Brevet FR3019833A1 — publié le 20151016

La présente demande a pour objet un nouveau procédé de détection et d'indentification de Clostridium difficile basé sur l'utilisation d'un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase. Clostridium difficile est un bacille à Gram positif, anaérobie strict, sporulé, qui est retrouvé dans l'environnement tout comme dans le tube digestif de l'homme et de l'animal. Cette bactérie est le principal agent responsable des diarrhées nosocomiales. En particulier, elle est responsable de 15 à 25 % des diarrhées post-antibiotiques et de la quasi-totalité des colites pseudo-membraneuses, et peut entrainer la mort dans les cas les plus graves Une souche particulière de Clostridium difficile dénommée 027/NAP1/13I est particulièrement virulente et se retrouve sur l'ensemble du territoire métropolitain. De fait, l'incidence des infections à Clostridium difficile a beaucoup augmenté ces dernières années, en Amérique du Nord et en Europe, mettant au premier plan l'importance d'un diagnostic rapide et fiable. Les principaux facteurs de risque d'infection à Clostridium difficile (ICD) sont la prescription d'un traitement antibiotique et l'âge du patient (> 65 ans). Les facteurs qui entraînent une modification de l'écosystème digestif ou la motilité intestinale (laxatifs, ralentisseurs du transit, chirurgie gastro-intestinale...) peuvent également être à l'origine de la survenue d'une ICD. Cependant, il existe aussi des risques de contamination alimentaire, ce qui rend d'autant plus nécessaire le développement d'un test de détection de Clostridium difficile sensible et efficace (Eckert et al., J Med Microbiol, 62(Pt 9): 1435-1438, 2013). Le diagnostic des ICD repose actuellement sur différentes techniques telles que la détection de l'activité toxine (cytotoxicity activity, CTA). Toutefois, cette technique présente des inconvénients, telles que notamment sa durée de mise en oeuvre, et la nécessité de l'expertise de techniciens pour la lecture des résultats. En outre, ce test présente une faible sensibilité. Il est aussi possible d'utiliser un autre test diagnostic, la culture toxigénique (CT). Dans une première étape, les souches de Clostridium difficile sont isolées sur des milieux sélectifs comprenant une base gélosée additionnée d'antibiotiques comme le cyclosérine et la céfoxitine. Les colonies sont habituellement identifiées après 48 heures d'incubation en anaérobiose à 37°C sur la base de leur aspect et de leur odeur. Cette étape de culture peut aussi être mise en oeuvre sur une gélose contenant un composé chromogène spécifique de C. difficile. La demande WO 2009/092982 décrit ainsi un milieu contenant un substrat de la bêta-glucosidase dont l'hydrolyse indique la présence de Clostridium difficile. Cependant, la sensibilité de ce test n'est que de 94 %. Le caractère toxinogène in vitro de la souche isolée est ensuite déterminé dans une deuxième étape, par exemple par une méthode immuno-enzymatique. La méthode toxigénique est particulièrement sensible pour le diagnostic d'ICD et permet d'étudier les colonies isolées. Toutefois, cette méthode présente des inconvénients liés à sa durée (2 à 4 jours) et au nombre de manipulations requises. Il existe donc un réel besoin de disposer d'une technique de détection plus simple, plus spécifique, plus directe et moins coûteuse et permettant d'identifier C. difficile dans les échantillons des patients tout en évitant de combiner plusieurs tests générant un délai supplémentaire pour l'obtention des résultats et augmentant le risque de contaminations parasites ou d'erreur ainsi que le risque de la dissémination de la bactérie. De manière surprenante et inattendue, le présent inventeur a montré que l'utilisation d'un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase, permet d'identifier rapidement les bactéries Clostridium difficile de façon sensible et spécifique et ce, dès l'étape de culture. En particulier, lorsqu'il est mis en oeuvre sur un milieu solide gélose, le procédé de détection développé par l'inventeur est réalisable directement, par exemple à partir d'un échantillon issu d'un patient, sans nécessiter d'étape d'isolement préalable des différentes souches présentes dans cet échantillon. Par rapport aux procédés antérieurs, le procédé développé par l'inventeur permet une détection directe et rapide des bactéries Clostridium difficile. De façon remarquable, la présente invention permet ainsi de détecter des Clostridium difficile avec une sensibilité de 100 %, alors que les méthodes de l'art antérieur ne permettent au mieux que d'obtenir une sensibilité de 94 %. En effet, l'inventeur a observé qu'il est possible grâce à la fluorescence de détecter et d'identifier des colonies de Clostridium difficile même dans la région dense de l'isolement où les colonies de bactéries commensales auraient pu cacher le pathogène. La présente invention rend ainsi possible la détection et, avantageusement, l'identification au niveau de l'espèce ou du groupe d'espèces, d'une colonie fluorescente de Clostridium difficile et ce, même en présence de milliers d'autres colonies susceptibles de se développer sur le milieu sélectif solide objet de l'invention. En fait, les colonies de Clostridium difficile détectées par le milieu de l'invention sont fluorescentes tandis que les autres microorganismes ne fluorescent pas. En particulier, le procédé selon l'invention peut être appliqué à la détection de souches de Clostridium difficile choisie dans le groupe constitué des souches 001, 002, 003, 005, 012, 014/020/077, 015, 017, 018, 019, 023, 027, 029, 046, 048, 049, 050, 053, 056, 070, 075, 078/126, 081, 087, 094, 095, 106, 117, 131, 156, 168 et 169 (Eckert et al., Med Mal Infect, 43(2): 67-74, 2013), et encore préférentiellement dans le groupe constitué des souches 027, 014/020/077, 078/126, 015, 002 et 005. Un objet de la présente invention consiste donc en un procédé de détection directe de bactéries Clostridium difficile dans un échantillon comprenant les étapes successives : a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase, b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Clostridium difficile, et c) de détection des colonies de bactéries Clostridium difficile formées sur ledit milieu de culture. Avantageusement, le procédé selon la présente invention comprend en outre une étape d) permettant de conclure à la présence ou non d'une bactérie particulière en fonction de la fluorescence des colonies formées. Il s'agit par conséquent d'une étape d) d'identification de bactéries Clostridium difficile dans ledit échantillon. On notera à cet égard que l'utilisation d'un composé fluorogène améliore grandement la limite de détection des Clostridium difficile. La détection étant basée sur l'émission par les colonies positives de fluorescence, elle est possible même sur des colonies de très petite taille, qui n'auraient pu être identifiées autrement. De ce fait, la méthode de l'invention permet d'obtenir un résultat après 12-18 heures d'incubation seulement, alors que les méthodes de l'art antérieur requièrent de 24 à 48 heures. Par - échantillon biologique », on entend tout type de prélèvement microbiologique, tel que par exemple un prélèvement de matières alimentaires (produits laitiers, viande, etc.), un prélèvement de sol, un prélèvement sur un mammifère (peau, muqueuses, etc.), de préférence l'homme, ou l'un de ses dérivés comme une préculture issue d'un tel prélèvement. Avantageusement, ledit échantillon biologique est un échantillon biologique liquide, comme de la salive, du sang ou de l'urine, un échantillon biologique solide, comme des fèces ou un produit alimentaire, ou encore un dérivé d'un échantillon biologique liquide ou solide tel qu'une pré-culture d'un tel échantillon biologique liquide ou solide. Avantageusement encore, ledit échantillon biologique comprend différents microorganismes, lesquels peuvent appartenir à des espèces voire à des genres distincts. À titre d'exemple, ledit échantillon biologique comprend au moins deux microorganismes différents, de préférence au moins cinq microorganismes différents et, de manière particulièrement préférée, au moins dix microorganismes différents. Par - milieu de culture », on entend un milieu permettant la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter. Ledit milieu de culture comprend en effet les nutriments nécessaires à la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter. Par - nutriments nécessaires à la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter », on entend la composition d'un milieu de base nécessaire à ladite croissance. L'homme du métier connaît parfaitement la composition de tels milieux et est à même de l'adapter si nécessaire en fonction de la spécificité de certains microorganismes ou de contraintes qui pourraient être liées à certains cas de la présente invention (transparence du milieu par exemple). Ces nutriments sont notamment choisis dans le groupe comprenant du carbone, de l'azote, du soufre, du phosphore, des vitamines, des inducteurs de croissance, des hydrates de carbone, des sels (par exemple calcium, magnésium, manganèse, sodium, potassium), des complexes nutritifs (par exemple des acides aminés, du sang, du sérum, de l'albumine) ainsi que des peptones et des extraits de tissus animaux et végétaux. Le milieu de culture utilisé dans le cadre de la présente invention pour la détection des bactéries Clostridium difficile, et qui constitue un autre objet selon la présente invention, peut être sous forme solide, serai-solide, liquide ou lyophilisée. De préférence, ledit milieu de culture est un milieu gélose, lequel milieu de culture est, à titre d'exemple, à base d'agar. Parmi les présentations des milieux de culture utilisables, on peut ainsi citer les boîtes de Pétri sur lesquelles se développent des microorganismes. Les milieux de culture selon la présente invention peuvent éventuellement comprendre un ou plusieurs agents antimicrobiens. Par - agent antinnicrobien», on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'un microorganisme. Sans être limitatif, une concentration comprise entre 5 mg/l et 5 g/l est particulièrement adaptée à la présente invention. On peut citer comme agent antinnicrobien, un antibiotique tel que la D-cyclosérine, les céphalosporines, telles que la céfoxitine ou le céfotaxime, la colistine, la polymixine, la fosfomycine, la tobramycine, la gentamicine, l'aztréonam, le triméthoprime, les quinolones telles que l'acide nalidixique, un antifongique tel que notamment l'amphotéricine B, le fluconazole ou l'itraconazole. Par antibiotique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une bactérie. Ils appartiennent notamment aux groupes des céphalosporines, des aminosides, des polypeptides, des sulfamides, des quinolones. A titre indicatif, on peut citer notamment les antibiotiques céfotaxime, ceftazidime, céfoxitine, ceftriaxone, cefpodoxime, aztréonam, trinnéthoprime, tobrannycine, moxalactam, fosfonnycine, D-cyclosérine, polymixine, colistine. Par antifongique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une levure ou d'une moisissure. A titre indicatif, on peut citer notamment l'amphotéricine B, le fluconazole, l'itraconazole, le voriconazole, la cycloheximide. En particulier, il est avantageux d'utiliser des milieux de culture comprenant de la céfoxitine et de la D-cyclosérine. La quantité efficace d'agent antimicrobien à utiliser peut être déterminée simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales. Par - mise en culture », on entend l'inoculation dudit milieu de culture par tout ou partie de l'échantillon biologique et incubation dudit milieu de culture inoculé. L'homme du métier adaptera les conditions d'incubation en fonction du milieu de culture, de l'échantillon biologique et du microorganisme spécifique à détecter en fonction de ses connaissances générales. En particulier, selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'incubation de l'étape b) est effectuée en anaérobiose. L'étape d'incubation peut être réalisée à une température d'environ 30°C à 43°C, de préférence 37°C, et ce pendant une durée d'environ 12 à 24 h. Cependant, en fonction des moyens dont il disposera, l'homme du métier pourra adapter la température et la durée de cette étape d'incubation au regard de ses connaissances générales. Par - procédé de détection directe », on entend un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon, de préférence un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement de chacune des souches bactériennes présentes dans l'échantillon. En effet, le procédé selon l'invention permet d'éviter l'étape d'isolement de colonies de bactéries candidates pouvant ensuite être soumises à un test plus précis de confirmation de l'identité des bactéries Clostridium difficile. Il s'applique donc à un échantillon brut comprenant un mélange de bactéries. Par - composé fluorogène », on entend un composé portant un fluorophore libéré après une hydrolyse par une enzyme spécifique. Le fluorophore ainsi libéré peut ainsi émettre de la lumière dans des conditions appropriées et permet ainsi d'identifier les colonies comprenant ladite enzyme. Avantageusement, ladite enzyme est la proline-aminopeptidase. Plus spécifiquement, par - composé fluorogène substrat de la proline-anninopeptidase », on entend donc ici un dérivé de proline comprenant un fluorophore lié de telle façon que le fluorophore est libéré à la suite du clivage dudit dérivé de proline par la proline-aminopeptidase, le clivage de ces composés par la proline-aminopeptidase étant nécessaire pour observer la fluorescence. De tels composés sont déjà connus : on citera notamment la L-proline 7-annido-4-nnéthylcounnarine. A cet égard, l'homme du métier saura déterminer sans peine les longueurs d'ondes d'excitation optimales entrainant l'émission de lumière par le fluorophore. A titre d'exemple, on mentionnera qu'une fluorescence peut être détectée à 460 nm quand la L-Proline 7-annido-4-nnethylcounnarine est excitée à 365 nm. Le substrat fluorogène est typiquement utilisé à une concentration allant de 0,01 à 0,5 g/l environ. Une concentration préférée se situe à 0,1 g/l environ. H est précisé que le substrat fluorogène présent dans le milieu de culture selon la présente invention peut être remplacé, ou associé, à au moins un substrat chromogène. Un deuxième aspect de la présente invention concerne un procédé de détection et/ou de discrimination des souches de Clostridium difficile toxinogènes dans un échantillon à l'aide d'un milieu de culture tel que défini ci-dessus. Dans une première étape de ce procédé, les souches des Clostridium difficile sont identifiées dans ledit échantillon à l'aide du procédé de détection décrit plus haut. Dans une deuxième étape, le pouvoir toxinogénique des souches ainsi identifiées est testé à l'aide d'un test approprié. De tels tests sont bien connus de l'homme du métier et comprennent entre autres le test CTA, les tests immunoenzymatiques et les tests de biologie moléculaire (voir par exemple Eckert et al., Journal des Antiinfectieux, 13(2) : 67-73, 2011). Selon un troisième aspect, l'invention porte sur un milieu de culture sélectif permettant de mettre en oeuvre le procédé tel que décrit ci-dessus. L'objet de la présente invention ne se limite pas à la description ci-dessus. D'autres modes de réalisation et avantages de la présente invention pourront ressortir de l'exemple ci-dessous, fourni ici à titre purement illustratif. Il est clair que ni l'objet ni la portée de la présente invention ne sont limités par cet exemple. Exemple Détection directe de bactéries Clostridium difficile à l'aide d'un milieu selon la présente invention : Différents échantillons contenant des suspensions de bactéries sont étalés directement sur boîte de Pétri comprenant un milieu gélose comprenant: - Peptones et yeast extract 25 g/L - NaCl 5 g/L - Agar 15 g/L - Pyruvate 2 g/L - K2HPO4 4 g/L - Fructose 1 g/L - Cysteine 0,1 g/L - Taurocholate 0,5 g/L - Amphotericine 0,01 g/L - Cycloserine 0,3 g/L - Cefoxitine 0,005 g/L - AMC-proline 0,075 g/L Après incubation pendant 12 à 24 heures, l'analyse visuelle des boîtes de Pétri permet d'identifier directement celles comprenant des colonies Clostridium 20 difficile. Ainsi, le procédé selon l'invention permet, en une seule étape de culture, de détecter spécifiquement et de différencier les bactéries Clostridium difficile, sans nécessité d'une étape préalable d'isolement ni étape ultérieure de différenciation. 25 REVENDICATIONS1) Procédé de détection directe de bactéries Clostridium difficile dans un échantillon comprenant les étapes successives : a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase, b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Clostridium difficile, et c) de détection des colonies de bactéries Clostridium difficile formées sur ledit milieu de culture. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend une étape d) d'identification de bactéries Clostridium difficile dans ledit échantillon. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit composé fluorogène est la L-proline 7-amido-4-méthylcoumarine. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il ne comprend pas d'étape préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le milieu de culture est un milieu gélose 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le milieu de culture comprend de la céfoxitine et de la D-cyclosérine. 7) Procédé de détection et/ou de discrimination des souches de Clostridium difficile toxinogènes dans un échantillon, comprenant des étapes consistant à : a) Détecter les bactéries Clostridium difficile dans ledit échantillon à l'aide du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, et b) Tester le pouvoir toxinogénique des souches ainsi identifiées. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le test de l'étape b) est un test CTA, un test immuno-enzymatique ou un test de biologie moléculaire. 9) Milieu de culture pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.