Brevet FR3002774A1 — publié le 20140905

LEVURES MUTANTES AYANT UNE PRODUCTION ACCRUE DE LIPIDES ET D'ACIDE CITRIQUE La présente invention concerne des levures mutantes présentant une production élevée de lipides et d'acide citrique. Il existe actuellement une surabondance en glycérol brut sur le marché, qui est principalement due à la demande croissante en bio-diésel (le glycérol étant le principal sous- produit de la production de bio-diésel). De même, de grandes quantités de glycérol aqueux sont générées lors de la production de bio-éthanol et/ou de boissons alcoolisées (par exemple par fermentation) ou lors de la saponification des graisses. La conversion du glycérol en produits à plus forte valeur ajoutée au moyen de technologies chimiques et/ou de fermentation présente un très fort intérêt. Certains microorganismes oléagineux sont capables de convertir des substrats, tels que des matières grasses ou du glycérol, en lipides, notamment en triglycérides et acides gras. Ces microorganismes oléagineux possèdent la capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides, à hauteur d'au moins 20% de leur matière sèche. Chez les levures, on trouve quelques espèces oléagineuses, dites non-conventionnelles, parmi lesquelles on peut citer celles appartenant aux genres Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodo,sporidium, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia (voir pour revues Beopoulos et al., 2009a ; Papanikolaou et al., 2011a et 2011b). Yarrowia lipolytica est une levure hémiascomycète. Elle est considérée comme un modèle de bioconversion pour la production des protéines, des enzymes et de dérivés lipidiques (voir pour revue Nicaud, 2012). Elle est naturellement présente dans des environnements pollués de pétrole et notamment dans les fractions lourdes, ce qui témoigne de son potentiel de dégradation des substrats organiques. Cette levure a déjà été testée avec succès pour sa capacité de dégradation des substrats organiques comme le naphthalène, le dibenzofurane et le trinitrotoluène (voir pour revue : Thevenieau et al., 2009a et 2009b ; Beopoulos et al., 2009b et 2009e). Y. lipolytica est l'une des levures oléagineuses les plus étudiées en raison non seulement de sa capacité à accumuler des lipides à hauteur de plus de 50% de sa matière sèche selon un profil de culture défini, mais aussi de sa capacité unique à accumuler de l'acide linoléique à des niveaux élevés (plus de 50% des acides gras produits) ainsi que des lipides à haute valeur ajoutée, tels que l'acide stéarique, de l'acide palmitique et de l'acide oléique, dans des proportions similaires à celles que l'on trouve dans le beurre de cacao (Papanikolaou et al., 2001 ; Papanikolaou et al., 2010). Y. lipolytica peut être efficacement cultivée sur une grande variété de composés hydrophobes (acides gras libres, triacylglycérols, n-alcanes, etc.), grâce à l'expression de familles multigéniques codant pour des enzymes clés impliquées dans la décomposition de ces composés (par exemple, acyl-CoA oxydases, lipases). L'assimilation de ces substrats lipidiques peut entrainer une modification de la composition en acides gras tant du substrat résiduel que de la matière grasse accumulée, ayant parfois comme résultat la synthèse de lipides avec des propriétés intéressantes (Papanikolaou et al., 2001 ; Beopoulos et al., 2009a ; Papanikolaou et al., 2010 ; 2011a et 2011b). La synthèse des lipides chez Y lipolytica s'effectue soit par la biosynthèse de novo d'acides gras via la production des précurseurs des acides gras comme l'acétyl-CoA et le malonyl-CoA et leur intégration dans la voie de biosynthèse des lipides (voie de Kennedy), soit par l'accumulation ex novo, via l'incorporation des acides gras préexistant dans le milieu de fermentation ou dérivant de l'hydrolyse des huiles, des graisses, des triglycérides et des esters méthyliques du milieu de culture et leur accumulation à l'intérieur de la cellule. Les voies principales de biosynthèse de novo des lipides chez Y lipolytica et Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae ; levure dite non-oléagineuse) sont bien conservées. Différents procédés ont été développés pour permettre la fermentation du glycérol par Y. lipolytica et le convertir en lipide d'organisme unicellulaire (SCO, « single tell oil ») et/ou en acide citrique (citrate) (Papanikolaou et al., 2002 ; Rywhiska et al., 2009 ; Beopoulos et al., 2009a). Les biosynthèses, à la fois de SCO et d'acide citrique, à partir du glycérol ou d'autres substrats (e.g., des hexoses) utilisés comme unique substrat ou en co-substrat dans les premières étapes de culture, sont biochimiquement équivalentes et s'effectuent après une limitation (carence) nutritionnelle dans le milieu de culture de Y. lipolytica, généralement une limitation en azote ou phosphate (Papanikolaou et Aggelis, 2009 ; Papanikolaou et al., 201 la). Plus précisément, pour la production de lipides (SCO), il faut imposer une limitation en azote en jouant sur le rapport C/N avec une forte concentration en carbone (C) et une faible concentration en azote (N) et pour la production d'acide citrique, il faut imposer une carence en azote uniquement. En outre, quand la croissance cellulaire de Y. lipolytica s'effectue sur des substrats à base de glycérol ou de sucre (« oses »), elle est capable soit de produire en grandes quantités uniquement des graisses intra-cellulaires (Tsigie et al., 2011 ; Fontanille et al., 2012) soit de produire uniquement de l'acide citrique sans accumuler des quantités importantes de lipides cellulaires (Anastassiadis et al., 2002 ; Papanikolaou et al., 2002 et 2008 ; Tai and Stephanopoulos, 2013). Il a été rapporté que selon les conditions de culture, Y. lipolytica peut produire simultanément de l'acide citrique (-50 g/L) et des lipides (-32% de sa matière sèche) (André et al., 2009), ou produire de manière séquentielle des lipides cellulaires et de l'acide citrique (Makri et al., 2010). La voie de biosynthèse impliquée lors d'une limitation en azote dans le milieu de culture des levures oléagineuses pour la production de lipides est connue (voir pour revue Beopoulos et al., 2009a). La limitation en azote active l'AMP désaminase, ce qui entraîne une diminution de la concentration d'AMP (adénosine monophosphate) dans les mitochondries. Cette diminution de la concentration d'AMP inhibe l'enzyme isocitrate déshydrogénase, qui catalyse la conversion de l'isocitrate en a-cétoglutarate (a-KG). L'aconitase catalyse l'isomérisation de l'isocitrate en citrate dans les mitrochondries. Le citrate sort alors des mitochondries et est transformé en acétyl-CoA et oxaloacétate par l'ATP-citrate dans le cytosol. L'acétyl-CoA accumulé en grande quantité dans le cytosol permet la synthèse d'acide gras également en grande quantité. Des souches de Y. lipolytica mutantes (obtenues par mutation naturelle ou génétiquement modifiées) capables de produire des quantités plus élevées de lipides ou d'acide citrique par rapport aux souches sauvages ont été obtenues. Par exemple, Rywifiska et al. (2009) ont obtenu des souches mutantes de Y. lipolytica acétate négatif (ace-; incapables de croître sur acétate comme seule source de carbone et d'énergie) capables de bio-convertir, en fermentation discontinue, le glycérol (utilisé comme substrat) en acide citrique plus efficacement que la souche sauvage dont elles dérivent. Tai et al. (2012) ont obtenu une souche de Y. lipolytica génétiquement modifiée sur-exprimant la diacylglycérol acyltransférase (DGA1) et l'acétyl-CoA carboxylase (ACC1) capable d'accroître la production de lipides à partir du glucose, dans des conditions de culture avec un rapport C/N fort ou modéré, par rapport à la souche sauvage dont elle dérive. Des souches mutantes capables d'accumuler des quantités de lipides plus importantes par rapport aux souches sauvages ont aussi été décrites dans les Demandes Internationales WO 2010/004141 et WO 2012/001144. Il apparaît donc souhaitable d'obtenir des souches mutantes de levure capables d'accumuler des quantités de lipides et/ou d'acide citrique plus importantes par rapport aux souches sauvages. De manière surprenante, les inventeurs ont montré qu'une souche de levure Yarrowia lipolytica génétiquement modifiée dont le gène PHD1 (présent sur le chromosome F, YALIOF02497g) codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase a été délété, et cultivé sur glycérol, présente non seulement une consommation ralentie de glycérol, mais aussi une production accrue de lipides et d'acide citrique, par rapport à la souche de levure Yarrowia lipolytica W29 de type sauvage dont elle dérive. Chez les levures, la 2-méthylcitrate déshydratase (EC 4.2.1.79) est une protéine mitochondriale qui catalyse la conversion du 2-méthylcitrate en 2-méthyl-cis aconitate dans le cycle du 2-méthycitrate du métabolisme du propionate (Uchiyama et al., 1982). En particulier, chez Yarrowia lipolytica, la 2-méthylcitrate déshydratase est une protéine de 520 acides aminés, codée par le gène PHD] (YALIOF02497g). La séquence d'acides aminés de la 2-méthylcitrate déshydratase de Y. lipolytica CLIB122 est disponible sous le numéro d'accès GI:50554999 (ou GI:49650778) dans la base de données GENBANK, et représentée par la séquence SEQ ID NO : 1. La séquence nucléotidique de l'ADNc codant cette 2-méthylcitrate déshydratase est disponible sous le numéro d'accès GI:50554998 dans la base de données GENBANK. Les Inventeurs ont déterminé que la séquence d'acides aminés de la 2-méthylcitrate déshydratase de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO : 1) présente au moins 55% d'identité et au moins 70% de similarité avec les 2-méthylcitrate déshydratases des hémiascomycètes, en particulier 62% d'identité et 73% de similarité avec celle de Saccharomyces cerevisiae disponible sous le numéro d'accès SACEOP06226p dans la base de données Génolevures (Sherman et al., 2009), 62% d'identité et 75% de similarité avec celle de Zygosaccharomyces rouxii disponible sous le numéro d'accès ZYROOF04466p dans la base de données Génolevures, 61% d'identité et 75% de similarité avec celle de Saccharomyces kluyveri disponible sous le numéro d'accès SAKLOB02948p dans la base de données Génolevures, 62% d'identité et 76% de similarité avec celle de Kluyverornyce,s' lactis var. lactis disponible sous le numéro d'accès KLLAOE14213p dans la base de données Génolevures, 59% d'identité et 74% de similarité avec celle de Remothecium gossypii disponible sous le numéro d'accès ERGOOG08404p dans la base de données Génolevures, 61% d'identité et 72% de similarité avec celle de Candida glabrata disponible sous le numéro d'accès CAGLOL09108p dans la base de données Génolevures, 67% d'identité et 78% de similarité avec celle de Pichia sorbitophila disponible sous le numéro d'accès PISOOA12716p dans la base de données Génolevures, et 67% d'identité et 79% de similarité avec celle de Pichia sorbitophila disponible sous le numéro d'accès PISO0B12783p dans la base de données Génolevures. Les Inventeurs ont également déterminé que la séquence d'acides aminés de la 2-méthylcitrate déshydratase de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO : 1) présente au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité avec les 2-méthylcitrate déshydratases de souches de Candida de la même clade que celle de Y. lipolytica, en particulier 98,7% d'identité et 99,6% de similarité avec celle de la souche de C. galli CBS9722, 97,9% d'identité et 99,4% de similarité avec celle de la souche de C. yakushimensis CBS10253, 96,5% d'identité et 98,1% de similarité avec celle de la souche de C. phangngensis CBS10407, 95,6% d'identité et 98,5% de similarité avec celle de la souche de C. alimentaria CBS10151, et 87,3% d'identité et 94% de similarité avec celle de la souche de C. hispaniensis CBS9996. L'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase dans une levure permet d'obtenir une souche de levure mutante capable de produire des lipides et de l'acide citrique lorsqu'elle est cultivée sur un milieu approprié (e.g., glycérol) non carencé. La présente invention a donc pour objet une souche mutante de levure, caractérisée en ce que l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche est inhibée. Ladite souche mutante de levure est capable de produire une plus grande quantité de lipides et/ou d'acide citrique que la souche parente de levure dont elle dérive. L'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase peut être totale ou partielle. La présente invention inclut toutes les souches de levures et notamment les 20 souches de levure appartenant aux genres Candida, Cryptoccocus, Hansenula, Kluyveromyces, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizzosaccharomyces, Trichosporon ou Yarrowia. De préférence, ladite souche de levure est une souche de levure oléagineuse. Les souches de levure oléagineuse sont bien connues de l'homme du métier. Elles possèdent la 25 capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides, à hauteur d'au moins 20% de leur matière sèche (voir Ratledge, 1994). Elles appartiennent généralement au genre Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium (e.g., Rhodosporidium toruloides), Rhodotorula (e.g., Rhodotura glutinis), Trichosporon ou Yarrowia. Une souche plus particulièrement préférée au sens de la présente invention est une 30 souche de levure de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica. On entend par 2-méthylcitrate déshydratase, une enzyme (EC 4.2.1.79) qui catalyse la conversion du 2-méthylcitrate en 2-méthyl-cis aconitate et qui possède au moins 55% d'identité, et par ordre croissant de préférence au moins 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité, ou 70% de similarité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de similarité avec la séquence d'acides SEQ ID NO : 1, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité et de similarité indiqués ici sont calculés à partir d'un alignement global des séquences d'acides aminés effectué à l'aide de l'algorithme « needle » (Needleman et Wunsch, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : « Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » : 0,5.L'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase peut être obtenue de diverses manières par des méthodes connues en elles mêmes. De préférence, ladite 2-méthylcitrate déshydratase comprend une région prpD (correspondant au domaine PRK09425 dans la base de données CDD ; Marchler-Bauer et al., 2011) présentant la séquence consensus SEQ ID NO : 8 (correspondant aux acides aminés 37 à 517 de la séquence SEQ ID NO : 1). De manière avantageuse, cette inhibition peut être obtenue par mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase. La mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression de ce gène, notamment au niveau du promoteur, conduisant à une inhibition de la transcription ou de la traduction de la 2-méthylcitrate déshydratase. Avantageusement, la mutation au niveau de la séquence codante est effectuée dans la séquence codant la région prpD de la 2-méthylcitrate déshydratase. La mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase peut être effectuée par génie génétique. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. Des méthodes permettant de déléter ou d'insérer une séquence génétique donnée chez la levure, en particulier chez Y. lipolytica, sont bien connues de l'homme du métier (voir pour revue Madzak et al., 2004). A titre d'exemple, on peut utiliser la méthode appelée POP IN / POP OUT qui a été utilisée chez les levures, particulièrement chez Y. lipolytica, pour la délétion des gènes LEU2, URA3 et XPR2 (Barth et Gaillardin, 1996). On peut également utiliser la méthode SEP (Maftahi et al., 1996) qui a été adaptée chez Y. lipolytica pour la délétion des gènes PDX (Wang et al., 1999). Avantageusement, on peut aussi utiliser la méthode SEP/Cre développée par Fickers et al. (2003) et décrite dans la Demande Internationale WO 2006/064131. En outre, des méthodes permettant d'inhiber l'expression ou l'activité d'une protéine de levure sont décrites dans la Demande Internationale WO 2012/001144. Une méthode très avantageuse selon la présente invention consiste à remplacer la séquence codante du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase par une cassette d'expression contenant la séquence d'un gène codant pour un marqueur de sélection (e.g., le gène URA3 [YALIOE26719g] codant pour l'orotidine-5'- phosphate décarboxylase). On peut aussi introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles dans le gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase, ayant pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou d'inhiber la transcription ou la traduction du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase. La mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase peut aussi être effectuée à l'aide d'agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Cette mutagenèse permet aussi d'introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles dans le gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase. Le gène muté codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase peut être identifié par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène. Outre la mutation conduisant à l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase, la souche mutante de levure selon la présente invention peut présenter une ou plusieurs mutations additionnelles. A titre d'exemples, on peut citer des mutations conduisant à une déficience de la bêta-oxydation des acides gras, telles que l'inhibition des gènes endogènes PEX, PDX1-6, MFE1, POT], et/ou conduisant à l'accumulation des lipides, telles que l'inhibition du gène endogène GUT2 et/ou la surexpression du gène endogène GPD1 (voir les Demandes Internationales WO 2010/004141 et WO 2012/001144) et/ou conduisant à une déficience de la remobilisation des triglycérides, tel que l'inhibition des gènes endogènes TGL3 et/ou TGL4 (voir la Demande Internationale WO 2012/001144). On peut également citer des mutations conduisant à une augmentation du rendement de production de lipides, telles que la surexpression des gènes endogènes ACC1, DGA] et/ou DGA2 (Tai et al., 2012, Beopoulos et al., 2012). Une souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche est inhibée, l'expression du gène endogène TGL4 de ladite souche est inhibée et les gènes endogènes GPDI et ACC1 de ladite souche sont surexprimés. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une souche mutante de levure selon la présente invention à partir d'une souche de levure parente, comprenant une étape de mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase telle que définie ci-dessus dans ladite souche de levure parente, et éventuellement en outre une étape de mutagenèse conduisant à l'inhibition d'un ou plusieurs des gènes endogènes PDXI-6. MFE1, TGL3, TGL4, GUT2, et/ou une étape de mutagenèse conduisant à la surexpression des gènes endogènes GPD], ACC1, DGAI et DGA2, de préférence une étape de mutagenèse conduisant à l'inhibition du gène TGL4 et une étape de mutagenèse conduisant à la surexpression des gènes endogènes GPD1 et ACC1. L'inhibition et/ou la surexpression des gènes endogènes peuvent être effectuées par génie génétique. Ladite souche de levure parente peut être une souche de levure de type sauvage (e.g., la souche de Y lipolytica W29) ou mutante (e.g., la souche de Y. lipolytica Pol d). Selon un mode de réalisation avantageux de ce procédé, l'étape de mutagenèse comprend la délétion de la séquence codante du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase et éventuellement le remplacement de cette séquence codante par une séquence exogène, telle que, par exemple, la séquence d'un gène codant pour un marqueur de sélection (e.g., le gène URA3). La présente invention a également pour objet un procédé pour augmenter la production de lipides et/ou d'acide citrique d'une souche de levure, caractérisé en ce que l'on inhibe dans ladite souche de levure l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase. L'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase peut être réalisée comme décrit ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé pour augmenter la production de lipides comprend en outre l'inhibition dans ladite souche de levure de l'expression d'un ou plusieurs des gènes endogènes PDXI-6, MFE1, TGL3, TGL4 et GUT2 et/ou la surexpression dans ladite souche de levure d'un ou plusieurs des gènes endogènes GPD1, ACCI, DGA1 et DGA2. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une souche mutante de levure selon la présente invention pour la production de lipides et/ou d'acide citrique. La production de lipides peut être favorisée par rapport à la production d'acide citrique lorsque la souche mutante de levure selon la présente invention est cultivée en contrôlant la valeur du rapport entre la vitesse de consommation de carbone et la vitesse de consommation d'azote, tel que décrit dans la Demande Internationale WO 2010/076432. La production de lipides peut aussi être favorisée par rapport à la production d'acide citrique en utilisant une souche mutante selon la présente invention surexprimant en outre les gènes codant pour l'ATP citrate lyase, l'ACC (acétyl-coA carboxylase), DGA1 (diacylglycérol acyltransférase 1) et/ou DGA2 (diacylglycérol acyltransférase 2). Des méthodes pour favoriser l'accumulation de lipides sont aussi décrites par Beopoulos et al. (2009). La présente invention a également pour objet un procédé de production de lipides et/ou d'acide citrique, comprenant une étape de culture d'une souche mutante de levure selon la présente invention sur un milieu approprié. Les méthodes pour extraire les lipides ou l'acide citrique qui sont produits par des levures en culture sont bien connues de l'homme du métier (Papanikolaou et al., 2001 ; 2002 et 2008 ; André et al., 2009). A titre d'exemple, les lipides totaux (extraits dans un mélange de Folch) peuvent être extraits selon la méthode décrite par Papanikolaou et al., 2001, et fractionnés selon les méthodes décrites par Guo et al., 2000 et Fakas et al., 2006, alors que les acides organiques produits et le glycérol résiduel peuvent typiquement être purifiés par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Selon un mode de réalisation préféré de ce procédé, le milieu contient comme source de carbone du glucose et/ou du glycérol, de préférence le milieu contient comme source de carbone du glycérol seulement. Le glycérol peut être brut ou pur. Avantageusement, ledit milieu n'est pas carencé en azote. La production de lipides peut être favorisée par rapport à la production d'acide citrique comme indiquée ci-dessus. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple non-limitatif illustrant l'augmentation de la production de lipides et d'acide citrique par une souche mutante de levure Y. lipolytica dans laquelle l'expression de la 2-méthylcitrate déshydratase est inhibée (souche JMY1203), par rapport à la souche sauvage de Y lipolytica W29 dont elle dérive, ainsi que des figures annexées : Figure 1 : Cinétique de la consommation d'ions ammonium (A), de la production de biomasse (B), de la consommation de glycérol (C) et de la production d'acide citrique total (D) au cours de la croissance des souches de Yarrowia lipolytica W29 et JMY1203 cultivées sur un milieu à base de glycérol (Glol) limité en azote. Conditions de culture : croissance dans des fioles de 250 ml à 185 t/mn, Glol0 = 90 g/L, pH initial = 6,0 ± 0,1 maintenu ensuite entre 4,8 et 6,0, TOD> 40% (v/v), température d'incubation de 28°C. Chaque point représente la moyenne de deux mesures indépendantes. Figure 2 : Cinétique des lipides totaux dans la biomasse sèche (%, p/p) au cours de la croissance des souches de Yarrowia lipolytica W29 (A) et JMY1203 (B) dans un milieu à base de glycérol limité en azote. Conditions de culture : croissance dans des fioles de 250 ml à 185 t/mn, Glolo = 40, 60 et 90 g/L, pH initial = 6,0 + 0,1 maintenu ensuite entre 4,8 et 6,0, TOD> 40% (v/v), température d'incubation de 28°C. Chaque point représente la moyenne de deux mesures indépendantes. EXEMPLE : OBTENTION ET CARACTÉRISATION D'UNE SOUCHE MUTANTE DE LEVURE YARROWIA LIPOLYTICA DANS LAQUELLE L'EXPRESSION DE LA 2-MÉTHYLCITRATE DÉSHYDRATASE EST INHIBÉE 1) Matériel et méthodes i) Souches et milieux La souche mutante de Y. lipolytica selon la présente invention est dérivée de la souche auxotrophique de Y. lipolytica Pol d (Leu Ura- ; CLIB 139 ; de génotype MatA Ura3-302, Leu2-270, xpr2-322), elle-même dérivée de la souche sauvage de Y. lipolytica W29 (de génotype MatA ; ATCC20460) par modification génétique. Les souches Pol d et W29 ont été décrites par Barth et Gaillardin (1996). Ces deux souches Pol d et W29 ne présentent pas de différences quant à la production de lipides et d'acide citrique. Les cellules de levure ont été cultivées sur les milieux YPD (Barth et al., 1996) ou YNBCas (YNBD avec casamino acides 0,2%) pour la sélection des transformants. La souche d'Escherichia coli Machl -T1 (Invitrogen) a été utilisée pour la transformation et l'amplification de l'ADN plasmidique recombinant. Les cellules ont été cultivées sur un milieu LB (Sambrook et al., 1989). La Kanamycine (40 ug/mL) a été utilisée pour la sélection des plasmides. h) Construction de la cassette de délétion YALI0F02497 Le gène PHD1 (YALI0F02497) de la souche de Y. lipolytica Po 1 d a été délété en remplaçant la région codante de ce gène par une cassette contenant le gène URA3 comme marqueur de sélection, selon la méthode d'invalidation de gène (« gene disruption ») décrite par Fickers et al. (2003). Plus précisément, les régions promotrices (P) et terminatrices (T) du gène YALI0F02497 [T1] ont été obtenues par amplification PCR de l'ADN génomique de Y. lipolytica W29 en utilisant les paires d'amorces YALI0F02497-P1 (SEQ ID NO : 2) / YALI0F02497-P2 (SEQ ID NO : 3) pour amplifier la région promotrice, et YALI0F02497-T1 (SEQ ID NO : 4) / YALI0F02497-T2 (SEQ ID NO : 5) pour amplifier la région terminatrice. Les amorces YALI0F02497-P2 et YALI0F02497-T1 ont été conçues pour introduire un site de restriction Iscel à l'extrémité 3' du fragment P et à l'extrémité 5' du fragment T. Les fragments P-Iscel et T-Iscel correspondants ont été regroupés et utilisés comme matrices pour l'amplification de la cassette P-Iscel-T avec le couple d'amorces YALI0F02497-P1 / YALI0F02497-T2. La cassette P-Iscel-T a été clonée dans le plasmide pCR4®Blunt-TOPO (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France), et transformée dans la souche d'E. cou Machl-T1 (Invitrogen). La construction résultante, dénommée pYALIOF02497-PT (JME739), a été vérifiée par analyse de restriction avec Iscel et séquencée. Le fragment loxR-URA3-loxP codant pour le gène URA3 a été excisé du plasmide JMP121 (Fickers et al., 2003) par restriction Iscel et cloné au site correspondant dans pYALIOF02497-PT de manière à insérer le marqueur de sélection URA3 entre le fragment P et T de la cassette P-Iscel-T au niveau du site Iscel. La construction résultante, dénommée pYALIOF02497-PUT (JME740) comprend la cassette PUT du gène YALI0F02497 (cassette YALI0F02497-PUT). La délétion AYALIOF02497::URA3 a été introduite dans la souche de Y lipolytica Pold (JMY195), selon la méthode décrite par Fickers et al. (2003), donnant lieu à la souche délétée JMY1203 (de génotype MatA, Ura3-302, Leu2-270, xpr2-322, AYALIOF02497....URA3). La cassette d'invalidation a été amplifiée par PCR et utilisée pour transformer la souche de Y. lipolytica Pold. Les transformants Ura+ ont été sélectionnés sur milieu YNBCas. L'invalidation du gène a été vérifiée par PCR en utilisant la paire d'amorces YALI0F02497-verl (SEQ ID NO: 6) / YALI0F02497-ver2 (SEQ ID NO: 7). Deux transformants (YALI0F02497-1 et YALI0F02497-5) présentaient un fragment PCR de 3,7 kb correspondant au gène invalidé. L'invalidation du gène dans ces deux transformants a été confirmée par Southern blot. iii) Conditions de culture La souche sauvage Y. lipolytica W29 et la souche génétiquement modifiée JMY1203 ont été utilisées pour les fermentations. Toutes les expériences ont été effectuées dans des fioles de culture sous agitation. Le milieu de culture utilisé contenait (en g/L): KH2PO4 7,0; Na2HPO4 2,5; MgSO4x7H20 1,5; CaC12x2H20 0,1; FeC13x6H20 0,15; ZnSO4x7H20 0,02; MnSO4XH2O 0,06 (Papanikolaou et al., 2002). Le sulfate d'ammonium et l'extrait de levure ont été utilisés comme sources d'azote à une concentration de 0,25 à 2,5 g/L respectivement. Le glycérol brut (Industrie hellénique de la glycérine et des acides gras SA ; pureté environ 70%, g/g, impuretés composées de sels de potassium et de sodium 12%, p/p, de matériau organique non-glycérol 1%, v/v, d'eau 17%, g/g et de méthanol Des fioles coniques de 250 ml remplies de 50 ± 1 mL de milieu de culture ont été inoculées avec 1 ml de pré-culture en phase exponentielle contenant 1-3x106 cellules (concentration de la biomasse initiale Xo environ 0,10 g/L). Les fioles ont été incubées à une température de 28°C et agitées à 180 t/mn dans un agitateur rotatif (New Brunswick Sc, États-Unis). La pré-culture a été effectuée dans le milieu synthétique mentionné ci-dessus avec du glycérol pur (pureté 98%) utilisé en tant que substrat à 20 g/L. iv) Méthodes analytiques Dans tous les essais, la production de biomasse sèche, la consommation de glucose ou de glycérol, la sécrétion d'acides organiques, la concentration d'azote résiduel et la production intra-cellulaire de lipides ont été évaluées. Le pH initial du milieu de culture était de 6,0 + 0,1. Au cours des cultures, le pH a été maintenu dans une plage comprise entre 4,8 et 6,0 par addition, périodiquement de KOH 5M. La tension en oxygène dissous (TOD en %, v/v) a été mesurée à l'aide d'une électrode sélective (oxi200 Sensodirect, Lovinbod). Tous les essais ont été effectués en conditions aérobiques (TOD> 40%, v/v, pour toutes les phases de croissance). Les cellules de levure ont été récoltées par centrifugation (Hettich Universal 320-R, Allemagne) à 10000xg/15 min et lavées 3 fois avec de l'eau distillée. La concentration en biomasse (X, g/L) a été déterminée par le poids sec (85±5°C/24 h). Le glycérol (Glol, en g/L), le glucose (Glc, en g/L) et les acides organiques ont été analysés par HPLC comme décrit par André et al. (2009). La concentration en acide iso-citrique a été déterminée par un procédé enzymatique, en mesurant le NADPH2 produit lors de la conversion de l'acide isocitrique en acide a-cétoglutarique, catalysée par l'iso-citrate déshydrogénase, comme décrit par Papanikolaou et al. (2002). La quantité totale d'acide citrique (acide citrique et isocitrique) produite a été caractérisée en tant que Cit (en g/L). La détermination des ions ammonium a été faite à l'aide d'une électrode sélective d'ammonium (Hach 95-12, Allemagne). Les lipides totaux cellulaires (L, en g/L) ont été extraits à partir de la biomasse sèche avec un mélange de chlorofointe/méthanol 2/1 (v/v) et ont été déterminés par gravimétrie. Les lipides cellulaires ont été fractionnés en leurs fractions lipidiques. Brièvement, un poids connu de lipides extraits (environ 200 mg) a été dissous dans du chloroforme (3 ml) et a été fractionné en utilisant une colonne (25 x 100 mm) d'acide silicique, activé par chauffage une nuit à 110°C (Fakas et al., 2006). Des applications successives de chloroforme, d'acétone et de méthanol produisent des fractions contenant des lipides neutres (N), des glycolipides plus des sphingolipides (G+S) et des phospholipides (P), respectivement (Guo et al., 2000 ; Fakas et al., 2006). Le poids de chaque fraction a été déterminé après évaporation du solvant respectif. Les lipides totaux cellulaires ou les fractions lipidiques individuelles ont été convertis en leurs acides gras esters méthyliques (FAME) au cours d'une réaction en deux étapes avec du sodium méthanolique et du méthanol chlorhydrique (Fakas et al., 2006). Cette méthode a été choisie de manière à éviter la trans- isomérisation des acides gras. Les FAMEs ont été analysés dans un appareil de chromatographie en phase gazeuse (GC-FID) (Fisons série 8000) selon Fakas et al. (2006). Les FAMEs ont été identifiés par comparaison à des étalons. 2) Résultats i) Croissance des souches de Y. lipolytica sur glucose ou glycérol brut Les souches de Y lipolytica W29 et JMY1203 ont été cultivées dans un milieu limité (carencé) en azote avec une concentration initiale en glycérol (Glo10) ou en glucose (G1c0) ajustée à 40 g/L. Les cultures de ces deux souches sur glucose sont considérées comme une base de comparaison. Les résultats de la cinétique sont décrits dans le Tableau 1 ci-après. Tableau 1 : Données quantitatives des souches de Y. lipolytica W29 et JMY1203 provenant de cultures sur milieu limité en azote et contenant du glucose ou du glycérol en tant que substrat à une concentration initiale de 40 g/L. Représentation de la biomasse (X, g/L), des lipides (L, g/L), de l'acide citrique total (Cit, g/L), du glycérol consommé (Glolcons, g/L) et du glucose consommé (Glccons, g/L) lorsque : la quantité maximale de lipides dans le poids sec de levure (%, g/g) (a) et la concentration maximale d'acide citrique total (b) sont atteintes. Conditions de culture : croissance dans des fioles de 250 ml à 185 t/mn, pH initial = 6,0 + 0,1 maintenu ensuite entre 4,8 et 6,0, TOD> 40% (v/v), température d'incubation de 28°C. Chaque point représente la moyenne de deux mesures indépendantes. Souche Source Temps (h) Gioleras (g/L) Giceras (g/L) X Lipides L Y-volo] Cit Yot/Glol de (g/L) (%, (g/L) (Yuoie) (g/L) (Ycivcie) (g/g) carbone g/g) (g/g) W29 Glc a 91,5 - 21,9 11,2 5,8 0,65 0,030 18,2 0,83 Glc b 170 - 37,0 11,0 2,4 0,26 0,007 31,4 0,85 JMY1203 Glc a 72,5 - 12,2 3,2 10,1 0,32 0,026 6,8 0,56 Glc b 150 - 34,5 1,8 5,1 0,09 0,003 15,2 0,44 W29 Glol a 72 12,9 - 10,7 10,0 1,07 0,083 6,0 0,47 Glol b 160 39,9 - 12,5 1,6 0,20 0,005 19,1 0,48 JMY1203 Glola 96 19,0 - 5,5 14,9 0,82 0,043 11,8 0,62 Glol b 160 39,9 - 7,0 10,0 0,70 0,018 31,0 0,78 Dans toutes les expériences et indépendamment de la source de carbone utilisée, les souches W29 et JMY1203 ont consommé, avec des taux comparables, l'azote extra-cellulaire disponible (NH4' initial à 55±10 ppm, épuisement de l'azote en 60 ± 5 heures après inoculation). La souche W29 présente une production de biomasse supérieure à celle de la souche JMY1203 sur les deux substrats, compris entre 10,7-12,5 g1L. Pour la souche JMY1203, la production de biomasse atteint un maximum de 7 g/L en présence de glycérol ; sur glucose, la concentration de biomasse diminue au cours de la culture jusqu'à 1.8 g/L, suggérant une lyse cellulaire en fin de culture. La production de citrate augmente après l'épuisement de l'azote du milieu, conduisant à sa sécrétion. Pour la souche W29, la production du citrate est supérieure sur glucose, atteignant Citmax=31,5 g/L avec un taux de conversion de Ycitio1c=0,85 g/g. Sur glycérol, la production de citrate maximale est 1,65 fois plus faible (Citmax19,1 g/L, taux de bioconversion en glycérol Yca/Gim=0,48 g/g) que sur milieu glucose et le taux de conversion a diminué de 56%. La souche JM1203 présente des caractéristiques opposées sur glucose ; la production de citrate et les taux de conversion sont de Citmax-15,2 g/L et "{nt/01°1-0,44 g/g, respectivement, alors que sur glycérol brut la Citmax était 2,04 fois plus élevée (31 g/L), correspondant à une augmentation de 37,4 % du taux de conversion atteignant 0,78 g/g. Ces résultats indiquent une différence du flux de carbone selon la croissance sur glucose ou glycérol pour les deux souches, qui présentent un phénotype opposé. De plus, même si la souche JMY1203 produit moins de biomasse comparé à la souche W29, elle présente une augmentation de 1,74 fois plus de lipides, atteignant 10,1%, g/g, du poid sec (PS) sur glucose et 1,49 fois plus de lipides sur glycérol, atteignant 14,9%, g/g, du PS. Le glycérol est un meilleur substrat en ce qui concerne l'accumulation de lipides pour ces deux souches. Une diminution rapide des lipides accumulés est observée pour la souche W29 ou le contenu lipidique diminue de 5,8 à 2,4%, g/g, du PS (diminution de 58% du taux de lipides) sur glucose et de 10 à 1,6%, g/g, du PS sur glycérol. Ceci démontre une remobilisation importante des lipides accumulés avec une augmentation simultanée de la production d'acide citrique, particulièrement en présence de glycérol. Pour la souche JMY1203, la quantité de lipides accumulés diminue de 10,1 à 5,1%, g/g, du PS (49,5% de diminution) sur glucose et de 14,9 à 10%, g/g, du PS (32,9% de diminution) sur glycérol. On observe alors que la souche W29 remobilise plus rapidement ces réserves lipidiques sur glucose que la souche JMY1203. Sur milieu glycérol la remobilisation est similaire pour les deux souches. ii) Croissance des souches de Y. lipolytica sur glycérol brut à des concentrations initiales en substrat élevées Des milieux limités en azote contenant la même quantité d'azote initiale que celle décrite précédemment mais une concentration initiale en glycérol brut plus élevée ont été utilisés (Glolo à 60 et 90 g/L). Les résultats de la cinétique sont décrits dans le Tableau 2 ci-après. Tableau 2 : Données quantitatives des souches de Y. lipolytica W29 et JMY1203 provenant de cultures sur milieu limité en azote à une concentration initiale constante et contenant du glycérol comme substrat à deux concentrations initiales différents (Glolo, g/L). Représentation de la biomasse (X, g/L), des lipides (L, g/L), de l'acide citrique total (Cit, g/L) et du glycérol consommé (Glolcons, g/L) lorsque : la quantité maximale de lipides dans le poids sec de levure (%, g/g) (a) et la concentration maximale d'acide citrique total (b) sont atteintes. Conditions de culture : croissance dans des fioles de 250 ml à 185 t/mn, Glolo = 60 ou 90 g/L, pH initial = 6,0 ± 0,1 maintenu ensuite entre 4,8 et 6,0, TOD> 40% (v/v), température d'incubation de 28°C. Chaque point représente la moyenne de deux mesures indépendantes. Souche Glolo Temps Glolco', X (g/L) Lipides L (g/L) Yucloi Cit Ycit/oioi (g/g) (g/L) (h) (g/L) (%, g/g) (g/g) (g/L) W29 60 a 72 19,7 7,6 9,5 0,73 0,037 1,9 0,10 60 b 226 59,9 10,7 4,1 0,44 0,007 27,0 0,45 JMY1203 60 a 72,5 16,0 3,1 19,0 0,59 0,031 4,1 0,26 60 b 281 60,1 3,9 10,5 0,41 0,007 45,5 0,76 W29 90 a 96 24,0 8,0 11,1 0,88 0,037 11,4 0,47 90 b 310 85,5 5,3 8,6 0,46 0,005 36,8 0,43 JMY1203 90 a 78 14,4 4,5 26,6 1,20 0,083 9,1 0,64 90 b 340 63,2 3,5 6,9 0,24 0,004 57,7 0,91 La représentation graphique des cinétiques des souches W29 et JMY1203 lors de l'essai Glolo = 90 g/L est montrée à la Figure 1. L'azote extra-cellulaire (NH4+ initial à 55 + 10 mg/L) a été épuisé à environ 60 h après inoculation pour les deux souches (Figure 1A). Le taux d'absorption de l'azote était similaire indépendamment de la concentration Glolo employée ou de l'utilisation du glucose comme substrat pour les deux souches testées (cinétiques non présentées). Malgré l'épuisement en azote, la concentration de la biomasse a nettement augmenté pour la souche W29, atteignant la valeur Xfna, d'environ 10 g/L après 150 h (Figure 1B) et puis a rapidement diminué. La souche JMY1203 présente un taux de croissance plus faible ; la production de biomasse a cessé après l'épuisement de l'azote assimilable du milieu de culture et a été maintenue constante jusqu'à la fin de la culture. La consommation de glycérol a été constante et quasi-linéaire pour les deux souches testées, à la fois dans les phases de croissance en azote équilibrée (0-60 h) et limitée (60 à 330 h), avec un taux de consommation du glycérol rGioi (= --.4Gol/z1t) de 0,26 g/L pour la souche W29, valeur nettement plus élevée que 0,18 g/L obtenu pour la souche JMY1203 (Figure 1C). Bien que de l'acide citrique ait été produit par les deux souches en phase de croissance équilibrée, la production de Cit s'est principalement effectuée après épuisement en azote du milieu. La production d'acide citrique semble être presque linéaire pour la souche W29 avec un taux de production d'acide citrique total rc,t (= 4Cilt4t) de 0,11 g/L, alors que cette valeur est 1,54 fois plus élevée pour la souche JMY1203 (0,17 g/L.h ; Figure 1D). Les deux souches présentent le même comportement quelle que soit la concentration en glycérol, ce qui indique que les taux de consommation du glycérol et de production du citrate sont souche dépendants (sauvage vs mutant). En ce qui concerne l'accumulation de lipides, les deux souches présentaient un comportement complètement différent (Figure 2A, B). Au cours de la phase non-limitante en azote et quelle que soit la concentration en glycérol, la souche W29 a accumulé des lipides avec un taux similaire, pour atteindre un maximum de 10% g/g du PS dans toutes les conditions testées. Cependant, après épuisement de l'azote, les lipides sont rapidement remobilisés à des concentrations faibles de glycérol, alors qu'à des fortes concentrations de glycérol les lipides ne sont pas remobilisés (Figure 3A). Ce comportement suggère une régulation de la voie de dégradation des lipides en fonction de la concentration de glycérol. En revanche, pour la souche JMY1203, l'accumulation lipidique dépend clairement de la concentration de glycérol pendant la phase de croissance où l'azote n'était pas limitant, tandis que la dégradation des lipides pendant la phase de carence en azote n'était pas affectée en fonction de la concentration en glycérol (Figure 3B). L'accumulation de lipides atteint 26,6%, g/g, du PS pour une concentration initiale de glycérol (Glolo) de 90 g/L, et 14,9% pour une Glolo de 40 g/L. La souche W29 a présenté une concentration plus élevée de la biomasse par rapport à la souche JMY1203. Comme précédemment, l'augmentation de la concentration Glolo a donné lieu à une diminution de la quantité de biomasse (X) produite par la souche W29, suggérant une potentielle inhibition du substrat. Une observation similaire peut être faite également pour la souche JMY1203, en tenant compte du fait que la quantité X est d'environ 7 g/L pour l'essai avec Glolo = 40 g/L, et environ 4 g/L pour l'essai avec Glolo = 90 g/L. D'une autre part, la concentration Cit (en g/L) a sensiblement augmenté avec l'augmentation de la concentration Glolo du milieu ; la souche W29 produit deux fois plus de citrate à Glolo = 90 g/L, par rapport au taux du citrate produit à Glolo = 40 g/L. Toutefois, le rendement de conversion de l'acide citrique produit par glycérol consommé (Ycit,G101) est resté relativement constant à 0,45 g/g (voir les Tableaux 2 ci-dessus et 3 ci-dessous), atteignant un maximum de 0,48 g/g, ce qui suggère être le seuil de bioconversion du glycérol en acide citrique pour la souche W29, dans ces conditions de culture. Pour la souche JMY1203, même si la biomasse obtenue était nettement plus faible par rapport à la souche W29, la production de citrate et le taux de bioconversion du glycérol augmentent avec la concentration en glycérol. La quantité de citrate est passée de 31 g/L à environ 58 g/L et le rendement de bioconversion du glycérol en acide citrique (valeur Yc,t/Gioi) est passé de 0,78 g/g à Glolo = 40 g/L à la valeur impressionnante de 0,91 g/g à Glol0 = 90 g/L. Ces valeurs représentent une augmentation de 1,6 fois pour la production de citrate et de 2,1 fois du rendement de conversion du glycérol en citrate, par rapport à la souche W29. L'acide citrique est le principal composé du citrate total produit, car le dosage de l'acide iso-citrique a montré que l'acide isocitrique était d'environ 5-8%, g/g, de l'acide citrique total produit quelle que soit la souche testée et la concentration Glolo du milieu. Dans l'essai avec la quantité Citma, atteinte, la quantité d'acide isocitrique dosée était d'environ 5%, g/g, du Cit. La valeur Ycit/Gioi exceptionnelle qui a été obtenue, montre que la souche génétiquement modifiée JMY1203 peut être utilisée pour favoriser la conversion du glycérol brut en acide citrique. iii) Analyse des lipides La composition en acide gras (AG) des lipides cellulaires produits a été étudiée à la fin des phases de croissance pour les deux souches cultivées sur glucose et glycérol brut. Elle est représentée aux Tableaux 3 (souche W29) et 4 (souche JMY1203) ci-après. Tableau 3 : Composition en acides gras des lipides cellulaires totaux produits par la souche Yarrowia lipolytica W29 au cours de sa croissance dans un milieu limité en azote contenant du glucose (à 40 g/L) ou du glycérol (à 40, 60 ou 90 g/L). Les conditions de culture sont identiques à celles décrites pour les Tableaux 1 et 2. LE : fin de la phase exponentielle. ES : début de la phase stationnaire. S : phase stationnaire. Acides gras (% p/p) Substrat Phase de croissance C16:0 A9C16:1 C18:0 A9C18:1 A9' I2C18:2 Gle0=40 g/L LE ou ES (60-90) 12,7 6,2 5,3 55,1 20,4 S (110-160) 19,2 6,9 8,1 44,6 20,9 Glo10-40 g/L LE ou ES (60-90) 17,8 9,6 15,1 54,2 2,8 S (110-160) 22,3 14,1 9,0 48,1 6,2 Glolo=60 g/L LE ou ES (60-90) 21,5 6,9 18,1 44,9 9,9 S (110-160) 20,1 8,4 19,5 40,8 11,2 G1o1o=90 g/L LE ou ES (60-90) 15,9 6,0 15,5 47,1 9,1 S (110-160) 16,8 6,8 14,5 46,7 14,9 Tableau 4 : Composition en acides gras des lipides cellulaires totaux produits par la souche Y lipolytica JM1203 au cours de sa croissance dans un milieu limité en azote contenant du glucose (à 40 g/L) ou du glycérol (à 40, 60 ou 90 g/L). Les conditions de culture sont identiques à celles décrites pour les Tableaux 1 et 2. LE : fin de la phase exponentielle. ES : début de la phase stationnaire. S : phase stationnaire. Acides gras (% p/p) Substrat Phase de croissance C16:0 A9C16:1 C18:0 A9C18:1 A9'12C18:2 Gle0=40 g/L LE ou ES (60-90) 9,7 6,2 7,0 64,8 11.8 S(110-160) 13,1 9,1 2,2 58,7 16,4 Glo10-40 g/L LE ou ES (60-90) 25,7 4,4 10,0 54,2 5,1 S (110-160) 21,5 8,1 13,3 47,6 9,1 Glolo=60 g/L LE ou ES (60-90) 24,0 3,8 15,2 52,4 4,1 S (110-160) 21,2 5,8 14,7 52,0 5,8 Glolo=90 g/L LE ou ES (60-90) 22,7 5,0 13,4 59,7 4,0 S (110-160) 17,3 7,1 19,1 52,3 3,2 Il ressort de ces résultats que la composition en AG a été modifiée en fonction de la concentration Glolo utilisée et le temps de fermentation, et que des différences ont également été observées entre la croissance sur glucose et sur glycérol. Certaines différences dans les profils en AG ont été observées entre les deux souches utilisées, car la culture de la souche W29 a conduit à la synthèse d'un lipide microbien moins riche en acide oléique (°9C18:1) et plus riche en acide linoléique (°9'12C18:2) que pour la souche JMY1203. Pour les essais équivalents sur Glol et Glc (concentration initiale de 40 g/L) (Tableau 3), la composition en AG des lipides cellulaires de la souche W29 a présenté quelques différences, puisque la culture sur glucose a été accompagnée par la synthèse d'un lipide plus riche en A9.12C18:2. Des différences dans la composition en AG des lipides cellulaires ont été observées pour la souche JMY1203, pour les essais similaires sur Glol et Glc (Tableau 4) ; la croissance sur glucose a été accompagnée par la synthèse d'un lipide plus riche en mC18:1 et °9,12C18:2 et moins riche en AG saturé. Pour la souche W29, l'augmentation de la concentration Glolo a entraîné une légère diminution de la concentration de A9C18:1 et une augmentation plus nette de la concentration de A9'12C18:2 (Tableau 3) ; la tendance inverse a été constatée pour la souche JMY1203 (Tableau 4). La composition en AG cellulaire a présenté une évolution en fonction du temps de culture, car dans la plupart des cas étudiés, la concentration cellulaire de A9C18:1 avait tendance à diminuer avec l'évolution de la fermentation. L'analyse des différentes fractions lipidiques (N, G+S et P) pour Glolo = 90 g/L à la phase stationnaire, a montré que pour la souche JMY1203, la quantité de la fraction N est plus élevée que celle pour la souche W29 (voir Tableau 5 ci-après) Tableau 5 : Distribution des fractions lipidiques et composition en acides gras des lipides totaux (T), des lipides neutres (N), des glycolipides plus des sphingolipides (G+S) et de phospholipides (P) des souches de Y. lipolytica W29 et JMY1203 au cours de leur croissance dans un milieu limité en azote contenant du glycérol (à 90 g/L). Les conditions de culture sont identiques à celles décrites au Tableau 2 ci-dessus. Le point d'échantillonnage pour l'analyse des lipides est situé dans la phase stationnaire de croissance (110-160 h). Souche Fraction %, p/p 16:0 °916:1 18:0 3'9 1 8 : 1 A9'1218:2 lipidique W29 T 16,8 6,8 14,5 46,7 14,9 N 73,0 15,9 7,0 12,8 48,1 13,1 G+S 18,9 18,1 6,1 15,1 45,1 14,1 P 8,1 15,5 6,2 13,9 45,1 17,9 JMY1203 T 17,3 7,1 19,1 52,3 3,2 N 91,0 17,0 6,1 20,4 52,0 2,9 G+S 2,2 17,6 7,4 18,1 50,2 3,3 P 6,8 15,9 7,8 15,4 53,1 7,1 L'analyse des différentes fractions lipidiques (N, G+S et P) a montré que la composition en AG de ces fractions présentait des similitudes avec la composition en AG des lipides totaux, alors que la fraction P était légèrement plus riche en AG poly-insaturés (principalement A9'1218:2) (Tableau 5). Les différences dans les quantités de N, G+S et P pour les souches W29 et JMY1203 peut se refléter dans la composition différente en AG des lipides totaux de ces levures (voir Tableaux 3 et 4). Dans les essais avec les plus faibles quantités de lipides totaux produits (cas de la souche W29), de plus grandes quantités des fractions G+S et P (en %, plp, dans les lipides totaux) (qui sont plus insaturés), ont été synthétisées. Le rendement de production d'acide citrique par la souche JMY1203 a été comparé à celui de plusieurs souches de Y. lipolytica connues et cultivées dans des conditions diverses de fermentation sur des supports composés de glycérol brut ou pur. Les résultats sont présentés au Tableau 6 ci-après (légendes : n.r. : Non renseigné dans le document. * : D = 0,009 11-1. $ : D = 0,021 11-1. § : Valeur totale de l'acide citrique, la teneur en acide iso- citrique représente environ 5%, p/p, de l'acide citrique total). Souche Acide Type de Rendement Type de Référence citrique Glycérol (glg) fermentation JMY1203 57,7 Brut 0,9e Fiole agitée ACA-DC 50109 33,6 Brut 0,44 Fiole agitée Papanikolaou et al., 2002 Wratislavia 1.31 124,5 0,62 Bioréacteur Rymowicz et en discontinu al., 2006 (batch) Wratislavia AWG7 88,1 0,46 Wratislavia K1 75,7 0,40 NRRL YB-423 21,6 Pur 0,55 Fiole agitée Levinson et al., 2007 NCIM 3589 77,4 Brut n.r Imandi et al., 2007 ACA-DC 50109 62,5 0,56 Papanikolaou et al., 2008 A-101-1.22 112,0 0,60 Bioréacteur Rymowicz et en discontinu al., 2008 ACA-YC 5033 50,1 0,44 Fiole agitée André et al., 2009 A-101 66,5 Pur 0,44 Bioréacteur Rywiriska et al., 2010a en discontinu 66,8 Brut 0,43 Wratislavia K1 53,3 Pur 0,34 36,8 Brut 0,25 Wratislavia 1.31 126,0 0,63 Bioréacteur alimenté en discontinu (fed-batch) Rywiriska et al., 2010b Wratislavia AWG7 157,5 0,58 Wratislavia 1.31 155,2 0,55 Wratislavia AWG7 154,0 0,78 Répétition Rywitiska et discontinue Rymowicz, 2010 N15 19,08 Pur 0,55 Fiole agitée Kamzolova et al., 2011 98,0 0,70 Bioréacteur alimenté en discontinu Wratislavia AWG7 86,5 0,59 Bioréacteur Rywhiska et al., en continu* 2011 63,3 0,67 Bioréacteur en continus Les résultats montrent que le rendement de conversion du glycérol en acide citrique (acide citrique produit par unité de glycérol consommé) de la souche JMY1203 selon la présente invention est plus élevé que celui de différentes souches de Y. lipolytica décrites dans l'art antérieur. 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Souche mutante selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'en outre, l'expression d'un ou plusieurs des gènes endogènes PDXI-6, MFE], TGL3, TGL4 et GUT2 de ladite souche est inhibée et/ou un ou plusieurs des gènes endogènes GPDJ, ACCI, DGAI et DGA2 de ladite souche est surexprimé. 6. Procédé d'obtention d'une souche mutante de levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à partir d'une souche de levure parente, caractérisée en ce qu'il comprend une étape de mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase dans ladite souche de levure parente. 7. Procédé pour augmenter la production de lipides et/ou d'acide citrique d'une souche de levure, caractérisé en ce que l'on inhibe dans ladite souche de levure l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en que l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase est obtenue par mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de délétion du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9 pour augmenter la production de lipides, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'inhibition dans ladite souche de levure de l'expression d'un ou plusieurs des gènes endogènes PDXI-6, MFEI , TGL3, TGL4 et GUT2 et/ou la surexpression dans ladite souche de levure d'un ou plusieurs des gènes endogènes GPD], ACC1, DGA I et DGA2 11. Utilisation d'une souche mutante de levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la production de lipides et/ou d'acide citrique. 12. Procédé de production de lipides et/ou d'acide citrique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture d'une souche mutante de levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 sur un milieu approprié. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit milieu contient comme source de carbone du glucose et/ou du glycérol.