Brevet FR3020639A1 — publié le 20151106

La présente invention concerne le domaine de la détermination du polymorphisme de longueur d'un gène, en l'occurrence le gène CR1. Il a en effet été démontré que les polymorphismes de 5 longueur du gène CR1 sont impliqués dans la susceptibilité d'un individu à développer différentes maladies graves, et notamment la maladie d'Alzheimer, le lupus érythémateux disséminé, ou encore le paludisme. Ce gène CR1 code pour une glycoprotéine transmembranaire 10 CR1 (également appelée protéine CD35) de haut poids moléculaire, environ 200 kDa (kilodaltons). Cette glycoprotéine CR1 (CD35) est présente à la surface de nombreux types cellulaires, notamment les érythrocytes, les lymphocytes B, certains types de cellules T, les monocytes, les 15 neutrophiles, les éosinophiles, les cellules dendritiques folliculaires, les astrocytes foetaux ou encore les podocytes glomérulaires. La glycoprotéine CR1 intervient dans la régulation de la réponse immunitaire déclenchée au cours de maladies infectieuses 20 et autoimmunes. En particulier, CR1 constitue un récepteur à certains composants du complément, comme C3b, C4b, C3bi (C3b inactif), Clq et MBL (mannan-binding lectin). CR1 sera appelé, dans la suite de la description, protéine CR1 ou récepteur CR1. 25 L'une des principales fonctions de la protéine CR1 est de réguler l'activation du complément en empêchant la formation des convertases des voies classiques et alternes, lesdites convertases consistant en des protéases qui sont responsables de l'activation du système du complément. En d'autres termes, le 30 CR1 est un inhibiteur de la voie classique et de la voie alterne du complément. CR1 agit également comme cofacteur du facteur I, ce dernier intervenant dans l'inflammation, en modulant le clivage de C3b en C3b et C3bi, C3c en C3dg et de C4b en C4c puis en C4d. La protéine CR1 permet en outre la clairance, c'est-à-dire l'élimination, des complexes immuns couverts de C3b et de C4b dans le foie et dans la rate. D'un point de vue structural, la protéine CR1 présente 5 quatre formes différentes, ou allotypes, présentant chacune un poids moléculaire différent. En d'autres termes, la protéine CR1 montre un polymorphisme allotypique de longueur. Les quatre formes différentes de CR1 présentent respectivement un poids moléculaire de 160, 190, 220 et 250 kDa. 10 En termes de nomenclature, la forme de CR1 présentant un poids moléculaire de 190 kDA est appelée CR1*1, de même que le gène codant pour cette forme. Les formes de poids moléculaire 220 kDA, 160 kDA et 250 kDa sont respectivement notées CR1*2, CR1*3 et CR1*4. 15 Cette nomenclature a été récemment établie afin d'éviter les erreurs fréquentes, dues à l'ancienne nomenclature, dans les équipes de recherche non spécialisées dans l'étude de la protéine CR1*1. Dans l'ancienne nomenclature, les deux formes les plus 20 communes de CR1 ont d'abord été nommées F (Fast) et S (Slow) (190 kDa et 220 kDa respectivement) d'après la rapidité de leur migration électrophorètique. L'allotype de 160 kDa découvert ensuite a pris le nom de F'. Lors de l'isolement d'un quatrième allotype la nomenclature a changé, pour devenir A, B, C et D 25 (190 kDa, 220 kDa, 160 kDa et 250 kDa respectivement). L'ordre de ces différentes lettres était en accord avec la fréquence de chacun des allotypes. Toutefois, de nombreuses personnes utilisaient les lettres A, B, C et D pour désigner les molécules en fonction de leur taille (A étant la plus grande et D la plus 30 petite), et il a été décidé de modifier la nomenclature pour utiliser à présent CR1*1, CR1*2, CR1*3 et CR1*4. Les différentes formes de la protéine CR1 sont représentées sur la figure 1 annexée (d'après Wong W. W., 1989). La forme la plus fréquente de CR1 est la forme CR1*1, avec 35 une fréquence allélique de l'ordre de 83%, mais pouvant varier en fonction de l'origine géographique des populations. L'allèle CR1*1 reste majoritaire. La forme CR1*2 est retrouvée dans les populations avec une fréquence de l'ordre de 16%. Pour ce qui est des formes CR1*3 et CR1*4, celles-ci sont très marginales et représentent une fréquence de l'ordre de 1% chacune, cette fréquence variant toujours selon l'origine des personnes. La forme la plus fréquente de CR1, CR1*1, comporte 30 structures répétitives, les SCR pour Short Consensus Repeat, encore appelées CCP (Complement Control Protein). De telles structures ont été mises en évidence à partir de l'ADNc (complémentaire) codant pour CR1*1. Sur la figure 1 annexée, chaque SCR de CR1*1 est 15 représentée par une petite sphère de couleur grise plus ou moins foncée. Les structures homologues sont coloriées de manière identique Les structures SCR sont regroupées en une structure, ou domaine de taille supérieure, nommée LHR pour Long Homologous 20 Repeat. Chaque LHR comprend 7 SCR, comme illustré sur la figure 1. La forme CR1*1 de la protéine comporte 4 LHR, qui sont appelés LHR-A, LHR-B, LHR-C et LHR-D, depuis la région N-terminale vers la région C-terminale de ladite protéine, et du 25 milieu extracellulaire vers la membrane cytoplasmique. En ce qui concerne la forme CR1*2 de CR1, celle-ci comprend 5 LHR comme suit, depuis le milieu externe vers la membrane cellulaire : LHR-A, LHR-B, LHR-B, LHR-C et LHR-D. Pour ce qui est de CR1*3, celle-ci comporte 3 LHR : LHR-A, 30 LHR-C et LHR-D. Enfin, la forme la plus rare CR1*4 est composée de 6 LHR avec LHR-A, suivi par 3 LHR-B, LHR-C et LHR-D Ainsi, les différents allotypes de la protéine CR1 diffèrent par le nombre et le type de LHR qui les composent. 35 Chaque individu peut porter, à la surface de ses cellules, un ou plusieurs allotypes, comme illustré sur la figure 2 annexée. Ainsi, sur les résultats d'une analyse par Western Blot de cinq sujets, visibles sur cette figure, on remarque cinq profils allotypiques différents. Plus particulièrement, le sujet 1 exprime à la fois CR1*1 (190 kDa) et CR1*3 (160 kDa), le sujet 2 exprime uniquement CR1*1 (190 kDa), le sujet 3 exprime uniquement CR1*2 (220 kDa), le sujet 4 exprime à la fois CR1*1 (190 kDa) et CR1*2 (220 kDa) et le sujet 5 exprime à la fois CR1*2 (220 kDa) et CR1*4 (250 kDa). Ainsi, la technique d'analyse par western blot est la technique originelle qui permet de diagnostiquer le polymorphisme de longueur de CR1 de chaque individu, en permettant de mettre en évidence la présence d'allotypes différents à la surface de leurs cellules. Toutefois, cette technique d'analyse présente un certain nombre d'inconvénients. En particulier, l'analyse protéique par western blot ne peut être effectuée qu'après extraction des membranes cellulaires. De ce fait, elle est lourde à réaliser, et coûteuse en temps. En effet, une telle manipulation nécessite environ deux jours de travail. En outre, la technique suppose d'obtenir du matériel vivant et en bon état en début de procédure pour espérer avoir des résultats exploitables. Or, le déterminisme du polymorphisme de longueur de CR1 permet de détecter la susceptibilité de certains individus à développer des maladies graves, comme la maladie d'Alzheimer ou le lupus érythémateux disséminé. En outre, la détermination du polymorphisme de longueur de 30 CR1 permettrait également de détecter la susceptibilité d'un individu à développer certaines formes de paludisme. En effet, il a été mis en évidence, notamment, que les individus exprimant, à la surface de leurs cellules, la forme CR1*2 du récepteur, également dénommée forme longue de CR1, 35 étaient plus susceptibles d'être atteints par les maladies susmentionnées. Cela est dû au fait que le polymorphisme de longueur du récepteur CR1 entraîne notamment une variation dans le nombre de sites de liaison dudit récepteur à ses ligands, en particulier le C3b et le C4b. En conséquence, il est primordial de proposer une méthode de détermination du polymorphisme de longueur du CR1 qui soit à la fois simple, rapide, et fiable. Une telle méthode permettrait de connaître rapidement la susceptibilité de nombreux individus à des pathologies graves et lourdes, et de proposer de manière précoce un traitement adapté aux individus susceptibles de les développer. Or, il a été expliqué ci-dessus que la technique traditionnelle de détermination du polymorphisme par analyse protéique ne permet pas un diagnostic rapide et à grande 15 échelle. En outre, les techniques d'amplification ou d'hybridation segmentaire par biologie moléculaire n'ont jamais permis d'obtenir des résultats satisfaisants permettant le typage de tous, ou quasiment tous, les individus. Cela s'explique 20 notamment par le fait que les segments du gène CR1 présentent un caractère extrêmement répétitif. Il convient donc de proposer, pour remédier aux inconvénients des techniques existantes, une méthode fiable, simple et applicable rapidement à un grand nombre d'individus 25 permettant de déterminer le polymorphisme du CR1, afin de savoir avec précision et rapidement si un individu donné est susceptible de développer certaines pathologies. Il a alors été mis au point, selon une démarche inventive, une méthode de biologie moléculaire exploitant la distribution 30 quantitative du LHR B au sein du récepteur CR1. En effet, les différents allotypes de CR1 présentent chacun un domaine LHR A, un domaine LHR C et un domaine LHR D, comme cela est d'ailleurs visible sur la figure 1 jointe. Toutefois, l'allotype CR1*3 ne comporte pas de LHR B tandis 35 que les allotypes CR1*1, CR1*2 et CR1*4 comportent respectivement 1, 2 et 3 domaines LHR B. A cet effet, la présente invention concerne une méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1, celui-ci comprenant un domaine LHR (Long Homologous Repeat) A, un domaine LHR C et un domaine LHR D, ledit récepteur CR1 comportant en outre n domaine LHR B, avec n correspondant à un nombre entier compris entre 0 et 3, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : - on extrait du matériel génétique à partir d'un échantillon biologique prélevé sur un individu ; - à partir dudit matériel génétique, on amplifie, grâce à un seul couple d'amorces spécifiques, un premier segment du domaine LHR B, représentant un variant caractéristique du LHR B, nommé segment variant B, et un deuxième segment appartenant à au moins un domaine, ledit domaine étant choisi parmi les domaines LHR A, LHR C et LHR D, ledit deuxième segment étant nommé segment non variant, ledit segment variant B et ledit segment non variant présentant, en dehors des zones d'hybridation desdites amorces, au moins trois différences de nucléotides ; on déduit, en utilisant un outil quantitatif, le nombre d'amplicons de segment variant B et le nombre d'amplicons de segment non variant, le ratio variant B/non variant étant différent en fonction du polymorphisme de longueur du récepteur CR1. De manière avantageuse, le deuxième segment, ou segment non variant, est un segment du domaine LHR C. Selon un exemple intéressant, ledit segment variant B et ledit segment non variant présentent, en dehors des zones 30 d'hybridation desdites amorces, au moins trois et au plus vingt différences de nucléotides, de préférence au moins trois et au plus quinze, et encore plus préférentiellement au moins trois et au plus dix différences de nucléotides. Dans un mode de réalisation préférentiel, ledit segment 35 variant B et ledit segment non variant présentent, en dehors des zones d'hybridation desdites amorces, cinq différences de nucléotides. Avantageusement, on amplifie le segment variant B et le segment non variant avec un couple d'amorces comprenant une 5 amorce sens de SEQ ID NO:1 et une amorce antisens SEQ ID NO:2 L'amorce sens de SEQ ID NO:1 est également identifiée par la référence CN3 et sa séquence est la suivante : 5' GGCCTTAGACTTCTCCTGC 3' (SEQ ID NO:1) L'amorce antisens de SEQ ID NO:2 est également identifiée 10 par la référence CN3re et sa séquence est la suivante : 5' GTTGACAAATTGGCGGCTTCG 3' (SEQ ID NO:2) De préférence, l'outil quantitatif permettant de déduire le ratio variant B/non variant est la technique par analyse des courbes de fusion à haute résolution, ou HRM (High Resolution 15 Melting), des amplicons obtenus lors de l'étape d'amplification. La méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon l'invention peut avantageusement être utilisée pour diagnostiquer la présence de l'allotype CR1*2 du récepteur CR1 à la surface des cellules chez un individu. 20 La présente invention est également relative à l'utilisation de la méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 pour diagnostiquer la susceptibilité d'un individu à développer un lupus érythémateux disséminé, la maladie d'Alzheimer ou le paludisme. 25 La présente invention comporte de nombreux avantages. D'une part, le polymorphisme de longueur du CR1 est déterminé très rapidement. En effet, les résultats sont obtenus en 2h environ, une fois que l'extraction du matériel génétique a été effectuée. Au contraire, la technique biochimique traditionnelle, 30 reposant sur une analyse protéique par western blot, nécessite des étapes qui sont relativement longues : une électrophorèse d'extraits membranaires cellulaires à travers un gel d'acrylamide, une étape de transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose ou de polyvinylidène fluoride (PVDF) 35 et une étape d'identification des allotypes du récepteur CR1 par immunochimioluminescence. En outre, la méthode de détermination du polymorphisme de longueur de CR1 est très efficace et elle a notamment été validée par la comparaison avec les résultats d'une analyse protéique classique, par la technique du western blot, sur 140 5 sujets chez lesquels étaient représentés l'ensemble des génotypes connus du polymorphisme de longueur de CR1. La méthode selon l'invention a montré des résultats identiques à ceux obtenus par l'analyse traditionnelle par western blot, et peut de ce fait être considérée comme étant très fiable. En outre, 10 les tests statistiques effectués ont montré que les résultats étaient significatifs (t Les figures 4A et 4B illustrent les courbes qui sont obtenues lors de l'analyse par PCR-HRM du polymorphisme de longueur du récepteur CR1. L'analyse à l'aide du logiciel « LightCycler 480 software » (LC480; Roche) des courbes de fusion à haute résolution des amplicons obtenus par PCR à partir d'ADN génomique de sujets présentant des allotypes de CR1 différents, montre des profils de courbes différents qui permettent de discriminer les sujets en fonction de leur profil d'expression allotypique de CR1. La figure 4A illustre un premier mode de représentation, appelé «Normalized and Shifted Melting Curves» (« Courbes de fusion normalisées et décalées »), et la figure 4B représente un second mode de représentation appelé «Normalized and Temp-Shifted Difference Plot» (« Graphique différentiel des courbes normalisées et regroupées à une température »). Les profils de courbes sont repartis selon les groupes qui ont été notés F'F, F, FS, S et T, selon l'ancienne nomenclature des différents allotypes du récepteur CR1. La figure 4C illustre la concordance entre les groupes de profils de courbe de fusion (F'F, F, FS, S et T) obtenus pour cinq individus par la méthode selon l'invention, utilisant la PCR-HRM comme outil quantitatif, et les résultats des allotypes CR1 observés, chez les mêmes individus, par western blot lors d'une analyse protéique du polymorphisme de longueur de CR1. L'association entre le phénotypage des allotypes du polymorphisme de longueur de CR1 par western blot et le génotypage des allèles du polymorphisme de longueur de CR1 par PCR-HRM est hautement concordante et statistiquement significative ( L'allotype CR1*2 du récepteur CR1, qui a été déterminé comme étant l'allotype présent chez les individus susceptibles de développer une pathologie du type lupus érythémateux disséminé, maladie d'Alzheimer ou paludisme, comporte deux domaines LHR B. Ainsi, pour CR1*2, n est égal à 2. En ce qui concerne à présent les allotypes CR1*3 et 4, qui sont les allotypes les plus rares du récepteur CR1, ceux-ci comportent respectivement zéro et trois domaine(s) LHR B. Ainsi, pour l'allotype CR1*3, n est égal à 0, tandis que pour le CR1*4, n est égal à 3. Ainsi, de manière particulièrement originale, la méthode de détermination du polymorphisme de longueur du récepteur CR1 selon l'invention exploite, d'une part, cette différence du nombre de domaines LHR B entre les différents allotypes, et, d'autre part, le fait que les différents domaines LHR présentent certains points communs, ou homologies. De ce fait, ladite méthode comprend d'abord une première étape, dans laquelle on extrait du matériel génétique à partir d'un échantillon biologique prélevé sur un individu. Le matériel génétique qui est extrait de l'individu chez lequel on souhaite déterminer le polymorphisme de longueur du récepteur CR1 consiste, de préférence, soit en de l'ADN (acide désoxyribonucléique), notamment de l'ADN génomique, soit en de l'ARNm (acide ribonucléique messager). Dans le cas où le matériel génétique est constitué par de l'ARNm, celui-ci est rétrotranscrit en de l'ADN préalablement à l'étape d'amplification. Avantageusement, on extrait le matériel génétique d'un échantillon biologique consistant en du sang, de la lymphe, de l'urine, de la salive, un prélèvement par biopsie, des tissus, ou tout autre liquide biologique ou prélèvement biologique contenant des cellules et étant adéquat pour permettre une extraction de matériel génétique. Ainsi, l'échantillon biologique peut également être de tout 35 autre type, par exemple des vestiges archéologiques. L'étape d'extraction de matériel génétique peut être effectuée par les techniques classiquement utilisée par l'homme du métier et adaptées à cet effet. En particulier, l'extraction de matériel génétique peut 5 être effectuée au moyen de kits commerciaux adaptés spécialement à cet effet. Dans une deuxième étape de la méthode selon l'invention, on amplifie ledit matériel génétique extrait par l'intermédiaire d'un seul couple d'amorces. 10 Concernant l'amplification dudit matériel génétique, celle- ci est avantageusement réalisée par la technique classique de réaction de polymérisation en chaine, abrégée PCR. Pour en revenir audit couple d'amorces unique, celui-ci permet, à partir dudit matériel génétique, à la fois une 15 amplification d'un premier segment du domaine LHR B et une amplification d'un deuxième segment appartenant à au moins un autre des domaines du récepteur CR1. En d'autres termes, ledit couple d'amorces permet également d'amplifier un segment du domaine LHR A, ou un segment du 20 domaine LHR C, ou un segment du domaine LHR D. Il est également envisageable, dans un mode de réalisation particulier, que le couple d'amorces unique mis en oeuvre dans la méthode selon l'invention permette l'amplification d'un segment qui est retrouvé dans plusieurs domaines LHR A, LHR C, ou LHR D. 25 Le segment du domaine LHR B qui est amplifié dans la méthode selon l'invention, avec ledit couple d'amorces, représente un variant caractéristique du LHR B, et est nommé segment variant B ». Le deuxième segment amplifié, appartenant à au moins un des 30 autres domaines LHR du récepteur CR1, est appelé « segment non variant ». Les deux segments, variant B et non variant, sont amplifiés par les mêmes amorces, et présentent en dehors des zones des segments où les amorces s'apparient avec l'ADN pour initier 35 l'amplification, avantageusement au moins trois différences de nucléotides. Plus préférentiellement encore, ledit segment variant B et ledit segment non variant présentent, en dehors des zones d'hybridation desdites amorces, au moins trois et au plus vingt différences de nucléotides, de préférence au moins trois et au plus quinze, et encore plus préférentiellement au moins trois et au plus dix différences de nucléotides. Une telle caractéristique permet, dans une étape ultérieure, de déterminer, par l'utilisation d'un outil quantitatif adapté à cet effet : - le nombre d'amplicons de segment variant B - le nombre d'amplicons de segment non variant. Le ratio entre le nombre d'amplicons de segment variant B et de segment non variant est déterminé (ratio variant B/non variant), et celui-ci est différent en fonction du polymorphisme 15 de longueur du récepteur CR1. En effet, le nombre d'amplicons de segment non variant ne change pas d'un individu à un autre. D'un autre côté, le nombre d'amplicon de segment variant B est modifié en fonction du ou des allotypes de CR1 exprimé(s) à la surface des cellules de 20 l'individu dont est extrait le matériel de départ. Cela est dû au fait que le nombre de domaine(s) LHR B varie entre 0 et 3 en fonction que l'individu exprime le CR1*1, le CR1*2, le CR1*3, ou le CR1*4. La méthode selon l'invention est donc, selon une démarche 25 inventive, basée sur le fait que les deux types de segments amplifiés présentent des homologies de séquences, permettant l'appariement d'un seul couple d'amorces, tout en présentant un certain nombre de différences, pour que l'outil quantitatif permettent de discriminer les amplicons de segment variant B et 30 les amplicons de segment non variant. Dans un exemple tout particulièrement intéressant de la méthode de détermination du polymorphisme de longueur de CR1, le deuxième segment amplifié par le couple d'amorces, autrement dit le segment non variant, est un segment appartenant au domaine 35 LHR C. Dans un mode de réalisation préférentiel, le segment variant B et le segment non variant, qui appartient de préférence au domaine LHR C, présentent, en dehors des zones d'hybridation du couple d'amorces spécifiques, cinq différences de nucléotides. Cela permet, de manière avantageuse, d'une part, que les amorces s'apparient aux deux segments génomiques, c'est-à-dire le segment variant B et le segment non variant, par exemple du LHR C. D'autre part, les cinq différences de nucléotides facilitent la détermination, au moyen de l'outil quantitatif choisi, du nombre d'amplicons de segment variant B et de segment non variant, par exemple du LHR C. Tout préférentiellement, pour l'amplification des segments variant B et non variant du LHR C, on utilise une 15 amorce sens et une amorce antisens de séquences respectives SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:2 sur le listage de séquences. Ces amorces sens et antisens, également référencées CN3 et CN3re respectivement, présentent plus particulièrement les séquences suivantes : 20 - SEQ ID NO:1 : 5' GGCCTTAGACTTCTCCTGC 3' - SEQ ID NO:2 : 5' GTTGACAAATTGGCGGCTTCG 3' Le principe de ce mode réalisation particulier de la méthode de détection du polymorphisme de longueur décrit ici est de tirer parti de l'existence de cinq changements de nucléotides 25 dans un segment génomique du LHR B, représentant un variant caractéristique du LHR B (segment variant B), ce dernier étant un segment génomique homologue du LHR C (segment non variant). Le segment variant B et le segment génomique du LHR C sont repris et alignés sur la figure 3 qui est annexée. Les cinq 30 changements de nucléotides entre ces deux segments sont mis en évidence sur cette figure. En outre, les zones d'hybridation des amorces CN3 et CN3re sont représentées par un encadré. Si on amplifie les segments génomiques dans les domaines LHR B et LHR C selon les polymorphismes de longueur, le nombre 35 de copies des segments variants B et non variants sera différent et le ratio segment variant B/segment non variant sera fonction du polymorphisme de longueur de CR1. On entend par séquence homologues deux séquences qui ont un ancêtre commun ; l'homologie entre deux séquences se mesure par leur similarité, qui correspond au pourcentage d'identité ou de substitution entre lesdites deux séquences. Une similarité importante entre deux séquences est signe d'homologie. Selon un mode de réalisation particulier, l'outil quantitatif avec lequel on déduit le ratio entre segment variant B et segment non variant est la technique par analyse des courbes de fusion à haute résolution, ou technique HRM (High Resolution Melting), appliquée aux amplicons obtenus lors de l'étape d'amplification. En effet, deux individus différents, présentant chacun un polymorphisme de longueur du récepteur CR1 différent, ont, par définition, un ratio segment variant B/segment non variant différent. Par conséquent, ces deux individus vont présenter chacun un profil spécifique de courbe de fusion à haute résolution, en fonction du polymorphisme de longueur du récepteur CR1, et donc du ratio segment variant B/segment non variant. Toutefois, tout autre outil quantitatif adapté peut être utilisé, comme les méthodes de PCR quantitative ou d'hybridation en temps réel. Pour en revenir à la technique HRM, celle-ci permet notamment, de manière particulièrement fiable, de détecter un polymorphisme génétique, dans des échantillons d'ADN double brin. Avantageusement, au moyen de cette technique, il est possible de distinguer deux amplicons présentant une différence d'au moins un nucléotide. Les amplicons obtenus lors de l'étape d'amplification sont dans un premier temps chauffés, de manière très progressive, par pas de température les plus fins possibles, afin d'obtenir des résultats les plus précis possibles. Généralement, les amplicons sont chauffés progressivement entre une température de 50°C et une température de 95°C. A une certaine température, les deux brins de la molécule d'ADN se séparent. Ce phénomène est appelée fusion de l'ADN. Dans la technique HRM de fusion à haute résolution, le but est d'observer cette fusion en temps réel, grâce à l'utilisation 5 d'agents intercalants. Ces agents sont fluorescents lorsqu'ils sont fixés à la molécule d'ADN double brin. En l'absence d'ADN double brin, ces agents intercalants ne peuvent donc pas se fixer, et le niveau de fluorescence est très faible. 10 Lorsque l'on débute l'analyse par la technique HRM, les amplicons sont sous forme double brin. Un grand nombre de molécules d'agent intercalant peut alors se fixer à l'ADN, et l'intensité de la fluorescence est très importante. Lorsque, au cours de l'analyse, la température est 15 progressivement augmentée, les deux brins d'ADN des amplicons se séparent, et la fluorescence diminue. On obtient alors une courbe de fusion de l'ADN, qui représente l'intensité de la fluorescence émise par les molécules d'agent intercalant, en fonction de la température à 20 laquelle sont soumis les amplicons. Les courbes de fusion, obtenues lors de la mise en oeuvre de la méthode de caractérisation du polymorphisme de longueur du récepteur CR1, sont représentées sur la figure 4A ci-jointe. Les changements dans la molécule d'ADN se traduisent par 25 une variation dans la cinétique de fusion de l'ADN, cette variation pouvant être détectée du fait de la haute résolution utilisée. Ainsi, sur la figure 4A, des profils de courbes différents sont observés, et ils correspondent à des individus présentant 30 des allotypes différents du récepteur CR1 (F'F, F, FS, S et T). La figure 4B montre un second mode de représentation des courbes, et l'on remarque également les différences entre les individus présentant des formes différentes du récepteur CR1. Différentes études scientifiques ont démontré que les 35 personnes qui expriment, à la surface de leurs cellules, la forme CR1*2 du récepteur CR1, sont plus susceptibles de développer certaines pathologies, notamment la maladie d'Alzheimer, le lupus érythémateux disséminé, ou encore le paludisme. La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative 5 incurable, qui touche le tissu cérébral, et entraîne la perte progressive et irréversible des fonctions mentales. Pour ce qui est du lupus érythémateux disséminé, cette pathologie est d'origine autoimmune, et touche le tissu conjonctif. 10 Enfin, concernant le paludisme, il s'agit d'une maladie infectieuse causée par un parasite, appartenant au genre Plasmodium. Le paludisme est propagé par l'intermédiaire d'un moustique anophèle. De récents résultats d'études scientifiques ont démontré 15 que le parasite responsable du paludisme, Plasmodium falciparum, était capable de se fixer sur les SCR n°1, 2 et 3 du récepteur CR1. Or, ces SCR présentent une très forte homologie avec les SCR 8, 9 et 10 du domaine LHR B du récepteur CR1. Il en résulte qu'il est probable que l'allotype CR1*2 du récepteur CR1 soit un 20 facteur de risque pour le développement du paludisme. En conséquence, la méthode de caractérisation du polymorphisme de longueur du récepteur CR1 permet de mettre en évidence les individus porteurs de la forme CR1*2. Ces derniers ont plus de risques de développer l'une ou l'autre de ces 25 maladies. Un diagnostic précoce et rapide de cette susceptibilité à la maladie d'Alzheimer, au lupus érythémateux disséminé, ou encore au paludisme permet de proposer aux personnes concernées un traitement adapté dans les meilleurs délais. 30 La méthode selon l'invention est donc particulièrement avantageuse, et elle peut être mise en oeuvre aisément sur un grand nombre d'individus, afin d'obtenir des résultats rapidement. L'exemple 1 ci-dessous est destiné à illustrer un mode de 35 réalisation particulièrement préférentiel de la méthode de détermination du polymorphisme de CR1 selon l'invention. Cet exemple ne doit toutefois pas être considéré comme étant limitatif de l'invention. Exemple 1 : Caractérisation du polymorphisme de longueur du récepteur CR1 par amplification du segment variant de LHR B 5 et du segment non variant de LHR C et analyse HRM Les amorces CN3 et CN3re, de SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:2 respectivement ont été synthétisées par la société Eurogentec (Seraing, Belgique). Ces amorces permettent d'amplifier les segments 10 génomiques représentés sur la figure 3, correspondant au segment variant B et au segment non variant du domaine LHR C. Pour amplifier ces segments, la réaction d'amplification a été effectuée sur du matériel génétique extrait de cinq individu, par PCR, dans un volume total de 20 pL, utilisant : 15 - 10 pL de « LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix 2X concentré » (Roche, Meylan, France) ; - 2 pL de MgC12 (25 mM), - 1 pL d'amorce CN3 de SEQ ID NO:1 concentrée à 300 nmol/L, 20 - 1 pL d'amorce CN3re de SEQ ID NO:2 concentrée à 300 nmol/L, - 5 pL d'eau, et - 10 ng d'ADN génomique. Les réactions de PCR sont réalisées à l'aide de plaques 25 de 96-puits "LightCycler 480 multiwell Plate 96, white" (Roche, Meylan, France) selon le protocole d'amplification suivant: - un cycle à 95°C pendant 10 minutes, - 45 cycles à 95°C pendant 10 secondes, à 62°C pendant 15 secondes, et à 72°C pendant 20 secondes. 30 La fusion à haute résolution (High Resolution Melting ou HRM) des amplicons obtenus lors de l'étape de PCR est réalisée à l'aide de l'appareil "LightCycler 480 System" (Roche, Meylan, France) et permet de mettre en évidence des profils de courbe de fusion qui correspondent aux allotypes du polymorphisme de 35 longueur de CR1. Ces profils de courbes de fusion sont visibles sur les figures 4A et 4B, correspondant à deux modes de représentation différents desdites courbes. Le logiciel de l'appareil permettant la réalisation de la PCR HRM permet le passage de l'une à l'autre représentation. Il permet ainsi de réaliser le graphique différentiel des courbes normalisées, visible sur la figure 4B, pour le bruit de fond, la fluorescence finale, et la température de fusion finale. Les résultats qui ont été obtenus par la méthode selon l'invention ont été comparés aux résultats obtenus lors de la mise en oeuvre de la technique classique de détermination du polymorphisme du CR1 par western blot. Cela est illustré sur la figure 4C. La présente méthode de détection du polymorphisme de CR1, par amplification PCR suivie d'une détermination des températures de fusion des amplicons obtenus par HRM, présente des résultats concordants avec la technique traditionnelle d'analyse protéique par western blot. En outre, la méthode selon l'invention permet l'obtention 20 des résultats de manière particulièrement rapide, en comparaison avec la technique traditionnelle. REVENDICATIONS1.Méthode de détermination du polymorphisme de longueur du récepteur CR1, celui-ci comprenant un domaine LHR (Long Homologous Repeat) A, un domaine LHR C et un domaine LHR D, ledit récepteur CR1 comportant en outre n domaine LHR B, avec n correspondant à un nombre entier compris entre 0 et 3, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : - on extrait du matériel génétique à partir d'un échantillon biologique prélevé sur un individu ; - à partir dudit matériel génétique, on amplifie, grâce à un seul couple d'amorces spécifiques, un premier segment du domaine LHR B, représentant un variant caractéristique du LHR B, nommé segment variant B, et un deuxième segment appartenant à au moins un domaine, ledit domaine étant choisi parmi les domaines LHR A, LHR C et LHR D, ledit deuxième segment étant nommé segment non variant, ledit segment variant B et ledit segment non variant présentant, en dehors des zones d'hybridation desdites amorces, au moins trois différences de nucléotides ; - on déduit, en utilisant un outil quantitatif, le nombre d'amplicons de segment variant B et le nombre d'amplicons de segment non variant, le ratio variant B/non variant étant différent en fonction du polymorphisme de longueur du récepteur CR1. 2. Méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon la revendication 1 caractérisée en ce que le deuxième segment, ou segment non variant, est un segment du domaine LHR c. 3. Méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que ledit segment variant B et ledit segment non variant présentent, en dehors des zones d'hybridation desdites amorces, au moins trois et au plus vingt, de préférenceau moins trois et au plus quinze, de préférence au moins trois et au plus dix différences de nucléotides. 4.Méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que ledit segment variant B et ledit segment non variant présentent, en dehors des zones d'hybridation desdites amorces, 5 différences de nucléotides. 5.Méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'on amplifie le segment variant B et le segment non variant avec un couple d'amorces comprenant une amorce sens de SEQ ID NO:1 et une amorce antisens SEQ ID NO:2. 6.Méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'outil quantitatif permettant de déduire le ratio variant B/non variant est la technique par analyse des courbes de fusion à haute résolution ou HRM (High Resolution Melting) des amplicons obtenus lors de l'étape d'amplification. 7.Utilisation de la méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon l'une quelconque des revendications précédentes pour diagnostiquer la présence de l'allotype CR1*2 du récepteur CR1 à la surface des cellules chez un individu. 8.Utilisation de la méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon l'une des revendications 1 à 6 pour 25 diagnostiquer la susceptibilité d'un individu à développer un lupus érythémateux disséminé. 9.Utilisation de la méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon l'une des revendications 1 à 6 pour diagnostiquer la susceptibilité d'un individu à développer la 30 maladie d'Alzheimer. 10. Utilisation de la méthode de détermination du polymorphisme du récepteur CR1 selon l'une des revendications 1 à 6 pour diagnostiquer la susceptibilité d'un individu à développer le paludisme.