Brevet FR3023292A1 — publié le 20160108

OLIGO-LAMBDA-CARRAGHÉNANES, COMPOSITIONS COSMÉTIQUE, DERMATOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE LES CONTENANT, ET LEURS UTILISATIONS DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un mélange d'oligo-lambda- carraghénanes, ainsi qu'à un procédé de préparation d'un mélange d'oligo- À-carraghénanes, à une composition pharmaceutique, dermatologique ou cosmétique le contenant. La présente invention se rapporte également à un mélange d'oligo-À-carraghénanes pour son application comme médicament, ainsi que pour une utilisation cosmétique. La présente invention trouve son application dans les domaines médicaux, dermatologiques et cosmétiques. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Les À-carraghénanes sont des D-galactanes sulfatés constituants de la matrice des parois cellulaires de certaines algues rouges. Ils sont constitués de sous-unités carrabioses comprenant deux galactoses sulfatés liés par une liaison 13(1-4). Ces carrabioses sont liés entre eux par des liaisons a(1-3). Dans le cas des algues rouges, l'infection par un agent pathogène comme la bactérie P. carrageenovora se traduit par une dégradation ou une hydrolyse des À-carraghénanes pariétaux par l'enzyme bactérienne À- carraghénase apportée par la bactérie. L'hydrolyse des carraghénanes pariétaux des algues rouges génère des fractions oligosaccharidiques présentant différents degrés de polymérisation, dont certains interviennent comme médiateurs de signaux de transduction cellulaires lors d'une infection bactérienne. Ces fractions oligosaccharidiques pourraient être impliquées dans l'élicitation de réactions de défense chez les plantes. L'intérêt de ce type d'oligosaccharides sulfatés extraits des algues est largement reconnu, notamment pour des applications en santé. Toutefois, les procédés d'hydrolyse chimiques conventionnels ne permettent pas de préserver le large potentiel bioactif que possèdent les polysaccharides d'algues marines et tout particulièrement leurs produits d'hydrolyse en préservant la complexité structurale naturelle et initiale des oligosaccharides générés. Par exemple, les procédés d'hydrolyse chimique ne permettent pas de préserver le profil de sulfatation naturel, ce qui altère le potentiel d'activité biologique des molécules générées. D'autres méthodes consistent à sulfater des oligosaccharides afin de les fonctionnaliser. Ce procédé chimique ne permet pas, sinon difficilement, de maîtriser finement un état de sulfatation propice à une activité biologique précise. Ces difficultés techniques touchant aux procédés de préparation connus ont pour conséquence qu'il est ardu de tirer profit d'une biodiversité pourtant riche, et d'exploiter ce potentiel en générant un large éventail de molécules naturelles, accentuant ainsi les chances d'identifier des nouvelles molécules bioactives. Récemment une forme recombinante de l'enzyme À-carraghénase a été produite (FR2873387, ([1])). Toutefois, elle n'a pas été décrite comme permettant l'obtention de fractions oligosaccharidiques bioactives. Il existe donc un réel besoin d'obtenir des fractions oligosaccharidiques présentant une activité biologique intéressante, en particulier au moyen d'un procédé permettant de contrôler les caractéristiques des fractions obtenus, tout en étant adapté à une production à l'échelle industrielle de ces fractions oligosaccharidiques. Description de l'invention La Demanderesse a mis au point, aux termes d'un processus de recherche élaboré, un procédé d'hydrolyse enzymatique innovant, combinant les avantages d'être finement contrôlable, de permettre la génération de produits de taille et de structure chimique également contrôlés, de qualité améliorée notamment grâce à un état de sulfatation préservé. Ce procédé innovant donne donc enfin la possibilité de tirer profit d'un réservoir de biodiversité naturelle afin d'isoler des molécules bioactives, au moyen d'un procédé qui plus est respectueux de l'environnement. La Demanderesse a ainsi réussi, dans le cadre de ses recherches, à générer des fractions d'oligosaccharides bioactifs, pour des applications innovantes. Un premier objet de l'invention se rapporte à un mélange d'oligo-À15 carraghénanes, possédant un pourcentage en poids d'oligo-Àcarraghénanes ayant un degré de polymérisation égal à 8 compris de 50 à 60% par rapport au poids total du mélange. En d'autres termes, l'invention se rapporte à un mélange comprenant de 50 à 60% en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de 2 0 polymérisation égal à 8, par rapport au poids total du mélange. On entend par « oligo-À-carraghénane », au sens de la présente invention, un oligosaccharide issu de l'hydrolyse du À-carraghénane. Le Àcarraghénane peut-être extrait à partir d'algues rouges marines, plus particulièrement les rhodophycées. Ces algues rouges marines peuvent 25 appartenir aux ordres des Gigartinales, Ahnfeltiales, et notamment les espèces Chondrus crispus et Gigartina sp., Mazzaella sp., Chondracanthus sp. Il peut s'agir plus particulièrement de Gigartina skottsbergii. Le À-carraghénane peut avoir un poids moléculaire allant de 200 kDa à 700 kDa, notamment aux environs de 500 kDa. 3 0 On entend par « degré de polymérisation égal à X », au sens de la présente invention, un nombre d'unités monomères constitutives de la chaîne d'oligo-À-carraghénane, égal à X. La masse moléculaire d'une unité disaccharidique d'oligo-À-carraghénane, c'est-à-dire deux monomères glucidiques liés par une liaison osidique, étant d'environ 580 Da, un degré de polymérisation X correspond à une masse moléculaire de l'oligo-Àcarraghénane d'environ X x 290 Da. A titre d'exemple, un oligo-À- carraghénane ayant un degré de polymérisation égal à 2 possède une masse moléculaire égale à environ 580 Da, un oligo-À-carraghénane ayant un degré de polymérisation égal à 8 possède une masse moléculaire égale à environ 2320 Da. A titre d'exemple, une unité disaccharidique d'oligo-À-carraghénane, comprenant une liaison osidique, possède la formule chimique suivante : OH cm 0 On entend par « mélange », au sens de la présente invention, tout produit constitué d'oligo-À-carraghénanes ayant différents degrés de polymérisation. Les degrés de polymérisation des oligo-À-carraghénanes du mélange peuvent être notamment de 2 à 20. Le mélange peut par exemple comprendre des oligo-À-carraghénanes dont le degré de polymérisation est de 2 à 20. La masse moléculaire de ce mélange peut aller de 580 à 5800 Da. Par exemple, le mélange d'oligo-À-carraghénanes peut posséder un 20 pourcentage en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation égal à 8 compris de 52 à 58%, ou de 54 à 56%, par exemple de 55%, par rapport au poids total du mélange. Par exemple, le mélange d'oligo-À-carraghénanes peut posséder un pourcentage en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de S03- 1 S03- polymérisation compris entre 2 (DP2) et 7 (DP7) inférieur à 1%, par exemple inférieur à 0,90%, ou inférieur à 0,80%. Le mélange de l'invention peut comprendre en outre de 20 à 25% en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation de 9 à 12, par rapport au poids total du mélange. En d'autres termes, le mélange de l'invention peut comprendre en outre de 20 à 25% en poids d'oligo-Àcarraghénanes ayant un degré de polymérisation pouvant être égal à 9 et/ou 10, et/ou 11, et/ou 12. Il peut s'agir par exemple de 21 à 24%, ou de 22 à 23% en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation de 9 à 12, par exemple d'environ 22%, par rapport au poids total du mélange. Le mélange de l'invention peut comprendre en outre de 20 à 25% en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation allant de 13 à 16, par rapport au poids total du mélange. En d'autres termes, le mélange de l'invention peut comprendre en outre de 20 à 25% en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation pouvant être égal à 13 et/ou 14, et/ou 15, et/ou 16.11 peut s'agir par exemple de 21 à 24%, ou de 22 à 23% en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation de 13 à 16, par exemple environ 23%, par rapport au poids 2 0 total du mélange. Avantageusement, le mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention possède une activité biologique. De manière particulièrement avantageuse, le mélange d'oligo-Àcarraghénanes de l'invention possède une activité impliquée dans la 25 réparation tissulaire et la cicatrisation, notamment une activité biologique sur deux facteurs essentiels à la réparation tissulaire : la réaction inflammatoire et la migration cellulaire. En particulier, le mélange d'oligo-Àcarraghénanes de l'invention peut stimuler la réaction inflammatoire et la migration cellulaire. Avantageusement, le mélange de l'invention stimule, 30 chez les macrophages, la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF- alpha (« Tumor Necrosis factor alpha »). On entend par « réaction inflammatoire », au sens de la présente invention, tout processus homéostatique impliqué dans la limitation de l'extension des lésions tissulaires, destruction de l'agent causal et activation du processus de réparation tissulaire. Une phase inflammatoire implique notamment des cellules macrophages qui ont un rôle primordial dans la phase de détersion de la plaie. Elle prépare également la seconde phase de cicatrisation proprement dite, impliquant la migration des cellules épithéliales pour la régénération des tissus endommagés. Le mélange de l'invention trouve donc des applications en santé humaine et animale. Ainsi, un autre objet de l'invention se rapporte à un mélange d'oligoÀ-carraghénanes de l'invention, comme médicament. En d'autres termes, l'invention se rapporte à l'utilisation d'un mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention, comme médicament, ainsi qu'à un médicament comprenant un mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention. Le médicament de l'invention ou le mélange peut être destiné à des patients affectés par une pathologie dans laquelle une immunostimulation et/ou une angiogenèse est souhaitée ou est bénéfique. Le médicament ou le mélange peut être destiné à des patients 2 0 affectés par une pathologie ou un état pour lesquels une réparation tissulaire et/ou une cicatrisation de la peau est souhaitée et/ou nécessaire. Il peut s'agir par exemple de tout état nécessitant une réparation tissulaire, comme par exemple un état suivant une blessure, ou un état suivant un acte chirurgical, par exemple une greffe. Alternativement, il peut s'agir 25 d'une maladie cardiovasculaire. Ainsi, un autre objet de l'invention se rapporte au mélange d'oligo-Àcarraghénanes de l'invention, pour son application comme médicament pour la réparation tissulaire et/ou la cicatrisation. En d'autres termes, il s'agit de l'utilisation d'un mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention 30 dans la préparation d'un médicament destiné à la réparation tissulaire et/ou la cicatrisation. Un autre objet de l'invention se rapporte à une composition pharmaceutique, dermatologique ou cosmétique, comprenant un mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention. Une composition pharmaceutique de l'invention peut comprendre en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir notamment d'un excipient permettant la libération contrôlée du ou des principes actifs, comme par exemple le Compritol® 888 ATO (Glyceryl dibehenate EP, Glyceryl behenate NF/Ch.P), ou permettant une amélioration de la solubilité et de la biodisponibilité, comme par exemple le CapryolTM 90 (Propylene glycol monocaprylate (type II) NF), vétérinaire, comme par exemple le GeleolTM Mono and Diglycerides NF (Glycerol monostearate 40-55 (type I) EP, Mono and diglycerides NF, Glyceryl stearate (USA FDA IIG)), nutraceutique, comme par exemple le Biogapress Végétal BM297ATO (Glyceryl dipalmitostearate E471/GRAS), ou des Solubilisants topiques/promoteurs de pénétration cutanée come par exemple le CapryolTM 90 (Propylene glycol monocaprylate (type II) NF), un émulsifiant comme le Plurol® Diisostearique (Triglycerol diisostearate EP/NF), cette liste n'étant pas limitative. Le médicament ou la composition pharmaceutique de l'invention peuvent être sous une forme destinée à la voie orale, percutanée. Il/elle peut se présenter sous la forme d'un sirop, d'une solution injectable ou d'une solution orale. Il/elle peut se présenter sous forme d'une poudre, de granules, d'un spray, d'une crème, d'une lotion ou d'un collyre, cette liste n'étant pas limitative. Le médicament ou la composition pharmaceutique de l'invention peut comprendre une concentration en mélange comprise entre 1 et 5 mg/kg corporel et par jour, par exemple entre 2 et 4 mg/kg, par exemple 1, ou 2, ou 3, ou 4, ou 5 mg/kg. Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation cosmétique d'un mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention, pour l'amélioration de l'aspect de la peau et/ou l'aspect d'une cicatrice. Une telle utilisation cosmétique s'entend d'une utilisation non thérapeutique, uniquement esthétique. En d'autres termes, une utilisation cosmétique s'entend par des utilisateurs sains, pour améliorer l'aspect d'une peau saine ou pour améliorer l'aspect d'une cicatrice. Il peut s'agir par exemple d'un état de la peau suivant une opération de chirurgie esthétique. A ce titre, l'invention s'entend d'une composition cosmétique comprenant le mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention. La composition cosmétique selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs supports cosmétiquement acceptable(s). Dans la présente, par « support cosmétiquement acceptable» on entend tout support cosmétique connu de l'homme du métier, il peut s'agir par exemple de tout support cosmétique pouvant être cité dans le dictionnaire INCI (International Nomenclature of Cosmetic Ingredients) publié par le PCPC (Personal Care Products Council). Selon l'invention, la composition cosmétique peut, par exemple, se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier. Il peut s'agir, par exemple d'une forme choisie parmi une émulsion huile-dans-l'eau, eau-dans-l'huile, une émulsion multiple, une microémulsion, d'une émulsion solide, un gel aqueux ou hydro-alcoolique, une crème, un lait, une pommade, une huile, un baume, un onguent, un gel, d'un masque, une poudre, un support imbibé, par exemple un patch transdermique, une solution, une lotion aqueuse ou hydroalcoolique, un spray, une suspension et/ou une cire, un sérum biphase, par exemple comprenant une fraction huileuse et une fraction aqueuse. Selon l'invention, la composition peut être sous toute forme connue de l'homme du métier dans les domaines de la cosmétique et de la dermatologie, sans aucune restriction galénique particulière. La composition selon la présente invention peut être, par exemple une composition pour le soin du visage, du corps, par exemple des compositions pour le visage et/ou le corps. La composition de l'invention peut être obtenue par tout procédé approprié connu de l'homme du métier pour la fabrication d'une composition cosmétique et/ou dermatologique. Il peut s'agir, par exemple d'un simple mélange. Il peut s'agir également, par exemple, d'un procédé comprenant une étape d'incorporation d'une phase interne dans une phase externe au moyen d'un émulseur, par exemple d'une turbine de type rotor-stator. Le mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention peut être préparé selon toute méthode connue de l'homme du métier. Un autre objet de l'invention se rapporte à un procédé de préparation du mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention, comprenant les étapes de : a) hydrolyse d'une préparation de À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation moyen de 3000 au moyen d'une Àcarraghénase, b) isolation d'un mélange d'oligo-À-carraghénanes présentant un pourcentage en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation égal à 8 compris entre 50 et 60% par rapport au poids total du mélange. Au sens de la présente invention, la « préparation de Àcarraghénanes » peut être obtenue par toute méthode connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une extraction basique à chaud de À-carraghénanes à partir d'une algue rouge, ceci permettant l'obtention d'un bain d'extraction, suivie d'une étape de filtration/concentration par isoprapanol permettant l'obtention d'un gel, puis d'une étape de passage/séchage. La préparation de À-carraghénanes peut comprendre des oligo-À-carraghénanes dont le degré de polymérisation est compris entre 1000 et 5000, par exemple entre 1500 et 4500, ou entre 2000 et 4000, ou entre 2500 et 3500, et notamment un degré de polymérisation moyen d'environ 3000 (poids moléculaire moyen de 500 kDalton). On entend par « À-carraghénase », au sens de la présente invention, toute enzyme permettant d'hydrolyser le À-carraghénane. En d'autres termes, il peut s'agir de toute enzyme permettant de rompre les liaisons osidiques sans endommager les monomères. Il peut s'agir d'une enzyme recombinante ou d'une enzyme obtenue par extraction à partir des cellules bactériennes P. carrageenovora. La production et la purification de l'enzyme peuvent être effectuées selon toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple au moyen de la méthode de Guibet et al. (Guibet et al (2007), Biochem. J., 404: 105-114, ( [2] )) . Dans le cas d'une enzyme recombinante, il peut s'agir d'une enzyme naturellement sécrétée par la bactérie marine P. carrageenovora, souche bactérienne référencée à l' »American Type Culture Collection » (ATCC) sous le numéro 43555. Il peut s'agir de l'enzyme décrite dans le document FR2873387 ( [1 ] ). L'hydrolyse peut être réalisée pendant un temps allant d'environ 18 heures à environ 30 heures ou plus, à une température d'environ 30°C, ou dans des conditions thermodynamiques équivalentes. Préférentiellement, le temps est d'environ 19h à 22h à 30°C. Avantageusement, le temps d'hydrolyse est d'environ 20 heures, afin d'obtenir un enrichissement en oligo-À-carraghénanes optimal. Avantageusement, la concentration d'enzymes dans le milieu n'est pas limitante. La concentration peut être d'au moins 4 pg/ml de Àcarraghénase, par exemple de 5 pg/ml, ou 6 pg/ml, ou 7 pg/ml de Àcarraghénase. A l'issue de la phase d'hydrolyse, une fraction d'oligo-À- carraghénanes est obtenue, dans laquelle les molécules d'oligo-Àcarraghénanes présentent un degré de polymérisation allant de 2 à 20. Cette fraction peut notamment contenir entre 52 et 54 % en poids d'oligoÀ-carraghénanes de degré de polymérisation égal à 8, par rapport au poids total de la fraction. L'isolation du mélange d'oligo-À-carraghénanes de l'invention peut être réalisée par toute méthode de séparation connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une méthode chromatographique préparative, comme la chromatographie par exclusion de taille ou encore de techniques de chromatographie d'échanges d'anions et/ou de 3 0 l'ultrafiltration sur membranes. Dans un mode de réalisation du procédé de l'invention, l'étape b) peut être précédée d'une étape d'isolation d'une fraction d'oligo-À- carraghénanes présentant un pourcentage en poids d'oligo-Àcarraghénanes ayant un degré de polymérisation allant de 8 à 16 compris entre 70 et 85% par rapport au poids total du mélange. Enfin, un autre objet de l'invention est un mélange d'oligo-À- carraghénanes susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé tel que défini ci-dessus. Ce mélange possède les caractéristiques techniques du mélange tel que défini ci-avant. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures La figure 1 représente une analyse en gel C-PAGE de la cinétique d'hydrolyse du À-carraghénane par la À-carraghénase. Elle montre la migration des oligo-À-carraghénanes et identifie notamment les DP2, DP4, DP6 et DP8 pour des temps d'hydrolyse (minutes) de 0, 15, 30, 60, 120, 320, 1170 et 1410. - La figure 2 représente une analyse par chromatographie d'exclusion de taille préparative des oligo-À-carraghénanes obtenus par hydrolyse enzymatique du À-carraghénane par la À-carraghénase, avec les pics d'élution des oligosaccharides en index de réfraction (mV) en fonction du temps d'élution en minutes. Panel A : chromatogramme complet montrant notamment les pics d'élution pour les DP16-8, DP6 et DP4. Panel B : élargissement en ordonnées du chromatogramme visualisé sur le panel A ; le rectangle DP16-8 et le rectange DP6 du panel A indiquent les fractions retenues pour isoler les oligosaccharides de DP8 à 16 et DP6 respectivement. - La figure 3 représente une analyse qualitative en gel filtration des fractions d'oligo-À-carraghénanes purifiées en Index de réfraction (mV) par rapport au temps d'élution en minutes. Panel A : DP6 purifié. Panel B : mélange présentant une majorité de DP8. - La figure 4 représente une observation microscopique des monocytes THP-1 non traitées (panel de gauche) et de monocytes après traitement au PMA (200 nM) pour leur différenciation en macrophages (panel de droite). Les flèches indiquent les extensions cytoplasmiques (grossissement x200, observation à 30 heures +/- traitement au PMA). - La figure 5 représente une observation microscopique de la morphologie de macrophages THP-1 non traités (panel A) et des macrophages THP-1 après 24 heures de traitement avec le mélange DP8 d'oligo-À-carraghénanes (panel B ; 0,7g/1). - La figure 6 représente une régression linéaire du logarithme de l'absorbance (ordonnées) en fonction du logarithme de la concentration de TNF-alpha (abscisses). - La figure 7 représente une étude de l'effet des oligo-Àcarraghénanes DP8 et DP6 sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1, exprimée par la concentration de TNF-alpha en pg/ml pour une échantillon comprenant, de gauche à droite : le contrôle (ctl correspondant aux cellules incubées sans ajout d'oligo-À-carraghénane) seul ; le contrôle + LPS ; les DP6 ; les DP6 + LPS ; les DP8 ; les DP8 + LPS. Les traitements sont effectués à la concentration de 0,35 g/I. Le LPS est utilisé à 0,1 pg/m I. - La figure 8 représente un effet de doses croissantes d'oligo-Àcarraghénanes « DP8 » sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1 (les concentrations de TNF-alpha sont indiquées en g/1). Les concentrations en DP8 sont les suivantes (de gauche à droite) : 0 g/I, 0,175 g/I, 0,35 g/I et 0,7 g/I. - La figure 9 est une représentation graphique des résultats obtenus pour la migration des kératinocytes (« wound healing ») traités par les oligo-À-carraghénanes en mélange DP8 à la concentration finale de 0,7 g/l dans le milieu de culture des cellules [oligo-À(DP8)] ou par le contrôle (sérum physiologique). Panel A : résultats obtenus pour les trois expériences indépendantes ; *P L'enzyme sécrétée dans le surnageant de culture est alors purifiée par ultrafiltration tangentielle sur un système Pellicon (Millipore, 30 kDa), puis par précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium (30 % final) et enfin dialyse des fractions contre un tampon phosphate 20 mM de pH égal à 7,4. Ce protocole permet l'obtention d'une enzyme suffisamment purifiée et stable plusieurs mois à 4°C. Hydrolyse enzymatique du À-carraghénane Une cinétique de digestion est préalablement établie afin de définir les conditions expérimentales propices à un enrichissement en oligo-À- carraghénanes d'une échelle de taille s'étalant des degrés de polymérisation (DP) les plus petits (« oligos limites ») aux DP moyens (env. DP20). Le substrat est préparé par dissolution du À-carraghénane à 0,5 % dans un tampon phosphate 25 mM, NaCI 100mM, pH 7. Une hydrolyse est effectuée sur un millilitre de ce substrat par ajout de l'enzyme à la concentration de 5 pg/ml. La réaction est régulièrement agitée manuellement, notamment dans les premières heures de l'hydrolyse pendant lesquelles le substrat peu hydrolysé rend le mélange réactionnel visqueux. La réaction est menée pendant 24 heures avec échantillonnages réguliers du milieu réactionnel. Pour chaque échantillon, la réaction est stoppée par chauffage au bain marie à 95°C pendant 10 minutes. L'analyse des échantillons et ainsi de la cinétique d'hydrolyse du Àcarraghénane se fait par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (« Carbohydrate-PAGE ») et révélation des oligosaccharides libérés au nitrate d'argent. Pour l'hydrolyse à plus grande échelle, les conditions retenues sont 20 heures d'incubation sous agitation, à 30°C, avec 5 pg/ml de Àcarraghénase. Deux cent cinquante millilitres de substrat sont ainsi hydrolysés, soit 1,25 grammes de À-carraghénane. Purification et analyse des oligo-À-carraghénanes La purification des oligosaccharides est effectuée par ultrafiltration de l'hydrolysat sur membrane de seuil de filtration fixé à 30 kDa (cellule Amicon, Millipore). Le filtrat est dialysé contre l'eau distillée puis concentré environ 50 fois par chauffage / évaporation sous vide jusqu'à l'obtention d'un volume de 6 ml. Ce concentré est ensuite filtré à travers une membrane à 0,45 pm afin d'éliminer toute trace de précipité salin en préparation de l'étape de purification suivante. Les oligo-À-carraghénanes contenus dans le concentré obtenu à l'étape précédente sont séparés par chromatographie d'exclusion de taille préparative sur deux colonnes de seuil d'exclusion fixé à 30 kDa (« Hiload Tm 26/60 SuperdexTM 30 prep grade », GE Healthcare) montées en série et couplées à un appareillage de marque Gilson. La détection se fait avec un réfractomètre différentiel (« Spectra System RI-50 »). L'élution est effectuée dans un tampon de carbonate d'ammonium à 100 mM par fractions de 10 ml avec un collecteur « Gilson 215 liquid handler ». Les fractions correspondant aux oligosaccharides d'intérêt sont regroupées de façon à isoler les oligosaccharides de DP4 et de DP6, alors que les DP de 8 à 16 sont regroupés. Les oligosaccharides en solution sont alors lyophilisés. Une deuxième analyse des fractions purifiées à l'étape précédente est effectuée par chromatographique d'exclusion de taille en injectant une solution à 0,4% dans l'eau mQ sur un appareillage « Dionex Ultimate® 3000 » et une colonne SuperdexTM peptide 10/300. La séparation s'effectue en 60 minutes sous éluant nitrate de lithium (LiNO3) à 100 mM. Pour les tests cellulaires, les fractions oligosaccharidiques lyophilisées correspondant aux DP 8 à 16, d'une part, et correspondant au DP6, d'autre part, sont solubilisées, dans du tampon phosphate salin (PBS) pour les tests d'immunostimulation, et dans du sérum physiologique pour les tests de « wound healing ». 2/ Mesure de l'activité immunostimulante in vitro sur cellules: mesure de la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages 2.1/ Culture cellulaire Les cellules sont les monocytes THP-1 isolés à partir du sang d'un enfant âgé d'un an atteint d'une leucémie monocytaire aigüe [Tsuchia S. et al., Int J Cancer 26 : 171-176 (1980), ( [4] )]. Elles sont cultivées dans le milieu de culture RPMI 1640 + Glutamax® (Life technologies) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (s-RPMI), à 37°C sous une atmosphère enrichie à 5% de CO2. Les cellules présentent une morphologie ronde et croissent en suspension avec formation de grappes (figure 4, panel de gauche). L'ensemencement se fait à 1.105 cellules/ml et la culture est diluée lorsque que la concentration cellulaire atteint 1.106 cellules/ml. 2.2/ Obtention des macrophages Les macrophages sont obtenus par différenciation des monocytes THP-1 avec le phorbol 12-myristate 13-acetate [PMA, Tsuchia S. et al., Cancer Res 42 : 1530-1536 (1982), ( [5] )] . Les monocytes sont lavés et repris à 1.106 cellules/ml dans le milieu de culture RPMI 1640 + Glutamax® non supplémenté en sérum auquel est ajouté 200nM de PMA (Sigma Aldrich). Les cellules sont alors rapidement transférées dans des plaques de culture cellulaires 12 puits dans lesquels seront effectués les traitements par les composés. Chaque puits (3,8 cm2) est ensemencé par 1 ml de la suspension cellulaire (1.106 cellules) et les cellules sont incubées pendant 24 à 48 heures à 37°C sous 5% de CO2. A l'issue de cette période de différenciation, la majorité des cellules adhère au fond des puits de culture et les cellules adoptent une morphologie de type macrophage, ce qui est observable sur la figure 4 (panel de droite). 2.3/ Traitement des macrophages Le milieu de différenciation est éliminé et les cellules lavées dans 1m1 de PBS puis 1m1 de s-RPMI afin d'éliminer le PMA ainsi que les cellules non adhérentes. Les cellules adhérées au fond des puits sont reprises dans 1 ml de milieu s-RPMI pour les traitements. Les cellules sont traitées pour une durée de 24 heures par les oligoÀ-carraghénanes, aux concentrations de 0,70 g/I, 0,35 g/I et 0,175 g/I. Le témoin négatif correspond aux cellules incubées sans ajout de composé. Six puits sont utilisés pour chaque concentration testée. A l'issue de cette étape, pour chaque concentration testée, 3 puits sont utilisés afin de poursuivre l'incubation des cellules en présence de lipopolysaccharide bactérien à la concentration de 0,1 pg/ml (LPS d'Escherichia coli sérotype 0111:B4, réf. L2630 Sigma Aldrich) pendant 6 heures (Takashiba et al 1999, Infect. & Immun. 67: 5573-8, ( [6])). Le LPS est reconnu pour stimuler la sécrétion de TNF-alpha chez ces cellules (Wright et al 1990, Science 249: 1431, ( [7])). Ainsi, chaque condition est testée en triplicata indépendants. 2.4/ Mesure du relargaqe de TNF-alpha par les macrophages : test ELISA La mesure de la sécrétion de TNF-alpha se fait dans le surnageant de culture des macrophages par un dosage en ELISA (« enzyme-linked immunosorbent assay »). Ce test est effectué en plaques 96 puits. Brièvement, le fond des puits est enrobé d'un premier anticorps reconnaissant spécifiquement le TNF-alpha. Cet anticorps va permettre de capturer et d'isoler le TNF-alpha présent dans le surnageant de culture. Un deuxième anticorps biotinylé est ensuite ajouté afin de détecter les molécules de TNF-alpha préalablement capturées. Cet anticorps est alors spécifiquement détecté par l'ajout de la streptavidine couplée à une enzyme peroxydase (HRP). L'ajout d'un substrat chromogénique de la peroxydase permet alors de mesurer en spectrophotométrie la quantité de TNF-alpha initiale présente dans le surnageant testé. Ce calcul se fait par l'établissement, en parallèle des tests, d'une courbe étalon de concentrations de TNF-alpha recombinant allant de 0 à 2000 pg/ml. La régression linéaire est obtenue en passant les valeurs de concentration de TNF-alpha et d'absorbance correspondantes en échelle log10 (figure 6). La réaction chromogénique est stoppée par l'ajout d'acide sulfurique et la lecture est effectuée à une longueur d'onde de 450nm avec une correction automatique à 540nm. Chaque surnageant de culture à l'issue de l'étape précédente a fait l'objet de deux tests ELISA indépendants. Ainsi, pour chaque condition de traitement nous avons obtenu six valeurs d'absorbance. Matériel, produits, tampons, temps d'incubation, concentrations d'utilisation des différents réactifs et références : - anticorps de capture (ref. MAB610, R&D Systems) : 2 pg/ml dans le PBS ; 100 pl par puits ; incubation sur la nuit à température ambiante - TNF-alpha recombinant (ref. 210-TA, R&D Systems) : dilution dans TBST-BSA ; 100 pl de chaque dilution dans les puits de la gamme étalon ; incubation 2 heures à température ambiante - Surnageants de culture : 100 pl par puits ; incubation 2 heures à température ambiante - anticorps de détection (ref. BAF210, R&D Systems) : 50 ng/ml dans le tampon Tris NaCI 0,1% BSA 0,05% Tween20 (TBST-BSA) ; 100 pl par puits ; incubation 2 heures à température ambiante - Streptavidine-HRP (ref. 43-4323, 1,25 mg/ml, Invitrogen) : utilisation au 1:20000è dans le TBST-BSA ; 100 pI par puits ; incubation de 20 minutes à température ambiante. - Substrat chromogénique : 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) (ref. T5525, Sigma) : dissolution à 0,1 mg/mi dans un tampon phosphate-citrate 0,05 M ; 100 pI par puits ; incubation 20-30 mintues à température ambiante - Acide sulfurique : 0,5 M ; 100 pI par puits - Lecteur de microplaques : Safire2, TECAN Ltd 3/ Mesure de l'effet sur la migration cellulaire : test du « wound healing » Ces expériences ont été effectuées sous prestation auprès de la plateforme ImPACcell du réseau Biogenouest à Rennes. 3.1/ Cellules et traitement par les composés Les cellules utilisées sont des HaCAT, lignée humaine de kératinocytes immortalisés. Elles sont cultivées dans le milieu DMEM supplémenté par de la glutamine et 10% de sérum de veau foetal. Pour le test de « wound healing », les cellules sont ensemencées dans des plaques 96 puits de manière à obtenir une monocouche. A confluence, les cellules sont traitées 24 heures avec les oligosaccharides. Le sérum physiologique est utilisé comme contrôle de référence. 3.2/ Mesure de la migration cellulaire Après 24 heures de traitement des cellules par les composés, une griffure est faite sur le tapis cellulaire en utilisant un cône de pipette de 200 pl stérile. Le milieu de culture n'est pas changé après la griffure, les cellules sont donc toujours en présence des composés pendant le suivi de la migration cellulaire qui s'étale sur 4 jours. La migration cellulaire est observée en « time lapse » avec un vidéomicroscope en contraste de phase (Microscope inversé automatique de marque Zeiss et de type « Axiovert 200M »). Le système de mesure est équipé d'une chambre thermostatée régulant la température et l'atmosphère enrichi en CO2 afin de maintenir les cellules en conditions physiologiques. Les coordonnées x, y et z de la griffure sont enregistrées pour chaque puits. Ainsi, au moment de la griffure puis à intervalles de temps réguliers, 6 photos (grossissement x10) de la griffure sont faites à la même position pour chaque puits. Ces acquisitions sont automatisées par l'utilisation du logiciel « Axioimager » (Zeiss). Ce protocole d'acquisition d'image permet une bonne représentativité pour déterminer l'ampleur de la migration cellulaire aux abords de la griffure. Pour quantifier la migration cellulaire, les images sont analysées grâce au logiciel « Simple PCI » (Hamamatsu) qui permet de mesurer la superficie de la griffure. À chaque temps d'acquisition, cette superficie est soustraite à la superficie de la griffure des contrôles au temps zéro et est exprimée en pourcentage de fermeture de la griffure. Les résultats représentent la moyenne calculée pour un total de 4 griffures pour le composé à tester et 8 griffures pour le contrôle. Trois expériences indépendantes ont été menées, et pour chacune l'analyse statistique des résultats a été faite en utilisant un test « One-Way ANOVA 2 0 » suivi d'un « test t de Bonferroni ». Exemple 2 : RESULTATS 1/ Préparation, analyses et purification des oligo-À-carraghénanes 25 1.1/ Analyse de la cinétique d'hydrolyse du À-carraghénane L'objectif de ce travail étant d'étudier le potentiel bioactif des oligo-Àcarraghénanes, nous avons recherché le temps d'hydrolyse par l'enzyme permettant un enrichissement en oligosaccharides de DP Ainsi, par cette approche préliminaire, nous avons choisi un temps d'incubation de 20 heures pour la préparation des oligo-À-carraghénanes. 1.2/ Purification par chromatographie d'exclusion de taille préparative Le chromatogramme permet de faire une première analyse visuelle du profil du mélange d'oligo-À-carraghénanes purifiés. On retrouve ici l'enrichissement en oligosaccharides de DP6 et 4 (figure 2, panel A, rectangles rouge et noir respectivement). Les oligosaccharides de DP8 et supérieurs sont produits en faibles quantités (figure 2, panel A, rectangle bleu). On peut néanmoins distinguer les pics d'élutions des DP8 à 16 en effectuant un grossissement de l'échelle de l'axe des ordonnées (figure 2, panel B, rectangle bleu). On constate de plus que dans ce cas, le DP8 est majoritaire. Ainsi les fractions correspondant respectivement au pic d'élution du DP6 (rectangle rouge) d'une part, et aux pics d'élution des DP8 à 16 (rectangle bleu) d'autre part, sont rassemblées puis lyophilisées pour les étapes suivantes. 1.2/ Analyse par chromatographie d'exclusion de taille Les produits lyophilisés issus de l'étape de purification des fractions d'oligo-À-carraghénane par chromatographie d'exclusion de taille (figure 2) ont été analysés une seconde fois avec une approche analytique plus rapide afin de vérifier leur pureté. Les résultats de cette analyse sont exposés à la figure 3. Le chromatogramme visualisé sur le panel A montre que les fractions retenues pour purifier l'oligosaccharide de DP6 ne contiennent effectivement que cette molécule. Le chromatogramme du panel B indique que l'oligosaccharide de DP8 est la molécule majoritairement représentée dans le mélange analysé. En revanche, la résolution moindre de cette analyse ne permet pas de visualiser clairement la présence des oligosaccharides de DP14 et DP16. Les produits de lyophilisation sont pesés afin de calculer le rendement de purification des oligosaccharides d'intérêt. Ainsi, à partir de 1,25 gramme de À-carraghénane initial, nous avons produit et purifié : - 90 mg de DP6, soit un rendement de 7,2% - 24 mg de mélange contenant majoritairement du DP8, soit un rendement de 1,9% Le protocole d'hydrolyse n'ayant pas été optimisé pour la production de ces oligosaccharides en particulier mais pour un mélange, les rendements sont faibles. Par souci de simplification, la nomenclature DP8 est utilisée pour désigner le mélange oligosaccharidique contenant majoritairement du DP8. 2/ Observation microscopique de la morphologie des cellules THP-1 2.1/ Effet du traitement des monocytes au PMA pour leur différenciation en macrophages Les monocytes en culture sont observables sous formes de cellules rondes en suspension dans le milieu de culture, avec formation de grappes (figure 4, gauche). Le traitement au PMA à une concentration de 200 nM entraîne rapidement l'adhérence des cellules au fond du puits de culture. Les cellules deviennent plus granuleuses et adoptent une forme plus allongée avec des extensions cytoplasmiques (figure 4, droite). Ces caractères morphologiques indiquent, pour ce type cellulaire, une différenciation des monocytes en macrophages. 2.2/ Effet du traitement par les oligo-À-carraghénanes sur la morphologie des macrophages Les cellules sont observées après 24 heures de traitement avec les oligo-À-carraghénanes, avant traitement secondaire au LPS (figure 5). En comparaison avec les macrophages non traités (figure 5, gauche), on remarque une accentuation des caractères morphologiques caractéristiques des macrophages, notamment une proportion plus grande de cellules allongées avec extensions cytoplasmiques (figure 5, droite). Ces observations suggèrent ainsi que les oligo-À-carraghénanes induisent le phénotype macrophagique des cellules. 3/ Test ELISA : courbe étalon de TNF-alpha Une gamme de concentrations de TNF-alpha comprises entre 15,6 et 2000 pg/ml est utilisée afin de définir l'équation de proportionnalité entre les mesures d'absorbance effectuées à l'issue du dosage ELISA et les concentrations de TNF-alpha. La régression linéaire est obtenue en effectuant une transformation logarithmique des valeurs (figure 6). 4/ Effet des olicio-À-carraghénanes sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages Le potentiel immunomodulateur des oligo-À-carraghénanes est évalué en étudiant leur effet sur la sécrétion de la cytokine TNF-alpha par les macrophages. Ainsi les effets de l'oligosaccharide DP6 et du mélange DP8 sont comparés, ce qui est illustré sur la figure 7. Alors que des concentrations très discrètes de TNF-alpha sont détectables dans les surnageants de culture des macrophages non traités, un traitement au LPS induit une très forte augmentation de la sécrétion de TNF-alpha à des niveaux supérieurs à 2000 pg/ml de surnageant de culture. Ces contrôles internes à l'expérience montrent que nous pouvons utiliser cette approche expérimentale afin étudier l'effet de composés sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages. On constate qu'un traitement aux oligo-À-carraghénanes de DP6 entraîne une légère stimulation de la sécrétion de TNF-alpha. Cet effet est beaucoup plus marqué (x10) lorsque les macrophages sont incubés en présence d'oligo-À-carraghénanes en mélange DP8. Ceci indique un effet direct de la longueur de la chaine oligosaccharidique sur l'activité biologique observée. Un traitement simultané des macrophages avec le mélange DP8 et le LPS n'induit pas plus de sécrétion de TNF-alpha qu'un traitement au LPS seul. Cela suggère que les niveaux observés de sécrétion de TNF-alpha après stimulation au LPS sont saturants et ne sont pas augmentables par un co-traitement avec un deuxième stimulant de la sécrétion de la cytokine. Afin de prouver la spécificité de la stimulation, nous avons testé l'effet de doses croissantes d'oligo-À-carraghénanes en mélange DP8. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 8. Ces résultats confirment que les oligo-À-carraghénanes stimulent la sécrétion de TNF-alpha chez les macrophages, et ce, de façon proportionnelle à la dose de composé utilisée pour effectuer les traitements. Nous n'observons pas non plus dans cette expérience une sécrétion accrue de TNF-alpha lors d'un traitement simultané par les oligo-À-carraghénanes et par le LPS. Ainsi, les résultats obtenus n'indiquent pas si la stimulation de la sécrétion de TNF-alpha par les oligoÀ-carraghénanes met en jeu les mêmes voies de signalisation que le LPS. Ces premiers résultats indiquent que les oligo-À-carraghénanes sont capables d'activer une réponse de type inflammatoire chez les macrophages par la stimulation de la sécrétion de TNF-alpha. La forte différence de stimulation induite par le mélange DP8 par rapport à celle qui est induite par l'oligo-À-carraghénane DP6 illustre bien, pour ce type de composé, l'importance de la longueur de la chaîne oligosaccharidique et renforce les arguments en faveur d'une relation étroite entre activité biologique des oligosaccharides et leur degré de polymérisation. 5/ Effet des oligo-À-carrachénanes sur la migration cellulaire (test du « wound healing ») Trois expériences indépendantes ont été menées afin d'étudier l'effet des oligo-À-carraghénanes sur la migration des kératinocytes. Les résultats sont représentés à la figure 9. L'analyse des résultats montre un effet activateur du mélange DP8 5 d'oligo-À-carraghénanes sur la migration des kératinocytes. L'effet activateur de ce mélange est reproductible et a été confirmé dans chacune des expériences réalisées (figure 9, panel A). La moyenne de ces 3 expériences, réalisées chacune en quadruplicate, montre ainsi une augmentation significative de la migration 10 cellulaire induite par le mélange DP8 d'oligo-À-carraghénanes après 48h d'incubation des kératinocytes (figure 9, panel B). En comparaison, des expériences identiques ont été menées en incubant les kératinocytes avec la fraction DP6 d'oligo-À-carraghénanes (données non montrées). 15 Ces résultats ont été obtenus pour des concentrations en DP6 du même ordre de grandeur que celles utilisées pour le mélange DP8. Alors que dans la première expérience le composé DP6 montre un effet inverse à celui observé pour le mélange DP8, c'est-à-dire inhibiteur de la migration cellulaire, cet effet n'est pas reproductible pour les deux expériences 20 suivantes. Ainsi, le composé DP6 ne semble pas avoir d'effet sur la migration des kératinocytes. Ce résultat appuie donc les résultats obtenus lors de l'étude de l'immunomodulation et met une nouvelle fois l'accent sur l'existence d'un lien direct entre la longueur de la chaine oligosaccharidique des oligo-À- 25 carraghénanes et l'activité biologique de ceux-ci. CONCLUSION Il est montré ici que des oligo-À-carraghénanes dérivés du Àcarraghénane, un polysaccharide extrait de la macro-algue rouge Gigartina 30 skottsbergii et présent dans de nombreuses algues rouges, présentent une activité immunomodulatrice sur un modèle cellulaire animal d'étude in vitro, une lignée monocytaire humaine. Ces oligo-À-carraghénanes sont obtenus par un processus innovant d'hydrolyse enzymatique des polysaccharides par la À-carraghénase de la bactérie marine Pseudolteromonas carrageenovora, enzyme qui a été caractérisée sous sa forme recombinante. L'enzyme est utilisée sous sa forme native, c'est-à-dire purifiée à partir de sa souche bactérienne qui l'exprime naturellement. Pour la première fois, nous montrons que cette enzyme peut être utilisée pour produire des oligo-À-carraghénanes biologiquement actifs chez l'humain. L'effet immunomodulateur des oligosaccharides démontré ici concerne la stimulation des caractères de différenciation des monocytes en macrophages, acteurs essentiels de l'immunité et de la réponse inflammatoire, ainsi que la stimulation de la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF-alpha par ces cellules. Ces résultats sont le reflet d'une réponse extracellulaire des 15 macrophages dans un contexte d'enclenchement du processus immunitaire et inflammatoire. Il est également démontré que les oligo-À-carraghénanes générés sont capables de stimuler la migration des kératinocytes dans un contexte de réparation d'un tapis cellulaire. 20 Il est montré que l'action spécifique d'un mélange d'oligosaccharides contenant majoritairement un oligo-À-carraghénane de DP8 en comparaison avec un oligo-À-carraghénane isolé de DP6. Ceci suggère une relation très étroite entre la structure des composés et leurs activités biologiques respectives. 25 Le procédé d'hydrolyse enzymatique de la présente invention permet donc le contrôle fin de la taille et de la nature des produits oligosaccharidiques générés. Il est ici démontré que les composés sont actifs sur des macrophages en stimulant leurs caractères pro-inflammatoires notamment par 30 l'augmentation de la sécrétion de la cytokine TNF-alpha. Ils sont également capables de stimuler la migration de kératinocytes dans un contexte de réparation d'un tapis cellulaire endommagé mécaniquement. Ces deux aspects constituent des étapes très importantes dans les processus de réparation tissulaire et de cicatrisation suite à une perte de l'intégrité d'un tissu. En effet ils font intervenir les macrophages dès les premières étapes de la réaction inflammatoire afin d' « épurer » la plaie (étape de détersion) et, dans un second temps, les cellules épithéliales (notamment les kératinocytes) qui vont proliférer et migrer afin de réparer les tissus endommagés au niveau de la plaie. Il faut par ailleurs noter que l'inflammation régule de nombreuses autres fonctions biologiques, dont les dérèglements sont à la base de nombreux désordres pathologiques. Ainsi, les oligo-À-carraghénanes présentent un intérêt d'application dans le domaine de l'immunostimulation au sens large. La migration cellulaire est également un élément important dans l'angiogenèse qui, outre son rôle dans la réparation tissulaire, représente une cible thérapeutique de choix pour le traitement des maladies cardiovasculaires. En effet, l'angiogenèse est un processus puissant et physiologique qui est la façon naturelle par laquelle un organisme répond au manque d'irrigation sanguine d'un organe vital en produisant des vaisseaux sanguins parallèles afin de surmonter l'ischémie.20 REFERENCES 1. FR 2 873 387. 2. Guibet et al (2007), Biochem. J., 404: 105-114. 3. Weigl et Yaphe (1966), Canadian J. Microbiol., 12(5): 939-947. 4. Tsuchia S. et al., Int J Cancer 26 : 171-176 (1980). 5. PMA, Tsuchia S. et al., Cancer Res 42 : 1530-1536 (1982). 6. Takashiba et al 1999, Infect. & Immun. 67: 5573-8. 7. Wright et al 1990, Science 249: 1431. 10 29 REVENDICATIONS1. Mélange d'oligo-À-carraghénanes, caractérisé en ce qu'il possède un pourcentage en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation égal à 8 compris entre 50 et 60% par rapport au poids total du mélange. 2. Mélange selon la revendication 1, comprenant en outre un pourcentage en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation 9 à 12 compris entre 20 et 25% par rapport au poids total du mélange. 3. Mélange selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre un pourcentage en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation allant de 13 à 16 compris entre 20 et 25% par rapport au poids total du mélange. 4. Procédé de préparation d'un mélange d'oligo-À-carraghénanes, comprenant les étapes de : a) hydrolyse d'une préparation d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation moyen de 3000 au moyen d'une Àcarraghénase, b) isolation d'un mélange d'oligo-À-carraghénanes présentant un pourcentage en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation égal à 8 compris entre 50 et 60% par rapport au poids total du mélange. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'étape b) est précédée d'une étape d'isolation d'une fraction d'oligo-À-carraghénanes présentant un pourcentage en poids d'oligo-À-carraghénanes ayant un degré de polymérisation allant de 8 à 16 compris entre 70 et 85% par rapport au poids total du mélange. 30 3023292 6. Mélange d'oligo-À-carraghénanes susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé tel que défini dans la revendication 4 ou 5. 5 7. Composition pharmaceutique, dermatologique ou cosmétique, comprenant un mélange d'oligo-À-carraghénanes tel que défini dans les revendications 1 à 3 ou 6. 8. Mélange d'oligo-À-carraghénanes tel que défini dans les 10 revendications 1 à 3 ou 6, comme médicament. 9. Mélange d'oligo-À-carraghénanes tel que défini dans les revendications 1 à 3 ou 6, pour son application comme médicament pour la réparation tissulaire et/ou la cicatrisation. 15 10. Utilisation cosmétique d'un mélange d'oligo-À-carraghénanes tel que défini dans les revendications 1 à 3 ou 6, pour l'amélioration de l'aspect d'une peau saine.