Brevet FR3021745A1 — publié le 20151204

DISPOSITIF ET PROCÉDÉ DE CARACTÉRISATION D'UNE PARTICULE DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne le domaine général des systèmes microfluidiques et en particulier, la caractérisation des particules dans un milieu liquide. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE Dans de nombreux domaines, on cherche à déterminer les paramètres physiques de particules ou de micro-objets pour par exemple analyser des échantillons liquides comportant ces objets. Ce peut être le cas, par exemple, pour réaliser un tri de cellules vivantes à des fins d'analyse biologique, un diagnostic biologique ou médical, ou encore dans le domaine du génie génétique ou agro-alimentaire. En effet, il est souvent nécessaire d'extraire des pathogènes potentiels contenus dans un milieu complexe (par exemple, échantillon de sang, d'urine, de salive, etc.) en vue de les analyser. D'autres applications concernent par exemple la production industrielle de micro-objets inertes en forme de poudres, bâtonnets, fibres, etc. D'une manière générale, une caractérisation de particules peut être effectuée à l'aide des moyens mécaniques, hydrodynamiques, ou électriques et selon des techniques de fluidiques passives ou actives. Une caractérisation fluidique passive prend avantage de l'écoulement du fluide pour distinguer les particules selon leurs tailles. Cette technique est assez limitée car elle utilise principalement la ségrégation par taille et n'est pas adaptée pour toutes les formes de particules. Une technique active ajoute à l'écoulement du fluide une autre force physique qui tire profit des propriétés physiques intrinsèques et spécifiques des particules telles que, par exemple, la masse, ou les caractéristiques diélectriques ou magnétiques. Plusieurs techniques actives peuvent être utilisées, telles que, par exemple, la ségrégation par effet de champ électrique. Cette technique prend avantage des différences de 3021745 2 polarisabilité des particules entre elles et par rapport au milieu de suspension. Toutefois, cette technique est incompatible avec des liquides présentant une conductivité élevée ou des charges électriques. De plus, il peut être souhaitable de déterminer de manière individuelle les 5 paramètres physiques d'une particule, ce qui est bien souvent impossible dans les techniques pré-citées. L'objet de la présente invention est par conséquent de remédier aux inconvénients précités en proposant un procédé et un dispositif efficaces, simples et précis pour caractériser une particule de forme quelconque dans un milieu liquide 10 éventuellement chargé. EXPOSÉ DE L'INVENTION L'invention a pour objet un procédé de caractérisation d'une particule dans un milieu liquide, ladite particule et ledit milieu liquide ayant des impédances acoustiques différentes, ledit procédé comportant les étapes suivantes : 15 - appliquer simultanément des première et seconde ondes acoustiques stationnaires sur ladite particule, lesdites première et seconde ondes acoustiques étant configurées pour créer sur ladite particule un moment de rotation entraînant cette dernière en rotation sur elle-même, - mesurer une vitesse angulaire (i.e. une vitesse de rotation ou une fréquence de 20 rotation) de ladite particule, et - caractériser ladite particule en fonction de sa vitesse angulaire. Ce procédé non intrusif, non destructif et sans contact avec la particule permet de caractériser cette dernière selon des critères de taille, d'élasticité ou de densité en fonction de la vitesse angulaire et tout en étant compatible avec des particules dans des 25 fluides électriquement chargés. La caractérisation des particules permet par exemple de les trier selon leur taille ou leur élasticité. Avantageusement, l'application desdites première et seconde ondes acoustiques sur ladite particule comprend les étapes suivantes : - émission de la première onde acoustique selon une première direction, 3021745 3 - émission de la seconde onde acoustique selon une seconde direction sécante à la première direction, lesdites première et seconde ondes acoustiques étant stationnaires, ayant sensiblement une même amplitude et une même fréquence et présentant entre elles un déphasage prédéterminé en fonction de l'angle de 5 croisement desdites première et seconde directions, et - placement de ladite particule au croisement desdites première et seconde directions sur un noeud de pression desdites première et seconde ondes acoustiques. Avantageusement, l'angle de croisement desdites première et seconde directions est sensiblement droit. 10 Avantageusement, le déphasage entre la première onde et la deuxième onde étant sensiblement égal à n/2. Avantageusement, la détermination de la vitesse angulaire (vitesse de rotation ou fréquence de rotation) de ladite particule comprend les étapes suivantes : - capturer une succession d'images de ladite particule lorsqu'elle est placée en un 15 noeud de pression au croisement desdites première et seconde directions pendant un temps prédéterminé, et - faire un traitement d'image sur ladite succession d'images pour déterminer la vitesse angulaire de ladite particule. Avantageusement, ledit traitement d'image comprend un calcul d'une fonction 20 de corrélation entre chaque image de ladite particule et une image de référence sélectionnée parmi ladite succession d'images. Avantageusement, le procédé comporte en outre les étapes suivantes : - déterminer la fréquence de rotation de ladite particule pour différentes fréquences acoustiques des première et seconde ondes acoustiques, et 25 - construire un spectre de fréquences de rotation de ladite particule en fonction desdites différentes fréquences acoustiques. Avantageusement, le procédé comporte également une construction dudit spectre pour différents types de particules. Selon une particularité de la présente invention, les particules sont des objets vivants (cellules, bactéries, levures, etc.) ou des objets inertes (billes, fibres, etc.). 3021745 4 Avantageusement, les particules sont de forme quelconque et typiquement de taille inférieure à environ 0,1 mm. L'invention vise également un dispositif microfluidique de caractérisation d'une particule dans un milieu liquide, ladite particule et ledit milieu liquide ayant des 5 impédances acoustiques différentes, ledit dispositif comportant : - un substrat comprenant des premier, deuxième et troisième canaux fluidiques gravés sur une première surface du substrat et concourants dans une zone de croisement, lesdits premier et deuxième canaux fluidiques étant des premier et deuxième canaux acoustiques destinés à guider la propagation d'ondes acoustiques et ledit troisième 10 canal fluidique étant un canal de circulation fluidique destiné à amener ladite particule dans ladite zone de croisement, - des générateurs d'ondes acoustiques destinés à générer des première et seconde ondes acoustiques stationnaires suivant lesdits premier et deuxième canaux acoustiques respectivement, lesdites première et seconde ondes acoustiques étant 15 configurées pour créer sur ladite particule un moment de rotation entraînant cette dernière en rotation sur elle-même, - des moyens d'observation disposés au niveau de ladite zone de croisement et destinés à collecter des données d'observation relatives à ladite particule lorsqu'elle est placée dans ladite zone de croisement, et 20 - des moyens de traitement destinés à calculer une vitesse angulaire de ladite particule à partir desdites données d'observation et à caractériser ladite particule en fonction de sa vitesse angulaire. Avantageusement, lesdites première et seconde ondes acoustiques ont sensiblement une même amplitude et une même fréquence, lesdits générateurs d'ondes 25 et canaux acoustiques étant configurés pour former un noeud de pression au niveau de ladite zone de croisement. Avantageusement, les premier et deuxième canaux acoustiques sont sensiblement orthogonaux. Avantageusement, lesdites première et seconde ondes acoustiques présentent 30 entre elles un déphasage sensiblement égal à n/2. 3021745 5 Selon un mode de réalisation de la présente invention, le dispositif comporte : - au moins deux cavités formées dans le substrat, chacune étant située à au moins une extrémité desdits premier et deuxième canaux acoustiques, - une membrane déformable disposée à une seconde surface du substrat opposée à 5 ladite première surface, ladite membrane étant destinée à assurer une étanchéité des cavités et à transmettre une excitation vibratoire dans les cavités, - au moins deux générateurs d'ondes acoustiques disposés aux niveaux desdites cavités en contact avec la membrane déformable de manière à transmettre des ondes acoustiques dans le milieu liquide contenu dans lesdits premier et second 10 canaux acoustiques, et - un capot transparent disposé sur la première surface du substrat comportant les canaux fluidiques. Selon une première variante, le dispositif comporte deux cavités, deux générateurs d'ondes acoustiques et deux réflecteurs, chaque canal acoustique 15 comportant un générateur d'ondes acoustique à une extrémité et un réflecteur à l'autre extrémité. Selon une deuxième variante, le dispositif comporte quatre générateurs d'ondes acoustiques, chaque canal acoustique comportant un générateur d'ondes acoustique à chaque extrémité. 20 D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans la description détaillée non limitative ci-dessous. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS On décrira à présent, à titre d'exemples non limitatifs, des modes de réalisation 25 de l'invention, en se référant aux dessins annexés, dans lesquels : La Fig. 1 illustre de manière très schématique un procédé microfluidique de caractérisation d'une particule, selon l'invention ; La Fig. 2 illustre de manière très schématique un dispositif microfluidique de caractérisation d'une particule, selon un mode de réalisation de l'invention ; 3021745 6 Les Figs. 3A et 3B illustrent de manière très schématique un dispositif microfluidique de caractérisation d'une particule, selon un mode de réalisation préféré de l'invention ; La Fig. 4 illustre des images successives d'une cellule biologique à des instants 5 différents de sa rotation, selon l'invention ; La Fig. 5 illustre un graphique d'une fonction de corrélation des images de la Fig. 4 en fonction du temps ; et La Fig. 6 illustre des vitesses de rotations de cellules dans différents états en fonction de la fréquence de l'onde acoustique, selon l'invention. 10 EXPOSÉ DÉTAILLÉ DES MODES DE RÉALISATION PRÉFÉRÉS Le principe général de l'invention est de caractériser une particule à partir de sa propre vitesse de rotation générée par un couple d'ondes acoustiques. La Fig. 1 illustre de manière très schématique un procédé microfluidique de 15 caractérisation d'une particule, selon l'invention. Ce procédé comporte à l'étape El une application simultanée d'une première onde acoustique stationnaire W1 et d'une seconde onde acoustique stationnaire W2 sur une particule 1 dans un milieu liquide 3. La particule 1 peut être un objet vivant (cellule, bactérie, levure, etc.) ou un objet inerte (bille, fibre, etc.). Par ailleurs, la particule 1 peut 2 0 être de forme quelconque et typiquement de taille inférieure à 0,1 mm. Les première et seconde ondes acoustiques W1, W2 sont configurées pour créer sur la particule 1 un moment de rotation entraînant cette dernière en rotation sur elle-même. Avantageusement, les ondes acoustiques W1, W2 sont des ondes ultrasonores de fréquence typiquement entre 20kHz et 200kHz. 25 Il existe plusieurs travaux mentionnant l'action des ondes acoustiques sur des objets dans un milieu fluide. En particulier, Busse et al. dans un article intitulé « Torque generated by orthogonal acoustic waves-Theory », J. Acoustical Society of America 69(6), juin 1981, décrivent théoriquement le phénomène de rotation d'un objet en forme de disque, cylindre ou sphère sous l'effet d'un couple acoustique. 3021745 7 En effet, lorsque deux ondes acoustiques W1, W2 croisées sont utilisées pour créer un couple acoustique sur une particule 1 présentant un rayon très inferieur à la longueur d'onde acoustique, la particule 1 se met à tourner sur elle-même si l'amplitude acoustique est suffisante. Ce couple acoustique dépend des propriétés physiques de la 5 particule 1 et en particulier de ses paramètres élastiques et de sa taille. La rotation peut être réalisée lorsque les caractéristiques mécaniques et acoustiques de la particule 1 sont différentes de celles du milieu liquide 3 environnant. Par ailleurs, on notera qu'un couple visqueux s'oppose à la rotation de la particule, de même qu'un couple de frottement pariétal si la particule est en contact avec une paroi. 10 De manière générale, la rotation générée par le couple acoustique dépend du contraste d'impédance acoustique entre la particule 1 et le milieu fluide 3 environnant. On rappellera que l'impédance acoustique d'un matériau est égale au produit de la masse volumique du matériau par la vitesse du son dans ce même matériau. Conformément à l'invention, la première onde acoustique stationnaire W1 est 15 émise en direction de la particule 1 selon une première direction D1 et la seconde onde acoustique stationnaire W2 est émise selon une seconde direction D2 sécante à la première direction. La particule 1 est placée au croisement de ces deux directions D1, D2 sur un noeud de pression des première et seconde ondes acoustiques W1, W2. Le noeud de pression permet d'amplifier la rotation tout en piégeant la particule dans une zone de 20 croisement 5. La seconde onde acoustique W2 présente sensiblement la même amplitude et la même fréquence que la première onde acoustique W1. En outre, les première et seconde ondes acoustiques W1, W2 présentent entre elles un déphasage prédéterminé en fonction de l'angle de croisement des première et seconde directions D1, D2. 25 Avantageusement, pour créer un couple acoustique optimal, l'angle de croisement des première et seconde directions D1, D2 est sensiblement droit et le déphasage entre la première onde acoustique W1 et la deuxième onde acoustique W2 est sensiblement égal à n/2. A l'étape E2, lorsque les première et seconde ondes acoustiques W1, W2 sont 30 appliquées sur la particule 1 piégée dans la zone de croisement 5, on mesure la vitesse 3021745 8 angulaire de cette particule 1. On notera que le terme « vitesse angulaire » englobe une vitesse de rotation en radians par unité de temps ou une fréquence de rotation en nombre de tours par unité de temps. La mesure de la vitesse peut par exemple être réalisée par des moyens optiques 7 combinés à des moyens de traitement 9 d'images. 5 Ensuite, à l'étape E3 on caractérise la particule 1 selon sa vitesse angulaire (par exemple en radis ou en tours/s). En effet, la connaissance de la vitesse angulaire renseigne sur la taille et l'élasticité de la particule 1. Ainsi, la caractérisation de la particule peut être réalisée en définissant par exemple le spectre S des vitesses de rotation de la particule en fonction de la fréquence de l'excitation acoustique (voir aussi 10 Fig. 6). La Fig. 2 illustre de manière très schématique un dispositif microfluidique de caractérisation d'une particule, selon un mode de réalisation de l'invention. Ce dispositif 11 comporte un substrat 13, des générateurs d'ondes acoustiques 15, des moyens d'observation 7 et des moyens de traitement 9. 15 Le substrat 13 comprend des premier 17, deuxième 19 et troisième 21 canaux fluidiques gravés sur une première surface 13a du substrat 13 et concourants dans une zone de croisement 5. Les premier 17 et deuxième 19 canaux fluidiques sont des premier et deuxième canaux acoustiques destinés à guider la propagation des ondes acoustiques W1 et W2 20 respectivement. Le troisième canal fluidique 21 est un canal de circulation fluidique destiné à amener la particule 1 dans la zone de croisement 5. Le dispositif 11 comporte au moins deux générateurs d'ondes acoustiques 15, chacun étant implanté dans le substrat 13 au niveau d'au moins une extrémité des premier et deuxième canaux acoustiques 17, 19. Les générateurs d'ondes acoustiques 15 25 sont configurés pour générer des première et seconde ondes acoustiques stationnaires W1, W2 suivant les premier et deuxième canaux acoustiques 17, 19 respectivement, en formant un noeud de pression au niveau de la zone de croisement 5. Selon une première variante, chaque canal acoustique comporte un générateur d'ondes acoustiques 15 sur une extrémité et un réflecteur 23 sur l'autre extrémité. Selon 30 une autre variante, le dispositif comporte deux paires de générateurs d'ondes 3021745 9 acoustiques 15 placées en vis-à-vis, chaque canal acoustique comportant un générateur d'ondes acoustiques 15 sur chaque extrémité (voir Fig. 3B). Avantageusement, les premier et deuxième canaux acoustiques 17, 19 sont sensiblement orthogonaux. Dans ce cas, les générateurs d'ondes acoustiques 15 sont 5 configurés pour générer les première et seconde ondes acoustiques W1, W2 avec un déphasage sensiblement égal à n/2. En outre, les première et seconde ondes acoustiques W1, W2 ont sensiblement une même amplitude et une même fréquence. Ainsi, l'application de ces ondes acoustiques W1, W2 crée sur la particule 1 un moment de rotation entraînant cette dernière en rotation sur elle-même. 10 Les moyens d'observation 7 sont disposés au niveau de la zone de croisement 5 et sont destinés à collecter des données d'observation relatives à la particule 1 lorsque cette dernière est placée dans la zone de croisement 5. Les moyens d'observation 7 comportent par exemple un système optique tel qu'un microscope ou un dispositif d'imagerie sans lentille et les données d'observation sont alors une succession d'images. 15 Les moyens de traitement 9 sont connectés aux moyens d'observation 7 pour recevoir et utiliser les données d'observation afin de calculer (par exemple par un traitement d'images) la vitesse angulaire de la particule 1. Les moyens de traitement 9 sont en outre configurés pour caractériser la particule 1 en fonction de sa vitesse angulaire. 20 Les Figs. 3A et 3B illustrent de manière très schématique un dispositif microfluidique de caractérisation d'une particule, selon un mode de réalisation préféré de l'invention. La Fig. 3A est une vue schématique du substrat et la Fig. 3B est une coupe du dispositif. Le dispositif microfluidique 11 comprend un substrat 13 ayant une première 25 surface 13a et une seconde surface 13b. Les première et secondes surfaces 13a, 13b sont parallèles entre elles et espacées l'une de l'autre d'une épaisseur comprise entre par exemple quelques centaines de microns et quelques millimètres. Le diamètre ou la diagonale du substrat 13 peut être de l'ordre de quelques dizaines de millimètres à quelques dizaines de centimètres. Par exemple, le substrat 13 peut être réalisé dans un 30 wafer de 100 mm de diamètre et 500 um d'épaisseur. Le matériau du substrat 13 peut 3021745 10 être choisi parmi les matériaux suivants : le verre, pyrex ou un matériau organique tel que le polycarbonate ou le PEEK, le silicium monocristallin, le silicium polycristallin, le nitrure de silicium, l'oxyde de silicium, le nickel, le tungstène, etc. Dans toute la description qui va suivre, par convention, on utilise un repère 5 orthonormé direct en coordonnées cartésiennes (X,Y,Z). Le plan (X,Y) est parallèle aux première et seconde surfaces 13a, 13b et la direction Z est orientée à partir de la seconde surface 13b vers la première surface 13a. Les première et seconde surfaces 13a, 13b du substrat 13 désignent les surfaces supérieure et inférieure du substrat. Les termes « inférieur » et « supérieur » sont ici à 10 comprendre en termes d'orientation suivant la direction Z du repère orthonormé (X,Y,Z). On notera que le substrat 13 peut être maintenu dans un support 25 par exemple en aluminium qui assure au substrat 13 une bonne stabilité. Par ailleurs, des cavités 151a-151d et canaux fluidiques 17, 19, 21 sont réalisés dans le substrat 13 par des techniques classiques de microélectronique, par exemple, par 15 photolithographie suivie des étapes de gravure. Des premier 17, deuxième 19 et troisième 21 canaux fluidiques de sections rectangulaires sont gravés sur la surface supérieure 13a du substrat 13. Les trois canaux 17, 19, 21 sont rectilignes selon des droites concourantes formant ainsi une zone de croisement 5 sensiblement au milieu de la première surface 13a. La longueur de chaque 20 canal peut être de l'ordre de quelques dizaines de millimètres à quelques dizaines de centimètres. Les premier et deuxième canaux fluidiques 17, 19 sont des premier et deuxième canaux acoustiques présentant chacun une section carrée de côté égal à quelques centaines de microns, par exemple 200 iim. Le premier canal acoustique 17 est 25 sensiblement orthogonal au deuxième canal acoustique 19, les deux canaux se croisant en leurs milieux dans la zone de croisement 5. Par ailleurs, les extrémités de chaque canal acoustique 17, 19 sont connectées avec une paire de cavités 151a-151d en vis-à-vis. Les quatre cavités 151a-151d sont réalisées sous forme de trous traversants par rapport au substrat 13 et peuvent présenter 3021745 11 la forme d'un disque (ou de toute autre forme), de quelques millimètres de diamètre, par exemple de 12 mm, et bien entendu d'une profondeur égale à l'épaisseur de substrat 13. En outre, chacune des cavités 151a-151d est connectée à un conduit d'entrée 27a ou de sortie 27b de fluide par l'intermédiaire d'un conduit de communication 29a- 5 29d. En effet, des conduits traversants d'entrée et de sortie sont réalisés sous forme de puits débouchant sur les conduits de communication 29a-29d. Ainsi, chaque canal acoustique communique d'un côté avec un conduit d'entrée 27a et d'un autre côté avec un conduit de sortie 27b par l'intermédiaire des cavités 151a-151d disposées à ses extrémités. Ceci permet d'introduire un liquide (par exemple de l'eau) dans les cavités 10 151a-151d et canaux acoustiques 17, 19 correspondants. Une membrane 31 déformable est disposée sur la surface inférieure 13b du substrat 13. La membrane 31 déformable est avantageusement réalisée en un matériau souple qui peut être du verre, du silicium ou un matériau organique tel que le polycarbonate qui peut facilement être collé sur la surface du substrat 13. L'épaisseur de 15 la membrane 31 peut être comprise entre quelques microns et quelques centaines de microns, par exemple 50 um. Ainsi, la membrane 31 assure l'étanchéité des cavités 151a-151d et contribue à former des générateurs d'ondes acoustiques 15. La vibration de la membrane 31 aux niveaux des cavités 151a-151d est obtenue à l'aide d'émetteurs en forme par exemple de pastilles 153 piézoélectriques disposées sur 20 la face inférieure de la membrane 31 créant ainsi des sources acoustiques en faisant vibrer les cavités 151a-151d contenant du liquide. Par exemple chaque pastille 153 est un cristal de PZT fourni par Noliac de 9 mm de diamètre pour une épaisseur de 2 mm. Ainsi, deux paires d'émetteurs 153 sont placés en vis-à-vis afin d'exciter des première et seconde ondes acoustiques stationnaires W1, W2 dans les premier et second canaux 25 acoustiques 17, 19 telles que le centre de la zone de croisement 5 soit un noeud de pression. Les deux paires d'émetteurs 153 sont avantageusement déphasés de n/2 au moyen d'un générateur de signaux 155 et sont configurés pour émettre des signaux acoustiques de même fréquence et sensiblement de même amplitude. Par ailleurs, le troisième canal fluidique 21 est un canal de circulation fluidique 30 destiné à amener la particule 1 dans la zone de croisement 5. Le canal de circulation 3021745 12 fluidique 21 présente une section rectangulaire dont chaque côté est égal à quelques centaines de microns. Par exemple, le canal peut présenter une largeur de 600 um sur 200 um de profondeur. En outre, un moyen microfluidique 33 pour individualiser les particules est 5 connecté au canal de circulation 21 en amont de la zone de croisement 5 par rapport au sens d'écoulement. Par exemple, deux canaux microfluidiques 33a, 33b latéraux convergent dans une section amont du canal de circulation 21. Ces canaux latéraux 33a, 33b sont destinés à diluer le fluide dans le canal de circulation 21 avec un fluide tampon afin d'individualiser et de centrer les particules. En particulier, ils sont configurés pour 10 délivrer les particules de manière successive tout en créant une inter distance entre les particules de l'ordre de 50 fois la largeur du canal de circulation 21 afin de les séparer suffisamment pour ne caractériser qu'une particule 1 à la fois. Par exemple, une distance d'environ 3 mm peut être créée entre deux particules consécutives pour une largeur du canal de circulation de 600 um. 15 Le dispositif 11 comporte également des orifices (non représentés) dans le support 25 débouchant au niveau du canal de circulation fluidique 21 et des canaux latéraux 33a, 33b permettant de connecter ces canaux à des pompes péristaltiques, pousse-seringues ou contrôleur de flux 35 comportant le liquide d'intérêt à analyser et le liquide tampon. 20 Le dispositif 11 comprend également un capot 37 disposé en regard de la surface supérieure 31a du substrat 13. Le capot 37 est avantageusement réalisé en un matériau transparent qui peut être du verre, du pyrex ou un matériau organique tel que le polycarbonate. Par ailleurs, le dispositif 11 comprend un microscope 107 disposé au dessus de la 25 zone de croisement 5 permettant de filmer une particule 1 placée dans cette zone. Le microscope 107 est relié à une unité de traitement 9 (par exemple un ordinateur) pour faire un traitement d'images permettant de déterminer la vitesse de la particule 1 et par conséquent, de la caractériser. En effet, ce dispositif 11 peut être utilisé pour caractériser des particules inertes 30 ou des objets vivants comme des cellules. Les cellules peuvent être préparées par un 3021745 13 protocole biologique quelconque et on peut ensuite utiliser le dispositif 11 pour détecter par exemple, les cellules défectueuses. A titre d'exemple, des monocytes humains THP sont cultivés en présence d'un milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) complet (i.e. présence de 10% 5 sérum de veau fétal). Les cellules sont cultivées adhérentes dans des boites traitées pour la culture cellulaire eucaryote. Les cellules sont divisées avant qu'elles n'atteignent la confluence par trypsination. Pour synchroniser les cellules en phase GO correspondant à un état donné de leur cycle de vie, le milieu est remplacé par RPMI sans sérum. La privation de sérum 10 (serum starvation, en anglais) permet d'accumuler les cellules dans la phase GO du cycle cellulaire. La synchronisation effective est contrôlée par un marquage à l'iodure de propidium et une analyse en cytométrie en flux afin d'observer l'accumulation de cellules avec un stock de 2N chromosomes typiques de la phase G0/G1. Pour l'analyse sur le dispositif 11, les cellules sont détachées du support de 15 culture par trypsination, puis resuspendues à une concentration de 103 à 104 cellules pour 100 pi dans le milieu de culture ou dans un tampon biologique adapté. Ces cellules en suspension de forme sphéroïdale et de diamètre de l'ordre de 10 p.rn à 30 p.rn peuvent être mises en circulation dans le canal fluidique de circulation 21 grâce par exemple à un contrôleur de flux 35 de type Fluigent connecté au canal de 20 circulation 21. La Fig. 4 illustre des images successives d'une cellule biologique dans la zone de croisement à des instants différents de sa rotation. Avantageusement, l'unité de traitement 9 est connectée au contrôleur de flux 35 ainsi qu'au microscope 107 afin de commander automatiquement le flux et la prise des 25 images. Ainsi, lorsque l'unité de traitement 9 détecte le passage d'une cellule 1 dans la zone de croisement 5, elle commande le contrôleur de flux 35 pour arrêter le flux de façon à immobiliser la cellule 1 au centre de la zone de croisement 5. Des ondes acoustiques stationnaires ultrasonores W1, W2 de même fréquence 30 (de l'ordre de quelques dizaines de kHz) et sensiblement de même amplitude (de l'ordre 3021745 14 de 10 kPa) sont appliquées sur la cellule 1 qui se met alors à tourner sur elle-même tout en restant dans la zone de croisement 5 qui coïncide avec un noeud de pression.. Ensuite, une vidéo est déclenchée pendant un temps prédéterminé afin de mesurer automatiquement par un traitement d'images la vitesse de rotation de la cellule 5 1. On notera que le temps de prise d'images est ajusté selon la vitesse de rotation de la cellule 1. A titre d'exemple, le traitement d'images peut être réalisé selon un algorithme de corrélation basé sur le calcul d'une fonction de corrélation entre chaque image de la cellule 1 et une image de référence sélectionnée arbitrairement parmi la succession 10 d'images de la vidéo. Plus particulièrement, l'unité de traitement 9 est configurée pour enregistrer une image de référence (par exemple, la première image Im0) et ensuite une fonction de corrélation 2D comprise entre 1 et 0 est calculée pour toutes les images suivantes lmj (ici, j=1, 9). 15 Un graphique de la fonction de corrélation en fonction du temps est illustré sur la Fig. 5. Ce graphique montre l'oscillation de la fonction de corrélation en fonction de l'angle de la cellule 1. Chaque pic P représente un tour complet de la cellule 1 autour d'elle-même. Selon cet exemple, deux pics consécutifs quelconques sont espacés d'environ une seconde et donc la fréquence de rotation de la cellule 1 est de l'ordre de 20 1Hz. On notera que la légère décroissance des pics au cours du temps est due au fait que la cellule 1 peut se dégrader ou se déplacer légèrement. Ainsi, lorsque la cellule 1 fait un tour complet, la corrélation n'est pas parfaite. L'unité de traitement 9 est en outre configurée pour appliquer une analyse de Fourier de type FFT (Fast Fourier Transform) pour déterminer la fréquence dominante de 25 la fonction de corrélation et par conséquent, la vitesse de rotation de la cellule. Cette vitesse est un indicateur qui permet de caractériser la cellule (élasticité, taille, densité, état cellulaire, etc.). Une fois la cellule 1 caractérisée, le flux reprend jusqu'à la cellule suivante. En itérant ce processus pour différentes fréquences, l'unité de traitement 9 est configurée 3021745 15 pour tracer le spectre des fréquences de rotation en fonction de la fréquence des ondes acoustiques appliquées sur la cellule 1. En effet, la Fig. 6 illustre les vitesses de rotations de cellules dans différents états en fonction de la fréquence de l'onde acoustique. Dans cet exemple, les cellules sont des 5 monocytes humains THP-1. L'axe des ordonnées représente la fréquence de rotation en kHz et l'axe des abscisses représente la fréquence d'excitation en kHz. On voit que pour ces cellules, la vitesse de rotation est maximale autour d'une fréquence d'excitation d'environ 30kHz. En outre, le spectre illustre quatre courbes C1-C4 correspondantes à des cellules 10 dans différentes phases. En particulier, les cellules représentées par les courbes Cl et C2 sont synchronisées à l'état GO et présentent donc respectivement des spectres en fréquence similaires. En revanche, les cellules représentées par les courbes C3 et C4 sont synchronisées à d'autres stades de développement que l'état GO et présentent respectivement des spectres en fréquence différents de ceux des cellules associées aux 15 courbes Cl et C2. Ainsi, une modélisation des vitesses de rotation permet de caractériser chaque type de cellules et donc on peut utiliser cette modélisation pour discriminer les cellules. Plus généralement, pour un objet donné (particule inerte ou cellule biologique), on peut accéder au spectre en fréquence de rotation en fonction de la fréquence 20 acoustique d'excitation. En outre, pour une fréquence acoustique donnée, on peut accéder à l'histogramme des vitesses de rotations d'une population cellulaire donnée, ou d'une famille d'objets tels des billes ou des fibres. Alternativement, pour une population d'objet, et notamment une population d'objets de même type, on peut déterminer la fréquence de rotation de chaque objet 25 pour une fréquence acoustique donnée, puis constituer l'histogramme des fréquences de rotation pour l'ensemble de la population. Cela permet de caractériser ladite population. Ainsi, selon la modélisation ad hoc des vitesses de rotation des particules étudiées, la présente invention permet de caractériser ces particules en fonction de leur état, taille, étape du cycle, état pathologique ou non, sensibilité à un médicament, etc. 30 Cette caractérisation peut être utilisée pour par exemple détecter selon une approche 3021745 16 statistique des particules présentant des anomalies ou pour appliquer au mieux une technique de sélection ou triage des particules selon différents paramètres. En particulier, l'utilisation du procédé ou dispositif de caractérisation selon l'invention en biologie permet d'accéder à des paramètres physiques (notamment 5 l'élasticité) inaccessibles avec les technologies de l'état de l'art. En outre, le procédé selon l'invention peut être appliqué pour un contrôle qualitatif de productions en grandes quantités de micro-objets (poudres, bâtonnets, fibres, etc.) et pour un tri de ces objets selon leurs caractéristiques. 10 REVENDICATIONS1. Procédé de caractérisation d'une particule dans un milieu liquide, ladite particule et ledit milieu liquide ayant des impédances acoustiques différentes, caractérisé en ce que ledit procédé comporte les étapes suivantes : - appliquer simultanément des première et seconde ondes acoustiques stationnaires (W1, W2) sur ladite particule (1), lesdites première et seconde ondes acoustiques étant configurées pour créer sur ladite particule un moment de rotation entraînant cette dernière en rotation sur elle-même, - mesurer une vitesse angulaire de ladite particule (1), et - caractériser ladite particule en fonction de sa vitesse angulaire. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'application desdites première et seconde ondes acoustiques sur ladite particule comprend les étapes suivantes : - émission de la première onde acoustique (W1) selon une première direction (D1), - émission de la seconde onde acoustique (W2) selon une seconde direction (D2) sécante à la première direction, lesdites première et seconde ondes acoustiques étant stationnaires, ayant sensiblement une même amplitude et une même fréquence et présentant entre elles un déphasage prédéterminé en fonction de l'angle de croisement desdites première et seconde directions, et - placement de ladite particule (1) au croisement desdites première et seconde directions sur un noeud de pression desdites première et seconde ondes acoustiques. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'angle de croisement desdites première et seconde directions (D1, D2) est sensiblement droit. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le déphasage entre la première onde acoustique (W1) et la deuxième onde acoustique (W2) étant sensiblement égal à n/2. 3021745 18 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la détermination de la vitesse angulaire de ladite particule comprend les étapes suivantes : 5 - capturer une succession d'images de ladite particule (1) lorsqu'elle est placée en un noeud de pression au croisement des directions desdites première et seconde ondes acoustiques stationnaires (W1, W2) pendant un temps prédéterminé, et - faire un traitement d'image sur ladite succession d'images pour déterminer la vitesse angulaire de ladite particule. 10 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit traitement d'image comprend un calcul d'une fonction de corrélation entre chaque image (lmj) de ladite particule (1) et une image de référence (1m0) sélectionnée parmi ladite succession d'images. 15 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : - déterminer une fréquence de rotation de ladite particule (1) pour différentes 20 fréquences des ondes acoustiques, et - construire un spectre de fréquences de rotation de ladite particule en fonction desdites différentes fréquences acoustiques. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comporte une 25 construction dudit spectre pour différents types de particules. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite particule est un objet vivant ou un objet inerte. 3021745 19 10. Dispositif microfluidique de caractérisation d'une particule dans un milieu liquide, ladite particule et ledit milieu liquide ayant des impédances acoustiques différentes, caractérisé en ce qu'il comporte : - un substrat (13) comprenant des premier, deuxième et troisième canaux fluidiques 5 (17, 19, 21) gravés sur une première surface (13a) du substrat et concourants dans une zone de croisement (5), lesdits premier et deuxième canaux fluidiques étant des premier et deuxième canaux acoustiques (17, 19) destinés à guider la propagation d'ondes acoustiques (W1, W2) et ledit troisième canal fluidique étant un canal de circulation fluidique (21) destiné à amener ladite particule (1) dans ladite zone de 10 croisement, - des générateurs d'ondes acoustiques (15) destinés à générer des première et seconde ondes acoustiques stationnaires suivant lesdits premier et deuxième canaux acoustiques respectivement, lesdites première et seconde ondes acoustiques étant configurées pour créer sur ladite particule un moment de rotation entraînant cette 15 dernière en rotation sur elle-même, - des moyens d'observation (7) disposés au niveau de ladite zone de croisement (5) et destinés à collecter des données d'observation relatives à ladite particule lorsqu'elle est placée dans ladite zone de croisement, et - des moyens de traitement (9) destinés à calculer une vitesse angulaire de ladite 20 particule à partir desdites données d'observation et à caractériser ladite particule en fonction de sa vitesse angulaire. 11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que lesdites première et seconde ondes acoustiques ont sensiblement une même amplitude et une 25 même fréquence, et en ce que lesdits générateurs d'ondes (15) et canaux acoustiques (17, 19) sont configurés pour former un noeud de pression au niveau de ladite zone de croisement (5). 12. Dispositif selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que les 30 premier et deuxième canaux acoustiques (17, 19) sont sensiblement orthogonaux 3021745 20 13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que lesdites première et seconde ondes acoustiques présentent entre elles un déphasage sensiblement égal à n/2. 5 14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu'il comporte : - au moins deux cavités (151a, 151b) formées dans le substrat (13), chacune étant située à au moins une extrémité desdits premier et deuxième canaux acoustiques 10 (17, 19), - une membrane déformable (31) disposée à une seconde surface (13b) du substrat (13) opposée à ladite première surface, ladite membrane déformable (31) étant destinée à assurer une étanchéité des cavités et à transmettre une excitation vibratoire dans les cavités, 15 - au moins deux générateurs d'ondes acoustiques (15) disposés aux niveaux desdites cavités en contact avec la membrane déformable (31) de manière à transmettre des ondes acoustiques dans le milieu liquide contenu dans lesdits premier et second canaux acoustiques, et - un capot (37) transparent disposé sur la première surface du substrat comportant les 20 canaux fluidiques. 15. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte deux cavités, deux générateurs d'ondes acoustiques (15) et deux réflecteurs (23), chaque canal acoustique comportant un générateur d'ondes acoustique à une 25 extrémité et un réflecteur à l'autre extrémité. 16. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte quatre générateurs d'ondes acoustiques (15), chaque canal acoustique (17, 19) comportant un générateur d'ondes acoustique à chaque extrémité. 30