Brevet FR3000500A1 — publié le 20140704

DESCRIPTION Domaine technique de l'invention L'invention relève du domaine de la biologie industrielle. Plus précisément, l'invention concerne l'obtention de nouveaux microorganismes, enzymes et protéines capables de dégrader la cellulose ou l'hémicellulose. Etat de la technique antérieure Les cellulases constituent le troisième plus gros marché d'enzymes, avec des applications dans le traitement du coton, l'industrie du papier, les détergents et l'alimentation animale. Une autre application émergente des cellulases, avec un potentiel économique de 100 à 1000 fois plus important est l'utilisation de la biomasse cellulosique dans des bioraffineries pour produire du sucre qui peut lui-même être utilisé pour synthétiser du l'ethanol ou d'autres biocarburants ou produits chimiques de commodité. Les cellulases sont une famille d'enzymes complexes, agissant généralement en synergie avec au moins trois enzymes différentes : endo-beta-glucanase, exo-beta-glucanase et beta-glucosidase. La quasi-totalité des cellulases produites actuellement sont produites par des champignons comme Trichoderma resei, et des recherches ont lieu pour utiliser diverses espèces de champignons thermophiles. Divers microorganismes ont été décrits comme étant capables de dégrader la cellulose, c'est notamment le cas de diverses espèces de bactéries et de levure. On retrouve en particulier certains de ces microorganismes dans l'appareil digestif des ruminants ou des termites, capables respectivement de digérer de l'herbe et du bois. Les cellulases actuellement utilisées industriellement ont un coût de production trop élevé pour permettre leur utilisation à grande échelle pour la fabrication de biocarburants de deuxième génération ou de produits chimiques de commodité. Par exemple, on estime que le coût de revient des cellulases est de l'ordre de 20 centimes par litre d'ethanol, ce qui est beaucoup trop élevé, sachant que l'ethanol lui-même est vendu moins de 50 centimes par litre (Klein-Marcuschamer et al.: The Challenge of Enzyme Costs for Biofuels. Biotechnology and Bioengineering 2012 Apr;109(4):1083-7). La même problématique se retrouve pour des biocarburants avancés (butanol, octane, substituts au diesel et au jet fuel, ...) et pour de nombreux produits chimiques produits par fermentation (PLA ou Polylactic Acid, PTT ou PolyTriméthylène Téréphtalate, PBS ou Polybutylène Succinate, PEIT ou Polyethylene Isosorbide Terephtalate, IPC ou Isosorbide Polycarbonate, alcènes, butanediol, etc.). Il est bien connu que l'efficacité d'un cocktail de cellulases donné dépend très fortement du type de biomasse cellulosique utilisé : par exemple des enzymes efficaces sur de la bagasse ne seront pas efficaces sur du tourteau de maïs ou de la sciure de bois. Cette efficacité dépend en outre du type de prétraitement qu'aura subit la biomasse à hydrolyser. Au vu de l'importance des applications pour lesquelles le coût et l'efficacité des cellulases constitue une barrière importante, l'obtention de nouvelles cellulases présente un intérêt industriel certain. Une problématique analogue existe pour la dégradation de l'hémicellulose. Par commodité, dans la suite du texte, toutes les cellulases, hémicellulases et enzymes ou protéines auxiliaires impliquées dans la production de cellobiose, glucose, xylose et autres sucres à 6 ou 5 carbones à partir de biomasse cellulosique sont appelées « cellulases », toutes les activités enzymatiques ou activités facilitant l'action de ces enzymes sont appelées « activités cellulolytiques », et tous les composés naturels ou de synthèse comprenant de la cellulose ou de l'hémicellulose sont appelés « composés cellulosiques ». Description de l'invention L'invention concerne un procédé d'obtention de microorganismes doués d'une activité cellulolytique caractérisé en ce qu'il contient les étapes suivantes : Etape 1 : nourrir un singe folivore pendant au moins 12 heures et de préférence au moins 96 heures, avec un régime alimentaire comprenant un composé cellulosique, Etape 2 : effectuer un prélèvement de la flore microbienne du tube digestif dudit singe, Etape 3 : mettre en culture pendant 12 heures, de préférence au moins 7 jours, le prélèvement dans un milieu contenant un composé cellulosique. Dans un mode de réalisation, le singe est de la famille des Cercipithedae ou d'une famille apparentée, préférentiellement de l'espèce Trachypithecus obscurus. Dans un mode de réalisation, ledit régime alimentaire contient de la biomasse cellulosique. Dans un mode de réalisation, ladite biomasse cellulosique a subi un prétraitement par une action physique ou par des agents chimiques. Dans un mode de réalisation, ledit régime alimentaire contient, au fil du temps, une proportion croissante de biomasse cellulosique et préférentiellement, lors des dernières heures, de la biomasse cellulosique comme unique source de glucides. Dans un mode de réalisation, la biomasse cellulosique utilisée est de la paille de blé, de la bagasse de cane à sucre, du tourteau de palmiste, du tourteau de maïs, de la paille de riz ou des résidus agricoles, forestiers ou papetiers, industriels ou urbains. Dans un mode de réalisation, à l'étape 3, on procède à l'extraction de l'ADN du prélèvement et on séquence tout ou partie de l'ADN extrait. Dans un mode de réalisation, à l'étape 3, on procède à l'extraction de l'ADN du prélèvement et on utilise les techniques du metagenome. Dans un mode de réalisation, on produit dans un hôte de type bactérie, levure ou champignon, une ou plusieurs enzymes isolée dans l'un des microorganismes sélectionné à l'issue de l'étape 3. Le procédé selon l'invention s'appuie sur la source originale de cellulases que constitue la flore microbienne de l'appareil digestif des singes folivore, notamment des signes de la famille des Cercipithecidae, en particulier de l'espèce des Semnopithèques obscurs (Trachypithecus obscurus) présents notamment dans la jungle malaisienne et en particulier dans l'lle de Langkawi ainsi qu'au Laos, en Birmanie en Thaïlande en Inde et au Bengladesh. De manière surprenante, que les Semnopithèques obscurs sont capables d'avoir une alimentation composée à plus de 50 % de feuilles. Il a également été observé qu'ils sont capables de survivre lorsqu'on les nourrit de manière quasi-exclusive des feuilles, de salade ou autres aliments riches en cellulose et dépourvus d'autres glucides. Le procédé selon l'invention constitue la première application à visée industrielle de ces observations. Un objet de l'invention est donc l'obtention puis la production de nouvelles enzymes cellulases ou hémicellulases présentant des propriétés améliorées. Ainsi, les enzymes issues du procédé selon l'invention pourront notamment avoir une activité catalytique plus importantes que les enzymes actuelles pour un type de substrat biomasse cellulosique donné, ce qui permet de réduire les coûts de production de sucres et, en conséquence, d'améliorer la rentabilité économique de très nombreux procédés de biotechnologies industrielles visant à produire des carburants ou d'autres produits chimiques de commodité par fermentation. Un autre objet de l'invention est l'isolation de nouvelles cellulases qui ne sont pas, intrinsèquement, douées de propriétés améliorées mais qui sont différentes des cellulases actuelles et sont donc des candidats intéressants pour être améliorées par des techniques d'ingénierie des protéines connues de l'homme du métier. Ces enzymes, ou des microorganismes les exprimant, ont vocation à être utilisées dans des bioraffineries. 30 REVENDICATIONSRevendication 1 - Procédé d'obtention de microorganismes doués d'une activité cellulolytique caractérisé en ce qu'il contient les étapes suivantes : Etape 1 : nourrir un singe folivore pendant au moins 12 heures et de préférence au moins 96 heures, avec un régime alimentaire comprenant un composé cellulosique, étape 2 : récupérer un prélèvement préalablement prélevé de la flore microbienne du tube digestif dudit singe, Etape 3 : mettre en culture pendant 12 heures, de préférence au moins 7 jours, le prélèvement dans un milieu contenant un composé cellulosique. Revendication 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le singe est de la famille des Cercipithedae ou d'une famille apparentée, préférentiellement de l'espèce Trachypithecus obscurus. Revendication 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le régime alimentaire contient de la biomasse cellulosique. Revendication 4 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la biomasse cellulosique a subi un prétraitement par une action physique ou par des agents chimiques. Revendication 5 - Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que, au fil du temps, ledit régime contient, une proportion croissante de biomasse cellulosique et préférentiellement, lors des dernières heures, de la biomasse cellulosique comme unique source de glucides. Revendication 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la biomasse cellulosique utilisée est de la paille de blé, de la bagasse de cane à sucre, du tourteau de palmiste, du tourteau de maïs, de la paille de riz ou des résidus agricoles, forestiers, papetiers, industriels ou urbains. Revendication 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape 3 est suivie d'une étape 4 d'extraction de l'ADN du prélèvement effectué préalablement à l'étape 2. 30Revendication 8 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'on séquence tout ou partie dudit ADN extrait à l'étape 4. Revendication 9 - Procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8 caractérisé en ce qu'on produit dans un hôte de type bactérie, levure ou champignon, une ou plusieurs enzymes codées par l'ADN extrait à l'étape 4.