Brevet FR3012964A1 — publié le 20150515

La présente invention concerne l'utilisation d'adjuvants pour la formulation de compositions vaccinales destinées à la prévention de maladies aviaires et destinées à être appliquées par administration in ovo (injection dans rceuf), ledit adjuvant comprenant au moins une phase huileuse et au moins un sel inorganique divalent pharmaceutiquement acceptable. 10 Un adjuvant de vaccin est un excipient amplifiant la réponse immunologique contre l'antigène du vaccin auquel il est associé. Ces adjuvants sont de natures diverses. Ils peuvent aussi bien consister en des liposomes, en des émulsions comprenant au moins une phase huile et au moins une phase aqueuse, du type adjuvants dits de Freund, en des adjuvants d'origine biologique (cytokines, 15 oligonucléotides...) ou en des sels minéraux insolubles dans l'eau. Parmi les sels minéraux utilisés comme adjuvants de compositions vaccinales, on peut citer par exemple l'hydroxyde d'aluminium, qui est très couramment utilisé. Pour la formulation de compositions vaccinales contenant un antigène inactivé et destinées à l'injection d'espèces aviaires, les adjuvants de type émulsions eau dans huile sont 20 majoritairement utilisés. L'utilisation d'adjuvants dans les compositions vaccinales permet notamment: - d'augmenter l'intensité de la réponse protectrice conférée par une dose de vaccin, permettant d'assurer un meilleur niveau de protection; - de prolonger la durée de la protection conférée par une dose de vaccin, 25 assurant une protection plus durable des animaux dans les élevages tout au long de leur croissance; - d'obtenir, avec une dose antigénique moindre, une efficacité équivalente à celle conférée par une dose complète utilisée sans adjuvant. Ainsi, une entité de production de vaccin se verra, avec une même capacité productive, capable de 30 produire un nombre supérieur de doses de vaccins. De même, un conditionnement existant pourra être proposé pour vacciner un plus grand nombre d'animaux. - de diminuer le nombre d'immunisations nécessaires pour assurer une protection vaccinale. 3012 964 2 La prévention des maladies aviaires infectieuses d'origine virale, bactérienne ou parasitique est cruciale pour soutenir le développement de la production avicole. La vaccination est une méthode préconisée pour la prévention d'un grand nombre de maladies des espèces aviaires, telles que la maladie de Newcastle, la grippe aviaire, la maladie de Gumboro, la maladie de Marek, la coccidiose, la bronchite infectieuse, la pasteurellose aviaire.... Les poulets de chairs vivent au plus quelques mois et reçoivent de multiples vaccins au cours de leur vie, notamment durant leurs premiers jours. Les vaccins aviaires peuvent être administrés par injection sous cutanée ou intramusculaire chez le poussin ou l'adulte, par voie mucosale (orale, intranasale, intraoculaire), par administration de masse (nébulisation ou administration dans l'eau de boisson), ou par injection dans rceuf quand l'embryon atteint 18 ou 19 jours après fécondation (administration in ovo). La vaccination par voie injectable est utilisée classiquement pour l'administration de vaccins aviaires. Cependant, la vaccination d'un très grand nombre d'animaux représentant des couts de main d'ceuvre élevés dans les conditions d'élevage intensif, de nouvelles méthodes ont été développées plus récemment. La vaccination in ovo est ainsi une méthode d'administration vaccinale de plus en plus plébiscitée, car applicable directement dans les établissements de couvaison (couvoirs), et qui permet des réductions importantes de coût et de temps dédiés à la vaccination. Les antigènes dédiés aux compositions vaccinales aviaires peuvent être constitués de pathogènes tués (vaccins inactivés), de pathogènes vivants dont la virulence a été réduite (vaccins vivants atténués), de protéines immunogènes recombinantes (vaccins sous-unitaires) ou de vecteurs vivants recombinants (vaccins vectorisés). Les vaccins vivants atténués et vectorisés sont généralement assez efficaces pour ne pas nécessiter l'ajout systématique d'adjuvants, même s'il est possible d'amplifier l'efficacité de vaccins vivants à l'aide d'adjuvants adaptés, comme décrit par exemple dans la demande de brevet W02011/117507. A l'inverse, la formulation de vaccins inactivés et sous-unitaires nécessite généralement l'ajout d'un adjuvant d'immunité pour atteindre l'efficacité vaccinale requise. Les vaccins commerciaux actuellement administrés in ovo sont des vaccins vivants atténués ne contenant pas d'adjuvant. Les vaccins vivants atténués pouvant présenter des risques de réversion de virulence, le développement de vaccins inactivés ou sous-unitaires pour la vaccination in ovo est intéressant. Cependant, les compositions vaccinales aviaires contenant un antigène inactivé ou sous-unitaire et un adjuvant huileux de type eau dans huile, très largement utilisées pour l'administration par injection au poussin ou à l'adulte, ne sont pas utilisables telles quelles pour une administration in ovo. En effet, les adjuvants huileux généralement utilisés pour la vaccination des poussins et des adultes sont toxiques pour le développement de l'embryon dans rceuf. Le développement d'un adjuvant spécifique permettant l'utilisation d'antigènes inactivés in ovo est donc nécessaire. Un adjuvant destiné à l'administration in ovo doit donc présenter les caractéristiques spécifiques suivantes : - être non toxique pour le développement de l'embryon aviaire ; - être compatible avec les vaccins vivants atténués (non virucide) ; - augmenter la protection conférée par l'antigène vaccinal, selon les modalités décrites précédemment. Diverses technologies adjuvantes ont déjà été testées pour la vaccination in ovo, telles que les sels d'hydroxyde d'aluminium, les polymères de type carbomères, les adjuvants d'origine biologique, tels que les CPG, les cytokines et chemokines, la saponine. Cependant il n'existe pas de consensus et le développement de nouvelles formulations adjuvantes efficaces et à coût compatible pour la vaccination in ovo reste nécessaire. En ce qui concerne les vaccins aviaires injectables chez le poussin ou l'adulte, les technologies adjuvantes les plus efficaces sont les émulsions de type eau dans huile composées d'une phase aqueuse et d'une phase huileuse basée sur une huile minérale. Aucun adjuvant basé sur des émulsions huileuses n'a pourtant été trouvé efficace pour la vaccination in ovo jusqu'ici, notamment en raison de problèmes de toxicité. Il a été montré précédemment que les adjuvants de type émulsion ou microémulsion huile dans eau sont compatibles avec les vaccins vivants et peuvent être utilisés comme adjuvants d'immunité pour les vaccins vivants (demande de brevet W02011/117507). Cependant, parmi ces technologies, il a été montré que la plupart des adjuvants de cette famille sont toxiques pour le développement embryonnaire dans rceuf. C'est pourquoi il existe un besoin de mettre en oeuvre des adjuvants contenant une émulsion huile dans eau possédant les caractéristiques requises, comme: - ne pas être toxiques pour le développement embryonnaire des poussins ; - être capable d'augmenter la protection donnée par un antigène sous- unitaire dédié à la vaccination aviaire administré in ovo. La présente invention a donc pour objet une composition comprenant au moins une huile minérale, un tensioactif présentant un caractère hydrophile caractérisé par une valeur HLB égale à 12 et un sel inorganique divalent destinée à être employée comme adjuvant dans une composition de vaccin pour la vaccination in ovo d'espèces aviaires caractérisée en ce que ladite composition est une émulsion ou microémulsion de type huile dans eau. Par ailleurs, des modes de réalisation de l'invention peuvent comporter l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : Une composition telle que définie précédemment, comprenant pour 100% de sa masse: - de 50% à 97% d'eau, plus particulièrement de 70% à 97% d'eau, et encore plus particulièrement de 80% à 97% d'eau; - de 1% à 45% d'adjuvant huileux, plus particulièrement de 1% à 30% d'adjuvant huileux, et encore plus particulièrement de 2% à 10% d'adjuvant huileux; - de 0,1% à 10% d'au moins un sel inorganique divalent, plus particulièrement de 0,1% à 8%, et encore plus particulièrement de 0,2% à 3%; - de 0% à 10% d'au moins un agent complexant, plus particulièrement de 0% à 8%, et encore plus particulièrement de 0% à 3%. Une composition telle que définie précédemment, caractérisée en ce que ledit adjuvant huileux comprend pour 100% de sa masse: - de 40% à 95% d'au moins une huile minérale, plus particulièrement de 50% à 95% d'au moins une huile minérale, et encore plus particulièrement de 50% à 90% d'au moins une huile minérale; - de 5% à 60% d'au moins un tensioactif, plus particulièrement de 5% à 50% d'au moins un tensioactif, et encore plus particulièrement de 10% à 50% d'au moins un tensioactif. Une composition telle que définie précédemment, caractérisée en ce que ledit au moins un sel inorganique divalent est choisi parmi le gluconate de manganèse, le gluconate de calcium, l'aspartate de calcium, le gluconate de zinc, le gluconate de fer, le chlorure de calcium. Une composition telle que définie précédemment, caractérisée en ce que le dit au moins un agent complexant est choisi parmi l'acide éthylène diamine tétra 5 acétique (EDTA), le gluconate de sodium, le gluconate de potassium et le polyacrylate de sodium. Une composition telle que définie précédemment, caractérisée en ce que le tensioactif est un ester de sucre éthoxylé. Une composition telle que définie précédemment, caractérisée en ce que 10 l'huile minérale est une huile de vaseline blanche de qualité injectable. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une composition vaccinale destinée à la vaccination in ovo d'espèces aviaires comprenant au moins un antigène et une composition adjuvante d'immunité telle que définie précédemment. Par ailleurs, des modes de réalisation de l'invention peuvent comporter l'une 15 ou plusieurs des caractéristiques suivantes : Une composition telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que l'antigène contient au moins une protéine sous unitaire recombinante. Une composition telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que ladite protéine sous unitaire est une protéine d'Eimeria, plus particulièrement d'Eimeria 20 acervulina et plus particulièrement la profiline 3-1E, à but de protection contre la coccidiose aviaire. Une composition telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la dite protéine sous unitaire est une protéine de Clostridium perfringens, plus particulièrement la toxine NetB, ou la toxine alpha, les protéines pyruvate ferredoxin 25 oxidoreductase (PFO), ou elongation factor-Tu (EF-Tu), à but de protection contre l'entérite nécrotique. Une composition telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que ledit antigène contient au moins une protéine de Clostridium perfringens, plus particulièrement la toxine NetB, ou la toxine alpha, les protéines pyruvate ferredoxin 30 oxidoreductase (PFO), ou elongation factor-Tu (EF-Tu), et une protéine d'Eimeria, plus particulièrement d'Eimeria acervulina et plus particulièrement la profiline 3-1E, à but de protection contre la coccidiose aviaire et l'entérite nécrotique aviaire. Une composition telle que définie ci-dessus, comprenant au moins un antigène vivant antiparasitaire de la coccidiose. Une composition telle que définie ci-dessus, comprenant au moins un antigène vivant utilisé dans les vaccinations aviaires. Par microémulsion, on comprend une dispersion thermodynamiquement stable de deux liquides immiscibles, stabilisée par un (ou plusieurs) tensioactif(s). Ces dispersions sont en général transparentes car les tailles typiques des mésophases sont inférieures à la longueur d'onde de la lumière, et souvent nanométriques. Un exemple est donné par la dispersion aqueuse de petites gouttelettes d'huiles stabilisées par des tensioactifs. De par leur diamètre (quelques dizaines de nanomètres), elles sont invisibles à l'oeil nu et même au microscope. Leur taille peut être mesurée par des techniques microscopiques comme la diffusion de rayonnement aux petits angles. Les émulsions ou microémulsions objet de la présente invention ont une couleur à l'échelle macroscopique sur une gamme allant de bleuté à blanc. Les huiles minérales utilisées pour la préparation des adjuvants huileux sont sélectionnées dans le groupe constitué par les huiles minérales, hydrocarbures, obtenues par distillation du pétrole et par la mise en oeuvre d'étapes de traitement subséquentes comme par exemple les étapes de désulfurisation, de désasphaltage, d'extraction des composés aromatiques, d'extraction des cires, et autres étapes de traitement de finition (on peut citer par exemple les huiles du type MARCOL 52, MARCOL 82, DRAKEOL 5, DRAKEOL 6, EOLANE 170...). Les tensioactifs présents dans les adjuvants huileux sont des tensioactifs émulgateurs, présentant un caractère hydrophile caractérisé par une valeur HLB comprise entre 8 et 15. De préférence sa valeur HLB est égale à 12. Un tel tensioactif peut consister en un alkylpolyglycoside ou un mélange d'alkylpolyglycosides; des saponines; des lécithines; des alcanols polyoxyéthylés; des polymères comprenant des blocs polyoxyéthylènes et polyoxypropylènes; des esters obtenus par condensation d'un acide gras, avantageusement un acide gras liquide à 20°C avec un sucre, du sorbitol, du mannitol ou du glycérol. Ledit sucre peut consister en du glucose ou du saccharose ou, de préférence, mannitol. A titre d'esters préférés, on peut citer les esters d'acides gras, comme par exemple l'acide oléique, l'acide stéarique, l'acide palmitique, l'acide laurique, et de sorbitol ou de mannitol, obtenus par estérification de l'acide gras avec le sorbitol ou le mannitol, ou bien par estérification avec les produits résultant de l'anhydrisation de la chaîne polyhydroxylée du sorbitol ou du mannitol qui se cyclise en position 1-4 ou en position 2-6, ou bien par estérification avec le sorbitol ou le mannitol et avec les produits résultant de l'anhydrisation de la chaîne polyhydroxylée du sorbitol ou du mannitol qui se cyclise en position 1-4 ou en position 2-6. Comme esters de mannitol particulièrement préférés, on peut citer les oléates de mannitol, les oléates de mannitan, les oléates de mannitol éthoxylés à 5 moles ou 10 moles ou 15 moles ou 20 moles d'oxyde d'éthylène, les oléates de mannitan éthoxylés à 5 moles ou 10 moles ou 15 moles ou 20 moles d'oxyde d'éthylène. Des dérivés d'esters de sucre de polyéthylèneglycol, de sorbitol ou de glycérol peuvent être également mis en oeuvre. Les autres types de tensioactifs préférés consistent en des huiles végétales éthoxylées, comme par exemple des huiles de maïs éthoxylées ayant entre 3 moles et 40 moles d'oxyde d'éthylène, des huiles de colza éthoxylées ayant entre 3 moles et 40 moles d'oxyde d'éthylène, des huiles de ricin éthoxylées ayant entre 3 moles et 60 moles d'oxyde d'éthylène. L'invention sera mieux comprise au regard des exemples et figures ci-après. Exemples Exemple 1: Compatibilité des adjuvants avec le développement embryonnaire aviaire Pour mesurer la compatibilité des adjuvants avec la vaccination in ovo d'embryons de poulet, différents adjuvants de type émulsion huile dans eau, compatibles avec différents vaccins vivants atténués, ont été formulés en vaccins placebo (phase aqueuse : PBS). 0,1m1 de chacune de ces formules placebos ont été injectés à l'aide d'un injecteur Intelliject (Avitech) et d'une aiguille de 17,5cm et 18- gauge dans la cavité amniotique d'ceufs fertilisés de 18 jours. La toxicité est mesurée comme le nombre de poussins éclos après injection avec un vaccin placebo adjuvé par rapport au nombre de poussins éclos après injection avec 0,1m1 de PBS non adjuvé. Pour comparaison, un placebo basé sur un adjuvant aviaire de référence de type émulsion eau dans huile, utilisé pour la vaccination des poulets adultes, a été inclus dans le test. Deux séries d'essais ont été réalisés, les résultats sont présentés ci-dessous. Essai 1: Groupe Adjuvant Composition du vaccin Nombre Nombre de d'éclosion par rapport au contrôle non adjuvé d'ceufs poussins injectés éclos 1 Non adjuvé PBS 25 13 Reference 100% 2 Emulsion 1 Huile minérale 1 25 15 115% Système tensioactif 1 Sel divalent % adjuvant sec: 12% 3 Emulsion 2 Huile minérale 2 25 14 108% Système tensioactif 1 Sel divalent complexant EDTA % adjuvant sec: 6% 4 Emulsion 3 Huile minérale 1 25 14 108% Système tensioactif 1 Sel divalent complexant EDTA % adjuvant sec: 12% Emulsion 4 Huile minérale 1 25 11 85% Système tensioactif 2 sel divalent complexant EDTA % adjuvant sec: 6% 6 Emulsion 5 Huile minérale 1 25 6 46% Système tensioactif 1 % adjuvant sec: 15% 7 Emulsion 6 Huile minérale 2 25 6 46% Système tensioactif 2 % adjuvant sec: 15% 8 Contrôle : % adjuvant sec: 70% 25 8 62% Emulsion eau dans huile minérale 3012 964 9 Les groupes 2 à 5 utilisent les émulsions 1 à 4. Dans ces compositions, la fraction non aqueuse représente en final dans le vaccin préparé un pourcentage allant de 6 à 12% (huile + tensioactif + sels). Le tensioactif 1 est de la famille des esters de sucre éthoxylé. Le tensioactif 2 est de la famille des alcools gras éthoxylés. 5 Les huiles minérales 1 et 2 sont des huiles de vaseline blanche de qualité injectable (par exemple: Marcol 52® de Exxon). Le sel divalent est un sel de manganèse ou de calcium. Le schéma de formule type est une base (huile minérale + tensioactif HLB12) représentant 10% auxquels s'ajoutent 2% de sels dans une solution aqueuse qsp 100%. Ces préparations permettent d'obtenir un taux de natalité non significativement différent du groupe injecté sans adjuvant (groupe 1) indiquant une bonne tolérance. Les groupes 6 à 8, de compositions qualitative et quantitative proches, induisent de fortes mortalités (taux de natalité entre 46 et 62%). Ces formules sont basées sur des mélanges huiles + tensioactifs seulement. Essai 2: Groupe Adjuvant Dose Nombre d'oeufs injectés Nombre de % d'éclosion (% d'adjuvant / PBS) poussins éclos par rapport au contrôle non adjuvé 1 PBS/ Non adjuvé 100p1 17 9 - 2 Emulsion 1 100p1 17 12 133% 3 Emulsion 3 100p1 17 11 122% 5 Contrôle : 100p1 16 5 55% Emulsion eau dans huile Remarque : le nombre de poussin éclos est équivalent pour les groupes 1 à 3. Il est significativement plus faible pour le groupe 5. Dans cet essai, on confirme que des émulsions de type 2 et 3 sont compatibles avec la vaccination in ovo en n'induisant pas de mortalité ; l'émulsion E/H induit une forte mortalité et n'est pas compatible avec cette application dans les conditions testées. 3012 964 10 Ces deux essais montrent que seuls les adjuvants contenant une émulsion et un sel divalent pharmaceutiquement acceptable sont compatibles avec le développement embryonnaire aviaire. Exemple 2 : 1er essai d'efficacité : Modèle de vaccin in ovo recombinant 5 contre la coccidiose L'efficacité des adjuvants sélectionnés après les tests d'innocuité a ensuite été testée sur un modèle de vaccin sous-unitaire contre la coccidiose injecté in ovo. La coccidiose est une maladie aviaire parasitaire entérique causée par les parasites du genre Eimeria. 10 Il a été montré précédemment que la vaccination par injection de poulets avec un vaccin sous-unitaire adjuvé à l'aide d'un adjuvant eau dans huile et comprenant comme antigène la profiline 3-1E d'Eimeria acervulina recombinante permettait d'induire une protection homologue contre une infection par E. acervulina et une cross-protection contre les 2 autres souches majeures d'Eimeria responsables de la 15 coccidiose (E. maxima, E. tenella). Dans ce cas, l'antigène seul n'est pas assez immunogène pour induire une protection, et l'ajout de l'adjuvant est requis [cf S.I. Jang, H.S. Lillehoj, S.H. Lee, K.W. Lee, E.P. Lillehoj, F. Bertrand, L. Dupuis, S. Deville. MontanideTM ISA 71 VG adjuvant enhances antibody and cell-mediated immune responses to profilin subunit 20 antiqen vaccination and promotes protection against Eimeria acervulina and Eimeria tenella. Experimental Parasitology 127 (2011) 178-183. Ainsi que S.I. Jang, D.K. Kim, H.S. Lillehoj, S.H. Lee, K.W. Lee, F. Bertrand, L. Dupuis, S. Deville, J. Ben Arous, E. P. Lillehoj Evaluation of MontanideTM ISA 71 VG Adjuvant during Profilin Vaccination against Experimental Coccidiosis. PLoS ONE 8(4) (2013) e59786]. L'antigène 3-1E d'Eimeria acervulina (50pg/dose) a donc été combiné avec les adjuvants sélectionnés à l'étape précédente pour une injection in ovo. Les groupes de vaccination sont présentés ci-dessous. 0,1m1 de chacun de ces vaccins ont été injectés à l'aide d'un injecteur Intelliject (Avitech) et d'une aiguille de 17,5cm et 18-gauge dans la cavité amniotique d'ceufs fertilisés de 18 jours. 3012 964 11 Groupe Vaccin Dose Nombre Nombre de Infection d'oeufs poussins injectés éclos 1 PBS 100p1 15 14 Aucune 2 PBS 100p1 15 13 E.A. 10000 3 Antigène 3-1E 50pg/100p1 15 11 E.A. 10000 4 Antigène 3-1E 50pg/100p1 15 11 E.A. 10000 + Emulsion 1 5 Antigène 3-1E 50pg/100p1 15 12 E.A. 10000 + Emulsion 3 Remarque : le nombre de poussins éclos est équivalent pour les groupes 1 à 5. Après éclosion, les poulets vaccinés in ovo sont soumis à une épreuve 5 infectieuse à 18 jours post vaccination (15 jours après éclosion) par inoculation dans rcesophage de 10000 oocytes sporulés d'Eimeria acervulina. La résistance à l'infection est mesurée par l'enregistrement de la prise de poids après infection, le comptage des oocytes excrétés, la mesure des lésions intestinales et la réponse sérologique anti-profiline 3-1E. 10 Les résultats sont analysés statistiquement par analyse ANOVA. Les différences sont considérées comme significatives pour p Exemple 3 : 2nd essai d'efficacité : Modèle de vaccin in ovo recombinant bivalent contre la coccidiose et l'entérite nécrotique Dans un second temps, l'efficacité des adjuvants sélectionnés a été testée sur un modèle de vaccin sous-unitaire divalent contre la coccidiose et l'entérite nécrotique injecté in ovo. La coccidiose est une maladie aviaire parasitaire entérique causée par les parasites du genre Eimeria. L'entérite nécrotique est une maladie aviaire entérique bactérienne, causée par la bactérie Clostridium perfringens, et potentialisée par la présence d'une pré- infection par Eimeria. Il a été montré précédemment que la vaccination par injection de poulets avec un vaccin sous-unitaire adjuvé comprenant comme antigène la toxine NetB de Clostridium perfringens recombinante permettait d'induire une protection contre une infection par Clostridium perfringens. L'antigène NetB seul n'est pas assez immunogène pour induire une protection, et l'ajout d'un adjuvant est requis [cf S.I. Jang, H.S. Lillehoj, S.H. Lee, K.W. Lee, E.P. Lillehoj, Y.H. Hong, D.J. An, W. Jeong, J.E. Chun, F. Bertrand, L. Dupuis, S. Deville, J. Ben Arous - Vaccination with Clostridium perfringens recombinant proteins in combination with MontanideTM ISA 71 VG adjuvant increases protection against experimental necrotic enteritis in commercial broiler chickens. Vaccine 30 (2012) 5401-5406]. L'antigène 3-1E d'Eimeria acervulina (50 pg/dose) et l'antigène NetB (50 pg/dose) de Clostridium perfringens ont donc été combinés avec les adjuvants sélectionnés pour une injection in ovo. Les groupes de vaccination sont présentés ci-dessous. 0.1m1 de chacun de ces vaccins ont été injectés à l'aide d'un injecteur Intelliject (Avitech) et d'une aiguille de 17,5cm et 18-gauge dans la cavité amniotique d'ceufs fertilisés de 18 jours. 3012 964 14 Groupe Vaccin Dose Nombre Nombre de Infection d'oeufs injectés poussins éclos 1 PBS 100p1 15 11 aucune 2 PBS 100p1 15 10 EM 10,000 C.P 1x109CFU 3 3-1E 100p1 15 9 EM 10,000 Non adjuvé C.P 1x109CFU 4 3-1E + NetB 50pg/100p1 15 7 EM 10,000 Non adjuvé C.P 1x109CFU 5 3-1E + NetB + Emulsion 1 50pg/100p1 15 7 EM 10,000 C.P 1x109CFU 7 3-1E + NetB + Emulsion 3 50pg/100p1 15 7 EM 10,000 C.P 1x109CFU Remarque : le nombre de poussins éclos est considéré comme équivalent pour tous les groupes. Après éclosion, les poulets vaccinés in ovo (5 poulets/groupe) sont soumis à 5 une épreuve infectieuse à 18 jours post vaccination (15 jours après éclosion) par inoculation dans rcesophage de 10000 oocytes sporulés d'Eimeria acervulina, puis 3 jours après (21 jours après vaccination) à une infection par 109 CFU de C. perfringens. La résistance à l'infection est mesurée par l'enregistrement de la prise de 10 poids après infection, la mesure des lésions intestinales, la réponse sérologique anti- toxine NetB, et la prolifération des splénocytes après restimulation par la toxine NetB. Les résultats sont analysés statistiquement par analyse ANOVA. Les différences sont considérées comme significatives pour p Pour 2 animaux/groupe, la rate a été prélevée 16 jours après immunisation (avant infection). Les splénocytes ont été isolés puis restimulés en présence de NetB pour 48h. La reprolifération est présentée par un indice de stimulation. Les résultats sont illustrés sur la figure 3. Conclusion du 2nd essai d'efficacité: Les résultats obtenus montrent que les adjuvants de type émulsion huile dans eau contenant un sel divalent objet de l'invention, complexés ou non, sont compatibles avec la vaccination in ovo et augmentent la protection contre l'entérite nécrotique conférée par un antigène sous-unitaire. Les animaux des groupes adjuvés montrent après infection une prise de poids plus élevée, des lésions intestinales plus faibles que les animaux vaccinés avec l'antigène non adjuvé. Ils montrent aussi des titres d'anticorps sériques et des indices de restimulation lymphocytaire spécifiques de l'antigène plus élevés que les animaux vaccinés avec l'antigène non adjuvé. Dans ce cas, le vaccin non adjuvé ne permet pas d'obtenir une protection contre l'infection par C. perfringens. REVENDICATIONS1. Composition comprenant au moins une huile minérale, un tensioactif présentant un caractère hydrophile caractérisé par une valeur HLB égale à 12 et un sel inorganique divalent destinée à être employée comme adjuvant dans une composition de vaccin pour la vaccination in ovo d'espèces aviaires caractérisée en ce que ladite composition est une émulsion ou microémulsion de type huile dans eau. 2. Composition selon la revendication précédente comprenant pour 100% de sa masse: - de 50% à 97% d'eau, plus particulièrement de 70% à 97% d'eau, et 15 encore plus particulièrement de 80% à 97% d'eau; - de 1% à 45% d'adjuvant huileux, plus particulièrement de 1% à 30% d'adjuvant huileux, et encore plus particulièrement de 2% à 10% d'adjuvant huileux; - de 0,1% à 10% d'au moins un sel inorganique divalent, plus particulièrement de 0,1% à 8%, et encore plus particulièrement de 0,2% à 3%; 20 - de 0% à 10% d'au moins un agent complexant, plus particulièrement de 0% à 8%, et encore plus particulièrement de 0% à 3%. 3. Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce que ledit adjuvant huileux comprend pour 100% de sa masse: 25 - de 40% à 95% d'au moins une huile minérale, plus particulièrement de 50% à 95% d'au moins une huile minérale, et encore plus particulièrement de 50% à 90% d'au moins une huile minérale; - de 5% à 60% d'au moins un tensioactif, plus particulièrement de 5% à 50% d'au moins un tensioactif, et encore plus particulièrement de 10% à 50% d'au 30 moins un tensioactif. 4. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que ledit au moins un sel inorganique divalent est choisi parmi le gluconate de manganèse, le gluconate de calcium, l'aspartate de calcium, le gluconate de zinc, le gluconate de fer, le chlorure de calcium. 5. Composition selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que le dit au moins un agent complexant est choisi parmi l'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA), le gluconate de sodium, le gluconate de potassium et le polyacrylate de sodium. 6. Composition selon l'une des revendications 3 à 5 caractérisée en ce que le tensioactif est un ester de sucre éthoxylé. 7. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en 15 ce que l'huile minérale est une huile de vaseline blanche de qualité injectable. 8. Composition vaccinale destinée à la vaccination in ovo d'espèces aviaires comprenant au moins un antigène et une composition adjuvante d'immunité telle que définie aux revendications 1 à 7. 20 9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'antigène contient au moins une protéine sous unitaire recombinante. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite 25 protéine sous unitaire est une protéine d'Eimeria, plus particulièrement d'Eimeria acervulina et plus particulièrement la profiline 3-1E, à but de protection contre la coccidiose aviaire. 11. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la dite 30 protéine sous unitaire est une protéine de Clostridium perfringens, plus particulièrement la toxine NetB, ou la toxine alpha, les protéines pyruvate ferredoxin oxidoreductase (PFO), ou elongation factor-Tu (EF-Tu), à but de protection contre l'entérite nécrotique. 10 3012 964 19 12. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit antigène contient au moins une protéine de Clostridium perfringens, plus particulièrement la toxine NetB, ou la toxine alpha, les protéines pyruvate ferredoxin oxidoreductase (PFO), ou elongation factor-Tu (EF-Tu), et une protéine d'Eimeria, 5 plus particulièrement d'Eimeria acervulina et plus particulièrement la profiline 3-1E, à but de protection contre la coccidiose aviaire et l'entérite nécrotique aviaire. 13. Composition selon la revendication 12, comprenant au moins un antigène vivant antiparasitaire de la coccidiose. 14. Composition selon la revendication 13, comprenant au moins un antigène vivant utilisé dans les vaccinations aviaires. 15