 - 665. Cette technique utilise, elle aussi, une excitation à deux couleurs. En outre, l'optimisation du contraste dynamique se fait de manière empirique, ce qui introduit une complexité de mise en oeuvre additionnelle. L'article de Q. Wei et A. Wei « Optical Imaging with Dynamic Contrast Agents », Chem. Eur. J., 17, 1080 - 1091 présente plusieurs techniques de contraste dynamique connues. Outre les techniques précitées OLID et SAFIRe, basées sur une modulation optique de la fluorescence, cet article décrit des techniques exploitant une modulation magnétomotive ou photothermique. Ces techniques sont complexes à mettre en oeuvre, justement car elles nécessitent à la fois un système optique pour l'excitation et la détection de la fluorescence et un système de modulation non optique (magnétique ou thermique). Ainsi, toutes les techniques de détection de fluorescence connues de l'art antérieur exploitant un contraste dynamique présentent l'inconvénient d'une mise en oeuvre relativement complexe. En outre, aucune d'entre elles ne présente une sélectivité suffisante pour permettre la détection successive d'un nombre important (de l'ordre de 10, voire davantage) d'espèces fluorescentes dans un même échantillon. Par ailleurs, ces techniques ont été développées exclusivement pour des applications microscopiques et ne peuvent pas être transposées aisément à la télédétection d'espèces fluorescentes dans l'environnement. 10 L'invention vise à surmonter au moins un des inconvénients précités de l'art antérieur. Un objet de l'invention permettant d'atteindre ce but est un procédé de détection d'au moins une espèce fluorescente réversiblement photoconvertible, comportant les étapes suivantes : 15 a) éclairer un échantillon contenant ladite ou au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photoconvertible avec une lumière d'éclairage modulée périodiquement ; et b) détecter un rayonnement de fluorescence émis par ledit échantillon ainsi éclairé ; 20 caractérisé en ce qu'il comprend également l'étape suivante : c) extraire l'amplitude de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence présentant la même périodicité que ladite lumière d'éclairage modulée périodiquement et en quadrature de phase par rapport à elle ; 25 et en ce que l'intensité moyenne de ladite lumière d'éclairage et sa fréquence de modulation sont choisies de manière à maximiser ladite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence. Selon différents modes de réalisation de l'invention : - Ladite lumière d'éclairage peut présenter une intensité 30 moyenne I° et être modulée à une fréquence f avec : k'i. I° = al2 + a21 f = IdVir où : - 0-12/' et o-211° sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite ; et - id'1 est la constante cinétique de ladite réaction thermo-induite. - Ledit échantillon peut contenir une pluralité de dites espèces fluorescentes réversiblement photoconvertibles présentant des propriétés dynamiques différentes, lesdites étapes a) à c) étant mises en oeuvre 10 successivement pour la détection d'au moins deux dits espèces fluorescentes réversiblement photoconvertibles. - Lesdites étapes b) et c) peuvent être mises en oeuvre par détection synchrone dudit rayonnement de fluorescence. - Lors de ladite étape a), ledit échantillon peut être éclairé par 15 une lumière d'éclairage sensiblement monochromatique. - Ledit échantillon peut contenir au moins une autre espèce fluorescente. - Le procédé peut comporter également l'étape suivante : d) déterminer la concentration de ladite ou d'au moins 20 une dite espèce fluorescente réversiblement photoconvertible à partir de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence extraite lors de ladite étape c). - Ladite ou au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photoconvertible peut être choisie parmi : une protéine 25 fluorescente photochrome ; et un complexe d'une biomolécule, comme par exemple un aptamère ou une protéine, avec une sonde fluorogène. Un autre objet de l'invention est un procédé de microscopie à fluorescence mettant en oeuvre un tel procédé de détection. Encore un autre objet de l'invention est un procédé de 30 télédétection optique mettant en oeuvre un tel procédé de détection. D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux figures annexées données à titre d'exemple, dans lesquelles: - la figure 1 illustre le principe général d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention ; - les figures 2A et 2B sont des graphiques illustrant comment les composantes en phase et en quadrature de l'intensité de fluorescence 5 dépendent des paramètres dynamiques d'une espèce fluorescente réversiblement photoconvertible ; - la figure 3 est un graphique illustrant l'application d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention à la détermination de la concentration d'une espèce fluorescente réversiblement photoconvertible ; 10 - la figure 4 illustre l'application d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention à la détection du complexe fluorescent réversiblement photoconvertible « Spinach » ; - la figure 5 illustre l'application d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention à l'imagerie sélective d'un mélange comprenant le 15 complexe fluorescent réversiblement photoconvertible « Spinach » et un fluorophore interférent à l'intérieur d'un dispositif microfluidique ; - la figure 6 illustre l'application d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention à l'imagerie sélective d'un mélange comprenant la protéine fluorescente réversiblement photoconvertible « Dronpa » et un 20 fluorophore interférent à l'intérieur d'un dispositif microfluidique ; - la figure 7 illustre schématiquement l'appareil expérimental utilisé pour obtenir les figures 5 et 6 ; et - la figure 8 illustre schématiquement un appareil pouvant être utilisé dans des applications de télédétection selon un mode de réalisation 25 de l'invention. Comme illustré sur la figure 1, un procédé de détection selon l'invention comprend l'éclairage d'un échantillon E, contenant une espèce fluorescente réversiblement photoconvertible P, par un faisceau lumineux d'excitation FEX modulé de manière périodique. Dans l'exemple non limitatif de 30 la figure 1 on considère le cas d'un faisceau d'excitation modulé sinusoïdalement à une fréquence angulaire 0), dont l'intensité est donnée par 1(040[1+6. sin (0)t)] où I° est l'intensité moyenne et &1 est l'amplitude de modulation. Plus généralement on pourra moduler l'intensité du faisceau d'excitation avec toute fonction périodique, dont la fréquence est indiquée par f=1/T (T étant la période ; dans le cas d'une modulation sinusoïdale f---.03/2Tc). L'utilisation d'une modulation par une fonction en créneau (onde rectangulaire, de rapport cyclique quelconque) est particulièrement avantageuse en raison de sa simplicité de mise en oeuvre. La modulation peut également être obtenue en déplaçant périodiquement un faisceau d'éclairage, par exemple dans le cadre d'une observation en microscopie à balayage ; en effet, si on considère une 10 région localisée d'un échantillon (par exemple une chambre ou un conduit d'un dispositif microfluidique), un déplacement périodique d'un faisceau d'éclairage modifie l'illumination de façon analogue à une modulation périodique de l'intensité dudit faisceau. Le faisceau d'excitation FEX est de préférence sensiblement 15 monochromatique, c'est-à-dire que son spectre présente un seul maximum d'intensité, et/ou une largeur spectrale non supérieure à 50 nm. L'espèce fluorescente réversiblement photoconvertible présente deux états différents échangeables sous l'action de la lumière. Il peut s'agir d'une espèce fluorescente photochrome, ou de tout autre système dont le 20 comportement dynamique peut se réduire à un échange entre deux états sous l'action de la lumière ; ces états peuvent correspondre à des configurations stéréochimiques différentes d'une molécule, à un état lié/non lié d'un complexe, etc. Sur la figure 1, le premier état - thermodynamiquement plus stable - est indiqué par 1 et représenté par un carré plein ; le second état - 25 thermodynamiquennent moins stable - est indiqué par 2 et représenté par un carré creux. Ces deux états possèdent des brillances différentes. Dans un souci de simplicité, et à titre d'exemple non limitatif, on peut considérer que seul l'état 1 est fluorescent de manière significative. La longueur d'onde du faisceau d'excitation, X, permet à la fois --C) l'excitation de l'émission de fluorescence des états 1 et 2, et également la conversion de l'état 1 vers l'état 2 et vice-versa. Ainsi, en cas d'éclairage avec une intensité constante I : - l'état 1 est converti en l'état 2 avec une constante cinétique G-121, 0-12 étant la section efficace de photoconversion de l'état 1 en l'état 2; - l'état 2 est converti en l'état 1 avec une constante cinétique CT21I+012, CY21 étant la section efficace de photoconversion de l'état 2 en l'état 1 et 012 étant la constante cinétique de relaxation thermique de l'état 2 vers l'état I. En variante, on pourrait utiliser deux faisceaux distincts, à des longueurs d'onde différentes : un premier faisceau, modulé, destiné à induire la photoconversion du fluorophore, et un second faisceau, pouvant être modulé ou 10 pas, destiné à exciter l'émission de fluorescence. Cependant, l'utilisation de deux faisceaux complique la mise en oeuvre du procédé de détection ; par conséquent, dans la suite on considérera exclusivement le cas d'un procédé à un seul faisceau. L'échantillon - et plus précisément l'espèce P qu'il contient - 15 éclairé par le faisceau d'excitation modulé FEX, émet un rayonnement de fluorescence FLU dont l'intensité est, elle-aussi, modulée et peut être décomposée en : - une composante en phase avec le faisceau d'excitation, indiquée sur la figure par IFin ; et 20 - une composante en quadrature avec le faisceau d'excitation, indiquée sur la figure par IF°Le. Les présents inventeurs se sont rendus compte qu'il est possible de choisir l'intensité moyenne 10 du faisceau d'éclairage et sa fréquence de modulation f de manière à maximiser l'amplitude de la 25 composante en quadrature du rayonnement de fluorescence. Les valeurs optimales des paramètres 1° et f qui maximisent cette amplitude dépendent des paramètres G2i, 012 et G12 de l'espèce fluorescente réversiblement photoconvertible considérée. Ainsi, un faisceau d'excitation optimisant l'amplitude de la composante en quadrature de l'émission d'une espèce 30 fluorescente réversiblement photoconvertible cible n'optimisera pas celle d'autres espèces fluorescentes (réversiblement photoconvertibles ou non) pouvant être présentes dans l'échantillon. On obtient ainsi une détection sélective par contraste dynamique. Une caractéristique avantageuse de l'invention est que les valeurs optimales des paramètres I° et f peuvent être calculées à partir des propriétés dynamiques de l'espèce à détecter, et plus particulièrement de cy21, 012 et 0.12. Il n'est donc pas nécessaire d'avoir recours à une optimisation itérative, par essais, comme dans certaines techniques de l'art antérieur. Par ailleurs, les valeurs optimales de I° et de f peuvent être déterminées de manière analytique. Un autre avantage de l'invention est que la détection sélective peut être quantitative. Autrement dit, un étalonnage permet de déterminer la 10 concentration de l'espèce fluorescente réversiblement photoconvertible cible à partir de l'amplitude de la composante en quadrature de l'intensité de fluorescente. L'extraction de l'amplitude de la composante en quadrature de l'émission fluorescente ne pose pas de difficulté particulière. Elle peut se faire, 15 par exemple, par détection synchrone (« lock-in » en anglais) ou par analyse de la transformée de Fourier de l'intensité de fluorescence. De même, la modulation du faisceau d'excitation peut être obtenue par des méthodes connues, par exemple la modulation directe d'une source de rayonnement ou l'utilisation d'un modulateur de lumière, électro-optique ou mécanique. 20 Contrairement à des techniques connues de l'art antérieur, il n'est pas nécessaire de prévoir une pluralité de faisceaux d'excitation. Un seul faisceau d'éclairage - ou une pluralité de faisceaux de même longueur d'onde et même modulation, voire même un éclairage monochromatique diffus - peut être utilisé. 25 La théorie à la base de l'invention sera maintenant exposée plus en détail à l'aide des figures 2A et 2B. En l'absence d'éclairage, l'espèce fluorescente photoconvertible P existe presque exclusivement dans son état le plus stable, 1. Lorsque le système est éclairé avec une intensité I° on observe une 30 photoconversion de l'état 1 vers l'état 2 caractérisée par une constante de vitesse : (1) et une conversion - à la fois thermique et photo-induite - de l'état 2 vers l'état 1 caractérisée par une constante de vitesse : ) (2) Après une période pré-stationnaire dont la durée est définie par le temps de relaxation 1/ , le système atteint un régime photo-stationnaire, caractérisé par la constante de photoisomérisation apparente (3) Dans ce régime, les concentrations des états 1 et 2, notées 10 10 et 20 respectivement, sont données par : o (4) où Prof est la concentration totale de l'espèce P. L'intensité de l'émission de fluorescence est donnée par : (5) 15 où Q1 et 02 sont les brillances moléculaires des états 1 et 2 respectivement, avec Q1#Q2. On considère maintenant le cas d'un éclairage modulé sinusoïdalement à la fréquence angulaire (I) et avec une amplitude de modulation E : 20 1(t)=101-1 -Fe sin (0)01 (6) Si E 1) se produit à la fois thermiquement (symbole « A » sur la figure 4) et sous l'effet d'un éclairage (symbole « hv »), tandis que la réaction cis-trans (1-->2) est exclusivement 30 photoinduite (symbole « hv »). En régime de faible éclairage, les réactions de photoisomérisation sont lentes par rapport aux réactions de complexation/décomplexation. Par conséquent, les paires d'états (1 free ; 1 ; bound) et (2free ; 2bound) peuvent être considérées comme des états virtuels Ï et Ainsi, le système « Spinach - DFHBI » peut être considéré comme une espèce fluorescente réversiblement photoconvertible, et la théorie exposée plus haut s'applique. Un dispositif microfluidique comprenant quatre canaux (profondeur 200 pm, largeur 50 pm) a été utilisé comme échantillon ; les canaux 1 à 4 du dispositif ont été remplis avec les solutions suivantes : 1 : (Spinach 250 nM, DFHBI 2,5 pM) + 75 nM Fluorescéine; 10 2 : (Spinach 500 nM, DFHBI 5 pM) + 50 nM Fluorescéine ; 3 : (Spinach 500 nM, DFHBI 5 pM) seul ; 4: Fluorescéine 100 nM seule. Le système (Spinach - DFHBI) constitue l'espèce cible et la Fluorescéine un fluorophore interférent. 15 Le panneau « a » de la figure 5 montre une image de fluorescence de ce dispositif microfluidique acquise, au moyen d'un microscope, en présence d'un éclairage constant ; le panneau « b » montre l'intensité de fluorescence normalisée correspondante, I°F,norm, intégrée sur la longueur des canaux imagés. Les panneaux « c» et « d » correspondent au 20 cas d'un éclairage modulé et d'une détection en quadrature, dans des conditions optimales pour la détection de l'espèce cible. On peut observer sur le panneau «d » que les intensités de fluorescence 10LdF,norm, mesurées conformément à l'invention, sont sensiblement proportionnelles aux concentrations de (Spinach - DFHBI) : deux fois plus 25 importantes dans les canaux 2 et 3 que dans le canal 1 et zéro dans le canal 4. Au contraire, les mesures effectuées en éclairage constant (panneau « b ») sont considérablement perturbées par la présence de Fluorescéine (intensité dans le canal 4 sensiblement égale à celle dans le canal 1, alors que l'espèce cible y est absente). 30 Une seconde validation, illustrée par la figure 5 utilise, en tant qu'espèce fluorescente réversiblement photoconvertible, la protéine « Dronpa ». Un dispositif microfluidique comprenant quatre chambres carrées (longueur x largeur x épaisseur = 400 x 400 x 20 pm) a été utilisé comme échantillon ; les chambres 1 à 4 du dispositif ont été remplies avec les solutions suivantes : 1 : (Dronpa-2 20 pM, BSA 100 pM) (en haut à gauche) ; 2 : Fluorescéine 1 pm seule (en haut à droite) ; 3: (Dronpa-2 10 pM, BSA 100 pM) (en bas à gauche) ; 4: (Dronpa-2 5 pM, BSA 100 pM) (en bas à droite); Le système Dronpa-2 constitue l'espèce cible et la Fluorescéine un fluorophore interférent. Le panneau «a» de la figure 6 montre une image de fluorescence de ce dispositif microfluidique acquise, au moyen d'un microscope, en présence d'un éclairage constant. Le panneau « b » correspond au cas d'un éclairage modulé et d'une détection en quadrature, dans des conditions optimales pour la détection de l'espèce cible. On peut observer sur le panneau « b » que les intensités de fluorescence IwtF,norm, mesurées conformément à l'invention, sont sensiblement proportionnelles aux concentrations de Dronpa-2 : un rapport 4 et 2 pour les chambres 1 et 3 comparé à la chambre 4. On observe également que l'intensité de fluorescence 1°utF,norm est proche de zéro dans le carré contenant uniquement la Fluorescéine. Bien entendu, d'autres espèces fluorescentes réversiblement photoconvertibles que celles mentionnées ci-dessus peuvent être utilisées pour mettre en oeuvre l'invention. La figure 7 illustre un appareil pour la mise en oeuvre d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention, du type utilisé pour la réalisation des validations expérimentales décrites ci-dessus. Un tel appareil, illustré à titre d'exemple non limitatif, comprend une source de lumière SLM constituée par une barre de diodes électroluminescentes, alimentée par une source d'alimentation AM. La modulation du faisceau lumineux d'excitation FEX généré par ladite source est obtenue par modulation de la puissance électrique d'alimentation. L'émission des diodes électroluminescentes étant à bande large, le faisceau FEX est filtré par un premier filtre optique F1, avant d'être dirigé sur un échantillon, constitué en l'espèce par un dispositif microfluidique DMF. L'échantillon ainsi éclairé est observé, par sa face arrière, par un objectif OBJ qui prélève le rayonnement de fluorescence et le focalise en un faisceau FLU. Ce dernier est filtré (filtres F2, F3) et dirigé, par l'intermédiaire d'un miroir M et d'une lentille LF, sur une caméra CAM. Un processeur PR (en fait, un ordinateur programmé de manière opportune) pilote la source d'alimentation AM et la caméra CAM de manière à effectuer une détection en quadrature telle que décrite plus haut. Pour effectuer une simple détection ou un titrage, sans imagerie, la caméra CAM peut être remplacée par un capteur ponctuel de lumière. La figure 8 illustre un appareil pour la mise en oeuvre d'un procédé selon un autre mode de réalisation de l'invention, permettant de détecter à distance des sondes fluorescentes réversiblement photoconvertibles dans l'environnement. Dans une telle application, la grande sélectivité rendue possible par la détection en quadrature est nécessaire pour faire émerger le signal utile du fond très intense constitué par la lumière ambiante. Dans l'appareil de la figure 8, la source de lumière SLM' est un oscillateur laser fonctionnant en régime continu. Le faisceau d'excitation FEX est expansé et collimaté par deux lentilles Li, L2, puis modulé par un modulateur électro-optique MEO. Deux miroirs orientables M1 et M2 sont utilisés pour balayer une cible à observer CO (une surface du sol ou d'un plan d'eau), contenant au moins une espèce fluorescente réversiblement photoconvertible P (Dronpa, par exemple). Le rayonnement de fluorescence FLU est collecté par un objectif d'une caméra CAM', qui acquiert une image de la cible. Comme dans le cas précédent, un processeur PR pilote le modulateur MEO et la caméra CAM' de manière à effectuer une détection en quadrature telle que décrite plus haut. L'invention a été décrite en considérant le cas d'une espèce réversiblement photoconvertible émettant un rayonnement de fluorescence. Toutefois, le procédé de détection en quadrature qui vient d'être décrit peut également exploiter toute autre observable spectroscopique permettant de distinguer les deux états d'une espèce réversiblement photoconvertible. A titre d'exemple non limitatif on peut considérer l'absorbance (en particulier en régime de faible absorption, où la loi de Beer-Lambert peut être linéarisée) ; dans ce cas, au lieu de détecter un rayonnement de fluorescence on détecte une intensité lumineuse transmise qui est rapportée à une intensité lumineuse incidente, puis on détermine l'amplitude de sa composante en quadrature de phase. Un autre exemple est constitué par la reflectance. Les équations 19 - 21, qui définissent les conditions d'éclairage optimales, s'appliquent quelle que soit l'observable spectroscopique considérée. REVENDICATIONS1. Procédé de détection d'au moins une espèce fluorescente réversiblement photoconvertible (P), comportant les étapes suivantes : a) éclairer un échantillon contenant ladite ou au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photoconvertible avec une lumière d'éclairage (FEX) modulée périodiquement ; et b) détecter un rayonnement de fluorescence (FLU) émis par ledit échantillon ainsi éclairé ; 10 caractérisé en ce qu'il comprend également l'étape suivante : c) extraire l'amplitude (IF"t) de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence présentant la même périodicité que ladite lumière d'éclairage modulée périodiquement et en quadrature de phase par rapport à elle ; 15 et en ce que l'intensité moyenne de ladite lumière d'éclairage et sa fréquence de modulation sont choisies de manière à maximiser ladite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite lumière 20 d'éclairage présente une intensité moyenne I° et est modulée à une fréquence f avec : 0-12+ 0-2i f = où : - 51210 et 52110 sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite ; et 25 - q1 est la constante cinétique de ladite réaction thermo- induite. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit échantillon contient une pluralité de dites espèces fluorescentes 30 réversiblement photoconvertibles présentant des propriétés dynamiquesdifférentes, lesdites étapes a) à c) étant mises en oeuvre successivement pour la détection d'au moins deux dits espèces fluorescentes réversiblement photoconvertibles. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel lesdites étapes b) et c) sont mises en oeuvre par détection synchrone dudit rayonnement de fluorescence. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans 10 lequel, lors de ladite étape a), ledit échantillon est éclairé par une lumière d'éclairage sensiblement monochromatique. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ledit échantillon contient au moins une autre espèce fluorescente. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes comportant également l'étape suivante : d) déterminer la concentration de ladite ou d'au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photoconvertible à partir de la composante 20 de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence extraite lors de ladite étape c). 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ladite ou au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photoconvertible est choisie parmi : 25 une protéine fluorescente photochrome ; et un complexe d'une biomolécule avec une sonde fluorogène. 9. Procédé de microscopie à fluorescence mettant en oeuvre 30 un procédé de détection selon l'une des revendications précédentes. 10. Procédé de télédétection optique mettant en oeuvre un procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 8.