Brevet FR3001975A1 — publié le 20140815

MUTANTS D'HERPÈSVIRUS AVIAIRE OBTENUS PAR DÉLÉTION La présente invention concerne des compositions vaccinales comprenant des délétions d'une région de 60 pb de la région 5' du promoteur du gène LAT de l'herpès virus aviaire pathogène (GaHV-2), l'agent causal de la maladie de Marek. Les compositions décrites sont des compositions stables de virus qui sont dépourvues d'une partie du génome de GaHV-2, pouvant être utiles comme souches vaccinales « stables » incapables de revenir à un phénotype pathogène. La maladie de Marek (MM) est une maladie néoplasique extrêmement contagieuse affectant les poulets, éprouvée par le virus-1 de la maladie de Marek (également connu sous le nom d'herpèsvirus aviaire de type 2 ou GaHV-2). L'infection et la MM résultante provoquent les pertes les plus importantes de volailles dans le monde. Elle est principalement évitée grâce à la vaccination et le vaccin CVI988 qui est actuellement utilisé est le vaccin le plus efficace contre la MM dans le monde. Le vaccin CVI988 est un vaccin associé aux cellules, produit à partir d'un isolat de GaHV-2 prélevé en 1972 sur un poulet légèrement malade et atténué par des passages en culture cellulaire (Rispens et al., 1972). Des analyses génomiques comparatives de séquences nucléotidiques entre le vaccin CVI988 et des souches virulentes ont permis d'identifier plusieurs mutations entre ces souches. Cependant, à l'exception des mutations dans Meq, l'oncogène principal de GAHV-2 et le gène le plus étudié de ce virus, les mutations causales responsables de l'atténuation et de la protection induite par CVI988 restent à établir. Spatz et Silva (2007) ont décrit différents motifs 5 de séquence dans la région 5' du gène LAT et ont montré que les souches virulentes de GAHV-2 contiennent des répétitions de 60 pb absentes dans les souches vaccinales. Ces répétitions possèdent une activité de promoteur régulant à la fois l'expression du gène lat 10 et des microARN (Stik et al., 2010, Strassheim et al., 2012), et sont potentiellement impliquées dans les lymphomes éprouvés par GAHV-2. En outre, une analyse de séquences de bases de données a montré que cette région varie entre différents isolats de CVI988 (c'est-à-dire 15 BP5, Intervet et CVI988-BAC). La présente description concerne en partie la région du génome de CVI988 située à l'extrémité 5' du gène LAT (transcrit associé à la latence). Les répétitions de 60 pb régulent à la fois le 20 gène LAT et le groupe des microARN. L'émergence de nouvelles souches très virulentes de virus de la maladie de Marek insensibles à l'immunité vaccinale a été décrite à plusieurs reprises. Il est donc nécessaire de trouver de nouveaux vaccins 25 pour offrir une protection contre la maladie de Marek. Figure 1. Montre l'hétérogénéité de diverses délétions de la région de 60 pb dans le vaccin CVI988. Figure 2. Délétion d'une copie de la région 5' de LAT par la procédure de recombinaison à deux étapes. 30 Figure 3. Diagramme de mutagenèse de pRB1B-5 pour éliminer la région 5' de LAT. Figure 4. Comparaisons des séquences de la région 5' de LAT des bacmides délétés pRB1BApl et pRB1B42 à la séquence parent RB1B. Figure 5. Charge virale des virus BACRB1BAp lors 5 d'une infection in vivo. Figure 6. Evaluation de l'atténuation des virus BACRB1BAP. Figure 7. Protection induite par les virus BACRB1BAp contre une épreuve avec des souches virales 10 pathogènes. Figure 8. Effet d'une infection par les virus BACRB1BAp sur les organes lymphoïdes. Figure 9. Effet d'une vaccination et d'une épreuve sur les organes lymphoïdes. 15 Figure 10. Comparaisons des séquences de la région 5' de LAT des bacmides délétés pRB1BAal et pRB1BAa2 à la séquence parent RB1B. La description présentée dans le présent document concerne des compositions comprenant des génomes de 20 virus aviaire, dans lesquelles le génome comprend un segment de région courte unique (Us) flanqué à chaque extrémité d'un segment de séquence répétée inversée courte (Rs), chaque Rs comprenant un segment de séquence répétée de 60 paires de bases (pb) dans le 25 génome viral natif, au moins une partie du segment de séquence répétée de 60 pb étant supprimée d'un des segments Rs ou des deux segments Rs. Dans certains modes de réalisation, les compositions sont dérivées d'une souche virale de 30 GaHV-2 ou sont une souche virale de GaHV-2. Les génomes peuvent comprendre des délétions dans la région 5' du gène des transcrits associés à la latence (LAT) englobant le promoteur du gène des transcrits associés à la latence (LAT) et peuvent fournir une délétion génomique d'au moins une partie englobant le segment de séquence répétée de 60 paires de bases (pb) au sein de chaque séquence Rs. Les délétions génomiques peuvent comprendre une délétion totale d'un segment ou de deux segments de séquence répétée de 60 pb dans les segments de séquence Rs et peuvent comprendre une délétion totale des segments de séquence répétée de 60 pb dans les deux segments de séquence Rs. Les délétions génomiques peuvent comprendre une délétion de type alpha et/ou une délétion de type bêta des segments de gène Rs tels que décrits dans le 15 présent document. Dans certains modes de réalisation, les délétions génomiques sont recombinantes (c'est-à-dire construites après une manipulation moléculaire du génome viral pour supprimer des segments spécifiques) en partie ou en 20 totalité et sont générées dans une culture cellulaire après une électroporation ou d'autres moyens appropriés de transfert d'un vecteur recombinant à chromosome bactérien artificiel (BAC). Dans certains modes de réalisation, les 25 compositions comprennent une ou plusieurs compositions immunogènes pouvant être sélectionnées parmi une ou plusieurs particules virales et/ou pseudo-particules virales (VLP) contenant la délétion génomique ou les délétions génomiques ou peuvent être délivrées sous la 30 forme de compositions d'acides nucléiques. La ou les délétions génomiques décrites dans le présent document peuvent être répliquées et propagées in vivo et/ou in vitro et peuvent, dans certains modes de réalisation, être inactivées après propagation. Dans certains modes de réalisation, les particules virales peuvent se répliquer in vivo dans une espèce aviaire et peuvent être un virus GaHV de type 2 recombinant. L'invention décrit des compositions pouvant être un acide nucléique ou un virus qui comprend en outre un virus GaHV de type 2 recombinant supplémentaire ou un acide nucléique comprenant une délétion différente dans le génome par rapport au premier virus recombinant ou au premier acide nucléique. Les compositions comprenant un génome recombinant peuvent comprendre également des antigènes supplémentaires du même pathogène ou d'un pathogène différent, par exemple un antigène de l'herpèsvirus du dindon. Les compositions décrites dans le présent document peuvent comprendre en outre un adjuvant, une cytokine ou un autre agent immunorégulateur. Dans certains exemples, les compositions peuvent comprendre une délétion dérivée d'un ou de plusieurs 25 des génomes de RB-1B, de CVI988 et de 648A ou de n'importe quel génome de GaHV-2 ou de GaHV-3. Les compositions peuvent être utilisées comme compositions immunogènes et, plus particulièrement, comme vaccin. 30 Dans d'autres modes de réalisation, la description propose des méthodes de traitement ou de prévention d'une infection d'un animal par la maladie de Marek, comprenant l'administration à l'animal de la composition décrite et revendiquée dans le présent document. Les méthodes revendiquées peuvent être appliquées à des espèces aviaires choisies, par exemple, dans le groupe constitué du poulet, du canard et du dindon. Les compositions décrites et revendiquées dans le présent document peuvent être utilisées pour préparer un médicament destiné au traitement ou à la prévention de la maladie de Marek chez un animal et, dans certains modes de réalisation, l'animal appartient à une espèce aviaire choisie parmi le poulet, le canard, le dindon et tout autre volaille ou est n'importe quel autre animal susceptible d'être infecté par un pathogène GaHV. Vaccins ou compositions pour induire une réponse immunitaire De manière appropriée, une composition vaccinale 20 ou immunogène, telle que décrite et revendiquée dans le présent document, peut comprendre un support ou diluant pharmaceutique, par exemple une solution saline physiologique, du propylène glycol et équivalents. De manière appropriée, une composition vaccinale ou 25 immunogène, telle que décrite et revendiquée dans le présent document, peut comprendre des molécules immunorégulatrices, notamment des adjuvants, des cytokines et/ou des modulateurs des récepteurs de type Toll, comme décrit en détail ci-dessous. 30 Méthodes de vaccination Le vaccin peut être administré par voie orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée. La dose de vaccin qui est fournie sera traditionnellement basée sur l'âge et/ou le poids et/ou la condition physique de l'espèce aviaire. Dans un mode de réalisation, un vaccin peut être préparé sous la forme d'un vaccin vivant. Dans d'autres modes de réalisation, le vaccin peut être inactivé et administré avec ou sans un ou plusieurs adjuvants et/ou d'autres antigènes, comme décrit en détail ci-dessous. Dans un mode de réalisation, un vaccin peut être préparé sous la forme d'un virus atténué pouvant être produit en développant le virus dans des embryons ou dans une culture cellulaire. Un tel vaccin atténué peut également être injecté directement, administré avec de l'eau potable ou par pulvérisation. Un virus atténué ou non atténué peut également être donné par inoculation (par exemple, par voie sous-cutanée). Dans un mode de réalisation, l'administration est réalisée immédiatement après l'éclosion, appelé jour 0 de croissance. Dans un mode de réalisation, l'administration peut être une ou plusieurs administrations réalisées après le jour 0 de croissance. Dans un mode de réalisation, la méthode de la présente invention comprend en outre une ou plusieurs administrations supplémentaires d'une dose élevée de compositions immunogènes de l'invention, administrée après l'administration d'une dose initiale. Dans un mode de réalisation, l'administration supplémentaire ou les administrations supplémentaires sont choisies dans le groupe constitué : du gavage oral ; de l'injection directe ; de l'administration par pulvérisation l'administration au moyen d'un gel ; l'administration dans la nourriture ; et l'administration dans l'eau potable. Dans un mode réalisation, l'administration supplémentaire OU administrations supplémentaires comprennent administration par pulvérisation. Dans un mode réalisation, l'administration supplémentaire OU administrations supplémentaires sont réalisées immédiatement après l'éclosion, appelée jour 0 dans le domaine concerné. Dans un mode de réalisation, l'administration ou les administrations sont réalisées 15 après le jour 0 de croissance. La méthode de vaccination de la présente invention peut également impliquer une administration in ovo, pendant le dernier quart de l'incubation, de compositions immunogènes vivantes dans les oeufs des 20 oiseaux. Dans le cas des poulets, une administration in ovo est réalisée dans l'oeuf ou sur des oiseaux âgés d'une journée. Dans d'autres modes de réalisation in ovo, la vaccination peut être réalisée à d'autres moments, par exemple entre les jours 1 et 2, 1 et 3, 1 25 et 4, 1 et 5 ou les jours 1 et 20 d'incubation ou au jour 18 ou 19 d'incubation. Dans le cas des dindons, une administration in ovo peut également être réalisée aux jours 21 à 26 d'incubation. Le jour de l'inoculation in ovo peut être ajusté pour maximiser 30 les effets de la vaccination. de de de de les une de les Un vaccin anti-MM réussi doit habituellement être capable de se répliquer dans des cultures cellulaires, ne doit pas être immunosuppresseur et doit déclencher une réponse immunitaire qui est protectrice. Cependant, dans certains modes de réalisation, les vaccins ou les compositions immunogènes décrites dans le présent document peuvent être administrés sous la forme d'une préparation virale inactivée ou sous la forme d'un vaccin à acides nucléiques. Une réponse protectrice permettra d'éviter ou de réduire les signes et les symptômes de la MM chez un oiseau, éprouvés par une infection par le GaHV de type 2 ou un autre virus pathogène applicable, qui reçoit un vaccin tel que décrit dans le présent document. Traitement Un virus, une pseudo-particule virale ou une séquence d'acides nucléiques de l'invention peut être utilisé pour modifier le système immunitaire d'un aviaire. Une telle modification de la réponse immunitaire peut être utilisée pour traiter un-oiseau ou pour éviter qu'un oiseau soit infecté. Le traitement comprend n'importe quel régime pouvant être bénéfique pour un oiseau. Le traitement peut être réalisé par rapport à une affection existante ou peut être prophylactique (traitement préventif). Le traitement peut comprendre des effets curatifs, de soulagement ou prophylactiques. Le traitement peut être fourni par n'importe quelle voie appropriée. La dose précise dépendra d'un certain nombre de facteurs, par exemple de la nature précise de l'antigène du vaccin ou de l'utilisation d'adjuvants particuliers. Adjuvants Dans certains modes de réalisation, les compositions immunogènes décrites dans le présent document comprennent au moins un adjuvant. Le terme « adjuvant » fait référence à un composé ou à un mélange qui renforce la réponse immunitaire contre un antigène. Les adjuvants appropriés comprennent, mais sans s'y limiter, l'alun, le phosphate d'aluminium, l'hydroxyde d'aluminium, le MF59 (4,3 % en poids/volume de squalène, 0,5 % en poids/volume de polysorbate 80 (Tween 80), 0,5 % en poids/volume de trioléate de sorbitane (Span 85)), un acide nucléique contenant CpG (où la cytosine est non méthylée), le QS21 (adjuvant saponine), le MPL (monophosphoryl lipide A), le 3DMPL (MPL 3-0-désacylé), les extraits d'Aquilla, les mutants ISCOMS LT/CT, les microparticules de poly(D,L-lactide- co-glycolide) (PLG), le Quil A, les interleukines et équivalents. Pour les applications vétérinaires telles que, mais sans s'y limiter, les expérimentations animales, on peut utiliser l'adjuvant de Freund, la N-acétyl- muramyl-L-thréonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), la N-acétyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (CGP 11637, appelée nor-MDP), la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2- (1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycéro-3- hydroxyphosphoryloxy)-éthylamine (CGP 19835A, appelée MTP-PE) et le RIBI, qui contient trois composants extraits de bactéries, le monophosphoryl lipide A, le dimycolate de tréhalose et un squelette de membrane cellulaire (MPL+TDM+CWS) dans une émulsion de squalène à 2 %/Tween 80. D'autres exemples d'adjuvants permettant de 5 renforcer l'efficacité de la composition comprennent, mais sans s'y limiter : (1) les formulations d'émulsicn huile-dans-eau (avec ou sans autres agents immunostimulants spécifiques, tels que les muramyl-peptides (voir ci-dessous) ou des composants de membrane 10 cellulaire de bactéries), par exemple (a) le MF59TM, contenant 5 % de squalène, 0,5 % de Tween 80 (monooléate de polyoxyéthylène sorbitane) et 0,5 % de Span 85 (trioléate de sorbitane) (contenant éventuellement un muramyl-tri-peptide lié par liaison 15 covalente à la dipalmitoyl phosphatidyléthanolamine (MTP-PE)) formulé sous la forme de particules submicroniques au moyen d'un microfluidiseur, (b) le SAF, contenant 10 % de squalane, 0,4 % de Tween 80, 5 % de polymère L121 bloqué au pluronique et du thr-MDP 20 soit microfluidisé sous la forme d'une émulsion submicronique, soit vortexé pour générer une émulsion a plus grosses particules, et (c) le système adjuvant RIBITM (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contenant 2 % de squalène, 0,2 % de Tween 80 et un ou plusieurs 25 composants de membrane cellulaire de bactéries, tels que le monophosphorylipide A (MPL), le dimycolate de tréhalose (TDM) et un squelette de membrane cellulaire (CWS), de préférence MPL + CWS (DETOXTM) ; (2) les adjuvants de type saponine, tels que le QS21, le 30 STIMULONTM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), l'Abisco® (Isconova, Suède) ou l'Iscomatrix° (Commonwealth Serum Laboratories, Australie), peuvent être utilisés ou des particules peuvent être générés à partir de ceux-ci, telles que les ISCOMS (complexes immunostimulants), ces ISCOMS pouvant être dépourvus de 5 détergent supplémentaire (3) l'adjuvant complet de Freund (CFA) et l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) ; (4) les cytokines, telles que les interleukines (par exemple IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), les interférons (par exemple, l'interféron 10 gamma), le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), le facteur onconécrosant (TNF), etc. ; (5) le monophosphoryl lipide A (MPL) ou le MPL 3-0-désacylé (3dMPL), facultativement en l'absence sensible d'alun quand il est utilisé avec des 15 saccharides pneumococciques ; (6) des combinaisons de 3dMPL avec, par exemple, le QS21 et/ou des émulsions huile-dans-eau ; (7) des oligonucléotides comprenant les motifs CpG, c'est-à-dire contenant au moins un dinucléotide CG dans lequel la cytosine n'est pas 20 méthylée ; (8) un polyoxyéthylène éther ou un ester de polyoxyéthylène ; (9) un tensioactif de type ester de sorbitane polyoxyéthyléné en combinaison avec un octoxynol ou un polyoxyéthylène alkyl éther ou un tensioactif de type ester en combinaison avec au moins 25 un tensioactif non ionique supplémentaire, tel qu'un octoxynol ; (10) une saponine et un oligonucléotide immunostimulant (par exemple, un oligonucléotide CpG) ; (il) un immunostimulant et une particule de sel métallique ; (12) une saponine et une émulsion huile-30 dans-eau ; (13) une saponine (par exemple, QS21) + 3dMPL + IM2 (éventuellement + un stérol) ; (14) d'autres substances jouant le rôle d'agent immunostimulants pour renforcer l'efficacité de la composition. Les muramyl-peptides comprennent la N-acétyl-muramyl-L-thréonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), la N-25 acétyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (norMDP), la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutarninyl-L-alanine-2- (1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-hydroxy-phosphoryloxy)-éthylamine MTP-PE), etc. Les composés immunomodulateurs particulièrement utiles pour réguler une réponse immunitaire chez une espèce aviaire peuvent comprendre une ou plusieurs substances suivantes : l'IFN-a ; l'IFN-p ; l'IFN-y ; l'interleukine-1P ; l'interleukine-2 ; l'interleukine- 6 ; l'interleukine-8 ; l'interleukine-15 ; l'interleukine-16 ; l'interleukine-18 ; le SCF ; le MGF ; le TGFP ; la lymphotactine et la chimiokines CC. ; le mip-1R ; le CXC ; Une « réponse immunitaire » dirigée contre un antigène ou une composition vaccinale est le développement chez un sujet d'une réponse immunitaire à médiation humorale et/ou cellulaire dirigée contre des molécules présentes dans l'antigène ou la composition vaccinale d'intérêt. Dans le cadre de la présente invention, une « réponse immunitaire à médiation humorale » est une réponse immunitaire médiée par des anticorps et implique la génération d'anticorps ayant une affinité pour l'antigène/vaccin de l'invention, tandis qu'une « réponse immunitaire à médiation cellulaire » est une réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T et/ou d'autres leucocytes. Une « réponse immunitaire à médiation cellulaire » est déclenchée par la présentation d'épitopes antigéniques en association avec les molécules de classe I ou de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Ceci active les lymphocytes T auxiliaires CD4+ spécifiques de l'antigène ou les lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (« CTL »). Les CTL ont une spécificité pour les antigènes peptidiques qui sont présentés en association avec des protéines codées par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) et exprimées sur les surfaces des cellules. Les CTL aident à induire et favorisent la destruction intracellulaire de microbes intracellulaires, ou la lyse des cellules infectées par de tels microbes. Un autre aspect de l'immunité cellulaire implique une réponse spécifique à l'antigène par les lymphocytes T auxiliaires. Les lymphocytes T auxiliaires aident à stimuler la fonction et concentrent l'activité des cellules effectrices non spécifiques sur les cellules présentant des antigènes peptidiques en association avec les molécules de CMH sur leur surface. Une « réponse immunitaire à médiation cellulaire » fait également référence à la production de cytokines, de chimiokines et d'autres molécules de ce type produites par les lymphocytes T activés et/ou d'autres leucocytes, notamment celles dérivant des lymphocytes T CD4+ et CD8+. La capacité d'un antigène particulier ou d'une composition particulière à stimuler une réponse immunologique à médiation cellulaire peut être déterminée par un certain nombre d'essais, par exemple par des essais de lymphoprolifération (activation des lymphocytes), des essais faisant appel à des cellules cytotoxiques CTL, par le dosage des lymphocytes T spécifiques de l'antigène chez un sujet sensibilisé ou par la mesure de la production des cytokines par les lymphocytes T en réponse à une nouvelle stimulation avec l'antigène. Ces essais sont bien connus dans l'art. Une réponse immunitaire « protectrice » ou un « traitement » avec une réponse immunitaire fait référence à la capacité d'un vaccin ou d'une composition immunogène à déclencher une réponse immunitaire, à médiation humorale et/ou cellulaire, qui sert à protéger l'animal contre une infection ou contre les séquelles post-infection. La production fournie n'a pas besoin d'être absolue, c'est-à-dire que l'infection n'a pas besoin d'être totalement évitée ou éradiquée, s'il existe une amélioration statistiquement significative par rapport à une population témoin d'animaux. La protection peut simplement atténuer la gravité de l'infection ou ralentir l'apparition des symptômes. Les antigènes, tels qu'utilisés dans le présent document, peuvent également être des mélanges de plusieurs antigènes individuels. Le terme « antigène » fait référence à un composé, à une composition ou à une substance immunogène pouvant stimuler la production d'anticorps ou d'une réponse de lymphocytes T, ou les deux, chez un animal, notamment des compositions qui sont injectées à un animal ou absorbées par un animal. La réponse immunitaire peut être dirigée contre la totalité de la molécule ou contre une partie de la molécule (par exemple, un épitope ou un haptène). Le terme « antigène » peut être utilisé pour faire référence à une macromolécule individuelle ou à une population homogène ou hétérogène de macromolécules antigéniques. Un antigène réagit avec les produits d'une immunité humorale et/ou cellulaire spécifique. Le terme « antigène » englobe généralement les fragments tels que les protéines, les polypeptides, les fragments protéiques antigéniques, les acides nucléiques, les oligosaccharides, les polysaccharides, les produits chimiques organiques ou inorganiques ou les compositions, et équivalents. Le terme « antigène » comprend tous les épitopes antigéniques apparentés. L'expression « composition immunogène » fait référence à n'importe quelle composition pharmaceutique contenant un antigène, une telle composition pouvant être utilisée pour déclencher une réponse immunitaire chez un animal. La réponse immunitaire peut comprendre une réponse de type lymphocyte T, une réponse de type lymphocyte B ou à la fois une réponse de type lymphocyte T et de type lymphocyte B. Des lymphocytes T ou anticorps spécifiques de l'antigène peuvent être générés pour permettre la protection future d'un hôte immunisé. La présente description décrit de nouvelles caractéristiques de la séquence se trouvant juste en aval des télomères, se prolongeant à partir de la région 5' en amont du gène LAT vers l'extrémité du groupe de microARN mdvl-miR-M8-M10 (miARN) cartographié dans le premier intron du gène LAT, appelée « la région 5' du gène LAT » (Strassheim et al., 2012). Deux copies de cette région sont présentes dans les génomes de la souche CVI988 et de la souche GAHV-2 pathogène. Une des deux copies de la région 5' de LAT de 60 pb se trouve dans les répétitions Rs, flanquant la région Us. Le vaccin CVI988 est un vaccin associé aux cellules de GAHV-2, produit à partir d'un isolat prélevé en 1972 sur un poulet légèrement malade et atténué par des passages en culture cellulaire (Rispens et al., 1972). Des analyses génomiques comparatives de séquences nucléotidiques entre le vaccin CVI988 et des souches virulentes ont permis d'identifier plusieurs mutations entre ces souches. Cependant, à l'exception des mutations dans Meq, l'oncogène principal de GAHV-2 et le gène le plus étudié de ce virus, les mutations causales responsables de l'atténuation et de la protection induite par CVI988 restes à établir. Ce travail s'est concentré sur la région du génome de CVI988 située à l'extrémité 5' du gène LAT (transcrit associé à la latence), un long ARN hautement épissé non codant, ne codant aucune protéine associée. La séquence se trouvant juste en aval des télomères, se prolongeant à partir de la région 5' en amont du gène LAT vers l'extrémité du groupe de microARN mdvl-miR-M8-M10 (miARN) cartographié dans le premier intron du gène LAT (Strassheim et al., 2012) a été analysée en détail. Cette région comprend à partir de son extrémité 5' vers son extrémité 3' des motifs de 60 pb répétés en tandem, le site d'initiation de la transcrition du gène LAT, le premier exon du gène LAT et le premier intron du gène LAT jusqu'à extrémité du groupe de microARN mdvl-miR- M8-M10 (miARN). Deux copies de cette région sont présentes dans les génomes de la souche de CVI988 et de la souche GAHV-2 pathogène, dans chaque répétition inversée courte (Rs) flanquant la région unique courte (Us) du génome. Spatz et Silva (2007) ont décrit différents motifs de séquence dans cette région et ont montré que les souches virulentes de GAHV-2 contiennent des répétitions de 60 pb absentes dans les souches vaccinales. Ces répétitions possèdent une activité de promoteur régulant à la fois l'expression du gène LAT et des microARN (Stik et al., 2010, Strassheim et al., 2012), et sont potentiellement impliquées dans les lymphomes éprouvés par GAHV-2. En outre, une analyse de séquences de bases de données a montré que cette région varie entre différents isolats de CVI988 (c'est-à-dire BP5, Intervet et CVI988-BAC). Ce travail comprenait une étude et une analyse du motif de séquence présent dans les vaccins CVI988 disponibles chez Fort-Dodge/Pfizer Animal Health. Grâce à l'analyse de cinq lots de vaccins commerciaux, trois vaccins CVI988 monovalents et deux 20 vaccins bivalents (CVI988 combinés avec HVT, l'herpèsvirus du dindon Meleagrid), il a été démontré que tous les lots de CVI988 étaient constitués d'une population mixte de sous-types génétiques. Vingt sous-types différents ont été identifiés et tous ces sous- 25 types présentaient une délétion partielle ou totale de la région répétée de 60 pb, correspondant aux promoteurs du gène Lat et au groupe de microARN mdvlmiR-M8-M10 (figure 1). Cinq sous-types de délétion étaient communs à tous les lots de CVI988 et les 30 dénommés sous-types principaux alpha et bêta ont été détectés avec les fréquences les plus élevées (respectivement deux 51 % et de 24 %) dans tous les lots. Comme le montre une analyse de différents lots du vaccin CVI988, la composition génomique de la teneur virale de ce vaccin comprend une population hétérogène de différentes structures génomiques dans les souches atténuées. Cette analyse des lots de CVI988 a révélé au moins vingt sous-types différents (figure 1). Cette observation démontre clairement que le vaccin CVI est un mélange de différents sous-types. Dans des échantillons de souches RB1B virulentes, nous avons montré que la région 5' de LAT était également variable et que RB1B était constituée d'une population mixte de sous-types génétiques englobant principalement un nombre variable de répétition de 60 pb, des sous-types délétés étant très rarement détectés. La production de vaccins CVI988 nécessite des passages en culture cellulaire et nous avons étudié ces populations de sous-types de CVI988 pour déterminer si 20 elles restaient stables après l'infection de cultures cellulaires, en utilisant des fibroblastes d'embryons secondaires de poulet pendant 80 passages successifs de CVI988. Nous avons observé une évolution dynamique des fréquences des sous-types de CVI988 et, de manière 25 frappante, des sous-types non délétés portant deux à sept répétitions ont été observés à partir du 70e passage. Une évolution dynamique des fréquences des sous-types de CVI988 a également été observée in vivo. La présente conception de nouveaux vaccins 30 potentiels plus étroitement liés aux souches virales émergentes que CVI988 est basée sur la description de la population mixte de sous-types génétiques de LAT en 5' présente dans le vaccin CVI988. L'objectif est de mimer les sous-types de CVI988 en créant des sous-types à LAT en 5' supprimé à partir d'une souche virale émergente de GaHV-2 tout en préservant toute son immunogénicité. La délétion de la région 5' de LAT d'une souche GaHV-2 virulente permettra de réduire son caractère pathogène et d'induire une protection vaccinale. De plus, le « vaccin » sera capable de se répliquer in vitro dans des fibroblastes d'embryons aviaires. Il se répliquera également in vivo chez les poulets tout en notant dépourvu d'effet immunosuppresseur. Nous avons construit des virus recombinants délétés à partir du virus vvRB1B pris comme modèle. Nous avons supprimé le bacmide RB-1B, pRB-1B-5 de la région 5' de LAT. Nous avons élaboré des délétions correspondant respectivement aux sous-types bêta et alpha de CVI988. Il convient de souligner qu'il existe deux copies de la séquence LAT en 5' dans le génome du MDV, une dans chaque région Rs. Nous avons généré un pRB1B-5 portant deux délétions bêta, un pRB1B-5 portant deux délétions alpha et un pRB1B-5 portant une délétion alpha et une délétion bêta. La procédure de recombinaison Red à deux étapes (Tischer et al., 2006) combinant une recombinaison Red obtenue grâce au phage À et un clivage avec l'endonucléase I-SceI pour permettre des délétions sans cicatrice a été utilisée. Deux sous-types principaux observés étaient les sous-types « alpha » (a) et « bêta » ((3). La délétion « bêta » comprend les répétitions de 60 pb et s'étend vers l'amont du groupe mdvl-miR-M8-M10, tandis que la délétion « alpha » s'étend vers l'intérieur du groupe de microARN, en supprimant miR-M8 (voir la figure 1). Au contraire, dans les échantillons de souches 5 RB1B virulentes, la région 5' de LAT englobe principalement un nombre variable de répétitions de 60 pb et des sous-types délétés ont été très rarement détectés. La délétion de la région englobant les répétitions 10 de 60 pb d'une souche pathogène a été étudiée pour déterminer si de telles constructions pouvaient être utilisées dans le développement de nouveaux vaccins. Une prévalence élevée de sous-types délétés dans les souches vaccinales CVI988 qui n'étaient pas supprimés 15 dans la souche RB1B virulente a été observée. La région supprimée correspond à une région de promoteur du gène LAT, qui transcrit un ARN long non codant et qui ne code aucune protéine connue. Ce travail a donc exploré la délétion impliquée de cette région dans une souche 20 virulente afin de diminuer son caractère pathogène, tout en conservant une réponse immunitaire protectrice après l'administration sous forme de vaccin. Comme précédemment mentionné, deux copies de la région se prolongeant à partir de la région 5' en amont 25 du gène LAT vers l'extrémité du groupe de microARN mdvl-miR-M8-M10 (miARN) sont présentes dans les génomes du CVI988, les souches atténuées et pathogènes du MDV, au sein de chaque répétition inversée courte (Rs) flanquant la région courte unique (Us) du génome. 30 Des virus recombinants ont été construits en supprimant la région répétée de 60 pb d'un bacmide codant le génome de RB1B. Il existe deux copies de cette séquence répétée dans le génome du MDV, une dans chaque région Rs. Des délétions correspondant au sous-type bêta à partir de pRB1B-5, supprimant le promoteur mais conservant la totalité du groupe de microARN mdvlmiR-M8-M10, ont été construites au moyen d'une recombinaison Red à deux étapes (Tischer et al., 2006). Cette procédure combine une recombinaison Red obtenue grâce au phage X et un clivage avec l'endonucléase I- Scel pour permettre des délétions sans cicatrice. De cette manière, des bacmides RB1B portants deux copies de la délétion bêta ont été isolés et nous avons évalué leur caractère pathogène et leurs propriétés de protection en tant que vaccin. La présente invention envisage les diverses constructions de délétions de cette région pour les souches GaHV-2 de la maladie de Marek, telles que les souches atténuées, les souches GaHV-2 virulentes, très virulentes, très virulentes plus déjà isolées et décrites ainsi que toute autre nouvelle souche GaHV-2 isolée dans n'importe quelle partie du monde. La présente invention envisage également les diverses délétions des souches GaHV-3. Comme précédemment mentionné, cinq sous-types de délétion étaient communs à tous les lots de CVI988 et les dénommés sous-types principaux alpha et bêta ont été détectés avec les fréquences les plus élevées (respectivement deux 51 % et de 24 %) dans tous les lots. Au contraire, dans les échantillons de souches RB1B très virulentes, la région 5' de LAT englobe principalement un nombre variable de répétitions de 60 pb et des sous-types délétés ont été très rarement détectés. Sur la base de ce qui précède, la délétion de la région englobant les répétitions de 60 pb à partir d'une souche pathogène a été réalisée pour construire 5 de nouveaux vaccins. La région supprimée correspond à une région de promoteur du gène LAT, qui transcrit un long ARN non codant qui ne code aucune protéine. A la suite des délétions rapportées, on suppose que l'immunogénicité totale du virus RB1B contenant ces 10 délétions est préservée. Méthodes générales (i) Cellules et virus Des fibroblastes d'embryons de poulet (CEF) ont 15 été préparés à partir de 11 embryons de Leghorn blanc B13/B13 d'un jour exempts d'organismes pathogènes spécifiques, élevés à l'INRA (PFIE, 37380, Nouzilly, France), et utilisés comme cellules secondaires (Schat and Purchase, 1998). Les CEF ont été maintenus dans un 20 milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) complété avec 2,5 % de sérum de veau foetale, 1,25% de sérum de poulet, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de fungizone et 2 % de bouillon tryptose phosphate (TPB). Le virus vvRB1B utilisé dans cette étude a été préparé à partir 25 d'un stock de leucocytes du sang périphérique (PBL) prélevés sur un poulet B13/B13 42 jours post-infection (JPI). Ce stock a été stocké à -140 °C. Le virus vv+ 648A a été préparé à partir d'un stock de splénocytes fourni par A. Fadly de chez USDA-ARS, ADOL, 30 East Lansing, MI, USA. Le vaccin CVI988 (Poulvac, lot MD18800 Pfizer/Fort Dodge) a été utilisé comme vaccin témoin. Les virus dérivés de BAC ont été récupérés à partir du clone 5 parent pRB1B BAC et de constructions à délétion BAC, comme décrit ci-dessous. (ii) Bactéries, plasmides et clones BAC Le maintien de BAC et les recombinaisons Red ont été réalisées dans des souches d'E. cou EL250 (DH1OB X cI857 recA+<>araC-PBAD flpe) fournies par V. Nair (IAH, Compton, Berkshire, UK) et GS1783 (DH1OB X cI857 A(crobioA)<>araC-Pwo I-sceI) fournis par N. Osterrieder (Freie Universitat, Berlin, Allemagne). Les produits PCR ont été clonés en utilisant E. coli TG1 (SupE hsdA5 thi ,8,(lac-proAB)/F'rtraD36 proAB+ lacIq lacZnM15). Le plasmide pEPKanS-2, qui porte le gène de résistance à la kanamycine, aphAl et un site de reconnaissance I-SceI contigu et le plasmide p-BAD-/- sceI, exprimant l'enzyme I-SceI par réduction avec de l'arabinose utilisés pour construire les bacmides recombinants ont été fournis par V. Nair (IAH, Compton, Berkshire, UK). Le clonepRB1B-5 utilisé pour la mutagenèse a été fourni par V. Nair (IAH, Compton, Berkshire, UK). Il contient des séquences de vecteur BAC insérées dans le locus Us2 du génome de RB1B (Petherbridge et al., 2004), comme décrit pour les génomes de MDV par Schumacher et al., 2000. (iii) Amorces Les amorces que nous avons utilisées pour les manipulations de clonage sont présentées dans le tableau 1. Les oligonucléotides ont été synthétisés sur 30 commande (Sigma) Tableau 1 : amorces utilisées pendant la mutagenèse à deux étapes Matrice Nom de Séquences des amorcesa Produit l'amorce PCR ou/but pEPkan-S2 Bêta CGTGGCATATTCCTACGGAAACCTATT PKanI- Del-I- Sceb Sce for GTTCTGTGGTTGGTTTCGATCTAT TAGGGATAACAGGGTAATCGATTT Bêta ATAGATCGAAACCAACCACAGAACAATA Del-I- Sce rev GGTTTCCGTAGGAATATGCCACG GCCAGTGTTACAACCAATTAACC Alpha TTGTTCCGTAGTGTTCTCGTGACACT aKKanI- Del-I- Sce Sce for AACTCGAGATCCCTGCGAAATGACA TAGGGATAACAGGGTAATCGATTT Alpha TGTCATTTCGCAGGGATCTCGAGTTAG Del-I Sce rev TGTCACGAGAACACTACGGAACAA GCCAGTGTTACAACCAATTAACC pKanI-Sce Bêta Del TCGACGAAATTTTTTTTTATACAGTG 3KanI-Sce PCR for pleine longueur pour insertion dans pRB1B-5c TGTGGCCGCGAGAGGGTTAGAGGG CGTGGCATATTCCTACGG Beta Del ATAGATCGAAACCAACCAC PCR rev Matrice Nom de Séquences des amorcesa Produit l'amorce PCR ou/but aKanI-Sce Alpha TCGACGAAATTTTTTTTTATACAGTG aKanI-Sce Del PCR pleine for longueur pour insertion dans pRB1B-5 TGTGGCCGCGAGAGGGTTAGAGGGTTG TTCCGTAGTGTTCTCGTG Alpha TGTCATTTCGCAGGGATCTCG Del PCR rev pRB1BBAC5d, Alpha/ TCGACGAAATTTTTTTTTATAC Criblage pRB1BAPe, Bêta Del par pRB1Ma, Seq for délétion pRB1BAaP Bêta Del GCGTGACCTCTACGGAACAATAGTT Seq rev Alpha GTTCTTCCTATGAGGCTTCCATTCC Del Seq rev Notes de bas de page pour le tableau 1:sou -j i1C C11 gras, amorces d'extrémité 5', extensions homologues aux séquences flanquantes bêta ciblées ; a séquence d'amorce dans le sens 5'-3' ; b premier produit PCR pour l'insertion de la cassette ; C deuxième et dernier produit PCR pour l'insertion dans pRB1B-5 ; d pRB1B-5 en tant que témoin négatif pour l'insertion pendant le criblage par PCR ; e BAC RB1B0P, £a or AaF3 les deux copies supprimées (iv) Méthode de recombinaison Red à deux étapes pour la mutagenèse de pRB1BBAC Pour la mutagenèse de pRB1BBAC, nous avons utilisé la méthodologie de recombinaison à deux étapes (Tischer et al., 2006 ; 2010). Cette procédure consiste à utiliser le système de recombinaison Red associé à l'utilisation de la megaendonucléase I-SceI. Un marqueur de sélection de positif, utilisé pour introduire la modification souhaitée par l'intermédiaire de la première recombinaison Red, a été éliminé par la seconde recombinaison Red intramoléculaire par l'intermédiaire d'une duplication de séquence préalablement introduite. Génération d'une construction PCR de transfert Plus précisément, nous avons généré une construction PCR de transfert qui contenait 50 nt homologues à la séquence en 5' flanquant la séquence cible à supprimer, en amont des répétitions de 60 pb, c'est-à-dire la même séquence à la fois pour les délétions bêta et alpha (figure 2, représentée par une barre noire), 20 nt à partir du marqueur de sélection de positif inséré, c'est-à-dire aphAl, qui confère une résistance à la kanamycine, un site 1-SceI contigu et une duplication de 51 nt homologues à la séquence en 3' flanquant la séquence cible à supprimer dans le premier intron du gène LAT, c'est-à-dire 142 544 nt à 143 389 nt pour la délétion bêta et 142 544 nt à 143 535 nt pour la délétion alpha (figure 2, représenté par une barre grise). Le marqueur de sélection de positif, aphAl ou kanR, et le site de restriction I-SceI utilisé pour introduire la modification souhaitée dans une première étape de recombinaisons ont été amplifiés par deux PCR successives à partir du plasmide pEPkan-S2 avec les amorces appropriées (tableau 1). Les PCR ont été réalisées à partir de 2 ng de matrice avec l'ADN polymérase GoTaq® (Promega). Après l'amplification par PCR, une digestion des produits PCR avec DpnI a été réalisée à 37 °C pendant une heure. Les produits PCR ont été purifiés sur gel, après une électrophorèse sur agarose à 0,7 % en utilisant le kit NucleoSpin Gel & PCR Clean-up° (Macherey-Nagel). Afin de vérifier l'intégrité des produits PCR, un amplicon a été cloné en utilisant le pGEM-T Easy Vector Systems® (Promega). Après une nuit d'incubation à 12 °C, le mélange de ligature a été introduit par électroporation dans des cellules d'E. cou TG1 électrocompétentes avec les réglages suivants : 15 kV/cm (1,5 kV avec des cuvettes de 0,1 cm), 25 pF et 200 Q. Les bactéries soumises à l'électroporation ont été étalées sur des plaques de 20 LB-agar avec de l'ampicilline, du X-gal (5-bromo-4- chloro-indolyl-p-D-galactopyranoside) et de l'IPTG (isopropyl P-D-1-thiogalactopyranoside), et incubées à 37 °C pendant la nuit. Un criblage par PCR a été réalisé afin de vérifier l'efficacité du clonage. Après 25 une purification sur gel, les clones positifs ont été séquencés par les services de ©Eurofins MWG Operon. Préparation d'E. cou EL250 ou GS1783 électrocompétente (Tischer et al. 2006 ; 2010) Les bactéries E. coli EL250 ou GS1783 contenant 30 les BAC ont été cultivées pendant une nuit dans 10 ml de LB contenant du chloramphénicol pour la sélection des BAC, et cultivées pendant une nuit à 32 °C avec agitation à 200 tr/m (tour par minute). Dix millilitres de la culture d'une nuit ont été inoculés sur un nouveau milieu LB un rapport 1/20 avec du chloramphénicol, puis agités à 200 tr/m à 32 °C jusqu'à ce que l'Am) atteigne 0,5 nm. Ensuite, la culture a été placée dans un bain d'eau à 42 °C et agitée vigoureusement pendant 15 minutes afin d'induire le système de recombinaison Red. La croissance des bactéries a été arrêtée en plaçant la culture sur de la glace pendant 20 minutes. Trois étapes de lavage ont été effectuées avec de l'eau refroidie dans de la glace après une centrifugation à 4 °C et à 4500 g pendant 5 minutes. Le culot de bactéries a été remis en suspension dans du glycérol à 10 % à 1/100 de volume de culture. Electroporation et première recombinaison Red 100 ng du vecteur de transfert ont été introduits par électroporation dans 50 pl de bactéries avec les réglages suivants : 15 kV/cm (1,5 kV avec des cuvettes de 0,1 cm), 25p F et 200 O. Du milieu LB (950 pl) a été ajouté aux bactéries soumises à l'électroporation et après une incubation à 32 °C, 200 tr/m pendant une heure, les bactéries ont été étalées sur des plaques Lb-agar avec les antibiotiques appropriés, le chloramphénicol et la kanamycine. Les clones positifs ont été sélectionnés par PCR et RFLP (polymorphisme de tailles des fragments de restriction), puis amplifiés par une culture d'une nuit. Des cellules électrocompétentes ont été préparées sans l'étape d'induction à 42 °C. Ensuite, l'expression de l'enzyme I-SceI a été réalisée soit par l'électroporation de 100 ng de pBAD-I-scel comme précédemment décrit, soit par une induction avec de l'arabinose à 1 %. Les bactéries positives ont été sélectionnées sur des plaques d'agar contenant du chloramphénicol, de la kanamycine et de l'ampicilline. Seconde recombinaison Red La seconde recombinaison Red a été réalisée comme la première recombinaison, mais sans la sélection pour 10 le marqueur positif kanR. Une induction avec de l'arabinose à 1 % a été réalisée pour permettre le clivage du BAC par l'enzyme I-SceI. Les bactéries ont été mises sur des plaques d'agar contenant du chloramphénicol et de l'ampicilline, et incubées à 15 32 °C pendant la nuit. La perte du marqueur de sélection de positif a été vérifiée par un milieu sélectif et une PCR effectuée comme précédemment décrit. Afin de perdre p-BAD, les clones positifs ont été cultivés sur des plaques d'agar avec ou sans 20 ampicilline et, finalement, les clones qui avaient perdu leur résistance à l'ampicilline ont été sélectionnés pour poursuivre la mutagenèse. (v) analyse de l'ADN Pour vérifier les délétions dans les constructions 25 pRB1B-BAC, une amplification par PCR avec les amorces appropriées a été réalisée sur un ADN purifié provenant de constructions de mutants pRB1B avec le kit de chromatographie par affinité à base de silice NucleoBond® Xtra Midi (Macherey Nagel). 30 Pour déterminer si la procédure de mutagenèse avait introduit des réarrangements ou des délétions indésirables, un ADN provenant de constructions de mutants pRB1B et de pRB1B-5 parent a été digéré avec EcoRI, séparé sur un gel d'agarose à 0,7 % et coloré avec du bromure d'éthidium. (vi) Reconstitution de virus dérivés de BAC Des virus dérivés de BAC ont été reconstitués par la transfection de CEF secondaires avec 1 pg d'ADN BAC en utilisant la Lipofectamine® (Invitrogen®) selon les instructions du fabricant. Des cellules en monocouche ont été cultivées pendant 4-5 jours, trypsinées et ensemencées sur des CEF nouvellement préparés non infectés en monocouche pendant trois passages successifs. (vii) Essais d'immunofluorescence Pour les essais d'immunofluorescence (IF), des CEF secondaires ont été cultivés sur des plaques à 6 puits ou à 96 puits, puis transfectés avec 1 mg d'ADN de pRB1B-5, de pRB1BPA1 ou de pRB1BpA2, comme décrit ci-dessous, ou infectés avec le vaccin CVI988. Les cellules ont été fixées avec 1 % de paraformaldéhyde (PFA) 4 à 5 jours après la transfection ou l'infection. Une coloration par immunofluorescence a été réalisée avec un anticorps monoclonal anti-VP5 de souris, clone 3F19 (dilution à 1/200) (données non publiées), jouant le rôle d'anticorps primaire et un anticorps secondaire conjugué à l'Alexa 488 anti-souris de chèvre (1/1000, Invitrogen). Les noyaux des cellules ont été colorés avec le colorant de Hoechst. (viii) Titrage des virus Le titrage des virus a été réalisé par une dilution en série de cellules congelées, ensemencées sur des CEF nouvellement préparés nouvellement préparés non infectés en monocouche. Les cellules en monocouche ont été cultivées pendant 4 à 5 jours et traitées pour des essais IF. Des plaques de virus ont été identifiées par marquage au VP5. Le titre des virus dans l'échantillon a été déterminé en triple et exprimé en unité donnant naissance à une plaque (pfu) par ml. (ix) Méthodes statistiques L'analyse statistique a été réalisée avec le test 10 de Wilcoxon-Mann Whitney non paramétrique, tel que mis en oeuvre dans « R : A language and environment for statistical computing ». (x) Nomenclature Les bacmides à ADN sont appelés pRB1B-5 pour la 15 souche parent, pRB1BAP1, pRB1BAP2, pRB1BAal, pRB1B0a2, pRB1B041, pRB1B0aP2 pour les différentes structures recombinantes délétées à bacmides à ADN. Les particules virales reconstituées à partir d'une transfection avec des bacmides à ADN dans des CEF 20 sont appelées BACRB1B-5 pour la souche parent, BACRB1BA31, BACRB1B0P2, BACRB1BAa1, BACRB1BAa2, BACRB1BA001, BACRB1BA42 pour les constructions recombinantes délétées. 25 Exemple 1 : isolement des virus (i) Isolement des constructions de bacmides pRB1B.843 L'isolement des constructions de bacmides pRB113043 a été réalisé au moyen de la méthodologie de 30 recombinaison à deux étapes décrite ci-dessus (Tischer et al., 2006). La première délétion bêta a été générée de la manière décrite brièvement. Une construction de transfert a été générée à partir du plasmide pEPkanS-2 par deux amplifications PCR successives au moyen des amorces Bêta Del I-Sce for et rev pour la première, et 5 Bêta Del PCR for et rev pour la seconde. Après l'électroporation de cette construction de transfert dans des bactéries EL250, la recombinaison Red a été induite à 42 °C pendant 15 minutes, et les clones bactériens résistant à la kanamycine ont été isolés et 10 criblés par PCR avec les amorces Bêta del Seq for et rev (tableau 1). Un clone présentant les deux produits PCR attendus avec 1177 pb et 982 pb, correspondant respectivement à l'insert (3I-Sce et à la région 5' de LAT de type sauvage, a été isolé. L'enzyme I-SceI a été 15 induite par l'électroporation du plasmide p-BAD-I-sceI et l'ajout de 1 % d'arabinose pour exciser le gène de résistance KanR qui avait été obtenu par l'induction de la recombinaison Red. Les clones recombinants qui avaient perdu la résistance à la kanamycine ont été 20 criblés avec les amorces Bêta Del Seq for et rev (tableau 1). Un clone présentant les deux produits PCR, 138 pb et 982 pb correspondant respectivement à la délétion bêta et à la région 5' de LAT de type sauvage, a été isolé. La délétion de la seconde copie de la 25 région 5' de LAT a été réalisée par l'électroporation de la construction de transfert dans des bactéries GS1783, et les autres étapes ont été menées comme précédemment décrit. Après un criblage avec les amorces Bêta Del Seq for et rev, deux clones bactériens 30 présentant un unique produit PCR de 138 pb attendu ont été isolés et l'ADN de bacmide a été davantage analysé. Une amplification PCR avec les amorces Bêta del Seq for et rev (tableau 1) bordant la région supprimée attendue a été réalisée sur deux clones sélectionnés de pRB1B4, les clones 1 et 2, ainsi que sur l'ADN pRB1B-5 parent. La taille attendue de 138 pb après la délétion bêta a été amplifiée avec les clones pRB1B0p1 et 2, ce qui indique que les deux constructions portaient la délétion bêta dans les deux copies de la région 5' de LAT. Au contraire, une amplification PCR réalisée sur l'ADN pRB1B-5 parent a produit un seul amplicon de 982 pb correspondant aux deux copies non délétées de la région 5' de LAT. Les séquences des produits PCR pour les clones pRB1B41 et 2 correspondaient à la délétion bêta attendue (coordonnées 142 545 - 143 389 dans IRs), en comparaison avec la séquence de pRB1B BAC5 parent (figure 4). Les profils d'électrophorèse de l'ADN digéré par EcoRI provenant des clones pRB1BAP1 et 2 ou de pRB1B-5 parent n'ont montré aucun réarrangement important, ce qui suggère que l'intégrité globale de l'ADN viral est préservée pendant la procédure de recombinaison à médiation red à deux étapes pour les deux constructions BAC (données non présentées). (ii) Reconstitution des virus BACRB1B0p infectieux L'ADN provenant de pRB1BA(31 ou 2, ou de pRB1B-5 a été transfecté dans des CEF secondaires, cultivés pendant 4 à 5 jours et co-ensemencés avec des CEF nouvellement préparés pendant trois passages. Les cultures cellulaires ont été observées chaque jour au microscope pour vérifier la présence de plaques de virus. Nous avons habituellement observé des plaques de virus au second passage et nous n'avons observé aucune différence majeure entre les cultures résultant de la transfection avec pRB1B-5 ou avec les constructions à délétion BAC. Pour confirmer la production d'une descendance du virus GAHV-2, nous avons mis en oeuvre une IIF par le marquage de la protéine VP5 principale de la capside avec un anticorps monoclonal anti-VP5. Les CEF infectés avec pRB1B-5, pRB113Lp1 ou 2 présentaient un marquage comparable de VP5, ce qui confirme l'apparition des cycles lytiques induits par les virus récupérés soit à partir du pRB1B-5 parent, soit à partir de pRB113,831 ou 2 délété. Les titres en virus obtenus à partir des CEF collectés par trypsinisation au troisième passage après la transfection avec l'ADN de bacmide étaient à peu près comparables (données non présentées), ce qui indique que tous les virus reconstitués à partir des bacmides parents et délétés présentaient des caractéristiques de croissance comparables. Au troisième passage, les CEF produisant des virus BACRB1Ba1 et 2 ont été trypsinés et congelés à -142 °C sous la forme de stocks de virus BACRB1B0I31 et 2 associés aux cellules. Pour évaluer la région 5' de LAT des virus 25 BACRB1W1 et 2 au troisième passage, des analyses par PCR et des clonages ont été mis en oeuvre. Tous les clones présentaient un amplicon PCR correspondant à la délétion bêta, ce qui montre que les virus BACRBlagl et 2 présentaient une population homogène de sous-types 30 bêta, contrairement au vaccin CVI988. De plus, malgré la délétion LAT en 5', toutes les constructions ont conservé leur capacité à se répliquer dans un système in vitro comme la construction BAC parent, ce qui suggère que la région 5' de LAT est superflue pour la réplication lytique in vitro du MDV. (iii) Réplication in vivo des virus BACRB1BL3 Pour déterminer si les virus BACRB1B1in et 2 se répliquent in vivo, nous avons mis en oeuvre une qPCR 10 sur un ADN extrait de lymphocytes du sang périphérique provenant de poulets infectés. 16 poulets d'un jour ont reçu par inoculation intramusculaire (IM) 1000 pfu de virus reconstitués provenant de BACRB1B13l, de BACRB1W2 ou de BACRB1B-5 en tant que témoin positif 15 de MM. Un groupe de 16 poulets a également reçu par inoculation 1000 pfu de vaccin CVI988. Des poulets Leghorn blanc d'un jour, exempts d'organismes pathogènes spécifiques (SPF) et négatifs aux anticorps maternels sensibles à la MM (Lohmann, Allemagne), ainsi 20 qu'un groupe de poulets témoins éclos en même temps et servant de témoins, ont été utilisés. Des PBL ont été prélevés sur 3 à 6 poulets dans chaque groupe à divers moments temporels (12, 21, 33, 69 jours post-infection jpi), comme précédemment décrit (Debba-Pavard et al., 25 2008), et l'ADN était préparé par extraction au phénol chloroforme (Sambrook et al., 1989). Des réactions de PCR quantitative en temps réel (q-PCR) ont été effectuées, dans des plaques de réaction à 96 puits MicroAmp° Fast (Applied Biosystems). 30 En bref, chaque réaction contenait 0,1 pM de chaque amorce, 100 ng d'ADN, 10 pl de Fast SYBR® Green Master Mix 2X (Applied Biosystems) dans un volume réactionnel total de 20 pl. Des réactions ont été effectuées en triple pour tous les étalons, les échantillons à tester et les témoins. Un système PCR en temps réel StepOnePlusTM (Applied Biosystem) a été utilisé pour amplifier et détecter les produits réactionnels. L'estimation de la charge virale dans les PBL issus des poulets infectés par BACRB1BAP1 et 2, BACRB1B-5 et CVI988 a été effectuée par une qPCR ciblant le gène UL26 viral de GAHV-2. Des amorces spécifiques UL26 sens TTGCACAGTCGGAGCAGTTCTTGCGC et UL26 antisens TGACTGGCGGCTGTCTCTAGTGTACG ont été utilisées. 40 cycles ont été mis en oeuvre avec les paramètres de cycle suivants : 94 °C pendant 15 secondes, 56 °C pendant 30 secondes, 72 °C pendant 1 minute. Le nombre de copies du gène UL26 a été calculé à partir d'une courbe étalon établie avec un plasmide pGEM-T easy UL26. Les résultats présentés sur la figure 5 montrent que les virus BACRB1B0P1 et 2 sont capables de se répliquer dans des PBL issus de poulets infectés à une vitesse plus lente que le virus BACRB1B-5 et à une vitesse plus élevée que CVI988. Pour les deux virus recombinants BACRB1BAP1 et 2, une augmentation de la charge virale a été observée à partir du jour 12 pi jusqu'au jour 21 pi, et une charge virale « plateau » a été observée par la suite. Exemple 2 : atténuation et stabilité des virus BACRB1BAP (i) Etude de la pathogenèse chez les poulets Pour déterminer si BACRB1BAP1 et 2 étaient atténués, 16 poulets d'un jour ont reçu par inoculation intramusculaire (IM) 1000 pfu de virus reconstitués provenant de BACRB1W1, de BACRB1B0332 et de BACRB1B-5 en tant que témoin positif de MM. Un groupe de 16 poulets a également reçu par inoculation 1000 pfu de vaccin CVI988. Des poulets Leghorn blanc d'un jour, exempts d'organismes pathogènes spécifiques (SPF) et négatifs aux anticorps maternels sensibles à la MM (Lohmann, Germany), ainsi qu'un groupe de poulets 15 témoins éclos en même temps et servant de témoins, ont été utilisés. Tous les groupes de poulets ont été suivis pendant 68 à 71 jours. Tous les poulets survivants ont été euthanasiés à la fin de l'expérience. Tous les poulets qui avaient succombés de mort 20 naturelle ou qui avaient été tués ont subi un examen post-mortem pour vérifier la présence de tumeurs MM denses et d'une atrophie des organes lymphoïdes. La mortalité due à la MM a été déterminée. Toutes les procédures expérimentales ont été menées à l'INRA (PFIE, 25 37380 Nouzilly, France) conformément aux protocoles autorisés pour l'utilisation des animaux en recherche. La mortalité due à la MM a été suivie pendant l'expérience de pathogenèse. Le pourcentage de survivants a été calculé tous les 7 jours à partir du 30 jour de l'inoculation. Comme le montre la figure 7, aucun poulet n'est mort durant les 68 jours de la période expérimentale après l'inoculation des virus dérivés de BACRB1Mp ou la vaccination avec CVI988. Au contraire, 55 % des poulets ayant reçu par inoculation un virus dérivé de BACRB1B-5 sont morts avec un lymphome MM bien développé à partir du jour 42 jpi, et 77 % d'entre eux présentaient une atrophie du thymus ou de la bourse et des lésions MM denses lors de l'autopsie finale, 68 jpi (figure 6, tableau 2). Au jour 68 jpi, un poulet ayant reçu par inoculation BACRB1a831 présentait une atrophie de la bourse sans aucun autre signe de MM et un poulet ayant reçu par inoculation BACRB1B132 présentait un croissance modéré du ventricule succenturié qui a nécessité un examen histologique supplémentaire pour déterminer si cette lésion était une lésion spécifique de la MM. Par conséquent, les virus dérivés de BACRB1Ba. présentaient un caractère pathogène résiduel faible par rapport au virus dérivé de BACRB1B-5, la délétion de sous-type bêta conçue dans le promoteur LAT conduisant à l'atténuation de BACRB1B-5. Une perte totale du caractère pathogène pourrait être obtenue en effectuant plusieurs passages cellulaires in vitro successifs. (ii) Stabilité de la région 5' de LAT dans les virus 25 BACRB1B1P A la fin de l'expérience in vivo, nous avons déterminé s'il existait des variants moléculaires de la région 5' de LAT dans des PBL prélevés sur des poulets infectés par BACRB1BA(31 et 2. En mettant en oeuvre une 30 PCR avec la paire d'amorces GCTAGGGGTTCGACGAAAT/ CCGGACCGAGAACACAGTGAT et un clonage, nous avons observé plus de 95 % de clones portant la délétion bêta, ce qui montre la stabilité des virus BACRB1BApl et 2. Exemple 3 : vaccination avec les virus BACRB1BAp (i) Essai de protection Six groupes de 16 poulets d'un jour ont été utilisés. Quatre groupes ont été vaccinés par injection IM de 1000 pfu de BACRB1B41 ou 2 et ont reçu par inoculation 500 pfu de vvRB1B ou de vv+648A, respectivement, 7 jours après la vaccination. Les deux derniers groupes n'ont pas été vaccinés et ont reçu une inoculation en même temps que les groupes vaccinés de 500 pfu de vvRB1B ou de vv+648A, respectivement. Deux groupes supplémentaires de 16 et de 10 poulets ont été vaccinés par injection IM de 1000 pfu de CVI988, et ont reçu par inoculation 500 pfu de vvRB1B ou de vv+648A, respectivement, sept jours après la vaccination. Des poulets Leghorn blanc d'un jour, exempts d'organismes pathogènes spécifiques (SPF) et négatifs aux anticorps maternels sensibles à la MM (Lohmann, Germany), ainsi qu'un groupe de poulets témoins éclos en même temps et servant de témoins, ont été utilisés. Tous les groupes de poulets ont été suivis pendant 68 à 71 jours. Tous les poulets survivants ont été euthanasiés à la fin de l'expérience. Tous les poulets qui avaient succombés de mort naturelle ou qui avaient été tués ont subi un examen post-mortem pour vérifier la présence de tumeurs MM denses et d'une atrophie des organes lymphoïdes. La mortalité due à la MM a été déterminée. Toutes les procédures expérimentales ont été menées à l'INRA (PFIE, 37380 Nouzilly, France) conformément aux protocoles autorisés pour l'utilisation des animaux en recherche. (ii) Protection induite par les virus BACRB1BAp ou le 5 vaccin CVI988 contre une épreuve avec vvRB1B ou vv+648A La mortalité due à la MM a été suivie pour déterminer si les virus dérivés de BACRB1BAp pouvaient induire une protection contre une épreuve avec vvRB1B ou vv+648A (figure 7). L'atrophie des organes 10 lymphoïdes et les lésions MM denses ont également été enregistrées pendant l'épreuve et sont résumées dans le tableau 2. Tous les poulets non vaccinés ayant reçu par inoculation vvRB1B sont morts avec une atrophie de la bourse ou du thymus, et des lésions MM denses à partir 15 du 14e au 52e jpé (figure 7A, tableau 2). Au contraire, aucun des poulets vaccinés avec CVI988 n'est mort après l'épreuve avec vvRB1B, tandis que deux et trois poulets sont morts dans les groupes vaccinés respectivement avec BACRB1B0(31 ou BACRB1B0P2 (figure 7A, tableau 2). 20 Il doit être noté qu'un poulet vacciné avec CVI988 a présenté des signes cliniques transitoires de paralysie et une atrophie des organes lymphoïdes primaires à la fin de l'expérience. Dans le cas de l'épreuve avec vv+648A, tous les poulets non vaccinés sont morts à 25 partir du 10e au 28e jpé (figure 7B). Comme on pouvait s'y attendre pour l'infection avec vv+ de poulets négatifs aux anticorps maternels, nous avons observé un stade précoce de mortalité, avec une atrophie sévère des organes lymphoïdes primaires en l'absence de 30 lymphome MM, suivi par un stade de développement de lymphome MM. Au contraire, après l'épreuve avec vv+648A, aucun poulet vacciné avec CVI988 n'est mort pendant la période expérimentale (figure 7B), tandis que trois poulets sont morts dans chacun des groupes de poulets vaccinés avec BACRB1B4 (figure 7B, tableau 2). A la fin de l'expérience, un des poulets vaccinés avec CVI988 présentait un développement manifeste de lymphome et trois poulets vaccinés avec BACRB1M3l présentaient des nodules de petite taille laissant supposer la présence d'une MM, qui ont nécessité un examen histologique supplémentaire (tableau 2). Par conséquent, les virus dérivés de BACRB1BAp ont pu induire environ 80 % de protection contre la mortalité due à une épreuve avec vv RB1B ou vv+648 durant la période expérimentale. Tableau 2. Etudes du caractère pathogène et de protection : données globales Provocation Lot Vaccin/ Virus Jour VoieA TA/BA Lésions Mort BAC B C par MM Me Essais de pathogénicité Témoin Aucun aucun - - 0/7 0/7 0/7 négatif CVI988 CVI988 aucun - - 0/7 0/7 0/7 BACRB1B41 BACRB1B41 aucun - - 0/13 0/13 0/13 BACRB1B8p2 BACRB1B42 aucun - - 1/13 1/13 1/13 RB1B BAC5 RB1B BAC5 aucun - - 9/13 9/13 6/13 Vaccin Témoin aucun aucun - - 1/10 0/10 0/10 négatif CVI988 + CVI988 RB1B 7 IM 1/6 0/6 0/6 RB1B BACRB1Bap1 + RB1B BACRB1Bap1 RB1B 7 IM 3/12 2/12 2/12 BACRB1B0p2 + RB1B BACRB1B0p2 RB1B 7 IM 4/13 3/13 3/13 RB1B aucun RB1B 7 IM 13/13 13/13 13/13 CVI988 + CVI988 648A 7 IM 1/13 1/13 0/13 648A BACRB1Bap1 + 648A BACRB1Bap1 648A 7 IM 4/14 3/14 3/14 BACRB1Bap2 + 648A BACRB1Bap2 648A 7 IM 3/13 3/13 3/13 648A aucun 648A 7 IM 13/13 13/13 13/13 Notes de bas de page pour le tableau 2 : AIM intramusculaire ; Bnombre de poulets présentant une atrophie du thymus (TA) ou de la bourse (BA). cNombre de poulets présentant des lésions denses, à 5 l'exclusion de l'atrophie de la bourse ou du thymus (les lésions suspectes n'ont pas été incluses). DMD mortalité. (iii) Effet d'une vaccination avec BACRB1BA41 et 2 sur 10 la charge virale après épreuve avec vvRB1B La charge virale après épreuve avec vvRB1B dans des PBL prélevés sur des poulets vaccinés avec BACRB1BA(31, 2, et CVI988 a été estimée au moyen d'une qPCR ciblant le gène Us2 viral de GaHV-2. Des PBL ont 15 été prélevé sur 6 poulets dans chaque groupe à différents moments temporels (21, 33, 69 jours post-infection jpi), comme précédemment décrit (Debba-Pavard et al., 2008). L'essai par qPCR a détecté spécifiquement la charge virale après épreuve avec 20 vvRB1B chez des poulets vaccinés avec BACRB1B41, 2, car une cassette BAC a été insérée dans le locus Us2. Des amorces spécifiques US2 sens TATTGTCGGGAATGGCCCACG et US2 antisens TCGCATTGCGCTCGAATGTA ont été utilisées. 40 cycles ont été mis en oeuvre avec les paramètres de cycle suivants : 94 °C pendant 15 secondes, 59 °C pendant 30 secondes, 72 °C pendant 30 secondes. Le nombre de copies du gène UL26 a été calculé à partir d'une courbe étalon établie avec un plasmide pGEM-T easy UL26. Les résultats sont présentés dans le tableau 3. Dans tous les groupes vaccinés, nous avons détecté une diminution significative de la charge virale après épreuve avec vvRB, représentant moins de 1 pour cent de poulets non vaccinés infectés par vvRB1B. De plus, la charge virale après épreuve avec vvRB1B a diminué au cours de l'expérience pour les poulets vaccinés avec BACRB1BAP1 et CVI988, mais pas dans le cas des poulets vaccinés avec BACRB1BAP2. En effet, la diminution de la charge virale après épreuve avec vvRB1B était plus importante chez les poulets vaccinés avec BACRB1BAP1 que chez les poulets vaccinés avec BACRB1BA32.20 Tableau 3 : charge virale de vvRB1B altérée par une vaccination avec les virus recombinants BACRB1BApl et 2 Jour de Groupe a l'échantillonnage (jpé) US2 21 RB1B CVI988 + RB1B BACRB1B.8431 + RB1B BACRB1B42 + RB1B 88000 (100 %) 580 (0,66 %) 100 (0,12 %) 100 (0,12 %) 33 RB1B CVI988 + RB1B BACRB1B41 + RB1B BACRB1W2 + RB1B 25500 (100 %) 400 (1,58 %) 20b (0,007 %) 110b (0,44 %) CVI988 + RB1B 50c 69 BACRB1B41 + RB1B 10c BACRB1B42 + RB1B 200c Notes de bas de page pour le tableau 3 : a nombre de copies du génome de GaHV-2 /2.104 cellules, les 5 pourcentages de copies sont calculés par rapport à ceux de vvRB1B. Les différences entre les groupes ont été analysées par un test de Wilcoxon. b Les différences entre les non vaccinés et les éprouvés par vvRB1B sont significatives 10 (p Les poulets non vaccinés et soumis à l'épreuve étaient morts avant 69 jpé, aucun pourcentage. jpé, jour post-épreuve. Exemple 4 : effet sur les organes lymphoïdes (i) Effet d'une infection avec les virus BACRB1BAp sur les organes lymphoïdes Nous avons évalué l'effet d'une infection avec le 10 vaccin CVI988 et les virus dérivés de BACRB1BA131, 2 ou BACRB1B-5 sur le poids des organes lymphoïdes à 13 jpi et à 68 jpi, la fin de l'expérience. A 12 jpi, trois poules de chaque groupe ont été sacrifiées. Après avoir pesé le corps, collecté et pesé les organes lymphoïdes, 15 la moyenne du poids relatif des organes lymphoïdes a été calculée. Nous n'avons observé aucune différence manifeste pour le poids relatif de la bourse entre les groupes de poulets par rapport aux poulets témoins. Au contraire, tous les groupes de poulets infectés 20 semblaient présenter une diminution du poids relatif du thymus est une augmentation du poids relatif de la rate, par rapport aux témoins. Nous avons noté la même tendance dans tous les groupes de poulets infectés, compris dans le groupe infecté par CVI988, qui 25 présentait la valeur de poids relatif de rate la plus élevée. Cette observation peut indiquer que les virus dérivés de BACRB1Ba ne présente pas d'effet spécifique sur les organes lymphoïdes par rapport au BACRB1B-5 parent ou au vaccin CVI988. 30 A la fin de l'expérience in vivo, tous les poulets vivants ont été pesés, les organes lymphoïdes ont été collectés et pesés et les poids relatifs ont été calculés. La distribution et les histogrammes des moyennes des poids relatifs des organes lymphoïdes sont présentés sur la figure 8. Nous n'avons noté aucune différence manifeste en ce qui concerne les poids relatif de la bourse de Fabricius entre les groupes de poulets (p 0,05, test de Wilcoxon-Mann Withney), et une grande plage de valeurs principalement pour les rates du groupe BACRB1B-5, en raison d'une splénomégalie importante chez un des poulets MM. Il doit être noté que seulement 6 poulets BACRB1B-5 étaient encore vivants à 69 jpi, les 7 autres étant morts à partir du 38 jpi avec des lésions spécifiques de la MM. En ce qui concerne thymus, tous les groupes contenant les poulets ayant reçu par inoculation le CVI988 présentaient des valeurs comparables, légèrement inférieure à celle du groupe témoin. De plus, nous avons observé 3/13 poulets ayant une splénomégalie modérée dans le groupe BACRB1Mpl et 1/12 ayant une atrophie de la bourse et du thymus dans le groupe BACRB1B42. (ii) Effet d'une vaccination avec les virus BACRB1B0P ou le vaccin CVI988 sur l'atrophie des organes 25 lymphoïdes induite par une épreuve avec vvRB1B ou vv+648A Nous avons déterminé si une vaccination avec les virus BACRB1BÉ3 ou le vaccin CVI988 pouvait diminuer l'atrophie des organes lymphoïdes induite par une 30 épreuve avec vvRB1B ou vv+ 648A. A 13 jpé, trois poules de chaque groupe ont été sacrifiées. Après avoir pesé le corps, collecté et pesé les organes lymphoïdes, la moyenne du poids relatif des organes lymphoïdes a été calculée. Comme attendu, vvRB1B et vv+648A ont induit une atrophie sévère de la bourse et du thymus, illustrée par une chute du poids relatif du thymus et de la bourse. De manière remarquable, les virus BACRB1BAP ont semblé diminuer l'atrophie induite par vvRB1B de manière aussi efficace que CVI988. De la même manière, les poulets vaccinés avec CVI988 ou BACRB1Be- 1 et soumis à une épreuve avec vv+648A n'ont pas présenté d'atrophie de la bourse ou du thymus. Cependant, le poids relatif moyen du thymus des poulets vaccinés avec BACRB1B4-2 et soumis à une épreuve avec 648A était inférieur à celui des poulets vaccinés avec CVI988 ou BACRB1BA3l et soumis à une épreuve avec 648A, mais significativement plus non vaccinés et infectés volume important de données élevé que celui des poulets par 648A. En réalité, un a été obtenu dans le groupe BACRB1BA(32 soumis à une épreuve avec 648A, un poulet présentant une atrophie du thymus et de la bourse comparable au groupe vv+648A, mais pas les autres. Nous avons observé une augmentation des poids relatifs des rates dans tous les groupes de poulets vaccinés ou non et soumis à une épreuve avec vvRB1B, par rapport au groupe témoin. Une augmentation modérée a été observée lors de l'épreuve avec vv+648A, le groupe non vacciné présentant une diminution du poids relatif de la rate par rapport au groupe témoin. Il doit également être noté qu'une grande plage de valeurs de poids relatif de la rate a été obtenue dans certains groupes de poulets, avec une perte ou un gain de poids probablement dû à une infection cytolytique par les lymphocytes, une activation immunitaire des lymphocytes ou une lymphoprolifération néoplasique. A la fin de l'expérience de épreuve in vivo, 68 à 71 jpé, tous les poulets vivants ont été pesés, les organes lymphoïdes ont été collectés et pesés et les poids relatifs ont été calculés. Tous les poulets non vaccinés et soumis à une épreuve avec vvRB1B ou vv+648A étaient morts à cause de lésions MM. La figure 9 représente la moyenne des poids relatifs des organes lymphoïdes provenant du groupe de poulets vaccinés et soumis à l'épreuve et provenant des témoins. Nous n'avons observé aucune différence manifeste en ce qui concerne les poids relatifs du thymus entre les groupes de poulets vaccinés, ce qui indique que les virus BACRB1B0P peuvent avoir le même effet que les vaccins CVI988 sur cet organe lymphoïde. Les poids relatifs de la bourse de Fabricius ont légèrement augmenté par rapport à ceux des témoins non vaccinés, ce qui montre que les virus BACRB1BÊ43 et CVI988 sont capables de diminuer l'atrophie et l'immunosuppression ultérieure induites par des souches MDV vv ou vv+. Une splénomégalie modérée, le plus souvent significativement différente par rapport aux témoins non vaccinés, a été observée dans tous les groupes vaccinés (figure 9 A, B). Pour conclure, les virus BACRB1B8P ont le même effet que le vaccin CVI988 sur les organes lymphoïdes avec des poulets soumis à une épreuve avec les souches vvRB1B et vv+648A.30 Exemple 5 : effet de passages en série sur les virus BACRB1BAp Des passages cellulaires supplémentaires ont été réalisés pour atteindre une perte totale du caractère 5 pathogène, comme décrit ci-dessus. En bref, des fibroblastes d'embryons de poulets (CEF) sont préparés à partir de 11 embryons d'un jour de Leghorn blanc B13/B13 exempts d'organismes pathogènes spécifiques, élevés à l'INRA (PFIE, 37380, Nouzilly, France), et 10 utilisés comme cellules secondaires (Schat and Purchase, 1998). Les CEF ont été maintenus dans un milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) complété avec 2,5 % de sérum de veau foetale, 1,25 % de sérum de poulet, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de fungizone et 2 % de 15 bouillon tryptose phosphate (TPB). Les virus BACRB1Ba. récupéré au troisième passage post-transfection avec l'ADN de bacmide ont été co-ensemencés avec des CEF nouvellement préparés, cultivés pendant 4 à 5 jours et récupérés pour effectuer des passages en série sur des 20 CEF nouvellement préparés. Les cultures cellulaires ont été observées tous les jours au microscope pour surveiller la présence de plaques de virus. Habituellement, des plaques typiques de MDV ont été observées à partir du troisième jour post-infection. 25 Pour confirmer la production d'une descendance du virus MDV, nous avons mis en oeuvre une IIF par le marquage de la protéine VP5 principale de la capside avec un anticorps monoclonal anti-VP5. Vingt passages en série ont été réalisés avec les virus BACRB1BAp1 et 2. La 30 descendance du virus GaHV-2 a été maintenue tout au long de ces 20 passages. Pour évaluer la stabilité de la région 5' de LAT des virus BACRB1W1 et 2, des analyses par PCR en utilisant la paire d'amorces GCTAGGGGTTCGACGAAAT/CCGGACCGAGAACACAGTGAT et un clonage ont été réalisées tous les cinq passages. Tous les clones, sauf un, présentaient un amplicon PCR correspondant à la délétion bêta, ce qui montre la stabilité des virus BACRB1BAp1 et 2 durant les passages en série in vitro, contrairement au vaccin CVI988. Exemple 6 : isolement des virus BACRB1BAa (i) Isolement des constructions de bacmides pRB1Ma De nouvelles délétions, en tant que sous-type alpha de la région 5' de LAT, ont été construites à 15 partir du génome BAC pRB1B-5 du vvRB1B, comme décrit ci-dessus. Ces délétions comprennent les délétions « alpha » de la région de microARN de LAT du génome en utilisant des techniques moléculaires similaires à celles décrites pour les délétions bêta décrites ci-20 dessus. Les délétions alpha ont été obtenues comme suit est des virus recombinants BACRB1BAa ont été récupérés. La première délétion alpha a été générée de la manière décrite brièvement. Une construction de transfert a été générée à partir du plasmide pEPkanS-2 par deux 25 amplifications PCR successives au moyen des amorces Alpha Del I-Sce for et rev pour la première, et Alpha Del PCR for et rev pour la seconde. Après l'électroporation de cette construction de transfert dans des bactéries GS1783, la recombinaison Red a été 30 induite à 42 °C pendant 15 minutes, et les clones bactériens résistant à la kanamycine ont été isolés et criblés par PCR avec les amorces Alpha del Seq for et rev (tableau 1). Un clone présentant les deux produits PCR attendus avec 1203 pb et 1156 pb, correspondant respectivement à l'insert aI-Sce et à la région 5' de LAT parent, a été isolé. L'enzyme I-SceI a été induite par l'ajout de 1 % d'arabinose pour exciser le gène de résistance KanR qui avait été obtenu par l'induction de la recombinaison Red. Les clones recombinants qui avaient perdu la résistance à la kanamycine ont été criblés avec les amorces Alpha Del Seq for et rev (tableau 1). Un clone présentant les deux produits PCR, 166 pb et 1156 pb correspondant respectivement à la délétion Alpha et à la région 5' de LAT de type sauvage, a été isolé. La délétion de la seconde copie de la région 5' de LAT a été réalisée par l'électroporation de la construction de transfert dans des bactéries GS1783, et les autres étapes ont été menées comme précédemment décrit. Après un criblage avec les amorces Alpha Del Seq for et rev, deux clones bactériens présentant un unique produit PCR de 166 pb attendu ont été isolés et l'ADN de bacmide a été davantage analysé. Une amplification PCR avec les amorces Alpha del Seq for et rev (tableau 1) bordant la région supprimée attendue a été réalisée sur deux clones sélectionnés de pRB1B0a, les clones 1 et 2, ainsi que sur l'ADN pRB1BBAC5 parent. La taille attendue de 166 pb après la délétion alpha a été amplifiée avec les clones pRB1BAal et 2, ce qui indique que les deux constructions portaient la délétion alpha dans les deux copies de la région 5' de LAT. Au contraire, une amplification PCR réalisée sur l'ADN pRB1B-5 parent a produit un seul amplicon de 1156 pb correspondant aux deux copies non délétées de la région 5' de LAT. Les séquences des produits PCR pour les clones pRB1BAal et 2 correspondaient à la délétion alpha attendue (coordonnées 142 545 - 143 535 dans IRs, figure 5), en comparaison avec la séquence de pRB1B parent (figure 10). Les profils d'électrophorèse de l'ADN digéré par EcoRI provenant des clones pRB1B0a1 et 2 ou du pRB1B-5 10 parent n'ont montré aucun réarrangement important, ce qui suggère que l'intégrité globale de l'ADN viral est préservée pendant la procédure de recombinaison à médiation red à deux étapes pour les deux constructions BAC (données non présentées). 15 (ii) Reconstitution du virus BACRB1BAa infectieux L'ADN provenant de pRB1BAal ou 2, ou de pRB1B-5 a été transfecté dans des CEF secondaires, cultivés pendant 4 à 5 jours et co-ensemencés avec des CEF 20 nouvellement préparés pendant trois passages. Les cultures cellulaires ont été observées chaque jour au microscope pour vérifier la présence de plaques de virus. Nous avons habituellement observé des plaques de virus au second passage et nous n'avons observé aucune 25 différence majeure entre les cultures résultant de la transfection avec pRB1B-5 ou avec les constructions à délétion BAC. Pour confirmer la production d'une descendance du virus MDV, nous avons mis en oeuvre une IIF par le marquage de la protéine VP5 principale de la 30 capside avec un anticorps monoclonal anti-VP5. Les CEF infectés avec pRB1B-5, pRB1BAa1 ou 2 présentaient un marquage comparable de VP5, ce qui confirme l'apparition des cycles lytiques induits par les virus récupérés soit à partir du pRB1B-5 parent, soit à partir de pRB1BAal ou 2 délété. Au troisième passage, les CEF produisant des virus BACRB1BAa 1 et 2 ont été trypsinés et congelés à -142 °C sous la forme de stocks de virus BACRB1BAa 1 et 2 associés aux cellules. Pour évaluer la région 5' de LAT des virus BACRB1BAal et 2 au troisième passage, des analyses par PCR avec la paire d'amorces GCTAGGGGTTCGACGAAAT/ CCGGACCGAGAACACAGTGAT et des clonages ont été mis en oeuvre. Tous les clones présentaient un amplicon PCR correspondant à la délétion alpha, ce qui montre que les virus BACRB1BAa1 et 2 présentaient une population homogène de sous-types alpha, contrairement au vaccin CVI988. Par conséquent, malgré la délétion alpha de LAT en 5', ces constructions ont conservé leur capacité à se répliquer dans un système in vitro comme le bacmide parent, ce qui suggère que mdvl-miR-M8 est superflu pour la réplication lytique in vitro du MDV. Des passages cellulaires supplémentaires sont effectués comme décrit ci-dessus pour la délétion bêta pour obtenir une perte totale du caractère pathogène et pour évaluer la stabilité des délétions. Exemple 7 : isolement des virus BACRB1B £a3 (i) Isolement des constructions de bacmides pRB1BAap Afin de mimer CVI988 avec une construction unique, 30 nous avons isolé un recombinant portant une délétion alpha dans une copie de la région 5' de LAT et une délétion bêta dans la seconde copie. Ce recombinant a été généré à partir de pRB1B-5, de la manière décrite dans les méthodes générales. Dans une première étape de recombinaison, la délétion alpha été générée. Une construction de transfert a été générée à partir du plasmide pEPkanS-2 par deux amplifications PCR successives au moyen des amorces alpha Del I-Sce for et rev pour la première, et alpha Del PCR for et rev pour la seconde (tableau 1). Après l'électroporation de ce produit PCR dans des bactéries GS1783, la recombinaison Red a été induite à 42 °C pendant 15 minutes, et les clones bactériens résistant à la kanamycine ont été isolés et criblés par PCR avec les amorces alpha del Seq for et rev (tableau 1). Un clone présentant les deux produits PCR attendus avec 1203 pb et 1156 pb, correspondant respectivement à l'insert aI-Sce et à la région 5' de LAT de type sauvage, a été isolé. L'enzyme I-SceI a été induite par l'ajout de 1 % d'arabinose pour exciser le gène de résistance KanR. Les clones recombinants qui avaient perdu la résistance à la kanamycine ont été criblés avec les amorces alpha Del Seq for et rev (tableau 1). Un clone présentant les deux produits PCR, 166 pb et 1156 pb correspondant respectivement à la délétion alpha et à la région 5' de LAT parent, a été isolé. Une construction de transfert a été générée à partir du plasmide pEPkanS-2 par deux amplifications PCR successives au moyen de Bêta Del ISce for et rev pour la première, et de Bêta Del PCR for et rev pour la seconde (tableau 1). Après l'électroporation de ce produit PCR de transfert dans le clone à délétion alpha, la recombinaison Red a été induite à 42 °C pendant 15 minutes, et les clones bactériens résistant à la kanamycine ont été isolés et criblés par PCR avec les amorces alpha del Seq for et rev (tableau 1). Un clone présentant les deux produits PCR attendus avec 1351 pb et 166 pb, correspondant respectivement à l'insert p I-Sce et à la délétion alpha de LAT en 5', a été isolé. L'enzyme I-SceI a été induite par l'ajout de 1 % d'arabinose pour exciser le gène de résistance KanR. Les clones recombinants qui avaient perdu la résistance à la kanamycine ont été criblés avec les amorces alpha Del Seq for et rev bordant la région supprimée attendue. Deux clones présentant les deux produits PCR, 166 pb et 312 pb correspondant respectivement aux délétions alpha et bêta, ont été isolés. Les séquences des produits PCR provenant des clones pRB1B0e 1 et 2 correspondaient aux séquences de délétions alpha et bêta attendues, en comparaison avec la séquence pRB1BBAC5 parent. Les profils d'électrophorèse de l'ADN digéré par 20 EcoRi provenant des clones BACRB1BAce 1 et 2 ou de pRB1BBAC5 parent n'ont montré aucun réarrangement important, ce qui suggère que l'intégrité globale de l'ADN viral est préservée pendant la procédure de recombinaison à médiation red à deux étapes pour les 25 deux constructions BAC (données non présentées). (ii) Reconstitution du virus RB1BAcc1 infectieux L'ADN provenant de pRB1BA41 ou 2, ou de pRB1B-5 a été transfecté dans des CEF secondaires, cultivés 30 pendant 4 à 5 jours et co-ensemencés avec des CEF nouvellement préparés pendant trois passages. Les cultures cellulaires ont été observées chaque jour au microscope pour vérifier la présence de plaques de virus. Nous avons habituellement observé des plaques de virus au second passage et nous n'avons observé aucune différence majeure entre les cultures résultant de la transfection avec pRB1B-5 ou avec les constructions à délétion BAC. Pour confirmer la production d'une descendance du virus MDV, nous avons mis en oeuvre une IIF par le marquage de la protéine VP5 principale de la capside avec un anticorps monoclonal anti-VP5. Les CEF infectés avec pRB1B-5, pRB1Ma3l ou 2 présentaient un marquage comparable de VP5, ce qui confirme l'apparition des cycles lytiques induits par les virus récupérés soit à partir du BACRB1B-5 parent, soit à partir de BACRB1Map1 ou 2 délété. Au troisième passage, les CEF produisant des virus BACRB1BA41 et 2 ont été trypsinés et congelés à -142 °C sous la forme de stocks de virus BACRB1BA4 1 et 2 associés aux cellules. Pour évaluer la région 5' de LAT des virus 20 BACRB1BA4 1 et 2 au troisième passage, des analyses par PCR et des clonages ont été mis en oeuvre. Des passages cellulaires supplémentaires sont effectués comme décrit ci-dessus pour la délétion bêta pour obtenir une perte totale du caractère pathogène et 25 pour évaluer la stabilité des délétions. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans 30 pour autant sortir du cadre de l'invention. Références Debba-Pavard, M., Ait-Lounis, A., Soubieux, D., Rasschaert, D., and Dambrine, G. (2008) : Vaccination against Marek's disease reduces telomerase activity and viral gene transcription in peripheral blood leukocytes from challenged chickens. Vaccine 26, 4904-12. Petherbridge, L., Brown, A. C., Baigent, S. J., Howes, K., Sacco, M. A., Osterrieder, N., and Nair, V. K. (2004): Oncogenicity of virulent Marek's disease virus cloned as bacterial artificial chromosomes. J Virol 78, 13376-80. Rispens, B. H., van Vloten, H., Mastenbroek, N., Maas, H. J., and Schat, K. A. (1972): Control of Marek's disease in the Netherlands. I. Isolation of an avirulent Marek's disease virus (strain CVI 988) and its use in laboratory vaccination trials. Avian Dis 16, 108-25, Sambrook, J., Fritch, E.F., Maniatis, T., (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring 20 Harbour Laboratory Press. Schat, K. A., and Purchase, H. G. (1998): Cellculture methods. In A laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, 4th edn, pp. 223-234. Kennet Square, PA: American 25 Association of Avian Pathologists. Schumacher, D., Tischer, B.K.,Fuchs, W., and Osterrieder, N. (2000): Reconstitution of Marek's disease virus serotype 1 (MDV-1) from DNA clones as a bacterial artificial chromosome and characterization of 30 a glycoprotein-B negative MDV-1 mutant. J Virol 74, 11088-98. Spatz, S. J., and Silva, R. F. (2007): Sequence determination of variable regions within the genomes of gallid herpesvirus-2 pathotypes. Arch Virol 152, 166578. Stik, G., Laurent, S., Coupeau, D., Coutaud, B., Dambrine, G., Rasschaert, D., and Muylkens, B. (2010): A p53-dependent promoter associated with polymorphic tandem repeats controls the expression of a viral transcript encoding clustered microRNAs. RNA 16, 2263- 76. Strassheim, S., Stik, G., Rasschaert, D., and Laurent, S. (2012): mdvl-miR-M7-5p, located in the newly identified first intron of the latency-associated transcript of Marek's disease virus, targets the immediate-early genes ICP4 and ICP27. J Gen Virol 93, 1731-42. Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., and Osterrieder, N. (2006): Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless 20 DNA manipulation in Escherichia coli. Biotechniques 40, 191-7. Tischer, B. K., Smith, G.A., and Osterrieder, N. (2010): En passant mutagenesis: A two step markerless Red recombination system. In Vitro Mutagenesis 25 Protocols, Methods in Molecular Biology 634, 421-30. REVENDICATIONS1. Génome de virus aviaire, dans lequel le génome comprend un segment de région courte unique (Us) flanqué à chaque extrémité d'un segment de séquence répétée inversée courte (Rs), chaque Rs comprenant un segment de séquence répétée de 60 paires de bases (pb) dans le génome viral natif, au moins une partie du segment de séquence répétée de 60 pb étant supprimée d'un des segments Rs ou des deux segments Rs. 2. Génome de virus aviaire selon la revendication 1, qui provient d'une souche virale GaHV-2. 3. Génome de virus aviaire selon la revendication 2, dans lequel le génome comprend une délétion dans la région région 5' du gène des transcrits associés à la latence (lat) englobant le promoteur du gène des transcrits associés à la latence (lat). 4. Génome de virus aviaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la délétion génomique comprend au moins une partie englobant le segment de séquence répétée de 60 paires de bases (pb) au sein de chaque séquence Rs. 5. Génome de virus aviaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la délétion génomique comprend une délétion totale d'un segment ou des deux segments de séquence répétée de 60 pb dans les segments de séquence Rs. 6. Génome de virus aviaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la délétion génomique comprend une délétion totale des segments deséquence répétée de 60 pb dans les deux segments de séquence Rs. 7. Génome de virus aviaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la délétion génomique comprend au moins une délétion choisie parmi une délétion alpha et une délétion bêta. 8. Génome de virus aviaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la délétion génomique comprend à la fois une délétion alpha et une délétion bêta. 9. Génome de virus aviaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel au moins une délétion comprend une délétion par recombinaison. 10. Génome de virus aviaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, qui est une composition immunogène. 11. Génome de virus aviaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le génome est présent au sein d'une particule virale ou une pseudo-particule virale. 12. Génome de virus aviaire selon la revendication 11, dans lequel le génome est présent dans un virus pouvant se répliquer dans une espèce aviaire et/ou en culture cellulaire. 13. Génome de virus aviaire selon la revendication 11, qui est un virus GaHV de type 2 recombinant. 14. Génome de virus aviaire selon la revendication 11, qui est un virus GaHV de type 2 comprenant une ou plusieurs délétions parmi une délétion alpha et bêta. 15. Génome de virus aviaire selon la revendication 14, qui comprend une délétion alpha. 16. Génome de virus aviaire selon la revendication 15, dans lequel le virus est dérivé de BACR1BlAci. 17. Génome de virus aviaire selon la revendication 14, qui comprend une délétion bêta. 18. Génome de virus aviaire selon la revendication 17, dans lequel le virus est dérivé de BACRB1B181 et/ou de BACRB1B1[32. 19. Composition comprenant un génome de virus aviaire tel que défini dans l'une quelconque des 10 revendications 1 à 18. 20. Composition selon la revendication 19, comprenant en outre un virus GaHV de type 2 recombinant supplémentaire comprenant une délétion différente dans le génome par rapport à la délétion alpha. 15 21. Composition selon la revendication 20, dans laquelle le virus GaHV de type 2 supplémentaire comprend une délétion bêta. 22. Composition selon la revendication 21, dans laquelle le virus GaHV de type 2 supplémentaire 20 comprend un virus dérivé de BACRB1Bâp1 et/ou de BACRB1Bâp2. 23. Composition selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, comprenant en outre un antigène supplémentaire. 25 24. Composition selon la revendication 23, dans laquelle l'antigène supplémentaire comprend au moins un antigène de l'herpèsvirus du dindon. 25. Composition selon l'une quelconque des revendications 19 à 24, comprenant en outre un adjuvant, 30 une cytokine ou un autre agent immunorégulateur. 26. Composition selon l'une quelconque des revendications 19 à 25, comprenant une délétion dérivée d'un des génomes de RB-1B, de CV1988 et de 648A ou de n'importe quel génome de GaHV-2 ou de GaHV-3. 27. Vaccin comprenant un génome de virus aviaire tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 18 ou une composition telle que définie dans l'une quelconque des revendications 19 à 26. 28. Génome de virus aviaire, composition ou vaccin 10 tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 27, pour une utilisation en thérapie. 29. Génome de virus aviaire, composition ou vaccin tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 27, pour une utilisation dans le traitement ou la 15 prévention de la maladie de Marek chez un animal. 30. Génome de virus aviaire, composition ou vaccin selon la revendication 29 pour l'utilisation selon la revendication 29, dans lequel l'animal est une espèce aviaire choisie dans le groupe constitué du poulet, du 20 canard, du dindon, de la caille, du faisan et du pigeon. 31. Génome de virus aviaire, composition ou vaccin selon la revendication 30 pour l'utilisation selon la revendication 30, dans lequel l'espèce aviaire est un poulet.