Brevet FR3009312A1 — publié le 20150206

Résumé de l'invention La présente invention concerne un nouveau modèle tissulaire in vitro qui reproduit des caractéristiques moléculaires et structurales de la Dermatite Atopique (DA). Ce modèle d'épiderme tridimensionnel présente également toutes les caractéristiques d'une fonction barrière altérée. Ce modèle est obtenu en stimulant un substitut cutané avec un réactif pro-inflammatoire contenant au moins de l'IL-1f3. Ce réactif induit la production de médiateurs moléculaires clés dans la pathologie de la DA et une modulation de la fonction barrière cutanée. La présente invention concerne également une méthode de criblage ou d'évaluation de principes actifs pouvant avantageusement être utilisés dans le traitement de la DA et des peaux sèches à très sèches à tendance atopique. Description de l'art antérieur La DA est définie, en clinique, comme une maladie inflammatoire de la peau ayant une grande incidence dans les pays industrialisés. Elle est caractérisée par un terrain génétique complexe, un système immunitaire perturbé, l'implication de facteurs environnementaux et des manifestations typiques sur la peau (Wollenberg, A., Rawer, H. C. & Schauber, J. (2011) Innate immunity in atopic dermatitis. Clin.Rev.Allergy Immunol., 41, 272-281). La DA implique également un défaut de barrière cutanée. La filaggrine est une des protéines importantes de la différenciation terminale des kératinocytes et donc de la fonction barrière de la peau. Les mutations non sens du gène codant pour cette protéine représentent un facteur de prédisposition majeur de la DA, de l'asthme et des allergies (Cornelissen, C., Marquardt, Y., Czaj a, K., Wenzel, J., Frank, J., Luscher-Firzlaff, J., Luscher, B. & Baron, J. M. (2011) IL-31 regulates differentiation and filaggrin expression in human organotypic skin models. iAllergy Clin.Immunol.). Très récemment, une étude a permis de montrer que, dans la peau des patients DA, la filaggrine est moins exprimée que chez des 1 sujets sains quelque soit le génotype (Pellerin, L., Henry, J., Hsu, C. Y., Balica, S., Jean-Decoster, C., Mechin, M. C., Hansmann, B., Rodriguez, E., Weindinger, S., Schmitt, A. M., Serre, G., Paul, C. & Simon, M. (2013) Defects of filaggrin-like proteins in both lesional and nonlesional atopic skin. iAllergy Clin.Immunol., 131, 1094-1102). Par ailleurs, une forte diminution de la claudine-1, protéine des jonctions serrées, a été observée dans la peau des patients atteints de DA (De Benedetto, A., Rafaels, N. M., McGirt, L. Y., Ivanov, A. I., Georas, S. N., Cheadle, C., Berger, A. E., Zhang, K., Vidyasagar, S., Yoshida, T., Boguniewicz, M., Hata, T., Schneider, L. C., Hanifin, J. M., Gallo, R. L., Novak, N., Weidinger, S., Beaty, T. H., Leung, D. Y., Barnes, K. C. & Beck, L. A. (2011) Tight junction defects in patients with atopic dermatitis. iAllergy Clin.Immunol., 127, 773-786). Outre une altération de ces protéines structurales essentielles au maintien de l'homéostasie épidermique, une déficience dans la production des peptides anti-microbiens (PAMs) ou un défaut d'expression du récepteur Toll-like de type 2 (TLR-2) qui assurent ensemble l'immunité innée épithéliale, ont été aussi observés dans la peau de patients DA (Niebuhr, M., Heratizadeh, A., Wichmann, K., Satzger, I. & Werfel, T. (2011) Intrinsic alterations of pro-inflammatory mediators in unstimulated and TLR-2 stimulated keratinocytes from atopic dermatitis patients. Exp.Dermatol., 20, 468472). Les modèles in vitro de DA sont un champ d'investigation permanent. Quelques modèles in vitro de DA ont déjà été décrits dans l'art antérieur: - un modèle de kératinocytes cultivés en monocouche (Kinoshita, H., Takai, T., Le, T. A., Kamijo, S., Wang, X. L., Ushio, H., Hara, M., Kawasaki, J., Vu, A. T., Ogawa, T., Gunawan, H., Ikeda, S., Okumura, K. & Ogawa, H. (2009) Cytokine milieu modulates release of thymic stromal lymphopoietin from human keratinocytes stimulated with double-stranded RNA. iAllergy Clin.Immunol., 123, 179-186) : sur ces cellules, Kinoshita démontre l'induction de TSLP par la combinaison de Poly I:C et TNFOE ou la combinaison Poly I:C et IL-4 + IL13 (Kinoshita, H., Takai, T., Le, T. A., Kamijo, S., Wang, X. L., Ushio, H., Hara, M., Kawasaki, J., Vu, A. T., Ogawa, 2 T., Gunawan, H., Ikeda, S., Okumura, K. & Ogawa, H. (2009) Cytokine milieu modulates release of thymie stromal lymphopoietin from human keratinocytes stimulated with double-stranded RNA. iAllergy Clin.Immunol., 123, 179-186). Ce modèle de kératinocytes cultivés en monocouche présente cependant l'inconvénient de travailler sur des cellules prolifératives et non différenciées. De ce fait, elles n'expriment pas la plupart des marqueurs de différenciation épidermique. Le modèle est donc éloigné de la pathologie DA qui affecte toutes les couches vivantes de l'épiderme, dont une des couches les plus différenciées de l'épiderme, la couche granuleuse. Cette dernière est essentielle à la formation des précurseurs de l'enveloppe cornée et du ciment lipidique qui sont à l'origine de la fonction barrière cutanée, essentiellement portée par la couche cornée, la couche la plus superficielle et la plus différenciée de l'épiderme. Par ailleurs, ce modèle de kératinocytes cultivés en monocouche est limitant par le fait qu'il ne permet pas de cribler des principes actifs à vocation de protection ou de réparation de la fonction barrière et de l'intégrité tissulaire. Il ne permet pas non plus de procéder à des évaluations de produits ou formulations par voie topique. Ce modèle n'est donc pas adapté pour l'évaluation de composés candidats au traitement de la DA ou à la réparation de la fonction barrière de la peau. - un modèle sur explant de peau humain : les auteurs ont observé une induction de TSLP par la combinaison des cytokines IL4 et IL13 (Bogiatzi, S. I., Fernandez, I., Bichet, J. C., Marloie-Provost, M. A., Volpe, E., Sastre, X. & Soumelis, V. (2007) Cutting Edge: Proinflammatory and Th2 cytokines synergize to induce thymie stromal lymphopoietin production by human skin keratinocytes. lImmunol., 178, 3373-3377), ou par la combinaison TNFa + IL4 (Bogiatzi, S. I., Guillot-Delost, M., Cappuccio, A., Bichet, J. C., Chouchane-Mlik, O., Donnadieu, M. H., Barillot, E., Hupe, P., Chlichlia, K., Efremidou, E. I., Aractingi, S., Bayrou, O. & Soumelis, V. (2012) Multiple-checkpoint inhibition of thymie stromal lymphopoietin-induced T(H)2 response by T(H)17-related cytokines. iAllergy Clin.Immunol.). Le modèle sur explant de peau humain présente cependant l'inconvénient de dépendre de déchets opératoires de peau humaine. Il est donc lié de manière inhérente à une grande variabilité. La reproductibilité des résultats est 3 ainsi fortement impactée et limite le développement de screening de principe actifs et de formulations. Ce modèle n'est donc pas adapté pour l'évaluation de composés candidats au traitement de la DA ou à la réparation de la fonction barrière de la peau. - D'autres auteurs ont rapportés des modèles désignés comme « modèles de DA» mais sans démontrer la production de TSLP (Kamsteeg, M., Bergers, M., de Boer, R., Zeeuwen, P. L., Hato, S. V., Schalkwijk, J. & Tjabringa, G. S. (2011) Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am.IPathol., 178, 2091-2099); or le marqueur TSLP est essentiel dans l'initiation de la DA et doit être un marqueur indispensable à obtenir in vitro. Il ressort de ce constat général qu'il est nécessaire de disposer d'un modèle tissulaire in vitro plus pertinent et robuste permettant d'identifier des composés modulateurs de la réponse inflammatoire induite. Ces composés pourront en effet être utilisés pour traiter la DA ou pour réparer la fonction barrière de la peau. Ce modèle tissulaire pourra plus particulièrement être utilisé pour cribler des composés candidats et sélectionner ceux présentant un effet sur les différentes caractéristiques épidermiques de la DA, c'est à dire sur le défaut de barrière associé à une altération de l'intégrité structurale, sur la réponse innée épithéliale spécifique, et/ou sur la réponse inflammatoire kératinocytaire spécifique. Ce modèle tissulaire doit être pleinement différencié, reproductible et robuste, afin de permettre l'évaluation de compositions contenant lesdits composés candidats et destinées à être utilisées sous forme topique. Description détaillée de l'invention La cytokine TSLP (« Thymic stromal lymphopoietin ») est reconnue par l'homme de l'art comme le marqueur clé dans l'initiation de la DA. Soumelis et al, ont montré que TSLP était fortement exprimée par les kératinocytes des patients atteints de DA. 4 Cette cytokine est associée au recrutement et à l'activation des cellules de Langerhans in situ, ce qui a permis de suggérer pour la première fois que TSLP pouvait être une cytokine initiatrice précoce et directe des cellules dendritiques (Soumelis, V., Reche, P. A., Kanzler, H., Yuan, W., Edward, G., Homey, B., Gilliet, M., Ho, S., Antonenko, S., Lauerma, A., Smith, K., Gorman, D., Zurawski, S., Abrams, J., Menon, S., McClanahan, T., Waal-Malefyt, R. R., Bazan, F., Kastelein, R. A. & Liu, Y. J. (2002) Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat.Immunol., 3, 673-680). De plus, il a été démontré que TSLP est un élément essentiel dans le processus d'inflammation allergique chez l'homme (Liu, Y. J. (2006) Thymic stromal lymphopoietin: master switch for allergic inflammation. iExp.Med., vol 203 N°2, 269-273) (Takai, T. (2012) TSLP expression: cellular sources, triggers, and regulatory mechanisms. Allergol.Int., 61, 3-17) impliqué dans la physiopathologie de la DA mais aussi de l'asthme (Shikotra, A., Choy, D. F., Ohri, C. M., Doran, E., Butler, C., Hargadon, B., Shelley, M., Abbas, A. R., Austin, C. D., Jackman, J., Wu, L. C., Heaney, L. G., Arron, J. R. & Bradding, P. (2012) Increased expression of immunoreactive thymic stromal lymphopoietin in patients with severe asthma. iAllergy Clin.Immunol., 129, 104-111), de l'oesophagite à éosinophiles (Sherri!!, J. D., Gao, P. S., Stucke, E. M., Blanchard, C., Collins, M. H., Putnam, P. E., Franciosi, J. P., Kushner, J. P., Abonia, J. P., Assa'ad, A. H., Kovacic, M. B., Biagini Myers, J. M., Bochner, B. S., He, H., Hershey, G. K., Martin, L. J. & Rothenberg, M. E. (2010) Variants of thymie stromal lymphopoietin and its receptor associate with eosinophilic esophagitis. iAllergy Clin.Immunol., 126, 160-165) et de la rhinite allergique (Bunyavanich, S., Melen, E., Wilk, J. B., Granada, M., Soto-Quiros, M. E., Avila, L., Lasky-Su, J., Hunninghake, G. M., Wickman, M., Pershagen, G., O'Connor, G. T., Weiss, S. T. & Celedon, J. C. (2011) Thymie stromal lymphopoietin (TSLP) is associated with allergic rhinitis in children with asthma. Clin.Mol.Aller ., 9:1). 5 Outre TSLP, d'autres cytokines et chemokines sont considérées comme des marqueurs de cette pathologie. Ainsi, les concentrations en RANTES/CCL5 et IL-6 dans les sérums de patient DA sont directement corrélées avec la sévérité de la maladie (Horney, B., Steinhoff, M., Ruzicka, T. & Leung, D. Y. (2006) Cytokines and chemokines orchestrate atopic skin inflammation. iAllergy Clin.Immunol., 118, 178-189; Samochocki, Z., Alifier, M., Bodera, P., Jeziorkowska, R., Rosiak, E., Jurkiewicz, B., Glinska, O., Glinski, W. & Stankiewicz, W. (2012) T-regulatory cells in severe atopic dermatitis: alterations related to cytokines and other lymphocyte subpopulations. Arch.Dermatol.Res., 304, 795-801). De même, l'expression de MCP-3/CCL7 semble augmentée dans les zones tissulaires préalablement challengées de patients DA (Ying, S., Robinson, D. S., Meng, Q., Barata, L. T., McEuen, A. R., Buckley, M. G., Walls, A. F., Askenase, P. W. & Kay, A. B. (1999) C-C chemokines in allergen-induced late-phase cutaneous responses in atopic subjects: association of eotaxin with early 6-hour eosinophils, and of eotaxin-2 and monocyte chemoattractant protein-4 with the later 24-hour tissue eosinophilia, and relationship to basophils and other C-C chemokines (monocyte chemoattractant protein-3 and RANTES). lImmunol., 163, 3976-3984). Enfin, le taux d'IL-8 dans le stratum corneum de la peau de patients DA est également corrélé avec la sévérité de la maladie dans l'étude d'Amarbayasgalan et al (Amarbayasgalan, T., Takahashi, H., Dekio, I. & Monta, E. (2012) Interleukin-8 Content in the Stratum Corneum as an Indicator of the Severity of Inflammation in the Lesions of Atopic Dermatitis. Int.Arch.Allergy Immunol., 160, 63-74). Le but des présents inventeurs étaient de disposer d'un modèle épidermique tridimensionnel stratifié et différencié permettant de déterminer in vitro, de façon fiable et reproductible, la capacité d'un composé (ou d'une composition le contenant) à moduler les marqueurs de la DA, et notamment la sécrétion de la cytokine TSLP, ainsi qu'éventuellement la sécrétion des autres cytokines décrites ci-dessus. Dans ce contexte, les inventeurs ont identifié une combinaison pro-inflammatoire apte à générer la production de ces marqueurs de manière significative et reproductible. En particulier, cette combinaison permet d'induire, dans une peau reconstruite ou dans un épiderme reconstruit: 6 - la production de TSLP de manière significative et reproductible (cf figures lA et 7); - la production d'autres marqueurs clés de la DA tels que RANTES/CCL5 (figure 2A) et/ou MCP-3/CCL7 (figure 3A) et/ou IL-6 (figure 4A) et/ou IL-8 (figure 5A) de manière significative et reproductible; - la génération d'une signature transcriptionnelle caractéristique de celle décrite dans l'épiderme de patient DA (cf. figures 1B, 2B, 3B, 4B, et 5B) ; et - la dégradation de marqueurs ultrastructuraux indicateurs de l'intégrité de la barrière cutanée telle que celle observée in vivo dans la peau de patients DA (figure 6). Une caractéristique essentielle de la combinaison pro-inflammatoire selon la présente invention est qu'elle contient de l'interleukine IL-1(3. Les inventeurs ont en effet pu démontrer que l'incubation d'une peau ou d'un épiderme reconstruit(e) avec un réactif contenant une quantité efficace d'IL-1(3 induisait une forte production de TSLP (cf. figure 1), et des autres marqueurs de la DA (cf. figures 2 à 5). Les inventeurs ont également constaté qu'il était avantageux d'associer l'IL-1(3 à un ligand du récepteur TLR-2 (SEQ ID NO :9) et/ou un ligand du récepteur TLR-3 (SEQ ID NO :10). Selon un premier aspect, la présente invention concerne donc un réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant entre 10 et 500 ng/mL, de préférence entre 20 et 200 ng/mL, de manière encore plus préférée, 6Ong/mL d'interleukine IL-1(3. Dans un mode de réalisation particulier, ledit réactif contient également : a. Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, d'un ligand du récepteur TLR-2, ou b. Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, d'un ligand du récepteur TLR-3. 7 Dans un mode de réalisation encore plus particulier, ledit réactif contient également : a. Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, d'un ligand du récepteur TLR-2, et b. Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, d'un ligand du récepteur TLR-3. L'IL-1f3 est une cytokine sécrétée par les macrophages, les monocytes, les cellules dendritiques et les kératinocytes. Elle augmente l'expression des facteurs d'adhésion sur les cellules endothéliales, afin de faciliter la transmigration des leucocytes sur le ou les sites d'infection. Cette cytokine a, chez l'homme, la SEQ ID NO :1. Elle est vendue sous forme recombinante par différentes sociétés, notamment Tebu-Bio, R&D systems et Invivogen. Le TLR-2 (« Toll-like receptor 2 ») reconnaît de nombreux motifs antigéniques (PAMP pour « Pathogen Associated molecular patterns ») localisés à la surface de pathogènes (lipoprotéines de membranes bactériennes, peptidoglycanes de bactéries Gram+, zymosan, hémagglutinine du virus des oreillons,...). De préférence, dans le cadre de la présente invention, le ligand du récepteur TLR2 est un composé de la paroi cellulaire d'une bactérie Gram-positive, tel qu'un peptidoglycane, l'acide lipoteichoique ou une lipoprotéine, un lipoarabinomanne de mycobactérie ou le zymosan de la paroi cellule de la levure. De manière encore plus préférée, dans le cadre de la présente invention, le ligand du récepteur TLR2 est le lipopeptide tri-acyle Pam3CSK4 de formule : OS e r-Lys -Lys -Lys -Lys ONH O 0 C H3 Ce ligand est commercialisé par différentes sociétés, notamment Invivogen, Tocris Bioscience. H 3C C 8 Le TLR-3 (« Toll-like receptor 3 ») reconnait quant à lui exclusivement l'ARN double brin. Le Poly I :C (poly[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-y1)- 3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl dihydrogen phosphate), de formule : ri est le ligand le plus couramment utilisé pour le TLR3. Il est commercialisé par de nombreuses sociétés, notamment Invivogen, Tocris Bioscience. D'autres ligands du TLR3 peuvent être utilisés, comme le poly (A :U). Dans le cadre de la présente invention, le ligand du TLR3 utilisé est le poly (I :C). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le réactif de stimulation pro- inflammatoire contient: - 6Ong/mL d' IL-1(3, - 101.1g/mL de Poly I:C, et - 51.1.g/mL de Pam3CKS4. Dans un autre aspect, la présente invention vise l'utilisation d'un réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant de l'interleukine IL-1(3 pour reproduire in vitro la physiopathologie de la DA et/ou altérer la fonction barrière dans un substitut cutané. 9 Dans cette utilisation, ledit réactif contient entre 10 et 500 ng/mL, de préférence entre 20 et 200 ng/mL, de manière encore plus préférée, 6Ong/mL d'interleukine IL-1(3. Dans un mode de réalisation préféré, ledit réactif pro-inflammatoire comprend en outre un ligand du récepteur TLR-2 et/ou un ligand du récepteur TLR-3, lesdits ligands étant tels que définis ci-dessus. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, ledit ligand du récepteur TLR-2 est Pam3CKS4 et en ledit ligand du récepteur TLR-3 est le poly I:C. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la présente invention vise l'utilisation d'un réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant : - entre 10 et 500 ng/mL, de préférence entre 20 et 200 ng/mL, de manière encore plus préférée, 6Ong/mL d'interleukine IL-1(3, et - Entre 3 et 20 lag/mL, de préférence entre 3 et 15 lag/mL, de manière encore plus préférée 51.1.g/mL de Pam3CKS4, ou - Entre 3 et 20 lag/mL, de préférence entre 3 et 15 lag/mL, de manière encore plus préférée 101.1.g/mL de Poly (I :C). Dans un mode de réalisation préféré entre tous, la présente invention vise l'utilisation d'un réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant : entre 10 et 500 ng/mL, de préférence entre 20 et 200 ng/mL, de manière encore plus préférée, 6Ong/mL d'interleukine IL-1(3, et Entre 3 et 20 lag/mL, de préférence entre 3 et 15 lag/mL, de manière encore plus préférée 51.1.g/mL de Pam3CKS4, et Entre 3 et 20 lag/mL, de préférence entre 3 et 15 lag/mL, de manière encore plus préférée 101.1.g/mL de Poly (I :C). Ainsi, le réactif de stimulation pro-inflammatoire peut contenir avantageusement: - 6Ong/mL d' IL-1(3, - 101.1.g/mL de Poly I:C, et 10 - 51.1g/mL de Pam3CKS4. Dans le contexte de la présente invention, le terme « substitut cutané » désigne une peau reconstruite ou un épiderme reconstruit, de préférence humain, qui contient des cellules différenciées, réparties en plusieurs couches. En particulier, la peau reconstruite contient, au sens de la présente invention, au moins deux compartiments, un compartiment dermique, et un compartiment épidermique. Par « épiderme reconstruit », on entend au sens de la présente invention un épiderme généré in vitro par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier (cf., par exemple, Use of Epidermal Equivalents Generated from Follicular Outer Root Sheath Cells in vitro and for Autologous Grafting of Chronic Wounds. Alain Limat, Thomas Hunziger. Cells Tissues Organs 2002;172:79-85 ; A simple reconstructed human epidermis: preparation of the culture model and utilization in in vitro studies) (Poumay Y, Dupont F, Marcoux S, Leclercq-Smekens M, Hérin M, Coquette A. Arch Dermatol Res. 2004 Oct;296(5):203-11. Epub 2004 Sep 2. ). Par « peaux reconstruites », on entend au sens de la présente invention une composante épidermique contenant des kératinocytes, générée in vitro et une composante dermique contenant des fibroblastes, générée in vitro. La peau reconstruite est disponible commercialement. Ainsi, le modèle de l'invention est un modèle tridimensionnel de peau ou d'épiderme reconstruit, stratifié et différencié, qui présente des caractéristiques clés de la physiopathologie de la DA ou d'une fonction barrière altérée. Dans ce cas, les 4 couches épidermiques (couche basale, couche spineuse, couche granuleuse et couche cornée) y sont distinctes et fonctionnelles. Par « fonction barrière de la peau », on entend, au sens de la présente invention, la protection conférée par la couche épidermique sur la peau. Cette fonction consiste plus particulièrement à protéger l'organisme de la déshydratation dans un milieu non aquatique. Pour mesurer la fonction et l'intégrité de la barrière cutanée en clinique, les méthodes biométriques sont utilisées. Les deux analyses fonctionnelles les plus 11 courantes sont la perte insensible en eau, dont l'augmentation signifie une perte de la fonction de barrière, et la cornéométrie qui quantifie l'état d'hydratation de la couche cornée. Par « fonction barrière altérée », on entend, au sens de la présente invention, une diminution de la fonction de protection telle que définie ci-dessus. Elle se traduit notamment par une sécheresse cutanée qui peut conduire à des pathologies secondaires comme les eczémas, les hypodermites, et les ulcères chroniques. La présente invention vise également un procédé pour reproduire in vitro la physiopathologie de la DA et/ou altérer la fonction barrière dans un substitut cutané, ladite méthode contenant les étapes : i. Mettre en contact ledit substitut cutané avec un milieu de maintenance contenant un réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant entre 10 et 500 ng/mL d'interleukine IL-1(3, et ü. Incuber pendant 2 à 48 heures. Dans un mode de réalisation préféré, ledit milieu de maintenance contient, outre de l'IL-1(3, entre 3 et 20 i.tg/mL d'un ligand du récepteur TLR-2, et/ou entre 3 et 20 1.1.g/mL d'un ligand du récepteur TLR-3, lesdits ligands étant tels que définis ci-dessus. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, ledit ligand du récepteur TLR-2 est Pam3CKS4 et en ledit ligand du récepteur TLR-3 est le poly I:C. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, ledit milieu de maintenance contient: entre 10 et 500 ng/mL, de préférence entre 20 et 200 ng/mL, de manière encore plus préférée, 6Ong/mL d'interleukine IL-1(3, et Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, de manière encore plus préférée 51.1.g/mL de Pam3CKS4, ou Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, de manière encore plus préférée 101.1g/mL de Poly (I :C). 12 Dans un mode de réalisation préféré entre tous, ledit milieu de maintenance contient : entre 10 et 500 ng/mL, de préférence entre 20 et 200 ng/mL, de manière encore plus préférée, 6Ong/mL d'interleukine IL-1(3, et Entre 3 et 20 lag/mL, de préférence entre 3 et 15 lag/mL, de manière encore plus préférée 51.1.g/mL de Pam3CKS4, et Entre 3 et 20 lag/mL, de préférence entre 3 et 15 lag/mL, de manière encore plus préférée 101.1.g/mL de Poly (I :C). Ainsi, ledit milieu de maintenance peut contenir avantageusement: - 60ng/mL d' IL-1(3, - 101.1.g/mL de Poly I:C, et - 51.1.g/mL de Pam3CKS4. L'incubation peut être avantageusement réalisée à une température comprise entre 36°C et 38°C. Le taux de CO2 est généralement compris entre 4% et 6%. Enfin, cette incubation est préférentiellement réalisée dans une atmosphère saturée en humidité. Dans un mode de réalisation particulier, on pourra consécutivement appliquer un stress de déshydratation (température, hygrométrie) et/ou un stress physique (UV). Une incubation de quelques heures (typiquement entre 2 et 4 heures) du substitut cutané avec le réactif pro-inflammatoire de l'invention suffit pour induire la production des cytokines TSLP, RANTES, MCP-3, IL-6 et/ou IL-8, ce qui est observé en analysant le taux d'ARNm de ces cytokines (cf figures 1B, 2B, 3B, 4B, et 5B). La production et la sécrétion de ces protéines est quant à elle observée après une incubation plus longue, typiquement entre 10 et 48h. Le temps d'incubation dépend donc de la mesure que l'on souhaite effectuer sur le modèle cutané. 13 Dans un autre aspect, la présente invention vise spécifiquement le substitut cutané obtenu par le procédé décrit ci-dessus. Ce substitut cutané reproduit la physiopathologie de la dermatite atopique. D'autre part, il présente une fonction barrière altérée. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules présentes dans ce substitut cutané sécrètent la cytokine TSLP de SEQ ID NO :2. Dans un mode de réalisation préféré, les cellules présentes dans ce substitut cutané sécrètent, outre la cytokine TSLP, la cytokine RANTES (SEQ ID NO :3) et/ou MCP-3 (SEQ ID NO :4) et/ou IL-6 (SEQ ID NO :5) et/ou IL-8 (SEQ ID NO :6). Dans un mode de réalisation encore plus préféré, les cellules présentes dans ce substitut cutané sécrètent, outre la cytokine TSLP, les protéines RANTES (SEQ ID NO :3), MCP-3 (SEQ ID NO :4), IL-6 (SEQ ID NO :5) et IL-8 (SEQ ID NO :6). Un tel substitut cutané est idéal pour étudier les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la DA et l'effet de composés modulateurs sur cette pathologie. Dans un autre mode de réalisation particulier, ce substitut cutané présente une fonction barrière altérée et exprime les protéines filaggrine (SEQ ID NO :7) et claudine-1 (SEQ ID NO :8) en plus faible quantité par rapport à un épiderme ou une 20 peau normale. Dans un dernier aspect, la présente invention concerne une méthode de criblage pour l'identification in vitro de composés destinés au traitement de la DA et des peaux sèches à tendance atopique, comprenant la mise en contact, par application topique ou par ajout dans le milieu de culture, desdits composés (ou de compositions les 25 contenant) avec le substitut cutané de l'invention. Ces composés peuvent être avantageusement inclus dans une composition, par exemple dans une composition cosmétique ou dermatologique (cf exemple II ci-dessous). Par « traitement de la DA », on fait référence ici de préférence au traitement 30 d'appoint de cette pathologie (entre les crises). 14 Cette méthode de criblage comprend de préférence les étapes : a. Mesurer la quantité de TSLP sécrétée, b. Comparer la valeur obtenue à l'étape a) avec celles mesurées en l'absence du composé candidat. De façon optionnelle, il est également possible de mesurer, outre la quantité de TSLP sécrétée, la quantité des protéines RANTES, MCP-3, IL-6 et IL-8 sécrétées, ainsi que l'expression des protéines filaggrine et claudine-1 dans le substitut cutané. Le composé candidat (ou une composition le contenant) sera sélectionné si la quantité de TSLP, et optionnellement de RANTES, de MCP-3, d'IL-6 et/ou d'IL-8 sécrétées diminue significativement selon un test statistique (par exemple : test de Student si les résultats suivent une loi normale ou test Mann Withney dans le cas contraire), et/ou si l'expression des protéines filaggrine et/ou claudine-1 augmente significativement selon un test statistique (par exemple : test de Student si les résultats suivent une loi normale ou test Mann Withney dans le cas contraire) dans le substitut cutané lorsque le composé est ajouté. L'invention vise également une méthode de criblage pour l'identification in vitro de composés destiné à restaurer la fonction barrière de la peau, comprenant la mise en contact, par application topique ou par ajout dans le milieu de culture, desdits composés (ou des compositions les contenant) avec le substitut cutané de l'invention. Cette méthode de criblage comprend de préférence les étapes : a. Mesurer l'expression des protéines filaggrine et/ou claudine-1 dans ledit substitut cutané, b. Comparer la valeur obtenue à l'étape a) avec celle(s) mesurée(s) en l'absence du composé candidat. 15 De façon optionnelle, il est également possible de mesurer, outre la quantité des protéines filaggrine et/ou claudine-1 exprimées, la quantité des protéines TSLP, RANTES, MCP-3, IL-6 et/ou IL-8 sécrétées par ledit substitut cutané, avant et après l'application du composé candidat. Un composé candidat (ou une composition le contenant) sera sélectionné si l'expression de la filaggrine et/ou de la claudine-1 mesurée après l'application de ce composé est supérieure à l'expression de la filaggrine et/ou de la claudine-1 mesurée en l'absence de ce composé. Le composé candidat (ou une composition le contenant) sera sélectionné si la quantité de TSLP, et optionnellement de RANTES, de MCP-3, d'IL-6 et/ou d'IL-8 sécrétées diminue significativement selon un test statistique (par exemple : test de Student si les résultats suivent une loi normale ou test Mann Withney dans le cas contraire), et/ou si l'expression des protéines filaggrine et/ou claudine-1 augmente significativement selon un test statistique (par exemple : test de Student si les résultats suivent une loi normale ou test Mann Withney dans le cas contraire) dans le substitut cutané lorsque le composé est ajouté. La présente invention concerne enfin une méthode de criblage pour l'identification in vitro de composés ou compositions les contenant destinés à la prévention de la DA et des peaux sèches à tendance atopique, comprenant les étapes suivantes: a. Appliquer de façon topique ou par ajout dans le milieu de culture un composé candidat ou une composition le contenant avec un substitut cutané, b. Ajouter sur ledit substitut cutané un milieu de maintenance contenant un réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant entre 10 et 500 ng/mL d'interleukine IL-1(3, c. Incuber pendant 2 à 48 heures, d. Mesurer la quantité de TSLP sécrétée, 16 e. Comparer la valeur obtenue à l'étape d) avec celle mesurée en l'absence du composé candidat. Dans un mode de réalisation préféré, ledit milieu de maintenance contient: entre 10 et 500 ng/mL, de préférence entre 20 et 200 ng/mL, de manière encore plus préférée, 6Ong/mL d'interleukine IL-1(3, et Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, de manière encore plus préférée 51.1.g/mL de Pam3CKS4, ou Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, de manière encore plus préférée 101.1g/mL de Poly (I :C). Dans un mode de réalisation encore plus préféré, ledit milieu de maintenance contient : - entre 10 et 500 ng/mL, de préférence entre 20 et 200 ng/mL, de manière encore plus préférée, 6Ong/mL d'interleukine IL-1(3, et - Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, de manière encore plus préférée 51.1.g/mL de Pam3CKS4, et - Entre 3 et 20 pg/mL, de préférence entre 3 et 15 iag/mL, de manière encore plus préférée 101.1g/mL de Poly (I :C). Ainsi, ledit milieu de maintenance peut contenir avantageusement: - 60ng/mL d' IL-1(3, - 101.1g/mL de Poly I:C, et - 51.1.g/mL de Pam3CKS4. De façon optionnelle, dans ce procédé, il est également possible de mesurer, outre la quantité de TSLP sécrétée, la quantité des protéines RANTES, MCP-3, IL-6 et IL-8 sécrétées, ainsi que l'expression des protéines filaggrine et claudine-1 dans le substitut cutané. 17 Le composé candidat (ou une composition le contenant) sera sélectionné si la quantité de TSLP, et optionnellement de RANTES, de MCP-3, d'IL-6 et/ou d'IL-8 sécrétées diminue significativement selon un test statistique (par exemple : test de Student si les résultats suivent une loi normale ou test Mann Withney dans le cas contraire), et/ou si l'expression des protéines filaggrine et/ou claudine-1 augmente significativement selon un test statistique (par exemple : test de Student si les résultats suivent une loi normale ou test Mann Withney dans le cas contraire) dans le substitut cutané lorsque le composé est ajouté. Dans toutes ces méthodes de criblage, la quantité de protéine TSLP et des autres protéines sécrétées peut être mesurée par toute technique de dosage protéique connue de l'homme de l'art, et notamment par ELISA ou par western-blot. Par ailleurs, l'expression des protéines filaggrine et claudine-1 peut être évaluée en mesurant la quantité d'ARNm codant pour ces protéines, par qPCR, par Northern Blot ; ou par immunohistochimie sur des coupes de cellules. L'incubation peut être avantageusement réalisée à une température comprise entre 36°C et 38°C. Le taux de CO2 est généralement compris entre 4% et 6%. Enfin, cette incubation est préférentiellement réalisée dans une atmosphère saturée en humidité. Dans un mode de réalisation particulier, on pourra consécutivement appliquer un stress de déshydratation (température, hygrométrie) et/ou un stress physique (UV). Légendes des figures La figure 1 représente la production de TSLP par des épidermes reconstruits après différentes combinaisons stimulantes. (A) Analyse de la production de TSLP relarguée dans les sous-nageant de culture des épidermes reconstruits après 24 heures de stimulation. (B) Analyse à 4 heures et 24 heures de l'expression du gène TSLP par l'analyse en PCR quantitative en temps réel des ARNm extraits des épidermes reconstruits. #: P La figure 3 représente la production de la cytokine MCP-3/CCL7 par des épidermes reconstruits après différentes combinaisons stimulantes. (A) Analyse de la production de MCP-3/CCL7 relarguée dans les sous-nageant de culture des épidermes reconstruits après 24 heures de stimulation. (B) Analyse à 4 heures et 24 heures de l'expression des gènes codant pour MCP-3/CCL7 par l'analyse en PCR quantitative en temps réel des ARNm extraits des épidermes reconstruits. #: P Caractérisation des stimulations pro-inflammatoires La stimulation pro-inflammatoire a été testée en combinant un ou plusieurs des facteurs solubles suivants : - IL-1(3, et/ou - Poly I:C , et/ou - Pam3CKS4. Les concentrations de ces facteurs intégrées dans la combinaison de la stimulation pro-inflammatoire étaient les suivantes : - 6Ong/mL - 101.1g/mL Poly I:C - 51.1.g/mL Pam3CKS4. Caractérisation du temps de stimulation La durée de stimulation est comprise entre 4H et 24H. 21 Traitements des épidermes A la fin de la stimulation, les épidermes reconstruits ont été cryo-conservés pour des analyses histologiques et immunohistologiques ou bien lyses dans du tampon RLT (QIAGEN, Hilden, Germany) afin d'en extraire l'ARNm et procéder à une l'analyse transcriptionnelle. Les sous-nageants des épidermes ont été prélevés. Tous les échantillons ont été stockés à -80°C. Exemple 1: Analyse de TSLP et des autres marqueurs DA par dosage protéique (figures IA, 2A, 3A, 4A et 5A ) Matériel et méthodes La concentration en TSLP des échantillons a été déterminée par test ELISA à l'aide d'un kit spécifique (DuoSet, R&D Systems). La production de RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7, d'IL-6 et/ou d'IL-8 a été analysée grâce à la technologie Luminex® xMAP® selon les instructions du fournisseur (HCYTOMAG-60K, Millipore, Saint Charles, Missouri, USA). Les seuils minimum de détection pour TSLP, RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7, IL-6 and IL-8 dans les sous-nageants de culture ont été de 15.6, 1.2, 3.8, 0.9 and 0.4 pg/mL respectivement. Tous les résultats en dessous de ces seuils ont été considérés comme nuls. Résultats - La stimulation IL-1B permet une forte production de TSLP sécrétée dans les sous-nageants de culture des épidermes reconstruits (figure 1A). - La stimulation IL-1B + Poly IC permet une forte production de TSLP sécrétée dans les sous-nageants de culture des épidermes reconstruits (figure 1A). - La stimulation IL-1B + PAM3CSK4 permet une forte production de TSLP sécrétée dans les sous-nageants de culture des épidermes reconstruits (figure 1A). 22 - La stimulation IL-1B + Poly IC + PAM3CSK4 permet une forte production de TSLP sécrétée dans les sous-nageants de culture des épidermes reconstruits (figure 1A). - La stimulation IL-1B additionnée de Poly IC ou PAM3CSK4 augmente de façon synergique la production de RANTES/CCL5 (figure 2A). - La stimulation IL-1B + Poly IC + PAM3CSK4 permet la plus forte production de RANTES/CCL5 relarguée dans les sous-nageants de culture des épidermes reconstruits (figure 2A). - La combinaison de deux des trois composants parmi IL-1B ou Poly IC ou PAM3CSK4 permet une sécrétion plus importante de la chemokine MCP3/CCL7 que lorsque la stimulation est composée d'un seul réactif (figure 3A). - La stimulation IL-1B + Poly IC + PAM3CSK4 permet la plus forte production d'IL-6 sécrétée dans les sous-nageants de culture des épidermes reconstruits (figure 4A). - La stimulation IL-1B + Poly IC + PAM3CSK4 permet la plus forte production d'IL-8 sécrétée dans les sous-nageants de culture des épidermes reconstruits (figure 5A). Exemple 2 : Profil d'expression génique (PCR quantitative en temps réel) Matériel et méthode L'ARN total a été extrait des tissus reconstruits à l'aide du kit RNeasy® Fibrous Tissue Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) qui comporte une étape de DNAse et une étape de Protéinase K. Les extractions ont été réalisées à l'aide de l'appareil QlAcube (QIAGEN) selon les instructions du fournisseur. La concentration des ARN et leur qualité a été vérifiée grâce au spectrometreNanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Wilmington, Delaware, USA). Puis, 1µg d'ARN purifié a été rétrotranscrit grâce au mix High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Life Technologies, Grand Island, New-York, USA). Les expériences Taqman ont ensuite été réalisées sur l'appareil ViiATM 7 System Real-Time PCR System grâce à la 23 technologie TaqMane LowDensityArrays (Life Technologies, Grand Island, New-York). L'analyse des résultats a été faite avec le logiciel Data Assist (v3.0 Life Technologies, Grand Island, New-York, USA). Résultats - Après 4h de stimulation avec IL-1B + Poly IC + PAM3CSK4, l'expression de TSLP en ARNm est fortement augmentée en comparaison du groupe témoin (figure 1B). - L'expression génique de RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7, IL-6 et IL-8 est augmentée 4h après la stimulation IL-1B + Poly IC + PAM3CSK4 en comparaison du groupe témoin, corroborant les résultats observés au niveau protéique par les dosages correspondants (figures 2B, 3B, 4B et 5B). Exemple 3 : Analyses de la filaggrine et de la claudine-1 après stimulation avec le 15 milieu de maintenance (figure 6) Matériel et méthodes Les coupes des tissus cryo-préservés ont une épaisseur de 5p.m. Ces coupes ont été réalisées à l'aide d'un cryostat et colorées à l'Hémalin/Eosine. 20 Les marquages immuno-histologiques ont été réalisés avec les anticorps suivants : Filaggrine (FLG, 1:200, Vector, VP-F706 [Burlingame, California, USA]), Claudine 1 (CLD1, 1:500, DBS, RP 153-05 [Pleasanton, California, USA]). L'anticorps secondaire correspondant a ensuite été appliqué et le kit peroxydase system a été 25 utilisé (Vectastain Elite ABC Universal kit, Vector [Burlingame, California, USA]) avec les réactifs du kit ImmPACT DAB Substrate (Vector [Burlingame, California, USA]). Plusieurs coupes de chaque spécimen ont été réalisées afin d'être représentatif 30 24 La semi quantification des marquages de la filaggrine et de la claudine-1 a été réalisée avec un logiciel d'analyse d'images du type ImageJ (NIH) [au minimum 5 prises de vue par conditions]. Pour chaque prise de vue, le marquage a été déterminé comme un ratio de la zone marquée sur la surface épidermique totale. Résultats : Au vu des résultats obtenus, la Demanderesse a mis en évidence les points suivants : - La stimulation IL-1f3 + Poly IC + PAM3CSK4 provoque une diminution de marquage de la filaggrine dans la couche granuleuse des épidermes reconstruits en comparaison au témoin. La semi-quantification confirme que la réduction est significative et supérieure à 50%. - L'expression génique de la filaggrine est réduite 24h après la stimulation IL-1(3 + Poly IC + PAM3CSK4 en comparaison du groupe témoin, corroborant les résultats obtenus avec les immuno-marquages de la protéine correspondante. - La stimulation IL-1B + Poly IC + PAM3CSK4 provoque une diminution de marquage de la claudine-1 dans les couches supra-basales des épidermes reconstruits en comparaison au témoin. La semi-quantification confirme que la réduction est significative et de 60%. II. EVALUATION DE PRODUIT FINI dans l'indication peaux très sèches, atopiques : Mise en évidence de l'efficacité de la crème Exomega Matériel et méthodes Des épidermes reconstruits générés comme décrits dans le paragraphe précédent ont été traités avec une crème placebo ou la crème A-Derma Exomega DEFI. Les crèmes ont été appliquées à la surface du stratum cornéum des épidermes. Les épidermes ont ensuite été incubés dans du milieu de culture supplémenté avec la stimulation telle que décrite contenant ILl p, Poly :IC et PAM3CSK4. A la fin de l'incubation, les 25 surnageants des épidermes ont été récoltés pour effectuer un dosage TSLP par un test ELISA Résultats Les résultats sont présentés sur la figure 7. La crème Placebo n'inhibe pas dans ces conditions la production de TSLP; La crème A-Derma Exomega DEFI inhibe significativement la production de TSLP. Les moyennes représentent les valeurs de n= 2 donneurs en triplicats d'épidermes et duplicats techniques. (soit au total n = 12 valeurs) 26 REVENDICATIONS1) Réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant : a. Entre 10 et 500 ng/mL d'interleukine IL-113, et b. Entre 3 et 20 lig/mL d'un ligand du récepteur TLR-2, et/ou c. Entre 3 et 20 lag/mL d'un ligand du récepteur TLR-3, dans lequel ledit ligand du récepteur TLR-2 est choisi parmi : un peptidoglycane, l'acide lipoteichoique, une lipoprotéine, un lipoarabinomanne de mycobactérie ou le zymosan de la paroi cellule de la levure, et ledit ligand du récepteur TLR-3 est choisi parmi: le poly I :C et le poly A :U. 2) Utilisation d'un réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant entre 10 et 500ng/mL d'interleukine IL-1(3 pour reproduire in vitro la physiopathologie de la dermatite atopique et/ou altérer la fonction barrière dans un substitut cutané. 3) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit réactif pro- inflammatoire comprend en outre un ligand du récepteur TLR-2 et/ou un ligand du récepteur TLR-3, dans laquelle ledit ligand du récepteur TLR-2 est choisi parmi : un peptidoglycane, l'acide lipoteichoique, une lipoprotéine, un lipoarabinomanne de mycobactérie ou le zymosan de la paroi cellule de la levure, et ledit ligand du récepteur TLR-3 est choisi parmi : le poly I :C et le poly A :U. 4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit ligand du récepteur TLR-2 est Pam3CKS4 et en ce que ledit ligand du récepteur TLR-3 est le poly I:C. 5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que ledit réactif pro-inflammatoire est tel que défini dans la revendication 1. 6) Procédé pour reproduire in vitro la physiopathologie de la dermatite atopique et/ou altérer la fonction barrière dans un substitut cutané, ladite méthode contenant les étapes : a. Mettre en contact ledit substitut cutané avec un milieu de maintenance contenant un réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant entre 10 et 50Ong/mL d'interleukine IL-113, etb. Incuber pendant 2 à 48 heures. 7) Substitut cutané reproduisant la physiopathologie de la dermatite atopique, obtenu par le procédé de la revendication 6, ledit substitut sécrétant la cytokine TSLP. 8) Substitut cutané ayant une fonction barrière altérée, obtenu par le procédé de la revendication 6, ledit substitut exprimant les protéines filaggrine et claudine-1. 9) Méthode de criblage pour l'identification in vitro de composés destiné au traitement de la dermatite atopique et des peaux sèches à tendance atopique, comprenant la mise en contact, par application topique ou par ajout dans le milieu de culture, desdits composés avec le substitut cutané tel que défini dans la revendication 7, et comprenant de préférence les étapes : a. Mesurer la quantité de TSLP sécrétée, b. Comparer la valeur obtenue à l'étape a) avec celle mesurée en l'absence du composé candidat. 10) Méthode de criblage pour l'identification in vitro de composés destiné à restaurer la fonction barrière de la peau, comprenant la mise en contact, par application topique ou par ajout dans le milieu de culture, desdits composés avec le substitut cutané tel que défini dans la revendication 8, et comprenant de préférence les étapes : a. Mesurer l'expression de la filaggrine et/ou de la claudine-1 par ledit substitut cutané, b. Comparer la valeur obtenue à l'étape a) avec celle(s) mesurée(s) en l'absence du composé candidat. 11) Méthode de criblage pour l'identification in vitro de composés destiné à la prévention de la dermatite atopique et des peaux sèches à tendance atopique, comprenant les étapes suivantes: a. Appliquer de façon topique ou ajouter dans le milieu de culture, un composé candidat avec un substitut cutané, b. Ajouter sur ledit substitut cutané un milieu de maintenance contenant un réactif de stimulation pro-inflammatoire contenant entre 10 et 500 ng/mL d'interleukine IL-1(3, c. Incuber pendant 2 à 48 heures, d. Mesurer la quantité de TSLP sécrétée,e. Comparer la valeur obtenue à l'étape d) avec celle mesurée en l'absence du composé candidat.