Brevet FR3001974A1 — publié le 20140815

PROCEDE DE PURIFICATION DE CELLULES La présente invention concerne un procédé de purification de cellules. Bien que la régénération du tissu nerveux existe chez les mammifères au sein du système nerveux central, cette capacité d'auto réparation reste très faible. Cela reflète l'incapacité des cellules souches neurales et des cellules progénitrices neurales à proliférer et à migrer dans les régions endommagées en quantité suffisante pour réparer et reconstruire les circuits neuronaux. La transplantation cellulaire est apparue dans les 20 dernières années comme une approche intéressante pour traiter des atteintes neurologiques centrales ou périphériques (Brevet US 2009/0214484). Les cellules neurales sont dérivées du feuillet ectodermique qui donne l'épiderme et le tissu nerveux. On distingue différents types de cellules neurales comme par exemple les neurones (dopaminergiques, serotoninergiques, GABAenergiques, ...) ou les cellules gliales comprenant les astrocytes (Dupin et al., Neural crest progenitors and stem cells: From early development to adulthood. Developmental Biology 366:83-95 (2012)). Les déficits en cellules neurales sont responsables de nombreuses pathologies et notamment : les maladies dégénératives aiguës ou chroniques comme par exemple la maladie de parkinson ou la chorée de Hungtington, la sclérose en plaque, les accidents vasculaires cérébraux, les problèmes visuels, les atteintes de la rétine, les troubles auditifs, les atteintes médullaires, les atteintes nerveuses périphériques incluant les neurones et les plaques neurales motrices, les nerfs (spécialisés du système autonome ou pas), les sphincters, le atteintes du système neurosensoriel en incluant le système visuel, le système auditif, etc... Aussi, il apparaît important de pouvoir fournir des méthodes permettant de remplacer ou de palier au déficit des cellules neurales afin de traiter ces différentes maladies. Plusieurs méthodes ont été proposées afin de remédier à ce problème. Par exemple, la demande US 2009/0068155 décrit un procédé d'administration de cellules neurales dans le système nerveux central. Des techniques de thérapie cellulaire ont également été proposées. Mais l'ensemble de ces techniques ne permet pas d'obtenir un résultat satisfaisant. L'utilisation de cellules souches neurales est apparue comme prometteuse dans le cadre de la thérapie. Les applications potentielles de ces cellules sont en effet importantes in vitro notamment dans les domaines du drug screening, de la neurotoxicologie, de l'électrophysiologie, de la thérapie cellulaire ou régénérative. Toutefois, de telles cellules souches sont présentes en quantité très faible dans les tissus et les organes, et il est difficile de les isoler et de les purifier. Les méthodes actuelles d'isolement reposent principalement sur la détection de marqueurs de surface tels que le CD15 ou le CD133 (Obermair et al., A novel classification of quiescent and transit amplifying adult neural stem cells by surface and metabolic markers permits a defined simultaneous isolation, Stem Cell Research 5:131- 143 (2010)). Toutefois, ces méthodes sont rendues difficiles et imparfaites car il n'existe aucun antigène spécifique des cellules neurales. En effet, les marqueurs des cellules neurales ne sont pas toujours exprimés de manière constitutive au cours du cycle cellulaire et sont généralement exprimés par d'autres lignées cellulaires et par les cellules tumorales. La particularité des cardiomyocytes et des cellules neurales est d'avoir un taux élevé de mitochondries, alors que le nombre de mitochondries est faible dans les cellules embryonnaires totipotentes. Le nombre de mitochondries augmente durant la différenciation et atteint un nombre particulièrement élevé dans les cardiomyocytes. Durant le développement, les mitochondries vont migrer de la zone juxta nucléaire vers d'autres parties du cytoplasme avec par exemple une association au niveau de l'appareil contractile pour les cardiomyocytes. La forme des mitochondries change avec l'apparition de phénomènes de fusion/fission. La quantité de copies ADN augmente également dans les mitochondries et le potentiel de 30 membrane change. Le métabolisme de ces mitochondries au cours du développement est particulier car la demande d'énergie dans ces cellules est particulièrement élevée, et les mitochondries vont passer d'un métabolisme énergétique pour fournir de l'ATP glycolytique anaérobie à un métabolisme aérobie avec beta oxydation des acides gras en faisant intervenir le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire mitochondriale. Ces modifications vont s'accompagner d'une modification du potentiel de la membrane mitochondriale qui augmente. Cette différence de potentiel est particulièrement marquée dans les cardiomyocytes où la demande énergétique est importante du fait de leur métabolisme actif et du travail en anaérobiose lors de l'effort. La « machinerie » enzymatique qui accompagne ces modifications va également augmenter les systèmes de protection de ces cellules en cas d'agression, notamment contre les métabolites mitochondriaux de type radicaux libres, également appelés ROS (Reactive Oxygen Species), qui induisent des lésions de l'ADN mitochondrial. Lors de la différenciation cellulaire, et avec la variation du potentiel de membrane, il y a une augmentation de la production des radicaux libres. Aussi, l'utilisation de marqueurs de l'état physiologique des mitochondries pourrait être un bon moyen pour isoler des cellules souches. Hattori et al. (Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature 20 Methods, vol? n1 61-66, (2010)) ont montré que le marquage des cellules par un marqueur potentiométrique mitochondrial (le TMRM) rend possible la purification et l'isolement des cardiomyocytes. Cette étude montre que les précurseurs de cardiomyocytes ont un taux de fixation du TMRM élevé et représentent 98% de la fraction des cellules. Pour que le TMRM rentre 25 dans les cellules, il faut qu'il existe une différence de potentiel de membrane et donc que les cellules soient vivantes. Les cellules dont le taux de marquage par le TMRM est faible sont majoritairement des cellules mortes. Les cellules isolées par Hattori et al. sont des cardiomyocytes, mais ces cellules n'ont pu être isolées qu'à un stade tardif du développement des cellules cardiaques, soit à 10 jours 30 de développement embryonnaire, alors que beaucoup de marqueurs des cellules cardiaques (notamment les marqueurs transcriptionnels) sont présents dès le 3ème jour de développement et que les cellules présentent déjà des propriétés contractiles au Sème jour du développement. Bien que les marqueurs de mitochondries semblent être prometteurs pour l'isolement des cellules, il existe toujours un réel besoin de disposer d'un procédé de purification et d'isolement de cellules, notamment à des stades précoces du développement embryonnaire. L'un des objets de l'invention est de fournir un procédé permettant une purification efficace des cellules. Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé permettant d'obtenir et de purifier plusieurs types cellulaires distincts, les types cellulaires étant bien différenciés. L'invention concerne un procédé d'isolement, de purification et/ou d'enrichissement de cellules, comprenant une étape de mise en contact d'un tissu ou de cellules avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou le cas échéant d'augmenter la production de radicaux libres, ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres pouvant correspondre à un seul et même marqueur, de telle sorte que - si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres sont utilisés de manière simultanée, ou si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres correspondent à un seul et même marqueur, ledit procédé permet l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement de cellules souches neurales, et - si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries sont utilisés de manière séparée ou étalée dans le temps, ledit procédé permet l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement de cellules souches neurales et/ou de cellules cardiomyocytaires. La présente invention est basée sur la constatation surprenante faite par les Inventeurs que l'utilisation de marqueurs mitochondriaux, permettant de mesurer le potentiel de membrane de la mitochondrie et au moins un autre marqueur de la mitochondrie permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres permet de purifier, d'isoler et/ ou d'enrichir des cellules, notamment des cellules souches, et en particulier des cellules souches à un stade très précoce de leur différenciation, notamment des cellules cardiaques et des cellules neurales. Ce procédé fait appel à des propriétés particulières des mitochondries des cellules neurales et/ou des cardiomyocytes au cours de leur développement et à une conjonction de marqueurs mitochondriaux. Par ailleurs, contrairement à des méthodes de purification de cellules basées sur la sélection de marqueurs de différenciation membranaire, ou une sélection de cellules déterminées par des moyens génétiques, le procédé selon l'invention permet d'obtenir des cellules non tumorales, c'est à dire des cellules non transformées qui n'ont perdu aucun des caractères que possèdent les cellules d'un organisme (perte de sénescence, perte d'inhibition de contact...). Dans l'invention, le terme « cellules souches » englobe des cellules isolées ou pas, multipotentes ou totipotentes. Il peut s'agit de préparations ou de tissus. Il peut par exemple s'agir de tissu en développement, de tissu embryonnaire ou de tissu gestationnel en incluant les annexes (cordon ombilical, placenta, liquide amniotique), de tissus différenciés néonataux ou autres comme des tissus adultes. Dans l'invention, les termes « cellules souches neurales » ou « cellules neurales » peuvent être employés l'un pour l'autre. Les cellules souches neurales sont des cellules multipotentes qui peuvent se différencier en certains types de cellules matures, comme par exemple les neurones, les cellules gliales ou encore les astrocytes. Dans l'invention, « l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement » signifient qu'il est possible, au moyen du procédé tel que décrit, soit de purifier les cellules, c'est-à-dire d'obtenir des cellules déterminées. Par exemple, la purification de cellules neurales signifie que les cellules obtenues sont toutes des cellules neurales, et que la population cellulaire ne contient pas, ou contient une infime partie (moins de 1%, préférentiellement moins de 0,1%) de cellules autres que des cellules neurales. - soit d'isoler les cellules, c'est-à-dire d'extraire de leur contexte naturel une population cellulaire où l'ensemble des cellules est de même phénotype. - soit d'enrichir en cellules, c'est-à-dire à partir d'une population mixte de cellules, qui peuvent être isolées et purifiées, de réaliser une sélection d'une sous-population particulière de cellules, de telle sorte qu'à l'issue de l'enrichissement, cette sous population soit majoritaire. Le procédé permet également de combiner ensemble l'isolement, la purification et 10 l'enrichissement. Aussi, l'invention concerne un procédé d'isolement de cellules tel que défini ci-dessus. L'invention concerne de plus un procédé de purification de cellules tel que défini ci-dessus. L'invention concerne par ailleurs un procédé d'enrichissement de cellules tel que défini 15 ci-dessus. L'invention concerne également un procédé d'isolement et de purification de cellules tel que défini ci-dessus. L'invention concerne aussi un procédé d'isolement et d'enrichissement de cellules tel que défini ci-dessus. 20 L'invention concerne également un procédé de purification et d'enrichissement de cellules telles que défini ci-dessus. Enfin, l'invention concerne aussi un procédé d'isolement et de purification et d'enrichissement de cellules tel que défini ci-dessus. 25 Les cellules ou tissus peuvent être d'origine animale ou pas. Il peut s'agir de tissus vivants, mais également de cellules obtenues à partir de tissu postmortem puisqu'il apparaît que les cellules souches survivraient après la mort du sujet pendant quelques temps. Il peut également s'agir de cellules génétiquement modifiées, de cellules fusionnées ou de cellules iPS (induced pluripotent stem cell) obtenues par la 30 reprogrammation génétique de cellules somatiques. Il peut s'agir de tissus embryonnaires, de lignées embryonnaires animales ou humaines. Les tissus particulièrement riches en cellules neurales sont privilégiés comme par exemple au niveau du système nerveux central, les régions paraventriculaires et le gyrus hypocampal. On peut également utiliser des cellules isolées à partir de tissus comme le derme, notamment au niveau du cuir chevelu. Dans un aspect particulier de l'invention, les populations cellulaires à partir desquelles il est possible de purifier, isoler et/ou enrichir des cellules au moyen du procédé selon l'invention ne sont pas issues de la destruction d'embryon humain. Le procédé selon l'invention peut être utilisé soit in vitro pour isoler des cellules en culture, soit in vitro comme contrôle de la qualité des cellules au cours du criblage de cellules avant implantation chez l'animal, notamment chez l'homme. Le procédé est avantageusement mis en oeuvre in vitro. Il existe actuellement des techniques de cytométrie, pour trier les cellules et répondre aux exigences cliniques, compatibles avec leur utilisation chez l'homme (Babetta et al., Flow cytometry : A multipurpose technology for a wide spectrum of global biosecurity applications, Journal of Laboratory Automation vol. 14(3):148-156 (2009)). Il est également possible de purifier les cellules, sans avoir recours à un trieur de cellules, sur la base de propriétés magnétiques ou électromagnétiques en ayant recours à des particules ferromagnétiques couplées aux marqueurs (Corr et al., Multifunctional Magnetic-fluorescent Nanocomposites for Biomedical Applications, Nanoscale Research Letters 3:87-104 (2008) ; Medintz et al., Potential clinical applications of quantum dots. Int J Nanomedicine 3 (2): 151-167 (2008)). Le procédé selon l'invention permet de purifier, d'isoler ou d'enrichir en cellules neurales, ou en deux populations distinctes de cellules neurales et de cellules cardiomyocytaires. Les cellules neurales purifiées selon l'invention peuvent être utilisées pour les régénérations nerveuses centrales ou périphériques. En particulier, les cellules neurales obtenues selon le procédé selon l'invention sont appropriées dans le cadre du traitement des maladies neurodégénératives, de l'AVC, de l'amblyopie et des problèmes rétiniens comme par exemple la dégénérescence maculaire, le traumatisme médullaire et/ou la dégénérescence médullaire, la reconstruction nerveuse périphérique, l'innervation de tissus musculaires, les plaques motrices, le « tissu engineering » de tissus innervés comme un tissu musculaire ou cardiaque, de glandes, tissu neuroendocrine (comme par exemple l'hypophyse, la glande surrénale, les ilots de Langerhans), la fabrication de tissu musculaire lisse ou squelettiques ou cardiaques innervés, le traitement de trouble spastiques... Cette approche permet également d'isoler des cellules cardiaques vivantes, à un stade embryonnaire précoce, i.e. vers le hème jour de développement. Au 10ème jour du développement, l'isolement des cellules est rendu plus aisé qu'avec un seul marquage. Le procédé selon l'invention permet d'isoler des cardiomyocytes sur la base de leur potentiel mitochondrial, puisque la sélection se fait sur un potentiel rapporté à la masse mitochondriale. Les cellules isolées ne sont pas tumorales non plus. Le procédé selon l'invention peut également être utilisé in vitro afin de tester la toxicité ou l'efficacité de produits chimiques ou médicamenteux. Les cellules isolées selon le procédé de l'invention peuvent être associées in vitro ou in vivo à des supports ou des dispositifs médicaux et/ou chirurgicaux. L'homme de métier est capable de choisir ces supports et dispositifs selon ses besoins, en faisant appel à ses connaissances techniques. Dans l'invention, par « individu », on entend tout animal, notamment des mammifères, en particulier des humains. Par « marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie » on définit dans 25 l'invention une molécule qui permet de détecter les mitochondries actives, lesquelles étant capables de maintenir une différence de potentiel entre leur milieu intérieur et leur milieu extérieur. Dans l'invention, la fixation initiale du marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie dépend du potentiel de membrane mitochondriale et nécessite donc que la 30 mitochondrie soit vivante. Ce marqueur se fixe de manière covalente à la matrice mitochondriale. La fixation initiale est fonction du potentiel initial de la mitochondrie. Une fois le marqueur fixé, si le potentiel de la mitochondrie change, la fixation du 20 marqueur reste inchangée. La fixation du marqueur est proportionnelle à la masse de mitochondries de la cellule. Des méthodes pour mesurer le potentiel de membrane mitochondriale chez les vertébrés ont été rapportées en utilisant un « quencher » de fluorescence non spécifique (demande US 2010/0209960). Il est également possible de mesurer le potentiel de membrane en modifiant des molécules d'intérêt pour les rendre fluorescentes comme par exemple de l'ATP fluorescent (Umezu et al., Biochemical characterization of the novel rice kinesin K23 and its kinetic study using fluorescence resonance energy transfer between an intrinsic tryptophan residue and a fluorescent ATP analogue, J Biochem 149(5), pages 539-550 (2011)), de modifier les fluorophores eux-mêmes comme par exemple par la modification de YFP (Abraham et al., Bidirectional fluorescence resonance energy transfer (FRET) in mutated and chemically modified yellow fluorescent protein (YFP), Bioconj Chem 22(2):227-34 (2011)). Il est également possible d'utiliser des marqueurs spécifiques des mitochondries d'une espèce donnée (comme par exemple le marqueur SYTO 18, spécifique des mitochondries de levures). Dans la présente invention, le « marqueur sensible au potentiel de membrane mitochondriale » peut correspondre à un marqueur permettant de mesurer l'activité de la chaîne respiratoire et/ou son niveau de développement, notamment aéro/anaérobie. Il peut s'agir par exemple d'un marqueur se fixant de manière spécifique sur des facteurs de transcription, reflétant ainsi le développement ou l'activité de la chaîne respiratoire. La production aérobique d'ATP par la mitochondrie est un mécanisme complexe qui fait intervenir la glycolyse, l'oxydation des acides gras (ou « beta oxidation »), le cycle de Krebs (« citric acid cycle »), et la phosphorylation oxydative (OXPHOS, « oxidative phosphorylation »). Ce procédé de production d'énergie ATP est bien supérieur à celui de la respiration anaérobique. La glycolyse anaérobique a lieu dans le cytoplasme et donne lieu à la production de pyruvate, de NADH (nicotinamide adenine dinucleotide) et d'ATP. La respiration aérobique a lieu, quant à elle, dans la mitochondrie, l'acétyl-CoA est produit à partir du pyruvate issu de la glycolyse et de l'oxydation des acides gras. L'Acétyl-CoA entre dans le cycle de Krebs pour produire du NADH, du FADH2 (flavin adenine dinucleotide) et de l'ATP. Le NADH et le FADH2 vont être utilisés par le complexe respiratoire mitochondrial (mtETC, Mitochondrial encoded Electron Transport Chain ») pour créer un gradient électrique et chimique au niveau de la membrane mitochondriale. Les électrons à haute énergie dérivés de NADH et FADH2 sont transférés au complexe I et II respectivement, puis vers le coenzyme Q qui va transférer les électrons vers le complexe III. Le cytochrome C est le deuxième accepteur d'électron, il transmet les électrons au complexe IV (« cytochrome C oxidase COX »). Dans l'étape finale, les électrons sont acceptés par l'oxygène via la production d'H20. Les complexes I, III et IV utilisent l'énergie libérée par le transfert d'électrons pour activer les pompes à protons qui vont transférer des protons dans l'espace inter-membranaire mitochondriale et générer un gradient de pH et de potentiel. L'ATP est finalement produit par le retour des protons vers la matrice mitochondriale à travers le complexe V, qui utilise alors l'énergie générée par le gradient électrochimique pour produire l'ATP à partir de l'adénosine diphosphate (ADP) et du phosphate inorganique. Le potentiel de membrane mitochondriale est donc en relation étroite avec l'activité de la chaîne respiratoire et son métabolisme, surtout aérobie, qui augmente ce potentiel. Cette chaîne est un complexe multiprotéique (complexe I (NADH deshydrognease), complexe II (succinate dehydrogenase), complexe III (cytochrome c reductase), complexe IV (cytochrome c oxidase COX), complexe V, et deux transporteurs d'électrons : coenzyme Q et cytochrome C). Il existe des marqueurs pour ces différents complexes ainsi que pour d'éventuels isotypes durant la maturation ou pour les facteurs de transcription codant ces complexes. Par « marqueur sensible au potentiel de membrane mitochondriale », on entend également des marqueurs reconnaissant spécifiquement des métabolites issus directement, ou indirectement, du métabolisme de la chaîne respiratoire ou de la différentiation neurale. Les radicaux libres (ou ROS, Reactive Oxygen Species) constituent un produit dérivé de l'activité de la chaîne respiratoire. Les radicaux libres sont toxiques pour la cellule et peuvent notamment entraîner des détériorations de l'ADN mitochondrial (mtDNA). Lors de l'activation du métabolisme aérobique, il y a une augmentation des enzymes antioxydantes comme par exemple, la Cu/Zn superoxide dismutase (Cu/ZnSOD), la glutathione peroxydase 1 (GPx1) et la peroxyredoxine (Prx) 1 et 2. Du fait de l'hypermétabolisme de la phosphorylation oxydative (OXPHOS), la production de radicaux libres va augmenter. L'augmentation localisée de radicaux libres va elle-même augmenter par des boucles d'auto-amplification. La capacité des cellules à utiliser la production aérobique d'énergie, et à s'adapter à l'augmentation de produits dérivés comme les radicaux libres, pourrait être un facteur clef de la différenciation cellulaire. L'activité aérobie de la chaîne respiratoire va donc aboutir à une différence de potentiel membranaire, un gradient de pH et également une augmentation de la production de radicaux libres. Ainsi, le fait de détecter une différence de potentiel ou de pH ou bien la production de radicaux libres dans certaines conditions peut être équivalent dans la présente invention. Le « marqueur sensible au potentiel de membrane », TMRM, que nous avons utilisé va augmenter la production de radicaux libres après excitation. En parallèle, un autre marqueur peut être utilisé pour détecter la production locale mitochondriale de radicaux libres, comme par exemple la dihydrorhodamine 123, ou mesurer le pH local mitochondrial, comme par exemple le SNARF 1 (acetyl methylester ayant une structure dérivée du TMRM spiro). Dans l'invention, il est possible de combiner au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, ce qui signifie qu'un ou deux, ou trois, ou plusieurs marqueurs sensibles au potentiel de membrane de la mitochondrie peuvent être combinés avec un ou deux, ou trois, ou plusieurs marqueurs permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel soit ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, soit ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, ou les deux, sont des marqueurs de type cationique. Ainsi, dans l'invention - soit le marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie est un marquer cationique, le marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres n'étant pas cationique, - soit le marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie n'est pas un marquer cationique, le marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres est un marqueur cationique, - soit le marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et le marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres sont des marqueurs cationiques. Les marqueurs cationiques selon l'invention sont de préférence des marqueurs lipophiles et chargés électriquement, dans le cas présent de charge positive (cf marqueurs cationiques). L'accumulation des cations dans la mitochondrie va dépendre de différents paramètres, notamment du potentiel de membrane mitochondriale, du potentiel de membrane plasmique et du ratio volume mitochondrial par rapport au volume cellulaire. Les marqueurs vont donc pénétrer dans les mitochondries à potentiel élevé. Le marqueur sera choisi de façon à ce que le marqueur ne se fixe pas de manière covalente à la matrice mitochondriale. Il est en fait libre, uniquement retenu dans la mitochondrie du fait de la dépolarisation de la membrane. Si cette polarisation diminue, il y a alors relargage progressif du marqueur en dehors de la mitochondrie. Si la mitochondrie se dépolarise totalement, il y a libération complète du marqueur. Dans un mode de l'invention, ces marqueurs peuvent être des marqueurs fluorescents ou pas. Ces marqueurs ont un spectre d'absorption dans lequel on stimulera le marqueur avec une source d'énergie comme une onde électromagnétique et un spectre d'émission dans lequel on analysera la libération d'énergie comme une fluorescence par exemple. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé tel que mentionné ci-dessus, dans lequel soit ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie ou soit ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, soit les deux, sont des marqueurs fluorescents. L'utilisation de marqueurs fluorescents est avantageuse car elle permet de mesurer, et de quantifier, le marqueur utilisé. La fluorescence peut être intrinsèque (lorsque le marqueur en tant que tel est fluorescent) ou extrinsèque (lorsque le marqueur est couplé à un fluorophore). Parmi les marqueurs mitochondriaux fluorescents sensibles au potentiel de membrane utilisés selon l'invention, on peut lister, sans être limitatif : - la Rhodamine 123 (R123) ; - le methylester de tetramethylrhodamine (TMRM, C25H25C1N207, Tetramethylrhodamine, methylester (Xanthylium,3,6-bi s(dimethylamino)-9-(2- (methoxycarbonyl)pheny1)-,perchlorate)) comme par exemple T668; - l'éthylester de tetramethylrhodamine (TMRE, (C26H27C1No7, Tetramethylrhodamine ethylester, perclorate (Xanthylium, 3,6- b i s(dim ethyl amino)-9- [2-(ethoxycarb onyl)phenyl] p erchl orate)) comme par exemple TMRE T669; - le tetram ethylrhodamine-5 -mal eimi de - le 5,5' ,6,6'-tetrachloro- 1,1' ,3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC), - le JC-9, - le 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6), et - le 2-(4-(dimethylamino)styryl)-N-ethylpyridinium iodide) (DASPEI) - le mitotracker Green FM MTG,« Mitotracker dye », - Mitotracker red CMXRos, - Mitotracker orange CMTM:Ros, - Dihydrorhodamine 123 (C21H18N203 benzoic acid, 2-(3,6-diamino-9H-xanthene- 9-y1)-, methyl ester ayant la même structure que le TMRM mais sans la méthylation des cycles aromatiques) 1 Parmi les marqueurs mitochondriaux fluorescents permettant la détection de la masse mitochondriale on peut lister, sans pour autant être limitatif : - le Mitotracker Green FM (MTG), - le Mitotracker Red 580nm MitoTracker® Red FM (MTR), - le MitoTracker® Deep Red FM (MTDR), - ou par exemple des marqueurs qui détectent une activité de la séquence El alpha pyruvate déshydrogénase (cf cell light mitochondria-GFP C010600 Invitrogen®), - ou par exemple des marqueurs permettant par contraste d'évaluer le volume total des mitochondries de la cellule (comme le marqueur cytoplasmique calcein-AM), - la nonyl acridine orange fluorescente, - un marqueur reconnaissant la cardiolipine, dont le niveau d'expression à membrane de la mitochondrie est proportionnel à la masse mitochondriale - un marqueur qui reconnaît spécifiquement des facteurs de transcription mitochondriaux codant pour la réplication ou la transcription de l'ADN mitochondrial, comme par exemple et de manière non exclusive, les facteurs de transcription TFAM, TFB2M, POLG. D'autres marqueurs tels que des marqueurs permettant d'analyser des activités biologiques enzymatiques, la modification locale du pH, le calcium (par exemple le Fluo-5N AM), des marqueurs permettant de mesurer différentes activités de la phosphorylation oxydative et du cycle de Krebs mitochondrial (cf aussi rhod-2 Koopman WJ, Computer-assisted live cell analysis, Methods 2008 46(4) :304- 311)(Fluo-5N AM C501-147F2N3025 qui sur le plan chimique est dérivé du TMRM avec une modification de la chaîne latérale et une substitution des cycles aromatiques les métabolites), les radicaux libres, l'ATP « turnover », la cytochrome oxydase, l'activité superoxide des protéines antioxydantes (telles que MnSOD ou CuZnSOD), l'activité lactate déshydrogénase ou encore l'expression de certains gènes régulateurs mitochondriaux peuvent être utilisés. Ces marqueurs sont intéressants car leur fixation initiale ne dépend pas directement du potentiel de la mitochondrie. Il est également possible d'utiliser des vecteurs d'expression codant une séquence El alpha pyruvate déshydrogénase fusionnée à la GFP ou RFP. Des marqueurs avantageux permettent de mesurer la quantité de radicaux libres (ROS). On peut citer, sans être limitatif : - le RedoxSensor Red CC-1, - le MitoTracker Red CM-H2XRos, - la Dihydrorhodamine 6G, qui n'est pas fluorescente, - MitoTracker® Orange CM-H2TMRos, et - les marqueurs type DCFDA, dont CM-H2DCFDA (5-(and-6)-chloromethy1-2',7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester) ou DCF-DA ou H2DCFDA, - Dihydrorhodamine 123. Les nombreux fluorophores susceptibles d'être couplés aux marqueurs sont bien connus de l'homme du métier. De manière non limitative, on peut citer par exemple le TMR, la fluorescéine (FITC), la calcéine, la dichlorofluorescéine, les cyanines, les molécules Alexa, ou encore les protéines fluorescentes, notamment la CFP, la GFP, l'YFP, la DsRed ou la Flavine. Le recours à des fluorophores particuliers dépend généralement de leur spectre d'absorption et d'émission. Par exemple, la Dichlorofluorescéine (DCF) ou la Calcéine peuvent être idéalement couplées au TMRM. Parmi les fluorophores susceptibles d'être couplés aux marqueurs, il est également possible d'utiliser des « quantum dots » (QDot), c'est-à-dire des nanocristaux dont la fluorescence varie selon leur diamètre. De manière non limitative, on peut citer par exemple le QDot ZnSe, le QDot CdSe ou le QDot CdTe. Egalement, l'invention concerne dans un autre mode de réalisation avantageux un procédé tel que défini ci dessus, dans lequel ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie est choisi parmi l'ester méthylique de tétraméthyle rhodamine (TMRM) et l'ester éthylique de tétraméthyle rhodamine (TMRE). Ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane peut idéalement être choisi dans la liste ci-dessous : - l'ester méthylique de tétraméthyle rhodamine (TMRM) - l'ester de tétraméthyle rhodamine (TMRE) - le tetramethylrhodamine-5-maleimide - la Rhodamine 123 (R123), - le 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1), - le JC-9, - le 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6), et - le 2-(4-(dimethylamino)styryl)-N-éthylpyridinium iodide) (DASPEI). Ces différents marqueurs peuvent être modifiés chimiquement, liés ou associés à d'autres composés. De manière surprenante, les Inventeurs ont constaté que les cellules neurales présentent des propriétés particulières pendant leur développement. Les cellules neurales possèdent en effet un potentiel de membrane mitochondrial bas et stable associé à un nombre élevé de mitochondries, ainsi qu'un système de protection leur permettant de résister à la toxicité des radicaux libres. Les cellules neurales sont donc capables de résister à des agents toxiques tels que les radicaux libres, notamment ceux induits lors d'une stimulation du TMRM. Les cardiomyocytes ont, quant à eux, un haut potentiel de membrane, moins stable, pour un nombre inférieur de mitochondries, ces cellules sont donc moins protégées vis-à-vis des radicaux libres. Les cellules totipotentes, ainsi que les autres types cellulaires, possèdent moins de mitochondries et sont, quant à elles, beaucoup moins protégées vis-à-vis des radicaux libres. Ainsi, le marquage d'une population cellulaire avec un marqueur sensible au potentiel de membrane mitochondrial, tel que le TMRM, permet de sélectionner les populations de cellules souches neurales et de cardiomyocytes. Lesquelles populations peuvent alors être distinguées l'une de l'autre par un marquage à l'aide d'un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries. Les Inventeurs ont également constaté de manière surprenante que le marquage simultané du TMRM avec un second marqueur mitochondrial, tel que le MTG, entraîne une dépolarisation et la mort des cellules qui ne sont pas des cellules souches neurales. Une stimulation du TMRM par l'intermédiaire du second marqueur pourrait être à l'origine d'une libération plus importante de radicaux libres, toxiques pour les autres types cellulaires. De cette manière, un marquage simultané d'une population cellulaire permet de sélectionner les cellules souches neurales qui sont les plus résistantes. Pour cette raison, les populations cellulaires peuvent également être distinguées en utilisant un marqueur permettant d'augmenter la production de radicaux libres. Ainsi, dans l'invention le deuxième marqueur peut être à la fois un marqueur qui permet de mesurer le nombre de mitochondries et un marqueur qui, de la manière dont il est employé dans l'invention, va augmenter la production de radicaux libres. Par exemple, l'activation du MTG entraîne un transfert d'énergie par FRET vers le TIVIRM dont la sur-activation entraîne alors une production augmentée de radicaux libres. L'isolement des cellules neurales est alors facilité par la propriété de ces cellules d'être mieux protégées vis-à-vis des radicaux libres par rapport aux autres types cellulaires, dont les cardiomyocytes. Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé susmentionné, dans lequel ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres est choisi parmi les marqueurs de protéines mitochondriales ou les marqueurs de l'ADN mitochondrial. Dans la présente invention deux ou plusieurs marqueurs mitochondriaux peuvent être suffisants pour isoler les cellules d'intérêts, surtout si ces marqueurs sont liés à d'autres marqueurs non spécifiques des mitochondries. Il peut être possible également d'utiliser différents marqueurs du développement mitochondrial pour isoler les cellules neurales. Ces marqueurs sont des marqueurs reliés à la masse et au nombre de mitochondries, les marqueurs permettant de détecter des protéines structurales, des marqueurs permettant de détecter des activités enzymatiques spécifiques, des marqueurs permettant de mesurer les différentes copies de l'ADN mitochondrial, des marqueurs métaboliques ou des marqueurs de réplication, de transcription, de packing ou de réparation de l'ADN mitochondrial (tels que TFAM, TFB2M, POLG) Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé susmentionné, où le marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres est du traceur de mitochondrie vert (MitoTracker Green ; MTG, C34H28C15N30 (Benzoxazolium,2-[3-[5,6-dichloro-1,3- bis[[4-(chloromethyl)pheny1]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-ylidene] -1-propenyl]-3- methyl-,chloride)). Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé susmentionné, où le second marqueur est du traceur de mitochondrie vert (MitoTracker Green ; MTG) et le premier marqueur est le TMRM ou le TMRE. Les marqueurs utilisés selon l'invention peuvent être modifiés chimiquement et peuvent même être combinés entre eux. Ils peuvent être reliés par un spacer (« branched » ou non) qui peut servir à transférer l'énergie. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini précédemment dans lequel ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres permettent un transfert d'énergie de l'un à l'autre des marqueurs pouvant entraîner une production de radicaux libres. Dans un autre mode de réalisation avantageux, ledit au moins un marqueur sensible au 20 potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres sont fluorescents, et permettent un transfert d'énergie ou FRET. L'échange d'énergie entre marqueurs fluorescents est appelé « FRET » (« Fluorescence 25 Resonance Energy Transfert ») (Revue : Selvin PR, Nature Structural Biology, vol.7:9 (2000)). On considère le fluorochrome donneur d'énergie et le receveur d'énergie. Ce phénomène nécessite généralement une compatibilité énergétique entre les molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir au moins partiellement le spectre d'absorption de l'accepteur ou être très proche. Il y a des possibilités pour 30 modifier les différents marqueurs et permettre cette interaction. Le mécanisme de FRET s'applique par extension à un échange d'énergie entre des molécules qui ne sont pas forcément fluorescentes et l'échange d'énergie n'a pas forcement lieu dans le domaine de l'onde visible. Il existe de nombreux accepteurs pour les donneurs d'énergie. Par exemple, le cryptate de terbium et le crypate d'europium peuvent être utilisés avec des fluorophores de type Cy5, mais ils présentent aussi l'avantage de pouvoir être associés à des fluorophores de type fluorescéine ou des protéines fluorescentes (GFP). Pour le MTG, la longueur d'onde d'absorption est de 490nm et la longueur d'onde d'émission est de 516 nM. Pour le TMRM, la longueur d'onde d'absorption est de 549 nm et la longueur d'onde d'émission de 574 nM. Ainsi, il peut y avoir transfert d'énergie entre les deux marqueurs, ou FRET. Lorsqu'il y a mécanisme de FRET entre les deux marqueurs, la fluorescence émise par le MTG à 516 nM diminue et l'on constate une augmentation de la fluorescence à 549 nM dans le spectre du TMRM. Aussi, la lumière émise par le MTG est à une longueur d'onde correspondant à la longueur d'onde d'excitation du TMRM. Dans la présente invention, les Inventeurs ont montré que le FRET entre le MTG et le TMRM permet d'identifier les cellules souches neurales et d'éliminer les autres contingents cellulaires. Pour les cellules souches neurales, les cellules vont donc rester positives pour le premier marqueur car leur potentiel de membrane reste stable. En présence du deuxième marqueur, le transfert d'énergie a lieu du fait de la compatibilité du transfert d'énergie. La fluorescence du deuxième marqueur va diminuer, mais la fluorescence du premier marqueur va être très augmentée : il y a phénomène de FRET. Avec cette méthode, les cellules neurales auront un marquage très positif pour le premier marqueur, qui est paradoxalement augmenté à cause du FRET. Les cellules seront ainsi faciles à identifier en analysant les fluorescences pour les deux marqueurs (premier marqueur « high » et « intermédiaire » pour le second marqueur). Le phénomène de FRET permet donc la sélection positive des cellules d'intérêt dont la fluorescence est augmentée, mais permet également la diminution de la fluorescence des autres cellules, qui ne sont pas des cellules d'intérêt, par dépolarisation et/ou mort cellulaire. Cette méthode de sélection entraîne un enrichissement dans la préparation des cellules d'intérêt qui survivent plus facilement et une diminution des autres des cellules plus sensibles à la toxicité. Le premier marquage TMRM peut se faire sur des cellules isolées en cluster ou pas, sur un embryon ou sur des tissus pour la même durée. Dans d'autre cas, il est possible de dissocier les cellules dans une solution enzymatique (comprenant par exemple de la collagénase) ou pas. Les procédés de préparation de cellules neurales à partir de tissus sont bien connus de l'homme du métier. Il est possible de rincer deux fois les cellules en PBS sans calcium et sans magnésium puis dans une solution de trypsine EDTA qui chélate le calcium et polarise les cellules. Après dissociation, on reprend les cellules dans le milieu de culture ou dans un tampon puis on effectue le marquage pendant une 1/2 h. à 37C°. Deux lavages des cellules sont ensuite réalisés avec le tampon TMRM (116 nM NaC1, 20 mM Hepes, 12,5 mM NaH2PO4, 5,6 mM glucose, 5,4 mM KC1 0.8 mM MgSO4 Ph 7,35). La fluorescence est ensuite lue directement par cytométrie de flux. Outre la combinaison avantageuse TMRM/MTG, d'autres couples de marqueurs peuvent être utilisés dans l'invention. Sans limitation, on peut citer les couples suivants : - TMRE/MTG, - JC-1/Mitotracker red 580nm, - Rhodamine 123 /MTG, - TMRM /BODIPY 11 (dans ce cas l'utilisation avantageuse est réalisée avec 1,0 1.1.1\4 de BODIPY 11 pendant 30 min à température ambiante, et pendant 30 min avec du TMRM à 0,10 pM), - Cy3/Cy5, - GFP/YFP, - GFP/DsRed, - Alexa 488/Alexa 568, - Alexa 546/Alexa 594, - Alexa 594/ Alexa 647, - Mitotracker Orange (CMTMRos)/MTG, - TMRM/Quantum Dot ayant une absorption à moins de 500 nm ou plus de 600nm et émission dans le spectre de l'accepteur ici TMRM (500-600 nm) comme par exemple Quantum Dot CdSE/ZnS, - TMRM/ Quantum Dot CdSE/ZnS couplé à des naoparticules (y- Fe2O3), - TMRM couplé directement à une source d'énergie ou une chaine de transmission énergie, - TMRM/TMRM modifié afin d'avoir un pic d'émission dans le pic d'absorption du TMRM et servir de donneur d'énergie. (Il est possible de modifier les cycles aromatiques pour changer la fluorescence par exemple, par méthylation de ces cycles ou interposition d'une chaine carbonée sur la chaine latérale. Bien entendu, cette liste n'est pas limitative, et l'homme de métier est capable d'adapter les combinaisons de son choix selon les types cellulaires souhaités. Selon un mode de réalisation avantageux, l'un des marqueurs peut être non fluorescent, mais capable de délivrer de l'énergie au marqueur fluorescent et entraîner l'augmentation de l'activité biologique du premier marqueur, entraînant par exemple l'augmentation de radicaux libres toxiques. Une telle approche permet de faciliter la purification des cellules plus résistantes. Dans un mode de réalisation préférentiel, l'invention concerne un procédé d'isolement des cellules neurales, dans lequel le marqueur sensible au potentiel de membrane et le marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres correspondent à un marqueur unique. En effet, il est possible de coupler chimiquement un marqueur sensible au potentiel de membrane avec : - un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries ou, - un marqueur permettant d'augmenter la production de radicaux libres, ou - un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et d'augmenter la production de radicaux libres. Par exemple, il est possible de concevoir un marqueur unique composé d'un premier marqueur sensible au potentiel de membrane et d'un second marqueur qui absorbe de l'énergie dans un spectre d'absorption donné, et la réémet dans un spectre d'émission compatible avec le spectre d'absorption du premier marqueur sensible au potentiel de membrane mitochondriale. De manière non limitative, un tel marqueur unique peut être par exemple le TMRM couplé chimiquement à un quantum dot. Le quantum Dot absorbe de l'énergie puis émet l'énergie dans le spectre d'absorption du TMRM par FRET. Cette délivrance d'énergie va s'accompagner d'une « suractivation » du TMRM avec une production très augmentée de radicaux libres par rapport à la production obtenue en l'absence du capteur d'énergie. L'invention concerne également un procédé d'isolement de cellules souches neurales et/ou cardiomyocytaires, tel que défini précédemment, ledit procédé comprenant : a. une étape d'incubation d'une population cellulaire avec i. soit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, ii. soit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, b. une étape d'incubation de la population cellulaire marquée à l'étape a), avec i. soit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, si au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie a été utilisé à l'étape a), ii. soit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, si au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres a été utilisé à l'étape a), et c. une étape d'isolement des cellules souches neurales et/ou cardiomyocytaires. L'invention concerne également un procédé d'isolement de cellules souches neurales et/ou cardiomyocytaires, tel que défini précédemment, ledit procédé comprenant : a. une étape d'incubation d'une population cellulaire avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, notamment le TMRM ou le TMRE, b. une étape d'incubation de la population cellulaire marquée à l'étape a), avec au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, notamment le MTG, et c. une étape d'isolement des cellules souches neurales et/ou cardiomyocytaires. L'invention concerne également un procédé d'isolement de cellules souches neurales et/ou cardiomyocytaires, tel que défini précédemment, ledit procédé comprenant : a. une étape d'incubation d'une population cellulaire, avec au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, notamment le MTG, et b. une étape d'incubation d'une population cellulaire préalablement prélevée avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, notamment le TMRM ou le TMRE, c. une étape d'isolement des cellules souches neurales et/ou cardiomyocytaires. Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé d'isolement de cellules souches neurales susmentionné, ledit procédé comprenant : a. une étape d'incubation d'une population cellulaire avec : i. simultanément au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, et au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, ou ii. si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres correspondent à un seul et même marqueur, avec ce seul et même marqueur, et b. une étape d'isolement des cellules souches neurales. Il est également possible dans l'invention de réaliser une étape préliminaire de marquage au TMRM, avant l'étape a) susmentionnée. Cette étape permet d'isoler des cellules marquées au TMRM. Les cellules sont alors mises en cultures, et/ou lavées dans un tampon approprié, pendant une durée d'environ 1 heure à environ 48 heures, préférentiellement d'environ 1 heure à environ 24 heures. Les cellules sont ensuite incubées selon l'étape a) susmentionnée. Avantageusement, l'invention concerne un procédé d'isolement de cellules souches neurales tel que défini précédemment, ledit procédé comprenant : a. une première étape d'incubation d'une population cellulaire avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, notamment le TMRM ou le TMRE, et b. une seconde étape de sélection de la population cellulaire présentant un marquage positif pour ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur, et c. une troisième étape d'incubation de la population cellulaire sélectionnée à l'étape b) avec au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, notamment le MTG, ladite troisième étape permettant d'obtenir une population marquée à la fois par ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et par le dit marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, et d. une étape d'isolement des cellules souches neurales présentant un marquage positif pour ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur, et un marquage positif pour ledit marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé d'isolement des cellules souches neurales tel que défini précédemment, dans lequel la population cellulaire sélectionnée à l'étape b) est incubée avec un marqueur sensible au potentiel de membrane mitochondriale, simultanément ou séparément de l'étape c). Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé d'isolement des cellules souches neurales tel que défini précédemment, ledit procédé comprenant : a. une première étape d'incubation d'une population cellulaire avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, notamment le TMRM ou le TMRE, et b. une seconde étape de sélection de la population cellulaire présentant un marquage positif pour ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur, et c. une troisième étape d'incubation de la population cellulaire sélectionnée à l'étape b) avec au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, notamment le MTG, ladite troisième étape étant différée d'au moins plusieurs heures, de préférence environ 24 heures, afin d'atténuer le marquage de la population cellulaire par ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie utilisé à l'étape a), de préférence d'environ 65%, et d. une étape d'isolement des cellules souches neurales présentant un marquage positif pour ledit marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres d'environ au moins 10 000 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur. Avantageusement, l'invention concerne un procédé d'isolement des cellules cardiomyocytaires tel que défini précédemment, ledit procédé comprenant : a. une première étape d'incubation d'une population cellulaire préalablement prélevée avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, notamment le TM:1M ou le TMRE, et b. une seconde étape de sélection de la population cellulaire présentant un marquage positif pour ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur, et c. une troisième étape d'incubation de la population cellulaire sélectionnée à l'étape b) avec au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, notamment le MTG, ladite troisième étape étant différée d'au moins plusieurs heures, de préférence environ 24 heures, afin d'atténuer le marquage de la population cellulaire par ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie utilisé à l'étape a), de préférence d'environ 65%, et d. une étape d'isolement des cellules cardiomyocytaires présentant un marquage positif pour ledit marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres d'environ de 100 à 1000 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur. Avantageusement, l'invention concerne un procédé d'isolement tel que défini précédemment, dans lequel soit l'étape de sélection d'une population cellulaire, soit l'étape d'isolement des cellules d'intérêt, soit les deux étapes, sont réalisées en utilisant un appareil de cytométrie en flux, de préférence un trieur de cellules. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel soit ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, soit ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, soit les deux, sont couplés à au moins une particule magnétique. Si le premier et/ou deuxième marqueur est couplé à une particule magnétique, il s'ensuit que les cellules positives ou doubles positives présentent un magnétisme plus important. Celles-ci peuvent être sélectionnées par rapport aux autres populations cellulaires en utilisant un champ magnétique, par exemple par l'intermédiaire d'une colonne d'affinité avec aimants. Les cellules mortes, quant à elles, vont relarguer les marqueurs et leur magnétisme va diminuer, elles ne seront donc pas sélectionnées. Dans le cas où le TMRM et le MTG sont couplés à des particules magnétiques, les cellules souche neurales, qui sont marquées au TMRM et au MTG, présentent le magnétisme le plus important et vont être sélectionnées préférentiellement. La fixation par les marqueurs étant réversible sur quelques jours, les particules sont relarguées et le magnétisme des cellules va diminuer par la suite. Sous cette forme l'invention est particulièrement adaptée à une application clinique car des appareils de tri cellulaire, utilisant des colonnes aimantées ou des champs magnétiques, permettent d'éviter tout contact entre les cellules et l'appareil. Il est possible de trier les cellules marquées avec un marqueur magnétique en utilisant la méthode décrite ci-dessous. 1) La population cellulaire est incubée avec le marqueur magnétique. 2) La population cellulaire incubée est placée dans un champ magnétique ou électromagnétique de faible ou forte intensité. 3) Les cellules marquées avec le marqueur magnétique sont chargées et vont donc se fixer sur les parois du support. 4) L'échantillon est lavé, et les cellules non chargées, qui ne sont pas fixées sur les parois, sont éliminées. 5) Du milieu est rajouté à l'échantillon ; 6) Le champ magnétique est arrêté et les cellules marquées sont resuspendues dans le 30 milieu. Dans un système de flux où les cellules sont en mouvement, les cellules marquées avec un marqueur magnétique peuvent être déviées selon leur charge, et donc selon leur marquage, afin d'être isolées. De manière non limitative, le coeur (core) des particules magnétiques est généralement composé de magnétite Fe304 comme le cobalt ferrite, ou de magnetite FeO3 comme le manganèse ferrite. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel ladite moins une particule magnétique est une nanoparticule présentant des propriétés superparamagnétiques. Sous la forme de nanoparticules, les métaux ferromagnétiques peuvent devenir superparamagnétiques. Les nanoparticules ne sont alors plus magnétiques en permanence, mais le deviennent uniquement en présence d'un champ magnétique. Le recours à ces nanoparticules superparamagnétiques limite donc l'apparition d'agrégats de particules et de cellules, et permet un marquage plus uniforme. Le couplage de nanoparticules superparamagnétiques à des marqueurs fluorescents est connu de l'homme du métier. Des nanoparticules d'oxide de fer superparamagnétiques peuvent par exemple être couplées à du TMRM (Maurizi et al., Langmuir, 25(16), 8857- 8859 (2009)). Les nanoparticules magnétiques peuvent également être couplées à des quantum dots, par exemple. Une nanoparticule ferromagnétique pouvant être couplée à un marqueur mitochondrial peut être par exemple le SPIO (SuperparaMagnetic Iron Oxide). Avantageusement, l'invention concerne un procédé d'isolement tel que défini précédemment, dans lequel soit l'étape de sélection d'une population cellulaire, soit l'étape d'isolement des cellules d'intérêt, soit les deux étapes, sont réalisées en utilisant un appareil de tri magnétique, de préférence une colonne aimantée. Un autre aspect de l'invention concerne un kit comprenant au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou le cas échéant d'augmenter la production de radicaux libres, ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres pouvant correspondre à un seul et même marqueur, de telle sorte que - si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres sont utilisés de manière simultanée, ou si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres correspondent à un seul et même marqueur, ledit procédé permet l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement de cellules souches neurales, et - si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries sont utilisés de manière séparée ou étalée dans le temps, ledit kit permet l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement de cellules souches neurales et/ou de cellules cardiomyocytaires. Avantageusement, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus dans lequel soit ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, soit ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, soit les deux, sont des marqueurs fluorescents. L'invention sera mieux illustrée par les 10 exemples et les 11 figures suivants. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES. Les figures 1A-1D représentent le marquage au TMRM des cellules embryonnaires 30 ES-D3 au 10ème jour de développement embryonnaire. La figure lA représente l'analyse par cytométrie de flux des cellules ES-D3. L'axe des Y représente la granulosité des cellules (SSC) et l'axe des X représente la taille des cellules. La fenêtre P1 représente les cellules sélectionnées. La figure 1B représente l'intensité de marquage TMRM de cellules issues de la fenêtre Pl, après un marquage de 30 min, à 37°C avec 50 nM de TMRM. L'axe des X représente la fluorescence TMRM, en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente le nombre de cellules. La figure 1C représente la fluorescence intrinsèque verte des cellules non marquées par le TMRM. L'axe des X représente la fluorescence TMRM, en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente le nombre de cellules. Le cadre indique l'intensité d'auto fluorescence. La figure 1D représente le marquage TMRM en fonction de l'auto fluorescence verte. Seules les cellules ayant une faible fluorescence verte (FITC) sont sélectionnées. L'axe des X représente la fluorescence verte intrinsèque, en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente la fluorescence TMRM en unité arbitraire logarithmique. Les cadres représentent les cellules fortement marquées au TMRM (high), moyennement marquées (mid) et faiblement marquées (low). Les figures 2A-2C représentent la caractérisation des cellules fortement ou moyennement marquées au TMRM. La figure 2A représente la variation d'expression de MHC (marqueur cardiaque) des cellules fortement marquées au TMRM (deuxième colonne) ou moyennement marquées (3ème colonne). La première colonne représente le marquage total dans les cellules au 10ème jour de différenciation. La figure 2B représente des cellules fortement ou moyennement marquées au TMRM, qui ont été remises en culture. Les amas correspondent à la réagrégation des cellules qui ont adhéré sur la plaque de culture. La figure 2C représente le résultat de la remise en culture des cellules faiblement marquées au TMRM. On constate qu'aucune cellule n'est capable de proliférer. Les cellules sont donc mortes. Les figures 3A-3C représentent la caractérisation des cellules souches neurales, fortement marquées au T1VIR1VI, après double marquage TMRM et MTG, séquentiel ou concomitant, à partir de cellules ES-D3 après 10 jours de développement. La figure 3A représente l'analyse par cytométrie de flux des cellules ES-D3 après marquage au TIVIRM. L'axe des X représente la fluorescence verte intrinsèque, correspondant à l'autofluorescence, l'axe des Y représente le marquage TIVIRM. Le cadre sélectionne les cellules fortement marquées au TMRM. La figure 3B représente les cellules issues du cadre mentionné à la figure 3A, et marquées 1 heure après avec du MTG. L'axe des X représente le marquage MTG, l'axe des Y représente le marquage TIVIRM. Les cellules entourées par l'ellipse dans le cadre indiqué « 2x pos » sont des cellules neurales et représentent 1,2% de la population (zone Q2). Les autres cellules sont essentiellement des cellules cardiomyocytaires mortes représentant 80% de la population cellulaire (zone Q3), ou des cellules dépolarisées ou en train de mourir qui représentant 18,4% de la population cellulaire (zone Q4). La figure 3C représente les cellules issues du cadre mentionné à la figure 3A, et marquées 1 heure après avec du MTG et du TIVIRM. L'axe des X représente le marquage MTG, l'axe des Y représente le marquage TMRM. Les cellules entourées par l'ellipse continue dans le cadre indiqué « 2x pos » sont des cellules neurales (zone Q2). Leur marquage TMRM est augmenté par phénomène de FRET (augmentation de la fluorescence rouge et diminution de la fluorescence verte). Le niveau de fluorescence sans FRET est indiqué par l'ellipse discontinue. La majorité des cellules est maintenant dans la zone Q3 correspondant aux cellules mortes, le nouveau marquage avec du TMRM/MTG n'a pas affecté la taille de la population neurale (zone Q2). La population majoritairement cardiomyocytaire a pratiquement disparue ( Les figures 4A-4C représentent la caractérisation des cellules souches neurales, moyennement marquées au TMRM, après double marquage TMRM et MTG, séquentiel ou concomitant, à partir de cellules ES-D3 après 10 jours de développement. La figure 4A représente l'analyse par cytométrie de flux des cellules ES-D3 après marquage au TMRM. L'axe des X représente la fluorescence verte intrinsèque, correspondant à l'autofluorescence, l'axe des Y représente le marquage TMRM. Le cadre sélectionne les cellules moyennement marquées au TMRM. La figure 4B représente les cellules issues du cadre mentionné à la figure 3A, et marquées 1 heure après avec du MTG. L'axe des X représente le marquage MTG, l'axe des Y représente le marquage TMRM. Les cellules entourées par l'ellipse dans le cadre indiqué « 2x pos » sont des cellules neurales et représentent 0,8% de la population cellulaire (zone Q2). Les autres cellules sont des cellules mortes représentant 96,6% de la population cellulaire (zone Q3) ou en train de mourir (2,9%) (zone Q4). La figure 4C représente les cellules issues du cadre mentionné à la figure 3A, et marquées 1 heure après avec du MTG et du TMRM. L'axe des X représente le marquage MTG, l'axe des Y représente le marquage TMRM. Les cellules entourées par l'ellipse continue dans le cadre indiqué « 2x pos » sont des cellules neurales (zone Q2). Leur marquage TMRM est augmenté par phénomène de FRET. Le niveau de fluorescence sans FRET est indiqué par l'ellipse discontinue. Les autres cellules sont principalement des cellules mortes représentant 97,9% de la population cellulaire (zone Q3). On constate que le TMRM est également particulièrement toxique vis-à-vis des cellules non cardiomyocytes de la préparation. Les figures 5A-5F représentent l'évolution du marquage TMRM au cours du développement. Les figure 5A, C et E représentent respectivement l'intensité de fluorescence TMRM de cellules ES-D3 après 0, 5 ou 10 jours de développement, lesdites cellules n'étant pas marquées avec du TMRM. L'axe des X représente la fluorescence TMRM, en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente le nombre de cellules. Les figure 5B, D et F représentent respectivement l'intensité de fluorescence TMRM de cellules ES-D3 après 0, 5 ou 10 jours de développement, lesdites cellules étant marquées avec du TMRM 50 nM, 30 min à 37°C. L'axe des X représente la fluorescence TMRM, en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente le nombre de cellules. Les figures 6A-6F représentent l'évolution du marquage MTG au cours du développement. Les figure 6A, C et E représentent respectivement l'intensité de fluorescence MTG de 15 cellules ES-D3 après 0, 5 ou 10 jours de développement, lesdites cellules n'étant pas marquées avec du MTG. L'axe des X représente la fluorescence MTG, en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente le nombre de cellules. Les figure 6 B, D et F représentent respectivement l'intensité de fluorescence MTG de 20 cellules ES-D3 après 0, 5 ou 10 jours de développement, lesdites cellules étant marquées avec du MTG 50 nM, 30 min à 37°C. L'axe des X représente la fluorescence MTG, en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente le nombre de cellules. La figure 7 représente le double marquage TMRM/MTG des cellules ES-D3 à 0 25 jours de développement. L'axe des X représente le marquage MTG, l'axe des Y représente le marquage TMRM. Les cellules dans les cadres Ql+Q'1, Q2+Q'2, Q3 et Q4 représentent respectivement 0,7%, 11.1%, 43,1% et 45,2%. Les cadres Q1 et Q2 représentent les marquages élevés au TMRM, les cadres Q'l et Q'2 30 représente les marquages TMRM intermédiaires. 10 La figure 8 représente le double marquage TMRM/MTG des cellules ES-D3 à 5 jours de développement. L'axe des X représente le marquage MTG, l'axe des Y représente le marquage TMRM. Les cellules dans les cadres Ql+Q'1, Q2+Q'2, Q3 et Q4 représentent respectivement 1,7%, 19.1%, 67% et 12,2%. Les cadres Q1 et Q2 représentent les marquages élevés au TMRM, les cadres Q'l et Q'2 représente les marquages TMRM intermédiaires. Les cellules indiquées par une ellipse sont des cellules neurales vivantes. La figure 9 représente le double marquage TMRM/MTG des cellules ES-D3 à 8 jours de développement. L'axe des X représente le marquage MTG, l'axe des Y représente le marquage TMRM. Les cellules dans les cadres Ql, Q2, Q3 et Q4 représentent respectivement 1,7%, 18,2%, 78% et 2,1%. Les cadres Q1 et Q2 représentent les marquages au TMRM intermédiaires. Les cellules indiquées par une ellipse sont des cellules neurales vivantes. Les cellules Q1+Q3+Q4 présentent un enrichissement des marqueurs MHC et GATA4, marqueurs cardiaques. Seules les cellules Q1 sont cultivables. Les cellules Q2 sont des cellules neurales vivantes et expriment fortement le marqueur 20 MASH1. Les figures 10A-10F représentent des cellules issues des fractions Q1-Q4 décrites dans la figure 9. 25 La figure 10A représente des cellules issues des fractions Ql, Q3 et Q4, après un jour de culture. La membrane cellulaire est altérée et les cellules ne sont pas adhérentes, il s'agit de cellules mortes. La figure 10B représente des cellules issues des fractions Ql, Q3 et Q4, après deux jours de culture. La membrane cellulaire est altérée et les cellules ne prolifèrent pas. 30 La figure 10C représente des cellules issues de la fraction Q2, après un jour de culture. Les cellules rondes réfringentes sont caractéristiques des cellules embryonnaires. Les cellules allongées réfringentes sont des cellules en division. La figure 10D représente des cellules issues de la fraction Q2, après deux jours de culture. La figure 10E représente des cellules issues de la fraction Q2, après un jour de culture en deux dimensions. La flèche indique un prolongement de type dendrite. La figure 10F représente des cellules issues de la fraction Q2, après deux jours de culture en deux dimensions. La flèche indique un prolongement de type axone. Les figures 11A-11D représentent le procédé de sélection de cellules cardiomyocytaires et neurales. La figure 11A représente la sélection des cellules sur la base du marqueur TMRM (voir figure 1D). L'axe des X représente la fluorescence verte intrinsèque, en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente la fluorescence TMRM en unité arbitraire logarithmique. La figure 11B représente le nombre de cellules issues de la population présentant un marquage TMRM élevé et qui présentent toujours un marquage élevé après culture pendant 24 heures sans TMRM. Elles représentent 34.7% de la population. L'axe des X représente le marquage TMRM en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente le nombre de cellules. La figure 11C représente le marquage MTG des cellules positives au TMRM de la figure 11B. Les cellules indiquées par l'ellipse 1 sont mortes, celles indiquées par l'ellipse 2 sont des cellules cardiaques, et celles indiquées par l'ellipse 3 sont des cellules neurales. L'axe des X représente le marquage MTG en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente le nombre de cellules. La figure 11D représente le marquage MTG des cellules de cellules issues de la population présentant un marquage TMRM intermédiaire et qui présentent toujours un marquage après culture pendant 24 heures sans TMRM. Les cellules indiquées par l'ellipse 1 sont mortes, par l'ellipse 2 sont une population mixte de cellules cardiaques et d'autres types cellulaires, et par l'ellipse 3 sont des cellules neurales. L'axe des X représente le marquage MTG en unité arbitraire logarithmique et l'axe des Y représente le nombre de cellules. EXEMPLES Exemple 1 : utilisation d'un marquage intra-mitochondrial relié au potentiel de membrane globale de la mitochondrie pour l'isolement de cardiomyocytes à partir de cellules embryonnaires de souris. Ce protocole est transposable à l'isolement de cardiomyocytes d'autres origines, notamment l'isolement de cardiomyocytes humains à partir de cellules embryonnaires humaines (cellules ES) ou à partir de cellules différenciées reprogrammées à un stade de totipotence (iPS). Ce protocole peut aussi être appliqué à des tissus ou des cellules isolées à partir de tissus. Dans les expériences suivantes les concentrations de TMRM utilisées ont été de 50 nM mais cela n'est qu'à titre indicatif. Des concentrations plus faibles de 10 nM, voire 0.1 nM, peuvent être utilisées et certains auteurs rapportent l'utilisation de concentration de TMRM et de MTG jusqu'à 500 nM, voire 1000 nM. Les durées d'incubation sont également à titre indicatif et dépendent de la température, du type de cellule, du tampon utilisé, de la volonté ou pas de saturer ou pas la fixation du marqueur pour avoir une répartition plus homogène ou pas. Quand les concentrations de marqueurs augmentent, la toxicité augmente, la spécificité diminue notamment pour leur relation ou pas avec le potentiel de membrane cellulaire. Il existe également une toxicité cumulée pour ces marqueurs. Comme cela avait été rapporté précédemment (cf. Hattori et al. Nature Methods 2010 vol? n1 61-69), les Inventeurs ont marqué des cellules embryonnaires de souris ES-D3 avec un marqueur fluorescent cationique methylester de tetramethylrhodamine (TMRM), comme par exemple T668 InvitrogenTM à 10 jours du développement embryonnaire. Les cellules ES-D3 (ATCC biological Ressource Center (Manassas, Virginia) ont été cultivées et amplifiées et maintenues indifférenciées sur des plaques de cultures. En présence de milieu de culture complet qui associe le milieu DMEM (high glucose Dulbecco' s modified eagle media, Gibco) avec 0.1 mM d'acides aminés non essentiels (Gibco), 0.1 mM beta Mercaptoethanol (Sigma), 100 microg/ml pénicilline et streptomycine (Invitrogène) et d'un inhibiteur de la différenciation (« Leukemia Inhibiting Factor ») (LIF) (1000 UT/mi) et de faible concentration de sérum de veaux foetal (5%). La différenciation est initiée en formant des corps embryonnaires qui sont des « clusters » de cellules. Le LIF est ensuite retiré et la concentration en sérum de veau foetal est portée à 20%. Le début de l'induction est considéré comme jour 0 (EBS jour 0); Les cellules dans la préparation sont non différenciées. Ce sont des cellules totipotentes qui expriment les marqueurs des cellules souches mais pas les marqueurs des cellules différenciées (Puceat M., Protocols for cardiac differenciation of embryonic stem cell, Methods 2008 ; Leschik J., Cardiac commitment of primate embryonic stem cells, Nature Protocol, 2008). La formation initiale de cette structure 3D comme les corps embryonnaires est une technique classique pour obtenir une induction des 3 feuillets du développement embryonnaire. Il existe cependant d'autres alternatives pour différencier les cellules sans former des corps embryonnaires en différenciant directement les cellules en culture 2D (Puceat M., Protocols for cardiac differenciation of embryonic stem cell, Methods 2008). Les cellules indifférenciées en culture sont mise en suspension en les traitant pendant 5 minutes avec de la trypsine EDTA avant d'être reprises dans le milieu de culture. Les corps embryonnaires sont obtenus en faisant des gouttes de cellules et de milieu (cf 800 cellules pour des gouttes de 20 microlitres) qui sont placées sur un couvercle inversé de boîte de culture pour 48h. Les corps embryonnaires sont transférés sur des plaques 2D peu adhérentes au deuxième jour du développement embryonnaire (EBS-D2). Au Sème jour, les corps embryonnaires vont être transférés sur des plaques très adhérentes du fait de la présence de gélatine. Les cellules vont être alors cultivées jusqu'au 10ème jour ou plus. En utilisant cette technique, les premiers marqueurs de transcription cardiaques apparaissent au 3ème jour avec des cellules différenciées. Ces cellules présentent des propriétés contractiles à EBS-day7-8 du fait de l'expression de protéines de l'appareil contractile des cardiomyocytes. Comme proposé par Hattori, les Inventeurs ont marqué les cellules à EBS day 10 avec du TMRM. Le 10ème jour correspond déjà à un stade tardif de la différenciation des cellules cardiaques puisque beaucoup de cellules cardiaques battent déjà. Le marquage en TMRM peut se faire sur le corps embryonnaire, l'embryon en entier ou après dissociation de l'embryon en cellules en suspension en utilisant des solutions enzymatiques ou pas. Dans le cas présent, les cellules ont été rincées avec du tampon PBS sans calcium, sans magnésium à pH 7.4, les cellules ont ensuite été dissociées pendant 15 min à 37°C avec de la trypsine EDTA. Les cellules sont reprises dans le milieu de culture pour au moins une 1/2 heure pour leur laisser le temps réparer les dommages causés par le traitement trypsique. Le temps de la dissociation va dépendre de l'état d'agrégation des cellules. La viabilité des cellules mesurée par marquage au bleu trypan est de plus de 80%. Les cellules vont alors être incubées en avec le marqueur TMRM (50 nM) à 37°C pendant 30 min dans l'incubateur. Cette concentration est celle utilisée précédemment par Hattori et al.. Il s'agit d'une concentration non toxique pour les cellules. Le marquage peut se faire dans des petits tubes avec 500 microlitres de milieu pour 1 million de cellule. A la fin de l'incubation, les cellules sont lavées deux fois avec du tampon TMRM (116 nM NaC1, 20 mM Hepès, 12,5 mM NaH2PO4, 5,6 mM glucose, 5,4 mM KC1 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) avant d'être analysées et éventuellement triées par cytométrie de flux . Irradiation des cellules au niveau du pic d'absorption du TMRM à 549 nM et analyse au niveau de son pic d'émission à 574 nM. Les incubations peuvent se faire en milieu de culture ou dans des tampons se rapprochant en composition ionique et éléments des milieux de culture comme par exemple le tampon TMRM. Certaines cellules ont une autofluorescence au niveau du vert FITC. Dans l'étude de Hattori, les cardiomyocytes étaient donc les cellules TMRM avec un niveau de fluorescence élevée et des cellules FITC négative. En effectuant les marquages TMRM ESD-3 à EBS jour 10, les Inventeurs ont obtenus des cellules marquées par le TMRM (TMRM positives) et des cellules non marquées (TMRM négatives). Parmi les cellules marquées, certaines présentent un niveau de marquage très élevé, mais aucune limite claire ne permet de séparer les marquages forts des marquages intermédiaires. (cf. figure 1). Pour permettre de savoir où se trouve la limite nous avons utilisé un marquage concomitant réalisé sur des cellules isolées à partir de digestion à la collagénase de tissu myocardique de souris. En utilisant des préparations de cardiomyocytes adultes de souris ou des lignées de cardiomyocytes humains, les Inventeurs ont défini une limite permettant de différencier les cellules fortement marquées par le TMRM des cellules présentant un marquage intermédiaire. Les compensations déterminées peuvent alors être utilisées pour d'autres expériences. Au moyen d'un cytomètre de flux, les cellules ont été triées et misées en culture séparément. (cf. figure 2). Les cellules TMRM négative sont des cellules mortes. Les cellules TMRM intermédiaire et élevée sont des cellules qui, en culture sur plaques de gélatine, ont la capacité de s'auto-agréger, ce qui est une caractéristique des cellules embryonnaires. Les proportions d'ARNm pour certains marqueurs de cellules cardiaques comme par 15 exemple le MHC par rapport à la quantité d'ARNm évaluée pour un marqueur non spécifique d'un type cellulaire donné, comme par le GAPDH, est augmenté dans la fraction TMRM élevée par rapport à la fraction TMRM intermédiaire plus de 5 fois. La fraction TMRM élevée est donc enrichie en cellules cardiaques (cf. figure 2). D'après 20 Hattori, 98% des cellules dans cette population sont des cardiomyocytes. En utilisant cette technique, Hattori n'ont pas été capable d'isoler des cardiomycytes à un temps plus précoce avec une bonne discrimination, quelque soit l'espèce considérée. Le marquage en utilisant un seul marqueur mitochondrial sensible au potentiel de membrane pour isoler cardiomyocytes reste un marquage difficile et ne permet pas 25 d'isoler facilement les progéniteurs des cardiomyocytes puisque l'isolement est relativement tardif Exemple 2: Méthode d'isolement de cellules souches neurales impliquant un transfert d'énergie entre les différents marqueurs. 30 Dans cet exemple, les Inventeurs montrent comment enrichir une population d'intérêt en utilisant un marqueur intracellulaire pour éliminer, par dépolarisation et/ou par mort cellulaire, les cellules qui ne sont pas recherchées et au contraire sélectionner les cellules. Cet exemple montre par ailleurs qu'il est possible d'isoler des cellules souches neurales à un stade du développement embryonnaire, où ces cellules ne sont pas prédominantes. Cette purification repose sur l'observation faite par les Inventeurs que les cellules neurales présentent des propriétés particulières pendant le développement embryonnaire. Comme indiqué précédemment, compte tenu de leur nombre élevé de mitochondries et de leur potentiel de membrane mitochondrial stable, les cellules neurales résistent à la toxicité des radicaux libres induits lors d'une stimulation du TMRM, tandis que les cardiomyocytes sont moins protégés. Les cellules totipotentes sont, elles, encore moins protégées vis-à-vis des radicaux libres. Cet exemple illustre également le phénomène de FRET entre les marqueurs MTG et TMRM. Les cellules ES-D3 à au 10ème jour de développement embryonnaire présentant un marquage au TMRM « élevé» ont été isolées. Cette fraction cellulaire est composée majoritairement de cardiomyocytes. Les Inventeurs ont effectué un deuxième marquage sur ces cellules pour quantifier la masse mitochondriales de ces cellules, marquage qui a été effectué de manière séquentielle dans le temps (cf. figure 3). Pour évaluer la masse mitochondriale, les Inventeurs ont utilisé une sonde mitochondriale fluorescente le MTG, qui est une sonde cationique qui diffuse librement à travers la membrane mitochondriale pour se fixer dans la mitochondrie en fonction du potentiel initial de la mitochondrie. Toutefois, contrairement au TMRM, la sonde MTG utilisée se fixe une fois à l'intérieur de la mitochondrie de manière covalente à la matrice mitochondriale de telle sorte que même si le potentiel de la mitochondrie change, le marquage ne va pas changer. La rétention du MTG dans la mitochondrie dépend principalement du potentiel initial de cette mitochondrie et du nombre de mitochondries. La fixation du MTG (Mitotracker Green MTG, comme par exemple mitotracker Green FM M-7514 InvitrogenTM) est fonction de la masse mitochondriale alors que celle du TIVIRM est fonction du potentiel de membrane. Pour le TMRM, la diffusion initiale est la même que le MTG pour ce qui est du potentiel de membrane, mais une fois dans la mitochondrie, il n'y a pas de fixation covalente, de telle sorte que si le potentiel change, il y a relargage du TMRM. La distribution du TMRM et du MTG à l'intérieur de la mitochondrie est identique. Cette proximité spatiale participe à l'échange d'énergie par FRET entre les deux marqueurs. Le MTG est donc proportionnel à la masse mitochondriale alors que le TMRM est proportionnel au potentiel de membrane. Si la cellule meurt, il y a perte du potentiel de membrane et destruction des membranes mitochondriales avec relargage du MTG et du TMRM. Par contre, si la cellule se dépolarise, il y a alors une diminution du potentiel de membrane avec une perte du TMRM, mais la fixation du MTG ne change pas. Il existe une toxicité cumulative des différents marqueurs. Jusqu'à 100 nM, la fixation du MTG est peu influencée par les variations du potentiel membranaire. Le TMRM permet de mesurer le potentiel global des mitochondries d'une cellule, mais sans mettre cette valeur en rapport avec le nombre de mitochondrie, il est impossible de savoir s'il s'agit d'un grand nombre de mitochondries avec un faible potentiel de membrane ou un nombre plus limité de mitochondrie mais avec un haut potentiel. Après tri à l'aide d'un cytomètre de flux, les cellules présentant un marquage TMRM élevé ont été reprises en milieu de culture pendantl heure afin de laisser aux cellules le temps pour récupérer. Cette incubation permet également au TMRM de ressortir des cellules qui se dépolarisent, notamment des cellules cardiaques, et ainsi protéger un certain nombre de cellules de la toxicité combinée du double marquage TMRM/MTG. Après 1 heure, les cellules ont été marquées avec du MTG 50 nM ajouté au milieu de culture pendant 1/2 heure à 37°C. Les cellules ont été lavées deux fois des cellules dans du tampon TMRM, puis analysées par cytométrie de flux. Deux sources d'énergie lumineuse ont été utilisées : 490 nM et à 549 nM et les fluorescences ont été analysées à 516 nM et à 574 nM (cf. figure 3). Deux populations de cellules sont visibles après un marquage TMRM puis MTG à une heure d'intervalle : - une population majoritaire de cellules TMRM négatives avec une fluorescence MTG de type intermédiaire ou basse, et - un groupe de cellule représentant quelques pourcent seulement de la population totale qui est un groupe de cellules à fluorescence TMTM élevée et avec une fluorescence MTG élevée également. Ce dernier groupe de cellules exprime les marqueurs des cellules neurales. Les cellules TMRM et MTG négatives sont des cardiomyocytes morts. Les cellules TMRM négatives et MTG intermédiaires sont des cellules dépolarisées possiblement en train de mourir. Toutes les cellules de la préparation étaient initialement des cellules avec un marquage 5 TMRM élevé et correspondant majoritairement à des cardiomyocytes. Les cardiomyocytes sont donc les cellules majoritaires de la préparation. Le fait que les cellules deviennent TMRM négatives signifie que suite au marquage MTG, les cardiomycytes se sont dépolarisés ou sont morts. Il est possible que les cardiomyoctes se soient dépolarisés spontanément. L'effet directe 10 du marquage MTG peut être mis en évidence, car si lors du marquage secondaire on utilise à nouveau une combinaison de TMRM avec du MTG au lieu de MTG tout seul on voit que l'effet de dépolarisation est encore plus marqué. La dépolarisation et la mort des cardiomyocytes est donc due à la présence de MTG dans la préparation sur des cellules préalablement marquée avec du TMRM. 15 Pour une même valeur de TMRM initiale, on constate que la quantité de MTG est plus importante dans les cellules neurales ce qui signifie que le potentiel de membrane de leur mitochondrie est plus faible que celui des cardiomyocytes. Les cellules neurales ont un potentiel de membrane qui reste stable puisqu'elles 20 maintiennent leur marquage TMRM même après un marquage MTG. Lors du second marquage, si au lieu de faire uniquement un marquage TMRM on effectue un marquage MTG et TMRM simultané (50 nM pour chaque marqueur), on constate qu'il existe : - une population de cellules TMRM négative MTG négative qui sont 25 majoritairement des cardiomyoctes morts et - une population de cellules dont la fluorescence MTG diminue légèrement et dont la fluorescente TMRM augmente beaucoup. Cette seconde population correspond à des cellules neurales qui reste polarisées et sont résistantes à la toxicité cumulée du double marquage TMRM/MTG. La diminution de la 30 fluorescence MTG au profit de la fluorescence TMRM est due à un transfert d'énergie entre le MTG donneur et TMRM accepteur (FRET). En présence de TMRM la fluorescence propre du MTG diminue et il y a transmission d'énergie sur le TMRM, très proche spatialement, et dont la longueur d'onde d'absorption est proche de la longueur d'onde d'émission du MTG. Exemple 3 : Utilisation de marqueurs intracellulaires pour faciliter l'isolement et l'enrichissement d'une population d'intérêt. Comme précédemment, les cellules ES-D3 EBS day 10 ont été marquées avec du TMRM 50 nM pendant 1/2heure à 37°C dans l'incubateur. Les cellules de niveau de fluorescence intermédiaire « TMRM intermédiaire » ont été isolées par sélection en cytométrie de flux avec tri cellulaire (cf. figure 4). Il existe actuellement des techniques de cytométrie pour trier des cellules et répondre aux exigences cliniques compatible avec leur utilisation chez l'homme, il existe également des techniques de purification à partir de particules magnétiques couplées à des marqueurs. Les cellules intermédiaires sont les cellules vivantes qui ne contiennent pas beaucoup de cardiomyocytes et qui sont dans la fraction à fluorescence TMRM intermédiaire. Cette fraction contient moins de 10% de cardiomyocytes et contient d'autres types cellulaires dont les cellules neurales. Les cellules TMRM intermédiaire vont être cultivées en milieu de culture. Si l'on pratique après 1 heure un marquage séquentiel avec le MTG 50 nM, on voit apparaître à nouveau deux populations, la première est TMRM intermédiaire et MTG élevé (zone Q2)et la seconde est TMRM basse et MTG intermédiaire ou négative (zone Q4 ou zone Q3). La population TMRM intermédiaire correspond à des cellules neurales. La population TMRM négative correspond à une population de cellules dépolarisées ou en voie de mort cellulaire car la combinaison séquentielle TMRM puis MTG après un intervalle de temps court est toxique pour la majorité des cellules de la préparation. Si maintenant, lors du second marquage, on marque les cellules TMRM intermédiaire avec un marquage MTG combiné au TMRM, on constate que l'effet néfaste sur une grande partie des cellules est encore accentué puisque pratiquement toutes les cellules deviennent TMRM et MTG négatives. Par contre il existe toujours le groupe de cellules dont la fluorescence MTG diminue un peu et dont la fluorescence TMRM est augmentée. Ce sont majoritairement des cellules neurales confirmées après tri sélectif Ce qui est avantageux dans cette méthode d'isolation, c'est que bien que l'on démarre d'une population avec une fluorescence TMRM intermédiaire initialement, on constate que l'association d'un marquage MTG avec un transfert d'énergie permet d'augmenter la fluorescence TMRM de ces cellules qui deviennent TMRM élevée comme le sont initialement les cardiomyocytes. Le niveau de fluorescence TMRM observé ne correspond pas à un haut niveau de potentiel de membrane de ces cellules mais à une fluorescence augmentée artificiellement par un mécanisme de transfert d'énergie entre les différents marqueurs utilisés. Cette augmentation de fluorescence facilite l'isolation des cellules neurales alors que dans le même temps la fluorescence TMRM des cellules non neurales est diminuée (cf. figure 4). Exemple 4 : Utilisation d'un marquage intracellulaire pour l'isolement de cellules neurales durant le développement embryonnaire. Actuellement, il n'existe pas de méthode simple permettant d'isoler des cellules neurales au sein d'une population de cellule embryonnaire. Les cellules souches totipotentes ES-D3 avant le début de différenciation (EBS jour 0), au 5' jour ou au 8' jour de la différenciation embryonnaire ont été marquées, ou non, 20 avec les marqueurs intracellulaires TMRM, MTG, ou TMRM et MTG de manière concomitante. Afin d'obtenir des cellules pouvant être analysées par cytométrie de flux, les cellules ont été détachées avec une solution de trypsine EDTA pendant 5 min. Dans le cas des cellules EBS-jour 0, une incubation de 30 minutes est nécessaire. 25 Pour les cellules EBS au jour 5, où les amas cellulaires sont très compacts et donc plus difficile à dissocier, l'incubation est de 10 min. Après dissociation, les cellules sont passées à travers un filtre de 70 micromètres qui permet de retenir les amas non dissociés et ne pas gêner l'analyse par cytométrie de flux. Le marquage est réalisé dans du milieu de culture pendant 30 min, à 37°C avec du 30 TMRM et du MTG à une concentration de 50 nM respectivement, puis les cellules sont lavées dans du tampon TMRM 2X et analysées par cytométrie de flux. L'irradiation des cellules avec les longueurs d'onde respectives du MTG et TMRM a été réalisée, et une analyse de la fluorescence dans le spectre d'émission du MTG et du TMRM a été effectuée. Une fenêtre d'analyse a été réalisée sur les cellules de la préparation d'après leur taille et leur granulosité. Des cellules non marquées ou marquées uniquement avec du TMRM et du MTG permet de définir la positivité pour chaque marqueur, et de réaliser les compensations nécessaires à une analyse correcte. On constate qu'au cours du développement embryonnaire, en suivant les marqueurs TMRM ou MTG, une proportion croissante de cellules exprime les marqueurs. Pour le TMRM, cela signifie qu'il se développe un groupe de cellules à haut potentiel de membrane, même si ce potentiel global est à rapporter à la masse mitochondriale pour connaitre le potentiel mitochondrial exact. Les cellules présentant un marquage TMRM élevé représentent de 10% de la population au jour 0, à 13% au jour 5 et 31% au jour 8 (cf. figure 5). L'augmentation de cette fluorescence peut être due au développement de cellules présentant beaucoup de mitochondries à haut potentiel de membrane, un faible nombre de mitochondries mais présentant un haut potentiel de membrane ou un grand nombre de mitochondries avec un faible potentiel de membrane. Lorsque les cardiomyocytes se développent, leur métabolisme passe de l'anaérobiose à aérobiose et leur potentiel de membrane augmente. Le marqueur MTG permet de quantifier la masse cellulaire. Les cardiomyocytes et les cellules neurales ont un niveau élevé de mitochondries. Ce qui est important dans ces expériences est la cinétique de ces différents évènements lors de la différenciation cellulaire. On constate également qu'au cours de la différenciation le nombre de cellules avec une masse mitochondriale importante augmente (cf. figure 6). Si l'on effectue un marquage concomitant TMRM et MTG au jour 0, au jour 5, et au jour 8, on constate très bien que dès le jour 0, il n'existe pas réellement de population visible (cf. figure 7). Par contre, au jour 5 (cf. figure 8), et au jour 8 (cf. figure 9), et donc très tôt dans le développement embryonnaire, une population présentant un double marquage TMRM et MTG apparaît (fraction Q2). L'expression combinée de ces deux marqueurs permet de séparer les cellules en voie de différenciation des cellules plus immatures totipotentes. Il est possible de trier ces cellules, ces dernières étant viables dans plus de 80% des cas après le tri. Pour les autres fractions TMRM positive MTG négatives (fraction Q1), TMRM négative MTG positive (fraction Q3) ou TMRM négative et MTG négative (fraction Q4) il n'est pas possible de cultiver les cellules dans le milieu de culture de différenciation des cardiomyocytes ou autre. La population double positive (fraction Q2) est une fraction composée de cellules vivantes enrichie en marqueur de cellules neurales (cf. figure 9).. Ceci est confirmé en mesurant par PCR quantitative l'expression du marqueur MASH-1, ce dernier étant exprimé plus de 20 fois par rapport aux cellules non neurales Il s'agit d'un enrichissement très important qui signifie que dans la fraction Q2, la majorité des cellules sont des cellules neurales. D'autres marqueurs tels que MHC et GATA4, spécifiques des cellules souches cardiaques, ne sont pas surreprésentés. Par contre si l'on considère les autres fractions, les marqueurs neuronaux sont diminués. Dans les fractions Ql, Q3 et Q4 les marqueurs cardiaques sont enrichis par rapport à la fraction Q2. La technique de sélection est intéressante, car elle permet de ne sélectionner que les cellules vivantes. En effet, le fait que les cellules aient un marquage TMRM positif signifie qu'elles ont un potentiel de membrane mitochondriale, donc une mitochondrie fonctionnelle, ce qui implique qu'elles soient vivantes. La méthode de sélection permet donc d'éliminer les cellules non recherchées tout en permettant une sélection positive des cellules d'intérêts sur la base de l'activité métabolique mitochondriale et de paramètres morphologiques, telle que la masse mitochondriale. Il n'y a donc pas nécessité d'associer cette technique à des marquages de viabilité cellulaire pour s'assurer que les marquages observés sont spécifiques et ne résultent pas d'une fixation non spécifique. Toutefois, cette méthode ne permet pas de sélectionner les cellules totipotentes. Les cellules neurales triées selon le procédé de l'invention adhèrent sur un support, tel qu'une boite de culture classique, et sans qu'il soit besoin d'ajouter au milieu des protéines permettant l'adhérence cellulaire (lamine, fibronectine, collagène ...) (cf. figure 10). Normalement, la différenciation des cellules neurales est difficile à obtenir sans avoir recours à des méthodes de culture très particulière. Les cellules peuvent être cultivées dans des milieux adaptés à la culture des cellules neurales ou à la culture des cardiomyocytes. De manière remarquable, près de 50% des cellules isolées sont des cellules en division. Certaines cellules sont biréfringentes, caractéristique des cellules embryonnaires peu différenciées. Après quelques jours en culture, des expansions cytoplasmiques caractéristiques de cellules type neuronal apparaissent tandis que d'autres cellules ont plutôt des caractéristiques de cellules gliales. Certaines cellules ont tendance à se réagréger spontanément. Après culture des cellules sur lame de verre et marquage par la « Nestine », la majorité des cellules sont positives pour la Nestine, ce qui confirme le phénotype de cellules souches neurales. Il est possible d'associer les cellules à des supports tridimensionnels comme des supports de collagène modifiés, ou non, avec des molécules d'adhésions supports et/ou protéoglycanes qui peuvent être réticulés, ou non, avec des agents non toxiques comme par exemple un réticulant chimique comme la génipine (tel que décrit dans la demande WO 2009/007531). Les marqueurs mitochondriaux employés TMRM et MTG ne sont pas spécifique d'espèces. Des résultats identiques peuvent être obtenus avec des cellules humaines type « ES » et « iPS ». Les cellules neurales peuvent également être identifiées à partir d'une préparation de tissu différencié. Exemple 5 : Méthode d'isolement de cellules à l'aide de marqueurs mitochondriaux pour obtenir une population cellulaire à malignité réduite. Généralement, les méthodes de tri cellulaire basé sur la détection de marqueurs de surface permettent de trier non seulement des cellules normales, mais également des cellules tumorales. Les techniques de manipulation génétique exposent également les cellules ainsi transformées à un risque de tumorigénicité augmentée. Le risque tumoral est un risque très important avec les cellules embryonnaires et il est intéressant d'utiliser des méthodes qui permettent de ne pas sélectionner de cellules tumorales. Les cellules tumorales sont souvent retrouvées dans les populations de cellules totipotentes. Il faut donc privilégier les techniques qui ne sélectionnent pas ces cellules. Le procédé selon l'invention pourrait être utilisé également pour contrôler des préparations de cellules souches neurales avant leur implantation obtenues avec les autres procédés. Les cellules isolées doublement positives pour les marqueurs TMRM et MTG ont été cultivées pendant une semaine, puis agrégées (1.9 x 105 cellules) et implantées dans des matrices de collagène dans les muscles spinaux de souris immunodéprimés NOD-SCID. Dans aucune des greffes il n'a été observé de tumeurs, même après 2 mois suivant l'injection. A l'inverse, 85% des souris greffées avec des cellules totipotentes indifférenciées ont développées des tumeurs. Exemple 6 : Méthode d'isolement de manière concomitante des cardiomyocytes et des cellules neurales, à l'aide d'un marquage séquentiel. Le but de ce procédé est de protéger les cardiomyocytes de la toxicité induite par l'un des marqueurs, notamment de la toxicité du TMRM lorsqu'il est associé au MTG. Pour ce faire, les cellules sont d'abord marquées par du TMRM, puis triées. Le Marquage TMRM, qui ne persiste qu'environ 24 heures, est alors éliminé, et les cellules TMRM positives sont marquées au MTG. Dans ces expériences, la population TMRM positive de départ est très largement enrichie en cardiomyocytes (TMRM élevée) comme décrit dans Hattori et al. (cf. figure 11). Au bout de 24h, 34% des cellules sont encore TMRM positives parmi les cellules TMRM présentant un marquage élevé. Après 48h, le pourcentage de cellules marquées au TMR diminue encore. Dès lors, il est possible de réaliser un second marquage au MTG (50 nM). De manière intéressante, 92% des cellules présentant un marquage TMRM élevé sont positives au MTG, voir même très positives pour ce marquage, avec des niveaux de fluorescences supérieures à 103. Alors que si le marquage MTG est effectué 1 h après le marquage TMRM, seules 18% des cellules présentant un marquage TMRM élevé sont positives pour le MTG. Si les marquages TMRM et MTG sont effectués de manière concomitante, seules 9,8% des cellules présentant un marquage TMRM élevé sont positives au MTG. Il existe d'autre part, en cas de marquage séquentiel, plusieurs niveaux de fluorescence MTG qui permettent d'isoler la population de cardiomyocytes. Le fait que les cellules isolées fixent le MTG signifie également que les cellules sont vivantes. Il existe d'autres approches qui peuvent être utilisées pour réduire la toxicité vis-à-vis des cardiomyocytes, par exemple l'utilisation d'agents bloquant la dépolarisation mitochondriales, d'agents diminuant la production de superoxide et /ou d'hydrogènes peroxides, d'agents antiapoptotiques. Par ailleurs, il est possible de combiner la méthode de l'invention avec des méthodes visant à augmenter la protection des cardiomyocytes en soumettant les cellules, avant le marquage, à un stress (hypoxie, hypoglycémie, température etc...) visant à augmenter les agents antiapoptotiques. Ces méthodes ont pour intérêt de permettre l'isolement de cardiomyocytes en diminuant les concentrations de TMRM et/ou de MTG. Il peut être également intéressant de protéger les cardiomyocytes par exemple en utilisant uniquement la longueur d'onde correspondant au deuxième marqueur MTG 490 nM et analyse à 516 nM et en irradiant pas les cellules sur la longueur d'onde du TMRM à 549 nM lors du deuxième tri cellulaire. On effectue alors un tri secondaire des cellules uniquement sur la fluorescence MTG à 516 nM. L'ordre des marquages peut être inversé même si la fluorescence MTG est plus prolongée que la fluorescence TMRM. La rapidité de libération des différents marqueurs en fonction du type de cellule et de son état de différenciation pourrait être utilisée pour identifier différentes populations d'intérêt pour un stade du développement donné. Les différentes méthodes peuvent être combinées. Exemple 7: Il est possible d'associer le procédé d'isolement de l'invention avec des méthodes classiques permettant de détecter des marqueurs antigéniques et/ou génétiques des cellules d'intérêt. Ces combinaisons (marquages selon l'invention et autres marquages) peuvent être simultanées, séparées ou étalées dans le temps, et ce de manière répétée une ou plusieurs fois au besoin. Il est possible par exemple de présélectionner des cellules souches neurales à l'aide d'un marqueur de différenciation déterminé, puis de mettre en oeuvre le procédé de l'invention afin d'éliminer les cellules susceptibles d'être tumorales récupérées lors du premier marquage. Grâce à ces combinaisons, il est possible de trier les cellules souches neurales ou peu tumorales, et de sélectionner au sein de ces cellules un type, ou plusieurs types, de cellules neurales de phénotypes différents (les astrocytes, les cellules gliales ou des neurones particuliers par exemple). Exemple 8 : Purification de cellules neurales à partir de cellules souches isolées de tissus La technique de préparation des cellules souches à partir de tissus est connue de l'homme du métier. De préférence, on choisit les tissus ou les compartiments d'organes qui ont été rapportés comme riches en cellules d'intérêt. Toutefois, certaines zones du tissu central ne sont pas forcement facile d'accès. Des méthodes de préparation de cellules neurales à partir de tissus plus accessibles comme le tissu dermique ont été décrites chez l'homme (Ernst et al., Exp. Dermatol. (6):549-55 (2010)). Il est également possible d'isoler ces cellules à partir de tissus pathologiques comme du tissu cutané cicatriciel (Yang et al., Tissue Engineering Part C : Methods 4 : 619-629 (2010)). On peut également privilégier les tissus dont certaines cellules dérivent des crêtes neurales comme les fausses nasales ou la pulpe dentaire, la muqueuse buccale, les follicules pileux, le sang comme du sang de cordon ombilical. Il est encore possible d'isoler des cellules souches neurales à partir de tissu adipeux (Ahmadi et al., Tissue and Cell, vol. 44 ; 2 : 87-94 (2012)) (Vindigni et al. Neural. Res. 5 August 2009). Un morceau de tissu neural est obtenu par biopsie avec un scapel et est digéré dans une solution mixte de Ham's/DMEM F12 (1:1) contenant de la papaïne (2.5 UT/mi), de la DNaseI, (250 UT/mi), de la dispase II (1UI/m1) incubée à 37°C. La solution d'arrêt est une solution mixte de HAM' s/DMEM avec 10% fetal bovine serum (FBS). Après dissociation, les cellules et les débris sont passés dans un filtre de 70 micromètres. Un enrichissement éventuel est possible en réalisant un gradient de Ficoll ou de Percoll. Les débris de myéline sur le dessus sont aspirés et les 2/3 de la fraction entre les globules rouges et la surface sont collectés. Les cellules sont lavées en PBS et le reste des globules rouges peut être éliminé en incubant la préparation avec du chlorure d'ammonium à température ambiante pendant 5 min. Les marquages peuvent être effectués en tout début de préparation, après isolation des cellules ou après culture. Pour des raisons de reproductibilité, il est préférable d'effectuer le marquage sur les cellules isolées. Les cellules sont incubées dans le tampon avec les marqueurs TM:1M 50 nM et MTG 50 nM pendant une demi heure à 37°C, puis les cellules sont lavées avant le passage en cytomètre de flux. La population neurale peut être isolée. L'autre possibilité et de mettre les cellules en culture et procéder au tri cellulaire plus tardivement sur une préparation enrichie en cellules neurales. On peut également enrichir la préparation en cellules en incubant avec les marqueurs et en irradiant dans le spectre du MTG. Les cellules sont alors cultivées en Ham's/DMEM F12 avec de la glutamine, N2 du supplément N2, du FGF-2 (20 ng/ml), de l'EGF (20 ng/ml) et de l'héparine (5 [tg/mi) sur des plaques de culture en plastique. Pour obtenir les cellules différenciées, les cellules sont cultivées dans le milieu de différentiation (N2 supplémenté avec du FBS 0,5% et de la forskoline 1 lag) sur des plaques couvertes d'un mélange polyornithine/laminine Exemple 9: Obtention de cellules pluripotentes à partir de cellules somatiques reprogrammées. Les cellules somatiques peuvent être reprogrammées à l'aide d'une construction génétique pour devenir des cellules pluripotentes. Ces cellules pluripotentes sont appelées iPS. Ces cellules peuvent être autologues. Elles ont la capacité de former différents types cellulaires dérivés des cellules souches neurales. La construction génétique pour leur reprogrammation peut être retirée mais ces cellules conservent un risque tumoral persistant. Des méthodes d'isolement de cellules neurales à partir de cellules pluripotentes ont été proposées avec des marquages de surface en utilisant une population CD184+(CXCR4)/CD271-/CD44- /CD24+ et en cultivant ces cellules en présence de facteurs de croissance comme FGF, EGF (Yuan et al., PLOS one, Vol.6, Issue 3, e17540 (2011)). Cependant, ces techniques ne permettent pas d'isoler directement les cellules neurales et nécessite une subculture qui peut altérer les propriétés des cellules et les rendre tumorales. De plus, le marqueur CD184 n'est pas spécifique des cellules neurales. Selon l'invention, les cellules neurales peuvent être isolées au sein d'une population de cellules iPS, permettant d'éliminer les cellules tumorales. Exemple 10 : Couplage d'un marqueur mitochondrial à un marqueur fluorescent comme un quantum dot et/ou une particule magnétique. Les marqueurs mitochondriaux utilisés dans l'invention peuvent être liés à la fois à des molécules fluorescentes, comme par exemple à des « quantum dots », et/ou à des microparticules ferromagnétiques, préférentiellement des nanoparticules, comme par exemple le SPIO (Superpara Magnetic Iron Oxide). Le marqueur TMRM peut être couplé avec un quantum Dot qui absorbe de l'énergie puis émet l'énergie dans le spectre d'absorption du TMRM et transmet cette énergie par FRET. Cette délivrance d'énergie va s'accompagner d'une « suractivation » du TIVIRM avec une production très augmentée de ROS par rapport à la production obtenue en l'absence du capteur d'énergie. Les techniques de fabrication des SPIO, comme par exemple la co-précipitation en phase aqueuse, sont bien connues de l'homme du métier (cf. Mossart R., IEEE trans. Magne. 1981 17, 1247-1248 ; L. Maurizi, Langmuir 2009, 25(16), 8857-8859 ; Wang D., University of New Orleans thèse 2005 :CDSE Quantum Dots and luminescent/magnetic particles for biological applications). Dans de nombreuses interactions chimiques, un groupe Fe-OH présent sur la particule ferromagnétique va être impliquée. Les particules SPIO sont neutres dans les conditions physiologiques et ont tendance à s'agglutiner. Pour limiter cette agglutination, différents polymères hydrophyliques peuvent être fixés à la surface des SPIO (Makhluf S., Nanotechnol. 2006, 2829-2840 ; Kohler N., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7206-7211). Le polyethylène glycol (PEG) est l'un des polymères couramment utilisés à cause de son hydrophobicité et de sa biocompatibilité. L'attachement covalent du PEG au SPIO stabilise le SPIO pour une période prolongée dans les conditions physiologiques (Lee H., Chem Soc. 2006 126, 7238-7389). En fonction du nombre de polymères (PEG)n, il est possible de modifier la taille du « spacer » entre le premier marqueur et la particule magnétique. Il existe différents type de PEG linéaires ou pas, dont les extrémités sont modifiées chimiquement pour interagir avec des groupements d'intérêt directement ou en utilisant un crosslinker. Il est facile de modifier les PEG pour réagir avec des groupements de type sulfuryl, amine, carboxyl, ou maleimide par exemple. Il est également possible de lier le PEG aux particules ferromagnétiques en utilisant une extrémité du PEG présentant un groupement particulier qui va se lier spontanément à la particule métallique. Il s'agit généralement de PEG avec un groupement Thiol à l'extrémité (PEG-Thiol) ou Lipoamide (PEG-lipoamide). Le groupement thiol va se lier par une liaison métaux-S-R directement pour le PEG-thiol ou « bidental métaux-S/S» pour le composant lipoamide. Le PEG thiol réagit principalement avec l'or. Le composant lipoamide interagit, quant à lui, avec la majorité des métaux comme l'argent, l'or et autres métaux. L'autre extrémité du PEG peut être protégée chimiquement par un groupement méthyl. Il est cependant possible de fonctionnaliser ce groupement méthyl en utilisant par exemple une longue chaîne de polyester type CT(PEG)n avec une exposition périodique de groupements carboxyliques à l'extrémité à la place duradical methyl. Ces groupements vont pouvoir être impliqués dans des réactions chimiques avec des groupement amine en utilisant des crosslinkers hétérobifonctionnels ou pas, comme EDC+/-NHS. Le PEG peut également être produit avec un groupement thiol ou lipoamide, à une extrémité, et, à l'autre extrémité, un groupement pour réagir avec un groupe sulfuryl, amine, carboxyl ou autre par interaction directe ou en utilisant un crosslinker. Les « crosslinkers » sont connus de l'homme du métier, tout comme les agents de couplage utilisés classiquement. Les quantum dots peuvent être préparés par différentes techniques bien connues de l'homme du métier (Wang D., CDSE Quantum Dots and luminescent/Magnetic Particles for biological applications, thèse Université de New Orleans, 2005; Boatman et al., a safer easier faster synthesis for CdSe Quantum Dot nonocrsytals, J Chem Educ, 82:16971699 (2005)). Le quantum Dot peut avoir des propriétés magnétiques par exemple. Il est possible 10 d'utiliser le TMRM couplé au Quantum Dot CdSE/ZnS modifié avec des molécules magnétiques type -Fe2O3. Le couplage de particules ferromagnétiques à des marqueurs fluorescents a été déjà démontré. (Massard R., IEEE Trans. Magn., 17:1247-1248, 1981). Les propriétés supramagnétiques sont intéressantes car les marqueurs ont alors une meilleure 15 biodistribution et pas de tendance à s'agglutiner. Pour lier un marqueur à une particule ferromagnétique, il existe de nombreuses façons. La première consiste à fonctionnaliser la particule en introduisant différents groupements, notamment carboxyliques, thiols, maleimides ou autres. 20 Il est possible d'introduire par exemple un ou plusieurs groupements « maleimide » sur des particules ferromagnétiques pour permettre l'interaction avec la molécule d'intérêt. Cette technique est utilisée pour fonctionnaliser les particules ferromagnétiques (Park J., Nat Mater, 3:891-895, 2004; Sun S., JAm Chem Soc, 126: 273-279, 2004 ; Xie J., JAm 25 Chem Soc, 130:7542-7543, 2008 ; Wang D., thèse Université de New Orleans, CDSE Quantum Dots and luminescent/Magnetic Particles for biological applications, 2005). Récemment, J. Xie a décrit une technique pour coupler des nanoparticules de très petite taille (quelques nm) à des particules de Fe304. La surface des particules de Fe304 a été fonctionnalisée en utilisant le « 4-methylatechol (4-MC) » comme surfactant. Le 4-MC 30 fixé au Fe304 a ensuite lié un groupement -NH2 porté par une molécule d'intérêt en utilisant la réaction de Mannich en présence de formaldehyde (Xie, J., J Am Chem. Soc, 130:7542-7543, 2008). Une autre technique classique consiste à utiliser des agents qui vont réagir avec les groupement Fe-OH pour introduire des groupement thiols ou carboxyliques qui sont plus réactifs. Un composant chimique classiquement utilisé est le « DMSA » (2,3- dimercaptosuccinic acid) (cf. Fauconier N., J Colloid Interfac Sci, 194:427-433, 1997; Roger J, Eur Phys J Apply Phys, 5:321-325, 1999 ; Wang D., thèse Université de New Orleans, CDSE Quantum Dots and luminescent/Magnetic Particles for biological applications, 2005). Couplage du TMRM au SPIO L'approche, ici utilisée pour le TMRM, peut être transposée à un autre marqueur mitochondrial. Le TMRM peut être modifié avec un accepteur donneur d'énergie et/ou des particules ferromagnétiques. La chaine de liaison entre le TMRM et le capteur d'énergie peut être modifiée pour transmettre cette énergie comme par exemple par transfert d'électron. Le TMRM peut être facilement modifié chimiquement pour l'introduction de groupements chimiques réactifs par l'homme du métier, comme par exemple via les groupements -COOCH3 pour le TMRM. Il est possible de fonctionnaliser la molécule SPIO avec différents groupes pour lier de manière spécifique le TMRM ou le marqueur fluorescent. La thiolisation de quantum Dot CdSE/Zn couplé à des particules ferromagnétiques a été décrite par thèse par Wang D. (thèse de l'Université de New Orleans, CDSE Quantum Dots and luminescent/Magnetic Particles for biological applications, 2005). Le TMRM appartient au groupe des marqueurs réactifs avec les thiols (« thiol reactive dye ») et va donc spontanément se lier à des groupements -SH. Ainsi, si les SPIO sont modifiés avec des groupements -SH comme après fonctionnalisation avec le DMSA, le TMRM va se lier aux groupements -SH. Il est possible de modifier les molécules TMRM pour introduire des groupes chimiques. Les molécules TMRM ont des groupements - COOCH3 et -COOCH2CH3 respectivement qui vont pouvoir être modifiés pour introduire par exemple des sites -NH2. Ces sites pourront alors se lier avec des sites NH2 ou -SH en utilisant des crosslinkers appropriés. Différents types de crosslinker peuvent être utilisés, comme par exemple des dérivés hétéro-bifonctionels tels que le SIA, le SPDP ou le maléimide NHS-PEG. Les « linkers » hétéro-bifonctionels vont reconnaître un motif -NH2 ou -SH. Les techniques de couplage sont bien connues de l'homme du métier. (cf MK Yu, Targeting strategies for multifunctional nanoparticules in cancer imaging and therapy, Theranostics, 2:1,3-30, 2012). Il est également possible d'utiliser des techniques de type « Click chemistry » ou « Hybridisation » (cf. MK Yu, Targeting strategies for multifunctional nanoparticules in cancer imaging and therapy, Theranostics, 2:1,3-30, 2012). La liaison entre le TMRM et le SPIO peut faire intervenir un spacer comme par exemple le PEG. Le TMRM peut être lié au SPIO par le biais de ce « spacer ». La molécule qui lui est attachée peut être un quantum Dot avec particule ferromagnétique et un capteur/donneur d'énergie à sa surface comme le CdSE/ZnS. Il est possible par le biais du spacer de grande taille de maintenir les particules ferromagnétiques à l'extérieur de la cellule alors que le TMRM va se fixer à l'intérieur de la cellule. Ce type d'approche est intéressant car il va limiter l'incorporation de matériel étranger dans la cellule. Lorsque la cellule se dépolarise, le TMRM va être relargué et la particule ferromagnétique va être libérée de la cellule. De manière alternative, il est aussi possible d'utiliser des nanoparticules métalliques, recouvertes de graphite, sur lesquelles il est possible de fixer de manière covalente les marqueurs mitochondriaux (Turbobeads). Couplage TMRM au QuantumDot CdSE/ZnS La surface des quantum Dot type CdSE/ZnS peut être modifiée avec différents ligands carboxyliques comme par exemple, l'acide mercaptoacetique ou l'acide mercaptosuccinique, ce qui les rend solubles dans l'eau et les rend biologiquement compatibles. Les quantum Dots peuvent alors être modifiés chimiquement pour introduire des groupements réactifs comme des groupements thiols par exemple (-SH). Il est alors possible de fixer sur ces groupements thiols des molécules chimiques d'intérêt comme par exemple le marqueur TMRM. Il est également possible de rendre ce quantum Dot magnétique en le faisant interagir par ces groupements avec des molécules ferromagnétiques comme par exemple des 5 molécules de type y-Fe203. Le TMRM peut dans ce cas être couplé au Quantum Dot type CdSE/ZnS. Pour créer ces groupement actifs sur les particules, les molécules (y- Fe2O3) sont reprises dans du DMSA (meso2,3-dimercaptosuccinic acid) et dans un solvant organique/inorganique (chloroforme :méthanol :eau 10/5/1) afin d'obtenir des groupements carboxyliques et thiols à la surface des particules magnétiques. Il est alors 10 possible de fixer le TMRM au Quantum Dot par le groupement thiol, puis de fixer le composé obtenu avec la particule magnétique, via les groupement thiols ou carboxyliques résiduels. Isolement des cellules neurales en utilisant le TMRM couplé au quantum dot CdSE/ZnS 15 magnétique Le spectre d'absorption des quantum dot CdSe est très large. Les quantum dots CdSe ont une absorption importante à moins de 600 nm, cette absorption diminue progressivement de 350 nm à 600, avec une légère réaugmentation autour de 550 nm. 20 Le spectre d'émission des quantum dot CdSe est beaucoup plus étroit avec une émission entre 500 et 600 nm (thèse de l'Université de New Orleans, CDSE Quantum Dots and luminescent/Magnetic Particles for biological applications, 2005). Pour les quantum Dot CdSe(ZnS)-thiol, le spectre d'émission est entre 525nm et 625 nm, légèrement inférieur à celui des nanoparticules magnétiques CdSe/ZnS. 25 Le spectre d'absorption du TMRM est 500-600 nm et son spectre d'émission est 550-700 nm. Le TMRM est donc capable d'absorber l'énergie émise par le quantum dot CdSe. Pour isoler les cellules neurales, les cellules sont d'abord incubées avec le marqueur unique : TMRM couplé au quantum dot CdSE/ZnS magnétique. Il est alors possible de 30 trier les cellules marquées positivement via une colonne aimantée (Pankhurst et al., Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine, J Phys D: Appl Phys, 36 :R167-R181, 2003; Zborowski et al., Magnetic cell sorting, Methods Mol Biol., 295:291-300, 2005; Ito et al., Medical application of functionalized magnetic nanoparticles, J Biosci Bioeng, 100(1):1-11, 2005; Sofarik et al., Use of magnetic techniques for the isolation of cells, Journal of Chromatography, 722:33-53, 1999). Les cellules marquées au TMRM sont alors irradiées dans le spectre d'absorption du quantum dot et/ou du TMRM. L'irradiation du quantum dot TMRM entraîne une stimulation plus intense du TMRM ce qui conduit à une augmentation de la production de radicaux libres, induisant parmi les cellules TMRM positives la mort des cardyomyocytes et une survie préférentielle des cellules neurales. Le tri cellulaire par magnétisme n'est donc pas indispensable et la possibilité d'une simple irradiation peut suffire pour enrichir la préparation en cellules neurales du fait d'une survie préférentielle de ces cellules vis-à-vis des radicaux libres par rapport aux autres types cellulaires. REVENDICATIONS1. Procédé d'isolement, de purification et/ou d'enrichissement de cellules, comprenant une étape de mise en contact d'une population cellulaire, ladite population cellulaire n'étant pas issue de la destruction d'embryon humain, avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou le cas échéant, d'augmenter la production de radicaux libres, ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres pouvant correspondre à un seul et même marqueur, de telle sorte que - si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres sont utilisés de manière simultanée ou si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres correspondent à un seul et même marqueur, ledit procédé permet l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement de cellules souches neurales, et - si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries sont utilisés de manière séparée ou étalée dans le temps, ledit procédé permet l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement de cellules souches neurales et/ou de cellules cardiomyocytaires. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel soit ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, soit ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, soit les deux, sont des marqueurs de type cationique.3. 4. 5. 6. 7. 8. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel soit ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, soit ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, soit les deux, sont des marqueurs fluorescents. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie est choisi parmi l'ester méthylique de tétraméthyle rhodamine (TMRM) et l'ester éthylique de tétraméthyle rhodamine (TMRE). Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres est choisi parmi les marqueurs de protéines mitochondriales, et les marqueurs de l'ADN mitochondrial. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres est du MTG . Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres permettent un transfert d'énergie de l'un à l'autre des marqueurs pouvant entraîner une production de radicaux libres. Procédé d'isolement de cellules souches neurales et/ou cardiomyocytaires, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit procédé comprenant : a. une étape d'incubation d'une population cellulaire avec i. soit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, ii. soit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres,b. une étape d'incubation de la population cellulaire marquée à l'étape a), avec i. soit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, si au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie a été utilisé à l'étape a), ii. soit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, si au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres a été utilisé à l'étape a), et c. une étape d'isolement des cellules souches neurales et/ou cardiomyocytaires. 9. Procédé d'isolement de cellules souches neurales selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit procédé comprenant : a. une étape d'incubation d'une population cellulaire avec, : i. simultanément au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, et au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou 20 d'augmenter la production de radicaux libres, ou ii. si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la 25 production de radicaux libres correspondent à un seul et même marqueur, avec ce seul et même marqueur, et b. une étape d'isolement des cellules souches neurales. 30 10. Procédé d'isolement de cellules souches neurales selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit procédé comprenant :a. une première étape d'incubation d'une population cellulaire avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, notamment le TMRM ou le TMRE, et b. une seconde étape de sélection de la population cellulaire présentant un marquage positif pour ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur, et c. une troisième étape d'incubation de la population cellulaire sélectionnée à l'étape b) avec au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, notamment le MTG, ladite troisième étape permettant d'obtenir une population marquée à la fois par ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et par le dit marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, et d. une étape d'isolement des cellules souches neurales présentant un marquage positif pour ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur, et un marquage positif pour ledit marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel la population cellulaire sélectionnée à l'étape b) est incubée avec un marqueur sensible au potentiel de membrane mitochondriale, simultanément ou séparément de l'étape c). 12. Procédé d'isolement des cellules souches neurales selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ledit procédé comprenant :a. une première étape d'incubation d'une population cellulaire avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, notamment le TMRM ou le TMRE, et b. une seconde étape de sélection de la population cellulaire présentant un marquage positif pour ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur, et c. une troisième étape d'incubation de la population cellulaire sélectionnée à l'étape b) avec au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, notamment le MTG, ladite troisième étape étant différée d'au moins plusieurs heures afin d'atténuer le marquage de la population cellulaire par ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie utilisé à l'étape a), et d. une étape d'isolement des cellules souches neurales présentant un marquage positif pour ledit marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres d'environ au moins 10 000 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur. 13. Procédé d'isolement des cellules cardiomyocytaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ledit procédé comprenant : a. une première étape d'incubation d'une population cellulaire préalablement prélevée avec au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, notamment le TMRM ou le TMRE, et b. une seconde étape de sélection de la population cellulaire présentant un marquage positif pour ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, de préférence environ au moins 100 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur, etc. une troisième étape d'incubation de la population cellulaire sélectionnée à l'étape b) avec au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, notamment le MTG, ladite troisième étape étant différée d'au moins plusieurs heures afin d'atténuer le marquage de la population cellulaire par ledit marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie utilisé à l'étape a), et d. une étape d'isolement des cellules cardiomyocytaires présentant un marquage positif pour ledit marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres d'environ de 100 à 1000 fois supérieur au niveau de marquage des cellules considérées comme non marquées par ledit marqueur. 14. Procédé d'isolement selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, dans lequel soit l'étape de sélection d'une population cellulaire, soit l'étape d'isolement des cellules d'intérêt, soit les deux étapes, sont réalisées en utilisant un appareil de cytométrie en flux, de préférence un trieur de cellules. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel soit ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, soit ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, soit les deux, sont couplés à au moins une particule magnétique. 16. Procédé d'isolement selon la revendication 15, dans lequel soit l'étape de sélection d'une population cellulaire, soit l'étape d'isolement des cellules d'intérêt, soit les deux étapes, sont réalisées en utilisant un appareil de tri magnétique, de préférence une colonne aimantée.17. Kit comprenant au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou le cas échéant d'augmenter la production de radicaux libres, de telle sorte que - si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres sont utilisés de manière simultanée, ledit kit permet l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement de cellules souches neurales, et - si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres correspondent à un seul et même marqueur, ledit procédé permet l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement de cellules souches neurales, et - si ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie et ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries sont utilisés de manière séparée ou étalée dans le temps, ledit kit permet l'isolement, la purification et/ou l'enrichissement de cellules souches neurales et/ou de cellules cardiomyocytaires. 18. Kit selon la revendication 17 dans lequel soit ledit au moins un marqueur sensible au potentiel de membrane de la mitochondrie, soit ledit au moins un marqueur permettant de quantifier le nombre de mitochondries et/ou d'augmenter la production de radicaux libres, soit les deux, sont des marqueurs fluorescents.25