Brevet FR3021330A1 — publié le 20151127

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte à un procédé de dosage d'acides nucléiques de type ADN, issus d'un relargage aptamères ADN immobilisés sur le support d'une colonne de chromatographie par affinité, permettant de contrôler l'intégrité de ladite colonne et la qualité du produit purifié. Ce procédé permet, notamment, de mesurer le relargage des aptamères ADN à partir du support. Plus précisément, le dosage des aptamères de type ADN est réalisé par la méthode de PCR quantitative, dans un mélange réactionnel contenant i) un couple d'amorces nucléotidiques non dégénérées, spécifiques desdits aptamères ADN, et ii) un agent intercalant fluorescent s'hybridant avec le produit de l'amplification, c'est-à-dire des acides nucléiques ADN double brins. ART ANTERIEUR Les aptamères sont des oligonucléotides, synthétiques, de type ARN ou ADN (simple brin ou double brins), capables de se lier spécifiquement à un ligand. Ce ligand peut être lui-même de nature très variée, notamment des protéines, des sucres, des lipides, des petites molécules organiques, voire même des cellules entières. Les aptamères nucléiques ARN ou ADN sont classiquement sélectionnés par la mise en oeuvre du procédé SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) décrit par Tuerk et al. (1990, Science, Vol. 249 : 505-510), ou l'une de ses nombreuses variantes. Le procédé SELEX a été mis au point afin de sélectionner des aptamères nucléiques se liant spécifiquement à un ligand d'intérêt. Une banque combinatoire d'oligonucléotides synthétiques est utilisée comme produit de départ. Les acides nucléiques qui ont une bonne affinité et une bonne spécificité pour le ligand d'intérêt sont sélectionnés à la suite d'une pluralité de cycles successifs de fixation/amplification sur le ligand cible. De par leurs caractéristiques de liaison spécifique à très haute affinité à un ligand cible, les aptamères nucléiques sont souvent considérés comme étant des anticorps de nature nucléotidiques. De plus, les aptamères nucléiques sont décrit comme non immunogènes, n'induisent pas d'effets secondaires résultant d'une réponse immunitaire non voulue et sont manipulables dans des conditions de fortes concentration saline et à des pH très variés, notamment à pH basique. Grâce à toutes ces caractéristiques, et de manière plus générale, les aptamères nucléiques trouvent une application dans des domaines aussi variés que : - (i) la détection de ligands cibles, en particulier pour le diagnostic médical ; c'est le cas par exemple de l'identification et la détection de biomarqueurs pour certaines pathologies, la détection de toxine bactérienne, voire la détection et l'isolation de cellules entières, comme par exemple des bactéries pathogènes ; - (ii) l'utilisation des aptamères pour l'adressage de principes actifs de manière ciblées vers un type de cellules spécifique, voire à l'échelle cellulaire ; - (iii) la conception de nouveaux principes actifs ; et - (iv) la purification de ligands cibles, en particulier la purification de protéines d'intérêt thérapeutique. Dans le cadre plus spécifique de la purification de molécules d'intérêts par chromatographie d'affinité, divers travaux ont par ailleurs rapporté la mise au point de méthodes d'obtention de supports solides sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques (Romig et al. (1999, J Chrommatography B : Biomedical Sciences et Applications, Vol. 731 (2) : 275-284), Deng et al. (2003, J Chromatogr A, Vol. 1005 (12) : 123-130), par Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 1111 (2) : 115-119), Ravelet et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 1117 (1) : 1-10), Ruta et al. (2008, Anal Bioanal Chem, Vol. 390 (4) : 1051-1057), Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol. 80 (10) : 3915-3920 ; 2008, Anal Chem, Vol. 80 (19) : 7586-7593)). Toutefois, les supports décrits dans ces publications ont en général une utilisation qui est restreinte à des séparations de petites quantités de ligands et ne sont pas adaptés à la purification de protéines, par exemple de protéines d'intérêt thérapeutique, à une échelle industrielle. Avec le temps, certains auteurs se sont attachés à la conception de supports de chromatographie d'affinité à base d' aptamères nucléiques susceptibles de pouvoir être compatibles avec une purification de protéines à l'échelle industrielle. On peut citer par exemple les travaux de Han et al. (2012, J Chomatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, Vol. 903 : 112-117), qui ont visé la mise au point d'un support pour chromatographie d'affinité sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques anti-lysozyme. A terme, des supports de chromatographie d'affinité à base d'aptamères nucléiques, aptes à être mis en oeuvre de manière fiable, reproductible, durable et à des coûts compatibles avec une utilisation à l'échelle industrielle seront rendus accessibles au public. Le demandeur a notamment mis au point un support de chromatographie utilisable à l'échelle industrielle (WO 2012/090183). La disponibilité concrète de supports d'affinité à base d'aptamères nucléiques pour les industriels rendra nécessaire la conception de protocoles complets de purification, dont les conditions opératoires seront spécifiquement adaptées à cette nouvelle technologie. Comme cela est classique, de tels protocoles de purification, notamment lorsqu'ils sont destinés à la purification de protéines d'intérêt thérapeutique destinées à être administrées à l'homme ou l'animal, devront comprendre une ou plusieurs étapes (i) de détermination de l'intégrité du support d'affinité, lequel est susceptible de subir des détériorations avec les durées croissantes d'utilisation, et (ii) de détermination qualitative des produits purifiés obtenus. En effet, lors du procédé de séparation de protéines par chromatographie d'affinité, par exemple au moyen de colonnes dans lesquelles sont fixés des molécules de protéine A ou des anticorps spécifiques, il est bien connu que le support d'affinité subit des détériorations. Notamment, ces détériorations peuvent résulter en un relargage des substances qui se détachent du support, et entraînant dans le flux d'écoulement de la colonne, comme par exemple des fragments de protéine A ainsi que des anticorps ou des fragments d'anticorps. En conséquence, pour ces techniques d'immuno-affinité, des tests de mesure de l'intégrité du support sont couramment réalisés, lesquels incluent une détection et/ou une quantification des anticorps ou fragments d'anticorps dans le flux d'écoulement de la colonne de chromatographie ou dans la préparation de protéine purifiée obtenue. Ainsi, lorsque les ligands d'intérêt ont un usage médical chez l'homme ou l'animal, le demandeur pense qu'il est essentiel de vérifier l'intégrité du support d'affinité à base d'aptamères nucléiques, aux fins notamment de vérifier la survenue d'un éventuel relargage de l'aptamère nucléique au cours de la purification, de nature à contaminer la protéine purifiée. De manière similaire à ce qui est pratiqué pour l'utilisation de supports de chromatographie couramment utilisés, le demandeur a estimé qu'il était important de concevoir des tests de mesure de l'intégrité du support de séparation par affinité, lorsque des supports de chromatographie d'affinité basés sur des aptamères nucléiques seront concrètement utilisés dans des processus de séparation des protéines thérapeutiques, à l'échelle industrielle. Ces tests de mesure devront être intégrés dans les protocoles d'évaluation de l'étape de purification à l'échelle industrielle et potentiellement dans les tests de libération des protéines thérapeutiques purifiées. Il existe donc un besoin évident de mettre au point un protocole de dosage de ces aptamères ADN, susceptibles d'être relargués par une colonne de chromatographie d'affinité, qui soit facilement mis en oeuvre à l'échelle industrielle, reproductible, très sensible et peu coûteux. RESUME DE L'INVENTION Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de dosage d'acides nucléiques de type ADN, susceptibles d'être relargués dans un liquide d'écoulement d'une colonne de chromatographie par affinité, contenant un support sur lequel sont immobilisés lesdits aptamères ADN, lesdits acides nucléiques de type ADN représentant les aptamères ADN entiers, « ou un fragment de ceux-ci », ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon dudit liquide d'écoulement susceptible de contenir des acides nucléiques de type ADN relargués par le support de la colonne de chromatographie par affinité ; b) réaliser une amplification par PCR des acides nucléiques de type ADN contenus dans ledit échantillon, en utilisant un mélange réactionnel comprenant (i) un couple d'amorces nucléotidiques sens et anti-sens non dégénérées spécifiques desdits acides nucléiques de type ADN et (ii) un agent intercalant fluorescent, afin d'obtenir un produit d'amplification sous la forme d'acides nucléiques ADN double brins complexés avec ledit agent intercalant fluorescent ; et c) quantifier les aptamères ADN, ou leurs fragments, en mesurant le niveau d'un signal de fluorescence généré par ledit produit d'amplification et en comparant ce niveau de fluorescence à celui obtenu par une gamme standard générée par une concentration connue dudit aptamère ADN. De manière avantageuse, le liquide d'écoulement est obtenu après une étape choisie parmi la charge de l'échantillon à analyser sur la colonne de chromatographie par affinité, le lavage de la colonne, l'élution et la régénération de ladite colonne de chromatographie par affinité. Selon un mode préféré de réalisation, l'amorce nucléotidique non dégénérée anti-sens s'apparie à une première extrémité de l'acide nucléique de type ADN à doser. De la même manière, la séquence complémentaire de l'amorce nucléotidique 10 non dégénérée sens s'apparie à une deuxième extrémité de l'acide nucléique complémentaire de l'ADN à doser. Les amorces nucléotidiques sens et anti-sens ne se chevauchent pas. De manière avantageuse, chaque amorce nucléotidique non dégénérée recouvre au moins 7 bases de la séquence de l'acide nucléique de type ADN à doser et au maximum 15 50% de la séquence de l'acide nucléique de type ADN à doser. De préférence, le couple d'amorces nucléotidiques non dégénérées est contenu dans le mélange réactionnel à une concentration finale allant de 50 à 1000 nM, avantageusement au moins 800 nM. 20 Selon un mode de réalisation préféré, l'agent intercalant fluorescent est choisi parmi les fluorophores de la famille des cyanines asymétriques, avantageusement un fluorophore de formule chimique C32H37N4S, encore plus avantageusement un fluorophore de numéro CAS 163795-75-3. En pratique, le fluorophore est connue sous le nom de SYBRTM Green. 25 De manière avantageuse, l'étape de PCR quantitative (ou Q-PCR) comprend 20 à 50 cycles, avantageusement 40 cycles. De préférence, chaque cycle contient une étape de dénaturation de 15 secondes à 95°C et une étape d'hybridation et d'élongation de 1 minute à 60°C. Un deuxième aspect de l'invention concerne l'utilisation du procédé 30 précédemment décrit pour déterminer l'intégrité de la colonne de chromatographie par affinité au cours de sa mise en oeuvre. Un troisième et dernier aspect de l'invention concerne l'utilisation du procédé objet de la présente demande pour déterminer la contamination d'un échantillon provenant de l'élution de la colonne de chromatographie par affinité par un acide nucléique de type ADN. L'invention est illustrée plus en détail ci-dessous grâce à aux exemples non limitatifs et à l'aide des figures suivantes. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 illustre une courbe standard du nombre de cycles seuil 10 correspondant à un changement de fluorescence (Ct) en fonction d'une gamme standard de concentrations connues de l'aptamère nucléique MaptHl.1 CSO. La Figure 2 illustre les profils d'une courbe de dissociation, ou courbe de fusion, correspondant à une mesure de fluorescence en fonction de la température, pour chacune des concentrations de la gamme de concentrations finales de l'aptamère nucléique 15 MaptHl.1 CSO dans l'échantillon (allant de 100 pg/ml à 0,01 pg/ml, grâce à une série de dilutions au 1/10ème). La Figure 3 illustre une courbe standard du nombre de cycles seuil correspondant à un changement de fluorescence (Ct) en fonction d'une gamme standard de concentrations connues de l'aptamère nucléique Nonapta 5.1. 20 La Figure 4 illustre les profils d'une courbe de dissociation, ou courbe de fusion, correspondant à une mesure de fluorescence en fonction de la température, pour chacune des concentrations de la gamme de concentrations finales de l'aptamère nucléique Nonapta 5.1 dans l'échantillon (allant de 1000 pg/ml à 0,1 pg/ml, grâce à une série de dilutions au 1/10ème). 25 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention fournit un procédé de dosage d'acides nucléiques dans un échantillon, adapté à la détection et/ou la quantification d'aptamères nucléiques ADN, ou de fragments de ces derniers, lesdits acides nucléiques provenant d'un support de 30 chromatographie d'affinité desquels ils se sont détachés. Après de longues recherches, le demandeur a mis au point un procédé fiable, reproductible, de très grande sensibilité et peu coûteux, apte à détecter et/ou quantifier les acides nucléiques issus d'un relargage d'aptamères ADN, ou bien de fragments de ces d' aptamères ADN, initialement immobilisés sur un support de chromatographie d'affinité. On rappelle que les aptamères nucléiques consistent en des oligonuléotides de petite taille ; ils ont généralement une longueur inférieure à 50 nucléotides et sont donc difficiles à isoler, détecter, et a fortiori quantifier, surtout lorsqu'ils sont présents à des concentrations très faibles au sein d'un échantillon à tester. La principale difficulté pour doser de petits oligonucléotides peut être surmontée par la technique d'amplification par PCR dite en temps réel ou PCR quantitative (Q-PCR). Cette technique, dont le principe est connu a notamment été utilisée pour la caractérisation des aptamères ADN retenus à l'issue de chaque cycle du procédé SELEX de sélection d'aptamères (Ruff et al., 2012, ISRN Mol. Biol., Vol. 2012, Article ID 939083). Néanmoins, cette technique semble tout à fait adaptée pour amplifier des aptamères présentant une taille largement supérieure à 50 nucléotides (dans ce cas 74 nucléotides). Ainsi, selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les aptamères de type ADN susceptibles d'être relargués ont une longueur inférieure à 74 nucléotides. Par longueur inférieure à 74 nucléotides, on entend une longueur de 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 ou 30 nucléotides. Selon un autre mode de réalisation préféré, les aptamères de type ADN susceptibles d'être relargués ont une longueur inférieure à 50 nucléotides. Par une longueur « inférieur à 50 nucléotides » on englobe une longueur inférieure à 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 36, 35, 34, 33, 32, 31 et 30 25 nucléotides. Selon un autre mode de réalisation préféré, les aptamères de type ADN susceptibles d'être relargués ont une longueur comprise entre 20 et 60 nucléotides, de préférence une longueur comprise entre 20 et 50 nucléotides, de préférence une longueur de 36 ou 39 nucléotides. 30 Par ailleurs, la technique d'amplification par Q-PCR permet aussi la détection et la quantification d'aptamères liés à un ligand cible. Dans ce contexte, la détection et la quantification du ligand cible sont réalisées de manière indirecte. Les aptamères ADN sont en effet utilisés comme molécules détectables, à la place des anticorps, utilisés dans les techniques antérieures. Ce procédé, parfois désigné « apta-PCR », a été décrit notamment par Pinto et al. (2009, Mol Biosyst, Vol. 5(5) : 548-553). Les méthodes ci-dessus sont compatibles avec la technologie SYBRTM Green, c'est-à-dire un agent intercalant fluorescent qui se fixe uniquement sur des ADN double brin. La mise en oeuvre des différents protocoles d'extraction et de PCR quantitative disponibles nécessite de se plier à des recommandations contraignantes. Celles-ci concernent tout particulièrement : - la fragilité et la volatilité de l'aptamère simple brin et de taille inférieure à 100 nucléotides ; - la nature de l'acide nucléique à amplifier, généralement double brin et supérieure à 50 nucléotides, pour une taille optimale de 150 nucléotides ; - la nature des amorces nucléotidiques, qui sont généralement conçues par des programmes spécifiques, pour tenir compte de certains paramètres tels que leur longueur, leur taux en résidus C+G, la présence de plusieurs nucléotides particuliers contigus, leur température de fusion, leur contenu en base A ou T à chaque extrémité de l'amorce, le risque d'auto-repliement d'une amorce sur elle-même ou d'appariement des deux amorces; - la quantité minimale (et/ou maximale) d'acides nucléiques à amplifier, initialement présent dans l'échantillon ; - les paramètres de temps et de température des cycles d'amplification. Toutes ces contraintes rendent a priori l'utilisation d'une technique de PCR quantitative difficilement réalisable dans le but recherché, à savoir le dosage d'aptamères, 25 ou de fragments d'aptamères relargués à partir d'un support de colonne de chromatographie par affinité, sur lequel ces aptamères sont immobilisés. En effet, le demandeur s'attend à ce que la fixation des aptamères sur un support de colonne de chromatographie par affinité soit suffisamment forte pour résister aux étapes de charge de l'échantillon, de lavage, élution et régénération de la colonne. 30 De plus, il est bien connu que ces différentes étapes sont mises en oeuvre avec une grande quantité de liquide. Ainsi, on peut s'attendre à ce que la quantité d'acides nucléiques relarguée soit très faible. De manière inattendue, le demandeur s'est aperçu que la technique de PCR quantitative pouvait, sous certaines conditions, être adaptée au dosage d'acides nucléiques. De manière surprenante, en s'éloignant des recommandations des fabricants, la mise au point d'un procédé de dosage a pu être déterminée sur un aptamère intègre. L'invention concerne un procédé de dosage d'acides nucléiques de type ADN, susceptibles d'être relargués dans un liquide d'écoulement d'une colonne de chromatographie par affinité, contenant un support sur lequel sont immobilisés lesdits aptamères ADN, lesdits acides nucléiques de type ADN représentant les aptamères ADN entiers, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon dudit liquide d'écoulement susceptibles de contenir des acides nucléiques de type ADN relargués par le support de la colonne de chromatographie par affinité ; b) réaliser une amplification par PCR des acides nucléiques de type ADN contenus dans ledit échantillon en utilisant un mélange réactionnel comprenant (i) un couple d'amorces nucléotidiques sens et anti-sens non dégénérées spécifiques desdits acides nucléiques de type ADN et (ii) un agent intercalant fluorescent, afin d'obtenir un produit d'amplification sous la forme d'acides nucléiques ADN double brins complexés avec ledit agent intercalant fluorescent. c) quantifier les aptamères ADN, en mesurant le niveau d'un signal de fluorescence généré par ledit produit d'amplification et en comparant ce niveau de fluorescence à celui obtenu par une gamme standard générée par une concentration connue 25 dudit aptamère ADN. De manière surprenante, le demandeur a montré que la simple utilisation d'un agent intercalant permet de doser des acides nucléiques de type ADN de petites tailles et qui par ailleurs est facilement mis en oeuvre à l'échelle industrielle, reproductible, très 30 sensible et peu coûteux fonctionne, contrairement à l'utilisation d'autres méthodes classiquement utilisées pour la Q- PCR pour le dosage d'acides nucléiques, pour lesquelles la mise en oeuvre n'est pas adaptée à un tel dosage. C'est le cas, notamment, de la technique Q-PCR classique, pour laquelle il est connu d'utiliser un mélange réactionnel comprenant (i) un couple d'amorces nucléotidiques sens et anti-sens de petite taille non dégénérées spécifiques desdits acides nucléiques de type ADN et (ii) une sonde de petite taille spécifique desdits acides nucléiques, amorces et sonde modifiées ou non par la substitution de quelques nucléotides par un nucléotide équivalent de type « LNA » (locked nucleic acid), la sonde étant couplée en 5' à un reporter fluorescent (chimie TaqMan), lequel émet un signal en cas d'amplification lié à l'activité 5'exonucléase de la Taq Polymerase. Il sera en effet montré dans les exemples qu'une telle méthode classique (sonde 10 TaqMan) ne permet pas le dosage d'un aptamère de 39 nucléotides (voir exemple 3). En pratique, le liquide d'écoulement est obtenu après une étape de charge, de lavage, d'élution ou de régénération de ladite colonne de chromatographie par affinité. De par leur forte concentration ionique et/ou leur pH, les tampons utilisés pour 15 les différentes étapes de purification classiques par chromatographie par affinité peuvent être en effet plus ou moins délétères pour la colonne en elle-même. Un avantage dans le choix d'aptamères nucléotidiques pour la réalisation de support de colonne de chromatographie est le fait que les aptamères peuvent résister à de fortes concentrations en sels et qu'ils peuvent être soumis à des conditions de pH très 20 variés. La quantification du relargage des aptamères lors de la mise en oeuvre de la chromatographie par affinité est essentielle pour contrôler le rendement de la purification, et surtout pour mesurer le degré de contamination des aptamères dans le produit de 25 l'élution, c'est-à-dire le ligand d'intérêt. La mise au point de ce procédé de dosage repose sur l'utilisation d'amorces nucléotidiques non dégénérées sens et anti-sens qui s'apparient chacune à une des extrémités de l'aptamère ADN. Le choix des amorces nucléotidiques peut ne pas être réalisé par un logiciel 30 spécialisé, mais peut s'appuyer simplement sur la séquence de l'aptamère cible. Dans la plupart des protocoles de PCR à disposition, le « design » des amorces peut être long et fastidieux, car un certain nombre de paramètres sont à vérifier. C'est le cas par exemple de la longueur, du taux en résidus C+G, de la présence de plusieurs nucléotides identiques contigus, de la température de fusion, du contenu en bases A ou T à chaque extrémité de l'amorce. De plus, il est avantageux que les amorces nucléotidiques sens et anti-sens ne se chevauchent pas. Ainsi, chaque amorce nucléotidique non dégénérée recouvre au maximum 50 % de la séquence de l'aptamère ADN. L'expression « au maximum 50% », relative au recouvrement de la séquence de l'aptamère ADN, englobe au maximum 49%, 48%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%. 47%, 32%, 17%, En pratique, chaque amorce nucléotidique non dégénérée recouvre au moins 7 bases de la séquence de l'acide nucléique de type ADN à doser. L'expression « au moins 7 bases » englobe au moins 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 et 36 bases. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, chaque amorce nucléotidique non dégénérée possède une taille comprise entre 10 et 30 nucléotides, de préférence entre 10 et 20 nucléotides, de préférence d'environ 15 nucléotides. En pratique, le couple d'amorces nucléotidiques non dégénérées est contenu dans le mélange réactionnel à une concentration finale allant de 50 à 1 000 nM, avantageusement au moins 800 nM. Ainsi, la concentration finale en amorces nucléotidiques non dégénérées englobe une concentration finale d'au moins 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950 et 975 nM. Dans le cadre dans cette invention, il est essentiel que la détection de l'aptamère amplifié ne soit pas réalisé par une sonde de type TaqMan ou Beacon, mais par un agent intercalant fluorescent car la taille de l'aptamère rend impossible la présence de deux amorces et d'une sonde sans chevauchement. En pratique, le fluorophore est choisi parmi les fluorophores de la famille des cyanines asymétriques. Plus précisément, il s'agit d'un fluorophore connu sous le nom de SYBRTM Green, soit un fluorophore de formule chimique C32H37N4S, de numéro CAS 163795-75-3. Le fluorophore SYBRTM Green se fixe de manière aspécifique sur un ADN double brins, et est plus sensible et beaucoup moins toxique que le bromure d' éthidium. De manière classique, et comme recommandé par les fabricants de kit PCR, l'étape de PCR quantitative (Q-PCR) comprend 20 à 50 cycles. En pratique, 40 cycles, voire dans certaines conditions critiques 50 cycles peuvent être réalisés en routine, ce qui constitue un nombre de cycles suffisant pour détecter une faible quantité initiale en aptamère d'intérêt. De préférence, chaque cycle contient une étape de 15 secondes à 95°C et une étape de 1 minute à 60°C. De manière surprenante et inattendue, la présente invention permet de détecter des aptamères à une concentration dans l'échantillon aussi basse que 0,1 pg/ml, soit un gain de sensibilité d'un facteur 20 000, par rapport à l'utilisation d'un kit de Q-PCR selon les recommandations du fabricant (concentration initiale environ égale à 1 ng/50 soit 20 ng/ml). Ainsi, la présente invention fournit un procédé de dosage d'aptamères de type ADN qui présente les caractéristiques suivantes : - facilité de mise en oeuvre, pas de « design » des amorces, une seule étape de PCR et une mesure de la fluorescence ; - économique, à cause des amorces non dégénérées et de l'utilisation de l'agent intercalant fluorescent SYBRTM Green ; - plus sensible que le dosage des acides nucléiques selon les protocoles classiques. La présente invention concerne aussi l'utilisation du procédé précédemment décrit pour déterminer l'intégrité de la colonne de chromatographie par affinité au cours de sa mise en oeuvre. Au moins le relargage des aptamères sera important, au plus la colonne aura une durée de vie importante. Il est à noter que ce procédé de dosage peut avantageusement être mis en oeuvre comme une méthode de contrôle qualité dans le processus d'immobilisation des aptamères sur un support solide. Ce procédé de dosage permet donc de rendre accessible et peu coûteux le contrôle en routine du niveau d'immobilisation des aptamères par de nombreux procédés chimiques et ou enzymatiques, en vue de la fabrication de colonnes de chromatographie par affinité. Enfin, et comme vu ci-dessus, l'invention se rapporte à une utilisation du procédé de dosage pour déterminer la contamination d'un échantillon provenant de l'élution de la colonne de chromatographie par affinité par un acide nucléique de type ADN. Ceci contribue donc à une analyse de type contrôle qualité du ligand, de type médicament ou autre, purifié par chromatographie d'affinité, en vue de garantir son usage sans danger pour l'homme et/ou l'animal. La présente invention est en outre illustrée, sans y être limitée, par les exemples suivants. EXEMPLES Exemple 1 : Procédé de dosage de l'aptamère Mapt H1.1-CSO dirigé contre le facteur H du complément selon un procédé conforme à l'invention. a) Séquences - aptamère d'intérêt Mapt H1.1-CSO : SEQ ID No. 1: ggt ctc ggg cac ggg tca ggc ggt tat acg gtg ccc (36 nucléotides). - amorce nucléotidique sens (AH1): SEQ ID No. 2 : ggt ctc ggg cac ggg tca (18 nucléotides, contenu en C+G= 72 %) - amorce nucléotidique anti-sens (AH2): SEQ ID No. 3 : ggg cac cgt ata acc (15 nucléotides, contenu en C+G= 60 %). Les deux amorces recouvrent 92 % de la totalité de la séquence. Le taux de recouvrement ne permet pas d'utiliser une sonde de type « TaqMan », mais est compatible 25 avec un agent intercalant fluorescent de type SYBRTM Green. b) Utilisation du Kit SYBRTM Green de Life Technologies - dilution dans de l'eau pour préparation injectable (PPI) du SYBRTM Green PCR Master Mix à 1X final ; - ajout des amorces sens et anti-sens à une concentration finale de 0,8 pM 30 chacune ; - programme universel Life Technologies, soit 40 cycles, avec pour chaque cycle, une étape de dénaturation à 95°C pendant 15 secondes, suivie par une étape d'hybridation et d'élongation à 60°C pendant 1 minute. c) Détermination de la gamme standard (courbe étalon) Une gamme étalon a été préparée à partir d'une solution d'aptamère Mapt H1.1-CSO à une concentration de 1iag/m1 (51.1.1 ajouté au Master Mix), pour laquelle une série de dilution au 1/10ème est réalisée dans de l'eau pour préparation injectable. On obtient ainsi une gamme de standard (STD) de concentration suivante : - « STD I », de concentration finale en aptamères égale à 100 pg/ml. - « STD II », de concentration finale égale à 10 pg/ml. - « STD III », de concentration finale égale à 1 pg/ml. - « STD IV », de concentration finale égale à 0,1 pg/ml. - « STD V », de concentration finale égale à 0,01 pg/ml La Figure 1 décrit une courbe étalon représentant le cycle seuil (ou cycle threshold, Ct) en fonction du log de la concentration en aptamère. Le cycle seuil Ct représente le nombre de cycle d'amplification à partir duquel le niveau de fluorescence de base devient significatif et correspond à une amplification détectable. Dans la Figure 1, la Q-PCR est quantitative sur une large gamme de concentration, allant jusqu'à 0,01 pg/ml environ. Ainsi, l'utilisation en routine d'un protocole de Q-PCR comptant 40 cycles, permettra de détecter, en fonction de la séquence d'intérêt, une concentration initiale en aptamère aussi faible que 0,01 pg/ml. La Figure 2 décrit la courbe de dissociation de tous les amplicons de la gamme standard. Elle est obtenue à la fin de la PCR par une augmentation lente et progressive de la température de 60 à 95°C. La dissociation de l'amplicon est suivie par l'obtention d'une Tm (température de dissociation) qui dépend de sa taille et de sa séquence. Ainsi, pour un même amplicon, quel que soit sa quantité, le Tm est identique, ce qui permet donc de valider sa spécificité, puisque le SYBRTM Green, en tant qu'agent intercalant, se fixe sur tout brin d'ADN double brin en cours d'amplification. Dans ce cas, on obtient un Tm homogène et attendu, c'est-à-dire un Tm compatible avec le Tm du Mapt H1.1-CSO, soit un Tm compris entre 78,5 et 78,8°C. Exemple 2 : Procédé de dosage de l'aptamère Nonapta 5.1 dirigé contre le Facteur IX de la coagulation selon un procédé conforme à l'invention. a) Séquences - Aptamère d'intérêt Nonapta 5.1 SEQ ID No. 4 : acc ttt aac cca cta gtc taa gcg ggt cta gcg tcg tcc (39 nucléotides) - amorce nucléotidique sens (F9-1) SEQ ID No. 5 : acc ttt aac cca cta gtc (18 nucléotides, contenu en C+G = 44%) - amorce nucléotidique anti-sens (F9-2) SEQ ID No. 6 : gga cga cgc tag acc (15 nucléotides, contenu en C+G = 67%) Les deux amorces nucléotidiques spécifiques n'ont pas fait l'objet d'un « design » à l'aide d'un logiciel spécifique, mais tiennent compte de certaines contraintes. Les deux amorces recouvrent 85 % de la totalité de la séquence. Le taux de recouvrement ne permet pas d'utiliser une sonde de type « TaqMan », mais est compatible avec un agent intercalant fluorescent de type SYBRTM Green. b) Procédé Le mode opératoire suivi est le même que celui décrit dans le premier exemple par utilisation du kit SYBRTM Geen Applied. c) Résultats La Figure 3 décrit une courbe étalon représentant le cycle seuil (ou cycle Threshold, Ct) en fonction du log de la concentration en aptamère. La Q-PCR est quantitative sur une large gamme de concentration, allant jusqu'à 0,1 pg/ml environ, qui correspond à un Ct moyen situé entre 23 et 24. A partir de Ct supérieur à 27, le signal se confond avec le bruit de fond et n'est plus quantifiable. Ainsi, l'utilisation en routine d'un protocole de Q-PCR comptant 40 cycles, permettra là aussi de détecter une concentration initiale en aptamère aussi faible que 0,1 pg/ml. Comme précédemment pour l'exemple 1, il a pu être montré une homogénéité des valeurs de Tm de l'amplicon Nonapta 5.1, et ce, quel que soit sa quantité (Figure 4). Exemple 3 : Q-PCR réalisé avec une sonde TaqMan pour le dosage de l'aptamère nucléotidique Nonapta 5.1 selon un procédé « classique ». Les deux exemples suivants correspondent à une méthode alternative de dosage 5 d' aptamère ADN par Q-PCR par utilisation d'une sonde TaqMan. Etant donné la petite taille du nucléotide à amplifier, et étant donné que les deux amorces périphériques et la sonde interne ne peuvent se chevaucher, il est nécessaire d'utiliser des amorces et une sonde de très petite taille (taille inférieure ou égale à 10 nucléotides). Les Tm correspondants des amorces étant très basses, le choix se porte sur 10 des amorces modifiées de type LNA (« locked nucleic acid », comprenant une liaison de type 2'-O, 4'-C methylène), ce qui consiste à remplacer quelques nucléotides par des nucléotides modifiés (modified RNA nucleotide) qui augmentent la stabilité thermique des amorces (et donc leur Tm). La sonde est elle-même modifiée de type LNA, sa Tm devant être supérieure à la Tm des deux amorces. 15 Exemple 3.1 : dosage avec deux amorces LNA et une sonde LNA de petite taille. a) Séquences : - Aptamère nonapta 5.1 20 SEQ ID No. 4 : acc ttt aac cca cta gtc taa gcg ggt cta gcg tcg tcc - Amorce sens-LNA* : SEQ ID No. 7 : cc[t] t[t][a] [a][c]c c - Amorce anti-sens-LNA* : SEQ ID No. 8 : gg[a] c[g]a c[g]c t 25 - Sonde-LNA* : SEQ ID No. 9 : Fam-tc[t] a[a]g [c]g[g] gt-bhql * En crochet, sont indiqués les nucléotides modifiés (nucléotide de type LNA) ; Fam représente une carboxy-fluorescéine déoxythymidine ; Bhql représente une Black Hole Quencher-1 déoxythymidine. 30 b) Procédé et résultats Un premier essai a été réalisé avec le kit TaqMan Universal Master Mix de Life Technologies et utilisation du programme universel de Life Technologies (Tableau 1, PCR1). Il n'y a pas eu d'amplification observée. Un deuxième essai a été réalisé en travaillant à trois températures et en abaissant la température d'hybridation (annealing) tenant compte du Tm des amorces (Tableau 1, PCR2). La PCR n'a pas non plus fonctionné comme indiqué dans le tableau 1. Tableau 1 PCR Conditions Résultat PCR 1 (Programme Life Technologies) 95°C' / 60°C2 Pas d'amplification PCR 2 95°C1/ 45°C3 / 60°C4 Pas d'amplification température de dénaturation ; température d'hybridation et d'élongation ; température d'hybridation ; 4température d'élongation. En l'absence de réponse, des essais complémentaires ont été réalisés pour voir si l'absence d'amplification était due à la sonde-LNA ou aux deux amorces-LNA. Les 15 deux amorces-LNA ont été évaluées en conditions SYBRTM Green sans la sonde-LNA. Trois essais ont été réalisés avec trois conditions différentes dont un abaissement de la température d'Annealing (Tableau 2, PCR1, PCR2, PCR3). Les PCR n'ont pas fonctionné comme indiqué dans le tableau 2. 20 Tableau 2 PCR Conditions Résultat PCR 1 95°C' /45°C2 Pas d'amplification PCR 2 95°C' / 45°C3 / 60°C4 Pas d'amplification PCR 3 95°C' / 40°C2 Pas d'amplification 'température de dénaturation ; 2température d'hybridation et d'élongation ; 3température d'hybridation ; 4température d'élongation. Il n'y a donc pas d'amplification avec les petites amorces-LNA en présence ou en absence de sonde-LNA aux différentes conditions opératoires testées, même les moins stringentes. On en déduit que les nucléotides LNA modifient trop la structure de ces amorces et déstabilisent la Taq Polymérase lors de son ancrage. Exemple 3.2 : Q-PCR avec deux amorces de petite taille et une sonde-LNA de petite taille a) Séquences : - Amorce sens : SEQ ID No. 10 : cct tta acc c - Amorce anti-sens : gac gac gct - Sonde 1* : SEQ ID No. 11 : Fam-tct [a]ag [c]gg gt-bhql - Sonde 2* : SEQ ID No. 12 : Fam-tct aa[g] cgg gt-bhql * En crochet, sont indiqués les nucléotides modifiés (nucléotides de type LNA) ; Fam représente une carboxy-fluorescéine déoxythymidine ; Bhql représente une 20 Black Hole Quencher-1 déoxythymidine. b) Procédé et résultats La Q-PCR a été réalisée en présence des deux amorces avec l'une ou l'autre sonde-LNA avec le kit TaqMan Universal Master Mix et avec une température 25 d'hybridation (annealing) de 30°C. Les PCR n'ont pas fonctionné. En l'absence d'amplification, un essai complémentaire a été réalisé pour voir si l'absence d'amplification était due aux sondes-LNA ou aux deux amorces. Les deux amorces ont été testées en Sybr Green en l'absence de sonde avec une température d'hybridation (annealing) abaissée à 20°C pour évaluer leur capacité de fixation ou de 30 stabilité. La PCR n'a pas fonctionné. Conclusion Les essais de Q-PCR réalisés sur deux amorces périphériques sens et anti-sens de taille recommandée (quinzaine de nucléotides) par utilisation d'un intercalant de type SYBRTM Green sont possibles sur un aptamère d'une trentaine de nucléotides. Ils supposent la détermination d'une courbe de dissociation pour valider la spécificité de l'amplification. Les essais de Q-PCR réalisés en sonde TaqMan ne sont pas concluants : - Si la taille recommandée des amorces est maintenue, une sonde ne peut être utilisée car il y a chevauchement avec les amorces. - Si des amorces de plus petite taille (9 à 10 nucléotides) sont utilisées, leur Tm est trop bas et est critique dans les conditions habituelles de la PCR. - Si des amorces de plus petite taille (9 à 10 nucléotides) modifiées par le remplacement de plusieurs nucléotides de type LNA pour augmenter leur Tm sont utilisées, cela impacte aussi sur leur structure et l'accrochage de la Taq Polymérase pour initier l'amplification. REVENDICATIONS1. Procédé de dosage d'acides nucléiques de type ADN, susceptibles d'être relargués dans un liquide d'écoulement d'une colonne de chromatographie par affinité, contenant un support sur lequel sont immobilisés lesdits aptamères ADN, lesdits acides nucléiques de type ADN représentant les aptamères ADN entiers, ou un fragment de ceux-ci, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon dudit liquide d'écoulement susceptible de contenir des acides nucléiques de type ADN relargués par le support de la colonne de chromatographie par affinité ; b) réaliser une amplification par PCR des acides nucléiques de type ADN contenus dans ledit échantillon, en utilisant un mélange réactionnel comprenant (i) un couple d'amorces nucléotidiques sens et anti-sens non dégénérées spécifiques desdits acides nucléiques de type ADN et (ii) un agent intercalant fluorescent, afin d'obtenir un produit d'amplification sous la forme d'acides nucléiques ADN double brins complexés avec ledit agent intercalant fluorescent ; et c) quantifier les aptamères ADN, ou leurs fragments, en mesurant le niveau d'un signal de fluorescence généré par ledit produit d'amplification et en comparant ce niveau de fluorescence à celui obtenu par une gamme standard générée par une 20 concentration connue dudit aptamère ADN. 2. Procédé de dosage selon la revendication 1 caractérisé en ce que les aptamères de type ADN susceptibles d'être relargués ont une longueur inférieure à 74 nucléotides. 3. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en 25 ce que les aptamères de type ADN susceptibles d'être relargués ont une longueur inférieure à 50 nucléotides. 4. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les aptamères de type ADN susceptibles d'être relargués ont une longueur de 36 ou 39 nucléotides. 30 5. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le liquide d'écoulement est obtenu après une étape choisie parmi la charge, le lavage, l'élution et la régénération de ladite colonne de chromatographie par affinité. 6. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'amorce nucléotidique non dégénérée anti-sens s'apparie à une première extrémité de l'acide nucléique de type ADN à doser. 7. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la séquence complémentaire de l'amorce nucléotidique non dégénérée sens s'apparie à une deuxième extrémité de l'acide nucléique de type ADN à doser. 8. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sens et anti-sens ne se chevauchent pas. 9. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en 10 ce que chaque amorce nucléotidique non dégénérée recouvre au moins 7 bases de la séquence de l'acide nucléique de type ADN à doser et au maximum 50% de la séquence de l'acide nucléique de type ADN à doser. 10. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le couple d'amorces nucléotidiques non dégénérées est contenu dans le mélange 15 réactionnel à une concentration finale allant de 50 à 1 000 nM, avantageusement au moins 800 nM. 11. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'agent intercalant fluorescent est choisi parmi les fluorophores de la famille des cyanines asymétriques, avantageusement un fluorophore de formule chimique C32H37N4 S , 20 encore plus avantageusement un fluorophore de numéro CAS 163795-75-3. 12. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'étape de PCR quantitative (ou Q-PCR) comprend 20 à 50 cycles, avantageusement 40 cycles. 13. Procédé de dosage selon l'une des revendications précédentes caractérisé 25 en ce que chaque cycle contient une étape de 15 secondes à 95°C et une étape de 1 minute à 60°C. 14. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes pour déterminer l'intégrité de la colonne de chromatographie par affinité au cours de sa mise en oeuvre. 30 15. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 13 pour déterminer la contamination d'un échantillon provenant de l'élution de la colonne de chromatographie par affinité par un acide nucléique de type ADN.