Brevet FR3007988A1 — publié le 20150109

INHIBITION DE LA SYNTHÈSE DE LA PROTÉINE pAPP OU DE L'ACTIVITÉ DU PEPTIDE AR DANS LES PLEXUS CHOROÏDES. L'invention est relative à des moyens de diminuer la production de peptide P-amyloïde, utilisables dans le cadre de la prévention ou du traitement de maladies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer. Le peptide 13-amyloïde (peptide AR) est le constituant majeur des dépôts amyloïdes extracellulaires observés dans le cortex cérébral des patients atteints de maladie d'Alzheimer. Ce peptide provient du clivage d'une protéine transmembranaire dénommée protéine pAPP (pour « P-Amyloid Precursor Protein »). Le peptide AR résulte de la maturation de la protéine pAPP par la voie dite « amyloïdogénique », impliquant l'action successive de deux activités protéasiques, la p-sécrétase et la y-sécrétase, qui libèrent 15 respectivement les extrémités N- et C-terminales du peptide. L'accumulation de peptides AR dans le milieu extracellulaire induit des altérations des membranes cellulaires provoquant une entrée massive de calcium dans la cellule et s'accompagnant d'une réaction inflammatoire. Ces 20 lésions entraîneraient la mort neuronale. Une voie alternative de maturation protéolytique de la protéine pAPP est la voie dite « non amyloïdogénique » ; dans cette voie, une autre enzyme, l'a-sécrétase, coupe la PAPP au milieu de la séquence AR. 25 Cette coupure prévient la formation du peptide AR, et libère une forme soluble et sécrétée dénommée sAPP, qui a des propriétés neuroprotectrices et une fonction mitogène sur les cellules souches neurales adultes (CAILLE et al., Development, 131, 2173-81, 2004). La production du sAPP est 30 donc incompatible avec celle du 13A4 généré par l'action de la béta- (en N-terminal) et la gamma- (en C-terminal) secrétase. La protéine PAPP est exprimée dans de nombreux tissus de l'organisme, et notamment par les neurones, y compris au niveau cérébral. Les plexus choroïdes sont des structures localisées au niveau des ventricules, plus particulièrement au niveau du toit du 4e ventricule et de la jonction entre les ventricules latéraux du cerveau et le 3e ventricule. Ils sont constitués d'un épithélium constitué de cellules épendymaires associées par des jonctions serrées et reposant sur une membrane basale qui les sépare d'un stroma conjonctivo-vasculaire composé d'un réseau de capillaires sanguins fenestrés, et de fibres de collagène produites par les fibroblastes présents dans ce stroma. Les plexus choroïdes fabriquent le liquide céphalorachidien (LCR), en jouant un rôle de barrière sélective autorisant le passage de certaines molécules entre le sang et le LCR, et en bloquant d'autres. Ils synthétisent également un certain nombre de protéines, qui sont sécrétées dans le LCR. Bien que la présence de BAPP dans les plexus choroïdes ait été rapportée (SASAKI et al., Brain Res, 755, 193-201, 1997), son niveau d'expression n'avait pas été déterminé auparavant. Les Inventeurs ont maintenant constaté, lors d'une analyse par séquençage des ARN des cellules épithéliales du plexus choroïde, que le gène codant pour PAPP faisait partie de ceux qui étaient les plus fortement exprimés dans cette structure, et que le niveau d'expression de cette protéine dans le plexus choroïde était très supérieur à celui observé dans d'autres régions du cerveau précédemment connues pour l'exprimer à un niveau élevé. Ils ont également observé une expression très élevée de la protéine APLP-2, qui appartient à la même famille que pAPP et qui comme celle-ci peut générer par maturation protéolytique une forme soluble (sAPLP-2) ayant des propriétés neuroprotectrices et neurotrophes, mais qui, contrairement à pAPP ne forme pas de peptide Ap car l'APLP-2 ne contient pas la séquence AP (WASCO et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 10758-62, 1992). Cette observation faite par les Inventeurs de l'importance quantitative des plexus choroïdes comme source de pAPP permet de proposer de cibler cette structure cérébrale pour y bloquer ou diminuer la production de PAPP, et en conséquence celle du peptide Ap, ou pour y bloquer ou diminuer l'activité du peptide Ap. La présente invention a en conséquence pour objet 5 un inhibiteur de la synthèse de la protéine pAPP ou un inhibiteur de l'activité du peptide Ap pour l'utilisation comme médicament pour l'administration aux plexus choroïdes, dans le cadre du traitement d'une maladie neurodégénérative. Si l'on choisit d'inhiber la synthèse de la 10 protéine pAPP, l'inhibiteur utilisé peut être avantageusement choisi parmi les oligonucléotides antisens et les ARNs interférents dirigés contre le gène codant pour cette protéine. Les fonctionnalités de la protéine pAPP liées à 15 la production de sAPP peuvent être compensées par la protéine APLP-2, qui est également fortement exprimée dans les plexus choroïdes. Si cette compensation n'est pas suffisante, on peut surexprimer le sAPP sous forme recombinante dans les 20 cellules épithéliales des plexus choroïdes. Dans ce cas, l'oligonucléotide antisens ou l'ARNi utilisé pour inhiber la synthèse de la protéine PAPP sera préférentiellement dirigé contre une région du gène codant pour la partie C-terminale de cette protéine, afin de ne pas interférer avec la synthèse 25 du sAPP recombinant. Si l'on choisit d'inhiber l'activité du peptide Ap, on peut utiliser dans ce but un anticorps ou un fragment d'anticorps sélectivement dirigé contre ce peptide et capable de bloquer son activité. De nombreux anticorps possédant 30 cette propriété sont connus en eux-mêmes ; à titre d'exemples non-limitatifs, on citera scFV APIB, SCEVAPKDEIB (SUDOL et al. , Mol Ther, 17, 2031-40, 2009), scFV59 (FUKUCHI et al., Neurobiol Dis, 23, 502-11, 2006), ou CBAJ342 (ZHANG et al., Neurobiol Dis, 14, 365-79, 2003). 35 Des vecteurs utilisables dans le cadre de la présente invention pour l'expression des oligonucléotides antisens, des ARNi, du sAPP, ou d'anticorps dirigés contre le peptide Ap, dans les cellules du plexus choroïde sont des vecteurs viraux ciblant préférentiellement ces cellules. Il s'agit par exemple de vecteurs dérivés de virus adénoassociés (AAV) des sérotypes 2, 4 ou 5 (CACHON-GONZALEZ et al., Mol Ther, 20, 1489-500, 2012; DODGE et al., Mol Ther, 18, 2075-84, 2010; DONSANTE et al., Mol Ther, 19, 2114-23, 2011; WATSON et al., Hum Gene Ther, 16, 49-56, 2005). Quel que soit le vecteur choisi, on peut également placer l'oligonucléotide antisens, l'ARNi, le sAPP, ou l'anticorps dirigé contre le peptide AR, sera placé dans le vecteur choisi, sous contrôle d'un promoteur spécifique des cellules du plexus choroïde ; à titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs utilisables dans ce cadre, on citera le promoteur du gène CRFR2p (REGEV et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 4424-9, 2010), le promoteur de la transthyrétine (COSTA et al., Molecular and Cellular Biology, 6, 4697-708, 1986), ou celui du gène GPR125 (PICKERING et al., BMC Neuroscience, 9, 97, 2008). Le plexus choroïde a aussi l'avantage d'être facilement accessible par des voies peu invasives, en particulier via l'injection de substances pharmacologiques dans le système veineux et, plus favorablement, dans le sinus rétro-orbital qui est tout proche de la face baso-latérale du plexus choroïde. Il est donc possible d'adresser au plexus choroïde des molécules ou des vecteurs viraux pouvant modifier transitoirement ou de façon permanente l'expression et/ou la sécrétion du 3APP, du 8A4 et du sAPP par le plexus choroïde. Les maladies neurodégénératives pouvant être traitées conformément à l'invention sont notamment les formes 30 sporadiques et familiales de la maladie d'Alzheimer. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs démontrant l'expression de I3APP dans les plexus choroïdes, et décrivant la 35 construction de vecteurs viraux permettant de réguler cette expression ou d'inhiber l'activité du peptide PA4. EXEMPLE 1 : EXPRESSION DE LA PROTÉINE BAPP DANS LES PLEXUS CHOROÏDES. Nous avons comparé le niveau d'expression de 8APP et de deux molécules proches, APLP-1 et APLP-2, dans le plexus choroïde, l'hippocampe, la zone subventriculaire et le cortex visuel primaire d'une souris d'environ 8 semaines d'âge. Après dissection des tissus, les ARNs sont extraits et l'abondance des ARNs messagers pour les gènes APP, APLP1 et APLP2 sont déterminés par RT-qPCR grâce à des amorces spécifiques de chaque gène. Les niveaux d'expression sont rapportés à celui d'un géne de ménage, l'HPRT. Les résultats sont illustrés par la Figure 1 et le Tableau I ci-dessous. Légende de la Figure 1 et du Tableau I : 4ème ventricule : ChP 4V ; ventricules latéraux : ChP LV ; hippocampe : Hc) ; zone subventriculaire : SVZ ; cortex visuel primaire :V1. Tableau I APP APIP1 ApW2 ChP 4V 2.07 0.82 2.61 ChP LV 1.80 0.86 3.28 SVZ 0.82 1.03 1.19 Hc 1.00 1.00 1.00V1 1.58 115 1.59 Ces résultats montrent clairement que le plexus choroïde exprime 2 fois à 3 fois plus de transcrits d'APP et d'APLP2 que les autres structures. EXEMPLE 2 : CONSTRUCTION D'UN VECTEUR VIRAL POUR L'EXPRESSION 25 DE SAPP DANS LE PLEXUS CHOROIDE. La séquence codante pour sAPP (nt 201-2213 de NM 000484, Genbank) est insérée dans un vecteur lentiviral dérivé de pTRIPâU3[PGK+beta2/IRES2+eGFP+WPRE] (MASKOS et al., 2005, Nature 436: 103-107), en aval du promoteur FoxJl qui 30 n'est pas actif dans les cellules neuronales (ZHANG et al., 2007, Am J Respir Cell Mol Biol 36: 515-519), et en amont de la séquence codante d'un peptide intermédiaire (P2A, KIM et al., 2011, PLoS one 6(4) e18556) suivie de celle de la GFP. Le plasmide résultant (pLFsAPP-P2Gfp) est cotransfecté avec les plasmides codant pour les protéines virales requises dans une lignée d'empaquetage appropriée (HEK 293T). Les particules virales sont ensuite récupérées dans le milieu de culture, concentrées et titrées. Les lentivirus obtenus sont injectés dans le sinus retro-orbital, d'où ils ont un accès privilégié au plexus choroïde. EXEMPLE 3: CONSTRUCTION D'UN VECTEUR POUR L'EXPRESSION D'UN 10 ANTICORPS À SIMPLE CHAÎNE CONTRE LE PA4 Les ARNm extraits d'hybridomes exprimant un anticorps monoclonal anti-(3A4 tel que scFV Ar, scFvApKDEIB (SUDOL et al., 2009, précité), scFV59 (FUKUCHI et al., 2006, précité) ou CBAP42 (ZHANG et al., 2003, précité), sont 15 utilisés pour amplifier séparément les parties variables des chaines lourdes et légères selon le protocole décrit par BARBAS et al. (2001, "Phage display, a laboratory manual", CSHL Press) adapté dans le laboratoire (LESAFFRE et al., Neural Development, 2, 2, 2007). Disposés de part et d'autre 20 de la séquence codante d'un long lieur flexible, ces minigènes sont fusionnés à une étiquette formée de 6 tag myc, et introduits dans le vecteur lentiviral bi-cistronique décrit ci-dessus (Cf. Exemple 2). Le plasmide résultant (pLFsabA4-P2Gfp) est 25 utilisé pour produire des lentivirus qui sont injectés comme décrit ci-dessus (cf. Exemple 2). REVENDICATIONS1) Inhibiteur de la synthèse de la protéine pAPP ou de l'activité du peptide AR, pour l'utilisation comme médicament pour l'administration aux plexus choroïdes pour le traitement d'une maladie neurodégénérative. 2) Inhibiteur de la synthèse de la protéine pAPP pour l'utilisation comme médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est choisi parmi les oligonucléotides antisens et les ARNs interférents dirigés contre le gène codant pour cette protéine. 3) Inhibiteur de l'activité du peptide AR pour l'utilisation comme médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est un anticorps ou un fragment d'anticorps sélectivement dirigé contre ledit peptide. 4) Inhibiteur de la synthèse de la protéine pAPP ou de l'activité du peptide AR, pour l'utilisation comme médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est administré à l'aide d'un vecteur viral permettant son expression spécifique dans les cellules des plexus choroïdes.