Brevet FR3007770A1 — publié le 20150102

Méthode de détection in vitro de souches de Legionella pneumophila résistantes aux antibiotiques La présente invention concerne une méthode de détection in vitro de souches de Legionella pneumophila résistantes aux antibiotiques, notamment aux fluoroquinolones. L'invention concerne également des sondes nucléotidiques et un kit de réactifs permettant la détection de souches bactériennes Legionella pneumophila résistantes aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone. L'invention concerne enfin une technique de PCR en temps réel pour la mise en oeuvre de la susdite méthode de détection in vitro de souches de Legionella pneumophila résistantes aux antibiotiques. Legionella pneumophila, bactérie à Gram négatif, est l'agent étiologique principal de la légionellose, pneumonie potentiellement grave chez l'Homme. Les fluoroquinolones et les macrolides sont les antibiotiques de première ligne dans le traitement de la légionellose. Toutefois, les échecs thérapeutiques sont fréquents et la mortalité demeure élevée, en moyenne 10 à 15%, et plus de 30% chez les patients immunodéprimés. A ce jour, ces échecs thérapeutiques n'ont jamais été associés à des résistances acquises aux antibiotiques chez L. pneumophila. En effet, de nombreuses études réalisées in vitro n'ont pas permis de montrer de résistance acquise aux fluoroquinolones ou aux macrolides chez les souches naturelles de L. pneumophila isolées chez l'Homme ou isolées de l'environnement (Baltch AL et al., Antimicob. Agents Chemother., 1998, 42(12) :3153-6; Baltch AL et al., Antimicob. Agents Chemother., 1995, 39(8) :1661-6; Garcia MT et al., Antimicob. Agents Chemother., 2000; 44(8) : 2176-8; Higa F. et al., J. Antimicrob. Chemother. 2005 ; 56(6) :1053-7 ; Jonas D. et al., I Antimicrob. Chemother., 2001 ; 47(2) :147-52 ; Onody C. et al., I Antimicrob. Chemother., 1997 ; 39(6) :815-6). Plusieurs auteurs considèrent que l'acquisition de résistance aux antibiotiques, en particulier aux fluoroquinolones, chez L. pneumophila est un phénomène inexistant (Roig J. et Rello J., I Antimicrob. Chemother., 2003 ;51(5) :1119-29 et Fields BS. et al., Clin. Microbiol. Rev. 2002 ; 15(3) : 506-26). Les macrolides et les fluoroquinolones sont donc considérés comme des antibiotiques fiables dans le traitement de la légionellose (Roig J. et Rello J., I Antimicrob. Chemother., 2003 ;51(5) :1119-29 et Fields BS. et al., Clin. Microbiol. Rev. 2002 ; 15(3) : 506-26). Seule la rifampicine est déconseillée en monothérapie du fait du risque très élevé de sélectionner des mutants résistants chez la plupart des bactéries. Les fluoroquinolones, antibiotiques à large spectre, font partie de la grande famille des quinolones, antibiotiques de synthèse. Les fluoroquinolones sont des quinolones dites de seconde génération, dans lesquelles, le fluor a été ajouté pour augmenter la pénétration des molécules de quinolones dans les cellules (jusqu'à 200 fois plus). Les quinolones et fluoroquinolones ont pour cibles les topoisomérases bactériennes de type II : l'ADN gyrase constituée des protéines GyrA et GyrB, et la topoisomérase IV constituée des protéines parC et parE. Certaines mutations affectant les gènes codant ces topoisomérases de type II sont connues pour induire une résistance aux quinolones et fluoroquinolones chez les bactéries. Chez les espèces à Gram négatif, notamment chez Escherichia coli, ces mutations de résistance aux fluoroquinolones affectent principalement le gène gyrA codant la protéine GyrA de l'ADN gyrase. Les substitutions d'acides aminés qui en résultent sont situées dans la région QRDR (Quinolone Resistance Determining Region) de GyrA, comprenant les acides aminés en position 67 à 106 [Soussy C.J. Quinolones and gram-negative bacteria. In Antibiogram. Courvalin P, Leclercq R, and Rice L.B. Eds. ESKA Publishing, ASM Press, 2010, p261-274]. Le niveau de sensibilité aux fluoroquinolones varie chez une même bactérie en fonction de ou des acides aminés situés au niveau de ces positions. Toutefois, les mutations responsables de résistance aux fluoroquinolones les plus fréquentes sont celles conduisant à une substitution au niveau des acides aminés en positions 83, 87 ou plus rarement 84 de la protéine GyrA (selon la numération adoptée chez Escherichia coli), constituant la sous-unité A de l'ADN gyrase. Les mutations gyrA83 et gyrA87 sont fréquemment observées in vivo [Jacoby GA. Mechanisms of resistance to quinolones. Clin Infect Dis. 2005;41 Suppl 2:S120-6], et ont été reproduites in vitro [Barnard FM, Maxwell A. Interaction between DNA gyrase and quinolones: effects of alanine mutations at GyrA subunit residues Ser(83) and Asp(87). Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45(7):1994-2000]. Ces positions sont identiques sur le gène gyrA de L. pneumophila souche Paris (NC 006368.1). Les inventeurs ont montré précédemment [Almahmoud I, Kay E, Schneider D, Maurin M. Mutational paths towards increased fluoroquinolone resistance in Legionella pneumophila. J Antimicrob Chemother. 2009;64(2):284-93] par sélection in vitro de mutants résistants aux fluoroquinolones, que les positions clés pour la résistance aux fluoroquinolones chez L. pneumophila souche Paris correspondent également aux acides aminés 83 et 87 de la protéine GyrA. La souche Paris de L. pneumophila (CIP 107629T) est l'une des souches de référence connue pour être sensibles aux fluoroquinolones [Roch N, Maurin M. Antibiotic susceptibilities of Legionella pneumophila strain Paris in THP-1 cells as determined by real-time PCR assay.J Antimicrob Chemother. 2005;55(6):866-71]. D'autres souches sensibles aux fluoroquinolones sont décrites, telles que L. pneumophila Philadelphia (ATCC 33152), L. pneumophila Lens (CIP 108286) et L. pneumophila Lorraine (CIP 108729). Par ailleurs, les inventeurs ont déja décrit des souches mutantes résistantes aux fluoroquinolones préalablement sélectionnés in vitro et présentant une ou plusieurs des mutations gyrA83 et gyrA87 [Almahmoud I, Kay E, Schneider D, Maurin M. Mutational paths towards increased fluoroquinolone resistance in Legionella pneumophila. J Antimicrob Chemother. 2009;64(2):284-93]. Il s'agit de L. pneumophila 1 LPPI1 (CIP107629T, à savoir la souche Paris mutée en position 83 (T83I) du gène gyrA), L. pneumophila 1 LPPI4 (CIP107629T, à savoir la souche Paris mutée en position 83 (T83I) et en position 87 (D87N) du gène gyrA) et la souche L. pneumophila 1 LPPI5 (CIP107629T, à savoir la souche Paris mutée en position 83 (T83I) et en position 87 (D87H) du gène gyrA). Cependant, à ce jour, il est admis par la communauté scientifique que L. pneumophila ne peut pas acquérir in vivo, de résistance aux antibiotiques, en particulier aux fluoroquinolones utilisées en pratique clinique. Plusieurs facteurs sont habituellement évoqués pour expliquer ce constat chez L. pneumophila (Fields BS. et al., Clin Microbiol Rev. 2002;15(3):506-26): 1) Contrairement à E. coli, L. pneumophila se multiplie essentiellement en milieu intracellulaire dans les protozoaires libres (amibes) de l'environnement aquatique ou dans les macrophages alvéolaires chez les patients infectés ; cette niche spécifique de multiplication ne serait pas propice aux échanges de gènes de résistance aux antibiotiques comme cela a été décrit chez de nombreuses autres bactéries (entérobactéries par exemple) ; 2) Contrairement à certaines souches de E. coh, et notamment les E. coli entérohémorragiques, qui possèdent un réservoir animal chez les ruminants, il n'existe pas de réservoir animal connu pour L. pneumophila. Il n'y aurait donc pas de pression de sélection par les antibiotiques utilisés en pratique vétérinaire ou en agroalimentaire ; 5- 3) Contrairement à certaines souches de E. coli pour lesquelles des cas de transmission interhumaine, notamment par transmission oro-fécale, ont été rapportés, la légionellose n'est pas une maladie de transmission interhumaine, ce qui limiterait encore les chances de transmission d'éventuels mutants résistants aux antibiotiques. La sensibilité des bactéries aux antibiotiques peut être évaluée par des méthodes 10 phénotypiques, comme la réalisation d'un antibiogramme et la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) des antibiotiques. Ces méthodes ne sont pas réalisées en routine pour des bactéries à croissance fastidieuse comme L. pneumophila, du fait de l'impossibilité d'isoler la souche bactérienne en cause chez la plupart des patients infectés. 15 Des méthodes moléculaires basées sur la technique de PCR et de PCR en temps réel ont été développées ces dernières années afin de détecter les mutations de résistance aux antibiotiques à partir de souches isolées ou directement dans des prélèvements (cliniques ou d'environnements divers) contenant les souches mutantes. L'ensemble des données disponibles à ce jour semblent indiquer l'inexistence in vivo de 20 souches de L. pneumophila résistantes aux antibiotiques chez des patients atteints de légionellose. Contrairement aux hypothèses formulées par la communauté scientifique, les Inventeurs ont mis en évidence que l'acquisition d'une résistance aux fluoroquinolones chez L. pneumophila est possible in vivo, chez des patients infectés par ce pathogène. L'un des aspects de l'invention est une méthode de détection de souches de L. pneumophila résistantes aux antibiotiques. L'un des autres aspects de l'invention est la mise au point de séquences nucléotidiques d'amorces et de sondes (sondes en tandem) permettant d'amplifier et de détecter spécifiquement les mutations impliquées dans la résistance aux antibiotiques chez l'espèce L. pneumophila. L'un des autres aspects de l'invention est une technique de PCR en temps réel permettant de déterminer des mutations spécifiques responsables de la résistance. L'un des autres aspects de l'invention est un kit de détection de la résistance des souches 10 L. pneumophila aux fluoroquinolones permettant d'éviter les échecs thérapeutiques et la mortalité élevée chez les patients atteints de légionellose. La présente invention repose sur une méthode in vitro permettant la mise en évidence d'au moins une souche bactérienne de Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone, dans un échantillon biologique, par la 15 détection : - d'une mutation sur l'une au moins des positions 83, 84, 87 ou équivalentes par rapport à la SEQ ID NO : 1 chez une protéine GyrA de L. pneumophila ayant au moins 90 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1, ladite mutation résultant en une protéine GyrA mutée, ou 20 - d'un acide nucléique codant la dite protéine GyrA mutée, la détection de ladite mutation ou de l'acide nucléique codant ladite protéine GyrA mutée indiquant la présence d'au moins une souche bactérienne Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, dans l'échantillon. La SEQ ID NO: 1 représente la séquence de la protéine sauvage GyrA de L. Pneumophila (Protéine GyrA de L. pneumophila souche Paris, numéro d'accession : YP 123696.1), codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 13. On entend par échantillon biologique, tout prélèvement de tissus, de cellules, d'organes, de fluides, de sécrétions ou de sang, issus du corps humain ou animal, et leurs dérivés. Au sens de la présente demande, la résistance aux antibiotiques est définie comme la capacité d'un microorganisme de résister aux effets des antibiotiques et ce in vitro et in vivo. Cette résistance est habituellement définie par la mesure de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d'un antibiotique vis-à-vis d'une bactérie donnée, selon une méthode validée par un organisme de référence, tel que le Clinical and Laboratorty standard Institue (CLSI) [CLSI. M07-A9: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Ninth Edition. Vol. 32 N° 2]. Une souche est dite résistante à un antibiotique si la CMI de cet antibiotique vis-à-vis de la souche considérée est supérieure à une valeur critique définie par ce même organisme de référence. Au sens de la présente demande, le terme « position équivalente » signifie un nucléotide du gène gyrA ou un acide aminé de la protéine GyrA de même nature et fonction que celui décrit chez E. coli pour une position donnée, bien que la numérotation de cette position puisse être différente dans l'espèce considérée par rapport à E. coli du fait d'un nombre différent de nucléotides (gyrA) ou d'acides aminés (GyrA) entre les deux espèces. On entend également par « identité », le nombre de nucléotides identiques entre deux séquences de même longueur, déterminé pour chaque position dans les séquences. Dans les souches sauvages de L. pneumophila, la position 83 de la protéine GyrA est occupée par une thréonine (T), la position 84 est occupée par une alanine (A) et la position 87 est occupée par un acide aspartique (D). Une souche bactérienne de L. pneumophila selon l'invention, est dite mutée dès lors que la position 83 de la protéine GyrA n'est plus occupée par une thréonine (T), et/ou dès lors que la position 84 n'est plus occupée par une alanine (A), et/ou dès lors que la position 87 n'est plus occupée par un acide aspartique (D). Une mode particulier de réalisation de l'invention concerne une méthode in vitro permettant la mise en évidence d'au moins une souche bactérienne de Legionella 10 pneumophila résistante aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone, dans un échantillon biologique, méthode dans laquelle la protéine GyrA mutée est telle que: - l'acide aminé en position 83 est différent de T et les acides aminés en positions 84 et 87 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 84 est différent de A, et les acides aminés en positions 83 15 et 87 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 87 est différent de D, et les acides aminés en positions 83 et 84 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé. L'expression « les acides aminés en positions 84 et 87 (ou 83 et 87) ou (83 et 84) peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé » signifie que lesdits acides aminés peuvent 20 être aussi bien l'acide aminé présent dans une souche sauvage que tout autre acide aminé. Dans ce dernier cas, l'acide aminé considéré constitue donc une mutation. Une souche bactérienne de L. pneumophila selon l'invention présentant une protéine GyrA mutée, peut donc contenir une seule mutation, une double mutation ou une triple mutation. Les souches comprenant une seule mutation sont donc mutées en position 83 ou en position 84 ou en position 87. Les souches comprenant une double mutation, sont donc mutées soit en positions 83 et 84, soit en positions 84 et 87, soit en position 83 et 87. Les souches comprenant une triple mutation, sont donc mutées conjointement sur les trois positions 83 ; 84 et 87. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la méthode in vitro permettant la mise en évidence d'au moins une souche bactérienne de Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone, s'applique lorsque la protéine GyrA mutée est telle que : - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V et les acides aminés en positions 84 et 87 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 84 est : P ou V et les acides aminés en positions 83 et 87 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V et les acides aminés en positions 83 et 84 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V, ledit acide aminé en position 84 est : P ou V, et ledit acide aminé en position 87 est n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V, ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V et ledit acide aminé en position 84 est n'importe quel acide aminé, 20 ou - ledit acide aminé en position 84 est : P et V, ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V et ledit acide aminé en position 83 est n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V, ledit acide aminé en position 84 est : P ou V et ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V. Lorsque l'acide aminé en position 83 est muté, les acides aminés en position 84 et 87 peuvent être les acides aminés de la protéine sauvage, soit respectivement A (alanine) et D (acide aspartique) ou n'importe quel autre acide aminé, c'est-à-dire que les acides aminés en position 84 et 87 peuvent également être mutés. Lorsque l'acide aminé en position 84 est muté, les acides aminés en position 83 et 87 peuvent être les acides aminés de la protéine sauvage, soit respectivement T (thréonine) et D (acide aspartique) ou n'importe quel autre acide aminé, c'est-à-dire que les acides aminés en position 83 et 87 peuvent également être mutés. Lorsque l'acide aminé en position 87 est muté, les acides aminés en position 83 et 84 peuvent être les acides aminés de la protéine sauvage, soit respectivement T (Thréonine) et A (Alanine) ou n'importe quel autre acide aminé, c'est-à-dire que les acides aminés en position 83 et 84 peuvent également être mutés. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite méthode in vitro permettant la mise en évidence d'au moins une souche bactérienne de Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone, s'applique lorsque la protéine GyrA mutée est telle que : - ledit acide aminé en position 83 est : une isoleucine (I), une leucine (L), un tryptophane (W), une alanine (A) ou une valine (V), ledit acide aminé en position 84 est une alanine (A) et ledit acide aminé en position 87 est un acide aspartique (D), ou - ledit acide aminé en position 84 est : une proline (P) ou une valine (V) et ledit acide aminé en position 83 est une thréonine (T) et ledit acide aminé en position 87 est un acide aspartique (D), ou - ledit acide aminé en position 87 est : une asparagine (N), une glycine (G), une tyrosine (Y), une histidine (H) ou une valine (V) et ledit acide aminé en position 83 est une thréonine (T) et ledit acide aminé en position 84 est une alanine (A), ou - ledit acide aminé en position 83 est : une isoleucine (I), une leucine (L), un tryptophane (W), une alanine (A) ou une valine (V), ledit acide aminé en position 84 est : une proline (P) ou une valine (V) et ledit acide aminé en position 87 est un acide aspartique (D), ou - ledit acide aminé en position 83 est : une isoleucine (I), une leucine (L), un tryptophane (W), une alanine (A) ou une valine (V), ledit acide aminé en position 87 est : une asparagine (N), une glycine (G), une tyrosine (Y), une histidine (H) ou une valine (V) et ledit acide aminé en position 84 est une alanine (A), ou - ledit acide aminé en position 84 est : une proline (P) ou une valine (V), ledit acide aminé en position 87 est : une asparagine (N), une glycine (G), une tyrosine (Y), une histidine (H) ou une valine (V) et ledit acide aminé en position 83 est une thréonine (T). Le tableau ci-dessous montre l'ensemble des mutations possibles en acides aminés, sur chacune des trois positions 83, 84 et 87 et les codons correspondants. Acide aminé en position 83 Acide aminé Acide aminé en position 87 en position 84 I ATT P CCT N AAT ATC CCC AAC ATA CCA G GGT L CTT CCG GGC CTC V GTT GGA CTA GTC GGG CTG GTA Y TAT TTG GTG TAC TTA H CAT W TGG CAC A GCT V GTT GCC GTC GCA GTA GCG GTG Acide aminé en position 83 Acide aminé Acide aminé en position 84 en position 87 V GTT GTC GTA GTG La méthode selon l'invention permet la détection d'une protéine GyrA mutée qui comprend la séquence consensus suivante : GDX1X2VYX3T (SEQ ID NO : 2), dans laquelle : Xi, X2 et X3 correspondent respectivement aux acides aminés mutés en positions 83, 84 et 87, et - Xi est différent de T (thréonine), et X2 et X3 sont n'importe quel acide aminé, ou - X2 est différent de A (alanine), et Xi et X3 sont n'importe quel acide aminé, ou - X3 est différent de D (acide aspartique), et Xi et X2 sont n'importe quel acide 10 aminé. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, dans la protéine GyrA mutée, l'acide aminé correspondant à Xi, différent de T peut être une isoleucine (I), une leucine (L), un tryptophane (W), une alanine (A) ou une valine (V), et X2 et X3 15 correspondent à n'importe quel acide aminé, ou - l'acide aminé correspondant à X2 est une proline (P) ou une valine (V), et X1 et X3 correspondent à n'importe quel acide aminé, ou - l'acide aminé correspondant à X3 est une asparagine (N), une glycine (G), une tyrosine (Y), une histidine (H) ou une valine (V), et Xi et X2 correspondent à n'importe quel acide 20 aminé, ou - l'acide aminé correspondant à X1, différent de T, est une isoleucine (I), une leucine (L), un tryptophane (W), une alanine (A) ou une valine (V), X2 est une proline (P) ou une valine (V) et X3 est n'importe quel acide aminé, ou - l'acide aminé correspondant à X1, différent de T, est une isoleucine (I), une leucine (L), 5 un tryptophane (W), une alanine (A) ou une valine (V), X3 est une asparagine (N), une glycine (G), une tyrosine (Y), une histidine (H) ou une valine (V) et X2 est n'importe quel acide aminé, ou - l'acide aminé correspondant à X2 est une proline (P) ou une valine (V), X3 est une asparagine (N), une glycine (G), une tyrosine (Y), une histidine (H) ou une valine (V) et 10 X1 est n'importe quel acide aminé, ou - l'acide aminé correspondant à X1, différent de T, est une isoleucine (I), une leucine (L), un tryptophane (W), une alanine (A) ou une valine (V), X2 est une proline (P) ou une valine (V) et X3 est une asparagine (N), une glycine (G), une tyrosine (Y), une histidine (H) ou une valine (V). 15 Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la méthode de l'invention permet la détection d'une protéine GyrA mutée qui comprend la séquence consensus GDX1X2VYX3T dans laquelle : - X1 est I, L, W, A ou V, X2 est A et X3 est D, ou - X2 est P ou V, X1 est T et X3 est D, ou 20 - X3 est N, G, Y, H ou V, X1 est T et X2 est A, ou - X1 est I, L, W, A ou V, X2 est P ou V et X3 est D, ou - X1 est I, L, W, A ou V, X3 est N, G, Y, H ou V et X2 est A, ou - X2 est P ou V, X3 est N, G, Y, H ou V et X1 est T, ou - X1 est I, L, W, A ou V, X2 est P ou V et X3 est N, G, Y, H ou V. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la méthode permet la détection de la séquence du gène codant ladite protéine GyrA mutée. Cette séquence possède au moins une substitution d'un nucléotide par rapport à la SEQ ID NO : 3 (GGGGATACAGCTGTTTATGACAC), en position équivalente à la position 7, 8, 10, 11, 19, 20 ou 21 par rapport à la SEQ ID NO : 3 , où les nucléotides en positions 7 et 8 correspondent aux deux premiers nucléotides du codon codant l'acide aminé en position 83 de la protéine GyrA de Legionella pneumophila, les nucléotides en positions 10 et 11 correspondent aux deux premiers nucléotides du codon codant l'acide aminé en position 84, et les nucléotides en positions 19, 20 et 21 correspondent aux trois nucléotides du codon codant l'acide aminé en position 87. Selon en autre mode de réalisation de la présente invention, la séquence de l'acide nucléique codant ladite protéine GyrA mutée comprend une séquence choisie parmi : - SEQ ID NO : 4 (GGGGATTCAGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 5 (GGGGATCCAGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 6 (GGGGATGCAGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 7 (GGGGATAAAGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 8 (GGGGATATAGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 9 (GGGGATAGAGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 10 (GGGGATACAACTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 11 (GGGGATACATCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 12 (GGGGATACACCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 14 (GGGGATACAGATGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 15 (GGGGATACAGTTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 16 (GGGGATACAGGTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 17 (GGGGATACAGCTGTTTATAACAC), - SEQ ID NO : 18 (GGGGATACAGCTGTTTATTACAC), - SEQ ID NO : 19 (GGGGATACAGCTGTTTATCACAC), - SEQ ID NO : 20 (GGGGATACAGCTGTTTATGTCAC), - SEQ ID NO : 21 (GGGGATACAGCTGTTTATGGCAC), - SEQ ID NO : 22 (GGGGATACAGCTGTTTATGCCAC), - SEQ ID NO : 23 (GGGGATACAGCTGTTTATGAGAC), - SEQ ID NO : 24 (GGGGATACAGCTGTTTATGAAAC), - SEQ ID NO : 25 (GGGGATTTAGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 26 (GGGGATTTGGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 27 (GGGGATCTTGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 28 (GGGGATCTCGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 29 (GGGGATCTAGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 30 (GGGGATCTGGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 31 (GGGGATTGGGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 32 (GGGGATGCTGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 33 (GGGGATGCCGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 34 (GGGGATGCGGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 35 (GGGGATGTTGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 36 (GGGGATGTCGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 37 (GGGGATGTAGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 38 (GGGGATGTGGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 39 (GGGGATACACCCGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 40 (GGGGATACACCAGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 41 (GGGGATACACCGGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 42 (GGGGATACAGTCGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 43 (GGGGATACAGTAGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 44 (GGGGATACAGTGGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 45 (GGGGATACAGCTGTTTATAATAC), - SEQ ID NO : 46 (GGGGATACAGCTGTTTATGGTAC), - SEQ ID NO : 47 (GGGGATACAGCTGTTTATGGAAC), - SEQ ID NO : 48 (GGGGATACAGCTGTTTATGGGAC), - SEQ ID NO : 49 (GGGGATACAGCTGTTTATTATAC), - SEQ ID NO : 50 (GGGGATACAGCTGTTTATCATAC), - SEQ ID NO : 51 (GGGGATACAGCTGTTTATGTTAC), - SEQ ID NO : 52 (GGGGATACAGCTGTTTATGTAAC), - SEQ ID NO : 53 (GGGGATACAGCTGTTTATGTGAC), - SEQ ID NO : 54 (GGGGATTTCGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 55 (GGGGATATTGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 56 (GGGGATATCGCTGTTTATGACAC), - SEQ ID NO : 61 (GGGGATTTTGCTGTTTATGACAC), Dans le cadre de la présente invention, la détection de la présence de ladite protéine GyrA mutée ou de l'acide nucléique cible codant ladite protéine GyrA mutée est effectuée par une technique choisie parmi : le western blot, le northern blot, le southern blot, la PCR (Polymerase Chain Reaction), la PCR en temps réel, la PCR hybridation, la PCR array, la TMA (Transcription-Mediated Amplification), le NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), la LCR (Ligase Chain Reaction), l'hybridation ADN/ARN, la puce à ADN, le séquençage ADN/ARN, le dot-blot, la technique RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Dans un mode de réalisation avantageux, la détection de la présence dudit acide nucléique codant ladite protéine GyrA mutée est effectuée par PCR en temps réel. La PCR en temps réel utilise le principe de base de la PCR classique (amplification cyclique d'un fragment d'ADN, basée sur une réaction enzymologique) avec pour différence une amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel. A chaque cycle d'amplification, la quantité d'ADN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l'émission est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons produits. Ceci permet d'obtenir une cinétique de la réaction et donc la quantification de l'ADN alors que la PCR classique ne donne que la mesure finale. La détection ou la quantification du signal fluorescent en temps réel peut être faite à l'aide d'agents intercalants ou de sondes. L'agent intercalant le plus utilisé actuellement est le SYBR®Green (Roche, Meylan, France). S'agissant des sondes, il existe 4 technologies différentes, permettant la mesure d'un 10 signal flurorescent : « Taqman » ou hydrolyse de sondes, « HybProbes » (FRET) ou hybridation de 2 sondes, « Molecular Beacons » ou balises moléculaires et « Scorpion » ou amorces scorpion. Dans le cadre de l'invention, la PCR en temps réel est utilisée pour la détection des mutations gyrA83, 84 et/ou 87, en utilisant par exemple, deux sondes en tandem : une 15 sonde dite d'ancrage et une sonde dite de détection. Dans le cadre de la présente invention, le fluorophore situé sur la sonde d'ancrage est par exemple du LCRed-640 (Roche Diagnostic), et le fluorophore situé sur la sonde d'émission est par exemple la fluorescéine. La fixation de ces deux sondes à l'ADN cible entraine d'abord l'excitation du 20 fluorophore situé sur la sonde d'ancrage, puis un phénomène de FRET « fluorescence resonnance energy transfer » se réalise, entre ce fluorophore et la fluorescéine située sur la sonde de détection. La fluorescéine émet alors une fluorescence mesurée en temps réel par l'appareil, et dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'ADN amplifié. Une courbe de fusion, établie en fin d'amplification, permet de déterminer une température de fusion caractéristique de la taille et du contenu en bases de l'amplicon (ADN amplifié). Une mutation affectant ce fragment entraine un décalage vers le bas de la température de fusion. Le fragment testé ici est délimité de la base 241 à la base 263 de gyrA de la souche L. pneumophila Paris [GGGGATACAGCTGTTTATGACAC], soit de l'acide aminé 81 à l'acide aminé 88 de GyrA de ladite souche [GDTAVYDT]. Il inclut donc les positions T83, A84 et D87, qui sont liées à la résistance aux fluoroquinolones chez L. pneumophila. Cette technique montre une modification de la température de fusion en cas d'altération de ce fragment d'ADN, quelle que soit la mutation et sa position. En raison de variations naturelles de L. pneumophila dans la séquence nucléotidique, pouvant entrainer d'autres mutations, les résultats obtenus par la méthode selon l'invention peuvent être confirmés par une technique complémentaire comme par exemple le séquençage de l'ADN amplifié. Il est cependant aisé d'envisager, à partir de l'état de l'art, d'autres techniques permettant de s'affranchir des variations de séquences ADN au niveau de la sonde d'ancrage et/ou de cibler spécifiquement les mutations d'intérêt sans nécessité d'une étape complémentaire. Par exemple, l'utilisation d'une sonde de détection de type sonde à hydrolyse ou « Taqman », « phare » (Beacon en anglais) ou « scorpion » pourrait permettre de cibler la même région de gyrA où se produisent les mutations responsables des substituions en positions 83, 84 et 87, sans utilisation d'une sonde d'ancrage. Des exemples de ce type de technique sont présentés dans la littérature, concernant la détection de la résistance aux fluoroquinolones chez Mycobacterium tuberculosis (Chakravorty S. et al., J Clin Microbiol. 2011;49(3):932-40) ou chez Staphylococcus aureus (Lapierre P. et al., J Clin Microbiol. 2003;41(7):3246-51). Il est également possible de détecter spécifiquement des mutations attendues sur des nucléotides spécifiques par d'autres techniques de façon à éliminer les résultats faussement positifs liées aux mutations non liées à la résistance aux antibiotiques. Ceci peut être obtenu notamment par l'utilisation de sondes multiples, « en tandem » (Page S. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2008; 52(11) : 4155-8 et Glocker E. et al., J. Clin. Microbiol. 2004; 42(5): 2241-6), à hydrolyse ou « Taqman ») (Ben Shabat M. et al., J. Clin. Microbiol., 2010;48(8):2909-15 et Wilson DL et al., J. Clin. Microbiol., 2000; 38(11):3971-8), de type «sondes verrouillées» ou «locked nucleic acid probes» (van Doorn HR. et al., Int.' Tuberc. Lung Dis., 2008;12(7):736-42). La technique de PCRhybridation (Cambau E. et al., PLoS Negl. Trop. Dis. 2012;6(7):1739) ou l'utilisation de micropuces à ADN (Matsuoka M. et al., J. Med. Microbiol. 2008;57:1213-1219) permettent également la détection spécifique de mutations de résistance. Ces différentes techniques permettent de détecter des SNP (single nucleotide polymorphism) au niveau de fragments ADN spécifiques, et permettraient donc de détecter de façon ciblée les mutations responsables de la résistance aux fluoroquinolones chez L. pneumophila. Certaines de ces techniques sont déjà commercialisées comme par exemple le test Xpert TB/RIF ® (Cepheid) qui détecte à l'aide d'une sonde « Phare » la résistance à la rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis. La méthode de détection de la présence de l'acide nucléique cible codant ladite protéine GyrA mutée, selon l'invention comprenant les étapes de : a) mise en contact d'un échantillon biologique susceptible de contenir un acide nucléique cible appartenant à une souche bactérienne de Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, avec un couple d'amorces capables de s'hybrider spécifiquement avec ledit acide nucléique cible, et b) lorsqu'il y a amplification par PCR dudit acide nucléique cible en utilisant le couple d'amorces pour obtenir un produit d'amplification, ledit produit d'amplification 5 comprenant une séquence ayant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, c) détection d'un acide nucléique codant la protéine GyrA mutée, Lorsqu'un acide nucléique codant ladite protéine GyrA mutée est détecté, cela indique la présence d'au moins une souche bactérienne Legionella pneumophila résistante aux 10 antibiotiques, dans l'échantillon. Selon la méthode de la présente invention, le produit d'amplification obtenu à l'étape b) est un amplicon de 259 nucléotides. Cet amplicon de 259 nucléotides correspond à la SEQ ID NO : 57 ou à toute séquence présentant un pourcentage d'identité égal à au moins 90 % avec la séquence SEQ ID NO : 57. 15 On entend par « amplicon », tout fragment d'ADN amplifié par PCR, à l'aide de deux amorces. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape b) de ladite méthode de détection d'un acide nucléique cible codant ladite protéine GyrA mutée, est réalisée en utilisant une amorce ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 58, 20 et/ou une amorce ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 59. On entend par « amorce », un fragment d'ADN dont la taille est généralement comprise de 15 nucléotides à 25 nucléotides, capable de s'hybrider à un brin d'ADN servant de matrice, à une température de fusion donnée, de manière à permettre la duplication de ce brin d'ADN. Les amorces utilisées dans la méthode selon l'invention, sont représentées par les séquences SEQ ID NO : 58 (amorce sens, nommée LpgyrALSFw et correspondant à la séquence d'acide nucléique suivante : CCTGATGTACGTGATGGTTTAA) et SEQ ID NO : 59 (amorce anti-sens, nommée LpgyrALSRv et correspondant à la séquence d'acide nucléique suivante : GCATGGCAGCTGGAGCATCTCC), ou toute autre séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec lesdites séquences SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 59. De plus, l'étape b) de ladite méthode de détection d'un acide nucléique cible codant ladite protéine GyrA mutée, peut être réalisée à l'aide d'au moins une sonde nucléotidique susceptible de s'hybrider avec l'acide nucléique cible. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode de détection, nécessite l'utilisation de sondes. Dans le système de PCR en temps réel développée par les inventeurs, une sonde dite de détection et une sonde dite d'ancrage sont nécessaires. La sonde de détection pouvant être utilisée dans le cadre de la présente invention, est une séquence d'acide nucléique représentée par la séquence SEQ ID NO : 3 ou par toute autre séquence nucléotidique présentant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 (nommée LpgyrALSP1). Cette sonde de détection est liée de manière covalente à au moins une molécule marqueur permettant sa détection par un dispositif adapté. La molécule marqueur est choisie parmi un fluorochrome ou un isotope radioactif. Un fluorochrome est une substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation. Un fluorochrome utile dans la cadre de l'invention, peut être choisi parmi : fluorescéine, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, Red613, Red640, Rhodamine, Texas red, TRITC, Alexa Fluor, cette liste n'étant pas exhaustive. De préférence, le fluorochrome liée à la sonde de détection dans le cadre de l'invention est de la fluorescéine fixée en 3' de ladite sonde. La méthode de détection selon l'invention peut aussi comprendre une sonde d'ancrage, qui couplée à la sonde de détection permet la détection du produit d'amplification obtenu à l'étape b). La sonde d'ancrage selon l'invention est une séquence d'acide nucléique représentée par la séquence SEQ ID NO : 60 (nommée LpgyrALSP3) ou par toute autre séquence nucléotidique présentant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 60. Cette sonde d'ancrage est liée de manière covalente à au moins une molécule marqueur permettant sa détection par un dispositif adapté. Dans le cadre de la présente invention, l'extrémité 5' de la sonde d'ancrage est liée à un fluorochrome accepteur. Le fluorochrome accepteur peut être choisi parmi fluorescéine, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, Red613, Red640, Rhodamine, Texas red, TRITC, Alexa Fluor, cette liste n' étant pas exhaustive. Plus particulièrement, le fluorochrome accepteur peut être le produit LightCycler® Red 640 (Roche Diagnostic). La sonde d'ancrage présente en son extrémité 3', une phosphorylation notée « P », empêchant son élongation par l'ADN polymérase. . La sonde d'ancrage se présente donc sous la forme 5'-LCRed640-TTGTTCGTATGGCTCAGCCTTTTTC-P-3' Il faut que la sonde de détection soit à proximité de la sonde d'ancrage pour que la transmission du signal de fluorescence puisse avoir lieu. En effet, lorsque les deux sondes sont séparées, le fluorochrome donneur situé sur la sonde de détection n'émet qu'un bruit de fond de fluorescence alors que lorsqu'elles sont hybridées à moins de 10 nucléotides de distances (= distance en nucléotides entre la sonde de détection et la sonde d'ancrage), la proximité des 2 fluorochromes permet le transfert de l'énergie du fluorochrome donneur vers le fluorochrome accepteur provoquant l'émission fluorescente de ce dernier (FRET : Fluorescent Resonnance Energy Transfer) Selon un mode particulier de l'invention, une courbe de fusion du produit d'amplification est générée après l'étape c). La présente invention vise également à protéger un couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment du gène gyrA de Legionella pneumophila, comprenant une amorce ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 58 (LpgyrALSFw), et une amorce ayant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 59 (LpgyrALSRv). Ces couples d'amorces permettent d'amplifier un fragment comprenant 259 nucléotides. La méthode selon l'invention et tout particulièrement l'étape d'amplification d'un fragment du gène gyrA peut être réalisée avec une amorce sens correspondante à la séquence SEQ ID NO :58 et une amorce anti-sens choisie parmi toutes les séquences d'acides nucléiques présentant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 59 ou avec une amorce sens correspondante à une des séquences choisies parmi le groupe comprenant toutes les séquences d'acides nucléiques présentant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 58 et une amorce anti-sens correspondante à la séquence SEQ ID NO : 59 ou encore avec une amorce sens correspondante à une des séquences choisies parmi le groupe comprenant toutes les séquences d'acides nucléiques présentant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 58 et une amorce anti-sens correspondante à une des séquences choisies parmi le groupe comprenant toutes les séquences d'acides nucléiques présentant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 59. La présente invention vise également à protéger un kit de réactifs permettant la détection 25 de souches bactériennes Legionella pneumophila résistantes aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone, comprenant au moins un couple d'amorces permettant l'amplification du fragment d'intérêt, à savoir l'amplicon de 259 nucléotides correspondant à la séquence SEQ ID NO :59 et au moins une sonde choisie parmi celles représentées par les séquences SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 60, que sont les sondes de détection et d'ancrage. La méthode de détection selon l'invention pourra être utilisée pour le diagnostic d'une infection par une bactérie Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone, chez un patient. Pour cela, à partir d'un prélèvement d'un patient susceptible de présenter des souches de L. pneumophila résistantes aux antibiotiques, la méthode de détection du gène gyrA muté par PCR en temps réel est mise en oeuvre. Un tel prélèvement peut notamment être un prélèvement des sécrétions des voies respiratoires, mais aussi du sang, du sérum, du plasma, des urines, des biopsies tissulaires (exemples : biopsies pulmonaires ou pleurales), différents liquides de ponction (exemples : liquide céphalorachidien, liquide articulaire, liquide pleural) et diverses suppurations (exemple : abcès pulmonaire) La méthode de détection selon l'invention pourra être utilisée pour la détermination ou la prédiction de l'efficacité d'un traitement aux fluoroquinolones chez un patient infecté par la bactérie Legionella pneumophila. En effet, devant tout échec thérapeutique chez des patients atteints de légionellose, la méthode de détection selon l'invention pourra être mise en oeuvre pour s'assurer que le patient ne présente pas de résistance aux antibiotiques de type fluoroquinolones, de façon à modifier le schéma thérapeutique s'il y a lieu. LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : La figure 1 représente les courbes de fusion obtenues pour une souche de L. pneumophila Paris sensible aux fluoroquinolones (température de fusion de 59 °C), pour un mutant gyrA83 (température de fusion de 56,6 °C) et pour un double mutant rA83+ rA87 (température de fusion de 50 °C). Figure 2 : La figure 2 représente les amplifications par PCR en temps réel du gène gyrA chez différentes espèces de Legionella. L'inoculum bactérien testé pour chaque espèce est préalablement standardisé. Figure 3 : La figure 3 représente les pics de fusion obtenus pour quatre souches de L. pneumophila et trois autres espèces de Legionella. Figure 4 : La figure 4 représente les pics de fusion obtenus pour 2 souches de L. pneumophila Paris et 21 souches appartenant à d'autres espèces de Legionella. Figure 5 : La figure 5 représente les courbes de fusion en RT-PCR LP-gyrA montrant une température de fusion (Tm) de 59°C pour L. pneumophila Paris, et pour la plupart des prélèvements respiratoires des patients atteints de légionellose. Les prélèvements 1-2 et 2-2 montrent au contraire une diminution d'environ 4-5°C du Tm suggérant une mutation du gène gyrA. Figure 6 : La figure 6 représente les résultats de séquençage du gène gyrA pour la souche L. pneumophila Paris sensible aux fluoroquinolones, et pour les prélèvements respiratoires effectués chez les patients 1 et 2, soit avant traitement par les fluoroquinolones (1-1 et 21) soit à différents temps lors du traitement par ces antibiotiques (1-2, 2-2, 2-3, et 2-4). EXEMPLES Exemple 1 : Amplification du fragment GGGGATACAGCTGTTTATGACAC du gène gyrA (ID: 3119437) de la souche PARIS de L. pneumophila (Genbank NC 006368.1, SEQ ID NO: 13), fragment codant les acides aminés liés à la résistance aux fluoroquinolones. Les amorces décrites ci-dessous permettent d'amplifier et de détecter un fragment du gène gyrA de L. pneumophila (gène gyrA : SEQ ID NO : 1). Amorce sens « LpgyrALSFw »: 5'-CCTGATGTACGTGATGGTTTAA-3' (SEQ ID NO : 58) Amorce anti-sens « LpgyrALSRv » : 5'-GCATGGCAGCTGGAGCATCTCC-3' (SEQ ID NO : 59) Sonde de détection « LpgyrALSP1 » : 5' -GGGGATACAGCTGTTTATGACAC-Fluo-3' (SEQ ID NO : 3) Sonde d'ancrage « LpgyrALSP3 » 5' -LCRed640- TTGTTCGTATGGCTCAGCCTTTTTC-P-3' (SEQ ID NO : 60) La méthode de détection est basée sur une PCR en temps réel, utilisant la technologie dite de FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfer). Dans ce système, on utilise 2 sondes dont l'une est porteuse en 3' d'un fluorochrome émetteur et l'autre en 5' d'un fluorochrome accepteur. Les sondes sont choisies de façon à s'hybrider à leurs séquences cibles en étant espacées l'une de l'autre de 1 à 5 nucléotides. Lorsque les deux sondes sont séparées, le fluorochrome donneur n'émet qu'un bruit de fond de fluorescence alors que lorsqu'elles sont hybridées à moins de 10 nucléotides de distance, la proximité des deux fluorochromes permet le transfert de l'énergie du fluorochrome donneur vers le fluorochrome accepteur provoquant l'émission fluorescente de ce dernier (FRET : Fluorescent Resonnance Energy Transfer). On mesure alors l'acquisition de la fluorescence, proportionnelle à la quantité d'ADN synthétisée, au moment de l'hybridation.25 La sonde d'ancrage contient le fluorophore LCRed-640 (Sigma Aldrich, L'Isle d'Abeau Chesnes 38297 Saint-Quentin Fallavier, France) en 5'. La sonde de détection contient de la fluorescéine en 3'. L'émission de fluorescence est détectée en temps réel par l'appareil d'amplification. Une courbe de fusion est établie en fin d'amplification et permet de déterminer une température de fusion caractéristique de la taille et du contenu en bases de l'amplicon. Une mutation affectant ce fragment entraine un décalage vers le bas de la température de fusion. Le fragment testé ici va du nucléotide situé en position 241 au nucléotide situé en position 263 de gyrA de L. pneumophila Paris [GGGGATACAGCTGTTTATGACAC], soit de l'acide aminé 81 à l'acide aminé 88 de GyrA de L. pneumophila Paris [GDTAVYDT]. Il inclut donc les positions T83, A84 et D87, qui sont liées à la résistance aux fluoroquinolones chez L. pneumophila. Les amorces utilisées permettent d'obtenir un amplicon de 259 pb (SEQ ID N°57). L'amplification est réalisée dans les conditions ci-dessous, sur un appareil de type Light- Cycler (Roche Diagnostics, Meylan, France). Amorce sens Amorce antisens Sonde de détection Sonde (l'ancrage NIgc12 Fastart UDG Eau qualité PCR Extrait ADN Volume final Concentration Volume pour une initiale PCR 5pNloUtiL 2411 5pNiloUtit 2411 )I^lol/tiL 2pMol/uL 2.4tiL 2tiL 0.5ttL 0. l ut_ 5tiL 20 uL Concentration finale 0.5pNloUtiL 0.5pMol/uL 0.2pNloUtiL 0.4pNli.)1/pL Programme Température Durée Nombre de cycles Mode d'acquisition UDG ambiante 5min 1 Aucun Amplification Dénaturation initiale 95°C 10min 1 Dénaturation 95°C 1()sec Aucun Hybridation 55°C. lOsec 45 Single Elongation 72°C 15sec Courbe de fusion Dénaturation 95°C. Osec 1 Aucun Hybridation 65°C 30sec 1 Aucun Nielting 95°C Osec 1 Continu 0 1aCisec Refroidissement 40°C 30sec Les résultats sont donnés à la figure 1. Le simple mutant gyr83 a une température de fusion de 56.6°C, le double mutant gyr83+gyr87 a une température de fusion de 50°C, alors que la souche Paris non mutée a une température de fusion de 59°C. Exemple 2 : Evaluation de la sensibilité et de la spécificité du test RT-PCT LP-gyrA La sensibilité et la spécificité du test RT-PCR LP-gyrA a été évaluée sur un grand nombre de souches. - Sur une collection de souches de L. pneumophila sensibles aux fluoroquinolones ; Espèce Souche Legionella pneumophila Paris (CIP 107629T) Legionella pneumophila Philadelphia (ATCC 33152) Legionella pneumophila Lens (CIP 108286) Legionella pneumophila Lorraine (CIP 108729) Sur les mutants résistants aux fluoroquinolones préalablement sélectionnés in vitro et présentant une ou plusieurs des mutations gyrA83 et gyrA87 ; Espèce Souche Legionella pneumophila 1 LPPI1 CIP107629T + mutation gyrA83 (T831) Legionella pneumophila 1 LPPI4 CIP107629T + mutations gyrA83 (T831) et gyrA87 (D87N) Legionella pneumophila 1 LPPI5 CIP107629T + mutations gyrA83 (T831) et gyrA87* (D87H) - Sur une collection de souches appartenant à différentes espèces de Legionella autre que L. pneumophila ; Espèce Souche Legionella parisiensis ATCC 35299 Legionella parisiensis ATCC 700174 Legionella longbeachae ATCC 33462 Legionella longbeachae ATCC 33485 Legionella bozemanii ATCC 33217 Legionella bozemanii ATCC 35545 Legionella jordanis ATCC 700762 Legionella jordanis ATCC 33624 Legionella tucsonensis ATCC 4918 Legionella gormanii ATCC 33297 Legionella maceachemii ATCC 35300 Legionella anisa ATCC 35290 Legionella lansingensis ATCC 49751 Legionella dumoffi ATCC 35280 Legionella oakridgensis ATCC 33761 Legionella oakridgensis ATCC 700515 Legionella wadsworthii ATCC 33877 Espèce Souche Legionella mackelia ATCC El 3525 Legionella birmingham ATCC 700709 Legionella hackeliae ATCC 35999 Legionella birmingham ATCC 73702 Legionella micdadei ATCC 33218 Legionella donaldsonii ATCC LC878 Legionella feeleii sgl ATCC 35072 Legionella feeleii sg2 ATCC 35849 Legionella feeleii ATCC 700514 - Sur une collection de souches cliniques bactériennes n'appartenant pas au genre Legionella, et potentiellement responsables d'infections des voies respiratoires chez l'Homme Espèce Souche Staphylococcus aureus ATCC 12598 Staphylococcus aureus ATCC 29737 Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 Enterococcus faecium CIP 54.32 Corynebacterium jeikeium CIP 82.51 Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Streptococcus mitis ATCC 49456 Streptococcus pneumoniae ATCC 6303 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Bacillus subtilis ATCC 6633 Escherichia cou ATCC 25922 Escherichia cou ATCC 35218 Serratia marcescens CIP 103551 Espèce Souche Citrobacter koseri ATCC 27156 Kiebsiella pneumoniae ATCC 23357 Pseudomonas aeruginosa CIP 5933 Acinetobacter baumanii ATCC 19606 La figure 2 montre que le test détecte de façon sensible et spécifique le fragment ciblé du gène gyrA de L. pneumophila. Les amorces définies amplifient préférentiellement le fragment gyrA de L. pneumophila. Toutefois, pour un nombre de cycles d'amplification supérieur ou égal à 35, un signal d'amplification peut être observé pour d'autres espèces de ce genre. Néanmoins, la figure 3 montre que le test permet, sur la base des courbes de fusion, de faire la distinction entre les souches de L. pneumophila (souches Paris, Philadelphia, Lorraine et Lens) et les souches de trois autres espèces de Legionella. Par ailleurs, les températures de fusion des souches de Legionella d'appartenant pas à l'espèce pneumophila sont supérieures à celles obtenues pour L. pneumophila. De la même manière, la figure 4 montre que 21 souches de Legionella appartenant à d'autres espèces que L. pneumophila ont des températures de fusion supérieures à celle de L. pneumophila souche Paris, à l'exception des souches de l'espèce L. longbeachea qui présentent un pic de fusion autour de 50°C. Néanmoins, elles ne peuvent pas être confondues avec les courbes de fusion des mutants gyrA du fait de leur profil en triple pics de fusion (50°C, 60°C, 65°C). La sensibilité analytique du test RT-PCR-LPgyrA a été testée sur une série de dilutions de raison 10, d'ADN de L. pneumophila Paris, à partir d'un inoculum bactérien de 8,6 *107 bactéries. Le tableau 1 montre les résultats de cette analyse. Une suspension contenant 9 copies de génomes/test permet une amplification reproductible. Inc Pos Name Type CP Conc Std Z 1 Blanc gyrA Contrôle négatif Z 2 ADN gyrA soL:che Pans Ssandarc 11.27 ':.:,.60E7 ',..--,.2, 0E7 E 3 ADN g .,r ' D-1 S:ar cbrr.-. 15.25 1.07E7 9.30E6 E ADN gyrA 10-2 'T"D'sanciarc 20.04 8.72E5 9.30E5 E 5 ADN g q-4,. 1D-3 S:ardarc: 24.08 9.53E4 9.30E4 E 6 ADN gyra 10-4 S:ardarc 27.82 1.02E4 9.30E3 E 7 ADN (:,,rA 10-5 '7."r:ar riarc 31.49 9.74E2 9.30E2 E 8 ADN gyrA 0-6 S:arsiarc 34.87 9.67E1 9.30E1 l ti ADN g yrrA 10-7 '-_-..araarc 38.19 8.73E0 9.30E0 Z 10 ADN ,:y1-A. 10-8 S:ardarc 9.30E-1 11 ADN gyr, 0-9 S:ardarc 9.30E-2 Tableau 1 : Amplification du gène gyrA de L. pneumophila Paris à partir d'une série de dilutions de raison 10 d'un inoculum bactérien de 8,6 107 bactéries (par test). Exemple 3: Evaluation de la pertinence du test RT-PCT LP-gyrA sur des prélèvements des voies respiratoires de patients atteints de Légionellose due à L. pneumophila Sur la base de l'analyse des expectorations de 5 patients atteints de légionellose, la présence de L. pneumophila mutées gyrA83 résistantes a pu être détectée. La figure 5 montre les courbes de fusion obtenues sur la base de prélèvements de patients atteints de légionellose. Pour deux de ces patients, l'ADN a été amplifié à partir d'un prélèvement clinique et le gène gyrA séquence. Chez le patient 1, la séquence 1-1 ne présente pas de mutation par rapport à la souche Paris. Après traitement aux fluoroquinolones, on note un mélange de séquences ADN (ACA/ATC, Y=CouT) (séquence 1-2), qui témoigne de la présence simultanée de bactéries sensibles et de bactéries résistantes aux fluoroquinolones par substitution Thr83Ile en position 83 de la protéine GyrA. Pour le patient 2, la souche initiale (séquence 2-1) est sensible aux fluoroquinolones (données vérifiées par isolement de la souche et détermination de sa sensibilité à ces antibiotiques et par RT-PCR LP-gyrA sur prélèvement respiratoire initial), et à différents temps lors du traitement par les fluoroquinolones, l'amplification met en évidence une séquence gyrA mutée (ATA au lieu de ACA) (séquences 2-2, 2-3, 2-4) entraînant la même substitution Thr83Ile responsable de la résistance aux fluoroquinolones chez L. pneumophila. REVENDICATIONS1) Méthode in vitro permettant la mise en évidence d'au moins une souche bactérienne de Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone, à partir d'un isolat obtenu en culture ou directement dans un échantillon biologique, par la détection : - d'une mutation sur l'une au moins des positions 83, 84, 87 ou équivalentes par rapport à la SEQ ID NO : 1 chez une protéine GyrA de L. pneumophila ayant au moins 90 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1, ladite mutation résultant en une protéine GyrA mutée, ou - d'un acide nucléique codant la dite protéine GyrA mutée, la détection de ladite mutation ou de l'acide nucléique codant ladite protéine GyrA mutée indiquant la présence d'au moins une souche bactérienne Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, dans l'échantillon. 2) Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la protéine GyrA mutée est telle que: - l'acide aminé en position 83 est différent de T et les acides aminés en positions 84 et 87 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 84 est différent de A, et les acides aminés en positions 83 et 87 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 87 est différent de D, et les acides aminés en positions 83 et 84 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé. 3) Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la protéine GyrA mutée est telle que : - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V et les acides aminés en positions 84 et 87 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou- ledit acide aminé en position 84 est : P ou V et les acides aminés en positions 83 et 87 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V et les acides aminés en positions 83 et 84 peuvent correspondre à n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V, ledit acide aminé en position 84 est : P ou V, et ledit acide aminé en position 87 est n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V, ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V, et ledit acide aminé en position 84 est n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 84 est : P et V, ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V, et ledit acide aminé en position 83 est n'importe quel acide aminé, ou - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V, ledit acide aminé en position 84 est : P ou V, et ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V, notamment dans laquelle la protéine GyrA mutée est telle que : - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V, ledit acide aminé en position 84 est A et ledit acide aminé en position 87 est D, ou - ledit acide aminé en position 84 est : P ou V, et ledit acide aminé en position 83 est T et ledit acide aminé en position 87 est D, ou - ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V, et ledit acide aminé en position 83 est T et ledit acide aminé en position 84 est A, ou - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V ledit acide aminé en position 84 est : P ou V, et ledit acide aminé en position 87 est D, ou - ledit acide aminé en position 83 est : I, L, W, A ou V, ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V, et ledit acide aminé en position 84 est A, ou- ledit acide aminé en position 84 est : P ou V, ledit acide aminé en position 87 est : N, G, Y, H ou V, et ledit acide aminé en position 83 est T. 4) Méthode selon la revendication 1, dans laquelle ladite protéine GyrA mutée comprend la séquence consensus : GDX1X2VYX3T (SEQ ID NO : 2), dans laquelle : Xi, X2 et X3 correspondent respectivement aux acides aminés mutés en positions 83, 84 et 87, et - Xi est différent de T, et X2 et X3 sont n'importe quel acide aminé, ou - X2 est différent de A, et Xi et X3 sont n'importe quel acide aminé, ou - X3 est différent de D, et Xi et X2 sont n'importe quel acide aminé. 5) Méthode selon la revendication 4, dans laquelle : - X1 est I, L, W, A ou V, et X2 et X3 correspondent à n'importe quel acide aminé, ou - X2 est P ou V, et X1 et X3 correspondent à n'importe quel acide aminé, ou - X3 est N, G, Y, H ou V, et Xi et X2 correspondent à n'importe quel acide aminé, ou - X1 est I, L, W, A ou V, X2 est P ou V et X3 est n'importe quel acide aminé, ou - X1 est I, L, W, A ou V, X3 est N, G, Y, H ou V et X2 est n'importe quel acide aminé, ou - X2 est P ou V, X3 est N, G, Y, H ou V et X1 est n'importe quel acide aminé, ou - X1 est I, L, W, A ou V, X2 est P ou V et X3 est N, G, Y, H ou V. en particulier dans laquelle : - X1 est I, L, W, A ou V, X2 est A et X3 est D, ou- X2 est P ou V Xi est T et X3 est D, ou - X3 est N, G, Y, H ou V, Xi est T et X2 est A, ou - X1 est I, L, W, A ou V, X2 est P ou V et X3 est D, ou - X1 est I, L, W, A ou V, X3 est N, G, Y, H ou V et X2 est A, ou - X2 est P ou V, X3 est N, G, Y, H ou V et Xi est T. 6) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle la séquence dudit gène codant ladite protéine GyrA mutée possède au moins une substitution d'un nucléotide par rapport à la SEQ ID NO : 3, en position équivalente à la position 7, 8, 10, 11, 19, 20 ou 21 par rapport à la SEQ ID NO : 3, où les nucléotides en positions 7 et 8 correspondent aux deux premiers nucléotides du codon codant l'acide aminé en position 83 de la protéine GyrA de Legionella pneumophila, les nucléotides en positions 10 et 11 correspondent aux deux premiers nucléotides du codon codant l'acide aminé en position 84, et les nucléotides en positions 19, 20 et 21 correspondent aux trois nucléotides du codon codant l'acide aminé en position 87. et en particulier dans laquelle la séquence dudit acide nucléique codant ladite protéine GyrA mutée comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 4 à 12 et SEQ ID NO : 14 à 56. 7) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, la détection de la présence de ladite protéine GyrA mutée ou de l'acide nucléique cible codant ladite protéine GyrA mutée étant effectuée par une technique choisie parmi : le western blot, le northern blot, le southern blot, la PCR, la PCR en temps réel, la PCR hybridation, la PCR array, la TMA, le NASBA, la LCR, l'hybridation ADN/ARN, la puce à ADN, le séquençage ADN/ARN, le dot-blot, la technique RFLP (Restriction fragment length polymorphism),en particulier dans laquelle ladite détection de la présence dudit acide nucléique cible codant ladite protéine GyrA mutée est effectuée par PCR en temps réel. 8) Méthode l'une quelconque des revendications 1 à 7, ladite méthode comprenant les étapes de : a) mise en contact d'un échantillon biologique susceptible de contenir un acide nucléique cible appartenant à une souche bactérienne de Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, avec un couple d'amorces capables de s'hybrider spécifiquement avec ledit acide nucléique cible, et b) lorsqu'il y a amplification par PCR dudit acide nucléique cible en utilisant le couple d'amorces pour obtenir un produit d'amplification, ledit produit d'amplification comprenant une séquence ayant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 : c) détection d'un acide nucléique codant la protéine GyrA mutée, la détection d'un acide nucléique codant ladite protéine GyrA mutée indiquant la présence d'au moins une souche bactérienne Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, dans l'échantillon, et en particulier dans laquelle ledit produit d'amplification obtenu à l'étape b) correspond à une séquence ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 57, et en particulier dans laquelle l'étape b) est réalisée en utilisant une amorce ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 58, et/ou une amorce ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 59, et en particulier dans laquelle une courbe de fusion dudit produit d'amplification est générée après l'étape c). 9) Méthode selon la revendication 8, dans laquelle la détection dudit produit d'amplification obtenu à l'étape b) est effectuée à l'aide d'au moins une sonde nucléotidique susceptible de s'hybrider avec l'acide nucléique cible,notamment dans laquelle ladite sonde nucléotidique présente au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3. et en particulier dans laquelle ladite sonde de détection ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 est utilisée avec au moins une sonde d'ancrage ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 60. 10) Sonde nucléotidique comprenant une molécule d'acide nucléique ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, ladite sonde nucléotidique étant notamment liée par une liaison covalente à au moins une molécule marqueur permettant sa détection par un dispositif adapté, ladite molécule marqueur étant notamment choisie parmi un fluorochrome ou un isotope radioactif 11) Sonde nucléotidique comprenant une molécule d'acide nucléique ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 60 liée par une liaison covalente à un fluorochrome. 12) Couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment du gène gyrA de Legionella pneumophila comprenant une amorce ayant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 58, et une amorce ayant au moins 90 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 59. 13) Kit de réactifs permettant la détection de souches bactériennes Legionella pneumophila résistantes aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone, comprenant au moins un couple d'amorces tel que défini selon la revendication 12 et au moins une sonde telle que définie aux revendications 10 à 11. 14) Utilisation de la méthode définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour le diagnostic d'une infection par une bactérie Legionella pneumophila résistante aux antibiotiques, notamment de type fluoroquinolone, chez un patient, ou pour la détermination ou la prédiction de l'efficacité d'un traitement aux fluoroquinolones chez un patient infecté par la bactérie Legionella pneumophila.