Brevet FR3005743A1 — publié le 20141121

PROCÉDÉ DE DIAGNOSTIC DE LA CIVD DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique et à un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique. La présente invention se rapporte également à un procédé de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique. La présente invention se rapporte notamment à un procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique. La présente invention trouve une application notamment dans le domaine médical et vétérinaire. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. État de la technique Le choc septique est un syndrome caractérisé par une réaction inflammatoire de l'hôte en réponse à un agent pathogène responsable d'une hypotension résistante à l'expansion volémique et nécessitant l'introduction de vasopresseurs (noradrénaline) et s'accompagnant de défaillances viscérales. La coagulation est activée de manière constante au cours du choc septique et participe à la défense de l'hôte. Toutefois, cette activation peut être « dérégulée » avec une thrombopénie et une consommation des facteurs de la coagulation et des inhibiteurs se traduisant par des microthromboses et responsable d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Cet état procoagulant est lié à une activation cellulaire intense via l'induction de cytokines pro-inflammatoires et à des modifications phénotypiques de l'endothélium vasculaire, qui prend alors un caractère pro-adhésif, pro-inflammatoire et pro-thrombotique L'association entre CIVD, gravité et défaillance multiviscérale est connue de longue date, motivant l'utilisation de traitements anticoagulants au cours du choc septique en plus des traitements étiologiques et des défaillances d'organes. Toutefois, les études cliniques portant sur des traitements ayant un impact sur la coagulation - qui n'ont jamais ciblé spécifiquement les patients présentant une CIVD - se sont révélées décevantes car ne permettant pas d'améliorer le pronostic des patients. Toutefois, l'analyse en sous-groupes, a permis de mettre en évidence une amélioration des patients traités ayant présenté une CIVD. Les données actuelles de la littérature montrent qu'un choc 15 septique est accompagné par une intense activation cellulaire inflammatoire, à l'origine d'un remodelage de la membrane plasmique de la cellule. De façon caractéristique, la membrane la phosphatidylsérine (PhtdSer) est transloquée du feuillet interne dans le feuillet externe de la bicouche tandis que le cytosquelette est clivé et n'est plus capable de 2 0 contrebalancer les tensions membranaires dues à cette translocation. L'ensemble aboutit à la libération de microparticules dans l'espace vasculaire. L'exposition de PhtdSer est une caractéristique commune aux microparticules. La détection de la PhtdSer permet d'accéder à la mesure de la quantité totale des microparticules quelque soit leur origine cellulaire. 25 Toute cellule est capable d'émettre des microparticules. Dans le vaisseau, les microparticules constituent un pool de biomarqueurs et de bioeffecteurs circulants capables de moduler de nombreuses fonctions vasculaires dont la réponse procoagulante et la vasomotricité. Elles véhiculent un signal biologique propre aux conditions de leur émission par 30 la cellule parentale. De plus, leurs caractéristiques membranaires leur confèrent des propriétés généralement procoagulantes, pro-inflammatoires et pro-apoptotiques, mais aussi pro-fibrinolytiques. Ainsi, selon le contexte physiopathologique, les microparticules peuvent s'avérer bénéfiques ou délétères pour l'organisme. Chez l'homme, en dehors de toute situation pathologique, les microparticules sont détectables à de faibles concentrations dans le sang et dans les fluides biologiques et témoignent de l'homéostasie cellulaire des tissus. Des taux élevés de microparticules circulantes sont rapportés dans de nombreux états pathologiques thrombotiques, inflammatoires, traumatiques, dégénératifs ou cancéreux. Dans le compartiment vasculaire, la source principale de microparticules serait la plaquette mais les variations de microparticules d'autres sources cellulaires peuvent être spécifiquement associées à certaines pathologies comme le rejet de greffe cardiaque ou l'hypertension artérielle pulmonaire. Au cours du choc septique, la génération de microparticules d'origines endothéliale, plaquettaire et monocytaire, mais aussi érythrocytaire ou granulocytaire est rapportée. Dans ce contexte particulier, leurs propriétés pro-inflammatoires et pro-apoptotiques favoriseraient la survenue d'un syndrome de défaillance multiviscérale. Chez le rat, il a été démontré que les microparticules pourraient ainsi promouvoir l'importante vasoplégie observée au cours du choc septique, participer à la modulation du statut oxydant ou encore, contribuer à un statut procoagulant. Les infections graves, comme le choc septique, sont caractérisées par une activation de la coagulation avec globalement un état procoagulant et antifibrinolytique. Au cours du sepsis, les processus hémostatiques sont cependant nécessaires à la défense de l'hôte contre l'agent pathogène et seule une production excessive de thrombine peut mener à la dysfonction viscérale. L'activation des réactions de coagulation puis de fibrinolyse au cours du sepsis permet de limiter la croissance et la dissémination de l'agent pathogène, constituant ainsi un mécanisme de défense au même titre que l'immunité innée ou l'activation du complément. Les microparticules qui augmentent la surface d'interaction avec les éléments circulants ont alors un effet bénéfique. Elles favorisent ainsi les interactions récepteurs/ligands et le recrutement des cellules (plaquettes, monocytes, neutrophiles) au site initial de la lésion vasculaire et de la réaction inflammatoire locale. Dans la coagulopathie du choc septique, le Facteur Tissulaire (FT) porté par les microparticules monocytaires constituerait une deuxième entité procoagulante portée par les microparticules. En effet, il joue un rôle clé dans l'initiation et la propagation de la cascade de la coagulation. Il a été montré que les microparticules monocytaires participent à la dissémination d'un potentiel procoagulant en exprimant le FT à leur surface. La génération de thrombine est possible à la surface des microparticules exposant le FT (MP-FT+) de façon indépendante des réactions de la coagulation dites de la phase contact qui nécessitent la présence de facteur FXII. Les propriétés procoagulantes des MP-FT+ ont été rapportées dans l'infection au méningocoque mais aussi après injection de LPS chez des individus sains. Dans ce dernier cas, une augmentation forte et transitoire des concentrations en MP-TF+ est observée 3-4 heures après l'injection. Elle s'accompagne d'une monocytopénie transitoire, ce qui suggère que ces microparticules constitueraient alors le support principal de la réponse procoagulante dépendante du Facteur Tissulaire et donc de la génération de thrombine. Le diagnostic de CIVD est difficile sur le plan biologique. En particulier, il n'existe pas à ce jour de « définition biologique » consensuelle de la CIVD. Deux tests basés sur l'élaboration de scores combinant la mesure de différentes variables biologiques ont été proposés. Le premier décrit en 2001 émane de l'International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH), le second de la Japanese Association for Acute Medicine (JAAM) en 2005 et revu en 2006. Le score de l'ISTH est basé sur la présence d'une thrombopénie sévère, d'une diminution du taux de prothrombine (allongement du temps de Quick), d'une consommation du fibrinogène et d'une élévation des D-dimères, marqueurs de la fibrinolyse. Il permet de diagnostiquer les CIVD survenant au cours des pathologies néoplasiques, des traumatismes, des pathologies obstétricales mais apparait déficient au cours du choc septique en raison de l'importance du syndrome inflammatoire qui s'accompagne d'une thrombocytose, d'une élévation du fibrinogène et de la présence de D-dimères. Le Score ISTH s'avère donc peu à-même de permettre une détection de CIVD lors d'un choc septique. Le score JAAM a été développé afin de détecter la CIVD lors de choc septique, et ne retient pas le fibrinogène comme critère diagnostic tout en utilisant des valeurs seuil plus « cohérentes » pour les D-dimères et les plaquettes dans le cadre d'un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS). De nouvelles discussions au niveau du comité CIVD de l'ISTH ont été conduites pour décliner l'entité « CIVD » en coagulopathies obstétricales, traumatiques, septiques ou oncologiques afin de mieux définir les paramètres et valeurs seuils du score ISTH. En pratique, l'usage des scores précités nécessite une mise en oeuvre spécifique, à partir d'échantillons particuliers. En outre, il n'existe pas actuellement de procédé permettant de détecter de manière sure et systématique une coagulation intravasculaire disséminée. Il n'existe pas non plus de procédé et/ou de moyen permettant de prédire la survenue, par exemple à partir d'un échantillon biologique, d'une coagulation intravasculaire disséminée. De plus, il n'existe pas dans l'état de la technique de procédé permettant de déterminer chez un individu présentant un choc septique si celui-ci va déclencher/présenter dans un futur proche une coagulation intravasculaire disséminée. Il existe donc un réel besoin de trouver un procédé et/ou un moyen palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé rapide et efficace permettant de détecter la CIVD réduire les coûts et d'améliorer ainsi le pronostique vital des individus. Description de l'invention La présente invention a pour but de surmonter les inconvénients de l'art antérieur en fournissant un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant une mesure de la concentration d'un marqueur biologique. En particulier, les inventeurs de la présente invention montrent que le procédé de l'invention permet de déterminer la présence d'une CIVD chez un individu présentant un choc septique et/ou d'identifier un individu susceptible de développer une CIVD. Dans la présente par « marqueur biologique » on entend au moins un marqueur biologique choisi dans le groupe comprenant les microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation CD31, les microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation CD105, la E-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble, le facteur V circulant et la P-Sélectine soluble. Selon l'invention par « microparticules membranaires », on entend les microparticules membranaires libérées, par exemple dans l'espace vasculaire à partir de cellules, par exemple des cellules endothéliales, des plaquettes, des monocytes, des granulocytes ou polynucléaires (neutrophiles, éosinophiles ou basophiles) ou de leurs précurseurs circulants, des cellules érythrocytaires, des lymphocytes ou d'origine non vasculaire. Par exemple, les microparticules membranaires peuvent avoir une taille, c'est-à-dire un diamètre individuel, compris entre 50 nm et 1 pm et peuvent s'associer en agrégats avec des cellules circulantes notamment les polynucléaires. Par exemple, les microparticules membranaires peuvent porter une activité facteur tissulaire ou une activité fibrinolytique. Dans la présente par « échantillon biologique » on entend tout échantillon obtenu à partir de mammifères, par exemple un mammifère choisi dans le groupe comprenant l'ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea. Il peut s'agir par exemple d'un humain ou d'un animal. Il peut s'agir par exemple d'un animal d'élevage, d'un animal de compagnie, d'un animal en voie de disparition ou de tout autre animal, y compris manipulé génétiquement. Selon l'invention, l'échantillon biologique peut être un échantillon de sang, de plasma, de sérum, de liquide bronchiolo-alvéolaire. Selon l'invention, l'échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique ou un risque de choc septique. Selon l'invention la mesure de la concentration du marqueur biologique choisi peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Par exemple, la mesure de la concentration de microparticules membranaires porteuse de Cluster de Différenciation peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basée sur la reconnaissance de sondes fluorescentes, par exemple des anticorps marqués, des sondes protéiques ou lipidiques, fixées ou non sur des billes, voire des sondes reconnaissant le matériel génétique inclus dans les microparticules comme les miRNA. Les sondes peuvent aussi être spécifique de la PhosphatidylSérine (PhtdSer) par exemple l'annexine 5 ou tout autre dérivé d'annexine obtenu par génie moléculaire, par exemple les diannexines. Les sondes peuvent également, par exemple, reconnaitre des lipides de la membrane et leurs degrés de compaction, par exemple des sondes lipidiques à chaînes carbonées plus ou moins longues. Les sondes protéiques peuvent être par exemple des anticorps détectant les clusters de différentiation à la surface des microparticules ou détectant toute autre protéine ou enzyme hébergée à la surface des microparticules ou dans la microparticule comme les métalloprotéinases, les récepteurs de protéines à activités enzymatiques, par exemple le facteur tissulaire ou uPar les cytokines et interleukines. La mesure de la concentration des microparticules peut également être réalisée par dosage quantitatif des lipides totaux ou des protéines totales. La mesure de la concentration de microparticules membranaire peut être également réalisée, par exemple, via un test prothrombinase tel que décrit dans Hugel B, Zobairi F, Freyssinet JM. Measuring circulating cell-derived microparticles. J Thromb Haemost. 2004 Oct;2(10):1846-7 [12]. Brièvement, dans ce procédé, les facteurs de coagulation du sang et la concentration de calcium sont déterminés en sorte que PhtdSer est le paramètre limitant dans la génération de thrombine soluble à partir de prothrombine exogène ajoutée dans le milieu réactionnel. Les résultats sont exprimés en équivalent PhtdSer nanomolaire (nM éq. PhtdSer) par référence à une courbe étalon établie avec des liposomes de composition connue et concentration tel que décrit dans Hugel B, Zobairi F, Freyssinet JM. « Measuring circulating cell- derived microparticles » J Thromb Haemost. 2004 Oct;2(10):1846-7 [12]. La mesure de la concentration des microparticules peut également être réalisée, par exemple, par mesure de l'activité facteur tissulaire. Brièvement le procédé utilise des facteurs de la coagulation spécifiques du complexe dit Tenase et de dose la formation de facteur Xa à partir de facteur X ajouté dans le milieu réactionnel tel que décrit dans Aupeix K, Hugel B, Martin T, et al. « The significance of shed membrane particles during programmed cell death in vitro, and in vivo, in HIV-1 infection. » J Clin Invest 1997; 99(7): 1546-54. [13]. L'activité portée par les MP-FT+ est rapportée à une courbe étalon de concentration connue en facteur tissulaire. La concentration obtenue est exprimé en Moles par litre d'activité facteur tissulaire. La mesure de la concentration de marqueurs biologiques solubles, par exemple la E-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble, le facteur V et/ou la P-Sélectine soluble, peut être réalisée via un procédé immunologique, par exemple un procédé ELISA, par exemple après insolubilisation sur plaque multipuits, ou en utilisant des billes recouvertes d'anticorps pour un dosage par cytométrie en flux tels que décrits par Fu Q, Zhu J, Van Eyk JE. « Comparison of multiplex immunoassay platforms ». Clin Chem. 2010 Feb;56 (2) : 314-8 [6] et/ou tout procédé connue de l'homme du métier adapté à la mesure de la concentration de marqueurs biologiques. Par exemple, pour la E-Sélectine soluble la mesure de la concentration peut être réalisée par un procédé immunologique, par exemple il peut s'agir du procédé décrit dans le document Lobb RR, Chi- Rosso G, Leone DR, Rosa MD, Bixler S, Newman BM, Luhowskyj S, Benjamin CD, Dougas IG, Goelz SE, et al. « Expression and functional characterization of a soluble form of endothelial-leukocyte adhesion molecule 1 » J Immunol. 1991;147:124-9 [6] ou Okajima K, Harada N, Sakurai G, Soga Y, Suga H, Terada T, et al. « Rapid assay for plasma soluble E-selectin predicts the development of acute respiratory distress syndrome in patients with systemic inflammatory response syndrome» Transi Res. 2006 Dec; 148 (6):295-300 [4]. Par exemple, pour la P-Selectine la mesure de la concentration peut être réalisée par un procédé immunologique, par exemple il peut s'agir du procédé décrit dans le document Dunlop LC, Skinner MP, Bendall LJ, Favaloro EJ, Castaldi PA, Gorman JJ, Gamble JR, Vadas MA, Berndt MC. « Characterization of GMP-140 (P-selectin) as a circulating plasma protein» J Exp Med. 1992; 175: 1147-50. [7] ou Thom J, Gilmore G, Yi Q, Hankey GJ, Eikelboom JW. « Measurement of soluble P-selectin and soluble CD40 ligand in serum and plasma. » J Thromb Haemost. 2004 Nov;2(11):2067-9. [8] Par exemple, pour la glycoprotéine V soluble la mesure de la concentration peut être réalisée par un procédé immunologique, par exemple il peut s'agir d'un procédé Elisa, il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document de Azorsa DO, Moog S, Ravanat C, Schuhler S, Follea G, Cazenave JP, et al. « Measurement of GPV released by activated platelets using a sensitive immunocapture ELISA--its use to follow platelet storage in transfusion. » Thromb Haemost. 1999;81(1):131-8 [9]. Par exemple, pour le facteur V la mesure de la concentration peut être réalisée par un procédé immunologique, par exemple un procédé immunologique de type ELISA, par un test de coagulation permettant par exemple, la mesure de l'activité procoagulante par exemple réalisée par méthode chronométrique sur plasma décalcifié selon la méthode de détermination du temps de Quick (adjonction de thromboplastine et de plasma déficient en facteur V et mesure du temps de coagulation après adjonction de calcium. L'apport de plasma déficient en facteur V rend le temps uniquement du taux de facteur V apporté par le plasma à étudier. Le résultat est exprimé en pourcentage (%) par rapport à une courbe de référence obtenue par dilution d'un pool de plasmas témoins. La mesure du temps de coagulation peut être magnétique (oscillation d'une bille) ou par mesure de la densité optique. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document QUICK AJ. « The assay and properties of labile factor (factor V). » J Clin Pathol 1960;13:457-62 [10], ou par un procédé enzymologique, il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document Tilley D, Levit I, Samis JA. « Measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay. » J Vis Exp. 2012(67) [11]. En particulier, la présente invention à pour objet un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) comprenant une mesure à partir d'un premier échantillon biologique de la concentration RMCD105 de microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation 105 (CD105). Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection peut comprendre en outre une étape de comparaison de la concentration RMCD105 mesurée avec une valeur de référence RCD105. Selon l'invention la valeur de référence RCD105 peut être la valeur de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD105 mesurée chez un sujet sain ou la moyenne de la valeur de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence. Dans la présente par « sujet sain de référence », on entend un mammifère, par exemple un être humain ou un animal, n'ayant pas de pathologie aiguë ou chronique et/ou ne prenant pas de traitement médical. Selon l'invention, le groupe de « sujets sains de référence » peut être de même sexe et/ou de même âge que celui du mammifère à partir duquel est obtenu l'échantillon biologique. Avantageusement le groupe de « sujets sains de référence » est de même sexe et de même âge que celui du mammifère à partir duquel est obtenu l'échantillon biologique Selon l'invention par « groupe de sujets de référence » on entend un groupe permettant de définir un intervalle de référence fiable. Il peut s'agir par exemple d'un groupe comprenant au moins 20 sujets de référence tel que définis ci-dessus, par exemple un groupe comprenant de 40 à 200 sujets de référence. Selon l'invention, la valeur de référence RCD105 est une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC obtenue à partir d'analyse statique de valeurs obtenues à partir d'un groupe de sujets de référence présentant un choc septique Selon l'invention, la valeur de référence RCD105 peut être une valeur comprise dans un intervalle de référence IRcD105 qui peut être les valeurs de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD105 mesurée chez 90% d'un groupe de sujets sains de référence. Selon l'invention la valeur de référence RCD105 peut être une concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation 5 supérieure à 1,0 nM équivalent PhosphatidylSérine (eq PhtdSer), avantageusement supérieure à 1,3nM eq PhtdSer. Avantageusement, les inventeurs ont montré qu'une valeur RMCD105 supérieure à la valeur de référence RCD105 indique une CIVD. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont 10 montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration RMCD105 permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 67,5 % et une spécificité supérieure ou égale à 84,6 % Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de 15 la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration Rrrluni de microparticules membranaires porteuses du le cluster de différenciation 31 (CD31). Selon l'invention, le second échantillon biologique est un 20 échantillon biologique tel que défini ci-dessus. Selon l'invention, le second échantillon biologique peut être identique ou différent du premier échantillon biologique. Selon l'invention, les premier et second échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. 25 Selon l'invention, le premier et/ou le second échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison de la concentration Rrncini mesurée avec une valeur de référence Rc031. 30 Selon l'invention la valeur de référence RCD31 peut être la valeur de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD31 mesurée chez un sujet sain ou la moyenne de la valeur de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence. Selon l'invention, la valeur de référence RCD31 peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC. Selon l'invention la valeur de référence RCD31 peut être une concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation inférieure à 1,5 nM équivalent PhtdSer, avantageusement inférieure à 1,4035 nM eq PhtdSer. Avantageusement, les inventeurs ont montré qu'une valeur Rrrluni inférieure à la valeur de référence RCD31 indique une CIVD. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration Rrrluni permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 80,0 % et une spécificité supérieure ou égale à 38,5 %. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont également montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration de la RMCD105 et de la RMCD31 permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 67,5 et une spécificité supérieure ou égale à 84,6. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de mesure dans un troisième échantillon biologique de la concentration d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant l'E-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble et la P-Sélectine soluble. Selon l'invention, le troisième échantillon biologique est un échantillon biologique tel que défini ci-dessus. Selon l'invention les premier, second et troisième échantillons biologiques peuvent être indépendamment identiques ou différents les uns des autres. Selon l'invention, les premier, second et troisième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, les premier, second et troisième échantillons biologiques peuvent indépendamment provenir d'un mammifère présentant un choc septique. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de mesure, dans un quatrième échantillon biologique, de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD11a, de la numération des leucocytes et du calcul du rapport RCD11/Ieu de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD11a sur la numération en leucocytes. Selon l'invention, le quatrième échantillon biologique est un échantillon biologique tel que défini ci-dessus. Selon l'invention les premier, second, troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent être indépendamment identiques ou différents les uns des autres. Selon l'invention, les premier, second, troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, les premier, second, troisième et quatrième échantillons biologiques peuvent indépendamment provenir d'un mammifère présentant un choc septique. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection peut comprendre en outre une étape de comparaison du rapport RCD11/Ieu calculée avec une valeur de référence ROCD11 /leu- Selon l'invention, la valeur de référence ROCD11/Ieu peut être la valeur du rapport de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD11a divisée par la numération en leucocyte mesuré chez un sujet sain de référence ou la moyenne de la valeur du 3 0 rapport mesurée chez un groupe de sujets sains de référence. Selon l'invention, la valeur de référence ROCD11/Ieu peut être une valeur supérieure à 0,45nM/G La mesure de la concentration de leucocytes peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé d'analyse en cytométrie en flux sur automate, par exemple avec l'automate ADVIA 2120 commercialisé par la société Siemens. Les inventeurs de la présente invention ont également montré de manière surprenante et inattendue que les marqueurs biologiques précités évoluent en fonction du temps sur l'individu d'où provient l'échantillon. En outre, les inventeurs ont démontré de manière surprenante qu'il est possible de prévoir l'évolution/la survenue d'une CIVD. Aussi, la présente invention a pour objet un procédé de prédiction et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) et de la concentration R0CD31 de microparticules membranaire portant le cluster de différenciation 31 (CD31) b. comparaison de la valeur mesurée R0CD105 avec une valeur de référence RCD105 c. comparaison de la valeur mesurée ROCD31 avec une valeur de référence RCD31 d. Affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieure à la valeur Rc0105 ou d'une valeur VcD105 égale à 0 si R0c0105 est inférieure à la valeur RCD105 e. Affectation d'une valeur VCD31 égale à 1 si ROCD31 est inférieure à la valeur RCD31 ou d'une valeur VCD31 égale à 0 si R0CD31 est supérieure à la valeur RCD31 f. Calcul du score S selon la formule suivante : 3005 743 16 S= E VCD1 05 X a+ VCD31 X 13 dans laquelle E est une valeur comprise entre -4,035 et -1,094, a est une valeur comprise entre 1,638 et 4,066 13 est une valeur comprise entre 0,193 et 3,138 5 dans lequel une valeur de S supérieure à 0,2892 indiquant une CIVD et/ou l'apparition d'une CIVD. En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés avec le devenir du mammifère dont il provient. Avantageusement selon l'invention, E peut être égal à -2,565. 10 Avantageusement selon l'invention, a peut être égal à 2,852. Avantageusement selon l'invention, R peut être égal à 1,665. Ainsi, selon l'invention, le score S peut être de formule suivante : S = -2,565 + VCD1 05 X 2,852 + VCD31 x 1,665. 15 En outre, les inventeurs ont montré que lorsque la valeur de S est supérieure à 0,2892 le procédé permet avantageusement une prédiction avec une sensibilité supérieure ou égale à 67,5 et une spécificité supérieure ou égale à 84,6. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de suivi de 20 l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre les étapes suivantes : b'. mesure de la concentration RoFv du facteur V; c'. comparaison de la valeur mesurée RoFv avec une valeur de référence RFV 25 d'. affectation d'une valeur VFV égale 1 si RoFv est supérieure à la valeur RFv ou d'une valeur VFV égale 0 si RoFv est inférieure à la valeur RFv f'. Calcul du score S' selon la formule suivante : S'= -4,259 + VCD105 x 3,246 + VCD31 x 2,1776 + VFV x 2,1059 dans lequel une valeur de S' supérieure à 0,2663 indiquant une CIVD et/ou 30 l'apparition d'une CIVD. 3005 743 17 Selon l'invention, la valeur de référence RFV peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC obtenu à partir d'analyse statique de valeurs obtenues à partir d'un groupe de sujets de référence 5 En outre, les inventeurs ont montré avantageusement que lorsque la valeur de S' est supérieure à 0,2663 le procédé permet avantageusement une prédiction avec une sensibilité supérieure ou égale à 87,5 et une spécificité supérieure ou égale à 71,1. Les inventeurs de la présente invention ont également montré 10 de manière surprenante et inattendue que les marqueurs biologiques précités évoluent en fonction du temps et de l'application d'un traitement sur l'individu d'où provient l'échantillon. Aussi, la présente invention à pour objet un procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique 15 comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) avant ledit traitement ; b. mesure de la concentration R1CD105 de microparticules 20 membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), après ledit traitement ; et c. détermination du rapport SCD105 selon la formule suivante SCD105 = (Ricoio5/ Rocoio5) 25 une valeur de SCD105 supérieure ou égale à 1 indiquant l'évolution de la CIVD. Avantageusement, les inventeurs ont montré que lorsque que la valeur de SCD105 est supérieure ou égale à 1, le traitement peut être qualifié d'efficace. Selon l'invention le procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre : - à l'étape a) la mesure de la concentration d'au moins un marqueur biologique choisi parmi la concentration R0c031 de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 31 (CD31), la concentration en l'E-Selectine soluble, la concentration en glycoprotéine V soluble et/ou la concentration en P-sélectine soluble, et - à l'étape b) la mesure de la concentration d'au moins un marqueur biologique choisi parmi la concentration R1c031 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 31 (CD31), la concentration en l'E-Sélectine soluble, la concentration en glycoprotéine V soluble et/ou la concentration en P-sélectine soluble après le traitement. La présente invention a également pour objet un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105). Selon l'invention par moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la détection des microparticules qui portent CD105. Il peut s'agir par exemple des molécules choisies dans le groupe comprenant des anticorps, des sondes lipidiques, synthétiques ou naturelles incluant les annexines et leurs dérivés synthétiques, insolubilisés ou non sur tout type de support, des ligands peptidiques ou protéiques, des enzymes et substrats chromogéniques et des matériaux fonctionnalisés pour l'insolubilisation ou la capture des microparticules. Il peut s'agir par exemple de plaques StreptaWell High Bind (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, réf. : 11 989 685 001) recouvertes de streptavidine, des anticorps IgG1-Bi (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. 1128), des anticorps IgG2a-Bi (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. 1129), des anticorps anti-CD105 humain: Anti human CD105-Bi (R&D systems, Mineapolis, USA, réf. MAB10972), des anticorps anti-CD31 humain: iMouse Anti human CD31-Bi (Caltag, Burlingam, USA, réf. MHCD3115-4 PPACK (Merck, Darmstadt, Germany), Dns-GGACK (Merck, Darmstadt, Germany), Vésicules synthétiques PS/PC 33/67 (Avanti Polar), CaCl2 (Sigma, St Louis, Missouri, USA), facteur humain Va ("Human Factor Va") (référence : 405, American Diagnostica, Stamfort, USA), facteur humain Xa ("Human Factor Xa") (référence : EZ007B, Biogenic, Perols, France), Prothrombine humaine ("Human Prothrombin") (référence PPOO6C, Hyphen BioMed, Neuville sur Oise, France), pNAPEP0216 (référence : 61 01 0216, Cryopep, Montpellier, France) La présente invention a également pour objet un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 31 (CD31). Selon l'invention par moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires portant le cluster de différenciation 31 (CD31) on entend on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la détection des microparticules combiné avec la détection de CD31 ou des éléments de contrôlant l'expression de CD31, par exemple les ARNs et/ou les protéines, par exemple des molécules choisies dans le groupe comprenant des anticorps, des sondes lipidiques, synthétiques ou naturelles incluant les annexines et leurs dérivés synthétiques ou non, insolubilisés ou non sur tout type de support, des ligands peptidiques ou protéiques, des enzymes et des substrats chromogéniques, des activités enzymatiques catalysées par des protéines comme l'activité facteur tissulaire. Il peut s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basée sur la reconnaissance de sondes fluorescentes, par exemple des anticorps marqués ou des sondes protéiques, fixés ou non sur des billes. Les sondes protéiques peuvent être par exemple des anticorps détectant le cluster de différentiation CD31 à la surface des microparticules ou toute autre protéine ou enzyme hébergée à la surface des microparticules ou dans la microparticule en relation avec l'exposition de CD31. Il peut également s'agir d'une détection par ELISA des microparticules porteuses de CD31. Les sondes protéiques peuvent être combinées à des sondes lipidiques qui reconnaissent la PhtdSer ou encore les lipides de la membrane des microparticules et leur degré de compaction. La présente invention a également pour objet un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) et/ou des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 31 (CD31). Selon l'invention par moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires portant le cluster de différenciation 105 2 0 (CD105) on entend on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la détection des microparticules combiné avec la détection de CD105 ou des éléments de contrôlant l'expression de CD105, par exemple les ARNs, les protéines, par exemple des molécules choisies dans le groupe comprenant des anticorps, des sondes lipidiques, synthétiques ou 25 naturelles incluant les annexines et leurs dérivés synthétiques ou non, insolubilisés ou non sur tout type de support, des ligands peptidiques ou protéiques, des enzymes et des substrats chromogéniques, des protéines portant une activité biologique propre ou capables d'en acquérir une par interaction avec le milieu environnant choisie parmi le sang, plasma, 30 sérum, liquide bronchoalvéolaire et/ou le tissu vasculaire, des activités enzymatiques catalysées par des protéines comme l'activité facteur tissulaire. Il peut s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basée sur la reconnaissance de sondes fluorescentes, par exemple des anticorps marqués ou des sondes protéiques, fixés ou non sur des billes. Les sondes protéiques peuvent être par exemple des anticorps détectant le cluster de différentiation CD105 à la surface des microparticules ou toute autre protéine ou enzyme hébergée à la surface des microparticules ou dans la microparticule en relation avec l'exposition de CD105. Il peut également s'agir d'une détection par ELISA des microparticules porteuses de CD105. Les sondes protéiques peuvent être combinées à des sondes lipidiques qui reconnaissent la PhtdSer ou encore les lipides de la membrane des microparticules et leur degré de compaction. La présente invention a également pour objet un kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant en outre des moyens de mesure d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant l'E-Selectine soluble, la glycoprotéine V soluble et la P-sélectine soluble. Selon l'invention par moyens de mesure d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant la E-Selectine soluble, la glycoprotéine V soluble et la P-sélectine soluble, on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la détection / mesure des dits marqueurs. Il peut s'agir par exemple des molécules choisies dans le groupe comprenant des anticorps, par exemple spécifique du fragment soluble de la Esélectine, du fragment soluble de la P-sélectine, du facteur V, des ligands peptidiques ou protéiques de ces fragments, par exemple des récepteurs par exemple le PSLG-1, fonctionnalisés ou non pour permettre leur insolubilisation ou leur détection. Il peut également s'agir de substrats et/ou d'activateurs du facteur V. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures - La figure 1 représente des diagrammes en bâton des résultats obtenus en fonction de la présence d'une CIVD (gris) ou pas de CIVD (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieures et inférieures les 25ème et 75ème percentiles et les barres en « T » les 10ème et 90ème percentiles). Les lignes en pointillés représentent les valeurs normales. L'ordonnée représente soit la concentration en plaquettes en G/L, le temps prothrombine en pourcent par rapport à une courbe étalon, la concentration en D-dimères en mg/L, la concentration en monomère de fibrine en mg/L, la concentration en fragments de prothrombine F1+2 en pmol/L ou la protéine C en pourcent par rapport à une courbe étalon. L'abscisse représente la condition et le jour de mesure : 1er (D1), Sème (D3) et 7ème (D7) jour. - La figure 2 A représente un diagramme en bâton de la concentration des microparticules membranaires en équivalents phosphatidylSérine (ordonnée) lors d'un choc septique (en gris) ou non (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieures et inférieures les 25ème et 75ème percentiles et les barres en « T » les 10ème et 90ème percentiles). Les résultats représentés sont la concentration totale de Microparticules mem branaires (PhtdSer-microparticules), des microparticules membranaires dérivées des plaquettes (GPIbmicroparticules), des microparticules membranaires dérivées des leucocytes (CD11a-microparticules) et des microparticules membranaires dérivées des cellules endothéliales (CD105-microparticules, CD31- microparticules and CD62E-microparticules). - La figure 2 B représente un diagramme en bâton de la concentration des microparticules membranaires en équivalents phosphatidylSérine (ordonnée) en fonction du temps lors d'une CIVD (en gris) ou non (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieure et inférieure les 25ème et 75ème percentiles et les barres en « T » les 10ème 3005 743 23 et 90ème percentiles). Les lignes en pointillées représentent les valeurs normales. Les analyses statistiques représentent les différences des mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps. 5 - La figure 3 A représente un diagramme en bâton de la concentration des microparticules membranaires dérivées des plaquettes (GPIb-microparticules) (ordonnée) avec une CIVD (en gris) ou non (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieure et inférieure les 25ème et 75ème percentiles et les barres en « T » les 10ème et 90ème 10 percentiles). - La figure 3 B représente un diagramme en bâton de la concentration du rapport de la concentration de la GPV soluble (sGPV) sur le nombre de plaquettes (ordonnée) avec une CIVD (en gris) ou non (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieures et 15 inférieures les 25ème et 75ème percentiles et les barres en « T » les 10ème et 90ème percentiles). La figure 4 représente des diagrammes en bâton des résultats obtenus en fonction de la présence d'une CIVD (gris) ou pas de CIVD (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieure et inférieure 20 les 25 ème et 75ème percentiles et les barres en « T » les 10ème et 90ème percentiles). Les lignes en pointillés représentent les valeurs normales. L'ordonnée représente soit la concentration des microparticules membranaires portant le CD105 en nM équivalent PhosphatidylSérine, la concentration des microparticules membranaires portant le CD31 en nM 25 équivalent PhosphatidylSérine, la concentration en E-sélectine soluble en pg/L, le rapport P-sélectine soluble / nombre de plaquettes en pg/G, la concentration en activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) ng/L ou la concentration en inhibiteur de l'activateur du plasminogène PAI-1. L'abscisse représente la condition et le jour de mesure : 1er (D1), Sème (D3) 30 et 7ème (D7). Les analyses statistiques représentent les différences des 3005 743 24 mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps. La figure 5 représente des diagrammes en bâton des résultats obtenus en fonction de la présence d'une CIVD (gris) ou pas de CIVD 5 (blanc) (la barre représente la médiane, les limites supérieures et inférieures les 25ème et 75ème percentiles et les barres en « T » les 10ème et 90ème percentiles). Les lignes en pointillés représentent les valeurs normales. L'ordonnée représente soit la concentration des leucocytes en G/L, du rapport microparticules membranaires portant le CD11a /le nombre 10 de leucocyte en nM/G, la concentration de l'interleukine 6 (IL-6) en ng/L, la concentration de l'interleukine 10 (IL-10) en ng/L, la concentration de facteur nécrosant de tumeur alpha (TNF-alpha) en ng/L, la concentration en protéine 1 Monocytaire Chimo-attractante (MCP-1) en ng/L. L'abscisse représente la condition et le jour de mesure : 1er (D1), 3ème (D3) et 7ème 15 (D7). Les analyses statistiques représentent les différences des mesures répétées entre les sujets avec une CIVD ou non en fonction du temps. La figure 6 représente une courbe ROC obtenue avec les marqueurs MP-CD105 et MP-CD31 avec en ordonnée la sensibilité et en abscisse la spécificité (100-spécificité). 20 EXEMPLES Exemple 1 : étude et procédé de détection de la CIVD 1. Matériel et méthodes : 25 Les patients : Cent patients adultes consécutifs (18 à 85 ans) atteints de choc septique ont été inclus de façon prospective après l'admission en unité de réanimation médicale (soins intensifs médicaux) de trois hôpitaux tertiaires et 92 patients ont été étudiés. Le comité d'éthique du Centre Hospitalier Universitaire de Strasbourg a approuvé cette étude (Comité de 30 Protection des Personnes Est-IV, Strasbourg). Le consentement éclairé a été obtenu auprès du patient ou, s'il n'était pas en mesure de consentir, 3 0 0 5 74 3 25 auprès de la famille au moment de l'admission, et confirmé par le patient dès que son état le permettait. Les soins ont été prodigués selon l'état de l'art et sans intervention thérapeutique spécifique. Les patients présentant une insuffisance cardiaque (classe NYHA IV) ou hépatique (Child-Plugg C) 5 au stade terminal, ou présentant des maladies cancéreuses évolutives ont été exclus. Six patients ont été exclus en raison d'une coagulation ou d'un volume insuffisant de plasma et deux patients présentant un âge supérieur à 85 ans et une insuffisance hépato-cellulaire Child C ont été exclus (tableau 1). 10 Le tableau 1 ci-dessous présente les caractéristiques des patients lors de leur admission. Total N=92 Pas de CIVD Valeur p CIVD N=52 Caractéristiques Sexe masculin 59 (64,1) 33 (63,5) 26 (65,0) 0,97 N (%) Age 61,5 (15,0) 62,3 (14,4) 60,5 (15,9) 0,58 SAPS II 57,5(18,1) 51,9 14,3 64,9 20,0 Les réactifs en fonction du marqueur et des procédés utilisés sont indiqués dans le tableau 2 suivant Tableau 2. Références des réactifs utilisés Méthode Référence Fournisseur PT Chronométrique STA-NEOPLASTINE Cl 10 Stago FV Chronométrique STA-DEFICIENT V Stago TCA Chronométrique STA-PTT AUTOMATE 5 Stago Fg Chronométrique STA-FIBRINOGEN 5 Stago AT Chromogénique STA-STACHROM AT III 6 Stago PC Chromogénique STA-STACH ROM Stago PROTEIN C D-Di Immuno-turbidimétrique STA-LIATEST D Dl Stago 3005 743 28 FM Immuno-turbidimétrique STA-LIATEST FM Stago F1+2 ELISA Enzygnost® F 1+2 Siemens sGPV ELISA Asserachrom sGPV Stago La numération des plaquettes et des leucocytes a été obtenue par un procédé d'analyse en cytométrie en flux sur automates de routine d'hématologie, par exemple de type ADVIA 2120, Siemens AG et collectée 5 à partir des rapports médicaux. L'activateur du plasminogène de type tissulaire (t-PA) et l'inhibiteur de l'activateur de plasminogène 1 (PAI-1), l'interleukine 6 (IL-6), l'interleukine 10 (IL-10), le facteur nécrosant de tumeur alpha (TNF-a), la protéine chimiotactique des monocytes-1 (MCP-1), la P-sélectine soluble 10 et la E-sélectine soluble ont été quantifiés par une technique immunologique dérivée d'ELISA utilisant les billes fonctionnalisées FlowCytomix (Bender MedSystems GmbH) détectées à l'aide d'un cytomètre en flux FACS-scan (Becton Dickinson). Les résultats ont été analysés en utilisant le logiciel FlowCytomix Pro 3.0 (Bender MedSystems 15 GmbH). Selon l'enseignement du document Finjheer R et al. (Fijnheer R, Frijns CJ, Korteweg J, et al. « The origin of P-selectin as a circulating plasma protein.» Thromb Haemost 1997; 77(6): 1081-5. [1]) la P-sélectine soluble et le rapport P-sélectine soluble / plaquette ont été calculés afin 20 d'évaluer la contribution relative de l'origine plaquettaire et de la P- sélectine endothéliale. Score CIVD Les scores CIVD ont été calculés selon le score JAAM 2006 (Gando S, Iba T, Eguchi Y, et al. A multicenter, prospective validation of disseminated intravascular coagulation diagnostic criteria for critically iII patients: comparing current criteria. Crit Care Med 2006; 34(3): 625-31. [2]) par mesure répétée pendant les premières 24 heures et une CIVD précoce a été confirmée si les scores étaient supérieurs ou égale à 4 à l'admission (jour 1) et / ou au deuxième jour. 3005 743 29 L'analyse des microparticules et la détermination de leur concentration a été évaluée comme suit : les microparticules (MP) ont été mesurées par dosage enzymatique fonctionnel appelé dosage prothrombinase qui détecte la PhosphatidylSérine (PhtdSer) exposée à la 5 surface des MP et après capture des microparticules sur de l'annexine-5 insolubilisée ou des anticorps insolubilisés selon le procédé décrit dans Hugel et al. [12]. En bref, dans cette analyse fonctionnelle, les facteurs de coagulation sanguine et les concentrations de calcium sont établies pour s'assurer que la PhtdSer est le paramètre limitant de la génération de la 10 thrombine soluble à partir de la prothrombine exogène. Les résultats ont été exprimés en nanomoles par litre d'équivalent PhosphatidylSérine (nM éq. PhtdSer) par référence à une courbe étalon établie avec des liposomes de composition et de concentration connues ([13]). Le phénotype des MP a été déterminé en utilisant des anticorps spécifiques biotinylésau lieu de 15 l'annexine-5: anti-GPIb (plaquettes), anti-CD11 a (leucocytes), anti-CD62E (E-sélectine, cellules endothéliales stimulées), anti-CD31) et anti-CD105 (cellules endothéliales). Les limites/valeurs normales chez des volontaires sains ont été établis précédemment dans le laboratoire des inventeurs selon le même procédé. 20 En outre, le procédé / les solutions particulières utilisées pour déterminer la concentration des microparticules ainsi que les marqueurs était les suivants : lère étape : Phase préanalytique de lavage des microparticules de plasma de patients 25 Le plasma de patients de la cohorte a été traité comme suit : - Mélange de 900 pL plasma + 9 pL du mélange (PPACK [50 pM]/Dns-GGACK [50 pM]/CaCl2 [50 mM] (1/1)) - Laisser incuber 10 minutes à température ambiante à savoir 22°C - Centrifugation 1 heure à 14000 x g - Jeter le surnageant - Gratter le culot qui contient les microparticules à l'aide d'un portoir - Ajouter 900 pL de tampon TBS (50 mM Tris, 120 mM NaCI, 2,7 mM KCI, pH 7,5) Albumine 3g/L (sans Calcium) - Centrifuger 1 h à 14000 x g - Jeter le surnageant - Gratter le culot qui contient les microparticules lavées à l'aide d'un portoir - Ajouter 900p1 TBS Albumine humaine 3g/L (sans Calcium) - Conservation des échantillons à -80°C avant dosage. Toutes les dilutions ont été réalisées dans du TBS, Ca2+ 1 mM, tween 0,05% (tampon T) et les lavages dans du TBS, Ca2+ 1 mM (tampon L) 2ème étape : dosage et phénotypage des Microparticules Dans cet étape, le dosage a été réalisé sur plaque StreptaWell High Bind (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, réf. : 11 989 685 001) Toute les dilutions ont été réalisée avec du TBS, Ca2+ 1 mM, Albumine humaine 3 g/L et les lavages soit en TBS, Ca 2+ 1 mM, tween 0,05% (tampon T) ou en TBS, Ca2+ 1 mM (tampon L) Insolubilisation de l'Annexine 5-Biotinylée et des Anticorps-Biotinylés : Une solution stock (0,32 mg/mL) d'annexineV-Biotinylée est préparée est diluée à 250 ng/mL. Une solution d'anticorps IgG1-Biotinylé (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. 1128) (stock 100 pg/mL) a été diluée à 10 pg/mL. Une solution d'anticorps IgG2a-Biotinylé (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. 1129) (stock 500 pg/mL) diluée à 10 pg/mL. Une solution comprenant la Mouse Anti human Gp1b-alpha-Bi 2008 (fourni par François Lanza et biotinylé au laboratoire (stock 1,1 mg/mL) a été diluée à 2 pg/mL. Une solution comprenant des anticorps de souris Mouse Anti human CD105-Biotinylé (R&D systems, Mineapolis, USA, réf. MAB10972) (stock 0,48 mg/mL) a été diluée à 10 pg/mL. Une solution comprenant des anticorps de souris Mouse Anti human CD31-Biotinylé (Caltag, Burlingam, USA, réf. MHCD3115-4) (stock 200 pg/mL) a été diluée à 10 pg/mL. Une solution comprenant Mouse Anti human CD11a-Biotinylé (Leinco, St Louis, Missouri, USA, réf. C172) (stock 100 pg/mL) a été diluée à 10 pg/mL. Une solution comprenant le Mouse Anti human CD62E-Biotinylé (Ancell, Bayport, MN, USA, réf. : 240-030) (stock 1 mg/mL) a été diluée à 10 pg/mL. Chacune des solutions a été ajoutée indépendamment dans différents puits (100 pL/puits). La plaque avec les puits dans lesquels les solutions sont présentes a été agitée et incubée 30 minutes à 37°C. La plaque a été ensuite lavée trois fois avec 250 pL de tampon L Préparation des plasmas de référence : des échantillons de pool de plasma pauvre en plaquettes (PPP) ont été décongelés et 50 pM de PPACK (Merck, Darmstadt, Germany) et 50 pM de Dns-GGACK (Merck, Darmstadt, Germany) ont été ajoutés et agités. Préparation des vésicules standards : une gamme de vésicules congelées allant d'environ 2 à 30 nM eq PhtSer ont été déposés. Les vésicules étaient les PS/PC 33%/67% (mol/mol) (Avanti Polar) avec une solution de CaCl2 50 mM Préparation des microparticules lavées issues de plasma de patients de la cohorte: les microparticules lavées ont été mises dans une solution comprenant 30 mM final de Calcium Dépôt des échantillons et standards : 100 pL/puits de solution d'échantillons et standards ont été déposés et la plaque a été mise sous agitation et incubation 1 heure à 37°C. Des Lavages ont été ensuite réalisés comme suit : - 3 X 5 min. X 250 pL de tampon T à 22°C - 1 X 5 min. X 250 pL de tampon L à température ambiante à savoir 22°C. Détection de l'activité prothrombinase : Un pool de facteurs comprenant du CaCl2 1M (Sigma, St Louis, Missouri, USA, 2 mM dans les 100 pL de milieu réactionnel : MR), du facteur Va humain (« Human Facteur Va » référence : 405, American Diagnostica, Stamfort, USA, 250 pM dans les 100 pL de MR), du facteur Xa humain « Human Facteur Xa » référence : EZ007B, Biogenic, Perols, France, 106 pM dans les 100 pL de MR) a été utilisé. 100 pL/puits dudit pool ont été ajoutés. La plaque a été ensuite agitée. La prothrombine utilisée était la prothrombine humaine (référence PPOO6C, Hyphen BioMed, Neuville sur Oise, France, 3,5 pM dans les 50 pL) et 50 pL/puits ont été ajoutés et la plaque agitée et incubée 10 min. à 37°C. Le substrat chromogène était le pNAPEP0216 (référence : 61 01 0216, Cryopep, Montpellier, France, 1,52 mM dans les 50 pL) : 50 pL/puits ont été ajoutés. Une lecture cinétique immédiate après ajout du substrat à 405 nm sur 3 minutes (8 à 10 s entre les points, Vmax sur 3 points) a été réalisée à l'aide d'un spectromètre Versamax (Molecular Devices, Wokingam Berkshire, UK). Statistique Les variables ont été décrites comme des fréquences, et la comparaison a été faite par un test de x2 ou un test exact de Fisher. Les données quantitatives ont été données en moyennes et déviations standards et analysées avec le test de Kruskall-Wallis. Les mesures répétées ont été analysées par ANOVA ou avec un modèle linéaire mixte et deux voies ANOVA comprenant les analyses post-hoc qui ont été réalisées en utilisant le test t avec correction de Bonferroni pour les multiples comparaisons lorsque indiqué. Avant de procéder à cette analyse, les variables ont été évaluées pour leur normalité et les variables dont la distribution n'est pas normalisée ont été transformées en utilisant soit une transformation logarithmique, racine carrée, inverse ou exponentielle. Plusieurs modèles de régression logistique ont été effectuées pour expliquer la survenue d'une CIVD. Il a été vérifié que la mort avant le jour 7 n'a pas d'influence sur les niveaux ou l'évolution dans le temps des microparticules, F1+2, AT, PC, leucocytes, plaquettes, sGPV/plaquettes, E-sélectine soluble, P-sélectine soluble et l'IL-10. Toutes les statistiques ont été réalisées avec le logiciel MedCalc® 12.5.0 (Ostend, 3005 743 33 Belgium) (http://www.medcalc.org/index.php Version de 2012). Une valeur de p Dans les deux groupes, la génération de thrombine et la fibrinolyse ont persistées au fil du temps, malgré les soins apportés et la restauration des facteurs de coagulation et des inhibiteurs. Néanmoins, un retard de la restauration de AT et PC a été observé chez les patients avec une CIVD (p La GPV soluble (sGPV) a été évaluée comme un autre indicateur de l'activation plaquettaire par la thrombine et le rapport sGPV/plaquettes était significativement plus élevée chez les individus avec une CIVD (0,7 ± 1,1 vs. 0,2 ± 0,2 pg/G, p=0,02) (figure 3) en dépit des concentrations plasmatique normales de sGPV. Bien que la mesure des GPIb-microparticules soit apparue comme un outil fiable pour détecter l'activation plaquettaire, le rapport sGPV/plaquettes était plus précis pour montrer l'activation des plaquettes due à la présence de thrombine au cours de la CIVD. Indépendamment de la présence d'une CIVD (p=0,15), l'apoptose des cellules endothéliales a été mise en évidence par une augmentation importante des microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation CD31 à des concentrations élevées jusqu'au 7ème jour (D7) (p= 0,19) (figure 4). Par ailleurs, les concentrations plasmatiques de PAI-1 et t-PA n'étaient pas significativement plus élevées dans la CIVD (figure 4). Les concentrations de Microparticules membranaires porteuses du CD105 (CD105-MPs) sont restées considérablement élevées (p Tableau 4 : microparticules et hémostase à l'admission Normal Pas de CIVD Pré CIVD CIVD identifiée (CIVD N=52 au premier identifiée au jour deuxième N=30 jour) N=10 Microparticules (nMeq PhdSer) Anx-A5 (Total) 4,9 ±2,0 14,0±7,7 16,1±9,7 14,3±7,6 GPlba[3(Plaquettes) 3,5±2,2 6,6±6,4* 2,5±3,1* 4,3±4,1 CD11a (Leucocytes) 3,2±2,2 4,5±2,8* 10,3±11,6 5,9±3,9 * CD31 (Endothélium - 0,1±0,1 1,6±2,0 1,1±1,2 1,2±1,1 apoptoses) CD105 (Endothélium - 0,4±0,3 0,8±0,6*t 2,7±2,4* 1,8±1,7t activation) CD62E (Endothélium - 0,0±0,0 0,0±0,1 0,3±0,9 0,0±0,1 activation) Hémostase Leucocytes (G/L) [4,2-10,7] 16,0±9,5t 16,1±15,9 9,2±11,5t Plaquettes (G/L) [150-400] 275±130*t 94±88*§ 213±178t§ Temps prothrombine (%) [70-120] 45±19* 35±17* 36±16 Fibrinogène (g/L) [2,0-4,0] 5,8±1,9 4,6±2,2 5,3±2,6 D-Dimères (mg/L) [ Cet exemple démontre que la concentration des microparticules membranaires porteuses du CD105 et la concentration des microparticules membranaires porteuses du CD31 sont des marqueurs de la CIVD. Une analyse statistique des données biologiques obtenues a été ensuite réalisée. Il s'agissait en particulier d'une analyse par régression logistique ciblée sur la concentration des microparticules membranaires porteuses du CD105, la concentration des microparticules membranaires porteuses du CD31 et de la concentration du facteur V (FV) fonction de la présence ou absence de la CIVD chez les patients précités. Pour ce faire, le logiciel utilisé était MedCalc® 12.5.0 (Ostend, Belgium, http://www.medcalc.org/index.php, version de 2012) en utilisant les fonctions : - Frequency table & Chi-square test, - Fisher's exact test, - Kruskal-Wallis test, - One-way analysis of variance, - Repeated measures analysis of variance, - Logistik regression, - ROC curve analysis et a permis la détermination d'une règle de décision et l'élaboration d'une courbe ROC (figure 6) (Delacour, H., et al., La Courbe ROC (receiver operating characteristic) : principes et principales applications en biologie clinique, Annales de biologie clinique, 2005 ; 63 (2) : 145-54 [14]). Cette analyse a montré que lors d'un choc septique, une concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 supérieure à 1,3 nM éq. PhtdSer déterminée selon le procédé décrit ci-dessus, permet de détecter une CIVD avec une sensibilité 67,5 % et une spécificité de 84,6 % Cette analyse a également montré que lors d'un choc septique, une concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD31 inférieur ou égale à 1,4035 nM éq. PhtdSer déterminée selon le procédé décrit ci-dessus, permet de détecter une CIVD avec une sensibilité de 80,0 % et une spécificité de 38,5 %. Enfin cette étude à montrer que lors d'un choc septique, une concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 supérieure à 1,3 nM éq. PhtdSer et une concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD31 inférieur ou égale à 1,4035 nM éq. 3005 743 41 PhtdSer déterminées selon le procédé décrit ci-dessus permet de détecter une CIVD avec une sensibilité de 67,5 et une spécificité de 84,6. Exemple 2 : détermination de l'algorithme pour détection/prédiction 5 de la CIVD chez un sujet test et mise en oeuvre. Dans cet exemple, la détermination de l'algorithme de détection/prédiction de la CIVD a été effectuée à partir de données cliniques obtenues à l'exemple 1 précité. Pour ce faire, une analyse statistique a été effectuée via 10 MedCalc 12.5.0 (Ostend, Belgium, http://www.medcalc.org/index.php, version de 2012) en utilisant les fonctions : - Frequency table & Chi-square test, - Fisher's exact test, - Kruskal-Wallis test, 15 - One-way analysis of variance, - Repeated measures analysis of variance, - Logistik regression, - ROC curve analysis La construction de l'algorithme a été menée à l'aide de la 20 modélisation par régression logistique de la CIVD précoce (Pré CIVD) dans la cohorte de patients de l'exemple 1 : analyse univariée puis multivariée pour les variables liées significativement à la survenue d'une CIVD précoce avec rK0,20. Dans ce contexte, chaque patient a été caractérisé par les concentrations vcD105 et vcD31 calculées suivant le 25 procédé décrit dans l'exemple 1. L'application du procédé de calcul du score de prédiction S à partir de la formule suivante : S = -2,565 + VCD105 X 2,852 + VCD31 X 1,665 Dans laquelle la valeur VCD105 était égale à 1 si la concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 était supérieure à 1,3 nM éq. PhtdSer ou égale à 0 si la concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 était inférieure ou égale à 1,3 nM éq. PhtdSer ; et la valeur VcD31 était égale à 1 si la concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 était inférieure ou égale à 1,4035 nM éq PhtdSer ou égale à 0 si la concentration dans un échantillon de plasma des microparticules membranaires porteuses du CD105 était supérieure à 1,4035 nM éq PhtdSer. Une valeur de S supérieure à 0,2892 indiquant une CIVD et/ou l'apparition d'une CIVD. Le procédé a été également mis en oeuvre avec le score de prédiction suivant : S = E + VcDiosx a VCD31 X P, dans lequel -4,035 REVENDICATIONS1. Procédé in-vitro de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un premier échantillon biologique comprenant une mesure de la concentration RrncE)105 de microparticules membranaires porteuses du cluster de différenciation 105 (CD105). 2. Procédé de prédiction et/ou de détection selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de comparaison de la concentration mesurée avec une valeur de référence RCD1O5. 3. Procédé de prédiction et/ou de détection selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'échantillon biologique est choisi dans le groupe comprenant un échantillon de sang, de plasma, de sérum, liquide de lavage bronchiole-alvéolaire. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration RmCD31 de microparticules membranaires porteuses du le cluster de différenciation 31 (CD31). 5. Procédé selon la revendication 4, comprenant en outre une étape de comparaison de la concentration mesurée avec une valeur de référence RcID31. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques sont un seul et même échantillon. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques proviennent d'un patient présentant un choc septique. 3005 743 46 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la valeur de référence RcD1o5 est supérieure à 1,3 nM équivalent PhosphatidylSérine (éq. PhtdSer). 5 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, dans lequel la valeur de référence RCD31 est inférieure à 1,4035 nM éq. PhtdSer. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, dans lequel le procédé comprend en outre la mesure dans un troisième 10 échantillon biologique de la concentration d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant l'E-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble et la P-sélectine soluble 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le procédé 15 comprend en outre la mesure dans un quatrième échantillon biologique de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD11 a, de la numération des leucocytes et du calcul du rapport RCD11/leu de e la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD11 a sur la numération des leucocytes. 20 12. Procédé selon la revendication 10, dans lequel lesdits premier, second et troisième échantillons biologiques sont un seul et même échantillon. 25 13. Procédé de prédiction et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), de la 30 concentration RoCD31 de microparticules membranaire portant le cluster de différenciation 31 (CD31), b. comparaison de la valeur mesurée RocD105 avec une valeur de référence RCD1 05c. comparaison de la valeur mesurée ROCD31 avec une valeur de référence RcD31 d. affectation d'une valeur VCD1O5 égale à 1 si ROCD105 est supérieure à la valeur RCD1O5 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si ROCD105 est inférieure à la valeur RCD105, e. affectation d'une valeur VCD31 égale à 1 si RoCD31 est inférieur à la valeur RcD31 ou d'une valeur CD 31 égale à 0 si RocD31 est supérieure à la valeur RCD31 f. calcul du score S selon la formule suivante : S= E+ VcD105X a+ Vco3i x [3 dans laquelle E est compris de -4,035 à -1,094, a est compris de 1,638 à 4,066, 0 est compris de 0,193 à 3,138 14. Procédé de prédiction et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon la revendication 13 dans lequel dans la formule S E est égal à -2,565, a est égal à 2,852 et 0 est égal à 1,665. 15. Procédé de suivi de l'efficacité d'un traitement de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration RocD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105) avant ledit traitement ; b. mesure de la concentration R1cp1o5 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), après ledit traitement ; et c. détermination du rapport SCD105 selon la formule suivante : SCD105= (R1CD105 /ROCD105) une valeur de SCD105 supérieure ou égale à 1 indiquant une évolution de la CIVD 16. Kit de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) portant des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105). 17. Kit selon la revendication 16 comprenant en outre des moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires portant le cluster de différenciation 31 (CD31). 18. Kit selon la revendication 16 ou 17 comprenant en outre des moyens de mesure d'au moins un marqueur choisi dans le groupe comprenant l'E-Sélectine soluble, la glycoprotéine V soluble, le facteur V et la P-sélectine soluble. 19. Kit selon l'une quelconque des revendications 16 à 18 dans lequel les moyens de mesure de la concentration de microparticules membranaires portant le cluster de différenciation 105 (CD105) sont choisis dans le groupe comprenant des anticorps, des sondes lipidiques, synthétiques ou naturelles, des ligands peptidiques ou protéiques, des enzymes, des substrats chromogéniques, des protéines portant une activité biologique propre ou capables d'en acquérir une par interaction avec le milieu environnant choisie parmi le sang, plasma, sérum, liquide bronchoalvéolaire et/ou le tissu vasculaire.