Brevet FR3020809A1 — publié le 20151113

DERIVES DE 4-VINYL-2CYCLOPENTENE-1-ONE LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION EN TANT QU'AGENT ANTIBIOTIQUE La présente invention concerne de nouveaux dérivés de 4-vinyl- 2cyclopentène-1-one, leur préparation et leur utilisation en tant qu'agent antibiotique. Les maladies infectieuses représentent la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. Les infections impliquant des germes résistants aux traitements actuels posent un grand problème de santé publique et engendre un surcoût de traitement exorbitant estimé à 62 milliards d'euros. En Europe, 6,2 % des patients qui passent plus de deux jours en soins intensifs contractent des infections pulmonaires et 3,0 % des infections sanguines. 70 % des antibiotiques approuvés par la FDA (Food and Drug Administration, USA) et plus de 80 % des antibiotiques connus sont d'origine naturelle. Ces antibiotiques ont principalement été isolés à partir de microorganismes (bactéries et champignons filamenteux), ressources inépuisables pour la découverte d'antibiotiques et préférentiellement à large spectre, efficaces contre les infections multiples communautaires et nosocomiales. La présente demande concerne une nouvelle famille de molécules antibiotiques de formule générale (I) 0 (I) dans laquelle : R1 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en C1 à C4 ; R2 représente un radical hydroxyle ou alkoxyle en C1 à C4, et R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en C1 à C4 ; leurs énantiomères et mélanges d'énantiomères en particulier sous forme racémique. Plus particulièrement la présente demande concerne une famille de molécules antibiotiques de formule générale (la) 0 OH (la) Le composé de formule (la) a été isolé à partir d'un champignon filamenteux Trichoderma, en particulier de l'espèce atroviride. La souche Trichoderma LMA utilisée a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM. Cette molécule a été isolée et testée dans des conditions particulière incluant : 1. La mise en culture de Trichoderma, en particulier de Trichoderma atroviride, 2. La capture in-situ, en cours de culture, des molécules naturelles produites par Trichoderma (produits naturels, métabolites secondaires). Cette capture des molécules est réalisée grâce à un protocole connu mais peu utilisé dans le domaine et appelé « Extraction en phase solide » ou SPE, 3. L'isolement et la purification du composé de formule (la) et l'identification de sa structure chimique, 4. La réalisation des tests biologiques pour mettre en évidence des activités antibiotiques. La mise en culture de Trichoderma consiste à partir d'une boîte de pétri sur laquelle le microorganisme s'est développé, les spores et fragments de mycélium sont récupérés sans distinction en grattant la surface de la boîte de gélose avec un liquide stérile, préférentiellement du milieu de culture liquide. Les spores et mycélium sont ensuite étalés ou introduits dans un milieu de culture de microorganismes solide ou liquide, préférentiellement liquide et préférentiellement le milieu PDB (Potatoes Dextrose Broth) composé d'extraits de pomme de terre et de sucre, dont la composition est par exemple la suivante : fécule de pomme de terre 4 g/L, dextrose 20 g/L. La souche fongique est cultivée à une température comprise entre 0°C et 50°C, préférentiellement entre 20°C et 37°C, et préférentiellement à 30°C sous agitation soit rotative soit grâce à une turbine entraînée par un moteur entre 25 et 300 rotations par minute, préférentiellement à une vitesse de 150 rotations par minute. La culture est constamment aérée soit par aération spontanée par l'oxygène contenu dans l'air ambiant, soit par aération forcée par injection d'oxygène par exemple celui compris dans l'air comprimé. La culture ainsi décrite peut être réalisée dans n'importe quel dispositif de culture microbiologique solide ou liquide connu de l'homme du métier, préférentiellement dans des Erlenmeyers ou dans des fermenteurs quelles que soient leurs dimensions ou leur taille. La durée de la culture doit correspondre au maximum de production de la molécule, elle peut varier de 1 à 15 jours, préférentiellement de 3 à 7 jours et préférentiellement encore 5 jours. La capture in situ, en cours de culture, des molécules naturelles produites par Trichoderma est réalisée grâce à un protocole peu utilisé dans le domaine et appelé « Extraction in situ et en phase solide » ou in situ SPE. Ce protocole consiste à introduire un élément solide inerte durant la culture du microorganisme capable de piéger les molécules d'intérêt libérées par ce dernier tout au long de la culture. Idéalement, ce protocole implique des résines de natures variées et préférentiellement des résines neutres comme celles décrites dans le tableau suivant et préférentiellement des résines apolaires composées de copolymères polystyrène-divinylbenzène (PS-DVB) de type )(AD et préférentiellement la résine XAD-16. La résine est lavée avant utilisation avec une solution aqueuse et méthanolique, et récupérée soit par décantation soit par filtration. La résine est ensuite introduite dans le milieu de culture de manière stérile, soit avant, soit après la stérilisation de celui-ci. Préférentiellement, la résine est introduite dans le milieu de culture avant stérilisation puis stérilisée en même temps que le milieu. Les quantités de résine varient de 1g/L à 100 g/L, préférentiellement entre 10 g/L et 50 g/L et préférentiellement à 30 g/L. Exemples de Matrice Surface Taille Porosité résines (m2/g) particule (mi/mi) (mm) )(AD 7-HP Ester 450 0.43 - 0.69 1.4 acrylique )(AD 4 Polystyrène > 725 0.49 - 0.69 > 0.5 DVB Diaion HP-20 Polystyrène 600 > 0.25 1.3 DVB )(AD 16 Polystyrène > 800 0.56 - 0.71 > 0.55 DVB Sepabeads Polystyrène 1000 > 0.25 1.2 DVB En ce qui concerne l'isolement et la purification du composé de formule (la) et l'identification de sa structure chimique, la résine est récupérée seule ou mélangée à la biomasse par toute technique de séparation entre une matrice solide et un contenant liquide, lorsque la culture de Trichoderma a duré le temps nécessaire pour la production optimale du composé de formule (la). Ces méthodes connues de l'homme du métier incluent de façon non limitative tous les moyens et techniques de filtration, centrifugation, décantation ou séchage. Préférentiellement, la résine seule ou mélangée à la biomasse est récupérée par filtration spontanée ou forcée sous vide, préférentiellement sur un filtre poreux quelle que soit sa nature et préférentiellement sur un tissu inerte. La résine est traitée par la suite soit après sa séparation de la biomasse, soit en mélange avec la biomasse. Les molécules captées par la résine sont récupérées par mise en contact de celle-ci avec un solvant quelle que soit sa nature, de préférence un solvant organique, et de préférence le dichlorométhane ou le méthanol, et ce plusieurs fois jusqu'à la récupération de la totalité des molécules d'intérêt. Le solvant ayant dissous les molécules d'intérêt, est ensuite récupéré par filtration puis évaporé par différentes techniques connues de l'homme du métier. Il en résulte un résidu qui contient 302 0 809 5 entre autres la molécule d'intérêt de formule (la) mélangée à d'autres molécules produites par le microorganisme, ou présentes initialement dans le milieu de culture. La présence de la molécule d'intérêt dans ce mélange est confirmée par des analyses chromatographiques ou spectrométriques connues de 5 l'homme de l'art, parmi lesquelles les différentes techniques de chromatographie, la résonnance magnétique nucléaire ou la spectrométrie de masse. De préférence, la présence du composé de formule (la) est mise en évidence grâce à la chromatographie liquide haute performance HPLC couplée à des détecteurs de type PDA, DEDL et spectrométrie de masse. 10 La molécule cible de formule (la) est par la suite purifiée à partir du résidu total par des techniques chromatographiques connues de l'homme du métier, incluant de façon non limitative, la chromatographie sur colonne de silice ou sur colonne en phase inverse, à pression atmosphérique ou sous pression. Préférentiellement la molécule du composé de formule (la) est pré- 15 purifiée par chromatographie sur une colonne de silice normale puis purifiée par HPLC préparative dans les conditions suivantes : chromatographie sur silice en phase normale par un mélange de solvant heptane / acétate d'éthyle (9 / 1) pendant 20 à un débit de 30 mL/min, puis HPLC préparative sur une colonne C18 en utilisant un gradient linéaire d'eau et d'acétonitrile allant de 0 % à 100 % d'acétonitrile en 10 minutes suivi d'un palier à 100 % d'acétonitrile pendant 5 minutes à un débit de 4 mL/min. Après lyophilisation, 12 mg du composé de formule (la) ont été obtenus à partir de 8L de culture. La structure de la molécule du composé de formule (la) a été réalisée par des méthodes spectroscopiques. Les spectres et autres données analytiques sont rapportés dans les figures annexées. Les analyses structurales RMN (figure 1) corrélées aux données issues de l'HRESIMS (spectrométrie de masse haute résolution) ont permis de déterminer la formule brute suivante C9H1004 de masse moléculaire 182.0574. La RMN 13C (figure 2) montre la présence de 9 signaux (49.4 ; 51.7 ; 77.7 ; 120.2 ; 133.9 ; 149.2 ; 163.4 ; 166.4 ; 205.7 ppm), le spectre proton montre la présence de six groupes de protons (2.60 ; 3.74 ; 6.17 ; 6.20 ; 6.91 ; 7.33 ppm). L'analyse du spectre HSQC (figure 3) corrélé au spectre 1D 1H et 13C montre la présence d'un groupement méthoxy à 51.7 ppm, un groupe méthylène à 49.4 ppm et quatre groupements alcènes à 120.2 ; 133.9 ; 149.2 et 163.4 ppm. L'absence de tâches de corrélations de trois carbones permet de conclure à la présence de trois carbones quaternaires : un de type cétone à 205.4 ppm ; un de type ester ou lactone à 166.4 ppm et un de type alcool tertiaire à 77.7 ppm. Le spectre COSY (figure 4) montre des corrélations entre les protons d'alcènes montrant l'existence sur la molécule de deux insaturations de type 10 éthyléniques. La structure de la molécule du composé de formule (la) est confirmée par les corrélations du spectre HMBC (figure 5) et ses interactions scalaires longues distances résumées dans le tableau ci-dessous. Carbone n° Ôc (ppm) HSQC 61-1 (ppm) HMBC 1 205,7 C - H2 ; H3 ; H5 2 133,6 CH 6,20 d (5,5 Hz) H1 ; H3 - H4 ; H5 3 163,4 CH 7,33 d (5,5 Hz) H1 ; H2 H4 ; H5 4 77,7 C - H3 ; H5 ; H6 5 49,4 CH2 2,63 d (5,5 Hz) H1 ; H2 H3 ; H4 6 120,2 CH 6,17 d (16,0 Hz) H3 ; H7 ; H8 7 149,2 CH 6,91 d (16,0 Hz) H6 H8 8 166,4 C - H7 H9 9 51,7 CH3 3,74 s H8 15 La combinaison des données RMN et des informations, obtenue par spectrométrie de masse confirme qu'il s'agit d'une molécule de type cyclopentènone hydroxylée en position 4 substituée par une chaîne linéaire de type acrylate de méthyle. Le spectre d'absorption UV montre un maximum à 20 max = 257 nm. Le spectre infrarouge (figure 6) montre des bandes d'absorption à 3400, 3050, 1800, 1600 cm-1 confortant la présence d'une cétone d'un alcool et des doubles liaisons. Le signe du pouvoir rotatoire mesuré pour la molécule du composé de formule (la) ap = +169 (20 mg/10mL CH2Cl2) a été comparé à celui de molécules ressemblantes comme la trichodénone A an = +56. Les composés de formules (I) et (la) peuvent également être synthétisés conformément au schéma réactionnel mentionné ci-après, faisant apparaître deux voies alternatives dont l'une implique la protection du groupement hydroxy ou alkoxy en position 4 par le chlorure de tert-butyldiméthylsylyle (TBDMS-Cl). MW : MicroWave (microondes) LDA : Lithium Diisopropylamide n-BuLi : n-ButylLithium THF : Tetrahydrofurane RT : Room Temperature (température ambiante) PCC : Pyridinium ChloroChromate TBDMSCI : tert-Butyldimethylsilyl chloride DMAP : 4-dimethylaminopyridine Et3N : Triethylamine o/n : over night (pendant la nuit) AcOH : acide acétique Red-Al® : sodium bis(2-methoxyethoxy)aluminumhybride Schéma réactionnel de préparation du composé de formule (la) Les différents composés de formule (I) pourront être obtenus conformément au schéma réactionnel ci-dessus en choisissant les composés réactionnels de départ substitués de façon correspondante aux composés de formule (I) à préparer. En particulier, les groupements R3 et R4 peuvent être introduits à la première étape en choisissant le substituant approprié sur la chaîne du furfuryl alcool (Microwave- or Microreactor- Assisted Conversion of furfuryl Alcohols into 4-Hydroxy-2-cyclopentenones, K. Ulbrich et al., Synlett 2010, N° 13, pp 2037-2040) ou ultérieurement dans la séquence synthétique. Une fois purifiée, la molécule du composé de formule (la) est redissoute dans des solvants appropriés et à une concentration appopriée, préférentiellement dans du diméthyl-solfoxide DMSO à la concentration de 10 mg/ml. Cette solution initiale est ensuite diluée en fonction des différents tests biologiques à réaliser. Deux séries de tests ont été réalisées. Des tests de citytoxicité sur une lignée de cellules cancéreuses KB (carcinome) et une lignée de cellules équivalentes non-cancéreuse MRC5. Le tableau qui suit rapporte le pourcentae d'inhibition de la croissance par la molécule du composé de formule (la) aux concentrations de 1 et 10 micromolaire. Il se dégage de ce résultat qu'aux concentrations utilisées aucune cytotoxicité n'est observées, ni vis-à-vis de cellules tumorales, ni vis-à-vis de cellules saines. 10-5M 10-6M KB 0 ± 9 0 ± 10 MRC5 2 ± 12 1 ±3 La molécule du composé de formule (la) a été engagée dans des tests antibiotiques selon la technique des zones d'inhibition, sur différentes bactéries Gram positives et Gram négatives, à la concentration de 100 pg. En parallèle, des tests similaires sont réalisés avec des antibiotiques témoins avec des quantités variables selon l'antibiotique soit 10 pg, soit 30 pg. Zone d'inhibition Antibiotique de Zone d'inhibition Microorganisme cible pour 100pg du référence et par les composé de la quantité déposée antibiotiques de formule (la) référence (cm) Escherichia cou/ 2 7 Chloramphénicol 1 0 (ATCC 25922) (30pg) Klebsiella 2,9 Chloramphénicol 2,5 pneumoniae (30pg) (ATCC 1001) Enterobacter 1,2 Chloramphénicol 1,5 cloacae (30pg) (ATCC 13047) Micrococcus 3,2 Chloramphénicol 3,2 luteus (30pg) (ATCC 10240) Bacillus subtillis 2 7 Gentamycine 1 2 (ATCC 6633) (1 Opg) Streptococcus 2,0 Pénicilline (30pg) 3,5 pneumoniae (ATCC 49619) Acinetobacter 3,2 Gentamycine 0,9 baumanii (1 Opg) (ATCC 19606) Pseudomonas - Gentamycine 1,3 aeruginosa (1 Opg) (ATCC 27853) Staphylococcus 3,0 Gentamycine 1,2 aureus (1 Opg) (ATCC 25923) La figure 7 annexée montre que l'activité antibiotique du composé de formule (la) est dose dépendante. La Figure 7 illustre l'activité antibiotique du composé de formule (la) sur différents microorganismes pathogènes cibles à des concentrations de 1 à 100 pg en comparaison avec le chloramphénicol et la gentamycine, respectivement à 30 pg et à 10 pg. Elle montre par exemple dans le cas d'Escherichia coli ATCC 25922, que le composé (la) présente une activité bien supérieure à celle du chloramphénicol. En effet, l'inhibition par 1 pg du composé de formule (la) équivaut à celle obtenue avec 30pg de chloramphénicol. Les mêmes observations et conclusions peuvent être faites pour toutes les souches sensibles au composé de formule (la) comme le montre la figure 7. Ceci montre qu'en plus du large spectre de bactéries pathogènes sensibles, la molécule du composé de formule (la) est efficace à très faibles doses. La présente invention concerne les composés de formule (la) pour leur utilisation en tant qu'agent antibiotique en particulier en tant qu'agent antibiotique à large spectre et notamment à l'encontre de bactéries pathogènes Gram positives et Gram négatives multirésistantes. La présente invention concerne une composition pharmaceutique contenant à titre de principe actif au moins un composé de formule (I) ou (la) associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable, qui pourra être déterminée aisément selon les connaissances générales de l'homme du métier en fonction de la voie d'administration retenue.20 REVENDICATIONS1. Composé répondant à la formule générale (I) suivante : 0 (I) dans laquelle : R1 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en C1 à C4 ; R2 représente un radical hydroxyle ou alkoxyle en C1 à C4, et R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en C1 à C4 , leurs énantiomères et mélanges d'énantiomères en particulier sous forme racémique. 2. Composé selon la revendication 1 répondant à la formule (la) suivante : 0 O OH 15 (la) 3. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) ou (la) selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par la mise en oeuvre des étapes opérationnelles suivantes : i. mise en culture d'un champignon filamenteux Trichoderma en particulier 20 de Trichoderma atroviride dans un milieu et des conditions appropriées ; ii. en cours de culture, capture in situ par extraction en phase solide d'un composé de formule (I) ou (la) ; iii. isolement et purification du composé de formule (I) ou (la). 10 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape de capture in situ est réalisée par extraction en phase solide après introduction dans le milieu de culture d'au moins une résine neutre apolaire. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite résine est un copolymère polystyrène-divinylbenzène. 6. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) ou (la), selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il implique la mise en oeuvre des étapes illustrées dans le schéma réactionnel ci-après, les réactifs de départ étant éventuellement substitués de manière appropriée pour obtenir les composés de formule (I) avec les significations R1 à R4 telles que définies précédemment : 7. Composé de formule (I) ou (la) selon l'une des revendications 1 et 2, pour son utilisation en tant qu'agent antibiotique. 8. Composé selon la revendication 7, pour son utilisation en tant qu'agent 20 antibiotique à large spectre. 9. Composé selon la revendication 8, pour son utilisation en tant qu'agent antibiotique à l'encontre de bactéries pathogènes Gram positives et Gram négatives multirésistantes. .7.- LDA or n-BuLi THR rt, 1h ° OH TBDMS-C1 E: N sl C, on TBDMSO 1.- LDA or n-BuLi THF. RT, 1h OH AcOH, THF/H20 48h OTBDMS 015 10. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif au moins un composé de formule (I) ou (la) associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable.