Brevet FR3005420A1 — publié le 20141114

Procédé de stabilisation de suspensions d'érythrocytes encapsulant un principe actif, suspensions obtenues. La présente invention concerne un procédé de stabilisation des suspensions d'érythrocytes ou globules rouges encapsulant un principe actif. L'invention concerne aussi un procédé de préparation de telles suspensions, les méthodes de traitement utilisant ces suspensions, ainsi que de nouvelles suspensions d'érythrocytes stables encapsulant un principe actif. Divers procédés ont été décrits pour permettre l'incorporation de principes actifs dans les érythrocytes. Parmi ces procédés, la technique dite de lyse-rescellement est la plus répandue. Cette technique comprend trois variantes, qui sont la dialyse hypotonique, la « preswelling » hypotonique et la dilution hypotonique, toutes basées sur la différence de pression osmotique entre l'intérieur et l'extérieur des érythrocytes. Ces variantes ont en commun les cinq étapes suivantes : un culot globulaire est lavé et centrifugé une ou plusieurs fois avec un tampon physiologique, les érythrocytes sont mis en contact avec un milieu liquide hypotonique aboutissant à l'ouverture de pores dans la membrane érythrocytaire, le principe actif entre dans les érythrocytes, les pores sont refermés (« rescellés ») à l'aide d'un tampon hypertonique, enfermant le principe actif à l'intérieur des érythrocytes, puis ceux-ci sont mis en suspension dans une solution de conservation. La technique de dialyse hypotonique est la plus intéressante et a fait l'objet de développements industriels. Celle décrite dans EP 1 773 452 est la plus performante actuellement, elle présente l'avantage d'être reproductible et d'améliorer le rendement d'encapsulation du principe actif. La stabilité des produits ainsi obtenus est un élément clé pour leur utilisation en thérapeutique humaine. Notamment la quantité d'hémoglobine extracellulaire présente dans le produit au moment de son injection au patient doit être inférieure à un seuil prédéterminé. Par exemple, la FDA, l'autorité de santé américaine, requiert un seuil inférieur ou égal à 0,2 g/dL d'hémoglobine extracellulaire dans le produit fini pour pouvoir être injecté à l'homme. Les produits obtenus par les procédés de l'art antérieur sont sujet à une hémolyse durant la période de leur stockage et de leur transport avant injection. Cette hémolyse due à l'éclatement des érythrocytes les plus fragiles va libérer de l'hémoglobine dans le milieu extracellulaire de sorte que ces produits ne répondront plus à l'exigence de la FDA au moment de leur injection. Un objectif de l'invention est donc de proposer un procédé permettant d'améliorer la stabilité des suspensions d'érythrocytes encapsulant un principe actif. Un objectif de l'invention est notamment de proposer un procédé permettant de produire des suspensions d'érythrocytes incorporant un principe actif ayant un taux d'hémoglobine extracellulaire stable après stockage ou restant conforme aux recommandations de la FDA ou de toute autre autorité sanitaire. Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel procédé applicable à toute suspension d'érythrocytes encapsulant un principe actif, quel que soit le procédé employé pour son obtention, notamment par un procédé de lyse-rescellement. Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel procédé permettant de produire une suspension d'érythrocytes encapsulant un principe actif stabilisée et avec un bon rendement cellulaire. Ces objectifs, ainsi que d'autres, peuvent être atteints en éliminant les érythrocytes les plus fragiles de la suspension issue de la procédure d'encapsulation, de manière à obtenir une suspension comportant des érythrocytes résistant à l'hémolyse dans la proportion la plus grande possible. Ceci permet de conserver la suspension d'érythrocytes jusqu'à son injection au patient, sans qu'elle subisse une hémolyse sensible, ce qui permet de disposer, au moment de l'injection, d'une suspension ayant un taux réduit d'hémoglobine extracellulaire. Le procédé de l'invention prévoit donc l'élimination des érythrocytes les plus fragiles ainsi que l'hémoglobine extracellulaire, de même que le principe actif extracellulaire. La demanderesse réussit cela tout en conservant un rendement cellulaire correct, en trouvant le bon compromis entre l'élimination des plus fragiles et la conservation d'un maximum d'érythrocytes. La demanderesse a même pu déterminer des conditions permettant, de manière surprenante, de stabiliser une suspension d'érythrocytes encapsulant un principe actif, tout en améliorant le rendement cellulaire. Par « encapsulant », on entend que le principe actif est présent essentiellement ou totalement à l'intérieur. « Essentiellement » signifie qu'une proportion minoritaire du principe actif peut néanmoins se trouver piégée dans la membrane. Par « encapsulant un principe actif », on entend que les érythrocytes incorporent une molécule ayant une fonction de principe actif, ou encore que l'ensemble formé par l'érythrocyte et la molécule qu'il incorpore, a la fonction de principe actif. Par « solution d'incubation », on entend la solution dans laquelle les érythrocytes encapsulant un principe actif sont présents lors de l'étape d'incubation. L'incubation peut se faire sur une large plage d'hématocrite, notamment entre 10 et 85 % d'hématocrite. Par « solution de conservation », on entend la solution dans laquelle les érythrocytes stabilisés encapsulant un principe actif sont mis en suspension sous leur forme adaptée à être stockée en attendant leur injection. Une solution de conservation comprend de préférence au moins un agent favorisant la conservation des érythrocytes, notamment choisi parmi glucose, dextrose, adénine et mannitol. Par « érythrocytes fragiles », on entend les érythrocytes issus de la procédure d'incorporation qui sont susceptibles, une fois en suspension dans une solution de conservation, d'être lyses lorsque la suspension est conservée entre 2 et 8°C, notamment au bout d' 1 à 72 h. Par « hématocrite initial », on entend l'hématocrite avant perte cellulaire due à la lyse des érythrocytes fragiles lors de l'incubation. La notion de « stabilisation » s'apprécie essentiellement par la stabilité dans le temps des érythrocytes incorporant un principe actif, en termes notamment de perte en hémoglobine intracellulaire ou en taux d'hémoglobine extracellulaire. Par « suspension d'érythrocytes stabilisée », on entend notamment une suspension ayant une teneur d'hémoglobine extracellulaire qui reste inférieure ou égale à 0,2 g/dL jusqu'à son utilisation chez l'homme, celle-ci pouvant intervenir notamment de 1 à 72 heures après la production du lot d'érythrocytes incorporant le principe actif. Par « suspension d'érythrocytes stabilisée prête-à-l'emploi », on entend la suspension stabilisée dans une solution permettant l'injection à un patient, notamment en solution de conservation. Son hématocrite est généralement égal ou supérieur à 40%. Par « culot d'érythrocytes », on entend un concentrat ou concentré d'érythrocytes recueilli après séparation des érythrocytes du milieu liquide dans lequel ils étaient en suspension auparavant. La séparation peut se faire par filtration ou par centrifugation. La centrifugation est le moyen généralement employé pour une telle séparation. Un culot comprend une certaine proportion du milieu liquide. Généralement, le culot a un hématocrite compris entre 70 et 85 %. Le procédé s'applique quelle que soit la technique utilisée pour incorporer ou encapsuler le principe actif. Il s'applique tout particulièrement à la technique phare de lyse- rescellement, notamment celle à dialyse hypotonique, de préférence celle décrite dans EP 1 773 452 auquel l'homme du métier peut se référer. Le contenu de EP 1 773 452 est incorporé ici par référence. La présente invention a pour premier objet un procédé d'obtention d'une suspension stabilisée d'érythrocytes encapsulant un principe actif, comprenant l'encapsulation d'un principe actif à l'intérieur d'érythrocytes par lyse-rescellement, l'obtention d'une suspension ou d'un culot comprenant des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, l'incubation du culot ou de la suspension en l'état ou après ajout d'une solution d'incubation, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg. L'incubation est effectuée notamment pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, en particulier supérieure ou égale à 1 h. On procède ensuite à l'élimination du milieu liquide de la suspension incubée et la mise en suspension des érythrocytes obtenus dans une solution permettant l'injection de la suspension à un patient, de préférence une solution de conservation permettant l'injection de la suspension à un patient. L'osmolalité indiquée est celle de la solution dans laquelle les érythrocytes sont en suspension ou en culot au moment considéré. Le procédé conforme à l'invention comprend notamment les étapes suivantes : (a) encapsulation d'un principe actif à l'intérieur d'érythrocytes, comprenant la mise en contact avec un milieu hypotonique (permettant l'ouverture de pores dans la membrane des érythrocytes), la mise en contact avec le principe actif (pour permettre son entrée dans les érythrocytes), le rescellement des érythrocytes, notamment à l'aide d'un milieu isotonique ou hypertonique, avantageusement hypertonique, (b) obtention ou préparation d'une suspension ou d'un culot comprenant des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, (c) incubation du culot ou de la suspension de l'étape (b) en l'état ou après ajout d'une solution d'incubation, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, notamment supérieure ou égale à 1 h, (d) élimination du milieu liquide de la suspension incubée de l'étape (c), (e) mise en suspension des érythrocytes obtenus sous (d) dans une solution permettant l'injection de la suspension à un patient, de préférence une solution de conservation permettant l'injection de la suspension à un patient. Suivant une première modalité, l'étape suivant l'encapsulation par lyse-rescellement, notamment l'étape (b), comporte au moins 1 cycle de lavage, de préférence 2 ou 3 cycles de lavage, par dilution de la suspension ou du culot obtenu à l'étape de lyse-rescellement ou l'étape (a) dans une solution, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, puis obtention d'un culot d'érythrocytes ou d'une suspension. Ce culot ou cette suspension comprend des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg. On applique ensuite les étapes suivantes, e.g. (c), (d) et (e). Suivant une deuxième modalité, à l'étape de lyse-rescellement ou l'étape (a), le rescellement des érythrocytes à l'aide d'un milieu isotonique ou hypertonique produit la suspension d'érythrocytes pouvant ensuite subir l'incubation, e.g. la suspension de l'étape (b), dans une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg. En d'autres termes, l'étape de lyse-rescellement ou l'étape (a) comporte une étape de rescellement des érythrocytes dans laquelle les érythrocytes en suspension encapsulant un principe actif, sont mélangés à une solution de rescellement isotonique ou hypertonique, avantageusement hypertonique, produisant une suspension d'érythrocytes à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg. Dans cette modalité, l'étape d'incubation ou l'étape (c) comprend l'incubation de la suspension issue du rescellement. L'incubation est réalisée pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, notamment supérieure ou égale à 1 h. On applique ensuite les étapes suivantes, e.g. (d) et (e). Les étapes suivant la lyse-rescellement, e.g. (b) à (e), sont conduites dans des conditions aboutissant à la lyse des érythrocytes fragiles, ou d'une majorité d'entre eux, notamment plus de 50, 60, 70, 80 ou 90 %, ou plus. Pour ce faire, on peut jouer sur la durée d'incubation, la température d'incubation et sur l'osmolalité de la solution dans laquelle les érythrocytes sont en suspension. Plus l'osmolalité est élevée, plus la durée d'incubation peut être importante. Plus l'osmolalité est basse, plus l'incubation peut être courte pour obtenir le même effet. De même, plus la température est élevée, plus la durée d'incubation peut être courte, et inversement. Un ou plusieurs cycles de lavage permettront ensuite d'éliminer les débris cellulaires et l'hémoglobine extracellulaire, ainsi que le principe actif extracellulaire. Selon l'invention, un cycle de lavage comprend la dilution de la suspension ou du culot d'érythrocytes, puis la séparation entre les érythrocytes et la solution de lavage. De préférence, une étape de lavage comprend de préférence 2 ou 3 cycles dilution-séparation. La séparation peut être réalisée par tout moyen approprié, tel que filtration et centrifugation. La centrifugation est préférée. L'incubation n'est pas limitée par l'hématocrite de la suspension. C'est ainsi que l'on peut incuber une suspension ayant un hématocrite initial compris généralement entre 10 et 85 %, notamment entre 40 et 80 %. On parle plutôt de culot à partir de 70% et de suspension en dessous de cette valeur. L'étape d'élimination ou (d) vise à «éliminer la partie liquide de la suspension ou du culot incubé, afin d'éliminer notamment les débris cellulaires et l'hémoglobine extracellulaire, ainsi que, par voie de conséquence, le principe actif extracellulaire. Suivant une première modalité de l'étape d'élimination ou (d), on effectue une séparation, notamment centrifugation, ceci étant notamment applicable à une suspension. Cette séparation peut être suivie d'un ou plusieurs, par exemple 2 ou 3, cycles de lavage, par dilution en solution isotonique, puis séparation, notamment par centrifugation. Suivant une deuxième modalité de l'étape d'élimination ou (d), on effectue une dilution, avant une séparation, notamment centrifugation, ceci étant applicable à une suspension ou à un culot. La dilution peut être effectuée notamment avec une solution de lavage isotonique ou avec une solution de conservation. L'étape finale ou (e) consiste à préparer la suspension finale telle qu'elle pourra être administrée au patient, sans autre traitement. Suivant une première modalité de cette étape, on effectue une dilution du culot d'érythrocytes issu de l'étape d'élimination ou (d) avec la solution d'injection, notamment de conservation. Suivant une deuxième modalité de cette étape, on effectue un ou plusieurs cycles de lavage du culot d'érythrocytes issu de l'étape d'élimination ou (d) avec la solution d'injection, notamment de conservation, par dilution suivie de séparation. Après lavage, on remet les érythrocytes en suspension dans la solution d'injection, notamment de conservation. Le procédé de l'invention peut comprendre en outre une, plusieurs ou la totalité des caractéristiques suivantes : - l'étape d'incubation ou (c) est réalisée à une température comprise entre environ 2 et environ 39 °C, sur une durée suffisante pour assurer la lyse des érythrocytes fragiles ; - l'étape d'incubation ou (c) est réalisée à basse température, notamment comprise entre environ 2 et environ 10 °C, en particulier entre environ 2 et environ 8 °C, et dure d'environ 1 h à environ 72 h, notamment d'environ 6 h à environ 48 h, de préférence d'environ 19 h à environ 30 h; - l'étape d'incubation ou (c) est conduite à une température plus élevée comprise entre environ 20 et environ 39 °C, notamment à la température ambiante (25 °C ± 5 °C) et dure d'environ 30 min à environ 10 h, notamment d'environ 1 h à environ 6 h, de préférence d'environ 2 h à environ 4 h ; on peut travailler à température encore plus élevée que la température ambiante, mais cela peu avoir un impact négatif sur le rendement cellulaire, la P50 et/ou la teneur en 2,3-DPG ; - à l'étape d'incubation ou (c), la suspension est à un hématocrite initial compris entre 10 et 85 (:)/0, notamment entre 40 et 80 %; on peut incuber un culot issu de séparation ayant par exemple un hématocrite entre 70 et environ 85 (:)/0, ou un culot dilué ayant un hématocrite compris entre environ 40 et 70 % ; - l'étape d'incubation comprend une agitation de la suspension ; - l'étape d'incubation ne comprend pas d'agitation ; - comme solution pour le lavage et/ou l'incubation, on utilise une solution aqueuse de NaCI dosée pour obtenir l'osmolalité souhaitée ; à titre d'exemple, une solution peut ainsi comprendre 0,9% de NaCI; cette solution peut aussi comprendre, notamment en plus du NaCI, du glucose, notamment du glucose monohydrate, du phosphate monosodique dihydraté, du phosphate disodique dodecahydraté ; à titre d'exemple, une composition comprend : NaCI 0,9%, glucose monohydrate 0,2%, phosphate monosodique dihydraté 0,034%, phosphate disodique dodecahydraté 0,2%; - le lavage à l'étape finale ou (e) est réalisé avec la solution de conservation ; - l'osmolalité de la solution (partie liquide) dans la suspension prête-à-l'emploi ou pouvant être injectée au patient est comprise entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg ; - l'hématocrite de la suspension prête-à-l'emploi ou pouvant être injectée au patient est égal ou supérieur à 40% ; - on effectue toutes les étapes de lavage, incubation avec la solution de conservation ; - la solution de lavage de l'étape (b) et/ou la solution de lavage de l'étape (e) et la solution de conservation sont de même composition et comprennent un ou des composés favorisant la conservation des érythrocytes ; - la solution de conservation (et la ou les solutions de lavage ou d'incubation le cas échéant) est une solution aqueuse comprenant du NaCI, de l'adénine et au moins un composé parmi glucose, dextrose et mannitol ; - la solution de conservation (et la ou les solutions de lavage ou d'incubation le cas échéant) comprend NaCI, adénine et dextrose, de préférence milieu AS3 ; - la solution de conservation (et la ou les solutions de lavage ou d'incubation le cas échéant) comprend NaCI, adénine, glucose et mannitol, de préférence milieu SAG-Mannitol ou ADsol. La présente invention peut aussi être définie par un procédé d'obtention d'une suspension stabilisée d'érythrocytes incorporant un principe actif, comprenant notamment les étapes suivantes : (a) encapsulation d'un principe actif à l'intérieur d'érythrocytes, comprenant la mise en contact avec un milieu hypotonique (permettant l'ouverture de pores dans la membrane des érythrocytes), la mise en contact avec le principe actif (pour permettre son entrée dans les érythrocytes), le rescellement des érythrocytes à l'aide d'un milieu isotonique ou hypertonique et récolte d'une suspension ou d'un culot d'érythrocytes comprenant un groupe d'érythrocytes dits fragiles, à savoir susceptibles, une fois en suspension dans une solution de conservation, d'être lyses lorsque la suspension est conservée entre 2 et 8°C, notamment au bout de 1 à 72 h, (b-c) lavage et incubation des érythrocytes obtenus sous (a) dans une solution et des conditions aboutissant à la lyse des érythrocytes fragiles, ou d'une majorité d'entre eux, notamment plus de 50, 60, 70, 80 ou 90 (:)/0, (d) élimination du milieu liquide de la suspension incubée de l'étape précédente, (e) mise en suspension des érythrocytes obtenus sous (d) dans une solution permettant l'injection de la suspension à un patient, de préférence une solution de conservation permettant l'injection de la suspension à un patient. Suivant une caractéristique, l'étape (b) comprend l'obtention ou la préparation d'une suspension ou d'un culot comprenant des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg. Suivant une caractéristique, l'étape (c) comprend l'incubation du culot ou de la suspension de l'étape (b) en l'état ou après ajout d'une solution d'incubation, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, notamment supérieure ou égale à 1 h. Suivant une caractéristique, l'étape (d) comprend le lavage des érythrocytes obtenus sous (c) pour éliminer les débris cellulaires et l'hémoglobine extracellulaire, notamment 2 ou 3 cycles de lavage. Ce procédé peut reprendre les deux modes de réalisation et leurs diverses modalités et caractéristiques qui sont décrits ici. Les procédés selon l'invention comprennent notamment l'étape suivante : (a) encapsulation d'un principe actif à l'intérieur d'érythrocytes, comprenant la mise en contact avec un milieu hypotonique permettant l'ouverture de pores dans la membrane des érythrocytes, la mise en contact avec le principe actif pour permettre son entrée dans les érythrocytes, le rescellement des érythrocytes à l'aide d'un milieu isotonique ou hypertonique. A noter que le principe actif peut être présent dans la suspension d'érythrocytes avant la lyse de ces derniers, ou encore être ajouté pendant la lyse ou après la lyse, mais toujours avant le rescellement. Dans un mode de réalisation de cette étape (a), le procédé comprend les sous-étapes suivantes : (al) disposer d'une suspension d'érythrocytes à un hématocrite égal ou supérieur à 60 ou 65%, (a2) mesure de la fragilité osmotique des érythrocytes dans cette suspension, (a3) procédure de lyse et d'internalisation du principe actif, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes dans un dispositif de dialyse, notamment une cartouche de dialyse, à contre-courant d'une solution de lyse, ajustement du débit de la suspension d'érythrocytes ou ajustement du débit de la solution de lyse ou ajustement de l'osmolarité de la solution de lyse, en fonction de la fragilité osmotique mesurée sous (a2), (a4) procédure de rescellement des érythrocytes. Dans ce mode de réalisation, l'étape (al) comprend le lavage/centrifugation d'un culot globulaire, et la mise en suspension des érythrocytes lavés dans un tampon physiologique à hématocrite égal ou supérieur à 60 ou 65%. De préférence, une température de 2 à 8°C est maintenue tout au long des étapes (al) et (a3) et de préférence, les produits sont engagés à une température comprise entre 2 et 8°C. De préférence, la procédure de rescellement des érythrocytes est réalisée au moyen d'une solution hypertonique et, de préférence, à une température comprise entre 30 et 40°C, notamment 37°C environ. Après rescellement, on sépare les érythrocytes et le milieu de rescellement par une procédure de séparation, de préférence centrifugation. Après centrifugation, on récupère un culot d'érythrocytes dans le tube ou récipient de centrifugation. Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, on y récupère toute ou sensiblement toute la fraction susceptible de contenir des érythrocytes, afin d'augmenter le rendement cellulaire final après élimination subséquente des érythrocytes fragiles. Dans un mode de réalisation, le principe actif est la L-asparaginase. D'autres modes de réalisation comprennent l'incorporation, de préférence encapsulation d'un principe actif choisi parmi : IHP, ADI, Facteur VIII, Facteur IX, alglucosidase, bêta-glucosidase, bisphosphonates, notamment de 2ème et 3ème génération, uricase, thymidine phosphorylase, adénosine déiminase, etc. Les érythrocytes peuvent, par exemple entre les étapes (a) et (b) ou après l'étape (c) ou (d), subir un traitement complémentaire modifiant la surface des érythrocytes ou leur apportant des fonctionnalités par greffage ou couplage en surface, afin d'en modifier les propriétés. Il peut s'agir de l'un des traitements suivants : - traitement chimique à l'aide d'agents modifiant la surface des globules rouges et notamment d'agents pontants ou réticulants tels que le Bis(Sulfosuccinimidyl) subérate (B53), le glutaraldéhyde et la neuraminidase ; - traitement thermique, par exemple effectué dans les conditions suivantes : chauffage des globules rouges d'environ 15 minutes à environ 90 minutes, de préférence d'environ 25 à environ 50 minutes, à une température comprise entre environ 42 et environ 55°C, de préférence entre environ 47 et environ 51°C ; - la formation du complexe immun avec un anticorps de préférence de sous-type IgG ; par exemple anticorps anti-Rhésus, anticorps anti-glycophorine A et anticorps anti-CR1 (CR1 = récepteur complément de type 1). Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'une étape d'incubation d'une suspension d'érythrocytes, notamment encapsulant un principe actif, suivie d'une élimination du milieu d'incubation, de préférence par lavage pour éliminer le milieu d'incubation, pour stabiliser des érythrocytes ou une suspension d'érythrocytes. De préférence, cette utilisation comprend en outre l'étape supplémentaire de placer les érythrocytes en suspension dans une solution de conservation. Les diverses caractéristiques plus précises mentionnées ci-dessus s'appliquent à cet objet de l'invention. Notamment, suivant une caractéristique, cette étape d'incubation comprend l'incubation d'une suspension ou d'un culot comprenant des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, notamment supérieure ou égale à 1 h. Notamment encore, suivant l'invention, cette incubation peut comprendre une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - l'étape d'incubation est réalisée à une température comprise entre environ 2 et environ 39 °C, sur une durée suffisante pour assurer la lyse des érythrocytes fragiles ; - l'étape d'incubation est réalisée à basse température, notamment comprise entre environ 2 et environ 10 °C, en particulier entre environ 2 et environ 8 °C, et dure d'environ 1 h à environ 72 h, notamment d'environ 6 h à environ 48 h, de préférence d'environ 19 h à environ 30 h; - l'étape d'incubation est conduite à une température plus élevée comprise entre environ 20 et environ 39 °C, notamment à la température ambiante (25 °C ± 5 °C) et dure d'environ 30 min à environ 10 h, notamment d'environ 1 h à environ 6 h, de préférence d'environ 2 h à environ 4 h ; on peut travailler à température encore plus élevée que la température ambiante, mais cela peu avoir un impact négatif sur le rendement cellulaire, la P50 et/ou la teneur en 2,3-DPG ; - à l'étape d'incubation, la suspension est à un hématocrite initial compris entre 10 et 85 (:)/0, notamment entre 40 et 80 %; on peut incuber un culot issu de séparation ayant par exemple un hématocrite entre 70 et environ 85 (:)/0, ou un culot dilué ayant un hématocrite compris entre environ 40 et 70 % ; - l'étape d'incubation comprend une agitation de la suspension ; - l'étape d'incubation ne comprend pas d'agitation. Un autre objet de l'invention est une suspension stabilisée d'érythrocytes encapsulant un principe actif, susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. En particulier, la suspension, en solution de conservation, se caractérise par un taux d'hémoglobine extracellulaire maintenu égal ou inférieur à 0,5, en particulier à 0,3, notamment à 0,2, de préférence à 0,15, mieux encore à 0,1 g/dI à 72 h et conservation à une température comprise entre 2 et 8°C. En particulier, la suspension, en solution de conservation, se caractérise par un taux d'hémoglobine extracellulaire maintenu égal ou inférieur à 0,5, en particulier à 0,3, notamment à 0,2, de préférence à 0,15, mieux encore à 0,1 g/dI pendant une durée comprise entre 24 h et 20 jours, notamment entre 24 et 72 h et conservation à une température comprise entre 2 et 8°C. Le taux d'hémoglobine extracellulaire est avantageusement mesuré par la méthode manuelle de référence décrite dans G.B. Blakney et A.J. Dinwoodie, Clin. Biochem. 8, 96102, 1975. Des automates existent aussi qui permettent également de faire cette mesure, avec une sensibilité qui leur est propre. On a néanmoins montré dans les exemples avec trois méthodes différentes que le procédé de l'invention permettait d'obtenir un taux conforme ou que les trois méthodes sont utilisables pour effectuer ce contrôle. En particulier, la suspension, en solution de conservation, se caractérise par un taux d'hémolyse maintenu égal ou inférieur à 2, notamment à 1,5, de préférence à 1 % à 72 h et conservation à une température comprise entre 2 et 8°C. En particulier, la suspension, en solution de conservation, se caractérise par un taux d'hémolyse maintenu égal ou inférieur à 2, notamment à 1,5, de préférence à 1 % pendant une durée comprise entre 24 h et 20 jours, notamment entre 24 et 72 h et à une température comprise entre 2 et 8°C. En particulier, l'hématocrite de la suspension est égal ou supérieur à 40%. Dans un mode de réalisation, le principe actif est la L-asparaginase. D'autres modes de réalisation comprennent l'incorporation, de préférence encapsulation d'un principe actif choisi parmi : IHP, ADI, Facteur VIII, Facteur IX, alglucosidase, bêta-glucosidase, bisphosphonates, notamment de 2ème et 3ème génération, uricase, thymidine phosphorylase, adénosine déiminase, etc. Avantageusement, la suspension en solution de conservation est prête à l'emploi, tout en ayant un taux d'hémoglobine extracellulaire réduit, notamment conforme à la recommandation de la FDA. Un autre objet de l'invention est une méthode de traitement thérapeutique par injection d'une suspension d'érythrocytes encapsulant un principe actif. Dans un premier mode de réalisation de cette méthode, on injecte au patient une suspension d'érythrocytes encapsulant un principe actif préparée entre 1 et 72 h, notamment entre 10 et 72 h avant injection. Cette suspension a un hématocrite égal ou supérieur à 40 %. Elle se trouve dans une solution de conservation. Le taux d'hémoglobine extracellulaire est égal ou inférieur à 0,5, en particulier à 0,3, notamment à 0,2, de préférence à 0,15, mieux encore à 0,1 g/dl, et/ou le taux d'hémolyse égal ou inférieur à 2, notamment à 1,5, de préférence à 1 %. La suspension n'est pas lavée ou similaire avant injection. Dans une autre mode de réalisation, cette méthode comprend les étapes de disposer d'un culot globulaire, le mettre en suspension dans une tampon physiologique à un hématocrite égal ou supérieur à 60 ou 65 %, encapsuler dans ces érythrocytes un principe actif par une procédure de lyse et rescellement, incuber les érythrocytes obtenus, les laver et recueillir une suspension d'érythrocytes finale. La suspension a un hématocrite égal ou supérieur à 40 %. Elle se trouve en solution de conservation. On conserve cette suspension à une température comprise entre 2 et 8 °C. On injecte cette suspension finale au patient entre lh et 72h, de préférence entre 24 et 72 h après obtention. Cette suspension a un taux d'hémoglobine extracellulaire égal ou inférieur à 0,5, en particulier à 0,3, notamment à 0,2, de préférence à 0,15, mieux encore à 0,1 g/dI et/ou un taux d'hémolyse égal ou inférieur à 2, notamment à 1,5, de préférence à 1 %. La suspension n'est pas lavée ou similaire avant injection. Cette méthode comprend notamment les étapes suivantes: (al) disposer d'une suspension d'érythrocytes à un hématocrite égal ou supérieur à 60 ou 15 65%, (a2) mesure de la fragilité osmotique des érythrocytes dans cette suspension, (a3) procédure de lyse et d'internalisation du principe actif, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes dans une cartouche de dialyse, à contre-courant d'une solution de lyse, ajustement du débit de la suspension d'érythrocytes ou ajustement du débit de la 20 solution de lyse ou ajustement de l'osmolarité de la solution de lyse, en fonction de la fragilité osmotique mesurée sous (a2), (a4) procédure de rescellement des érythrocytes, (b) optionnellement au moins un cycle de lavage par dilution de la suspension ou du culot obtenu en (a4) dans une solution, puis récupération d'un culot d'érythrocytes ou d'une 25 suspension dans de la solution de lavage, (c) incubation du culot ou de la suspension de l'étape (a4) ou (b) en l'état ou après ajout d'une solution d'incubation, (d) élimination du milieu liquide de la suspension incubée de l'étape (c), (e) mise en suspension des érythrocytes obtenus sous (d) dans une solution permettant 30 l'injection au patient, notamment une solution de conservation. Dans un mode de réalisation de cette méthode, les érythrocytes renferment de la Lasparaginase. Il peut aussi s'agir de l'un des autres principes actifs mentionnés plus haut, sans que cela soit limitatif. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation 35 pris à titre d'exemples non limitatifs, et se référant au dessin dans lequel la figure unique schématise le procédé décrit dans EP 1 773 452 et celui de l'invention, et montre les résultats obtenus pour chacun d'eux en termes d'hémoglobine extracellulaire sur 72 heures. Exemple 1 : Incubation de globules rouges en NaCI glucosé et à température ambiante pendant une durée variable Des culots de globules rouges humains ont été traités en l'absence ou en présence de principe actif (L-asparaginase) selon le procédé décrit dans le brevet EP 1 773 452 jusqu'à la fin du rescellement, et l'on a récupéré des suspensions de globules rouges (GR) dans des poches de sang. Les poches de GR ont ensuite été transférées sur un laveur (Cobe 2991). Les suspensions ont été pré-diluées avec NaCI 0,9% et glucose 0,2%, puis transférées dans des poches de centrifugation. Les suspensions ont été centrifugées à 3000 tour/min pendant 2 min. Les surnageants ont été ensuite envoyés à la poche de déchet avec un débit de sortie de surnageant réglé à 350 ml/min. L'opération de dilution/centrifugation a été répétée encore deux fois pour terminer le cycle de lavage. Puis les poches de centrifugation contenant les GR à 80% d'hématocrite ont été laissées à température ambiante (24 ±5 °C) dans le laveur pendant 30 min, 1h ou 3h. A la fin de l'incubation, un autre cycle de lavage a été réalisé. Les GR ont ensuite été remis en suspension avec 100 ml de solution de conservation AS-3 (Caridian BOT) et conservés à 5 ±3 °C. La stabilité du produit a été déterminée avec la mesure de l'hémoglobine extracellulaire le jour de la fabrication (JO), puis 24h après (J1), puis 48h après (J2), etc. Cette mesure a été effectuée par deux méthodes : avec un automate (automate Oeil Dyn Ruby : mesure à 555 nm, linéarité hémoglobine 0,0-25,0 g/dI ± 0,3, coefficient de variation Mesure de l'hémoglobine extracellulaire par spectrophotométrie Excell 2280 (g/dI) ert rendement cellulaire en % : JO J1 J2 J3 Rendement cellulaire Procédé 0,3 ± 0,08 0,83 ± 0,22 1 ± 0,22 1,08 ± 0,22 -65% (moyenne sur 189 EP1773452 lots) Procédé Exemple 0.11±0.02 0.11±0.03 0.12±0.03 0.13±0.03 -54 ± 3% (moyenne sur 1 5 lots) Procédé Exemple 0.08±0.02 0.13±0.04 0.13±0.06 0.15±0.06 -73 ± 5 % (moyenne sur 4 9 lots) Exemple 5: Réduction du taux d'hémoglobine extracellulaire après optimisation du procédé de fabrication La figure unique compare les taux d'hémoglobine extracellulaire retrouvés dans les produits fabriqués selon le procédé décrit dans le brevet EP 1 773 452 ou selon le procédé de l'exemple 1. La réduction de l'hémoglobine extracellulaire après 72h de conservation est significative puisqu'elle passe de 1,5 g/dI pour le procédé EP 1 773 452 à une valeur inférieure à 0,2 g/dI après optimisation, soit une réduction du taux d'hémoglobine supérieure à 7. REVENDICATIONS1. Procédé d'obtention d'une suspension stabilisée d'érythrocytes encapsulant un principe actif, comprenant l'encapsulation d'un principe actif à l'intérieur d'érythrocytes, l'obtention d'une suspension ou d'un culot comprenant des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, l'incubation du culot ou de la suspension en l'état ou après ajout d'une solution d'incubation, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, notamment supérieure ou égale à 1 h, l'élimination du milieu liquide de la suspension incubée et la mise en suspension des érythrocytes obtenus dans une solution permettant l'injection de la suspension à un patient. 2. Procédé selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : (a) encapsulation d'un principe actif à l'intérieur d'érythrocytes, comprenant la mise en contact avec un milieu hypotonique, la mise en contact avec le principe actif, le rescellement des érythrocytes, (b) obtention d'une suspension ou d'un culot comprenant des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, (c) incubation du culot ou de la suspension de l'étape (b) en l'état ou après ajout d'une solution d'incubation, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, notamment supérieure ou égale à 1 h, (d) élimination du milieu liquide de la suspension incubée de l'étape (c), (e) mise en suspension des érythrocytes obtenus sous (d) dans une solution permettant l'injection de la suspension à un patient, de préférence une solution de conservation permettant l'injection de la suspension à un patient. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'étape (b) comporte au moins 1 cycle de lavage, de préférence 2 ou 3 cycles de lavage, par dilution de la suspension ou du culot obtenu en (a) dans une solution, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entreenviron 290 et environ 330 mOsmol/kg, puis obtention d'un culot d'érythrocytes ou d'une suspension. 4. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'étape (a) comporte une étape de rescellement des érythrocytes dans laquelle les érythrocytes en suspension encapsulant un principe actif, sont mélangés à une solution de rescellement hypertonique, produisant une suspension d'érythrocytes en suspension dans une solution, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, et l'étape (c) comprend l'incubation de la suspension de l'étape (b) pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, notamment supérieure ou égale à 1 h. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel, à l'étape (d), on effectue soit une séparation, notamment centrifugation, soit on effectue une dilution, avant une séparation, notamment centrifugation. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel l'étape d'incubation (c) est réalisée à une température comprise entre environ 2 et environ 39 °C. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel : - l'étape d'incubation (c) est réalisée à basse température, notamment comprise entre environ 2 et environ 10 °C, en particulier entre environ 2 et environ 8 °C, et dure d'environ 1 h à environ 72 h, notamment d'environ 6 h à environ 48 h, de préférence d'environ 19 h à environ 30 h ; ou - l'étape d'incubation (c) est conduite à une température comprise entre environ 20 et environ 39 °C, notamment à la température ambiante (25 °C ± 5 °C) et dure d'environ 30 min à environ 1 h, notamment d'environ 1 h à environ 6 h, de préférence d'environ 2 h à environ 4h. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le principe actif est choisi parmi : L-asparaginase, IHP, ADI, Facteur VIII, Facteur IX, alglucosidase, bêta-glucosidase, bisphosphonates, notamment de 2ème et 3ème génération, uricase, thymidine phosphorylase, adénosine déiminase. 9. Suspension stabilisée d'érythrocytes encapsulant un principe actif, susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 10. Suspension selon la revendication 9, caractérisée par un taux d'hémoglobine extracellulaire maintenu égal ou inférieur à 0,5, en particulier à 0,3, notamment à 0,2, de préférence à 0,15, mieux encore à 0,1 g/dI et/ou un taux d'hémolyse maintenu égal ou inférieur à 2, notamment à 1,5, de préférence à 1 (:)/0, à 72 h après mise en suspension dans la solution de conservation et à une température comprise entre 2 et 8°C. 11. Suspension selon la revendication 9, caractérisée par un taux d'hémoglobine extracellulaire maintenu égal ou inférieur à 0,5, en particulier à 0,3, notamment à 0,2, de préférence à 0,15, mieux encore à 0,1 g/dI et/ou un taux d'hémolyse maintenu égal ou inférieur à 2, notamment à 1,5, de préférence à 1 (:)/0, pendant une durée comprise entre 24 h et 20 jours, notamment entre 24 et 72 h après mise en suspension dans la solution de conservation et à une température comprise entre 2 et 8°C. 12. Suspension selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans laquelle le principe actif est choisi parmi : L-asparaginase, IHP, ADI, Facteur VIII, Facteur IX, alglucosidase, bêta-glucosidase, bisphosphonates, notamment de 2ème et 3ème génération, uricase, thymidine phosphorylase, adénosine déiminase.