Brevet FR3002846A1 — publié le 20140912

UTILISATION DE SOUCHES ATTENUEES DE PARASITE POUR LA PREVENTION ET/OU LE TRAITEMENT DE LESIONS OCULAIRES ASSOCIEES A UNE INFECTION PAR TOXOPLASMA GONDIL La présente invention concerne l'utilisation de souches vivantes atténuées de parasite pour la prévention et/ou le traitement de lésions oculaires associées à une infection par Toxoplasma gondii, chez les mammifères et chez l'Homme en particulier. Les apicomplexes sont des parasites protozoaires intracellulaires obligatoires qui possèdent un cycle de vie pouvant faire intervenir plusieurs hôtes. Le phylum de ces parasites se subdivise en plusieurs familles. Toxoplasma gondii (T gondii) appartient à la famille des Sarcocystidae. Ce protozoaire existe sous trois formes infectieuses qui varient en fonction de l'hôte et du stade infectieux : o le tachyzoïte : forme proliférative et infectieuse qui se multiplie de manière asexuée dans les cellules des hôtes intermédiaires (i.e. l'ensemble des homéothermes) et définitifs (i.e. les félidés et le chat en particulier), o le bradyzoïte : forme à division lente et à bas niveau de métabolisme du parasite contenu dans des kystes, o le sporozoïte : forme contenue dans les oocystes, qui résulte de la multiplication sexuée du parasite dans l'intestin des hôtes définitifs (i.e. chat et autres félidés). Le chat, hôte définitif du parasite, s'infecte en ingérant des proies parasitées contenant des kystes (ou des tachyzoïtes si la proie est en phase aigüe de toxoplasmose (Dubey, 2002, 1 Parasitol., 88 : 713-717)), ou par l'ingestion d'oocystes. L'infection du chat conduit à la formation, dans son intestin, de gamétocytes dont la fusion conduit à la formation d' oocystes qui seront ensuite disséminés dans l'environnement, via les féces. Ces oocystes qui renferment les sporozoïtes, sporulent et demeurent très longtemps infectieux dans le milieu extérieur. Leur caractère pathogène persiste au moins un an. Après ingestion d' oocystes par les hôtes définitifs et intermédiaires, les sporozoïtes libérés infectent les entérocytes de l'hôte et se transforment en tachyzoïtes qui se disséminent dans l'organisme. Sous la pression du système immunitaire, le tachyzoïte se transforme en bradyzoïte qui persiste dans des kystes avec un tropisme préférentiel pour le système nerveux central, la rétine et les muscles. L'ingestion de tissus enkystés est la deuxième cause de contamination des hôtes définitifs et intermédiaires. Après ingestion de kystes, les bradyzoïtes sont libérés et infectent les cellules entéro-épithéliales et se transforment en tachyzoïtes, qui se disséminent dans l'organisme de l'hôte et qui, sous la pression du système immunitaire, formeront, de nouveau, des bradyzoïtes intra-kystiques. Les souches de T gondii sont classées sous trois types (Howe et al, 1995, 1 Infect. Dis., 171 : 1561-1566) en fonction de leur degré de virulence in vivo : les souches de Type I (i.e. la souche RH) sont hautement virulentes (Sibley et al, 1992, Nature, 359 : 82-5) alors que les souches de Types II (i.e. les souches ME49, 76K ou Prugniaud) et III (i.e. les souches CEP ou M7741) sont relativement moins virulentes et établissent généralement des infections chroniques (Howe et al., 1997, 1 Clin. Microbiol., 35 : 1411-4). Par ailleurs, de nombreuses souches atypiques non rattachables aux trois premiers types sont identifiées notamment en Afrique et en Amérique du Sud (Darde, 2008, Parasite, 15 : 366-71 ; Rajendran et al, 2011, Infect. Genet. Evol., 12 : 359-68 ; Mercier et al, 2010, PLoS Negl. Trop. Dis., 4 : e876, Ferreira et al., 2006, Infect. Genet. Evol., 6 : 22-31). Toxoplasma gondii est à l'origine d'une maladie infectieuse : la toxoplasmose. Extrêmement répandue, avec plus d'un tiers de la population mondiale infectée, les conséquences de la toxoplasmose peuvent être dramatiques dans deux cas particuliers : (i) chez les femmes enceintes séronégatives puisque le parasite peut franchir la barrière placentaire et infecter le foetus provoquant ainsi un avortement ou de sévères malformations ou de graves troubles psychomoteurs chez le nouveau-né et (ii) chez les personnes immunodéprimées telles que les sujets infectés par le virus VIH chez qui la toxoplasmose, parasitose opportuniste, peut entraîner de graves troubles cérébraux ou cardiaques, létale en absence de traitement. Chez les personnes immunocompétentes, la toxoplasmose est généralement bénigne. Cependant, depuis quelques années, de nombreuses publications décrivent l'impact de cette maladie infectieuse au niveau oculaire. La rétine constitue un site préférentiel d'enkystement du parasite. Ainsi, la toxoplasmose est la cause la plus fréquente d'inflammations intra-oculaires et d'uvéites postérieures chez les individus immunocompétents. Ces inflammations intra-oculaires peuvent entrainer une modification des constituants des fluides oculaires (humeur aqueuse et humeur vitrée) et altérer ainsi la fonction visuelle. La toxoplasmose est également responsable de rétinochoroïdites liées le plus souvent à la réactivation de parasites contenus dans les kystes rétiniens, kystes pouvant résulter : o soit d'une infection congénitale (i.e contractée in utero au cours de la grossesse). L'infection du foetus dans les premières semaines de la grossesse conduit à des lésions oculaires majeures (microphtalmie, cataracte, vastes foyers de rétinochoroïdite). Un suivi ophtalmologique des enfants infectés par T gondii in utero doit être assuré régulièrement durant les sept premières années de vie de l'enfant. Le suivi de signes fonctionnels (i.e. altération de la vision, myodésopsies, scotome) doit immédiatement orienter le praticien vers une réactivation de T gondii caractérisée par une phase multiplicatrice du parasite. o soit d'une infection acquise. L'infection congénitale ne constitue pas l'unique étiologie des toxoplasmoses oculaires. En effet, le rôle des infections d'origine acquise a été démontré dans de nombreux cas de toxoplasmose oculaire, notamment chez plusieurs membres d'une même fratrie ou lorsque la prévalence est élevée dans certaines zones géographiques. Au cours des toxoplasmoses oculaires d'origine acquise, les manifestations oculaires peuvent être concomitantes à la primo-infection ou différées, parfois des années ou des décennies après celle-ci. Le taux de réactivation de T gondii résultant d'une infection d'origine acquise est comparable à celui résultant d'une infection congénitale et quelle que soit leur origine étiologique, les lésions engendrées sur la rétine peuvent entrainer une détérioration ou une perte de la vision si elles se trouvent proche de la macula ou du nerf optique. La prévalence et l'incidence de la toxoplasmose oculaire dépendent fortement de la zone géographique. En France, où, comme en Europe, prédomine les souches de Type II, la prévalence de la toxoplasmose oculaire dans la population n'a pas été évaluée avec certitude mais l'incidence de la maladie serait de 2% des patients infectés et concernerait donc environ 800.000 patients. Dans certaines régions du Monde, et notamment en Amérique du Sud, où prédominent les souches de T gondii de Type I (i.e. les plus virulentes), l'incidence de la toxoplasmose oculaire est nettement plus élevée. Ainsi, dans la région d'Erechim, ville située dans le sud du Brésil, les cicatrices rétinochoroïdiennes toxoplasmiques ont été retrouvées chez 17,7% des sujets examinés et sur une population totale de 2 millions d'habitants, 20.000 personnes ont perdu l'usage d'un oeil et 5.000 personnes sont totalement aveugles (Jones et al, 2006, Emerg Infect Dis, 12: 582-587; Silveira et al., 2009, Expert Rev. Anti infect. Ther. 7: 905908). Le diagnostic de la toxoplasmose oculaire est essentiellement clinique. Lorsque les lésions observées au fond d'oeil sont atypiques, l'analyse sérologique des anticorps anti-T gondii peut être effectuée, non seulement dans le sérum des patients, mais également dans l'humeur aqueuse de l'oeil. Les mesures des taux d'IgG anti-T gondii et des taux d'IgG totales dans ces deux compartiments permettent de déterminer la valeur du coefficient de Desmonts. Ce coefficient correspond au rapport IgG antiT gondii I IgG totales dans l'humeur aqueuse sur le rapport IgG anti-T gondii I IgG totales dans le sang. Lorsque ce rapport est supérieur à 3, on estime qu'il existe une synthèse locale d'anticorps anti-T gondii traduisant une infection intra-oculaire. Lorsque ce rapport est inférieur à 2, la production locale d'anticorps anti-T gondii n'est pas démontrée, sans qu'une toxoplasmose oculaire puisse être éliminée. Une valeur comprise entre 2 et 3 est douteuse pour affirmer une production locale d'anticorps anti- T gondii. Dans les 2 derniers cas, la présence du parasite dans l'humeur aqueuse peut être détectée par l'amplification de l'ADN de T gondii par la technique de Polymerase Chain Reaction. Les traitements actuels (Engstrom et al, 1991, Am. I Ophthalmol., 111 : 601-610) sont basés sur l'utilisation de pyriméthamine ou de sulfadiazine. Ces antiparasitaires ou antibiotiques, en inhibant le métabolisme de l'acide folique, bloquent la synthèse des acides nucléiques du parasite. Ces composés sont actifs sur les tachyzoïtes, mais sont inactifs sur les bradyzoïtes. Le cotrimoxazole et la clindamycine agissent également sur les tachyzoïtes. L'azithromycine possède une action in vitro sur les bradyzoïtes qui se révèle faible in vivo sur cette forme parasitaire. L'atovaquone présente le meilleur potentiel d'action in vivo, tant sur les tachyzoïtes que sur les bradyzoïtes. Ces composés doivent être utilisés à forte concentration pour franchir la barrière hémato-oculaire et atteindre des taux suffisants au niveau de la rétine. De ce fait, ces médicaments peuvent avoir des effets secondaires dramatiques (syndrome de Lyell, agranulocytose, colite pseudo-membraneuse) et nécessitent une supplémentation du patient en folates. L'utilisation de ces composés peut être associée à une corticothérapie. Le but des corticoïdes est de limiter la réaction inflammatoire associée aux rétinochoroïdites d'origine toxoplasmique. La prednisone constitue le corticoïde de référence. L'administration de corticoïdes est toutefois réservée aux patients immunocompétents. Ces composés ne possédant pas d'effet kysticide, ils ne peuvent, par conséquent, pas empêcher la réactivation de T gondii enkysté conduisant aux récidives de la maladie, estimées à 15% à deux ans. Ils ne sont, par conséquent, prescrits que lorsque la fonction visuelle est menacée (atteinte maculaire ou papillaire). Le but du traitement est alors d'activer la cicatrisation des lésions existantes. Les traitements thérapeutiques permettent de limiter les dommages lors d'une réactivation du parasite enkysté mais ne préviennent en aucun cas les réactivations ultérieures. Longtemps sous-estimée, la toxoplasmose oculaire a donc des conséquences graves et cette infection fait maintenant partie des programmes de veilles sanitaires instaurés en France, au Brésil, etc... La mise sur le marché d'un vaccin antitoxoplasmose efficace, limitant par la suite la dissémination du parasite dans les tissus oculaires et les conséquences cliniques de poussées ultérieures est une stratégie intéressante et prometteuse pour limiter l'impact de cette maladie infectieuse (Silveira et al., 2009, Expert Rev. Anti infect. Ther. 7 : 905-908). Il existe par conséquent un réel besoin de mise au point d'agent de prévention et/ou de traitement des lésions oculaires chez un mammifère, notamment un mammifère déjà infecté par T gondii ou un mammifère susceptible d'être infecté par T gondii et de développer une toxoplasmose. Récemment, une souche vaccinale vivante atténuée de T gondii a été mise au point par invalidation de deux gènes codant pour les protéines TgMIC1 et TgMIC3 (EP 1 703 914 B1 et US 7, 964, 185 B2 / Cérède et al, 2005 1 Exp. Med., 201 : 453-63). Cette souche, dénommée Toxo micI-3 KO, génère une réponse immunitaire forte et spécifique contre T gondii et permet de prévenir les effets d'une infection ultérieure chez la souris (Ismaël et al, 2005, 1 Infect. Dis., 194 : 1176-1183) et également chez la brebis (Mevelec et al, 2010, Vet. Res., 41: 49-60). Il a également été démontré que la virulence in vivo n'est que très peu affectée par l'inactivation isolée de TgMIC1 ou de TgMIC3 ; en revanche, elle est fortement diminuée par l'inactivation simultanée des deux protéines, mettant en évidence le rôle synergique des deux protéines (Cérède et al, 2005 1 Exp. Med., 201 : 453-63). Un des buts de l'invention est de fournir un agent permettant de réduire, au niveau de l'oeil, chez un mammifère, l'inflammation consécutive à une infection par T gondii. Un autre but de l'invention est de réduire la réaction inflammatoire se produisant dans l'oeil au moment de la réactivation de T gondii chez un mammifère déjà infecté 10 par T gondii. Un autre but de l'invention est de fournir un agent permettant de réduire le nombre de kystes, notamment intra-rétiniens, permettant ainsi la prévention de lésions oculaires liées à la réactivation de T gondii. Encore un autre but de l'invention est de fournir un vaccin contre les lésions 15 oculaires engendrées par T gondii. La présente invention a pour objet des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement, chez un mammifère, des lésions oculaires associées à une infection par un apicomplexe de la 20 famille des Sarcocystidae. La présente invention a pour objet des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement, chez un mammifère, des lésions oculaires associées à une infection par un apicomplexe de la famille des Sarcocystidae, lesdites souches possédant une virulence atténuée par rapport 25 à une souche virulente de T .gondii de type RH. La présente invention a pour objet des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement, chez un mammifère, des lésions oculaires associées à une infection par un apicomplexe de la famille des Sarcocystidae, lesdites souches possédant une virulence atténuée par rapport 30 à une souche virulente, c'est-à-dire une souche ayant une virulence substantiellement identique à la virulence de la souche à partir de laquelle la souche de virulence atténuée a été obtenue. Par « prévention », on désigne la prophylaxie ayant pour but d'empêcher l'apparition ou la propagation d'une maladie. Il s'agit notamment de protéger un individu prédisposé à la contraction et au développement des lésions oculaires associées à une infection par un apicomplexe de la famille des Sarcocystidae. Il s'agit notamment de protéger un mammifère exposé à un risque de contamination par son environnement. Par « traitement », on désigne non seulement l'inhibition de la progression de la pathologie, mais également l'atténuation, voire la disparition, des symptômes liés à cette pathologie. Le traitement a pour but de réduire l'amplitude des symptômes jusqu'à leur disparition complète permettant à l'individu de retrouver un état physiologique normal. Par « mammifère », on désigne les êtres humains, les animaux de compagnie et les animaux de rentes ou d'élevage, lesquels présentent un intérêt économique et commercial pour les industries agroalimentaires. Par « souches de Toxoplasma gondii », on désigne des souches de Toxoplasma gondii qui possèdent une virulence atténuée, inférieure à la virulence des souches de T .gondii de type RH dont elles dérivent, mais qui conservent néanmoins un pouvoir immunogène identique à celui des souches de T gondii de type RH afin de pouvoir les utiliser dans la prévention ou le traitement d'une pathologie associée à une infection par un apicomplexe de la famille des Sarcocystidae. Cette virulence atténuée peut résulter de l'invalidation d'au moins un gène lié à la virulence du parasite. Cette invalidation génique peut survenir lors d'un processus naturel d'évolution de l'espèce ou être réalisée in vitro par les techniques de biologie moléculaire bien connues de l'Homme de l'Art. Dans le premier cas, l'invalidation génique survient au hasard du génome alors que dans l'autre cas, l'invalidation génique est ciblée sur un ou plusieurs gènes spécifiques. Qu'elle soit d'origine naturelle ou bien consécutive de la main de l'Homme, cette invalidation génique aboutit à l'absence d'expression de la protéine codée par le ou les gènes invalidés ou à l'expression d'une ou de plusieurs protéines non fonctionnelles. La modification in vitro du patrimoine génétique de Toxoplasma gondii confère à la souche un caractère de mutant, par opposition à la souche sauvage dont elle dérive. Les souches sauvages de parasites ont non seulement un potentiel immunogène mais sont également virulentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables d'induire une pathologie associée à Toxoplasma gondii (i.e. la toxoplasmose), rendant leur utilisation impropre dans le cadre de la présente invention. Par « pathologies associées à une infection par un apicomplexe de la famille des Sarcocystidae », on désigne les maladies résultant d'une infection par un protozoaire appartenant au phylum des apicomplexes, et en particulier des parasites appartenant à la famille des sarcocystidae qui comporte le genre Toxoplasma. Selon un mode de réalisation particulier, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, ledit mammifère est un être humain ou un animal. Selon un autre mode de réalisation, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, lesdites souches de Toxoplasma gondii possèdent au moins une adhésine MIC-1 et/ou une adhésine MIC-3 inactivée par une modification génique portant sur l'un au moins des gènes mic-1 et/ou mic-3. Selon un autre mode de réalisation particulier, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, lesdites souches de Toxoplasma gondii possèdent au moins une adhésine MIC-1 et/ou une adhésine MIC-3 inactivée par la délétion d'au moins un des gènes mic-1 et/ou mic-3. Par « une adhésine MIC-1 et/ou une adhésine MIC-3 », on désigne les protéines des micronèmes, également appelées adhésines, MIC-1 et/ou MIC-3 qui jouent un rôle dans la mobilité, la migration ou l'invasion cellulaire des parasites du phylum des apicomplexes chez son hôte. Ces protéines possèdent des modules de liaisons qui leur permettent de se fixer sur les cellules de l'hôte. Par « une adhésine inactivée », on désigne une adhésine dont la fonction ne peut plus être assurée au sein de la cellule. Une adhésine est inactivée lorsqu'elle n'est pas produite ou lorsqu'elle est produite mais ne possède pas d'activité fonctionnelle. L'inactivation peut également être la conséquence de modifications posttraductionnelles inopérantes ou insuffisantes (i.e. glycosylation, isoprénylation, phosphorylation, sulfatation, amidation, acétylation, alkylation) de l'adhésine qui ne lui permettent pas d'assurer sa fonction. L'inactivation d'une adhésine peut également être obtenue de manière indirecte en altérant ou en supprimant l'expression d'une ou plusieurs autres protéines (notamment d'autres adhésines) qui se lient à l'adhésine pour former un complexe fonctionnel. La déstructuration d'un tel complexe entraine une perte de fonction de l'adhésine. Par « modification génique », on désigne toute mutation réalisée dans la séquence nucléique d'un gène aboutissant à l'absence d'expression de la protéine codée par ce gène ou aboutissant à l'expression d'une forme non fonctionnelle de la protéine codée par ce gène. Cette opération nécessite l'intervention de la main de l'Homme de l'art lorsqu'elle est opérée in vitro. Cette mutation peut consister en la délétion de tout ou partie du gène, ou de sa région codante, ou de sa région promotrice, en l'insertion ou la substitution de nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène. Par « gène mic-1 », on désigne le gène codant pour la protéine des micronèmes MIC-1, également appelée adhésine MIC-1. Cette protéine contient plusieurs modules dont des domaines de liaison qui lient spécifiquement le lactose. La protéine MIC-1 est également capable de se lier à la surface des cellules hôtes. Par « gène mic-3 », on désigne le gène codant pour la protéine des micronèmes MIC-3, également appelée adhésine MIC-3. Cette protéine s'homodimérise pour former un complexe de 90 kDa. MIC-3 comporte des domaines de type EGF et un domaine de type lectine. La protéine MIC-3 est également capable de se lier à la surface des cellules hôtes. Selon encore un autre mode de réalisation, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, lesdites souches de Toxoplasma gondii possèdent les deux adhésines MIC-1 et MIC-3 inactivées par une modification génique portant sur les deux gènes mic-1 et mic-3. Selon encore un autre mode de réalisation particulier, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, lesdites souches de Toxoplasma gondii possèdent les deux adhésines MIC-1 et MIC-3 inactivées par la délétion des deux gènes mic-1 et mic-3. Par « modification génique portant sur les deux gènes mic-1 et mic-3 », on désigne la mutation réalisée dans la séquence nucléique du gène mic-1 et dans celle du gène mic-3. Cette double mutation aboutit à l'absence d'expression des protéines MIC-1 et MIC-3 ou aboutit à l'expression d'une forme non fonctionnelle des protéines MIC-1 et MIC-3. Cette souche mutante de Toxoplasma gondii est appelée Toxo mic1-3 KO et possède une virulence très atténuée en comparaison avec les souches sauvages de T gondii de type RH dont elle dérive. Les souches Toxo mic1-3 KO conservent toutefois un fort pouvoir immunogène. La construction détaillée de la souche Toxo mic1-3 KO est décrite dans les documents Cérède et al, 2005 1 Exp. Med, 201 : 453-63, US 7,946, 185 B2 et EP 1 703 914 Bi. Les souches Toxo mic1-3 KO ont conservé leur capacité à coloniser les tissus cibles sans qu'il y ait développement d'un quelconque phénomène pathogène consécutif à l'administration desdites souches à un mammifère. L'invalidation des gènes mic/ et mic3 n'altère en aucune manière le potentiel immunogène de ces souches, mais réduit considérablement leur virulence par rapport à une souche virulente, c'est-à-dire une souche ayant une virulence substantiellement identique à la virulence de la souche à partir de laquelle la souche de virulence atténuée a été obtenue. Selon un autre mode de réalisation, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, ledit apicomplexe de la famille des Sarcocystidae est Toxoplasma gondii. Par « Toxoplasma gondii », on désigne les protozoaires du phylum des apicomplexes capables de provoquer des malformations congénitales ou des fausses couches chez la plupart des mammifères homéothermes et des oiseaux. Ces parasites sont notamment capables de provoquer la toxoplasmose chez l'Homme, le porc, la brebis, les rongeurs ou tout mammifère qu'il possède un système immunitaire mature ou déficient. Selon un autre mode de réalisation, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, lesdites lésions oculaires appartiennent au groupe comprenant ou constitué des inflammations intra- oculaires, des uvéites, des hyalites ou des rétinochoroïdites. Par « inflammations intra-oculaires », on désigne toute sécrétion de cytokines et de chimiokines participant à la réponse immunitaire et tout recrutement ou activation des cellules du système immunitaires contenu dans l'oeil. Par « uvéites », on désigne l'inflammation de l'uvée, un complexe vascularisé permettant de nourrir l'oeil et qui comprend l'iris, le corps ciliaire (élément anatomique auquel sont reliés les ligaments retenant le cristallin) et la choroïde. Cette inflammation peut être provoquée par un virus, une bactérie ou un parasite ou être due à une maladie auto-immune. L'uvéite peut être antérieure, intermédiaire ou postérieure en fonction des compartiments de l'oeil qu'elle affecte. L'uvéite peut être douloureuse ou non et associée à une baisse d'acuité visuelle. L'oeil peut apparaitre rouge avec notamment, un larmoiement ou une photophobie. Par « hyalites », on désigne l'inflammation du vitré de l'oeil qui correspond à une uvéite intermédiaire. Par « rétinochoroïdites », on désigne des entités cliniques qui comprennent toute lésion du complexe rétine-choroïde. Toujours inflammatoires, elles peuvent être d'origine infectieuse ou auto-immune. Les rétinochoroïdites correspondent donc à une inflammation de l'uvée postérieure, c'est-à-dire de la rétine et de la choroïde. Selon un mode de réalisation plus particulier, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, lesdites lésions oculaires sont consécutives à une primo-infection dudit mammifère par T gondii. Par « primo-infection », on désigne la première mise en contact dudit mammifère avec le parasite T gondii. Cette primo-infection conduit à une réponse immunitaire caractérisée notamment par la production d'anticorps anti-T gondii et par l'activation d'une réponse immunitaire cellulaire dirigée spécifiquement contre T gondii. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, lesdites lésions oculaires sont consécutives à une réactivation de la forme asexuée de T gondii. Par « réactivation de la forme asexuée de T gondii », on désigne la conversion des bradyzoïtes de T gondii en tachyzoïtes et à la libération de ces derniers après rupture du kyste, induisant ainsi une contamination des cellules. La réactivation de T gondii peut être consécutive à une déficience du système immunitaire du mammifère infecté. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, lesdites lésions oculaires sont consécutives à une primo-infection dudit mammifère par T gondii et à une réactivation de la forme asexuée de T gondii. Selon un mode de réalisation particulier, dans l'utilisation selon la présente invention des souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel, lesdites souches sont mises en contact avec ledit mammifère à raison de 100 à 108 tachyzoïtes. Par « tachyzoïte », on désigne la forme de réplication rapide et asexuée de Toxoplasma gondii. Le tachyzoïte a une taille de 5-8 x 2-3 i.tm. La partie apicale du parasite comporte des conoïdes qui participent à la pénétration du parasite dans la cellule hôte. Les micronèmes, les rhoptries et les granules denses constituent les trois organelles majeures du tachyzoïte qui comporte également un noyau, un apicoplaste, un appareil de Golgi, un réticulum endoplasmique et un organite proche de la mitochondrie. La dose efficace de tachyzoïtes en vue du traitement prophylactique des mammifères permet de limiter l'infection ou la transmission de l'agent pathogène responsable de la toxoplasmose. Un autre but est d'empêcher l'apparition de nouvelles lésions intra-oculaires lors de réactivations du parasite enkysté. Un tel traitement pourra être adapté et/ou répété autant de fois que nécessaire par l'Homme de l'Art, en fonction de l'âge et du statut immunologique du mammifère. La mise en contact des tachyzoïtes avec le mammifère est réalisable non seulement sur un mammifère présentant les symptômes inhérents à la toxoplasmose, mais également sur un mammifère ne présentant aucun de ces symptômes mais qui présente un risque d'infection par des souches virulentes de Toxoplasma gondii susceptible d'induire la toxoplasmose et donc ces symptômes. Selon un mode de réalisation particulier, les souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon la présente invention se trouvent sous une forme galénique choisie parmi le groupe comprenant ou constitué par des suspensions liquides, des dispersions solides ou liquides, des poudres, des pâtes ou des lyophilisats. La forme galénique est adaptée par l'Homme de l'Art en fonction du mode d'administration choisi. Tous les modes classiques d'administration peuvent être envisagés : par voie entérale (per os par exemple) par voie parentérale (injection intraveineuse, intramusculaire ou intra-péritonéale par exemple) ou par pulvérisation intra-nasale. Selon un mode de réalisation plus particulier, les souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon la présente invention peuvent être associées à, au moins un autre antigène, au moins un adjuvant, au moins un stabilisant, au moins un conservateur, au moins un vecteur ou un mélange de ces produits permettant de stimuler et d' accroitre la réponse immunitaire dudit mammifère. Par « antigène », on désigne toute protéine naturelle ou recombinante, sous sa forme native ou mutée, issue d'un parasite ou d'un agent pathogène autre que Toxoplasma gondii capable d'induire chez un mammifère une réponse immunitaire cellulaire ou humorale. Le but de l'association de la souche mutante de Toxoplasma gondii avec un tel antigène est d'amplifier la réponse immunitaire du mammifère et de lui conférer ainsi une meilleure protection vis-à-vis d'une infection à apicomplexe. Par « adjuvant », on désigne toute substance capable de renforcer et prolonger la réponse immunitaire dirigée contre l'antigène ciblé. Le mécanisme mis en jeu afin de rendre la réponse immunitaire plus efficace est dépendant de l'adjuvant utilisé. Les adjuvants sont des substances bien connues de l'Homme de l'Art parmi lesquelles figurent notamment les sels d'aluminium, le squalène, les saponines, les constituants ou les toxines bactériennes, ou encore certaines protéines (peptone, albumine, caséine). Par « stabilisant ou conservateurs », on désigne les composés permettant une parfaite conservation des souches de Toxoplasma gondii dans leur conditionnement. Le but de ces composés est de garantir la viabilité des souches de T gondii. Les stabilisants ou conservateurs sont des substances bien connues de l'Homme de l'Art parmi lesquelles figurent notamment, les hydrates de carbone (sorbitol, mannitol, lactose, saccharose, glucose, dextran, tréhalose), les solvants organiques polaires tels que le DMSO (diméthylsulfoxyde), les polysorbates. Par « vecteur » on désigne une entité utilisée pour faire pénétrer un gène d'intérêt dans une cellule. Les vecteurs sont des substances bien connues de l'Homme de l'Art parmi lesquelles figurent notamment les nanoparticules, les ISCOMs (i.e. « immune stimulatory complexes »), etc... Par « accroître la réponse immunitaire », on désigne l'activation des différentes voies du système immunitaire du mammifère par la combinaison constituée par la souche mutante de T gondii avec un second antigène. Il s'agit d'activer la réponse immunitaire innée par le biais d'un accroissement de la synthèse de cytokines de catégories distinctes comme les interférons ou les interleukines. L'interleukine-12 (IL-12) est capable de stimuler les cellules Natural Killer (NK). Les cellules ainsi stimulées vont sécréter de l'interféron-y (IFN-y) qui joue un rôle majeur dans la protection contre les parasites intracellulaires tels que T gondii. Chez un mammifère adulte possédant un système immunitaire mature et compétent, la réponse immunitaire repose sur une immunité adaptative (prolifération spécifique en réponse aux antigènes étrangers par des lymphocytes T CD4+ et CD8+) en plus de la réponse innée. Selon un autre mode de réalisation particulier, les souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon la présente invention peuvent être associées à au moins un composé antiparasitaire ou un antibiotique choisi dans le groupe comprenant ou constitué de la pyriméthamine, la sulfadiazine, le cotrimoxazole, la clindamycine, l'azithromycine ou l'atovaquone. Selon un autre mode de réalisation plus particulier, les souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon la présente invention peuvent être associées à au moins un composé antiparasitaire ou un antibiotique choisi dans le groupe comprenant ou constitué de la pyriméthamine, la sulfadiazine, le cotrimoxazole, la clindamycine, l'azithromycine ou l'atovaquone et, à un corticoïde. La présente invention concerne également une méthode pour prévenir l'apparition et/ou traiter, chez un mammifère, les lésions oculaires provoquées par un ou plusieurs apicomplexes de la famille des Sarcocystidae comprenant une étape d'administration de tachyzoïtes d'une souche ou de plusieurs souches mutantes de Toxoplasma gondii de virulence atténuée audit mammifère permettant de réduire le nombre de lésions oculaires. Selon un mode de réalisation particulier, dans la méthode selon la présente invention, les souches mutantes de Toxoplasma gondii possèdent au moins une adhésine MIC-1 ou une adhésine MIC-3 inactivée par une modification génique portant sur l'un au moins des gènes mic-1 ou mic-3. Selon un mode de réalisation plus particulier, dans la méthode selon la présente invention, les souches mutantes de Toxoplasma gondii possèdent au moins une adhésine MIC-1 et/ou une adhésine MIC-3 inactivée par la délétion d'au moins un des gènes mie- 1 et/ou mic-3. Selon un autre mode de réalisation particulier, dans la méthode selon la présente invention, les souches mutantes de Toxoplasma gondii possèdent les deux adhésines MIC-1 et MIC-3 inactivées par une modification génique portant sur les deux gènes mic-1 et mic-3. Selon un autre mode de réalisation plus particulier, dans la méthode selon la présente invention, les souches mutantes de Toxoplasma gondii possèdent les deux adhésines MIC-1 et MIC-3 inactivées par la délétion des deux gènes mic-1 et mic-3. Selon un autre mode de réalisation particulier, dans la méthode selon la présente invention, le mammifère est un être humain ou un animal. Chez un mammifère non vacciné selon la méthode de la présente invention, une infection d'épreuve conduit à la synthèse intraoculaire élevée d'IFN-y. La méthode selon la présente invention inhibe cette synthèse intraoculaire d'IFN-y résultant de l'infection d'épreuve. La présente invention concerne également une méthode pour prévenir l'apparition et/ou traiter, chez un mammifère, l'inflammation intra-oculaire provoquée par un ou plusieurs apicomplexes de la famille des Sarcocystidae comprenant une étape d'administration de tachyzoïtes d'une souche ou plusieurs souches mutantes de Toxoplasma gondii de virulence atténuée audit mammifère. Selon un autre mode de réalisation plus particulier, dans la méthode selon la présente invention, l'administration de tachyzoïtes d'une souche ou de plusieurs souches mutantes de Toxoplasma gondii est effectuée par voie entérale ou par voie parentérale. Les figures et les exemples suivants sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de la présente invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Description des figures Figure lA : signes cliniques ophtalmologiques chez la souris Swiss Webster (0F1) 4 semaines après l'infection d'épreuve. La détermination des signes cliniques ophtalmologiques est réalisée sous loupe binoculaire sur chaque oeil de chacune des souris 4 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Les souris ont été vaccinées avec 100 tachyzoites de la souche Toxo mic1-3 KO 4 semaines avant l'infection d'épreuve (colonne noire) ou non (colonne grise). - en abscisse : o (a) lésions oculaires de type uvéites/hyalites, o (b) lésions oculaires de type hémorragiques, o (c) lésions oculaires de type taies cornéennes, o (d) lésions oculaires de type cataractes. - en ordonnée : pourcentage d'yeux présentant des lésions. Figure 1B : signes cliniques ophtalmologiques chez la souris Swiss Webster (0F1) 8 semaines après l'infection d'épreuve. La détermination des signes cliniques ophtalmologiques est réalisée sous loupe binoculaire sur chaque oeil de chacune des souris 8 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Les souris ont été vaccinées avec 100 tachyzoites de la souche Toxo mic1-3 KO 4 semaines avant l'infection d'épreuve (colonne noire) ou non (colonne grise). - en abscisse : o (a) lésions oculaires de type uvéites/hyalites, o (b) lésions oculaires de type hémorragiques, o (c) lésions oculaires de type taies cornéennes, o (d) lésions oculaires de type cataractes. - en ordonnée : pourcentage d'yeux présentant des lésions. Figure 1C : signes cliniques ophtalmologiques chez la souris Swiss Webster (0F1) 12 semaines après l'infection d'épreuve. La détermination des signes cliniques ophtalmologiques est réalisée sous loupe binoculaire sur chaque oeil de chacune des souris 12 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Les souris ont été vaccinées avec 100 tachyzoites de la souche Toxo mic1-3 KO 4 semaines avant l'infection d'épreuve (colonne noire) ou non (colonne grise). - en abscisse : o (a) lésions oculaires de type uvéites/hyalites, o (b) lésions oculaires de type hémorragiques, o (c) lésions oculaires de type taies cornéennes, o (d) lésions oculaires de type cataractes. - en ordonnée : pourcentage d'yeux présentant des lésions. Figure 2A: évaluation du nombre de kystes intracérébraux chez la souris Swiss 10 Webster (OH) 4 semaines après l'infection d'épreuve. Le comptage du nombre de kystes intracérébraux a été réalisé à partir d'un broyat de cerveau de souris, 4 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente une souris. Huit à dix comptages sont effectués sur 10 !AL de ce broyat à l'aide d'un 15 microscope binoculaire sur cellules de Malassez. La moyenne est ensuite calculée et rapportée à l'ensemble du volume initial pour évaluer le nombre de kystes intracérébraux. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (0F1) : - lot (i) : souris ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO 20 par voie intrapéritonéale puis infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (carrés noirs), - lot (ii) : souris uniquement infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (ronds noirs). - en ordonnée : nombre de kystes intracérébraux. 25 Figure 2B: évaluation du nombre de kystes intracérébraux chez la souris Swiss Webster (OH) 8 semaines après l'infection d'épreuve. Le comptage du nombre de kystes intracérébraux a été réalisé à partir d'un broyat de cerveau de souris, 8 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente 30 une souris. Huit à dix comptages sont effectués sur 10 [1.1_, de ce broyat à l'aide d'un microscope loupe binoculaire sur cellules de Malassez. La moyenne est ensuite calculée et rapportée à l'ensemble du volume initial pour évaluer le nombre de kystes intracérébraux. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (0F1) : - lot (i) : souris ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO par voie intrapéritonéale puis infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (carrés noirs), - lot (ii) : souris uniquement infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (ronds noirs). - en ordonnée : nombre de kystes intracérébraux. Figure 2C: évaluation du nombre de kystes intracérébraux chez la souris Swiss Webster (0F1) 12 semaines après l'infection d'épreuve. Le comptage du nombre de kystes intracérébraux a été réalisé à partir d'un broyat de cerveau de souris, 12 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente une souris. Huit à dix comptages sont effectués sur 10 !AL de ce broyat à l'aide d'un microscope loupe binoculaire sur cellules de Malassez. La moyenne est ensuite calculée et rapportée à l'ensemble du volume initial pour évaluer le nombre de kystes intracérébraux. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (0F1) : - lot (i) : souris ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO par voie intrapéritonéale puis infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (carrés noirs), - lot (ii) : souris uniquement infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (ronds noirs). - en ordonnée : nombre de kystes intracérébraux. Figure 3A: évaluation du nombre de kystes intra-rétiniens chez la souris Swiss Webster (0F1) 4 semaines après l'infection d'épreuve. Le comptage du nombre de kystes intra-rétiniens a été réalisé sur le complexe rétine-choroïde des yeux énucléés des souris 4 semaines après que les souris aient été 30 infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente une souris. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (0F1) : - lot (i) : souris ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic/- 3 KO par voie intrapéritonéale puis infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (carrés noirs), - lot (ii) : souris uniquement infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (ronds noirs). - en ordonnée : nombre de kystes intra-rétiniens. Figure 3B : évaluation du nombre de kystes intra-rétiniens chez la souris Swiss Webster (0F1) 8 semaines après l'infection d'épreuve. Le comptage du nombre de kystes intra-rétiniens a été réalisé sur le complexe rétine-choroïde des yeux énucléés des souris 8 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente une souris. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (OF 1) : - lot (i) : souris ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic/- 3 KO par voie intrapéritonéale puis infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (carrés noirs), - lot (ii) : souris uniquement infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (ronds noirs). - en ordonnée : nombre de kystes intra-rétiniens. Figure 3C: évaluation du nombre de kystes intra-rétiniens chez la souris Swiss Webster (0F1) 12 semaines après l'infection d'épreuve. Le comptage du nombre de kystes intra-rétiniens a été réalisé sur le complexe rétine-choroïde des yeux énucléés des souris 12 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente une souris. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (OF 1) : - lot (i) : souris ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic/- 3 KO par voie intrapéritonéale puis infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (carrés noirs), - lot (ii) : souris uniquement infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (ronds noirs). - en ordonnée : nombre de kystes intra-rétiniens. Figure 4A: dosage de l'IFN-y dans l'humeur aqueuse de souris Swiss Webster (0F1) 4 semaines après le début de l'infection d'épreuve. Le dosage de l'interféron gamma (IFN-y) dans l'humeur aqueuse a été réalisé 4 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente une souris. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (0F1) - lot (i) : souris ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO par voie intrapéritonéale puis infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (carrés noirs), - lot (ii) : souris uniquement infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (ronds noirs). - en ordonnée : concentration en IFN-y en pg/mL. Figure 4B: dosage de l'IFN-y dans l'humeur aqueuse de souris Swiss Webster (0F1) 8 semaines après le début de l'infection d'épreuve. Le dosage de l'interféron gamma (IFN-y) dans l'humeur aqueuse a été réalisé 8 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente une souris. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (0F1) - lot (i) : souris ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO par voie intrapéritonéale puis infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (carrés noirs), - lot (ii) : souris uniquement infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (ronds noirs). - en ordonnée : concentration en IFN-y en pg/mL. Figure 4C: dosage de l'IFN-y dans l'humeur aqueuse de souris Swiss Webster (0F1) 12 semaines après le début de l'infection d'épreuve. Le dosage de l'interféron gamma (IFN-y) dans l'humeur aqueuse a été réalisé 12 semaines après que les souris aient été infectées par voie orale avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente une souris. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (0F1) - lot (i) : souris ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO par voie intrapéritonéale puis infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (carrés noirs), - lot (ii) : souris uniquement infectées par 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii (ronds noirs). - en ordonnée : concentration en IFN-y en pg/mL. Figure 5A: signes cliniques ophtalmologiques chez le souriceau Swiss Webster (OH) âgé de 4 semaines et infecté in utero par Toxoplasma gondii. La détermination des signes cliniques ophtalmologiques chez le souriceau âgé de 4 semaines et infecté in utero par Toxoplasma gondii est réalisée à l'aide d'une loupe binoculaire sous anesthésie générale par inhalation d'isoflurane gazeux à 2,5% (oxygène à 3L/min). Afin d'évaluer l'inflammation, la cotation suivante est utilisée : - Stade 0 : pas d'inflammation, - Stade 1 : Tyndall en chambre antérieure ou vitréen modéré, - Stade 2: Tyndall en chambre antérieure ou vitréen sévère et/ou dilatation des vaisseaux iriens et/ou conjonctivo-scléraux, - Stade 3 : Trouble cornéen et précipités rétro-cornéens et/ou hyalite très sévère, - Stade 4 : Cataracte secondaire. Chaque point représente le stade clinique cumulé pour un souriceau (stade clinique cumulé étant la somme des stades cliniques des 2 yeux par souriceau). - en abscisse : lots de souriceaux Swiss Webster (0F1) : o lot (i) : souriceaux nés de mères ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO par voie intra-péritonéale puis infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (ronds noirs), o lot (ii) : souriceaux nés de mères non vaccinées et non infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (carrés noirs), o lot (iii) : souriceaux nés de mères ayant uniquement été infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (triangles noirs). - en ordonnée : stade clinique cumulé. Figure 5B : signes cliniques ophtalmologiques chez le souriceau Swiss Webster (OH) âgé de 8 semaines et infecté in utero par Toxoplasma gondii. La détermination des signes cliniques ophtalmologiques chez le souriceau âgé de 8 semaines infecté in utero par Toxoplasma gondii est réalisée post-mortem à l'aide d'une loupe binoculaire. Afin d'évaluer l'inflammation, la cotation suivante est utilisée : - Stade 0 : pas d'inflammation, - Stade 1 : Tyndall en chambre antérieure ou vitréen modéré, - Stade 2: Tyndall en chambre antérieure ou vitréen sévère et/ou dilatation des vaisseaux iriens et/ou conjonctivo-scléraux, - Stade 3 : Trouble cornéen et précipités rétro-cornéens et/ou hyalite très sévère, - Stade 4 : Cataracte secondaire. Chaque point représente le stade clinique cumulé pour un souriceau (stade clinique cumulé étant la somme des stades cliniques des 2 yeux par souriceau). - en abscisse : lots de souriceaux Swiss Webster (0F1) : o lot (i) : souriceaux nés de mères ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO par voie intra-péritonéale puis infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (ronds noirs), o lot (ii) : souriceaux nés de mères non vaccinées et non infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (carrés noirs), o lot (iii) : souriceaux nés de mères ayant uniquement été infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (triangles noirs). - en ordonnée : stade clinique cumulé. Figure 6 : évaluation du nombre de kystes intracérébraux chez le souriceau Swiss Webster (OH) âgé de 8 semaines et infecté in utero par Toxoplasma gondii. Le comptage du nombre de kystes intracérébraux a été réalisé à partir d'un broyat de cerveau de souriceaux âgés de 8 semaines et dont les mères ont été infectées ou non à J12 gestation avec 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Huit à dix comptages sont effectués sur 10 [1.1_, de ce broyat à l'aide d'une loupe binoculaire sur cellules de Malassez. La moyenne est ensuite calculée et rapportée à l'ensemble du volume initial pour évaluer le nombre de kystes intracérébraux. Chaque point représente un souriceau. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (0F1) : o lot (i) : souriceaux nés de mères ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO par voie intra-péritonéale puis infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (ronds noirs), o lot (ii) : souriceaux nés de mères non vaccinées et non infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (carrés noirs), o lot (iii) : souriceaux nés de mères ayant été uniquement infectées par kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (triangles noirs). - en ordonnée : nombre de kystes intracérébraux. Figure 7 : évaluation du nombre de kystes intra-rétiniens chez le souriceau Swiss 15 Webster (OH) âgé de 8 semaines et infecté in utero par Toxoplasma gondii. Le comptage du nombre de kystes intra-rétiniens a été réalisé sur le complexe rétine-choroïde des yeux énuclées des souriceaux âgés de 8 semaines et dont les mères ont été infectées ou non à J12 de gestation par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii. Chaque point représente un souriceau. - en abscisse : lots de souris Swiss Webster (0F1) : o lot (i) : souriceaux nés de mères ayant reçu 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO par voie intrapéritonéale puis infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (ronds noirs), o lot (ii) : souriceaux nés de mères non vaccinées et non infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (carrés noirs), o lot (iii) : souriceaux nés de mères ayant uniquement été infectées par 15 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii à J12 de gestation (triangles noirs). - en ordonnée : nombre de kystes intra-rétiniens. Exemple 1 : Efficacité de la souche Toxo mic1-3 KO dans la prévention de la toxoplasmose dans un modèle murin de toxoplasmose oculaire chronique 1 - Protocole expérimental 1.1 - Animaux La vaccination est réalisée sur des souris Swiss Webster (0F1), non consanguines, femelles, âgées de 8 semaines provenant du centre d'élevage Janvier (Le Genest-Saint-Isle, France). Les souris sont maintenues tout au long de l'expérimentation en animalerie de niveau de confinement 2 afin de limiter au mieux le risque de contamination externe. 1.2 - Souche de T. gondii 1.2.1 - Souche Toxo mic1-3 KO La souche mutante de Toxoplasma gondii, Toxo mic1-3 KO, dont les gènes codant pour les protéines MIC1 et MIC3 ont été invalidés, est entretenue par passages successifs sur une lignée de fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivée dans du milieu DMEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) auquel est ajouté du sérum de veau foetal 10%, 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Après lyse du tapis cellulaire, les tachyzoïtes sont récupérés dans le surnageant puis dénombrés sur cellule de Malassez. La concentration est ensuite ajustée pour 20 obtenir une dose finale de 100 tachyzoïtes dans 200 pL de milieu DMEM, correspondant à la dose vaccinale par souris. 1.2.2 - Souche RH La souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, dont est dérivée la souche Toxo mic1-3 KO, est également entretenue par passages successifs sur une lignée de 25 fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivés dans du milieu DMEM auquel est ajouté du sérum de veau foetal 10%, 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Pour la préparation de l'extrait parasitaire total, les tachyzoïtes de la souche RH sont lavés, soniques deux fois à 60 watt/s durant 10 min dans la glace et centrifugés à 30 2000 g pendant 30 min à +4°C. Le surnageant est récupéré et la concentration est déterminée par un kit de dosage (dosage BCA) qui utilise comme standard de la Sérum Albumine Bovine (SAB). Les aliquots sont conservés à -20°C. 1.2.3 - Souche 76K La souche 76K de Type II est utilisée pour l'infection d'épreuve des souris. Cette souche est conservée sous forme de kystes par passages continus sur souris CBA/J par gavage (souris cycle). La veille de l'infection d'épreuve, une souris cycle, infectée au minimum deux mois auparavant par des kystes de la souche 76K, est sacrifiée par dislocation cervicale. Les cerveaux des souris sont récupérés après badigeon à l'alcool du pelage de la tête de l'animal. Une incision cutanée aux ciseaux est réalisée au niveau d'une ligne nucale rétro-auriculaire. Le scalp est ensuite antéversé et deux craniotomies débutant au niveau du trou occipital jusqu'aux os frontaux sont effectuées. La voute crânienne est alors retirée et le cerveau est prélevé dans son intégralité. Le cerveau est ensuite broyé dans 5 mL de milieu RPMI dans un potter. Le broyat est laissé une nuit à +4°C. Après dénombrement des kystes sur cellule de Malassez, la concentration est ajustée pour obtenir des doses d'infection de 200 !IL contenant chacune 50 kystes. 1.3 - Protocoles de vaccination / infection d'épreuve Des souris Swiss-OF1 sont réparties en deux lots distincts : o lot (i) : composé de 27 souris femelles vaccinées par voie intra- péritonéale à l'aide d'une aiguille 25 gauges. La vaccination est réalisée avec 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO dont la production est décrite au paragraphe 1.2.1. o lot (ii) : composé de 30 souris femelles témoins non vaccinées, Vingt-huit jours après vaccination (J28), une prise de sang rétro-orbitale a été réalisée sur l'ensemble des souris afin de diagnostiquer la séroconversion chez les souris par la technique ELISA. Trente jours après vaccination (J30) les souris des lots (i) et (ii) ont été soumises à une infection d'épreuve par gavage à l'aide d'une canule de 18 gauges avec 50 kystes de la souche 76K de Toxoplasma gondii, préparés conformément à la description faite au paragraphe 1.2.3. Vingt-huit jours après l'infection d'épreuve (J58), une prise de sang rétro-orbitale a été réalisée sur l'ensemble des souris. Pour chaque lot, un tiers des animaux a été sacrifié 4 semaines après le gavage (J58), un autre tiers à 8 semaines (J86) et le dernier tiers à 12 semaines (J104). Sur chaque souris, un examen ophtalmologique est effectué. Les kystes toxoplasmiques intracérébraux et intra-rétiniens sont dénombrés et la réponse immunitaire intra-oculaire est analysée. 1.4 - Analyses sérologiques Le statut sérologique des souris est déterminé par un test ELISA de type indirect. Les prélèvements sanguins sont centrifugés à 5.000 g pendant 15 min et le sérum est récupéré. L'extrait parasitaire total de la souche RH dont la préparation est décrite au paragraphe 1.2.2 est dilué dans un tampon carbonate pH9,6 pour obtenir une concentration finale de 101.tg/mL. Des plaques 96 puits à fond plat sont alors sensibilisées une nuit à +4°C par un dépôt dans chaque puits de 100 [IL d'extrait total de Toxoplasma gondii . Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec le tampon de lavage (PBS 1X - Tween 20 0,05%) puis saturées pendant 1h30 à 37°C avec une solution de PBS 1X - Tween 20 0,05% complémentée avec 4% de Sérum Albumine Bovine (SAB) (Sigma). Le milieu est ensuite éliminé. Les sera à tester sont dilués au 1/50ème dans une solution de PBS 1X - Tween 20 0,05% et sont déposés en duplicate dans les puits. Après une heure d'incubation à 37°C et une nouvelle série de lavage, l'anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline (Sigma A3562, goat anti-Mouse IgG) et dilué au 1/5000ème est déposé à raison de 100 [IL par puits. Les échantillons sont alors incubés pendant une heure à 37°C. Après une nouvelle série de trois lavages, la révélation est faite par l'ajout dans chaque puits de 100 [IL d'une solution de paranitrophénylphosphate disodique (PnPP) (Sigma) à 1 mg/mL, dans un tampon DEA-HC1. Après 20 min d'incubation à température ambiante et à l'abri de la lumière, l'absorbance à 405 nm est mesurée grâce à un lecteur de plaque (Multiskan MCC340 Wallace). Les souris sont considérées comme séroconverties lorsque l'absorbance obtenue est 2,5 fois supérieure à l'absorbance obtenue avec le témoin négatif issu de sérum de souris naïves saines. 1.5 - Analyses ophtalmologiques Avant le sacrifice des souris, des analyses ophtalmologiques sont réalisées à l'aide d'une loupe binoculaire (pied colposcope Zeiss OPMI 99 sur lequel est fixée une tête binoculaire Zeiss F170 avec ses deux objectifs) après instillation de deux gouttes de mydriactum 0,1% dans chaque oeil à 10 min d'intervalle. L'examen du fond d'oeil est ensuite réalisé à l'aide de ce même outil en s'aidant d'une lentille « superfield » de 90 dioptries. L'animal est amené sous le faisceau lumineux avec un zoom de 0,6. L'oeil est centré, puis la lentille est amenée à 5 mm du globe oculaire sans entrer en contact avec ce dernier. 1.6 - Analyse de la réponse immunitaire intraoculaire Immédiatement après sacrifice, un prélèvement d'humeur aqueuse est réalisé sous loupe binoculaire à l'aide d'une aiguille 30 gauge montée sur seringue de 1 mL. Les deux prélèvements correspondant aux deux yeux d'une même souris sont réunis et l'IFN-y intra-oculaire est dosé par ELISA (BD Opt EIA Mouse IFN-y ELISA set). A J1, l'anticorps de capture dilué au 1/250 dans du tampon de « coating » (tampon de dilution : 85 mM de NaHCO3, 15 mM de Na2CO3, pH9,5) est déposé sur plaque 96 puits. Ces plaques sont incubées à +4°C toute la nuit. Après lavage avec du tampon PBS 1X - Tween 20 0,05%, la plaque est saturée pendant 1h à température ambiante avec du tampon de saturation (PBS 1X - 10% SVF) à raison de 200 [iL par puits. Après une nouvelle série de trois lavages, les échantillons d'humeur aqueuse dilués au 1/10ème dans du tampon de saturation sont déposés puis incubés pendant deux heures à température ambiante à raison de 50 [iL par puits. En parallèle, une gamme est réalisée à partir de l'IFN-y murine obtenu dans le commerce. Après une nouvelle série de lavage, 50 [iL de la solution contenant l'anticorps et l'enzyme de détection sont déposés à la dilution de 1/250ème dans du tampon de saturation et incubés pendant 1h. Après une nouvelle série de lavage, la plaque est révélée avec le substrat (Tetramethylbenzidine, Sigma), à raison de 50 [iL par puits. Après 30 min, 25 [iL de solution stop (H2504 2N) sont ajoutés. Les densités optiques sont lues à 450 nm à l'aide d'un lecteur de plaques (Multiskan MCC340 Wallace). 1.7 - Numération des kystes intra-rétiniens et intracérébraux 1.7.1 - Kystes intracérébraux Les cerveaux des souris sont récupérés après badigeon à l'alcool du pelage de la tête de l'animal. Une incision cutanée aux ciseaux est réalisée au niveau d'une ligne nucale rétro-auriculaire. Le scalp est ensuite antéversé et deux craniotomies débutant au niveau du trou occipital jusqu'aux os frontaux sont effectuées. La voute crânienne est alors retirée et le cerveau est prélevé dans son intégralité. Le cerveau est ensuite broyé dans 5 mL de milieu RPMI dans un potter. Le broyat est laissé une nuit à +4°C. Pour le comptage des kystes, huit à dix comptages sont effectués sur 10 !AL de ce broyat à l'aide d'un microscope binoculaire sur cellules de Malassez. La moyenne est ensuite calculée et rapportée à l'ensemble du volume initial pour évaluer le nombre de kystes intracérébraux. 1.7.2 - Kystes intra-rétiniens Après le prélèvement d'humeur aqueuse, les yeux des souris sont énucléés. Sous loupe binoculaire, un débridement conjonctival complet est pratiqué. Une incision limbique est réalisée et la cornée est extraite. Quatre incisions orthogonales sclérales sont ensuite réalisées vers le pôle postérieur aux ciseaux de Vannas et l'ensemble rétine- choroïde-sclère est étalé à plat sur le plan de travail. Le cristallin est également prélevé en maintenant au maximum le gel vitré au contact de la rétine afin de minimiser les traumatismes. Le complexe rétine-choroïde est alors délicatement prélevé à l'aide d'un micromanipulateur et placé dans 50 !AL de milieu RPMI, puis homogénéisé en pratiquant des « allers-retours » dans le cône d'une micropipette. Pour le comptage des kystes, l'intégralité du prélèvement est observée entre lame et lamelle à l'aide d'une loupe binoculaire. 2 - Résultats 2.1. - Déroulement de l'expérimentation Trente jours après vaccination, les souris ont été soumises à une infection d'épreuve par gavage avec 50 kystes de la souche 76K. 2.2. - Analyses sérologiques Un mois après la vaccination, une analyse sérologique a été réalisée sur tous les animaux. Les 27 animaux vaccinés du lot (i) présentent un titre en anticorps supérieur à 2,5 fois celui des souris témoins du lot (ii) et sont donc considérés comme séroconvertis vis-à-vis de Toxoplasma gondii. Au contraire, les souris du groupe témoin demeurent séronégatives. Une deuxième analyse sérologique a été réalisée, un mois après l'infection d'épreuve. Après l'infection d'épreuve, l'ensemble des souris du lot (i) vacciné et infecté et du lot (ii) uniquement infecté sont séropositives. Par ailleurs, la densité optique observée à partir des sérums des souris vaccinées et infectées est supérieure à celle observée à partir des souris uniquement vaccinées ou uniquement infectées, reflétant ainsi un taux d'anticorps plus élevé chez les souris vaccinées et infectées comparativement à celui observé chez les souris uniquement vaccinées ou uniquement infectées. 2.3. - Analyses ophtalmologiques Quatre semaines post-infection d'épreuve, trente huit yeux ont été examinés (18 dans le groupe vacciné puis infecté - lot (i) et, 20 dans le groupe témoin infecté - lot (ii). Les résultats sont présentés à la figure 1A. Dans le groupe témoin infecté (lot (ii)), huit yeux ont présenté des signes inflammatoires : 7 étaient de type uvéite (35%) et un seul de type hémorragique (5%). Ces signes ont donc été retrouvés chez 40% des yeux analysés. Dans le groupe vacciné puis infecté (lot (i)), aucune lésion inflammatoire n'a été observée, mais un animal présentait de manière bilatérale une taie cornéenne (11% des yeux analysés) et un autre une cataracte (11% des yeux analysés). A huit semaines post-infection d'épreuve, trente huit yeux ont été examinés (18 dans le groupe vacciné puis infecté - lot (i) et, 20 dans le groupe témoin infecté - lot (ii)). Dans le groupe témoin infecté (lot (ii)), six yeux ont présenté des signes inflammatoires de type uvéite (30%), deux yeux des signes de cataractes (10%) et un seul des signes de type hémorragique (5%). Ces signes ont donc été retrouvés chez 45% des yeux analysés. Dans le groupe vacciné puis infecté (lot (i)), aucune lésion inflammatoire n'a été observée mais un animal présentait, de nouveau, une taie cornéenne de manière bilatérale (Figure 1B). A douze semaines post-infection d'épreuve, trente six yeux ont été examinés (16 dans le groupe vacciné puis infecté - lot (i) et, 20 dans le groupe témoin - lot (ii)). Dans le groupe témoin infecté (lot (ii)), cinq yeux ont présenté des signes inflammatoires de type uvéite (25%) et trois de cataracte (15%). Ces signes ont donc été retrouvés chez 40% des yeux analysés. Dans le groupe vacciné puis infecté (lot (i)), aucune lésion inflammatoire n'a été observée (Figure 1C). En résumé, des lésions ont été retrouvées dans 41,6% des yeux des souris témoins non vaccinées et infectées (lot (ii)). Les principaux signes cliniques observés sont des hyalites (30%), des hémorragies (3.3%) et des cataractes (8,3%). Dans le groupe vacciné et infecté (lot (i)), seuls 7,7% des yeux présentaient des lésions cornéennes bilatérales. De plus, ces signes cliniques n'étant pas décrits comme une conséquence d'une infection à T gondii, ils sont très probablement dus à une autre cause telle qu'un traumatisme subi dans les cages ou lors des manipulations. 2.4. - Numération des kystes intracérébraux et intra-rétiniens 2.4.1 - Kystes intracérébraux La présence de kystes intracérébraux a été recherchée dans les cerveaux des souris témoins uniquement infectées (lot (ii)) et vaccinées et infectées (lot (i)) : - A quatre semaines post-infection d'épreuve, les souris témoins (lot (ii)) présentent un nombre moyen de kystes intracérébraux de 718 ± 187 kystes alors qu'aucun kyste n'a été dénombré dans les cerveaux des souris vaccinées au préalable (lot (i)) (Figure 2A), - A huit semaines post-infection d'épreuve, les souris témoins (lot (ii)) présentent un nombre moyen de kystes intracérébraux de 880 ± 394 kystes alors qu'aucun kyste n'a été dénombré dans les cerveaux des souris vaccinées au préalable (lot (i)) (Figure 2B), - A douze semaines post-infection d'épreuve, les souris témoins (lot (ii)) présentent un nombre moyen de kystes intracérébraux de 1.094 ± 303 kystes alors qu'aucun kyste n'a été dénombré dans les cerveaux des souris vaccinées au préalable (lot (i)) (Figure 2C). 2.4.2 - Kystes intra-rétiniens La présence de kystes intra-rétiniens a été recherchée dans les yeux des souris témoins uniquement infectées (lot (ii)) et vaccinées et infectées (lot (i)): - A quatre semaines post-infection d'épreuve, les souris témoins (lot (ii)) présentent un nombre moyen de kystes par oeil de 4,50 ± 2,26 contre 0,66 ± 0,77 kystes par oeil pour les souris du lot vacciné (lot (i)) (Figure 3A), - A huit semaines post-infection d'épreuve, les souris témoins (lot (ii)) présentent un nombre moyen de kystes par oeil de 5,55 ± 3,56 contre 0,44 ± 0,51 kystes par oeil pour les souris du lot vacciné (lot (i)) (Figure 3B), - Enfin, à douze semaines post-infection d'épreuve, les souris témoins (lot (ii)) présentent un nombre moyen de kystes par oeil de 4,3 ± 2,66 contre 0,31 ± 0,60 kystes par oeil pour les souris du lot vacciné (lot (ii)) (Figure 3C). Cette expérience a permis de mettre en évidence une nette diminution du nombre de kystes intra-rétiniens chez les souris vaccinées (lot (i)) en comparaison avec les souris témoins non vaccinées (lot (ii)). Ainsi, seulement 40% des yeux (21/52 yeux) des souris vaccinés (lot (i)) ont présenté des kystes intra-rétiniens contre 96% des yeux des souris témoins (lot (ii)) (58/60 yeux). De même, le nombre moyen de kystes intra- rétiniens est de 4,8 ± 2,85 kystes par oeil pour les souris témoin (lot (ii)) contre 0,46 ± 0,63 kystes par oeil pour les souris vaccinées (lot (i)), soit une diminution supérieure à 90%. 2.5. - Analyse de la réponse immunitaire Des prélèvements d'humeur aqueuse ont été réalisés chez les souris du groupe témoin (lot (ii)) et du groupe vacciné (lot (i)). La cytokine IFN-y a été dosée dans l'humeur aqueuse. La défense oculaire se fait par l'augmentation de production d'IL-12 qui induit à son tour une sécrétion d'IFN-y et de TNF-a. Cet environnement intraoculaire inflammatoire est fortement délétère pour l'oeil. Quatre semaines après l'infection d'épreuve, la sécrétion intraoculaire moyenne d'IFN-y chez les individus témoins non vaccinés mais infectés (lot (ii)) est de 7.659 ± 7.980 pg/mL (Figure 4A). Toujours chez les animaux du lot (ii), cette sécrétion intraoculaire est de 722 ± 1.045 pg/mL à huit semaines post-infection (Figure 4B) et de 1.200 ± 1.866 pg/mL à douze semaines post-infection (Figure 4C). Cette diminution s'explique par l'évolution spontanée des poussées inflammatoires, résolutives en 4 semaines environ. Pour les souris vaccinées préalablement avec la souche Toxo mic1-3 KO (lot (i)), aucune sécrétion locale d'IFN-y n'est détectée, quatre (34 ± 42 pg/ml), huit (21 ± 34 pg/mL) ou douze (1 ± 2 pg/mL) semaines après l'infection (Figures 4A, 4B et 4C), témoignant indirectement de l'absence de processus inflammatoire délétères pour les yeux. Exemple 2: Efficacité de la souche Toxo mic1-3 KO pour la prévention de la toxoplasmose dans un modèle murin de toxoplasmose oculaire congénitale 1 - Protocole expérimental 1.1 - Animaux La vaccination est réalisée sur des souris Swiss Webster (0F1), non consanguines, femelles, âgées de 8 semaines provenant du centre d'élevage Janvier (Le Genest-Saint-Isle, France). Les souris sont maintenues tout au long de l'expérimentation en animalerie de niveau de confinement 2 afin de limiter au mieux le risque de contamination externe. 1.2 - Souches de T gondii 1.2.1 - Souche Toxo mic1-3 KO La souche mutante de Toxoplasma gondii, Toxo mic1-3 KO, dont les gènes codant pour les protéines MIC1 et MIC3 ont été invalidés, est entretenue par passages successifs sur une lignée de fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivés dans du milieu DMEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) auquel est ajouté du sérum de veau foetal 10%, 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Après lyse du tapis cellulaire, les tachyzoïtes sont récupérés dans le surnageant puis dénombrés sur cellule de Malassez. La concentration est ensuite ajustée pour obtenir une dose finale de 100 tachyzoïtes dans 200 pL de milieu DMEM, correspondant à la dose vaccinale par souris. 1.2.2 - Souche RH La souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, dont est dérivée la souche Toxo mic1-3 KO, est également entretenue par passages successifs sur une lignée de fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivés dans du milieu DMEM auquel est ajouté du sérum de veau foetal 10%, 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Pour la préparation de l'extrait parasitaire total, les tachyzoïtes de la souche RH sont lavés, soniqués deux fois à 60 watt/s durant 10 min dans la glace et centrifugés à 2.000 g pendant 30 min à +4°C. Le surnageant est récupéré et la concentration est déterminée par un kit de dosage (dosage BCA) qui utilise comme standard de la Sérum Albumine Bovine (SAB). Les aliquots sont conservés à -20°C. 1.2.3 - Souche 76K La souche 76K de Type II est utilisée pour l'infection d'épreuve des souris. Cette souche est conservée sous forme de kystes par passages continus sur souris CBA/J par gavage (souris cycle). La veille de l'infection d'épreuve, une souris cycle, infectée deux mois auparavant par des kystes de la souche 76K, est sacrifiée par dislocation cervicale. Les cerveaux des souris sont récupérés après badigeon à l'alcool du pelage de la tête de l'animal. Une incision cutanée aux ciseaux est réalisée au niveau d'une ligne nucale rétro-auriculaire. Le scalp est ensuite antéversé et deux craniotomies débutant au niveau du trou occipital jusqu'aux os frontaux sont effectuées. La voute crânienne est alors retirée et le cerveau est prélevé dans son intégralité. Le cerveau est ensuite broyé dans 5 mL de milieu RPMI dans un potter. Le broyat est laissé une nuit à +4°C. Les kystes sont alors dénombrés sur cellule de Malassez et la concentration est ajustée pour obtenir des doses d'infection de 2001.iL contenant chacune 15 kystes. 1.3 - Protocoles de vaccination / infection d'épreuve Des souris femelles Swiss-OF1 sont réparties en trois lots distincts : - lot (i) constitué de 10 souris femelles vaccinées et infectées (lot vacciné / infecté). Les souris sont vaccinées au premier jour de l'expérimentation (JO) par voie intra-péritonéale à l'aide d'une aiguille 25 gauges. La vaccination est réalisée avec 100 tachyzoïtes de la souche Toxo mic1-3 KO dont la production est décrite au paragraphe 1.2.1., - lot (ii) constitué de 5 souris femelles non vaccinées et non infectées (lot non vacciné / non infecté), - lot (iii) constitué de 15 souris femelles non vaccinées et infectées (lot non vacciné / infecté). Vingt-huit jours après vaccination (J28), une prise de sang sous-maxillaire a été réalisée sur l'ensemble des souris vaccinées afin de diagnostiquer les souris séroconverties (lot vacciné / infecté - lot (i)). Deux mois après vaccination, les souris séropositives du lot vacciné / infecté (lot (i)) ainsi que toutes les souris du lot non vacciné / non infecté (lot (ii)) et du lot non vacciné / infecté (lot (iii)) ont été mises au mâle pendant 3 jours à raison de 3 souris femelles pour un mâle. Les souris gestantes sont diagnostiquées par pesée. Au douzième jour de gestation, les souris diagnostiquées gestantes du lot vacciné / infecté (lot (i)) et du lot non vacciné / infecté (lot (iii)) ont été soumises à une infection d'épreuve par gavage à l'aide d'une canule 18 gauges avec 15 kystes de la souche 76K, dont la préparation est décrite au paragraphe 1.2.3. Quatre semaines après les mises-bas, les souriceaux bénéficient d'un examen ophtalmologique réalisée sous anesthésie générale obtenue par inhalation d'isoflurane gazeux à 2,5% (oxygène à 3 1 par minute) dans une cage d'induction (Mark 5, Minerve SA) pendant 2 à 5 minutes, par groupe de 5 souris au maximum. Huit semaines après les mises-bas, les souriceaux sont sacrifiés et un deuxième examen ophtalmologique est effectué. Les kystes oculaires et cérébraux sont dénombrés et la réponse immunitaire intraoculaire est analysée. 1.4 - Analyse sérologique Le statut sérologique des souris est déterminé par un test ELISA de type indirect. Pour les mères, les statuts sérologiques ont été étudiés 4 semaines après vaccination et 4 et 8 semaines après l'infection d'épreuve. Pour les souriceaux, les statuts sérologiques ont été étudiés à la quatrième et huitième semaine de vie. Les prélèvements sanguins sont centrifugés à 5.000 g pendant 15 min et le sérum est récupéré. L'extrait total de la souche RH dont la préparation est décrite au paragraphe 1.2.2 est dilué dans un tampon carbonate pH9,6 pour obtenir une concentration finale de 10 !..tg/mL. Des plaques 96 puits à fond plat sont alors sensibilisées une nuit à +4°C par un dépôt dans chaque puits de 100 [IL d'extrait total de Toxoplasma gondii . Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec le tampon de lavage (PBS 1X - Tween 20 0,05%) puis saturées pendant 1h30 à 37°C avec une solution de PBS 1X - Tween 20 0,05% complémentée avec 4% de sérum albumine bovine (SAB) (Sigma). Le milieu est ensuite éliminé. Les sera à tester sont dilués au 1/50ème dans une solution de PBS 1X - Tween 20 0,05% et sont déposés en duplicate dans les puits. Après une heure d'incubation à 37°C et une nouvelle série de lavage, l'anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline (Sigma A3562, goat anti-Mouse IgG) et dilué au 1/5000ème est déposé à raison de 100 [IL par puits. Les échantillons sont alors incubés pendant une heure à 37°C. Après une nouvelle série de trois lavages, la révélation est faite par l'ajout dans chaque puits de 100 [IL d'une solution de paranitrophénylphosphate disodique (PnPP) (Sigma) à 1 mg/mL, dans un tampon DEA-HC1. Après 20 min d'incubation à température ambiante et à l'abri de la lumière, l'absorbance à 405 nm est mesurée grâce à un lecteur de plaque (Multiskan MCC340 Wallace). Les souris sont considérées comme séroconverties lorsque l'absorbance obtenue est 2,5 fois supérieure à l'absorbance obtenue avec le témoin négatif issu de sérum de souris naïves et saines. 1.5 - Analyses ophtalmologiques Pour chaque souriceau, nous avons pu procéder à deux examens ophtalmologiques. Le premier est réalisé après 4 semaines de vie sur des individus anesthésiés selon le protocole précédemment décrit. Le deuxième est réalisé à 8 semaines de vie, après euthanasie. Après anesthésie ou euthanasie des souris, des analyses ophtalmologiques sont réalisées à l'aide d'une loupe binoculaire (pied colposcope Zeiss OPMI 99 sur lequel est fixée une tête binoculaire Zeiss F170 avec ses deux objectifs) après instillation de deux gouttes de Mydriactum® 0,1% dans chaque oeil. L'examen du segment antérieur est réalisé en respectant l'hydratation cornéenne afin d'éviter l'apparition d'une kératite d'exposition ou d'un oedème cornéen susceptible de créer des artéfacts. L'examen ophtalmologique a permis de noter la survenue d'uvéite antérieure (précipités rétro-cornéens pigmentés) et/ou de cataracte (opalescence cristallinienne, cataractes suturale ou sous-capsulaire voire véritable cataracte nucléaire), de hyalite ou d'hémorragies rétiniennes. Afin d'évaluer l'inflammation, la cotation suivante a été utilisée (Sauer et al., 2009 Journal Français d'Ophtalmologie, 32: 742-749) : - Stade 0 : pas d'inflammation, - Stade 1 : Tyndall en chambre antérieure ou vitréen modéré, - Stade 2: Tyndall en chambre antérieure ou vitréen sévère et/ou dilatation des vaisseaux iriens et/ou conjonctivo-scléraux, - Stade 3 : Trouble cornéen et précipités rétro-cornéens et/ou hyalite très sévère, - Stade 4 : Cataracte secondaire. 1.6 - Numération des kystes intra-rétiniens et intracérébraux 1.6.1 - Kystes intracérébraux Les cerveaux des souris sont récupérés après badigeon à l'alcool du pelage de la tête de l'animal. Une incision cutanée aux ciseaux est réalisée au niveau d'une ligne nucale rétro-auriculaire. Le scalp est ensuite antéversé et deux craniotomies débutant au niveau du trou occipital jusqu'aux os frontaux sont effectuées. La voute crânienne est alors retirée et le cerveau est prélevé dans son intégralité. Le cerveau est ensuite broyé dans 5 mL de milieu RPMI dans un potter. Le broyat est laissé une nuit à +4°C. Pour le comptage des kystes, huit à dix comptages sont effectués sur 10 [iL de ce broyat à l'aide d'une loupe binoculaire sur cellules de Malassez. La moyenne est ensuite calculée et rapportée à l'ensemble du volume initial pour évaluer le nombre de kystes intracérébraux. 1.6.2 - Kystes intra-rétiniens Après le prélèvement d'humeur aqueuse, les souris sont énucléées. Sous loupe binoculaire, un débridement conjonctival complet est pratiqué. Une incision limbique est réalisée et la cornée est retirée. Quatre incisions orthogonales sclérales sont ensuite réalisées vers le pôle postérieur aux ciseaux de Vannas et l'ensemble rétine-choroïdesclère est étalé à plat sur le plan de travail. Le cristallin est également retiré en laissant le gel vitré au maximum en contact avec la rétine afin de minimiser les traumatismes. Le complexe rétine-choroïde est alors délicatement prélevé à l'aide d'un micromanipulateur et placé dans 50 [iL de milieu RPMI, puis homogénéisé en faisant des « aller-retour » dans le cône d'une micropipette. Pour le comptage des kystes, l'intégralité du prélèvement est observée à l'aide d'une loupe binoculaire entre lame et lamelle. 1.7 - Analyse de la réponse immunitaire intraoculaire Immédiatement après sacrifice, un prélèvement d'humeur aqueuse est réalisé sous loupe binoculaire à l'aide d'une aiguille 30 gauge montée sur seringue de 1 mL. Les deux prélèvements correspondant aux deux yeux d'une même souris sont réunis et l'IFN-y intra-oculaire est dosé par ELISA (BD Opt EIA Mouse IFN-y ELISA set). A J1, l'anticorps de capture dilué au 1/250ème dans du tampon de « coating » (tampon de dilution : 85 mM de NaHCO3, 15 mM de Na2CO3, pH9,5) est déposé sur plaque de 96 puits. Ces plaques sont incubées à +4°C toute la nuit. Après lavage avec du tampon PBS 1X - Tween 20 0,05%, la plaque est saturée pendant 1h à température ambiante avec du tampon de saturation (PBS 1X, 10% SVF) à raison de 200 [iL par puits. Après une nouvelle série de trois lavages, les échantillons d'humeur aqueuse dilués au 1/10ème dans du tampon de saturation sont déposés puis incubés pendant deux heures à température ambiante (50 [iL par puits pour l'IFN-y). En parallèle, une gamme est réalisée à partir d'IFN-y murine obtenu dans le commerce. Après une nouvelle série de lavage, 50 [iL de la solution contenant l'anticorps et l'enzyme de détection sont déposés à la dilution de 1/250ème dans du tampon de saturation et incubés pendant 1h. Après une nouvelle série de lavage, la plaque est révélée avec le substrat (Tetramethylbenzidine), à raison de 50 [iL par puits. Après 30 min, 25 [iL de solution stop (H2SO4 2N) sont ajoutés. Les densités optiques sont lues à 450 nm à l'aide d'un lecteur de plaques (Multiskan MCC340 Wallace). 2 - Résultats 2.1. - Déroulement de l'expérimentation Dans le but de démontrer l'efficacité de la souche Toxo mic1-3 KO dans la prévention de la toxoplasmose oculaire par transmission materno-foetale, des souris femelles ont été vaccinées, mises au mâles et infectées à mi-gestation par une souche sauvage de T gondii. Les souris du lot (i), ainsi que les souris témoins des lots (ii) et (iii) ont été mises aux mâles. Puis, les souris des lots (i) et (iii) ont été soumises à une infection d'épreuve par voie orale au douzième jour de gestation avec 15 kystes de la souche 76K de T gondii. La mortalité périnatale a été évaluée durant les 4 premières semaines de vie. Ainsi, au cours de cette période, 6 souriceaux sur 127 sont morts dans le lot (i) vacciné soit 4,72%. Dans le lot (ii), constitué de souris témoins non vaccinées et non infectées, un seul souriceau sur 43 est mort (2,3%) et, dans le lot (iii) constitué de souris témoins non vaccinées et infectées, 27 souriceaux sur 83 sont morts (32,5%). 2.2. - Analyses ophtalmologiques Les examens cliniques réalisés à la quatrième semaine de vie des souriceaux ont été réalisés sous anesthésie générale chez les 219 souriceaux (121 pour le lot (i), 42 pour le lot (ii) et 56 pour le lot (iii)). Dans le lot (i) constitué de souriceaux issus de mères vaccinées et infectées, 13,1% des souriceaux présentaient des signes cliniques contre 71,4% dans le lot (iii) constitué des souriceaux issus de mères non vaccinées mais infectées (p Dans le lot (i), seuls 23 souriceaux sur 121 présentaient des signes cliniques d'inflammation endoculaire, soit 19%. Au contraire, dans le lot (iii), 41 souriceaux sur 56 présentaient une inflammation symptomatique, soit 73,2% (p Aucune différence significative n'est par contre notée entre les lots (i) et (ii), tant pour le nombre de souriceaux présentant des inflammations symptomatiques (3 sur 42 souriceaux, soit 7,1% des souriceaux du lot (ii), soit p = 0,0711), que pour le niveau du stade clinique cumulé moyen (0,32 ± 1,24 pour les souriceaux du lot (ii), soit p = 0,094). En revanche, il est noté un accroissement des stades cliniques cumulés par souriceau au cours du temps, entre la quatrième et la huitième semaine de vie (Figures 5A et 5B). 2.3. - Numération des kystes intracérébraux et intra-rétiniens 2.3.1 - Kystes intracérébraux Un prélèvement de cerveau a été effectué chez 121 souriceaux du lot (i), chez 36 souriceaux du lot (ii) (6 souriceaux non prélevés) et chez 50 souriceaux du lot (iii) (6 non prélevés). Une différence significative est observée entre le nombre de souriceaux présentant une infection cérébrale dans le lot (i) (36,4%) et le nombre de souriceaux présentant une infection cérébrale dans le lot (iii) (98%) (p De plus, le nombre de kystes intra-rétiniens moyen par souriceau (Figure 7) est également très significativement plus faible chez les animaux du lot (i) (0,56 ± 1,18 kystes par oeil) que chez les animaux du lot (iii) (2,54 ± 4,10 kystes par oeil). 2.4 - Analyse de la réponse sérologique A la quatrième semaine de vie, le test ELISA de dosage des anticorps sériques anti-T gondii pratiqué selon la procédure décrite au paragraphe 1.4 montre que 98% des souriceaux du lot (i) étaient séropositifs contre 34% chez les souriceaux du lot (iii). Aucun souriceau du lot (ii) ne présentait d'anticorps anti-T gondii. Ainsi, la densité optique observée à 405 nm était significativement moindre pour les sera des souriceaux du lot (iii) que pour les sera des souriceaux du lot (i) (p = 0,008), reflétant un taux d'anticorps pour les souriceaux du lot (iii) inférieur à celui des souriceaux du lot (i). A la huitième semaine de vie, aucune séroconversion additionnelle n'était constatée chez les souriceaux du lot (i), 98% de souriceaux présentant des anticorps sériques. En revanche, 100% des souriceaux du lot (iii) étaient séropositifs. La totalité des souriceaux du lot (ii) était séronégative. 2.5 - Analyse de la réponse immunitaire intraoculaire La totalité des yeux des souriceaux a pu être testée. La concentration moyenne d'IFN-y en chambre antérieure était de 1.170,5 ± 1.918,7 pg/mL chez les souriceaux du lot (i), de 2.147,6 ± 3.917,5 pg/mL chez les souriceaux du lot (iii) et de 940,9 ± 180,0 pg/mL chez les souriceaux du lot (ii). La concentration moyenne d'IFN-y en chambre antérieure est significativement réduite chez les souriceaux du lot (i) comparée à celle observée chez les souriceaux du lot (iii) (p = 0,027), mais, pour ce paramètre, il n'y aucune différence statistiquement significative entre les souriceaux du lot (i), d'une part, et ceux du lot (ii), d'autre part (p = 0,44). De plus, la concentration en IFN-y en chambre antérieure est corrélée au nombre de kystes rétiniens moyen (p Enfin le stade clinique cumulé moyen à la huitième semaine de vie est strictement corrélé au nombre de kyste intra-rétinien moyen (p REVENDICATIONS1. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement, chez un mammifère, des lésions oculaires associées à une infection par un apicomplexe de la famille des Sarcocystidae. 2. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon la revendication 1, lesdites souches possédant une virulence atténuée par rapport à une souche virulente de T gondii de type RH. 3. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ledit mammifère est un être humain ou un animal. 4. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle lesdites souches de Toxoplasma gondii possèdent au moins une adhésine MIC-1 et/ou une adhésine MIC-3 inactivée par une modification génique portant sur l'un au moins des gènes mic-1 et/ou mic-3. 5. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle lesdites souches de Toxoplasma gondii possèdent les deux adhésines MIC-1 et MIC-3 inactivées par une modification génique portant sur les deux gènes mic-1 et mic-3. 6. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit apicomplexe de la famille des Sarcocystidae est Toxoplasma gondii. 7. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle lesdites lésions oculaire appartiennent au groupe comprenant ou constitué des inflammations intra-oculaires, des uvéites, des hyalites ou des rétinochoroïdites. 8. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle lesdites souches sont mises en contact avec ledit mammifère à raison de 100 à 108 tachyzoïtes. 9. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle lesdites souches se trouvent sous une forme galénique choisie parmi le groupe comprenant ou constitué par des suspensions liquides, des dispersions solides ou liquides, des poudres, des pâtes ou des lyophilisats. 10. Souches de Toxoplasma gondii isolées de leur milieu naturel pour leur utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle lesdites souches sont associées à au moins un autre antigène, au moins un adjuvant, au moins un stabilisant, au moins un conservateur ou un mélange desdits produits permettant de stimuler et d'accroitre la réponse immunitaire dudit mammifère.