Brevet FR3020464A1 — publié le 20151030

Méthode de détermination de la reprotoxicité d'eaux douces Domaine technique L'invention concerne le domaine des méthodes d'analyses écotoxicologiques des eaux. Plus particulièrement, elle concerne la détermination de la reprotoxicité des eaux douces à l'aide d'une sonde biologique, c'est-à-dire d'un organisme aquatique qui sert comme modèle pour caractériser l'état de reprotoxicité d'une eau douce dans laquelle il est introduit pour y séjourner pendant une durée déterminée aux fins de l'essai. Etat de la technique L'utilisation d'organismes aquatiques comme indicateur écotoxicologique pour le diagnostic et la surveillance de l'état écotoxicologique d'une eau douce est connue en tant que telle. Parmi les organismes aquatiques, les crustacés ont été identifiés comme un taxon adapté à cette utilisation : ils sont ubiquistes dans les eaux douces de l'Europe, facile à prélever et à élever, faciles à calibrer et à garder en cage dans un flux d'eau à surveiller. Plusieurs documents se focalisent sur les daphnies : VVO 2013/081496 décrit un dispositif de test impliquant cet organisme, RU 2491546 décrit une méthode pour estimer la génotoxicité à partir de l'observation de la seconde génération de daphnies, RU 2377560 décrit une méthode d'exposition de daphnies à une eau naturelle ou un effluent permettant de déterminer aisément leur mortalité, DE 4110877 utilise l'analyse de leurs mouvements tels que détectés par une cellule photoélectrique, VVO 90/12886 utilise l'analyse par fluorescence d'une activité enzymatique des daphnies. Une autre famille de crustacés étudiée dans ce contexte est les gammaridés. Les demandes de brevet DE 19848230 (Almut Gerhardt), DE4313109 (Liess) et SU2029948 (Université de Saint Petersbourg) décrivent la détection de changements comportementaux de gammaridés induits par le degré de pollution de l'eau dans laquelle ils séjournent. Plus particulièrement, le premier document décrit la modification du mouvement des animaux et l'analyse spectrale des variations de champ magnétique induites par leurs mouvements, le second décrit la détection de la remontée à la surface des animaux en fonction du degré de pollution, alors que le troisième présente une autre analyse de leurs mouvements. Ces méthodes sont plus fines que celles qui comptabilisent simplement la mortalité des animaux, et elles permettent de caractériser plus spécifiquement la neurotoxicité des eaux. D'autres méthodes impliquant des crustacés détectent une réponse métabolique spécifique au stress qu'ils subissent dans leur milieu aquatique, telle que la production de certains « protéines de choc » (VVO 90/13028 et VVO 90/02947). Encore d'autres méthodes utilisent des sondes biologiques comme des algues (EP 2 177 905), l'étude comportementale de poissons ou de mouches (VVO 2008/150096), l'évaluation de la fertilité d'oaufs de mollusques (EP 1 256 800) ou du degré d'ouverture des coquilles d'une moule (DE 4443788), un poisson transgénique particulier (US 2004/147030), des embryons de mouches (US 6,365,129), des cultures de rotifères (US 5,798,222), des embryons et larves d'échinidés (RU 2 057 337). Plusieurs publications décrivent l'utilisation du crustacé Gammarus fossarum comme biosonde pour l'évaluation de la toxicité d'eaux douces naturelles. Ainsi, la publication « Acetylcholinesterase activity in Gammarus fossarum (Crustacea Amphpoda) - Intrinsic variability, reference levels, and a reliable tool for field surveys » par B. Xuereb et al., parue dans la revue Aquatic Toxicology 93 (2009), p. 225-233, décrit l'utilisation d'une population de mâles Gammarus fossarum de taille standardisée comme sonde pour caractériser l'effet de polluants neurotoxiques à travers l'activité du biomarqueur acétylcholine-estérase. La publication « Linking genotoxic responses in Gammarus fossarum germ cells with reproduction impairement, using the Cornet assay" par E. Lacaze et al., parue dans la revue Environmental Research 111 (2011), p. 626-634, décrit une corrélation entre l'endommagement de l'ADN induit par des substances génotoxiques dans le sperme de Gammarus fossarum et l'apparition d'anomalies embryonnaires. La publication « Vitellogenin-like proteins in the freshwater amphipod Gammarus fossarum (Koch, 1835): Functional characterization throughout reproductive process, potential or use as an indicator of oocyte quality and endocrine disruption biomarkers in males" par G. Jubeaux et al., parue dans la revue Aquatic Toxicology 112-113 (2012), p. 72-82, décrit l'influence de certains perturbateurs endocriniens sur la concentration de la protéine vitellogénine, qui caractérisent le cycle de reproduction de Gammarus fossarum. La publication "Ovarian cycle and embryonic development in Gammarus fossarum: Application for reproductive toxicity assessment" par O. Geffard et al., parue dans la revue Environmental Toxicology and Chemistry 29 (10), p. 2249-2259 (2010), décrit l'influence de contaminants sur le cycle de développement gonadique et embryonnaire chez Gammarus fossarum. La publication "In situ feeding assay with Gammarus fossarum (Crustacea): Modelling the influence of con founding factors to improve water quality biomonitoring" par R. Coulaud et al., parue dans la revue VVater Research 45 (2011), p. 6417-6429, décrit la détermination d'un indice d'inhibition d'alimentation chez Gammarus fossarum, qui caractérise l'effet toxique de contaminants dans l'environnement. Ainsi, les macro-invertébrés aquatiques apparaissent comme des candidats prometteurs pour développer une biosonde pour la caractérisation écotoxicologique d'eaux douces. Cependant, il manque une méthode pour caractériser la reprotoxicité d'eaux douces à l'aide d'une biosonde représentative, ubiquiste dans les eaux douces d'Europe, facile à prélever, à élever et à manipuler, facile à calibrer et à garder en cage dans un flux d'eau à surveiller, et facile à observer et à analyser ; proposer une telle méthode représente le problème que l'invention cherche à résoudre. Objets de l'invention L'invention est basée sur la découverte que la synchronisation entre l'embryogenèse, la vitellogenèse et les stades de mue chez les Gammaridae, et en particulier chez le genre Gammarus, peut être perturbée par des substances toxiques et/ou par des substances perturbant le système hormonal de cette espèce d'invertébré (perturbateurs endocriniens) , et qu'il est possible de distinguer entre ces deux phénomènes perturbateurs ; ainsi il est possible d'utiliser les Gammaridae, et en particulier les espèces du genre Gammaridae, comme biosonde pour caractériser la toxicité, et en particulier la reprotoxicité, d'une eau douce. Cette caractérisation de l'eau naturelle se fait par une exposition des organismes de la famille Gammaridae à l'eau à caractériser, et elle peut se faire en site naturel, malgré les variations de température qu'une telle eau naturelle peut subir au cours de la durée de l'exposition. On sait en effet que de nombreux phénomènes physiologiques et cycles biologiques chez les Gammaridae, et en particulier chez Gammarus, dépendent de la température de l'eau ; tel est le cas du cycle de mue. Les présents inventeurs ont résolu cette difficulté par un procédé nouveau qui permet de tenir compte des effets de température non seulement lors de l'interprétation des données collectées lors d'un tel essai, mais encore lors de la conception de l'essai même. En effet, le procédé selon l'invention implique de définir en fonction de la température du milieu naturel certains paramètres d'exposition sur lesquels l'expérimentateur peut agir pour tenir compte de cette température, et en particulier la durée de certaines étapes d'exposition des Gammaridae à leur milieu naturel à caractériser. Plus précisément, selon l'invention le problème est résolu par un procédé pour déterminer l'état de reprotoxicité d'une eau douce à l'aide de crustacés d'une espèce sélectionnée parmi les crustacés de la famille des Gammaridae, et de préférence sélectionné parmi les crustacés du genre Gammarus, dans lequel procédé (A) on approvisionne des crustacés d'une même espèce composé de mâles et de femelles en état de précopulation, à savoir un premier lot M de mâles et un deuxième lot de crustacés adultes en couple C en état de précopulat, ledit lot C étant composé de mâles et de femelles, lesdites femelles étant sélectionnées de manière à être toutes prêtes à pondre et à muer dans le jour ou les deux jours qui suivent ; (B) on met les lots M et C dans l'eau douce à caractériser pendant une première période d'exposition de durée DE1 prédéterminée, et on détermine la température moyenne Ti de l'eau au cours de ladite première période d'exposition DE1 ; (C) à l'issue de la durée d'exposition DE1 on (C.a) récupère le lot M, et on (C.b) continue à exposer ledit lot C pendant une deuxième période d'exposition de durée DE2 prédéterminée, et on détermine la température moyenne T2 de l'eau au cours de cette deuxième période d'exposition DE2, et on (C.c) détermine pour chacun des crustacés femelles du lot C : (i) le stade de développement embryonnaire (paramètre appelé ici « critère d'embryogenèse ») Ec, et (ii) un paramètre qui représente la vitellogénèse, et qui est de préférence la surface ovocytaire (paramètre appelé ici « critère de vitellogénèse ») Vb, et (iii) le stade de mue Ma; et on (C.d) évalue la synchronisation entre les critères du stade de mue, de vitellogénèse et d'embryogénèse, et si Ma, Vb et E, sont synchronisés on évalue si la distribution statistique des femelles dans les différents stades de mue est conforme à une distribution de référence obtenue dans des conditions de non-toxicité. La durée DE2 de ladite deuxième période d'exposition peut être déterminée à partir de la température moyenne Ti de l'eau au cours de ladite première durée d'exposition de durée DE1. Dans un mode de réalisation, on détermine la consommation d'aliments solides des crustacés du lot M au cours de ladite durée DE1. On vérifie ainsi si le lot M montre une inhibition de l'alimentation. Cette détermination peut se faire avec une source d'alimentation solide en feuilles de surface prédéterminée. Dans un mode de réalisation, on vérifie si Ma, Vb et E, sont synchronisés et la distribution statistique des femelles dans les différents stades de mue est conforme à une distribution de référence obtenue dans des conditions de non-toxicité, et si ces conditions sont remplies on conclut que l'eau à caractériser ne présente pas de toxicité, alors que si Ma, Vb et E, sont synchronisés et la distribution statistique des femelles dans les différents stades de mue n'est pas conforme à une distribution de référence obtenue dans des conditions de non-toxicité, on conclut que l'eau à caractériser présente une toxicité générale. Si Ma, Vb et E, ne sont pas synchronisés et on constate une inhibition de l'alimentation, on conclut que l'eau à caractériser présente une toxicité générale, et si Ma, Vb et E, ne sont pas synchronisés et on constate l'absence d'inhibition de l'alimentation on conclut que l'eau à caractériser provoque une toxicité spécifique, de type perturbation endocrinienne, La durée d'exposition DE2 est avantageusement déterminée en déterminant le pourcentage attendu de femelles en stade de mue AB, Cl, 02, Dl et D2 au bout de n jours lors d'une exposition à températures variables. Dans ce but on peut procéder de la manière suivante : (a) on détermine la température moyenne Ti, de chaque jour n, (b) pour chacune de ces n températures Tn on calcule une durée d en jours qui correspond au temps qui serait nécessaire pour le crustacé pour passer à cette température du début du cycle de mue initial au début du stade de mue D2, (c) en utilisant ces n durées d on calcule le pourcentage p de réalisation des 4 premiers stades de mue à la fin des n jours, (d) à partir du pourcentage p on calcule les probabilités q d'avoir réalisé la transition entre chacun des cinq stades à la fin des n jours, (e) à partir de ces probabilités q on détermine les proportions de femelles attendues respectivement aux stades AB, Cl, 02, Dl et D2 au bout de n jours. Dans une première variante de ce mode réalisation on choisit la durée DE2 de manière à ce que le nombre de femelles au stade de mue 02 soit maximum. Dans une deuxième variante on choisit la durée DE2 de manière à ce qu'au moins 60%, de préférence au moins 70%, et encore plus préférentiellement au moins 80% des femelles soient au stade de mue 02. Le procédé selon l'invention peut être mise en oeuvre de manière avantageuse avec des crustacés de l'espèce Gammarus fossarum. Dans ce cas, on approvisionne à l'étape A des crustacés de l'espèce Gammarus fossarum et à l'étape (Oc): (a) pour déterminer le stade de mue Ma on considère que a = 1 pour le stade de mue AB qui regroupe les stades de post-mue A et B, a = 2 pour le stade de mue Cl, a = 3 pour le stade de mue 02, a = 4 pour le stade de mue Dl, a = 5 pour le stade de mue D2, (b) pour déterminer le critère de la vitellogénèse Vb on considère que : b = 1 si la surface ovocytaire est comprise entre 20 100 pm2 et 23 700 pm2, b = 2 si la surface ovocytaire est comprise entre 34 900 pm2 et 43 900 pm2, b = 3 si la surface ovocytaire est comprise entre 99 200 pm2 et 112 800 pm2, b = 4 si la surface ovocytaire est comprise entre 129 700 pm2 et 136 300 pm2, b = 5 si la surface ovocytaire est comprise entre 158 200 pm2 et 169 800 pm2; (c) pour déterminer le critère de l'embryogenèse E, on considère que c = 1 au stade de l'embryon nouvellement fertilisé, ovale et indifférencié, c = 2 au stade de l'apparition de la ventroflexion, c = 3 au stade de l'apparition du céphalothorax et de la segmentation des appendices, c = 4 au stade où les yeux sont clairement visibles (ommatidies) et les appendices sont complètement développés, c = 5 au stade du juvénile nouvellement éclos. Dans cette mise en oeuvre avantageuse avec l'espèce Gammarus fossarum, on considère que Ma, Vb et E, sont synchronisés si a = b = c, et que Ma, Vb et E, ne sont pas synchronisés si cette condition a = b = c n'est pas remplie. Chez Gammarus fossarum, le stade de mue est déterminé à partir de l'analyse fine des évolutions tégumentale du dactylopodite et du protopodite de la première et deuxième paire de périopodes. La méthode selon l'invention peut être utilisée pour caractériser des eaux douces naturelles. D'une manière générale, les températures Tl et T2 doivent être compatibles avec la survie des crustacés choisis. Pour les Gammaridae elles sont avantageusement comprises entre 0°C et 28°C. Avantageusement, ces températures se situent dans la zone d'occurrence naturelle des espèces de Gammaridae. , Figures La figure 1 montre de manière schématique la corrélation entre la fertilité (exprimée en 30 nombre d'ovocytes par femelle) et le stade de mue de femelles de Gammarus fossarum. La taille médiane est de 8,3 mm avec un interquartile de 1 mm (n=80 femelles). La figure 2 montre de manière schématique la corrélation entre la consommation alimentaire et la taille corporelle de Gammarus fossarum. La figure 3 montre de manière schématique la corrélation entre la consommation alimentaire de Gammarus fossarum. et la température de l'eau. La figure 4 montre de manière schématique la relation entre la température et la durée des différents stades du cycle de mue chez Gammarus fossarum. Les carrés blancs correspondent aux observations pour la conductivité de 600 ± 50 pS cm-1 et les points noirs pour la conductivité de 200 ± 50 pS cm-1. Le point caractérisé par ses renvois aux axes correspond à une condition d'essai en laboratoire où l'on obtient en milieu contrôlé (21 jours à 12,5°C) une majorité de femelles au stade de mue 02. Les courbes ont été calculées par un modèle linéaire généralisé pour chacun des cinq stades de mue. La figure 5 montre de manière schématique l'anatomie d'un représentant du genre Gammarus. On distingue le prosoma (P), le mesosoma (S), le metasola (T) et le urosoma (U), ainsi que : le céphalon (C), l'ocelle (0), le telson (E), les uropodes (U1), les pléopodes (P1), les péréiopodes (P2), les gnathopodes (G), l'antenne (A1), l'antennule (A2) avec la flagelle principale (F2) et la flagelle accessoire (F1). Description détaillée Nous décrivons ici un procédé complet de détermination du degré de toxicité d'une eau douce à caractériser, qui inclut le procédé selon l'invention. Etape (1) : On approvisionne des individus (crustacés) d'une même espèce de la famille des gammares, de préférence du genre Gammarus, et encore plus préférentiellement de l'espèce Gammarus fossarum. Etape (2) : On garde les crustacés en quarantaine pendant une durée prédéterminée DQ (typiquement comprise entre 15 jours et quatre semaines), dans des conditions de température (de préférence 12°C), éclairage (cycle 16-8 ou, de préférence, cycle 14-10) et d'alimentation (ad libitum) contrôlées, dans une eau non-contaminée. Etape (3) : A l'issue de la durée de quarantaine DQ, on sélectionne un premier lot M de crustacés mâles non parasités, les crustacés du premier lot ayant de préférence une taille homogène proche d'une taille de référence (pour les crustacés de l'espèce Gammarus fossarum entre 9.5 et 11.5 mm en moyenne), et on sélectionne un deuxième lot de crustacés adultes en couple C en état de précopulat, les femelles devant être synchronisées entre elles en termes d'état reproductif, celles-ci devant toutes être prêtes à pondre et à muer (mue prévue un ou deux jours après la date de tri). Etape (4) : On met un nombre prédéterminé de crustacés du premier lot M et du deuxième lot C en cages dans l'eau à caractériser pendant une première durée d'exposition DE1 prédéterminée (typiquement 7 jours), et on détermine les températures moyennes journalières de l'eau au cours de ladite durée d'exposition DE1. On alimente les crustacés du lot M en début de test à partir d'une source d'alimentation solide et on détermine à l'issue de ladite durée DE1 la consommation d'alimentation solide. Etape (5) : A l'issue de la durée d'exposition prédéterminée DE1 : (a) On récupère le lot M de mâles, (b) On détermine la durée d'exposition DE2 d'une deuxième période de prolongation de l'exposition pour le lot de couples C, de préférence à l'aide d'une méthode P1 décrite ci-dessous. (c) On continue à exposer ledit lot C pendant ladite deuxième période d'exposition de durée DE2 à l'eau à caractériser, et on détermine les températures moyennes journalières de l'eau sur ladite durée d'exposition DE2. (d) On récupère le lot de couples C à l'issue de la période DE2, ainsi que les enregistrements de température pendant la période DE2. Le lot C est ramené au laboratoire. (e) On détermine une durée de stabulation post-exposition DPE et la température de stabulation pour le lot C de couples, de préférence selon une méthode P2 qui est décrite ci-dessous. (f) On effectue pour ledit lot C de couples une stabulation pendant la durée DPE et à la température T3. (g) On détermine pour chacun des crustacés femelles du lot C (au moins 10, de préférence au moins 15 femelles) : (i) le stade de développement embryonnaire (ce paramètre étant appelé ici « critère d'embryogenèse ») Ec, et (ii) la surface ovocytaire (ce paramètre étant appelé ici « critère de vitellogénèse) Vb, et (iii) le stade de mue Ma.35 A ce stade, on dispose d'une part d'un enregistrement des températures (toutes les heures) au cours de l'expérimentation (depuis le tri initial, le transport sur site, l'exposition sur site, le retour au laboratoire et l'éventuelle stabulation de post-exposition) et d'autre part, de la détermination du stade de mue (AB, Cl, 02, D1 ou D2) de chacune des femelles récupérées en fin de test. Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, on doit analyser au moins 10, et de préférence au moins 15 femelles. Etape (6) : A partir des résultats obtenus à l'étape 5 (g) on évalue, de préférence en utilisant la méthode P3 décrite ci-dessous, la présence ou l'absence d'un retard ou d'un décalage anormal dans le déroulement du cycle de reproduction au cours de l'exposition in situ, un tel décalage étant indiqué par la désynchronisation entre le critère d'embryogenèse, le critère de vitellogénèse et le stade de mue. Plus précisément : (a) Evaluation de la synchronisation entre les critères du stade de mue, de la vitellogénèse et de l'embryogenèse. Le critère de toxicité procède d'une interprétation simultanée des trois critères de mue, de vitellogénèse et d'embryogenèse. Si Ma, Vb et E, sont synchronisés tel que a=b=c, alors on constate qu'il n'y a pas de désynchronisation. Dans le cas contraire on constate qu'il y a une désynchronisation. (b) Dans le cas où il y a désynchronisation on continue la procédure avec l'étape 7. 25 (c) Dans le cas où il n'y a pas de désynchronisation on effectue une analyse quantitative des données pour déterminer s'il y a un retard anormal dans le déroulement du cycle de reproduction au cours de l'exposition in situ (i.e. au cours de l'exposition à l'eau à caractériser) : 30 (i) A partir de l'enregistrement journalier des températures (pendant la durée d'exposition DE1+DE2+DPE), on calcule grâce à la méthode P1 décrite ci-dessous les proportions attendues de femelles dans les différents stades. Ces proportions 35 correspondent à la distribution de référence attendue en cas de non-toxicité au cours de l'exposition. (ii) Les pourcentages de femelles dans les différents stades de mue sont alors comparés statistiquement entre observations et distribution de référence. (iii) Si cette analyse montre un décalage entre les données observées et les données de référence, alors on décide que l'eau présente une toxicité générale. Dans le cas contraire on décide que l'eau ne présente pas de toxicité vis-à-vis du déroulement du cycle de mue et de reproduction. Etape (7) : Dans le cas où à l'étape 6(b) on conclut à la présence d'une désynchronisation, on analyse les données qui représentent l'impact de l'exposition à l'eau à caractériser sur l'alimentation des mâles, telles qu'obtenues à l'étape 4. (a) Si l'on constate un impact sur l'alimentation, selon l'écart de référence, on conclut que l'eau présente une toxicité générale. (b) Si l'on constate l'absence d'impact sur l'alimentation on constate que l'eau à caractériser provoque une toxicité spécifique, de type perturbation endocrinienne. Ainsi, le procédé aboutit à une conclusion parmi trois conclusions possibles par rapport à la qualité de l'eau caractérisée : « pas de toxicité générale », « toxicité générale », « toxicité spécifique, de type perturbation endocrinienne ». Afin de ne pas alourdir la description du procédé selon l'invention, nous décrivons ici de manière séparée et de manière très détaillée quatre méthodes désignées par Pi, P2, P3 et P4 pouvant être utilisées, à des stades différentes, dans le procédé selon l'invention. Pour les méthodes Pi, P2 et P3 les paramètres numériques définissant les conditions expérimentales (paramètres opérationnels) sont donnés ici pour l'espèce Gammarus fossarum. Ils peuvent varier légèrement par rapport aux valeurs et fourchettes de valeurs préférées indiquées, à condition de vérifier que ces paramètres opérationnels représentent toujours le même phénomène biologique, et à condition de déterminer de nouveau les paramètres empiriques (paramètres résultants) indiqués. L'homme du métier sera en mesure de vérifier leur applicabilité, et le cas échéant déterminer leurs valeurs numériques pour les autres espèces du genre Gammarus et les autres familles de Gammaridae. Méthode P1 Nous décrivons ici la méthode P1 permettant de prédire le pourcentage attendu de femelles en stade AB, Cl, 02, D1 et D2 au bout de n jours lors d'une exposition à températures variables. Les paramètres chiffrés s'appliquent à l'espèce Gammarus fossarum ; pour d'autres espèces, d'autres genres et d'autres familles de crustacés ils doivent être déterminés au préalable. 1) À partir de l'enregistrement des températures effectué typiquement toutes les heures pendant les n jours, on calcule la température moyenne de chaque jour. On dispose ainsi de n températures moyennes (en °C), une pour chaque jour : Ti, T2, ..., 15 Tn. 2) Pour chacune de ces températures moyennes, on calcule une durée d (en jours) qui correspond au temps qui serait nécessaire pour le gammare pour passer à cette température du début du cycle de mue (point de départ du test) au début du stade D2 (i.e. 20 réalisation des 4 premiers stades). Pour cela on applique la formule empirique : d = (31.92-0.5430 * T)/(-0.0125+0.0742 * T). On obtient donc n durées théoriques de cycle : dl, d2, dn. 25 3) Avec ces n durées, on calcule ensuite un pourcentage (p) de réalisation des 4 premiers stades du cycle à la fin des n jours. p= 1/d1 + 1/d2 +... + 1/dn. 4) A partir de ce pourcentage p, on calcule les probabilités d'avoir réalisé la transition entre chacun des 5 stades à la fin des n jours. Pour l'espèce Gammarus fossarum on 30 utilise les formules empiriques suivantes : a) Probabilité d'avoir réalisé la transition du stade B vers le stade Ci: ABC1 = exp(-3.7225+0.1101*p)/ (1+ exp(-3.7225+0.1101*p)) b) Probabilité d'avoir réalisé la transition du stade Cl vers le stade C2 : Cl C2 = exp(-17.6788+0.2497*p) / (1+ exp(-17.6788+02497*p)) 35 c) Probabilité d'avoir réalisé la transition du stade C2 vers le stade Di: C2D1 = exp(-59.3139+0.6655*p) / (1+ exp(-59.3139+0.6655*p)) d) Probabilité d'avoir réalisé la transition du stade D1 vers le stade D2: Dl D2 = exp(-26.2050+0.2602*p) / (1+ exp(-26.2050+0.2602*p)) 5) A partir de ces 4 probabilités, on déduit les proportions de femelles attendues respectivement en stade AB, Cl, 02, D1 et D2 au bout de n jours: Proportion au stade AB = 1 - ABC1 Proportion au stade Cl = ABC1 - 01 02 Proportion au stade 02 = 01 02 - C2D1 Proportion au stade D1 = C2D1 - Dl D2 Proportion au stade D2 = D1D2 Méthode P2: Nous décrivons ici une méthode pour déterminer la durée d'exposition du test de reprotoxicité in situ. 1) Après une première période d'exposition DE1 (préférentiellement 7 jours d'exposition), on récupère un premier enregistrement des températures effectué typiquement toutes les heures pendant la première période d'exposition. 2) A partir de cet enregistrement, on crée des enregistrements virtuels de températures prévisionnelles pour des durées d'exposition allant de 10 à 30 jours, en prolongeant les DE1 jours d'enregistrement par une duplication artificielle de la série des températures qui ont été enregistrées pendant les DE1 premiers jours. 3) On calcule, avantageusement à l'aide de l'algorithme indiqué ci-dessus (P1), la proportion de femelles attendue en stade 02, pour 10, 11, ..., 29, 30 jours d'exposition, en considérant les enregistrements de températures prévisionnelles. 4) On fixe la date d'arrêt de l'exposition in situ en choisissant la plus petite durée qui permet d'avoir au moins 80% de femelles en 02. On détermine ainsi une deuxième période d'exposition DE2. 5) À la récupération des systèmes d'exposition à la date ainsi choisie, l'enregistrement des températures réelles pendant le test est récupéré. A l'aide de la méthode P1 décrite ci-dessus, on vérifie si la proportion de femelles en stade 02 attendue est supérieure à 35 80%. Si cette condition est remplie, on effectue les mesures biologiques (étape 5 (g)). Si cette condition n'est pas remplie (i.e. si les températures d'exposition ont été plus faibles que dans le scénario prévisionnel), on maintient les gammares en stabulation pendant une durée post-exposition supplémentaire au laboratoire DPE (maximum 3 jours). Pour fixer la température de cette stabulation, on calcule à l'aide de l'algorithme P1 indiqué ci-dessus la proportion de femelles en 02 attendue si on ajoute DPE jours d'exposition à 10°C, 11°C, ..., 15°C, 16°C à l'enregistrement des températures. On choisit alors pour la stabulation la plus faible des températures qui permet d'obtenir au moins 80% des femelles en 02. Les mesures biologiques sont réalisées après cette stabulation. Méthode P3: Nous décrivons ici en plus grand détail les trois critères dont la possible désynchronisation est utilisée dans la méthode selon l'invention comme un indicateur de la toxicité de l'eau à caractériser. Les paramètres chiffrés s'appliquent à l'espèce Gammarus fossarum; pour d'autres espèces, d'autres genres et d'autres familles de crustacés ils doivent être déterminés au préalable. (i) Critère du stade de mue : détermination du stade de mue Ce critère se décline en cinq stades de mue Ma où est un nombre entier de 1 à 5, soit M1, M2, M3, M4 et M5. Le stade M1 est le stade de mue AB (regroupement des stades de post-mue A et B). Le stade M2 est le stade de mue Cl. Le stade M3 est le stade de mue C2. Le stade M4 est le stade de mue Dl. Le stade M5 est le stade de mue D2. (ii) Critère de la vitellogénèse : détermination de la surface ovocytaire moyenne Ce critère se décline en cinq stades de vitellogénèse Vb où b est un nombre entier de 1 à 5, soit V1, V2, V3, V4 et V5. Le stade V1 est le stade dans lequel la surface ovocytaire est comprise entre 20 100 pm2 et 23 700 pm2. Le stade V2 est le stade dans lequel la surface ovocytaire est comprise entre 34 900 pm2 et 43 900 pm2. Le stade V3 est le stade dans lequel la surface ovocytaire est comprise entre 99 200 pm2 et 112 800 pm2. Le stade V4 est le stade dans lequel la surface ovocytaire est comprise entre 129 700 pm2 et 136 300 pm2. Le stade V5 est le stade dans lequel la surface ovocytaire est comprise entre 158 200 pm2 et 169 800 pm2. Pour une espèce de crustacés donnée, ces surfaces ovocytaires ne dépendent pas de la taille de l'individu, mais les indications chiffrées correspondent ici à l'espèce Gammarus fossarum ; pour d'autres espèces de crustacés ces valeurs doivent être déterminées au 10 préalable. (iii) Critère de l'embryogenèse: détermination du stade de développement embryonnaire Ce critère se décline en cinq stades d'embryogenèse E, où c'est un nombre entier de 1 à 5, soit E1, E2, E3, E4 et E5. 15 Le stade El est le stade de l'embryon nouvellement fertilisé, ovale et indifférencié. Le stade E2 est le stade de l'apparition de la ventroflexion. Le stade E3 est le stade de l'apparition du céphalothorax et de la segmentation des appendices. Le stade E4 est le stade où les yeux sont clairement visibles et les appendices sont 20 complètement développés. Le stade E5 est le stade du juvénile nouvellement éclos. Méthode P4 : Critère de l'impact sur l'alimentation Les paramètres chiffrés donnés pour cette méthode s'appliquent à l'espèce Gammarus 25 fossarum ; pour d'autres espèces, d'autres genres et d'autres familles de crustacés ils doivent être déterminés au préalable. Des disques de feuilles sont préparés à partir de feuilles d'aulne séchées puis réhydratées dans de l'eau douce, renouvelée typiquement une fois par jour pendant deux jours (étape dite de « leaching »). Les feuilles sont ensuite étalées sur une planche puis découpées à l'emporte-pièce pour réaliser des disques de 30 2,2 centimètres de diamètre. Dans le cas où il y a désynchronisation, on analyse s'il y a un impact sur l'alimentation. On détermine l'indice d'inhibition de l'alimentation (paramètre appelé « FI », Feeding Inhibition) qui exprime l'écart par rapport à la valeur attendue sans contamination pour la température du milieu d'exposition : FI = (FRpréd - FR,) / FRpréd) x 100 où FI représente le taux d'inhibition en pourcents, FRpréd exprimé en [mm2 jourl individu-1] représente le taux d'alimentation attendu et FR; exprimé en [mm2 jourl individu-1] représente le taux d'alimentation mesuré pour le réplicat i (voir ci-dessous). Le taux d'alimentation prédit doit être corrigé en fonction de la température moyenne T de l'eau et de la taille moyenne des individus utilisés. Le taux d'alimentation prédit pour un réplicat d'individus d'une taille moyenne de 10,5 mm suit la relation linéaire suivante en fonction de la température : FRpréd [mm2 jourl individu-1] = 1,85 T [°C] + 3,14 et doit être corrigé vers le haut ou vers le bas de 4,526 [mm2 jourl individu-1] par mm de taille moyenne supplémentaire ou taille en moins ; cet ajustement en fonction de la taille est valable pour une gamme de tailles moyennes comprises entre 9.5 et 11.5 mm. Le taux d'alimentation mesuré FR; est déterminé comme FR; = (2 x Stémoin S;)/[(N + L;)/2] x 1/7 Où Stémoin représente la surface restante de 10 disques de feuilles témoins sans gammares, S; représente la surface restante des 20 disques de feuilles consommées pour le réplicat i, et L; représente le nombre de gammares vivants à l'arrêt de l'essai pour le réplicat i, et N représente le nombre de gammares au début de l'essai (typiquement 20). Le test est considéré comme pertinent pour des survies supérieures à 75%. Le témoin comportant les disques de feuilles exposés sans gammares permet d'intégrer la dégradation des disques liée aux contraintes du milieu d'exposition. Le taux d'alimentation est exprimé en millimètres carré de surface consommée par jour et par gammare. Nous donnons ici des précisions sur certaines des étapes du procédé complet de détermination du degré de contamination d'une eau douce afin de faciliter à l'homme du métier l'exécution du procédé selon l'invention. Un premier aspect particulier de l'invention est que le procédé selon l'invention nécessite un contrôle de la température d'exposition des crustacés. La température de l'eau influe sur le métabolisme de Gammarus fossarum, et sur différents phénomènes et paramètres qui sont essentiels pour l'invention. La figure 3 montre l'influence de la température sur la consommation alimentaire. La figure 4 montre l'influence de la température du milieu aquatique sur la durée des différents stades du cycle de mue. Elle a été compilée à partir de mesures faites dans des conditions artificielles de température constante. On constate ainsi que pour les expérimentations en site réel, où l'expérimentateur ne peut pas agir sur la température du milieu aquatique pour la rendre constante, la durée d'exposition doit être adaptée à cette température ; le procédé selon l'invention permet cette adaptation en températures variables. Précisions sur l'étape (1) : Les crustacés approvisionnés doivent être sains et doivent avoir vécu dans une eau propre. Ils peuvent être prélevés soit sur un site naturel dont la qualité de l'eau a été convenablement qualifiée au préalable, soit à partir d'un élevage en eau propre. Précisions sur l'étape (3) : La figure 5 montre de manière schématique l'organisation générale d'un gammare. La ligne dorsale entre les deux flèches indique la mesure de sa taille. La figure 2 montre la relation entre la taille du corps et la consommation alimentaire 20 moyenne de l'espèce Gammarus fossarum. Précisions sur l'étape (2) : L'objectif de cette phase de stabulation (mise en quarantaine) est d'éliminer les individus affaiblis, d'assurer une homogénéité physiologique des organismes utilisés quelle que soit la saison (réserves énergétiques, taux d'activité comportementale), et de les acclimater aux futures conditions d'exposition. 25 Cette phase de stabulation peut se faire dans des aquariums contenant de préférence l'eau dans lequel les crustacés avaient été prélevés, renouvelée au goutte à goutte (typiquement le volume de l'aquarium est renouvelé quatre fois par jour) par une eau douce qui présente de préférence une conductivité proche de celle de l'eau à caractériser dans le futur site exposition (typiquement comprise entre 300 et 600 pS cm-1), et 30 oxygénée en continu par bullage. Avantageusement la température est comprise entre 11°C et 13°C, et la photopériode est de 14 h jour / 10 h nuit. L'alimentation doit être adaptée à l'espèce de crustacé utilisée : pour l'espèce Gammarus fossarum on utilise avantageusement des feuilles d'aulne séchées (Ainus glutinosa) complétées par des vers du genre Tubifex une fois par semaine. Précisions sur l'étape (3) : Cette étape est avantageusement effectuée en laboratoire quelques jours avant le début de l'exposition à l'eau à caractériser. Elle peut aussi être faite avant l'étape (2) (mise en quarantaine). Le tri peut s'effectuer sur une table lumineuse avec de l'eau du milieu de stabulation (en évitant l'échauffement de l'eau par la source lumineuse et l'air ambiant). Pour la plupart des crustacés de la famille des Gammaridae, et notamment pour le genre Gammarus (et a fortiori pour l'espèce Gammarus fossarum), les femelles en reproduction sont identifiables à l'oail nu par la présence d'ovocytes noirs dans le dos et/ou d'embryons dans le marsupium (poche incubatrice ventrale située sous l'abdomen), et leur état reproductif précis par rapport au stade de mue est également identifiable à l'oail nu. Les mâles sont identifiables à l'oail nu par l'absence d'ovocytes et d'embryons ; en cas de doute l'observation à la loupe binoculaire des papilles génitales permet de confirmer le phénotype mâle. On évite les individus parasités (présence de tâches orangées ou blanches, visibles notamment à travers la cuticule). Avantageusement on prévoit un nombre d'individus d'au moins 10% supérieur aux besoins pour pallier aux erreurs de tri et à la perte par la mortalité naturelle et le cannibalisme. Pour le tri des couples, on ne retient que les précopulats dont la femelle est en fin de phase de cycle reproductif. Pour cela, on sélectionne les femelles qui possèdent des ovaires très développés et des juvéniles au sein de leur marsupium. Précisions sur l'étape (4) : Le transfert des individus des lots M et C du laboratoire vers le site d'essai (i.e. le cours d'eau à caractériser) est avantageusement effectué dans des conditions assurant une survie optimale des individus. Les individus sont mis en chambres d'encagement remplies d'une eau similaire à celle utilisée à l'étape 2, et qui présente une température et conductivité similaires à celle utilisées à l'étape 2. On prévoit une alimentation à volonté. On veillera à ce que la température de l'eau ne change pas de manière significative pendant le transfert. Les lots M et C sont avantageusement gardés séparés. Pour un Gammaridae en bonne santé, qui n'a pas été altéré par des polluants, la consommation alimentaire augmente de manière linéaire avec la taille du corps, comme le montre la figure 2. Précisions sur les étapes (5)(e) et 5(f) : Ces étapes sont optionnelles : après l'exposition in situ du lot C (étape 5 (c)), on détermine la température d'exposition pour ajuster le moment où l'on effectue les analyses biométriques typiquement au microscope (étape 5 (g)) et obtenir un maximum de femelles du lot C au stade de mue C2. Précisions sur l'étape (5) (g)(i) : Chez les Gammaridae, et a fortiori dans Gammarus fossarum, le stade de développement embryonnaire peut être évalué sous un microscope optique (un grossissement d'environ 80x convient) après avoir retiré les embryons du marsupium et déposés sur une lame de verre. Voir aussi la description donnée en relation avec la méthode P3 pour la définition des stades de développement embryonnaire. Précisions sur l'étape (5) (g)(ii) : Chez les Gammaridae, et a fortiori dans Gammarus fossarum, la surface ovocytaire (correspondant à la surface des ovocytes) est déterminée à partir d'observations des femelles (montées in toto entre deux lamelles de verre) au microscope optique (un grossissement d'environ 50x convient) ; ces observations peuvent être évaluées à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images. Cela est décrit en détail dans l'article précité de Geffard et al., p. 2250. Précisions sur l'étape (5) (g)(iii) : Chez les Gammaridae, et a fortiori dans Gammarus fossarum, le stade de mue est déterminé à partir de l'analyse fine des évolutions tégumentale du dactylopodite et du protopodite de la première et deuxième paire de périopodes ; cela est décrit en détail dans l'article précité de Geffard et al. Précisions sur l'étape (6) : Chez les femelles saines et sexuellement actives de Gammaridae, et a fortiori de Gammarus fossarum, la vitellogenèse (maturation des gonades) et le développement des embryons dans le marsupium (i .e. l'embryogenèse) se déroulent de manière parfaitement synchrone, à chaque cycle de mue, à l'état naturel (i.e. en l'absence de polluants et autres éléments perturbateurs). Les juvéniles éclos, issus de la ponte précédente, sortent du marsupium peu de temps avant l'exuviation de leur mère. Suite à cette exuviation, la femelle pond des oeufs dans le marsupium qui seront aussitôt fécondés par un mâle. Parallèlement, dans les gonades, un nouveau lot d'ovocytes primaires entre en vitellogenèse. L'exuviation peut ainsi être considérée comme le point de départ et d'aboutissement de la maturation gonadique ainsi que du développement embryonnaire dans le marsupium. Chez les femelles saines et sexuellement actives, le cycle de mue s'effectue dans un temps précis, fonction de la température du milieu de vie. Pour une espèce de Gammaridae donnée, la durée d'un cycle de mue dépend principalement de la température (voir la figure 4). REVENDICATIONS1. Procédé pour déterminer l'état de reprotoxicité d'une eau douce à l'aide de crustacés d'une espèce sélectionnée parmi les crustacés de la famille des Gammaridae, et de préférence sélectionnée parmi les crustacés du genre Gammarus, dans lequel procédé (A) on approvisionne des crustacés d'une même espèce composés de mâles et de femelles en état de précopulation, à savoir : - un premier lot M de mâles et - un deuxième lot de crustacés adultes en couple C en état de précopulat, ledit lot C étant composé de mâles et de femelles, lesdites femelles étant sélectionnées de manière à être toutes prêtes à pondre et à muer dans le jour ou les deux jours qui suivent ; (B) on met les lots M et C dans l'eau douce à caractériser pendant une première période d'exposition de durée DE1 prédéterminée, et on détermine la température moyenne Ti de l'eau au cours de ladite première période d'exposition DE1 ; (C) à l'issue de la durée d'exposition DE1 : (a) on récupère le lot M, et (b) on continue à exposer ledit lot C pendant une deuxième période d'exposition de durée DE2 prédéterminée, et on détermine la température moyenne T2 de l'eau au cours de cette deuxième période d'exposition DE2 ; (c) on détermine pour chacun des crustacés femelles du lot C: (i) le stade de développement embryonnaire (paramètre appelé ici « critère d'embryogenèse ») Ec, et (ii) un paramètre Vb qui représente la vitellogénèse, et qui est de manière préférée la surface ovocytaire (paramètre appelé ici « critère de vitellogénèse »), et (iii) le stade de mue Ma; (d) on évalue la synchronisation entre les critères du stade de mue, de vitellogénèse et d'embryogénèse, et - si Ma, Vb et E, sont synchronisés on évalue si la distribution statistique des femelles dans les différents stades de mue estconforme à une distribution de référence obtenue dans des conditions de non-toxicité. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel à l'étape B on détermine la consommation d'aliments solides des crustacés du lot M au cours de ladite durée DE1 . 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel si Ma, Vb et E, sont synchronisés et la distribution statistique des femelles dans les différents stades de mue est conforme à une distribution de référence obtenue dans des conditions de non-toxicité, on conclut que l'eau à caractériser ne présente pas de toxicité, et si Ma, Vb et E, sont synchronisés et la distribution statistique des femelles dans les différents stades de mue n'est pas conforme à une distribution de référence obtenue dans des conditions de non-toxicité, on conclut que l'eau à caractériser présente une toxicité générale. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel si Ma, Vb et E, ne sont pas synchronisés et on constate une inhibition de l'alimentation, on conclut que l'eau à caractériser présente une toxicité générale, et si Ma, Vb et E, ne sont pas synchronisés et on constate l'absence d'inhibition de l'alimentation on conclut que l'eau à caractériser provoque une toxicité spécifique, de type perturbation endocrinienne, 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la durée d'exposition DE2 est déterminée en déterminant le pourcentage attendu de femelles en stade de mue AB, Cl, 02, D1 et D2 au bout de n jours lors d'une exposition à températures variables. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel (a) on détermine la température moyenne Ti, de chaque jour n, (b) pour chacune de ces n températures Tn on calcule une durée d en jours qui correspond au temps qui serait nécessaire pour le crustacé pour passer à cette température du début du cycle de mue initial au début du stade de mue D2, (c) en utilisant ces n durées d on calcule le pourcentage p de réalisation des 4 premiers stades de mue à la fin des n jours, (d) à partir du pourcentage p on calcule les probabilités q d'avoir réalisé la transition entre chacun des cinq stades à la fin des n jours,(e) à partir de ces probabilités q on détermine les proportions de femelles attendues respectivement aux stades AB, Cl, 02, D1 et D2 au bout de n jours. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel on approvisionne à l'étape A des crustacés de l'espèce Gammarus fossarum. Et à l'étape 0(c): (a) pour déterminer le stade de mue Ma on considère que a = 1 pour le stade de mue AB qui regroupe les stades de post-mue A et B, a = 2 pour le stade de mue Cl, a = 3 pour le stade de mue 02, a = 4 pour le stade de mue D1, a = 5 pour le stade de mue D2, (b) pour déterminer le critère de la vitellogénèse Vb on considère que : b = 1 si la surface ovocytaire est comprise entre 20 100 pm2 et 23 700 pm2, b = 2 si la surface ovocytaire est comprise entre 34 900 pm2 et 43 900 pm2, b = 3 si la surface ovocytaire est comprise entre 99 200 pm2 et 112 800 pm2, b = 4 si la surface ovocytaire est comprise entre 129 700 pm2 et 136 300 pm2, b = 5 si la surface ovocytaire est comprise entre 158 200 pm2 et 169 800 p m2 ; (c) pour déterminer le critère de l'embryogenèse E, on considère que : c = 1 au stade de l'embryon nouvellement fertilisé, ovale et indifférencié, c = 2 au stade de l'apparition de la ventroflexion, c = 3 au stade de l'apparition du céphalothorax et de la segmentation des appendices, c = 4 au stade où les yeux sont clairement visibles (ommatidies) et les appendices sont complètement développés, c = 5 au stade du juvénile nouvellement éclos. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel on considère que Ma, Vb et E, sont synchronisés si a = b = c, et que Ma, Vb et E, ne sont pas synchronisés si cette condition a = b = c n'est pas remplie.9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, dans lequel on détermine l'inhibition de l'alimentation en alimentant les crustacés avec une source d'alimentation solide en feuilles de surface prédéterminée. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel on détermine durée DE2 de ladite deuxième période d'exposition à partir de la température moyenne Ti de l'eau au cours de ladite première durée d'exposition de durée DE1.