Brevet FR3011937A1 — publié le 20150417

Procédé d'identification de l'espèce animale mammifère d'origine de la viande ou gélatine d'un échantillon à tester La présente invention concerne un procédé d'identification de l'espèce animale d'origine éventuelle de protéines contenues dans un échantillon de matière biologique à tester, et plus particulièrement un procédé d'identification de l'espèce animale bovine, ovine ou porcine d'origine éventuelle de la viande ou de la gélatine de l'espèce animale bovine, ovine ou porcine d'origine éventuelle de la viande ou de la gélatine d'une dite espèce animale particulière, éventuellement contenue dans un échantillon de matière alimentaire à tester. On entend ici par "échantillon de matière alimentaire", aussi bien un prélèvement de viande ou de gélatine ou d'un plat ou produit alimentaire susceptible d'en contenir et suspecté de provenir d'une espèce animale indéterminée et dont on veut déterminer les différentes sources animales de la viande ou gélatine qu'elle contient. On entend ici par «viande », l'ensemble des aliments animaux constitués par les tissus musculaires associés à du gras, des nerfs et du sang, ainsi que la triperie et les abats. C'est une production agricole issue de l'élevage ou un produit de la chasse. Les animaux producteurs de viande sont les animaux de boucherie, les animaux de basse-cour et les gibiers. La consommation de viande est controversée et, dans diverses cultures et religions, frappée de certains interdits. La gélatine est utilisée comme épaississant, stabilisant ou agent texturant dans des produits comme les confiseries, les crèmes glacées, les confitures, les yaourts, la margarine, les gâteaux... Elle est également utilisée dans les produits allégés pour simuler la sensation de gras en bouche et créer de la texture sans ajouter de calories L'identification précise de l'espèce animale d'origine éventuelle de protéines contenues dans un échantillon de matière alimentaire de la viande ou gélatine est requise dans les contrôles sanitaires en vu de détecter des fraudes éventuelles et aussi à des fins de pratiques religieuses ou coutumières notamment dans le cas de l'origine porcine. C'est pourquoi, se sont développé les méthodes moléculaires basées sur l'analyse de l'ADN pour l'identification des animaux. Ces méthodes reposent sur l'amplification par un procédé connu par ailleurs comme «Polymerase Chain Reaction» (PCR) d'un ou de plusieurs fragments de l'ADN du génome de l'espèce animale. L'ADN amplifié est ensuite séquence, la séquence obtenue est comparée avec des séquences contenues dans des bases électroniques de données. Toutes les méthodes basées sur l'amplification d'ADN par PCR sont sujettes à des risques importants de contamination et de faux positifs. Il est donc nécessaire de développer d'autres techniques d'identification faisant appel à des méthodes ne dépendant pas de l'opérateur (méthodes objectives), mais permettant une connaissance cumulée sous forme de bases de données. Il a été montré que d'autres molécules organiques pouvaient être utilisées comme marqueurs d'identification animale. Parmi ces molécules organiques, les protéines présentent l'avantage d'avoir une séquence et éventuellement une structure résistant aux dégradations après la mort de l'animal. Actuellement, le séquençage des acides aminés qui constituent une protéine peut être utilisé pour identifier des espèces animales. Toutefois, ces techniques sont limitées à l'analyse d'un tout petit nombre de protéines, essentiellement les kératines et l'albumine. En outre, les techniques de séquençage des protéines sont des techniques extrêmement sophistiquées demandant un équipement très spécifique et une expertise rare dans ce domaine. Dans les articles de BUCKLEY et al. dans Rapid Communications in Mass Spectrometry, vol. 23, n°23, 2009-12, pp 3843-3854 et dans Analytical Biochemistry, vol. 374, n°2, 2008-03, pp 325-334, on a analysé des préparations peptidiques spécifiques connues provenant de digestion enzymatique du seul collagène extrait d'échantillons de fragments d'os d'espèces animales mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF, ce qui a permis de discriminer certaines des espèces animales mammifères entre elles par analyse d'un nombre limité de pics des spectres obtenus. Dans l'article de MAZZEO et al., dans Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 56, n°23, 14 novembre 2008, pp 11071-11076, on a réalisé une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF d'extraits protéiques d'échantillons de tissu musculaire de poissons qui ont permis, sur la base de l'analyse d'un seul pic spécifique autour de 11 kDa, de discriminer certaines espèces de poissons proches phylogénétiquement. Les inventeurs ont déterminé qu'il était possible, à partir de préparations peptidiques ou d'extraits de protéines totales d'échantillons de matière alimentaire contenant ou pas de la viande ou gélatine d'origine animale ou non, d'obtenir des spectres contenant une grande diversité de pics caractéristiques selon l'espèce animale en cause par spectrométrie de masse appelée «matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight» (MALDI-TOF). En outre, les inventeurs ont déterminé des profils de pics spécifiques selon l'espèce animale. Plus généralement, les inventeurs ont démontré que l'analyse des profils de spectres par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, constituait une nouvelle méthode d'identification spécifique de la viande ou gélatine d'origine d'espèce animale. Ce type d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF selon la présente invention offre des avantages sur les méthodes actuellement disponibles. Premièrement, elle ne repose pas sur l'observation morphologique ni macroscopique ni microscopique et peut donc être appliquée non seulement à des produits intègres mais aussi à des fragments de produits. Deuxièmement, il suffit de disposer d'un petit fragment de produit dont le volume est toujours disponible quelques soient les circonstances y compris lorsqu'il s'agit d'analyser la composition en espèces animales d'aliments contenant de tels composant broyés. Troisièmement, il s'agit d'une technique rapide puisque l'identification peut être obtenue dans un délai sensiblement inférieur au délai actuel d'obtention des séquences d'ADN. Quatrièmement, la méthode est extrêmement moins coûteuse puisque après investissement dans l'achat d'un spectromètre de masse, le coût d'une analyse est inférieur de 1 centime d'euro. Cinquièmement, cette approche permet de constituer des bases de données à partir desquelles les différents utilisateurs peuvent identifier les espèces animales dont les représentants sont contenus dans la base de données, et augmenter par eux-mêmes la base de données en incrémentant des nouveaux profils et des nouvelles espèces animales. Enfin, contrairement aux méthodes actuelles reposant sur l'analyse d'une seule protéine, l'approche développée selon la présente invention consiste à analyser le cas échéant toutes les protéines présentes dans l'échantillon initial en garantissant la sensibilité et la spécificité de l'approche. Le but de la présente invention est donc de fournir une méthode améliorée d'identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF de l'espèce animale d'origine de viande ou gélatine dans une matière alimentaire. Selon la présente invention, on réalise l'analyse de spectres 20 complets de spectrométrie de masse MALDI-TOF de préparations peptidiques ou d'un extrait de protéines totales d'un échantillon de matière alimentaire Plus précisément, la présente invention fournit un procédé d'identification de l'espèce animale bovine, ovine ou porcine d'origine 25 éventuelle de la viande ou de la gélatine d'une dite espèce animale particulière, éventuellement contenue dans un échantillon de matière alimentaire à tester, dans lequel on réalise les étapes suivantes dans lesquelles: a/ on réalise une préparation d'un extrait protéique de protéines 30 entières ou d'un extrait peptidique à partir dudit échantillon, et b/ on réalise un spectre de ladite préparation par spectrométrie de masse dite de type MALDI TOF, et c/ on compare le spectre obtenu à l'étape b/avec au moins un spectre de référence d'un dit extrait protéique ou respectivement peptidique d'un échantillon de référence de viande ou de produit alimentaire en contenant, ladite viande étant choisie au moins parmi de la viande bovine, viande ovine et viande porcine, ou un échantillon de référence de gélatine ou de produit alimentaire en contenant, ladite gélatine étant choisie au moins parmi de la gélatine bovine ou gélatine porcine, et d/ On identifie la présence de viande ou respectivement de gélatine de l'espèce animale mammifère bovine, ovine ou porcine d'origine du dit échantillon testé comme étant celle d'une dite espèce animale de référence si on retrouve dans le spectre obtenu à l'étape b/ ci-dessus, des pics en commun comprenant au moins des pics spécifiques d'un dit spectre de référence de l'étape c/ ci-dessus le cas échéant et/ou par détermination de la proximité du spectre de l'échantillon testé avec un spectre de référence , de préférence par classification hiérarchique. On entend ici par "pic caractéristique", un pic dont l'intensité relative, exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité, est supérieure à au moins 3 fois celle du bruit de fond. On entend ici par "pic en commun entre le spectre obtenu et un spectre de référence", un pic dont la masse moléculaire ne se différencie pas de plus de ±1 Da par rapport à la masse moléculaire du pic du spectre de référence et présentant une intensité relative ne s'écartant pas de ±20% de la valeur d'intensité relative dudit pic dans le spectre de référence exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité dans le spectre, comme explicité ci-après. A l'étape d), l'analyse de la proximité du spectre de masse obtenu pour l'échantillon testé par rapport aux spectres de référence par classification hiérarchique peut se faire dans une dite représentation de type clustering, dendogramme ou 2D décrite connue de l'homme l'art décrite ci-après. Selon d'autres caractéristiques particulières conventionnelles du procédé de l'invention, aux étapes b/ et c/: - les pics desdits spectres sont définis par une paire de coordonnées composées d'une abscisse constituée du rapport masse/charge (m/z) de 2 000 à 20 000 Da, plus particulièrement de 500 à 4000 Da, la coordonnée en ordonnée étant une intensité relative ou en unité arbitraire, et on retient de préférence dans le spectre que les 50, de préférence au moins les 70 pics de plus grandes intensités; et - on ne prend en compte lesdits spectres d'échantillons de référence et spectres d'échantillons à analyser que si lesdits spectres présentent un score de qualité supérieure à 2, ledit score de qualité étant constitué de l'addition des deux notes n1 et n2 ayant chacune une valeur de 0 à 6 avec : - n1 est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques dudit spectre n, tel que spécifié plus précisément dans l'exemple 2 ci-après, et - n2 est la note attribué en fonction de la valeur du rapport signal/bruit (Rmax) du pic de plus grande intensité dudit spectre, tel que spécifié plus précisément dans l'exemple 1 paragraphe 1.2 ci-après ; et - à l'étape c/ de comparaison, on compare le spectre obtenu avec des spectres de référence d'une dite banque comprenant les spectres différents d'échantillons de de référence, en retirant, dans les spectres obtenus et les spectres de référence, les pics des spectres témoins négatifs les spectres de préparations provenant d'un matériel contenant des protéines ou composants chimiques utilisés pour les étapes d'extraction et/ou de purification à l'étape a/.Plus particulièrement, à titre de témoin négatif,le cas échéant ,on réalise des spectres de préparations peptidiques résultant de l'autolyse de l'enzyme, de préférence la trypsine, utilisée pour ladite digestion enzymatique de l'étape a/, et, de préférence, des spectres de préparations purifiées provenant de la digestion enzymatique de composants chimiques provenant d'une colonne de purification utilisée à l'étape a/. On entend ici par "intensité relative", une intensité exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité ou autrement exprimée par le rapport de (intensité du pic/ intensité du bruit de fond). Selon d'autres caractéristiques préférées, à l'étape c/ : - le spectre de référence de la viande de boeuf comprend les pics spécifiques suivants : 2162 Da, 3256 Da, 3616 Da, 6511 Da, 8477 Da, 13733 Da, 13882 Da, 13997 Da, 16952 Da et 17070 Da; - le spectre de référence de la viande de porc comprend les pics spécifiques suivants : 3341 Da, 4999 Da, 5457 Da, 5471 Da, 7518 Da, 8474 Da et 16946 Da; - le spectre de référence de la gélatine de porc comprend les pics spécifiques aux valeurs de masse (m/z) suivantes : 1177 Da, 1180 Da, 1666Da, 1892 Da, 2005 Da, 2188 Da, 2980 Da, 3265 Da, 3281 Da et 20 3605 Da; et - le spectre de référence de la gélatine de boeuf comprend les pics spécifiques suivants : 1192 Da, 1297 Da, 1308 Da, 1427 Da, 1580 Da, 1580 Da, 1632 Da, 1769 Da, 1922 Da, 1975 Da, 2216 Da, 2404 Da, 2549 Da et 2853 Da. 25 Selon d'autres caractéristiques plus particulières, à l'étape c/, on compare le spectre de référence de la gélatine de porc et de boeuf comprend les pics caractéristiques mentionnés dans le tableau 1, pour la gélatine de porc, et le tableau 2, pour la gélatine de boeuf, décrits à l'exemple 2 ci-après dans lesquels les différents pics caractéristiques présentent les paramètres mentionnés suivants : -m/z : rapports (masse/charge) en abscisse des différents pics caractéristiques du spectre, les différentes valeurs de m/z pouvant varier de Plus particulièrement, le procédé, dans un deuxième mode de réalisation, est caractérisé en ce que : - à l'étape a/, ledit échantillon à tester est un échantillon de produit alimentaire susceptible de contenir un agent gélifiant ou texturant choisi de préférence parmi (a) les produits alimentaires sucrés comprenant les confiseries, les crèmes glacées, les confitures, les yaourts et les gâteaux et (b) produits alimentaires allégés texturé pour simuler la sensation de gras en bouche et créer de la texture comme la margarine, et -à l'étape c/, on compare le spectre de l'échantillon testé avec les spectres de référence de gélatine comprenant au moins le spectre de la gélatine de porc, et - à l'étape d/, on identifie le cas échéant la présence de gélatine de porc dans l'échantillon si le spectre de l'échantillon testé comprend au moins les pics spécifiques du spectre de référence de la gélatine de 25 porc. Plus particulièrement, à l'étape a/, on réalise une préparation peptidique ou protéique présentant une concentration d'au moins 100 mg/ml, de préférence de 300 à 100 mg/ml. Plus particulièrement encore, à l'étape a/, on réalise un extrait protéique de protéine entière d'un échantillon de viande ou de produit alimentaire en contenant par les étapes successives suivantes de : - broyage de morceaux dudit échantillon, et - une dilution de dudit broyat, de préférence dans de l'eau distillée et/ou un solvant de solubilisation de protéines, de préférence encore de l'acide formique et/ou de l'acétonitrile, pour obtenir une dite suspension de dudit broyat, et - élimination ladite suspension de dit broyat analysée étant débarrassée des débris solides de taille supérieure à 100 pm, de préférence supérieure à 50 pm, dans ladite suspension de broyat, de préférence par centrifugation, et récupération d'un dit extrait protéique à partir de ladite suspension, de préférence par récupération du surnageant et sans désalinisation de ladite suspension de centrifugation. Plus particulièrement encore, à l'étape a/, on prépare un extrait peptidique de gélatine ou de produit alimentaire en contenant par les étapes successives suivantes de : - mise en suspension de morceaux dudit échantillon dans une solution tampon aqueuse, de préférence une solution de bicarbonate d'ammonium, puis - chauffage à 80°C de ladite suspension pour obtenir une liquéfaction de la gélatine, et - ajout d'une enzyme de digestion enzymatique, de préférence trypsine porcine, pour obtenir un dit extrait protéique. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faite de manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 représente les spectres d'échantillons de viande de boeuf hachée (spectre 1A) et d'un plat cuisiné consistant dans des tomates cuites farcies de viande de boeuf (spectre 1B) de l'exemple 1, l'intensité des pics étant exprimée en unité arbitraire (ua). -la figure 2 représente les spectres de différents échantillons de viande de porc (spectre 2A) et d'un plat cuisiné consistant dans des pieds de porc (spectre 2B) et de cervelas de porc (spectre 2C) de l'exemple 1, l'intensité des pics étant exprimée en unité arbitraire (ua). - la figure 3 est une représentation en dendogramme de la proximité des spectres de 17 types d'échantillons de viandes et plats cuisinés ou produit alimentaire en contenant de l'exemple 1, les valeurs d de 0 à 1 000 sur l'axe sont les niveaux de "distance" entre les types d'échantillons concernés. - la figure 4 représente un spectre d'échantillon de gélatine de boeuf commenté au paragraphe 2.3 de l'exemple 2, - la figure 5 représente un spectre d'échantillon de gélatine de porc commenté au paragraphe 2.3 de l'exemple 2, - la figure 6 représente 4s spectres de différents échantillons de gélatine (spectres A6 et B6) et produits alimentaires (bonbons) en 20 contenant (spectres C6 etD6) commentés au paragraphe 2.3 de l'exemple 2. Exemple 1 : Détection de viande dans des plats cuisinés. 1.1) Protocole de préparation des échantillons d'extraits protéiques. 25 On réalise une dilution de dit broyat, de préférence dans de l'eau distillée et/ou un solvant de solubilisation de protéines, de préférence encore de l'acide formique et/ou de l'acétonitrile, pour obtenir une dite suspension de broyat d'une concentration de 100 à 1000 mg/ml de préférence de 100 à 200 mg/ml. Ladite suspension de dit broyat analysée étant débarrassée des débris de taille supérieure à 100 pm, de préférence supérieure à 50 pm, de préférence par centrifugation et récupération du surnageant et sans désalinisation de ladite suspension. Pour faire, plus précisément, les échantillons de viandes ou de plats cuisinés ou produits alimentaires à base de viande sont découpés en morceaux de 2 mm3 puis lavés à l'eau distillée afin d'éliminer les sels, puis broyés après mise en suspension dans 200 pl d'eau HPLC contenant 200 pl d'acide formique à 70% et de l'acétonitrile. Puis les protéines sont solubilisées extraites grâce à l'acétonitrile et les débris restant sont éliminés par centrifugation 2 minutes à 13000 g. Il n'y a pas de digestion enzymatique des échantillons. On obtient donc un échantillon d'extrait protéique de protéines totales dans le surnageant de centrifugation par analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF. De façon connue, on réalise un broyage grâce à des particules de 15 poudre de verre de taille inférieure à 100 pmpar fragmentation mécanique effectuée à l'aide d'un dispositif de type FastPrep -24 Instrument (MP biomedicals, FRANCE). 1.2) Acquisition des spectres par spectrométrie de type MALDI- TOF sur des extraits protéiques d'échantillons de viande ou produit 20 alimentaire à base de viande. L'échantillon est co-cristallisé avec une matrice de type hcca (acide 4-hydroxy alpha-cyano cinnamique) puis les spectres seront obtenus sur l'appareil Microflex LT® (Bruker Daltonics) selon la méthodologie suivante : 25 Le protocole de dépôt comprend les étapes suivantes consistant à: 1- déposer 1 pL d'extrait protéique sur une position prédéfinie (cercles appelés « spots ») de la cible (plaque en acier inoxidable BRUKER DALTONICS, 2- déposer 1 pL de matrice (HCCA à saturation dans 50% d'acétonitrile 2,5% d'acide trifluoroacétique, qsp eau distillée), 3- laisser sécher pendant 5 minutes à température ambiante, 4- introduire la plaque contenant les dépôts dans le spectromètre 5 de masse, 5- Démarrer l'ordinateur associé au spectromètre pour lancer les analyses, et 6- Lancer l'acquisition des spectres de masse MALDI-TOF. Les paramètres appliqués au spectromètre de masse sont les 10 suivants : - Mode linéaire positif - Electrode 151 : 20,00 kV, Electrode IS2 : 18,055 kV, Electrode de focalisation : 6,0 kV - Post-ion-extraction (PIE) : 120 ns, Fréquence du laser : 60Hz, 15 Gain du détecteur : 8,8 X, Gamme de masse : de 2 000 à 20 000 Da. Les spectres sont obtenus via une méthode automatique contrôlée par le logiciel FLEXCONTROL® du fabricant BRUKER DALTONICS® les paramètres sont les suivants pour chaque spot : - Somme de 240 tirs par série de 40 tirs 20 - Afin que les tirs aient balayé l'ensemble de l'échantillon de façon homogène l'acquisition se fait sur 6 positions différentes selon une géométrie hexagonale. - Pré-tirs : 10 tirs à 40% de la puissance maximum laser servent à dessaler l'échantillon (contamination par les sels minéraux) 25 - Puissance laser : 30 % à 45 °h - Sélection du spectre : sur une gamme de masse de 4 000 à 20 000 Da. Le spectromètre est régulé via le logiciel FLEXCONTROL® qui est le logiciel de gestion du spectromètre de masse MALDI-TOF fourni par le fabricant Bruker Daltonics. - L'acquisition des spectres est au final réalisée via le logiciel Biotyper-RTC® du fabricant BRUKER DALTONICS® qui permet d'appliquer la méthode automatique décrite ci-dessus à une série d'échantillons en prenant en compte les critères mentionnés précédemment et un score de qualité ou score de validation qui représentent l'addition de 2 notes n1 + n2 (n1 étant fonction du nombre de pics et n2 fonction du rapport signal/bruit de fond). - n1 est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques du spectre n, avec . n1 = 0 pour n 8, n1 = 1 pour 8 Ledit spectre moyen issu de plusieurs spectres est établi par le logiciel BIOTYPER® à partir des spectres individuels dans lesquels sont recherchés des pics dits « valides » selon une méthode se résumant ainsi : - l'étendue du pic sur l'axe des abscisses ne doit pas excéder 25 Da, - la variation de la ligne de base du pic doit être contenue dans l'intervalle moyen de variation des lignes de base de l'ensemble des pics du spectre, et - l'intensité du pic est considérée lorsque le rapport signal/bruit de fond est supérieur à 3. Une fois les pics d'intérêt ainsi sélectionnés, le logiciel réalise une moyenne des intensités pour chaque valeur de m/z présents dans au moins 25% des spectres individuels. 1.3) Méthodes d'analyse des spectres. Les inventeurs ont comparé entre eux deux spectres moyens entre eux ou un nouveau spectre avec les spectres moyens contenus dans la base de données de spectres d'échantillons connus décrits ci-après grâce au logiciel BIOTYPER-RTC® développé par le fabricant du spectromètre de masse MALDI-TOF (BRUKER DALTONICS®). Le logiciel BioTyper® identifie des spectres inconnus par comparaison avec des spectres de référence stockés dans une base de données ou autre spectre comparatif par une analyse des pics qu'ils contiennent. Les résultats d'identification sont donnés sous forme de d'un score d'identification calculé comme ci-après explicité. Dans un premier temps, les deux spectres sont alignés. On assigne une erreur acceptable pour la masse des pics de chaque spectre (±1 Da) et le logiciel repositionne les deux spectres (autrement dit, si l'écart entre les pics du même spectre et entre les pics de l'autre spectre est trop différent, le logiciel ne pourra pas aligner les spectres). Ensuite, les spectres obtenus subissent le traitement suivant par le logiciel BioTyper® 3.0: - Une soustraction de ligne de base, afin d'éliminer le bruit de fond, et - Un lissage des pics par mise à 0 des intensités inférieures à un seuil égal à 10% de l'intensité du pic maximale, afin d'augmenter la résolution, puis - une liste de masse de pics est créée. 1.3.1) La comparaison d'un spectre inconnu avec le spectre de référence (par exemple, le spectre moyen présent dans la base de données) est évaluée en utilisant des scores d'identification dédiés. Les algorithmes, qui permettent de calculer ces scores, sont décrits dans le manuel fourni par Bruker Daltonics®. En résumé, le score d'identification est égal à log (indice1 + indide2 + indice3), avec : - un indice 1 de valeur maximale de 1000 quand l'ensemble des pics de la référence de la base de données sont trouvés dans le spectre à identifier, l'indice 1 étant de zéro si il n'y a aucune correspondance, et -un indice 2 étant de valeur maximale de 1000, si l'ordre de classification des pics par intensité croissante du spectre à identifier est identique à l'ordre de classification des pics de la référence, et -un indice 3 étant de valeur maximale de 1000, si les pics non attribués du spectre à identifier ne matche sur aucune référence. Les algorithmes, qui permettent de calculer ces scores, sont décrits dans le manuel fourni par BRUKER DALTONICS® qui donne un exemple succinct de la méthode employée dans son manuel "Software for microorganism identification and classification". Ainsi, un pic identique entre deux spectres ou avec un spectre de la base de données et le spectre analysé, obtient un score positif alors que l'absence d'un pic se traduit par un score négatif. L'ensemble des scores obtenus est exprimé en échelle logarithmique. Les scores obtenus pour identifier et classifier les microorganismes (Fournier PE, Couderc C, Buffet S, Flaudrops C, Raoult D. Rapid and cost-effective identification of Bartonella species using mass spectrometry. J Med Microbiol. 2009, 58:1154-1159) sont ceux que les inventeurs ont utilisés pour identifier et classifier les types de tissus solides cancéreux et non cancéreux. Ainsi, un score d'identification compris entre 0 et 1,699 permet d'exclure l'identité du spectre analysé avec celui d'un type donné présent dans la base de données ou le spectre avec lequel il est comparé. Un score d'identification compris entre 1,700 et 1,999 suggère que le spectre analysé est identique à celui présent dans la base de données et un score d'identification supérieur à 2,0 permet une identification certaine. 1.3.2) Les inventeurs ont analysé les distances ou proximités entre les différents spectres par regroupement ou classification hiérarchique, dit "clustering", en adaptant le logiciel MultiExperiment Viewer (MeV) 4.3. Ce logiciel gratuit et d'accès libre est accessible, entre autres, à l'adresse http://www.tm4.org/mev/. Il est classiquement utilisé pour analyser les données transcriptomiques en "microarray" (puces à ADN).Le "clustering" met en évidence les signatures spécifiques des différents types de viande et la représentation en dendogramme qui en résulte permet de mieux visualiser la "distance" relative entre plusieurs types de viande. Dans le dendogramme de la figure 3, les traits verticaux indiquent que les spectres des types ou groupes d'échantillons reliés présentent un certain pourcentage de pics en commun, ce pourcentage étant d'autant plus grand que les traits verticaux sont petits. La longueur des traits horizontaux délimitant un trait vertical, rend compte de la "distance" entre les spectres concernés, étant inversement proportionnelle au nombre de pics en commun. 1.4) Résultats des analyses de spectres. 1.4.1) Quand on compare les spectres d'échantillon de viande et échantillons de produit alimentaire ou plat cuisiné à base de la même viande ayant servie à sa fabrication, on observe de nombreux pics communs entre les spectres spécifiques des protéines de la viande qu'ils contiennent. Ainsi, à titre d'exemple illustratif, sur la figure 1 représente les spectres d'échantillons issus de viande de boeuf hachée (spectre 1A) et d'un plat cuisiné consistant dans des tomates cuites farcies de la même viande de boeuf hachée (spectre 1B), les encadrements de pics A à F représentent les pics spécifiques du spectre lA que l'on retrouve en commun dans le spectre 1B du plat cuisiné, à savoir : - Al : le pic à la valeur de masse (m/z) suivante : 2162 - B1 : les pics aux valeurs de masse (m/z) suivantes : 3256 Da, 3616 - Cl : le pic à la valeur de masse (m/z) suivante : 6511 Da - D1 : le pic à la valeur de masse (m/z) suivante : 8477 Da - El : les pics aux valeurs de masse (m/z) suivantes : 13733 Da, 13882 Da, 13997 Da - Fl : les pics aux valeurs de masse (m/z) suivantes : 16952 Da, 17070 Da. De même, sur la figure 2 représentant les spectres de différents échantillons issus de viande de porc (spectre 2A) et d'un plat cuisiné consistant dans des pieds de porc (spectre 2B) et de cervelas de porc (spectre 2C), les encadrements de pics A à F représentent les pics spécifiques du spectre 2A que l'on retrouve dans les spectre 2B et 2C, à savoir : - A2 : le pic à la valeur de masse (m/z) suivante : 3341 Da - B2 : le pic à la valeur de masse (m/z) suivante : 4999 Da - C2 : les pics aux valeurs de masse (m/z) suivantes : 5457 Da, 5471 Da, - D2 : le pic à la valeur de masse (m/z) suivante : 7518 Da - E2 : le pic à la valeur de masse (m/z) suivante : 8474 Da - F2 : les pic à la valeur de masse (m/z) suivante : 16946Da 1.4.2) Regroupement par classification hiérarchique La figure 3 est une représentation en dendogramme de la proximité des spectres de 17 types d'échantillons de viandes et plats cuisinés ou produit alimentaire en contenant résultant d'une analyse par classification hiérarchique, les valeurs d de 0 à 1 000 sur l'axe sont les niveaux de "distance" entre les types cellulaires concernés. Les distances (d) entre deux types cellulaires sont d'autant plus petites qu'ils sont proches, c'est-à-dire qu'ils ont d'autant plus de pics caractéristiques communs partagés dans leurs spectres (et vice et versa). Ainsi, sur la figure 3, les spectres 51 à 517 correspondent aux échantillons de : -51 : oreille de porc, -S2 : tomate farcie de viande de boeuf, -S3 et S4 : purées de pommes de terre et viande de boeuf hachée (dit «hachis parmentier») de deux sources commerciales différentes, -S5, S6 et S7 : viande hachée de boeuf de trois sources commerciales différentes, -S8 : selle d'agneau, -S9 : jarret d'agneau, -510 : pieds de porc, -511 : saucisse de viande majoritairement de porc, -512 : filet de longe de porc dit « filet mignon de porc » -513 : plat de lentilles et jambon et saucisses de porc dit «petit salé aux lentilles», -514 : saucisse sèche de viande de porc dénommé « saucisson», -515: saucisse à l'ail cuite de viande majoritairement de porc et cervelle de boeuf dénommé « cervelas », -516 et 517 : deux morceaux de viande de cheval différents : rôti de filet (516) et hampe (517). Sur la figure 3, on a effectué une classification hiérarchique de proximité en 6 groupes A3 à F3 de spectres des différents échantillons des différents types, à savoir : - groupe A3: spectre 51 -groupe B3: spectres S2 à S4 plats ou produits à base de viande de boeuf), - groupe C3: spectres S5 à S7 (viandes de boeuf), -groupe D3: spectres S8 et S9 (viandes d'agneau), -groupe E3: spectres 510 à 515 (plats ou produits à base de viande de porc) à S4, -groupe F3: spectres 516 à 517 (viandes de cheval). Sur la figure 3, Il y a « clusterisation » entre les différents types viandes d'une même espèce et des produits alimentaires ou plats cuisines en contenant à l'exception de l'oreille de porc ( spectre 51) qui est constituée de cartilages et non de muscles ce qui peut expliquer sa non « clusterisation » avec les viandes de porc et produits alimentaires en contenant. Les plats cuisinés ou produits alimentaires « clusterisent » avec les viandes qui ont servies à leur élaboration. Il est donc ainsi possible par clusterisation de déterminer l'origine de la viande ayant servie la fabrication d'un plat cuisiné. 1.4.3) Identification par score Biotyper. En outre, des spectres moyens des plats cuisinés et des viandes ont été réalisé grâce au Biotyper3.0. Les spectres moyens des plats cuisinés ont été comparés à une base de données comprenant les spectres moyens des viandes (l'identification est réalisée par homologie spectrale). Et, les scores ou indices d'identification suivants ont pu comme rapporté dans le tableau A ci-après : Tableau A : Plats cuisinés viandes ayant le plus de score pics communs parmentier de boeuf (S3) steak haché (S4) 1.796 petit salé aux lentilles (513) pied de porc 1.515 saucisson à l'ail (514) filet mignon de porc (512) 1.757 Saucisse de porc (511) filet mignon de porc (512) 2.109 cervelas (515) pied de porc (510) 1.545 On observe que le score d'identification permet une identification de la viande contenue dans un plat cuisiné par homologie spectrale avec le spectre de la viande ayant été utilisée pour la fabrication d'un plat cuisiné. Les scores plus bas, pour les plats plus proches du pied de porc, peuvent s'expliquer par le faible ratio de viande dans ces plats. Il apparait possible de déterminer par MALDI-TOF, l'origine de la viande dans plats cuisinés soit par « clusterisation » soit par identification via le score d'identification par biotyper 3.0. Exemple 2 : Détection de gélatine. 2.1) Préparation des échantillons. On a utilisé les gélatines suivantes: - Gélatine de peau de porc : fournisseur Sigma aldrich (DE), référence : G6144-100g - Gélatine de peau de boeuf : fournisseur Sigma aldrich (DE), référence : G9391-100g On a préparé des échantillons de gélatine en mettant 200 mg de poudre de gélatine de porc ou de boeuf dans un tube eppendorf. On a préparé des échantillons de produit alimentaire contenant de la gélatine (bonbons) en découpant à l'aide d'un scalpel un morceau solide de 2 mm3 et le mettant dans un tube eppendorf. On a préparé des extraits peptidiques par digestion enzymatique-comme suit. On ajoute 200 pl bicarbonate d'ammonium à 50mM pour constituer une solution tampon compatible avec la spectrométrie de masse MALDITOF,et on chauffe 30 min à 80 °C pour liquéfier le produit alimentaire. Puis, on ramène l'échantillon à 37°C et on ajoute 200 pl de trypsine porcine à 20 pg/ml pour réaliser la digestion enzymatique. Puis, on laisse incuber à 37°C au moins deux heures et on réalise les spectres de l'extrait peptidique obtenu avec un spectromètre Ultraflex. Ce protocole a permis d'obtenir des spectres de bonne résolution par une méthode automatique, ce qui est requis pour une méthode de diagnostic. 2.2) Acquisition des spectres par spectrométrie de type MALDI- TOF sur des extraits peptidiques d'échantillons de gélatine et ou produit alimentaire en contenant. Pour les spectres des figures 4 à 6, on a mis en oeuvre l'appareil spectromètre Ultraflex® (Bruker Daltonics) (à la place de l'appareil Microflex®) selon les mêmes méthodologie et matériel décrits à l'exemple 1, excepté les paramètres suivants pour la mise en oeuvre du spectromètre Ultraflex : Les paramètres appliqués au spectromètre de masse sont les suivants : - Mode linéaire positif - Electrode 151 : 25,00 kV, Electrode IS2 : 21,4 kV, Electrode de focalisation : 10,0 kV - Post-ion-extraction (PIE) : 10 ns, Fréquence du laser : 60Hz, Gain du détecteur : 9,1 X, Gamme de masse : de 1 000 à 4 000 Da. -Acquisition automatique (spectres sommés) : -Acquisition par séries de 50 tirs, -Nombres séries : 8 sur des positions différentes du spot (400 spectres), -Géométrie de déplacement : spiral large 2.3) Résultats 2.3.1) Le spectre de l'échantillon d'extrait de gélatine de boeuf est représenté figure 4 et comprend les pics listé au tableau 1 mentionné ci-après. Tableau 1 : m/z(Da) S/N m/z(Da) S/N m/z(Da) S/N 1064.5504 3.2 1604.7663 21.4 2363.0827 4.3 1089.5451 5.4 1620.7623 4.1 2415.0908 9.7 1095.5535 4.2 1636.7763 3.9 2420.5074 8.7 1105.5598 92.9 1655.7594 25 2428.2289 3.2 1111.5476 10.8 1666.7241 6 2430.1917 4.7 1112.539 9.3 1679.7895 5.7 2431.1251 14.3 1121.5649 32.3 1703.8013 5.6 2435.4989 3.1 1128.5227 3.1 1710.8253 3.1 2438.1289 9.7 1143.5795 4.4 1719.7835 22 2447.3393 4.1 1161.5528 5.5 1734.8028 7.2 2452.1014 4.6 1163.5686 6.5 1781.5761 3.7 2453.956 8.1 1177.5383 7.3 1795.8854 12.7 2535.1612 4.1 1180.6134 19.8 1797.7682 5 2629.2199 4.4 1203.5537 4 1812.8262 4.7 2637.1405 4.7 1224.6016 7.7 1824.29 3.1 2653.3792 13 1225.6049 8.5 1874.9104 3.4 2670.3747 6.7 1238.6497 4.7 1889.0583 3.2 2685.2375 6.9 1240.6281 38.7 1892.8711 6.9 2688.2093 15.1 1273.556 13.4 1946.5544 11.4 2750.9354 3.1 1289.5447 8.7 1961.9798 41 2766.5531 4.6 1332.6022 7.5 1997.92 7.1 2883.3897 28.3 1369.6561 6.8 2005.8507 4.2 2980.28 11 1385.6481 7.1 2012.977 27.9 2987.5863 10.4 1406.7289 3.8 2025.118 3.4 2993.6599 4 1408.6031 13.7 2026.8142 3.5 3084.7301 4.6 1417.6716 4.2 2027.9798 12.3 3136.7422 3.2 1435.63 23.5 2039.8506 3 3149.7971 3.1 1439.7931 3.8 2041.5675 7.7 3153.1893 7.7 1447.7031 7.5 2056.9905 17 3159.0632 5.7 1453.7046 29.7 2074.04 7.7 3167.6524 6.7 1457.6119 4.3 2081.9066 4.7 3183.3571 5.9 1459.6389 47.6 2090.0327 7.2 3225.4971 8.9 1466.6613 3.4 2108.0629 9.7 3241.3821 5.7 1473.6441 4.9 2131.0603 28.3 3265.5365 6.3 1550.7189 13 2164.9552 4.2 3281.4994 6.7 1562.7812 10.2 2188.069 9.1 3326.3907 4.1 1584.8205 4.3 2247.0596 3.2 3387.6835 5 1586.721 14.9 2274.1733 4.9 3408.5173 4.3 1588.7323 5.6 2290.1914 4.3 3605.5744 7.1 2.3.2) Le spectre de l'échantillon d'extrait de gélatine de porc est représenté figure 5 et comprend les pics listé au tableau 2 mentionné ci-après. Tableau 2 : m/z(Da) S/N m/z(Da) S/N m/z(Da) S/N 1069.461 9.4 1473.585 4.9 2082.1473 5.8 1079.4029 7.2 1496.640 4.1 2090.9751 3.2 1089.4818 5.7 1551.689 5.9 2094.9243 5.9 1095.4991 10.4 1562.724 15.7 2098.1622 5.8 1099.4691 3.5 1570.5722 3.7 2110.9573 3.6 1105.4949 57.2 1580.7297 8.7 2114.9805 5.6 1106.4994 58.6 1584.7381 3.4 2131.0813 26.2 1110.4887 3.6 1586.6714 24.8 2216.0978 17.5 1111.6003 6.5 1589.8855 3.7 2234.065 5.6 1112.4896 16.2 1606.6903 9.7 2255.1328 3.8 1115.451 5 1632.683 3.7 2265.0524 5.3 1121.5119 4.9 1636.7077 8.3 2274.9962 9.2 1126.472 5.6 1648.717 11 2404.1686 10.4 1128.4912 3.3 1655.722 28.5 2420.1458 4.4 1162.4916 8.7 1658.7382 8.6 2431.1797 3.1 1163.5039 8 1677.8796 5 2442.1288 3.4 1192.6785 6.7 1693.8848 4.4 2455.1526 4.3 1208.6609 5.9 1704.6192 3.3 2471.1366 8.5 1209.5748 13.8 1710.7781 7.7 2495.0013 5.7 1223.5316 9.3 1719.7657 21.1 2550.0524 6.3 1225.6113 7 1723.7549 4.4 2686.1971 3.3 1226.5151 9.5 1726.775 4.5 2690.3818 4.4 1239.5848 5 1769.7813 5 2781.2857 4.1 1241.5715 42 1813.7668 3.8 2853.4094 23.5 1251.5551 3.5 1820.7558 4.9 3003.0158 5.1 1267.6022 24 1889.0209 3.7 3068.871 5.7 1289.5212 4 1922.878 13.9 3085.1266 6.3 1308.5837 23.8 1960.8799 13 3101.3196 5.2 1332.6136 3.5 1975.9179 32.5 3110.494 3.6 1343.567 4.9 1981.9166 5.7 3151.3274 4.8 1409.6214 9.8 1997.9398 19.4 3169.6905 3.4 1427.6366 52.8 2020.0439 6.6 3212.2194 4.6 1435.5884 33.7 2026.816 3.4 3225.1279 5.1 1437.6497 8.2 2039.8831 3.9 3227.5677 13.2 1443.582 3.6 2041.8332 8.6 3383.9489 3.2 1447.6602 4.2 2056.031 13.8 3647.2458 5.2 1453.6407 3.2 2057.8893 20.2 1459.598 60.8 2074.9161 8.6 2.3.3) Les spectres d'échantillons gélatine de porc et respectivement de gélatine de boeuf ont été comparé via le logiciel Flexanalysis 3.3 (Bruker Daltonics, DE) afin de trouver des pics spécifiques à chaque espèces. La détection des pics est réalisée par une méthode automatique paramétrée per le logiciel Flexcontrol®. On a ainsi déterminé un profil spécifique à la gélatine de porc des pics spécifiques au porc pour les valeurs de masse (en M/Z) : 1177, 1180, 1666, 1892, 2005, 2188, 2980, 3265, 3281, 3605 Da. De même, On a ainsi déterminé un profil spécifique à la gélatine 10 de boeuf des 10 pics spécifiques au porc pour les valeurs de masse (en M/Z) : 1192, 1297, 1308, 1427, 1580, 1632, 1769, 1922, 1975, 2216, 2404, 2549, 2853 Da. 2.3.4) Test sur des échantillons contenant ou non de la gélatine On a testé différents types de produits sucrés ou de desserts du commerce selon les protocoles ci-dessus de préparation des échantillons et d'acquisition de spectres Dans les échantillons contenant de la gélatine de porc (bonbon dur ou mou à sucer ou bonbon du type à base de guimauve) l'ensemble des pics spécifiques de la gélatine de porc y sont retrouvés. En revanche, ces mêmes échantillons les pics spécifiques de la gélatine de boeuf ne sont détectés. Dans les échantillons de produits ne contenant pas de la gélatine de porc (crème dessert, bonbon dit «hallal» sans gélatine de porc), les pics spécifiques de la gélatine de porc ou de boeuf ne sont pas détectés. Il est donc possible de détecter de la gélatine de porc dans un aliment et en faisant la distinction avec la gélatine de boeuf grâce à ces profils de pics spécifiques. Ainsi, Il est possible de détecter de façon spécifique, si un aliment contient de la gélatine de porc ou non et sans faire la confusion avec de la gélatine de boeuf. A titre illustratif, la figure 6 représente des spectres suivants : - spectre A6 : spectre d'échantillon de gélatine de boeuf, - spectre B6 : spectre d'échantillon de gélatine de porc, - spectre C6 : spectre d'échantillon de bonbon contenant de la gélatine de porc, - spectre D6 : spectre d'échantillon de 4 bonbon hallal (sans gélatine de porc). Dans les spectres B6 et C6, on retrouve les 10 pics spécifiques de la gélatine de porc indiqués par des flèches.15 REVENDICATIONS1. Procédé d'identification de l'espèce animale bovine, ovine ou porcine d'origine éventuelle de la viande ou de la gélatine d'une dite espèce animale particulière, éventuellement contenue dans un échantillon de matière alimentaire à tester, dans lequel on réalise les étapes suivantes dans lesquelles: a/ on réalise une préparation d'un extrait protéique de protéines entières ou d'un extrait peptidique à partir dudit échantillon, et b/ on réalise un spectre de ladite préparation par spectrométrie 10 de masse dite de type MALDI TOF, et c/ on compare le spectre obtenu à l'étape b/avec au moins un spectre de référence d'un dit extrait protéique ou respectivement peptidique d'un échantillon de référence de viande choisi au moins parmi de la viande bovine, viande ovine et viande porcine, ou un 15 échantillon de référence de gélatine choisie au moins parmi de la gélatine bovine ou gélatine porcine, et d/ On identifie la présence de viande ou respectivement de gélatine de l'espèce animale mammifère bovine, ovine ou porcine d'origine du dit échantillon testé comme étant celle d'une dite espèce 20 animale de référence si on retrouve dans le spectre obtenu à l'étape b/ ci-dessus, des pics en commun comprenant au moins des pics spécifiques d'un dit spectre de référence de l'étape c/ ci-dessus le cas échéant et/ou par détermination de la proximité du spectre de l'échantillon testé avec un spectre de référence , de préférence par 25 classification hiérarchique. 2. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape c/, le spectre de référence de la viande de boeuf comprend les pics spécifiques suivants : 2162 Da, 3256 Da, 3616 Da,6511 Da, 8477 Da, 13733 Da, 13882 Da, 13997 Da, 16952 Da et 17070 Da. 3. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape c/, le spectre de référence de la viande de porc comprend les pics spécifiques suivants : 3341 Da, 4999 Da, 5457 Da, 5471 Da, 7518 Da, 8474 Da et 16946 Da. 4. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'à l'étape c/, le spectre de référence de la gélatine de porc comprend les pics spécifiques aux valeurs de masse (m/z) suivantes : 1177 Da, 1180 Da, 1666 Da, 1892 Da, 2005 Da, 2188 Da, 2980 Da, 3265 Da, 3281 Da et 3605 Da. 5. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'à l'étape c/, le spectre de référence de la gélatine de boeuf comprend les pics spécifiques suivants : 1192 Da, 1297 Da, 1308 Da, 1427 Da, 1580 Da, 1580 Da, 1632 Da, 1769 Da, 1922 Da, 1975 Da, 2216 Da, 2404 Da, 2549 Da et 2853 Da. 6. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'à l'étape c/, on compare le spectre de référence de la gélatine de porc comprend les pics caractéristiques mentionnés dans le tableau 1 suivant, dans lequel les différents pics caractéristiques sont numérotés dans la première colonne, et les paramètres suivants ont les significations suivantes : - m/z : rapports (masse/charge) en abscisse des différents pics caractéristiques du spectre, les différentes valeurs de m/z pouvant varier de 7.2 2452.1014 4.6 1163.5686 6.5 1781.5761 3.7 2453.956 8.1 1177.5383 7.3 1795.8854 12.7 2535.1612 4.1 1180.6134 19.8 1797.7682 5 2629.2199 4.4 1203.5537 4 1812.8262 4.7 2637.1405 4.7 1224.6016 7.7 1824.29 3.1 2653.3792 13 1225.6049 8.5 1874.9104 3.4 2670.3747 6.7 1238.6497 4.7 1889.0583 3.2 2685.2375 6.9 1240.6281 38.7 1892.8711 6.9 2688.2093 15.1 1273.556 13.4 1946.5544 11.4 2750.9354 3.1 1289.5447 8.7 1961.9798 41 2766.5531 4.6 1332.6022 7.5 1997.92 7.1 2883.3897 28.3 1369.6561 6.8 2005.8507 4.2 2980.28 11 1385.6481 7.1 2012.977 27.9 2987.5863 10.4 1406.7289 3.8 2025.118 3.4 2993.6599 4 1408.6031 13.7 2026.8142 3.5 3084.7301 4.6 1417.6716 4.2 2027.9798 12.3 3136.7422 3.2 1435.63 23.5 2039.8506 3 3149.7971 3.1 1439.7931 3.8 2041.5675 7.7 3153.1893 7.7 1447.7031 7.5 2056.9905 17 3159.0632 5.7 1453.7046 29.7 2074.04 7.7 3167.6524 6.7 1457.6119 4.3 2081.9066 4.7 3183.3571 5.9 1459.6389 47.6 2090.0327 7.2 3225.4971 8.9 1466.6613 3.4 2108.0629 9.7 3241.3821 5.7 1473.6441 4.9 2131.0603 28.3 3265.5365 6.3 1550.7189 13 2164.9552 4.2 3281.4994 6.7 1562.7812 10.2 2188.069 9.1 3326.3907 4.1 1584.8205 4.3 2247.0596 3.2 3387.6835 5 1586.721 14.9 2274.1733 4.9 3408.5173 4.3 1588.7323 5.6 2290.1914 4.3 3605.5744 7.17. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'à l'étape c/, on compare le spectre de référence de la gélatine de boeuf comprend les pics caractéristiques mentionnés dans le tableau 2 suivant, dans lequel les différents pics caractéristiques sont numérotés dans la première colonne, et les paramètres suivants ont les significations suivantes : - m/z : rapports (masse/charge) en abscisse des différents pics caractéristiques du spectre, les différentes valeurs de m/z pouvant varier de 11. Procédé d'identification selon la revendication 9, caractérisé en ce que - à l'étape a/, ledit échantillon à tester est un échantillon de plat cuisiné susceptible de contenir de la viande, et - à l'étape c/, on compare le spectre de l'échantillon testé avec les spectres de référence de différents types de viandes choisis parmi la 10 viande de boeuf, d'agneau et de porc, et - à l'étape d/, on identifie le cas échéant la présence d'un type donné de viande si le spectre de l'échantillon testé se situe à proximité d'un spectre de référence dudit type de viande donné par classification hiérarchique par clusterisation. 15 12. Procédé d'identification selon la revendication 9, caractérisé en ce que : - à l'étape a/, ledit échantillon à tester est un échantillon de produit alimentaire susceptible de contenir un agent gélifiant ou texturant choisi de préférence parmi (a) les produits alimentaires sucrés 20 comprenant les confiseries, les crèmes glacées, les confitures, les yaourts et les gâteaux et (b) produits alimentaires allégés texturé pour simuler la sensation de gras en bouche et créer de la texture comme la margarine, et - à l'étape c/, on compare le spectre de l'échantillon testé avec 25 les spectres de référence de gélatine comprenant au moins le spectre de la gélatine de porc, et - à l'étape d/, on identifie le cas échéant la présence de gélatine de porc dans l'échantillon si le spectre de l'échantillon testé comprendau moins les pics spécifiques du spectre de référence de la gélatine de porc. 13. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'à l'étape a/, on réalise une préparation peptidique ou protéique présentant une concentration d'au moins 100 mg/ml, de préférence de 300 à 100 mg/ml. 14. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 3, 8, 10, 11 et 13, caractérisé en ce qu'à l'étape a/, on réalise un extrait protéique de protéine entière d'un échantillon de viande ou de produit alimentaire en contenant, par les étapes successives suivantes de : - broyage de morceaux dudit échantillon, et - dilution dudit broyat, de préférence dans de l'eau distillée et un solvant de solubilisation de protéines, de préférence encore de l'acide 15 formique et/ou de l'acétonitrile, pour obtenir une suspension dudit broyat, et - élimination des débris solides de taille supérieure à 100 pm, de préférence supérieure à 50 pm, dans ladite suspension de broyat, de préférence par centrifugation, et récupération d'un dit extrait protéique 20 à partir de ladite suspension, de préférence par récupération du surnageant de centrifugation. 15. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1, 2, 4 à 7, 9, 12 et 13, caractérisé en ce qu'à l'étape a/, on prépare un extrait peptidique de gélatine ou de produit alimentaire en contenant 25 par les étapes successives suivantes de : - mise en suspension de morceaux dudit échantillon dans une solution tampon aqueuse, de préférence une solution de bicarbonate d'ammonium, puis- chauffage à 80°C de ladite suspension pour obtenir une liquéfaction de la gélatine, et - ajout d'une enzyme de digestion enzymatique, de préférence trypsine porcine, pour obtenir un dit extrait protéique.5