Brevet FR3015050A1 — publié le 20150619

DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne le domaine de la mesure de dose de rayonnements ionisants reçue par des tissus biologiques. L'invention concerne en particulier la préparation de tissus biologiques comprenant de la kératine, en particulier de tissus du type ongles, cheveux, ou peau-cornée, pour une mesure de dose, et un procédé de détermination de dose d'un échantillon de tels tissus incluant la préparation des échantillons. ETAT DE LA TECHNIQUE Lors d'accidents radiologiques, il est vital d'estimer les doses reçues aux points les plus exposés. Lors d'une irradiation dite corps entier, ou la totalité de l'organisme est exposé, la distribution de dose dans l'organisme est généralement hétérogène. Il est donc important de déterminer les organes ou parties de l'organisme les plus exposées et de déterminer les doses aux organes les plus sensibles aux rayonnements. Une irradiation externe à forte dose d'une partie de l'organisme, causée par des rayonnements ionisants de nature X, gamma, béta ou neutron, se traduit entre autres par des effets déterministes qui apparaissent à partir de valeurs d'une certaine valeur de doses. Par exemple au niveau de la peau, les effets peuvent se manifester sous la forme d'un érythème jusqu'à à la nécrose des tissus pour des doses supérieures ou égales à 25 Gy. Dans le cas d'irradiation partielle de l'organisme ou localisée (champ collimaté, manipulation de sources radioactives,...) les doses peuvent être localement très élevées et atteindre des valeurs de dose de quelques dizaines ou centaines de Gy. L'évolution des lésions est difficile à prévoir sur la seule base des observations signes cliniques et une information sur la dose et sa distribution permet d'objectiver le niveau d'irradiation et d'estimer les conséquences sur l'organismes et de mettre en oeuvre les traitements les plus adaptés. La détermination de doses reçues par un échantillon de tissus biologiques peut être mise en oeuvre par différentes méthodes, telles que la spectroscopie à résonance paramagnétique électronique (RPE) ou la luminescence qui peut elle- même être mise en oeuvre par différentes méthodes de stimulation parmi les méthodes thermiques, chimiques, optiques, etc. Ces techniques exploitent la présence de radicaux libres ou défauts induits par l'irradiation dans un matériau, c'est-à-dire des espèces chimiques comprenant au moins un électron non apparié, de défauts, ou d'ions qui sont générés après l'interaction du matériau avec des rayonnements ionisants (photons, électrons, protons, neutrons, particules a, etc. Pour des irradiations localisées, par exemple sur les mains en cas d'accident de manipulation de sources radioactives, la distribution de dose sur la partie du corps touchée peut être très hétérogène, certaines zones pouvant recevoir localement des doses atteignant quelques dizaines de Gray. Dans ces cas, il est important de déterminer les doses maximales reçues et les volumes de l'organisme les plus irradiés. Dans ces situations, les techniques connues de dosimétrie s'avèrent mal adaptée. Les techniques de dosimétrie biologique ne permettent que d"estimer une dose du corps entier, ce qui n'est pas pertinent. Par exemple, les doses reçues par les mains ne peuvent être déterminées qu'à partir de mesures sur des biopsies d'os. Les techniques telles que la spectroscopie RPE ne peuvent donc être utilisées qu'en cas d'amputation ou si des échantillons peuvent être prélevés durant une intervention chirurgicale. Le prélèvement est donc très invasif et ne permet pas d'obtenir facilement plusieurs mesures de doses sur différentes zones d'une main pour établir une distribution de dose. Il a déjà été envisagé de réaliser des mesures de dose sur les ongles ou les cheveux, mais cette mesure est complexe dans les ongles du fait des signaux intrinsèques des ongles, et des signaux parasites induits par le stress mécanique lors de la coupe des ongles et dans les cheveux du fait de la présence de mélanine De plus, les espèces radicalaires radio-induites déjà identifiées dans les ongles et les cheveux sont instables et très sensibles à l'humidité, ce qui empêche de l'application de cette technique quelles que soient les circonstances. En particulier, les espèces radicalaires précédemment identifiées pour mener mesure de dose par détection d'un signal radio-induit étant sensibles à l'humidité, le signal disparaissait complètement par exemple dès qu'un individu s'était lavé les mains. Il en va de même pour les radicaux libres générés par le stress mécanique dans les ongles. Cette caractéristique est apparente sur les figures la et 1 b, qui montrent respectivement la réponse en spectroscopie RPE d'ongles ayant subi respectivement un stress mécanique (coupe, figure la) et une irradiation (figure 1b) en fonction d'une durée d'hydratation. Il existe donc un besoin pour proposer une manière fiable et non invasive de mesurer une dose reçue localement, par exemple au niveau des mains ou des pieds avec les ongles ou au niveau de la tête avec les cheveux. PRESENTATION DE L'INVENTION Un but de l'invention est de proposer un procédé de mesure de dose sur des tissus biologiques comprenant de la kératine, notamment des tissus du type ongles, cheveux, ou couche-cornée de la peau. Un autre but de l'invention est de proposer un procédé de préparation de tissus biologiques sur lesquels une mesure de dose est mise en oeuvre, pour améliorer la qualité du signal lors de la mesure. A cet égard, l'invention a pour objet une espèce radicalaire radio-induite, caractérisée en ce qu'elle présente lors de la mesure d'un échantillon de tissu biologique du type ongles, cheveux ou peau-cornée par spectroscopie RPE en onde continue à température ambiante: - un facteur de Landé de 2,004, - lors de mesures en bande Q et à température ambiante, une intensité de signal minimum et une intensité de signal maximum, lesdites intensités étant atteintes pour des valeurs de champ magnétiques séparées de 1,8 mT, - lors de mesures en bande X, un signal formant un singulet, et - à plus haute fréquence, un signal présentant une anisotropie de facteur de Landé. L'espèce radicalaire présente en outre une intensité de signal en spectroscopie RPE ou en mesure de dose par luminescence croissant avec une dose reçue par l'échantillon de tissu jusqu'à atteindre un niveau de saturation, puis un niveau d'expression décroissant avec la dose à partir dudit niveau de saturation, jusqu'à un niveau d'annihilation. L'espèce radicalaire présente en outre une intensité de signal stable avec l'humidité et stable à plus ou moins 20% lors d'une exposition à une température inférieure à 180°C. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un échantillon de tissus biologiques comprenant de la kératine, en particulier de tissus du type ongles, cheveux ou peau-cornée, pour une mesure de dose, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'hydratation de l'échantillon pendant une durée supérieure à 5 minutes, et - la déshydratation contrôlée de l'échantillon. Avantageusement, mais facultativement, le procédé de préparation d'un échantillon comprend en outre au moins l'une des caractéristiques suivantes : - la déshydratation contrôlée de l'échantillon hydraté comprend le séchage dudit échantillon dans un dessicateur pendant une durée supérieure à 10 heures, de préférence égale à 15 heures pour des mesures en spectroscopie RPE en bande Q. - l'échantillon de tissus biologiques hydraté est installé dans le séchoir sous vide avec une quantité de matériau dessicant, ledit matériau étant de préférence du gel de silice. - la masse de l'échantillon avant hydratation est comprise entre 2 et 5 mg, et la durée de l'hydratation est de préférence égale à 10 minutes. Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de détermination d'une dose reçue par un échantillon préparé par le procédé selon la description qui précède, le procédé comprenant : a) la mise en oeuvre d'une mesure de signal radio-induit, suivie d'une irradiation de l'échantillon, de manière répétée jusqu'à atteindre un niveau de référence d'intensité du signal, b) la détermination d'une valeur absolue de dose reçue par au moins un échantillon de référence, correspondant au niveau de référence d'intensité de signal, et c) la détermination du niveau de dose reçue initialement par le premier échantillon comme étant la soustraction, de la valeur de dose reçue par l'échantillon de référence, de la dose totale ajoutée à la dose initiale du premier échantillon lors de la mise en oeuvre de l'étape a). Avantageusement, mais facultativement, le procédé de détermination d'une dose selon l'invention peut en outre comprendre au moins l'une des caractéristiques suivantes : - le niveau de référence est un niveau de saturation de l'intensité du signal avec la dose reçue ou d'annihilation du signal. - Le procédé comprend en outre une étape préliminaire comprenant : o la mise en oeuvre d'une mesure de signal radio-induit sur l'échantillon dont on veut déterminer la dose reçue pour obtenir une première intensité de signal, o l'irradiation de l'échantillon à une dose inférieure à 5 Gy, de préférence inférieure à 1 Gy, o la mise en oeuvre d'une seconde mesure sur l'échantillon pour obtenir une seconde intensité de signal, et o la comparaison des intensités des deux intensités pour en déduire une estimation d'un niveau de dose initial reçu par l'échantillon relativement à une niveau de dose correspondant à un niveau de saturation de l'intensité de signal. - l'échantillon est préparé par le procédé de préparation selon la description qui précède après chaque irradiation de l'étape a). - la technique de mesure d'intensité de signal radio-induit mise en oeuvre est la spectroscopie RPE ou la mesure par luminescence. - l'étape b) de détermination d'une valeur de dose reçue par un échantillon de référence correspondant au niveau de référence d'intensité de signal est mise en oeuvre à partir d'une courbe reliant des valeurs absolues de doses reçues par l'échantillon de référence à des niveaux d'intensité de signal, ladite courbe étant réalisée : o en moyennant des courbes générées à partir de mesures sur des tissus biologiques provenant d'une pluralité d'individus, o à partir de mesures réalisées sur des tissus biologiques non irradiés provenant du même individu que le premier échantillon, ou o à partir de mesures réalisées sur des tissus biologiques irradiés provenant du même individu que le premier échantillon, lesdites mesures étant mises en oeuvre par mesure de thermoluminescence postérieurement à l'étape a), et le premier échantillon ayant été chauffé entre l'étape a) et lesdites mesures pour supprimer le signal radio-induit initial. - chaque courbe est générée par l'une des méthodes suivantes : o découpe d'un échantillon de référence en une pluralité de fragments et mise en oeuvre, sur les fragments, d'irradiations à des doses distinctes et déterminées, et mesure d'une intensité de signal radio-induit dans l'échantillon pour chaque dose, o mise en oeuvre d'irradiations successives de l'échantillon de référence à des doses connues, chaque irradiation étant suivie d'une mesure d'intensité de signal radio-induit, ou o mise en oeuvre d'irradiations successives à des doses distinctes et déterminées, chaque irradiation étant suivie d'une mesure d'intensité de signal radio-induit par mesure de thermoluminescence, puis d'un chauffage de l'échantillon pour supprimer le signal radio-induit. Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne également un procédé de détermination d'une dose reçue par un échantillon par la mise en oeuvre d'une méthode par ajouts dosés ou par comparaison d'un signal radio-induit de l'échantillon mesuré par spectroscopie RPE ou par mesure de luminescence avec une courbe d'étalonnage pré-établie, caractérisé en ce qu'il comprend, pour chaque mesure de signal radio-induit réalisée sur un échantillon, la détermination des contributions du signal intrinsèque de l'échantillon et du signal de l'espèce radicalaire radio-induite selon l'invention. Avantageusement, mais facultativement, ce procédé de détermination de dose peut en outre comprendre au moins l'une des caractéristiques suivantes : - l'échantillon de tissu est un échantillon d'ongles, et la détermination des contributions du signal intrinsèque de l'échantillon et de l'espèce radicalaire radio-induite comprend la mesure d'un signal radio-induit de l'échantillon pour une même dose reçue par l'échantillon, après deux durées d'hydratation distinctes, et la déduction, à partir des mesures, des contributions du signal intrinsèque et du signal de l'espèce radio-induite. - l'échantillon de tissu est un échantillon d'ongles, et la détermination des contributions du signal intrinsèque de l'échantillon et de l'espèce radicalaire radio-induite comprend la mesure d'un signal radio-induit de l'échantillon avant et après exposition à un faisceau d'ultrasons pendant une durée déterminée, et la déduction, à partir des mesures, desdites contributions. - la détermination des contributions du signal intrinsèque de l'échantillon et de l'espèce radicalaire radio-induite comprend la mesure d'un signal radio-induit de l'échantillon après une exposition à des micro-ondes à une première puissance, et une exposition à des micro-ondes à une seconde puissance, supérieure à la première, et la déduction, à partir des mesures, desdites contributions. Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de détermination de risques de développement de lésions cutanées chez un sujet ayant reçu une irradiation externe, ladite méthode comportant des étapes consistant à: i. estimer ou déterminer la dose reçue par la mise en oeuvre du procédé qui précède, et ii. déterminer en fonction de la dose de l'étape i) la probabilité de survenue de lésions externes. Un autre mode de réalisation de l'invention concerne une méthode de choix d'une thérapie à apporter à un sujet ayant reçu une irradiation externe, ladite méthode comprenant des étapes de : I. détermination des risques de développement de lésions cutanées chez ledit sujet, et Il. choix d'une thérapie au vu des risques déterminés dans l'étape I). L'espèce radicalaire identifiée présente une stabilité élevée à l'humidité et à la température, contrairement aux autres espèces radicalaires précédemment identifiées. Le procédé de préparation de l'échantillon de tissus biologiques permet donc d'améliorer la qualité du signal mesuré après irradiation. En effet, les espèces radicalaires instables résultant d'un stress mécanique ou d'une irradiation présentent un niveau d'expression supérieure à celui de l'espèce radicalaire radio- induite qui a été identifiée, masquant ainsi lors d'une mesure le signal radio-induit par cette espèce. L'humidification de l'échantillon permet donc d'éliminer toutes les espèces instables pour retrouver uniquement les signaux de l'espèce stable. Puis, la déshydratation contrôlée des tissus permet de rendre les mesures reproductibles et comparables d'un échantillon à l'autre, car les tissus présentent un signal intrinsèque stable thermiquement mais dont l'intensité croit avec la durée de séchage des tissus. Des procédés de détermination d'une dose ont également été adaptés à la caractéristique particulière de variation de l'intensité du signal intrinsèque SGI selon le niveau d'hydratation de l'ongle et du fait de la variabilité entre les échantillons de l'intensité du signal intrinsèque SGI. Les procédés de mesure de dose classiques (courbes d'étalonnage ou ajouts dosés) nécessitent la détermination de la composante du signal intrinsèque SGI des ongles ou du signal intrinsèque de la mélanine ou de tous autres signaux intrinsèques dans le signal mesuré ou son élimination sélective pour estimer l'intensité du RIS5 dans le signal mesuré. DESCRIPTION DES FIGURES D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels : - Les figures I a et 1 b, déjà décrites également, représentent l'évolution de la réponse en spectroscopie RPE d'ongles ayant subi respectivement un stress mécanique et une irradiation, en fonction d'une durée d'hydratation. - La figure 2 représente les principales étapes d'un procédé de préparation d'un échantillon de tissus biologiques pour une mesure de dose. - Les figures 3a et 3b représentent les évolutions des signaux RPE pour les espèces radicalaires signal intrinsèque et RIS5 (signal radio-induit stable) en fonction de l'hydratation et du séchage de l'échantillon. - La figure 3c est une courbe représentant la stabilité thermique du signal de l'espèce RIS5 par un procédé d'annihilation thermique isochrone. - La figure 4 représente la réponse en spectroscopie RPE d'un ongle coupé et d'un ongle traité selon le procédé de préparation. - La figure 5 représente les principales étapes d'un procédé de détermination d'une dose par spectroscopie RPE. - La figure 6 représente l'évolution de l'intensité du signal RPE de l'espèce R15 en fonction d'une dose reçue. - La figure 7 représente l'évolution de l'intensité des signaux RIS5 et SGI en fonction d'une puissance micro-ondes à laquelle ils sont soumis. DESCRIPTION DETAILLEE D'AU MOINS UN MODE DE REALISATION DE 20 L'INVENTION L'invention repose sur l'identification d'une espèce radicalaire présentant une importante stabilité à l'humidité et à la température, cette espèce étant induite lors de l'irradiation d'un échantillon de tissu biologique comprenant de la kératine du 25 type ongles, cheveux, ou couche cornée de la peau (stratum corneum). Cette espèce radicalaire est caractérisée par ses caractéristiques spectroscopiques, qui sont les suivantes : - Son facteur de Landé g est égal à 2,004, - Lors d'une mesure de signal par spectroscopie RPE en onde continue en 30 bande Q (34 GHz) à température ambiante, cette espèce produit un signal présentant un minimum et un maximum, l'écart en champ magnétique entre ces extrema étant de 1,8 mT. D'autres caractéristiques sont décrites plus en détails ci-après, qui sont : - La stabilité du signal de l'espèce RIS5 à l'humidité, - La stabilité du signal de l'espèce RIS5 à la température, et - La caractéristique particulière du signal de l'espèce RIS5 en fonction de la dose reçue. Cette espèce sera appelée dans la suite RIS5. Cette espèce n'avait pas été détectée jusqu'à présent car l'intensité de son signal (RPE ou luminescent), suite à une irradiation d'un échantillon de tissu, est de faible intensité notamment en comparaison du niveau d'expression des espèces radio-induites ou induites par stress mécanique par une même technique de mesure, comme par exemple la spectroscopie RPE ou la luminescence. De plus, le signal de cette espèce RIS5 présente des caractéristiques similaires au signal intrinsèque du tissu qui préexiste à toute irradiation ou tout stress mécanique, et qui est appelé dans la suite SGI. Le caractère stable à l'humidité permet de proposer un procédé 100 de préparation de tels tissus biologiques, qui améliore la qualité du signal mesuré au cours d'une mesure de dose. Les principales étapes de ce procédé sont représentées en figure 2. Une première étape consiste à hydrater 110 l'échantillon de tissus biologiques. Cette étape permet de supprimer les espèces instables radio-induites ou induites par le stress mécanique, pour ne mesurer que le signal provenant de l'espèce RIS5 et du signal intrinsèque SGI. Ceci minimise également le signal intrinsèque SGI du tissu. Cette hydratation, ou humidification, comprend la mise en contact des échantillons de tissus avec un milieu aqueux, de préférence pendant une durée supérieure à au moins 5 minutes. De préférence, les tissus sont plongés pendant cette durée dans de l'eau distillée. La durée d'hydratation est adaptée en fonction de l'échantillon considéré : en fonction de l'épaisseur des tissus prélevés, de la date de prélèvement, etc. Les tissus biologiques convenant pour la mise en oeuvre de la méthode de l'invention sont les tissus contenant de la kératine. Par « kératine », on entend ici une protéine cytoplasmique qui se trouve dans les cellules des épithéliums, tissus formant la couche superficielle de la peau (épiderme) et des muqueuses. La kératine est particulièrement abondante dans la couche superficielle de l'épiderme, que l'on appelle la couche cornée, et dans ses annexes, les phanères (poils, cils, cheveux, ongles). Les tissus biologiques de la méthode selon l'invention sont donc de préférence choisis parmi les ongles, cheveux, et la couche cornée de la peau (stratum corneum). Pour un échantillon dont la masse est comprise entre 2 et 5 mg, la durée d'hydratation est de préférence comprise entre 5 et 20 minutes, et avantageusement égale à 10 minutes, pour aboutir à un compromis entre la suppression des radicaux libres instables et la durée de mise en oeuvre du procédé de préparation. Le procédé comprend ensuite une étape 120 de séchage des échantillons de manière contrôlée. En effet, comme visible sur la figure 3a, l'intensité du signal intrinsèque SGI pour les ongles augmente avec le temps de déshydratation des tissus, les données de la figure 3a étant fournies après traitement d'humidification « WT » suivi d'une durée de séchage à l'air (par exemple VVT n°6 + 6 jours signifie un sixième traitement à l'eau suivi d'une durée de 6 jours se séchage à l'air). En revanche, comme illustré en figure 3b, l'humidification suivie d'un séchage n'a qu'une faible influence sur l'intensité du signal de l'espèce RIS5 dans l'échantillon, qui est manifestée dans la figure par son signal RPE (amplitude pic-àpic, mesurée à un niveau de dose de l'échantillon correspondant à un maximum d'expression de l'espèce RIS5 par rapport au signal intrinsèque SGI, c'est-à-dire d'environ 45 Gy) : la première hydratation génère une diminution de l'intensité du fait de la présence de radicaux instables (éliminés par l'hydratation) mais les hydratations et séchages subséquents ne modifient pas son intensité. Cette stabilité thermique de l'espèce RIS5 est également visible sur la figure 3c, qui est une courbe isochrone réalisée en mesurant le signal de l'espèce RIS5 après des paliers de 20 minutes au cours duquel l'échantillon est exposé à des températures croissantes par pas de 20°C. On constate que le signal est stable à plus ou moins 20% jusqu'à une température de 180°C. Il est par conséquent nécessaire, pour que le procédé soit reproductible et permette de comparer des signaux mesurés sur différents échantillons, que dans le cas des ongles la contribution du signal intrinsèque SGI soit identique d'une mesure à l'autre, d'autant plus que cette contribution peut représenter une proportion importante, jusqu'à 90% du signal pour une irradiation de quelques Gray. Avantageusement, l'étape de séchage est mise en oeuvre en plaçant l'échantillon de tissus dans un dessicateur (séchoir sous vide). La durée de séchage nécessaire est fonction du type de mesure réalisée. Par exemple, une mesure en spectroscopie RPE en bande Q nécessitera une durée de séchage supérieure à une mesure en bande X du fait de la plus grande sensibilité à l'humidité de la mesure en bande Q. Par exemple, en bande Q pour les ongles, un compromis entre sensibilité de la mesure et minimisation de l'intensité du signal SGI correspond à une durée d'au moins 10 heures, de préférence de l'ordre de 15 heures dans le dessiccateur. L'échantillon est placé avec un matériau dessicant comme du silicagel, ou gel de silice. Alternativement, l'échantillon peut être chauffé à une température contrôlée, pendant une période de temps déterminée. On a représenté en figure 4a réponse par spectroscopie RPE d'un ongle ainsi traité, en comparaison avec un ongle coupé mais non traité. On remarque qu'une proportion importante du signal a été supprimée. En référence à la figure 5, on va maintenant décrire un procédé de détermination d'une dose reçue par un échantillon de tissus biologiques comprenant de la kératine, qui comprend après irradiation l'espèce RIS5. L'espèce radio-induite RIS5 utilisée pour la détection de dose présente une caractéristique particulière : l'intensité du signal n'est pas linéaire avec la dose reçue par l'échantillon de tissus, comme les espèces radicalaires couramment exploitées pour une mesure de dose. Le signal mesuré de RIS5 présente au contraire une zone croissante avec la dose jusqu'à atteindre un niveau dit de saturation, au-delà duquel une dose supplémentaire reçue entraine une diminution de l'intensité du signal du RIS5. L'intensité du signal de l'espèce RIS5 en fonction de la dose reçue par l'échantillon est représenté en figure 6 avec des mesures réalisées en spectroscopie RPE pour deux échantillons : le premier échantillon, pour lequel les valeurs sont représentées par des carrés pleins, n'a pas été irradié à l'origine, et a subi des post-irradiations pour tracer l'évolution du signal en fonction de la dose. Le deuxième échantillon, dont les valeurs sont représentées par des cercles, a subi une dose initiale de 15 Gy pour simuler une exposition accidentelle à des rayonnements, avant d'être irradiés à nouveau pour tracer l'évolution du signal en fonction de la dose. Un procédé original 200 de détermination de la dose est proposé sur la base de la comparaison des caractéristiques de la courbe de variation de l'intensité du signal correspondant au RIS5 et au signal intrinsèque SGI dans le cas des ongles (du signal RIS5 et du signal de la mélanine pour les cheveux) de l'échantillon analysé avec celle d'un échantillon vierge. Les caractéristiques peuvent être par exemple la dose de saturation du RIS5 ou la dose d'annihilation du RIS5 (dose pour laquelle l'intensité du signal mesuré s'annule et ne varie plus avec une dose supplémentaire). Ce procédé présente l'avantage de ne pas avoir à déterminer l'intensité du signal intrinsèque SGI pour estimer l'intensité du RIS5 comme avec les méthodes classiques de détermination de la dose. Le procédé 200 dont les étapes sont représentées en figure 5 permet d'estimer la dose reçue par l'échantillon de façon adaptée à ce comportement particulier, et notamment à partir du comportement de saturation en intensité à partir d'une certaine dose. Ce procédé comprend une première étape 220, qui comprend la mise en oeuvre d'irradiation successives de l'échantillon à des doses connues, chaque irradiation étant suivie d'une mesure d'intensité de signal radio-induit, jusqu'à ce que l'intensité du signal radio-induit atteigne un niveau déterminé. Ce niveau, appelé niveau de référence, est très avantageusement le niveau de saturation ou d'annihilation en intensité, puisque ces niveaux sont simples à identifier : le niveau de saturation du fait de la faible variation de l'intensité lors de son inflexion, et le niveau d'annihilation du fait de l'annulation du signal, et surtout ils sont atteints pour une unique valeur de dose, contrairement aux autres niveaux d'intensité, qui sont atteints pour deux valeurs de dose (respectivement avant et après irradiation). Alternativement, ce niveau peut être un niveau d'intensité inférieur au niveau de saturation, et atteint pour une dose inférieure ou supérieure à la dose correspondant au niveau de saturation. Avantageusement dans ce cas, l'étape 220 comprend une étape préliminaire de détermination 210 d'un niveau de dose initial relatif reçu par l'échantillon par rapport au niveau de dose correspondant à la saturation du niveau d'expression de RIS5. Cette détermination comprend la mise en oeuvre 211 d'une première mesure d'intensité de signal radio-induit sur l'échantillon obtenir une première intensité de signal. Puis, après la première irradiation de l'étape 220, ou une irradiation 212 étant mise en oeuvre séparément avant l'étape 220, cette irradiation étant de préférence à une dose faible, de préférence inférieure à 10 Gray, et préférablement inférieure à 5 Gray, par exemple égale à 1 Gray, une seconde mesure d'intensité 213 de signal radio-induit sur l'échantillon est mise en oeuvre pour obtenir une deuxième intensité de signal. De préférence, entre l'irradiation 212 et la mesure 213, l'échantillon irradié est de nouveau préparé 214 par le procédé 100 décrit ci- avant afin de supprimer les composantes instables. La comparaison 215 des deux intensités des signaux mesurés permet de déterminer si la dose initialement reçue par l'échantillon est supérieure ou inférieure au niveau de dose correspondant à la saturation en intensité de l'expression de RIS. En effet, si le second signal présente une intensité supérieure à celle du premier signal, cela signifie que la dose initiale reçue par l'échantillon est inférieure à la dose correspondant au niveau de saturation en intensité. Ceci correspond à un niveau de dose de l'ordre de quelques Gray, ou au plus de l'ordre de quelques dizaines de Gray, par exemple inférieur à 40 ou 50 Gray. Au contraire, si le second signal présente une intensité inférieure à celle du premier signal, cela signifie que la dose initiale de l'échantillon est supérieure à la dose correspondant à un niveau de saturation. Ceci correspond à un niveau de dose de l'ordre de plusieurs dizaines de Gray, par exemple supérieur à 40 à 50 Gray. Le niveau de dose correspondant à la saturation impose le choix de la dose utilisée pour l'irradiation de l'étape 212, puisqu'il faut minimiser le risque de dépasser le niveau de dose correspondant à la saturation. Cette étape préliminaire est avantageusement mise en oeuvre pour vérifier que le niveau de dose initial reçu par l'échantillon est inférieur au niveau de saturation, auquel cas le niveau d'intensité de référence utilisé pour estimer la dose est alors de préférence le niveau de saturation. S'il est déterminé que le niveau de dose initial est supérieur au niveau de saturation, le niveau d'intensité de référence utilisé peut être le niveau d'annihilation. De retour à la figure 5, une fois la dose additionnelle déterminée à l'étape 220 pour amener l'échantillon à présenter le niveau de référence du signal, le procédé comprend ensuite une étape 230 consistant à déterminer la valeur absolue de la dose reçue par un autre échantillon, dit de référence, pour que le signal radio- induit mesuré pour cette dose corresponde au niveau de référence du signal. L'échantillon de référence est présumé non irradié initialement. Pour ce faire, plusieurs méthodes sont possibles. Un premier mode de réalisation consiste à générer une courbe de calibration à partir d'échantillons de tissus semblables provenant de personnes différentes, les échantillons n'ayant pas été irradiés initialement. Pour chaque individu, une courbe dose reçue / intensité du signal radio-induit mesuré peut être construite par ajouts successifs de doses déterminées, le signal étant mesuré entre chaque nouvelle irradiation - et l'échantillon étant repréparé à la mesure de dose par le procédé 100 décrit ci-avant avant chaque mesure. La technique de mesure peut dans ce cas être la spectroscopie RPE, la mesure de luminescence ou toute autre technique connue. Alternativement, une courbe peut aussi être générée en scindant un échantillon en plusieurs fragments, et en irradiant chaque fragment à des doses différentes connues. L'intensité de signal radio-induit de chaque fragment est ensuite mesurée par la même technique pour obtenir une courbe reliant les différentes doses à différentes intensités. Selon encore un autre mode de réalisation, une courbe peut être réalisée par la mise en oeuvre d'irradiations successives à des doses distinctes et déterminées, chaque irradiation étant suivie d'une mesure d'intensité de signal radio-induit par mesure de thermoluminescence, puis d'un chauffage complémentaire de l'échantillon pour supprimer le signal radio-induit. La courbe de calibration est ensuite générée en moyennant des courbes obtenues pour les différents individus. Alternativement, la Demanderesse a constaté que le niveau de dose correspondant à une saturation en intensité du niveau d'expression de RIS5 est constant pour les différents tissus biologiques de même nature d'un même individu, par exemple pour les différents ongles d'un même individu. A la place de réaliser une courbe de calibration à partir des échantillons provenant d'une population d'individus, il est donc avantageux de réaliser une courbe intensité de signal / dose à partir d'un échantillon de tissu du même individu, de préférence dont on présume qu'il n'a pas été irradié. Par exemple si l'échantillon de tissu dont on veut mesurer la dose provient d'un ongle de la main, car celle-ci a subi une irradiation du fait d'une manipulation accidentelle d'une source, il peut être avantageux de construire une courbe à partir d'un échantillon d'ongle provenant d'un orteil. La courbe elle-même peut être construite selon les techniques décrites ci-avant pour les courbes servant à la réalisation de la courbe de calibration. Avantageusement, si les mesures de signal radio-induit sont des mesures de thermoluminescence, il est avantageux de chauffer l'échantillon servant à générer la courbe pour supprimer les éventuels signaux radio-induits qui pourraient tout de même préexister. Ainsi, il est possible de déterminer le niveau de dose total reçu par un échantillon pour atteindre le niveau de référence du signal radio-induit. De retour à la figure 5, lors d'une étape 240, on détermine le niveau de dose initiale reçu par le premier échantillon, en soustrayant à la valeur absolue de la dose reçue par l'échantillon de référence (correspondant au niveau de référence en intensité atteint lors de l'étape 220) le niveau de dose total ajouté au premier échantillon lors de l'étape 220. Chaque étape de mesure d'un niveau d'intensité de signal radio-induit peut être mise en oeuvre par l'une des techniques connues parmi lesquelles la spectroscopie RPE, celle-ci étant de préférence mise en oeuvre en bande Q, c'est-à-dire que l'échantillon est soumis à un faisceau électromagnétique de fréquence comprise entre 33 et 50 Ghz, ou la mesure de luminescence, avantageusement par activation thermique (mesure de thermoluminescence). La RPE en bande Q présentant l'avantage d'une meilleure sensibilité pour les échantillons de petits volumes. Alternativement au procédé 200, il est possible d'utiliser des méthodes classiques de dosage telles que par exemple : La méthode par ajouts dosés qui consiste à réaliser une première mesure d'intensité de signal, par exemple par spectroscopie RPE ou par luminescence, puis à réaliser une série de post-irradiations de l'échantillon à des doses connues et réitérer les mesures d'intensités de signal. On mesure ensuite la variation d'intensité de signal en fonction de la variation de dose reçue pour établir un coefficient de sensibilité et déduire la dose absorbée initialement, La méthode par comparaison d'une intensité de signal mesurée pour la dose reçue à déterminer par rapport à une courbe d'étalonnage préétablie. Pour appliquer ces méthodes, il est cependant nécessaire de pouvoir estimer les contributions respectives du RIS5 et des signaux intrinsèques ou d'éliminer sélectivement ces signaux intrinsèques, ces deux types de signaux présentant les mêmes caractéristiques de signal RPE en bande X et Q ou en luminescence. Plusieurs approches peuvent être considérées : 1. Dans le cas spécifique des ongles, comme l'intensité du signal RIS5 n'évolue pas au cours du temps après hydratation, contrairement au signal intrinsèque SGI qui augmente jusqu'à atteindre une valeur constante, il est donc possible, en réalisant des mesures à des temps différents après hydratation, d'estimer les composantes respectives du RIS5 et du signal intrinsèque. Compte tenu de la différence de comportement du signal intrinsèque et du RIS5 après humidification, il est en théorie possible d'estimer la contribution de chaque signal dans le signal mesuré à g=2,004 en mesurant ce signal après humidification (A1) et après stabilisation du signal intrinsèque(A2) où la Demanderesse a identifié que l'amplitude du signal intrinsèque SGI est multiplié par un facteur moyen de 2,2. En effet, nous avons alors un système de deux équations à deux inconnues (Equ. 1), facilement résolu (Equ. 2). Al (Asignal int risèque Am5) Équation 1 A2 = (2,2 x Asignal int risèque AR185) (A2 - A1) et Asignal insè que h tr 1,2 (A2 - 2,2 x AI) A RIS5 2 Équation 2 avec Al l'amplitude du signal à g=2,004 mesurée 12 heures après humidification et A2 celle mesurée après stabilisation. Cette approche peut être mise en oeuvre quelle que soit la technique de mesure (spectroscopie RPE, luminescence, etc.). 2. Dans le cas spécifique des ongles, il est possible d'utiliser des ultrasons pour différencier les signaux RIS5 et SGI. L'utilisation des ultrasons a pour effet de réduire l'intensité du RIS5 et du signal intrinsèque SGI mais dans des proportions différentes. Par exemple une exposition de 45 minutes aux ultrasons (35 kHz, avec les échantillons dans de l'eau distillée à 25°C) permet de réduire l'intensité du signal intrinsèque d'un facteur 5 et d'un facteur 10 celle du RIS5. De la même manière que précédemment en réalisant une mesure avant et après traitement, avec système de deux équations à deux inconnues, il est possible d'estimer les composantes respectives du signal intrinsèque et du RIS5. 3. Utilisation du comportement différencié de l'intensité du signal intrinsèque ou de la mélanine et RIS5 vis à vis de la puissance micro-onde utilisée pour la mesure en spectroscopie RPE comme pour l'émail dentaire selon la méthode décrite dans l'article « Selective saturation method for EPR dosimetry with tooth enamel », E. A. lgnatiev, A.A. Romanyukha, A.A. Koshta, A. Wieser, Appl. Radiat. Isot., 47, 333337 (1996). Comme visible sur la figure 7, l'intensité du signal intrinsèque SGI augmente avec la puissance micro-onde pour atteindre un point de saturation puis décroît (la figure représente les amplitudes pic-à-pic normalisées du signal RIS5 et du signal intrinsèque SGI en fonction de la racine carrée de la puissance micro- onde, la mesure étant réalisée en bande X à température ambiante avec une cavité résonante haute sensibilité). Le point de saturation du RIS5 est atteint pour des valeurs plus élevées de la puissance micro-onde. En réalisant des mesures d'un échantillon à deux puissances micro-ondes différentes (faible puissance, par exemple comprise entre Oet 20 mW, de préférence entre 0 et 10 mW et forte puissance, par exemple comprise entre 10 et 200 mW), il est possible de générer un système d'équation à deux inconnues dont la résolution permet de déterminer les amplitudes respectives du signal intrinsèque et du RIS5. En cas d'une irradiation d'une partie seulement du corps, la dose locale peut être supérieure à la dose reçue par l'ensemble du corps par plusieurs ordres de grandeur. Le procédé de l'invention est donc particulièrement avantageux parce qu'il permet de déterminer facilement et précisément la dose reçue par les tissus irradiés. Il est donc possible pour l'homme du métier de déterminer les risques de développement de lésions cutanées chez la personne irradiée et ce, avant même que celles-ci n'apparaissent. Plus ce diagnostic est précoce et plus les chances d'issue favorable sont élevées. Selon un autre aspect, l'invention porte donc sur une méthode de détermination de risques de développement de lésions cutanées chez un sujet ayant reçu une irradiation externe, ladite méthode comportant des étapes consistant à: a) mesurer la dose reçue selon le procédé de l'invention, et b) déterminer en fonction de la dose de l'étape a) la probabilité de survenue de lésions externes. L'homme du métier saura, au vu de la littérature médicale, relier la dose reçue à un risque de développer des lésions cutanées. Par exemple, on considère habituellement qu'une dose absorbée comprise entre 3 et 10 Gy conduit à des érythèmes, une dose supérieure à 3 Gy à une dépilation, une dose comprise entre 8 et 12 Gy à une radioépidermite sèche, une dose comprise entre 12 et 20 gy à une radioépidermite exsudative, une dose comprise entre 20 et 25 Gy à une ulcération et une dose supérieure à 25 Gy à une nécrose des tissus irradiés. L'homme du métier peut ainsi définir la meilleure stratégie thérapeutique à apporter selon la nature de la dose. L'invention a donc pour objet, dans un autre aspect, une méthode pour déterminer la thérapie à apporter à un sujet ayant reçu une irradiation externe, ladite méthode comprenant des étapes de : a) détermination des risques de développement de lésions cutanées chez ledit sujet, et b) choix d'une thérapie au vu des risques déterminés dans l'étape a). L'homme du métier pourra par exemple décider de pratiquer une exérèse médicale des tissus irradiés, en identifiant ceux-ci à l'aide du procédé de l'invention. Alternativement, il pourra pratiquer une thérapie cellulaire de cellules souches mésenchymateuses autologues. Celle-ci devrait conduire au remplacement des cellules tuées par l'irradiation par les cellules obtenues par différenciation à partir desdites cellules souches. L'homme du métier peut enfin choisir de combiner les deux thérapies, à savoir une exérèse et une thérapie cellulaire. La présente invention présente en outre l'avantage de permettre d'identifier dans une population potentiellement exposée les sujets qui ont plus particulièrement besoin de soins. En effet, la méthode de l'invention permet également de déterminer des doses de l'ordre du Gy. De ce fait, elle peut être avantageusement utilisée pour identifier les personnes irradiées nécessitant des soins immédiats ou un suivi particulier parmi ladite population exposée. Dans ce cas, il peut être particulièrement utile pour l'homme du métier de se référer à une dose corps entier seuil pour déterminer si un sujet nécessite des soins urgents. Il est connu par exemple que dans le cas d'une irradiation sur le corps entier, la dose létale moyenne est de 5 Gy pour l'homme. Pour des doses croissantes, supérieures à 1-2 Gy, le syndrome d'irradiation aigüe se traduit principalement pour les plus fortes doses par, successivement une altération de la composition sanguine, un dérèglement gastro-intestinal et des troubles neurologiques. En deçà de 1 Gy, les manifestations de toxicité sont plus rares mais on peut observer une baisse temporaire des globules rouges, de la fertilité et de l'immunité. A cet égard, l'homme du métier pourra en particulier consulter les recommandations du projet européen Multibiodose (www.multibiodose.eu)). Préférentiellement, cette dose est supérieur ou égale à 0,5 Gy, plus préférentiellement cette dose est supérieur ou égale à 1 Gy ; encore plus préférentiellement cette dose est de 2 Gy. Pour identifier les sujets nécessitant un traitement dans une population potentiellement exposée, il est particulièrement avantageux d'utiliser des courbes d'étalonnages préétablies pour estimer les doses reçues. Dans ce cadre, les procédés de mesure peuvent être mis en oeuvre in vivo ou sur des échantillons prélevés (ex vivo). Bien que ce ne soit pas la seule source d'échantillon de tissu biologique comprenant de la kératine qui puisse être utilisée dans cette application, les ongles présentent plusieurs avantages : - Le prélèvement est facilement réalisé et de façon non invasive ; - L'analyse de prélèvements de différentes parties du corps permet de déterminer le niveau d'hétérogénéité de la distribution de la dose ou la configuration d'irradiation ; - La sensibilité de la technique et compatible avec les niveaux de doses à mesurer pour la ségrégation ; et - Quelle que soit la technique envisagée pour analyser les tissus, il est possible de réaliser un grand nombre de mesure (plus important que les techniques conventionnelles comme la cytogénétique), au minimum de l'ordre de quelques centaines sur une semaine comme recommandé par le projet européen Multibiodose (www.multibiodose.eu)). REVENDICATIONS1. Procédé de préparation (100) d'un échantillon de tissus biologiques comprenant de la kératine, en particulier de tissus du type ongles, cheveux ou peau-cornée, pour une mesure de dose, caractérisé en ce qu'il comprend : l'hydratation (110) de l'échantillon pendant une durée supérieure à 5 minutes, et la déshydratation contrôlée (120) de l'échantillon. 2. Procédé de préparation (100) d'un échantillon de tissus biologiques selon la revendication 1, dans lequel la déshydratation contrôlée (120) de l'échantillon hydraté comprend le séchage dudit échantillon dans un dessicateur pendant une durée supérieure à 10 heures, de préférence égale à 15 heures pour des mesures en spectroscopie RPE en bande Q. 3. Procédé de préparation (100) d'un échantillon de tissus biologiques selon la revendication 2, dans lequel l'échantillon de tissus biologiques hydraté est installé dans le séchoir sous vide avec une quantité de matériau dessicant, ledit matériau étant de préférence du gel de silice. 4. Procédé de préparation (100) d'un échantillon de tissus biologiques selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la masse de l'échantillon avant hydratation est comprise entre 2 et 5 mg, et la durée de l'hydratation est de préférence égale à 10 minutes. 5. Procédé de détermination (200) d'une dose de rayonnements ionisants reçue par un échantillon préparé par le procédé selon l'une des revendications 1 à 4, le 30 procédé comprenant : a) la mise en oeuvre d'une mesure de signal radio-induit (211), suivie d'une irradiation de l'échantillon (220), de manière répétée jusqu'à atteindre un niveau de référence d'intensité du signal,b) la détermination d'une valeur absolue de dose de rayonnements ionisants reçue (230) par au moins un échantillon de référence, correspondant au niveau de référence d'intensité de signal, et c) la détermination du niveau de dose de rayonnements ionisants reçue initialement (240) par le premier échantillon comme étant la soustraction, de la valeur de dose de rayonnements ionisants reçue par l'échantillon de référence, de la dose de rayonnements ionisants totale ajoutée à la dose de rayonnements ionisants initiale du premier échantillon lors de la mise en oeuvre de l'étape a). 6. Procédé de détermination (200) d'une dose de rayonnements ionisants selon la revendication précédente, dans lequel le niveau de référence est un niveau de saturation de l'intensité du signal avec la dose de rayonnements ionisants reçue ou d'annihilation du signal. 7. Procédé de détermination (200) d'une dose de rayonnements ionisants selon l'une des revendications 5 ou 6, comprenant en outre une étape préliminaire comprenant : la mise en oeuvre d'une mesure (211) de signal radio-induit sur l'échantillon dont on veut déterminer la dose de rayonnements ionisants reçue pour obtenir une première intensité de signal, l'irradiation de l'échantillon (212) à une dose de rayonnements ionisants inférieure à 5 Gy, de préférence inférieure à 1 Gy, la mise en oeuvre d'une seconde mesure (213) sur l'échantillon pour obtenir une seconde intensité de signal, et la comparaison (215) des intensités des deux intensités pour en déduire une estimation d'un niveau de dose de rayonnements ionisants initial reçu par l'échantillon relativement à une niveau de dose de rayonnements ionisants correspondant à un niveau de saturation de l'intensité de signal. 8. Procédé de détermination (200) d'une dose de rayonnements ionisants selon l'une des revendications 5 à 7, dans lequel l'échantillon est en outre préparé (214)par le procédé selon l'une des revendications 1 à 4 après chaque irradiation de l'étape a). 9. Procédé de détermination (200) d'une dose de rayonnements ionisants selon l'une des revendications 5 à 8, dans lequel la technique de mesure d'intensité de signal radio-induit mise en oeuvre est la spectroscopie RPE ou la mesure par luminescence. 10. Procédé de détermination (200) d'une dose de rayonnements ionisants selon l'une des revendications 5 à 8, dans lequel l'étape b) de détermination d'une valeur de dose de rayonnements ionisants reçue par un échantillon de référence correspondant au niveau de référence d'intensité de signal est mise en oeuvre à partir d'une courbe reliant des valeurs absolues de doses de rayonnements ionisants reçues par l'échantillon de référence à des niveaux d'intensité de signal, ladite courbe étant réalisée : en moyennant des courbes générées à partir de mesures sur des tissus biologiques provenant d'une pluralité d'individus, - à partir de mesures réalisées sur des tissus biologiques non irradiés provenant du même individu que le premier échantillon, ou - à partir de mesures réalisées sur des tissus biologiques irradiés provenant du même individu que le premier échantillon, lesdites mesures étant mises en oeuvre par mesure de thermoluminescence postérieurement à l'étape a), et le premier échantillon ayant été chauffé entre l'étape a) et lesdites mesures pour supprimer le signal radio-induit initial. 11. Procédé de détermination (200) d'une dose de rayonnements ionisants selon la revendication 10, dans lequel chaque courbe est générée par l'une des méthodes suivantes - découpe d'un échantillon de référence en une pluralité de fragments et mise en oeuvre, sur les fragments, d'irradiations à des doses de rayonnements ionisants distinctes et déterminées, et mesure d'une intensité de signal radio-induit dans l'échantillon pour chaque dose de rayonnements ionisants,mise en oeuvre d'irradiations successives de l'échantillon de référence à des doses connues, chaque irradiation étant suivie d'une mesure d'intensité de signal radio-induit, ou mise en oeuvre d'irradiations successives à des doses de rayonnements ionisants distinctes et déterminées, chaque irradiation étant suivie d'une mesure d'intensité de signal radio-induit par mesure de thermoluminescence, puis d'un chauffage de l'échantillon pour supprimer le signal radio-induit. 12. Procédé de détermination d'une dose de rayonnements ionisants reçue par un échantillon par la mise en oeuvre d'une méthode par ajouts dosés ou par comparaison d'un signal radio-induit de l'échantillon mesuré par spectroscopie RPE ou par mesure de luminescence avec une courbe d'étalonnage pré-établie, caractérisé en ce qu'il comprend, pour chaque mesure de signal radio-induit réalisée sur un échantillon préparé par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 4, la détermination des contributions du signal intrinsèque (SGI) de l'échantillon et du signal d'une espèce radicalaire radio-induite (RIS5) présentant, lors de la mesure d'un échantillon de tissu biologique du type ongles, cheveux ou peau-cornée par spectroscopie RPE en onde continue à température ambiante: un facteur de Landé de 2,004, lors de mesures en bande Q et à température ambiante, une intensité de signal minimum et une intensité de signal maximum, lesdites intensités étant atteintes pour des valeurs de champ magnétiques séparées de 1,8 mT, lors de mesures en bande X, un signal formant un singulet, et à plus haute fréquence, un signal présentant une anisotropie de facteur de Landé. 13. Procédé de détermination selon la revendication 12, dans lequel l'échantillon de tissu est un échantillon d'ongles, et la détermination des contributions du signal intrinsèque (SGI) de l'échantillon et de l'espèce radicalaire radio-induite (RIS5) comprend la mesure d'un signal radio-induit de l'échantillon pour une même dose de rayonnements ionisants reçue par l'échantillon, après deux durées d'hydratationdistinctes, et la déduction, à partir des mesures, des contributions du signal intrinsèque (SGI) et du signal de l'espèce radio-induite. 14. Procédé de détermination selon la revendication 12, dans lequel l'échantillon de tissu est un échantillon d'ongles, et la détermination des contributions du signal intrinsèque (SGI) de l'échantillon et de l'espèce radicalaire radio-induite (RIS5) comprend la mesure d'un signal radio-induit de l'échantillon avant et après exposition à un faisceau d'ultrasons pendant une durée déterminée, et la déduction, à partir des mesures, desdites contributions. 15. Procédé de détermination selon la revendication 12, dans lequel la détermination des contributions du signal intrinsèque (SGI) de l'échantillon et de l'espèce radicalaire radio-induite (RIS5) comprend la mesure d'un signal radio-induit de l'échantillon après une exposition à des micro-ondes à une première puissance, et une exposition à des micro-ondes à une seconde puissance, supérieure à la première, et la déduction, à partir des mesures, desdites contributions. 16. Méthode de détermination de risques de développement de lésions cutanées chez un sujet ayant reçu une irradiation externe, ladite méthode comportant des étapes consistant à : i. déterminer la dose de rayonnements ionisants reçue selon l'une quelconque des revendications 5 à 15, et ii. déterminer en fonction de la dose de rayonnements ionisants de l'étape i) la probabilité de survenue de lésions externes.25