Brevet FR3004451A1 — publié le 20141017

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se situe dans le domaine des médicaments dérivés du plasma sanguin ou équivalents recombinants. Elle concerne un procédé de préparation d'une solution de protéine C viralement sécurisée, comprenant : a) la fourniture d'une solution de protéine C préalablement purifiée, b) une première étape de nanofiltration de ladite solution de protéine C préalablement purifiée à travers un nanofiltre ayant une taille moyenne de pores comprise entre 15 et 35 nm, et c) une deuxième étape de nanofiltration de la solution de protéine C obtenue à l'issue de la première nanofiltration à travers un deuxième nanofiltre ayant une taille moyenne de pores inférieure ou égale à 20 nm, avantageusement inférieure ou égale à 15 nm. Elle concerne également une solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par ce procédé, ainsi que son utilisation en tant que médicament, notamment en thérapie de substitution des déficits congénitaux ou acquis en protéine C. ART ANTERIEUR La protéine C (PC) est une protéine synthétisée par le foie, vitamine K-dépendante, qui circule dans le plasma sous forme de zymogène, à la concentration de 5 mg/l. Elle est activée par la thrombine associée à la thrombomoduline à la surface des cellules endothéliales et cette réaction est potentialisée par ta liaison de la PC à son récepteur endothélial (endothelial protein C receptor, EPCR). La protéine C activée (PCa) est un puissant régulateur de la coagulation : en présence de son cofacteur, la protéine S (PS), à la surface des phospholipides exposés par les plaquettes et les cellules endothéliales activées et en présence d'ions calcium, elle inactive par une réaction protéolytique les facteurs Villa et Va, inhibant ainsi la génération de thrombine. Elle diminue de ce fait à la fois la formation du caillot de fibrine et l'activation d'un inhibiteur de fibrinolyse (thrombin activatable fibrinolytic inhibitor ou TAFI) par ta thrombine. Différents déficits en protéine C ont été décrits. Ceux-ci peuvent être congénitaux (ou constitutionnels) ou acquis. Les patients ayant un déficit en protéine C, en raison d'une synthèse réduite et/ou d'une baisse d'activité de la protéine C, ont une capacité diminuée à réguler négativement ta formation de thrombine par les facteurs Va et Villa, une fois que ceux-ci ont été activés par tes faibles quantités de thrombine générées lors de la phase d'initiation de la coagulation. Ce trouble de la coagulation est associé à un risque accru de thromboses veineuses (thrombophilie). Dans les formes tes plus sévères de déficit congénital, celui-ci se manifeste dès ta période néonatale, par un tableau d'une extrême gravité, associant des hématomes nécrotiques typiques de purpura fulminans, des thromboses veineuses et une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Dans tes déficits partiels, les sujets atteints présentent des thromboses veineuses profondes, parfois compliquées d'embolie pulmonaire, ou des thromboses superficielles. Les thromboses artérielles sont rares. Les premiers accidents peuvent survenir dès l'adolescence, mais le plus souvent surviennent après 30 ans, et augmentent ensuite avec l'âge. Dans un peu plus de la moitié des cas, des thromboses spontanées surviennent, mais dans tes autres cas, un facteur déclenchant est identifié (prise d'estroprogestatifs, immobilisation, grossesse). Ces déficits peuvent se compliquer de nécrose cutanée à l'introduction des antivitamines K. Les concentrés de protéine C peuvent être utilisés en thérapie de substitution des déficits en protéine C. L'un des concentrés actuellement sur le marché, Protexel®, est obtenu à partir de cryosurnageant du plasma par un procédé de purification comprenant trois étapes de chromatographie d'échange d'ions et une étape de chromatographie d'affinité. Outre des précautions au niveau de la collecte du plasma humain (tri des donneurs, tests des échantillons pour la présence de certains virus) et l'effet d'élimination virale lié aux étapes de purifications, te procédé de préparation comprend entre outre une étape de traitement solvant-détergent, afin de limiter les risques de transmission de virus transmissibles par le sang, tels que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) ou les virus des hépatites. Cependant, si l'étape de traitement solvant-détergent est relativement efficace vis à vis des virus enveloppés, son efficacité est limitée concernant les virus non enveloppés, tels que le parvovirus B19 ou le virus de l'hépatite A. Il existe donc un besoin pour des concentrés de protéine C avec une sécurité virale améliorée, notamment vis-à-vis des petits virus non enveloppés. Radosevich et al-2003 décrit un procédé de préparation d'un concentré de protéine C à partir de cryosurnageant du plasma par un procédé de purification similaire à celui du médicament Protexel®, avec en outre une étape de nanofiltration à 15 nm. Cependant, contrairement aux spéculations de Radosevich et al-2003, cette unique étape de nanofiltration supplémentaire ne permet pas une amélioration suffisante de la sécurité biologique du produit obtenu, notamment vis-à-vis des petits virus non enveloppés. RESUME DE L'INVENTION Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont découvert qu'il était avantageux de modifier te procédé décrit dans Radosevich et al-2003 en ajoutant une étape additionnelle de nanofiltration à 20 nm, avant l'étape de nanofiltration à 15 nm. L'ajout de cette étape de nanofiltration, qui joue un rôle de première barrière d'exclusion, permet en effet de rendre le procédé plus robuste vis-à-vis de la sécurisation virale du produit obtenu, notamment par une réduction supérieure à 4log10 (exigence réglementaire permettant de déterminer si une étape est considéré comme efficace) des petits virus non enveloppés vis-à-vis d'une réduction supérieure à 2logio lors d'une seule étape de nanofiltration. Cette double étape de nanofiltration permet également, de manière surprenante, l'élimination efficace des agents transmissibles non conventionnels (ATNC), notamment de la protéine prion PrPsc rencontrée dans les cas d'encéphalopathies spongiformes transmissibles, avec un facteur de réduction supérieur ou égal à 3.30 logo. Ces étapes de nanofiltration assurent ainsi un effet d'exclusion par la taille et un effet d'absorption des virus et des ATNC. Cette double étape de nanofiltration permet donc d'augmenter la surface absorbante et par conséquent d'obtenir un facteur de réduction des virus et des ATNC plus élevé que par une unique étape de nanofiltration. De plus, le fait d'enlever les agrégats suite au premier filtre permet d'améliorer le facteur de réduction des virus et des ATNC et donc d'améliorer l'efficacité de la deuxième étape de nanofiltration suivante. La présente invention concerne donc un procédé de préparation d'une solution de protéine C viralement sécurisée, comprenant : a) la fourniture d'une solution de protéine C préalablement purifiée, b) une première étape de nanofiltration de ladite solution de protéine C préalablement purifiée à travers un nanofiltre ayant une taille moyenne de pores comprise entre environ 15 et environ 35 nm, et c) une deuxième étape de nanofiltration de la solution de protéine C obtenue à l'issue de la première nanofiltration à travers un deuxième nanofiltre ayant une taille moyenne de pores inférieure ou égale à environ 20 nm, avantageusement inférieure ou égale à environ 15 nm. De préférence, la solution de protéine C préalablement purifiée possède une activité spécifique en protéine C d'au moins 75 Ul /mg de protéines totales, au moins 100 Ul /mg de protéines totales, au moins 125 Ul /mg de protéines totales, au moins 150 Ul /mg de protéines totales, avantageusement au moins 160 Ul /mg de protéines totales, au moins 170 UI/mg de protéines totales, au moins 180 Ul /mg de protéines totales, plus avantageusement au moins 190 UI/mg de protéines totales, voire au moins 200 Ul/mg de protéines totales. De plus ou alternativement, la concentration en protéine C de la solution de protéine C préalablement purifiée est d'environ 2 à environ 100 UI/ml, avantageusement d'environ 10 à environ 90 Ul/ml, d'environ 20 à environ 80 UI/ml, d'environ 30 à environ 70 UI/ml, ou d'environ 40 à environ 60 UI/ml, notamment d'environ 50 Ul/ml. De plus ou alternativement, ta teneur en protéines de la solution de protéine C préalablement purifiée est de préférence d'environ 0,02 à environ 0,5 g/l, avantageusement d'environ 0,1 à environ 0,5 g/l, d'environ 0,15 à environ 0,45 g/l, ou d'environ 0,2 à environ 0,3 g/l notamment d'environ 0,25 g/l. De plus ou alternativement, la solution de protéine C est de préférence une solution de protéine C non activée. De plus ou alternativement, il peut s'agir d'une solution de protéine C d'origine plasmatique ou recombinante. Dans un mode de réalisation, une telle solution de protéine C préalablement purifiée a été obtenue par purification d'une fraction plasmatique, notamment le cryosurnageant du plasma, par au moins une étape de chromatographie. Avantageusement, ta purification de la fraction plasmatique comprend au moins une étape de chromatographie d'échange d'ions et/ou au moins une étape de chromatographie d'affinité. De plus, la solution de protéine C préalablement purifiée peut avoir été partiellement inactivée viralement par une étape d'inactivation virale, en particulier par un traitement solvant-détergent. Dans un mode de réalisation préféré, la solution de protéine C préalablement purifiée a été obtenue à partir de cryosurnageant du plasma par un procédé de purification comprenant les étapes suivantes : i) une première étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel de dextrane réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE) ; ii) une étape d'inactivation virale, en particulier par un traitement solvant- détergent ; iii) une deuxième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE) ; iv) une troisième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel de polymère de méthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diméthylaminoéthanol (DMAE) ; et y) une étape de chromatographie d'affinité utilisant une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés des molécules d'héparine, ou une étape de chromatographie échangeuse de cations utilisant une résine ayant pour matrice un gel de polymère de méthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements sulfoisobutyle. Dans un mode de réalisation préféré de la première étape de nanofiltration, celle-ci est effectuée à : - une pression comprise entre 700 et 900 mbar, avantageusement entre 750 et 850 mbar, notamment d'environ 800 mbar ; et/ou - une température comprise entre 10 et 30 °C, avantageusement entre 15 et 25 °C, notamment d'environ 20°C. De plus ou alternativement, le premier nanofiltre a de préférence une taille moyenne de pores d'environ 20 nm, avantageusement le premier nanofiltre est une membrane à 5 fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammonium ayant une taille de pores d'environ 20 nm. Dans un mode de réalisation préféré de la deuxième étape de nanofiltration, celle-ci est effectuée à : - une pression comprise entre 300 et 900 mbar, entre 300 et 800 mbar, entre 300 10 et 700 mbar, entre 300 et 600 mbar, avantageusement entre 350 et 550 mbar, notamment d'environ 450 mbar ; et/ou - une température comprise entre 10 et 30 °C, avantageusement entre 15 et 25 °C, notamment d'environ 20°C. De plus ou alternativement, le deuxième nanofiltre a de préférence une taille moyenne 15 de pores d'environ 15 nm, avantageusement le deuxième nanofiltre est une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammonium ayant une taille de pores d'environ 15 nm. Dans les deux étapes de nanofiltration, te volume de charge par surface est de 20 préférence compris entre 4 et 24 1/m2 (soit entre 4.103 et 24.103 ml/m2). De plus ou alternativement, la concentration de charge par surface (multiple de la concentration en protéine C et du volume de charge par surface) est de préférence comprise entre 7.104 et 2,4.106 UI/m2, avantageusement entre 7.104 et 1.106 UI/m2. 25 L'invention concerne en outre une solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'invention. De préférence, celle-ci possède une activité spécifique d'au moins 230 UI/mg de protéines totales, avantageusement au moins 235 Ul/mg de protéines totales, au moins 240 UI/mg de protéines totales, au moins 245 UI/mg de protéines totales, au moins 250 UI/mg de 30 protéines totales, plus avantageusement au moins 255 UI/mg de protéines totales, voire au moins 260 UI/mg de protéines totales, ou au moins 265 UI/mg de protéines totales. L'invention concerne également une solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par te procédé de préparation selon l'invention, pour son 35 utilisation en tant que médicament. En particulier, celle-ci peut être utilisée en thérapie de substitution des déficits congénitaux ou acquis en protéine C, notamment dans ta prévention ou le traitement des thromboses associées à un déficit congénital ou acquis en protéine C. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1. Profils SDS-PAGE colorés au bleu de Coomassie. Comparaison des lots nanofiltrés (lots de validation) et des lots nanofiltrés (Blots de référence), en conditions non réductrices (A) et en conditions réductrices (B). Pistes 1 et 8 : standard de poids moléculaire Mark 12 (poids moléculaires (PM) apparents pour ces gels en KDa) ; Piste 2 - lot de validation LI1 (09L10705) ; Piste 3 - lot de validation LI2 (09L11867) ; Piste 4 - lot de validation LI3 (09L12784) ; Piste 5 - lot de référence (09L12391) ; Piste 6 - lot de référence (09L06161) ; Piste 7 - lot de référence (09L09766). PC : protéine C. HPM : Haut Poids Moléculaire. Figure 2. Profils SDS-PAGE colorés au nitrate d'argent. Comparaison des lots nanofiltrés (lots de validation) et des lots nanofiltrés (Blots de référence), en conditions non réductrices (A) et en conditions réductrices (B). Pistes 1 et 8 : standard de poids moléculaire Mark 12 (poids moléculaires (PM) apparents pour ces gels en KDa) ; Piste 2 lot de validation LI1 (09L10705) ; Piste 3 - lot de validation LI2 (09L11867) ; Piste 4 - lot de validation LI3 (09L12784) ; Piste 5 - lot de référence (09L12391) ; Piste 6 - lot de référence (09L06161) ; Piste 7 - lot de référence (09L09766). PC : protéine C. HPM : Haut Poids Moléculaire. Figure 3. Représentation de Pareto montrant l'influence des différents paramètres testés (A : Volume de charge ; B : Concentration en Protéine C ; AB : multiple AxB ; C : pression d'alimentation sur le filtre 15N, D : température, E : volume de chasse par surface, F : pH de la solution à filtrer, G : osmolalité de ta solution à filtrer, H : lot de matière première) sur le rapport DF/DI. Figure 4. Influence du volume de charge et de la concentration en protéine C sur le rapport DF/ DI, déterminée sur ta base du modèle suivant : DF / DI = + 89,00851 + 1,81179E-003 * Volume de charge + 0,12565 * Concentration en Protéine C - 2,54896E- 003 * Volume de charge * Concentration en Protéine C. Figure 5. Représentation de Pareto montrant l'influence des différents paramètres testés (A : Volume de charge ; B : Concentration en Protéine C ; AB : multiple AxB ; C : pression d'alimentation sur le filtre 15N, D : température, E : volume de chasse par surface, F : pH de ta solution à filtrer, G : osmolalité de la solution à filtrer, H : lot de matière première) sur le rendement en Protéine C. Figure 6. Influence du volume de charge et de la concentration en protéine C sur te rendement en Protéine C, déterminée sur la base du modèle suivant : Rendement Protéine C = + 42,89650 + 0,18078 * Volume de charge + 0,55923 * Concentration en Protéine C - 1,83082E-003 * Volume de charge * Concentration en Protéine C. Figure 7. Rendement en protéine C (%) en fonction de ta quantité de protéine C (UI) nanofiltrée, pour un filtre de 0,01 m2. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Procédé La présente invention concerne un procédé de préparation d'une solution de protéine C viralement sécurisée, comprenant : a) la fourniture d'une solution de protéine C préalablement purifiée, b) une première étape de nanofiltration de ladite solution de protéine C préalablement purifiée à travers un nanofiltre ayant une taille moyenne de pores comprise entre environ 20 et environ 35 nm, et c) une deuxième étape de nanofiltration de la solution de protéine C obtenue à l'issue de la première nanofiltration à travers un deuxième nanofiltre ayant une taille moyenne de pores inférieure ou égale à environ 20 nm, avantageusement inférieure ou égale à environ 15 nm. Etape a) : fourniture d'une solution de protéine C préalablement purifiée Le procédé selon l'invention comprend donc deux étapes successives de nanofiltration d'une solution de protéine C. La solution de protéine C qui est soumise aux deux étapes de nanofiltration est un concentré de protéine C, ce qui signifie qu'elle a été préalablement purifiée et enrichie en protéine C. En effet, bien qu'une étape de nanofiltration puisse en théorie être ajoutée à n'importe quel stade du procédé, il est préférable de l'introduire à un stade où la protéine d'intérêt a déjà été séparée des principaux contaminants, cela contribuant à améliorer le rendement et l'efficacité de l'étape de nanofiltration. Ainsi, de préférence, la solution de protéine C préalablement purifiée possède une activité spécifique en protéine C d'au moins 75 UI/mg de protéines totales, au moins 100 UI/mg de protéines totales, au moins 125 UI/mg de protéines totales, au moins 150 UI/mg de protéines totales, avantageusement au moins 160 UI/mg de protéines totales, au moins 170 UI/mg de protéines totales, au moins 180 UI/mg de protéines totales, plus avantageusement au moins 190 UI/mg de protéines totales, voire au moins 200 Ul/mg de protéines totales. De plus ou alternativement, ta teneur en protéines de la solution de protéine C préalablement purifiée est avantageusement adaptée à la mise en oeuvre d'une étape de nanofiltration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores inférieure ou égale à environ 35 nm. De préférence, la teneur en protéines de ta solution de protéine C préalablement purifiée est d'environ 0,02 à environ 0,5 g/l, avantageusement d'environ 0,1 à environ 0,5 g/l, d'environ 0,15 à environ 0,45 g/l, ou d'environ 0,2 à environ 0,3 g/l notamment d'environ 0,25 g/l. La concentration en protéine C de ta solution de protéine C préalablement purifiée est alors avantageusement d'environ 1,5 à environ 100 UI/ml, avantageusement d'environ 10 à environ 90 UI/ml, d'environ 20 à environ 80 UI/ml, d'environ 30 à environ 70 Ul/ml, ou d'environ 40 à environ 60 Ul/ml, notamment d'environ 50 Ul/ml. En effet, ce paramètre influence deux points importants : - Le rapport débit final/débit initial (DF/D1). Ce rapport DF/DI, généralement exprimé en pourcentage du débit initial, qui indique si le filtre est plus ou moins colmaté à la fin de l'étape de nanofiltration. Pour un rapport DF/DI inférieur à 10% il existe un risque de colmatage du nanofiltre. Pour éviter tout risque de colmatage du filtre et optimiser la durée de filtration, un rapport DF/DI d'au moins 25% peut être visé. Plus la concentration en protéine C est élevée, plus le rapport DF/DI a tendance à diminuer, à volume de charge (c'est-à-dire le volume de solution de protéine C par m2 de surface du filtre) égal. Cependant, pour une concentration en protéine C inférieure à 100 UI/ml, un rapport DF/DI supérieur à environ 30% est généralement observé, évitant ainsi un bouchage du filtre. - Le rendement en protéine C des étapes de nanofiltration. En effet, les inventeurs se sont aperçus que pour obtenir un bon rendement en protéine C à l'issue des deux étapes de nanofiltration, une quantité minimale de protéine C doit être injectée sur le filtre. Ainsi, à volume de charge égal, plus la concentration en protéine C augmente, plus la quantité de protéine C augmente, et plus le rendement en protéine C augmente. Pour les concentrations en protéine C indiquées ci-dessus, un rendement acceptable en protéine C peut être obtenu. La solution de protéine C soumise aux deux étapes de nanofiltration peut être une solution de protéine C non activée ou activée. R s'agit de préférence d'une solution de protéine C non activée. Il peut s'agir d'une solution de protéine C d'origine plasmatique ou recombinante. Avantageusement, il s'agit d'une solution de protéine C d'origine plasmatique. Procédé de purification préalable d'une solution de protéine C d'origine plasmatique Dans un mode de réalisation, une telle solution de protéine C préalablement purifiée a été obtenue par purification d'une fraction plasmatique, notamment le cryosurnageant du plasma, par au moins une étape de chromatographie. Par « fraction plasmatique », on entend toute fraction obtenue par séparation des constituants (ou fractionnement) du plasma, avantageusement humain, par les technologies usuelles. La première étape du fractionnement du plasma est généralement une décongélation lente à froid du plasma congelé, suivie d'une centrifugation, conduisant à l'obtention d'un précipité (appelé « cryoprécipité ») et d'un liquide surnageant ce précipité (appelé « cryosurnageant »). D'autres fractions enrichies en différentes protéines du plasma peuvent ensuite être purifiées par différentes technologies, notamment de chromatographie échangeuse d'ions ou d'affinité. Avantageusement, ta fraction plasmatique à partir de laquelle la solution de protéine C préalablement purifiée est obtenue est le cryosurnageant du plasma. Cependant, d'autres fractions intermédiaires plus enrichies en protéine C peuvent également être utilisées, la purification avant nanofiltration étant alors simplifiée (nombre réduit d'étapes de purification). Avantageusement, la purification de la fraction plasmatique (notamment du cryosurnageant du plasma) comprend au moins une étape de chromatographie d'échange d'ions et/ou au moins une étape de chromatographie d'affinité. En effet, la purification d'une solution fortement enrichie en protéine C à partir du cryosurnageant du plasma implique généralement plusieurs étapes de chromatographie, comme décrit dans Burnouf et al-2008 (voir Figure 2). La chromatographie d'échange d'ions et ta chromatographie d'affinité sont largement utilisées dans le fractionnement du plasma (voir Burnouf et al-2008, Figure 2). La chromatographie d'échange d'ions permet de séparer les molécules en fonction de leur charge apparente. Dans le cadre de la purification préalable d'une solution de protéine C, des étapes de chromatographie échangeuse d'anions sont de préférence utilisées, c'est-à-dire qu'une résine chargée positivement est utilisée comme phase stationnaire. Ces résines chargées positivement sont généralement constituées d'un polymère réticulé ou gel, sur lequel des groupements chargés positivement sont greffés. Cependant, des étapes de chromatographie échangeuse de cations peuvent également être utilisées, c'est-à-dire qu'une résine chargée négativement est utilisée comme phase stationnaire. Ces résines chargées négativement sont généralement constituées d'un polymère réticulé ou gel, sur lequel des groupements chargés négativement sont greffés. Le polymère réticulé ou gel peut notamment être choisi parmi le dextrane (ex : Sephadex®), l'agarose (ex : Sepharose®), ta cellulose, les polymères de méthacrylate (ex : Fratogel0), les polymères vinyliques (ex : Fractoprep®).Le gel peut avantageusement se présenter sous forme de billes, avec un diamètre moyen compris entre 30 et 100 pm. Les groupements chargés positivement peuvent notamment être choisis parmi les groupements suivants : diéthylaminoéthyle (DEAE), diméthylaminoéthyle (DMAE), triméthylaminoéthyl (TMAE), ou aminoéthyle quaternaire (QAE). Les groupements chargés positivement peuvent être greffés soit directement sur te gel (ex : DEAE-Sephadex®, DEAE-Sepharose®), notamment par des liaisons de type éther, soit par l'intermédiaire de longues chaînes de polymère linéaires appelées - tentacules », permettant une meilleure accessibilité des groupements aux protéines comprises dans la solution à purifier (ex : Fractogel® EMD DMAE, Fractoprep® DEAE). Les tentacules sont avantageusement un polymère linéaire d'acrylamide comprenant 15 à 50 unités d'acrylamide. Des exemples de résines échangeuses d'anion appropriées dans le cadre de ta purification préalable de la solution de protéine C incluent notamment les résines suivantes : DEAE-Sephadex®, QAE-Sephadex®, DEAE-Sepharose® Fast Flow, DEAESepharose® CL-6B, Fractogel® EMD DEAE, Fractogel® EMD DMAE, Fractogel® EMD TMAE, Fractoprep® DEAE, Fractoprep® DEAE, Fractoprep® TMAE. Les groupements chargés négativement peuvent notamment être choisis parmi les groupements suivants : sulfométhyle, sulfoéthyle, sulfopropyle, sulfoisobutyle, carboxy, ou carboxyméthyle. Ils peuvent être greffés soit directement sur te gel (ex : CM-Sephadex®, SP-Sephadex®, 5 CM-Sepharose®, SP-Sepharose®, où CM signifie carboxyméthyle et SP signifie sulfopropyle), notamment par des liaisons de type éther, soit par l'intermédiaire de longues chaines de polymère linéaires appelées « tentacules », permettant une meilleure accessibilité des groupements aux protéines comprises dans la solution à purifier (ex : Fractogel® EMD S03-, Fractogel® EMD SE Hicap, Fractogel® EMD C00-, 10 Fractoprep® S03). Les tentacules sont avantageusement un polymère linéaire d'acrylamide comprenant 15 à 50 unités d'acrylamide. Des exemples de résines échangeuses d'anion appropriées dans le cadre de la purification préalable de la solution de protéine C incluent notamment les résines suivantes : Fractogel® EMD S03-, Fractogel® EMD SE Hicap, Fractogel® EMD COQ", 15 Fractoprep® 503, CM-Sephadex®, SP-Sephadex®, CM-Sepharose®, SP-Sepharose®. La chromatographie d'affinité permet de séparer spécifiquement les molécules se liant à un ligand particulier. Dans le cadre de la purification préalable d'une solution de protéine C, des étapes de chromatographie d'affinité à l'héparine sont couramment utilisées. Pour cela, on utilise une résine constituée d'un polymère réticulé ou gel, sur 20 lequel est greffée l'héparine. Le polymère réticulé ou gel est du même type que pour la chromatographie échangeuse d'ions (voir ci-dessus). L'héparine peut notamment être de l'héparine porcine, en particulier de l'héparine porcine de la muqueuse intestinale. Elle est greffée au polymère réticulé ou gel par une 25 liaison covalente, qui peut être obtenue par différentes réactions chimiques, par exemple par amination réductrice (notamment résine Heparin Sepharose 6 Fast Flow de Pharmacia Biotech), par un procédé utilisant du CNBr (notamment résine Heparin Sepharose CL-6B de GE HealthCare Biosciences), du NHS (notamment résine Heparin Sepharose High Performance ou HiTrap Heparin de Pharmacia Biotech), de 30 l'épichlorohydrine (notamment résine Heparin Agarose de Sigma), ou un monoaldéhyde (notamment résines Hep-SuperFlowlm, Hep-Super Flow Plus de Sterogene). De plus, la solution de protéine C préalablement purifiée peut avoir été partiellement inactivée viralement par une étape d'inactivation virale. Par « étape d'inactivation 35 virale », on entend une étape dans laquelle les virus ne sont pas éliminés de la solution (des antigènes peuvent encore être détectés), mais sont rendus inactifs et donc inoffensifs. Ces étapes incluent notamment le chauffage à sec, la pasteurisation, et le traitement solvant-détergent. Ces différentes étapes d'inactivation virale sont bien connues de l'homme du métier (voir notamment tes directives de l'OMS concernant les 40 procédures d'inactivation et d'élimination virale destinées à assurer la sécurité virale des produis dérivés du plasma sanguin humain, disponibles sur le site Internet de l'OMS). Dans un mode de réalisation préféré, la solution de protéine C préalablement purifiée peut avoir été partiellement inactivée viralement par une étape de traitement solvant- détergent. Une telle étape est réalisée par traitement de la solution par un mélange de solvant, notamment le tri-(N-butyl)-phosphate (TnBP), et d'un détergent, notamment le Polysorbate 80 (Polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate) ou te polyoxyethylene-p-toctylphenot (Triton X-100), dans des conditions appropriées. Le traitement peut notamment être réalisé en présence de 1% (poids/volume) de Polysorbate 80 et 0,3% (volume/volume) de TnBP pendant au moins 7 heures à 25+1 °C. Procédé de purification préalable préféré d'une solution de protéine C d'origine plasmatique Dans un mode de réalisation préféré, la solution de protéine C préalablement purifiée a été obtenue à partir d'un cryosurnageant du plasma par un procédé de purification comprenant les étapes suivantes : i) une première étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel de dextrane réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE) ; ii) une étape d'inactivation virale, en particulier par un traitement solvant- détergent ; iii) une deuxième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE) ; iv) une troisième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel de polymère de méthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diméthylaminoéthanol (DMAE) ; et y) une étape de chromatographie d'affinité utilisant une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés des molécules d'héparine, ou une étape de chromatographie échangeuse de cations utilisant une résine ayant pour matrice un gel de polymère de méthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements sulfoisobutyle. Etape i) La première étape d'obtention de la solution de protéine C préalablement purifiée à partir du cryosurnageant du plasma est une première étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel de dextrane réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diéthylaminoéthyle (DEAE). Cette première étape permet d'éliminer la plupart des contaminants protéiques, comme l'albumine ou les IgG. Elle repose sur l'utilisation d'une résine ayant pour matrice un gel de dextrane réticulé, sur lequel sont greffés des groupements DEAE. Avantageusement, le gel de dextrane est obtenu par réticulation de dextrane avec de l'épichlorohydrine et se présente sous forme de billes d'un diamètre de 40 à 125 pm (Sephadex®). Il existe différents types de Sephadex® selon le degré de réticulation du gel de dextrane. Pour une protéine comme ta protéine C, ayant un poids moléculaire d'environ 62 000 daltons (Da), un Sephadex® de type G-50, adapté à la séparation des molécules ayant un poids moléculaire entre 30 000 et 100 000 Da, parait le plus approprié. Les groupements DEAE sont attachés aux billes de gel de dextrane, avantageusement aux unités glucose du gel de dextrane, par des liaisons éther. On parle alors d'utiliser une résine DEAE-Sephadex®, qui est une résine préférée pour la première étape de chromatographie d'échange d'anions de l'étape i). Etape ii) La deuxième étape d'obtention de la solution de protéine C préalablement purifiée à partir du cryosurnageant du plasma est une étape d'inactivation virale. Celle-ci vise en particulier à l'inactivation des virus enveloppés, et éventuellement en outre des virus non enveloppés. Elle peut être choisie parmi le chauffage à sec, la pasteurisation, et le traitement solvant-détergent. Dans un mode de réalisation avantageux, il s'agit d'une étape de traitement solvant-détergent, telle que décrite ci-dessus. Etape iii) La troisième étape d'obtention de la solution de protéine C préalablement purifiée à partir du cryosurnageant du plasma est une deuxième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE). Cette deuxième étape de chromatographie d'échange d'anions permet une séparation partielle de la protéine C et des composants du complexe prothrombique (facteur VII, facteur II, facteur X et facteur IX). Elle repose sur l'utilisation d'une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés des groupements DEAE. Avantageusement, le gel d'agarose est un gel de 4 à 6% d'agarose réticulé, notamment d'environ 6% d'agarose réticulé, obtenu par réticulation d'agarose avec de l'épichlorohydrine et se présente sous forme de billes d'un diamètre de 15 à 165 pm (Sepharose®), notamment d'un diamètre moyen de 30 à 100 pm, en particulier d'un diamètre moyen de 90 pm (Sepharose Fast Flow, Sepharose 4 Fast Flow, Sepharose XL). Une résine particulièrement préférée est la résine Sepharose Fast Flow, comprenant des billes à 6% d'agarose réticulé d'un diamètre moyen de 90 pm (distribution de 45 à 165 pm). Les groupements DEAE sont attachés aux billes de gel d'agarose, avantageusement par des liaisons éther. On parle alors d'utiliser une résine DEAE-Sepharose®, qui est une résine préférée pour ta deuxième étape de chromatographie d'échange d'anions de l'étape iii). Etape iv) La quatrième étape d'obtention de la solution de protéine C préalablement purifiée à partir du cryosurnageant du plasma est une troisième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel de polymère de méthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diméthylaminoéthanol (DMAE). Cette troisième étape de chromatographie d'échange d'anions permet de séparer la protéine C du facteur X et d'autres protéines résiduelles (inhibiteur de trypsine inter- alpha, fibrinogène, fibronectine, facteur II, facteur IX, etc...). Elle repose sur l'utilisation d'une résine ayant pour matrice un gel de polyméthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements DMAE. Avantageusement, le gel est un copolymère de méthacrylate et se présente sous ta 15 forme de billes d'un diamètre de 20 à 40 pm (Fractogel® (S)) ou de 40 à 90 pm (Fractogel® (M)). En outre, la résine est de préférence « tentaculaire », c'est-à-dire que les groupements DMAE sont de préférence attachés au gel de polymère de méthacrylate réticulé par l'intermédiaire de longues chaines de polymère linéaires appelées « tentacules », 20 permettant une meilleure accessibilité des groupements aux protéines comprises dans la solution à purifier. Les tentacules sont avantageusement un polymère linéaire d'acrylamide comprenant 15 à 50 unités d'acrylamide. Les tentacules sont avantageusement liées de façon covalente à des groupements hydroxyles du squelette de polymère de méthacrylate réticulé. 25 Une résine particulièrement préférée est la résine Fractogel® EMD DMAE, constituée d'un copolymère d'oligoéthylèneglycol, de glycidylméthacrylate, et de pentaérythroldiméthacrylate, auquel sont greffées des tentacules, constituées de chaines d'acrylamide polymérisé avec une longueur de 15 à 50 unités d'acrylamide. Un nombre moyen de 30 groupements DMAE sont liés de façon covalente à chacune des 30 tentacules. Etape v) La cinquième étape d'obtention de la solution de protéine C préalablement purifiée à partir du cryosurnageant du plasma est une étape de chromatographie d'affinité utilisant une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés 35 des molécules d'héparine, ou une étape de chromatographie échangeuse de cations utilisant une résine ayant pour matrice un gel de polymère de méthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements sulfoisobutyle. Cette étape permet de concentrer la protéine C et réduit les contaminants résiduels de la fraction obtenue à l'étape précédente. Dans un premier mode de réalisation, elle repose sur l'utilisation d'une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés des molécules d'héparine. Avantageusement, le gel d'agarose est un gel de 4 à 6% d'agarose réticulé, notamment d'environ 6% d'agarose réticulé, obtenu par réticulation d'agarose avec de l'épichlorohydrine et se présente sous forme de billes d'un diamètre de 15 à 165 pm (Sepharose®), notamment d'un diamètre moyen de 30 à 100 pm, en particulier d'un diamètre moyen de 90 pm (Sepharose Fast Flow, Sepharose 4 Fast Flow, Sepharose XL). Une résine particulièrement préférée est la résine Sepharose CL-6B, comprenant des billes à 6% d'agarose réticulé d'un diamètre moyen de 90 pm (distribution de 45 à 165 Pm). Les molécules d'héparine peuvent être des molécules d'héparine porcine, en particulier de l'héparine porcine de ta muqueuse intestinale. Elles sont attachées aux billes de gel d'agarose par une liaison covalente, qui peut être obtenue par différentes réactions chimiques, par exemple par amination réductrice (notamment résine Heparin Sepharose 6 Fast Flow de GE Healthcare Biosciences), par un procédé utilisant du CNBr (notamment résine Heparin Sepharose CL-6B de Pharmacia Biotech), du NHS (notamment résine Heparin Sepharose High Performance ou HiTrap Heparin de Pharmacia Biotech), de l'épichlorohydrine (notamment résine Heparin Agarose de Sigma), ou un monoaldéhyde (notamment résines Hep-SuperFlowlm, Hep-Super Flow Plus de Sterogene). Des résines particulièrement préférées sont les résines Heparin Sepharose 6 Fast Flow (6% agarose réticulé, billes de diamètre moyen de 90 pm, liaison de l'héparine porcine de la muqueuse intestinale par amination réductrice) et Heparin Sepharose CL-6B (6% agarose réticulé, billes de diamètre moyen de 90 pm, liaison de l'héparine porcine de la muqueuse intestinale par un procédé CNBr) de GE Healthcare Biosciences, en particulier la résine Heparin Sepharose CL-6B. Dans un deuxième mode de réalisation, l'étape v) repose sur l'utilisation d'une résine ayant pour matrice un polymère de méthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements sulfoisobutyle. Avantageusement, le gel est un copolymère de méthacrylate et se présente sous la forme de billes d'un diamètre de 20 à 40 pm (Fractogel® (S)) ou de 40 à 90 pm (Fractogel® (M)). En outre, la résine est de préférence « tentaculaire », c'est-à-dire que tes groupements sulfoisobutyle sont de préférence attachés au gel de polymère de méthacrylate réticulé par l'intermédiaire de longues chaînes de polymère linéaires appelées « tentacules », permettant une meilleure accessibilité des groupements aux protéines comprises dans la solution à purifier. Les tentacules sont avantageusement un polymère linéaire d'acrylamide comprenant 15 à 50 unités d'acrylamide. Les tentacules sont avantageusement liées de façon covalente à des groupements hydroxyles du squelette de polymère de méthacrylate réticulé. Une résine particulièrement préférée est la résine Fractogel® EMD S03", constituée d'un copolymère d'oligoéthylèneglycot, de glycidylméthacrylate, et de pentaérythroldiméthacrylate, auquel sont greffées des tentacules, constituées de chaines d'acrylamide polymérisé avec une longueur de 15 à 50 unités d'acrylamide. Un nombre moyen de 30 groupements sulfoisobutyle sont liés de façon covalente à chacune des tentacules. Autres procédés de purification préalable préférés d'une solution de protéine C d'origine plasmatique La solution de protéine C préalablement purifiée peut également être obtenue par purification des fractions obtenues à l'issue des étapes i), ii), iii), ou iv) du procédé décrit ci-dessus, en mettant en oeuvre les étapes de purification additionnelles suivantes : - purification à partir de la fraction obtenue à l'issue de l'étape i) : étapes ii), iii), iv) et y), - purification à partir de la fraction obtenue à t'issue de l'étape ii) : étapes iii), iv) et v), - purification à partir de la fraction obtenue à l'issue de l'étape iii) : étapes iv) et y), - purification à partir de la fraction obtenue à t'issue de l'étape iv) : étape v). Solution de protéine C recombinante Dans un autre mode de réalisation, la solution de protéine C peut avoir été préalablement purifiée à partir d'une solution de protéine C recombinante. Par « recombinante », on entend qu'une cassette d'expression de la protéine C, avantageusement humaine, est introduite dans un hôte hétérologue (c'est-à-dire qui n'exprime pas naturellement la protéine C d'intérêt). La protéine C est alors produite par l'hôte hétérologue. Cet hôte peut être une simple cellule de production (procaryote ou eucaryote), ou bien un hôte multicellulaire transgénique, notamment animal ou végétal. Etapes b) et c) : deux étapes de nanofiltration successives La solution de protéine C préalablement purifiée fournie à l'étape a) du procédé selon l'invention est alors soumise aux deux étapes successives b) et c) de nanofittration décrites ci-dessous. Par « nanofiltration », on entend une étape de filtration à travers un « nanofiltre », c'est-à-dire à travers un filtre dont la taille moyenne des pores et de l'ordre de quelques nm à quelques dizaines de nm. Celle-ci peut notamment être comprise entre 5 et 80 nm. Pour chaque filtre, la taille des pores suit une distribution de type gaussienne, centrée autour d'une taille de pores moyenne (ou porosité moyenne). Selon le filtre, la largeur de la distribution de taille des pores peut être plus ou moins importante. De préférence, on utilisera dans le cadre de la présente invention des filtres ayant une largeur de distribution de la taille des pores ta plus étroite possible. Avantageusement, la taille des pores varie d'au plus quelques nm (par exemple au plus 6 nm, au plus 5 nm, au plus 4 nm, au plus 3 nm, ou au plus 2 nm) autour de la taille moyenne. Pour une taille moyenne de N nm, la taille des pores est alors de N±6 nm, N±5 nm, N±4 nm, N±3 nm, ou N±2 nm. Selon les fabricants, la porosité moyenne (ou taille moyenne des pores) du filtre peut être définie de différentes façon : 1) par une taille moyenne de pores en nm (éventuellement associée à une largeur de distribution), 2) par tes virus retenus et/ou non retenus par le filtre, ou 3) par une valeur seuil de poids moléculaire. Dans te 1' cas, il est simple de constater si te filtre peut ou non être utilisé dans la 1ère ou la deuxième étape de nanofiltration du procédé selon l'invention. De tels filtres, définis par une taille moyenne de pores en nm, incluent les filtres de la gamme Planova®, constitués d'une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammoniumn et commercialisés par Asahi-Kasei (Planova® 15N, Planova® 20N, Planova® 35N, Planova® 75N), et ceux de la gamme Ultipor®, qui ont une membrane de polyfluorure de vinylidène modifié à ta surface et sont commercialisés par Pall (DV20 et DV50). Dans le 2ème cas, lorsque la porosité moyenne du filtre est définie par les virus retenus par le filtre, on considèrera que la taille moyenne des pores du filtre correspond à la taille du plus petit virus retenu par le filtre. De tels filtres, définis par les virus retenus par le filtre, incluent les filtres Viresolve® NFP (rétention des parvorirus, membrane en polyfluorure de vinylidène modifié à la surface) et Viresolve® NFR (rétention des rétrovirus, membrane en polyéthersulfone) commercialisés par Millipore, et Virosart® CPV (rétention du parvovirus canin, membrane à double couche de polyéthersulfone) commercialisé par Sartorius. Dans le 3ème cas, lorsque la porosité moyenne du filtre est définie par un seuil de poids moléculaire, la taille moyenne des pores peut être estimée en fonction de ta taille d'une protéine globulaire ayant pour poids moléculaire la valeur seuil donnée. De tels filtres, définis par un seuil de poids moléculaire, incluent les filtres Viresolve® 70 (seuil de 70 kDa) et Viresolve® 180 (seuil de 180 kDa) avec une membrane en polyfluorure de vinylidène modifié à la surface et commercialisés par Millipore, et les filtres Omega® 100 (seuil de 100 kDa) et Omega® 300 (seuil de 300 kDa) avec une membrane en polyéthersulfone et commercialisés par Pall. Ces filtres sont généralement répartis en deux catégories, selon qu'ils sont capables ou non d'éliminer les plus petits virus non enveloppés comme tes parvovirus ou te virus de l'hépatite A : - filtres éliminant efficacement les virus non enveloppés ayant une taille entre 18 et 30 nm (parvovirus, virus de l'hépatite A) : Planova® 15N, Planova® 20N, Ultipor® DV20, Viresolve® NFP, Virosart® CPV, Viresolve® 70, et Omega® 100 ; - filtres destinés à l'élimination de plus gros virus non enveloppés : Planova® 35N, Planova® 75N, Viresolve® NFR, Viresolve® 180, et Omega® 300. Les caractéristiques des différents filtres mentionnés ci-dessus sont résumées dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1. Caractéristiques d'exemples de nanofiltres susceptibles d'être utilisés dans le cadre du procédé selon l'invention. Fabricant Filtre Membrane Définition de Commentaires la porosité Asahi-Kasei Planova® 15N fibres creuses de 15 ± 2 nm Rétention des virus non cellulose enveloppés tes plus petits régénérée au (parvovirus) cuprammonium Planova® 20N 19 ± 2 nm Planova® 35N 35 ± 2 nm Destinés à l'élimination de plus gros virus non enveloppés Planova® 75N 72 ± 2 nm Pall Ultipor® DV20 polyfluorure de Rétention Rétention des virus non vinylidène modifié d'une enveloppés les plus petits à la surface particule de (parvovirus) nm Ultipor® DV50 Rétention Destinés à l'élimination d'une de plus gros virus non particule de enveloppés 50 nm Omega® 100 polyéthersulfone Seuil de 100 Rétention des virus non kDa enveloppés les plus petits (parvovirus) Omega® 300 de Destinés à l'élimination Seuil kDa 300 de plus gros virus non enveloppés Miltipore Viresolve® polyfluorure de Rétention des Rétention des virus non NFP vinylidène modifié parvovirus enveloppés les plus petits à la surface (parvovirus) Fabricant Filtre Membrane Définition de Commentaires la porosité Viresolve® potyéthersulfone Rétention des Destinés à l'élimination NFR rétrovirus de plus gros virus non enveloppés Viresolve® 70 polyfluorure de Seuil de 70 Rétention des virus non vinytidène modifié kDa enveloppés les plus petits à ta surface (parvovirus) Viresolve® 180 Seuil de 180 Destinés à l'élimination kDa de plus gros virus non enveloppés Sartorius Virosart® CPV double couche de Rétention Rétention des virus non polyéthersulfone parvovirus enveloppés tes plus petits canin (parvovirus) Les étapes a) et b) successives de nanofiltration sont destinées à assurer la sécurité virale de la solution de protéine C, en particulier vis-à-vis des petits virus non enveloppés, comme le parvovirus B19 ou le virus de l'hépatite A. Elles permettent de préférence une réduction du titre viral d'au moins 4 logs décimaux (exigences réglementaires), de préférence au moins 5 logs décimaux, voire au moins 6 logs décimaux. Elles sont également destinées à assurer la sécurité de la solution de protéine C concernant les agents transmissibles non conventionnels (ATNC) comme tes prions. Elles permettent de préférence une réduction de la quantité de protéines prion d'au moins 3 logs décimaux. Etape b) : 1èoe nanofiltration à travers un nanofiltre ayant une taille moyenne de pores comprise entre environ 15 et environ 35 nm La première étape de nanofiltration est réalisée en utilisant un filtre ayant une taille moyenne de pores comprise entre environ 15 et environ 35 nm, de préférence d'environ nm. De tels filtres incluent notamment les filtres Planova® 15N, Planova® 20N, Ultipor® DV20, Viresolve® NFP, Virosart® CPV, Viresolve® 70, Omega® 100 (tous destinés à l'élimination des plus petits virus non enveloppés), et également les filtres Planova® 20 35N et Viresolve® 180, destinés à l'élimination de plus gros virus non enveloppés mais dont la porosité est encore relativement faible. De préférence, le premier nanofiltre a une taille moyenne de pores d'environ 20 nm, est peut être choisi parmi les filtres Planova® 20N, Ultipor® DV20, Viresolve® NFP, 25 Virosart® CPV, Viresolve® 70, Omega® 100. Avantageusement te premier nanofiltre est une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammonium ayant une taille de pores d'environ 20 nm, comme le filtre Planova® 20N. De plus ou alternativement, la première étape de nanofiltration est effectuée à : a) une pression comprise entre 700 et 900 mbar, avantageusement entre 750 et 850 mbar, notamment d'environ 800 mbar ; et/ou b) une température comprise entre 10 et 30 °C, avantageusement entre 15 et 25 °C, notamment d'environ 20°C. Ces paramètres ont en effet été trouvés optimaux par tes inventeurs. Concernant la pression, il est généralement recommandé de ne pas utiliser une pression supérieure à 1 bar. L'utilisation d'une pression inférieure ou égale à 900 mbar ajoute une marge de sécurité. Par ailleurs, afin d'optimiser le débit et donc la durée de l'étape de nanofiltration, la pression utilisée est de préférence proche de la valeur limite supérieure souhaitée (900 mbar), et donc avantageusement supérieure ou égale à 700 mbar. Concernant la température, une température comprise entre 10 et 30 °C, proche de la température ambiante, est avantageuse car facile à maintenir et sans coût supplémentaire (de chauffage ou de refroidissement du système et du produit). De plus, une température supérieure à 30 °C pourrait potentiellement avoir un effet de dégradation sur ta protéine C, tandis qu'une température inférieure à 10°C pourrait potentiellement générer une viscosité augmentée et diminuer la filtrabilité de la solution. Etape c) : 2ème nanofiltration à travers un nanofiltre ayant une taille moyenne de pores 25 inférieure ou égale à environ 20 nm, avantageusement inférieure ou égale à environ 15 nm La deuxième étape de nanofiltration est réalisée en utilisant un filtre ayant une taille moyenne de pores inférieure ou égale à environ 20 nm. De tels filtres incluent notamment les filtres Planova® 15N, Planova® 20N, Ultipor® 30 DV20, Viresolve® NFP, Virosart® CPV, Viresolve® 70, Omega® 100 (tous destinés à l'élimination des plus petits virus non enveloppés). Bien entendu, la taille moyenne de pores du filtre utilisé pour la deuxième étape de nanofiltration est inférieure ou égale à celle du filtre utilisé pour la première étape de nanofiltration. 35 Avantageusement, le filtre utilisé pour la deuxième étape de nanofiltration est un filtre dont la porosité est définie sous la forme d'une taille moyenne de pores en nm. En particulier, ce filtre est de préférence une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammonium ayant une taille de pores d'environ 15 nm à environ 20 nm, comme les filtre Planova® 15N et Planova® 20N. De préférence, la deuxième étape de nanofiltration est réalisée en utilisant un filtre ayant une taille moyenne de pores inférieure ou égale à environ 15 nm, et notamment d'environ 15 nm, avantageusement le deuxième nanofiltre est une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammonium ayant une taille de pores d'environ 15 nm, comme le filtre Planova® 15N. Il convient de noter que les filtres utilisés tors de la première et de la deuxième étape de nanofiltration peuvent être de nature différente (composition de membrane distincte). Dans ce cas, la membrane du filtre utilisé pour la deuxième étape de nanofiltration est de préférence une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammonium (filtres Planova® 15N et Planova® 20N), la membrane du filtre utilisé pour la 1 ère étape de nanofiltration étant choisie parmi d'autres types de membranes, et notamment tes membranes suivantes : polyfluorure de vinylidène modifié à la surface (filtres Ultipor® DV20, Viresolve® NFP, Viresolve® 70 et Viresolve® 180), polyéthersulfone (Omega® 100, Omega® 300, Viresolve® NFR), ou double couche de polyéthersulfone (filtre Virosart® CPV). De plus ou alternativement, la deuxième étape de nanofiltration est effectuée à : a) une pression comprise entre 300 et 900 mbar, entre 300 et 800 mbar, entre 300 et 700 mbar, entre 300 et 600 mbar, avantageusement entre 350 et 550 mbar, notamment d'environ 450 mbar ; et/ou b) une température comprise entre 10 et 30 °C, avantageusement entre 15 et 25 °C, notamment d'environ 20°C. Ces paramètres ont en effet été trouvés optimaux par les inventeurs. Concernant ta température, tes raisons sont les mêmes que celles mentionnées ci-dessus pour la première étape de nanofiltration. Concernant ta pression, si celle-ci pourrait également être avantageusement comprise entre 700 et 900 mbar, pour les raisons exposées ci-dessus pour la première étape de nanofiltration, lorsque les deux étapes de nanofiltration sont réalisées en série, sans récupération intermédiaire du produit de ta première nanofiltration, te débit final moindre obtenu à la fin de la première étape de nanofiltration ne permet pas d'appliquer une pression aussi forte au deuxième nanofiltre. Une pression comprise entre 300 et 600 mbar, avantageusement entre 350 et 550 mbar, est alors généralement obtenue.Etapes b) et c) : optimisation du rapport DF/DI et du rendement en protéine C. Outre la concentration en protéine C de ta solution préalablement purifiée, un autre paramètre qui influence le rapport DF/ DI et le rendement en protéine C des deux étapes de nanofiltration est le volume de charge par surface (rapport du volume de solution utilisé à la surface du filtre) utilisé. En effet, plus il augmente, et plus de rapport DF/DI a tendance à diminuer. A l'inverse, plus il augmente, plus la quantité totale de protéine C augmente, et plus te rendement en protéine C augmente. Afin d'obtenir un rapport DF/DI supérieur à 25% et un rendement acceptable en protéine C, le volume de charge par surface est de préférence compris entre 4 et 24 l/m2 (soit entre 4.103 et 24.103 ml/m2). Du fait de l'importance à ta fois de la concentration en protéine C et du volume de charge par surface des étapes de nanofiltration sur le rapport DF/DI et sur le rendement final en protéine C, un autre paramètre d'intérêt est le multiple de ces deux valeurs : concentration en protéine C (en UI/ml) x volume de charge par surface (en ml/m2), donnant ainsi une valeur en Ul/m2, que nous appellerons ici « concentration de charge par surface ». Au vu des valeurs spécifiées pour la concentration en protéine C et pour te volume de charge par surface, la concentration de charge par surface est comprise entre 8.103 et 2,4.106 Ul/m2. Cependant, afin de garantir un rapport DF/DI supérieur à 25%, la concentration de charge par surface est avantageusement inférieure ou égale à 106 Ul/m2. De plus, afin de garantir un bon rendement en protéine C à l'issue des deux étapes de nanofiltration, la concentration de charge par surface est avantageusement supérieure ou égale à 7.104 Ul/m2. Ainsi, avantageusement, la concentration de charge par surface est avantageusement comprise entre 8.103 et 106 Ul/m2, entre 7.104 et 2,4.106 Ul/m2, ou encore plus avantageusement entre 7.104 et 106 Ul/m2. Solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'invention L'invention concerne en outre une solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'invention. Par rapport aux solutions de protéine C d'origine plasmatiques purifiées par au moins une étape de chromatographie comme te médicament Protexel (non nanofiltré) ayant obtenu une AMM le 14 décembre 2001 et commercialisé en France à partir du 17 avril 2002, ou comme celle décrite dans Radosevich et al-2003, ta solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'invention possède une activité spécifique en protéine C plus élevée. L'activité spécifique de Protexel non nanofiltré (correspondant à l'AMM du 14 décembre 2001) est d'environ 200 à 210 Ul/mg de protéines totales, et celle de la solution de protéine C obtenue dans Radosevich et al-2003 est d'environ 215 Ul/mg de protéines totales. Celle de la solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'invention est d'au moins 230 Ul/mg de protéines totales, avantageusement au moins 235 Ul/mg de protéines totales, au moins 240 Ul/mg de protéines totales, au moins 245 Ul/mg de protéines totales, plus avantageusement au moins 250 Ul/mg de protéines totales, au moins 255 Ul/mg de protéines totales, au moins 260 Ul/mg de protéines totales, voire d'au moins 265 Ul/mg de protéines totales.40 La solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'invention est également caractérisée par une faible activité spécifique en contaminants comme le facteur II, le facteur VII, et la protéine S: - facteur II : activité spécifique inférieure à 25x103 Ul/mg de protéines totales, - facteur VII : activité spécifique inférieure à 0,11 Ul/mg de protéines totales, - protéine S : activité spécifique inférieure à 0,15 Ul/mg de protéines totales, de préférence inférieure à 0,14 Ul/mg de protéines totales, inférieure à 0,13 Ul/mg de protéines totales, inférieure à 0,12 Ul/mg de protéines totales, inférieure à 0,11 Ul/mg de protéines totales. En particulier, la solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'invention possède un rapport d'activité spécifique (protéine S/protéine C) inférieur à 10-3, avantageusement inférieur à 0,9x10-3 ; inférieur à 0,8x10-3 ; plus avantageusement inférieur à 0,7x103 ; inférieur à 0,6x10-3 ; encore plus avantageusement inférieur à 0,5x103. De plus, ta solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'invention comprend une teneur en IgM inférieure à 1 mg/g de protéines totales, avantageusement inférieure à 0,9 mg/g de protéines totales, inférieure à 0,8 mg/g de protéines totales, inférieure à 0,7 mg/g de protéines totales, inférieure à 0,6 mg/g de protéines totales, plus avantageusement inférieure à 0,5 mg/g de protéines totales. La solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par te procédé de préparation selon l'invention comprend également de préférence une teneur en protéine C4 inférieure à 0,05 g/g de protéines totales, avantageusement inférieure à 0,04 g/g de protéines totales, voire inférieure à 0,03 g/g de protéines totales. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant ta solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé 30 de préparation selon l'invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. La solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'invention ou ta composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solution injectable. 35 Alternativement, elle peut en outre avoir été lyophilisée et se présenter sous forme de poudre à reconstituer. En particulier, une formulation appropriée comprend séparément une poudre contenant 500 UI de protéine C et un solvant (10 ml d'eau notamment) de façon à former, après reconstitution, une solution de protéine C à une concentration de 50 UI/ml. Applications thérapeutiques L'invention concerne également une solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par te procédé de préparation selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament. En particulier, celle-ci peut être utilisée en thérapie de substitution des déficits congénitaux ou acquis en protéine C, notamment dans la prévention ou le traitement des thromboses associées à un déficit congénital ou acquis en protéine C. En particulier, elle est indiquée dans : - Les déficits constitutionnels sévères en protéine C, homozygotes ou hétérozygotes composites du nouveau-né responsables d'une thrombose veineuse sévère et massive et de l'adulte lors du relais héparine/anti-vitamine K pour éviter la nécrose cutanée ; et - La prévention de la thrombose chez l'hétérozygote lors d'interventions chirurgicales et de césariennes, en cas d'inefficacité ou de contre-indication du traitement héparine/antivitamine K. La posologie utile dépend du niveau de base de protéine C et de l'indication, et peut notamment être ta suivante : - Dans le déficit constitutionnel sévère en protéine C o A ta phase aiguë (purpura fulminans néonatal) : 240 Ul /kg/jour administrées en 4 fois dès la confirmation diagnostique afin de maintenir un taux plasmatique résiduel minimum de 25 % de protéine C. La dose quotidienne peut être ensuite réduite progressivement, jusqu'à injection de 100 Ul /kg/jour à adapter en fonction du taux de protéine C et des marqueurs d'activation de l'hémostase (taux de D-dimères ou de fragment 1+2 de la prothrombine). Le traitement sera poursuivi jusqu'à cicatrisation complète des lésions cutanées ou pendant au moins 15 jours tors de l'introduction du traitement par les antivitamines K. o Lors d'épisodes thrombotiques : 100 Ul /kg/jour en 1 à 2 perfusions quotidiennes. Le traitement doit être poursuivi tant que l'INR (International Normalized Ratio) n'a pas atteint un niveau suffisant (>2,5) ou que l'amélioration clinique n'est pas constatée. o En traitement préventif : 100 Ul/kg/jour 1 à 3 fois par semaine. En cas de situation à risque, les doses à injecter peuvent être de 100 Ul /kg/jour administrées en 1 à 2 doses quotidiennes (en association éventuelle avec les antivitamines K). - Dans le déficit constitutionnel modéré chez l'hétérozygote La posologie sera adaptée en fonction de différents paramètres, notamment te taux initial de protéine C, la récupération et la durée de vie déterminées ou attendues chez le patient, l'âge et la nature de l'intervention chirurgicale. A titre indicatif, 50 à 100 Ul/kg/jour en 1 à 2 injections quotidiennes. Les exemples qui suivent visent à illustrer ta présente invention. EXEMPLES Exemple 1 : Effet des deux étapes de nanofiltration sur la composition du produit et efficacité de la rétention virale Une analyse des risques ou conséquences potentiels générés par l'ajout de la nanofiltration 20-15 nm au procédé de production de PROTEXEL non nanofiltré a fait apparaitre les risques suivants : - Rétention sur te filtre, avec deux conséquences possibles : o Diminution de la teneur en principe actif, o Elimination ou diminution de la teneur en protéines accompagnantes. - Modification des caractéristiques structurales et fonctionnelles de la Protéine C, - Risque thrombogène : activation potentielle des facteurs de coagulation, susceptible de conduire à des effets indésirables lors de l'administration (évènements thromboemboliques), - Réduction virale inférieure à 4logio (exi gence réglementaire) susceptible d'entrainer une amélioration insuffisante de ta sécurité biologique du produit. Chacun de ces risques/conséquences potentiels ont été analysés en comparant te produit Protexel non nanofiltré au même produit ayant subi une double nanofiltration à 20 puis 15 nm. Matériels et méthodes Préparation de la solution de protéine C préalablement purifiée La solution de protéine C préalablement purifiée (Protexel non nanofiltré) a été préparée à partir de cryosurnageant du plasma par un procédé comprenant : - une première étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine DEAE-Sephadex® ; - une étape de traitement solvant-détergent en présence de 1% (poids/volume) de Polysorbate 80 et 0,3% (volume/volume) de TnBP pendant au moins 7 heures à 25±1°C; - une deuxième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine DEAE-Sepharose® Fast Flow (FF) ; - une troisième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine Fractogel® EMD DMAE ; et - une étape de chromatographie d'affinité utilisant une résine HéparineSepharose®. Nanofiltration Trois lots de référence (Protexel non nanofiltré) n'ont pas été nanofiltrés : 09L12391, 09L06161, 09L09766. Trois autres lots (lots de validation) ont été nanofiltrés (Protexel nanofittré) comme décrit ci-dessous : LI1, LI2 et LI3. L'étape de nanofiltration est réalisée sur une séquence de filtres ASAHI PLANOVA en cellulose régénérée, de porosité 20 nm pour le premier filtre et 15 nm pour le filtre final. La surface filtrante de chacun des deux filtres est de 1m2. La filtration 20 nm est réalisée selon les conditions standard suivantes: - Pression transmembranaire : 800 +/- 100 mbar - Température de travail: 20+/- 5 °C La filtration 15 nm est réalisée selon les conditions standard suivantes: - Pression transmembranaire : 450 +/- 100 mbar - Température de travail: 20 +/- 5 °C La charge protéique injectée sur les nanofiltres n'est pas un paramètre standard critique dans les limites de la taille de lot définie pour le procédé. Avant utilisation, tous les filtres sont rincés à l'eau PPI. Après filtration, la séquence est rincée avec du tampon ; ta solution de rinçage est mélangée au filtrat. Pendant la filtration, la pression et la température sont enregistrées. L'intégrité des filtres est testée avant et après filtration. Dosage des protéines accompagnantes Afin de vérifier l'impact de ta nanofiltration sur le profil en protéines accompagnantes (potentielle rétention) et d'établir la comparabilité à ce stade, les trois lots de validation de protéine C nanofiltrée ainsi que trois lots de référence fabriqués selon le procédé en vigueur ont fait l'objet des analyses complémentaires suivantes : - IgM, - ITI (Inter-alpha-Trypsine Inhibiteur), - Fraction C4 du complément, - Protéine S (totale), - Facteur II, - Facteur VII, - Facteur IX, Le choix de ces protéines a été dicté par les connaissances acquises sur ce produit et les données de validation du dossier d'AMM PROTEXEL en vigueur. Ces protéines ont été quantifiées selon des méthodes Ph. Eur. 2.7.1 (immunonéphélémétrie pour la fraction C4 du complément, méthode Elisa pour les autres protéines). Electrophorèse des protéines accompagnantes (SDS-PAGE) Afin de vérifier l'impact de la nanofiltration sur les caractéristiques structurales et fonctionnelles du produit et d'établir ta comparabilité avant et après nanofiltration, les trois lots de validation de protéine C nanofiltrée (L11, L12 et L13) ont fait l'objet d'une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE). Les profils obtenus ont été comparés à ceux obtenus pour des lots de référence non nanofi ltrés (09L12391, 09L06161, 09L09766). Résultats Conformité aux paramètres de nanofiltration Les études menées lors du développement à échelle laboratoire (cf section 3.2.S.2.6) ont démontré que les paramètres de nanofiltration et leurs valeurs cibles attendues étaient les suivants : - Pression transmembranaire (filtre 15 nm) :450 +/- 100 mbar - Température de travail : 20°C +/- 5°C Aucun paramètre critique n'est observé pour cette étape. La limite de colmatage des nanofiltres n'a jamais été atteinte malgré une charge protéique testée à l'échelle pilote cinq fois supérieure à celle appliquée à l'échelle industrielle. Le Tableau 2 ci-après présente tes paramètres de l'étape de nanofiltration obtenus pour les trois lots de validation. Tableau 2: Résultats des paramètres de nanofiltration Paramètre Critère LI1 LI2 L13 d'acceptation Pression 450 +/- 100 430 480 502 transmembranaire 15 nm (mbar) Température de 15 - 25 20 - 21 20 - 21 20 - 21 travail (°C) Débit initial (11h) - 15 19 17 Débit final (111-1) - 14 17 16 soit 93 % du soit 89 % du soit 94 % du débit initial débit initial débit initial Les trois lots de validation ont été fabriqués conformément aux valeurs attendues. Concentration et activité spécifique en protéine C Les résultats obtenus pour les trois lots de validation de produit nanofiltré sont présentés dans le Tableau 3. Ces résultats sont comparés à un bilan qualité des 9 lots non nanofiltrés fabriqués entre 2008 et 2011 selon le procédé de production sans étapes de nanofiltration. Aucune différence notable n'est observée entre les lots nanofiltrés et les lots non nanofiltrés, excepté pour les protéines totales et par conséquent l'activité spécifique (protéine C/ protéines totales). Les résultats inférieurs en protéines totales obtenus pour les lots de validation nanofiltrés (0,19 g/l en moyenne versus 0,25 g/l en moyenne pour les lots de référence non nanofiltrés) sont expliqués par le profil en protéines accompagnantes obtenu pour ces lots (cf ci-dessous). Tableau 3. Résultats des lots nanofiltrés et comparaison à un bilan qualité de lots non nanofiltrés. Contrôle Méthode Critère Lots de validation nanofiltrés Lots non nanofiltrés (Bilan qualité acceptation 2008 à 2011) LI1 L12 LI3 Moyenne (SD) n = 9* ESSAIS Protéines totales (g/l) Ph. Eur. 0 10 - 0,40 , 0,18 0,20 0,19 0,25 (0,01)** ' (2.5.33 - 1) DOSAGES Protéine C (UI/ml) Chromogéni que 40 - 60 49 53 52 50 (2,8)** Activité spécifique (UI/mg de protéines totales) Protéine C / Protéines totales > 100 272 265 274 204 (5,7)** * Totalité des lots fabriqués entre 2008 et 2011 selon le procédé décrit à l'AMM PROTEXEL 50 Ul/ml en vigueur (non nanofiltrés) ** Pour ces paramètres, la moyenne présentée est celle établie sur les 2 derniers lots 2010-2011 contrôlés, comme pour les lots de validation, selon les nouvelles méthodes de dosage des protéines totales (Ph.Eur. 2.5.33 - 3) et de la protéine C (chromogénique) implémentées en 2010 suite à autorisation Afssaps du 25 juillet 2010.25 Comparabilité Biopharmaceutique du produit fini Electrophorèse des protéines accompagnantes (SDS-PAGE) La Figure 1 présente les profils obtenus en conditions non réductrices et réductrices, après coloration au bleu de Coomassie ou au nitrate d'argent (AgNO3). Les lots de validation nanofiltrés présentent une bande majoritaire à 56 kDa correspondant à ta protéine C et des bandes de plus faible intensité à 61 et 58 kDa qui pourraient correspondre au précurseur de ta protéine C et à la protéine C activée. Ces mêmes bandes, d'intensité comparables, sont retrouvées pour le produit non nanofiltré (lots de référence). Les lots de référence présentent en outre des bandes correspondant à des protéines de hautes masses moléculaires, non détectées dans le produit nanofiltré. La nanofiltration, comme cela était attendu, a entraîné l'élimination des protéines de masses moléculaires élevées. L'étape de nanofiltration ne génère pas de nouvelles bandes marqueurs d'une dégradation éventuelle. D'autre part, les résultats démontrent la reproductibilité entre les trois lots de validation nanofiltrés. Ces résultats montrent que l'ajout de ta nanofiltration est sans impact sur les bandes correspondant au principe actif (Protéine C). Dosage des protéines accompagnantes Les résultats bruts sont présentés dans le Tableau 4 suivant. Tableau 4: Comparaison des lots de validation nanofiltrés aux lots de référence non nanofiltrés. Protéines accompagnantes - résultats bruts (valeur minimale/moyenne/valeur maximale) Analyse Lots de validation, nanofiltrés Lots de référence, non nanofiltrés Valeur Moyenne Valeur Valeur Moyenne Valeur minimale maximale minimale maximale IgM (mg/g) 0,1 0,3 0,4 2,0 2,4 2,9 ITI (mg/g) 0,6 1,2 1,7 1,5 3,9 6,9 C4 (g/g) Les autres étapes (inactivation virale par traitement solvant-détergent et étapes contributives de chromatographie) permettent au total d'obtenir un facteur de réduction virale d'au moins 6 logs pour la plupart des virus (seule exception, le virus de l'hépatite A, VHA, avec plus de 4,7 logs). Tableau 6: Etudes de validation virale du procédé de préparation (facteur de réduction virale en logarithmes décimaux) Virus ajoutés Virus enveloppés Virus non enveloppés VIH-1 Sindbis BVDV PRV VSV SV40 VHA PPV Modèle pour VIH VHC VHC Virus ADN, Virus de Virus très VHA Parvovirus B19 enveloppé la rage résistant (VHB) (1) Etapes Traitement k 4.8 k 4.8 k 5.4 k 4.1 6.2 N/A N/A N/A spécifiques solvant-détergent (S/D) Nanofiltration à 4.5 NT k 5.9 NT NT 5.4 k 4.7 6.6 20 puis 15 nm Etapes Chromatographie 2.2 1.8 2.2 3.4 2.1 1.7 NT NT contributives (DEAE Sephadex) Chromatographie 3.5 NT NT k 4.5 2.8 2.0 1.5 (2) 1.0 (2) (DEAE Sepharose) Capacité de réduction virale ?. 12.8 ?. 6.6 ? 13.5 ?. 8.6 9.0 7.4 ? 4.7 6.6 globale En gras: valeurs de réduction prises en compte dans le calcul de ta capacité de réduction globale (calculée en ajoutant les facteurs de réduction des étapes complémentaires dans leur mode d'action pour l'inactivation/l'élimination virale). Par virus, le facteur de réduction le plus élevé entre les deux étapes de chromatographie a été pris en compte. VIH : virus de l'immunodéficience humaine ; VHC : virus de l'hépatite C, BVDV : virus de la Diarrhée 5 Virale Bovine ; VHB : virus de l'hépatite B ; VSV : virus de la stomatite vésiculaire ; VHA : virus de l'hépatite A ; PPV : parvovirus porcin. N/A: non applicable - le traitement S/D n'est pas efficace contre les virus non enveloppés. NT: non tested. (1) SV-40 a une taille similaire au virus de l'hépatite B (VHB) (40-50 nm versus 42 nm). (iJ (2) Données de support. U1 1-1 Conclusions En conclusion, les analyses réalisées montrent que l'ajout d'une double étape de nanofiltration à 20 puis 15 nm permet d'obtenir un facteur de réduction virale d'au moins 4 logslo pour les petits virus enveloppés comme les virus de l'hépatite A (VHA) ou le parvovirus porcin. De plus, les lots nanofiltrés sont conformes aux spécifications en vigueur et qualitativement comparables à ceux non nanofiltrés. Les différences observées pour les protéines de hauts poids moléculaires (liées à l'action d'exclusion stérique de ta nanofiltration) et en protéine S, sont sans impact négatif sur ta qualité et l'activité de de la solution de protéine C administrée au patient, tout en permettant d'augmenter l'activité spécifique en protéine C du produit. Exemple 2: Influence de différents paramètres sur le rapport DF/DI et sur le rendement en protéine C Afin de définir tes bornes des paramètres critiques et clés des deux étapes de nanofiltration, l'impact de plusieurs paramètres (volume de charge en protéine C, concentration en protéine C, volume de chasse, pression d'alimentation sur le filtre 15N, température, pH et osmolalité de ta solution à filtrer, lot de matière première) sur le rendement en Protéine C et sur te rapport du débit final au débit initial (rapport DF/DI, qui définit te risque de colmatage lors de la nanofiltration) a été testé à une échelle 1/100 (nanofiltres d'une surface de 0,01 m2). Matériels et méthodes Matière première Les étapes de nanofiltration ont été réalisées sur une solution de protéine C préalablement purifiée (Protexel non nanofittré) a été préparée à partir de 25 cryosurnageant du plasma par un procédé comprenant : - une première étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine DEAE-Sephadex® ; - une étape de traitement solvant-détergent en présence de 1% (poids/volume) de Polysorbate 80 et 0,3% (volume/volume) de TnBP pendant au moins 7 heures à 30 25±1°C; - une deuxième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine DEAE-Sepharose® Fast Flow (FF) ; - une troisième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine Fractogel® EMD DMAE ; et 35 - une étape de chromatographie d'affinité utilisant une résine Héparine- Sepharose®. Filtres Les nanofiltres PLANOVA utilisés dans cette étude sont les suivants : 1) Planova® 20N (Ref : 20NZ-010; surface : 0,01 m2), 2) Planovae 15N (Ref : 15NZ-010; surface : 0,01 m2). Conditions imposées des étapes de nanofiltration - Séquence 20N-15N - Débit : 5 - 50 L/h - Pression : 150 - 800 mbar - Mesure de pression et de température en amont du filtre 15N - Conduite de la nanofiltration pilotée en débit selon une pression constante - Nanofiltration faite à température ambiante (15 - 25 °C) - Pas de préfiltration 0.2 pm - 0.1 pm. Paramètres analysés Les paramètres étudiés et leurs bornes hautes et basses sont ceux présentés dans le Tableau 7 ci-dessous. Tableau 7 : Récapitulatif des paramètres étudiés pour les étapes de nanofiltration. Paramètres unité Valeur basse Valeur haute Volume de charge par surface ml 40 240 Concentration en protéine C UI/ml 4 91 Volume de chasse par surface ml 8 24 Pression d'alimentation sur 15N mbar 150 600 Température °C 14 30 PH 6,5 8,0 Osmolalité mosmol/kg 200 360 Lot de matière première - NA NA Le plan d'expérience semi factoriel permet d étudier les réponses linéaires et les interactions simples entre les paramètres étudiés. Deux essais nommés « essais cibles » sont également ajoutés à des valeurs cibles correspondant à de la matière de départ non ajustée. Cette matière, bien que congelée, correspond aux caractéristiques d'un éluât CL6B issue d'un lot industriel et permet d'obtenir des valeurs se rapprochant du centre des bornes. Ces deux points permettent de vérifier la linéarité du modèle.25 Méthodes analytiques Les protéines totales ont été dosées par mesure de la DO à 280 nm. L'activité Protéine C a été mesurée par une méthode chromogénique. Le profil d'impuretés a été analysé par SDS-PAGE. Résultats Les facteurs de réponses étudiés sont : - DF/DI : rapport du débit final sur le débit initial. Ce rapport doit être supérieur à 25 % pour garantir une absence de colmatage tors du procédé. - Le rendement en protéine C, calculé à partir de l'activité en Protéine C avant et après nanofiltration. Il n'y a pas de critère d'acceptation pour le rendement mais celui-ci doit préférentiellement être te plus élevé possible. Les résultats sont montrés dans tes Tableaux 8 et 9 ci-dessous. Tableau 8 : valeurs des paramètres des essais réalisés pour le plan d'expériences Paramètre Paramètre 2 Paramètre 3 Paramètre 4 Paramètre 5 Paramètre Paramètre 7 Paramètre 8 6 Volume de Concentration Prot. C Pression Température Volume de pH produit Osmolalité Lot matière charge Ul/ml entrée 15N °C rinçage produit premiere ml mbar ml mOsm/kg N° N° essai run * 09PCNG147016 110 35,4 475 23,5 20 7,05 251 -1 ** 09PCNG147017 110 41,7 475 22 20 6.96 251 1 1 09PCNG147026 40 82,2 152 30,6 30 6,5 354 -1 2 09PCNG147030 217 101,1 159 29.6 8 6,49 209 1 3 09PCNG147021 240 3,1 151 14 30 6,56 349 1 4 09PCNG147019 40 2,4 155 13,6 8 6,52 199 -1 5 09PCNG147023 40 2,5 593 29.4 30 6.60 213 1 6 09PCNG147031 240 90,2 558 13.9 30 6,47 210 -1 7 09PCNG147025 40 91,6 578 30,6 8 8,03 205 -1 8 09PCNG147024 40 94,8 560 14,9 8 6,52 352 1 9 09PCNG147018 240 3,5 596 13,2 8 6.91 249 1 10 09PCNG147022 40 3,5 149 29.2 8 8,06 351 1 11 09PCNG147027 240 89,9 652 29.8 30 7,96 359 1 12 09PCNG147029 240 83,9 152 14.69 8 7,95 355 -1 13 09PCNG147028 240 2,3 600 29.1 8 6,55 353 -1 14 09PCNG147032 40 93,1 145 14.3 30 7,98 209 1 15 09PCNG147020 40 3 595 13,1 30 8,03 348 -1 16 09PCNG147033 240 2,7 151 29.1 30 8,01 208 -1 * : essai cible : éluât industriel (lot 09L00973) non ajusté ** : essai cible : éluât industriel (lot 09L02197) non ajusté. Tableau 9 : bilan analytique des essais Durée Durée min Rendement protéine C filtration rinçage DF/DI min N° N° essai run * 09PCNG147016 37 15 77,4 95.3 .. 09PCNG147017 41 16 71,4 91.5 1 09PCNG147026 39 38 90.0 91.6 2 09PCNG147030 296 29 41.7 94.8 3 09PCNG147021 317 51 82.4 92.1 4 09PCNG147019 42 9 72.7 33.0 09PCNG147023 9 11 102.2 56.5 6 09PCNG147031 94 18 72.7 90.7 7 09PCNG147025 8 8 95.6 90.1 8 09PCNG147024 13 10 96.8 90.4 9 09PCNG147018 80 5 90.6 86.4 09PCNG147022 34 8 91.7 50.2 11 09PCNG147027 89 30 32.6 100.2 12 09PCNG147029 464 41 41.2 98.7 13 09PCNG147028 53 8 91.1 92.6 14 09PCNG147032 52 16 87.5 96.3 09PCNG147020 12 15 97.0 52.8 16 09PCNG147033 203 31 91.7 67.8 * : essai cible : éluât industriel (lot 09L00973) non ajusté ** : essai cible : éluât industriel (lot 09L02197) non ajusté De ces essais, nous pouvons noter que : - Nous n'avons pas observé de déviation majeure par rapport au protocole, dans la 5 conduite du procédé. - Nous n'avons pas observé de colmatage lors des essais puisque nous n'avons jamais atteint un DF/DI inférieur à 25 % dans les conditions opératoires appliquées. - Le rendement de l'étape de nanofiltration est compris entre 33 et 100 % en fonction des valeurs étudiées. 10 Influence des paramètres sur le rapport DF/DI Une représentation de Pareto montre l'influence des facteurs sur te rapport DF/DI (voir Figure 3). Les facteurs A (volume de charge) et B (concentration en protéine C) et l'interaction AB ont une valeur supérieure à ta limite de Bonferroni. Les autres facteurs n'ont pas 15 d'influence significative sur le rapport DF/DI. L'analyse Anova décrite dans te Tableau 10, montre que le modèle construit avec les facteurs A, B et AB est significatif (p-value inférieure à 0,05 pour le modèle et chaque facteur). Tableau 10 : Analyse ANOVA de la variance pour les facteurs A, B et AB Source Somme des carrés df Moyenne valeur F valeur p des carres Modèle 5590.30 3 1863.43 14.62 0.0001 A-Volume de 2232.45 1 2232.45 17.51 0.0009 charge B- 1675.68 1 1675.68 13.15 0.0028 Concentration en Protéine C AB 1948.11 1 1948.11 15.28 0.0016 Résiduel 1784.47 14 127.46 Total corrigé 7374.76 17 Un modèle avec 2 facteurs (A et B) et l'interaction AB est donc utilisé pour étudier le rapport DF/DI. Différentes analyses ont permis de montrer que la distribution des points est bien effectuée selon une loi normale et que les résultats calculés possèdent une bonne corrélation avec les résultats observés à l'exception du run 6 plus éloigné de la droite de corrélation. La formule du modèle est la suivante : DF / Dl = + 89,00851 + 1,81179E-003 * Volume de charge + 0,12565 * Concentration en Protéine C - 2,54896E-003 * Volume de charge * Concentration en Protéine C. Sur la base de ce modèle, l'influence du volume de charge et de la concentration en protéine C sur le rapport DF/ Dl est représentée sur ta Figure 4. Le rapport DF/ DI sera d'autant plus faible que la concentration en protéine C ou le volume de charge seront importants. Les deux paramètres génèrent un effet amplifié dans les bornes hautes (interaction AB). La valeur haute du volume de charge (A = 240 ml) pour une concentration en protéine C standard (B = 35 Ul/ml) donne un DF/DI calculé à 72.4 % selon le graphique ci-dessous. La valeur haute de ta concentration en protéine C (B = 91 Ul/ml) pour un volume de charge standard (A = 110 ml) donne un DF/DI calculé à 79.5 % selon le graphique ci-dessous. Les valeurs hautes des deux facteurs (A=240 ml ; B = 91 Ul/ml) donnent un DF/DI = 45.2 % selon te modèle. Il y a bien une forte interactivité des deux facteurs. Influence des paramètres sur le rendement en Protéine C Une représentation de Pareto montre l'influence des différents facteurs sur le rendement en Protéine C (voir Figure 5). De ce premier résultat, les 3 paramètres les plus influents sur te rendement sont te 5 volume de charge (Facteur A), la concentration en protéine C (Facteur B) et l'interaction AB. L'analyse Anova décrite dans le Tableau 11, nous montre que le modèle construit avec les facteurs A, B et AB est significatif (p-value inférieure à 0.05 pour le modèle et chaque facteur). 10 Tableau 11 : Analyse ANOVA de la variance pour les facteurs A, B et AB Source Somme des carrés df Moyenne valeur F valeur p des carres Modèle 5401.56 3 1800.52 16.84 L'hypothèse suivante peut expliquer ces résultats: le rendement est corrélé à la quantité totale de protéine C appliquée sur le nanofiltre. Si les facteurs A et B sont aux bornes basses, la quantité filtrée est très faible, et le rendement est alors faible (52 %). Si un des facteurs seulement est faible, l'autre facteur compense et permet d'obtenir une quantité standard en protéine C. Dans ce cas, le rendement est plus élevé. Si les deux facteurs sont aux valeurs hautes, ta quantité de protéine C est élevée ; le rendement est alors important (97 %). Une autre hypothèse consiste à considérer que le dosage en Protéine C aux bornes basses est imprécis et génère donc une grande incertitude dans les mesures. Ceci est peu vraisemblable car nous obtenons aussi un faible rendement avec une forte concentration en protéine C et un faible volume de charge. Vérification du modèle par les résultats obtenus lors des Lots Laboratoires Les lots Laboratoires ont été préparés dans les mêmes conditions que les essais aux valeurs cibles PCNG147016 et PCNG147017 présents dans le plan d'expérience. Les résultats suivants ont été obtenus pour ces essais: Tableau 12. Comparaison des valeurs de rapport DF/DI et de rendement en protéine C modélisées avec les valeurs réelles pour les lots Laboratoires. A B DF/D1 réel DF/DI Rendement Rendement Volume Concentration en Protéine C 0/0 modèle protéine C protéine C de Ul/mt cX) réel modèle charge c% % ml N° run N° essai 1101 09PCNG147039 110 29,1 81 85 89 73 LL02 09PCNG147039 110 35,8 72 84 89 76 LL03 09PCNG147039 110 42 68 83 88 78 Les valeurs calculées par le modèle sont plus élevées pour le rendement et plus faibles pour DF/DI mais elles restent comparables aux valeurs obtenues expérimentalement. Aux valeurs cibles présentes tors des lots laboratoire, le rendement est de t'ordre de 89 %. L'effet de sous-charge en quantité de protéine C sur la surface de filtre utilisée est donc plus faible que la valeur estimée par le modèle, avec une pente linéaire entre les deux bornes des facteurs A et B. Une représentation non linéaire du rendement pourrait indiquer la valeur minimale en quantité de protéine C à nanofiltrer afin de minimiser la perte en rendement. Si l'on considère te rendement en protéine C en fonction de la quantité de protéine C nanofiltrée, te graphique de la Figure 7 peut être réalisé, à partir des essais du plan d'expérience associés aux lots laboratoire. Sur la Figure 7, on peut observer que pour une valeur en quantité de protéine C inférieure à 700 UI (pour un filtre de 0,01 m2), te rendement en protéine C diminue du fait de ta surface importante du nanofiltre. Cette valeur de 700 UI, qui est le produit de la concentration par le volume appliqué, est une valeur de l'Edge of Failure liée à l'obtention d'un rendement en protéine C. Conclusion Le rendement en Protéine C et le rapport des débits DF/DI ont été étudiés en fonction des paramètres impliqués dans ta conduite d'une nanofiltration (volume de charge, concentration en protéine C, volume de chasse, pression sur le filtre 15N, température, pH, osmolalité, lot de matière première) et leurs éventuelles interactions aux bornes basses et hautes. il ressort que seuls deux facteurs ont une influence significative sur le débit et le rendement en protéine C: le volume de charge à nanofiltrer et la concentration en protéine C. L'interaction de ces deux facteurs a également un rôle significatif sur les réponses par une amplification de la réponse « DF/DI » aux valeurs hautes et de la réponse « Rendement » pour tes valeurs basses. A partir des données obtenues, un modèle de la nanofiltration peut être représenté par les formules suivantes : DF / DI = + 89,00851 + 1,81179E-003 * Volume de charge + 0,12565 * Concentration en Protéine C - 2,54896E-003 * Volume de charge * Concentration en Protéine C. Rendement Protéine C = + 42,89650 + 0,18078 * Volume de charge + 0,55923 * 20 Concentration en Protéine C - 1,83082E-003 * Volume de charge * Concentration en Protéine C. Pour le débit, celui-ci diminue aux valeurs hautes, sans atteindre toutefois la limite de colmatage (DF/DI=25%), malgré une charge en protéine C cinq fois supérieure à la quantité utilisée en production. Ces valeurs hautes sont donc des valeurs validées 25 (Proven Operating range). On peut noter que pour une même quantité de protéine C à filtrer, le colmatage apparaît plus tôt avec une concentration élevée. Il est donc préférable de diluer la solution si l'on souhaite filtrer une grande quantité de protéine C. Les valeurs hautes du volume et de la charge n'ont pas d'effet sur le rendement. Elles 30 correspondent donc à des valeurs validées (Proven Operating range) pour le rendement. La quantité en Protéine C correspondant aux valeurs hautes utilisées dans le modèle correspond à 240 ml x 91 UI/ml = 21840 UI à l'échelle 1 /100ème soit 2184000 UI pour l'échelle industrielle. Cette valeur est très grande par rapport à la quantité standard de protéine C utilisée (de l'ordre de 11 litres * 40 UI/ml = 400000 UI) soit 5 fois le proven 35 operating range. Les valeurs basses du volume et de la charge génèrent une baisse de rendement pour un Edge of Failure de l'ordre de 700 UI (soit 70000 UI à l'échelle production). En dessous de cette valeur, le rendement en protéine C diminue significativement. Les facteurs suivants ne sont pas influents et leurs valeurs hautes et basses correspondent donc à des valeurs validées (« Proven Operating Range ») du procédé: volume de chasse, pression sur le filtre 15N, température, pH, osmolalité, lot de matière première. Aucun paramètre critique du procédé n'a été identifié pour les réponses en rendement et en débit. Le Tableau 13 ci-dessous montre les valeurs des « Proven Operating range » et l'Edge of failure obtenues à partir de la caractérisation biochimique des deux étapes de nanofiltration de la solution de protéine C préalablement purifiée. Tableau 13 : Proven operating range et Edge of failure pour le rendement en protéine C et le rapport de débits DF/DI (colmatage) pour l'échelle 1/100è- Paramètres unité Plage validée Valeur critique (Edge of failure) (Proven operating range) Volume de charge par surface ml valeur haute : 240 ml Concentration en protéine C Ul/ml valeur haute 91 Ul/ml Protéine C totale k 700 UI Volume de chasse par surface ml 8-24 Pression d'alimentation sur 15N mbar 150-600 Température °C 14-30 pH - 6,5-8,0 Osmolalité mosmol/kg 200-360 En résumé, dans les conditions opératoires testées, aucun paramètre critique pour tes deux réponses étudiées (rapport DF/DI et rendement en protéine C) n'a été identifié. Les valeurs hautes et basses des facteurs étudiés correspondent à des plages d'opération validées (« proven operating range »), à l'exception de l'interaction entre le volume et ta concentration en protéine C (concentration de charge de surface), pour laquelle une valeur minimale (valeur « d'edge of failure ») estimée à 700 U1/0,01 m2 (soit 7.104 Ul /m2) a été déterminée, en dessous de laquelle le rendement diminue. Exemple 3 : Efficacité de rétention des prions par les deux étapes de nanofiltration Outre des virus, les produits dérivés du sang sont également susceptibles de contenir 25 des agents transmissibles non conventionnels (ATNC), notamment de la protéine prion PrPsc rencontrée dans les cas d'encéphalopathies spongiformes transmissibles. Il est donc également important qu'au moins une étape du procédé de préparation d'un médicament dérivé du sang permette d'éliminer de façon significative une éventuelle contamination par ce type d'agents pathogènes. L'effet des deux étapes de nanofiltration du procédé selon l'invention sur ce type d'agents a donc été testé. Matériels et méthodes Solution de protéine C préalablement purifiée Cette solution est la même que celle décrite aux Exemples 1 et 2. Agents transmissibles non conventionnels utilisés La souche de prion 263K, adaptée aux hamsters, est un bon modèle de la tremblante du mouton et autres maladies associées. Une fraction microsomale, préparée à partir d'un homogénat de cerveau infecté et comprenant 2,8 x 103 unités arbitraires de protéine PrPs`, a été ajoutée à la solution de protéine C préalablement purifiée avant la mise en oeuvre des deux étapes de nanofiltration. Nanofiltration Les deux étapes de nanofiltration ont été réalisées comme décrit à l'Exemple 1. Détermination de la rétention en protéine PrPs` par tes deux étapes de nanofiltration La quantité résiduelle de protéine PrPs` a été mesurée par western 'Mot, en utilisant l'anticorps 3F4. Celui-ci reconnaît la protéine de prion PrP normale (PrP`, sensible aux protéases), et également la protéine de prion associée à la maladie (PrPs`, relativement résistante aux protéases). Une digestion à la protéinase K est utilisée pour distinguer entre la forme normale (PrP`, sensible aux protéases) et celle associée à la maladie (PrPs`, relativement résistante aux protéases). Cette digestion est réalisée avec une solution à 10 pg/ml de protéinase K. Résultats Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 14 ci-dessous. Tableau 14. Rétention en protéine PrPs` par tes deux étapes de nanofiltration Echantillon PrPs` totale Facteur de Facteur de (unités clairance réduction arbitraires) (10g10) (logio) Essai 1 Avant nanofiltration 20N-15N 2,8 x 103 / / Après nanofiltration 20N-15N S. 1,4 x 10° k 4,1 ?.. 3,3 Essai 2 Avant nanofiltration 20N-15N 2,8 x 103 / / Après nanofiltration 20N-15N s_ 1,4 x 10° ? 4,1 ? 3,3 Conclusion Les résultats présentés ci-dessus montrent clairement que les deux étapes de nanofiltration à 20 puis 15 nm sont efficaces pour réduire significativement la quantité de protéine prion PrPs` susceptible de se trouver dans une solution de protéine C préalablement purifiée (facteur de réduction en PrPs` d'au moins 3,3 logio). REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Burnouf Thierry. Hématologie 2008 ; 14 (1) : 36-47 Radosevich M. et al. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003 Jun 25;790(1- 2):199-207. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'une solution de protéine C viralement sécurisée, 5 comprenant : a) ta fourniture d'une solution de protéine C préalablement purifiée, b) une première étape de nanofiltration de ladite solution de protéine C préalablement purifiée à travers un nanofiltre ayant une taille moyenne de pores comprise entre 15 et 35 nm, et 10 c) une deuxième étape de nanofiltration de la solution de protéine C obtenue à l'issue de la première nanofiltration à travers un deuxième nanofiltre ayant une taille moyenne de pores comprise inférieure ou égale à 20 nm, avantageusement inférieure ou égale à 15 nm. 15 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ta solution de protéine C préalablement purifiée possède une activité spécifique en protéine C d'au moins 150 UI/mg de protéines totales, avantageusement au moins 180 UI/mg de protéines totales, plus avantageusement au moins 200 UI/mg de protéines totales. 20 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la concentration en protéine C de ta solution de protéine C préalablement purifiée est d'environ 2 à environ 100 UI/ml, avantageusement d'environ 40 à environ 60 Ul/ml, notamment d'environ 50 UI/ml. 25 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la teneur en protéines de la solution de protéine C préalablement purifiée est d'environ 0,02 à environ 0,5 g/l, avantageusement d'environ 0,1 à environ 0,5 g/l, notamment d'environ 0,25 g/l. 30 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la solution de protéine C est une solution de protéine C non activée. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la solution de protéine C préalablement purifiée a été obtenue par purification d'une 35 fraction plasmatique, notamment te cryosurnageant du plasma, par au moins une étape de chromatographie. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la purification de la fraction plasmatique comprend au moins une étape de chromatographie d'échange d'ions et/ou 40 au moins une étape de chromatographie d'affinité. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la solution de protéine C préalablement purifiée a été partiellement inactivée viralement par une étape d'inactivation virale, en particulier par un traitement solvant-détergent. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ta solution de protéine C préalablement purifiée a été obtenue à partir de cryosurnageant du plasma par un procédé de purification comprenant les étapes suivantes : a) une première étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel de dextrane réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE) ; b) une étape d'inactivation virale, en particulier par un traitement solvant-détergent ; c) une deuxième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE) ; d) une troisième étape de chromatographie d'échange d'anions utilisant une résine ayant pour matrice un gel de polymère de méthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements diméthylaminoéthanot (DMAE) ; et e) une étape de chromatographie d'affinité utilisant une résine ayant pour matrice un gel d'agarose réticulé, sur lequel sont greffés des molécules d'héparine, ou une étape de chromatographie échangeuse de cations utilisant une résine ayant pour matrice un gel de polymère de méthacrylate réticulé, sur lequel sont greffés des groupements sulfoisobutyle. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la première étape de nanofiltration est effectuée à : a) une pression comprise entre 700 et 900 mbar, avantageusement entre 750 et 850 mbar, notamment d'environ 800 mbar ; et/ou b) une température comprise entre 10 et 30 °C, avantageusement entre 15 et 25 °C, notamment d'environ 20°C. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le premier nanofittre a une taille moyenne de pores de 20 nm, avantageusement le 35 premier nanofiltre est une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée au cuprammonium ayant une taille de pores d'environ 20 nm. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la deuxième étape de nanofiltration est effectuée à :a) une pression comprise entre 300 et 900 mbar, avantageusement entre 300 et 600 mbar, plus avantageusement entre 350 et 550 mbar, notamment d'environ 450 mbar ; et/ou b) une température comprise entre 10 et 30°C, avantageusement entre 15 et 25°C, notamment d'environ 20°C. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que te deuxième nanofiltre a une taille moyenne de pores de 15 nm, avantageusement le deuxième nanofiltre est une membrane à fibres creuses formée de cellulose régénérée 10 au cuprammonium ayant une taille de pores d'environ 15 nm. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que pour les deux étapes b) et c) de nanofiltration, le volume de charge par surface est compris entre 4 et 24 l/m2. 15 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que pour les deux étapes b) et c) de nanofiltration, la concentration de charge par surface est comprise entre 7.104 et 2,4.106 Ul/m2, avantageusement entre 7.104 et 1.106 Ul/m2. 20 16. Solution de protéine C viralement sécurisée susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15. 17. Solution de protéine C viralement sécurisée selon ta revendication 16, caractérisée en ce qu'elle possède une activité spécifique d'au moins 230 UI/mg de protéines 25 totales, avantageusement au moins 240 Ul /mg de protéines totales, plus avantageusement au moins 250 Ul /mg de protéines totales, voire au moins 260 Ul /mg de protéines totales, ou au moins 265 11I/mg de protéines totales. 18. Solution de protéine C viralement sécurisée selon la revendication 16 ou la 30 revendication 17, pour son utilisation en tant que médicament. 19. Solution de protéine C viralement sécurisée selon la revendication 16 ou la revendication 17, pour son utilisation en thérapie de substitution des déficits congénitaux ou acquis en protéine C, notamment dans la prévention ou te traitement 35 des thromboses associées à un déficit congénital ou acquis en protéine C.