Brevet FR3004194A1 — publié le 20141010

PROCEDE DE FABRICATION D'UN SUPPORT D'ANALYSE COMPRENANT-UNE MATRICE MICROBIENNE, SUPPORT ASSOCIE ET UTILISATIONS DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION [0001] L'invention se rapporte au domaine de la fabrication de supports d'analyse, en particulier des substrats de SERS ou/et LSPR, c'est-à-dire utilisés pour réaliser des Spectres Raman Exhaltés de Surface ou/et des résonances plasmoniques de surface. L'invention porte également sur de tels supports d'analyse et leur utilisation. [0002] Les performances des biocapteurs utilisant une détection SERS/LSPR dépendent étroitement de la façon dont sont organisées les nano-particules métalliques sur le substrat, mais également de leur taille, leur forme et des distances inter-particules. Un besoin dans ce domaine est de réaliser des motifs de dimensions microniques dans lesquels les nano-particules sont réparties. A l'heure actuelle, les techniques connues sont difficilement reproductibles ou sont complexes et/ou coûteuses pour ce qui est des consommables utilisés. ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE [0003] L'état de la technique propose des procédés de fabrication de supports d'analyse. Ainsi, on connaît par le document EP 2 442 142, un procédé de fabrication d'un support d'analyse comprenant une couche d'accroche de 3-mercaptopropyl- trimethoxysilane (MPTMS) et une couche de nanoparticules. Le procédé de ce document est basé sur une lithographie. [0004] Ce type de procédé s'avère très complexe. En outre les appareillages et consommables utilisés dans ce procédé sont onéreux. [0005] On connaît également des supports d'analyse dans des documents tels que R. A. Halvorson, P. J. Vikesland, Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) for environmental Analyses, Environ. Sci. Technol. 2010, 44, 7749-7755. [0006] Malheureusement, le support d'analyse du type présenté dans ce document n'a pas des propriétés optiques satisfaisantes et un bruit de fond gênant est observé lors de son utilisation. EXPOSE DE L'INVENTION [0007] L'invention vise notamment à proposer un procédé plus simple, moins onéreux et facilement reproductible par rapport à l'état de la technique. [0008] Pour ce faire est proposé un procédé de fabrication d'un support d'analyse qui comprend une couche nanostructurée de métal précieux, comprenant les étapes pour : - fournir un substrat diélectrique, en particulier un substrat SERS/LSPR, - déposer au moins une couche intermédiaire sur le substrat, - déposer une couche fine de nanoparticules de métal précieux, de préférence d'or, sur ladite au moins une couche intermédiaire, et de préférence recuire la couche fine de nanoparticules de métal précieux. [0009] Selon un premier aspect de l'invention, la couche intermédiaire comprend des microorganismes configurés pour former une matrice incrustée de nanoparticules de métal précieux. Le terme « matrice » peut s'entendre comme « ensemble de moules », « support de motifs » ou encore « templates » en langue anglaise. [0010] Par « substrat diélectrique » on entend tout matériau solide transparent ou opaque à la lumière visible, aux Ultra-Violets ou aux Infra Rouges. Ce matériau comprend avantageusement des atomes de silicium ou des groupements d'oxyde de silicium. De manière générale, le substrat diélectrique peut consister en un verre minéral (silicosodocalcique, borosilicate, vitrocéramique etc) ou un verre organique (polymère thermoplastique tel qu'un polyuréthane ou un polycarbonate) ou tout autre matériau diélectrique. Ce type de substrat est par exemple utilisé pour réaliser des Spectres Ramman Exhaltés de Surface (SERS) et/ou des résonances plasmoniques de surface (LSPR). [0011] Pour l'interprétation de la présente invention, l'expression « métal précieux » peut désigner tout type de métal utilisé dans les technologies de type SERS/LSPR. Cette expression désigne par exemple le platine, le palladium, l'or, l'argent, le cuivre ou l'aluminium. [0012] De manière surprenante, le demandeur s'est aperçu que la couche de microorganismes confère de meilleures propriétés optiques au support d'analyse. [0013] En outre, cette couche de microorganismes comme matrice permet une bonne organisation des nanoparticules de métal précieux suivant un motif particulier avec une très bonne reproductibilité. [0014] De plus, les coûts liés au procédé selon l'invention sont également abaissés par rapport à l'utilisation de couches d'accroche par exemple à base de MPTMS et/ou à l'utilisation de nanolithographie pour l'organisation des nanoparticules. [0015] Enfin, l'utilisation de cette couche de microorganisme permet d'augmenter la densité de nanoparticules sur une surface donnée. [0016] Selon un autre aspect, les microorganismes sont des bactéries ou des levures. [0017] De préférence, la couche de métal précieux est déposée par évaporation ou par pulvérisation. [0018] Selon une variante, le procédé de fabrication comprend une étape pour fonctionnaliser le support d'analyse, de préférence avec une molécule biologique. [0019] Avantageusement, les microorganismes sont préalablement déshydratés et/ou fixés, et facultativement conservés dans une solution de déshydratation et/ou une solution de fixation. [0020] Selon une variante intéressante, la couche de métal précieux est déposée suivant une structuration supplémentaire, de préférence au moyen d'un masque, en particulier d'une grille de microscopie électronique. En particulier, le maillage préféré est de quelques dizaines de micromètres, de préférence environ 90 micromètres. La couche intermédiaire peut aussi être déposée suivant une structuration supplémentaire identique ou différente de celle de la couche de métal précieux. [0021] Par structuration, on entend un motif, régulier ou non, d'organisation de la couche de métal précieux. [0022] L'invention porte également sur un support d'analyse qui comprend une couche nanostructurée de métal précieux, comprenant : - un substrat diélectrique, en particulier un substrat SERS/LPRS, - une couche intermédiaire prévue sur le substrat, - une couche fine recuite de nanoparticules de métal précieux, de préférence d'or, sur ladite au moins une couche intermédiaire. [0023] Selon un premier aspect, la couche intermédiaire comprend des microorganismes, de préférence des bactéries ou des levures, configurées pour former une matrice aux nanoparticules de métal précieux. [0024] Selon un autre aspect, la couche de métal précieux mesure de 2 à 6 nm, de préférence 4 nm. [0025] Selon une variante intéressante, le support d'analyse est fonctionnalisé, de préférence avec une molécule biologique ou chimique. [0026] Un autre objet de l'invention consiste en un kit d'analyse d'un échantillon comprenant un support d'analyse tel que décrit précédemment ou obtenu par un procédé de fabrication tel que décrit précédemment. [0027] L'invention porte également sur un procédé d'analyse d'un échantillon comprenant la mise en place de l'échantillon sur un support d'analyse tel que décrit précédemment ou obtenu par un procédé de fabrication tel que décrit précédemment. L'échantillon peut ensuite être analysé. [0028] Un autre objet de l'invention consiste en une utilisation d'une couche microbienne comprenant des microorganismes configurés pour former une matrice pour des nanoparticules de métal précieux, pour réaliser un support d'analyse comprenant une couche nanostructurée de métal précieux. En particulier, l'invention porte sur une méthode basée sur une telle utilisation. [0029] L'invention porte également sur un kit de fabrication d'un support d'analyse comprenant : - un substrat diélectrique, en particulier un substrat SERS/LSPR, et - des microorganismes de préférence déshydratés et/ou fixés, facultativement conservés dans une solution de déshydratation et/ou une solution de fixation. [0030] En particulier, le kit de fabrication est configuré pour réaliser le procédé décrit précédemment. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES [0031] D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description qui suit, en référence aux figures annexées, qui illustrent : la figure 1A, des spectres LSPR de nanostructures d'or (NP-Au) avec différentes épaisseurs de film (2 nm. 4 nm et 6 nm. respectivement) sans couche bactérienne ; la figure 1B, des spectres SERS desdites nanostructures d'or avec un dépôt de 10pL de BPE à 10-5 M ; la figure 2, des spectres SERS de nanostructures d'or avec ou sans matrice bactérienne, avec un dépôt de 10pL de BPE à 10-5 M; la figure 3, des spectres SERS nanostructures d'or avec matrice bactérienne et avec différentes concentrations en BPE ; la figure 4, une image en microscopie de bactéries lors de la mise en oeuvre du procédé selon une variante préférée de l'invention ; - la figure 5, une comparaison de la densité de particules fixées avec ou sans matrice bactérienne. [0032] Pour plus de clarté, les éléments identiques ou similaires sont repérés par des signes de référence identiques sur l'ensemble des figures. DESCRIPTION DETAILLEE D'UN MODE DE REALISATION [0033] Le principe général des SERS est développé dans des publications scientifiques notamment M. G. Albrecht, J. A. Creighton, Anomalously intense Raman spectra of pyridine at a silver electrode, J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 5215-5217 ; A. Campion, P. Kambhampati, Surface-enhanced Raman scattering, Chem. Soc. Rev. 1998, 27, 241-250; R. A. Halvorson, P. J. Vikesland, Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) for environmental Analyses, Environ. Sci. Technol. 2010, 44, 7749-7755. Exemple de culture et fixation de cellules microbiennes : cas des bactéries E. coli [0034] Des bactéries E. coli sont cultivées dans un milieu LB frais (2 mg de LB de référence Sigma® L320) dans 100 mL d'eau doublement distillée (ddH2O) et autoclavée à 121°C pendant 15 minutes). [0035] Une goutte d'E. coi/ est déposée dans 10 mL dudit milieu LB contenant 10pL de kanamycine à 50 mg/mL. Les bactéries sont cultivées à 37°C pendant 12 heures au bain-marie, jusqu'à l'obtention d'une densité optique de 0,7. Ensuite, 1 mL de la suspension cellulaire résultante est centrifugée à 10 000 rpm pendant 10 minutes puis lavée deux fois avec un tampon PBS. [0036] Le culot cellulaire de bactéries obtenu est fixé dans 500pL de glutaraldéhyde (référence Sigma® G7651) dans une solution aqueuse à 2,5% en poids, à 4°C pendant 4 heures. Après la fixation, la suspension cellulaire est centrifugée à 10 000 rpm pendant 5 minutes puis lavée deux fois avec de l'eau doublement distillée. [0037] Ensuite, la suspension a subi une déshydratation progressive par étape en utilisant des solutions aqueuses d'éthanol de concentration respectives de 30%, 50%, 70%, et 100%. [0038] Chaque étape est conduite pendant 15 minutes à 4°C, et suivi d'une centrifugation à 10 000 rpm pendant 5 minutes et un lavage à l'eau doublement distillée. [0039] Enfin, les cellules bactériennes sont dispersées dans 1 mL d'éthanol absolu pour être prêtes à être utilisées comme matrice SERS/LSPR. Exemple de fabrication de matrice cellulaire avec des nanostructures d'or (NP- Au) : cas des bactéries E. coli [0040] Une lame de microscopie classique est découpée en morceaux de 10 mm sur 5 mm, et est utilisée pour préparer des substrats SERS. Le substrat de verre est exposé à un une solution à 2:8 de détergent Deco-90/ddH2O dans un bain marie ultrasonique à 50°C pendant 15 min. Ce détergent (Decon-90) est commercialisé par Sigma-Aldrich. [0041] Après avoir été séchée dans un flux d'azote, 20pL de la suspension bactérienne obtenue précédemment (DO 0,7) dans de l'éthanol absolu sont prélevés et déposés sur le substrat de verre nettoyé, puis séchés librement à l'air. Par la suite, une grille de cuivre TEM (Microscopie Electronique à Transmission) de 3,05 mm de diamètre avec un maillage de 200 (commercialisé sous la marque Pelco®) est de préférence fixé sur le verre modifié par des bactéries et utilisé comme masque pour une évaporation d'un un film fin d'or au moyen d'un évaporateur de métal sous vide (Référence Plassys MEB 400) en mode faisceau d'électron. Dans les exemples étudiés, l'épaisseur va de 2 nm à 6 nm. [0042] Enfin, après avoir enlevé la grille de cuivre TEM, le verre évaporé d'or est transféré dans un four à haute température pour effectuer un recuit à 550°C pendant 8 heures sous atmosphère d'oxygène. Mesures optiques et caractérisation de la morphologie [0043] Les mesures d'extinction LSPR (Localized Surface Plasmon Resonances Résonances Plasmon de Surface Localisées) sont effectuées en utilisant un système confocal Ultra Violet-visible-infra rouge proche (UV-vis-NIR) artisanal, comprenant une fibre optique d'illumination de 600 nm de diamètre une fibre optique de collecte de 150 nm de diamètre en mode transmission. Le faisceau incident est focalisé perpendiculairement sur la surface de l'échantillon présentant des nanoparticules d'or. La performance SERS des substrats obtenus est évaluée en utilisant un marqueur Raman non résonant de trans-1,2-bis(4-pyridyl)éthylène (BPE). Les mesures SERS sont conduites en utilisant un système de microscope Jobin Yvon LabRam® équipé d'un laser de 633 nm et de 11mW fonctionnant en mode rétrodiffusé. Des goutes (10pL) de solution de BPE à différentes concentrations s'étalant de 10-5 à 10-12 M sont déposées sur le substrat d'or sur matrice de bactéries, puis les résultats du SERS sont enregistrés avec un objectif à 10x directement dans l'air. La morphologie des cellules bactériennes fixées et des substrats SERS est caractérisée en utilisant un microscope électronique à balayage (MEB) à émission de champ (de référence FEG eLine, Raith). Avant l'imagerie MEB, tous les échantillons sont soumis à une pulvérisation cathodique d'une couche fine de palladium afin de supprimer les effets de charge. Résultats et discussions [0044] Les échantillons obtenus après le recuit à haute température montrent que des nanoparticules d'or qui sont dispersées et extrêmement stables sur le substrat de verre. La morphologie de ces nanostructures (notamment en termes de taille, de forme et d'espacement entre particules) peut être facilement modifiée par des paramètres expérimentaux, tels que l'épaisseur d'évaporation du film d'or. Cela détermine les propriétés finales du LSPR qui affectent fortement l'efficacité SERS des substrats obtenus. [0045] En termes de taille de nanoparticules d'or, il a déjà été rapporté que de larges tailles de nanoparticules d'or 40 nm) impliquent généralement une intensité SERS excellente quand les particules sont proches l'une de l'autre (voir notamment Hongyu Chen et al. Measuring Ensemble-Averaged Surface-Enhanced Raman Scattering in the Hotspots of Colloidal Nanoparticle Dimers and Trimers, J. AM. CHEM. SOC. 2010, 132, 3644-3645). Ainsi selon une variante, l'invention porte sur un support où les nanoparticules mesurent au moins 40 nm tout en étant compatible avec ladite analyse. [0046] Selon une autre variante, les nanostructures d'or sont déposées par évaporation suivie par le protocole de recuit à haute température. Dans ces cas, la taille des particules et la distance entre les particules augmentent en même temps que l'augmentation de l'épaisseur du film évaporé. Dans cette variante, des épaisseurs de de 2, 4 et 6 nm d'or évaporé ont été testées pour optimiser l'intensité SERS. Les échantillons utilisés dans ces expériences ont été préparés selon le protocole à multicycle d'évaporation développé dans le document Rodica E. Ionescu et al., Sensitive Localized Surface Plasmon Resonance Multiplexing Protocols Anal. Chem. 2012, 84, 8020-8027. [0047] Dans ces tests, les spectres d'extinction LSPR ont été enregistrés en mesures d'extinction de transmission (Figure 1A) et leurs propriétés SERS correspondantes ont été évalués en enregistrant les spectres Raman après le dépôt de 10pL de solution de BPE (10-5 M) sur différentes zones de nanoparticules d'or (Figure 1B) comme illustré dans l'encart des figures correspondantes. [0048] Les résultats de LPSR de la figure 1A montrent que la longueur d'onde de résonance plasmon est légèrement décalée vers le rouge, tandis que la densité optique maximale augmente considérablement avec une épaisseur accrue d'évaporation d'or. [0049] Une augmentation importante du maximum de densité optique de 0,19 à 0,52 avec un léger décalage vers le rouge de la longueur d'onde de résonance (10 nm) ont été observés lorsque l'épaisseur d'évaporation passe de 2 nm à 6 nm. Lorsque ces échantillons ont été utilisés comme substrats pour des mesures SERS, les nanoparticules d'or avec une épaisseur évaporation d'or intermédiaire de 4 nm ont présenté la plus grande intensité SERS pour une même goute de BPE par rapport aux autres épaisseurs (Fig. 1B). Les pics peuvent être identifiés d'après les publications de l'art antérieur (notamment P. G. Etchegoin et al., Single-molecule surface-enhanced Raman spectroscopy of Nonresonant Molecules, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1446614472 ; B. Gu et al., Free-standing optical gold bowtie nanoantenna with variable gap size for enhanced Raman spectroscopy, Nano Lett. 2010, 10, 4952-4955 ; M. J. Sepaniak et al., Controllable nanofabrication of aggregate-like nanoparticle substrates and evaluation for surface enhanced Raman spectroscopy, ACS Nano 2009, 3, 38453853). [0050] Comme on peut le voir sur la figure 1B, il y a un bruit de fond important de sorte que les pics d'intensité SERS inférieurs à 2000 u.a. sont difficilement identifiables. [0051] Il semble préférable, pour ce qui concerne le BPE, d'effectuer des analyses avec une épaisseur d'évaporation de 4nm. Cette épaisseur peut être différente en fonction des constituants du support d'analyse et/ou du type d'échantillon à analyser. [0052] De manière surprenante la demanderesse c'est aperçue que des microorganismes, en particulier des bactéries, pouvaient servir de matrice (template) pour contrôler l'assemblage des nanoparticules de métal précieux, en particulier d'or pendant leur mise en place et/ou leur recuit à haute température (comme par exemple 550°C après 8 heures). [0053] Après des essais illustrés en figure 2, la demanderesse s'est aperçue d'une augmentation extraordinaire de l'intensité Raman en comparaison avec un essai sans matrice microbienne tel qu'exposé ci-dessus (épaisseur de 4 nm). [0054] Comme on peut le voir sur la figure 2 le bruit de fond est considérablement diminué. En effet, des pics qui n'étaient pas identifiables sont maintenant clairement identifiés, notamment le pic à 1425 cm-1. Cependant certains d'entre eux pourraient être attribués aux bactéries utilisées. [0055] En outre l'intensité Raman des pics est considérablement augmenté, jusqu'à 8 fois par rapport aux essais sans microorganismes. En conséquence, la détection peut être effectuée avec un appareillage moins précis et par conséquent moins onéreux. [0056] Des tests à 2 et 6 nm ont également montré une augmentation considérable de l'intensité SERS dans les mêmes conditions. [0057] En se référant à la figure 3, des spectres SERS ont été réalisés avec différentes concentrations en BPE. La courbe contrôle est une courbe réalisée avec un support ne comprenant pas de matrice microbienne. [0058] Etonnamment, le support selon l'invention permet de réaliser des dosages de composés chimiques ou biologiques grâce à la précision d'organisation des nanostructures conférées par la matrice microbienne. En effet, on peut voir que les pics majeurs sont clairement identifiables de 10-5 à 10-12 M. Ces pics ont augmenté de manière proportionnelle à l'augmentation de la concentration en composé chimique BPE utilisé comme molécule modèle. [0059] Les autres pics n'ayant pas augmenté de manière proportionnelle seraient indépendant de ceux de l'échantillon étudié. Ceci permet de discriminer facilement les pics pertinents. [0060] La morphologie et la topographie des étapes du procédé ont été caractérisées. En se référant à la figure 4, la partie A illustre la morphologie typique de cellules bactériennes après fixation au glutaraldéhyde. Les cellules bactériennes E. coli présentent une longueur d'environ 1 à 2 pm et une épaisseur d'environ 600 nm. On peut voir la rugosité de la surface bactérienne ainsi que les flagelles péritriches. [0061] La partie B de la figure 4 illustre une couche recuite de nanoparticules obtenue à haute température (de préférence environ 550 °C) en partant d'un film d'or évaporé sur une lame de verre pour une épaisseur de 4 nm, sans matrice bactérienne. On observe que les nanoparticules sont régulièrement dispersées sur la surface du support d'analyse. La taille moyenne des nanoparticules peut être mesurée. Elle est d'environ 20 nm. [0062] La partie C de la figure 4 illustre une couche recuite de nanoparticules d'or pour une épaisseur de 4 nm, avec une matrice bactérienne. Comme on peut l'observer, on obtient des agrégats de nanoparticules d'or confinés dans les cellules microbiennes. Cela aboutit à une plus grande densité de nanoparticules (NPs) à l'intérieur des matrices microbiennes. De même, on a une densité moins importante des NPs en dehors des cellules microbiennes. [0063] La partie D est un agrandissement deux fois illustrant des cellules bactériennes de la partie C. Comme on peut l'observer, les nanoparticules les plus larges sont générées au centre de la cellule. De plus, une grande quantité de particules plus fines sont organisées de manière dense au niveau de l'enveloppe cellulaire. En particulier une distance inter-particules de moins de 10 nm a été observée. [0064] Selon une hypothèse, la disposition de points chauds plasmoniques localisés en particulier à proximité de la membrane des cellules microbiennes, serait responsable des excellentes propriétés SERS des supports d'analyse selon l'invention. Le mécanisme exact n'est pas encore clairement élucidé. [0065] La répartition de tailles et la densité des nanoparticules à l'intérieur (partie A) et à l'extérieur (partie B) d'une cellule ont été analysées au moyen du logiciel ImagJ® développé par le National Institute of Health. Les résultats sont illustrés en figure 5. Pour une meilleure comparaison, l'analyse des nanoparticules à l'extérieur de la cellule s'est faite suivant une surface identique à celle de la cellule (partie B). Pour plus de simplicité, les calculs ont été faits sur la base de la surface couverte corrélée négativement à la distance entre les particules. [0066] Pour ce qui concerne les nanoparticules localisées dans la cellule (partie A), on observe une plus grande répartition de taille. Elle s'étend majoritairement de 5 nm à 30 nm. Il y a une majorité de nanoparticules ayant une taille allant de 10 à 20 nm. Au contraire, pour ce qui concerne les nanoparticules localisées à l'extérieur de la cellule (partie B), on observe une répartition de taille beaucoup plus petite. Il y a une majorité de nanoparticules ayant une taille allant de 20 nm. [0067] La surface couverte (densité) par les nanoparticules à l'intérieur de la matrice est de 44,2%. Elle est deux fois plus importante que celle des nanoparticules à extérieur de la matrice, qui est de 20.4%. [0068] Sur la base de ces analyses de zones on peut conclure que, pour une surface totale donnée, une densité de couverture plus importante correspondrait à une plus petite distance entre les particules. Cela tendrait à expliquer l'extraordinaire augmentation de l'intensité SERS enregistrée avec les matrices bactériennes. [0069] Des essais ont également été réalisés avec des films évaporés de 2 et 6nm d'épaisseur. Ces essais sont illustrés au tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : Film d'or (en nm) Intérieur de la cellule Extérieur de la cellule 2 5-20 32,7% 8-10 17,4% 4 5-30 44,2% 2025 20,4% 6 5-40 33,7% 4050 18,2% [0070] Avec une évaporation de 2 nm de film d'or, les nanoparticules obtenues sont plus petites que celles obtenues à 4 nm. Les particules à l'intérieur des cellules sont de même plus nombreuses que celles à l'extérieur. Quantitativement, les nanoparticules à l'intérieur des matrices montrent une distribution de tailles de 5 à 20 nm et une couverture de 32,7%. La densité est donc légèrement inférieure dans le cas d'une épaisseur de 2 nm, par rapport à 4 nm. A l'extérieur, les nanoparticules sont plus uniformes en taille (8nm). La surface couverte est cependant de 17%. Cette surface couverte est environ deux fois inférieure à celle à l'intérieur de la matrice bactérienne. [0071] Des caractéristiques similaires sont observées avec une évaporation de 6 nm. La distribution de tailles est comprise entre 5 et 40 nm dans les cellules. A l'extérieur de la matrice les tailles sont d'environ 40 nm. La surface couverte est également environ deux fois plus importante à l'intérieur (37,7%) par rapport à l'extérieur. [0072] Ainsi, les caractéristiques d'organisation des nanoparticules dans une matrice microbiennes sont vérifiées à 2 et 6nm et probablement à d'autres épaisseurs. [0073] De nombreuses combinaisons peuvent être envisagées sans sortir du cadre de l'invention ; l'homme de métier choisira l'une ou l'autre en fonction des contraintes économiques, ergonomiques, dimensionnelles ou autres qu'il devra respecter. [0074] L'homme du métier pourra par exemple adapter l'invention à des microorganismes différents et/ou à des métaux précieux différents. REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un support d'analyse qui comprend une couche nanostructurée de métal précieux, comprenant les étapes pour : - fournir un substrat diélectrique, en particulier un substrat SERS/LSPR, - déposer au moins une couche intermédiaire sur le substrat, - déposer une couche fine de nanoparticules de métal précieux, de préférence d'or, sur ladite au moins une couche intermédiaire, et de préférence recuire la couche fine de nanoparticules de métal précieux, caractérisé en ce que la couche intermédiaire comprend des microorganismes, de préférence des bactéries ou des levures, configurés pour former une matrice aux nanoparticules de métal précieux. 2. Procédé de fabrication selon la revendication 1, caractérisé en ce que la couche de métal précieux est déposée par évaporation ou par pulvérisation. 3. Procédé de fabrication selon l'une des revendications 1 ou 2, comprenant une étape pour fonctionnaliser le support d'analyse, de préférence avec une molécule biologique/chimique. 4. Procédé de fabrication selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les microorganismes sont préalablement déshydratés et/ou fixés, et facultativement conservés dans une solution de déshydratation et/ou une solution de fixation. 5. Procédé de fabrication selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la couche de métal précieux est déposée suivant une structuration supplémentaire, de préférence au moyen d'un masque, en particulier d'une grille de microscopie électronique. 6. Support d'analyse qui comprend une couche nanostructurée de métal précieux, comprenant : - un substrat diélectrique, en particulier un substrat SERS/LSPR, - une couche intermédiaire prévue sur le substrat, - une couche fine de nanoparticules de métal précieux, de préférence d'or, sur ladite au moins une couche intermédiaire,caractérisé en ce que la couche intermédiaire comprend des microorganismes, de préférence des bactéries ou des levures, configurés pour former une matrice aux nanoparticules de métal précieux. 7. Support d'analyse selon la revendication 6, caractérisé en ce que la couche de métal précieux mesure de 2 à 6 nm, de préférence 4 nm. 8. Support d'analyse selon la revendication 6 ou 7, fonctionnalisé, de préférence avec une molécule biologique. 9. Kit d'analyse d'un échantillon comprenant un support d'analyse selon l'une des revendications 6 à 8, ou obtenu par un procédé de fabrication selon l'une des revendications 1 à 5. 10. Procédé d'analyse d'un échantillon comprenant la mise en place de l'échantillon sur un support d'analyse selon l'une des revendications 6 à 8, ou obtenu par un procédé de fabrication selon l'une des revendications 1 à 5. 11. Kit de fabrication d'un support d'analyse comprenant : - un substrat diélectrique, en particulier un substrat SERS, et - des microorganismes de préférence déshydratés et/ou fixés, facultativement conservés dans une solution de déshydratation et/ou une solution de fixation. 12. Utilisation d'une couche microbienne comprenant des microorganismes configurés pour former une matrice pour des nanoparticules de métal précieux, pour réaliser un support d'analyse comprenant une couche nanostructurée de métal précieux.