Brevet FR3008186A1 — publié le 20150109

Procédé de détection non destructif d'interactions protéines uranium sur gels d'électrophorèse Domaine technique Il est question ici du domaine technique des procédés d'étude d'interactions non covalentes entre des biomolécules et des espèces chimiques et notamment des procédés d'étude d'interactions entre biomolécules et cations métalliques, de leur identification par séparation sur gel d'électrophorèse natif et par cartographie des gels par SLRT (Spectro-fluorimétrie Laser à Résolution Temporelle). Une espèce chimique peut être un élément chimique (par exemple métaux, terres rares, actinides), éventuellement sous forme moléculaire (par exemple U022±). État de la technique Certaines espèces chimiques, telles que l'uranium, peuvent interagir avec des biomolécules, et particulièrement les peptides, les protéines et les acides nucléiques. Néanmoins, les mécanismes d'interaction entre ces espèces chimiques et les biomolécules sont encore mal connus. Or, il serait utile de pouvoir identifier les biomolécules qui sont la cible de certaines espèces chimiques, et notamment de radionucléides comme l'uranium, afin de mieux comprendre les mécanismes de toxicité au niveau moléculaire et cellulaire. L'étude de la spéciation des espèces chimiques comme l'uranium, et notamment leur interaction avec les biomolécules est de première importance pour appréhender les mécanismes de toxicité. Pour cela il faut pouvoir isoler les biomolécules cibles de l'uranium. Une méthode couramment utilisée pour la séparation de biomolécules utilise un gel d'électrophorèse à travers lequel une migration des biomolécules est réalisée par l'application d'un champ électrique. La migration peut être effectuée sur une ou deux dimensions permettant ainsi d'affiner la séparation des biomolécules selon leurs poids moléculaires et leurs charges. Cette technique peut être utilisée en conditions non dénaturantes, c'est-à-dire en conservant les interactions non covalentes entre les biomolécules et les espèces chimiques. Afin de pouvoir visualiser les biomolécules (par exemple des protéines ou acides nucléiques) sur le gel d'électrophorèse, celles-ci sont colorées en trempant le gel d'électrophorèse dans une solution contenant un colorant. Le colorant réagit avec certaines fonctions chimiques des biomolécules. Ainsi, l'ensemble des biomolécules est coloré. Cette méthode n'est donc pas spécifique et ne vise qu'à identifier les biomolécules sur le gel d'électrophorèse. Elle ne permet pas d'identifier les biomolécules qui auraient interagi avec une espèce chimique. La nécessité de détecter certaines espèces chimiques, tels les métaux, directement sur un gel d'électrophorèse a entrainé de nombreux développements techniques. On peut citer par exemple l'ablation laser (aussi connue par l'acronyme AL) couplée à la spectrométrie de masse à source plasma à couplage inductif (ICPMS) qui permet une cartographie de la présence de métal sur un gel et ainsi d'en déduire éventuellement les interactions avec les biomolécules. Dans cette méthode, les points révélés par coloration traduisant la présence de biomolécules sont ablatés par un faisceau laser puis les molécules ablatées sont envoyées avec un flux d'argon dans un ICPMS pour détecter les éléments. Si le gel n'est pas coloré, l'ablation par laser peut être réalisée en aveugle et tout le gel d'électrophorèse est alors balayé par le faisceau laser. Cependant, cette méthode peut prendre près de quatre heures pour l'analyse d'1 cm2 de gel. Par ailleurs, cette méthode est complexe et coûteuse, nécessitant un personnel spécialisé. De plus, cette méthode détruit le gel d'électrophorèse ce qui empêche l'utilisation du gel pour identifier la biomolécule. Enfin, l'ablation par laser peut contaminer les surfaces avoisinantes sur le gel, ce qui rend délicat l'interprétation des résultats de l' ICPMS. D'autres méthodes peuvent être utilisées. Par exemple la vaporisation électrothermique (ETV) couplée à l'ICPMS, l'autoradiographie gamma, la fluorescence de rayons X générés par un synchrotron et l'émission de rayons X induits par protons (PIXE). Cependant, l'ETV-ICPMS nécessite de découper le gel et rend impossible toute cartographie du gel d'électrophorèse, l'autoradiographie gamma utilise des isotopes radioactifs émetteurs de rayonnement gamma des métaux ou l'activation neutronique de ceux-ci générant des déchets radioactifs qu'il faut ensuite traiter ou stocker et n'est pas applicable à la détection d'espèces chimiques qui n'émettent pas de rayonnement gamma ou un rayonnement gamma trop faible pour être détecté comme l'uranium. La fluorescence de rayons X générés par un synchrotron et l'émission de rayons X induits par protons (PIXE) requièrent, quant à elles, l'accès à des installations lourdes et peu disponibles alors que la fluorescence de rayon X traditionnelle n'est pas suffisamment sensible. Présentation Un objectif de la présente est de pallier au moins un des inconvénients des techniques antérieures. Pour cela, un procédé d'étude des interactions non covalentes de biomolécules avec un métal à partir d'un mélange de biomolécules ayant été mis au contact du métal est proposé. Ce procédé comprend les étapes suivantes : - la séparation sur un gel d'électrophorèse en conditions non dénaturantes des biomolécules du mélange ; le séchage du gel d'électrophorèse ; l'application d'un révélateur de fluorescence du métal ou d'un intensificateur de fluorescence du métal sur le gel d'électrophorèse, le révélateur ou l'intensificateur étant aptes à agir avec le métal pour former une entité fluorescente ; - la cartographie par spectrofluorimétrie laser à résolution temporelle d'au moins une partie du gel d'électrophorèse en mesurant l'intensité de la fluorescence de l'entité fluorescente. Ce procédé permet une cartographie rapide du métal sur le gel. Par conséquent, il est possible de localiser les zones du gel où sont situées les biomolécules ayant interagi avec celui-ci. Ce procédé est par ailleurs non destructif et permet de conserver l'intégrité du gel d'électrophorèse et des biomolécules, ce qui permet l'identification postérieure des biomolécules, par exemple par spectrométrie de masse. La quantification relative du métal ayant interagi avec ces biomolécules est également possible. De manière générale, il est question de l'utilisation de la séparation sur gel d'électrophorèse couplée à la spectrofluorirnétrie laser à résolution temporelle pour l'identification de biomolécules ayant interagi avec un métal auquel les biomolécules ont été exposées. Dessins D'autres objectifs, caractéristiques et avantages apparaîtront à la description qui suit en référence aux dessins donnés à titre illustratif et non limitatif, parmi lesquels : - la figure 1 représente schématiquement les étapes du procédé d'étude de biomolécules capables d'interactions non covalentes avec une espèce chimique séparées sur gel d'électrophorèse natif et de la localisation des biomolécules ayant interagi avec l'espèce chimique; - la figure 2 représente schématiquement le système pour la cartographie par SLRT ; - la figure 3 est un graphe montrant l'intensité (en unité arbitraire) de la fluorescence mesurée sur des zones délimitées sur un gel d'électrophorèse séché à l'aide d'un spot laser, sur lequel a été appliqué un révélateur, l'intensité de fluorescence est proportionnelle à la quantité d'uranium déposée sur chaque zones délimitées ; - la figure 4 est une cartographie de l'intensité relative de fluorescence (en unité arbitraire) en fonction de la position de la zone délimitée sur la surface du gel d'électrophorèse séché, un révélateur ayant été appliqué sur ce gel après migration des biomolécules dont une partie a réagi avec l'uranium au degré d'oxydation VI ; et - la figure 5 est un agrandissement de la figure 4 sans les 9 premiers millimètres du gel d'électrophorèse qui correspondent au front de migration. Description Un procédé d'étude des interactions non covalentes entre biomolécules et un métal, à partir d'un mélange de biomolécules ayant été mises au contact du métal est décrit ci-après en référence à la figure 1. De manière générale, il est question ici de l'utilisation de la séparation sur 10 gel d'électrophorèse en conditions non dénaturantes couplée à la spectrofluorimétrie laser à résolution temporelle pour l'identification de biomolécules ayant interagi avec une espèce chimique, et plus particulièrement un métal, à laquelle les biomolécules ont été exposées. Les biomolécules sont typiquement des acides nucléiques, des peptides ou 15 des protéines. Les acides nucléiques comprennent l'acide désoxyribonucléique et l'acide ribonucléique. Les peptides sont des polymères d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Les protéines sont des macromolécules composées d'un ou de plusieurs peptides liés ayant subi ou non des modifications post-traductionnelles comme une glycosylation et qui peuvent 20 contenir des cofacteurs variés. Le terme de métal ne signifie pas nécessairement le métal pur, mais l'élément métal, qui peut être par exemple le métal à différents degrés d'oxydation. Cet élément métal peut être présent seul, par exemple sous la forme d'atomes ou d'ions, soit dans un composé neutre ou chargé. Le métal est 25 un métal fluorescent naturellement ou pouvant être rendu fluorescent à l'aide d'un révélateur. De préférence, le métal est choisi parmi le groupe comprenant : l'uranium, le curium, l'américium, et les lanthanides. On s'intéresse plus particulièrement à l'uranium, et notamment à sa forme oxydée au degré VI ; l'uranium étant un élément utilisé dans de nombreuses 30 industries, en cas d'exposition interne, l'uranium forme de nombreux complexes avec les biomolécules. L'espèce chimique est fournie sous une forme chimique solide ou liquide, et généralement sous la forme d'oxydes ou de sels. Par exemple, dans le cas de l'uranium, celui-ci est fourni sous la forme d'acétate d'uranyle (UO2(CH3-000)2) ou de nitrate d'uranyle (UO2(NO3)2), de préférence en solution. Les interactions étudiées sont des interactions engendrant des liaisons entre les biomolécules et le métal qui dans le domaine de la biologie sont dites faibles, c'est-à-dire que l'on s'intéresse ici à toutes les liaisons à l'exception des liaisons covalentes (liaisons dans lesquelles chaque atome apporte un électron pour former la liaison) ; ces dernières n'entrent pas dans le cadre de la présente description. Les liaisons sont choisies parmi le groupe comprenant : les liaisons de coordination (présentes dans les complexes), les liaisons ioniques, les liaisons hydrogène, et les liaisons de Van der Waals. De préférence, le métal réagit avec une partie des biomolécules pour former des complexes. Ce procédé peut soit être réalisé sur un mélange de biomolécules ayant été mis au contact du métal préalablement, soit comprendre une étape préalable de mise au contact des biomolécules avec le métal. Dans le cas où le procédé comprend la mise au contact El des biomolécules avec le métal, cette étape peut être réalisée soit in vivo, soit in vitro. Par exemple, les biomolécules proviennent d'extraits cellulaires de cellules eucaryotes ou procaryotes, qui ont été exposées au métal. Alternativement, ces biomolécules éventuellement purifiées sont mélangées in vitro avec le métal dans un milieu approprié pour permettre les interactions entre les biomolécules et le métal. Les biomolécules, dont au moins une partie a éventuellement réagi avec le métal, sont ensuite extraites, et éventuellement purifiées. Ce procédé comprend la séparation E2 sur un gel d'électrophorèse natif (i.e. en conditions non dénaturantes) des biomolécules du mélange. De préférence, la séparation est réalisée par migration des biomolécules sur gel d'électrophorèse en conditions non dénaturantes selon deux dimensions, sur un ou deux gels. Dans le cas de l'utilisation d'un seul gel, une première séparation suivant une première direction est effectuée, suivie d'une séparation suivant une deuxième direction perpendiculaire à la première direction. Dans le cas de l'utilisation de deux gels, un premier gel permet la séparation suivant une première direction. Le premier gel est ensuite découpé pour extraire la bande de gel le long de laquelle les biomolécules ont migré. La bande de gel est ensuite mise au contact sur sa longueur avec un deuxième gel présentant généralement une maille différente du premier gel et un pH différent du premier, pour une séparation suivant une deuxième direction perpendiculairement à la première direction. Le gel d'électrophorèse peut être un gel d'acrylamide ou un gel d'agarose. L'homme du métier saura choisir le type de gel d'électrophorèse adéquat selon les biomolécules étudiées. Un gel d'acrylamide est généralement utilisé pour séparer des biomolécules dont la taille varie entre environ 5 et environ 2 000 kDa. Dans le cas d'un gel d'acrylamide, la teneur en acrylamide varie d'environ 6 % à environ 18 % en poids pour le gel de séparation, de préférence d'environ 6 % à environ 12 %, et d'environ 4 % pour le gel de concentration. L'épaisseur est de préférence comprise entre environ 0,5 mm et environ 1,5 mm, encore de préférence comprise entre environ 0,7 mm et environ 0,8 mm, toujours de préférence environ 0,75 mm. Également, de préférence, un peigne de 15 puits est utilisé. La combinaison d'une épaisseur d'environ 0,75 mm et d'un peigne de 15 puits permet de concentrer les biomolécules déposées sur le gel d'électrophorèse et ainsi d'optimiser l'intensité du signal de fluorescence du métal. Le procédé comprend ensuite le séchage E3 du gel d'électrophorèse. Le séchage permet de fixer les biomolécules sur le gel d'électrophorèse et de conserver celui-ci. Le séchage du gel est réalisé juste après la migration, pendant environ 30 à environ 90 min, de préférence environ 60 min, de manière à éviter la diffusion des biomolécules dans le gel dans toutes les directions qui diminuerait la qualité de séparation et à une température comprise entre environ 15°C et environ 90°C, de préférence entre environ 50°C et environ 90°C, encore de préférence entre environ 60°C et environ 80°C, toujours de préférence environ 70°C. Le procédé comprend ensuite l'application E4 d'un révélateur de fluorescence du métal ou d'un intensificateur de fluorescence du métal sur le gel d'électrophorèse, le révélateur ou l'intensificateur étant apte à agir avec le métal pour former une entité fluorescente. Un révélateur est une molécule qui réagit avec le métal au début non fluorescent pour former une entité fluorescente. L'intensificateur est une molécule qui réagit avec le métal déjà fluorescent mais dont l'intensité n'est pas suffisante pour former une entité fluorescente dont la fluorescence est amplifiée. Par exemple, dans le cas de l'uranium au degré d'oxydation VI, l'intensificateur est avantageusement l'acide phosphorique. De manière générale, le révélateur ou l'intensificateur réagit avec le métal pour former des liaisons chimiques qui ne sont pas des liaisons covalentes pures. Par exemple, l'acide phosphorique forme avec l'uranium au degré d'oxydation VI un complexe plus stable que ceux formés entre les biomolécules et le métal. Dans le cas de l'utilisation de l'acide phosphorique comme révélateur de la présence d'uranium sur le gel, la concentration de la solution d'acide phosphorique est avantageusement comprise entre environ 0,05 mmol/L et 10 mmol/L, de préférence entre environ 0,05 mmol/L et 1 mmol/L, encore de préférence environ 0,075 mmol/L. Le procédé comprend également la cartographie E5 par spectrofluorimétrie laser à résolution temporelle (SLRT) d'au moins une partie du gel d'électrophorèse en mesurant l'intensité de la fluorescence de l'entité fluorescente afin de localiser sur le gel les protéines ayant interagi avec le métal. La SLRT est une méthode analytique particulièrement sensible pour l'identification et la caractérisation de certains actinides (uranium, américium et curium) et lanthanides (europium, terbium, samarium, dysprosium, cérium, gadolinium et thulium) luminescents en solution. Le principe de cette méthode est fondé sur une excitation du métal par un laser pulsé suivie d'une mesure de l'intensité de la luminescence après un délai suivant l'impulsion laser, de l'ordre de quelques microsecondes, de manière à éliminer les luminescences parasites. L'intervalle de temps entre l'impulsion laser et le démarrage de la mesure de fluorescence, appelé la porte de mesure, est choisi de façon à optimiser l'intensité du signal et le rapport signal sur bruit. Les deux paramètres délai et porte de mesure peuvent être ajustés De manière générale, la puissance du laser est réglée de manière à ne pas détériorer le gel d'électrophorèse et/ou les biomolécules, par exemple la puissance du laser est d'environ 3 pJ. La mise en forme du faisceau laser est avantageusement réalisée de manière à illuminer une zone délimitée de diamètre d'environ 1 mm à environ 4 mm à la surface du gel d'électrophorèse séché (spot lumineux), de préférence environ 2 mm ou environ 3 mm. La mesure de la luminescence peut s'effectuer de deux manières : la collection coaxiale et la collection latérale. La collection coaxiale consiste à mesurer la luminescence suivant le même angle d'incidence que le faisceau laser envoyé. La collection latérale consiste à mesurer la luminescence avec un angle différent de l'angle d'incidence du faisceau laser envoyé. Alors que la collection coaxiale permet une meilleure répétabilité, la collection latérale est plus efficace, c'est-à-dire que le signal mesuré est plus intense. La collection latérale, par exemple avec un angle de 45° par rapport à l'angle d'incidence du faisceau laser, est préférée car la luminescence est généralement faible. Le balayage du gel d'électrophorèse par le faisceau laser peut être effectué avec identification préalable des zones où les biomolécules sont présentes, par exemple par coloration d'un gel d'électrophorèse témoin obtenu dans les mêmes conditions que le gel à cartographier mais subissant en plus une étape de coloration (par exemple au Bleu de Coonnassie, au nitrate d'argent, etc.). Le balayage peut encore être effectué en aveugle et le faisceau laser balaie alors la surface du gel d'électrophorèse suivant un quadrillage donné correspondant au diamètre du faisceau laser à la surface du gel d'électrophorèse, par exemple le pas est compris entre environ 0,5 mm et environ 5 mm, de préférence entre environ 1 mm et environ 3 mm, encore de préférence environ 2 mm. De manière avantageuse, le pas est égal au diamètre du spot lumineux. Le procédé peut ensuite comprendre la quantification du métal sur au moins une partie du gel d'électrophorèse et/ou l'identification des biomolécules ayant réagi avec le métal. Un exemple de système 1 pour la cartographie SLRT est décrit ci-après en référence à la figure 2. Ce système comprend un support 11 de gel d'électrophorèse pour recevoir un gel d'électrophorèse séché, une platine 12 de nnicrodéplacennents couplée au support 11 pour déplacer celui-ci de manière stable et reproductible, une source laser 13 pour l'émission d'un faisceau laser, un système optique 14 disposé sur le trajet du faisceau laser entre la source laser 13 et le support 11 pour mettre en forme le faisceau laser sur la surface du gel 2 d'électrophorèse disposé sur le support 11. La platine 12 peut être reliée à une commande 15 pour sa commande automatique comme déjà connu de l'homme du métier. Le support 11 est réglable de manière à approcher ou éloigner sa surface de la source laser 13. La source laser 13 une source laser innpulsionnelle dont la longueur d'émission est adaptée à l'absorption de l'espèce chimique, avantageusement un Nd:YAG couplé à un oscillateur paramétrique optique. Par exemple, la détection de l'uranium au degré d'oxydation peut être réalisée avec une source laser émettant dans l'ultraviolet, avantageusement à 266 nm, ou dans le visible, avantageusement à 410 nm, avec une durée d'impulsion de 5 ns/impulsion et une fréquence d'impulsion de 10 Hz. Le dispositif optique 14 permet d'atténuer l'énergie du laser au niveau de la surface du gel d'électrophorèse. De manière générale, la source laser est réglable pour ajuster la puissance. Le support 11, la platine 12 et le système optique 14 proviennent de préférence d'un bâti de microscope. Le système 1 peut éventuellement comprendre une caméra vidéo 16 pour contrôler la position de la surface du gel 2 d'électrophorèse par rapport au point de focalisation de la source laser 13. La caméra vidéo 16 est reliée à un dispositif 19 d'affichage d'image. Le système 1 comprend également un capteur 17, de préférence par fibre optique, pour collecter la réponse du gel d'électrophorèse à l'excitation par le faisceau laser. La collecte de la réponse peut être coaxiale telle que déjà connu de l'homme du métier. Une telle collecte coaxiale 171 permet d'assurer une meilleure reproductibilité de la mesure. La collecte peut alternativement être latérale 172 (c'est-à-dire à 45° par rapport au support) permettant une meilleure efficacité de la collecte des photons émis. De préférence, la collecte est latérale, notamment pour des réponses du gel d'électrophorèse faibles. Le système 1 comprend en outre un spectromètre 18, de préférence multicanal. Le spectromètre 18 peut être équipé d'un réseau 300 tr/mm (trait par millimètre) afin de pouvoir acquérir l'ensemble du spectre de fluorescence du métal. Exemple Cultures bactériennes en présence d'uranium Des bactéries Escherichia coli ont été mises en culture pendant une nuit à 37°C et sous agitation (150 rpm) dans du milieu de culture Luria Bertani (LB) contenant 100 mmol/L d'acide 2-nnorpholinoéthanesulfonique (MES) à pH 5,5. Cette préculture a été utilisée pour ensemencer un nouveau milieu de culture LB contenant 4 % de glucose, à pH 4,5 et la culture a été agitée à 150 rpm à 37°C. Quand l'absorbance à 600 nm a atteint 0,4 de densité optique (DO), les bactéries ont été soumises à une exposition à l'acétate d'uranyle à 50 ou 100 pmol/L pendant 150 minutes, à 37°C et sous agitation à 150 rpm. Les cellules ont ensuite été récoltées par centrifugation (5000 rpm, 20 minutes), lavées 2 fois avec du milieu LB puis le culot bactérien a été congelé à -80°C. Préparation des extraits cellulaires Les cellules bactériennes ont été reprises dans 50 nnnnol/L de tampon trishydroxylannine-anninoéthane (Tris) à pH 7 contenant 1 mmol/L d'inhibiteur de protéase fluorure de 4-(2-aminoéthyl)benzènesulfonyle hydrochloré (AEBSF). Les cellules bactériennes sont ensuite cassées par sonication. Les protéines solubles des cellules bactériennes ont été récupérées dans le surnageant après une étape d'ultracentrifugation à 45 000 rpm pendant 45 minutes à 4°C. La concentration en uranium dans le surnageant a été mesurée par spectrométrie de masse par torche à plasma (ICP-MS). Séparation des protéines sur gel d'électrophorèse en conditions non dénaturantes Des échantillons comprenant les protéines ont été préparés en conditions non dénaturantes, c'est-à-dire en utilisant exclusivement du glycérol dans le tampon de charge et sans étape de chauffage. Les gels ont été effectués avec le système Mini-Protean 3 de Biorad et leur dimension est de 6 cm (longueur de migration) par 8 cm (largeur du gel), leur épaisseur de 0,75 mm. 75 à 100 pg de protéines ont été déposés pour réaliser la première dimension, en utilisant des puits de 3 mm de large. La migration a été effectuée sous une tension de 110 V durant 2 heures 15 min pour chacune des dimensions. Des gels en deux dimensions ont été réalisés en utilisant pour la première dimension un gel à 6% d'acrylamide à pH 8.8 et pour la seconde dimension un gel à 10% d'acrylamide et à pH 7.5. La bande de gel de séparation de la première dimension est placée perpendiculairement au gel de séparation de la deuxième dimension à la place des puits de dépôt des échantillons au sein de la partie du gel dite de concentration. La migration est ensuite réalisée de manière identique à celle de la première dimension. Séchage Le gel d'électrophorèse est ensuite séché sous vide à l'aide d'un Gel Dryer model 583 de Biorad pendant 1 heure à 70°C. Dépôt du révélateur De l'acide phosphorique à 0,075 mmol/L est vaporisé sur l'ensemble du gel d'électrophorèse séché à l'aide d'une pompe à galet et d'un nébuliseur. Cartographie La cartographie est réalisée à l'aide du système décrit ci-dessus. Le support de gel d'électrophorèse et la source laser utilisés sont réglés de manière à ce qu'un faisceau laser avec un diamètre d'environ 2 mm soit formé sur la surface du gel d'électrophorèse. La source laser est une source laser impulsionnelle Nd:YAG émettant dans l'ultraviolet, notamment à la longueur d'onde de 266 nm, avec une durée impulsionnelle d'environ 5 ns et une fréquence de 10 Hz. L'énergie de la source laser est réglée à environ 3 pJ. La collection de la réponse est choisie latérale. Par ailleurs, le spectromètre multicanal a été équipé d'un réseau 300 traits/mm afin d'acquérir l'ensemble du spectre de fluorescence de l'uranyle entre 420 et 620 nm. La commande est réglée afin de déplacer la platine par pas de 2 mm pour les gels en une dimension et par pas de 3 mm pour les gels en deux dimensions. Proportionnalité de l'intensité de la réponse par rapport à la quantité d'uranyle et limite de détection Le procédé décrit dans l'exemple ci-dessus a été adapté afin de démontrer le caractère proportionnel de l'intensité de la réponse de l'uranyle complexé à l'acide phosphorique à une excitation à 266 nm par laser et d'identifier la limite de détection. Pour cela, des dépôts contenant des quantités décroissantes de 50 nmol à 0,5 pmol d'acétate d'uranyle ont été réalisés sur un gel d'électrophorèse à 18 % en acrylamide séché. De l'acide phosphorique a ensuite été vaporisé sur l'ensemble du gel d'électrophorèse. Chacun des spots a été analysé par SLRT. La figure 3 montre que l'intensité de fluorescence enregistrée est proportionnelle à la quantité d'uranium 20 déposée sur les zones délimitées dans une gamme de 0,5 à 10 pmol d'uranyle et que la limite de détection est de l'ordre de la picomole. Des expériences menées en absence et en présence d'acide phosphorique ont montré que l'utilisation de l'acide phosphorique comme révélateur présente deux avantages : celui d'exacerber le signal de fluorescence mesuré 25 et également celui de l'uniformiser, en enregistrant un seul type de spectre de fluorescence. Conservation de l'interaction uranyle et biomolécule après migration 30 Afin d'évaluer le pourcentage de conservation de l'interaction protéine- uranyle après migration des complexes sur gels d'électrophorèse, la quantité d'uranium contenue sur les zones délimitées de protéine a été déterminée par ICP/MS après migration selon une dimension. Ces gels ont été réalisés avec des protéines purifiées qui avaient été incubées au préalable avec de l'acétate d'uranyle. La quantité d'uranyle mesurée a été comparée à la quantité d'uranyle associée aux protéines avant migration (voir tableau 1). Dans le tableau, EL33 P, CaM2 et CaM2/nonP sont des peptides modèles qui chélatent l'uranium. Protéine Quantité avant migration (nmol) Quantité mesurée par ICP/MS (pmol) Peptide EL33 P 2,7 4,4 CaM2 20 pg 2,4 4,9 CaM2 10 pg 1,2 4,9 CaM2/nonP 20 pg 2,4 5,4 CaM2/nonP 10 pg 1,2 6,5 Tableau 1 Les résultats obtenus montrent que 0,3 à 0,5 % de l'interaction uranyle- biomolécule sont conservés pour les protéines testées. Les conditions d'électrophorèse choisies permettent de conserver une partie de l'interaction protéine-uranyle. La présence de l'uranium a également pu être mise en évidence sur ces gels par SLRT, ce qui démontre que le pourcentage d'uranium retenu est suffisant pour permettre la détection par SLRT. Les mesures effectuées sur des gels avec migration d'une solution d'acétate d'uranyle seule ont permis de détecter l'uranium uniquement au niveau du front de migration et du gel de concentration, ce qui prouve que l'acétate d'uranyle n'est pas retenu par la partie de gel dite de séparation. La mesure d'un signal par SLRT sur les gels implique donc la préexistence d'une interaction uranyle/biomolécule au niveau des zones délimitées identifiées par SLRT.25 Cartographie de l'uranyle sur un gel d'électrophorèse en deux dimensions Des gels en deux dimensions ont été obtenus en déposant 100 pg d'extraits cellulaires solubles de cellules d'E. coui, cultivées en présence de 100 pmol/L d'acétate d'uranium et cartographiés sur des zones choisies avec un pas de 3 mm. Les résultats montrent que la majorité de l'uranium se retrouve dans le front de migration (voir les pics les plus grands sur la figure 4). Cependant, en dehors du front de migration, des zones de concentration en uranium contrastées (pauvres et riches en uranium) ont pu être identifiées sur le gel par mesure de l'intensité de fluorescence par SLRT comme le montrent les figures 4 et 5. Cette répartition discrète de l'uranyle démontre que les interactions uranyle-biomolécule observées sont spécifiques et que certains groupes de protéines ont une affinité accrue pour l'uranium. La cartographie de ces gels a mis en évidence des zones délimitées discrètes correspondant à des interactions uranyle-biomolécule. Il a donc pu être démontré que l'approche de cartographie par SLRT d'un gel d'électrophorèse permet d'identifier des interactions uranyle-biomolécule sur des gels d'électrophorèse en acrylamide en conditions non dénaturantes.20 REVENDICATIONS1. Procédé d'étude des interactions non covalentes entre biomolécules et métaux à partir d'un mélange de biomolécules ayant été mis au contact du métal, comprenant les étapes suivantes : la séparation sur un gel d'électrophorèse des biomolécules du mélange ; le séchage du gel d'électrophorèse ; l'application d'un révélateur de fluorescence du métal ou d'un intensificateur de fluorescence du métal sur le gel d'électrophorèse, le révélateur ou l'intensificateur étant apte à agir avec le métal pour former une entité fluorescente ; et - la cartographie par spectrofluorimétrie laser à résolution temporelle d'au moins une partie du gel d'électrophorèse en mesurant l'intensité de la fluorescence de l'entité fluorescente afin de localiser sur le gel les protéines ayant interagi avec le métal. 2. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre au préalable la mise en contact des biomolécules avec le métal par mélange de ceux-ci dans un milieu non dénaturant in vitro. 3. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre au préalable la mise en contact de cellules en culture avec le métal par l'exposition in vivo des biomolécules au métal, et l'extraction du mélange à partir des cellules. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le métal est de l'uranium, de préférence de l'uranium à l'état d'oxydation VI. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le révélateur est l'acide phosphorique. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la séparation sur gel d'électrophorèse est réalisée par migration des biomolécules sur deux dimensions, sur un ou deux gels. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant en outre la quantification du métal sur au moins une partie du gel d'électrophorèse. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant en outre l'identification des protéines ayant interagi avec le métal. 9. Utilisation de la séparation sur gel d'électrophorèse couplée à la spectrofluorimétrie laser à résolution temporelle pour l'identification de biomolécules ayant interagi avec un métal auquel les biomolécules ont été exposées.