Brevet FR3008900A1 — publié le 20150130

NANOPARTICULES LIPIDIQUES MULTICOMPARTIMENTEES DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se place dans le cadre du développement de nanotechnologies pour l'administration de principes actifs. La présente invention se rapporte à des nanoparticules lipidiques multicompartimentées, (ci-après dénommées cellisomes), leur procédé de préparation et leur utilisation comme vecteur pour l'administration de molécule d'intérêt, notamment par voie injectable, orale nasale ou cutanée. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (11) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Durant les trente dernières années, deux grandes catégories de systèmes nanométriques de vecteurs de molécules d'intérêt ont été développées : les systèmes polymériques et lipidiques. Les premiers d'entre eux se sont montrés relativement décevant du point de vue de leur industrialisation, probablement pour des raisons de toxicité. Aussi les formulations disponibles sur le marché sont majoritairement à base de lipides qui ont généré deux grandes familles de vecteurs : les liposomes et les particules lipidiques (nanoémulsion (NE), les nanoparticules lipidiques nanostructurées (NLC), les nanoparticules lipidiques solides (SLN)). Les liposomes ont donné lieu à de nombreuses applications cosmétiques et plusieurs médicaments sur le marché, alors que les particules lipidiques, de mise au point plus récente, sont présentes dans de nombreux produits cosmétiques et en essais cliniques pour le domaine pharmaceutique. Les liposomes sont définis comme une structure artificielle constituée d'une ou plusieurs bicouches lipidiques concentriques, emprisonnant entre elles des compartiments d'eau ou de tampon aqueux. Les liposomes sont préparés à partir d'un seul ou plusieurs types de phospholipides naturels ou de synthèse qui s'organisent de sorte que les têtes polaires se regroupent entre elles pour permettre l'établissement de la bicouche. La façon la plus classique de préparer des liposomes est celle dite de l'hydratation d'un film lipidique. Les liposomes sont de plus en plus développés en tant que vecteurs de principes actifs qu'ils soient hydrosolubles, liposolubles ou amphiphiles. Leur encapsulation dans la phase aqueuse ou dans la bicouche lipidique permet ainsi de protéger les principes actifs vis-à-vis d'une dégradation enzymatique ou d'une élimination par le système immunitaire, mais également de diminuer leurs éventuels effets secondaires toxiques (e.g. hémolyse, thrombophlébite, coagulation sanguine) lors d'une administration parentérale. (Meure et al., Aaps Pharmscitech, 9 : 798-809, 2008 ; Storm et Crommelin, Pharmaceutical Science & Technology Today, 1 : 19-31, 1998) [1, 2]. A la base d'une douzaine de compositions commerciales (e.g. Myocet®, Doxile/Caelyx°, AmBisome®, Visudyne®, etc...), les liposomes présentent cependant plusieurs inconvénients majeurs : un manque de spécificité pour la cellule cible, une oxydation et instabilité physique des phospholipides nécessitant leur lyophilisation, une production à l'échelle industrielle délicate, et une certaine limitation dans la quantité de molécules d'intérêt encapsulables. En effet, des molécules amphiphiles ou lipophiles sont capables de s'associer aux liposomes par insertion dans leurs membranes mais au risque d'une déstabilisation de cette dernière. Les émulsions sont de fines dispersions de gouttelettes d'un liquide (phase dispersée) dans un autre (phase dispersante ou continue) qui lui est très peu miscible ; elles sont le plus souvent de type huile/eau. On parle de nanoémulsions (NE) lorsque la granulométrie obtenue est très fine, c'est-à-dire une taille moyenne de l'ordre de la centaine de nanomètres. Elles sont généralement fabriquées par fragmentation mécanique d'une phase huileuse dans une phase aqueuse, et éventuellement stabilisées par la présence de tensioactif. Par rapport à des émulsions classiques, la petite taille des globules leur confère des propriétés intéressantes sur le plan pharmaceutique, notamment en termes de stabilité physique pendant le temps de stockage et de voie d'administration possible, en particulier la voie intra-veineuse qui requiert l'utilisation de gouttelettes de petites tailles. Toutefois, ces systèmes ne peuvent incorporer que des principes actifs très lipophiles solubles dans les huiles constitutives de ces émulsions (huile de soja, d'olives), limitant ainsi leurs applications potentielles. Les nanoparticules lipidiques solides (SLN) et lipidiques nanostructurées (NLC) ont été développées afin d'augmenter la stabilité physicochimique des principes actifs encapsulés et la stabilité après administration des vecteurs lipidiques dans leur ensemble, pour généralement les exploiter à terme en cosmétologie du fait de leurs propriétés d'adhésivité, d'occlusion et d'hydratation de la peau et en pharmacie pour l'administration et la protection de principes actifs d'intérêt. (Bunjes, Current Opinion in Colloid & Interface Science, 16(5) : 405-411, 2011 ; Harde et al., Expert Opinion on Drug Delivery, 8(11) : 1407-1424, 2011 ; Harms et al., Journal of Drug Delivery Science and Technology, 21(1) : 89-99, 2011 ; Joshi et Muller, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 71 : 161-172, 2009 ; Muller et al., Current Drug Discovery technologies, 8(3) : 207-227, 2011 ; Pardeike et al., International Journal of Pharmaceutics, 366: 170-184, 2009 ; Souto et Doktorovova, Methods in Enzymology, 464: 105-129, 2009) [3-9]. Comme dans le cas des nanoémulsions décrites précédemment, la très grande lipophilie des matières premières utilisées limite le choix des principes actifs potentiellement administrables. De plus, il a été montré que le polymorphisme des lipides à l'état solide influe grandement sur la stabilité physique de ces systèmes (expulsion des molécules actives, gélification), notamment dans le cas des SLN. Des nanocapsules lipidiques développées par l'Université d'Angers ont été obtenues par un procédé d'inversion de phase et sont entourées par une monocouche de phospholipides. Bien que très proches des nanodispersions de type SLN et NLC, ces particules ont été décrites comme des nanocapsules stabilisées par une couche cristallisée de phospholipides et d'un tensioactif non-ionique polyoxyéthyléné (Demande Internationale WO 01/64328 ; Huynh et al., Journal of Pharmaceutics, 379 : 201-209, 2009) [10, 11]. Intéressante car relativement « douce », la technique d'inversion de phase nécessite l'utilisation de matières premières relativement spécifiques et un contrôle très fin des températures pendant le procédé de préparation. Ces aspects peuvent présenter une limite au développement de cette approche à très grande échelle. Il y a quelques années des émulsions cationiques submicroniques composées de structures bicompartimentales huile/eau, nommées « sacs à main » ou « hand-bags » ont été développées (figure 1). Leur formation nécessite la présence de stéarylamine qui favoriserait l'insertion massive de triglycérides dans la bicouche lipidique délimitant le compartiment aqueux, pour les exploiter à terme comme vecteur de principes actifs (Texeira et al., Pharmaceutical Research, 17: 1329-1332, 2000) [12]. Malheureusement, la proportion de ces objets bicompartimentés reste minoritaire (moins de 20%) parmi une multitude d'autres objets formés pendant la préparation (micelles, liposomes, nanoémulsions). De plus, l'utilisation d'un tensioactif cationique comme la stéarylamine est à envisager avec précaution compte tenu de la toxicité de ce type de produit vis-à-vis des membranes biologiques chargées négativement. Plus marginales, des nanoémulsions de particules ayant un diamètre de 10-250 nm (nommées émulsomes ou ultrasomes) comprenant un coeur lipidique composé d'un lipide sous forme liquide ou solide entouré et stabilisé par au moins une bicouche phospholipidique, comme dans les liposomes, ont été développées et destinées à l'administration par voie parentérale, orale, rectale, intranasale ou topique de molécules liposolubles ou hydrosolubles (Brevet US 5,576,016 ; Gupta et al., Journal of Drug Targeting, 15 : 437-444, 2007 ; Gupta et Vyas, Journal of Drug Targeting, 15 : 206-217, 2007 ; Kretschmar et al., Mycoses, 44 : 281-286, 2001 ; Paliwal et al., International Journal of Pharmaceutics, 380: 181-188, 2009 ; Wu et al., Journal of Immunology, 185(6) : 3401-3407, 2010) [1318]. Le procédé de préparation de ces émulsomes est difficilement exploitable à l'échelle industrielle car il nécessite l'utilisation d'un solvant organique, le dépôt et la réhydratation d'un film phospholipidique. En effet, ces particules sont principalement obtenues par une technique d'hydratation d'un film phospholipidique très proche de celle employée pour les liposomes exceptée que la phase aqueuse contient des nanoparticules lipidiques préformées. La particule finale résulte de « l'emprisonnement statistique » des gouttelettes huileuses dans des bicouches phospholipidiques. En conséquence, le procédé génère a priori différentes populations d'objets (émulsomes, liposomes, nanoémulsions ou nanoparticules solides) sans solidarisation entre les parties lipidiques et phospholipides. Ceci peut a priori induire des problèmes de stabilité des systèmes au cours de certaines opérations de purification (centrifugation par exemple) ou pendant le stockage. Il existe donc un réel besoin de vecteurs lipidiques palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé de production simple permettant de maîtriser la stabilité des vecteurs lipidiques sur le long terme pour l'administration de large quantité de molécules d'intérêt ayant une large gamme de polarité, et éventuellement d'envisager la co-encapsulation de principes actifs hydrophiles et lipophiles dans un même nano-objet Description de l'invention S'appuyant sur leurs propres expériences autour de la stabilité et la toxicité des nanosystèmes lipidiques, les Inventeurs ont développé de nouvelles nanoparticules lipidiques multicompartimentées (ou cellisomes) représentant un système hybride entre ceux précédemment décrits, à savoir les liposomes et les particules lipidiques, et qui pourraient s'apparenter au globule gras du lait (figure 2A-C) dans lequel une matrice lipidique est stabilisée par une tricouche phospholipidique (figure 3). L'originalité principale des cellisomes de l'invention provient de leur morphologie multicompartimentée malgré un procédé de préparation simple (Homogénéisation Haute Pression) et transposable à l'échelle industrielle. Par ailleurs les matières premières utilisées sont peu onéreuses, déjà reconnues par diverses pharmacopées et employées dans l'industrie pharmaceutique. Dans les cellisomes de l'invention, le coeur lipidique peut être constitué de mélanges lipidiques liquides ou semi-solides à température ambiante (25°C) incorporant des glycérides et des esters de polyéthylèneglycol. Ce dernier aspect est très important pour permettre l'encapsulation dans lesdites nanoparticules de principes actifs (PA) ayant une large gamme de polarité (PA lipophiles dans les glycérides, PA plus hydrophiles dans les polyéthylèneglycols). En outre, contrairement à ce qui est observé pour de nombreux vecteurs de médicaments, la stabilité des suspensions de cellisomes de l'invention s'étend sur plusieurs dizaines de mois sans nécessiter aucune étape de lyophilisation comme dans le cas des liposomes par exemple. La stabilisation des cellisomes de l'invention est assurée par un mélange de tensio-actifs contenant des phospholipides (e.g. Phospholipon® 90G) et des mélanges de tensioactifs non-ioniques dont certains de type « hydrophobe - hydrophile - hydrophobe » de HLB>11 selon l'échelle de Griffin. Ces tensioactifs tri-séquencés peuvent par exemple appartenir à la famille des macrogol-glycérides (e.g. Gelucire® 50/13) ou des acides gras polyoxyéthylénés (e.g. Polyoxyéthylène 40 stéarate). Ce mélange de tensioactifs a préalablement montré son intérêt dans la stabilisation à très long terme (plus de 4 ans) de nanoparticules de beurre de cacao et la très faible toxicité de ces dernières a été montrée sur un test colorimétrique au sel de tetrazolium (MTT). Le mélange et le traitement de ces excipients selon le protocole décrit ci-après aboutit à la formation des cellisomes de l'invention, de préférence dans le cas d'une phase lipidique à base de linoleoyl polyoxylglycérides et/ou oleyl polyoxylglycérides (Labrafil®), clairement différente d'une image de nanoémulsion typique (NE). Par ailleurs, des mesures d'épaisseur de la couche sombre extérieure, donc dense aux électrons, suggèrent fortement un premier compartiment lipophile (matrice ou coeur lipidique) au moins en partie enrobé par un second compartiment hydrophile délimité par une bicouche phospholipidique (bicouche). En outre, il ressort de l'étude de la structure des cellisomes de l'invention que ledit premier compartiment est au moins en partie ancré audit second compartiment du fait de l'utilisation de tensioactifs non-ioniques adaptés tels que ceux décrits ci-dessus. Sans se trouver limité par cette explication, il semblerait que la clé de voûte de l'architecture des cellisomes de l'invention repose sur l'utilisation d'un mélange tensioactif non ionique hydrophile contenant au moins un dérivé tri-segmenté de type « hydrophobe - hydrophile - hydrophobe ». Les segments hydrophobes pourront être constitués d'alcools gras, d'acides gras, de glycérides, de cholestérol ou de tout autre groupement affin pour les membranes phospholipidiques. La partie hydrophile sera constituée de polymères de type polyoxyéthylène, polypropylène, polysaccharide ou tout type de polymère capable de générer, en association avec les segments hydrophobes, des tensioactifs de HLB >11. Le HLB est ici défini selon l'échelle de Griffin. Ces tensioactifs pourront par exemple appartenir à la famille des polyoxylglycérides ou macrogol-glycérides, des esters d'acides gras polyoxyéthylénés ou des alkyl éthers de polyoxyéthylène, de préférence seront le Gelucire 50/13 ou le polyoxyéthylène (40) stéarate. Les esters d'acide gras polyoxyéthylénés sont des mélanges d'acide gras estérifiés par une chaine hydrophile de poly(oxyéthylèneglycol), et contiennent un mélange, en proportion variable, de dérivés séquencés à deux blocs de type acide gras - PEG (monoesters) et de dérivés séquencés à trois blocs de type acide gras - PEG - acide gras (diesters). Les macrogol-glycérides contiennent en plus des glycérides. En particulier, le Gelucire® 50-13 est un mélange de glycérides et d'acide gras estérifiés par une chaine hydrophile de poly(oxyéthylèneglycol) de 1500g/mol, qui contient environ 40% de dérivés séquencés à trois blocs de type acide gras - PEG - acide gras (figure 4A). Dans le système proposé, la fraction de diesters est très certainement le point d'ancrage entre la bicouche et la partie lipidique (figure 4B). En effet, il est connu de l'art que l'incorporation de phospholipides dans une formulation de type particules lipidiques aboutit généralement à des préparations hétérogènes contenant deux types d'objets, des nanoparticules d'une part et des liposomes d'autre part. Un même résultat a été obtenu en appliquant le protocole expérimental de l'invention en l'absence des tensioactifs non-ioniques de type « hydrophobe - hydrophile - hydrophobe » de HLB>11 selon l'échelle de Griffin (données non représentées). Dans le système proposé, la fraction de ces tensioactifs est très certainement le point d'ancrage entre la bicouche et la partie lipidique (figure 4B). La présente invention a donc pour objet des nanoparticules lipidiques multicompartimentées (ou cellisomes) ayant un diamètre moyen d'environ 10 à 500 nm, caractérisées en ce qu'elles comprennent un premier compartiment lipophile au moins en partie enrobé par un second compartiment hydrophile délimité par une bicouche phospholipidique, ledit premier compartiment étant au moins en partie ancré audit second compartiment. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, les cellisomes de l'invention ont un indice de polydispersité (i.e. la distribution de taille d'une population de particules) d'environ 5 à 15 %, de préférence de 10%. De préférence les cellisomes de l'invention ont un diamètre moyen d'environ 100 à 250 nm. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le compartiment lipophile des cellisomes de l'invention est constitué de lipides dans l'état liquide ou semi-solide à température ambiante. De préférence, ledit compartiment lipophile est essentiellement constitué d'un ester d'acide gras éventuellement mélangé avec un glycéride. De préférence ledit ester d'acide gras est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de mono-, di- esters de polyéthylène glycols dont la masse molaire de la partie hydrophile varie de 100 à 700 g/mol. De préférence le glycéride est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de mono-, di- et tri-esters de glycérol liquide ou solide à température ambiante. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la bicouche 5 phospholipidique des cellisomes de l'invention est essentiellement constituée de phospholipide et de tensio-actif hydrophile non ionique. De préférence ledit phospholipide est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de phospholipides essentiellement zwitterioniques. 10 De préférence ledit tensio-actif non ionique est choisi dans groupe consistant en un mélange tensioactif non ionique hydrophile contenant au moins un dérivé tri-segmenté de type « hydrophobe - hydrophile hydrophobe ». Les segments hydrophobes pourront être constitués d'alcools gras, d'acides gras, de glycérides, de cholestérol ou de tout autre 15 groupement affin pour les membranes phospholipidiques. La partie hydrophile sera constituée de polymères de type polyoxyéthylène, polypropylène, polysaccharide ou tout type de polymère capable de générer, en association avec les segments hydrophobes, des tensioactifs de HLB >11. Le HLB est ici défini selon l'échelle de Griffin. Ces tensioactifs 20 pourront par exemple appartenir à la famille des polyoxylglycérides ou macrogol-glycérides, des esters d'acides gras polyoxyéthylénés ou des alkyl éthers de polyoxyéthylène, de préférence seront le Gelucire 50/13 ou le polyoxyéthylène (40) stéarate. La présente invention a également pour objet des nanoparticules 25 lipidiques multicompartimentées (ou cellisomes) de l'invention comprenant en outre au moins une molécule d'intérêt. De préférence la molécule d'intérêt est choisie parmi un acide nucléique, une protéine, un polysaccharide et une petite molécule. La présente invention a également pour objet une composition 30 pharmaceutique comprenant une suspension de nanoparticules lipidiques multicompartimentées (ou cellisomes) de l'invention dans un excipient pharmaceutiquement acceptable. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de nanoparticules lipidiques multicompartimentées (ou cellisomes) de l'invention comprenant les étapes suivantes : - préparation d'une émulsion huile/eau comprenant au moins un lipide, un phospholipide, un tensio-actif hydrophile non ionique, et éventuellement au moins une molécule d'intérêt ; - homogénéisation de ladite émulsion sous haute pression. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit procédé de l'invention comprend en outre une étape de chauffage de l'émulsion à une température de 30 à 80°C, de préférence à 70°C, avant son homogénéisation. De préférence ledit lipide est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de mono- et di-esters de polyéthylène glycols dont la masse molaire de la partie hydrophile varie de 100 à 700 g/mol. De préférence ledit phospholipide est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de phospholipides essentiellement zwitterioniques. De préférence ledit tensio-actif hydrophile non ionique est choisi dans le groupe consistant en la famille des polyoxylglycérides ou macrogol- glycérides, des esters d'acides gras polyoxyéthylénés ou des alkyl éthers de polyoxyéthylène, de préférence le Gelucire® 50/13 ou le polyoxyéthylène (40) stéarate. De préférence l'émulsion huile/eau du procédé de l'invention comprend : - 5-30% de lipides, de préférence du Labrafil® M2125CS ou M1944CS ; - 0,5-5% de phospholipides, de préférence du Phospholipon 90G® ; - 0,5-5% de macrogol-glycérides ou d'esters d'acide gras polyoxyéthylénés, de préférence du Gélucire® 50-13 ou du polyoxyéthylène (40) stéarate ; - Eau, qsp pour 100g. La présente invention a également pour objet les nanoparticules lipidiques multicompartimentées (ou cellisomes) de l'invention pour une utilisation comme vecteur pour l'administration d'une molécule d'intérêt. La présente invention a également pour objet les nanoparticules lipidiques multicompartimentées (ou cellisomes) de l'invention pour une utilisation comme médicament, de préférence un médicament administré par voie injectable, orale, nasale ou cutanée. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures - La figure 1 représente des images de microscopie électronique de structures nommées « sacs à main » ou « hand-bags » obtenus avec différentes conditions opératoires. Quelque soient ces dernières, la proportion de « sacs à main » reste minoritaire. - La figure 2 représente les descriptions schématiques et images en cryo-microscopie électronique par transmission (cryo-TEM) de 2 0 liposomes (A), de particules lipidiques (B), et un schéma du globule gras du lait (C), - La figure 3 montre une image en cryo-TEM des nanoparticules lipidiques multicompartimentées de l'invention. - La figure 4 représente les constituants du Gelucire® 50-13 (A), 25 et un schéma de la supra-structure membranaire des nanoparticules lipidiques multicompartimentées de l'invention (B). - La figure 5 représente un schéma de préparation des nanoparticules lipidiques multicompartimentées de l'invention. - La figure 6 représente le suivi sur 20 mois de la taille des 30 nanoparticules lipidiques multicompartimentées et de leur polydispersité pour le Labrafil® M 2125 CS - La figure 7 représente l'étude de la stabilité de la quercétine solubilisée en milieu aqueux [H2O à température ambiante ; milieu aqueux à pH7,4 à température ambiante ; milieu gastrique simulé (SGF) à température ambiante ; milieu gastrique simulé (SGF) à 37°C ; milieu intestinal reconstitué (SIF) à température ambiante] (A), et de la stabilité chimique de différentes concentrations (1, 2, 3, 4 et 5`)/0) de quercétine encapsulée dans les nanoparticules lipidiques multicompartimentées de l'invention (B, droite) ; la stabilité physique des particules est représentée sur la partie gauche de la figure 7B. EXEMPLES Exemple 1 : Obtention des nanoparticules lipidiques multicompartimentées (ou cellisomes) Préparation La préparation des nanoparticules lipidiques multicompartimentées est schématisée dans la figure 5. Les nanodispersions ont été préparées à l'aide d'un homogénéisateur à 2 étages (APV 2000, Invensys, Albertslund, Danemark) équipé d'un 2 0 système de chauffage et associé à un Ultra-turrax T25 (Janke & Kunkel GMBH & Co.KG, IKA®-Labotechnik, Allemagne) pour la préparation de l'émulsion primaire. Pour chaque lot, 50 g de nanodispersions ont été préparés selon le protocole incluant les trois étapes suivantes: 25 Emulsification : Tout d'abord, les lipides et les tensioactifs (Gélucire® 50/13 et Phospholipon® 90G) ont été pesés et introduits dans des flacons de 20 ml et 100 ml, respectivement. La quantité d'eau nécessaire a été ajoutée dans le flacon contenant les tensioactifs puis la suspension de tensioactifs a été préparée à 70°C sous agitation mécanique (Ultra-turrax T25, Janke & 30 Kunkel GMBH & Co.KG, IKA®-Labotechnik, Allemagne), à la vitesse de 9500 rpm pendant 5 min. Enfin, le mélange lipidique, également chauffé à 70°C, a été ajouté dans la phase aqueuse et agité par Ultra-turrax à la vitesse de 13500 rpm pendant 5 min, pour obtenir une pré-émulsion (H/E). Diminution et homogénéisation de la taille des particules par HHP : La pré-émulsion obtenue a été rapidement introduite dans l'homogénéisateur à deux étages (APV 2000, Invensys, Albertslund, Danemark) chauffé au préalable à 70°C. Elle y a subi plusieurs cycles d'homogénéisation continue pendant 5 minutes, sous un double effet de pression (la pression du 1el- étage est de 600 bar et celle du 2nd étage est de 200 bar), pour former une nanoémulsion (H/E) à chaud. Refroidissement des particules : Les nanodispersions ont été ensuite maintenues à température ambiante et à 4°C. Composition Les nanoparticules lipidiques multicompartimentées obtenues par le procédé de préparation décrit ci-dessus comprennent à titre d'exemple : Lipides (Labrafil®) 5 à 20% Phospholipides (Phospholipon 90G) 1% Macrogol-glycérides (Gelucire® 50-13) 2% Eau (qsp) 100g Stabilité des nanoparticules lipidiques multicompartimentées Le stockage à température ambiante des nanoparticules lipidiques multicompartimentées en suspension dans l'eau a été suivi sur plusieurs mois, au regard de leur taille et de leur polydispersité. Ce suivi a été montré en exemple pour le Labrafil® M 2125 CS. L'écart-type sur le diamètre moyen (n=3) généralement masqué par le symbole, a confirmé la bonne reproductibilité du procédé. Le diamètre de nanoparticule inférieur à 200nm est adapté à une administration intra-veineuse. La polydispersité inférieure à 0,2 traduit une distribution étroite des tailles autour de la moyenne. En suspension dans l'eau, les nanoparticules lipidiques multicompartimentées les plus anciennes ont conservé un diamètre (170- 180 nm) et une polydispersité (-0,1) identiques pendant plus de 20 mois (figure 6). Exemple 2: Nanoparticules lipidiques multicompartimentées (ou cellisomes) comme vecteurs de principes actifs Préparation des nanoparticules lipidiques multicompartimentées comme vecteurs de principes actifs Les nanoparticules lipidiques multicompartimentées obtenues par le protocole ci-dessus ont été testées quant à leur capacité à encapsuler des principes actifs pharmaceutiques Pour ce faire, à titre d'exemple, des études ont été menées sur l'encapsulation de la quercétine. Ce principe actif présente le double inconvénient d'être très peu soluble dans l'eau (-0.4 pg/ml) et rapidement hydrolysé dans certaines conditions de pH. Les bénéfices de l'encapsulation sur ces deux points ont donc été étudiés. Les particules ont été préparées suivant le protocole décrit précédemment, en solubilisant à saturation le principe actif dans la phase lipidique avant son émulsification dans la phase aqueuse contenant les tensioactifs. Le principe actif non encapsulé a été séparé par ultracentrifugation (LE-80K Ultracentrifuge Optima, 30000 rpm, 1h, 4°C) puis la fraction encapsulée a été dosée dans le surnageant, contenant les nanoparticules, par chromatographie liquide haute performance (CLHP) selon une méthode développée au laboratoire. A savoir, la quercétine a été dosée à l'aide d'un appareillage CLHP de chez WatersTM, équipé d'un détecteur UV (WatersTM 2487 Dual À Absorbance Detector), d'une pompe (WatersTM 1525 Binary CLHP Pump), d'un injecteur associé à un passeur d'échantillon automatisé (WatersTM 717 plus Autosampler) et d'un dégazeur en ligne (WatersTM In-Line Degasser AF). La séparation a été effectuée sur une colonne (Modulo-cart QK 3 C18-2 colonnes, 150 mm x 3 mm, Interchim) à 25°C avec une phase mobile acétonitrile - eau - acide trifluoroacétique (30:70:0.1, v/v). La longueur d'onde du détecteur a été fixée à 371 nm. Le débit était de 0,5 ml/min et le volume injecté de 20 pl. La gamme d'étalonnage établie à partir de trois solutions mères indépendantes et contenant des particules lipidiques blanches possédait un coefficient de corrélation (r2) de 0.9998 et une zone de linéarité large de 50 à 5000 ng/ml. Ces chiffres ont confirmé que la spécificité, la sensibilité et la précision de la méthode étaient élevées dans les conditions de chromatographie déterminées. Avant l'analyse CLHP, tous les échantillons ont été dissous dans le méthanol à des concentrations comprises dans la gamme linéaire, puis filtrés à travers une membrane de porosité moyenne 0,2 pm (Minisart® High-Flow Hydrophilic 16532K, Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Allemagne). La méthode CLHP mise au point permet de séparer le PA et les excipients, et donc de déterminer directement la teneur en PA encapsulé dans les particules lipidiques, ainsi que la stabilité et les cinétiques de libération dans les différents milieux de dissolution. La charge maximale en principe actif dans la suspension est d'environ 1% (soit 5.103 fois sa solubilité aqueuse) avec un rendement d'encapsulation d'environ 96% dans les conditions optimum. En outre, il est apparu que la présence de PEG à la surface des nanoparticules leur permet a priori de bénéficier de la propriété de furtivité (échappement à la capture par le système réticulo-endothélial) largement décrite pour les liposomes « pegylés » et primordiale pour leur administration in vivo. Stabilité de la quercétine libre ou encapsulée La stabilité de la quercétine, hydrolysée en milieu aqueux et encapsulée dans les nanoparticules lipidiques multicompatimentées de l'invention, a été testée. Pour ce faire, la stabilité de la quercétine dans différents milieux a été quantifiée par dosage CLHP. Les différents milieux considérés ont été le milieu gastrique simulé (SGF - US Pharmacopeia) à température ambiante et à 37°C, le milieu intestinal simulé (SIF - US Pharmacopeia), un tampon HEPES 10 mM (pH 7,4) et l'eau à température ambiante. Des prélèvements sur 24h ont notamment montré que dans de l'eau à température ambiante, environ 50% de la quercétine est dégradée en 17h (figure 7A) alors que cette molécule est plus stable dans les milieux plus acides. En revanche, après encapsulation, et stockage sous forme de suspension dans l'eau, le dosage après ultracentrifugation des nanoparticules a montré qu'environ 100% de la quercétine était retrouvée après 90 jours de conservation (figure 7B droit). Par ailleurs, les particules encapsulant le principe actif sont restées physiquement stables au moins 90 jours, à température ambiante comme à 4°C (figure 7B gauche). Listes des références 1. Meure et al., Aaps Pharmscitech, 9 : 798-809, 2008 2. Storm et Crommelin, Pharmaceutical Science & Technology Today, 1 : 19-31, 1998 3. Bunjes, Current Opinion in Colloid & Interface Science, 16(5) : 405411, 2011 4. Harde et al., Expert Opinion on Drug Delivery, 8(11) : 1407-1424, 2011 5. Harms et al., Journal of Drug Delivery Science and Technology, 21(1) : 89-99, 2011 6. Joshi et Muller, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 71 : 161-172, 2009 7. Muller et al., Current Drug Discovery technologies, 8(3) : 207-227, 15 2011 8. Pardeike et al., International Journal of Pharmaceutics, 366: 170184, 2009 9. Souto et Doktorovova, Methods in Enzymology, 464: 105-129, 2009 10. Demande Internationale WO 01/64328 20 11. Huynh et al., Journal of Pharmaceutics, 379 : 201-209, 2009 12. Texeira et al., Pharmaceutical Research, 17 : 1329-1332, 2000 13. Brevet US 5,576,016 14. Gupta et al., Journal of Drug Targeting, 15 : 437-444, 2007 15. Gupta et Vyas, Journal of Drug Targeting, 15 : 206-217, 2007 25 16. Kretschmar et al., Mycoses, 44 : 281-286, 2001 17. Paliwal et al., International Journal of Pharmaceutics, 380: 181-188, 2009 18. Wu et al., Journal of Immunology, 185(6) : 3401-3407, 2010 REVENDICATIONS1) Nanoparticules lipidiques multicompartimentées ayant un diamètre moyen d'environ 10 à 500 nm, caractérisées en ce qu'elles comprennent un premier compartiment lipophile au moins en partie enrobé par un second compartiment hydrophile délimité par une bicouche phospholipidique, ledit premier compartiment étant au moins en partie ancré audit second compartiment. 2) Nanoparticules selon la revendication 1, où l'indice de polydispersité est d'environ 5 à 15 %. 3) Nanoparticules selon la revendication 1 ou 2, où le diamètre moyen est d'environ 100 à 250 nm. 4) Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 où le compartiment lipophile est constitué de lipides dans l'état liquide ou semi-solide à température ambiante. 5) Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où le compartiment lipophile comprend un ester d'acide gras éventuellement mélangé avec un glycéride. 6) Nanoparticules selon la revendication 5, où ledit ester d'acide gras est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de mono-, di- esters de polyéthylène glycols dont la masse molaire de la partie hydrophile varie de 100 à 700 g/mol. 7) Nanoparticules selon la revendication 5, où le glycéride est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de mono-, di- et tri-esters de glycérol liquide ou solide à température ambiante.FR n°1357363 8) Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, où la bicouche phospholipidique comprend au moins un phospholipide et un tensioactif hydrophile non ionique. 9) Nanoparticules selon la revendication 8, où ledit phospholipide est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de phospholipides zwitterioniques. 10) Nanoparticules selon la revendication 8, où ledit tensioactif hydrophile non ionique est choisi dans le groupe consistant en les polyoxylglycérides ou macrogol-glycérides, les esters d'acides gras polyoxyéthylénés et les alkyl éthers de polyoxyéthylène 11) Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant en outre au moins une molécule d'intérêt. 12) Nanoparticules selon la revendication 11, où la molécule d'intérêt est choisie parmi un acide nucléique, une protéine, un polysaccharide et une petite molécule. 13) Composition pharmaceutique comprenant une suspension de nanoparticules telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 12 dans un excipient pharmaceutiquement acceptable. 14) Procédé de préparation de nanoparticules lipidiques multicompartimentées telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 12 comprenant les étapes suivantes : - préparation d'une émulsion huile/eau comprenant au moins un lipide, un phospholipide, un tensio-actif hydrophile non ionique, et éventuellement au moins une molécule d'intérêt ; - homogénéisation de ladite émulsion sous haute pression.FR n°1357363 15) Procédé selon la revendication 14, comprenant en outre une étape de chauffage de l'émulsion à une température de 30 à 80°C avant son homogénéisation. 16) Procédé selon la revendication 14, où ledit lipide est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de mono- et di-esters de polyéthylène glycols dont la masse molaire de la partie hydrophile varie de 100 à 700 g/mol. 17) Procédé selon la revendication 14, où ledit phospholipide est choisi dans le groupe consistant en des mélanges de phospholipides zwitterioniques. 18) Procédé selon la revendication 14, où ledit tensio-actif hydrophile non ionique est choisi dans le groupe consistant en les polyoxylglycérides ou macrogol-glycérides, les esters d'acides gras polyoxyéthylénés et les alkyl éthers de polyoxyéthylène. 19) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, où l'émulsion huile/eau comprend : 5-30% de lipides, de préférence du Labrafil® M2125CS ou M1944CS ; 0,5-5% de phospholipides, de préférence du Phospholipon 90G® ; 0,5-5% de polyoxylglycérides ou macrogol-glycérides, d'esters d'acides gras polyoxyéthylénés ou d'alkyl éthers de polyoxyéthylène, de préférence du Gélucire® 50-13 ou du polyoxyéthylène (40) stéarate. 20) Nanoparticules telles que définies dans l'une quelconque des 30 revendications 1 à 10 pour une utilisation comme vecteur pour l'administration d'une molécule d'intérêt.FR n°1357363 21) Nanoparticules telles que définies dans la revendication 11 ou 12 pour une utilisation comme médicament.