Brevet FR3009091A1 — publié le 20150130

La présente invention concerne le domaine médical, et notamment le pronostic dans le domaine du cancer. Plus précisément, l'invention est relative à un procédé de pronostic chez un patient atteint d'un cancer, qui est basé sur l'étude de la variation de deux isotopes stables d'un élément chimique, et en particulier d'un élément métallique. Pour la prise en charge des patients atteints de cancer, il est très important de pouvoir déterminer un pronostic, de manière à pouvoir adapter au mieux le traitement et/ou le suivi de ces patients. Par exemple, une thérapie plus intensive ou modifiée peut être envisagée chez les patients qui sont atteints d'un cancer associé à un pronostic défavorable, notamment dans le but de les traiter efficacement et préventivement avant l'apparition de métastases éventuelles. De même, une simple surveillance peut être considérée comme suffisante chez les patients qui sont atteints d'un cancer peu ou pas évolutif associé à un pronostic plutôt favorable. Il existe à ce jour un certain nombre de critères cliniques, histologiques et biologiques qui permettent de déterminer le pronostic d'un cancer. Plus spécifiquement, il est possible d'utiliser des biomarqueurs de type antigène (PSA ou antigène prostatique spécifique, ACE ou antigène carcino-embryonnaire, CA15.3 ou Carbohydrate Antigen 15.3, CA19.9 ou Carbohydrate Antigen 19.9), génétique (HER2 ou Human Epidermal growth factor Receptor-2, KRAS) ou cellulaire HCG ou hormone gonadotrophine chorionique, gastrine, AFP ou alpha foeto-protéine, CYFRA 21-1 ou CYtokeratin-21-FRAgment. Il reste néanmoins difficile de prévoir comment un cancer va évoluer et il est donc difficile de prédire quels sont les patients qui ont un cancer à haut potentiel évolutif et qui doivent donc être traités de façon intensive et quels sont les patients pour lesquels une simple surveillance serait suffisante. De plus, pour les patients sous traitement, les marqueurs connus sont souvent peu fiables ce qui rend difficile l'estimation de l'efficacité de la thérapeutique mise en place, voire l'anticipation d'une récidive éventuelle. 2 3009091 Tout ceci limite donc de manière substantielle les possibilités d'ajustement des traitements actuellement disponibles. Disposer de nouvelles approches pronostiques permettrait une meilleure segmentation de la population des patients atteints de cancer en 5 sous-catégories et ainsi de pouvoir guider les cliniciens dans leurs démarches thérapeutiques et adapter au mieux les traitements aux patients. En particulier, un marqueur et notamment un marqueur sérique de pronostic ou d'évolutivité serait un outil très utile pour décider de la mise en place ou de la poursuite de traitements de fonds aux effets secondaires souvent 10 importants, et de la fréquence à laquelle le suivi clinique doit être réalisé. Dans ces conditions, il existe un réel besoin de disposer de nouveaux marqueurs pronostiques concernant le pronostic ou l'évolutivité des cancers. De plus, il serait très avantageux de disposer d'un marqueur facilement détectable pour améliorer le confort du patient et diminuer les coûts de santé 15 publique associés au suivi de ces cancers. C'est dans ce contexte que les inventeurs ont découvert ce qui fait l'objet de la présente invention, qui est en particulier basée sur l'étude de la variation isotopique de deux isotopes stables d'un élément chimique, et en particulier d'un élément métallique, pour établir un pronostic chez les 20 patients atteints de cancer. Selon un premier aspect, la présente invention a donc pour objet un procédé de pronostic d'un cancer chez un sujet, comprenant les étapes suivantes, voire consistant en les étapes suivantes - mesurer le rapport isotopique entre deux isotopes stables d'un 25 élément chimique dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet, - comparer ce rapport isotopique à celui mesuré dans un échantillon de référence, - conclure sur le pronostic, favorable ou défavorable, dudit cancer 30 chez ledit sujet en fonction de la variation du rapport isotopique. Ainsi, les inventeurs ont montré que la variation du rapport isotopique entre deux isotopes stables d'un élément chimique, et notamment 3 3009091 d'un élément métallique, est associée à une évolution du cancer, dans un sens positif ou négatif, ce qui en fait un marqueur de pronostic du cancer utile pour le suivi des sujets diagnostiqués, en particulier chez l'homme. Autrement dit, les variations isotopiques qui sont observées chez les patients 5 atteints d'un cancer sont en accord avec les variations de cette maladie, en termes d'évolution. Dans l'art antérieur, les variations d'isotopes stables de certains éléments ont été étudiées, et éventuellement proposées pour une utilisation future sous la forme d'un diagnostic de maladies liées à ces éléments, 10 comme le cuivre pour la maladie de Wilson (Aramendla M. et al., 2013, 28, 675-681). Une étude des variations isotopiques du fer a également été menée chez des patients atteints d'hémochromatose héréditaire par rapport à des individus sains (Krayenbuehl, P-A. et al., 2005, Blood, 105 (10), 38123816). 15 S'agissant du cancer, le seul lien mis en évidence jusqu'à maintenant d'un point de vue diagnostic entre les éléments chimiques et le cancer a été étudié sous l'angle des concentrations totales d'éléments métalliques tels que le cuivre, mais jamais sous l'angle de l'isotopie stable (Hrgovcic M. et al., 1973, 31, 1337-1345; Fisher G. L. et al., 1976, 37, 356-363). 20 Dans le cadre de la présente demande, les termes « cancer » et « tumeur » sont utilisés indifféremment pour désigner un cancer, c'est-à-dire qu'ici le terme « tumeur » s'entend désigner une tumeur maligne c'est-à-dire cancéreuse. Au sens de la présente invention, l'expression « mesurer le rapport 25 isotopique» s'entend désigner la mesure in vitro ou ex vivo dudit rapport isotopique. Dans le cadre du procédé selon l'invention, l'établissement du « pronostic » consiste à déterminer l'évolution, favorable ou défavorable, du cancer, et notamment l'agressivité et/ou l'extension tumorale. Le 30 « pronostic » peut également couvrir l'évaluation de la réponse, que ce soit dans un sens positif ou négatif, à un traitement mis en place chez un sujet 4 3009091 pour qui le diagnostic du cancer a déjà été posé, comme par exemple une chirurgie, une radiothérapie, une chimiothérapie, etc. Les éléments chimiques, et en particulier les éléments métalliques, peuvent exister dans la nature sous plusieurs formes, les isotopes, qui ne 5 diffèrent que par leur nombre de neutrons et donc par leur masse atomique. Les isotopes dits stables sont pourvus d'un noyau de structure stable, qui ne subit aucune modification au cours du temps en l'absence d'apport d'énergie extérieure, contrairement aux isotopes dits radioactifs qui possèdent un noyau instable qui se transforme spontanément en un autre 10 par émission d'un rayonnement ou d'une particule. La présente invention est en particulier mise en oeuvre sans aucun ajout d'un traceur radioactif, de quelque sorte que ce soit. Les éléments chimiques qui peuvent exister sous forme d'isotopes peuvent avoir deux isotopes différents ou plus. Ainsi, selon le procédé de 15 l'invention, le rapport isotopique de deux isotopes stables qui est mesuré peut notamment être le rapport entre un isotope 1 et un isotope 2 pour lequel la masse de l'isotope 1 est supérieure à celle de l'isotope 2, et ce quel que soit l'élément chimique concerné qui possède des isotopes stables. En revanche, il est également possible de mesurer le rapport 20 isotopique selon l'invention entre l'isotope 2 et l'isotope 1 tels que définis ci- dessus. Idéalement, le rapport isotopique qui est mesuré est rapporté à la valeur d'un standard ou étalon isotopique de l'élément chimique choisi. Le choix du standard ou étalon utilisé est donc fonction de l'élément chimique 25 duquel on souhaite mesurer le rapport isotopique. Ceci permet avantageusement de pouvoir mesurer séparément dans le temps le rapport isotopique dans l'échantillon à tester et le rapport isotopique dans l'échantillon de référence, et ainsi d'éviter de devoir mesurer ces deux rapports isotopiques en même temps. Parmi les standards ou étalons qui 30 peuvent être utilisés, on peut notamment citer le standard international STD NIST SRM 976 (copper isotopic standard) pour le cuivre, le standard Alfa 5 3009091 Aesar Lot 02040110 (Zn standard) pour le zinc ou le standard STD IRMM 14 (Iron isotopic standard) pour le fer par exemple. Dans le cas particulier où l'élément chimique dont on souhaite mesurer le rapport isotopique possède plus de deux isotopes stables et que 5 l'on souhaite comparer les valeurs de rapports isotopiques différents d'un même élément chimique entre l'échantillon à tester et l'échantillon de référence, le rapport isotopique qui est mesuré dans le procédé selon l'invention peut être rapporté à l'écart de masse entre les deux isotopes ou tout du moins tenir compte de cet écart de masse pour la comparaison. 10 Globalement, quelle que soit la manière de mesurer le rapport isotopique dans le cadre du procédé de l'invention, les conclusions quant au pronostic seront les mêmes dans la mesure où celles-ci sont basées sur la variation de ce rapport isotopique. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de 15 l'invention, le rapport isotopique est mesuré à l'aide de la formule I suivante : (isotope de masse plus élevée/isotope de masse plus faible) ECH ou REF d EL (%) = X 1000 (isotope de masse plus élevée/isotope de masse plus faible) STD dans laquelle : 20 EL représente l'élément chimique duquel on souhaite mesure le rapport isotopique ECH représente l'échantillon biologique à tester REF représente l'échantillon de référence STD représente le standard ou étalon isotopique de l'élément chimique EL 25 choisi. La méthode de mesure du rapport isotopique des deux isotopes stables selon l'invention peut être n'importe quelle méthode connue par l'homme du métier dans le domaine. En particulier, on peut citer la spectrométrie de masse, et notamment la spectrométrie de masse à source 6 3009091 plasma et à multi-collection ou MC-ICP-MS, mais également les techniques nucléaires ou laser. Selon un autre mode de réalisation selon la présente invention, le procédé comprend, préalablement à la mesure du rapport isotopique entre 5 deux isotopes stables de l'élément chimique choisi, une étape de mesure de la concentration totale dudit élément dans l'échantillon biologique à tester. Cette étape préalable peut également être réalisée par toute méthode connue par l'homme du métier du domaine de l'invention, et notamment par spectrométrie de masse, comme par exemple l'ICP-MS à quadripole avec 10 cellule de collision ou à haute résolution, par absorption atomique avec ou sans four graphite, ou bien encore par spectrométrie d'émission optique comme la technique ICP-AES (Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry). L'élément chimique dont le rapport isotopique est mesuré dans le 15 procédé de l'invention est de préférence choisi parmi les éléments des périodes 2 à 16 du tableau périodique de Mendeleïev, et en particulier des périodes 2 à 12 et de la période 16 de ce tableau. Parmi les éléments chimiques de la période 2, le magnésium et le calcium sont préférés. 20 Parmi les éléments chimiques de la période 16, le soufre est particulièrement préféré. De préférence, l'élément chimique dont le rapport isotopique est mesuré dans le procédé de l'invention est un élément métallique, et de manière particulièrement préférée est un métal de transition. Au sens de 25 l'invention, un métal de transition est un des 38 éléments des périodes 4 à 7 et des groupes 3 à 12 hormis le lutécium 71Lu (un lanthanide) et le lawrencium 103Lr (un actinide). De manière particulièrement préférée, l'élément chimique dont le rapport isotopique est mesuré dans le procédé de l'invention est choisi parmi 30 les métaux de transition des périodes 8, 11, 12, et notamment le fer (période 8), le cuivre (période 11) et le zinc (période 12). 7 3009091 Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le métal de transition dont le rapport isotopique est mesuré dans le procédé de l'invention est choisi parmi le cuivre et le zinc, et de préférence c'est le rapport isotopique du cuivre qui est mesuré. 5 Ainsi, l'élément chimique dont le rapport isotopique est mesuré selon l'invention est de préférence choisi dans le groupe constitué du cuivre, du zinc, du fer, du magnésium, du calcium et du soufre. S'agissant du rapport isotopique lui-même, si l'élément chimique choisi est le cuivre, on peut mesurer le rapport isotopique Cu65/Cu63 ou 10 l'inverse : Cu63/Cu65, car le cuivre ne possède que deux isotopes stables. Pour le zinc ou le fer par exemple, qui possèdent plus de deux isotopes stables, n'importe quel rapport isotopique peut être mesuré dans le cadre de la présente invention. Par exemple, si le rapport isotopique mesuré concerne le zinc, on peut mesurer n'importe quel rapport de deux isotopes stables 15 différents choisis parmi Zn64, Zn66, Zn67, Zn68, Zn70, et notamment le rapport Zn66/Zn64 ou l'inverse, Zn66/ Zn68 ou l'inverse, Zn66/ Zn70 ou l'inverse, Zn66/ Zn67 ou l'inverse, Zn64/ Zn67 et l'inverse, etc. De même, si le rapport isotopique mesuré concerne le fer, on peut mesurer n'importe quel rapport de deux isotopes stables différents choisis parmi Fe54, Fe56, Fe57, 20 et Fe58. Dans le cadre de l'invention, le sujet chez qui on souhaite établir le pronostic selon la présente invention peut être atteint de n'importe quel type de cancer, notamment d'un cancer du côlon, du sein, du foie, de l'estomac, des poumons, de la prostate, de la paroi antérieure de la vessie, du rectum, 25 d'un cancer colorectal. De préférence, le procédé de pronostic selon la présente invention est mis en oeuvre chez un sujet atteint d'un cancer du côlon ou d'un cancer du sein. De préférence, le sujet n'est atteint que d'un seul type de cancer pour lequel on souhaite établir le pronostic, et de préférence est exempt de 30 toute autre maladie, telle qu'une maladie inflammatoire chronique. Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon biologique à tester issu du sujet» ou « échantillon biologique issu du sujet à 8 3009091 tester », tout échantillon biologique susceptible de contenir l'élément chimique duquel on souhaite mesurer le rapport isotopique entre deux isotopes stables, et provenant du sujet chez qui on souhaite déterminer le pronostic du cancer. 5 L'échantillon biologique à tester utilisé dans le cadre du procédé selon l'invention peut être de différente nature. L'homme du métier saura adapter la nature de l'échantillon biologique à tester en fonction du type de cancer dont est atteint le sujet. Quel que soit le type de cancer, l'échantillon biologique à tester peut 10 être choisi parmi les tissus ou les cellules isolées à partir de ces tissus mais aussi les fluides ou sécrétions biologiques tels que l'urine, le sang total, le plasma, le sérum, ou les cellules isolées à partir de ces fluides ou sécrétions. D'une manière générale, l'échantillon biologique à tester est de préférence du sérum. 15 L'échantillon biologique à tester peut contenir l'élément chimique à la fois à l'état libre mais également associé ou lié à des protéines ou enzymes contenues dans l'échantillon biologique. Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon la présente invention, l'échantillon biologique à tester est préalablement débarrassé de 20 l'élément chimique qui est présent à l'état libre et la mesure du rapport isotopique est faite uniquement sur la fraction de l'élément chimique qui est associée à des protéines contenues dans l'échantillon biologique. Dans ce cadre, l'échantillon biologique à tester peut donc être constitué d'une ou de plusieurs protéines à laquelle l'élément chimique choisi (EL) est associé, 25 c'est-à-dire une ou plusieurs protéines qui contient un ou plusieurs ions dudit élément chimique comme groupe(s) prosthétique(s) ou une ou plusieurs enzymes qui utilisent ledit élément chimique comme co-facteur catalytique, et notamment une ou plusieurs protéine(s) ou enzyme(s) telle(s) que les métallothionéines ou la céruloplasmine. 30 Les échantillons biologiques à comparer, à savoir l'échantillon à tester et l'échantillon de référence, sont de préférence de même nature (fluides ou sécrétions biologiques, tissus, cellules issues de ceux-ci, etc) ou 9 3009091 tout du moins d'une nature compatible pour constituer une référence quant à la mesure du rapport des deux isotopes stables. Dans le cadre de l'invention, l'échantillon de référence est un échantillon biologique issu du même dit sujet à tester lors d'un prélèvement 5 antérieur, c'est-à-dire un échantillon biologique qui a été obtenu antérieurement dans le temps par rapport à l'échantillon biologique à tester. De préférence, l'échantillon de référence est constitué d'un échantillon biologique directement antérieur par rapport à l'échantillon à tester, c'est-à-dire celui qui précède l'échantillon à tester dans l'ordre des prélèvements 10 effectués chez le sujet. La fréquence des prélèvements dans le temps est adaptée à celle des suivis qui sont habituellement pratiqués en fonction du type cancer et du stade de celui-ci. Le protocole de suivi est adapté à chaque sujet et à sa prise en charge initiale. 15 Par exemple, l'échantillon antérieur issu du même sujet que le sujet chez qui on cherche à établir le pronostic peut être par exemple l'échantillon antérieur obtenu au moment du diagnostic du cancer chez le sujet à tester, ou bien un échantillon obtenu avant le traitement du sujet pour être comparé à un échantillon à tester obtenu après traitement, ou encore un échantillon 20 antérieur obtenu au cours du traitement dudit sujet. Par « traitement », on entend tout traitement chirurgical, greffe, chimique ou radiologique. Ainsi, les indications qui sont mentionnées ci-dessus pour l'échantillon biologique à tester s'appliquent également et intégralement à l'échantillon de référence, aussi bien en termes général que préférentiel. 25 Selon l'invention, le rapport des isotopes stables qui est mesuré dans l'échantillon à tester est comparé à celui mesuré dans un échantillon de référence, et la mise en évidence d'une variation de ce rapport permet de conclure sur le pronostic du cancer chez le sujet testé. Dans le cadre de la présente invention, le pronostic consiste 30 notamment à déterminer l'évolution du cancer et/ou l'efficacité d'un traitement dans le cadre du suivi de l'état du patient, que ce soit dans un sens positif ou négatif. 10 3009091 En particulier, si le rapport isotopique mesuré est un rapport entre un isotope 1 et un isotope 2 pour lequel la masse de l'isotope 1 est supérieure à celle de l'isotope 2, le pronostic dudit cancer chez ledit sujet est défavorable lorsqu'une diminution de ce rapport isotopique est mise en 5 évidence par rapport à celui mesuré dans l'échantillon de référence, et favorable lorsqu'une augmentation de ce rapport isotopique est mise en évidence par rapport à celui mesuré dans l'échantillon de référence, étant entendu que lorsque l'échantillon à tester, et de préférence également l'échantillon de référence, est un fluide ou une sécrétion biologique, et en 10 particulier du sérum. A l'inverse, si le rapport isotopique mesuré est un rapport entre un isotope 2 et un isotope 1 pour lequel la masse de l'isotope 1 est supérieure à celle de l'isotope 2, le pronostic dudit cancer chez ledit sujet est défavorable lorsqu'une augmentation de ce rapport isotopique est mise en évidence par 15 rapport à celui mesuré dans l'échantillon de référence, et favorable lorsqu'une diminution de ce rapport isotopique est mise en évidence par rapport à celui mesuré dans l'échantillon de référence, étant entendu que l'échantillon à tester, et de préférence également l'échantillon de référence, est un fluide ou une sécrétion biologique, et en particulier du sérum. 20 Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de l'invention, les variations du rapport isotopique telles que décrites ci-dessus aux deux paragraphes précédents sont avantageusement des variations du rapport isotopique du cuivre. De manière préférée, lorsque le rapport isotopique est mesuré à 25 l'aide de la formule I décrite ci-dessus par spectrométrie de masse à source plasma et à multi-collection ou MC-ICP-MS, une variation de ce rapport, que ce soit positive ou négative, d'au moins 0,10 permet de conclure sur le pronostic du cancer dont est atteint le sujet. Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet 30 l'utilisation de la mesure/de l'étude des variations isotopiques d'isotopes stables d'un élément chimique comme marqueur pronostic d'un cancer. Par « marqueur pronostic », on entend désigner un marqueur d'évolution ou de progression du cancer ou un marqueur d'extension tumoral. Dans le cadre de ce deuxième aspect de l'invention, la mesure des variations isotopiques consiste de préférence à mesurer la variation du rapport isotopique entre deux isotopes stables d'un élément chimique, de préférence d'un métal de transition, mesuré dans un échantillon biologique issu d'un sujet atteint d'un cancer pour lequel on souhaite établir un pronostic par rapport au même rapport isotopique mesuré dans un échantillon de référence. Tous les modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont mentionnés ci-dessus concernant le procédé constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de l'utilisation. En particulier, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'élément chimique dont les variations du rapport isotopique sont mesurées est un élément métallique, et de manière particulièrement préférée est un métal de transition, tels que définis ci-dessus dans le cadre du procédé, et notamment le cuivre. Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-20 dessous en référence aux figures annexées qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention, et dans lesquelles : - les figures lA et 1B représentent les profils d'évolution au cours du temps du dosage de l'ACE (Antigène Carcino-Embryonnaire)(A) et du 25 marqueur CA19.9 (Carbohydrate Antigen 19.9)(B) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du côlon (patient 1-côlon). - les figures 2A et 2B représentent les profils d'évolution au cours du temps du dosage de l'ACE (Antigène Carcino-Embryonnaire)(A) et du 30 marqueur CA19.9 (Carbohydrate Antigen 19.9)(B) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du côlon (patient 2-côlon). 12 3009091 - la figure 3 représente le profil d'évolution au cours du temps du marqueur CA19.9 (Carbohydrate Antigen 19.9) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du côlon (patient 3-côlon). 5 - les figures 4A et 4B représentent le profil d'évolution au cours du temps du marqueur CA15.3 (Carbohydrate Antigen 15.3)(A) et du marqueur ACE (Antigène Carcino-Embryonnaire)(B) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du sein (patient 1-sein). 10 - la figure 5 représente le profil d'évolution au cours du temps du dosage de l'ACE (Antigène Carcino-Embryonnaire) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du sein (patient 2-sein). EXEMPLES 15 Echantillons biologiques Les échantillons ont été obtenus au Centre Léon Bérard (Lyon) qui dispose d'un centre de ressources biologiques prévu pour la conservation des prélèvements. Les échantillons de sérums ont été prélevés sur les patients lors de leurs visites à l'hôpital et avec leur consentement écrit à des fins de recherche et ensuite maintenus à -160°C sous formes de paillettes de 200p1. Préparation des échantillons biologiques Les sérums ont été récupérés à partir des paillettes de 200pl fournies par le Centre de ressources biologique du Centre Léon Bérard et il a été ajouté 1 ml d'acide nitrique ultra-pur et 0,2 ml d'eau oxygéné ultra-pure et chauffée à 80°C pendant 12 heures dans des récipients en PFA pour procéder à la mise en solution ou minéralisation. Ensuite a eu lieu l'étape de séparation chimique sur colonne échangeuse d'ions (type AG-MP 1) pour obtenir l'élément à mesurer purifié comme expliqué ci dessous. Mesure du rapport isotopique La mesure d'un rapport isotopique dans un échantillon par spectrométrie de masse à source plasma et à multicollection (MC-ICP-MS) nécessite des étapes préalables de minéralisation, d'extraction et de 13 3009091 purification des éléments d'intérêt, faute que quoi de nombreuses interférences et effets de matrice rendraient l'analyse impossible. Pour cela, une première étape de préparation chimique a été réalisée dans une salle blanche par chromatographie sur résine échangeuse d'ion à la 5 suite d'une minéralisation. Les protocoles de séparation ont été réalisés dans une salle en légère surpression et sous atmosphère filtrée afin d'éviter la contamination des échantillons par les poussières du milieu extérieur. Pour préparer les échantillons de sérum, le protocole de séparation des éléments a été réalisé comme décrit par Maréchal et al., 1999, Chemical Geology, 156, 10 251-273. Les rapports isotopiques ont été calculés dans les échantillons (à tester et de référence) à l'aide de la formule I décrite ci-dessus. Mesure des marqueurs ACE, CA19.9, CA15.3 Ces marqueurs ont été mesurés en dosage immunologique selon la 15 technique LOCI sur un appareil Siemens VISTA, en suivant les prescriptions du constructeur. Analyse des données Les données ont été reportées sur les figures avec une barre d'erreur correspondant à deux écart-types sur le standard analysé pendant toute une 20 session de mesure. Celui-ci est analysé avant et après chaque échantillon à comparer pour faire le calcul, c'est-à-dire avant et après l'échantillon à tester et avant et après l'échantillon de référence. RESULTATS Exemple 1 : étude de la mesure isotopique du cuivre chez des 25 patients atteints d'un cancer du côlon Trois patients atteints d'un cancer du côlon ont été suivis pendant leur prise en charge et le rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 a été mesuré sur les échantillons disponibles comme indiqué ci-dessus. D'autres marqueurs (ACE et CA19.9) utilisés habituellement pour le suivi des patients atteints de 30 ce type de cancer ont également été mesurés. Les résultats des mesures réalisées au cours du suivi de ces trois patients sont regroupés dans les figures 1 à 3 : 14 3009091 Patient 1-côlon Un cancer du côlon (adénocarcinome de type Lieberkuhnien) a été détecté en janvier 2008 et suivi d'une colectomie droite avec anastomose laparoscopique puis d'une chimiothérapie de type FOLFOX 4. 5 Le 20 février 2011, le rapport dCu a chuté mais le dosage ACE reste faible donc négatif alors que l'état du patient s'est fortement dégradé avec une évolution méta-hépatique nécessitant la mise en place d'une chimiothérapie de type FOLFIRI-AVAS i IN. Les valeurs du dosage ACE sont restées négatives ( REVENDICATIONS1 - Procédé de pronostic d'un cancer chez un sujet, consistant notamment à déterminer l'évolution du cancer et/ou l'efficacité d'un traitement dans le cadre du suivi de l'état du patient, comprenant les étapes suivantes : - mesurer le rapport isotopique entre deux isotopes stables d'un élément chimique dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet, - comparer ce rapport isotopique à celui mesuré dans un échantillon de référence, - conclure sur le pronostic dudit cancer chez ledit sujet en fonction de la variation du rapport isotopique. 2 - Procédé de pronostic d'un cancer chez un sujet selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport isotopique mesuré est un rapport entre un 15 isotope 1 et un isotope 2 pour lequel la masse de l'isotope 1 est supérieure à celle de l'isotope 2. 3 - Procédé de pronostic d'un cancer chez un sujet selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le rapport isotopique qui est mesuré est rapporté à la valeur d'un standard ou étalon isotopique de 20 l'élément chimique choisi. 4 - Procédé de pronostic d'un cancer chez un sujet selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le rapport isotopique est mesuré à l'aide de la formule I suivante : 25 d EL (%o) = 1 (isotope de masse plus élevée/isotope de masse plus faible) Eus ou REF (isotope de masse plus élevée/isotope de masse plus faible) STD - X 1000 dans laquelle : EL représente l'élément chimique duquel on souhaite mesure te rapport isotopique ECH représente l'échantillon biologique à testerREF représente l'échantillon de référence STD représente le standard ou étalon isotopique de l'élément chimique EL choisi. - Procédé de pronostic selon l'une quelconque des revendications 5 précédentes, caractérisé en ce que le rapport isotopique des deux isotopes stables est mesuré par spectrométrie de masse à source plasma et à multicollection ou MC-ICP-MS. 6 - Procédé de pronostic selon les revendications 4 et 5, caractérisé en ce qu'une variation d'au moins 0,10 permet de conclure sur le pronostic du cancer dont est atteint le sujet. 7 - Procédé de pronostic selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élément chimique dont le rapport isotopique est mesuré est un élément métallique, de préférence un métal de transition. 8 - Procédé de pronostic selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'élément métallique est un métal de transition choisi parmi le cuivre et le zinc, de préférence le cuivre. 9 - Procédé de pronostic selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique à tester est choisi parmi les tissus ou les cellules isolées à partir de ces tissus, les fluides ou sécrétions biologiques tels que l'urine, le sang total, le plasma, le sérum, ou les cellules isolées à partir de ces fluides ou sécrétions. 10 - Procédé de pronostic selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique à tester est constitué d'une ou de plusieurs protéines qui contient un ou plusieurs ions dudit élément chimique comme groupe(s) prosthétique) ou une ou plusieurs enzymes qui utilisent ledit élément chimique comme co-facteur catalytique. 11 - Procédé de pronostic selon l'une quelconque des revendications 30 précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon de référence est un échantillon biologique issu du même dit sujet à tester lors d'un prélèvement antérieur.12 - Procédé de pronostic selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pronostic dudit cancer chez ledit sujet est défavorable lorsqu'une diminution de ce rapport isotopique est mise en évidence par rapport à celui mesuré dans l'échantillon de référence, et favorable lorsqu'une augmentation de ce rapport isotopique est mise en évidence par rapport à celui mesuré dans l'échantillon de référence, si le rapport isotopique mesuré est un rapport entre un isotope 1 et un isotope 2 pour lequel la masse de l'isotope 1 est supérieure à celle de l'isotope 2, étant entendu que lorsque l'échantillon à tester est un fluide ou une sécrétion biologique. 13 - Utilisation de la mesure/de l'étude des variations isotopiques d'isotopes stables d'un élément chimique comme marqueur pronostic d'un cancer. 14 - Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que la mesure des variations isotopiques consiste à mesurer la variation du rapport isotopique entre deux isotopes stables d'un élément chimique mesuré dans un échantillon biologique issu d'un sujet atteint d'un cancer pour lequel on souhaite établir un pronostic par rapport au même rapport isotopique mesuré dans un échantillon de référence.