Brevet FR3015296A1 — publié le 20150626

La présente invention concerne le domaine général des substituts biodégradables et bio-assimilables, pour application biomédicale. En particulier, la présente invention concerne un nouvel hydrogel de chitosane présentant d'excellentes propriétés de suturabilité et différentes déclinaisons de cet hydrogel, adaptées à différentes applications biomédicales, notamment pour servir de patch pour la régénération tissulaire colorectale, ou encore de substitut vasculaire. Le chitosane, est un dérivé partiellement, voire totalement, désacétylé de la chitine. Ses différentes formes sont notamment caractérisées par leur degré d'acétylation (DA) et par leur masse moléculaire moyenne en masse Mw. Le chitosane est un polysaccharide connu pour être biocompatible, biorésorbable, bactériostatique et fongistatique. Le chitosane a déjà fait l'objet d'application pour la constitution de substitut vasculaire, notamment dans la demande de brevet WO 2011/151603, dont certains des inventeurs de la présente demande de brevet sont à l'origine. Bien que les substituts vasculaires décrits dans la demande de brevet WO 2011/151603 soient annoncés comme suturables, les inventeurs de la présente demande de brevet ont constaté qu'ils ne donnaient pas entière satisfaction en termes de maniabilité et de souplesse d'utilisation, en particulier lors de la réalisation de la suture. Par ailleurs, le chitosane n'a jamais, d'après la revue de la littérature effectuée, été utilisé comme matrice en ingénierie colorectale. L'ingénierie tissulaire colorectale est peu développée dans la littérature. Les principales matrices utilisées ont été des matrices synthétiques (PGA-PLA), ou biologiques de type sous muqueuse intestinale de porcs décellularisées et composées de 900Io de collagène. Cependant, l'intérêt du chitosane a été rapporté in vitro dans les mécanismes d'échanges para- et trans-cellulaires de la barrière intestinale (Rosenthal R, Günzel D, Finger C, et al. The effect of chitosan on transcellular and Paracellular mechanism in the intestinal epithelial barrier. Biomaterials 2012;33(9):2791-2800.) et dans l'ingénierie de la paroi musculaire intestinale (Zakhem E, Raghavan S, Gilmont RR, Bitar KN. Chitosan-based scaffolds for the support of smooth muscle constructs in the intestinal tissue engineering. Biomaterials 2012;33(19):4810 4817). Dans la dernière étude citée, la matrice utilisée était composite : chitosane-collagène. Des matrices composites de chitosane - SIS (Lauto A. Integration of extracellular matrix with chitosan adhesive film for sutureless tissue fixation. Lasers in Surgery and Medicine 2009;41:366-371) et chitosane-PGLA (Lawrence BJ, Maase EL, Lin HK, Madihally SV. Multilayer composite scaffolds with mechanical properties similar to small intestinal submucosa. J Biomed Mater Res A 2009 ; 88(3), 634-643) (Mirani RD, Pratt J, Lyer P, Madihally SV. The stress relaxation characteristics of composite matrices etched to produce nanoscale surface features. Biomaterials 2009 ; 30(5) : 703-710) ont été rapportées dans des études in vitro pour augmenter la résistance mécanique et la suturabilité de l'implant. D'autre part, le chitosane semble également avoir démontré un intérêt comme film adhésif dans le concept de « Photochimical tissue bonding », permettant une réparation tissulaire sans suture (Lauto A, Mawad D, Barton M, Gupta A, Piller S, Hook J. Photochemical tissue bonding with chitosan Adhesive films. BioMed Eng Online 2010;9:47). Enfin, en dehors de l'ingénierie colorectale, le chitosane a été très récemment associé au polycaprolactone pour la réalisation d'une matrice composite de type « sandwich », afin d'augmenter la suturabilité de l'implant dans la réparation de défects congénitaux de la paroi cardiaque (Pok S, Myers JD, Madihally SV, Jacot 3G. A multilayered scaffold of a chitosan and gelatin hydrogel supported by a PCL core for cardiac tissue engineering. Acta Biomateriala 2013;9:5630-5642). Dans ce contexte, la présente demande de brevet a pour objectif de proposer un hydrogel de chitosane dont la structure a été sélectionnée pour présenter des propriétés améliorées en termes de suturabilité, notamment par rapport aux hydrogels décrit dans la demande WO 2011/151603, et offrir un nombre plus important d'applications en tant qu'implant biomédical. L'invention concerne un hydrogel physique d'un chitosane présentant un degré d'acétylation (DA) inférieur ou égal à 15% caractérisé en ce que le paramètre P, correspondant au produit de la masse moléculaire moyenne en masse Mw du chitosane exprimée en kg/mol par la concentration du chitosane dans l'hydrogel exprimée en % massique par rapport à la masse totale de l'hydrogel, est supérieur ou égal à 1500 %.kg/mol. Une telle sélection permet d'atteindre des performances en termes de suturabilité compatibles avec des applications chirurgicales. De manière avantageuse, l'hydrogel physique de chitosane présente l'une des caractéristiques ci-dessous ou l'une quelconque des combinaisons de caractéristiques ci-dessous, voire toutes les caractéristiques ci-dessous : - le chitosane constitutif de l'hydrogel présente un DA appartenant à la gamme allant de 0 à 5 % ; le paramètre P appartient à la gamme allant de 2 000 à 6 000 %.kg/mol, et, de préférence, à la gamme allant de 2 000 à 4 000 %.kg/mol ; le chitosane constitutif de l'hydrogel présente une masse moléculaire moyenne en masse Mw appartenant à la gamme allant de 120 à 1 000 kg/mol, et, de préférence, à la gamme allant de 300 à 700 kg/mol ; - la masse de chitosane constitutif de l'hydrogel représente de 1,5% à 6% en masse de la masse totale de l'hydrogel, et, de préférence, de 2,5% à 5% en masse de la masse totale de l'hydrogel ; ce pourcentage massique correspond à la concentration du chitosane dans l'hydrogel exprimée en % massique utilisée dans le calcul du paramètre P; - l'hydrogel comporte une fraction significative de l'allomorphe cristallin anhydre du chitosane, éventuellement en mélange avec une forme cristalline hydratée, avec, de préférence, la forme cristalline anhydre qui représente au moins 5%, de préférence au moins 10% en masse du chitosane cristallin présent ; - l'hydrogel est obtenu par coagulation d'une solution ou d'un gel hydro-alcoolique de chitosane ; - l'hydrogel est obtenu par coagulation dans une solution aqueuse de soude, de potasse ou d'ammoniaque, à une concentration de 0,5 à 10 mol/L, préférentiellement de 2 à 8 mol/L. Bien entendu, la masse moléculaire moyenne en masse Mw du chitosane et la concentration du chitosane dans l'hydrogel exprimée en massique seront choisies dans les gammes mentionnées, de manière à obtenir une valeur souhaitée pour le facteur P de l'hydrogel suturable supérieure ou égale à 1500 %.kg/mol, voire appartenant à l'une des gammes préférées allant de 2 000 à 6 000 %.kg/mol, ou de 2 000 à 4 000 %.kg/mol. La présente invention a également pour objet les implants pour la régénération tissulaire constitués au moins en partie d'un hydrogel selon l'invention. De manière avantageuse, un implant selon l'invention présente l'une des caractéristiques ci-dessous ou l'une quelconque des combinaisons de 15 caractéristiques ci-dessous, voire toutes les caractéristiques ci-dessous, lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre - l'implant comporte une couche, dite suturable, constituée d'un hydrogel selon l'invention et au moins une autre couche d'hydrogel physique, dite colonisable, formée d'un chitosane présentant un 20 degré d'acétylation (DA) inférieur ou égal à 15% et dont le paramètre P est supérieur ou égal à 400 %.kg/mol et inférieur à 1 500 %.kg/mol et appartient, de préférence à la gamme allant de 400 à 900 %.kg/mol ; - le chitosane de la couche colonisable présente un DA appartenant à la 25 gamme allant de 0 à 5 °A) ; - le chitosane de la couche colonisable présente une masse moléculaire moyenne en masse Mw appartenant à la gamme allant de 80 à 1 000 kg/mol, et, de préférence, à la gamme allant de 100 à 700 kg/mol ; 30 -la masse de chitosane dans la couche colonisable représente de 0,5% à 6% en masse de la masse totale de ladite couche, et, de préférence, de 0,5% à 3% en masse de la masse totale de ladite couche ; bien entendu, la masse moléculaire moyenne en masse Mw du chitosane et la concentration du chitosane dans l'hydrogel exprimée en % massique seront choisies dans les gammes mentionnées, de manière à obtenir une valeur souhaitée pour le paramètre P de l'hydrogel colonisable ; - la couche colonisable est constituée d'un hydrogel physique de chitosane, présentant quasi-exclusivement une forme cristalline hydratée du polysaccharide, et de préférence exempte de forme cristalline anhydre ; - la couche colonisable est réalisée à partir d'une solution aqueuse de chitosane exempte d'alcool, qui après dépôt est coagulée par neutralisation ; - la couche suturable et la couche colonisable sont en contact et liées entre elles par enchevêtrement macromoléculaire du chitosane des deux couches à leur interface ; - l'implant se présente sous la forme d'un patch pour la régénération tissulaire colorectale ; de manière avantageuse, l'implant comporte une couche suturable centrale disposée entre deux couches colonisables, de préférence, identiques ; un tel implant présente un intérêt tout particulier pour son utilisation dans le traitement de fistules coliques, rectales, pelviennes ou périnéales ; - l'implant se présente sous la forme d'un substitut vasculaire ; selon un mode de réalisation préféré, le substitut vasculaire se présente sous la forme d'un tube creux comprenant au moins une couche suturable formant la partie interne du tube et au moins une couche colonisable formant la partie externe du tube ; en particulier, le substitut vasculaire peut être formé d'un tube creux constitué d'au moins deux membranes tubulaires coaxiales, dont au moins une membrane est constituée d'une couche suturable et au moins une membrane est constituée d'une couche colonisable ; le terme « membranes » est utilisé pour désigner deux couches quand ces dernières ne seront pas solidaires mais pourront bouger l'une par rapport à l'autre ; de préférence, la ou les membrane(s) constituée(s) d'une couche suturable forme(nt) une structure tubulaire interne et la ou les membrane(s) constituée(s) d'une couche colonisable forme(nt) une structure tubulaire externe ; dans des modes de réalisation particuliers, au moins deux membranes tubulaires sont séparées par un espace inter-membranaire contenant des cellules ou fragments de tissus biologiques ; de préférence, l'épaisseur de la couche suturable appartient à la gamme allant de 10 microns à 5 millimètres ; - l'implant est caractérisé par une valeur de suturabilité normalisée, obtenue selon la méthode décrite dans les exemples, qui est d'au moins 50 gf/mm. La description ci-après, en référence aux Figures annexées permet de mieux comprendre l'invention. La Figure 1 est une vue schématique en perspective d'un exemple de patch colorectal conforme à l'invention. La Figure 2 est une vue schématique en perspective d'un exemple de substitut vasculaire conforme à l'invention. La Figure 3 est une vue schématique en coupe d'un autre exemple de patch colorectal conforme à l'invention. La Figure 4 présente des valeurs de suturabilité obtenue dans le cadre de l'invention, en fonction du paramètre P et des concentrations en soude dans le bain de coagulation utilisé. La ri illustre un exemple de dispositif pouvant être utilisé pour réaliser les mesures de valeurs de suturabilité normalisée données dans le cadre de l'invention. Par hydrogel de chitosane, on entend un matériau visco-élastique comportant au moins 80% en masse d'eau, et de préférence, au moins 90% en masse d'eau. Un hydrogel contient, en général, de 0,1% à 20% et, de préférence de 0,5 à 10% en masse de chitosane. Dans le cadre de l'invention, l'hydrogel est dit physique, car les interactions responsables de la réticulation inter-chaînes donnant sa cohésion à l'hydrogel sont de type physique, et sont notamment des liaisons hydrogène et/ou des interactions hydrophobes, par opposition à un hydrogel dit chimique (nommé également hydrogel réticulé), dans lequel les interactions inter-chaînes sont de type liaison covalente. Aucun agent de réticulation chimique n'est présent dans un hydrogel purement physique. De manière avantageuse, dans le cadre de l'invention, les hydrogels physiques de chitosane sont constitués exclusivement d'eau et de chitosane, et contiennent, de préférence, plus de 90% (m/m) d'eau. En particulier, de tels hydrogels ne comportent ni collagène, ni polycaprolactone, ni agent de réticulation chimique toxique (du 1.0 type glutaraldéhyde, formaldéhyde, épichlorhydrine, etc...). Dans le cadre de l'invention, les masses moléculaires moyennes en masse Mw du chitosane sont déterminées par chromatographie d'exclusion stérique, dont les conditions expérimentales sont décrites dans la publication «Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic 15 medium » A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005. Le degré d'acétylation (DA) est déterminé en utilisant la technique de RMN du proton, en suivant la méthodologie d'Hirai (Asako Hirai, Hisashi Odani, Akio Nakajima, Polymer Bulletin (1991) Volume: 26, Issue: 1, 20 Publisher: Springer, Pages: 87-94). Le paramètre P, dont l'invention a mis en évidence son caractère essentiel pour l'obtention des caractéristiques de suturabilité, peut être défini par l'équation suivante : P=Mw (kg/mol) x C (% massique du chitosane dans l'hydrogel) 25 Il est donc exprimé en %.kg/mol. Les chitosanes de faible DA utilisés dans le cadre de l'invention présentent des propriétés fongistatiques et bactériostatiques, et auront, donc un effet bénéfique supplémentaire, sur les parties lésées, après implantation. Les hydrogels de chitosane utilisés dans le cadre de l'invention, du fait du DA 30 du chitosane et de leur forte teneur en eau, génèrent peu de réponse inflammatoire, et sont donc parfaitement adaptés aux applications biomédicales envisagées. Dans le cadre de l'invention, il est avantageux, pour la constitution d'un hydrogel suturable, de choisir un polysaccharide de haute masse moléculaire. En particulier, un chitosane présentant une masse moléculaire moyenne en masse Mw supérieure à 350 kg/mol pourra être utilisé, pour favoriser la formation de liaisons inter-cristallines, de liaisons hydrogène et d'interactions hydrophobes, ainsi que la formation d'une forte densité de noeuds d'enchevêtrement à divers niveaux d'échelle de la morphologie de l'hydrogel. Les hydrogels suturables, selon l'invention, ne sont pas rapidement colonisés par des cellules, que ce soit in vivo ou in vitro. Ils ont une structure dense résultant d'une forte densité d'enchevêtrements. De ce fait, leur structure peut interdire ou limiter la colonisation cellulaire. Dans le cadre de l'invention, ils seront, de préférence, associés à un hydrogel physique de chitosane aux propriétés différentes, dit colonisable, pour former des patchs colorectaux, des substituts vasculaires, ou plus généralement des implants. L'hydrogel suturable a pour objectif d'assurer une bonne tenue mécanique de l'implant final et de permettre sa suturabilité, ce qui permettra d'assurer l'étanchéité de la liaison tissu-implant. Dans les hydrogels de chitosane colonisables, le paramètre P est choisi dans une gamme qui permet la colonisation cellulaire, tout en restant dans les limites d'obtention d'un hydrogel. L'hydrogel physique de chitosane colonisable présentera une porosité ouverte, autorisant la pénétration des cellules et donc la colonisation de l'hydrogel. De manière préférée, les implants selon l'invention sont constitués à plus de 98% en masse d'hydrogel(s) physique(s) de chitosane, voire exclusivement constitués d'eau et de chitosane. En particulier, de tels implants ne comportent ni collagène, ni polycaprolactone, ni sous muqueuse intestinale de porcs décellularisée. Dans les patchs colorectaux selon l'invention, l'hydrogel suturable assure le rôle pariétal et permet de garantir l'absence de fuite du contenu viscéral vers la cavité abdominale, alors que l'hydrogel colonisable assure la reconstruction cellulaire par invasion cellulaire et permet également un renfort de la paroi constituée par l'hydrogel suturable et une plus grande étanchéité au niveau du passage des fils utilisés pour sa mise en place dans l'organisme. La Figure 1 illustre un tel patch se présentant sous la forme d'une plaque, comportant une couche 2 d'hydrogel de chitosane suturable associée sur l'une de ses grandes faces ou sur ses deux grandes faces à une 5 couche J, d'hydrogel de chitosane colonisable. Les épaisseurs des différentes couches pourront être identiques ou différentes selon l'application visée, par exemple, en fonction de la vitesse de biorésorption de l'implant souhaitée. Par exemple, les patchs colorectaux selon l'invention pourront présenter une surface de 1 cm2 à 200 cm2 et/ou une épaisseur de 0,1 à 10 10 mm. De tels patchs colorectaux sont parfaitement adaptés pour le traitement des fistules coliques, rectales, pelviennes ou périnéales, en particulier chez l'homme, que ce soit par voie gynécologique (recto-vaginale, favorisée par des antécédents d'hystérectomie) ou urinaire (recto-urétrale). 15 Ces fistules peuvent être consécutives à : - une chirurgie d'exérèse rectale avec anastomose colorectale ou coloanale, - une chirurgie de résection de prostate (prostatectomie), - une radiothérapie pelvienne, les doses nécessaires pour le traitement 20 des cancers du col utérin et de la prostate étant de 60 à 80 Gy (dans 3 à 20% des cas, les patients peuvent présenter une rectite radique ou une microrectie, l'apparition d'une fistule recto-vaginale ou recto-urétrale étant beaucoup plus rare), - une maladie inflammatoire du tube digestif (Maladie de Crohn), 25 - un traumatisme périnéal. Les patchs colorectaux, selon l'invention, sont plus performants que les techniques actuellement utilisées dans de tels cas. En effet, les techniques instrumentales telles que l'obturation du trajet avec de la colle biologique ne donnent pas de bons résultats en raison de l'absence de trajet intermédiaire. 30 Les essais in vivo présentés dans les exemples, en comparaison avec la matrice SIS (Small Intestinal Submucosa), une matrice biologique à base de sous-muqueuses intestinales de porc, approuvée par la FDA pour la pratique clinique comme renfort pariétal, ont également montré des performances similaires ou améliorées pour le patch selon l'invention. Dans leur forme la plus simple, les substituts vasculaires, selon l'invention, peuvent être constitués exclusivement d'un hydrogel physique de chitosane selon l'invention dit suturable. Les substituts vasculaires 10 selon l'invention comporteront, quant à eux, de préférence, un tube interne - formé d'un hydrogel physique de chitosane selon l'invention, dit suturable, et un tube externe 30 coaxial avec le tube interne formé d'un hydrogel physique de chitosane, dit colonisable, comme illustré .Igure 2. La mise en oeuvre d'un tube formé d'au moins deux couches d'hydrogel différent correspondant à une enveloppe externe, placée autour d'une structure tubulaire interne, telles que ci-dessus définies, va alors permettre d'assurer la reconstruction d'un canal conjonctif externe de soutien avant complète dégradation du substitut. Par exemple, les substituts vasculaires, selon l'invention, qui se présentent sous la forme d'un tube creux pourront présenter un diamètre externe de 100 pm à 5 cm et/ou une épaisseur de 10 pm à 5 mm. Les patchs colorectaux ou les substituts vasculaires, selon l'invention, qui comportent une couche d'hydrogel physique de chitosane dite suturable et une couche d'hydrogel physique de chitosane dite colonisable, pourront être traités avant leur implantation dans l'organisme de manière à coloniser la couche colonisable, par exemple, avec des cellules. La présence d'une couche colonisable permet, lorsque le substitut vasculaire ou le patch est implanté, la reconstitution d'un tissu de soutien 25 avant dégradation du substitut ou patch et l'affaiblissement subséquent de ses propriétés mécaniques. De manière préférée, la colonisation cellulaire de la couche colonisable par les cellules du tissu conjonctif au contact duquel le substitut vasculaire est destiné à être implanté, intervient en moins de 10 jours. 30 L'hydrogel suturable, selon l'invention, peut être obtenu par coagulation d'une solution ou d'un gel hydro-alcoolique de chitosane. Dans le cas où l'hydrogel doit être formé sous la forme d'un tube (ce qui est le cas pour la formation de substitut vasculaire), l'hydrogel suturable selon l'invention peut être obtenu, par coagulation, d'une solution hydro-alcoolique de chitosane, extrudable, présentant d'une part le DA sélectionné et d'autre part une Mw et une concentration choisies pour obtenir un paramètre P dans la gamme sélectionnée. En particulier, il est possible d'utiliser une solution hydro-alcoolique du type mélange eau/alcool dans laquelle l'alcool est, de préférence, un polyalcool, par exemple, choisi parmi les 1,2- et 1,3-propanediol, les 1,2-, 1,3- et 1,4-butanediol et le 1,2,3-propanetriol (glycérol), avec une proportion 10 eau/alcool (v/v), par exemple de (20/80) à (95/5), et de préférence de 40/60 à 90/10(v/v). La mise en oeuvre d'une telle solution hydro-alcoolique permet la formation d'une fraction significative d'un allomorphe ou d'une forme cristalline anhydre du chitosane, ce qui n'est pas le cas avec une solution aqueuse qui conduit à l'allomorphe hydraté seul. De préférence, la solution 15 hydro-alcoolique utilisée est obtenue en partant de chitosane en solution aqueuse acide, de préférence, une solution contenant de l'acide acétique, et en ajoutant le polyalcool retenu. L'acide est introduit en quantité stoechiométrique par rapport aux fonctions amine du chitosane. Avec la mise en oeuvre d'un tel procédé, l'hydrogel physique de 20 chitosane obtenu présente une fraction significative de l'allomorphe cristallin anhydre du chitosane, éventuellement en mélange avec une forme cristalline hydratée. La forme cristalline anhydre représente au moins 5%, de préférence, au moins 10°/0 en masse du chitosane cristallin présent. Dans le cas où l'hydrogel suturable doit être formé sous la forme d'un 25 tube creux, on utilise un filage comprenant une étape d'extrusion au travers d'une filière, par exemple tubulaire, d'une solution hydro-alcoolique de chitosane. L'extrudat obtenu est ensuite introduit dans un bain coagulant (notamment une solution alcaline ou des vapeurs alcalines). Ce procédé comprend au moins un cycle de coagulation partielle lors de laquelle la 30 coagulation est interrompue. Le cycle de coagulation est réalisé en introduisant la solution hydro-alcoolique de chitosane coagulable extrudée dans un bain ou une chambre de coagulation, dans des conditions permettant d'obtenir une fibre qui, en section transversale, présente une section partiellement coagulée. Le bain ou la chambre de coagulation contient un agent coagulant tel qu'un gaz alcalin comme l'ammoniac ou une solution alcaline de soude, potasse ou d'ammoniaque dont la diffusion dans la solution permet de la faire passer localement à l'état gel ou coagulé. L'arrêt de la coagulation, se fait notamment en sortant la fibre formée du bain ou de la chambre de coagulation et en effectuant un rinçage, notamment à l'eau. Le fait d'arrêter la coagulation de la fibre de chitosane permet, notamment, de former le canal central de la fibre creuse en arrêtant la coagulation avant la prise en masse de l'hydrogel au coeur de la fibre, sans avoir besoin de préformer la cavité à l'aide d'un élément central à diamètre fixe comme dans une filière annulaire. Cette coagulation séquencée permet également de contrôler l'épaisseur du tube formé. Pour plus de détails, on pourra se référer au brevet FR 2 920786. Dans le cas où l'hydrogel doit être formé sous la forme d'une plaque (cas d'un patch), la solution hydro-alcoolique est déposée dans un moule de la forme souhaitée et une première coagulation partielle est réalisée par séchage partiel à une température appartenant le plus souvent à la gamme allant de 40°C à 80°C, préférentiellement à 50°C, avec évaporation du solvant et, en particulier avec évaporation de l'eau. Un gel intermédiaire alcoolique est ainsi formé. Une telle étape permettra d'obtenir au final un hydrogel plus concentré. En effet, dans ce cas, la concentration en chitosane dans la solution hydro-alcoolique déposée est inférieure à la concentration souhaitée dans l'hydrogel final, la concentration finale pouvant être déduite à partir de la concentration initiale en tenant compte de la quantité de solvant évaporé. Ensuite, une coagulation en milieu alcalin, dans les mêmes conditions que celles décrites pour la formation d'un tube, est réalisée. Dans les deux cas, la neutralisation pourra être réalisée grâce à une solution aqueuse alcaline, par exemple contenant de la soude, de la potasse ou de l'ammoniaque, en tant qu'agent alcalin, à une concentration de 0,5 à 10M, préférentiellement de 2M à 8M. L'homme du métier choisira la concentration en agent alcalin, de manière à optimiser les propriétés de suturabilité et obtenir la suturabilité souhaitée. En particulier, dans le cas de la neutralisation d'une solution hydro-alcoolique de chitosane par un bain de soude (solvant dans la solution : 50% eau / 50% 1,2-propanediol), la concentration optimale en agent alcalin sera plus faible lorsqu'on augmentera la valeur de P (comme cela ressort des résultats présentés F _1 4). Pour des P supérieurs ou égaux à P=1500 %.kg/mol, cette concentration optimale en soude [Na0H1 Joptimale (exprimée en mol/L) sera liée au paramètre P par la relation suivante : [Na0H1 Joptimale = P/375 + 10,8. La neutralisation sera, suivie d'un rinçage à l'eau pour éliminer l'excès de base et de sels. L'hydrogel colonisable est, quant à lui, réalisé à partir d'une solution aqueuse de chitosane exempte d'alcool, qui est déposée sur l'hydrogel suturable ou sur un gel intermédiaire (cas du patch), puis neutralisée. Cette solution peut contenir en plus de l'eau et du chitosane, des sels ajoutés, tel que du chlorure de sodium, qui contribuent à l'écrantage des charges dans la solution polyélectrolytique, et donc au désenchevêtrement des chaînes de polysaccharide pendant la neutralisation et la formation d'un gel plus poreux. Là encore, la solution aqueuse de chitosane utilisée est une solution aqueuse acide, contenant notamment de l'acide acétique. L'acide est introduit, de préférence, en quantité stoechiométrique par rapport aux fonctions amine du chitosane. Il est également possible d'utiliser une solution aqueuse d'acétate ou chlorhydrate de chitosane. Une telle solution est déposée sur le gel, par trempage ou par tout moyen approprié (pinceau ou dépôt automatisé). La neutralisation peut se faire dans les mêmes conditions que la neutralisation de l'hydrogel suturable. La neutralisation des différentes couches d'un patch pourra être menée simultanément. Dans le cas d'un implant sous la forme d'un tube, la neutralisation des tubes interne et externe peut se faire séparément en deux étapes, ou en une seule étape simultanément de façon analogue à la préparation d'un patch. Avec un tel procédé, l'hydrogel colonisable obtenu est un hydrogel physique de chitosane présentant quasi-exclusivement une forme cristalline hydratée, et de préférence, exempte de forme cristalline anhydre. Par quasi-exclusivement, on entend que plus de 95%, voire plus de 98% en masse de la fraction cristalline présente, sont constitués de cristaux d'une forme cristalline hydratée. Afin de favoriser la liaison entre les deux couches d'hydrogel, de l'acide, préférentiellement de l'acide acétique correspondant, de préférence, à l'acide déjà présent, sera ajouté à la solution aqueuse de chitosane utilisée pour la formation de l'hydrogel colonisable, juste avant son dépôt sur l'hydrogel suturable, par exemple à raison de 1 pL d'acide /g de solution aqueuse. De cette façon, après dépôt de la solution aqueuse de chitosane utilisée pour la formation de l'hydrogel colonisable et mise en contact pendant un temps suffisant (par exemple pendant 90 minutes), le chitosane de la couche suturable en contact avec cette solution aqueuse se re-dissout partiellement en surface conduisant à un enchevêtrement des chaînes de chitosane des deux couches 2 et 3 à l'interface 4, par référence à la Figure 1. Avec la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, pour la préparation 15 de substituts vasculaires, il est possible, en utilisant des cycles de neutralisation interrompue comme décrit dans le brevet FR 2 920786, de réaliser un assemblage de tubes creux multi-membranaires de façon à ce qu'une ou plusieurs membranes soient suturables. Ceci permet la conception de substituts vasculaires cellularisés (incorporation de cellules souches, 20 cellules musculaires lisses, etc...), en particulier implantables et suturables destinés à l'ingénierie tissulaire du vaisseau sanguin (en particulier, pour les petites artères). Dans un tel cas, au moins deux membranes tubulaires sont séparées par un espace inter-membranaire contenant des cellules vivantes. De tels exemples de cellularisation sont décrits dans la demande wo 25 2011/151603 à laquelle on pourra se référer pour plus de détails. Dans le cas d'une cellularisation entre deux membranes, un espace doit être présent pour permettre l'introduction de cellules, les membranes ne doivent donc pas être solidaires. Il est également possible d'introduire dans un ou plusieurs espaces inter-membranaires des fragments de tissus biologiques. Il est 30 également possible de constituer des substituts vasculaires jouant le rôle de glandes ou bioréacteurs in vivo ou in vitro lorsque des cellules à activité endocrinienne sont introduites dans un ou plusieurs espaces inter- membranaires d'une structure tubulaire multi-membranaire. La lumière interne pourra alors être utilisée pour faire circuler le sang (application in vivo) ou on pourra mettre en oeuvre un milieu de culture oxygéné et adapté pour assurer la survie, le développement, la maturation et l'activité cellulaire (application in vitro). Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif. le ,-7-rnparatif : rni de h demande WO 2011/151503 Un tube de 5 mm de diamètre externe et de 5 cm de long est obtenu après extrusion par un pousse seringue d'un collodion hydroalcoolique 50/50 eau/1,2-propanediol, v/v, à la concentration en acétate de chitosane (DA= 1,5% et Mw=350 000 g/mol) de 2% g/g d'eau, et coagulation dans une solution aqueuse de soude 1M. La coagulation est interrompue par extraction 15 du gel de forme tubulaire du bain de coagulation après 5 minutes et rinçage à l'eau. La fin de la neutralisation est ensuite réalisée dans un bain de soude de concentration 4M, ce qui conduit à la formation d'un coeur gélifié. L'extraction du gel de coeur est effectuée manuellement, puis un rinçage dans 5L d'eau permutée pendant 12h est réalisé pour enlever les sels et 20 l'alcool résiduel. Le gel ainsi obtenu présente un paramètre P de 700 %.kg/mol. Exemple 1: Elaborat: )atch a 'recta (exemple d'un mode de réalisation) Un patch 1 constitué d'une structure tri-couche à base d'hydrogels 25 physiques de chitosane comme illustré . Lar_ 3 est préparé. Le chitosane utilisé a une masse Mw de 420 kg/mol. La couche centrale 2 est constituée d'un gel concentré à 7% (g/g) en chitosane de DA égal à 1,5%, obtenu à partir d'une solution hydro-alcoolique (50% (g/g) eau, 50% (g/g) 1,2-propanediol) d'acétate de chitosane 30 concentré à 3,5% (g/g). Cette couche centrale 2 a pour objectif d'assurer une bonne tenue mécanique au dispositif final et de permettre sa sutura bilité. Les 2 couches externes et 2 sont identiques et constituées d'un hydrogel concentré à 3% (g/g) en polymère obtenu à partir d'une solution aqueuse de chitosane de DA égal à 3%. Ces 2 couches 31 et 32 plus poreuses ont pour objectif de favoriser la colonisation cellulaire. Couche Mw (kg/mol) DA (%) C (% massique) P (%.kg/mol) 2 suturable 420 1,5 7 2940 31 et 32 420 3 126 colonisables Elaboration de la matrice tri-couche Une solution aqueuse de chitosane à 3% (g/g) est préparée pour l'élaboration des couches externes : le chitosane est dispersé dans de l'eau déionisée, de l'acide acétique est ajouté pour obtenir une protonation stoechiométrique des fonctions amine du chitosane et ainsi permettre sa dissolution. En parallèle, une solution hydro-alcoolique de chitosane est préparée pour l'élaboration de la couche centrale. Pour cela, on commence par réaliser une solution aqueuse de chitosane concentrée à 7% (comme expliqué ci- dessus), puis une quantité massique d'alcool (1,2-propanediol) égale à la quantité d'eau est ajoutée. Le tout est ensuite mis sous agitation mécanique pendant une heure. Le solvant final de la solution est constitué de 50% (g/g) d'eau et 50% (g/g) d'alcool. Après préparation de ces deux solutions de chitosane, la formation de la matrice tri-couche s'effectue alors en 2 étapes. La lère étape consiste à fabriquer la couche centrale à partir de la solution hydro-alcoolique de chitosane. La solution hydro-alcoolique est étalée à la spatule dans une boîte de Pétri, et l'ensemble est ensuite placé à l'étuve à 50°C pendant au moins 12h. Lors de l'évaporation du solvant, des interactions hydrophobes et des liaisons hydrogène se créent, conduisant progressivement à la formation d'un réseau tridimensionnel. Le gel ainsi formé est retiré de l'étuve, après évaporation de 50% de la masse initiale. La 2ème étape consiste à étaler à la spatule une fine pellicule de solution aqueuse de chitosane à 3% sur les 2 faces du gel hydro-alcoolique à 7% précédemment obtenu. Afin de favoriser l'attachement des couches d'hydrogels externes sur la couche centrale, de l'acide acétique est ajouté au préalable à la solution aqueuse de chitosane juste avant son étalement (environ 1 pL d'acide /g de solution aqueuse). Après 90 minutes de mise en contact des solutions aqueuses avec le gel hydro-alcoolique, l'ensemble est neutralisé dans une solution de soude à 7mol/L pendant 60 minutes. Cette neutralisation va permettre la gélification des 2 couches externes. Des rinçages à l'eau déionisée sont effectués jusqu'à ce que le pH des eaux de lavage soit neutre. Le dispositif final ne contient plus d'alcool, uniquement de l'eau et du chitosane. Il est ensuite stérilisé par autoclavage. Des études in vivo ont été menées afin de comparer le patch obtenu et la matrice SIS (pour « Small Intestinal Submucosa » qui est une matrice biologique à base de sous-muqueuses intestinales de porc, approuvée par la FDA pour la pratique clinique comme renfort pariétal), en termes de régénération tissulaire après implantation in vivo. L'expérimentation a été réalisée chez 16 lapins mâles de race néo-zélandaise. Les lapins ont été répartis en 2 groupes selon la matrice biologique acellulaire implantée : matrice SIS (n=8) et matrice de chitosane selon l'exemple 1 (n=8), en remplacement d'un défect trans-pariétal colique ovoïde de 2 x 1 cm, soit 1 cm2. Chaque groupe a été subdivisé en 2 sous-groupes de 4 lapins, respectivement euthanasiés à 30 et 60 jours après implantation. Une analyse comparative a ensuite été réalisée entre les 8 lapins du groupe « matrice SIS » et les 8 lapins du groupe « matrice chitosane » à partir des résultats cliniques, macroscopiques, histologiques et immunohistochimiques. L'étude in vivo réalisée a montré que les matrices SIS et à base d'hydrogel physique de chitosane permettait la réparation d'un défect colique, malgré la flore bactérienne présente au sein d'un colon non préparé. L'analyse histologique des greffons de SIS et de chitosane explantés a montré que la zone de greffe était le siège d'une régénération épithéliale partielle à 4 semaines et complète à 8 semaines après implantation. Cette régénération semble être plus précoce dans le groupe « matrice chitosane ». En effet, chez 50% des lapins sacrifiés à 4 semaines, on observait déjà une régénération épithéliale complète de la zone de greffe avec présence d'entérocytes immatures. A 8 semaines, la régénération muqueuse était complète dans les deux groupes avec présence de mucus au sein des entérocytes. Aucune régénération de la couche musculaire lisse n'a été mise en évidence après implantation de la matrice SIS en accord avec la littérature. Après implantation de la matrice de chitosane, des ilots musculaires fragmentés ont été identifiés à 8 semaines au sein de la couche sous-muqueuse de la zone de greffe, alors qu'aucun n'était présent à 4 semaines. La contraction de la zone de greffe était comparativement similaire entre les deux matrices. De même, l'étude de la néoangiogénèse par le compte du nombre de micro-vaisseaux/champs n'a pas mis en évidence de différence entre les deux groupes. En revanche, la fibrose inflammatoire évaluée par la mesure du rapport d'épaisseur entre la zone de greffe et la paroi normale a significativement diminuée dans le groupe chitosane entre 4 et 8 semaines. Dans le groupe SIS, la fibrose inflammatoire n'a pas régressé de façon significative. La régression de la fibrose inflammatoire constatée avec la matrice chitosane peut s'expliquer par une meilleure biocompatibilité. En effet, l'examen des coupes histologiques des expiants de chitosane a révélé la présence d'une résorption macrophagique de la matrice au sein de la paroi de la zone de greffe, alors qu'aucun signe de résorption du SIS n'a été identifié. -Exemple 2: E'- -ation dnT ibstitut r,Iaire L'invention a été utilisée pour élaborer un substitut vasculaire de petit calibre (de 2,6mm de diamètre externe et de 800pm d'épaisseur). Le tube a 30 été réalisé à partir d'une solution hydro-alcoolique (50% eau - 50% 1,2- propanediol) de chitosane, de concentration en polymère égale à 5% et de degré d'acétylation de 5% (g/g), conduisant à un paramètre P de 3000 %. kg/mol . Plus précisément, une solution de chitosane à 10% en masse est préparée. Pour cela, le chitosane est dispersé dans un volume d'eau 5 déionisée. De l'acide acétique est ajouté de façon à permettre une protonation stoechiométrique des fonctions amine du chitosane. Après dissolution du polymère, un volume de 1,2-propanediol est ajouté pour obtenir une concentration finale de 5% en chitosane dans un milieu hydro-alcoolique. Les bulles d'air présentes dans la solution sont éliminées 10 par des cycles successifs de centrifugation - repos (3 à 5 cycles). La solution homogène est ensuite extrudée via un système seringue - doseur de fluide à air comprimé. La seringue est équipée d'un cône d'extrusion aux dimensions nécessaires à l'obtention d'un jonc de diamètre de 2,6 mm environ. L'extrusion se fait directement dans un bain coagulant 15 de soude (NaOH) de concentration 7M permettant la déprotonation du chitosane et la formation d'un hydrogel. Le temps de passage dans le bain coagulant déterminera l'épaisseur de la fibre creuse. Dans ce cas précis, un temps de bain de 90 secondes permet d'obtenir une épaisseur d'environ 800 pm. 20 L'hydrogel est ensuite plongé dans un grand volume d'eau déionisée pour stopper la gélification et assurer la neutralisation de l'échantillon. Le tube ainsi formé, est vidé de son coeur encore sous forme de solution, par passage d'un courant d'eau ou d'air à travers celui-ci. L'hydrogel final est ensuite stérilisé par autoclavage. 25 Tests de suturabilité Des tests mécaniques de résistance à la suture ont été réalisés sur des tubes d'hydrogel creux de différentes valeurs de P et obtenus par le procédé décrit ci-dessus. Les résultats des tests de suturabilité sur des hydrogels tubulaires de différents P sont présentés dans le Tableau de la Fe T 30 avec « Cp » qui désigne la concentration en chitosane dans l'hydrogel, en % (m/m), [NaOH] qui désigne la concentration en soude dans le bain coagulant, en mol/L et e qui désigne l'épaisseur de la membrane du tube creux, en pm. Le DA du chitosane utilisé est de 5%, sa Mw est de 600 kg/mol. Le solvant initial de la solution de chitosane est composé de 50% d'eau et de 50% de 1,2-propanediol. La suturabilité des tubes de chitosane a été mesurée par un test de résistance à la déchirure par un fil de suture en polypropylène. La méthode développée consiste à faire un point de suture non serré dans l'échantillon d'hydrogel et à augmenter graduellement le poids du mobile qui y est accroché. Pour cela, un échantillon de tube de chitosane de 0,5-1 cm de long est 10 découpé. Une paroi de cet échantillon est traversée de part en part à l'une de ses extrémités, à 3 mm du bord, avec un fil de polypropylène de marque Prolène 6/0 (Ethicon, Somerville, NJ, USA) soutenant un récipient d'eau, comme illustré . -e 5. L'échantillon est positionné verticalement parallèlement à sa longueur. La quantité d'eau a été progressivement 15 augmentée, de manière à faire croître progressivement le poids de traction jusqu'à la déchirure du tube. La force nécessaire pour induire cette déchirure correspond à la suturabilité exprimée en gramme force. Chaque mesure a été répétée 3 fois sur un tube. La valeur du poids à la rupture est appelée « suturabilité » et est exprimée en gf (gramme force). 20 On définit alors la suturabilité normalisée, comme étant la valeur de la suturabilité divisée par l'épaisseur de l'échantillon exprimée en millimètres. Dans le cas d'un tube d'hydrogel creux, cette épaisseur est égale à l'épaisseur de la paroi du tube. Les tubes fabriqués avec une valeur de P de 2100 et 3000 %.kg/mol montrent une valeur de suturabilité normalisée 25 généralement supérieure à 50 gf/mm, ce qui en pratique est une valeur adaptée à la suture dans la pratique chirurgicale. La valeur de la suturabilité normalisée peut être encore optimisée en faisant varier la concentration du bain coagulant, comme cela apparaît sur les résultats du tableau présenté 30 Expérimentation in vivo: Afin de mettre en évidence la suturabilité in vivo, un tube de chitosane conforme à l'exemple 2 est implanté dans un modèle de remplacement aortique chez le rat adulte Wistar (14 semaines). Le tube testé correspondant à l'exemple 2, présente une valeur de suturabilité de 50 gf (soit une suturabilité normalisée d'environ 60 gf/mm) et un P de 3000 %.kg/mol. Après une anesthésie au pentobarbital (55 mg/kg), la paroi abdominale du rat est incisée par médiane. L'aorte est ensuite séparée de la veine cave sur toute sa longueur. Les branches collatérales de l'aorte sont disséquées et ligaturées (fil 9/0). Lorsque l'aorte est totalement libérée de la bifurcation iliaque à la veine rénale gauche, elle est clampée en proximal et en distal. Après section de l'aorte, un segment d'environ 5 mm de longueur est retiré. L'implantation de la prothèse vasculaire, d'environ 1 cm de long, se fait alors en suturant chaque anastomose, en termino-terminale, par environ 14 points séparés de fil nylon 9/0. Il est constaté que la prothèse en chitosane était facilement suturée à l'artère native. Après déclampage, l'absence de fuite au niveau des anastomoses est constatée. Les 48h qui ont suivi montrent une parfaite vitalité du rat avec une mobilité normale des pattes arrière. Après 2 jours, le rat est réopéré. Il est constaté que la prothèse ne présente ni rupture ni déchirement, ni fuite anastomotique. REVENDICATIONS1. Hydrogel physique d'un chitosane présentant un degré d'acétylation (DA) inférieur ou égal à 15% caractérisé en ce que le paramètre P, correspondant au produit de la masse moléculaire moyenne en masse Mw du 5 chitosane exprimée en kg/mol par la concentration du chitosane dans l'hydrogel exprimée en % massique par rapport à la masse totale de l'hydrogel, est supérieur ou égal à 1500 %.kg/mol. 2. Hydrogel physique selon la revendication 1 caractérisé en ce que le chitosane présente un DA appartenant à la gamme allant de 0 à 5 %. 3. Hydrogel physique selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le paramètre P appartient à la gamme allant de 2 000 à 6 000 %.kg/mol, et, de préférence, à la gamme allant de 2 000 à 4 000 %.kg/mol. 4. Hydrogel physique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le chitosane présente une masse moléculaire moyenne 15 en masse Mw appartenant à la gamme allant de 120 à 1 000 kg/mol, et, de préférence, à la gamme allant de 300 à 700 kg/mol. 5. Hydrogel physique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la masse de chitosane représente de 1,5% à 6% en masse de la masse totale de l'hydrogel, et, de préférence, de 2,5% à 5% en 20 masse de la masse totale de l'hydrogel. 6. lydrogel physique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comporte une fraction significative de l'allomorphe cristallin anhydre du chitosane, éventuellement en mélange avec une forme cristalline hydratée, avec, de préférence, la forme cristalline anhydre qui 25 représente au moins 5%, de préférence au moins 10% en masse de la masse de chitosane cristallin présent. 7. Hydrogel physique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est obtenu par coagulation d'une solution ou d'un gel hydro-alcoolique de chitosane. 30 8 - Hydrogel physique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il est obtenu par coagulation dans une solution aqueuse de soude, de potasse ou d'ammoniaque, à une concentration de 0,5 à 10 mol/L, préférentiellement de 2 à 8 mol/L. - Implant pour la régénération tissulaire constitué au moins en partie d'un hydrogel selon l'une des revendications 1 à 8. 10 - Implant selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comporte une couche, dite suturable, constituée d'un hydrogel selon l'une des revendications 1 à 8 et au moins une autre couche d'hydrogel physique, dite colonisable, formée d'un chitosane présentant un degré d'acétylation (DA) inférieur ou égal à 15% et dont le paramètre P est supérieur ou égal à 400 10 %.kg/mol et inférieur à 1 500 %.kg/mol et appartient, de préférence à la gamme allant de 400 à 900 %.kg/mol. 11 - Implant selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce que le chitosane de la couche colonisable présente un DA appartenant à la gamme allant de 0 à 5 °h. 15 12 - Implant selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 caractérisé en ce que le chitosane de la couche colonisable présente une masse moléculaire moyenne en masse Mw appartenant à la gamme allant de 80 à 1 000 kg/mol, et, de préférence, à la gamme allant de 100 à 700 kg/mol. 13 - Implant selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 caractérisé 20 en ce que la masse de chitosane dans la couche colonisable représente de 0,5% à 6% en masse de la masse totale de ladite couche, et, de préférence, de 0,5% à 3% en masse de la masse totale de ladite couche. 14 - Implant selon l'une quelconque des revendications 9 à 13 caractérisé en ce que la couche colonisable est constituée d'un hydrogel physique de 25 chitosane, présentant quasi-exclusivement une forme cristalline hydratée, et de préférence, exempte de forme cristalline anhydre. 15 - Implant selon l'une quelconque des revendications 9 à 14 caractérisé en ce que la couche colonisable est réalisée à partir d'une solution aqueuse de chitosane exempte d'alcool, qui, après dépôt, est coagulée par 30 neutralisation. 16 - Implant selon l'une quelconque des revendications 9 à 15 caractérisé en ce que la couche suturable et la couche colonisable sont en contact etliées entre elles par enchevêtrement macromoléculaire du chitosane des deux couches à leur interface. 17 - Implant selon l'une quelconque des revendications 9 à 16 caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un patch pour la régénération tissulaire colorectale. 18 - Implant selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il comporte une couche suturable centrale disposée entre deux couches colonisables, de préférence identiques, telles que définies à l'une quelconque des revendications 10 à 16. 19 - Implant selon la revendication 17 ou 18 pour son utilisation dans le traitement de fistules coliques, rectales, pelviennes ou périnéales. 20 - Implant selon l'une quelconque des revendications 9 à 16 caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un substitut vasculaire. 21 - Implant selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il se présente 15 sous la forme d'un tube creux comprenant au moins une couche suturable formant la partie interne du tube et au moins une couche colonisable formant la partie externe du tube. 22 - Implant selon la revendication 20 ou 21 se présentant sous la forme d'un tube creux constitué d'au moins deux membranes tubulaires coaxiales, 20 dont au moins une membrane est constituée d'une couche suturable et au moins une membrane est constituée d'une couche colonisable. 23 - Implant selon la revendication 22 caractérisés en ce que la ou les membrane(s) constituée(s) d'une couche suturable forme(nt) une structure tubulaire interne et la ou les membrane(s) constituée(s) d'une couche 25 colonisable forme(nt) une structure tubulaire externe. 24 - Implant selon la revendication 22 ou 23 caractérisé en ce qu'au moins deux membranes tubulaires sont séparées par un espace intermembranaire contenant des cellules ou des fragments de tissus biologiques. - Implant selon l'une quelconque des revendications 20 à 24 30 caractérisé en ce que l'épaisseur de la couche suturable appartient à la gamme allant de 10 microns à 5 millimètres.26 - Implant selon l'une quelconque des revendications 9 à 24 caractérisé par une valeur de suturabilité normalisée, obtenue selon la méthode décrite dans les exemples, est d'au moins 50 gf/mm.