Brevet FR3018819A1 — publié le 20150925

- 1 - Domaine technique La présente invention concerne un médicament et plus particulièrement un médicament pour inhiber ou diminuer la réponse immunitaire et inflammatoire. La présente invention concerne également un médicament pour le traitement des maladies pour lesquelles la réponse immunitaire ou inflammatoire est délétère pour le patient comme la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies auto-immunes et les maladies auto-inflammatoires. Technique antérieure La régulation du système immunitaire et de l'inflammation est un des buts thérapeutiques à atteindre pour éviter la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) et traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires. La GvHD est une complication de la greffe provoquée par la transplantation de cellules hématopoïétiques allogéniques. Actuellement, la stratégie principale pour lutter contre l'apparition de la GvHD ou pour traiter les maladies auto- immunes et auto-inflammatoires consiste à utiliser des immunosuppresseurs (corticoïdes, chimiothérapie) pour induire une immunosuppression générale chez le patient. Toutefois, ces traitements immunosuppresseurs exposent le patient à de possibles infections et à des rechutes de son hémopathie. De nouvelles stratégies sont actuellement à l'étude, notamment l'utilisation de cellules suppressives comme les lymphocytes T régulateurs (Treg) mais à ce jour l'efficacité de cette thérapie n'a pas été démontrée dans des essais cliniques de phase Un autre type cellulaire connu sous l'acronyme MDSC (pour "myeloid derived suppressor cells") intervient aussi pour réguler UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 2 - négativement le système immunitaire. Ce sous-type cellulaire est rare ou absent chez les individus en bonne santé et retrouvé en cas de pathologie et notamment en cas de cancer. L'injection de ces cellules a permis chez l'animal de promouvoir la tolérance des greffes après transplantation mais la rareté de ces cellules rend difficile leur utilisation en clinique. La présente invention, propose l'utilisation d'un nouveau sous-type cellulaire de cellules myéloïdes suppressives générées à partir des cellules circulantes isolées du sang des patients et utilisables pour traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires et la maladie du greffon contre l'hôte. La présente invention propose également un procédé de préparation, ex vivo, de cette population de cellules immunosuppressives. Résumé de l'invention Ainsi la présente invention, concerne notamment une cellule exprimant le CD33, le CD11b, le CD14, le CD163, le 20 CD206, l'HLA-DR, le CD44, le CD31, le CD105 et le CCR5. Les déposants ont pu générer, ex vivo ces cellules, les caractériser par l'étude de l'expression des molécules citées ci-dessus. Les déposants ont pu également montrer l'utilité de ces cellules dans le cadre du traitement de 25 certaines pathologies dont la neutralisation du système immunitaire du patient à traiter est indiquée. Dans le cadre de la présente invention, le terme «cellule» fait référence à une cellule eucaryote naturelle ou recombinante. Préférentiellement, ladite cellule est une 30 cellule humaine et encore plus préférentiellement ladite cellule dérive d'une cellule souche hématopoïétique. Le terme «dérive» entend signifier que ladite cellule est issue, directement ou indirectement, de la division d'une UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 3 - cellule souche hématopoïétique. Les différents marqueurs cités dans le cadre de la présente invention sont bien connus de l'homme du métier. De manière préférée, lesdits marqueurs désignent l'un quelconque des isoformes humains 5 desdits marqueurs. La nomenclature CD (pour cluster of differentiation), notamment utilisée dans le cadre de cette demande, a été proposée et établie par le ler groupe de travail et conférence internationale sur les antigènes des leucocytes humains, en réunion à Paris en 1982. La 10 nomenclature en question est maintenue par le HCDM et notamment consultable sur le site de l'association (www .hcdm.org). Dans le cadre de la présente invention, le terme « exprime » entend indiquer que la cellule selon 15 l'invention produit les protéines citées. Plus particulièrement, lorsque lesdites protéines sont des protéines membranaires, le terme « exprime » signifie que ladite protéine est exprimée à la membrane cellulaire de ladite cellule. Lorsque ladite protéine est une protéine 20 soluble, le terme « exprime » entend signifier que ladite protéine est exprimée vers le domaine extracellulaire. Selon un mode de réalisation tout à fait préféré, la cellule selon l'invention exprime le CD33, le CD11b, le CD14, le CD163, le CD206, l'HLA-DR, le CD44, le CD31, CD105 25 et le CCR5. Selon un mode de réalisation préféré, la cellule selon l'invention n'exprime pas les molécules suivantes le CD1a, le CD80, le CD86, le CD16, le CD56, le CD3, le CD19, le CD66b, le CCR7et le PDLl. Selon un mode de réalisation préféré, la cellule 30 selon l'invention exprime le CCL2, et l'IL-6. Selon un mode de réalisation préféré, la cellule selon l'invention ne n'exprime pas les suivantes l'IL-4, l'IL-5, l'IL-12p70, le UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 4 - INF-a, le CCL20, l'IFNy, le granzyme B, le FasL soluble, le TGF-13. La présente invention concerne également une cellule selon l'invention pour utilisation comme médicament. L'utilisation possible comme médicament de la cellule selon l'invention a été notamment démontrée dans un modèle expérimental de la maladie du greffon contre l'hôte et peut être étendue à toutes les pathologies où une neutralisation temporaire du système immunitaire peut être souhaitée. Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation de la cellule selon l'invention pour le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte, des maladies auto-inflammatoires comme l'artérite gigantocellulaire (Maladie de Horton), la polyarthrite rhumatoïde, les maladies auto-immunes et le rejet de greffe. La présente invention concerne également une composition comprenant une cellule selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Parmi les vecteurs pharmaceutiquement acceptables on peut citer le sérum 20 physiologique, le PBS, le glucosé 5%, le RPMI. La présente invention concerne également une cellule selon l'invention pour induire l'augmentation des lymphocytes T CD8 régulateurs La présente invention concerne également une cellule 25 selon l'invention pour induire une inhibition de la prolifération des lymphocytes T effecteurs. La composition selon l'invention peut comprendre en outre toutes drogues nécessaires dans le cadre du traitement envisagé. Préférentiellement, ladite composition 30 comprend entre 1 X 107 et 1 X 108 cellules par injection et un nombre d'injections de 1 à 20 injections en fonction de la tolérance et de la réponse. UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 5 - Les cellules selon l'invention peuvent être injectées chez le patient par toutes les voies connues de l'homme du métier. Parmi celles-ci, la voie intraveineuse est préférée. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'une cellule selon l'invention comprenant les étapes consistant à : - (i) cultiver des monocytes en présence d'IL-6 et de GM-CSF. - (ii) isoler dans les cellules obtenues à l'issue de l'étape précédente, les cellules exprimant le CD33. Les monocytes proviennent préférentiellement du sang périphérique du patient à traiter, ou du sang de volontaires sains allogéniques. Les monocytes peuvent être obtenus préférentiellement en utilisant 2 techniques, soit après isolation magnétique des cellules exprimant le CD14, soit à partir des cellules CD34+ isolées du sang périphérique par tri magnétique puis multipliées lors d'une culture en présence de « CD34 expansion medium » puis différentiées en monocytes lors d'une culture en présence de M-CSF. - (ii) après 7 jours de culture, isoler par tri magnétique à partir des cellules obtenues à l'issue de l'étape précédente, les cellules exprimant le CD33. L'homme du métier connait bien les techniques permettant d'isoler les cellules en fonction de leurs phénotypes. Lesdites techniques utilisent habituellement des anticorps, éventuellement marqués, spécifiques desdits phénotypes puis une technique permettant de séparer les cellules ayant fixé lesdits anticorps des autres cellules. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 6 - en ce que l'étape (ii) consistant à isoler les cellules exprimant le CD33 est réalisée via un trieur de cellules. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable 5 en ce que l'étape (ii) consistant à isoler les cellules exprimant le CD33 est réalisé via des billes magnétiques. L'étape (i) consistant à cultiver des monocytes en présence d'IL-6 et de GM-CSF peut être mise en oeuvre dans les conditions de culture habituellement utilisées pour ce 10 type de cellules. Préférentiellement, les cellules sont maintenues à 37°C et 5% de CO2 dans un milieu de culture adéquat. Préférentiellement ledit milieu de culture est du RPMI1640. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention 15 est remarquable en ce que l'IL-6 présent dans le milieu de culture à l'étape (i) est compris entre 5 et 15ng/m1 et tout à fait préférentiellement entre 8 et 12ng/ml. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable en ce que le 20 GM-CSF présent dans le milieu de culture à l'étape (i) est compris entre 5 et 15ng/m1 et tout à fait préférentiellement entre 8 et 12ng/ml. La concentration de GM-CSF et d'IL-6 indiquée est la concentration initiale dans le milieu de culture au moment de sa mise en contact 25 avec les cellules. Avantageusement, ledit milieu de culture est renouvelé régulièrement tous les 2 ou 3 jours. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable en ce que l'étape (i) est effectuée pendant une période comprise 30 entre 4 et 10 jours et tout à fait préférentiellement de 7 jours. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation selon l'invention est remarquable en ce que l'étape (i) est effectuée à 37°C. UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 7 - Description des modes de réalisation Matériel et méthodes - Préparation des cellules selon l'invention Les cellules mononucléaires du sang périphérique ont été isolées chez des donneurs sains ou chez les patients à traiter en utilisant 2 techniques. La première technique consiste à réaliser une centrifugation du sang périphérique sur gradient de Ficoll, récupérer les PBMC (pour cellules mononucléées du sang périphérique), puis isoler les monocytes par tri magnétique en utilisant l'anticorps antiCD14 couplé à une bille magnétique. La seconde consiste à isoler du sang périphérique les cellules exprimant le CD34 par tri magnétique, puis à cultiver ces cellules en présence de milieu favorisant leur multiplication (CD34 expansion medium), puis à les différencier en les cultivant en présence de M-CSF. Les monocytes ont été ensuite cultivés à une concentration de 5.106 cellules/ml dans du RPMI1640, supplémentés par 10% de Sérum de veau foetal, lOng/m1 de GMCSF et lOng/m1 d'IL-6 pendant 7 jours, le milieu étant renouvelé tous les 3 jours. Les cellules selon l'invention ont été ensuite purifiées, après marquage avec un marqueur spécifique du CD33, via un trieur de cellule. - Test de prolifération cellulaire Des lymphocytes T, des lymphocytes T CD4+CD25- et des lymphocytes T CD4+CD25+ ont été marquées par le kit "Cell trace Violet cell proliferation kit" (Cell Trace, Carlsbad, CA). Les cellules marquées sont cultivées en présence de billes recouvertes d'anti CD3/anti CD28 (Dynabeads, Invitrogen, Cergy Pontoise, France) avec ou sans les UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 8 - cellules selon l'invention. La prolifération des lymphocytes T a été détectée par cytométrie en flux. - Analyse morphologique L'analyse morphologique des cellules selon l'invention a été effectuée après un marquage Wright/Giemsa. - Dosage des Cytokines La concentration en IFN-y, INF-a, IL-10, IL-6 et TGF10 13 a été déterminée dans le surnageant de culture des cellules cultivées par la technique ELISA. - Modèle animal de la maladie du greffon contre l'hôte 15 Des souris NOD/SCID/IL2Ryc-/- (Jackson Laboratory), âgées de 8 à 12 semaines, ont reçu en intraveineux des cellules mononucléées du sang périphérique (20.106 cellules par souris) avec ou sans cellules selon l'invention (5.106 cellules par souris). Le mélange des cellules est fait 20 juste avant l'injection. La détection des signes de maladie du greffon contre l'hôte a été réalisée tous les 3 jours en aveugle. - Analyse histologique des lésions de la maladie du 25 greffon contre l'hôte Les organes prélevés sur les souris traitées ont été fixés dans du formaldéhyde et inclus dans de la paraffine. Des coupes de 5pm sont réalisées et colorées à l'éosine et à l'hématoxyline. 30 UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 9 - Résultats Les cellules ainsi obtenues appelées HuMoSC ont les caractéristiques physiques, phénotypiques et fonctionnelles comme décrit ci-dessous. - Caractère physique des cellules selon l'invention Après coloration par le colorant Wright/Giemsa, les HuMoSC apparaissent comme une population homogène de cellules mononucléées de grande taille à cytoplasme basophile. - Phénotype des cellules selon l'invention Les cellules selon l'invention ont un phénotype CD33+CD11b+CD14+CD163+CD206+ HLA-DR+CD44+CD31+CD105+ CCR5+, et 15 expriment faiblement le CCR6. Les cellules selon l'invention n'expriment pas le CD1a, le CD80, le CD86, le CD16, le CD56, le CD3, le CD19 et le CCR7. 20 - Effet des cellules selon l'invention sur la prolifération des lymphocytes T Des lymphocytes T autologues stimulés ont été cocultivés avec les cellules selon l'invention avec un ratio de 2 lymphocytes T/cellules selon l'invention. Il a été 25 constaté que les lymphocytes T, stimulés co-cultivés avec les cellules selon l'invention, prolifèrent moins que les lymphocytes T cultivés seuls. Une analyse séparée des lymphocytes T a montré que la prolifération des lymphocytes T CD4+ et des lymphocytes T CD8+ était également inhibée 30 par les cellules selon l'invention. Par ailleurs, l'effet antiprolifératif des cellules selon l'invention est également observé sur les Lymphocytes T autologues et sur les lymphocytes T allogéniques. Les lymphocytes T co- UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE - 10 - cultivés avec les cellules selon l'invention n'expriment pas le marqueur CD25+ contrairement aux lymphocytes T cultivés seuls. L'analyse des surnageants de culture des différents échantillons a permis de mettre en évidence que 5 les cellules selon l'invention bloquent la production de cytokine pro-inflammatoire (INF-y et INF-a) par les lymphocytes T. Ainsi les cellules selon l'invention sont remarquables en ce sens qu'elles bloquent l'activation cellulaire et la prolifération cellulaire des lymphocytes T 10 CD4+ et CD8+, autologues et allogéniques et leur sécrétion de cytokines. - Les cellules selon l'invention protègent de l'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte Les souris ayant reçu des cellules du sang 15 périphérique humain développent les signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte entre 20 et 30 jours après l'injection et meurent avant le 50ème jour après l'injection. Au contraire, les souris ayant reçu une coinjection de cellules du sang périphérique humain avec les 20 cellules selon l'invention ne présentent que de faibles signes de la maladie du greffon contre l'hôte et survivent à cette injection. En particulier les lésions histologiques de GvHD au niveau hépatique sont nettement diminuées dans le groupe qui a reçu les cellules selon l'invention. UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE REVENDICATIONS1 - Cellule caractérisée en ce qu'elle exprime le CD33, le CD11b, le CD14, le CD163, le CD206, l'HLA-DR, le CD44, le CD31, CD105, et le CCR5. 2 - Cellule selon la revendication précédente caractérisée en ce qu'elle n'exprime pas une ou plusieurs molécules choisies dans le groupe comprenant le CD1a, le CD80, le CD86, le CD16, le CD56, le CD3, le CD19, le CCR7 et le PDLl. 3 Cellule selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle exprime une ou plusieurs molécules choisies dans le groupe comprenant le CCL2 et l'IL-6. 4 Cellule selon l'une des revendications précédentes pour utilisation comme médicament. 5 - Cellule selon l'une des revendications 20 précédentes pour le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte, des maladies auto-inflammatoires, de l'artérite giganto-cellulaire (Maladie de Horton), de la polyarthrite rhumatoïde, des maladies auto-immunes et du rejet de greffe. 25 6 - Cellule selon l'une des revendications précédentes pour induire l'augmentation des lymphocytes T CD8 régulateurs. UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE- 12 - 7 - Cellule selon l'une des revendications précédentes pour induire une inhibition de la prolifération des lymphocytes T effecteurs. 8 - Composition comprenant une cellule selon l'une des revendications 1 à 7 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 9 - Procédé de préparation d'une cellule selon l'une 10 des revendications 1 à 7 comprenant les étapes consistant à : - (i) cultiver des monocytes en présence d'IL-6 et de GM-CSF. - (ii) isoler dans les cellules obtenues à l'issue de 15 l'étape précédente, les cellules exprimant CD33. - Procédé de préparation selon la revendication précédente caractérisé en ce que les cellules dérivant d'au moins une cellule hématopoïétique sont des PBMC. 11 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 10 caractérisé en ce que l'étape consistant à isoler dans les cellules exprimant CD33 est un trieur de cellules. 12 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 10 caractérisé en ce que l'étape consistant à isoler dans les cellules exprimant le CD33 est réalisé via des billes magnétiques. 13 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisé en ce que l'IL-6 présent UBCHU1-FR-2_TEXTE DEPOSE_SO/GE 20 25 30- 13 - dans le milieu de culture à l'étape (i) est compris entre 5 et 15 ng/ml. 14 - Procédé de préparation selon l'une des 5 revendications 9 à 13 caractérisé en ce que le GM-CSF présent dans le milieu de culture à l'étape (i) est compris entre 5 et 15 ng/ml. 15 - Procédé de préparation selon l'une des 10 revendications 9 à 14 caractérisé en ce que l'étape (i) est effectuée pendant une période comprise entre 4 et 10 jours. 16 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 9 à 15 caractérisé en ce que l'étape (i) est 15 effectuée à 37°C. 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