Brevet FR3004537A1 — publié le 20141017

Procédé de mesure d'un milieu d'intérêt par résonance de plasmon de surface et système associé Domaine de l'invention L'invention concerne un procédé et un système de mesure d'un milieu d'intérêt par résonance de plasmon de surface. Etat de l'art Les biocapteurs présentent de nombreux domaines d'application. Ils sont ainsi utilisés pour la quantification de biomolécules. Certains biocapteurs reposent sur des techniques de lecture optique. Les techniques par fluorescence présentent une grande sensibilité de mesure mais nécessitent un marquage préalable des molécules à analyser. Il en résulte un surcoût associé important et un temps de préparation considérable. Elles modifient aussi la structure des molécules à analyser ce qui peut introduire un biais. Le plasmon de surface (SP) est un mode d'oscillation d'électrons de conduction d'un métal à l'interface avec un diélectrique. Il se manifeste sous la forme d'une onde qui se propage le long de l'interface, l'onde étant associée à un champ électromagnétique évanescent, c'est-à-dire qu'il est confiné à la surface (décroissance exponentielle). Une technique développée pour les biocapteurs et utilisant des SP est désignée sous le nom de SPR (pour « Surface Plasmon Resonance »). La configuration standard comprend une couche métallique séparant 2 milieux diélectriques : le milieu d'intérêt et un milieu d'indice de réfraction plus élevé. Une première surface du film métallique à l'interface avec le milieu d'indice élevé est éclairée par une onde lumineuse incidente. Lorsque les conditions de résonance plasmonique sont réunies, un SP se propage à l'interface entre la couche métallique et 1 le milieu d'intérêt, au niveau d'une deuxième surface de la couche métallique opposée à la première surface. L'onde lumineuse traverse par exemple un prisme afin d'assurer un couplage entre l'onde incidente et le plasmon de surface se propageant à l'interface couche métallique et milieu d'intérêt. La deuxième surface peut être fonctionnalisée ; elle peut ainsi présenter des biomolécules fixées, les biomolécules pouvant s'associer sélectivement avec une molécule d'intérêt dont on veut mesurer la présence dans le milieu d'intérêt. Au couplage entre la lumière incidente et le SP est associé un angle d'incidence de résonance OSP. A cet angle de résonance OSP correspond une baisse abrupte et un minimum de l'intensité du faisceau réfléchi par la première surface issu de la lumière incidente. Cette valeur OSP dépend fortement de l'indice optique du milieu d'intérêt au voisinage de la deuxième surface, et donc de la concentration en molécules au niveau de la deuxième surface, et donc de l'association entre les biomolécules fixées et les molécules d'intérêt. A partir de l'évolution de l'intensité réfléchie en fonction de l'angle d'incidence, on mesure la variation temporelle de l'indice de réfraction local proche de l'interface métal/milieu d'intérêt. Ceci permet de quantifier les molécules d'intérêt qui se sont liées à la surface et de suivre leur dynamique d'association et de dissociation avec l'interface fonctionnalisée. Il est ainsi possible de mesurer la présence de molécules d'intérêt dans le milieu d'intérêt sans réaliser de marquage préalable de ces molécules. A ce jour, la lecture optique des systèmes SPR peut se faire de différentes façons : La première propose de balayer l'angle d'incidence afin de reconstituer le pic d'absorption et de mesurer la variation de la position angulaire du maximum d'absorption OSP ou bien la variation de la position angulaire de la pente maximale du pic d'absorption 2 Une autre méthode propose de se fixer à une position angulaire proche de la résonnance qui maximise la variation de la réflectivité en fonction de la concentration en biomolécules. On mesure alors la variation d'intensité de la réflectivité. Cette méthode possède l'avantage d'être plus rapide car elle ne nécessite pas de balayage. On se place en général au niveau de la pente maximale du pic d'absorption en fonction de l'angle d'incidence, ce qui maximise la sensibilité du capteur. il est aussi possible d'utiliser une source lumineuse polychromatique et d'étudier le décalage spectral de la résonance. Certaines configurations, dites SPRi (pour imagerie SPR) proposent d'effectuer une imagerie SPR permettant un multiplexage, c'est-à-dire plusieurs mesures en parallèle, en cartographiant un champ électromagnétique réfléchi. Il est ainsi possible de mesurer plusieurs interactions en des zones différentes de la couche métallique. Le système SPRi-PIexTM de la société Genoptics, est un exemple commercial de ce type de configuration. Cependant dans ces systèmes basés sur la lecture optique du faisceau réfléchi, la parallélisation des mesures est limitée par une faible résolution latérale due à la présence du prisme qui ne permet pas de s'approcher de l'interface couche métallique/milieu d'intérêt ; ceci limite l'ouverture numérique du système de collection. Augmenter la résolution spatiale de ces systèmes nécessite d'élargir la dispersion angulaire du faisceau réfléchi. Cette dispersion est liée à celle du faisceau incident. Or, la sensibilité à la variation de l'indice de réfraction dépend, au premier ordre, de l'inverse de la dispersion angulaire. La résolution spatiale et la sensibilité de la cartographie SPR sont donc deux paramètres complémentaires. L'augmentation du multiplexage se fait donc au détriment de la sensibilité du biocapteur. Pour s'affranchir du désavantage du prisme, il 3 est possible de le substituer par un objectif à grande ouverture numérique à immersion dans l'huile dans une configuration en réflexion totale interne. De la même façon qu'en imagerie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF), l'angle d'incidence 0 du faisceau dépend de la position p du faisceau dans le plan focal arrière de l'objectif (pupille de l'objectif). B = asin(fla) , avec le paramètre géométrique a dépendant de l'objectif et de l'indice de l'huile. Cette géométrie est utilisée en imagerie SPR pour cartographier en particulier des membranes cellulaires. Cependant la sensibilité à l'indice optique de cette configuration est bien plus faible car la dispersion angulaire du faisceau incident dépend de la taille 4p du faisceau focalisé dans le plan focal arrière. Op At9 = ,\11 - (D2 La dispersion angulaire devient ainsi de plus en plus conséquente lorsque l'on s'approche des grands angles d'incidence nécessaires aux conditions d'excitation du SP. De plus, en pratique, le réglage du faisceau incident, et notamment la maitrise de sa dispersion angulaire, lors de son passage par l'objectif s'avère très délicat. Les documents W02009078511 et W02011105692 décrivent des systèmes de mesure par marquage fluorescent et imagerie de fluorescence, l'intensité du rayonnement produit par les marqueurs fluorescents associés aux biomolécules fixées sur un support étant augmentée en soumettant ces molécules à un champ électromagnétique par SPR. Ces systèmes présentent les inconvénients liés au marquage cités précédemment. Le document W03091713 décrit un système permettant de réaliser en parallèle une mesure par marquage fluorescent et une mesure par imagerie SPR de réflexion. L'imagerie par marquage fluorescent fournit 4 des informations quantitatives uniquement par le nombre de molécules marquées détectées est reste donc peu précise par rapport à l'imagerie SPR. L'imagerie SPR présente les mêmes inconvénients décrits ci-avant de diminution de la précision lors d'une mise en parallèle. Présentation générale de l'invention Un but de l'invention est de fournir un procédé et un système de mesure qui ne présente pas les inconvénients des systèmes décrits ci- avant. Un but de l'invention est ainsi de présenter une plus grande résolution latérale en conservant une grande sensibilité. Un autre but de l'invention est de proposer un procédé et un système de mesure présentant ces avantages sans impliquer une 15 augmentation de la complexité du système ou du procédé associé. A cet effet, il est prévu un procédé de mesure d'un milieu d'intérêt par résonance de plasmon de surface, le procédé comprenant des étapes consistant à : - éclairer par une source lumineuse une première surface d'une 20 couche métallique d'un support disposé entre le milieu d'intérêt et la source lumineuse, - produire, au niveau d'une deuxième surface de la couche métallique, à une interface avec le milieu d'intérêt, un premier champ électromagnétique évanescent de plasmon de surface, 25 - soumettre le premier champ électromagnétique évanescent à un milieu diffusant ou luminescent comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à diffuser ou émettre par luminescence dans le milieu d'intérêt un deuxième champ électromagnétique fonction 30 du premier champ électromagnétique, 5 - réaliser une mesure de résonance de plasmon de surface, par un capteur de lumière, du deuxième champ électromagnétique diffusé ou émis par luminescence, - obtenir une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en transmission à partir du deuxième champ électromagnétique mesuré. L'invention peut être avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises seules ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles - la cartographie obtenue est une cartographie de la variation d'une concentration moléculaire à l'interface, - la cartographie obtenue est une cartographie de variation de densité de matière à l'interface, - la cartographie obtenue est une cartographie d'indice optique à l'interface, - l'imagerie de plasmon de surface est une imagerie de plasmon de surface plein champ, - dans lequel le milieu diffusant ou luminescent est une couche diffusante ou luminescente solide du support, - une couche en un matériau diélectrique est disposée entre la couche métallique et la couche diffusante ou luminescente solide, - une étape de fonctionnalisation par un traitement une surface de la couche diffusante ou luminescente solide destinée à être mise en contact avec le milieu d'intérêt, - la couche diffusante ou luminescente solide est obtenue par un traitement chimique superficiel de la couche métallique, - la couche diffusante ou luminescente solide est obtenue par dépôt de fluorochromes et/ou de boîtes quantiques, 6 - la couche diffusante ou luminescente solide est obtenue par dépôt d'une couche de polymères luminescents ou de chaînes carbonées luminescentes, - le milieu diffusant ou luminescent comprend un état de rugosité d'une surface, - le milieu diffusant ou luminescent est un milieu liquide dans lequel sont dissouts les éléments diffusants ou luminescents. L'invention concerne également un système de mesure par résonance de plasmon de surface d'un milieu d'intérêt adapté pour mettre 10 en oeuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système comprenant : - un support en contact avec le milieu d'intérêt, le support comprenant une couche métallique, - une source lumineuse, le support étant disposé entre le milieu 15 d'intérêt et la source lumineuse, pour éclairer une première surface de la couche métallique selon un angle ; la source lumineuse et le support étant adaptés pour produire, au niveau d'une deuxième surface de la couche métallique, à une interface avec le milieu d'intérêt, un premier champ électromagnétique 20 évanescent de plasmon de surface, - un milieu diffusant ou luminescent, le milieu diffusant ou luminescent comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à diffuser ou émettre par luminescence un deuxième champ 25 électromagnétique fonction du premier champ électromagnétique à partir du premier champ électromagnétique évanescent transmis aux éléments diffusants ou luminescent, - un capteur de lumière disposé de sorte à mesurer le deuxième champ électromagnétique diffusé ou émis par luminescence, 30 - des moyens de traitement de données de plasmon de surface du deuxième champ électromagnétique, les données étant 7 issues des mesures du capteur de lumière, les moyens de traitement de données étant adaptés pour obtenir une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en transmission. L'invention concerne en outre l'utilisation d'un tel procédé ou d'un 5 tel système pour une cartographie d'imagerie de plasmon surface d'une membrane cellulaire fonctionnalisée disposée dans le milieu d'intérêt. Présentation des figures 10 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront lors de la description ci-après d'un mode de réalisation. Aux dessins annexés : - la figure 1 représente un système selon un exemple de mode de 15 réalisation de l'invention, - la figure 2 représente un support d'un système selon un exemple de mode de réalisation de l'invention, - la figure 3 représente un support fonctionnalisé d'un système selon un exemple de mode de réalisation de l'invention, 20 - la figure 4 illustre une utilisation pour l'imagerie membranaire d'un système ou d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention, - la figure 5 représente sous forme d'un graphique des données mesurées au cours d'un procédé selon un exemple de mode de 25 réalisation de l'invention en fonction de l'angle d'excitation d'une solution eau-éthanol, - la figure 6 représente sous forme d'un graphique l'évolution de l'indice optique d'une solution eau-éthanol en fonction du temps obtenue par un procédé selon un exemple de mode de réalisation 30 de l'invention, 8 - la figure 7 représente sous forme d'un graphique une tomographie d'un motif lithographié de silice obtenu par un procédé selon un exemple de mode réalisation de l'invention, - la figure 8 représente sous forme d'un organigramme un procédé selon un exemple de mode de réalisation de l'invention. Description de l'invention Système de mesure En référence à la figure 1, un système de mesure par résonance de plasmon de surface d'un milieu d'intérêt 100 est décrit. Le milieu d'intérêt est par exemple un milieu liquide dont on veut mesurer une concentration moléculaire, ou la concentration moléculaire en un certain élément cible, par exemple une biomolécule. Support En référence à la figure 2, le système comprend un support 300 en zo contact avec le milieu d'intérêt 100. Le support 300 comprend une couche métallique 310. La couche métallique présente une première surface 312 et une deuxième surface 314. La couche métallique peut comprendre une couche mince d'or ou d'argent, ou d'un autre métal ou alliage métallique adapté. La couche 25 métallique peut avoir une épaisseur de 20 à 100 nm, par exemple une épaisseur de 40 à 65 nm, par exemple une épaisseur de 50 nm. Ainsi, la couche métallique est par exemple une couche mince d'or ou d'argent de 30 à 80 nm d'épaisseur. Le support peut comprendre une couche de substrat 320. La 30 couche de substrat 320 peut être réalisée en un matériau transparent, par exemple en un verre, par exemple en silice. La couche de substrat 320 9 peut être réalisée en un matériau transparent possédant un indice de réfraction supérieur à celui du milieu d'intérêt. La couche de substrat 320 est par exemple une lame de verre ou un prisme, un dépôt métallique pouvant être directement réalisé sur un prisme. La couche métallique peut 5 avoir été déposée sur la couche de substrat 320. La couche de substrat 320 peut être réalisée de sorte à assurer la robustesse du support 300, par exemple pour renforcer la couche métallique 310 et assurer une meilleure durabilité du support 300. La couche de substrat 320 peut présenter une épaisseur supérieure à celle de la couche métallique 310. 10 La couche de substrat a par exemple une épaisseur comprise entre 100 et 500 nm. L'interface substrat 320 / couche métallique 310 peut être située sur la première surface 312 de la couche métallique. En outre, une sous-couche dite d'adhésion peut être disposée entre la couche métallique 310, 15 présentant les propriétés plasmoniques, et le substrat 320 afin d'assurer l'adhésion de la couche métallique 310. La sous-couche mesure par exemple quelques nanomètres. La sous-couche peut être par exemple en chrome ou titane. zo Source lumineuse Le système comprend une source lumineuse 200. Le support 300 est disposé entre le milieu d'intérêt 100 et la source lumineuse 200. La couche de substrat 320 est par exemple disposée entre la couche métallique 310 et la source lumineuse 200. 25 La source lumineuse 200 peut être une source d'un faisceau lumineux incident 420, par exemple d'un rayonnement monochromatique. La source lumineuse 200 est par exemple une source d'un rayonnement monochromatique cohérent, par exemple de type laser. La source lumineuse 200 est par exemple une source d'un rayonnement 30 monochromatique non cohérent, par exemple une diode électroluminescente. 10 La source lumineuse 200 et le support 300 sont adaptés pour produire au niveau de la deuxième surface 314 de la couche métallique 310 un premier champ électromagnétique 460 évanescent de plasmon de surface. La source lumineuse 200 permet d'éclairer la première surface 312 de la couche métallique 310. Cet éclairage est réalisé selon un angle de sorte produire, au niveau de la deuxième surface 314 de la couche métallique 310, le premier champ électromagnétique 460 évanescent de plasmon de surface. L'angle est par exemple un angle d'incidence 10 spécifique de plasmon de surface correspondant à une réflexion totale du champ propagatif correspondant, correspondant ainsi à un pic d'absorption de lumière réfléchie, par exemple du faisceau réfléchi 440. Le premier champ électromagnétique 460 évanescent est produit à une interface avec le milieu d'intérêt 100. Par interface entre la deuxième 15 surface 314 et le milieu d'intérêt, on entend la zone les séparant. L'interface peut ainsi se réduire à une surface d'interaction entre les deux, ou comprendre une zone d'une épaisseur donnée non nulle. L'interface est d'une épaisseur suffisamment faible pour que le premier champ électromagnétique 460 évanescent dépende du milieu d'intérêt, en 20 particulier de l'indice optique du milieu d'intérêt au voisinage de la deuxième surface 324. Une telle influence est typiquement sensible sur une profondeur de l'ordre de 100 nm, qui correspond à l'ordre de grandeur de pénétration du premier champ électromagnétique 460 évanescent. Le système peut comprendre un prisme 350. Le prisme 350 est par 25 exemple un prisme en verre. Le support 300 peut être posé sur le prisme 350. La continuité d'indice entre le support 300 et le prisme 350 peut être assuré par un fluide de couplage, par exemple de l'huile. Alternativement, le support peut reposer et être en contact avec un fluide de couplage tel que de l'huile, le fluide de couplage se substituant alors au prisme. Un 30 milieu diélectrique peut ainsi être formé et comprendre le prisme 350 et/ou l'huile et/ou la couche de substrat. 11 Milieu diffusant ou luminescent Le système comprend un milieu diffusant ou luminescent 330. Le milieu diffusant ou luminescent 330 comprend des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci. Les éléments diffusants ou luminescents sont répartis de sorte à diffuser ou émettre par luminescence un deuxième champ électromagnétique 480 fonction du premier champ électromagnétique 460. Le deuxième champ électromagnétique 480 est un champ Io électromagnétique propagatif. Par stable on entend que la répartition est conservée durant une période de temps déterminée durant laquelle une étape de mesure est réalisée. La stabilité n'implique pas nécessairement que les éléments diffusants ou luminescents soient immobiles. La stabilité de la répartition 15 peut être obtenue par exemple par un système de microfluidique permettant de conserver une répartition locale stationnaire même si les éléments diffusants ou luminescents sont en mouvement. Le deuxième champ électromagnétique 480 est diffusé ou émis à partir du premier champ électromagnétique 460 évanescent transmis aux zo éléments diffusants ou luminescents. La profondeur de pénétration du premier champ électromagnétique 460 évanescent étant typiquement de l'ordre de 100 nm, une partie du milieu diffusant ou luminescent 330 est par exemple disposé dans un tel voisinage de la couche métallique 310. Le premier champ électromagnétique 460 peut par exemple exciter et 25 détecter les éléments diffusants ou luminescents situés dans ce voisinage, qui correspond par exemple à l'interface entre la deuxième surface 314 et le milieu d'intérêt 100. Contrairement aux techniques de marquage par luminescence, en particulier par fluorescence selon l'art antérieur, il n'est pas nécessaire de 30 marquer les molécules d'intérêt. Le marquage constitue une étape coûteuse aussi bien par le temps nécessaire au marquage que par le coût 12 élevé des marqueurs. Le marquage peut perturber, par ailleurs, la structure des molécules à analyser et introduire un biais dans la mesure. Ces raisons justifient l'utilisation des techniques de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur par rapport aux techniques de marquage selon l'art antérieur, en dépit de la plus faible sensibilité des premières par rapport aux deuxièmes. Dans le système décrit, le milieu diffusant ou luminescent ne constitue pas un marquage, ce qui permet de limiter le coût d'utilisation tout en bénéficiant d'une grande résolution latérale, offrant en particulier une bonne capacité de multiplexage. Le milieu diffusant ou luminescent peut être un milieu diffusant. Le milieu diffusant ou luminescent peut être un milieu luminescent. Par luminescence, on entend un phénomène de type fluorescence ou phosphorescence. Le milieu luminescent peut être un milieu fluorescent ou un milieu phosphorescent. Le milieu diffusant ou luminescent peut être une couche diffusante ou luminescente 330 solide du support 300. La couche diffusante ou luminescente 330 peut être disposée entre la couche métallique 310 et le milieu d'intérêt 100. La couche diffusante ou luminescente 330 solide peut être obtenue par un traitement chimique superficiel de la couche métallique 310, par exemple par oxydation superficielle. Le milieu diffusant ou luminescent peut comprendre un état de rugosité d'une surface 314. La couche métallique 310 est par exemple une couche d'argent, la couche diffusante résultante étant alors une couche d'oxyde d'argent. En effet, une telle couche d'oxyde d'argent présente typiquement une surface diffusante. La couche diffusante ou luminescente 330 solide peut être obtenue par dépôt de fluorochromes et/ou de boîtes quantiques. La surface d'une telle couche tournée vers le milieu d'intérêt 100 forme ainsi une surface fluorescente. La couche diffusante ou luminescente 330 solide peut être obtenue par dépôt d'une couche de polymères luminescents ou de chaînes 13 carbonées luminescentes. Une telle couche est par exemple ancrée à la deuxième surface de la couche métallique. Une couche en un matériau diélectrique (non représentée) peut être disposée entre la couche métallique 310 et la couche diffusante ou luminescente 330 solide. Une telle couche en matériau diélectrique peut ainsi permettre d'éviter des phénomènes de désactivation, par exemple de photo-blanchiment, ou d'extinction de luminescence (« quenching » en terminologie anglo-saxonne). Une surface de la couche diffusante ou luminescente 330 solide destinée à être mise en contact avec le milieu d'intérêt 100 peut être fonctionnalisée par un traitement. Une telle fonctionnalisation peut être réalisée en vue de mesures biochimiques ou d'observations biologiques. Cette fonctionnalisation peut être réalisée juste avant la mesure. La surface de la couche diffusante ou luminescente 330 peut être 15 biofonctionnalisée par avance. En référence à la figure 3, il est décrit un exemple de support 300 d'un tel système comprenant par exemple une couche diffusante ou luminescente 330 fonctionnalisée de sorte à présenter des biomolécules formant des ligands 332 ancrés à sa surface. Ces ligands 332 peuvent par exemple se lier avec certaines biomolécules 20 d'intérêt 110 que l'on veut quantifier dans le milieu d'intérêt 100. L'imagerie par plasmon de surface telle que mise en oeuvre par le système permet en effet une grande sensibilité vis-à-vis de la concentration moléculaire à l'interface entre le support 300 et le milieu d'intérêt 100. 25 En référence à la figure 4, il est décrit un exemple de support 300 d'un tel système pour l'imagerie cellulaire. L'absence de marquage de fluorescence est un atout. Un tel marquage peut en effet induire une perturbation de la biochimie cellulaire. Une cellule 120 peut présenter une membrane qui a partiellement au moins adhéré à la surface du support 30 300, par exemple à la surface de la couche diffusante ou luminescente 14 0 et peut ainsi être observée grâce au confinement du premier champ électromagnétique 460 évanescent. Le milieu diffusant ou luminescent peut-être issu de l'état de rugosité d'une surface 314 sans nécessairement impliquer la formation d'une nouvelle couche. Il est ainsi possible d'utiliser l'état de rugosité de la couche métallique augmentée ou non par un traitement corrosif de la deuxième surface 314 de la couche métallique 310. Le milieu diffusant ou luminescent peut être un milieu liquide dans lequel sont dissouts les éléments diffusants ou luminescents. Les éléments diffusants ou luminescents sont alors répartis de manière stable dans le milieu diffusant ou luminescent. En particulier, le milieu diffusant ou luminescent liquide peut ainsi être réparti dans le milieu d'intérêt 100, par exemple par dissolution, en conservant la répartition stable des éléments diffusants ou luminescents. Une possibilité est d'utiliser un système d'écoulement microfluidique du milieu d'intérêt pour assurer une stabilité de répartition. Le système permet donc l'utilisation de supports 300 nécessitant un coût du même ordre que celui des supports utilisés dans les systèmes de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur. L'ajout possible d'une couche diffusante ou luminescente 330 n'implique en effet pas de modification significative de coût de fabrication. Par ailleurs, des éléments diffusants ou luminescents utilisés pour un milieu diffusant ou luminescent liquide, tels que des colorants fluorescents, présentent un faible coût. De même, un traitement chimique permettant de produire une rugosité de surface, tel qu'une oxydation chimique, implique également un faible coût voire un coût nul si la rugosité obtenue lors de la fabrication de la couche, par exemple lors du dépôt métallique est suffisante. Capteur 15 Le système comprend un capteur de lumière 500. Le capteur de lumière 500 est disposé de sorte à mesurer le deuxième champ électromagnétique 480 diffusé ou émis par luminescence. Le capteur de lumière 500 est par exemple un objectif de microscope, par exemple un objectif de microscope à grande ouverture numérique. Le système décrit permet une amélioration du rendement par rapport aux techniques de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur car il permet d'accroître de plusieurs ordres de grandeur les possibilités de multiplexage. Moyens de traitement Le système comprend des moyens de traitement 600 de données relatives au premier champ électromagnétique 460 évanescent, en particulier relatives aux plasmons de surface, les données étant issues de la collection du deuxième champ électromagnétique 480. Les données en entrée des moyens de traitement 600 sont issues des mesures du capteur de lumière 500. Les moyens de traitement 600 de données sont adaptés pour obtenir une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en zo transmission. Les moyens de traitement donnent, en sortie, une cartographie de la concentration moléculaire proche de la deuxième surface par imagerie de plasmon de surface en transmission. 25 Procédé En référence à la figure 8, il est décrit un procédé de mesure d'un milieu d'intérêt 100 par résonance de plasmon de surface. Le procédé de mesure est par exemple mis en oeuvre au moyen du système 30 précédemment décrit. 16 Le procédé peut comprendre une première étape 700 de fonctionnalisation par un traitement de la surface du support -ou de la couche diffusante ou luminescente 330 solide- destinée à être mise en contact avec le milieu d'intérêt 100. Le procédé comprend une deuxième étape consistant à éclairer 710 par la source lumineuse 200 la première surface 312 de la couche métallique 310 du support 300 disposé entre le milieu d'intérêt 100 et la source lumineuse 200. Le procédé comprend une troisième étape consistant à produire 10 720, au niveau d'une deuxième surface 314 de la couche métallique 310, à une interface avec le milieu d'intérêt 100, un premier champ électromagnétique 460 évanescent de plasmon de surface. Le procédé comprend une quatrième étape consistant à soumettre 730 le premier champ électromagnétique 460 évanescent à un milieu 15 diffusant ou luminescent 330 comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à diffuser ou émettre par luminescence dans le milieu d'intérêt 100 un deuxième champ électromagnétique 480, par exemple propagatif, fonction du premier champ électromagnétique 460. 20 Le procédé comprend une cinquième étape consistant à réaliser 740 une mesure de résonance de plasmon de surface par un capteur de lumière 500 du deuxième champ électromagnétique 480 diffusé ou émis par luminescence. Le procédé comprend une sixième étape consistant à obtenir 750 25 une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en transmission à partir du deuxième champ électromagnétique 480 mesuré. On peut ainsi effectuer une cartographie en transmission des variations à l'interface entre le support 300 et le milieu d'intérêt 100, en particulier entre la deuxième surface 314 et le milieu d'intérêt, et donc une imagerie en 30 diffusion ou en luminescence de type résonance de plasmon de surface en transmission. 17 Un tel procédé et/ou un tel système permet(tent) d'améliorer la résolution latérale sans perte de sensibilité vis-à-vis des variations d'indice optique. En effet, l'imagerie de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur nécessite de collecter le signal réfléchi sur la première surface 312 de la couche métallique 310. Lorsque la mesure selon l'art antérieur est réalisée à l'aide d'un prisme d'indice élevé, le champ excitateur est une onde plane. Une telle mesure implique une faible résolution spatiale car la présence du prisme empêche de s'approcher suffisamment près de la première surface 312 et l'ouverture numérique lors de la mesure est ainsi réduite. Lorsque l'excitation selon l'art antérieur est réalisée à l'aide d'un objectif à grande ouverture numérique immergé dans l'huile, l'onde incidente présente une dispersion angulaire due à la taille finie du faisceau focalisé dans le plan focal arrière de l'objectif. Il en résulte une faible sensibilité à la variation de l'indice optique. Par ailleurs, le procédé et le système décrits permettent d'obtenir une cartographie plus précise et plus fidèle du premier champ électromagnétique 460 évanescent. En effet, l'imagerie utilisant la résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur induit des effets d'interférences lumineuses dans le signal réfléchi. Il en résulte un bruit supplémentaire. A l'inverse, dans le procédé décrit, lorsque le signal est émis, par exemple par luminescence sous la forme du deuxième champ électromagnétique 480, celui-ci est incohérent et ne présente pas un tel inconvénient. Le procédé peut permettre la collecte d'un signal avec une ouverture numérique limitée uniquement par le capteur de lumière 200 utilisé. En effet, le procédé se distingue de l'imagerie en résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur, qui nécessite la collecte d'un signal en réflexion de la première surface 312 de la couche métallique, par exemple le faisceau lumineux réfléchi 440. Ainsi, dans l'art antérieur, 18 l'ouverture numérique est considérablement réduite du fait de la difficulté à s'approcher suffisamment près de la première surface 312 de la couche métallique 310. Par ailleurs, la cartographie décrite permet d'étudier en une seule mesure les effets d'un facteur variable. En particulier, il est possible d'obtenir un gradient de concentration latérale du facteur à étudier grâce à un système impliquant un écoulement microfluidique du milieu d'intérêt. La microfluidique permet un contrôle de la quantité introduite au cours du temps. La cartographie obtenue peut être une cartographie de la variation d'une concentration moléculaire à l'interface. La cartographie obtenue peut être une cartographie de variation de densité de matière à l'interface. La cartographie obtenue peut être une cartographie d'indice optique à l'interface. En référence aux figures 5 et 6, des résultats de mesures de l'évolution temporelle de l'indice optique d'un mélange eau/éthanol au cours d'un tel procédé sont décrits. L'éthanol possédant un indice optique plus élevé que l'eau, est également plus volatile. Ainsi, par évaporation, l'indice optique décroît au cours du temps. En référence à la figure 5, un graphique représentant l'intensité lumineuse collectée normalisée en fonction de l'angle de rotation en degré, à différents temps de mesure en minute, est décrit. La mesure a été réalisée par un système tel que décrit précédemment, présentant un milieu luminescent consistant en des molécules fluorescentes de rhodamine 700 dissoutes dans le mélange eau/éthanol. Les courbes marquées par des points représentent des données expérimentales tandis que les courbes continues représentent les ajustements gaussiens correspondants pour chaque temps de mesure. Ces ajustements ont été réalisés pour déterminer la position angulaire du centre des courbes. Les différents niveaux de gris représentent des mesures à des temps différents. Ainsi la courbe continue 900 correspond aux mesures 19 effectuées à l'instant initial t = 0 min, la courbe continue 920 correspond aux mesures effectuées à l'instant t = 20 min, la courbe continue 940 correspond aux mesures effectuées à l'instant t = 42 min, la courbe continue 960 correspond aux mesures effectuées à l'instant t = 68 min. Le décalage dans le temps du pic de résonance est dû à l'évaporation de l'éthanol. En référence à la figure 6, un graphique représentant l'indice optique de la solution eau/éthanol en fonction du temps est décrit. La courbe 802 représente l'évolution de l'indice optique mesurée à l'aide du système de mesure par résonance de plasmon de surface décrit. La conversion de l'angle de résonance correspondant au centre des courbes repose sur un modèle théorique sur la base des conditions de Fresnel pour une multicouche d'indices de réfraction. La précision des mesures, représentée par des barres d'erreur sur la courbe 802, est de l'ordre de 10-4 unité d'indice optique. Une telle sensibilité n'est limitée que par l'instabilité de puissance de la source lumineuse 200, ici du laser utilisé et par les fluctuations thermiques de la salle où est effectuée la mesure, lors de la mesure. La courbe 801 représente l'évolution de l'indice optique mesurée 20 par un réfractomètre commercial environ 10 minutes avant et 10 minutes après les mesures effectuées par le système décrit. Cette mesure initiale et cette mesure finale sont représentées par des points. L'imagerie de plasmon de surface peut être une imagerie de plasmon de surface plein champ. Il n'est ainsi pas nécessaire de recourir 25 à un balayage de surface, comme dans le cas de certaines techniques de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur. Une imagerie de plasmon de surface plein champ telle que celle décrite permet un rendement supérieur aux techniques de multiplexage de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur. 30 En référence à la figure 7, un graphique d'une tomographie d'un motif lithographié de silice obtenue à l'aide du système et/ou du procédé20 de mesure par résonance de plasmon de surface décrit. Le motif lithographié est une marche passant de 15 nm d'épaisseur à 18 nm d'épaisseur. Les distances selon X et Y sont représentées en pm, la distance selon Z étant représentée en nm. L'épaisseur est représentée en nuance de gris, l'échelle étant en nm. Dans cette configuration, le signal est produit par la diffusion de la couche métallique induite par la présence de rugosité de la surface lors du dépôt du métal. L'utilisation du procédé et du système technique n'est pas limitatif en termes d'imagerie. Une telle utilisation peut être combinée à d'autres techniques afin de réaliser une imagerie multimodale. Ceci est aisé car l'observation par le capteur de lumière 400 est directe et non inversée. Un couplage peut en particulier être réalisé avec des techniques de fluorescence, par exemple de type PALM/STORM ou TIRF. 21 REVENDICATIONS1. Procédé de mesure d'un milieu d'intérêt (100) par résonance de plasmon de surface, le procédé comprenant des étapes consistant à : - éclairer (710) par une source lumineuse (200) une première surface (312) d'une couche métallique (310) d'un support (300) disposé entre le milieu d'intérêt (100) et la source lumineuse (200), - produire (720), au niveau d'une deuxième surface (314) de la Io couche métallique (310), à une interface avec le milieu d'intérêt (100), un premier champ électromagnétique (460) évanescent de plasmon de surface, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des étapes consistant à : - soumettre (730) le premier champ électromagnétique (460) 15 évanescent à un milieu diffusant ou luminescent (330) comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à diffuser ou émettre par luminescence dans le milieu d'intérêt (100) un deuxième champ électromagnétique (480) fonction du premier champ 20 électromagnétique (460), - réaliser (740) une mesure de résonance de plasmon de surface, par un capteur de lumière (500), du deuxième champ électromagnétique (480) diffusé ou émis par luminescence, - obtenir (750) une cartographie d'imagerie de plasmon de 25 surface en transmission à partir du deuxième champ électromagnétique (480) mesuré. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cartographie obtenue est une cartographie de la variation d'une concentration 30 moléculaire à l'interface. 22 3004 53 7 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cartographie obtenue est une cartographie de variation de densité de matière à l'interface. 5 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cartographie obtenue est une cartographie d'indice optique à l'interface. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'imagerie de plasmon de surface est une imagerie de 10 plasmon de surface plein champ. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le milieu diffusant ou luminescent est une couche diffusante ou luminescente (330) solide du support (300). 15 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel une couche en un matériau diélectrique est disposée entre la couche métallique (310) et la couche diffusante ou luminescente (330) solide. 20 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, comprenant en outre une étape (705) de fonctionnalisation par un traitement une surface de la couche diffusante ou luminescente (330) solide destinée à être mise en contact avec le milieu d'intérêt (100). 25 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel la couche diffusante ou luminescente (330) solide est obtenue par un traitement chimique superficiel de la couche métallique (310). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans 30 lequel la couche diffusante ou luminescente (330) solide est obtenue par dépôt de fluorochromes et/ou de boîtes quantiques. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel la couche diffusante ou luminescente (330) solide est obtenue par dépôt d'une couche de polymères luminescents ou de chaînes carbonées 5 luminescentes. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le milieu diffusant ou luminescent comprend un état de rugosité d'une surface (314). 10 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le milieu diffusant ou luminescent est un milieu liquide dans lequel sont dissouts les éléments diffusants ou luminescents. 15 14. Système de mesure par résonance de plasmon de surface d'un milieu d'intérêt (100) adapté pour mettre en oeuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système comprenant : - un support (300) en contact avec le milieu d'intérêt (100), le support comprenant une couche métallique (310), 20 - une source lumineuse (200), le support (300) étant disposé entre le milieu d'intérêt (100) et la source lumineuse (200), pour éclairer une première surface (312) de la couche métallique (310) selon un angle, la source lumineuse (200) et le support (300) étant adaptés pour produire, au niveau d'une deuxième 25 surface (314) de la couche métallique (310), à une interface avec le milieu d'intérêt (100), un premier champ électromagnétique (460) évanescent de plasmon de surface, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : - un milieu diffusant ou luminescent (330), le milieu diffusant ou 30 luminescent (330) comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à 24diffuser ou émettre par luminescence un deuxième champ électromagnétique (480) fonction du premier champ électromagnétique (460) à partir du premier champ électromagnétique (460) évanescent transmis aux éléments diffusants ou luminescent, - un capteur de lumière (500) disposé de sorte à mesurer le deuxième champ électromagnétique (480) diffusé ou émis par luminescence, - des moyens de traitement (600) de données de plasmon de Io surface du deuxième champ électromagnétique (480), les données étant issues des mesures du capteur de lumière (500), les moyens de traitement (600) de données étant adaptés pour obtenir une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en transmission. 15 15. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 13 ou d'un système selon la revendication 14 pour une cartographie d'imagerie de plasmon surface d'une membrane cellulaire fonctionnalisée disposée dans le milieu d'intérêt. 20 25