Brevet FR3012151A1 — publié le 20150424

METHODE DE RECUPERATION DE METAUX D'INTERET A L'AIDE D'UN MICROORGANISME RECOMBINANT La présente invention concerne une méthode de récupération de métaux d'intérêt tel que le césium (Cs) à l'aide d'un microorganisme modifié génétiquement. Elle s'inscrit donc dans la bioremédiation. ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE Les métaux sont des matériaux couramment utilisés dans l'industrie mais qui sont en général dommageables pour l'environnement. Par conséquent, les effluents liquides nécessitent d'être décontaminés. Dans le contexte des centrales nucléaires, le risque nucléaire s'ajoute à la toxicité naturelle des métaux, faisant de leur élimination des effluents une question cruciale. Parmi les métaux relargués par les alliages d'acier utilisés dans les conduits et tuyaux, on peut citer le nickel (Ni) et le cobalt (Co), notamment son radioisotope activé 60Co. Par ailleurs, la contamination par le césium (Cs), notamment ses radioisotopes activés 134Cs et 137Cs, est également problématique. Les solutions actuelles de décontamination des effluents liquides font appel à des résines échangeuses d'ions, qui sont non-spécifiques et donc inefficaces pour la décontamination de ces métaux à faible concentration, ce qui rend ces traitement couteux. Le retrait de ces métaux est réalisé en utilisant de grands volumes de résine non-incinérable, qui doivent alors être traités comme des déchets radioactifs avec un stockage à long terme dans des centres dédiés jusqu'à l'extinction des radioisotopes. Ainsi, l'espace est un problème clef dans le stockage des déchets radioactifs. Par conséquent, il existe un besoin évident de solutions techniques moins chères, plus spécifiques et moins volumineuses pour le traitement des métaux présents dans les effluents liquides. Par ailleurs, ces métaux peuvent avoir une valeur marchande importante. Il existe donc un intérêt pour leur recyclage et leur utilisation ultérieure dans de nombreux domaines de l'industrie. La présente invention s'inscrit dans la recherche de solutions techniques permettant de séparer un composé métallique spécifique à faible concentration, dans un effluent de débit élevé. Elle s'inscrit dans le traitement biologique des déchets (bioépuration) à l'aide d'un microorganisme modifié, offrant ainsi une solution efficace, spécifique, de moindre coût et impact environnemental en comparaison avec les méthodes de traitement physico-chimiques classiques. DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention concerne un microorganisme modifié génétiquement pour la rétention d'au moins un métal d'intérêt, ledit microorganisme présentant les caractéristiques suivantes : - une capacité améliorée à capter ledit métal ; et - une capacité améliorée à adhérer à un support. Dans le cadre de l'invention, l'expression « microorganisme modifié génétiquement » signifie que le microorganisme selon l'invention ne se trouve pas dans la nature et est modifié par introduction de nouveaux éléments génétiques et/ou par délétion ou modification des éléments génétiques endogènes du microorganisme. Un tel microorganisme peut également être soumis à une pression de sélection, en combinant mutagénèse dirigée et mise en culture dans le milieu de sélection. Dans la suite de l'exposé et pour des raisons de simplification, le terme « gène » est utilisé de manière équivalente à « élément génétique ». Il s'agit donc d'une séquence d'acide nucléique, qui peut avoir tout type de fonctionnalité. Elle peut par exemple correspondre à une séquence codante (codant notamment un transporteur ou un régulateur), ou bien un promoteur. Notamment lorsqu'il s'agit d'une séquence codante, celle-ci peut être optimisée, c'est-à-dire modifiée pour intégrer les codons préférentiels de l'hôte dans lequel cette séquence est à exprimer. Selon un autre mode de réalisation privilégié, seule la séquence codante du gène d'intérêt est isolée et mise en oeuvre. Un microorganisme peut exprimer des gènes exogènes si ceux-ci sont introduits dans ledit microorganisme avec tous les éléments permettant leur expression chez le microorganisme hôte. Les techniques permettant l'introduction d'ADN exogène dans un hôte sont bien connues de l'homme du métier et comprennent notamment la transformation, l'électroporation, le transfert conjugatif, la transduction. Les gènes exogènes peuvent être intégrés dans le génome de l'hôte, notamment par recombinaison homologue ou intégration chromosomique, ou exprimé de manière extrachromosomique à l'aide de plasmide ou de vecteurs. Différents types de plasmides sont bien connus de l'homme du métier, qui diffèrent notamment par leur origine de réplication, leur promoteur (inductible ou constitutif), leur marqueur (par exemple une résistance à un antibiotique ou la capacité à croitre dans un milieu sélectif) et le nombre de copies par cellule. Selon un mode de réalisation particulier, les gènes endogènes peuvent également être modifiés pour moduler leur expression et/ou leur activité, par exemple en introduisant des mutations dans les séquences codantes pour modifier le produit du gène ou en introduisant des séquences hétérologues en plus ou en remplacement des séquences régulatrices endogènes. La modulation des gènes endogènes peut résulter en une surexpression ou une augmentation de l'activité du produit du gène endogène ou au contraire une diminution de l'expression ou de l'activité de celui-ci. Des éléments importants pour contrôler l'expression des gènes sont les promoteurs. Ainsi, les gènes peuvent être exprimés à l'aide de promoteurs de force variable, inductible ou constitutif. Selon un mode de réalisation particulier, les promoteurs utilisés dans le cadre de l'invention sont des promoteurs inductibles par le métal d'intérêt, comme par exemple le promoteur PrcnA actif en présence de nickel ou de cobalt. Alternativement, il peut s'agir d'un promoteur inductible par un composé chimique peu couteux et inerte, tel que l'IPTG (isopropyl (3-D-1-thiogalactopyranoside). Ces promoteurs peuvent être homologues ou hétérologues. Des promoteurs couramment utilisés par l'homme du métier sont par exemple Ptac, Plac, D'autres éléments importants pour contrôler l'expression des gènes sont les régulateurs, aussi bien de type activateur que répresseur. Ainsi, en modulant l'expression d'un régulateur endogène, soit au niveau de son expression (par exemple en modifiant son promoteur ou en augmentant le nombre de copies, par exemple en apportant une copie en trans sur un plasmide) soit en modifiant son activité (notamment par mutagénèse soit pour l'inactiver ou au contraire le rendre plus actif), il est possible de moduler l'expression du gène ou de l'ensemble de gènes (par exemple d'un opéron) placé sous le contrôle de ce régulateur. L'apport d'un régulateur exogène est également envisageable. Dans le cadre de l'invention, le terme « microorganisme » désigne avantageusement une bactérie, une levure ou un champignon. Préférentiellement, le microorganisme est une bactérie. De manière préférée, le microorganisme est une Enterobacteriaceae, avantageusement une espèce d'Escherichia, encore plus avantageusement une souche d'Escherichia coll. Alternativement il peut s'agir d'une souche Gram+ telle que Bacillus spp. Un microorganisme selon l'invention est destiné à récupérer au moins un métal d'intérêt. Dans le cadre de l'invention, un métal d'intérêt est avantageusement défini comme un métal présent dans les effluents liquides générés par l'industrie, en particulier par l'activité des centrales nucléaires. Il est considéré comme un contaminant dans le cadre de cette industrie mais sa récupération en vue d'une réutilisation dans une autre industrie peut être d'intérêt. Dans le cadre de l'industrie du nucléaire, il peut s'agir des produits de fission tels que l'iode (I) ou le césium (Cs), ou des produits d'activation tels que le cobalt (Co), le manganèse (Mn), l'argent (Ag) ou le nickel (Ni). L'invention peut viser les différents isotopes d'un métal donné, par exemple dans le cas du nickel 62Ni, 63Ni, 56Ni, 58Ni, 60Ni, 61Ni, 64Ni... Selon un mode de réalisation particulier, un tel métal est un cation, possiblement monovalent tel que Cs, ou divalent tel que Ni ou Co. La notion de rétention s'entend à la fois comme la possibilité d'éliminer le métal présent dans l'effluent, ou au moins de réduire sa concentration, et la possibilité de récupérer ce métal capté par le microorganisme selon l'invention, ce qui permet de l'extraire du milieu et de le stocker/concentrer au niveau du microorganisme. Bien entendu, plusieurs métaux de nature différente peuvent être visés. Ainsi, la présente invention trouve notamment des applications dans la dépollution, l'épuration des eaux ou la bioremédiation. Selon un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation d'un microorganisme tel que défini dans le cadre de la présente demande pour la dépollution des effluents notamment radioactifs ou pour la récupération du métal d'intérêt. Selon une première caractéristique avantageuse, un microorganisme selon l'invention est modifié génétiquement pour présenter une capacité améliorée à adhérer à un support. Selon l'invention, le microorganisme peut présenter naturellement une capacité à adhérer et les modifications génétiques apportées ont pour but d'améliorer cette capacité. Alternativement, le microorganisme ne présente pas naturellement de capacité à adhérer et les modifications génétiques apportées ont pour but de lui conférer cette capacité. Dans le cadre de l'invention, la « capacité à adhérer » est définie comme la capacité à se fixer à ou à s'adsorber sur un support, avantageusement une surface inerte, et plus particulièrement un support adapté dans le cadre de l'application visée à savoir la biofiltration. De manière avantageuse, il s'agit d'un support solide, encore plus avantageusement incinérable. Fonctionnellement, un tel support permet la fixation ou l'adhérence des microorganismes, notamment en raison de sa rugosité et/ou de son élasticité de surface, généralement via des liaisons Van der Walls, des interactions électrostatiques et hydrophobes. Selon un mode de réalisation particulier, il s'agit d'un support de nature organique, voire polymérique. Dans le cadre de l'invention, il a été mis en évidence qu'un support en polystyrène (PS), en PVC, en polypropylène ou en polyamide (C6H13N0), avantageusement en polystyrène, était adapté. Alternativement, il peut être envisagé un support en nylon, en coton, en sable, en verre... Ledit support peut se présenter comme une surface plane ou sous forme de structures tridimensionnelles telles que des fibres ou des billes. Ces structures, notamment des billes, peuvent être compactées dans une colonne. Ainsi et de manière plus générale, une colonne peut être garnie à l'aide d'un tel support. Selon un autre aspect, l'invention concerne également une unité de filtration ou cartouche de filtration comprenant un microorganisme et un support tel que défini ci-dessus. De manière privilégiée, le microorganisme selon l'invention adhère ou est adsorbé à la surface du support, avantageusement via ses facteurs d'adhérence. Selon un mode de réalisation particulier, le microorganisme modifié selon l'invention est capable de former un biofilm à la surface dudit support. La formation d'un biofilm présente l'avantage de conférer auxdits microorganismes une meilleure résistance aux conditions adverses, notamment à une forte teneur en métaux, et accroît leur capacité d'adsorption due aux capacités de la matrice extracellulaire du biofilm à fixer les métaux et différents polluants. A titre d'exemple, pour former ces biofilms, E. coli dispose de plusieurs structures ou facteurs d'adhérence qui peuvent être soit de nature osidique (acide colanique, cellulose...) soit de nature protéique, sous forme de monomères (adhésine) ou de polymères (fimbriae : pili de type 1, curli, pili conjugatif ..) [1]. Parmi toutes ces structures, deux d'entre elles sont particulièrement efficaces comme « colle » protéique : les curli, qui sont des polymères protéiques extracellulaires naturellement produits par certaines souches d'E. coli et qui forment à la surface de la bactérie un enchevêtrement de « fils » qui lui permet d'adhérer aux supports qu'elle colonise ; - le facteur F ou pili conjugatif ou encore pili sexuel est un polymère protéique qui se présente sous la forme d'un tube ou appendice se situant à la surface de la paroi de nombreuses bactéries à Gram négatif (dont E. coli) par lequel une bactérie transmet de l'ADN à une autre bactérie. L'expression des gènes impliqués dans la formation de ces pili conduit à la formation d'un épais biofilm par E. coli [2]. Ainsi, la présente invention vise un microorganisme dont la capacité à adhérer à un support est conférée par une augmentation de la production ou de l'activité d'au moins un facteur d'adhérence, avantageusement des curli et/ou des pili. Selon un mode de réalisation particulier, le microorganisme selon l'invention est modifié génétiquement pour produire ou surproduire les curli. Différentes solutions techniques sont envisageables : - introduire au moins une copie des gènes de structure des curli ou des gènes de biosynthèse des curli, par exemple l'opéron csg (BAEFG) d'E. colt Celui-ci peut être placé sous la régulation du métal d'intérêt ; - modifier un régulateur contrôlant la synthèse des curli. A titre d'exemple, il est possible de modifier l'activateur transcriptionnel OmpR en un super activateur des gènes de biosynthèse des curli, avantageusement via une mutation à la position 234 ([3], [4]). Selon un mode de réalisation avantageux, le microorganisme selon l'invention est obtenu par introduction de l'allèle ompR234, avantageusement par introduction dans le génome, encore plus avantageusement par transduction. Alternativement ou de surcroît, le microorganisme selon l'invention comprend au moins une copie fonctionnelle, éventuellement additionnelle, de l'opéron csg, avantageusement d'E.coli. Les gènes csgB et csgA codent les protéines de structure des curli alors que les gènes csgE, F et G codent la partie spécifique de la machinerie de sécrétion. De manière avantageuse, l'expression de cet opéron est placée sous le contrôle d'un promoteur sensible au métal d'intérêt, de sorte qu'en présence de ce métal dans le milieu, il y a une production massive de curli permettant au microorganisme d'adhérer au support en présence. De manière encore plus avantageuse, le gène codant le répresseur de ce promoteur est placé en position divergente. Lorsque la concentration intracellulaire en métal est suffisante, le métal se fixe sur le répresseur et l'inactive, d'où la transcription des gènes nécessaires à la production de curli. Il peut par exemple s'agir du répresseur rcnR sensible à la présence de cobalt et de nickel, en combinaison avec le promoteur PrcnA [5]. Selon un autre mode de réalisation, le microorganisme selon l'invention est modifié génétiquement pour produire ou surproduire les pili, avantageusement le facteur F. Ceci peut notamment être obtenu par introduction d'un plasmide codant le facteur F, avantageusement par transfert conjugatif. De manière connue [2], le plasmide F est un grand ADN circulaire, d'environ 100 kb, constitué de trois grandes catégories de gènes : - les gènes tra ; - les gènes de résistances ; et - les gènes de métabolisme. Les gènes tra sont impliqués dans les phénomènes de régulation, la synthèse du pilus, la stabilisation de l'agrégation, et dans le métabolisme de transfert. Le pilus F est une structure protéique creuse qui sert de lien entre la bactérie donneuse et la bactérie receveuse. Une bactérie produisant le pilus F va adhérer aux bactéries voisines. Le pilus F permet également l'adhésion de la bactérie à un support inerte. Ces deux approches peuvent être combinées, c'est-à-dire que le microorganisme est modifié génétiquement pour à la fois produire ou surproduire les curli et les pili. Selon un mode de réalisation privilégié, la ou les structures d'adhérence produites ou surproduites dans un microorganisme selon l'invention présentent une capacité à fixer le métal d'intérêt. De manière avantageuse pour détecter l'adhérence du microorganisme selon l'invention, en particulier la formation de biofilms, il est également possible de le rendre détectable visuellement, notamment par fluorescence. Les moyens correspondants sont connus de l'homme du métier. Il peut par exemple s'agir de l'introduction d'un gène codant une protéine fluorescente, avantageusement autofluorescente telle que la GFP (« Green Fluorescent Protein »), avantageusement par insertion chromosomique. Selon une seconde caractéristique avantageuse, un microorganisme selon l'invention est modifié génétiquement pour présenter une capacité améliorée à capter au moins un métal d'intérêt. Selon l'invention, le microorganisme peut présenter naturellement une capacité à capter ce métal et les modifications génétiques apportées ont pour but d'améliorer cette capacité. Alternativement, le microorganisme ne présente pas naturellement de capacité à capter ce métal et les modifications génétiques apportées ont pour but de lui conférer cette capacité. De manière avantageuse, la capacité à capter le métal est liée à la capacité du microorganisme à faire entrer le métal et/ou à empêcher sa sortie. En d'autres termes, le microorganisme est modifié pour : - augmenter la production ou l'activité de la ou des pompe(s) d'influx du métal, et/ou - diminuer voire bloquer la production ou l'activité de la ou des pompe(s) d' efflux du métal. Ces pompes peuvent êtres des transporteurs spécifiques du métal en question, éventuellement de plusieurs métaux d'intérêt, ou une pompe ionique capable de prendre en charge plusieurs ions. Par exemple et dans le cas particulier du cobalt ou du nickel, il est possible de : - greffer un transporteur spécifique du cobalt, avantageusement codé par les gènes NiCoT provenant préférentiellement de Rhodopseudomonaspalustris ou Novosphingobiumaromaticivorans ([6]), avantageusement par leur apport sur un plasmide multicopies sous le contrôle du promoteur Ptac; et/ou - inactiver la pompe d'efflux qui vide la cellule du cobalt en excès, avantageusement par délétion ou inactivation du gène rcnA [7]. A noter que le transporteur NiCoT est également un transporteur du nickel. Ainsi, la production ou la surproduction de ce transporteur permet à la fois la capture du cobalt et du nickel. Il en est de même pour la pompe d'efflux. Dans le cas du césium, aucun transporteur spécifique n'a été trouvé à ce jour. Toutefois, l'étude de la bioaccumulation du 137Cs montre que différents organismes, aussi bien des bactéries, des champignons, que des plantes (par exemple Rhizopusarrhizus, Penicillium chrysogenum ou Saccharomyces cerevisae) sont capables de l'accumuler en quantités différentes [8]. L'accumulation du césium par ces organismes est bien documentée mais peu de travaux ont permis de caractériser les gènes impliqués. Dans le cas où le transporteur permettant l'entrée du césium a été identifié, il s'agit en général d'un canal potassique. Certains de ces canaux ne sont pas spécifiques et ne font pas la distinction entre les ions potassium (K+), rubidium (Rb+) et césium (Cs+) car ceux-ci ont des caractéristiques physiques (rayon ionique, valence...) semblables [8]. Selon un mode de réalisation particulier en relation avec la rétention du césium, la pompe d'efflux d'intérêt est le système Kup (« K+uptake » ; [9]) qui est un canal permettant le transport des ions potassium (K+) et césium (Cs+) chez E. colt L'amplification de la capacité à capter le métal peut donc être obtenue par expression ou surexpression du gène kup, par exemple d'E. coui, avantageusement apporté par un plasmide multi-copies. Avantageusement, la séquence codante du gène kup est placée sous un promoteur Ptrc, dérivé du promoteur Plac et inductible par l'IPTG. Selon un mode de réalisation particulier, un microorganisme selon l'invention se présente sous forme lyophilisée, ce qui permet son stockage et sa conservation. Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'une unité de filtration tel que définie ci-dessus. Plus précisément et de manière avantageuse, un tel procédé comprend les étapes suivantes : - incubation du support, du microorganisme et d'un milieu de culture adapté au microorganisme permettant le développement de sa capacité à adhérer audit support et à capter le métal d'intérêt, avantageusement pendant au moins 24 heures ; - élimination du milieu de culture ; - éventuellement ajout d'un milieu de culture acidifié, avantageusement à l'aide de HC1, et/ou carencé en ions transportés par la pompe d'influx du métal d'intérêt, avantageusement carencé en K+ dans le cas de la pompe K+/Cs+. Dans un premier temps, du milieu de culture du microorganisme en présence est ajouté au support puis ensemencé à l'aide du microorganisme selon l'invention dont les caractéristiques génétiques dépendent notamment du métal d'intérêt. Un milieu de culture adapté permet la survie et la multiplication du microorganisme, avantageusement pendant une durée d'au moins 24 heures, voire 48 heures. En outre, ce milieu contient avantageusement les composés permettant d'exercer une pression de sélection sur le microorganisme, notamment un ou plusieurs antibiotiques à une concentration adaptée, assurant ainsi le maintien des caractéristiques génétiques introduites dans le microorganisme. Par ailleurs, il peut également contenir les inducteurs nécessaires à l'activité des promoteurs recombinants introduits dans le microorganisme et gouvernant l'expression des gènes d'intérêt. Un milieu de culture adapté désigne un milieu, avantageusement un milieu liquide, stérile, qui comprend les nutriments essentiels ou bénéfiques au maintien et/ou à la croissance des cellules tels que des sources de carbone ou un substrat carboné ; des sources d'azote, par exemple de la peptone, des extraits de levure, des extraits de viande, des extraits de malt, de l'urée, du sulfate d'ammonium, du chlorure d'ammonium, du nitrate d'ammonium et du phosphate d'ammonium ; des sources de phosphore, par exemple du phosphate monopotassique ou bipotassique, ; des éléments de trace (notamment des sels de métaux), par exemple des sels de magnésium, de cobalt et/ou de manganèse ; ainsi que des facteurs de croissance tels que des acides aminés, des vitamines, .... Des milieux de croissance bien connus de l'homme du métier sont par exemple les milieux M9 ou M63. Tout milieu ayant une composition identique ou similaire peut donc être mis en oeuvre. Les conditions de culture sont définies par l'homme du métier en fonction du microorganisme en présence. Elles concernent plus particulièrement : - la température, généralement entre 20 et 55°C, voire entre 25 et 40°C, avantageusement 37°C pour E. coli ; - la présence d'oxygène, à savoir des conditions d'aérobiose (dans lesquelles l'oxygène est fourni en dissolvant du gaz dans la phase liquide), des conditions de micro-aérobie (dans lesquelles un mélange de gaz contenant de 0.1 à 10% d'oxygène complété avec de l'azote est dissous dans la phase liquide), ou des conditions d'anaérobie (par exemple par barbotage d'un gaz inerte comme l'azote dans le milieu de culture). Pendant cette première phase, le microorganisme doit se multiplier et exprimer les facteurs d'adhérence nécessaire à sa fixation au support. Dans le même temps, le système d'influx du métal d'intérêt doit être mis en place. Après croissance, le milieu de culture est éliminé. A l'issue de cette étape, le microorganisme selon l'invention est donc adsorbé à la surface du support et l'unité de filtration est prête à l'emploi. Il suffit alors de mettre en contact l'effluent liquide à traiter, comprenant avantageusement le métal d'intérêt. Selon un mode de réalisation particulier, l'unité de filtration se présente sous la forme d'une cartouche ou d'une colonne et la mise en contact avec l'effluent se fait par écoulement, grâce à la gravité ou à l'aide d'une pompe. Il peut parfois être nécessaire de soumettre l'unité de filtration à un prétraitement, avant sa mise en contact avec l'effluent à traiter. C'est notamment le cas lorsque la pompe d'influx n'est pas un transporteur spécifique du métal d'intérêt, comme c'est le cas des pompes à césium qui sont également des pompes à potassium. Dans ce cas et pour augmenter la capacité du microorganisme à pomper ou capter le métal d'intérêt, il est avantageux de : - incuber le microorganisme ou l'unité de filtration en présence d'un milieu acidifié, avantageusement un milieu de culture acidifié. L'acide chlorhydrique (HC1) est préférentiellement utilisé pour acidifier le milieu à un pH avantageux de 5 ; et/ou - incuber le microorganisme ou l'unité de filtration en présence d'un milieu, avantageusement un milieu de culture carencé en ions transportés par la pompe d'influx du métal d'intérêt, avantageusement carencé en K+ dans le cas de la pompe K+/Cs+. Cette incubation peut durer plusieurs minutes, avantageusement pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes. La présente invention va être illustrée plus avant en rapport avec une souche d'E.coli modifiée génétiquement pour former un biofilm présentant la capacité à adsorber le césium (Cs). En d'autre terme, elle concerne l'élaboration d'un biofiltre bactérien pour la rétention de césium. Toutefois, ces exemples ne sont en aucun cas limitatifs. FIGURES La figure 1 représente la contribution respective des curli et du facteur F à l'adhérence d'E. coli MG1655 au polystyrène. Quantification de l'adhérence sur plaque 24 puits, une seule mesure par souche cultivée en milieu M63Mt1 (KH2PO4 13,6 g/L ; (NH4)2SO4 2 g/L ; FeSO4 7H20 0,5 mg/L ; MgSO4 7H20 0,2 g/L pH 7,2 (ajusté avec KOH) + Mannitol 2%). - : pas de production ; +++ : forte production. L'ensemble des souches et plasmides utilisés sont référencés dans le Tableau 1. La figure 2 représente la masse de césium accumulé (ng) par unité de masse bactérienne (mg de poids sec) pour une souche surproduisant ou non le transporteur Kup de Cs (Ass31 et Ass34, respectivement) en présence de quantités initiales variables de Cs dans le milieu : 6650 lag ou 2,5 mM (A) ; 665 lag ou 0,25 mM (B) ; 66,5 lag ou 0,025 mM (C). La figure 3 représente le dopage des capacités de bioaccumulation du césium d'E.coli par implantation du transporteur Kup. Quantités de césium accumulées par gramme de poids sec bactérien par la souche produisant le transporteur Kup (Ass31) représentées par des carrés, à comparer aux quantités de césium accumulées par la souche isogénique non productrice du transporteur Kup (Ass34) représentées par des cercles. Un agrandissement de la zone de faible concentration initiale en césium figure en encart. La figure 4 quantifie l'influence de la présence du couple {Ptrc/IPTG} sur la production du transporteur Kup et donc sur l'accumulation du césium en milieu acidifié. EXEMPLES MATERIEL ET METHODES 1/ Souches (Tableau 1), plasmides et produits de PCR (Tableau 2) : ID Description de la Genotype Phénotype (adhérence, résistance,...) référence souche Ass01 818x962 selection MG1655 malT :: Tn/O ompR234, F' p0Xgen, clonel Adhérence (curli et facteur F) GmR, TetR Gm Tet clone 1 Ass05 Collection biofilm MG1655 csgA::uidA-kan malT::Tn10 (ompR +) KanR, TetR [10] 856 Ass09 Collection biofilm MG1655 malT :: Tn/O ompR234 TetR [10] 818 Ass13 856x962 selection MG1655 csgA::uidA-kan Adhérence (Facteur F) , GmR, TetR, KanR Gm Tet (20.03) malT::Tn10 pOxgen :Tn10 (ompR +), F Ass31 Ass19 / pAss06 MG1655 CmR malT::Tn10 ompR234 PA1/04/03-gfpmut3*, F' pOXgen, pAss06 Adhérence (Facteur F et curlis) GmR CmR clone G , , , TetR KanR Fluorescence, transporteur Cs+ Ass34 Ass19 / pASSO7 MG1655 CmR malT::Tn10 ompR234 PA1/04/03-gfpmut3*, F pOXgen, pAss07 Adhérence (Facteur F et curlis), GmR, CmR, TetR, KanR, Fluorescence Tableau 1 : liste des souches ID Description du plasmide ou du produit de PCR Référence pAss06 Fusion Ptrc-RBS-kup cloné aux sites EcoRI/Psti de pSB1K3 KanR pAss07 Promoteur Ptrc cloné aux sites EcoRI/Psti de pSB1K3 KanR F'pOXgen Plasmide dérivé du facteur F possédant les gènes tra (synthèse des pili F et transfert conjugatif) et un gène de résistance à la gentamicine. Transférable par conjugaison. [11] Primer ctgcagcggccgctactagtaTTAGATTTCGACCTGAGTAC Synthèse Reverse trkD Genecust MG1655 Primer gaattcgcggccgcttctagATGAGCACTGATAATAAGCAA Synthèse Forward trkD Genecust MG1655 Tableau 2 : liste des plasmides et produits de PCR 2/ Evaluation de l'adhérence : Le milieu de culture des bactéries est une boîte de Pétri, dont le matériau constitutif est du polystyrène. L'évaluation des performances d'adhérence de la souche est donc réalisée sur ce matériau. Les performances d'adhérence ont été évaluées par détermination du pourcentage d'adhérence en plaque 24 puits en polystyrène, par estimation du nombre de bactéries par mesure de la densité optique à 600 nm après fractionnement de la culture en une fraction composée du surnageant (bactéries libres) et une fraction constituée par le biofilm (bactéries fixées). 3/ Evaluation de l'absorption de Césium : Les tests réalisés dans cette étude utilisent l'isotope stable non radioactif du césium, 133CS. La capacité d'accumulation du césium des souches cultivées sous forme de biofilm a été estimée par dosage ICP-MS (InductivelyCoupled Plasma/ Mass Spectrometry). Les tests d'accumulation menés permettent de connaître à la fois la quantité de césium que chaque bactérie est en mesure d'accumuler, ainsi que la valeur potentielle de saturation de la capacité bactérienne d'accumulation. Ces tests ont comporté les phases distinctes suivantes : A/ Culture du biofilm en M63 Mtl (KH2PO4 13,6 g/L ; (NH4)2SO4 2 g/L ; FeSO4 7H20 0,5 mg/L ; MgSO4 7H20 0,2 g/L pH 7,2 (ajusté avec KOH) + Mannitol 2%) en boîte de Petri pendant 48h. B/ Sevrage en ions potassium de 30 minutes. Cette phase s'effectue en milieu M9 sans potassium (Na2HPO4, 7H20 12,8 g/L, NH4C1 1 g/L, NaC1 0,5 g/L, MgSO4 2 mM, CaC12 0,1 M, pH 7 ajusté avec NaOH + Mannitol 2%), afin de ne pas concurrencer la capacité d'importation intracellulaire de l'élément césium. La solution mère de césium est préparée à partir de chlorure de césium >99,9% (qualité analytique, Fisher®), dilué dans de l'eau acidifiée avec de l'acide nitrique à 2% (pH de la solution mère 1,3). Cette solution mère est diluée au moins 1000 fois lors de son ajout dans le milieu circulant dans le procédé lors de la phase d'épuration et modifie peu le pH du milieu M9Mt1 sans potassium utilisé (pH7). C/ Phase d'accumulation du césium de 2 heures à 37°C. Le transport actif des métaux par les bactéries est très rapide (quelques minutes) et les expériences de bioaccumulation se conduisent généralement en moins d'une heure ([12,-13]). Afin de maximiser l'efficacité de la capture les essais ont été effectués sur 2h. Après incubation du biofilm avec le M9 sans potassium mais contenant différentes concentration de césium, le surnageant est prélevé. Le biofilm est rincé puis récupéré par grattage. D) Analyse des échantillons de surnageants et de biofilms par ICP-MS. Trois concentrations de césium ont été testées en triplicat : 2,5 mM, 0,25 mM et 0,025 mM. La capacité de biosorption est exprimée en masse de césium accumulé (ng) par unité de masse bactérienne (mg de poids sec). RESULTATS Exemple 1 : Optimisation de l'adhérence Une souche d'E. cou MG1655 dont le gène ompR est muté à la position 234 transformant l'activateur transcriptionnel OmpR en un super activateur des gènes de biosynthèse des curli a été utilisée ([3], [4]), correspondant à la souche Ass09. Une deuxième structure d'adhérence a été implantée pour venir renforcer les capacités adhésives de la souche MG1655 ompR234 . La surproduction des pili a été obtenue par transfert conjugatif du plasmide F'pOXgen dans la souche Ass09, donnant la souche Ass01. Pour faciliter la visualisation puis la quantification de l'adhérence par microscopie, ainsi que repérer facilement un éventuel détachement du biofilm, une version fluorescente de la souche Ass01 a été construite par insertion chromosomique d'un gène codant une protéine autofluorescente (GFP). La souche ainsi créée est référencée Ass19. Exemple 2 : Optimisation de la capture de césium La souche Ass19 a été choisie comme support (« chassis ») pour accueillir le plasmide portant la construction permettant la synthèse du transporteur de potassium et de césium Kup (pAss06portant la construction génétique Ptrc-kup). Cette souche Ass19 transformée par pAss06 est référencée Ass31. Cette souche possède donc quatre caractéristiques : 1) autofluorescence ; 2) surproduction de curli ; 3) surproduction de pili F ; et 4) surproduction du transporteur de potassium et de césium Kup. Chacune de ces propriétés est associée à un marqueur antibiotique (respectivement Chloramphénicol, Tétracycline, Gentamicine et Kanamycine). Par ailleurs, une souche contrôle Ass34 a été construite. Il s'agit de la même souche qu'Ass31 pour les caractéristiques de fluorescence et d'adhérence (MG1655 fluorescente surproduisant les curli et le Facteur F), mais le plasmide résistant à la Kanamycine est déficient pour la production du transporteur Kup (plasmide contrôle pAss07, contenant uniquement le promoteur Ptrc sans la séquence codante du transporteur). Exemple 3 : Evaluation de l'adhérence Les contributions respectives des curli et du Facteur F dans le phénomène d'adhérence pour la souche MG1655 sont représentées Figure 1. Ces résultats montrent qu'aussi bien la production de pili conjugatifs (souche Ass13) que de curli (souche Ass09) permet d'augmenter l'adhérence alors qu'une adhérence maximale au polystyrène est observée lors d'une production combinée de pili conjugatifs et de curli (souche Ass01). De manière attendue, la souche fluorescente Ass19 présente un profil d'adhérence (86 ± 4% sur 6 répétitions) comparable à la souche Ass01. Par ailleurs, l'adhérence de la souche Ass31 surproduisant le transporteur du césium est remarquable avec un pourcentage d'adhérence au polystyrène de 98% (±1,5 sur 6 répétitions). Exemple 4 : Evaluation de l'accumulation de césium La figure 2 compare les résultats obtenus pour les deux souches Ass31 et Ass34 selon la concentration de césium dans le milieu. Les résultats montrent un gain d'accumulation important, variant d'un facteur 8 à 84, dépendant de la concentration en césium dans le milieu. Les facteurs d'accumulation obtenus sont respectivement de 8,34 et 84 pour des concentrations en césium de 0,025 mM (66,5 lag de césium présents dans les 20 mL baignant les bactéries), 0,25 mM (665 pg de césium présents dans les 20 mL baignant les bactéries) et 2,5 mM (6650 lag de césium présents dans les 20 mL baignant les bactéries). Ces résultats montrent que l'implantation de la construction génétique Ptrc-kup permet une augmentation significative de la capacité de biosorption de la souche bactérienne initiale. Les valeurs de capacité de biosorption ainsi obtenues ont ensuite été représentées en fonction de la quantité de césium présente dans le milieu (Figure 3). Il apparaît une capacité d'accumulation bactérienne croissante avec la teneur en césium du milieu. L'absence d'un palier ou d'un fléchissement de la croissance de la caractéristique ainsi obtenue démontre que la saturation du système n'a pas encore été atteinte avec les concentrations en césium testées. Exemple 5 : Optimisation de l'accumulation de césium Dans la souche Ass31, le gène Kup est placé sous le contrôle d'un promoteur fort nommé Ptrc. Ce promoteur actif dans par défaut peut être sur-induit par l'introduction d'isopropyl 13Dlthiogalactopyranoside (IPTG) dans le milieu avec comme conséquence attendue une surproduction du transporteur Kup, et donc une plus grande capacité d'accumulation du césium par la souche bactérienne Ass31. Afin de tester ce gain potentiel d'efficacité, la souche Ass31 a été cultivée en biofilm en présence d'IPTG. D'autre part, toujours dans un objectif d'optimisation des capacités de sorption, le milieu a été acidifié à l'aide d'un acide minéral (HC1) ou d'un acide organique (Acide Malique). Après sevrage en ions K+, le biofilm a été mis au contact d'une solution à pH 5 de césium 25 nM, 2,51.1M et 250 1.1M pendant 10 minutes. Les meilleures performances ont été atteintes en milieu acide chlorhydrique, et pour la concentration molaire de césium la plus faible testée, à savoir 25 nM. Par comparaison aux résultats présentés à la figure 2, les bactéries élevées dans l'IPTG et placées dans ces conditions permettent une accumulation de césium plus de 200 fois supérieure à celle du mutant non induit (Figure 4). Le couplage {promoteur Ptrc/IPTG} apporte donc un gain d'efficacité spectaculaire dans le cadre de la conception d'un biofiltre épurateur de césium. REFERENCES 1. Beloin, C., A. Roux, and J.M. Ghigo, Escherichia coli biofilms. Curr Top Microbiol Immunol, 2008. 322: p. 249-89. 2. Ghigo, J.M., Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development. Nature, 2001. 412(6845): p. 442-5. 3. Vidal, O., et al., Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J Bacteriol, 1998. 180(9): p. 2442-9. 4. Jubelin, G., et al., CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J Bacteriol, 2005. 187(6): p. 2038-49. 5. Blaha D et al., The Escherichia coli metalloregulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site : insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie, 2011 93:434-439. 6. Raghu, G., et al., Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl Microbiol Biotechnol, 2008. 81(3): p. 571-8. 7. Rodrigue A, Effantin G and Mandrand-Berthelot MA Identification of rcnA (yohM), a nickel and cobalt resistance gene in E. coli. 2005 J. Bacteriol. 187: 2912-2916. 8. Avery, S.V., Cesium accumulation by microorganisms: uptake mechanisms, cation competition, compartmentalization and toxicity. J Ind Microbiol, 1995. 14(2): p. 7684. 9. Bossemeyer, D., A. Schlosser, and E.P. Bakker, Specific cesium transport via the Escherichia coli Kup (TrkD) K+ uptake system. J Bacteriol, 1989. 171(4): p. 221921 10. Prigent-Combaret, C., et al., Complex regulatory network controls initial adhesion and biofilm formation in Escherichia coli via régulation of the csgD gene .J Bacteriol. 2001 Dec;183(24):7213-23. 11. Johnson, RC, Reznikoff WS., Copy number of Tn5 transposition Genetics 1984 May; 107(1): 9-18. 12. Deng, X., et al., Bioaccumulation of nickel from aqueous solutions by genetically engineered Escherichia coli. Water Res, 2003. 37(10): p. 2505-11. 13. Deng, X., X.E. Yi, and G. Liu, Cadmium removal from aqueous solution by genemodified Escherichia coli JA1109. J Hazard Mater, 2007. 139(2): p. 340-4. REVENDICATIONS1. Microorganisme modifié génétiquement pour la rétention d'au moins un métal d'intérêt, ledit microorganisme présentant les caractéristiques suivantes : - une capacité améliorée à adhérer à un support, conférée par une augmentation de la production ou de l'activité d'au moins un facteur d'adhérence ; et - une capacité améliorée à capter ledit métal, conférée par une augmentation de production ou d'activité d'une pompe d'influx dudit métal. 2. Microorganisme selon la revendication 1 caractérisé en ce que le microorganisme est une bactérie, avantageusement Escherichia coli. 3. Microorganisme selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la capacité à adhérer à un support est conférée par une augmentation de la production ou de l'activité des curli et/ou des pili. 4. Microorganisme selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la capacité à capter au moins un métal d'intérêt est en outre conférée par inhibition d'une pompe d'efflux dudit métal. 5. Microorganisme selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il exprime un marqueur fluorescent, par exemple la protéine GFP. 6. Microorganisme selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le métal d'intérêt est le césium (Cs). 7. Microorganisme selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il porte la mutation ampR234. 8. Microorganisme selon la revendication 6 ou 7 caractérisé en ce qu'il exprime ou surexprime le facteur F, avantageusement par transfert conjugatif d'un plasmide codant le facteur F. 9. Microorganisme selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisé en ce qu'il exprime ou surexprime la pompe Kup, avantageusement par apport de la séquence codante sur un plasmide multi-copies. 10. Utilisation d'un microorganisme selon l'un des revendications 1 à 9 pour la dépollution des effluents notamment radioactifs ou pour la récupération du métal d'intérêt. 11. Unité de filtration comprenant un support et un microorganisme selon l'un des revendications 1 à 9, ledit microorganisme étant avantageusement adsorbé à la surface dudit support. 12. Unité de filtration selon la revendication 11 caractérisée en ce que le support est en polystyrène. 13. Procédé de préparation d'une unité de filtration selon la revendication 11 ou 12 comprenant les étapes suivantes incubation du support, du microorganisme et d'un milieu de culture adapté au microorganisme permettant le développement de sa capacité à adhérer audit support et à capter le métal d'intérêt, avantageusement pendant au moins 24 heures ; élimination du milieu de culture ; éventuellement ajout d'un milieu de culture acidifié, avantageusement à l'aide de HC1, et/ou carencé en ions transportés par la pompe d'influx du métal d'intérêt, avantageusement carencé en K+ dans le cas de la pompe K+/Cs'. 14. Procédé de décontamination d'un effluent contenant au moins un métal ou de récupération d'au moins un métal à partir d'un effluent comprenant une étape de mise en contact entre le microorganisme selon l'un des revendications 1 à 9 et ledit effluent. 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que l'effluent est mis à écouler dans une unité de filtration selon la revendication 11 ou 12.