Brevet FR3003863A1 — publié le 20141003

CANAL CALCIQUE D'ABEILLE ET UTILISATIONS DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un canal calcique isolé d'abeille comprenant une sous unité Caval . La présente invention se rapporte également à un canal calcique isolé d'abeille comprenant une sous unité Caval , une protéine régulatrice Cava2,5 et/ou une protéine régulatrice Cap. La présente invention se rapporte également à des séquences d'acides nucléiques codant pour ces sous unités isolées d'abeille, à des vecteurs comprenant ces séquences codantes, à un procédé de fabrication de ces canaux calciques. La présente invention se rapporte également à un procédé de détermination de la toxicité d'une molécule et/ou de détection d'une molécule toxique et/ou d'analyse de la toxicité d'une molécule utilisant un canal calcique isolé d'abeille. La présente invention trouve notamment des applications dans le domaine agricole, écologique, chimique et dans le domaine apicole. En particulier, elle trouve des applications, pour l'analyse/l'identification de la toxicité ou de l'innocuité de molécules, par exemple de molécules chimiques, vis-à-vis des abeilles. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (E]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique La régression et le déclin inhabituellement élevés des colonies d'abeilles enregistrés ces dernières années, menant souvent à un syndrome d'effondrement des ruches, par exemple jusqu'à 40% du cheptel en Espagne en 2007, sont extrêmement préoccupants. Ces effondrements ne semblent pas tous passer par une mortalité immédiate des abeilles mais pourraient aussi être la conséquence de modifications de comportements sociaux au sein de la ruche aboutissant à sa disparition. Les recherches menées sur les causes de ces effondrements, essentiellement réalisées sur Apis mellifera, mettent en cause plusieurs facteurs incluant l'intensification de l'agriculture, l'existence de parasites, de pathogènes ou de prédateurs. En France le débat sur ces effondrements s'est surtout focalisé sur l'utilisation des insecticides. En particulier, et même si une toxicité aigüe de ces produits (40 ng/abeille) semble écartée dans la plupart des cas, une toxicité chronique, voire synergique, s'opérant pour des doses beaucoup plus faibles ayant peu d'effets létaux immédiats, mais des effets comportementaux non négligeables sur le long terme, pourrait être impliquée (Suchail et al., 2001 [1]). Les pyréthrinoïdes aussi bien vendus comme médicament vétérinaire (contre les parasites des chats et chiens), comme produit ménager (bombe insecticide) que comme insecticide utilisé en agriculture, en horticulture ou en apiculture, ont pour cible principale, chez l'insecte, une protéine de la membrane des neurones responsable de leur excitabilité à savoir les canaux sodiques dépendant du voltage codés par le gène para. Leur action passe par une diminution de la désactivation de ces canaux aboutissant à une hyperexcitabilité nerveuse délétère (Kadala et al., 2010 [2] ;Ray and Fry, 2006 [3]). L'analyse de leur toxicité chez les mammifères a permis de démontrer l'existence d'autres cibles sur les neurones et notamment les canaux calciques dépendant du voltage (CCDV). Ces canaux jouent un rôle fondamental dans l'excitabilité cellulaire, la transmission synaptique, l'expression génique et dans de nombreuses autres fonctions, plus intégrées, dépendant du calcium, par exemple la mémoire, l'apprentissage etc. (Catterall, 2000 [4]). Ils constituent une cible reconnue de nombreux médicaments utilisés en médecine humaine, ou d'autres régulateurs utilisés en recherche fondamentale. Des rôles biologiques similaires du calcium ont été retrouvés chez l'abeille (Grunewald, 2003 [5]). Il a par exemple été montré, in vivo chez l'abeille, que des variations de calcium intracellulaires au niveau des cellules de Kenyon jouent un rôle important dans les mécanismes d'apprentissage et de mémoire olfactive, deux fonctions potentiellement importantes pour le butinage et le retour à la ruche, fonctions touchées par les insecticides. Malheureusement, malgré le séquençage du génome d'Apis mellifera réalisé en 2006 (Weinstock et al., 2006), et l'identification de certains gènes codant pour ces canaux, aucun de ces gènes n'a, à l'heure actuelle, été cloné et exprimé, aucun anticorps ni aucun siRNA validé n'est encore disponible pour des expériences in vitro, comme in vivo. Ce manque prive clairement la recherche et l'industrie d'outils extrêmement précieux pour la compréhension des mécanismes moléculaires régulant l'excitabilité cellulaire, le comportement de l'abeille (Weinstock et al., 2006 [6]), la toxicité de ces molécules, mais aussi pour des études toxicologiques comparées précises entre insectes nuisibles et utiles et/ou mammifères, ou la mise au point de tests simples de toxicité. Il existe donc un réel besoin d'identifier, d'isoler et de caractériser les canaux calciques d'abeille palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier un canal susceptible d'être utilisé dans un procédé permettant d'identifier, quantifier et/ou tester la toxicité d'une molécule vis-à-vis des abeilles, permettant ainsi de réduire les coûts et d'améliorer, notamment la production apicole et/ou l'écologie. Description de l'invention La présente invention a précisément pour but de répondre à ce besoin en fournissant des sous-unités de canaux calciques d'abeille de séquence choisie dans le groupe comprenant la séquence SEQ ID N° 1 à 3 du listage annexé et des canaux calciques d'abeille isolés d'abeille comprenant une sous unité Cava1 de séquence choisie dans le groupe comprenant la séquence SEQ ID N° 1 à 3 du listage annexé. Ces sous unités de SEQ ID n°1 à 3 ont été appelées respectivement amCavl a, amCav2b ou amCav3a par les inventeurs. En particulier, les inventeurs ont identifié, isolé et fournissent en particulier les sous unités d'un canal calcique d'abeille, en particulier d'Apis mellifera. La présente invention a également pour objet un canal calcique isolé d'abeille comprenant : une sous unité Caval telle que définie ci-dessus et comprenant en outre au moins une protéine régulatrice choisie parmi une protéine régulatrice Cava2,5 de séquence choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID NO 6 à 8 du listage annexé, et au moins une protéine régulatrice Cavp choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N° 4, 5 et 107 du listage annexé. Les sous unités de SEQ ID n°6 à 8 ont été appelées respectivement amCava21, amCava2Ô2 ou amCava2Ô3 par les inventeurs. Les sous unités de SEQ ID n°4, 5 et 107 ont été appelées respectivement amCavpa, amCavpb ou amCavpc par les inventeurs. Avantageusement, selon l'invention le canal calcique isolé d'abeille est un complexe protéique comprenant une sous unité Caval , une protéine régulatrice Cava2,5 et une protéine régulatrice Cap. La présente invention se rapporte également aux acides nucléiques codant pour une sous unité Caval selon la présente invention, notamment pour la protéine de séquence SEQ ID n° 1 à 3 du listage annexé. Il peut s'agir par exemple d'une séquence nucléotidique comprenant ou constituée de la séquence SEQ ID n° 9 à 11 respectivement du listage de séquences annexé. La présente invention se rapporte également à une séquence nucléotidique codant pour la protéine régulatrice Cava2,5 de séquence SEQ ID n° 6 à 8 du listage de séquences annexé. Il peut s'agir par 3003 863 5 exemple de la séquence SEQ ID n° 15 à 17 respectivement du listage de séquences annexé. La présente invention se rapporte également à une séquence nucléotidique codant pour la protéine régulatrice Cavp de séquence SEQ 5 ID n° 4, 5 ou 107 du listage de séquences annexé. Il peut s'agir par exemple de la séquence SEQ ID n° 12 à 14 respectivement du listage de séquences annexé. La présente invention se rapporte également aux acides nucléiques codant pour un complexe protéique comprenant une sous unité 10 Cava1, une protéine régulatrice Cava2,5 et une protéine régulatrice Cavp selon la présente invention, notamment pour la protéine de séquence SEQ ID n°1 à 8 et 107. Il peut s'agir par exemple d'une séquence nucléotidique comprenant ou constituée de la séquence SEQ ID n°9 à 17 du listage de séquences annexé. 15 La présente invention se rapporte également à un vecteur comprenant une séquence nucléotidique codant pour une des sous unités Cavai et/ou une protéine régulatrice Cava2-E, et/ou une protéine régulatrice Cavp d'abeille de la présente invention, par exemple un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID n° 9 à 17 20 On entend par « vecteur » au sens de la présente invention, des vecteurs d'expression et/ou de sécrétion dans une cellule hôte déterminée. Ils peuvent par exemple être des vecteurs d'origine plasmidique ou virale, comportant, outre la séquence d'acide nucléique, les moyens nécessaires à son expression. Ces moyens peuvent par exemple inclure un promoteur, 25 des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Le vecteur d'expression peut également comprendre d'autres éléments tels qu'une origine de réplication, un site de clonage multiple, un enhanceur, un peptide signal qui pourra être fusionné en phase avec le polypeptide 30 produit lors du clonage, et un ou plusieurs marqueurs de sélection. Le vecteur peut être un des vecteurs connus de l'homme du métier pour fabriquer des protéines par recombinaison génétique. Il peut s'agir par 3003 863 6 exemple d'un vecteur plasmidique, d'un vecteur viral, par exemple un vecteur adénoviral, un vecteur retroviral, un bactériophage. Il est choisi en général notamment en fonction de l'hôte cellulaire choisi. Le vecteur peut être par exemple choisi parmi les vecteurs listés dans le catalogue 5 http://www.promega.com/vectors/mammalian_express_vectors.htm [7] ou http///wwwqiagen.com [8] ou encore https://www.lifetechnologies.com [18]). Il peut s'agir par exemple du vecteur d'expression décrit dans le document W083/004261 [10]. Les acides nucléiques de la présente invention ou les vecteurs 10 de la présente invention sont utilisables notamment pour la fabrication par recombinaison génétique des sous unités Cavai et/ou des protéines régulatrices de la présente invention. Aussi, la présente invention se rapporte également à une cellule hôte comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention ou un vecteur selon l'invention telle que définie 15 ci-dessus. Les acides nucléiques de la présente invention ou les vecteurs de la présente invention sont utilisables notamment pour la fabrication par recombinaison génétique des canaux calciques de la présente invention. Aussi, la présente invention se rapporte également à une cellule 20 transformée comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. On entend par « cellule transformée » au sens de la présente invention une cellule procaryote ou eucaryote. Les cellules transformables selon la présente invention sont celles couramment utilisées pour les 25 recombinaisons génétiques. Elles incluent notamment des cellules de bactéries telles que Escherichia cou i ou Bacillus sp., des cellules de levures telles que Saccharomyces cerevisiae, des cellules de champignons telles que Aspergillus figer, des cellules d'insectes, telles que SF9, et des cellules de mammifères (notamment humaines) telles que les lignées 30 cellulaires CHO, HEK 293, PER-C6, des cellules d'amphibiens, par exemple des ovocytes de xenope, etc. Les techniques de recombinaison génétiques utilisables dans la présente invention sont celles connues de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple des techniques décrites dans Guide to Molecular Cloning Techniques (Guide to Molecular Cloning Techniques, Editeurs Berger SL et Kimmel AR, Methods in Enzymology, vol. 152 [11]) ou Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Editeurs Green MR et Sambrook J., Cold Spring Harbor Laboratory Press [12]) En fonction de la cellule à transformer, l'homme du métier peut 10 aisément déterminer les moyens nécessaires à l'introduction et à l'expression de la séquence nucléotidique de la présente invention dans la cellule hôte choisie, ainsi que le vecteur d'expression utilisable. La cellule transformée par un vecteur d'expression ou une séquence nucléique selon l'invention exprime alors le polypeptide 15 correspondant de manière stable, comme décrit dans les exemples ci- dessous. L'homme du métier peut aisément vérifier que la cellule hôte exprime le polypeptide de manière stable, par toute technique connue de l'homme du métier permettant d'identifier les peptides de la présente invention en fonction de leur poids moléculaire notamment, par exemple en 20 utilisant la technique du Western blot. La cellule transformée peut être toute cellule appropriée pour la fabrication par recombinaison génétique de canaux calciques de la présente invention à partir des séquences nucléiques ou des vecteurs de l'invention. Il peut s'agir par exemple d'E. Coll, par exemple E. cou BL21, 25 E. cou/ Origami (DE3) de Pischia pastoris, de Saccharomyces cerevisiae, de cellules d'insectes, par exemple un système cellules d'insectesbaculovirus (par exemple cellules d'insecte SF9 utilisant un système d'expression de baculovirus), de mammifères, par exemple des cellules hek293, de batraciens par exemple des ovocytes de xenope 30 Les moyens de culture de ces cellules sont ceux connus de l'homme du métier, par exemple ceux décrits dans les documents précités. Les inventeurs sont les tout premiers à avoir isolé et caractérisé une sous-unité Caval une protéine régulatrice Cava2,5 et une protéine régulatrice Cavp du canal calcique d'abeille. En particulier, les inventeurs ont en outre montré que ce canal composé d'une sous unité Caval et/ou de la protéine régulatrice Cava2,5 et/ou de la protéine régulatrice Cavp d'abeille sont sensibles à certains composés qui peuvent modifier les propriétés du canal composé d'une sous unité Caval et/ou la protéine régulatrice Cava2,5 et/ou de la protéine régulatrice Cavp d'abeille, par exemple par obturation du pore du canal, par exemple par modification des cinétiques du courant calcique ou par exemple par modification de sa sensibilité au voltage, et peuvent donc être utilisés notamment pour analyser la toxicité de molécules. La présente invention se rapporte donc également à un procédé de détermination de la toxicité d'une molécule et/ou analyse de la toxicité d'une molécule et/ou détection d'une molécule toxique, ledit procédé comprenant une étape d'analyse électrophysiologique ou d'imagerie calcique comprenant la mise en contact de ladite molécule avec un canal selon l'invention ou avec une cellule transformée selon l'invention. La présente invention se rapporte également à la détermination de l'interaction entre le canal selon l'invention et une molécule. Dans la présente par « molécule » on entend toute molécule que l'on souhaite tester afin de déterminer si elle interagit avec la sous unité Caval et/ou la protéine régulatrice Cava2,5 et/ou de la protéine régulatrice Cavp d'abeille. Il peut s'agir par exemple de molécules chimiques et/ou biologiques, par exemple de molécules utilisées comme insecticide, comme désherbant, comme antifongique, comme engrais, phytosanitaires, et plus généralement de toute molécule utilisée dans les domaines de la production agricole, animalière, viticole, domestique, etc. Il peut s'agir de molécules existantes ou de nouvelles molécules qui grâce à la présente invention pourront être testées avant utilisation dans la nature. La présente invention fournit donc un moyen efficace pour lutter contre la disparition des abeilles et/ou en déterminer les causes. A titre d'exemple, les molécules chimiques peuvent être des insecticides, par exemple perméthrine, par exemple alléthrine, des engrais, des pesticides. A titre d'exemple, les molécules d'origines biologiques peuvent être des venins d'insectes, par exemple d'araignée, des venins de mollusques, par exemple d'escargot ou des venins de vertébrés, par exemple de serpent. Dans la présente par « analyse électrophysiologique » on entend toute technique électrophysiologique connue de l'homme du métier. Par exemple, l'analyse électrophysiologique peut être réalisée en voltage imposé à simple ou double électrodes en patch-Clamp, en courant imposé. Il peut s'agir par exemple de la technique décrite dans le document Electrophysiologie moléculaire 2001 Ed. M. Joffre, collection enseignement de sciences, Herman [13] ou de la technique décrite dans le document Microelectrode techniques, The Plymouth Workshop Handbook 1988, Ed. N.B. Standen, P.T.A Gray and M.J. Whitaker, The Company of Biologists Limited ou Single Channel recording 1983 Ed. B. Sackmann and E Neher. Plenum Press, New York. [14] Avantageusement, une molécule candidate peut être déterminée comme étant toxique lorsqu'elle inhibe, diminue, augmente ou altère le courant du canal selon l'invention. Dans la présente par « imagerie calcique » on entend tout procédé d'imagerie calcique connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans Calcium Measurement Methods, 2010 Ed Alexei, Verkhratsky; Petersen, Ole H. Series: Neuromethods, vol. 43 Humana Press [15]. Avantageusement, la détermination de la toxicité d'une molécule peut être effectuée par comparaison de l'activité et/ou aux propriétés du canal selon l'invention en présence de ladite molécule candidate par rapport à l'activité et/ou aux propriétés du canal selon l'invention en l'absence de ladite molécule candidate. Lors de cette détermination, on peut utiliser l'une des cellules hôtes précitées, transformée au moyen d'une séquence nucléotidique ou d'un vecteur selon l'invention, et exprimant l'une ou plusieurs des protéines de la présente invention. On favorise de préférence des cellules qui expriment l'une ou plusieurs des protéines de la présente invention et la ou les présente sur sa surface cellulaire comme canal. Il peut s'agir par exemple de cellules de xenope ou de cellules HEK293 telles que présentées dans les exemples ci-dessous. On peut également réaliser la détermination par l'une des techniques de chromatographie, ou d'immunoprécipitation connues de l'homme du métier adaptées pour réaliser des essais d'interaction entre la ou les protéines de la présente invention et les molécules à tester. Il peut s'agir par exemple d'une méthode de chromatographie par affinité, adsorption, etc. Selon l'invention, l'analyse de la toxicité d'une molécule peut être effectuée par comparaison de l'activité et/ou des propriétés du canal selon l'invention en présence de ladite molécule candidate par rapport à l'activité et/ou aux propriétés du canal selon l'invention en l'absence de ladite molécule candidate ou en présence d'une molécule de référence dont on connait l'interaction avec la ou les protéines du canal. Des mesures d'étalonnage peuvent également être effectuées, avec une molécule de référence, à différentes concentrations, comme par exemple le cadnium, ou la nifedipine D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, données à titre illustratif. Brève description des figures - La figure 1 représente un schéma des exons présents dans le gène codant la sous unité amCav1a, la séquence nucléique de l'ADNc de la sous unité amCav1a (SEQ ID n°9) et la séquence peptidique correspondante (SEQ ID n°1). - La figure 2 représente un schéma des exons présents dans le gène codant la sous unité amCav2b, la séquence nucléique de l'ADNc de la sous unité amCav2b (SEQ ID n°10), la séquence peptidique correspondante (SEQ ID n°2) et la séquence peptidique des exons alternatifs du gène codant la sous unité amCav2. - La figure 3 représente un schéma des exons présents dans le gène codant la sous unité amCav3a, la séquence nucléique de l'ADNc de la sous unité amCav3a (SEQ ID n°11), séquence peptidique correspondante (SEQ ID n°3) et la séquence peptidique des exons alternatifs du gène codant la sous unité amCav3. - La figure 4 représente un schéma des exons du gène codant la sous unité Cav137 la séquence nucléique de l'ADNc de la sous unité amCavi3a (SEQ ID n° 12) et la séquence peptidique correspondante (SEQ ID n°4) - La figure 5 représente les séquences nucléotidiques de l'ADNc de deux autres variants de la sous unité CavI3, amCavi3b (SEQ ID 13) et amCavi3c (SEQ ID n° 14) et leur séquence peptidique, amCavi3b (SEQ ID n°5) et amCavi3c (SEQ ID n° 107). - La figure 6 représente un schéma des exons du gène codant la sous unité amCava2Ô1 , la séquence nucléique de l'ADNc de la sous unité amCava2Ô1 (SEQ ID n° 15) et la séquence peptidique correspondante (SEQ ID n°6) - La figure 7 représente un schéma des exons du gène codant la sous unité amCava2Ô2, la séquence nucléique de l'ADNc de la sous unité amCava2Ô2 (SEQ ID n° 16) et la séquence peptidique correspondante (SEQ ID n°7) - La figure 8 représente un schéma des exons du gène codant la sous unité amCava2Ô3, la séquence nucléique de l'ADNc de la sous unité amCava2Ô3 (SEQ ID n° 17) et la séquence peptidique correspondante (SEQ ID n°8) - La figure 9 représente les traces de courants enregistrés en voltage-imposé des canaux calciques d'Apis mellifera Cava (AmCaV1a en haut, ou AmCav2b en bas) avec les protéines Cavp (AmCavpa) et Cava2- '51 (AmCaVa2-1) après injection dans des ovocytes de Xénopes d'ARN synthétisé in vitro. A: Courants enregistrés en voltage-imposé sur ces deux types d'ovocytes (trois jours post-injection) lors de l'application d'une dépolarisation de -80 mV à +10 ou +20 mV de 400 ms de durée. B Courbes courant-voltage enregistrées sur ces ovocytes montrant la voltage-dépendance de l'ouverture de ces canaux calciques d'Apis mellifera. L'ordonné représente le courant calcique normalisé à -1 par rapport à son maximum d'amplitude à +10mV, l'abscisse représente la valeur de la dépolarisation en millivolt (mV), a gauche avec AmCaV1a et à droite avec AmCav2b, dans les deux cas en présence de AmCavpa et Am C aVa2-Ôl. - La figure 10 A représente les traces de courants calciques Cava (AmCaV2b) avec les protéines Cavp (AmCavpa) et Cava2-E, (AmCava2- '51 ) enregistrées en voltage-imposé 3 jours après injection d'ARN dans un ovocyte de Xénopes. La trace référencée cont représente le courant enregistré dans des conditions contrôles, la trace notée perm a été enregistrée à l'état stable après perfusion de perméthrine à 20 pM dans le milieu d'incubation. La figure 10 B représente un diagramme en bâton montrant le pourcentage moyen de l'amplitude du courant (ordonné) en absence (cont) ou en présence (perm) de la perméthrine (20pM), normalisé par rapport au contrôle à 100%. La figure 10 C représente les variations de l'amplitude du courant (normalisée par rapport au début de l'enregistrement fixe à 1, ordonné) en fonction du temps (en secondes) après perfusion de la permethrine à 20 pM dans le milieu extracellualire (début de la perfusion marqué par une flèche). - La figure 11 A représente un gel de RT-PCR de l'analyse de l'expression des deux variants de Cavp d'abeille à différents stades de développement d'une larve et d'une pupe, aux jours 6 à 16 après 3003 863 13 l'éclosion. La figure 11 B représente un Western-blot d'extraits cellulaires de cellules Hek T293 transfectées avec le cDNA codant les sous unités amCavi3a (Am-Cava) ou amCavi3b (Am-Cavpb) (a, b, respectivement), ou de cerveau (B) et de thorax (T) d'abeille adulte en utilisant des anticorps 5 primaires dirigés soit contre la partie amino-terminale (Nt-Ab) soit contre la partie carboxy-terminale (Ct-Ab) de la sous unité amCavi3a. La figure 11 C représente une tranche de cerveau (25 lm d'épaisseur) marquée avec l'anticorps Nt-Ab. La coloration est observée dans le complexe central (CC), le calice des corps pédonculés (MB), le lobe optique (OL) (lam = 10 lamina, lob = lobula et med = médullaire), et les lobes antennaires (AL). La figure 11 D représente une photographie d'immunofluorescence marquant l'expression de la protéine Cavp dans les neurones des lobes antennaires en culture. La figure 11 E représente une photographie d'immunofluorescence marquant l'expression de la protéine Cavp dans 15 une culture primaire de cellules musculaires, Le marquage du noyau (pointes de flèches) n'est observé que dans les cellules musculaires. En parties D et E l'anticorps primaire Ct-Ab a été utilisé. - La figure 12 A représente des photographies de larves 10 jours (J10), 11 jours (J11) et 16 jours (J16) après éclosion. La figure 12 B 20 représente des gels d'agaroses d'acides nucléiques montrant le profil d'expression déterminé par RT-PCR de deux des variants de la sous-unités Cavp (amCavi3a (AmCavpa) et amCavi3b (AmCavpb)), des sous unités Cava1 (amCav1a (CaV1), amCav2b (CaV2) et amCav3a (CaV3)), et des sous unités Cava-Ô (amCava2Ô1 (Cava2,51), amCava2Ô2 (Cava2,52) 25 et amCava2Ô3 (Cava2-Ô3)) des canaux calciques d'Apis mellifera au cours du développement de J6 à J16. - La figure 13 A représente des traces de courants de canaux calciques de lapin (rabbit CaV2.2), avec les protéines Cava2,51 de lapin et AmCavpa d'abeille, exprimés dans l'ovocyte de Xenope et enregistrés en 30 voltage-imposé 3 jours post-injection lors de dépolarisation de -80 mV à +10 mV de 400 ms de durée. Les deux traces superposées montrent les traces enregistrées en absence (control) et en présence (Allet) d'alléthrine (20pM). La figure 13 B représente un diagramme en bâton montrant l'effet moyen sur l'amplitude des courants de canaux calciques de lapin (rabbitCaV2.2) en présence deCava2,51de lapin seul (H20) ou avec la protéine Cav13 (variants a (AmCavpa) ou b (AmCavi3b)). La figure 13 C représente l'effet sur l'amplitude du courant en pAmpère (ordonné) en fonction du temps (en secondes) de la perfusion de l'allethrine dans le milieu extracellulaire sur un ovocyte de Xenope exprimant un canal calcique de lapin (rabbitCaV2.2) avec la protéine CaVa2-E, de lapin et la protéine CaVpa d'abeille. - La figure 14 représente les propriétés fonctionnelles des sous- unités Am-CaVpa et Am-CaVpb. La figure 14 A gauche: représente les traces des courants enregistrés à partir de trois différents ovocytes exprimant le canal calcique CaV2.3 et CaVa2-E, de lapin sans (H20) ou avec la protéine Cavp d'abeille (variants a (AmCavpa) ou b (AmCavpb)) pendant une dépolarisation de 400 ms de -80 mV à +10 ou +20 mV (les traces sont superposées). A droite: un diagramme en bâton représente les moyennes de pics d'amplitude de courants mesurés durant les dépolarisations similaires à celles de la partie gauche. La figure 14 B gauche représente la cinétique d'inactivation, quantifiée en R400 (courant relatif résiduel après une dépolarisation de 400 ms à +10 mV), pour les canaux calciques CaV2.3 et CaVa2-E, de lapin sans (H20) ou avec la protéine Cavp d'abeille (variant a (AmCavpa) ou b (AmCavpb)). La figure 15 B droite représente la moyenne de temps pour le pic de courant en millisecondes (ms) pour les canaux calciques CaV2.3 et CaVa2-E, de lapin sans (H20) ou avec la protéine Cavp d'abeille (variant a (AmCavpa) ou b (AmCavi3b)). La figure 14 C représentent les courbes courant-voltage (à gauche) et inactivation dépendante du voltage (isochrone à 2,5 sec, à droite) pour les canaux calciques CaV2.3 et CaVa2-E, de lapin sans (H20) ou avec la protéine Cavp d'abeille (variant a (AmCavpa)). Dans les deux cas, l'amplitude du courant est normalisée à 1 par rapport à l'amplitude la plus grande de la courbe (courant relatif, Rel. Current, en ordonné), et le voltage est exprimé en millivolts (mV). - La figure 15 représente la différence des cinétiques d'inactivation des canaux calciques CaV2.3 et CaVa2-E, de lapin sans (H20) ou avec la protéine Cavp (variant abeille (AmCav[3a), ou de rat ([31 ou 132). La figure 15 A gauche représente les traces de courants enregistrés à partir d'ovocytes exprimant le canal calcique CaV2.3 et CaVa2-E, de lapin sans (H20) ou avec la protéine Cavp d'abeille (Am-13a), Cav[32a de rat, ou Cav[31b de rat). La figure 15 A droite représente un diagramme en bâton de la cinétique d'inactivation moyenne du courant exprimée en R400 (courant résiduel après 400ms) de canaux calciques CaV2.3 et CaVa2-E, de lapin sans (H20) ou avec la protéine Cavp d'abeille (Cava), Cav[32a de rat, ou Cav[31b de rat. La figure 15 B représente des photographies de cellules HeK-293 transfectées avec la protéine Cav13 d'abeille (Am-Cava) marquées avec un anticorps Ct-Ab (contre la partie carboxy terminale de Am-Cava) et un anticorps secondaire de lapin couplé à l'alexa 488 (image de gauche), marquées au colorant de Hoecht (milieu) et l'image fusionnée (droite). La figure 15 C représente un diagramme en bâton de l'effet sur l'inactivation, exprimé en R400, du canal CaV2.3 de lapin en présence de Cavp d'abeille (Am-Cava) ou de Cav[32a de rat, de la présence (+) ou l'absence (-) de 2Br-palmitate (injecté 30-60 min avant l'enregistrement dans les ovocytes). La figure 15 D représente des courbes de constantes de temps d'inactivation (Tinac) exprimées en seconde et du pourcentage d'inactivation lente (%-cslow) par rapport à l'inactivation totale en fonction du voltage pour le canal CaV2.3 de lapin en présence de Cavp d'abeille (Am-Cava) ou de Cav[32a de rat. La figure 15 E représente les traces de courants unitaires de canaux enregistrés dans des ovocytes exprimant le canal CaV2.3 de lapin en présence du Cav13 d'abeille (Am-Cava, à gauche) ou Cav[32a (à droite) de rat. Sont mis en évidence, au début et à la fin des courbes, les phases de dépolarisations utilisées pour calculer les probabilités d'ouverture. La courbe rouge en dessous de chaque enregistrement représente la moyenne de 100 enregistrements en canal unitaire pour le canal CaV2.3 de lapin en présence du Cavp d'abeille (Am-Cava, à gauche) ou Cav[32a (à droite) de rat. La figure 15 F gauche représente un diagramme en bâton de la probabilité d'ouverture moyenne du canal dans la phase précoce (E) ou tardive (L) de dépolarisation enregistrée dans des ovocytes exprimant le canal CaV2.3 de lapin en présence du Cavp d'abeille (Am-Cava, grisé) ou Cav32a (en blanc) de rat. La figure 15 F Droite représente un diagramme en bâton représentant la moyenne en milliseconde des constantes d'ouverture rapide et lente (fast tau et slow tau) enregistrées dans des ovocytes exprimant le canal CaV2.3 en présence du Cavp d'abeille (AmCavpa, grisé) ou Cavp2a (en blanc) de rat à deux potentiels différents (-20 mV et 0 mV) - La figure 16 A représente des diagrammes en bâton de la moyenne de l'inactivation exprimée en R400 de canaux CaV2.3 de lapin exprimés avec le Cavp d'abeille (Am-Cava ou Am-Cavpb) ou Cavp2a de rat dans des conditions contrôles (C) ou en présence de genistein (G), staurosporine (S), H89 (H), Wortmannin (W), ou LY294002 (L). La figure 16 B gauche : représente la trace de courant enregistrée durant une rampe de voltage de -80 à +80mV pendant 150ms sur un neurone antennaire d'abeille, milieu : traces de courants superposées enregistrées à partir de trois neurones d'abeille en culture après incubation dans une solution contrôle (C), ou avec un inhibiteur de S/T kinases H89 (H), ou un inhibiteur de Pl3kinase Wortmannin (W) durant une dépolarisation de -80 à +10mV de 100 ms de durée, droite : diagramme en bâton représentant l'inactivation moyenne quantifiée en R90 (courant résiduel après une dépolarisation de 90 ms à +10 mV) après incubation de 30-60 min des neurones en culture dans une solution contrôle (C), ou additionnée d'un inhibiteur de S/T kinases H89 (H, 50pM), ou d'un inhibiteur de Pl3kinase Wortmannin (W, 10pM). La figure 16 C gauche représente: une trace de courant enregistré durant une rampe de voltage de -80 à +80mV pendant 150ms à partir de cellules musculaires de pattes méthatoraciques d'abeille fraichement dissociées, milieu : traces de courant enregistrées à partir de cellules musculaires de pattes méthatoraciques après incubation dans une solution contrôle (C), ou additionnée d'un inhibiteur de S/T kinases H89 (H, 50pM), ou un inhibiteur de Pl3kinase Wortmannin (W, 10pM) durant une dépolarisation de -80 à +10mV d'une durée de 400ms, droite : diagramme en bâton représentant l'inactivation moyenne quantifiée en R400 après incubation des cellules musculaires dans une solution contrôle (C), ou additionnée d'un inhibiteur de S/T kinases H89 (H), ou d'un inhibiteur de Pl3kinase Wortmannin (W). EXEMPLES Exemple 1: identification et production d'un canal calcique isolé d'abeille Les protocoles suivants ont été appliqués pour l'identification et la production d'un canal calcique isolé d'abeille. 1. Extraction des ARNs totaux du cerveau d'abeille. Pour l'extraction des ARN totaux, les pistons broyeurs, les micropipettes ainsi que la paillasse ont été soigneusement nettoyés avec la solution RNaseZap (Life Technologies, Saint Aubin, France). Les tubes de 1,5m1 (Eppendorf France SAS, Le Pecq, France) ont été autoclaves. L'eau utilisée dans toute la procédure est de l'eau stérile et dépourvue d'activité nucléase (Swampscott, MA, USA). Les abeilles butineuses adultes ont été anesthésiées à 4°C ou par inhalation de CO2. Le cerveau a été prélevé rapidement sous une loupe binoculaire et placé dans un tube de 1,5m1 gardé dans la glace. L'ARN a été extrait en utilisant le kit RNeasy Mini Kit (Q1AGEN SAS, Courtaboeuf, France). Les cerveaux, environ 12 cerveaux par extraction représentant environ 25mg de tissu, ont été broyés à l'aide d'un piston dans 600 pL de tampon RLT. Les recommandations du fabricant ont été suivies pour le reste de la procédure. Les ARN totaux ont également été extraits à partir de têtes entières. Les têtes d'environ 20 à 30 abeilles ont été broyées dans un potter dans 4m1 de RNAwiz (Life Technologies SAS, Saint Aubin, France). Le lysat a été transféré dans un tube stérile de 14 ml (BD, NJ, USA). Le volume a été ajusté à 4m1 avec du RNAwiz, agité au vortex pendant 1 minute et incubé pendant 5 minutes à température ambiante, à savoir 20°C. Un millilitre de chloroforme a été ajouté au lysat. Ce mélange a été agité au vortex pendant 1 minute, incubé 10 minutes à température ambiante, puis centrifugé à 5000g pendant 40 minutes à 4°C dans un rotor F-34-6-38 équipé d'adaptateurs (Eppendorf France SAS, Le Pecq, France). La phase aqueuse, surnageante, a été très proprement récupérée, en évitant toute contamination par l'interface, et transférée dans un nouveau tube de 14 ml. Le volume de phase aqueuse a été ajusté à 2,5m1 avec de l'eau et 5 ml d'isopropanol ont été ajoutés. Ce mélange a été agité au vortex pendant 30 secondes, incubé pendant 10 minutes à température ambiante, puis centrifugé à 5000g pendant 60 minutes à 4°C. Le culot obtenu a été lavé avec 5m1 d'une solution d'éthanol à 75% et centrifugé à 5000g pendant 10 minutes à 4°C. Après élimination du surnageant, le culot a été laissé à sécher pendant 5 minutes à température ambiante avant d'être resuspendu dans 50 à 100pL d'eau. La concentration des ARNs totaux a été mesurée par spectrophotométrie sur un Biophotomètre (Eppendorf France SAS, Le Pecq, France). L'intégrité de l'ARN a été vérifiée en faisant migrer sur un gel d'agarose un aliquot, à savoir environ 50Ong d'ARN en solution. Les solutions d'ARN ont ensuite été stockées à -80°C pour une utilisation ultérieure. 2. Synthèse du premier brin d'ADNc. La synthèse du premier brin d'ADNc a été réalisée en utilisant la SuperScript II Reverse Transcriptase (Life Technologies, Saint Aubin, France). Un mélange réactionnel de 12pL composé de 3pg d'ARN total, de 1pL d'une solution d'amorces Oligo(dT)18 à 0,514/pL (Fermentas France, Saint Rémy Lès Chevreuse, France), de 1pL d'une solution de nucléotides dNTP à 10mM, et d'eau a été réalisé. Ce mélange a été incubé pendant 5 minutes à 65°C puis gardé sur la glace. A ce mélange ont été ajoutés : 4pL du tampon de réaction (5X First Strand Buffer) et 2pL d'une solution de dithiothréitol (DTT) à 100mM fournie par le fabricant avec l'enzyme, et 1pL d'inhibiteur de RNases RiboLock (Fermentas France, Saint Rémy Lès Chevreuse, France). Ce mélange a été incubé pendant 2 minutes à 37°C puis 1pL de Reverse Transcriptase a été ajouté. La réaction a été incubée pendant 50 minutes à 42°C et stoppée en l'incubant pendant 15 minutes à 70°C. La réaction a été refroidie 2 minutes sur la glace, 1pL de RNase H (Fermentas France, Saint Rémy Lès Chevreuse, France) a été ajouté, et la réaction a été incubée pendant 20 minutes à 37°C. L'extrémité 5' de l'ADNc a été obtenue par RACE-PCR en utilisant 1014 d'ARN total et le kit First Choice RLM-RACE (Life Technologies, Saint Aubin, France) en suivant les recommandations du fabricant. Les solutions d'ADNc ont été stockées à -20°C pour une utilisation ultérieure. 3. Amplification de l'ADNc par Réaction de Polymérisation en Chaine (PCR) et clonage des fragments. Dans cet exemple, les amplifications ont été réalisées selon le procédé suivant : la polymérase Herculase II Fusion (Agilent Technologies France SAS, Les Ulis, France) a été utilisée pour amplifier des fragments d'ADNc dans des réactions de 50pL comprenant : 1pL d'enzyme, 10pL de tampon de réaction (5X Herculase II Reaction Buffer) fourni par le fabricant, 1pL d'une solution de nucléotides dNTP à 10mM, 11_11 de chaque amorce à 10IAM, 0 à 8% diméthylsulfoxyde (DMSO, fourni avec l'enzyme par le fabricant), de l'eau et la matrice d'ADN consistant en soit 11_11 de cDNA issu de la réaction de Reverse Transcription décrite ci dessus, soit 10Ong de vecteur plasmidique. Le nombre de cycle, les températures et durées des cycles de dénaturation (92-98°C; 20-60s), d'hybridation (55- 65°C, 20-60s), et d'élongation (68 ou 72°C, 30s-3mn) des PCR pour obtenir les fragments ont été optimisés empiriquement pour chaque couple d'amorces et sont indiqués ci-dessous. Les réactions de PCR ont été réalisées en utilisant un PTC-150 MiniCycler (MJ Research Inc, MA, USA) équipé d'un couvercle chauffant. Le résultat de l'amplification a été analysé en faisant migrer un aliquot, à savoir environ 50 de la réaction de PCR sur un gel d'agarose. Pour les réactions positives identifiées, le volume restant des réactions d'amplification, soit 451_11, a été déposé sur un gel d'agarose, les bandes ont été excisées du gel et purifiées avec le kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel EURL, Hoerd, France). Les fragments purifiés ont été traités avec 1pL de T4 Polynucleotide Kinase (Life Technologies, Saint Aubin, France) dans un volume réactionnel de 50pL en présence de : 10pL de tampon de réaction (5X Forward Buffer) fourni par le fabricant et 5pL d'une solution d'ATP à 10mM. Les fragments phosphorylés ont été insérés dans le vecteur de clonage pBluescript-II SK (Agilent Technologies France SAS, Les Ulis, France) ouvert par l'enzyme de restriction EcoRV (New England Biolabs France, Evry, France) et déphosphorylé par la Phosphatase Alkaline CIF (New England Biolabs France, Evry, France), en utilisant la T4 DNA ligase (New England Biolabs France, Evry, France), en suivant les recommandations du fabricant. Les vecteurs recombinants ont été séquences sur les deux brins par Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany). Les séquences ont été analysées grâce à la suite logicielle Vector NTI 5.0 (InforMax, MD, USA). Les digestions enzymatiques ont été réalisées en suivant les recommandations du fabricant (New England Biolabs France, Evry, France). Les fragments issus de la digestion enzymatique ont été séparés sur un gel d'agarose et les bandes d'intérêt ont été excisées et purifiées avec le kit NucleoSpin Extract II (Macherey- Nagel EURL, Hoerd, France) en suivant les recommandations du fabricant. Les fragments purifiés ont été insérés dans les vecteurs de clonage en utilisant la T4 DNA ligase (New England Biolabs France, Evry, France), en suivant les recommandations du fabricant. Construction du vecteur de clonage pBS-PL4. Les oligonucléotides PL006 et PL007 ont été repris à 114/pL, aliquotes à 10Ong/pL et stockés à -20°C pour une utilisation ultérieure. Pour chacun des oligonucléotides, un mélange réactionnel de 25 pL comprenant 10Ong d'oligonucléotides, 5pL de tampon de réaction (5X Forward Buffer) fourni par le fabricant, 2,5pL d'une solution d'ATP à 10mM, 1pL de T4 Polynucleotide kinase (Life Technologies, Saint Aubin, France) et de l'eau a été réalisé, incubé 30 minutes à 37°C puis 30 minutes à 65°C. Un mélange comprenant 5pL de chacun des oligonucléotides phosphorylés (PL006 et PL007) et 10pL d'une solution de Tris à 5mM a été réalisé, placé dans le thermocycleur PTC-150 MiniCycler (MJ Research Inc, MA, USA). Le mélange a été chauffé pendant 3 minutes à 90°C puis la température a été abaissée de 1°C par minute jusqu'à 30°C, pour obtenir un fragment double brin (« linker PL4 »), qui a été stocké à -20°C pour une utilisation ultérieure. Le vecteur pBluescript-II SK a été ouvert par les enzymes de restriction Sacl et Kpnl comme décrit ci-dessus et purifié sur gel d'agarose en utilisant le kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel EURL, Hoerd, France), en suivant les recommandations du fabricant. Le linker PL4 a été inséré dans le vecteur pBluescript-II SK ouvert Sacl-Kpnl en utilisant la T4 DNA ligase (New England Biolabs France, Evry, France), 3pL de « linker PL4 », 10Ong de vecteur, 2pL de tampon de réaction (10X T4 DNA ligase Reaction Buffer) fourni par le fabricant et de l'eau pour obtenir un volume de réaction de 20pL. La réaction a été incubée 5 heures à température ambiante (20°C). Un vecteur recombinant dénommé pBS-PL4 a été séquence pour vérifier l'insertion du linker PL4. 4. Construction du vecteur de clonage pBS-PL6. Les oligonucléotides PLI 0 et PLI 1 ont été repris à 114/pL, aliquotes à 10Ong/pL et stockés à -20°C pour une utilisation ultérieure. Pour chacun des oligonucléotides, un mélange réactionnel de 25 pL comprenant 10Ong d'oligonucléotides, 5pL de tampon de réaction (5X Forward Buffer) fourni par le fabricant, 2,5pL d'une solution d'ATP à 10mM, 1pL de T4 Polynucleotide kinase (Life Technologies, Saint Aubin, France) et de l'eau a été réalisé, incubé 30 minutes à 37°C puis 30 minutes à 65°C. Un mélange comprenant 5pL de chacun des oligonucléotides phosphorylés (PL10 et PLI 1) et 10pL d'une solution de Tris à 5mM a été réalisé, placé dans le thermocycleur PTC-150 MiniCycler (MJ Research Inc, MA, USA). Le mélange a été chauffé pendant 3 minutes à 90°C puis la température a été abaissée de 1°C par minute jusqu'à 30°C, pour obtenir un fragment double brin (« linker PL6 »), qui a été stocké à -20°C pour une utilisation ultérieure. Le vecteur pBluescript-II SK a été ouvert par les enzymes de restriction Notl et Kpnl comme décrit ci-dessus et purifié sur gel d'agarose en utilisant le kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel EURL, Hoerd, France), en suivant les recommandations du fabricant. Le linker PL6 a été inséré dans le vecteur pBluescript-II SK ouvert Notl-Kpnl en utilisant la T4 DNA ligase (New England Biolabs France, Evry, France), 3pL de « linker PL6 », 10Ong de vecteur, 2pL de tampon de réaction (10X T4 DNA ligase Reaction Buffer) fourni par le fabricant et de l'eau pour obtenir un volume de réaction de 20pL. La réaction a été incubée 5 heures à température ambiante (20°C). Un vecteur recombinant dénommé pBS-PL6 a été séquence pour vérifier l'insertion du linker PL6. 5 Construction du vecteur de clonage pBS-PL7. Les oligonucléotides PL12 et PL13 ont été repris à 114/pL, aliquotes à 10Ong/pL et stockés à -20°C pour une utilisation ultérieure. Pour chacun des oligonucléotides, un mélange réactionnel de 25pL comprenant 10Ong d'oligonucléotides, 5pL de tampon de réaction (5X Forward Buffer) fourni par le fabricant, 2,5pL d'une solution d'ATP à 10mM, 1pL de T4 Polynucleotide kinase (Life Technologies, Saint Aubin, France) et de l'eau a été réalisé, incubé 30 minutes à 37°C puis 30 minutes à 65°C. Un mélange comprenant 5pL de chacun des oligonucléotides phosphorylés (PL12 et PL13) et 10pL d'une solution de Tris à 5mM a été réalisé, placé dans un thermocycleur PTC-150 MiniCycler (MJ Research Inc, MA, USA). Le mélange a été de chauffé pendant 3 minutes à 90°C puis la température a été abaissée de 1°C par minute jusqu'à 30°C, pour obtenir un fragment double brin (« linker PL7 »), qui a été stocké à -20°C pour une utilisation ultérieure. Le vecteur pBluescript-II SK a été ouvert par les enzymes de restriction Notl et Kpnl comme décrit ci-dessus et purifié sur gel d'agarose en utilisant le kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel EURL, Hoerd, France), en suivant les recommandations du fabricant. Le linker PL7 a été inséré dans le vecteur pBluescript II-SK ouvert Notl-Kpnl en utilisant la T4 DNA ligase (New England Biolabs France, Evry, France), 3pL de « linker PL7 », 10Ong de vecteur, 2pL de tampon de réaction (10X T4 DNA ligase Reaction Buffer) fourni par le fabricant et de l'eau pour obtenir un volume de réaction de 201_11. La réaction a été incubée 5 heures à température ambiante (20°C). Un vecteur recombinant dénommé pBS- PL7 a été séquence pour vérifier l'insertion du linker PL7. 6. Amplification de la séquence nucléotidique de la sous unité amCav1a. Une RACE-PCR utilisant les amorces 5' OUTER Primer (fourni par le fabricant dans le kit First Choice RLM-RACE) et amcav1-019AS pour la 1ère PCR, selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 1min à 94°C, 1min à 55°C, 1min à 72°C), et les amorces 5'INNER Primer (fourni par le fabricant dans le kit First Choice RLM-RACE) et amcav1-025AS pour la seconde PCR, selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : lmin à 94°C, lmin à 55°C, lmin à 72°C), a été réalisée, et a permis d'identifier les nucléotides 1 à 442 de la séquence SEQ ID NO°9. Le fragment amplifié, dénommé Cav1(50B11), a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav1-016S et amcav1-024AS a été réalisée, selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 35 cycles : 1min à 94°C, 1min à 60°C, 1min à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 367 à 1122 de la séquence SEQ ID NO°9. Le fragment amplifié, dénommé Cav1(35), a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav1-007S et amcav1-010AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 30s à 54°C, 3min à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 511 à 3526 de la séquence SEQ ID NO°9. Le fragment amplifié, dénommé Cav1(12), a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav1-011S et amcav1-009AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 1min à 54°C, 3min à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 3085 à 5143 de la séquence SEQ ID NO°9. Le fragment amplifié, dénommé Cav1(11), a été cloné dans pBluescript-II SK selon le 3003 863 24 protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav1-003S et amcav1-004AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 30 cycles : 30s à 95°C, 30s à 58°C, 2min à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 2174 à 4445 de la séquence SEQ ID NO°9. Le 5 fragment amplifié, dénommé Cav1(5), a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav1- 005S et amcav1-006AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 30 cycles : 30s à 95°C, 30s à 58°C, 2min à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 4446 à 5850 de la séquence SEQ ID 10 NO°9. Le fragment amplifié, dénommé Cav1(6), a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav1-008S et amcav1-012AS (localisé dans l'extrémité 3' non codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 30s à 60°C, 2min à 72°C), et a permis 15 d'identifier les nucléotides 5121 à 5937 de la séquence SEQ ID NO°9. Le fragment amplifié, dénommé Cav1(23), a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. 7. Construction de la séquence nucléotidique de la sous unité amCav1a. 20 Une réaction de PCR chevauchante (« overlap PCR ») a été réalisée pour obtenir le fragment Cav1(42) en utilisant les fragments de PCR Cav1(42A) et Cav1(42B) amplifiés en utilisant respectivement les amorces amcav1-029S (localisé dans l'extrémité 5' non codante) et amcava1-026AS, et amcav1-016S et amcav1-019AS pour introduire un 25 site de restriction Notl en 5' du codon Start de la SEQ ID n°9. Les fragments Cav1(42A) et Cav1(42B) ont été obtenus selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 30 cycles : 30s à 92°C, 30s à 56°C, lmn à 72°C), en utilisant comme matrice 10Ong de plasmide contenant respectivement le fragment Cav1(50B11) et Cav1(12). Les fragments 30 Cav1(42A) et Cav1(42B) ont été purifiés sur gel d'agarose comme décrit ci-dessus. Le fragment Cav1(42) a été obtenu en réalisant une PCR selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO, et 25 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 56°C, 90s à 72°C), 30 de chacun des fragments Cav1(42A) et Cav1(42B) purifiés et les amorces amcav1-029S et amcav1-019AS. Le fragment Cav1(42) a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav1-008S et amcav1- 030AS (localisé dans l'extrémité 3' non codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 30 cycles : 30s à 92°C, 30s à 56°C, 1mn à 72°C), en utilisant comme matrice 10Ong de plasmide contenant le fragment Cav1(23), pour introduire un site de restriction Kpnl en 3' du codon Stop de la SEQ ID n°9. Le fragment obtenu, dénommé Cav1(43) a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci- dessus. La séquence de la sous unité amCav1a entière a été obtenue en joignant les différents fragments de PCR en utilisant des sites de restriction présents dans les fragments chevauchants dans le vecteur pBS-PL7. Pour ce faire, le fragment Cav1(43) issu de la digestion enzymatique du fragment Cav1(43) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL7 en utilisant les enzymes de restriction Agel (position 5258 dans la SEQ ID n°9) et Kpnl selon le protocole décrit ci dessus. Un fragment Cav1(5a) issu de la digestion enzymatique du fragment Cav1(5) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II KS (Agilent Technologies) en utilisant les enzymes de restriction Xbal (position 2750 dans la SEQ ID n°9) et Xhol (position 3758 dans la SEQ ID n°9) selon le protocole décrit ci-dessus. Le fragment Cav1(42) issu de la digestion enzymatique du fragment Cav1(42) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL7 en utilisant les enzymes de restriction Notl et BamHI (position 911 dans la SEQ ID n°9) selon le protocole décrit ci-dessus. Un fragment issu la digestion enzymatique du fragment Cav1(11) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cav1(6) en utilisant les enzymes de restriction Aatll (position 4803 dans la SEQ ID n°9) et Notl selon le protocole décrit ci- dessus pour générer le fragment Cav1(11b+6). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav1(11b+6) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL7 contenant le fragment Cav1(43) en utilisant les enzymes de restriction Xhol (position 3758 dans SEQ ID n°9) et Agel (position 5258 dans SEQ ID n°9) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav1(11b+6+43). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav1(11b+6+43) inséré dans le vecteur pBS-PL7 a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II KS contenant le fragment Cav(5a) en utilisant les enzymes de restriction Xho (postion 3758 dans SEQ ID n°9) et Kpnl selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav1(5+11+6+43). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav1(12) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBSPL7 contenant le fragment Cav1(42) en utilisant les enzymes de restriction BamHI (position 911 dans SEQ ID n°9) et Xbal (position 2750 dans SEQ ID n°9) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav1(42+12). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav1(5+11+6+43) inséré dans le vecteur pBluescript-II KS a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL7 contenant le fragment Cav1(42+12) en utilisant les enzymes de restriction Xbal (position 2750 dans SEQ ID n°9) et Kpnl selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment amCav1a. 8. Amplification de séquence nucléotidique de la sous unité amCav2b. Une RACE PCR utilisant les amorces 5'0UTER Primer et amcav2- 021AS pour la 1ère PCR, selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 94°C, 30s à 56°C, 2mn à 72°C), et les amorces 5'INNER Primer et amcav2-022AS pour la seconde PCR, selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 94°C, 30s à 56°C, 1mn à 72°C), a été réalisée et a permis d'identifier les nucléotides 47 à 342 de la séquence SEQ ID NO°10. Le fragment amplifié, dénommé Cav2(22Jj), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une RACE PCR utilisant les amorces 5' OUTER Primer et amCav2-021AS pour la 1ère PCR, selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 40 cycles : 30s à 94°C, 30s à 56°C, 2mn à 72°C), et les amorces amcav2-025S et amcav2-022AS pour la seconde PCR, selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 40 cycles : 30s à 94°C, 30s à 56°C, 2mn à 72°C) a été réalisée, et a permis d'identifier les nucléotides 1 à 342 de la séquence SEQ ID NO°10. Le fragment amplifié, dénommé Cav2(36a), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav2-007S et amcav2- 002AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 30 cycles : 30s à 95°C, 30s à 56°C, 2mn à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 132 à 1710 de la séquence SEQ ID NO°10. Le fragment obtenu, dénommé Cav2(1.1), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav2- 024S et amcav2-023AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 40 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 56°C, 1mn à 72°C°), et a permis d'identifier les nucléotides 1475 à 2110 de la séquence SEQ ID NO°10. Le fragment amplifié, dénommé Cav2(28), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav2-003S et amcav2-006AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 30s à 56°C, 4mn à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 1689 à 5460 de la SEQ ID n°10, incluant les exons 21a, 25 et 29 mais pas les exons 18 et 26. Le fragment amplifié, dénommé Cav2(18), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. 9. Construction de la séquence nucléotidique de la sous unité amCav2b Une réaction de PCR chevauchante (« overlap PCR ») a été réalisée pour obtenir le fragment Cav2(54) en utilisant les fragments de PCR Cav2(54A) et Cav2(29B) amplifiés en utilisant respectivement les amorces amcav2-031S (localisé dans l'extrémité 5' non codante) et amcav2-028AS, et amcav2-007S et amcav2-016AS pour introduire un site de restriction Notl en 5' du codon Start de la SEQ ID n°10. Les fragments Cav2(54A) et Cav2(29B) ont été obtenus selon le protocole décrit ci- dessus (avec 4% DMSO et 25 cycles : 20s à 98°C, 20s à 56°C, 1mn à 68°C), en utilisant comme matrice 10Ong de plasmide contenant respectivement le fragment Cav2(36a) et Cav2(1.1). Les fragments Cav2(54A) et Cav2(29B ont été purifiés sur gel d'agarose comme décrit ci- dessus. Le fragment Cav2(54) a été obtenu en réalisant une PCR selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 25 cycles : 20s à 98°C, 20s à 56°C, 1mn à 68°C), 31_11 de chacun de fragments Cav2(54a) et Cav2(29B) purifiés et les amorces amcav2-031S et amcav2-016AS. Le fragment Cav2(54) a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav2-013S et amcav2- 015AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 30s à 60°C, 2mn à 72°C). Le fragment amplifié, dénommé Cav2(21), a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav2-0135 et amcav2- 026A5 (localisé dans l'extrémité 3' non codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 25 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 56°C, 1mn à 72°C), en utilisant comme matrice 10Ong de plasmide contenant le fragment Cav2(21), pour introduire un site de restriction Kpnl en 3' du codon Stop de la SEQ ID n°10. La séquence de la sous unité amCav2b entière a été obtenue en joignant les différents fragments de PCR en utilisant des sites de restriction présents dans les fragments chevauchants dans le vecteur pBS-PL6. Un fragment Cav2(18b) issu de la digestion enzymatique du fragment Cav2(18) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL6 en utilisant les enzymes de restriction BamHI (position 4177 dans SEQ ID n°10) et Xhol (position 4446 dans SEQ ID n°10) en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav2(30) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL6 contenant le fragment Cav2(18b) en utilisant les enzymes de restriction Xhol (position 4646 dans SEQ ID n°10) et Kpnl selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav2(18b+30). Un fragment Cav2(28) issu de la digestion enzymatique du fragment Cav2(28) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL6 en utilisant les enzymes de restriction Csp45I (position 1566 dans SEQ ID n°10) et Sali (position 2012 dans SEQ ID n°10) selon le protocole décrit ci-dessus. Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav2(1.1) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL6 contenant le fragment Cav2(28) en utilisant les enzymes de restriction Mlul (position 442 dans SEQ ID n°10) et Csp45I (position 1560 dans SEQ ID n°10) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav2(1.1+28). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav2(54) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBSPL6 contenant le fragment Cav2(1.1+28) en utilisant les enzymes de restriction Notl et Mlul (position 442 dans SEQ ID n°10) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav2(54+1.1+28). Un fragment Cav2(18a) issu de la digestion enzymatique du fragment Cav2(18) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBSPL6 contenant le fragment Cav2(54+1.1+28) en utilisant les enzymes de restriction Sali (position 2012 dans SEQ ID n°10) et BamHI (position 4177 dans SEQ ID n°10) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer un fragment Cav2(54+1.1+28+18a). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav2(54+1.1+28+18a) inséré dans le vecteur pBS-PL6 a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL6 contenant le fragment Cav2(18b+30) en utilisant les enzymes de restriction Notl et BamHI (position 4177 dans SEQ ID n°10) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment amCav2b. 10. Amplification de la séquence nucléotidique de variants de la sous unité amCav2. Une PCR utilisant les amorces amcav2-0035 et amcav2-004A5 a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 30 cycles : 30s à 95°C, 30s à 58°C, 2mn à 72°C), et a permis d'identifier un fragment Cav2(2) localisé entre les nucléotides 1689 et 3778 de la SEQ ID n°10, incluant les exons 18 et 21a (figure 24/4). Le fragment amplifié a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav2-012S et amcav2-006AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 1mn à 54°C, 3mn à 72°C), et a permis d'identifier un fragment dénommé Cav2(3.1) localisé entre les nucléotides 3593 et 5460 de SEQ ID n°10, incluant les exons 21b, 25, 26 et 29. Le fragment amplifié a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav2-012S et amcav2-006AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 1mn à 54°C, 3mn à 72°C), et a permis d'identifier un fragment dénommé Cav2(3.2) localisé entre les nucléotides 3593 et 5460 de la SEQ ID n°10, incluant les exons 21a et 25, mais pas les exons 26 et 29. Le fragment amplifié a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav2-012S et amcav2-006AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 1mn à 54°C, 3mn à 72°C), et a permis d'identifier un fragment dénommé Cav2(3.3) localisé entre les nucléotides 3593 et 5460 de la SEQ ID n°10, incluant les exons 21a et 26, mais pas les exons 25 et 29. Le fragment amplifié a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav2-013S et amcav2-015AS (localisé dans l'extrémité 3' non codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 30s à 60°C, 2mn à 72°C), et a permis d'identifier un fragment, dénommé Cav2(21) localisé entre les nucléotides 4371 et 5460 de la SEQ ID n°10, incluant les exons 26 et 29, mais pas l'exon 25.. Le fragment amplifié a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. 11. Amplification de la séquence nucléotidique de la sous unité amCav3a. Une RACE PCR utilisant les amorces 5' OUTER Primer et amcav3- 018AS pour la 1ère PCR, selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4 % 3003 863 31 DMSO et 40 cycles :1mn à 94°C, 1mn à 55°C, 1mn à 72°C), et les amorces 5' INNER Primer et amcav3-019AS pour la seconde PCR selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 40 cycles :1 mn à 94°C, lmn à 55°C, 1mn à 72°C) a été réalisée et a permis d'identifier les nucléotides 5 1 à 426 de la séquence SEQ ID N° 11. Le fragment amplifié, dénommé Cav3(49E13), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav3-023S (localisé dans l'extrémité 5' non codante) et amcav3-007AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 35 cycles : lmn à 94°C, 10 1 mn à 60°C, 2mn à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 1 à 891 de la séquence SEQ ID N°11. Le fragment amplifié, dénommé Cav3(59), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav3-021S et amcav3-012AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 35 cycles : 15 1mn à 94°C, 1mn à 60°C, 2mnn à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 2720 à 4909 de la SEQ ID n° 11, incluant l'exon 17a. Le fragment amplifié, dénommé Cav3(56), a été cloné dans le vecteur pBLuescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav3-001S et amcav3-020AS a été réalisée selon le protocole 20 décrit ci-dessus (sans DMSO et 35 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 60°C, 2mnn à 72°C), et a permis d'identifier un fragment localisé entre les nucléotides 606 et 3302 de la SEQ ID n°11, incluant l'exon 17b. Le fragment amplifié, dénommé Cav3(55), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les 25 amorces amcav3-003S et amcav3-004AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 35 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 60°C, 2mnn à 72°C), et a permis d'identifier un fragment localisé entre les nucléotides 3112 et 5698 de la SEQ ID n°11, incluant l'exon 17b (figure 3 5/5). Le fragment amplifié, dénommé Cav3(32), a été cloné dans le vecteur 30 pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav3-005S et amcav3-006AS (localisé dans l'extrémité 3' non codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 35 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 60°C, 2mnn à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 5591 à 7701 de la séquence SEQ ID N°11. Le fragment amplifié, dénommé Cav3(33), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. 12. Construction de la séquence nucléotidique de la sous unité amCav3a La séquence de la sous unité amCav3a entière a été obtenue en joignant les différents fragments de PCR en utilisant des sites de restriction présents dans les fragments chevauchants dans le vecteur pBluescript-II SK (Agilent Technologies France SAS, Les Ulis, France). Une PCR utilisant les amorces amcav3-011S et amcav3-004A5 selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 35 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 60°C, 2mnn à 72°C) a été réalisée. Le fragment amplifié, dénommé Cav3(57), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci- dessus. Une PCR utilisant les amorces amcav3-013S et amcav3-022AS (localisé dans l'extrémité 3' non codante) a été réalisé selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 25 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 56°C, 1mnn à 72°C) en utilisant comme matrice 10Ong de plasmide contenant le fragment Cav3(33) pour introduire un site de restriction AfIll et un site de restriction Kpnl en 3' du codon Stop de la SEQ ID n°11. Le fragment amplifié, dénommé Cav3(58), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II-SK selon le protocole décrit ci-dessus. Un fragment Cav3(58a) issu de la digestion enzymatique du fragment Cav3(58) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK en utilisant les enzymes de restriction Sali (position 7348 dans SEQ ID n°11) et Kpnl en suivant le protocole décrit ci-dessus. Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav3(33) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cav3(58a) en utilisant les enzymes de restriction HindlIl (position 5669 dans SEQ ID n°11) et Sali (position 7348 dans SEQ ID n°11) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav3(60). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav3(59) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cav3(60) en utilisant les enzymes de restriction Notl et EcoRI (position 741 dans SEQ ID n°11) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav3(59+60). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav3(56) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cav3(55) en utilisant les enzymes de restriction Espl (position 2789 dans SEQ ID n°11) et Xbal (position 4267 dans SEQ ID n°11) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav3(55+56). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav3(59) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cav3(55+56) en utilisant les enzymes de restriction Kpnl et Spel (position 760 dans SEQ ID n°11) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav3(59+55+56). Un fragment Cav3(57) issu de la digestion enzymatique du fragment Cav3(57) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBS-PL4 en utilisant les enzymes de restriction Xbal (position 4267 dans SEQ ID n°11) et HindlIl (position 5669 dans SEQ ID n°11) selon le protocole décrit ci-dessus. Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav3(57) inséré dans le vecteur pBS-PL4 a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cav3(59+60) en utilisant les enzymes de restriction EcoRI et HindlIl (position 5669 dans SEQ ID n°11) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment Cav3(59+57+60). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cav3(59+55+56) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cav3(59+57+60) en utilisant les enzymes de restriction Notl et Xbal (position 4267 dans SEQ ID n°11) selon le protocole décrit ci-dessus pour générer le fragment amCav3a. 13. Amplification de la séquence nucléotidique de la sous unité amCavi3a. Une PCR utilisant les amorces amb2-003S et amb2-004AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4 % DMSO et 30 cycles : 30s à 98°C, 30s à 50°C, 2mn à 72°C), et à permis d'identifier les nucléotides 1 à 1635 de la SEQ ID n°12, incluant les exons 1 a, 4b et 9. 14. Construction de la séquence nucléotidique de la sous unité amCavi3a. Le fragment amplifié au point précédent, dénommé amCavi3a, a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. 15. Amplification de la séquence nucléotidique de la sous unité amCavi3b. Une PCR utilisant les amorces amb2-006S (localisé dans l'extrémité 5' non codante) et amb2-007AS (localisé dans l'extrémité 3' non codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30 s à 95°C, 30s à 60°C, 2mn à 72°C), et à permis d'identifier les nucléotides 1 à 1413 de la SEQ ID n°13, incluant les exons lb et 4b mais pas l'exon 9. 16. Construction de la séquence nucléotidique de la sous unité amCavi3b. Le fragment amplifié au point précédent, dénommé amCavi3b, a été cloné dans pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. 17. Amplification de la séquence nucléotidique de la sous unité amCavi3c. Une PCR utilisant les amorces amb2-008S (localisé dans l'extrémité 5' non codante) et amb2-007AS (localisé dans l'extrémité 3' non codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30 s à 95°C, 30s à 60°C, 2mn à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 1 à 1632 de la SEQ ID n°14, incluant les exons la et 4a mais pas l'exon 9. 18. Construction de la séquence nucléotidique de la sous unité amCavi3c. Le fragment amplifié au point précédent, dénommé amCavi3c, a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. 19. Amplification de la séquence nucléotidique de la sous unité 5 amCava21. Une PCR utilisant les amorces amcava2d-012S (localisé dans l'extrémité 5' non codante) et amcava2d-013AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 35 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 60°C, 2mn à 72°C) et a permis d'identifier les nucléotides 1 à 1314 de la 10 SEQ ID n°15. Une PCR utilisant les amorces amcava2d-014S et amcava2d-015AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 35 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 60°C, 2mn à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 1264 à 2344 de la SEQ ID n°15. Une PCR utilisant les amorces amcava2d-016S et amcava2d-017AS (localisé dans 15 l'extrémité 3' non codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci- dessus (sans DMSO et 35 cycles : lmn à 94°C, lmn à 60°C, 2mn à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 2322 à 3615 de la SEQ ID n° 15. 20. Construction de la séquence nucléotidique de la sous unité 20 amCava21. Une PCR utilisant les amorces amcava2d-012S et amcava2d017AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans DMSO et 30 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 60°C, 3mn à 72°C). Le fragment amplifié, dénommé amCava21, a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon 25 le protocole décrit ci-dessus. 21. Amplification de la séquence nucléotidique de la sous unité amCava2Ô2. Une PCR utilisant les amorces amcava2d-018S (localisé dans 30 l'extrémité 5' non codante) et amcava2d-019AS (localisé dans l'extrémité 3' non codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (sans 3003 863 36 DMSO et 32 cycles : 1mn à 94°C, 1mn à 60°C, 3mn à 72°C), et à permis d'identifier les nucléotides 1 à 3597 de la SEQ ID n°16. 22 Construction de la séquence nucléotidique de la sous unité amCava2Ô2 Le fragment amplifié au point précédent, dénommé amCava2Ô2, a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. 23. Amplification de la séquence nucléotidique de la sous unité 10 am Cava2Ô3. Une PCR utilisant les amorces amcava2d-010S (localisé dans l'extrémité 5' non codante) et amcava2d-007AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 cycles : 30s à 95°C, 30s à 60°C, 2mn à 72°C), et a permis d'identifier les nucléotides 1 à 864 de la 15 SEQ ID n° 17. Le fragment amplifié, dénommé Cava2d(25), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcava2d-001S et amcava2d-002AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 30 cycles : 30s à 95°C, 30s à 58°C, 2mn à 72°C), et a permis d'identifier les 20 nucléotides 1 à 1716 de la SEQ ID n°17. Le fragment amplifié, dénommé Cava2d(7), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcava2d-003S et amcava2d-004AS a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 30 cycles : 30s à 95°C, 30s à 58°C, 2mn à 72°C), et a permis 25 d'identifier les nucléotides 1690 à 3529 de la SEQ ID n°17.Le fragment amplifié, dénommé Cava2d(8), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Une PCR utilisant les amorces amcava2d-005S et amcava2d-011AS (localisé dans l'extrémité 3' codante) a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 35 30 cycles : 30s à 95°C, 30s à 60°C, 2mn à 72°C), et à permis d'identifier les nucléotides 2999 à 3582 de la SEQ ID n°17.. Le fragment amplifié, dénommé Cava2d(26), a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. 24. Construction de la séquence nucléotidique de la sous unité 5 amCava2Ô3. La séquence de la sous unité amCava2d3 entière a été obtenue en joignant les différents fragments de PCR en utilisant des sites de restriction présents dans les fragments chevauchants. Une réaction de PCR chevauchante (« overlap PCR ») a été réalisée pour obtenir le fragment 10 Cava2d(27) en utilisant les fragments de PCR Cava2d(27A) et Cava2d(27B) amplifiés en utilisant respectivement les amorces amcava2d006S et amcava2d-002AS et amcava2d-003S et amcava2d-009AS. Les fragments Cava2d(27A) et Cava2d(27B) on été obtenus selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 25 cycles : 30s à 92°C, 30s à 55°C, 15 30s à 72°C), en utilisant comme matrice 10Ong de plasmide contenant respectivement le fragment Cava2d(7) et Cava2d(8). Les fragments Cava2d(27A) et Cava2d(27B) ont été purifiés sur gel d'agarose comme décrit ci-dessus. Le fragment Cava2d(27) a été obtenu en réalisant une PCR selon le protocole décrit ci-dessus (avec 4% DMSO et 25 cycles : 30s 20 à 92°C, 30s à 55°C, 45s à 72°C), 31_11 de chacun des fragments Cava2d(27A) et Cava2d(27B) et les amorces amcava2d-006S et amcava2d-009AS. Le fragment Cava2d(27) a été cloné dans le vecteur pBluescript-II SK selon le protocole décrit ci-dessus. Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cava2d(25) inséré dans le vecteur 25 pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cava2d(7) en utilisant les enzymes de restriction HindlIl et Mlul (position 798 dans SEQ ID n°17) pour générer le fragment Cava2d(25+7) selon le protocole décrit ci-dessus. Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cava2d(26) inséré dans le vecteur 30 pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cava2a(8) en utilisant les enzymes de restriction Agel (position 3287 dans SEQ ID n°17) et Notl selon le protocole décrit ci- dessus, pour générer le fragment Cava2d(8+26). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cava2d(27) inséré dans le vecteur pBluescript-II SK a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cava2d(8+26) en utilisant les enzymes de restriction HindlIl et Aatll (position 1834 dans SEQ ID n°17) selon le protocole décrit ci-dessus, pour générer le fragment Cava2d(27+8+26). Un fragment issu de la digestion enzymatique du fragment Cava2d(25+7) a été sous cloné dans le vecteur pBluescript-II SK contenant le fragment Cava2d(27+8+26) en utilisant les enzymes de restriction HindlIl et PshAl (position 1206 dans SEQ ID n°17) selon le protocole décrit ci-dessus, pour générer le fragment amCava2Ô3. La séquence nucléique des amorces utilisées dans les différentes réactions / protocoles précités est indiquée dans le tableau 1 suivant. Les oligonucléotides/amorces ont été fournis sous forme lyophilisée par Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany). Les amorces ont été resuspendues à 100IAM dans de l'eau, aliquotées à 10IAM et stockées à - 20°C pour une utilisation ultérieure. Tableau 1 : séquence nucléique des amorces utilisées SEQ Nom Séquences (5'-3') Orientation ID N° 18 PL10 GGCCGCTTACGCGTAATTCGAATTGTCGACTT GGATCCTTCTCGAGAAGGTAC / 19 PL11 CTTCTCGAGAAGGATCCAAGTCGACAATTCGA ATTACGCGTAAGC / PL12 GGCCGCTTGGATCCAATCTAGATTCTCGAGTT ACCGGTAAGGTAC / 21 PL13 CTTACCGGTAACTCGAGAATCTAGATTGGATC CAAGC / 22 Amorce 5'0UT ER GCTGATGGCGATGAATGAACACTG (Life Technologies) / 23 5'INNE R CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTT Amorce GATG (Life Technologies) 24 amcav1 -019AS CGTCCTCGATGTTGTAAAGCACCTC Antisens 25 amcav1 -025AS GGTTGGTCAAATTAGAATCGCCG Antisens 26 amcav1 -016S ATGACGATATTCGCCAACTGCATCG Sens 27 amcav1 -024A5 AACGAAGAATGCCCCAAGTATGACC Antisens 28 amcav1 -007S GCTTACGGCTTCGTCGCTCACC Sens 29 amcav1 -010AS GCTGATTTTTATCGAGCTCGCAG Antisens 30 amcav1 -11S 0 CAGTTCGTGTTCGCCGTCGTTG Sens 31 amcav1 -009A5 CTCTGTGGAACGACGAGTACGGC Antisens 32 amcav1 -003S CCGAATCGTTGACTGCCATCGA Sens 33 amcav1 -004A5 GGGTCGTACTCGGACCACAGACGA Antisens 34 amcav1 -005S CGACGCCAAAGGTCGTATCAAGCAT Sens 35 amcav1 -006A5 TTATATCGATGGATCCGAGGTCGTG Antisens 36 amcav1 -008S GCCGTACTCGTCGTTCCACAGAG Sens 37 amcav1 -012A5 GAACACTAGAATCTATCGGCCGATGG Antisens 38 amcav1 -029S TAGCGGCCGCAGAAGGAGAAGAGAGGAAGG GAGGG Sens 39 amcava 1- GGATACGGTGTGTAGACCGCAAGG Antisens 026AS 40 amcav1 ATGGTACCGAACACTAGAATCTATCGGCCGAT Antisens -030AS GG 41 am cav2 -021AS CAACGTGCGCAGATCCATATCC Antisens 42 am cav2 -022AS GATGTTGCGCAAATAGGAGCCAC Antisens 43 am cav2 -025S CTTAAAGTGGTGCCTCAGCACGAAG Sens 44 am cav2 -007S GCCCTTCGAGTACGCCGTCC Sens 45 am cav2 -002A5 GCTACGCATCGAGCTGAGCAGC Antisens 46 am cav2 -024S TGTTCATCAAGGTGTACGCGCTC Sens 47 am cav2 -023A5 GGATCTCTTTCTCGATCTCCTGCG Antisens 48 am cav2 -003S GCTGCTCAGCTCGATGCGTAGC Sens 49 am cav2 -006A5 CTAGCACCAGTCGTCCTCGTCGC Antisens 50 am cav2 -031S GTGCGGCCGCTACCTGGTCTGGTGGACATGG Sens 51 am cav2 -028A5 GGCGATGATGGTGAGCAG Antisens 52 am cav2 -016A5 CTCGGATTTGTTGTCCGTGTTACACG Antisens 53 am cav2 -013S CACGATCAGAAGTATTTGGCCTCTGCAG Sens 54 Amcav 2- AAGAATTCACGCGCAAACCCTAAGACG Antisens 015AS 55 am cav2 -026A5 TCGGTACCACGCGCAAACCCTAAGAC Antisens 56 am cav2 -004A5 GCGCGATGTTACCGAATACCTGC Antisens 57 am cav2 TCGGCTTCCTGAGGCTGTTTCG Sens -012S 58 am cav2 -015AS AAGAATTCACGCGCAAACCCTAAGACG Antisens 59 amcav3 -018AS TCGACGCATGGTTGGTACATCC Antisens 60 amcav3 -019AS CATGCTCACCCTTTCGAACCAC Antisens 61 amcav3 -023S GTGCGGCCGCCTGCCGCTGAACGCTTATCAA G Sens 62 amcav3 -007AS CAGGAAGCACCGTTGACGCA Antisens 63 amcav3 -021S CTGGATCCTAATCGCGGAAGGTCCATTTGG Sens 64 amcav3 -012A5 CCCGTAATGGCCCTTAATGACC Antisens 65 amcav3 -001S CGCAGATTCCTGGAATAGATTGGAC Sens 66 amcav3 -020A5 CTGGATCCGAACGTTCTCAACACACTCAGCC Antisens 67 amcav3 -003S CATTTCAACGACATCGTCTGGGC Sens 68 amcav3 -004A5 GATAAAGATGTAACCCTAAGGCAAGAAGC Antisens 69 amcav3 -005S TGCCAAAAGCTCTGACTTACGCTC Sens 70 amcav3 -006A5 CAACATTGAACCCTTGCAGCACTC Antisens 71 amcav3 -023S GTGCGGCCGCCTGCCGCTGAACGCTTATCAA G Sens 72 amcav3 - 011S CGGAAGATGAATCTCCTCGTAGAG Sens 73 amcav3 -013S AAGAGAATTGGCCGCAGAGCA Sens 74 amcav3 -022A5 GAGGTACCCTTAAGCAACATTGAACCCTTGCA GCACTC Antisens 75 amb2- 003S ATGTCGAGGCAGCTTCGCGCTGAACGGGACC A Sens 76 amb2- 004AS CTAAATGGCGTTCAATGCGCGCGGGTCTTGC T Antisens 77 amb2- 006S GAGCGAGAGTTTAGCGGAGAGTCAACGC Sens 78 amb2- 007AS GACCCCCACTAAAGAGCAGTGGTGC Antisens 79 amb2- 008S CGAGGCGTAGGATCGTGAGTGGAAG Sens 80 am cava 2d- AACGACAACGACGACGACGG Sens 012S 81 am cava 2d- ATCTGTTACGTCAGCGTAGACCGG Antisens 013AS 82 am cava 2d- CGTACGGATCATCCAACGATCTGG 014S 83 am cava 2d- CAAACCACTGGGTTACCTTCGCA Antisens 015AS 84 am cava 2d- TGCGAAGGTAACCCAGTGGTTTG Sens 016S 85 am cava 2d- TCCTAATGAAAAAATTAATGTTGACCAAGG Antisens 017AS 86 am cava 2d- ACACAAACGTGCGGTCACCG Sens 018S 87 am cava 2d- ACATTCGTATCGTACACGATGAGTGATAA Antisens 019AS 88 am cava 2d- GGTGAAGACGCATATGTACAAACTTCTACG Sens 010S 89 amcava 2d- CGGGCCTAACGTGTCGAGGAT Antisens 007AS 90 amcava 2d- ATGTTTCTATCCGTCAAGAAATTTGTACA Sens 001S 91 amcava 2d- TGGATGTAATGGGCCGTCGTATTC Antisens 002AS 92 amcava 2d- GCCGAATACGACGGCCCATTACATC Sens 003S 93 amcava 2d- AGGGACGATTCGCGCTACCG Antisens 004AS 94 amcava 2d- TGGACGATTCGATCGGACAAG Sens 005S 95 amcava 2d- GTCTCTCATATCCGTCTGTCTGTCCGTC Antisens 011AS 96 amcava 2d- ATCCTCGACACGTTAGGCCCG Sens 006S 97 amcava 2d- TGGATGTAATGGGCCGTCGTATTC Antisens 002AS 98 amcava 2d- GGATGTACCTTCCAATTGTTCCCC Antisens 009AS 108 PL006 cactagtaagcttcatatgggcgccgcggccgcacgcgtttcgaat ctagagaattcctcgagggtac 109 PL007 cctcgaggaattctctagattcgaaacgcgtgcggccgcggcgcc catatgaagcttactagtgagct Tel que démontré précédemment, les séquences entières du canal calcique, à savoir trois sous unités Cavai (amCavl a, amCav2b et amCav3a) et une sous unité Cavp (trois variants identifiés et clonés amCavpa, amCavpb et amCavpc) et trois sous unités Cava2-E, (amCava2Ô1 , amCava2Ô2 et amCava2Ô3) d'abeille, ont été pour la première fois isolées et séquencées. Une étude de l'expression du canal calcique Cava et des protéines Cavp et Cava2-E, d'abeille a été réalisée sur des larves d'abeille au cours de son développement par analyse par transcription inverse et Réaction de Polymérisation en Chaine (RT- PCR) à partir d'ARNm obtenus à différent stade du développement comme décrit, par exemple dans (Schlenstedt et al (2006) (Schlenstedt J., Balfanz S., Baumann A. & Blenau W. Am5-HT7 : Molecular and pharmacological characterization of the first serotonin receptor of the honeybee (Apis mellifera). J. Neurochem, 98: 1958-1998 [16]); Moignot et al (2009) (Moignot B., Lemaire C., Quinchard S., Lapied B. & Legros C. The discovery of a novel sodium channel in the cockroach Periplaneta americana: Evidence for an early duplication of the para-like gene. Insect Biochem and Mol. Biol. 39: 814-823 [17]), en utilisant les amorces suivantes amCavpa : ATGTCGAGGCAGCTTCGCGCTGAACGGGACCA SEQ ID N°75 et CCTGCTGCCTCAGGGCCTCC SEQ ID N°99, amCavpb : ATGATCGGATACAATCAACACAATTCCGG SEQ ID N°100 et CCTGCTGCCTCAGGGCCTCC SEQ ID N°99, amCav1a : GCCGTACTCGTCGTTCCACAGAG SEQ ID N°36 et GAACACTAGAATCTATCGGCCGATGG SEQ ID N°37, amCav2b : CACGATCAGAAGTATTTGGCCTCTGCAG SEQ ID N°53 et AAGAATTCACGCGCAAACCCTAAGACG SEQ ID N°54, amCav3a : TGGACGATTCGATCGGACAAG SEQ ID N°94 et CGTACGGATCATCCAACGATCTGG SEQ ID N°82, amCavcc2Ô1 : TGCGAAGGTAACCCAGTGGTTTG SEQ ID N°84 et TCCTAATGAAAAAATTAATGTTGACCAAGG SEQ ID N°85, amCavcc2Ô2 : CAATTCGACCTTGATGAACTGCG SEQ ID N°110 et ACATTCGTATCGTACACGATGAGTGATAA SEQ ID N°111 et pour amCava2Ô3 : TGGACGATTCGATCGGACAAG SEQ ID N°94 et AGGGACGATTCGCGCTACCG SEQ ID N°93. Les photographies des gels d'agarose obtenus sont représentées sur la figure 12. Comme montré sur cette figure, les trois sous unités Cavai du canal calcique (amCav1a (CaV1), amCav2b (CaV2) et amCav3a (CaV3)) et deux des variants de la sous unité Cavp (AmCaVpb et AmCaVpa) et les sous unités Cava2Ô (amCava2Ô1 (Cava2,51), amCava2Ô2 (Cava2,52) et amCava2Ô3 (Cava2-Ô3)) isolés, sont exprimés au cours du développement de l'abeille. Exemple 2: Mesure de la régulation de l'activité du canal calcique après expression dans des lignées cellulaires. Dans cet exemple, le canal calcique Cava et les protéines Cavp et Cava2-E, isolés ont été exprimés dans des cellules Hek TSA201, dérivées des HEK, qui sont des cellules embryonnaires humaines de rein. Elles ont été transfectées de façon stable par le large antigène T du virus SV40. Ce large antigène T est produit par la cellule. Lors de la transfection transitoire de plasmide contenant l'origine de réplication du virus SV40, l'antigène T va venir interagir avec le site de réplication et va ainsi amplifier la réplication du plasmide provoquant une production massive de la protéine d'intérêt. La préparation des boites de culture a été réalisée comme suit. Des boites de Pétri de 35mm de diamètre utilisées pour la culture ont été recouvertes avant toute transfection. Il s'agit d'un traitement avec de la polyornithine (ref. P3655, Sigma) préparée comme suit : 10 mg de polyornithine sont dissous dans 66 ml d'eau stérile ou de PBS. La solution est filtrée sur un filtre avec des pores d'un diamètre de 0,22pm, aliquotée par 1 ml / dans des tubes de 15 ml avant stockage à -20°C. La polyornithine a été utilisée diluée au 1 /1 Oe (soit 15pg /ml) dans du PBS trois jours avant culture (J-3). Un ml de la solution a été placé dans chaque boite de Pétri de 35mm et laissé sécher à 37°C. Le jour de culture (J), toutes les boites 35mm sont rincées 3 fois avec du PBS, avant de repiquer les cellules. Le milieu de culture utilisé dans cet exemple est un milieu complet qui a été préparé frais avant chaque expérimentation comme suit : Décomplémentation du sérum: 1/2 heures à 56°C DMEM HG (GIBCO ref 41965); 10% SVF (GIBCO ref 10106). Dans cet exemple, le repiquage des cellules a été effectuée avec les solution suivantes : 5 ml de milieu (DMEM HG) ont été placés dans un tube à centrifuger de 15 ml (tube 1), 2 ml de Trypsine soit 100p1 de trypsine (GIBCO ref 25090) et 1,9 ml de PBS (sans Ca, sans Mg), 15 ml de PBS, 10 ml de milieu complet (pour un repiquage simple, 900p1 de milieu DMEM HG: permet le comptage d'une solution diluée 10X). L'ensemble de ces solutions a été mis à 37°C pendant quelques minutes. Le milieu de culture a été aspiré, 4 ml de PBS ont été ajoutés, puis mélangés pour rincer le fond de la boite, et réaspirés. 2 ml de trypsine diluée ont été ajoutés directement sur les cellules et sans précaution. Les boites de culture ont été incubées sous la hotte pendant quelques secondes. Les boites ont alors été tapotées avec la main pour finir de décoller les cellules encore attachées.2 ml de PBS ont été alors rajoutés directement sur les cellules. Les 4m1 de suspension cellulaire ont été alors récupérés et placés dans le tube (1) contenant 5 ml de milieu de base. Un second rinçage des boites de culture est effectué avec 3m1 de PBS afin de recueillir les cellules résiduelles. Cette suspension est ajoutée au tube (1).. Le tube a été ensuite centrifugé 3 min à 1500 tr/mn à température ambiante, à savoir 20°C. Le surnageant a été enlevé en laissant 200/300p1 de milieu résiduel au dessus du culot de cellules. Les cellules ont alors été resuspendues en agitant le fond du tube avec les doigts. Enfin 2 ml de milieu frais ont été ajoutés pour finir la remise en suspension des cellules a l'aide d'une pipette Pasteur stérile rodée à 50%. Les cellules ont été comptées avec une cellule de Malassez et ensemencées à raison de 3.105 cellules par boîte de 35mm. La transfection des cellules a été réalisée comme suit. Les cellules ont été ensemencées à 3.105 cellules par boîte de 35mm (recouvertes (« coatés » en poly 0), puis incubées à 37°C et sous 5% de CO2 pendant 24 h. 5 !Ag d'un mélange d'ADN (1pg/p1) codant pour les différentes sous-unités des canaux calciques ont été mixés avec du milieu de base (qsp 1000 à température ambiante, à savoir 21°C+/-1°C. 10 pl de superfect (Qiagen) ont été ajoutés et mélangés (haut et bas 5 fois à la pipette P100) à cette solution, puis laissés incuber à température ambiante , à savoir 21°C+/-1°C pendant 5-10 min. Pendant ce temps, le milieu de culture complet a été aspiré et les boites rincées avec 2,5 ml de PBS(préchauffés à 37°C). 900 pl de milieu de croissance (à 37°C ont été ajoutés au mélange ADN-Superfect et mélanger haut et bas 2 fois. Le PBS des boites de culture a été enlevé et remplacé par le mélange de transfection. Ces boites ont été incubées 2h à 37°C et sous 5% de CO2 Puis, le mélange de transfection a été doucement aspiré, et les cellules ont été lavées avec 2,5 ml de PBS. 2 ml de milieu de croissance a été finalement ajouté et les cellules ont été stockées à 37°C sous 5% de CO2 pour l'analyse des courants calciques. Les mélanges d'ADN utilisés ont été réalisés à partir de solutions stock d'ADN à 1pg/p1 contenant l'ADN codant pour une des différentes sous-unités des canaux calciques, insérées dans un vecteur d'expression eucaryote avec ou sans étiquette N ou C-terminale obtenu à l'exemple 1 précité. Pour le premier et le second variant du canal calcique Cava, (AmCaV1 et AmCaV2), les vecteurs d'expression codant pour les protéines Cavp et Cava2-E, ont été mélangés dans un rapport 1 :1 :1 avec le canal. Ces mélanges ont été transfectés dans les cellules selon le procédé qui vient d'être décrit: Des vecteurs contenant les séquences pIRES et deux gènes (CaV1 et Cavp par exemple) peuvent aussi être préparés par biologie moléculaire pour ce type de transfection. Dans tous les cas, soit une des sous-unités est étiquetée avec une protéine fluorescente de type GFP, soit un vecteur codant pour une protéine fluorescente de ce type est cotransfecté avec les sous-unités du canal (dans un rapport 10 :1 :1 :1 pour GFP : Cava : Cavp et Cava2,5). Les cellules exprimant le canal sont ensuite visualisées grâce à un microscope équipé de la fluorescence Enregistrement de l'activité des canaux calciques Sur cellules isolées, exprimant transitoirement ou de manière stable le canal Cava, et/ou la protéine Cavp et/ou la protéine Cava2-Ô, différentes méthodes ont été utilisées pour analyser l'effet de substances sur les canaux calciques. La mesure de l'activité des canaux calciques a été réalisée, dans cet exemple, avec un procédé électrophysiologique et/ou par imagerie calcique. a. Méthode électrophysiologique. Les cellules transfectées, ont été repiquées à faible densité, à savoir 1.105 cellules/boite à J-1 dans plusieurs boites de Pétri de 35mm. Le jour J, ces boites ont été rincées une fois avec du PBS, et une fois avec une solution d'enregistrement de type extracellulaire (en mM : TEA-CI, 155; MgC12, 2; HEPES, 10; Glucose, 10; CaCI ou BaCI entre 2 et 20; pH=7.4 (TEA-OH)) ou tout type de solution permettant d'enregistrer l'activité électrique du canal calcique. Cette boite a été transférée sur la platine d'un microscope inversé (type Leica DMIRB ou équivalent) équipé d'un système d'épifluorescence, et d'un système de perfusion de la boite de Pétri. L'enregistrement de l'activité du canal a alors été réalisé en VVhole cell recording en utilisant un amplificateur de patch-clamp Axopatch 200 ou équivalent, connecté à un ordinateur par une interface de type Digidata 1200 (Axon Ist., ou équivalent). Les sauts de potentiels appliqués à la cellule comme l'enregistrement des courants ont été réalisés grâce au logiciel pClamp (ver 7, Axon Inst, ou équivalent). Les pipettes d'enregistrement ont été en général étirées à partir de verre capillaire (marque Clark electromedical Instrument GC150T10, ou équivalent) par une étireuse programmable horizontale (type P-93 Sutter Inst. ou équivalent), pour donner des pipettes qui ont une résistances de 2-15 MS) quand elles ont été remplies avec une solution de type intracellulaire (en mM : CsCI, 110; HEPES, 25; EGTA ou BAPTA, 10 ; ATP(Mg), 4; GTP(Na), 0,3; Tris-phosphocréatine 10; pH=7,3 CsOH 290 mOsm). De manière générale l'activité du canal a été enregistré lors de sauts de potentiels à partir d'un potentiel de repos de -80 mV vers un potentiel entre -40 et +60 mV (généralement à +10 mV, maximum de la courbe courant-voltage). L'effet de substance sur le canal calcique est alors évalué en enregistrant les modifications dans l'amplitude, les cinétiques ou l'activation voltage dépendant du courant lors de la perfusion de la substance à différentes concentrations. La mesure de l'activité du canal peut aussi être enregistré en canal unitaire avec d'autres méthodes déjà décrite par exemple en « cellattached », « inside-out », « outside-out » patch clamp tel que décrit dans « Electrophysiologie moléculaire » 2001 Ed. M. Joffre, collection enseignement de sciences, Herman [13] ou « Microelectrode techniques, The Plymouth Workshop Handbook » 1988, Ed. N.B. Standen, P.T.A Gray and M.J. Whitaker, The Company of Biologists Limited ou « Single Channel recording » 1983 Ed. B. Sackmann and E Neher. Plenum Press, New York [14]. b. Méthode imagerie calcique Les cellules transfectées ont été repiquées à faible densité à J-1 sur des couvercles (« coverslips ») recouvertes (« coatés ») comme précédemment et placées dans plusieurs boites de Pétri de 35mm. Le jour J, ces boites ont été rincées deux fois avec du PBS. Elles sont ensuite incubées en présence d'un indicateur calciques fluorescent traversant les membranes, souvent sous une version AM, (c'est-à-dire acetoxymethyl ester,) radiométrique ou non, comme par exemple le fluo-3 ; fura-2, à une concentration de 5pg Fura2-AM/m1 PBS+1mg/m1 BSA fatty acid free) entre 30min à 2h. Cette boite est ensuite rincée 2 à 3 fois avec du PBS, et une fois avec une solution d'enregistrement de type extracellulaire comprenant en mM: NaCI, 155; MgC12, 2 ;HEPES, 10; Glucose, 10; CaCI entre 2 et 20; pH=7,4 (TEA-OH) permettant d'enregistrer l'activité électrique du canal calcique 15-30 min après ce dernier lavage. La boite est transférée sur la platine d'un microscope inversé (type Leica DMIRB ou équivalent) équipé d'un système d'épifluorescence, et d'un système de perfusion de la boite de Pétri. L'enregistrement de l'activité du canal se fait alors en imagerie à l'aide d'une caméra CCD ou autre montée sur le microscope, ou par un ou deux photomultiplicateurs. L'activité du canal est donnée par la mesure des variations de la concentration calcique intracellulaire (mesurée comme une variation de fluorescence, ou un rapport de variation de fluorescence) après une dépolarisation de la cellule obtenue soit par la perfusion d'un concentration de KCI de 20 à 60mM extérieure, soit par l'activation de canal dépolarisant sensible à la lumière (channelrhodopsine-2) et activé par un flash bleu (488 nm, optogénétique). Le contrôle positif pour la mesure de la concentration calcique est effectué par la perfusion de 20pM ionomycine (ionophore calcique) successivement avec 10 mM EGTA ou 20 mM Ca2+ pour obtenir le ratio, minimum (Rmin) et maximum (Rmax). Le rapport de fluorescence Fura-2 350/380 est alors converti en concentration calcique [Ca]i, par l'équation standard: [Ca]i = K [(R- Rmin)/(Rmax-R)]*Sf/Sb OÙ Sf and Sb sont respectivement les intensités d'émission à 380 nm pour le Calcium libre et le Calcium fixé au Fura2. Cette ensemble d'opération est réalise par divers types de logiciel, dontTillvision (dTill photonics GmbH), ou équivalent, en imagerie ou directement avec des photomultiplicateurs (on peut utiliser aussi Clampex ver 7) L'analyse de l'effet de substance sur cette activité du canal calcique est obtenue en comparant l'activité du canal, mesurée dans ces conditions avec ou sans la substance dans le milieu. Une diminution ou une altération de l'activité du canal en présence de la substance test montrant que celle-ci touche le fonctionnement du canal et est donc potentiellement toxique Exemple 3 : procédé d'analyse de la toxicité d'une molécule Dans cet exemple, l'analyse de la toxicité d'une molécule a été réalisée par étude des courants calciques en fonction de ladite molécule. Deux méthodes sont utilisées, avec des variantes - la mesure de courants calciques par électrophysiologie (sur ovocytes ou lignée cellulaire) - la mesure de courants calciques par imagerie calcique de fluorescence sur lignée cellulaire La mesure de la régulation de l'activité du canal calcique après expression dans des ovocytes de Xénope. Préparation des ARN Les vecteurs contenant les sous unités amCav1a, amCav2b, amCav3a, amCavi3a, amCavi3b, amCavi3c, amCava2Ô1 , amCava2Ô2 et amCava2Ô3, tels qu'obtenus ci-dessus, ont été linéarisés en utilisant une enzyme de restriction coupant en 3' du codon Stop (voir Tableau 2). Un volume réactionnel de 501_11 contenant 10 !Ag de plasmide, 31_11 de l'enzyme appropriée (New England Biolabs France, Evry, France), 5 pl de tampon de réaction fourni par le fabricant et de l'eau a été incubé pendant 3 heures à 37°C. La linéarisation du plasmide a été vérifiée en faisant migrer un aliquot de la réaction, à savoir 30, sur un gel d'agarose. Le plasmide linéarisé a été purifié avec le kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel EURL, Hoerd, France) en suivant les recommandations du fabricant excepté que l'élution du plasmide linéarisé a été réalisée dans 301_11 d'eau. Le cDNA a été dosé par spectrophotométrie sur un Biophotomètre (Eppendorf France SAS, Le Pecq, France). La transcription in vitro a été réalisée en utilisant le kit T3 ou T7 mMessage mMachine (Life Technologies, Saint Aubin, France) en suivant les recommandations du fabriquant. L'ARN a été purifié en utilisant le kit RNeasy Mini Kit (Qiagen SAS, Courtaboeuf, France) en suivant les recommandations du fabricant, excepté que l'élution de l'ARN purifié a été réalisée dans 301_11 d'eau. L'ARN a été dosé par spectrophométrie, la concentration ramenée à 1144.1.1 avec de l'eau. L'intégrité de l'ARN a été vérifiée en faisant migrer un aliquot, à savoir 500ng d'ARN, sur un gel d'agarose. L'ARN a ensuite été stocké à -20°C pour une utilisation ultérieure. Tableau 2: ADNc, vecteur, enzyme de restriction et polymérase utilisées pour la transcritption in vitro. ADNc Vecteur Enzyme Polymérase SEQ ID amCav1a pBS-PL7 Kpnl T3 SEQ ID n°9 amCav2b pBS-PL6 Kpnl T3 SEQ ID n°10 amCav3a pBluescript-II AfIll T3 SEQ ID n°11 SK amCava2Ô1 pBluescript-II BamHI T7 SEQ ID n°15 SK amCava2Ô2 pBluescript-II Xbal T7 SEQ ID n°16 SK amCava2Ô3 pBluescript-II BamHI T7 SEQ ID n°17 SK amCavi3a pBluescript-II Xbal T3 SEQ ID n°12 SK amCavi3b pBluescript-II Xbal T7 SEQ ID n°13 SK amCavi3c pBluescript-II Xbal T7 SEQ ID n°14 SK Préparation des ovocytes Matériel : -une pince à bouts -une pince à bouts -fil de suture pointus ronds -une boite de pétri -une pince à bouts -une paire de ciseaux (50mm) coupes pointus -0R2 à 20°C 3003 863 53 Isolement des ovocytes Une femelle Xenopus laevis, obtenue par le laboratoire CRBM, UMR 5237 du CNRS à Montpellier, a été plongée dans un bocal contenant de l'eau additionnée une solution aqueuse de MS222 (éthyl- 5 aminobenzoate méthane sulfonate, ref A5040, Sigma) à 0,2% à 4°C pendant 15 à 20 minutes. Une fois le xénope endormi, il a été placé sur de la glace en decubitus dorsal. Deux incisions ont alors été réalisées, au niveau de l'épiderme et du plan musculaire sous-jacent, sur 1cm à 1,5cm sur le coté, dans la partie basse de l'abdomen. Les sacs ovariens 10 contenant les ovocytes ont été retirés à l'aide d'une pince courbe à bouts ronds, isolés et placés dans une boite de Pétri remplie d'0R2. Le muscle, puis l'épiderme ont ensuite été recousus, et le xénope replacé dans son aquarium pour le réveil. Les sacs ovariens ont été alors dilacérés avec deux pinces dans la boite de Pétri, puis transférés dans un tube Falcon de 50m1 et rincés 3 fois avec 30 ml d'0R2 à chaque fois Au dernier rinçage, le tube Falcon a été rempli d'une solution contenant 30 ml d'0R2 et 30 mg de collagénase 1A (ref C9891 Sigma) afin de dissocier les ovocytes des cellules folliculaire. Ce tube a alors été placé sous agitation orbitale (1 révolution/sec.) pendant 2 heures. Après 2h (ou dès que les cellules folliculaires ont été dissociées des ovocytes, visualisable par une inspection sous loupe binoculaire 30x), les ovocytes ont été rincés 2 à 3 fois avec une solution 0R2 (30m1 à chaque fois), puis 2 fois avec une solution ND965.Les ovocytes isolés sont alors transférés dans cette solution dans une boite de Pétri de 100mm. A partir de cette boite, des lots de 30-40 ovocytes sont sélectionnés puis isolés dans des boites de Pétri de 30mm pour l'injection. Tableau 3 : composition des solutions 0R2 et ND96S 0R2 mM g/I g/2I ND96S mM g/I g/2I NaCI 82,5 4,81 9,62 NaCI 96 5,6 11,2 KCI 2 0,15 0.30 KCI 2 0,15 0,30 MgC12 1 Hepes 5 0,2 0,40 CaCl2 1,8 0,264 0,528 PH=7,2 (NaOH) 1,19 2,38 MgC12 1 0,2 0,4 HEPES 5 1,19 1,38 Pyruvate 2.5 0,275 0,55 Gentam icyne 0,05 1m1 2m1 pH=7,5-7,6 (NaOH) Injection des ovocytes avec des ARN ou des ADNc Des pipettes en verre pour l'injection des acides nucléiques ont été préparées à partir de capillaires en verre Clark Electromedical Instrument CG150T10 qui ont été étirés à chaud sur une étireuse verticale (de type Sutter Inst. P-30) ou horizontale (de type Sutter Inst. P93) pour donner une ouverture finale de quelques pm. L'injection d'acide nucléique se fait sous loupe binoculaire (x30). La pipette a été montée sur un micromanipulateur et connectée à un système d'injection. Elle a été remplie de 1 à 2 pl de mélange d'acides nucléiques, et a ensuite été utilisée pour injecter les acides nucléiques dans 20 à 30 ovocytes. Le même type d'injection a été réalisé pour les différents mélanges d'acide nucléique de séquences nucléiques. Quand le mélange d'acides nucléique est de l'ADN, l'injection a été réalisée au milieu du pôle animal, quand il s'agit d'ARN, l'injection a été réalisée dans la zone équatoriale. Les mélanges d'ADN ou d'ARN utilisés ont été comme suit : pour le canal, l'ADNc codant pour le Cava et ses variants, à savoir les séquences SEQ ID NO 1, ou 2 et 6 et 4 ont été injectées. L'ADNc codant pour le Cava (2 et 3) de séquences SEQ ID NO 1 ou 2 ont été injectées avec un ADNc codant pour le CaVp (SEQ ID NO 4 ou 5), et un ADNc codant pour CaVa1-Ô2 et ses variants (SEQ ID NO 6). Les ADNc ou ARNc ont été préparés à une concentration de 1pg/p1 Après injection, les ovocytes comprenant respectivement l'ADNc/ARN codant pour le Cava (2 et 3) de séquences SEQ ID NO 1 ou 2 la CaVp (SEQ ID NO 4 ou 5), et la CaVa1-Ô2 (SEQ ID NO 6) ont été obtenus Une fois injectés, les ovocytes sont replacés dans leur boite qui est étiquetée, puis conservés en ND96S pendant 2-5 jours. Enregistrement électrophysiologique. Après injection, les oeufs ont été placés, un à un, dans une cuve d'enregistrement (connectée à la masse par le biais d'une pipette remplie d'Agar dissout à 2% dans du KCI 3M reliée à la tête de ((bain)) de l'amplificateur de courant (de type Geneclamp 500, Axon Inst. ou équivalent). Deux électrodes construites comme les électrodes d'injection mais remplies de KCI 3M, ont été connectées aux têtes « voltage » et « courant » de l'amplificateur. Après avoir testé la résistance de ces deux électrodes (0,2-1 MS)), elles ont été introduites dans l'ovocyte, et l'amplificateur réglé sur le mode « voltage imposé ». L'ovocyte ainsi empalé a été perfusé avec une solution permettant l'enregistrement de l'activité des canaux calciques à savoir une solution Bant10 (composition (en mM) : BaOH, 10; TEAOH, 20; C50H, 2; NMDG, 50; HEPES, 10; pH =7,2 avec de l'acide méthane sulfonique). Le courant de baryum résultants de l'expression des canaux codés par les différents acides nucléiques a été enregistré en appliquant les sauts de voltage à partir d'un potentiel de repos fixé à -80mV, vers des potentiels supérieurs (de -50 à +80 mV) durant 50 à 1000 msec ou plus. L'ensemble stimulation de l'ovocyte et enregistrement des courants a été réalisé grâce au logiciel pclamp (Clampex ver 7, Axon Inst. ou supérieur) ou équivalent, tournant sur un ordinateur connecté à l'amplificateur grâce à une carte d'acquisition Digidata 1200 (Axon Inst) ou équivalent. L'expression de ces ADNs a été obtenue d'un point de vue fonctionnel, les substances à tester ont été injectées dans le milieu extérieur, dans l'exemple présent dissoutes dans du Bant 10, et l'effet de la substance sur le canal et les protéines régulatrice est alors enregistré. L'effet de la substance testée peut être une diminution ou une augmentation du courant de baryum, des modifications dans les autres paramètres liés au canal calcique : les cinétiques du courant ou l'activation dépendante du voltage ou l'inactivation du canal. Des variations dans ces différents éléments sont le signe d'un effet toxique sur l'entrée de Ca2+. Ainsi, une variation/modification de ces paramètres permet d'identifier des composés potentiellement toxiques pour les abeilles. La figure 9 représente les résultats obtenus avec les canaux calciques d'abeille Cava (AmCaVa1) et CaVa (AmCava2) co-exprimés avec les protéines régulatrices d'abeille Cavp (AmCavpa) et Cava2-E, (AmCava2-Ô1) de façon fonctionnelle dans des ovocytes de Xénopes. Des courbes courant-voltage classiques sont obtenues. Cette expérience démontre clairement l'expression de canaux calciques d'abeilles dans les ovocytes de Xénopes. Après expression, 20 pM de permethrine, un pyréthrinoide connu comme insecticide, a été perfusé dans le milieu de culture de l'ovocyte exprimant les canaux calciques d'abeilles Cava (AmCaVa1) et CaVa (AmCava2) co-exprimés avec les protéines régulatrices d'abeille Cavp (AmCavpa) et Cava2-E, (AmCava2-Ô1) de façon fonctionnelle et une observation des courants calciques a été réalisée telle que décrit ci- dessus. La figure 10 démontre clairement que les canaux calciques d'abeille sont sensibles à l'insecticide qui provoque une inhibition du courant calcique. Cette expérience démontre clairement que le canal calcique d'abeille Cava, et les protéines Cavp et Cava2,51 isolés peuvent être utilisés afin de détecter des molécules toxiques et/ou déterminer la toxicité de molécule et/ou d'analyser la toxicité d'une molécule. En outre cet exemple démontre clairement que le canal calcique d'abeille Cava, et les protéines Cavp et Cava2,51 isolées peuvent être utilisées afin de détecter une interaction entre le canal calcique d'abeille Cava, et les protéines Cavp et Cava2,51 et une molécule. Exemple 4: Caractérisation de l'activité de la protéine d'abeille Cavp. Abeilles larves, nymphes et adultes ont été anesthésiés par refroidissement à 4°C. L'ARN total a été extrait à l'aide RNeasy Mini kit (Qiagen) ou le réactif Trizol (Invitrogen). Premier brin d'ADNc a été obtenu à partir d'oligo-dT amorcées ARN total en utilisant le Superscript II de la transcriptase inverse (Invitrogen). H-Cava et Am-Cavpb ADNc ont été amplifiés avec amb2-008S (SEQ ID NO 79) et amb2-007AS (SEQ ID NO 78), et avec les oligonucléotides amb2-006S (SEQ ID NO 77) et amb2- 007AS (SEQ ID NO 78), respectivement, en utilisant l'Herculase polymérase II Fusion (Agilent Technologies). Les ADNc ont été clonés dans pBluescript (Agilent Technologies) et entièrement séquences. L'analyse par réaction en chaîne polymérase-transcriptase inverse (RTPCR) de l'expression de Cavp dans différents tissus d'abeilles adultes a été réalisé avec les amorces amb2-003S (SEQ ID NO 75) et amb2-004AS (SEQ ID NO 76) qui amplifient un fragment de1635-pb par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). L'analyse de l'expression par RT-PCR de Cava et Cavpb au cours du développement d'abeilles a été réalisée avec les amorce amb2-003S (SEQ ID NO 75) et an-lb-013AS (CCTGCTGCCTCAGGGCCTCC (SEQ ID NO 99) et amb-014S (ATGATCGGATACAATCAACACAATTCCGG (SEQ ID NO 100) et AMB- 013AS qui amplifient respectivement un fragment de 574 pb et un fragment de 391-pb. Am-pTF1 qui correspond à Am-Cava tronqué de ses 78 premiers acides aminés qui a été obtenu par PCR avec les amorces amb005S (CCCTCGAGCCACCATGGGCTCGGCAGACTCGAACTAC (SEQ ID NO 101)), séquence Xhol et séquence Kosak) et amb-007AS. AM-pb-mut correspondant à Am-Cavpb muté sur quatre résidus dans son extrémité N- terminale a été obtenue par une PCR chevauchante de deux fragments amplifiés avec T7 (séquence présente dans pBluescript) et an-lb-016AS (GAGCCCTGCGCGAATAGCTTGTTGGCGCCGGCATTGTGTTGATTGG CTCCGATCATC (SEQ ID NO 102) et amb-015S (GATGATCGGAGCCAATCAACACAATGCCGGCGCCAACAAGCTATTCG CGCAGGGCTC (SEQ ID NO 103)) et an-lb-017AS (GAACAACGCCTTCTGCATCATGTCC (SEQ ID NO 104), respectivement. 3003 863 58 Toutes les constructions ont été vérifiées par séquençage. Anticorps Anticorps polyclonaux de lapin ont été générés contre des peptides 5 synthétiques correspondant aux extrémités N-terminale de AmCavpa (NH2-MSRQLRAERDHVSRC-CONH2 (SEQ ID NO 105)) ou à l'extrémité C terminale commune C (NH2-CRQQQDPRALNAI-COOH (SEQ ID NO 106)): Nt-Ab et Ct-Ab, respectivement. Les sérums ont été recueillis, et anticorps ont été purifiés par affinité contre le peptide ayant servi à 10 l'immunisation. Leur spécificité a été vérifiée à l'aide d'un gel protéique (« Western Blot ») en utilisant des extraits cellulaires de cellules HEK 293 transfectées avec les deux variant d'épissages ou des tissus du cerveau des abeilles, et par immunofluorescence sur des cellules transfectées, ou des tranches de cerveau. 15 Électrophysiologie Des oocytes de Xenopus ont été préparés et injectés in vitro avec de l'ARN transcrit (20-40 n1 de mélange de CaV2.3 (Genbank No accession: X67855) + a2,5 (M86621) + / - AmCaVp ou Cavp2a (M80545) 20 ou Cavp1b (X61394) à 1 pg/pl, stoechiométrie 1:1:1) comme déjà décrit dans Restituito S, Cens T, Barrere C, Geib S, Galas S, De Waard M, Charnet P (2000) The p2a subunit is a molecular groom for the Ca2+ channel inactivation gate. J Neurosci 20:9046-9052 [11]. Des Cav2.1 (X57476) et Cav2.2 (D14157) de lapin ont également été utilisées. Des 25 courants macroscopiques ont été enregistrées en voltage-imposé à deux électrodes et analysés dans la solution BANT10 d'enregistrement: (en mM): BaOH, 10; TEAOH, 20; NMDG, 50; C50H, 2; HEPES, 10; pH 7,2 avec de l'acide méthanesulfonique. Les courants ont été filtrées (500 Hz) et numérisés (2 kHz) à l'aide d'une interface de Digidata-1200 (Axon 30 Instruments). L'acquisition des données a été faite en utilisant la version 7 du logiciel pClamp (Axon Instruments). Environ 30 n1 de BAPTA (en mM: BAPTA acide libre, 100; C50H, 10; HEPES, 10; pH 7,2 C50H) ont été injectés dans chaque ovocyte (10 psi, 150 ms) au début de l'enregistrement en utilisant une troisième électrode afin de minimiser la contamination par le courant Cl- activé par le Ca2+. Des courbes d'inactivation isochrones (2,5 s de potentiel de conditionnement suivies d'une dépolarisation test de 400 ms à +10 mV) ont été analysées à l'aide des équations suivantes: I / I max =Rh, + (1 - Rin)/ (1 + exp ((V - Vin)/ kin dans laquelle I était l'amplitude du courant mesuré pendant l'impulsion d'essai à +10 mV pour un potentiel de conditionnement variant de -80 à 50 mV; Imax l'amplitude du courant maximum; Vin le potentiel de demi- inactivation; V le potentiel de conditionnement, kin la pente, et Rn la proportion de canaux non-inactivés. La cinétique d'inactivation a été quantifiée comme R400, le rapport de l'amplitude du pic du courant sur l'amplitude du courant enregistrée à la fin d'une dépolarisation de 400ms. Les traces de courant ont été également définies à l'aide d'une équation bi- exponentielle donnant la valeur des constantes de temps d'inactivation lente et rapide (Tfast et Tslow), et l'amplitude relative de Tslow. Les courbes courant-voltage ont été définies à l'aide de l'équation suivante: I / I max = G x (V- Erev)/ (1 + exp ((V-Vact) kact)) dans laquelle I est l'amplitude du courant mesuré pendant la dépolarisation variant de -80 à +50 mV; Imax l'amplitude du courant maximum de la courbe courant-voltage; la conductance G normalisée macroscopique, E'v le potentiel d'inversion apparent extrapolé, N'ad le potentiel de demi-activation, V la valeur de la dépolarisation et kact un facteur de pente. Pour les enregistrements en canal unique, la membrane vitelline ovocyte a été éliminée en utilisant une pince après immersion dans une solution hypertonique (200 mM NaCI, 10 mM de HEPES), et l'ovocyte a ensuite été placé dans la chambre d'enregistrement remplie d'une solution dépolarisante (100 mM KCI, 5 mM de HEPES, 10 mM d'EGTA, pH 7,2 ajusté avec du KOH; l'osmolarité à - 250 mosmol). Les pipettes de patch, une fois recouverte (coatée) (Sylgard (D) et polies avait une résistance de 8-12 MO, quand elles sont remplies avec une solution contenant 100 mM BaCl2, 5 mM de HEPES (pH 7,2 a été ajusté avec NaOH; - 290 mOsm). Les courants en cellules attachées été enregistrés avec un amplificateur Axo-patch 200B (Molecular Devices), filtrés à 2 kHz, et numérisé à 10 kHz en utilisant une interface Digidata 1200 et stockés sur un ordinateur en utilisant le logiciel Clampex. Les potentiels de jonction étaient de 1-3 mV et ont donc été négligés. Les courants ont été analysés avec le logiciel Clampfit (Molecular Devices). Les courants de fuites ont été soustraits au moyen de la commande de réglage manuel de Clampfit. Les ouvertures des canaux ont été détectées par un seuil fixé à 50% du courant. La conductance du canal et les constantes de temps d'ouverture ont été calculées à partir de régressions non linéaires effectuées sur les histogrammes d'amplitude et de temps ouvert obtenus à différents potentiels en utilisant des modèles gaussien et multi-exponentielle, respectivement. La Popen a été calculée en divisant le temps total que le canal passe à l'état ouvert sur le temps total d'enregistrement. Cette Popen a aussi été déterminée sur les phases précoce (Po précoce, premières 40 ms) ou tardive (Po tardive, dernières 40 ms) de chaque dépolarisation pendant 100 dépolarisations successives. La moyenne des Popen a été calculée à partir de ces 100 courbes consécutives. Le test t de Student ou ANOVA a été utilisé pour tester les différences entre les valeurs moyennes. Toutes les valeurs sont des moyennes ± l'écart-type. Tranches de cerveau d'abeilles : des cerveaux d'abeilles domestiques ont été disséqués à 4°C dans du PBS supplémenté avec du paraformaldéhyde 4% et fixés dans la même solution pendant 2 h 30 min. Après rinçage dans du PBS, ils ont été successivement mis en incubation dans 15% et 30% de saccharose pendant respectivement 4 h et pendant la nuit. Des tranches de cerveau (25 pm d'épaisseur) ont été faites et perméabilisées avec 0,1% de Triton-X100 dans du PBS et bloquées avec PBS-0,1% Triton X100 et 0,5% de sérum albumine de bovin (BSA) et 10% de sérum de chèvre normal (NGS). Elles ont ensuite été incubés pendant 2 h à température ambiante, à savoir 21°C +/-2°C avec l'anticorps Nt-Ab anticorps dilué au 1/1000 dans du PBS-0,1% de Triton X100 et 10% de NGS. Après lavage au PBS, la réaction a été bloquée avec PBS- 0,5% de BSA et 10% NGS. Dans le cas d'une révélation par immunofluorescence, des anticorps secondaires anti-lapin TRITC (AB-Cam, France) ont été appliqués au 1/100 pendant 1h30 min dans du PBS-1%BSA. Après lavage dans du PBS, les tranches ont été montés dans du MowioI-4-88 (Polysciences Inc, Warrington, PA) et observées au microscope. Dans le cas du système de détection à base de peroxydase, des anti-anticorps de lapin biotinylés (Vector Laboratories, USA) ont été appliqués au 1/500 dans du PBS NGS-10%. Le kit VectaStain ABC (Vector Laboratories, USA) a été utilisé selon les recommandations du fabricant. Après rinçage dans du PBS, les coupes ont été incubées avec une solution de 3,3'- diaminobenzidine additionné de 3% de NiCl2. La réaction a été bloquée avec du PBS - 0,05% d'azide sodium, et les tranches ont été déshydratées par incubation successives dans des solutions d'éthanol (de 50% à 100%). Après rinçage avec du limonène, les tranches ont été montées en utilisant la solution Eukitt (Kindler GmbH et Co, Allemagne). Immunoblot : des cellules HEK293 ont été transfectées avec pCS4- AmCaVpa ou AmCaVpb obtenus comme décrit ci-dessus et cultivées pendant 48 h. Huit A. mellifera ont été anesthésiées à 4°C pendant 30 min, et l'antenne, le cerveau, les jambes, le thorax, l'abdomen et ont été recueillis. Les tissus d'abeille et les cellules HEK ont été lysées dans 50 mM de Tris pH = 7,2, NaCI 150 mM, EDTA 2 mM complété par un cocktail inhibiteur de la protéase (Complete, Roche Applied Sciences). Les cellules ont été ensuite centrifugées à 14000 tours par minutes à 4°C durant 15 minutes, et le surnageant a été soumis à un gel de protéine (Western Blot) en déposant 10pg/puits de protéines sur un gel à 10%, soumis à une migration pendant deux heures à 100V, puis un transfert de 1 heure à 100V à 4°C. On révèle l'expression de AmCaVp en utilisant les anticorps Nt-Ab ou Ct-Ab dilué au 1/1000. Dans cet exemple, les composés chimiques inhibiteurs ont été utilisés comme suit : Genistein (10 pM), la staurosporine (2 pM), H89 (2-50 uM), Wortmannin (10 pM), et LY294002 (10 pM) ont été ajoutés au milieu d'incubation 1-2 h avant les enregistrements. Le 2Br-palmitate a été injecté à 1 mM dans des ovocytes 4 h avant les enregistrements (concentration intra-ovocytaire calculée - 10 pM) et ajouté dans le milieu extérieur. L'aléthrine (20pM) a été soit ajoutée au milieu d'incubation 2 h avant les enregistrements, et/ou perfusée à cette concentration pendant les enregistrements. Pour les muscles et les neurones, les cultures ont été traitées avec Wortmannin ou H89 pendant 30-60 min avant les enregistrements via l'ajout dans le milieu de culture. Les courants ont été enregistrés sur quatre à dix cellules dans chaque condition et les R90 ou R400 ont été calculés et moyennés pour chaque situation. Tel que montré sur la figure 11 l'expression de Cavp a été confirmé dans l'ensemble des larves et des pupes à différentes étapes de développement d'abeilles et dans les tissus nerveux et musculaires (Figure 11 A). Deux anticorps spécifiques dirigés contre l'extrémité N-terminale (Nt-Ab) de Cavp et l'extrémité C-terminale commune(Ct-Ab) ont été produits et purifiés par affinité. Leurs spécificités ont été testées sur des cellules HEK293 exprimant AmCavpa ou le variant AmCavpb. Comme attendu, l'anticorps Ct-Ab a révélé deux espèces de - 70 et - 55 kDa dans respectivement les lysats cellulaire de cellules HEK 293 transfectées avec Am-Cava et Am-Cavpb (Figure 11 B). Dans des extraits cellulaires de cerveaux des abeilles (Figure 11 B, colonne B), le Ct-Ab a révélé deux transcris migrant à 70 et 55 kDa correspondant aux variantes a et b. Fait intéressant, la bande de 70 kDa migre sous forme d'un doublet chez les abeilles. Ce doublet a également été observée avec le Nt-Ab anticorps, que le plus petit variant n'a pas été détecté (Figure 11 B). Dans les extraits de muscle (à partir de thorax, Figure 11 B, colonne T), la coloration par le Ct-Ab a été beaucoup plus faible, mais une bande principale à mobilité légèrement plus faible (c'est-à-dire supérieur à 70 kDa) était néanmoins visible. Cette bande a également été révélée par la coloration avec le Nt-Ab, mais des bandes supplémentaires de masses moléculaires inférieures et supérieures ont également été observées. lmmunomarquage de coupes de cerveau axial avec Nt-Ab a confirmé la large expression de l'Am-Cavp dans tout le cerveau, avec un marquage ponctuée de plusieurs structures telles que le complexe central, le lobe optique, le calice des corps pédonculés, ou les lobes antennaires (AL) (Figure 11 C), concordant avec l'existence de flux voltage-dépendants de Ca2+ dans les neurones de ces structures. Cette expression a été confirmée par analyse RT-PCR (donnée non fournie). En culture primaire de neurones à partir de lobes antennaires, des images d'immunofluorescence utilisant Ct-Ab ont montré une expression d'Am-Cavp dans le soma et les dendrites (Figure 11 D). Dans les cellules musculaires, la coloration avec le Ct-Ab a révélé une localisation spécifique supplémentaire dans certains noyaux de la fibre (Figure 11 E) qui n'a pas été trouvée dans les neurones ou dans les cellules HEK293. Comme montré dans la figure 14 la co-expression dans des ovocytes de Xenopus de Cavp d'abeille (Am-Cava), de CaV2.3 et de CaVa2ô de lapin a augmenté l'amplitude du courant qui a plus que doublé (Figure 14 A), a déplacé la courbe courant-tension vers les potentiels hyperpolarisés, augmenté la pente d'activation, et a augmenté le pourcentage du courant non-inactivant dans les courbes d'inactivation isochrones (Figure 14 B et C). Les cinétiques d'activation et d'inactivation de courant ont également été modifiées. Le temps au pic du courant a été retardée de 14 ± 1 à 31 ± 1 ms (n = 60 et 150, sans ou avec la sous-unité Am-Cava, respectivement, figure 14 B), et une forte diminution de l'inactivation a été enregistrée, ce qui conduit à une augmentation du courant restant en fin de dépolarisation par rapport au pic du courant (R400, Figure 14 B). Des résultats similaires ont également été trouvés lorsque Cavp d'abeille (Am-Cava) a été exprimée avec les canaux Cav2.1 ou CaV2.2. L'expression du variant b de la Cavp d'abeille (AmCavpb) à la place de l'AmCavpa a également retardé l'activation et réduit l'inactivation (Figure 14 A et B). L'inactivation lente enregistrée avec ces deux variants rappelle l'effet de la sous-unité de rat CaVp2a (Fig. 15A), qui est connue pour ralentir l'inactivation du canal par une interaction, via le palmitate, avec la membrane plasmique et un site polybasique situé à la limite du domaine GK. Comme prévu, l'inactivation induite par CaVp2a lente a été accélérée par l'injection de 2Br-palmitate (un inhibiteur de la palmitoyle transférase). La Cavp d'abeille (AmCavpa) a également été localisée à la membrane plasmique lorsqu'elle est exprimée seule dans des cellules HEK293 (Figure 15B), mais, à la différence de la sous-unité CavI32a il n'existe pas de signal de palmitisation dans l'extrémité N-terminal du Cavp d'abeille. L'analyse de la cinétique d'inactivation a démontré que, dans tous les cas, l'inactivation peut être décrite par la somme de deux composantes exponentielles. Dans le cas d'AmCavpa, l'inactivation tardive pourrait être clairement attribuée à un ralentissement de la composante rapide s'accompagnant d'une augmentation de la contribution de la composante lente (Figure 15D) alors que pour le CaVp2a de rat, le principal changement a été un ralentissement de la constante de temps lente d'inactivation (non représenté). En accord avec un mécanisme différent, l'inactivation lente induite par Cavp d'abeille (AmCavpa) était insensible aux 2Br-palmitate (Figure 15C). Au niveau d'un canal unique, l'inactivation lente est clairement visible pour les canaux associés au Cavp d'abeille (AmCavpa) et au CaVp2a de rat comme une persistance de la probabilité d'ouverture du canal au cours de la dépolarisation (Figure 15E et Popen Figure 15F), tout en ayant une grande différence dans les constantes de temps lentes d'ouverture des canaux CaV2.3 avec ces deux protéines (Figure 15F droite) confirmant que les mécanismes de régulation du canal sont différentes. Plusieurs régulateurs potentiels de l'activité des canaux ont été également testés. Différents lots d'ovocytes ont donc été incubées avec des inhibiteurs de tyrosine kinases (génistéine, 10 pM), de sérine/thréonine kinases (staurosporine, 10 pM ou H89, 50 pM) ou des phosphoinositides kinases (PI3K) (Wortmannin, 10 pM, ou LY294002, 10 pM), et l'inactivation des courants Ba2+ a été analysée dans ces différentes conditions. Les canaux contenant la Cavp d'abeille (AmCavpa) sont clairement sensibles aux inhibiteurs de PI3K, la Wortmannine et LY294002 (W, L, Figure 16 A), tout en étant insensible ou peu sensible aux inhibiteurs de tyrosine et Sérine/thréonine kinases, à savoir la génistéine, la staurosporine ou le H89, respectivement (G, S, H, Figure 16 A). Par contre Les canaux contenant la Cavp d'abeille (AmCavpb) sont eux clairement sensibles aux inhibiteurs de tyrosine et Sérine/thréonine kinases, (la génistéine, la staurosporine ou le H89, respectivement: G, S, H, Figure 16 A), alors qu'ils sont insensibles aux inhibiteurs de la Pl3kinase (W et L). Dans des cultures de neurones d'abeilles (Figure 16 B), ainsi que dans les cellules musculaires fraîchement dissociées (Figure 16 C), un courant Ba2+ à haut seuil a pu être enregistré. Dans les deux cas, l'inactivation de ces courants est sensible à Wortmannin et H89. En collaboration avec l'analyse par Western blot (Figure 11 A), ceci confirme l'expression fonctionnelle des deux variants de Cavp d'abeille dans les neurones et les muscles abeilles. Des expériences similaires ont été réalisées avec des cellules de Xenope co-exprimant le canal CaV2.2, le CaVa2ô de lapin avec un Cavp d'abeille (Am-Cava ou Am-Cava) après incubation ou non (H20) avec de l'Alléthrine (Allet). Comme montré sur la figure 13, l'Alléthrine diminue l'amplitude des courants des canaux calciques en présence du Cavp d'abeille et montrent un rôle régulateur de Am-CavI3 (variant a ou b) sur le blocage des canaux par l'allethrine. Cette expérience démontre clairement que le canal calcique d'abeille Cava, et les protéines Cavp et Cava2,51 isolés peuvent être utilisés afin de détecter des molécules toxiques et/ou déterminer la toxicité de molécule et/ou d'analyser la toxicité d'une molécule. En outre cet exemple démontre clairement que le canal calcique d'abeille Cava, et les protéines Cavp et Cava2,51 isolés peuvent être utilisés afin de détecter une interaction entre le canal calcique d'abeille Cava, et les protéines Cavp et Cava2,51 et une molécule.30 Liste de références 1. Buraei,Z. and Yang,J. (2010). The {beta} Subunit of Voltage-Gated Ca2+ Channels. Physiol Rev. 90, 1461-1506. 2. Kadala,A., Charreton,M., Le Conte,Y., Jakob,I., and Collet,C. (2010). 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The discovery of a novel sodium channel in the cockroach Periplaneta americana: Evidence for an early duplication of the para-like gene. Insect Biochem and Mol. Biol. 39: 814-823 18. https://www.lifetechnologies.com REVENDICATIONS1. Canal calcique isolé d'abeille comprenant une sous-unité Cava1 de séquence choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID n° 1 à 3. 2. Canal calcique selon la revendication 1 comprenant en outre au moins une protéine régulatrice choisie parmi une protéine régulatrice Cava2,5 de séquence choisie dans le groupe comprenant la séquence SEQ ID NO 6 à 8 et une protéine régulatrice Cavp de séquence choisie dans le groupe comprenant la séquence SEQ ID n° 4, 5 et 107. 3. Canal calcique selon la revendication 2, comprenant un canal Cava1, une protéine régulatrice Cava2,5 et une protéine régulatrice Cavp 4. Acide nucléique codant pour un canal Cava1 et/ou une protéine régulatrice Cava2,5 et/ou une protéine régulatrice Cavp telle(s) que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 4. 6. Cellule transformée comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 4 ou un vecteur selon la revendication 5. 7. Procédé de fabrication d'un canal calcique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 par recombinaison génétique utilisant un acide nucléique selon la revendication 4 ou un vecteur selon la revendication 5. 8. Procédé de détermination de la toxicité d'une molécule et/ou de détection d'une molécule toxique et/ou d'analyse de la toxicité d'une molécule comprenant : une étape d'analyse électrophysiologique et/ou d'imagerie calcique comprenant la mise en contact de ladite molécule avec un canal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou avec une cellule transformée selon la revendication 6. 9. Utilisation d'un canal calcique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour la détermination de l'interaction moléculaire entre ledit canal et une molécule.