Brevet FR3005317A1 — publié le 20141107

LEVURES MUTANTES CAPABLES DE PRODUIRE UN ACIDE GRAS INHABITUEL La présente invention concerne des levures mutantes capables de produire un acide gras inhabituel par bioconversion ou par néosynthèse et l'utilisation de ces levures pour la production de cet acide gras inhabituel. Les acides gras industriels proviennent principalement des huiles minérales ou des huiles végétales. Ces acides gras industriels sont destinés à différentes applications, comme l'alimentation, les peintures et vernis, les lubrifiants, les imperméabilisants, les plastiques et les polymères. Ils peuvent être de structures très diverses, par exemple acides gras polyinsaturés, à chaînes très courtes ou très longues, possédant des groupes hydroxyles ou époxy, ou possédant une ou plusieurs double ou triple liaisons conjuguées. Le coût d'obtention d'acides gras industriels à partir d'huiles minérales est onéreux en raison du coût de plus en plus élevé de la matière première et des coûts de traitement chimique de ces huiles minérales. Certaines espèces végétales produisent des acides gras aux propriétés intéressantes dans le domaine industriel mais ces espèces sont généralement des espèces sauvages, exotiques et/ou non-agronomiques. L'utilisation de micro-organismes, en particulier de souches de levure, pour la production d'acides gras industriels représente une alternative à l'utilisation des ressources fossiles et végétales. Chez une levure, un acide gras inhabituel est un acide gras qui n'est pas naturellement synthétisé par celle-ci. L'acide ricinoléique (acide 12-hydroxy-9-cis-octadécénoïque ; Cl 8:1-0H) est un acide gras oméga-9 hydroxylé, qui est inhabituel chez les levures. L'acide ricinoléique (AR) et ses dérivés trouvent plusieurs applications industrielles, par exemple dans l'alimentation en tant qu'additifs, le textile en tant que tensioactifs ou agents mouillant de pigments, le papier en tant qu'agents antimousse ou additifs imperméabilisants, le plastique pour la fabrication du Nylon-11, des plastifiants, des tubes ou des films, les parfums et cosmétiques en tant qu'émulsifiants ou déodorants, l'électronique pour la fabrication des fluides de condensateurs, du polyuréthane ou des résines de polyamide, les produits pharmaceutiques, les peintures, les encres, les adhésifs et les lubrifiants. Plus récemment, l'acide ricinoléique a été proposé en tant que composant du biodiésel et comme additif lubrifiant pour remplacer des composés lubrifiants à base de soufre dans le diesel de pétrole. L'acide ricinoléique représente environ 90% des acides gras totaux des graines de ricin (Ricinus communis) (Yamamoto et al., 2008). La forte teneur en acide ricinoléique dans l'huile de ricin, associée à une teneur élevée en huile dans les graines de ricin et à la multitude d'applications de l'acide ricinoléique, font du ricin une culture oléagineuse à forte valeur économique. Cependant, un inconvénient majeur à la culture extensive du ricin est la teneur élevée dans ses graines de la ricine, une protéine extrêmement toxique (Knight, 1979). L'utilisation de la ricine a longtemps soulevé des préoccupations de santé publique. En raison de législations sur la santé, la plupart de l'approvisionnement des pays occidentaux en acide ricinoléique repose sur l'importation de l'huile de ricin provenant de pays en développement, dans lesquels l'instabilité économique entraîne souvent des fluctuations de l'offre, de la qualité et du prix de l'huile (Chan et al., 2010). Il n'existe pas de nombreuses sources alternatives au ricin pour produire de l'acide ricinoléique. La seule espèce connue pour produire des quantités significatives d'acide ricinoléique est Claviceps purpurea - l'ergot de seigle - qui accumule dans ses sclérotes de l'acide ricinoléique jusqu'à hauteur de 23% de ses lipides totaux (Meesapyodsuk et al., 2008). A titre de comparaison, le coton, le soja et les espèces de Lesquerella produisent de l'acide ricinoléique à hauteur de 0,27%, 0,03% et 0,3% de leurs lipides totaux, respectivement (Yamamoto et al., 2008). La quantité limitée de sources naturelles d'acide ricinoléique a conduit les chimistes à développer des procédés pour la préparation d'hydroxy-acides gras à partir d'huiles végétales commerciales (Dahlke B et al., 1995). Parallèlement, des efforts considérables d'ingénierie génétique ont été réalisés pour produire de l'acide ricinoléique dans les graines de la plante modèle Arabidopsis thaliana et chez les levures modèles Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe. Cependant, ces levures ne sont pas des levures oléagineuses, c'est à dire qu'elles ne possèdent pas la capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides. La stratégie d'ingénierie génétique dans ces espèces modèles consiste en une expression hétérologue de l'oléate (Al2) hydroxylase de ricin ou de Claviceps purpurea, codée par le gène FAH12. En effet, au cours de la biosynthèse de l'acide ricinoléique, l'acide oléique est hydroxylé par l'enzyme Fahl 2p en position sn-2 de la phosphatidylcholine principalement, dans le réticulum endoplasmique (Bafor et al., 1991) L'hydroxylation s'effectue à la position 12 de l'acide oléique estérifié. Les oléate désaturases et les oléate hydroxylases appartiennent à la même famille de protéines membranaires et possèdent une séquence peptidique et une fonction similaires. Elles partagent le même substrat oléique et leurs réactions sont très compétitives (Broun et al., 1998). L'oléate (Al2) désaturase (FAD2) forme préférentiellement de l'acide linoléique et l'oléate hydroxylase forme préférentiellement de l'acide oléique. Pour la production d'acide ricinoléique chez A. thaliana, il a donc été proposé de déléter le gène codant l'oléate (Al2) désaturase avant l'expression de l'oléate (Al2) hydroxylase. Cependant, l'expression transgénique de l'oléate (Al2) hydroxylase de Ricinus communis (RcFAH12) conduit à l'accumulation d'acide ricinoléique et d'autres acides gras hydroxylés à hauteur seulement de 15-20% des acides gras totaux dans les graines d'A. thaliana (Broun et Somerville, 1997 ; Smith et al., 2003). La co-expression transgénique de RcFAH12 et de l'acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase de Ricinus communis (RcDGAT2) conduit à une augmentation de l'accumulation d'acides gras hydroxylés jusqu'à 30% des acides gras totaux dans les graines, mais cela représente une teneur toujours plus faible celle que l'on trouve dans les graines de ricin (Lu et al., 2006 ; Burgal et al., 2008). Pour la production d'acide ricinoléique chez les levures S. cerevisiae et S. pombe - qui ne contiennent pas de gènes codant pour des oléate (Al2) désaturases - l'expression hétérologue de l'oléate (Al2) hydroxylase de C. purpurea (CpFAH12) conduit à une accumulation d'acide ricinoléique à hauteur respectivement de 8% et 53% des acides gras totaux (Mavraganis et al., 2010. ; Holic et al., 2012). Chez S. cerevisiae, lorsque l'acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase de C. purpurea (CpDGAT2) est co-exprimée avec RcFAH12, la teneur en acide ricinoléique augmente faiblement jusqu'à 10% des acides gras totaux (Mavraganis et al., 2010). Néanmoins, les lipides totaux dans ces levures représentent seulement environ 5% du poids sec des cellules (CDW). Ces levures mutantes ne peuvent donc pas être considérées comme des solutions alternatives à la production d'acide ricinoléique. Ces résultats montrent que l'expression transgénique d'une oléate (Al2) hydroxylase seule ou en combinaison avec une acyltransférase spécifique de l'acide ricinoléique (DGAT2) chez A. thaliana et les levures ne suffit pas à produire de l'acide ricinoléique à une teneur élevée comme l'on trouve dans l'huile de ricin. Il existe donc un besoin d'obtenir des organismes mutants capables d'accumuler des quantités d'acide ricinoléique comparables à celles que l'on trouve chez le ricin. L'acide vernolique (acide 12,13-époxy-9-cis-octadécénoïque ; C18H3203) est un acide gras oméga-9 époxydé, qui est également inhabituel chez les levures. L'acide vernolique trouve plusieurs applications industrielles, par exemple dans les colles, les peintures, les plastiques, les encres, le textile et l'industrie pharmaceutique. L'acide vernolique représente au moins 60% des acides gras totaux des graines de Vernonia galamensis et d'Euphorbia lagascae. Certains microorganismes oléagineux sont capables de convertir des substrats, tels que des matières grasses, des sucres ou du glycérol, en lipides, notamment en triglycérides et acides gras. Ces microorganismes oléagineux possèdent la capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides, à hauteur d'au moins 20% de leur matière sèche. Chez les levures, on trouve quelques espèces oléagineuses, dites non-conventionnelles, parmi lesquelles on peut citer celles appartenant aux genres Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia (voir pour revues Beopoulos et al., 2009 ; Papanikolaou et al., 2011a et 2011b). Yarrowia lipolytica est une levure hémiascomycète. Elle est considérée comme un 10 modèle de bioconversion pour la production des protéines, des enzymes et de dérivés lipidiques (voir pour revue Nicaud, 2012). Elle est naturellement présente dans des environnements pollués de pétrole et notamment dans les fractions lourdes. Y. lipolytica est l'une des levures oléagineuses les plus étudiées en raison non seulement de sa capacité à accumuler des lipides à hauteur de plus de 50% de sa matière sèche selon un profil de culture 15 défini, voire plus de 80% de sa matière sèche lorsque des modifications génétiques appropriées sont effectuées, mais aussi de sa capacité unique à accumuler de l'acide linoléique à des niveaux élevés (plus de 50% des acides gras produits dans certaines conditions de culture) ainsi que des lipides à haute valeur ajoutée, tels que l'acide stéarique, de l'acide palmitique et de l'acide oléique (Papanikolaou et al., 2001 ; Beopoulos et al. 20 2008 ;Papanikolaou et al., 2010 ; Dulermo et Nicaud 2011). Y. lipolytica est aussi capable d'accumuler plus de 90% de lipides neutres, sous forme de triacylglycérols (TAG). Y. lipolytica peut être efficacement cultivée sur une grande variété de composés hydrophobes (acides gras libres, triacylglycérols, n-alcanes, etc.) comme seule source de carbone et d'énergie, grâce à l'expression de familles multigéniques codant pour des enzymes clés 25 impliquées dans la décomposition de ces composés (e.g., acyl-CoA oxydases, lipases) (Papanikolaou et al., 2001 ; Beopoulos et al., 2009a ; Papanikolaou et al., 2010 ; 2011a et 2011b). La synthèse des lipides chez Y. lipolytica s'effectue soit par la biosynthèse de novo d'acides gras via la production des précurseurs des acides gras comme l'acétyl-CoA et le malonyl-CoA et leur intégration dans la voie de biosynthèse des lipides (voie de Kennedy), 30 soit par l'accumulation ex novo, via l'incorporation des acides gras préexistant dans le milieu de fermentation ou dérivant de l'hydrolyse des huiles, des graisses, des triglycérides et des esters méthyliques du milieu de culture et leur accumulation à l'intérieur de la cellule. Les voies principales de biosynthèse de novo des lipides chez Y. lipolytica et Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae ; levure dite non-oléagineuse) sont bien conservées. Les gènes impliqués dans le métabolisme des acides gras chez les levures, en particulier chez Y. lipolytica, sont décrits dans Beopoulos et al. (2009) et la Demande Internationale WO 2010/004141. Chez les levures, la [3-oxydation est une voie de dégradation des acides gras qui se situe uniquement dans les peroxysomes. Cette voie permet la formation d'acétyl-CoA à partir d'acides gras à chaîne paire et de propionyl-CoA à partir d'acides gras à chaîne impaire. La (3-oxydation comporte quatre réactions successives au cours desquelles la chaîne carbonée de l'acyl-CoA est réduite de deux atomes de carbone. Une fois la réaction opérée, l'acyl-CoA réduit de deux carbones peut retourner dans la spirale de la (3-oxydation (hélice de Lynen) et subir une nouvelle réduction de deux carbones. Ces cycles de décarboxylation peuvent être interrompus suivant la nature de l'acyl-CoA, la disponibilité en substrat, la présence de coenzyme A, d'acétyl-CoA ou selon le ratio NAD+/NADH. Dans la première étape de la 13-oxydation, après la libération des acides gras des triacylglycérols (TAG) par les lipases, la forme active d'acyl-CoA formé est oxydée par une molécule de Flavine Adénine Dinucléotide (FAD) pour former une molécule de trans-A2-énoyl-CoA grâce à une acyl-CoA oxydase (AOX). La [3-oxydation chez Y. lipolytica a été largement décrite (Wang et al., 1999b ; Mlickova et al. 2004). Il existe 6 acyl-CoA oxydases chez Y lipolytica, codées par les gènes PDX1 à 6, qui présentent des spécificités différentes vis-à-vis du substrat (Wang et al., 1999a et 1999b ; Luo et al., 2000 et 2002). Le trans-A2-énoyl-CoA est ensuite hydraté par la 2- énoyl-CoA hydratase. La molécule de 3-hydroxyacyl CoA formée est oxydée par le NAD+ pour former une molécule de 3-cétoacyl-CoA. Ces deux dernières étapes sont catalysées par une protéine bifonctionnelle codée par le gène MFE1 (enzyme multifonctionnelle ayant une fonction de 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase). Le 3-oxoacyl-CoA thioester est alors clivé par une 3-oxoacyl-CoA thiolase codée par le gène POTI (Einerhand et al., 1995). Un coenzyme A est ensuite ajouté pour former un acétyl-CoA et un acyl-CoA diminué de deux carbones. Des souches mutantes de Y. lipolytica dans lesquelles la bêta-oxydation des acides gras est invalidée en raison de la délétion des 6 gènes PDX endogènes ont été décrites par Beopoulos et al. (2008) et dans la Demande Internationale WO 2012/001144. Ces souches mutantes présentent une augmentation de l'accumulation des lipides par rapport aux souches parentes. Par ailleurs, Y. lipolytica est actuellement utilisée pour la transformation industrielle de l'acide ricinoléique en y-décalactone, un composé aromatique avec des notes fruitées et huileuses que l'on peut trouver naturellement dans les fruits et les aliments fermentés (Schrader et al., 2004). Dans le cadre de leurs recherches, les inventeurs ont obtenu une souche mutante de levure Yarrowia lipolytica génétiquement modifiée qui peut être utile comme souche de levure matrice pour l'obtention d'autres souches mutantes de Y. lipolytica capables de produire des acides gras oméga-9 inhabituels. Dans cette souche de Y. lipolytica génétiquement modifiée, l'oléate (412) désaturase endogène (encodée par le gène FAD2) a été invalidée afin d'empêcher la transformation de l'acide oléique en acide linoléique. La voie de la B-oxydation, responsable de la dégradation des réserves lipidiques, a été abolie par la délétion des 6 gènes PDX codants pour les 6 Acyl-CoA oxydases (AOX1 à AOX6) endogènes. L'accessibilité du substrat oléique sous forme de phospholipides pour une enzyme (par exemple une hydroxylase ou une époxydase) a été facilitée par l'invalidation des 3 gènes codant pour les triacylglycérol acyltransférases endogènes (DGA1, DGA2, LR01), afin d'empêcher le stockage de l'acide oléique sous forme de TAG. Cette souche mutante de Y. lipolytica matrice contenant les 10 modifications génétiques pox1- 6A,dgal A,dga2A,lro 1 Afad2 A est dénommée JMY2159. Elle est incapable de dégrader l'acide oléique, de le stocker sous forme de triglycérides et de le transformer par désaturation en acide linoléique. A partir de cette souche matrice JMY2159, les inventeurs ont ensuite obtenu des souches mutantes de levure Y lipolytica génétiquement modifiées possédant une capacité considérable d'accumulation de lipides et capable de synthétiser de l'acide ricinoléique jusqu'à plus de 7% de leur matière sèche. L'expression hétérologue dans la souche matrice JMY2159 d'une séquence nucléotidique codant l'oléate (Al2) hydroxylase de Ricinus communis (RcFAH12), sous le contrôle du promoteur constitutif TEF, a permis d'obtenir une souche mutante (dénommée JMY2331) produisant de l'acide ricinoléique à hauteur de 7% de ses lipides totaux. L'expression hétérologue dans la souche matrice JMY2159 d'une ou de deux séquences nucléotidiques codant l'oléate (412) hydroxylase de Claviceps purpurea (CpFAH12), respectivement sous le contrôle du promoteur constitutif TEF, a donné lieu à des souches mutantes (dénommée JMY2324 et JMY2511 respectivement) capable d'accumuler de l'acide ricinoléique à hauteur de 29% et 35% respectivement de leurs lipides totaux. La surexpression dans une souche similaire à la souche JMY2511 (dans laquelle les deux séquences nucléotidiques codant CpFAH12 sont respectivement sous le contrôle du promoteur TEF ; souche JMY2527) de la phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT) endogène codée par le gène Y1LR01, qui est une enzyme capable de catalyser la formation du triacylglycérol à partir du 1,2-sn-diacylglycérol permet d'atteindre une accumulation d'acide ricinoléique dans la souche mutante ainsi obtenue (dénommée JMY2556 ou JMY2853 selon les auxotrophies de la souche) à hauteur de 42% de ses lipides totaux. Ce taux de production d'acide ricinoléique de la souche JMY2556 peut être encore augmenté en augmentant le nombre de copies des gènes CpFAH12 et Y1LR01, ou en inhibant l'expression de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de la souche et/ou en surexprimant une ou plusieurs des enzymes endogènes de ladite souche suivantes : la monoacylglycérol acyltransférase, la patatin-like triacylglycérol lipase, au moins une des deux sous-unités de l'ATP citrate lyase, la diacylglycérol:choline-O phosphotransférase, l'éthanolamine phosphotransférase, la phospholipase A2, une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltranférase, une cytochrome-b5 réductase, l'inositol/phosphatidyl inositol phosphatase et l'élongase. Les modifications génétiques effectuées chez Yarrowia lipolytica peuvent aussi l'être chez les autres levures oléagineuses. Ces souches mutantes de levure oléagineuse peuvent être utilisées comme alternatives à la production d'acide ricinoléique par le ricin, dans la mesure où elles sont faciles à cultiver, et ce indépendamment des saisons et du climat. La présente invention a donc pour objet un procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse utile comme souche de levure matrice pour l'obtention d'autres souches mutantes de levure oléagineuse comprenant : (a) l'inhibition de la bêta-oxydation des acides gras dans ladite souche, (b) l'inhibition de l'expression ou de l'activité des acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases 20 (DGAT) endogènes de ladite souche, (c) l'inhibition de l'expression ou de l'activité de l'oléate désaturase (FAD2) endogène de ladite souche, et éventuellement (d) l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'une phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT) endogène de ladite souche. 25 Les étapes (a) à (d) du procédé selon la présente invention peuvent être mises en oeuvre dans n'importe quel ordre, simultanément ou séquentiellement. Selon un mode de réalisation avantageux de ce procédé, l'inhibition de la bêta-oxydation des acides gras définie à l'étape (a) ci-dessus est obtenue par : - l'inhibition de l'expression ou de l'activité des acyl-CoA oxydases (AOX) endogènes de 30 ladite souche et/ou - l'inhibition de l'expression ou de l'activité de l'enzyme multifonctionnelle ayant les activités 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase et énoyl-CoA hydratase endogène de ladite souche et/ou - l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 3-oxoacyl-CoA thiolase endogène de ladite souche. Les souches de levure oléagineuse sont bien connues de l'homme du métier. Elles possèdent la capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides, à hauteur d'au moins 5 20% de leur matière sèche (Ratledge, 1994). Elles appartiennent généralement au genre Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium (e.g., Rhodosporidium toruloides), Rhodotorula (e.g., Rhodotura glutinis), Trichosporon ou Yarrowia. Les génomes de Lipomyces et de Rhodosporidium ont été séquencés : pour Lipomyces starkeyi, voir le Joint Genome Institute (JGI) et pour Rhodosporidium toruloides, 10 voir Kumar et al. (2012) et Zhu et al. (2012). Une souche plus particulièrement préférée au sens de la présente invention est une souche de levure de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica. On entend par souche de levure matrice une souche de levure à partir de laquelle d'autres modifications génétiques peuvent être effectuées dans ladite souche. 15 L'inhibition de l'expression ou de l'activité d'une enzyme définie dans la présente invention peut être totale ou partielle. Elle peut être obtenue de diverses manières par des méthodes connues en elles mêmes de l'homme du métier. De manière avantageuse, cette inhibition peut être obtenue par mutagenèse du gène codant pour ladite enzyme. 20 La mutagenèse du gène codant pour ladite enzyme peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression de ce gène, notamment au niveau du promoteur, conduisant à une inhibition de la transcription ou de la traduction de ladite enzyme. La mutagenèse du gène codant pour ladite enzyme peut être effectuée par génie 25 génétique. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. Des méthodes permettant de déléter (supprimer) ou d'insérer une séquence génétique donnée chez la levure, en particulier chez Y. lipolytica, sont bien connues de l'homme du métier (voir pour revue Barth et Gaillardin, 1996 ; Madzak et al., 2004). A titre d'exemple, on peut utiliser la méthode appelée POP IN / POP OUT qui a 30 été utilisée chez les levures, particulièrement chez Y. lipolytica, pour la délétion des gènes LEU2, URA3 et XPR2 (Barth et Gaillardin, 1996). On peut également utiliser la méthode SEP (Maftahi et al., 1996) qui a été adaptée chez Y. lipolytica pour la délétion des gènes PDX (Wang et al., 1999b). Avantageusement, on peut aussi utiliser la méthode SEP/Cre développée par Fickers et al. (2003) et décrite dans la Demande Internationale WO 2006/064131. En outre, des méthodes permettant d'inhiber l'expression ou l'activité d'une enzyme chez les levures sont décrites dans la Demande Internationale WO 2012/001144. Une méthode avantageuse selon la présente invention consiste à remplacer la séquence codante du gène codant pour ladite enzyme par une cassette d'expression 5 contenant la séquence d'un gène codant pour un marqueur de sélection. On peut aussi introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles dans le gène codant pour ladite enzyme, ayant pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou d'inhiber la transcription ou la traduction du gène codant pour ladite enzyme. La mutagenèse du gène codant pour ladite enzyme peut aussi être effectuée à 10 l'aide d'agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Cette mutagenèse permet aussi d'introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles dans le gène codant pour ladite enzyme. Le gène muté codant pour ladite enzyme peut être identifié par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène. 15 Il est possible d'utiliser toute méthode de sélection connue de l'homme du métier compatible avec le gène (ou les gènes) marqueur(s) utilisés. Les marqueurs de sélection permettant la complémentation d'une auxotrophie, également communément appelés marqueurs d'auxotrophie, sont bien connus de l'homme du métier. Le marqueur de sélection URA3 est bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de levure dont 20 le gène URA3 (séquence disponible dans les bases de données Génolevures (http://genolevures.org/) sous le nom YALIOE26741g ou UniProt sous le numéro d'accès Q12724), codant pour l'orotidine-5'-phosphate décarboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en uracile. L'intégration du marqueur de sélection URA3 dans cette souche de levure permettra alors de 25 restaurer la croissance de cette souche sur un milieu dépourvu d'uracile. Le marqueur de sélection LEU2 décrit notamment dans le brevet US 4,937,189 est également bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de levure dont le gène LEU2 (YALI0000407g), codant la 13-isopropylmalate déshydrogénase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en leucine. Comme 30 précédemment, l'intégration du marqueur de sélection LEU2 dans cette souche de levure permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en leucine. Le marqueur de sélection ADE2 est également bien connu de l'homme du métier dans le domaine de la transformation de la levure. Une souche de levure dont le gène ADE2 (YALIOB23188g), codant pour la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en adénine. Là encore, l'intégration du marqueur de sélection ADE2 dans cette souche de levure permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en adénine. Des souches de Y. lipolytica auxotrophiques Leu- lira' ont été décrites par Barth et Gaillardin, 1996. Avantageusement, ladite souche mutante de levure est auxotrophe pour la leucine (Leu) et éventuellement pour l'orotidine-5'-phosphate décarboxylase (Ura'). Chez les levures, 6 gènes PDXI, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6 codent 6 isoformes d'acyl-coenzymeA oxydases (AOX ; E.C. 6.2.1.3) impliquées, au moins partiellement, dans la (3-oxydation des acides gras. L'inhibition, partielle ou totale, de l'expression ou de l'activité de ces isoenzymes conduit à l'accumulation par les levures d'acide dodécanedioïque, sans consommation des lipides accumulés. Plus particulièrement, la séquence codante des gènes PDX1-6 et la séquence peptidique des A0X1-6 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures (http://genolevures.org/) ou 15 GenBank sous les numéros d'accès ou noms suivants : PDX1 / AOX1 = YALI0E32835g / YALI0E32835p, PDX2 / AOX2 = YALIOF10857g / YALIOF10857p ; PDX3 / AOX3 = YALIOD24750g / YALIOD24750p ; PDX4 / AOX4 = YALI0E27654g / YALI0E27654p ; PDX5 / AOX5 = YALI0C23859g / YALI0C23859p ; PDX6 / AOX6 = YALIOE06567g / YALIOE06567p. Les séquences peptidiques des acyl-CoA oxydases de Y. lipolytica 20 présentent 45 % d'identité ou 50 % de similarité avec celles des autres levures. Le degré d'identité entre les acyl-CoA oxydases varie de 55 à 70 % (ou 65 à 76 % de similarité) (Demande Internationale WO 2006/064131). Un procédé d'inhibition de l'expression des 6 AOX endogènes dans une souche de Y. lipolytica a été décrit dans les Demandes Internationales WO 2006/064131, WO 2010/004141 et WO 2012/001144. 25 Chez les levures, l'enzyme multifonctionnelle possède trois domaines : deux domaines ayant une activité 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase (E.C. 4.2.1.74 ; domaines A et B) et un domaine ayant une activité énoyl-CoA hydratase (E.C. 4.2.1.17 ; domaine C). Cette enzyme est codée par le gène MFE1 (« Multifunctional enzyme type 1 »). Plus particulièrement, la séquence codante du gène MFE1 et la séquence peptidique de la 3- 30 hydroxyacyl-CoA déshydrogénase et énoyl-CoA hydratase de Y lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOE15378g / YALIOE15378p. Un procédé d'inhibition de l'expression de ladite enzyme multifonctionnelle endogène dans une souche de Y lipolytica a été décrit par Haddouche et al. (2011). Chez les levures, la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (E.C. 2.3.1.16) est codée par le gène POT1 (« Peroxisomal Oxoacyl Thiolase 1 »). Plus particulièrement, la séquence codante du gène POT1 et la séquence peptidique de la 3-oxoacyl-CoA thiolase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI018568g / YALI018568p. Un procédé d'inhibition de l'expression de la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase endogène dans une souche de Y lipolytica a été décrit par Berninger et al. (1993). Chez les levures, les acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases (DGAT ; E.C. 2.3.1.20) sont codées par deux gènes : DGA1 et DGA2 (Beopoulos et al., 2009 et 2012 ; 10 Demande Internationale WO 2012/001144). Plus particulièrement, la séquence codante du gène DGA1 et la séquence peptidique de l'acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases 1 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0E32769g / YALI0E32769p. La séquence codante du gène DGA2 et la séquence peptidique de l'acyl-CoA:diacylglycérol 15 acyltransférases 2 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOD07986g / YALIOD07986p. Chez Rhodoturula glutanis, une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase a été décrite par Rani et al. (2013). Un procédé d'inhibition de l'expression d'une ou des 2 DGAT (DGAT1 et/ou DGAT2) endogènes dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par 20 Beopoulos et al. (2012). Certaines levures possèdent naturellement un gène codant pour une oléate (Al2) désaturase (E.C. 1.14.19.6) qui est codée par le gène FAD2. Par exemple, Y. lipolytica possède ce gène alors que S. cerevisiae (qui n'est pas considérée comme une levure oléagineuse) ne le possède pas (Ratledge, 2004 ; Beopoulos et al., 2008). Plus 25 particulièrement, la séquence codante du gène FAD2 et la séquence peptidique de l'oléate (Al2) désaturase de Y lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOB10153g / YALIOB10153p. Si la souche de levure ne possède pas de gène codant pour une oléate (Al2) désaturase, alors l'étape (c) du procédé selon la présente invention ne sera pas mise en oeuvre. 30 Chez les levures, la phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT ; E.C. 2.3.1.158) est codée par le gène LRO1 (Beopoulos et al., 2009 et 2012 ; Demande Internationale WO 2012/001144). Plus particulièrement, la séquence codante du gène LRO1 et la séquence peptidique de la phospholipide:diacylglycérol acyltransférase de Y. lipolytica CLIB 122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOE16797g / YALIOE16797p. Un procédé d'inhibition de la PDAT endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Beopoulos et al. (2012). La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une 5 souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel, comprenant les étapes (a) à (c) définies ci-dessus, éventuellement l'étape (d) définie ci-dessus, et en outre l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité oléate hydroxylase (E.C. 1.14.99.33) ou oléate époxydase (E.0 1.14.99.- ; Lee et al., 1998). 10 On entend par enzyme hétérologue, une enzyme que ne possèdent pas naturellement les levures oléagineuses. Ce peut être une enzyme provenant de tout organisme procaryote ou eucaryote. Des enzymes présentant une activité oléate hydroxylase ou oléate époxydase (Lee et al., 1998) sont connues de l'homme du métier. L'utilisation d'une enzyme particulière 15 présentant une activité hydroxylase ou époxydase dépend de l'acide gras oméga-9 inhabituel que l'homme du métier souhaite faire produire à la souche mutante de levure oléagineuse. Selon un mode de réalisation préféré de ce procédé, l'acide gras oméga-9 inhabituel est l'acide ricinoléique et ledit procédé comprend l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité oléate (Al2) hydroxylase, telle qu'une 20 oléate (Al2) hydroxylase (FAH12) ou une oléate (Al2) désaturase (FAD2) mutée pour qu'elle présente une activité oléate (Al2) hydroxylase, de préférence une oléate (Al2) hydroxylase. Selon un mode de réalisation avantageux de ce procédé, ladite oléate (Al2) hydroxylase est l'oléate (Al2) hydroxylase de Ricinus communis (RcFAH12) ou provient d'un champignon de la division des ascomycètes, de préférence de la famille des 25 Clavicipitaceae, de préférence encore du genre Claviceps et tout préférentiellement de l'espèce Claviceps purpurea (CpFAH12). La séquence peptidique de l'enzyme RcFAH12 est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès GI:187940238. Une séquence nucléotidique codant RcFAH12 optimisée pour son expression chez la levure est représentée par la séquence SEQ 30 ID NO : 21. La séquence peptidique de l'enzyme CpFAH12 est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès GI:194271137. Une séquence nucléotidique codant CpFAH12 optimisée pour son expression chez la levure est représentée par la séquence SEQ ID NO : 22. L'oléate (Al2) désaturase mutée présentant une activité oléate (412) hydroxylase peut être obtenue par échange de domaine de l'oléate (Al2) désaturase par un ou plusieurs domaine d'une oléate (Al2) hydroxylase conférant l'activité hydroxylase (domaines H2 et/ou H3), et/ou par mutagénèse (e.g., substitution) d'un ou plusieurs acides aminés de l'oléate (Al2) désaturase par un ou plusieurs acides aminés d'une oléate (Al2) désaturase conférant une activité hydroxylase. A titre d'exemple chez les plantes, des oléate désaturases mutées présentant une activité oléate hydroxylase ont été décrites par Broun et al. (1998) et Broadwater et al. (2002). Avantageusement, l'oléate (Al2) désaturase mutée provient d'un champignon de la famille des Clavicipitaceae, de préférence encore du genre Claviceps et de préférence encore de l'espèce Claviceps purpurea (CpFAD2 ; Meesapyodsuk et al., 2007) ou provient d'une levure de la famille des hémiascomycètes, de préférence du genre Yarrowia et de préférence encore de l'espèce Yarrowia lipolytica (Y1FAD2 : YALIOB10153 g / YALIOB101539). Chez C. purpurea, la séquence d'acides aminés de l'oléate désaturase (CpFAD2) possède 86 % d'identité avec la séquence d'acides aminés de l'oléate hydroxylase (CpFAH12). La différence de fonction entre la désaturase et l'hydroxylase de C. purpurea est donc contenue dans les acides aminés correspondant aux 14% de séquences divergentes entre ces 2 enzymes. Des CpFAD2 mutées (protéines chimères) présentant une activité oléate (Al2) hydroxylase sont représentées en tant que SEQ ID NO : 49, 50 et 51, de préférence SEQ ID NO : 51. La surexpression d'une enzyme (endogène, orthologue, hétérologue) définie dans la présente invention dans une souche mutante de levure selon la présente invention peut être obtenue de diverses manières par des méthodes connues en elles mêmes. La surexpression d'une enzyme définie dans la présente invention peut être effectuée en plaçant une ou plusieurs (de préférence deux ou trois) copies de la phase ouverte de lecture de la séquence codant ladite enzyme sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées. Lesdites séquences régulatrices comprennent des séquences promotrices, placées en amont (en 5') de la phase ouverte de lecture de la séquence codant ladite enzyme, et des séquences terminatrices, placées en aval (en 3') de la phase ouverte de lecture de la séquence codant ladite enzyme. Des séquences promotrices qui peuvent être utilisées chez la levure sont bien connues de l'homme du métier et peuvent correspondre notamment à des promoteurs inductibles ou constitutifs. A titre d'exemple de promoteurs utilisables dans le procédé selon la présente l'invention, on peut citer notamment le promoteur d'un gène de Y. lipolytica qui est fortement réprimé par le glucose et qui est inductible par les acides gras ou les triglycérides tel que le promoteur PDX2 du gène de l'acyl CoA oxydase 2 (AOX2) de Y lipolytica et le promoteur du gène LIP2 décrit dans la Demande Internationale WO 01/83773. On peut aussi 5 utiliser le promoteur du gène FBAI codant la fructose-bisphosphate aldolase (Demande US 2005/0130280), le promoteur du gène GPM codant la phosphoglycerate mutase (Demande Internationale WO 2006/0019297), le promoteur du gène YATI codant le transporteur de l'ammonium (US 2006/0094102), le promoteur du gène GPAT codant la glycérol-3-phosphate 0-acyltransférase (Demande US 2006/0057690), le promoteur du gène TEF (Muller et al., 10 1998 ; Demande US 2001/6265185), le promoteur hybride hp4d (Demande Internationale WO 96/41889) ou encore les promoteurs hybrides XPR2 décrits dans Mazdak et al. (2000). Des séquences terminatrices qui peuvent être utilisées chez la levure sont également bien connues de l'homme du métier. On peut citer, à titre d'exemple de séquences terminatrices utilisables dans le procédé selon l'invention, la séquence terminatrice du gène 15 PGKJ et la séquence terminatrice du gène LIP2 décrits dans la Demande Internationale WO 01/83773. La séquence nucléotidique des séquences codantes des gènes hétérologues peut être optimisée pour son expression dans la levure par des méthodes bien connues de l'homme du métier (voir pour revue Hedfalk, 2012). 20 La surexpression d'une enzyme endogène peut être obtenue en remplaçant les séquences contrôlant l'expression de ladite enzyme endogène par des séquences régulatrices permettant une expression plus forte, telles que celles décrites ci-dessus. L'homme du métier peut ainsi remplacer la copie du gène codant une enzyme endogène dans le génome, ainsi que ses séquences régulatrices propres, par transformation de la souche mutante de levure par un 25 polynucléotide linéaire comprenant la phase ouverte de lecture de la séquence codant ladite enzyme endogène sous le contrôle de séquences régulatrices telles que celles décrites ci-dessus. Avantageusement, ledit polynucléotide est encadré par des séquences qui sont homologues de séquences situées de chaque côté du gène codant ladite enzyme endogène chromosomique. Des marqueurs de sélection peuvent être insérés entre les séquences assurant 30 la recombinaison afin de permettre, après transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. Avantageusement aussi, les séquences promotrices et terminatrices utilisées appartiennent à des gènes différents de celui codant pour l'enzyme endogène à surexprimer, de manière à minimiser les risques de recombinaison non désirée dans le génome de la souche de levure. La surexpression d'une enzyme endogène peut aussi être obtenue par l'introduction dans la souche de levure selon l'invention de copies surnuméraires du gène codant ladite enzyme endogène sous le contrôle de séquences régulatrices telles que celles décrites ci-dessus. Lesdites copies supplémentaires codant ladite enzyme endogène peuvent être portées par un vecteur épisomal, c'est-à-dire capable de se répliquer dans la levure. De préférence, ces copies supplémentaires sont portées par un vecteur intégratif, c'est-à-dire s'intégrant à un endroit donné dans le génome de la levure (Mazdak et al., 2004). Dans ce cas, le polynucléotide comprenant le gène codant ladite enzyme endogène sous le contrôle de régions régulatrices est intégré par intégration ciblée. L'intégration ciblée d'un gène dans le génome d'une levure est une technique de biologie moléculaire bien connue de l'homme du métier : un fragment d'ADN est cloné dans un vecteur intégratif, introduit dans la cellule à transformer, lequel fragment d'ADN s'intègre alors par recombinaison homologue dans une région ciblée du génome receveur (Orr-Weaver et al., 1981). Des procédés de transformation des levures sont également bien connus de l'homme du métier et sont décrits, notamment, par Ito et al. (1983), Klebe et al. (1983) et Gysler et al. (1990). Des marqueurs de sélection peuvent aussi être insérés entre les séquences assurant la recombinaison afin de permettre, après transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. Lesdites copies supplémentaires peuvent aussi être portées par des fragments de 20 PCR dont les extrémités sont homologues à un locus donné de la levure, permettant ainsi l'intégration desdites copies dans le génome de la levure par recombinaison homologue. Lesdites copies supplémentaires peuvent également être portées par des vecteurs d'autoclonage ou des fragments de PCR dont les extrémités présentent une région zeta absente du génome de la levure, permettant ainsi l'intégration desdites copies dans le génome 25 de la levure par insertion aléatoire comme décrit dans la Demande US 2012/0034652. Toute méthode de transfert de gène connue de l'art antérieur peut être utilisée pour introduire dans une souche de levure une cassette d'invalidation d'un gène ou introduire un gène codant une enzyme. De préférence, on utilise la méthode à l'acétate de lithium et au polyéthylène glycol décrite par Gaillardin et al. (1987) et Le Dali et al. (1994). 30 Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser de l'acide ricinoléique selon la présente invention, il comprend en outre la surexpression dans ladite souche de levure d'une enzyme capable de catalyser la formation du triacylglycérol (TAG) à partir du 1,2-sndiacylglycérol. Cette enzyme capable de catalyser la formation du triacylglycérol (TAG) à partir du 1,2-sn-diacylglycérol peut être une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (DGAT ; E.C. 2.3.1.20) ou une phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT ; E.C. 2.3.1.158). Cette enzyme peut être endogène de ladite souche de levure. De préférence, cette enzyme est une 5 PDAT, de préférence encore la PDAT endogène de ladite souche de levure. La PDAT permet de transférer l'acide ricinoléique du phospholipide au diacylglycérol. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser de l'acide ricinoléique selon la présente invention, il comprend en outre : 10 - la surexpression d'une monoacylglycérol acyltransférase, avantageusement d'une monoacylglycérol acyltransférase de levure, avantageusement encore de la monoacylglycérol acyltransférase endogène de ladite souche et/ou - la surexpression d'une patatin-like triacylglycérol lipase, avantageusement d'une patatin- like triacylglycérol lipase de levure, avantageusement encore de la patatin-like triacylglycérol 15 lipase endogène de ladite souche et/ou - l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche et/ou - la surexpression d'au moins une des deux sous-unités de l'ATP citrate lyase, avantageusement d'au moins une des deux sous-unités de l'ATP citrate lyase de levure, 20 avantageusement encore d'au moins une des deux sous-unités de l'ATP citrate lyase endogène de ladite souche et/ou - la surexpression d'une diacylglycérol:choline-O phosphotransférase, avantageusement d'une diacylglycérol:choline-O phosphotransférase de levure, avantageusement encore de la diacylglycérol:choline-O phosphotransférase endogène de ladite souche et/ou 25 - la surexpression d'une éthanolamine phosphotransférase, avantageusement d'une éthanolamine phosphotransférase de levure, avantageusement encore de l'éthanolamine phosphotransférase endogène de ladite souche et/ou - la surexpression d'une phospholipase A2, avantageusement d'une phospholipase A2 de levure, avantageusement encore de la phospholipase A2 endogène de ladite souche et/ou 30 - la surexpression d'une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltranférase, avantageusement d'une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltranférase de levure, avantageusement encore d'une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltranférase endogène de ladite souche et/ou - la surexpression d'une cytochrome-b5 réductase, avantageusement d'une cytochrome-b5 réductase endogène de ladite souche et/ou - la surexpression d'une inositol/phosphatidyl inositol phosphatase, avantageusement de l'inositol/phosphatidyl inositol phosphatase endogène de ladite souche et/ou - la surexpression d'une élongase, avantageusement d'une élongase endogène de ladite souche. Les enzymes surexprimées dans ladite souche de levure peuvent provenir de tout organisme procaryote ou eucaryote. La séquence codante des gènes codant ces enzymes peut être optimisée pour son expression dans la levure par des méthodes bien connues de l'homme du métier (voir pour revue Hedfalk, 2012). Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, au moins une des 10 enzymes surexprimées est endogène de ladite souche, de préférence toutes les enzymes surexprimées sont endogènes de ladite souche. Chez les levures, la monoacylglycérol acyltransférase (MAGT ; 1-acyl-sn- glycérol-3-phosphate acyltransférase ; E.C. 2.3.1.51) est codée par le gène SLC1 (Beopoulos et al., 2009 et 2012 ; Demande Internationale WO 2012/001144). Plus particulièrement, la 15 séquence codante du gène SLC1 et la séquence peptidique de la monoacylglycérol acyltransférase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOE18964g / YALIOE18964p. Chez les levures, la patatin-like triacylglycérol lipase (TGL5 ; triacylglycerol 20 lipase ; E.C. 3.1.1.3) est codée par le gène TGL5 (Beopoulos et al., 2009 et 2012). Plus particulièrement, la séquence codante du gène TGL5 et la séquence peptidique de la patatinlike triacylglycérol lipase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOD16379g / YALIOD16379p. 25 Chez les levures, la 2-méthylcitrate déshydratase (E.C. 4.2.1.79) est une protéine mitochondriale qui catalyse la conversion du 2-méthylcitrate en 2-méthyl-cis aconitate dans le cycle du 2-méthycitrate du métabolisme du propionate (Uchiyama et al., 1982 ; Tabuchi et al., 1981). Elle est codée par le gène PHD1. Plus particulièrement, la séquence codante du gène PHD1 et la séquence peptidique de la méthylcitrate déshydratase de Y. lipolytica 30 CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOF02497g / YALIOF02497p. Chez les levures, l'ATP citrate lyase (E.C. 2.3.3.8) consiste en deux sous-unités codées par deux gènes (ACL1 et ACL2 respectivement) (Beopoulos et al., 2009). L'ATP citrate lyase de certaines levures oléagineuses a été caractérisée par Boulton et al. (1981). Plus particulièrement, la séquence codante des gènes ACL1 et ACL2 et la séquence peptidique des sous-unités A et B de l'ATP citrate lyase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les numéros d'accès ou les noms suivants : ACL1 / sous-unité A : YALI0E34793g / YALI0E347939p, et ACL2 / sous-unité B : 5 YALI0D24431g / YALI0D24431p. Chez les levures, la diacylglycérol:choline-O phosphotransférase (E.C. 2.7.8.2) est codée par le gène CPTJ. Plus particulièrement, la séquence codante du gène CPT1 et la séquence peptidique de la diacylglycérol:choline-O phosphotransférase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le 10 numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOE26565g / YALIOE26565p. Chez les levures, l'éthanolamine phosphotransférase (EPT1 ; E.C. 2.7.8.1) est codée par le gène EPT1. Plus particulièrement, la séquence codante du gène EPT1 et la séquence peptidique de l'éthanolamine phosphotransférase de Y lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le 15 nom suivant : YALIOC10989g / YALIOC10989p. Chez les levures, la phospholipase A2 (PLA2 ; E.C. 3.1.1.3 ; 3.1.1.13 ; 3.1.1.4 et 2.3.1.51) est codée par le gène LPA1. Plus particulièrement, la séquence codante du gène LPA1 et la séquence peptidique de la phospholipase A2 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le 20 nom suivant : YALIOF10010g / YALIOF10010p. Chez les levures, les acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltranférases (LPCAT ; (E.C. 2.3.1.51 ; 2.3.1.23 ; 2.3.1.-) sont codées par 3 gènes, respectivement LCA1, LCA2 et LCA3. Plus particulièrement, la séquence codante des gènes LCA1, LCA2 et LCA3 et la séquence peptidique des acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltranférases 1, 2 et 3 de Y. 25 lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les numéros d'accès ou les noms suivants : LCA1 : YALIOF19514g / YALIOF19514p ; LCA2 : YALIOC20625g / YALIOC20625p et LCA3 : YALIOC14036g / YALIOC14036p. Chez les levures, les cytochrome-b5 réductases (E.C. 1.6.2.2) sont codées par deux gènes, respectivement MCR1 et CBR1 (Sickmann et al., 2003 ; Dujon et al., 2004). Plus 30 particulièrement, la séquence codante des gènes MCR1 et CBR1 et la séquence peptidique des cytochrome-b5 réductases de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les numéros d'accès ou les noms suivants : MCR1 : YALIOD11330g / YALIOD11330p et CBR1 YALIOD04983g/ YALIOD04983p. Chez les levures, l'inositol/phosphatidyl inositol phosphatase (E.C. 3.1.3.-) est codée par le gène SACI (Whitters et al., 1993). Plus particulièrement, la séquence codante du gène SAC1 et la séquence peptidique de l'inositol/phosphatidyl inositol phosphatase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOD05995g / YALIOD05995p. Chez les levures, les élongases (E.C. 2.3.1.199) sont codées par deux gènes, respectivement EL01 et ELG2. Plus particulièrement, la séquence codante des gènes EL01 et EL02 et la séquence peptidique des élongases A et B respectivement de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les 10 numéros d'accès ou les noms suivants : EL01 : YALIOF06754g, et EL02 : YALIOB20196g. Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel selon la présente invention, l'acide gras oméga-9 inhabituel est l'acide vernolique et ledit procédé comprend l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité 15 oléate (Al2) époxydase. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'oléate (Al2) époxydase est celle de Crepis alpina, Crepis Palaestina ou Vernonia galamensis (Lee et al., 1998). La présente invention a également pour objet 20 - une souche mutante de levure oléagineuse utile comme souche de levure matrice pour l'obtention d'autres souches mutantes de levure oléagineuse et - une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel, de préférence capable de produire de l'acide ricinoléique ou de l'acide vernolique, de préférence encore de l'acide ricinoléique, 25 susceptibles d'être obtenues par un procédé selon la présente invention défini ci-dessus. On peut citer, à titre d'exemple de souches mutantes de levure oléagineuse utiles comme souches de levures matrices pour l'obtention d'autres souches mutantes de levure oléagineuse, celles de génotype : - pox1-621 dga14 lrolZ1dga2.4 fad24 ou 30 - ura3-302 leu2-270 xpr2-322 pox1-621dga1.4 1ro14 dga221 fadl 4. On peut citer, à titre d'exemple de souches mutantes de levure oléagineuse capable de synthétiser de l'acide ricinoléique celles de génotype : - pox1-6z1dgal4 lro121 dga2z1fad221 pTEF-CpFAH12 - pox1-6.4 dga14 1rolZ1 dga24 fad2z1pTEF- CpFAH12x2 pTEF-LRO1 - pox1-64 dga14 froid dga2z1 fad24 pTEF-CpFAH12x3 pTEF-LRO1x2. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel selon la présente invention telle que définie ci-dessus pour la production d'un acide gras oméga-9. Ledit acide gras oméga-9 est de préférence de l'acide ricinoléique ou de l'acide vernolique, de préférence encore de l'acide ricinoléique. La présente invention a également pour objet un procédé de production d'acide gras oméga-9, comprenant une étape de culture sur un milieu approprié d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel selon la présente invention telle que définie ci-dessus. Ledit acide gras oméga-9 est de préférence de l'acide ricinoléique ou de l'acide vernolique, de préférence encore de l'acide ricinoléique. Ledit procédé de production d'acide gras oméga-9 comprend une première étape de culture de ladite souche mutante de levure oléagineuse selon la présente invention dans un milieu approprié et une seconde étape de récolte des acides gras oméga-9 produits par la culture à l'étape 1. Ledit milieu approprié peut comprendre différentes sources carbonées pour la croissance telles que par exemple du glucose, du saccharose ou du glycérol. Des sources complexes d'apport de ce substrat carboné peuvent également être utilisées telles que des mélasses. Il peut aussi comprendre des huiles végétales ou de l'acide oléique comme substrat de bioconversion. Ledit milieu approprié peut être un milieu riche à base d'extrait de levure, de tryptone ou de peptone (par exemple extrait de levure 5g/L-glucose 50g/L), ou un milieu minimum classique tel que décrit par Mlickova et al. (2004) ou optimisé pour ladite levure (Demande Internationale WO 2007/144445 ; Emond et al., 2010) comprenant des oligoéléments, du fer et des vitamines ainsi que de l'acide orthophosphorique et de l'ammoniac ou toute autre source d'azote connue de l'homme du métier. Les milieux de culture et les procédés de culture des levures oléagineuses sont bien connues de l'homme du métier. La culture des levures oléagineuse peut être réalisée en fermenteur. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à l'obtention d'une souche mutante de levure Y. lipolytica matrice selon la présente invention et de souches mutantes de levure Y. lipolytica capables de synthétiser de l'acide ricinoléique, ainsi que des figures annexées : Figure 1 : Tableau décrivant les plasmides et les souches d'E. coli et de Y. lipolytica utilisés pour l'obtention des souches mutantes de Y. lipolytica selon la présente invention. Figure 2 : Représentation schématique de la construction des souches mutantes de Y. lipolytica selon la présente invention et leur génotype. Figure 3 : Couples d'amorces utilisés pour le clonage des gènes d'intérêt. Figure 4 : Composition en acides gras (pourcentages par rapport aux acides gras totaux) de souches mutantes de levure (A) exprimant l'oléate hydroxylase de R. communis (RcFAH12) ou de C. purpurea (CpFAH12) dans différents fonds génétiques et (B) co- exprimant RcFAH12 ou CpHAH12 et l'oléate désaturase de R. communis (RcDGAT2), de C. purpurea (CpDGAT2) ou de Y lipolytica (Y1LRO1) dans différents fonds génétiques. Figure 5 : Séquence des amorces utilisées pour le clonage des gènes impliqués dans le métabolisme lipidique de Y. lipolytica. Les amorces sens (for) contiennent un site BamHI, les amorces anti-sense (rev) contiennent un site AvrII. Les sites introduits sont soulignés. Les sites internes BamHI dans le gène ACL2 on été éliminés par la modification d'une base (en gras) au site BamHI. Les sites BamHI, BamHI mutés et Avril sont soulignés. Figure 6 : Schéma de la stratégie adoptée pour l'amplification du gène ACL2 de Y lipolytica tout en éliminant les deux sites de restrictions BamHI. Figure 7 : Souches mutantes de levure Y. lipolytica obtenues à partir de la souche 20 JMY2853 (Ura-, Leu-) par surexpression ou délétion d'un gène cible. Les résultats des modifications génétiques sur la production d'acide ricinoléique sont représentés en pourcentage par rapport à la souche JMY2556. La souche JMY2556 (Ura+, Leu-) a été utilisée comme contrôle car elle présente les mêmes auxotrophies que les souches construites. * + :surexpression ; - : délétion. 25 Figure 8 : (A) Représentation schématique de différentes protéines chimères entre une désaturase (en gris) et une hydroxylase (en noir). (B) Composition lipidique de différentes souches après 96h de culture en fiole contenant 5% de glucose (YED5) pour les souches mutantes de levure QPF-CpFAH12, QPF-H2_hyd, QPF-H2/H3_hyd et QPF-H2/H3_hyd Cterm. 30 EXEMPLE I : OBTENTION ET CARACTÉRISATION D'UNE SOUCHE MUTANTE DE LEVURE Y. LIPOLYTICA MATRICE POUR L'OBTENTION D'AUTRES SOUCHES MUTANTES DE LEVURE ; SOUCHES MUTANTES DE LEVURE OBTENUES À PARTIR DE LADITE SOUCHE DE LEVURE MATRICE ET 5 CAPABLES DE SYNTHÉTISER DE L'ACIDE RICINOLÉIQUE 1) Matériel et méthodes 0 Souches et milieux Les souches mutantes de Y. lipolytica sont dérivées de la souche auxotrophique de Y lipolytica Pol d (Leu tira" ; CLIB 139 ; de génotype MatA Ura3-302, Leu2-270, xpr2-322), 10 elle-même dérivée de la souche sauvage de Y lipolytica W29 (de génotype MatA ; ATCC 20460) par modification génétique. Les souches Pol d et W29 ont été décrites par Barth et Gaillardin (1996). Les souches utilisées pour l'obtention des souches selon la présente invention sont présentées dans le tableau de la Figure 1. Leur construction est représentée à la Figure 2 et décrite en détail ci-dessous. 15 Le milieu et les conditions de culture de Y. lipolytica ont été décrits par Barth et Gaillardin (1996). Un milieu riche (YPD), un milieu minium + glucose (YNB) et un milieu minimum + casaminoacides (YNBcasa) ou uracile (YNBura) ont été préparés comme décrit par Mlickova et al. (2004). Le milieu minimum (YNB) contient 0,17% (p/v) de base azotée de levure (sans acide aminé et sulfate d'ammonium, YNBww; Difco, Paris, France), 0,5% (p/v) 20 de NH4C1, 0,1% (p/v) d'extrait de levure (Bacto-DB) et 50 mM de tampon phosphate (pH 6,8). Le milieu glucose pour la néosynthèse de l'acide ricinoléique (YED5) contient 1% (p/v) d'extrait de levure (Bacto-DB) et 5% (p/v) de glucose. La souche d'Escherichia coli Machl -T1 (Invitrogen) a été utilisée pour la transformation et l'amplification de l'ADN plasmidique recombinant. Les cellules ont été 25 cultivées sur un milieu LB (Sambrook et al., 1989). La Kanamycine (40 lig/mL) a été utilisée pour la sélection des plasmides. ii) Techniques générales de biologie moléculaire Les techniques de biologie moléculaire standards, bien connues de l'homme du métier, ont été utilisées. Les enzymes de restriction ont été obtenues auprès de New England 30 Biolabs (Evry, France). L'ADN génomique des transformants de levure a été obtenu comme décrit par Querol et al. (1992). Un cycleur thermique (Applied Biosystem 2720) et les ADN polymérases Taq (Takara, Shiga, Japon) et Pyrobest (Takara, Shiga, Japon) ont été utilisés pour l'amplification PCR. Les fragments amplifiés ont été purifiés avec le kit de purification QIAgen (Qiagen, Hilden, Allemagne) et les fragments digérés d'ADN ont été récupérés à partir de gels d'agarose avec le kit d'extraction de gel QlAquick (Qiagen). L'ensemble de programmes STADEN (Dear et Staden, 1991) a été utilisé pour l'analyse des séquences. La transformation des cellules de levure a été réalisée par la méthode à l'acétate de lithium (Gaillardin et al., 1985). iii) Construction de souches de Y. lipolytica disruptées et excision du marqueur Les cassettes de délétion ont été produites par amplification par PCR comme décrit par Fickers et al. (2003) en utilisant les couples d'amorces décrits par Beopoulos et al. (2008 et 2012) et à la Figure 3. Les cassettes PT (voir Fickers et al., 2003) ont ensuite été insérées dans le vecteur PCR4RBlunt-TOPO (Life Technologies, Carlsbad, Californie) et le 10 marqueur auxotrophe (URA3 ou LEU2) a ensuite été inséré par clonage au niveau du site Iscel des vecteurs pour générer les vecteurs JME correspondants (PUT ou PLT) (voir Figure 1). Les cassettes de disruption PUT et PLT ont été introduites dans le génome de Y. lipolytica par transformation par la méthode à l'acétate de lithium. Les transformants Ura+ et Leu+ ont été sélectionnés sur les milieux YNBcasa et YNBura, respectivement. Les amorces ylAl2- 15 verl et ylAl2-ver2 correspondantes (voir Figure 3) ont été utilisées pour vérifier la disruption du gène par amplification PCR des loci génomiques. L'excision des marqueurs a été réalisée en utilisant le système de recombinase Cre-lox par transformation avec le plasmide réplicatif pUB4-Crel (JME547) comme décrit par Fickers et al. (2003). Les souches ont ensuite été curées du plasmide par réplications successives sur milieu riche. 20 iv) Clonage et expression des hydroxylases et acyltransférases hétérologues sous le contrôle du promoteur constitutif TEF Les gènes d'intérêt ont été placés sous le contrôle du promoteur constitutif TEF de Yarrowia lipolytica (Muller et al., 1998). Les codons des gènes hétérologues codant pour une hydroxylase et une acyltransferase ont été optimisés pour une expression dans la levure et 25 synthétisé par Genscript (New Jersey, USA). Les gènes codant ont ensuite été insérés entre les sites de restriction BamHE-AvrII du vecteur d'expression dérivé de JMP62 contenant le promoteur pTEF et le marqueur de sélection URA3ex (JME1046) décrit par Nicaud et al. (2002). Les vecteurs JMP62 contenant le marqueur de sélection LEU2ex ont été obtenus par le remplacement du marqueur à l'aide du site de restriction Iscel en amont / aval d'URA3ex 30 dans le vecteur JME802 (Fickers et al., 2003 ; Nicaud et al., 2002). Les plasmides ont été digérés par Notl préalablement à la transformation. Les transformants ont été sélectionnés par auxotrophie sur le milieu minimal adéquat. y) Analyse des lipides Les lipides de l'équivalent de 10 unités DO de cellules en culture lyophilisées ont été extraits par la procédure décrite par Folch et al. (1957) pour l'analyse CCM (chromatographie sur couche mince) ou ont été directement convertis en leurs esters méthyliques pour l'analyse GC, tel que décrit par Browse et al. (1986). L'analyse GC des esters méthyliques d'acides gras (EMAG) a été réalisée sur un chromatographe en phase gazeuse (Varian 3900) équipé d'un détecteur à ionisation de flamme et d'une colonne Varian FactorFour vf-23ms, avec une spécification de lavage à 260°C de 3pA (30 m, 0,25 mm, 0,25 gm). Les acides gras (AG) ont été identifiés par comparaison avec les esters méthyliques d'acides gras standards commerciaux (FAME32, Supelco; ricinoléate de méthyle, Sigma) et quantifiés par la méthode standard interne avec l'ajout de 50 mg de C17:0 commercial (Sigma). vi) Analyse des lipides par chromatographie sur couche mince (CCM) Des plaques CCM pré-revêtues (silice G60, 20 x 20 cm, 0,25 mm d'épaisseur) de Merck (Allemagne) ont été utilisées. Les classes de lipides ont été séparées avec le solvant hexane / éther éthylique / acide acétique, 80/20/1 (v/v/v). Pour la révélation, les plaques ont été pulvérisées avec 1% de vanilline sulfurique dans de l'éthanol et incubées à 105°C pendant 10 min. Les différentes classes de lipides ont été identifiées à l'aide d'étalons commerciaux (Nu-chek, USA). 2) Résultats i) Comparaison de l'expression hétérologue des oléate hydroxylases de Claviceps purpurea (CpFAH12) et de Ricin us communis (RcFAH12) pour la production de d'acide ricinoléique Pour évaluer les capacités enzymatiques des oléate (Al2) hydroxylases de plante (R. communis) et de champignon (C. purpurea) à synthétiser des acides gras hydroxylés dans Y lipolytica, les gènes codant RcFAH12 et CpFAH12 ont été exprimés indépendamment l'un de l'autre, sous le promoteur constitutif fort pTEF, dans différents fonds génétiques de Y. lipolytica. Les séquences codantes de RcFAH12 et CpFAH12 ont été optimisées pour leur 30 expression dans la levure (SEQ ID NO : 21 et 22 respectivement). Afin d'éviter la conversion d'acide oléique en acide linoléique par la désaturase endogène de Y. lipolytica, le gène de Y. lipolytica codant la Al2 désaturase endogène (FAD2 ; YALIOB10153g) a été délété avant l'expression hétérologue des oléate hydroxylases. Cette délétion a été effectuée à la fois dans la souche Po 1 d et la souche JMY1233 (pox1-6A). Les mutants obtenus, dénommés JMY1366 et JMY1762 respectivement, ont été incapables de synthétiser de l'acide linoléique. La souche JMY2159 rassemblant les délétions invalidant la 13-oxydation (poxl- 64), la synthèse des TAG (dgalzi dga2z1 froid) et la désaturation A 12 (fad24) est nommée PQF pour simplification. Les cultures ont été effectuées en mode batch sur un milieu contenant du glucose (YED5), en favorisant la néosynthèse des lipides. Comme le montre la Figure 4A, les mutants fad24 exprimant l'hydroxylase de ricin (RcFAH12) ont réussi à synthétiser et accumuler de l'acide ricinoléique à seulement 0,3% de ses lipides totaux, indépendamment de leur aptitude à réaliser une 13-oxydation (souches JMY1760 et JMY1763). La souche mutante délétée des TAG acyltransférases exprimant RcFAH12 (JMY2331) contient 7% d'acide ricinoléique, ce qui suggère que l'absence d'activité enzymatique dans les constructions précédentes est due en grande partie à l'indisponibilité du substrat (acide oléique estérifié en TAG). La construction homologue exprimant la CpFAH12 (JMY2324) contenait jusqu'à 29% d'acide ricinoléique (Figure 4A). Ces résultats démontrent que l'enzyme fongique est plus performante dans Y. lipolytica que l'enzyme de plante. En outre, toutes les souches testées ont été capables de synthétiser de l'acide linoléique (C18:2), en raison du potentiel bien connu des enzymes oléate hydroxylases à posséder une activité bifonctionnelle hydroxylation / désaturation. Chez les souches exprimant RcFAH12, l'acide linoléique s'élevait à 0,5% des lipides totaux, alors que pour les souches exprimant CpFAH12 ce pourcentage s'élevait à 15% des lipides totaux. Le rapport de l'hydroxylation sur l'activité de désaturation, ne semble pas seulement être spécifique de l'espèce, mais est aussi lié à l'activité enzymatique. Il était de 10:1 pour la souche PQF- RcFAH12 (JMY2331) et 2:1 pour la souche PQF-CpFAH12 (JMY2324). h) Amélioration de la production d'acide ricinoléique: augmentation du nombre de copies des hydroxylases et co-expression avec des acyltransférases spécifiques de l'acide ricinoléique L'expression d'une copie supplémentaire de l'hydroxylase CpFAH12 dans le 30 même contexte génétique (JMY2511) a permis d'obtenir une souche mutante produisant de l'acide ricinoléique à hauteur de 35% de ses lipides totaux (Figure 4B). Ces résultats démontrent que l'efficacité de l'hydroxylation est associée au nombre de copies exprimées. En outre, pour les souches exprimant CpFAH12 le pourcentage d'acide linoléique s'élève à 15% et 21% des lipides totaux en fonction de la simple ou double surexpression de CpFAH12 respectivement (souches JMY2324 et JMY2511). Là aussi, le rapport de l'hydroxylation sur l'activité de désaturation ne semble pas seulement être spécifique de l'espèce, mais est aussi lié à l'activité enzymatique. Il était de 2:1 pour la souche PQF-CpFAH12 (JMY2324) et de 1,5:1 pour la souche PQF-CpFAH12x2 (JMY2511). Cependant, la fraction d'acides gras C18 insaturés (acide oléique, acide linoléique et acide ricinoléique) est restée constante et a représenté environ 70% des lipides totaux pour toutes les souches testées. En termes d'accumulation de lipides, la souche fad24-RcFAH12 (JMY1760) a accumulé des lipides jusqu'à 4% du son poids sec, alors que pour la souche pox1-64fad24-RcFAH12 (JMY1763) l'accumulation de lipides a atteint 7% du poids sec. Toutes les souches dérivées de PQF ont accumulé des lipides à environ 5% du poids sec. Pour déterminer si le niveau de la synthèse d'acide ricinoléique est lié à la capacité d'accumulation des souches de levure, il a été exprimé de manière indépendante, sous le contrôle du promoteur pTEF, l'acyltransférase spécifique de l'acide ricinoléique DGAT2 de R. communis (RcDGAT2) et de C. purpurea (CpDGAT2) respectivement, dans la souche PQF-CpFAH12. Les séquences codantes de RcDGAT2 et CpDGAT2 ont été optimisées pour leur expression dans la levure (SEQ ID NO : 23 et 24 respectivement). Il a aussi été surexprimé dans la souche PQF-CpFAH12 l'acyltransférase YlLRO1 native qui utilise le groupe sn-2 des phospholipides où se produit l'hydroxylation comme le donneur d'acyle pour l'estérification des TAG. La composition en acides gras des mutants exprimant l'acyltransférase est présentée à la Figure 4B. Une diminution significative de 2 fois le niveau d'acide ricinoléique a été observée dans la souche co-exprimant CpFAH12-RcDGAT2 (JMY2329), en comparaison à la souche parente exprimant hydroxylase de C. purpurea (JMY2324), accumulant de l'acide ricinoléique à seulement 14% des lipides totaux. Les deux souches ont accumulé des lipides jusqu'à 5% de leur poids sec, mettant en évidence la baisse importante de la quantité d'acide ricinoléique produite lorsque l'acyltransférase DGAT2 de R. communis est exprimée. Dans la souche co-exprimant FAH12/DGAT2 de C. purpurea (JMY2517) seulement 5% d'acide ricinoléique a été détectée (environ 5% des lipides totaux). Concernant la souche co-exprimant FAH12/DGAT2 de R. communis (JMY2235) l'accumulation de RA était de 2,5% des lipides totaux (environ 5% de lipides totaux), qui correspond à une diminution de 3 fois par rapport à la souche parentale n'exprimant pas la RcDGAT2 (JMY2231). Toutes les souches exprimant DGAT étaient cependant capables de former du TAG, bien que de l'acide ricinoléique n'ait pas été détectée dans cette fraction. Ces résultats démontrent que la spécificité vis-à-vis de l'acide ricinoléique des DGATs de R. communis et C. purpurea est altérée lorsqu'elles sont exprimées dans Y. lipolytica. Néanmoins, la souche CpFAH12 sur-exprimant l'acyltransférase LRO1 native de Y. lipolytica (JMY2556 [Ura+, Leu-] ou JMY2853 [Ura-, Leu-], le numéro de la souche variant selon les auxotrophies) a accumulé de l'acide ricinoléique jusqu'à 42% de ses lipides totaux, avec une fraction représentant 20% de l'acide ricinoléique total, estérifié en TAG. Cela correspond à une augmentation de 1,4 fois de l'accumulation d'acide ricinoléique par rapport à la souche parentale (JMY2511). L'accumulation de lipides a atteint 13% du poids sec des cellules, correspondant à une augmentation de 2,5 fois par rapport aux souches n'exprimant pas LR01. La quantité d'acide ricinoléique produite a atteint 70011g/mL (ou 63mg/g de poids sec). En accord avec les résultats précédents, dans toutes les souches testées l'oléate hydroxylase est capable de continuer la réaction d'hydroxylation suivant la formation de l'acide linoléique (22%), mais avec un ratio d'hydroxylation sur la désaturation s'élevant à 2:1. La souche JMY2853 a servi comme souche de levure matrice pour la surexpression en multicopie des gènes codant les enzymes CpFAH12 et Y1LR01. Une souche comprenant 3 copies de CpFAHJ2 et 2 copies de l'acyltransferase YlLRO1 a été obtenue (souche JMY3030). Elle produit jusqu'à 53% d'acide ricinoléique en néosynthèse sur un milieu glucose. EXEMPLE II : PRODUCTION D'ACIDE RICINOLÉIQUE PAR LA SOUCHE DE LEVURE Y. LIPOLYTICA JMY3030 EN FERMENTEUR EN MODE FED-BATCH La souche JMY3030 (contenant 3 copies de CpFAH12 et 2 copies de Y1LR01) a été utilisée en fermenteur de 10 L (4 L de volume liquide). En fermenteur, les conditions de culture sont parfaitement contrôlées (régulation du pH, de la température et de l'aération). La quantité de biomasse et donc de cellules productrices est alors améliorée ce qui permet d'augmenter la production de l'acide ricinoléique. La fermentation a été conduite en mode fed-batch, avec du glucose comme source carbonée pour la croissance et de l'acide oléique comme substrat de bioconversion. La culture a été réalisée sur le milieu minimum optimisé pour Yarrowia lipolytica (synthétique), avec ajout d'oligoéléments, de fer et de vitamines, tel que décrit dans la Demande Internationale WO 2007/144445, avec 160 g/L de glucose et 24 g/L d'acide oléique au total et un pH régulé à 6 avec de l'acide orthophosphorique et de l'ammoniac. La culture a été ensemencée à une concentration en biomasse de 0,48g/L et le taux de croissance moyen a été de 0,19 La concentration cellulaire a atteint 90 &cive. Quatre ajouts contrôlés d'acide oléique ont été réalisés, d'abord par ajout d'émulsion d'acide oléique à 20% (v/v) puis d'acide oléique non émulsionné (pur à 80%). La concentration finale d'acide ricinoléique produit est de 12 g/L, avec une pureté de 60% sur les lipides totaux. EXEMPLE III : MODIFICATIONS GENETIQUES DE LA SOUCHE DE LEVURE Y. LIPOLYTICA JMY2853 (JMY2556) POUR AUGMENTER SA PRODUCTION 5 D'ACIDE RICINOLÉIQUE Des gènes susceptibles d'augmenter la néosynthèse de l'acide ricinoléique ont également été identifiés. Ces nouveaux gènes cibles ont fait l'objet de nouvelles constructions de souches à partir de la souche matrice JMY2853. L'insertion des gènes d'intérêt dans le vecteur JMP62-Ura3ex-pTEF est faite par 10 l'amplification des gènes avec les amorces décrites à la Figure 5 dans lesquelles ont été introduites les séquences des enzymes de restriction BamHI et Avril aux extrémités 5' et 3' respectivement. Les plasmides et les produits de PCR sont digérés par les enzymes et ligaturés pour obtenir les vecteurs d'expression. Pour le gène YlACL2 qui contient deux sites de restriction BamHI, des mutations 15 ont été introduites permettant d'éliminer ces sites (voir Figure 6). Les vecteurs d'expression ont été vérifiés par séquençage. Les constructions des autres vecteurs d'expression contenant les gènes Phospholipase A2 (YALIOF10010g), TGL5 (YALIOD16379g), LCAT3 (YALIOC14036g) et LRO2 (YALIOE08206g) ont été réalisées à partir de gènes synthétiques directement 20 synthétisés et clonés (Eurofins). Certaines souches mutantes obtenues présentent des résultats significatifs aussi bien dans la bioconversion de l'acide oléique en acide ricinoléique que dans l'accumulation des lipides produits. Les résultats de ces souches mutantes sont présentés à la Figure 7. EXEMPLE IV : EVOLUTION DE L'OLÉATE DÉSATURASE D'Y. LIPOLYTICA EN 25 OLÉATE HYDROXYLASE De manière à obtenir un microorganisme ne contenant pas de gènes provenant d'une espèce différente, il a été envisagé de transformer la désaturase de Y. lipolytica en hydroxylase. En effet, les hydroxylases et les désaturases sont des enzymes homologues qui appartiennent à la même famille de protéine et qui partagent une forte similarité, tant dans 30 leur séquence que dans leur fonction : toutes deux modifient l'acide oléique (soit en créant une désaturation soit en créant une hydroxylation). Cependant l'hydroxylase de C. purpurea et la désaturase de Y lipolytica venant de deux organismes différents, elles ne partagent que 47% d'acides aminés identiques. Il a donc été choisi de travailler dans un premier temps avec la désaturase de C. purpurea qui possède 86 % d'acides aminés identiques à ceux de son hydroxylase. Ainsi, la différence de fonction entre la désaturase et l'hydroxylase de ce champignon est contenue dans les 14% de séquences divergentes entre ces deux enzymes. Des chimères entre la désaturase de C. purpurea (CpFAD2) et l'hydroxylase de C. 5 purpurea (CpFAH12) ont été construites et exprimées dans la souche pox164dgalAlroltIdga2z1fad24 (notée QPF). La représentation de ces protéines chimères est schématisée à la Figure 8A. Les domaines H2 (acides aminés 189 à 233), H3 (358-434) et H3 Cterm (358-477) de l'hydroxylase CpFAH12 ont été intégrés dans la désaturase (CpFAD2). Ces domaines ont été identifiés comme cruciaux dans la fonction d'hydroxylation de la 10 protéine. Les séquences peptidiques correspondant à ces chimères sont les séquences SEQ ID NO : 49 (H2-hyd), 50 (H2/H3-hyd) et 51 (H2/H3-hyd Cterm). Dans toutes les souches exprimant ces chimères une production d'acide ricinoléique a pu être observée (voir Figure 8B), celle-ci représentant 2% des acides gras pour la souche QPF-H2 hyd, 20% pour la souche QPF-H2/H3 hyd, et 30% pour la souche QPF- 15 H2/H3 hyd Cterm. Cette dernière souche permet de retrouver un niveau d'hydroxylation identique à celui obtenu avec la souche exprimant l'hydroxylase CpFAH12. (29% d' hydroxyl ation). Une exploration plus poussée des résidus d'acide aminé responsables de la fonction d'hydroxylation de l'enzyme a permis d'identifier plus précisément trois positions 20 dans la fonction d'hydroxylation. Une souche exprimant un variant de la désaturase CpFAD2 combinant seulement 3 mutations (CpFAD2 A197G, T1981, et A370C) permet d'obtenir 10% d'hydroxylation contre 29% pour l'hydroxylase CpFAH12. RÉFÉRENCES 25 Bafor M. et al., 1991, Biochem J., 280:507-514 Barth G. and Gaillardin C., 1996 Yarrowia lipolytica, In Nonconventional yeasts in biotechnology, vol. 1, K. Wolf, K.D. Breunig, and G. 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Procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse utile comme souche de levure matrice pour l'obtention d'autres souches mutantes de levure oléagineuse 5 comprenant : (a) l'inhibition de la bêta-oxydation des acides gras dans ladite souche, (b) l'inhibition de l'expression ou de l'activité des acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases endogènes de ladite souche, (c) l'inhibition de l'expression ou de l'activité de l'oléate désaturase endogène de ladite 10 souche, et éventuellement (d) l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'une phospholipide:diacylglycérol acyltransférase endogène de ladite souche. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibition de la bêta-oxydation des acides gras définie à l'étape (a) est obtenue par : 15 - l'inhibition de l'expression ou de l'activité des acyl-CoA oxydases endogènes de ladite souche et/ou - l'inhibition de l'expression ou de l'activité de l'enzyme multifonctionnelle ayant les activités 3 -hydroxyacyl-CoA déshydrogénase et énoyl-CoA hydratase endogène de ladite souche et/ou 20 - l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 3-oxoacyl-CoA thiolase endogène de ladite souche. 3. Procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel, comprenant les étapes (a) à (c) définies à la revendication 1, éventuellement l'étape (d) définie à la revendication 1, et en outre 25 l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité oléate hydroxylase ou oléate époxydase. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la souche mutante de levure appartient au genre choisi parmi Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon ou Yarrowia. 30 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la souche mutante de levure est une souche mutante de Yarrowia lipolytica. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'acide gras oméga-9 inhabituel est l'acide ricinoléique et en ce qu'il comprendl'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité oléate (Al2) hydroxylase. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'enzyme présentant une activité oléate (Al2) hydroxylase est une oléate (Al2) hydroxylase ou une oléate (Al2) désaturase mutée pour qu'elle présente une activité oléate (Al2) hydroxylase. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'oléate (412) hydroxylase est l'oléate (Al2) hydroxylase de Ricinus communis (RcFAH12) ou provient d'un champignon de la division des ascomycètes. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'oléate (Al2) 10 hydroxylase provient d'un champignon de la famille des Clavicipitaceae, de préférence du genre Claviceps et de préférence encore de l'espèce Claviceps purpurea (CpFAH12). 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'oléate (Al2) désaturase mutée provient d'un champignon de la famille des Clavicipitaceae, de préférence du genre Claviceps et de préférence encore de l'espèce Claviceps purpurea (CpFAD2) ou 15 provient d'une levure de la famille des hémiascomycètes, de préférence du genre Yarrowia et de préférence encore de l'espèce Yarrowia lipolytica (Y1FAD2). 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la surexpression dans ladite souche d'une enzyme capable de catalyser la formation du triacylglycérol (TAG) à partir du 1,2-sn-diacylglycérol. 20 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'enzyme capable de catalyser la formation du TAG à partir du 1,2-sn-diacylglycérol est une phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT), de préférence la PDAT endogène de ladite souche. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce 25 qu'il comprend en outre : la surexpression d'une monoacylglycérol acyltransférase et/ou la surexpression d'une patatin-like triacylglycérol lipase et/ou l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche et/ou 30 la surexpression d'au moins une des deux sous-unités d'une ATP citrate lyase et/ou la surexpression d'une diacylglycérol:choline-O phosphotransférase et/ou la surexpression d'une éthanolamine phosphotransférase et/ou la surexpression d'une phospholipase A2 et/ou la surexpression d'une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltranférase et/oula surexpression d'une cytochrome-b5 réductase et/ou la surexpression d'une inositol/phosphatidyl inositol phosphatase et/ou - la surexpression d'une élongase. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que toutes les enzymes surexprimées sont endogènes de ladite souche. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'acide gras oméga-9 inhabituel est l'acide vernolique et en ce qu'il comprend l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité oléate (Al2) époxydase. 16. Souche mutante de levure oléagineuse caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 1 à 15. 17. Utilisation d'une souche mutante de levure susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 3 à 15 pour la production d'un acide gras oméga-9. 18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'acide gras oméga-9 est l'acide ricinoléique et en ce que la souche mutante de levure est susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 6 à 14. 19. Procédé de production d'acide gras oméga-9, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture sur un milieu approprié d'une souche mutante de levure susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 3 à 15. 20. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'acide gras oméga-9 est l'acide ricinoléique et en ce que la souche mutante de levure est susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 6 à 14.25