Brevet FR3006192A1 — publié le 20141205

COMPOSÉS DE TYPE PHÉNYLE PROPÉNAMIDE POUR LEUR UTILISATION EN TANT QUE MÉDICAMENT La présente invention concerne des composés de type phényle propénarnide de formule (1) pour leur utilisation en tant que médicament, et plus particulièrement pour leur application en chimiothérapie anticancéreuse, ainsi que pour le traitement d'autres types de maladies, et notamment des maladies psychiatriques, des pathologies de type neurodégénératif, des maladies parasitaires, virales ou fongiques. La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant les composés de formule (I). Le cytosquelette des cellules eucaryotes est composé des microfilaments d'actine, des filaments intermédiaires et des microtubules. Ces derniers sont constitués de l'assemblage de dimères de tubuline ot et [3 et forment des tubes creux de polymères de tubuline. Nucléés à partir d'un centre organisateur, le centrosome, les microtubules sont des constituants essentiels de la cellule : ils jouent notamment un rôle important dans l'organisation complexe du cytoplasme, les positionnements des organelles et noyau, la motilité cellulaire mais également au cours de la division cellulaire. Lors de la division, le fuseau mitotique constitué de microtubules permet la ségrégation correcte des chromosomes, aboutissant à la naissance de deux cellules filles. Le moindre défaut du fuseau, s'il n'est pas corrigé, pourra aboutir à une aberration génomique conduisant potentiellement à la tumorigenèse (A. Castillo et al., Cancer Res., 2007, 67:1013847 ; G. J. Kops et al., Nat. Rev. Cancer, 2005, 5:773-85). En outre, les microtubules sont des structures dynamiques alternant polymérisation et dépolymérisation ; cette propriété est également importante pour le bon déroulement de la mitose (M. A. Jordan et al., Nat. Rev. Cancer, 2004, 4 :253-65 ; P. Niethammer et al., PLoS Biol, 2007, 5:e29). La cellule contrôle l'état de polymérisation et de dépolymérisation du réseau microtubulaire grâce à des protéines qui permettent soit de le stabiliser (CLIP 170 par exemple), soit de le dépolymériser (MCAK et Kif2A). De par le rôle crucial qu'il joue dans la division cellulaire, le fuseau mitotique est depuis longtemps identifié comme une cible importante en chimiothérapie anticancéreuse. L'altération de la fonction des microtubules peut avoir des effets dramatiques sur la viabilité des cellules causant un arrêt du cycle en mitose et pouvant aller jusqu'à l'induction de l'apoptose de la cellule. A l'heure actuelle, le succès clinique de plusieurs agents connus pour modifier la dynamique des microtubules font de la tubuline l'une des cibles les mieux validées en chimiothérapie anticancéreuse. Par ailleurs, en plus du cancer, l'implication du cytosquelette microtubulaire dans l'étiologie d'un grand nombre de maladies a été décrite, comme par exemple les maladies mentales et neurodégénératives, les infections virales et parasitaires (B. P. Chatterji et aL, Expert Opin. Ther. Pat., 2011, 21:167-86 ; M. S. Henning et al., J. Virol., 2010, 84:8990-5; P. F. Kao et al., PLoS One, 2010, 5:e13337). Les agents pharmacologiques ciblant le cytosquelette microtubulaire et ses différents effecteurs 5 présentent donc un intérêt thérapeutique pour le traitement d'un grand nombre de maladies. Certaines thérapies anticancéreuses s'appuient sur l'utilisation de poisons des microtubules depuis de nombreuses années (H. Igarashi et al., Case Rep' Oncol., 4:534-41 ; A. L. Risinger et aL, Cancer Treat. Rev., 2009, 35:255-61; C. Rodriguez-Antona et al., Pharmacogenomies, 12:449-51 ; Demande US 2011/0263663). Parmi ces drogues, on peut 10 citer la vincristine et la vinblastine, alcaloïdes extraits de la pervenche de Madagascar : ces composés ciblent les microtubules, les dépolymérisent et induisent l'arrêt des cellules en mitose, puis leur mort, Ils sont utilisés en chimiothérapie pour le traitement, entre autres, des lymphomes hodgkinien et non hodgkinien, du cancer du sein et du poumon. D'autres composés ciblent la dynamique du réseau microtubulaire, en le stabilisant, ce qui se traduit 15 par la formation de fuseaux mitotiques aberrants : c'est le cas des taxanes comme le paclitaxel et le taxotère. Cibler le cytosquelette microtubulaire, rechercher des antimitotiques ou encore des drogues agissant sur la dynamique des microtubules reste un enjeu majeur dans la recherche de composés anticancéreux (I. R. Jackson et al., Nat. Rev. Cancer, 2007, 7:107-17). 20 Cependant, malgré l'efficacité démontrée de ces drogues, de nombreux effets secondaires sont associés tels que troubles neurologiques, neuromusculaires, digestifs, etc. De plus, des phénomènes de résistance au traitement finissent par apparaître, notamment par la surexpression par les cellules cancéreuses de pompes d'efflux comme la glycoprotéine-P (Pgp) ou la BPRC (Breast Cancer Resistance Protein), cette surexpression permettant aux 25 cellules tumorales d'échapper à la thérapie administrée (D. Turk et al., Cancer Res., 2009, 69:8293-301). Ainsi, la découverte de nouveaux traitements anticancéreux ou l'amélioration de drogues existantes pour aboutir à des composés encore plus efficaces et présentant moins d'effets indésirables reste un enjeu crucial. 30 En mettant en oeuvre le test décrit par E. Vassal et al., J. Biomol. Screen, 2006, 11:377-89, les Inventeurs ont découvert une nouvelle classe de composés de type phényle propénarnide de formule (I) ciblant et stabilisant le cytosquelette microtubulaire, sans toutefois agir directement sur la tubuline. Les Inventeurs ont également mis en évidence que ces composés induisent une réorganisation des microfilaments d'actine et bloque la motilité cellulaire. Ils ont en outre observé une accumulation des cellules dans les phases S et G2/M du cycle cellulaire. Le principe du test d'E. Vassal et al. repose sur les propriétés de substrat de deux enzymes impliquées dans une des modifications post-traductionnelles de la tubuline : le cycle de tyrosinationidétyrosination (Figure 1). Au cours de ce cycle, le résidu tyrosine présent à l'extrémité C-terminale de l'a-tubuline est clivé par une Tubuline CarboxyPeptidase (TCP) puis ré-ajouté par une Tubuline Tyrosine Ligase (TTL). La TTL n'agit que sur les dimères libres de tubuline et a une cinétique plus rapide que la TCP. Ainsi, les microtubules dynamiques sont majoritairement tyrosinés (MTs-Tyr ou tubuline-Tyr) et seule une faible proportion de microtubules peu dynamiques sont détyrosinés (MTs-Glu ou tubuline-Glu). On observe cependant un enrichissement en MTs-Glu en présence de protéines stabilisatrices ou lors du traitement des cellules par des agents stabilisants comme le paclitaxel. La présente invention a donc pour premier objet un composé de type phényle 15 propénamide répondant à la formule (I) suivante : RI (I) dans lequel : R1 représente une chaîne alkyle ou alcoxy, linéaire ou ramifiée en Ci-C12, et de 20 préférence en C1-C6, une chaîne aleényle ou aleynyle, linéaire ou ramifiée en C2-C2, et de préférence en C2-C6, une chaîne cycloalkyle en C3-Cu, et de préférence en C3-C7, un groupe aryle en C4-C12, et de préférence en C5-C6, un groupe hétéroaryle en C3- C 1, et de préférence en C4-05, ou une chaîne -COOR dans laquelle R' représente un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle ou alcoxy, linéaire ou ramifiée en C1-C12, et de 25 préférence en C1-C6, une chaîne alcényle ou alcynyle, linéaire ou ramifiée en C2-C12, et de préférence en C2-C6, une chaîne cycloalkyle en C3-C12> et de préférence en C3-C7, un groupe aryle en C4-C12, et de préférence en C5-C6, un groupe hétéroaryle en C3- C 11 , et de préférence en C4-05, ledit radical R1 pouvant éventuellement comprendre dans sa chaîne un hétéroatome ou une fonction carbonyle, et ledit radical R1 pouvant 30 éventuellement être substitué, par exemple par un ou plusieurs groupes indépendamment choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes hydroxyle, cyano, nitro, carbonyle, carboxyle, carboxyester, arnino, alcoxy en C1-C12, alkylamino en C12, aryle aryle en C4-C12 ou hétéroaryle en C3-C11, R2 représente un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle ou alcoxy linéaire ou ramifiée en C1-C12, et de préférence en C1-C6, une chaîne alcényle ou alcynyle, linéaire ou ramifiée en C2-C12, et de préférence en C2-C6, une chaîne eycloalkyle en C3-C12, et de préférence en C3-C7, un groupe aryle en C4-C12, et de préférence en C5-C6, un groupe hétéroaryle en C3-C11, et de préférence en C4-05, un groupe benzoyle - C(=0)C6H5, ou un groupe -C(=0)R3 dans lequel R3 est un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle ou alcoxy linéaire ou ramifiée en C1-C12, et de préférence en C1-C6, un groupe aryle en C4-C12, et de préférence en C5-C6, ou un groupe hétéroaryle en C3-C11, et de préférence en C4-05, lesdits radicaux R2 et R3 pouvant éventuellement être substitués, par exemple par un ou plusieurs groupes indépendamment choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes hydroxyle, cyano, nitro, carbonyle, carboxyle, carboxyester, amino, alcoxy en C1-C12, alkylamino en C1-C12, aryle en C4-C12 ou hétéroaryle en C3-C11, et ses sels pharmaceutiquement acceptables, en tant que médicament. Du fait de l'implication incontournable du cytosquelette microtubulaire dans de nombreuses fonctions cellulaires, et face aux phénomènes de résistance fréquemment observés chez les patients traités par les chimiothérapies traditionnelles, la découverte des composés de formule (I) ciblant directement ou indirectement la tubuline via une action sur des régulateurs de la tubuline présente un intérêt majeur en thérapie anticancéreuse. Par ailleurs, compte-tenu des nombreuses fonctions du réseau microtubulaire, de tels composés peuvent aussi présenter des applications pour le traitement de maladies mentales, virales ou parasitaires. Les composés de formule (I) de l'invention présente une bonne biodisponibilité puisqu'ils sont capables de pénétrer dans la cellule. En outre, ces composés se solubilisent très facilement (milieu de culture cellulaire, tampon de biochimie, tampon utilisé pour les injections sur souris), ce qui permet d'éviter la synthèse de nouveaux analogues aux modes d'action équivalents. Des études toxicologiques ont également démontrés que ces composés étaient très bien tolérés par les animaux. Au sens de la présente invention, on entend par : - Alkyle: un groupe aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 12 atomes de carbone, et de préférence de 1 à 6 atomes de carbone. Le terme « ramifié » signifie qu'au moins un groupe alkyle inférieur tel qu'un méthyle ou un éthyle est porté par une chaîne alkyle linéaire. A titre de groupe alkyle, on peut mentionner par exemple les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, i-propyle, n-butyle, t-butyle et n-pentyle ; Cycloalkyle : un groupe aliphatique hydrocarboné cyclique monovalent ayant 3 à 12 atomes de carbone, et de préférence de 3 à L Le groupe cycloalkyle peut avoir une ou plusieurs doubles liaisons et peut être opfionnellement substitué. A titre de groupe cycloalkyle, on peut mentionner par exemple les groupes cyclopropyle, cyclohexyle et cyclohexényl e ; - Alcényle : un groupe aliphatique hydrocarboné insaturé comprenant au moins une double liaison carbone-carbone, et ayant 2 à 12 atomes de carbone, et de préférence 2 à 6 atomes de carbone ; Alcynyle : un groupe aliphatique hydrocarboné insaturé comprenant au moins une triple liaison carbone-carbone, et ayant 2 à 12 atomes de carbone, et de préférence 2 à 6 atomes de carbone ; - Alcoxy : un groupe 0-alkyle dans lequel le groupe alkyle peut prendre la même signification que celle indiquée ci-dessus. A titre d'exemple de groupes alcoxy, on peut notamment citer les groupes méthoxy, éthoxy, n-propoxy, iso-propoxy, n-butoxy et pentoxy ; Alkylamino : un groupe mono ou di(Ci-C12)alkylamino dans lequel le groupe alkyle peut prendre la même signification que celle indiquée ci-dessus, incluant les groupes C2-C6 cycloamino tels que 1' aziridin- I -yl, I ' azetidin-l-yl, la pyrrolidin-1 -yl, la pipéridin-l-yl, l'azepan-l-yl, la morpholin-4-y1 et la thiomorpholin-4-y1 ; Aryle : tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'au moins un cycle aromatique ; un cycle aromatique correspond à tout groupe mono- ou polycyclique plan comportant un système rt délocalisé dans lequel chaque atome du cycle comporte une orbitale p, lesdites orbitales p se recouvrant les unes les autres ; parmi de tels groupes aryles, on peut mentionner les groupes phényle, biphényle, pentalène, naphthalène, benzylphényle et anthracène. Les groupes aryles de l'invention comprennent de préférence de 4 à 12 atomes de carbone, et de manière encore plus préférée de 5 ou 6 atomes de carbone ; Hétéroaryle : tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'au moins un cycle aromatique tel que défini ci-dessus et contenant au moins un hétéroatome choisi parmi P, S, et N; parmi les groupes hétéro aryles, on peut mentionner les groupes furane, pyridine, pyrrole, thiophène, imidazole, pyrazole, oxazole, isoxazole, thiazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, benzofurane, isobenzofurane, indole, isoindole, benzothiophène, benzo[c]thiophène, benzimidazole, indazole, benzoxazole, benzisoxazole, benzothiazole, quinoléine, isoquinoléine, quinoxaline, quinazoline, cinnoline, purine, et aciidine. Les groupes hétéroaryles de l'invention comprennent de préférence de 3 à 11 atomes de carbone, et de manière encore plus préférée de 4 ou 5 atomes de carbone ; Les atomes d'halogène sont choisis parmi les atomes de brome, de chlore, de fluore et d'iode, et de préférence parmi les atomes de brome, de chlore et de fluore. Selon un mode de réalisation préférée, R2 est un groupe -C(----0)R3 dans lequel R3 est 10 un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle ou alcoxy linéaire ou ramifiée en C1-C12, et de préférence en Ci -C6, un groupe aryle en C4-C12, et de préférence en C5-C6, ou un groupe hétéroaryle en C3-C1j, et de préférence en C4-05. De manière encore plus avantageuse, le radical R2 est un groupe -C(-=0)R3 dans lequel R3 est une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C1-C6 ou un groupe phényle. 15 Les composés de formule (I) les plus préférés sont choisis parmi les composés suivants : CF-13 Composé PPA1 ou (H3c)2Hc NH NH 20 La présente invention a également pour objet un composé de formule (1) pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement de maladies choisies parmi le cancer, les (H3C)2HC NH NH Composé PPA2 pathologies de type neuro-dégénératif, les maladies parasitaires, les glaucomes, les maladies virales et les maladies fongiques. Plus particulièrement, l'invention a pour objet la prévention et/ou le traitement : - de cancers choisis parmi le cancer des testicules, le cancer de l'ovaire, le cancer du 5 poumon, le cancer du sein, la maladie de Hodgkin, les leucémies et tumeurs solides, les neuroblastomes, mélanomes, gliomes, glioblastomes et sarcomes, le cancer du côlon, le cancer du pancréas, - de pathologies de type neuro-dégénératif choisies parmi la schizophrénie, la maladie d'Alzheimer et autres syndromes neuro-dégénératifs apparentés telle que la maladie 10 de Huntington, - de maladies parasitaires impliquant des parasites apicomplexes, les parasites avec des cils ou flagelles, la toxoplasmose, la Listeria, la Giarda, le Trichomonas, le Plasmodium, l'Enteromonas hominis, - de virus tel que le virus du SIDA, et 15 de maladies fongiques telles que les mycoses. Enfin, la présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant en tant que principe actif au moins un composé selon l'invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. L'expression « excipient pharmaceutiquement acceptable » désigne des diluants, des 20 adjuvants ou des véhicules, tels que des conservateurs, des charges, des agents de désintégration, des agents mouillants, des agents émulsifiants, des agents de mise en suspension, des solvants, des dispersants, des revêtements, des agents antibactériens et antifongiques, des agents isotoniques, des retardateurs d'absorption et leurs analogues. La composition pharmaceutique de la présente invention peut être administrée par 25 toute voie appropriée, par exemple, par voie orale, buccale, inhalation, par voie sublinguale, nasale, par voie percutanée, par voie transdermique ou parentérale (y compris par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et infra-coronaire). Par conséquent, la composition pharmaceutique de l'invention peut se présenter sous des formes diverses, telles que sous forme de gélules, de capsules, de comprimés, de suspensions à prendre par voie 30 orale, des pastilles ou des solutions injectables, des pommades, ou sous toute autre forme d'administration appropriée. Une « dose thérapeutiquement efficace » désigne la quantité de composé de formule (I) qui conduit à l'effet thérapeutique désiré. La toxicité et l'efficacité thérapeutique d'un composé de formule (1) peuvent être facilement déterminées par des procédures pharmaceutiques standard sur des cultures cellulaires ou des animaux, soit par la détermination de la DL50 (dose létale pour 50% de la population), soit par la détermination de la DE50 (dose thérapeutique efficace dans 50% de la population), Le rapport de dose entre les effets toxiques et thérapeutiques est l'indice thérapeutique, qui est exprimée par le rapport entre DL50 et DE50. La dose de composé de formule (I) est de préférence comprise dans une plage de concentrations qui comprennent la DE50. La posologie peut varier dans cette plage en fonction de la forme galénique employée, et la voie d'administration choisie. La formulation exacte, la voie d'administration et la posologie peuvent être choisies 10 par un médecin au vu de l'état du patient. Le dosage et les fréquences d'administration peuvent être ajustés individuellement pour fournir des niveaux plasmatiques de composé de formule (1) qui soient suffisants pour maintenir les effets préventifs ou thérapeutiques. D'autres facteurs tels que l'âge, le poids, la taille, le sexe ainsi que certains paramètres biologiques (taux d'excrétion, association avec d'autres médicaments, allergies...) sont 15 également à prendre en compte pour déterminer la quantité de composition pharmaceutique à administrer. Pour une utilisation sur des humains ou animaux, les composés de formule (I) peuvent être administrés seuls, mais ils sont de préférence administrés en mélange avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, dont la nature dépend de la voie d'administration 20 et de la forme galénique. La composition pharmaceutique de l'invention peut donc être formulée de manière classique en utilisant un ou plusieurs supports physiologiquement acceptables comprenant un ou plusieurs excipient(s) et/ou auxiliaires(s) qui facilitent la transformation des composés de formule (I) dans des préparations pouvant être utilisées en pharmacie. Parmi les excipients et les adjuvants susceptibles d'être utilisés dans la 25 composition pharmaceutique de l'invention, on peut citer les agents antiagglomérant, les conservateurs, les colorants, les vitamines, les sels minéraux, les modificateurs de goût, les agents d'enrobage, les agents d'isolation, les agents stabilisants, les agents mouillants, les dispersants, les émulsifiants, les arômes, les agents de solubilisation, etc., leurs mélanges et plus généralement tout excipient classiquement utilisé dans l'industrie pharmaceutique. 30 A titre d'exemple, lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie orale, le support peut comprendre un ou plusieurs excipients tels que le talc, le lactose, l'amidon ou des amidons modifiés, la cellulose ou les dérivés de cellulose, les polyéthylènes glycols, les polymères d'acide acrylique, la gélatine, le stéarate de magnésium, les graisses animales ou végétales d'origine naturelle ou synthétique, les dérivés paraffiniques, les glycols, etc. Pour des informations générales à propos de la formulation et de l'administration de compositions pharmaceutiques, on peut évidemment se référer au livre « Remington's Pharmaceutical Sciences », dernière édition. Bien sûr, l'homme de l'art veillera à cette occasion à ce que les excipient(s) et/ou auxiliaire(s) éventuellement utilisés soient compatibles avec les propriétés intrinsèques de la composition pharmaceutique de l'invention. La composition pharmaceutique de l'invention peut être fabriquée de façon classique, c'est-à-dire par les méthodes de mélange, dissolution, granulation, fabrication de dragées, émulsification, eneapsulation, piégeage ou lyophilisation. La formulation convenable dépend de la voie d'administration choisie. Selon un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique de l'invention comprend, en plus d'un composé de foimule (I), au moins un autre principe actif anticancéreux. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des exemples mettant en évidence les propriétés stabilisatrices de composés tétracycliques de formule (I) selon l'invention, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : la Figure 1 représente le cycle de détyrosinationityrosination de la tubuline, la Figure 2 montre des cellules HeLa incubées avec du DMSO (A, B) ou du paelitaxel (C, D) ou le composé PPA1 (E, F) durant 2h. Les cellules ont ensuite été traitées 30 min en présence (B, D, F) ou non (A, C, E) de nocodazole. Après fixation, la tubuline a été marquée, ainsi que les noyaux. Barre d'échelle = 20 pm. Les images ont été acquises automatiquement sur l'INCell Analyzer 1000 à l'objectif 20x à raison de 3 champs par puits. L'analyse d'images a peimis d'extraire de façon automatique l'intensité moyenne correspondant au contenu des cellules en microtubules pour chaque concentration de composés (5 à 0,3 FiM pour Paclitaxel et 50 à 3,1 gM pour PPA1) (graphe). L'expérience a été réalisée en triplicat, - la Figure 3 représente l'effet du composé PPA I à 100 uM sur l'assemblage de la tubuline purifiée in vitro en comparaison avec le DMSO, - la Figure 4 représente le marquage du cytosquelette d'actine de cellules HeLa en présence soit de DMSO 0,5%, soit de paclitaxel à 511\4, soit du composé PPA1 à 50 gM, la Figure 5-Haut montre l'effet de la latrunculine après traitement de cellules HeLa avec du DMSO 0,5% (A), du paclitaxel 5 uM (B) ou une molécule PPA1 50 p,11/1 (C). Après traitement, les cellules ont été fixées puis une incubation avec du Hoechst et de la phalloidine couplée à l'Alexa-488 a permis de marquer respectivement les noyaux et l'actine. Les images ont été acquises automatiquement sur l'INCell Analyzer 1000 à l'objectif 20x à raison de 10 champs par puits. Barre d'échelle - 20 it.m. La Figure 5-Bas montre la quantification par analyse d'images sous 'maga du phénotype de protection à la dépolymérisation induite par la latrunculine, la Figure 6 représente le suivi du déplacement des cellules durant 4h avec ou sans composé PPA1 (acquisition d'une image toutes les 5 min). Les films ont été analysés sous Image L: longueur moyenne du déplacement ; d: distance parcourue entre t = 0 et t = 4h, la Figure 7 représente l'état de phosphorylation de la cofiline suite à une addition de dose décroissante de composé PPA1 (100 à 3,13 uM) par rapport au DMSO et à un contrôle positif (9-benzoyloxy-5,11-diméthy1-2H,6H-pyrido[4,3-bjcarbazol-1-one, Composé 1 décrit dans la Demande WO 2010/095042 A2). L'histogramme représente le ratio des intensités de la phospho-cofiline et de la cofiline (quantification faite sous ImageJ). EXEMPLE Réalisation du criblage : Le criblage décrit par E. Vassal et al., J. Biomol. Screen, 2006, 11:377-89 est réalisé en microplaques de 96 puits, Brièvement, après 2h d'incubation des composés, les cellules HeLa sont perméabilisées avec un tampon spécifique qui permet de conserver l'intégrité des microttibules et d'éliminer la tubuline libre. Après fixation, un immunomarquage est réalisé avec des anticorps primaires spécifiques des MTs-Glu et des MTs-Tyr, suivi d'un marquage avec des anticorps secondaires couplés à l'A1exaFluore-488 (émission dans le canal vert) et à la Cyanine-3 (émission dans le canal rouge), respectivement. Un marquage des noyaux (Hoechst, émission dans le canal bleu) est également réalisé afin d'avoir un contrôle sur la quantité de cellules par puits. Pour ce test, les cellules sont incubées en présence de Hoechst (#33258, Sigma), à 1 j.tg.mL-I dilué dans un tampon PBS lx/BSA 1% pendant 30 minutes, puis rincées trois fois dans du tampon de lavage (PBS lx/Tween 20 0,01%). En fin de test, les résultats sont obtenus par lecture de la fluorescence pour chaque longueur d'onde à l'aide d'un lecteur de microplaques. Ainsi, les drogues ayant provoqué une dépolymérisation du réseau microtubulaire sont détectées par l'émission d'un faible signal dans le canal rouge, alors que les drogues stabilisantes sont détectées grâce à une augmentation d'intensité de fluorescence dans le canal vert. Le criblage des molécules chimiques de la collection commerciale de la société Chembridge, à une concentration de 50 uM, a été effectué sur cellules HeLa. Une double validation a été réalisée au moment du criblage secondaire avec, en plus de la lecture sur le lecteur de microplaques de la plateforme robotique, des acquisitions automatiques d'images à l'aide d'un système de microscopie automatisé [criblage à haut contenu en information ou High Content Screening (HCS)]. Les études de validation et de caractérisation des composés sélectionnés ont été réalisées en microplaques en utilisant la méthodologie de criblage et analyse à haut contenu en information (High Content Analysis ou HCA). Les images acquises ont ensuite été analysées avec des logiciels d'analyse d'images dédiés. Ainsi, l'action des composés sur différents tests cellulaires a été évaluée, à la fois en dose-réponse et en cinétique. Les phénotypes cellulaires et subcellulaires ont pu être quantifiés avec précision par HCA. Les quantifications obtenues ont permis de mettre en évidence les effets des composés utilisés en concentration décroissante ou en cinétique, et ainsi de déterminer la dose active minimale d'utilisation de ces composés. Résultats : L'activité stabilisante d'un composé de formule (I) selon l'invention, Le. le composé PPA1 (#5259940, Chembridge), a été évaluée sur les cellules HeLa (lignée humaine, issue d'un carcinome du col de l'utérus). (1-13C)2HC Composé PPA1 Il a également été vérifié que ce phénotype était également observable dans d'autres types de lignées cellulaires cancéreuses ou non. L'effet du composé PPAI a ainsi été validé dans des cellules MCF7, issues d'un cancer du sein, et dans des cellules MCF1OA qui sont des cellules épithéliales de glande mammaire, non cancéreuses. Structure du composé actif et d'analogues structuraux : Des analogues structuraux au composé PPA1 ont également été sélectionnés via le site de Chembridge Hit2Lead.com. Un analogue du composé PPA1 et répondant à la structure suivante a également été testé : Composé PPA2 (#6735771, Chembridge) Un composé PPA3 (#5264378, Chembridge) hors invention ayant une structure proche de celle du composé PPA1, mais ne comprenant pas de radical R1 a également été testé : CH3 Composé PPA3 La capacité des composés PPA1, PPA2 et PPA3 à induire la formation de MTs-Glu à une concentration de 50 itM a été évaluée. Un protocole d'analyse d'images automatisé a été développé pour quantifier ce phénotype. L'analyse de l'intensité de fluorescence correspondant au contenu en MTs-Glu (canal de fluo A488) montre qu'en présence du contrôle bio-actif, Paclitaxel, 66% de cellules sont enrichies en MTs-Glu. En présence du composé PPA1 et de son analogue PPA2, 33,4% et 29% des cellules HeLa sont respectivement enrichies en MTs-Glu. L'analogue PPA3 testé n'a pas d'effet sur la formation de microtubules stabilisés. Cette relation structure activité met en évidence le caractère essentiel du radical R1 dans la conservation du phénotype d'intérêt. (H3C)2HC NH NH Effets du composé PPA.I sur la dynamique du réseau microtubulaire et du cytosquelette d'actine : Réseau microtubulaire Les microtubules sont des structures dynamiques et labiles, sensibles aux variations de 5 température et qui peuvent dépolymériser lorsqu'ils sont soumis à un abaissement de la température, Certaines protéines comme la protéine STOP (C. Bose et al., Cell. Struct. Funct., 1999, 24 :393-9) ou des agents chimiques comme le paclitaxel sont capables de protéger le réseau microtubulaire d'une dépolymérisation induite par le froid. Le composé PPA1 a été testé dans ces conditions, toutefois il n'empêche pas, même partiellement, la dépolymérisation 10 induite par une incubation de 30 min à 4°C. Son mode d'action est donc différent de celui du paclitaxel. Par ailleurs, les microtubules ne peuvent polymériser qu'au-dessus d'une certaine concentration critique de tubuline. Tout phénomène conduisant à abaisser cette concentration critique (dilution, séquestration par des composés chimiques tels que le nocodazole) induits 15 une dépolymérisation du réseau microtubulaire, sauf si ces derniers sont stabilisés ou ont une dynamique ralentie. La capacité du composé PPA1 à stabiliser ou à ralentir la dynamique des microtubules a été évaluée. Dans cette expérience, des cellules HeLa sont traitées pendant 2h avec le composé, puis incubées 30 min en présence de nocodazole, une drogue dépolymérisante qui 20 « séquestre » la tubuline libre. Lors du traitement avec le composé PPA1, les microtubules montrent une certaine résistance à la dépolymérisation normalement induite par le nocodazole. Les résultats obtenus ont été analysés de manière visuelle et quantifiés par analyse automatisée des images (Figure 2). L'analyse quantitative de ces résultats par HCA a permis de montrer que le composé 25 PPA1 utilisé à une concentration de 50 itM permet de protéger en partie les microtubules de la dépolymérisation induite par le nocodazole. On observe un effet-dose sur la stabilisation des microtubules après traitement au nocodazole, particulièrement à 50 et 25 M. L'effet diminue progressivement à 25 uM, pour atteindre le même niveau qu'en DMSO à 12,5 la.M. Comparée à la stabilisation induite par le paclitaxel, la molécule PPA1 utilisée à 501.tM stabilise environ 30 un quart de la population des microtubules. Ce composé est donc capable de ralentir la dynamique des microtubules mais pas de les stabiliser complètement. Des drogues stabilisantes comme le paclitaxel, sont capables d'induire l'assemblage de la tubuline in vitro, à une concentration inférieure à celle de la concentration critique d'assemblage. Des tests ont donc été réalisés afin de savoir si le composé PPA1 stabilisait les microtubules par action directe ou indirecte sur la tubuline. Pour cela un test in vitro d'assemblage de tubuline a été effectué, en présence ou en absence des protéines associées aux microtubules. Pour ce test, de la tubuline purifiée (1 ing.mL-1) est incubée dans du 5 tampon MEM (MES 100 mM, EGTA 1 mM, MgC12 1 mM) en présence des drogues. Après 10 min d'incubation, l'assemblage est démarré par injection de GTP (1 mM) et de MgCl2 (5 mM) à 37°C. L'assemblage de la tubuline est suivi par lecture de la DO à 350 mn toutes les 7 secondes durant 30 min dans un lecteur de microplaques. Chaque condition est testée en triplicat. L'effet du composé PPA1 à 100 1.1M sur l'assemblage de la tubuline purifiée in vitro 10 en comparaison avec le DMSO est présenté à la Figure 3. Quelques soient les conditions (en présence ou non de protéines associées), le composé PPA1 est incapable de potentialiser l'assemblage de la tubuline en microtubules. Son action de ralentissement de la dynamique des microtubules cellulaires ne résulte donc pas de sa fixation directe sur la tubuline, ni de sa fixation sur une des protéines associées aux 15 microtubules présentes dans la préparation de tubuline utilisée dans le test. De plus, il est connu que les drogues qui agissent sur la dynamique des microtubules entraînent un arrêt des cellules dans le cycle avec notamment une accumulation des cellules dans les phases S et G2/M. Des expériences de cytométrie en flux avec le composé PPA1 ont été réalisées. Le Tableau 1 ci-après montre la répartition des cellules au cours des différentes 20 phases du cycle cellulaire après 26h d'incubation avec du DMS00,5% ou du composé PPA1 à 50 1iM. Les cellules ont été marquées à l'iodure de propidium, puis analysées au FACScalibur (30 000 cellules analysées pour chaque condition). Tableau 2 : Résultats de cytométrie en flux Traitement DMSO 0,5% PPA1 50RM Phase G1 69,34% 60,83% Phase S 11,74% 14,02% Phase G2fin 17,27% 22,91% 25 Ces résultats mettent en évidence un déplacement dans le cycle vers les phases S et G2/M. Cytosquelette d'actine : L'effet du composé PPA1 sur le eytosquelette d'actine, après 2h d'incubation sur des cellules HeLa, a également été investigué. Les résultats sont présentés à la Figure 4. Dans le cas de contrôles comme le DMSO ou le paclitaxel, les câbles d'actine ou fibres de stress sont clairement visibles. En revanche, le réseau d'actine semble remanié après traitement avec le composé PPA1, comme le montre l'absence de fibres de stress sur les bords des cellules. Suite à l'observation de ce phénotype, l'effet du composé PPA1 en présence de latrunculine a été étudié. La latrunculine est un poison de l'actine qui se lie à l'actine-G, actine monomérique, et empêche ainsi la polymérisation de l'actine. Dans les cellules, la latrunculine entraîne la dépolymérisation des fibres d'actine existantes. Ce composé est ajouté à 0,1 1.1M pendant 30 min, après incubation de 2h avec les composés contrôles (DMSO, Paclitaxel) ou le composé PPA1 (Figure 5-Haut). En présence de DMSO ou de paclitaxel et suite au traitement à la latrunculine, des « vésicules » apparaissent dans le canal vert ce qui corrèle avec une dépolymérisation des fibres d'actine. En revanche, l'effet obtenu avec le composé PPA1 montre qu'il est capable de s'opposer partiellement à la dépolymérisation normalement induite par la latrunculine, ce qui indique que ce composé ralentit la dynamique des microfilaments d'actine. Ce résultat a été quantifié à l'aide du logiciel 'Maga (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997- 2011). La Figure 5-Bas, montre un exemple de segmentation des noyaux et des vésicules ainsi que la quantification du phénotype. La molécule PPA1 bloque très nettement l'apparition des vésicules après traitement à la latrunculine. Effet sur la motilité cellulaire : L'activité du composé PPA1 a été testée sur la motilité des cellules MCF10A, cellules épithéliales non cancéreuses. Des films ont été réalisés en contraste de phase ainsi qu'en fluorescence (suivi du mouvement des noyaux après coloration au Hoechst vital) sur une durée de 4h. La Figure 6 montre les tracés obtenus suite au mouvement de chaque cellule. Alors qu'en DMSO, les cellules se déplacent normalement (2,2 nm/s et distance parcourue de 17,8 Mm), les cellules traitées avec le composé PPA1 ont tendance à faire de petits mouvements en restant sur place ; leur vitesse est réduite à 1,8 nm/s et la distance parcourue entre le début et la fin du film est seulement de 5,4 m ce qui montre que les cellules ne se déplacent que très peu. Le composé PPA1 induit donc une réorganisation du cytosquelette d'actine, il est capable de s'opposer à l'effet dépolymérisant de la latrunculine et bloque la motilité des cellules. Inhibition de la_phosphotylation de la cofiline : L'activité du composé PPA1 sur l'état de phosphorylation de la cofiline a également été analysé par western blot, en comparaison avec le 9-benzoyloxy-5,11-diméthy1-2H,6Hppido[4,3-Mcarbazol-1-one (Composé 1 décrit dans la Demande WO 2010/095042 A2) (noté « contrôle positif» dans la Figure 7). La cofiline est une protéine régulatrice de l'actine, qui agit sur sa dynamique et est capable d'entraîner sa dépolymérisation ; elle est également un substrat de la LIM Kinase. Le composé PPA1 utilisé à 100 et 50 piM, bloque la phosphorylation de la cofiline au même niveau que le contrôle positif (Figure 7), avec un effet dose-dépendant aux concentrations les plus faibles bien visible après quantification avec La même expérience a été réalisée sur des cellules MCF10A et une inhibition de la 15 phosphorylation de la cofiline a également été observée. Evaluation de la toxicité du composé PPAI : Test de toxicité sur lignées de cellules cancéreuses : Lors de traitements de chimiothérapie, des phénomènes de résistance apparaissent au cours du temps. Cela s'explique notamment par la surexpression par les cellules cancéreuses 20 de pompes d'efflux comme la glycoprotéine-P (Pgp) ou la BPRC (Breast Cancer Resistance Protein) : cette surexpression permet alors aux cellules tumorales d'échapper à la thérapie administrée. L'effet cytotoxique du composé PPA1 a donc été étudié sur un ensemble de lignées de cellules cancéreuses ou non, incluant des lignées résistantes, ceci via des tests de viabilité 25 cellulaire (test MTT). La toxicité a été évaluée sur quatre lignées cellulaires cancéreuses. Les cellules ont été ensemencées 24h avant l'addition du composé PPA1 . L'effet cytotoxique des molécules appliquées à des doses croissantes (log en log) a été évalué sur une durée de 48h, puis la mesure de la cytotoxicité a été réalisée grâce à un test MTT. G150 = Growth Inhibition 50% 30 (concentration à laquelle 50% des cellules meurent). Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Toxicité évaluée sur différentes lignées cellulaires Lignées cellulaires G150 (el) MESSA 83,8 ±2,5 MESSA-DX5 71,5 + 2,4 MCF7 33 ± 5,3 HeLa 27± 3,4 Ces résultats montrent que le composé PPA1 présente une activité cytotoxique variable selon le type cellulaire (de 27 à 84 MM), avec une toxicité plus importante sur 5 cellules MCF7 et HeLa. La G150 obtenue sur cellules MESSA est équivalente à celle obtenue sur MESSA-DX5. Ces dernières sont équivalentes aux cellules MESSA, mais sont résistantes à des drogues comme la doxorubicine, le paclitaxel, la colchicine du fait de la surexpression de pompes Pgp (W. G. Harker et al., Cancer Research, 1985, 45:4091-4096). Le composé PPA1 présente le même degré de toxicité sur les cellules MESSA que sur les cellules 10 MESSA-DX5, ce qui indique qu'il n'est pas un substrat des pompes d' efflux. Ce composé est donc actif sur cette lignée chimio-résistante. Etude de toxicologie sur souris : En collaboration avec l'animalerie de l'iRTSV (F. Sergent et H. Pointu, iRTSV/BCFanimalerie), une étude de toxicologie a été mise en oeuvre sur souris CD1 avec 15 des doses croissantes de composé PPA1. Pour cela, des injections intra-péritonéales de différentes concentrations de composé PPA1 (60 mg/kg, 30 mg/kg et 15 mg,/kg) ont été réalisées quotidiennement chez la souris pendant 7 jours. Des injections de sérum physiologique ou du mélange PEG400 40% / sérum physiologique 50% / DMSO 10% ont été réalisées comme contrôle. Chacune des conditions a été testée sur 7 animaux (3 mâles et 4 20 femelles) de manière à obtenir des résultats statistiquement valables. Le suivi du poids de chaque animal ainsi que de sa consommation de nourriture a été réalisé quotidiennement. A l'issue des 7 jours d'injection, nous n'avons eu aucune mortalité de souris, quelque soit la dose testée. Une perte de poids des animaux après la première injection du composé à 30 et 60 mg/kg a toutefois été observée ; cette perte a été directement corrélée à une baisse de 25 consommation de nourriture au cours des premiers jours et a ensuite été suivie par une reprise de poids immédiate dès la seconde injection. Les poids des souris traitées avec le composé PPA1 ont évolué de la même manière que pour les souris contrôles. L'analyse macroscopique des organes prélevés en fin d'étude (reins, foie, rate, poumons, coeur, cerveau) s'est révélée normale pour tous les groupes d'animaux (contrôles ou 30 traités). Aucune toxicité du composé PPA1 testé sur l'animal n'a été observé, et ce quelle que soit la dose injectée, REVENDICATIONSI) Composé caractérisé en ce qu'il répond à la formule (1) suivante : RI dans lequel : R1 représente une chaîne alkyle ou alcoxy, linéaire ou ramifiée en C1-C12, une chaîne alcényle ou alcynyle linéaire ou ramifiée en C2-C12, une chaîne cycloalkyle en C3-C12, un groupe aryle en C4-C12, un groupe hétéroaryle en C3-C11, ou une chaîne - COOR' dans laquelle R' représente un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle ou alcoxy, linéaire ou ramifiée en C1-C12, une chaîne alcényle ou alcynyle, linéaire ou ramifiée en C2-C12, une chaîne cycloalkyle en C3-C12, un groupe aryle en C4-C12, un groupe hétéroaryle en C3-C11, ledit radical R1 pouvant éventuellement comprendre dans sa chaîne un hétéroatome ou une fonction carbonyle, et ledit radical R1 pouvant éventuellement être substitué, R2 représente un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle ou alcoxy linéaire ou ramifiée en C1-C12, une chaîne alcényle ou alcynyle, linéaire ou ramifiée en C2-C12, une chaîne cycloalkyle en C3-C12, un groupe aryle en C4-C12, un groupe hétéroaryle en C3-C11, un groupe benzoyle -C(=0)C6F15, ou un groupe -C(----0)R3 dans lequel R3 est un atome d'hydrogène, une chaîne alkyle ou alcoxy linéaire ou ramifiée en C1-C12, un groupe aryle en C4-C12 ou hétéroaryle en C3-C11, lesdits radicaux R2 et R3 pouvant éventuellement être substitués, et ses sels phartnaceutiquement acceptables, en tant que médicament. 2) Composé selon la revendication 1, dans lequel R1 est une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C1-C6. 3) Composé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel R2 est un groupe -C(70)R3 dans lequel R3 est une chaîne alkyle ou alcoxy linéaire ou ramifiée en C1- C12, ou un groupe aryle en C4-C12 ou hétéroaryle en C3-C11. 4) Composé selon la revendication 3, dans lequel R2 est un groupe -C(=0)R3 dans lequel R3 est une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C1-C6 ou un groupe phényle. 5) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, choisi parmi les composés suivants : OU (H3C)2HC Composé PPA1 (113C)2HC NH Composé PPA2 6) Composé de formule (1) pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 5 pour la prévention et/ou le traitement de maladies choisies parmi le cancer, les pathologies de type neuro-dégénératif, les maladies parasitaires, les glaucomes, les maladies virales et les maladies fongiques. 7) Composé de formule (1) pour son utilisation selon l'une des revendications I à 6 pour la prévention et/ou le traitement de cancers choisis parmi le cancer des testicules, le cancer de l'ovaire, le cancer du poumon, le cancer du sein, la maladie de Hodgkin, les leucémies et tumeurs solides, les neuroblastomes, mélanomes, gliomes, glioblastomes et sarcomes, le cancer du côlon, le cancer du pancréas. 8) Composé de formule (1) pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 6 pour la prévention et/ou le traitement de pathologies de type neuro-dégénératif choisies parmila schizophrénie, la maladie d'Alzheimer et autres syndromes neuro-dégénératifs apparentés telle que la maladie de Huntington. 9) Composé de formule (I) pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 6 pour la prévention et/ou le traitement de maladies parasitaires impliquant des parasites apicomplexes, les parasites avec des cils ou flagelles, la toxoplasmose, la Listeria, la Giarda, le Trichomonas, le Plasmodium,l'Enteromonas hominis. 10) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que principe actif au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 9 et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 11) Composition pharmaceutique selon la revendication 10, comprenant en outre un autre principe actif anticancéreux.