Brevet FR3023467A1 — publié le 20160115

PROCÉDÉS D'ÉVALUATION DE L'ATROPHIE VAGINALE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne les procédés d'évaluation de l'atrophie vaginale impliquant des capteurs sensoriels, le pH, la biochimie, la génomique ou l'histologie des lèvres et de l'orifice vaginal. ARRIÈRE-PLAN DE L'INVENTION La ménopause est un événement de vieillissement naturel et normal qui concerne toutes les femmes. La ménopause peut être définie comme la cessation de l'ovulation et des menstruations pendant au moins 12 mois sans cause pathologique évidente. L'âge typique de la ménopause est de 51 ans et on estime qu'aujourd'hui aux États-Unis (d'après un recensement effectué en 2010) plus de 53 millions de femmes ont atteint l'âge de la post- ménopause (50 ans et plus). D'autres femmes entrent dans la catégorie post-ménopause en subissant une hystérectomie totale (ablation des deux ovaires et de l'utérus). Parallèlement à la post-ménopause, on constate une chute drastique de l'oestradiol dans la circulation à moins de 10 % du niveau typique au cours de la période de procréation de la femme. La baisse des concentrations d'cestrogène provoque des changements anatomiques majeurs qui entraînent des symptômes uniques et des questions liées à la qualité de vie. Alors que la diminution du taux d'oestrogène a été signalée comme ayant un effet systémique sur le corps, la peau et les cheveux de la femme, cet effet se manifeste également au niveau de la zone urogénitale et est diagnostiqué comme étant l'atrophie vaginale ou AV. L'évaluation de l'AV peut nécessiter l'insertion d'un spéculum dans le vagin de la femme. Des évaluations subjectives sont effectuées, incluant notamment la disparition des crêtes du vagin, la béance de l'urètre, un vestibule télescopique, la présence de pétéchies dans le vagin et la perte d'élasticité de l'orifice vaginal (diagnostiquée par toucher vaginal). Les symptômes prédominants signalés par les femmes incluent entre autres une sensation de sécheresse vaginale, des douleurs lors de la pénétration sexuelle, des saignements accompagnant la pénétration sexuelle et des démangeaisons vaginales et génitales. Les mesures et procédés de test objectifs de l'AV reposent sur des tests intravaginaux, à la surface de la muqueuse. L'hymen est une membrane entourant ou recouvrant partiellement l'orifice vaginal externe (le tissu qui entoure cette ouverture peut être appelé anneau hyménal). L'hymen marque la limite entre les organes génitaux internes et externes. Il est composé d'une fine membrane fibreuse tapissant le vagin, inférieur, recouvert sur sa surface externe par un épithélium pavimenteux stratifié et kératinisé, et sur sa surface interne par un épithélium pavimenteux stratifié non kératinisé avec glycogène (comme l'épithélium vaginal). Pour beaucoup de femmes atteintes d'AV, l'hymen peut se contracter et perdre son élasticité, ce qui rend les examens objectifs de l'AV difficiles ou désagréables. Le tissu associé à l'ouverture du vagin est également dénommé orifice vaginal. Les mesures objectives relatives à l'AV sont en grande partie limitées au pH vaginal (nécessitant généralement un spéculum pour créer un accès adéquat), pour lequel un pH supérieur ou égal à 5,5 a été classé comme un signe d'AV. La muqueuse épithéliale recueillie par le frottis vaginal (nécessitant également l'insertion du spéculum dans le vagin) peut être analysée pour vérifier l'abondance relative des cellules mûres (appelée indice de maturation vaginale ou IMV). Cependant, la relation entre l'IMV et l'AV varie selon le clinicien et la variation peut être assez importante. De même il n'existe aucun rapport évident entre la symptomatologie et l'évaluation clinique d'une femme ou les mesures objectives du pH vaginal de la femme. Un autre procédé objectif potentiel permettant de diagnostiquer l'AV et l'efficacité d'un traitement peut inclure la réalisation d'une biopsie vaginale pour le profilage de la transcription. Obtenir une biopsie vaginale est assez difficile et nécessite l'utilisation d'un spéculum. En outre, il est impossible de préciser l'endroit d'où provient la biopsie ni d'assurer l'uniformité des propriétés. Par exemple, des différences d'épaisseur de la biopsie peuvent fausser les données provenant du derme. Par ailleurs, à l'exception du pH vaginal, tous les autres procédés sont subjectifs et ne sont pas fiables. Un autre problème réside dans le fait que toutes les procédures vaginales, telles que le classement subjectif de l'atrophie vaginale, le prélèvement pour mesure du pH vaginal ou les frottis vaginaux pour connaître l'IMV exigent l'insertion d'un spéculum dans le vagin. Cette procédure peut être très douloureuse, surtout chez les femmes qui souffrent d'AV. Même si le spéculum peut être lubrifié (généralement avec du gel d'échographie disponible dans le commerce) pour en faciliter l'insertion, cela peut compromettre le prélèvement du pH et fausser l'IMV. La douleur causée par l'insertion d'un spéculum peut influencer la décision d'une femme de consulter afin d'obtenir un diagnostic et un traitement pour AV. Ainsi, sont nécessaires des procédés de diagnostic de l'AV et des procédés d'évaluation de l'efficacité potentielle des traitements contre l'AV qui ne reposent pas sur l'utilisation d'un spéculum, le prélèvement d'échantillons de tissu vaginal et qui réduisent le niveau de subjectivité par un recours à un procédé quantitatif et objectif. RÉSUMÉ DE L'INVENTION L'invention concerne un éventail d'un ou plusieurs procédés permettant d'identifier les changements urogénitaux associés à l'atrophie vaginale. Un premier objet de la présent invention est un éventail de procédés comprenant: mesurer le pH au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres, de l'orifice vaginal ou d'une combinaison de ceux-ci ; déterminer la sensibilité à la brosse au niveau de l'orifice vaginal ; évaluer la quantité de glycogène au niveau de l'orifice vaginal ; réaliser une biopsie au niveau de l'orifice vaginal et analyser les cellules épithéliales au niveau de l'orifice vaginal ; évaluer la teneur en protéines au niveau de l'orifice vaginal ou des grandes lèvres ou des petites lèvres ; évaluer les quantités de métabolites au niveau de l'orifice vaginal ou des grandes lèvres ou des petites lèvres ; évaluer la quantité d'histamine au niveau de l'orifice vaginal ou des grandes lèvres ou des petites lèvres ; effectuer une cartographie thermique transcriptomique au niveau des grandes lèvres ou des petites lèvres ou de l'orifice vaginal ; et évaluer l'expression des gènes au niveau des grandes lèvres pour un changement dans l'ensemble des sondes génétiques. L'éventail de procédés de la présente invention peut comprendre un procédé de mesure de pH qui comprend également l'utilisation d'une sonde pH. L'éventail de procédés de la présente invention peut comprendre un procédé dans lequel les changements dans l'ensemble des sondes génétiques sont limités aux sondes génétiques associées à l'expression du collagène. L'éventail de procédés de la présente invention peut comprendre un procédé dans lequel les changements dans l'ensemble des sondes génétiques, sont limités à la progression du cycle cellulaire. L'éventail de procédés de la présente invention peut comprendre un ou plusieurs des procédés qui sont utilisés dans l'évaluation de l'étendue de l'atrophie vaginale avant et après un protocole thérapeutique. Ledit traitement peut en outre provoquer la diminution du pH lié à une atrophie de 0,1 à 2,0 unités de pH. Ledit traitement peut provoquer la diminution du pH lié à une atrophie de 0,3 à 1,5 unité de pH. Ledit traitement peut en outre entraîner un pH de l'orifice vaginal de 3,5 à 5,8 unités de pH. Ledit traitement peut être un émollient en application urogénitale ou vaginale constitué d'cestrogène, d'isoflavones, de niacinamide, d'hyaluronine, de panthénol, d'huiles grasses, d'acides tamponnés et des mélanges de ceux-ci. Ledit traitement peut être un système d'administration par voie orale ou cutanée constitué d'oestrogène. L'analyse des cellules épithéliales au niveau de l'orifice vaginal de l'éventail de procédés de la présente invention peut comprendre en outre la mesure de l'abondance de crêtes épidermiques dans l'anneau de l'hymen, dans lequel les procédés comprennent en outre un traitement, et dans lequel le traitement provoque une augmentation de 10 à 100 % de l'abondance des crêtes. L'analyse des cellules épithéliales au niveau de l'orifice vaginal de l'éventail de procédés de la présente invention peut comprendre en outre la mesure de l'épaisseur du tissu épithélial de l'hymen, dans lequel les procédés comprennent en outre un traitement, et dans lequel le traitement provoque une augmentation de 10 à 300 % de l'épaisseur liée à l'atrophie. L'invention concerne également un procédé d'évaluation de l'efficacité d'un protocole de traitement de l'atrophie vaginale. Le procédé d'évaluation de l'efficacité d'un protocole de traitement de l'atrophie vaginale comprend : effectuer une évaluation de l'atrophie vaginale avant le traitement à l'aide d'un ou plusieurs procédés de diagnostic ; appliquer un ou plusieurs des traitements topiques au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres, de l'orifice vaginal, du vagin ou d'une combinaison de ceux-ci ; effectuer une évaluation post-traitement de l'état de l'atrophie vaginale en utilisant les mêmes procédés de diagnostics que ceux utilisés avant le traitement ; et déterminer la différence entre les évaluations de l'atrophie vaginale avant et après le traitement, afin d'évaluer l'effet global du traitement topique. Le ou les procédés de diagnostics utilisés avant et après le traitement comprennent : mesurer le pH au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres, de l'orifice vaginal ou d'une combinaison de ceux-ci ; déterminer la sensibilité à la brosse au niveau de l'orifice vaginal ; évaluer le glycogène au niveau de l'orifice vaginal ; effectuer une analyse de la biopsie des cellules épithéliales de l'orifice vaginal ; évaluer les protéines au niveau de l'orifice vaginal ; effectuer une cartographie thermique transcriptomique au niveau des grandes lèvres ou des petites lèvres ; évaluer l'expression des gènes au niveau des grandes lèvres pour une sonde génétique donnée ; effectuer une évaluation post-traitement de l'état de l'atrophie vaginale en utilisant les mêmes procédés de diagnostic que ceux utilisés pour l'évaluation prétraitement de l'AV ; et déterminer la différence entre les évaluations de l'atrophie vaginale avant et après le traitement, afin d'évaluer l'effet global du traitement topique. L'invention concerne également une trousse permettant d'évaluer l'efficacité d'un protocole de traitement de l'atrophie vaginale, comprenant : un procédé d'évaluation prétraitement de l'atrophie vaginale comprenant un traitement topique à appliquer au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres, de l'orifice vaginal, du vagin ou d'une combinaison de ceux-ci ; un procédé d'évaluation post-traitement de l'état de l'atrophie vaginale comprenant les mêmes procédés de diagnostic que ceux utilisés avant le traitement ; ainsi qu'un moyen de déterminer la différence entre les évaluations de l'atrophie vaginale avant et après le traitement, afin d'évaluer l'effet global du traitement topique. Le ou les procédés de diagnostic utilisés dans le cadre du prétraitement et du post-traitement comprennent : mesurer le pH au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres, de l'orifice vaginal ou de combinaisons de ceux-ci ; déterminer la sensibilité à la brosse au niveau de l'orifice vaginal ; évaluer le glycogène au niveau de l'orifice vaginal ; effectuer une analyse de la biopsie des cellules épithéliales de l'orifice vaginal ; évaluer la teneur en protéines au niveau de l'orifice vaginal ; effectuer une cartographie thermique transcriptomique au niveau des grandes lèvres ou des petites lèvres ; ou évaluer l'expression des gènes au niveau des grandes lèvres pour une sonde génétique donnée. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS Alors que la description se termine avec des revendications soulignant particulièrement et revendiquant distinctement le sujet de la présente invention, on pense que l'invention sera plus aisément comprise à la lecture de la description suivante prise conjointement avec les dessins joints, sur lesquels : La Figure 1 montre des images de biopsies prélevées au niveau de l'orifice vaginal. La Figure 2 montre une image utilisée pour la mesure du tissu épithélial. DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION Les procédés inclus dans l'éventail de procédés de la présente invention afin d'évaluer l'atrophie vaginale ainsi que l'efficacité des traitements contre l'atrophie vaginale ne nécessitent pas l'utilisation d'un spéculum, ni l'accès au vagin. L'éventail de procédés suivant réduit le niveau de subjectivité en utilisant un procédé quantitatif et objectif H est entendu qu'un praticien peut s'appuyer sur un procédé unique ou sur une combinaison des procédés décrits ci-dessous. Les procédés suivants utilisent des zones autres que le canal vaginal qui sont facilement accessibles et qui peuvent servir à mesurer objectivement les changements liés à l'atrophie urogénitale et qui ne nécessitent pas d'outils invasifs tels que le spéculum. En outre, ces zones peuvent être étroitement liées aux symptômes signalés par les femmes ainsi qu'à l'efficacité des traitements. Ces zones comprennent les lèvres et l'anneau hyménal de la zone urogénitale. Ces deux zones sont particulièrement intéressantes en raison de leur accessibilité. L'anneau hyménal, comme le vagin, est une surface muqueuse, à la différence de l'épithélium stratifié des lèvres. Les procédés suivants, en utilisant les lèvres et l'anneau hyménal (ou l'orifice vaginal), peuvent permettre d'effectuer une analyse du pH, une histologie, un test de sensibilité à la brosse, un profilage des métabolites et un profilage de transcription des gènes. Les métabolites ont été identifiés à l'aide d'outils analytiques tels que la CG-SM, puis quantifiés à partir des extraits provenant de la brosse et des bandelettes de ruban. Mesure de pH au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres et de l'anneau hyménal Une personne du métier peut ne pas se limiter à cette description. Le pH peut être mesuré à l'aide de papier pH disponible dans le commerce ou par une sonde pH à tête plate. Parmi les exemples non limitatifs de papier pH ou de bandelettes pH figurent le papier pHydrion (plage de 3,0 à 5,5 ; Hydrion MicroEssentials Laboratory Inc., New York, New York, É.-U.) et les bandelettes de diagnostic pHion (plage de 4,5 à 9,0; iHerb.com). Parmi les exemples non limitatifs d'une sonde pH à tête plate figure le SkinCheck HI-98109 (Hanna Instruments, Woonsocket, Rhode Island, É.-U.). Le pH peut être mesuré à l'aide d'une bandelette de pH, celle-ci étant tenue par un forceps, afin de placer la bandelette de pH au contact de la zone désirée pendant 30 secondes. La procédure d'utilisation de la sonde pH est la suivante. 1. Avant d'utiliser la sonde pH, retirer le capuchon protecteur et conditionner l'électrode en faisant tremper l'embout (de préférence jusqu'à 5 cm/2 pouces du bord inférieur, plus préférablement jusqu'à 3 cm/1,5 pouce du bord inférieur) dans une solution tampon fraîche de pH 7 (par exemple la solution HI7007P de Hanna Instruments) de 1 heure à aussi longtemps que 24 heures. Pendant le conditionnement, la sonde doit être en position « Off » (Arrêt). 2. Étalonner la sonde pH. Allumer la sonde pH. Commencer par rincer la sonde conditionnée à l'aide d'eau distillée, préférablement dans de l'eau distillée déminéralisée. Tremper l'embout de l'électrode de la sonde dans une solution tampon de pH 7 (tampon datant de moins de 30 jours, de préférence un tampon frais). Laisser la lecture se stabiliser (c'est-à-dire de préférence moins de 1 heure, plus préférablement moins de 15 minutes). Une fois la lecture stabilisée, utiliser un petit tournevis pour ajuster le pH à 7,00 +/- 0,02 avec un trimmer (vis supérieure gauche lorsque vous regardez l'affichage de l'électrode) afm que la mesure indique 7,00. Rincer l'embout de l'électrode à l'eau (c'est-à-dire à l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée déminéralisée), secouer pour éliminer l'excédent et répéter le processus à l'aide d'un tampon frais de pH 4,0 (par exemple la solution HI70004P de Hanna Instruments). Laisser la lecture se stabiliser (c'est-à-dire de préférence moins de 1 heure, plus préférablement moins de 15 minutes). Une fois la lecture stabilisée, utiliser un petit tournevis pour ajuster le pH à 4,00 +/- 0,02 avec le trimmer (en haut à droite lorsque vous regardez l'affichage de l'électrode) afin que la mesure indique 4,00. Le pH mètre est prêt à prendre des mesures. L'embout de la sonde peut être laissé dans une solution tampon (de préférence jusqu'à 5 cm/2 pouces du bord inférieur, plus préférablement jusqu'à 3 cm/1,5 pouces du bord inférieur) pour un maximum de 2 heures. 3. Mesures. Le commutateur du pH mètre doit être en position active. Rincer l'embout de l'électrode avec de l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée déminéralisée et laisser l'excédent d'eau s'égoutter ou agiter délicatement pour retirer l'excédent. Tenir l'électrode entre 45 et 135 degrés de la surface de la peau, de préférence entre 60 et 120 degrés de la surface de la peau, et plus préférablement entre 75 et 105 degrés de la surface de la peau. Laisser l'affichage de la sonde pH se stabiliser pendant moins de 15 minutes, de préférence moins de 5 minutes, plus préférablement moins de 1 minute. Après utilisation, rincer l'embout de l'électrode à l'eau (c'est-à-dire, de l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée déminéralisée), secouer l'excédent et commencer à prendre une mesure sur un autre site urogénital du même sujet. Si la sonde n'est pas utilisée immédiatement, elle peut être rincée à l'eau (c.-à-d., de l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée déminéralisée) et transférée dans un bain de tampon de pH 4,0 ou 7,0 jusqu'à son utilisation pendant un maximum de 2 heures. 4. Après utilisation, ou entre les sujets. Après avoir utilisé le pH mètre, placer le commutateur en position désactivée. Pour entreposer la sonde pH ou l'utiliser sur un autre sujet, il faut la décontaminer ou la désinfecter. Pour ce faire, utiliser l'une des deux méthodes préférables suivantes. La première consiste à plonger la sonde (de préférence à moins de 5 cm/2 pouces du bord inférieur, plus préférablement à moins de 3 cm/1,5 pouces du bord inférieur) dans de l'alcool isopropylique à 70 % de préférence pendant 20 à 40 minutes, plus préférablement pendant 25 à 35 minutes. La sonde est ensuite rincée à l'eau (c'est-à-dire, de l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée déminéralisée) et réétalonnée. Alternativement, on peut utiliser une lingette germicide (alcool Sani-Cloth HB sans PDI, Orangeburg, New York, É.-U.) ou un spray (le désinfectant Citrex Hospital Spray de Cardinal Health, Columbus, Ohio, É.-U.) Après l'application, attendre 3 à 5 minutes, de préférence 3 à 4 minutes, plus préférablement 2,5 à 4 minutes. Procéder ensuite à un rinçage à l'eau (c'est-à- dire à l'eau distillée, de préférence à l'eau distillée déminéralisée) et au réétalonnage. Pour entreposer la sonde pH après décontamination, rincer la sonde à l'eau (c'est-à-dire à l'eau distillée, de préférence à l'eau distillée déminéralisée), secouer pour retirer l'excédent et placer le capuchon sur l'embout de la sonde ou verser de 1 à 10 gouttes de la solution de stockage HI 70300 Storage Solution (Hanna Instruments) dans le capuchon protecteur avant de le placer sur l'extrémité de la sonde. La sonde pH ou les bandelettes à pH peuvent servir à mesurer le pH au niveau des grandes lèvres externes, des grandes lèvres internes, des petites lèvres et de l'anneau hyménal. Pour les mesures au niveau des lèvres et de l'anneau hyménal, la sonde pH est préférable, alors que la bande de pH convient mieux au vagin. Pour les mesures au niveau des lèvres, la sonde ou la bandelette peut être placée au centre (entre la partie postérieure et antérieure) de la zone anatomique. Pour les mesures au niveau de la zone hyménale, la sonde pH est pratiquement perpendiculaire ou peut varier entre 45° et 1350 du site anatomique. Mesure de la sensibilité de l'orifice vaginal à l'aide d'une brosse souple et d'analyses biochimiques Le procédé peut également inclure un procédé permettant de mesurer la sensibilité de l'orifice vaginal à l'aide d'un outil souple, par exemple une brosse. Parmi les exemples de brosse figurent les brosses rondes, par exemple les brosses buccales MasterAmp Buccal Brushes d'Epicentre Biotechnologies (Madison, Wisconsin, É.-U.). Les brosses doivent être douces pour les tissus, tel que défini par le bord des soies, leur longueur et leur dureté. Les brosses peuvent être mises en contact avec l'anneau hyménal afin de mesurer la sensibilité ou afin de recueillir un échantillon de tissu biologique sur la brosse. Le procédé implique de mettre la brosse en contact avec l'anneau hyménal. Le contact avec l'anneau hyménal est maintenu pendant au moins 1 seconde. Mettre la brosse en contact avec l'anneau hyménal peut inclure les étapes suivantes : demander au sujet d'adopter une position adéquate pour que la sonde de test soit correctement placée, exposer l'anneau hyménal, tenir le manche de la brosse et mettre la brosse légèrement en contact avec le tissu hyménal à une force située entre 1 psi (6,9 kPa) et 0,01 psi (69 Pa), telle que par exemple, inférieure àl psi (6,9 kPa), inférieure à 0,5 psi (3,4 kPa), ou inférieure à 0,1 psi (690°Pa) et déplacer la brosse à travers la zone désirée du tissu pour un prélèvement de tissu. Avant de mettre la brosse en contact avec l'anneau hyménal, le sujet doit adopter une position adéquate pour que la sonde de test soit correctement placée. Dans de nombreux cas, mais sans s'y limiter, un fauteuil d'examen gynécologique peut convenir. Ce fauteuil permet d'ajuster la position du sujet. Une fois que le sujet est correctement positionné, déployer les lèvres afin que la zone 25 hyménale soit exposée. L'étape suivante consiste à saisir la poignée de la brosse, à insérer et poser la brosse (brosse buccale MasterAmp Buccal Brush de Epicentre Biotechnologies) n'importe où le long de l'anneau hyménal, de préférence dans les positions 3, 6, 9 ou 12 heures. Pour déterminer la sensibilité d'une brosse, on peut tenir l'extrémité de la poignée en 30 -plastique entre le pouce et l'index et, dans un mouvement de rotation, faire pivoter la brosse de 1 à 25 cycles sur la surface du tissu, de préférence de 2 à 15 cycles, plus préférablement de 3 à 10 cycles. Chaque cycle prend moins de 5 secondes, de préférence moins de 2 secondes. Une fois que la brosse entre en contact avec l'anneau hyménal, la brosse doit être retirée et coupée afin d'être recueillie dans un flacon de prélèvement (tubes de microcentrifuge Bio Plas [Bio Plas 4204] et bouchons à vis avec joints toriques [Bio Plas 4215R] de VWR [VWR International LLC, Radnor, Pennsylvanie, É.-U.], tubes à jupe à fond conique no. de réf. 20170-710 et VWR 20170-770) que l'on ferme ensuite avec un bouchon à vis. Le flacon peut alors être placé dans de la glace sèche et être stocké dans un congélateur à -70 °C (ou moins) pendant un maximum de six mois. Un ou plusieurs échantillons sur brosse peuvent être prélevés, comme, par exemple, on peut répéter le procédé entre 2 et 10 fois, de préférence entre 2 et 5 fois. Les échantillons sur brosse peuvent être prélevés afin d'effectuer des mesures sur les protéines, l'ADN, le glycogène, l'histamine, les cytokines et les métabolites. Le procédé peut également requérir que la cliente remplisse un questionnaire concernant l'expérience. Le questionnaire peut contenir des questions relatives à la sécheresse vaginale. Le questionnaire peut permettre d'établir si la cliente a senti la brosse et si le contact était désagréable. Le questionnaire peut demander à la cliente de décrire la sensation. Le questionnaire peut également poser des questions sur des sujets tels que la sécheresse de la peau génitale, la sécheresse vaginale, les démangeaisons de la peau génitale, les démangeaisons vaginales, les difficultés rencontrées lors des rapports sexuels et sur une combinaison de ces sujets. Le questionnaire peut demander à la cliente de noter les aspects décrivant le contact avec la brosse, par exemple en attribuant un niveau de désagrément. Les notes peuvent être fondées sur une échelle de 1 à 10; 1 pour une femme qui n'a ressenti aucune sensation et 10 pour une femme qui a ressenti les sensations les plus fortes. Comme indiqué plus haut, les brosses peuvent être analysées afin d'effectuer des mesures sur les protéines, l'ADN, le glycogène, l'histamine, les cytokines et les métabolites. Les brosses peuvent être analysées pour connaître la teneur en glycogène en utilisant la trousse de dépistage de glycogène EnzyChromTM Glycogen Assay Kit (BioAssay Systems, Hayward, Californie, É.-U.). La trousse de dépistage de glycogène EnzyChromTM emploie un réactif unique qui combine la décomposition enzymatique (hydrolyse) du glycogène par l'a-amylase et l'amyloglucosidase, l'oxydation du glucose par la glucose oxydase et la détection du peroxyde d'hydrogène par un réactif colorimétrique/fluorogène avec du colorant (de Material Safety Data Sheet qui accompagne la trousse de dépistage de glycogène EnzyChromTm). L'intensité de la couleur du produit issu de la réaction à une longueur d'onde de 570 nm ou l'intensité de la fluorescence à ke',,,, 530/585 nm est directement proportionnelle à la concentration en glycogène dans l'échantillon (Zhou, M et al. Analytical Biochem 253:162-168, 1997). Les concentrations de glucose dans les échantillons sont déterminées par l'ajout d'un blanc de réactifs échantillon contenant de la glucose oxydase et du colorant sans 5 enzymes d'hydrolyse. La teneur en glycogène est déterminée en soustrayant le glucose libre de la teneur totale en glucose (glycogène + glucose libre). Une courbe d'étalonnage est générée en utilisant une solution mère pour préparer des concentrations croissantes de glycogène, exprimée en microgrammes par millilitre (p,g/m1). Trois échantillons de contrôle qualité (CQ élevé, CQ moyen et CQ faible) préparés à partir de la solution 10 mère sont utilisés pour surveiller les performances du dosage lors de l'analyse d'échantillon. Prélever une biopsie L'éventail de procédés peut également inclure le prélèvement d'une biopsie au niveau des 15 grandes lèvres, des petites lèvres ou de l'orifice vaginal. La biopsie peut être utilisée pour l'analyse histologique, l'analyse biochimique ou l'analyse transcriptomique. Pour prélever la biopsie, la surface de la peau est d'abord nettoyée à la Bétadine, puis anesthésiée à l'aide d'un anesthésique topique tel que la lidocaïne, en quantité d'environ 0,05 à 4 ml/cm2. L'anesthésie doit être appliquée juste au-dessous de la zone à biopsier. Une fois que l'anesthésie a engourdi 20 la zone, la surface est nettoyée avec de l'alcool. Les biopsies de la peau peuvent être prélevées par un médecin qualifié à l'aide d'un instrument de biopsie Tischler Morgan (disponible auprès de Gynex Corporation, Redmond, Washington, É.-U.) en respectant les normes de stérilisation, et être suivies d'une fermeture par suture le cas échéant. Si nécessaire, des mesures supplémentaires peuvent être entreprises pour l'hémostase. Pour cette procédure, il 25 est possible d'utiliser une suture chromique afin que les fils de suture soient absorbés naturellement de sorte qu'il ne soit pas nécessaire de retirer les points de suture. La zone de la biopsie peut être traitée avec de la Polysporine, puis recouverte d'une compresse de gaze médicale ou d'un pansement. Une visite postopératoire peut être prévue pour tous les sujets afin de constater la guérison de la zone biopsiée. 30 Il est entendu que plusieurs biopsies peuvent être prélevées. Les échantillons de biopsie peuvent être traités selon la procédure suivante. Les échantillons de biopsie sont utilisables pour l'évaluation histologique en transférant d'abord la biopsie dans un pot de formol préalablement étiqueté (formol à 10 % neutre tamponné, VWR 89370-094 ou équivalent). L'échantillon peut être conservé dans du formol pendant la nuit, puis transféré dans une cassette en plastique contenant de l'éthanol à 70 % pour un éventuel enrobage à la paraffine, une coupe et une coloration (par exemple, par hémotoxyline/éosine). La biopsie peut aussi être congelée pour une éventuelle coupe et coloration congelées. Les échantillons de biopsie sont utilisables pour l'analyse transcriptomique en transférant d'abord la biopsie dans une solution de RNALater (Life Technologies, no. de réf. AM7021, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, É.-U.) puis en l'immergeant dans une solution saline tamponnée au phosphate (Life Technologies, no. 10010031 ou équivalent) et en l'asséchant avec une lingette Kimwipee (produite par Kimberly Clark Corporation, Irving, Texas, É.-U.). L'échantillon peut ensuite être transféré dans un tube Eppendorf (VWR, no. de réf. 022363204) de 1,5 ml dont on referme ensuite le bouchon, puis placé dans un bain de glace sèche à l'éthanol ou dans un congélateur à -70 °C (ou plus froid) jusqu'au traitement de l'ARN. Les échantillons de biopsie peuvent être utilisés pour l'évaluation histologique et l'analyse transcriptomique. Une évaluation histologique peut être effectuée en procédant comme suit : 1. Après les traitements au formol et à éthanol, le tissu peut être nettoyé au xylène (VWR, no. de réf. MK866802 ou équivalent) puis enrobé dans de la paraffine dans un moule afin de se solidifier. Une fois le bloc de tissu refroidi sur la plaque froide, puis retiré du moule, il est placé dans le congélateur (environ -4 °C) jusqu'à ce qu'il soit sectionné. Retirer le tissu du congélateur et le garder au froid dans un bac à glace (ou équivalent) posé sur la glace. Couper le bloc et le répartir par sections d'une épaisseur de 3 à 4 i.tm à l'aide d'un microtome (Leica RM2125 RTS, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Allemagne ou équivalent). Les sections peuvent être placées sur un bain d'eau afin de retirer tous les plis ou rides. Les sections peuvent être disposées sur une lame de microscope chargée positivement (VWR, no. de réf. 89500-498 ou équivalent) et l'excédent d'eau doit être retiré des lames. Les lames sont chargées dans un bac de coloration Ventana Symphony, puis colorées avec de l'hémotoxyline et de l'éosine (H&E) ou tout autre colorant désiré (par exemple, PAS, Trichrome et autres) ou teintées par coloration immunologique (par exemple, Ki67, CD3, S100, etc.) en utilisant le système Ventana Symphony (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona, É.-U). Les échantillons de biopsie, sur brosse ou sur bandelette peuvent être extraits afin d'effectuer des mesures sur les protéines, l'ADN, le glycogène, l'histamine et les métabolites. Mesure du glycogène Les brosses peuvent être analysées pour connaître la teneur en glycogène en utilisant la trousse de dépistage de glycogène EnzyChromTM Glycogen Assay Kit (BioAssay Systems, Hayward, Californie, É.-U.). La trousse de dépistage de glycogène EnzyChromTM emploie un réactif unique qui combine la décomposition enzymatique (hydrolyse) du glycogène par l'a-amylase et l'amyloglucosidase avec l'oxydation du glucose par la glucose oxydase et la détection du peroxyde d'hydrogène par un réactif colorimétrique/fluorogène avec du colorant (de Material Safety Data Sheet qui accompagne la trousse de dépistage de glycogène EnzyChromTM). L'intensité de la couleur du produit issu de la réaction à une longueur d'onde de 570 nm ou l'intensité de la fluorescence à ke,dem = 530/585 nm est directement proportionnelle à la concentration en glycogène dans l'échantillon (Zhou, M et al. Analytical Biochem 253:162-168, 1997). Les concentrations de glucose dans les échantillons sont déterminées par l'ajout d'un blanc de réactifs échantillon contenant de la glucose oxydase et du colorant sans enzymes d'hydrolyse. La teneur en glycogène est déterminée en soustrayant le glucose libre de la teneur totale en glucose (glycogène + glucose libre). Une courbe d'étalonnage est générée en utilisant une solution mère pour préparer des concentrations croissantes de glycogène, exprimée en microgrammes par millilitre (tg/ml). Trois échantillons de contrôle qualité (CQ élevé, CQ moyen et CQ faible) préparés à partir de la solution mère sont utilisés pour surveiller les performances du dosage lors de l'analyse d'échantillon. Les réactifs suivants peuvent être utilisés dans l'analyse du glycogène : 1) Trousse de dépistage de glycogène EnzyChromTM Glycogen Assay Kit, 30 BioAssay Systems, no. de réf. E2-GN-100. Congeler la trousse à -20 °C pendant un maximum de 6 mois. La trousse contient les réactifs suivants : a) Tampon de test, 12 ml b) Colorant, 120 tl c) Enzyme A (a-amylase, amyloglucosidase), séchée d) Enzyme B (oxydase de glucose), 120 1.11 e) Amidon étalon, so mg/ml, 50 ; 2) Eau, purifiée par le système de filtration Millipore Milli-Q (Merck Millipore, Billerica, Massachusetts, É.-U.) ou équivalent ; 3) Chlorure de sodium 5M (NaC1), Sigma-Aldrich, no. de réf. S5150, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, É.-U., ou équivalent ; 4) Comprimés de cocktail inhibiteur de protéase, COMPLE I ETm, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim (Allemagne), no. de réf. 11-697-498-001 ; 5) Paquets de solution saline dans un tampon phosphate (STP), Sigma-Aldrich Corp., no. de réf. P3813. Diluer 1 paquet de tampon STP dans 1 litre d'eau. Entreposer la solution STP à température ambiante pendant un maximum de 1 mois ; ou 6) Tampon d'extraction (« I », STP + NaC1 0,25 M + inhibiteurs de protéase). Ajouter 15 50 ml de NaC1 5M (réactif no. 3) à 950 ml de STP pour préparer du NaC1 0,25 M. Filtrer le réactif à l'aide d'une fiole filtrante de 0,2 um (unité de filtration sous vide, stérile, Nalgene, no. de réf. 567-0020 ou équivalent, Nalge Nunc International Corporation, Rochester, New-York, É.-U.). Pour cette solution, dissoudre 20 comprimés d'inhibiteur de protéase (réactif no. 4) dans 1000 ml. Entreposer à température ambiante pendant un maximum de 1 mois. 20 Préparation des échantillons sur brosse pour la mesure du glycogène Les étapes suivantes peuvent servir à préparer les échantillons pour mesurer le glycogène. 1. Retirer les tubes en polypropylène contenant les échantillons sur brosse du congélateur à -70 °C. 25 2. Ajouter le tampon d'extraction (TE, réactif no. 6) dans chaque tube en polypropylène : a) Aliquoter 1,5 ml de TE dans chaque tube. b) Replacer chaque bouchon à vis, bien serrer les bouchons. 3. Placer les flacons dans un sonicateur avec bain de glace (4 à 10 °C) pendant environ 30 minutes (nettoyeur à ultrasons, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, 30 Connecticut, É.-U. ou équivalent). 4. Passer les tubes au vortex pendant 10 secondes à l'aide d'un mélangeur vortex multitubes (mélangeur vortex multitubes, VWR, no. de réf. VX2500 ou équivalent). 5. Utiliser des pinces ayant été préalablement nettoyées avec des lingettes germicides (SaniClothe Plus, PDI, Inc., no. de réf. Q89072 ou équivalent), saisir et retirer les échantillons sur brosse de chaque tube tout en appuyant la brosse contre l'intérieur du tube pour retirer tout liquide résiduel. Essuyer les pinces avec des lingettes germicides jetables et laisser sécher avant de manipuler le prochain échantillon sur brosse. 6. Centrifuger l'extrait pendant 5 minutes à 3 000 tr/min (à température ambiante ; Allegra X-12R, Beckman-Coulter, Fullerton, Californie, É.-U. ou équivalent). 7. Transférer les extraits dans les plaques à puits profonds : a) Déboucher chaque tube d'extrait. b) Placer les tubes sur le portoir de tubes du dispositif de manipulation des liquides (dispositif de manipulation des liquides automatisé) dans l'ordre, selon le modèle de la plaque. c) À l'aide du dispositif de manipulation des liquides automatisé (JANUS, Perkin- Elmer, Packard MultiPROBE ou équivalent), transférer une partie aliquote du liquide surnageant (après l'étape de centrifugation, l'aliquote doit avoisiner le résultat requis pour la mesure adéquate du glycogène, par exemple 250 !IL d'aliquote) dans une plaque à 96 puits profonds de 2 ml vide (Axygen Scientific, no. de réf. P-DW-20-C ou équivalent, Corning Inc., Corning New York, É.-U.) pour la mesure du glycogène. En cas de résultats mis en attente, c'est-à-dire si la concentration en glycogène est trop élevée, il peut être nécessaire de diluer l'échantillon de liquide surnageant. d) Bien mettre en place la plaque de bouchons sur les plaques à puits profonds (agitateur de plaques microtitre, Lab-line Instruments, Inc., VWR, no. de réf. 57019-0600 ou équivalent). e) Passer les plaques à puits profonds au vortex pendant 10 secondes à l'aide de l'agitateur vortex multitubes. 0 Congeler les plaques à puits profonds et les tubes contenant les extraits à -70 °C ou moins pour des analyses futures. 8. Pour effectuer une deuxième extraction, placer les brosses extraites dans d'autres tubes en polypropylène et répéter les étapes 2 à 7. Dosage du glycogène 1) Équilibrer les réactifs de dosage et les extraits d'échantillons à l'étude à température ambiante (20 à 25 °C) sur une paillasse. **Pendant l'expérience, conserver les enzymes décongelées de la trousse de test EnzyChromTM sur de la glace ou au réfrigérateur (2 à 8 °C). 2) Reconstituer l'enzyme A. a. Ajouter 120 pl de tampon de test au flacon d'enzyme A séchée. b. Passer le flacon au vortex pour dissoudre complètement le contenu. 3) Préparer les étalons de travail. Diluer 50 mg/mi d'amidon étalon dans le tampon d'extraction (TE) comme suit pour élaborer des étalons de travail. Passer la solution au vortex après chaque dilution pour la mélanger. Stdl = glycogène 200 tg/ml = amidon étalon 10 pl (50 mg/mi) + TE 2,49 ml Std2 = glycogène 150 pg/m1= 300 pl de glycogène 200 pg/m1+ TE 100 Std3 = glycogène 100 tg/ml = 200 pl de glycogène 200 pg/m1+ TE 200 pl Std4 = glycogène 50 itg/m1= 200 p.1 de glycogène 100 pg/m1+ TE 200 gl Std5 = glycogène 25 .tg/ml = 200 pl de glycogène 50 pg/m1+ TE 200 pl Std6 = glycogène 12,5 tg/ml = 200 pl de glycogène 25 lig/m1+ TE 200 pl Std7 = glycogène 6,25 pg/m1= 200 !al de glycogène 12,5 pg/m1+ TE 200 pl Std8 = glycogène 3,125 lag/m1= 200 pl de glycogène 6,25 tg/ml + TE 200 pl Blanc =TE 4) Préparer des CQ de dosage du glycogène CQ élevé = glycogène 80 tg/ml = 80 pl de glycogène 200 pg/m1+ TE 120 pl CQ moyen = glycogène 40 pg/m1= 40 pl de glycogène 200 tg/ml + TE 160 pl CQ faible = glycogène 10 pg/m1= 50 pl de CO moyen + TE 150 pli 5) Passer au vortex la plaque à puits profonds d'extraits d'échantillon à l'aide de l'agitateur vortex multitubes (30 s, vitesse 7). 6) Ajouter. 10 pl d'étalon, un CQ de dosage ou des échantillons à l'étude en double exemplaire dans chaque puits de la plaque de dosage (plaque à fond plat en polystyrène transparent à 96 puits, Becton Dickinson, no. de réf. 3072 (Becton Dickinson and Company, 30 Franklin Lakes, New Jersey, É.-U.) ou équivalent) à l'aide d'une pipette monocanal de 10 pl selon le modèle de la plaque à 96 puis. 7) Préparer le réactif de travail (suffisamment pour 64 puits) en ajoutant 701.11 d'enzyme A + 701a1 d'enzyme B +70 pl de réactif colorant à un tampon de test de 6,3 ml. 8) Préparer le blanc de réactifs échantillon (suffisamment pour 32 puits)en ajoutant 40 fil d'enzyme B + 40 jtl de réactif colorant à un tampon de test de 3,6 ml. 9) Ajouter 90 pl de réactif de travail à chaque étalon, CQ de dosage et puits d'échantillon de la plaque de dosage à l'aide d'une pipette multicanaux électronique en mode multidistribution (2 x 90 0). 10) Ajouter 90 pl de blanc de réactifs échantillon dans chaque puits d'échantillon témoin (pas d'enzyme A), comme indiqué en rouge sur le modèle de la plaque de test à l'aide d'une pipette multicanaux électronique en mode multidistribution (2 x 90 1.11). 11) Mélanger le contenu de la plaque de dosage à l'aide de l'agitateur de plaques microtitre pendant 10 secondes à vitesse 5. 12) Recouvrir la plaque à l'aide d'un couvercle en plastique ; incuber sur la paillasse pendant 30 min à température ambiante (20 à 25 °C). 13) Mesurer la densité optique : Lire la plaque à une longueur d'onde de 570 nm avec un lecteur de microplaques informatisé (SpectraMax 340PC384, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, Californie, É. ou équivalent). Les données sont générées à l'aide d'un logiciel de lecture de plaques adapté (SOFTmaxe PRO Software pour lecteurs de microplaques, SOFTmaxe PRO pour Windows, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, Californie, É.-U. ou équivalent). Les réglages de lecteur de plaque suivants sont recommandés : Paramètres de l'instrument : Mode : Endpt Li Longueur d'onde : Li : 570 nm Mélange automatique : ON (MARCHE) Analyse des données Calculs statistiques : Les étalons et contrôles de qualité sont dosés dans deux puits chacun, ce qui entraîne des valeurs de densité optique (DO) en deux exemplaires. Les résultats de DO sont présentés sous forme de Moyenne des doublons de DO. L'algorithme de régression pour l'analyse des données est un ajustement quadratique de la concentration nominale des étalons et des valeurs moyennes de DO. CV en % (coefficient de variation) = (écart-type/DO moyenne) x 100 % Biais en % (concerne les étalons et les CQ uniquement) - ((concentration calculée - concentration nominale)/concentration nominale) x 100 % Dosage du glycogène : S'il y a une possibilité que les échantillons contiennent du glucose, des puits d'échantillons témoins distincts doivent être préparés sans aucun réactif d'enzyme A. Pour calculer la concentration en glycogène dans chaque échantillon, soustraire la concentration en glucose présente dans chaque puits d'échantillon de référence (sans enzyme A) de la concentration totale en glycogène + glucose présent dans le puits d'échantillon correspondant (enzyme A + enzyme B) : [Glycogène Mesure des protéines La mesure des protéine peut être effectuée à l'aide des réactifs suivants : 1) Réactif de dosage des protéines Pierce BCATM A, Thermo Scientific, no. de réf. 23223, 1000 ml contenant du carbonate de sodium, du bicarbonate de sodium, de l'acide bicinchoninique et du tartrate de sodium en hydroxyde de sodium 0,1 M. 2) Réactif de dosage des protéines Pierce BCATM B, Thermo Scientific, no. de réf. 23224, 25 ml contenant 4 % de sulfate cuivrique. 3) Étalon d'albumine, 2 mg/ml, Thermo Scientific, no. de réf. 23210, 50 ml, contenant de l'albumine de sérum bovin (ASB) à 2,0 mg/m1 dans 0,9 % de solution saline et 0,05 % d'azoture de sodium. 4) Eau, purifiée par le système de filtration Millipore Milli-Q ou équivalent. 5) Chlorure de sodium 5M (NaC1), Sigma, no. de réf. S5150 ou équivalent. 6) Comprimés de cocktail inhibiteur de protéase, COMPLETETm, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne, no. de réf. 11-697-498-001. 7) Paquet de solution saline dans un tampon phosphate (STP), Sigma, no. de réf. P3813. Diluer 1 paquet de tampon STP dans 1 litre d'eau. Entreposer la solution STP à température ambiante jusqu' à 1 mois. 8) Albumine de sérum bovin (ASB), 30 %, Sigma, no. de réf. A8577 ou équivalent. 9) Tampon d'extraction (« TE », STP + NaCl 0,25 M + inhibiteurs de protéase). Préparer une solution STP (réactif no. 5). Ajouter 50 ml de NaCl 5M (réactif no. 3) à 950 ml de STP ]échantillon = [Glycogène + Glucosel ]échantillon [Glucose,l échantillon pour préparer du NaC1 0,25 M. Filtrer à l'aide d'une fiole filtrante de 0,2 um. Pour cette solution, dissoudre 20 comprimés d'inhibiteur de protéase (réactif no. 4) dans 1000 ml. Entreposer à température ambiante pendant un maximum de 1 mois. PROCÉDURE Répéter les étapes 1 à 6 ci-dessus, de « Préparation des échantillons sur brosse pour la mesure du glycogène ». Après l'étape 6 de « Préparation des échantillons sur brosse pour la mesure du glycogène », transférer les extraits vers les plaques à puits profonds : 1. Déboucher chaque tube d'extrait. 2. Placer les tubes dans le portoir MultiPROBE dans l'ordre selon le modèle de la plaque. 3. À l'aide du dispositif de manipulation des liquides automatisé, transférer une partie aliquote du liquide surnageant (après l'étape de centrifugation, l'aliquote doit avoisiner le résultat requis pour la mesure adéquate de protéines, par exemple 250 ut, d'aliquote) dans une plaque à 96 puits profonds de 2 ml vide. En cas de résultats mis en attente, c'est-à-dire si la concentration en protéines est trop élevée, il peut être nécessaire de diluer l'échantillon de liquide surnageant. 4. Bien mettre en place la plaque de bouchons sur les plaques à puits profonds. 5. Passer les plaques à puits profonds au vortex pendant 10 secondes à l'aide de l'agitateur vortex multitubes. 6. Congeler les plaques à -70 °C ou moins pour des analyses futures. DOSAGE 1) Préparer les étalons d'albumine au sérum bovin (ASB) a) Préparer une solution d'ASB mère de 1 mg/mi en ajoutant 12 ml d'étalon d'albumine 2 mg/mi (réactif no. 3) à 12 ml de tampon d'extraction (TE, réactif no. 9). b) Préparer une solution d'ASB mère intermédiaire de 400 tg/m1 comme suit : Solution mère intermédiaire, 400 ug/m1= 16 ml d'ASB 1 mg/m1+ 24 ml TE. Aliquoter des volumes de 1 ml dans des tubes préalablement étiquetés et congeler à -80 °C jusqu'au jour de l'analyse. c) Pour préparer des étalons d'ASB, effectuer des doubles dilutions successives de la solution mère intermédiaire (400 pg/m1). Passer soigneusement au vortex après chaque dilution. Le volume restant de 500 pl, de chaque étalon est suffisant pour remplir 4 plaques de puits en double exemplaire. Stdl, 200 pg/m1= 500 pL 400 pg/m1+ 500 !IL TE Std2, 100 itg/m1= 500 pl, 200 14m1+ 500 pL TE Std3, 50 pg/m1= 500 100 pg/m1 + 500 id, TE Std4, 25 !tg/mi = 500 pl, 50 ktg/m1+ 500 pl, TE Std5, 12,51itg/m1= 5001..iL 25 tg/m1+ 500 pl, TE Std6, 6,25 eg/m1= 500 pl, 12,5 tg/m1+ 500 'IL TE Std7, 3,125 ia.g/m1= 500 tL 6,25 iig/m1+ 500 pL TE Std8, 1,56 gg/m1= 500 pt 3,125 pg/m1+ 500 p.L TE Blanc = 500 lit TE *Remarque : l'étalon 8 sert de point d'ancrage à la courbe d'étalonnage et ne sera pas considéré comme un étalon. La limite inférieure de quantification du procédé est 3,125 ltg/ml. 2) Préparer les CQ du dosage à l'albumine de sérum bovin (ASB) a) Préparer des solutions de CQ élevé, moyen et faible comme suit : CQ élevé, 75 itg/m1= 3 ml ASB 1 mg/m1 + 37 ml TE QC moyen, 40 p,g/m1= 1,6 ml ASB 1 mg/mL + 38,4 ml TE CQ faible, 20 gg/m1= 800 pl, ASB 1 mg/m1 + 39,2 ml TE b) Aliquoter 300 pL, de chaque CQ dans des tubes préalablement étiquetés et congeler à -80 °C jusqu'au jour de l'analyse. 3) Préparer le réactif de travail BCATM. a) Combiner 240 pl de réactif BCATM B avec 12 ml de réactif BCATM A par plaque de 96 puits (plaque à fond plat en polystyrène transparent à 96 puits ; Becton Dickinson, no. de réf. 3072 ou équivalent). b) Passer soigneusement au vortex. 4) Ajouter 50 pl aux étalons et CQ en double des puits dans la plaque de dosage en utilisant la pipette monocanal électronique en mode multidistribution selon les indications de la plaque. Passer chaque tube au vortex avant de procéder à l'ajout. ) Passer la plaque à puits profonds au vortex pendant 30 secondes à l'aide de l'agitateur vortex multitubes. 6) Ajouter 50 lit à chaque échantillon inconnu unique des puits depuis la plaque à puits profonds dans chaque plaque de dosage à l'aide d'une pipette électronique à 8 canaux en mode inversé selon les indications de la plaque. 7) Ajouter 100 pi, au réactif de travail BCATM @réparé à l'étape no. 3) dans son puits à l'aide d'une pipele électronique à 8 canaux en mode multidistribution. Recouvrir d'un couvercle en plastique. 8) Incuber la plaque à 39 °C pendant 45 minutes sur un bloc de chauffage à sec. (Remarqué : la température réelle des solutions dans la plaque de dosage est d'environ 37 °C). 9) Mesurer la densité optique : Lire la plaque à une longueur d'onde de 562 nm avec un lecteur de microplaques informatisé. Les données sont générées à l'aide du logiciel de lecteur de plaques adapté. Les réglages de lecteur de plaque suivants sont recommandés : Paramètres de l'instrument : Mode : Endpt Li Longueur d'onde : Li : 562 nm Mélange automatique : ON (MARCHE) ANALYSE DES DONNÉES: Calculs statistiques : Les étalons et contrôles sont dosés dans deux puits chacun, ce qui entraîne des valeurs de densité optique (DO) en deux exemplaires. Les résultats de DO sont présentés sous forme de Moyenne des doublons de DO. L'algorithme de régression pour l'analyse des données est un ajustement quadratique de la concentration nominale des étalons et des valeurs moyennes de DO. CV en % (coefficient de variation) = (écart-type/DO moyenne) x 100 % Biais en °A (concerne les étalons et les CQ uniquement) = ((concentration calculée - concentration nominale)/concentration nominale) x 100 % CRITÈRES D'ACCEPTATION: 1) Puits doubles (CV en %) Le CV en % entre les deux valeurs de DO doit respecter les critères suivants : a) Le CV en % doit être 0,001 pour chaque puits d'étalons 1 à 7. Si les valeurs DO de n'importe quel puits 30 d'étalons sont inférieures à 0,001, les échantillons doivent être analysés de nouveau ultérieurement. Mesure de l'histamine Ce test repose sur (1) US 8420054 (qui correspond à une mesure de l'épithélium stratifié et non de la muqueuse épithéliale) et sur (2) Kerr, K., Schwartz, J.R., Filloon, T., Fieno, A., Wehmeyer, K., Szepietowski, J.C., et Mills, K.J.; Scalp Stratum Corneum Histamine Levels : Novel Sampling Method Reveals Association with Itch Resolution in Dandruff/Seborrhoeic Dermatitis Treatment, Acta Derm Venereol 91:404-408, 2011). Procédure Après l'étape 6 de « Préparation des échantillons sur brosse pour la mesure du glycogène », transférer les extraits dans des plaques à puits profonds. 1. Déboucher chaque tube d'extrait. 2. Placer les tubes dans le portoir MultiPROBE dans l'ordre selon le modèle de la plaque. 3. À l'aide du dispositif de manipulation des liquides automatisé, transférer une partie aliquote du liquide surnageant (après l'étape de centrifugation, l'aliquote doit avoisiner le résultat requis pour la mesure adéquate de l'histamine, par exemple 100 kit d'aliquote) dans une plaque à 96 puits profonds vide (plaque Axygen). En cas de résultats mis en attente, c'est-à-dire si la concentration en histamine est trop élevée, il peut être nécessaire de diluer l'échantillon de liquide surnageant. 4. Les échantillons peuvent être complétés par des réactifs classiques, comme l'albumine, afin d'éviter des pertes d'analyte aux parois du matériel de laboratoire. 5. Bien mettre en place la plaque de bouchons sur les plaques à puits profonds. 6. Passer les plaques à puits profonds au vortex pendant 10 secondes à l'aide de l'agitateur vortex multitubes. 7. Congeler les plaques à -80 °C pour des analyses futures. Dosage 1. Les étalons et contrôles de l'histamine peuvent être préparés selon les procédés conventionnels. L'histamine sera dosée à l'aide d'un kit de test immuno-enzymatique de l'histamine (EIA) (kit d'EIA de l'histamine, distributeur aux États-Unis, Cayman Chem Co., no. 589651/Fabriquant de kit d'EIA d'histamine (France), SPbio, no. de réf. A05890). 2. Un tampon de lavage, un réactif de dérivé, un traceur d'histamine ACHe et un réactif d'Ellman peuvent être préparés selon les procédés conventionnels. 3. Les étalons, les contrôles et les échantillons sont dérivés dans une plaque à puits profonds. 4. Les plaques sont lavées à l'aide d'un tampon, et les étalons, les témoins, les échantillons et les contrôles qualité sont ajoutés à la plaque et incubés pendant 24 heures à 4 °C. 5. Les plaques sont ensuite lavées avant l'ajout du réactif d'Elman et l'incubation dans le noir à température ambiante. 6. Les plaques peuvent être lues par spectrophotométrie standard. L'analyse des données est réalisée selon les calculs et méthodes statistiques standards. Avec une autre application, les extraits obtenus des brosses sont placés dans une plaque à 96 puits. On ajoute à chaque puits un étalon interne stable d'histamine (D.sub.4-histamine) marqué par isotope (ISTD) et dilué à l'aide d'eau acidifiée. Un ensemble d'étalons d'histamine est préparé dans la plaque à 96 puits en polypropylène sur une gamme d'étalonnage approprié dans l'eau acidifiée ; on y ajoute l'étalon interne. Les étalons et les extraits sur brosses sont analysés à l'aide d'une chromatographie liquide haute performance en phase inverse en mode gradient couplée avec une spectrométrie de masse en tandem (HPLC/MS/MS). L'histamine et l'ISTD sont surveillés par électronébulisation à ions positifs (ESI). Une courbe d'étalonnage est construite en traçant le signal de chacun des étalons, défini ici comme étant le rapport de zone de pic (zone de pic d'histamine/zone de pic d'ISTD) en fonction de la masse de l'histamine pour l'étalon correspondant. La masse de l'histamine dans les étalons et les échantillons d'extraits de brosses est ensuite rétrocalculée à l'aide de l'équation de régression générée. Le résultat peut soit être déclaré comme la masse de l'histamine, soit être normalisé en divisant par la quantité de protéines également trouvée dans l'extrait sur brosse. Mesure des cytokines Alors que la procédure décrite ici détaille un dosage d' interleukine la (IL-1a) et d'antagoniste de récepteur de l'interleukine 1 (IL-lra), des dosages similaires pour d'autres interleukines, notamment l'11-6, l'11-8, l'IL-10 (sans exhaustivité) peuvent être réalisés de manière similaire. Réactifs 1. Bio-Plex Pr0TM Human Cytokine IL-la Assay, Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, California, É.-U., no. de réf. YF0001DVXM. Le kit contient les composants suivants, tous conservés de 2 à 8 °C : a) Cytokine humaine standard 23 Plex, groupe II (no. de réf. 171-D60001), lyophilisée. b) Billes magnétiques couplées IL-la (10x, no. de réf. 171-B6001M), 600 'IL. c) Anticorps de détection IL-la (10x), 320 Ill. d) Streptavidine-phycoérythrine, 100x ; PHOTOSENSIBLE entreposer à l'abri de la lumière. e) Tampon, 50 ml. f) Tampon de lavage, 130 ml (no. de réf. 171-304500, 1,5 L). g) Diluant d'anticorps de détection, 5 ml. 2. Cytokine humaine standard 27 Plex, groupe I (no. de réf. 171-D50001), lyophilisée. 3. Ensemble Bio Plex Pr0TM Human Cytokine IL-ira, Bio-Rad Laboratories, Inc., no. 171B5002M. Entreposer de 2 à 8 °C : b) Billes magnétiques couplées IL-ira (10x, no. de réf. 171-B5002M), 600 1.11. c) Anticorps de détection IL-ira (10x), 320 pl 4. Eau, purifiée par le système de filtration Waters Millipore Milli-Q ou équivalent 5. Chlorure de sodium 5M (NaC1), Sigma, no. de réf. S5150 ou équivalent. 6. Comprimés de cocktail inhibiteur de protéase, COMPLETETm, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne, no. de réf. 11-697-498-001. 7. Paquet de solution saline dans un tampon phosphate (STP), Sigma, no. de réf. P3813. Diluer 1 paquet de tampon STP dans 1 litre d'eau. Entreposer la solution STP à température ambiante jusqu' à 1 mois. 8. Albumine de sérum bovin (ASB), 30 %, Sigma, no. de réf. A8577 ou équivalent. 9. Tampon d'extraction (« 1E », STP + NaC10,25 M + inhibiteurs de protéase). Préparer une solution STP (réactif no. 7). Ajouter 50 ml de NaC15M (réactif no. 6) à 950 ml de STP pour préparer du NaC1 0,25 M. Filtrer à l'aide d'une fiole filtrante de 0,2 inn. Pour cette solution, dissoudre 20 comprimés d'inhibiteur de protéase (réactif no. 6) dans 1000 ml. Entreposer à température ambiante pendant un maximum de 1 mois. 10. Tampon d'échantillon de cytokine (« TEC » ; STP + NaC1 0,25 M + inhibiteurs de protéases + ASB 2 %). Ajouter 2 ml d'ASB 30 % (réactif no. 8) à 28 ml de tampon d'extraction de cytokine (réactif no. 9). Conserver à 2 à 8 °C jusqu'à une semaine. 11. Liquide de gainage Bio-Rad, 20 L, no. de réf. 171-000055 ou équivalent. 12. Kit d'étalonnage Bio-Rad, no. de réf. 171-203060. Appareil et matériaux : 1. Dispositif de manipulation des liquides autenatisé, Packard MultiPROBE, Perkin-Elmer ; Waltham, Massachusetts, É.-U. ou équivalent. 2. Bio-Plex Suspension Amy System, Bio-Rad Laboratories, Inc. ou équivalent. 3. Logiciel Bio-Plex Manager pour station de travail Bio-Plex, BioRad Laboratories, Inc., ou équivalent. 4. Station de lavage Bio Plex Pro II (pour les tests à partir de billes magnétiques et en polystyrène), no. de réf. 300-34377, Bio-Rad Laboratories, Inc. ou équivalent. 5. Nettoyeur à ultrasons, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, Connecticut, É.-U. ou équivalent. 6. Centrifugeuse, Allegra X-12R, Beckman-Coulter, Fullerton, Californie, É.-U. ou équivalent. 7. Agitateur vortex, Vortex Genie-2, VWR Scientific Products Inc., no. de réf. 58815-178 ou équivalent. 8. Agitateur de plaques microtitre, Lab-line Instruments, Inc. (VWR, no. de réf. 57019- 0600) ou équivalent. 9. Microplaques à fond plat noir à 96 puits, no. de réf 171-025001, BioRad Laboratories, Inc. 10. Microplaques à 96 puits à fond V, no. de réf. 651261, Greiner Bio-One International AG, Kremsmünster, Autriche ou équivalent. 11. Film d'étanchéité en aluminium, no. de réf. PCR-AS-200, Axygen Scientific ou équivalent. 12. Film adhésif d'étanchéité des microplaques, VWR, no. de réf 60941-062 ou équivalent. 13. Réservoirs à réactifs jetables, Vista Lab, 50m!, VWR, no. de réf 802026-350 ou équivalent. 14. Pipettes électroniques de distribution monocanal ou multicanaux, pipettes manuelles avec embouts de pipette jetables correspondants ou équivalent. 15. Tubes de microcentrifugeuse en polypropylène, 2,0 ml, Bio-Plas, Inc., San Rafael, Californie, no. de réf. 4204 ou équivalent. 16. Tubes de microcentrifugeuse, 1,7 ml, Sorenson BioScience, no. de réf. 11700 ou équivalent. 17. Tubes de centrifugeuse coniques en polypropylène (15 ml, no. de réf. 352097 et 50 ml, no. de réf. 352098), Becton Dickinson ou équivalent. 18. Plaques à 96 puits profonds de 2 ml, Nunc, VWR, no. de réf. 73520-474 ou équivalent. 19. Plaque d'étanchéité pour plaques de prélèvement à 96 puits profonds ronds (2,0 ml), no. de réf. AM-2ML-RD, Axygen Scientific ou équivalent. 20. Unités de filtration sous vide, membrane PES, diamètre de pore 0,2 gm, stérile, NALGENE, no. de réf. 567-0020 ou équivalent. Procédure : Après l'étape 6 de « Préparation des échantillons sur brosse pour la mesure du glycogène », transférer les extraits dans des plaques à puits profonds : 1. Déboucher chaque tube d'extrait. 2. Placer les tubes dans le portoir MultiPROBE dans l'ordre selon le modèle de la plaque. 3. Ajouter 40 jtl par puits d'ASB 30 % (réactif no. 8) d'une plaque à 96 puits profonds. 4. À l'aide du dispositif de manipulation des liquides automatisé, transférer une partie aliquote du liquide surnageant (après l'étape de centrifugation, l'aliquote doit avoisiner le résultat requis pour la mesure adéquate de la cytokine, par exemple 250 !IL d'aliquote) dans une plaque à 96 puits profonds vide (plaque Axygen). En cas de résultats mis en attente, c'est-à-dire si la concentration en protéines est trop élevée, il peut être nécessaire de diluer l'échantillon de liquide surnageant. 5. Bien mettre en place la plaque de bouchons sur les plaques à puits profonds. 6. Passer les plaques à puits profonds au vortex pendant 10 secondes à l'aide de l'agitateur vortex multitubes. 7. Congeler les plaques à -80 °C pour des analyses futures. Dosage 1) Équilibrer les réactifs de dosage, la matrice CQ et les échantillons à l'étude à température ambiante (20 à 25 °C) sur la paillasse. 2) Préparer le tampon d'échantillon de cytokine (TEC, réactif no. 10) en ajoutant 2 ml d'ASB 30 % (réactif no. 8) à 28 ml de tampon d'extraction de cytokine (réactif no. 9). 3) Élaborer des étalons de cytokine humaine. a) Reconstituer chaque flacon d'étalons de cytokine humaine : Groupe I (réactif no. 2) et groupe II (réactif no. la) avec 250 jil de LEC. Mélanger doucement au vortex chaque flacon pendant 3 secondes. Laisser les flacons incuber pendant 30 minutes sur la glace. b) Afin d'élaborer des étalons de travail, effectuer des dilutions successives du cocktail étalon des groupes I/II. Passer soigneusement au vortex après chaque dilution. Pour les concentrations des étalons de travail no. 1 (STD 1), se référer aux cartes de valeur standard pour chaque lot STD 1 = 190 !al du cocktail étalon du groupe I + 190 tl du cocktail étalon du groupe II + 215 pide 1EC STD 2 = 150 p.1 de Std 1 + 450 de TEC STD 3 = 150 de Std 2 + 4500 de TEC STD 4 = 150 pl de Std 3 + 450 pl de TEC STD 5 = 150 pl de Std 4 + 450 1.11 de TEC STD 6 = 150 Ill de Std 5 + 450 1.1,1 de TEC STD 7 = 150 pl de Std 6 + 450 !al de TEC STD 8 = 150 Fil de Std 7 + 450 pl de TEC STD 9 = 150 1.11 de Std 8 + 450 Ill de TEC Blanc = TEC *Std 1 est exclu (masqué) de la courbe d'étalonnage IL-lalpha et ne sera pas considéré comme un étalon pour IL-lalpha. Std 2 est la LSDQ (limite supérieure de quantification) de la méthode pour IL-lalpha. **Std 9 est exclu (masqué) de la courbe d'étalonnage IL-lalpha et ne sera pas considéré comme un étalonneur pour IL-ira. Std 8 est la LSDQ (limite supérieure de quantification) de la méthode pour IL-ira. Concentrations d'étalonneur de cytokines humaines (pg/ml) - exemple : Lot no. 5023535, 5015357 Étalon Facteur de dilution IL-1 alpha IL-ira Std 1 1 25358* 30137 Std 2 4 6339,5 7534 Std 3 16 1585 1883,56 Std 4 64 396,2 470,89 Std 5 256 99,05 117,7 Std 6 1024 24,76 29,43 Std 7 4096 6,19 7,36 Std 8 16384 1,55 1,84 Std 9 65536 0,3875 0,46** 4) Préparer des CQ de dosage de la cytokine humaine. a) Pour préparer le test de CQ-1 (AQC-1), ajouter 100 gl de Std 1 à 900 gl de TEC; mélanger au vortex. b) Préparer une dilution au centième de Std 1 en ajoutant 100 gl d'AQC-1 à 900 gl de TEC; mélanger au vortex. c) Pour préparer le CQ-2 de dosage, ajouter 100 gl de la solution préparée à l'étape 4b à 400 gl de TEC, mélanger au vortex. 5) Préparer une double dilution de matrice CQ en ajoutant 200 il de solution CQ élevé et 200 gl de solution CQ faible fraîchement décongelées à 200 gl de TEC ; mélanger au vortex. 6) Préparer des billes d'anticorps immobilisées lx, mettre à l'abri de la lumière. a) Mélanger au vortex les flacons de billes à vitesse moyenne pendant 30 secondes. À l'aide d'une pipette, retirer tout liquide bloqué dans le bouchon. b) Diluer les billes 10x : 575 gl de billes IL-la, (réactif no. lb) + 575 pl de billes IL-ira (réactif no. 3a) + 4,6 ml du tampon de test (réactif no. le) ; mélanger au vortex. c) Stabiliser pendant 20 minutes à température ambiante avant utilisation. 7) Préparer des extraits d'échantillons dilués a) Mélanger la plaque de puits profonds contenant les extraits d'échantillon sur l'agitateur vortex multitubes pendant 30 secondes. b) Centrifuger la plaque de puits profonds à 3000 tr/min pour enlever les débris. c) Préparer une double dilution de l'échantillon en ajoutant 50 0 d'extraits d'échantillon à 50 p.1 de TEC dans la plaque à fond V Addition selon le modèle de plaque à 96 puits à l'aide de la pipette à 8 canaux (en mode inversé). 8) Charger la plaque Addition a) Verser 100 0 d'étalons, les CQ de dosage et la matrice CQ diluée dans chaque puits de la plaque à fond V Addition selon modèle de plaque à l'aide de la pipette monocanal (mode multidistribution, 2 x 100 0). b) Fermer à l'aide d'un film pour plaques en plastique. 9) Amorcer la station de lavage Bio-Plex Pro II. a) Remplir la bouteille de liquide no. 2 d'eau distillée ; amorcer le canal 2. b) Fixer le flacon de liquide no. 1 contenant suffisamment de tampon de lavage Bio-Plex pour laver la station ; amorcer le canal 1. 10) Ajouter les billes d'anticorps immobilisées 1 x dans la plaque de test noire à fond plat. a) Mélanger au vortex les billes diluées pendant 30 secondes à vitesse moyenne. b) Verser les billes diluées dans le réservoir de réactifs et ajouter 50 0 à chaque puits de la plaque noire à fond plat à l'aide de la pipette à 8 canaux (mode multidistribution). 11) Laver deux fois la plaque de dosage à l'aide de la station de lavage Bio-Plex Pro II. a) Laissez la plaque reposer sur des aimants pendant 15 secondes. b) Laver les puits deux fois avec le programme MAG X2. c) RINSE DAY (rinçage jour) avec le tampon de lavage - Canal 1. 12) Charger la plaque de dosage noire à fond plat. a) Mélanger doucement la plaque Addition sur l'agitateur de plaques (300 tr/min) pendant 3 secondes. b) Ajouter 50 0 d'étalons, de CQ de dosage, de matrice CQ diluée et d'extraits d'échantillon dilués dans chaque puits de la plaque de dosage noire à fond plat selon le modèle de plaque à l'aide de la pipette à 8 canaux (en mode inversé). 13) Fermer la plaque de dosage à l'aide du film d'étanchéité en aluminium pour plaques et incuber sur l'agitateur de plaques pendant 40 minutes à température ambiante (20 à 25 °C). a) Fermer la plaque à l'aide du film d'étanchéité adhésif en aluminium afin de la garder à l'abri de la lumière. b) Augmenter progressivement la vitesse de l'agitateur de plaques jusqu'à atteindre 1100 tr/min (vitesse 10) ; agiter pendant 30 secondes. c) Réduire progressivement la vitesse de l'agitateur de plaques jusqu'à atteindre 300 tr/min (vitesse 3). 10 d) Incuber sur l'agitateur de plaques pendant 40 minutes à température ambiante (20 à 25 °C). 14) Préparer les anticorps de détection 1 x (DAb) Doivent être préparés de 10 à 15 minutes avant utilisation. a) Mélanger au vortex les DAb 10x pendant 20 secondes à vitesse moyenne, puis 15 effectuer un essorage rapide pendant 30 secondes. b) Ajouter 300 ul de DAb 10x IL-la (réactif no. 1c) + 300 ul de DAb 10x IL-ira (réactif no. 3b) + 2,4 ml de diluant d'anticorps de détection (réactif no. 1g). 15) Laver trois fois la plaque de dosage à l'aide de la station de lavage Bio-Plex Pro II. a) Laissez la plaque reposer sur des aimants pendant 15 secondes. 20 b) Laver les puits deux fois avec le programme MAG X3. c) RINSE DAY (rinçage jour) avec le tampon de lavage - Canal 1. 16) Ajouter les anticorps de détection lx dans la plaque de dosage noire à fond plat. a) Mélanger doucement au vortex les anticorps de détection 1x pendant 3 secondes. b) Verser dans le réservoir de réactifs et ajouter 251.11 d'anticorps de détection lx dans 25 chaque puits à l'aide de la pipette à 8 canaux (mode multidistribution). 17) Fermer la plaque de dosage à l'aide du film d'étanchéité en aluminium pour plaques et incuber sur l'agitateur de plaques pendant 30 minutes à température ambiante (20 à 25 °C). a) Fermer la plaque à l'aide du film d'étanchéité adhésif en aluminium afin de la garder 30 à l'abri de la lumière. b) Augmenter progressivement la vitesse de l'agitateur de plaques jusqu'à atteindre 1100 tr/min (vitesse 10) ; agiter pendant 30 secondes. c) Réduire progressivement la vitesse de l'agitateur de plaques jusqu'à atteindre 300 tr/min (vitesse 3). d) Incuber sur l'agitateur de plaques pendant 30 minutes à température ambiante (20 à 25 °C). 18) Préparer la streptavidine-PE lx. Doit être préparée 10 minutes avant utilisation ; mettre à l'abri de la lumière. a) Mélanger au vortex la streptavidine-PE 100x (réactif no. 1d) pendant 20 secondes à vitesse moyenne, puis effectuer un essorage rapide pendant 30 secondes. b) Ajouter 60111 de streptavidine-PE 100x à 5,94 ml de tampon d'essai. Passer soigneusement au vortex. 19) Laver trois fois la plaque de dosage à l'aide de la station de lavage Bio-Plex Pro II. a) Laissez la plaque reposer sur des aimants pendant 15 secondes. 15 b) Laver les puits deux fois avec le programme MAG X3. c) RINSE DAY (rinçage jour) avec le tampon de lavage - Canal 1. 20) Ajouter la streptavidine-PE lx dans la plaque de dosage noire à fond plat. a) Mélanger la streptavidine-PE lx pendant 5 secondes à vitesse moyenne. b) Verser dans le réservoir de réactifs et ajouter 50 pl de streptavidine-PE lx dans chaque 20 puits à l'aide de la pipette à 8 canaux (mode multidistribution). 21) Fermer la plaque de dosage à l'aide du film d'étanchéité en aluminium pour plaques et incuber sur l'agitateur de plaques pendant 10 minutes à température ambiante (20 à 25 °C). a) Fermer la plaque à l'aide du film d'étanchéité adhésif en aluminium afin de la garder 25 à l'abri de la lumière. b) Augmenter progressivement la vitesse de l'agitateur de plaques jusqu'à atteindre 1100 tr/min (vitesse 10) ; agiter pendant 30 secondes. c) Réduire progressivement la vitesse de l'agitateur de plaques jusqu'à atteindre 300 tr/min (vitesse 3). 30 d) Incuber sur l'agitateur de plaques pendant 10 minutes à température ambiante (20 à 25 °C). 22) Laver trois fois la plaque de dosage à l'aide de la station de lavage Bio-Plex Pro II. a) Laissez la plaque reposer sur des aimants pendant 15 secondes. b) Laver les puits deux fois avec le programme MAG X3. c) RINSE NIGHT (Rinçage nuit) avec le tampon de lavage - Canal 2. 23) Remettre les billes en suspension dans le tampon. a) Ajouter 120 microL de tampon dans chaque puits à l'aide de la pipette à 8 canaux. b) Fermer la plaque à l'aide du film d'étanchéité adhésif en aluminium afin de la garder à l'abri de la lumière. c) Augmenter progressivement la vitesse de l'agitateur de plaques jusqu'à atteindre 1100 tr/min (vitesse 10) ; agiter pendant 30 secondes. 24) Analyser la plaque sur le lecteur Bio-Plex Suspension Array Reader. Lecture de 50 billes par région, volume de l'échantillon : 50 tl. Portes DD : 5000 à 25 000 25) En cas d'analyse d'une seconde plaque de dosage, répéter les étapes 3 à 25. 15 Modèle de plaque à 96 puits 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Std09 Std05 Std01 UNK1 UNK9 UNK17 UNK25 UNK33 UNK41 UNK49 UNK57 TEC B Std09 Std05 Std01 UNK2 UNK10 UNK18 UNK26 UNK34 UNK42 UNK50 UNK58 TEC C Std08 Std04 AQC1-1 UNK3 UNK11 UNK19 UNK27 UNK35 UNK43 UNK51 UNK59 HQC-2 D Std08 Std04 AQC1-2 UNK4 UNK12 UNK20 UNK28 UNK36 UNK44 UNK52 UNK60 LQC-2 E Std07 Std03 AQC2-1 UNK5 UNK13 UNK21 UNK29 UNK37 UNK45 UNK53 UNK61 AQC1-3 F Std07 Std03 AQC2-2 UNK6 UNK14 UNK22 UNK30 UNK38 UNK46 UNK54 UNK62 AQC1-4 G Std06 Std02 HQC-1 UNK7 UNK15 UNK23 UNK31 UNK39 UNK47 UNK55 UNK63 AQC2-3 H Std06 Std02 LQC-1 UNK8 UNK16 UNK24 UNK32 UNK40 UNK48 UNK56 UNK64 AQC2-4 Analyse des données : Calculs statistiques : Les étalons sont dosés dans deux puits chacun, entraînant des valeurs d'intensité de fluorescence (IF) doubles. La moyenne des doublons de valeurs IF des étalons pour 20 chaque cytokine est tracée et analysée à l'aide d'une méthode d'ajustement de courbe de régression non linéaire comprenant 5 paramètres logistiques d'ajustement (5-PL). La concentration de chaque cytokine est interpolée à partir de la courbe d'étalonnage. CV en °A (coefficient de variation) = (écart-type/IF moyenne) X 100 % Biais en % (concerne les étalons et les CQ de dosage uniquement) = ((concentration calculée - concentration nominale)/concentration nominale) x 100 % % de récupération (concerne les étalons et les CQ de dosage uniquement) = (concentration calculée/concentration nominale) x 100 % Concentration calculée = concentration observée ; interpolée à partir de la courbe d'étalonnage Concentration nominale = concentration attendue Critères d'acceptation : 1) Puits doubles (CV en %) Le CV en % entre les doublons des valeurs IF doit répondre aux critères suivants : a) Le CV en % doit être L'analyse de thèmes biologiques dans l'identification les processus biologiques régulés peut être effectuée à l'aide de termes et de méthodes issus de Gene Ontology et semblables aux DAVID Bioinformatics Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov), et peut être également trouvée dans les références suivantes, (1) Huang da, W., B.T. Sherman, and R.A. Lempicki, Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc, 2009. 4(1): p. 44-57, and (2) Huang da, W., B.T. Sherman, and R.A. Lempicki, Bioinformatics enrichment tools : paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res, 2009. 37(1): p. 1-13. L'ARN purifié obtenu à partir de la biopsie extraite a été converti en copies d'ARNe marquées à la biotine à l'aide du kit HT 3' IVT Express d'Affymetrix (no. de réf. 901253, Santa Clara, Californie, É.-U.) ainsi que du protocole fourni par Affymetrix réalisé sur une station de travail de laboratoire automatisé Beckman Biomeke FXP (Beckman, no. de réf. A31842, Beckman Coulter, Brea, Californie, É.-U.). L'ARNe biotinylé a été fragmenté par hydrolyse alcaline limitée, puis hybridé pendant la nuit sur les plaques de dosage GeneTitane HG-U219 d'Affymetrix à l'aide du protocole et de l'instrument GeneTitant d'Affymetrix fournis par Affymetrix. Après le traitement, les images des puces ont été converties en données numériques à l'aide de l'algorithme PLIER au moyen de l'Expression Console GeneChip d'Affymetrix. Plus précisément, les demandeurs ont constaté que parmi les quasi 49 000 ensembles de sondes génétiques correspondant à environ 22 000 gènes, environ 2500 ensembles de sondes, soit environ 5 %, pourraient être significatifs uniquement par hasard à p Les demandeurs ont constaté que les procédés ci-dessus peuvent servir à l'évaluation de l'ampleur de l'atrophie vaginale avant et après un protocole de traitement. Dans un mode de réalisation, l'éventail de procédés peut être utilisé dans l'évaluation d'un traitement. Le traitement peut réduire le pH lié à une atrophie de 0,1 à 2,0 unités de pH ou de 0,3 à 1,5 unité de pH. Dans un mode de réalisation, l'éventail de procédés peut être utilisé dans l'évaluation d'un traitement. Le traitement peut entraîner des unité s de pH de 3,5 à 5,8 au niveau de l'orifice vaginal. Dans un mode de réalisation, l'éventail de procédés peut servir à l'évaluation d'un traitement par analyse des cellules épithéliales de l'orifice vaginal et par évaluation de l'abondance des crêtes épidermiques dans l'anneau hyménal. Un traitement peut provoquer une augmentation 20 de 10 à 100 % de l'abondance des crêtes épidermiques. Dans un mode de réalisation, la méthode d'analyse des cellules épithéliales de l'orifice vaginal peut également inclure la mesure de l'épaisseur du tissu épithélial de l'hymen avant et après un traitement. Un traitement peut provoquer une augmentation de 10 à 300 % de l'épaisseur liée à une atrophie. 25 Dans un mode de réalisation, la méthode de l'analyse du glycogène au niveau de l'orifice vaginal peut également inclure la mesure de la quantité de glycogène avant et après traitement. Un traitement peut provoquer une augmentation de 10 à 300 % de la quantité de glycogène. Dans un mode de réalisation, la méthode d'analyse des composants de la synthèse des 30 protéines tels que la N-formylméthionine ou la méthionine au niveau de l'orifice vaginal peut également inclure la mesure de la quantité de N-formylméthionine ou de méthionine, avant et après traitement. Un traitement peut provoquer une augmentation de 10 à 100 % des composants de la synthèse des protéines, tels que la N-formylméthionine ou la méthionine. Dans un mode de réalisation, la méthode d'analyse des composants du métabolisme du glycogène tels que le maltohexaose, le maltopentaose, le maltotriose ou le maltose au niveau de l'orifice vaginal peut également inclure la mesure de la quantité de maltohexaose, de maltopentaose, de maltotriose ou de maltose avant et après traitement. Un traitement peut provoquer l'augmentation de 10 à 100 % des composants du métabolisme du glycogène, tels que le maltohexaose, le maltopentaose, le maltotriose ou le maltose. Dans un mode de réalisation, la méthode d'analyse des composants de production d'alcool tels que le mannitol, le sorbitol ou l'arabitol au niveau de l'orifice vaginal peut également inclure la mesure de la quantité de mannitol, de sorbitol ou d'arabitol avant et après traitement. Un traitement peut provoquer une diminution de 10 à 400 % des composants de la production d'alcool tels que le mannitol, le sorbitol ou l'arabitol. Dans un mode de réalisation, la méthode d'analyse des composants de l'inflammation, tels que le 12-HETE, l'arachidonate ou le linoléate au niveau de l'orifice vaginal peut également inclure la mesure de la quantité de 12-HETE, de l'arachidonate ou du linoléate avant et après traitement. Un traitement peut provoquer la diminution de 10 à 400 % des composants de l'inflammation tels que 12-HETE, l'arachidonate ou le linoléate. Dans un mode de réalisation, la méthode de l'analyse de l'activité des sondes génétiques au niveau de l'orifice vaginal peut également inclure la mesure des modifications transcriptomiques des sondes génétiques avant et après traitement. Un traitement peut provoquer l'augmentation de l'activité transcriptomique des sondes génétiques dans 1 à 90 % du total de l'ensemble de sondes génétiques. Un traitement peut provoquer la diminution de l'activité transcriptomique des sondes génétiques dans 1 à 90 % du total de l'ensemble de sondes génétiques. Les compositions de traitement peuvent inclure un émollient en application labiale ou vaginale constitué de composés cestrogéniques, d'isoflavones ou de phytostéroïdes et d'agents de traitement de la peau (comme, entre autres, la niacinamide ou le panthénol), d'hyaluronane, d'huiles grasses, d'acides tamponnés, d'hydratants et de mélanges de ceux-ci. Les compositions de traitement peuvent également inclure un système d'administration par voie orale ou cutanée constitué d'cestrogène. L'cestrogénothérapie, généralement administrée par voie orale ou cutanée, est également appelée hormonothérapie substitutive, ou HTS. Dans un mode de réalisation, la sélection de la matière grasse s'effectue en fonction de l'indice de stabilité de l'huile (« OS! »), qui doit être d'environ 10 heures au moins, d'environ 14 heures au moins ou d'environ 18 heures au moins à 110 °C ou 120 °C. Un indicateur fréquent utilisé pour la surveillance de la stabilité à l'oxydation est l'apparition d'hydroperoxydes (indice de peroxyde ou PV) au fil du temps. La stabilité à l'oxydation peut également être exprimée en fonction du temps requis pour obtenir les produits d'oxydation secondaire lors de l'aération d'un échantillon à température élevée. Cette durée, qu'on appelle indice de stabilité de l'huile ou OSI, est normalement mesurée à 110 °C ou 120 °C [Amer Oil Chem Soc Oil Stability Index Method Cd 12b- 92] à l'aide de l'instrument Rancimat (Brinkmann Instruments, Inc.) ou de l'instrument d'OSI (Omnion, Inc.). On considère que les matières grasses comprenant des niveaux relativement élevés d'acide oléique ont tendance à être plus stables dans le cadre de la présente invention. Dans un mode de réalisation, la matière grasse comprend au moins environ 10 %, d'environ 10 % à environ 80 %, ou d'environ 15 % à environ 70 % d'acide oléique par rapport au poids de la matière grasse. Dans un mode de réalisation, la matière grasse comprend d'environ 0,0005 % à environ 16 %, ou d'environ 0,005 % à environ 8 %, ou d'environ 0,01 % à environ 2,4 % d'acide oléique par rapport au poids de la matière grasse. Les exemples, entre autres, de matières grasses adaptées et présentant les propriétés désirées décrites ici incluent l'huile de colza oléique (Brassica Campestris, B. napus, B. rapa, caractérisées par une teneur en acide oléique supérieure à 70 % en poids, par ex. l'huile de colza à teneur en acide oléique élevée, l'huile de colza à teneur en acide oléique très élevée ou l'huile de colza partiellement hydrogénée), l'huile de marula (Sclerocarya birrea), l'huile de palme (Elaeis Guineensis), l'oléine de palme, la stéarine de palme, la superoléine de palme, l'huile de noix de pécan, l'huile de pépins de courge, l'huile de carthame oléique (Carthamus Tinctorius, caractérisée par une teneur en acide oléique supérieure à 30 % en poids et une teneur en acide gras oméga-6 inférieure à 50 % en poids, p. ex. l'huile de carthame à teneur en acide oléique élevée), l'huile de sésame (Sesamum indicum, S. orientale), l'huile de soja (Glycine max, par ex. l'huile de soja à teneur en acide oléique élevée, l'huile de soja à faible teneur en acide linolénique, l'huile de soja partiellement hydrogénée), l'huile de tournesol oléique (Helianthus annus, caractérisée par une teneur en acide oléique supérieure à 40 % en poids, par ex. l'huile de tournesol à teneur en acide oléique moyenne ou élevée) et les mélanges de celles-ci. L'huile de colza oléique, l'huile de palme, l'huile de sésame, l'huile de carthame à teneur en acide oléique élevée, l'huile de soja à teneur en acide oléique élevée, l'huile de tournesol à teneur en acide oléique moyenne et l'huile de tournesol à teneur en acide oléique élevée sont des huiles courantes obtenues à partir de plantes et peuvent également être obtenues à partir d'organismes non génétiquement modifiés (sans OGM). Les exemples de matières grasses disponibles sur le marché chez plusieurs distributeurs comprennent entre autres : Cargill pour l'huile de soja partiellement hydrogénée (p. ex. l'huile de soja Preference® 110W ou l'huile de soja à stabilité élevée Preferencee 300) l'huile de tournesol à teneur en acide oléique moyenne (par ex. l'huile de tournesol à teneur en acide oléique moyenne NuSune), l'huile de tournesol à teneur en acide oléique élevée (par ex. l'huile de tournesol à teneur en acide oléique élevée Clear Valleye), l'huile de colza à teneur en acide oléique élevée, l'huile de colza à teneur en acide oléique très élevée et l'huile de colza à faible teneur en acide érucique partiellement hydrogénée (par ex. l'huile de colza à teneur en acide oléique élevée Clear Valley® 65 et l'huile de colza à teneur en acide oléique élevée Clear Valley® 75), l'huile de colza à teneur en acide oléique élevée de Lambert Technology (par ex. Oleocal C104), l'huile de marula Arch Personal Care, l'huile de soja à teneur en acide oléique élevée Pioneer (par ex. Plenishe), l'huile de soja à faible teneur en acide linolénique Asoyia (par ex. Ultra Low Linolenic Soybean °H®), ainsi que l'huile de sésame raffinée Dipasa, Inc. Les agents de traitement de la peau peuvent également comprendre des agents de traitement de la peau supplémentaires comme la niacinamide, l'oxyde de zinc, l'hexamidine, le panthénol et autres, ainsi que des mélanges de ceux-ci. Les agents de traitement de la peau adaptés sont décrits dans U.S. 2003/0082219 Al. Dans un mode de réalisation, l'hydratant est généralement présent dans la composition de traitement en quantités de 0,1 à 20 % (poids/poids), de préférence de 1 à 15 % (poids/poids) et plus préférablement de 2 à 12 % (poids/poids). Les hydratants appropriés sont par exemple les acides aminés, l'acide pyrrolidone carboxylique, l'acide lactique et ses sels, le lactitol, l'urée et les dérivés de l'urée, l'acide uréique, la glucosamine, la créatinine, les produits de fissure du collagène, le chitosane ou les sels/dérivés du chitosane, et en particulier les polyols et les dérivés du polyol (par ex. l'éthylène glycol, le propylèneglycol, le butanediol, le pentylène glycol, l'hexylèneglycol, l'érythrite, le 1,2,6- hexanetriol, le polyéthylène glycol tel que le PEG-4, PEG-6, PEG-7 PEG-8, PEG-9, PEG10, PEG-12, PEG-14, PEG-16, PEG-18, PEG-20, PEG-135, PEG 150), le sucre et les dérivés du sucre (par ex. le fructose, le glucose, le maltose, le maltitol, la mannite, l'inosite, la sorbite, le sorbitylsilandiol, le saccharose, le tréhalose, le xylose, le xylitol, l'acide glucuronique et ses sels), le sorbite éthoxylé (Sorbeth-6, Sorbeth-20, Sorbeth-30, Sorbeth-40), le miel et le miel hydrogéné, les hydrolysats d'amidon hydrogéné, ainsi que des mélanges de protéines de blé hydrogénées, de protéines de lait hydrolysées, de lécithine, de pythantriol, d'acide hyaluronique et leurs sels, ainsi que les copolymères d'acétate PEG-20. Les hydratants particulièrement privilégiés sont la glycérine, la diglycérine et la triglycérine. Dans un mode de réalisation, la matière cestrogénique est généralement présente dans la 10 composition de traitement en quantités de 0,001 % à 10 % (poids/poids), de préférence de 0,01 % à 8 % (poids/poids) et plus préférablement de 0,05 % à 5 % (poids/poids). Les matières cestrogéniques adaptées sont l'estradiol, l'estrone et l'estriol. Les phytostéroïdes représentent les matières extraites des plantes. Les ingrédients représentatifs peuvent inclure des structures stéroïdiennes et non stéroïdiennes possédant 15 toutes deux une activité biologique proche de l'activité stéroïdienne. Les exemples de matières stéroïdiennes incluent les stéroïdes issus d'huile végétale, c'est-à-dire le sitostérol, le stigmastérol et le campestérol. Les structures non stéroïdiennes incluent les isoflavones, les flavones et les phytocestrogènes. Les isoflavones, qui incluent la génistéine, la daidzéine, la formononétine et l'équol ont été identifiés comme des 20 traitements utiles pour les symptômes associés à la ménopause et périménopause (Brevet U.S. 5498631 à GORBACH 12 mars 1996), à la dépression et la démence (Brevet U.S. 5733926 à GORBACH 31 mars 1998, Brevet U.S. 6083526 GORBACH, 4 juillet 2000), au plissement de la peau (Brevet U.S. 6060070 à GORBACH 9 mai 2000) et au cancer (W.O. 2004022023 de NOVOGEN). 25 Dans un mode de réalisation, la matière d'isoflavone est généralement présente dans la composition de traitement en quantités de 0,001 % à environ 40 % (poids/poids) d'isoflavones, de préférence de 0,001 % à environ 4 % (poids/poids), plus préférablement de 0,01 % à environ 2 % (poids/poids) d'isoflavones. Les isoflavones peuvent être sélectionnées dans le groupe constitué des isoflavones de soja, des isoflavones de trèfle, de génistéine, de 30 daidzéine, de formononétine, de biochanine A, d'équol-S, d'équol-R ou d'extrait de plante mimétique. « Extrait de plante mimétique » signifie dans le contexte de cette demande tout extrait de plante capable d'imiter l'action des isoflavones identifiées. Dans un mode de réalisation, un ou plusieurs des procédés de l'éventail de procédés peuvent être inclus dans un kit d'évaluation de l'efficacité d'un régime de traitement de l'atrophie vaginale comprenant une méthode d'évaluation pré-traitement, un traitement topique à appliquer sur les grandes lèvres, les petites lèvres, l'orifice vaginal, le vagin ou des combinaisons de ceux-ci, une méthode d'évaluation post-traitement de l'atrophie vaginale et un moyen de déterminer la différence entre les évaluations pré-traitement et de post-traitement de l'atrophie vaginale afin d'évaluer l'effet global du traitement topique. La méthode d'évaluation pré-traitement et la méthode d'évaluation post-traitement peuvent être une seule ou plusieurs des méthodes d'évaluation de l'atrophie vaginale décrites ci-dessus, y compris en autres : des mesures du pH au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres, de l'orifice vaginal ou des associations de celles-ci ; la détermination de la sensibilité à la brosse au niveau de l'orifice vaginal ; le dosage du glycogène au niveau de l'orifice vaginal ; l'analyse de la biopsie des cellules épithéliales au niveau de l'orifice vaginal ; l'évaluation de la teneur en protéines au niveau de l'orifice vaginal ; la cartographie thermique transcriptomique au niveau des grandes lèvres ou des petites lèvres ; ou l'évaluation de l'expression des gènes au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres, de l'orifice vaginal, du vagin, ou des associations de ces zones. Le kit peut également inclure un ou plusieurs articles absorbants utilisés en association avec la méthode d'évaluation. Dans le présent document, l'article absorbant peut inclure un article d'hygiène féminine, une serviette hygiénique féminine, une serviette interlabiale, un protège-slip, une serviette pour adulte incontinent, une culotte d'incontinence pour adulte, une couche pour adulte incontinent, une compresse de gaze stérile, une lingette humide et un pansement. Les dimensions et les valeurs indiquées dans le présent document ne doivent pas être interprétées comme strictement limitées aux valeurs numériques indiquées. À la place, et sauf indication contraire, chacune de ces dimensions correspond aussi bien à la valeur indiquée qu'à une plage équivalente fonctionnelle autour de cette valeur. Par exemple, une dimension décrite comme «40 mm » veut dire « environ 40 mm ». Les valeurs décrites ici comme seuils de la fourchette numérique ne doivent pas être comprises comme étant strictement limitées aux valeurs numériques exactes citées. Plutôt, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, chaque plage numérique veut dire à la fois les valeurs citées et n'importe quels nombres entiers dans l'intervalle. Par exemple, une plage décrite comme allant de « 1 à 10 » veut dire « 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ». La citation de n'importe quel document ne doit pas être interprétée comme une admission que le document relève d'une technique antérieure par rapport à la présente invention. Au point où n'importe quelle signification ou définition d'un terme dans ce document est en conflit avec n'importe quelle signification ou définition du même terme dans un autre, la signification ou définition attribuée à ce terme dans le présent document devra prévaloir. Alors que des modes de réalisation particuliers de la présente invention ont été illustrés et décrits, il serait évident aux personnes du métier que divers autres changements et modifications peuvent être apportés sans sortir de l'esprit et du champ d'application de l'invention. Il est prévu, par conséquent, de couvrir dans les revendications annexées toutes ces variantes et modifications qui appartiennent au champ d'application de la présente invention. REVENDICATIONS1. Éventail d'un ou plusieurs procédés d'identification des modifications urogénitales associées à l'atrophie vaginale, caractérisé en ce que les procédés comprennent : a. la mesure du pH au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres, de l'orifice vaginal ou des combinaisons de ceux-ci ; b. la détermination de la sensibilité à la brosse au niveau de l'orifice vaginal ; c. l'évaluation de la quantité de glycogène au niveau de l'orifice vaginal ; d. la réalisation d'une biopsie au niveau de l'orifice vaginal et l'analyse des cellules épithéliales au niveau de l'orifice vaginal ; e. l'évaluation de la quantité de protéines au niveau de l'orifice vaginal, des grandes lèvres ou de petites lèvres ; f. l'évaluation des quantités de métabolites au niveau de l'orifice vaginal, des grandes lèvres ou des petites lèvres ; g. l'évaluation de la quantité d'histamine au niveau de l'orifice vaginal, des grandes lèvres ou des petites lèvres ; h. la cartographie thermique transcriptomique au niveau des grandes lèvres, des petites lèvres ou de l'orifice vaginal ; et i. l'évaluation de l'expression des gènes au niveau des grandes lèvres pour un changement dans l'ensemble des sondes génétiques. 2. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le procédé de mesure de pH comprend en outre l'utilisation d'une sonde pH. 3. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les changements dans l'ensemble des sondes génétiques sont limités aux sondes génétiques associées à l'expression du collagène. 4. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les changements dans l'ensemble des sondes génétiques, sont limités à la progression du cycle cellulaire. 5. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que un ou plusieurs des procédés sont utilisés dans l'évaluation de l'étendue de l'atrophie vaginale avant et après un protocole thérapeutique. 6. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le traitement provoque la diminution du pH lié à une atrophie de 0,1 à 2,0 unités de pH. 7. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, caractérisé en ce que le traitement provoque la diminution du pH lié à une atrophie de 0,3 à 1,5 unité de pH. 8. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le traitement entraîne un pH de l'orifice vaginal de 3,5 à 5,8 unités de pH. 9. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que le traitement est un émollient en application urogénitale ou vaginale constitué d'oestrogène, d'isoflavones, de niacinamide, d''hyaluronine, de panthénol, d'huiles grasses, d'acides tamponnés et des mélanges de ceux-ci. 10. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que le traitement est un système d'administration par voie orale ou cutanée constitué d'oestrogène. 11. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'analyse des cellules épithéliales au niveau de l'orifice vaginal comprend en outre la mesure de l'abondance de crêtes épidermiques dans l'anneau de l'hymen, dans lequel les procédés comprennent en outre un traitement, et dans lequel le traitement provoque une augmentation de 10 à 100 % de l'abondance des crêtes. 12. Éventail de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'analyse des cellules épithéliales au niveau de l'orifice vaginalcomprend en outre la mesure de l'épaisseur du tissu épithélial de l'hymen, dans lequel les procédés comprennent en outre un traitement, et dans lequel le traitement provoque une augmentation de 10 à 300 % de l'épaisseur liée à l'atrophie.