Brevet FR3004621A1 — publié le 20141024

SOUCHE DE LACTOBACILLUS RHAMNOSUS RÉGULATRICE DU MÉTABOLISME LIPIDIQUE. L'invention est relative à l'utilisation de probiotiques pour réguler le métabolisme lipidique. Le métabolisme des lipides joue un rôle important dans l'homéostasie énergétique. L'énergie provenant de la nourriture est emmagasinée dans les adipocytes sous forme de réserves lipidiques qui sont utilisées quand c'est nécessaire pour satisfaire les besoins énergétiques du corps. Un apport calorique excédant les dépenses caloriques induit l'accumulation de graisse corporelle, conduisant au surpoids et à plus long terme à l'obésité. Le surpoids est défini par un indice de masse corporelle (IMC) supérieur ou égal à 25, et l'obésité par un IMC supérieur ou égal à 30. L'obésité constitue un facteur important dans l'apparition de maladies telles que l'hypertension, le diabète de type II, les maladies cardio-vasculaires, les maladies du foie et certains cancers, et devient rapidement un problème majeur de santé publique. Le nombre de personnes obèses dans le monde a plus que doublé depuis 1980. En 2008, plus de 1,4 milliards d'adultes étaient en surpoids, et parmi ceux-ci, plus de 200 millions d'hommes et presque 300 millions de femmes étaient obèses. Il est généralement reconnu que parmi les causes principales de la fréquence actuelle de l'obésité et des désordres métaboliques qui lui sont associés figurent une activité physique réduite et une alimentation riche en graisses et en sucre. Toutefois, les différences interindividuelles observées au niveau de la propension à l'accumulation de graisse et la prise de poids sont également corrélées avec d'autres facteurs, tels que le fond génétique, les conditions sanitaires, les traitements médicaux, l'âge ou le manque de sommeil. Parmi les nombreux gènes impliqués dans l'obésité figure celui codant pour la protéine ANGPTL4 (angiopoietin like 4) également appelée FIAF (fasting induced adipose factor), PGAR (PPAR-y induced angiopoietin-related protein), ou HFARP (hepatic fibrinogen/angiopoietin related protein). Cette protéine a été initialement découverte en 2000 (YOON et al., Mol Cell Biol, 20, 5343-9, 2000; KERSTEN et al., J Biol Chem, 275, 28488-93, 2000; KIM et al., Biochem J, 346 Pt 3, 603-10, 2000). Elle est bien conservée chez les mammifères avec 77% d'homologie de séquences entre l'homme (hANGPTL4) et la souris (mANGPTL4) (KIM et al., Biochem J, 346 Pt 3, 603-10, 2000). Elle est majoritairement exprimée dans le foie, le tissu adipeux (TA) et l'intestin, et son expression est accrue par le jeûne et l'exercice physique. ANGPTL4 est un gène cible des récepteurs nucléaires PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors), notamment PPAR-y dans le TA et le colon, et PPAR-oc dans le foie et l'intestin grêle. Parmi les effets physiologiques attribués à ANGPTL4 figure notamment son rôle dans le métabolisme des lipides et du glucose. En particulier, ANGPTL4 inhibe l'activité de la lipoprotéine lipase (LPL) en favorisant la dissociation des dimères actifs de LPL en monomères inactifs (SUKONINA et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 17450-5, 2006), ce qui conduit à la mobilisation des triglycérides comme source d'énergie en faveur des organes périphériques, et à la limitation du stockage excessif des graisses, dans des organes tels que dans le tissu adipeux, le coeur et les macrophages. Il a également été observé qu'ANGPTL4 améliorait la tolérance au glucose chez des souris obèses présentant un diabète de type II (XU et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 6086-91, 2005) mais induisait par ailleurs dans ce modèle animal une hyperlipidémie à court terme. Chez l'homme, une corrélation inverse entre les niveaux d'ANGPTL4 plasmatique, l'adiposité, ou l'augmentation du glucose sanguin a été rapportée (ROBCIUC et al., J Lipid Res, 51, 824-31, 2010 ; ROBCIUC et al., J Lipid Res, 52, 1575-82, 2011). D'autres effets ont été attribuées à la protéine ANGTPL4, tels qu'un effet anorexigène (KIM et al., Diabetes, 59, 2772-80, 2010) ou une diminution de l'inflammation causée par les lipides alimentaires saturés (LICHTENSTEIN et al., Cell Metab, 12, 580-92, 2010). Il a été observé qu'il existait une forte variation interindividuelle du taux d'ANGPTL4 plasmatique (ROBCIUC et al., J Lipid Res, 51, 824-31, 2010), mais que le fond génétique ne jouait qu'un rôle mineur dans cette variabilité (ROBCIUC et al., J Lipid Res, 52, 1575-82, 2011). Par ailleurs, il a été montré que le microbiote intestinal jouait un rôle important dans le contrôle de l'expression d'ANGPTL4 dans l'intestin grêle. Le niveau d'expression d'ANGPTL4 dans l'intestin grêle est plus élevé chez les souris axéniques que chez des souris conventionnelles, et la colonisation des souris axéniques réduit son niveau d'expression (BACKHED et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 15718-23, 2004). Ces modulations d'expression d'ANGPTL4 sont corrélées aux niveaux d'activité de la Lipoprotéine Lipase (LPL) dans le tissu adipeux et le coeur, et par conséquent au stockage des graisses dans le tissu adipeux. Plus récemment il a été observé que des bactéries commensales ou probiotiques pouvaient moduler l'expression d'ANGPTL4. Ainsi, Lactobacillus paracasei F19 induit l'expression intestinale d'ANGPTL4 (PPARs dépendante) se traduisant in vivo par une diminution de la masse graisseuse (ARONSSON et al., PLoS One, 5, 2010). De la même façon, une bactérie commensale, Clostridium tyrobutyricum, induit une forte expression d'ANGPTL4 lors de la colonisation de souris axéniques (KORECKA, et al, Am J.Physiology Gastrointest Liver Physiol, sous presse, 2013). Les mécanismes intervenant dans cette régulation bactérienne sont à l'heure actuelle mal élucidés : elle peut dans certains cas être directe ; dans d'autres cas elle peut être médiée par des facteurs sécrétés ou des métabolites tel que les acides gras à chaine courte (AGCCs), ou le peroxyde d'hydrogène (H202) (KORECKA, et al, Am J.Physiology Gastro, sous presse, 2013; GROOTAERT et al., Environ Microbiol, 13, 1778-89, 2011). De manière plus générale, le rôle du microbiote intestinal dans l'obésité fait l'objet d'un intérêt croissant, et il a été suggéré que sa manipulation à l'aide de prébiotiques, probiotiques, ou symbiotiques, pourrait aider à réduire l'obésité et les troubles métaboliques associés (MALLAPPA et al., Indian J Endocrinol Metab, 16, 20-7, 2012; DELZENNE et al., Nat Rev Endocrinol, 7, 639-46, 2011). Il a été rapporté que certaines souches de probiotiques permettaient de réduire l'accumulation de graisse, et/ou les troubles métaboliques liés à l'obésité. Les effets de ces différents probiotiques apparaissent toutefois spécifiques de la souche concernée, et médiés par des mécanismes qui diffèrent d'une souche à l'autre. Dans ce contexte, les Inventeurs ont testé différentes souches de lactobacilles pour déterminer leurs effets sur l'expression de la protéine ANGPTL4, et ont identifié parmi celles-ci une souche de Lactobacillus rhamnosus capable d'augmenter significativement cette expression. Il s'agit de la souche de Lactobacillus rhamnosus déposée selon le traité de Budapest le 19 Mai 2010 sous le numéro 1-4317 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 Rue du Docteur Roux, Paris). Cette souche est également décrite dans la Demande PCT WO 2011/148219. En conséquence, la présente invention a pour objet l'utilisation de la souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 ou d'une composition contenant ladite souche, pour prévenir ou réduire l'accumulation excessive de graisse dans les adipocytes et les conséquences métaboliques et/ou inflammatoires en découlant telles que la résistance à l'insuline chez un sujet ou l'inflammation chronique. De préférence ledit sujet est un mammifère, qui peut être un animal ou un humain. En particulier, la présente invention englobe la souche CNCM 1-4317 de Lactobacillus rhamnosus ou une composition contenant ladite souche, pour l'utilisation comme médicament dans le traitement, la prévention, ou l'atténuation d'une pathologie due à une accumulation excessive de graisse corporelle et/ou à la résistance à l'insuline. Des exemples de pathologies résultant de l'accumulation excessive de graisse corporelle sont le surpoids, l'obésité et les troubles qui y sont liés, comme le syndrome métabolique, le diabète de type II, la stéatose hépatique non alcoolique, l'hypertension, ou l'inflammation chronique, etc. La présente invention englobe également l'utilisation non-thérapeutique de la souche CNCM 1-4317 pour prévenir ou réduire l'accumulation excessive de graisse corporelle chez un sujet dans un but esthétique. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, la souche CNCM 1-4317 de Lactobacillus rhamnosus peut être utilisée sous forme de bactéries entières qui peuvent être vivantes, ou non-vivantes, par exemple inactivées par la chaleur. Alternativement, elle peut être utilisée sous la forme d'un lysat bactérien, ou sous forme de fractions bactériennes; les fractions bactériennes convenant à cette utilisation sont notamment des surnageants de cultures de la souche CNCM 1-4317. Les compositions utilisées dans la présente invention peuvent être sous toute forme appropriée pour l'administration, en particulier l'administration orale. Cela inclut, par exemple, les formulations semi-solides, liquides et poudres. Lorsque les bactéries se présentent sous forme de bactéries vivantes, la composition peut comprendre typiquement de 105 à 1013 unités formant colonies (ufc), en particulier au moins 106 ufc, de préférence au moins 107 ufc, avantageusement au moins 108 10 ufc, et de manière tout à fait préférée au moins 109 ufc par gramme de poids sec de la composition. Dans le cas d'une composition liquide, ceci correspond généralement à de 104 à 1012 ufc, de préférence au moins 105 ufc, plus préférablement au moins 106 UFC, avantageusement au moins 107 ufc, et de manière tout à fait préférée au moins 109 ufc/ml. Les compositions préférées pour une utilisation dans la présente invention 15 sont des compositions nutritionnelles, y compris les produits alimentaires et en particulier des produits laitiers. Ces compositions nutritionnelles comprennent également des compléments alimentaires et des aliments fonctionnels. Un «complément alimentaire» désigne un produit fabriqué à partir de composés habituellement utilisés dans les denrées alimentaires, mais qui est sous la forme de comprimés, de poudre, de capsules, potion ou toute autre forme non 20 associée habituellement avec des aliments, et qui a des effets bénéfiques pour la santé. Un «aliment fonctionnel» est un aliment qui, outre ses propriétés nutritionnelles, a aussi des effets bénéfiques pour la santé. En particulier, les compléments alimentaires et des aliments fonctionnels peuvent avoir un effet physiologique - de protection ou curatif - contre une maladie, par exemple contre une maladie chronique. 25 D'autres exemples de compositions appropriées pour une utilisation dans la présente invention sont des compositions pharmaceutiques ou cosmétiques. Les compositions de l'invention peuvent également comprendre, outre la souche CNCM 1-4317, une ou plusieurs autre(s) souche(s) de bactéries lactiques, probiotiques ou non, par exemple une ou plusieurs souche(s) bactérienne(s) choisie(s) parmi les genres 30 Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, et les bifidobactéries. En particulier, cette (ces) autre(s) souche(s) peu(ven)t inclure une ou plusieurs souche(s) de Streptococcus thermophilus, et/ou une ou plusieurs souche(s) de Lactobacillus bulgaricus. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'effet de la souche CNCM 35 1-4317 sur l'expression de la protéine ANGPTL4. EXEMPLE 1 INDUCTION DE L'EXPRESSION DU GÈNE ANGPTL4 PAR DES BACTÉRIES LACTIQUES DANS DES CELLULES ÉPITHÉLIALES INTESTINALES. L'effet de plusieurs souches bactériennes appartenant aux espèces 5 L.paracasei et trhamnosus sur l'expression du gène ANGPTL4 a été mesuré dans des cellules coliques cancéreuses HT29, et comparé avec celui de la rosiglitazone (agoniste du récepteur PPARy, connu pour augmenter très fortement l'expression d'ANGPTL4). Cultures cellulaires Les cellules HT29 ont été cultivées dans du milieu DMEM (Lonzae) 10 supplémenté avec 20% de sérum de veau foetal (SVF) (Lonzae), 2mM de glutamine (Sigma0), 1X d'acides aminés non essentiels (AANE) (Invitrogen0) et SOU/mi d'un mélange pénicilline streptomycine (Lonza0) dans un environnement contenant 10% de CO2 à 37°C. Les cellules ont été décollées à la trypsine-versene EDTA (Lonzae) et déposées en plaque 6 puits. 625,000 cellules ont été déposées par puits et cultivées pendant 15 48h dans du milieu DMEM sans antibiotique. Le milieu a été changé avant de mettre les cellules en contact pendant 6h avec les suspensions bactériennes, du milieu DMEM (contrôle négatif) ou de la rosiglitazone (contrôle positif). Les cultures cellulaires ont alors été rincées au PBS (Lonza0) avant d'en extraire l'ARN. 20 La rosiglitazone (Cayman chemical0) a été préparée dans du DMSO et diluée dans le milieu de culture cellulaire. Cette préparation à été mise en contact avec les cellules à une concentration finale de 101.1M. Cultures bactériennes Une pré-culture des souches de Lactobacillus paracasei et rhamnosus a été 25 réalisée dans du MRS (Man, Rogosa and Sharpe medium - Oxoide CM0359) pendant une nuit. Les bactéries ont ensuite été ensemencées à 0,2% du volume final et cultivées pendant 6h. 1 ml de chaque bactérie a été centrifugé à 6000g pendant 10 minutes et lavés au PBS. Les culots bactériens ont été repris dans le milieu cellulaire DMEM sans 30 antibiotique à une D0600 (densité optique) finale de 0,1 ce qui correspond à environ 2 à 7 x 107 CFU/ml. Les suspensions bactériennes ont alors été ajoutées aux cellules à 20% du volume final. Extraction ARNs et synthèse d'ADNc 35 L'extraction des ARNs cellulaires a été réalisée avec le kit « RNeasy mini kit » (Qiagen0) selon les instructions du fournisseur. L'ARN a été dosé au nanodrop et un gel d'agarose a été réalisé pour déterminer la qualité des ARNs. La synthèse des ADNc a été effectuée à partir d'1;_tg final d'ARN à l'aide du kit « High capacity cDNA reverse transcription » (Applied Biosystemse) et l'appareil « T100 Thermal Cycler » (BioradO) selon les instructions du fournisseur. Les ADNc obtenus ont été dosés au nanodrop et des préparations à 10Ong411 ont été réalisées dans de l'eau nuclease free (Ambion0) pour la RTqPCR. RT-qPCR Les RTqPCRs ont été réalisées à l'aide des réactifs « Taqman0 gene expression master » (Applied Biosystemsk) avec l'appareil (ABI PRISM 7000 - Applied Biosystemse) selon les instructions du fournisseur. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Graph Pad Prism 5 (version 8.0). Les résultats sont illustrés par la Figure 1. Légende de la Figure 1 : en abscisse, souches testées ; en ordonnée, expression d'ANGPTL4, normalisée par rapport au gène contrôle b-actine. p REVENDICATIONS1) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament pour la prévention ou le traitement d'une pathologie résultant d'une accumulation excessive de graisse corporelle et/ou à la résistance à l'insuline. 2) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite pathologie est choisie parmi le surpoids, l'obésité, et les maladies en résultant. 3) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit médicament est formulé pour l'administration par voie orale. 4) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite souche est contenue dans une composition administrable par voie orale. 5) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite composition est un aliment ou un complément alimentaire. 6) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite composition est un produit laitier.20