Brevet FR3004462A1 — publié le 20141017

Production commerciale de peptidases ClA par expression transitoire chez les plantes La présente invention se rapporte à une cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une peptidase C lA liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, afin d'exprimer par expression transitoire une peptidase C lA mature et active dans la plante. Les protéases ont une place prépondérante sur le marché mondial des enzymes, estimé à environ US$ 3 milliards (Leary et al., 2009, Mar Policy 33, 183-194), car elles jouent un rôle important dans la biotechnologie. En effet, d'une part, les protéases interviennent en tant que molécules d'intérêt, en tant que telles ; d'autre part elles permettent de réaliser des clivages protéolytiques qui modifient les propriétés chimiques, physiques, biologiques et immunologiques des protéines. Ainsi, les protéases sont des enzymes parmi les plus importantes, en raison de leurs multiples applications dans les industries alimentaires (brasserie, viandes, produits laitiers, présure), pharmaceutiques et l'industrie des détergents (Doran, 2002, Plant biotechnology and transgenic plants. New York; Mercel Dekker inc,; 143-163). Parmi les protéases les plus couramment utilisées, on trouve les peptidases de la famille ClA. Les peptidases C lA (ou protéases C 1A) sont des protéases à cystéine (CysProt), également connues sous le nom de thiol protéases, largement distribuées parmi les organismes vivants. Ainsi on les retrouve chez les procaryotes et les eucaryotes (par exemple les bactéries, les parasites, les plantes, les invertébrés et les vertébrés). Le mécanisme catalytique de ces enzymes implique une cystéine dans le site actif. La papaïne, enzyme végétale, est le membre le plus étudié parmi les protéases à cystéine. Un grand nombre de CysProt ont été isolées à partir des plantes, comme l'actinidine, la protéinase 52,, la chymopapaïne et la bromélaïne. Les CysProt les plus utilisées sont les enzymes lysosomales telles que les caspases, les enzymes vacuolaires telle que la papaïne, l'actinidine et la bromelaine, et enfin les protéases de type cathepsines (Palma et al., 2002, Plant Physiol. biochem, 40: 521-530). Cette famille de protéases est une cible potentielle de médicaments pharmaceutiques pour traiter des maladies caractérisées par une dégradation excessive de la matrice extracellulaire telles que l'ostéoporose, l'arthrite, les maladies vasculaires et le cancer. Elles ont également été identifiées comme des acteurs essentiels de la croissance, de la différenciation cellulaire, de la signalisation, et de l'invasion de l'hôte par divers agents pathogènes de l'homme, notamment des parasites pathogènes causant le paludisme, la maladie de Chagas et la schistosomiase. Enfin, les peptidases de la famille C lA constituent également le groupe 1 des allergènes et sont reconnues comme des allergènes majeurs. A ce titre, elles sont actuellement une cible pour le traitement des allergies par désensibilisation (Lecaille et al., 2002, Chem Rev, 102: 4459-4488 et McKerrow et al., 2006, Annu Rev Pathol, 1: 497-536). Les CysProt partagent des caractéristiques communes. Ainsi, toutes les protéases C lA présentent des ponts disulfures nécessaires pour leur structure fonctionnelle ; elles contiennent une triade catalytique formée par trois résidus d'acides aminés conservés (Cys, His et Asn), et un résidu Gln impliqué dans le maintien de la conformation de l'enzyme sous forme active. Les CysProt sont synthétisées sous forme de précurseurs inactifs ou peu actifs (préproprotéines) pour empêcher la protéolyse inappropriée. La préproprotéine comprend un peptide signal, un propeptide N-terminal de 130 à 150 acides aminés, et la protéine mature d'environ 220 à 270 acides aminés. L'activation de ces protéases a lieu soit sous l'action d'enzymes de maturation, soit par autocatalyse. L'activation a lieu par protéolyse intra- ou intermoléculaire contrôlée, en particulier par clivage du propeptide inhibiteur (Wiederanders et al. 2003, Current Protein and Peptide Science, 4, 309-326). Ce propeptide joue ainsi un rôle important en tant que modulateur de l'activité de la protéase, afin de garantir que la protéase soit maturée au bon endroit et/ou au bon moment (Demidyuk et al. 2010, J. Biol. Chem, 285, 2003-2013). À ce jour, de nombreux efforts ont été réalisés pour exprimer les CysProt sous forme recombinante dans une grande variété de systèmes d'expression (Brômme et al., 2004, Methods, 32, 199-206). Ces travaux ont très souvent conduit à des échecs compte tenu de la structure complexe des peptidases de la famille ClA. Il existe donc un besoin pour produire les CysProt, et notamment les peptidases C 1A, sous forme recombinante, et ce de façon reproductible et efficace (avec un bon rendement). Il 30 existe également un besoin pour produire des peptidases C lA à des niveaux commercialement et économiquement acceptables. De façon surprenante étant donné leur toxicité in vivo, les inventeurs ont maintenant découvert que la production de peptidases C lA sous forme recombinante est possible, par expression transitoire chez les plantes. Cette production, qui se fait dans une cellule végétale, permet l'obtention d'une peptidase C lA sous forme mature et active, avec un bon rendement, de façon très simple et reproductible. En outre, la peptidase C lA obtenue n'est pas contaminée par des protéases et/ou d'autres contaminants d'origine animale. Les inventeurs ont ainsi pu obtenir une production, à des niveaux commercialement acceptables, de plusieurs peptidases ClA. L'invention a donc pour objet une cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une peptidase C lA liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S. La molécule d'ADN liée au promoteur fort permet d'exprimer de façon transitoire une peptidase C lA mature et active dans la cellule. De préférence, ladite cellule végétale est une cellule de Nicotiana benthamiana. L'invention a également pour objet une plante comprenant au moins une cellule végétale selon l'invention. Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé de production d'une peptidase C 1A, comprenant l'expression de ladite peptidase C lA dans une cellule végétale selon l'invention, ou dans une plante comprenant une telle cellule. Un autre objet de l'invention se rapporte à une peptidase C lA susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, avec une cellule végétale selon l'invention, ou avec une plante selon l'invention. La peptidase ainsi obtenue peut être utilisée comme médicament. Elle peut également être utilisée dans le diagnostic d'allergies, et être intégrée dans un kit de diagnostic d' allergies . La cellule végétale selon l'invention comprend une molécule d'ADN liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S. Par « lié de manière fonctionnelle », on entend que la molécule d'ADN est fusionnée avec le promoteur fort, de telle sorte que le promoteur fort induise la transcription de la molécule d'ADN. Cela permet l'expression de ladite molécule d'ADN sous forme transitoire, i.e. sans intégration de l'ADNc dans le génome de la cellule végétale. En effet, l'utilisation de l'expression transitoire dans une cellule végétale ou une plante selon l'invention permet d'augmenter les rendements de production des protéases C lA sous forme active jusqu'à des niveaux élevés, compatibles avec une exploitation commerciale, mais incompatibles avec la survie d'une plante qui exprimerait ces protéases toxiques de façon stable. Cette toxicité pour l'hôte d'expression est notamment illustrée par l'impossibilité de produire la protéase Der pl sous forme active chez la levure P. pastoris ou chez la bactérie E. coli. Dans le cas d'une expression transitoire, la récolte de la biomasse végétale a lieu lors du pic d'expression de la protéine recombinante, i.e. typiquement 4 à 6 jours après la transfection. Dans un mode de réalisation préféré, la peptidase C lA est choisie parmi les peptidases C lA d'acariens et les peptidases C lA végétales. De préférence, la peptidase C lA d'origine végétale est une peptidase C lA d'Asteraceae ou de Fabaceae. Les gènes codant pour les peptidases C lA sont bien connus. Ainsi, un grand nombre de ces gènes ont été clonés et caractérisés (http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=C1). A titre d'exemple, parmi les quelque 800 protéases codées par les génomes de plantes, plus de 140 correspondent à des cystéine-protéases (CysProt) qui peuvent être regroupés en 15 familles et en 5 clans (Rawlings et al. 2010, Nucleic acids Res, 38, D227-233), dont les papaïne-protéases C lA (clan CA, famille Cl, sous-famille C 1A), encore subdivisés en protéines de type cathepsine L, B, H ou F en fonction de leurs structures génétiques et des relations phylogénétiques (Martinez and Diaz , 2008, BMC Evol Biol, 8, 198-209). Plus préférentiellement, la peptidase C lA est choisie parmi Der pl (peptidases C lA du groupe 1 de Dermatophagoides pteronyssinus), Der fl (peptidases C lA du groupe 1 de Dermatophagoides farinae), Eur ml (peptidases C lA du groupe 1 de Euroglyphus maynei), PEPC1 (Cysteine peptidase - CysP d'Aster tripolium), SH-EP (Sulfhydryl-endopeptidase- vignain de Vigna mungo), AMB (peptidases C lA d'Ambrosia artemisiifolia, d'Ambrosia psilostachya et d'Ambrosia trifida) et les protéines présentant au moins 70%, de préférence au moins 80%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 99% d'identité avec l'une de ces dernières. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, J. Mol Evol., 18:38-46), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). La molécule d'ADN comprend au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine de la peptidase ClA. La préproprotéine de la peptidase C lA comprend un peptide signal, un propeptide et la protéine mature C 1A. La séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine selon l'invention comprend donc une séquence codant le peptide signal, une séquence codant le propeptide et une séquence codant la protéine mature C lA. Le peptide signal est notamment tout peptide signal reconnu par la cellule végétale, provenant ou non d'une peptidase C 1A. Il cible notamment la peptidase C lA dans le milieu intercellulaire. De préférence, le peptide signal est celui de la chitinase de tabac, ou le peptide signal naturel de la peptidase. Le propeptide est, quant à lui, issu d'une peptidase C 1A. Le propeptide contient le motif GxNxFxD qui semble être essentiel pour un clivage correct de la forme précurseur de la protéase. La signature non contiguë ERFNIN (Ex3Rx3Fx3Nx3I/Vx3N) est spécifique des cathepsines L et H-like, alors que l'on observe une signature ERFNAQ chez la cathepsine Flike. Cette signature est de fonction inconnue (Grudkowska et Zagdanska 2004, Acta Biochim Pol, 51:609-624 Martinez and Diaz, 2008,BMC Evol Biol, 8, 198-209). En revanche, les protéases de type cathepsine B ne portent pas cette signature (Wiederanders 2003, Current Protein and Peptide Science, 4, 309-326; Martinez Diaz et 2008, BMC Evol Biol, 8, 198209). En outre, certaines cathepsines L peuvent également contenir une extension C-terminale, qui comprend une région riche en Pro et un domaine granuline présentant une forte homologie avec les protéases de la famille épithéline/granuline des animaux (Yamada et al. 2001, Plant Physiol, 127: 1626-1634). Dans un mode de réalisation préféré, la séquence nucléotidique hétérologue selon l'invention comprend, comme propeptide, un propeptide de peptidases C 1A, notamment d'acariens. De préférence, le propeptide de la préproprotéine de la peptidase C lA est le propeptide naturel ou le propeptide muté ou non de Der pl. Selon l'invention, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine peut être obtenue à partir d'un gène connu déjà cloné codant pour une peptidase C 1A, ou bien par criblage d'une banque d'ADNc avec des anticorps anti-protéase. Les méthodes utilisées sont bien connues de l'homme de l'art, et incluent notamment l'identification du gène par hybridation avec des sondes, PCR, séquençage et clonage moléculaire. Il est également possible de synthétiser le gène pour refléter l'utilisation des codons préférés chez les plantes ; dans ce cas, on parle d'optimisation de codons, souvent utile pour une forte expression des protéases sélectionnées (Murray et al, Nucleic Acid Res. 17:477 498 (1980)). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine est liée à une séquence (appelée séquence d'adressage) permettant de cibler un compartiment de stockage de la peptidase C 1A, afin de contrôler sa maturation. Cette maturation est nécessaire pour l'obtention des protéases sous forme active. Elle comprend en particulier le clivage protéolytique du propeptide N-terminal ; ce dernier a lieu lorsque la préproprotéine de la peptidase C lA est exprimée chez les plantes. Au contraire, il n'est pas effectué dans les systèmes de production bactériens ou de levures. Dans un mode de réalisation préférée de la présente invention, la peptidase C lA est produite en fusion avec son propre propeptide ou en fusion avec le propeptide de la peptidase C lA d'acariens, afin d'augmenter les rendements de production de la protéine. De préférence, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine selon l'invention comprend en outre une séquence peptidique d'adressage intracellulaire. De préférence, cette séquence peptidique d'adressage cible la peptidase C lA sous forme soluble ou membranaire vers le réticulum endoplasmique ou les différents compartiments constitutifs du système endomembranaire de sécrétion de la cellule végétale. De préférence, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine selon l'invention est mutée afin de contrôler la maturation de la protéase. Dans ce cas, elle peut être mutée de manière à bloquer le clivage protéolytique, par exemple en utilisant une version modifiée du propeptide de Der pl, le propeptide-Lys, où le dernier acide aminé est muté en Lys; ou bien mutée de manière à contrôler la cinétique de clivage de ce propeptide en utilisant le propeptide-Gly, issu du propeptide de Der pl mais après mutation de l'asparagine du site de glycosylation en glutamine. De préférence, le propeptide peut donc être choisi parmi le propeptide de Der pl où le dernier acide aminé est muté en lysine, et le propeptide de Der pl où l'asparagine du site de glycosylation est mutée en glutamine. Une fois que le gène d'intérêt a été isolé et modifié pour contenir tout ou partie des modifications décrites ci-dessus et obtenir la séquence nucléotidique hétérologue, cette dernière est placée dans un vecteur d'expression par des méthodes classiques. La sélection d'un vecteur d'expression approprié dépendra de la méthode d'introduction du vecteur d'expression dans des cellules hôtes. Un vecteur d'expression typique contient des éléments d'ADN procaryote codant pour une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique à fournir pour la croissance et la sélection du vecteur d'expression dans l'hôte bactérien, un site de clonage pour l'insertion d'une séquence d'ADN exogène codant pour la protéase; des éléments d'ADN eucaryotes comme une séquence d'initiation de la transcription du gène exogène, comme un promoteur, et des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquence de terminaison / polyadénylation séquences et une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing. Il contient également des séquences telles que des t-DNA qui sont nécessaires pour l'intégration d'un morceau d'ADN dans la plante. De préférence, le vecteur d'expression est pAG01. Les promoteurs utilisés pour contrôler l'expression de la protéase sont des promoteurs forts, et peuvent être des promoteurs de gènes de plantes, tels que par exemple, le promoteur de l'ubiquitine, le promoteur de la petite sous-unité de la ribulose-1, 5-bis-phosphate carboxylase, des promoteurs d'Agrobacterium tumefaciens, les promoteurs de la nopalinesynthase et de l'octopine synthase, ou encore des promoteurs viraux comme les 19S et 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV). De préférence, le promoteur fort est le 35S. L'expression élevée et la qualité des peptidases recombinantes produites dans l'invention permettent de concevoir une production commerciale des protéases C 1A. En effet, la peptidase C lA est typiquement exprimée en une quantité égale à au moins 0,1 % des protéines solubles totales de la plante, mais souvent en une quantité beaucoup plus élevée, pouvant atteindre 5 à 10%. La plante comprenant les cellules végétales selon l'invention peut être une plante entière, mais peut également être une partie de plante, telle que des feuilles. La plante ou les cellules végétales selon l'invention peuvent être utilisées en tant que telles, comme médicament. A titre d'exemple, lorsque la protéase C lA est utilisée comme une enzyme digestive, il peut être particulièrement avantageux de nourrir directement l'animal par la plante exprimant cette protéase. Dans d'autres applications, la protéase recombinante est purifiée après extraction à partir de la plante ou des cellules végétales qui l'expriment. Afin de faciliter sa purification, la protéase pourra être exprimée en fusion avec des tags (His6, GST, MBP, FLAG etc..) qui seront localisés de préférence en position N- ou C-terminale de la protéine mature. La peptidase C lA susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, avec une cellule végétale selon l'invention, ou avec une plante selon l'invention, peut être utilisée comme médicament. Elle peut également être utilisée dans le diagnostic d'allergies, notamment d'allergies aux acariens ou d'allergies à certaines plantes. L'invention a donc également pour objet un kit de diagnostic d'allergies, comprenant la peptidase selon l'invention, et des moyens de mesure des anticorps dirigés contre cette peptidase. Les méthodes générales de culture de plantes, ainsi que les procédés pour introduire des vecteurs d'expression dans un tissu végétal, sont à la disposition de l'homme de l'art. Ils sont variés et dépendent de la plante sélectionnée. De préférence, les plantes seront cultivées selon les techniques propres à la plateforme Allergopur. Ce procédé de production de protéines recombinantes est décrit dans la demande FR1255510, et comprend une première étape de culture de la plante, en aéroponie ou en hydroponie, de préférence culture sur flotteur libre, et sous éclairage LEDs. Après cette première étape, notamment cinq semaines de culture en hydroponie sur des flotteurs libres, l'agroinfiltration des plantes est réalisée sous vide, par des agrobactéries comprenant un fragment d'ADN codant pour la protéase C lA recombinante. Cette étape d' agroinfiltration peut être mise en oeuvre par tout moyen permettant de faire le vide. De préférence, dans le procédé utilisé selon l'invention, elle est réalisée sous vide par effet Venturi. Parmi les agrobactéries utilisables selon l'invention, on peut citer de préférence, les souches LBA4404, GV3101, EHA 101/105 ou C58. Une fois l'étape d' agroinfiltration réalisée, les plantes sont typiquement égouttées tête en bas pendant 15 minutes, puis remises en culture, typiquement 4 à 6 jours, idéalement en assurant une brumisation fréquente de ces dernières pendant les 6 premières heures de culture qui suivent l'agroinfiltation. Enfin, la protéine est extraite et purifiée. Les exemples qui suivent, illustrent, mais ne visent pas à limiter la portée de l'invention. Il sera évident pour l'homme de l'art que des variantes et modifications sont possibles et entrent dans le cadre et l'esprit de l'invention. Les légendes des figures sont les suivantes : Figure 1 : Représentation schématique des différentes cassettes permettant de produire une peptidase C lA mature et active en utilisant soit le peptide signal et le propeptide naturel de la protéine (A), soit le peptide signal de la chitinase de tabac et le propeptide de Der pl (appelé aussi DP1) (P08176) afin d'augmenter les rendements (B), soit le peptide signal de la chitinase de tabac et le propeptide Der pl modifié par insertion d'une lysine en position C- terminale du propeptide pour contrôler le clivage du propeptide (C) ou encore le peptide signal de la chitinase de tabac et le propeptide de Der pl muté sur le site de N-glycosylation afin de contrôler la cinétique de clivage du propeptide (D) . A (SEQ ID NO :1-4): ADNc codant pour la forme naturelle de la protéine. Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande W02008/056265, B (SEQ ID NO :5): ADNc codant pour la forme mature d'une peptidase C lA fusionné à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. (1996) et au propeptide Der pl (p08176 - aa 19 à 98). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande W02008/056265, C (SEQ ID NO :6): ADNc codant pour la forme mature d'une peptidase C lA fusionné à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. (1996)) et au propeptide Der pl (p08176 - AA 19 à 98) où l'acide aminé 98 est substitué par une Lys. Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande W02008/056265, D (SEQ ID NO :7) : ADNc codant pour la forme mature d'une peptidase C lA fusionné à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M. (1996) et au propeptide Der pl (p08176 - AA 19 à 98) où l'asparagine 34 du site de glycosylation est mutée en glutamine. Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande W02008/056265. Figure 2 : La plateforme AllergoPur utilisée pour l'expression et la production des différentes formes de peptidases ClA. Figure 3 : Représentation schématique de l'ADNc codant la forme précurseur de la peptidase C lA d'Aster tripolium (A), Vigna mungo (C) ou d'acariens (D) ou codant une forme précurseur chimérique de la peptidase C lA d'Asteracées (B). Les gènes sont exprimés sous dépendance du promoteur 35S, et en amont de la séquence de terminaison de transcription de la nopaline synthase. Le plasmide comprend les séquences nécessaires à l'incorporation dans la plante en utilisant Agrobacterium, comprenant les limites gauche et droite de l'ADN-T, la région d'origine de réplication, et le site de co-intégration. Un TAG sera ou non intégré en position N- ou C-terminale de la protéine mature. Figure 4: Les protéines extraites de plantes non transfectées (WT piste 1) ou transfectées sous vide pour l'expression des protéines DP1 (piste 2), SHEP (piste 3) ou PEPC1 (piste 4) ont été analysées par SDS-PAGE (panneau A) et immmunodétection avec un anticorps dirigé contre une étiquette Flag (panneau B). L'analyse par immunodétection met en évidence la production spécifique des 3 protéases de la famille C 1A. Ces protéases sont exprimées sous la forme précurseur (*) et sous la forme mature (**). Figure 5: Les protéines extraites de plantes non transfectées (WT piste 1), transfectées sous vide avec la protéine DP1 (piste 2), SHEP (piste 3) ou PEPC1 (piste 4) ont été analysées par SDS-PAGE (panneau A) et immmunodétection avec un anticorps dirigé contre une étiquette Flag (panneau B). Les protéines ont été extraites en condition native puis incubées à 4°C à 0 min, 120 min ou toute la nuit (0/N). L'analyse SDS-PAGE met en évidence la protéolyse de plusieurs protéines endogènes des extraits de plantes exprimant une protéase C lA alors que ces protéines sont stables dans les extraits contrôles (WT) (Panneau A). La protéase C lA contenue dans ces extraits est stable dans les mêmes conditions (panneau B). Figure 6 : Les protéines extraites de plantes non transfectées (WT piste 1), transfectées sous vide avec la protéine DP1 (piste 2), SHEP (piste 3) ou PEPC1 (piste 4) ont été analysées par SDS-PAGE (panneau A) et immmunodétection avec un anticorps dirigé contre une étiquette Flag (panneau B). Les protéines ont été extraites en condition dénaturante en présence d'un agent réducteur puis incubées à 4°C à 0 min, 120 min ou toute la nuit (0/N). Dans ces conditions, l'analyse SDS-PAGE met en évidence une forte dégradation des protéines endogènes des extraits de plantes exprimant une protéase C lA alors que ces protéines sont stables dans les extraits contrôles (WT). Cette dégradation est quasi totale pour les extraits incubés sur la nuit (Panneau A). Dans les mêmes conditions certaines protéases C lA sont également dégradées au cours du temps comme l'illustre l'analyse par immunodétection (panneau B). Figure 7 : Les protéines extraites de plantes non transfectées (WT piste 1) ou transfectées sous vide avec la protéine DP1 (piste 2), ou par la protéine DerplL (DP1L) dont le propeptide a été muté par substitution de Gln 98 par une lysine (piste 3) ont été analysées par SDS-PAGE et immmunodétection avec un anticorps dirigé contre une étiquette Flag. L'analyse par immunodétection met en évidence la production la forme précurseur et la forme mature pour les plantes exprimant la protéine DP1, alors que seule la forme précurseur inactive est produite chez les plantes exprimant DP1L. Figure 8: Les protéines extraites de plantes transfectées sous vide avec la protéine DP1 ont été purifiées sur colonne GE Healthcare HisTrap Excell puis les fractions totale (FT), non retenue sur la colonne (FNR) ou retenue sur la colonne (FR) ont été analysées par électrophorèse SDS PAGE. Comme l'illustre la piste FR, la protéase DP1 est purifiée à 85%, cette étape est suivie d'une étape de gel filtration pour parfaire la purification. EXEMPLE : Design moléculaire et synthèse de gène Les ADNc sont synthétisés en optimisant l'usage des codons pour leur reconnaissance par le système végétal. Dans le cadre de cette invention, l'optimisation préférée est l'optimisation pour une expression chez Nicotiana benthamiana, comme indiqué en Figure 1. Préparation des plasmides Des sites de restriction Xba I /kpn I et Sal I / Sac I sont respectivement intégrés aux extrémités 5' et 3' de l' ADNc lors de la synthèse. Ces sites sont ensuite utilisés afin de cloner les ADNc dans le vecteur binaire d'expression pAGO1 (Figure 1). Les ADNc sont clonés en amont d'un promoteur 35S (35S) et en aval d'une séquence de terminaison de la nopaline synthase (tnos) ; le vecteur pAGO1 contient en outre une cassette d'expression permettant d'exprimer l'inhibiteur de silencing p19 simultanément de la protéine recombinante afin d'augmenter les rendements de production. Les vecteurs sont ensuite utilisés pour transformer la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens. Expression transitoire des peptidases ClA dans des feuilles de Nicotiana benthamiana Utilisation de la plateforme AllergoPur Pour la production par expression transitoire Agobacterium tumefaciens LBA4404 est utilisé pour le transfert d'un ADNc codant la protéase sans que le gène d'intérêt soit intégré dans le génome de la cellule végétale : on parle ici de transfection et non de transgenèse. Les plantes sont cultivées en condition hydroponique en présence d'un milieu nutritif (GHE, floragrow, floramicro, florabloom, 10mL/ 15mL/ 5mL pour 10 L d'EAU osmose) et sous éclairage LED. L'agrobactérie est transférée dans le tissu foliaire par agro-infiltration selon deux procédés. Pour la production de petits lots de protéases destinés au criblage de prototypes, les agrobactéries sont injectées manuellement grâce à une seringue appliquée contre l'épiderme de la face inférieure de la feuille. Des disques foliaires prélevés dans les feuilles 4 à 6 jours après l'agro-infiltration sont utilisés pour l'analyse des différents prototypes de protéases. Cette étape de criblage permet de définir le vecteur d'expression qui sera utilisé pour l'obtention d'une protéase de qualité optimale. Le même procédé est utilisé pour la production commerciale à grande échelle mais dans ce cas, l'agro-infiltration s'effectue sous vide, dans des enceintes contenant plusieurs litres d'une culture d'agrobactéries et où plusieurs dizaines de plantes sont infiltrées simultanément. Ces plantes sont ensuite remises en culture pendant 4 à 6 jours avant la purification de la protéase C lA à partir des extraits foliaires (Figure 2). Expression de 4 peptidases de la famille Cl L'expression des protéines ainsi que les rendements sont respectivement analysés par Western blotting et ELISA. Les résultats sont illustrés pour 3 peptidases C lA de plantes (SH-EPP12412 et PEPC1-Q75QV8) ou d'acarien (DP1- p08176) (Figures 3 et 4). Les protéases exprimées sont actives. En effet, les protéines végétales extraites à partir des feuilles exprimant les protéases C lA sont rapidement dégradées après l'extraction, alors qu'elles sont stables dans les extraits de plantes non transfectées (Figure 5). De plus, cette dégradation des protéines endogènes est beaucoup rapide et incontrôlée lorsque l'extraction est réalisée en présence d'agents réducteurs (Figure 6). Cette activité accrue des peptidases C lA en présence des agents réducteurs est une caractéristique de ces protéases (Beers et al, 2000, Plant Mol Biol, 44: 399-415). Production d'une protéase ClA sous la forme d'un précurseur inactif La fusion de l'ADNc codant la protéine mature de DP1 avec la séquence signal de la chitinase et le propeptide modifié par la substitution glutamine 98 / lysine en position C-terminale du propeptide (DP1L, SEQ ID NO :6) permet comme l'illustre la figure 7 de bloquer le clivage du propeptide et d'accumuler une protéine inactive dans l'extrait végétal. Ce propeptide peut ensuite être clivé in vivo lors d'une co-expression de la protéine Lys-C ou in vitro en incubation avec la même protéine. Purification et caractérisation Comme l'illustre la figure 8, les protéases sont extraites à partir de la biomasse fraîche ou congelée puis purifiées sur colonne HisTrap Excell. Comme l'illustre la piste FR, la protéase DP1 est purifiée à 85%, cette étape est suivie d'une étape de gel filtration pour parfaire la purification. REVENDICATIONS1. Cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une peptidase C 1 A liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort. 2. Cellule végétale selon la revendication 1, dans laquelle la peptidase est choisie parmi les peptidases C lA d'acariens et les peptidases C 1 A végétales. 3. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 2, dans laquelle la peptidase C lA est choisie parmi Der p 1, Der fl, Eur m 1, PEPC1, SH-EP, AMB et les protéines présentant au moins 70% d'identité avec l'une de ces dernières. 4. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle la peptidase C lA est exprimée en une quantité égale à au moins 0,1 % des protéines solubles totales de la plante. 5. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle la séquence nucléotidique hétérologue comprend la séquence codant un peptide signal choisi parmi les peptides signaux reconnus par la cellule végétale, de préférence le peptide signal naturel de la peptidase ou celui de la chitinase de tabac ; et un propeptide choisi parmi les propeptides de peptidases C 1A, le propeptide de Der p 1, le propeptide de Der p 1 où le dernier acide aminé est muté en lysine, et le propeptide de Der p 1 où l'asparagine du site de glycosylation est mutée en glutamine. 6. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle la séquence nucléotidique hétérologue comprend en outre une séquence peptidique d'adressage qui cible la peptidase C lA sous forme soluble ou membranaire vers le réticulum endoplasmique ou les différents compartiments constitutifs du système endomembranaire de sécrétion de la cellule végétale. 7. Plante comprenant au moins une cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 6. 8. Procédé de production d'une peptidase ClA, comprenant l'expression de ladite peptidase C lA dans une cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 6, ou dans une plante selon la revendication 7. 9. Peptidase C lA susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 8. 10. Peptidase selon la revendication 9, pour son utilisation comme médicament. 11. Utilisation de la peptidase selon la revendication 9 dans une méthode de diagnostic in vitro d'allergies, notamment d'allergies aux acariens ou d'allergies à certaines plantes.