Brevet FR3012152A1 — publié le 20150424

DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne des tests biologiques, l'étude du développement des animaux, et des évaluations de toxicologie 5 environnementale et écologiques. RESUME DE L'INVENTION L'invention décrit les séquences d'amorces d'ADN conçues pour 10 la détermination d'informations sur des gènes ou des transcrits d'espèces d'anoures. Il existe des milliers d'espèces d'anoures connues dans le monde entier et l'obtention d'informations génétiques à partir de chaque espèce pour le développement de tests de réaction en chaîne par polymérase en temps réel quantitative (qPCR) n'est pas réalisable. Notre 15 invention comprend une ou plusieurs paires d'amorces conçues spécialement qui peuvent être appliquées à diverses espèces d'anoures recouvrant des centaines de millions d'années dans l'évolution, incluant les espèces communément utilisées dans des études de laboratoire pour des tests de développement et/ou de toxicité et les espèces sentinelles 20 utilisées pour des évaluations de toxicologie environnementale ou écologiques. Il est décrit ici des conditions optimisées pour l'utilisation de ces amorces dans des exemples de tissus d'anoures. Un autre aspect de l'invention est un test à haut rendement sensible, rapide, utile pour soutenir une évaluation de risques potentiels sur des clades de vertébrés, 25 et qui est utile aussi pour l'évaluation de mélanges de contaminants complexes. ARRIERE-PLAN 30 Les amphibiens sont utilisés largement comme organismes modèles scientifiques dans la recherche sanitaire et environnementale, comme organismes tests, et ont un rôle indéniable comme espèces sentinelles, comme source d'aliments et dans la lutte contre les insectes. Contrairement aux mammifères ayant des ressources génomiques 35 étendues, il existe un défi particulier pour évaluer les points finaux de l'expression génique dans les espèces d'amphibiens où les clades présentent une divergence dans l'évolution de plus de 300 millions d'années (AmphibiaWeb 2012). Parmi les amphibiens, les grenouilles et les crapauds qui représentent les anoures sont les plus nombreux sur la planète, représentant plus de 6 000 des quelque 7 000 espèces connues (AmphibiaWeb 2012). Malgré ce nombre impressionnant, seules deux espèces de pipidés étroitement apparentées, Xenopus /aevis et Xenopus tropicalis, ont des ressources génomiques suffisantes pour des études d'expression génique. Toutefois de nombreuses autres espèces incluant celles qui ont divergé il y a plus de 200 millions d'années, servent d'espèces importantes, régionalement et globalement. Il existe un déficit d'informations génomiques les plus minimales conduisant à un investissement significatif en temps et en ressources ne serait-ce que pour cloner une partie d'un gène individuel afin de développer des outils d'expression génique validés pour une espèce d'intérêt. Pour contourner cette difficulté, nous avons développé une suite de séries d'amorces prêtes pour la qPCR qui identifient des gènes particuliers et/ou leurs transcrits. Chaque paire d'amorces a été validée pour fonctionner selon des critères stringents dans des espèces aussi diverses que les pipidés et les ranidés. L'utilisation de ces séries d'amorces fournit une solution simple à faible coût au problème de comparaison entre les espèces des réponses et des sensibilités. Les perturbateurs endocriniens (EDC) sont des substances chimiques, environnementales ou artificielles, qui perturbent les voies de signalisation endocrines des humains et de la faune. L'exposition à des EDC conduit souvent au cancer, à des problèmes de fécondité et à d'autres maladies (Vandenberg, Colborn et al. 2012). De ce fait, le risque provenant de ces effets d'exposition a conduit à un grand besoin de procédés sensibles et appropriés pour indiquer les effets délétères des EDC. Pour cette raison, il existe un intérêt considérable dans le développe- ment de nouveaux tests diagnostiques pour détecter des EDC dans l'environnement ainsi que dans des produits destinés à la consommation humaine ou qui sont utilisés pour emballer des produits alimentaires comme les récipients alimentaires en plastique. Plus de 80 000 substances chimiques sont enregistrées comme étant utilisées aux USA (NIEHS 2013) et il existe des soucis croissants concernant leur impact car il est maintenant établi que les EDC ne suivent pas la règle classique de "la 301 2 1 5 2 3 dose fait le poison" (Vandenberg, Colborn et al. 2012). Au contraire, des réponses non monotones et des effets à faible dose sont communs actuellement dans les études d'hormones naturelles et des EDC et des liens clairs entre les expositions environnementales aux EDC et les 5 maladies/ incapacités humaines deviennent évidents (Vandenberg, Colborn et al. 2012). Les EDC sont trouvés généralement à faibles concentrations dans l'environnement, mais des quantités même très petites peuvent avoir un impact démontrable comme perturbateurs hormonaux. En fait, une activité biologique peut être détectée au-dessous 10 des limites de détection analytique courantes et la mesure des EDC dans le contexte de mélanges complexes comme un effluent d'eaux usées municipales n'est pas nécessairement un bon prédicteur d'activité biologique (Quanrud et Propper 2010). Etant donné que de nombreux écosystèmes aquatiques contiennent des concentrations significatives de 15 contaminants environnementaux (Kolpin, Furlong et al. 2002), et que beaucoup de ces composés et/ou leurs métabolites ont été détectés dans le plasma humain (National Report on Human Exposure to Environmental Chemicals, Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services, http://www.cdc.gov/exposurereport), nous 20 avons développé une suite d'outils pour indiquer les effets délétères des EDC. De tels cribles peuvent être utilisés comme évaluation de premier niveau des risques sanitaires d'exposition pour les espèces de la faune et les êtres humains. La majeure partie de ce que nous connaissons concernant les EDC concerne des substances qui perturbent les voies de 25 signalisation des estrogènes et des technologies pour détecter les EDC estrogènes ont été développées (Van Aggelen, Ankley et al. 2010; Necker et Hollert 2011). BREVE DESCRIPTION DES DESSINS 30 La FIGURE 1 est un cladogramme représentant certaines familles majeures de l'ordre des anoures. Les FIGURES 2A(1) à 2A(10) ; 2B(1) à 2B(10) et 2C(1)-2C(10) illustrent les résultats du processus d'assurance/ contrôle de 35 qualité à trois étages démontrant l'activité des séries d'amorces selon un mode de réalisation de l'invention. La FIGURE 3 illustre les résultats d'une démonstration de sensibilité aux hormones thyroïdiennes des transcrits de gènes cibles dans Rana catesbeiana selon un mode de réalisation de l'invention. La FIGURE 4 est une autre illustration des résultats d'une 5 démonstration de sensibilité aux hormones thyroïdiennes des transcrits de gènes cibles dans Rana catesbeiana selon un mode de réalisation de l'invention. La FIGURE 5 est une illustration des résultats d'une démonstration de sensibilité aux hormones thyroïdiennes des transcrits de 10 gènes cibles dans Xenopus /aevis selon un mode de réalisation de l'invention. La FIGURE 6 illustre les résultats de tests démontrant que des séries d'amorces selon un mode de réalisation de l'invention sont utilisables dans une large plage d'espèces d'anoures. 15 La FIGURE 7 sont des illustrations d'exemples représentatifs de performances de séries d'amorces sur l'ADN génomique sur différentes espèces d'anoures. DESCRIPTION DETAILLE DE L'INVENTION 20 Les hormones thyroïdiennes (TH) sont cruciales pour la croissance, le développement et le métabolisme normaux chez tous les vertébrés y compris les êtres humains (Morreale de Escobar, Obregon et al. 2004; Zoeller et Rovett 2004). Chez les mammifères foetaux et 25 nouveau-nés, des contaminants environnementaux comme le perchlorate et les biphényles polychlorés (PCB) ont un impact sur l'action des TH contribuant à de graves défauts dans le développement et la fonction d'organes incluant des déficits cognitifs et moteurs, une croissance osseuse anormale, des problèmes cardiaques et un métabolisme des 30 lipides altéré (Zoeller et Rovett 2004; Bernai 2005; Cheng 2005; Siesser, Cheng et al. 2005; Liu et Brent 2010). Le cerveau est particulièrement vulnérable (Porterfield 1994; Brucker-Davis 1998; Jones, Thoemke et al. 2005; Zoeller 2005; Zoeller et Crofton 2005) et l'impact d'un hypothyroïdisme modéré pendant les phases développementales critiques 35 peut avoir des coûts sociétaux significatifs (Miller, Crofton et al. 2009). Chez les amphibiens, les TH sont nécessaires pour la métamorphose du 301 2 1 5 2 têtard en grenouille juvénile et une perturbation de l'action des TH conduit à l'inaptitude de la grenouille à se développer normalement (Shi 2000). De ce fait, une modification de l'action des TH au cours des stades précoces de l'histoire de la vie peut conduire à des issues délétères dramatiques 5 pour les êtres humains et les espèces de la faune. Les mécanismes de l'action des TH sont communs parmi les vertébrés et impliquent une voie régulatrice complexe, cependant le haut degré de sensibilité à une perturbation des TH du têtard a été identifié comme substitut puissant pour l'identification de substances chimiques et/ou de contaminants qui 10 perturbent la signalisation des TH chez les vertébrés. (OECD 2009; Helbing 2012). L'invention présente un procédé innovant qui est basé sur une lecture d'expression génique pour détecter les activités perturbant les TH utilisant des espèces d'anoures comme organismes modèles, ce qui 15 améliore largement la puissance du test de métamorphose de têtards de grenouille dans l'aptitude à la prédiction et l'applicabilité aux tests de laboratoire et aux applications sur site sur une plage de toutes les espèces sentinelles de grenouilles. De plus, l'invention décrit des séries d'amorces d'ADN validées pour des gènes qui sont essentiels comme références ou 20 "normaliseurs". Ces normaliseurs peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec des amorces utilisées pour évaluer la réactivité aux TH, ce qui augmente la plage d'utilité et d'application. De plus, cette série de gènes normaliseurs n'est pas seulement spécifique de la fonction thyroïdienne, mais servira aussi de suite robuste de gènes de référence 25 pour tout type d'application de la qPCR utilisant tout gène de réponse évalué pour toute étude utilisant des espèces d'anoures. L'invention comprend une ou plusieurs paires d'amorces d'ADN (tableau 1) qui ont été conçues contre des gènes "normaliseurs" et/ou sensibles de sorte que la même paire d'amorces représentant un gène 30 donné peut fonctionner de manière fiable et quantitative chez les anoures quelle que soit l'espèce. ions de aPCR et caractéristiques des séries d'amorces d'ADN d'anoures 999 Gene Cibles géniques Abréviation des gènes Amorce UP Amorce DOWN Tempéra- tu re d'anne- lage Profil de thermocycle Amplicon TAXI collagène type 1 alpha 2 col1a2 TAXI up CTGGTGGTGGATATGATGGT TAXI dn GAGTCTTAAGTCACGGCAAG 60 15s, 30s, 45s 182 TAX5 Bêta-actine cytoplasmique actb TAX5 up TACAGCTTCACCACCACAG TAX5 dn TCCACATCTGCTGGAAGGT 60/64* 15s, 30s, 45s 478 TAX7 protéine ribosomique S10 rps10 TAX7 up TAX7 dn ARCRGCACTGCGYCTGTA 60 15s, 30s, 45s 213 TTTGCYTGGCGKCACTTTT TAX8 protéine protéolipidique myéline A plpl TAX8a up TGGCTGARGGATTYTAYACC TAX8 dn ACAGCAGAGCAGGCAAMGA 60 15s, 30s, 45s 256 TAX9 Récepteur alpha thra TAX9 up TGATAAGGCCACAGGRTACCACT A TAX9 dn CGGGTGATCTTGTCGATRA 60 15$, 30s, 45s 141 d'hormones thyroïdiennes TAXI 0 Récepteur bêta thrb TAXI 0 up CTCATAGAAGAAAACAGAGAAAA RAGA TAXI 0 dn GAAGGCTTCTAAGTCCACTTT TCC 60 15s, 30s, 45s 237 d'hormones thyroïdiennes TAX12 déiodinase de type Il dio2 TAX12a CCTGGCTCTSTAYGACTC TAXI 2d dn RGCTGATCCRAARTTGAC 62 15s, 30s, 45s up 295 TAX15 contenant leucine zipper àrégion basique induit par TH thibz TAX15a ASCTCCRCAGAAYCAGCA TAX15a dn TCACGTACCAGGCCAAAA 62 15s, 30s, 30s 354 up TAXI 6 facteur type Kruppel 9 klf9 TAXI 6a CYGCTCAGTGTCTGGTGT TAXI 6a dn ARGGGCCGGTACTTGTTT 62 15s, 30s, 30s 250 up TAX18 fibronectine fnl TAX18 up GGCCATGARGGWGGAC TT TAX18 dn CCATTGCCWGTGCAGATA 60 15s, 30s, 45s 373 TAX20 métallopeptidase de matrice 2 mmp2 TAX20a TACAACAGCTGCACTGAT TAX20a dn TCCTTGTCATAGTCTTCTGT 62 15s, 30s, 30s 248 up TAX22 protéine ribosomique L8 rp18 TAX22 up CAGGGGACAGAGAAAAGGTG TAX22 dn TGAGCTTTCTTGCCACAG 60 15s, 30s, 45s 270 TAX23 facteur d'élongation 1 alpha eeflal TAX23 up GCTGCTGGTGTTGGTGART TAX23 dn AGCATGTTGTCACCRTTCC 60 15s, 30s, 45s 257 TAX27 homologue de translocase de membrane mito- chondriale interne 50 timm50 TAX27 up GCTWCAYCCAGAGTGGTCG1T TAX27 dn GCTGYTCCTCCTGCTCCA 60 15s, 30s, 45s 497 TAX28 ornithine transcarba- mylase otc TAX28 up YATGACYGATGCTGTTCTAG TAX28 dn CATAWCCCTTTGGTGTTGC 60 15s, 30s, 30s 272 * Températures d'annelage de Xenopus laevis/Rana catesbeiana 301 2 1 5 2 7 Les exemples de l'utilisation de l'invention sont d'indiquer la réactivité à l'action d'hormones thyroïdiennes ou d'indicateurs de phases du développement atteintes. Nous démontrons que ces amorces fonctionnent bien sur la plage d'évolution des anoures et démontrent aussi la plage de tissus dans lesquels les amorces peuvent être utilisées de manière fiable dans le contexte d'évaluation des niveaux d'ARNm (ADNc) ou de niveaux géniques (ADN génomique). Finalement, nous présentons aussi une application spécifique de la technologie pour identifier des perturbations dans la signalisation des hormones thyroïdiennes. Une grande diversité d'espèces d'anoures sont utilisées dans une large plage de disciplines comme la biologie développementale et du cancer, la physiologie, l'écologie, la biologie moléculaire, la biochimie, du stade d'oeuf au stade adulte. Chaque étude basée sur la qPCR exige l'utilisation de transcrits de gènes de référence ou de gènes pour pouvoir interpréter les données expérimentales. L'hypothèse de base est que le ou les gènes de référence ne varient pas du fait des conditions de traitement de l'expérience et que le type de référence ou de "normaliseur" varie selon le contexte expérimental (Bustin, Beaulieu et al. 2010). De ce fait, une sélection de candidats gènes normaliseurs est nécessaire ainsi que l'identification et l'utilisation de normaliseurs multiples pour augmenter la robustesse de la série de données. De plus, cette série de gènes normaliseurs n'est pas seulement spécifique de la fonction thyroïdienne, mais servira aussi de suite robuste de gènes de référence pour tout type d'application de la qPCR utilisant tout gène de réponse évalué pour toute étude utilisant des espèces d'anoures. Les inventeurs ont identifié des candidats gènes sensibles aux TH qui sont communs parmi les mammifères et les grenouilles qui serviraient pour jouer le rôle d'indicateurs significatifs de perturbation des TH dans le contexte d'un test de métamorphose d'amphibiens (AMA) (Searcy, Beckstrom-Sternberg et al. 2012). L'espèce suggérée pour le AMA est Xenopus /aevis avec un intérêt supplémentaire dans l'utilisation de Silurana (Xenopus) tropicalis (Mitsui, Fujii et al. 2006) apparentée. Cependant, plusieurs nations sont intéressées aussi dans l'utilisation d'espèces natives pertinentes pour leurs environnements comme Rana pipiens et Pseudacris regilla (Canada), Rana temporaria (Europe) et Pana rugosa (Japon), Rhinella (Bufo) marins (Amérique latine, Australie et Asie du sud-est), ou la seule grenouille véritablement cosmopolite, Rana catesbeiana (Bruno 2001; Veldhoen, Skirrow et al. 2006; Oka, Miyahara et al. 2009; Marlatt, 301 2 1 5 2 8 Veldhoen et al. 2013). Des évaluations toxicologiques sur différentes espèces sont hautement souhaitables pour permettre une comparaison directe entre les espèces en ce qui concerne les sensibilités et l'évaluation de l'impact de différentes histoires de vie et compositions génomiques (Relyea et Jones 2009; Helbing 2012). Les amorces conçues ont été soumises à des tests de spécificité par qPCR et d'applicabilité dans chaque tissu d'intérêt dans Xenopus /aevis et Rana catesbeiana. Ces deux espèces couvrent les familles de grenouilles les plus communément utilisées qui s'étendent sur environ 200 millions d'années d'évolution (Sumida, Kato et al. 2004) (Figure 1). Les inventeurs ont déterminé que si les paires d'amorces fonctionnent bien pour les deux espèces, la probabilité qu'elles fonctionnent pour des espèces intermédiaires est garantie. La Figure 1 est un cladogramme d'anoures représentant des familles majeures d'intérêt courant dans le domaine scientifique et de la conservation. Xenopus laevls est un membre des pipidés tandis que Rana catesbeiana est un membre des ranidés. Adapté de AmphibiaWeb: Phylogenetic view of Amphibia [web application] 2012. Regents, Berkely, CA, disponible: http:amphibiaweb.org (14 mai 2012). La conception et le protocole de vérification rigoureux des inventeurs incluent une confirmation de séquences d'amplicons, une analyse de courbe de fusion de routine, la production de courbes d'étalonnage pour chaque série d'amorces, et la détermination de l'efficacité de l'amplification. Toutes les procédures sont en accord avec les directives de Minimum Information for Publication of qPCR Experiments (précis MIQE) (Bustin, Beaulieu et al. 2010). La technologie de qPCR présente la technique génétique disponible la plus précise et sensible qui permette une détection à haut rendement de transcrits d'ARNm de faible abondance. Du fait de sa robustesse relative et du faible coût opératoire, cette technologie est actuellement celle qui répond le mieux aux demandes du contexte réglementaire et les tests développés ont une traduction immédiate pour les laboratoires réglementaires. Nous avons choisi de nous concentrer sur un procédé de détection basé sur SYBR car celui-ci est actuellement le moins coûteux à mettre en oeuvre (bon du point de vue prix pour l'utilisateur final) et davantage de laboratoires ont accès à l'équipement nécessaire pour la lecture ce qui augmente le potentiel commercial. Notre procédure de contrôle/assurance de qualité des amorces a été normalisée et suit un processus de contrôle de qualité et d'assurance de qualité (QC/QA) à trois étages, comme suit. QC/QA d'étage 1 L'ARN total provenant de l'espèce animale cible et du type de tissu cible est converti en ADN complémentaire (ADNc) et soumis à une interrogation avec les paires d'amorces de qPCR supposées conçues contre des gènes d'intérêt. La fonction de chaque paire d'amorces dans le test de qPCR est déterminée pour un signal d'amplification représentatif d'un produit d'ADNc ciblé unique. Des réactions de qPCR témoins ne contenant pas d'ADNc sont mises en oeuvre pour évaluer les interactions inter- et intra-amorces de fond qui peuvent contribuer au bruit de fond. Les conditions de thermocycle sont choisies pour chaque paire d'amorces spécifique de gène qui maximise la spécificité du signal tout en minimisant le bruit de fond. Les produits d'ADN générés dans le test de qPCR sont ensuite confirmés comme étant de longueur prédite correcte par analyse par électrophorèse en gel d'agarose. QC/QA d'étage 2 La spécificité dans l'amplification d'ADN de chaque paire d'amorces de qPCR est confirmée encore par isolement et évaluation dépendante de la séquence de produits d'ADN générés par qPCR qui contribuent au signal basé sur SYBR. Deux procédés peuvent être utilisés : 1) la cartographie de fragments dérivés d'endonucléases de restriction d'ADN amplifié par qPCR, ou 2) le séquençage d'ADN du produit de qPCR. Ceci sert à confirmer la spécificité du signal SYBR de qPCR recueilli et l'identité de la séquence génique amplifiée par chaque paire d'amorces utilisée en qPCR. QC/QA d'étage 3 Garantir que les données des signaux basés sur SYBR recueillies pendant la qPCR peuvent être employées d'une manière quantitative, la similarité dans les performances des paires d'amorces relatives doit être satisfaite en utilisant les informations obtenues par analyse par qPCR d'une série de dilutions d'ADNc cible provenant du tissu d'intérêt. La sensibilité et l'aptitude de chaque paire d'amorces spécifique de gènes à détecter des changements linéaires dans l'abondance d'ADNc cible est évaluée. Les performances des paires d'amorces d'un gène test sont comparées aux performances de paires d'amorces provenant de gènes de référence pour garantir des efficacités d'amplification comparables. Le contexte tissulaire est important car nous avons trouvé, ainsi que d'autres, que certaines amorces, bien qu'elles soient spécifiques de leur cible génique, peuvent présenter des performances réduites dans certains contextes tissulaires. Les résultats du processus QC/QA à trois étages pour chacune des séries d'amorces énumérées dans le tableau 1 sont présentés dans la figure 2. Ceci démontre que les séries d'amorces fonctionnent pour amplifier spécifiquement l'amplicon approprié dans une variété de contextes. Un résumé des types de tissus qui sont utilisables pour des analyses de transcriptomique pour chaque série d'amorces est trouvé dans le tableau 2. Dans le tableau 2, les tissus particuliers de Rana catesbeiana et Xenopus /aev/s dans lesquels chaque série d'amorces est utilisable sont désignés de la manière suivante : T = nageoire caudale HL = membre postérieur I = intestin H = coeur Li = foie B = cerveau Lu = poumon Tableau 2 Résumé des types de tissus dans lesquels chaque série d'amorces est utilisable dans Rana catesbeiana et Xenopus laevis. Cibles T HL Rana H catesbeiana B Lu T HL Xenopus laevis H Li B géniques I Li I TAXI col 1 a2 / / / / / / / / / / / / / TAX5 actb / / / / / / / / / / / / / TAXI rps10 / / / / / / / / / / / / / TAX8 plpl / IX/XY /IX X X XX TAX9 thra / / / / / / / / / / / / / TAX10 thrb / / / / / / / / / / / / / TAX12 dio2 X / /XXIX X X / X X1 TAX15 thibz ? / YIYIYIVIXXX TAX16 klf9 YIYXY / /XXIXXX TAXI 8 fnl / / / / / / / / X / / X / TAX20 mmp2 / / / / / / / / X / / X / TAX22 rpt8 V I V V V V V V I V V V V TAX23 eeflal V V V V V V V V V 1 I I V TAX27 timm501 V 1 1 V V V V X V 1 V V TAX28 otc X X XXIX X X X X X -( X Restrictions tissulaires Signal propre - Utiliser librement X Signal non spécifique - Ne pas utiliser j, Plage de détection limitée - Utiliser avec précaution Les résultats QC/QA plus des signes de fonctionnalité dans des tissus de Rana catesbeiana et Xenopus /aevis sont présentés sur la figure 2, qui comprend les figures 2A(1) à 2A(10) ; les figures 2B(1) à 2B(10) et les figures 2C(1) à 2C(10). Sur ces figures, les résultats du processus QC/QA à trois étages par une série d'amorces sur des tissus de Rana catesbeiana et Xenopus laevis sont montrés. Chacune des 30 séries d'amorces est identifiée au sommet de chaque figure de dessin. L'assurance de qualité (QA) de chaque paire d'amorces est établie par une procédure d'évaluation à trois étages qui inclut : étage 1, un retour de signal dépendant d'ADNc propre avec un faible bruit de fond déterminé par amplification qui est associé avec la production d'un produit d'ADN unique pour chaque type de tissu d'anoure comme déterminé par des courbes de dissociation et des analyses électrophorétiques ; étage 2, confirmation dépendante de séquence d'un ciblage spécifique de gène par cartographie avec des endonucléases de restriction ou séquençage d'ADN direct du produit d'ADN amplifié isolé ; et étage 3, évaluation de l'efficacité comparative des paires d'amorces sur une série de dilutions d'ADNc spécifique de tissu car elle concernait les 301 2 1 5 2 12 performances de qPCR de la paire d'amorces de référence choisie sur la même série de dilutions d'ADNc. La pente de la performance de qPCR liée doit être 0,1 pour être considérée appropriée pour ce type de tissu. La décision de ce qu'une paire d'amorces serait utilisée pour discerner un transcrit de gène comme normaliseur ou test est hautement dépendante du contexte expérimental et inclut des considérations de type de tissu, de temps de prélèvement, de type d'exposition et d'espèces examinées. Les exemples de candidats gènes normaliseurs qui seraient utilisés dans une quelconque expérience de qPCR pour jouer le rôle de référence d'entrée incluent, mais ne sont pas limités à : colla2, actb, fnl, rps10, pipi, rpI8, eeflal et timm50 (tableau 1). Les exemples de candidats gènes sensibles aux hormones thyroïdiennes dans Rana catesbeiana (figures 3 et 4) et Xenopus /aevis (figure 5) incluent, mais ne sont pas limités à : colla2, actb, pipi, thra, thrb, dio2, thibz, klf9, fn1, mmp2 et otc. La figure 3 illustre une démonstration de sensibilité aux hormones thyroïdiennes des transcrits de gènes cibles dans Rana catesbeiana. Facteur de changement des données d'expression pour les transcrits de gènes indiqués comme déterminé au moyen du procédé Ct comparatif (& Ct) utilisant de multiples normaliseurs de transcrits de gènes. Les données sont exprimées dans des diagrammes encadrés sous forme de facteur de changement dans les niveaux d'expression par rapport au groupe témoin de véhicule. Des têtards prémétamorphiques ont subi une injection de témoin de véhicule (C) ou de la concentration indiquée d'hormone thyroïdienne et les tissus ont été recueillis au bout de 48 heures. La concentration pour les expositions T3 sont 0,01, 0,1, 1,0, 10, 25 et 50 nM et 0,05, 0,5, 5,0, 50, 125 et 250 nm pour T4. Les médianes sont montrées sous forme de traits noirs continus dans l'encadrement et l'encadrement indique les 25ème et 75ème percentiles. Les trichites indiquaient la plage. "a" : significativement différent du groupe témoin de véhicule (p REVENDICATIONS1. Composition de matière comprenant une paire d'amorces choisie dans le groupe consistant en les paires d'amorces A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N et 0 : Paire d'amorces Première amorce Seconde amorce A CTGGTGGTGGATATGATGGT GAGTCTTAAGTCACGGCAAG B TACAGCTTCACCACCACAG TCCACATCTGCTGGAAGGT C TTTGCYTGGCGKCACTTTT ARCRGCACTGCGYCTGTA D TGGCTGARGGATTYTAYACC ACAGCAGAGCAGGCAAMGA E TGATAAGGCCACAGGRTACCACTA CGGGTGATCTTGTCGATRA F CTCATAGAAGAAAACAGAGAAAARAGA GAAGGCTTCTAAGTCCACTTT TCC G CCTGGCTCTSTAYGACTC RGCTGATCCRAARTTGAC H ASCTCCRCAGAAYCAGCA TCACGTACCAGGCCAAAA I CYGCTCAGTGTCTGGTGT ARGGGCCGGTACTTGTTT J GTTGCCATGARGGWGGAC CCATTGCCWGTGCAGATA K TACAACAGCTGCACTGAT TCCTTGTCATAGTCTTCTGT L CAGGGGACAGAGAAAAGGTG TGAGCTTTCTTGCCACAG M GCTGCTGGTGTTGGTGART AGCATGTTGTCACCRTTCC N GCTWCAYCCAGAGTGGTCGTT GCTGYT CCTCCTGCTCCA O YATGACYGATGCTGTTCTAG CATAWCCCTTTGGTGTTGC 2. Groupe de gènes normaliseurs comprenant deux ou plusieurs paires d'amorces choisies dans le groupe consistant en les paires d'amorces A, B, C, D, L, M et N :Paire d'amorces Première amorce Seconde amorce A CTGGTGGTGGATATGATGGT GAGTCTTAAGTCACGGCAAG B TACAGCTTCACCACCACAG TCCACATCTGCTGGAAGGT C TTTGCYTGGCGKCACTTTT ARCRGCACTGCGYCTGTA D TGGCTGARGGATTYTAYACC ACAGCAGAGCAGGCAAMGA L CAGGGGACAGAGAAAAGGTG TGAGCTTTCTTGCCACAG M GCTGCTGGTGTTGGTGART AGCATGTTGTCACCRTTCC N GCTWCAYCCAGAGTGGTCGTT GCTGYTCCTCCTGCTCCA 3. Groupe de gènes sensibles aux hormones thyroïdiennes comprenant deux ou plusieurs paires d'amorces choisies dans le groupe consistant en les paires d'amorces A, B, D, E, F, G, H, I, J, K et 0 : Paire d'amorces Première amorce Seconde amorce A CTGGTGGTGGATATGATGGT GAGTCTTAAGTCACGGCAAG B TACAGCTTCACCACCACAG TCCACATCTGCTGGAAGGT D TGGCTGARGGATTYTAYACC ACAGCAGAGCAGGCAAMGA E TGATAAGGCCACAGGRTACCACTA CGGGTGATCTTGTCGATRA F CTCATAGAAGAAAACAGAGAAAARAGA GAAGGCTTCTAAGTCCACTTT TCC G CCTGGCTCTSTAYGACTC RGCTGATCCRAARTTGAC H ASCTCCRCAGAAYCAGCA TCACGTACCAGGCCAAAA I CYGCTCAGTGTCTGGTGT ARGGGCCGGTACTTGTTT 1 GTTGCCATGARGGWGGAC CCATTGCCWGTGCAGATA K TACAACAGCTGCACTGAT TCCTTGTCATAGTCTTCTGT O YATGACYGATGCTGTTCTAG CATAWCCCTTTGGTGTTGC 4. Composition ou groupe de gènes selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour une utilisation dans un procédé d'identification de perturbations dans la signalisation des hormones thyroïdiennes. 5. Composition ou groupe de gènes pour une utilisation selon la revendication 4, où ledit procédé est un test de métamorphose de têtard de grenouille. 6. Composition ou groupe de gènes pour une utilisation selon la revendication 5, où ledit procédé comprend une première phase comprenant l'exposition d'un têtard à un composé d'intérêt, le retrait de première et seconde parties de la queue du têtard, l'exposition de la première partie à un test d'apoptose, et une seconde phase comprenant l'exposition de la seconde partie à un test pour détecter des décalages dans une quantité de transcrits d'ARNm prédéterminés. 7. Composition ou groupe de gènes pour une utilisation selon la revendication 6, où la première phase comprend en outre la détermination de ce que le composé d'intérêt est actif sur le tronc thyro-cervical. 8. Composition ou groupe de gènes pour une utilisation selon la revendication 6 ou 7, où la seconde phase comprend en outre l'exposition de la seconde partie à une qPCR. 9. Composition ou groupe de gènes pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, où la seconde phase comprend en outre l'exposition de la seconde partie à une qPCR utilisant une paire d'amorces comprenant une première amorce et une seconde amorce, où la paire d'amorces est choisie dans le groupe consistant en les paires d'amorces A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N et 0 comme défini dans la revendication 1. 10. Composition ou groupe de gènes pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, où la seconde phase comprend en outre l'exposition de la seconde partie à une qPCR utilisant deux ou plusieurs paires d'amorces, où chaque paire comprend une première amorce et une seconde amorce, et les paires d'amorces sont choisies dans le groupe consistant en les paires d'amorces A, B, D, E, F, G, H, I, J, K et 0 comme défini dans la revendication 1. 11. Procédé de test de métamorphose de têtard de grenouille comprenant une première phase et une seconde phase, où la première phase comprend l'exposition d'un têtard à un composé d'intérêt, le retrait de première et seconde parties de la queue du têtard, l'exposition de la première partie à untest d'apoptose, et la seconde phase comprend l'exposition de la seconde partie à un test pour détecter des décalages dans une quantité de transcrits d'ARNm prédéterminés.