Brevet FR3013992A1 — publié le 20150605

La présente invention concerne le domain,?. techniqu_ de la chromatograpu e. En partia er, lnveïbon concerne un procédé de fabrication par photo-greffage de dispositifs multimodaux, de très pete tail e, particulièrement adaptés chrographie en phase liquide. Les techniques c-Irorna oa regroupent les lues séparatives reposant sur 1..itaraction e soluté avec une phase stationna:n.,., une phase MODile; Jnase .static,,,nnaire peut être disposée l'intérieu7de c.-nts type', micro-Fhaidique, notarnrnent cc,iunne C177)7,7d:ographique, se présentant sous a forme d'un r ou à rtérejt c:72,flUX ouverts ou fermés, amneeeu eer ue o,.ibstna. Il est de plus eu p;us re.cherché des dispoçitifs hromatographie en phase liquide notamment, pOELJr. proposer des portati qui permettent ce nanolftre, Ld lir--tation des .' SÎUMeSte Ordre du yobmes, par rapport aux outlis « c'assiques » ilseri des ru :I d'HPLC :0: - :r-rç-'rit pertan e dans es don -seines où le volume.cicnLUce z. nsitant 'ne-santé, environnement la miniaturisation des tecn ueis, is..hromatagne niqucuod dtîsyntheuu de -nases statienoarresIOVOntes dans des syi -mes retard-fluet u, eu type colonne. rt Faure rt I dans Electron'noresis, tt;lt 71, 2499-251.1 ii.Ulisation d'une phase stationnaire dans des s -es chromategraohiques constituée d'un polymère réticuie se trouvant sous ia forme d'on monolithe poreux. Je plus, dans le domaine de la chromatographie, les systèmes de sla or par od:romét de masse deviennent incontournables. La se r bUité cl ,:.:1étection est dérand nt!a r tu (I?:: liquide en sortie de _ tnn phioue. Er i icaiier, uits optmurns pour des colonnes de c iques dizaines de microns de diamètre interne (de l'f.7.)rdre de la centaine de nanolitres/min) sont biens adaptés pour les sources rano-spray de ce de De plus es techniqUCr ..ornitographiques se doRent cifh-e adaptées à l'ara yse de matrices de un plus complexes, 'e challenge étant de pouvoir séparer, en une seule e plus de composés possible. Dans ce contexte, deux approches :-pales ont été envi s : (I) l'utilisation de colonnes de très grande :',..Agueur et (ii) des ani,Wses en chromatographie associant/couplant différents modes chrornatographicces (analyse r lticiimensionnelle). Dans ce cadre, on peut citer deux techniques d'analyse uitidi 1-nsionnelle. La première consiste à réaliser en ligne une, ivoire plusieurs, étape(s) de préparation cllécheritilion, en amont de l'étape de séparation/détection. Cette technique ne donne-s satisfeenan car, à dodue fois cu ii tel couplage cihysque est les risques c4outer des v: s morts, perdre en efficacité et de créer des fuites, sont 10 . La derodême technique dnrdyse multidimensionnelle, concerne le couplage d'au moins deux colonFizs de séporotion cdftérent (chromatographie bidimensionnelle notée 1,Ciii Dv . ne permet pc cc contrôler .. oints d'accroche des ILtion riaH.tes et ne conduit pas à une fonctionnation heinogene. La derhande de brevet US 2004/101442, quant à _crit un procédé de épma n rouit mir: autFInt décrire un procédé pou éparer le support chronii,:ic ce1 pi utiliser. Le procer P de séparation r un maténau Lingue, p mentaut uce eu rs multirr odal propyps,c domaines de teede pores, d-iaque domaine de tale de pores contenant des groupements de St.irace de fonctionnali- cqfrérente. Aucune 1formation n'est donnée sur e mode de çreffage au sein des pores' si ce n'est qu'il est nécessaire d'utiliser des pro,: permettant de grcer, de façon sélective, des pores d'une taille donnée, ce qui pose des probh ries de mise en oeuvre p f Une solution consistant en l'utilisation de colonnes monolithiques de t.-:e a été propcsée pou rc..rforicire simultanérrent aux besoins de miniaturisation e rtaugmar tation de capacité de p s. Ces monolithes présentent comme avantage,. par rapport aux colonnes rernp (z7,5 particules de silice standard, d'avoir une plus grande perrre ettant de 3013 992 4 travail er sur de plus grandes longueurs), d'être synt, (ft:sables /ri Sit/ dans des colionnE,as l!iires de si fondue (permettant de s'affranchir d'utiliser des f'tec p0i,ir bloquer ies particules dans la colonne) et d'être donc compatibiEr avec une détection en spectrométrie de masse. Il -7 CÎéjà été proposé de fonctionna Per de tels monolithes poreux. On peut citer !es travaux de Zajickova Z. et al. dans Journal of liquid chrc- raphy and seateci techniques, 8 640-16( qui met en oeuvre ude réaction photochimique 5ur moncHhc de silice, par greffage d'ur porto}ur d'une fonction .méthacr,-are et réaction de photo- monomère méthacry orcée par de la qu'initiateur de radicaux iibres Nuanrnoins, e cou ,e 10 metr ylaH'-iéth clac pose des problèmes pour conserver des (.hromatogrï3phpues optirnaes. L'utilisation ' MOI-0111' r. acrylates a égaiement. été mise en oeuvre R. Des et al J. Sci, 15 2013, 36, :") 9 3 - 0 0 1, Dans cet article, un monolithe de silice (st , -1,-tDare dans un tub' Yi' une silanisation avec un silane acisylte (ost ensuite menée, sulvie d'une fonslionnalisiation avec des monomères iates en utilisant I 'éther P vahyl Penzoïne en tant jjq P tiateur r - radicaux ocal.satior de a réaction photochimique est démont Pe mais la 20 mise en oeuvre ce COUP e ac ate-apryit e est, eencc}re difficile a mettre en oeuvre pour rie psi: si ta- or les propriétés ctliucriategrap1iqUe5, Les fonctions ceirniques sur es SUpport et en solution étant de r, nature, 'initiE..tion r.:.,iclicalaire s eus§ hien à la surface que dans I u trie de ft olution. Les couches obtenues ne sont donc pas mono-rno('-kulaires, rtias Putôt 25 poiyP es. Les fabricants de colonnes chronlatce ,esisys nt, depuis . 1/2 temps, 'es colonne fonctionna par des couches hm, .es et imoc)-moléculaires au im ment des nnes polymériques, afin de :maximiser la reproductibilité des lots de synthèse. AUS§, recePer concerne un procédé de fabrication d'un disp, 4-, 30 comoreecini. en monolithe poreux confiné dans un circuit micro-fluidique, ledit moncilithe poreux comportant au moins deux zones distinctes, dont au moins une zone (Z) porteuse d'une fonction ra té R. liée au monolithe poreux. par une liaison covalente, et obtenue grâce aux étapes successives suivantes : a) l'obtention d'un monolithe poreux porteur de fonctions réactives X à l'intérieur du circuit b) la fonctionna isation, par mise en contact du monolithe poreux porteur des fonction réactives X avec un réactif comprenant une fonction réactive Y et la onctionnatté R souhaée sur la zone déter-mine, (Z), en précence d'un initiatet: lx libres par abstraction suivie d'une illumination i0ca PP 10 entraînant a réaction des fonctions X et Y, de manière à obtenir un pont covalent, c) le rincary, nu monohtha pueux, les fonctions X et Y étant deflnies comme suit soit X est une fonction comportant un hydroqène abs, a-.U: choisie 15 parmi les fonctions les fonctions alkyiamhie prés -t un atome d'hydr-nOso porté par ur. carbone par rapport à [atome d azo e; et les fonctions éther pvtsrcntant un atome céhydroqène porté par un carbone en position si - rapport à l'atome - ne et Y comoorte w h isdtu dru, 20 sa comporte une insatura.tien et Y est une fonctior tant un hydrogène abstractible rie fonctions -SH' -OH, les tondions d wlarnine présentant un atome d'hycir porté par un carbone on position alpna par rapport b ,tirne d'azote, et les fonctions éther présentant: or atome d'h Tin . _ porté par un 25 carbone en position alpha par ruse), l'atome cioxygène. Selon un mode de réalisation padiculier, le procédé selon l'invention permet la fabricetion d'un dispositif comprenant un monolithe poreux confiné dans un circuit micro-fluidic 'nolitne poreux comportant u moins deux zones (Z1. et Z2), chaque zone étant porteuse d'une fonctionnalité (Ri. 30 et R2) différente liée au monolithe poreux par une liaison covalente,. et comprend les étapes successives suivantes : a) 'obtention d'un monolithe poreux porteur de fonctions réactives I: à l'intérieur du circuit micro-fluidique, b) une première fonctionnalisation localisée, par mise en contact du monolithe poreux porteur de fonctions réactives X avec un réactif comprenant uva fonction réactive et la fonctionna Ri souhaitée sur une zone déterminée Zi, en présence d'un initiateur de radicaux libres par abstraction d'hydroqène, suivie d'une illumination localisée de la zone ciblée Z, entraînant a réaction des fonctions et Y1, de manière à obtenir un pont covalen c) le rinçage du monolithe poreux, d) une deuxième forictionnalis !oces.ée, par mise en contact du monolithe poreux porteu comprenant une fonction ictit 'onotionna hé R2 'araunalt.ée sur une autre zone determinee iiiresence un initiateur de radicaux libres par abstraction dinycrogène' suive dune illumination localisée de la zone ctblee 7,entraînant la réaction des fonctions X et Y2, de manière à obtenir un nont covalent, et e) le rinçag., du monolithe poreux, les fonctions X'. Y1 et ries comme suit - sait X est une licitiction corne tant un hydrociène abstracti 1.1a choisie parmi les fonctions -SH, -OH, les fc dons alkyamine prét un atome ci iyibroi ène porté carbone en position alpha - par rapport à Vatome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en :)sition alpha per rapport à l'atome d'oxygène et Y et Y2, identi fféren s comportent une insaturation ; soit X comporte une insaturation et Yi et '(z, identiques ou Piffiiiren , sont une fonction comportant un hydrorne absiaactible clnbh e parmi les fonctions -SH, -OH, les fonctions amine préser E::orne d'hydrogène porté par un carbone en ositionalpha à ilatotrie d'azote, et les fonctions éther présentant un atome :ctions 'cives X avec cri ré actif d'hydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'oxygène. Tien entendu, plus de deux fonctionnesatons pourront être réalisées. Le procédé selon l'invention consiste à coupler la synthèse in situ de monolithe poreux dans des systèmes micro-fluidiques, nosam ment du type cconne ou tube capillaire, ou micro-canal, avec une fonstionnallsaUun du monolithe :sée permettant d'élaborer des dis t-x -J présentant des modes cbromatoqraphiques différents. cadre de l'invention, n monolithe poreux est préparé 10 directement à 'intérieur du circuit micro-fluidique. Les. monolithes s,abores, de nature essonf'Slement ino z Tue, portent des fonctions organiques leur apportant LJ ctvite de SI ce appropriée, nom s fonctions réactives X. Ces fonction- reactkes X peuvent être incrddes directement Fu cours de la s'y monolithe en utilisant un précurseur porteur de 15 fonctions, apportées après in synthèse mcnotthe pa e biais d'nyznrs de couplaas Ensuite, un dit comprenant une fonction réactive (jdnàdquement Y dans le cas de la ore .f.-,-)sisterf nal 2 dans le cas «unO deuxième...) et ha forictioncialite souhaltée 20 le cas de Et prem'ère frandionnalisation, R ans le cas d'une deuxiE ...) sur une zone cétermnl Misé sous irradiation lumineuse, pour obtenir 'oncticnnalisston souhaitée dans une zone souhaitde du monolithe. Le choix de la oncionnalité du réactif et donc de la fonctionnalité greffée au final sur le monolithe, dépend du mode chromstogi envisagé. Les 25 riLi'ctions photochitdques mises en oeuvre dans le Lac: l'invention sont s rapides pues minutes, voire dizai s 'e les «actions tb-T.irrnquernent hsees dans l'an_ - Heur onctionnalisation monornodale de colonne. De plus, une telle activation photochimique permet de ocaliser la zone modifiée. En réalisant au moins deux étapes successives 30 -d'irradiation localisée avec des réactifs comprenant des fonctionnalités différentes, il est possible d'obtenir dans un rn,,:;me circuit micro-fluidique au moins deux zones présentant chacune une ,riztîonn_.,--21!.té différente. Il est ainsi p... ..: Je coupler dans un même circuit micro-fluidique différents modes chromatographiques. Dans le cadre de l'invention, on met en oeuvre à chaque forpatlorresation' une réaction photo-chimlaue entre deux fonctions réactives différentes apprfJs X ou Y. Une des deux fonctions réactives X ou :ossde un hvd rogène fac Lament abstractible. Par contre, la fonction X ou Y nui pc n hydroqène facilement abstractible ne présentera pas avec l'autre fonction X ou d'insneatior pour ne pas rentrer en 00i Y. 10 La réacticn entre !es forcrionn. et Y (n pn les fonctions X et X et Y2) entriia, ier la réaction entre e un simni covalent, sans reaction de potume nsasion en surface. Aussi, par rappoi méthode précédente f`,.métJr n ateiacryte), cette méthode permet d'éviter la photo- bon en surface. J sPagit donc iste d photmcrreffm 15 en surface de rpoiecuies fonctunnasées, La foncrtonnaki, uttrfée dans , selon Lnvention eenrai or générai, couche rtfl 0 n °- nvention permet éqai ernent d Pviter le ,ade cotonnes par lais di,i,inicin Le rt 'Invention détaillé dans la description qui va suivre. Par « hydrogène ahstractible » on entend un atome d'hydrogène le pi-ci7".: molécui coupla (connecteur) ou le couplage par ie biais de vanne 20 plusieurs systèmes de pornpade, e:. Le physique,. ohot:m activation; mésence d'un initiateur de e, pour former un riadica . A titre de capabLe 25 radicaux erdevésou acteur fonctions porteuses d'un hyclrociene abstratibe, on utilisera fonction -SH, -0H, une fonction alky -iaine présentant un atome d'hydre- porté par un carbone en position aipda par rapport à l'atome d'azote, ou une fonction éther ttinsecitant un atome G yeroène porté par un carbone en position 30 alpha par rapport à ratone oxygèn.e, qui possède au moins un hydrogène facilement abstractlb e. Il est, notamment, reconrn que les thipis et les - kylamines présentant un atome d'hydrogène en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et en parcie,,JNer du type amines tertiaires, sont des donn7Ars,r',.1ne efficaces (permettant obtenir des transferts d'hydrogène efficaces). Ces donneurs d'hydrogène permettent donc de C la réaction sur ces groupements spécifiques même en présence d'autres molécules possédant des hydrogènes comme des cryates ou méthacrylates, par exemple. Ln /onction c,u1 coruporire une insaturation est, qua-, à elle, par exemple, choide parmi es groupes comprenant u -C=C- ou ni !es aicény'es tels que le croupe vinyle, rsacne les acryamdes, les vinyl e7s, les vinyl esters, Akv allyltriaT N-vinylamides, les es aHyhsocyanurates, - sters insatue 'es reyaéimides N- Fre-yeaali-h les diènes mec selon nvention n'est nullementdes monolithes particuiiers Le manoilthe est un matériau monobloc poreux et triple liaison notamment 10 les a cyny- norb7)7n, yletho substit contlnu, formé d'un squelette délimitant eseau de inacropores r ffées des fonctions florganique, et interconnectés sim organiques. Le uratèrn. peu notamment d'oxyde de slIciun, d'cxvce de titane ou d'oxyde de -zft.c0,1Rjm, 2 -:ore d'ov:/cio J'hafnium, Le morolthepeur j{.. T.. avec un seul préuum ou avec un mélançe ce plwjeurs précurseurs dont certains au moins, sont mono ou muftifon ionnels, Le monolithe poreux présentera une porosité adaptée aux procédée de chromatographle, En particulier, il pourra présenter une perosicé mixte, avec une macroporo pour l'écoulement 25 d'une phase mobile et une méso- ou microporosité pour aug.rneater la surface spécifique. La. synthèse situ du monolithe à l'intéheur du circuit micro-fluidique est, de manière classique., menée par mise en oeuvre d'un procédé soi-gel avec îu moins un agent porogène, du type tensio-actifs ou polymères, qui 30 confère porosité au monolithe obtenu et permet d'obtenir la porosité souhaitée .Kanishi et al, .3 SOL-GEL SCI TECHNOm. (1997) 8 :1, 547-552). Les techniques classiques de synthèse par voie s g telles que décrites 3013 992 10 dans Ou J. et al, Recent advances in preparation and application of hybrid organic-siiica monolithic capillary coinins, Electrophoresis 2013, 34, 126-140 ou Ashraf Ghanerr, Tohru Ikegam, Recent advances in silica-based monolitt.7: Préparations, characterizations and appl oticiins' J. Sep. Sci. 2011, 34, 1945-1957) pourront être utilisées. La fonction réactive X permettant la réaction de photo-greffage peut. être insérée directement 'sur ie monolithe lors de sa synthèse dans le circuit micro-fluidique ou greffée après synthèse lorsque e monolithe est déjà positionné dans le circuit micro-fti,..;idi . En effet, îobtentPrn du monolithe poreux porteur de fonctions réactives X peut être réaêtée par fonCionnesirotion dun monolithe ooreux norcjanicii obtenu par procédé sol-gel. L'obtenton du monolithe poreux erreur de fonchons réoi. -s X peut aussi être réalisée en une seule irentemerit à l' nt, iriu circuit micro-fluidique par mise en couvre d'un pru cfa sol-gel avec utilisation d'un précurseur directe, utilisera ur 3ue de précurseurs, dont l'un est porteur de la fonction tlive X, Va la fors formation du résou inorcantn.o etl'obtention de le concentration SOLihajzfC en fonctions réactives X. Lorsqu'un seul précurseur est utésé ou lorsque es précurseurs uttisés ne comprennent pas la fonction rt tir-live X. une Eicliditionneile est utilisée pour introduire les foncttons particulier, un ou usieurs compost danosiliciés (alkoxy- chloro- ilane, diméthyiamino-silaiie cisiiazeinei par exerrii', )orteur d'une fonction X sera introduit, de manière à former par réaction sur les OH résiduels rie 25 surface du monolithe, des ponts MO-Si, avec M = Si, Ti, Hf ou Zr, par exemple, en fonction de la nature de la structure inorganique Je monolithe. Les acides phosphonigues et les pirosphonates se lien-. dament à la surface de monolithes à base de TiO2 ou Zr02 notamment, L pourront être utilisés pour introduire les fonctions réactives X. Les molécules portant un 30 motif catéchoi sent également capables de produire des couches qui adhèrent fortement sur le titane et pourront donc être utilisées pour fonctionnaliser des monolithes poreux à base de T102. Lorsque plusieurs Avec une précurseurs sont s, l'un sera porteur de fondions réactives pour réaliser ultérieurement l'étape d fonctionnalisation par photo-greffage. Le groupement réactif X peut être directement lié à un atome de silicium, titane, zirconium ou hafnium du monolithe ou lié par l'intermédiaire d'un bras de En général, les fonctions réactives X seront présentes sur !e monolithe. ,._{) eux à raison de 0,1 à 10 pmol/m2. Compte-tenu du mode de fonctionnalisation !photochimique, le monolithe doit être transparent aux orirjueurs «onde d'irradiation utilisées. Les oxydes métal précédemment cités sont parfaitement adaptés. 0 Le monolithe ainsi formé leur du circuit micro-fluidique porteur de fonctcns réacfves X est ensu te mi'e, en contact avec le ;'éact.ac porteur, à une entre portées par le pan ine fonction rt ie the extr va réa îr avec les fonctions groupement fonctionne! vpermettant de ctooter r à a Z.UHe ce monolithe xtliectionnée les pop 15 chromatopraphiques rées. Ces deux extu-émitén sevent âtre directement - entre elles ou liées par un bu;7; de bison. Le bras de liaison qui peut être utilisé entre le monolithe et la ',notion -X et/ou entre tes fonctions Y et R peut être, per exemple, - chréne one, fle,aire ou ific-e ou un particulier comme, par exemple, un motif de type oxyde 20 C éshyfttne.Ce moté peut être répétitif ,iymend utilisera un rat-' rt foncolki ctr.,n..; X supérieur ou égal à 1, de manlère à optimiser la densité functIonrielatien obtenue au final sur le monolithe. Le plus souvent, une solution contenant le réactif porteur de la fonction 25 réactive Y et de ia fonctionnaLé R et l'agent lrOtdateur sera utilisée pour tuer le monolithe poreux. Une telle sC r est préparée soit directement dans le réactif à greffer, soit dans un solvant. Le solvant peut être un solvant organique, un de solvants oi-ganiques, un solvant. aqueux ou un mélange hycirn-org,- e. A titre d'exemp as dose vent, on 30 peut citer le THF, le méthanol, bacéte Id 3, Veau et leurs mélanges. L'agent niitiatteuE est, de préférence, solu5le dans ladite solution. Ii est également envisaqeabe le réaliser des réactions de photo-greffage après adsorption de 3013 992 12 l'agent initiateur sur le mcnofithe poreux, voire de réaliser l'adsorpt[c du réactif et de l'agent initiateur avant 11' ton. La concentration en réactif porteur de la fonction réactive Y et de I onctionnaiLé R, dans la solution utilisée, est, en général, de 0,2 à 1M. De manière préférée' l'ensemble des réactifs nécessaires pour réa iser le greffage de la fonctionnalité R dintérêt, à savoir le réactif porteur de la fonctionnalité R et de la fonction réactive Y qui ;ta réagir avec aimonolithe réactif et l'agent initiateu, sont introduits dans un même mélange réactionnel avec lequel le monolithe réactif va être mis en contact et soumis à une photoérroolation. La photo-irradiation étant menée de façon localisée, la totalfté dL moaalithe poreux peut axe mis en contact avec le réactif et Vanent initiateur, L'oeent initiateuit est, préférence, activable .-vonnement UV, bien cu'une activation sous payons X ou gamma pusse écialementêtre envisa es A titre (J'exemples d'agents inItIateurs adaptés, on peut citer la bereaphencind et ses dérivés, les thio', nthones, la toine et ses ners; le 'benzyle et ses étals; lacetophenone et ses ddHvés les alkylphenones et leurs le alpha hydroxycétones; ies acylphospline eicies; et les ittanoc ne_ On utilisera, de pre,erence, un aqent type :'icirrish Dans l cadre de l'invention, l'agent initiateur est utilisé dans des quantités su ;antes pour perrn ttre l'abstraction d'hydmqène sans écranter (masquerlumière incidente. La quantité do eaz inftiateur sera dépendante de l'agent initiateur utilisé et sera alan u ar l'homme du :étier, En général, Ia qua i'agent initiateur utinsée rH comprise entre 0,1 à 10 % en masse par rapport à la masse totale de ta solution d'imprégnation utilisée. L'illumination localisée conduisant au phot. est, le plus souvent, réalisée à une longueur d'orrie =7,-='teriai-ir. a , yu' e allant de 200 à 600 nm, en 'particulier à la gamme T e 240 à 380 nm. L'énergie d'irradiation est, en général, de C, 3 3.cm-2 à 9 J.cm-2, et plus particulièrement, de 1 à 3 3.cm-2. La durée d'irradiation est, par exemple, de 1 à 20 min, de préférence de 1 à 10 min. L'irradiation est, en généra réalisée, sous des conditions normales de température (température ambian et de pression (pression atmosphérique). Li-radiation est par utilisation d'un masque ou d'une irradlation focasée, afin d'obtehlt la fonctionnesation rdsitée per réaction des fonctions X et Y dans la zone ciblée. L'irradiation est dite ocalisée, car seule est irradiée la zone dans !&u!elle on souhaite obtenir la fonctionnalisati n. Si plusieurs fonctionnalisations sont successivement mises en oeuvre, à chaque fois une zone différente sera irradiée, Une fois une première fcnctionnasaUon réalisée par réaction des fonctions X et Y (nommées Y1 dans le cas de la première nctlonnall monolithe poreux est rincé, par exemple, avec le solvant c qui peut. être noterai-rient le TI-IF, le noF, ecétoriltgle si. deuxièrn fonctionnalisation peut i.is-e mise, i oeuvre. La Figure 1 iHustre schématiquement un e::>-r.ernple, du procédé selon rinV irradiation localise au moyen d'un masque, 3res un exemp. De mailiere avantageuse, dans le cadre de l'invenutm, on moins une onctonnahsaton conduisant e une romnionnalite parmi c oisie - _s chaînes a ky e, Caires polymérioues, par exemple. - les groupes porteurs de fonction ionîsable comme es acides cnroxyIiques et les amines, - les groupements ionisés et/ou zvmittérioniques, tels que 2rounes sulfates, sulfonates, ammonium quaternaires, phosphates, p ceintes, bétaUne et su foretaline, - les molécules biologiques telles que les aptamères, les acides lucléiques, les phospholipides, es protéines, les sucres, les fragments d'anticorps, cMlatants tels que l'acide nitri otriac nue, l'acide nitriicdiacéti - les groupe, i.ents polaires tels que les amides, et - les sélecteurs chiraux. 3013 992 14 Selon des modes de réalisation préférés, au moins deux fonctionnal5DUOnS différentes seront réalisées avec des réactifs sélectionnés pour obtenir : deux zones de pda rl:és efférentes, 5 une zone échangeuse d'ions et une zone hydrophobe, une zone échangeuse o'ions et une zone laydr. ou bien une zone hydrophile et une zone hydrophobe. Dans le cadre de l'invention, le ci.-cuit micro-étutoique sera, le plus souvent' délimité par une colonne de chromatograo car un ou 10 plusieurs canaux aménacjels dans un substrat Dans de ts circuits micro- ues, le Otance traversée per e fais aveud'irradiation utilisé dans qui correspond a, deur ou au diamet , cOnD uit, e lnférleure à 500 pro, de ra arence à 100 um. Ceci permet notamment - radar due ,a Furnlère reçue sera relativernent horr, cagne au 15 poreux, Dans le cas d'un s,pbstrat dans lequel n ou sieurs canaux sent - de tels canaux sont, le plus souvent, de section transversale. rectangulaire avec le plus grand transversale gui appertlent à in gamme allant: souvent les canaux: auront une section transversale fei 20 lumèlme devra traverser le substrat pour pouvar leur sache. 200 microns, Bien de sorte. la hotohoiti cl.3. coM me le cas avers les oc onnes chroma phiqu s. En effet, le procédé selon l'invention étant basé sur l'utilisation de sourr,aç dIrraCation pour initier une réaction radicalaire, ie rios'eriau délimitant. le r nne ou les canaux devra étre transparent à l' ation 25 utilisée. Ce ce, le matériau consdrutif du substrat ou de la os.,.onne sera transparent lumq dans uni me de longueurs dlrnde allant de 200 à 600 nm, en particur- ur e allant de à 380 rrIlt les irradiations se faisant en général à une longueur d'onde de 254 nm, 365 nm ou 380 nm. 30 Par ailleurs, le mriau constitutif du substrat ou de la colonne est, pour ce type d'' 'c -en dive ifograohhr, de préférence, inerte pchimiquement principara. uti:isés en chromatographie liquide. On pourra choislr un matériau constitutif du substrat ou de la colonne qui ne réagira pas avec le solvant utilisé dans l'application chromatographique, notamment avec l'acétonitrile, le méthanol, le tétra.hydrofurane, le 1-propanol, le 2-propanol et/ou l'acétone. A titre d'exemples de tels matériaux, on peut citer le verre, la silice fondue, le quartz, le COC, et pour des applications en biochromatographie (nécessitant des cond. d'analyse respectueuses des m s biolocliques), il est. envisageable. cïtfser îe PDMS polydimétny Tioxane), le PMMA (polyméthy méthacrylate) ou le PS (po en fonction de la longueur 10 d'onde choisie pour l'irradiation solvants utifsPs dans la phase mobile. Le procécie- un l'in perrn de fabriquer des dispositifs chromatogrph autorisa nt a circulation ce milieux gazeux ou iquide.s. Dans ce dernL c s, la circu'atior sera assurée par des système(s) de pompage (pompe liPLC, par exemple), utilisation de champs éectriques 15 électrochrernatcgraphie), ou de fome centrifuge (Lab on CD, par exemple). Les dispositifs obtenus pourront être: utfsés en techniques séparatives,, pour de préparation d'échantillon réaliser différentes ma successives ichantillon 20 chromatoqr ligue (phase in Ce t,je de dispositifs m munopreconcentration, purification" OSStkJO ymatique, ion, par exem- traitement marquage) et séparation écharpe cl'ion irisés et multi-foncUonnels revêt un intérêt. particulier dans les domaines de la pro eomique urit) ou de l'environnement, par -nple. Ils pourront aussi faire hobet d'intégration dans des systèmes plus cgiiip'exes (ou intégrés) type Laboratoire sur puce 25 .(« lab on chip »). Les exemptes ci-près, en 7-ence aux Agures 7 à 11 annexées qui présentent des chromatogrammes obtenus en suivant le signal UV à 214 nm, sont donnés à titre purement illustra-tif et permettent de mieux comprendre 30 1 exemple defon 'o 'don ço morLolittLuii dE T?.oaratorl elmede de polarité d:epas inversée 3013 992 16 Le support de départ est une colonne monolithique de silice synthétisée dans un tube capillaire de silice fondue de 75 pm de diamètre interne revêtu par un film téflon: transparent aux UV. L'ensemble de la colonne capillaire est clans une première étape fonctionnalisé avec du vinyl trirriChoinisiiane. Le mélange réactionnel est obtenu en mélangeant 50 pI de vinyl trimétha:ysitane et 25 pI de .triéthylam! '. à 1 mL d'un méthanol/eau (95/5 ; v/v). Le capifiaire est - p du mélange réactio et p.acé ..ans un four à 80°C pendant 6 heures. Pour réaliser le photo-greffage, la cotonne rncnoltrhhtue fcnctionnaFsée avec les fonctions vinyle est ensuite rempile une 50tUt!On constituée de 0,577 g d'i-oct?' (X77) et de 0,1 rni_ d'une sohsden 0,0455 de benzopAnone Pans du THF, dans 1,9 mL, de THF. Le carifte est bouché a ses extrémités pRr .des bouchons en scone et rdecé dans un four d'illumination à une n rie :365 nrn, perdant 5 minutes. La cotonne est ensuite te sous débit de THF pendant 20 minutes, La colonne est oarau chrometogra ph inversée, La hase rnobie est un métane methano/eau (80/20, L'analyse est réasée en injectant trois solutés t. louré pe il-enzène et hexy)benn, chromatopramme obtenu est présenté e- et met. en évidence la séparation du penzylbenzene et de l'hexy;sen4ene ,..hiourée est utilisée pour marquer le temps mort de la colonne) sur te colonne photo- une l'ODT. Les `7,, ;-- rs de rétention pour le peritylbenzène benzène sont 2,5 et 3,6. Le coefficient de v7v*-3tion inter-capillaire sur 3 colonnes différentes obtenues selon mode opératoire de est de 2%. Il est montré que le pocIcEdé Yotogreffage utilisé pas l'efficacité intrinsèque dur-,uppol. En effet, après photo-greffage, l'efficacité des coionnes est similaire aux efficacités des colonnes avant greffage (mesures effectuées en mode HILIC sur la silice). La rétention des colonnes par le procédé de photo-greffage est comparable voire supérieure aux cotonnes monolithiques fonctionnalisées par voie « classique ». Les colonnes chroniatographiques particulaires ou 3013 992 17 monolithiques utHisées en mode de phase inversée sont majoritairement obtenues p effage d'un silane monofonctionnel très réact - le hylam (octadécyl)silane (C18-ODS). Ce ré f I met tenir des couches monornokkubires denses. La justiflci, i de l'utiPsaton duo silane monotonchonnei repose sur la quarté et la reproductibilité d, d couches obtenues. Ces supports de chromatographie sont classiquement pris comme référence. La ronctirEr ration des mêmes supports Urpet_ 10 point de monolithiques fonctionnalisés avec le dinn:thyl(orteo. stane (C18-0DS) est utilisée comme nce, Il convient de noter que dans ce cas, ce type de réaction r'est pas localisable. L comparaison de colonnes obtenues pa e prc:cedé p Ct. o ch, mie Li e et de cc (.-::),ines obtenir iec le C. 'll)rds montre que o- colonnes donnent des rétentions du même ordre Ot;, rirandour. Un demfù me test chrornatograph est utds pour apprécier la 15 nature des couches obten En utilisahs la nié me hase mobHe méthanol, v/v), deux ïydrocarbures aromatiques triphénylène et Iortho- )hényl'. ont é udies, tous tes doux avant des proprit hvo ronhobes analogues, mars des différences d'encombrement stérai analyse 20 permet dcibserver la façon dont sont organisées les cnaines cm rs de la phase 7::taitionnare, L'ortho-terphényie possédant. unE',. L Lure tridinrensionne est donc encombrant et si (t's chaînes ne se mais entremaidos, --ie pourra pas passer à Itntérieur des chaînes L sera donc moins retenu que le triphénylène. Le trie quant à lui, possède 25 une structure plane, il est donc plus facilement retenu par la phase lnafte. De ce fait, en calculant leur sélectivi (a= k (th) /k (o-ter)), il est 7,sible d'avoir une idée sur t -,-J,3.his:Uic.)n des chaînes au sein de la phase stationnaire. Ainsi, plus la sélectivité est mportante, plus les chaînes sont entremêlées, ce qui se trade me h fait que la phase stationnaire 30 sépare mieux les composés, du fait de leur taille. Les valeurs de sélectivité calculées a\ - colonne photo-greffée avec VODT sont de l'ordre de 1,5 et sont sembla vs à ce qui est obtenu pour des 3013 992 18 couches C18-ODS. Ce test montre clairement que la fonctionnalisation obtenue se rapproche plus d'une couche monomoléculaire, à l'instar des couches obtenues par silanisation avec le C18-ODS, que d'une couche polymérique comme celle obtenue par réaction d'acrylate ou méthacrylate sur des surface acrylate ou méthacrylate ou par silanisation avec des silanes tri-fonctionnels de type trichlorosilane 2ème exernrIe de fonctiorn1alisation: Elaboration d'une colonne lullbilogiolithi en mode d'interaction h hi HILI.C1, Une colonne monolithique fonctionnalisée avec les onctions wo. 10 obtenue, conformément à l'exemple 1, est remplie dune solution pour réaliser- le photo-greffage constituée de 0,132 g de cysteine et de 0,136 mL d'une solution aqueuse à 22,1 mg/mL de cinlydrochlorure de 2,2"-azobis(2- me ylpropicriamicie) (AIBA), dans 0,864 mi d'eau. Le capillaire est bouché à émites par L es bouchons en silicone et placé dans un four 15 d'illumination à une longueur d'onde de 365 nm, pendant 5 minutes. La colonne est ensuite lavée sous débit avec de l'eau perdant 30 minutes.. La colonne é cmactérisée en mode HILIC pour i- séparation d'un mélange d'uracile, d'adénosine, de cytosine phase mobile est un mélange acétonitrile eau (90/. 20 Le chromatogramme présenté Figure 3 est out ne et de aphtalène. La ). n en suivant le signal UV à 214 nm et met en évidence la séparation en mode HILIC de l'uracile, de l'adénosine, de le cytosine et de la cytidine (le naphtalène est utilisé comme marquei r de temps mort) sur la colonne capillaire monolithique photo- gre istéine. 25 modification de la silice par un monomère hydrosoluble(la cystèine dans ce cas) en milieu aqueux est donc réaflsabie en utilisant un photo-initiateur soluble en milieu aqueux. 3ème exemple de fonctionnalisatien : Fia rati n n nne capjllaire moi :lithique échanqeuse decaons 30 Une colonne monolithique fonctionnalisée avec les fonctions vinyle obtenue, conformément à l'exemple 1, est remplie d'une soiution pour réaliser le photo-greffage constituée de 0,0164 g de sodium 2- 3013 9 92 19 mercaptoéthanesulfonate (SMES) et de 0,136 mL d'une solution aqueuse à 22,1 mgjmL de dydrochtsrure de 2,2 "-azobis(2-methylpropionamide) (AIBA)' dans 0,864 mL cl eau. e capillaire est bouché à ses extrémités par des bouchons en licone et placé dans un four d'illumination à une longueur d'onde de 36 pendant 5 minutes. La colonne est ensuite lavée sous débit avec de l'eau pendant 30 minutes. Les tests sur les colonnes échangeuses de cations sont menés avec un mélange de bétabloquants dans une phase mobte acftonitriie/tampon phosphate 5, 10 mM phosphate avec une concentration en KCI de 10 10 reg/mL. Le chromatoc ,:,rnme présenté Figure 4 et obtenu en suivent le signal UV à 214 nrn et met en évidence la séparation de beta-.5 bbquanits sur la colonne capi1are rckonoithique photo-dre ée avec le SMES. Il apparatdonc que le greffage n .ionomère chargé a été éal é 15 avec uccès et permet rie séparer des esp: chargées positivement. Les mesures de capacité réalisées avec at.énotn donnent des va!etiirs de l'ordre de 4,5 rv de monolithe 'tins un capillaire de 75 pm de dmètre interne )oration de ce type de support en amont de colonnes hydrophobes 'e,vêt tout particulier pour les analyses 20 multidimensioneres de peptides, Ela çapjU,aire onolitiWqqe aration iodale g ant, ligie 4.-j0,3,:e.Lz911ge71.de pe échane de. cationer'ieme deuxièm _permettant dei sepa ana yit,tsi_p_a_r_ . 25 p2larlté de has jflyée, anrèUgpr lutin dc . zone Z2 Deux étapes de photo-fonctionnarisation sont réalisées à la suite dans un capillaire rie silice fondue de 75 pm de diamètre interne, 10 centimètres de longueur et rempli de monolithe de silice. L'ensemble de la colonne capillaire monolithique est dans une première étape fonctionnalisé avec le 30 vinyl thrriéttioxyane, comme décrit à l'exemple 1, puis subit un inertage des fonctions OH résiduelles de la silice, de faccn collective sur l'ensemble de la colonne monolithique par un traitement au HM DZ ( examéthyldisilazane) pendant 2 heures. .Fc-;ntionn.E.,isauon de la zone Z1 (zone puse de cations (1 cm de La colonne monolithique fonctionnalisée avec les fonctions vn st remplie d'une r iddon peur réaliser le photo-greffage constituée de 0,0164 g de 2-mer ; vu anesulfonate de sodium (MES) et de 0,136 mL d'une solution , 22,1 mn/mL de dihydruchlorure de 2,2 '-azobïs(2 méthvopionamide'i "AI 0,854 FId'eau, Le capfllaire est, rempli 10 avec cefte solution et juche sesextrémités nar des Louchcn5 en sikone. Le capiilaire est ensuite irradié pendant 5 365 nm en errant soin de masquer la zone correspondant à la zonE Le masquage est éaHné en introdt., nrn,3!e de la zone correspondant à la zone Z2 dans un tube Je eux colonne est ensuite cu.s débit, 1.5 -dant 20 minutes, O Fonction lonclue Le mélange de ,hete-. 0,1 mL d'une sokibpr à 20 129 mi de THF, a s- ensuite irradié pendant minuses à 355 nnn en prenant masu»-ge est réalisé en introduiant l'ensenlu est cens nr57'2 de bennouhé none 'ODT et de -ns t ')lare est a masquer la :one aire est rembii avec la solut Dar ciiiss ons en siliconas Le cc un tube opaque aux UV. La COlOrie est ensuit- sous 25 c:Lit de T. F pene.,I-.t 20 minutes. ,,-)ne et Léchai-Con est constitué d'un mélange de benzène, v/v). propanolci ,4a=9,42) dans une solution de méthanol/eau L'échantillon est injecté par pression (3 bans, 0,2 min). La séparation est réalisée dans cri premier temps avec une mmmobile constituée de 70 % 30 en volume de méthanol et de 30 % en vm, d'une solution de KCI à 50 L. Le chromatO 'T me présenté Fig t 3 est obtenu en 5LiKielt le V à 214 n et met en évidence la séparation obtenue du mélange de propranolol, Benzène et Toluène sur la colonne capillaire monolithique rultimodale (1 cm d'échanqe de cations (SMES) et 9 cm de phase inverse (OUI )). Le premier pic correspond au temps mort de la colonne, les trois solutés sont ensuite parfaitement séparés. L'ajout de sel dans la phase rnobk permet de masquer s rétention par échange de cations liée à la zone Z1 lu capiiiaire. La séparation repose principalement sur un mécanisme de p - -:age en cnornatoiraphie à polarité de phases inversée. Le colutE, le plus paire est élué en premier, alors que le rouène présenrzz- Ti groupement méthyle en plus par rapport au benzène est le soluté le plus retenu. Une seconde analyse est réalisée dans une phase mobile métha u LM, si- -s se!, La séparation est présentée sur e chromatogramme ésenté r'gure u, obtenu en suivan Ultà 24 nr-n Sur le chromatogramme, à part du solvant (temps rtio seuls le benzène et la toluène sont glués de la colonne., Sans pour masquer la partie dchange propanolol ionisé positivement à pH neutre intera rtement avec lo support ot est retenu dans la zone 71, Dans ces conditions, ii est possible dans un premier temps de stroarer sélectivement les produits neutres et de retenir, dans la colonne, les composes chargés positivement. Afin d'éluer le Dropranool de la partie éc saute d'ions, une nouvene eu on est réisee en ajoutant dans la phase Ç.lobi.e des sels (Me0 u 70/30, v/v, avec 15 mg/mL de KCI). Le chromatogramme obtenu en suivant le si nal L'', 214 nm est présenté Figure 7 et met en évidence l'abaissement de la I me le base correspondant au changement de phase mobile (présence .-e sel) et intervenant au temps mort de !? colonne. Par la suite, un seul pic est détecté au temps de rétention du propranolol identifié lors de la première analyse (chromatogramme de la Fklure 5). En conclusion, une colonne rnulUmedale constituée d'une partie échangeuse de cations (1cm en entrée de colonne) et d'une partie phase à 3013 9 92 22 polarité de phases inversées (9 cm) a été réalisée par photochimie selon le procédé détaillé dans la présente invention. Cette colonne multimoda e permet de séparer des composés neutres et chargés selon un double mécanisme (mode mixte de chromatographie de polarité de phases inversée 5 et de chromatograph d'échange de cations. La partie échangeuse de cations permet d'établir des interactions avec 1,as composés chargés positivement (responsables de la rétention du prc7 _n l'absence de sel dans a phase mobile) et la zone fonctionnalisée permet de séparer les solutés selon leur caractère hydrophobe respons-bie. e ,a séparation des 3 10 solutés en présence de sel). Sèrn e.xeriple de ftctionnaflsation Elaboratior 1'unecolonrie ire morwlithigle Dyne une zone Z de 'ions et linedeuxième Zone Z, le séporer nalytes zone ePPS chrornt:oqraphe a poh ité de, pba-,,r.tÎflhsée Une colonne idenieg à celle. déctite à Vexernple 4 est utilisée., l'échantillon est couse tué .mélange de ', bêtabloquants (Nadoletl, -oh et, woprenolof) en solution dans un mélange méthanol/eau (70/30, chromatogramme obtenu en suivant le signai UV à 214 nm 20 est présenté Figure 8 Volume injecté 5 nanolitres, Séparation réalisée à 12. bars « 'net en évidence la séparation obtenue avec une phase mcblie saline .(Métranol/e I v/v avec 15 CD. 'La masque la rétention de à partie .échangeuse de cations, ésercn de sel composés sont alors essentiellement séparés,. selon un mécanisme de partage en phase 25 inverse. L'échantLcn est ensuite dilué 20 fois et !'analyse est répétée dans les mêmes ccH. ions de séparation que précédemment. Le résultat de la séparation est présenté sur le chromatogramme oc la Figure 9 (volume 5 nanolitres, séparation rétiisée. à 12 bars, détection à 214 nm). 30 Seul le pic de solvant est clairement visible, les pics des trois solutés sont difficilement détectables dans le bruit de fond. La concentration des solutés se trouve donc proche de la limite de détection. 3013 992 23 Dans une troisième expérience, le volume injecté est augmenté de 5 nL à 100 nL (20 fois plus), afin de pré-concentrer les bêtabloquants solubilisés dans une phase mobile sans sel sur la partie échangeuse de cations, les autres conditions son,: maintenues constantes. Le chromatogramme obtenu est présenté sur la FOqure 1 On observe l'abas:ement de la ligne de base qui correspond au chanqement nie moli le. (présence de se! de !a colonne, 'a d suite, les pics e iterino temps mort rresporint au nadoloi, oxprenoioi et nmpranolo idendPés ors de première anai.ye (Fulurpi. 0 Ces composés ont été injectes en continu perdant 4 mHutes sous une pression de 3 bars (volume 20 fola ipérieu;- au voiurne injeot. dans la cas du chromate ce colonne sur la zor :an . se de nations avant détre nues et s parésdans la zone de phase inverse, En réshsart L mémoexpédence,mais en uluant 15 l'écina,riallon avec un solvant contenant du KG plus possible dttenir une séparation correcte ces, (chromatiogrammie de En effet, ijection de en présence de sel, masque la partie échanceuse decattso, les sole.- avancent donc dans la colonne sans concentratio Ce résultat confirme quo la bs-coricentr est bien réalisée 20 sur la cérne écdanpeuse de cations. En conclusior une co,'onne rnuitimcdàle constitué-' partie échan!.-Jeuse de cations (1cm en entrée de ccildiar et d'unE e phase à polarita, de phase ln ée (9 cm) réallade par photochimie scion le procédé détaillé dans la présente ion. Cette colonne mut modale 25 permet de der Oe.s composés res et U selon un double mécanisme ;scie mixte) de chrorrowgraph!e.de p de pha717 inversée et de chrome -iraphie cdons. L7 partie é- - : )9nuse de cations permiat ab!ir des interactions avec les composés chargés positivement (responsable de la rétention du proprano ai en l'absence de sel 30 dans C phase mobile) et la zone fonctionnalisée C1 perrinï.,t de séparer les c,c) Lité' - '-aur caractère hydrophobe (responsable de la séparation des 3 soi Uté: Es résence de sel). REVENDICATIONS1 - Procédé de fabrication d'un dispositifcomprEnant un monolithe poreux confiné dans un circuit micro-fluicilq:'..., ledit monolithe poreux comportant au moins deux zones distinctes, dont au noirs une zone (Z) porteuse d'une fonctionnalité- liée au monolithe poreux par une liaison covalente, et obtenue grâce aux étapes successives suivantes : a) l'obtention d'un monolttra poreux porteur de fonctions réactives X à l'intérieur du circuit micro-fluidiq b) la fonctionnaUsaUon, par mise en con,..act du monolithe poreux, porteur des fonctions réactives X avec un réactif comprenant une fonctionnalitéR soub sur la zone détermirprésence d'un rthateur de r x libres par abstraction suivie (l'une u uirin.31jon localisée de la zone entrainant la réaction des fondions X et de manière à obtenir un pont covalent, c) fe rinçage du monolithe poreux, les fonctions X et Y étant définies comme sut Soit X est onction comportant un hydrcl>.-::ié abstrnctihle choisie parmi les fonctions - H, -OH, es fonctions alkylarnin, ;entant un atome d'hydroriène norté par un carbone en position aipha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions _iner présentant un atome irogène porté par un carbone en position _apha par rapport: à d'oxygène et Y comporte une insaturation ; soit X comporte une insaturation et Y est une foncton comportant un hydrogène abstractible choisie parmi les fonctions -SH, -0H, les fonctions ;,:kylarrftIE, présentant un atome cunydrogène porté par un carbone en position alpha par rapport à l'atome d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'hydrogène porté par un carbone en position alpha pare rapport à l'atome d'oxygène. 2 - Procédé de fabrication, selon la revendication 1, d'un dispositif comprenant un monolithe poreux confiné dans un circuit micro-fluidique, ledit monolithe poreux comportant au moins deux zones et Z2, chaquezone étant porteuse d'une -fonctionmliite R1 ou -2 différente liée au monolithe poreux par une liaison ite, comprenant les étapes successives suivantes : a) l'obtention d'un monolithe poreux porteur de fonctions réactives X à l'intérieur du circuit micro-fluidique, b) une première fonctionnalisation iocalisée, par mise en contact du monolithe poreux, porteur de fonctions réactives X avec un réactif comprenant une fonction réactive Y1 et la fonctionnalité R1 souhaitée sur une zone abterminée Z, en présence initiateur de radicaux 10 Sibres par abstraction ne, ukfe d'une Iftimination localisée a zone dolée Z1, entraïnant la réaction des fonctions V et Y1, de nidère fice'-ntenir Ur, pont covalent, c) oholithe poreux, d) une deuxième fonctionnalisadon locahsée, par rriso en contact du 15 monolithe poreux porteur de fonctionu reaclivez X avec un réactif comprenant une fonction réactive Y2 et à foncdonnahtb R2 souhaitée sur une noter zone dfitnrrninete Ze en Drésence d'un initiateur de radeau r r oar abstraction d cri e d'une illumination localisée a -ne ciblée Z2, entraînant la réaction des fonctions :- 20 tenir un pont covalent, e ithe poreux, les foncËons X, et Y2 étant définies comme suit : soit X est une fonction comportant un hydroçée abstractible choisie 25 parmi Ie atome rappc ctions -51-1, -OH, les fonctions alkt atffinisiii présentant un fine porté par un carbone en podtinn aiphr par orne d'azote, et les fonctions éther presentant un atome d'hyd i-e porté par un position alpha par rapport à l'aton le uxygène et. I et. 2, itiei tiques ou différents, comportent une insaturation ; 30 soit X comporte une insaturation et i et Y2, identiques ou différents, sont une fonction comportar L hydrogène abstractible choisie parmi les fonctions -SI1, -OH l5 alkylamine présentant un atomepar un car ï":.;fl'a en position alpha par rapport à Vat e d'azote, et les fonctions éther présentant un atome d'h cène porté par un carbone en po, bon n'ptio par rapport à l'atüffle d'cxyq 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qui?. est la fonction comportant un hydrogène abstractible choisie parn-ii les fonctions -OH les fonctions --lamine présentant un atome d'hydrogène porté un carbone en position alpha rapport à l'atome d'azote, et les fonr:177n7 éther présentant un atome oqène porté par un carbone en pos n alpha pvl-apport à l'atome dici - Procédé selon a i-evendicar',-, 2 ou 3 caractérisé en ce que la fonction qui cornecmd.e une iriser:: est choisie parmi lus groupes comprenant une doubie teison une trple liaLson nota ru uni um s aicényles te cupevinyle, es alcynFes, les 15 acry atus, lesT acm inné si es, es vinyl s' esters: [es cote les /éVinyi amides, f a es, [ /Vminyhamides, mu a hc ally?scficyanurates, esters insaturés, acryonitriie Procédé e C 20 en ce que I u base d'[ e mon ooeuu est notamment risi parmi IFtiicr d'oxyde d'ha 6 - Procé,L.. selon l'une quelconque des revendlcations 1 à 5 caractérisé en ce que la réaction entre les onctions X el: Y entraîne un simple greffage 25 covalent, sans réaction de t sityrrierisaticiin ein surace. Es maléimi revendications LI bs caractérisé au inorganique, de zirconium et océé selon rune . Jepecinoue ,sies revend en ce que tecOon du monoine. poreux, portEur ions 1 à 6 cariv-T fonctions réaerk,es X, 7- est réalisé par préférence, préaieblement obter u par 30 micro fluidique. Procédé selon quelconque des reven( .ations 1 à 6 caractérisé ,LLionnalisation d'un monolithe poreux inorganique, de procédé sol-gel à l'intérieur du circuit en ce que tobtention à Intérieur du circuit micrlee u T du monolithe 3013 992 27 poreux porteur de fonctions réactives est réalisé en une seule étape par mise en oeuvre d'un procédé sol-gel avec utilisation d'un précurseur fonctionnalisé. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé 5 en ce que l'illumination localisée est réalisée à une longueur d'onde appartenant à la gamme allant de 200 à 600 nm, en particulier dans une gamme a-lbrs, de 240 à 380 nm, 1 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce eue la mise en contact du monolithe poreux porteur de fonctions réactives X avec un réactif comprenant une fonction réactive Y et la fonctiurma!ité R souhaioàe sur une zone errneée et réalisée par imprégnation eu monoHthe avec une soblion contenant le ctif et l'agent initiateur, par exemple. dans un solvant: notamment )arrni le THF, le méthane)! l'eau et leurs me Pro se Ion l'une quelconque des revendications 1 à 10 care', ben é en ont initiateur de radicaux bres est choisi parmi la be iienone et ses CL les thioxanthones, or benzoïne et ses éthers; le les alkyle:erronés et 25 - ies chaînes polvrnériques, par exempt, , du type nolpéthylène glycol, - les groupe:, murs de fonction ionisaMe comme es acides carboxylques et les amines, - les groupements ionisés et/ou zwittérioniques, tek que les groupes sulfates, sultonates, ammoniumn quaternaires, phesptate.s'. phophonates, beteifile et, - les molécules bTolo loues telles que les aptamères, les acides nucléiques, les phospholipIdes, les protéines, les sucres, ;es fragments d'anticorps, alpha hydro)(sin- phosphine on s; et les on l'une, qiJelconclue des revendf7.7bOrr ,u'on réalise ou moins une for Cnonnaisaticiri conduisant à leurs 'ives; titanocènes' - Procédé onctionnalité P. choisie parmi : chaïnesles agents chélatants tels que l'acide nitrilotriacétique, l'acide 'acétique, et oupements pore s tom s que les amides. 13 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'au moins deux onctionnalisations différentes sont réalisées avec des réactifs sélectionnés pour obLmir : - deux zones c différentes, e ZO n e d'ion5 et: une zone hyJ une zone écnangeurie d'ions et une zone hyc1r bien une no oph le et une zone selon Aine iebonque o reve jcations 1 13 cattérié on ce qt.e e circuit micro-fluidici -Iet délimmté per une coiunne de dm ma ou par un ou plusie. 3. canaux am dans un substrat. 15 - Procédé :une uuelconque des revend els 1 à 14 caractérisé en ce que ;e Jrcuit microd^jdique présente une profondeur ou un damètre inférieur à 500 pm, de prééronce à 100 pm.20