Brevet FR3003169A1 — publié le 20140919

Utilisation de microorganismes pour diminuer le taux de triméthylamine dans une cavité du corps humain, notamment pour le traitement de la triméthylaminurie ou d'une vaginose bactérienne et la prévention des maladies cardiovasculaires La présente invention a trait à l'utilisation de microorganismes permettant de métaboliser la triméthylamine (TMA) dans au moins une cavité du corps humain (ci-après « cavité humaine ») comprenant une flore microbienne susceptible de produire de la TMA et donc de diminuer le taux de cette TMA au niveau de la cavité humaine. L'invention concerne l'utilisation de ces microorganismes dans l'intestin pour diminuer le taux intestinal de cette TMA. L'invention a notamment pour objectif de permettre le traitement de la triméthylaminurie et/ou de diminuer le taux de triméthylamine N-oxyde (TMAO), ce qui permet de prévenir la formation des plaques d'athérome et de fournir un moyen supplémentaire pour la prévention des maladies cardio-vasculaires. La triméthylaminurie (ou TMAU, urémie à TMA, ou syndrome de l'odeur du poisson pourri ou encore fish-odor syndrome) est une maladie génétique dans laquelle la personne déficiente génétiquement en une enzyme (mono-oxygénase à flavine 3 FM03) ne peut pas efficacement transformer le TMA en TMAO au niveau du foie. Dans certains cas également, la déficience en cette capacité de transformation est sporadique et acquise. La triméthylamine s'accumule alors dans l'organisme et est finalement éliminée par la sueur, l'urine et l'expiration, avec une forte odeur de poisson. Si aucune étude réelle ne montre l'incidence générale de la maladie, le chiffre de 1 % de la population américaine a été cependant avancé. Dans ce qui suit, on désignera une telle personne comme un patient déficient en métabolisme de la TMA. La TMA intestinale a une origine alimentaire et résulte notamment de la conversion du TMAO, de la choline ou de la lécithine apportés par l'alimentation (notamment oeuf, viande, foie, germe de blé, poisson, etc.). Ces composés sont transformés au niveau de l'intestin par le microbiote intestinal. Par ailleurs chez les personnes possédant l'enzyme FM03 active, le TMA est transformée en TMAO dans le foie et ce métabolite se retrouve dans la circulation sanguine. Wang et al. (Nature 2011, 472(7341), 57-63; voir également K. Rak and D.J. Rader, Cardiovascular Disease, News and Views, Nature2011, 472, 40-41) enseignent que la TMAO circulante peut contribuer à un développement des plaques d'athérome dans les artères et donc aux maladies cardiaques. La vaginose bactérienne est une maladie bénigne chez la femme dont la cause est un déséquilibre de la flore microbienne vaginale. Ce déséquilibre proviendrait d'une déplétion de la flore lactobacillienne au profit de l'augmentation d'une flore anaérobie comprenant notamment Gardnerella vaginalis. La vaginose bactérienne est caractérisée par des pertes ou fluides vaginaux grisâtres et odorants. L'odeur de ces pertes ou fluides vaginaux est due à la présence de TMA (Wolrath et al. APMIS 2002, 110, 819-824; voir également Wolrath et al. APMIS 2005, 113, 513-516). L'invention concerne également l'utilisation de ces microorganismes dans le vagin pour diminuer le taux de la TMA dans les fluides vaginaux. L'invention a notamment pour objectif de permettre le traitement des fluides vaginaux dans le cas d'une vaginose bactérienne ou de tout dérèglement ou maladie entraînant une production locale de TMA, ce qui permet de diminuer les fortes odeurs des pertes vaginales ou fluides vaginaux. L'invention a également pour objet un nouveau microorganisme susceptible d'être utilisé dans ces applications. Les Archaea méthanogènes sont des microorganismes qui produisent du méthane dans des conditions anaérobies. On retrouve certaines Archaea dans le système digestif d'animaux tels que les ruminants, ainsi que chez certains individus humains, en particulier les individus âgés. Ainsi, l'équipe de B. Dridi (International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology 2012, 62, 1902-1907) présente l'isolement d'un tel microorganisme dénommé Methanomassiiiicoccus luminyensis dont il est décrit que sous une atmosphèreavec H2, cette Archaea peut réduire le méthanol en méthane. Il est également décrit que ce microorganisme est incapable de méthanogenèse à partir de la triméthylamine, ainsi que d'autres substrats, sous atmosphère de CO2. Le génome complet de cette Archaea a été publié et mentionné dans A. Gorlas, Journal of Bacteriology, Septembre 2012, Vol. 194, 17, p. 4745, le génome étant accessible dans EMBL sous les références d'accès CAJE01000001 à CAJE01000026. A l'heure actuelle, il n'a pas été décrit, notamment chez l'homme, d'Archaea capable d'utiliser et de métaboliser la TMA in vivo. Les inventeurs ont réussi à identifier une nouvelle espèce d'Archaea méthanogène dans un échantillon de sels d'un individu humain, espèce comprenant un gène codant pour une TMA méthyltransférase et un gène codant pour protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, susceptibles, en présence d'hydrogène et en anaérobie, conditions rencontrées dans certains organes ou les cavités qu'ils délimitent, tels que l'intestin, le colon humain et le vagin, de métaboliser la TMA, de sorte qu'il est proposé ici d'utiliser ces microorganismes pour métaboliser la TMA pour en diminuer le taux, notamment intestinal ou vaginal. Il a en outre été découvert que cette souche d'Archaea présente également un gène de résistance aux sels biliaires, notamment un gène codant pour une hydrolyse des sels biliaires, favorisant ainsi la survie et le maintien du microorganisme au niveau intestinal. Ce microorganisme est dénommé ci-après souche 1 ou Methanomethylophilus alvus. Les inventeurs ont également identifié que la souche d'Archaea Methanomassifficoccus luminyensis décrite par D. Didri et al. (supra), dénommée parfois ci-après souche 2, possède également les gènes codant pour une TMA méthyltransférase et pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA susceptibles de permettre le métabolisme du TMA en présence de l'hydrogène dans l'intestin. On pense que la TMA est métabolisée avec formation de protéines méthylées (protéines corrinoide méthylées) qui captent les méthyles de la TMA. Cette protéine méthylée est sans doute ensuite entraînée dans la voie de la méthanogénèse, aboutissant à la production de méthane. Par définition, on parlera indifféremment ici d'un organe délimitant une cavité ou de la cavité elle-même, susceptible de contenir une flore microbienne anaérobie susceptible de produire ou produisant de la TMA. On peut aussi définir cette organe ou cavité comme un organe ou cavité contenant de la TMA produite par la flore microbienne. Cette production de TMA est généralement obtenue en présence d'une source d'hydrogène issue du métabolisme microbien. L'invention a donc pour objet une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase. Le microorganisme est capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans un organe ou une cavité humaine selon la définition supra. La composition peut être utilisée comme médicament pour traiter, diminuer ou supprimer la TMA au niveau de l'organe ou de la cavité humaine, et/ou traiter toute pathologie, désagrément ou dérèglement caractérisé par la présence de TMA ou dérivé de la présence de TMA. Une composition selon l'invention contient un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans au moins une cavité humaine comprenant une flore microbienne susceptible de produire de la TMA, pour utilisation comme médicament pour traiter, diminuer ou supprimer la TMA au niveau de la cavité humaine. Selon un premier aspect, l'invention concerne une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin, pour utilisation comme médicament pour diminuer ou supprimer la TMA au niveau intestinal et/ou dans le foie. Plus précisément, dans un premier mode de réalisation, l'utilisation vise à traiter la triméthylaminurie. Le patient traité a un déficit en capacité à métaboliser la TMA. Notamment, il est déficient en enzyme FM03 active. Dans un deuxième mode de réalisation, l'utilisation vise la diminution du taux du métabolite hépatique de la TMA, le TMAO, notamment du TMAO plasmatique. Cette utilisation peut viser la prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou la prévention des maladies cardiovasculaires. Le patient visé est soit un patient capable de métaboliser la TMA, soit un patient déficient en métabolisme de la TMA mais traité à l'aide d'un médicament permettant de rétablir un métabolisme de la TMA en TMAO, par exemple avec la composition selon l'invention. La métabolisation de la TMA, en amont, permet alors de limiter la production de TMAO par le foie. L'utilisation de la composition selon l'invention chez un patient déficient en métabolisme de la TMA permet de combiner les deux effets, métabolisme de la TMA ou traitement de la triméthylaminurie et diminution de la TMAO plasmatique, prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou prévention des maladies cardiovasculaires. L'invention a aussi pour objet une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin, pour traiter la triméthylaminurie. L'invention a donc aussi pour objet une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin, pour utilisation comme médicament pour diminuer le taux de TMAO plasmatique, prévenir la formation de plaques d'athérome et/ou prévenir les maladies cardiovasculaires. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans le vagin, pour traiter, diminuer ou supprimer la TMA présente dans le vagin ou les fluides vaginaux. En particulier, sans vouloir être lié à la théorie, on pense que la TMA présente dans le vagin ou les fluides vaginaux résulte de la conversion de composés, comprenant un groupement azoté substitué par trois méthyles, par la flore microbienne vaginale. Dans un mode de réalisation, l'utilisation vise à traiter les fluides vaginaux dans le cas d'une vaginose bactérienne et diminuer ou supprimer les odeurs dues à la présence de TMA. Pour assurer la métabolisation de la TMA par les microorganismes selon l'invention, il est préférable que les méthyles de la TMA soient transférés à une autre molécule. Dans un mode de réalisation, le microorganisme exprime également une protéine corrinoide susceptible de jouer ce rôle d'accepteur de méthyle. Cette protéine est en particulier une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA. Dans un mode de réalisation, le microorganisme comporte également un gène de résistance aux sels biliaires, de préférence un gène codant pour une hydrolase des sels biliaires, telle qu'une choloylglycine hydrolase. Suivant un mode de réalisation préféré, dans ces compositions, le microorganisme est une Archaea méthanogène, notamment d'origine humaine ou animale, de préférence humaine. Dans un mode de réalisation, la composition comprend la souche Methanomassiliicoccus luminyensis DSM No. 25720, disponible auprès de la collection DSMZ (Inhoffenstrafle 7B, 38124 Braunschweig, Allemagne). Dans un mode de réalisation les microorganismes sont vivants. Dans d'autres modes de réalisation, ils peuvent être tués ou inactivés. Les compositions selon l'invention peuvent comprendre en outre un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation, la composition est un extrait de culture, de préférence un extrait concentré. Notamment, un extrait concentré de microorganisme vivant est employé. Dans un mode de réalisation, la composition ou un extrait servant de principe actif dans la composition comprend une population de microorganismes consistant essentiellement ou consistant exclusivement en microorganismes méthanogènes conformes à l'invention. La composition peut en comprendre une espèce ou une souche unique, ou bien en comprendre au moins deux espèces ou souches différentes. Dans un autre mode de réalisation, la composition ou un extrait servant de principe actif dans la composition comprend une population de microorganismes comprenant au moins une espèce ou une souche de microorganisme méthanogène conforme à l'invention, et un ou plusieurs autres microorganismes, notamment venant de culture. La composition peut comprendre une espèce ou une souche unique de microorganisme méthanogène conforme à l'invention, ou bien en comprendre au moins deux espèces ou souches différentes. Dans un mode de réalisation, les microorganismes sont lyophilisés. La lyophilisation est réalisée par une technique standard. La composition peut alors comprendre un excipient et/ou un stabilisant de lyophilisation standard, et tout autre additif utile. La composition se présente sous une forme adaptée à la cavité ou à l'organe à traiter. La composition se présente de préférence sous une forme d'administration par voie orale. Pour l'intestin notamment, cette forme orale peut avantageusement comprendre une forme d'administration entérique, notamment une capsule entérique, une gélule entérique, un comprimé comportant un coating entérique, une encapsulation, e.g. microencapsulation, avec un matériau procurant une protection entérique, la combinaison d'au moins deux de ces moyens dont l'un au moins procure une protection entérique, etc. Le terme entérique signifie que la forme d'administration protège la composition jusqu'à ce qu'elle atteigne l'intestin. Par exemple, la composition, notamment le lyophilisat de microorganismes, peut être revêtu par coating à l'aide d'agents protecteurs, notamment choisis de manière usuelle parmi les protéines, polysaccharides, gommes, et autres agents de coating entériques. Dans un mode de réalisation, un double coating est réalisé suivant l'enseignement de EP 1 514 553. La forme d'administration peut aussi être adaptée à une administration directe dans une cavité du corps telle que le vagin, par exemple sous forme d'ovules. La forme d'administration peut aussi être adaptée à une administration par la voie rectale, par exemple suppositoire ou analogue. Dans ce mode de réalisation, les compositions selon l'invention contiennent de 10 à 1013 microorganismes. La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement destinée à diminuer la teneur en TMA chez un patient qui en a besoin. L'invention a donc pour objet une méthode pour diminuer ou supprimer la TMA au niveau d'une cavité ou d'un organe humain, notamment au niveau intestinal, vaginal et/ou dans le foie, comprenant l'administration à un patient qui en a besoin, d'une quantité suffisante d'une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase. Ce microorganisme est capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans la cavité, notamment l'intestin ou le vagin. De préférence, le microorganisme exprime également une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA. De préférence encore, le microorganisme exprime également une hydrolase des sels biliaires, notamment une choloylglycine hydrolase. Dans un mode de réalisation, la composition comprend une Archaea méthanogène, notamment Methanomethylophilus alvus ou Methanomassiliicoccus luminyensis. Dans une premier mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de traitement de la triméthylaminurie. Le patient traité a un déficit en capacité à métaboliser la TMA. Notamment, il est déficient en enzyme FM03 active. Dans un deuxième mode de réalisation, l'invention concerne une méthode permettant de diminuer le taux du métabolite hépatique de la TMA, le TMAO, notamment le TMAO plasmatique. Cette méthode peut viser la prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou la prévention des maladies cardiovasculaires. Le patient visé est soit un patient capable de métaboliser la TMA, soit un patient déficient en métabolisme de la TMA mais traité à l'aide d'un médicament permettant de rétablir un métabolisme de la TMA en TMAO, par exemple avec la composition selon l'invention. La métabolisation de la TMA, en amont, permet alors de limiter la production de TMAO par le foie. La méthode appliquée chez un patient déficient en métabolisme de la TMA permet de combiner les deux effets, métabolisme de la TMA ou traitement de la triméthylaminurie, et diminution de la TMAO plasmatique, prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou prévention des maladies cardiovasculaires. Dans un troisième mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de traitement des fluides vaginaux dans le cas d'une vaginose bactérienne. La méthode vise notamment à diminuer ou supprimer la TMA et/ou les odeurs associées à la présence de TMA. Dans un mode de réalisation préféré les microorganismes sont vivants. Dans un mode de réalisation, on administre au patient au moins une dose contenant une quantité suffisante de microorganismes pour obtenir l'effet recherché entre diminution du taux de TMA, diminution du taux de TMAO, ou encore combinaison des deux. Des doses supplémentaires peuvent être administrées de manière étalée dans le temps, notamment à intervalles de temps régulier, par exemple à chaque repas, pour maintenir l'effet recherché. Dans un autre mode de réalisation dans lequel le microorganisme est forcément vivant, on administre au patient soit au moins une dose immédiatement efficace pour obtenir l'effet recherché entre diminution du taux de TMA, diminution du taux de TMAO, ou encore combinaison des deux, soit une dose d'ensemencement, le développement intra-intestinal ou intra-vaginal du microorganisme permettant ensuite d'obtenir l'effet recherché. Dans un mode de réalisation, le microorganisme s'implante dans l'intestin sur le long terme. On peut alors envisager une ou plusieurs (e.g. de 1 à 5) doses initiales, par exemple prises au moment des repas, puis des compléments à intervalles de temps régulier, ou après des épisodes de dérangement intestinal (diarrhées ou autres). Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme s'implante dans le vagin sur le long terme. On peut alors envisager une ou plusieurs (e.g. de 1 à 5) doses initiales, par exemple prises au lever et/ou au coucher, puis des compléments à intervalles de temps régulier, ou après des épisodes de pertes vaginales odorantes importantes. Les compositions utilisées dans ces méthodes de traitement peuvent avoir les différentes caractéristiques développées supra. La culture peut correspondre à un consortium de microorganismes, issu par exemple d'une mise en culture de selles de patient humain ou d'un animal, contenant entre autres Methanomethylophilus alvus, et de préférence, ce microorganisme représente plus de 10 %, de préférence plus de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % des microorganismes dans le consortium. Notamment, ce microorganisme représente dans le consortium, plus de 10 %, de préférence plus de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % des 10 souches méthanogènes les plus fréquemment rencontrées chez l'homme (Methanobacteriales de type Methanobrevibacter smithii et Methanosphaera stadtmanae). La culture peut aussi être une culture pure de Methanomethylophilus alvus. La culture comprend un véhicule adapté. La culture est maintenue en conditions d'anaérobie. 15 Liste des séquences : SEQ ID Acides aminés Nucléotides NO: 1 Amorce mttb Fw 2 Amorce mttb Rv 3-8 Amorces L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples de mise en oeuvre non limitatifs. Exemple 1: Méthode d'isolement et de culture d'une Archaea méthanogène 20 consommatrice de TMA : 1.1. méthode de détection moléculaire : Les méthodes de biologie moléculaire permettent de mettre en évidence et distinguer les Archaea méthanogènes consommatrices de TMA (appelées ici Methanomethylophilales) entre eux. Une première phase peut consister à mettre en 25 évidence des Archaea méthanogènes à l'aide de l'ARN 16S en prenant les ARN 16S des souches 1 et 2 décrites supra, ou des ADN codant pour ces ARN16S, à l'aide des amorces appropriées. Une deuxième phase (ou première phase si la classification a déjà été réalisée) consiste à détecter la présence d'un gène mttb (ou mttB), et éventuellement, en plus, un gène mttc (ou mttC). Des amorces utilisables pour la détection du gène mttb sont les suivantes : Fw: SEQ ID NO: 1: GCACTTCCACCACATCG Rv: SEQ ID NO: 2: AGCTGRGACAGRACGAT Où R correspond à une base purique, A ou G Amplicon: 270-300 pb. 1.2. méthode de culture, d'enrichissement et d'isolement La culture / l'isolement est initialement réalisé à partir de selles fraiches, provenant d'un humain : cet humain peut être une personne chez laquelle préalablement la présence de méthanogènes en général, et de Methanomethylophilales en particulier aura été mise en évidence avec les techniques de détection moléculaire citées ci-dessus (à partir d'ADN extraits de ces selles, selon les méthodologies standards= par le kit QIAGen DNA Stool Kit). Alternativement, la mise en évidence de la présence de Methanomethylophilales pourra être réalisée en parallèle de la mise en culture, selon cette même méthodologie. Toutes les manipulations sont effectuées en conditions stériles et anaérobie stricte (flux de N2). Les selles, une fois récupérées sont traitées immédiatement. Sinon, alternativement, leur conservation peut être réalisée avant emploi, plusieurs heures à 4°C, en pot fermé, dans lequel une anaérobie a été instaurée, sans modification dramatique apparente sur les résultats et la survie des méthanogènes dans l'échantillon. Environ 500 à 600 mg de selles sont récupérés à l'aide d'une seringue 1 ml insuline, dont l'extrémité est coupée (soit environ 0.4 ml). Ils sont placés dans 10 ml de milieu 141 DSMZ (Methanogenium medium) spécifique pour les microorganismes méthanogènes, en atmosphère H2/CO2 (80/20, pression de 2 atm.) en fiole antibiotique de 60 ml. Pour favoriser le développement des Methanomethylophilales, et ainsi enrichir la culture en consortium, on dispose en plus dans le tube : - d'un substrat spécifique de ce groupe = méthanol (à 80 mM final), - ou, alternativement, d'une de ses « sources » naturelles dans le colon humain, à savoir la pectine qui sera hydrolysée par d'autres microbes du consortium (et potentiellement les Methanomethylophilales) de manière à donner entre autres du méthanol. - Divers antibiotiques tels que la bacitracine ou le metronidazole, (100 mg/L) ; Dridi et al (supra) ont proposé divers antibiotiques pour lesquels Methanomassiliicoccus luminyensis est résistant (bacitracine, metronidazole, ordinazole, squalamine) Cette culture est ensuite réalisée à 37°C, sous agitation légère ; le suivi de la culture est assuré continuellement, par PCR quantitative, de préférence quotidiennement. Selon les types de souches de Methanomethylophilales, divers temps de doublement sont observés, et peuvent varier du simple au triple, voire davantage. A titre d'exemple, le cas de figure rencontré avec des selles d'un patient porteur de Methanomethylophilus alvus est illustré, depuis l'inoculation d'un échantillon de selles. Il s'agit d'un patient présentant 106 nombre de copies de gènes 16S rRNA /ml de culture de Methanobrevibacter smithii (Mbs), 10 fois plus de M. alvus (Mx), et encore 10 fois plus de bactéries (selles au moment de la mise en culture, temps 0). Dans les premiers jours d'une culture en milieu standard, sans apport de pectine ou de méthanol, les Mbs et certaines bactéries se développent beaucoup plus vite et supplantent Mx, avant une stabilisation et un développement retardé de Mx, à des taux se rapprochant de la quantité initiale dans l'échantillon. Ce taux peut être amélioré en ajoutant du méthanol, ou même de la pectine, substrat générateur de méthanol, comme dans ce cas au jour 20: on observe alors une nette amélioration de la proportion de Mx au cours du temps par rapport aux bactéries et à Mbs. Cette méthode peut être répétée : lors du suivi (de préférence quotidien), il est alors possible de déterminer le meilleur moment pour repiquer le consortium ou simplement re-supplémenter la culture en méthanol / pectine (par exemple sur une phase de plateau observée à partir du jour 20). Après un certain nombre de cycle d'enrichissement, on est en mesure de réaliser des isolements d'une souche de Mx à partir de ce mélange, par cultures individualisées d'un clone de ce milieu liquide en consortium. Ceci est effectué par la méthode des Roll-Tubes, méthode qui permet, en anaérobie, d'obtenir des colonies isolées en milieu solide DSMZ 141 + agar, en présence de méthanol (atmosphère anaérobie, contenant au moins de l'H2). Dans cette culture en milieu solide, les premières colonies qui apparaissent (Ière semaine) ne sont pas les Mx recherchés. Les colonies, petites, qui apparaissent par la suite (notamment après 2 ou 3 semaines de culture), sont récupérées et servent à inoculer individuellement, colonie par colonie, des tubes de milieu DSMZ-141. En parallèle, on détermine, par PCR quantitative, si la colonie repiquée est ou non un Mx. Dans le cas positif, l'isolement est alors réalisé, la culture repiquée selon la vitesse de croissance de Mx en milieu liquide 141 supplémenté avec du méthanol, sous atmosphère H2/CO2. La pureté de la souche isolée peut alors être vérifiée, soit en re-isolant, selon la méthode décrite ci-dessus (colonies isolées en milieu solide selon la technique des Roll-Tube), soit en analysant les courbes de dissociation obtenues sur les amplicons des -PCR quantitatives. 1.3. Protocole de quantification rapide de lignées procarvotiques en culture Ce protocole sert au suivi en parallèle des Methanomethylophilales ou Mmp (Mx-M. alvus, M. luminyensis, autres), des Methanobacteriales (Mbac, telles que Methanobrevibacter smithii ou Methanosphaera stadtmanae) et des bactéries totales (Bac) dans les cultures d'enrichissement afin de définir les meilleures conditions pour la croissance de M. alvus et Mxl - Principe : Lyse d'un petit aliquote (0,1 à 0,2 ml) de culture à haute température + choc osmotique Réduction de la concentration des inhibiteurs de PCR par centrifugation et dilution du surnageant Quantification des groupes d'intérêts en PCRq Les gammes étalons de quantification sont préparées à l'avance, et consistent en des amplicons PCR, réalisés avec les amorces décrites, purifiées et quantifiées selon les méthodes classiques. - Matériel : Centrifugeuse (mettre à 4°C) Thermomixeur (mettre à 99°C) Thermocycleur - Amorces Mmp, Mbac et Bac: MxF (AS-05_Fw ; 77) : ggg gTA ggg gTA AAA TCC TG (SEQ ID NO: 3) MxR (AS-06_Rv; 78) : Cgg ggT ATC TAA TCC CgT TT (SEQ ID NO :4) MbacF (MbS-01_Fw; 75) : gCg AAC Cgg AU AgA TAC CC (SEQ ID NO : 5) MbacR (MbS-02_Rv; 76) : AgT CTT gCg ACC gTA CTT CC (SEQ ID NO : 6) BacF (ES-06_Fw; 71) : ACT CCT ACg ggA ggC Ag (SEQ ID NO : 7) BacR (ES-07_Rv; 72) : gTA TTA CCg Cgg CTg CTg (SEQ ID NO : 8) Note : Les amorces MxF et MxR ciblent à la fois les Methanomethylophilales proches de M. alvus et celles proches de M. luminyensis. Il est possible de déterminer laquelle de ces lignées domine sur l'autre (ou s'il y a codominance), de manière qualitative, par l'observation des courbe de dissociations : les amplicons de M. alvus se dissocient autour de 84°C alors que ceux de M. luminyensis se dissocient autour de 85,5°C. Cette différence de température de dissociation n'a pas été clairement définie pour les Methanobacteriales. - Composition du Mix : Utilisation du kit Eurogentec MESA GREEN qPCR Master Mix Mix Volume (pl) Volume final 18 Master Mix 9 Amorce F 0,8 Amorce R 0,8 H20 5,4 ADNg 2 - Condition de la PCRq avec les amorces ci-dessus : Premier segment : 95 °C pendant 10 min Second segment : 95 °C pendant 30 sec 59 °C pendant 20 sec 72 °C pendant 30 sec 80 °C pendant 20 sec lecture de la fluo Troisième segment (courbe de dissociation, défini par l'appareil): 95 °C pendant 1 min 59 °C pendant 30 sec 95 °C pendant 30 sec Note : la lecture se fait à 80°C afin que l'ADN double brin aspécifique soit dénaturé (autour de 76 °C) avant la lecture. - Extraction à la chaleur et préparation de la quantification par PCRq - Annoter tous les tubes avant de sortir les cultures de l'étuve - Transférer un peu plus de 100 pl de culture (avec une seringue 1m1 et une aiguille bleue, traversant le septum du tube de culture anaérobie) dans un tube Eppendorf - Re-transférer 100 pl de ce prélèvement (avec une P100) dans un autre tube - Centrifuger à 16000g ; 4°C ; 10 min ; ceci permet de culoter les cellules, et de se débarrasser d'inhibiteurs présents dans le milieu de culture - Pendant la centrifugation, mettre 90 pl d'eau milliQ dans des Eppendorf de 1,5 ml - Remplacer le surnageant par 100 pl d'H20 distillée ; permet d'enlever les ADN libres des cellules mortes, les inhibiteurs de PCR, de créer un choc osmotique qui facilite la lyse car les cellules culotées se retrouvent dans un milieu très peu concentré - Ajouter une pointe de spatule de billes de verre de 0,2 pm, et vortexer 5 s - Placer dans le Thermomixeur ; 99°C sans agitation pendant 3min, avec agitation 1400 tr/min pendant 7 min, sans agitation pendant 10 min ; les cellules sont lysées par la chaleur - Préparer le mix PCR en mélangeant l'eau et les amorces. - Centrifuger à 16000g; 4°C ; 10 min ; les débris cellulaires sont culotés et le contenu dissous des cellules, dont l'ADN, reste dans le surnageant. - Ajouter le master mix dans le mix PCR, et commencer à le répartir sur la plaque. - Reprendre 10 pl de surnageant dans un tube propre et l'ajouter aux 90 pl d'eau milliQ ; - Placer les tubes dans la glace jusqu'à la quantification. - A partir de l'appareil de PCRq, sur l'ordinateur, lancer le logiciel MxPro et choisir « Sybr assay with dissociation curve » pour permettre le préchauffage de la lampe pendant la répartition des ADNg sur la plaque PCR. - Répartir les échantillons d'ADNg sur la plaque. - Vérifier que tous les puits sont bien fermés. - Centrifuger la plaque à 500g max. pendant 5 s pour faire descendre les mix au fond des puits. - Rentrer le programme PCR et le plan de plaque dans le logiciel. Exemple 2 : Préparation d'une composition : La culture finale obtenue à l'exemple 1.1, contenant le microorganisme méthanogène de l'invention, est utilisée pour préparer une composition administrable. Elle est cependant de préférence utilisable comme stock, pour effectuer des cultures en anaérobie et en présence d'hydrogène et d'un substrat contenant du méthanol, propager le microorganisme et préparer des lots pour la fabrication de la composition selon l'invention. Le milieu et les conditions de culture sont alors celles décrites précédemment (milieu DSM 141, supplémenté en méthanol, sous atmosphère anaérobie contenant du H2). Les cultures obtenues, sont éventuellement concentrées, et sont lyophilisées, avant d'être incorporées à des gélules entériques. Exemple 3: Préparation d'une composition : On réalise une culture de la souche DSM No. 25720, et les cultures sont utilisées pour préparer des lots pour la fabrication de la composition selon l'invention. Les cultures sont effectuées en anaérobie et en présence d'hydrogène et d'un substrat contenant du méthanol (par exemple, milieu DSM 141, supplémenté en méthanol, sous atmosphère anaérobie contenant du H2). Les cultures obtenues, sont éventuellement concentrées, et sont lyophilisées, avant d'être incorporées à des gélules entériques. Exemple 4: Préparation d'une composition : On réalise une culture de la souche DSM No. 25720, et les cultures sont utilisées pour préparer des lots pour la fabrication de la composition selon l'invention. Les cultures sont effectuées en anaérobie et en présence d'hydrogène et d'un substrat contenant du méthanol (par exemple, milieu DSM 141, supplémenté en méthanol, sous atmosphère anaérobie contenant du H2). Les cultures obtenues, sont éventuellement concentrées, et sont lyophilisées, avant d'être incorporées à des ovules. Ces ovules sont des formes d'administration adaptées à être placées dans le vagin. REVENDICATIONS1. Composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans au moins une cavité humaine comprenant une flore microbienne susceptible de produire de la TMA, pour utilisation comme médicament pour traiter, diminuer ou supprimer la TMA au niveau de la cavité humaine. 2. Composition pour utilisation selon la revendication 1, dans laquelle l'organe humain est l'intestin, pour traiter diminuer ou supprimer la TMA au niveau intestinal et/ou dans le foie. 3. Composition pour utilisation selon la revendication 1 ou 2, pour traiter la triméthylaminurie. 4. Composition pour utilisation selon la revendication 1 ou 2, pour diminuer le taux de TMAO plasmatique, prévenir la formation de plaques d'athérome et/ou prévenir les maladies cardiovasculaires. 5. Composition pour utilisation selon la revendication 1, dans laquelle l'organe humain est le vagin, pour traiter, diminuer ou supprimer la TMA présente dans le vagin ou les fluides vaginaux. 6. Composition pour utilisation selon la revendication 1 ou 5, pour traiter les fluides vaginaux dans le cas d'une vaginose bactérienne et diminuer ou éliminer les odeurs dues à la présence de TMA. 7. Composition pour utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le microorganisme exprime également une protéine corrindide acceptrice de groupement méthyle de TMA. 8. Composition pour utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le microorganisme comporte également un gène de résistance aux sels biliaires,notamment un gène codant pour une hydrolase des sels biliaires, de préférence une choloylglycine hydrolase. 9. Composition pour utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle le microorganisme est une Archaea méthanogène, notamment d'origine humaine ou animale, de préférence d'origine humaine.