Brevet FR3005861A1 — publié le 20141128

UTILISATION COSMETIQUE D'UN PRINCIPE ACTIF OBTENU A PARTIR DE SILYBU/14 MARIANU/14 POUR UN EFFET AMINCISSANT / ANTI-CELLULITE La présente invention se rapporte à l'utilisation cosmétique en application topique d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum pour un effet amincissant et/ou anti-cellulite. L'invention concerne également un procédé de traitement cosmétique de la peau pour un effet amincissant et/ou anti-cellulite. La cellulite est une modification particulière des cellules graisseuses et des fibres de collagène, qui résulte d'une accumulation excessive de graisses dans la couche profonde de la peau, le tissu adipeux. Pour combattre l'aspect inesthétique dit de « peau d'orange » qui en découle, il 10 existe actuellement différents produits cosmétiques amincissants et anticellulite, qui agissent tous avec des mécanismes proches. L'objectif de la présente invention, est de proposer un nouveau principe actif cosmétique amincissant capable de combattre efficacement l'aspect disgracieux de la « peau d'orange », avec un mécanisme d'action différent de celui des 15 principes actifs cosmétiques existants. En particulier, l'invention propose d'utiliser un principe actif qui soit capable d'agir sur les cellules souches / progénitrices adipocytaires. A cet effet, l'invention vise l'utilisation d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum. 20 Le chardon argenté ou Silybum marianum est une plante herbacée de la famille des Astéracées, originaire de la région méditerranéenne. Le fruit du chardon argenté, et les préparations qui en dérivent, sont traditionnellement utilisés dans le traitement symptomatique fonctionnel digestif. Cette plante est listée dans les plusieurs monographies thérapeutiques. Des extraits de chardon argenté ont été utilisés dans des produits cosmétiques pour diverses applications, notamment des applications antivieillissement, anti inflammatoire ou encore anti-acné. La présente invention vise spécifiquement l'utilisation d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum pour un effet amincissant et/ou anti-cellulitique. De façon surprenante, l'application sur la peau d'un principe actif obtenu à partir 10 de Silybum marianum permet de réduire le stockage des graisses et de limiter la différenciation des cellules souches / progénitrices adipocytaires, pour un effet amincissant et anti-cellulitique. L'invention vise donc spécifiquement l'utilisation dans une composition à application topique d'une quantité efficace d'au moins un principe actif obtenu à 15 partir de Silybum marianum comme principe actif cosmétique, ledit principe actif et/ou ladite composition étant destinés à un effet amincissant et/ou anticellulitique. L'invention a également pour objet un procédé cosmétique de soin de la peau destiné à un effet amincissant et/ou anti-cellulitique, comprenant l'application 20 topique d'une composition comprenant entre 0,01 et 5% en poids de matière sèche, d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum. La présente invention est maintenant décrite en détail. L'invention vise donc l'utilisation cosmétique dans une composition à application topique d'une quantité efficace d'au moins un principe actif obtenu à partir de 25 Silybum marianum comme principe actif cosmétique, ledit principe actif et/ou ladite composition étant destinés à un effet amincissant et/ou anti-cellulitique. Le développement de l'hypoderme implique son remodelage important qui repose sur - l'hypertrophie des adipocytes, c'est-à-dire l'augmentation de l'accumulation des lipides au sein de gouttelettes lipidiques conduisant à la fusion de ces dernières et à l'augmentation de la taille des cellules, ceci résultant d'un déséquilibre entre les processus de lipogenèse et de lipolyse, - l'hyperplasie adipocytaire ou adipogenèse qui aboutit à l'augmentation du nombre de préadipocytes capables de se convertir en adipocytes matures. L'hyperplasie ou adipogenèse représente un processus complexe par lequel de nouveaux adipocytes se développent à partir de cellules souches / progénitrices adipocytaires. Ce processus implique deux évènements majeurs - le recrutement et la prolifération des cellules souches / progénitrices pour augmenter le nombre de préadipocytes, - la différenciation des préadipocytes en adipocytes matures fonctionnels capables de synthétiser et de stocker des lipides au sein de gouttelettes lipidiques. Ces deux étapes sont visualisées par l'expression de marqueurs précoces, tardifs ou très tardifs qui inhibent ou qui favorisent la différenciation adipocytaire. Les cellules souches / progénitrices adipocytaires sont en effet caractérisées par la présence ou l'absence de protéines de surface (C1)34+ / Cb31-) et elles expriment également des marqueurs précoces tels que le Pref-1 (« Preadipocyte 20 Secreted Factor 1 ») facteur 1 synthétisé par les préadipocytes. L'étape de différenciation est caractérisée par l'apparition ou la disparition successive de marqueurs tout au long de la maturation adipocytaire tels que : - des facteurs de transcription qui déclenchent cette différenciation dont C/EBPs (« CCAAT/Enhancer Binding Proteins ») et PPARy (« Peroxisome 25 Proliferator Activator Recpetor y ») - le facteur A bb1/SREBP-1c (Adipocyte determi nation and differenciation factor 1 / Sterol Regulatory Element-Binding Proteins 1c) qui active l'expression des enzymes impliquées dans la synthèse des lipides. Ces changements sont accompagnés par des modifications épigénétiques, le remaniement du cytosquelette et un remodelage de la matrice extracellulaire environnante. A la suite de ces évènements précoces, survient la phase de différenciation terminale marquée par l'acquisition par l'adipocyte de propriétés lipogéniques et lipolytiques, de diverses sensibilités hormonales et de capacités sécrétoires. Selon l'invention un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum peut être utilisé pour limiter la différenciation des cellules souches / progénitrices adipocytaires. En particulier, un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum peut être utilisé pour maintenir le statut des cellules souches / progénitrices, notamment en maintenant la synthèse de Pref-1 au cours de la différenciation adipocytaire. Il permet ainsi de favoriser l'état indifférencié des cellules souches / progénitrices adipocytaires, et limite le programme de différenciation adipocytaire. Un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum peut être utilisé également pour limiter l'adipogenèse, notamment en réduisant la synthèse de SREBP-1c et en réduisant l'accumulation de gouttelettes lipidiques au sein des adipocytes. Selon l'invention, un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum peut également être utilisé pour stimuler l'activité lipolytique des adipocytes matures. Il peut être utilisé notamment pour accroître l'hydrolyse des triglycérides présents dans le compartiment lipidique des adipocytes différenciés en acides gras non estérifiés de façon significative et dose-dépendante. En stimulant ainsi l'activité lipolytique, il favorise l'élimination des lipides stockés au sein des cellules adipeuses. L'invention vise donc l'utilisation cosmétique dans une composition à application topique d'une quantité efficace d'au moins un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum comme principe actif cosmétique, ledit principe actif et/ou ladite composition étant destinés : - à limiter la différenciation des cellules souches / progénitrices adipocytaires, en particulier en maintenant le statut des cellules souches et en limitant l'adipogenèse, - à réduire le stockage des graisses, en particulier en activant la lipolyse. Appliqué sur la peau, un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum permet ainsi un effet amincissant visible et une amélioration de la peau d'orange pour un effet anti-cellulite. La silhouette est affinée et l'aspect cellulite gommée, la peau paraissant plus lisse, plus ferme et tonifiée. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'invention vise l'utilisation d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum tel que décrit en suivant. Préférentiellement le principe actif utile selon l'invention est un hydrolysat de de Silybum marianum. Encore plus préférentiellement, il s'agit d'un hydrolysat enzymatique de Silybum marianum. Par « hydrolysat » au sens de l'invention, on entend tout extrait obtenu à partir de Silybum marianum, comprenant au moins une étape d'hydrolyse. Par « hydrolysat enzymatique » au sens de l'invention, on entend tout extrait 20 obtenu à partir de Silybum marianum, comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique. Le principe actif utile selon l'invention présente préférentiellement une couleur ambrée. Selon un mode de réalisation préféré, il comprend au moins 30 % de polyphénols. 25 Il peut se présenter sous forme liquide non visqueux et être défini par au moins une des caractéristiques exposées ci-après, préférentiellement toutes. Matières sèches : Le taux de matières sèches d'un principe actif utile selon l'invention (mesuré par passage à l'étuve à 105°C en présence de sable d'un échantillon de poids initial donné jusqu'à obtention d'un poids constant) peut être compris entre 10 et 100 g/I, préférentiellement entre 22 et 33 g/I. Mesure du pH : Le pH (mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante) peut être compris entre 4 et 7, préférentiellement entre 5 et 6. Polyphénols : Détermination de la teneur en polyphénols Le dosage des composés phénoliques est réalisé par lecture de l'intensité de coloration en présence de ferricyanure de potassium, intensité détectable à 715nm et comparée à une gamme étalon d'hespéridine. Le taux de polyphénols peut être compris entre 4 et 55g/I, préférentiellement entre 10 et 18 g/I. La teneur en polyphénols est d'au moins 30% en poids de matière sèche. Elle est préférentiellement comprise entre 30 et 82% en poids de matière sèche. Caractérisation des polyphénols La caractérisation et la quantification des polyphénols du principe actif selon l'invention peut être réalisée par chromatographie liquide haute pression. L'analyse du chromatogramme est réalisée par comparaison avec une bibliothèque constituée de composés polyphénoliques standards. Le principe actif selon l'invention contient des flavonols, des composés de type silybine, et des composés hydroxycinnamiques. Carbohydrates : Détermination de la teneur en sucres totaux Le dosage de la teneur en sucres totaux peut être réalisé par la méthode de DUBOIS (DUBOIS M. et al., (1956), Analytical chemistry, 28, n°3 p. 350- 356). En présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres réducteurs donnent un composé jaune orangé. A partir d'une gamme étalon, on peut déterminer le taux de sucres totaux d'un échantillon. La teneur en sucres totaux est préférentiellement comprise entre 9 et 41% en poids de matière sèche. Caractérisation de la fraction carbohydrate : La détermination de la taille des carbohydrates d'un principe actif selon l'invention peut être réalisée par chromatographie liquide haute performance. Préférentiellement les sucres du principe actif comprennent des monosaccharides de masse moléculaire inférieure à 180ba et des oligosaccharides de masse molaire comprise entre 180 et 1990ba (degré de polymérisation minimum 2 maximum de 11). De façon préférée, plus de 50%, préférentiellement environ 60%, des sucres du principe actif selon l'invention sont des oligosaccharides de degré de polymérisation compris entre 2 et 11 (caractérisation des carbohydrates du principe actif par chromatographie HPLC). Par ailleurs, les sucres simples du principe actif selon l'invention sont préférentiellement composés majoritairement de glucose (analyse de la composition en sucres simples du principe actif selon l'invention). Il contient également du fructose, du fucose et du galactose. Teneur en cendres brutes : La teneur en cendres brutes est déterminée par la pesée des résidus issus de l'incinération à 550°C dans un four à moufle électrique (VULCANTM). Le poids du résidu est calculé en déduisant la tare. La teneur en cendres brutes est déterminée en pourcentage de poids par rapport au poids total de la matière sèche du principe actif. Elle est comprise entre 3 et 7% en poids de matière sèche. Protéines : La teneur en protéines d'un principe actif selon l'invention peut être déterminée par la méthode de KJELDHAL (référence : Official method of analysis of the A.O.C. 1975, 12th ed. W Horwitz, E.b., New York, p 15-60), et exprimée en pourcentage de poids par rapport au poids total de la matière sèche du principe actif. La teneur en protéines est préférentiellement comprise entre 6 et 22% en poids de matière sèche de principe actif. Identification de la fraction active : Le principe actif selon l'invention est composé majoritairement de sucres et de polyphénols. Lorsque le principe actif est traité avec du charbon activé et filtré, on obtient la fraction 1. L'analyse des chromatogrammes HPLC des composés polyphénoliques de la fraction 1 et du principe actif selon l'invention montre que la fraction 1 ne contient plus (ou en très faible quantité) les composés phénoliques présents initialement dans le principe actif. L'étude de l'activité lipolytique de la fraction 1, a été réalisée in vitro sur des adipocytes matures 3T3F44-2A, par mesure des acides gras libres non estérifiés (AGNE) après différenciation complète des préadipocytes en adipocytes matures contenant des lipides sous forme de gouttelettes. Testé à 1%, le principe actif selon l'invention augmente l'activité lipolytique des adipocytes matures de 927%. En comparaison, la fraction 1, testée à 1% ne présente qu'une très faible activité (moins de 20%). La fraction active du principe actif selon l'invention correspond aux composés polyphénoliques. Le principe actif utile selon l'invention peut être obtenu par un procédé comprenant une étape d'hydrolyse, préférentiellement une étape d'hydrolyse enzymatique. L'hydrolyse enzymatique est préférentiellement réalisée à l'aide d'une 5 carbohydrase. Un procédé particulièrement adapté comprend au moins la succession des étapes suivantes - solubilisation de Silybum marianum dans un mélange butylène glycol / eau, 10 - au moins une hydrolyse enzymatique. Préférentiellement, il est obtenu par un procédé comprenant au moins la succession des étapes suivantes : - solubilisation de Silybum marianum, préférentiellement en poudre, dans un mélange butylène glycol / eau préférentiellement dans les 15 proportions 75 / 25, - hydrolyse enzymatique à l'aide d'une carbohydrase, - séparation des phases soluble et insoluble par décantation, centrifugation, filtration ou tout autre moyen permettant la séparation de deux phases soluble et insoluble, 20 - inactivation enzymatique par traitement thermique, - filtration et filtration stérilisante. Des étapes de désodorisation et de décoloration peuvent être ajoutées. Les paramètres des différentes étapes doivent être ajustés afin d'obtenir des principes actifs comprenant une fraction polyphénolique représentant au moins 25 30% de la matière sèche. Le principe actif utile selon l'invention obtenu à partir de Silybum marianum est préférentiellement intégré dans une composition cosmétique, qui peut être dans différentes formes galéniques, adaptée à l'administration par voie topique cutanée et à une application sur la peau. Une telle composition peut se présenter notamment sous forme d'émulsion huiledans-eau, émulsion eau-dans-huile, émulsion multiple (Eau/Huile/Eau ou Huile/Eau/Huile) qui peuvent être éventuellement des microémulsions ou des nanoémulsions, ou sous forme de solution, suspension, hydrodispersion, gel aqueux ou poudre. Elle peut être plus ou moins fluide et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Il s'agit préférentiellement d'une composition comprenant entre 0,01% et 5% de principe(s) actif(s) obtenu à partir de Silybum marianum utile selon la présente invention. Cette composition comprend, outre l'actif, un milieu physiologiquement acceptable et de préférence cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne provoque pas de sensations d'inconfort inacceptables pour l'utilisateur telles que des rougeurs, tiraillements ou picotements. Les compositions utiles selon l'invention peuvent contenir comme adjuvant au moins un composé choisi parmi - les huiles, qui peuvent être choisies notamment parmi les huiles de silicone, linéaires ou cycliques, volatiles ou non volatiles ; - les cires, telles que l'ozokérite, la cire de polyéthylène, la cire d'abeille ou la cire de carnauba ; - les élastomères de silicone, - les tensioactifs, de préférence émulsionnants, qu'ils soient non ioniques, 25 anioniques, cationiques ou amphotères ; - les co-tensioactifs, tels que les alcools gras linéaires ; - les épaississants et/ou gélifiants, - les humectants, tels que les polyols comme la glycérine ; - les filtres organiques, - les filtres inorganiques, - les colorants, les conservateurs, les charges, - les tenseurs, - les séquestrants, - les parfums, - et leurs mélanges, sans que cette liste soit limitative. Des exemples de tels adjuvants sont cités notamment dans le Dictionnaire CTFA (International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook publié par le Personal Care Product Council). Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et leur quantité, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas, ou sensiblement pas, altérées par l'ad jonction envisagée. Les compositions cosmétiques comprenant au moins un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum sont notamment destinées aux mêmes applications que celles exposées pour le principe actif obtenu à partir de Silybum marianum. L'invention vise donc également un procédé cosmétique de soin de la peau pour un effet amincissant, comprenant l'application topique sur la peau d'une composition comprenant entre 0,01 et 5% en poids de matière sèche d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum. La composition appliquée est préférentiellement sous forme de soin corporel amincissant. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, elle est appliquée au moins une fois par jour, préférentiellement 2 fois par jour, sur les cuisses et le ventre notamment. Le procédé cosmétique de soin de la peau peut également comprendre une application combinée à un massage des zones sur lesquelles est appliquée la composition comprenant un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum. L'invention peut être illustrée par des exemples et des résultats d'essais, ces exemples et essais n'étant pas limitatifs. EXEMPLES Un exemple de procédé d'obtention et de principe actif utile selon l'invention est présenté en suivant, ainsi que des exemples de composition incluant un tel principe actif. Exemple 1 : principe actif utile selon l'invention Un exemple de procédé d'obtention d'un principe actif utile selon l'invention, comprend la mise en oeuvre des étapes suivantes : - solubilisation de 50g de poudre de Silybum marianum dans 1L de mélange butylène glycol / eau (75/25) - hydrolyse enzymatique à l'aide d'une carbohydrase pendant 50 mn, - séparation des phases soluble et insoluble par centrifugation, - inactivation enzymatique par traitement thermique pendant 6 heures à 85°C, - filtration et filtration stérilisante sur filtre 0,22p. Le principe actif obtenu présente les caractéristiques suivantes : - aspect : liquide limpide - couleur : ambrée - teneur en matières sèches : 27,8 g/I - pH : 5,5 - teneur en polyphénols : 12,2g/I, soit 44% en poids par rapport à la matière sèche - teneur en sucres totaux : 31% en poids par rapport à la matière sèche, - teneur en protéines : 20% en poids par rapport à la matière sèche, - teneur en cendres : 5% en poids par rapport à la matière sèche. Exemple 2 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans un lait amincissant sprayable Phase A. Eau QSP 100% Propylène glycol 9% Phase B. DUB ZENOAT (Stéarinerie Dubois) 4% DUB ININ (Stéarinerie Dubois) 3% DUB VINYL (Stéarinerie Dubois) 3% DUB PIS (Stéarinerie Dubois) 3% DUB MM (Stéarinerie Dubois) 2% DUB IPP (Stéarinerie Dubois) 2% DUB PULPIE (Stéarinerie Dubois) 4% DUB 340 (Stéarinerie Dubois) 2% MONTANOV 14 (Seppic) 3% Phase C. Principe actif de l'exemple 1 2% Conservateur 0,7% Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids. Cette émulsion très fluide, jaune, sans odeur présente un pH de 6,4. Elle présente un étalement facile, une pénétration rapide et un fini doux. Ce lait peut être obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - mélanger A, chauffer au bain marie à 80°C sous agitation magnétique - mélanger B, chauffer au bain marie à 80°C sous agitation magnétique - émulsionner B dans A sous rotor sator à 1500 tours/min - à 30°C, ajouter C, dans l'ordre indiqué, sous rotor sator à 1500 tours/min - laisser refroidir en abaissant régulièrement la vitesse d'agitation du rotor sator et ce, jusqu'à complète homogénéisation de l'émulsion. Exemple 3 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans un gel amincissant de massage Phase A. Eau QSP 100% Carbopol Ultrez 20 (Novéon) 1% Phase B. Beeswax 0,5% DUB LILIROSE (Stéarinerie DUBOIS) 2% Lanol 14M (Seppic) 6,3% Phase C. Principe actif de l'exemple 1 2% Conservateur 0,7 % Glycérol 3% Ethanol 1% Phase D. Silicone Microcare M1600 (Thor) 10% Silicone Microcare M8100 (Thor) 6 % Phase E. NaOH qsp pH 4,5 Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids. Ce gel émulsionné siliconé, épais, blanc et sans odeur, a un pH de 4,5. Il présente une application fraîche, avec un effet eau, un fini doux et sec. Il peut être obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - mélanger A, chauffer au bain marie à 80°C sous agitation mécanique en veillant à bien disperser le gel, - mélanger B, chauffer au bain marie à 80°C sous agitation magnétique, - émulsionner B dans A sous rotor sator à 2000 tr/min, - à 40°C ajouter C, à 2000 tr/min, - A 30°C, ajouter D, sous rotor sator à 1800 tr/min, - ajuster enfin le pH avec E, toujours sous rotor sator et laisser agiter jusqu'à complète homogénéisation. Exemple 4 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans une crème amincissante légère Phase A. Eau QSP 100% Satialgine U5551 (begussa) 1% Phase B. Huile d'amande douce (Sictia) 10% DUB RGAE (Stéarinerie Dubois) 4% DUB 1632 (Stéarinerie Dubois) 2% DUB ZENOAT (Stéarinerie Dubois) 5% Phase C. Conservateur 0,7 % Principe actif de l'exemple 1 3% Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids. Cette émulsion-gel onctueuse, écrue et sans odeur, a un pH de 5. Il présente un 15 étalement glissant avec un fini sec et mat et un effet frais. Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - mélanger A, disperser le gel au bain marie à 80°C sous agitation mécanique à 1000 tours/min, - mélanger B, chauffer au bain marie à 80°C sous agitation magnétique, 20 - émulsionner B dans A sous rotor sator à 1700 tr/min, - à 30°C ajouter C, dans l'ordre indiqué sous rotor sator à 1800 tours/min et laisser sous agitation jusqu'à complet refroidissement. Exemple 5 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans une crème amincissante et hydratante 25 Phase A. Eau QSP 100% Satialgine US551 (begussa) 1% 16 Glycérol 5% Sucrose Ester 15p 1% Phase B. DUB PTCC (Stéarinerie Dubois) 9% DUB DPHCC (Stéarinerie Dubois) 7% DUB 340 (Stéarinerie Dubois) 4% Alcool cétylique 2% DUB GMS (Stéarinerie DUBOIS) 1% MONTANOV 202 (Seppic) 2% Phase C. Principe actif de l'exemple 1 3% Conservateur 0,7 % Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids. Cette émulsion épaisse, blanche et sans odeur a un pH de 5,5. Elle présente un étalement confortable, un fini cotonneux et légèrement filmogène. Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes - mélanger A, chauffer au bain marie à 80°C sous agitation mécanique à environ 800 tours/min en veillant à bien disperser le gel, - mélanger B, chauffer au bain marie à 80°C sous agitation magnétique, - émulsionner B dans A sous rotor sator à 2500 tr/min, - ajouter C, aussitôt, dans l'ordre indiqué sous rotor sator à 3000 20 tours/min, - laisser refroidir sous agitation jusqu'à complète homogénéisation. Exemple 6 : utilisation d'un principe actif selon l'invention dans un lait corporel Phase A. Eau QSP 100% Glycérol 3% 25 Phase B. Lanol 14M (Seppic) 1% Montanov 202 (Seppic) 2% Lanol 1688 (Seppic) 10% Phase C. DC 200 (Dow Corning) 0.65% Phase D. Ethanol 8% Principe actif de l'exemple 1 2% Conservateur 0,7 % Phase E. Sepigel 305 (Seppic) 2% Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids. Cette émulsion épaisse, blanche et sans odeur a un pH de 6,1. Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - mélanger A, chauffer au bain marie à 80°C, - mélanger B, et chauffer au bain marie à 80°C sous agitation magnétique, - émulsionner A dans B sous rotor sator entre 2000 et 5000 tr/min, - à 40°C, ajouter C, puis I), toujours sous rotor stator, - ajouter C, aussitôt, dans l'ordre indiqué sous rotor sator à 3000 15 tours/min, - laisser agiter jusqu'à complet refroidissement, - ajouter E, - laisser sous agitation jusqu'à complète homogénéisation. EVALUATION DE L'EFFICACITE COSMETIQUE AMINCISSANTE ET ANTI-CELLULITIQUE 20 D'UN PRINCIPE ACTIF OBTENU A PARTIR DE SILY131/44 MARIANL/44 A. Tests in vitro A.I. Mise en place du modèle cellulaire des cellules souches / progénitrices adipocytaires A.I.1. _Isolement et caractérisation phénotypique des cellules 25 souches / progénitrices et adipocytaires Les cellules souches / progénitrices adipocytaires présentes dans la fraction stroma-vasculaire (F5V) de lipoaspiration ou de plasties abdominales, sont la seule population cellulaire du tissu adipeux capable de présenter une différenciation adipocytaire en condition adipogénique. Ces cellules souches / progénitrices adipocytaires sont positives pour le marqueur Cb34 et négatives pour le marqueur Cb21 (Cb34+ / Cb31-). Elles sont isolées de façon spécifique à l'aide de kits dédiés. L'enrichissement est mesuré à l'aide d'un cytomètre en flux et l'acquisition et l'analyse sont réalisées à l'aide de logiciels. La mise en place de cette technique permet un enrichissement en cellules souches / progénitrices adipocytaires de 90%. A.I.2. Modèle de différenciation des cellules souches / progénitrices adipocytaires Les cellules souches / progénitrices adipocytaires subissent au cours de la différenciation adipocytaire des modifications morphologiques, enzymatiques et biochimiques. Afin de vérifier ces modifications, un modèle de différenciation a été réalisé. Le protocole opératoire est décrit en suivant. A JO, les cellules souches / progénitrices Cb34+ /C1)31- sont ensemencées dans un milieu favorisant la prolifération, et incubées à 37°C. Pendant plusieurs jours, le milieu de culture est éliminé puis remplacé par un milieu de culture favorisant la différenciation adipocytaire. Le niveau de synthèse de Pref-1 et de SREBP-1c ainsi que la quantité de gouttelettes lipidiques sont analysés à l'aide d'un immunomarquage à différents stades de différenciation. L'intensité du marquage de Pref-1 est proportionnelle à l'intensité de fluorescence jaune présente au niveau des cellules. Plus la couleur jaune est élevée, plus la synthèse de Pref-1 est augmentée. L'intensité du marquage de SREBP-1c est proportionnelle à l'intensité de la fluorescence rouge présente au niveau des noyaux des cellules. Plus la couleur rouge est élevée, plus la synthèse de SREBP-1c est augmentée. Les gouttelettes lipidiques sont visualisées par la fluorescence verte. Une analyse quantitative des images est réalisée à l'aide d'un logiciel permettant de mesurer une intensité ou une surface de fluorescence ramenée à un nombre de cellules. Cette quantification est exprimée en Unité Arbitraire (UA). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous Tableau 1 Avant Début de Pendant la différenciation différenciation différenciation Pref-1 (UA) 4205 1467 / SREBP-1c (102xUA) 137 713 2050 Gouttelettes lipidiques (102xUA) 44 2498 10088 Ces résultats montrent bien qu'au cours de la différenciation des cellules souches / progénitrices Cb34+ / Cb31- en adipocytes matures : - la synthèse de Pref-1, marqueur précoce exprimé par les cellules souches / progénitrices et les préadipocytes, diminue entrainant une perte du statut indifférencié des cellules souches / progénitrices, et - la synthèse du facteur de transcription SREBP-1c, exprimé lorsque la phase de différenciation adipocytaire est initiée et régule les gènes lipogéniques, est augmentée conjointement à la formation de gouttelettes lipidiques qui caractérisé les adipocytes matures. A.II. Efficacité d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum sur les cellules souches / progénitrices adipocytaires. A.II.1. Etude du maintien du statut des cellules souches / progénitrices adipocytaires : évaluation de la synthèse de Pref-1 L'objectif de cette étude est d'évaluer la capacité d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum (exemple 1) à maintenir la synthèse d'un marqueur 5 précoce des cellules souches / progénitrices, le Pref-1 qui inhibe la différenciation adipocytaire. L'étude est réalisée par immunocytofluorescence selon le protocole opératoire décrit en suivant. A JO, les cellules souches / progénitrices adipocytaires sont ensemencées dans 10 un milieu favorisant la prolifération et incubées à 37°C. Pendant plusieurs jours, le milieu de culture est éliminé et les cellules sont traitées avec le principe actif de l'exemple 1 à 0,01%, 0,05% et 0,10% (V/V) dans un milieu de culture favorisant la différenciation adipocytaire. Le TNF-a à 0,25nM est utilisé comme témoin positif. 15 Après la différenciation adipocytaire, on analyse la synthèse de Pref-1 : réalisation d'un marquage immunocytologique et lecture de l'immunomarquage (voir point A.I.2). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2. Tableau 2 Synthèse de Pref-1 Maintien du statut de (UA) cellules souches / progénitrices (%) Avant la différenciation adipocytaire Témoin 4205 Pendant la différenciation adipocytaire Témoin 1467 TNF-a 0,25nM 2648 43 Principe actif de l'exemple 1 à 0,01% 2041 21 Principe actif de l'exemple 1 à 0,05% 2612 42 Principe actif de l'exemple 1 à 0,10% 3210 64 Testé à 0,1% sur cellules souches / progénitrices en cours de différenciation, le principe actif de l'exemple 1 maintient la synthèse de Pref-1 de 64%. Ces résultats montrent qu'un principe actif obtenu à partir de de Si lybum marianum peut être utilisé pour conserver la statut non différencié des cellules 5 souches / progénitrices adipocytaires et par conséquent pour un effet amincissant et anti-cellulite. A.II.2 Etude de l'adipogenèse : évaluation de la synthèse de SREBP-1c et de la formation de gouttelettes lipidiques Cette étude a pour objectif d'évaluer la capacité d'un principe actif obtenu à 10 partir de Si lybum marianum (exemple 1) à limiter sur des cellules souches / progénitrices en cours de différenciation : - la synthèse de SREBP/1c, facteur de transcription régulant l'expression des gènes de la lipogenèse - l'accumulation des gouttelettes lipidiques caractéristiques des adipocytes 15 matures. L'étude est réalisée par immunofluorescence et le protocole opératoire est décrit en suivant. A JO, les cellules souches / progénitrices adipocytaires sont ensemencées dans un milieu favorisant la prolifération et incubées à 37°C. 20 Pendant plusieurs jours, le milieu de culture est éliminé et les cellules sont traitées avec le principe actif de l'exemple 1 à 0,01%, 0,05% et 0,10% (V/V) dans un milieu de culture favorisant la différenciation adipocytaire. Le TNF-a à 0,25nM est utilisé comme témoin positif. Pendant la différenciation adipocytaire, on analyse la synthèse de SREBP-1c et le 25 contenu des gouttelettes lipidiques : réalisation d'un marquage immunocytologique et lecture de l'immunomarquage (voir point A.I.2). Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 3 et 4. Tableau 3 Synthèse de SREBP-lc Efficacité / témoin (%) (102xUA) Avant la différenciation adipocytaire Témoin 137 Début de la différenciation adipocytaire Témoin 713 Pendant la différenciation adipocytaire Témoin 2050 TNF-a 0,25nM 216 -89 Principe actif de l'exemple 1 à 0,01% 1622 -21 Principe actif de l'exemple 1 à 0,05% 1319 -36 Principe actif de l'exemple 1 à 0,10% 766 -63 Tableau 4 Accumulation de Efficacité / témoin (%) gouttelettes lipidiques (102xU A) Avant la différenciation adipocytaire Témoin 44 Début de différenciation adipocytaire Témoin 2498 Pendant la différenciation adipocytaire Témoin 10088 TNF-a 0,25nM 14 -100 Principe actif de l'exemple 1 à 0,01% 7345 -27 Principe actif de l'exemple 1 à 0,05% 5832 -42 Principe actif de l'exemple 1 à 0,10% 1693 -83 On constate que testé à 0,10% sur cellules souches / progénitrices en cours de différenciation adipocytaire, le principe actif de l'exemple 1 réduite la synthèse de SREBP-1c de 63% et l'accumulation de gouttelettes lipidiques au sein des adipocytes de 83%. Ces résultats montrent qu'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum peut être utilisé pour limiter l'adipogenèse. A.III. Efficacité d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum sur les cellules matures adipocytaires A.III.1 Sur modèles 2b d'adipocytes matures Le but de cette étude est d'évaluer in vitro sur adipocytes 3T3F44-2A et sur adipocytes humains, l'influence d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum (exemple 1) sur l'activité lipolytique, par mesure des acides gras libres non estérifiés (AGNE), après différenciation complète des préadipocytes matures en adipocytes matures. Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant. Les préadipocytes sont ensemencés dans un milieu de culture favorisant la prolifération adipocytaire et incubées à 37°C. Après plusieurs jours, le milieu est éliminé puis remplacé par du milieu favorisant la différenciation adipocytaire. Lorsque les cellules sont différenciées, le milieu est éliminé, puis remplacé par un milieu contenant 0,10%, 0,25%, 0,50% et 1% du principe actif de l'exemple 1 ou une solution de caféine à 1% utilisée comme témoin positif. Les cellules sont ensuite incubées à 37°c, puis les surnageants de culture sont récupérés. Le dosage des AGNE est réalisé à l'aide de kits colorimétriques dédiés. Il est lu à 540nm. Une gamme étalon est réalisée en parallèle de façon à exprimer les résultats en pM d'AGNE. Les résultats obtenus sur adipocytes 3T3F44-2A matures sont présentés dans le tableau 5 et ceux obtenus sur adipocytes humains matures dans le tableau 6, ci-25 après. Tableau 5 Taux d'AGNE (pM) Activité lipolytique / témoin (%) Témoin 93 Principe actif de l'exemple 1 à 0,10% 133 +43 Principe actif de l'exemple 1 à 0,25% 368 +296 Principe actif de l'exemple 1 à 0,50% 734 +689 Principe actif de l'exemple 1 à 1% 955 +927 Caféine (37,5g/1) 1% 451 +385 Tableau 6 Taux d'AGNE (pM) Activité lipolytique / témoin (%) Témoin 23 Principe actif de l'exemple 1 à 0,25% 26 +13 Principe actif de l'exemple 1 à 0,50% 32 +39 Principe actif de l'exemple 1 à 1% 40 +74 Caféine (37,5g/1) 1% 41 +78 On constate que testé à 1% le principe actif de l'exemple 1 stimule la libération des AGNE : - de 927% sur adipocytes 3T3F44-2A, et - de 75% sur adipocytes humains. Ces résultats montrent qu'un principe actif obtenu à partir de de Silybum marianum peut être utilisé pour un activité lipolytique et ainsi favoriser le déstockage des lipides. A.III.2 Sur modèles 31) d'adipocytes matures L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet lipolytique principe actif obtenu à 10 partir de Silybum marianum (exemple 1) sur l'hypoderme par la mesure du volume des adipocytes matures traduisant ainsi la capacité du principe actif à décongestionner le tissu adipeux. Cette étude a été réalisée par coloration histologique (Hématoxyline Éosine) sur hypoderme humain. Des punchs de plusieurs mm de diamètre sont réalisés à partir de plastie humaine et sont maintenus en survie dans du milieu de culture. Ces explants sont traités quotidiennement avec le principe actif de l'exemple 1 formulé à 1% et 2% (V/V), avec la caféine ou avec le placebo en systémique. Les explants sont récupérés après plusieurs jours de traitement, fixés, déshydratés et inclus en paraffine. Des coupes (41.n) sont ensuite réalisées à l'aide d'un microtome. Une coloration histologique Hématoxyline 2osine (HE) est réalisée. La visualisation en contraste de phase du tissu adipeux, est réalisée sur microscope couplé à un système d'analyse d'images. L'étude du diamètre s'est fait par une extraction du contour des adipocytes à l'aide du logiciel Matlab®. La méthode appliquée permet d'analyser la surface de chaque adipocyte : le résultat étant la moyenne de la surface totale des adipocytes détectés exprimée en pixels. Les résultats sont présentés dans le tableau 7 ci-après. Tableau 7 Surface Efficacité / ad i pocytai re Témoin (nb pixels) (%) Témoin 3101 Caféine 2419 -22 Principe actif de l'exemple 1 à 1% 2536 -18 Principe actif de l'exemple 1 à 2% 2322 -2520 On constate que le principe actif de l'exemple 1 testé à 2% sur hypoderme de peau humaine, réduit significativement le volume des adipocytes matures de 25% et permet ainsi la décongestion du tissu adipeux. B. Tests in vivo B.I. Etude de l'effet amincissant et anti-cellulitique Cette étude a pour objectif d'évaluer in vivo sur volontaires, l'effet amincissant d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum (exemple 1) formulé à 2% en émulsion (composition de l'exemple 6), sur un groupe de volontaires n'ayant pas bénéficié de massage régulier en comparaison au placebo. Cette étude a été réalisée sur les paramètres cutanés suivants par les méthodes décrites ci-après - le tour de cuisse par mesure centimétrique, - le relief des capitons sur le côté extérieur de la cuisse par projection de franges, - le stade de cellulite, par évaluation visuelle par jury d'après une échelle de stades. La projection de franges porte sur des acquisitions à l'aide d'un appareil dédié à la mesure 3b du relief cutané, et étude des paramètres : o de rugosité moyenne de surface en 31) : ^ Sq : moyenne quadratique de rugosité de surface ^ Sa : moyenne arithmétique de rugosité de surface o de volume : volume positif, c'est-à-dire le volume supérieur à la surface de la peau L'évaluation visuelle est réalisée par jury entrainé à partir de photographies 25 standardisées du côté extérieur de la cuisse en position verticale éclairée par une lumière rasante et un système de pincement contrôlé permettant une pression standardisée de la zone. L'étude a été réalisée sur un groupe de volontaires présentant les caractéristiques suivantes : - âge compris entre 31 et 50 ans - IMC compris entre 20 et 27 - répartition des stades de cellulite : 56% des volontaires en stade 2 ou 3 et 44% en stade 4 ou 5. Les différentes évaluations ont été réalisées avant et après 56 jours d'applications biquotidiennes. Le protocole opératoire est le suivant. Entre J-14 et JO, les volontaires arrêtent d'appliquer des crèmes au niveau des cuisses. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau du côté extérieur des cuisses et : - on réalise l'acquisition 31) de chacune des zones par projection de franges - on réalise des photographies - on effectue des mesures centimétriques du tour de cuisse. Entre JO et J56 les volontaires appliquent deux fois par jour la composition de l'exemple 6 et le placebo. A J56, on retrouve les mêmes deux zones cutanées symétriques au niveau du 20 côté extérieur des cuisses qu'à JO et : - on réalise l'acquisition 31) de chacune des zones par projection de franges - on réalise des photographies - on effectue des mesures centimétriques du tour de cuisse. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 8 pour la mesure 25 centimétrique du tour de cuisse, le tableau 9 pour l'évaluation du relief par projection de franges et le tableau 10 pour l'évaluation visuelle de la cellulite par jury entrainé. Tableau 8 Tour de cuisse Différence J56-J0 (cm) Placebo -0,2 Composition de l'exemple 6 -0,8 Tableau 9 Variation / JO (%) Paramètre Sa Paramètre Sq Volume positif Placebo +0,2 -0,3 +0,5 Composition de l'exemple 6 -12,1 -12,7 -7,4 Tableau 10 Variation / JO (%) Placebo -7,8 Composition de l'exemple6 -19,3 Ces résultats montrent que dans les conditions de cette étude, après 56 jours d'applications biquotidiennes, et en comparaison au placebo, un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum permet d'améliorer les paramètres cutanés suivants : - le tour de cuisse - le relief des capitons au niveau des cuisses - l'aspect peau d'orange. B.II. Etude de l'effet amincissant et anti-cellulitique en combinaison à un massage mécanique régulier L'objectif de cette étude est d'évaluer in vivo sur volontaires, l'effet amincissant d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum (exemple 1) formulé à 2% en émulsion (composition de l'exemple 6), utilisé en combinaison à un massage mécanique, et en comparaison au placebo. Cette étude a été réalisée sur les mêmes paramètres cutanés que l'étude du point B.I, avec les méthodes d'évaluation. Les méthodes suivantes ont été utilisées L'étude a été réalisée sur un groupe de volontaires présentant les caractéristiques suivantes : - âge compris entre 25 et 50 ans - IMC compris entre 19 et 28 - répartition des stades de cellulite : 56% des volontaires en stade 2 ou 3 et 15 44% en stade 4 ou 5. Les différentes évaluations ont été réalisées avant et après 56 jours d'applications biquotidiennes. Le protocole opératoire est le suivant. Entre J-14 et JO, les volontaires arrêtent d'appliquer des crèmes au niveau des 20 cuisses. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau du côté extérieur des cuisses et : - on réalise l'acquisition 3b de chacune des zones par projection de franges - on réalise des photographies 25 - on effectue des mesures centimétriques du tour de cuisse. Entre JO et J56 les volontaires appliquent deux fois par jour la composition de l'exemple 6 et le placebo en combinaison à des massages mécaniques. L'appareil utilisé pour les massages est identique pour tous les volontaires et se présente sous forme de rouleaux de massage avec des picots en silicone. A J56, on retrouve les deux mêmes zones cutanées symétriques au niveau du côté extérieur des cuisses qu'à JO et : - on réalise l'acquisition 31) de chacune des zones par projection de franges - on réalise des photographies - on effectue des mesures centimétriques du tour de cuisse. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 11 pour la mesure centimétrique du tour de cuisse, le tableau 12 pour l'évaluation du relief par pro jection de franges et le tableau 13 pour l'évaluation visuelle de la cellulite par jury entrai né. Tableau 11 Tour de cuisse Différence J56-J0 (cm) Placebo -0,41 Composition de l'exemple 6 -0,81 Tableau 12 Variation / JO (%) Paramètre Sa Paramètre Sq Volume positif Placebo -8,3 -8,8 -6,9 Composition de l'exemple 6 -16,4 -16,5 -12,1 Tableau 13 Variation / JO (%) Placebo -20,6% Composition de l'exemple 6 -31,1% Ces résultats montrent que dans les conditions de cette étude, après 56 jours d'applications biquotidiennes, un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum formulé à 2% en émulsion, utilisé combiné à un massage mécanique, permet d'améliorer les paramètres cutanés suivants : - le tour de cuisse - le relief des capitons au niveau des cuisses - l'aspect peau d'orange. L'utilisation combinée d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum avec un instrument de massage amplifie les effets amincissants du principe actif 10 obtenu à partir de Silybum marianum. REVENDICATIONS1. Utilisation dans une composition cosmétique à application topique d'une quantité efficace d'au moins un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum, comme principe actif cosmétique, ledit principe actif et/ou ladite composition étant destinés à un effet amincissant et/ou anti-cellulite. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le principe actif cosmétique et/ou la composition cosmétique sont destinés à limiter la différenciation des cellules souches adipocytaires. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le principe actif cosmétique et/ou la composition cosmétique sont destinés à limiter la différenciation des cellules souches adipocytaires en maintenant le statut des cellules souches et en limitant l'adipogenèse. 4. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que le principe actif cosmétique et/ou la composition cosmétique sont destinés à réduire le stockage des graisses. 5. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que le principe actif cosmétique et/ou la composition cosmétique sont destinés à réduire le stockage des graisses en activant la lipolyse. 6. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que le principe actif est un hydrolysat de Silybum marianum. 7. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que le principe actif est obtenu par un procédé comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique de Silybum marianum. 8. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que le principe actif comprend au moins 30% de polyphénols en poids de 25 matière sèche. 9. Utilisation selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que le principe actif présente au moins une des caractéristiques suivantes - entre 30 et 82 % de polyphénols, - entre 11 et 41% de carbohydrates, 5 les pourcentages étant donnés en poids de matière sèche. 10. Procédé cosmétique de soin de la peau pour un effet amincissant et/ou anti-cellulite, comprenant l'application topique sur la peau d'une composition contenant entre 0,01 et 5% en poids d'un principe actif obtenu à partir de Silybum marianum. 10 11. Procédé cosmétique de soin de la peau la revendication 10, caractérisé en ce que la composition est appliquée en combinaison à un massage mécanique.