Brevet FR3019712A1 — publié le 20151016

- 1 - Modèle animal et ses utilisations L'invention concerne un modèle animal et ses utilisations. La molécule de signalisation Hedgehog (Hh) appartient à une famille de morphogènes (Ingham et al. 2001, Dev Biol, 330(2) ; 3059-87) comprenant trois membres (Sonic Hedgehog (Shh), Desert Hedgehog et Indian Hedgehog) homologues au produit du gène de polarité segmentaire Hh chez la drosophile. Shh est synthétisé sous la forme d'un précurseur qui subit une série de modifications post-traductionnelles au cours desquelles la protéine est clivée par une activité enzymatique présente dans sa partie C-terminale. Cette autoprotéolyse génère un fragment C-terminal (ShhC) et le fragment N-terminal biologiquement actif (ShhN). Ce dernier est modifié par l'addition d'une molécule de cholestérol en C-terminal et d'une molécule d'acide gras sur le résidu cystéine N-terminal déprotégé après l'élimination du peptide signal (Varjosalo et al. 2008). La sécrétion de la protéine ShhN dépend de son interaction avec d'autres protéines. C'est le cas de la protéine Dispatched qui s'apparente à la famille des transporteurs possédant un domaine senseur de stérols, mais aussi des composantes de la matrice extracellulaire telles que les héparanes sulfates protéoglycanes. La formation de formes oligomériques de ShhN ou le relargage de la molécule par protéolyse de ses deux extrémités ont aussi été proposés. ShhN transmet son action par l'intermédiaire d'un complexe contenant deux protéines transmembranaires: Patched (Ptc) une protéine à 12 domaines trausmembranaires (TM) présentant une structure de type transporteur et Smoothened (Smo) une protéine à 7 domaines TM aux membres de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). En l'absence de son ligand Shh, Ptc inhibe Smo par un mécanisme qui reste encore hypothétique, mais qui est vraisemblablement de nature catalytique et fait intervenir une potentielle activité de Ptc dans le transport de molécules lipidiques membranaires. La cascade intracellulaire consécutive à la fixation de Shh sur Ptc et la levée de l'inhibition exercée par Ptc sur Smo s'accompagnent de l'accumulation de Smo dans une organelle spécifique, le cil primaire. De nombreux facteurs intracellulaires dont les protéines Suppressor of Fused (SuFu) et PKA, mais aussi les facteurs de transcription Gli sont également transloqués dans le cil. Cet adressage au cil est nécessaire à la conversion des facteurs Gli en formes activatrices qui conduiront à l'activation transcriptionnelle des gènes cibles tels que Ptc et Gli 1. Le rôle régulateur de la voie de signalisation des protéines Hedgehog durant le développement embryonnaire a été largement étudié. Hh a été associé aux processus de maintien et de réparation du tissu normal, à la régulation spatiotemporelle de la - 2 - prolifération et de la différenciation cellulaire. Le morphogène a notamment été impliqué dans le développement du système nerveux central. Le rôle essentiel de la signalisation Hh est attesté par les conséquences dramatiques d'une signalisation Hh déficitaire chez le foetus humain observées dans le syndrome de l'holoprosencéphalie. Plus récemment, la voie Shh a été identifiée dans le cerveau adulte, où la forme active aminoterminale de la molécule est exprimée dans de nombreuses régions du système nerveux mature suggérant de nouveaux rôles pour cette voie. Celle-ci participe notamment à l'établissement et au maintien des niches neurogéniques. Shh régule la prolifération des précurseurs oligodendrocytaires dans le cerveau non lésé et constitue un régulateur positif des oligodendrocytes au cours de la réparation du tissu cérébral démyélinisé. La modulation de la voie de signalisation Shh représente donc un enjeu dans la thérapeutique des pathologies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques, mais aussi d'autres maladies neurodégénératives. Pour la maladie de Parkinson et à un moindre degré pour la maladie d'Alzheimer, ces hypothèses reposent sur les activités de survie et de différenciation induites par Shh seul ou en présence d'autres facteurs de croissance. Shh est aussi capable de réduire in vitro l'activité électrique des neurones du noyau subthalamique impliqués dans la maladie de Parkinson. Enfin, des études ont mis en évidence les effets positifs de l'activation de la voie par la protéine Shh elle-même, sur les troubles comportementaux observés dans un modèle de cette même pathologie. Il existe donc un besoin d'étudier la voie de signalisation Shh afin de pourvoir déterminer, directement chez l'animal, son implication dans les pathologies susmentionnées. Des dysfonctionnements de la voie de signalisation Shh ont également été associés à de nombreux cancers. En effet, des mutations inactivatrices de Ptc sont associées au syndrome de Gorlin ou naevomatose basocellulaire, une maladie autosomale dominante caractérisée par des malformations cranofaciales et cérébrales, mais surtout par l'incidence élevée de diverses tumeurs, plus particulièrement des carcinomes basocellulaires au niveau cutané et des médulloblastomes au niveau cérébral. Des formes sporadiques de médulloblastomes et de carcinomes basocellulaires ont aussi été associées à des mutations des gènes Ptc ou Smo humains. Des mutations de Shh ont également été identifiées dans des carcinomes basocellulaires. D'autres types de tumeurs ont aussi été associés à un défaut de la voie de signalisation Hh. La localisation de ces tumeurs est étroitement corrélée aux sites d'expression des composantes de la voie au cours du développement embryonnaire. A titre d'exemple non-limitatif on peut citer: des cancers du sein et des méningiomes associés à des mutations de Ptc, des glioblastomes associés à des mutations de Gli, des cancers - 3 - gastro-intestinaux, notamment des cancers primaires de l'estomac et du colon, des cancers de la prostate, de la vessie, de l'ovaire, les rhabdomyosarcomes, les cancers du poumon à petites cellules. Toutefois, ces modèles concernent un gène Ptc muté et ne permettent pas d'étudier in 5 vivo la fonction du gène Ptc sauvage. On connait de l'état de la technique des modèles animaux d'invalidation de Ptc. Par exemple, la demande internationale WO 99/61582 enseigne des animaux transgéniques Ptc-/- Ces animaux meurent au stade embryonnaire du fait d'un défaut de fermeture du tube neural et pour des raisons de malformation cardiaque. 10 Aussi, la question de la fonction de Ptc dans le cerveau, notamment chez les animaux adultes, demeure irrésolue. Un des objets de l'invention est d'obvier à ces inconvénients en proposant des animaux modèles permettant d'étudier in vivo la fonction de Ptc sauvage, notamment dans le cerveau. 15 Un autre objet de l'invention est de proposer une méthode d'invalidation du gène Ptc permettant de contrôler dans l'espace et dans le temps l'expression dudit gène. L'invention concerne un mammifère transgénique non humain, présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant le récepteur membranaire patched ou Ptc dans les cellules souches neurales et/ou dans les cellules gliales, ledit mammifère 20 ayant une masse corporelle totale au moins 30% inférieure à la masse corporelle total dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales. Les inventeurs ont conçu un modèle animal présentant une invalidation du gène 25 Patched spécifique dans certaines cellules, en mettant à profit les techniques de transgénèse et de croisement sexués d'animaux. L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que les animaux adultes invalidés pour le gène Patched (Ptc) ne développent pas de tumeurs et ont une masse réduite. Un exemple de réduction de la masse de souris 30 transgéniques selon l'invention est donné à titre illustratif ci-après. Par ailleurs, les inventeurs ont également fait la constatation inattendue que la délétion, ou l'invalidation fonctionnelle, du gène Ptc avait pour conséquence d'inhiber la différenciation des cellules souches et ainsi d'augmenter leur nombre. Il y a donc un enrichissement en cellules souches neurales chez les animaux présent l'invalidation 35 fonctionnelle de Ptc dans les cellules souches neurales et les cellules gliales. Une telle réduction de la masse est observée lorsque le gène Ptc est invalidé dans les cellules souches neurales ou les cellules gliales, ou en d'autre terme dans les cellules - 4 - exprimant le marqueur Glast. Avantageusement, l'invention concerne un mammifère transgénique non humain adulte, présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant le récepteur membranaire patched ou Ptc dans les cellules souches neurales et/ou dans les cellules gliales, ledit mammifère ayant une masse corporelle totale au moins 30% inférieure à la masse corporelle total dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales. Dans l'invention, on entend par « invalidation fonctionnelle » toute action génétique ou épigénétique permettant d'inhiber l'expression d'un ou plusieurs gènes ou ayant pour effet de rendre le produit d'un gène dépourvu de son activité. Généralement, l'invalidation fonctionnelle passe par la délétion totale ou partielle d'une ou plusieurs séquences codantes d'un gène ayant pour effet d'inhiber l'expression du produit dudit gène, ou de permettre l'expression d'un produit ne présentant plus ses propriétés biologiques (perte ou modification d'activité enzymatique, perte ou modification de sa conformation tridimensionnelle...). La délétion de gènes chez les animaux passe généralement par la technique de « Knock-out » qui consiste à exciser tout ou partie d'un gène (en particulier la délétion d'un ou plusieurs exons) en vue d'en supprimer son expression ou de supprimer l'activité de la protéine qu'il code. 11 est également possible d'utiliser des techniques de « Knock-in » qui consistent à introduire de manière ciblée un élément génétique dans un gène déterminé afin soit d'en inhiber l'expression, soit de modifier le cadre de lecture, de sorte que le produit dudit gène est alors non fonctionnel. D'autres techniques d'invalidation sont bien connues de l'homme du métier, comme par 25 exemple la mutagenèse aléatoire utilisant des agents chimiques modifiant l'ADN. Comme mentionné ci-dessus, l'invention concerne avantageusement « un mammifère transgénique non humain adulte ». Par animal transgénique, on entend dans l'invention un animal génétiquement modifié dont le patrimoine génétique a été modifié par l'homme. Bien évidemment dans le 30 contexte de l"invention, les mammifères transgéniques ne concernent pas les humains. Par « un mammifère transgénique non humain adulte » on entend dans l'invention un mammifère biologiquement stable ayant acquis sa maturité sexuelle et donc susceptible de se reproduire, s'il est fertile. Le mammifère selon l'invention est notamment un rongeur, notamment un rat ou une 35 souris, ou un animal de laboratoire (chien, chat, singe, lapin, hamster...). Plus particulièrement, le mammifère transgénique selon l'invention est un rongeur, notamment une souris. - 5 - L'homme du métier, selon le mammifère considéré, est capable de déterminer aisément si l'animal a acquis le statut d'adulte. Par exemple, dans le cas de souris, les animaux adultes ont plus de 6 semaines notamment plus de 8 semaines. En d'autres termes, chez la souris, les animaux de plus de 6 à 8 semaines sont considérés comme adultes. Dans un mode de résiliation avantageux, l'invention concerne un mammifère transgénique non humain tel que défini précédemment, où lesdites cellules souches neurales et/ou lesdites cellules gliales sont des cellules exprimant le gène neural Glast. Dans l'invention, les animaux n'exprimant plus de récepteur Patched dans les cellules souches neurales ou les cellules gliales, ou encore exprimant une forme non fonctionnelle du gène Patched, présentent une masse réduite d'au moins 30% inférieure par rapport au même animal exprimant le gène Patched dans lesdites cellules souches neurales et les cellules gliales. Par « au moins 30% inférieur » ont entends dans l'invention au moins 30%, au moins 31 (:)/0, au moins 32 (:)/0, au moins 33 (:)/0, au moins 34 (:)/0, au moins 35 (:)/0, au moins 36 (:)/0, au moins 37 (:)/0, au moins 38 (:)/0, au moins 39 (:)/0, au moins 40 (:)/0, au moins 41 (:)/0, au moins 42 (:)/0, au moins 43 (:)/0, au moins 44 (:)/0, au moins 45 (:)/0, au moins 46 (:)/0, au moins 47 (:)/0, au moins 48 (:)/0, au moins 49 % ou au moins 50 %. Plus avantageusement, les animaux n'exprimant plus de récepteur Patched dans les cellules souches neurales ou les cellules gliales, ou encore exprimant une forme non fonctionnelle du gène Patched, présentent une masse réduite de 30% à 40% inférieure par rapport au même animal exprimant le gène Patched dans lesdites cellules souches neurales et les cellules gliales. Avantageusement, l'invention concerne un mammifère transgénique non humain, présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant le récepteur membranaire patched ou Ptc dans les cellules souches neurales et/ou dans les cellules gliales, ledit mammifère ayant une masse corporelle totale au moins 30%, mais au plus de 40%, inférieure à la masse corporelle total dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales. Les cellules souches neurales sont des cellules souches multipotentes, capables de 30 s'auto-renouveler, dont le potentiel de différenciation est restreint aux types cellulaires neuraux, notamment : les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes. Durant l'embryogenèse, ces cellules souches neurales sont situées dans la zone ventriculaire du tube neural. Elles génèrent l'ensemble des types cellulaires nécessaires au système nerveux central (à l'exception de la microglie), par un 35 processus appelé neurogenèse. Dans le système nerveux, les cellules gliales sont les cellules qui forment l'environnement des neurones. Elles assurent le maintien de l'homéostasie, produisent - 6 - la myéline et jouent un rôle de soutien et de protection du tissu nerveux en apportant les nutriments et l'oxygène, en éliminant les cellules mortes et en combattant les pathogènes. Les cellules gliales représentent environ 50% du volume cérébral1 et presque 90 % des cellules du cerveau. On distingue en général 4 principaux types de cellules gliales : les astrocytes, les oligodendrocytes, les cellules de Schwann et la m icrog lie. Glast (pour GLutamate ASpartate Transporter en anglais) aussi appelé EAAT1 (pour Excitatory Amino Acid Transporter 1 en anglais) est une protéine exprimée de manière prédominante à la membrane cellulaire et permettant d'épurer le glutamate de l'espace extracellulaire. Glast est exprimé dans le système nerveux central et en particulier dans les astrocytes. De manière plus avantageuse, l'invention concerne un mammifère transgénique non humain tel que défini précédemment, où lesdites cellules gliales sont des cellules exprimant le gène neural Glast, et notamment des cellules astrocytaires. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un mammifère transgénique tel que défini ci-dessus, ledit mammifère ayant un génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl, à l'exception des cellules souches neurales et des cellules souches gliales qui ont un génotype Glast-CreERT2;Ptc-/-. Afin de réaliser l'invalidation fonctionnelle de Ptc, les inventeurs ont tiré profit du 20 système d'invalidation basé sur la recombinase Cre et sa capacité à exciser des séquences nucléiques comprises entre les séquences cibles LoxP. De plus, afin de réaliser une invalidation spécifique, les inventeurs ont mis à profit l'utilisation d'une recombinase Cre inductible : la CreERT2. La recombinase CreERT2 - permettant le contrôle spatio-temporel de la mutagenèse 25 somatique - est devenue ces dernières années la référence technologique pour l'étude in vivo des mécanismes d'action et de l'expression des gènes, par une excision contrôlée d'acides nucléiques compris entre les séquences LoxP. La CreERT2 est une fusion entre la recombinase Cre et le domaine de liaison au ligand du récepteur aux oestrogènes. 30 Le contrôle spatial des modifications génétiques nécessite l'emploi d'un promoteur spécifique de tissu qui contrôle l'expression de la recombinase Cre. Pour obtenir un contrôle temporel de la suppression réalisée par la recombinase Cre, l'enzyme a été fusionnée à un nouveau domaine de liaison à l'ADN muté du récepteur humain aux oestrogènes (ERT2). Sous sa forme non liée à un ligand, la CreERT2 ne possède 35 aucune activité recombinase, et n'est donc pas capable d'exciser des acides nucléiques compris entre des séquences LoxP. Suite à l'administration du tamoxifène (un antagoniste aux récepteurs aux estrogènes), la protéine fusion Cre ERT2 est - 7 - capable de pénétrer dans le noyau cellulaire et de créer la modification génétique. ERT2 se lie au tamoxifène mais pas aux oestrogènes endogènes ce qui permet à la protéine fusion CreERT2 de rester cytoplasmique chez les animaux non traités avec du tamoxifène. Le contrôle temporel par le tamoxifène permet de créer les modifications génétiques à un moment précis du développent, à un temps défini par l'homme du métier. Dans le cadre de l'invention, afin de cibler spécifiquement l'invalidation de Patched dans les cellules souches neurales et les cellules gliales, et notamment astrocytaires, les inventeurs ont utilisé une CreERT2 placée sous contrôle du promoteur du gène Glast (aussi appelé dans l'invention promoteur Glast), dont le produit d'expression est retrouvé dans les lesdites cellules souches neurales et gliales. Au final, tel que décrit dans la partie expérimentale ci-après, les inventeurs ont mis à profit le croisement de souris transgéniques pour le gène Ptc, bordé de séquences LoxP, de génotype Pte/fi, avec des souris transgéniques ayant inséré au locus Glast le gène de la recombinase Cre inductible au tamoxifène, de génotype. Glast-CreERT2. Après croisement, la descendance est sélectionnée de sorte que les animaux possèdent les deux types de transgènes : Glast-CreERT2 et Ptcfvfl. Le génotype de ces animaux est donc Glast-CreERT2 ; Ptcfvfl. Avant traitement au tamoxifène, l'ensemble des cellules des animaux issus des croisements précédents sont de génotype Glast-CreERT2 ; Ptcfvfl. Après traitement au tamoxifène, les cellules qui n'expriment pas le gène Glast n'exprimeront pas la recombinase Cre. Aussi, dans ces cellules il n'y aura pas d'invalidation de du gène Ptc. Ces cellules demeurerons de génotype Glast-CreERT2 ; Ptcfvfl. Dans les cellules souches neurales et les cellules gliales, notamment astrocytaires, le 25 gène Glast s'exprime. Aussi, la recombinase Cre CreERT2 s'exprime également et est activable par le tamoxifène. Ces cellules auront donc une invalidation du gène Ptc, et seront de génotype Glast-CreERT2;Ptc-/-. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un animal transgénique tel que défini précédemment, ledit mammifère ayant un génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl, à 30 l'exception des cellules souches neurales et des cellules souches gliales qui ont un génotype Glast-CreERT2;Ptc-/- et expriment un ou plusieurs marqueurs permettant qui n'est pas exprimé dans les autres cellules, notamment les cellules exprimant ledit récepteur Ptc. Afin de suivre la recombinaison par la recombinase Cre, il peut être avantageux de 35 disposer d'animaux transgéniques susmentionnés possédant également un ou plusieurs transgènes inductibles qui seront exprimés ou activés lorsque la recombinase Cre sera activée par le tamoxifène. - 8 - Un exemple de marqueur avantageux est un transgène codant la protéine fluorescente jaune (YFP) possédant un codon stop entouré de séquences LoxP. Ce transgène peut être placé sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire, en particulier le promoteur du gène ROSA26. De tels animaux sont connus de l'homme du métier. Par exemple, chez la souris, les animaux possédant ladite protéine YFP recombinante inductible par la recombinase Cre sont notamment les souris B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortml (EYFP)Cos/+ disponibles sous le numéro 006148 au Jackson Laboratory. Le mammifère selon l'invention a un génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl, R26R-YFP/+, et les cellules expriment Ptc mais n'expriment pas la protéine fluorescente jaune ou YFP, 10 tandis que les cellules souches neurales et des cellules souches gliales n'expriment plus Ptc mais expriment la YFP. Un tel animal transgénique permet de suivre l'expression de la recombinase Cre de d'identifier les cellules dans lesquelles la recombinaison s'est produite. Il est également possible de suivre la descendance des cellules ayant subi la recombinaison, et plus 15 largement suivre l'évolution, in vivo, des cellules recombinée au cours du développement ou de la vie adulte de l'animal. Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention concerne un mammifère transgénique tel que défini précédemment, où malgré la réduction de la masse corporelle totale dudit mammifère, ledit mammifère présente un cerveau 20 essentiellement similaire à celui dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales. Les inventeurs ont constaté que l'invalidation fonctionnelle de Ptc dans les cellules souches neurales et dans les cellules gliales, notamment les cellules astrocytaires, 25 avait pour conséquence de réduire la masse totale des animaux. Toutefois, et de manière surprenante, la masse globale du cerveau des animaux transgéniques, notamment adultes, selon l'invention n'est pas différente des animaux témoins qui n'ont pas d'invalidation fonctionnelle de Ptc dans les cellules souches neurales et les cellules gliales. 30 Par « essentiellement similaire », on entend dans l'invention une similitude non exacte qui peut être due à la variabilité individuelle des animaux. On peut considérer que deux cerveaux ont des masses essentiellement similaires s'ils ont à plus ou moins cinq pourcents près la même masse. Ce qui est notable, comme cela a été indiqué précédemment, c'est que le cerveau des 35 animaux transgéniques selon l'invention est enrichi en cellules souches neurales par rapport aux animaux ne présentant pas d'invalidation du gène Ptc. L'invention concerne également une cellule isolée de génotype Glast-CreERT2;Ptc-/-. - 9 - Les cellules Glast-CreERT2;Ptc-/- sont nouvelles. Ces cellules sont en particulier des cellules souches neurales de génotype Glast-CreERT2;Ptc-/-. Ces cellules peuvent être isolées des animaux transgéniques tels que définis précédemment. Aussi, avantageusement, l'invention concerne une cellule isolée de génotype Glast5 CreERT2;Ptc-/- susceptible d'être obtenue à partir de l'animal transgénique susmentionné. Il peut également s'agir de cellules souches gliales, notamment des astrocytes de génotype Glast-CreERT2;Ptc-/- obtenus à partir des animaux transgéniques selon l'invention. 10 Dans le cadre des cellules souches neurales issues des animaux transgéniques selon l'invention, il est possible de les isoler et de les purifier selon le protocole défini par Daynac et al. (Daynac et al., Stem Cell Research (2013) 11, 516-528). Brièvement, les cerveaux des animaux sont micro disséqués et les cellules sont dissociées à l'aide d'une pipette. Les cellules sont ensuite marquées avec des anticorps dirigés contre des 15 antigènes de surface spécifiques des cellules souches neurale. Pour la souris, les cellules sont marquées avec les anticorps anti-CD124, anti-LeX/CD15, anti-Glast et anti EGFR. Si les marqueurs susmentionnés sont couplés, directement ou indirectement avec des marqueurs fluorescents, il est possible d'isoler les cellules souches neurales par cytométrie de flux et tri cellulaire. Cette méthode permettra de détecter parmi une 20 population hétérogène les cellules qui présentent les marqueurs appropriés. L'homme du métier connait très bien ces méthodes de cytométrie. L'invention concerne en outre un mammifère transgénique non humain présentant le génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl. Les mammifères transgéniques Glast-CreERT2;Ptcfvfl sont les mammifères issus du 25 croisement de souris Glast-CreERT2 et de souris Ptcflifl. Ces mammifères sont les prérequis pour obtenir une invalidation spécifique de tissus du gène Ptc, et notamment une invalidation dans les cellules souches neurales et les cellules gliales. L'invention concerne en outre une cellule isolée de génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl, cette cellule est notamment susceptible d'être obtenue à partir du mammifère 30 transgénique tel que défini ci-dessus. Avantageusement, le mammifère transgénique susmentionné est de génotype GlastCreERT2;Ptcfvfl, R26R-YFP/+. L'invention concerne de plus l'utilisation du tamoxifène pour l'invalidation, notamment in vitro, du gène Ptc dans des cellules de mammifères de génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl. 35 L'invention concerne également l'utilisation de tamoxifène pour l'obtention d'un mammifère transgénique tel que défini précédemment. L'utilisation de tamoxifène a pour effet d'induire l'expression de la recombinase Cre -10- CreERT2, et de permettre la délétion des séquences du gène Ptc comprises entre les séquences LoxP. Aussi, in vitro ou in vivo, il est possible d'invalider spécifiquement le gène Ptc dans les cellules souches neurales et les cellules gliales, notamment les cellules astrocytaires. L'utilisation de tamoxifène permet également d'induire in vivo la délétion de Ptc dans les cellules souches neurales et les cellules gliales, dans des mammifères GlastCreERT2;Ptcfvfl, et d'obtenir ainsi des mammifères de génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl, ayant des cellules souches neurales et des cellules souches gliales, notamment astrocytaires de génotype Glast-CreERT2;Ptc-/-. Le tamoxifène est utilisé dans le cadre de l'invention à une dose de 0,1mg à 10 mg, notamment 1mg en une ou plusieurs injections lorsqu'il s'agit de traitre un animal transgénique, ou directement dans le milieu de culture lorsqu'il s'agit de cellules en culture. Dans le cadre d'animaux, et d'une utilisation in vivo, le tamoxifène peut être administré 15 par voie intrapéritonéale, mais également par voie sous-cutannée, par voie intracrânienne, par voie transdermale ou toute autre mode d'administration bien connu de l'homme du métier. Toujours dans le cadre d'une administration chez l'animal, le tamoxifène peut être administré en une ou plusieurs doses séparées dans le temps. Un régime posologique 20 avantageux consiste en une administration quotidienne pendant 3 à 7 jours consécutifs, notamment 5 jours consécutifs. L'invention concerne également l'utilisation d'un mammifère transgénique tel que défini précédemment, pour purifier des cellules souches neurales. Comme il déjà été mentionné plus haut, l'invalidation de Ptc a pour effet notamment 25 d'inhiber la différentiation des cellules souches neurales. Ces cellules souches neurales vont donc s'accumuler et seront donc plus facilement identifiable et purifiable. Aussi, le mammifère transgénique tel que défini précédemment est très utile pour obtenir une plus grande population de cellules souches neurales comparé à un mammifère n'ayant pas d'invalidation du gène Ptc. 30 L'invention concerne également une méthode d'inhibition de la différenciation des cellules souches neurales, comprenant une étape de mise en contact de cellules souches neurales préalablement obtenues à partir d'un mammifère transgénique non humain présentant le génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl avec du tamoxifène. Comme mentionné précédemment, l'induction de la CreERT2 a pour effet d'inhiber la 35 différenciation des cellules souches neurales de génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl. Aussi, si l'on met en contact les cellules souches neurales, qui ont préalablement été isolées d'un animal transgénique tel que défini précédemment, il est possible d'inhiber leur différenciation en les incubant avec une dose efficace de tamoxifène. Les cellules vont alors exprimer la recombinase CreERT2 et ainsi perdre l'expression du gène Ptc. Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation du tamoxifène pour induire le 5 blocage de la différenciation, en particulier in vitro, de cellules souches neurales ou de cellules gliales, lesdites cellules souches et cellules neurales présentant un génotype Glast-CreERT2; L'invention concerne en outre une méthode de modulation, notamment in vitro, de l'expression du gène Ptc dans des cellules souches neurales ou dans des cellules 10 gliales, notamment des cellules souches isolées, ladite méthode comprenant une étape de mise en contact desdites cellules souches neurales ou desdites cellules gliales avec une dose efficace de tamoxifène. D'autres aspects peuvent se dégager de l'invention telle qu'elle est exposée ci-dessus. En effet, les inventeurs ont pu réaliser une invalidation du gène Ptc dans des cellules 15 spécifiques, et disposent donc d'un excellent modèle pour étudier la voie de signalisation Hh dans ces cellules. On peut ainsi envisager l'utilisation du mammifère transgénique selon l'invention en tant que modèle d'étude de la voie Hh. Par exemple il est possible d'utiliser ce modèle en réintroduisant dans les cellules Ptc-/- un ou plusieurs effecteurs du récepteur Ptc afin de 20 disséquer le mécanisme de la voie Hh. La voie Hh étant également impliquée dans différentes pathologies, le modèle animal créé par les inventeurs et objet de la présente invention permet également de décrypter les mécanismes de maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques,... 25 Un autre aspect qui se dégage de l'invention est le blocage de la différenciation des cellules souches neurales. Le mammifère transgénique selon l'invention pourrait donc être utilisé pour cribler des composés ou des molécules capables de lever l'inhibition de la différenciation des cellules souches neurales n'exprimant plus le gène Ptc. Un procédé de criblage pourrait consister par exemple en la mise en contact d'un 30 composé, susceptible de lever l'inhibition de la différenciation induite par l'absence d'expression ou d'activité de Ptc, avec des cellules souches neurales de génotype Glast-CreERT2 ; Ptc Encore un autre aspect de l'invention concerne spécifiquement les cellules astrocytaires. L'invention concerne dans cet aspect une méthode d'étude de la 35 plasticité des astrocytes comprenant l'étude des cellules astrocytaires susceptibles d'être obtenues à partir des animaux transgéniques susmentionnés. -12- L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples et des figures détaillés ci-après. Légende des figures : Délétion inductible de Ptc dans les astrocytes et les cellules souches neurales de 5 la zone subépendymaire de cerveau adulte. Cx : cortex cérébral, LV : ventricule latéral, Sp : aire septale. Les figures 1A à 1C représentent des coupes d'immunohistofluorescence indiquant la présence d'une population de cellules Ptc+ co-exprimant le marqueur astroglial GFAP 10 dans la partie dorsale de zone subépendymaire. Les élargissements des régions encadrées sont présentés sous chaque figure. La barre représente 50 pm. La figure 1A représente un double marquage GFAP et DAPI. La figure 1B représente un double marquage Ptc et DAPI. La figure 1 C représente un double marquage Ptc et GFAP. 15 Les figures 2A à 2C représentent une double immunohistofluorescence sur des lames de cerveau de souris hétérozygotes Ptc+/LacZ exprimant le rapporteur sur un allèle Ptc utilisant des anticorps anti- p-galactosidase et anti-GLAST. Les élargissements des régions encadrées sont présentés sous chaque figure et montrent noyaux 13Gal+ 20 entourés d'un signal GLAST+ (têtes de flèches blanches) ou non (tete de flèche blanche et noire). La barre représente 50 pm. La figure 2A représente un double marquage GLAST et DAPI. La figure 2B représente un double marquage P-Gal et DAPI. La figure 2C représente la superposition des marquages des figures 2A et 2B. 25 Les figures 3A à 3F représentent les signaux fluorescents YFP, GLAST et GFAP de la zone subépendymaire de souris Glast-CreERT2;R26R-YFP (YFP témoin) deux mois après l'administration de tamoxifène. La flèche blanche indique une cellule co- exprimant YP avec soit le marqueur Glast, soit le marqueur GFAP. Les carrés 30 correspondent à des agrandissements de la région indiquée par la flèche. Les noyaux sont marqués au DAPI. La barre représente 100 pm. La figure 3A représente un double marquage YFP et DAPI. La figure 3B représente un double marquage Glast et DAPI. La figure 3C représente la superposition des marquages des figures 3A et 3B. 35 La figure 3D représente un double marquage YFP et DAPI. La figure 3E représente un double marquage GFAP et DAPI. La figure 3F représente la superposition des marquages des figures 3D et 3E. -13- Les figures 4A à 4E représentent des hybridations in situ de deux gènes cibles de hedgehog : Ptc et Gli1. Dans les souris Ptc-/- (Glast-CreERT2;Ptcflifl), les exons 8 et 9 sont flanqués de sites loxP. Dans ces souris, les exons 8 et 9 sont délétés par l'activation au tamoxifène de la recombinase CreERT2 sous contrôle du promoteur Glast (Galst-CreERT2) qui est exprimée à partir du locus endogène Glast. Les souris Ptcflifl traitées au tamoxifène sont utilisées en contrôle. Les animaux sont étudiés deux mois après le traitement au tamoxifène. Une sonde ribonucléique Ptc del couvrant les exons 8 et 9 du gène Ptc est utilisée pour détecter les transcrits sauvages Ptc. Cette sonde correspond à la moitié de la longueur totale du transcrit Ptc et comprend la partie C-terminale. Dans les souris témoins, la sonde Ptc del, Ptc et Gli permettent la détection d'un faible marquage précédemment décrit dans la zone subépendymaire avec un marquage plus intense dans la niche ventrale. Dans les souris Ptc -/-' de forts signaux Ptc et Gli sont détectés dans les régions ventrales et dorsales de la zone subépendymaire, tandis qu'aucun signal n'est observé avec la sonde ribonucléique Ptc del. Les régions encadrées correspondent à un agrandissement de la région indiquée par un carré noir. La barre représente 200 pm. La figure 4A représente le marquage avec la sonde Ptc del sur les souris témoins. La figure 4B représente le marquage avec la sonde Ptc del sur les souris Ptc-/- La figure 4C représente le marquage Ptc sur les souris témoins. La figure 4D représente le marquage Ptc sur les souris Ptc-/- La figure 4E représente le marquage Gli1 sur les souris témoins. La figure 4F représente le marquage Gli1 sur les souris Ptc-/- Altération de la prolifération cellulaire et phénotype chez l'adulte SEZ/RMS après délétion de Ptc. Les figures 5A et 5B représentent la détection par immunohistofluorescence de la prolifération des cellules en utilisant un anticorps anti BrdU sur des lames de cerveau de souris Ptc-/- et témoins, traitées un an auparavant avec du tamoxifène et analysées 30 deux heures après une courte pulsation de BrdU. La barre représente 10 pm. La figure 5A représente un double marquage BrdU et DAPI sur des souris témoins. La figure 5B représente un double marquage BrdU et DAPI sur des souris Ptc-/- La figure 6 représente un histogramme montrant l'évolution du nombre de cellules 35 BrdU+ et GFAP+ dans la zone subépendymaire après traitement au tamoxifène. L'axe des ordonnées représente le nombre de cellules BrdU+ par mm2, et l'axe des abscisses représente le temps après le traitement : 10 jours, 2 mois, 6 mois et 1 an. *IDÉ0.001 . -14- Les figures 7A à 7F représentent des photos d'immunohistofluorescence indiquant l'expression du récepteur à l'EFR (EGFR) et de PSA-NCAM dans la zone subépendymaire des souris témoin et Ptc-/-' un an après l'administration de tamoxifène. 5 CPu, caudate putamen; LV, ventricule latéral. La barre représente 50 pm. La figure 7A représente le marquage EGFR sur les souris témoins. La figure 7B représente le marquage EGFR sur les souris Ptc-/- La figure 7C représente le marquage PSA-NCAM sur les souris témoins. La figure 7D représente le marquage PSA-NCAM sur les souris Ptc-/- 10 La figure 7E représente le triple marquage EGFR, PSA-NCAM et DAPI sur les souris témoins. La figure 7F représente le triple marquage EGFR, PSA-NCAM et DAPI sur les souris Ptc-/- . 15 La figure 8 représente un graphique illustrant et quantifiant les résultats décrits dans les figures 7A à 7F. L'axe des ordonnées représente le nombre de cellules positives par mm2. **p50.001. Les figures 9A et 9B représentent des immunohistofluorecences montrant l'expression 20 du gène GFAP dans la région subépendymaire s chez des souris témoins et Ptc-/-' un an après le traitement au tamoxifène. La barre représente 50 pm. La figure 9A représente le marquage GFAP sur des souris témoins. La figure 9B représente le marquage GFAP sur des souris Ptc-/- 25 La figure 10 représente un graphique illustrant et quantifiant les résultats décrits dans les figures 9A et 9B. L'axe des ordonnées représente le nombre de cellules GFAP par mm2, et l'axe des ordonnées représente le temps après le traitement au tamoxifène (10 jours, 2 mois et 1 an). Les figures 11A à 11L sont des micrographies fluorescentes de la région 30 subépendymaire de souris adultes témoins ou Ptc-/- Ces micrographies montre les immunomarquages pour Glast et GFAP/Ki67 en tant que marqueurs astrocytaire et des cellules souches, Sox2 et Sox9 en tant que facteurs de transcriptions nécessaires à la formation des cellules souches neurales, EGFR et PSA-NCAM en tant que marqueur de TAP et de migration des neuroblastes. En parallèle, les marquages au BrdU 35 indiquent la prolifération cellulaire. Les lignes discontinues délimitent la barrière entre le ventricule latéral, ou le corpus callosum, selon l'indication. cc, corpus callosum; CPu, caudate putamen; LV, ventricule latéral. La barre représente 100 pm sauf pour le -15- double marquage GFAP/Ki67 où elle représente 25 pm. La figure 11A représente le double marquage DAPI et Glast sur les souris témoins. La figure 11B représente le double marquage DAPI et Glast sur les souris Ptc-/- La figure 11C représente le double marquage GFAP et Ki67 sur les souris témoins. La figure 11D représente le double marquage GFAP et Ki67 sur les souris Ptc-/- La figure 11E représente le double marquage Sox2 et DAPI sur les souris témoins. La figure 11F représente le double marquage Sox2 et DAPI sur les souris Ptc-/- La figure 11G représente le double marquage Sox9 et DAPI sur les souris témoins. La figure 11H représente le double marquage Sox9 et DAPI sur les souris Ptc-/- La figure 111 représente le double marquage EGFR et DAPI sur les souris témoins. La figure 11J représente le double marquage EGFR et DAPI sur les souris Ptc-/- La figure 11K représente le double marquage BrdU et PSA-NCAM sur les souris témoins. La figure 11L représente le double marquage BrdU et PSA-NCAM sur les souris Ptc-/- La figure 12 représente un histogramme montrant le nombre de chaque type cellulaire par mm2 identifiées aux figures 11A à L. Les valeurs sont des moyennes ± l'écart type pour 2 à 4 lames par animal pour 3 à 4 animaux. *p50.05. Destinée cellulaire après délétion de Ptc dans la zone subépendymaire. Les figures 13A à 13H sont des photos de fluorescence des cellules Glast+ dans des souris YFP-Ptc/-ou YFP-témoins traitées deux mois auparavant avec du tamoxifène. La YFP est détectée dans la zone subépendymaire, le courant de migration rostrale (RMS) et le bulbe olfactif (OB). Une plus faible densité de cellules YFP+ est observé dans le RMS et l'OB des souris YFP-Ptc-/- comparé aux souris YFP-témoins. Par contre, aucune différence n'est observée dans la zone subépendymaire. La barre représente 50 pm. La figure 11A représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris témoins, dans la zone subépendymaire. La figure 11B représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris témoins, dans 30 le courant de migration rostrale. La figure 11C représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris témoins, dans le bulbe olfactif granulaire (GrO). La figure 11D représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris témoins, dans la couche glomérulaire (GI). 35 La figure 11E représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris Ptc /-, dans la zone subépendymaire. La figure 11F représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris Ptc -/-, dans le -16- courant de migration rostrale. La figure 11G représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris Ptc-/-, dans le GrO. La figure 11H représente le double marquage DAPI et YFP sur les souris Ptc-/-, dans la GI. Les figures 14A à 14C représentent des histogrammes montrant la densité de cellules YFP+ dans (14A) la région subépendymaire, (14B) Gro et (14C) GI. Les valeurs sont des moyennes ± l'écart type de 2 à 4 lames par animal, pour 3 à 4 animaux. L'axe des abscisses représente le nombre de cellules YFP+ par mm2. Les colonnes grises représentent les animaux témoins, les colonnes noires représentent les souris Ptc-/- Les figures 15A à 15J représentent des immunohistofluorescence utilisant les marqueurs NeuN, c-fos, Cb, TH, ou des mybrydations in situ utilisant une sonde v-Glut2 sur des lames de souris YFP-témoins ou YFP-Ptc-/- au niveau du bulbe olfactif. Les têtes de flèches blanches montrent un double marquage. La barre représente 50 pm. La figure 15A représente le double marquage YFP et NeuN sur des souris YFPtémoins. La figure 15B représente le double marquage YFP et c-fos sur des souris YFP-témoins. La figure 15C représente le double marquage YFP et Cb sur des souris YFP-témoins. La figure 15D représente le double marquage YFP et TH sur des souris YFP-témoins. La figure 15E représente le double marquage YFP et v-Glut2 sur des souris YFPtémoins. La figure 15F représente le double marquage YFP et NeuN sur des souris YFP-Ptc-/- La figure 15G représente le double marquage YFP et c-fos sur des souris YFP-Ptc-/- La figure 15H représente le double marquage YFP et Cb sur des souris YFP-Ptc-/- La figure 151 représente le double marquage YFP et TH sur des souris YFP-Ptc-/- La figure 15J représente le double marquage YFP et v-Glut2 sur des souris YFP-Ptc-/- La figure 16 est un histogramme montrant le pourcentage de chacune des cellules dans la population YFP. ***pÉ0.0005. Les figures 17A et 17B représentent des lames de cerveaux de réalisées au niveau de OB dans des souris témoins (17A) et Ptc-/- (17B) traitées un an auparavant avec du 35 tamoxifène, les lames sont colorées à l'éosine et à l'hématoxyline. Aucune altération de l'architecture cellulaire multicouche n'est observée dans l'OB. La barre représente 200 pm. -17- L'activation soutenue de la voie Hh dans des progéniteurs neuraux dérivés de la région subépendymaire maintient la multipotence des cellules souches neurales dans des tests de formations de neurospères. Les figures 18A à 18B représentent respectivement des tests de formation de neurosphères à partir de cellules issues de souris témoins et de souris Ptc-/- Les neurosphères de cellules issues de la zone subépendymaire sont analysées deux mois après l'administration de tamoxifène. La barre représente 100pm La figure 18C montre l'expression du gène Gli1 à partir des neurosphères décrites aux figures 18A et 18B. On observe une hausse de l'expression de Gli1 dans les cellules Ptc-/- par rapport aux cellules témoins. La figure 19 représente le nombre de neurosphères obtenues à chaque passage a été 15 analysé par un modèle de régression linéaire. Le taux d'expansion clonale est représenté par la pente des courbes (Ptc-/- 0.256±0.047 vs témoin 0.226±0.016, p>0.05). La figure 20 est un graphique représentant le pourcentage du nombre total de de 20 sphères obtenues à partir de 5000 cellules ensemencées (138 pour les souris Ptc-/- et 98 pour les souris témoins). Les barres représentent : en blanc le nombre de sphères de diamètre supérieur à 100m, en gris clair le nombre de sphères de diamètre compris entre 50 et 100 pm, et en gris foncé le nombre de sphère de diamètre compris entre 5 et 50 pm. 25 La figure 21 est un graphique représentant l'évaluation de l'expression de marqueurs de cellules progénitrices (Sox2, Sox9 et Nestine) dans les cellules issues de neurosphères dissociées 12h après ensemencement en présence de facteurs de croissances. La quantification de chaque type cellulaire indique une augmentation du 30 nombre de cellules Sox9+ et Nestine+. Les nombres moyens de cellules comptées sont 227±67 pour les cellules Ptc-/- et 356±147 pour les cellules témoins. *, pÉ0.05, **, pÉ0.01. Les figures 22 à 24 représentent des histogrammes montrant le potentiel de 35 différentiation de neurosphères issues de souris Ptc-/- et témoins cultivées 7 jours sans facteurs de croissance en présence ou non d'un modulateur pharmacologique de Hh, incluant un agoniste de Smo (SAG ; 0,3 pM) et un antagoniste de Smo (MRT-83 ; 3 -18- pM). Les cellules différenciées sont analysées par immunohistofluorescence en utilisant des anticorps anti-Tuj1, anti-GFAP et anti 01i2 pour caractériser les cellules neuronales (Figure 22), les cellules astrogliales (figure 23) et oligodendrogliales (figure 24). En absence de drogue, une diminution significative des du pourcentage de cellules Tij1+ et 5 Olig2+ est observée dans les cellules Ptc-/- comparées aux cellules témoins. Le nombre moyen de cellules pour chaque marqueur est 1699±309 pour les cellules Ptc-/- et 3822±128 pour les cellules témoins. Les données sont des moyennes ± l'écart type du pourcentage de noyaux DAPI+ qui expriment les marqueurs. ***, p50.005; ns, non significatif. Les barres noires représentent les cellules Ptc-/-, les barres grises 10 représentent les cellules témoins. Le déficit en Ptc augmente la division symétrique des cellules souches neurales en régulant positivement la voie de signalisation Notch. Les figures 25A à 25H représentent des tests de mesurant la symétrie des divisions 15 cellulaires réalisés à partir de cellules isolées de la zone subépendymaire de souris sauvages. Les cellules sont cultivées pendant 24 à 36 heures en présence des drogues indiquées. Les cellules ont marquées avec Glast et EGFR en tant que marqueurs de cellules souches neurales et de progéniteurs transitoires en expansion. Les noyaux sont marqués au DAPI. 20 La figure 25A représente un double marquage Glast et DAPI. La figure 25B représente un double marquage EGFR et DAPI. La figure 25C représente un double marquage Glast et DAPI, après traitement au SAG (0,3 pM). La figure 25D représente un double marquage EGFR et DAPI, après traitement au SAG 25 (0,3 pM). La figure 25E représente un double marquage Glast et DAPI, après traitement au LY411575 (10 pM). La figure 25F représente un double marquage EGFR et DAPI, après traitement au LY411575 (10 pM). 30 La figure 25G représente un double marquage Glast et DAPI, après traitement au LY411575 (10 pM) et au SAG (0,3 pM). La figure 25H représente un double marquage EGFR et DAPI, après traitement au LY411575 (10 pM) SAG (0,3 pM). 35 La figure 26 est un histogramme montrant l'analyse quantitative du pourcentage de chaque type de division. Ces données montrent que le traitement au SAG augmente le nombre de paires symétriques Glast+/EGFR- comparé aux conditions basales sans -19- drogue. Cet effet est contrecarré par un traitement simultané avec un antagoniste de Smo et Notch, respectivement MRT-83 et LY411575. La figure 27 montre une augmentation de l'expression de Gli1 (D), Notch1 (A), et les effecteurs de Notch Hes1 (B) et Hes5 (C) dans les progéniteurs isolés dérivés de la zone subépendymaire de souris adultes Ptc-/- par rapport aux animaux contrôles. Les résultats sont présentés sous forme de gel présentant les résultats de PCR semiquantitative. L'actine-13 est utilisée comme contrôle de charge des ARN. Les figures 28A à 28F représentent un test de mesure de la symétrie des divisions cellulaires à partir de précurseurs isolés dérivés de la zone subépendymaire de souris adultes Ptc-/- et témoins, indiquant que les cellules exprimant Glast issues des souris Ptc-/- génèrent fréquemment deux précurseur Glast+ après 24 à 36h, comparé aux cultures témoins. La figure 28A représente une division symétrique de cellule EGFR-, marquée avec Glast et du DAPI. La figure 28B représente une division symétrique de cellule EGFR-, marquée avec EGFR et du DAPI. La figure 28C représente une division symétrique de cellule EGFR+, marquée avec 20 Glast et du DAPI. La figure 28D représente une division symétrique de cellule EGFR+, marquée avec EGFR et du DAPI. La figure 28E représente une division asymétrique d'une cellule marquée avec Glast et du DAPI. 25 La figure 28F représente une division asymétrique d'une cellule marquée avec EGFR et du DAPI. La figure 29 est un histogramme représentant les données quantifiées des expériences présentées aux figures 28A et 28B. 30 Les figures 30A à 30D représentent des marquages fluorescents BrdU et Ki67 de lames de zone subépendymaire dérivées de souris Ptc-/- et témoins qui ont été traitées avec du tamoxifène 2 mois auparavant et qui ont été analysées 2h ou 24h après une simple injection de BrdU. Les têtes de flèches montrent les cellules the BrdU+Ki67-. La 35 barre représente 100 pm. La figure 30 A montre un double marquage BrdU/Ki67 réalisé 2h après injection du BrdU sur des cellules issues de souris témoins. -20- La figure 30 B montre un double marquage BrdU/Ki67 réalisé 24h après injection du BrdU sur des cellules issues de souris témoins. La figure 30 C montre un double marquage BrdU/Ki67 réalisé 2h après injection du BrdU sur des cellules issues de souris Ptc-/- La figure 30 D montre un double marquage BrdU/Ki67 réalisé 24h après injection du BrdU sur des cellules issues de souris Ptc-/- La figure 31 montre le pourcentage de cellules BrdU+ cells dans la population de cellules en division 2h après l'injection de BrdU. Les valeurs sont des moyennes ± 10 l'écart type de trois expériences. La figure 32 montre le pourcentage de cellules BrdU+ cells dans la population de cellules en division 24h après l'injection de BrdU. Les valeurs sont des moyennes ± l'écart type de trois expériences. **, pS0.01 15 Reconstitution de la niche de cellules souches de la zone subépendymaire dans des souris Ptc4- après injection d'AraC in vivo. Les figures 33A à 33C correspondent à des vues coronaires de la zone 20 subépendymaire montrant les cellules ayant incorporé le BrdU 10j après le retrait de la pompe dans des animaux Ptc-/- ou témoins traités avec un placébo ou de l'AraC. Les animaux ont reçu du tamoxifène six mois avant l'expérience. La barre représente 100 pm La figure 33A représente le marquage BrdU/DAPI de souris témoins traitées avec le 25 placébo. La figure 33B représente le marquage BrdU/DAPI de souris témoins traitées avec l'AraC. La figure 33C représente le marquage BrdU/DAPI de souris Ptc-/- traitées avec le placébo. 30 La figure 33D représente le marquage BrdU/DAPI de souris Ptc-/-traitées avec l'AraC. La figure 34 est un histogramme montrant la quantification des cellules marquées au BrdU chez les animaux témoins et chez les animaux Ptc-/- ***, pÉ0.0001; ns, non significatif. 35 Expression de Ptc dans la zone subépendymaire adulte. La figure 35 est une hybridation in situ du transcrit Ptc dans la partie dorsale de la -21- zone subépendymaire. La photo du bas est un agrandissement de la région encadrée de la photo du haut. La barre représente 100 pm. Les figures 36A à 36C sont des marquages immunohistofluorescents réalisés au niveau de la partie dorsale de la zone subépendymaire en utilisant un sérum anti Ptc. Les signaux associés aux cellules Ptc+ sont observés dans la zone subépendymaire. La figure 36A représente le marquage avec l'anti sérum. La barre représente 25 pm. La figure 36B représente I marquage avec le DAPI. La figure 36C représente la superposition des marquages. Les figures 37A à 37C sont des marquages immunohistofluorescents réalisés au niveau de la partie dorsale de la zone subépendymaire en utilisant un sérum anti Ptc prétraité avec une protéine de fusion utilisée pour l'immunisation. Les signaux associés aux cellules Ptc+ ne sont pas observés dans la zone subépendymaire. La barre représente 25 pm. La figure 37A représente le marquage avec l'anti sérum, pré traité. La figure 37B représente I marquage avec le DAPI. La figure 37C représente la superposition des marquages. Les figures 38 et 39 représentent des marquages immunohistofluorescents réalisés au niveau de la zone subépendymaire en utilisant le sérum anti-Ptc (Figure 38) ou le sérum pré-immun (figure 39). Le sérum permet d'identifier les cellules Ptc+ tandis que le sérum pré-immun ne le permet pas. La figure 40 représente un western-blot analysant des lysats totaux (4pg de protéines) de cellules HEK293 transfectées transitoirement avec un vecteur vide (mock) ou avec un vecteur contenant la séquence complète du Ptc murin. Les protéines ont été séparée par SDS-PAGE et révélée en utilisant un sérum anti-Ptc. La tête de flèche indique un bande majoritaire de 140 kDa détectées dans les cellules HEK293-Ptc mais pas dans les cellules HEK293-mock. Un second signal de 200 kDa est détecté dans les cellules HEK293-Ptc pouvant témoigner de modifications post traductionnelles. Des protéines de cervelet (Cb, 30pg) ont été analysées avec le sérum anti Ptc et on observe une bande de 140 kDa. Ce signal disparait dans le cervelet (Cb*) lorsque le sérum est prétraité avec la fusion ayant permis l'immunisation. La charge est contrôlée par la détection de l'actine. Caractérisation de la recombinaison Cre-dans des souris transgéniques. -22- Les figures 41A à 41G représentent des images de fluorescence obtenue à partir d'animaux YFP-témoins ayant reçus une dose de tamoxifène pendant 5 jours, et analysés 2 mois après l'induction. La figure 41A représente un cerveau complet. Le marquage représente l'expression de la YFP. La barre représente 500pm. Cb, cervelet; cc, corpus callosum; CPu, caudate putamen; Cx, cortex cérébral; DG, dentate gyrus; LV, ventricule latéral; OB, bulbe olfactif; RMS, courant de migration rostrale. La figure 41B est un agrandissement de la région du bulbe olfactif. La figure 41C est un agrandissement de la région du caudate putamen. La figure 41D est un agrandissement de la région de la zone subépendymaire . La figure 41E est un agrandissement de la région du cortex cérébral. La figure 41F est un agrandissement de la région du dentate gyrus. La figure 41G est un agrandissement de la région du cervelet. Les figures 42A à 42D représente des hybridations in situ utilisant une sonde ribonucléique de Gli1 sur des lames issues de souris Glast-CreERT2/Ptcfvfl traitées avec un placébo ou du tamoxifène 10 jours avant l'analyse. L'induction de Gli1 est détectée seulement après traitement au tamoxifène. La figure 42A représente un marquage sur des souris Glast-CreERT2/Ptcfvfl traitées 20 avec le placébo. La barre représente 400 pm. La figure 42B représente un marquage sur des souris Glast-CreERT2/Ptcflifl traitées avec le tamoxifène. La barre représente 400 pm. La figure 42C représente un agrandissement de la région marquée par un carré sur la figure 42A. La barre représente 100 pm. 25 La figure 42D représente un agrandissement de la région marquée par un carré sur la figure 42B. La barre représente 100 pm. Les figures 43A et 43B montrent que l'expression de Gli1 est fortement augmentée sur les lames issues de souris Ptc-/- un an après le traitement au tamoxifène. La barre 30 représente 200 pm. La figure 43A est une hybridation in situ utilisant la sonde ribonucléique Gli1 sur des lames issues de souris témoins. La figure 43B est une hybridation in situ utilisant la sonde ribonucléique Gli1 sur des lames issues de souris Ptc-/- 35 La délétion conditionnelle de Ptc dans les cellules Glast+ de la zone subépendymaire ne modifie pas l'apoptose cellulaire. -23- Les figures 44A et 44B sont des expériences de mesure d'apoptose par TUNEL sur des zones subépendymaire s de souris témoins (Figure 44B) ou de souris Ptc-/- (figure 44A). La barre représente 100 pm. La figure 45 est un histogramme montrant la quantification des noyaux apoptotiques de cellules de la zone subépendymaire de souris témoins ou Ptc-/- 10jours ou 1 an après traitement au tamoxifène. Recombinaison dans le lignage oligodendroglial. Les figures 46A et 46B représentent des immunohistofluorescences détectant Olig2 réalisées au niveau du corpus callosum de souris YFP-témoins et YFP-Ptc-/- Les cellules exprimant la YFP correspondent à la fois aux astrocytes endogènes exprimant Glast et aux progénitures des cellules souches Glast+ née dans la zone subépendymaire et qui ont migré et se sont différenciées en cellules du lignage oligodendroglial. La barre représente La figure 4A représente un double marquage YFP Olig2 dans des souris YFP-témoins. La figure 4A représente un double marquage YFP Olig2 dans des souris YFP-Ptc-/- Les figures 47 et 48 représentent des histogrammes montrant la quantification de la densité de cellules YFP+ (figure 47 ; nombre de cellules YFP+ par mm2) et le pourcentage de cellules YFP+ (figure 48) qui coexpriment Oligo2 dans des souris YFPcontrol et YFP-Ptc-/- Le nombre de cellules comptées : 187 pour YFP-témoins et 74 pour YFP-Ptc-/- ). Visualisation de cultures cellulaires dérivées de la zone subépendymaire de souris témoins et de souris Ptc4- Les figures 49A à 49F représentent des immunohistofluorescences utilisant des 30 anticorps anti- Sox2, anti-Sox9 et anti-Nestine réalisées sur des cultures de précurseurs maintenus en absence de facteurs de croissance pendant 12h avant l'expérience. Les noyaux sont marqués au DAPI. La barre représente 100 pm. La figure 49A représente un double marquage Sox2/DAPI sur des cultures issues de souris témoins. 35 La figure 49B représente un double marquage Sox2/DAPI sur des cultures issues de souris Ptc-/- La figure 49C représente un double marquage Sox9/DAPI sur des cultures issues de -24- souris témoins. La figure 49B représente un double marquage Sox9/DAPI sur des cultures issues de souris Ptc-/- La figure 49D représente un double marquage Nestine/DAPI sur des cultures issues de 5 souris témoins. La figure 49E représente un double marquage Nestine/DAPI sur des cultures issues de souris Ptc-/- Les figures 50A et 50R représentent des immunohistofluorescences utilisant des 10 anticorps anti-Tuj1, anti-Olig2 et anti-GFAP réalisé sur des cellules précurseurs issues de souris témoins ou Ptc-/- maintenues 7 jours avant l'expérience en présence ou en l'absence de l'agoniste de Hh SAG (0,3 pM) et l'antagoniste de Hh MRT-83 (3pM). Les noyaux sont marqués au DAPI. La barre représente 100pm. La figure 50A représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules témoins, sans 15 traitement. La figure 50B représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du SAG. La figure 50C représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du MRT-83. 20 La figure 50D représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules Ptc-/-' sans traitement. La figure 50E représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules Ptc-/-' traitées avec du SAG. La figure 50F représente un double marquage Tuj1/DAPI sur des cellules Ptc-/-' traitées 25 avec du MRT-83. La figure 50G représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules témoins, sans traitement. La figure 50H représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du SAG. 30 La figure 501 représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du MRT-83. La figure 50J représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules Ptc-/-' sans traitement. La figure 50K représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules Ptc-/-' traitées 35 avec du SAG. La figure 50L représente un double marquage Olig2/DAPI sur des cellules Ptc-/-' traitées avec du MRT-83. -25- La figure 50M représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules témoins, sans traitement. La figure 50N représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du SAG. La figure 500 représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules témoins, traitées avec du MRT-83. La figure 50P représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules Ptc-/-' sans traitement. La figure 50Q représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules Ptc/-' 10 traitées avec du SAG. La figure 5OR représente un double marquage GFAP/DAPI sur des cellules Ptc/-' traitées avec du MRT-83. Déplétion des cellules incorporant du BrdU dans la région subépendymaire s de 15 souris sauvages. Les figures 51A à 51C sont des vues coronales de région subépendymaire s montrant des cellules incorporant du BrdU après injection d'AraC ou de placébo dans des souris sauvages. La figure 51A représente un simple marquage BrdU sur des souris traitées avec le 20 placébo. La figure 51B représente un simple marquage BrdU sur des souris traitées avec l'AraC. La figure 51C représente un double marquage BrdU/DAPI sur des souris traitées avec le placébo. La figure 51D représente un double marquage BrdU/DAPI sur des souris traitées avec 25 l'AraC. La figure 52 représente un histogramme quantifiant le nombre de cellules BrdU+/mm2, dénotant d'une diminution de la prolifération dans les souris traitées à l'AraC. ***, 1:0.0001. 30 Influence de la délétion de Ptc sur la masse des souris La figure 53 représente un histogramme montrant la réduction de masse des souris YFP-Ptc-/- par rapport aux souris YFP-témoins après l'injection pendant une semaine de tamoxifène à des souris âgées de 2 à 4 mois. La masse est mesurée 5 mois après 35 injection, et on observe une diminution de 25% de la masse des souris Ptc-/- Test T de Student*** p La délétion de Ptc affecte la prolifération et diminue la neurogenèse. Pour déterminer l'effet de la délétion de Ptc dans les cellules Glast+ dans la SEZ, le taux de prolifération rapide des cellules (TAP et neuroblastes) est mesuré par administration de BrdU par impulsion à des intervalles de 2h. Les impulsions ont été réalisées à différents temps (10 jours, 2, 6, 12 mois). Dans les animaux témoins, le nombre de cellules BrdU positives diminue entre 2 et 6 mois après le traitement, ce qui révèle probablement un déclin régulier lié à l'âge. De manière intéressante, les cellules BrdU positives diminuent dans les cellules de la SEZ des souris Ptc-/- comparées aux souris témoins tout au long de l'étude. A 10 jours, la diminution de 27% est déjà hautement significative et cette diminution va jusqu'à 54% à 2 mois. La diminution de la prolifération rapide est observé jusqu'à 6 mois après traitement et a quasiment disparue au bout d'un an dans les souris Ptc-/-. Les inventeurs ont exclu de leur hypothèses la diminution de la survie cellulaire puisque le nombre de cellules TUNEL positives n'est pas significativement différent dans la SEZ des souris Ptc-/-, tout au long de l'étude. De manière remarquable, la visualisation des cellules EGFR+ dans la SEZ, montre une diminution de plus de 93% dans les souris Ptc-/-, au bout de 12 mois. Le nombre de cellules PSA-NCAM est également réduit de plus de 90% dans les souris Ptc-/-, ce qui est corrélé avec le fort taux d'excision dans ces animaux ce qui a pour conséquence une quasi absence de neuroblastes migrant de la SEZ (Figures 7A à 7F et 8). Par contre, la densité de cellules GFAP+ qui correspond aux astrocytes et aux cellules souches neurales dans la SEZ montre une augmentation de 62% dans les souris Ptc-/-, après 12 mois (Figures 9A et 9B et 10). A 2 mois, la quantification des populations cellules de la SEZ montre que la délétion de Ptc augmente de presque 2 fois le nombre de cellules Glast+ qui correspondent aux cellules astrocytaires et aux cellules souches neurales, et de presque 2 fois le nombre de cellules souches Ki67+/GFAP+. Les TAP et les neuroblastes diminuent de deux fois comme l'indique les marquages par l'EGFR et PSA-NCAM (Figures 11A à 11L et 12). De plus, en l'absence de Ptc, les inventeurs ont observé une augmentation du nombre de cellules Sox2+ et Sox9+, tous deux exprimés dans les TAP et les cellules souches neurales. Ces données montrent que la délétion de Ptc est associée à une augmentation du nombre de cellules souches neurales de type astrocytes dans la SEZ et une diminution du nombre de TAP et de neuroblastes migrants. -29- Les cellules filles issues des cellules recombinées sont suivies grâce à l'expression de la YFP dans les souris Glast-CreERT2;Ptcflel;R26R-YFP (dites YFP-Ptc-I-) et dans les souris YFP-témoins traitées au tamoxifène, deux mois après le traitement. Comme attendu, de forts signaux YFP sont détectés dans le système SEZ-RMS-OB des souris témoins (Figure 13A à 13H) et également dans le corpus callosum (cc) où elles révèlent les populations nouvelles issues de la SEZ et les cellules astrogliales exprimant Glast dans les tractus fibreux (Figure 46A et 46B). Dans les animaux YFPPtc-1-, la quantification des cellules YFP+ dans les couches granuleuses (GrO) et gloméruleuses (GI) du bulbe olfactif (OB) (Figure 14A à 14C) et dans le cc (Figures 46A et 46B and 47) montre une diminution respective de 69%, 36% et 51%. De plus, le signal fluorescent est drastiquement réduit dans le RMS (qui relie la SEZ au OB) (Figures 13A à 13H). Comme les résultats montrent une diminution des nouvelles cellules dans la SEZ, les inventeurs ont étudié le phénotype des cellules dérivées de la SEZ dans leurs organes de destination : OB (Figures 15A à 15J et 16), et cc (Figure 48). Dans le GrO, la couche de l'OB où les cellules maturent en interneurones gabaergiques, le pourcentage de cellules YFP+ exprimant le marqueur neural NeuN ou cfos, un facteur de transcription rapidement régulé par l'activité neurale, reste inchangé dans les souris Ptc-/-. Ces données indiquent qu'il n'y a pas de différence dans la proportion de neurones ayant intégré la couche GrO. The inventeurs ont alors étudié le pourcentage de cellules YFP+ exprimant la tyrosine hydoxylase (TH), la calbindine ou le transporteur 2 vésiculaire du glutamate (vGlut2), qui marquent un sous-groupe de cellules ayant intégré la couche GI. Dans les mutants conditionnels Ptc, le pourcentage de cellules nouvellement générées marquées à la calbindine n'est pas significativement modifié. Par contre, le pourcentage de cellules YFP+ coexprimant soit TH ou vGlut2 est respectivement trois fois plus élevé ou réduit. De manière remarquable, un an après le traitement au tamoxifène, l'architecture cellulaire multicouche de l'OB n'est pas modifiée dans les souris Ptc-/- comparé au témoin (Figure 17A et 17B). Dans le cc, une diminution de deux fois des cellules YFP+ exprimant Olig2 est observée dans les souris Ptc-/- (Figure 48) suggérant que la délétion de Ptc diminue la capacité de genèse de nouveaux précurseurs d'oligodendrocytes. L'ensemble de ces résultats montre que la genèse de nouveaux précurseurs est largement diminuée dans la SEZ des mutant Ptc conditionnels. Bien que ces précurseurs aient encore la capacité de se différencier en neurones et en oligodendrocytes respectivement dans l'OB ou le cc, ils ne présentent pas les caractéristiques de la différenciation. L'invalidation de Ptc dans les progéniteurs neuraux dérivés de la SEZ modifie la -30- capacité de différenciation cellulaire dans des tests de neurospère. Pour évaluer les conséquences de l'invalidation de Ptc dans les progéniteurs SEZ, les inventeurs ont utilisé le test des neurosphères pour étudier les propriétés des cellules souches et des cellules progénitrices dans les deux modèles Ptc-/- et témoin. Aucune différence de formation des sphères de cellules dérivées de la SEZ de souris Ptc-/- n'est observée deux mois après le traitement au tamoxifène, malgré une augmentation de l'expression de Gli (Figures 18A à 18C et 19). L'expansion clonale montre que l'absence de Ptc n'altère pas l'apparente capacité d'auto-renouvellement des neurosphères. Toutefois la quantification des sous populations des neurosphères selon leur diamètre montre un grand nombre de neurosphères larges (k100 pm) dérivées de la SEZ de souris Ptc-/- (Figure 20). Cette observation suggère que les neurosphères issues de la SEZ de souris Ptc-/- possèdent plus de cellules souches que celles issues de la SEZ de souris témoin, puisque cela avait déjà été proposé que les cellules souches neurales actives donnent naissance à des sphères de large taille alors que les progéniteurs donnent naissance à des spheres plus petites. Ces résultats sont cohérents avec la diminution de TH dans la SEZ des animaux Ptc/- Une fois dissociées, les neurosphères sont cultivées pendant 12h en l'absence de facteurs de croissance. De manières significative, plus de cellules expriment le marqueur Sox9 dans les neurosphères Ptc-/- comparé aux neurosphères témoins. (Figure 21; voir également Figures 49A à 49F). Par contre, l'expression de Sox2 n'est pas modifiée de manière significative dans les deux types de neurosphères, alors que le nombre de cellules neuroépithéliales Nestine positives est augmenté de 1,6 fois dans les souris déficientes en Ptc, ce qui témoigne d'une diminution de la différenciation. Pour étudier la multipotence des cellules souches neurales Ptc /-, les neurosphères ont été cultivées pendant 7 jours en l'absence de facteurs de croissance pour permettre la différenciation en neurones en oligodendrocytes et en astrocytes. Bien que les cellules souches neurales Ptc-/- conservent leur multipotence, leur capacité à se différencier est modifiée (Figures 21, 22 et 23; voir également Figures 50A à 50R). Le pourcentage de neuroblastes Tuj1+ et d'oligodendrocytes Olig2+ est réduit significativement dans les souris Ptc-/- tandis que le nombre d'astrocytes GFAP+ n'est pas modifié par la délétion de Ptc. La modulation par l'intermédiaire de Smo a été étudiée. (Figures 21, 22 et 23). En accord avec l'activation de Smo dans le phénotype Ptc-/-, le nombre de neuroblastes Tuj1+, d'oligodendrocytes Olig2+ et d'astrocytes GFAP+ est réduit dans les souris témoins après addition de SAG, un activateur de Smo. Par contre, l'inhibiteur de Smo MRT-83 ne modifie pas la genèse des cellules suggérant que la voie Hh est antagonisée par Ptc. Toutefois, le MRT-83 augmente la capacité des cellules Ptc-/- à se différencier en neuroblastes, en oligodendrocytes et en -31- astrocytes. Aussi, la restauration du phénotyoe Ptc-/- par le blocage de Smo est associé à l'inhibition constitutive que Ptc exerce sur Smo. De plus, l'invalidation de Ptc diminue le nombre total de cellules entrant en différenciation bien qu'elle n'inhibe pas la différenciation terminale des cellules déjà engagée dans le processus de différentiation. L'absence de Ptc dans les progéniteurs neuraux conduit à la formation de paires symétriques Glast+/EGFR+ par l'intermédiaire de la voie Notch et réduit la sortie du cycle cellulaire des TAP. L'inactivation de Ptc dans les cellules Glast+ de la SEz adulte conduisant à une augmentation des cellules souches neurales a conduit les inventeurs à évaluer la potentielle interconnexion entre les voies Hh et Notch qui a été impliquée dans la régulation du cycle cellulaire durant la corticogénèse et le maintien des cellules souches neurales. Dans un premier temps, les inventeurs ont utilisé le test de clonalité des paires de cellules adapté du protocole décrit dans (Dave et al. 2011, PIoS one 6, e14680). Les cellules primaires ont été ensemencées directement après leur isolement de la SEZ et maintenues en culture pendant 24 à 36h pour permettre la division cellulaire. Les anticorps anti-Glast et anti-EGFR ont été utilisés pour marquer respectivement les cellules souches et leur descendance. Les cellules isolées de la SEZ de souris contrôles ont été traitées avec l'agoniste de Smo (SAG) en présence ou en l'absence d'inhibiteur de la y-sécrétase, le LY411575, qui inhibe l'activation des récepteurs Notch endogens dépendants de la protéolyse. Le SAG promeut les paires symétriques Glast+/EGFR- au dépens des paires Glast+/EGFR+ compare aux conditions basales. L'effet médié par le SAG est contrebalancé par le traitement au LY411575 comme par le traitement à l'antagoniste de Smo MART-83 (Figures 25A à 25H et 26). Ces résultats indiquent la genèse de paires symétriques Glast+/EGFR- est dépendante de la voie Hh, correspondant à un état activé des cellules souches neurales différent de celui des cellules Glast+/EGFR+ qui est dépendant de la voie Notch. Les inventeurs ont alors réalisés des analyses par RT-PCR dans les neurosphères dérivées de zone sous ventriculaire (SVZ) d'animaux Pct-/- ou contrôles traités au tamoxifène pendant deux mois. Notch, Hes1 et HesS sont surexprimés lorsque Ptc est invalidé (Figures 27A à 27E), démontrant que la voie Notch est activée par la délétion de Ptc. Les inventeurs ont ensuite testé si l'effet sur la symétrie des cellules souches neurales Glast+EGFR- observée sous activation pharmacologique de Smo pourrait être observé dans la cadre de la délétion de Ptc dans les cellules souches adultes. Dans des cultures de cellules dérivées de souris Ptc-/- traitées au tamoxifène deux mois auparavant, une augmentation de 4 à 5 fois des paires symétriques Glast+/EGFR- est -32- observée au dépens des paires symétriques Glast+/EGFR+ comparé aux contrôles (Figures 28A à 28F et 29). La délétion de Ptc dans les cellules souches neurales dérivées de la SEZ favorise donc la formation de cellules souches neurales Glast+/EGFR- symétriques. L'absence de diminution significative de paires symétriques Glast+/EGFR+ suggère que l'activation pharmacologique de Smo dans les neurosphères contrôles n'est pas complètement comparable à l'invalidation in vivo de Ptc en ce qui concerne le mécanisme d'auto-renouvellement des cellules souches neurales Glast+/EGFR- et les cellules souches neurales actives. Les inventeurs ont réalisé des expériences de pulsation de BrdU dans une population de cellules en cycle cellulaire exprimant Ki67 dans la SEZ d'animaux ayant reçu une dose de tamoxifène deux mois auparavant. Une pulsation de BrdU de 2h montre une prolifération des TAP et dans une moindre mesure des neuroblastes. Ce protocole a permis aux inventeurs de déterminer que l'index de marquage n'est pas modifié par l'inactivation de Ptc (Figures 30A à 30C et 31). Les inventeurs ont également évalué le nombre de cellules sortant du cycle cellulaire lors que les animaux sont tués 24h après l'injection de BrdU. La quantification du nombre de cellules en prolifération restant en cycle 24h après incorporation du BrdU (cellules Ki67+) montre un pourcentage de 2 fois moins de cellules sorties du cycle cellulaires dans les souris Ptc-/- que dans les contrôles (Figure 32). Ces résultats montrent que la délétion de Ptc diminue le nombre de cellules sortant du cycle cellulaire proliférant rapidement et donc leur capacité à différencier. Ptc est nécessaire à la reconstitution de la niche de cellules souches de la SEZ après un traitement in vitro à l'AraC. Les inventeurs ont testé dans les animaux Ptc-/- et témoins traités au tamoxifène 6 mois auparavant le taux de cellules souches neurales restant après traitement à l'antimitotique AraC, agent qui tue les cellules souches en prolifération, les T et le neuroblastes proliférant, mais préserve les cellules souches neurales quiescentes. Après une inactivation transitoire de la neurogénèse par traitement à l'AraC, la SEZ endommagée est régénérée par des cellules souches neurales de type astrocyte résultant de l'augmentation de la prolifération et de la genèse de cellules souches neurales actives et de TAP. Immédiatement après le traitement à l'AraC (Jour 0), les cellules ayant incorporé le BrdU sont majoritairement absentes (Figures 51 et 52). Dix jours après (Jour 10), la population cellulaire BrdU+ est revenue à la normale dans les SEZ témoins comparé au placebo (Figures 33A et 33B et 34). Toutefois, le nombre de cellules BrdU+ dans les SEZ Ptc-/- est 3 fois plus bas après traitement à l'AraC comparé au placebo (Figures 33C et 33D et 34). Ces données montrent que, suite au traitement -33- AraC, l'absence de Ptc inhibe l'activation des cellules souches neurales quiescentes et inhibe leur induction vers des TAP. Aussi, Ptc est requis pour la régénération de la SEZ après lésion. Discussion L'inactivation conditionnelle de Ptc dans les cellules souches neurales permet d'étudier l'activation de la signalisation Hh in vivo de manière indépendante du ligand dans la SEZ. Cette activation est médiée par la levée de l'inhibition de Ptc sur Smo et promeut la genèse de paires symétriques Glast+/EGFR- comme cela est observé in vitro. De plus, les données des inventeurs suggèrent également une alteration de la transition entre les cellules souches neurales actives et les TAP, ce qui rend compte de la diminution des TAP et pat conséquent de la diminution des neuroblastes. L'expression de la voie Notch et des facteurs de transcription Sox2 et Sox9, connus pour inhiber la différentiation neurale est également augmentée. En relation avec cette altération de la transition entre les celles souches neurales actives et les TAP, les inventeurs ont également que les cellules souches neurales déficientes en Ptc ne régénéraient pas correctement la SEZ après traitement avec un agent anti-mitotique. L'activation soutenue de Hh dans les SEZ de souris Ptc/-maintient la pluripotence, mais influence la destinée des précurseurs dérivés de la SEZ vers soit un phénotype oligodendroglial dans le cc ou un phénotype glutaminergique ou dopaminergique, deux populations des interneurones de l'OB periglomérulaire, cette détermination étant d'un grand intérêt dans les mécanismes de réparation du cerveau. L'activation à long terme de la signalisation Hh est toujours détectée un an après la recombinaison de Ptc. Cependant, l'absence d'altération majeure de la morphologie de l'OB observée par les inventeurs est en accord avec les données déjà rapportées montrant que la neurogenèse adulte dans la SEZ permet seulement un renouvellement partiel des nouveaux neurones dans l'OB. Les résultats des inventeurs montrent que l'interaction entre les voies de signalisation Hh et Notch dans la neurognèse adulte peut contribuer au maintien des cellules souches neurales, inhibant ainsi leur transition vers les TAP. Une telle interconnexion a été proposée comme étant requise pour la régulation des divisions neurogéniques et dans le développement d'une corticogenèse correcte. L'activation constitutive de la voie Hh par l'intermédiaire de la délétion Ptc dans les cellules de la crête neurale entérique active également fortement la voie Notch par l'intermédiaire de la surexpression de Hes-1 et induit une gliogenèse prématurée inhibant la formation par ces cellules de ganglions durant le développement du système nerveux entérique. En accord avec l'interconnexion des voies Hh et Notch dans la SEZ adulte, les cellules -34- souches neurales sont à la fois des cellules Hh- et Notch-. Si les facteurs de transcription Hes sont généralement considérés comme des effecteurs canoniques de la voie Notch, une activité Hh/Hes1 indépendante de Notch a été décrite au cours de la prolifération des progéniteurs dans la rétine. Bien que le lien direct entre Hes1 et la voie Hh dans les cellules souches adultes reste inconnu, les résultats des inventeurs montrent que l'effet de l'activation de Hh est dépendant de Notch. Les TAP ont été décrites comme régulant l'auto-renouvèlement des cellules souches neurales in vivo et une interaction entre les voies de signalisation EGFR et Notch a été proposée comme ayant des rôles sélectifs dans ce processus où EGFR est un régulateur en amont de Notch par l'intermédiaire d'un mécanisme non autonome. Puisque l'inactivation conditionnelle de Ptc conduit à une grande diminution des TAP exprimant EGFR dans la SEZ, la diminution subséquente d'EGFR pourrait amplifier l'induction de la voie Notch et être responsable des effets observés. Egalement, l'augmentation de Sox9 dans les mutant Ptc-/- est en accord avec les résultats indiquant que la signalisation Hh active induit la transcription de Sox9 résultant en la capacité des cellules neuroépithéliale à former des neurosphères. Bien que Ptc ait été décrit comme un gène suppresseur de tumeur, les inventeurs ont montré que sa délétion dans les cellules souches neurales de type astrocytaire augmente la capacité souche de ces cellules sans induire de formation de tumeurs. Une des explications est que Ptc contrôle les étapes majeures du maintien de cellules souches dans la SEZ : l'absence d'activité antagoniste sur Smo conduit à un blocage des cellules prolifératives EGFR+, probablement par une augmentation des divisions symétriques des cellules souches neurales. Les résultats des inventeurs montrent que les signaux médiés par Ptc sont impliqués dans la régulation de la genèse des cellules souches requises pour le maintien d'au taux de neurogenèse normal. Plutôt que promouvoir l'expansion des cellules souches neurales et de leurs précurseurs, la délétion de Ptc est associé à un blocage de la prolifération des cellules EGFR+ conduisant à une quasi disparition de la neurogenèse. Ainsi, les souris Glast-CreERT2;Ptcflel sont un bon modèle pour évaluer la régulation et les mécanismes de transduction du signal dans les cellules souches de la SEZ, dans les conditions normales ou pathologiques. Ces souris sont d'un intérêt majeur pour évaluer l'effet de Ptc dans le maintien des cellules souches neurales dans la zone subgranulaires de l'hippocampe. Procédures expérimentales Animaux. Sauf indications contraires, des animaux de 8 à 12 semaines ont été utilisés. Les souris Glast-CreERT2 (Mori et al. 2006, Glia 54, 21-34) ont été reçues dans un -35- contexte génétique mélange 129 x C57BL/6 et croisées sur trois générations avec des souris de contexte génétique C57BL/6. La lignée de souris Patched floxé homozygote (Uhmann et al.; 2007, Blood, 110, 1814-1823) ont été reçues et maintenue dans un contexte génétique C57BL/6. La lignée de souris rapporteuse R26R-YFP/+ (Srinivas et al., 2001, BMC Dev. Biol. 1, 4) ont été maintenues dans un contexte génétique C57BL/6. Les souris Glast-CreERT2 ont été croisées avec les souris Patched floxées. La descendance a alors été croisée avec les souris R26R-YFP/+ comme décrit précédemment (Soriano, 1999, Nature 21, 70-71). Toutes les procédures ont été mises 10 en oeuvre selon les directives européennes 86/806/EEC. Administration de tamoxifène et de BrdU. Le tamoxifène (Sigma) a été dissout dans de l'huile de maïs (Sigma) à une concentration de 10 mg/mL et 1mg a été injecté aux animaux par voie intrapéritonéale (i.p.) deux fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Les animaux ont été sacrifiés 10 jours, 2 mois, 6 mois ou 12 mois après la fin du 15 traitement au tamoxifène. Afin de marquer les cellules prolifératives, les souris ont reçu par voie i.p. une injection de bromodéoxyuridine (BrdU; Sigma; 100 mg/kg de masse corporelle) 4heures ou 2 heures avant le sacrifice (groupes de 5 à 6 souris). Pour la détermination de la sortie du cycle cellulaire, les animaux ont reçu deux injections i.p. de BrdU à deux heures d'intervalle et ont été sacrifiées 24h après la dernière injection. 20 Perfusion à l'aide de mini pompes osmotiques. Pour tuer les cellules proliférant rapidement dans la SEZ, de l'AraC (2% Sigma) dans un véhicule (0,9% de sel) a été perfuse dans le ventricule latéral de souris témoins et Ptc-/- qui ont été traitées 6 mois auparavant avec du tamoxifène. Les inventeurs ont utilisé des mini pompes osmotiques (Alzet). Après 7 jours de perfusion, les pompes sont retirées et les souris tuées 10 jours 25 après la fin du traitement AraC. N=4 par conditions. Des canules ont été implantées stéréotacicalement dans le ventricule latéral aux coordonnées suivantes : AP, 0.2 mm; ML, 0.8 mm; DV, -2.5 mm (en rapport avec Bregma). Histologie et marquages immunologiques. Les animaux ont été perfusés, ou non, avec de la paraformaldéhyde à 4% et les sections de tissus ont été découpées au 30 cryostat. Les anticorps utilisés sont décrits ci-après. Pour les marquages hématoxyline et éosine, l'hématoxyline (Vector) et l'éosine (Polysciences) ont été utilisés. Les noyaux sont marqués au DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole ; Vector). Hybridation in situ (ISH). Le protocole et la synthèse des sondes ribonucléiques Ptc, Gli1 et GFAP ont été décrits précédemment (Traiffort et al., 1999, Eur. J. Neurosci. 11, 35 3199-3214). La sonde Ptc del correspond aux nucléotides 1025-1305 de Ptc murin (Genbank n° d'accession NM_008957.2). La sonde vGlut2 a été décrite précédemment (Borgius et al., 2010, Mol. Cell. Neurosci. 45, 245-257). -36- Cultures de neurosphères. La SEZ télencéphalique a été disséquée à partir d'adultes sauvages, Ptc-/- ou témoins (Pastrana et al., 2011, Cell stem cell 8, 486-498). Les fragments de SEZ ont été digérés dans une solution de papaïne 5sigma) et de trypsine (Invitrogen) pendant 20 min à 37C et dissociées mécaniquement par passage dans une aiguille d'épaisseur 26. Sans indications contraires, les cellules ont été ensemencées à 5000 cellules par puits dans des plaques 24-puits dans du milieu sans sérum consistant en du DMEM additionné avec du B27, de la pénicilline/streptomycine, du sodium pyruvate et en présence de 20 ng/mL d'EGF et 10 ng/mL de facteur basique de croissance des fibroblastes (FGF, Invitrogen). Après 6 à 9 jours en culture, les sphères sont récoltées, incubées dans 0,05% de trypsine (Invitrogen) pendant 30 à 60 min à 37C, sont dissociées mécaniquement et séparé es en cellules uniques au travers d'une seringue comme décrit précédemment. Sauf indication contraire, les expériences utilisant des cellules isolées ou des neurosphères (traitées ou non avec des drogues) sont réalisées après un ou deux passages ou sur des sphères primaires. Pour les expériences de multipotence, 5 à 10 sphères ont été cultivées sur des lamelles recouvertes de la poly-lysine (Sigma) dans le milieu dépourvu de sérum décrit ci-dessus pendant 7 jours. Pour les études de fluorescence, les cellules ont été fixées dans 4% PFA à 4C pendant 30 min, avant de bloquer pendant 30 min à température ambiante dans 0,5% de BSA dans du PBS. Les cellules fixées ont alors été incubées avec un anticorps primaire à température ambiante pendant 90 min, suivi par une incubation avec les anticorps secondaires pendant 60 min à température ambiante et montées sur des lames. Pour les tests de cellules appariées, des cellules isolées sont ensemencées directement après microdissection de la zone sous ventriculaire (SVZ) sur des lamelles à une densité cellulaire d'environ 50 000 cellules part puits. Les cultures ont été maintenues pendant 24 à 36 h en présence de 1Ong/mL d'EGF. Les analyses IHF sont réalisées comme décrit ci-dessus. Environ 60 paires ont été étudiées dans chaque échantillon issu d'animaux sauvages ou mutants. Drogues. Le SAG et le MRT-83 ont été synthétisées comme décrit précédemment (Roudaut et al, 2011, Mol. Pharmacol. 79, 453-460). RT-PCR semi-quantitative. Les ARN totaux ont été extraits en utilisant le kit Trizol (Invitrogen) à partir de cultures de sphères dérivées d'animaux traités au tamoxifène 2 mois auparavant. Les ARN ont subi une transcription inverse dans 20 pl de solution comprenant la reverse transcriptase Superscript II (Invitrogen). Les réactions de réaction de polymérisation en chaine (PCR) ont été réalisées en utilisant la polymérase Go Taq (Promega). Les amorces spécifiques sont décrites ci-après. L'actine a été -37- utilisée comme témoin de charge des ARN. Quantification et analyse statistique. Les signaux immunofluorescents ont été détectés par un microscope épifluorescent conventionnel (DMRXA2; Leica Microsystems) équipé d'une caméra CDD (Photometrics) or scannée pour les plans Z 5 pour la colocalisation par un micoscope ApoTome (ZEISS) et le logiciel Axiolmager. Les sections optiques sont de 1pm d'intervalle. Les signaux immunofluorescents sont quantifiés avec le logiciel Image. Les comptages cellulaires sont présentés en tant que moyennes de plusieurs coupes de SEZ ou bulbes olfactifs d'au moins trois souris pour chaque groupe. Les analyses statistiques sont réalisées en utilisant un test bilatéral t de 10 Student. Une signifiance statistique est considérée pour p REVENDICATIONS1. Mammifère transgénique non humain, présentant une invalidation fonctionnelle du gène codant le récepteur membranaire patched ou Ptc dans les cellules souches neurales et/ou dans les cellules gliales, ledit mammifère ayant une masse corporelle totale au moins 30% inférieure à la masse corporelle total dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales. 2. Mammifère transgénique non humain selon la revendication 1, où lesdites cellules souches neurales et/ou lesdites cellules gliales sont des cellules exprimant le gène neural Glast. 3. Mammifère transgénique selon la revendication 1 ou la revendication 2, ledit mammifère ayant un génotype Glast-CreERT2;Ptc", à l'exception des cellules souches neurales et des cellules souches gliales qui ont un génotype Glast-CreERTZ Pte-. 4. Mammifère transgénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où malgré la réduction de la masse corporelle totale dudit mammifère, ledit mammifère présente un cerveau essentiellement similaire à celui dudit mammifère transgénique ne présentant pas d'invalidation fonctionnelle dudit gène codant le récepteur membranaire Ptc dans lesdites cellules souches neurales et/ou dans lesdites cellules gliales. 5. Cellule isolée de génotype Glast-CreERT2;Ptc-/-. 6. Mammifère transgénique non humain présentant le génotype Glast-CreERT2;Ptcfvfl. 7. Utilisation in vitro du tamoxifène pour l'invalidation du gène Ptc dans des cellules de mammifères de génotype Glast-CreERT2;Ptc". 8. Méthode d'inhibition in vitro de la différenciation des cellules souches neurales, comprenant une étape de mise en contact de cellules souches neurales préalablement obtenues à partir d'un mammifère transgénique non humain présentant le génotype GlastCreERT2;Ptc" avec du tamoxifène. 30 35 9. Utilisation in vitro du tamoxifène pour induire le blocage de la différenciation de cellules souches neurales ou de cellules gliales, lesdites cellules souches et cellulesneurales présentant un génotype Glast-CreERT2;Ptc-/-. 10. Méthode de modulation in vitro de l'expression du gène Ptc dans des cellules souches neurales ou dans des cellules gliales, notamment des cellules souches isolées, ladite méthode comprenant une étape de mise en contact desdites cellules souches neurales ou desdites cellules gliales avec une dose efficace de tamoxifène