Brevet FR3000216A1 — publié le 20140627

Utilisation de protéases particulières pour la détection de trichophytons et de pathologies associées La présente invention se rapporte à la détection de la présence de champignons du genre Trichophyton chez l'être humain ou l'animal, au niveau de la peau et des phanères. L'invention vise en particulier un procédé de détection de trichophytons, comprenant une étape de détermination de la présence dans un échantillon de peau ou de phanère, d'au moins une protéase choisie parmi cinq protéases particulières. L'invention a également pour objet spécifique des anticorps monoclonaux dirigés contre ces protéases et un kit de diagnostic en contenant. Les trichophytons sont des champignons parasites qui se développent sur la peau, le cuir chevelu ou les ongles et provoquent chez l'homme ou l'animal des dermatophytoses. Chez l'homme par exemple, les trichophytons peuvent être responsables de l'herpès ciriné sur la peau, de la teigne tondante sur le cuir chevelu, du kérion ou du sycosis trichophytique sur la barbe et de l'onychomycose sur les ongles. Ces maladies sont très gênantes et peuvent provoquer d'autres complications pathologiques graves. Leurs aspects inesthétiques et parfois handicapants peuvent également avoir des effets psychosociaux négatifs importants pour les personnes qui en sont atteintes. Il existe actuellement des moyens thérapeutiques pour traiter les pathologies provoquées par des trichophytons chez l'homme ou l'animal, mais ces traitements sont étroitement liés à la justesse du diagnostic posé. Or, les mycoses de la peau ou des phanères peuvent être dues à des agents fongiques autres que des trichophytons, comme des levures, des moisissures ou d'autres dermatophytes, et dans ce cas le traitement devra être différent. De plus, elles peuvent être confondues avec d'autres pathologies ou traumatismes de la peau ou des phanères. Par exemple, les signes cliniques de dystrophie des ongles comme le psoriasis, le trauma, la tumeur unguéale, le lichen plan et l'infection bactérienne ressemblent à des onychomycoses et peuvent être sources de confusion. Il est donc essentiel de pouvoir poser un diagnostic précis, une inexactitude engendrant la mise en place d'une solution thérapeutique inefficace. Aujourd'hui, il existe différents outils de diagnostic, mais aucun n'est satisfaisant. Pour l'onychomycose notamment, on connaît six outils différents (Rothmund et al., 2012), dont deux sont couramment utilisés : l'observation directe, dont l'incertitude conduit inévitablement à des erreurs de diagnostic, et la mise en culture de l'agent pathogène qui est un procédé long, peu pratique et non accessible à tous. Il existe également un immuno-kit produit par la société NISSHO CORPORATION, qui présente l'avantage d'être rapide et facile d'utilisation, mais qui manque de sensibilité et surtout de spécificité. En effet, la détection des dermatophytes est réalisée par l'utilisation d'un anticorps détectant un polysaccharide présent sur la paroi cellulaire des trichophytons, mais également sur celle de nombreux autres dermatophytes. Il subsiste donc un besoin pour une solution permettant de détecter rapidement, facilement et spécifiquement la présence de trichophytons sur la peau ou les phanères, et en particulier sur les ongles, palliant les inconvénients des outils de diagnostic actuels. C'est l'objectif de la présente invention qui se propose, pour y répondre, d'utiliser au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2. L'invention vise donc l'utilisation d'au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour la détection de la présence, dans un échantillon de peau ou de phanère humain ou animal, d'au moins un trichophyton. En particulier, l'invention vise un procédé de détection de la présence d'au moins un trichophyton, comprenant une étape de détermination de la présence dans un échantillon de peau ou de phanère issu d'un être humain ou d'un animal susceptible d'être infecté par un trichophyton, d'au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2. Les trichophytons recherchés et détectés sont impliqués dans des pathologies de la peau et/ou des phanères. Par phanères au sens de l'invention, on entend toutes productions épidermiques protectrices, annexes ou téguments, contenant un fort pourcentage de kératine comme les poils, les cheveux et les ongles. Avantageusement, la présence d'au moins une de ces protéases au niveau de la peau ou des phanères, est spécifique uniquement de la présence de trichophytons. Cette détermination peut être faite par différents moyens pouvant faire l'objet d'outils de diagnostic rapides, faciles d'utilisation, et spécifiques des trichophytons, permettant ainsi la mise en place d'un traitement efficace et ciblé dans un délai très court. Deux moyens sont particulièrement adaptés, la détermination par spectrométrie de masse et l'immuno-détection. Pour mettre en oeuvre ce deuxième moyen, selon un objet particulier, l'invention vise également un anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou un fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2, ainsi qu'un kit comprenant un tel anticorps. L'invention est maintenant décrite en détail. L'invention se rapporte donc à l'utilisation d'au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour la détection de la présence, dans un échantillon de peau ou de phanère humain ou animal, d'au moins un trichophyton impliqué dans une mycose de la peau et/ou des phanères. Préférentiellement cette utilisation consiste en la mise en oeuvre d'un procédé de détection de la présence d'au moins un trichophyton impliqué dans une mycose de la peau et/ou des phanères, comprenant une étape de détermination de la présence dans une échantillon de peau ou de phanère issu d'un être humain ou d'un animal susceptible d'être infecté par un trichophyton, d'au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2. La détermination de la présence d'au moins une des protéases est réalisée in vitro à partir d'un échantillon de peau ou de phanères, mais reflète la présence de cette protéase in vivo au niveau de la peau ou des phanères de la personne ou l'animal sur lequel on a prélevé 1 ' échantillon. Les échantillons utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention sont obtenus par tout moyen adapté. Lorsque l'échantillon est un échantillon d'ongle, il est préférentiellement obtenu par grattage du lit de l'ongle ou par perçage de l'ongle à l'aide d'une micro chignole. Cette dernière méthode de prélèvement est notamment décrite dans le brevet US7848799. Lorsque l'échantillon provient d'une lésion mycosique de la peau, il est préférentiellement obtenu par grattage à l'aide d'une curette. Selon l'invention, la présence dans l'échantillon d'au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, est synonyme d'une infection par au moins un trichophyton. En effet il s'agit de protéases sécrétées spécifiquement par les trichophytons jouant un rôle dans la digestion des kératines, et qui, selon l'invention, se retrouvent au niveau de la peau et des phanères infectés par au moins un trichophyton. L'utilisation selon l'invention est adaptée pour la détection de tout trichophyton impliqué dans une mycose de la peau et/ou des phanères chez l'homme ou l'animal, en particulier Trichophyton bullosum, Trichophyton circonvolutum, Trichophyton concentricum, Trichophyton eboreum, Trichophyton equinum, Trichophyton eriotrephon, Trichophyton fischeri, Trichophyton gourvilii, Trichophyton interdigitale, Trichophyton kanei, Trichophyton krajdenii, Trichophyton longifusum, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton phase oliforme, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton soudanense, Trichophyton sp. CZ-2011, Trichophyton sp. FSU 10097, Trichophyton sp. IFM 41172, Trichophyton sp. LM 10725, Trichophyton terrestre, Trichophyton thuringiense, Trichophyton tonsurans, Trichophyton vanbreuseghemii, Trichophyton verrucosum, Trichophyton violaceum et Trichophyton yaoundei, quelle que soit la souche s'il en existe plusieurs. L'utilisation selon l'invention est tout particulièrement adaptée à la détection de Trichophyton interdigitale et/ou Trichophyton rubrum, encore plus préférentiellement de Trichophyton rubrum, quelle que soit la souche. La détection de la présence de trichophytons par la détermination d'au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2 selon l'invention, peut notamment être utilisée pour le dépistage, le suivi thérapeutique et/ou le diagnostic d'une pathologie chez l'homme ou l'animal, en particulier d'une mycose liée à une infection par trichophyton. L'invention est également relative à au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour son utilisation dans une méthode de dépistage, de suivi thérapeutique et/ou de diagnostic d'une pathologie liée à une infection par au moins un trichophyton, Il peut s'agir par exemple pour l'homme de l'herpès ciriné, de la teigne tondante, du kérion, du sycosis trichophytique ou d'une onychomycose. L'invention vise tout particulièrement le dépistage, le suivi thérapeutique et/ou le diagnostic d'une onychomycose. Ainsi, l'invention vise également au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour son utilisation dans une méthode de dépistage, de suivi thérapeutique et/ou de diagnostic d'une onychomycose. Par suivi thérapeutique, on entend l'utilisation selon l'invention et plus particulièrement le procédé de détection de la présence de trichophytons dans un échantillon de peau ou de phanères d'un être humain ou d'un animal pour suivre l'évolution d'un traitement de l'infection par trichophyton. Selon une première variante, l'utilisation selon l'invention et plus particulièrement le procédé de détection de la présence de trichophytons dans un échantillon de peau ou de phanères d'un être humain ou d'un animal, comprend une étape de détermination de la présence d'au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, par spectrométrie de masse quantitative (MRM - « Multiple Reaction Monitoring) ». La méthode MRM permet la détection et la quantification d'une protéine donnée dans un mélange complexe, à l'aide d'un spectromètre de masse qui permet de cibler les peptides d'une protéine donnée et de ne détecter que ceux-ci pour les quantifier. Les analyses en spectrométrie de masse sont préférentiellement réalisées avec différents spectres de masse essentiellement en mode MS/MS couplé en amont à une nano-HPLC. Le dosage des peptides peut également être réalisé avec une source (ionisante) différente de type MALDI. Selon l'invention, cette étape consiste en particulier à identifier par spectrométrie de masse quantitative au moins une des séquences peptidiques appartenant à une desdites protéases, préférentiellement une des séquences peptidiques suivantes : - SEQ ID n°1 : LSVAEGVGLFNVLQEK - SEQ ID n°2 : ALVSHDGTFVGSSK - SEQ ID n°3 : GGVGIWISDAK - SEQ ID n°4 : INFVGYGQSTTK - SEQ ID n° 5 : TLYVTAEDHATGK - SEQ ID n° 6 : AAGAIVYNNVPGSLAGTLGGLDK - SEQ ID n°7 : VSFGIITDNVNANLTK - SEQ ID n°8 : LIVGFVTELAK - SEQ ID n°9 : HANAVNAMIATLSK - SEQ ID n°10 : KPGGTTYYYDPSAGK - SEQ ID n°11 : MANDVIQSPGEGTTGK - SEQ ID n°12 : VLDCDGSGSNSGVIK - SEQ ID n°13 : ADFSNYGAVVDVYAPGK - SEQ ID n°14: SVMNMSLGGPR - SEQ ID n°15 : QMAIDVIQNPGASTTSK Les séquences 1 à 5 sont spécifiques de la dipeptyl peptidase V, la séquence 6 est spécifique de la leucine aminopeptidase 2, les séquences 7 à 9 sont spécifiques de la leucine aminopeptidase 1, les séquences 10 à 14 sont spécifiques de la subtilisin-like protease 6 et la séquence 15 est spécifique de la subtilisin-like protease 7. La détection d'au moins une des séquences peptidiques appartenant à la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 ou la leucine aminopeptidase 2, est spécifique de la présence d'un trichophyton dans l'échantillon et par conséquent d'une pathologie liée à la présence de ce trichophyton. Ce procédé permet de détecter les trichophytons présents avec une haute sensibilité, une haute spécificité, et une haute sélectivité. Selon un autre avantage, il permet également de quantifier les protéases détectées et par conséquent de quantifier les trichophytons présents dans l'échantillon. Selon une autre variante, l'utilisation selon l'invention et plus particulièrement le procédé de détection de la présence de trichophytons dans un échantillon de peau ou de phanères d'un être humain ou d'un animal, comprend la mise en oeuvre d'un test immunologique permettant de déterminer la présence dans l'échantillon, d'au moins une des protéases choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 ou la leucine aminopeptidase 2, préférentiellement au moins une des protéases choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 et la leucine aminopeptidase 2. De façon particulièrement adaptée, ce test immunologique comprend l'utilisation d'au moins un anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou un fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2. Cet anticorps peut notamment être utilisé pour détecter et identifier la présence de la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 par un système d'immuno détection comme par exemple une immuno-détection en phase liquide (ELISA par exemple) ou en phase semi-solide ou une méthode basée sur un flow de solution latéral (« lateral flow system »). Des systèmes analogues sont déjà connus par exemple pour le diagnostic rapide des angines à streptocoque bêta-hémolytique du groupe A (Streptatest). Comme la spectrométrie de masse, ce procédé permet de détecter la présence de trichophytons avec une haute sensibilité et une haute spécificité. Avantageusement, ce procédé peut être mis en oeuvre par tous et permet d'obtenir un résultat rapidement, généralement en 15 minutes. Pour mettre en oeuvre ce procédé, l'invention a également pour objet des anticorps monoclonaux dirigés contre la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou un fragment de ces anticorps capables de se lier respectivement à la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2. Ces anticorps sont obtenus par des procédés classiques à partir de l'inoculation à un rongeur par exemple, de dipeptyl peptidase V, de subtilisin-like protease 6 ou de leucine aminopeptidase 2. Les protéines ou des fragments de ces protéines purifiées ou recombinantes obtenues par génie génétique sont utilisés en tant qu'immunogènes. Selon un dernier objet, l'invention vise un kit de diagnostic d'une pathologie de la peau et/ou des phanères liée à une infection par au moins un trichophyton, comprenant au moins un anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, il s'agit d'un kit pour le diagnostic rapide de l'onychomycose. L'invention est à présent exemplifiée par des essais non limitatifs, illustrant l'invention et montrant en particulier sa haute spécificité en regard de la détection de la présence des trichophytons chez des sujets infectés. Certains essais ont été réalisés par spectrométrie de masse et d'autres par immuno-détection à partir d'échantillons d'ongle ou de peau. I. Protocoles d'analyse des échantillons applicables aux différents essais I.1 Extraction des protéines Les échantillons de peau sont obtenus par biopsie. Les échantillons d'ongles sont constitués du grattage du lit de l'ongle. Pour chaque échantillon : les protéines ont été extraites et solubilisées dans une solution contenant 50 mM d'ammonium bicarbonate et 0,1% ALS-400 (ref Proteabio). Le détergent non ionique ALS-400 est un détergent compatible avec l'analyse en spectrométrie de masse. L'extraction a été effectuée sous agitation dans un Thermo mixer (Eppendorf) avec une vitesse de 1400 rpm, à 4°C pendant 2 heures. Le surnageant contenant les protéines solubilisées a été récupéré par centrifugation (à 14000 rpm, à 4°C, pendant 10 minutes). Les débris insolubles ont été éliminés par filtration à travers un filtre de 0,22 iam par centrifugation (Millipore, Billerica, États-Unis, réf : UFC3OGVNB), à 14000 rpm, à 4°C, pendant 10 minutes. 1.2 Immuno-détection : Western Blot Les analyses en western blot se sont déroulées après la séparation des protéines en SDS-PAGE, selon le protocole suivant : 1. Transfert des protéines depuis le gel sur une membrane de nitrocellulose avec le système /B1OtTM Gel Transfer Device (Invitrogen, US). 2. Humidification de la membrane avec du PBS lx pendant 5 minutes. 3. Blocage des sites non spécifiques de la membrane avec le tampon de blocage Odyssey pendant une heure à température ambiante (0,4 ml/cm2). 4. Dilution de l'anticorps primaire (sérum total anti-protéases) dans le tampon de blocage Odyssey au 1 : 3000. Incubation sous agitation douce pendant toute la nuit. 5. Lavage de la membrane avec du PBS 1X contenant 0,1% de Tween-20 pendant 10 minutes. (3 lavages successifs). 6. Dilution de l'anticorps secondaire marqué à l'IRDye 800CW au 1 : 5000 dans le tampon de blocage Odyssey à l'abri de la lumière. 7. Incubation pendant 60 minutes à l'abri de la lumière 8. Lavage de la membrane, à l'abri de la lumière, avec du PBS 1X contenant 0,1% de Tween-20 pendant 10 minutes. 3 lavages. 9. Lavage de la membrane, à l'abri de la lumière, avec du PBS 1X afin d'éliminer le Tween-20. 10. La membrane est scannée pour la détection dans l'infrarouge (Odyssey LI-COR). 1.3 Spectrométrie de masse Les analyses en spectrométrie de masse ont été réalisées avec un triple quad, QSTARe XL, essentiellement en mode MS/MS couplé en amont à une nano-HPLC. La préparation des échantillons pour l'analyse en spectrométrie de masse comprend une étape de réduction et d'alkylation des ponts disulfures des protéines, suivi d'une étape de digestion enzymatique (la trypsine étant couramment la plus utilisée). Les peptides obtenus par digestion sont ensuite analysés en spectrométrie de masse. La digestion enzymatique peut se faire, soit directement dans le gel : digestion « in-gel », soit en solution. Avec la digestion « in- gel », les protéines sont préalablement séparées en SDS-PAGE. Par contre, la digestion en solution permet de digérer toutes les protéines à partir d'une même fraction protéique. Cette méthode est généralement utilisée dans les cas où les échantillons sont faiblement complexes ou ne sont pas compatibles avec une séparation en SDS- PAGE. La combinaison du SDS-PAGE et la digestion in-gel, montre l'avantage de dénaturer et séparer les protéines et de limiter ainsi l'influence des protéines très abondantes qui par encombrement stérique gênent l'analyse en spectrométrie de masse. Le choix de la méthode de digestion dépend principalement de la quantité et de la complexité de l'échantillon à analyser. Digestion directe en solution : Pour les échantillons protéiques, au préalable à la digestion par la trypsine, une réduction suivie d'une alkylation des ponts disulfures a été effectuée. Cette étape a été réalisée à l'aide d'un agent réducteur, le dithiothréitol (DTT) et d'un agent alkylant, l'iodoacétamide. Dans un premier temps, les échantillons cliniques ont été incubés dans une solution tampon de 100 mM de bicarbonate d'ammonium en présence de 10 mM de dithiothréitol à 56°C pendant 45 minutes sous agitation, puis incubés avec 55 mM d'iodoactamide pendant 30 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. La trypsine a été utilisée afin de « découper » la ou les protéine(s) en peptides qui seront ensuite analysés en spectrométrie de masse. La trypsine hydrolyse spécifiquement la liaison peptidique du côté C-terminal après les acides aminés lysine et arginine (Lys-1-Xaa ou Arg-1-Xaa) si l'acide aminé suivant n'est pas une proline. La quantité de trypsine a été utilisée dans des ratios (enzyme/substrat) entre 1/10 et 1/100 afin d'éviter une autolyse de la trypsine dans le cas d'une concentration trop forte en enzyme ou une hydrolyse incomplète des protéines pour une concentration en trypsine trop faible. La digestion en solution par la trypsine a été réalisée dans un ratio enzyme/protéine compris entre 1/100 et 1/10 à partir d'une solution de trypsine (1 mg/mi) diluée préalablement dans une solution 1 mM HC1. L'incubation a été réalisée à 37°C pendant toute la nuit sous agitation. Digestion « in gel » : Au préalable à la digestion « in gel », une réduction suivie d'une alkylation des ponts disulfures dans les échantillons cliniques a été effectuée selon le protocole décrit dans la partie de « Digestion directe en solution ». La digestion « in gel » s'est déroulée selon les étapes suivantes : 1. Les bandes d'intérêt ont été découpées à partir d'un gel, en sections égales de taille 1-1,5 mm en utilisant un scalpel, en prenant soin d'inclure uniquement le gel coloré. 2. Les morceaux de gel coupés ont été placés dans un tube plastique de 2 ml (Eppendorf). 3. Les morceaux de gel ont été couverts avec 200 pl de 120 mM bicarbonate d'ammonium avec 40% d'acétonitrile (ACN) puis incubés à 37 ° C pendant 30 minutes. Les solutions ont été éliminées. 4. L'étape 3 a été répétée une fois. 5. Les morceaux de gel ont été séchés au SpeedVac (Eppendorf, France) pendant 15 minutes. 6. La solution de trypsine (0,6 ils) a été ajoutée dans le tube contenant les morceaux de gel. La quantité d'enzyme ajoutée a été ajustée afin de recouvrir le gel. 7. Environ 50 pl de 40 mM bicarbonate d'ammonium contenant 9% d'ACN ont été ajoutés dans le tube afin de recouvrir les morceaux de gel. 8. L'incubation a été réalisée à 37°C pendant toute la nuit. 9. Après l'incubation, la solution contenant les peptides a été transférée dans un nouveau tube. 10. 50 pl de la solution 50% acétonitrile contenant 0.1% acide formique ont été ajoutés dans le tube contenant les morceaux de gel à 37°C pendant 30 minutes sous agitation. Le surnageant a été ensuite combiné avec la solution récupérée dans l'étape 9. Cette étape a été renouvelée. 11. La solution contenant les peptides extraits a été filtrée par centrifugation à 1750 rpm pendant 2 minutes en utilisant un filtre Ultrafree-MC 0,22 ,um (Millipore, États-Unis) afin d'enlever les morceaux de gels résiduels. 12. Le filtrat récupéré dans l'étape 11 a été évaporé au SpeedVac (Eppendorf Concentrator 5301, France) pendant 60 minutes. 13. 20 pl de la solution 3% ACN contenant 0,1% acide formique ont été ajoutés dans le tube puis la solution a été transférée dans un tube spécial pour l'analyse en spectrométrie de masse. COUPLAGE NANO HPLC - QSTARe XL (MS/MS) Le système HPLC (LC Packing/DIONEX) est composé d'une pompe Ultimate disposant d'un diviseur permettant de délivrer un nano débit (de l'ordre de 200 nanol/min.), d'un injecteur d'échantillons Famos (configurable également en plaque 96 puits) et d'une pompe Switchos permettant une pré-concentration des échantillons ainsi que l'élimination des sels pouvant nuire à la détection en spectrométrie de masse. La phase mobile est composée d'une phase A (95 volumes eau, 5 volumes ACN (acétonitrile) et 0.1 volume HCOOH (acide formique)) et d'une phase B (95 volumes ACN, 5 volumes eau et 0.1 volume HCOOH) avec un débit de 200 nl/min en suivant un gradient pour la séparation des peptides. La séparation chromatographique est effectuée sur une colonne Atlantis C18, Waters (75 tm x 15 cm) d'une granulométrie de 3 pm. Une pré-concentration de l'échantillon est effectuée sur une colonne C18 LcPaking de 5 mm de longueur, de 300 i.tm de diamètre et d'une granulométrie de 5 i.tm. La phase mobile de pré-concentration est composée d'une phase C (97 volumes d'eau, 3 volumes ACN et 0.1 volume HCOOH) avec un débit de 30 1.11/min. Le basculement de la vanne se fait 3 min après l'injection. Le volume d'injection est de liai, mais peut être, selon le type d'analyse, augmenté à 10 O. Spectrométrie de masse : Le spectromètre de masse est composé d'une source nano electrospray (nanoESI), dont la tension de l'aiguille se situe entre 1000 et 2000 V réglée lors de la calibration. La résolution est située entre 11000 et 13000 à la masse 879.9 amu (atomic mass unit) (lors de la calibration), le niveau de curtain gas (gaz rideau) est de 30. Tous les spectres ont été acquis en mode réflecteur des ions positifs. L'analyseur quadripolaire a été utilisé pour faire de la fragmentation dans la cellule de collision par l'argon. La fragmentation est effectuée pour des ions plus grands que 400 amu et plus petits que 1200 amu avec un état de charge compris entre 2 et 3 amu et dont l'abondance est supérieure à 10 counts. Ces ions sont exclus durant 20 secondes après acquisition et pour une fenêtre de 4.0 amu, le nombre de scans acquis pour chaque MS/MS est de 1 ou 2. La durée des runs varie de 80 mn à 90 mn selon les échantillons et des contrôles qualité sont effectués environ tous les 10 runs par des injections de digest de glutamate déshydrogénase à une concentration de 50 femtomoles. Si le digest de glutamate déshydrogénase est identifié sur plus de 5 peptides significatifs à l'aide du logiciel Mascot, les analyses sont considérées comme valides. Le logiciel Analyst QS 1.0 (Applied Biosystems) a été utilisé pour l'acquisition des données et pour le contrôle des instruments. II.Essais réalisés par immuno-détection Des essais ont été réalisés pour montrer la spécificité de la détection des protéases utiles selon l'invention, en particulier en regard d'autres protéases connues pour être sécrétées par un trichophyton (Trichophyton rubrum) susceptibles d'être présentes dans les échantillons. Ces essais ont été réalisés par Western Blot à partir d' échantillons: - d'ongles infectés par Trichophyton rubrum chez des personnes atteintes d'onychomycose, et - d'ongles traumatisés. Les protéases recherchées sont : - la dipeptyl peptidase IV (DDPIV), - la dipeptyl peptidase V (DDPV) - la subtilisin-like protease 3 (SUB3), - la subtilisin-like protease 4 (SUB4), - la subtilisin-like protease 6 (SUB6), - la subtilisin-like protease 7 (SUB7), - la leucine aminopeptidase 2 (LAP2), et - la métallocarboxypeptidase (M14A) Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous :25 Protéases Détectée en western blot Détectée en western blot dans les ongles infectés dans les ongles par T. rubrum traumatisés DPPIV NON NON DPPV OUI NON SUB3 NON NON SUB4 NON NON SUB6 OUI NON SUB7 OUI NON LAP2 OUI NON M14A NON NON Ces résultats montrent que seules les protéases DPPV, SUB6, SUB7, et LAP2 sont détectées par western blot dans les ongles infectés par un trichophyton. De plus, on constate que ces protéases ne sont pas présentes dans les ongles traumatisés, non infectés par un trichophyton. D'autres essais ont été réalisés pour montrer la spécificité de la présence des protéases DPPV, SUB6, SUB7,et LAP2 au niveau des ongles infectés par un trichophyton, en regard d'autres échantillons de peau ou d'ongles non infectés par un trichophyton. Ces essais ont été réalisés par western-blot à partir d' échantillons: - d'ongles infectés par Trichophyton rubrum chez des personnes atteintes d'onychomycose - de peau saine - du stratum corneum de peau saine (couches de l'épiderme superficielles) - d'ongles traumatisés et - d'ongles atteints de psoriasis. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci- dessous : Protéases ongles Peau saine Peau saine ongles Psoriasis infectés par (biopsies) stratum traumatisés atteinte de T rubrum corneum l'ongle DPPV OUI NON NON NON NON SUB6 OUI NON NON NON NON SUB7 OUI NON NON NON NON LAP2 OUI NON NON NON NON Ces résultats montrent encore la spécificité de la présence des protéases DPPV, SUB6, SUB7, et LAP2 dans des échantillons d'ongles infectés par un Trichophyton. Essais réalisés par spectrométrie de masse quantitative Des essais complémentaires ont été réalisés pour montrer la spécificité de la détection des protéases utiles selon l'invention avec un autre moyen de détermination. Ces essais ont été réalisés par spectrométrie de masse à partir d' échantillons: - d'ongles infectés par Trichophyton rubrum chez des personnes atteintes d'onychomycose, et - d'ongles traumatisés. Les protéases recherchées sont : - la dipeptyl peptidase IV (DDPIV), - la dipeptyl peptidase V (DDPV), - la subtilisin-like protease 3 (SUB3), - la subtilisin-like protease 4 (SUB4), - la subtilisin-like protease 6 (SUB6), - la subtilisin-like protease 7 (SUB7), - la leucine aminopeptidase 1 (LAP1), - la leucine aminopeptidase 2 (LAP2), et - la métallocarboxypeptidase (M14A). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci- dessous : Protéases Détectée en Détectée en spectrométrie spectrométrie de masse de masse dans les ongles dans les ongles infectés traumatisés par T. rubrum DPPIV NON NON DPPV OUI NON SUB3 NON NON SUB4 NON NON SUB6 OUI NON SUB7 OUI NON LAP1 OUI NON LAP2 OUI NON M14A NON NON Ces résultats montrent que seules les protéases DPPV, SUB6, SUB7, LAP2 et LAP1 sont détectées par spectrométrie de masse dans les ongles infectés par un trichophyton en regard d'autres protéases connues pour être sécrétées par un trichophyton tel que Trichophyton rubrum. De plus, on constate que ces protéases DPPV, SUB6, SUB7, LAP2 et LAP1 ne sont pas présentes dans les ongles traumatisés, non infectés par un trichophyton. D'autres essais ont été réalisés pour montrer la spécificité de la présence d'une des protéases utiles selon l'invention, à savoir SUB6, au niveau des ongles infectés par un trichophyton, en regard d'ongles infectés par d'autres dermatophytes, présentant d'autres pathologies ou traumatisés. Ces essais ont été réalisés par spectrométrie de masse à partir d'échantillons d'ongles présentés dans le tableau suivant : Echantillons d'ongles Nombre de sujets Trichophyton rubrum 30 Trauma (mycologie négative) 10 Trichophyton rubrum + melanine 2 Trichophyton interdigitalis 5 Scytalidium dimidiatum 4 Fusarium 2 Aspergillus 1 Psoriasis Onychopathy (mycologie 2 négative) Onychogriffose (mycologie négative) 1 Les séquences recherchées par spectrométrie de masse reflétant la présence de SUB6 sont : - SEQ ID n°11 : MANDVIQSPGEGTTGK - SEQ ID n°12 : VLDCDGSGSNSGVIK Les résultats obtenus pour la détection de SUB6 dans échantillons sont présentés dans le tableau ci-après : Echantillons d'ongles SUB6 positif SUB6 positif (Nombre de sujets) (%) Trichophyton rubrum 30 100 Trauma (mycologie négative) 0 0 Trichophyton rubrum + mélanine 2 100 Trichophyton interdigitalis 0 0 Scytalidium dimidiatum 0 0 Fusarium 0 0 Aspergillus 0 0 Psoriasis Onychopathy (mycologie négative) 0 0 Onychogriffose (mycologie négative) 0 0 Ces résultats confirment encore que la détection de la protéase SUB6 est spécifique de la présence d'au moins un trichophyton dans l'échantillon testé. REVENDICATIONS1. Utilisation d'au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour la détection de la présence, dans un échantillon de peau ou de phanère humain ou animal, d'au moins un trichophyton, caractérisée en ce qu'elle consiste en la mise en oeuvre d'un procédé de détection de la présence d'au moins un trichophyton, comprenant une étape de détermination de la présence dans un échantillon de peau ou de phanère issu d'un être humain ou d'un animal susceptible d'être infecté par un trichophyton, d'au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2. 2. Utilisation selon la revendication 1, pour la détection de Trichophyton interdigitale et/ou Trichophyton rubrum. 3. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que l'échantillon est un échantillon d'ongle obtenu par grattage du lit de l'ongle ou par perçage de l'ongle à l'aide d'une micro chignole. 4. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, pour le dépistage, le suivi thérapeutique et/ou le diagnostic d'une pathologie liée à une infection par au moins un trichophyton. 5. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, pour le dépistage, le suivi thérapeutique et/ou le diagnostic d'une onychomyco se. 6. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre d'un test immunologique permettant de déterminer la présence dans l'échantillon, d'au moins une des protéases choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 et la leucine aminopeptidase 2. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le test immunologique comprend l'utilisation d'au moins un anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-likeprotease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou un fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de détermination de la présence d'au moins une desdites protéases réalisée par spectrométrie de masse quantitative. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'étape de détermination de la présence d'au moins une desdites protéases, consiste à identifier par spectrométrie de masse quantitative au moins une des séquences peptidiques appartenant à une desdites protéases. 10. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que l'étape de détermination de la présence d'au moins une desdites protéases, consiste à identifier par spectrométrie de masse quantitative au moins une des séquences peptidiques suivantes : SEQ ID n°1 : LSVAEGVGLFNVLQEK SEQ ID n°2 : ALVSHDGTFVGSSK SEQ ID n°3 : GGVGIWISDAK - SEQ ID n°4 : INFVGYGQSTTK - SEQ ID n° 5 : TLYVTAEDHATGK SEQ ID n° 6 : AAGAIVYNNVPGSLAGTLGGLDK - SEQ ID n°7 : VSFGIITDNVNANLTK - SEQ ID n°8 : LIVGFVTELAK SEQ ID n°9 : HANAVNAMIATLSK - SEQ ID n°10 : KPGGTTYYYDPSAGK - SEQ ID n°11 : MANDVIQSPGEGTTGK - SEQ ID n°12 : VLDCDGSGSNSGVIK SEQ ID n°13 : ADFSNYGAVVDVYAPGK SEQ ID n°14 : SVMNMSLGGPR - SEQ ID n°15 : QMAIDVIQNPGASTTSK 11. Anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucineaminopeptidase 2, susceptible d'être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 7. 12. Kit de diagnostic d'une pathologie de la peau et/ou des phanères liée à une infection par au moins un trichophyton, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal selon la revendication 11. 13. Kit de diagnostic de l'onychomycose, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal selon la revendication 11. 14. Au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour son utilisation dans une méthode de dépistage, de suivi thérapeutique et/ou de diagnostic d'une pathologie liée à une infection par au moins un trichophyton. 15. Au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour son utilisation dans une méthode de dépistage, de suivi thérapeutique et/ou de diagnostic d'une onychomycose.