Brevet FR3018685A1 — publié le 20150925

La présente invention concerne l'utilisation d'extraits d'une plante très répandue, notamment en Europe, dans des compositions cosmétiques, ainsi que dans des compositions pharmaceutiques. Plus précisément, elle se rapporte à de nouvelles applications de la salicaire pour traiter la peau, les phanères et les muqueuses. La salicaire commune (Lythrum solicaria L) est une plante herbacée de la famille des Lythroceoe qui prospère à proximité des cours d'eau où elle forme de longues inflorescences rose pourpré semblables à des épis et facilement reconnaissables. Les feuilles sont comestibles crues ou cuites, la tige et sa pulpe le sont après cuisson seulement. La salicaire peut devenir vite envahissante et s'avère être une problématique dans certaines régions où des stratégies d'éradications sont envisagées. Très riche en tanin, la salicaire a été utilisée en médecine depuis l'antiquité, notamment pour son action hémostatique et antihémorragique, sous forme de compresses de fleurs. Active dans les entérites banales, surtout chez le nourrisson, elle a aussi servi contre la dysenterie et sa forte teneur en fer la rend efficace contre l'anémie. Son utilisation se fait alors sous forme d'infusion de fleurs séchées. La salicaire est reconnue en traitement médicinal de toutes les diarrhées, ainsi que celle du nourrisson et la dysenterie des tuberculeux. Les propriétés de la salicaire sont idéales dans les inflammations de l'estomac et la leucorrhée, dans l'eczéma et les ulcères. Elle est également utilisée dans les grippes intestinales. Selon l'article Z. Tunalier et al. (2007) Journal of Ethnopharmacology 110, 539-547, on connait l'utilisation d'extraits de salicaire pour traiter, en application locale, les varices, les hémorroïdes, des saignements gingivaux et l'eczéma. Cette utilisation repose sur les propriétés anti-inflammatoires de la salicaire. La présente invention met en évidence de nouvelles applications cosmétiques et pharmaceutiques de la salicaire, en particulier pour réparer les peaux âgées ou lésées par des dermatoses diverses, comme le psoriasis, la dermatite atopique.... L'extrait de salicaire améliore significativement la fonction barrière de l'épiderme pour lutter contre les agressions externes et joue donc un rôle de protecteur cutané. Ces extraits de salicaire jouent aussi un rôle favorable dans les compositions anti-âge. Les auteurs de l'invention ont découvert que la salicaire permettait de stimuler l'expression de différents marqueurs protéiques essentiels dans la formation 35 du stratum corneum ou couche cornée, dont l'enzyme-clé, la transglutaminase TGK. Le stratum corneum est la partie la plus superficielle de la peau et représente l'aboutissement du processus de différenciation des kératinocytes. Au cours de cette différenciation, les kératinocytes issus de l'assise basale subissent une série de remaniements métaboliques et structuraux tout au long de leur migration vers la surface de la peau. Le dernier stade est leur transformation en cornéocytes dont l'accumulation en une structure cohésive constitue le stratum corneum qui assure la fonction de barrière. Tout au long du processus de différenciation, plusieurs protéines interviennent. L'une d'elles, la TGK, de la famille des glutaminases catalyse l'établissement de liaisons peptidiques covalentes du type s(g-glutamyI)-lysine entre divers précurseurs protéiques qui forment le stratum corneum et lui confère cette capacité à protéger la peau vis-à-vis d'agressions extérieures et à limiter la diffusion de l'eau provenant de l'intérieur. La transglutaminase forme des polymères de protéines généralement insolubles. Ces polymères biologiques sont indispensables à l'organisme pour créer des barrières et structures stables. La présente invention vise précisément à offrir de nouvelles compositions pharmaceutiques, dermatologiques ou cosmétiques capables de stimuler les facteurs intervenant dans la différenciation, appelés facteurs pro-différenciants comme la TGK, permettant ainsi d'améliorer les conditions de la peau, des phanères, des muqueuses sains ou lésés. Selon l'invention, les compositions ci-dessus comprennent, à titre de principe actif, au moins un extrait de salicaire. On entend par « extrait de salicaire », un extrait ou un mélange d'extrait de plante du genre Solicaria sp de la famille des Lythracées. Il s'agit plus spécialement d'un extrait ou d'un mélange d'extrait de cellules de Solicaria sp. Ce matériel cellulaire peut être obtenu par culture in vitro ou in vivo. Par culture in vitro, on entend l'ensemble des techniques connues de l'homme du métier qui permettent de manière artificielle l'obtention d'un végétal ou d'une partie d'un végétal. Ainsi, l'extrait peut être un extrait ou un mélange d'extraits d'organe (racine, tige, feuille, écorce), voire de 30 cellules d'organe, d'au moins une plante du genre Solicaria sp de la famille des Lythracées, ou encore un extrait de cellules indifférenciées d'au moins une telle plante. Les applications selon l'invention s'étendent au traitement des phanères et des muqueuses. Par phanères selon l'invention, on inclut notamment les ongles et le système pileux, en particulier les cheveux. Par muqueuses, on entend les tissus de 35 revêtement des cavités anatomiques, qui se raccordent à la peau par des orifices naturels, comme la bouche, l'estomac, l'intestin, ainsi que ceux de cavités naturelles externes comme les narines, les oreilles. Ainsi, la présente invention a pour objet une utilisation cosmétique ou pharmaceutique d'un extrait de salicaire pour protéger la peau, les phanères et les muqueuses des agents extérieurs physiques, chimiques ou biologiques, et/ou pour améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau et/ou renforcer les phanères, notamment les cheveux, et les muqueuses. Elle a aussi pour objet un procédé de traitement cosmétique de lutte contre la sécheresse d'une peau ou de traitement cosmétique d'une peau sèche, ledit 10 procédé comprenant une étape selon laquelle on applique au moins un extrait de salicaire sur la peau. L'invention porte aussi sur un procédé de traitement cosmétique anti-âge de la peau ou de traitement cosmétique d'une peau âgée, comprenant une étape selon laquelle on applique au moins un extrait de salicaire sur la peau. Ce traitement 15 permet de retarder les phénomènes de vieillissement de la peau, mais aussi de réparer une peau âgée. Dans toute application cosmétique de l'invention, un extrait de salicaire peut être associé à un autre ou d'autres agents prodifférenciants de la peau, comme le calcium, la vitamine D et leurs dérivés. 20 Selon un autre aspect, l'invention concerne les applications pharmaceutiques d'un extrait de salicaire, telles que présentées ci-après. Un des objets de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant un extrait de salicaire, pour restaurer la fonction barrière de l'épiderme d'une peau lésée. Cet état peut résulter de l'action d'un agent extérieur physique, 25 chimique ou biologique et/ou d'un trouble ou d'une maladie, comme par exemple du psoriasis ou une dermatose atopique. Un autre objet est une composition pharmaceutique comprenant un extrait de salicaire, pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière d'une muqueuse ou pour restaurer la fonction barrière d'une muqueuse lésée. A titre 30 d'exemple, il peut s'agir de la muqueuse intestinale. La lésion de la muqueuse peut résulter d'un trouble ou d'une maladie ; dans le cas de la muqueuse intestinale, la lésion peut être provoquée par le syndrome du colon irritable. Dans la visée thérapeutique de l'invention, l'extrait de salicaire peut être administré par voie topique, il peut aussi être administré par voie orale. Selon un aspect de l'invention, l'extrait est administré après que le processus inflammatoire est terminé, notamment en traitement réparateur par reconstruction du stratum corneum. Dans une composition de l'invention, l'extrait de salicaire peut aussi être 5 associé à un ou plusieurs agents anti-inflammatoires et/ou immunosuppresseurs utilisés dans le traitement de l'inflammation cutanée, tels que les cyclosporines et leurs dérivés, les biothérapies anti-cytokines et les corticoïdes. Un extrait de salicaire selon l'invention peut être obtenu par toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier. On peut en 10 particulier citer les procédés d'extraction solide-liquide en milieux alcooliques (notamment méthanoliques, éthanoliques), aqueux, ainsi qu'en milieux utilisant des solvants tels que les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités, comme les milieux hydroalcooliques. 15 Avantageusement, un extrait est obtenu par extraction de salicaire en milieu hydroalcoolique, notamment une solution aqueuse d'éthanol. Selon cette variante, la concentration de l'éthanol varie de préférence d'environ 20 à environ 40% (v/v), mieux encore elle est d'environ 30% (v/v). Les méthodes alternatives aux solvants peuvent aussi être envisagées 20 comme le CO2 supercritique, les micro-ondes... Ces modes de préparation font partie intégrante de l'invention. Ces extraits peuvent être utilisés tels quels sous forme liquide ou en poudre, non purifiés ou purifiés. Si l'extrait est en poudre, son séchage peut être conduit par toute 25 technique bien connue de l'homme du métier. L'extrait peut être séché par atomisation, évaporation ou lyophilisation. La poudre ainsi obtenue peut être encapsulée dans des liposomes ou autres vecteurs et supports pour une meilleure homogénéité de la composition et une meilleure diffusion du principe actif notamment sur la peau. 30 L'extrait est de préférence obtenu à partir des parties aériennes de salicaire. Les auteurs ont observé que les extraits obtenus par macération hydroalcoolique des parties aériennes de salicaire présentent une forte activité biologique. Ceci quel que soit le pourcentage d'éthanol dans le solvant d'extraction. 35 Des résultats similaires sont observés dans l'eau ou de l'éthanol. Les extraits de salicaire selon l'invention peuvent être associés dans les compositions de l'invention avec des substances augmentant la protection cutanée. A titre d'exemple mais de manière non limitative, on peut citer les associations avec des mucopolysaccharides, des vitamines, des céramides, des substances antiradicalaires, des filtres U.V. De même, l'activité réparatrice des extraits selon l'invention est particulièrement intéressante quand ils sont associés avec des substances ayant un effet cicatrisant comme des protéines, l'acide hyaluronique, des acides aminés, et/ou avec des substances anti-inflammatoires, anti-âge, après-solaire ou avec des actifs anti-acné, anti-dermatoses... L'activité protectrice des extraits de l'invention vis-à-vis des radicaux libres et des UV est également très intéressante dans le domaine capillaire, notamment dans le cas d'association avec des substances facilitant le bon état du cuir chevelu et de celui du cheveu, comme des minéraux, des vitamines, des céramides, des extraits protéiques, des mucopolysaccharides, des acides de fleurs ou de fruits. Les compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées à une application topique pour prévenir et/ou traiter de nombreuses altérations cutanées. L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation dermo-cosmétique d'un extrait de salicaire, comme agent réparateur et/ou protecteur de la peau et du système pileux comme les cheveux, notamment pour lutter contre les agressions externes, telles que celles liées à la pollution, au soleil, au stress oxydatif, au vieillissement et aux pathologies cutanées entrainant un dysfonctionnement de l'homéostasie de l'épiderme ou des cheveux. C'est pourquoi, une application directe des compositions de l'invention concerne la lutte contre le vieillissement et la mort cellulaire induits par les UV. L'invention se rapporte aussi à l'une utilisation de ces compositions en tant que prolongateur de bronzage. Pour une utilisation cosmétique, les compositions de l'invention peuvent se présenter sous la forme de crèmes, gels, lotions, laits, émulsions H/E et E/H, solutions, onguents, pulvérisateurs, huiles corporelles, lotions capillaires, shampooings, lotions après-rasage, savons, bâtons protecteur des lèvres, bâtons et crayons pour maquillage. Les compositions peuvent comprendre tous excipients nécessaires à leur formulation. Ainsi, lorsqu'elles sontsous la forme de gel, elles comprennent des excipients appropriés tels que les esters de cellulose ou d'autres agents gélifiants, tels que le carbopol, la gomme guar, etc... Ces compositions cosmétiques peuvent aussi prendre la forme de lotion ou solution dans laquelle les extraits et/ou molécules sont sous forme encapsulée, par exemple dans des microsphères. Ces microsphères peuvent par exemple être constituées de corps gras, d'agar et d'eau. Les agents actifs peuvent être aussi 5 incorporés dans des vecteurs de type liposomes, glycosphères, dans des chylomicrons, des macro-, micro-, nano-particules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules et aussi être adsorbés sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux. Ces émulsions jouissent d'une bonne stabilité et peuvent être conservées pendant le temps nécessaire pour l'utilisation à des températures 10 comprises entre 0 et 50 °C sans qu'il y ait sédimentation des constituants ou séparation des phases. Les compositions cosmétiques de l'invention comprennent de l'ordre de 0,01 à 5%, préférentiellement entre 0,1 et 2,5% d'extrait de salicaire lorsqu'elles sont sous forme de poudre et de l'ordre de 0,01 à 25%, préférentiellement entre 0,5 et 10% 15 lorsqu'elles sont sous forme encapsulée. Les pourcentages sont exprimés en poids d'extrait sec de salicaire par rapport au poids de la composition finale. Pour la préparation de ces compositions, les extraits de salicaire sont mélangés aux excipients généralement employés en cosmétique. Les compositions cosmétiques de l'invention peuvent aussi contenir des 20 additifs ou des adjuvants usuels en cosmétologie, comme par exemple des agents antibactériens ou des parfums mais aussi des lipides d'extraction et/ou de synthèse, polymères gélifiants et viscosants, tensio-actifs et émulsifiants, principes actifs hydro ou liposolubles, extraits de plantes, extraits tissulaires, extraits marins, actifs de synthèse. 25 L'utilisation cosmétique ou dermocosmétique d'extraits comprend tous les soins du corps et de la peau y compris les produits solaires, protecteurs et bronzants, les produits anti-âge, anti-seborrhéïques, toniques, les produits assurant l'amélioration de l'aspect de la peau y compris le traitement acnéique, les rougeurs cutanées, le traitement du cuir chevelu et celui de la chute des cheveux. 30 Les compositions cosmétiques de la présente invention peuvent aussi comprendre d'autres principes actifs complémentaires choisis pour leur action, par exemple pour la protection solaire, l'effet anti-rides, l'activité antiradicalaire et antioxydante, l'activité anti-irritante, la nutrition cellulaire, la respiration cellulaire, l'hydratation et la régénération cellulaire, les traitements anti-séborrhéïques, ainsi que 35 d'autres principes actifs ayant une action sur la tonicité cutanée, la protection du cheveu. Les compositions cosmétiques de la présente invention sont de préférence à utiliser quotidiennement en les appliquant une ou plusieurs fois par jour. Les compositions cosmétiques de la présente invention sont très bien tolérées, elles ne présentent aucune phototoxicité et leur application sur la peau, pour des périodes de temps prolongées, n'implique aucun effet systémique. L'invention concerne aussi l'utilisation d'extraits de salicaire pour la préparation de compositions dermocosmétiques présentant une activité anti-inflammatoire et dermoprotectrice. Ces compositions sont utiles pour prévenir et/ou traiter notamment des maladies dermatologiques liées à des activités séborrhéiques, acnéiques et/ou inflammatoires. Ces compositions dermocosmétiques se présentent sous forme liquide, de poudre, de pâte ou d'émulsion, seule ou en combinaison avec d'autres substances. Elles comprennent de l'ordre de 0,01 à 25% en poids d'extrait de salicaire. Les pourcentages sont exprimés en poids d'extrait sec de salicaire par rapport au poids de la composition finale. Pour les préparations de ces compositions dermocosmétiques, les extraits de salicaire sont mélangés à des excipients. En conséquence, de manière générale, l'invention se rapporte à l'utilisation d'un extrait de salicaire, pour la préparation d'une composition pharmaceutique, nutraceutique, dermatologique ou cosmétique destiné à prévenir et/ou traiter les pathologies et désordres résultant : - du vieillissement naturel ou prématuré de la peau ou des cheveux, - de dermatoses, comme le psoriasis, la dermatite atopique..., - d'états inflammatoires des systèmes cutanés ou pileux, induisant des démangeaisons, irritations, rougeurs chroniques, irritations et démangeaisons persistantes et des troubles fonctionnels de la fragilité capillaire, - d'un problème de coagulation du sang. Une composition pharmaceutique selon l'invention comprend outre au 25 moins un agent actif comme défini précédemment, un vecteur, ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. La présente invention est maintenant illustrée, de manière non limitative, par les exemples 1 à 5 suivants. L'exemple 1 illustre des procédés de préparation d'extraits de salicaire 30 selon l'invention. Les exemples 2 à 4 suivants illustrent les propriétés des extraits ci-dessus de l'invention qui ont été évaluées par la capacité de ces extraits à stimuler l'expression de marqueurs-clé de la différenciation épidermique. Les marqueurs choisis, tous impliqués dans l'arrangement des filaments de kératine et dans la formation de l'enveloppe de la couche cornée, sont la transglutaminase K (TGK), la filaggrine et la cytokératine 10 (KRT10). La TGK catalyse l'établissement de liaisons peptidiques du type s(g-glutamy1)-lysine entre divers précurseurs protéiques. La filaggrine et la KRT10 sont peu exprimées dans les monocouches de kératinocytes primaires et sont considérés comme des marqueurs de différenciation terminale de l'épiderme. L'exemple 5 met en évidence les propriétés d'un extrait de l'invention 10 évaluées par sa capacité à stimuler l'expression de kératines, composants majeurs de la tige pilaire. Les exemples font référence aux figures 1 à 7, selon lesquelles : Figure 1 représente l'influence de l'extrait EX1OMF1046, sur l'expression de différents marqueurs de la différenciation épidermique, par les cultures de 15 kératinocytes à l'état basal, évaluée par RT-qPCR. Figure 2 présente les images numériques de coupe d'épidermes reconstruits (RHE) traités par un témoin, une référence et l'extrait de l'invention EX1OMF1046 à 20ug/ml, et leurs effets sur l'expression de marqueurs de la différenciation épidermique. 20 Figure 3 représente l'influence de l'extrait EX1OMF1046, sur l'expression de différents marqueurs de la différenciation épidermique, par les cultures de kératinocytes stimulées ou non par un mélange de cytokines IL-17, OSM et TNFot (mixPS0), évaluée par RT-qPCR. Figure 4 présente les images numériques de coupes d'épidermes 25 reconstruits stimulés par un mélange de cytokines IL-17, OSM, TNFot traités par un témoin, une référence (JAK inhibitor 1) et l'extrait de l'invention EX1OMF1046 à 20ug/ml, et leurs effets sur l'expression du marqueur de différenciation épidermique KRT10. Figure 5 représente l'influence de l'extrait EX1OMF1046, sur l'expression 30 de différentes chimiokines induites par l'inflammation, par les cultures de kératinocytes stimulées ou non par un mélange de cytokines IL-17, OSM et TNFot (mixPS0), évaluée par RT-qPCR. Figure 6 représente l'influence de l'extrait EX1OMF1046, sur la libération de l'IL-8 par des épidermes reconstruits (RHE à J13) stimulés par le mélange de 35 cytokines IL-17, OSM et TNFot (mix-PSO) pendant 48h, observés à la figure 4. Figure 7 présente un schéma d'une boucle inflammatoire chronique de la peau (par exemple, psoriasis) illustrant le stade d'intervention de l'extrait EX1OMF1046 dans cette boucle. Exemple 1 : Obtention des extraits de salicaire Différents extraits de salicaire (EX3MF1046, EX4MF1046, EX1MF1046 et EX2MF1046) ont été obtenus dans le présent exemple, selon un protocole général décrit ci-après et dont les conditions spécifiques à chaque extrait sont spécifiées dans le tableau 1. Protocole général : Une masse de parties aériennes de salicaire, préalablement séchées, est broyée et mise à macérer pendant 24 heures dans un solvant de macération. Pendant toute la durée de la macération, le mélange a été maintenu sous agitation, à 20°C. Après macération, le résidu de plante est séparé de l'extrait par clarification et filtration. L'extrait est ensuite directement concentré par évaporation sous vide, puis séché par atomisation et obtenu sous forme d'une poudre, à l'exception des extraits EX1OMF1046 et EX13MF1046 qui, avant concentration, sont mis au contact de charbon actif (0,5kg), laissés sous agitation pendant une heure puis séparés du charbon actif par filtration. Tableau 1 Référence de Masse de Solution de macération Extrait l'extrait salicaire traitée Masse Solvant Masse EX3MF1046 5kg 50kg Ethanol dans eau 550g 30% (v/v) EX1OMF1046 5kg 50kg Ethanol dans eau 300g 30% (v/v) EX4MF1046 50g 500g Eau 3g EX1MF1046 50g 500g Ethanol dans eau 2g 90% (v/v) EX2MF1046 50g 500g Ethanol dans eau 4g 90% (v/v) EX13MF1046 25g 500g Acétate d'éthyle 300nng Exemple 2: Evaluation dans des primocultures de kératinocvtes épidermiques humains normaux (NHEK) 1) Matériels et méthodes Cellules Kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK) ; référence BlOalternatives K341, utilisés au troisième passage. Conditions de culture : 37°C, 5% CO2 Milieu de culture : KeratinocyteSFM complémenté avec facteur de 10 croissance épidermique (EGF) 0,25ng/ml, extrait pituitaire (EP) 25u.g/m1 et gentamycine 25ug/ml. Milieu d'essai : KeratinocyteSFM complémenté avec gentamycine 25ug/ml. 15 Extraits testés Dans l'étape initiale de sélection d'un extrait pour la poursuite des essais, et après évaluation de cytotoxicité préalable, les extraits EX1MF1046, EX2MF1046, EX3MF1046, EX4MF1046 et EX13MF1046 sont testés aux concentrations suivantes : EX1MF1046, 0,005 mg/mi 20 EX2MF1046, 0,003 mg/mi EX3MF1046, 0,005 mg/mi EX4MF1046, 0,005 mg/mi EX13MF1046, 0,005 mg/mi L'étape ci-dessus a conduit à retenir les extraits EX3MF1046 et 25 EX1OMF1046 qui correspond à l'extrait EX3MF1046 filtré, pour les essais suivants. Ils sont évalués aux concentrations suivantes : EX3MF1046, entre 0,0016 mg/mi et 0,02 mg/ml; concentration non cytotoxique. EX1OMF1046, 0,02 mg/mi 30 Immunomarquages in situ Les kératinocytes ont été ensemencés et cultivés à confluence en plaques 96 puits puis le milieu a été remplacé par du milieu d'essai contenant ou non (témoin) l'extrait testé ou la référence (CaCl2 à 1,5 mM) et les cellules ont été incubées pendant 35 72 heures. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=3, pour chaque marqueur. Après incubation, le milieu d'essai est éliminé et les cellules sont rincées, fixées et perméabilisées. Les cellules sont marquées avec les anticorps primaires dirigés contre les protéines d'intérêt (TGK, filaggrine et KRT10) 1. Ces anticorps ont été révélés par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (GAMAlexa 488). En parallèle, les noyaux des cellules sont colorés par le Hoechst 33258 (bisbenzimide). L'acquisition des images est réalisée avec un système d'imagerie à haute résolution, INCell AnalyzerTm1000 (GE Healthcare). Pour chaque puits, 5 saisies d'images numérisées sont effectuées. Les marquages sont quantifiés par mesure de l'intensité de fluorescence des protéines rapportée au nombre de noyaux identifiés par le Hoechst (intégration des données numériques par le logiciel Developer Toolbox 1.5, GE Healthcare). Le screening des extraits n'a été réalisé que sur le paramètre TGK (tableau 2). Analyse des transcrit, RT-qPCR Les kératinocytes ont été ensemencés et cultivés à confluence en plaques 24 puits puis le milieu a été remplacé par du milieu d'essai contenant ou non (témoin) le composé à l'essai ou la référence (CaCl2 à 1,5 mM) et les cellules ont été incubées pendant 48 heures. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=3, pour chaque marqueur. Après incubation, le milieu d'essai a été éliminé et les cellules ont été rincées et congelées à -80 °C. L'expression des marqueurs a été évaluée par RT-qPCR sur les ARN messagers (ARNm) extraits des tapis cellulaires de chaque traitement (les réplicats ont été poolés avant l'extraction de l'ARN). Les étapes d'extraction d'ARN, reverse 25 transcription, amorces et conditions de PCR ont été décrites précédemment 1-3. 2) Résultats Screening Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous qui illustre le 30 niveau d'expression de la TGK via le marquage fluorescent des NHEK, l'intensité de fluorescence des NHEK étant proportionnelle à l'expression de TGK. Tableau 2 Composé testé Ténnoin EX1M F1046 0,005nnen1 EX2M F1046 0,003nnen1 EX3M F1046 0,005nnen1 EX4M F1046 0,005nnen1 EX13M F1046 0,001nnen1 Taux / ++ ++ ++++ ++ / d'expression de TGK L'extrait EX3MF1046 se révèle le plus actif dans ces conditions. Influence de l'extrait EX3MF1046 à différentes concentrations, sur l'expression de TGK Le tableau 3 illustre le niveau d'expression de la TGK via le marquage fluorescent des NHEK pour différentes concentration de l'extrait EX3MF1046. Tableau 3 Traitement Expression TG1 Le tableau 4 présente une évaluation du niveau d'expression des trois marqueurs ci-dessus via le marquage fluorescent des NHEK. Tableau 4 Traitement Expression TKG Expression filaggrine Expression KRT10 Composé testé Concentration Témoin - +1- + CaCl2 1,5nnM +++ +++ +++ EX1OMF1046 20p.g/nnl ++++ ++ ++++ On observe que la filtration de l'extrait EX3MF1046 maintient l'effet pro-différenciant de l'extrait. Dans cette expérience, on retrouve l'effet inducteur de TGK et on observe une très forte surexpression de protéine KRT10. Contrairement au calcium qui focalise l'effet sur quelques cellules en les transformant en très grosses cellules différenciées (cornéocytes), EX1OMF1046 induit une très forte surexpression de KRT10 dans de nombreuses cellules mais n'augmente pas significativement la taille des cellules. Le mécanisme d'action du calcium et de EX1OMF1046 sont donc différents et pourraient être additionnels ou synergiques. Ceci est confirmé par l'analyse de la filaggrine, qui augmente (plus modérément) suite au traitement par EX1OMF1046, mais sans induire la production caractéristique de granules de filaggrine dans les cellules répondant au calcium. Influence de l'extrait EX1OMF1046, sur l'expression d'autres marqueurs 25 de la différenciation épidermique L'analyse a été élargie à d'autres marqueurs protéiques de la différenciation épidermique, à savoir, la loricine, l'involucrine et la kératine 1 (KRT1). L'influence de EX1OMF1046 à 20 ug/m1 est étudiée sur l'expression des transcrits des différents marqueurs ci-dessus par les cultures de kératinocytes à l'état basal. Les traitements sont de 48 h, l'analyse est réalisée par RT-qPCR. Les résultats sont donnés en % des témoins non traités après randomisation des expressions relatives par rapport au gène de ménage GAPDH. Ils sont représentés sur la figure 1. Les analyses en RT-qPCR montrent une surexpression très nette de tous les marqueurs de différenciation en présence de l'extrait ; les stimulations étaient fortes (stimulation d'un facteur 4 à plusieurs dizaines de fois selon les marqueurs) et toutes supérieurs à celles obtenues avec le calcium, à l'exception du marqueur involucrine. Exemple 3 : Evaluation dans des épidermes reconstruits (RHE) 1) Matériels et méthodes Epidermes reconstruits RHE produits à partir de kératinocytes de prépuce humain et largement décrits dans les publications de BlOalternatives 1-4. Les RHE sont cultivés à 37°C, 5% CO2, à l'interface air-liquide, en milieu Epilife + calcium 1,5 mM et compléments, sans vitamine C. La référence pour les études d'effets pro-différenciants est la vitamine C (50 ug/m1). Extraits testés Extrait EX1OMF1046, testé à 20 ug/ml, dans le milieu de culture des RHE. Immunomarquages in situ Les RHE sont placés à l'interface air-liquide (JO) et cultivés pendant 7 jours en présence ou absence (témoin) de l'extrait EX10MF1046 ou de la vitamine C (référence). A la fin de l'incubation, les épidermes sont rincés puis fixés dans une solution de formaldéhyde. Les tissus fixés sont déshydratés par des bains d'éthanol successifs et croissants puis inclus en paraffine « Paraplast ». Des coupes transversales sont réalisées au microtome (épaisseur 5 um) puis maintenues à température ambiante jusqu'à la réalisation des marquages. Les coupes sont déparaffinées puis les sites antigéniques sont démasqués dans une solution de tampon citrate pH6 (DAKO, S1700). Après lavage en PBS-T, les coupes sont incubées avec une solution de peroxyde d'hydrogène 3% durant 5 minutes. Après lavage, les coupes sont ensuite incubées à température ambiante pendant 1 heure avec l'anticorps primaire (anti-TGK, SC-25786; anti-KRT10, SC-23877; anti-filaggrine, SC-66192; tous de chez Santa-Cruz Biotech). Après lavage, le marquage est révélé avec un kit de détection streptavidine-peroxydase (DAKO, réf. K0690) couplé au chromogène AEC (DAKO, K346111). Après contre-coloration à l'hématoxyline et lavage en eau ultrapure, les coupes sont montées entre lame et lamelle en milieu aqueux Glycergel (DAKO, C056330). Les coupes sont observées à l'aide d'un microscope NIKON E400. Les images numériques sont enregistrées avec une caméra NIKON DS-Ri1 et le logiciel NIS-Elements 3.10. 2) Résultats Le passage à l'interface air-liquide conduit, dans les conditions optimales de reconstruction épidermique, à une très forte différenciation qu'il est très difficile de 10 sur-stimuler. Aussi il convient de se mettre en conditions non-optimales ou légèrement carencées pour voir l'effet de produits stimulant la différenciation. Les images numériques obtenues sont présentées à la figure 2. Dans ces conditions expérimentales présentant une carence (vitamine C), l'extrait EX1OMF1046 montre une nette compensation et une forte stimulation de 15 l'expression de KRT10, filaggrine et TGK. Exemple 4: Effets protecteur des lésions cutanées induites par l'inflammation (psoriasis, dermatites) de l'épiderme ; évaluation dans des épidermes reconstruits (RHE) 20 1) Matériels et méthodes Cellules et épidermes reconstruits Les NHEK sont préparés comme dans l'exemple 2. Les RHE sont préparés comme dans l'exemple 3 (milieu complet incluant 25 vitamine C). Mélange inflammatoire, référence Le mélange inflammatoire (mix cytokines, M3) est constitué d'interleukine-17 (IL-17), oncostatine M (OSM) et tumor-necrosis factor alpha (TNFoc), toutes provenant de chez R&D Systems, à la concentration finale de 3 ng/ml chaque. 30 La référence est le « JAK inhibitor 1)> (Calbiochem CAS 457081-03-7) à I.J.M final. Extrait testé Extrait EX1OMF1046, testé à 20 ug/ml, dans le milieu de culture des RHE. Analyse des transcrit, RT-qPCR 35 Les NHEK sont pré-cultivés comme dans l'exemple 2 puis traités pendant 24 h avec l'extrait EX1OMF1046 (20 ug/m1) ou le JAK inhibitor (10 uM). Le mélange de cytokines est ensuite ajouté aux milieux contenant ou non l'extrait et les cultures sont poursuivies pendant 24 h. A la fin de l'incubation, les tapis cellulaires sont rincés puis extraits en tampon de lyse ; les protocoles et analyses suivants sont les mêmes que ceux de l'exemple 2. Les résultats sont donnés en % des témoins non traités, ils sont représentés à la figure 3. Immunomarquages in situ Les RHE sont placés à l'interface air-liquide (JO) et cultivés jusqu'à J11. 10 Puis les RHE sont traités en systémique avec l'extrait EX10MF1046 (20 ug/m1) ou le JAK inhibitor (10 uM) pendant 7h. Le mélange de cytokines est ajouté aux milieux contenant ou non les produits et les cultures sont poursuivies pendant 48 h. Le traitement des tissus, les marquages et l'analyse sont réalisés comme dans l'exemple 3. Des images numériques des coupes observées sont enregistrées. 15 Les NHEK ou les RHE sont traités par l'extrait EX10MF1046 ou la référence, puis par un mélange cytokinique constitué par au moins une cytokine activant la voie Jak/Stat, soit OSM ou IL-22 (activateurs de STAT-3/1) ; un activateur de voie NF-kB, soit IL-1 ou TNF-cc et une troisième cytokine pouvant être l'IL-17 (activateur de CREBP) orientant vers une réponse de type psoriasis ou l'IL-4/IL-13 20 (activateur de STAT-6), orientant vers la dermatite atopique 5-7. A noter que toutes ces cytokines sont aussi plus ou moins activatrices des voies MAKPkinases (mitogenactivated protein kinases) chez le kératinocyte. Dans ces mélanges, les cytokines inductrices de STAT-3/1 (OSM, IL-22) 2-3' 7 sont cruciales dans la physiopathologie cutanée, elles sont responsables de l'effet sur la différenciation cutanée et des 25 modifications morphologiques observées dans ces pathologies. Les autres cytokines, notamment IL-17, TNF-a et IL-1 5-7 sont plus impliquées et de façon hautement synergique dans l'induction de l'immunité innée (peptides antimicrobiens) et la production de chimiokines responsables du maintien et de l'amplification de la boucle inflammatoire responsable de ces pathologies chroniques 5-7. 30 Ce mélange choisi contient l'OSM comme inducteur de STAT-3/1, associé au TNF-a (NF-kB, MAPkinases) et à l'IL-17 (pour donner l'orientation « psoriasis », Th17. Ce mélange a un effet inflammatoire hautement synergique qui mime donc la pathologie inflammatoire cutanée au niveau de l'épiderme et en particulier le psoriasis. Le remplacement de L'IL-17 (cytokine Th17) par une ou plusieurs cytokines 35 Th2 (IL-4/IL-13) conduirait à un phénotype cutané plus proche de la dermatite atopique6. Dans les deux cas, la différenciation anormale de l'épiderme est remarquable, avec perte des marqueurs de différenciation terminale, hyperplasie (etc). La référence est le « JAK inhibitor 1 », inhibiteur large de voie Jak-Stat et testé à forte concentration. Dosages ELISA Les milieux de culture des RHE à 48h sont prélevés et congelés à -80°C. Le contenu en IL-8 a été dosé à l'aide d'un kit ELISA spécifique (R&D Systems DY208), selon le protocole préconisé par le fournisseur. 2) Résultats L'influence de l'extrait EX1OMF1046 à 20 ig/mi est étudiée sur l'expression des transcrits des marqueurs KRT1, KRT10, filaggrine et loricrine, par les cultures de kératinocytes stimulées (ou non (Ctrl-) par un mélange de cytokines (IL-17, OSM, TNFot à 3 ng/ml, mix PSO). Les traitements sont de 48 h au total, l'analyse est réalisée par RT-qPCR. Les résultats sont représentés sur la figure 3. Ils montrent que l'extrait EX1OMF1046 protège l'épiderme des effets de l'inflammation en restaurant l'expression des marqueurs de différenciation tardive, filaggrine et loricrine, et que cet extrait induit une forte surexpression des kératines KRT1 et KRT10 dans ces conditions. L'extrait EX1OMF1046 protège donc potentiellement des défauts de différenciation de l'épiderme induits par l'inflammation. L'expression de KRT10 par des épidermes reconstruits (RHE analyse à J13) 25 stimulés par le mélange de cytokines IL-17, OSM, TNFot est observée sur les images numériques représentées à la figure 4. Cette figure montre une restauration partielle mais nette de l'expression de la protéine KRT10 par le traitement avec l'extrait EX1OMF1046 dans les RHE traités par le mélange pro-inflammatoire. 30 La figure 5 montre l'effet inhibiteur de l'extrait EX1OMF1046 (à 201.1g/m1) de l'expression de chimiokines induite par l'inflammation des kératinocytes. Cet effet résulte de l'interruption de la boucle inflammatoire en empêchant le recrutement de leucocytes au niveau de la peau lésionnelle. Cet effet s'ajoute aux effets sur la différenciation (figure 3) pour contribuer au retour à une homéostasie normale de la 35 peau (résolution de l'inflammation). D'autre part, comme cela a été vu au niveau des transcrits (figure 5), EX1OMF1046 inhibe très fortement l'expression/libération de chimiokines et notamment l'IL-8 au niveau de la protéine (figure 6), confirmant son effet inhibiteur potentiel du recrutement de leucocytes (polynucléaires dans le cas de l'IL-8) au niveau des lésions cutanées (en plus de l'effet positif sur ces mêmes lésions). Ces effets 1) protecteurs des lésions cutanées et 2) limitant l'infiltration leucocytaire dans la peau sont résumés dans la figure 7 qui représente schématiquement une boucle d'inflammation chronique de la peau (psoriasis...). EX1OMF1046 protège donc des effets délétères (lésions cutanées) des 10 cytokines produites par les leucocytes (1), tout en bloquant le recrutement des infiltrats leucocytaires et cassant ainsi le cercle vicieux de l'inflammation chronique (2). Exemple 5 : Effets sur le renforcement du cheveu 15 1) Matériels et méthodes Cultures de follicules de cheveu humain in vitro Les bulbes de cheveux sont microdisséqués à partir d'un lifting et placés dès l'isolement en milieu de culture (Milieu E de William complémenté ; Invitrogen) 20 contenant ou non (témoin), l'extrait à l'essai puis incubés pendant 72 heures. Pour chaque condition, un excès de bulbes est préparé afin d'atteindre la valeur cible de 6 cheveux/condition sélectionnés en final. En fin d'incubation, les cheveux sont congelés à sec en azote liquide et stockés à -80°C jusqu'à l'extraction d'ARN. 25 Extrait testé Extrait EX1OMF1046, testé à 20 ug/ml, dans le milieu de culture des RHE. Analyse des transcrit, RT-qPCR L'isolement et le contrôle qualité des ARN sont réalisés comme dans l'exemple 2. 30 L'amplification des ARN et la synthèse des analogues d'ARN biotinylés (ARNa) sont réalisés à l'aide du kit « GeneChip 3'IVT Express» (Affymetrie). L'hybridation et le marquage sont réalisés à l'aide du kit « GeneAtlasTM hybridization, wash and stain kit for 3'IVT arrays » (Affymetrix). L'hybridation des ARNa fragmentés sur la puce Affymetrix® HG-U219 est réalisée sur la station d'hybridation « GeneAtlasTm 35 fluidics station » (Affymetrix®) pendant 20 heures à 45°C. Toutes les procédures expérimentales et de normalisation sont réalisées selon les directives du fournisseur. L'analyse est effectuée par microarray full transcriptome sur puce Affymetrix® HG-U219. 2) Résultats Les kératines sont des composants majeurs de la tige pilaire. Une augmentation de ces kératines aura potentiellement un impact positif sur le développement/renforcement capillaire. L'effet de l'extrait EX1OMF1046 par rapport au témoin est illustré dans le tableau 5 suivant qui donne l'expression de transcrits de marqueurs de différenciation 10 dans des follicules de cheveu humain maintenus en survie in vitro. Tableau 5 Affy U219 Témoin Salicaire Nom du gène Abréviation Probe Set ID RE1 RE2 Facteur de modulation 11723952_at 120.1177 441.5676 3.68 keratin 1 KRT1 11757401_a_at 1557.519 3385.916 2.17 keratin 10 KRT10 11731852_at 54.47806 114.4569 2.10 loricrin LOR 11738505_at 1956.021 3712.088 1.90 keratin associated protein 13-1 KRTAP13-1 11757905_x_at 295.5005 513.2589 1.74 keratin 18 KRT18 11759172_at 40.7767 70.12949 1.72 keratin associated protein 19-4 KRTAP19-4 11759392_at 59.00863 100.2564 1.70 keratin associated protein 21-2 KRTAP21-2 11731500_a_at 264.1598 431.7103 1.63 keratin 19 KRT19 11738284_at 2832.61 4332.157 1.53 keratin associated protein 13-2 KRTAP13-2 15 Cette expérience montre que les transcrits de certaines kératines et protéines associées ont une tendance nette à l'augmentation d'expression, comme la KRT1, la KRT10 et la loricrine. On retrouve en cela les effets sur les kératinocytes. Les effets sont moins visibles que dans les exemples précédents du fait 1) que le follicule 20 est moins sensible aux traitements car « protégé » par les feuillets internes et externes (les kératinocytes ne sont pas en contact direct avec le milieu) et par son propre volume (accessibilité aux kératinocytes internes au follicule) et 2) que la méthode utilisée par microarrays est moins sensible que la qPCR. BIBLIOGRAPHIQUES 1) Mcheik JN, Barrault C, Pedretti N, Garnier J, Juchaux F, Levard G, Morel F, Lecron JC, Bernard FX. Foreskin-isolated keratinocytes provide successful extemporaneous autologous paediatric skin grafts. J Tissue Eng Regen Med. 2013 Mar 14. doi: 10.1002/term.1690. [Epub ahead of print] Boniface K, Bernard FX, Garcia M, Gurney AL, Lecron JC, Morel F. IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. J Immunol. 2005 Mar 15;174(6):3695-702. Boniface K, Diveu C, Morel F, Pedretti N, FrogerJ, Rayon E, Garcia M, Venereau E, Preisser L, Guignouard E, Guillet G, Dagregorio G, Pène J, Moles JP, Yssel H, Chevalier S, Bernard FX, Gascan H, Lecron JC. Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. J Immunol. 2007 Apr 1;178(7):4615-22. Guenou H, Nissan X, Larcher F, Feteira J, Lemaitre G, Saidani M, Del Rio M, Barrault CC, Bernard FX, Peschanski M, Baldeschi C, Waksman G. Human embryonic stem-cell derivatives for full reconstruction of the pluristratified epidermis: a preclinical study. Lancet. 2009 Nov 21;374(9703)1745-53 Guilloteau K, Paris I, Pedretti N, Boniface K, Juchaux F, Huguier V, Guillet G, Bernard FX, Lecron JC, Morel F.Skin Inflammation Induced by the Synergistic Action of IL-17A, IL-22, Oncostatin M, IL-1 alpha, and TNF-alpha Recapitulates Some Features of Psoriasis. J Immunol. 2010 Mar 24. [Epub ahead of print] Bernard FX, Morel F, Camus M, Pedretti N, Barrault C, Garnier J, Lecron JC. Keratinocytes under Fire of Proinflammatory Cytokines: Bona Fide Innate Immune Cells Involved in the Physiopathology of Chronic Atopic Dermatitis and Psoriasis. J Allergy (Cairo). 2012;2012:718725. doi: 10.1155/2012/718725. Epub 2012 Nov 5. U52012142755A1 2) 3) 4) 5) 6) 7) REVENDICATIONS1. Utilisation d'un extrait de salicaire pour la fabrication d'une composition cosmétique pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière de l'épiderme. 2. Utilisation d'un extrait de salicaire pour la fabrication d'une composition cosmétique pour améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau ou pour renforcer le cheveu. 3. Utilisation d'un extrait de salicaire pour la fabrication d'une composition cosmétique pour lutter contre la sécheresse de la peau ou pour traiter 10 une peau sèche. 4. Utilisation d'un extrait de salicaire pour la fabrication d'une composition cosmétique pour traiter une peau âgée. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu par extraction solide-liquide de salicaire en 15 milieu hydroalcoolique, par exemple dans une solution aqueuse d'éthanol en une concentration variant de 20 à 40% (v/v). 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir des parties aériennes de salicaire. 7. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que l'extrait 20 est associé avec un autre agent prodifférenciant de la peau tel que le calcium, la vitamine D et leurs dérivés. 8. Composition pharmaceutique comprenant un extrait de salicaire, pour restaurer la fonction barrière de l'épiderme d'une peau lésée, en particulier lésée par un agent extérieur physique, chimique ou biologique et/ou par un trouble ou une 25 maladie, par exemple par une dermatose comme le psoriasis ou la dermatite atopique. 9. Composition pharmaceutique comprenant un extrait de salicaire, pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière d'une muqueuse par exemple d'une muqueuse intestinale lésée, ou pour restaurer la fonction barrière d'une muqueuse 30 lésée, par application topique ou par voie orale dudit extrait. 10. Composition selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que l'extrait de salicaire est associé à un ou plusieurs agents anti-inflammatoires et/ou immunosuppresseurs utilisés dans le traitement de l'inflammation cutanée, tels que les cyclosporines et leurs dérivés, les biothérapies anti-cytokines et les corticoïdes.