Brevet FR3001464A1 — publié le 20140801

DESCRIPTION La présente invention concerne un procédé d'isolement sélectif d'acides nucléiques d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide contenant, notamment, de très nombreux acides nucléiques de cellules non ciblées. Elle concerne également son utilisation, des tests de diagnostic basés sur un procédé d'isolement de microorganismes d'intérêt et des kits pour permettre l'isolement des acides nucléiques de micro-organismes d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide comprenant, notamment, des micro-organismes d'intérêt, des cellules non ciblées et, éventuellement, des débris de micro-organismes d'intérêt et/ou de cellules non ciblées. L'état de la technique est constitué par un certain nombre de publication scientifique et de brevets. Ainsi en 1992, Baker et ses collaborateurs décrivent l'utilisation d'un réactif nommé saponine pour lyser de manière différentielle des cellules humaines et isoler le pathogène plasmodium du sang total. Ils ont démontré que la saponine avec une concentration finale faible, de l'ordre de 0,015 peut lyser des cellules humaines dans 20 pL de sang total tamponné au citrate et fournir assez de lysat propre pour faire une détection PCR. La demande de brevet EP-A-0.745.849 a revisité cette approche différentielle d'utilisation de la saponine pour des volumes de sang total plus larges (5 mL) avec une solution finale concentrée en saponine de l'ordre de 0,020-0,125 %. Une autre demande de brevet EP-A-2.185.681 propose une méthode de préparation des solutions de saponine, en utilisant une solution de saponine plus concentrée, c'est- à-dire avec une concentration finale comprise entre 2 et 10 pour un volume de sang total de taille moyenne, soit mL. Cette invention propose d'utiliser des tampons hypotoniques ou physiologiques pour de telles solutions de 5 saponine. Toutefois, de nos jours, aucune solution rapide n'est disponible pour isoler et identifier une très faible quantité de cellules pathogènes au sein de volumineux échantillons biologiques. Par exemple, pour la septicémie le besoin est de pouvoir identifier de 1 à 10 unités formant des colonies (CFU, Colony-Forming Unit) de pathogènes dans 10 mL de sang total dans un délai de moins de 6 heures, soit dans les cas les plus difficiles 1 fg d'acide nucléique de pathogène ciblé pour plus de 800 pg d'acides nucléiques non ciblés (humain). Les problèmes rencontrés dans le diagnostic des maladies infectieuses sont donc : 1) la complexité de l'échantillon matriciel incluant d'ordinaire très peu de cellules de pathogènes, d'une part, et un très grand nombre de cellules humaines, et autres cellules ou particules, d'autre part, qui doivent être éliminées pour ne pas s'immiscer dans l'isolement et l'identification des pathogènes, et 2) les limitations physiques pour isoler un très petit nombre de pathogènes à partir d'un très grand volume d'échantillon. En résumé, le défi est d'éliminer le maximum d'éléments (cellules et/ou particules) non-ciblés en gardant le maximum de cibles pathogènes qui étaient initialement peu présentes afin d'accroître artificiellement leur concentration et faciliter leur détection. L'invention décrite ici est une méthode qui peut isoler et identifier un petit nombre de pathogènes à partir de grands volumes d'échantillons biologiques dans un délai relativement court. Ces pathogènes sont de manière non limitative des bactéries, des virus et des champignons. L'invention permet d'identifier d'aussi faibles quantités que 3 CFU dans 10 mL de sang total (soit 0,3 CFU/mL), avec une limite de détection jamais décrite dans la littérature. Sa nouveauté est basée sur : 1. Une limite de détection attractive jamais atteinte précédemment de l'ordre de 0,3 CFU / mL, en rapport au besoin clinique qui est de 0,1 à 1 CFU/mL. 2. Une capacité à utiliser différents sangs totaux tamponnés avec de l'EDTA ou du Citrate mais aussi avec de l'héparine. L'héparine est un réactif très utilisé à l'hôpital, mais souvent écarté dans les approches de biologie moléculaire du fait de sa capacité à empêcher l'amplification d'acides nucléiques et les réactions à base d'enzyme(s). Cette invention peut gérer le sang tamponné à l'héparine, ce qui n'est pas le cas en général des méthodes moléculaires décrites dans la littérature. 3. Une capacité à utiliser de grands volumes de sang total de 10 mL ou plus. 4. L'utilisation de polyéthylène glycol (PEG) pour améliorer la précipitation des cellules pathogènes (virales). La précipitation d'ADN ou de virus est très bien décrite dans la littérature Cependant, l'utilisation de PEG pour précipiter des cellules bactériennes ou de levures est absente dans l'état de l'art . Etant donné que la saponine est un réactif semblable au détergent, les cellules ou particules pathogènes peuvent flotter à l'intérieur du tube ou avoir des difficultés à précipiter dans le fond d'un tube sous l'effet d'une centrifugation. Même si certains échantillons traités ne le nécessitent pas, l'ajout de PEG garantit une précipitation des cibles qui est constante sans risque de flottaison. De plus, cet ajout de PEG améliore le collage des culots contenant des pathogènes sur le tube plastique et la résistance aux lavages de surface. 5. Associer la lyse différentielle avec de la saponine avec des traitements à base de nucléases fortement concentrés ; en d'autres termes, lyser des cellules non-cibles qui vont libérer leurs acides nucléiques, qui dans un deuxième temps seront dégradés par un traitement aux nucléases. Cette lyse différentielle libère une grande quantité d'acides nucléiques humains. Typiquement 880 pg d'ADN humain peuvent être extraits de 10 ml de sang total. Ces acides nucléiques humains sont la source d'importants problèmes quand le but est de détecter un très petit nombre de copies d'acides nucléiques pathogènes : i) ils entrent en compétition lors de la purification des acides nucléiques cibles pathogènes en saturant les réactifs de capture d'acides nucléiques en raison de leur excès (comme par exemple les membranes de silice, les billes de silice magnétiques, les matrices de chromatographie ou d'affinité, etc.), ii) ils interférèrent pendant les amplifications des molécules pathogènes. En éliminant le maximum d'acides nucléiques humains, les limites de détection sont améliorées. Selon ces points critiques, l'invention utilise une grande quantité de nucléases pour éliminer un maximum d'acides nucléiques humains après la lyse par la saponine. La combinaison de saponine avec un traitement de nucléases fortement concentrées n'a jamais été décrite dans la littérature. 6. Enfin, nous avons démontré que la solution saponine tamponnée, avec un pH compris entre 6 et 9, permet d'éviter la précipitation d'éléments indésirables du sang, particulièrement des globules rouges. Les scientifiques ont précédemment utilisé des tampons près de pH 7 pour la solution saponine, mais sans jamais corréler l'impact de ce pH avec la stabilité de l'échantillon. En résumé, la présente invention combine différentes utilisations de produits chimiques permettant d'atteindre une limite de détection de pathogène compatible avec les valeurs de détection d'une gamme clinique (0,1 à 1 CFU/mL). L'utilisation combinée de saponine avec du PEG et au moins une nucléase n'a jamais été décrite et permet une amélioration technique de ces réactifs peut inconnue à ce jour. La combinaison être complète (saponine + PEG + nucléase) ou partielle (saponine + nucléase ou saponine + PEG seulement ou encore PEG seul) pour préparer l'échantillon pour une analyse d'identification ou une détection. A cet effet, la présente invention concerne un procédé d'isolement sélectif d'acides nucléiques d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide comprenant, notamment :30 - des micro-organismes d'intérêt dont la membrane cellulaire ou la capside ne contient pas de cholestérol, tels que certains procaryotes, certaines levures ou virus, et - des éléments non ciblés, c'est-à-dire : - des cellules non ciblées dont la membrane cellulaire contient du cholestérol, et - éventuellement, des débris de micro-organismes d'intérêt et/ou de cellules non ciblées, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact l'échantillon biologique liquide avec une formulation de saponine, afin de déstabiliser les membranes cellulaires ou enveloppes virales contenant du cholestérol, b) réaliser un choc osmotique des cellules non-ciblées afin de les lyser spécifiquement, c) ajouter une solution d'au moins une enzyme apte à lyser les acides nucléiques libres (ADN et/ou ARN) issues des éléments non ciblés lysés en solution dans l'échantillon, d) inactiver l'enzyme ajoutée à l'étape (c), et e) rendre accessible les acides nucléiques de microorganismes d'intérêt non dégradés par l'enzyme de l'étape (c). Selon un second mode de réalisation, le procédé d'isolement sélectif d'acides nucléiques d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide comprend, notamment : - des micro-organismes d'intérêt dont la membrane cellulaire ou la capside ne contient pas de cholestérol, tels que certains procaryotes, certaines levures ou virus, et - des éléments non ciblés c'est-à-dire : - des cellules non ciblées dont la membrane cellulaire contient du cholestérol, et - éventuellement, des débris de micro-organismes d'intérêt et/ou de cellules non ciblées, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact l'échantillon biologique liquide avec une formulation de saponine, afin de déstabiliser les membranes cellulaires ou enveloppes virales contenant du cholestérol, b) réaliser un choc osmotique des cellules non-ciblées afin de les lyser spécifiquement, c) ajouter un agent de précipitation des microorganismes d'intérêt non lysés en solution dans l'échantillon, et d) rendre accessible les acides nucléiques de micro- organismes d'intérêt non accessibles par l'action des étapes a) et b). Selon un troisième mode de réalisation, le procédé d'isolement sélectif d'acides nucléiques d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide comprenant, notamment : - des micro-organismes d'intérêt dont la membrane cellulaire ou la capside ne contient pas de cholestérol, tels que certains procaryotes, certaines levures ou virus, et des éléments non ciblés c'est-à-dire : - des cellules non ciblées dont la membrane cellulaire contient du cholestérol, et - éventuellement, des débris de micro-organismes d'intérêt et/ou de cellules non ciblées, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact l'échantillon biologique liquide avec une formulation de saponine, afin de déstabiliser les membranes cellulaires ou enveloppes virales contenant du cholestérol, b) réaliser un choc osmotique des cellules non-ciblées afin de les lyser spécifiquement, c) ajouter un agent de précipitation des micro- organismes d'intérêt non lysés en solution dans l'échantillon, et d) ajouter une solution d'au moins une enzyme apte à lyser les acides nucléiques libres (ADN et/ou ARN) issues des éléments non ciblés lysés en solution dans l'échantillon, e) inactiver l'enzyme ajoutée à l'étape (c), f) obtenir les acides nucléiques de micro-organismes d'intérêt : - non dégradés par l'enzyme de l'étape (c), et - non accessibles par l'action des étapes a) et b). Quel que soit le mode de réalisation, le procédé d'isolement est caractérisé en ce que la saponine est dans 20 un volume au moins égal ou supérieur au volume de l'échantillon à concentration égale. La concentration finale en saponine est comprise entre 0,5 et 20%. 25 Le procédé d'isolement est également caractérisé en ce que l'agent de précipitation est constitué par le polyéthylène glycol (PEG). 30 Le procédé d'isolement est aussi caractérisé en ce que la saponine est constituée par un triterpénoïde. Selon certaines variantes de réalisation du procédé d'isolement, lors de l'étape (c), l'enzyme apte à lyser les acides nucléiques libres est une enzyme qui peut être inactivée soit : - chimiquement par l'ajout d'EDTA et/ou d'EGTA et/ou de DIT et/ou de 13-mercaptoéthanol et/ou de DEPC, - physiquement par l'augmentation de la température entre 40 et 100°C en présence ou non de détergents, tels que le Sodium Docécyl Sulfate (SDS). L'invention concerne également une utilisation d'un procédé, selon les modes réalisation présentés ci-dessus, pour l'isolement de micro-organismes d'intérêt, dans un échantillon de sang, que lors du procédé, le pH est maintenu dans une fourchette entre 5 et 10, préférentiellement entre 6 et 9, par l'ajout d'une solution : - basique si la valeur du pH est inférieure à 5, préférentiellement inférieure à 6, - acide si la valeur du pH est supérieure à 10, préférentiellement supérieure à 9, afin que le pH soit compris dans la fourchette. Selon une variante d'utilisation, l'invention utilise une formulation de saponine conduisant à une concentration finale supérieure à 1%, préférentiellement supérieur à 3%,et/ou un agent précipitant à une concentration de 0,5 à 20%, et/ou une enzyme apte à lyser les acides nucléiques libres (ADN et/ou ARN) contenant entre 500 et 20000 unités enzymatiques. L'invention concerne encore un test de diagnostic basé sur un procédé d'isolement de micro-organismes d'intérêt, tel que décrit ci-dessus, ou sur les utilisations d'un procédé pour l'isolement des miro-organismes d'intérêt, telles que décrites ci-dessus. L'invention concerne enfin un kit de diagnostic pour permettre l'isolement des acides nucléiques de microorganismes d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide comprenant, notamment, des micro-organismes d'intérêt, des cellules non ciblées et, éventuellement, des débris de micro-organismes d'intérêt et/ou de cellules non ciblées, le kit comprenant : a)un récipient, et (b) au moins une formulation de saponine, et (c) au moins une solution d'au moins une enzyme apte à lyser les acides nucléiques et/ou au moins une solution d'un agent de précipitation, tel que le polyéthylène glycol (PEG). Le kit comprend en outre : (d) au moins une solution acide et/ou au moins une solution basique, et/ou (e) de l'EDTA et/ou de l'EGTA et/ou du DIT et/ou du 13-mercaptoéthanol et/ou du DEPC et/ou (f) au moins un détergent ou un agent anionique. Dans la suite de cette demande de brevet, les termes utilisés reçoivent les définitions suivantes : - Par « déstabiliser les membranes cellulaires ou enveloppes virales », on entend les mécanismes physico-chimiques conduisant à une perte de régulation de l'osmolarité au niveau membranaire ou de l'enveloppe virale, une perturbation du transport membranaire et l'apparition potentielle de pores au niveau de la membrane cellulaire ou de l'enveloppe virale. - Les termes « micro-organismes d'intérêt » comprennent tous pathogènes potentiellement pathogènes notamment pour l'homme. Ces micro-organismes regroupent des virus, des bactéries, des champignons (levures) mais aussi des animaux microscopiques. - Les « acides nucléiques d'intérêt » correspondent aux acides nucléiques (ADN et ARN) contenus dans les cellules ou particules des « micro-organimes d'intérêt » définis ci-dessus.Par « cellules non ciblées », il faut comprendre toutes les cellules d'organismes vivants qui ne contiennent pas d'« acides nucléiques d'intérêts » comme définis ci-dessus. - L'abréviation « EDTA » correspond à l'acide éthylènediamine tétraacétique (correspondant en anglais à EthyleneDiamineTetraacetic Acid). - L'abréviation « EGTA » correspond à l'acide tétraacétique éthylène glycol (soit en anglais Ethylene Glycol Tetraacetic Acid). - L'abréviation « DIT » correspond au Dithiothreitol. - L'abreviation « DEPC » correspond à Diéthylpyrocarbonate. - L'abréviation CFU est pour Colony-Forming Unit ou unité formant des colonies - Par le terme « détergents » on entend toutes classes de molécules pouvant induire une modification physico- chimiques d'autres molécules. Ces détergents peuvent être de nature chimique comme le SDS, le tween-20, le tritonx-100, le brij97 ou enzymatiques. - Par « échantillon biologique liquide », il faut comprendre un échantillon liquide sélectionné parmi le groupe suivant : liquide amniotique, humeur aqueuse, bile, sang, sécrétion mamellaire, lavage broncho alvéolaire, liquide cérébro spinal, chyle, chyme, fèces, liquide interstitiel, lymphe, menstruations, mucus, plasma, liquide pleural, pus, salive, sébum, sperme, sérum, crachat, sueur, fluide synovial, larme, urine et humeur vitrée. Les exemples ci-joints sont présentés pour démontrer l'efficacité du procédé selon l'invention. Exemple 1 : Détection de 5 et 10 CFU de Pseudomonas aeruginosa dans 10 mL de sang total À l'intérieur d'un tube plastique de 50 mL, 20 mL de sang total traité par l'EDTA ont été inoculés avec 20, 10, 2 et 0 (contrôle négatif) CFU de Pseudomonas aeruginosa. Le nombre de CFU insérées dans le sang a été vérifié par étalement sur milieux gélosés en boîte de Petri. Les 20 mL de sang inoculés ont été divisés en deux et chaque volume de 10 mL a été déposé dans deux tubes plastiques de 50 mL pour avoir des duplicatas. Quarante millilitres d'une solution filtrée de 4 % de saponine, 50 mM Tris-HC1 à pH 8,0 et 4% de PEG-8000 ont été ajoutés au sang inoculé. Les tubes ont été agités par inversion deux fois, incubés à température ambiante pendant 5 minutes et centrifugés à 12000 g pendant 10 minutes. Le surnageant a été éliminé et le culot collant a été lavé trois fois avec 15 mL de 4 % PEG-8000. Un volume de 200 pL de Tris-HC1 à 10 mM à un pH de 7,5 a été ajouté au culot. Par la suite, 10 pL de DNAse I (500 u/pl ; Roche) et 2 pL RNAse If (50 u/pL ; New England Biolabs) ont été mis dans les tubes. Les culots ont été digérés par les enzymes pendant 10 minutes avec deux agitations par vortex après 2 minutes et 4 minutes d'incubation. Après la digestion par les nucléases, 10 pL d'EDTA à 0,5 M et pH 8,0 ont été ajoutés aux tubes. Les échantillons ont été transférés dans des microtubes d'une contenance de 1,5 mL, contenant 200 mg de billes de verre de diamètre de 1 mm et 50 mg de billes de zirconium de 0,1 mm de diamètre. Les microtubes ont été chauffés 10 minutes à 80°C. On a ensuite ajouté 20 pL de Protéinase K (Novagen) et 40 pL à 10 % de SDS aux tubes. Les microtubes ont été incubés 5 minutes à température ambiante et chauffés 5 minutes à 80°C. La lyse mécanique des cellules de Pseudomonas a été réalisée en agitant les tubes contenant les billes pendant 20 minutes à l'aide d'un vortex. L'ADN présent dans le supernageant de lyse a été purifié avec l'aide du kit Nucleospin Blood® de Macherey-Nagel. Une amplification PCR quantitative a été réalisée avec l'utilisation de l'éluat au complet, soit 40 pl. Les échantillons à 5 CFU de Pseudomonas aeruginosa ont bien été détectés sur un réplica à l'aide de l'invention, et une détection partielle d'un réplica sur deux a été observé pour 1 CFU insérée, comme cela est bien présenté sur le Tableau I suivant : Echantillon Cq Nombre de réplica positif 10 CFU total 38,78 2/2 10 CFU total 37,74 5 CFU total 42,18 2/2 5 CFU total 37,84 1 CFU total 41,73 1/2 1 CFU total N/A* Contrôle négatif N/A* 0/2 Contrôle négatif N/A* : aucun signal de fluorescence n'a été détecté après 50 cycles d'amplification. Tableau I : Evaluation de la limite de détection pour Pseudomonas aeruginosa à l'aide du procédé selon l'invention Exemple 2 : Détection de 28 et 140 CFU de Candida albicans dans 10 mL de sang total À l'intérieur d'un tube plastique de 50 mL, 20 mL de sang total traité par l'EDTA ont été inoculés avec 140, 28 et 0 (contrôle négatif) CFU de Candida albicans. Le nombre de CFU inséré dans le sang a été vérifié par étalement sur milieux gélosés en boîte de Petri. Les 20 mL de sang inoculés ont été divisés en deux et chaque volume de 10 mL a été déposé dans deux tubes plastiques de 50 mL pour avoir des duplicatas. Quarante millilitres d'une solution filtrée de 4 % de saponine, 50 mM Tris-HC1 à pH 8,0 et 4% de PEG-8000 ont été ajoutés au sang inoculé. Les tubes ont agités par inversion deux fois, incubés à température ambiante pendant 5 minutes et centrifugés à 12000 g pendant 10 minutes. Le surnageant a été éliminé et le culot a été lavé trois fois avec 15 mL de 4 % PEG-8000. Un volume de 200 pL de Tris-HC1 à 10 mM à un pH de 7,5 a été ajouté au culot. Par la suite, 10 pL de DNAse I (500 p/pL ; Roche) et 2 pL RNAse If (50 p/pL ; New England Biolabs) ont été mis dans les tubes. Les culots ont été digérés par les enzymes pendant 10 minutes avec deux agitations par vortex après 2 minutes et 4 minutes d'incubation. Après la digestion par les nucléases, 10 pL d'EDTA à 0,5 M et pH 8,0, un volume de 40 pl de SDS 10% et 20 pl de Protéinase K ont été ajoutés aux tubes. Les échantillons ont été transférés dans des microtubes d'une contenance de 1,5 mL, contenant 200 mg de billes de verre de diamètre de 1 mm et 50 mg de billes de zirconium de 0,1 mm de diamètre. Les microtubes ont été chauffés 60 minutes à 80°C. La lyse mécanique des cellules de Candida albicans a été réalisée en agitant les billes pendant 20 minutes à l'aide d'un vortex. L'ADN présent dans le surnageant de lyse a été purifié avec l'aide du kit Nucleospin Blood® de MachereyNagel et purifié une seconde fois à l'aide du kit gDNA Clean-up XS® de Macherey-Nagel. Une amplification PCR quantitative a été réalisée avec l'utilisation de l'éluat au complet soit 40 pL. Les échantillons à 28 CFU de Candida albicans ont été détectés sur un réplica à l'aide de l'invention, comme cela est bien représenté sur le Tableau 2 suivant : Echantillon Cq Nombre de réplica positif 140 CFU total 37,44 2/2 140 CFU total 36,78 28 CFU total 40,08 2/2 28 CFU total 38,42 Contrôle négatif N/A* 0/1 : aucun signal de fluorescence n'a été détecté après 50 cycles d'amplification. Tableau 2 : Evaluation de la limite de détection pour Candida albicans à l'aide du procédé selon l'invention Exemple 3 : Détection de 20000 virions d'Adénovirus 5 humain dans 10 mL de sang total À l'intérieur d'un tube plastique de 50 mL, 10 mL de sang total traité à l'EDTA ont été inoculés avec 20000 virons d'Adénovirus 5 humain. Quarante millilitres d'une solution filtrée de 4 % de saponine, avec 50 mM Tris-HC1 à pH 8,0 et 4% de PEG-8000 ont été ajoutés au sang inoculé. Les tubes ont été agités par inversion deux fois, incubés à température ambiante pendant 5 minutes et centrifugés à 12000 g pendant 10 minutes. Le surnageant a été éliminé et le culot été lavé trois fois avec 15 mL de 4 % PEG-8000. Un volume de 200 pL de Tris-HC1 à 10 mM et à un pH de 7,5 a été ajouté au culot. Par la suite, 10 pL de DNAse I (500 p/pl ; Roche) et 2 pL RNAse If (50 p/pL ; New England Biolabs) ont été mis dans les tubes. Les culots ont été digérés par les enzymes pendant 10 minutes avec deux agitations par vortex après 2 minutes et 4 minutes d'incubation. Après la digestion par les nucléases, 10 pL d'EDTA 0,5 M, pH 8,0 et 40 pl de SDS 10% ont été ajoutés aux tubes. Les échantillons ont été transférés dans des microtubes d'une contenance de 1,5 mL, contenant 200 mg de billes de verre de diamètre de 1 mm et 50 mg de billes de zirconium de 0,1 mm de diamètre. Les microtubes ont été chauffés 10 minutes à 80°C. La lyse mécanique des virions a été réalisée en agitant les tubes contenant les billes pendant 20 minutes à l'aide d'un vortex. L'ADN présent dans le surnageant de lyse a été purifié avec l'aide du kit Nucleospin Blood® de Macherey-Nagel. Les acides nucléiques ont été élués avec 40p1. Une amplification PCR quantitative a été réalisée avec l'utilisation de 10 pl d'éluat. Les 20000 virions ont bien été détectés à l'aide de l'invention, voir Tableau 3 suivant : Cq Nombre de réplica positif Echantillon 20000 virions total 34,7 1/1 Tableau 3 : Evaluation de la limite de détection d'Adénovirus 5 humain à l'aide de l'invention REVENDICATIONS1. Procédé d'isolement sélectif d'acides nucléiques d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide comprenant, notamment : - des micro-organismes d'intérêt dont la membrane cellulaire ou la capside ne contient pas de cholestérol, tels que certains procaryotes, certaines levures ou virus, et - des éléments non ciblés, c'est-à-dire : - des cellules non ciblées dont la membrane cellulaire contient du cholestérol, et - éventuellement, des débris de micro-organismes d'intérêt et/ou de cellules non ciblées, le procédé comprenant les étapes suivantes : a)mettre en contact l'échantillon biologique liquide avec une formulation de saponine, afin de déstabiliser les membranes cellulaires contenant du cholestérol, b)réaliser un choc osmotique des cellules non-ciblées afin de les lyser spécifiquement, c)ajouter une solution d'au moins une enzyme apte à lyser les acides nucléiques libres (ADN et/ou ARN) issues des éléments non ciblés lysés en solution dans l'échantillon, d)inactiver l'enzyme ajoutée à l'étape (c), et e)rendre accessible les acides nucléiques de microorganismes d'intérêt non dégradés par l'enzyme de l'étape (c). 2. Procédé d'isolement sélectif d'acides nucléiques d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide comprenant, notamment : - des micro-organismes d'intérêt dont la membrane cellulaire ou la capside ne contient pas decholestérol, tels que certains procaryotes, certaines levures ou virus, et - des éléments non ciblés c'est-à-dire : - des cellules non ciblées dont la membrane cellulaire contient du cholestérol, et - éventuellement, des débris de micro-organismes d'intérêt et/ou de cellules non ciblées, le procédé comprenant les étapes suivantes : a)mettre en contact l'échantillon biologique liquide avec une formulation de saponine, afin de déstabiliser les membranes cellulaires contenant du cholestérol, b)réaliser un choc osmotique des cellules non-ciblées afin de les lyser spécifiquement, c)ajouter un agent de précipitation des micro- organismes d'intérêt non lysés en solution dans l'échantillon, et d)rendre accessible les acides nucléiques de microorganismes d'intérêt non accessibles par l'action des étapes a) et b). 3. Procédé d'isolement sélectif d'acides nucléiques d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide comprenant, notamment : - des micro-organismes d'intérêt dont la membrane cellulaire ou la capside ne contient pas de cholestérol, tels que certains procaryotes, certaines levures ou virus, et des éléments non ciblés c'est-à-dire : - des cellules non ciblées dont la membrane cellulaire contient du cholestérol, et - éventuellement, des débris de micro-organismes d'intérêt et/ou de cellules non ciblées, le procédé comprenant les étapes suivantes :a)mettre en contact l'échantillon biologique liquide avec une formulation de saponine, afin de déstabiliser les membranes cellulaires contenant du cholestérol, b)réaliser un choc osmotique des cellules non-ciblées afin de les lyser spécifiquement, c)ajouter un agent de précipitation des microorganismes d'intérêt non lysés en solution dans l'échantillon, et d)ajouter une solution d'au moins une enzyme apte à 10 lyser les acides nucléiques libres (ADN et/ou ARN) issus des éléments non ciblés lysés en solution dans l'échantillon, e)inactiver l'enzyme ajoutée à l'étape (d), f)obtenir les acides nucléiques de micro-organismes 15 d'intérêt : - non dégradés par l'enzyme de l'étape (d), et - non accessibles par l'action des étapes a) et b). 4. Procédé d'isolement, selon l'une quelconque des 20 revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la saponine est dans un volume au moins égal ou supérieur au volume de l'échantillon à concentration égale. 5. Procédé d'isolement, selon la revendication 4, 25 caractérisé en ce que la concentration finale en saponine est comprise entre 0,5 et 20%. 6. Procédé d'isolement, selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'agent de 30 précipitation est constitué par le polyéthylène glycol (PEG). 7. Procédé d'isolement, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la saponine est constituée par un triterpénoïde. 8. Procédé d'isolement, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3 à 7, caractérisé en ce que, lors de l'étape (c), l'enzyme apte à lyser les acides nucléiques libres est une enzyme qui peut être inactivée, à l'étape (d) de la revendication 1 ou à l'étape (e) de la revendication 3, soit : - chimiquement par l'ajout d'EDTA et/ou d'EGTA et/ou de DTT et/ou de P,-mercaptoéthanol et/ou de DEPC, soit - physiquement par l'augmentation de la température entre 40 et 10000 en présence ou non de détergents, tels que le Sodium Docécyl Sulfate (SDS). 9. Utilisation d'un procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour l'isolement de micro- organismes d'intérêt, dans un échantillon de sang, caractérisé en ce que lors du procédé, le pH est maintenu dans une fourchette entre 5 et 10, préférentiellement entre 6 et 9, par l'ajout d'une solution : - basique si la valeur du pH est inférieure à 5, préférentiellement inférieure à 6, - acide si la valeur du pH est supérieure à 10, préférentiellement supérieure à 9, afin que le pH soit compris dans la fourchette. 10. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour l'isolement de microorganismes d'intérêt, ou utilisation selon larevendication 9, caractérisée en ce qu'elle utilise une formulation de saponine conduisant à une concentration finale supérieure à 1%, préférentiellement supérieur à 3%,et/ou un agent précipitant à une concentration de 0,5 à 20%, et/ou une enzyme apte à lyser les acides nucléiques libres (ADN et/ou ARN) contenant entre 500 et 20000 unités enzymatiques. 11. Test de diagnostic basé sur un procédé d'isolement de micro-organismes d'intérêt selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou sur les utilisations d'un procédé pour l'isolement des micro-organismes d'intérêt selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10. 12. Kit de diagnostic pour permettre l'isolement des acides nucléiques de micro-organismes d'intérêt au sein d'un échantillon biologique liquide comprenant, notamment, des micro-organismes d'intérêt, des cellules non ciblées et, éventuellement, des débris de micro-organismes d'intérêt et/ou de cellules non ciblées, le kit comprenant : (a) un récipient, et (b) au moins une formulation de saponine, et (c) au moins une solution d'au moins une enzyme apte à lyser les acides nucléiques et/ou au moins une solution d'un agent de précipitation, tel que le polyéthylène glycol (PEG). 13. Kit, selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le kit comprend en outre : d)au moins une solution acide et/ou au moins une solution basique, et/oue)de l'EDTA et/ou de l'EGTA et/ou du DTT et/ou du pmercaptoéthanol et/ou du DEPC et/ou f)au moins un détergent ou un agent anionique.