Brevet FR3023466A1 — publié le 20160115

PROCÉDÉS D'ÉVALUATION DE L'ATROPHIE VAGINALE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne les procédés pour évaluer l'atrophie vaginale impliquant des capteurs sensoriels, le pH, la biochimie, la génomique et/ou l'histologie des lèvres et de l'introïtus. ARRIÈRE-PLAN DE L'INVENTION La ménopause est un événement naturel normal dû à l'âge qui affecte toutes les femmes. La ménopause peut être définie comme l'arrêt de l'ovulation et des menstruations durant au moins 12 mois sans aucune cause pathologique évidente. L'âge typique de la ménopause est à 51 ans et on estime aujourd'hui qu'aux États-Unis (Recensement 2010), il y a plus de 53 millions de femmes qui ont atteints l'âge post-ménopause (50+ ans). D'autres femmes entrent dans la catégorie post-ménopause du fait d'une hystérectomie totale (ablation de l'utérus et des deux ovaires). Une baisse considérable de l'oestradiol circulant, jusqu'à moins de 10 % du niveau typique durant les années reproductives d'une femme, est associée à la post-ménopause. La diminution des oestrogènes donne lieu à des changements anatomiques majeurs menant à des symptômes uniques et des questions sur la qualité de vie. Tandis qu'on a signalé que la diminution des oestrogènes a un effet systémique sur le corps d'une femme, sur sa peau et ses cheveux, l'effet est également remarqué au niveau de la zone urogénitale, ceci étant diagnostiqué comme l'atrophie vaginale ou AV. L'évaluation de l'AV peut nécessiter l'insertion d'un spéculum à l'intérieur du vagin de la femme. On réalise des évaluations subjectives qui incluent la perte des crêtes hyménales, la béance de l'urètre, l'étroitesse du vestibule, la présence de pétéchies dans le vagin, et la perte d'élasticité des tissus diagnostiquée par le palper (digital) à l'introïtus. Les symptômes prédominants signalés par les femmes comprennent une sensation de sécheresse vaginale, des douleurs lors d'une pénétration sexuelle, un saignement lors d'une pénétration sexuelle, une démangeaison vaginale et une démangeaison de la peau génitale ; parmi d'autres. Des mesures objectives et des procédés d'essai pour l'AV dépendent des tests vaginaux à la surface muqueuse. L'hymen est une membrane qui entoure ou couvre partiellement l'ouverture externe vaginale (le tissu entourant cette ouverture peut être dénommé l'anneau hyménal). L'hymen est la limite entre les organes génitaux internes et externes. Il consiste en une membrane fine fibreuse qui recouvre la partie inférieure du vagin, recouvert sur sa surface externe par un épithélium squameux stratifié kératinisé et sur la surface interne par un épithélium squameux stratifié non kératinisé avec du glycogène (comme l'épithélium vaginal). Chez beaucoup de femmes souffrant d'AV, l'hymen peut se contracter et perdre de l'élasticité rendant ainsi le test objectif d'AV difficile ou désagréable. Le tissu vaginal associé avec l'ouverture vaginale est aussi nommé l'introïtus Des mesures objectives de l'AV se limitent en grande partie au pH vaginal (nécessitant typiquement un spéculum pour créer un accès adéquat) où un pH supérieur ou égal à 5,5 a été classifié en tant que signe d'une AV. Le frottis par raclage de la couche épithéliale vaginale (nécessitant également l'insertion d'un spéculum à l'intérieur du vagin) peut être analysé pour une abondance relative des cellules matures (appelé index de maturation vaginal ou lMV). Cependant, la relation entre 11MV et l'AV varie parmi les cliniciens et la variation peut être relativement large. De façon similaire il n'y a pas de relation claire entre les symptômes d'une femme et une évaluation clinique, ou des mesures objectives du pH vaginal. Un autre procédé objectif potentiel pour le diagnostic de l'AV et l'effet d'un traitement peut comprendre la récolte d'une biopsie vaginale pour un profilage transcriptionnel. L'obtention d'une biopsie vaginale est relativement difficile et nécessite l'utilisation d'un spéculum En outre, on ne peut pas préciser d'où la biopsie est tirée ni assurer des propriétés uniformes de la biopsie. Par exemple, des différences dans l'épaisseur de la biopsie peut biaiser les données provenant du derme. Un autre procédé objectif potentiel pour le diagnostic de l'AV et l'effet d'un traitement peut comprendre la récolte de tissus superficiels provenant de l'anneau hyménal ou des grandes lèvres ou des petites lèvres pour le profilage métabolique. En outre, à l'exception du pH vàginal, tous les autres procédés sont subjectifs et ne sont pas fiables. Un autre problème est que toutes les procédures vaginales telles que le classement subjectif de l'atrophie vaginale ou la récolte du pH vaginal ou la récolte du curetage vaginal pour l'IMV nécessitent l'insertion d'un spéculum à l'intérieur du vagin. Cette procédure peut être relativement douloureuse spécialement chez les femmes qui souffrent d'une AV. Tandis que le spéculum peut être lubrifié (typiquement avec un gel pour ultrasons commercial) afin de faciliter l'insertion, cela peut compromettre la récolte du pH et de l'IMV. La douleur due à l'insertion d'un spéculum peut influencer la décision de la femme quant à la recherche d'un diagnostic et d'un traitement pour l'AV. À ce titre il existe un besoin de procédés de diagnostic de l'AV et de procédés pour examiner l'efficacité potentielle des traitements pour l'AV qui ne dépendent pas de l'usage d'un spéculum, de l'échantillonnage de tissus vaginaux, et réduisent le niveau de subjectivité en utilisant un procédé quantitatif et objectif. RÉSUMÉ DE L'INVENTION Un ensemble d'un ou de plusieurs procédés pour identifier des changements urogénitaux associés à l'atrophie vaginale est décrit. Un premier objet de l'invention est un ensemble de procédés comprenant : mesurer le pH aux grandes lèvres, petites lèvres, introïtus, ou des combinaisons de ceux-ci ; déterminer la sensibilité de la brosse à l'introïtus ; évaluer la quantité de glycogène à l'introïtus ; réaliser une biopsie à l'introïtus et analyser les cellules épithéliales à l'introïtus ; évaluer la quantité de protéines en testant à l'introïtus ou aux grandes lèvres ou aux petites lèvres ; évaluer les métabolites et leurs quantités à l'introïtus ou aux grandes lèvres ou aux petites lèvres ; évaluer la quantité d'histamine à l'introïtus ou aux grandes lèvres ou aux petites lèvres ; cartographier la chaleur transcriptomique aux grandes lèvres ou aux petites lèvres ou à l'introïtus ; et évaluer l'expression des gènes aux grandes lèvres pour un changement dans l'ensemble des sondes génétiques. L'ensemble de procédés de la présente invention peut comprendre un procédé de mesure du pH qui comprend en outre l'utilisation d'une sonde pH. L'ensemble de procédés de la présente invention peut comprendre un procédé dans lequel les changements dans l'ensemble des sondes génétiques sont limités aux sondes génétiques associées à l'expression du collagène. L'ensemble de procédés de la présente invention peut comprendre un procédé dans lequel les changements dans l'ensemble des sondes génétiques sont limités à la progression cyclique cellulaire. L'ensemble de procédés de la présente invention peut comprendre un ou plusieurs des procédés qui sont utilisés pour évaluer l'étendue de l'atrophie vaginale avant et après le régime de traitement. Ledit traitement peut montrer un effet de réduction du pH relatif à l'atrophie de 0,1 unités à 2,0 unités de pH. Ledit traitement peut montrer un effet de réduction du pH relatif à l'atrophie de 0,3 unités à 1,5 unités. Ledit traitement peut en outre entraîner un pH dans l'introïtus de 3,5 à 5,8 unités. Ledit traitement peut être un émollient appliqué par voie urogénitale ou vaginale constitué d'oestrogène, d'isoflavones, de niacinamide, d'hyaluronine, de panthénol, d'huiles grasses, d'acides tamponnés, et de mélanges de ceux-ci. Ledit traitement peut être un système d'administration par voie orale ou dermique constitué d'oestrogène. L'analyse des cellules épithéliales à l'introïtus de l'ensemble de procédés de la présente invention peut comprendre en outre la mesure de l'abondance de couches épineuses de l'épiderme dans l'anneau hyménal, dans lequel les procédés comprennent en outre un 10 traitement, et dans lequel le traitement montre un effet d'augmentation de l'abondance des crêtes épidermiques de 10 à 100%. L'analyse des cellules épithéliales à l'introïtus de l'ensemble de procédés de la présente invention peut comprendre en outre la mesure de l'épaisseur de l'épithélium hyménal, dans lequel les procédés comprennent en outre un traitement, et dans lequel le 15 traitement montre un effet d'augmentation de l'épaisseur relative à l'atrophie de 10 à 300 %. Le traitement de l'ensemble de procédés de la présente invention peut entraîner un niveau différentiel de métabolites d'au moins 10%. Un autre objet de la présente invention est un kit qui comprend un ou plusieurs des 20 procédés de l'ensemble de procédés de la présente invention, ledit kit comprenant en outre un procédé d'évaluation pré-traitement pour l'atrophie vaginale ; un traitement topique pour application aux grandes lèvres, aux petites lèvres, à l'introïtus, au vagin, ou à des combinaisons de ceux-ci ; un procédé d'évaluation post-traitement pour un état d'atrophie vaginale comprenant les mêmes procédés de diagnostic que ceux utilisés dans 25 l'évaluation pré-traitement de l'atrophie vaginale ; et un moyen pour déterminer la différence entre les évaluations pré-traitement et post-traitement de l'atrophie vaginale pour évaluer l'effet global du traitement topique. De plus, le kit de la présente invention peut éventuellement contenir un ou plusieurs articles absorbants utilisés en combinaison avec le procédé d'évaluation dans lequel 30 l'article absorbant est choisi dans le groupe consistant en ; un interlabial, un article d'hygiène féminine, une serviette d'hygiène féminine, une doublure d'hygiène féminine, une serviette d'incontinence pour adultes, un pantalon d'incontinence pour adultes, une couche-culotte d'incontinence pour adultes, une gaze stérile, une lingette humide et un pansement pour blessures. Un procédé pour évaluer l'efficacité d'un régime de traitement de l'atrophie vaginale est en outre décrit. Le procédé pour évaluer l'efficacité d'un régime de traitement de l'atrophie vaginale comprend : évaluer pré-traitement l'atrophie vaginale en utilisant un ou plusieurs procédés de diagnostic ; appliquer un ou plusieurs traitements topiques aux grandes lèvres, petites lèvres, introïtus, vagin, ou des combinaisons de ceux-ci ; évaluer post-traitement l'état de l'atrophie vaginale en utilisant les mêmes procédés de diagnostic que ceux utilisés dans l'évaluation pré-traitement de l'atrophie vaginale ; et déterminer la différence entre les évaluations pré-traitement et post-traitement de l'atrophie vaginale pour évaluer l'effet global du traitement topique. L'un ou plusieurs procédés de diagnostic utilisés dans le pré-traitement et le post-traitement comprennent : mesurer le pH aux grandes lèvres, petites lèvres, introïtus, ou des combinaisons de ceux-ci ; déterminer la sensibilité de l'introïtus par contact avec la brosse ; évaluer le glycogène en testant à l'introïtus ; analyser une biopsie des cellules épithéliales à l'introïtus ; évaluer les métabolites issus de l'introïtus, des grandes lèvres, petites lèvres ou de combinaisons de ceux-ci ; évaluer les protéines en testant à l'introïtus ; réaliser une cartographie thermique des transcriptomes au niveau des grandes lèvres ou des petites lèvres ; évaluer l'expression des gènes aux grandes lèvres pour un ensemble de sondes de gènes ; évaluer post-traitement l'état de l'atrophie vaginale en utilisant les mêmes procédés de diagnostic que ceux utilisés dans l'évaluation pré-traitement de l'atrophie vaginale ; et déterminer la différence entre les évaluations pré-traitement et post-traitement de l'atrophie vaginale pour évaluer l'effet global du traitement topique. Un kit pour évaluer l'efficacité d'un régime de traitement de l'atrophie vaginale comprenant ; un procédé d'évaluation pré-traitement pour l'atrophie vaginale comprenant ; un traitement topique destiné aux grandes lèvres, petites lèvres, introïtus, vagin, ou des combinaisons de ceux-ci ; un procédé d'évaluation post-traitement pour l'état d'atrophie vaginale comprenant les mêmes procédés de diagnostic que ceux utilisés dans l'évaluation avant traitement de l'atrophie vaginale ; et un moyen pour déterminer la différence entre les évaluations pré-traitement et post-traitement de l'atrophie vaginale pour évaluer l'effet global du traitement topique. L'un ou plusieurs procédés de diagnostic utilisés pré-traitement et post-traitement incluent : mesurer le pH aux grandes lèvres, petites lèvres, introïtus, ou des combinaisons de ceux-ci ; déterminer la sensibilité de l'introïtus par contact avec la brosse ; évaluer le glycogène en testant à l'introïtus ; évaluer les métabolites aux grandes lèvres, petites lèvres, introïtus, ou des combinaisons de ceux-ci ; analyser une biopsie des cellules épithéliales à l'introïtus ; évaluer les protéines en testant à l'introïtus ; réaliser une cartographie thermique des transcriptomes au niveau des grandes lèvres ou aux petites lèvres ; ou évaluer l'expression des gènes aux grandes lèvres pour un ensemble de sondes de gènes. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES Alors que la description se termine avec des revendications soulignant particulièrement et revendiquant distinctement le sujet de la présente invention, on pense que l'invention sera plus aisément comprise à la lecture de la description suivante prise conjointement avec les dessins joints, dans lesquels : La Figure 1 montre des images de biopsies prises à l'introïtus. La Figure 2 montre une image utilisée dans la mesure du tissu épithélial. La Figure 3 est un diagramme de Venn représentant les sondes de gène qui augmentent chez la femme en post-ménopause DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION Les procédés compris dans l'ensemble de procédés de la présente invention pour l'évaluation de l'atrophie vaginale et l'évaluation de l'efficacité des traitements de l'atrophie vaginale ne requièrent pas l'usage d'un spéculum ni un accès au vagin. Le ensemble de procédés suivant réduit le niveau de subjectivité en utilisant un procédé quantitatif et objectif. On comprend que l'on peut se fier à un procédé unique ou à une combinaison des procédés décrits ci-dessous. Les procédés suivants utilisent des sites autres que le canal vaginal, lesquels sont facilement accessibles et utilisables pour mesurer de façon objective des changements associés à l'atrophie urogénitale et qui ne nécessitent pas l'utilisation d'outils invasifs tels qu'un spéculum. En outre, ces sites peuvent être étroitement associés aux symptômes rapportés par les femmes et à l'efficacité des traitements. Ces sites comprennent les lèvres (qui incluent les grandes lèvres ou les petites lèvres) et l'anneau hyménal de la zone urogénitale. Ces sites sont particulièrement attractifs du fait de leur accessibilité. L'anneau hyménal, comme le vagin, est une surface muqueuse, contrairement aux épithéliums stratifiés des lèvres. Les procédés suivants, utilisant les lèvres et l'anneau hyménal (ou introïtus), peuvent comprendre le pH, l'histologie, la sensibilité au prélèvement par brosse, le profilage des métabolites et le profilage des transcriptions de gènes. Tel qu'il est utilisé ici, le terme « niveau différentiel » d'un métabolite ou d'une protéine ou d'une transcription peut inclure tout niveau augmenté ou diminué. Pour les fins de cette discussion, un niveau différentiel d'un métabolite peut définir également de façon plus large une protéine ou une transcription. Dans un mode de réalisation, un niveau différentiel signifie un niveau qui est augmenté : d'au moins 5 ; d'au moins 10 ; d'au moins 20 %; d'au moins 30 %; d'au moins 40 %; d'au moins 50 %; d'au moins 60 %; d'au moins 70 %; d'au moins 80 % ; d'au moins 90 %; d'au moins 100 %; d'au moins 110 %; d'au moins 120 %; d'au moins 130 %; d'au moins 140 %; d'au moins 150 % ; ou plus. Dans un autre mode de réalisation, un niveau différentiel signifie un niveau qui est diminué de : au moins 5 % ; d'au moins 10 %; d'au moins 20 %; d'au moins 30 % ; d'au moins 40 % ; d'au moins 50 % ; d'au moins 60 % ; d'au moins 70 %; d'au moins 80 %; d'au moins 90 %; d'au moins 100 % (c'est-à-dire, le métabolite est absent). Un métabolite est exprimé à un niveau différentiel qui est statistiquement significatif (c'est-à-dire, une valeur p inférieure à 0,05 et/ou une valeur q inférieure à 0,10 telles que déterminées en utilisant le test de T de Student, le test T de Welch ou le test de sommes des rangs de Wilcoxon). Tel qu'il est utilisé ici, le terme « niveau de référence » d'un métabolite (ou d'une protéine ou d'une transcription) signifie un niveau du métabolite qui est indicatif d'une atrophie ou d'une non-atrophie, d'un phénotype, ou d'un manque de ceux-ci, ainsi que d'une combinaison d'états atrophiques, de phénotypes, ou d'un manque de ceux-ci. Dans un mode de réalisation, un niveau de référence atrophique d'un métabolite signifie un niveau du métabolite qui est indicatif d'un diagnostic positif d'une AV chez un sujet. Dans un autre mode de réalisation, un « niveau de référence sain » d'un métabolite signifie un niveau de métabolite qui est indicatif d'un diagnostic positif d'un état non-atrophique chez un sujet. Dans un mode de réalisation, un « niveau de référence » d'un métabolite (ou d'une protéine ou d'une transcription) peut être un ou plus de ce qui suit : quantité ou concentration absolue ou relative du métabolite ; présence ou absence du métabolite ; une plage de quantité ou de concentration du métabolitel; une quantité ou concentration minimale et/ou maximale du métabolite ; une quantité ou concentration moyenne du métabolite ; et/ou une quantité ou concentration médiane du métabolite. Dans un autre mode de réalisation, des « niveaux de référence » pour des combinaisons de métabolites peuvent aussi être des ratios de quantités absolues ou relatives ou des concentrations de deux ou plusieurs métabolites les uns par rapport aux autres. Des niveaux de références appropriés positifs et négatifs de métabolites pour un état atrophique particulier, un phénotype, ou un manque de ceux-ci peuvent être déterminés en mesurant des niveaux de métabolites désirés chez un ou plusieurs sujets appropriés, et de tels niveaux de référence peuvent être ajustés à des populations spécifiques de sujets (par exemple, un niveau de référence peut correspondre à l'âge ou correspondre aux années depuis la dernière période de menstruations de sorte que des comparaisons peuvent être réalisées entre les niveaux des métabolites dans des échantillons à partir de sujets d'un certain âge et des niveaux de référence pour un état atrophique particulier, un phénotype, ou un manque de ceux-ci dans un certain groupe d'âge). Dans un autre mode de réalisation, les niveaux de références peuvent être adaptés à des techniques spécifiques qui sont utilisées pour mesurer des niveaux de métabolites dans des échantillons biologiques (par exemple, LC-MS, GC-MS, etc.), où les niveaux de métabolites peuvent différer selon la technique spécifique qui est utilisée. Dans un tel autre mode de réalisation, « un métabolite de référence » peut inclure au moins un composé choisi parmi : un composé généré par le métabolisme d'acides aminés, un composé généré par le cycle de l'urée ; un composé généré dans la conversion du glutathion ; un composé généré par le métabolisme des lipides ; un composé généré par le métabolisme des glucides ; un composé généré par le métabolisme d'un acide nucléique ; des vitamines ; et des cofacteurs Dans encore un autre mode de réalisation, les « métabolites de référence » peuvent inclure un ou plusieurs acides aminés alanine, cystéine, glutamine, acide glutamique, histidine, leucine, isoleucine, lysine, arginine, méthionine, phénylalanine, proline, sérine, thréonine, tryptophane, tyrosine, valine, acide phénylacétique, N-acétyl méthionine, N-formyl-méthionine, et dipeptides de combinaisons de deux acides aminés. Dans encore un autre mode de réalisation, les « métabolites de référence » peuvent inclure un ou plusieurs composés choisis parmi : un composé généré par le métabolisme de la purine ou pyrimidine ; adénine, adénosine, cytodine, cytosine, thymine, inosine, hypoxanthine, uridine, guanosine, guanine, ornithine, et thymidine. Dans encore un autre mode de réalisation, les « métabolites de référence » peuvent 10 inclure au moins un composé choisi parmi : un composé généré par le métabolisme de sphingolipides et lysolipides, sphingonine, sphingosine, N-palmitoyl sphingosine, palmitoyl sphingomyéline, stéaroyl sphingomyéline, 1- stéaroylglycérophophoéthanolamine, 1-linoléoylglycérophosphosérine, 1- oléoylglycérophosphoglycérol, 1-palmitoléoylglycérophosphocholine, glutathion réduit, 15 glutathion oxydé, choline et acide urique. Dans un tel autre mode de réalisation, « un métabolite de référence » peut inclure au moins un composé choisi parmi : un composé généré par le métabolisme du nicotinamide (niacinamide) ; un composé généré par le métabolisme du nicotinamide adénine 20 dinucléotide (NAD) ; un composé généré par le métabolisme du nicotinamide mononucléotide (NMN) ; le métabolisme de l'acide mononucléotide nicotinique (NaMN) ; et des vitamines B3. Les mesures peuvent être exprimées comme le rapport du NAD à sa forme réduite, le NADH ou comme un rapport du NADPH à sa forme oxydée, NADP (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate). 25 Dans un tel autre mode de réalisation, « un métabolite de référence » peut inclure au moins un composé choisi parmi : un composé généré par du fructose, du galactose et le métabolisme du galactose tel que le sorbitol, le mannitol, le mannitol- 1 -phosphate. 30 Dans un tel autre mode de réalisation, « un métabolite de référence » peut inclure au moins un composé choisi parmi : un composé généré par le métabolisme du glycogène, tel que le maltohexaose, le maltopentaose, le maltotétraose, le maltotriose ou le maltose. Dans un tel autre mode de réalisation, « un métabolite de référence » peut inclure au moins un composé choisi parmi : un composé généré par le métabolisme du glucose, tel que le lactate, le pyruvate, le glucose- 1 -phosphate, le glucose-6-phosphate, le fructose-65 phosphate ou le 3-phosphoglycérate. Les techniques métabolomiques peuvent être utilisées pour identifier des composés nouveaux et non-nommés. Les procédés sont décrits dans au moins le brevet des États-Unis 7,884,318; Evans et al., 2009, Analytical Chemistry 81: 6656-6667; et Lawton et al., 2008, Pharmacogenomics 9: 383-397. 10 Des techniques de profilage métabolomique sont décrites plus en détails dans les exemples énoncés ci-dessous comme dans les brevets des États-Unis N°. 7,005,255, US7,329,489 ; US7,550,258 ; US7,550,260 ; US7,553,616 ; US7,635,556 ; US7,682,783 ; US7,682,784 ; US7,910,301 et US7,947,453. 15 Les métabolites peuvent être identifiés en utilisant des techniques analytiques telles que décrites et quantifiées depuis des extraits dérivés des échantillons brossés et de bandes en ruban. La métabolomique se réfère à l'expression des métabolites dans un organisme vivant. Tel qu'il 20 est utilisé ici, le terme « métabolite » signifie toute substance produite par le métabolisme ou nécessaire pour ou prenant part à un procédé métabolique particulier. Le terme ne comprend pas de grandes macromolécules, telles que de grandes protéines (par exemple, des protéines avec des poids moléculaires de plus de 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, ou 10,000) ; de grands acides nucléiques (par exemple, des acides nucléiques avec des poids 25 moléculaires de plus de 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, ou 10,000) ; ou de grands polysaccharides (par exemple, des polysaccharides avec un poids moléculaires de plus de 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, ou 10,000). Le terme métabolite comprend des molécules de signalisation et des intermédiaires dans les réactions chimiques qui transforment l'énergie issue de la nourriture en des formes disponibles 30 comprenant, mais sans se limiter à: sucres, acides gras, acides aminés, nucléotides, antioxydants, vitamines, co-facteurs, lipides, intermédiaires formés pendant les processus cellulaires, et autres petites molécules. Mesure du pH aux grandes lèvres, petites lèvres et anneau hyménal Une personne du métier ne peut être restreinte par cette description. Le pH peut être mesuré en utilisant un papier pH disponible dans le commerce ou une sonde pH à tête plate. Des exemples non-limitants de papier pH ou bandelettes pH incluent des papiers pHydrion (plage 3,0-5,5 ; Hydrion MicroEssentials Laboratory Inc., New York, New York, EAU) et les bandelettes d'essai de diagnostic pHion (plage 4,5-9,0 ; iHerb.com). Un exemple non-limitant d'une sonde pH à tête plate inclut, par exemple, la SkinCheck HI-98109 (Hanna Instruments, Woonsocket, Rhode Island, USA). Le pH peut être mesuré en utilisant une bandelette pH et en maintenant la bandelette pH en utilisant une pince pour placer la bandelette pH en contact avec la zone désirée pendant 30 secondes. La procédure pour utiliser la sonde pH est la suivante. 1. Avant d'utiliser la sonde pH, retirer le capuchon protecteur et conditionner l'électrode en trempant l'extrémité (préférablement moins de 5 cm/2 pouces de l'extrémité inférieure, plus préférablement moins de 3 cm/1,5 pouces de l'extrémité inférieure) dans une solution tampon fraiche à pH 7 (par exemple solution HI7007P des instruments Hanna) pendant 1 heure à aussi longtemps que 24 heures. Durant la période de conditionnement, la sonde devrait être en position « inactivée ». 2. Calibrer la sonde pH. Mettre la sonde pH en marche. Premièrement, rincer la sonde conditionnée dans de l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée désionisée. Tremper l'extrémité de l'électrode de la sonde dans un tampon à pH 7 (un tampon qui ait moins de 30 jours, de préférence un tampon frais). Laisser la lecture se stabiliser (c'est-à-dire, préférablement moins de 1 heure, plus préférablement moins de 15 minutes). Après la stabilisation de la lecture, utiliser un petit tournevis pour ajuster à un pH 7,00 +/- 0,02 avec le trimmer (vis gauche supérieure lorsque l'on regarde l'affichage de l'électrode) afin de lire 7,00. Rincer l'extrémité de l'électrode à l'eau (c'est-à-dire, de l'eau distillée, de préférence eau distillée désionisée), éliminer l'excédent, et répéter le processus en utilisant un tampon frais à pH 4,0 (par exemple une solution HI70004P issue de Hanna Instruments). Laisser la lecture se stabiliser (c'est-à-dire, préférablement moins de 1 heure, plus préférablement moins de 15 minutes). Après que la lecture se soit stabilisée, utiliser un petit tournevis pour ajuster à un pH 4,00 +/- 0,02 avec le trimmer (supérieur droit lorsque l'on regarde l'affichage de l'électrode) afin de lire 4,00. Le mètre est prêt pour prendre des mesures. L'extrémité de la sonde peut être laissée dans les solutions de tampon (préférablement moins de 5 cm/2 pouces de l'extrémité inférieure, plus préférablement moins 3 cm/1,5 pouces de l'extrémité inférieure) jusque pendant 2 heures. 3. Mesures. L'interrupteur du pH-mètre doit être sur ACTIVÉ. Rincer l'extrémité de l'électrode à l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée désionisée, et permettre à l'excèdent d'eau de s'égoutter ou ôter doucement l'excédent. Maintenir l'extrémité de l'électrode à 45-135 degrés de la surface de la peau, de préférence 60-120 degrés de la surface de la peau, et plus préférablement 75-105 degrés de la surface de la peau. Laisser l'affichage de la sonde pH se stabiliser pendant moins de 15 minutes, de préférence moins de 5 minutes, plus préférablement moins de 1 minute. Après usage, rincer l'extrémité de l'électrode à l'eau (c'est-à-dire, à l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée désionisée), éliminer l'excédent et commencer à prendre une mesure à un autre site urogénital du même sujet. Si la sonde n'est pas utilisée immédiatement, la sonde peut être rincée à l'eau (c'est-à-dire, de l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée désionisée) et transférée dans un bain de tampon de soit pH 4,0 ou 7,0 jusqu'à utilisation pour un maximum de 2 heures. 4. Après usage ou entre sujets. Après l'utilisation du pH-mètre, tourner le commutateur du mètre en position INACTIVÉE. Pour soit stocker la sonde pH ou l'utiliser sur un autre sujet, il est nécessaire de décontaminer ou de désinfecter la sonde pH. Cela est effectué en choisissant une de deux manières préférables. Une manière est d'immerger la sonde (préférablement moins de 5 cm/2 pouces de l'extrémité inférieure, plus préférablement moins de 3 cm/1,5 pouces de l'extrémité inférieure) dans 70 % d'alcool isopropylique, préférablement pendant 20 à 40 minutes, plus préférablement pendant 25 à 35 minutes. La sonde est ensuite rincée à l'eau (c'est-à-dire, de l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée désionisée) et recalibrée. De façon alternative, on peut utiliser un essuie-main germicide (Sani- Cloth HB sans alcool de PDI, Orangeburg, New York, USA) ou un pulvériseur (Citrex Hospital Spray Disinfectant from Cardinal Health, Columbus, Ohio, USA). Après application, attendre de 3 à 5 minutes, préférablement 3-4 minutes, plus préférablement de 2,5 à 4 minutes. Cela est suivi par le rinçage à l'eau (c'est-à-dire, de l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée désionisée), et un recalibrage. Pour stocker la sonde pH après la décontamination, rincer la sonde à l'eau (c'est-à-dire, de l'eau distillée, de préférence de l'eau distillée désionisée), éliminer l'excédent, et soit placer le capuchon protecteur sur l'extrémité de la sonde ou ajouter une à 10 gouttes de solution de stockage HI 70300 (Hanna Instruments) dans le capuchon protecteur avant de le placer sur la pointe de la sonde. La sonde pH ou les bandelettes pH peuvent être utilisées pour mesurer le pH aux grandes lèvres extérieures, aux grandes lèvres intérieures, aux petites lèvres, et à l'anneau hyménal. Pour les mesures aux lèvres et à l'anneau hyménal, la sonde pH est préférée, tandis que pour le vagin il y a une préférence pour la bandelette pH. Pour les mesures aux lèvres, la sonde ou la bandelette peut être placée au milieu (entre postérieur et antérieur) du site anatomique. Pour les mesures à la zone hyménale, la sonde pH est presque perpendiculaire à ou peut varier de 45° à 1350 du site anatomique. Mesurer la sensibilité de l'introïtus avec une brosse douce et des analyses biochimiques Le procédé peut en outre inclure un procédé pour mesurer la sensibilité de l'introïtus en utilisant un outil doux, tel que, par exemple, une brosse. Des exemples de brosses comprennent des brosses rondes telles que, par exemple, des brosses MasterAmp Buccal provenant d'Epicentre Biotechnologies (Madison, Wisconsin, USA). Les brosses doivent être douces au tissu, tel que défini par le bord des poils, la longueur des poils et la dureté des poils. Les brosses peuvent être placées en contact avec l'anneau hyménal comme un moyen pour mesurer la sensibilité et/ou un moyen pour prélever un échantillon de tissu biologique sur la brosse. Le procédé comprend la mise en contact de la brosse avec l'anneau hyménal. La mise en contact avec l'anneau hyménal se fait pendant au moins 1 seconde. La mise en contact de la brosse avec l'anneau hyménal peut inclure les étapes suivantes : placer le sujet dans une position de telle sorte que la sonde d'essai puisse être correctement 30 placée, exposer l'anneau hyménal, tenir le manche de brosse et placer la brosse en contact léger avec le tissu hyménal à une force entre 1 psi (6,9 kPa) et 0,01 psi (69 Pa), telle que par exemple, inférieure àl psi (6,9 kPa), inférieure à 0,5 psi (3,4 kPa), ou inférieure à 0,1 psi (690°Pa) et déplacer la brosse à travers la zone désirée du tissu pour un prélèvement de tissu. Avant la mise en contact de la brosse avec l'anneau hyménal, le sujet devra être placé dans une position telle que la sonde d'essai puisse être correctement placée. Dans de nombreux cas, mais sans y être limité, cela devrait être réalisé sur un lit d'examen gynécologique. Ce lit a la capacité d'ajuster la position du sujet. Une fois que le sujet est correctement positionné, écarter les lèvres de sorte que la zone hyménale soit exposée. La prochaine étape consiste à saisir le manche de la brosse, insérer et poser la brosse (Brosse 10 MasterAmp Buccal provenant dEpicentre Biotechnologies) à n'importe quel endroit le long de l'anneau hyménal, de préférence aux positions 3 ou 6 ou 9 ou 12 heures. Pour déterminer la sensibilité à une brosse, on peut tenir l'extrémité du manche en plastique entre l'index et le pouce et avec un mouvement rotatif tournoyant, faire tourner la brosse de 1 à 25 cycles sur la surface du tissu, de préférence de 2 à 15 cycles, plus préférablement de 15 3 à 10 cycles. Chaque cycle prendra moins de 5 secondes, de préférence moins de 2 secondes. Une fois que la brosse a été mise en contact avec l'anneau hyménal, la brosse doit être retirée et coupée de telle sorte que la brosse finisse dans un flacon de ramassage (tubes micro centrifuge Bio Plas (Bio Plas 4204) et coiffes à visser avec des anneaux en forme 20 de 0 (Bio Plas 4215R) provenant de VWR, (VWR International LLC, Radnor Pennsylvania, USA) tubes coniques bordés #20170-710 et VWR 20170-770) et, au moyen d'une coiffe à visser le flacon est fermé. Le flacon peut ensuite être placé dans de la neige carbonique et peut être stocké dans un congélateur à -70 °C (ou moins) jusqu'à une durée de six mois. 25 Un ou plusieurs échantillons de brosse peuvent être recueillis, tel que, par exemple, l'on puisse répéter le processus entre 2-10 fois, de préférence 2 à 5 fois. Les échantillons de brosse peuvent être extraits pour mesurer les protéines, l'ADN, le glycogène, l'histamine, la cytokine, et les métabolites. Le procédé peut en outre inclure que le consommateur remplisse un questionnaire sur 30 l'expérience. Le questionnaire peut inclure des questions relatives à la sécheresse vaginale. Le questionnaire peut confirmer si le consommateur sent la brosse et si le contact a été désagréable. Le questionnaire peut demander au consommateur de décrire la sensation. Le questionnaire peut en outre poser des questions à propos de sujets tels que, par exemple, sécheresse de la peau génitale, sécheresse vaginale, démangeaison de la peau génitale, démangeaison vaginale, difficultés pour avoir des rapports, et des combinaisons de ceux-ci. Le questionnaire peut demander au consommateur d'évaluer les aspects du contact avec la brosse, tel que, par exemple, un niveau de désagrément. Les évaluations peuvent se baser sur une échelle de 1 à 10, où un représente ne ressentir aucune sensation et 10 représente la plus forte sensation. Comme mentionné ci-dessus, les brosses peuvent être analysées pour mesurer les protéines, l'ADN, le glycogène, l'histamine, la cytokine, et les métabolites. Les brosses peuvent être analysées pour la teneur en glycogène en utilisant le kit d'essai de glycogène EnzyChromTM (BioAssay Systems, Hayward, Californie, USA). Le kit d'essai de glycogène EnzyChromTM utilise un seul réactif de travail qui combine la dégradation enzymatique (hydrolyse) du glycogène via l'a-amylase et l'amyloglucosidase avec l'oxydation du glucose par la glucose oxydase et la détection du peroxyde d'hydrogène via un réactif colorant colorimétrique/fluorogénique (provenant de la fiche de données de sécurité du matériel accompagnant le kit d'essai de glycogène EnzyChromTm). L'intensité de la couleur du produit de la réaction à une longueur d'ondes de 570 nm, ou l'intensité de fluorescence à Xeven, = 530/585 nm est directement proportionnelle à la concentration de glycogène dans l'échantillon (Zhou M et al. Analytical Biochem 253:162-168, 1997). Les concentrations de glucose dans les échantillons sont déterminées par l'ajout d'un réactif blanc d'échantillon contenant la glucose oxydase et le colorant sans les enzymes d'hydrolyse. La teneur en glycogène est déterminée par la soustraction du glucose libre à partir du glucose total (glycogène + glucose libre). Une courbe de calibration est générée en utilisant une solution de base pour préparer des concentrations croissantes de glycogène, exprimées en microgrammes par millilitre (lig/mL). Trois échantillons de contrôle de qualité (CQ élevé, CQ moyen et CQ faible) préparés à partir de la solution de base sont utilisés pour suivre la performance des essais durant l'analyse d'échantillons. Prélèvement d'une biopsie L'ensemble de procédés peut également inclure le prélèvement d'une biopsie à partir des grandes lèvres, petites lèvres ou de l'introïtus. La biopsie peut être utilisée pour une analyse histologique, une analyse biochimique ou une analyse transcriptomique. Pour prélever la biopsie, la surface de la peau est nettoyée en premier avec de la Bétadine et ensuite anesthésiée avec un anesthésique topique tel que, par exemple, la lidocaïne d'approximativement 0,05 à 4 ml/cm2. L'anesthésique doit être placé juste en-dessous de la zone où s'effectue la biopsie. Une fois que l'anesthésique a endormi la zone, la surface est nettoyée avec de l'alcool. Les biopsies de la peau peuvent être prélevées par un médecin qualifié en utilisant un instrument de biopsie Tischler Morgan (disponible chez Gynex Corporation, Redmond, Washington, USA) en utilisant des techniques aseptiques standards suivies par une fermeture par suture, si nécessaire. Si nécessaire, des mesures supplémentaires peuvent être utilisées pour l'hémostase. Une suture par fils résorbables peut être utilisée dans cette procédure et on s'attend à ce qu'elle s'absorbe naturellement de telle sorte que le retrait de cette suture ne sera pas nécessaire. La zone de la biopsie peut être traitée au polysporin et couverte avec un tampon de gaze ou un pansement pour lésion médical. Une visite post-chirurgicale peut être prévue pour chaque sujet afin d'observer la cicatrisation du site où a été effectuée la biopsie. Il est entendu que plus d'une biopsie peut être prélevée. Les échantillons de biopsie peuvent être traités selon la procédure suivante. Les échantillons de biopsie peuvent être utilisés pour une évaluation histologique en transférant en premier la biopsie dans un pot préalablement étiqueté contenant du formol (formol neutre tamponné à 10 %, VWR 89370-094 ou équivalent). L'échantillon peut être conservé dans le formol durant la nuit et ensuite transféré dans une cassette en plastique contenant de l'éthanol à 70 % pour une inclusion dans la paraffine, une coupe et une coloration éventuelles (par exemple, mais sans se limiter à, l'hémotoxyline/éosine). La biopsie peut également être congelée pour une coupe et une coloration congelées éventuelles. Les échantillons de biopsie peuvent être utilisés pour une analyse transcriptomique en transférant en premier la biopsie dans une solution de RNALater (Life Technologies Cat#AM7021, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) suivi par une immersion dans une solution saline tamponnée par phosphate (Life Technologies Cat. #10010031 ou équivalent) et ensuite séchés avec un Kimwipe® (produit par Kimberly Clark Corporation, Irving, Texas, USA). L'échantillon peut être ensuite transféré dans un tube Eppendorf de 1,5 ml (VWR Cat#022363204) et au bouchon fermé et placé dans un bain de neige carbonique et d'éthanol ou dans un congélateur à -70 °C (ou plus froid) jusqu'au processus d'ARN. Les échantillons de biopsie peuvent être utilisés pour une évaluation histologique et une analyse transcriptomique. L'évaluation histologique peut être réalisée selon la procédure suivante : 1. Après les traitements au formol et à l'éthanol, le tissu peut être nettoyé avec du xylène (VWR Cat# MK866802 ou équivalent) et ensuite être emballé dans de la paraffine dans un moule de base et laissé se solidifier. Après le refroidissement du bloc de tissu sur la plaque froide et son retrait du moule de base, il est placé dans un congélateur (environ -4°C) jusqu'à sa découpe. Retirer le tissu du congélateur et maintenir à froid sur glace dans un bac à glaçons (ou équivalent). Tailler le bloc et couper des sections d'épaisseur de 3-4 jim en utilisant un microtome (Leica RM2125 RTS, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Allemagne ou équivalent). Les sections peuvent être placées dans un bain d'eau et toute pliure ou ride éliminée. On peut placer les sections sur une lame de microscope chargée positivement (VWR Cat# 89500-498 ou équivalent) et laisser l'excès d'eau s'écouler ou drainer des lames. Les lames sont chargées sur un plateau de coloration Ventana Symphony et sont colorées pour l'hémotoxyline et l'éosine (H&E), ou d'autres colorations histochimiques désirables (tel que PAS, Trichrome, et autres) ou des colorations immunologiques (tel que Ki67, CD3, S100, et autres) en utilisant le système Ventana Symphony (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona, USA). Les échantillons de biopsie, les échantillons de brosse ou les échantillons de bandelettes peuvent être extraits pour mesurer les protéines, l'ADN, le glycogène, l'histamine et les métabolites. Mesure du glycogène Les brosses peuvent être analysées pour la teneur en glycogène en utilisant le kit d'essai de glycogène EnzyChromTM (BioAssay Systems, Hayward, Californie, USA). Le kit d'essai de glycogène EnzyChromTM utilise un seul réactif de travail qui combine la dégradation enzymatique (hydrolyse) du glycogène via l'a-amylase et l'amyloglucosidase avec l'oxydation du glucose par la glucose oxydase et la détection du peroxyde d'hydrogène via un réactif colorant colorimétrique/fluorogénique (provenant de la fiche de données de sécurité du matériel accompagnant le kit d'essai de glycogène EnzyChromTm). L'intensité de la couleur du produit de la réaction à une longueur d'ondes de 570 nm, ou l'intensité de fluorescence à 2ex/em = 530/585 nm est directement proportionnelle à la concentration de glycogène dans l'échantillon (Zhou M. et al. Analytical Biochem 253:162-168, 1997). Les concentrations de glucose dans les échantillons sont déterminées par l'ajout d'un réactif blanc d'échantillon contenant la glucose oxydase et le colorant sans les enzymes d'hydrolyse. La teneur en glycogène est déterminée par la soustraction du glucose libre à partir du glucose total (glycogène + glucose libre). Une courbe de calibration est générée en utilisant une solution de base pour préparer des concentrations croissantes de glycogène, exprimées en microgrammes 10 par millilitre (Ftg/mL). Trois échantillons de contrôle de qualité (CQ élevé, CQ moyen et CQ faible) préparés à partir de la solution de base sont utilisés pour suivre la performance des essais durant l'analyse d'échantillons. Les réactifs suivants peuvent être utilisés dans l'analyse du glycogène : 1) Kit d'essai du glycogène EnzyChromTM, Systèmes Biotest, Catalogue #E2-GN-100. 15 Stocker le kit congelé à -20 °C pour une durée maximale de 6 mois. Le kit contient les réactifs suivants : a) Tampon d'essai, 12 mL b) Réactif de coloration, 120 j.t1., c) Enzyme A (a-Amylase, Amyloglucosidase), séché 20 d) Enzyme B (Glucose Oxydase), 120 !IL e) Standard d'amidon, 50 mg/mL, 50 1..tL ; 2) Eau, purifiée par le système de filtration Millipore Milli-Q (Merck Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) ; ou équivalent ; 3) 5M chlorure de sodium (NaC1), catalogue Sigma-Aldrich #S5150, Sigma-Aldrich 25 Corp., St. Louis, Missouri, USA ; ou équivalent ; 4) Comprimés d'un mélange d'inhibiteurs de protéase, COMPLETETm, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne, catalogue #11-697-498-001. 5) Paquets de tampons de solution saline tamponnée par phosphate (PBS), Sigma-Aldrich Corp., Catalogue #P3813. Diluer 1 paquet de tampons de PBS dans 1 litre d'eau. Stocker la 30 solution PBS à température ambiante pendant un maximum de 1 mois ; ou 6) Tampon d'extraction (`EB', PBS+0,25 M NaC1+ inhibiteurs de Protéase). Ajouter 50 mL de 5 M de NaCl (Réactif #3) à 950 mL de PBS pour préparer 0,25M de NaCl. Filtrer le réactif en utilisant une fiole filtrante de 0,2 im (unité de filtre à vide, stérile, catalogue Nalgene 567-0020 ou équivalent, Nalge Nunc International Corporation, Rochester, New York, USA). Dans cette solution, dissoudre 20 comprimés d'inhibiteurs de protéase (réactif #4) par 1000 mL Stocker la solution à température ambiante pendant un maximum de 1 mois. Préparation d'échantillons de brosse pour mesurer le glycogène Les étapes suivantes peuvent être utilisées pour préparer des échantillons pour mesurer le glycogène. 1. Retirer les tubes de polypropylène contenant des échantillons de brosse du congélateur à -70 °C. 2. Ajouter le tampon d'extraction (EB, Réactif # 6) à chaque tube de polypropylène : a) Aliquote 1,5 mL EB à chaque tube. b) Replacer chaque bouchon à visser, bien resserrer les bouchons. 3. Soniquer les flacons dans un bain de glace (4-10 °C) pendant approximativement 30 minutes (Ultrasonic Cleaner, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, Connecticut, USA ; ou équivalent). 4. Tourbillonner les tubes pendant 10 secondes en utilisant un vortex multi-tubes (MultiTube Vortexer, VWR Catalogue # VX2500 ; ou équivalent). 5. Utiliser des pinces qui ont été lavées avec des lingettes germicides (Sani-Cloth® Plus, PDI, Inc., Catalogue #Q89072; ou équivalent), prendre et retirer les échantillons de brosse de chaque tube, tout en pressant la brosse contre l'intérieur du tube pour enlever tout fluide résiduel. Essuyer les pinces avec des tissus germicides jetables, et sécher à l'air avant de manipuler le prochain échantillon de brosse. 6. Centrifuger l'extrait pendant 5 minutes à 3000 tours/min (température ambiante ; Allegra X-12R, Beckman-Coulter, Fullerton, Californie, USA ; ou équivalent). 7. Transférer les extraits dans des plaques à puits profonds : a) Décapuchonner chaque tube d'extrait. b) Placer les tubes en rangée de tubes dans le portoire pour tubes de gestionnaire de liquides (du gestionnaire automatisé de liquides) en ordre selon le modèle de plaque. c) En utilisant le gestionnaire automatisé pour liquides (JANUS, Perkin-Elmer, Packard MultiPROBE ; ou équivalent), transférer une aliquote du surnageant (après l'étape de centrifugation, l'aliquote devrait se rapprocher de ce qui est nécessaire pour une mesure adéquate du glycogène, un exemple peut être une aliquote de 2501.1L) dans une plaque vide à 96 puits profonds de 2 ml (Axygen Scientific, Catalogue #P-DW-20-C ; ou équivalent, Corning Inc., Corning New York, USA) pour glycogène. En fonction des résultats, c'est-à-dire, une concentration de glycogène trop élevée, il pourrait être nécessaire de diluer l'échantillon de surnageant. d) Fermer les opercules des capuchons de façon sécurisée sur les plaques à puits profonds (Titer Plate shaker, Lab-line Instruments, Inc., catalogue VWR #570190600 ou équivalent). e) Tourbillonner les plaques à puits profonds durant 10 secondes en utilisant un vortex multi-tubes. f) Congeler les plaques à puits profonds et les tubes contenant les extraits à - 70 °C ou moins pour les analyses ultérieures. 8. Si une deuxième extraction est effectuée, placer les brosses extraites dans d'autres tubes de polypropylène et répéter les étapes 2-7. Essai du glycogène 1) Équilibrer les réactifs d'essai et étudier les extraits des échantillons à température ambiante (20-25 °C) sur le plan de travail. **Pendant l'expérience, maintenir les enzymes fondues du kit d'essai EnzyChromTM sur glace ou réfrigérées (2-8 °C). 2) Reconstituer l'enzyme A. a. Ajouter 120 III- du tampon d'essai au flacon d'enzyme A séchée b. Tourbillonner le flacon pour une dissolution complète. 3) Préparer les standards de Iravail. Diluer 50 mg/mL de standard d'amidon dans le tampon d'extraction (EB) comme suit pour préparer les standards de travail. Tourbillonner après chaque dilution pour mélanger la solution. Stdl = 200iag/m1 de glycogène = 101.1L de standard d'amidon (50 mg/mL) + 2,49 mL d'EB Std2 = 150 i.t.g/m1 de glycogène = 300 j.iL de 200 ug/m1 de glycogène + 100 !IL d'EB Std3 = 100 ig/mi de glycogène = 200 gL, de 200 mg/m1 de glycogène + 200 gL, d'EB Std4 =50 .tg/ml de glycogène = 200 !ut de 1001.1g/m1 de glycogène + 200 ML d'EB Std5 = 25 lig/mi de glycogène = 200 ML de 50 g/m1 de glycogène + 200 ML d'EB Std6 = 12,5 mg/m1 de glycogène = 200 ML de 25 g/mi de glycogène + 200 ML d'EB Std7 = 6,25 l.tg/m1 de glycogène = 200 ML de 12,5 g/m1 de glycogène + 200 ML d'EB Std8 = 3,125 g/rn1 de glycogène = 200 1.11_, de 6,25 m.g/m1 de glycogène + 200 ML d'EB Blanc = EB 4) Préparer les CQ des essais de glycogène QCE = 80pg/m1 de glycogène = 80 ML de 200 itg/m1 de glycogène + 120 g, d'EB QCM = 40pg/m1 de glycogène =40 Mt, de 200 mg/m1 de glycogène + 160 lit d'EB LQC = 10pg/m1 de glycogène =50 pi, de QCM + 150 ML d'EB 5) Tourbillonner la plaque aux puits profonds des extraits d'échantillons en utilisant un vortex multi-tubes (30 sec, vitesse #7) 6) Ajouter 10 uL de Standard, CQ d'essai ou échantillons d'étude en double pour chaque puits de la plaque d'essai (plaque à fond plat à 96 puits en polystyrène transparent ; catalogue Becton Dickinson #3072, (Becton Dickinson et Company, Franklin Lakes, New Jersey, USA) ou équivalent) en utilisant une pipette de 10 MLà canal unique selon le modèle de plaque à 96 puits. 7) Préparer le réactif de travail (suffisamment pour 64 puits) en ajoutant 70 Mt d'enzyme A + 70 pl, d'enzyme B + 70 ML de réactif colorant à 6,3 mL de tampon d'essai. 8) Préparer le réactif témoin de l'échantillon (suffisamment pour 32 puits) en ajoutant 40 MI, d'enzyme B + 401.1L de réactif colorant à 3,6 mL tampon d'essai. 9) Ajouter 90 uL de réactif de travail à chaque standard, CQ d'essai et puits d'échantillon de la plaque d'essai en utilisant un pipetteur électronique multi-canaux en mode multi-distribution (2 X 90 FIL) 10) Ajouter 90 uL de réactif témoin de l'échantillon à chaque puits de blanc d'échantillon (Pas d'enzyme A), comme indiqué en rouge sur le modèle de plaque d'essai, en utilisant un pipetteur électronique multi-canaux en mode multidistribution (2 X 90 'IL). 11) Mélanger la plaque d'essai sur le secoueur de plaque à titrage mis à la vitesse 5 pendant 10 secondes. 12) Couvrir la plaque avec un couvercle en plastique ; incuber sur le plan de travail pendant 30 min. à température ambiante (20-25 °C) 13) Mesure de la densité optique: Lire la plaque à une longueur d'ondes de 570 nm avec un lecteur de microplaque contrôlé par ordinateur (SpectraMax 340PC384, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, Californie, USA; ou équivalent). Les données sont générées en utilisant un logiciel de lecteur de plaque correspondant (SOFTmax® PRO Software pour lecteurs de microplaques, SOFTmax® PRO pour Windows, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, Californie, USA; ou équivalent). Les paramètres de lecteur de plaque suivants sont recommandés : Paramètres d'instrument : Mode : Endpt Li Longueur d'onde : Li : 570 nm Mélange Auto : ACTIVÉ Analyse des données : Calculs statistiques : Les contrôles standards et de qualité sont testés dans des puits doubles, entraînant des valeurs de densité optique (DO) doubles. Les résultats de DO sont reportés comme la moyenne (moyenne) des valeurs de DO doubles. L'algorithme de régression pour l'analyse de données est un ajustement quadratique de la concentration nominale des standards de calibration et des valeurs moyennes de DO. %CV (Coefficient de variation) = (Déviation standard/moyenne DO)*100 % % Biais (Applicable aux standards et aux CQ uniquement) = ((Concentration calculée - Concentration nominale)/Concentration nominale)*100 % Détermination du glycogène : S'il y a une possibilité que les échantillons contiennent du glucose, les puits de blanc d'échantillons séparés devraient être préparés sans qu'ils contiennent le réactif d'enzyme A. Pour calculer la concentration de glycogène dans chaque échantillon, soustraire la concentration de glucose déterminée dans chaque puits de blanc d'échantillon (sans enzyme A) de la concentration totale de glycogène + glucose déterminée dans le puits de l'échantillon correspondant (enzyme A + enzyme B) : [Glycogène]échantillon = [Glycogène + Glucose 'échantillon - [Glucose]échantillon Mesure des protéines La mesure des protéines peut être réalisée en utilisant les réactifs suivants : 1) Réactif A d'essai de protéines BCATM de Pierce, Thermo Scientific, Catalogue #23223, 1000 mL contenant du carbonate de sodium, du bicarbonate de sodium, de l'acide bicinchoninique et du tartrate de sodium dans 0,1 M d'hydroxyde de sodium. 2) Réactif B d'essai de protéines BCATM de Pierce, Thermo Scientific, Catalogue #23224, 25 mL contenant 4 % de sulfate de cuivre. 3) Standard d'albumine, 2 mg/mL, Thermo Scientific, Catalogue #23210, 50 mL, contenant de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 2,0 mg/mL dans solution saline de 0,9 % et azoture de sodium de 0,05 %. 4) Eau, purifiée par le système de filtration Millipore Milli-Q ; ou équivalent 5) 5M de chlorure de sodium (NaCl), catalogue Sigma #S5150 ; ou équivalent. 6) Comprimés d'un mélange d'inhibiteurs de protéase, COMPLETETm, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne, catalogue #11-697-498-001. 7) Paquets de tampons de solution saline tamponnée par phosphate (PBS), Sigma, Catalogue #P3813. Diluer 1 paquet de tampons de PBS dans 1 litre d'eau. Stocker la solution PBS à température ambiante pendant un maximum de 1 mois. 8) Albumine de sérum bovin (BSA), 30 % Sigma, Catalogue #A8577 ; ou équivalent. 9) Tampon d'extraction ('EB', PBS+0,25M NaC1+ inhibiteurs de Protéase). Préparer la solution PBS (Réactif #5). Ajouter 50 mL de 5 M de NaCl (Réactif #3) à 950 mL de PBS pour préparer 0,25 M de NaCl. Filtrer en utilisant une fiole filtrante de 0,2 im. Dans cette solution, dissoudre 20 comprimés d'inhibiteurs de protéase (réactif #4) par 1000 mL. Stocker la solution à température ambiante pendant un maximum de 1 mois. PROCÉDURE Répéter les étapes 1 à 6 qui se trouvent ci-dessus de « Préparation des échantillons de brosse pour mesurer le glycogène » Après l'étape 6 de la « Préparation des échantillons de brosse pour mesurer le glycogène », transférer les extraits dans les plaques à puits profonds : 1. Décapuchonner chaque tube d'extrait. 2. Placer les tubes dans le support multi-sondes dans l'ordre du modèle des plaques. 3. En utilisant le gestionnaire automatisé pour liquides, transférer une aliquote du surnageant (après l'étape de centrifugation, l'aliquote devrait se rapprocher de ce qui est nécessaire pour une mesure adéquate de protéines, un exemple peut être une aliquote de 2501.11.) dans une plaque à 96 puits profonds de 2 ml vide. En fonction des résultats, c'est-à-dire, une concentration de protéines trop élevée, il pourrait être nécessaire de diluer l'échantillon de surnageant. 4. Fixer les opercules des capuchons de façon sécurisée sur les plaques à puits profonds. 5. Tourbillonner les plaques à puits profonds durant 10 secondes en utilisant un vortex multi-tubes. 6. Congeler les plaques à puits profonds à -70 °C ou moins pour des analyses ultérieures. ESSAI 1) Préparer les standards d'albumine de sérum bovin (BSA) a) Préparer une solution de stockage de BSA de 1 mg/mL en ajoutant 12 mL de standard d'albumine à 2 mg/mL (réactif #3) à 12 mL du tampon d'extraction (EB, réactif #9). b) Préparer une solution de stockage de BSA intermédiaire à 400 gg/mL comme suit : InterStock, 400 pWmL = 16 mL de 1 mg/mL de BSA +24 mL de EB. Volumes d'aliquote de 1 mL dans des tubes pré-étiquetés et congeler à -80 °C jusqu'au jour d'analyse. c) Pour préparer les standards de BSA, effectuer une série de dilutions de facteur 2 d'InterStock (400 Idg/mL). Bien tourbillonner après chaque dilution. Le volume restant de 500 pi, de chaque standard est suffisant pour exécuter 4 plaques dans des puits doubles. Stdl, 200 pg/mL = 500 pL de 400 pg/mL + 500 pL de EB Std2, 100 pg/mL = 500 pL de 200 tg/mL + 500 pL de EB Std3, 50 pg/mL = 500 pL de 100 1.1g/mL + 500 pL de EB Std4, 25 pg/mL = 500 ML de 50 gg/mL + 500 ML de EB Std5, 12,5 pg/mL = 500 gL, de 25 pg/mL + 500 pi., de EB Std6, 6,25 pg/mL = 500 FIL de 12,5 pg/mL + 500 pL de EB Std7, 3,125 pg/mL = 500 FIL de 6,25 pg/mL + 500 ML de EB Std8, 1,56 pg/mL= 500 Mt de 3,125 p.g/mL + 500 ML de EB Blanc = 500 pL, de EB * Note : Std 8 est utilisé comme point d'ancrage pour la courbe de calibration et ne sera pas considéré comme étalonneur. Le LLOQ du procédé est 3,125 pg/mL. 2) Préparer les essais de CO d'albumine de sérum bovin (BSA) a) Préparer les solutions de CQE, CQM et CQF comme suit: CQE, 75 pg/mL =3 mL de 1 mg/mL de BSA +37 mL de EB CQM, 4011g/mL = 1,6 mL de 1 mg/mL de BSA + 38,4 mL de EB CQF, 20 pg/mL = 800 ML de 1 mg,/mL de BSA + 39,2 mL de EB b) Aliquote de 300 mL de chaque CQ dans des tubes pré-étiquetés et congeler à - 80 °C jusqu'au jour d'analyse. 3) Préparer le réactif de travail BCATM. a) Combiner 240 pL, du réactif B de BCATM avec 12 mL du réactif A de BCATM par plaque à 96 puits (plaque à fond plat à 96 puits en polystyrène transparent ; catalogue Becton Dickinson #3072, ou équivalent). b) Bien tourbillonner. 4) Ajouter 50 pt par standards des puits et CQ en double dans une plaque d'essai en utilisant un pipetteur électronique à canal unique en un mode multi-distribution selon le plan de la plaque. Tourbillonner chaque tube avant l'addition. Tourbillonner les échantillons des plaques à puits profonds durant 30 secondes en utilisant un vortex multi-tubes. 6) Ajouter 50 'IL par puits d'échantillons inconnus en simple depuis la plaque à puits profonds dans la plaque d'essai en utilisant un pipetteur électronique à 8 canaux en mode pipette inversée selon le plan de la plaque. 7) Ajouter 100 MI, par réactif de travail de BCATM de puits (préparé à l'étape #3) en utilisant un pipetteur électronique à 8 canaux en mode multi-distribution. Couvrir avec une opercule en plastique. 8) Incuber la plaque à 39 °C pendant 45 minutes sur des blocs de chauffage à sec. (Note: La température réelle des solutions dans la plaque d'essai est d'approximativement 37 °C) Mesure de la densité optique : Lire la plaque à une longueur d'ondes de 562 nm avec un lecteur de microplaques contrôlé par ordinateur. Les données sont générées en utilisant un logiciel de lecteur de plaque correspondant. Les paramètres de lecteur de plaque suivants sont recommandés : Paramètres d'instrument : Mode : Endpt Li Longueur d'onde : Li : 562 nm Mélange Auto : ACTIVÉ ANALYSE DES DONNÉES: Calculs statistiques : Les contrôles et les standards sont testés dans des puits doubles, entraînant des valeurs de densité optique (DO) doubles. Les résultats de DO sont reportés comme la moyenne (moyenne) des valeurs de DO doubles. L'algorithme de régression pour l'analyse de données est un ajustement quadratique de la concentration nominale des standards de calibration et des valeurs moyennes de DO. %CV (Coefficient de variation) = (Déviation standard/moyenne DO)*100 % % Biais (Applicable aux standards et aux CQ uniquement) = ((Concentration calculée - Concentration nominale)/Concentration nominale)*100 % CRITÈRES D'ACCEPTATION: 1) Puits doubles (%CV) Le %CV entre les valeurs de DO doubles doit satisfaire les critères suivants : a) %CV doit être de 0,001 pour chaque puits des standards 1-7. Si les valeurs de DO dans un quelconque puits standard sont inférieures à 0,001, les échantillons doivent être réanalysés dans une expérience ultérieure. Mesure de l'histamine Cet essai est basé sur (1) US 8420054 (qui se réfère à une mesure provenant des épithéliums stratifiés et non du tissu épithélial non muqueux) et (2) Kerr, K., Schwartz, J.R., Filloon, T., Fieno, A., Wehmeyer, K., Szepietowski, J.C., et Mills, K.J.; Scalp Stratum Corneum Histamine Levels: Novel Sampling Method Reveals Association with Itch Resolution in Dandruff/Seborrhoeic Dermatitis Treatment, Acta Derm Venereol 91:404-408, 2011). Procédure Après l'étape 6 de la 'Préparation des échantillons de brosse pour mesurer le glycogène', transférer les extraits dans les plaques à puits profonds. 1. Décapuchonner chaque tube d'extrait. 2. Placer les tubes dans le support multi-sondes dans l'ordre du modèle des plaques. 3. En utilisant le gestionnaire automatisé pour liquides, transférer une aliquote du surnageant (après l'étape de centrifugation, l'aliquote devrait se rapprocher de ce qui est nécessaire pour une mesure adéquate de l'histamine, un exemple peut être une aliquote de 100 1.tL) dans une plaque à 96 puits profonds vide (plaque Axygen). En fonction les résultats, c'est-à-dire, une concentration d'histamine trop élevée, il pourrait être nécessaire de diluer l'échantillon de surnageant. 4. Des réactifs conventionnels peuvent être additionnés aux échantillons, tel que l'albumine, pour aider à prévenir la perte d'analytes aux parois des articles de laboratoire. 5. Fixer les opercules des capuchons de façon sécurisée sur les plaques à puits profonds. 6. Tourbillonner les plaques à puits profonds durant 10 secondes en utilisant un vortex multi-tubes. 7. Congeler les plaques à puits profonds à -80 °C pour des analyses ultérieures. Essai 1. Les témoins et standards d'histamine peuvent être préparés selon des procédés conventionnels. L'histamine sera quantifiée avec un kit d'immuno-essai enzymatique (EIA) pour l'histamine (Histamine EIA Kit (Distributeur américain, Cayman Chem Co. #589651/Histamine EIA kit Manufacture (France), SPbio #A05890). 2. Un tampon de lavage, un réactif de dérivatisation, un traceur d'histamine ACHe et un réactif d'Ellman peuvent être préparés selon des procédés conventionnels. 3. Les standards, les contrôles et les échantillons sont dérivatisés dans une plaque à puits profonds. 4. Les plaques sont lavées avec un tampon et les standards, les blancs, les échantillons et les contrôles de qualité sont ajoutés à la plaque et sont incubés durant 24 heures à 4 °C. 5. Les plaques sont ensuite lavées avant l'ajout d'un réactif d'Elman et l'incubation dans l'obscurité à température ambiante. 6. Les plaques peuvent être lues par spectrophotométrie standard. L'analyse des données est réalisée avec des procédés et des calculs standards statistiques. Dans un autre mode de réalisation, les extraits issus des brosses sont disposés dans une plaque à 96 puits. Chaque puits est additionné d'un standard interne d'histamine (ISTD) étiqueté avec un isotope stable (D.sub.4-histamine) et dilué avec de l'eau acidifiée. Un ensemble de standards d'histamine est préparé dans la plaque en polypropylène à 96 puits sur une plage de calibrations appropriée dans de l'eau acidifiée et est additionné d'ISTD. Les standards et les extraits de brosse sont analysés en utilisant une chromatographie liquide haute performance en phase inverse et à gradient avec une spectrométrie de masse en tandem (CLHP/SM/SM). L'histamine et l'ISTD sont suivis par électronébulisation d'ions positifs (EST). Une courbe standard est réalisée en traçant le signal, défini ici comme le rapport de la surface du pic (surface du pic de l'histamine/ surface du pic ISTD), pour chaque standard par rapport à la masse de l'histamine pour le standard correspondant. Les masses de l'histamine dans les standards de calibration et les échantillons d'extrait de brosse sont ensuite rétro-calculées en utilisant l'équation de régression générée. Le résultat peut être reporté comme la masse d'histamine ou le résultat peut être standardisé en divisant la quantité de protéine qui a été également trouvée dans l'extrait de brosse. Mesures des cytokines Tandis que la procédure décrite ici détaille un essai pour l'interleukine la (IL-1a) et l'antagoniste du récepteur d'interleukine 1 (IL-ira), des essais similaires pour d'autres interleukines, telles que I1-6, I1-8, IL-10 et d'autres (ne sont pas limités) peuvent être effectués de manière similaire. Réactifs 1. Essai Bio-Plex Pr0TM de cytokine IL-la humaine, Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, Californie, USA, Catalogue #YF0001DVXM. Le kit contient les composants suivants, tous stockés à 2 - 8 °C: a) Standard 23-Plex de cytokine humaine, Groupe II (catalogue #171-D60001), lyophilisé. b) Billes magnétiques couplées à l'IL-la (10X, catalogue #171-B600IM), 600 III, c) Anticorps de détection de l'IL- la (10X), 320 pL d) Streptavidine-Phycoérythrine, 100X; PHOTOSENSIBLE, conserver dans l'obscurité. e) Tampon d'essai, 50 mL Tampon de lavage, 130 mL (catalogue #171-304500, 1,5 L) g) Diluant d'anticorps de détection, 5 mL 2. Standard 27-Plex de cytokine humaine, Groupe I (catalogue #171-D50001), lyophilisé 3. Ensemble de Bio-Plex Pr0TM de cytokine humaine IL-ira, Laboratoires Bio-Rad, Inc., Catalogue 171B5002M. Conserver à 2 - 8 °C: a) Billes magnétiques couplées à IL-ira (10X, catalogue #171-B5002M), 600 FIL b) Anticorps de détection de FIL-ira (10X), 320 uL 4. Eau, purifiée par le système de filtration Waters Milli-Q ; ou équivalent 5. 5 M de chlorure de sodium (NaC1), catalogue Sigma #S5150 ; ou équivalent. 6. Comprimés d'un mélange d'inhibiteurs de protéase, COMPLETETm, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne, catalogue #11-697-498-001. 7. Paquets de tampons de solution saline tamponnée par phosphate (PBS), Sigma, Catalogue #P3813. Diluer 1 paquet de tampons de PBS dans 1 litre d'eau. Stocker la solution PBS à température ambiante pendant un maximum de 1 mois. 8. Albumine de sérum bovin (BSA), 30 % Sigma, Catalogue #A8577 ; ou équivalent. 9. Tampon d'extraction (`EB', PBS+0,25M de NaCI+Inhibiteurs de protéase). Préparer une solution PBS (réactif #7). Ajouter 50 mL de 5 M de NaC1 (réactif #6) à 950 mL de PBS pour préparer 0,25 M de NaCl. Filtrer en utilisant une fiole filtrante de 0,2 iam. Dans cette solution, dissoudre 20 comprimés d'inhibiteurs de protéase (réactif #6) par 1000 mL. Stocker la solution à température ambiante pendant un maximum de 1 mois. 10. Tampon d'échantillon de cytokine ('CSB' ; PBS+0,25 M de NaCl+Inhibiteurs de protéase+BSA à 2 %) Ajouter 2 mL de BSA à 30 % (réactif #8) à 28 mL de tampon d'extraction de cytokine (réactif #9). Stocker à 2 - 8 °C pendant un maximum d'une semaine. 11. Liquide de gaine Bio-Rad, 20 L, catalogue #171-000055, ou équivalent. 12. Kit de calibration Bio-Rad, catalogue #171-203060. Appareil et matériaux : 1. Gestionnaire automatisé pour liquides, Packard MultiPROBE, Perkin-Elmer ; Waltham, Massachusetts, USA, ou équivalent. 2. Système d'ensemble de suspensions Bio-Plex, Bio-Rad Laboratories, Inc. ; ou équivalent. 3. Logiciel Bio-Plex Manager pour station de travail Bio-Plex, Bio-Rad Laboratories, Inc. ; ou équivalent. 4. Station de lavage Bio-Plex Pro II (pour des essais utilisant des billes de polystyrène et magnétiques), catalogue #300-34377, Bio-Rad Laboratories, Inc. ; ou équivalent. 5. Nettoyeur à ultrasons, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, Connecticut, USA; ou équivalent. 6. Centrifuge, Allegra X-12R, Beckman-Coulter, Fullerton, Californie, USA ; ou équivalent. 7. Mélangeur Vortex, Vortex Genie-2, VWR Scientific Products Inc., Catalogue # 58815- 178 ; ou équivalent. 8. Agitateur Titer Plate, Lab-line Instruments, Inc. (VWR catalogue #57019-0600), ou équivalent. 9. Microplaques à fond plat noires à 96 puits, catalogue # 171-025001, Bio-Rad Laboratories, Inc. 10. Microplaques à fond en forme de V à 96 puits, catalogue # 651261, Greiner Bio-One International AG, Kremsmünster, Autriche ; ou équivalent. 11. Film d'étanchéité en aluminium, catalogue #PCR-AS-200, Axygen Scientific ; ou équivalent. 12. Film d'étanchéité adhésif de microplaque, catalogue WR #60941-062 ; ou équivalent. 13. Réservoirs de réactifs jetables, Vista Lab, 50 mL, catalogue VWR #802026-350; ou équivalent. 14. Pipetteurs électroniques de distribution à canal unique et à multi-canaux, pipetteurs manuels à embouts de pipettes correspondants jetables ; ou équivalent. 15. Tubes de microcentrifugation en polypropylène, 2,0 mL, Bio-Plas, Inc., San Rafael, CA, catalogue #4204 ; ou équivalent. 16. Tubes de microcentrifugation, 1,7 mL, Sorenson BioScience, catalogue #11700 ; ou équivalent. 17. Tubes de centrifugeuse coniques en polypropylène (15 ml, catalogue #352097 et 50 mL, catalogue #352098), Becton Dickinson, ou équivalent. 18. Plaques à puits profonds de 2 mL à 96 puits Nunc, catalogue VWR # 73520-474 ; ou équivalent. 19. Plaques de collection à 96 puits circulaires profonds à opercule étanche (2,0 mL), Catalogue # AM-2ML-RD Axygen Scientific ; ou équivalent. 20. Unités de filtres à vide, membrane PES, taille de pore de 0,2 inn, stérile, catalogue NALGENE #567-0020 ; ou équivalent. Procédure : Après l'étape 6 de la 'Préparation des échantillons de brosse pour mesurer le glycogène', transférer les extraits dans les plaques à puits profonds. 1. Décapuchonner chaque tube d'extrait. 2. Placer les tubes dans le support multi-sondes dans l'ordre du modèle des plaques. 3. Ajouter 40 p.L par puits de BSA à 30 % (réactif #8) dans une plaque à 96 puits profonds. 4. En utilisant le gestionnaire automatisé pour liquides, transférer une aliquote du surnageant (après l'étape de centrifugation, l'aliquote devrait se rapprocher de ce qui est nécessaire pour une mesure adéquate de la cytokine, un exemple peut être une aliquote de 250 !IL) dans une plaque à 96 puits profonds vide (plaque Axygen). En fonction des résultats, c'est-à-dire, une concentration de protéines trop élevée, il pourrait être nécessaire de diluer l'échantillon de surnageant. . Fixer les opercules des capuchons de façon sécurisée sur les plaques à puits profonds. 6. Tourbillonner les plaques à puits profonds durant 10 secondes en utilisant un vortex multi-tubes. 7. Congeler les plaques à puits profonds à -80 °C pour des analyses ultérieures. 5 Essai 1) Équilibrer les réactifs d'essai, les CQ des matrices et les échantillons de l'étude à température ambiante (20-25 °C) sur le plan de travail. 2) Préparer un tampon d'échantillon de cytokine (CSB, réactif #10) en ajoutant 2 mL de BSA à 30 % (réactif #8) à 28 mL de tampon d'extraction de cytokine (réactif #9). 3) Préparer les standards de cytokine humaine a) Reconstituer chaque flacon de standards de cytokine humaine : Groupe I (réactif #2) et groupe II (réactif #1a) avec 250 i.EL de CSB. Tourbillonner doucement chaque flacon pendant 3 secondes. Laisser les flacons incuber pendant 30 minutes sur glace. b) Pour préparer les standards de travail, effectuer des dilutions en série du cocktail standard de groupe 1/11. Bien tourbillonner après chaque dilution. Pour les concentrations du Std 1 de travail, se référer à des fiches de valeurs pour chaque lot. Std 1 = 190 ML de Cocktail du Std du groupe I + 190 lit de Cocktail du Std du groupe II +215 pl, de CSB Std 2= 150 ML Std 1 + 450 !IL vCSB Std 3 = 150 ML Std 2 + 450 ML vCSB Std 4= 150 ML Std 3 + 450 ML vCSB Std 5 = 150 ML Std 4 + 450 'IL vCSB Std 6= 150 lut Std 5 + 450 ML vCSB Std 7 = 15OMLStd6+45OMLvCSB Std 8 = 150 ML Std 7 + 450 pi, vCSB Std 9 = 150 Std 8 + 450 vCSB Blanc = CSB *Le Standard 1 est exclu (masqué) de la courbe de calibration de l'IL-lalpha, et ne sera pas pris en compte comme un étalonneur pour l'IL-lalpha. Le Standard 2 est l'ULOQ (limite supérieure de quantification) du procédé pour l'IL-lalpha. **Le Standard 9 est exclu (masqué) de la courbe de calibration de l'IL- ira, et ne sera pas pris en compte comme un étalonneur pour l'IL-lra. Le Standard 8 est la LLOQ (limite inférieure de quantification) du procédé pour l'IL- lra. Concentrations de l'étalonneur de cytokine humaine (pg/mL) - Exemple : Lot #5023535, 5 5015357 Standard Facteur de dilution IL-lalpha IL-ira Std 1 1 25358* 30137 Std 2 4 6339,5 7534 Std 3 16 1585 1883,56 Std 4 64 396,2 470,89 Std 5 256 99,05 117,7 Std 6 1024 24,76 29,43 Std 7 4096 6,19 7,36 Std 8 16384 1,55 1,84 Std 9 65536 0,3875 0,46** 4) Préparer l'essai des CQ de cytokine humaine a) Pour préparer le CQ-1 d'essai (AQC-1), ajouter 100 lat de Std 1 à 900 lai, de CSB, tourbillonner. b) Préparer la dilution à 1/100 du Std 1 en ajoutant 100 pL d'AQC-1 à 900 pL de CSB, 10 tourbillonner. c) Pour préparer le CQ-2 d'essai, ajouter 100 IaL de solution préparée à l'étape 4b à 400 'IL de CSB, tourbillonner. 5) Préparer la dilution à 1/2 des CQ des matrices en ajoutant 200 tL de chaque de QCE et QCF fraîchement dégelés à 200 itL de CSB, tourbillonner. 15 6) Préparer des billes d'anticorps immobilisés 1X, protéger de la lumière. a) Tourbillonner les flacons avec les billes à une vitesse moyenne pendant 30 secondes. Pipeter tout liquide piégé du capuchon. b) Diluer les billes 10X: 575 i_EL de billes d'IL-la (réactif #1b) + 575 pt de billes d'ILlra (réactif #3a) + 4,6 ml de tampon d'essai (Réactif #1e) ; tourbillonner. 20 c) Équilibrer pendant 20 min à température ambiante avant usage. 7) Préparer les extraits d'échantillons dilués a) Tourbillonner la plaque aux puits profonds d'extraits d'échantillons en utilisant un vortex multi-tubes pendant 30 secondes. b) Centrifuger la plaque aux puits profonds à 3000 tours/min pour retirer les débris. c) Préparer la dilution à 1/2 de l'échantillon en ajoutant 50 lit d'extraits d'échantillons à 50 ML de CSB dans une plaque d'addition au fond en forme de V selon le modèle de plaque à 96 puits en utilisant un pipetteur à 8 canaux (mode de pipette inversée). 8) Charger la plaque d'addition a) Ajouter 100 pl, de standards, de CQ d'essai et de CQ des matrices dilués à chaque puits de la plaque d'addition au fond en forme de V selon le modèle de plaque en utilisant un pipetteur à canal unique (mode multi-distribution, 2 x 100 Mt). b) Sceller avec un scellant pour plaques. 9) Préparer la station de lavage Bio-Plex Pro II. a) Remplir la bouteille 2 de liquide avec l'eau DI; Préparer le Canal 2. b) Attacher la bouteille de liquide 1 contenant suffisamment de tampon de nettoyage BioPlex à la station de lavage ; Préparer le Canal 1. 10) Ajouter les billes d'anticorps immobilisés 1X dans la plaque d'essai à fond plat noire. a) Tourbillonner les billes diluées pendant 30 secondes à une vitesse moyenne. b) Verser les billes diluées dans le réservoir du réactif et ajouter 50 pt à chaque puits de la plaque noire à fond plat en utilisant le pipetteur à 8 canaux (mode multi-distribution). 11) Laver la plaque d'essai deux fois en utilisant la station de lavage Bio-Plex Pro II a) Laisser la plaque posée sur des aimants pendant 15 secondes 20 b) Laver les puits deux fois en utilisant le programme MAG X2 c) RINCER DE JOUR avec le tampon de lavage - Canal 1. 12) Charger la plaque d'essai noire à fond plat a) Tourbillonner doucement la plaque d'addition sur l'agitateur de plaque (300 tours/min) pendant 3 secondes 25 b) Ajouter 50 pl, de Standards, de CQ d'essais, de CQ des matrices diluées, et d'extraits d'échantillons dilués à chaque puits de la plaque d'essai noire à fond plat selon le modèle de plaque en utilisant un pipetteur à 8 canaux (mode de pipette inversée). 13) Sceller la plaque d'essai avec un scellant en feuille de plaque, et incuber sur un agitateur pour plaque pendant 40 minutes à température ambiante (20-25 °C). 30 a Sceller la plaque avec un scellant adhésif en feuille pour plaque pour la protéger de la lumière. b) Augmenter lentement la vitesse de l'agitateur pour plaque jusqu'à 1100 tours/min (vitesse 10) ; mélanger pendant 30 secondes. c) Diminuer lentement la vitesse de l'agitateur pour plaque jusqu'à 300 tours/min (vitesse 3) d) Incuber sur l'agitateur pour plaque pendant 40 minutes à température ambiante (20-25 °C). 14) Préparer des anticorps de détection 1X (DAb) a) Tourbillonner des DAb 10X pendant 20s à vitesse moyenne, suivi de 30 sec. de tours rapides. b) Ajouter 300 ML de DAb 10X d'IL-la (réactif #1c) + 300 kit de DAb 10X d'IL- lra (réactif #3b) + 2,4 ml de diluant d'anticorps de détection (réactif #1g). 15) Laver la plaque d'essai trois fois en utilisant la station de lavage Bio-Plex Pro 11 a) Laisser la plaque posée sur des aimants pendant 15 secondes b) Laver les puits deux fois en utilisant le programme MAG X3 c) RINCER DE JOUR avec le tampon de lavage - Canal 1. 16) Ajouter des anticorps de détection 1X à la plaque d'essai noire à fond plat a) Tourbillonner doucement les anticorps de détection 1X pendant 3 secondes b) Verser dans le réservoir du réactif et ajouter 25 ML d'anticorps de détection 1X à chaque puits en utilisant le pipetteur à 8 canaux (mode multi-distribution). 17) Sceller la plaque d'essai avec un scellant en feuille de plaque, et incuber sur un agitateur pour plaque pendant 30 minutes à température ambiante (20-25 °C). a Sceller la plaque avec un scellant adhésif en feuille pour plaque pour la protéger de la lumière. b) Augmenter lentement la vitesse de l'agitateur pour plaque jusqu'à 1100 tours/min (vitesse 10) ; mélanger pendant 30 secondes. c Diminuer lentement la vitesse de l'agitateur pour plaque jusqu'à 300 tours/min (vitesse 3) d) Incuber sur l'agitateur pour plaque pendant 30 minutes à température ambiante (20-25 °C). 18) Préparer de la Streptavidine-PE 1X. La Streptavidine-PEP est préparée de préférence 10 min avant l'utilisation et protégée de la lumière. a) Tourbillonner la Streptavidine-PE 100X (réactif #1d) pendant 20 sec. à une vitesse moyenne, suivi de 30 sec. de tours rapides. b) Ajouter 60 'IL de Streptavidine-PE 100X dans 5,94 ml de tampon d'essai. Bien tourbillonner. 19) Laver la plaque d'essai trois fois en utilisant la station de lavage Bio-Plex Pro II a) Laisser la plaque posée sur des aimants pendant 15 secondes 5 b) Laver les puits deux fois en utilisant le programme MAG X3 c) RINCER DE JOUR avec le tampon de lavage - Canal 1. 20) Ajouter de la Streptavidine-PE 1X à la plaque d'essai noire à fond plat a) Tourbillonner la Streptavidine-PE 1X pendant 5 secondes à une vitesse moyenne. b) Verser dans le réservoir du réactif et ajouter 50 !IL de Streptavidine-PE 1X à chaque 10 puits en utilisant le pipetteur à 8 canaux (mode multi-distribution). 21) Sceller la plaque d'essai avec un scellant en feuille de plaque, et incuber sur un agitateur pour plaque pendant 10 minutes à température ambiante (20-25 °C). a) Sceller la plaque avec un scellant adhésif en feuille pour plaque pour la protéger de la lumière. 15 b) Augmenter lentement la vitesse de l'agitateur pour plaque jusqu'à 1100 tours/min (vitesse 10) ; mélanger pendant 30 secondes. c) Diminuer lentement la vitesse de l'agitateur pour plaque jusqu'à 300 tours/min (vitesse 3) d) Incuber dans l'agitateur pour plaque pendant 10 minutes à température ambiante (20- 20 25 °C). 22) Laver la plaque d'essai trois fois en utilisant la station de lavage Bio-Plex Pro II a) Laisser la plaque posée sur des aimants pendant 15 secondes b) Laver les puits deux fois en utilisant le programme MAG X3 c) RINCER DE NUIT à l'eau - Canal 2 25 23) Resuspendre les billes dans le tampon d'essai a) Ajouter 120 microL de tampon d'essai à chaque puits en utilisant un pipetteur à 8 canaux. b) Sceller la plaque avec un scellant adhésif en feuille pour plaque pour la protéger de la lumière. c) Augmenter lentement la vitesse du agitateur pour plaque jusqu'à 1100 tours/min 30 (vitesse 10) ; mélanger pendant 30 secondes. 24) Faire passer la plaque sur le lecteur d'essai de suspensions Bio-Plex. Lire 50 billes par région, volume d'échantillon : 50 pL. Ponts DD : 5,000 à 25,000 25) En cas d'analyse d'une deuxième plaque d'essai, répéter les étapes 3 - 25. 5 Modèle de plaque à 96 puits 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Std09 Std05 Std01 INC1 INC9 INC17 INC25 INC33 INC41 INC49 INC57 CSB B Std09 Std05 Std01 INC2 INC10 INC18 INC26 INC34 INC42 INC50 INC58 CSB C Std08 Std04 AQC1-1 INC3 INCH INC19 INC27 INC35 INC43 INC51 INC59 HQC-2 D Std08 Std04 AQC1-2 INC4 INC12 INC20 INC28 INC36 INC44 INC52 INC60 LQC-2 E Std07 Std03 AQC2-1 INC5 INC13 INC21 INC29 INC37 INC45 INC53 INC61 AQC1-3 F Std07 Std03 AQC2-2 INC6 INC14 INC22 INC30 INC38 INC46 INC54 INC62 AQC1-4 G Std06 Std02 HQC-1 INC7 INC15 INC23 INC31 INC39 INC47 INC55 INC63 AQC2-3 H Std06 Std02 LQC-1 INC8 1NC16 INC24 INC32 INC40 INC48 INC56 INC64 AQC2-4 Analyse des données : Calculs statistiques : Les standards sont testés dans des puits doubles, entraînant des valeurs d'intensité de fluorescence (FI) doubles. La moyenne (moyenne) des valeurs de FI doubles des standards 10 pour chaque cytokine sont représentées et analysées en utilisant un procédé d'ajustement de la courbe de régression non linéaire d'ajustement logistique à 5 paramètres (5-PL). La concentration de chaque cytokine est interpolée à partir de la courbe standard. %CV (Coefficient de variation) = (Déviation standard/moyenne FI)*100 % 15 % Biais (Applicable aux standards et aux CQ d'essai uniquement) = ((Concentration calculée -Concentration nominale)/Concentration nominale)*100 % % Recouvrement (Applicable aux standards et aux CQ d'essai uniquement) = 20 (Concentration calculée /Concentration nominale)*100 % Concentration calculée = Concentration observée ; interpolée depuis la courbe standard Concentration nominale = concentration attendue Critères d'acceptation : 1) Puits doubles (%CV) Le % CV entre les valeurs de FI doubles doit satisfaire les critères suivants : a) %CV doit être Les candidats ont trouvé que le tissu muqueux de l'introïtus subit un changement considérable similaire au canal vaginal. Comme illustré dans la figure 1, les images histologiques des changements anatomiques et histologiques considérables à l'introïtus qui sont similaires au vagin. Par exemple, le tissu épithélial dans des échantillons issus d'un groupe post-ménopause parait considérablement plus fin par rapport aux échantillons issus d'un groupe pré-ménopause ou groupe post-ménopause + HRT. Les cellules épithéliales qui sont typiquement remplies avec du glycogène sont plates. Une nouvelle caractéristique associée à l'introïtus et appuyée par l'état de ménopause est l'apparition de rides épineuses ou de la couche épineuse sur l'épiderme (notées par les flèches blanches). Celles-ci sont des intrusions de tissu épithélial dans le derme et servent à stabiliser ou à fournir des liaisons fortes avec le derme sous-jacent. Cette caractéristique est typiquement observée pour un épithélium squameux stratifié exposé à l'air. Avec la ménopause, il y a une atténuation ou un raccourcissement/disparition de la couche épineuse relative à la pré-ménopause. Avec le traitement HRT, aussi bien l'épaisseur du tissu épithélial que la taille de la couche épineuse augmentent (figure Post-ménopause + HRT). Dans la figure 2, on peut mesurer l'épaisseur relative du tissu épithélial et l'abondance relative de la couche épineuse avec les formules suivantes (en utilisant des images grossies soit 4X ou 10X, de préférence une image grossie 10X): La ligne curvilinéaire '0' se réfère à l'interface entre le tissu épithélial et l'interface de l'air ou paraffine. La ligne curvilinéaire 'CF se réfère au bord entre le tissu épithélial et tissu dermique. Créer des lignes limite de l'image du tissu de telle sorte qu'une ligne perpendiculaire (ou une ligne à peu près) est tracée à travers les lignes '0' et 1.1' dans les zones qui sont dépourvues de couche épineuse. Déterminer la longueur des lignes '0' et IP (mesurés en pixels) entre les limites. Pour déterminer une approximation de l'abondance de la couche épineuse, diviser la longueur de If par '0'. Créer des lignes perpendiculaires supplémentaires (ou des lignes presque perpendiculaires ; dl, d2,... dn) tracées à travers les lignes '0' et '11' et mesurer l'épaisseur épithéliale 'd' (mesurée en pixels). Pour déterminer une approximation de l'épaisseur épithéliale utiliser les formules suivantes. (0 +2 U ) E th Eth = épaisseur épithéliale O = ligne mesurée en pixels de l'interface épithélium-air. U = ligne mesurée en pixels de l'interface épithélium-derme. dl, d2,...d' = lignes à travers le tissu épithélial De façon similaire, les candidats ont trouvé que l'utilisation des cartographies thermiques des transcriptomes peut être utilisée pour déterminer les changements dans la zone hyménale et des grandes lèvres. L'analyse de l'activité des gènes (aussi appelée transcriptomique peut être faite à partir d'une biopsie provenant de la zone labiale ou hyménale pour déterminer les changements associés à la ménopause et aux effets du traitement. Le profilage transcriptionnel est connu du spécialiste dans la technique comme le montrent Cotreau et al. (Cotreau MM, Chennathukuzhi VM, Harris HA, Han L, Dorner AJ, Apseloff G, Varadarajan U, Hatstat E, Zakaria M, Strahs AL, Crabtree JS, Winneker RC, et Jelinsky SA. Maturitas 58:366- 376, 2007) où le profilage transcriptionnel est issu d'une biopsie vaginale pour déterminer les effets d'un patch dermique dicestrogène sur l'atrophie vaginale. Une approche plus large pour l'analyse transcriptomique dans laquelle les données sont analysées pour une classification hiérarchique pour visualiser les motifs globaux peut être effectuée en utilisant le logiciel OmniViz Version 6.1.4 (Instem Scientific, Cambridge, R.-U). L'analyse du thème biologique pour identifier les processus biologiques régulés peut être effectuée en utilisant les termes ontologiques des gènes et des procédés qui sont similaires aux ressources bioinformatiques DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) et peut également être trouvée dans les références suivantes, (1) Huang da, W., B.T. Sherman, et R.A. Lempicki, Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc, 2009. 4(1): p. 44-57, et (2) Huang da, W., B.T. Sherman, et R.A. Lempicki, Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res, 2009. 37(1): p. 1-13. Le profilage transcriptomique peut également être obtenu à partir de prélèvements épithéliaux superficiels provenant des grandes lèvres ou des petites lèvres obtenus par bandelettes adhésives. L'ARN purifié obtenu à partir de la biopsie extraite a été converti en des copies d'ARNc étiquetées par la biotine en utilisant le kit express Affymetrix HT 3' IVT Express (Cat. #901253, Santa Clara, Californie, USA) et le protocole fourni par Affymetrix tel que réalisé sur une station de travail d'automatisation de laboratoire Beckman Biomek@ FXP (Cat. Beckman #A31842, Beckman Coulter, Brea, Californie, USA). L'ARNc biotinylé a été fragmenté par une hydrolyse alcaline limitée et ensuite hybridé durant toute la nuit aux plaques d'essai Affymetrix GeneTitan@ HG-U219 en utilisant l'instrument Affymetrix GeneTitan@ et le protocole fourni par Affymetrix. Suivant le processus, les images des puces ont été converties en données numériques en utilisant l'algorithme PLIER tel que 10 réalisé dans la console Affymetrix GeneChip Expression. De manière spécifique les candidats ont trouvé que des approximativement 49 000 ensembles de sondes génétiques correspondant à approximativement 22 000 gènes, on s'attendrait à ce qu'approximativement 2500 ensembles de sondes ou environ 5 % soient significatifs dû uniquement au hasard à p Spécifiquement, les candidats ont trouvé que les gènes reliés au collagène sont régulés au niveau de la zone hyménale, c'est-à-dire des changements (augmentations ou diminutions) associés à la ménopause inversés avec le traitement de la ménopause. Des exemples de gènes liés au collagène dont l'activité a été modifiée par la ménopause et inversée par le traitement de la ménopause incluent le collagène de type I, collagène de type III, collagène de type V, collagène de type VIII, collagène de type XVI, collagène de type XVII, lysyl oxydase, fibrilline, fibromoduline, intégrine, protéoglycane sulphate d'héparane, cathepsine Li, lumicane, dermatopontine, protéine 4 associée au microfibrillaire, facteur de croissance de tissu conjonctif, matrice métallopeptidase 10. En outre, les gènes liés à la sénescence sont similairement régulés par les traitements de l'atrophie de la ménopause et le changement entre la pré-ménopause et ceux soumis à l'atrophie vaginale. En outre, les protéines structurelles mitochondriales, les ARN ribosomiques et les enzymes associées avec la production d'énergie incluant la chaîne de transport d'électrons et la respiration cellulaire sont similairement régulés par les traitements de l'atrophie de la ménopause et le changement entre la pré-ménopause et ceux soumis à l'atrophie vaginale. Les candidats ont trouvé que les changements dans l'ensemble des sondes génétiques pour évaluer l'atrophie peuvent se limiter aux sondes génétiques associées à l'expression du collagène. Les candidats ont trouvé que les changements dans l'ensemble des sondes génétiques pour évaluer l'atrophie peuvent se limiter à la progression du cycle cellulaire. Les candidats ont trouvé que les femmes en pré-ménopause versus les femmes en post-ménopause connaissant une atrophie vaginale diffèrent dans leurs résultats cliniques de l'atrophie et dans la sécheresse vaginale et dans les niveaux des rapports douloureux. Les candidats ont également trouvé que le pH au niveau de la zone hyménale est en corrélation la plus étroite avec le pH dans le canal du vagin. Les candidats ont également trouvé que le pH des grandes lèvres augmente dans une quantité mesurable avec le début de la ménopause et est inversé avec les traitements de l'atrophie de la ménopause. Tester aux grandes lèvres, petites lèvres, et/ou introïtus permet l'évaluation de l'atrophie vaginale sans la nécessité d'insérer un spéculum à l'intérieur du canal vaginal. L'ensemble de procédés ci-dessus permet l'évaluation en utilisant le pH, la sensibilité à la brosse, l'évaluation du niveau de glycogène à partir d'une brosse ou d'une biopsie, l'évaluation des protéines à partir d'une brosse ou d'une biopsie, l'analyse des cellules épithéliales issues de la biopsie, l'utilisation de la cartographie thermique, l'activité des gènes pour déterminer l'expression des gènes, ou des combinaisons de ceux-ci. Les candidats ont trouvé que les procédés ci-dessus peuvent être utilisés pour évaluer l'étendue de l'atrophie vaginale avant et après le régime de traitement. Dans un mode de réalisation, l'ensemble de procédés peut être utilisé pour évaluer un traitement. Le traitement peut réduire le pH relatif à l'atrophie de 0,1 à 2,0 unités de pH ou de 0,3 unités à 1,5 unités. Dans un mode de réalisation, l'ensemble de procédés peut être utilisé pour évaluer un traitement. Le traitement peut donner des résultats de pH de 3,5 à 5,8 unités dans l'introïtus. Dans un mode de réalisation, l'ensemble de procédés peut être utilisé pour évaluer un traitement en analysant les cellules épithéliales à l'introïtus et l'abondance de la couche 30 épineuse de l'épiderme dans l'anneau hyménal. Un traitement peut montrer un effet d'augmentation de l'abondance des épines de 10 à 100 %. Dans un mode de réalisation, le procédé pour analyser les cellules épithéliales à l'introïtus peut en outre inclure la mesure de l'épaisseur de l'épithélium hyménal avant et après un traitement. Un traitement peut montrer un effet d'augmentation de l'épaisseur relative à l'atrophie de 10 à 300 %. Dans un mode de réalisation, le procédé pour analyser le glycogène à l'introïtus peut en outre inclure la mesure de la quantité de glycogène avant et après un traitement. Un traitement peut montrer un effet d'augmentation de la quantité de glycogène de 10 à 300 %. Dans un mode de réalisation, le procédé pour analyser les composants de la synthèse de protéines tels que la N-formylméthionine et/ou la méthionine à l'introïtus peut en outre inclure la mesure de la quantité de N-formylméthionine et/ou la méthionine avant et après un traitement. Un traitement peut montrer un effet d'augmentation des composants de la synthèse des protéines tels que la N-formylméthionine et/ou la méthionine de 10 à 1000 % Dans un mode de réalisation, le procédé d'analyse des composants du métabolisme du glycogène tels que le maltohexaose et/ou le maltopentaose et/ou le maltotriose et/ou le maltotraose et/ou le maltose à l'introïtus peut en outre inclure la mesure de la quantité de maltohexaose et/ou maltopentaose et/ou maltotriose et/ou maltotraose et/ou maltose avant et après le traitement. Un traitement peut montrer un effet d'augmentation des composants du métabolisme du glycogène tel que le maltohexaose et/ou le maltopentaose et/ou le maltotriose et/ou le maltose de 10 à 1000 %. Dans un mode de réalisation, le procédé d'analyse des composants de la glycolyse tel que le glucose, le lactate, et le pyruvate. Un traitement peut montrer un effet d'augmentation des composants de la glycolyse tels que le glucose et/ou le lactate et/ou le pyruvate de 10-500 %. Dans un mode de réalisation, le procédé d'analyse des composants du fructose, galactose, et du métabolisme du galactose tels que le sorbitol, le mannitol et le mannitol- 1-phosphate à l'introïtus peut en outre inclure la mesure de la quantité de sorbitol, mannitol et mannitol-1- phosphate avant et après le traitement. Un traitement peut montrer un effet de diminution des composants du fructose, galactose, et du métabolisme du galactose tels que le sorbitol, le mannitol et le mannitol-1-phosphate de 10-200 %. Dans un mode de réalisation, le procédé d'analyse des composants de la synthèse des protéines et du métabolisme des protéines (incluant des acides aminés et des dipeptides comme décrit ci-dessus) à l'introïtus peut en outre inclure la mesure de la quantité d'acides aminés et de dipeptides avant et après le traitement. Un traitement peut montrer un effet d'augmentation des acides aminés et des dipeptides de 10-5000 %. Dans un mode de réalisation, le procédé d'analyse des composants de l'inflammation tels que le 12-HETE et/ou l'arachidonate et/ou le linoléate à l'introïtus peut en outre inclure la mesure de la quantité de 12-HETE et/ou d'arachidonate et/ou de linoléate avant et après le traitement. Un traitement peut montrer un effet de diminution des composants de l'inflammation tels que le 12-HETE et/ou l'arachidonate et/ou le linoléate de 10 à 400 %. Dans un mode de réalisation, le procédé d'analyse de l'activité de sondes génétiques à l'introïtus peut en outre inclure la mesure des changements des sondes génétiques transcriptomiques avant et après traitement. Un traitement peut montrer un effet d'augmentation de l'activité des sondes génétiques transcriptomiques dans 1 à 90 % de l'ensemble total de sondes génétiques. Un traitement peut montrer un effet de diminution de l'activité des sondes génétiques transcriptomiques dans 1 à 90 % de l'ensemble total de sondes génétiques. Dans un mode de réalisation, le procédé d'analyse de l'activité du collagène liée aux gènes au niveau de l'anneau hyménal, peut en outre inclure la mesure des changements transcriptomiques avant et après le traitement. Un traitement peut montrer un effet d'augmentation de l'activité du collagène liée aux gènes de 10 à 400 %. Un traitement peut montrer un effet de diminution de l'activité du collagène liée aux 20 gènes de 10 à 400 %. Les compositions de traitement peuvent inclure un émollient appliqué par voie labiale ou vaginale comprenant des composés cestrogéniques, des isoflavones ou des phytostéroïdes, des modulateurs des récepteurs sélectifs d'oestlogène et des agents de traitement de la peau (tels que mais sans se limiter à: la niacinamide et/ou le panthénol), de l'hyaluronine, des huiles 25 grasses, des acides tamponnés, des crèmes hydratantes, et des mélanges de ceux-ci. Les compositions de traitement peuvent en outre inclure un système d'administration orale ou dermique comprenant des oestrogènes. Le traitement aux oestrogènes, généralement par administration orale ou dermique, est également dénommé thérapie de remplacement hormonal ou HRT. 30 Dans un mode de réalisation, le matériau oléagineux est choisi pour avoir un indice de stabilité oléagineux (« OS! ») d'au moins environ 10 heures, au moins environ 14 heures, ou au moins environ 18 heures à 110 °C ou 120 °C. Une mesure commune pour faire le suivi de la stabilité oxydative est le développement d'hydroperoxydes (valeur de peroxyde ou PV) au cours du temps. La stabilité oxydative peut aussi être exprimée en termes du temps requis pour obtenir des produits d'oxydation secondaires lorsqu'on aère un échantillon à température élevée. Ce temps, appelé l'indice de stabilité oléagineux ou OSI, est normalement mesuré à 110 °C ou 120 °C [Procédé d'indice de stabilité oléagineux Amer Oil Chem Soc Cd 12b-92[ en utilisant l'instrument Rancimat (Brinkmann Instruments, Inc.) ou l'instrument OSI (Omnion, hic.). On croit que les matériaux oléagineux comprenant des niveaux relativement élevés d'acide oléique tendent à être plus stables dans le contexte de la présente invention. Dans un mode de réalisation, le matériau 10 oléagineux comprend au moins environ 10 %, d'environ 10 % à environ 80 %, ou d'environ 15 % à environ 70 %, en poids du matériau oléagineux, d'acide oléique. Dans un mode de réalisation' le matériau oléagineux comprend d'environ 0,0005 % à environ 16 %, d'environ 0,005 % à environ 8 %, ou d'environ 0,01 % à environ 2,4 %, en poids de matériau oléagineux, d'acide oléique. Des exemples non-limitants de matériaux 15 oléagineux appropriés présentant les propriétés désirées décrites ici comprennent l'huile oléique de canola (Brassica campestris, B. napus, B. rapa ; caractérisée par le fait qu'elle ait un contenu oléique supérieur à 70 % en poids, par exemple, l'huile de canola à teneur élevée en acide oléique, l'huile de canola à teneur très élevée en acide oléique ou l'huile de canola partiellement hydrogénée), l'huile de noyau de marula. (Sclerocarya birrea), l'huile 20 de palme (huile d'Elaeis Guineensis), l'oléine de palme, la stéarine de palme, la superoléine de palme, l'huile de noix de pécan, l'huile de graines de courge, l'huile oléique de carthame (Carthamus Tinctorius ; caractérisée par le fait qu'elle ait un contenu oléique supérieur à environ 30 % en poids et un contenu en acide gras oméga-6 inférieur à environ 50 % en poids, par exemple, l'huile de carthame riche en acide oléique), l'huile de 25 sésame (Sesamum indicum, S. orientale), l'huile de soja (Glycine max, par exemple, le soja riche en acide oléique, l'huile de soja à faible teneur en acide linolénique, partiellement hydrogénée), l'huile oléique de tournesol (Helianthus annus ; caractérisée par le fait qu'elle ait un contenu oléique supérieur à environ 40 % en poids, par exemple, l'huile de tournesol à teneur intermédiaire en acide oléique ou l'huile de tournesol à teneur 30 élevée en acide oléique), et des mélanges de celles-ci. L'huile oléique de canola, l'huile de palme, l'huile de sésame, l'huile de carthame à teneur élevée en acide oléique, l'huile de soja à teneur élevée en acide oléique, l'huile de tournesol à teneur intermédiaire en acide oléique et l'huile de tournesol à teneur élevée en acide oléique sont des huiles communes issues de sélection végétale et peuvent être également issues d'organismes non génétiquement modifiés (non OGM). Des exemples non-limitatifs de matériaux oléagineux sont disponibles dans le commerce auprès d'un nombre de vendeurs, incluant Cargill pour l'huile de soja partiellement hydrogénée (c'est-à-dire, l'huile de soja Preference@ 110W ou l'huile de soja à stabilité élevée Preference@ 300), l'huile de tournesol à teneur intermédiaire en acide oléique (c'est-à-dire, huile de tournesol à teneur oléique intermédiaire NuSun@), l'huile de tournesol à teneur élevée en acide oléique (c'est-à-dire, l'huile de tournesol à teneur élevée en acide oléique Clear Valley0), l'huile de canola à teneur élevée en acide oléique, l'huile de canola à teneur très élevée en acide oléique et l'huile de colza érucique à teneur faible partiellement hydrogénée (c'est-à-dire, l'huile de canola à teneur élevée en acide oléique Clear Valley@ 65 et l'huile de canola à teneur élevée en acide oléique Clear Valley@ 75) ; Lambert Technology pour l'huile de canola à teneur élevée en acide oléique (c'est-à-dire, Oleocal C104) ; Arch Personal Care pour l'huile de noyau de marula ; Pioneer pour l'huile de soja à teneur élevée en acide oléique (c'est-à-dire, Plenish@) ; Asoyia pour l'huile de soja à teneur linolénique faible (c'est-à-dire, Ultra Low Linolenic Soybean Oil@) ; et Dipasa, Inc. pour l'huile de sésame raffinée. Les agents de traitement de la peau peuvent en outre comprendre des agents de traitement de la peau additionnels tels que le niacinamide, l'oxyde de zinc, l'hexamidine, le panthénol, et similaires, et des mélanges de ceux-ci. Les agents de traitement de la peau appropriés sont décrits dans US 2003/0082219 Al. Dans un mode de réalisation, l'agent hydratant est typiquement présent dans la composition de traitement en des quantités de 0,1 - 20 % (w/w), de préférence de 1 - 15 % (w/w), et plus préférablement 2 -12 % (w/w). Des agents hydratants appropriées sont, par exemple, les acides aminés, l'acide carboxylique pyrrolidone, l'acide lactique et ses sels, le lactitol, l'urée et les dérivés d'urée, l'acide uréique, la glucosamine, la créatinine, les produits de dégradation du collagène, le chitosane ou les sels/dérivés de chitosane, et en particulier les polyols et les dérivés de polyol (par exemple l'éthylène glycol, le propylène glycol, le butylène glycol, le pentylène glycol, l'hexylène glycol, l'érythrite, le 1,2,6- hexanetriol, les polyéthylène glycols tels que le PEG-4, le PEG-6, le PEG-7, le PEG-8, le PEG- 9, le PEG-10, le PEG-12, le PEG-14, le PEG-16, le PEG- 18, le PEG-20, le PEG135, le PEG 150), les sucres et dérivés de sucres (par exemple le fructose, le glucose, le maltose, le maltitol, le mannite, l'inosite, le sorbite, le sorbitylsilandiol, le sucrose, le tréhalose, le xylose, la xylite, l'acide glucuronique et ses sels), le sorbite éthoxylé (Sorbeth-6, Sorbeth-20, Sorbeth-30, Sorbeth-40), le miel et le miel hydrogéné, les hydrolysates d'amidon hydrogéné, et aussi des mélanges de protéines d'avoine hydrogénées, de protéines de lait hydrolysées, de lécithine, de pythantriol, d'acide hyaluronique et ses sels, et de copolymères d'acétate de PEG-20. Des agents hydratants particulièrement préférés sont la glycérine, la diglycérine et la triglycérine. Dans un mode de réalisation, le matériau cestrogénique est typiquement présent dans la composition de traitement en une quantité de 0,001 - 10 % en poids, de préférence de 0,01 - 8 % en poids et plus préférablement de 0,05 - 5 % en poids, par rapport au poids de la composition de traitement. Les matériaux cestrogéniques appropriés sont l'oestradiol, l'oestrone et l'oestriol. Les phytostéroïdes représentent des matériaux qui sont extraits des plantes. Les ingrédients représentatifs peuvent inclure des structures stéroïdiennes et non stéroïdiennes possédant toutes deux une activité biologique comme celle des stéroïdes. Des exemples de matériaux stéroïdes incluent des stéroïdes dérivés d'huile végétale, c'est-à-dire le sitostérol, le stigmastérol et le campestérol. Les structures non stéroïdiennes incluent des isoflavones, de fiavones et de coumestanes. Les isoflavones, qui incluent la genestéine, la daidzéine, la formononetine et l'équol, ont été identifiées comme des traitements utiles pour des symptômes associés à la ménopause et la périménopause (US Pat. 5498631 à GORBACH 12 Mars 1996), la dépression et la démence (US Pat US 5733926 à GORBACH 31 Mars 1998, US Pat US 6083526 à GORBACH, 4 juillet 2000), les rides cutanées (US Pat US 6060070 à GORBACH 9 mai 2000), et le cancer (WO 2004022023 à NOVOGEN). Dans un mode de réalisation, le matériau isofiavone est typiquement présent dans la composition de traitement en des quantités de 0,001 % à environ 40 % en poids d'isoflavones, de préférence 0,001 % à environ 4 % en poids, plus préférablement 0,01 % à environ 2 % en poids d'isoflavones, par rapport au poids de la composition de traitement. Les isoflavones peuvent être choisies dans le groupe consistant en des isoflavones de soja, des isoflavones de clous de girofle, de la génestéine, de la daidzéine, de la formononetine, de la biochanine A, du S-équol, du R-équol ou d'un extrait de plante mimétique. L'extrait de plante mimétique signifie, dans le contexte de l'application, tout extrait de plante capable de mimer l'action des isoflavones identifiées. Dans un mode de réalisation, un ou plusieurs des procédés au sein de l'ensemble de procédés peut être compris dans un kit pour l'évaluation de l'efficacité d'un régime de traitement de l'atrophie vaginale qui comprend un procédé d'évaluation pré-traitement ; un traitement topique pour l'application sur les grandes lèvres, les petites lèvres, l'introïtus, le vagin, ou des combinaisons de ceux-ci ; un procédé d'évaluation post-traitement pour l'atrophie vaginale ; et un moyen pour déterminer la différence entre les évaluations pré-traitement et post-traitement de l'atrophie vaginale pour évaluer l'effet global du traitement topique. Le procédé d'évaluation pré-traitement et le procédé post-traitement peuvent être un ou plusieurs des procédés décrits ci-dessus pour l'évaluation de l'atrophie vaginale, y compris mais sans se limiter à: la mesure du pH aux grandes lèvres, aux petites lèvres, à l'introïtus, ou des combinaisons de ceux-ci ; la détermination de là sensibilité de l'introïtus par contact avec la brosse ; l'évaluation du glycogène à l'introïtus ; une analyse de biopsie des cellules épithéliales à l'introïtus ; l'évaluation d'un test de protéines à l'introïtus ; la cartographie thermique transcriptomique aux grandes lèvres ou aux petites lèvres ; ou l'évaluation de l'expression des gènes aux grandes lèvres, aux petites lèvres, à l'introïtus, au vagin, ou à des combinaisons de ceux-ci. Le kit peut en outre inclure un ou plusieurs articles absorbants utilisés en combinaison avec le procédé d'évaluation. Tel qu'il est utilisé ici, l'article absorbant peut inclure un article d'hygiène féminine, une serviette d'hygiène féminine, un interlabial, une doublure d'hygiène féminine, une serviette d'incontinence pour adultes, un pantalon d'incontinence pour adultes, une couche-culotte d'incontinence pour adultes, une gaze stérile, une lingette humide et un pansement pour blessures. Les dimensions et valeurs décrites ici ne doivent pas être comprises comme étant strictement limitées aux valeurs numériques exactes citées. À la place, sauf indication contraire, chaque dimension telle veut dire à la fois la valeur citée et la plage fonctionnellement équivalente entourant cette valeur. Par exemple, une dimension décrite comme « 40 mm » veut dire « environ 40 mm ». Les valeurs décrites ici comme seuils de plages ne doivent pas être comprises comme étant strictement limitées aux valeurs numériques exactes citées. Plutôt, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, chaque plage numérique veut dire à la fois les valeurs citées et n'importe quel nombre entier dans la plage. Par exemple, une plage décrite comme allant de « 1 à 10 » veut dire « 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 ». La citation de tout document ne doit pas être interprétée comme une admission qu'il s'agit d'une technique antérieure par rapport à la présente invention. Dans la mesure où toute signification ou définition d'un terme dans ce document est en conflit avec toute signification ou définition du même terme dans un autre document, la signification ou définition attribuée à ce terme dans le présent document devra prévaloir. Bien que des modes de réalisation particuliers de la présente invention ont été illustrés, il sera évident pour le spécialiste de la technique que diverses autres variantes et modifications peuvent être apportées sans sortir de l'esprit et du champ d'application de l'invention. Il est prévu, par conséquent, de couvrir dans les revendications annexées toutes ces variantes et modifications qui appartiennent au champ d'application de la présente invention. REVENDICATIONS1. Ensemble d'un ou de plusieurs procédés pour l'identification des changements urogénitaux associés à l'atrophie vaginale, caractérisé en ce que les procédés comprennent : a. la mesure du pH aux grandes lèvres, petites lèvres, introïtus, ou des combinaisons de ceux-ci ; b. la détermination de la sensibilité de l'introïtus au contact avec la brosse ; c. l'évaluation de la quantité de glycogène à l'introïtus ; d. la réalisation d'une biopsie à l'introïtus et l'analyse des cellules épithéliales à l'introïtus ; e. l'évaluation de la quantité de protéines en testant à l'introïtus ou aux grandes lèvres ou aux petites lèvres ; f. l'évaluation des quantités de métabolites à l'introïtus ou aux grandes lèvres ou aux petites lèvres ; g. l'évaluation de la quantité d'histamine à l'introïtus ou aux grandes lèvres ou aux petites lèvres ; h. la cartographie thermique transcriptomique aux grandes lèvres ou aux petites lèvres ou à l'introïtus ; et i. l'évaluation de l'expression des gènes à l'introïtus ou aux grandes lèvres ou aux petites lèvres pour un changement dans l'ensemble des sondes génétiques. 2. Ensemble de procédés selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé de mesure du pH comprend en outre l'utilisation d'une sonde pH. 3. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les changements dans l'ensemble des sondes génétiques sont limités aux sondes génétiques associées à l'expression du collagène. 4. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les changements dans l'ensemble des sondes génétiques sont limités à la progression cyclique cellulaire. 5. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que un ou plusieurs des procédés sont utilisés pour évaluer l'étendue de l'atrophie vaginale avant et après le régime de traitement. 6 Ensemble de procédés selon la revendication 5, caractérisé en ce que le traitement montre un effet de réduction du pH relatif à l'atrophie de 0,1 unités à 2,0 unités de pH. 7. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, caractérisé en ce que le traitement montre un effet de réduction du pH relatif à l'atrophie de 0,3 unités à 1,5 unités. 8. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le traitement entraîne un pH dans l'introïtus de 3,5 à 5,8 unités. 9. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que le traitement est un émollient appliqué par voie urogénitale ou vaginale constitué d'cestrogène, d'isoflavones, de niacinamide, d'hyaluronine, de panthénol, d'huiles grasses, d'acides tamponnés, et de mélanges de ceux-ci. 10. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que le traitement est un système d'administration par voie orale ou dermique constitué d'cestrogène. 11. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'analyse des cellules épithéliales à l'introïtus comprend en outre la mesure de l'abondance de couches épineuses de l'épiderme dans l'anneau hyménal, danslequel les procédés comprennent en outre un traitement, et dans lequel le traitement montre un effet d'augmentation de l'abondance des crêtes épidermiques de 10 à 100 %. 12. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'analyse des cellules épithéliales à l'introïtus comprend en outre la mesure de l'épaisseur de l'épithélium hyménal, dans lequel les procédés comprennent en outre un traitement, et dans lequel le traitement montre un effet d'augmentation de l'épaisseur relative à l'atrophie de 10 à 300 %. 13. Ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, caractérisé en ce que le traitement entraîne un niveau différentiel de métabolites d'au moins 10%. 14. Kit caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs des procédés de l'ensemble de procédés selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel le procédé est utilisé dans un kit comprenant en outre un procédé d'évaluation pré-traitement pour l'atrophie vaginale ; un traitement topique pour application aux grandes lèvres, aux petites lèvres, à l'introïtus, au vagin, ou à des combinaisons de ceux-ci ; un procédé d'évaluation post-traitement pour un état d'atrophie vaginale comprenant les mêmes procédés de diagnostic que ceux utilisés dans l'évaluation pré-traitement de l'atrophie vaginale ; et un moyen pour déterminer la différence entre les évaluations pré-traitement et post-traitement de l'atrophie vaginale pour évaluer l'effet global du traitement topique. 15 Kit selon la revendication 14, contenant éventuellement un ou plusieurs articles absorbants utilisés en combinaison avec le procédé d'évaluation dans lequel l'article absorbant est choisi dans le groupe consistant en ; un interlabial, un article d'hygiène féminine, une serviette d'hygiène féminine, une doublure d'hygiène féminine, une serviette d'incontinence pour adultes, un pantalon d'incontinence pour adultes, une couche-culotte d'incontinence pour adultes, une gaze stérile, une lingette humide et un pansement pour blessures.