Brevet FR3008424A1 — publié le 20150116

La présente invention a pour objet un procédé de génération d'un organisme à partir d'une cellule, à l'exception d'un organisme humain, comprenant la modification ciblée du génome de ladite cellule par l'administration d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, l'agent étant administré sous la forme d'au moins une protéine, suivie de la génération dudit organisme à partir de ladite cellule. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome d'une cellule, l'agent étant administré dans la cellule sous la forme d'au moins une protéine, pour la génération d'un organisme à partir de la cellule dont le génome a été modifié. La présente invention a enfin pour objet une cellule dont le génome a été modifié par l'administration dans une cellule d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome d'une cellule, l'agent étant administré sous la forme d'une protéine, et l'utilisation d'une telle cellule. Les animaux transgéniques et notamment les animaux dits « knock-out » constituent un modèle important pour la communauté scientifique pour étudier et comprendre la fonction in vivo de gènes d'intérêt. La génération de tels organismes modèle implique la modification ciblée du génome de cellules à partir desquelles ces organismes seront générés. Cette modification ciblée est réalisée principalement à l'aide de protéines ayant une action enzymatique. Les nucléases font partie des enzymes les plus utilisées, elles peuvent induire la cassure d'ADN double brin à un locus particulier du génome, ces cassures étant alors réparées par un mécanisme de recombinaison, conduisant à des insertions et/ou délétions dans le gène ciblé. Classiquement, des ARNs messager transcrits in vitro sont injectés dans l'oeuf et traduits par l'embryon. Cette technique pose toutefois des problèmes car le pic d'accumulation n'est atteint qu'après plusieurs divisions, surtout chez les embryons dont le développement est rapide. Ceci est une source de difficulté pour identifier et sélectionner les évènements de modification. Par ailleurs la présence d'événements de coupures du génome pendant une durée relativement longue pourrait être une source de mortalité cellulaire. Les méthodes de l'art antérieur décrivent l'existence de nombreux événements de 30 coupure indépendants dans seulement une partie des cellules, selon un phénomène appelé mosaïcisme, qui est préjudiciable à l'efficacité et à la rapidité de la génération des organismes transgéniques et induit notamment le besoin d'un nombre important d'animaux pour mener à bien ces programmes. Il est donc nécessaire de disposer de procédés toujours plus efficaces pour générer 5 des animaux transgéniques, et notamment des animaux aquatiques transgéniques. Les poissons d'élevage et autres animaux d'élevage constituent en particulier une population pour laquelle les besoins en la matière sont importants. Les inventeurs ont maintenant mis au point un procédé de génération d'organismes dont le génome a été modifié de façon ciblée, dans lequel l'agent capable d'induire 10 cette modification ciblée est directement administré dans la cellule sous une forme protéique. La production in vitro de certaines de ces protéines était auparavant réputée être trop difficile. Cette méthode résulte en un mosaïcisme de l'évènement de coupure bien plus faible que lorsque de l'ARNm correspondant à la même protéine est injecté dans la cellule. Ceci devrait favoriser la génération d'animaux 15 possédant soit des réparations incorrectes de leurs génomes soit des insertions de séquences d'ADN par NHEJ (« Non Homologous End Joining » ou recombinaison homologue selon le type de construction d'ADN introduite. De nombreuses applications nouvelles peuvent ainsi être envisagées. En effet, avec un procédé selon l'invention, il est possible d'obtenir des animaux non mosaïques ce qui permet 20 d'analyser les effets des mutations attendues dès la première génération (dite FO). Les phénotypes en FO peuvent être analysés après génotypage suivant une biopsie (dite Fin-Clip chez les poissons) et montrant un animal non mosaïque portant uniquement un type de mutation, et plus aucun allèle sauvage. L'amélioration des taux permet aussi d'espérer faciliter les cribles et limiter le nombre d'animaux 25 utilisés. Au contraire, avec une injection d'ARN messager, les événements de coupure n'interviennent pas dès le stade 1 car il faut le temps que la protéine soit traduite par l'embryon. Dans ce type d'expérience, il est connu que le pic de production est d'ailleurs atteint relativement tard vers le stade 8 à 64. L'administration d'un agent sous une forme protéique permet donc la génération 30 d'événements à un stade plus précoce que l'administration du même agent sous la forme d'un ARNm et réduit le phénomène de mosaïcisme. L'invention sera maintenant décrite de manière détaillée et illustrée d'exemples. L'invention a pour objet un procédé de génération d'un organisme animal à partir d'une cellule, à l'exception d'un organisme humain, comprenant la modification ciblée du génome de ladite cellule par l'administration dans cette cellule d'au moins un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, caractérisé en ce que ledit agent est administré sous la forme d'au moins une protéine, suivie de la génération dudit organisme à partir de ladite cellule. Selon un aspect particulier, la présente invention a pour objet un procédé de génération d'un animal transgénique comprenant la modification ciblée du génome dudit animal par l'administration dans l'une de ses cellules d'au moins un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, caractérisé en ce que ledit agent est administré sous la forme d'au moins une protéine, suivie par la génération dudit animal à partir de la cellule dont le génome a subi ladite modification ciblée. La transgénèse est une technique qui permet d'introduire un acide nucléique exogène dans une cellule hôte. La transgenèse implique que l'acide nucléique 15 exogène soit introduit dans le génome de l'organisme et se transmette à sa descendance. Les termes « acide nucléique » incluent l'ARN, l'ADN ou les hybrides ARN/ADN longs de plus d'un nucléotide, sous une forme simple ou double chaîne. Le terme « animal » inclut, sans y être limité, un mammifère, tel qu'un rongeur, 20 parmi lesquels peut être choisi un rat ou une souris, un primate non-humain, un ovin, un bovin, un chien, un insecte, un oiseau, tel qu'un poulet, un amphibien, tels qu'un xénope, un reptile, un poisson, une ascidie. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé de génération d'un organisme animal, comprenant la modification ciblée du génome 25 dudit organisme par l'administration dans l'une de ses cellules d'au moins un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, caractérisé en ce que ledit agent administré sous la forme d'au moins une protéine est une enzyme ou possède une activité enzymatique. Un agent capable d'induire la modification ciblée du génome désigne un agent capable de modifier l'ADN, et plus particulièrement une enzyme 30 capable de modifier l'ADN. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'agent peut être choisi dans le groupe de protéines constitué par : un activateur de transcription, un répresseur de transcription, une protéine permettant d'induire la résistance de la cellule à un élément particulier, une nucléase, de préférence une endonucléase, et plus préférentiellement une endonucléase de restriction, une topoisomérase, une ligase, une intégrase, une recombinase, une résolvase, une méthylase, une acétylase, une déméthylase, une déacétylase. Une endonucléase est une enzyme capable de générer une coupure dans une molécule d'ADN double brin à des sites hautement spécifiques. L'endonucléase peut être naturelle ou synthétique. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé de 10 génération d'un animal comprenant la modification ciblée du génome dudit animal, dans lequel ledit agent est une endonucléase de restriction. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, l'endonucléase de restriction est choisie parmi le groupe constitué par les endonucléases à doigt de zinc, les endonucléases de type « méganucléases » et les « Transcription Activator- 15 Like Effector (TALE) » nucléases, ou TALEN (Pillay et al., 2013 ; Alvin et al., 2013 ; Victoria et al., 2012 ; Peng et al., 2012). Les TALE sont des protéines qui se fixent à l'ADN de façon spécifique en reconnaissant des sites de 15 à 20 paires de bases, qui peuvent être modifiées par l'adjonction d'un autre domaine protéique, comme par exemple un domaine nucléase. Les TALE ou TALEN peuvent donc être 20 caractérisées par des zones (ou « doigts ») de reconnaissance différents. Ainsi, les TALE nucléases sont des endonucléases qui reconnaissent de longs sites de coupure et coupent ainsi de façon très spécifique les génomes de vertébrés. La coupure est suivie d'un événement de réparation, qui peut être imparfait et mutagène, soit par l'insertion d'une séquence introduite par l'utilisateur. Les applications sont 25 nombreuses pour générer des animaux au génome modifié. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans un procédé selon l'invention, l'endonucléase de restriction comprend au moins un domaine de liaison à l'ADN choisi parmi les domaines du groupe des effecteurs de transcription de type activateur, désignés aussi comme « Transcription Activator-Like Effector (TALE) ». 30 Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans un procédé selon l'invention, l'endonucléase de restriction comprend au moins un domaine de liaison à l'ADN choisi parmi les domaines du groupe des effecteurs de transcription de type activateur, désignés aussi comme « Transcription Activator-Like Effector (TALE) ». Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans un procédé selon l'invention, l'endonucléase de restriction comprend au moins un domaine de liaison à l'ADN choisi parmi les domaines du groupe des effecteurs de transcription de type activateur, désignés aussi comme « Transcription Activator-Like Effector (TALE) » et comprend une sous-unité capable d'assurer la liaison à l'ADN et une sous-unité capable d'exercer une activité catalytique. Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé de génération d'un animal comprenant la modification ciblée du génome dudit animal, par l'administration dans l'une de ses cellules d'au moins une endonucléase de restriction sous la forme d'au moins une protéine, dans lequel l'une des sous-unités de l'enzyme est codée par une séquence nucléotidique identique à, ou possédant au moins 90% d'identité avec, la séquence SEQ ID N°1, et une seconde sous-unité étant codée par une séquence nucléotidique identique à, ou possédant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID N°2. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique est défini en comparant les deux séquences de façon optimale, les séquences à comparer peuvent en effet comprendre des additions ou des délétions. Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions pour lesquelles les nucléotides sont identiques et en le divisant par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat par 100. Il est entendu que certaines modifications dans la séquence d'acide nucléique peuvent consister en des mutations silencieuses au niveau protéique. Selon un mode de réalisation préféré, dans un procédé selon l'invention l'une des sous-unités de l'enzyme est codée par une séquence nucléotidique possédant au moins 90%, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 98%, plus préférentiellement au moins 99% et encore plus préférentiellement 100% d'identité avec la séquence SEQ ID N°1. Selon un mode de réalisation préféré, dans un procédé selon l'invention l'une des 30 sous-unités de l'enzyme est codée par une séquence nucléotidique possédant au moins 90%, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 98%, plus préférentiellement au moins 99% et encore plus préférentiellement 100% d'identité avec la séquence SEQ ID N°2. Selon un mode de réalisation encore plus préféré, dans un procédé selon l'invention l'une des sous-unités de l'enzyme est codée par une séquence nucléotidique possédant 100% d'identité avec la séquence SEQ ID N°1, c'est-à-dire une séquence identique à SEQ ID N°1, et l'autre sous-unité de l'enzyme est codée par une séquence nucléotidique possédant 100% d'identité avec la séquence SEQ ID N°2, c'est-à-dire une séquence identique à SEQ ID N°2. Selon un mode de réalisation particulier, dans un procédé de génération d'un organisme animal à partir d'une cellule selon l'invention, l'agent capable d'induire la modification ciblée du génome, administré sous la forme d'au moins une protéine, comprend au moins une protéine ayant une séquence en acides aminés présentant au moins 90%, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 98%, de préférence au moins 99% et plus préférentiellement 100% d'identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID N°6 et SEQ ID N°7. Par « identité » est entendue la définition précédemment indiquée pour les comparaisons de séquences en acides nucléiques. Séquence en acides aminés de la protéine N 21 (SEQ ID N°6) : MGSSHEIFIFIEIHDYDIPTTENLYFQGHMAPKKKRKVYPYDVPDYAGYPYDV 20 PDYAGSYPYDVPDYAAHGTVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEAL VGHGFTHAHIVAL SQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWS GARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALT GAPLNLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASN NGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVL 25 CQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASH DGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVL CQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASH DGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPV LCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIAS 30 HDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLP VLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIA SNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLP VLCQAHGLTPDQVVAIA SHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIA SHDGGRPALESIVAQL SRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLP HAP AL IKRTNRRIPERT SHRVAGSQLVK SELEEKK SELRHKLKYVPHEYIELI EIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYG VIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYP S SVT EFKFLF V S GHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVL SVEELLIGGEMIKAGTLTL EEVRRKENNGEINFRS Séquence en acides aminés de la protéine N 22 (SEQ ID N°7) : MGS SHEIREIHHDYD IP T TENLYF Q GHMAPKKKRKVYPYDVPDYAGYPYDV PD YAGS YP YD VPD YAAHGT VDLRTL GY S QQQ QEKIKPKVRS TVAQHHEAL VGHGF THAHI VAL S QHP AAL GT VAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGK QW S GARALEALL TVAGELRGPPLQLD TGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNAL T GAPLNLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNN GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLC QAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNN GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLC QAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNN GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLC QAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNN GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLC QAHGL TPAQVVAIA SNIGGKQALETVQRLLPVLC Q AHGLTPD QVVAIA SHD GGKQALETVQRLLPVLC Q AHGLTPAQVVAIA SNGGGKQALETVQRLLPVL C QAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHD GGRPALESIVAQL SRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAP AL IKRTNRRIPERT SHRVAGSQLVK SELEEKK SELRHKLKYVPHEYIELIEIAR NS TQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHL GGSRKPD GAIYTVGSPIDYGVIVD TKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYP S SVTEFKF LEVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVL SVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVR RKENNGEINFRS* Selon un mode de réalisation plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de génération d'un organisme, comprenant la modification ciblée du génome d'une cellule par l'administration dans cette cellule d'au moins un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, l'agent étant administré sous la forme d'au moins une protéine, suivie de la génération de l'organisme à partir de la cellule dont le génome a été modifié, ledit agent étant choisi parmi les « cas », ou « CRISPR associated proteins » (Horvath et Banangou, 2013). Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un procédé de génération d'un organisme animal, comprenant la modification ciblée du génome d'une cellule par l'administration d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, l'agent étant administré sous la forme d'au moins une protéine dans le cytoplasme ou dans le noyau de la cellule, suivie de la génération de l'organisme à partir de la cellule dont le génome a été modifié. Selon un mode de réalisation plus particulier de l'invention, le procédé comprend l'administration d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, l'agent étant administré sous la forme d'au moins une protéine, dans le cytoplasme de la cellule. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé comprend l'administration d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, l'agent étant administré sous la forme d'au moins une protéine, dans le noyau de la cellule. Dans un procédé selon l'invention, l'agent capable d'induire la modification ciblée du génome, administré sous la forme d'au moins une protéine, est administré à la cellule, dans le cytoplasme ou dans le noyau, par injection, par microinjection, par électroporation, par balnéation ou par toute autre méthode connue par une personne du métier et connue pour permettre ou favoriser l'entrée d'au moins une protéine à l'intérieur d'une cellule. De préférence, l'agent sous forme protéique est administré par injection ou par microinjection. Selon un mode plus particulier d'un procédé selon l'invention, la cellule dans laquelle l'agent est administré sous la forme d'une protéine est une cellule animale, de préférence une cellule de vertébré sarcoptérygien ou actinoptérygien, mais aussi de prochordé, de deutérostomien ou protostomien, plus particulièrement une cellule de mammifère, une cellule de poisson, une cellule d'amphibien tel qu'un xénope. Selon un mode encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé de génération d'un organisme comprenant la modification ciblée du génome d'une cellule par l'administration d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, l'agent étant administré sous la forme d'au moins une protéine, suivie de la génération de l'organisme à partir de la cellule dont le génome a été modifié, dans lequel l'organisme est un poisson ou un mammifère d'élevage. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la cellule animale appartient à un genre choisi parmi : Rattus, Mus, Sus, Bos, Danio, Canis, Fehs, Equus, Salmo, 10 Oncorhynchus, Gallus, Meleagris, Drosophila ou Caenorhabditis. Selon un mode plus particulier d'un procédé selon l'invention, la cellule dans laquelle l'agent est administré sous la forme d'une protéine est une cellule animale, de préférence une cellule de mammifère, une cellule de poisson, ou une cellule d'amphibien telle qu'une cellule de xénope. Selon un mode encore plus particulier, 15 d'un procédé selon l'invention, l'organisme est un poisson d'élevage. Selon un mode particulier d'un procédé selon l'invention, l'agent capable d'induire la modification ciblée du génome et administré sous la forme d'au moins une protéine est administré à une cellule définie comme une cellule progénitrice. Selon un mode encore plus particulier d'un procédé selon l'invention, l'agent capable 20 d'induire la modification ciblée du génome et administré sous la forme d'au moins une protéine est administré à une cellule, ladite cellule étant choisie dans le groupe consistant en une cellule souche, une cellule somatique, un gamète, un blastomère, un ovocyte, un oeuf, un oeuf fécondé au stade une cellule ou un oeuf non fécondé. Dans un aspect particulier du procédé selon l'invention, la cellule est un zygote, 25 c'est-à-dire une cellule « oeuf » résultant de la fusion de deux gamètes, un ovocyte et un spermatozoïde. Dans un autre aspect particulier du procédé selon l'invention, la cellule est un ovocyte, c'est-à-dire, dans le cas d'un poisson, une cellule « oeuf » non fécondée. 30 Selon un aspect particulier, la présente invention a pour objet un procédé de génération d'un organisme animal, comprenant la modification ciblée du génome d'un oeuf ou d'un ovocyte par l'administration d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, l'agent étant administré dans l'oeuf ou dans l'ovocyte sous la forme d'au moins une protéine, suivie de la génération de l'organisme à partir de l'oeuf ou de l'ovocyte dont le génome a été modifié. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome d'un oeuf ou d'un ovocyte, l'agent étant administré dans l'oeuf ou l'ovocyte sous la forme d'au moins une protéine, pour la génération d'un organisme à partir de l'oeuf ou de l'ovocyte dont le génome a été modifié. La présente invention a enfin pour objet un oeuf ou un ovocyte dont le génome a été modifié par l'administration dans l'oeuf ou l'ovocyte d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome dudit oeuf ou ovocyte, l'agent étant administré sous la forme d'une protéine. La présente invention a enfin pour objet l'utilisation d'un tel oeuf ou ovocyte. Selon un mode encore plus particulier d'un procédé selon l'invention, l'agent capable d'induire la modification ciblée du génome et administré sous la forme d'au moins une protéine est administré à un oeuf non fécondé, simultanément à une injection intracytoplasmique de noyaux de spermatozoïde ou de noyau de toute cellule. L'invention a par ailleurs pour objet une protéine recombinante chimère possédant une activité endonucléase comprenant un ou plusieurs domaines de liaison à l'ADN et un ou plusieurs domaines catalytiques, et comprenant une première sous-unité codée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence identique, c'est-à-dire ayant 100% d'identité, ou ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 98 %, plus préférentiellement au moins 99% d'identité avec la séquence SEQ ID N°1, et une sous-unité codée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence ayant 100% d'identité, ou ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 98 %, plus préférentiellement au moins 99% d'identité avec la séquence SEQ ID N°2. L'invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique ayant au moins, 30 90%, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 98%, de préférence au moins 99%, ou 100% d'identité avec une séquence d'acide nucléique choisie parmi SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2. L'invention a également pour objet l'utilisation pour la génération d'un organisme, a l'exception d'un organisme humain, d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome d'une cellule, caractérisée en ce que ledit agent est administré dans ladite cellule sous la forme d'au moins une protéine. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet l'utilisation pour la génération d'un organisme, à l'exception d'un organisme humain, d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome d'une cellule, et dans laquelle ledit agent est administré dans ladite cellule sous la forme d'au moins une protéine, ledit agent étant une protéine à activité enzymatique, et de préférence une endonucléase de restriction. Selon un mode de réalisation plus particulier, l'invention a pour objet l'utilisation pour la génération d'un organisme, à l'exception d'un organisme humain, et dans laquelle ledit agent est administré dans ladite cellule sous la forme d'au moins une protéine, d'une endonucléase comprenant un domaine de liaison à l'ADN choisi parmi les domaines du groupe des effecteurs de transcription de type activateur, désignés aussi comme « Transcription Activator-Like Effector (TALE) » (WO 2011/072246). Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'invention a pour objet l'utilisation pour la génération d'un organisme, à l'exception d'un organisme humain, ledit agent étant administré dans ladite cellule sous la forme d'au moins une protéine, d'une endonucléase comprenant une sous-unité codée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 98%, plus préférentiellement au moins 99% d'identité et encore plus préférentiellement 100% d'identité avec la séquence SEQ ID N°1, et une sous-unité codée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95%, de préférence au moins 98%, plus préférentiellement au moins 99% d'identité et encore plus préférentiellement 100% d'identité avec la séquence SEQ ID N°2. L'invention a également pour objet une cellule hôte, à l'exception d'une cellule 30 humaine, dont le génome a été modifié par un procédé de génération d'un organisme, à l'exception d'un organisme humain, comprenant l'administration dans une cellule d'au moins un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, caractérisé en ce que ledit agent est administré sous la forme d'au moins une protéine, et la génération dudit organisme à partir de la cellule dont le génome a subi ladite modification ciblée. Ladite cellule hôte peut être la cellule dont le génome a été modifié par un procédé selon l'invention ou bien une cellule issue d'une cellule dont le génome a été modifié par un procédé selon l'invention. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une cellule selon l'invention pour le traitement ou la prophylaxie d'un trouble ou d'une maladie chez un individu, qui peut être un animal. L'invention a également pour objet un organisme, à l'exception d'un organisme humain, généré par un procédé selon l'invention, le génome dudit organisme ayant été modifié par l'administration dans une cellule d'au moins un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, ledit agent ayant été administré sous la forme d'au moins une protéine, et la génération dudit organisme ayant eu lieu à partir de la cellule dont le génome a subi ladite modification ciblée. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et figures suivants : BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1: Schéma du site de liaison de la TALE-nucléase spécifique du gène codant pour la GFP. Les séquences indiquées en gras représentent le site de liaison de la TALE-nucléase. Figure 2: La partie supérieure représente un schéma du clonage de la TALEnucléase dans un vecteur d'expression bactérien, la partie inférieure représente un 25 schéma de la production de la TALE-nucléase Figures 3A, 3B et 3C : La figure 3A montre la vérification de la présence de la TALE-nucléase recombinante sur un gel d'électrophorèse en bleu de Coomassie et en présence d'anticorps anti-HIS. La Figure 3B montre la vérification in vitro de l'activité de la protéine sur un gel d'électrophorèse en bleu de Coomassie. La Figure 30 3C montre la vérification in vitro de la spécificité de coupure de la protéine sur un gel d'électrophorèse en bleu de Coomassie. Les lettres L et R représentent respectivement la sous-unité gauche et droite de l'enzyme. Figures 4A et 4B : La figure 4A montre la répartition statistique, en pourcentage, des phénotypes d'intensité de protéine GFP vus sous loupe binoculaire. La figure 4B montre le phénotype sous loupe binoculaire en lumière du jour des embryons de chacune des classes. De gauche à droite, les images représentent la classe 1, la classe 2, la classe 3 et la classe 4 (ou le contrôle). , La partie inférieure de la Figure 4B représente l'activité de la Green Fluorescent Protein (GFP). Figure 5 : La figure 5 représente un exemple de résultat de séquençage pour un poisson dont les cellules proviennent de cellules injectées avec l'ARNm (partie A de la Figure) et un poisson dont les cellules proviennent de cellules injectées avec la protéine (partie B de la figure 5). Figures 6A et 6B : La figure 6A représente le nombre moyen de mutations (en ordonnées) par animal, pour chacune des classes après injection de protéine (rectangle clair) ou d'ARNm (rectangle foncé). La figure 6B représente le pourcentage de la mutation la plus fréquente par animal, après injection de (rectangle clair) ou d' ARNm (rectangle foncé). La figure 7 représente la séquence nucléotidique du plasmide pSB3N21. La partie soulignée de la séquence représente la séquence de la protéine codée par le plasmide. La figure 8 représente la séquence nucléotidique du plasmide pSB3N22. La partie 20 soulignée de la séquence représente la séquence de la protéine codée par le plasmide. EXEMPLES Exemple 1 : Production et caractérisation de la protéine TALE nucléase. Clonage de la TALE nucléase dans un vecteur d'expression bactérien La TALE nucléase ciblant la séquence d'intérêt a été assemblée selon une méthode adaptée de Huang et al., (2011). L'ADNc de la construction TALE-nucléase a été introduit par PCR grâce au kit In Fusion (Clontech) selon le protocole décrit par le fournisseur dans le vecteur d'expression bactérien pSKB3 (gracieusement fourni par le Dr Stephen K Burley) (Mihaylova et al., 2011). Les séquences obtenues pour les deux sous unités de la TALE nucléase sont les suivantes : pSKB3-N21 (SEQ ID N°1) et pSKB3-N22 (SEQ ID N°2). Production et purification de la TALE nucléase La surexpression des protéines recombinantes TALE nucléase N21 et TALE nucléase N22 a été induite dans les E. colt Rosetta (DE3)pLysS (Novagen) (présentant les codons rares AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA) par 0,2mM d'isopropyl-D-thiogalactoside (IPTG) à une D0600 de 0,8. Les cellules sont récoltées après croissance pendant 16h à 25°C, puis lysées par sonication dans un tampon 25 mM Tris-HCI pH 8.0, 300 mM NaCI, cocktail d'Inhibiteur de Protéase Ultra lx (Roche). Les étapes de purification ont été adaptées de Deng et al., (2012). Les protéines recombinantes solubles sont purifiées séquentiellement sur une résine Ni2.' (HIS-select Nickel affmity gel, SIGMA), précipitation avec 20% de Sulfate d'Ammonium et Superdex 300 GL 10/300 (GE-Healthcare). La protéine est stockée dans un tampon Tris-HCI 22,5mM pH 8, NaCI 270mM, EDTA 0,9mM, Glycérol 10%. Vérification in vitro de l'activité de la protéine produite La présence de la protéine recombinante est vérifiée (Figure 3A). Pour vérifier l'activité de la protéine, un plasmide contenant la cible de la TALE nucléase GFP est utilisée comme substrat (10 mM) en présence de 10/25/50nM de protéine : Tris0Ac 20mM, NaC1 100mM, KOAc 50mM, Mg0Ac 10mM, DTT 1mM, BSA 0,1mg/ml. Coupure 30min à 37°C (Figure 3B). Vérification in vitro de la spécificité de coupure de la protéine produite Pour la vérification de la spécificité de coupure, un duplex synthétique de 72 paires de bases contenant le cible de la TALEN GFP est utilisée comme substrat (0,2nM) en présence de : 2microM compétiteur 65 mer 2-5-10-25-50 ou 100nM protéine 50mMKAc/100mM NaC1/10mM Mg(0Ac)2/20mMtris0Ac pH8/1mMDTT. 15min à 37°C La coupure est détectée par la présence d'un fragment à 40pb (Figure 3C). Exemple 2 : Modification ciblée du génome d'oeufs fécondés de poisson zèbre Cellules Une lignée exprimant ubitiquitairement la eGFP est utilisée pour démontrer l'efficacité de la méthode : la lignée Ubi eGFP : switch III. L'autorisation d'utiliser librement la lignée pour tester efficacité des nucléases comme outils de transgénèse a été obtenue de Christian Mosimann (IMLS, Université de Zurich, Suisse). Cette lignée obtenue par transgenèse par transposition To12 porte une copie unique du transgène. Afin d'obtenir un échantillon homogène pour tester l'efficacité des nucléases, les oeufs servant aux injections sont issus du croisement de poissons- zèbres mâles homozygotes de la lignée Ubi eGFP : switch III avec des femelles de la lignée sauvage AB. Ainsi tous les descendants portent une copie du transgène et il n'y a pas d'expression maternelle du transgène. Dans les conditions contrôles (sans injection), 100 % de ces oeufs expriment la GFP de manière ubiquitaire. La solution testée est injectée dans le cytoplasme des oeufs ainsi obtenus au stade une cellule. Injections et culture Les oeufs de poissons zèbre sont collectés, triés et disposés dans une boîte d'injection (boîte de Petri recouverte d'agarose diluée dans un milieu de culture adapté au poisson zèbre a une concentration finale de 2,5%). Les aiguilles d'injection sont calibrées individuellement sous une loupe binoculaire pour libérer ml par injection. Les oeufs sont injectés avec 1 n1 de solution d'injection soit 2,8 fmol de chaque protéine ou 100 à 400 pg d'ARNm correspondant à chaque TALE nucléase. Les embryons injectés sont cultivés a 28°C pendant 24 à 48H, Injection de protéines Les TALE nucléases droite et gauche, sont co-injectées en solution, à une dose respective finale de 2,8 La solution d'injection est composée de tampon de digestion (1X : 20mM Tris Acétate 10mM MG acétate 50mM K acétate 1mM DTT pH7,9 et de NaC1 100 mM). Pour 5 pl de solution d'injection : 21.1.1 de TALE nucléase gauche (solution stock 71.1M), 21.1.1 de TALE nucléase droite (solution stock 71.1M) et liai de tampon de digestion 5X sont injectés. Injection contrôle d'ARNm de TALE (SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2) L'ARN de chaque TALE nucléase (droite et gauche) est synthétisé in vitro à l'aide 10 du kit mMES SAGE mMACHINE Ambion suivant le protocole fourni avec le kit L'ARN synthétisé est purifié sur colonne avec le kit Nucleospin RNA clean-up (Macherey Nagel). Les ARN de chaque TALE nucléase (droite et gauche) sont mélangés à des concentrations identiques dans de l'eau ultra pure sans nucléase. Les concentrations des solutions d'injection varient entre 100 et 400ngffil par TALE 15 nucléase soit entre 200 et 800 ng/ial total d'ARNm. Exemple 3 : Phénotypage des cellules de poisson-zèbres traitées selon le protocole de l'invention, répartition des phénotypes d'intensité de protéine GFP vus sous loupe binoculaire : 20 Pour les TALE nucléases dirigées contre la eGFP, (lignée eGFP Ubi : switch III) les injections sont faites dans un lignée de poisson zèbre hétérozygote pour la eGFP sous le contrôle du promoteur Ubiquitine. L'efficacité des TALE-nucleases est déterminée par l'expression résiduelle de GFP dans les larves (phénotypage) et par le séquençage génomique (génotypage). 25 Des fin-clips sont réalisés sur les FO de poisson-zèbre et l'ADN est extrait en vue de réaliser des PCRs comprenant les séquences flanquantes aux sites de coupure. Environ 20 clones en plasmide TOPO sont séquences, révélant ainsi une séquence dite de type sauvage (initial) ou une séquence modifiée (dite réécrite). Résultats : 30 Les embryons injectés sont triés sous une loupe binoculaire permettant la visualisation de la GFP in vivo et répartis en classes suivant leur degré de fluorescence. La Figure 4A montre la répartition des phénotypes d'intensité de protéine GFP vus sous loupe binoculaire. Aucune différence importante entre la répartition des embryons n'est observée après injection de protéine versus d'ARNm. La figure 4B montre le phénotype sous loupe binoculaire en lumière du jour des embryons de chacune des classes. Classe 1 : Embryon sans signal GFP visible. Classe 2 : Embryon présentant quelque cluster de cellules GFP positive Classe 3 : Embryon présentant une proportion équivalente de cellules GFP (-) et de cellules GFP (+) Classe 4: Embryon présentant une majorité de cellules GFP positive et quelque clusters de cellules GFP (-) Classe 5 : Embryon sans diminution du niveau de GFP, identique aux embryons non inj ectés. On observe une plus faible toxicité avec la TALE nucléase injectée sous forme de 15 protéine qu'avec la TALE nucléase injectée sous forme d'ARNm (moins d'embryons mal formés). L'administration de la protéine réduit plus efficacement l'expression de la GFP dans les embryons injectés au stade une cellule que l'administration de l'ARNm (6% contre 3%). Toutefois, l'efficacité globale de l'injection de protéines ou d'ARNm 20 est équivalente et conduit à une proportion similaire d'animaux mutants phénotypiquement. Exemple 4 : Génotypage des embryons injectés Préparation du matériel génétique 25 Les poissons des différentes classes sont élevés et le taux de transmission à la génération suivante est déterminé. Pour chaque poisson, un morceau de nageoire est coupé et placé dans 50 1.1.1 de tampon de lyse (10 mM Tris HC1 pH8, 50 mM KC1, 4mM EDTA, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40, 3001.1g/m1 de protéinase K). La lyse est faite à 55°C sur la nuit (12h) ; suivie d'une incubation 10 min à 95°C pour inactiver 30 la protéinase K. Amplification de la séquence cible de la TALE nucléase La séquence cible de la TALE nucléase est amplifiée par PCR à partir de lysat de morceau de nageoire. Les PCRs sont réalisées avec la polymérase GoTaq (Promega) selon le protocole fourni. La séquence de la GFP est la séquence SEQ ID N°3. Les amorces utilisées sont : « Primer fwd « : GGCAAGCTGACCCTGAAGT (SEQ ID N°4) « Primer rev « : GAAGGCTACGTCCAGGAGCG (SEQ ID N°5) Le programme PCR utilisé est : 95°C : 2 min 95°C : 30 sec 60°C : 30 sec 30 cycles 72°C : 30 sec 72°C: 5 min Les produits PCR sont purifiés sur colonne Gel&PCR Clean up (Macherey Nagel). Pour le clonage des amplicons, les produits de PCR purifiés sont clonés dans le vecteur pGEM-T (Promega) avec la T4 DNA ligase (Promega). PCR sur colonies Les colonies sont repiquées individuellement dans le mix PCR suivant : Tampon (5x) : 41.11 MgC12 (25mM) : 1,41 « Primer fwd » (10uM) : 0,41 « Primer rev » (10uM) : 0,41 dNTPs (10mM) : Polymérase GoTaq (5U411) : 0,41 H20: 12,2111 Le programme PCR utilisé est : 95°C: 10 min 95°C: 30 sec 60°C: 30 sec 30 cycles 72°C : 30 sec 72°C: 5 min Les produits PCR sont purifiés au préalable avec le mélange d'enzymes ExoSap-IT Clean-up (Affymetrix) selon le protocole fourni, puis séquences. Résultats : Ils sont présentés sur les Figures 5, 6A et 6B. La figure 6A représente le nombre 5 moyen de mutations par animal, après injection de protéine ou d'ARNm. La figure 6B représente les pourcentages de la mutation la plus fréquente par animal, après injection de protéine ou d'ARNm. Le génotypage des FO a révélé une différence significative entre les témoins ARN et les poisson-zèbre injectés avec les protéines dans une méthode selon l'invention. 10 Dans la classe 1 injectée en protéines, un poisson possède une insertion unique (sur 7 séquences) et plus aucune séquence de type sauvage, démontrant qu'un événement de coupure homozygote au stadel a effectivement eu lieu. Ceci est un résultat crucial démontrant l'efficacité de l'injection de protéines, alors que 7 événements indépendants sont observés dans un poisson injecté par des ARNs. Des poissons en 15 plus grand nombre ont pu être séquences dans les classes 2 et 3 (encore un peu d'expression GFP). Sur quatre poissons séquences après injection d'ARN, une moyenne de 12 délétions indépendantes a été observée alors que seules six insertions ont été observées après injection de protéine, ce qui représente une différence importante. 20 En conclusion, une signature génotypique très différente est obtenue selon que l'on injecte de l'ARNm ou des protéines. Les larves mutées par l'administration de la forme ARNm de la nucléase montrent une plus grande diversité d'évènements de réparation par liaison des extrémités non homologues (Non Homologous End Joining, NHEJ) que celles obtenues par l'administration de la nucléase protéique, 25 même si les fréquences globales de ces événements sont similaires. Une analyse détaillée des cassures double brin (Double Strand Breaks, DSB) montre que ceux-ci apparaissent à des stades plus précoces -éventuellement au stadel- après l'injection de la protéine, comme suggéré par la réduction du mosaïcisme dans les mutants poisson-zèbre comparés avec les mutants de poisson zèbre obtenus après l'injection 30 d'ARNm. Dans au moins un cas, la cassure réparation a même eu lieu dès le stade une cellule. Exemple 5 : Modification ciblée du génome d'ovocytes de xénope La technique implique d'utiliser l'injection intracytoplasmique de noyaux de spermatozoïde (ICSI). Pour les injections de protéines, la solution de protéine est incubée avec des noyaux de spermatides. Le mélange sert ensuite à injecter des ovocytes non fécondés. Pour les tests d'efficacité des TALE nucléases, les noyaux de spermatides sont issus de mâles porteur d'un rapporteur GFP à l'état hétérozygote et injectés dans des ovocytes sauvages. Un contrôle est réalisé en injectant des ovocytes issus de femelles transgéniques pour la GFP avec des noyaux de spermatides issus de mâles de lignée sauvage. Exemple 6 : Génotypage des cellules de xénope obtenues après fécondation par ICSI selon l'exemple 5 Dans le cas d'injection de spermatides de mâle portant la GFP avec la protéine, des 15 résultats montrant une très forte réduction des pourcentages des animaux exprimant la GFP sont obtenus. La plupart des animaux obtenus n'expriment plus du tout la GFP. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 20 - Alvin C, et al. (2013), "High Efficiency In Vivo Genome Engineering with a Simplified 15-RVD GoldyTALEN Design".PLoS ONE 2013 June 4th. - Deng et al., (2012). SciencExpress, 5 January 2012, 1-5 - Horvath et Barrangou, (2013) Cell Research, 23:733-734. - Huang et al., (2011), Nature Biotechnology, Vol.29, Number 8, 699-700. 25 - Pillay et al., (2013) "Evaluating the Mutagenic Activity of Targeted Endonucleases Containing a Sharkey FokI Cleavage Domain Variant in Zebrafish". Zebrafish 2013 June 20th. - Peng, P. et al., (2012) J Genet Genomics, 2012 October lst. - Mihaylova et al., (2011), Cell, May 13 ; 145(4) :607-621. 30 - Victoria M, et al., (2012) "In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system". Nature 2012 November 6th, REVENDICATIONS1. Procédé de génération d'un organisme à partir d'une cellule, l'exception d'un organisme humain, comprenant la modification ciblée du génome de ladite cellule par l'administration dans cette cellule d'au moins un agent capable d'induire la modification ciblée du génome, caractérisé en ce que ledit agent est administré sous la forme d'au moins une protéine, suivie de la génération dudit organisme à partir de ladite cellule. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent est une enzyme. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'enzyme est 10 une endonucléase de restriction. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'endonucléase de restriction comprend au moins un domaine de liaison à l'ADN choisi parmi les domaines du groupe des effecteurs de transcription de type activateur, désignés aussi comme « Transcription Activator-Like Effector (TALE) ». 15 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'endonucléase de restriction comprend deux sous-unités, une première sous-unité étant codée par une séquence nucléotidique identique à, ou possédant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID N°1, et une seconde sous-unité étant codée par une séquence nucléotidique identique à ou possédant au moins 90% d'identité avec la séquence 20 SEQ ID N°2. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine est administrée à la cellule par une méthode choisie parmi : l'injection, la micro-inj ection, 1' électroporation. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que 25 l'organisme est un animal choisi dans le groupe des mammifères et des poissons. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite cellule est choisie dans le groupe constitué par un oeuf, un ovocyte, un spermatozoïde. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que 30 ledit agent est administré dans un ovocyte simultanément à injection intracytoplasmique de noyaux de spermatozoïde. 10. Protéine ayant une activité endonucléase et comprenant une première sous-unité codée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence identique, ou ayant au moins 90% d'identité avec, la séquence SEQ ID N°1 et une sous-unité codée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence identique ou ayant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID N°2. 11. Utilisation pour la génération d'un organisme, à l'exception d'un organisme humain, d'un agent capable d'induire la modification ciblée du génome d'une cellule, caractérisée en ce que ledit agent est administré dans ladite cellule sous la forme d'au moins une protéine, la génération dudit organisme ayant lieu à partir de la cellule dont le génome a subi ladite modification ciblée. 12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit agent est une endonucléase comprenant un domaine de liaison à l'ADN choisi parmi les domaines du groupe des effecteurs de transcription de type activateur, désignés aussi comme « Transcription Activator-Like Effector (TALE) ». 13. Utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que l'endonucléase comprend une sous-unité codée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence identique ou ayant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID N°1 et une sous-unité codée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence identique ou ayant au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID N°2. 14. Cellule hôte non-humaine dont le génome a été modifié par un procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 15. Organisme non-humain obtenu par un procédé de génération d'un organisme selon l'une des revendications 1 à 9.