Brevet FR3010189A1 — publié le 20150306

- 1 - Domaine technique La présente invention concerne notamment un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer (MA). La présente 5 invention concerne également les kits de diagnostic permettant la mise en oeuvre des procédés selon l'invention. Technique antérieure L'augmentation de la durée de vie est actuellement 10 associée à une augmentation de la proportion de personnes développant des maladies neurodégénératives et en particulier la maladie d'Alzheimer. Cette maladie est fortement invalidante et a un cout élevé pour la société (1). Pour mieux comprendre cette pathologie, développer des 15 traitements appropriés encore inexistants et venir en aide aux personnes qui en sont atteintes, il est important de pouvoir disposer de biomarqueurs accessibles au cours d'un simple prélèvement sanguin sans nécessité d'avoir recours à des techniques sophistiquées et souvent uniquement 20 disponibles dans des structures hospitalières spécialisées comme l'IRM et la TEP (2, 3). Il est actuellement bien admis que la maladie d'Alzheimer (MA) est associée au niveau cortical à un excès de production de dépôts d'amyloïdes p (A(3) constituants les 25 plaques séniles (4, 5). Le peptide An contenant 38 à 42 acides aminés est issu du clivage protéolytique d'une protéine précurseur appelée APP (Amyloïd Precurcor Protein). La production d'An implique l'activation de la voie amyloïdogène faisant intervenir une p- et une y- 30 secrétase (6). En présence d'An, une cascade d'évènements conduisant à la neurodégénérescence est activée, en particulier l'hyperphosphorylation de la protéine tau UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE - 2 - (tubulin associated unit), conduisant à la déstabilisation des microtubules. La protéine tau est physiologiquement phosphorylée au niveau de certains sites tels que les résidus 5262, 5293, 5324 et 5356. Suite à son hyperphosphorylation au niveau des résidus 5212, 5214, S231, 5235 et 5422, tau se dissocie des microtubules compromettant ainsi leur stabilisation et leur fonctionnement (7). Ceci conduit à une altération des transports axonaux et dendritiques , ainsi qua une dégénérescence des neurones. Il en résulte une accumulation intraneuronale d'enchevêtrements de neurofibrilles constitués entre autre d'agrégats de protéines tau sous forme hyperphosphorylée. Actuellement, les biomarqueurs peptidiques, AP et tau-hyperphosphorylée (4, 5), quantifiables au niveau du liquide céphalorachidien (LCR), sont les seuls biomarqueurs diagnostiques reconnus de la MA. Toutefois, l'AF3 n'est pas synonyme de symptômes et la protéine tau hyperphosphorylée est un marqueur tardif. Du fait de la masse importante et de la diversité de lipides au niveau cérébral (cholestérol, dérivés oxydés du cholestérol, acides gras, phospholipides, sphingolipides) impliquant un métabolisme lipidique complexe, ces molécules pourraient aussi être impliquées dans la MA. Parmi les marqueurs lipidiques figurent des isoformes de l'Apolipoprotéine-E, en particulier ApoE-£4, reconnue comme facteur pronostique (8). Ainsi, des sujets porteurs de l'allèle £4 ont un risque plus élevé de développer une MA comparativement à ceux portant l'allèle £3, alors que ceux porteur de l'allèle E2 ont 30 réductions plasmatiques de spécifiquement par l'enzyme les neurones, ont aussi un risque plus faible (9). Des 24S-hydroxycholestérol, produit CYP46A1 au niveau cérébral par été rapportées et le 24S- hydroxycholestérol est actuellement considéré comme un UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE - 3 - biomarqueur des neurones actifs (10). Bien que moins de 1% de 24S-hydroxycholestérol soit excrété dans le LCR, des diminutions du taux de cet oxystérol ont été corrélées avec la sévérité des démences dans la MA et l'atrophie cérébrale (10, 11). Par ailleurs, des rôles potentiels du 7- cétocholestérol et du 7P-hydroxycholestérol résultant de l'auto-oxydation du cholestérol ont été suggérés en raison de l'augmentation du stress oxydatif au niveau des lésions cérébrales de patients atteints de MA (12, 13). Dans le LCR, le 24S-hydroxycholestérol, et éventuellement le 7- cétocholestérol et le 7P-hydroxycholestérol, pourraient ainsi constituer des facteurs diagnostiques de la MA, tout comme AR et tau hyperphosphorylée. Toutefois, le prélèvement de LCR est un geste clinique délicat, non réalisable en laboratoires d'analyses médicales de ville, mais uniquement dans des services de neurologie par des professionnels expérimentés. Ce type de dosage dans le LCR qui par ailleurs entraine des douleurs associées à la technique de prélèvement implique donc des coûts importants liés au déplacement du malade sur le lieu de prélèvement et/ou à l'analyse. Il existe donc un besoin pour de nouveaux marqueurs, présents dans un tissu biologique facilement accessible. Résumé de l'invention Ainsi la présente invention propose un nouveau procédé permettant le diagnostic des maladies neurodégénératives et notamment de la maladie d'Alzheimer. La présente invention concerne un procédé de diagnostic, in vitro, d'une maladie neurodégénérative à partir d'un échantillon biologique d'un patient ou d'un UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE - 4 - animal remarquable en ce qu'il comprend la mesure de la quantité de C26:0. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite mesure de la quantité de C26:0 est faite par 5 chromatographie. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite mesure de la quantité de C26:0 est faite par chromatographie en phase gazeuse. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, 10 ledit échantillon biologique est le sang. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ledit échantillon biologique est le plasma sanguin. Selon un autre mode de réalisation préféré de 15 l'invention, ledit échantillon biologique est la membrane des cellules du sang circulant. Selon un autre mode de réalisation tout à fait préféré de l'invention, ledit échantillon biologique est la membrane érythrocytaire. 20 Dans le cadre de la présente invention, le terme « maladie neurodégénérative » fait référence aux maladies choisit dans le groupe comprenant l'ataxie spinocérébelleuse, l'atrophie multisystématisée, la leucoaraiose, la Maladie d'Alexander, la Maladie d'Alpers, 25 la Maladie d'Alzheimer, la Maladie de Creutzfeldt-Jakob, la Maladie de Huntington, la Maladie de Parkinson, la Maladie de Pick, les Maladies lysosomales, la Myofasciite à macrophages, la Paralysie supranucléaire progressive, la Sclérose en plaques, la Sclérose latérale amyotrophique. 30 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite maladie neurodégénérative est la maladie d'Alzheimer. UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE - 5 - Le terme « échantillon biologique » fait référence à tous les fluides ou tissus du patient ou de l'animal et préférentiellement aux fluides contenant des érythrocytes du patient ou de l'animal. Le procédé selon l'invention 5 peut être mis en oeuvre avec un échantillon biologique brut (i.e. tel que prélevé sans avoir subi de modification), mais également après traitement de l'échantillon biologique par toutes les méthodes jugées souhaitables par l'homme du métier. Parmi ces traitements on peut citer la 10 centrifugation afin de séparer le plasma du sang total, la lyse des érythrocytes et l'extraction des membranes érythrocytaires, et/ou l'ajout de molécules permettant la conservation de l'échantillon biologique (e.g. antiprotéases). 15 Par « membrane érythrocytaire » on entend désigner la membrane plasmique des érythrocytes. Dans la présente demande, le terme C26:0 fait référence à l'acide hexacosanoïque également connu sous le nom d'acide cérotique. Le C26:0 selon l'invention peut être 20 libre ou estérifié en étant associé soit à du cholestérol, soit à des phospholipides. Dans la présente demande, le terme « mesure de la quantité » fait référence à la quantité de C26:0 ou à sa concentration dans l'échantillon biologique examiné. La 25 mesure du niveau d'expression peut être faite de manière quantitative ou semi quantitative, en effet il n'est pas nécessaire de connaître la quantité exacte de C26:0 mais simplement de déterminer si cette quantité est significativement supérieure à une norme. Cette norme peut 30 être facilement déterminée par l'homme du métier en utilisant un pool d'individus sains et en mesurant la quantité de C26:0 moyenne chez ces individus. Si le procédé selon l'invention révèle un niveau d'expression de C26:0 UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE - 6 - dans les échantillons biologiques des patients supérieurs au niveau d'expression normal, ledit patient sera susceptible d'être atteint d'une maladie neurodégénérative. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, 5 ladite norme est de 2.8 pMoles/L et préférentiellement 2.89 pMoles/L pour le C26:0 dans le plasma. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite norme est de 4.1 pMoles/L et préférentiellement 4.16 pMoles/L pour le C26:0 dans la membrane érythrocytaire. 10 Les techniques permettant de mesurer la quantité de C26:0 sont bien connues de l'homme du métier. Parmi ces techniques, on peut citer la chromatographie et préférentiellement la chromatographie en phase gazeuse. L'homme du métier pourra notamment utiliser la méthode 15 décrite à la référence (14). La chromatographie en phase gazeuse peut éventuellement être couplée à la spectrométrie de masse en faisant appel à des standards appropriés. Finalement, la présente invention concerne également des kits de diagnostic permettant de mettre en oeuvre le procédé 20 suivant l'invention. Description des modes de réalisation Matériel et Méthodes 25 Sélection des patients Une étude cas-témoins a été menée sur des patients qui ont consulté pour une plainte mnésique durant la période allant de janvier 2011 à juillet 2011. Un bilan 30 neuropsychologique détaillé évaluant la mémoire du travail, la mémoire épisodique, les fonctions exécutives, la fluence verbale, les fonctions gnosiques et praxiques et l'humeur a été appliqué à tous les patients. UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE - 7 - Les critères DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4é édition) ont été considérés pour tenir le diagnostic du syndrome démentiel. Pour la MA, les critères NINCDS-ADRDA (National 5 Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer Disease and Related Disorders Association) ont été utilisés. Les patients ont bénéficié d'un questionnaire détaillé prenant en compte les éléments suivants : 10 - L'âge, le sexe, le niveau d'instruction, la profession et les habitudes de vie, en particulier le tabagisme et l'alcoolisme, - Les antécédents personnels (diabète, hypertension artérielle, dyslipidémie, cardiopathie, 15 insuffisance rénale, traumatisme crânien...), - Une éventuelle consanguinité parentale ou cas similaires dans la famille, - L'âge de début de la maladie et de la lère consultation. 20 Les données ont été recueillies sur une fiche de renseignement pré-établie avec le consentement du patient. Les patients ont été choisis selon certains critères d'inclusion (>50 ans, diagnostic de démence validé selon les critères DSM IV) et d'exclusion (Refus de la personne 25 ou du tuteur, troubles auditifs ou visuels notables limitant la fiabilité des tests neuropsychologiques, pour les dosages biochimiques un refus de la personne ou du tuteur ou une insuffisance rénale et hépatique chronique, un syndrome dépressif sans atteinte cognitive (selon 30 l'échelle de dépression gériatrique « GDS : geriatric depression scale »). Les contrôles ont été recrutés selon des critères d'inclusion (>50 ans, score MMSE supérieur à 26) et d'exclusion (Refus de la personne, présence UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE - 8 - d'affections neurologiques centrales, présence d'antécédents familiaux de démence). Prélèvement sanguin Les échantillons de sang veineux ont été recueillis sur tube EDTA. Après centrifugation des échantillons de sang à 1 400 g pendant 10 min à 4°C, les surnageants plasmatiques ont été récupérés et aliquotés. Le culot cellulaire a été lavé 3 fois en NaC1 0,9% puis tous les aliquots ont été conservés à -80°C. Dosage des acides gras Le dosage du profil des acides gras a été réalisé selon la méthode décrite par (14). Dans un tube en verre, 100 pL de plasma ou d'érythrocytes et 100 pL de C17:0, utilisé comme un standard interne, ont été mélangés avec 2 mL d'acide hydrochlorique 5% méthanolique. Après agitation, le mélange a été incubé 2 h à 100°C. Après le refroidissement à température ambiante, les dérivés méthylés ont été extraits deux fois avec 2 mL de n-hexane, ensuite séchés sous un flux d'azote et dissous avec 60 pL n-hexane. 1 pL de l'extrait obtenu a été injecté dans le système de chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse (CPG/SM) (HP 5890 Series II GC / HP 5972 MSD) équipé du programme informatique HP Chemstation et d'une colonne HP-INNOWAX (Hewlett-Packard (HP), Palo Alto, CA, USA) de diamètre interne 250 pm, de longueur 30 m et d'épaisseur du film 0,25 pm. Les analyses ont été pratiquées dans les conditions suivantes: - gaz vecteur : Hélium - débit colonne : 1,1 mL /min, - mode d'injection : Split et rapport de Split : 1/10. Le programme du four était comme suit ; la température initiale du four : 100°C, 15°C/min jusqu'à 240°C pendant 10 min, température de l'injecteur 240°C et analyseur 280°C ; P 8,9Psi ; EMV UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE - 9 - 1376V ; PM 70eV. L'acquisition a été faite en mode SIM. La quantification a été faite à partir du rapport entre les surfaces des pics correspondant aux ions choisis pour les composés à doser et à celles des ions choisies pour l'étalon interne. Ce rapport a été comparé à des courbes d'étalonnage réalisées dans les mêmes conditions d'analyse à partir de produits standards. Le taux des acides gras à très longue chaîne est exprimé en }mol/L. Résultats Au niveau plasmatique, les résultats obtenus ont mis en évidence que l'acide gras à très longue chaîne C26:0 (acide hexacosanoïque) permet d'identifier avec une exactitude de 98,6% (courbe de ROC) les malades atteints de 15 MA et que le facteur de risque pour être atteint d'une MA est 4898 fois plus important lorsque les taux plasmatiques de C26:0 sont supérieurs à 2,89 pmoles/L. Au niveau érythrocytaire, les résultats obtenus ont mis en évidence que le C26:0 permet d'identifier avec une 20 exactitude de 98,7% (courbe de ROC) les malades atteints de MA et que le facteur de risque pour être atteint d'une MA est 2912 fois plus important lorsque les taux érythrocytaires de C26:0 sont supérieurs à 4,16 pmoles/L. Les déposants ont quantifié des acides gras dans le 25 plasma et dans les érythrocytes circulants de malades symptomatiques atteints de MA en les comparant par rapport à des sujets sains appartenant à la même tranche d'âge. L'acide gras à très longue chaîne (acide hexacosanoïque ; C26:0) a été quantifié par chromatographie 30 en phase gazeuse sur du plasma et des érythrocytes de sujets atteints de maladie d'Alzheimer (26 sujets Alzheimer) et de sujets sains (93 sujets témoins). UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE - 10 - Les analyses statistiques par courbes de ROC révèlent que l'acide gras à très longue chaîne C26:0 est un biomarqueur plasmatique et érythrocytaire puissant et très informatif de la MA. En effet, l'aire sous la courbe [AUC] associée est comprise entre 0,9970 et 1,0010 pour le C26:0 érythrocytaire et entre 0,9936 et -1,0030 pour le C26:0 plasmatique. Dans les 2 cas l'AUC diffère très significativement de la valeur 0,5 (p REVENDICATIONS1 - Procédé de diagnostic, in vitro, d'une maladie neurodégénérative à partir d'un échantillon biologique d'un patient ou d'un animal caractérisé en ce qu'il comprend la mesure de la quantité de C26:0. 2 - Procédé de diagnostic, in vitro, d'une maladie neurodégénérative selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite mesure de la quantité de C26:0 est faite par chromatographie. 3 - Procédé de diagnostic, in vitro, d'une maladie neurodégénérative selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite mesure de la quantité de C26:0 est faite par chromatographie en phase gazeuse. 4 - Procédé de diagnostic, in vitro, d'une maladie neurodégénérative selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est le sang. 20 5 - Procédé de diagnostic, in vitro, d'une maladie neurodégénérative selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est le plasma sanguin. 6 - Procédé de diagnostic, in vitro, d'une maladie 25 neurodégénérative selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est la membrane érythrocytaire. 7 - Procédé de diagnostic, in vitro, d'une maladie 30 neurodégénérative selon la revendication 1 caractérisé en UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE 10 15- 14 - ce que ladite maladie neurodégénérative est la maladie d'Alzheimer. UBFM01-FR-1_TEXTE DEPOSE_SO-GE