Brevet FR3011932A1 — publié le 20150417

DISPOSITIF ET PROCEDE DE MESURE DE FLUORESCENCE RESOLUE EN TEMPS POUR LE CRIBLAGE A HAUT DEBIT D'ECHANTILLONS DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION Le domaine technique de l'invention est celui du criblage à haut débit d'échantillons, notamment pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments par l'industrie pharmaceutique. La présente invention concerne un dispositif et un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps à haut débit pour le criblage à haut débit d'échantillons. L'invention concerne également un dispositif et un procédé de criblage à haut débit d'échantillons s'appuyant sur une mesure de fluorescence résolue en temps, ainsi qu'un dispositif et un procédé de tri à haut débit d'échantillons s'appuyant sur une mesure de fluorescence résolue en temps. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION L'implémentation et la mise en oeuvre de procédés de criblage à haut débit HTS (de l'anglais « High-Throughput Screening ») présentent un très grand intérêt pour l'industrie pharmaceutique et plus généralement pour la recherche académique, notamment dans les domaines de la biologie, de la biochimie ou de la biophysique. En effet, dès qu'une biomolécule est identifiée en tant que nouvelle cible thérapeutique potentielle, son interaction avec un très grand nombre de composés chimiques, typiquement plusieurs dizaines de milliers, est systématiquement étudiée afin de déterminer, parmi ces composés chimiques, ceux qui se lient à la biomolécule cible et pourraient donc être utilisés dans la conception de nouveaux médicaments. La plupart des méthodes HTS sont basées sur une détection de fluorescence de biomolécules marquées, dans des dispositifs automatisés capables de manipuler rapidement un grand nombre d'échantillons. Parmi les différentes mises en oeuvre possibles de détection de fluorescence, la détection de fluorescence résolue en temps TRF (de l'anglais « Time-Resolved Fluorescence ») présente un intérêt particulier car elle permet de révéler des informations intrinsèquement liées au marquage. La détection de fluorescence intégrée en temps, c'est-à-dire la détection d'intensité de fluorescence, est au contraire sensible aux fluctuations de concentration et sujette aux interférences avec des signaux de fond, tels que des signaux d'autofluorescence ou de diffusion. La détection TRF est cependant une technique plus complexe que la détection d'intensité de fluorescence et dont la mise en oeuvre demeure difficile dans des applications de criblage à haut débit HTS. La détection de fluorescence résolue en temps TRF est une mesure de la cinétique de décroissance d'un signal de fluorescence d'un chromophore en solution, après que ledit chromophore a été excité par une impulsion lumineuse ultra-courte. A l'échelle d'une molécule unique, cette cinétique de décroissance représente la probabilité d'émettre un photon unique par émission spontanée, c'est-à-dire par fluorescence, en fonction du temps après l'excitation. A cause de l'interaction du chromophore avec son environnement, la cinétique de décroissance de fluorescence est susceptible d'être fortement accélérée. C'est par exemple le cas du mécanisme de transfert résonant d'énergie de type Fôrster FRET (de l'anglais « Fôrster Resonance Energy Transfer »), qui est utilisé pour tester les interactions biomoléculaires. Le nombre total de photons détectés durant une fenêtre temporelle donnée est simplement l'intégrale de la cinétique de décroissance sur cette fenêtre temporelle. C'est ce nombre total de photons qui est mesuré lors d'une mesure d'intensité de fluorescence, réalisée en excitant une même solution avec une source lumineuse continue. Ainsi, plus la cinétique de décroissance de fluorescence est rapide, plus la quantité totale de photons détectés, c'est-à-dire l'intensité de fluorescence, diminue, ce qui signifie que le rendement quantique de fluorescence est réduit. La figure la représente schématiquement : - une cinétique 1 de décroissance de fluorescence résolue en temps d'un chromophore en solution, le chromophore n'ayant pas d'interaction avec une autre molécule ; - une cinétique 2 de décroissance de fluorescence résolue en temps du même chromophore en solution, le chromophore ayant une interaction avec une autre molécule. L'aire en-dessous de chaque courbe de cinétique est proportionnelle au nombre total de photons émis. C'est ce nombre total de photons émis qui est mesuré lors d'une mesure de fluorescence intégrée en temps, c'est-à-dire lors d'une mesure d'intensité de fluorescence, par exemple dans les dispositifs classiques de criblage HTS utilisant la détection de fluorescence. La figure 1 a montre l'aire 11 sous la courbe de cinétique 1 et l'aire 12 sous la courbe de cinétique 2. L'aire 11 est supérieure à l'aire 12. Une mesure d'intensité de fluorescence ne donne en revanche aucune information sur la répartition temporelle des photons émis et ne permet donc pas d'accéder aux allures des courbes de cinétique 1 et 2 proprement dites. Dans la plupart des procédés de criblage HTS, les interactions moléculaires et notamment les liaisons moléculaires sont testées en détectant un changement dans le rendement quantique de fluorescence d'un chromophore lié à une première molécule, lorsque cette première molécule interagit avec une autre molécule, par exemple en formant un complexe. Comme expliqué précédemment, ce changement dans le rendement quantique de fluorescence entraîne une cinétique de décroissance de fluorescence plus rapide et conséquemment une diminution de l'intensité de fluorescence. Cependant, un tel changement d'intensité de fluorescence n'est pas nécessairement causé par une variation du rendement de fluorescence quantique. Ainsi, une modification de l'intensité de fluorescence peut également être causée par des fluctuations d'autres paramètres extérieurs, tels que la concentration du chromophore en solution ou l'intensité de la source lumineuse d'excitation. En revanche, lorsqu'on réalise une mesure de fluorescence résolue en temps TRF, l'amplitude du signal peut certes être affectée par un changement de la concentration du chromophore ou de l'intensité lumineuse du laser d'excitation, mais pas la constante de temps de décroissance, appelée « durée de vie de fluorescence ». En effet, la durée de vie de fluorescence ne dépend pas de paramètres extérieurs : la durée de vie de fluorescence dépend uniquement des interactions moléculaires. C'est notamment la raison pour laquelle la technique d'imagerie par durée de vie de fluorescence FLIM (de l'anglais « Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy ») a été massivement développée, par exemple en biologie cellulaire, en plus de la microscopie en fluorescence classique. En effet, seule la technique FLIM permet de repérer les emplacements où les biomolécules interagissent - ou n'interagissent pas - les unes avec les autres, par opposition aux emplacements où les biomolécules se trouvent en faible ou en forte concentration au sein d'une cellule. Dans le présent contexte de criblage à haut débit HTS et pour les raisons qui viennent d'être exposées, la détection de fluorescence résolue en temps TRF est susceptible de réduire significativement le nombre de détections de « faux positifs » ou de « faux négatifs ». Le comptage de photons uniques avec corrélation temporelle TCSPC (de l'anglais « Time-Correlated Single Photon Counting ») est une technique d'acquisition numérique, selon laquelle l'acquisition du signal de fluorescence est réalisée en comptant les photons un par un et en enregistrant simultanément le temps d'arrivée de chacun de ces photons après l'impulsion d'excitation. Ainsi, le signal TRF est construit comme un histogramme du nombre de photons détectés dans des intervalles de temps successifs. La figure lb montre des données de cinétique de décroissance de fluorescence résolue en temps typiquement obtenues par une technique de comptage TCSPC, formant un histogramme 3. Le signal se construit progressivement, en comptant les photons un par un. Le bruit statistique, inhérent au processus d'émission de lumière, est de moins en moins prononcé à mesure que le nombre de photons détectés augmente. L'histogramme 3 converge ainsi asymptotiquement, pour un grand nombre de photons détectés, vers la courbe théorique 4 de cinétique de décroissance de fluorescence. Dans l'exemple représenté à la figure 1 b, l'histogramme 3 et la courbe théorique 4 sont simulés pour le cas où environ 1000 photons ont été détectés en tout. Après chaque impulsion d'excitation, un photon au maximum doit être détecté par canal de détection, afin d'éviter qu'un phénomène d'empilement (« pile-up ») ne se produise. En effet, si deux photons sont détectés en même temps sur un même canal de détection, l'un sera caché par l'autre. Un laser avec un taux de répétition élevé, typiquement supérieur à 10 MHz, est donc requis afin de permettre l'acquisition d'une courbe de décroissance de fluorescence avec un bon rapport signal à bruit dans un bref temps d'acquisition. Lorsque le nombre de photons détectés augmente, la forme de l'histogramme 3 évolue vers la forme des courbes de cinétique 1 et 2 représentées à la figure 1 a. La précision de la cinétique de décroissance de fluorescence est limitée par le bruit de détection des photons, qui diminue lorsque le nombre total de photons détectés augmente, donc lorsque le temps d'acquisition augmente. Nous abordons dans ce paragraphe la problématique de la mise en oeuvre d'une détection TRF pour des analyses automatisées de fluorescence. Par opposition à la détection de fluorescence intégrée en temps, la détection TRF doit permettre de réduire significativement les cas de « faux positifs » ou de « faux négatifs », grâce à la diminution de l'influence des signaux de fond ou des fluctuations de concentration. Dans le cadre d'applications de criblage HTS, la détection TRF a initialement été mise en oeuvre avec une détection analogique, en domaine fréquentiel, et pour des chromophores de grande longévité, c'est-à-dire présentant des durées de vie de fluorescence de l'ordre de quelques centaines de ns, comme les complexes de ruthénium - ainsi qu'exposé dans le document « Fluorescence- lifetime technologies for high-throughput screening », French, T.E. et al., p. 209- 218 (1998), ou de l'ordre de la microseconde, comme les lanthanides. Une telle mise en oeuvre analogique n'est cependant pas compatible avec une détection de fluorescence résolue en temps TRF pour la plupart des chromophores d'intérêt par exemple pour les analyses basées sur des mesures de FRET. Ces chromophores d'intérêt, comme les protéines fluorescentes et notamment la protéine GFP (de l'anglais « Green Fluorescent Protein »), ont en effet des durées de vie de fluorescence de l'ordre de quelques nanosecondes. Récemment, une équipe de l'université du Minnesota a décrit, dans le document « High-Throughput FRET Assay Yields Allosteric SERCA Activators », Cornea, R.L., S.J. Gruber, E.L. Lockamy, J.M. Muretta, D. Jin, J. Chen, R. Dahl, T. Bartfai, K.M. Zsebo, G.D. Gillispie, and D.D. Thomas, Journal of Biomolecular Screening. 18(1): p. 97-107 (2013), un procédé prometteur de criblage HTS efficace, basé sur des mesures de FRET dans des micro-puits. Dans ces travaux, la détection TRF est mise en oeuvre avec un procédé analogique nommé « Direct Waveform Recording » (DWR), c'est-à-dire « enregistrement direct de forme d'onde ». Ce procédé analogique DWR, qui utilise une source laser intense avec un faible taux de répétition - de l'ordre de 10 kHz - a été spécialement développé pour la détection TRF, dans des applications de criblage HTS. Les auteurs affirment en effet, dans le document « High-performance time-resolved fluorescence by direct waveform recording », Muretta, J.M., A. Kyrychenko, A.S. Ladokhin, D.J. Kast, G.D. Gillispie, and D.D. Thomas, Review of Scientific Instruments. 81(10): p. 103101-8 (2010), que le comptage de photons uniques avec corrélation temporelle TCSPC, qui est la forme la plus répandue de détection TRF, n'est pas compatible avec un criblage HTS. Avec l'approche analogique DWR, les auteurs parviennent à mettre en oeuvre des tests TRF avec un débit élevé : 384 micro-puits, contenant des solutions de 90 nL d'un marqueur fluorescent, ont ainsi été analysés en deux minutes. Toutefois, les auteurs abandonnent délibérément la sensibilité ultime, c'est-à-dire le photon unique, permise par le comptage TCSPC. Bien qu'un comptage TCSPC ait déjà été mis en oeuvre pour une détection TRF avec des microplaques - voir par exemple le document « A Fluorescence Lifetime-Based Assay for Abelson Kinase », Pritz, S. et al., Journal of Biomolecular Screening. 16(1): p. 65-72 (2011), une telle technique demeure bien moins performante en termes de débit et d'applications industrielles, puisqu'elle nécessite typiquement de 5 à 20 minutes pour une plaque comportant 384 micro-puits, avec 3000 à 10000 photons détectés par puits. L'état de la technique propose donc plusieurs types de dispositifs de mesure de 25 fluorescence résolue en temps TRF pour le criblage d'échantillons sur microplaques, les échantillons comportant des chromophores d'intérêt : - un dispositif avec une mise en oeuvre analogique de mesure de fluorescence TRF, adapté uniquement pour le criblage d'échantillons contenant des chromophores de grande longévité, c'est-à-dire présentant 30 des durées de vie de fluorescence de l'ordre de quelques centaines de ns ou de l'ordre de la microseconde. Cependant la majorité des chromophores d'intérêt ont des durées de vie de fluorescence beaucoup plus courtes, de l'ordre de quelques nanosecondes ; - un dispositif avec une mise en oeuvre analogique de mesure de fluorescence TRF, adapté pour le criblage d'échantillons contenant des chromophores avec des durées de vie de fluorescence de l'ordre de quelques ns, et offrant un débit de criblage de l'ordre de quelques centaines d'échantillons par minute. Ce dispositif n'implémente pas de méthode de comptage TCSPC et ne permet donc pas une sensibilité de détection au photon unique ; - un dispositif de mesure de fluorescence TRF par une méthode de comptage TCSPC, offrant une sensibilité de détection au photon unique, mais avec un débit de criblage de l'ordre de quelques dizaines d'échantillons par minute seulement. Ces dispositifs sont principalement limités par la vitesse à laquelle ils sont capables de traiter et d'analyser les données de criblage, mais également par la vitesse à laquelle ils parviennent à manipuler les échantillons. Des systèmes microfluidiques permettent d'améliorer ce dernier point, en autorisant la production et la manipulation d'échantillons sous forme de gouttes à une vitesse très élevée, à une fréquence de l'ordre du KHz, soit trois ordres de grandeur plus vite que des échantillons de type micro-puits sur micro-plaques. De tels systèmes microfluidiques permettent en outre de former des échantillons dont le volume est inférieur au nanolitre, ce qui représente une diminution de plus de quatre ordres de grandeur par rapport aux échantillons de type micro-puits sur micro-plaques. Deux dispositifs de criblage par comptage TCSPC utilisant un système microfluidique pour la production et la manipulation d'échantillons ont jusqu'à présent été décrits dans la littérature, notamment dans les documents « Highspeed FRET screening for optical proteomics in a microfluidic format », Visitkul, V. et al., p. 79020P-79020P (2011) et « Protein-protein interaction analysis in single microfluidic droplets using FRET and fluorescence lifetime detection », Benz, C. et al., Lab on a Chip. 13(14): p. 2808-2814 (2013). Cependant, ces deux dispositifs demeurent cette fois limités par la vitesse à laquelle ils parviennent à traiter et analyser les données de criblage. Ainsi, ils n'atteignent, au mieux, qu'un débit de criblage de quelques dizaines d'échantillons par seconde. RESUME DE L'INVENTION Dans ce contexte, la présente invention a pour but d'offrir une solution aux problèmes évoqués précédemment, en proposant un dispositif à la fois précis, fiable et à haut débit de mesure de fluorescence résolue en temps (TRF), pour le criblage à haut débit d'échantillons. Dans la présente description, on entend par « haut débit » un débit pouvant atteindre une fréquence de l'ordre de 1 KHz, donc très supérieur aux débits constatés dans l'art antérieur. A cette fin, l'invention concerne donc en premier lieu un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon, le dispositif fonctionnant avec une source lumineuse apte à produire une succession d'impulsions d'excitation pour l'excitation de l'échantillon de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence formant une émission de fluorescence, le dispositif comportant : - une unité de détection de photons uniques apte à détecter au moins une partie desdits photons de fluorescence, l'unité de détection de photons uniques générant un signal de détection pour chaque photon unique détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ; - une unité de mesure permettant de mesurer, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et générant une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ; - une unité d'analyse en temps réel des données numériques issues de ladite unité de mesure, comportant des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon. Grâce à l'invention, un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps TRF avec une mise en oeuvre numérique est donc proposé. L'unité de détection de photons uniques implémentée par le dispositif de l'invention garantit une sensibilité de détection ultime, chaque photon étant détecté de manière individuelle. Cette sensibilité au photon unique contribue en premier lieu à la précision et à la fiabilité du dispositif de l'invention. L'unité de mesure génère, pour chaque photon détecté par l'unité de détection, une donnée numérique caractéristique du temps d'arrivée dudit photon. On comprend que, pour un échantillon donné, une pluralité de photons de fluorescence est détectée par l'unité de détection, et donc une pluralité de données numériques est produite par l'unité de mesure, à destination de l'unité d'analyse. L'unité d'analyse permet un traitement numérique en temps réel et à haut débit de cette pluralité de données numériques. Comme mentionné plus haut, on entend par « haut débit » un débit pouvant atteindre une fréquence de l'ordre de 1 KHz. L'expression « analyse en temps réel des données numériques » est explicitée ci-après. On considère l'exemple de deux échantillons consécutifs, passant et résidant successivement dans une zone de mesure de fluorescence TRF sans qu'aucun autre échantillon ne se trouve entre eux. Les deux échantillons sont séparés par un intervalle de temps qui définit la fréquence de mesure de fluorescence TRF. Pendant son passage dans la zone de mesure, le premier échantillon est successivement excité par une pluralité d'impulsions d'excitation et le premier échantillon émet ainsi plusieurs photons de fluorescence en se désexcitant. Au moins une partie de ces photons de fluorescence est détectée, chaque photon de fluorescence détecté ayant un signal de détection et une donnée numérique caractéristique de ce signal de détection. Dans la présente description, on entend par « analyse en temps réel des données numériques » le fait que les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du premier échantillon sont traitées dans un intervalle de temps inférieur ou égal à l'intervalle de temps entre les premier et deuxième échantillons. Autrement dit, les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du premier échantillon sont traitées par l'unité d'analyse avant que ne lui parviennent les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du deuxième échantillon. On emploiera indifféremment dans la présente description les termes « en temps réel » et « à la volée ». Dans la présente description, le terme « émission de fluorescence » désigne l'ensemble des photons de fluorescence émis, avant les phases de collection et de détection. Le terme « signal de fluorescence » désigne quant à lui les photons de fluorescence qui, après leur émission, ont effectivement été collectés puis détectés. Outre les caractéristiques évoquées précédemment, le dispositif de mesure de fluorescence selon l'invention peut présenter une ou plusieurs caractéristiques complémentaires parmi les suivantes, considérées individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles : La grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon est avantageusement choisie parmi la liste suivante : - au moins une constante de temps de décroissance de fluorescence de l'échantillon ; - au moins un moment de la distribution temporelle des temps d'arrivée des photons de fluorescence de l'échantillon. Parallèlement à une ou plusieurs grandeurs, préférentiellement choisies dans la liste ci-dessus, caractérisant la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon, au moins une grandeur caractéristique de l'intensité de fluorescence de l'échantillon, comme le nombre total de photons détectés, pourra également être calculée. L'unité de mesure comporte avantageusement : - un moyen de mesure, et - une unité de déclenchement permettant d'assurer un fonctionnement synchrone entre la source lumineuse d'excitation et le moyen de mesure. 30 Selon un premier mode de fonctionnement, l'unité de déclenchement génère simultanément : - un premier signal de déclenchement vers la source lumineuse pour ordonner l'émission d'une impulsion lumineuse, et - un deuxième signal de déclenchement vers l'unité de mesure. Selon ce premier mode de fonctionnement, le taux de répétition de la source lumineuse est fixé par l'unité de déclenchement. Alternativement, selon un deuxième mode de fonctionnement, le taux de répétition des impulsions émises par la source lumineuse est déterminé par la source lumineuse elle-même, en fonction de ses caractéristiques intrinsèques, et une partie du faisceau lumineux est dirigée vers l'unité de déclenchement qui génère, pour chaque impulsion lumineuse émise, le deuxième signal de déclenchement vers l'unité de mesure. L'unité de déclenchement peut être un discriminateur à fraction constante comportant une photodiode. Le moyen de mesure de l'unité de mesure est avantageusement choisi parmi la liste suivante : - un convertisseur temps-amplitude ; - un compteur numérique rapide ; - un convertisseur temps-numérique. De tels moyens de mesure de l'unité de mesure autorisent avantageusement, en particulier par rapport à une unité de mesure analogique, une très grande diminution et optimisation de la quantité de données générées pour chaque évènement de détection, et qui doivent ensuite être stockées et/ou envoyées à l'unité d'analyse et traitées par ladite unité d'analyse. De tels moyens de mesure permettent en effet de mesurer l'intervalle de temps entre chaque signal de détection et son impulsion d'excitation : c'est donc une mesure de temps relative entre deux évènements, plutôt qu'une mesure d'un temps absolu. L'unité de détection de photons uniques comprend avantageusement au moins un détecteur de photons uniques choisi parmi la liste suivante : - une diode à avalanche ou une matrice de diodes à avalanche ; - une diode à avalanche à photon unique ou une matrice de diodes à avalanche à photon unique ; - un photomultiplicateur silicium ; - un tube photomultiplicateur ou une matrice de tubes photomultiplicateurs ; - un tube photomultiplicateur hybride ou une matrice de tubes photomultiplicateurs hybrides ; - un nanofil supraconducteur ; - un tube photomultiplicateur à galette de micro-canaux ou une matrice de tubes photomultiplicateurs à galette de micro-canaux On notera qu'une diode à avalanche et une diode à avalanche à photon unique se distinguent notamment par leur mode de fonctionnement, qui est donné par la polarisation de la diode : légèrement au-delà de la tension d'avalanche pour une diode à avalanche et bien au-delà pour une diode à avalanche à photon unique. L'unité de détection de photons uniques pourra comprendre un ou plusieurs détecteurs de photons uniques, selon différentes réalisations de l'invention. L'unité de détection de photons uniques comprend avantageusement plusieurs détecteurs de photons uniques et l'unité de mesure comprend avantageusement plusieurs moyens de mesure, chaque détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques fonctionnant avec un moyen de mesure de l'unité de mesure. Ainsi, une mesure de fluorescence TRF pourra avantageusement être réalisée : - simultanément sur plusieurs échantillons, selon une configuration « multichannel » de l'invention, afin d'accroître le débit de traitement ; - avec une résolution spectrale. Dans ce dernier cas, les photons de fluorescence issus d'un échantillon peuvent être diffractés, par exemple à l'aide d'un spectromètre, vers une pluralité de détecteurs, chaque détecteur de la pluralité de détecteurs étant alors associé à une certaine gamme de longueur d'onde ; - avec une résolution en polarisation ; - avec une résolution en direction de propagation. Dans le cas où l'unité de détection de photons uniques comporte plusieurs détecteurs de photons uniques, l'unité de mesure pourra comporter un seul moyen de mesure, ou préférentiellement plusieurs moyens de mesure et par exemple autant de moyens de mesure que de détecteurs de photons uniques. L'unité d'analyse est alors capable de traiter en parallèle les données numériques générées simultanément par les différents moyens de mesure de l'unité de mesure. Il est intéressant d'avoir plusieurs moyens de mesure pour mettre en oeuvre une mesure multiparamètre de fluorescence, ou simplement pour pouvoir compter plus vite tout en évitant le phénomène de « pile-up ». Une seule unité de déclenchement suffit a priori pour déclencher l'ensemble des moyens de mesure de l'unité de mesure. Il est cependant envisageable d'utiliser plusieurs sources lasers indépendantes, et on utilisera avantageusement dans ce cas une unité de déclenchement par source laser indépendante. Dans le cas de plusieurs sources lasers synchronisées entre elles, c'est-à-dire par exemple des diodes laser, une seule unité de déclenchement pourra suffire pour déclencher les sources laser synchronisées et les moyens de mesure. L'unité d'analyse comporte avantageusement des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de l'évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon, telle que : - l'anisotropie de fluorescence résolue en temps de l'échantillon ; - la corrélation de plusieurs signaux de fluorescence de l'échantillon détectés à différentes longueurs d'ondes ou l'évolution spectrale de la fluorescence de l'échantillon. Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif de criblage à haut débit utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps, le dispositif comportant : - un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps comportant des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon d'une pluralité d'échantillons ; - une unité de production et de manipulation de la pluralité d'échantillons capable d'apporter successivement chaque d'échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation de fluorescence ; - une unité de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation émises par la source lumineuse sur au moins une zone d'excitation de fluorescence de l'unité de production et de manipulation dans laquelle circule chaque échantillon ; - une unité de collection et de filtrage des photons de fluorescence, et de couplage optique desdits photons de fluorescence avec le dispositif de mesure de fluorescence ; - des moyens pour, à partir de la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon, attribuer audit échantillon une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat. Dans la présente description, on entend donc par « criblage » le fait de déterminer, pour chaque échantillon, une classe de résultat parmi une pluralité prédéterminée de classes de résultat, en fonction de la grandeur numérique calculée pour ledit échantillon par l'unité d'analyse du dispositif de mesure de fluorescence. Le dispositif de criblage à haut débit emploie avantageusement une unité microfluidique de manipulation d'échantillons, les échantillons étant des gouttelettes ou des cellules biologiques. Une telle unité microfluidique permet en effet la formation d'échantillons sous la forme de microgouttelettes de très faible volume, et la manipulation précise de ces échantillons à une cadence très élevée. Ainsi, une unité microfluidique pour la formation et la manipulation d'échantillons au sein d'un dispositif de criblage selon l'invention permet avantageusement d'exploiter les capacités de haut débit du dispositif de criblage selon l'invention de manière satisfaisante. Dans le dispositif de criblage de l'invention, l'unité d'analyse en temps réel a 25 avantageusement les moyens de : - détecter le passage de chaque échantillon ; - générer une distribution temporelle moyenne du signal de fluorescence d'une succession d'échantillons, et les grandeurs numériques caractéristiques de cette distribution ; 30 - générer une distribution temporelle du signal de fluorescence détecté entre les passages des échantillons et la moyenne glissante de ladite distribution temporelle. Le signal de fluorescence détecté entre les passages des échantillons est typiquement dû au fond de fluorescence de l'unité de manipulation des échantillons et/ou à la diffusion de la lumière d'excitation. En générant une distribution temporelle de ce signal de fluorescence « parasite » et la moyenne glissante de ladite distribution temporelle, on peut avantageusement corriger le résultat de la mesure de fluorescence de chaque échantillon. L'unité de couplage optique et de focalisation comporte avantageusement une ou plusieurs optiques diffractives ou réfractives, conventionnelles ou intégrées. L'unité de couplage optique et de focalisation du dispositif de criblage de l'invention assure notamment la mise en forme des impulsions lumineuses d'excitation issue de la source lumineuse, pour l'excitation efficace des échantillons dans au moins une zone spatialement définie de l'unité microfluidique de manipulation. Les impulsions lumineuses d'excitation peuvent être focalisées à l'aide d'éléments optiques conventionnels, comme des objectifs de microscope, ou bien couplées à l'unité microfluidique par propagation guidée sur puce ou grâce à des optiques intégrées. La mise en forme spatiale des impulsions lumineuses d'excitation en une ligne ou plusieurs spots peut être réalisée par des optiques diffractives ou réfractives. L'unité de collection, de filtrage et de couplage optique du dispositif de criblage de l'invention permet la collection efficace des photons de fluorescence émis par les échantillons en une ou plusieurs zones d'excitation et le couplage vers le dispositif de mesure de fluorescence. L'unité de collection, de filtrage et de couplage optique du dispositif de criblage de l'invention permet également un filtrage des photons de fluorescence par rapport à d'autres photons issus du fond lumineux, afin de discriminer les photons de fluorescence de la molécule d'intérêt des autres photons issus du fond lumineux, et donc de limiter le nombre de ces photons issus du fond lumineux : photons d'excitation, luminescence du dispositif microfluidique lui-même, ou de tout composé autre que la molécule d'intérêt dans l'échantillon. L'unité de collection, de filtrage et de couplage optique pourra avantageusement comporter un ou plusieurs éléments choisis parmi la liste suivante : - une ou plusieurs optiques conventionnelles ; - une ou plusieurs optiques intégrées ; - un ou plusieurs guides d'ondes intégrés ou non intégrés ; - un moyen de filtrage des photons de fluorescence par rapport aux autres photons issus du fond lumineux. L'unité de collection, de filtrage et de couplage optique permet avantageusement de résoudre en polarisation et/ou spectralement le signal de fluorescence collecté, et comporte un ou plusieurs éléments choisis parmi la liste suivante : - un moyen de filtrage ou de résolution spectrale en longueur d'onde des photons de fluorescence ; - un moyen de filtrage ou de résolution en polarisation des photons de fluorescence. Ainsi, on peut avantageusement fournir une résolution spectrale et/ou en polarisation du signal de fluorescence de chaque échantillon. Avec une telle unité de collection, de filtrage et de couplage optique, le dispositif de criblage comportera avantageusement un dispositif de mesure de fluorescence au sein duquel l'unité de détection de photons uniques comprend plusieurs détecteurs de photons uniques et l'unité de mesure comprend plusieurs moyens de mesure. Selon une mise en oeuvre avantageuse du dispositif de criblage de l'invention : - au sein du dispositif de mesure de fluorescence, l'unité de détection de photons uniques comprend plusieurs détecteurs de photons uniques et l'unité de mesure comprend plusieurs moyens de mesure, chaque détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques fonctionnant avec un moyen de mesure de l'unité de mesure ; - l'unité microfluidique comporte une pluralité de canaux microfluidiques pour la manipulation en parallèle d'échantillons ; - l'unité de couplage optique et de focalisation focalise les impulsions d'excitation sur au moins une zone spatialement définie de chaque canal microfluidique ; - l'unité de collection, de filtrage et de couplage optique permet de collecter, filtrer et coupler optiquement avec le dispositif de mesure de fluorescence les photons de fluorescence issus des échantillons circulant dans chaque canal microfluidique. Ainsi, selon cette mise en oeuvre « multicanal », le dispositif de criblage de l'invention permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en parallèle afin d'accroître le débit de criblage. De plus, pour un échantillon donné, plusieurs données de fluorescence résolue en temps pourront également être simultanément traitées, par exemple afin de fournir une résolution spectrale et/ou en polarisation du signal de fluorescence de chaque échantillon. Alternativement, un tel traitement simultané de plusieurs échantillons en parallèle pourra également être mis en oeuvre en effectuant des mesures en plusieurs zones spatialement définies d'un unique canal. Selon une autre alternative, les trois solutions précédentes pourront être combinées, dans une mise en oeuvre avec plusieurs canaux microfluidiques en parallèle, des mesures étant effectuées en plusieurs zones spatialement définies de chaque canal microfluidique. Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons, utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps, et 20 comportant : - un dispositif de criblage utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps et comportant des moyens pour attribuer en temps réel à chaque échantillon de la pluralité d'échantillons une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat ; 25 - des moyens pour réaliser une manipulation conditionnelle à haut débit desdits échantillons consécutive au résultat du criblage, en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon. Il pourra s'agir de mettre en oeuvre un traitement spécifique pour chaque échantillon, conditionné au résultat du criblage, comme par exemple : 30 - un tri : en fonction de son résultat de criblage, un échantillon peut être spécifiquement orienté au sein du dispositif microfluidique de manipulation. Par exemple, dans le cas d'un criblage binaire, des échantillons, circulant initialement dans un canal principal, seront orientés dans un premier sous-canal du canal principal si leur résultat de criblage est « positif », et dans un deuxième sous-canal du canal principal si leur résultat de criblage est « négatif ». - une fusion conditionnelle : en fonction de leurs résultats de criblage, deux échantillons peuvent être fusionnés afin de mélanger leurs contenus. On obtient alors, à partir de deux échantillons initiaux, un unique échantillon fusionné. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon, le procédé comportant : - une première étape, selon laquelle une source lumineuse émet une succession d'impulsions d'excitation pour l'excitation de l'échantillon de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence formant une émission de fluorescence ; - une deuxième étape, selon laquelle une unité de détection de photons uniques détecte au moins une partie desdits photons de fluorescence et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ; - une troisième étape, selon laquelle une unité de mesure détermine, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ; - une quatrième étape, selon laquelle une unité d'analyse traite en temps réel les données numériques issues de ladite unité de mesure et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon. La quatrième étape du procédé de mesure de fluorescence de l'invention pourra comprendre les sous-étapes suivantes : - selon une première sous-étape, l'unité d'analyse compte le nombre de photons de fluorescence détectés en fonction du temps d'arrivée desdits photons de fluorescence détectés et construit ainsi un histogramme du nombre de photons de fluorescence détectés en fonction de leur temps d'arrivée ; - selon une deuxième sous-étape, l'unité d'analyse calcule, à partir de l'histogramme construit lors de la première sous-étape, au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon et/ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps multiparamètre par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon, le procédé comportant : - une première étape selon laquelle une source lumineuse émet une succession d'impulsions d'excitation pour l'excitation de l'échantillon de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence formant une émission de fluorescence ; - une deuxième étape selon laquelle l'émission de fluorescence est résolue en une pluralité de faisceaux selon un premier paramètre tel que la longueur d'onde, la polarisation ou la direction de propagation de chaque photon de fluorescence ; - une troisième étape selon laquelle, pour chacun de ces faisceaux, un détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques détecte au moins une partie des photons de fluorescence et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ; - une quatrième étape selon laquelle un moyen de mesure de l'unité de mesure détermine, pour chaque faisceau, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation et chaque signal de détection issu d'un photon de florescence dudit faisceau, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ; - une cinquième étape selon laquelle l'unité d'analyse traite en temps réel les données numériques issues de chaque moyen de mesure de l'unité de mesure et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon, et/ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle des signaux calculés, résultant de la combinaison de divers signaux de fluorescence provenant de la mesure multiparamètre. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons avec une mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons, le procédé comportant : - une étape de production et de manipulation d'une pluralité d'échantillons afin d'apporter successivement chaque échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation ; - un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps, éventuellement multiparamètre, sur chaque échantillon par comptage de photons selon l'invention ; - une étape de criblage à haut débit de la pluralité d'échantillons selon laquelle le passage de chaque échantillon dans la zone d'excitation de fluorescence est détecté et, à partir de la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon, on détermine et on archive pour chaque échantillon une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat. Dans le procédé de criblage à haut débit du paragraphe précédent, le procédé de 30 mesure de fluorescence implémenté mettra avantageusement en oeuvre un dispositif de mesure de fluorescence comportant une unité d'analyse en temps réel permettant : - la détection du passage de chaque échantillon, - l'accumulation et l'analyse des photons de fluorescence émis par plusieurs échantillons successifs, - l'accumulation et l'analyse des photons de « fond » émis par l'ensemble du dispositif entre les échantillons successifs, - la correction de la mesure de fluorescence TRF des échantillons par soustraction de la mesure de fluorescence TRF du « fond ». Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons comportant : - un procédé selon l'invention de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons avec une mesure de fluorescence, éventuellement multiparamètre, résolue en temps par comptage de photon ; - une étape de tri à haut débit de la pluralité d'échantillons selon laquelle on réalise une manipulation conditionnelle de chaque échantillon en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon à l'issue du procédé de criblage selon l'invention. L'invention et ses différentes applications seront mieux comprises à la lecture de la description qui suit et à l'examen des figures qui l'accompagnent. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Les figures sont présentées à titre indicatif et nullement limitatif de l'invention. - La figure 1 a montre schématiquement une première cinétique de décroissance de fluorescence résolue en temps d'un chromophore en solution, le chromophore n'ayant pas d'interaction avec une autre molécule, et une deuxième cinétique de décroissance de fluorescence résolue en temps du même chromophore en solution, le chromophore ayant une interaction avec une autre molécule. - La figure 1 b montre des données de cinétique de décroissance de fluorescence résolue en temps typiquement obtenues par une technique de comptage TCSPC et formant un histogramme. - La figure 2a montre schématiquement un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps selon un mode de réalisation de l'invention. - La figure 2b montre schématiquement un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps selon un deuxième mode de réalisation de l'invention. - La figure 3a montre schématiquement un dispositif de criblage à haut débit selon un mode de fonctionnement. - La figure 3b montre schématiquement un dispositif de criblage à haut débit selon un deuxième mode de fonctionnement. - La figure 3c montre schématiquement un dispositif de criblage à haut débit selon un troisième mode de fonctionnement. - La figure 4 montre schématiquement un dispositif de tri à haut débit d'échantillons. - La figure 5a montre schématiquement l'organisation des étapes d'un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps selon l'invention. - La figure 5b montre schématiquement l'organisation des étapes d'un procédé de mesure de fluorescence multiparamètre résolue en temps selon l'invention. - La figure 6 montre schématiquement l'organisation des étapes d'un procédé de criblage à haut débit selon l'invention. - La figure 7 montre schématiquement l'organisation des étapes d'un procédé de tri à haut débit selon l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE D'AU MOINS UN MODE DE REALISATION DE 25 L'INVENTION Sauf précision contraire, un même élément apparaissant sur des figures différentes présente une référence unique. L'invention concerne un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps 30 par comptage de photons uniques pour le criblage ou le tri à haut débit d'échantillons. Dans la présente description, on entend par « criblage » le fait de déterminer puis archiver, pour chaque échantillon parmi une pluralité d'échantillons, une classe de résultat parmi une pluralité prédéterminée de classes de résultat. On entend par « tri » le fait d'utiliser le résultat d'une opération de criblage, c'est-à-dire la classe de résultat déterminée pour chaque échantillon parmi une pluralité d'échantillons, pour réaliser une opération de manipulation conditionnelle de chaque échantillon. Chaque échantillon comprend typiquement au moins un fluorophore en solution ou une cellule biologique marquée d'au moins un chromophore. Dans la présente description, on entend par « haut débit » un débit pouvant atteindre une fréquence de l'ordre de 1 KHz. Le dispositif de l'invention permet donc typiquement de cribler jusqu'à 1000 échantillons par seconde. Avec une méthode de comptage de photons uniques corrélés dans le temps TCSPC, les photons sont détectés un par un : de nombreux évènements de détection sont donc nécessaires pour construire un signal de détection de fluorescence résolue en temps TRF d' un échantillon donné. Le débit de détection, donc de criblage, est ainsi limité par le taux d'acquisition des évènements de détection. Le dispositif de l'invention doit donc permettre un taux d'acquisition des évènements de détection le plus grand possible, tout en assurant le traitement « à la volée », en temps réel, des données de détection desdits évènements de détection. L'expression « traitement en temps réel des données numériques » est explicitée ci-après. On considère l'exemple de deux échantillons consécutifs, passant et résidant successivement dans une zone de mesure de fluorescence TRF sans qu'aucun autre échantillon ne se trouve entre eux. Les deux échantillons sont séparés par un intervalle de temps qui définit la fréquence de mesure de fluorescence TRF. Pendant son passage dans la zone de mesure, le premier échantillon est successivement excité par une pluralité d'impulsions d'excitation et le premier échantillon émet ainsi plusieurs photons de fluorescence en se désexcitant. Au moins une partie de ces photons de fluorescence est détectée, chaque photon de fluorescence détecté ayant un signal de détection et une donnée numérique caractéristique de ce signal de détection. Dans la présente description, on entend par « analyse en temps réel des données numériques » le fait que les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du premier échantillon sont traitées dans un intervalle de temps inférieur ou égal à l'intervalle de temps entre les premier et deuxième échantillons. Autrement dit, les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du premier échantillon sont traitées par l'unité d'analyse avant que ne lui parviennent les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du deuxième échantillon. On emploiera indifféremment dans la présente description les termes « en temps réel » et « à la volée ». Les diodes à avalanche à photon unique SPAD (de l'anglais « Single Photon Avalanche Diodes »), ou photodiodes à avalanche polarisées en mode Geiger, sont des photodétecteurs ultra-sensibles, capables de détecter un photon unique. Bien que cette technique soit connue depuis les années 1970, les premiers travaux décrivant l'intégration réussie d'une photodiode à avalanche polarisée en mode Geiger dans un procédé CMOS standard datent seulement de la dernière décennie. La première matrice de système de comptage TCSPC complètement intégrée, notée ITCSPC pour « Integrated Time-Correlated Single Photon Counting », a été réalisée en 2008. La plupart des systèmes ITCSPC sont des matrices à deux dimensions et présentent une résolution temporelle de l'ordre de 100 ps FWHM (de l'anglais « Full Width at Half Maximum », largeur à mi-hauteur) et une efficacité quantique de détection de photon de plus de 25% pour les longueurs d'onde comprises entre 500 nm et 600 nm. Dans ces dispositifs, le taux de comptage associé au bruit d'obscurité DCR (de l'anglais « Dark Count Rate ») est généralement de l'ordre du kHz mais peut être réduit à quelques Hz par ilm2 en refroidissant le système. Le bruit d'obscurité DCR correspond au nombre d'événements uniques « détectés » par un photodétecteur, bien que le photodétecteur se trouve dans l'obscurité totale. Grâce à ces performances, des dispositifs de microscopie de fluorescence résolue en temps avec des matrices 2D de diodes SPAD ont d'ores et déjà été mis en oeuvre avec succès. Néanmoins, les systèmes 2D sont limités par leur architecture et leur mode d'action, en raison de contraintes spatiales. Par exemple, l'utilisation d'une technique d'obturation réduit la sensibilité. L'invention propose donc d'utiliser avantageusement un système avec un spot unique, ou un système « multi-spot » avec un nombre de spots réduit comme un système ITCSPC avec une matrice à une seule dimension, ce qui permet d'atteindre les limites physiques de la technologie en s'affranchissant des contraintes liées à une matrice à deux dimensions. Une matrice 1D constitue ainsi le design le plus adapté pour la présente application afin d'obtenir la meilleure sensibilité possible. La figure 2a montre un dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps selon un mode de réalisation de l'invention. Le dispositif 100 met en oeuvre : - une unité SPDet de détection de photons uniques ; - une unité M de mesure comportant un moyen de mesure TDC et une unité Trig de déclenchement ; - une unité RTA d'analyse en temps réel. Le dispositif 100 fonctionne avantageusement avec les éléments suivants, qui seront détaillés ultérieurement : - une source lumineuse LS d'excitation qui émet des impulsions d'excitation LP ; - une unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation LP vers un échantillon i_iD, pour l'excitation dudit échantillon i_iD de manière que ledit échantillon i_iD émette une pluralité de photons de fluorescence F ; - une unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique des photons de fluorescence F vers le dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps. L'unité SPDet de détection de photons uniques est un système permettant de détecter un photon unique, en tant qu'évènement unique. Chaque photon détecté est donc détecté de manière individuelle. L'unité SPDet de détection de photons uniques génère un signal de détection dès qu'elle détecte un photon. Il y a ainsi autant de signaux de détection distincts que de photons uniques détectés. L'unité SPDet de détection de photons uniques comprend notamment une partie photosensible, qui est le détecteur proprement dit. Ce détecteur peut par exemple être choisi parmi la liste suivante : - une diode à avalanche ou une matrice de diodes à avalanche ; - une diode à avalanche à photon unique SPAD (de l'anglais « single-photon avalanche diode ») ou une matrice de diodes à avalanche à photon unique ; - un photomultiplicateur silicium ; - un tube photomultiplicateur ou une matrice de tubes photomultiplicateurs ; - un tube photomultiplicateur hybride ou une matrice de tubes photomultiplicateurs hybrides ; - un nanofil supraconducteur ; - un tube photomultiplicateur à galette de micro-canaux ou une matrice de tubes photomultiplicateurs à galette de micro-canaux. L'unité SPDet de détection de photons uniques comprend également un module électronique afin de polariser le détecteur photosensible, mettre en forme le signal analogique délivré par le détecteur photosensible et générer en sortie le signal de détection. Dans le mode de réalisation illustré à la figure 2a, l'unité SPDet comporte un seul détecteur de photons uniques. Néanmoins, selon un autre mode de réalisation qui sera décrit ultérieurement, l'unité SPDet peut comporter plusieurs détecteurs de photons uniques, éventuellement intégrés sur une même puce électronique. L'unité de mesure M est un système qui mesure le temps écoulé entre l'impulsion LP d'excitation et le signal de détection. L'unité de mesure M comporte typiquement un moyen de mesure TDC et une unité de déclenchement Trig. Le moyen de mesure TDC est avantageusement un convertisseur temps-numérique. Après avoir mesuré le temps écoulé entre l'impulsion LP d'excitation et le signal de détection, le convertisseur temps-numérique génère en sortie une valeur numérique caractéristique de ce temps écoulé. L'ordre de grandeur de cette valeur numérique est typiquement compris entre quelques picosecondes et quelques nanosecondes. Par rapport à une unité de mesure analogique, ou à une unité de mesure numérique avec un très fort taux d'échantillonnage, l'unité de mesure M avec le moyen de mesure TDC autorise une très grande diminution et optimisation de la quantité de données générées pour chaque évènement de détection, et qui doivent ensuite être stockées et/ou envoyées à l'unité RTA d'analyse et traitées par ladite unité RTA d'analyse. L'unité de mesure M mise en oeuvre dans un dispositif de criblage selon l'invention permet en effet de mesurer l'intervalle de temps entre chaque signal de détection et son impulsion LP d'excitation : c'est donc une mesure de temps relative entre deux évènements, plutôt qu'une mesure d'un temps « absolu ». Ce faisant, l'unité de mesure M mise en oeuvre dans un dispositif de criblage selon l'invention permet d'éviter une génération, un stockage et un traitement énormes de données inutiles. La dynamique du convertisseur temps-numérique peut être réduite à quelques bits, jusqu'à moins de 4 ou 5 bits par exemple. Néanmoins un convertisseur temps-numérique avec une dynamique importante, jusqu'à plus de 32 bits, peut également être utilisé. Le temps de conversion du convertisseur temps-numérique doit être maintenu aussi faible que possible, de l'ordre de quelques nanosecondes, afin de réduire le temps mort pour l'ensemble du système de détection. Le moyen de mesure TDC mis en oeuvre par l'unité de mesure M peut par exemple être : - un ou plusieurs convertisseurs temps-amplitude ; - un ou plusieurs compteurs numériques rapides ; - un ou plusieurs convertisseurs temps-numérique utilisant une ligne à retard ; - un ou plusieurs des éléments listés ci-dessus. L'unité de mesure M pourra être intégrée avec l'unité SPDet sur une même puce électronique. L'unité Trig de déclenchement permet d'assurer un mode de fonctionnement synchrone entre le moyen de mesure TDC de l'unité de mesure M et la source lumineuse LS d'excitation. Deux modes de fonctionnement sont possibles pour l'unité Trig de déclenchement. Selon un premier mode de fonctionnement, l'unité Trig de déclenchement génère simultanément : - un premier signal de déclenchement vers la source lumineuse LS pour ordonner l'émission d'une impulsion lumineuse, et - un deuxième signal de déclenchement vers le moyen de mesure TDC. Selon ce premier mode de fonctionnement, le taux de répétition de la source lumineuse LS est fixé par l'unité Trig de déclenchement. Selon un deuxième mode de fonctionnement, le taux de répétition des impulsions LP émises par la source lumineuse LS est déterminé par la source lumineuse LS elle-même, en fonction de ses caractéristiques intrinsèques, et une partie du faisceau lumineux est dirigée vers l'unité Trig de déclenchement. Pour chaque impulsion lumineuse LP émise, l'unité Trig de déclenchement détecte donc une partie de ladite impulsion lumineuse LP et génère le deuxième signal de déclenchement vers le moyen de mesure TDC. L'unité Trig de déclenchement peut être un discriminateur à fraction constante comportant une photodiode. L'unité RTA d'analyse permet le traitement à la volée des données issues du moyen de mesure TDC afin de calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'emission de fluorescence de l'échantillon i_iD considéré. Cette grandeur numérique peut par exemple être : - au moins une constante de temps de décroissance de fluorescence de l'échantillon. Dans le cas d'une analyse supposant une décroissance exponentielle de fluorescence, une seule constante de temps de décroissance de fluorescence sera calculée. Dans le cas d'une analyse supposant une cinétique multi-exponentielle ou non-exponentielle de fluorescence, plusieurs constantes de temps caractéristiques pourront être calculées ; - au moins un moment de la distribution temporelle des temps d'arrivée des photons de fluorescence de l'échantillon. Le moment d'ordre 1, c'est-à-dire la valeur moyenne des temps d'arrivée des photons de fluorescence de l'échantillon, et/ou le moment d'ordre 2, c'est-à-dire l'écart quadratique moyen des temps d'arrivée des photons de fluorescence de l'échantillon, pourront notamment être calculés. Parallèlement à une ou plusieurs grandeurs, préférentiellement choisies dans la liste ci-dessus, caractérisant la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon, au moins une grandeur caractéristique de l'intensité de fluorescence de l'échantillon, comme le nombre total de photons détectés, pourra également être calculée par l'unité RTA d'analyse. L'unité RTA d'analyse peut par exemple réaliser une étape préliminaire de comptage du nombre de photons de fluorescence F détectés en fonction du temps d'arrivée desdits photons de fluorescence F détectés, et construire ainsi un histogramme du nombre de photons détectés en fonction du temps d'arrivée des photons détectés. L'unité RTA d'analyse calcule alors, à partir de l'histogramme précédemment construit, une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon i_iD considéré. Cette étape de comptage préliminaire est facultative : elle peut être réalisée ou non, en fonction de l'algorithme d'analyse choisi pour le calcul de ladite grandeur numérique. L'algorithme d'analyse peut notamment être implémenté : - sur puce (« on chip »), de manière intégrée : dans ce cas, l'unité RTA d'analyse, qui comprend la logique et l'intelligence de traitement, est intégrée sur le même circuit électronique que l'unité SPDet de détection et/ou l'unité de mesure M ; - de manière externe, sur des circuits intégrés spécifiques ; - à l'aide de composants numériques programmables, tel qu'un processeur ou un dispositif reconfigurable, par exemple un FPGA. L'algorithme d'analyse de l'unité RTA d'analyse est avantageusement choisi parmi la liste suivante : - un algorithme régressif de minimisation de l'erreur résiduelle ; - un calcul direct ; - un algorithme d'ajustement ; - un algorithme de reconnaissance utilisant un réseau de neurones ; - un algorithme basé sur une table de conversion. En résumé, l'unité RTA d'analyse pourra donc présenter l'un, l'autre ou les deux types de résultat suivants : - l'histogramme de mesure d'un échantillon i_iD non traité ou éventuellement filtré numériquement ; - l'évaluation d'une ou plusieurs grandeurs numériques caractéristiques de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon i_iD considéré, et éventuellement d'une grandeur caractéristique de l'intensité de fluorescence de l'échantillon i_iD considéré. On revient à présent sur la description de la source lumineuse LS d'excitation, de l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation, et de l'unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique, fonctionnant avec le dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps. La source lumineuse LS d'excitation est une source laser émettant des impulsions lumineuses LP ultra-courtes à un taux élevé de répétition. Dans la présente description, on entend par « impulsions ultra-courtes » des impulsions dont la durée appartient à l'intervalle compris entre quelques femtosecondes et plusieurs centaines de picosecondes, et on entend par « taux élevé de répétition » un taux de répétition supérieur à quelques centaines de kHz. La longueur d'onde d'émission de la source lumineuse LS est choisie ou accordée en fonction du type de fluorophore contenu dans chaque échantillon i_iD. La longueur d'onde d'émission de la source lumineuse LS est typiquement comprise entre 200 nm et 1500 nm. La source peut être utilisée pour exciter la fluorescence des échantillons par un processus d'absorption linéaire ou multiphotonique. La source lumineuse LS peut en particulier être choisie parmi la liste suivante : - un laser femtoseconde ou un laser picoseconde - par exemple un laser titane-saphire, un laser à colorant ou un laser à fibre - générant des impulsions lumineuses avec une largeur à mi-hauteur FWHM typiquement inférieure ou égale à 2 ps, à un taux de répétition typiquement ajustable, pouvant aller jusqu'à quelques centaines de MHz, et avec une puissance moyenne typiquement supérieure à quelques centaines de mW ; - une source optique non-linéaire telle qu'un oscillateur paramétrique optique (OPO) ou toute autre source utilisant par exemple la génération de seconde, troisième ou quatrième harmonique afin de fournir, par exemple à partir des sources lasers mentionnées au point précédent, une accordabilité en longueur d'onde allant de l'ultraviolet à l'infrarouge ; - une diode laser fonctionnant en mode impulsionnel déclenché, également appelé « Q-switch », générant des impulsions lumineuses avec une largeur à mi-hauteur FWHM typiquement comprises entre 10 ps et 200 ps, à un taux de répétition réglable allant de quelques Hz à plus de 100 MHz, et avec une puissance moyenne typiquement de l'ordre de 1 mW. Il est également envisageable de mettre en oeuvre une pluralité de diodes laser présentant des longueurs d'ondes d'émission variées afin de permettre une accordabilité en longueur d'onde. La puissance moyenne d'un tel système est typiquement de l'ordre de quelques mW ; - une source lumineuse étendue, également appelée source lumineuse à supercontinuum, peut être utilisée afin de contribuer à obtenir une source laser pulsée et accordable en longueur d'onde dans un large domaine de longueurs d'onde. Les impulsions lumineuses LP sont dirigées vers l'unité Foc de mise en forme spatiale, couplage optique et de focalisation. L'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation contribue à assurer une excitation efficace de chaque échantillon i_iD par une impulsion lumineuse LP, émise par la source lumineuse LS. Les impulsions lumineuses LP peuvent se propager librement dans l'espace ou être couplées dans une ou plusieurs fibres, comme dans le cas de diodes laser multiples, ou de multiples spots d'excitation. Les impulsions lumineuses LP d'excitation peuvent être mises en oeuvre dans de multiples lignes ou spots d'excitation. Il est ainsi possible d'employer avantageusement de l'optique diffractive, comme détaillé ultérieurement. Les impulsions lumineuses LP d'excitation peuvent être focalisées à l'aide d'éléments optiques conventionnels, comme des objectifs de microscope, ou bien des éléments d'optique à symétrie cylindrique pour la génération de lignes d'excitation, ou couplées par propagation guidée ou grâce à une optique intégrée. Chaque impulsion lumineuse LP est donc focalisée, en sortie de l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation, sur un échantillon i_iD pour l'excitation dudit échantillon i_iD. Lorsqu'il est excité par une impulsion lumineuse LP, l'échantillon i_iD se désexcite en émettant un ou plusieurs photons de fluorescence F par impulsion lumineuse LP excitatrice. Chaque échantillon i_iD est excité N fois, N étant typiquement compris entre plusieurs milliers et plusieurs centaines de milliers. Chaque échantillon i_iD se désexcitera alors N fois et émettra, au cours de ces N désexcitations, un ou plusieurs photons de fluorescence dont au maximum N seront détectés par l'unité de détection. L'unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique contribue à assurer une collection efficace des photons de fluorescence F émis lors des désexcitations successives de l'échantillon i_iD. Par « collection efficace », on entend qu'au mieux quelques pourcents des photons émis sont collectés et couplés vers l'unité SPDet de détection. Cette collection peut être réalisée à l'aide d'éléments optiques intégrés, ou par propagation guidée, ou à l'aide d'éléments d'optiques conventionnels, comme des objectifs de microscope. Dans ce dernier cas, l'objectif de microscope peut être identique à celui potentiellement utilisé dans l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation, dans la mesure où on utilise un miroir dichroïque afin de réfléchir la lumière d'excitation, c'est-à-dire les impulsions lumineuses LP, et de transmettre la lumière de fluorescence, c'est-à-dire les photons de fluorescence F. La lumière de fluorescence peut être ensuite filtrée grâce à des filtres passe-bandes ou à un polariseur. Un tel filtrage permet avantageusement de ne collecter que des photons de fluorescence F en rejetant d'autres photons issus du fond lumineux : photons d'excitation, photons de luminescence d'une unité de manipulation des échantillons i_iD, ou de tout composé autre qu'un fluorophore d'intérêt d'un échantillon i_iD. Le signal de fluorescence collecté et filtré se propage librement dans l'espace, ou bien dans une fibre. Il est ensuite couplé à un détecteur de photons uniques de l'unité SPDet de détection. La figure 2b montre un dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps selon un deuxième mode de réalisation de l'invention. Selon ce deuxième mode de réalisation de l'invention, l'unité SPDet de détection 30 de photons uniques comporte plusieurs détecteurs de photons uniques, par exemple disposés selon une matrice à une dimension. Le dispositif 101 selon le deuxième mode de réalisation de l'invention comporte donc plusieurs canaux de détection de photons uniques. Ce deuxième mode de réalisation permet avantageusement de réaliser une ou plusieurs des opérations suivantes : - augmenter le taux de comptage pour la mesure d'un signal de fluorescence. En augmentant le nombre de canaux de détection, on peut en effet compter plusieurs photons de fluorescence par impulsion d'excitation, si lesdits photons de fluorescence tombent sur des canaux de détection différents ; - optimiser, dans la mesure d'un signal de fluorescence, la sensibilité de détection par rapport au bruit d'obscurité DCR ; - recueillir simultanément plusieurs signaux de fluorescence issus de plusieurs échantillons. Ce cas sera détaillé ultérieurement ; - permettre, pour un signal de fluorescence issu d'un seul échantillon, une résolution dite « multiparamètre », c'est-à-dire une résolution à la fois temporelle et suivant au moins un autre paramètre. Dans ce dernier cas de résolution multiparamètre, le signal de fluorescence peut notamment être résolu : - spectralement, grâce à un spectromètre employant par exemple un réseau de diffraction ou un prisme, ou alternativement grâce à des filtres passe- bandes ou des miroirs dichroïques ; - en polarisation, grâce à un élément optique séparateur de polarisation ; - en direction de propagation. Le signal de fluorescence résolu selon plusieurs paramètres est alors divisé en une pluralité de faisceaux : - de longueurs d'onde différentes dans le cas d'une résolution spectrale ; - de polarisations différentes dans le cas d'une résolution en polarisation ; - de directions de propagation différentes dans le cas d'une résolution en direction de propagation. Chaque faisceau se propage librement dans l'espace, ou bien est couplé dans une fibre. Chaque faisceau est finalement couplé à un ou plusieurs détecteurs de photons uniques de l'unité SPDet de détection. Dans ce cas de résolution multiparamètre, l'unité d'analyse RTA pourra produire une analyse dite « multiparamètre » reposant sur une mesure d'au moins deux signaux de fluorescence, telle que : - une mesure résolue en temps d'anisotropie de fluorescence qui repose sur la résolution en polarisation ; - une mesure résolue en temps de décalages spectraux d'émission, qui repose sur la résolution spectrale ; - une mesure de corrélation d'au moins deux signaux de fluorescence détectés à des longueurs d'onde différentes. L'unité d'analyse RTA pourra fournir en temps réel une ou plusieurs constantes numériques caractérisant la cinétique d'évolution temporelle de tout signal résultant d'une analyse multiparamètre de la fluorescence. Selon le deuxième mode de réalisation où l'unité de détection de photons uniques comporte plusieurs détecteurs de photons uniques, l'unité M de mesure pourra comporter un seul moyen de mesure TDC, ou alternativement plusieurs moyens de mesure TDC et par exemple autant de moyens de mesure TDC que de détecteurs de photons uniques. L'unité d'analyse RTA pourra analyser en parallèle de multiples signaux de fluorescence. Les détecteurs de photons uniques, le ou les moyens de mesure TDC et l'unité d'analyse pourront être intégrés sur une ou plusieurs puces électroniques. La figure 3a montre un dispositif 200 de criblage à haut débit selon un mode de fonctionnement. Le dispositif 200 de criblage comporte : - le dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps illustré à la figure 2a ; - la source lumineuse LS d'excitation émettant les impulsions d'excitation LP ; - une unité microfluidique iiFC comportant un canal microfluidique Ch pour la circulation à haut débit d'une pluralité d'échantillons i_iD ; - l'unité Foc, décrite ci-dessus, de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation LP vers une zone spatialement définie, dite « zone d'excitation », du canal microfluidique Ch, pour l'excitation de chaque échantillon i_iD lors de son passage dans ladite zone d'excitation, de manière que ledit échantillon i_iD émette une pluralité de photons de fluorescence F ; l'unité Fil, décrite ci-dessus, de collection, de filtrage et de couplage optique des photons de fluorescence F vers le dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps. des moyens pour attribuer à chaque échantillon i_iD une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat, c'est-à-dire pour déterminer une appartenance de l'échantillon i_iD considéré à un groupe spécifique. Lesdits moyens d'attribution sont par exemple implémentés dans l'unité RTA d'analyse. Le résultat de l'ensemble de l'opération de criblage est de construire une base de données archivant le résultat d'analyse obtenu pour chaque échantillon. L'unité RTA d'analyse du dispositif 100 de mesure de fluorescence permet le calcul, pour chaque échantillon i_iD traité, d'une ou plusieurs grandeurs numériques caractéristiques de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence dudit échantillon i_iD. Pour être capable de réaliser une analyse échantillon par échantillon « à la volée », l'unité RTA d'analyse devra inclure une détection en temps réel du passage de chaque échantillon i_iD dans la zone d'excitation du canal microfluidique Ch. Le critère de détection des échantillons i_iD est fixé à l'avance ou peut évoluer en fonction des données accumulées. Ce critère peut par exemple porter sur le nombre de photons uniques détectés sur une fenêtre temporelle courte, par exemple 10 microsecondes, devant le temps de passage total de l'échantillon i_iD dans la zone d'excitation, qui est typiquement de l'ordre de 1ms ou plus. De plus, l'algorithme d'analyse de l'unité RTA d'analyse pourra : - calculer et renvoyer des données complémentaires sur la dimension des échantillons i_iD, sur l'espacement entre deux échantillons i_iD consécutifs ou sur la vitesse des échantillons i_iD, avec des informations statistiques, ceci par exemple afin de permettre un contrôle de la qualité des échantillons i_iD, ou de détecter une éventuelle fuite ou défaillance de l'unité microfluidique i_iFC ; - accumuler les signaux de fluorescence de plusieurs échantillons i_iD successifs identiques et générer l'évaluation d'une ou plusieurs grandeurs numériques caractéristiques de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'ensemble de ces échantillons i_iD identiques, de manière à réduire l'incertitude statistique sur ladite évaluation ; - accumuler le signal de fluorescence résolue en temps détecté entre les échantillons i_iD, et qui constitue le « fond » lumineux émis par l'ensemble du dispositif en présence d'impulsions lumineuses d'excitation LP, puis retrancher ce signal de fluorescence de fond au signal de fluorescence détecté dans les échantillons i_iD. Dans la présente description, on entend par « criblage » le fait de déterminer, pour chaque échantillon ou groupe d'échantillons identiques i_iD, une classe de résultat parmi une pluralité prédéterminée de classes de résultat, en fonction de la grandeur numérique calculée pour ledit échantillon ou groupe d'échantillons identiques i_iD par l'unité d'analyse RTA du dispositif 100 de mesure de fluorescence. Le criblage pourra notamment être binaire : dans ce cas, deux classes de résultat seront possibles : - une classe de résultat « haute », « positive », par exemple « 1 » ; - ou une classe de résultat « basse », « négative », par exemple « 0 ». Néanmoins, d'autres types de criblage sont tout à fait envisageables, par exemple avec trois classes de résultat ou plus. Le dispositif 200 de criblage à haut débit emploie avantageusement une unité microfluidique iiFC de manipulation d'échantillons i_iD. Une telle unité microfluidique i_iFC permet en effet la formation d'échantillons i_iD sous la forme de microgouttelettes de très faible volume, et la manipulation précise de ces échantillons à une cadence très élevée. On parvient notamment grâce à de telles 301 193 2 37 unités microfluidiques iiFC à former des échantillons dont le volume est inférieur au nanolitre, ce qui représente une diminution de plus de quatre ordres de grandeur par rapport aux échantillons de type micro-puits sur micro-plaques. De tels échantillons microfluidiques i_iD peuvent en outre être produits et manipulés à 5 une fréquence de l'ordre du KHz ou plus, soit trois ordres de grandeur plus vite que des échantillons de type micro-puits sur micro-plaques. Les échantillons i_iD pourront être des gouttelettes ou des cellules biologiques éventuellement contenues dans des gouttelettes à raison d'une ou plusieurs cellules biologiques par gouttelette. Dans la présente description, on emploie indifféremment les 10 termes « cellules biologiques » et « cellules vivantes ». La figure 3b montre un dispositif 201 de criblage à haut débit selon un deuxième mode de fonctionnement, dit « multicanal », dans lequel on effectue le criblage simultané en parallèle d'échantillons circulant dans une pluralité de canaux 15 microfluidiques. Le dispositif 201 comporte dans l'exemple représenté à la figure 3b : - le dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps illustré à la figure 2b ; - la source lumineuse LS ; 20 - un système microfluidique i_iFC comportant un premier canal microfluidique Ch1 pour la circulation à haut débit de premiers échantillons 1_01 et un deuxième canal microfluidique Ch2 pour la circulation à haut débit de deuxièmes échantillons 1_02 ; - l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de 25 focalisation des impulsions d'excitation LP vers : o une zone spatialement définie du premier canal microfluidique Ch1 pour l'excitation de chaque premier échantillon 1_01 lors de son passage dans ladite zone spatialement définie du premier canal microfluidique Ch1, de manière que ledit premier échantillon 1_01 30 émette une pluralité de premiers photons de fluorescence F1, o et vers une zone spatialement définie du deuxième canal microfluidique Ch2 pour l'excitation de chaque deuxième échantillon 1_02 lors de son passage dans ladite zone spatialement définie du deuxième canal microfluidique Ch2, de manière que ledit deuxième échantillon 1_02 émette une pluralité de deuxièmes photons de fluorescence F2 ; - l'unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique des premiers photons de fluorescence F1 et des deuxièmes photons de fluorescence F2 vers le dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps. Les deux zones spatialement définies des premier et deuxième canaux microfluidiques Ch1 et Ch2, également appelées « zones d'excitations » ou « spots d'excitation », sont par exemple obtenues, à partir de l'unité Foc de couplage optique et de focalisation, grâce à des moyens optiques décrits ci-dessus d'optique conventionnelle, réfractive, réflective, intégrée ou non. En particulier, la lumière excitatrice pourra être mise en forme spatialement selon une ligne continue de lumière excitatrice, ou une collection de points de focalisation, dont l'intersection avec les différents canaux microfluidiques constitue les zones d'excitation. Au sein de l'unité SPDet de détection de photons uniques du dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps, chaque émission de fluorescence est alors détectée par un ou plusieurs détecteurs de photons uniques, chaque détecteur de photons uniques étant équipé de son propre moyen de mesure TDC au sein de l'unité de mesure M, et de son propre moyen d'analyse au sein de l'unité RTA d'analyse. On a décrit à titre d'exemple le cas particulier où le dispositif 201 met en oeuvre deux canaux microfluidiques. Le dispositif 201 pourra plus généralement, et sur le même principe, comporter une pluralité de canaux microfluidiques pour la circulation, la détection et l'analyse en parallèle d'une pluralité d'échantillons. Le dispositif 201 permet donc avantageusement d'accroître le débit de manipulation et de criblage des échantillons. On a décrit précédemment le deuxième mode de fonctionnement du dispositif de criblage 201, présentant plusieurs points de focalisation en parallèle. Une autre configuration possible est celle d'un dispositif de criblage, non illustré, présentant plusieurs zones d'excitation en série le long d'un même canal microfluidique. Cette configuration implique plusieurs unités Fil en série, collectant, filtrant et couplant les divers signaux de fluorescence vers un dispositif de mesure de fluorescence 101 capable de détecter et analyser en parallèle ces différents signaux de fluorescence. Cette configuration autorise avantageusement un suivi de l'évolution de chaque échantillon i_iD au cours de son déplacement dans le système microfluidique pFC, et donc au cours du temps. On pourra ainsi étudier une cinétique de réaction biochimique au sein des échantillons, ou réaliser, selon une variante décrite ultérieurement, plusieurs étapes de tri successives sur les échantillons. On note également que les deux configurations précédemment décrites peuvent tout à fait être combinées dans une troisième configuration avec plusieurs points de focalisation/collection/détection/analyse en série et plusieurs points de focalisation/collection/détection/analyse en parallèle. Ce dernier type de fonctionnement pourrait nécessiter la conception de matrices bidimensionnelles de détecteurs de photons uniques/moyens de mesure TDC/unités d'analyse RTA afin de satisfaire des contraintes d'espace accrues. La figure 3c montre un dispositif 202 de criblage à haut débit selon un troisième mode de fonctionnement permettant le criblage d'un échantillon i_iD à partir d'une mesure de fluorescence résolue à la fois en temps, et selon un autre paramètre, comme par exemple la longueur d'onde (résolution spectrale), la polarisation ou la direction de propagation. Pour ce faire, le dispositif 202 comporte : - le dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps illustré à la figure 2b ; - la source lumineuse LS ; - le système microfluidique i_iFC comportant un canal microfluidique Ch pour la circulation à haut débit de la pluralité d'échantillons i_iD ; - l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation LP vers une zone spatialement définie du canal microfluidique Ch ; - une unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique de la pluralité de photons de fluorescence F vers le dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps, ladite unité permettant spécifiquement de résoudre spectralement, en polarisation ou en direction de propagation, la fluorescence collectée, selon la description ci-dessus. Selon une variante, les deuxième et troisième modes de fonctionnement, respectivement illustrées aux figures 3b et 3c, pourront être combinés afin de mettre en oeuvre un dispositif de criblage permettant un criblage en parallèle de plusieurs échantillons et, pour chaque échantillon criblé, l'obtention d'une résolution temporelle et d'une résolution selon un autre paramètre tel que la longueur d'onde, la polarisation ou la direction de propagation des photons de fluorescence dudit échantillon. On notera que pour des échantillons i_iD circulant dans l'unité microfluidique iiFC à une fréquence de 1 KHz, le temps de passage de chaque échantillon i_iD dans la zone d'excitation et de détection spatialement définie du canal microfluidique Ch, sera d'environ 1 ms. Pour une source lumineuse LS émettant des impulsions lumineuses LP avec une fréquence de répétition de 50 MHz, chaque échantillon i_iD sera excité 50000 fois au cours de son passage de 1 ms dans le spot de focalisation laser. Avec une telle fréquence de répétition, il y a 20 ns entre deux impulsions lumineuses LP consécutives. Le dispositif de mesure de fluorescence dispose donc, dans le cas particulier où la fréquence de répétition est de 50 MHz, de 20 ns au maximum pour que : - l'unité de détection SPDet détecte un photon de fluorescence F, - l'unité de mesure M mesure le temps d'arrivée du photon de fluorescence F et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ; - l'unité d'analyse RTA reçoive la donnée numérique et mette à jour, le cas échéant, l'histogramme du nombre de photons détectés en fonction du temps d'arrivée des photons détectés. Le dispositif de mesure de fluorescence dispose ensuite d'environ 1 ms pour que l'unité d'analyse RTA effectue le calcul d'au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon i_iD considéré. De même, le dispositif de criblage dispose d'environ 1 ms pour réaliser effectivement le criblage, c'est-à-dire : - effectuer le calcul d'au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon i_iD considéré, et - prendre une décision sur la nature de l'échantillon i_iD en lui attribuant une classe de résultat, parmi une pluralité de classes de résultat possibles. 10 La figure 4 montre un dispositif 300 de tri à haut débit d'échantillons. Le dispositif 300 de tri comporte : - le dispositif 100 de mesure de fluorescence illustré à la figure 2a. Alternativement, le dispositif 300 de tri peut également comporter le 15 dispositif 101 de mesure de fluorescence illustré à la figure 2b ; - la source lumineuse LS ; - un système microfluidique iiFC comportant un canal microfluidique Ch pour la circulation à haut débit de la pluralité d'échantillons i_iD, le canal microfluidique Ch se divisant en un premier sous-canal sCh1 et en un 20 deuxième sous-canal sCh2 ; - l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation LP vers une zone spatialement définie du canal microfluidique Ch ; - l'unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique de la pluralité de 25 photons de fluorescence F vers le dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps ; - des moyens Manip pour réaliser une manipulation à haut débit des échantillons i_iD en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon i_iD. 30 La manipulation à haut débit réalisée par les moyens Manip peut être : - un tri physique mettant en oeuvre un champ électrique ou des tirs lasers. Chaque échantillon i_iD est alors orienté soit dans le premier sous-canal sCh1, soit dans le deuxième sous-canal sCh2, en fonction de son résultat de criblage ; - toute autre manipulation de l'échantillon i_iD conditionnée au résultat de la mesure de fluorescence TRF fourni par les dispositifs 100 ou 101 de mesure de fluorescence TRF, respectivement illustrés aux figure 2a et 2b. Par exemple, un premier échantillon i_iD peut être fusionné avec un deuxième échantillon i_iD, afin de générer le mélange des deux échantillons et le démarrage d'une réaction biomoléculaire nouvelle, conditionnée au résultat de la mesure de fluorescence TRF. Selon une alternative (non illustrée à la figure 4), le premier sous-canal sCh1 peut comporter une subdivision et/ou le deuxième sous-canal sCh2 peut comporter une subdivision, afin de permettre un deuxième niveau de tri. La figure 5 montre l'organisation des étapes d'un procédé 500 selon l'invention de mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon i_iD. Le procédé 500 comporte : - une première étape 501 selon laquelle la source lumineuse LS émet une succession d'impulsions d'excitation LP pour l'excitation de l'échantillon i_iD de manière que l'échantillon i_iD émette une pluralité de photons de fluorescence F ; - une deuxième étape 502 selon laquelle l'unité de détection de photons uniques SPDet détecte au moins une partie desdits photons de fluorescence F et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence F détecté ; - une troisième étape 503 selon laquelle l'unité de mesure M détermine, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation LP et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ; - une quatrième étape 504 selon laquelle l'unité d'analyse RTA traite en temps réel les données numériques issues de l'unité de mesure M et calcule une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon i_iD, la quatrième étape 504 comportant avantageusement les sous-étapes suivantes : o une première sous-étape 504-1 selon laquelle l'unité d'analyse RTA compte le nombre de photons de fluorescence F détectés en fonction du temps d'arrivée desdits photons de fluorescence détectés et construit ainsi l'histogramme du nombre de photons de fluorescence F détectés en fonction de leur temps d'arrivée ; o une deuxième sous-étape 504-2 selon laquelle l'unité d'analyse RTA calcule, à partir de l'histogramme construit lors de la première sous- étape 504-1, la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon i_iD. La figure 5b montre l'organisation des étapes d'un procédé 510 selon l'invention de mesure de fluorescence résolue en temps multiparamètre par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon i_iD. Le procédé 510 comporte : - une première étape 511 selon laquelle la source lumineuse LS émet une succession d'impulsions d'excitation LP pour l'excitation de l'échantillon i_iD de manière que l'échantillon i_iD émette une pluralité de photons de fluorescence F formant une émission de fluorescence ; - une deuxième étape 512 selon laquelle l'émission de fluorescence est résolue en une pluralité de faisceaux selon un premier paramètre tel que la longueur d'onde, la polarisation ou la direction de propagation de chaque photon de fluorescence F ; - une troisième étape 513 selon laquelle, pour chacun de ces faisceaux, un détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques SPDet détecte au moins une partie des photons de fluorescence F et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence F détecté ; - une quatrième étape 514 selon laquelle un moyen de mesure TDC de l'unité de mesure M détermine, pour chaque faisceau, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation LP et chaque signal de détection issu d'un photon de florescence F dudit faisceau, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ; - une cinquième étape 515 selon laquelle l'unité d'analyse RTA traite en temps réel les données numériques issues de chaque moyen de mesure TDC de l'unité de mesure M et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon i_iD, et/ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle des signaux calculés, résultant de la combinaison de divers signaux de fluorescence provenant de la mesure multiparamètre. La figure 6 montre l'organisation des étapes d'un procédé 600 de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons i_iD avec une mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons. Le procédé 600 comporte : - une étape 400 de production et de manipulation d'une pluralité d'échantillons qui apporte successivement chaque d'échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation de la fluorescence ; - le procédé 500 de mesure de fluorescence de la figure 5a ou, alternativement, le procédé 510 de mesure de fluorescence multiparamètre de la figure 5b ; - une cinquième étape 505 de criblage à haut débit des échantillons i_iD selon laquelle, le passage de chaque échantillon dans la zone d'excitation de fluorescence est détecté et au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de chaque échantillon i_iD, on détermine et on archive pour chaque échantillon i_iD une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat. La figure 7 montre l'organisation des étapes d'un procédé 700 de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons i_iD. Le procédé 700 comporte : - le procédé 600 de criblage de la figure 6 ; - une sixième étape 506 de tri à haut débit des échantillons i_iD selon laquelle on réalise une manipulation conditionnelle des échantillons i_iD en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon i_iD à l'issue du procédé 600 de criblage. REVENDICATIONS1. Dispositif (100, 101) de mesure de fluorescence résolue en temps pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon (pD, 1_01, 1_02), le dispositif fonctionnant avec une source lumineuse (LS) apte à produire une succession d'impulsions d'excitation (LP, LP1, LP2) pour l'excitation de l'échantillon (pD, 1_01, 1_02) de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence (F, F1, F2) formant une émission de fluorescence, le dispositif (100, 101) étant caractérisé en ce qu'il comporte : - une unité de détection de photons uniques (SPDet) apte à détecter au moins une partie desdits photons de fluorescence (F, F1, F2), l'unité de détection de photons uniques générant un signal de détection pour chaque photon unique détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ; - une unité de mesure (M) permettant de mesurer, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation (LP, LP1, LP2) et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et générant une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ; - une unité d'analyse (RTA) en temps réel des données numériques issues de ladite unité de mesure (M), comportant des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon (pD,1_01,1_02). 2. Dispositif (100, 101) selon la revendication précédente caractérisé en ce que la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon (pD, µD1, 1_02) est choisie parmi la liste suivante : - au moins une constante de temps de décroissance de fluorescence de l'échantillon (pD, 1_01, 1_02) ; - au moins un moment de la distribution temporelle des temps d'arrivée des photons de fluorescence (F, F1, F2) de l'échantillon (pD,1_01,1_02). 3. Dispositif (100, 101) selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'unité de mesure (M) comporte : - un moyen de mesure (TDC), et - une unité de déclenchement (Trig) permettant d'assurer un fonctionnement synchrone entre la source lumineuse d'excitation (LS) et le moyen de mesure (TDC). 4. Dispositif (100, 101) selon la revendication précédente caractérisé en ce que le moyen de mesure (TDC) de l'unité de mesure (M) est choisi parmi la liste suivante : - un convertisseur temps-amplitude ; - un compteur numérique rapide ; - un convertisseur temps-numérique. 5. Dispositif (101) selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que : - l'unité de détection de photons uniques (SPDet) comprend plusieurs détecteurs de photons uniques, et - l'unité de mesure (M) comprend plusieurs moyens de mesure (TDC), chaque détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques (SPDet) fonctionnant avec un moyen de mesure (TDC) de l'unité de mesure (M). 6. Dispositif (101) selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'unité d'analyse (RTA) comporte des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de l'évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon (pD, i_iD1, 1_02), telle que : - l'anisotropie de fluorescence résolue en temps de l'échantillon (pD, i_iD1, 1_02) ; - la corrélation de plusieurs signaux de fluorescence de l'échantillon (pD, i_iD1, 1_02) détectés à différentes longueurs d'ondes ou l'évolution spectrale de la fluorescence de l'échantillon (pD, i_iD1, 1_02). 7. Dispositif (200, 201, 202) de criblage à haut débit utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps caractérisé en ce qu'il comporte : - un dispositif (100, 101) de mesure de fluorescence résolue en temps selon l'une quelconque des revendications précédentes, ledit dispositif (100, 101) comportant des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon d'une pluralité d'échantillons (pD, 1_01, 1_02) ; - une unité (pFC) de production et de manipulation de la pluralité d'échantillons (pD, 1_01, 1_02) capable d'apporter successivement chaque échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation de fluorescence ; - une unité (Foc) de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation (LP, LP1, LP2) émises par la source lumineuse (LS) sur au moins une zone d'excitation de fluorescence de l'unité (pFC) de production et de manipulation dans laquelle circule chaque échantillon (pD, 1_01, 1_02) ; - une unité (Fil) de collection et de filtrage des photons de fluorescence (F, F1, F2), et de couplage optique desdits photons de fluorescence (F, F1, F2) avec le dispositif (100, 101) de mesure de fluorescence ; - des moyens pour, à partir de la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon (pD, 1_01, 1_02), attribuer audit échantillon (pD, 1_01, 1_02) une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat. 8. Dispositif (200, 201, 202) de criblage selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'unité d'analyse en temps réel a les moyens de : - détecter le passage de chaque échantillon (pD, 1_01,1_02) ; - générer une distribution temporelle moyenne du signal de fluorescence d'une succession d'échantillons (pD, 1_01, 1_02), et les grandeurs numériques caractéristiques de cette distribution ; - générer une distribution temporelle du signal de fluorescence détecté entre les passages des échantillons (pD, 1_01, 1_02) et la moyenne glissante deladite distribution temporelle. 9. Dispositif (201) de criblage selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8 caractérisé en ce que : - l'unité (pFC) microfluidique comporte une pluralité de canaux microfluidiques (Ch1, Ch2) pour la manipulation en parallèle d'échantillons (pD1, 1_02) ; - l'unité de couplage optique et de focalisation (Foc) focalise les impulsions d'excitation (LP, LP1, LP2) sur au moins une zone spatialement définie de chaque canal microfluidique (Ch1, Ch2) ; - l'unité de collection, de filtrage et de couplage optique (Fil) permet de collecter, filtrer et coupler optiquement avec le dispositif (101) de mesure de fluorescence les photons de fluorescence (F1, F2) issus des échantillons (pD1, 1_02) circulant dans chaque canal microfluidique (Ch1, Ch2). 10. Dispositif (202) de criblage selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 caractérisé en ce que l'unité (Fil) de collection, de filtrage et de couplage optique permet de résoudre en polarisation et/ou spectralement le signal de fluorescence collecté, et comporte un ou plusieurs éléments choisis parmi la liste suivante : - un moyen de filtrage ou de résolution spectrale en longueur d'onde des photons de fluorescence (F, F1, F2) ; - un moyen de filtrage ou de résolution en polarisation des photons de fluorescence (F, F1, F2). 11. Dispositif (300) de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons (pD, 1_01, 1_02) utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps caractérisé en ce qu'il comporte : - un dispositif de criblage (200, 201, 202) utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, le dispositif de criblage (200, 201, 202) comportant des moyens pour attribuer en temps réel à chaque échantillon de la pluralitéd'échantillons (pD, 1_01, 1_02) une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat ; - des moyens (Manip) pour réaliser une manipulation conditionnelle à haut débit desdits échantillons (pD, 1_01, 1_02) consécutive au résultat du criblage, en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon (pD, 1_01,1_02). 12. Procédé (500) de mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon (pD, 1_01,1_02), le procédé comportant : - une première étape (501), selon laquelle une source lumineuse (LS) émet une succession d'impulsions d'excitation (LP, LP1, LP2) pour l'excitation de l'échantillon (pD, 1_01, 1_02) de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence (F, F1, F2) formant une émission de fluorescence ; - une deuxième étape (502), selon laquelle une unité de détection de photons uniques (SPDet) détecte au moins une partie desdits photons de fluorescence (F, F1, F2) et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence (F, F1, F2) détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ; - une troisième étape (503), selon laquelle une unité de mesure (M) détermine, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation (LP, LP1, LP2) et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ; - une quatrième étape (504), selon laquelle une unité d'analyse (RTA) traite en temps réel les données numériques issues de ladite unité de mesure (M) et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon (pD, 1_01, 1_02) ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon (pD, 1_01, 1_02). 13. Procédé (510) de mesure de fluorescence résolue en temps multiparamètre par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon (pD), le procédé (510) comportant : - une première étape (511) selon laquelle la source lumineuse (LS) émet une succession d'impulsions d'excitation (LP) pour l'excitation de l'échantillon (pD) de manière que l'échantillon (pD) émette une pluralité de photons de fluorescence (F) formant une émission de fluorescence ; - une deuxième étape (512) selon laquelle l'émission de fluorescence est résolue en une pluralité de faisceaux selon un premier paramètre tel que la longueur d'onde, la polarisation ou la direction de propagation de chaque photon de fluorescence (F) ; - une troisième étape (513) selon laquelle, pour chacun de ces faisceaux, un détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques (SPDet) détecte au moins une partie des photons de fluorescence (F) et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence (F) détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ; - une quatrième étape (514) selon laquelle un moyen de mesure (TDC) de l'unité de mesure (M) détermine, pour chaque faisceau, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation (LP) et chaque signal de détection issu d'un photon de florescence (F) dudit faisceau, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ; - une cinquième étape (515) selon laquelle l'unité d'analyse (RTA) traite en temps réel les données numériques issues de chaque moyen de mesure (TDC) de l'unité de mesure (M) et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon (pD), et/ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle des signaux calculés, résultant de la combinaison de divers signaux de fluorescence provenant de la mesure multiparamètre. 14. Procédé (600) de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons (pD, i_iD1, 1_02) avec une mesure de fluorescence résolue en temps parcomptage de photons, le procédé (600) comportant : - une étape (400) de production et de manipulation d'une pluralité d'échantillons afin d'apporter successivement chaque échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation ; - un procédé (500, 510) de mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons sur chaque échantillon selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13 ; - une étape (505) de criblage à haut débit de la pluralité d'échantillons (pD, 1_01,1_02) selon laquelle le passage de chaque échantillon (pD, 1_01, 1_02) dans la zone d'excitation de fluorescence est détecté et, à partir de la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon (pD, 1_01, 1_02), on détermine et on archive pour chaque échantillon (pD, 1_01, 1_02) une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat. 15. Procédé (700) de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons (pD, 1_01, 1_02) comportant : - le procédé (600) selon la revendication précédente de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons (pD, 1_01, 1_02) avec une mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons ; - une étape (506) de tri à haut débit de la pluralité d'échantillons (pD, µD1, 1_02) selon laquelle on réalise une manipulation conditionnelle de chaque échantillon (pD, 1_01,1_02) en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon (pD, 1_01,1_02) à l'issue du procédé (600) de criblage.