Brevet FR3016633A1 — publié le 20150724

IMMUNOGLOBULINE ANTI-TOXINE DU CHARBON La présente invention se rapporte à une immunoglobuline dirigée contre l'antigène protecteur de la toxine du charbon. Le charbon est une maladie infectieuse causée par une bactérie à gram positif, Bacillus anthracis. Cette bactérie est non mobile, et forme des spores, hautement résistantes, qui germinent en une forme végétative lorsqu'elles se trouvent dans des environnements tels que le sang ou les tissus des hommes ou des animaux. Malgré leur haute résistance, les spores ne se reproduisent pas, en revanche elles peuvent survivre des dizaines d'années dans le sol. Une infection par le charbon peut prendre trois formes : cutanée, pulmonaire ou digestive. L'infection pulmonaire est la plus fréquemment mortelle. En cas d'inhalation, les spores de B. anthracis passent dans les alvéoles où elles sont phagocytées par les macrophages et les cellules dendritiques, notamment. Les spores germent dans ces cellules et les formes végétatives se multiplient dans les ganglions. Les bactéries passent alors dans le sang, se reproduisent en continu et produisent des toxines, responsables en partie de la létalité de la maladie. Les toxines du charbon sont composées de trois protéines distinctes : l'antigène protecteur (PA, 83 kDa avant clivage enzymatique et 63 kDa après clivage), le facteur létal (LF, 90 kDa) et le facteur oedémateux (EF, 89 kDa). La toxine létale, qui joue un rôle prépondérant dans la pathogénicité, est formée de PA et LF ; et la toxine oedémateuse, dont le rôle dans la physiologie de la maladie est moindre, de PA et EF. Ces protéines sont sécrétées par la bactérie en tant que monomères non toxiques, et s'assemblent à la surface des cellules cibles pour former des complexes toxiques. Jusqu'à présent, plusieurs antibiotiques, tels que la pénicilline, la doxycycline et les fluoroquinolones (par exemple la ciprofloxacine), ont été utilisés pour le traitement des infections par le charbon. Cependant, certains de ces antibiotiques peuvent ne pas avoir d'effets sur certaines souches de B. anthracis, résistantes aux antibiotiques. De plus, les antibiotiques n'ayant pas d'action inhibitrice vis-à-vis des toxines du charbon, ils doivent être nécessairement administrés à des stades très précoces de l'infection ; or les diagnostics précoces sont difficiles à établir car les symptômes initiaux sont non spécifiques. Des vaccins, dont le composant majeur est l'antigène protecteur PA, ont été développés mais ne sont utilisés que pour des personnes susceptibles d'être en contact avec B. anthracis. De plus, du fait de la nécessité d'une période de plusieurs mois pour acquérir une immunité suffisante, ces vaccins ne peuvent pas être utilisés dans des situations d'urgence. En France actuellement, aucun de ces vaccins n'est agréé pour l'utilisation humaine. 11 est donc nécessaire de développer de nouvelles approches thérapeutiques et préventives, autres que les antibiotiques. L'immunisation passive avec des anticorps représente une stratégie efficace pour neutraliser la toxine. Plusieurs essais ont été réalisés pour neutraliser la toxine létale du charbon à l'aide d'anticorps monoclonaux contre l'antigène protecteur (PA) et le facteur létal (LF). La neutralisation de la toxine létale du charbon à l'aide d'un anticorps peut avoir lieu par inhibition de la liaison de PA à son récepteur cellulaire, inhibition du clivage de PA, inhibition de la liaison entre PA et LF ou encore inhibition de l'action de LF par exemple. Le développement de nouveaux anticorps permettant de neutraliser la toxine du charbon est ainsi d'un intérêt général pour une prévention et un traitement efficace du charbon. Dans un travail récent, un macaque a été immunisé avec l'antigène protecteur PA83 pour obtenir des anticorps destinés à traiter l'infection humaine par le charbon. A partir 25 de la moelle osseuse, les gènes codant des fragments d'anticorps Fab reconnaissant spécifiquement PA83 ont été amplifiés et clonés pour obtenir une librairie de fragments. Un fragment de haute affinité (Kd=3,4 nM) et neutralisant efficacement la toxine létale (concentration d'inhibition à 50% = 5,6 +/- 0,13 nM), désigné sous le nom de 35PA83, a 30 ensuite été isolé (Laffly et al., antimicrobial agents and chemotherapy, 2005, 49(8) : 3414-3420). Le fragment d'immunoglobuline 35PA83 neutralise la toxine du charbon en empêchant l'interaction de PA avec son récepteur cellulaire. Une immunoglobuline chimérique de 35PA83 appelée « v2 », dont les régions variables sont dérivées du fragment 35PA83, a été préparée et décrite dans la demande internationale W 0 2009/071860. Néanmoins, l'augmentation de l'affinité de ce fragment d'immunoglobuline vis-à-vis de l'antigène PA présenterait le double avantage de réduire la quantité d'immunoglobuline à administrer au patient et de réduire le coût du traitement, mais également celui de permettre une meilleure détection de la toxine du charbon. Un des buts de l'invention est ainsi de fournir une immunoglobuline présentant une haute affinité vis-à-vis de l'antigène PA de la toxine du charbon, et permettant une détection très sensible de la toxine du charbon. Un autre but de l'invention est de fournir une immunoglobuline permettant le traitement ou la prévention de pathologies lies à la toxine du charbon. Un autre but de l'invention est de fournir une méthode de détection de la toxine du charbon. Encore un autre but de l'invention est également de fournir un kit de détection de la toxine du charbon. La présente invention a ainsi pour objet une immunoglobuline de classe G dirigée contre l'antigène protecteur de la toxine du charbon, ou un de ses fragments, comprenant au moins : - une région variable de chaîne lourde comprenant une séquence d'acides aminés possédant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, étant entendu qu'elle comprend les acides aminés Leucine en position 51 et Glycine en position 67, et/ou - une région variable de chaîne légère comprenant une séquence d'acides aminés possédant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, étant entendu qu'elle comprend l'acide aminé Leucine en position 55. La séquence SEQ ID NO : 1 comprend une leucine en position 51 et une glycine en position 67. La séquence SEQ ID NO : 2 comprend une leucine en position 55. Les séquences selon l'invention présentent au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2, mais contiennent nécessairement, selon les cas, la leucine en position 51 et la glycine en position 67 (SEQ ID NO : 1), ou la leucine en position 55 (SEQ ID NO : 2). De préférence, l'immunoglobuline ou un de ses fragments selon l'invention a une 5 affinité pour l'antigène protecteur de la toxine du charbon inférieure à 2.10-o M, de préférence inférieure à 1.1e M, de préférence inférieure ou égale à 3,3.10-11 M. Le terme "immunoglobuline" est équivalent au terme "anticorps", c'est-à-dire qu'il fait référence à une protéine multimérique constituée de 4 chaînes participant à la 10 réponse immunitaire acquise. Par « fragment d'immunoglobuline », on entend un fragment ayant la capacité de se lier à l'antigène PA. De préférence, un tel fragment comprend au moins : - une région variable de chaîne lourde comprenant une séquence d'acides aminés 15 représentée par la séquence SEQ ID NO : 1, et/ou - une région variable de chaîne légère comprenant une séquence d'acides aminés représentée par la séquence SEQ ID NO : 2. Ainsi, d'une part, on peut utiliser une immunoglobuline de l'invention, i.e. une 20 molécule d'immunoglobuline entière, c'est-à-dire une immunoglobuline constituée de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères complètes. D'autre part, un fragment d'immunoglobuline selon l'invention peut être utilisé. Des fragments d'immunoglobuline bien connus sont par exemple les fragments F(ab')2, Fab, Fv, scFv et Fd. 25 Les immunoglobulines de type G (IgG) sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de 30 l'antigène contre lequel l'immunoglobuline est dirigée, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CH1, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique, tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps, reste accessible aux effecteurs immunitaires, phagocytes ou cellules tueuses, et le complément ; ces régions constantes ne sont pas impliquées dans la liaison à l'antigène. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CH2 et CH3, est glycosylée au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné, lié à l'asparagine en position 297 de la séquence de chaine lourde des anticorps selon la numérotation EU numbering (Asn 297 - cf Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969), et site IMGT http://www.imgcorg/IMGTScientificChart/Numbering/Hu IGHGnber.html). Dans la présente demande, par « Asn 297 », on entend en réalité l'asparagine en 15 position 305 de la séquence SEQ ID NO :5. La région variable est, quant à elle, impliquée dans la liaison de l'immunoglobuline à son épitope. 20 Une immunoglobuline dont la région constante (Fc) a été enzymatiquement clivée, de façon à en préserver la région charnière, est désignée comme un fragment F(ab')2 et conserve les deux sites de liaison à l'antigène. De même, une immunoglobuline dont la région constante, y compris la région charnière a été enzymatiquement clivée, ou qui a été produite sans cette région, est désignée 25 comme un fragment Fab et conserve un des deux sites de liaison à l'antigène. Le fragment Fd est formé des régions VH et CH1. Dans la région variable, on trouve les régions déterminant la complémentarité (CDRs, 30 complementary determining régions), aussi appelées régions hypervariables, qui interagissent directement avec l'antigène et ont donc un impact déterminant pour l'affinité d'un anticorps pour sa cible antigénique. Dans la région variable, on trouve un second type de régions, appelées régions charpentes (FRs, frameworks), qui maintiennent la structure tertiaire des CDRs. Ces régions charpentes sont relativement spécifiques de l'espèce où a été produite l'immunoglobuline. Dans le fragment Fd de la chaîne lourde et dans la chaîne légère, on trouve quatre régions charpentes (FR1 à 4) séparées respectivement par trois CDR (CDR1 à 3). Selon l'invention, une séquence possédant au moins 90% d'identité avec une séquence de référence, possède au moins 90 %, de préférence au moins 91%, 92%, 93%, 94%, 10 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, d'identité en acides aminés avec ladite séquence de référence. Le "pourcentage d'identité" entre deux séquences, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une 15 fenêtre de comparaison. La partie de la séquence d'acides aminés dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des "gaps") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprendrait pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions pour 20 lesquelles un résidu d'acide aminé est identique chez les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions pour lesquelles il y a identité entre les deux résidus d'acides aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en acides aminés des deux séquences entre elles. 25 L'invention repose sur l'observation surprenante faite par les inventeurs que la combinaison d'une double mutation spécifique de la chaîne lourde (qui aboutit à une leucine en position 51 et à une glycine en position 67 dans SEQ ID NO :1) et une mutation spécifique de la chaîne légère (qui aboutit à une leucine en position 55 dans 30 SEQ ID NO :2) entraîne une meilleure affinité de l'immunoglobuline 35PA83 vis-à-vis de la toxine du charbon par rapport aux immunoglobulines ou fragments d'immunoglobulines de l'art antérieur. La présence d'un résidu leucine en position 51 de la SEQ ID NO : 1 correspond à la leucine en position 54 sur la figure 2A. La présence d'un résidu glycine en position 67 de la SEQ ID NO : 1 correspond à la glycine en position 74 sur la figure 2A. La présence d'un résidu leucine en position 55 de la SEQ ID NO : 2 correspond à la leucine en position 68 sur la figure 2B. De préférence, l'invention concerne une immunoglobuline de classe G (IgG) dirigée contre l'antigène protecteur (PA) de la toxine du charbon, ou un de ses fragments, 10 comprenant : - une région variable de chaîne lourde comprenant la séquence SEQ ID NO : 1, et/ou - une région variable de chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID NO : 2. Les constantes de cinétique de l'interaction entre l'immunoglobuline de l'invention et 15 l'antigène PA, dont la constante d'affinité (KD), peuvent être déterminées par les techniques conventionnelles connues de l'homme du métier, notamment selon la méthode décrite dans l'exemple 4. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une immunoglobuline ou 20 un de ses fragments telle que définie ci-dessus, dans laquelle : - la région constante de ladite chaîne lourde comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par la séquence SEQ ID NO : 3, et - la région constante de chaîne légère comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par la séquence SEQ ID NO : 4. 25 Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une immunoglobuline telle que définie ci-dessus, dans laquelle : - chacune des chaînes lourdes comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 5, et 30 - chacune des chaînes légères comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 6. Une telle immunoglobuline est appelée 35PA83 « 6.20 » dans la présente demande. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite chaîne lourde et/ou ladite chaîne légère est liée à un peptide signal. Il est à noter que le peptide signal utilisé dans l'invention peut être différent du peptide signal naturellement associé à une protéine déterminée. L'utilisation d'un peptide signal permet d'augmenter le taux de sécrétion d'un polypeptide d'intérêt. Un tel peptide signal peut par exemple être optimisé de manière à augmenter le taux de 10 sécrétion de l'immunoglobuline de l'invention. Ainsi, un peptide signal connu de l'homme du métier peut être utilisé, comme par exemple un peptide signal tel que décrit dans le document W02011/114063. 15 Dans un mode de réalisation particulier, le peptide signal consiste en la séquence d'acides aminés suivante : MRWSWIFLLLLSITSANA (SEQ ID NO : 19). Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une immunoglobuline telle que définie ci-dessus, dans laquelle : 20 - chacune des chaînes lourdes comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 7, et - chacune des chaînes légères comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 8. 25 Les séquences de référence des chaînes, ou fragments de chaînes, lourdes et légères de l'immunoglobuline de l'invention sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous. SEQ ID NO: 1 Région variable de la chaîne lourde QVQLQESGPGLLKPSETLSLTCAVSGDSISGGYYWSWIRQSPGKG LEWIGLIYGSTADTRYNPSLKGRVTISKDTSKNQLSLQLRSVTAADT AVYYCARSGYNFWSGEYYGLDSWGQGAVVTVSS SEQ ID NO: 2 Région variable de la chaîne légère AIQLTQSPSSLSAYVGDKVTITCHASQGINSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLLSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQSEDFASYYCLQYDS APLAFGPGTKLDIK SEQ ID NO: 3 Région constante ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTS GVHTFPAVLQS SGLYSLSS VVTVPS SSLGT QTYICNVN de la chaîne lourde HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 4 Région constante de la chaîne légère RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 5 Chaîne lourde complète sans peptide signal QVQLQESGPGLLKPSETLSLTCAVSGDSISGGYYWSWIRQSPGKG LEWIGLIYGSTADTRYNPSLKGRVTISKDTSKNQLSLQLRSVTAADT AVYYCARSGYNFWSGEYYGLDSWGQGAVVTVSS AS TKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 6 Chaîne légère complète sans peptide signal AIQLTQSPSSLSAYVGDKVTITCHASQGINSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLLSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQSEDFASYYCLQYDS APLAFGPGTKLDIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 7 chaîne lourde avec peptide signal MRWSWII-LLLLSITS \ N AOVQLQESGPGLLKPSETLSLTCAVSG DS ISGGY Y W SW IRQSPGKGLEWIGLIYGSTADTRYNPSLKGRVTIS KDTSKNQLSLQLRSVTAADTAVYYCARSGYNFWSGEYYGLDSWG QGAVVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K SEQ ID NO: 8 chaîne légère avec peptide signal MRWSWII-LLLLSITS.\ N AAIQLTQSPSSLSAYVGDKVTITCHASQ GINSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLLSGVPSRFSGSGSGTDYTL TISSLQSEDFASYYCLQYDSAPLAFGPGTKLDIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC Tableau 1. Le peptide signal est surligné. La région variable est indiquée en italique. Les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention peuvent être des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme. En outre, les régions constantes humaines permettent d'assurer une demi-vie plus importante chez l'homme, via l'interaction aux récepteurs FcRn. De manière préférée, les régions constantes de chacune de chaînes légères de 5 l'immunoglobuline de l'invention sont de type K. Alternativement, la région constante de chacune des chaînes légères de l'immunoglobuline de l'invention est de type X,. Dans un mode de réalisation particulier, et notamment lorsque les régions constantes de 10 chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'immunoglobuline de l'invention sont des régions humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être de type yl, de type y2, de type y 3, ou encore de type y 4. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une immunoglobuline ou un 15 de ses fragments telle que définie ci-dessus, dans laquelle la région constante de chacune des chaînes lourdes est de type yl. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus, possédant sur son site de glycosylation Asn297 20 des N-glycannes dont le taux de fucosylation est inférieur à 65%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 40%. Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une immunoglobuline de classe G (IgG) dirigée contre l'antigène protecteur (PA) de la toxine du charbon, ou un 25 de ses fragments, comprenant : - une région variable de chaîne lourde comprenant une séquence d'acides aminés possédant au moins 90% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence comprenant la séquence SEQ ID NO : 2, étant entendu qu'elle comprend les acides aminés Leucine en position 51 et Glycine en position 67, et 30 - une région variable de chaîne légère comprenant une séquence d'acides aminés possédant au moins 90 % d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence comprenant la séquence SEQ ID NO : 2 étant entendu qu'elle comprend la Leucine en position 55, ladite immunoglobuline ou un de ses fragments possédant une constante d'affinité (KD) vis-à-vis dudit antigène protecteur de la toxine du charbon inférieure à 2.10-9M, de préférence inférieure ou égale à 3,3.10-11M, ladite immunoglobuline possédant sur son site de glycosylation Asn297 des N5 glycannes dont le taux de fucosylation est inférieur à 65%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 40%. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus, dans laquelle : 10 - la région constante de ladite chaîne lourde comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par la séquence SEQ ID NO : 3, et - la région constante de chaîne légère comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par la séquence SEQ ID NO : 4, ladite immunoglobuline ou un de ses fragments possédant une constante d'affinité (KD) 15 vis-à-vis dudit antigène protecteur de la toxine du charbon inférieure à 2.10-9M, de préférence inférieure ou égale à 3,3.10-11M, ladite immunoglobuline possédant sur son site de glycosylation Asn297 des Nglycannes dont le taux de fucosylation est inférieur à 65%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 40%. 20 Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une immunoglobuline telle que définie ci-dessus, dans laquelle : - chacune des chaînes lourdes comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 5, et 25 - chacune des chaînes légères comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 6, ladite immunoglobuline possédant une constante d'affinité (KD) vis-à-vis dudit antigène protecteur de la toxine du charbon inférieure à 2.10-9M, de préférence inférieure ou égale à 3,3.10-11M, 30 ladite immunoglobuline possédant sur son site de glycosylation Asn297 des Nglycannes dont le taux de fucosylation est inférieur à 65%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 40%. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une immunoglobuline telle que définie ci-dessus, dans laquelle : - chacune des chaînes lourdes comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 7, et - chacune des chaînes légères comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 8, ladite immunoglobuline possédant une constante d'affinité (KD) vis-à-vis dudit antigène protecteur de la toxine du charbon inférieure à 2.10-9M, de préférence inférieure ou égale à 3,3.10-11M, ladite immunoglobuline possédant sur son site de glycosylation Asn297 des N- glycannes dont le taux de fucosylation est inférieur à 65%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 40%. Les immunoglobulines de l'invention se distinguent donc notamment des 15 immunoglobulines anti-toxine du charbon déjà connues par leur faible taux de fucosylation. De plus, les immunoglobulines de l'invention présentent également un profil de Nglycosylation particulier. 20 Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus, possédant sur son site de glycosylation Asn297 une structure glycannique de type biantenné, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, présentant des mannoses terminaux et/ou des N-acétylglucosamines 25 terminaux non intercalaires. Les formes glycosylées envisageables pour les immunoglobulines selon l'invention sont présentées dans le tableau 2 suivant. Symbole Forme glycosylée GO Complexe biantenné avec structure agalactosylée G1 Complexe biantenné avec une structure comprenant un seul galactose GOF Complexe biantenné avec structure agalactosylée (GO), dans lequel le noyau pentasaccharidique est substitué par un fucose G1F Complexe biantenné avec une structure comprenant un seul galactose (G1), dans lequel le noyau pentasaccharidique est substitué par un fucose Tableau 2. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une immunoglobuline ou un de ses 5 fragments telle que définie ci-dessus, présentant une teneur supérieure à 60 % pour les formes GO+Gl+G0F+G1F, la teneur des formes G0F+G1F étant inférieure à 50 %. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus, présentant une teneur supérieure à 60 % pour les 10 formes GO+Gl+G0F+G1F, la teneur en fucose étant inférieure à 65 %. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus, présentant une teneur inférieure à 40% pour les formes G0F+G1F. 15 Un autre aspect de l'invention est un polynucléotide codant l'immunoglobuline de l'invention ou un de ses fragments. Ainsi, un autre aspect de l'invention concerne un polynucléotide comprenant au moins une séquence nucléotidique codant la chaîne lourde ou la chaîne légère d'une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un polynucléotide comprenant au moins une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 et 18. SEQ ID NO : 9 caggtgcagctgcaggaatctggccctggcctgctgaagcccagcgagacac tgtctctgacctgcgccgtgtccggcgactctatcagcggcggctactactggt cttggatcaggcagagccccggcaagggcctggaatggatcggcctgatcta cggcagcaccgccgacaccagatacaaccccagcctgaagggcagagtga ccatcagcaaggacaccagcaagaaccagctgtctctgcagctgagaagcg tgaccgctgccgacaccgccgtgtactactgtgccagaagcggctacaacttt tggagcggcgagtactacggcctggactcttggggacagggcgctgtcgtga cagtgtccagc Séquence nucléotidique codant la partie variable de la chaîne lourde SEQ ID NO : 10 gccatccagctgacccagagccctagctctctgagcgcctacgtgggcgaca aagtgaccatcacctgtcacgccagccagggcatcaacagctggctggcctg gtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccag cagcctgctgagcggcgtgcccagcagattcagcggctctggctctggcacc gactacaccctgaccatcagctccctgcagagcgaggacttcgccagctacta ctgcctgcagtacgacagcgcccctctggccttcggccctggaacaaagctgg acatcaag Séquence nucléotidique codant la partie variable de la chaîne légère SEQ ID NO :11 Séquence nucléotidique codant la partie constante de la chaîne lourde gcctctaccaagggcccaagcgtgttccctctggcccctagcagcaagtctac ctctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagc ccgtgaccgtgtcctggaactctggcgctctgacaagcggcgtgcacaccttc cctgccgtgctgcagtctagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgactgt gccctctagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagc ccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaag acccacacctgtcctccctgtcctgcccctgaactgctgggcggaccttccgtg ttcctgttccccccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcaggacccccga agtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttca attggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagag aggaacagtacaacagcacctacagggtggtgtctgtgctgacagtgctgca ccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggc cctgccagcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggacagcctcg cgagccccaggtgtacacactgcctcccagcagggacgagctgacaaagaa tcaggtgtccctgacctgtctcgtgaaaggcttctaccccagcgacattgccgt ggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccc ctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactccaagctgaccgtggaca agtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggc cctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccctggcaag SEQ ID NO : 12 aggaccgtggccgcaccaagtgtctttatcttcccacccagcgacgagcagct gaagtccggcacagcttccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctaccctaggg aagccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactccc Séquence nucléotidique upiapeâ3inââiunââpeââuu3ââ3333ânâneâu3inââ1p iââpupupââeâ3ân3inppuâeâ33e033â3â133appei 3U3aaeU333âUale133M333ââplUaâUeleUelââU3 131131-M33113eR33U3W3iteiiplip`iipii1331ppeini133etillebit11-1 ap.moT auptp uTjurpoD anbIppoapnu ODuanbas ST :ON QI ôas 3ee3==U3UU311 eaUU33a1â3333âU130133âââU33U333alâUael3e3Ulâ lââUU1U3UUaa3U13a33ââUU3âal3U3a1333U3âUea133 âU3U133U3313UââUU3âU3UââU3âa33a1â3âUUUââU33313UU3 ââ331âU3â1333â3UU3UââlââUaâlâUelââUU33âUaââU1333 U13113UU3Ual3â133âlâlâ3e33113âU3U3ââ331âUaleUee 3a3âU333U3331131U11131âlâUU33U3â33ââlâ33aâaUU31U3U ââleUUU3Uaâ1333ââ3113=1313333â3âU3a3U1âUe133â13 UpUleU3e3113aâaeaU3â133313âU31U33a1333U3Upe 33U=131=1313ââeU311aUeU333âlâeâeale133eC3 âMeâUU3U131apâleUU33333ââUU3ââ333âUaUeU3lUlâ 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gtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgctagtgaactctaga Tableau 3. Les séquences codantes sont indiquées en gras. Les séquences codant le peptide signal sont surlignées. Les séquences de Kozak sont soulignées. Les codons stop sont en italique et soulignés. De tels polynucléotides peuvent être insérés dans un vecteur recombinant pour le clonage ou pour l'expression des immunoglobulines de l'invention. Un autre aspect de l'invention est donc un vecteur comprenant un polynucléotide codant 10 l'immunoglobuline de l'invention ou un de ses fragments. Le terme "vecteur" se réfère à une molécule d'acide nucléique dans lequel une séquence d'intérêt peut être insérée par digestion avec une endonucléase de restriction, puis ligation, pour le transport entre différents environnements génétiques ou pour l'expression dans une cellule hôte. Les vecteurs sont par exemples les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Un vecteur de clonage est un vecteur capable de se répliquer dans une cellule hôte et qui 10 est de plus caractérisé par la présence de un ou plusieurs sites de restriction. Un vecteur d'expression est un vecteur dans lequel la séquence d'ADN d'intérêt peut être insérée par digestion avec une endonucléase de restriction et ligation de telle façon qu'elle puisse être répliquée et/ou transcrite en ARN. Les vecteurs peuvent contenir en outre un ou plusieurs marqueurs de sélection ou 15 d'identification des cellules ayant été transformées ou transfectées avec le vecteur. La présente invention inclut tous les vecteurs recombinants contenant des séquences codantes pour la transformation, transfection ou thérapie génique eucaryote ou procaryote. De tels vecteurs pourront être préparés selon les techniques 20 conventionnelles de biologie moléculaire et comprendront en outre un promoteur approprié, optionnellement une séquence signal pour l'export ou la sécrétion, et des séquences régulatrices nécessaires pour la transcription de la séquence nucléotidique. Le vecteur de l'invention peut comporter les séquences codant la chaîne lourde et/ou la 25 chaîne légère de l'immunoglobuline de l'invention. Un mode de réalisation de l'invention concerne donc un vecteur comprenant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus comprenant au moins une séquence nucléotidique codant la chaîne lourde ou la chaîne légère d'une immunoglobuline telle 30 que définie ci-dessus. Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un vecteur comprenant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus comprenant au moins une séquence nucléotidique codant la chaîne lourde et une séquence codant la chaîne légère d'une immunoglobuline telle que définie ci-dessus. Un des vecteurs approprié dans le cadre de l'invention est une molécule d'acide nucléique recombinante adaptée pour recevoir et exprimer un premier polynucléotide et un second polynucléotide, de façon à permettre l'expression d'anticorps hétérodimérique tel qu'un anticorps de longueur complète ou des fragments F(ab')2 ou Fab selon l'invention. Un tel vecteur fournit un système pour cloner indépendamment les deux polynucléotides dans deux cassettes séparées présentes dans le vecteur, de façon à former deux cistrons séparés pour l'expression d'un premier et d'un second polypeptide de l'anticorps hétérodimérique. Un tel vecteur d'expression est appelé vecteur dicistronique. Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle un polynucléotide codant la région variable de chacune des chaînes légères de l'immunoglobuline, et un polynucléotide codant la région constante de chacune des chaînes légères de l'immunoglobuline ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Un tel vecteur permet l'expression de ces polynucléotides dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier, et peuvent être un adénovirus, un rétrovirus, un plasmide ou un bactériophage, cette liste n'étant pas limitative. 11 est par ailleurs possible d'introduire dans un tel vecteur des unités de transcription, c'est-à-dire des polynucléotides contenant des éléments régulateurs nécessaires à la transcription d'un acide nucléique d'intérêt en ARN. Des unités de transcription connues de l'homme du métier peuvent être utilisées, 30 comme par exemple celles décrites dans le document W02013/061010. La cellule hôte productrice de l'immunoglobuline est une caractéristique importante car elle confère à l'immunoglobuline certaines de ses propriétés particulières. En effet, le moyen d'expression des immunoglobulines est à l'origine de modifications posttraductionnelles, notamment des modifications de la glycosylation, qui peuvent varier d'une lignée cellulaire à l'autre, et ainsi conférer des propriétés fonctionnelles différentes à des immunoglobulines ayant pourtant des structures primaires identiques. Un autre aspect de l'invention concerne donc une cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini ci-dessus. Une telle cellule hôte peut être une cellule procaryote ou eucaryote. Les 10 immunoglobulines de la présente invention peuvent notamment être produites dans des cellules eucaryotes, telles que des cellules YB2/0, CHO ou des hybridomes humains ou murins, ainsi que dans des cellules végétales et des animaux transgéniques. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une cellule hôte telle que 15 définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule choisie parmi : SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-Led O, CHO-Led, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653. 20 Dans un autre mode de réalisation préféré, l'immunoglobuline est produite dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL. P2. G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC n° CRL-1662). De préférence, la lignée cellulaire stable exprimant une immunoglobuline selon 25 l'invention, et plus particulièrement choisie dans le groupe précédemment décrit, a intégré le (ou les) vecteur(s) d'expression de la chaîne lourde et de la chaîne légère tel(s) que précédemment décrit(s). D'autres méthodes sont connues de l'homme du métier pour produire des 30 immunoglobulines faiblement fucosylées, et peuvent être utilisés pour la préparation des immunoglobulines de l'invention. De manière non exhaustive, il peut s'agir par exemple de méthodes de préparation d'anticorps dans des cellules cultivées en présence de kifunensine, comme cela est décrit par exemple dans le document US 7,700,321. Des analogues de fucose peuvent également être introduits dans le milieu de culture de cellules productrices d'anticorps comme décrit dans le document US 2009/0317869. Un autre moyen de produire des anticorps, peut être l'utilisation, par exemple de cellules pour lesquelles la voie de production des GDP-fucose est inhibée, par exemple par inhibition de l'une au moins des enzymes du cycle de production fucose, telle que décrit par exemple dans le document US 2010/291628 ou US 2009/0228994, le document EP 1,500,698, le document EP 1,792,987 ou encore le document US 7,846,725, cette liste n'étant pas limitative. Il est également possible d'utiliser des ARN interférent (ARNi) inhibant la 1,6- fucosyltransférase comme décrit dans le document US 7,393,683 ou le document WO 2006/133148. Il peut également s'agir de méthodes de préparation d'anticorps dans des animaux 20 transgéniques, comme cela est décrit dans le document WO 2007/48077. Il peut également s'agir de méthodes de préparation d'anticorps dans des levures, comme cela est décrit par exemple dans le document WO 02/00879. Dans le cas où la région Fc de l'anticorps possède 100% d'oligosaccharides non 25 fucosylés, c'est-à-dire quand la région Fc de l'anticorps est totalement dépourvue de fucose, il est possible d'utiliser des méthodes de préparation connues de l'homme du métier, comme par exemple celles décrites dans les documents EP 1,176,195, US 7,214,775, US 6,994,292, US 7,425,449, US 2010/223686, WO 2007/099,988, EP 1,705,251, cette liste n'étant pas limitative. Il peut s'agir par exemple d'une méthode 30 utilisant une cellule hôte exprimant au moins un acide nucléique codant pour l'anticorps de l'invention, et dont la glycosylation est modifiée par délétion du gène codant pour l'a 1,6-fucosyltransférase ou par addition d'une mutation de ce gène pour éliminer l'activité a 1,6-fucosyltransférase, et exprimant à ce titre un anticorps dépourvu de fucose. Il peut également s'agir d'une méthode comprenant la mutation des acides aminés de la partie Fc. Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, notamment 5 pharmaceutique, comprenant au moins une immunoglobuline, de préférence humaine, ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus. Une telle composition pharmaceutique comprend de façon préférée un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10 Un tel véhicule correspond au sens de l'invention à un matériel non toxique qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique des ingrédients actifs de la composition. Le terme "pharmaceutiquement acceptable" se réfère à un matériel non toxique qui est 15 compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme. Les caractéristiques du véhicule dépendront du mode d'administration. Dans un autre aspect, l'invention concerne une immunoglobuline, de préférence humaine, ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus, pour son utilisation comme 20 médicament. Dans un autre aspect, l'invention concerne une immunoglobuline, de préférence humaine, ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention de pathologies liées aux toxines du charbon. 25 Le terme "prévention" correspond à la prévention de l'apparition de la maladie chez un sujet, en particulier un humain, chez qui la maladie ne s'est pas encore déclarée. Le terme "traitement" correspond à l'inhibition de cette maladie, i.e. l'arrêt de son 30 développement, sa régression, ou à la disparition des symptômes et conséquences de la maladie, ou encore à la disparition des causes de la maladie. Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour la détection in vitro d'une toxine du charbon comprenant l'antigène protecteur (PA) dans un échantillon biologique, comprenant : - la mise en contact de l'échantillon avec au moins une immunoglobuline ou un de ses 5 fragments telle que définie ci-dessus, et - la détection de la liaison de ladite immunoglobuline ou un de ses fragments comme indicateur de la présence de ladite toxine du charbon. L'échantillon biologique peut être liquide, par exemple de la salive, de l'urine, du fluide cérébrospinal, du sérum ou du sang, ou solide ou semi-solide, par exemple des tissus ou 10 des matières fécales ou un tissu solide tel qu'utilisé couramment en diagnostic histologique. L'immunoglobuline de l'invention peut être utilisée in vitro, par exemple dans des tests immunologiques dans lesquels elles sont utilisées en phase liquide ou liées à un 15 véhicule de phase solide. Des exemples de véhicules bien connus sont le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, l'amylase, la cellulose naturelle ou modifiée, le polyacrylamide, l'agarose ou la magnétite. Des exemples de tests immunologiques utilisant l'immunoglobuline anti-PA de l'invention sont des radioimmunoessais, des marquages histoimmunologiques, des ELISA, des 20 westernblots, des essais d'immunoprécipitation, des essais d'immuno-diffusion, des essais de fixation du complément, des analyses par cytométrie de flux (FACS) ou encore des analyses par puces à protéines. L'immunoglobuline de l'invention peut être marquée. Des exemples de marqueurs 25 comprennent les enzymes, les radio-isotopes, les composés fluorescents, les métaux colloïdes, les composés chimioluminescents, et les composés bioluminescents. Les méthodes de liaison d'un marqueur à une immunoglobuline sont bien connues de l'homme du métier. 30 Une autre technique de marquage consiste à coupler l'immunoglobuline à des haptènes de faibles poids moléculaire, ces haptènes pouvant être spécifiquement modifiés au moyen d'une seconde réaction. Des exemples d'haptènes sont la biotine, qui réagit avec l'avidine, ou le dinitrophenol, le pyridoxal ou la fluorescéine, qui peuvent réagir avec des immunoglobulines spécifiques anti-haptènes. Dans un autre aspect, l'invention concerne un kit pour la détection d'une toxine du 5 charbon comprenant l'antigène protecteur (PA), ledit kit comprenant : - un récipient comprenant au moins une immunoglobuline anti-PA ou un de ses fragments de l'invention et qui peut être ou non marquée, - optionnellement, un récipient comprenant des solutions tampons, - et optionnellement un récipient comprenant des moyens de détection de 10 l'immunoglobuline ou un de ses fragments marquée, tel qu'une protéine de liaison à la biotine, par exemple l'avidine ou la streptavidine, liée à une molécule rapporteur, telle qu'un marqueur fluorescent ou enzymatique. Ce container peut aussi comprendre des moyens de détection de l'immunoglobuline ou un de ses fragments non marquée, soit essentiellement des anticorps ou fragments 15 d'anticorps. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit pour la détection d'une toxine du charbon comprenant l'antigène protecteur (PA) tel que défini ci-dessus, ledit kit comprenant : 20 - un récipient comprenant au moins une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus, marquée, et - un récipient comprenant des moyens de détection de ladite immunoglobuline ou un de ses fragments marquée. 25 La quantité d'immunoglobuline marquée administrée doit être suffisante pour permettre la détection de la liaison de l'immunoglobuline à la toxine. La quantité d'immunoglobuline marquée administrée dépendra de facteurs tels que l'âge et le sexe du sujet, ainsi que du stade de la maladie. La quantité administrée peut varier entre 0,01 mg/kg et 50 mg/kg, préférablement entre 0,1 mg/kg et 20 mg/kg, et plus préférablement 30 entre 0,1 mg/kg et 2 mg/kg. L'immunoglobuline de l'invention peut être liée à un radioisotope directement, ou indirectement, par l'intermédiaire de groupes fonctionnels. Des groupes fonctionnels couramment utilisés sont par exemple l'acide diéthylène-triaminepentacétique (DTPA) et l'acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA). Des exemples d'ions métalliques , radioisotopes sont in- ln 97Ru, "Ga, "Ga, 72As, 89Zr et 201T1. Les immunoglobulines de l'invention peuvent aussi être marquées avec un isotope 5 paramagnétique pour le diagnostic par imagerie de résonance magnétique (IRM) ou par résonance de spin électronique (ESR). Des radioisotopes gamma émetteurs de positrons peuvent également être utilisés, tels que 157Gd, 55Mn, 162D-y, 68Ga, 52Cr et 56Fe. Les immunoglobulines ou un de ses fragments de l'invention peuvent également être 10 utilisées in vitro ou in vivo pour suivre l'évolution du traitement de la maladie, par exemple en déterminant l'augmentation ou la diminution du nombre de cellules ciblées par les toxines du charbon ou les changements dans la concentration de la toxine PA dans un échantillon biologique. 15 Dans un autre aspect, la présente invention concerne également une méthode de traitement d'un sujet, de préférence un humain, susceptible d'être infecté par Bacillus anthracis, dans laquelle une quantité thérapeutiquement efficace d'une immunoglobuline selon l'invention est administrée audit sujet. 20 Le terme "quantité thérapeutiquement efficace" se réfère à la quantité qui est suffisante pour effectuer le traitement lorsqu'elle est administrée à un sujet qui nécessite un tel traitement. La quantité thérapeutique effective dépend du sujet, du stade de la maladie à traiter et du mode d'administration, et peut être déterminée par des opérations de routine par l'homme du métier. 25 Le terme "charbon" se réfère à toute maladie causée, directement ou indirectement, par une infection par Bacillus anthracis. Les symptômes initiaux d'une infection par inhalation ressemblent à ceux d'un rhume ou 30 d'une grippe (fièvre, douleurs musculaires). Après plusieurs jours, ces symptômes progressent vers des problèmes sévères de détresse respiratoire et de choc septique. Sans aucun traitement, l'inhalation de spores de Bacillus anthracis est en générale fatale. L'infection cutanée par le charbon a lieu lorsque la bactérie entre dans la peau au niveau d'une brèche cutanée préexistante. Cette infection donne lieu dans un premier temps à une papule, qui se développe en deux à trois jours en une vésicule puis en un ulcère de 1 à 3 centimètres de diamètre présentant une aire nécrotique au centre. L'infection gastro-intestinale par le charbon se développe suite à la consommation de viande contaminée et est caractérisée par une inflammation algue du tractus intestinal. Une quantité thérapeutiquement efficace correspond à une quantité suffisante pour diminuer les symptômes de la maladie et l'évolution de l'infection. Cette quantité peut varier avec l'âge, le sexe du sujet et le stade de la maladie et sera déterminée par l'homme du métier. Une quantité thérapeutiquement efficace peut varier entre 0,01 mg/kg et 50 mg/kg, préférablement entre 0,1 mg/kg et 20 mg/kg, et plus préférablement entre 0,1 mg/kg et 2 mg/kg, en une ou plusieurs administrations quotidiennes, pendant un ou plusieurs jours, de préférence en une ou deux administrations au total. Le mode d'administration peut être par injection ou par perfusion graduelle. L'injection 15 peut être intraveineuse, intra-péritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou transdermale. Les préparations pour une administration parentérale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses stériles, des suspensions ou des émulsions. Des exemples de solvents non-aqueux sont le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles 20 végétales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables tels que l'éthyl oléate. Des véhicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des émulsions ou des suspensions. Dans un autre aspect, l'invention concerne un immunoconjugué comprenant une 25 immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus lié à un agent thérapeutique. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un immunoconjugué comprenant une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie ci-dessus liée, de façon 30 directe ou indirecte, à un agent thérapeutique. De tels agents thérapeutiques comprennent des agents chimiques, des radionucléides, des agents immunothérapeutiques, des cytokines, des chimiokines, des toxines ou des inhibiteurs d'enzyme. Des exemples de toxines sont la chaîne A de la diphtérie, la chaîne A de l'exotoxine, la chaîne A de la ricine, la chaîne A de l'abrine, la chaîne A de la modeccin, l'alphasarcin, les protéines Aleurites fordii, les protéines dianthines, les protéines Phytolaca americana, l'inhibiteur momordica charantia, la curcine, la crotine, l'inhibiteur sapaonaria officinalis, la gélonine, la mitogélline, la restrictocine, la phénomycine, l'énomycine et le tricothecenes. Des exemples de radionucléide sont 212Bt, 1311, 131in, 90Y et 186Re. Avantageusement, l'immunoglobuline de l'invention ou un de ses fragments est associée à un traitement prophylactique avec la tétracycline. L'immunoglobuline de l'invention permet de raccourcir la prophylaxie basée sur la tétracycline, en arrêtant, de manière sécurisée, après un risque d'exposition, par un traitement rapide ("court traitement") de tétracycline suivi d'une injection de l'immunoglobuline de l'invention. Avantageusement, l'immunoglobuline de l'invention est associée à un traitement curatif avec la ciprofloxacine. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des figures et des exemples suivants. LEGENDES DES FIGURES Figure 1. Schéma en collier de perles de la région variable de la chaîne lourde (A) et de la chaîne légère (B) de l'immunoglobuline 35PA83. La représentation IMGT en collier de perles est réalisée en accord avec la numérotation IMGT. Les cercles hachurés correspondent aux positions manquantes de la numérotation IMGT. Figure 2. Schéma en collier de perles de la région variable de la chaîne lourde (A) et de la chaîne légère (B) de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 ». La représentation IMGT en collier de perles est réalisée en accord avec la numérotation IMGT. Les cercles hachurés correspondent aux positions manquantes de la numérotation IMGT. Figure 3. Profil HILIC-UPLC/FD des N-glycannes de l'anticorps 35PA83 « 6.20 » libérés après un traitement à l'aide de la peptidyl-N-glycosidase F (PNGase F). L'axe des abscisses correspond au temps d'élution en minutes. L'axe des ordonnées indique l'intensité relevée pour chaque composé identifié en unités d'émission. EXEMPLES Exemple 1 : Construction du vecteur codant l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » 15 - Souches d'Escherichia coli Les souches d'E. coli suivantes ont été utilisées : - XL1 (Stratagène, La jolla, CA) : recAl, endAl, gyrA96 thi-1 hsdR17 sup E44 relAl lac [F'proAB laclqZ3,M15 Tn10(Tetr)]. - SURE (Stratagène): e14(McrA) A(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endAl supE44 thi-1 20 gyrA96 relAl lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F'proAB laclqZ3,M15 Tn10 (Tetr)] - HB2151 (Carte et al., 1985), utilisée pour l'expression de Fabs solubles - TOP10 (Invitrogen) : utilisée pour la construction du vecteur d'expression eucaryote. 25 Toxines Les toxines du charbon (PA83, LF et EF) ont été achetées chez List laboratories. Construction de Fab mutants partir de 35PA83 Un variant a d'abord été construit afin d'humaniser le fragment d'immunoglobuline 30 35PA83. Ce variant a été obtenu en effectuant les mutations décrites dans les tableaux ci-dessous : Position de l'acide aminé 35PA83 Hu35PA83 1 Aucun Q 2 Aucun V 3 Aucun Q 4 Aucun L Aucun Q 6 Aucun E 7 Aucun S Tableau 4 : Mutations pour lhumanisation de la chaîne lourde de 35PA83 Position de l'acide aminé 35PA83 Hu35PA83 1 Aucun A 2 Aucun I 3 Aucun Q 4 Aucun L Tableau 5 : Mutations pour lhumanisation de la chaîne légère de 35PA83 5 A partir de ce variant humanisé, des séquences mutantes dérivées du gène 35PA83 ont ensuite été générées par Massive mutagenesis® (Biomethodes, Evry, France). Les mutations ont été introduites dans les CDRs des chaînes lourde et légère en utilisant des codons NNS (N code pour A, T, G, ou C et S code pour G ou C). Les régions CDRs ont été définies selon Kabat et al. (Wu and Kabat, 1970) et IMGT (Lefranc, Pommie et al., 2003). L'ADN obtenu a été utilisé pour transformer les cellules SURE par électroporation. Après ajout de milieu SB supplémenté en carbénicilline à la culture et incubation pendant lh à 37°C, 1 ml de phage helper VCSM13 (Andris-Widhopf et al., 2001) (environ 1012 pfu) a été ajouté à la culture. Après incubation pendant 2h, 70 µg/m1 de kanamycine ont été ajoutés et la culture a été mise sous agitation pendant la nuit. Sélection d'immunoglobulines par phage Les particules de phage-immunoglobuline ont été purifiées et concentrées à partir de 50 ml de culture par précipitation au polyéthylène glycol (PEG), puis re-suspendues dans 3 ml de PBS-BSA 1 %- azide 0,02% et filtrées sur un filtre de 0,45 !dm. Le titre de cette préparation de phage était d'environ 1010 pfu/ml. Les phages-immunoglobulines ont été soumis à trois cycles d'infection-sélection-récupération, correspondant à 5, 10 et 15 lavages respectivement, tel que précédemment décrits (Andris-Widhopf, Rader et al., 2000). Expression, extraction périplasmique et purification de Fab mutants solubles Chaque variant ADN a été transformé dans des bactéries de la souche d'E. coli HB2151, rendues chimiquement compétentes. Les cellules ont été cultivées à 30°C, agitées à 250 rpm dans 1 L de milieu SB contenant 50 µg/m1 de carbénicilline et 0,1 % de glucose. Lorsque la culture a atteint une absorbance à k= 600 nm de 1,5, une induction avec 1 mM d'IPTG (Isopropyl (3-D-1-thiogalactopyranoside) a été effectuée pendant 18h à 22°C. Les fragments d'immunoglobulines ont été extraites avec du sulfate de polymixine B 15 (Sigma) et purifiés sur colonne de nickel (Ni-NTA spin column, QIAGEN, Valencia, CA) selon les instructions du fabricant, puis dialyses avec du PBS 1 X à 4°C pendant 3h. Quantification du Fab soluble 20 La pureté du Fab a été testée par SDS-PAGE et sa concentration a été déterminée à l'aide du logiciel Quantity One(R) (Biorad). Mesure en temps réel de la résonance plasmonique de surface (SPR) Les constantes de cinétique de l'interaction entre PA83 et les variants 35PA83 ont été 25 déterminées en utilisant le système Biacore X SPR (BlAcore, Uppsala, Sweden). Le PA83 a été immobilisé sur une puce sensible CM5 (Biacore) en utilisant une procédure de couplage des aminés par injection de 30 pl de 2 µg/ml de PA83 dans 10 mM de sodium acétate pH 4,5. Pour minimiser la probabilité de reliaison, le KD a été mesuré en utilisant un débit élevé (30 0/min) et une quantité minimale d'antigène couplé (environ 30 500 RU, unités de résonance). Le taux de liaison de différentes concentrations de Fab allant de 5 à 400 nM dans du PBS a été déterminé à un débit de 30 0/min. Les données de liaison ont été introduites dans un modèle langmuir 1:1 du logiciel d'évaluation BIA (Biacore). Les constantes d'association et de dissociation (kon et koff respectivement) pour la liaison du Fab à PA83 ont été déterminées à 35°C. Analyse de séquences Les séquences des chaînes lourde et légère des clones sélectionnés ont été déterminées par Génome Express (Meylan, France) en utilisant les amorces ompseq et newpelseq (Andris-Widhopf, Rader et al., 2000). Les séquences ont été analysées en ligne, en utilisant le système IMGT. Parmi les clones sélectionnés, le variant 35PA83 « 6.20 » a été identifié. La région variable de la chaîne lourde (VH) du variant « 6.20 » (SEQ ID NO : 1) présente 2 mutations comparée à celle du Fab 35PA83 humanisé : H-L (résidu 54 selon la nomenclature d'IMGT) et S->G (résidu 74 selon la nomenclature d'IMGT). La région variable de la chaîne légère (VL) du variant « 6.20 » (SEQ ID NO : 2) présente 1 mutation comparée à celle du Fab 35PA83 humanisé : Q-L (résidu 68 selon la nomenclature d'IMGT). Construction du vecteur d'expression ATH-GA pour l'expression de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » Une séquence codant le peptide signal optimisé MB7 (SEQ ID NO :19, MRWSNNIFLLLLSITSANA) a été ajoutée en N-terminal des deux séquences codant respectivement les parties variables de la chaîne lourde et la chaîne légère du variant 35PA83 « 6.20 » (SEQ ID NO : 7 et 8). Ces séquences ont été optimisées et synthétisées par GeneArt (Regensburg, Germany). Les séquences des chaînes lourde et légère du variant ont ensuite été clonées dans le vecteur HK gen EFss pour obtenir le vecteur ATH-GA Le séquençage du vecteur ATH-GA a été réalisé selon la technique de Sanger (ou méthode des terminateurs de chaîne, réf. : Sanger F. et al, 1977, PNAS 74 : 5463). Les séquençages ont été réalisés par Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany) selon le niveau de qualité réglementaire« GLP ». Il s'agit du niveau de qualité maximal, avec couverture double brin de la séquence d'ADN, un minimum de redondance de 2 fois, une précision supérieure à 99,999%, des instruments dédiés, l'édition d'un rapport de qualité et l'archivage des documents générés. La préparation du vecteur ATH-GA a été conservée en tampon TE (10 mM Tris pH 8 et 1 mM EDTA) à -20°C avant ajustement à la concentration de 1µg/µl pour transfection 5 dans les lignées cellulaires YB2/0. Exemple 2 : Obtention de transformants producteurs de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » L'anticorps 35PA83 « 6.20 » a été produit dans les lignées YB2/0. Pour les 10 expérimentations ci-dessous, la technique ELISA mise en oeuvre se fait selon les conditions suivantes : Des plaques de 96 puits microtitrés (maxisorp, Nunc, Danemark) sont coatées avec du PA dilué dans du PBS (5 µg/ml, 100 pl par puits), durant la nuit à 4°C. Les plaques sont bloquées par ajout de 200 pl de PBS-BSA 5% à 37°C pendant 1 heure, et des sérums 15 dilués en série dans du PBS-Tween 20 0,1% - BSA 1% sont incubés (100 pl par puits) à 37°C pendant 2 heures. Une phosphatase alcaline anti-IgG de souris conjuguée ou une "anti-human IgG alkaline phosphatase conjugate " (Sigma) sont incubées (1/10 000) à 37°C pendant 1 heure. Un substrat P-Nitrophenyl Phosphate est ensuite incubé pendant 30 minutes à température ambiante. Les résultats sont déterminés par mesure de 20 l'absorbance à 405 nm avec un lecteur automatisé de microplaques (iEMS reader MF, Labsystems, Helsinki, Finlande). Le dernier point de dilution dont la réversion détermine le titre du sérum, est déterminé comme donnant un signal inférieur ou égal à 2 fois le sérum naïf utilisé pour le contrôle négatif. 25 a. Taux de transformation - Le vecteur ATH-GA a été introduit par électroporation dans la lignée cellulaire hôte YB2/0. Après mise en milieu sélectif (avec l'agent sélectif G418), des pools de transfectants ont été obtenus et étalés en milieu semi-solide en présence d'anticorps anti-IgG humaines fluorescent et dans des conditions permettant la 30 croissance de colonies isolées. L'intensité de fluorescence des colonies, proportionnelle à leur capacité de production, a été analysée par l'automate ClonePixFL (CPFL) et les colonies présentant la fluorescence la plus importante ont été reprises par l'automate. b. Sélection des transformants - Taux de production : premier dépistage des transformants plus forts producteurs La production d'IgG humaines a été déterminée par la technique ELISA sur les surnageants des puits de P96 en double sélection contenant de cellules afin de réaliser une première hiérarchisation des cloïdes sur leurs capacités de production. Trois dépistages successifs (tous les 2-3 jours) ont été réalisés et les 10 meilleurs producteurs de chaque dépistage ont été sélectionnés. Sur 528 transformants, 27 ont été 10 poursuivis et entretenus en P24 et une étude de leur productivité à J+3 et de leur production maximale (J+7) a été effectuée en parallèle. - Productivité à J+3 et production maximale (J+7) Les meilleurs clones producteurs sélectionnés avec une productivité en majorité 15 supérieure à 5 pcd et une production maximale supérieure à 10 µg/ml ont été amplifiés cellulairement en milieu sélectif (double sélection) pour sauvegarde en azote liquide. c. Sélection d'un clone et production de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » en cytoculteur 20 Un clone a été retenu pour la production de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » en cytoculteur (10L) en fonction de ses caractéristiques de croissance et productivité. L'immunoglobuline 35PA83 a été produite, concentrée et purifiée. Exemple 3 : Profil de N-glycosylation de 35PA83 « 6.20 » 25 Un dosage du taux de fucose sur les surnageants des cloïdes sélectionnés à J+3 et J+7 a été effectué par la technique ELISA. Pour déterminer le profil de N-glycosylation des immunoglobulines 35PA83 « 6.20 », celles-ci ont été traitées par voie enzymatique à l'aide de la peptidyl-N-glycosidase (PNGase F). Le profilage quantitatif du mélange de N-glycannes a ensuite été réalisé 30 par chromatographie liquide ultra-performance de partage en mode HILIC (UPLC/FD). Résultats : La figure 3 montre le profil de N-glycosylation des immunoglobulines 35PA83 « 6.20 ». Le tableau 6 recense les espèces majeures identifiées, affectées de leur rapport molaire relatif (RMR, %), les taux de fucosylation (Fuc), de G1cNAc intercalaire (Bis-G1cNAc) et de sialylation, ainsi que l'indice de galactosylation (Gal). Abréviations Structures glycanniques GO-Gn 0,7 GOF-Gn 0,7 GO 26,4 GOB 10,7 GOF 26,2 Man5 0,0 GOFB 15,8 G1(1,6) 2,7 G1(1,3) 1,5 G1(1,6)B 1,4 G1(1,3)B 0,0 G1(1,6)F 4,4 G1(1,3)F 1,9 G1(1,6)FB 3,3 G1(1,3)FB 0,3 G2 0,0 G2B 0,2 G2F 0,6 G2FB 1,5 G1(1,3)NeuAcl 0,0 G1(1,3)FNeuAcl 0,3 G1(1,3)FBNeuAc1 0,3 G2(1,3)NeuAcl 0,0 G2(1,3)BNeuAcl 0,0 G2F(1,3)NeuAcl 0,0 G2FB(1,3)NeuAcl 0,4 G2NeuAc2 0,0 G2BNeuAc2 0,0 G2FNeuAc2 0,0 G2FBNeuAc2 0M Pic non identifié 0,6 Taux de fucosylation (%) 40 Indice de galactosylation (%) 22 Taux de Bis-G1cNAc (%) 34 Tableau 6. L'immunoglobuline 35PA83 se caractérise par un profil de glycosylation strictement de type complexe biantennée avec des structures majoritairement agalactosylées de type GO (;:,'80%) dont le noyau pentasaccharidique est substitué ou non par un résidu de fucose (GOF), un résidu de G1cNAc intercalaire (GOB), voire les deux (GOFB). Des structures mono- et bigalactosylées de type G1,2(F)(B) sialylées ou non sont également observées en faible abondance (;:,'80%), avec un indice de galactosylation des N- glycannes de 22%. Le taux de fucosylation des N-glycannes est de 40%, tandis que le taux de structures à G1cNAc intercalaire est de 34%. Exemple 4 : Mesure des constantes cinétiques de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » Après la production d'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » dans des cellules YB2/0, le surnageant de culture cellulaire est récupéré, concentré 15 fois puis soumis à une chromatographie d'affinité au moyen d'une protéine recombinante de A-Sépharose. Une seconde étape de purification est mise en oeuvre au moyen de la colonne échangeuse de cation HiPrep 16/10 SP FF. L'intégrité de l'immunoglobuline purifiée et l'absence de contaminant sont contrôlés par SDS-PAGE et par ELISA pour la liaison au PA83 recombinant. Les constantes d'affinité sont mesurées par résonance de surface plasmonique (SPR) au moyen du BlAcore(TM) (Biacore Uppsala, Suède). PA83 (List biological laboratories, Campbell, CA) est immobilisé à un maximum de 210 RU sur une puce CM5 (Biacore) au moyen d'une liaison amine, selon les instructions du fournisseur. Un flux de 30 µl/min est maintenu durant la mesure. Pour chaque mesure, un minimum de 6 dilutions d'immunoglobuline dans du tampon HBS-EP (Biacore), avec des concentrations comprises entre 10 à 0,1 µg/ml, sont testées durant 1900 secondes. Après chaque dilution d'immunoglobuline, la puce est régénérée avec de la glycine pH 1,5 (Biacore), avec un flux de 100/min pendant 30 secondes. Les constantes d'affinité sont calculées au moyen d'une méthode d'analyte bivalent (Karlsson et al. 1991), et vérifié avec des tests de consistence interne (Schuck et al. 1996). Résultats : L'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » présente vis-à-vis de l'antigène PA83 30 une constante d'association (Ka) de 2,93.105 M, une constante de dissociation (Kd) de 9,70.10-6 M et une constante d'affinité (KD) de 3,3.10-11M. Exemple 5 : Mesure de l'effet neutralisant de 35PA83 « 6.20 » Le test de neutralisation in vitro est réalisé selon le protocole décrit par Little et al. (Little et al., 1990). La lignée cellulaire de macrophage de souris J774A.1 (ATCCLGC, Molsheim, France) est incubée pendant 16 h à une concentration de 14 000 cellules/puits sur une plaque de 96 puits. Les composants de la toxine létale, 400ng/m1 de PA (List laboratories) et 40 ng/ml de LF (chacun étant dilué dans du PBS à 1 mg/m1 et conservé congelé jusqu'à utilisation), sont ajoutés simultanément à l'immunoglobuline ou au milieu seul, et incubés pendant 1 heure à 37°C. Le produit de l'incubation est ensuite ajouté aux macrophages et incubé à 37°C pendant 4 heures. L'essai Cytotox(R) (Promega) est utilisé selon les indications du fournisseur pour évaluer la viabilité des cellules. Chaque essai est corrigé pour une viabilité cellulaire de 100% (les puits de contrôle sont ceux qui ne contiennent pas de toxine ni d'immunoglobuline) et une viabilité de 0% (les puits de contrôle étant ceux contenant de la toxine mais pas d'immunoglobuline). Résultats : La valeur de 50% de neutralisation (IC50) est déterminée pour l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 ». Exemple 6 : Etudes pharmacocinétiques Pour évaluer le temps de demi-vie de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », six souris A/J âgées de six semaines (Harlan, Gannat, France) ont été réparties en deux sous-groupes de taille égale. Toutes les souris ont reçu l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », administrée par une injection unique sous-cutanée à la dose de 10 mg/kg. Le sang a été collecté par ponction rétro-orbitale quotidienne, à partir du jour 1 et jusqu'au jour 6 après l'injection, puis du jour 8 jusqu'au jour 10 après l'injection, en utilisant chaque jour distinct les souris en alternance. Le temps de demi-vie de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » a été établi à partir des résultats des tests ELISA réalisés sur les pools d'échantillons de sérum, après extrapolation linéaire des valeurs obtenues. Pour réaliser les tests ELISA, les puits de plaques de microtitration de 96 puits ont été recouverts par incubation avec l'antigène PA83 ou l'antigène LF (List Laboratories) dilués dans du tampon PBS (5µg/ml, 100 pl par puits) pendant une nuit à 4°C. Les sites libres des puits de microplaque ont ensuite été bloqués par incubation avec un volume de 200 pl d'une solution d'albumine sérique bovine (BSA) à 5% dans du tampon PBS, pendant 1 heure à 37°C. Les sérums ont été dilués en série dans un tampon de PBS à 0,1 % de Tween® 20, 1% de BSA, puis incubés dans les plaques (100 Opuits), pendant 2 heures à 37°C. Les puits des plaques ont été ensuite incubés avec un conjugué IgG antisouris/phosphatase alcaline ou un conjugué IgG antihumain/ phosphatase alcaline dilué au 1/10 000 (Sigma, Saint Louis, Missouri, Etats- Unis), pendant 1 heure à 37°C. Le 5 substrat phosphate de P-nitrophényle (Sigma) a ensuite été ajouté et les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante. On a déterminé l'absorbance à 405 nm en utilisant un lecteur automatisé de microplaques (iEMS reader MF, Labsystems, Helsinki, Finlande). On a défini le point de dilution limite, dont la valeur réciproque correspond au titre anticorps du sérum, comme le point pour lequel la valeur 10 du signal était égale au double de la valeur du signal mesurée pour le sérum de souris naïves. Le sérum de souris naïves est utilisé comme témoin négatif. Exemple 7 : Etudes de protection passive des rats Pour les essais in vivo, on injecte à des rats Fischer (250 à 300g) (C. River, L'Abresle, 15 France) 40 p.g de PA (List biological laboratories, Campbell, CA) et 8 p.g de LF par 250g de rat, de la manière décrite dans Ezzel et al. (Ezzell et al., 1984), excepté le fait que la veine de la queue est utilisée. 4 animaux sont utilisés par groupe et pour l'évaluation de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », l'immunoglobuline est ajoutée au PA et au LF avant l'injection. On observe les rats 2 fois par jour pendant 10 jours. Tous 20 les essais in vivo présentés dans cette étude sont approuvés par le comité d'éthique local pour l'expérimentation et le soin animal. Préparation et utilisation des spores Sterne : Des spores de B. anthracis Sterne (collection Pasteur) sont préparées comme exposé dans Albrecht et al. (Albrecht et al., 2007), et gardées congelées (-20°C). Les spores 25 sont dénombrées par comptage de plaque viable après congélation/décongélation et le compte est vérifié quand chaque tube est utilisé dans cette étude. La LD50 de ces spores administrées par voie intraveineuse dans des souris males A/J (Harlan, Gannat, France), âgées de 9 semaines, pesant 20-25g, est établie à 1.104, menant à la mort en 48 à 72 heures, soit proche d'une valeur de 2.10(4) utilisée dans une autre étude (Albrecht et al., 30 2007). Exemple 8 : Prophylaxie par l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », court traitement avec la tétracycline, ou les 2 Pour les études d'un schéma prophylactique de l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » ou par tétracycline seulement, on injecte les immunoglobulines à des groupes de 10 souris A/J, par voie subcutanée, 12 heures avant l'infection (une injection de 5 mg/kg ou de 2 mg/kg). Le challenge est administré comme 10 000 LD50 ou 1.108 spores et les souris sont observées 2 fois par jour pendant 2 semaines, puis 5 fois par semaine pendant 2 semaines additionnelles. Les souris survivantes sont re-testées par infection un mois plus tard, avec la même quantité de spores, et observées pendant un mois additionnel. Pour les études d'un schéma prophylactique impliquant à la fois la tétracycline et l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », des groupes de 10 souris sont traités avec la tétracycline comme dans le schéma impliquant la tétracycline seule mais, en plus, l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » est injectée 12 heures avant le challenge. Pour les études de protection active, 10 souris sont injectées par voie subcutanée avec 5 1..tg de PA par souris, dans de l'adjuvant complet de Freund. Un second groupe reçoit la même injection puis, 1 mois plus tard, la réponse immunitaire de ce groupe est stimulée avec la même dose de PA dans de l'adjuvant de Freund incomplet. Exemple 9 : Prophylaxie par l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », court traitement 20 avec la doxycycline, ou les 2 L'étude de la prophylaxie avec la doxycycline, avec ou sans l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », a été réalisée avec des groupes de dix souris A/J âgées de 10 semaines (Harlan, Gannat, France), auxquelles on a injecté de manière prophylactique l'antibiotique par voie intra péritonéale, à la dose unique quotidienne de 5 mg/kg. La chimioprophylaxie a 25 débuté 12 heures avant l'infection et a été réalisée pendant 7 jours, ce qui représente une réduction de 9/10 de la durée standard qui est de 60 jours. On a choisi un dosage de doxycycline qui est approximativement le double du dosage humain standard (dosage quotidien de 3 mg/kg pour un humain adulte), et on a montré que des doses plus petites étaient efficaces contre B. anthracis (Friedlander et al., 1993, 30 J Infect Dis, Vol. 167: 1239-1243 ; Kalns et al., 2002, Biochem Biophys Res Commun, Vol. 297 : 506-509). Des doses plus grandes ont été utilisées (Heine et al., 2007, Antimicrob Agents Chemother, Vol. 51 : 1373-1379) ; on a toutefois observé qu'une dose de 50 mg/kg semblait mal tolérée chez les souris A/J, qui présentaient alors un gonflement de l'abdomen et un poil hérissé. Pour complémenter le traitement par la doxycycline avec l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », une dose unique de cet anticorps (1 ou 2 mg/kg) a été injectée ou non de manière concomitante à la dernière dose de doxycycline. L'infection a utilisé 1.108 spores injectées par voie intra péritonéale, ce qui représente 10 000 LD50. Les souris ont été observées deux fois par jour pendant les deux premières semaines, puis cinq fois par semaine pendant les deux semaines additionnelles. Exemple 10 : Thérapie avec l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », ciprofloxacine court traitement ou les 2 Pour les études de schéma thérapeutique, des groupes de 10 souris A/J sont challengées avec une dose de 1000 LD50 ou 1.107 spores. Après 12 heures, l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » (voie sous-cutanée, 1 injection de 10 mg/kg) ou la ciprofloxacine (voie subcutanée, 50 mg/kg 2 fois par jours pendant 5 jours) sont injectés séparément ou la ciprofloxacine et l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » sont toutes deux injectées le premier jour puis la ciprofloxacine seule est encore injectée pendant 4 jours additionnels. Exemple 11 : Thérapie avec l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 », ciprofloxacine court traitement ou les 2 (autre essai) Pour les études de traitement curatif, des groupes de 10 souris A/J sont infectées avec une dose de 1000 LD50 ou 1.107 spores. Après 12 heures, les souris ont été traitées avec la ciprofloxacine (par voie sous-cutanée, avec une injection initiale de 25 mg/kg) ou avec I'IgG 35PA83 « 6.20 » (voie subcutanée, 1 injection de 10 mg/kg) séparément ; ou la ciprofloxacine et I'IgG 35PA83 « 6.20 » sont toutes deux injectées simultanément à deux sites différents. On a aussi testé des délais additionnels de 24 heures et 48 heures avant de débuter le traitement combiné (ciprofloxacine et IgG 35PA83 « 6.20 »). Après la première administration du traitement, la ciprofloxacine seule (25 mg/kg, deux fois par jour) a été injectée durant les 4,5 jours suivants. La dose de ciprofloxacine a été choisie comme étant approximativement le double de la dose standard humaine (dose quotidienne de 20 mg/kg chez l'homme adulte), cette dose ayant déjà été utilisée efficacement contre B. anthracis (Kalns et al., 2002, Biochem Biophys Res Commun, Vol. 297: 506-509). La tolérance à cette dose sélectionnée a été favorablement testée chez les souris A/J avant de débuter cette étude. Cette partie de l'étude vise essentiellement à résoudre le problème de la survie à court-terme suivant un traitement différé, et la surveillance a été limitée à la période de 18 jours suivant l'infection. Exemple 12 : Comparaison entre les traitements anti-anthrax prophylactiques passifs et actifs Un traitement anti-anthrax prophylactique passif consiste en un traitement avec l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 ». Un traitement anti-anthrax prophylactique actif consiste en un traitement par immunisation avec l'antigène PA. Pour comparer l'immuno-protection active et passive, un groupe de dix souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec 5 1..tg de PA83 dans de l'adjuvant complet de Freund et infectées par voie intra péritonéale avec 10 000 LD50, un mois après. Un autre groupe de dix souris ont été immunisées de manière identique, mais ont reçu une immunisation de rappel quatre semaines après avec 5 1..tg de PA83 dans de l'adjuvant incomplet de Freund et infectées un mois après la seconde injection. En parallèle, on a évalué la protection passive par l'immunoglobuline 35PA83 « 6.20 » contre la même infection. Tous les animaux infectés ont été observés pendant un mois, et les résultats des deux types de prophylaxie ont été comparés. Exemple 13 : Comparaison entre une immunisation passive et un traitement tardif avec l'IgG 35PA83 « 6.20 » seule chez des lapins White New Zealand (WNZ) infectés par des spores de 9602 Pour l'étude d'immunisation passive, l'IgG 35PA83 « 6.20 » est injectée en intraveineuse à 2.5, 1, 0.5 mg/kg dans 3 groupes de 8 lapins WNZ, préalablement anesthésiés avec de l'imalgène 1000 (Merial, Lyon, France). Cinq minutes après, les animaux sont mis en contact avec 250 d'une suspension de spores de la souche virulente B.anthracis 9602, déposée sur chaque narine pour inhalation dans les poumons, et correspondant à 100 LDso- Pour le traitement tardif, les mêmes conditions expérimentales ont été utilisées, excepté 30 que 2 groupes de 8 animaux reçoivent l'injection d'IgG (2.5 mg/kg) 6h après une mise en contact avec 80 LD50 ou 200 LD50 de spores de B.anthracis 9602. Pour chaque groupe, 4 animaux additionnels sont utilisés dans les mêmes conditions expérimentales, comme contrôles positifs. Toutes les expériences avec la souche de B. anthracis 9602 sont réalisées dans un laboratoire de niveau de sécurité 3, et les animaux sont observés 21 jours après la mise en contact. Références bibliographiques Albrecht, M. T., H. Li, E. D. Williamson, C. S. Lebutt, H. C. Flick-Smith, C. P. Quinn, H. Westra, D. Galloway, A. Mateczun, S. Goldman, H. Groen, and L. W. Baillie. 2007. Human monoclonal antibodies against anthrax lethal factor and protective antigen act independently to protect against Bacillus anthracis infection and enhance endogenous immunity to anthrax. Infect Immun. Andhs-Widhopf, J., C. Rader, P. Steinberger, R. Fuller, and C. F. Barbas, 3rd. 2000. Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 242:159-181. Andhs-Widhopf, J., P. Steinberger, R. Fuller, C. Rader, and C. F. Barbas, 3rd. 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light - and 15 heavy-chain coding sequences. In C. F. Barbas, 3rd, D. R. Burton, J. K. Scott, and G. J. Silverman (ed.), Phage Display: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Carter, P., H. Bedouelle, and G. Winter. 1985. Improved oligonucleotide site- directed 20 mutagenesis using M13 vectors. Nucleic Acids Res 13:4431 -43. Ezzell, J. W., B. E. Ivins, and S. H. Leppla. 1984. Immunoelectrophoretic analysis, toxicity, and kinetics of in vitro production of the protective antigen and lethal factor components of Bacillus anthracis toxin. Infect Immun 45:761 -7. 25 Karlsson, R., A. Michaelsson, and L. Mattsson. 1991. Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical System. J Immunol Methods 145:229-40). Laffly, " Selection of a macaque Fab with framework regions like those in humans, high 30 affinity, and ability to neutralize the protective antigen (PA) of bacillus anthracis by binding to segment of PA between residues 686 and 694 ", Antimicrobial agents and chemotherapy, Aug. 2005, p. 3414-3420. Little, S. F., S. H. Leppla, and A. M. Friedlander. 1990. Production and characterization of monoclonal antibodies against the lethal factor component of Bacillus anthracis lethal toxin. Infect Immun 58:1606-13. Schuck, P., and A. P. Minton. 1996. Analysis of mass transport-limited binding kinetics in evanescent wave biosensors. Anal Biochem 240:262-72. REVENDICATIONS1. Immunoglobuline de classe G dirigée contre l'antigène protecteur de la toxine du charbon, ou un de ses fragments, comprenant au moins : - une région variable de chaîne lourde comprenant une séquence d'acides aminés possédant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, étant entendu qu'elle comprend les acides aminés Leucine en position 51 et Glycine en position 67, et/ou - une région variable de chaîne légère comprenant une séquence d'acides aminés possédant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, étant entendu qu'elle comprend un acide aminé Leucine en position 55. 2. Immunoglobuline selon la revendication 1, ayant une affinité pour l'antigène protecteur de la toxine du charbon inférieure à 2.10-9 M, de préférence inférieure à 1.10-9 M, de préférence inférieure ou égale à 3,3.10-11 M. 3. Immunoglobuline ou un de ses fragments, selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle : la région constante de ladite chaîne lourde comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par la séquence SEQ ID NO : 3, et - la région constante de chaîne légère comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par la séquence SEQ ID NO : 4. 4. Immunoglobuline selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle : - chacune des chaînes lourdes comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 5, et - chacune des chaînes légères comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 6. 30 5. Immunoglobuline ou un de ses fragments, selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite chaîne lourde et/ou ladite chaîne légère est liée à un peptide signal. 6. Immunoglobuline selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle : - chacune des chaînes lourdes comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 7, et - chacune des chaînes légères comprend, ou consiste en, une séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 8. 7. Immunoglobuline ou un de ses fragments, selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la région constante de chacune des chaînes lourdes est de type yl. 8. Immunoglobuline ou un de ses fragments, selon l'une quelconque des revendications précédentes, possédant sur son site de glycosylation Asn297 des N- glycannes dont le taux de fucosylation est inférieur à 65%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 40%. 9. Immunoglobuline ou un de ses fragments, selon la revendication 8, possédant sur son site de glycosylation Asn297 une structure glycannique de type biantenné, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, présentant des mannoses terminaux et/ou des N-acétylglucosamines terminaux non intercalaires. 10. Immunoglobuline ou un de ses fragments, selon la revendication 9, présentant une teneur supérieure à 60 % pour les formes G0+G1+G0F+G1F, les formes G0F+G1F étant inférieures à 50 %. 11. Immunoglobuline ou un de ses fragments, selon la revendication 9, présentant une teneur supérieure à 60 % pour les formes G0+G1+G0F+G1F, la teneur en fucose étant inférieure à 65 %. 12. Immunoglobuline ou un de ses fragments, selon la revendication 9, présentant une teneur inférieure à 40% pour les formes G1F+GOF. 13. Polynucléotide comprenant au moins une séquence nucléotidique codant la chaîne lourde ou la chaîne légère d'une immunoglobuline ou un de ses fragments telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14. Vecteur comprenant au moins un polynucléotide selon la revendication 13. 15. Cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 14. 16. Cellule hôte selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule choisie parmi : SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-Led O, CHO-Led, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653. 17. Composition, de préférence pharmaceutique, comprenant au moins une immunoglobuline, de préférence humaine, ou un de ses fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 18. Immunoglobuline, de préférence humaine, ou un de ses fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour son utilisation comme médicament. 19. Immunoglobuline, de préférence humaine, ou un de ses fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention de pathologies liées à la toxine du charbon. 20. Méthode pour la détection in vitro d'une toxine du charbon comprenant l'antigène protecteur dans un échantillon biologique, comprenant : - la mise en contact de l'échantillon avec au moins une immunoglobuline ou un de ses fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, et- la détection de la liaison de ladite immunoglobuline ou un de ses fragments comme indicateur de la présence de ladite toxine du charbon. 21. Kit pour la détection d'une toxine du charbon comprenant l'antigène protecteur, ledit kit comprenant : - un récipient comprenant au moins une immunoglobuline ou un de ses fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 marquée, et - un récipient comprenant des moyens de détection de ladite immunoglobuline ou un de ses fragments marquée. 10 22. Immunoconjugué comprenant une immunoglobuline ou un de ses fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 liée à un agent thérapeutique.