Brevet FR3002948A1 — publié le 20140912

- 1 - PROCEDE DE CAPTURE DE VIRUS La présente invention concerne un procédé de capture de virus présents dans des milieux aqueux, des méthodes pour éliminer, concentrer et quantifier lesdits virus et des matériaux pour leur mise en oeuvre. La contamination de l'eau par des virus est une cause majeure de préoccupation en matière de santé publique, car elle est reconnue comme une source importante de maladies d'origine hydrique. Plus de 120 types différents de virus, provenant de personnes infectées et donc susceptibles 10 de se retrouver dans les eaux environnementales, comme par exemple l'eau de consommation, ont été identifiés. Plusieurs de ces virus, comme les adénovirus, les entérovirus et le virus de l'hépatite A sont associés à de nombreuses maladies gastriques, comme la gastro-entérite et la diarrhée. Même à faible concentration, les virus représentent un danger en 15 raison de leurs capacités de virulence. A l'heure actuelle, la détection et la quantification de virus ainsi que la décontamination sont rendues difficiles : -d'une part à cause de la grande diversité des virus entériques potentiellement pathogènes pour l'homme (estimés à 120), 20 -d'autre part à cause des faibles concentrations retrouvées qui nécessitent des systèmes de captures des virus efficaces. Par conséquent, l'un des principaux défis à relever dans une perspective de gestion des risques est le développement de méthodes de détection des virus présents à faible concentration. 25 La détection des virus nécessite une étape de concentration efficace d'un grand volume d'eau dans un volume beaucoup plus petit. Actuellement les méthodologies utilisées sont principalement : la filtration par le procédé d'adsorption-élution, la floculation et la précipitation organique ainsi que l'ultrafiltration. 30 Les différentes techniques de filtration peuvent utiliser des filtres construits à partir d'une large gamme de matériaux : laine de verre, ester de cellulose, nitrocellulose, alginate, fibre de verre, polyethersulfone, polycarbonate, PTFE etc. Ils peuvent être utilisés à l'état natif ou modifié par la liaison de composés chimiques pouvant améliorer leurs propriétés. - 2 - Les filtres présentant à leur surface des charges sont généralement composés d'une surface pouvant réagir et lier de manière covalente des composés organiques ou inorganiques ou des polymères tels que l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyapatite, le polyéthylènimine, le poly méthyl méthacrylate, le polystyrène etc... Toutefois, les capacités de rétention de ces filtres sont variables en fonction de la matrice et du type de virus recherché. Les techniques d'ultrafiltration, basées également sur l'utilisation de filtres, modifiés ou non, donnent également des résultats variables en fonction des virus. Ces techniques ont un coût élevé et restent difficile à utiliser sur des gros volumes. (Cashdollar J.L. et al., J. Appl. Microbiol., (2013), Methods for primary concentration of viruses from water semples: a review and meta-analysis of recent studies doi :10.1111/jam .1243). Les techniques de précipitation ne peuvent être utilisées seules et sont toujours couplées à des techniques de filtration. La décontamination des virus dans les eaux peut être réalisée par différents procédés et doit conduire à un abattement de la concentration virale de 4 logs minimum. Les 2 principales méthodes de traitement de l'eau sont la désinfection physique et la désinfection chimique. La désinfection chimique par des agents tels que la chloramine, le chlore, le dioxyde de chlore et l'ozone, est couramment utilisée. Différentes études visant à évaluer l'efficacité de ces traitements sur l'élimination des virus entériques ont permis de mettre en évidence une variabilité de résistance des virus aux différents traitements rendant nécessaires des prétraitements pour assurer une meilleure décontamination. La désinfection physique peut être réalisée par les procédés de clarification et de filtration. La filtration granulaire, couramment utilisée, couplée à de la coagulation, de la floculation et de la clarification permet une élimination de 0,1 à 3,4 log de virus. Les virus dans l'eau pouvant être libres ou associés à des particules, leur adsorption dépend d'un certain nombre de facteurs, tels que le point isoélectrique et hydrophobicité à la fois du virus et de la particule. L'utilisation de membrane de microfiltration couplée à de la coagulation permet une élimination des virus jusqu'à 4 log avec des résultats variables en fonction des virus. L'utilisation de - 3 - membranes d'ultrafiltration permet une élimination des virus relativement efficace, cependant, les performances observées peuvent varier en fonction de la nature de la membrane utilisée, de la nature des virus présents. Les techniques de nanofiltration et d'osmose inverse, outre leur coût, sont difficiles à mettre en oeuvre à l'échelle pilote et nécessitent une surveillance de l'état des membranes. Ces méthodes sont par ailleurs peu compatibles avec les procédés industriels. Aujourd'hui, un des principaux challenges est d'améliorer la détection des virus entériques dans l'eau et donc de développer de nouvelles méthodes de concentration et d'extraction qui permettent de détecter de faibles concentrations de virus dans l'eau. Ainsi la demande internationale WO 2006/110632 décrit des filtres pour éliminer notamment les virus, lesdits filtres étant réalisés à partir d'un mélange de particules mésoporeuses et microporeuses recouvertes de polymères pouvant être choisis dans différentes catégories, comme par exemple la polyvinylamine, la poly(N-méthylvinylamine), la polyallylamine, la polyallyldiméthylamine, la polydiallylméthylamine, le chlorure de polydiallyldiméthylammonium, le chlorure de polyvinylpyridinium, la poly(2- vinylpyridine), la poly(4-vinylpyridine), le polyvinylimidazole, le poly(4- aminométhylstyrène), le poly(4-aminostyrène), le polyvinyl(acrylamide-co- diméthylam i nopropylacrylam ide), le polyvinyl(acrylamide-co- diméthyaminoethylméthacrylate), la polyéthylèneimine, la polylysine, les dendrimères DAB-Am et PAMAM, le chlorure d'éthacryl amodopropyl triméthyl ammonium (MAPTAC) et le chlorure de diallyl diméthyl ammonium (DADMAC). La demande GB 2431472 décrit un matériau composite formé de particules magnétiques, d'une substance portant un groupe hydroxy et d'une substance portant un groupe cationique, ces différents éléments étant liés entre eux soit par absorption, soit par des liaisons covalentes. Ce matériau, ajouté dans le milieu contenant les virus à extraire, fixe les virus en donnant un complexe virus-matériau qui est récupéré. Toutefois, il existe encore un besoin de disposer d'une méthode qui présente les avantages suivants : - être techniquement simple et rapidement réalisable, - 4 - - avoir un fort rendement, - concentrer une gamme de virus (peu spécifique), - déboucher sur un faible volume de concentrât - être peu chère - être capable de supporter de grands volumes d'eau - être répétable et reproductible - ne pas mettre en oeuvre de composés chimiques dangereux pour l'environnement et la santé humaine Au cours de leurs travaux, les inventeurs ont mis au point un procédé qui permet de satisfaire toutes ces exigences et met en oeuvre un matériau qui comprend des polymères arborescents de lysines, appelés dendrimères de polylysine . Ce type de matériau permet de piéger et de retenir les virus afin de les extraire de leur milieu, avec un fort rendement, sans dépense importante d'énergie, à faible coût et dans le respect de l'environnement puisque ces matériaux sont des composés issus de la chimie verte. Aussi la présente invention a-t-elle pour but de fournir un procédé de capture de virus qui pallie les inconvénients des procédés existants. La présente invention a également pour but de fournir un matériau revêtu de dendrimères greffés de polylysine (DGL) permettant la mise en 20 oeuvre de ce nouveau procédé. La présente invention a enfin pour but de mettre à disposition une méthode de décontamination de milieux aqueux et une méthode de détection et de quantification de virus mettant en oeuvre ledit procédé. La présente invention a donc pour objet un procédé de capture de 25 virus à partir d'un milieu aqueux susceptible d'en contenir, ledit procédé comprenant une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et de former un complexe dendrimères- 30 virus. Au sens de la présente invention, les termes « capture », « piégeage » et « complexation » sont équivalents. En effet, conformément à l'invention, les virus contenus dans le milieu aqueux sont capturés ou - 5 - piégés par fixation sur les dendrimères de polylysine avec lesquels ils forment un complexe virus-dendrimères stable dans l'eau. Au sens de la présente invention, on entend par « dendrimères de polylysine », des polymères arborescents de L-lysine tels ceux décrits par Denkewalter, R. G., et al., (Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units., in USP. 1981, Allied Corp.: US. ; Macromolecular highly branched homogeneous compound, in USP. 1983, Allied Corp.: US) et par Juan Rodriguez-Hernandez, et al. (Highly Branched PoIy (L-lysine). Biomacromolecules, (2003), 4: p. 249-258), Klok H. et al. (Dendritic-Graft Polypeptides, Macromolecules, (2002), 35: p. 8718-8723) ainsi que ceux à base de D- ou de L-lysine décrits dans la demande internationale W02006/114528 et appelés dendrimères greffés de polylysine (DGL). Tous ces dendrimères sont soit constitués uniquement de lysine, on parle dans ce cas d'homopolylysines, soit constitués de plus de 30% en mole de lysine et contenant également des unités d'autres aminoacides, on parle dans ce cas d'hétéropolylysines. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, on utilise des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, natifs ou modifiés. Des DGL de génération 1 ne permettent pas une bonne fixation des 20 virus alors que des dendrimères de générations supérieures à 7 ont tendance à former des agrégats qui rendent difficile leur utilisation. On entend par dendrimères greffés de polylysine natifs des dendrimères dans lesquels les fonctions amines sont libres. On entend par dendrimères greffés de polylysine modifiés, des 25 dendrimères dont tout ou partie des fonctions amines sont liées de manière covalente ou non à un autre acide aminé, à des fonctions chimiques électropositives (amines quaternaires, guanidine), à des fonctions hydrophobes telles que les chaines (C2-C18)alkyles, des fonctions cholestérols, ou des poly-éthylène-glycol. L'homme du métier saura réaliser 30 les modifications de ces groupes amines en faisant appel à ses connaissances générales ou aux techniques décrites dans la littérature, comme par exemple celles décrites par Rossi J.C. et al. (Functionalisation of free amino groups of lysine dendrigraft (DGL) polymers, Tetrahedron - 6 - Letters, (2012), 53, p: 2976-2979). Il saura également choisir le type de modifications à apporter en fonction du virus à cibler. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les dendrimères greffés de polylysine sont de générations 2 à 5, soit ceux de générations 2, 3, 4 ou 5. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, après l'étape de fixation des virus sur les dendrimères, le procédé peut comprendre au moins une étape choisie parmi une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants, une étape de récupération du complexe dendrimères- virus formé à la suite de l'étape de mise en contact, une étape de quantification des virus et une étape d'identification des virus. Le procédé peut également comprendre plusieurs de ces étapes, par exemple une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants et une étape de quantification des virus ou une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants et une étape d'identification des virus. Lorsque les dendrimères, notamment les DGL, sont utilisés en solution dans le milieu aqueux, le procédé comprend en outre, après l'étape de mise en contact, une étape d'immobilisation du complexe dendrimèresvirus formé à la suite de ladite étape de mise en contact et une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants. Les supports utilisés sont connus de l'homme du métier et peuvent être notamment choisis dans le groupe comprenant des phases stationnaires et des billes solides magnétiques ou non. L'étape de récupération des virus à partir des complexes fixés sur ces différents matériaux pourra être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier et sera fonction du type de matériau choisi pour fixer le complexe dendrimères-virus ; on peut citer à titre d'exemple, l'élution, la centrifugation et la séparation magnétique. Lorsque les dendrimères, notamment les DGL, sont utilisés immobilisés sur un support, ce dernier peut être choisi parmi les supports filtrants tels que les fibres de verre, les fibres de polymères chimiques, les filtres à base de polymères naturels et les filtres à base de polymères chimiques ou les supports de chromatographies. On peut citer à titre d'exemple les supports organiques choisis dans le groupe comprenant le - 7 - polypropylène, le polystyrène, le polyéthylène, le nylon, le polytétrafluoroéthylène (PTFE), le polyfluorure de vinylidène (PVDF), le polycarbonate (PC), les polysulfones, les polyéthersulfones (PES), le polytéréphtalate d'éthylène (PET), le polyméthacrylate de méthyle ou polyacrylique, l'alginate et les matériaux à base de cellulose (esters de cellulose : acétate de cellulose, nitrate de cellulose...), les supports inorganiques choisis parmi l'alumine et les fibres de verre. Les formats des dits supports solides peuvent êtres des particules magnétiques ou non ou des matrices poreuses inertes avec un agent de modification de surface. Les dendrimères, notamment les DGL peuvent être immobilisés à la surface de ces matériaux soit de manière non covalente par adsorption, soit de manière covalente, comme par exemple en utilisant des fonctions esters activées (NHS et sulfo-NHS), des fonctions époxy, des fonctions aldéhydes des fonctions acrylate ou méthacrylate ou par l'activation de surface par plasma, tel que le plasma d'argon, d'oxygène ou d'iode. La quantité de dendrimères fixée sur le support est fonction du type de support, du volume et du type de milieu aqueux, notamment de volume d'eau, à traiter. L'homme du métier saura à la lumière de ses connaissances générales choisir le type et la quantité de support revêtus de dendrimères nécessaires pour obtenir une efficacité optimale de la méthode. Lorsque les virus ont été récupérés, leurs acides nucléiques (ADN, ou ARN) peuvent être extraits par toute technique connue de l'homme du métier. L'extraction des acides nucléiques peut également être réalisée directement à partir du complexe virus-dendrimère. Le dendrimère peut être fixé de manière covalente sur le support ou absorbé après formation du complexe virus-dendrimère. L'étape d'identification et de quantification des virus à partir des acides nucléiques peuvent être réalisées par toutes techniques connues de l'homme du métier, notamment par réaction en chaîne par polymérisation (PCR ou polymérisation chain reaction), par amplification par transcription (TMA ou Transcription Mediated Amplification), par réaction en chaine de ligase (LCR ou ligase chain reaction), par amplification d'acide nucléique isothermique et initiée par des amorceurs chimériques (ICAN ou isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid), par amplification - 8 - isothermique d'ADN médiée par des boucles (LAMP ou Loop-mediated isothermal amplification of DNA). Les virus peuvent également être identifiés et quantifiés par immunodétection ou par des techniques de culture cellulaire. Lorsque les dendrimères sont utilisés directement en solution dans un milieu aqueux susceptible de contenir des virus, ils sont ajoutés audit milieu aqueux sous forme d'une solution dans l'eau, à une concentration comprise entre 1 milligramme et 1 gramme/litre, fixée en fonction de la qualité et de l'origine du milieu aqueux, notamment de l'eau à traiter. L'homme du métier saura fixer les quantités de dendrimères à la lumière de ses connaissances générales. L'homme du métier saura fixer la durée de la mise en contact entre le milieu aqueux et les dendrimères, notamment les DGL, à la lumière de ses connaissances générales. Cette durée pourra être de quelques secondes à quelques minutes selon le procédé d'homogénéisation du mélange et du volume de DGL en solution ajouté au volume d'échantillon à traiter. Au sens de la présente invention, on entend par «milieu aqueux» tout milieu comprenant au moins 50 % en poids d'eau. On peut citer à titre d'exemples non limitatifs, l'eau destinée à la consommation humaine, l'eau de réservoirs, l'eau issue de bassins d'épuration, l'eau de rivière, l'eau de mer, les liquides biologiques (notamment plasma, sang, sérum, urine, salive, lysat cellulaire), les liquides alimentaires aqueux (notamment jus de fruits, jus de légumes, lait ....) et les milieux de culture cellulaires. Tous ces milieux peuvent être traités directement ou après dilution, si cela s'avère nécessaire. Conformément à l'invention, le procédé permet la capture de tout virus entérique comme par exemple les adénovirus, les rotavirus, le virus de l'hépatite A et le Norovirus I, le virus de l'hépatite E (VHE), les rotavirus et les entérovirus (poliovirus, virus Coxsackie A et B, échovirus). La présente invention a également pour objet des matériaux comprenant des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2 à 5 (générations 2, 3, 4 ou 5), natifs ou modifiés et immobilisés soit sur un support organique choisi dans le groupe comprenant le polypropylène, le polystyrène, le polyéthylène, le nylon, le - 9 - polytétrafluoroéthylène (PTFE), le polyfluorure de vinylidène (PVDF), le polycarbonate (PC), les polysulfones, les polyéthersulfones (PES), le polytéréphtalate d'éthylène (PET), le polyméthacrylate de méthyle ou polyacrylique, l'alginate et les matériaux à base de cellulose (esters de cellulose : acétate de cellulose, nitrate de cellulose...), soit un support inorganique choisi parmi l'alumine et les fibres de verre. Avantageusement, le matériau utilisé présente une faible perte de charge. La présente invention a également pour objet une méthode d'élimination de virus contenus dans un milieu aqueux caractérisée en ce qu'elle comprend : a. une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, notamment des dendrimères greffés de polylysine, de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus, b. une étape de récupération du milieu aqueux exempt de virus et éventuellement, c. une étape de récupération des virus fixés sur les dendrimères Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le milieu aqueux duquel on élimine les virus est de l'eau destinée à la consommation 25 humaine. La présente invention a également pour objet, une méthode de quantification de virus dans un milieu aqueux susceptible d'en contenir caractérisée en ce qu'elle comprend : a. une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des 30 dendrimères de polylysine, notamment des dendrimères greffés de polylysine, de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus - 10 - de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus, b. une étape de récupération des virus ou du complexe dendrimères-virus, et c. une étape de quantification des virus, notamment par culture cellulaire, amplification de leur acide nucléique ou immunodétection. Les figures 1 à 5 et les exemples 1 à 4 qui suivent illustrent l'invention. La figure 1 donne la composition des milieux utilisés dans l'exemple 2. La figure 2 illustre la courbe standard permettant la quantification de la concentration en bactériophage MS2 de la solution. Elle représente la concentration en bactériophage exprimée en pfu/mL en fonction de la moyenne des cycles seuils (Ct) obtenus pour chaque concentration ± l'écart type. Chaque mesure a été réalisée en tri plicat. La figure 3 illustre l'efficacité moyenne d'adsorption calculée à partir de 6 expériences indépendantes pour le bactériophage MS2 selon la méthode décrite à l'exemple 2 et l'efficacité moyenne de récupération calculée à partir de 3 expériences indépendantes pour le bactériophage MS2 selon la méthode décrite à l'exemple 2. Les barres d'erreur représentent l'écart type. (A) Adsorption (B) Récupération. La figure 4 illustre la linéarité de la méthode de concentration de virus selon l'exemple 2. La courbe représente le logarithme du nombre prévu de particules virales dans une solution en fonction du nombre de particules virales récupérées après concentration. La figure 5 représente la récupération des particules virales. Les histogrammes représentent la récupération moyenne des particules pour chaque condition : a) concentration, b)lot et c) manipulateur. Cinq réplicats de chaque condition ont été réalisés et les barres d'erreur indiquent l'écart type. Deux concentrations ont été testées 10 pfu/mL (gris) et 100 pfu/mL (gris foncé). - 11 - Exemple 1 : Procédé de préparation d'un matériau sur lequel sont greffés des dendrimères greffés de polylysine. Le greffage de dendrimères greffé de poly-L-lysine (DGL) sur des surfaces de polypropylène est réalisé par activation par plasma des surfaces 5 de polypropylène. Brièvement, 5 g de DGL de générations 3 natifs (DGL-G3) sont modifiés en présence de 0,700 g de bicarbonate de sodium par addition de 0,21 g d'anhydride succinique dans 100 mL d'un mélange eau : tétrahydrofurane (H20:THF (1:1)) de manière à obtenir 5 à 10 % de groupes carboxyliques à la surface du DGL. Au bout de deux heures, le THF 10 est éliminé sous pression réduite et le DGL modifié est purifié par chromatographie d'exclusion stérique sur une résine Sephadex® G25 (colonne XK50) dans un tampon carbonate d'ammonium (0,1M) à 20 mL/min. Après élimination du carbonate d'ammonium en excès sous pression réduite, le DGL modifié est lyophilisé. Juste avant le greffage, le 15 DGL modifié est dissous dans l'eau à raison de 10 g/L et la solution est dégazée pendant 1 heure. Avant le traitement au plasma, des filtres en polypropylène (SICAM Géotextiles, France ; 8,4 mg ; 7 mm de diamètre, diamètre des fibres 25 pm) sont lavés dans un bain à ultrasons, successivement avec de l'eau puis de l'éthanol pendant 90 secondes et 20 finalement séchés dans un four à 60°C. Le réacteur à plasma est composé de deux électrodes cylindriques parallèles en aluminium (diamètre: 13 cm, distance entre les électrodes: 6 cm) placées dans un récipient cylindrique couplé à un générateur de RF (13,56 MHz) et muni d'une pompe à vide efficace (vitesse 18 m3/h, pression initiale dans le dispositif inférieure à 4 25 Pa). Les échantillons de polypropylène sont placés sur l'électrode inférieure dans un récipient en verre. La pression du réacteur est ajustée à 4 Pa. Ensuite, l'argon est introduit dans la chambre pour atteindre la pression désirée. Celle-ci est enregistrée avec une jauge régulée de Pirani. L'activation est réalisée avec une puissance de 10 W pour une pression du 30 plasma d'argon de 40 Pa pendant environ 90 secondes. Ensuite, les filtres activés par plasma sont recouverts d'une solution de DGL modifiés à 10 g/L pendant 2 heures à 25°C pour avoir un rendement de greffage complet. Après un lavage rapide par de l'eau, les filtres sont immergés dans un bain de tampon carbonate-bicarbonate 0,25 M à pH=11,25 avec 50% de - 12 - méthanol et soniqués pendant 1 heure à la température ambiante. Après un lavage important à l'eau ultrapure, les filtres sont lyophilisés et conservés sous vide à -20°C. Exemple 2: Evaluation de la capacité des DGL immobilisés à retenir les virus et à être utilisés comme outil de concentration et de quantification des virus 2.1. Matériel et méthodes 2.1.1. Culture des phages Un flacon de 250 mL contenant 25 mL de milieu LB Lennox (voir composition figure 1) est inoculé avec des cellules K12 Hfr d'E. cou i (NCTC 12486) qui sont laissées croître une nuit entière dans ledit milieu LB Lennox. La culture est incubée pendant 90 minutes à 37°C sous agitation (100 rpm). Une solution de bactériophage MS2 (NCTC12487) est ajoutée à la culture à une concentration finale en MS2 de 107 pfu/mL. Après 5 heures d'incubation à 37°C (agitation à 100 rpm), 2,5 mL de chloroforme sont ajoutés à la culture; ensuite le milieu de culture est refroidi à 4°C pendant 18 heures. Après cette incubation, la culture est centrifugée à 3 000 g pendant 20 minutes et le surnageant est récolté. Les stocks viraux initiaux de phages sont d'environ 1012 pfu/mL. Des fractions aliquotées de phages sont stockées à 80°C dans du glycérol à 20%. 2.1.2 Méthode de comptage des bactériophages Le nombre de bactériophages exprimé en plaques formant unité par unité de volume (plaque forming units, pfu per volume unit) est déterminé par titration standard (NF EN ISO 10705-1 (2001), en utilisant Salmonella typhimurium WG49 (NCTC 12484) comme hôte. Cinq cent microlitres de stock de Salmonella typhimurium WG49 (NCTC 12484), conservée à -80°C, sont inoculés dans un flacon de 250 mL contenant 50 mL de milieu TYGB (Tryptone yeast extract glucose broth ; voir composition figure 1). Quand la densité optique atteint 0,250 UDO600nm, la culture est placée sur de la glace fondue. Des dilutions en série de la solution de bactériophage sont réalisées. Alternativement, 1 mL de chaque dilution est mélangé avec 1 mL de culture de Salmonella typhimurium WG49 et 2,5 mL de milieu TYGA top agar (voir composition figure 1) et versé sur une boîte de pétri contenant - 13 - du milieu TYGA (voir composition figure 1). Les boîtes sont incubées pendant 18 heures à 37°C. Pour chaque dilution testée, deux séries sont réalisées. Une seule d'entre elles est traitée par de la RNAseA, à une concentration finale de 40 pg/mL. 2.1.3 Filtration sur le matériau Dix millilitres d'une solution d'eau artificiellement contaminée avec 106 pfu/mL et 108 pfu/mL de virus MS2 ont été utilisés pour déterminer la capacité de rétention des DGL. Le matériau greffé préparé selon l'exemple 1 est placé à l'extrémité inférieure d'une pipette sérologique. Une seringue de 50 mL est utilisée comme réservoir. La solution de virus est filtrée 10 fois à travers le matériau revêtu de DGL. 2.1.4 Extraction de l'ARN viral L'ARN viral est extrait en utilisant le Mini kit QIAamp Viral RNA (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. L'extraction est réalisée sur 140 pL de suspension virale dans l'eau traitée par du diéthylpyrocarbonate. L'ARN est élue avec 60pL de tampon AVE. Les extraits sont immédiatement stockés à -80°C. 2.1.5 Quantification des virus La quantification des virus est réalisée par amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (qRT-PCR) après extraction préalable de l'ARN selon l'exemple 2.1.4. La qRT-PCR est réalisée avec le kit KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR (CliniSciences) selon les recommandations du fournisseur. Un fragment de 168 pb est amplifié en triplicats, en utilisant le kit KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR (CliniSciences). Les milieux de réaction contiennent 10 pL de mélange KAPA SYBR FAST qPCR master (Clinisciences), 0,4 pL de mélange KAPA RT (Clinisciences), 100 nM de chaque amorce, 2 pL d'ARN purifié et de l'eau en quantité suffisante pour avoir un volume final de 20 pL. L'amorce sens est la séquence MS2-F, 5'-TCGATGGTCCATACCTTAGATGC-3' et correspond à la région du génome du bactériophage M52 1255 à 1277 et l'amorce antisens est la séquence MS2-R 3'-ACCCCGTTAGCGAAGTTGCT-5' et correspond à la région 1423 à - 14 - 1404 du génome du bactériophage MS2 (NC_001417) selon Ogorzaly et al. (Development of real-time RT-PCR methods for specific detection of Fspecific RNA bacteriophage genogroups: application to urban raw wastewater. J Virol Methods ,2006, 138, 131-139). La synthèse de l'ADNc est réalisée à 42 °C pendant 5 min puis la rétrotranscriptase est inactivée à 95 °C pendant 5 min, 40 cycles de PCR sont ensuite réalisés avec une dénaturation de 3 sec à 95 °C, 20 sec d'hybridation à 59,7 °C et 1 sec d'extension et d'acquisition des données à 72°C. Cette dernière étape est suivie par l'analyse d'une courbe de fusion réalisée en augmentant la 10 température de 50 à 90°C, à raison d'une augmentation de 0,2°C toutes les 2 sec avec un plateau de lecture pour obtenir le signal de fluorescence. 2.1.6 Etablissement des courbes standards Des dilutions au 1/100ème de stocks d'ARN de phages F-spécifiques (10 - 1012 pfu/ml) sont réalisées avec de l'eau contenant du 15 diéthylpyrocarbonate afin d'établir des courbes standards. Les mesures de qRT-PCR sont réalisées en triplicat. Un contrôle négatif, correspondant à du tampon d'élution AVE sans ARN, est ajouté à chaque essai. La valeur de Ct de chaque dilution amplifiée en triplicat par qRT-PCR est représentée en fonction du logarithme de la quantité initiale de phages exprimée en 20 pfu/mL. Une courbe standard est établie par régression linéaire simple pour des concentrations comprises entre iO4 pfu/mL et 1012 pfu/mL La pente de la courbe standard est utilisée pour déterminer l'efficacité (E) de la PCR selon la relation E = 10(11 (Kubista et al. ne real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med.,(2006), 27, 95- 25 125). Ainsi une courbe standard avec une pente de -3,33 correspond à une réaction 100 % efficace. 2.1.7 Calcul du taux de récupération et analyse statistique Le pourcentage de récupération est calculé comme étant le rapport 30 entre la concentration en virus après la filtration et la concentration théorique ensemencée dans l'eau. Une dilution mesurable de virus (104 pfu/mL) a été utilisée comme standard de PCR. La capacité d'absorption de bactériophages MS2 par les DGL est déterminée en comparant la concentration de virus dans l'eau avant et - 15 - après la filtration à travers les DGL. 10 millilitres de solutions standards dans l'eau avec des concentrations en virus de 106 pfu/mL et 108 pfu/mL sont utilisées pour déterminer la capacité d'absorption maximum des DGL. Elles sont filtrées à travers le matériau revêtu de DGL, éluées en utilisant directement le tampon de lyse du kit d'extraction d'ARN ; les ARN sont ensuite purifiés. L'analyse statistique est effectuée avec le logiciel R Development Core Team. La capacité des filtres à DGL à retenir les virus a été évaluée en utilisant de faibles concentrations en virus (en dessous de la limite de détection). Deux solutions de virus dans l'eau à 101 pfu/mL et 102 pfu/mL respectivement dans un volume final de 1L et 100 mL ont été utilisées. L'extraction de l'ARN est réalisée directement sur les DGL et l'ARN est élue dans 60 pL. Ces conditions conduisent à un facteur de concentration de 1660 et 16600 fois pour un volume percolé de respectivement 100mL ou 1L. Les essais sont réalisés cinq fois par trois expérimentateurs et deux lots de DGL. Au total, 60 expériences ont été réalisées, une randomisation des expérimentations a été réalisée afin de limiter l'effet jour. 2.1.8. Linéarité de la méthode de concentration des virus L'appréciation de la linéarité est nécessaire pour s'assurer que le nombre de particules dans un échantillon et le nombre de particules retrouvées après concentration et extraction sont corrélés de manière linéaire sur une plage importante de concentrations. 10 millilitres de 3 solutions titrées contenant respectivement 104, 106 and 108 pfu /mL sont percolées à travers le support à DGL. Le nombre de particules retenues est quantifié par qRT-PCR après extraction des ARN. Le facteur de concentration est de 166 fois. 2.2. Résultats 2.2.1 Courbes standard, efficacité et sensibilité de la qRT-PCR Les résultats sont donnés dans la figure 2. On n'observe pas d'amplification avec le témoin négatif. - 16 - Pour les concentrations testées, comprises entre 104 pfu/mL et 1012 pfu/mL on obtient une pente de -3,28. L'efficacité calculée selon la méthode donnée à l'exemple 2.1.6 est de 101,8% et le coefficient de corrélation au carré supérieur à 0,998. Pour chaque réaction qRT-PCR, des courbes de fusion ont été observées. Un seul pic, correspondant à la fusion de l'amplicon, est observé à 83 °C dans l'analyse des courbes de fusion. Ces données confirment la spécificité de l'amplification du produit de PCR. La limite de détection correspond au plus petit nombre d'unité génome qui donne un résultat en PCR avec un seuil à 90 %. 10 dilutions différentes préparées à 103 pfu/mL and 102 pfu/mL ont été analysées. La valeur limite de détection est de 103 pfu/mL correspondant à 4 pfu/puits de PER, avec 90 % d'échantillons positifs. La limite de quantification (Lq) correspondant à la première valeur de la courbe de calibration est de 104 pfu/mL, i.e 50 pfu/puits de PER. 2.2.2 Capacité de rétention et efficacité de récupération des bactériophages MS2 Les résultats sont donnés dans les figures 3A et 3 B. Aux deux concentrations testées, 80% des particules virales sont retenues sur le support DGL (figure 3A). Le pourcentage de récupération calculé comme étant le rapport entre le nombre de particules récupérées et le nombre de particules adsorbées sur le support est d'environ 77 % indépendamment de la concentration utilisée (Figure 3B). 2.2.3. Linéarité de la méthode de concentration des virus Les résultats sont donnés dans la figure 4. Les données montrent une bonne linéarité avec une pente proche de 1 (0,99 ± 0,04) ; une ordonnée à l'origine proche de zéro (- 0,02 ± 0,28) avec un coefficient de corrélation R2>0,985. 2.2.4. Analyse statistique des performances de rétention des DGL Les résultats sont donnés dans la figure 5. - 17 - En tenant compte de chaque modalité de filtration (manipulateur, lot de DGL, concentration), les DLG permettent une forte rétention et une bonne récupération des bactériophages (Figure 5) : le pourcentage de récupération allant de 87% à 258%. Une analyse de variance (ANOVA) montre qu'il n'y a aucune interaction entre les différents facteurs. L'ensemble de ces résultats prouvent que les DGL immobilisés sur support permettent une forte rétention et une récupération élevée des virus et ce indépendamment du volume filtré, de l'expérimentateur et du lot de 1.0 DGL. Exemple 3 : Méthode de décontamination utilisant des DGL en solution 3.1. Matériels et méthode 15 Une eau a été artificiellement contaminée avec 109 pfu/mL de bactériophages MS2. Cette eau a ensuite était divisée en 6 fractions égales de 10 mL (soit 1010 pfu). Dans trois d'entre elles, 5 mg de DGL de générations 3 sous forme d'une solution aqueuse à 50 mg/mi ont été ajoutés ; de l'eau pure été ajoutée dans les trois autres fractions (contrôle 20 négatif). Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, les 6 échantillons sont percolés sur une cartouche SCX (PhenomenexC)) chargée négativement. Une extraction des ARN des virus est réalisée sur 140pL de la solution 25 initialement contaminée et sur 140pL de chacun des 6 échantillons après leur filtration sur la cartouche SCX selon la méthode décrite à l'exemple 2.1.5. 3.2. Résultats de dénombrement des virus dans les filtrats Dans les échantillons n'ayant pas été traités avec le DGL, le 30 rendement de récupération moyen des virus obtenus est de 103% ± 8%, soit aucun abattement. Sur les échantillons traités avec le DGL, aucune quantification ni détection de virus n'a pu être observée suggérant que le taux de virus restant est inférieur à la limite de détection soit à 103 virus/mL. - 18 - Un abattement minimum de 6 logs de la contamination virale est donc observé, ce qui traduit l'efficacité du DGL en solution pour la décontamination de l'eau. Exemple 4: Capture du virus de l'hépatite A dans une eau de source commerciale 4.1. Matériel et méthodes Une eau de source commerciale a été artificiellement contaminée avec 3.104 génome copie /mL de virus d'hépatite A (lenticule de Health protection agency). L'eau a été percolée sur un support de polypropylene revêtu de DGL fabriqué selon le protocole de l'exemple 1. La quantité de virus retenue sur le support a été déterminée en dosant la quantité initiale de virus dans la solution et la quantité de virus restant dans l'eau après filtration. L'extraction d'ARN est réalisée avec le kit QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen) selon les recommandations du fabricant. La qRT-PCR est réalisée avec le kit KAPA SYBR Fast One-Step qRT-PCR (CliniSciences) selon les recommandations du fournisseur. Les séquences HAV68 :TCA CCG CCG TTT GCC TAG située de la position 68 à 85 et amorce reverse HAV240 : GGA 20 GAG CCC TGG AAG AAA G située de la position 241 à 223 du génome du virus de l'hépatite A ont été utilisées à une concentration finale de 215 nM. 4.2. Résultats de capture du virus de l'hépatite A par les DGL Une rétention du virus de l'hépatite A de 88% a été obtenue. 25 REVENDICATIONS1. Procédé de capture de virus à partir d'un milieu aqueux susceptible d'en contenir, ledit procédé comprenant une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dendrimères sont natifs ou modifiés. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dendrimères sont des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2 à 5, natifs ou modifiés. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, lorsque les dendrimères, notamment les dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7 sont en solution dans le milieu aqueux, le procédé comprend en outre une étape d'immobilisation du complexe dendrimères-virus formé à la suite de l'étape de mise en contact, sur un matériau choisi dans le groupe comprenant des phases stationnaires, des billes solides magnétiques ou non et une étape de récupération des virus ou d'un de leurs constituants. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu aqueux est choisi dans le groupe comprenant l'eau destinée à la consommation humaine, l'eau de réservoirs, l'eau issue de bassins d'épuration, l'eau de rivière, l'eau de mer, les liquides biologiques, les liquides aqueux alimentaires et les milieux de culture.- 20 - 6. Matériaux comprenant des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, natifs ou modifiés et immobilisés, soit sur un support organique choisi dans le groupe comprenant le polypropylène, le polystyrène, le polyéthylène, le nylon, le polytétrafluoroéthylène, le polyfluorure de vinylidène, le polycarbonate, les polysulfones, les polyétehrsulfones, le polytéréphtalate d'éthylène, le polyméthacrylate de méthyle ou polyacrylique, l'alginate et les matériaux à base de cellulose, soit un support inorganique choisi parmi l'alumine et les fibres de verre. 7. Méthode d'élimination de virus contenus dans un milieu aqueux caractérisée en ce qu'elle comprend : a. une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, notamment des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre aux virus de se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus, b. une étape de récupération du milieu aqueux exempt de virus et éventuellement, c. une étape de récupération des virus fixés sur les dendrimères. 8. Méthode de quantification de virus dans un milieu aqueux susceptible d'en contenir caractérisée en ce qu'elle comprend : a. une étape de mise en contact dudit milieu aqueux avec des dendrimères de polylysine, notamment des dendrimères greffés de polylysine de générations 2 à 7, avantageusement de générations 2, 3, 4 ou 5, lesdits dendrimères étant soit en solution dans ledit milieu aqueux, soit immobilisés sur un support, pour permettre au virus de- 21 - se fixer aux dendrimères et former un complexe dendrimères-virus, b. une étape de récupération des virus ou du complexe dendrimères-virus et c. une étape de quantification des virus, notamment par culture cellulaire, par amplification de leur acide nucléique ou par immunodétection.