Brevet FR3007411A1 — publié le 20141226

La présente invention concerne un polypeptide du type comprenant un anticorps à domaine unique dérivé d'un anticorps à chaîne lourde naturellement dépourvu de chaîne légère (VHH) de camélidé et dirigé spécifiquement contre la chromatine, plus particulièrement contre des protéines chromatiniennes, ainsi qu'une molécule d'acide nucléique codant pour un tel polypeptide. L'invention concerne également l'utilisation de ce polypeptide, en particulier pour la détection de la chromatine et/ou la visualisation en temps réel de la chromatine sans interférer avec la vitesse de prolifération cellulaire. A l'heure actuelle, la détection en imagerie de la chromatine peut être réalisée par trois grands types de procédés, plus particulièrement : - les procédés mettant en oeuvre des molécules fluorescentes qui s'intercalent ou se fixent sur l'ADN, telles par exemple que la 4',6'-diam idino-2- phénylindole (DAPI). Pour la plupart, ces molécules nécessitent la fixation et la perméabilisation des cellules. De plus, elles sont souvent classées comme cancérigènes, mutagènes et reprotoxiques (CMR) et elles nécessitent des précautions d'emploi contraignantes ; - les procédés mettant en oeuvre des anticorps conventionnels dirigés contre les protéines chromatiniennes, typiquement une histone, qui ne peuvent quant à eux être utilisés que sur des cellules fixées et perméabilisées ; - et les procédés comprenant l'expression ectopique dans l'organisme cible d'une histone fusionnée à une protéine fluorescente. Ces procédés par transgénèse constituent la seule approche permettant de suivre la chromatine en temps réel dans les cellules vivantes. La présente invention vise à proposer un outil polyvalent qui puisse être mis en oeuvre dans l'ensemble de ces procédés, et qui permette notamment de détecter / visualiser efficacement la chromatine tant in vitro qu'in vivo, aussi bien sous forme de protéine recombinante, en remplacement des anticorps conventionnels, par exemple dans les techniques d'immunofluorescence ou de Western blot, qu'en imagerie en temps réel des cellules vivantes ou fixées, par application directe non invasive sur le matériel biologique ou par l'expression de l'ADN codant dans lesdites cellules. Un objectif supplémentaire de l'invention est que cet outil puisse être produit facilement et à bas coût, notamment sous forme pure. A l'origine de l'invention est un projet à visée toute autre, plus particulièrement un projet visant au développement de biomarqueurs d'effets génotoxiques, précisément la phosphorylation de la sérine 139 de l'histone H2AX. Il a été découvert par les présents inventeurs que des polypeptides particuliers, comprenant le domaine VHH d'anticorps monocaténaires à chaîne lourde des camélidés, présentaient la propriété d'interagir spécifiquement avec la chromatine, et permettaient d'atteindre les objectifs que s'est fixés la présente invention. Il a notamment été découvert par les présents inventeurs, de manière surprenante, que ces polypeptides constituaient un outil permettant de détecter efficacement la chromatine, et en particulier : d'une part, sous forme de protéine recombinante en fusion avec un domaine protéique détectable, par immunofluorescence ou Western blot, avec un bruit de fond avantageusement négligeable ; et d'autre part, exprimés dans des cellules cibles, ou après pénétration dans ces cellules cibles, sans en perturber la progression du cycle cellulaire, si bien qu'ils permettent la visualisation en temps réel des chromosomes mitotiques dans les cellules vivantes en division, ceci sans nécessiter de fixation. Il a également été découvert par les présents inventeurs que les polypeptides présentant de telles propriétés particulièrement avantageuses étaient spécifiquement dirigés contre un complexe d'histones H2A et H2B. Ainsi, il est proposé selon la présente invention un polypeptide comprenant un anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine, cet anticorps étant dérivé d'un anticorps à chaîne lourde naturellement dépourvu de chaîne légère (VHH) de camélidé et étant capable de se lier spécifiquement à un complexe d'histones H2A et H2B. Dans « complexe d'histones H2A et H2B », on inclut ici les complexes 30 H2A-H2B dans lesquels une des histones H2A ou H2B, ou les deux, a (ont) subi une ou des modifications post-traductionnelles, telles qu'une acétylation, méthylation, phosphorylation, etc. Pour désigner ce complexe, on utilisera indifféremment dans la présente description les expressions « hétérodimère H2A-H2B » et « dimère H2A-H2B ». Les anticorps à domaine unique sont des anticorps naturels bien 5 connus en eux-mêmes, consistant en des anticorps à chaîne lourde dépourvus de chaînes légères. Leur domaine variable, communément nommé VHH, ou « nanobody », est typiquement formé d'une pluralité de régions, dont une pluralité de régions charpentes conservées, dites FR, et une pluralité de régions hypervariables, déterminant la complémentarité avec l'antigène, dites 10 CDR. Plus précisément, le domaine VHH comprend une première région charpente FR1, une première région hypervariable CDR1, une deuxième région charpente FR2, une deuxième région hypervariable CDR2, une troisième région charpente FR3, une troisième région hypervariable CDR3, et une quatrième région charpente FR4. 15 Le domaine VHH des anticorps monocaténaires à chaîne lourde des camélidés suffit à reconnaitre l'antigène : ce domaine monomérique et autonome possède des propriétés de liaison à l'antigène similaires à celles des anticorps conventionnels. De petite taille (15 kDa), particulièrement stable et soluble, il présente notamment l'avantage de pouvoir être produit de façon 20 recombinante, en masse, chez la bactérie ou d'autres espèces tant procaryotes qu'eucaryotes, le cas échéant en fusion avec une ou plusieurs protéine(s) fonctionnelle(s) d'intérêt, et de pouvoir ainsi être utilisé comme un anticorps monoclonal pour la détection d'un antigène. Comme exposé ci-dessus, il a maintenant été découvert par les 25 présents inventeurs que des polypeptides comprenant un anticorps dérivé d'un domaine VHH de camélidé, et capable de se lier spécifiquement à un hétérodimère H2A-H2B, s'avéraient être des outils particulièrement efficaces pour la détection / visualisation de la chromatine, par des techniques d'imagerie cellulaire, western-blot, cytométrie de flux, etc., ainsi que pour le 30 suivi de la chromatine en imagerie cellulaire en temps réel dans des cellules vivantes ou fixées. Les polypeptides selon l'invention s'avèrent également particulièrement avantageux pour la mise en oeuvre d'expériences de caractérisation fonctionnelle, d'inactivation ou de modification chimique de la chromatine. Plus particulièrement, les polypeptides selon l'invention, reconnaissant spécifiquement la chromatine, peuvent être utilisés comme anticorps en substitution des anticorps conventionnels, notamment en biochimie, par exemple pour la mise en oeuvre des techniques de western-blot classique et overlay, pull down, etc. Par rapport à la technologie déjà disponible des anticorps classiques, qui sont constitués de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères, ces polypeptides à domaine VHH s'avèrent plus compétitifs. En effet, d'une part, leur caractère monomérique permet de facilement les exprimer génétiquement, contrairement aux IgG classiques, et d'autre part, leur petite taille leur confère des propriétés de pénétration cellulaire, mais aussi intramoléculaire remarquables comparés aux anticorps conventionnels. Ils peuvent avantageusement être exprimés en bactérie, et donc purifiés à grande échelle et à très bas coût. En outre, il a notamment été observé par les présents inventeurs que ces polypeptides permettaient une détection efficace de la chromatine, avec un bruit de fond extrêmement faible, ceci chez tous les eucaryotes en immunofluorescence. De plus, ces polypeptides peuvent être exprimés directement en cellules et ils permettent donc le suivi en temps réel des structures chromatiniennes, par exemple pour suivre les mitoses sur cellules vivantes, tant chez les eucaryotes inférieurs que chez les eucaryotes supérieurs. Un des avantages principaux par rapport aux procédés basés sur l'expression ectopique d'une histone étiquetée dans la cellule, tels que proposés par l'art antérieur, est le fait qu'ils ne modifient pas la stoechiométrie des cibles. Ils permettent en outre une bonne visualisation de la chromatine, et ne perturbent avantageusement pas le cycle cellulaire. Sur cellules fixées, les polypeptides selon l'invention constituent en 30 outre une alternative avantageuse, notamment du point de vue du coût d'obtention et de mise en oeuvre, à l'utilisation d'agents intercalants pour la 3 0 0 7 4 1 1 5 coloration du noyau, tels que le DAPI ou l'iodure de propidium. En outre, ils peuvent être fusionnés simultanément à différents peptides/protéines fonctionnels d'intérêt, ce qui permet de passer d'une seule condition d'excitation/émission, pour les agents intercalants chimiques, à plusieurs 5 conditions pour les polypeptides conformes à l'invention, élargissant ainsi les possibilités de marquage multiple. De manière générale, les polypeptides selon l'invention peuvent par exemple être produits par immunisation de camélidés, par exemple de lamas, avec un hétérodimère H2A-H2B comme immunogène, purification des 10 lymphocytes et construction d'une banque de VHH, puis sélection, notamment par la technique dite de phage-display, à partir de cette banque, exprimée sur la capside d'un phage, des séquences codantes de VHH présentant une affinité pour un hétérodimère H2A-H2B. Ces techniques sont classiques en elles-mêmes, et bien connues de l'homme du métier. Elles sont notamment 15 décrites dans la publication de Lee et al. (2007). Les polypeptides selon l'invention peuvent autrement être obtenus par sélection, à partir d'une banque naïve d'un répertoire de camélidé, par la même technique de phage display, des séquences codantes de VHH présentant une affinité pour un hétérodimère H2A-H2B. 20 La sélection des VHH capables de se lier à un hétérodimère d'histones H2A et H2B peut être réalisée par tout test de liaison à l'antigène classique en lui-même. Peuvent être mises en oeuvre à cet effet les techniques bien connues de l'homme du métier d'immunoblotting, dot blot, ou immunoabsorption enzymatique ELISA (« enzyme-linked immunosorbent 25 assay »), en mettant à profit le fait que le dimère H2A-H2B peut être formé par simple mise en contact des deux protéines, dans des conditions physico-chimiques, notamment de pH et de salinité, appropriées. A cet effet, il peut notamment être utilisé les histones H2B et H2A humaines, de n° d'accession Genbank respectivement NP_733759.1 (GI:24586679) (H2A type 1-A) et NP 003505.1 (GI:4504249) (H2B type 1). La structure des histones H2A et H2B étant très fortement conservée chez l'ensemble des eucaryotes, les anticorps sélectionnés pour leur capacité de liaison à ce dimère d'origine humaine présentent également la capacité de se lier aux dimères H2A-H2B de toute autre espèce eucaryote. Des polypeptides particuliers selon l'invention sont tels que l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine présente : - la séquence d'acides aminés de l'une quelconque des séquences SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4, - une séquence comprenant une ou plusieurs délétion(s), addition(s) ou substitution(s) d'un ou plusieurs acides aminés par rapport à l'une de ces séquences, qui ne modifient pas de manière significative les caractéristiques de liaison de l'anticorps au complexe d'histones H2A et H2B, - et/ou une partie fonctionnelle d'une des séquences ci-dessus, conservant le(s) site(s) de liaison et le(s) domaine(s) protéique(s) nécessaires à la liaison au complexe d'histones H2A et H2B. Il est du ressort de l'homme du métier de déterminer quelles modifications peuvent être apportées aux séquences ci-dessus SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4, sans altérer de manière significative les propriétés de reconnaissance de l'antigène, à partir de ses connaissances théoriques et/ou de tests expérimentaux, notamment de tests de liaison à l'antigène hétérodimère H2A-H2B, comme indiqué ci-avant, réalisés sur des séquences obtenues par modifications ciblées ou aléatoires des séquences SEQ ID N° 1 à 4 ci-dessus. En particulier, les modifications par rapport aux séquences SEQ ID N° 1 à 4 ci-dessus sont préférentiellement réalisées dans les régions 25 hypervariables CDR des VH H. Entrent par exemple dans le cadre de l'invention des polypeptides obtenus par modifications des séquences SEQ ID N° 1 à 4 par substitution d'acides aminés par des acides aminés de même famille, par exemple d'un résidu basique tel que l'arginine par un autre résidu basique comme un résidu 30 lysine, d'un résidu acide tel que l'aspartate par un autre résidu acide comme le glutamate, d'un résidu polaire comme la sérine par un autre résidu polaire comme la thréonine, d'un résidu aliphatique comme la leucine par un autre résidu aliphatique comme l'isoleucine, etc. Des polypeptides selon l'invention présentent une séquence 5 homologue de l'une quelconque de ces séquences ci-dessus SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 4, avec une identité de séquence de 79,5 % et plus par rapport à l'une au moins de ces séquences. Selon une caractéristique préférentielle de l'invention, l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine est un domaine VHH. 10 Autrement, cet anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine peut consister en un VHH humanisé, c'est-à-dire comportant un ou plusieurs acides aminés de la séquence consensus humaine en lieu et place d'un ou plusieurs acides aminés typiques des camélidés. Il est du ressort de l'homme du métier de déterminer quels acides aminés peuvent être ainsi substitués 15 sans perdre la capacité de liaison à l'antigène H2A-H2B, comme indiqué ci- avant. Entrent également dans le cadre de l'invention des polypeptides dont la séquence est modifiée, par rapport aux séquences SEQ ID N° 1 à 4 ci-dessus, de sorte à augmenter l'affinité plus spécifiquement vis-à-vis d'un 20 dimère H2A-H2B dans lequel une ou les deux histones sont modifiées par des modifications post-traductionnelles participant par exemple à la réponse aux stress et plus généralement à l'expression de l'épigénome. De tels polypeptides permettent avantageusement de suivre spécifiquement des modifications post-traductionnelles des histones, comme les anticorps 25 classiques, mais avec la possibilité d'obtenir une diversité générée rapidement par les techniques de biologie moléculaire, des cribles sur des histones modifiées obtenues par purification biochimique et leur caractérisation en spectrométrie de masse. Ils rendent ainsi possible la mise en évidence de patterns différentiels, in vivo ou après fixation, obtenus en réponse à divers 30 stress cellulaires (endo- ou exogènes), dans une utilisation en biologie pronostique ou diagnostique. Préférentiellement, lorsque l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine est un domaine VHH, il présente, dans sa région hypervariable CDR1, un résidu sérine ou thréonine en position 30 selon la numérotation de Kabat, dans sa région hypervariable CDR2, un résidu glycine en position 58 selon la numérotation de Kabat, et dans sa région hypervariable CDR3, au moins un des acides aminés suivants, aux positions respectives suivantes, ces positions étant également définies selon la numérotation de Kabat : - en position 107 selon la numérotation de Kabat, un résidu arginine ; - et/ou en position 104 selon la numérotation de Kabat, un résidu glycine ; - et/ou en position 105 selon la numérotation de Kabat, un résidu sérine ou un résidu tyrosine ; - et/ou en position 110 selon la numérotation de Kabat, un résidu sérine ou un résidu thréonine. Le polypeptide selon l'invention peut en outre comprendre une séquence peptidique correspondant à un peptide fonctionnel d'intérêt ou une protéine fonctionnelle d'intérêt, ou une pluralité de telles séquences peptidiques correspondant à une pluralité de peptides / protéines fonctionnels d'intérêt. L'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine et ledit ou lesdits peptide(s) / protéine(s) fonctionnel(s) d'intérêt peuvent être séparés par espaceur dans la protéine de fusion ainsi formée. Selon l'invention, les peptides / protéines fonctionnels d'intérêt peuvent être de tout type, en fonction de l'utilisation particulière visée pour le polypeptide. Par exemple, mais non limitativement, il peut s'agir de protéines détectables, de préférence de protéines détectables par fluorescence, luminescence ou phosphorescence, de protéines d'adressage intracellulaire, ou encore de protéines, notamment d'enzymes, dont on souhaite étudier l'effet sur la chromatine ou les histones, ou dont on souhaite qu'elles affectent les marques épigénétiques de la chromatine. Pour l'application des polypeptides selon l'invention pour la détection / visualisation en temps réel de la chromatine, des exemples non limitatifs de telles protéines fonctionnelles d'intérêt sont les fluorophores GFP, YFP, mCherry, l'étiquette HA, SNAP, Flag, etc. Pour l'application à l'étude de la modification de fibre de chromatine ou d'histones, des exemples de protéines fonctionnelles d'intérêt entrant dans la constitution du polypeptide chimérique selon l'invention sont les ubiquitine- ligase E3, les histone acétyl-transférases, les histone méthyltransférases, les biotine ligases, les endonucléases, etc. Le ou les peptide(s) / protéine(s) fonctionnel(s) d'intérêt peuvent aussi bien être fusionnés à l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine à l'extrémité C-terminale, qu'à l'extrémité N-terminale, de ce dernier. Préférentiellement, la fusion est réalisée à l'extrémité C-terminale de l'anticorps. Le polypeptide selon l'invention peut en outre avantageusement comprendre une séquence peptidique correspondant à un peptide de pénétration cellulaire, dit CPP (pour l'anglais Cell Penetrating Peptide), tel que le peptide trans activateur de la transcription TAT du virus HIV1, ou le peptide Penetratin commercialisé par la société Innovagen (Chiu et al., 2010). Un polypeptide particulier selon l'invention comprend une séquence peptidique correspondant à un peptide de pénétration dans les cellules, et une séquence peptidique correspondant à une protéine détectable, telle qu'une protéine fluorescente. Ces séquences peptidiques peuvent être fusionnées à la même extrémité, C-terminale ou N-terminale, de l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine, ou respectivement à ses deux extrémités opposées. Un tel polypeptide s'avère en particulier tout à fait avantageux pour une application pour le marquage de la chromatine dans des cellules vivantes. Il peut à cet effet être directement appliqué, sous forme de protéine recombinante purifiée, sur la culture cellulaire, de manière non invasive, et permettre ainsi la visualisation en temps réel de la chromatine, sans nécessiter la mise en oeuvre de techniques de transgénèse. Un autre aspect de l'invention est une molécule d'acide nucléique codant pour un polypeptide répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant. L'invention concerne également un vecteur d'expression comprenant une telle molécule d'acide nucléique. Ce vecteur d'expression peut être de tout type connu en lui-même pour une mise en oeuvre en ingénierie génétique, notamment un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codant pour le polypeptide selon l'invention. Un objet supplémentaire de l'invention est une cellule hôte comprenant une molécule d'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention, et/ou un vecteur d'expression comprenant une telle molécule. Cette cellule hôte peut aussi bien être une cellule procaryote, en particulier bactérienne, notamment pour la production en masse du polypeptide conforme à l'invention, qu'une cellule eucaryote, inférieur ou supérieur, par exemple de levure, d'invertébrés ou de mammifères. En particulier, entrent dans le cadre de l'invention des lignées cellulaires exprimant, de manière stable, inductible ou constitutive, ou bien transitoire, un polypeptide selon l'invention. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un kit, trouvant application notamment pour la détection et/ou la visualisation en temps réel de la chromatine, en particulier d'un complexe d'histones H2A et H2B, ou encore pour leur modification, leur purification, et plus généralement pour leur étude. Ce kit comprend un polypeptide répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, et/ou une molécule d'acide nucléique codant pour un tel polypeptide, et/ou un vecteur d'expression comprenant une telle molécule d'acide nucléique et/ou une cellule hôte les comprenant. La présente invention concerne en outre un procédé de production d'un polypeptide répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, notamment en vue de son utilisation en tant qu'anticorps, ce procédé comprenant : - la culture de cellules hôtes comprenant une molécule d'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention, dans des conditions permettant l'expression de ce polypeptide, par exemple des cellules bactériennes, telles qu'Escherichia cou, de levure, telles que Saccharomyces cerevisiae, de mammifère ou d'insecte, - et la récupération du polypeptide ainsi produit. Un tel procédé permet notamment, mis en oeuvre chez Escherichia cou/ par exemple, une production en masse du polypeptide et à faible coût. Les polypeptides selon l'invention, les molécules d'acide nucléique codant pour ces polypeptides, les vecteurs d'expression comprenant ces molécules d'acide nucléique, et les cellules hôtes comprenant de telles molécules d'acide nucléique et/ou vecteurs d'expression, trouvent de nombreuses applications, tirant profit à la fois des propriétés d'affinité de l'anticorps à domaine unique pour les histones H2A et H2B sous leur forme hétérodimérique, et des propriétés des domaines VHH des anticorps monocaténaires à chaîne lourde des camélidés, propriétés qui combinées permettent avantageusement un ciblage particulièrement efficace de la chromatine, tant in vitro qu'in vivo. La présente invention concerne ainsi, de manière générale, l'utilisation d'un polypeptide répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, et/ou d'une molécule d'acide nucléique codant pour ce polypeptide, et/ou d'un vecteur d'expression comprenant une telle molécule d'acide nucléique, et/ou d'une cellule hôte les comprenant, pour la fixation d'un peptide / protéine fonctionnel d'intérêt à la chromatine, et plus particulièrement à une ou les deux histone(s) de l'hétérodimère H2A-H2B, ou encore pour provoquer une interférence fonctionnelle in cellulo, par inhibition de la liaison de ces histones avec un ligand naturel. Dans le premier cas, le type de peptide / protéine fonctionnel d'intérêt est choisi en fonction de l'application particulière visée. En particulier, selon l'invention, les polypeptides, les molécules d'acide nucléique, les vecteurs d'expression et/ou les cellules hôte selon l'invention peuvent avantageusement être utilisés pour la détection ou la visualisation, en temps réel, en imagerie cellulaire, de la chromatine, en particulier d'une histone 3 0 0 7 4 1 1 12 de l'hétérodimère H2A-H2B. Par exemple, sous forme de protéines recombinantes, les polypeptides selon l'invention, dans lesquels l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine est fusionné à une étiquette peptidique détectable, 5 peuvent être utilisés en remplacement des anticorps conventionnels, pour la mise en oeuvre de techniques de détection par immunofluorescence, sur cellules fixées, ou par western-blot. De manière tout à fait avantageuse, ils permettent alors le marquage de la chromatine en une seule étape. En immunofluorescence, sur cellules fixées, les polypeptides selon 10 l'invention permettent tout à fait avantageusement de détecter la chromatine avec un bruit de fond négligeable, ceci chez l'ensemble des eucaryotes. Ils permettent notamment l'imagerie des chromosomes mitotiques dans les cellules en division. Exprimés directement, au moyen d'un vecteur d'expression conforme 15 à l'invention, dans les cellules cibles, qu'elles soient vivantes ou fixées, l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine étant en fusion avec une étiquette peptidique détectable, par exemple un fluorophore protéique, ils permettent en outre de réaliser l'imagerie en temps réel de la chromatine. Des expériences d'imagerie en temps réel de cellules eucaryotes ainsi transfectées 20 ont notamment révélé une très nette concentration du fluorophore protéique sur la chromatine en interphase, ce qui permet de visualiser le noyau cellulaire. Ce résultat avantageux est obtenu quel que soit le fluorophore protéique mis en oeuvre, et que la fusion de ce dernier à l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine soit réalisée en C-terminal ou N-terminal de ce dernier. Il 25 est ainsi possible, selon l'invention, de suivre en temps réel l'ensemble de la chorégraphie des chromosomes de la prophase à la télophase. De plus, le fait que les cellules exprimant un polypeptide selon l'invention entrent en mitose démontre que ce dernier n'interfère avantageusement pas avec la progression du cycle cellulaire lorsqu'il est exprimé dans la cellule. 30 Sur cellules fixées et perméabilisées, les polypeptides selon l'invention, pouvant être produits à faible coût, constituent une alternative avantageuse à l'utilisation d'agents intercalants de type DAPI ou d'autres agents colorants, non intercalants, qui sont quant à eux bien plus coûteux et potentiellement cancérigènes. Lorsqu'il est produit sous forme recombinante, associé chimiquement, ou comprenant, en fusion traductionnelle avec l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine, un fluorophore protéique ou une enzyme d'intérêt, et éventuellement un peptide de pénétration cellulaire, les propriétés du polypeptide selon l'invention peuvent avantageusement être mises à profit pour amener le fluorophore protéique ou l'enzyme d'intérêt à la chromatine dans des cellules vivantes. Ceci peut être réalisé par simple mise en contact du polypeptide avec ces cellules, dont il s'ensuit sa pénétration dans les cellules, et son association spontanée à la chromatine. La visualisation ou la modification de la chromatine dans les cellules vivantes peut alors être avantageusement réalisée sans transgénèse, et très facile à mettre en oeuvre. Une application des polypeptides selon l'invention, dans lesquels l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine est fusionné à une protéine détectable par fluorescence, luminescence ou phosphorescence, et le cas échéant avec un peptide de pénétration cellulaire, et produits sous forme recombinante, est ainsi leur utilisation pour la visualisation en temps réel de la chromatine dans les cellules vivantes, par simple addition du polypeptide dans le milieu de culture cellulaire. Le polypeptide selon l'invention, et plus particulièrement une lignée cellulaire transgénique stable qui l'exprime, ou des cellules vivantes dans lesquelles il aurait pénétré, peuvent également être utilisés pour l'étude du cycle cellulaire, de la localisation du noyau, de la morphologie du noyau, ceci sans nécessiter de fixation ou de marquage par immunofluorescence. Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, et/ou d'une molécule d'acide nucléique codant pour un tel polypeptide, et/ou d'un vecteur d'expression comprenant une telle molécule d'acide nucléique, et/ou d'une cellule hôte les comprenant, pour la modification de fibres de chromatine. Préférentiellement, l'anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine y est alors en fusion avec une enzyme dont l'effet sur la chromatine veut être étudié. Sous forme recombinante, le polypeptide selon l'invention peut autrement être utilisé pour la purification de la chromatine, et en particulier du dimère H2A-H2B, par exemple par une technique d'immunoprécipitation. Le polypeptide selon l'invention trouve nombre d'autres applications. En particulier, en biochimie, sous forme recombinante, fusionné à une étiquette appropriée, telle qu'une étiquette GST (glutathion-S-transférase) ou CBD (domaine de liaison à la chitine) par exemple, le polypeptide selon l'invention peut être immobilisé sur un support solide, notamment sous forme de billes magnétiques, billes de sépharose, etc. La matrice d'affinité ainsi générée peut alors être utilisée pour purifier la chromatine, immobiliser des nucléosomes, purifier l'octamère d'histones, ou encore l'hétérodimère H2A-H2B, etc. Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 à 13, dans lesquelles : - la figure 1 montre, pour 96 VHH-HA issus d'une sous-banque de 20 VHH sélectionnée par phage display, les images obtenues par microscopie après immunofluorescence sur cellules fixées (image du haut) et le signal DAPI (image du bas) ; - la figure 2 montre les structures primaires de quatre anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine selon l'invention, nommés 25 respectivement S2 (de séquence SEQ ID N° 1), S12 (de séquence SEQ ID N° 2), C25 (de séquence SEQ ID N° 3) et C76 (de séquence SEQ ID N° 4) ; sur cette figure les différentes régions conservées (FR1, FR2, FR3 et FR4) et hypervariables (CDR1, CDR2, CDR3) de ces anticorps sont alignées ; 30 - la figure 3 représente une photographie d'un gel de polyamide dénaturant coloré au bleu de Coomassie, après migration : piste 1, d'un marqueur de poids moléculaire ; pistes 2 à 7, d'une solution contenant respectivement 1000, 500, 250, 125, 62 et 31 ng de BSA ; pistes 8 à 11, de 81_11 d'un milieu de culture bactérienne dans lequel ont été sécrétés les polypeptides conformes à l'invention respectivement S2-HA, S12-HA, C25-HA, C76-HA; piste 12, de 8 pl d'un milieu de culture bactérienne dans lequel a été sécrété le polypeptide comparatif C8-HA; la flèche indique la bande correspondant à ces polypeptides ; - les figures 4A et 4B montrent les résultats de tests d'immunoblotting réalisés sur des extraits protéiques de cellules humaines, au moyen respectivement de polypeptides conformes à l'invention S2-HA, S12-HA, C25-HA, C76-HA, et d'anticorps monoclonaux anti-H2AX et anti-yH2AX ; figure 4A, pour des extraits protéiques totaux de cellules humaines HCT116, traitées (« Eto+ ») ou non (« Eto- ») avec l'agent génotoxique étoposide, le marqueur de poids moléculaire étant représenté à gauche sur la figure ; figure 4B, pour les histones totales, obtenues par extraction acide à partir de cellules humaines HT1080 (traitées (« Eto+ ») ou non (« Eto- ») avec l'agent génotoxique étoposide), puis soumises (« Ppase+ ») ou non (« Ppase- ») à déphosphorylation, l'image de gauche correspondant à une membrane colorée au rouge Ponceau ; - la figure 5 montre les résultats de tests d'immunoblotting réalisés sur des solutions d'histones pures H2A, H2B, H3 et d'un mélange H2A-H2B, au moyen respectivement de polypeptides conformes à l'invention S2-HA, S12-HA, C25-HA, C76-HA, et du polypeptide comparatif C8-HA; l'image de gauche correspond à une membrane colorée au rouge Ponceau avant incubation avec les polypeptides ; - la figure 6 montre les images de microscopie en fluorescence de cellules humaines HCT116 fixées et perméabilisées traitées en immunofluorescence, montrant le signal VHH (image en haut à gauche) et le signal DAPI (image en bas à gauche), pour des polypeptides selon l'invention (S2-HA, S12-HA, C25-HA et C76-HA) et pour un polypeptide comparatif C8- HA; pour chaque image, l'image de droite associée montre un agrandissement d'une cellule en mitose indiquée par la flèche blanche sur l'image de gauche ; - la figure 7 montre des images de microscopie en fluorescence de fibroblastes embryonnaires murins sauvages, sur lesquels des dommages à l'ADN ont été induits (« Eto ») ou non (« NT »), traités en immunofluorescence avec des polypeptides selon l'invention (S2-HA, S12-HA, C25-HA et C76-HA), et un anticorps anti-yH2AX (contrôle) ; pour chacun, sur l'image du haut, « ADN » représente le signal émis par le DAPI; - la figure 8 montre des images de microscopie confocale en fluorescence d'embryons de Drosophila melanogaster, fixés et traités en immunofluorescence avec des polypeptides selon l'invention (S2-HA, S12-HA, C76-HA et C25-HA) et un polypeptide comparatif C8-HA, montrant pour chacun de ces polypeptides le signal VHH (image de gauche) et le signal ADN révélé par une coloration à l'iodure de propidium (image de droite) ; - la figure 9 montre des images de microscopie confocale en fluorescence d'embryons de Caenorhabditis elegans, fixés et traités en immunofluorescence avec des polypeptides conformes à l'invention S2-HA, S12-HA, C25-HA et C76-HA, et un polypeptide comparatif C8-HA, montrant pour chacun de ces polypeptides le signal VHH (image de gauche) et le signal ADN révélé par le DAPI (image de droite), chaque ligne présentant deux acquisitions du même champ ; - la figure 10 montre des images de microscopie en fluorescence de cellules de Saccharomyces cerevisiae traitées en immunofluorescence avec des polypeptides conformes à l'invention S2-HA, S12-HA et C25-HA, et un polypeptide comparatif C8-HA, montrant pour chacun de ces polypeptides le signal VHH (image de droite) et le signal ADN révélé par le DAPI (image de gauche) ; - les figures 11A et 11B montrent des images de microscopie temps réel de la chromatine pendant la progression du cycle cellulaire à travers la mitose ; figure 11A, images de microscopie champ large et temps réel de 3007 4 1 1 17 cellules HT1080 vivantes exprimant de manière stable le polypeptide conforme à l'invention S12-GFP, une pile d'images résultant d'une fréquence d'acquisition de 5 min étant présentée en éclaté avec inversion de l'échelle de gris ; figure 11B, images de microscopie confocale en fluorescence des 5 chromosomes d'une cellule mitotique exprimant S12-GFP, qui progresse de la prométaphase vers la télophase, la fréquence des acquisitions présentées sur l'éclaté étant de 4 min ; - la figure 12 montre les courbes représentant, pour chacun des polypeptides conformes à l'invention S2-GFP, S12-GFP, C25-GFP et C76- 10 GFP, en fonction du temps, la moyenne (pour 10 mesures indépendantes) des valeurs d'intensité relative de fluorescence dans une région discrète (ROI) du noyau de cellules HT1080 exprimant le polypeptide après photo-blanchiment par une illumination Laser ; - et la figure 13 représente un histogramme présentant, pour chacun 15 des polypeptides conformes à l'invention S2-GFP, S12-GFP, C25-GFP et C76- GFP, la moyenne (pour 10 mesures indépendantes) des valeurs du temps de demi-retour à la fluorescence T1/2, dans une région discrète du noyau de cellules HT1080 exprimant le polypeptide après photo-blanchiment par une illumination Laser, ces valeurs étant déduites de l'ajustement des courbes 20 constituées à partir des mesures relatives d'intensité en fonction du temps à la fonction 1(t)=IE -I x exp(-th). EXPERIENCE 1 - Identification d'anticorps à domaine unique dirigés contre la chromatine selon l'invention 25 Des anticorps à domaine unique dirigés contre la chromatine selon l'invention ont été identifiés par les présents inventeurs de la façon suivante. Construction d'une banque de VHH Une banque d'expression dédiée au phage display, contenant les séquences codantes du répertoire immun VHH d'un lama (Lama glama), a été 30 construite. Les ARN totaux des lymphocytes d'un lama immunisé par un phospho-peptide H2AX synthétique yH2AX de séquence SEQ ID N° 6 (KKATQASP°4QEY) ont été isolés. Ils ont été convertis en ADNc par l'action d'une reverse transcriptase (Superscript® II First Strand synthesis, Invitrogen), après hybridation d'amorces aléatoires. Les ADNc ainsi générés ont servi de matrice pour une réaction de polymérisation en chaîne (PCR), en utilisant le couple d'amorces : CALL01 : 5' GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG 3' (SEQ ID N° 7) CALL02 : 5' GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC 3' (SEQ ID N° 8) permettant l'amplification de la partie variable des chaines lourdes des immunoglobulines en deux produits PCR de taille différente, correspondant respectivement aux VH et VHH. Les séquences codantes des VHH ont été séparées de celles des VH par une électrophorèse en gel d'agarose. Après extraction du gel d'agarose, les ADNc des VHH ont servi de matériel de départ pour deux PCR nichées successives, visant à ajouter dans la bonne phase de lecture les sites de clonage Pstl en 5' et Notl en 3'. Après digestion par les enzymes de restriction Pstl et Notl, l'ADN a été purifié puis inclus par une réaction de ligation, au moyen d'une T4 DNA ligase, dans le vecteur pHEN4 décrit dans la publication d'Arbabi Ghahroudi et al. 20 (1997), digéré par les mêmes enzymes. Le produit de ligation a été introduit dans des bactéries TG1 (sup E) par électroporation, et les cellules transformées ont été étalées sur 96 boîtes (23 x 23 cm) contenant du milieu LB agar additionné d'ampicilline. L'ensemble des colonies bactériennes obtenues a été récolté et la 25 diversité de la banque ainsi générée a été estimée à 6,2.107. Établissement de lignées cellulaires exprimant de manière stable l'histone H2AX fusionnée aux étiquettes Strep ou Chitin Binding Domain (CBD) 3007 4 1 1 19 Afin de pouvoir immobiliser l'histone H2AX sur un support macroscopique solide (billes magnétiques), des vecteurs permettant d'établir l'expression stable de deux formes étiquetées de H2AX ont été construits. La séquence codante de H2AX a été amplifiée par PCR avec les 5 amorces suivantes : For 5' ACGGTACCTCGGGCCGCGGCAAG 3' (SEQ ID N° 9) Rev 5' CGGATCCCTATTAGTACTCCTGGGAGGC 3' (SEQ ID N° 10) Le fragment généré, digéré par les enzymes de restriction Kpnl et BamHI, a ensuite été cloné aux sites Kpnl - BamHI dans deux vecteurs 10 d'expression. Le vecteur pCBD-H2AX obtenu, dérivé du pTYB21 (New England Biolabs), permet l'expression de H2AX en fusion N-terminale avec le domaine de liaison à la chitine. Le vecteur p2xStrep-H2AX obtenu, dérivé du Strep-tag II (iba-lifesciences), permet l'expression de H2AX en fusion N-terminale avec le double tag Strep (2xStrep), de séquence SEQ ID N° 11 15 (WSHPQFEKGGGSGGGSGGGGSAWSHPQFEK) où la séquence VVSHPQFEK représente l'étiquette Strep. La lignée cellulaire permettant l'expression stable de CBD-H2AX a été générée par transfection du vecteur pCBD H2AX dans des cellules HT1080 (fibrosarcome humain) par l'agent de transfection jetPEI® (PolyPlus- transfection), puis sélection des intégrants stables par la généticine (G418). L'établissement de cellules HT1080 exprimant de manière stable 2xStrep-H2AX a été réalisé par transduction lentivirale. Pour cela, la séquence codante de la fusion a été sous clonée par les sites Nhel-BamHI dans le vecteur navette pTRIP-CMV XNCA (Sirven et al., 2001). Le vecteur pTRIP 2xStrep-H2AX résultant a permis de générer des particules lentivirales, utilisées pour transduire des cellules HT1080. Extraction de l'histone H2AX étiquetée de la chromatine et préparation des billes magnétiques Afin d'induire la phosphorylation de H2AX sur la serine 139, les cellules HT1080 exprimant CBD-H2AX ou 2xStrep-H2AX précédemment décrites ont été traitées avec l'agent radiomimétique calichéamicine à 4 nM final. Les histones ont par la suite été isolées par extraction selon le protocole décrit par Shechter et al. (2007). Succinctement, les noyaux ont été préparés par un traitement hypotonique combiné avec le détergent non ionique NP-40. Ils ont été lyses dans un tampon haut sel (2,5 M NaCI) qui permet de conserver les modifications post-traductionnelles et l'interaction entre H2A et H2B, puis l'ADN génomique a été fragmenté par sonication. Ce matériel a servi à charger des billes magnétiques de chitine (New England Biolabs) ou Strep-Tactin® (iba-lifesciences). Pour charger les billes de chitine, les billes magnétiques de chitine ont été lavées avec le tampon de lavage (Tris pH 8 20 mM, EDTA 1 mM, triton X100 0,05 %) contenant du chlorure de sodium (NaCI) à 500 mM, et incubées dans le tampon de blocage (tampon de lavage + 5 % BSA (albumine de sérum bovin)) pendant 40 min à 4 °C sous agitation. Les billes ainsi bloquées ont été lavées 2 fois avec du tampon de lavage 2 M NaCI, reprises dans 1 mL de tampon de lavage 2 M NaCI, puis incubées avec les histones purifiées pendant la nuit à 4 °C sous agitation. Les billes ont alors été lavées extensivement (10 fois avec du tampon de lavage 2 M NaCI), le dernier lavage se faisant en tampon de lavage 500 mM NaCI. Les billes magnétiques Strep-Tactin® (ibalifesciences) ont été chargées par incubation des billes dans un extrait haut sel obtenu sur des cellules HT1080::2xStrep-H2AX, puis le matériel a été lavé dans un tampon phosphate 300 mM NaCI. Sélection des clones par phage display et génération des sous- banques Cette étape a initialement visé à sélectionner des séquences codantes de VHH ayant de l'affinité pour l'histone yH2AX étiquetée, isolée de la chromatine de cellules humaines transgéniques. Le processus de sélection, décrit dans la publication de Lee et al. (2007), a impliqué trois phases distinctes. Dans un premier temps, une première sous-banque a été générée par une sélection phage display contre CBD-yH2AX sur les billes de chitine, avec la BSA comme agent bloquant. Cette première sous-banque VHH a ensuite servi de base dans deux sélections phage display distinctes, suivant le protocole détaillé décrit ci-après : l'une de nouveau contre CBD-yH2AX, avec la fl-caséine comme agent bloquant pour générer la sous-banque dite C, l'autre contre 2xStrep-yH2AX, pour générer la sous-banque dite S. Amplification de la banque et génération des phages Un aliquot bactérien de 1 mL (représentant 100 fois la diversité de la banque) a été amplifié dans 30 ml de milieu TY2X (20 min, 37 °C, 250 rpm) jusqu'à obtenir une DO à 600 nm de 0,25, avant d'être dilué dans 100 mL de TY2X additionné d'ampicilline à 100 pg/mL et de glucose à 1 %. La culture a été incubée 2 h, à 37 °C et 250 rpm, jusqu'à obtenir une DO à 600 nm de 0,5. Les bactéries sont alors infectées avec 1012 phages helper, correspondant à une multiplicité d'infection (MOI) de 40, et incubées 1 h à 37 °C, sans agitation. Après une incubation de 20 min à 37 °C à 230 rpm, la culture est centrifugée 10 min à 2000 rpm. Le culot bactérien, resuspendu dans 300 ml de TY2X additionné d'ampicilline à 100 pg/mL et de kanamycine à 75 pg/mL, est incubé pendant la nuit à 30 °C à 130 rpm. La culture est centrifugée 20 min à 5000 g, et le surnageant contenant les phages est récupéré. Ces derniers sont précipités 1h à froid au moyen de PEG8000 4 % 0,5 M NaCI, centrifugés 30 min à 4000 rpm à 4 °C puis resuspendus dans une solution de PBS 1X stérile, à raison d'environ 1012 phages/mL. La suspension est incubée avec 1 mL de tampon de blocage (tampon de lavage (Tris pH 8 20 mM, EDTA 1 mM, triton X-100 0,05 %) additionné de NaCI à 500 mM et de 5 % BSA) et 40 pl de billes, préalablement équilibrées en tampon de lavage 500 mM NaCI, pendant 40 minutes à 4 °C sous agitation. Les phages ne s'étant pas fixés aux billes de manière aspécifique sont récupérés dans le surnageant. Stratégie de purification des phages par affinité Les phages sont incubés avec les billes de chitine CBD-yH2AX pendant 3 h à 4 °C sous agitation. Les billes sont lavées extensivement (10 lavages (tampon de lavage à 500 mM NaCI), les deux derniers lavages s'effectuant sans Triton@ X-100), puis incubées dans du tampon de lavage additionné de trypsine 1,25 pg/ml et sans Triton®, pendant 30 min à température ambiante et sous agitation, afin d'inactiver les phages helper. Les billes sont alors incubées dans une solution TEA 2,8 % pendant 7 min sous agitation. Après ajout de Tris pH 7,4 à 1,5 M, sous agitation douce, le surnageant contenant les phages élues est récupéré. Les phages élues sont utilisés pour infecter des bactéries TG1, cultivées en milieu LB additionné de glucose 1 % jusqu'à une DO à 600 nm de 0,35, à 30 °C sans agitation pendant 1 h (MOI de 40). De plus, les bactéries TG1 sont ajoutées sur les billes contenant les phages non élues, incubées à 30 °C sans agitation pendant 1 h. Les bactéries TG1 sont rassemblées et étalées sur milieu TY2X agar additionné d'ampicilline à 100 pg/mL et de glucose à 0,5 %, et incubées 1 nuit à 30 °C. Les colonies sont récoltées en milieu LB liquide, et la suspension de bactéries centrifugée pendant 10 min à 2000 rpm et 4 °C. Le culot de bactéries est resuspendu afin de constituer la sous-banque du tour suivant de phage display. L'ajout de 50 % glycérol a permis sa conservation à -80 °C. Le deuxième tour de phage display a été réalisé de façon identique à celui décrit précédemment, en changeant cependant l'étiquette de la protéine immobilisée sur la colonne (étiquette 2xStrep), les billes d'affinité (billes StrepTactin®, iba-lifesciences) et l'agent bloquant (8-caséine, 1 mg/mi au final). La suspension bactérienne obtenue à la fin de ce deuxième tour de phage-display représente la sous-banque S (dont sont issus les clones S2 et S12 décrits ci-après). Parallèlement, une deuxième stratégie de purification des phages par affinité a été développée. Cette stratégie est comparable à celle décrite précédemment, excepté les modifications suivantes. Le premier cycle de phage-display a été réalisé sur une colonne Strep-Tactin® préparée avec la protéine de fusion 2xStrep-yH2AX et la BSA comme agent bloquant. Le second cycle de phage-display a été réalisé sur billes de chitine avec la protéine fusion CBD-yH2AX et la 8-caséine comme agent bloquant. Enfin, les protéines de fusion ont été obtenues à partir de l'extraction d'histone réalisée sur les lignées stables décrites précédemment, selon le protocole d'extraction à forte concentration en sel (Shechter et al. (2007)), suivi d'une sonication afin de fragmenter la chromatine. Cette deuxième stratégie a permis d'obtenir une sous-banque dite C (dont sont issus les clones C25 et C76 décrits ci-après). Crible des sous banques S et C et identification de polypeptides selon l'invention La stratégie retenue pour évaluer les sous-banques générées a consisté à produire (dans le périplasme) de manière clonale les VHH de la sous-banque, à partir de clones bactériens piqués au hasard, puis d'utiliser le milieu bactérien clonai dans lequel le VHH-HA est sécrété en immunofluorescence sur des cellules fixées, et enfin d'analyser en microscopie à fluorescence la structure intracellulaire reconnue par le clone VHH. Une plaque 96 puits (Deep well) contenant du milieu de culture bactérien (2TY additionné d'ampicilline 100 pg/ml) est ensemencée de manière clonale avec des clones d'une sous-banque piqués au hasard. La plaque est incubée à 37 °C sous agitation pendant 5 h. La D0600 atteint environ 0,4. Puis de l'isopropyl 8-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) est ajouté dans chaque puits (pour atteindre une concentration finale de 1 mM), de manière à induire la production des VHH. La température de culture est abaissée à 28 °C et la production est effectuée sur la nuit. Parallèlement, une plaque 96 puits dédiée à l'imagerie cellulaire (Imaging Plate BD Falcon®, coloris noir fond transparent) est ensemencée avec des cellules HT1080 à raison de 2.104 cellules par puits, et placée dans un incubateur à CO2 de culture cellulaire pendant la nuit. La plaque de culture bactérienne est centrifugée (4000 rpm, 15 min) afin de séparer les bactéries de leur milieu et de transférer spécifiquement le surnageant contenant le VHH-HA 300 7 4 1 1 24 sécrété. Les cellules en culture dans les puits de la plaque d'imagerie sont traitées à l'étoposide (10 pM) pendant 1 h, pour induire des cassures de l'ADN, fixées au paraformaldéhyde 4 °A pendant 15 min et perméabilisées, par un traitement par 0,5% Triton® X100 pendant 5 min. 50 pl de milieu bactérien 5 VHH-HA de la plaque fille sont transférés dans une plaque 96 puits, dont les puits contiennent 50 pl d'une dilution au 1/1000 d'un anticorps anti-HA (anti-HA 11 clone 16B12 Covance). Ce mélange est transféré dans la plaque d'imagerie contenant les cellules fixées et perméabilisées. Après incubation (1 h à température ambiante) et un lavage au PBS, l'anti HA est détecté par ajout 10 dans les puits de la plaque de 50 pl d'anticorps anti-souris couplé à l'Alexa Fluor® 488 (dilué au 1/1000 et incubé 1 heure sur les cellules). Après lavage de l'anticorps secondaire, l'ADN est marqué au DAPI, puis les cellules de chaque puits de la plaque sont imagées à l'aide d'un microscope inversé robotisé (ArrayScan Cellomics HCS reader). 15 Les images obtenues pour la sous-banque S sont montrées sur la figure 1. Sur cette figure, l'image du haut représente le signal obtenu par immunofluorescence, et l'image du bas représente le signal DAPI. On y observe qu'un marquage chromatinien homogène remarquablement spécifique est observé pour un certain nombre de clones. 20 L'ADN plasmidique de tous ces clones produisant un VHH marquant la chromatine a été purifié, puis séquence. Les séquences ont été alignées afin de purger les redondances. L'élimination des redondances des clones chromatiniens a permis de dégager deux VHH de la sous-banque S, nommés respectivement S2 (de séquence SEQ ID N° 1) et S12 (de séquence 25 SEQ ID N° 2), ainsi que deux VHH de la sous-banque C, nommés respectivement C25 (de séquence SEQ ID N° 3) et C76 (de séquence SEQ ID N° 4). Les séquences peptidiques du domaine VHH de chacun de ces clones sont montrées sur la figure 2. Sur cette figure sont indiquées les différentes 30 régions conservées et hypervariables de chaque séquence, ainsi que les résidus conservés particulièrement importants pour la liaison à la chromatine dans le CDR3, en positions respectivement 104, 105, 107 et 110 selon la numérotation de Kabat. A titre d'exemple comparatif négatif pour les tests ci-après, un clone C8, de séquence SEQ ID N°5, ne montrant pas d'affinité pour la chromatine, a également été sélectionné. EXPERIENCE 2 - Production des polypeptides recombinants chez Escherichia coui Les polypeptides conformes à l'invention S2-HA, S12-HA, C25-HA, et C75-HA, ainsi que le polypeptide comparatif C8, ont été produits chez E. cou, de la manière suivante. Pour chacun, le vecteur d'expression périplasmique bactérien pHEN4- VHH décrit ci-avant dans l'Expérience 1, est utilisé pour transformer la souche E. cou i BL21(DE3) (transformation au CaCl2). Du milieu de culture 2TY contenant 100 pg/mL d'ampicilline et 0,2 % de glucose est inoculé avec une colonie isolée issue de cette transformation, puis soumis à agitation à 37 °C et 220 rpm jusqu'à obtenir une D0600,, de 0,5. De l'IPTG, à 1 mM final, est alors ajouté à la culture, qui est poursuivie à 28 °C toute la nuit (soit pendant 16 h). La suspension bactérienne est centrifugée à 7000 rpm pendant 10 min, et le milieu, contenant le polypeptide selon l'invention, est récupéré. Un échantillon de 8 pl de chaque solution ainsi obtenue est soumis à analyse par séparation sur un gel de polyacrylamide dénaturant (SDS-PAGE) et coloration du gel au bleu de Coomassie. Des solutions de BSA à différentes concentrations connues sont soumises aux mêmes opérations, de sorte à évaluer, par comparaison de l'intensité des bandes respectives, la concentration du polypeptide selon l'invention (correspondant à une chimère anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine - étiquette HA) sécrété dans le milieu. Le gel obtenu après coloration est montré sur la figure 3. On y observe, pour chaque échantillon de milieu de culture, une bande d'environ 15 kDa, correspondant aux polypeptides selon l'invention S2-HA, S12-HA, C25-HA et C75-HA et au polypeptide comparatif C8-HA. On en déduit en outre, pour chacun des polypeptides testés, une concentration en polypeptide (correspondant à la bande indiquée par une flèche sur la figure) d'environ 20 pg/m I. Ces solutions peuvent être directement utilisées pour l'immunofluorescence ou l'immunoblotting. EXPERIENCE 3 - Identification de la cible moléculaire des polypeptides conformes à l'invention S2, S12, C25 et C76 Afin d'identifier la cible de S2, S12, C25 et C76, ces polypeptides, produits sous forme recombinante, ont été utilisés dans des expériences 15 d'immunoblotting. Le polypeptide C8 a été utilisé en tant que témoin comparatif. 3.1/ Analyse par immunoblotting sur des extraits totaux de cellules humaines Afin de déterminer si les polypeptides objets de la présente invention 20 sont capables de reconnaître leur cible immobilisée sur une membrane de nitrocellulose, et le cas échéant si le patron du signal est modifié par les dommages à l'ADN, et afin de définir la masse moléculaire de la cible à partir de sa mobilité électrophorétique, une expérience d'immunoblotting classique a été menée sur des extraits protéiques totaux préparés à partir de cellules 25 humaines, traitées ou non à l'étoposide. A cet effet, les protéines cellulaires totales de cellules humaines HCT116, traitées (« Eto+ ») ou non (« Eto- ») avec l'agent génotoxique étoposide, sont extraites par lyse directe des cellules dans le tampon de charge SDS. Le lysat ainsi obtenu est sonique avant son dépôt sur gel. Les protéines sont séparées par électrophorèse en gel dénaturant de polyacrylamide (NuPage@ Bis Tris, Life technologies), puis transférées sur membrane de nitrocellulose. Après un blocage dans du TBS-T (Tris Buffered Saline 0,1 % Tween@ 20), 5 % lait écrémé, la membrane est incubée pendant 1 h dans une dilution du polypeptide VHH-HA (5 pg/ml) combiné avec un anticorps anti-HA (HA-11 monoclonal souris 16B12 de Covance) dilué à 1 pg/ml dans du TBST, 5 % lait écrémé. Les membranes sont également sondées avec les anticorps monoclonaux anti-H2AX (Epitomics clone EPR895) et anti-yH2AX (Millipore). Après 3 lavages en TBS-T, le blot est incubé avec l'anticorps secondaire anti- souris couplé à la Horse Radish Peroxydase (HRP) (Cell Signaling), puis lavé 3 fois 10 min. La révélation est effectuée avec un substrat ECL (Enhanced Chemi-Luminescence West Dura Thermo scientific). L'émission de photon de la chemiluminescence est capturée par une caméra (G-Box Syngene). Les images obtenues sont montrées sur la figure 4A. On y observe que les polypeptides conformes à l'invention S2, S12, C25 et C76 reconnaissent tous une bande de mobilité électrophorétique similaire, légèrement au dessus de 15 kDa. La nature des signaux générés par les polypeptides de la présente invention n'est pas modifiée par l'induction de dommages à l'ADN, contrairement à ce qui est observé avec le contrôle anticorps anti-yH2AX. De manière remarquable, la masse moléculaire apparente de yH2AX et celles des espèces reconnues par les polypeptides objets de l'invention sont similaires, suggérant que ces derniers pourraient reconnaître une histone H2A ou H2B. 3.2/ Analyse par immunoblotting sur les histones de cellules humaines obtenus par extraction acide Afin de tester cette hypothèse, mais aussi déterminer si les VHH objets de l'invention reconnaissent un phospho-épitope, les histones ont été préparées à partir de cellules humaines en culture, traitées ou non à l'étoposide, par extraction acide. A cet effet, les histones sont extraites de cellules cultivées in vitro (HT1080), traitées ou non traitées par l'étoposide, par la technique de l'extraction acide décrite dans la publication de Shechter et al. (2007). Succinctement, après trypsination d'une culture adhérente sur plastique, 107 cellules sont lavées au PBS et pré-extraites par re-suspension dans 1 ml de tampon d'extraction (10 mM HEPES pH 7,5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgC12, 0,34 M saccharose, 0,5 °A NP40, 10 °A glycérol, cocktail d'inhibiteurs des protéases et phosphatases (Thermo)). Après 10 min d'incubation dans la glace, le matériel insoluble (noyaux) est culotté par centrifugation (10 000 g, 10 min à 4 °C). Les noyaux sont repris dans 400 pl de 0,4 N H2504 et incubés sur roue pendant 2 h. Après centrifugation (16 000 g, 10 min à 4 °C), le surnageant contenant les histones est récupéré et les histones sont précipitées par ajout d'acide tri-chloro acétique (TCA, 33 % final) et incubation sur glace pendant 1 h. Les histones sont culottées par centrifugation à 16 000 g, pendant 10 min à 4 °C, et le culot lavé 2 fois dans de l'acétone refroidie à -20 °C. Après séchage, le culot d'histone est repris dans 100 pl d'eau. Une partie des histones ainsi obtenues par extraction acide sont, si nécessaire, déphosphorylées par un traitement à la phosphatase alcaline (Roche) selon le protocole fourni par le fournisseur. Les deux préparations d'histones ainsi générées, traitées ou non par phosphatase, sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE et transférées sur membrane de nitrocellulose, selon le protocole décrit ci-avant. Une coloration au rouge Ponceau est réalisée en parallèle. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 4B. On y observe que les polypeptides S2, S12, C25 et C76 reconnaissent des espèces moléculaires dont les mobilités sont très similaires et légèrement situées au dessus du marqueur moléculaire 15 kDa. De manière remarquable, la nature des signaux n'est ni modifiée par les dommages à l'ADN, ni par le traitement phosphatase, alors que l'un et l'autre de ces deux traitements modifient largement le signal généré par l'anticorps anti-gamma H2AX (utilisé ici comme le contrôle de déphosphorylation). Ces résultats montrent que la cible des polypeptides objets de la présente invention est soluble dans l'acide, et n'est pas un phospho-épitope. De plus, la superposition de la colorations au rouge Ponceau, qui permet de visualiser les protéines présentes sur la membrane, avec le signal généré par les VHH S2, S12, C25, et C76, montre que ces derniers reconnaissent des espèces moléculaires se situant entre H3/H2B (qui possèdent une mobilité quasi-identique dans ces conditions d'électrophorèse) et H2A. Ces données restreignent les cibles des VHH conformes à l'invention aux histones H3, H2A, H2B, et permettent d'exclure l'histone H4, ainsi que l'histone H1 en tant que cible moléculaire. 3.3/ Analyse par immunoblotting sur des histones purifiées Afin de caractériser précisément la cible des VHH objets de l'invention, les mêmes expériences d'immunoblotting ont été menées sur les histones individuelles, obtenues par purification par HPLC. Afin de purifier individuellement chacune des 5 classes d'histones, un protocole de séparation des histones par chromatographie haute pression en phase inverse (RP HPLC), décrit dans l'article de Shechter et al. (2007), a été suivi. Plusieurs milligrammes d'histones solubilisées dans l'eau ont été injectés dans une colonne de phase inverse de type C4 équilibrée avec 5 °A d'acétonitrile, 0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA) dans de l'eau. L'élution des histones a été réalisée par un gradient d'acétonitrile (5 - 90 % sur 120 min, avec un débit de 0,8 ml/min). Les fractions obtenues (de 1 mL chacune) ont été lyophilisées, puis reprises dans 100 pl d'eau avant d'être analysées par électrophorèse en gel SDS-PAGE. Les fractions contenant les histones pures ont été retenues, et ont servi à la caractérisation de la cible des polypeptides objet de l'invention. 3007 4 1 1 A cet effet, les protéines des fractions ainsi obtenues, en particulier des fractions contenant H2A, H2B et H3, ainsi qu'un mélange des fractions H2A et H2B, sont séparées par électrophorèse en gel dénaturant de polyacrylamide (NuPage® Bis Tris, Life technologies), puis transférées sur 5 membrane de nitrocellulose. La révélation est réalisée selon le protocole décrit ci-avant. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 5. Cette figure montre que S2, S12, C25 et C76 sont capables de générer un signal uniquement sur la piste qui contient le mélange H2A - H2B. Ce signal est précisément localisé à 10 l'interface des deux bandes H2A et H2B, allant dans le sens d'une reconnaissance du dimère H2A-H2B, qui s'est reconstitué à l'interface des deux protéines déposées sur la membrane de nitrocellulose. L'histone H3 n'est pas reconnue, tandis que un faible halo émane des pistes où les histones H2A et H2B sont à l'état monomérique. Ces résultats montrent que S2, S12, C25, 15 C76 ne reconnaissent pas H3. Ils révèlent en revanche que leur cible est le dimère H2A-H2B, mais pas les monomères. Le test ci-dessus peut être mis en oeuvre pour sélectionner parmi des VHH obtenus par modifications des séquences SEQ ID N° 1 à 4, ceux présentant la capacité de se lier au dimère H2A-H2B. 20 EXPERIENCE 4 - Test d'immunofluorescence sur cellules en culture 4.1/ Matériel et méthodes La lignée HCT116 (adénocarcinome colique humain) et les MEF (fibroblastes embryonnaires murins) sont propagées dans du DMEM (Gibco 25 Life Technologies) supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal et des antibiotiques (pénicilline 10000 unités/mi et streptomycine 10000 pg/ml de Gibco life Technologies, diluées au 1/100), et incubées dans une atmosphère saturée en H20 contenant 5 % de CO2. Pour chaque type cellulaire, les cellules mises en culture sur des 30 lamelles de verre dédiées à l'imagerie cellulaire sont lavées dans du tampon 3007 4 1 1 31 phosphate salin (PBS), puis fixées dans une solution de PBS additionné de paraformaldéhyde à 4 %, pendant 15 min. Les cellules sont perméabilisées par une incubation de 5 min dans du PBS additionné de 0,25 % Triton® X100, puis un blocage est effectué dans du 5 PBS 1 % BSA. Les cellules sont incubées pendant une heure dans un mélange de polypeptide selon l'invention VHH-HA à 5 pg/ml et d'un anticorps anti-HA (monoclonal souris HA-11 Covance, utilisé à 0,5 pg/ml). Après trois lavages au PBS, un anticorps secondaire anti-souris couplé à l'Alexa Fluor® 488 10 (Molecular Probes Life Technologies) dilué au 1/1000 est ajouté sur les lamelles qui sont incubées pendant 45 min à température ambiante. Les cellules sont lavées 3 fois dans du PBS, le troisième milieu de lavage contenant du DAPI à 1 pg/ml. Finalement, le montage sur lame est effectué avec du milieu de montage DAKO. 15 4.2/ Sur cellules humaines Les polypeptides selon l'invention comprenant les anticorps respectifs S2, S12, C25 et C76 (VHH), fusionnés à l'étiquette HA, et un polypeptide comparatif comprenant le VHH C8, également fusionné à l'étiquette HA, ont été testés sur des cellules humaines HCT116 fixées. 20 Une observation en microscopie en fluorescence de chacune des lames est réalisée. Les résultats sont montrés sur la figure 6. Ils démontrent clairement que des polypeptides conformes à l'invention, comprenant les anticorps S2, S12, C25 ou C76, génèrent un signal chromatinien sur les cellules humaines fixées, contrairement au polypeptide comparatif C8-HA. 25 L'observation de l'ADN par le signal DAPI est quant à elle identique pour tous les polypeptides. A droite de chaque figure, l'agrandissement d'une cellule en mitose détaille la liaison des polypeptides sur les chromosomes mitotiques. 4.3/ Sur cellules murines Les polypeptides selon l'invention comprenant les anticorps S2, S12, C25 et C76, fusionnés à l'étiquette HA, ont été testés sur des cellules murines MEF (fibroblastes embryonnaires murins sauvages) fixées, traitées ou non à l'étoposide. Les cellules MEF sont ensemencées sur des lamelles de verre dédiées à l'imagerie. Un jour après l'ensemencement, les cellules sont traitées ou non pendant 1 h à l'étoposide (Sigma Aldrich) dilué dans le milieu de culture à une concentration finale de 10 pM. Les cellules sont ensuite fixées, perméabilisées, puis incubées avec un mélange VHH-HA et anti-HA, comme précédemment décrit. Afin de contrôler l'efficacité de l'induction de dommages à l'ADN par l'étoposide, une lamelle est immunocolorée avec un anticorps anti- yH2AX (Anti phospho histone H2AX 5er139 monoclonal souris clone JBW301 de Millipore dilué 1/1000 final). Une observation en microscopie en fluorescence de chacune des lames est réalisée, pour détecter les signaux respectivement générés par le DAPI (montrant l'ADN), l'anti-yH2AX et les polypeptides conformes à l'invention. Les résultats sont montrés sur la figure 7. Les polypeptides conformes à l'invention (comprenant les anticorps S2, S12, C25 ou C76) génèrent un signal indépendant de la présence de cassures double brin de l'ADN, contrairement au signal obtenu avec l'immunofluorescence anti-yH2AX, qui montre les foyers de cassure double brin après traitement à l'étoposide. EXPERIENCE 5 - Test d'immunofluorescence sur embryons fixés de Drosophile melanogaster Les embryons, obtenus après récolte d'ceufs pondus par des femelles Oregon R sauvages, ont été déchorionés à l'eau de Javel et fixés par du paraformaldéhyde 4 °A, puis conservés dans du méthanol à -20 °C. Les embryons sont ensuite réhydratés par 5 lavages en PBS 0,3 % Triton@ X100 et incubés 30 min dans du PAT (PBS 0,3 °A Triton@ X100 et 1 % BSA). La solution d'anticorps primaires consiste en un mélange du polypeptide VHH-HA (5 pg/ml final) avec un anticorps anti-HA (monoclonal HA-11 Covance dilué à 0,5 pg/ml) dans le PAT. Ces anticorps primaires sont appliqués toute la nuit sur les embryons à 4 °C. Ces derniers sont ensuite lavés 5 fois 10 min avec du PBS 0,3% Triton@ X100. Les anticorps primaires sont révélés par un anticorps anti-souris couplé à l'Alexa 488 (Molecular Probes Life Technologies) dilué au 1/1000 dans du PAT, par incubation pendant 5 h. Le lavage de l'anticorps secondaire est identique à celui des anticorps primaires, excepté que le premier lavage est effectué dans du PBS 0,3 % Triton@ X100 contenant de la RNase A 1 mg/ml, et de l'iodure de propidium 10 pg/ml, afin de marquer l'ADN. Les embryons sont montés dans du milieu de montage DAKO et imagés au microscope confocal Zeiss LSM 510. Les images obtenues, pour chacun des polypeptides S2-HA, S12-HA, C25-HA et C76-HA conformes à l'invention, et pour le polypeptide comparatif C8-HA, sont montrées sur la figure 8. On y observe que, contrairement au polypeptide comparatif C8-HA, les polypeptides conformes à l'invention permettent un marquage très sélectif de la chromatine. EXPERIENCE 6 - Test d'immunofluorescence sur le nématode Caenorhabditis elegans Les nématodes Caenorhabditis elegans sont collectés et lavés dans du PBS. Les téguments de l'animal sont destructurés et perméabilisés par la technique de « freeze cracking » entre deux lamelles de verre. Ainsi préparés, les vers sont associés à une lame traitée à la poly L-lysine et fixés par incubation dans un bain d'acétone glacé (5 min) suivi d'un bain de méthanol glacé (5 min). Les vers fixés sont rehydratés dans du PBS avant une incubation d'1 h dans un tampon anticorps PBS 0,5 mM EDTA, 0,5 % Triton@ X100, 1 % BSA, 2 % serum de veau foetal. Le mélange d'anticorps primaires utilisé est identique à celui précédemment décrit en référence à l'expérience 5 ci-avant. Les lames sont incubées sur la nuit avec le mélange d'anticorps primaires, puis lavées 3 fois 20 min dans du tampon de lavage (PBS 0,25% Triton® X100, 0,1 % BSA). L'anticorps secondaire anti-souris couplé à l'Alexa 488 dilué au 1/1000 est appliqué sur les lames pendant 5 h. Les lames sont lavées 3 fois 20 min 5 dans du PBS 0,25 % Triton® X100, 0,1 % BSA. Lors du second lavage, le tampon contient du DAPI (1 pg/ml) pour un marquage de l'ADN. Le montage final est effectué avec du milieu de montage DAKO, et les nématodes marqués sont imagés au microscope confocal Zeiss LSM 510. Les images obtenues, pour chacun des polypeptides conformes à 10 l'invention, et pour le polypeptide comparatif C8-HA, sont montrées sur la figure 9. On observe là encore que, contrairement au polypeptide comparatif C8-HA, les polypeptides conformes à l'invention permettent un marquage sélectif de la chromatine. 15 EXPERIENCE 7 - Test d'immunofluorescence sur la levure Saccharomyces cerevisiae Les levures Saccharomyces cerevisiae d'une culture de 50 ml sont fixées par ajout de 7,2 ml de paraformaldéhyde 37 %, et incubation pendant 45 min sous agitation douce. Les cellules sont culottées par centrifugation et 20 lavées 3 fois avec un tampon PBS 1,2 M sorbitol. Les cellules sont alors remises en suspension dans 1 ml de PBS 1,2 M sorbitol, 28 mM p-mercaptoéthanol, 1 mM fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Les parois sont digérées par l'ajout de 50 pl de zymolyase 10 mg/ml. Après une incubation de 20 min à 37 °C, les cellules sont culottées et lavées 25 avec du PBS 1,2 M sorbitol. La suspension de sphéroplastes est déposée sur une lamelle de verre recouverte de poly L-lysine, et les cellules ayant adhéré sont fixées par ajout sur la lamelle d'éthanol 70 % refroidi à -20 °C. L'incubation dans l'éthanol est 3007 4 1 1 35 effectuée sur la nuit à -20 °C. Les cellules sont réhydratées par une incubation de la lamelle dans du PBS. Une perméabilisation des membranes est effectuée par une incubation de 5 min dans du PBS 0,1 % NP40, 0,1 % BSA. Les cellules sont lavées dans du PBS 0,1 % BSA, puis le mélange VHH-HA et anticorps anti-HA dilué dans du PBS 0,1 % BSA est appliqué sur les lamelles. L'incubation de 2 h avec les anticorps primaires est suivie par un lavage dans du PBS. L'anticorps secondaire anti-souris couplé à l'Alexa 488 dilué au 1/1000 est appliqué sur les lamelles pendant 1 h. Les lamelles sont alors lavées une première fois dans du PBS contenant du DAPI à 1 pg/ml final, puis une seconde fois dans du PBS, avant d'être montées sur une lame à l'aide du milieu de montage DAKO. L'imagerie des levures est effectuée sur un microscope droit champ large (Leica DM5000), à l'objectif 63x. Les images obtenues, pour chacun des polypeptides S2-HA, S12-HA et C25-HA conformes à l'invention, ainsi que pour le polypeptide comparatif C8-HA, sont montrées sur la figure 10. On observe là encore que, contrairement au polypeptide comparatif C8-HA, les polypeptides conformes à l'invention permettent un marquage sélectif de la chromatine. EXPERIENCE 8 - Test d'imagerie cellulaire en temps réel sur cellules humaines L'objectif de cette expérience a été de déterminer si des polypeptides objets de la présente invention, comprenant un VHH fusionné à la protéine fluorescente GFP, pouvaient être exprimés de manière stable sans affecter la capacité des cellules à proliférer, ainsi que d'évaluer les performances de ces VHH-GFP dans le marquage fluorescent de la chromatine de cellules vivantes. Cette expérience a été réalisée avec les VHH conformes à l'invention S2, S12, C25 et C76. Matériel et méthodes Construction des vecteurs d'expression Afin d'exprimer les polypeptides comprenant un domaine VHH en fusion avec la GFP dans les cellules humaines, la séquence codante des VHH est amplifiée par PCR (avec la Phusion® DNA polymérase de New England Biolabs), à l'aide des amorces suivantes : N1VHH-F : 5' ATACTCGAGCCACCATGGCCCAGGTGCAGCTG 3' (SEQ ID N° 12) et N1VHH-R : 5' AATGGATCCGCGTAGTCCGGAACGTCGTACG 3' (SEQ ID N° 13) introduisant les sites Xhol et BamH I en 5' et 3' de la séquence. Les fragments PCR digérés par ces enzymes sont clonés aux sites Xhol - BamHI du vecteur d'expression pEGFP Ni (Clontech). Afin d'établir par transduction lentivirale des lignées cellulaires exprimant de manière stable les fusions VHH-GFP, les séquences codantes des vecteurs pEGFP Ni ont été sous-clonées dans le vecteur lentiviral navette pTRIP. Culture cellulaire et transduction lentivirale Les cellules humaines HT1080 (fibrosarcome) et 293T (lignée de rein embryonnaire transformée) sont propagées dans du DMEM (Gibco Life Technologies) supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal et des antibiotiques (pénicilline et streptomycine, 10 000 U/ml de Life Technologies), et incubées dans une atmosphère saturée en H20 contenant 5 % de CO2. Les particules virales sont produites par cotransfection (chlorure de calcium) du vecteur navette pTRIP VHH-GFP avec les vecteurs Gag-Pol 8.91 et VSV-G dans des cellules 293T. Les surnageants cellulaires des cellules tritransfectées, contenant les particules lentivirales, sont utilisés après titration pour transdu ire les cellules HT1080. Imagerie cellulaire en temps réel Les cellules exprimant un VHH-GFP sont ensemencées (20 000 à 80 000 cellules par puits) dans des chambres de culture dédiées à l'imagerie en temps réel (Labtek 2 puits Nunc), et incubées 24 à 72 h avant imagerie. La microscopie en temps réel des cellules transgéniques progressant dans le cycle cellulaire est réalisée à l'aide d'un microscope inversé champ large (Zeiss Axio Observer Z1) équipé d'une caméra CoolSnap ES2, d'une chambre d'incubation à atmosphère contrôlée (en température, hygrométrie, taux de CO2) et d'une platine motorisée pilotée par le logiciel Metamorph. Les cellules sont imagées toutes les 5 min en lumière transmise et en fluorescence par un objectif 20x. L'imagerie en temps réel de cellules mitotiques est également réalisée à l'aide d'un microscope confocal de type "Laser Scanning" (LSM 510 Zeiss) en position inversée, équipé d'une chambre d'incubation thermostatée identique à celle précédemment décrite, d'une platine motorisée pilotée par le logiciel Zen (Zeiss) et d'un objectif 40x à immersion eau. La fréquence d'acquisition a été de 4 min. Les piles d'images générées sont traitées avec le logiciel Fiji. Résultats Les successions d'images ainsi obtenues sont montrées respectivement sur les figures 11A et 11B, pour l'exemple particulier du polypeptide 512-GFP conforme à l'invention. Des résultats similaires ont été obtenus pour les polypeptides 52-GFP, C76-GFP et C25-GFP. L'expression des transgènes VHH-GFP étant maintenue dans les cellules transduites au fil de leurs passages, ceci montre que la présence des polypeptides objets de l'invention dans la cellule est parfaitement compatible avec le déroulement normal du cycle de division cellulaire. L'imagerie en temps réel de la fluorescence de la GFP émanant des cellules transgéniques (figure 11A) révèle un marquage spécifique de la chromatine dans les cellules vivantes, semblable à celui obtenu en immunofluorescence dans les cellules fixées. Il est important de noter que la localisation dans le compartiment nucléaire des polypeptides objets de la présente invention ne résulte pas de l'action d'une séquence de localisation nucléaire (NLS), puisque la fusion VHH-GFP n'en possède pas. En revanche, cette phénoménologie est très probablement liée à une diffusion passive à 3 0 0 74 1 1 38 travers les pores de l'enveloppe nucléaire qu'autorise la petite taille de la molécule. Comme le montre la figure 11A, les fusions VHH-GFP permettent le suivi en imagerie cellulaire, à l'échelle d'une population cellulaire ou de la 5 cellule unique, de la motilité cellulaire, de la forme du noyau, de celle des nucléoles, de la structure de la chromatine. Plus encore, les polypeptides conformes à l'invention ainsi exprimés dans les cellules permettent le suivi en temps réel de la chorégraphie des chromosomes mitotiques pendant la division cellulaire (figure 11B), autorisant 10 notamment l'étude de défaut de condensation de la chromatine, de ségrégation des chromatides en anaphase, de rotation de la plaque métaphasique, de durée des différentes phases de la mitose. Les polypeptides selon l'invention peuvent ainsi avantageusement être utilisés pour le criblage HCS (High content screening) de banques de composés, ou en RNAi. 15 EXPÉRIENCE 9 - Test de mobilité des polypeptides sur leur cible dans des cellules vivantes L'objet de cette expérimentation a été d'évaluer et de quantifier, par une approche de photo-blanchiment de la GFP effectuée sur les cellules 20 transgéniques VHH-GFP, la mobilité de polypeptides objets de la présente invention S2-GFP, S12-GFP, S45-GFP, C25-GFP et C76-GFP sur leur cible histone dans le noyau des cellules vivantes. Méthodologie Les expériences de recouvrement de la fluorescence après photo- 25 blanchiment (FRAP) ont été réalisées sur les cellules HT1080 qui expriment de manière stable les différents VHH-GFP ci-dessus. L'outil optique de photo-blanchiment, d'excitation du fluorophore et d'acquisition de l'émission de photon est un microscope confocal de type "Laser Scanning" (LSM 510 Zeiss) en position inversée, équipé d'une chambre d'incubation thermostatée 3007 4 1 1 39 identique à celle précédemment décrite, et piloté par le logiciel Zen (Zeiss). L'objectif utilisé est un 40x à immersion eau. Le photo-blanchiment et l'excitation du fluorophore sont réalisés par un Laser Argon accordé à 488 nm. Une sous-région du noyau (Region of Interest : 5 ROI), circulaire, est définie arbitrairement. La séquence FRAP d'illumination - acquisition de la fluorescence consiste en une première acquisition (état initial), puis une illumination par le Laser Argon (488 nm) de la ROI conduisant au photo-blanchiment de la zone est déclenchée, directement suivie d'une acquisition (t = 0) qui se poursuit toutes les secondes jusqu'au retour stabilisé 10 de la fluorescence émise. Pour chaque polypeptide, les mesures de FRAP ont été effectuées sur au moins 10 cellules indépendantes. Les calculs de la moyenne de l'intensité de la ROI, sa correction, la moyenne relative (moyenne d'intensité / valeur maximale du signal du retour de fluorescence), l'établissement de la courbe de l'intensité relative de la ROI en 15 fonction du temps, puis l'ajustement de cette courbe à une relation mathématique (#) reliant l'intensité en fonction du temps (permettant de déduire la valeur du temps de demi-recouvrement T1/2) sont effectués par la macro FRAP du logiciel Zen. Le calcul des moyennes et écarts-types (de 10 expériences indépendantes pour chaque polypeptide) des valeurs d'intensité 20 relative en fonction du temps et des T1/2 déduits, l'établissement des courbes et de l'histogramme afférents ont été réalisés à l'aide du tableur Excel. (#)1(t) = IE -I x exp(-t/T) OÙ IE est la valeur au plateau du retour, Il est la valeur de la fraction mobile, -c est la constante de temps qui décrit la mobilité de la molécule 25 étudiée, T1/2 est le temps de demi-retour de la fluorescence de la molécule fluorescente photo-blanchie avec T1/2 = In . Résultats Les courbes du recouvrement de la fluorescence en fonction du temps, pour chaque polypeptide conforme à l'invention, sont montrées sur la 30 figure 12. Les valeurs du temps déduit de demi-retour T1/2 du polypeptide sur sa cible, pour chacun des polypeptides testés, sont présentées sur la figure 13. L'échelle de valeur des T1/2, entre 3 et 1,5 secondes, indique une mobilité relativement importante des polypeptides conformes à l'invention sur leur cible histone. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Arbabi Ghahroudi et al. (1997) FEBS Lett., 414(3): 521-6 Chiu et al. (2010) Molecular Pharmacology, 77(4): 497-507 Lee et al. (2007) Nature Protocols, 2(11): 3001-8 Shechter et al. (2007) Nature Protocols, 2(6): 1445-57 Sirven et al. (2001) Mol Ther., 3(4): 438-48 REVENDICATIONS1. Polypeptide comprenant un anticorps à domaine unique dirigé contre la chromatine, dérivé d'un anticorps à chaîne lourde naturellement dépourvu de chaîne légère (VHH) de camélidé et capable de se lier spécifiquement à un complexe d'histones H2A et H2B. 2. Polypeptide selon la revendication 1, dans lequel ledit anticorps à domaine unique présente : - la séquence d'acides aminés de l'une quelconque des séquences SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4, - une séquence comprenant une ou plusieurs délétion(s), addition(s) ou substitution(s) d'un ou plusieurs acides aminés par rapport à l'une de ces séquences, qui ne modifient pas de manière significative les caractéristiques de liaison de l'anticorps à un complexe d'histones H2A et H2B, - et/ou une partie fonctionnelle d'une desdites séquences conservant le(s) site(s) de liaison et le(s) domaine(s) protéique(s) nécessaires à la liaison à 15 un complexe d'histones H2A et H2B. 3. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel ledit anticorps à domaine unique est un domaine VHH. 4. Polypeptide selon la revendication 3, dans lequel ledit anticorps à domaine unique comporte, en position 107 selon la numérotation de Kabat, un 20 résidu arginine. 5. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, dans lequel ledit anticorps à domaine unique comporte, en position 110 selon la numérotation de Kabat, un résidu sérine ou un résidu thréonine. 6. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, 25 dans lequel ledit anticorps à domaine unique comporte, en position 104 selonla numérotation de Kabat, un résidu glycine. 7. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel ledit anticorps à domaine unique comporte, en position 105 selon la numérotation de Kabat, un résidu sérine ou un résidu tyrosine. 8. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant en outre une séquence peptidique correspondant à un peptide / protéine fonctionnel d'intérêt, notamment une protéine détectable, de préférence une protéine détectable par fluorescence, luminescence ou phosphorescence. 9. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant en outre une séquence peptidique correspondant à un peptide de pénétration cellulaire. 10. Molécule d'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Vecteur d'expression comprenant une molécule d'acide nucléique selon la revendication 10. 12. Cellule hôte comprenant une molécule d'acide nucléique selon la revendication 10 et/ou un vecteur d'expression selon la revendication 11. 13. Procédé de production d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant la culture de cellules hôtes comprenant une molécule d'acide nucléique selon la revendication 10 dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide, et la récupération du polypeptide ainsi produit. 14. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 9, et/ou d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 10, et/ou d'un vecteur selon la revendication 11 et/ou d'une cellule hôte selon la revendication 12, pour la détection et/ou la visualisation entemps réel de la chromatine, en particulier d'un complexe d'histones H2A et H2B. 15. Utilisation selon la revendication 14, d'un polypeptide selon les revendications 8 et 9, dans lequel ladite protéine fonctionnelle d'intérêt est une 5 protéine détectable par fluorescence, luminescence ou phosphorescence, pour la visualisation en temps réel de la chromatine dans des cellules vivantes. 16. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et/ou d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 10, et/ou d'un vecteur selon la revendication 11 et/ou d'une 10 cellule hôte selon la revendication 12, pour la modification de fibres de chromatine in vitro, sur cellules fixées ou sur cellules vivantes en culture. 17. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la purification de la chromatine. 18. Kit, notamment pour la détection et/ou visualisation de la 15 chromatine, en particulier d'un complexe d'histones H2A et H2B, comprenant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et/ou une molécule d'acide nucléique selon la revendication 10, et/ou un vecteur selon la revendication 11 et/ou une cellule hôte selon la revendication 12.