Brevet FR3016637A1 — publié le 20150724

La présente invention a pour objet un procédé de production de glycosaminoglycane (GAG) in vivo, par ingénierie métabolique dans une cellule génétiquement modifiée. Dans un procédé selon l'invention, ladite cellule est génétiquement modifiée dans le but d'exprimer les gènes codant pour les enzymes adéquates pour la synthèse de GAG à partir d'un précurseur exogène à la cellule, et de préférence un précurseur exogène internalisé par ladite cellule. Selon un aspect particulier, la présente invention a pour objet un procédé de production de chondroïtine ou d'héparosane dans une cellule bactérienne génétiquement modifiée, à partir d'un précurseur béta-galactoside exogène, de préférence internalisé par la cellule. Selon un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une cellule de Escherichia coli comprenant au moins les gènes glcA-T, kfoC, kfiD et wbpP pour la production de chondroïtine. Selon un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une cellule de Esche ri chia coli comprenant au moins les gènes glcA-T, kfiA, kfiB kfiC et kfiD pour la production d'héparosane. La présente invention a également pour objet l'utilisation de glycosaminoglycane obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une l'invention pour la préparation d'un médicament. Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont des hétéro-polysaccharides qui composent la matrice extracellulaire. Ils sont composés d'une répétition d'un motif di-saccharidique composé, d'une part, d'une hexosamine qui peut être la N-acétylglucosamine ou la N-acétylgalactosamine, et, d'autre part, d'un acide uronique, qui peut être l'acide glucuronique ou l'acide iduronique, ou d'un galactose. Ces motifs peuvent être sulfatés. Les GAGs sont fortement chargés négativement du fait de la présence des groupes sulfate ou carboxyl sur la plupart de leurs oses, ce qui leur confère des propriétés viscosantes, ils jouent un rôle dans le maintien des tissus conjonctifs et sont également impliqués dans la reconnaissance cellulaire et la croissance des tissus. Selon la composition du motif di-saccharidique, on distingue parmi les GAGs : l'acide hyaluronique, la chondroïtine, la chondroïtine sulfate, le dermatane sulfate, l'héparane sulfate, l'héparine, l'héparosane et le kératane sulfate. La chondroïtine est un précurseur des chondroïtines sulfate et des dermatanes sulfate (Cimini et al., 2010). In vivo, la chondroïtine est sujette durant sa polymérisation à de nombreuses sulfatations, opérées par des chondroïtine sulfotransférases, qui résultent en la formation de groupes 0-sulfatés en des positions variées. Selon la position de ces groupements sulfates, les chondroïtines sulfate jouent différents rôles. Les GAGs peuvent être utilisés dans différents domaines thérapeutiques. Leur application la plus connue est le traitement des ostéoarthrites, ils possèdent une activité anti- inflammatoire et une action dans la régénération des cartilages. Plus récemment, il a été démontré que les chondroïtines sulfate ont des effets anti-viraux et anti-infectieux, elles sont également utilisées dans la régénération et l'ingénierie de tissus. Les chondroïtines sulfate sont aussi étudiées pour leur intérêt dans le diagnostic et le traitement de cancer (Jin et al., 2008 ; Yamada et Sugahara, 2011). De plus, la chondroïtine peut être utilisée comme adjuvant nutritionnel. L'héparosane, dont le squelette est un précurseur de la synthèse de l'héparine, peut être utilisé dans différentes applications thérapeutiques, en tant que précurseur d'héparine non animale ou de produits analogues de l'héparine, mais aussi pour la vectorisation de produits thérapeutiques. Les GAGs peuvent être extraits à partir de sources animales ou synthétisés par voie chimique, enzymatique ou microbiologique. La synthèse de ces composés par chimie organique traditionnelle reste cependant à ce jour très difficile. La chondroïtine sulfate et l'acide hyaluronique peuvent être extraits et purifiés à partir de tissu animal tel que les ailerons de requin, le cartilage de poisson ou les carcasses d'animaux. L'utilisation, notamment thérapeutique, de ces composés requiert des niveaux de qualité et de purification élevés et constants que l'extraction ne peut satisfaire pleinement, notamment du fait du risque de contamination des GAGs extraits de tissus animaux, par exemple par un virus ou un prion (Zanfardino et al., 2010 ; Wang et al., 2011) . Une autre source de GAGs est leur extraction de certaines bactéries pathogènes, où ils font partie de la capsule extracellulaire, ce qui leur confère un rôle de barrière naturelle face aux défenses de l'hôte. La production de chondroïtine à partir de polysaccharides capsulaires (Capsular Poly-Saccharides) a déjà été réalisée à partir des souches de E. coli pathogènes K4 et K5 (Schiraldi et al., 2010 ; Inoué et al., 1990). Cependant, la plupart des utilisations thérapeutiques de la chondroïtine nécessitent une taille de 14 à 20 kDa (Schiraldi et al., 2010). Les tailles moyennes des CPS sauvages sont d'environ 650 kDa et celles des GAGs produits par ingénierie métabolique sont d'environ 150 kDa (Krahulec et al., 2005), la chondroïtine ainsi obtenue doit donc être dépolymérisée préalablement à la plupart de ses utilisations thérapeutiques. Cette étape de dépolymérisation diminue l'homogénéité du produit et sa qualité d'un point de vue thérapeutique. Il existe donc actuellement un besoin de disposer d'un procédé de production de glycosaminoglycanes en qualité et en quantité appropriée pour un usage notamment thérapeutique. Ceci est maintenant l'objet de la présente invention. Les inventeurs ont en effet mis au point un procédé d'ingénierie par modification génétique d'une cellule permettant de produire des glycosaminoglycanes, et notamment de la chondroïtine et de l'héparosane, à partir d'un accepteur exogène de type béta-galactoside. Cet accepteur exogène à deux unités saccharidiques remplace l'accepteur naturel bactérien, ou accepteur « endogène ». Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit « accepteur exogène » peut être internalisé par la cellule. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ledit « accepteur exogène » peut être l'objet d'une synthèse intracellulaire par une bétagalactosyltransférase recombinante L'état de l'art ne décrit pas le béta-galactoside comme accepteur possible des enzymes possédant une activité de synthèse des GAGs. La biosynthèse des glycosaminoglycanes bactériens prend sa source dans le cytoplasme des bactéries, au voisinage de la membrane par laquelle ils transitent afin d'intégrer la paroi extracellulaire, à partir d'un accepteur membranaire endogène, vraisemblablement le diacylglycérophosphate (Whitfield, 2006). Il a été montré dans un système d'expression bactérien in vitro qu'en ajoutant dans le milieu réactionnel des oligosaccharides dont la taille minimale est de 6 unités saccharidiques, et en présence des nucléotide-sucres UDP-GlcA et UDP-Ga1NAc, la chondroïtine polymérase KfoC d'Escherichia coli K-4 qui possède les deux activités GlcA-transférase et Ga1NAc- transférase est capable de produire un polysaccharide d'une taille d'environ 20 kDa (Ninomiya et al, 2002). WO 01/04341 et Priem et al. (2002) décrivent la production d'oligosaccharides dans une souche bactérienne capable d'intégrer un précurseur exogène. Yavuz et al. (2008) décrit la production d'oligosaccharides glucuronylés dans E. Coli. Doherty et al. (US2011/0244520) ont décrit un procédé de production de chondroïtine dans une souche bactérienne utilisant un ensemble de gènes exogènes, mais en absence d'un précurseur exogène Les inventeurs ont maintenant démontré que, sous réserve de la présence dans la bactérie d'un glycosyl-béta galactoside et d'au moins une enzyme comportant une activité de synthèse d'un GAG à partir de glycosyl-béta galactoside, il est possible de réaliser la synthèse par ingénierie métabolique de GAG de polydispersité réduite et de taille adaptée à un usage thérapeutique (Figures 1 et 2). En particulier, les inventeurs ont démontré la possibilité de produire de la chondroïtine, par ingénierie métabolique, sous réserve de la présence dans la bactérie d'un glucuronyl-béta galactoside et d'une chondroïtine synthase bactérienne, et en présence d'un accepteur exogène béta-galactoside. Les inventeurs ont également démontré qu'en présence d'un accepteur exogène béta-galactoside et d'au moins un gène codant pour une enzyme capable de synthétiser l'héparosane, et de préférence les gènes kfiA, kfiB, kfiC et kfiD, il est possible de produire de l'héparosane, avec un rendement supérieur aux rendements obtenus par la mise en oeuvre des procédés déjà connus. La synthèse de GAG à partir d'un accepteur exogène par un procédé selon l'invention a pour avantage de permettre de transposer la voie de biosynthèse dans différents types de cellules capable d'internaliser ledit précurseur exogène. De ce fait, la présence de l'accepteur endogène membranaire propre à E. colt ou aux souches bactériennes pathogènes productrices de GAGs n'est pas nécessaire. Le GAG ainsi produit se caractérise par la présence en fin de chaine du précurseur exogène béta-glucuronide, ce motif s'apparente à un motif naturellement présent chez l'homme (Kakuda et al., 2004). Un procédé de production de GAG par voie métabolique selon l'invention présente également un intérêt économique en raison du faible coût du précurseur exogène utilisé. L'invention sera maintenant décrite de manière détaillée et illustrée d'exemples. La présente invention a pour objet un procédé de production de glycosaminoglycane (GAG) dans une cellule génétiquement modifiée, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: 1) l'obtention d'une cellule comprenant au moins : - un gène exogène codant pour une enzyme capable d'exercer une activité glycosyl transférase sur un substrat béta-galactoside, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule et la synthèse de glycosyl béta-glucuronide, - un gène codant pour une enzyme capable de synthétiser ledit glycosaminoglycane à partir du glycosyl béta-galactoside, ou les gènes codant pour les enzymes de la voie de synthèse dudit glycosaminoglycane à partir du glycosyl béta-galactoside, et les éléments permettant l'expression dudit ou desdits gènes dans ladite cellule, - un gène codant pour une enzyme capable d'assurer l'internalisation de béta-galactoside exogène par la cellule, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, et 2) la culture de ladite cellule en présence de béta-galactoside exogène et dans des conditions compatibles avec la production dudit GAG par la cellule. Le terme « glycosaminoglycane » (GAG) désigne un hétéro-polysaccharide composé d'une répétition d'un motif di-saccharidique composé d'une hexosamine et d'un acide uronique ou d'un galactose. Selon un aspect particulier, un procédé selon l'invention a pour objet la production dans une cellule génétiquement modifiée d'un GAG choisi dans le groupe constitué par : l'acide hyaluronique, la chondroïtine, la chondroïtine sulfate, le dermatane, le dermatane sulfate, l'héparane, l'héparane sulfate, l'héparine, l'héparosane, le kératane et le kératane sulfate. Le terme « cellule génétiquement modifiée » désigne un micro-organisme dont la séquence du génome a subi au moins une altération, une addition ou une délétion, afin de conférer un phénotype particulier à ladite cellule. Cette modification peut notamment être apportée par l'addition d'au moins un gène exogène et des éléments permettant l'expression de ce gène dans ladite cellule. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, ladite cellule est génétiquement modifiée par l'introduction d'au moins un gène exogène porté par un plasmide. Selon un autre aspect particulier d'un procédé selon l'invention, ladite cellule est génétiquement modifiée par l'introduction d'au moins un gène exogène intégré dans le génome de ladite cellule. Le terme « béta-galactoside exogène » désigne un composé précurseur, internalisé par ladite cellule, intervenant dans la voie de biosynthèse du GAG et substrat d'une enzyme ayant une activité glycosyl-transférase, de préférence une activité glucuronyl-transférase. Le terme « gène exogène » désigne un acide nucléique hétérologue, non naturellement présent dans la cellule, dont la séquence en nucléotides code pour une protéine définie. Ledit acide nucléique peut être de l'ADN, sous une forme simple brin ou double brin, ou de l'ARN. Dans un procédé selon l'invention, ledit gène exogène est introduit dans ladite cellule par les techniques bien connues de l'homme du métier spécialiste de la manipulation des acides nucléiques recombinants, telles que, par exemple, le choc thermique ou l'électroporation. Le terme « éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule » désigne notamment un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'acide nucléique est introduite dans ladite cellule sous la forme d'un vecteur d'expression qui comporte lesdits éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule. Un vecteur d'expression peut également comprendre un ou des éléments permettant son maintien dans la cellule, de façon stable au cours des générations successives. Ces éléments sont choisis en fonction de la cellule hôte utilisée, et peuvent être, notamment un gène codant pour la résistance à un antibiotique. Ledit vecteur peut posséder une réplication autonome ou bien s'intégrer dans le génome de la cellule hôte. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le vecteur d'expression est présent sous forme de plasmide, un plasmide pouvant porter un ou plusieurs des gènes exogènes d'intérêt pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention. Chacun des plasmides présents dans la cellule peut être caractérisé par le nombre de copies dudit plasmide dans la cellule. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, un plasmide portant au moins un gène exogène d'intérêt pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention est présent à un faible nombre de copies (« low copy »). Selon un autre aspect particulier d'un procédé selon l'invention, un plasmide portant au moins un gène exogène d'intérêt pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention est présent à un fort nombre de copies (« high copy »). Il est bien connu d'un homme du métier spécialiste du domaine technique que le niveau d'expression d'un gène peut être corrélé au nombre de copies du gène dans la cellule. L'expression « enzymes de la voie de synthèse dudit glycosaminoglycane à partir du glucuronyl béta-galactoside » désigne les différentes enzymes capables d'exercer une activité intervenant au cours de la voie de synthèse du GAG dans la cellule. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, ledit béta-galactoside exogène est présent dans le milieu de culture. Selon un autre aspect particulier d'un procédé selon l'invention, ledit béta-galactoside exogène est du béta-galactoside recombinant, produit par ladite cellule génétiquement modifiée, ladite cellule génétiquement modifiée comprenant au moins un gène exogène permettant la synthèse de béta-galactoside. Selon un mode de réalisation préféré d'un procédé selon l'invention, le béta-galactoside est choisi dans le groupe constitué par les béta-galactosides pris en charge par le système de transport actif de la bactérie, et de préférence dans le groupe constitué par : le lactose, le lactose-allyle, le béta-allylegalactoside, le béta-méthylgalactoside, le béta-galactoside d'allyle, le béta-galactoside de propargyle. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, la culture de ladite cellule génétiquement modifiée est réalisée en présence de béta-galactoside exogène, ledit bétagalactoside exogène étant ajouté durant la culture de façon à ce que le glycosyl-bétaglucuronide, obtenu par le transfert d'un groupe glucuronyl sur le béta-galactoside, soit présent dans le compartiment intracellulaire de la cellule pendant la plus grande partie de la culture, et de préférence pendant toute la durée de la culture. Le béta-galactoside peut être ajouté ponctuellement dans la culture ou sous forme d'ajout en goutte à goutte. Le béta-galactoside peut être ajouté à la culture à une concentration comprise entre environ 0,5 et environ 8 g/L, le terme « environ » exprimant une variation de l'ordre de 10%, de préférence entre environ 0,6 et environ 7 g/L, de préférence entre environ 1 et environ 5 g/L, et plus préférentiellement entre environ 1,5 et environ 4 g/L. L'invention a également pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention dans laquelle l'enzyme capable d'assurer l'internalisation par la cellule de béta-galactoside exogène est une perméase, de préférence une perméase spécifique du lactose, de préférence la béta-galactoside perméase codée par le gène LacY de E. coll. Dans un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, la culture de ladite cellule est réalisée selon un procédé bien connu par un homme du métier, qui peut mettre en oeuvre le procédé de culture et choisir la composition du milieu de culture, notamment la concentration en éléments nutritifs, et les paramètres de la culture, tels que la température, le pH, la concentration en oxygène, l'inoculation de la culture, selon ses connaissances générales. Le milieu de culture peut notamment comprendre au moins une source d'un ou plusieurs éléments choisis parmi : sucres, carbone, azote, phosphate, magnésium, calcium et vitamines. Dans un procédé selon l'invention, la culture peut être réalisée en fermenteur selon un procédé de fermentation conventionnel choisi parmi : la culture en batch, la culture en fed-batch ou la culture continue. De préférence, dans un procédé selon l'invention, la culture de ladite cellule génétiquement modifiée est réalisée en fed-batch. L'invention a également pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, dans laquelle l'enzyme capable d'exercer une activité glycosyl-transférase est une glucuronyl transférase. Selon un mode de réalisation particulier d'un procédé selon l'invention, la glucuronyl transférase est une glucuronyl transférase de mammifère. De préférence, la glucuronyl-transférase de mammifère est choisie est une glucuronyl transférase de rat ou une glucuronyl transférase de souris, et de préférence la glucuronyl-transférase de cerveau de souris. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de procédé de production de glycosaminoglycanes (GAGs) dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, dans lequel le gène codant pour une enzyme capable d'exercer une activité glycosyl-transférase sur un substrat béta-galactoside est le gène glcA-T (codant pour la béta-1-3- glucuronyl transférase de souris (Référence GenBank GI : 568960207). Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée, caractérisée en ce que le GAG est produit dans le cytoplasme de ladite cellule. L'invention a également pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, dans laquelle ladite cellule comprend en outre un gène codant pour une enzyme capable de synthétiser l'UDP-GlcA à partir d'UDP-Glc, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'enzyme capable de synthétiser l'UDP-GlcA à partir d'UDP-Glc est l'UDP-glucose déshydrogénase. L'invention a également pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, dans laquelle ladite cellule génétiquement modifiée comprend en outre un gène codant pour une enzyme capable de synthétiser l'UDP-GalNAc, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'enzyme capable de synthétiser l'UDP-GalNAc est l'UDP-N-acétyl- glucosamine épimérase de Pseudomonas aeroginosa. L'invention a également pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention dans laquelle au moins un gène de ladite cellule génétiquement modifiée codant pour une enzyme utilisant l'UDP-glcA pour la synthèse d'un produit cellulaire est inactivé. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite cellule est une bactérie de type Escherichia coli et le gène wcaJ codant pour l'enzyme utilisant l'UDP-glcA pour la synthèse de l'acide colanique est inactivé. L'invention a également pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention dans laquelle au moins un gène de ladite cellule génétiquement modifiée codant pour une enzyme capable d'hydrolyser le béta-galactoside est inactivé. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite cellule est une bactérie de type Escherichia coli et que l'enzyme capable d'hydrolyser le béta-galactoside dont le gène est inactivé est la béta-galactosidase codée par le gène LacZ. L'invention a également pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention dans laquelle ladite cellule est choisie parmi les bactéries et les organismes eucaryotes recombinants L'invention a également pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention dans laquelle ladite cellule génétiquement modifiée est choisie dans le groupe constitué par : Escherichia coli, Bacillus subtilis, Campylobacter pylori, Helicobacter pylori, Agrobacterium tuméfaciens, Staphylococcus aureus, Thermophilus aquaticus, Azorhizobium caulinodans, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitis, Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces pombe, Candida albicans et Corynebacterium glutamicum. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule génétiquement modifiée est une bactérie de souche Escherichia coll. Selon un mode de réalisation encore préféré de l'invention, ladite cellule génétiquement modifiée est une bactérie de souche Escherichia coli non pathogène. Plus particulièrement, ladite cellule génétiquement modifiée est choisie dans le groupe constitué par : la souche Escherichia coli K12, la souche DH1 de Escherichia coli K12 (référence ATCC : 68153), la souche DH1 de Escherichia coli K12 dans laquelle les gènes lacZ et wcaJ sont inactivés (Yavuz et al., 2008), une souche Escherichia colt du groupe B, de préférence Escherichia colt BL21. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule génétiquement modifiée est une levure. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée, caractérisé en ce que ledit GAG est la chondroïtine. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée, ledit procédé comprenant - 1) l'obtention d'une cellule comprenant au moins un gène exogène codant pour une enzyme capable d'exercer une activité glycosyl transférase sur un substrat bétagalactoside, un gène codant pour une enzyme capable de synthétiser la chondroïtine à partir de glycosyl béta-glucuronide, un gène codant pour une enzyme capable d'assurer l'internalisation par la cellule de béta-galactoside exogène, et 2) la culture de la cellule en présence de béta-galactoside exogène et dans des conditions compatibles avec la production de chondroïtine. Le terme « chondroïtine » désigne un GAG ayant pour motif di-saccharidique une Nacétylgalactosamine (Ga1NAc) et un acide glucuronique (G1cA) et peut être représenté par : « 4- GIcA-13-1,3-Ga1NAc-13-1 ». Selon un mode réalisation encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, dans lequel ledit béta-galactoside exogène est le lactose. Selon un mode réalisation encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, dans lequel l'enzyme capable d'exercer une activité glycosyl transférase sur un substrat bétagalactoside est une glucuronyl tranférase, de préférence une glucuronyl-transférase de mammifère. L'invention a également pour objet un procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée dans laquelle l'enzyme capable de synthétiser la chondroïtine est une synthase bactérienne capable de synthétiser la chondroïtine à partir de glucuronyllactose. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée dans lequel le gène codant pour une enzyme capable d'exercer une activité de synthèse de la chondroïtine est le gène kfoC codant pour la chondroïtine polymérase de la souche K4 de E. colt PMV-1 (Référence GenBank : GI : 21326784). Selon un autre mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée, caractérisé en ce que ledit GAG est l'héparosane. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée, ledit procédé comprenant - - l'obtention d'une cellule comprenant au moins un gène exogène codant pour une enzyme de mammifère capable d'exercer une activité glycosyl transférase sur un substrat béta-galactoside, les gènes codant pour les enzymes de la voie de synthèse dudit glycosaminoglycane à partir du glycosyl béta-galactoside, et les éléments permettant l'expression desdits gènes dans ladite cellule un gène codant pour une enzyme capable d'assurer l'internalisation par la cellule de béta-galactoside exogène, et - la culture de ladite cellule en présence de béta-galactoside exogène, et dans des conditions compatibles avec la production d'héparosane par ladite cellule. Le terme "héparosane" désigne un glycosaminoglycane bactérien composé de répétitions régulières de 443-glucuronyl-(1-4)-a-N-acetylglucosaminyl-1. L'héparosane est produit par des bactéries pathogènes telles que Escherichia colt K5 et Pasteurella multocida et trouvé dans la capsule bactérienne. Selon un autre mode de réalisation encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, caractérisée en ce que ledit béta-galactoside est le lactose. Selon un autre mode de réalisation encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, caractérisée en ce que ledit béta-galactoside est l'allyl-lactose. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, le procédé comprenant l'obtention d'une cellule de la souche K12 d'Escherichia colt, comprenant au moins : - un gène codant pour une glucuronyl transférase de mammifère, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène codant pour une chondroïtine synthase bactérienne, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène codant pour une béta-galactoside perméase, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, et la culture de ladite cellule en présence de béta-galactoside exogène et dans des conditions compatibles avec la production de chondroïtine par la cellule. Selon un aspect encore plus particulier de l'invention, le procédé de production de chondroïtine comprend l'obtention d'une cellule de la souche K12 d'Escherichia coli, comprenant au moins : - un gène codant pour la glucuronyl transférase de souris, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène codant pour la chondroïtine synthase kfoC de E. coli K4, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène codant pour une lactose perméase, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène codant pour une UDP-glucose deshydrogénase, et - un gène codant pour l'UDP-N-acetyl-glucosamine épimérase de Pseudomonas aeroginosa, et la culture de ladite cellule en présence de béta-galactoside exogène et dans des conditions compatibles avec la production dudit GAG par la cellule. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée, ledit procédé comprenant l'obtention d'une cellule de la souche K12 d'Escherichia coli, ladite cellule comprenant au moins les gènes glcA-T (GI: 568960207), kfoC (GI: 21326784), kfiD (UDP-glucose-6- dehydrogenase, E coli, GI 735963) et wbpP (Pseudomonas aeruginosa, GI : 6690131) et la culture de ladite cellule en présence de lactose exogène et dans des conditions compatibles avec la production de chondroïtine par la cellule. L'invention a également pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, comprenant l'obtention d'une cellule comprenant au moins : un gène codant pour une enzyme capable d'exercer une activité glycosyl transférase sur un substrat béta-galactoside, les gènes codant pour les enzymes de la voie de synthèse dudit glycosaminoglycane à partir du glycosyl béta-galactoside, et les éléments permettant l'expression dudit ou desdits gènes dans ladite cellule, un gène codant pour une enzyme capable d'assurer l'internalisation de béta-galactoside exogène par la cellule, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, et la culture de ladite cellule en présence de béta-galactoside exogène et dans des conditions compatibles avec la production d'héparosane par la cellule. Selon un mode réalisation encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, dans lequel ledit béta-galactoside exogène est le lactose. Selon un mode réalisation encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, dans lequel l'enzyme capable d'exercer une activité glycosyl transférase sur un substrat béta-galactoside est une glucuronyl tranférase, de préférence une glucuronyl-transférase de mammifère.L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, comprenant l'obtention d'une cellule comprenant au moins un gène exogène codant pour une G1cNAc transférase, un gène exogène codant pour une G1cA transférase, et un gène exogène codant pour une UDP-Glc deshydrogénase. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'invention a également pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, comprenant l'obtention d'une cellule de souche Escherichia coli, et de préférence la souche K12, ladite cellule comprenant au moins : - le gène glcA-T (GI 568960207), - le gène kfiA (GI : 496605) qui code pour une G1cNAc transférase, - le gène kfiB (SEQ ID N°1) qui code pour une protéine dont le rôle n'est pas connu à ce jour, - le gène kfiC qui code pour une glcA transférase (GI : 735964), - le gène kfiD qui code pour une UDP-Glucose 6 deshydrogénase (GI : 735963), et la culture de ladite cellule en présence d'un béta-galactoside choisi parmi : le lactose et le lactose allyle, dans des conditions compatibles avec la production d'héparosane par la cellule. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'invention a également pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, comprenant l'obtention d'une cellule de la souche Escherichia coli, et de préférence la souche K12 de Escherichia coli, ladite cellule comprenant au moins le gène codant pour une béta 1,3 glucuronyl transférase de mammifère et la séquence dont la référence est X77617.1 (23 octobre 2008) qui comprend les gènes kfiD, kfiC, kfiB et kfiA de E. coli et la culture de ladite cellule en présence d'un béta-galactoside choisi parmi : le lactose et le lactose allyle, dans des conditions compatibles avec la production d'héparosane par la cellule. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'invention a également pour objet un procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon l'invention, comprenant l'obtention d'une cellule de la souche Escherichia coli, et de préférence la souche K12 de Escherichia coli, ladite cellule comprenant au moins a) le gène glcA-T, et b) les gènes kfiA, kfiB kfiC et kfiD de E. coli ou au moins un gène codant pour une protéine ayant une fonction homologue à celle d'une protéine codée par kfiA, kfiB kfiC ou kfiDet la culture de ladite cellule en présence d'un béta-galactoside choisi parmi : le lactose et le lactose allyle, dans des conditions compatibles avec la production d'héparosane par la cellule. Dans un procédé selon l'invention, un gène codant pour une protéine ayant une fonction homologue à celle d'une protéine codée par kfiA, kfiB kfiC ou kfiD peut notamment être un gène homologue issu d'une autre souche bactérienne, telle que par exemple Pasteurella multocida, et notamment le gène PmHSJ qui code pour une protéine possédant la double activité G1cAT et G1cNAcT. La mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention permet de produire le GAG dans le compartiment cytoplasmique de ladite cellule modifiée. Les substrats des sulfotransférases, ou PAPS, sont également produits dans le cytoplasme des cellules. Du fait de la co-localisation possible du GAG et des PAPS, la sulfatation des GAGs est possible dans le cytoplasme desdites cellules génétiquement modifiées. Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de production de chondroïtine sulfate dans une cellule génétiquement modifiée, ledit procédé comprenant une première étape de production du GAG et une deuxième étape de sulfatation du GAG. La sulfatation du GAG peut être réalisée par la mise en oeuvre de procédés bien connus de l'homme du métier. La synthèse de chondroïtine sulfate peut être réalisée par sulfatation chimique ou enzymatique (Ninomiya et al., 2002). La sulfatation du GAG peut également être mise en oeuvre au sein de la cellule génétiquement modifiée dans laquelle le GAG est produit, notamment par la présence de gènes, endogènes ou exogènes, codant pour une enzyme capable d'exercer une activité de GAG sulfotransférase. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de GAG dans une cellule génétiquement modifiée comprenant 1) l'obtention d'une cellule comprenant au moins : un gène exogène codant pour une enzyme, de préférence de mammifère, capable d'exercer une activité glycosyl transférase sur un substrat béta-galactoside, de préférence une activité glucuronyl transférase, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule ; un gène codant pour une enzyme capable de synthétiser ledit GAG à partir de glycosyl béta- glucuronide, ou les gènes codant pour les enzymes de la voie de synthèse dudit glycosaminoglycane à partir du glycosyl béta-glucuronide, et les éléments permettant l'expression dudit ou desdits gènes dans ladite cellule, un gène codant pour une enzyme capable d'assurer l'internalisation de béta-galactoside exogène par la cellule, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, 2) la culture de ladite cellule en présence de béta-galactoside exogène et dans des conditions compatibles avec la production d'héparosane par la cellule, et 3) la purification du GAG produit à l'étape 2). La purification du glycosaminoglycane à partir de la culture de la cellule génétiquement modifiée peut être réalisée par tout moyen adapté connu de l'homme du métier. Ce moyen sera notamment adapté à la production de GAG dans le cytoplasme de la cellule génétiquement modifiée. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée, le procédé comprenant - 1) l'obtention d'une cellule de la souche K12 d'Escherichia colt, comprenant au moins : - un gène codant pour une glucuronyl transférase de mammifère, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène codant pour une chondroïtine synthase bactérienne, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène codant pour une béta-galactoside perméase, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, 2) la culture de ladite cellule en présence de béta-galactoside exogène et dans des conditions compatibles avec la production de chondroïtine par la cellule, et 3) la purification par chromatographie de la chondroïtine produite à l'étape 2). Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'une cellule de Escherichia colt comprenant au moins les gènes glcA-T, kfoC, kfiD et wbpP pour la production de chondroïtine. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'une cellule de Escherichia colt comprenant au moins les gènes glcA-T, kfiA, kfiB, kfiC et kfiD pour la production d'héparosane. Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation de chondroïtine obtenue par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention pour la synthèse de chondroïtine sulfate. L'invention a également pour objet l'utilisation d'héparosane obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention pour la synthèse d'héparosane sulfate. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation de GAG obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé l'invention pour la préparation d'un médicament, pour la régénération ou l'ingénierie de tissus ou pour la réalisation d'un test de diagnostic. Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation de la chondroïtine obtenue par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie choisie parmi : le cancer, l'osthéoarthrite et l'inflammation, ou pour un médicament destiné à être utilisé dans la régénération ou l'ingénierie tissulaire. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet l'utilisation de l'héparosane obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention d'un accident thrombo-embolique ou destiné à être utilisé en tant qu'agent anti-coagulant. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'un GAG obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, de préférence la chondroïtine ou l'héparosane, pour la préparation d'une composition alimentaire ou complément nutritionnel ou pour la préparation d'un produit cosmétique. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation de la chondroïtine obtenue par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention pour la préparation d'un complément nutritionnel. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et figures suivants. LEGENDES DES FIGURES Figure 1: Schéma synthétique de l'ingénierie métabolique des cellules génétiquement modifiées. Après l'entrée d'un accepteur dans la bactérie : expression hétérologue de glycosyltransférase d'intérêt (étape 2), accumulation des nucléotides sucres, substrats des glycosyltransférases (étape 3). Figure 2: Schéma de la stratégie de synthèse de chondroïtine chez E. coli à partir de lactose exogène (Lac), avec galactose (Gal), glucose (Glc), Uridine Di Phosphate (UDP), acide glucuronique (GlcA). Figure 3: Mesure des acides uroniques (barres noires) et des osamines (barres blanches) par dosages colorimétriques dans les fractions intracellulaires des souches recombinantes, avec de haut en bas KCB2, KCB1 et SBP9-24. La quantité en acides uroniques (UA) et en osamines est indiquée en g/L. Figure 4: Mesure des acides uroniques et des osamines par dosages colorimétriques dans les fractions intra et extracellulaires des souches recombinantes, avec de haut en bas : fraction extracellulaire de KCO3, KCO1 et KCB2, fraction intracellulaire de KCO3, KCO1 et KCB2. La quantité en acides uroniques (UA, barres noires) et en osamines (barres blanches) est indiquée en g/L. Figures 5A et 5B: Spectres issus de l'analyse en GPC de la chondroïtine produite par les souches recombinantes. Figure 5A : Analyse de la chondroïtine produite par la souche recombinante KCB2 (taille mesurée moyenne : 17.970 Da, polydispersité : 1,35). Figure 5B : Analyse de la chondroïtine produite par la souche recombinante KCO1 (taille mesurée moyenne : 73.510 Da, polydispersité : 1,42). Figures 6A à 6C: Spectres issus de l'analyse en chromatographie d'exclusion stérique « Multiangle light scattering » (SEC-MALS) des fractions SL (Figure 6A), AL1 (Figure 6B) et AL2 (Figure 6C) obtenues lors de la production d'héparosane. Figure 7 : Spectres issus de l'analyse en GPC (SEC-MALS) de la fraction héparosane produite dans la souche KHB3 à partir d'allyl-lactose. Pic 1, agrégats ; pic 2, Mw 52740 Da, Mw/Mn 1,17 ; pic 3, Mw 22346 Da, Mw/Mn 1,09. EXEMPLES Exemple 1 : Ingénierie de la glycosylation chez Escherichia coli La souche K12 d'E. coli (appelée DJ) utilisée pour la production de chondroïtine à partir de lactose exogène est décrite dans Yavuz et al. (2008), cette souche est une souche d'E. coli DH1 (référence ATCC : 68153) modifiée comme indiqué dans la publication de Yavuz et al. La souche K12 utilisée est transformée par un plasmide possédant le gène kfoC de E. coli K4. L'enzyme kfoC utilise de l'UDP-GalNac qui est apporté par l'expression de wbpP, gène codant pour une UDP-N-acétyl-glucosamine épimérase de Pseudomonas aeruginosa. Le gène wbpP de Pseudomonas aeruginosa, codant pour l'UPD-Glc épimérase, a également été introduit dans la bactérie. Pour la synthèse du glucuronyl-lactose, l'enzyme GlcA-T permet l'ajout d'un acide glucuronique (GlcA) sur le lactose à partir d'UDP-GlcA. Le gène codant pour la glucuronyltransférase de cerveau de rat (GlcA-T) est également introduit dans la bactérie. Il est important d'avoir une accumulation d'UDP-GlcA en amont. Pour ce faire, la souche est transformée avec un plasmide contenant le gène kfiD. Ce gène code pour une UDP-glucose déshydrogénase présente chez K5 permettant la synthèse d'UDP-GlcA à partir d'UDP-Glc. De plus, la souche K12 a été rendue LacZ- et wcaJ- par délétions. Le gène lacZ fait partie de l'opéron lactose, il code pour une béta-galactosidase qui hydrolyse le lactose en galactose et glucose. Son inactivation permet d'empêcher la dégradation du lactose et augmente donc sa disponibilité pour la synthèse métabolique du produit d'intérêt. Le gène wcaJ code, quant à lui, pour une enzyme utilisant de l'UDP-GlcA dans la synthèse d'acide colanique. Son inactivation permet, dans le cas présent, une accumulation d'UDP-GlcA. De plus, l'acide colanique étant un oligosaccharide acide, il peut interférer lors des purifications de la chondroïtine, le fait d'inhiber sa synthèse est donc d'autant plus bénéfique. La souche K12 lacZ-, wcaJ- est appelée DJ. Les différentes souches étudiées sont SBP9-24, KCB1 et KCB2 (Tableau 1). Souche Hôte Plasmides presents Résistances Commentaires SBP9-24 DJ pACT3-G1cA-T, pBS-kfoC, pBBR-kfiD, pWKS- wbpP KATC Souche de référence, 4 plasmides présents KCB1 DJ pBBR-kfiD, KAT 3 plasmides présents, gène G1cA-T inséré dans pBS-kfoC- G1cA-T, pWKS- wbpP un plasmide à grand nombre de copies KCB2 DJ pBBR-GIcA-T- kfiD, pBC-kfoC, KAT 3 plasmides présents, pWKS- wbpP G1cA-T inséré dans un plasmide à nombre moyen de copies KCO1 DJ pBBR-kfiD, pBC-kfoC, pWKS- wbpP KAT Contrôle sans G1cA-T KCO3 DJ pBBR-G1cA-T- kfiD, pBS-vide, KAT Contrôle sans KfoC pWKS- wbpP Tableau 1 : Caractéristiques des souches étudiées La souche SBP9-24 est considérée comme la construction de référence avec 4 plasmides, chacun portant un gène d'intérêt. KCB1 et KCB2 ne contiennent que 3 plasmides et se différencient par le plasmide qui porte 2 gènes (pBS-kfoC-G1cA-T pour KCB1 et pBBRG1cA-T-kfiD pour KCB2), leur différence étant que KCB2 possède le gène G1cA-T dans un plasmide au taux d'expression inférieur à celui que possède KCB1. Deux souches contrôles sont faites : KCO1 et KCO3, afin d'observer l'impact de l'expression de G1cA-T (KCO1) et de KfoC (KCO3) sur la production de chondroïtine. La souche BL21 lacZ-, wcaJ- de E. coli et transformée par les plasmides : pBBR-glcAT-kfiD pBS-lefoC pWKS-wbpP, est également utilisée. Exemple 2 : Production de chondroïtine dans E. coli à partir de lactose exogène Les transformations de E. coli K12 sont effectuées à partir de la souche K12 « DJ » qui est lacZ- et wcaJ-. Les plasmides (200 ng pour pBBR et pWKS, 100 ng pour pBS) sont ajoutés dans 100 luL de bactéries compétentes. Après 15 min dans la glace et un choc thermique de 45 secondes à 42°C, 400p.L de milieu SOC sont ajoutés et le tout est incubé 1 h à 37°C. Après concentration dans 100 microL de surnageant, le mélange est étalé sur boîte LBA + glucose (0,1% v/v) et les antibiotiques correspondants (0,1% v/v) et incubé à 30°C sur la nuit. Composition des milieux KH2PO4 (5 g/L), NH4PO4 (5 g/L), Acide citrique (0,5 g/L), NaOH (0,66 g/L), KOH (1,65 g/L), TMS (7,5 mL/L), Glycérol (2,4 g/L). Le glucose (17,5 g/L) et le MgSO4 (1 g/L) sont autoclavés séparément. La thiamine (10 mM) et les antibiotiques (35 mM) sont ajoutés après autoclave. Composition de l'alimentation Glycérol (750 g/L), MgSO4 (18 g/L), TMS (37,50 mL/L). L'alimentation est délivrée à un débit de 9 mL/min pendant la deuxième phase puis à un débit de 6 mL/min pendant la troisième phase (cf déroulement des cultures). Déroulement des cultures Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs Applikon de 3L avec un volume total de milieu de 1,5 L. Durant ces cultures, plusieurs paramètres sont contrôlés; l'oxygène à 40%, la température à 33 ou 28 °C suivant les phases de cultures et le pH à 6,80 avec de l'ammoniac à 30% (10). Le déroulement des cultures est divisé en plusieurs phases. La première phase correspond à une phase de croissance avec l'apport d'une source carbonée, le glucose. Ce dernier permet une répression catabolique, ainsi l'opéron lac, utilisé comme promoteur dans les plasmides apportant les gènes d'intérêt, est inhibé Cela permet d'éviter toute production avant l'induction est ainsi de favoriser la croissance des bactéries. Durant cette étape, la température de la culture est maintenue à 33°C. Cette étape est terminée lorsque tout le glucose ainsi que le glycérol présent dans le milieu de culture initial ont été consommés. La deuxième phase est une phase d'induction avec l'apport d'alimentation contenant du glycérol comme source carbonée en remplacement du glucose du milieu initial. L'alimentation est administrée à un débit de 9 mL/min. Après un test de réaction de la culture à l'alimentation (arrêt de l'apport en alimentation et observation d'une augmentation de l'oxygène), la température de la culture est diminuée à 28 °C. Après un second test de réponse à l'alimentation à cette température, l'induction de l'expression des gènes d'intérêt a été faite par injection d'IPTG à 50 mg/L. A ce moment, le précurseur exogène nécessaire à la chaîne de synthèse, le lactose, est également apporté dans le milieu à une concentration de 1,6 g/L. La troisième et dernière phase est entamée 5 h après l'induction par la diminution du débit d'alimentation (6 mL/min) de manière à ralentir la croissance bactérienne tout en continuant de fournir l'apport d'énergie nécessaire à la production du polysaccharide d'intérêt. Durant les cultures, des prélèvements d' 1,5 mL sont faits 1 h après l'induction (1 h), le lendemain de l'induction (24 h), le troisième jour une heure après la seconde injection de lactose (48 h) et le dernier jour avant l'arrêt des cultures (72 h). Après centrifugation 5 min à 13000g, le surnageant est mis à part (fraction extracellulaire) alors que le culot est repris dans 1 mL d'eau distillée puis mis à 100°c au bain-marie pendant 10 min. Après resuspension et centrifugation 3 min à 13000g, le culot contient les débris bactériens et le surnageant correspond à la fraction intracellulaire. Les fractions issues de ces prélèvement sont analysées sur couche mince de silice (CCM) par migration dans un tampon n-butanol / acide acétique / eau (2:1:1) pendant 30 minutes. Le standard utilisé lors de ces CCM est un mélange G1cA-Lac / lactose. La révélation des CCM est faite avec un mélange acétate d'éthyle (100 mL), diphénylamine (2 g), aniline (2 mL), acide phosphorique 85% (10 mL) et acide chlorhydrique (1 mL). Après l'arrêt des fermenteurs, la culture est récupérée puis centrifugée 20 min à 7000 rpm pour séparer les bactéries du milieu extracellulaire. Les culots bactériens, repris dans 500 mL d'H20, sont soumis à un traitement thermique (20 min à l'autoclave à 100 °C) de manière à lyser les bactéries. Pour finir, les culots sont resuspendus et broyés puis centrifugés 20 min à 7000 rpm de manière à éliminer les débris bactériens et conserver uniquement le surnageant qui correspond à la fraction intracellulaire des bactéries. Les surnageants récupérés suite à la première centrifugation correspondent aux fractions extracellulaires. Purification et analyse des sucres Dans un premier temps, le pH des fractions est ajusté à 3,5 par traitement à la résine échangeuse de cations (amberlite IR-120) ce qui permet de précipiter les protéines, les fractions sont centrifugées 20 min à 7000 rpm pour éliminer le précipité protéique et les surnageant ont vu leur pH ajusté à 6,5 par traitement à la résine échangeuse d'anions (Dowex 66). Dans un second temps, 500 mL des fractions sont soumis à une précipitation à l'éthanol (3 volumes d'éthanol à 96% pour 1 volume de fraction) de manière à précipiter la chondroïtine. Après 3h à 4°C, le mélange est centrifugé 20 min à 7000 rpm et le culot solubilisé dans 80 mL d'eau. Les fractions ainsi purifiées sont ensuite dosées en acide uronique (UA) et en osamine par dosage colorimétrique, respectivement par le procédé Blumenkrantz (1973) avec comme standard de l'acide glucuronique (G1cA) et celle de Morgan (1955) avec comme standard du Nacétyl galactosamine (Ga1NAc). Ces dosages ont permis d'obtenir une concentration théorique en chondroïtine grâce aux relations suivantes : n Q chondroïtine (Q UA / M qIca) X (M Qa1NAc - 18) + Q UA " Q chondroïtine = (Q osamines M GalNAc) X (M G1cA - 18) Qosamines » Les produits ainsi obtenus après purification ont été congelés à l'azote liquide puis lyophilisés de manière à obtenir une masse sèche pesée et utilisée pour la caractérisation du produit. Les différents produits de culture sont analysés en chromatographie de perméation de gel (GPC-SEC). La GPC-SEC est réalisée sur colonnes Shodex 802/803 éluées avec de nitrate de sodium (NaNO3) 0,1 M à un débit de 0,5 mL/min. La détection est triple avec un réfractomètre Waters, un détecteur MALS (Multi Angle Light Scaterring) 18 angles (Wyatt) et un dn/dC de 0,142 (W02012/089777). Les données sont traitées avec le logiciel Astra (Wyatt). Résultats Comparaison des différentes souches bactériennes recombinantes Plusieurs souches recombinantes sont comparées : SBP9-24, KCB1 et KCB2, afin de sélectionner la souche la plus intéressante en termes de qualité et de quantité pour la production du polysaccharide d'intérêt. Pour ce faire, il a été décidé dans un premier temps de comparer ces souches sur la synthèse de l'accepteur chimérique (GlcA-Lac). Le lactose doit être correctement internalisé dans la bactérie pour permettre une accumulation suffisante en intracellulaire de GlcA-Lac. Ce dernier pourra alors être reconnu en tant qu'accepteur par KfoC. Ainsi durant les cultures des différentes souches recombinantes, plusieurs prélèvements ont été faits afin d'évaluer par CCM les concentrations et la répartition du lactose et du GlcA-Lac. Il est possible de différencier les souches sur certains points. Tout d'abord, pour la vitesse de consommation du lactose, les souches à trois plasmides KCB1 et KCB2 ont totalement consommé le lactose du l' jour après 24 à 48h ce qui n'est pas le cas de SBP9-24. Au vu de ce résultat, il a été décidé de procéder à une seconde injection de lactose (1,6 g/L) au bout de 48h, ce sera également le cas pour toutes les autres cultures. Ce constat s'accorde avec un deuxième qui est que le lactose est beaucoup plus rapidement internalisé par les souches KCB 1 et 2 que par la souche SBP9-24 où l'on observe plus longtemps du lactose en extracellulaire après une injection. Dans le cas des 3 souches, on observe que le lactose est métabolisé en GlcA-Lac, signe que le début de la synthèse métabolique a lieu. Il semble cependant que les souches à trois plasmides soient plus performantes au niveau de la production de GlcA-Lac (forte vitesse de consommation en lactose, présence plus importante en GlcA-Lac en fin de culture). Dans un second temps, les souches sont comparées sur la production de chondroïtine elle- même, par le biais de dosages colorimétriques des acides uroniques et des osamines, permettant de quantifier la production de chondroïtine pour chaque souche. Une production accrue d'acides uroniques et d'osamines dans les souches à trois plasmides est observée (Figure 3). Une des raisons pouvant expliquer cette différence est le fait que la souche SBP9-24 pousse plus difficilement que les deux souches à trois plasmides. Entre KCB1 et KCB2, il semble que KCB2 produise davantage, signe que l'expression de GlcA-T n'a pas besoin d'être très forte puisque que cette enzyme est codée dans un plasmide à nombre moyen de copies (pBBR) chez KCB2 et non avec un plasmide à fort nombre de copies (pBS) dans KCB1. Il semble donc que la souche recombinante KCB2 soit la plus productive en chondroïtine à partir de l'accepteur chimérique, C'est donc cette souche qui a été choisie pour faire la production et la caractérisation de la chondroïtine. Analyse de la production de chondroïtine par la souche KCB2 Il est important de montrer que la production de chondroïtine chez KCB2 se fait à partir de l'accepteur chimérique, le glucuronyl-lactose. Pour cela, une souche contrôle, KCO1, est construite, elle ne posséde pas le gène codant pour GlcA-T. Ainsi, ce contrôle négatif ne peut transformer le lactose en GlcA-Lac. Cela donne une indication sur la production de chondroïtine lorsque le glucuronyl-lactose n'est pas présent. L'absence de glucuronyl-lactose chez KCO1 entraîne une baisse de la concentration en acide uronique et en osamine (Figure 4) donc en chondroïtine (0,5 g/L) dans la fraction intracellulaire. Cette quantité est environ trois fois inférieure à celle produite chez KCB2 (1,7 g/L). Ainsi, il apparaît qu'en l'absence de glucuronyl-lactose, la synthèse de chondroïtine s'effectue quand même, nécessairement à partir d'un accepteur endogène. La production de chondroïtine dans la souche recombinante KCB2 est également comparée à celle dans un autre contrôle : la souche KCO3. Cette souche est dépourvue du gène codant pour KfoC. Son absence dans la souche KCO3 résulte en la quasi absence d'acide uronique et d'osamine que ce soit dans la fraction intracellulaire ou en extracellulaire (Figure 4). A partir de la CCM issue des prélèvements de culture, il est observé que la production de glucuronyl-lactose a bien lieu. Ainsi, KfoC est indispensable à la synthèse de chondroïtine et cela même si l'accepteur chimérique est présent. Caractérisation et analyse de la chondroïtine Il a été montré précédemment qu'en l'absence de glucuronyl-lactose, la synthèse de chondroïtine a lieu à partir d'un accepteur endogène. Cela correspond à des résultats en synthèse in vivo montrés dans diverses publications. Cependant, l'analyse en GPC donne une taille de chondroïtine chez KCB2 (produite à partir de glucuronyl-lactose) de 17,5 kDa (Figure 5A) alors que les publications font rapport d'une taille de chondroïtine synthétisée (chez K4 ou K5) aux alentours de 100 à 600 kDa. On peut dès lors se demander si la faible taille obtenue chez KCB2 est due aux propriétés de la souche K12 ou au fait d'initier la synthèse par un accepteur différent. Pour répondre à cette question, une analyse en GPC est également menée sur les produits purifiées de KCO1 (souche contrôle sans GlcA-T) et la taille mesurée de la chondroïtine produite est d'environ 73 kDa (Figure 5B). Ainsi, la présence de glucuronyllactose, en tant que précurseur de la synthèse, entraîne la production d'une chondroïtine différente, plus petite de celle produite à partir de l'accepteur endogène. Un autre fait remarquable est qu'en présence de glucuronyl-lactose, la chondroïtine de 73 kDa est complètement absente (taille entre 15 et 20 kDa, polydispersité de 1,35) (Figure 5A). Deux hypothèses peuvent être formulées pour expliquer ce constat. La première est que la production de glucuronyl-lactose résulte en une plus grande présence de substrat pour KfoC que lorsque seul l'accepteur endogène est utilisé. Ainsi, l'enzyme KfoC recommence plus souvent la synthèse à partir d'oligosaccharides et de précurseur au lieu de poursuivre l'élongation de polysaccharides. Il en résulte ainsi une baisse de la taille moyenne de la chondroïtine produite. La seconde hypothèse est que l'environnement membranaire stabilise le couplage enzyme- chondroïtine au profit de la polymérisation du polysaccharide. En effet, à l'état sauvage, la synthèse de chondroïtine a lieu au niveau de l'espace péri-membranaire, l'accepteur endogène étant membranaire. A ce niveau, KfoC a l'appui de complexe membranaire pour la synthèse de chondroïtine dont les rôles sont mal connus (Whitfield, 2006). Le glucuronyllactose étant cytoplasmique, la synthèse, dans le cas de cette étude, a alors lieu loin de la membrane. Ce positionnement cytoplasmique de la synthèse a pu avoir un impact sur l'élongation de la chondroïtine. La production de chondroïtine dans une souche recombinante non pathogène de E. coli est donc intéressante car elle apporte, par rapport aux autres modes de production, une facilité de manipulation. Sur le plan qualitatif, la chondroïtine obtenue est d'une taille plus faible que celle obtenu par d'autres moyens (15 kDa contre une centaine de kDa en culture et 20 kDa in vitro). Ce mode de production est aussi avantageux au niveau de la quantité produite qui atteint les 1,7 g/L alors que les plus hautes productions en fermenteur chez E. coli K4 sont rapportées comme ayant une production de 1,4 g/L (Schiraldi et al., 2010). La chondroïtine produite a été analysée par RMN. La structure du motif de repétition 1G1cAb-3GalNAcb-41 est confirmée par analyse RMN du 1E1 et du 13C, dont les résultats sont conformes à ceux publiés dans la littérature pour le polysaccharide K4 défructosylé et la chondroïtine de Pasteurella multocida. Le spectre RMN du proton montre des signaux à 4.55, 3.43, 3.64 ppm qui correspondent aux H-1, H-3, et H-2 du résidu Glcp-UA. Les signaux à 4.18 et 2.08 ppm correspondent aux H-4 et H(Ac) du résidu Galp-NAc. La RMN du carbone montre les assignements caractéristiques du groupement N-acétamido à 23.91 et 176.22 ppm. On retrouve aussi l'assignement caractéristique du C-6 du résidu Glcp-UA à 175.61 ppm. Exemple 3 : Production de chondroïtine dans E. coli à partir de béta-methylgalactoside exogène Les souches bactériennes sont préparées et cultivées selon le protocole décrit dans l'exemple 2, à l'exception du fait que le béta-galactoside exogène consiste en du béta- methylgalactoside, ajouté à raison de 4,2 grammes dans le milieu de culture. La quantité de béta-méthylgalactoside ajouté au milieu est identique à la quantité de lactose ajouté dans l'exemple 2, en tenant compte des masses molaires différentes des deux produits. La fraction chondroïtine produite présente une taille de 37-61 kDa, c'est-à-dire une taille inférieure à celle de la chondroïtine obtenue en absence d'accepteur exogène, mais supérieure à celle obtenue en présence de lactose. Exemple 4 : Production d'héparosane par une souche d'Escherichia coli K12 en présence de glucuronyl-lactose intracellulaire. La production d'héparosane recombinant représente un enjeu particulier car ils peuvent être utilisés comme précurseurs de l'héparine, en particulier s'ils sont de petite taille d'environ 15-20 kDa (Manzoni et al., 1996). L'héparosane est formé d'un enchainement de 1-4)-(3-GlcA(1-4)-a-G1cNAc-(1-1. Sa voie de biosynthèse est semblable à celle du polysaccharide K4 et les gènes associés à l'exportation sont les mêmes (Whitfield, 2006). Une souche d'E coli K12 a été modifiée pour produire de l'héparosane (Barreteau et al., 2012). Cette souche exprime les gènes kfiABCD de E. colt (X77617 du 23 octobre 2008), dont la présence est nécessaire et suffisante pour produire de l'héparosane en intracellulaire, d'une taille approximative de 80 kDa. Cette souche a maintenant été transformée par un plasmide exprimant la glucuronyltransférase de souris permettant la synthèse intracellulaire de glucuronyl-lactose en présence de lactose. Pour suivre le résultat de cette étude, un premier indice attendu de la prise en charge du glucuronyl-lactose par les polymérases est la synthèse d'un polysaccharide de plus petite taille, si on s'en réfère aux résultats obtenus avec la chondroïtine pour lesquels c'est effectivement le cas. La même souche a été cultivée dans des fermenteurs de 2 litres en présence (7,5g de lactose ajoutés dans l'alimentation sur 3 jours).et en absence de lactose extracellulaire. Les résultats sont les suivants : Dosage des acides uroniques de la fraction précipitée à l'éthanol : Sans ajout de lactose : 825 mg total (environ 0,8 g/L héparosane) Avec ajout de lactose : 444 mg total (environ 0,45 g/L héparosane) Analyse de la taille des héparosanes recombinants : Les fractions ont été analysées en SEC-MAL pour l'obtention de la taille et de la dispersité des héparosanes produits. Cependant, la présence importante d'agrégats a nécessité une étape ultérieure de purification par chromatographie d'échange d'ions. La fraction « sans lactose » a été passée sur DEAE-A25 et une fraction retenue représentant 40% du total déposé a appelée SL a été récupérée. La fraction « avec lactose » a été passée sur DEAE-A25 et une fraction retenue appelée AL1 représentant seulement 20% du total déposé a été récupérée, cet écart de rendement pouvant être dû à la nature des héparosanes produits. Il a été décidé d'utiliser un échangeur plus fort de type QAE-A25. Ceci a permis la récupération d'une deuxième fraction appelée AL2, représentant 30% du total de la fraction initiale.Les fractions SL, AL1 et AL2 ont été analysées en SEC-MALS sans formation d'agrégats (Figures 6A à 6C). Les caractéristiques des pics analysés sont les suivantes : Pic 1 Pic 2 SL % total (RI detection) 67 33 Mw (Da) 7,57 x 104 2,05 x 104 Mz (Da) 1,06 x 105 2,26 x 104 Polydispersité (Mw/Mn) 1,4 1,1 AL1 % 44 68 Mw (Da) 5,49 x 104 1,87 x 104 Mz (Da) 6,43 x 104 2,17 x 104 Polydispersité (Mw/Mn) 1,4 1,3 AL2 % 49 51 Mw (Da) 6,94 x 104 2,72 x 104 Mz (Da) 7,35 x 104 2,89 x 104 Polydispersité (Mw/Mn) 1,4 1,06 Tableau 2 : Caractéristiques des héparosanes produits La fraction SL est essentiellement composée d'un polymère de taille déjà observée (Barreteau et al., 2012). Cependant, elle possède aussi une fraction de taille plus faible qui représente environ 30% du total. Les fractions AL1 et AL2 se distinguent par un enrichissement de la plus petite fraction (pic 2), qui représente au moins 50-70 % du total basé sur une quantification en réfractométrie. La production intracellulaire dans une souche recombinante d'E coli K12 capable de synthétiser de l'héparosane recombinant induit une modification de la quantité et des caractéristiques des héparosanes produits. Il en résulte un enrichissement d'un héparosane de petite taille d'environ 20 kDa. Exemple 5 : Production d'héparosane dans une souche Escherichia coli K12 en présence de glucuronyl-lactose intracellulaire. Les gènes spécifiques pour la synthèse de l'héparosane d'E coli appartiennent au cluster de l'opéron K5 et sont : kfiA, codant pour une GlcNAc transférase; kfiB, dont le rôle est inconnu; kfiC, codant pour une glcA transférase; kfiD, codant pour une UDP-Glc deshydrogénase. Le but de cette étude est l'ingénierie métabolique de E coli K12 afin de permettre une synthèse d'héparosane à partir d'un accepteur cytoplasmique exogène béta-glucuronylé provenant de l'action de la GlcA-T de souris (codé par le gène glcAT) sur un béta-galactoside. Plusieurs souches sont réalisées, décrites dans le tableau ci-dessous. La souche HB5 est décrite dans Barreteau et al. (2012). Souche Hôte Plasmides pBBR-kfiAB Tet, low copy PSU-kfiCD - pBBR-GlcAT- pBBR- pBS-kfiAC pSU-G1cAT Cm, low kfiD kfiABCD Amp, high copy Cm, low copy copy Tet, low copy Tet, low copy HB5 DJ + + - - - KHB1 DJ - - + - + _ KHB2 DJ - - - + - + KHB3 DJ - - + + + Tableau 3 : Caractéristiques des souches réalisées Une première souche KHB1 est réalisée, exprimant les gènes kfiA et kfiC codant pour les 2 glycosyltransférases impliquées dans la synthèse de l'héparosane dans un plasmide pBluescript (pBS) à grand nombre de copies, aux côté des gènes kfiD (synthèse d'UDP-GlcA) et glcAT (glucuronyltransférase de souris). Cette souche n'exprime pas KfiB, dans la mesure où il a été montré que cette protéine favorise la fixation de KfiC à la membrane, où se situe l'accepteur endogène membranaire (Hodson et al., 2000). Le but ici étant de réaliser la synthèse d'héparosane à partir du glucuronyl-lactose, on peut penser que cette association à la membrane ne soit plus nécessaire, voire néfaste car la localisation de l'accepteur endogène est également membranaire. Deux cultures sont menées avec ou sans lactose ajouté. Le lactose est ajouté à raison de 7,5g (pour 2 1 de culture) de façon continue pendant les 3 jours d'alimentation après induction. Les résultats sont obtenus après précipitation éthanolique de la fraction intracellulaire et dosage des acides uroniques. Aucune synthèse d'héparosane n'a été obtenue, que ce soit en présence ou en absence de lactose (Tableau 4). Ces résultats corroborent néanmoins ceux de la publication de Hodson et al., (2000), qui mentionne le rôle crucial de KfiB dans la stabilité du complexe enzymatique héparosane synthase. Il est donc décidé d'exprimer l'ensemble des gènes kfiABCD, en y ajoutant l'expression de la glucuronyltransférase de souris. Pour ce faire, les 4 gènes kfiABCD sont clonés dans un même plasmide à faible copie, ceci afin de permettre la co-expression avec le gène glcA-T dans un deuxième plasmide pSU également à faible nombre de copies. La souche baptisée KHB2 est cultivée en présence et en absence de lactose. En absence de lactose, cette souche produit une quantité d'héparosane comparable à celle obtenue avec la souche HB5 précédemment publiée (Barreteau et al., 2012). Ceci est cohérent avec le faite que ces 2 souches sont comparables y compris quant aux niveaux d'expression des 4 gènes kfiABCD, tous clonés dans des plasmides à faible nombre de copies. L'absence de lactose prive la bactérie de l'accepteur potentiel glucuronyl-lactose, ce qui explique les résultats similaires avec la souche de référence. En présence de lactose, il s'en suit une réduction de la production d'héparosane, mais le fait intéressant est que l'on observe un enrichissement de la fraction héparosane de petite taille, ce qui laisse présager que le complexe héparosane synthase a pris en charge le glucuronyl-lactose comme accepteur de polymérisation, dans la mesure où ce phénomène s'observe avec la synthèse de chondroïtine à partir du glucuronyl-lactose. Ces résultats montrent un faible rendement de production d'héparosane, et une fraction polysaccharidique obtenue composée de 2 fractions de tailles différentes. Une nouvelle souche baptisée KHB3 est alors réalisée. Il s'agit en fait d'une souche pour laquelle le niveau d'expression des gènes kfiA et kfiC est augmenté, en comparaison des autres gènes, ceci afin d'augmenter le niveau des activités glycosyltransférases par rapport à l'expression de KfiB. Les résultats sont surprenants : en présence de lactose, la production d'héparosane est doublée par rapport à la souche de référence HB5, ce qui est tout à fait inédit. Ce résultat a été confirmé en cultivant cette même souche en présence de lactose-allyle. Sans lactose, il n'y a pas augmentation de la production d'héparosane, et ce, malgré la plus forte expression des enzymes héparosane synthase KfiA et KfiC. Egalement pour la chondroïtine, nous avions observé que l'ajout de lactose augmentait le rendement de production. Ceci laisse à penser que la concentration en accepteur endogène membranaire est un facteur limitant de la production de chondroïtine et d'héparosane dans la souche Escherichia coli K-12. La présence abondante d'un accepteur auxiliaire cytoplasmique lèverait cette limitation. La faible expression de KfiB suffit apparemment à stabiliser le complexe enzymatique KfiA/KfiC malgré la plus forte expression de ce dernier. L'analyse en GPC a été réalisée sur la fraction préparée à partir d'allyl-lactose (Figure 7). Elle est composée de 2 espèces polysaccharidiques de taille 53 kDa et 22 kDa présentant une très faible polydispersité. Ces tailles sont inférieures à ce qui est produit normalement avec les gènes kfi, dans notre laboratoire et aussi dans la littérature et brevets existants. Ce phénomène est conforme à ce qui est observé avec la production de chondroïtine, où une réduction de taille en présence du glucuronyl-lactose est également observée. Souche Sans lactose Avec lactose Avec lactose allyle HB5 1,2 Non réalisé Non réalisé KHB1 Non détecté traces Non réalisé KHB2 0,9 0,45 Non réalisé KHB3 0,84 2,6 2,7 Tableau 4 : Quantité d'héparosane produit (exprimée en g/L de culture). RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES Cimini et al. (2010) Appl. Microbiol, and Biotechnol, 85(6):1779-1787. Jin et al. (2011) Biosci. Biotechnol. Biochem., 75(7), 1283-1289. 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Procédé de production de glycosaminoglycane (GAG) dans une cellule génétiquement modifiée, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) l'obtention d'une cellule comprenant au moins - un gène exogène codant pour une enzyme capable d'exercer une activité glycosyl-transférase sur un substrat béta-galactoside, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule et la synthèse de glycosyl bétagalactoside, - un gène codant pour une enzyme capable de synthétiser ledit glycosaminoglycane à partir du glycosyl béta-galactoside, ou les gènes codant pour les enzymes de la voie de synthèse dudit glycosaminoglycane à partir du glycosyl béta-galactoside, et les éléments permettant l'expression dudit ou desdits gènes dans ladite cellule, - un gène codant pour une enzyme capable d'assurer l'internalisation par la cellule de béta-galactoside exogène, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, b) la culture de ladite cellule en présence de béta-galactoside exogène et dans des conditions compatibles avec la production dudit glycosaminoglycane par ladite cellule. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'enzyme capable d'exercer une activité glycosyl transférase sur un substrat béta-galactoside est une glucuronyl-transférase de mammifère, de préférence la glucuronyl-transférase de souris. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que ladite cellule comprend en outre un gène codant pour une enzyme capable de synthétiser l'UDP-GlcA à partir d'UDP-Glc, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'enzyme capable de synthétiser l'UDP-GlcA à partir d'UDP-Glc est une UDP-glucose deshydrogénase, de préférence l'UDP-glucose déshydrogénase codée par le gène kfiD de E. coli K5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite cellule comprend en outre un gène codant pour une enzyme capable de synthétiser l'UDPGa1NAc, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ladite cellule est choisie parmi les bactéries et les organismes eucaryotes. 7 Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ladite bactérie est une bactérie de souche Escherichia coli non pathogène. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit glycosaminoglycane est la chondroïtine. 9. Procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée selon la revendication 8, dans lequel l'enzyme capable de synthétiser la chondroïtine à partir de glucuronyl-béta-galactoside est la chondroïtine synthase bactérienne de la souche K4 d'Escherichia coli capable de synthétiser la chondroïtine à partir de glucuronyl-lactose. 10. Procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée selon l'une des revendications 8 ou 9, ledit procédé comprenant l'obtention d'une cellule bactérienne de souche Escherichia coli, de préférence une cellule de souche K12 d'Escherichia coli, ladite cellule bactérienne comprenant au moins : - un gène exogène codant pour une glucuronyl transférase de mammifère, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène exogène codant pour une chondroïtine synthase bactérienne, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène exogène codant pour une lactose perméase, et les éléments permettant l'expression dudit gène dans ladite cellule, - un gène exogène codant pour une UDP-glucose deshydrogénase, et - un gène exogène codant pour l'UDP-N-acetyl-glucosamine épimérase de Pseudomonas aeroginosa, et les gènes wcaJ et LacZ de ladite cellule bactérienne ayant été inactivés.11. Procédé de production de chondroïtine dans une cellule génétiquement modifiée selon l'une des revendications 8 à 10, ledit procédé comprenant l'obtention d'une cellule bactérienne de type Escherichia colt, de préférence une cellule de la souche K12 d'Escherichia colt, ladite cellule comprenant au moins les gènes glcA-T, kfoC, kfiD et wbpP. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit glycosaminoglycane est l'héparosane. Procédé de production d'héparosane dans une cellule génétiquement modifiée selon la revendication 12, ledit procédé comprenant l'obtention d'une cellule bactérienne de souche Escherichia colt, de préférence une cellule de la souche K12 d'Escherichia colt, ladite cellule comprenant au moins : a) le gène glcA-T, et b) les gènes kfiA, kfiB kfiC et kfiD de E. colt ou au moins un gène codant pour une protéine ayant une fonction homologue à celle d'une protéine codée par kfiA, kfiB kfiC ou kfiD. Utilisation d'une cellule de Escherichia colt comprenant au moins les gènes glcA-T, kfoC, kfiD et wbpP pour la production de chondroïtine. Utilisation d'une cellule de Escherichia colt comprenant au moins les gènes glcA-T, kfiA, kfiB kfiC et kfiD pour la production d'héparosane. Utilisation de glycosaminoglycane obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 13 pour la préparation d'un médicament, d'une composition alimentaire ou d'un produit cosmétique. 12. 13. 14. 15. 16.25