Brevet FR3016888A1 — publié le 20150731

La présente invention concerne des gènes et enzymes bactériennes impliqués dans la synthèse de polymyxine E, une molécule antibiotique utilisée en thérapie contre les infections à bactéries Gram-négatives. ART ANTERIEUR Les polymyxines sont des molécules antibiotiques isolées à partir de Bacillus species ou de Paenibacillus species. Ces molécules sont des lipopeptides, constitués : - d'une chaine peptidique comprenant dix acides aminés, organisés en un heptapeptide cyclique et une chaine latérale de trois acides aminés, et - d'un acide gras fixé à l'extrémité N-terminale du peptide. Au moins 16 types de polymyxines ont été identifiés depuis la découverte de la polymyxine B en 1947. Parmi elles, les polymyxines B et E ont une activité antimicrobienne sur la plupart des souches d'Escherichia coli et de Pseudomonas aeruginosa, ainsi que sur toutes les souches de Salmonelles, Shigelles, et de nombreuses bactéries Gram-négatives. Ces antibiotiques ont donc été utilisés comme agents thérapeutiques dans de nombreux cas. Malheureusement, leurs effets toxiques sont tels qu'ils ont été peu à peu remplacés par des antibiotiques mieux tolérés. La figure 3 montre la structure générale des polymyxines, et les deux acides aminés spécifiques sont indiqués X et Y. Comme indiqué, la polymyxine B et E diffèrent par un seul acide aminé, le résidu 'X' étant une phenylalanine pour la polymyxine B et une leucine pour la polymyxine E, le résidu 'Y' pouvant être une leucine, isoleucine ou valine. En raison de la demande croissante de nouveaux antibiotiques pour lesquels il n'existe pas encore de résistance dans la population, de nouveaux agents antibiotiques sont recherchés, et les polymyxines sont de nouveau utilisées en clinique dans la lutte contre les bactéries Gram-négatives multi-résistantes. La colistine, identifiée sous le numéro CAS 1264-72-8, et telle que décrite dans la demande de brevet WO 1998/020836, est un antibiotique de la famille des polymyxines, permettant de traiter les infections dues aux bactéries Gram-négatives multirésistantes. Sa structure peptidique est indiquée en figure 1. Administrée par voie injectable, la colistine est utilisée dans la prise en charge des infections neuro-méningées, des infections urinaires, des infections urogénitales, des septicémies et des surinfections de plaies, brûlures et ulcères. Administrée par inhalation, la colistine est utilisée dans la prise en charge d'infections pulmonaires, notamment celles liées à la mucoviscidose. Enfin, en association avec de l'hydrocortisone et de la bacitracine, la colistine est utilisée pour traiter les infections bactériennes et inflammatoires de l'oeil, ainsi que les infections en chirurgie ophtalmique. La colistine est responsable de nombreux effets indésirables, notamment des effets néphrotoxiques et neurotoxiques. Ces effets toxiques sont imputables au caractère cationique de cette molécule, qui contient cinq charges positives, mais également au faible degré de pureté de la molécule, produite en fermenteur par culture de la souche originelle bactérienne la synthétisant, et purifiée à partir du milieu de fermentation. En effet, les polymyxines sont actuellement obtenues par isolement et purification à partir de milieux de culture de souches bactériennes produisant ces molécules, notamment des souches de Paenibacillus polymyxa. La purification de la molécule à partir des milieux de fermentation est insatisfaisante, et c'est pourquoi de nouvelles techniques de production sont envisagées. Notamment, des travaux sont menés pour identifier et cloner les gènes codant pour les polymyxines synthétases. Les polymyxines synthétases font partie de la famille des « Non-Ribosomal Peptide Synthétases» (NRPS) ; les gènes codant pour ces synthétases sont organisés en cluster comprenant plusieurs modules, dont l'ordre et la spécificité déterminent la structure du produit peptidique. Les NRPS permettent la synthèse de peptides présentant une variété structurale plus large que celle qui pourrait être obtenue si ces peptides étaient traduits à partir d'ARN messager par des ribosomes. De plus, les peptides ainsi produits peuvent subir des modifications notamment par la création de liaisons avec des acides hydroxylés, et des oxydations dans la chaine peptidique permettant d'obtenir des structures cycliques ainsi que des acylations, glycosylations, N-méthylation. De tels complexes NRPS ont été décrits chez de nombreux micro-organismes et sont impliqués dans la production de la tyrocidine, la gramicidine, la vancomycine, la pénicilline, et les fusaricidines. Les synthétases NRPS sont constituées de différents modules. Chaque module est capable d'activer un acide aminé, éventuellement le modifier et de le transférer ensuite sur l'acide aminé activé dans le module adjacent pour constituer un peptide. Chaque module est composé de plusieurs domaines et permet l'incorporation d'un acide aminé dans le peptide en cours d'élongation. Chaque module contient au minimum 3 domaines : - Adénylation (A) : domaine central dans l'action des peptides synthétases. Il permet la fixation d'un acide aminé spécifique et son activation grâce à une réaction d'adénylation de ce dernier (transformation de l'acide aminé en aminoacyl adénylé) ; - Thiolation (T ou PCP pour Peptidyl Carrier Protein) : permet au peptide en cours de synthèse de rester fixé à la synthétase tout au long du processus d'élongation via une liaison thioester ; - Condensation (C) : permet la formation de la liaison peptidique entre deux acides aminés de modules adjacents. La libération du peptide est induite par un domaine spécifique, le domaine Te (thioestérase). Ce domaine va couper la liaison thioester qui relie le peptide synthétisé au dernier domaine T. Ce domaine permet également la cyclisation de certains peptides. Il existe aussi des domaines secondaires facultatifs qui permettent d'effectuer des modifications au niveau des acides aminés comme l'épimérisation (transformation d'un acide aminé de la série L en isomère de la série D), la méthylation (ajout d'un groupement méthyle) ou encore la formylation (ajout d'un groupement formyle). Dans le cas des polymyxines, et comme indiqué en figure 2, trois synthétases sont essentielles à la synthèse : - le module PmxA possède quatre domaines d'adenylation, organisés de façon tridimensionnelle en « binding pocket » ou « poches de liaison spécifique » qui intègrent chacune un acide aminé spécifique dans la molécule de polymyxine ; - le module PmxB possède un domaine d'adenylation, et est responsable de l'intégration d'un seul acide aminé ; - le module PmxE possède cinq domaines d'adenylation qui intègrent les cinq autres acides aminés composants la chaine peptidique de la polymyxine. L'article de Choi et al. (Jounal of Bacteriology, 2009) ainsi que le brevet US 8,329,430 décrivent l'isolement d'un « cluster » (groupe) de gènes de la souche gram-positive Paenibacillus polymyxa E681 sécrétant de la polymyxine A. Cinq gènes constituent ce cluster : pmxA, pmxB, pmxC, pmxD et pmxE. Les gènes pmxC et pmxD codent pour des protéines de transport, alors que les trois autres gènes pmxA, pmxB et pmxE codent pour des synthétases. Ceci est en particulier démontré par une souche mutante ayant subi une mutation par insertion dans le gène pmxE : cette souche ne produit plus de polymyxine. Inversement, une souche de Bacillus subtilis transformée par l'introduction de ce cluster de gènes devient capable de produire de la polymyxine A en présence d'acide L-2,4-diaminobutyrique (précurseur de synthèse de la polymyxine). Shaheen et al. (Chemistry and Biology, 2011) ont également décrit l'identification et le séquençage d'un cluster de gènes issu de la souche Paenibacillus polymyxa PKB1. L'implication de ces gènes dans la biosynthèse de la polymyxine B est démontrée par mutation insertionnelle dans le gène pmxE : la souche pmxE- ne produit plus de polymyxine. De manière intéressante, ces gènes sont impliqués dans la biosynthèse de variants de la polymyxine B, comprenant en position 3 non pas un résidu D-2,4-diaminobutyrate mais son énantiomère le L-2,4-diaminobutyrate. D'autres clusters de gènes issus de souches de Paenibacillus polymyxa ont été isolés, mais leurs fonctions et spécificités sont uniquement prédictives et en aucun cas démontrées de manière fonctionnelle. Par ailleurs, des molécules « variantes » présentant de légères différences structurelles avec les polymyxines connues, et des effets toxiques amoindris, ont été rapportées. Ainsi, la demande de brevet WO 2009/098357 ainsi que l'article de Vaara and Vaara (Peptides, 2010) décrivent des variants de polymyxine B ne comprenant que trois charges positives et présentant des effets toxiques diminués. Des variants de polymyxine B ont également été décrits dans l'article de Shaheen et al. (2011). La technique actuellement utilisée pour produire la colistine, basée sur la fermentation de souches bactériennes productrices en milieux riches n'est pas satisfaisante, notamment en termes de pureté de la molécule, qui doit être purifiée à partir du milieu de fermentation. L'identification des gènes impliqués dans la synthèse de la colistine permettrait, par des procédés de génie génétique, de produire une molécule de polymyxine E plus pure, et également de créer des molécules synthétiques dérivées, présentant moins d'effets secondaires néfastes et/ou une meilleure activité. RESUME DE L'INVENTION La présente invention décrit l'isolement d'un cluster de gènes issu d'une souche de Paenibacillus alvei isolée de l'environnement, produisant de la polymyxine E, et leurs utilisations. La présente invention est relative à une synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre domaines d'adénylation, caractérisée en ce que le second domaine d'adénylation présente une séquence peptidique particulière représentée en SEQ ID NO 1, cette séquence formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine ou isoleucine. La présente demande est également relative à un groupe de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant un gène codant pour la synthétase PmxA, des gènes codant pour les synthétases PmxB et PmxE, et des gènes codant pour les protéines de transport PmxC et PmxD. La présente invention concerne également des micro-organismes transformés exprimant au moins les gènes pmxA, pmxB et pmxE, modifiés ou non, lesdits microorganismes transformés produisant de la polymyxine E ou des molécules variantes de cette polymyxine. FIGURES Figure 1. Structure peptidique de la polymyxine E Figure 2. Structure du cluster NRPS impliqué dans la synthèse de polymyxine E. Figure 3. Structures chimiques des différentes polymyxine B et E d'après Govaerts et collaborateurs (Govaerts et al., 2002a; Govaerts et al., 2002b). Figure 4. Effet antimicrobien de 20 pl du surnageant de culture de la bactérie B-LR et du mutant 5 sur un tapis bactérien de P. aeruginosa. Figure 5. Séquence peptidique PmxA ; en gras : séquences des domaines d'adénylation ; en gras et souligné : motifs spécifiques des « binding pockets ». DESCRIPTION DETAILLEE Polypeptides et polynucléotides L'invention est relative à l'isolement et l'identification de nouveaux gènes codant pour des polymyxines E synthétases, en particulier d'un gène codant pour la synthétase « PmxA » présentant un site d'adénylation particulier, formant une poche de liaison spécifique permettant l'intégration dans la molécule de polymyxine d'un résidu leucine ou isoleucine. Tous les termes techniques employés dans la présente demande sont bien connus de l'homme du métier et sont définis dans l'ouvrage de référence Sambrook et al. « Molecular Cloning: a Laboratory Manual ». Le terme « polynucleotide » désigne une chaine de nucléotides liés par covalence. Au sens de l'invention, ce terme désigne des acides nucléiques tels que l'acide ribonucléique (ARN) et l'acide désoxyribonucléique (ADN). Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observée pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus. De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » ; (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH = « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ; (15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ». Le terme « polypeptide » désigne une chaine d'acides aminés liés de façon covalente. Le terme « polymyxine E synthétases » désigne les enzymes capables d'intégrer un acide aminé spécifique dans la chaine d'acides aminés formant la polymyxine E, et le cas échéant de transformer l'acide aminé pour former une structure cyclique. Le terme « site d'adénylation » ou « domaine d'adénylation » désigne, dans la molécule de polymyxine synthétase, le domaine qui joue un rôle dans le choix et l'activation de l'acide aminé, tandis que le « domaine de condensation » catalyse la formation d'une liaison peptidique et que le « domaine de thiolation » est responsable du transport des composés en formation entre les modules. Le terme « poche de liaison » désigne une zone de la protéine présentant une structure tridimensionnelle de « poche », dans laquelle des interactions de haute spécificité avec un substrat ou, dans le cas présent, un acide aminé, permettront de sélectionner et d'activer cet acide aminé. L'expression « les acides aminés soulignés étant conservés » signifie que, même si de légères variations de séquences peuvent être observées entre deux protéines présentant la même activité catalytique, les acides aminés indiqués sont essentiels à la spécificité et à l'activité de cette protéine et ne peuvent donc pas être modifiés, sous peine de perdre ou diminuer la spécificité et/ou l'activité de cette protéine. La présente invention concerne une synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre sites d'adénylation, caractérisée en ce que le second site d'adénylation présente au moins 90 % d'identité avec la séquence peptidique suivante : VTEAEKADLLGRENDTTTEFPRGKTLIQLFEEQVERIPDAAAITLNEQE LTYRELNERVNRLARTLRSHGISKGRLVAILAERSIEMVVGMLAAHKAGAAYVPI DPEYPEERIRFLIEDSGGQVMLTQSRLRERLAGSDPVILLDDESFYHEDGTNLNTGI EATDLACVIYTSGTTGKPKGNPVSHRNIVRVVQNTNYIDITERDHVLQLSSYSFDG ATEDIFGALTNGARLVLVPYETLLEIGRLADLIQRERISVMFITTAFFNILVDVNVD CLRDVRAILEGGERVSVGHVRKALAHIGPGRLNHVYGPTESTVYTTYLPVDEVDE LAVTVPIGRPISNTTVYIVDSRNKLLPIGVAGELCVGGEGLVRGYNNRPELTAEKE VDNPFVPGERMYRTGDLAKWLPDGTIEYVGRTDDQVKIRGFRIELGEIEAQLQKV EGIRKTTVFARENASGEKQLCAYYEADCELPAAELKSVLSKELPAYMIPAYLIQLE RLPLTTNGKVDRRSLPAPEESLQPGGG (SEQ ID NO 1), les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine ou isoleucine. Selon un aspect particulier de l'invention, le second site d'adénylation de PmxA présente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 1, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine ou isoleucine. Selon un aspect particulier de l'invention, la synthétase PmxA comprend quatre poches de liaison spécifiques comprenant les acides aminés suivants : - DAWIVGAIVK (SEQ ID NO 2), spécifique pour un résidu leucine ; - DGFFLGVVYK (SEQ ID NO 3), spécifique pour un résidu leucine ou isoleucine ; - DVGEISAIDK (SEQ ID NO 4), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique ; - DVGEISAIDK (SEQ ID NO 5), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique. En particulier, la synthétase PmxA présentera la séquence polypeptidique présentée en SEQ ID NO 6, et montrée en figure 5, les domaines d'adénylation étant indiqués en gras, les acides aminés formant la poche de liaison étant soulignés. La synthétase PmxA présente quatre sites d'adénylation aux positions suivantes : - du résidu 234L au résidu 751Y ; - du résidu 1741V au résidu 2263G ; - du résidu 2815P au résidu 3345T ; - du résidu 3900E au résidu 4428G. La présente invention est également relative à un acide nucléique comprenant un cadre de lecture ouvert, codant pour une synthétase impliquée dans la synthèse de polymyxine E, présentant au moins 90% d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 7, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés. Selon un aspect particulier de l'invention, l'acide nucléique présente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 7, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés. La présente invention concerne également un groupe de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant notamment : - un gène codant pour la synthétase PmxA tel que défini ci-dessus, et - des gènes codant respectivement pour les synthétases PmxB et PmxE. Selon un aspect préféré de l'invention, ce groupe de gènes comprend également des gènes codant respectivement pour les protéines de transport PmxC et PmxD. Les séquences des protéines PmxC et PmxD isolées de la souche de Paenibacillus alvei sont montrées en séquences SEQ ID NO 12 et NO 13, respectivement. Selon un aspect particulier de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E comprend : - un gène pmxA présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 7, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés, - un gène pmxB présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 8, et - un gène pmxE présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 9. Selon un autre aspect de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E comprend : - un gène pmxA présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 7, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés, - un gène pmxB présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 8, et - un gène pmxE présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 9. Selon un autre aspect de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E comprend : - un gène pmxA présentant 100 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 7, - un gène pmxB présentant 100 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 8, et - un gène pmxE présentant 100 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 9. La présente invention est également relative à un acide nucléique de séquence SEQ ID NO 10, représentant la séquence complète du cluster issu de la souche de Paenibacillus alvei, comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, pmxD et pmxE impliqués dans la synthèse de polymyxine E. Le tableau 1 ci-dessous présente les différentes séquences d'acides nucléiques et protéiques référencées dans la présente demande : Numéro de Type Taille Définition séquence SEQ ID NO 1 Protéine 523 acides aminés Séquence peptidique du second site d'adénylation de la synthétase PmxA issue d'une souche de Paenibacillus alvei SEQ ID NO 2 Protéine 10 acides aminés Binding pocket du l' domaine d'adenylation de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine SEQ ID NO 3 Protéine 10 acides aminés Binding pocket du 2nd domaine d' adenylation de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine ou isoleucine SEQ ID NO 4 Protéine 10 acides aminés Binding pocket du 3ème domaine d'adenylation de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique SEQ ID NO 5 Protéine 10 acides aminés Binding pocket du 4ème domaine d' adenylation de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique SEQ ID NO 6 Protéine 4967 acides aminés Séquence peptidique complète de la synthétase PmxA issue d'une souche de Paenibacillus alvei ; voir également figure 5 SEQ ID NO 7 ADN 14901 paires de bases Séquence codante pour la synthétase PmxA présentant la séquence SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 8 ADN 3306 paires de bases Séquence codante pour la synthétase PmxB issue de Paenibacillus alvei SEQ ID NO 9 ADN 18876 paires de bases Séquence codante pour la synthétase PmxE issue de Paenibacillus alvei SEQ ID NO 10 ADN 41169 paires de bases Séquence codant pour le cluster complet comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, pmxD, et pmxE issu de Paenibacillus alvei SEQ ID NO 11 Protéine 1102 acides aminés Séquence peptidique de la synthétase PmxB issue d'une souche de Paenibacillus alvei SEQ ID NO 12 Protéine 608 acides aminés Séquence peptidique de la protéine PmxC issue d'une souche de Paenibacillus alvei SEQ ID NO 13 Protéine 577 acides aminés Séquence peptidique de la protéine PmxD issue d'une souche de Paenibacillus alvei SEQ ID NO 14 Protéine 6292 acides aminés Séquence peptidique de la synthétase PmxE issue d'une souche de Paenibacillus alvei SEQ ID NO 15-24 ADN 20 paires bases Sequences artificielles - oligonucléotides (voir tableau 2) Vecteurs d'expression La présente invention est également relative à un vecteur d'expression comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA tel que défini ci-dessus. Dans le cadre de l'invention, les termes « vecteur », « vecteur d'expression » et « plasmide » sont équivalents et sont utilisés conformément à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie moléculaire, du génie génétique et de la microbiologie. Très brièvement, il s'agit d'une molécule d'ADN, non virale, hébergée par une cellule hôte, distincte de l'ADN chromosomique naturel de ladite cellule hôte et capable de réplication autonome. Un « vecteur » est obtenu par des techniques classiques de biologie moléculaire et génie génétique, et dans lequel une ou plusieurs séquences nucléotidiques exogènes ont été insérées (ou clonées). La présente invention concerne un vecteur pour l'expression, par une cellule hôte, de séquences nucléotidiques exogènes, comprenant : - une origine de réplication, - des éléments permettant l'expression des gènes introduits, tels qu'un promoteur approprié, des enhancers... - au moins une séquence nucléotidique dont l'expression est souhaitée. Le choix du vecteur et, plus particulièrement, de l'origine de réplication qu'il porte dépend de la cellule hôte qui l'hébergera. En fonction du type de cellules hôtes, plusieurs copies d'un vecteur et/ou plusieurs vecteurs différents peuvent être introduits dans la même cellule hôte, simultanément ou séquentiellement. Le choix du vecteur dépendra également de la taille de la séquence d'acide nucléique à exprimer. En particulier, pour des séquences supérieures à 20 kilo-paires de bases, les fosmides, vecteurs capables de contenir de grandes séquences d'acides nucléiques (jusqu'à 40 kilo-paires de bases), seront préférés. Il est également possible d'utiliser plusieurs vecteurs comprenant chacun une portion d'un ensemble de gènes, et de transférer plusieurs vecteurs dans une même cellule hôte, ceci permettant d'exprimer tout un ensemble de gènes dans une même souche. D'autres vecteurs pouvant contenir des séquences de grandes tailles sont les cosmides et les chromosomes bactériens artificiels (BAC). Selon un aspect préféré de l'invention, le vecteur d'expression comprend totalement ou en partie un groupe de gènes tel que défini ci-dessus. Selon un autre aspect préféré de l'invention, le vecteur d'expression comprend totalement ou en partie un acide nucléique tel que défini ci-dessus. De manière préféré, le vecteur d'expression est un fosmide comprenant la totalité de la séquence d'ADN codant pour le cluster complet comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, pmxD, et pmxE issu de Paenibacillus alvei, présentant la séquence SEQ ID NO 10. Cellules hôtes Le terme « cellule hôte » ou « micro-organisme hôte » est utilisé dans le cadre de la présente invention pour désigner une cellule ayant été transformée, c'est-à-dire dans laquelle de l'ADN exogène a été introduit, cet ADN exogène étant notamment sous la forme d'un vecteur d'expression comprenant une séquence d'intérêt, qui sera exprimée grâce à la machinerie cellulaire de la cellule hôte, capable de synthétiser à partir de l'ADN exogène les ARNs messagers et les protéines correspondants à cet ADN. La présente demande concerne en particulier un micro-organisme transformé par introduction d'un gène ou groupe de gènes tel que défini ci-dessus, ou d'un ou de plusieurs vecteurs d'expression tel que présentés ci-dessus. L'invention est notamment relative à un micro-organisme transformé par introduction : - d'un gène codant pour une synthétase PmxA telle que définie ci-dessus, ou - d'un vecteur d'expression comprenant une séquence ADN codant pour une synthétase PmxA telle que définie ci-dessus, notamment la séquence telle que présentée en SEQ ID NO 7. L'invention porte également sur un micro-organisme transformé par introduction d'un groupe de gènes tel que défini ci-dessus, ou d'un acide nucléique codant pour tout ou partie des gènes pmxA, pmxB et pmxE, tels que définis ci-dessus, ou d'au moins un vecteur d'expression comprenant un gène codant pour tout ou partie des gènes pmxA, pmxB et pmxE, tels que définis ci-dessus. La transformation de micro-organismes est une technique couramment utilisée dans les laboratoires de biologie moléculaire, permettant d'introduire de l'ADN exogène dans le micro-organisme. Diverses techniques permettent la transformation d'un microorganisme, et notamment d'une bactérie compétente, et sont toutes bien connues de l'homme du métier. On peut en particulier citer l'électroporation, et l'utilisation de chlorure de calcium suivi d'un choc thermique. Dans un aspect préféré de l'invention, dans le micro-organisme transformé, le gène ou le groupe de gènes introduit est surexprimé. La surexpression d'un gène peut se définir par une expression augmentée de ce gène, c'est-à-dire une plus grande production d'ARN messager et de protéine codée par ce gène, dans la cellule. L'expression de la protéine sera notamment augmentée de 50 %, de 100 %, de 150 %, de 200 %, voire de 300 % par rapport au taux d'expression endogène observé dans une bactérie exprimant ce gène de façon naturelle, avant toute transformation. La surexpression d'un gène peut être obtenue de plusieurs façons, toutes bien connues de l'homme du métier. On citera en particulier : l'utilisation de promoteurs forts pour contrôler le niveau d'expression des gènes et l'augmentation du nombre de copies du gène dans la cellule. De préférence, le vecteur utilisé comprendra un promoteur fort sous le contrôle duquel sera inséré le gène, et ledit vecteur sera présent en un nombre important de copies, notamment 10, 20, 50 ou 100 copies dans la cellule hôte. L'homme du métier saura choisir le micro-organisme hôte le plus adapté pour l'expression d'un vecteur comportant le ou les gènes selon l'invention. En particulier, les bactéries Gram-positives seront préférées. Un micro-organisme particulièrement adapté est une bactérie appartenant au genre des Bacillus. Les espèces B. subtilis et Paenibacillus polymyxa sont particulièrement adaptées pour l'expression des polymyxines synthétases et à la production de polymyxine E. Les souches du genre Paenibacillus, et notamment de Paenibacillus alvei, et plus particulièrement la souche Paenibacillus alvei isolée dans l'environnement par les inventeurs, peuvent également être utilisées comme microorganisme hôte pour être transformées avec le vecteur ou l'acide nucléique tels que définis ci-dessus. Enfin, des bactéries synthétiques peuvent également être utilisées dans le cadre de la présente invention, comme cellules hôtes. Méthode de production de polymyxine E La présente demande est également relative à une méthode de production de polymyxine E, comprenant : - la mise en culture d'un micro-organisme transformé tel que défini ci-dessus, dans un milieu minéral approprié, et - la purification à partir du milieu de culture de la polymyxine E produite. Le terme « milieu minéral approprié » désigne un milieu de culture permettant la croissance des micro-organismes, et comprenant notamment des sels minéraux et des nutriments. Un milieu préféré présente la composition spécifique suivante : KH2PO4 anhydre 0,45 % (p/v), K2HPO4, 3H20 1,13 % (p/v), (NH4)2SO4 0,6 % (p/v), glucose 0,6 % (p/v), thiamine 0,001 %o (p/v), MgSO4, 7H20 0,02 % (p/v). Ce milieu peut comprendre également, le cas échéant, un précurseur nécessaire à la synthèse de polymyxine, en particulier l'acide diaminobutyrique. Selon un aspect préféré de l'invention, la culture est effectuée à une température de 30°C, et dure au moins 25 heures. De préférence, la culture a lieu dans 200 ml de milieu minéral dans des flasques de 1 L, sous agitation, pendant 30 h à 30°C. La présente invention concerne également une méthode de production de variants de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme tel que défini ci-dessus, dans un milieu minéral approprié, et la purification à partir du milieu de culture du ou des variants de la polymyxine E. La présente invention est également relative à des variants de la polymyxine E obtenus selon la méthode de production telle que décrite ci-dessus. Les « variants de polymyxine E » désignent des molécules dérivées de la structure de la polymyxine E (voir figure 1) et qui peuvent par exemple présenter un ou plusieurs acides aminés différents, sans pour autant être classifiés comme appartenant à un autre type de polymyxine. Les formes variantes peuvent être naturelles ou synthétiques. Par « variants naturels» on entend des variants synthétisés par des micro-organismes non transformés ; par « variants synthétiques » on entend des formes variantes synthétisées par des microorganismes transformés, qui n'ont pas été identifiées à l'état naturel. En particulier, les polymyxines synthétases codées par les gènes pmxA, pmxB et pmxE pourront être modifiées pour devenir spécifiques de la fixation de certaines acides aminés entrant dans la composition de la polymyxine E, afin de synthétiser des variants de polymyxine E présentant moins de charges cationiques et étant donc moins toxiques pour l'organisme humain. Ces variants de polymyxine E présentent des avantages et notamment une plus faible toxicité que la polymyxine E. La présente invention est relative à ces variants, ainsi qu'à leur utilisation dans le traitement des infections bactériennes à bactéries gram négatives. Les exemples ci-dessous illustrent l'invention revendiquée mais ne sont pas limitatifs. EXEMPLES Exemple 1: Identification d'une souche bactérienne productrice de polymyxine E, et mise en évidence du système génétique de production de la colistine. Un micro-organisme (B-LR) producteur de colistine (polymyxines El et E2), appartenant à l'espèce Paenibacillus alvei, a été isolé de l'environnement et cultivé. Une banque d'ADN génomique a été construite dans Escherichia coli en utilisant des vecteurs fosmidiques (900 clones). La recherche des gènes codants pour les enzymes synthétisant la colistine a été effectuée par PCR dégénérées. Les amorces utilisées ont été définies dans le but d'amplifier les domaines spécialisés dans l'intégration de l'acide diaminobutyrique (Dab), acide aminé le plus représenté dans la structure de la colistine (6 acides aminés/12). Trois clones d'intérêts ont été sélectionnés et séquences (Roche GS FLX). Les séquences obtenues ont pu être assemblées sur 50 kb. Les cadres ouverts de lecture ont été recherchés. Cinq d'entre eux nommés A, B, C, D et E décrivent un cluster d'environ 41 kb avec A (14.9 kb), B (3.3 kb), C (1.8 kb), D (1.7 kb) et E (18.9 kb) qui est représenté en figure 2. Par homologie de séquences les gènes A, B et E ont été identifiés comme codant pour des synthétases. Une étude in silico a permis de prédire l'implication de ces synthétases dans l'assemblage de la colistine (http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/ et http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps/). Les gènes C et D pourraient quant à eux être impliqués dans l'export et la résistance du micro-organisme producteur vis à vis de la colistine. Tableau 2 : Amorces permettant d'amplifier les gènes d'intérêt du cluster colistine de B-LR A (F)ATGGCTTTTGAAAAAGAAAC (R)GAACGCAAATTCGATCGTAT B (F)ATGAAATCTTTATTTGAAAA (R)GCTTCCATGCAGTACCCCGG E (F)ATGGAAATTATGAATCCGGG (R)GAAAATAATATCAATGGCCT C (F)ATGGAAGCTGACCGACAGCC (R)GTGTACGCCACCTCCCTGCG D (F)ATGAAAAAGGGCGGATGGCT (R)GCCGTACAGCCGGGCGTAAT Ces oligonucléotides sont représentés en SEQ ID NO 15 à 24. Exemple 2 : Comparaison des domaines d'adénylation de diverses souches de Paenibacillus productrices de molécules appartenant à la famille des polymyxines. Les enzymes impliquées dans la production des polymyxines appartiennent à la famille des synthétases non ribosomiques (NRPS). Ces synthétases sont capables d'élaborer un peptide particulier sans s'appuyer sur la traduction d'une matrice d'ARNm. La spécificité de la chaine peptidique produite dépend d'une séquence précise d'acides aminés de la synthétase constituant un domaine d'adénylation. Quatre domaines d'adénylation ont été identifiés in silico pour la synthétase A de B-LR, un pour B et cinq pour E. Chaque domaine d'adénylation contient une signature de dix acides aminés qui lui confère la spécificité d'intégrer un acide aminé précis au peptide non ribosomique en cours d'élongation. Ces signatures ont été identifiées in silico et comparées à celles décrites dans la littérature (tableau 3) à l'aide du programme disponible à l'adresse suivante : http ://nrps.informatik.uni-tuebingen. de/. Les souches E681 et ATCC21830 sont décrites dans le brevet US 8,329,430. La souche PKB1 est décrite dans l'article de Shaheen et al., 2011. La souche M-1 est décrite dans l'article de Niu et al., 2013. Tableau 3 : Acides aminés conférant la spécificité des domaines d'adénylation des polymyxines synthétases des souches E681, PKB1, ATCC21830, M-1 et B-LR Pmx A, 4 domaines A 1 2 3 4 E6 8 1 DAWIVGAIVK Leu DFWNIGMVHK Thr DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab PKB1 DAWTIAAIAK Phe DGFLLGLVYK Leu DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab 2 183 0 DAWIVGAIVK Leu DGFLLGLVYK Leu DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab M-1 DAWTIAAIAK Phe DFWNIGMVHK Thr DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab B-LR DAWIVGAIVK Leu DGFFLGVVYK Leu/Ileu DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab Pmx B, 1 domaine A 1 E6 8 1 DFWNIGMVHK Thi- PKB1 DFWNIGMVHK Thr 21830 DFWNIGMVHK Thr M-1 DFWNIGMVHK Thr B-LR DFWNIGMVHK Thr Pmx E, 5 domaines A 1 2 3 4 5 E681 DVGEISS IDK Dab DFWNIGM VHK Thr DVGEISS IDK Dab DVGEIS AIDK Dab DVGEIS AIDK Dab PKB1 DVGEISS IDK D ab DFWNIGM VHK Thr DVGEISS IDK D ab DVGEIS AIDK Dab DVGEIS AIDK Dab 21830 DVGEISS IDK Dab DFWNIGM VHK Thr DVGEISS IDK Dab DVGEIS AIDK Dab DVGEIS AIDK Dab M-1 DVGEISS IVK Dab DFWNIGM VHK Thr DVGEISS IDK Dab DVGEIS AIDK Dab DVGEIS AIDK Dab B-LR DVGEISS IDK Dab DFWNIGM VHK Thr DVGELS SIDK Dab DVGEIS AIDK Dab DVGEIS AIDK Dab Les synthétases de B-LR se distinguent au niveau du deuxième domaine d'adénylation de la synthétase PmxA et du troisième domaine de la synthétase PmxE. Les comparaisons avec les séquences protéiques issues de la souche BL-R avec les séquences protéiques déjà connues sont présentées dans le tableau 4 ci-dessous : Séquences tailles % ID séquences protéiques pb aa PKB1 E681 ATCC 21830 A 14901 4967 94 90 96 B 3306 1102 96 95 96 E 18876 6292 95 96 84 C 1824 608 D 1731 577 Exemple 3 : Construction d'un mutant pmxE- et analyse de sa production de colistine. Une séquence de 1 650 pb commençant à la fin de pmxD et finissant au début de pmxE a été sélectionnée et amplifiée. Elle a la particularité de posséder un site de restriction unique à l'enzyme SacII. La séquence amplifiée a été clonée dans le plasmide pGEM® 7Z. Le gène codant pour la résistance à l'apramycine a été intégré au niveau du site de restriction SacII. Cette construction a été introduite dans B-LR par électroporation. La sélection des mutants ayant subi un évènement de double recombinaison a été effectuée par culture sur milieu gélose supplémenté en apramycine. L'activité antimicrobienne du surnageant des mutants a été comparée à celle de B-LR. Le surnageant de culture du mutant 5 est moins actif que celui de la bactérie B-LR sauvage sur P. aeruginosa (Figure 4). Exemple 4 : Production hétérologue chez Bacillus subtilis et détection de la colistine. Bacillus est un hôte d'expression hétérologue phylogénétiquement proche de B-LR. Le fosmide manipulé pour héberger l'ensemble du cluster de production de la colistine est transféré dans la souche receveuse par électroporation. Les souches transformées sont électionnées sur milieu gélose supplémenté en antibiotique. La production de colistine se fait en milieu liquide supplémenté en acide diaminobutyrique (précurseur de synthèse). La détection de la colistine est réalisée après séparation de la biomasse du surnageant de culture. Des extractions permettent d'isoler la colistine avant sa caractérisation en spectrométrie de masse. REFERENCES BREVETS US 8,329,430 WO 1998/020836 WO 2009/098357 NON-BREVETS Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Mame . Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York Niu B, Vater J, Rueckert C, Blom J, Lehmann M, Ru JJ, Chen XH, Wang Q, Borriss R. "Polymyxin P is the active principle in suppressing phytopathogenic Er winia spp. by the biocontrol rhizobacterium Paenibacillus polymyxa M-1". BMC Microbiol. 2013 Jun 18;13(1):137. Choi SK, Park SY, Kim R, Kim SB, Lee CH, Kim JF, Park SH - "Identification of a polymyxin synthetase gene cluster of Paenibacillus polymyxa and heterologous expression of the gene in Bacillus subtilis" J. Bacteriol. May 2009 vol. 191 no. 10 - 3350-3358 M Shaheen, J Li, AC Ross, JC Vederas, SE Jensen - "Paenibacillus polymyxa PKB 1 Produces Variants of Polymyxin B-Type Antibiotics"- Chemistry & biology, Volume 18, Issue 12,23 December 2011, Pages 1640-1648 Martti Vaara, Timo Vaara - "Structure-activity studies on novel polymyxin derivatives that carry only three positive charges" - Peptides, Volume 31, Issue 12, December 2010, Pages 2318-2321 Govaerts, C., Orwa, J., Van Schepdael, A., Roets, E. & Hoogmartens, J. Characterization of polypeptide antibiotics of the polymyxin series by liquid chromatography electrospray ionization ion trap tandem mass spectrometry. - J Pept Sci 8, 45-55. (2002a). Govaerts, C., Orwa, J., Van Schepdael, A., Roets, E. & Hoogmartens, J. Liquid chromatography-ion trap tandem mass spectrometry for the characterization of polypeptide antibiotics of the colistin series in commercial samples. J Chromatogr A 976, 65-78. (2002b). REVENDICATIONS1. Synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre sites d'adénylation, caractérisée en ce que le second site d'adénylation présente au moins 90% d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 1 : VTEAEKADLLGRENDTTTEFPRGKTLIQLFEEQVERIPDAAAITLNEQE LTYRELNERVNRLARTLRSHGISKGRLVAILAERSIEMVVGMLAAHKAGAAYVPI DPEYPEERIRFLIEDSGGQVMLTQSRLRERLAGSDPVILLDDESFYHEDGTNLNTGI EATDLACVIYTSGTTGKPKGNPVSHRNIVRVVQNTNYIDITERDHVLQLSSYSFDG ATEDIFGALTNGARLVLVPYETLLEIGRLADLIQRERISVMFITTAFFNILVDVNVD CLRDVRAILEGGERVSVGHVRKALAHIGPGRLNHVYGPTESTVYTTYLPVDEVDE LAVTVPIGRPISNTTVYIVDSRNKLLPIGVAGELCVGGEGLVRGYNNRPELTAEKE VDNPFVPGERMYRTGDLAKWLPDGTIEYVGRTDDQVKIRGFRIELGEIEAQLQKV EGIRKTTVFARENASGEKQLCAYYEADCELPAAELKSVLSKELPAYMIPAYLIQLE RLPLTTNGKVDRRSLPAPEESLQPGGG, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine ou isoleucine. 2. Synthétase PmxA selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend quatre poches de liaison spécifiques comprenant les acides aminés suivants : - DAWIVGAIVK, spécifique pour un résidu leucine ; - DGFFLGVVYK, spécifique pour un résidu leucine ou isoleucine ; - DVGEISAIDK, spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique ; - DVGEISAIDK, spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique. 3. Synthétase PmxA selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence peptidique SEQ ID NO 6. 4. Acide nucléique comprenant un cadre de lecture ouvert, codant pour une synthétase impliquée dans la synthèse de polymyxine E selon la revendication 1, présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 7, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés. 5. Groupe de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA selon l'une desrevendications 1 à 3, et des gènes codant respectivement pour les synthétase PmxB et PmxE. 6. Groupe de gènes selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend également des gènes codant respectivement pour les protéines de transport PmxC et PmxD. 7. Groupe de gènes selon la revendication 5, comprenant : - un gène pmxA présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 7, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés, - un gène pmxB présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 8, et - un gène pmxE présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 9. 8. Acide nucléique de séquence SEQ ID NO 10, comprenant un groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E. 9. Vecteur d'expression comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA selon l'une des revendications 1 à 3, ou un acide nucléique selon la revendication 4. 10. Vecteur d'expression comprenant totalement ou en partie le groupe de gènes selon l'une des revendications 5 à 7 ou un acide nucléique selon la revendication 8. 11. Micro-organisme transformé par introduction d'un gène codant pour une synthétase PmxA selon l'une des revendications 1 à 3, ou d'un acide nucléique selon la revendication 4, ou d'un vecteur selon la revendication 9. 12. Micro-organisme transformé par introduction d'un groupe de gènes selon l'une des revendications 5 à 7, ou d'un acide nucléique selon la revendication 8, ou d'au moins un vecteur selon la revendication 10. 13. Micro-organisme transformé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que le gène ou le groupe de gènes est surexprimé. 14. Micro-organisme transformé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il appartient au genre Bacillus ou Paenibacillus. 15. Méthode de production de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme selon l'une des revendications 11 à 14 dans un milieu minéral approprié, et la purification à partir du milieu de culture de la polymyxine E produite. 16. Méthode de production de polymyxine E selon la revendication 15, caractérisé en ce que la culture est effectuée à une température de 30°C, et dure au moins 25 heures. 17. Méthode de production de variants de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme selon l'une des revendications 11 à 14 dans un milieu minéral approprié, et la purification à partir du milieu de culture du ou des variants de la polymyxine E. 18. Variants de la polymyxine E obtenus selon la méthode de production de la revendication 17. 19. Variants de polymyxine E selon la revendication 18, pour leur utilisation dans le traitement des infections bactériennes à bactéries Gram-négatives.