Brevet FR3002146A1 — publié le 20140822

UTILISATION D'HEMOGLOBINE D'ANNELIDES POUR TRAITER LES CANCERS La présente invention a trait à l'utilisation d'au moins une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour traiter les cancers, notamment pour diminuer l'hypoxie des cellules cancéreuses, et augmenter de ce fait l'efficacité de traitements de radiothérapie et de chimiothérapie. Le cancer est une maladie liée à la prolifération anormale et incontrôlable de cellules dites 10 malignes. Les cancers englobent des tumeurs dites solides, i.e. dans lesquelles les cellules se sont multipliées pour former une masse, et les lymphomes et leucémies où les cellules cancéreuses sont en circulation dans le sang, i.e. ne constituent donc pas de masse solide. 15 Une diminution de la pression partielle en oxygène (hypoxie tissulaire) a été mise en évidence dans la quasi-totalité des tumeurs solides chez l'homme (Raleigh J, Dewhirst M, Thrall D. Measuring tumor hypoxia. Semin Radiat Oncol 1996 ; 46 : 229-37). Dès les années 1950, l'architecture tumorale a été décrite comme une nécrose hyaline centrale, entourée de tissus viables, à une distance d'environ 100 pm des capillaires (Thomlinson RH, Gray LH. The 20 histological structure of some human lung cancers and possible implications for radiotherapy. Br J Cancer 1955; 9 : 539.). Les tumeurs présentent de larges zones ayant une faible pression partielle en oxygène dans lesquelles les cellules se trouvent en condition d'hypoxie. Le facteur de transcription hétérodimérique HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1) active une grande 25 variété de voies de signalisation permettant à la cellule cancéreuse d'acquérir une réponse adaptée au stress hypoxique. HIF-1 active une série de plus de 50 gènes codant pour des facteurs protéiques impliqués notamment dans la néo-angiogenèse, favorisant la progression tumorale et la dissémination métastatique, le métabolisme du glucose (Glut-1), la survie cellulaire et la chimiorésistance (MDR) (Lauzier MC, Michaud MD, Déry MA, Richard DE. HIF-1 30 activation during tumor progression : implications and consequences. Bull Cancer 2006 ; 93 : 349-56). La détection de la protéine HIF-1 dans les tumeurs a été corrélée à une diminution de la survie et à une réduction de la sensibilité à la chimiothérapie. Des cellules déficientes pour la protéine HIF-1 a montrent en effet une sensibilité accrue à de nombreux agents de chimiothérapie tels que la carboplatine ou l'étoposide (Unruh A, Ressel A, Mohamed HG, 35 Johnson RS, Nadrowitz R, Richter E, et al. The hypoxia-inducible factor-1 alpha is a negative factor for tumor therapy. Oncogene 2003 ; 22 : 3213-20). D'autre part, il a également été montré que l'hypoxie tumorale induit un arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S, et augmente la résistance à l'apoptose par l'inactivation du gène suppresseur de tumeurs p53. Il a ainsi été montré dans un modèle de fibrosarcome murin que les cellules hypoxiques sont 2 à 6 fois plus chimiorésistantes que les cellules normoxiques (Teicher BA, Holden SA, Al-Achi A, et al. Classification of antineoplasic treatments by their differential toxicity toward putative oxygenated and hypoxic tumor subpopulations in vivo in the FSalIC murine fibrosarcoma. Cancer Res 1990 ; 50 : 3339-44). L'hypoxie est également un facteur majeur de radiorésistance. Les altérations des bases nucléosidiques (cassure simple brin et double brin de l'ADN) peuvent être produites de manière « directe » par dépôt d'énergie sur les brins d'ADN ou, le plus souvent, de manière indirecte par la production de radicaux libres issus de la radiolyse de l'eau. L'oxygène va intervenir au sein de cette cascade radicalaire en permettant la création de radicaux libres à durée de vie plus longue. L'hypoxie pourrait être considérée comme une cible thérapeutique importante, étant donné sa grande spécificité tumorale (« L'hypoxie tumorale peut-elle devenir un avantage pour la chimiothérapie ? », Tredan et al, Bulletin du Cancer, 2008, vol. 95, n°5, pp. 528-534). De nouvelles thérapeutiques sont ainsi en cours de développement pour cibler les cellules en condition d'hypoxie. De nombreux agents susceptibles d'inhiber l'expression ou l'activité de HIFI sont également en phase préclinique ou clinique. Afin de pouvoir disposer de thérapies efficaces, il est pertinent d'identifier des thérapies qui inhibent l'hypoxie. En effet, en inhibant ou en diminuant ce mécanisme, les cellules cancéreuses peuvent redevenir sensibles aux traitements de radiothérapie et de chimiothérapie. Il existe donc un besoin pour réduire l'hypoxie de cellules cancéreuses, dans les cas de tumeurs solides. Les inventeurs ont maintenant découvert que, de façon surprenante, l'hémoglobine 30 extracellulaire d'Annélides permet de diminuer l'hypoxie de cellules cancéreuses, comme cela est démontré en exemple. La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'au moins une molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour traiter 35 les cancers, de préférence les tumeurs solides. De préférence, le traitement des cancers se fait par diminution de l'hypoxie des cellules cancéreuses ; cela les rend plus sensibles aux traitements de radiothérapie et de chimiothérapie. La présente invention concerne aussi au 25 moins une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour son utilisation pour diminuer l'hypoxie des cellules cancéreuses. La présente invention concerne ainsi un produit consistant en un agent anti-cancéreux et une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, comme préparation combinée pour l'utilisation simultanée, séparée ou séquencée, dans le traitement d'un cancer. De préférence, l'agent anticancéreux est choisi parmi les fludarabine, gemcitabine, capecitabine, methotrexate, taxol, taxotère, mercaptopurine, thioguanine, hydroxyurée, cytarabine, cyclophosphamide, ifosfamide, nitrosourées comme la carmustine et lomustine, complexes de platine comme la cisplatine, carboplatine et l'oxaliplatine, mitomycine, dacarbazine, procarbizine, etoposide, teniposide, campathecines, bleomycine, doxorubicine, idarubicine, daunorubicine, dactinomycine, plicamycine, mitoxantrone, L-asparaginase, epimbicm, 5-fluorouracile, taxanes comme le docetaxel et la paclitaxel, leucovorine, levam isole, irinotecan (CPT-11), SN-38, estramustine, moutarde d'azote, BCNU, vinblastine, vincristine et vinorelbine, les anticorps monoclonaux contre le récepteur EGF ou VEGF, comme le bevacizumab, cetuximab et panitumumab, imatimb mesylate, hexamethyhnelamine, topotecan, genisteine, erbstatine, lavendustine et aussi le bortezomib (ou PS341, vendu par Millenium Pharmaceuticals sous le nom Velcade). L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est présente chez les trois classes d'Annélides : les Polychètes, les Oligochètes et les Achètes. On parle d'hémoglobine extracellulaire car elle est naturellement non contenue dans une cellule, et peut donc circuler librement dans le système sanguin sans modification chimique pour la stabiliser ou la rendre fonctionnelle. L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est un biopolymère géant de poids moléculaire compris entre 2000 et 4000 kDa, constitué d'environ 200 chaînes polypeptidiques comprises entre 4 et 12 types différents que l'on regroupe généralement en deux catégories. La première catégorie, comptant 144 à 192 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites "fonctionnelles" qui portent un site actif de type hème, et sont capables de lier réversiblement l'oxygène ; ce sont des chaînes de type globine dont les masses sont comprises entre 15 et 18 kDa et qui sont très similaires aux chaînes de type a et [3 de vertébrés. La deuxième catégorie, comptant 36 à 42 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites de "structure" ou « linkers » possédant peu ou pas de site actif mais permettant l'assemblage des sous-unités appelées douzièmes ou protomères. Chaque molécule d'hémoglobine est constituée de deux hexagones superposés que l'on a nommés bicouche hexagonale (hexagonal bilayer) et chaque hexagone est lui-même formé par l'assemblage de six sous-unités (dodécamère ou protomère) en forme de goutte d'eau. La molécule native est formée de douze de ces sous-unités (dodécamère ou protomère). Chaque sous-unité a une masse moléculaire d'environ 250 kDa, et constitue l'unité fonctionnelle de la molécule native. De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d'Annélides Polychètes et les hémoglobines extracellulaires d'Annélides Oligochètes. De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille des Lumbricidae, les hémoglobines extracellulaires de la famille des Arenicolidae et les hémoglobines extracellulaires de la famille des Nereididae. Encore plus préférentiellement, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi l'hémoglobine extracellulaire de Lumbricus terrestris, l'hémoglobine extracellulaire d' Arenicola sp et l'hémoglobine extracellulaire de Nereis sp, plus préférentiellement l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina ou de Nereis virens. Selon l'invention, le protomère de globine de l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides constitue l'unité fonctionnelle de l'hémoglobine native, comme indiqué ci-dessus. Enfin, la chaîne de globine de l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides peut notamment être choisie parmi les chaînes de globine de type Ax et/ou Bx d'hémoglobine extracellulaire d'Annélides. L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne nécessitent pas de cofacteur pour fonctionner, contrairement à l'hémoglobine de mammifère, notamment humaine. Enfin, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne possédant pas de typage sanguin, ils permettent d'éviter tout problème de réaction immunologique. L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines peuvent être natifs ou recombinants. Selon l'invention, de préférence, la globine, le protomère de globine ou l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est présente dans une composition comprenant une solution tampon. Ladite solution tampon créée un environnement salin adéquat pour l'hémoglobine, ses protomères et ses globines, et permet ainsi le maintien de la structure quaternaire, et donc de la fonctionnalité de cette molécule. Grâce à la solution tampon, l'hémoglobine, ses protomères et ses globines sont capables d'assurer leur fonction d'oxygénation. La solution tampon selon l'invention est une solution aqueuse comprenant des sels, de préférence des ions chlorure, sodium, calcium, magnésium et potassium, et confère à la composition selon l'invention un pH compris entre 6.5 et 7.6 ; sa formulation est similaire à celle d'un liquide physiologiquement injectable. Dans ces conditions, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et ses globines restent fonctionnels. Dans la présente description, le pH s'entend à température ambiante (25°C), sauf mention contraire. De préférence, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, du chlorure de magnésium, du chlorure de potassium, ainsi que du sodium gluconate et du sodium acétate, et a un pH compris entre 6.5 et 7.6, de préférence égal à 7,1 ± 0,5, de préférence d'environ 7.35. Plus préférentiellement, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant 90 mM de NaCI, 23 Mm de Na-gluconate, 2,5 mM de CaCl2, 27 mM de Na-acétate, 1,5 mM de MgC12, 5 mM de KCI, et a un pH de 7,1 ± 0,5, pouvant contenir entre 0 et 100 mM d'antioxydant de type acide ascorbique et/ou glutathion réduit. De préférence, la composition est administrée au sujet par voie parentérale, de préférence par injection ou perfusion. De préférence, la composition comprenant l'hémoglobine, ses protomères ou ses globines, et la solution tampon est administrée en tant que telle. En effet, dans ce cas, l'hémoglobine, ses protomères ou ses globines, est présente dans une composition comprenant une solution tampon, de préférence une solution aqueuse comprenant des sels, et conférant à la composition un pH compris entre 6.5 et 7.6. De préférence, la composition contient uniquement l'hémoglobine, ses protomères ou ses globines, et une solution tampon consistant en une solution aqueuse comprenant des sels, et conférant à la composition un pH compris entre 6.5 et 7.6. La galénique d'administration est donc assez simple et efficace. De préférence, les cancers sont choisis parmi les carcinomes, les sarcomes, les mélanomes, les cancers du sein, du côlon, de l'ovaire, de la prostate, de l'utérus, du foie, du poumon et de la thyroïde. L'invention est décrite plus en détail dans les exemples suivants. Ces exemples sont fournis à des fins d'illustration uniquement, et ne sont pas limitatifs.35 Les figures sont illustrées par les légendes suivantes : Figure 1 : Quantification du marquage anti-GLUT-1 sur des sections de tissu tumoral dans le groupe contrôle (CtrI), et 1h et 5h après injection iv de 1200 mg/kg M101. Le signal positif observé sur les tranches de paraffine a été exprimé en fraction d'aire de cellules tumorales marquées comparée à la surface totale de la tumeur. Les valeurs correspondent à la moyenne de 3 échantillons (moyenne +/- SD). Exemples Matériel : Arenicola marina (M101): Deux lots à la concentration de 100 mg/mL et 178 mg/mL ont été utilisés pour cette étude. M101 est conservé à -80°C et décongelé à 4°C pour les études. La dilution de M101 à la concentration étudiée a été effectuée avec le tampon de stabilisation M101 : 4 mM KCI, 145 mM NaCI, 0,2 mM MgC12, 10 mM Hepes, 0,1 M NaOH ; pH7. Modèle tumoral in vivo, traitement par M101 et analyses immunohistochimiques des tumeurs. : Des cellules HT29 d'adénocarcinome colique humain (AI, HTB-38) ont été cultivées dans du milieu DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 1% de L-glutamine et 1% d'antibiotiques (pénicilline et streptomycine) à 37°C dans une atmosphère saturée en eau, à 5% CO2/ 95% d'air. Les cellules HT29 amplifiées in vitro (3.106 cellules) ont été injectées en sous-cutané au niveau du flanc droit de souris Nude âgées de 6-8 semaines, préalablement irradiées à la dose de 5 Gy. Lorsque le diamètre des tumeurs a atteint - 5 mm, les souris ont été injectées par voie intraveineuse avec M101 à 3 concentrations différentes (60, 600 et 1200 mg/kg). La capacité de M101 à réduire l'hypoxie dans les tumeurs a été suivie au cours du temps, par quantification de l'expression de GLUT-1 par immunohistochimie (anticorps anti-GLUT1 et détection par streptavidine-biotine). Pour ce faire, les souris ont été euthanasiées à différents temps après le traitement par M101 et des tumeurs HT29 prélevées à 5 min, 15 min, puis à 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 24 h. GLUT1 a été évaluée comme marqueur intrinsèque de l'hypoxie dans les tissus (Gbadamosi JK, Hunter AC, Moghimi SM (2002) PEGylation of microspheres generates a heterogeneous population of particles with differential surface characteristics and biological performance. FEBS Lett 532:338-344; Pionetti JM, Pouyet J (1980) Molecular architecture of annelid erythrocruorins. Extracellular hemoglobin of Arenicola marina (Polychaeta). Eur J Biochem 105:131-138.) Résultats Cinétique de l'oxygénation du tissu tumoral. La capacité d'oxygénation de M101 a été déterminée in vivo par évaluation de la réduction du niveau d'hypoxie des tumeurs sous-cutanées HT29 par quantification immunohistologique du marqueur GLUT-1 (tableau 1 ci-dessous). Tableau 1 Dose injectée (mg/kg) 60 600 1200 Contrôle +++ +++ +++ 5 min +++ ++/- +1- 15 min +++ ++/- +/- 1 h +++ +/- + 2h +++ + + 3h +++ +/- + 4h +++ +/- + 5 h +++ +/- +/- 6 h ++/- + + 24 h +++ +/- +1- Le niveau d'hypoxie tissulaire est évalué par quantification du marquage Glut-1 au cours du temps après injection intraveineuse de M101. Le niveau d'hypoxie tissulaire est déterminé selon l'échelle suivante : "+++", marquage Glut-1 très intense, très forte hypoxie tissulaire "++/-", marquage Glut-1 intense, hypoxie tissulaire forte "+", "+/-", marquage Glut-1 intermédiaire, hypoxie tissulaire réduite "+/-", marquage Glut-1 faible, hypoxie tissulaire faible Après numérisation des lames histologiques, un logiciel dédié a permis de mesurer le niveau d'hypoxie pour chaque condition. L'examen d'échantillons de tissus tumoraux après traitement (injection de M101 à 600 mg/kg et 1200 mg/kg) a montré que les zones d'hypoxie ont été réduites comparées aux contrôles, et sont remplacées par un tissu fibreux qui tend à se dissocier et infiltrer la tumeur. L'administration iv de M101 à la dose de 1200 mg/kg réduit le niveau de l'hypoxie tumorale de 20% en moyenne au bout dl heure (atteignant jusqu'à 40%) et de 23% après 5 heures (voir Figure 1). Ces données suggèrent que M101 est capable de diffuser dans le tissu tumoral et de réduire l'intensité de la coloration de GLUT-1, mettant ainsi en évidence son effet sur l'oxygénation tumorale. REVENDICATIONS1. Molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour son utilisation pour traiter les cancers. 2. Molécule selon la revendication 1, pour diminuer l'hypoxie des cellules cancéreuses. 3. Produit consistant en un agent anti-cancéreux et une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, comme préparation combinée pour l'utilisation simultanée, séparée ou séquencée, dans le traitement d'un cancer. 4. Molécule selon la revendication 1 ou 2 ou produit selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d'Annélides Polychètes. 5. Molécule selon l'une des revendications 1 à 3 ou produit selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille des Lumbricidae, les hémoglobines extracellulaires de la famille des Arenicolidae et les hémoglobines extracellulaires de la famille des Nereididae. 6. Molécule selon l'une des revendications 1 à 5 ou produit selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi l'hémoglobine extracellulaire de Lumbricus terrestris, l'hémoglobine extracellulaire d' Arenicola sp et l'hémoglobine extracellulaire de Nereis sp. 7. Molécule selon l'une des revendications 1 à 6 ou produit selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisée en ce que l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina et l'hémoglobine extracellulaire de Nereis virens. 8. Molécule selon l'une des revendications 1 à 7 ou produit selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisée en ce que les cancers sont des tumeurs solides. 9. Molécule selon l'une des revendications 1 à 8 ou produit selon l'une des revendications 3 à 8, 35 caractérisée en ce que les cancers sont choisis parmi les carcinomes, les sarcomes, les mélanomes, les cancers du sein, du côlon, de l'ovaire, de la prostate, de l'utérus, du foie, du poumon et de la thyroïde. 20 25 30 10. Molécule selon l'une des revendications 1 à 9 ou produit selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisée en ce que l'hémoglobine est présente dans une composition comprenant une solution tampon, de préférence une solution aqueuse comprenant des sels, et conférant à la composition un pH compris entre 6.5 et 7.6.