Brevet FR3008423A1 — publié le 20150116

L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, notamment en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, d'un protiste de la classe Labyrinthulomycete, en particulier du genre Aurantiochytrium. Le procédé permet d'obtenir un haut rendement en biomasse et un enrichissement des protistes ainsi cultivés en lipides et en caroténoïdes, et plus particulièrement en acide docosahexaénoïque (DHA) et en canthaxanthine et/ou en astaxanthine. Le procédé permet ainsi de cultiver des souches du genre Aurantiochytrium à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en lipides et/ou caroténoïdes, et plus particulièrement en acides gras polyinsaturés et en canthaxanthine et/ou en astaxanthine. L'invention se rapporte aussi à une nouvelle souche de protiste appartenant au genre Aurantiochytrium, particulièrement adaptée à la production de lipides et de caroténoïdes. Cette nouvelle souche du genre Aurantiochytrium est utile pour produire de l'acide docosahexaénoïque (DHA) et de la canthaxanthine et/ou en astaxanthine en mode mixotrophe. Préambule Les protistes sont des microorganismes à organisation cellulaire simple, c'est-à-dire qu'ils sont généralement unicellulaires et parfois multicellulaires mais ne présentent pas de tissus spécialisés. Ils peuvent être autotrophes ou hétérotrophes. Les protistes font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de secréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés. Aurantiochytrium est un protiste de la famille des Thraustochytriaceae, un groupe très répandu de champignon marin. Les Thraustochytrides sont connus pour produire une large gamme de lipides, en particulier des acides gras polyinsaturés, et quelques espèces sont connues pour produire des caroténoïdes. Parmi les acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés (AGHI) de la série des oméga-3 (PUFA-w3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA ou C20:5 w3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6 w3), et de la série des oméga-6 (PUFA-w6), en particulier, l'acide arachidonique (ARA ou AA ou encore acide eicosatétraénoïque C20:4 w6) ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques. Considéré comme nutriment essentiel, le DHA est nécessaire au développement normal et fonctionnel des cellules, et joue un rôle crucial dans divers processus et fonctions biochimiques. Sa nature polyinsaturée lui confère une importance cruciale vis-à-vis des propriétés de la membrane cellulaire, chez les végétaux comme chez les animaux : fluidité, flexibilité et perméabilité sélective permettant par exemple une adaptation effective, et même la survie, aux basses températures, en particulier chez les poissons. Le DHA est un constituant structurel majeur du cerveau humain et il en est le principal acide gras. Le DHA représente 15-20 % du cortex cérébral (le cerveau d'un adulte contient au moins 20 g de DHA) et 30-60 % de la rétine. Il est indispensable au développement du système nerveux central et à la fonction rétinienne, par incorporation dans les membranes cellulaires, et joue un rôle capital dans l'acquisition et le maintien satisfaisant des mécanismes de la vision et de la mémoire. Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, intégration dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive. De nouvelles sources de ces acides gras tels que l'EPA, le DHA et l'ARA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés. Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les protistes offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, elles ne présentent pas d'odeur désagréable et leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol. Enfin, les lipides produits par les protistes ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes 10 de séparation des acides gras d'intérêt. Par ailleurs, les caroténoïdes sont également des molécules d'intérêt. Ils sont généralement utilisés en tant que pigments, mais ils ont aussi un rôle important pour la santé de l'homme en tant qu'agents antioxydants. Enfin, ils présentent la capacité de stimuler le système 15 immunitaire. Pour mettre en oeuvre la production des acides gras et des caroténoïdes par des protistes à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Par exemple, les cultures peuvent être réalisées en condition autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe selon la souche, la 20 température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources telles 25 que la main d'oeuvre et la facilité de poursuivre la culture doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales. En tout état de cause, il est souhaitable que les protistes soient cultivés dans les conditions optimales pour augmenter le rendement de(s) l'acide(s) gras et de(s) caroténoïde(s) à produire. Ainsi, il est préférable 30 d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple au-delà de 80 g/I de matière sèche, plus de 30% d'acides gras en poids par rapport au poids total de la matière sèche et plus de 0,1 % en poids de caroténoïdes sur le poids total de matière sèche). L'effet de la lumière sur la croissance n'est pas réservé uniquement aux organismes photosynthétiques (plantes, cyanobactéries, microalgues et 5 macroalgues). Certains organismes non chlorophylliens possèdent des photorécepteurs qui leur permettent de capter l'énergie lumineuse, essentielle pour leur développement. Les photorécepteurs comme le phytochrome représentent un exemple typique d'un capteur de lumière qui contrôle le développement de l'organisme qui le possède. Différents 10 photorécepteurs ont été décrits à ce jour, à savoir, entre autres, les pigments accessoires, les cryptochromes et phototropines. Dans la perspective d'une exploitation industrielle, pour être rentable, la production de biomasse doit pouvoir être réalisée dans des photobioréacteurs fermés de grande dimension. Or, un tel mode de culture est 15 difficile à réaliser, car lorsque la densité des cellules augmente dans le milieu de culture, les cellules ont de plus en plus de difficulté à capter la lumière provenant de l'extérieur du réacteur. Il est alors nécessaire de brasser activement le milieu de culture, ce qui nécessite une importante dépense énergétique. 20 Les Thraustochytrides, en particulier Aurantiochytrium, sont connus pour produire du DHA lorsqu'ils sont cultivés en hétérotrophie [VV.K. Hong et al. (2011); Production of lipids containing high levels of docosahexaenoic acid by a newly isolated microalga, Aurantiochytrium sp. KRS101. Appl. Biochem. Biotechnol.: 164(8) :1468-80]. Aurantiochytrium est aussi connue 25 pour produire des caroténoïdes, tels que l'astaxanthine, la zéaxanthine, la canthaxanthine, l'échinénone, le bêta-carotène et la phoenicoxanthine [Yokoyama, R, Honda, D. (2007) Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, 30 Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov.; Mycoscience, Vol. 48, pp 199-211]. Il serait souhaitable de pouvoir obtenir des rendements en DHA et en caroténoïdes plus importants que ce qui est décrit dans l'art antérieur pour une exploitation industrielle plus efficace et plus rentable. Pour améliorer le rendement en DHA et en caroténoïdes, en particulier de la canthaxanthine et/ou en astaxanthine, une alternative aux modes de culture traditionnels serait de pratiquer les cultures en mode mixotrophe, c'est-à-dire avec un apport de lumière, de préférence, avec une intensité variable et/ou discontinue et en présence d'un apport de substrat organique. Il est entendu que le terme mixotrophe est usuellement employé à l'égard de souches présentant un chloroplaste, capable de se développer en présence de lumière en utilisant deux sources de carbone (organique et inorganique). Dans le cas des souches du genre Aurantiochytrium, un tel chloroplaste n'a pas été identifié. Toutefois, la souche étant à la fois hétérotrophe et réactive à la lumière, le terme mixotrophe sera élargi au sens de l'invention à cette catégorie de souche. On peut également utiliser le terme « photo-hétérotrophe » pour indiquer une telle souche. Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations de criblage de souches que le demandeur est parvenu à isoler des souches de protiste du genre Aurantiochytrium, cultivables en mode mixotrophe et permettant, dans les conditions de la présente invention, une production à haut rendement d'acides gras polyinsaturés et de caroténoïdes, notamment de DHA et des caroténoïdes, notamment de la canthaxanthine et de l'astaxanthine. Une souche (FCC 1324) représentative des nouvelles souches d'Aurantiochytrium ainsi isolées et sélectionnées, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni) le 21 juin 2013 selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro d'accession CCAP 4062/1.30 Description détaillée La présente invention a donc pour objet un procédé de culture des protistes de la classe Labyrinthulomycete, notamment de la famille 5 Thraustochytride, en particulier du genre Aura ntiochytrium, en mode mixotrophe, en particulier dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps. L'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est généralement comprise entre 5 pmol. m-2. s-1 et 1000 pmol. rn-2. S-1, de préférence entre 30 et 400 pmol. m-2. s-i. 10 Généralement, ces variations peuvent avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes. L'éclairement peut être notamment sous forme de flashs. 15 Ce procédé a pour avantage d'augmenter le rendement en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les protistes ainsi cultivés en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en acide docosahexaénoïque (DHA), et en caroténoïdes. Les caroténoïdes qui peuvent être produits par Aurantiochytrium selon un mode de réalisation de 20 l'invention sont l'astaxanthine, la zéaxanthine, la canthaxanthine, l'échinénone, le bêta-carotène et la phoenicoxanthine. Selon un mode de réalisation de l'invention, les caroténoïdes dominants sont la canthaxanthine et l'astaxanthine. La culture en mode mixotrophe de ce protiste s'effectue 25 préférentiellement en présence de 100 mM à 1,5 M, de préférence de 200 mM à 1,2 M, plus préférentiellement de 250 mM à 1 M, et encore plus préférentiellement de 300 mM à 600 mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides 30 et de caroténoïdes. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration suffisante. Ce substrat carboné organique comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, du saccharose et/ou du glycérol. Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés organiques adaptés à la culture en mixotrophie des protistes selon l'invention. Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en oeuvre de nouvelles souches de la classe Labyrinthulomycete, en particulier du genre Aurantiochytrium (Règne : Chromista, Ordre : Thraustochytriales, Famille: Thraustochytriaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés, notamment en DHA, et en caroténoïdes, notamment en canthaxanthine et/ou en astaxanthine, et notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 pE, dans un milieu riche en éléments organiques, par exemple le milieu Verduyn modifié (sels marins 15 g/L, (NH4)2SO4 3g/L , KH2PO4 1 g/L, MgSO4.71-120 , 0,5 g/L, Na2EDTA 24 mg/L, ZnSO4-7H20 3 mg/L, MnC12.2H20 3 mg/L, Na2Mo04-2H20 0,04 mg/L, FeSO4-7H20 10mg/L, pantothénate 3,2 mg/L, hydrochlorure de thiamine 9,5 mg/L, vitamine B12 0,15 mg/L, antimousse 0,1mL/L) dans lequel est ajouté un substrat carboné organique. De préférence, le substrat carboné organique comprend du glucose, du glycérol, dans une concentration équivalente ou supérieure à 300 mM. Par « souche », on entend non seulement les souches naturelles du genre Aurantiochytrium, mais également les mutants desdites souches naturelles. Une souche représentative des souches d'Aurantiochytrium selon 30 l'invention est la souche FCC 1324 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 4062/1. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives de biomasse ainsi que des lipides et des caroténoïdes, et plus particulièrement du DHA et de la canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine quand elles sont cultivées en mode mixotrophe, en particulier avec un apport en lumière variable ou discontinu, selon un mode de réalisation préféré de l'invention. Selon les analyses taxonomiques en cours, la souche CCAP 4062/1 appartient au genre Aurantiochytrium. L'invention porte sur toute souche de la classe Labyrinthulomycete, en particulier du genre Aurantiochytrium, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que le DHA et/ou des caroténoïdes tels que l'astaxanthine, la zéaxanthine, la canthaxanthine, l'échinénone, le bêta-carotène et la phoenicoxanthine. L'invention porte aussi sur toute espèce de protiste du genre Aurantiochytrium, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que le DHA, et des caroténoïdes tels que la canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine. Les souches Aurantiochytrium isolées selon l'invention permettent de produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives de biomasse ainsi que de lipides et de caroténoïdes, les lipides étant riches en DHA. En effet, le procédé de l'invention permet d'obtenir une biomasse d'Aurantiochytrium ayant 50% à 60 % de lipides par rapport au poids de la matière sèche. Le DHA peut représenter plus de 15 %, ou plus de 20 %, ou plus de 30 % des acides gras totaux contenus dans les protistes, les caroténoïdes étant riches en canthaxanthine et/ou en astaxanthine, et ladite canthaxanthine et/ou astaxanthine peut représenter plus de 0,1 %, ou plus de 0,15 %, ou plus de 0,2 % en poids sur le poids total de matière sèche. Les souches peuvent atteindre un niveau de productivité en canthanxathine et/ou en astaxanthine (quantité de produit d'intérêt produit, par litre de culture, par heure) de 0,05 mg/L/h, ou plus de 1 mg/L/h, ou plus de 1,5 mg/L/h. Dans la présente invention, les souches Aurantiochytrium (par exemple, la souche FCC 1324, isolée par le demandeur) qui sont cultivées en conditions mixotrophes, en particulier en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, permettent de produire de la canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine. Par contre, en conditions d'hétérotrophie aucune canthaxanthine n'est détectable. De plus, des quantités de biomasse obtenues en mode mixotrophe selon certains modes de réalisation de l'invention sont égales ou même supérieures (par exemple, approximativement supérieures de 10 à 18%) aux quantités obtenues en conditions d'hétérotrophie. Par conditions d'hétérotrophie, on entend des conditions de culture avec un milieu de culture identique, mais en l'absence de lumière. L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de protistes souches de la classe Labyrinthulomycete, notamment des familles Thraustochytride, en particulier du genre Aurantiochytrium, notamment de l'espèce Aurantiochytrium sp. telle que déposée, en mode mixotrophe, en particulier en présence d'un éclairement variable ou discontinu au cours du temps, par exemple sous forme de flashs, notamment en vue de produire des acides gras polyinsaturés et des caroténoïdes, tels que le DHA et la canthaxanthine et l'astaxanthine. L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des protistes souches de la classe Labyrinthulomycete, notamment des familles Thraustochytride et Labyrinthulide, en particulier, du genre Aurantiochytrium, notamment de l'espèce Aurantiochytrium sp. telle que déposée, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés et en caroténoïdes tels que le DHA et la canthaxanthine et l'astaxanthine, en mode mixotrophe, en particulier en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps. Il est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en oeuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des protistes et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides et de caroténoïdes. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux protistes a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des lipides ainsi qu'à la synthèse des caroténoïdes. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les protistes ont tendance à accumuler des réserves lipidiques et en caroténoïdes pour résister aux contraintes de leur environnement. Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées. Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de moins de 30 minutes. La durée peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. Selon certains modes de réalisation de l'invention, la durée du flash peut être de moins d'une seconde. Par exemple, le durée du flash peut être 1/10 d'une seconde, ou 2/10 d'une seconde, ou 3/10 d'une seconde, ou 4/10 d'une seconde ou 5/10 d'une seconde, ou 6/10 d'une seconde, ou 7/10 d'une seconde, ou 8/10 d'une seconde, ou 9/10 d'une seconde. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. Elle est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute. En général, le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 3600 par heure. Il peut être, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. Il peut être également compris entre 120 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. Il peut être également compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure. Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et de la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est entre 5 et 1000 pmol. m-2. s-1, de préférence entre 5 et 500 pmol. m-2. s-1, ou 50 et 400 pmol. m-2. s-1, et plus préférentiellement entre 150 et 300 pmol. m-2. s-i. 1 pmol. m-2. s-1 correspond à 1pE m-2. s-1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature. Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues. Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (pmol. m-2. s-1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière généralement comprise entre 5 et 1000, ou entre 50 et 800, ou entre 100 et 600 pmol. m-2. -1. s L'intensité de la lumière peut également varier entre 5 et 400 pmol. m-2. s-1. De préférence, l'amplitude de la variation d'intensité de lumière est entre 70 et 300 pmol. m-2. s-1 et plus préférentiellement entre 100 et 200 Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50p mol. m-2. s-i et 100 pmol. M-2S-1, ou 5 et 400 pmol. m-2s-1, ou 50 et 800 pmol. m-2. s-1 plusieurs fois chaque heure. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, de préférence, les valeurs 50 et 200 pmol. m-2. s-1. Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 pmol. m-2. s-1, les valeurs 0 et 100 pmol. m-2. s-1 ou préférentiellement encore les valeurs 0 et 200 pmol. m-2. s-1. Elle peut également atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 300 pmol. m-2. s-1, les valeurs 0 et 600 pmol. m-2. s-1, les valeurs 0 et 800 pmol. m-2. s-1 ou encore les valeurs 0 et 1000 pmol. m-2. s-1. Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction pmol. m-2. s-1. de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellules par ml et est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 106 et 5 x 106 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 15 pmol. m-2. s-1, de préférence, entre 5 et 10 pmol. m-2. 5-1. Quand la culture atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 pmol. m-2. s-1, par exemple, de préférence, entre 20 et 50 pmol. m-2. 5-1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 108 et 109 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 700 pmol. m-2. s-1, par exemple, de préférence, entre 50 et 150 pmol. m-2. s-1. Selon certains modes de réalisation, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, l'intensité de la lumière peut être plus importante par rapport aux valeurs citées ci-dessus. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 106 et 5 x 106 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 200 pmol. m-2. -1, s de préférence, entre 5 et 100 pmol. m-2. s-i. Quand la culture atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité 20 lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 30 et 500 pmol. m-2. -1, s par exemple, de préférence, entre 50 et 400 stade final, atteint une densité entre 108 et 109 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 100 et 1000 pmol. m-2. s-1 par exemple, de préférence, entre 200 et 500 pmol. m-2. s-1. 25 Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise entre environ 2000 et 600 000, de préférence entre 2000 et 300 000 pmol. m-2. Elle peut être comprise entre environ 4000 et 200 000 pmol. m-2 par heure. Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs 30 par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 pmol. m-2. s-1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 9000 pmol. m-2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée pmol. m-2. s-1. Quand la culture, au avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 pmol. rn-2. s-1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 12 000 pmol. m-2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 pmol. m-2. s-1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 pmol. m-2 Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité de 200 pmol. m-2. s-1, ce qui donne un apport total de lumière par 10 heure de 240 000 pmol. m-2. Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est de 105 et 5 x 105 cellules par ml, l'apport total de 15 lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 8000, de préférence 1500 et 6000 pmol. m-2, de préférence encore entre 2000 et 5000 pmol. m-2. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 67 000 pmol. m-2, de préférence entre 6000 et 50 000, et de 20 préférence encore entre 12 000 et 45 000 pmol. m-2, par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 300 000, par exemple, de préférence, entre 45 000 et 200 000 pmol. m-2, et par exemple, de préférence encore, entre 50 000 et 25 150 000 pmol. m-2. Selon un mode de l'invention, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 pmol. m-2. s-1, ce qui donne un apport total de 30 lumière par heure de 2250 pmol. m-2 à 4500 pmol. m-2. Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 pmol. m2. s-1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 pmol. m-2. Puis au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une 5 durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 pmol. m-2. s-1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 pmol. m-2. Selon un mode de l'invention, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x 105 cellules 10 par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 50 et 100 pmol. m-2. s-1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 15 000 pmol. m-2 à 30 000 pmol. m-2. Puis au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 50 flashs par heure, 15 chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 200 et 300 pmol. m-2. s-1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 100 000 à 150 000 pmol. m-2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une 20 intensité entre 350 et 450 pmol. m-2. s-1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 420 000 à 540 000 pmol. m-2. L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des sources de lumière réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Selon 25 un mode de réalisation préféré, l'éclairage des cultures est assuré par un dispositif d'illumination interne au fermenteur. Ainsi, l'efficacité de l'illumination est meilleure par rapport à une configuration où la lumière pénètre par des hublots à partir de sources disposées à l'extérieur. Les dispositifs d'illumination peuvent être disposés sur l'ensemble tournant muni 30 de pales ou sur des pièces tubulaires plongeant dans la masse à traiter, ou encore au fond ou au plafond de la cuve. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif d'illumination est situé sur les contre-pales à l'intérieur du fermenteur. Un tel dispositif est décrit dans la demande de brevet français N° 1353641. Le fermenteur est ainsi muni d'une pluralité de sources d'illumination portées par des contre-pales, ces dernières ayant pour fonction d'empêcher la formation d'un vortex au sein de la biomasse sous l'action de l'ensemble tournant de brassage. Ces sources d'illumination sont de préférence encapsulées, partiellement ou complètement dans au moins une partie de ces contre pales, dans une matière compatible avec la biomasse et en une épaisseur permettant de diffuser ladite lumière vers l'intérieur de la cuve. Une matière particulièrement bien adaptée est le polysulfone qui combine une bonne compatibilité avec les normes alimentaires (y compris les normes américaines de la Food and Drug Administration, ou FDA en abrégé), un bon coefficient de transfert thermique (permettant une évacuation de la chaleur vers la masse de micro-organismes et un caractère semi-transparent permettant une bonne transmission de la lumière, si le matériau a une épaisseur choisie entre 1 mm et 5 cm ; en outre, ce matériau conserve ses propriétés après un éventuel traitement thermique de stérilisation ou de nettoyage avec des détergents ou de l'acide. Si l'on modifie la combinaison de caractéristiques souhaitées, d'autres matériaux peuvent être choisis, par exemple le polyuréthane, le polypropylène, un matériau acrylique ou un polycarbonate. De manière préférée, les sources d'illumination sont des diodes électro-luminescentes (LED en abrégé); il s'agit de sources de lumière bien maîtrisées, aussi bien dans leur mise en oeuvre que dans leurs applications. De telles sources peuvent avoir des spectres d'émission très divers, puisqu'il y a des LED blanches (simulant la lumière solaire), mais aussi des LED à gamme spectrale réduite (par exemple centrées sur une lumière rouge, bleue ou verte). De telles sources d'illumination génèrent moins de chaleur que des bulbes ou des ampoules ; elles ont en outre des dimensions suffisamment petites pour pouvoir être implantées sur les faces des contre-pales sans induire de surépaisseur nuisant à la fonction principale de ces plaques. Le spectre des sources d'illumination est avantageusement dans le domaine du visible, mais peut aussi, en fonction des besoins, être à l'extérieur de ce domaine visible, par exemple dans les UV (par exemple pour des applications impliquant une stérilisation), ou dans les infra-rouges (par exemple, dans des applications visant à générer de la chaleur au sein de la masse à traiter). Les sources d'illumination peuvent avoir des régimes de commande (on parle aussi de régimes de contrôle ou de pilotage) très variés Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi cultivées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés et en caroténoïdes, notamment en DHA et en canthaxanthine et/ou en astaxanthine. Le procédé de culture selon l'invention permet de produire des lipides et des caroténoïdes. Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes : a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches de la classe Labyrinthulomycete, en particulier du genre Aurantiochytrium dans des conditions mixotrophes, en particulier en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 pmol. m-2. s-1 et 1000, de préférence entre 5 et 400 pmol. m-2. s-1, ces variations ayant lieu entre 2 et 3600, de préférence 5-400 fois par heure, b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement c) une étape de récupération des protistes ainsi cultivés. Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations. d) une étape de récupération de la matière hydrophobe des protistes, et éventuellement e) l'extraction du DHA (acide docosahexaénoïque) et des caroténoïdes de la matière hydrophobe récupérée. La matière hydrophobe comporte en effet les lipides et les caroténoïdes. Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce du genre Aurantiochytrium, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire du DHA et 10 des caroténoïdes. Le procédé de culture selon l'invention permet d'optimiser la production de la biomasse obtenue de la culture. Il permet également d'enrichir les protistes ainsi cultivés en acides gras polyinsaturés et en caroténoïdes, plus particulièrement en acide docosahexaénoïque (DHA) et 15 en canthaxanthine et/ou en astaxanthine. L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production de biomasse, ainsi que la production de lipides et de caroténoïdes, notamment d'acides gras, via la culture de protistes du genre Aurantiochytrium à caractère mixotrophe, de préférence cultivés ou 20 sélectionnés selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des protistes ainsi cultivés pour en extraire le contenu hydrophobe, en particulier les lipides dont le DHA et les caroténoïdes dont la canthaxanthine et l'astaxanthine. Les méthodes d'extraction sélective des lipides dont le DHA 25 sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959); A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol., 37:911-917]. Les méthodes d'extraction et d'analyse des caroténoïdes, dont la lutéine, sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites 30 par Wright et al. (1991) (S.W. Wright, S.W. Jeffrey, R.F.C. Mantoura, C.A. Llewellyn, T. Bjornland, D. Repeta, N. Welschmeyer : lmproved HPLC method for the analysis of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton. Marine ecology progress series : Vol. 77: 183-196, 1991). L'invention porte également sur les protistes de la classe Labyrinthulomycete, notamment de la famille Labyrinthulaceae et 5 Thraustochytriaceae, en particulier du genre Aurantiochytrium, susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Ces protistes sont enrichis en acides gras polyinsaturés et en caroténoïdes. Les lipides totaux de tels protistes représentent généralement plus de 40 '3/0, ou plus de 50 %, ou plus de 60 °A) en poids de la matière sèche. De manière 10 générale, ils peuvent avoir un titre de DHA de 10 g/L à 20 g/L. La canthaxanthine et/ou l'astaxanthine contenue par de tels protistes, selon un mode de l'invention, peut représenter plus de 0,1 cY0, ou plus de 0,15 %, ou plus de 0,2 % en poids sur le poids total de matière sèche. Les protistes selon un mode de réalisation de l'invention peuvent avoir ainsi une 15 productivité (quantité de produit d'intérêt produit, par litre de culture, par heure) de canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine de 0,05 mg/L/h, ou plus de 1 mg/L/h, ou plus de 1,5 mg/L/h. Ils peuvent avoir également avoir une productivité de DHA d'au moins 0,1 g/L/h, de préférence 0,2 g/L/h DHA, et plus préférentiellement d'au moins 0,3 g/L/h DHA. 20 Exemple 11 Les cultures d'Aurantiochytrium sont réalisées dans des fermenteurs 25 (bioréacteurs) de 1 à 2 L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 2N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1N). La température de culture est fixée à 26 °C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration 30 de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La pression d'oxygène dissous est régulée dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse d'agitation (250-600 t/min), le débit d'air (0,25- 1 vvm), voire le débit d'oxygène (0,1-0,5 vvm). Les paramètres de régulation, intégrés dans l'automate de supervision, permettent de maintenir une p02 constante à 15 %. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente. L'intensité ainsi que les cycles de lumière sont contrôlés par un automate dédié et supervisé par station informatique. Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 t/min) en enceinte thermostatée (26 °C) et éclairée entre 100 et 200 pE. Les pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu Verduyn modifié (sels marins 15 g/L, (NH4)2SO4 3g/L , KH2PO4 1 g/L, MgSO4.7H20, 0,5 g/L, Na2EDTA 24 mg/L, ZnSO4.7H20 3 mg/L, MnC12-2H20 3 mg/L, Na2Mo04.2H20 0,04 mg/L, FeSO4-7H20 10mg/L, pantothénate 3,2 mg/L, hydrochlorure de thiamine 9,5 mg/L, vitamine B12 0,15 mg/L). Le substrat carboné utilisé pour la culture en mixotrophie classique, en hétérotrophie et en mixotrophie flash (lumière variable/discontinue) en bioréacteur est du glucose à des concentrations entre 300 mM et 1 M. Suivi des cultures : La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GF/F, Whatman, puis séchage en étuve, à 105 °C, pendant 24 h minimum avant pesée). Concernant la quantification des lipides totaux, 108 cellules ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier. Pour la quantification des caroténoïdes, et notamment la canthaxanthine et de l'astaxanthine, 108 cellules ont été extraites. Les 25 méthodes d'extraction et d'analyse des caroténoïdes, dont la canthaxanthine et de l'astaxanthine, sont connues de l'homme du métier. Eclairement (pour la culture en mixotrophie) : La culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant 30 une durée de 30 secondes et une intensité de 200 pmol. m-2. s-1. L'apport de lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des lampes LED réparties autour de la paroi externe du fermenteur. Une horloge déclenche ces LED pour des temps d'éclairement ou des pulses (pour la culture en mixotrophie flash avec lumière discontinue). Résultats (n=3) : Masse Sèche (g/L) Lipides % DHA (des acides gras totaux) Astaxanthine (mg/g de MS) totaux (% de la MS) Mixotrophie Flash 115 +/- 2 56 +/- 3,6 18,3 +/- 2,8 1,1 +/- 0,1 Hétérotrophie 112,2 +1-1,6 44,5 +/- 2,9 19,1 +/- 2,5 0 REVENDICATIONS1. Procédé de production de DHA et/ou de caroténoïde(s), 5 en particulier de canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine, comprenant l'étape suivante : a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Aurantiochytrium. 10 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture en mode mixotrophe se fait dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 pmol. m-2. s-1 et 1000 pmol. m-2. s-1, ces variations ayant lieu entre 2 et 3600 fois par heure. 15 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'amplitude des variations d'intensité est comprise entre 70 et 300 pmol. m-2. s-1, et de préférence, entre 100 et 200 pmol. m-2. s-1. 20 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'un flash a une durée comprise entre 1/10 seconde et 10 minutes, de préférence 25 5 secondes et 10 minutes, de préférence encore entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute. 6. Procédé selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisé en ce que le nombre de flashs est entre 5 et 3600, de préférence entre 10 et 30 150, préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement entre 20 et 50 fois par heure. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la culture s'effectue en présence d'un substrat carboné organique à une concentration de 100 mM à 1,5 M, de préférence de 200 mM à 1,2 M, plus préférentiellement de 250 mM à 1 M, et encore plus préférentiellement de 300 mM à 600 mM d'un substrat carboné organique, le substrat carboné organique étant choisi parmi le saccharose, le glycérol, le glucose et les dérivés de cellulose et un mélange de ces molécules. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit substrat carboné organique présent dans le milieu de culture comprend au moins 300 mM de glucose et/ou glycérol. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement c) une étape de récupération des protistes ainsi cultivés, et éventuellement d) une étape de récupération de la matière hydrophobe, et éventuellement e) l'extraction du DHA (acide docosahexaénoïque) et de caroténoïde(s) de la matière hydrophobe récupérée. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, 25 caractérisé en ce que ledit protiste du genre Aurantiochytrium correspond à la souche FCC 1324, déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro d'accession CCAP 4062/1. 11. Souche FCC 1324 Aurantiochytrium sp., déposée auprès de la 30 CCAP, sous le numéro d'accession CCAP 4062/1. 12. Protiste du genre Aurantiochytrium susceptible d'être obtenu par le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ses lipides totaux représentent plus de 40%, ou plus de 50%, ou plus de 60 % en poids de la matière sèche et qu'il comporte plus de 0,1%, ou plus de 0,15 °A, ou plus de 0,2 % en poids de caroténoïde(s) en poids de la matière sèche. 13. Protiste selon la revendication 12, caractérisé en ce que le DHA représente plus de 15%, ou plus de 20%, ou plus de 30% de ses acides gras 10 totaux. 14. Protiste selon la revendication 12 ou 13, ayant une productivité en caroténoïde(s) de 0,05 mg/L/h, ou plus de 1 mg/L/h, ou plus de 1,5 mg/L/h et/ou une productivité de DHA d'au moins 0,1 g/L/h, de préférence 0,2 g/L/h 15 DHA, et plus préférentiellement d'au moins 0,3 g/L/h DHA. 15. Protiste selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le(s) caroténoïde(s) dominant(s) est/sont la canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine. 20